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JIM BATTAGIN
CINÉTICA ENZIMÁTICA E EFEITO DE
EXTRATOS NATURAIS NA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLICOSILTRANSFERASE DE
Streptococcus mutans
BRAGANÇA PAULISTA – SP
2010
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JIM BATTAGIN
CINÉTICA ENZIMÁTICA E EFEITO DE
EXTRATOS NATURAIS NA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLICOSILTRANSFERASE DE
Streptococcus mutans
ORIENTADORA
DRA. PATRÍCIA DE OLIVEIRA CARVALHO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde da
Universidade São Francisco (USF) para obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde.
BRAGANÇA PAULISTA – SP
2010
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BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ORIENTADORA: Profª Dra. Patrícia de Oliveira Carvalho
MEMBROS:
1 - Profª Dra. Patrícia de Oliveira Carvalho
2 - Profª Dra. Gabriela Alves Macedo
3 - Profª Dra. Giovana Radomille Tofoli
SUPLENTES:
1 - Profª Dra. Natália Reiko Sato Miyasaka
2 - Profª Dra. Aparecida Érica Bighetti Ribas
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE DA UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Data: 26/02/2010
Ficha catalográfica elaborada pelas bibliotecárias do Setor de
Processamento Técnico da Universidade São Francisco.
QW 142.5 Battagin, Jim.
B338c Cinética enzimática e efeito de extratos naturais na
atividade da enzima glicosiltransferase de Streptococcus
mutans / Jim Battagin.-- Bragança Paulista, 2010.
42 p.
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde da
Universidade São Francisco.
Orientação de: Patrícia de Oliveira Carvalho.
1. Streptococcus mutans. 2. Glicosiltransferase. 3.
3. Rosmarinus officinalis. I. Carvalho, Patrícia de
Oliveira. II. Título.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a meu falecido pai, cuja presença em minha vida é constante,
e seus ensinamentos produzirão frutos, advindos de sua capacidade como homem
íntegro, honesto e trabalhador.
Dedico também a minha mãe, sem a qual eu jamais teria vivido o que vivi na vida,
sempre amabilíssima, generosa, firme, rigorosa quando necessário, mas que Deus
sempre a iluminou para ser tudo isso.
Dedico ainda aos meus irmãos, a minha namorada, as minhas sobrinhas, as minhas
cunhadas e parentes que nos momentos de minha ausência nos eventos familiares,
souberam entender meus objetivos e me incentivaram para que cumprisse com êxito até
o final.
AGRADECIMENTOS
Agradeço muito a Deus, o criador de tudo.
Agradeço a Universidade São Francisco, sempre com admiração e respeito.
Agradeço ao Coordenador Dr. José Pedrazolli Jr., pelo dinamismo e
envolvimento com o ensino e a pesquisa.
Agradeço em especial a Profª Dra. Patrícia de Oliveira Carvalho, minha
orientadora que servirá de exemplo em meu futuro e com certeza criou em mim um algo
mais, motivando-me na pesquisa científica e mostrando-me o que é ser um professor
firme, capaz e sapiente.
Aos professores do curso de Pós-Graduação, em especial a Profª Natália Reiko
Sato Miyasaka, que contribuíram muito no meu aprendizado, exercendo a docência com
grandeza e alto nível de conhecimento.
Aos amigos de curso pela amizade sincera, pelos momentos compartilhados com
alegria.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisas: Fabiano Jares, Vânia, Verônica,
Neusa, Isabel, Júlio, Rosemary, Rafael, Viviane, Fernandas, Maria Elisa, Tatiana,
Marcelas, Juliana, Amandas, Gabrielle, Camila, Janilda, Bianca, Thais, Sônia, Leandro,
Ana Augusta, Denise, Daniel, Aline e tantos outros que estiveram ao meu lado em todos
os momentos.
Ao amigo e responsável pelo Laboratório de Pesquisas Fabiano Sallowicz pela
colaboração e apoio notável.
A verdadeira sabedoria consiste em saber como aumentar o bem-estar do
mundo”
Benjamin Franklin
RESUMO
A cavidade oral apresenta uma complexa comunidade de microrganismos que podem
estar aderidos aos dentes, a mucosa epitelial ou formando biofilmes. Dentre esses
microorganismos encontramos o principal agente etiológico da cárie dental, o Streptococcus
mutans (SM). A prevenção do acúmulo dessas bactérias e da formação do biofilme dental são
meios de combater a cárie dental. Face ao exposto, torna-se importante utilizar terapias
alternativas e produtos naturais, derivados de plantas, de forma segura, racional e benéfica,
como agentes antimicrobianos e antiaderentes frente às afecções bucais. O emprego de extratos
de plantas tem merecido a atenção de pesquisadores de vários países, já que podem inibir tanto a
atividade da enzima glicosiltransferase (GTF) produzida pelo SM como diretamente o
crescimento desta bactéria. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito inibitório in vitro
de extratos vegetais de Rosmarinus officinalis Linn (alecrim), Camelia sinensis (chá verde) e
Ilex paraguariensis (chá mate) sobre a atividade da glicosiltransferase e sobre o crescimento de
Streptococcus mutans. Além disto, foram estudados alguns parâmetros cinéticos da enzima. Os
resultados obtidos foram promissores com o extrato aquoso de Rosmarinus officinalis (alecrim)
que nas concentrações acima de 4mg/mL mostraram inibição significativa da atividade da GTF
(50 - 75%). Por outro lado, os outros extratos analisados não foram capazes de inibir o
crescimento bacteriano. Os resultados apontam que o extrato aquoso de alecrim pode ser uma
fonte valiosa para a descoberta de novas moléculas bioativas empregadas para a inibição da
enzima GTF e conseqüente inibição de síntese de glucanos envolvidos na cárie.
Palavras-chave: Streptococcus mutans, glicosiltransferase, Rosmarinus officinalis
ABSTRACT
The oral cavity presents a complex microbial community which can adhere to the teeth,
the epithelial mucous and form biofilms. The main etiological agent causing dental caries,
Streptococcus mutans (SM), can be found amongst these microorganisms. Thus one of the ways
to prevent dental caries could be to inhibit the growth of these bacteria and the biofilm
formation. Based on the above, the use of alternative therapies and natural products derived
from plants in a safe, rational and beneficial way, as antimicrobial and anti-adherent agents has
become of importance to overcome mouth infections. The use of plant extracts has attracted the
attention of researchers in various countries, since they can both inhibit the activity of the
enzyme glucosyltransferase (GTF) produced by the SM and also directly inhibit growth of these
bacteria. The objective of the present research was to evaluate the in vitro inhibitory effect of
the following vegetable extracts: Rosmarinus officinalis Linn (rosemary), Camelia sinensis
(green tea) and Ilex paraguariensis (mate tea) on the activity of glucosyltransferase and
Streptococcus mutans. Some of the kinetic parameters of the enzyme were also studied. The
results obtained with the aqueous extract of Rosmarinus officinalis (rosemary) were promising,
since it showed significant inhibition of GTF activity (50 – 75%) in concentrations above
4mg/mL On the other hand, the other extracts examined were unable to inhibit the bacterial
growth. The results show that the aqueous extract of rosemary could be avaluable source for the
discovery of new bioactive molecules for use in the inhibition of the enzyme GTF and
consequent inhibition of the synthesis of glucans involved in caries formation.
Key-words: Streptococcus mutans, glucosyltransferase, Rosmarinus officinalis
LISTA DE ABREVIATURAS
A Absorbância
ABF Azul de Bromofenol
ANOVA Análise de variância
ATCC American Type Culture Colection
ATP Adenosina trifosfato
BHI Brain Heart Infusion
CBG-250 Coomassie Brilliant Blue G
CIM Concentração inibitória mínima
DMSO Dimetilsulfóxido
EAG Equivalente em ácido gálico
GC-MS cromatografia gasosa-espectrometria de massas
GTF Glicosiltransferase
Km Constante de Michaelis-Menten
PIC Polissacarídeo intra-celular
SM Streptococcus mutans
Vmáx velocidade máxima
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição do meio BHI utilizado para crescimento de Streptococcus mutans
Tabela 2 Atividade da enzima glicosiltransferase de Streptococcus mutans
Tabela 3 Inibição da atividade da glicosiltransferase por clorexidina após 1 hora de
reação
Tabela 4 Conteúdo de fenólicos totais dos extratos de alecrim, chá-verde e chá-mate
Tabela 5 Valores de Absorbância a 630nm do caldo BHI após 48 horas de crescimento
de Streptococcus mutans
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Perfil de crescimento da cultura de Streptococcus mutans ATCC 25175 em
caldo BHI em função do tempo
Figura 2. Variação do pH da cultura de Streptococcus mutans ATCC 25175 após
crescimento em caldo BHI em função do tempo
Figura 3. Variação do conteúdo de hexoses neutras nas frações de alto e baixo peso
molecular do sobrenadante numa cultura de Streptococcus mutans crescida em BHI.
Figura 4. Efeito da concentração do substrato sacarose na atividade enzimática da
glicosiltransferase de Streptococcus mutans.
Figura 5. Leitura da Absorbância em função do tempo para avaliação da formação de
glucanos pela glicosiltransferase utilizando o substrato sacarose
Figura 6. Efeito do extrato aquoso de alecrim (Rosmarinus officinalis) na atividade da
Glicosiltransferase.
Figura 7. Efeito do extrato aquoso de erva-mate (Ilex paraguariensis) na atividade da
Glicosiltransferase.
