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LAURO MERA DE SOUZA
APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS E DA CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA NA CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOMOLÉCULAS DE BAIXA
MASSA MOLECULAR
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica, Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, Setor de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do
grau de Doutor em Ciências – Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki
Co-orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini
CURITIBA
2008
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iii
“Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito, nos aproxima”
Louis Pasteur
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iv
Agradecimentos:
À família:
Agradeço à minha mãe Maria, minha irmã Adriane e minha esposa Sandra por
estarem do lado todo este tempo, sempre me apoiando;
Aos orientadores:
Agradeço aos meus orientadores Prof. Guilherme L. Sassaki e Prof. Marcello
Iacomini por seus ensinamentos desde que eu comecei na Bioquímica. Agradeço pela
confiança e liberdade que me foi dedicada na conduta do meu trabalho;
Ao Prof. Philip A. J. Gorin que embora não tenha sido oficialmente co-orientador, sempre
contribuiu para enriquecer meu trabalho;
Aos amigos:
Durante estes anos de doutorado eu conheci muitas pessoas importantes. Estas
pessoas se tornaram grandes amigos, e estes amigos ajudam a mantermos nossa sanidade
mesmo nos momento difíceis de nossa vida.
A estas pessoas eu gostaria de dedicar um agradecimento muito especial:
Guilherme L. Sassaki, Rodrigo O. Faria, Rodrigo V. Serrato, Graciele Viccini, Thales R.
Cipriani, Alan G. Gonsalves, Luciana, Juliana, Marcelo Muller, Rose Adele, Phellipe, Rodrigo
Reis, Renato Bochichio...
• Ao Thales e por nossa parceira de trabalho bem sucedida com a Espinheira-Santa;
• Ao Marcelo Muller pela nossa recente parceira de trabalho com a arqueia, que com
certeza também vai ser muito bem sucedida;
• Aos alunos de iniciação científica Denise E. Costa, Carolina Sant’Ana e Daniel S. Riter,
pela amizade e pelo trabalho;
• À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Bioquímica, em nome da Prof
a
. Leda
Satie Chubatsu, pela dedicação prestada ao crescimento deste curso. Também ao Prof.
Miguel Noseda, atual coordenador do curso
v
Aos amigos do laboratório: Fernanda, Elaine, Andréia, Lucimara, Ana Helena, Rodrigo e
Dirce.
Ao Sr. Dalnei Serighelli, da Central de Produção e Comercialização de Plantas Medicinais,
Aromáticas e Condimentares do Paraná, pela gentileza no fornecimento do material para
esta pesquisa.
- Ao Prof. Dr. Olavo Guimarães, do Depto. de Botânica, pela identificação da planta.
- Ao CNPq e Pronex-Carboidratos pelo auxílio financeiro.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................................... IX
LISTA DE TABELAS...................................................................................................................... XIII
RESUMO........................................................................................................................................XIV
ABSTRACT.....................................................................................................................................XV
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS, SIGLAS E TERMOS:....................................................................XVI
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................... 1
1.1. ESPECTROMETRIA DE MASSAS: BREVE HISTÓRICO............................................................. 2
1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS: DEFINIÇÃO.......................................................................... 3
1.3. INSTRUMENTAÇÃO................................................................................................................... 5
1.4. FONTES DE IONIZAÇÃO............................................................................................................ 5
1.4.1. Ionização eletrônica (EI – Electron Ionization)........................................................................... 6
1.4.2. Ionização química (CI – Chemical Ionization)............................................................................ 7
1.4.3. Ionização por bombardeamento rápido de átomos (FAB – Fast Atom Bombardment)............... 8
1.4.4. Ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization).......................................................................................................................................... 9
1.4.5. Ionização por spray de elétrons (ESI – Electrospray Ionization)...............................................11
1.4.6. Ionização química a pressão atmosférica (APCI - Atmospheric Chemical Pressure Ionization) 13
1.4.7. Ionização por dessorção de spray de elétrons (DESI – Desorption Electrospray Ionization).....14
1.4.8. Outras fontes de íons ..............................................................................................................15
1.5. ANALISADORES DE MASSAS...................................................................................................16
1.5.1. Analisadores de Setor .............................................................................................................16
1.5.2. Quadrupolares (Q – Quadrupole) ............................................................................................16
1.5.3. Armadilha de íons (IT – Ion Trap, ou QIT – Quadrupole Ion Trap)............................................17
1.5.4. Tempo de Vôo (TOF – Time of flight).......................................................................................19
1.5.5. Analisadores com Transformada de Fourier (FT- Fourier-transform)........................................20
1.5.6. Analisadores de mobilidade de íons (IM – Ion Mobility)............................................................20
1.6. DETECTORES...........................................................................................................................21
1.6.1. Faraday cup ............................................................................................................................22
1.6.2. Multiplicadores de elétrons (EM – Electron Multiplier) ..............................................................22
1.6.3. Multiplicadores de fótons .........................................................................................................22
1.7. ESPECTROMETRIA DE MASSA DO TIPO TANDEM-MS ...........................................................23
1.8. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ACOPLADOS A ESPECTROMETRIA DE MASSAS.............25
1.8.1. Cromatografia em fase gasosa................................................................................................26
1.8.2. Cromatografia líquida de alta eficiência ...................................................................................26
1.9. APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE
BIOMOLÉCULAS..............................................................................................................................27
vii
1.10. OLIGOSSACARÍDEOS ............................................................................................................28
1.11. LIPÍDEOS.................................................................................................................................30
1.11.1. Fosfolipídeos.........................................................................................................................32
1.11.2. Glicolipídeos..........................................................................................................................33
1.12. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS..............................................................................................34
1.12.1. Flavonóides...........................................................................................................................34
2. OBJETIVOS .................................................................................................................................39
2.1. OBJETIVO GERAL.....................................................................................................................40
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................................40
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................41
3.1. FONTES DAS BIOMOLÉCULAS ................................................................................................42
3.2. OBTENÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO...................................................................................42
3.2.1. Phyllorhiza punctata................................................................................................................42
3.2.2. Maytenus ilicifolia ....................................................................................................................43
3.2.3. Haloarcula marismortui............................................................................................................43
3.3. EXTRAÇÕES .............................................................................................................................44
3.3.1. Extração e fracionamento de lipídeos de Phyllorhiza punctata .................................................44
3.3.2. Extrações e fracionamentos dos componentes de folhas de Maytenus ilicifolia........................44
3.3.3. Extração e fracionamento dos lipídeos da arquea Haloarcula marismortui..............................45
3.4. DERIVATIZAÇÕES QUÍMICAS ..................................................................................................46
3.4.1. Derivatização para análise em GC-MS....................................................................................46
3.4.2. Acetalação do flavonóis glicosídeos ........................................................................................47
3.5. MÉTODOS ANALÍTICOS............................................................................................................47
3.5.1. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas..................................................48
3.5.2. Cromatografia líquida de alto desempenho..............................................................................48
3.5.2.1. Cromatografia líquida de alto desempenho com derivatização pós-coluna............................50
3.5.2.2. Cromatografia líquida de alto desempenho acoplada a espectrometria de massas ...............51
3.5.3. Cromatografia em camada delgada (TLC - Thin Layer Chromatography).................................51
3.5.4. Análise por espectrometria de massas do tipo electrospray .....................................................51
3.5.5. Análise por espectroscopia de ressonância magnética nuclear................................................52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................................53
4.1. ANÁLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS .........................................................................................54
4.1.2. Influência dos adutores na fragmentação de oligossacarídeos.................................................57
4.2. ANÁLISE ESTRUTURAL DE LIPÍDEOS......................................................................................61
4.2.1. Análise dos padrões de fosfolipídeos.......................................................................................61
4.2.2. Análise de lipídeos de Phillorhiza punctata ..............................................................................63
4.2.2.1. Análise lo lipídeo da fração Pp-F6 por NMR..........................................................................63
4.2.2.2. Análise do lipídeo da fração Pp-F6 por ESI-MS ....................................................................66
4.2.3. Análise dos lipídeos de folhas de M. ilicifolia............................................................................69
viii
4.2.3.1. Identificação dos lipídeos de M. ilicifolia por tandem-MS em modo positivo...........................71
4.2.3.2. Identificação dos lipídeos de M. ilicifolia por tandem-MS em modo negativo .........................74
4.2.4. Análise dos lipídeos de H. marismortui ....................................................................................76
4.2.4. Análise dos fosfolipídeos de H. marismortui.............................................................................78
4.2.4.1. Arquetidil fosfato (aPA).........................................................................................................78
4.2.4.2. Arquetidil fosfoglicerol (aPG) ................................................................................................78
4.2.4.3. Arquetidil fosfoglicerosulfato (aPGS).....................................................................................80
4.2.4.4. Arquetidil fosfoglicerofosfato metil éster (aPGP-Me) .............................................................83
4.2.4.4. Estrutura do triglicolipídeo di-éter (TGD)...............................................................................86
4.3. ANÁLISE ESTRUTURAL DE FLAVONÓIDES DE M. ILICIFOLIA ....................................................89
4.3.1. Componentes de folhas de Maytenus ilicifolia..........................................................................89
4.3.2. Composição geral do extrato Mi-ET-SOL.................................................................................89
4.3.3. Análise de flavonóides livres e taninos condensados...............................................................92
4.3.3.1. Fração Mi-F1........................................................................................................................92
4.3.3.2. Fração Mi-F2........................................................................................................................94
4.3.4. Análise de flavonóides glicosilados........................................................................................100
4.3.4.1. ESI-MS em modo negativo.................................................................................................101
4.3.4.2. Tandem-MS em modo negativo..........................................................................................102
4.3.4.3. ESI-MS em modo positivo ..................................................................................................105
4.3.4.4. Tandem-MS dos compostos protonados.............................................................................106
4.3.4.5. Tandem-MS dos compostos sodiados ................................................................................108
4.3.4.6. Análise do glicosídeos por HPLC-UV-ESI-MS.....................................................................110
4.3.4.7. Desenvolvimento do método de 2D-LC-UV-MS a partir de Mi-ET-SOL ...............................113
4.3.4.8. Primeira dimensão: SEC ....................................................................................................114
4.3.4.8. Segunda dimensão: RP......................................................................................................116
4.3.4.9. Segunda dimensão como derivatização pós-coluna............................................................117
4.3.4.10. Descrição estrutural dos flavonóis glicosídeos de folhas de M. ilicifolia .............................120
4.3.4.11. Estrutura de flavonóis tetra-glicosídeos.............................................................................122
4.3.4.12. Estrutura de flavonóis tri-glicosídeos.................................................................................128
4.3.4.13. Estrutura de flavonóis di-glicosídeos.................................................................................131
4.3.4.14. Estrutura de flavonóis mono-glicosídeos...........................................................................136
4.3.4.15. Diferenciação parcial entre galactosídeos e glucosídeos por ESI-MS em modo off-line.....141
5. CONCLUSÕES...........................................................................................................................145
6. REFERÊNCIAS ..........................................................................................................................150
ANEXOS ........................................................................................................................................162
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática de um espectrômetro de massas ............................................. 05
Figura 2 – Típico processo de ionização eletrônica a 70 eV: Formação do cátion radical, seguida de
fragmentação e rearranjos moleculares.................................................................................................. 07
Figura 3 – Representação esquemática dos eventos de ionização química usando metano como gás
reagente .................................................................................................................................................... 08
Figura 4 – Representação esquemática da ionização química em modo negativo ............................... 08
Figura 5 – Ionização por fonte de MALDI........................................... ..................................................... 10
Figura 6 – Modelo de ionização por electrospray: (A) modelo do resíduo carregado, e (B) modelo de
dessorção de íons. .................................................................................................................................. 12
Figura 7 – Fonte de ionização DESI ........................................................................................................ 14
Figura 8 – Analisador de setor magnético................................................................................................ 16
Figura 9 – Representação esquemática de um quadrupolo .................................................................... 17
Figura 10 – Representações esquemáticas dos analisadores do tipo ion trap........................................ 18
Figura 11 – Representação esquemática do analisador TOF.................................................................. 19
Figura 12 – Representação esquemática de multiplicadores de elétrons .............................................. 22
Figura 13 – Modelo de triplo quadrupólo preparado para tandem-MS .................................................... 24
Figura 14 – Rearranjo McLafferty ............................................................................................................ 25
Figura 15 - Configurações possíveis para D-glucose e D-frutose ........................................................... 29
Figura 16 – Estruturas básicas de alguns lipídeos .................................................................................. 31
Figura 17 – Estruturas básicas dos flavonóides, mostrando a distribuição dos anéis A, B e C, e a
numeração de cada carbono.................................................................................................................... 35
Figura 18 – Estrutura de flavonóides ligados entre si, ou com carboidratos........................................... 36
Figura 19 – Esquema de HPLC preparado para derivatização pós-coluna............................................. 50
Figura 20 – Formação dos fragmentos de carboidratos .......................................................................... 54
Figura 21 – Nomenclatura para os fragmentos obtidos para glicoconjugados ........................................ 56
Figura 22 – Influência do adutor na fragmentação da celobiose e da maltose........................................ 58
Figura 23 – Influencia do adutor na fragmentação da maltopentaose e da estquiose............................. 60
Figura 24 – Fragmentação de um fosfolipídeo......................................................................................... 62
Figura 25 – Espectro de
13
C-DEPT da fração Pp-F6................................................................................ 65
x
Figura 26 – Espectros de 1H/13C-HMQC, 1H/1H-TOCSY e 1H/31P-HMBC da fração Pp-F6 ............... 66
Figura 27 – Espectros positivos de ESI-MS e CID-MS da fração Pp-F6 ................................................. 67
Figura 28 – Espectros positivos de ESI-MS e CID-MS da fração Pp-F6 após hidrólise .......................... 68
Figura 29 – Espectros ESI-MS em modo negativo e positivo da fração Mi-EL ....................................... 69
Figura 30 – Espectros ESI-MS em modo positivo e negativo da fração Mi-EL-S e Mi-EL-I .................... 70
Figura 31 – Espectros de CID-MS em modo positivo dos principais íons da fração Mi-EL-I .................. 72
Figura 32 – Espectro de CID-MS em modo positivo de um diglicosil diacilglicerol presente na fração
Mi-EL-I ...................................................................................................................................................... 73
Figura 33 – Espectro de CID-MS em modo negativo de sulfonoglicolipídeos presentes na fração Mi-
EL-I ........................................................................................................................................................... 75
Figura 34 – Espectros de ESI-MS modo negativo e positivo da fração Hm-EL ...................................... 76
Figura 35 – Nomenclatura para os fragmentos observados nos fosfolipídeos de H. marismortui .......... 77
Figura 36 – Estrutura e espectro de CID-MS em modo negativo do arquetidil fosfato ............................ 78
Figura 37 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo do arquetidil fosfoglicerol, e ESI-
MS em modo positivo do extrato após hidrólise ....................................................................................... 79
Figura 38 – Esquema de substituição de H
+
por D
+
nos grupos polares do aPGS e do aPGP ............... 81