SUMÁRIO
RESUMO vi
ABSTRACT vi
i
LISTA DE ABREVIATURAS viii
LISTA DE TABELAS i
x
LISTA DE FIGURAS x
1 - INTRODUÇÃO 1
1.1 Cárie dentária 1
1.2 Streptococcus mutans 3
1.3 A enzima glicosiltransferase 7
1.4 Os glucanos 8
1.5 O biofilme dental 9
1.6 Produtos naturais como inibidores da GTF 10
1.6.1 Rosmarinus officinalis L. (alecrim) 10
1.6.2 Camelia sinensis (chá-verde) 11
1.6.3 Ilex paraguariensis A. St.-Hill (erva-mate) 13
2 - OBJETIVOS 14
2.1 Objetivo geral 14
2.2 Objetivos específicos 14
3 - MATERIAIS E MÉTODOS 15
3.1 Microrganismo e condições de crescimento 15
3.2 Curva de crescimento de Streptococcus mutans 15
3.3 Quantificação dos produtos (expresso em hexoses neutras) presentes no
sobrenadante da cultura 16
3.4 Obtenção e caracterização da glicosiltransferase (GTF) 16
3.4.1 Preparação de extratos de GTF 16
3.4.2 Determinação da atividade de GTF de S mutans 17
3.4.2.1 Determinação de açúcares redutores 17
3.4.2.2 Quantificação de proteína total 17
3.4.2.3 Quantificação dos glucanos 18
3.4.2.4 Determinação dos parâmetros cinéticos da reação 18
3.5 Inibição da atividade da glicosiltransferase por extratos vegetais 18
3.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de diferentes
extratos sobre o crescimento de S. mutans 19
3.7 Determinação de fenóis totais 19
3.8 Análise estatística 20
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 21
4.1 Crescimento do Streptococcus mutans 21
4.1.1 Curva de crescimento 21
4.1.2 Variação do pH ao longo do crescimento 22
4.2 Estudo da variação do conteúdo de hexoses neutras presentes
no sobrenadante das culturas 23
4.3 Estudo da atividade e parâmetros cinéticos da glicosiltransferase (GTF) 24
4.4 Verificação da formação de glucanos 26
4.5 Inibição da atividade da glicosiltransferase por extratos vegetais 27
4.6 Determinação de fenóis totais 29
4.7 Concentração Inibitória Mínima (CIM) de extratos vegetais sobre
crescimento de S. mutans 30
5 - CONCLUSÃO 32
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 33
7 - ANEXOS 41
1-INTRODUÇÃO
1.1-Cárie dentária
É aceito universalmente que a cárie dentária é uma doença multifatorial, infecciosa,
transmissível e dieta dependente, que desmineraliza a estrutura dental (Keyes, 1960). Ao
conceituar a cárie dentária e seus fatores etiológicos podem-se determinar estratégias
preventivas de diagnóstico e tratamento.
Esse conceito é embasado na interação: dente suscetível, microrganismo e dieta
determinando a “doença” cárie, como o Diagrama de Keyes (Keyes, 1962). Para Newbrun
(1988), a cárie resulta de um processo crônico, após um tempo de interação desses 3 fatores
citados. Baseando-se no controle desses fatores, as estratégias implementadas só diminuem
a incidência de cárie, sem erradicá-la (Lima, 2008).
Assim hipoteticamente, o conceito de cárie e o entendimento sobre seus fatores
etiológicos estão incompletos, devendo ser conhecidos profundamente para que estratégias
preventivas objetivas possam ser realizadas (Lima, 2008).
O índice CPOD (dentes cariados, perdidos e obturados) é muito utilizado em
levantamentos epidemiológicos de saúde bucal, sendo recomendado pela OMS
(Organização Mundial de Saúde) para medir e comparar a experiência de cárie em
populações expressando assim a média de dentes cariados, perdidos e obturados num grupo
de indivíduos (World Health Organization, 1997). A OMS estabeleceu como meta para
2010, um índice CPOD menor ou igual a 1 para crianças aos 12 anos de idade (World
Health Organization, 1997). A cidade de Bragança Paulista situada na região de Campinas
obteve um índice CPOD de 2,51 em levantamento realizado entre 1998 e 2001 (Cypriano et
al, 2005).
Com relação à suscetibilidade à cárie, o indivíduo pode apresentar fatores
extrínsecos relacionados e estrutura sociocultural e fatores intrínsecos como fluxo,
composição e capacidade tampão da saliva, aspectos hereditários e imunológicos difíceis de
serem controlados, já os dentes possuem graus de mineralização do esmalte com maior ou
menor resistência aos ácidos (Lima, 2008).
Não existe um dente suficientemente resistente à cárie, e mesmo procurando
aumentar sua resistência, por métodos químicos e mecânicos, sempre depende-se do desafio
cariogênico que o indivíduo será submetido. Assim o fator suscetibilidade, é de importância
relativa para as estratégias preventivas (Lima, 2008).
Com relação aos microrganismos, o Streptococcus mutans (SM) não é o único a
participar do desenvolvimento da lesão (Sullivan et al, 1996), e somente sua presença na
placa dentária não explica variação na experiência de cárie (Tenuta et al, 2003). Também há
um declínio da cárie dentária, sem uma mudança aparente no nível de SM na saliva
(Bjarnason et al, 1994).
Procurando esclarecer a correlação entre a cárie dentária e a presença de
microrganismos, fluxo salivar, capacidade tampão da saliva e sacarose não se chegou a
resultado conclusivo e definitivo em relação à influência desses fatores no controle da cárie
dentária (Tenuta et al, 2003), sugerindo que os métodos de diagnóstico de pacientes de risco
sejam revistos (Sullivan et al, 1996).
A simples presença de microrganismos na cavidade bucal, na saliva ou na placa
bacteriana, não é um fator determinante para o aparecimento de cárie, mas sua participação
é inquestionável e indispensável, pois a lesão de cárie passa pelo metabolismo bacteriano,
culminando no processo fisiológico de “des-re” (desmineralização-remineralização), não
determinando a “doença” cárie (Thylstrup e Fejerskov, 1995) e não se justificando a
interpretação da cárie como uma doença infecciosa (Lima, 2008).
Com relação à dieta, considera-se que a desmineralização após uma ingestão
cariogênica se dá num determinado tempo, até a ação da saliva paralisar o processo,
determinando uma simples desmineralização reversível. Uma ingestão mais freqüente de
alimentos cariogênicos, produz um desequilíbrio “des-re” maior sendo indispensável e
inquestionável a necessidade de sua participação, mas não determinante, pois os resultados
são inconclusivos quanto seu papel na etiologia da cárie dentária, sendo insatisfatórias as
estratégias preventivas para sua eliminação ou controle (Lima, 2008).
Dependendo da freqüência da ingestão de dieta cariogênica, realiza-se um controle
periódico de placa, que permite a saliva exercer potencial remineralizador, mantendo o
equilíbrio da “des-re” e o tempo para formar a lesão de cárie será indeterminado, sendo um
fator relativo na etiologia da cárie (Lima, 2008).
A lesão de cárie pode ser evitada e controlada mesmo em situações de alta
experiência de cárie, pelo controle periódico de placa, que deve ser inversamente
proporcional à freqüência de dieta cariogênica, permitindo o reequilíbrio “des-re”,
impedindo a irreversibilidade das lesões. Outros fatores como: os salivares, imunológicos,
socioeconômicos, culturais, comportamentais, contagem de microrganismos e fluorterapia
são de importância relativa no estabelecimento de estratégias preventivas (Lima, 2008).
1.2- Streptococcus mutans
Streptococcus do grupo mutans (SM) foram descobertos no início do século XX, e
descritos como “mutantes” por sua morfologia celular ser mais achatada do que outros
estreptococos (Banas, 2003). A associação do Streptococcus mutans (SM) com a cárie
dental não foi reconhecida até que em 1960 pesquisadores reavivaram o interesse pela
bactéria. SM são versáteis microrganismos na etiologia da cárie dental (Menaker, 1984).
SM são os principais habitantes da cavidade oral, sendo encontrados em 90% dos humanos
(Baratieri, 1992).
SM são bactérias não esporuladas, catalase negativas, possuindo uma parede celular
constituída de proteínas, carboidratos e peptidoglicanos (Jawetz et al, 1998).
Microscopicamente as células do SM são cocos Gram positivas, tem morfologia ovalada e
medem cerca 0,5 a 0,75 mm de diâmetro, unidas aos pares ou em cadeias curtas ou médias,
e suas colônias tem tonalidade azul-clara, bordas onduladas e interior granular, são
anaeróbios facultativos e sua temperatura ótima de crescimento é de 37°C (Burnet et al,
1978).
Para crescimento desta bactéria, exige-se a seleção de um meio de cultura rico em
nutrientes onde essa espécie cresce mais quando na presença de 5% de gás carbônico
(Uzeda, 2002). O melhor meio seletivo para isolar SM é o ágar mitis salivarius bacitracina,
associado com 20% de sacarose e 0,2 unidades/ml de bacitracina, crescendo unicamente o
SM e suprimindo a maioria dos outros estreptococos (Newbrun, 1988). SM não hidrolisa
arginina, é α hemolítico promovendo no meio ágar sangue, onde suas colônias são brancas
ou cinza, circular ou irregular e unidas ao ágar (Uzeda, 2002), hemólise parcial de
eritrócitos (Newman e Nisengard, 1994). SM tem viabilidade de 100% em valores de pH
entre 5,5 e 6,0 para seu crescimento e multiplicação, valores de 91% a 98% no pH 5,0 e no
pH 3,0 suas células morrem (Li, 2001).
A identificação de SM é baseada na sua morfologia de suas colônias, seletividade ao
meio de cultura, coloração de Gram, morfologia na microscopia ótica e suas características
de crescimento em relação ao padrão enzimático e assimilação de açúcares (Koneman et al,
2001). A simples detecção não implica que haverá o desenvolvimento da cárie dental, já que
fatores socioeconômicos, culturais, ambientais (Mattos-Graner et al, 2001), além de uma
dieta de alto teor de sacarose e a qualidade e freqüência da higiene bucal são primordiais
para o seu desenvolvimento (Barbieri, 2005).
SM foram originalmente descritos como uma única espécie dividida em 8 grupos de
a a h devido a especificidade sorológica dos antígenos de carboidratos da parede celular e
são classificados SM sorotipo c, e e f que são os membros do grupo mutans que
predominam no homem (Bentley et al, 1991).
Segundo Kolenbrander e London (1993), SM se tornaram importantes agentes
patogênicos, associados com o início e patogenia da cárie dental. Esses autores observaram
que colonização de SM aos dentes ocorre em duas fases distintas, independentes, a fase
primária é dependente da interação específica de proteínas da película adquirida do esmalte
com moléculas de superfície da célula bacteriana denominadas adesinas, a fase secundária é
denominada de acúmulo e propicia o aumento do número de células bacterianas na placa
dental, porém SM não são bons colonizadores primários dos dentes devido suas adesinas
terem pouca afinidade a película adquirida em relação as de outras bactérias.
A adesão de SM na placa dental pode ser mediada por uma via dependente de
sacarose e responsável pela colonização ao hospedeiro com papel proeminente em iniciar
mudanças na ecologia da placa e podendo envolver a ligação do glucano a bactéria ou a
adesão do SM ao glucano na placa dental, já que in vitro na presença de sacarose, SM se
encobre de glucano (Banas, 2003).
Existe ainda uma via independente de sacarose onde os componentes salivares na
película adquirida do esmalte iniciam a adesão, influenciados por uma proteína de 185 kDa,
o antígeno I/II que tem estrutura baseada ao domínio aminoácido, mas com função variável
com relação a ligar-se a aglutininas salivares, componentes da película salivar e outras
bactérias da placa dental, sendo que os domínios ricos em prolina e alanina parecem
responsáveis pela interação antígeno I/II e componentes salivares (Banas, 2003).
As bactérias utilizam-se dos açúcares através de dois componentes enzimáticos: um
que envolve o transporte de açúcar para dentro da célula e outro para convertê-lo num
metabólito a ser degradado pela via glicolítica constitutiva do microrganismo (Thylstrup e
Fejerskov, 1995).
Em altos níveis de concentração de açúcares o produto final de excreção é o ácido
lático da via lactato desidrogenase, e nos baixos níveis de açúcar, a via piruvato formato-
liase gera ácido fórmico, acético e etanol (Takahashi-Abbe et al, 2003). No citoplasma, os
açúcares são convertidos e degradados através da via glicolítica que em SM é a via Embden-
Meyorhof, para obtenção de energia celular e síntese de material celular, e a glicose
metabolizada na via glicolítica tem a via hexose monofosfato que produz precursores
celulares e diminui o gasto energético para a biossíntese (Thylstrup e Fejerskov, 1995).
A degradação da glicose fornece energia para célula em ATP (adenosina trifosfato)
ou pela fosforilação no substrato ou no transporte de elétron. Na fosforilação no substrato,
compostos ricos em energia servem de substrato para quinase, formando ATP e na
fosforilação por transporte de elétrons, eventos conservam a energia como gradiente
eletromecânico de próton pela membrana celular, da transferência e elétrons dos substratos
reduzidos (Takahashi-Abbe et al, 2003), resultando na expulsão de prótons da célula,
formando gradiente de concentração de prótons e diferença de carga elétrica na membrana,
a força motriz do próton para geração de ATP e o movimento flagelar e fornecer energia
para o transporte celular (McNeill e Hamilton, 2003).
SM que não possui sistema de transporte de elétrons na sua membrana, a força
motriz do próton é gerada pela expulsão de íons da célula pela ATPase de hidrogênios com
produtos finais como ácido lático, num processo denominado efluxo do produto final
(Dashper e Reynolds, 1996).
Na cavidade oral ocorrem períodos maiores de falta de alimentos e também períodos
de excesso de alimentos, prejudiciais às bactérias, assim, o metabolismo é regulado pelo
índice de glicólise, pela conversão eficaz do açúcar em produtos finais metabólicos, pela
síntese de polissacarídeos intra e extra-celulares e pela inibição do sistema de transporte de
açúcares (Wright et al, 2002).
SM e outros estreptococos bucais produzem enzimas chamadas glicosiltransferases
(GTF), que transformam a sacarose da dieta em glicose e frutose, além de unirem moléculas
de glicose através de ligações glicosídicas α 1,6 e α 1,3 para formar glucanos insolúveis em
água (Banas, 2003). Os glucanos capacitam, em parte ao hidrogênio ligado aos polímeros de
glucano, a adesão de microrganismos ao esmalte dental por coagregação aderindo e
permitindo a colonização de outras bactérias inábeis na adesão direta durante a formação da
matriz do biofilme dental, chamada película adquirida (Nyvaad, 1993), sendo que
especificamente SM formam ácidos que desmineralizam o esmalte dentário iniciando a
lesão de cárie (Grönroos, 2000).
A aderência dos SM é mediada por adesinas das superfícies das bactérias associadas
a fimbrias ou fibrilas e receptores da superfície oral que são componentes salivares como
mucinas, glicoproteínas, amilase, lisozima, imunoglobulinas A e G, proteínas estaterinas e
componentes bacterianos ligados a superfície oral (Rudney et al, 1995), constituídas de
polissacarídeos, GTF e lectinas, que são adesinas protéicas com afinidade específica por
carboidratos. Existe mais de um tipo de adesina na superfície celular e interagem
multiplamente facilitando a ligação com as moléculas da película adquirida e receptores de
outras bactérias (Marsh, 2004).
Essa relação dos SM com o biofilme é o mecanismo no qual ele se adapta ao meio
ambiente e se torna dependente do biofilme para sobreviver e ter viabilidade no seu
ecossistema (Li et al, 2001). Além de sintetizar os polissacarídeos extra-celulares
(glucanos), SM são os únicos que aumentam a sua colonização, aderência e acúmulo em
presença de sacarose, e parecem produzir mais ácidos do que outras bactérias bucais, pois
fermentam vários tipos de açúcares, como manitol e sorbitol (De Lorenzo, 2004). SM são
mais resistentes aos ácidos (Gronroos, 2000), sendo regulados pelo Sistema Quorum
Sensing que é ativado para a tolerância ácida e formação do biofilme pela bactéria, através
da sua expressão genética em resposta a alterações na densidade populacional de
microrganismos (Li et al, 2002).
As propriedades de virulência do SM são a tolerância ácida, a produção de ácidos e a
atividade proteolítica, que permitem a sobrevida do microrganismo no biofilme adaptando-
se no seu ambiente, por meio de adesinas, glicosiltransferases, polissacarídeos extracelulares
e degradação de colágeno do substrato (Jackson et al, 1997).
SM também sintetizam polissacarídeos intra-celulares (PIC), que são metabolizados
para produção de ácidos na falta de carboidratos fermentáveis exógenos (Gronroos, 2000),
já que é importante que os microrganismos tenham energia para regulação osmótica,
manutenção do pH intracelular e renovação de proteínas e ácidos nucléicos e as
necessidades são suplementadas a partir de fontes endógenas. Quando houver açúcares em
excesso, o glicogênio será a fonte de energia potencial em forma de polissacarídeo
intracelular, assim ocorre um aumento no reservatório intracelular de frutose 1,6 bifosfato e
intermediários glicolíticos e inicia-se a síntese de polissacarídeos pela atuação da ADP-
glicose fosforilase (Thylstrup e Fejerskov, 1995). Os PIC atuam drenando os intermediários
glicolíticos da célula, protegendo contra metabólitos intermediários tóxicos (Iwami et al,
2001). Quando nenhum açúcar for suplementado pela dieta, os PICs são utilizados como
fonte de energia e os ácidos são excretados, num mecanismo regulado pelos níveis exógenos
de açúcar, onde nos baixos níveis a reserva intracelular aumenta, resultando na ativação de
glicogênio fosforilase e consumo da reserva intracelular de polissacarídeos (Thylstrup e
Fejerskov, 1995).
1.3 – A enzima glicosiltransferase (GTF)
SM secreta 3 tipos de GTF: (B, C e D) que são oriundas de genes GTF B, C e D
(Hanada e Kuramitsu, 1989). As GTF liberadas pelos SM na película adquirida do esmalte
estão na sua forma ativa (Rolla et al, 1983). A GTF B tem um peso molecular de 148 kDa e
catalisa a síntese de glucano insolúvel em água, predominantemente cadeias α 1,3 entre as
glicoses (Fukushima et al, 1992), a GTF D em torno de 143 kDa e catalisa a produção de
cadeias α 1,6 de glucano solúvel em água (Hanada e Kuramitsu, 1989) e a GTF C com peso
molecular de 138 kDa forma os glucanos solúvel e insolúvel em água (Fukushima et al,
1992). A GTF solúvel é extracelular e sintetiza dextrano, a GTF insolúvel e a GTF insolúvel
e solúvel são enzimas de superfície bacteriana e tem afinidade para o dextrano e sintetizam
o mutano (Kuramitsu e Nakano, 1992).
Além do SM vários outros estreptococos secretam GTF extracelular que podem
contribuir para aderência deles à película (Russell, 1994). As GTF do SM cooperativamente
sintetizam glucano insolúvel em água a partir da sacarose, e facilitam a habilidade dos SM
colonizarem sobre a superfície dental e formar a placa bacteriana (Ando et al, 2003).