Figura 39 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo e positivo do arquetidil
fosfoglicerosulfato .................................................................................................................................... 82
Figura 40 – Estrutura e espectros de CID-MS em modo negativo e positivo do arquetidil
fosfoglicerofosfato metil éster ................................................................................................................... 85
Figura 41 – Estrutura sugerida pelo espectro de CID-MS em modo e positivo do arquetidil
triglicosídeo ............................................................................................................................................... 87
Figura 42 –Espectro de DEPT
13
C NMR do arquetidil triglicosídeo ......................................................... 88
Figura 43 – Análise de ESI-MS em modo negativo da fração Mi-ET-SOL .............................................. 90
Figura 44 – Análise por HPLC-PAD e HPLC-MS da fração Mi-ET-SOL ................................................. 91
Figura 45 – Análise de NMR (HMQC-TOSY, COSY) da fração Mi-F1 .................................................... 93
Figura 46 – Espectro de ESI-MS em modo negativo da fração Mi-F2 .................................................... 94
Figura 47 – Perfil de fragmentação por CID-MS negativo dos dímeros de taninos ................................. 95
Figura 48 – Perfil de fragmentação por CID-MS negativo dos trímeros de taninos ................................ 97
Figura 49 – Cromatograma obtido por HPLC-MS em modo negativo da fração Mi-F2........................... 98
Figura 50 – Espectro de 13C-NMR da fração Mi-F2 ............................................................................... 100
xi
Figura 51 – Espectros de ESI-MS em modo negativo das frações Mi-F2 a Mi-F5................................... 101
Figura 52 – Espectros de ESI-MS em modo negativo mostrando alteração na formação dos íons de
acordo com a energia utilizada no cone ................................................................................................... 102
Figura 53 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo mostrando a formação de íons
regulares e radicais .................................................................................................................................. 104
Figura 54 – Espectros de ESI-MS em modo positivo mostrando alteração na formação dos íons de
acordo com a energia utilizada no cone.................................................................................................... 106
Figura 55 – Espectros de CID-MS em modo positivo mostrando o perfil de fragmentação dos
flavonóis glicosídeos na forma protonada – m/z 741 e 757 ..................................................................... 107
Figura 56 – Espectros de CID-MS em modo positivo mostrando o perfil de fragmentação dos
flavonóis tri-glicosídeos na forma sodiada – m/z 763 e 779...................................................................... 109
Figura 57 – HPLC-UV e HPLC-MS das frações Mi-F3 e Mi-F5 ............................................................... 112
Figura 58 – Cromatograma da fração Mi-F5 mostrando a sobreposição dos compostos de m/z 755 e
739 com aqueles de m/z 887 e 871, respectivamente ............................................................................. 113
Figura 59 – Perfil de separação dos compostos da fração MI-ET-SOL por cromatografia de exclusão
estérica na primeira dimensão .................................................................................................................. 114
Figura 60 – Perfil de cromatográfico por SEC dos compostos de m/z 609 e 593 [M-H]
-
......................... 115
Figura 61 – Perfil de cromatográfico bi-dimensional da fração Mi-ET-SOL ............................................. 117
Figura 62 – Espectro de ultravioleta dos flavonóis glicosídeos de M. ilicifolia ........................................ 119
Figura 63 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 919 [M+H]
+
............................ 122
Figura 64 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 903 [M+H]
+
............................ 123
Figura 65 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 933 [M+H]
+
............................ 123
Figura 66 – Perfil de fragmentação por CID-MS dos tetra-glicosídeos de m/z 889 [M+H]
+
e m/z 911
[M+Na]
+
..................................................................................................................................................... 125
Figura 67 – Perfil de fragmentação por CID-MS dos tetra-glicosídeos de m/z 873 [M+H]
+
e m/z 895
[M+Na]
+
..................................................................................................................................................... 127
Figura 68 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-hexobiosídeo e miricetina di-
ramno-hexosídeo - m/z 773 [M+H]
+
e m/z 795 [M+Na]
+
........................................................................... 129
Figura 69 – Perfil de fragmentação por CID-MS da miricetina ramno-hexosídeo e quercetina
hexobiosídeo - m/z 627 [M+H]
+
e m/z 649 [M+Na]
+
.................................................................................. 132
xii
Figura 70 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-hexisídeo - m/z 611 [M+H]
+
e
m/z 633 [M+Na]
+
....................................................................................................................................... 133
Figura 71 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campferol ramno-hexisídeo e quercetina
ramnobiosídeos - m/z 595 [M+H]
+
e m/z 617 [M+Na]
+
............................................................................. 134
Figura 72 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-arabinosídeo - m/z 581 [M+H]
+
e m/z 603 [M+Na]
+
.................................................................................................................................... 135
Figura 73 – Perfil de fragmentação in-source do campferol ramno-arabinosídeo - m/z 565 [M+H]
+
...... 136
Figura 74 – Perfil de fragmentação in-source da miricetina-hexosísdeo - m/z 481 [M+H]
+
..................... 137
Figura 75 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina-hexosídeo - m/z 465 [M+H]
+
e m/z 487
[M+Na]
+
.................................................................................................................................................... 137
Figura 76 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campeferol-hexosídeo - m/z 449 [M+H]
+
e m/z 471
[M+Na]
+
..................................................................................................................................................... 138
Figura 77 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina-arabinosídeo - m/z 435 [M+H]
+
e m/z
457 [M+Na]
+
............................................................................................................................................. 139
Figura 78 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campeferol-arabinosídeo - m/z 435 [M+H]
+
e m/z
457 [M+Na]
+
.............................................................................................................................................. 139
Figura 79 – Perfil de fragmentação por CID-MS de di-glicosídeos na forma de isopropilidenos ............ 142
Figura 80 – Perfil de fragmentação por CID-MS de tri-glicosídeos na forma de isopropilidenos ............ 144
xiii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Fontes das biomoléculas estudadas neste trabalho.................................... 42
TABELA 2 – Análise dos padrões de fosfolipídeos.......................................................... 62
TABELA 3 –Tandem-MS dos fosfolipídeos de H. marismortui......................................... 86
TABELA 4 – Composição de taninos na fração Mi-F2, por CID-MS................................ 99
TABELA 5 – Perfil de fragmentação dos flavonóis glicosídeos em modo negativo......... 105
TABELA 6 – Perfil de fragmentação dos flavonóis glicosídeos sodiados........................ 110
TABELA 7 – Análise de metilação dos flavonóis glicosídeos .......................................... 121
TABELA 8 – Resultado obtido por 2D-LC-MS com derivatização pós-coluna................. 141
xiv
RESUMO
A espectrometria de massas é uma das mais importantes técnicas de análise
estrutural da atualidade. Ela pode ser aplicada nas mais diversas áreas da ciência,
como química, biologia, medicina, forense, entre outras. Neste trabalho, várias
classes de biomoléculas de baixa massa molecular como oligossacarídeos, diversos
lipídeos e flavonóides, obtidos de diferentes fontes, foram analisados por
espectrometria de massas através de injeções diretas, ou por cromatografia líquida
acoplada à espectrometria de massas. O comportamento de oligossacarídeos nos
processos de fragmentação foi avaliado através de sua ionização com diferentes
adutores, como Li
+
, Na
+
e K
+
. Foi determinado que o Li
+
foi capaz de produzir um
considerável ganho na produção de íons fragmentos, e com menores energias que
os demais adutores. Para a análise de lipídeos de diferentes fontes, foi inicialmente
realizada uma padronização, por meio de ionização em modo positivo e negativo,
com padrões de fosfolipídeos. Um lipídeo identificado com ceramida aminoetil
fosfonato, característico de invertebrados, foi encontrado na cifomedusa Phyllorhiza
puncata. Dois glicolipídeos característicos de plantas foram encontrados em
Maytenus ilicifolia, sendo identificados como digalactosildiacilglicerol, através de seu
perfil de fragmentação em modo positivo. Outro glicolipídeo foi analisado em modo
negativo, sendo identificado como sufoquinovosildiacilglicerol, que apresenta um
grupo sulfonil ligado ao C-6 da quinovose. Um perfil abrangente do conteúdo de
lipídeos foi obtido da arquea Haloarcula marismortui, um microorganismo halofílico
isolado do Mar Morto. Diversos fosfolipídeos foram identificados tanto em modo
positivo quanto em negativo, todos contendo uma cadeia hidrofóbica que é
característica de arqueas, chamada de arqueol, que apresenta dois álcoois
ramificados contendo 20 carbonos conhecidos como geranilgeraniol, ligados ao
glicerol por ligações do tipo éter. Além dos fosfolipídeos, um glicolipídeo contendo
duas unidades de glucose e uma de manose, ligados ao arqueol, foi identificado em
H. marismortui. Grande parte deste trabalho também foi dedicada à análise
estrutural de flavonóides, taninos e flavonóis glicosídeos de folhas de M. ilicifolia.
Esta planta, conhecida como espinheira santa é utilizada em tratamentos de
distúrbios gástricos, e demonstrou ser capaz de sintetizar uma grande variedade
destes compostos. Flavonóides livres como catequina e epicatequina foram
identificados por LC-MS em modo positivo e negativo. Taninos foram analisados em
modo negativo, os quais demonostraram ser compostos de (epi)-catequina, (epi)-
afzelequina e (epi)-galocatequina, formando estruturas com dímeros até
heptâmeros, com sequências variadas. Diversos flavonóis glicosídeos contendo
principalmente galactose ligada a um núcleo aglicona, tipicamente campferol ou
quecetina, embora miricetina também foi encontrada. Entretanto um grande número
de isômeros contendo glucose no lugar da galactose foram encontrados. Estes
isômeros só puderam ser analisados através do acoplamento do espectrômetro de
massas a um sistema de cromatografia líquida, o qual foi realizado em modo bi-
dimensional, com uma coluna de exclusão estérica na primeira dimensão e de fase
reversa na segunda, permitindo a identificação de 36 flavonóis glicosídeos. Alguns
galactosídeos puderam ser diferenciados dos glucosídeos através de sua acetalação
e análise direta por ESI-MS, já que os galactosídeos apresentaram um ganho na sua
massa de 40 Da a mais que os glucosídeos, mostrando um grande potencial para
esta aplicação.
xv
ABSTRACT
Mass spectrometry is one of the most important techniques currently devoted
to structural analysis. It can be employed to several sciences, such as chemistry,
biology, medicine, forensics, and so on. In the present work, many classes of low
molecular biomolecules, such as oligosaccharides, several lipids and flavonoids,
from different sources were analyzed employing direct injection on mass
spectrometer source, or by coupling with liquid chromatography. The fragmentation
behavior of oligosaccharides with different adducts, such as Li
+
, Na
+
and K
+
, were
evaluated. Thus it was found that Li
+
provided best results, producing more fragment-
ions with lower energy than other adducts. Negative and positive ionization were
standardized for phospholipids analysis. Other lipids from different sources were
identified as ceramide amynoethylphosphonate, common in invertebrates, it was
found in the medusa Phyllorhiza punctata. Two glycolipids common in plants, were
found in Maytenus ilicifolia, they were identified as digalactosyldiacylglycerol, via
positive fragmentation, and in the negative analysis it was identified a
sulfoquinovosyldiacylglycerol, a glycolipid containing a sufonyl group bond to C-6 of
quinovose. A comprehensive lipid profile was carried out from archaea Haloarcula
marismortui, a microorganism from Dead Sea. Many phospholipids were identified by
negative and positive ESI-MS analysis, indicating the presence of archaeol, a
structure with two branched alcohols with 20 carbons, which are known as
geranylgeraniol, bond to glycerol via eter linkages. It was also found a glycolipid
containing two glucose units and a mannose unit, linked to archaeol. However the
major goal of this work was to develop analytical procedures for identifying
flavonoids, tannins, and flavonol glycosides from leaves of M. ilicifolia. This medicinal
plant was found to synthesize a wide range of these compounds. Free flavonoids
such as catechin and epicatechin were identified by LC-MS with negative and
positive ionization. Tannins were analyzed in the negative ionization, and were found
to be composed by (epi)-catechin, (epi)-afzelechin and (epi)-gallocatechin, forming
structures from dimers to heptamers, with variable sequence. Several flavonol
glycosides containing mainly galactose linked to an aglycone moiety, typically
kaempferol or quercetin, but miricetin was also found. However, many isomers
containing glucose instead galactose were found. In order to resolve the isomers a
two-dimensional liquid chromatography technique was employed, by using size
exclusion column in the first dimension and reversed phase in the second, which
allowed the identification of 36 flavonol glycosides. Some galactosides could be also
differentiated from glucosides in off-line ESI-MS after its acetalation, since the
galactosides had an increase of 40 Da higher than glucosides. This method proved
to be efficient for this differentiation.
xvi
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS, SIGLAS e TERMOS:
Compostos:
(Epi)Afz: Afzelequina ou Epiafzelquina;
(Epi)Cat: Catequina ou Epicatequina;
(Epi)Gall: Galocatequina ou Epigalocatequina;
2-AEP: Ácido 2-Aminoetilfosfônico;
aPA: Arquetidil Fosfato;
aPG: Arquetidil Fosfoglicerol;
aPGP: Arquetidil Fosfoglicerofosfato;
aPGP-Me: Arquetidil Fosfoglicerofosfato Metil Éster;
aPGS: Arquetidil Fosfoglicerosulfato;
Ara: Arabinose;
aTGD: Arquetidil Triglicosil Lipídeo;
CAEP: Ceramida Aminoetilfosfonato;
Camp: Campaferol;
DGDG: Digalactosildiacilglicerol;
f: Furanosídeo;
Gal: Galactose;
Glc: Glucose;
Gli: Glicerol;
MGDG, Monogalactosyldiacylglycerol;
Mir: Miricetina;
p: Piranosídeo;
PA: Ácido Fosfatídico;
Pas: Proantocianidinas;
PG: Fosfatildilglicerol;
PHG: Polar Head Group (Grupo Cabeça Polar);
Quer: Quercetina;
Rha: Ramnose;
SQDG; Sufoquinovosildiaciglicerol;
TFA: Trifluoroacetic Acid;
TGDG, Trigalactosildiacilglicerol;
xvii
Extratos e frações:
Hm-EL: Extrato Lipídico de H. marismortui;
Mi-EL: Extrato Lipídico de M. ilicifolia;
Mi-EL-I: Extrato Lipídico de M. ilicifolia fase inferior;
Mi-EL-S: Extrato Lipídico de M. ilicifolia fase superior;
Mi-ET-SOL: Extrato aquoso de M. ilicifolia solúvel em entanol;
Pp-EL: Extrato Lipídico de P. punctata;
Pp-EL-I: Extrato Lipídico de P. punctata fase inferior
Pp-EL-S: Extrato Lipídico de P. punctata fase superior
Espectrometria de massas e cromatografia:
APCI: Atmospheric Chemical Pressure Ionization (Ionização Química A Pressão
Atmosférica);
API: Atmospheric Pressure Ionization (Ionização Em Pressão Atmosférica);
CE: Capillary Electropheresis (Elétroforese Capilar);
CI: Chemical Ionization (Ionização Química);
CID-MS: Collision Induced Dissociation-Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas de
Dissociação Induzida por Colisão);
CRM: Charged-Residue Model (Modelo do Resíduo Carregado);
Da: Dalton (Unidade Massa Molecular);
DART: Direct Analysis In Real Time (Análise Direta em Tempo Real);
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer;
EI: Electron Ionization (Ionização Eletrônica);
EM: Electron Multipliers (Multiplicadores de Elétrons);
ESI: Electrospray Ionization (Ionização Por Spray de Elétrons);
ESI-MS: Electrospray Ionization-Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas com Fonte
Electrospray);
FAB: Fast Atom Bombardment (Ionização Por Bombardeamento Rápido de Átomos);
FD: Field Desorption (Dessorção de Campo);
FI: Field Ionization (Ionização de Campo);
FT: Fourier-Transform (Transformada de Fourier);
GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Cromatografia Gasosa Acoplada À
Espectrometria de Massas);
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência);
ICR: Ion Ciclotron Ressonance (Ressonância de Íon Ciclotron);
xviii
IDM: Íon-Desorption Model (Modelo da Dessorção de Íons);
IM: Ion Mobility (Mobilidade Iônica);
IT: Ion Trap (Armadilha de Íons);
LC-MS: Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (Cromatografia Líquida-Espectrometria
de Massas);
LSIMS: Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (espectrometria de massas de íon líquido
secundário);
m.u.: mass units (unidades de massa);
m/z: Relação massa/carga;
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Ionização Por Dessorção A Laser
Assistida Por Matriz);
MS/MS: Espectro de Fragmentação de Massa (Tandem-MS)
MS: Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas);
NL: Neutral Loss (Perda Neutra);
PD: Plasma Desorption (Dessorção por Plasma);
PDA: Photodiode Array (Detector de Arranjo de Diodos);
Q: Quadrupólo;
QIT: Quadrupole Íon Trap;
RF: Rádio Freqüência;
R
t
: Tempo de retenção relativo;
SEC: Size Exclusion Chromatography (cromatografia de exclusão por tamanho)
TIC: Total Ion Current (análise de íons totais)
TLC: Thin Layer Chromatography (Cromatografia Em Camada Delgada);
TOF: Time Of Flight (Tempo de Vôo).
Ressonância Magnética Nuclear:
δ: Delta – deslocamento químico (ppm)
COSY: Correlation Spectroscopy;
HMBC, Heteronuclear Multiple Bond Correlation;
HMQC, Heteronuclear Multiple Quantum Coherence;
HMQC-TOCSY, Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Spectroscopy-Total Correlation
Spectroscopy;
NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Ressonância Magnética Nuclear);
ROESY: Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy;
TOCSY: Total Correlation Spectroscopy;
xix
Termos associados às técnicas de análise:
• Heart-cutting: tipo de cromatografia bi-dimensional na qual apenas a parte de interesse é
transferida da primeira para segunda dimensão.
• On-line: análise acoplada de cromatografia com espectrometria de massas;
• Off-line: análise por infusão da amostra diretamente na fonte de ionização;
• Fragmentação in-source: quando ocorre fragmentação do analito direto na fonte de
ionização, sem acionamento da CID.
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. ESPECTROMETRIA DE MASSAS: BREVE HISTÓRICO
Os primeiros relatos sobre a massa atômica elementar datam de 1815,
quando o físico inglês W. Prout formulou sua teoria dos múltiplos do hidrogênio, no
qual ele constatou que a massa atômica e molecular de diversos elementos e
compostos eram múltiplos do hidrogênio, que ele havia determinado como contendo
1 unidade de massa (BUDZIKIEWICZ E GRIGSBY, 2005). Em 1886, o físico alemão
Eugen Goldstein observou raios formados em descargas de gás sob baixa pressão
que viajava através dos canais em um cátodo perfurado na direção do ânodo, e
chamou este fenômeno de "Kanalstrahlen" (raios canais). Mais tarde (1907),
utilizando campos magnéticos demonstrou que os raios produzidos revelavam que a
matéria era composta por elementos de massa variável, sendo que a mais leve era a
do hidrogênio. Em experimentos paralelos utilizando fortes campos magnéticos e
elétricos, Wilhelm Wien (1898) identificou a presença de um elemento com carga
positiva e massa igual a do hidrogênio, e em 1911 recebeu o Prêmio Nobel de
Física.
Também em paralelo, diversos estudos estavam sendo realizados por Joseph
J. Thomson, que em 1897 descobriu os elétrons, recebendo o Prêmio Nobel de
Física em 1906, como reconhecimento por esta descoberta. Posteriormente,
trabalhando sobre os experimentos de Wien, J. J. Thomson obteve um registro em
chapas fotográficas obtidos pela ionização do gás neônio. Contudo seus registros
acusavam a presença de duas marcas referentes ao neônio, que foram inicialmente
entendidas como se o gás neônio fosse formado por uma mistura de dois gases.
Mais tarde foi atribuído que a presença de compostos de massas diferentes no gás
neônio era devido à presença de seus isótopos (
20
Ne,
21
Ne e
22
Ne), assim, outros
compostos isotópicos acabaram sendo identificados (ASTON, 1920a,b; 1921;
THOMSON et al., 1921).
Em 1918, Arthur J. Dempster desenvolveu o primeiro espectrômetro moderno,
e fez a importante descoberta do isótopo
235
U. Em 1919, Francis W. Aston também
desenvolveu e melhorou seu espectrômetro de massas, o que lhe permitiu descobrir
212 isótopos naturais e em 1922 ele recebeu o Prêmio Nobel de Química pela sua
pesquisa. Os conceitos desenvolvidos por Arthur J. Dempster e Francis W. Aston
são utilizados até hoje no desenvolvimento dos modernos espectrômetros de massa
(BUDZIKIEWICZ E GRIGSBY, 2005; DASS, 2007).
3
Mais tarde, na década de 50, foi desenvolvida uma das principais técnicas de
análise de massas, chamada de íon trap (armadilha de íons). Seus criadores, Hans
G. Dehmelt e Wolfgang Paul receberam o Prêmio Nobel de Física (1989). Contudo,
todas as técnicas de ionização e análise de massas até então desenvolvidas, não
permitiam análises de moléculas de alta massa molecular, mas nos anos 80, John
Bennett Fenn desenvolveu um método de ionização suave chamado de electrospray
ionization, que permitiu a análise de macromoléculas com baixos níveis ou nenhuma
fragmentação. Fenn juntamente com Koichi Tanaka, quem desenvolveu outra
técnica suave de ionização chamada de soft laser desorption (1987), receberam o
Prêmio Nobel de Química em 2002. A importância do desenvolvimento desta técnica
analítca pode ser notada pelo grande número de Prêmios Nobel que foram dados
aos seus criadores.
1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS: DEFINIÇÃO
Espectrometria de massas pode ser entendida como uma técnica analítica
que permite a identificação da composição química de um determinado composto
isolado, ou de diferentes compostos em misturas complexas, através da
determinação de suas massas moleculares na forma iônica, (ou seja, com carga
elétrica líquida, positiva ou negativa), baseada na sua movimentação através de um
campo elétrico ou magnético. Esta movimentação é determinada pela razão entre a
massa de um determinado composto (analito) e sua carga liquida, designada por
m/z (mass to charge ratio). Assim, conhecendo o valor de m/z de uma molécula é
possível inferir sua composição química elementar, e com isso determinar sua
estrutura (Van BRAMER, 1998). A espectrometria de massas pode ser utilizada em
análises quantitativas, mas é em análises qualitativas que ela tem se destacado,
como na identificação de compostos em misturas e, principalmente, na
caracterização estrutural de compostos desconhecidos, que pode ser alcançado
através da formação de íons-molécula e de seus respectivos íons-fragmentos.
Poderíamos considerar então que a espectrometria massas fornece
informações precisas sobre a massa dos compostos analisados. Contudo devemos
tomar muito cuidado com este tipo de conclusão! Na realidade um espectrômetro de
massas fornece a massa obtida apenas de íons, entretanto nem todas as moléculas
contêm grupos químicos naturalmente carregados. Tomemos como exemplo a
4
glucose (Glc), uma molécula neutra, ou seja, sem carga líquida, que apresenta uma
massa molecular nominal de 180 Da. Os procedimentos de ionização para uma
molécula neutra como a Glc, envolvem a incorporação de adutores iônicos, sendo o
mais comum o cátion Na
+
. Neste processo, o adutor interage ou mesmo participa de
ligações coordenadas com o analito fornecendo a ele sua própria carga. Como
conseqüência deste processo de ionização a massa iônica da glucose passa de 180
Da para 203 Da, ou em termos mais apropriados, seu íon pseudo-molecular tem m/z
203 [M+Na]
+
, no qual z sendo igual a 1 (um) é possível pela subtração do adutor
conhecer a massa do composto original: m/z 203 – 23 (Na
+
) = 180 Da. É desta forma
que moléculas neutras podem ser analisadas por espectrometria de massas.
Em outros processos de ionização dependendo das características químicas
das moléculas a serem analisadas, pode se obter íons protonados, comuns em
moléculas contendo grupamentos R-NH
2
, ou então íons desprotonados, como no
caso de moléculas que apresentam grupamentos ácidos em suas estruturas. Nestes
dois casos os íons são chamados de íons quasi-moleculares (IUPAC, 2006).
A espectrometria de massas também é utilizada na determinação de razões
isotópicas. Tomemos como exemplo a análise de uma amostra de NaCl. Em solução
os íons Na
+
e Cl
-
estarão dissociados, e quando analisados em modo de detecção
de íons positivos, será obtido apenas um íon de m/z 23 referente ao Na
+
.
Entretanto, quando analisamos esta mesma solução em modo de detecção de íons
negativos veremos o aparecimento de dois íons, um de m/z 35 sendo este o íon
base (aquele aparece representando 100%) e outro de m/z 37, que deverá
representar cerca de 1/3 do íon base. Estes resultados devem-se à relação isotópica
apresentada pelos íons analisados. Átomos de sódio são mono-isotópicos, com uma
massa de 22,98977 m.u. (nominal de 23 m.u.). Já os íons cloreto apresentam dois
isótopos, um com massa de 34,9688527 m.u. (nominal de 35 m.u., com abundância
natural de cerca de 75%) e outro com massa de cerca de 36,9659026 m.u. (nominal
de 37 m.u., com abundância natural de cerca de 25%) (ASTON, 1920; 1921;
COPLEN et al., 2002; BUDZIKIEWICZ E GRIGSBY, 2005).
Moléculas orgânicas são formadas essencialmente por átomos de carbono e
hidrogênio, e ambos contêm dois isótopos principais, no caso do carbono temos o
isótopo leve
12
C (~99%) e o pesado
13
C (~1%), e para o hidrogênio temos o isótopo
leve
1
H (>99,9%) e o isótopo pesado
2
H (<0,1%). Apesar de aparecerem em baixas
concentrações naturais, moléculas contendo pelo menos 1 isótopo pesado podem
5
representar grande parte das moléculas naturais. Moléculas contendo diferentes
isótopos são designadas como isotopólogos.
1.3. INSTRUMENTAÇÃO
Um espectrômetro de massas é composto por 3 módulos principais: fonte de
íons, analisadores de massas e os detectores (Figura 1), que serão descritos a
seguir, contudo as bases físicas que envolvem a análise de íons, estão fora do
escopo deste trabalho.
Figura 1 – Representação esquemática de um espectrômetro de massas
Fontes de íons: parte do espectrômetro responsável pelo processo de ionização das
moléculas, ou seja, transformação de moléculas neutras em íons;
Analisadores de massas: parte do espectrômetro responsável pela separação dos íons de
acordo com seu m/z, realizado através de aplicações de campos elétricos e magnéticos;
Detectores: parte final de um espectrômetro de massas, responsável pela detecção e
amplificação dos íons.
1.4. FONTES DE IONIZAÇÃO
A ionização é o processo físico/químico de conversão de um átomo ou
molécula em um íon, adicionando ou removendo partículas carregadas como
elétrons ou outros íons. Este processo funciona de maneira diferente dependendo se
um íon positivo ou negativo está sendo produzido. Um íon de carga positiva é
produzido quando um elétron ligado a um átomo (ou molécula) absorve energia
suficiente para escapar da barreira elétrica que o limitava, desfazendo assim seu o
vínculo com o núcleo, sendo expelido para fora da eletrosfera. A quantidade de
energia necessária é chamada de potencial de ionização. Um íon negativamente
carregado é produzido quando um elétron livre choca com um átomo e é então
capturado, ficando no interior da barreira do potencial elétrico. Outras formas de
ionização serão descritas a seguir. Em alguns casos, um próton pode ser adicionado
FONTE DE ÍONS
ANALISADOR DE
MASSAS
DETECTOR
6
ou subtraído da molécula, rendendo os íons [M+H]
+
ou [M-H]
-
, respectivamente. Em
outros casos, os íons são formados através da interação com adutores, como metais
alcalinos (por exemplo, Li
+
, Na
+
, K
+
), formando íons positivos, ou então com anions
como Cl
-
, rendendo íons com cargas negativas (DASS, 2007; HOFFMANN e
STROOBANT, 2007).
Tendo em vista que os processos de ionização são fundamentais para a
espectrometria de massas, diversas fontes de ionização foram desenvolvidas ao
longo da sua história. Aqui serão descritos alguns dos principais métodos de
ionização utilizados, sendo que a ionização do tipo electrospray será abordada com
mais detalhes. As abreviações serão fornecidas com o nome em inglês, já que desta
forma elas são melhor conhecidas.
1.4.1. Ionização eletrônica (EI – Electron Ionization)
A ionização eletrônica, anteriormente chamada de ionização por impacto de
elétrons, é uma das técnicas mais amplamente utilizada nos processos de ionização
analítica, sendo muito empregada em sistemas acoplados com cromatografia
gasosa. Como pré-requisito básico, todos os analítos devem estar na sua forma de
vapor, e, portanto as amostras devem ser voláteis, o que acaba sendo uma limitação
da técnica (ELJARRAT e BARCELO, 2005, HOFFMANN e STROOBANT, 2007).
Na ionização por EI, um feixe de elétrons de 70 eV (1 eV = 1.60217733 ×
10
−19
J) é produzido por um filamento. Os elétrons são então acelerados por um
ânodo, e acabam interagindo e energizando as moléculas do analito na fase gasosa.
Como conseqüência desta energização, cerca de 20 eV são transferidos para as
moléculas. Como a energia de ionização típica de moléculas orgânicas é de 15 eV,
ocorre a ionização destas moléculas pela remoção de um elétron, produzindo um íon
com elétrons desemparelhados, portanto um íon radical. 70 eV são necessários para
que a energia dos elétrons apresentem comprimento de onda similar à energia das
ligações em moléculas orgânicas (~0,14 nm), assim a transferência de energia é
maximizada. Contudo, esta ionização gera íons com estado energético excedente
em 5-10 eV. Como as energias de ligação típicas em moléculas orgânicas esta entre
4-5 eV, este processo de ionização é seguido por sucessivas clivagens e rearranjos
moleculares (Figura. 2). Este processo de clivagem é conhecido como
fragmentação, e geralmente resulta em um espectro de massas contendo apenas
7
fragmentos iônicos, formados a partir da molécula original (KITSON et al.,1996;
ARDREY, 2003; ELJARRAT e BARCELO, 2005; HOFFMANN e STROOBANT,
2007; DASS, 2007). Novos avanços na tecnologia dos detectores têm permitido que
as fontes de EI possam ter sua energia regulável, o que tem permitido a obtenção de
íons moleculares através da redução da energia aplicada.
Figura 2 – Típico processo de ionização eletrônica a 70 eV: Formação do cátion radical,
seguida de fragmentação e rearranjos moleculares.
Fonte: ARDREY, 2003
1.4.2. Ionização química (CI – Chemical Ionization)
Umas das principais dificuldades das análises de massas através do uso da
EI é a alta produção de íons-fragmentos e seus rearranjos. Se por um lado estes
fragmentos são úteis para diferenciação de várias moléculas, principalmente
isóbaros, por outro lado a ausência de íon-molecular e as várias possibilidades de
rearranjos moleculares dificultam em muito o trabalho dos pesquisadores. Uma
forma encontrada para minimizar os efeitos da alta energia utilizada no EI, surgiu
com a ionização química, que consiste em produzir íons pela colisão dos analítos
com íons primários, provenientes de gases reagentes, previamente formados na
fonte (MUNSON e FIELD, 1966; HOFFMANN e STROOBANT, 2007).
Alguns destes gases reagentes mais comumente utilizados incluem: metano,
etano, amônia e isobutano. Os elétrons produzidos na fonte provocam a ionização
destes gases, produzindo seus respectivos íons radicais (Figura 3), os quais estarão
8
em maior quantidade do que o analito, assegurando assim que as moléculas a
serem analisadas sejam ionizadas. Os íons produzidos por este tipo de ionização
podem ser positivos, negativos e ainda é possível haver a formação íons com
adutores.
Figura 3 – Representação esquemática de alguns eventos durante a ionização química,
usando metano como gás reagente
Fonte: ARDREY, 2003
Dependendo das caracteríscas do analito, a ionização química também pode
produzir íons com cargas negativas (Figura 4).
Figura 4 – Representação esquemática da ionização química em modo negativo
Fonte: HOFFMANN e STROOBANT, 2007
1.4.3. Ionização por bombardeamento rápido de átomos (FAB – Fast Atom
Bombardment)
Desenvolvida no início dos anos 80 (BARBER, et al., 1981), é uma das
técnicas consideradas como de ionização suave, ou seja, a energia transferida para
9
as moléculas do analito é suficiente para causar sua ionização sem a geração
excessiva de fragmentos. Assim, diferente da EI, durante a ionização por FAB é
possível obter a molécula intacta na forma de íon. Outra diferença da EI para o FAB,
consiste no fato que em EI (assim como em CI), os analítos devem estar na forma
de vapor afim de que a ionização possa ocorrer. Já em FAB a ionização pode
ocorrer em moléculas polares, não voláteis e termicamente lábeis. FAB consiste em
uma técnica de ionização que utiliza uma matriz líquida e não volátil, na qual o
analito é dissolvido para que ocorra a transferência de energia. Matrizes comuns
incluem glicerol, tioglicerol, álcool 3-nitrobenzílico, dietanolamina e trietanolamina,
entre outras. A ionização acontece pela transferência de energia de átomos
acelerados para o analito, tipicamente pela emissão de um feixe de átomos de
argônio ou xenônio de alta energia (na ordem de 2-10 keV). No entanto a
transferência de energia pode ser obtida pela utilização de íons de alta energia,
como Cs
+
, e neste caso a técnica apesar conceitualmente ser igual ao FAB, recebe
o nome espectrometria de massas de íon líquido secundário (LSIMS – liquid
secondary ion mass spectrometry). Íons quasi-moleculares positivos [M+H]
+
ou
negativos [M-H]
-
, são geralmente obtidos por FAB ou LSIMS, embora o mecanismo
exato de ionização ainda seja considerado um mistério (SURMAN e VICKERMAN,
1981; TOMER, 1989; ARDREY, 2003; HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS,
2007).
1.4.4. Ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI – Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization)
Ionizações à laser foram introduzidas a partir da metade dos anos 80,
atendendo a mesma vertente das ionizações suaves, cujo principal objetivo era
obtenção de íons–moleculares (quasi-moleculares ou pseudo-moleculares). Dois
grupos se destacaram pelo desenvolvimento da técnica, na Alemanha, o grupo de F.
Hillenkamp e M. Karas, e no Japão o grupo encabeçado por Kiochi Tanaka. Os dois
grupos se destacaram em análises de proteínas e peptídeos, tendo conseguido
naquela época analisar proteínas entre 10 e 100 KDa (KARAS et al., 1987; KARAS e
HILLENKAMP, 1988; TANAKA et al., 1988).
10
Na ionização por MALDI, assim como no FAB, a amostra deve ser misturada
a uma matriz específica que auxiliará na sua ionização. Entretanto, agora a matriz
não é mais um líquido como em FAB, mas sim a amostra é misturada a uma matriz
que quando seca cristaliza-se juntamente com a analito. A transferência de energia
por MALDI ocorre através da irradiação pulsada de laser, a matriz energizada
converte a energia do laser em energia para a excitação do analito, promovendo sua
ionização (Figura 5). Esta forma de transferência de energia é eficiente na obtenção
de moléculas intactas, já que elas não sofrem incidência direta da excessiva energia
do laser, o que poderia causar sua decomposição. Este processo ocorre em uma
câmara sob vácuo e os íons então formados na fase gasosa são acelerados por
campos eletrostáticos em direção ao analisador (ARDREY, 2003; HOFFMANN e
STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Existe uma grande variedade de matrizes que podem ser utilizadas em
MALDI, constituídas principalmente de compostos aromáticos. As fontes de laser
também podem variar, no entanto a mais comum é a de N
2
, com comprimento de
onde de 337 nm. Os íons formados apresentam-se de modo geral protonados mono-
carregados em modo positivo, desprotonados em negativo. Contudo, não é incomum
de serem formados íons com duas ou mais cargas, ou com adutores como Na
+
ou
K
+
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Figura 5 – Ionização por fonte de MALDI
Fonte: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/images/maldi-mechanism.gif
11
1.4.5. Ionização por spray de elétrons (ESI – Electrospray Ionization)
ESI é uma das principais técnicas de ionização em pressão atmosférica (API
– atmospheric pressure ionization) e também uma das mais importantes na
determinação estrutural de diversas moléculas biológicas, consistindo em mais uma
das técnicas no conceito de ionização suave, permitindo a formação de íons a partir
de macromoléculas, superando sua propensão em fragmentar-se quando ionizadas.
Os primeiros relatos sobre a nebulização por electrospray datam de 1917,
descrito por Zaleny (NIESSEN, 2005), mas somente a partir de 1968 a técnica foi
utilizada para ionização de moléculas em aplicações de espectrometria de massas,
que surgiram com o grupo liderado por Malcom Dole, em seus estudos de
transferência de macromoléculas, na forma de íons, da fase líquida para fase
gasosa (DOLE et al., 1968; MACK et al., 1970; CLEGG e DOLE, 1971; TEER e
DOLE, 1975). Contudo, os grandes avanços da técnica foram obtidos a partir de
1983, com o grupo liderado por John B. Fenn, (YAMASHITA e FENN, 1984), que
mais tarde seria consagrado com o Prêmio Nobel em Química (2002) pelo
desenvolvimento do ESI-MS. Esta técnica permitiu análise de macromoléculas de
grande importância na química e biologia, assim como e em outras ciências (FENN
et al., 1989). O Prêmio também foi dado a Kiochi Tanaka, pelas suas contribuições
para o desenvolvimento do MALDI.
O processo de ionização por ESI ocorre quando um solvente volátil contendo
os analítos é bombeado através de um fino capilar de aço inoxidável. Uma alta
tensão é aplicada à ponta deste capilar, e como conseqüência deste forte campo
elétrico, a amostra que sai pelo capilar estará dispersa em um aerosol composto por
gotículas de solvente e analito altamente carregadas (YAMASHITA e FENN, 1984).
Este processo é auxiliado por um gás inerte (geralmente nitrogênio e chamado de
gás de nebulização) que é introduzido na fonte ESI, fluindo externamente ao capilar.
Este fluxo de gás está em temperaturas elevadas (150-200 ºC) e auxilia na
evaporação do excesso solvente e na formação do aerosol.
Embora os mecanismos que estão envolvidos nos processos de ionização por
ESI não tenham sido completamente elucidados, existem dois principais
mecanismos propostos. O modelo do resíduo carregado (CRM – charged-residue
model) e o modelo da dessorção de íons (IDM – íon-desorption model). Nestes dois
mecanismos, a ionização tem início pela formação do aerosol, produzido por um
12
processo que envolve a formação do cone de Taylor, a partir da ponta do capilar. O
cone de Taylor foi descrito por Geoffrey Ingram Taylor, em 1964, baseado nos
trabalhos de Zeleny. O cone começa a se formar quando as microgotas de um
solvente eletricamente condutivo são expostas a fortes campos elétricos, causando
uma deformação em sua superfície, que então surge como um cone com os lados
convexos e ponta arredondada. Conforme o campo elétrico aumenta excedendo a
tensão do solvente, o cone se inverte e um jato é lançado, formando um spray.