As GTF são fortemente envolvidas na utilização de sacarose como substrato e
produzem frutose e glucano com ligações α 1,3 e α 1,6 como produtos. As GTF B e C são
fatores de virulência associados com a patogênese da cárie dental (Koo et al, 2002). Outros
estudos mostram a importância da produção de glucano insolúvel na virulência de SM
(Yamashita et al, 1993).
As GTF B, C e D foram purificadas por uma coluna de cromatografia de
hidroxiapatita e o sobrenadante da cultura analisados, sendo que todas enzimas foram ativas
em solução e em película experimental, formada de saliva humana em contato com a GTF
em uma superfície de hidroxiapatita. Os valores de Km para o substrato sacarose de todas as
enzimas foram baixos quando a enzima foi adsorvida à superfície, comparados quando em
solução. Os autores relataram que o glucano formado pela GTF B ou GTF C, mas não pela
D, sobre a película experimental da GTF aumentou a aderência de SM por 7 a 9 vezes
comparado a aderência quando nenhum glucano estava presente na superfície da película.
Os resultados mostram que as GTF B, C e D são enzimaticamente ativas no estado
adsorvido e que a natureza do glucano produzido por elas pode influenciar a aderência dos
estreptococos orais em uma película experimental (Venkitaraman et al, 1995).
1.4 – Os Glucanos
O glucano é formado por monômeros de glicose unidos por ligações glicosílicas de
tipo α 1,3 e α 1,6, sendo um polissacarídeo extracelular. Glucanos são constituídos de
matrizes altamente hidratadas, os glicocálices, formados por heteropolissacarídeos e
podendo conter polipeptídeos. Os precursores dos glucanos formam-se no citoplasma, sendo
transportados pela membrana celular por carreadores lipidícos e polimerizados
externamente a membrana. SM e outros estreptococos sintetizam polissacarídeos
extracelulares a partir da sacarose, por meio de enzimas, as GTF, que clivam a sacarose,
liberando a frutose e obtendo energia para conversão extracelular de glicose em glucanos
ramificados (Banas, 2003).
Alguns dos glucanos que tem as moléculas de glicose com ligações α 1,3, são
altamente insolúveis em água, rígidos e formam agregados fibrosos, chamados mutanos. O
glucano insolúvel formado pela GTF B e C tem uma preponderância maior que 85% de
cadeias α 1,3 entre as moléculas de glicose, e o restante sendo cadeias α 1,6 e α 1,3
(Fukushima et al, 1992). Por outro lado, os glucanos chamados dextranos, que tem ligações
α 1,6, possuem cadeias flexíveis e são solúveis em água (Banas, 2003).
Os glucanos promovem o acúmulo de SM na superfície dental (Wiater et al, 1999) e
contribuem para o volume, cariogenicidade e integridade estrutural do biofilme dental (Cury
et al, 2000), e, além de ser um essencial fator de virulência dos SM relacionado a
patogênese da cárie dental (Yamashita et al, 1993), são reserva de energia para bactérias,
reguladores da permeabilidade da placa dental controlando a acidez nos dentes (Colby e
Russell, 1997).
1.5 – O biofilme dental
O termo biofilme corresponde a comunidade estruturada de microrganismos
aderidos a uma superfície inerte ou viva dentro de uma matriz de polímeros extracelulares
sob contínua ação de um fluxo num ambiente não estável (Leite et al, 2001).
Os biofilmes são formados de um ou vários microrganismos, um deles predomina
numa alta diversidade microbiana e passa a interagir com o hospedeiro e conviver junto aos
microrganismos oportunistas, além disso o biofilme facilita a sobrevivência e protege os
microrganismos contra adversidades ambientais e nutricionais (Leite et al, 2001).
O biofilme dental é essencial para que ocorra a cárie dental e a doença periodontal.
No biofilme cariogênico prevalece espécies de SM que produzem ácido lático quando na
presença de glicose, baixando o pH e desmineralizando o esmalte dental, além de outros
microrganismos acidogênicos (Hamada e Slade, 1980).
É importante compreender a formação e virulência do biofilme em função do tempo,
fatores imunológicos e microbianos, pois este é o fator chave para resolver as patologias
bucais de origem bacteriana (Montanaro et al, 2004).
O biofilme dental forma-se em 4 fases: formação de um filme condicionante ou
película no dente formada por glicoproteínas salivares, aderência, maturação e
desenvolvimento (Rozen et al, 2001). A adesão das bactérias é um processo complexo
multifatorial, influenciado pelo ambiente bucal, morfologia dental, superfície bacteriana,
hábitos do hospedeiro e superfície do substrato (Alves et al, 2006).
A remoção mecânica do biofilme é o método mais aceito para o seu controle (Jardim
et al, 1998). Diante da dificuldade em manter indivíduos motivados a realizar adequada
limpeza da cavidade bucal, com o objetivo de controlar o biofilme bucal é válido e
necessário associar métodos químicos aos mecânicos para controle da microbiota (Castro,
2001).
Vários fatores estão associados ao processo de adesão: interação de proteínas,
adesinas, lectinas e interações hidrofóbicas. A interferência com a adesão bacteriana na
superfície dos dentes pode ser um caminho para obter-se controle do biofilme dental,
influenciada por ação de agentes antimicrobianos naturais, nos estágios iniciais e reversíveis
de formação do biofilme, que ocorre na aderência bacteriana à película adquirida,
prevenindo a instalação de patologias orais. No segundo estágio de desenvolvimento do
biofilme, pode ser prevenida a síntese de glucanos insolúveis, inibindo atividade da GTF
que ocorre via dependente de sacarose (Pereira et al, 2006).
1.6 - Produtos naturais como inibidores de GTF
Em decorrência da incidência de doenças orais, do aumento da resistência de
bactérias aos antibióticos e dos efeitos adversos de alguns agentes antibacterianos usados na
odontologia, existe a necessidade de novas alternativas de prevenção e tratamento que sejam
seguras, efetivas e econômicas (Palombo, 2009).
Além disso, os produtos naturais são preferidos por uma grande parte da população e
demonstram possuir atividade antimicrobiana. Os extratos isolados de plantas usados na
medicina tradicional têm sido apontados como uma excelente alternativa às substâncias
químicas sintéticas para previnir as cáries (Palombo, 2009). Muitos agentes químicos
usados comercialmente podem alterar a microbiota e ter efeitos indesejáveis como vômitos,
diarréia e manchamento dental (Palombo, 2009).
Dentre as plantas que tem mostrado efeito antibacteriano e antiaderente está a
Punica granatum L. (Pereira et al, 2006). Otake et al (1991) mostraram que o chá-verde
possui efeito anti-cárie. Já o chá-preto, num estudo de Linke e Geros (2003) inibiu a
formação de cáries em ratos. Estudo recente realizado com o chá-verde por Ghaemi et al
(2008), mostrou inibição do crescimento e formação do biofilme dental. Segundo Koo et al
(2002) a própolis também tem efeito inibitório sobre a atividade da enzima
glicosiltransferase. Tsai et al (2007), observou efeito inibitório sobre a atividade da enzima
glicosiltransferase usando extratos de Rosmarinus officinalis Linn sobre Streptococcus
sobrinus.
1.6.1 – Rosmarinus officinalis L. (alecrim)
O alecrim é amplamente usado em todo mundo como erva medicinal. As plantas
medicinais são encontradas no Brasil de diversas formas, chá, xarope e tinturas (Matos,
1997).
O alecrim é um arbusto aromático da família Labiatae e possui folhas com pequenas
glândulas contendo óleo aromático (Al-Sereiti et al, 1999).
O alecrim apresenta propriedade analgésica, espasmolítica, antiinflamatória,
antifúngica, bem como atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas. Porém são raros relatos da atividade antimicrobiana do extrato de alecrim sobre
microrganismos do biofilme dental (Queiroz, 2008).
Seu óleo essencial constitui-se de hidrocarbonetos monoterpênicos, ésteres terpênicos,
linalol, verbinol, terpineol, 3-octanona acetato de isobornila. Os terpenóides são carnosol,
ácido carnosílico, oleânico, ursólico e outros. Os flavonóides são diosmetina, diosmina,
gencuonina, luteolina, hispidulina e apigenina. Contém ácido rosmarínico, caféico,
clorogênico, neoclorogênico e labiático (Alonso, 1998).
O extrato de alecrim é usado na indústria de alimentos por seu potencial antioxidante
(Frankel et al, 1996), além de ser benéfico para saúde com efeitos de proteção do fígado
(Sotelo-Felix et al, 2002) e antiulcerogênico (Dias et al, 2000).
Takarada et al (2004), afirmaram que o óleo essencial de alecrim demonstrou efeito
inibitório da aderência de S. mutans e atividade inibitória do crescimento de bactérias Gram-
negativas (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e F. nucleatum).
1.6.2- Camelia sinensis (chá verde)
As catequinas do chá verde, como as epicatequinas, epicatequinas galato, e
epigalocatequinas galato são responsáveis pelos efeitos biológicos tais como bactericidas, a
inibição da produção de glucano e a prevenção da aderência bacteriana à superfície dental
(Sasaki et al, 2004). Além disto, estas substâncias podem ter o potencial de reduzir a
destruição periodontal, resultante da atividade da proteinase da Porphyromonas gingivalis
(Okamoto et al, 2004).
Estudos mostram que as catequinas do chá verde podem inibir o crescimento de
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas com potencial moderado, entre elas SM
(Sakanaka et al, 1989). A atividade dos compostos fenólicos pode ser explicada baseando-se
em fortes ligações de hidrogênio, que poderiam alterar o ataque inicial de SM in vitro pela
ligação de proteínas ricas em prolina encontradas na película salivar ou com ácido
lipoteicóico sobre a superfície bacteriana (Badria e Zidan, 2004). A decocção do chá verde
inibe a α-amilase na saliva humana, reduzindo a maltose liberada em 70% e diminuindo o
potencial cariogênico do amido da comida (Mckay e Blumberg, 2002).