Neste momento ocorre a formação de minúsculas gotas de solvente contendo o
analito e repleto de cargas elétricas positivas ou negativas (de acordo com o modo
de análise). Como as microgotas de solvente sofrem ação de um fluxo de N
2
aquecido, elas passam a evaporar, tendo seu diâmetro reduzido rapidamente. Com
isso as cargas ali contidas passam a ter maior proximidade, e consequentemente
maior repulsão eletrostática. Quando esta repulsão atinge uma força maior do que a
tensão do solvente ocorre um colapso, que promove ruptura da microgota com
conseqüente formação de outras gotas de solvente e analito menores ainda (Figura
6). Esse processo é chamado de fissão Coulômbica porque ocorre por forças de
repulsão Coulômbicas (eletrostáticas). A partir deste ponto os dois mecanismos se
diferenciam. Segundo o CRM, as microgotas continuam a sofrer a evaporação e
fissão num processo contínuo até que tenha ocorrido a total dessolvatação das
moléculas, e assim ocorre a transferência das cargas que estavam contidas no
solvente para o analito, para formação de um íon isolado (Figura 6A). Já o modelo
IDM considera que com a evaporação, as gotículas de solvente chegam o
determinado raio em que a densidade elétrica na sua superfície é grande o
suficiente para expulsar os analítos diretamente para fora da gotícula, neste
momento ocorreria a transferência de carga entre o solvente e o analito (Figura 6B).
Existe ainda muita discussão quanto ao o mecanismo exato de transferência de
cargas entre o solvente e o analito, mas acredita-se que ambos os mecanismos
ocorram de acordo com o tipo de analito, ou seja, CRM ocorre em quando o analito
é composto por moléculas hidrofílicas, enquanto que o IDM se aplicaria melhor para
moléculas hidrofóbicas (YAMASHITA e FENN, 1984; FENN, et al., 1989; FENN, et
al., 1990; HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
13
Figura 6 – Modelo de ionização por electrospray: (A) modelo do resíduo carregado, e (B)
modelo de dessorção de íons.
Durante o processo de ionização, são comuns de serem formados íons
multicarregados (z > 1). Nestes casos, como o espectrômetro reconhece a relação
massa/carga (m/z), o resultado aparecerá com a massa do analito dividida pelo
número de cargas presentes na molécula. Entretanto é possível estimar a presença
de múltiplas cargas através da relação isotópica da amostra, ou seja, pela presença
natural de isótopos de
13
C ou
2
H (principais isótopos encontrados em biomoléculas),
entre outros. Tomemos como exemplo composto fictício de massa molecular de 199
Da, que apresentou um espectro de massa de m/z 200 [M+H]
+
. É de se esperar o
aparecimento de um íon de menor abundância de m/z 201 [M+H]
+
, decorrente da
presença de um isotopólogo com massa molecular de 200 Da. Agora imaginemos
que este composto permite ser duplamente carregado (z = 2), então teremos um
composto iônico de massa 201 Da, que aparecerá no espectrômetro como m/z
100,5 [M+2H]
2+
. Já o seu isotopólogo aparecerá com m/z 101 [M+2H]
2+
. A diferença
inicial dos isotopólogos mono-carregados era 1 Da, e como a massa dos íons
duplamente carregados foi dividida por dois, a diferença passou a ser de 0,5 Da
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007).
1.4.6. Ionização química a pressão atmosférica (APCI - Atmospheric Chemical
Pressure Ionization)
APCI é uma técnica de ionização similar à CI, entretanto como o próprio nome
sugere, ocorre em pressão atmosférica. Este tipo de ionização é geralmente
aplicado juntamente com fonte de electrospray, permitindo altas taxas de fluxo de
solvente, e, portanto pode ser utilizado em sistemas mistos de cromatografia líquida-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Capilar
Analito
Microgota
multicarregada
+
+
Formação
dos íons
Evaporação
Fissão
Repulsão
Coul
ô
mbica
+
+
+
+
Evaporação e
Fissão
IDM
CRM
A
B
+
+
+
+
+
Cone de
Taylor
Spray
+
+
+
F
onte
14
espectrometria de massas (LC-MS – liquid chromatography-mass spectrometry).
APCI é normalmente aplicada moléculas polares ou pouco polares, sendo que a
massa molecular não deve ser maior que 1500 Da (ARDREY, 2003, HOFFMANN e
STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
1.4.7. Ionização por dessorção de spray de elétrons (DESI – Desorption
Electrospray Ionization)
DESI é uma nova tecnologia de ionização baseada nos conceitos do ESI,
entretanto sua principal característica é que a amostra pode ser depositada em
alguma superfície, como teflon ou papel, ou ainda a ionização pode ser feita in-situ,
sem a necessidade de preparo das amostras. Este tipo de ionização conhecido
como ambient ionization, ou seja, a ionização pode ocorrer fora do espectrômetro,
foi desenvolvido por Robert Graham Cooks na Purdue University. Nele a superfície
onde a amostra esta depositada recebe um jato de spray, com solvente apropriado,
em alta velocidade, provocando a dessorção e ionização do analito e
consequentemente transferência dos íons para fase gasosa, pelos mesmos
princípios do ESI (Figura 7). Em recente trabalho, a equipe de Cooks demonstrou
um importante papel para análises forenses, recriando uma impressão digital através
do DESI, com o mapeamento da presença drogas (TAKÁTS et al., 2004; COOKS et
al., 2006; HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007; IFA et al., 2008).
Figura 7 – Fonte de ionização do tipo DESI
Fonte: COOKS et al, 2006
15
1.4.8. Outras fontes de íons
- Ionização de Campo (FI – Field Ionization) – O analito é submetido a um campo
elétrico muito forte para produzir íons através da remoção de um elétron. Porém,
assim como em EI e CI só pode ser aplicado em fase gasosa, contudo diferente de
EI produz essencialmente íons moleculares (HOFFMANN e STROOBANT, 2007;
DASS, 2007).
- Dessorção de Campo (FD – Field Desorption) – O ionização ocorre de forma
análoga ao FI, entretanto o analito não precisa ser volátil. Neste caso ele é
depositado em um filamento de tungstênio ou rênio, e então um potencial elétrico
produzido entre o filamento e um eletrodo. O aquecimento do filamento e o potencial
elétrico provocam a tranferência do analito para fase gasosa na forma de íon
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
- Dessorção por plasma (PD - Plasma Desorption) – a amostra é depositada em
uma folha de alumínio e é bombardeada por um feixe de plasma na ordem de MeV,
produzido pela fissão do Califórnio-252 (HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS,
2007).
- Thermospray – Este sistema é um dos principais antecessores do ESI, no qual o
solvente contendo o analito passa por um capilar de aço sob altas temperaturas, o
que promove o rápido aquecimento do solvente. Um spray é formado quando a
amostra passa por uma câmara sob vácuo e os íons formados são repelidos para o
analisador (HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
- Nanoelectrospray – Consiste de uma miniaturização da fonte ESI, no que diz
respeito a diâmetros de capilares e fluxo de solventes. Produz consequentemente
um spray com gotículas tipicamente menores que 200 nm, com menos energia do
que é necessário nas fontes ESI (HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
- PhotoSpray
TM
– A ionização ocorre em pressão atmosférica, e utiliza radiação UV
para ionizar um agente químico chamado de dopante, que irá ionizar os analítos por
transferência de protóns. Desenvolvido para intensificar a resposta à ionização de
compostos de baixa polaridade (Applied Biosystems)
- Análise direta em tempo real (DART – Direct Analysis in Real Time) –
semelhante ao DESI, contudo a ionização ocorre através de um feixe de He ou N,
excitados por energia eletrônica ou vibracional, causando a ionização das moléculas
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
16
1.5. ANALISADORES DE MASSAS
A fonte de ionização é a parte do espectrômetro de massas que produz os
íons a partir dos analítos, e realiza sua transferência para a fase gasosa (nos casos
onde a ionização não precisa ocorrer direto em amostra voláteis). Estes íons são
então levados para dentro do espectrômetro, sob um ambiente de vácuo, e então
conduzidos até o detector. A base da espectrometria de massas é a separação
destes íons por suas diferenças de m/z. Para atender esta necessidade, foram
desenvolvidas diferentes formas para controlar a trajetória desses íons através
espectrômetro, que são realizadas por campos elétricos e magnéticos, chamados de
analisadores de massas (na realidade são analisadores de íons, ou m/z), e são
quase tão diversificados quanto as fontes de íons.
1.5.1. Analisadores de Setor
Um analisador de massas de setor utiliza um campo elétrico estático, ou um
setor magnético (ou ainda a combinação dos dois) para afetar a trajetória e a
velocidade íons até sua chegada ao detector. Os íons são submetidos a uma
trajetória circular, e íons com maiores valores de m/z percorrem uma trajetória maior
enquanto que íons de menor valor de m/z percorrem uma trajetória menor, e assim
são separados (Figura 8). Como estes campos elétricos ou magnéticos alteram o
percurso dos íons durante sua passagem, eles podem ser utilizadas para selecionar
apenas íons desejados para que estes sejam posteriormente fragmentados
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Figura 8 – Analisador de setor magnético
Fonte: HERBERT e JOHNSTONE, 2003
17
1.5.2. Quadrupolares (Q – Quadrupole)
Analisadores quadrupolares utilizam campos elétricos oscilantes, gerados por
quatro barras metálicas (eletrodos), para estabilizar ou desestabilizar seletivamente
os íons, de acordo com seus valores de m/z, durante sua passagem pelo centro do
quadrupólo (Figura 9). O campo elétrico oscilante é gerado nos eletrodos pela
aplicação de potenciais de corrente-direta (DC – direct-current) e rádio-freqüência
(RF). Através de variações sistemáticas nos valores de DC e RF, a trajetória dos
íons é estabilizada ou desestabilizada, assim o quadrupolo funciona como um filtro.
Isso permite que os íons de diferentes valores de m/z cheguem com tempos
diferentes ao detector, e desta forma pode ser diferenciados. Este mesmo princípio
pode ser utilizado para estabilizar a trajetória de apenas um íon desejado, que pode
ser posteriormente fragmentado, como será visto posteriormente (HOFFMANN e
STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Figura 9 – Representação esquemática de um quadrupólo
Fonte: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html
1.5.3. Armadilha de íons (IT – Ion Trap, ou QIT – Quadrupole Ion Trap)
Analisador do tipo Paul trap, mais conhecidos como quadrupole ion trap ou
simplesmente ion trap, foi desenvolvido por Wolfgang Paul em 1960, o que lhe
rendeu o Prêmio Nobel de Física em 1989 (TODD, 1991; MARCH, 2005).
18
Os analisadores do tipo IT, operam por princípios físicos semelhantes aos do
quadrupolares. Contudo, neste caso os íons não mais descrevem uma trajetória
através do ambiente quadrupolar, e sim são aprisionados nele (por isso no nome
armadilha de íons). Outra diferença trata-se da arquitetura dos eletrôdos, que agora
são 3, sendo que o central tem um formato circular, e os dois das extremidades tem
geometria hiperbólica, para criar um campo elétrico quadrupolar em 3-D (Figura 10
A). Este campo elétrico mantém os íons em uma órbita estável em seu interior,
contudo os íons são ejetados para fora do analisador pela aplicação de uma rampa
crescente de RF, que consequentemente desestabiliza os íons ejetando-os em
direção ao detector, de forma crescente de acordo com seus valores de m/z
(MARCH, 2005; DASS, 2007).
Uma versão recente do IT 3-D é o analisador do tipo armadilha linear de íons
(LIT – linear ion trap), que opera pelos mesmos princípios do IT, contudo criando um
campo elétrico 2-D. Sua arquitetura, no entanto, é baseada no quadrupolo, ou seja,
apresenta quatro barras metálicas dispostas paralelamente (Figura 10 B), para criar
um ambiente quadrupolar em seu interior (HOFFMANN e STROOBANT, 2007).
Devido a sua capacidade única de manter os íons aprisionados em seu
interior, estes analisadores são capazes de proporcionar diversas ciclos
fragmentação, num processo chamado na espectrometria de massas de tandem-
MS
n
, onde n representa o número de fragmentações realizadas no analito.
Figura 10 – Representações esquemáticas dos analisadores do tipo ion trap
(A) 3D - ion trap (fonte: MARCH, 1997), e (B) ion trap linear (fonte: MARCH, 2005)
A
B
19
1.5.4. Tempo de Vôo (TOF – Time of flight)
Detectores de tempo de vôo são baseados no princípio de que os íons com
mesma carga têm energias cinéticas iguais, e sua velocidade será inversamente
proporcional à raiz quadrada da sua massa. Então se dois íons com mesma carga,
mas com massas diferentes, são acelerados através de um campo elétrico com
potencial constante, suas velocidades serão dependentes de suas massas, e eles
atingirão o detector com “tempos de vôo” diferentes. Assim, o íon de menor valor de
m/z (menor massa neste caso) atingirá o detector primeiro, enquanto que o de maior
massa levará mais tempo para chegar ao detector (HOFFMANN e STROOBANT,
2007; DASS, 2007).
O funcionamento deste tipo de analisador é fundamentalmente diferente dos
demais já descritos. Para o funcionamento do TOF, é imprescindível que todos os
íons formados na fonte (incluindo os com diferentes massas), entrem no analisador
ao mesmo tempo, pois só assim será possível determinar o tempo que cada íon
levou para percorrer toda a extensão do analisador. Para aumentar a distância
percorrida pelos ions, refletores são posicionados nos analisadores, o que permite
aumentar a precisão do analisador (Figura 11).
Figura 11 – Representação esquemática do analisador TOF
Fonte: ARDREY, 2003
20
1.5.5. Analisadores com Transformada de Fourier (FT- Fourier-transform)
Duas principais configurações utilizam a Transformada de Fourier para
converter os sinais de onda prescritos pela órbita dos íons em sinais referentes ao
espectro de massas (m/z): o analisador do tipo Orbitrap
TM
e o analisador de
ressonância de íon ciclotron (ICR – ion cyclotron resonance).
O conceito do ICR foi descrito por Lawrence e Edlefsen em 1930, sendo mais
tarde aplicado à espectrometria de massas (SOMMER et al., 1949). Contudo,
apenas em 1974 foi desenvolvida a tecnologia de FT-ICR (COMISAROW e
MARSHALL, 1974a). O conceito do ICR é similar, em alguns pontos, ao do
tradicional trap, que aqui recebe o nome de penning trap, operando por fortes
campos magnéticos e elétricos estáticos, a fim de aprisionar os íons. Estes íons ali
aprisionados são excitados por pulsos de RF para que descrevam órbitas coerentes,
e com detectores são medidos os sinais elétricos dos íons que passam próximos a
eles ao longo de um período, produzindo um sinal periódico. Como a freqüência de
um íon em sua órbita é determinada pelo seu m/z, os sinais detectados são
posteriormente deconvoluídos pela aplicação da FT, de forma semelhante de como
ocorre na espectroscopia de ressonância magnética nuclear (COMISAROW e
MARSHALL, 1974a,b; 1975 e 1996; WANCZEK, 1984). O analisador do tipo
Orbitrap
TM
opera de maneira muito similar ao ICR, contudo os íons são aprisionados
no interior do trap apenas por um campo elétrico, e passam orbitar ao redor de um
eletrodo central com oscilações harmônicas, das quais são obtidas as freqüências
em então deconvoluidas pela FT (HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
1.5.6. Analisadores de mobilidade de íons (IM – Ion Mobility)
Outra tecnologia recente que incluiu uma nova dimensão nas análises por
espectrometria de massas. Os analisadores de mobilidade iônica fazem parte de
espectrômetros híbridos, os quais combinam tecnologias tradicionais, com
analisadores capazes de diferenciar moléculas de mesma razão massa/carga,
porém com conformações diferentes. Um exemplo fácil para o entendimento pode
ser dado para análise de uma proteína, porém parte em seu estado nativo e parte
desnaturada, mas sem degradação da estrutura primária. Estas proteínas terão
21
conformações diferentes, mas ambas apresentam mesma massa e portanto o
mesmo valor de m/z quando analisadas por um simples analisador de massas.
Quando analisadas por IM um gráfico bi-dimensional será obtido, em um dos eixos
será fornecido o m/z (que será o mesmo), e no outro eixo serão obtidos dois sinais,
referentes a diferenças na mobilidade das duas proteínas através do analisador.
Outro exemplo prático desta tecnologia aplicado à análise de carboidratos pode ser
dado pela separação de monossacarídeos na forma de metil-glicosídeos. A forma de
metil-glicosídeos é importante para permitir a manutenção da configuração
anomérica, e com isso foi conseguido obter a separação dos isômeros α e β metil-
glicosídeos, bem como a separação de seus epímeros, como por exemplo, metil-
galactosídeo de metil-glucosídeo (DWIVEDI et al., 2007). Isômeros de
oligossacarídeos também podem ser diferenciados por esta técnica, sendo que a
separação pode ser alcançada devido a diferenças conformacionais que as ligações
α e β causam nas moléculas (LEE et al., 1997, CLOWERS et al., 2005).
A base para este tipo de separação reside para presença de uma câmara
específica chamada de drift chamber (câmara de deslizamento) a qual é preenchida
por um tipo de gás (argônio, por exemplo) oferecendo certa resistência para o
deslocamento dos íons no seu interior. Lá os íons são submetidos a um campo
elétrico uniforme, que conduz os íons através do câmara. A separação dos íons é
então obtida pelos efeitos combinados do campo elétrico impulsionando os íons em
direção ao detector, e do gás presente na câmara que tende a retardar os íons.
Desta forma, moléculas com conformações mais volumosas tendem percorrer a
câmara mais lentamente, quando comparadas com moléculas de mesma massa,
porém mais compactadas (CLEMMER et al., 1997; WU et al., 1998).
1.6. DETECTORES
Os detectores compreendem a porção final dos espectrômetros de massas,
sua função é detectar os íons que chegam até eles e amplificar o sinal. Os
detectores funcionam pela conversão dos feixes de íons em sinais elétricos, que
podem ser armazenados e traduzidos em imagens.
22
A
B
1.6.1. Faraday cup
Detecta os íons através da medição direta das cargas através de um eletrodo
de condutância. Embora robustos estes detectores não são utilizados em
espectrômetros que operam em modo varredura devido sua baixa sensibilidade e
baixo tempo de resposta (HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
1.6.2. Multiplicadores de elétrons (EM – Electron Multiplier)
Estão entre os detectores mais utilizados nos espectrômetros atuais.
Funcionam pela emissão de elétrons secundários produzidos por dynodes quando
os íons provenientes dos analisadores chocam-se a eles. Existem dois tipos de
multiplicadores de elétrons: discrete-dynode, constituído por 16 a 20 dynodes,
geralmente constituídos de cobre e berílio (Figura 12 A) e o continuous-dynode, no
qual a superfície atua como um eletrodo contínuo (Figura 12 B). Em ambos os
detectores os íons, provenientes do analisador, chocam-se com a superfície interna
do dynode, e são refletidos, num processo que se repete varias vezes. Em cada um
destes choques, cada íon emitido remove elétrons da superfície interna do detector,
e como o processo se repete (chamado de efeito cascata), ao final cada íon
incidente pode ser amplificado na ordem de 10
6
a 10
8
(HOFFMANN e STROOBANT,
2007; DASS, 2007).
Figura 12 – representação de multiplicadores de elétrons
(A) discrete dynode, e (B) continous-dynode. Fonte: DASS 2007
23
1.6.3. Multiplicadores de fótons
Seu funcionamento é similar ao multiplicador de elétrons, porém o feixe de
íons quando atingem o detector é convertido em fótons e então amplificado. Sua
construção também é semelhante ao EM, mas no lugar do dynode existe um
fotocatodo, recoberto por um material emissor de fótons (HOFFMANN e
STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
1.7. ESPECTROMETRIA DE MASSA DO TIPO TANDEM-MS
Tandem-MS pode ser entendido como espectrometria de massas de modo
seqüencial, ou seja, uma sequência de análise que envolve pelos menos três
estágios. O primeiro estágio é a seleção de um íon precursor (assim chamado
porque dele serão formados outros íons). O segundo estágio consiste na ruptura
deste íon precursor para gerar íons-fragmentos (antigamente chamados de íons
filhos numa adaptação do inglês daughter íons). O terceiro estágio compreende a
análise e detecção destes fragmentos formados pelos métodos já descritos
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Para realização de análises do tipo tandem-MS, também chamadas de
MS/MS ou MS
n
, é necessário equipamentos apropriados que permitam a seleção
específica de cada íon desejado. As configurações mais comuns são os triplo-
quadrupólos (Q-Q-Q) (Figura 13 A), quadrupólo-TOF, TOF/TOF, que são
equipamentos que apresentam três componentes em seqüência, sendo dois
analisadores separados por uma câmara de fragmentação. Nestes casos o íon
precursor é selecionado no primeiro analisador (chamado de MS
1
) e então somente
ele passa pelo segundo quadrupólo, que é uma câmara adaptada para realizar a
fragmentação do íon precursor, chamado de câmara de colisão. Neste caso, o modo
mais comum de se obter fragmentos é através da dissociação induzida por colisão
(CID – collision induced dissociation, também conhecida como CAD – collisionally
activated dissociation – dissociação ativada por colisão). Neste processo, a câmara
de colisão é preenchida com um gás inerte, como argônio (hélio e xenônio também
podem ser utilizados dependendo do tipo de espectrômetro), e então os íons são
acelerados pela aplicação de altos campos elétricos. Duas etapas são importantes
24
neste processo, a ativação por colisão, onde a energia translacional resultante é
convertida em energia interna, tornando as moléculas energeticamente excitadas, e
a dissociação uni-molecular, processo pelo qual as moléculas excitadas sofrem a
dissociação. Os fragmentos formados serão analisados pelo terceiro quadrupólo
(segundo analisador - MS
2
) antes de chegar até o detector (Figura 13 B)
(HOFFMANN e STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
Devido à sua arquitetura, estes espectrômetros são capazes realizar apenas
um ciclo de fragmentação, exceto quando a fragmentação já ocorre na fonte e é
chamada de in-source fragmentation. Contudo estes espectrômetros podem ser
construídos de forma contínua, para formar por exemplo os penta-quadrupólo, o qual
com duas câmaras de colisão permitem dois ciclos de fragmentação (existem
poucos penta-quadrupólos no mundo, um deles esta na Unicamp). Contudo, existem
outras plataformas que permitem vários ciclos de fragmentação, permitindo
realização de MS
n
, no qual n representa “infinitos” ciclos de fragmentação. Estes
espectrômetros são construídos com a tecnologia dos traps, os quais são capazes
de aprisionar seletivamente os íons por vários ciclos (MARCH, 2005).
Figura 13 – Modelo de triplo quadrupólo preparado para tandem-MS
(A) Triplo quadrupólo, fonte: Manual de operações da Waters, (B) esquema de seleção do íon
precursor e sua fragmentação
Analisador 1
Analisador 2
Câmara de
colisão
energizada
Analisador 1
Analisador 2
Câmara de
colisão
Capilar
Cones
Detector
MS
1
MS
2
Fragmentação
Capilar
Spray
Detector
A
B
25
Durante os processos de fragmentação são comuns de serem obtidos
fragmentos primários, aqueles produzidos por simples quebras das ligações
covalentes. Contudo, outros fragmentos podem ser mais difíceis de serem
interpretados, são os chamados de fragmentos secundários, produtos de rearranjos
moleculares ocorridos durante o processo de fragmentação. Um dos rearranjos mais
conhecidos é chamado de McLafferty, em homenagem a Fred W. Mclafferty quem o
descreveu. Este tipo de rearranjo ocorre quando uma molécula contendo um grupo
carbonílico (como um ácido graxo metil éster) passa por uma clivagem do tipo β, que
leva a formação de um íon radicalar (Figura 14) (McLAFFERTY, 1959; IUPAC,
2006).
Figura 14 – Rearranjo McLafferty
Típica formação do íon de m/z 74 a partir de ácidos graxos metil éster
1.8. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ACOPLADOS A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
“Cromatografia é um método de separação física na qual os componentes que serão
separados são distribuídos entre duas fases, uma das quais é estacionária (fase
estacionária), enquanto a outra (fase móvel) se move em uma direção definida” (IUPAC,
2006).
As amostras a serem analisadas podem ser inseridas diretamente na fonte
ionização num processo chamado de análise off-line, ou então podem passar algum
tipo separação cromatográfica a caminho da fonte de ionização, neste caso a
análise é conhecida como on-line. Análises on-line são geralmente obtidas através
do acoplamento de um sistema de cromatografia gasosa (GC) ou líquida (LC) a um
C
H
2
O
O
H
+
C
H
3
H
O
O
C
H
3
R
C
H
2
R
m/z 74
+
26
determinado tipo de espectrômetro de massas, mais recentemente sistemas de
eletroforese capilar (CE) também têm sido acoplados ao espectrômetro de massas.
1.8.1. Cromatografia em fase gasosa
A cromatografia gasosa ou líquido/gasosa foi introduzida em 1952 por James
e Martin (JAMES, 1952; JAMES e MARTIN, 1952a,b). Sua operação básica é a
volatilização e a transferência dos analítos para uma coluna cromatográfica, através
de uma interface aquecida chamada de injetor. A coluna cromatográfica também é
aquecida de forma controlada podendo criar rampas com temperaturas desejadas, e
para movimentar a amostra dentro da coluna usa-se um gás inerte, como hélio ou
nitrogênio, que é chamado de gás de arraste, o qual faz o papel da fase móvel
(KITSON et al., 1996). A aplicação desta técnica é ampla, contudo sua principal
limitação deve-se ao fato de que os analítos devem ser voláteis e estáveis nas
condições de análise.
A identificação dos compostos utilizando apenas o sistema de cromatografia
pelo seu tempo de eluição através da coluna era bastante difícil. A identificação
muitas vezes tinha que ser feita posteriormente, através da coleta do analito,
geralmente feita borbulhando o efluente da coluna em solvente ou então em
condensadores apropriados (chamados de cold trap), para só então realizar a
identificação por infravermelho ou por espectrometria de massas. Contudo não
demorou muito para que as técnicas de cromatografia gasosa e de espectrometria
de massas fossem acopladas, dando origem ao GC-MS. Um dos primeiros relatos
(senão o primeiro) sobre esta interface entre o GC e o MS é de Gohlke (1959). Hoje
em dia a técnica GC-MS é muito difundida, sendo que várias configurações podem
ser encontradas. Uma das mais comuns é o GC-MS utilizando ionização eletrônica
com detector do tipo ion trap.
1.8.2. Cromatografia líquida de alta eficiência
Diferente da cromatografia gasosa, onde tanto o analito quanto a fase móvel
são gases, na cromatografia líquida a amostra é introduzida na coluna de separação
dissolvida em um líquido (solvente). Nos sistemas modernos, uma bomba impulsiona
27
o solvente, e consequentemente o analito, através da coluna de separação até sua
chegada ao detector. As bombas e as colunas devem estar preparadas para
suportar grandes pressões (até 4 x 10
7
Pa, nos sitemas convencionais, ou maiores,
como nos sistemas de fast-HPLC ou UPLC – ultra performance liquid
chromatography – que suportam cerca de 2 a 3 vezes mais pressão). O fluxo pode
ser controlado através da bomba, que permite também a realização de sistemas de
gradientes de solventes, no qual é possível utilizar vários solventes e controlar seu
fluxo individualmente, permitindo alterar suas concentrações durante uma corrida. A
fase móvel é de modo geral composta por misturas de solventes orgânicos, ou
solventes orgânicos e água. As técnicas on-line de LC-MS permitem a transferência
de uma parte do efluente da coluna para fonte de ionização, que tipicamente é do
tipo electrospray (ARDREY, 2003).
O uso de um determinado tipo de coluna em um processo de fracionamento
muitas vezes não é suficiente para assegurar a completa separação de compostos
em misturas complexas. Recentemente, metodologias multi-dimensionais têm sido
desenvolvidas em cromatografia líquida, como por exemplo LC bidimensional (2D-
LC), a qual tem sido empregada de forma eficiente na separação e identificação de
uma ampla variedade de compostos. 2D-LC consiste de duas separações
cromatográficas distintas, na qual todo o efluente proveniente da primeira dimensão
(primeira coluna, por exemplo) é transferido para a segunda dimensão em várias
pequenas frações, esta técnica é conhecida como abrangente (comprehensive 2D-
LC). Outra técnica, conhecida como heart-cutting 2D-LC, implica na transferência
apenas da porção que é considerada de interesse do efluente da primeira dimensão
para a segunda dimensão (STOLL et al., 2007). Técnicas bi-dimensionais mais
comuns consistem de troca iônica x fase reversa, e exclusão estérica x fase reversa.
Ambas as técnicas podem ser acompanhadas por detecção de massas, sendo então
consideradas como análises multi-dimensionais.
1.9. APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS DETERMINAÇÃO
ESTRUTURAL DE BIOMOLÉCULAS
A espectrometria de massas tem se tornado cada vez mais indispensável na
caracterização estrutural de biomoléculas. Devido à sua alta sensibilidade e rápida
análise, ela é a técnica de primeira escolha nos processos analíticos. Suas
28
aplicações são ilimitadas, podendo ser utilizadas na caracterização de proteínas e
peptídeos, carboidratos como oligossacarídeos e glicoconjugados, lipídeos, produtos
do metabolismo secundário, entre outras aplicações. Neste trabalho serão
apresentadas aplicações da espectrometria de massas na análise estrutural de
oligossacarídeos, lipídeos – incluindo fosfolipídeos e glicolipídeos, flavonóides –
incluindo taninos e glicosídeos.
1.10. OLIGOSSACARÍDEOS
Oligossacarídeos são moléculas formadas pela ligação de dois ou mais
monossacarídeos, através de ligações conhecidas como glicosídicas, ocorrendo
entre a hidroxila ligada ao carbono anomérico (carbonos 1 ou 2 dependendo do tipo
de monossacarídeo) de uma unidade e qualquer outra hidroxila livre da outra
unidade, com conseqüente perda de uma unidade de água (STANEK et al., 1965;
PAOLETTI & JOHNSON, 1995). Estruturas com mais de 10 unidades
monossacarídicas são chamadas de polissacarídeos, embora de forma geral
polissacarídeos sejam formados por centenas de monossacarídeos.
Os oligossacarídeos são classificados de acordo com a sua origem, em
oligossacarídeos primários e secundários. Oligossacarídeos primários são aqueles
sintetizados in vivo a partir de mono ou oligossacarídeos, pela ação de uma
glicosiltranferase. Já oligossacarídeos secundários são aqueles originários por
algum tipo de hidrólise ácida ou enzimática, quer in vivo ou in vitro, sendo originados
de oligossacarídeos maiores, polissacarídeos, glicoproteínas e glicolipídeos, ou
outros glicoconjugados, (KANDLER e HOPF, 1980).
A determinação da estrutura química completa de oligossacarídeos é mais
difícil do que para proteínas ou oligonucleotídeos porque envolve a determinação de
outras características peculiares aos carboidratos, principalmente pela sua extensiva
capacidade de formar isômeros. Por exemplo, um simples monossacarídeo
composto por 6 átomos de carbono pode apresentar 4 centros quirais, gerando 2
4
=
16 combinações isoméricas diferentes. Além disso, carboidratos apresentam um
tendência a ciclização, e com isso ganha-se um centro quiral extra no carbono
anomérico que pode estar na configuração α ou β. Contudo, ainda a ciclização pode
ocorrer entre o carbono 1 e os carbonos 4 ou 5, formando anéis com configuração
furanosídica ou piranosídica, respectivamente. Desta forma são teóricamente
29
possíveis até 64 isômeros para um monossacarídeo do tipo aldohexose (como a
glucose), composto por 6 átomos de carbono (SOLOMONS e FRYHLE, 2000).
Entretanto, os monossacarídeos ainda podem variar na sua composição de
carbonos, tipicamente de 3 a 6 átomos, mas monossacarídeos com 7 carbonos
também são encontrados. Eles ainda podem ter origem de polihidroxialdeídos ou
polihidroxicetonas, o que permite um aumento considerável no número de
monossacarídeos diferentes (Figura 15).
Figura 15 - Configurações possíveis para D-glucose e D-frutose
Somando-se a tudo isso, os oligossacarídeos ainda podem estar ligados a
diferentes posições de suas unidade adjacentes, ou seja, uma hexose
(monossacarídeos de 6 átomos de carbono) na configuração piranosídica permite
ligações nos carbonos 1, 2, 3, 4 e 6, e na configuração furanosídica o carbono 4 está
indisponível, contudo liberando o carbono 5. Com isso, diversos tipos de
oligossacarídeos podem ser formados apenas com dois tipos de monossacarídeos.
Oligossacarídeos são moléculas conhecidas por participarem de processos
de reconhecimento célula-célula, célula-hospedeiro e ainda podem estar vinculados
diversas doenças. Eles podem estar na sua forma livre, ou ainda conjugados com
diversas outras estruturas, como lipídeos e proteínas, formando estruturas
complexas chamadas de glicoconjugados. Assim eles podem exercer a sua
O
H
O
H
O
H
O
H
H
H
O
H
H
O
H
O
O
H
H
H
H
O
H
O
H
H
O
H
H
O
H
O
H
H
H
H
O
H
O
H
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
H
O
H
H
O
H
H
O
H
O
H
O
H
O
H
H
O
H
H
O
H
H
O
H
O
H
D
-
glucose
α
-D-Glcp
β
-D-Glcp
α
-D-Glcf
β
-D-Glcf
O
H
O
H
H
H
O
H
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
H
H
O
H
H
O
H
H
H
O
H
O
O
H
H
H
O
H
H
O
H
H
O
H
H
O
H
O
O
H
H
O
H
O
H
H
H
O
H
O
H
O
O
H
H
O
H
O
H
H
H
O
H
O
H
D-frutose
α
-D-Frup
β
-D-Frup
α
-D-Fruf
β
-D-Fruf
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
estereocentros
30
influência no organismo através de interações seletivas, por exemplo, com proteínas
celulares de superfície. Carboidratos apresentam reconhecida capacidade
imunogênica e também estão envolvidos na diferenciação dos grupos sanguíneos
(KARLSSON et al., 2004).
Devido ao alto grau de complexidade e também de sua grande importância, a
caracterização da estrutura química de oligossacarídeos é um campo altamente
significativo de estudo. Os principais métodos utilizados são degradações químicas
ou enzimáticas seguidas da análise dos monossacarídeos constituintes através de
métodos cromatográficos, como cromatografia gasosa e/ou líquida. Embora um
pouco mais complexa, já que necessita que os monossacarídeos sejam
derivatizados para ser tornarem voláteis, a cromatografia gasosa detém a
preferência nas análises devido a sua alta eficiência de separação. Com o
acoplamento da espectrometria de massas à estes métodos cromatográficos, este
tipo de análise tornou-se muito mais confiável, e com o desenvolvimento de
derivatizações químicas específicas para identificação das ligações glicosídicas,
estas metodologias tornaram-se indispensáveis para química de carboidratos.
Contudo, a análise de oligossacarídeos intactos por espectrometria de
massas ainda é uma tarefa difícil, já que os tipos de ligações e os isômeros nem
sempre são distinguíveis por MS. Porém o desenvolvimento destas análises é
indispensável, pois fornecem informações importantíssimas sobre o tamanho do
oligossacarídeo e através de tandem-MS ainda fornecem a seqüência das unidades
monossacarídicas, principalmente quando se trata de glicoconjugados.