Zhang e Kashket (1998), também observaram que o extrato do chá verde inibe a
amilase salivar humana e pode reduzir o potencial cariogênico do amido presente nos
alimentos como as bolachas e bolos, pois este reduz a tendência deste tipo de alimento
liberar lentamente porções de carboidratos fermentáveis. Parece que a simultânea presença
de chá verde na dieta pode reduzir o potencial cariogênico da dieta. Apesar do conteúdo de
polifenol, o chá verde é uma natural reserva de flúor e um veículo de liberação de flúor na
cavidade oral.
Segundo Ghaemi et al (2008), o chá verde (não fermentado) na concentração de 1
mg/ml, não causou inibição da formação de biofilme após 7 dias de tratamento, porém com
3 mg/ml do extrato houve efeito bactericida sobre SM. O extrato de chá-verde exibiu a
maior inibição da atividade da glicosiltransferase entre vários outros extratos de ervas
(Limsong et al, 2004). Num estudo recente com 2 tipos de chás testados sobre SM, o chá
preto, semi-fermentado da Camelia sinensis pareceu ser mais efetivo contra crescimento e
formação do biofilme do que o chá verde, não fermentado (Ghaemi et al, 2008).
Foi demonstrado que o chá verde pode inativar a glicosiltransferase e a
dextransucrase, e assim inibir a formação de glucano insolúvel em água e ácido lático
(Otake et al, 1991).
A suplementação da água ingerida pelos ratos com 0,1% de chá verde junto a uma
dieta cariogênica foi capaz de reduzir significantemente as lesões de cárie de fissura (Wu e
Wei, 2002). Linke e LeGeros (2003) indicaram que o freqüente consumo de chá verde pode
diminuir a formação de cáries, mesmo na presença de açúcares da dieta. Ratos infectados
com SM e alimentados com uma dieta cariogênica em presença de chá verde tiveram seus
níveis de cárie reduzidos (Cabrera et al, 2006).
De acordo com Simpson et al (2001), após ingerir a infusão de chá-verde, cerca de
34% do fluoreto contido nele se liga fortemente aos tecidos orais, tendo um impacto
positivo na prevenção da perda dental.
Isso ocorre pelo mecanismo de ação do flúor, onde os dentes trocam íons cálcio e
fósforo com a saliva, variando de acordo com o pH do meio. Quando o flúor está presente
no meio bucal, a reposição mineral da saliva aumenta com formação de hidroxiapatita, num
pH maior ou igual a 5,5, e o dente ainda recebe íons na forma de fluorapatita. Se o pH cair
abaixo de 5,5, a saliva perde a capacidade de reposição mineral, e o dente recebe íons cálcio
e fósforo, na forma de fluorapatita, devido à presença de flúor. Constata-se a grande atuação
preventiva do flúor, que só é mantida se o pH estiver acima de 4,5. Se o pH cair abaixo
deste valor, ocorre a perda de íons cálcio e fósforo, e caso perdure, haverá cavitação. Caso o
pH volte a subir, o dente volta a receber íons na forma de fluorapatita ou na forma de
hidroxiapatita e fluorapatita, dependendo do pH do meio (Pinto, 1998).
Sugere-se que o extrato do chá verde pode ser responsável por notados efeitos na
saúde oral, pela inibição do crescimento das bactérias como SM. Muitos estudos indicaram
que o chá verde inibe o crescimento, produção ácida, metabolismo, e atividade da enzima
glicosiltransferase do SM e placa dental bacteriana, como conseqüência, o chá verde é
considerado como alimento funcional para saúde oral e é usado em formulações de cremes
dentais (Wu e Wei, 2002).
1.6.3– Ilex paraguariensis A. St.-Hill (erva-mate)
É uma planta perene que cresce no Sul do Brasil, Paraguai, Uruguai e Argentina,
sendo a fonte de uma bebida estimulante chamada “mate”, preparada após a infusão de
folhas secas ricas em cafeína (Kubo et al 1993).
O consumo de bebidas a base de erva-mate remonta de centenas de anos, e sua
utilização na medicina popular e por herboristas é recomendada para artrite, dor de cabeça,
constipação, reumatismo, hemorróidas, obesidade, fadiga, retenção de líquido, hipertensão,
digestão lenta e desordens hepáticas. As xantinas cafeína, teobromina, teofilina e os
compostos fenólicos como ácido cafeico e seus derivados, principalmente os ácidos
clorogênicos são responsáveis por vários dos efeitos farmacológicos citados (Bastos et al,
2007). Suas propriedades estimulantes são devidas a presença de metilxantinas, cafeína e
teobromina (Coelho et al 2001).
Os chás são bebidas populares e fontes significativas de compostos fenólicos, são
considerados integrantes das dietas devido ao seu potencial antioxidante. Alguns estudos
anteriores indicaram atividade antioxidante de infusões de erva-mate (Chandra e Mejia,
2004). Nestes trabalhos, os autores relataram a potente atividade antioxidante de infusões
aquosas de erva-mate, tanto in vitro como in vivo. O mecanismo proposto relaciona-se com
a presença, nas infusões, de substâncias capazes de seqüestrar radicais livres formados no
início do processo de oxidação.
Em experimentos recentes realizados utilizando animais, foi verificado que a
atividade antioxidante, relativo a proteção da oxidação de ácidos graxos poliinsaturados
(Martins et al, 2009) e proteção de dano de DNA (Miranda et al, 2008), pode ser detectada
após a administração oral por 60 dias de chá mate solúvel (fabricante Leão Jr.) nas
concentrações de 1,0 g/kg
e 2,0 g/kg de peso do animal. Estudos em humanos também
comprovaram estes efeitos (Matsumoto et al, 2009).
Kubo et al (1993), comprovaram a atividade antimicrobiana de
I
lex paraguariensis
frente a bactérias e fungos patogênicos. Dentre as bactérias que sofreram inibição total
encontram-se Bacillus subtilis, Brevibacterrium ammoniagenes, Propionibacterium acnes,
Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans. O extrato n-hexano da erva-mate inibe
espectro de atividade antimicrobiana.
Por outro lado, na literatura não há nenhum trabalho sobre o efeito do extrato de Ilex
paraguariensis na atividade da glicosiltransferase.
2 – OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral:
Investigar o efeito inibitório in vitro de extratos vegetais sobre a atividade da
glicosiltransferase e sobre o crescimento de Streptococcus mutans.
2.2-Objetivos específicos:
1. Estudar a cinética de crescimento de Streptococcus mutans, bem como a quantificação
dos glucanos produzidos por esta bactéria.
2. Determinar a atividade e parâmetros cinéticos da glicosiltransferase de Streptococcus
mutans.
3. Investigar o efeito inibidor do extrato de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e mate (Ilex
paraguariensis) sobre a atividade da GTF produzida por Streptococcus mutans.
4. Investigar a atividade antibacteriana dos extratos de alecrim (Rosmarinus officinalis L.),
mate (Ilex paraguariensis) e chá verde (Camelia sinensis) sobre o crescimento de
Streptococcus mutans.
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Microrganismo e condições de crescimento
Utilizamos no estudo a linhagem bacteriana de Streptococcus mutans ATCC 25175
(ATCC; Rockville, MD, USA), armazenada no Laboratório de Microbiologia da
Universidade São Francisco. O microrganismo foi cultivado a 37°C em caldo BHI (Brain
Heart Infusion) (Tabela 1), em anaerobiose, com os tubos colocados dentro de um
recipiente com tampa fechada e vedados junto à chama de vela para consumo quase total do
oxigênio. O caldo (1200 mL) foi preparado após dissolução em água destilada (37g/L) e
esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos. Os meios de cultura foram inoculados
com uma suspensão celular de SM numa concentração final de 10% (v/v). A manipulação
foi realizada numa câmara de fluxo laminar e à chama.
Tabela 1 – Composição do meio BHI utilizado para crescimento de S mutans
Composição (g/L)
Infusão de cérebro de vitelo 12,5
Infusão de coração de boi 5
Peptona 10
Cloreto de Sódio 5
D (+) – Glicose 2
Dihidrogenofosfato de Sódio 2,5
3.2. Curva de crescimento de Streptococcus mutans
O perfil de crescimento de células de Streptococcus mutans em caldo BHI ao longo
do tempo de incubação foi obtido por leituras de absorbância a 600nm. Após a incubação
das culturas a 37°C por 24horas, retirou-se de hora em hora alíquotas de 5mL para
determinar a absorbância a 600nm no espectrofotômetro (Jenway 6105 UV/VIS) e o valor
de pH em pHmetro (Digimed DM-20). O restante da cultura foi centrifugado a 10000 g por
30 minutos, para remoção de células. O sobrenadante congelado para experimentos
posteriores. Os ensaios foram realizados em duplicata (n=2).
3.3. Quantificação dos produtos (expresso em hexoses neutras) presentes no
sobrenadante da cultura.
Streptococcus mutans utiliza uma enzima, a GTF, para produzir glucanos usando
como substrato a glicose, monossacarídeo presente no meio de cultura. Assim, ao longo do
crescimento celular das culturas de SM, a bactéria faz uso da glicose para a síntese de
glucano, o que resulta numa variação da quantidade de açúcares redutores presentes no
sobrenadante da cultura.
Com o objetivo de separar as frações de elevada massa molecular das de baixa massa
molecular, estas últimas provavelmente compostas por componentes do meio de cultura
inicial, 1,5 mL de sobrenadante foi centrifugado com centricons YM-30 (limite de exclusão
30000 Milipore) durante 30 minutos a 3000g a 4ºC. Foram obtidas duas frações: a de baixa
massa molecular e a de alta massa molecular, e em seguida foi determinada a concentração
em hexoses neutras para cada fração segundo o método do fenol-ácido sulfúrico e leitura da
absorbância a 490 nm (Dubois, 1956). Os resultados foram expressos em concentração de
hexoses (μg) por mL de meio de cultivo utilizando a curva padrão de glicose (Anexo 1).
3.4. Obtenção e caracterização da Glicosiltransferase (GTF)
3.4.1. Preparação de extratos de GTF
Foram preparados e autoclavados 1200 mL de meio de cultura BHI, e inoculados
com 100 mL de suspensão celular de Streptococcus mutans, e posteriormente incubados a
37° C por 18 horas em condições anaeróbicas. As células foram removidas por
centrifugação a 10000g a 4° C por 30 minutos e o pH do sobrenadante ajustado para 6,8
com NaOH 2M. O sobrenadante recolhido foi precipitado com sulfato de amônio (50% p/v
de saturação) por 1 hora a 4° C e centrifugado a 10000g a 4° C por 20 minutos. O
precipitado foi dissolvido em tampão fosfato 0,1M (pH 6,8) e dialisado (em sacos de diálise
da Sigma, tamanho do poro 12 kDa) por 24 horas contra tampão fosfato 0,001M (pH 6,0)
contendo 0,01 de azida de sódio e 1mM de PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) a 4° C
(Tsai et al, 2007). Posteriormente o extrato foi liofilizado num período de 12 horas e
denominado extrato de GTF bruto, o qual foi utilizado para os estudos subsequentes. O
extrato seco ficou armazenado em freezer a -20° C.
3.4.2. Determinação da atividade de GTF de Streptococcus mutans
Considerando que a GTF degrada a sacarose em seus monossacarídeos constituintes
e depois utiliza a glicose para formar os glucanos, os testes de atividade da enzima foram
realizados a partir da quantidade de açúcares redutores presentes no meio de reação,
contendo o substrato sacarose. A atividade específica da enzima foi expressa em µmol de
glicose residual (U) no meio/ mg de proteína total. Além disto, foi realizada também a
determinação dos glucanos (solúveis e insolúveis) formados nesta reação conforme item
3.4.2.3.
3.4.2.1. Determinação de açúcares redutores
Ao meio de reação contendo 400 µL de solução de sacarose 10% (m/v) em solução
tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,3 foi adicionado a 50 µL de extrato de GTF, preparado
em três concentrações diferentes (0,5, 0,75 e 1 mg/mL) em solução tampão citrato-fosfato
0,1M pH 6,3. A mistura foi incubada a 35° C por 20 minutos com leve agitação. Os
açúcares redutores foram determinados pelo método de Somogy-Nelson (Somogy, 1945)
conforme descrito abaixo.
Após incubação misturou-se 0,5 mL do meio de reação descrito acima + 1 mL de
reagente Somogy-Nelson I, agitou-se e pôs em banho-maria em ebulição por 6 minutos.
Resfriou-se os tubos a temperatura ambiente, em seguida adicionou-se 1 mL de reagente
Somogy-Nelson II, agitou-se os tubos e foram deixados em repouso por 5 minutos. Então
foram adicionados 10 mL de água destilada e misturados por inversão. Mediu-se a
absorbância a 540 nm contra o branco. Foi preparado tubo branco substituindo-se a enzima
por água destilada no sistema de reação. Os resultados foram expressos em concentração de
glicose (μg) por mL de meio de cultivo utilizando uma curva padrão de glicose (Anexo 2).
3.4.2.2. Quantificação de proteína total
A concentração de proteínas totais das preparações enzimáticas foi determinada
baseada na metodologia proposta por Lowry et al (1951), utilizando albumina bovina como
padrão.
3.4.2.3. Quantificação dos glucanos
A formação dos glucanos foi determinada utilizando um sistema de reação composto
de 3mL de solução de sacarose 10% (m/v) em solução tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,3,
e 0,5 mL de extrato de GTF (1 mg/mL) preparado no mesmo tampão. A mistura foi
incubada a 37° C na estufa por 18 horas com leve agitação. A absorbância foi lida de hora
em hora a 560 nm até o tempo final de 18 horas (Makaya, 2007). Foi realizado um tubo
controle sem adição da enzima.
3.4.2.4. Determinação dos parâmetros cinéticos da reação
Para determinação do efeito da concentração do substrato sacarose na velocidade da
reação enzimática, alíquotas de 50 µL de extrato de GTF (0,5 e 1,0 mg/mL) foram
adicionados aos tubos contendo 400 µL de solução de sacarose em diferentes concentrações
(de 1 a 10% m/v), em solução tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,3. A mistura foi incubada a
35° C por 20 minutos e os açúcares redutores determinados pelo método de Somogy-Nelson
conforme item 3.4.2.1. A velocidade da reação foi expressa como quantidade de glicose
formada (μg) por mL de meio utilizando uma curva padrão de glicose (Anexo 2).
3.5. Inibição da atividade da glicosiltransferase por extratos vegetais
As folhas secas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e do chá mate (Ilex
paraguarienesis) foram adquiridas em supermercado em Bragança Paulista – SP, Brasil. As
folhas foram embebidas em água deionizada (5% m/v) aquecendo por 5 minutos. A infusão
aquosa foi resfriada a temperatura ambiente, centrifugada, filtrada e armazenada em
geladeira.
No meio de reação contendo 400 µL de solução de sacarose (10 % m/v) e 50 µL de
extrato de GTF (1 mg/mL) foram adicionados diferentes concentrações finais de extrato
aquoso de alecrim e de mate (4, 8 e 16mg/mL). A mistura foi incubada a 35° C por 20
minutos e os açúcares redutores determinados pelo método de Somogy-Nelson conforme
descrição do item 3.4.2.1. Os controles foram preparados sem a presença dos extratos
vegetais e os resultados expressos em quantidade de açúcares redutores residuais presentes
no meio. Para efeitos de comparação, alguns testes foram realizados com o uso de
clorexidina (0,06 e 0,12 mg/mL) utilizando as mesmas condições descritas acima. Todos os
ensaios foram realizados em triplicata.
3.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de diferentes extratos
sobre o crescimento de Streptococcus mutans
A atividade anti-estreptocócica dos extratos vegetais foi avaliada por determinar os
valores obtidos de Concentração Inibitória Mínima por um método modificado de diluição
em caldo BHI. Os extratos utilizados foram: alecrim (Rosmarinus officinalis L.), mate (Ilex
paraguarienesis) e chá verde (Camelia sinensis), os quais foram preparados por infusão na
concentração de 5% m/v conforme descrito acima.
Em resumo, culturas de Streptococcus mutans foram ajustados a 10
6
unidades
formadoras de colônias (UFC)/mL. Os extratos de alecrim, chá verde e chá-mate foram
diluídos com água destilada resultando em concentrações de 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 e 8
mg/mL de extrato aquoso. Em tubos estéreis contendo 6mL de BHI, 500 µL dos extratos
inibidores diluídos nas diferentes concentrações foram adicionados 100 µL de suspensão
salina bacteriana ajustada na Escala de Mcfarland de 0,5. Os ensaios foram realizados em
duplicata para cada concentração testada. Foram feitos 3 controles: O primeiro tubo
contendo BHI, DMSO e solução salina sem bactéria; no segundo BHI, DMSO e solução
salina com bactéria e no terceiro tubo BHI e solução salina com bactéria. Após a incubação
por 24 e 48h a 37° C sob condições anaeróbicas, o crescimento de Streptococcus mutans foi
estimado com espectrofotômetro a 630nm e observada a turbidez das amostras. A CIM foi
considerada a menor concentração do extrato onde não houve crescimento bacteriano
visível, ou seja, uma leitura da absorbância menor que 0,05.
3.7. Determinação de fenóis totais:
O conteúdo de fenóis totais dos extratos aquosos foi determinado de acordo com o
Método de Folin-Ciocalteau (Caetano, 2002). Inicialmente foi feita uma solução a 10% do
extrato seco em metanol. A partir desta solução, diluiu-se 100 vezes, obtendo-se assim uma
solução 0,01% m/v. Tomou-se uma alíquota de 1 mL e acrescentou-se 0,25 mL de solução
tampão carbonato-tartarato (750 mL de água quente, 200g de Na
2
CO
3
e 12g de tartarato de
sódio), em seguida, adicionou-se então 0,025 mL de reagente Folin-Ciocalteau (Merck) e
deixou-se agir em repouso por 30 minutos a temperatura de 20ºC. A absorbância foi medida
a 700 nm. O conteúdo de fenólicos totais expresso em mg por grama de extrato sólido, foi
calculado utilizando uma curva padrão de fenol (mg/L) (Anexo 3).
3.8. Análise estatística
Análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey foram utilizados para determinar a
diferença nos valores de média, baseados nos dados coletados das triplicatas de cada
experimento. A significância estabelecida é de p 0,05.
4-RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Crescimento de Streptococcus mutans
4.1.1. Curva de crescimento
A Figura 1 mostra a os valores médios de variação de Absorbância (A) em função do
tempo referente ao crescimento de Streptococcus mutans obtidos em duas medidas.