1.11. LIPÍDEOS
Os lipídeos constituem um grupo de compostos que, apesar de quimicamente
variáveis, exibem características comuns, como a de apresentarem cadeias
hidrofóbicas. De acordo com sua grande variabilidade estrutural (Figura 16), suas
funções biológicas também são igualmente diversas. Em muitos organismos, óleos e
gorduras são as principais formas de armazenar energia, enquanto os fosfolipídeos
e os esteróis constituem perto de metade da massa das membranas biológicas.
Alguns lipídeos estão, ainda, envolvidos com vários fenômenos celulares, como:
receptores para toxinas, interações célula-célula ou célula-parasita, pigmentos que
absorvem radiações luminosas, âncoras hidrofóbicas, podendo atuar também como
31
mensageiros intracelulares (KOCHETKOV & SMIRNOVA, 1986; HAKOMORI, 1990;
MUNNIK, 1998; 2001; GRIFFITTS et al., 2005).
Lipídeos são importantes componentes das membranas biológicas, sendo
que muitas funções das membranas são afetadas por alterações na composição
lipídica. O metabolismo de lipídeos é conhecido por ser fortemente afetado por
estresses ambientais, como estresses hídricos e contaminações por metais pesados
os quais resultam em alterações na composição de ácidos graxos, reduzindo o
conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados, como também afetando a biossíntese de
glicolipídeos (MATSON et al., 1972; JONES et al., 1987; HARWOOD, 1994).
Figura 16 – Estruturas de alguns tipos lipídeos e substintuintes
O
C
H
3
O
H
N
H
C
H
3
O
P
O
O
O
-
N
+
C
H
3
C
H
3
C
H
3
Esfingomielina
O
O
O
C
H
3
C
H
3
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
Monogalactosildiacilglicerol
R = H - Arquetidil fosfato
C
H
3
O
C
H
3
O
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
R
R = Glicerol - Arquetidil fosfoglicerol
R = Glicerosulfato - Arquetidil fosfatoglicerosulfato
Glicoesfingolipídeos do sistema sanguíneo ABO
:
R = H – tipo O
R = αGal-N-Ac – tipo A
R = αGal – tipo B
O
O
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
C
H
3
O
H
R
O
N
H
O
H
O
O
H
O
O
O
H
O
H
C
H
3
O
O
H
N
H
O
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
C
H
3
O
O
O
C
H
3
C
H
3
O
O
O
Triacilglicerol
C
H
3
32
1.11.1. Fosfolipídeos
Grande parte dos lipídeos presentes nas membranas apresenta em comum
em sua estrutura grupamentos fosfatos, estes lipídeos são anfipáticos, a orientação
das suas regiões hidrofóbicas e hidrofílicas dirige a sua posição nas bicamadas da
membrana. Os três tipos gerais de lipídeos de membrana são: glicerofosfolipídeos,
nos quais as regiões hidrofóbicas são compostas por ácidos graxos ligados ao
glicerol; os esfingolipídeos, no qual o único ácido graxo está unido a uma amina, a
esfingosina; e os esteróis, compostos caracterizados por um sistema rígido de
quatro anéis hidrocarbônicos fundidos. Os glicerofosfolipídeos e os esfingolipídeos
contêm álcoois polares como glicerol, inositol, etc, ou grupos carregados nas suas
extremidades, como grupos fosfato, colina, serina, etc. Dentro dessas três classes
de lipídeos de membrana aparece uma enorme diversidade de componentes como
resultado das variadas combinações de ácidos graxos e substâncias polares.
Uma classe distinta de lipídeos é encontrada em arqueas, particularmente
interessante por apresentarem características diferentes de lipídeos de outros
organismos, devido à presença de grandes quantidades de éteres-lipídeos (Figura
16). Estes éteres-lipídeos conferem alta resistência a membrana das arqueas,
necessários para suportar o alto stress dos ambientes onde são encontradas. Uma
estrutura comum, designada como arqueol, é composta de duas cadeias de 20
carbonos ligadas ao glicerol através de ligações do tipo éter. No entanto, arqueias
também podem conter lipídeos com cadeias mais curtas (C-15), mais longas (C-25)
ligadas ao glicerol (MANCUSO et al., 1985; MATSUBARA et al., 1994), ou ainda
uma cadeia carbônica maior, de 40 átomos de carbonos, ligados através de quatro
ligações éter a 2 unidades de glicerol (MACALADY et al., 2004; FAHY et al., 2005).
Cadeias carbônicas insaturadas são relatadas em arqueas (STIEHL et al., 2005;
GIBSON et al., 2005).
A natureza dos diferentes componentes de membrana pode mudar como
resposta a mudanças fisiológicas e ambientais (SAJBIDOR, 1997). Como são
sensíveis a alterações ambientais estes lipídeos tornam-se importantes
sinalizadores celulares. Em resposta a altas concentrações de sais (150 – 500 mM),
foi verificado em Chlamydomonas moewusii grande acúmulo de ácido fosfatídico
(PA) e diacilglicerol pirofosfato (DGPP) de forma dose e tempo dependente
(MUNNIK et al., 2000). Ácido fosfatídico pode ser produzido indiretamente via
33
fosfolipase C (PLC) e diacilglicerol quinase (DAG quinase), ou diretamente via
fosfolipase D (PLD), que é capaz de hidrolisar fosfolipídeos como fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina (MUNNIK et al., 1988). O acúmulo de PA e DGPP induzidos
pelo aumento na concentração de sais é um forte indício que estas moléculas são
mensageiros celulares, ativados em situações de estresse hídrico.
1.11.2. Glicolipídeos
Como o próprio nome sugere, glicolipídeos são formados pela associação de
lipídeos com carboidratos. Diferentes tipos de lipídeos e diferentes tipos de
carboidratos podem fazer parte destas estruturas, podendo ser glicoglicerolipídeos,
quando o carboidrato e os ácidos graxos estão unidos por uma unidade de glicerol,
ou então glicoesfingolipídeos, quando o glicerol e substituído pela esfingosina.
Glicolipídeos têm sido encontrados em todos os organismos vivos, estando presente
em procariotos, eucariotos, invertebrados e vertebrados (KOCHETKOV e
SMIRNOVA, 1986; CHAPMAN e BARBER, 1987).
Assim como os fosfolipídeos, os glicolipídeos estão localizados nas
membranas biológicas. Assim, através de interações intermoleculares, como pontes
de hidrogênio e interações hidrofóbicas, adotam conformações espaciais específicas
possibilitando vários fenômenos relacionados com a superfície celular; como
receptores para toxinas virais e bacterianas, interações célula-célula, moduladores
bioquímicos, podendo atuar, também no controle de interações biomoleculares
(KOCHETKOV e SMIRNOVA, 1986; HAKOMORI, 1990; NYHOLM e PASCHER,
1993; IZARD et al.,1994).
Os glicolipídeos mais abundantes encontrados em algas e vegetais são os
galactolipídeos e sulfolípídeos. Em termos estruturais os galactolipídeos podem
conter uma, duas ou três unidades de galactose ligadas ao glicerol (SASSAKI et al.,
1999; 2001a), enquanto no caso do sulfolipídeo o açúcar encontrado é chamado de
quinovose, uma desoxihexose com configuração de hidroxilas semelhante a da
glucose, e, portanto também é chamada de 6-desoxiglucose. Nestes glicolipídeos a
unidade de quinovose apresenta um grupo sulfonil (ou seja, com o átomo de enxofre
ligado diretamente ao carbono) na posição C-6. Estes lipídeos tem sido descritos em
diversos organismos, mas principalmente algas e plantas superiores (BENSON,
1963; BRUSH e PERCIVAL, 1972; KATAOKA e MISAKI, 1983; CHAPMAN e
34
BARBER, 1987; SASSAKI et al., 2001b). O sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG)
parece estar envolvido com proteínas de membranas com a função de manter a
atividade catalítica das mesmas (ANDERSON, 1975; GOUNARIS e BARBER, 1985).
Esta associação ocorre, provavelmente, devido à carga negativa do grupo sulfonato
do glicolipídeo com as cargas positivas das proteínas. Uma importante atividade
atribuída ao SQDG (e para o MGDG também) parece estar relacionada com a
inibição da enzima transcriptase reversa, com consequente efeito contra o vírus HIV
(GUSTAFSON et al., 1989; RESHEF et al., 1997). Atividades relacionadas com a
proteção contra alguns tipos de câncer também são relatadas para o MGDG e
SQDG (MAEDA et al., 2009)
Alguns glicolipídeos apresentam importantes aplicações biotecnológicas,
como os ramnolipídeos encontrados em Pseudomonas aeruginosa, que apresentam
grande potencial surfactante. Estes glicolipídeos são compostos por uma ou duas
unidades de ramnose, à qual estão ligados dois β-hidroxi-ácidos graxos, tipicamente
de cadeias médias, de 8 a 12 átomos de carbono. Insaturações também podem ser
encontradas nos ácidos graxos (MONTEIRO et al., 2007). Outra classe de lipídeos
que também despertam o interesse por suas propriedades surfactantes não se
tratam de glicolipídeos, mas sim lipopeptídeos, como a surfactina, encontrados
geralmente em bactérias do gênero Bacillus (BARROS et al., 2007).
1.12. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
São considerados produtos do metabolismo secundário aqueles produtos que
não são fundamentais para sobrevivência de um organismo. De modo geral aqueles
compostos que não são lipídeos, carboidratos, proteínas e ácidos nucléicos.
1.12.1. Flavonóides
Os flavonóides constituem um dos mais característicos grupos de metabólitos
presentes em plantas superiores, apresentando uma cadeia carbônica constituída
por 15 átomos de carbono distribuídos em 3 anéis, em uma configuração 6:3:6. Os 3
anéis são denominados de A, B e C, sendo que os anéis A e C encontram-se
fusionados. Assim os vários subgrupos de flavonóides são classificados de acordo
35
com o perfil de substituições no anel C, tão bem quanto pelo seu estado de
oxidação, podendo ser chamados flavonas, flavonóis, flavonona, flavanóis entre
outros (Figura 17). Também de acordo com a posição em que o anel B encontra-se
ligado ao anel C, estes compostos podem receber o tradicional nome de flavonóides
– quando o anel B está ligado ao carbono 2 do anel C; isoflavonóides – quando o
anel B está ligado ao carbono 3 do anel C e neoflavonóides - quando o anel B está
ligado ao carbono 4 do anel C (MARAIS et al., 2006).
Figura 17 – Estruturas básicas dos flavonóides, mostrando a distribuição dos anéis A, B e
C, e a numeração de cada carbono
* indicam estéreocentros
Os flavonóides podem ser encontrados na forma livre, entretanto são
comumente encontrados formando oligômeros entre si, via ligações entre C-4→C-8
ou C-4→C-6, dando origem as proantocianidinas do Tipo B (PA-B) e ainda uma
ligação adicional do tipo éter pode estar presente entre C-2→C-7 de unidades
O
A C
B
3
4 5
6
7
2
8
9
10
1’
2’
3’
4’
5’
6’
Flavana
O
O
H
*
Flavan
-
4
-
ol
*
*
Flavan
-
3
-
ol
O
O
H
*
*
*
Flavan
-
3,4
-
diol
O
O
H
O
H
O
O
*
Flavanona Flavona
O
O
Flavonol
O
O
O
H
O
Isoflavonó
i
de
*
O
Neoflavonó
i
de
*
36
adjacentes, formando as proantocianidinas do Tipo A (PA-A) (ES-SAFI et al., 2006;
LI e DEINZER, 2007). Estes oligômeros também são conhecidos como taninos ou
taninos condensados (Figura 18 A).
Além de poderem estar ligados entre si, muitos flavonóides são encontrados
na forma de glicoconjugados, os quais podem estar ligados a carboidratos via
grupos hidroxílicos, dando origem aos O-glicosídeos, ou ainda ligados diretamente a
carbonos, na forma de C-glicosídeos (Figura 18 B-E) (JUSTESEN, 2000; ES-SAFI et
al., 2005). Glicosil-flavonóides são freqüentemente encontrados como mono-, di-, tri-
e tetra-glicosídeos. Tipicamente os monossacarídeos ligados a flavonóides são
ramnose, galactose, glucose, arabinose, xilose entretanto monossacarídeos menos
comuns, como a apiose, podem encontrados ligados aos flavonóides (WU et al.,
2007).
Figura 18 – Estrutura de flavonóides ligados entre si, ou com carboidratos.
(A) Proantocianidina Tipo A, com ligações do tipo C4C6 e C4C8, com ligação éter entre C2C7.
(B) Estrutura de um flavonol glicosilado na posição O-3, (C) posição O-7, (D) O-4’ e (E) com ligação
em C-6.
Flavonóides são constantemente alvos de muitos estudos farmacológicos,
devido a importantes propriedades terapêuticas atribuídas a eles. Neste contexto
O
4
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
6
2
O
4
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
8
7
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
(A)
(
B
)
(
C
)
(
D
)
(
E
)
37
muitas evidências experimentais têm sido obtidas, as quais tem mostrado seu
envolvimento em processos anti-inflamatórios (YAMAMOTO e GAYNOR, 2001), anti-
microbianos e anti-câncer (RAUHA et al., 2000), bem como sua capacidade de inibir
a peroxidação de lipídeos induzida por Fe
2+
, o que mostra que um dos mecanismos
de atuação dos flavonóides é através da quelação de metais, sendo importantes
para sua atividade antioxidante (SEERAM e NAIR, 2002).
Alguns trabalhos têm mostrado que a posição na qual a porção glicosídica
encontra-se ligada aos flavonóides pode estar diretamente associada à atividade
biológica apresentada por eles (OHMORI et al., 2000; HEIM et al., 2002; YANG et
al., 2006). Flavonóides livres ou na forma de glicosídeos podem atuar de formas
diferentes, sendo que em muitos casos os glicosídeos apresentam melhor atividade
do que a forma de aglicona livre (MISHRA et al., 2003). Entretanto, os extratos
vegetais podem conter diversos isômeros, tanto em relação à posição da ligação do
carboidrato na aglicona, quanto à própria composição dos monossacarídeos, ou
ainda quanto ao tipo de ligação interglicosídica nos quais estes monossacarídeos
podem estar arranjados. Tipicamente a porção glicosídica pode estar ligada à
aglicona pelas hidroxilas das posições 3, 7 ou 4’, ou então aos carbonos 6 ou 8,
sendo que outros tipos de ligação são raros (CUYCKENS e CLAEYS, 2005). A
glicosilação também está diretamente relacionada com a bio-disponibilidade dos
flavonóides, pois alteram sua absorção intestinal (HOLLMAN et al., 1995;
MATSUMOTO et al., 2004), bem como a posição onde os açúcares estão ligados
afetam sua desglicosilação por células do intestino delgado e fígado (DAYA et al.,
1998) que consequentemente podem alterar o tipo de propriedade esperada.
Devido a grande diversidade estrutural que estes glicosídeos podem
apresentar diversos pesquisadores têm voltado sua pesquisa ao desenvolvimento de
técnicas analíticas que proporcionem uma análise mais detalhada à cerca destes
constituintes vegetais, principalmente no que diz respeito à identificação dos
isômeros. Assim, a cromatografia líquida e a espectrometria de massas emergem
com ferramentas imprescindíveis no desenvolvimento destas análises. Desta forma,
uma análise estrutural que vise identificar o seqüênciamento de um determinado
glicosídeo bem como a identificação do núcleo aglicona a ele ligado pode ser
rapidamente conseguida. Entretanto, trabalhos recentes têm mostrado preocupação
com desenvolvimento e simplificação de técnicas que permitam identificar a posição
de ligação dos carboidratos ao núcleo aglicona, bem como das ligações
38
interglicosídicas e assim a diferenciação dos isômeros que podem ser formados.
Estas diferenciações têm sido conduzidas de diferentes formas, tais como pela
complexação de metais (como cobre, magnésio, cálcio) com flavonóides glicosilados
conhecidos, e através da observação de seus comportamentos quando são
analisados através de processos de fragmentação no espectrômetro de massas. Isto
deve-se ao fato que os diferentes complexos metal-glicosídeo formados, podem
formar diferentes perfis fragmentação, permitindo criar um padrão específico para
cada um, possibilitando sua identificação (PIKULSKI e BRODBELT, 2003; DAVIS e
BRODBELT, 2004).
Durante os processos de análise por espectrometria de massas, foi
demonstrada a capacidade dos flavonóides glicosilados de formarem íons regulares
referentes a aglicona, bem como de íons referentes a radicais formados da aglicona,
obtidos por uma quebra homolítica obtidas por CID (HVATTUM e EKEBERG, 2003).
Dependendo das condições de análise, foi verificado que estes íons poderiam ser
formados com intensidades diferentes, e que existia uma correlação direta entre as
razões íon-normal/íon-radical, e a posição na qual os açúcares estavam ligados ao
flavonóide, gerando importantes dados para sua identificação (CUYCKENS e
CLAEYS, 2005). Outra maneira que tem sido utilizada na diferenciação dos sítios de
ligação é através de deslocamentos no espectro de ultra-violeta (UV), obtidos pela
administração de reagentes específicos. Inicialmente esta técnica era aplicada a
flavonóides glicosídeos purificados, e realizada em espectrofotômetros
convencionais. Entretanto, em se tratando de análise de extratos vegetais contendo
diversos destes compostos, a técnica mais recente faz uso de um sistema de
cromatografia líquida utilizando um detector de arranjo de fotodiodos (PDA), que
permite realizar uma varredura no espectro de UV, enquanto o sistema
cromatográfico efetua a separação dos diferentes compostos. Para completar a
análise, um sistema de derivatização pós-coluna permite a injeção dos reagentes de
deslocamento específicos, permitindo a análise on-line e individual dos compostos
presentes em uma mistura (DUCREY et al., 1995; TIBERTI et al., 2007).