024681012
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Absorbância (600 nm)
Tempo (horas)
Figura 1. Perfil de crescimento da cultura de Streptococcus mutans ATCC 25175 em caldo
BHI em função do tempo
Conforme demonstrado na Figura 1 pode-se identificar três fases do crescimento
bacteriano: a fase “log” ou exponencial, a fase estacionária e a fase de declínio. A fase “lag”
ou de adaptação não foi possível visualizar, possivelmente devido a rápida adaptação da
bactéria ao meio.
Passado este tempo de adaptação, as células começam a dividir-se a uma taxa
constante até atingirem um máximo de crescimento e o número de células aumenta
exponencialmente. É a chamada fase “log” ou exponencial. Pode ser verificado na Figura 1
que esta fase se estendeu até 4 horas.
Num sistema fechado este crescimento exponencial não pode ocorrer
indefinidamente, pois a produção de metabólitos e o consumo de nutrientes essenciais
chegam a um nível tal que leva a reduzir ou cessar o crescimento exponencial. A população
atinge assim uma fase estacionária (a partir de 4 horas até aproximadamente 10 horas) em
que não há variações significativas do número total de células. Nesta fase existe um
equilíbrio entre a taxa de morte e a taxa de divisões na população bacteriana.
Depois de atingida a fase estacionária pode-se observar um pequeno declínio, o que
corresponde a fase denominada fase de declínio. Nesta fase, as células morrem devido à
escassez de alimentos e ao nível elevado de produtos tóxicos, criando um ambiente onde as
células são incapazes de manter as suas funções vitais. Na Figura 1 podemos observar que
um pequeno declínio inicia-se após 10 horas de incubação. Essas observações são
semelhantes aos estudos de Makaya (2007).
4.1.2. Variação do pH ao longo do crescimento
Conforme demonstrado na Figura 2 podemos verificar uma diminuição nos valores
de pH em função do tempo (horas) obtidos pela média de duas medidas. Observamos que
existe uma diminuição pronunciada do valor de pH durante as primeiras 4 horas de
crescimento, que corresponde à fase exponencial da curva de crescimento de S. mutans em
BHI. A partir das 6 horas ocorre uma estabilização do pH que corresponde à fase
estacionária da curva de crescimento. Ao longo do crescimento o valor de pH variou entre
7,4 e 6,0.
Com o crescimento celular devido a produção de ácido lático é esperado a redução
no valor de pH do meio de cultura. Segundo a literatura os valores de pH do caldo após
crescimento de S. mutans tem variado entre 7,3 e 5,5 (Wiater et al, 1999). Makaya (2007),
obtiveram valores de pH entre 6,96 e 5,99.
024681012
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
Tempo (horas)
Figura 2. Variação do pH da cultura de Streptococcus mutans ATCC 25175 após
crescimento em caldo BHI em função do tempo
4.2. Estudo da variação do conteúdo de hexoses neutras presentes no sobrenadante das
culturas
Conforme demonstrado na Figura 3 verifica-se que a concentração em hexoses
neutras dos compostos de baixa massa molecular presentes no sobrenadante decresce ao
longo do tempo, com uma queda de 50 % aproximadamente após 10 horas de crescimento
bacteriano em relação ao valor inicial.
Por outro lado, a concentração em hexoses neutras determinada na fração de
compostos de alta massa molecular sofre grandes variações no decorrer do tempo.
Inicialmente observa-se um crescente aumento até por volta de 6 horas de crescimento
bacteriano e após este período a quantidade total de hexoses neutras na fração de alto peso
molecular é reduzida.
A fração de compostos de baixa massa molecular é rica em compostos presentes no
meio de cultivo e também em glicose. O decréscimo na concentração de hexoses neutras
observado nesta fração indica um alto consumo da glicose pela bactéria presente no meio de
cultura e uma possível formação de glucanos, seja solúvel ou insolúvel.
Em relação à inesperada redução do conteúdo de hexoses na fração de alto peso
molecular a partir de 6 horas de reação é possível que seja decorrente da queda de nutrientes
do meio e conseqüente uso dos glucanos como fonte de energia. Makaya (2007) observaram
que os compostos de alta massa molecular permaneciam constantes, tendo um pequeno
aumento após a 8ª hora de crescimento, indicando o início da formação de glucanos.
0246810
0
50
100
150
200
250
300
350
fração de alto PM
fração de baixo PM
concentração de hexoses neutras (ug/mL)
tempo (horas)
Figura 3. Variação do conteúdo de hexoses neutras nas frações de alto e baixo peso
molecular do sobrenadante numa cultura de Streptococcus mutans crescida em BHI.
4.3. Estudo da atividade e parâmetros cinéticos da glicosiltransferase (GTF)
A Tabela 2 expressa os resultados da média da atividade da enzima bruta obtidos em
dois ensaios diferentes. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a
quantidade de glicose residual no meio, expressa em μmol nas condições do ensaio.
Tabela 2. Atividade da enzima Glicosiltransferase de Streptococcus mutans
Ensaios Atividade de GTF
(U /mL de meio)
Concentração de proteínas
(mg/mL)
Atividade específica
(U/mg de proteínas)
1 13,4 ± 1,6 10,2 ± 0,4 1,31
2 15,6 ± 2.4 11,4 ± 0,7 1,36
Para determinação dos parâmetros cinéticos da enzima utilizou-se a representação de
Lineweaver-Burk (Figura 4), duplamente recíproca, ou seja, a relação 1/V e 1/[S] é linear se
a enzima tiver comportamento que obedeça a equação de Michaelis-Menten. A inclinação
da reta corresponde a razão Km/Vmáx, a interseção com o eixo 1/V corresponde a 1/Vmáx
e a interseção da reta extrapolada com o eixo 1/[S] é igual a -1/Km. Assim os parâmetros
Km e Vmáx podem ser obtidos por leitura direta no gráfico (Bracht e Iwamoto, 2003)
A velocidade máxima (Vmáx) de reação foi de 12,5 e 25,6 μmol de glicose/minuto
quando os sistemas de reações foram realizados com 0,5 e 1,0 mg/mL de enzima,
respectivamente. Nestas condições o valor da constante de Michaelis-Menten (Km)
determinado foi de aproximadamente 2,5 mM. Segundo Venkitaraman et al (1995) os
valores de Km obtidos para a enzima GTF em presença do substrato sacarose (10mM) em
solução (1000mM) e quando adsorvidas à superfície foram respectivamente de 30 e 12mM.
A constante de Michaelis-Menten corresponde à concentração de substrato para a
qual a velocidade da reação é metade da velocidade máxima e indica a afinidade da enzima
pelo substrato, sendo uma constante característica da enzima mesmo que seja também em
função de condições tais como temperatura, pH e força iônica (Bracht e Iwamoto, 2003) A
velocidade de reação inicial aumenta proporcionalmente com a concentração de substrato
quando esta é baixa. Progressivos aumentos do substrato produzem incrementos cada vez
menores de velocidade.
-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
0,24
0,28
1 / V μmol de açúcar redutor/min
1/ S (m M sacarose)
0,5 mg/mL GTF
1,0 mg/mL GTF
Figura 4. Efeito da concentração do substrato sacarose na atividade enzimática da
glicosiltransferase de Streptococcus mutans.
4.4. Verificação da formação de glucanos
Os valores obtidos de leitura de Absorbância medidos a 560 nm para a verificação de
formação de glucanos utilizando o sistema de reação descrito no item 3.4.2.3.estão
expressos na Figura 5. Foi observado um aumento gradativo na Absorbância devido
possivelmente à formação de glucano no decorrer do tempo de reação, confirmando a
atuação da enzima sobre o substrato sacarose e posterior polimerização. Os valores de A do
controle (sem enzima) foram mantidos em níveis próximos de zero.
0 2 4 6 8 10121416
0,0
0,1
0,2
0,3
com enzima (teste)
sem enzima (controle)
Absorbância (560 nm)
Tempo (horas)
Figura 5. Leitura da Absorbância em função do tempo para avaliação da formação de
glucanos pela glicosiltransferase utilizando o substrato sacarose
Os valores obtidos neste experimento utilizando o substrato sacarose estão
condizentes com os valores expressos na Figura 3, o qual expressa a formação de glucanos
medido diretamente no meio de cultivo em presença do substrato glicose presente no meio
BHI.
4.5. Inibição da atividade da Glicosiltransferase por extratos vegetais
Conforme descrito no item 3.5., ao meio de reação contendo 400 μL de solução de
sacarose (10 % m/v) e 50 μL de extrato bruto de GTF (1 mg/mL) foram testados a ação de
diferentes inibidores na atividade da enzima. Os resultados obtidos utilizando o extrato
aquoso de alecrim (Rosmarinus officinalis) e de mate (Ilex paraguarienesis) em diferentes
concentrações estão demonstrados nas Figuras 6 e 7, respectivamente.
Na Figura 6 pode-se observar que a presença do extrato aquoso de alecrim reduz
significativamente a concentração de açúcares redutores no meio, o qual é proporcional a
concentração do inibidor. Por outro lado, na Figura 7, pode-se observar que o efeito inibidor
do extrato aquoso de mate quando comparado ao teste controle (sem inibidor) é
praticamente nulo.
Tsai et al (2007), observaram a inibição completa da atividade da GTF em presença
do extrato aquoso de alecrim na concentração de 16 mg/mL, sendo que em menor
concentração (1,42 mg/mL) ainda é um efetivo inibidor comparado ao extrato metanólico de
alecrim.
O estudo comparativo da ação do extrato de Rosmarinus officinalis com o gluconato
de clorexidina, revelou igual atividade de inibição de síntese de glucano para o extrato e a
clorexidina em relação a S. mutans ATCC 25175 (Silva et al, 2008). Os mesmos autores
reportaram ainda que o extrato de Rosmarinus officinalis Linn. foi efetivo na inibição de
aderência de S. mitis ATCC 98811, S. mutans ATCC 25175 e S. sobrinus.