39
2. OBJETIVOS
40
2.1. OBJETIVO GERAL
• Desenvolver técnicas de separação e análise estrutural de oligossacarídeos,
lipídeos e flavonóides por cromatografia e espectrometria de massas, bem como
desenvolver técnicas de ionização que permitam obter diferentes informações
sobre a estrutura das moléculas pela formação de diferentes fragmentos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliação das melhores condições de ionização e fragmentação de
oligossacarídeos por ESI-MS;
• Determinação estrutural dos lipídeos da cifomedusa Phyllorhiza punctata;
• Determinação estrutural dos lipídeos da arquea Haloarcula marismortui;
• Determinação estrutural dos lipídeos de folhas de Maytenus ilicifolia;
• Determinação estrutural de flavonóides de Maytenus ilicifolia;
• Desenvolver técnicas de separação em cromatografia liquida para análise de
flavonóides;
• Desenvolver derivatizações químicas para identificação rápida do glicosídeos de
Maytenus ilicifolia.
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
42
3.1. FONTES DAS BIOMOLÉCULAS
Neste trabalho foram utilizadas diferentes classes de biomoléculas, como
lipídeos, oligossacarídeos e flavonóides. Para o seu desenvolvimento foram
utilizadas diversas fontes a fim de abranger uma grande variedade destes
compostos, assim foram utilizados desde padrões comerciais de lipídeos e
oligossacarídeos, assim como moléculas obtidas de diferentes fontes biológicas,
como descritas na Tabela 1.
TABELA 1 – Fontes das biomoléculas estudadas neste trabalho
3.2. OBTENÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO
3.2.1. Phyllorhiza punctata
Phyllorhiza punctata pertence ao Filo Cnidária, Classe Scyphozoa, Ordem
Rhizostomeae e à família Magistiidae. Exemplares foram coletados na Baía de
Guaratuba (Estado do Paraná, Brasil) durante o período de fevereiro a abril de 2003.
Estes meses foram ideais para fornecer os maiores exemplares, que podem chegar
Biomolécula Fontes de estudo
Oligossacarídeos Padrões Sigma Aldrich
Padrões Sigma Aldrich (fosfolipídeos)
Phyllorhiza punctata (medusa)
Maytenus ilicifolia (planta)
Lipídeos
Haloarcula marismortui (arquea)
Flavonóides
Maytenus ilicifolia
43
a 4,5 kg de peso fresco. Os espécimes coletados foram congelados e liofilizados. A
coleta e a identificação da espécie foram realizadas pela Profª. Maria Angélica
Haddad, Departamento de Zoologia - UFPR.
3.2.2. Maytenus ilicifolia
Maytenus ilicifolia pertence à Divisão Angiospermae, Classe Dicotyledoneae,
Subclasse Archichlamydeae, Ordem Celastrales e Família Celastraceae. Folhas de
M. ilicifolia foram obtidas em Colombo, região metropolitana de Curitiba, PR (Sul do
Brasil), foram doados pela Central de Produção e Comercialização de Plantas
Medicinais, Condimentares e Aromáticas do Paraná Ltda. A planta foi identificada
pelo Prof. Olavo Guimarães, do Departamento de Botânica, desta Universidade,
estão depositadas no Herbário da UFPR pelo voucher 30842.
3.2.3. Haloarcula marismortui
Haloarcula marismortui pertence à Super-reino Archaea, Filo Euryarchaeota;
Classe Halobacteria, Ordem Halobacteriales e Família Halobacteriaceae. Células de
H. marismortui foram gentilmente cedidas ao Msc. Marcelo Müller-Santos pelo Prof.
Francisco Rodríguez-Valera (Universidade Miguel Hernández, Alicante, Espanha).
As células foram cultivadas no meio utilizado para o crescimento do Halobaculum
gomorrense, que consiste nas seguintes concentrações por litro de meio: NaCl 125
g; MgCl
2
.6H
2
O 160 g; K
2
SO
4
5 g; CaCl
2
.2H
2
O 0.1 g; extrato de levedura 1 g,
casamino ácidos 1 g e amido 2 g (OREN et al., 1995), sendo o seu pH ajustado para
7,0 com uma solução de NaOH antes da autoclavagem. As células foram cultivadas
em meio líquido em agitador orbital (160 rpm) a 37 °C. Depois de 5 dias, o meio foi
centrifugado (10.000 rpm), e o material sedimentado foi lavado duas vezes com 2,5
mol/L de NaCl e, em seguida, liofilizado.
44
3.3. EXTRAÇÕES
3.3.1. Extração e fracionamento de lipídeos de Phyllorhiza punctata
Os epecimes liofilizados (100 g) foram extraídos três vezes com CHCl
3
:MeOH
(1:1 v/v, 400 mL) sob refluxo a 60 º C durante 3 horas cada. Os extratos orgânicos
foram filtrados e então combinados e evaporados em evaporador rotativo. Devido a
extensiva concentração de sais presentes no extrato, ele foi particionado entre
CHCl
3
-MeOH-H
2
O (2:1:1 v/v, 400 mL) dando origem duas frações, a superior (Pp-
ELS - 17,5 g), que reteve a alta concentração de sais e portanto descartada das
análises, e a fração inferior contendo o CHCl
3
(Pp-ELI - 2,8 g). A presença de
glicolipídeos e de lipídeos aminados e fosforilados foi determinada por análises em
TLC (sílica-gel 60G – Merck) utilizando CHCl
3
-MeOH-H
2
O (65:25:4, v/v) como
solvente.
A fração Pp-ELI foi aplicada em uma coluna (30 cm x 2 cm) preenchida com
sílica-gel 60G, tamanho da partícula 0.2-0.5 mm (Merck), e eluída com misturas
CHCl
3
-MeOH, com sucessivos aumentos na concentração MeOH (de 5 a 50%, v/v).
Cinquenta frações de 20 mL cada, foram recolhidas e analisadas por TLC, conforme
descrito acima. As frações foram combinadas de acordo com suas similaridades na
TLC, gerando 7 frações nomeadas de Pp-F1 a Pp-F7. Dois glicolipídeos diferentes
foram isolados e tiveram sua estrutura determinada durante o mestrado (SOUZA,
2003), e um amino-fosfonolipídeo foi isolado da fração Pp-F6, eluída com CHCl
3
-
MeOH (1:1, adicionado 0,2% NH
4
OH, v/v).
3.3.2. Extrações e fracionamentos dos componentes de folhas de Maytenus
ilicifolia
Folhas secas de M. ilicifolia (100 g) foram deslipidificadas por 3 sucessivas
extrações com 300 mL de CHCl
3
-MeOH (2:1, v/v) sob refluxo. Os extratos foram
combinados e evaporados até secura em evaporador rotativo gerando a extrato Mi-
EL. O resíduo desta extração foi extraído três vezes com água (500 mL) sob refluxo
(100 ºC), por 3 horas cada. Os extratos foram combinados e concentrados
parcialmente em evaporador rotativo (200 mL) e, em seguida, foi adicionado EtOH
45
frio (600 ml), a fim de precipitar macromoléculas, que foram separadas da fase
solúvel por centrifugação (10.000 rpm). Os compostos solúveis em etanol (Mi-ET-
SOL) foram concentrados parcialmente e, então, liofilizados.
Uma porção de Mi-ET-SOL (500 mg) foi aplicada em uma coluna (50 x 5 cm)
preenchida com silica-gel 60G (Merck) e fracionada utilizando diferentes misturas de
CHCl
3
-MeOH (variando de 95:5 v/v para 100% de MeOH). 100 frações contendo 20
mL cada, foram coletadas e evaporadas sob fluxo de nitrogênio, à temperatura
ambiente (~25 º C) e analisada por TLC em placas de silica-gel 60G (Merck).
Diferentes combinações foram utilizadas como solventes de eluição na TLC, como
CHCl
3
-MeOH-H
2
O (65:25:4, v/v), EtOAc:n-PrOH:AcOH:H
2
O (4:2:2:1, v/v) e n-PrOH-
H
2
O (7:3, v/v). As placas foram coradas por orcinol-H
2
SO
4
(100 ºC) para visualização
de glicosídeos, ou por MeOH-H
2
SO
4
(9:1, v/v) a 100 ºC, para visualização geral dos
componentes das amostras (SASSAKI et al., 2008). Frações semelhantes foram
combinadas para dar origem a 10 novas frações, chamadas de Mi-F1 a Mi-F10 que
foram posteriormente analisadas.
3.3.3. Extração e fracionamento dos lipídeos da arquea Haloarcula marismortui
Lipídeos de H. marismortui foram obtidos por extração das células (1,6 g) com
MeOH-CHCl
3
(2:1 v/v), sob refluxo a 60 ºC por 2 h (2 vezes). Os extratos (Hm-EL)
foram combinados, concentrados e analisados por TLC de sílica-gel 60G (Merck) e
corados com orcinol-H
2
SO
4
, a 100 ºC, (SKIPSKI, 1975; SASSAKI et al., 2008), e por
reagente de molibdato para detecção de grupamentos contendo fósforo (DITTMER e
LESTER, 1964). Um glicolipídeo foi detectado no extrato, e então purificado por
fracionamento em coluna (30 x 2 cm) contendo sílica-gel 60G (Merck), eluída com
CHCl
3
-MeOH, com o aumento da proporção de MeOH (de 5 a 60%, v/v). As frações
foram acompanhadas por TLC, conforme descrito previamente.
46
3.4. DERIVATIZAÇÕES QUÍMICAS
3.4.1. Derivatização para análise em GC-MS
Os reagentes e solventes utilizados nesta etapa do trabalho foram adquiridos
da marca Sigma ou Merck.
Metanólise – Amostras foram dissolvidas em 1M MeOH-HCl e mantidas a 100 ºC
por 4 h. As soluções foram neutralizadas com Ag
2
CO
3
, transferidas para tubos do
tipo eppendorf e centrifugadas a 10.000 rpm. O precipitado foi descartado e o
solúvel evaporado sob fluxo de N
2
.
Metilação – 300-700 µg de amostras foram dissolvidas em 300 µL de DMSO, 10 mg
de NaOH em pó foram adiconados e em seguida e 300 µL CH
3
I. A suspensão foi
agitada vigorosamente durante 1 h, então deixada por 14 h em repouso em
temperatura ambiente (~25 ºC). Os derivados per-O-metilados foram extraídos com
CHCl
3
e o extrato lavado várias vezes com água até pH neutro. Em seguida as
amostras foram secas sob fluxo de N
2
, e os resultantes derivados per-O-metilados
foram hidrolisados. Este método foi adaptado de Ciucanu e Kerek (1984).
Hidrólise – Para determinação da composição monossacarídica, as amostras foram
dissolvidas em 1M TFA (300 µL) a uma concentração de 1 mg/mL, utilizando frascos
de 4 mL com tampa rosqueável de teflon. As amostras foram mantidas a 100 ºC por
14 h e posteriormente evaporaradas sob fluxo de N
2
.
Para análise dos derivados per-O-metilados a hidrólise foi realizada em 45%
de ácido fórmico aquoso (v/v) e as amostras foram mantidas a 100 ºC por 14 h, e
posteriormente evaporaradas sob fluxo de N
2
.
Redução – As amostras hidrolisadas foram solubilizadas em 300 µL de H
2
O, e 1 mg
de NaBH
4
(ou NaBD
4
para os derivados metilados) foi adicionado. As amostras
foram mantidas por um período de 4-5 h em temperatura ambiente (~25 ºC), após
qual, foi adicionada resina trocadora de cátions fortemente ácida, até pH 6-7. A
resina foi removida e as amostras foram evaporaradas sob fluxo de N
2
. Em seguida
47
0,5 mL de MeOH foi adicionado e novamente evaporado em fluxo de N
2
. Este
processo foi repetido por 3 vezes para remoção do borato residual (WOLFROM e
THOMPSOM, 1963a).
Acetilação – As amostras provenientes do processo de redução foram re-
suspendidas em 400 µL de piridina-anidrido acético (1:1, v/v), e aquecidas por 2 h a
100 ºC. Os derivados acetilados foram extraídos em CHCl
3
(500 µL) e os reagentes
foram removidos por sucessivas lavagens com solução de CuSO
4
-5H
2
O (5%, v/v), e
no final foi adicionado Na
2
SO
4
anidro para remoção da água residual. Após
filtragem, as amostras foram transferidas para frascos limpos, e deixadas secar em
temperatura ambiente, ou no caso dos derivados metilados apenas armazenados
em geladeira (WOLFROM e THOMPSON, 1963b).
3.4.2. Acetalação do flavonóis glicosídeos
Amostras de flavonóis glicosídeos, bem como padrão de rutina (1 mg) foram
solubilizados em acetona anidra (1 mL), à qual foi adicionado 1% de H
2
SO
4
anidro.
As amostras foram deixadas sob agitação magnética intensa por 3 h e então NH
4
OH
foi adicionado até pH 7. As amostras foram transferidas para tubos tipo eppendorf, e
centrifugados a 10.000 rpm. O precipitado foi descartado, e o sobrenadante
evaporado sob fluxo de N
2
(adaptado de MORAVCOVÁ et al., 1994).
3.5. MÉTODOS ANALÍTICOS
O principal enfoque deste trabalho é a determinação estrutural de diferentes
biomoléculas por espectrometria de massas do tipo electrospray, com analisador do
tipo triplo quadrupólo. Contudo, muitas destas moléculas também foram analisadas
por outras técnicas, como cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas (GC-MS), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detector
de UV e de arranjo de fotodiodos (PDA – photodiode array detector), cromatografia
líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) e ressonância magnética
nuclear (NMR – nuclear magnetic resonance), de
13
C e
1
H.
48
3.5.1. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
Estas análises foram realizadas em GC-MS da marca Varian (Palo Alto, CA),
modelo Saturn 2000R. A detecção por massas foi feita através de ionização
eletrônica (70 eV) e analisador do tipo ion trap. A temperatura do injetor foi mantida
em 250 ºC e do trap em 200 ºC. Hélio 5.0 analítico foi utilizado como gás de arraste,
a um fluxo de 1 mL/min. As análises foram realizadas em coluna DB-225-MS (J&W),
com duas programações, de acordo com cada tipo de composto a ser analisado:
Análise de composição monossacarídica – temperatura de 50 ºC a 220 ºC a 40
ºC/min, matida por 25 min.
Análise de derivados metilados – temperatura de 50 ºC a 210 ºC a 40 ºC/min,
matida por 30 min.
A identificação dos compostos foi realizada pelos respectivos tempos de
retenção, espectro de fragmentação de massas, e, em alguns casos, por
comparação com padrões autênticos, ou pela biblioteca de massas NIST (National
Institute of Standards and Technology) conforme será descrito nos resultados.
3.5.2. Cromatografia líquida de alto desempenho
Os flavonóides foram analisados por HPLC utilizando um detector
convencional de UV, realizadas em um equipamento da marca Shimadzu, modelo
LC-10A, com detector de UV-Vis SPA-10, ou em equipamento Shimadzu
Prominence, LC-20A, com detector de arranjo de fotodiodos (PDA) SPD-20A.
Durante o desenvolvimento dos métodos de análise, foi utilizado o detector
convencional de UV, e o flavonóides foram detectados a 280 e 360 nm, enquanto
que para obtenção do espectro de absorbância no UV, o detector PDA foi
programado para varrer de 200 a 500 nm.
Três principais colunas foram utilizadas nas separações dos flavonóides, duas
sendo de fase reversa (RP – reveserd phase) e uma de separação por exclusão
estérica (SEC- size exclusion chromatography):
49
• Método 1: Coluna Synergy Fusion RP-C18, de 250 x 4,6 mm, com 4 µm de
dimensão de partículas (Phenomenex): utilizada na separação de flavonóides
livres, com fase móvel isocrática H
2
O-CH
3
CN-AcOH (89:10:1 v/v), adaptada de
Soares et al. (2005), a um fluxo de 0,8 mL/min e temperatura constante de 30 ºC.
As amostras foram solubilizadas em MeOH na concentração de 1 mg/mL com
volume no loop de injeção de 10 µL.
• Método 2: Coluna Supelcosil LC-18, 250 x 4,6 mm, com 5 µm de dimensão de
partículas (Supelco): utilizada na separação dos flavonóides glicosilados,
utilizando duas fases móveis em forma de gradiente. Solvente A composto de 1%
de AcOH em H
2
O (v/v), e solvente B composto de H
2
O:CH
3
CN:AcOH (49:50:1
v/v). As análises foram realizadas a 60 ºC, com fluxo de 1 mL/min. Com os
solventes foram desenvolvidos dois gradientes diferentes, ambos com
concentrações crescentes do solvente B: Gradiente A (RP-GA) iniciando
com10% de B, subindo para 30% em 5 min, de 30% a 50% em 25 min mantido
por 5 min, retornando a 10% de B em 35 min e mantido assim por 10 min. O
segundo gradiente, chamado de RP-GB iniciou com 10% de solvente B, subindo
para 40% em 15 min, mantido até 17 min e retornando a 10% em 20 min,
mantido por mais 10 min.
• Método 3: Coluna Ultrahydrogel 120, de 300 x 7,8 mm (Waters), também foi
utilizada na separação dos glicosídeos com os mesmos solventes do método 2,
com o seguinte gradiente (chamado SEC-GA): inicialmente 10% de solvente B,
subindo para 40% em 24 min, para 80% em 40 min mantido até 45 min e então
retornando para 10% de B em 50 min, mantido assim por mais 10 min. O fluxo foi
de 1 mL/min e da temperatura 60 ºC. As amostras foram solubilizadas na
concentração de 10 mg/mL em MeOH:H
2
O (1:1, v/v), com volume de injeção de
100 µL. Esta análise foi realizada em modo preparativo, e as frações foram
coletadas em coletor automático, e concentradas sob fluxo de nitrogênio à
temperatura ambiente (~25 ºC).