Para efeitos de comparação, alguns testes foram realizados com o uso de clorexidina
(0,06 e 0,12 mg/mL), um conhecido inibidor da atividade desta enzima, que possui
propriedades bacteriostáticas e bactericidas dependendo de sua concentração. Os resultados
estão expressos na tabela 3.
A clorexidina, um agente catiônico com amplo espectro de ação, inibe o
metabolismo do Streptococcus mutans, pois quando adsorvida às superfícies oral e
bacteriana carregadas negativamente, interferem no equilíbrio osmótico bacteriano, na
formação da película adquirida e adsorção bacteriana ao dente (Silva, 2008). Leonardo et al
(2001), numa análise anti-microbiana da solução de clorexidina 2% sobre bactérias Gram-
positivas, dentre elas Streptococcus mutans, por meio do teste de difusão em Agar,
relataram que a solução apresentou atividade antimicrobiana sobre todos os microrganismos
indicadores.
024681012
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle (sem inibidor)
alecrim (4 mg/ml)
alecrim (8 mg/ml)
alecrim (16 mg/ml)
Concentração de açúcares redutores (μg/mL)
Tempo (horas)
Figura 6. Efeito do extrato aquoso de alecrim (Rosmarinus officinalis) na atividade da
Glicosiltransferase.
024681012
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle (sem inibidor)
mate (4 mg/ml)
mate (8 mg/ml)
mate (16 mg/ml)
Concentração de açúcares redutores (μg/mL)
Tempo (horas)
Figura 7. Efeito do extrato aquoso de erva-mate (Ilex paraguariensis) na atividade da
Glicosiltransferase.
Tabela 3. Inibição da atividade da Glicosiltransferase por cloredixina após 1 hora de reação
Atividade de GTF (μg/ml)
meio sem inibidor
Atividade de GTF (μg/ml)
meio com inibidor
(clorexidina 0,06 mg/ml)
Atividade de GTF (μg/ml)
meio com inibidor
(clorexidina 0,12 mg/ml)
13,4 ± 1,3 7,2 ± 1,8* 2,29 ± 0,7*
P< 0.01 comparado ao controle (sem inibidor)
4.6. Determinação de fenóis totais
Conforme demonstrado na Tabela 4, variações não significativas no teor de fenólicos
totais dos extratos foram observadas. Embora quantidades ligeiramente superiores de
fenólicos totais tenham sido detectadas no extrato de chá-mate ele não teve efeito inibitório
sobre a atividade da GTF, quando comparado ao alecrim (Figura 6 e 7). Isto sugere que a
concentração de compostos fenólicos totais não determina a capacidade inibitória dos
extratos analisados na atividade da enzima GTF, mas sim possivelmente a natureza destes
compostos fenólicos presentes.
Segundo Asolini et al (2006), a erva-mate apresentou maior quantidade de compostos
fenólicos (145 mg equivamente de ácido gálico/g folha seca) diferindo estatisticamente de
outros tipos de chás analisados (arruda, alecrim, macela, alcachofra, sálvia, camomila
capim-limão e malva) sendo maiores nos extratos aquosos do que nos extratos etanólicos.
Entretanto, os autores não observaram nenhuma atividade antibacteriana do extrato aquoso
de erva-mate.
Tabela. 4 Conteúdo de fenólicos totais dos extratos de alecrim, chá-verde e chá-mate
preparados na concentração de 0,1mg/mL
Extrato vegetal analisado
(0,1mg/mL)
Concentração de fenólicos totais
(mg/g)
Alecrim 183 ± 12,3
Chá verde 185 ± 15,7
Chá mate 204 ± 8,4
4.7. Concentração Inibitória Mínima (CIM) de extratos vegetais sobre o crescimento
de Streptococcus mutans
O potencial de atividade antibacteriana de um extrato de planta pode ser determinado
a partir dos seus valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM).
Para efeitos de comparação a Tabela 5 mostra a média dos resultados de leitura de
Absorbância após 48 horas de crescimento bacteriano utilizando diferentes concentrações
dos três extratos testados. Os valores correspondem às suspensões bacterianas diluídas 1:1.
Tabela 5. Valores de Absorbância a 630nm do caldo BHI após 48 horas de crescimento de
Streptococcus mutans
Concentração
(mg/mL)
Camellia sinensis Ilex paraguariensis Rosmarinus officinalis
0,125 0,223 0,555 ND
0,25 0,244 0,737 0,876
0,5 0,104 0,636 0,776
1,0 0,114 0,715 0,765
2,0 0,130 0,764 ND
4,0 0,187 0,714 ND
8,0 0,189 0,651 ND
Controle (sem diluição) 0,904
ND: não determinado (valores de leitura superiores a 1,0)
Considerando que a CIM é a menor concentração do extrato onde não houve
crescimento bacteriano visível, ou seja, uma leitura da absorbância menor que 0,05,
podemos observar que os extratos testados não foram capazes de inibir o crescimento de
Streptococcus mutans.
Takarada et al (2004), buscaram verificar a ação do extrato hidroalcoólico de
Rosmarinus officinalis sobre Streptococcus mitis ATCC 9811, Streptococcus sanguis ATCC
10556, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus sobrinus ATCC 27609, espécies
bacterianas predominantes no biofilme supragengival, e Lactobacillus casei ATCC 7469 .
Todas as linhagens foram sensíveis ao extrato hidroalcoólico de Rosmarinus officinalis,
exceto Streptococcus mitis ATCC 9811. Foram observados halos de inibição de crescimento
bacteriano que variaram de 11 mm a 18 mm de diâmetro, sendo considerado ativo o extrato
que mostrou halos de inibição superior a 12 mm. A inibição do crescimento apresentou-se
homogênea, de acordo com o grau de concentração do extrato hidroalcoólico de alecrim.
Houve diminuição proporcional do diâmetro dos halos de inibição, à medida que a
concentração do extrato foi diminuída. Esses dados sugerem que o extrato de alecrim possui
compostos bioativos com atividade antimicrobiana in vitro sobre as cepas de Streptococcus
sanguinis ATCC 10556, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus sobrinus
ATCC 27609 e Lactobacillus casei ATCC 7469.
Queiroz et al (2008), demonstraram que as linhagens bacterianas de Streptococcus
mutans, S.mitis, S. sobrinus e Lactobacillus casei, mostraram ser susceptíveis a ação do
extrato hidroalcóolico da Rosmarinus officinalis Linn., observando-se halos de inibição que
variaram entre 11 e 20 mm. O extrato do alecrim não apresentou atividade antimicrobiana
sobre a linhagem de S. sanguis. Houve uma diminuição proporcional dos halos de inibição a
medida que a concentração do extrato foi diminuída. Em relação ao controle positivo
(gluconato de clorexidina à 0,12%), observa-se que também inibiu o crescimento de todas
as linhagens analisadas, mas com halos de inibição que variaram de 11 a 18 mm.
Kubo et al. (1993) comprovaram a atividade antimicrobiana de
I
lex paraguariensis
frente a bactérias e fungos patogênicos. Dentre as bactérias que sofreram inibição total
encontram-se Bacillus subtilis, Brevibacterrium ammoniagenes, Propionibacterium acnes,
Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans. Segundo relato dos autores os princípios
ativos de uma bebida como a erva-mate podem ser superiores como agentes antimicrobianos
quando comparados a muitos produtos naturais.
5-CONCLUSÃO
1. Os resultados permitem concluir que o crescimento da linhagem de Streptococcus mutans
ATCC 25175 leva a produção da enzima GTF, a qual é a responsável pela formação de
glucanos ao longo do tempo de incubação.
2. Segundo os parâmetros cinéticos da reação a enzima GTF apresenta alta afinidade pelo
substrato sacarose (km = 2,5mM), sugerindo sua participação na síntese de glucanos, e
portanto, na formação da lesão de cárie.
3. Dentre os extratos testados como inibidores da atividade da GTF somente o extrato
aquoso de alecrim (a partir da concentração de 4 mg/mL) foi capaz de inibir a atividade da
enzima. Entretanto, mesmo sendo um bom inibidor de atividade da enzima, esta capacidade
não está envolvida na inibição do crescimento de SM. Portanto, sugere-se que o alecrim
pode ser uma fonte valiosa para uso direto, ou ainda como precursor de novas moléculas
bioativas a serem empregadas para a inibição da GTF.
4. O efeito inibitório sobre a atividade da GTF verificado com o uso do extrato aquoso de
alecrim parece não estar relacionado com a concentração de compostos fenólicos totais, mas
possivelmente com a natureza destes compostos fenólicos presentes.
5. Modelos de estudos que possam reproduzir situações mais próximas aquelas encontradas
na cavidade oral são requeridas para avaliação de agentes antimicrobianos no tratamento e
prevenção de infecções orais biofilme-dependentes. Além disto, são necessários mais
estudos com extrato aquoso de alecrim sobre a atividade das enzimas glicosiltransferases
individualmente e purificadas.
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7-ANEXOS
y=4,7329x+0,0545
R
2
=0,9955
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Concentraçãodehexosesneutras(μg/ml)
Absorbância(490nm)
Anexo 1. Curva padrão de glicose para determinação das hexoses neutras pelo método do
fenol-ácido sulfúrico
y=0,0352x‐0,0061
R
2
=0,9649
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8 10121416
Concentraçãodeaçúcaresredutores(μg/ml)
Absorbância(540nm )
Anexo 2. Curva padrão de glicose para determinação de açucares redutores pelo método de
Somogy-Nelson
Anexo 3. Curva padrão de fenol para determinação de fenólicos totais pelo método de
Folin-Ciocalteau
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