50
3.5.2.1. Cromatografia líquida de alto desempenho com derivatização pós-
coluna
Derivatização pós-coluna foi realizada para determinação dos deslocamentos
no espectro de absorbância no UV dos flavonóides glicosilados. Foi utilizado HPLC-
PDA Shimadzu Prominence, sendo que as condições de análise cromatográfica são
as mesmas já descritas para análise dos glicosídeos em fase reversa. A
derivatização foi feita em um loop de 200 µL posicionado na saída coluna, com a
função de prolongar o percurso até o detector, atuando como local de reação. Dois
reativos de deslocamento foram utilizados: NaOH, 1 mol/L e AlCl
3
, 0,3 mol/L. Os
reativos foram combinados com os efluentes na saída da coluna através de uma
junção em “T” (Figura 19) injetados por uma bomba modelo LC-10A (Shimadzu) a
fluxo de 0,2 mL/min.
Figura 19 – Esquema do HPLC preparado para derivatização pós-coluna
Bomba A
Bomba B
Bomba C
Coluna
Detector
Junta “T
”
Loop
Solvente A
Solvente B
Reagente de
deslocamento
51
3.5.2.2. Cromatografia líquida de alto desempenho acoplada a espectrometria
de massas (LC-MS)
Após estabelecimento das melhores condições de separação cromatográfica,
as amostras foram submetidas à análise por LC-MS. O sistema foi montado com um
divisor de fluxo na saída da coluna, permitindo desviar um volume de 10 µL/min de
efluente para o espectrômetro de massas.
3.5.3. Cromatografia em camada delgada (TLC- Thin Layer Chromatography)
Estas análises foram realizadas em placas de silica-gel 60G (Merck), com 8
cm de altura total (7 cm a partir da origem). As análises foram desenvolvidas com
diferentes solventes de acordo com o tipo de composto a ser analisado: lipídeos –
CHCl
3
-MeOH-H
2
O (65:25:4, v/v), mono-, oligossacarídeos e glicosídeos – EtOAc-n-
PrOH-AcOH-H
2
O (4:2:2:1, v/v) ou n-PrOH-H
2
O (7:3, v/v). A visualização dos
compostos foi realizada com diferentes reagentes, de acordo com o tipo de
composto analisado: carboidratos – orcinol-H
2
SO
4
a 100 ºC (SKIPSKI, 1975),
compostos aminados – solução de ninhidrina a 100 ºC, compostos contendo fosfatos
– solução de molibdênio a temperatura ambiente (DITTMER e LESTER, 1964). Para
detecção geral e inespecífica, foi utilizada uma solução de 10% H
2
SO
4
em EtOH
(v/v) a 110 ºC (SASSAKI et al., 2008).
3.5.4. Análise por espectrometria de massas do tipo electrospray
Estas análises foram realizadas em espectrômetro de massas Quattro LC,
triplo quadrupólo (Waters). Nitrogênio foi utilizado como gás de nebulização e
dessolvatação e argônio como gás de colisão, para realização de fragmentações por
CID. A detecção foi feita em modo positivo e negativo de ionização em pressão
atmosférica (API). As amostras foram aplicadas por injeção direta utilizando uma
bomba de infusão (KD-Scietific) a um fluxo de 10 µL/min, ou então em modo de LC-
MS. Aquisição e o processamento de dados foram realizados utilizando o software
MassLynx 3.5, e as análises foram obtidas em modo de scan contínuo.
52
Os padrões de oligossacarídeos foram solubilizados na concentração de 50
µg/mL em H
2
O-MeOH (7:3, v/v) contendo 5 mMol/L de LiCl, NaCl ou KCl. Os
padrões de fosfolipídeos na concentração de 50 µg/mL, e os extratos de lipídeos na
concentração de ~200 µg/mL, foram solubilizadas MeOH-CHCl
3
-H
2
O (7:2:1, v/v). Em
alguns casos a H
2
O foi substituída por 0,1 M NaOH para obter um pH 10. Os
lipídeos de H. marismortui passaram também por substituição de prótons por
deutérios através de 2 sucessivas solubilizações seguidas de evaporação em
MeOD-CHCl
3
-D
2
O (7:2:1, v/v). Os solventes deuterados foram utilizados para
injeção destas amostras. Amostras de flavonóides (200 µg/mL) foram solubilizadas
em MeOH-H
2
O (7:3, v/v), ou em MeOH-H
2
O (7:3, v/v) contendo 5 mMol/L de HCl ou
NaCl. Como os analítos são de natureza química bastante diferente, as condições
de energia utilizadas na ionização também foram bastante variadas, e serão
descritas juntamente com os resultados.
3.5.5. Análise por espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Espectros de 1D e 2D de
1
H,
13
C e
31
P foram realizados em um equipamento
Bruker Avance DRX-400, com sonda inversa de 5 mm. Antes das análises, as
amostras submetidas a troca de H por D, por sucessivas solubilizações e
evaporações em solventes deuterados. Amostras de lipídeos foram trocadas com a
utilização de MeOD-CHCl
3
-D
2
O (7:2:1, v/v), e as amostras de flavonóides em MeOD-
D
2
O (7:3, v/v). Os espectros de lipídeos foram obtidos em CDCl
3
-MeOD (1:1, v/v)
com concentrações variando entre 30-50 mg/mL e o de flavonóides em MeOD-D
2
O
(7:3) com concentrações variando entre 15-50 mg/mL para os padrões de
epicatequina e catequina e 60-80 mg/mL para as amostras obtidas de M. ilicifolia.
Todos os espectros de NMR foram obtidos com temperatura de 30 ºC. Os
deslocamentos químicos de
13
C foram padronizados em relação ao Me
4
Si (δ = 0),
enquanto que os de
31
P relativos a solução aquosa (85%, v/v) de H
3
PO
4
(δ = 0).
53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
54
4.1. ANÁLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS
___________________________________________________________________
Em análises do tipo tandem-MS os principais pontos de quebra nos
oligossacarídeos são as próprias ligações glicosídicas, e portanto são formados
fragmentos com o equivalente a massa de um açúcar a menos. Contudo estas
análises devem levar em consideração que o átomo de oxigênio que une os dois
monossacarídeos deve ficar em uma das unidades, enquanto que a outra terá sua
massa reduzida com o equivalente a perda de uma molécula de água (- 18 m.u.), ou
seja, no caso das hexoses, de massa molecular de 180 Da, pela remoção de uma
unidade de água passa a ter massa 162 Da, as deoxihexoses de 164 para 146 Da e
as pentoses de 150 para 132 Da. Por exemplo, a sacarose [α-Glcp (1→2) β-Fruf] um
dissacarídeo não redutor, como característica intrínseca apresenta um ceto-açúcar
(frutose) na sua composição. Em análise por ESI-MS a sacarose produz íon pseudo-
molecular com m/z 365 [M+Na]
+
. A provável via de quebra da sacarose envolve a
transferência do próton de uma das unidades monossacarídicas para o oxigênio da
ligação, e com isso a unidade doadora passa formar uma espécie contendo uma
dupla ligação entre C-1 e C-2 (Figura 20).
Figura 20 – Formação dos fragmentos de carboidratos
*exemplo de formação da dupla ligação entre C1-C2
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
H
CID-MS
m/z 203
Na
+
m/z 185
Na
+
Na
+
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
H
m/z 365
*
55
Como será visto a seguir, a formação destes íons de açúcares contendo
duplas ligações entre C-1 e C-2 em outros açúcares redutores, ou em glicosídeos
parece ocorrer a partir do terminal não redutor, permitindo os fragmentos formados a
partir do terminal redutor ou a porção contendo a aglicona apresentem a massa
completa dos açúcares que o compõem juntamente com íon adutor. Outros tipos de
fragmentação podem ser obtidos de acordo com o tipo de ionização/fragmentação
que esteja sendo utilizado, como os obtido por ion trap em modo negativo
(KARLSSON et al., 2004).
Diversos tipos de íons podem ser formados durante os processos de
ionização nas análises de massas, mas as formas mais comuns de serem
encontrados são os íons formados a partir adutos de sódio [M+Na]
+
. Contudo,
adutores como K
+
também são comuns de serem encontrados ionizando
carboidratos, e devido à diferença de massa entre o Na
+
e o K
+
(16 Da), pode levar a
confusões. Já esta mesma diferença é encontrada em muitos açúcares, como
ramnose e fucose em relação às hexoses (ex. Man, Gal e Glc). É possível remediar
certos inconvenientes pela suplementação de algum tipo de íon adutor desejado no
solvente utilizado na amostra, mas concentrações altas destes íons podem suprimir
o sinal do analito.
O papel dos adutores não limita-se à formação dos íons durante a ionização,
mas parece afetá-los também nos processos de fragmentação. Para obter
informações quanto ao tipo de ionização que produziria melhor informação sobre
oligossacarídeos, análises foram realizadas utilizando como padrões de
oligossacarídeos redutores, maltose [α-Glcp-(1→4)-Glc], celobiose [β-Glcp-(1→4)-
Glc], maltopentaose [α-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→4)-Glc]
e como padrão de oligossacarídeo não redutor foi utilizado a estaquiose [α-Galp-
(1→6)-α-Galp-(1→6)-α-Glcp-(1→2)-β-Fruf]. Os terminais redutores da maltose,
celobiose e maltopentaose foram reduzidos pela utilização de NaBH
4
, a fim de gerar
uma diferença de 2 Da entre ele e o terminal não redutor, assim foi possível atribuir
de qual parte da molécula os fragmentos eram provenientes. Como eles formaram
estruturas contendo um poliol em um dos terminais, será utilizada a nomenclatura
proposta por Domon e Costello (1988) para identificação dos fragmentos obtidos a
partir de glicoconjugados. Seguindo esta nomenclatura os principais íons aqui
observados foram os do tipo Y
j
e B
i
. Os fragmentos do tipo Y
j
são aqueles que
permanecem ligados à aglicona (neste caso ao poliol), e o j subscrito indica o
56
número de monossacarídeos contidos no fragmento, contados a partir da aglicona.
Os fragmentos do tipo B
i
referem-se à porção da molécula contendo apenas os
monossacarídeos, o i subscrito indica o número de monossacarídeos contidos nos
fragmentos, contados a partir do terminal não redutor. O tipo de carga contida nos
fragmentos será indicado em sobrescrito (Figura 21).
Tipicamente os fragmentos B
i
+
são formados como consequência de uma
quebra das ligações glicosídicas, designado como clivagem tipo A1, que gera um íon
oxônio devido à formação de uma tripla ligação no oxigênio do anel glicosídico, este
tipo de fragmento não foi observado. Por outro lado, na formação dos fragmentos do
tipo Y
j
+
, a carga é mantida na porção da molécula que contém a aglicona, ocorrendo
a liberação dos resíduos de açúcar adjacentes como espécies neutras, com uma
dupla ligação entre C-1 e C-2 (Figura 20). Este tipo de quebra é referido como β-
clivagem (DELL, 1987). Contudo, estas espécies neutras produzidas pela β-
clivagem, foram observados formando íons com adutores específicos. Os demais
fragmentos descritos por Domon e Costello (1988) não foram encontrados nos
espectros, exceto pela presença de pequenos íons identificados como pertencendo
ao tipo Z
j
, quando Li
+
foi utilizado como adutor.
Figura 21 – Nomenclatura para os fragmentos obtidos para glicoconjugados
R = aglicona
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
R
O
O
H
O
H
O
H
O
H
Y
2
+
Y
1
+
Y
0
+
Z
1
+
Z
2
+
B
2
+
B
3
+
B
1
+
C
2
+
C
1
+
57
4.1.2. Influência dos adutores na fragmentação de oligossacarídeos
A maltose e a celobiose são dois isômeros diferenciado-se apenas pela
configuração anomérica do oxigênio que participa da ligação glicosídica. Após a
redução, a massa molecular de ambas passou de 342 para 344 Da.
Estes dois dissacarídeos foram submetidos a análise de fragmentação por
CID-MS, mantendo as energias de ionização no cone em 80 V e no capilar em 2,8
kV, porém variando a energia de colisão, que foi testada em 50 e 100 eV, e os íons
adutores, pela suplementação com 5 mMol/L de LiCl, NaCl ou KCl no solvente da
amostra. A concentração das amostras foi de 50 µg/mL.
Em ambos os casos foi verificado que o uso de Li
+
com adutor promoveu
melhor fragmentação dos dissacarídeos, que pode ser observada já com 50 eV,
enquanto que com Na
+
, apenas um pequeno íon foi formado tanto com 50 como
com 100 eV. Já com K
+
com adutor não houve a formação de fragmentos nestas
condições (Figura 22).
O principal fragmento observado foi identificado como sendo do glucitol (Y
0
+
)
somado à massa do adutor, que apareceu com m/z 189 [M+Li]
+
e 205 [M+Na]
+
,
destacando-se pela intensidade o íon formado com Li
+
. Duas características
chamaram a atenção: a formação dos fragmentos de m/z 205 foi mais intensa
quando formados a partir da maltose em relação a celobiose, e a formação de dois
fragmentos de baixa intensidade, que foram observados apenas com Li
+
, como
adutor. Estes dois fragmentos foram interpretados como B
1
+
e Z
0
+
, com m/z 169 e
171, respectivamente e foram formados em ambos os dissacarídeos, porém com
intensidades diferentes, com uma razão de 1:1 a partir da celobiose e 1:3 da maltose
(Figura 22 A, B). Embora estes resultados ainda sejam preliminares, esta relação
entre estes dois fragmentos pode ser importante para distinguir entre ligações
glicosídicas α e β.
58
Figura 22 – Influência do adutor na fragmentação da celobiose e da maltose.
Coluna A: estrutura e fragmentações da celobiose reduzida; coluna B estrutura e
fragmentações da maltose reduzida.
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
Y
0
+
B
1
+
Z
0
+
Y
0
+
B
1
+
Z
0
+
Y
0
+
Y
0
+
Z
0
+
B
1
+
[M+Li]
+
B
1
+
Z
0
+
[M+Li]
+
Y
0
+
Y
0
+
[M+Li]
+
[M+Li]
+
Y
0
+
Y
0
+
[M+Na]
+
[M+Na]
+
Y
0
+
[M+Na]
+
[M+Na]
+
[M+K]
+
[M+K]
+
[M+K]
+
[M+K]
+
A B
50 eV 50 eV
100 eV
100 eV
50 eV 50 eV
100 eV
100 eV
50 eV 50 eV
100 eV
100 eV
59
Dois oligossacarídeos maiores também foram testados com os diferentes
adutores, seguindo os mesmos comportamentos da maltose e da celobiose. Estes
oligossacarídeos foram a maltopentaose, um pentassacarídeo, que também foi
reduzido gerando em uma das extremidades um poliol com aumento de massa de 2
Da, para poder diferenciar os fragmentos provenientes de uma e de outra
extremidade, e a estaquiose, que é um tetrassacarídeo originado a partir da
sacarose, e portanto não apresenta terminal redutor. Os fragmentos de massa
obtidos a partir da maltopentaose reduzida foram nomeados de acordo com
nomenclatura de Domon e Costello (1988), contudo como a estaquiose não pôde ser
reduzida, esta nomenclatura não se aplica, e os fragmentos não são diferenciados
entre os dois terminais.
Como anteriormente, as amostras também foram solubilizadas a uma
concentração de 50 µg/mL, mesmo isso representando uma razão molar diferente
entre tetra- e pentassacarídeos, já que o objetivo foi comparar apenas o efeito do
adutor na mesma molécula. As energias de ionização foram as mesmas das
anteriores, 80 V no cone e 2,8 kV no capilar, porém as energias de colisão foram 80
e 110 eV. Conforme comentado, o processo de fragmentação de ambos os
oligossacarídeos apresentou melhor resposta de acordo com o tipo de adutor
utilizado, sendo que o Li
+
em todos os casos foi o que gerou mais informações sobre
a estrutura. Porém, no caso da estaquiose parece que sua estrutura é mais
suscetível ao processo de fragmentação nas condições utilizadas, já que produziu
fragmentos intensos com Na
+
, como os de m/z 527 e 365, consistentes com a
remoção de um e dois monossacarídeos, respectivamente. Mesmo utilizando o K
+
como adutor foi possível observar um fragmento de m/z 543, formado pela remoção
de um monossacarídeo (Figura 23).
60
Figura 23 – Influência do adutor na fragmentação da maltopentaose e da estaquiose
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
Y
2
+
B
2
+
Y
1
+
B
3
+
B
1
+
Y
3
+
Y
0
+
B
4
+
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
H
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
A
B
Coluna A: estrutura e fragmentações da maltopentaose reduzida; coluna B estrutura e fragmentações da
estquiose
[M+Li]
+
[M+Li]
+
[M+
Na
]
+
[M+
Na
]
+
[M+
K
]
+
[M+
K
]
+
80 eV
100 eV
80 eV
100 eV
80 eV
100 eV
[M+Li]
+
[M+Li]
+
[M+
Na
]
+
[M+
Na
]
+
[M+
K
]
+
[M+
K
]
+
80 eV
100 eV
80 eV
100 eV
80 eV
100 eV
B
1
+
Y
1
+
Y
0
+
B
2
+
B
3
+
Y
2
+
Y
3
+
B
1
+
Y
1
+
Y
0
+
B
2
+
Y
3
+
Y
1
+
Y
0
+
B
2
+
B
3
+
Y
2
+
Y
3
+
B
4
+
Y
1
+
Y
0
+
B
2
+
B
3
+
Y
2
+
Y
3
+
B
4
+
Y
3
+
61
4.2. ANÁLISE ESTRUTURAL DE LIPÍDEOS
___________________________________________________________________
4.2.1. Análise dos padrões de fosfolipídeos
A caracterização de fosfolipídeos tem muita relevância, já que estes são
importantes lipídeos responsáveis por várias funções celulares, e sua composição
pode até mesmo ser utilizada como biomarcador em determinadas patologias como
câncer, como demonstrado por Cooks et al. (2005), que utilizando o sistema de
análise de massas por DESI, fizeram uma varredura em uma secção de pulmão,
contendo tecido saudável e tumoral e verificaram grande variação no conteúdo de
fosfolipídeos entre os tecidos.
Neste trabalho vários padrões de fosfolipídeos (Sigma) foram submetidos a
análises por injeção direta na fonte de ESI-MS, para determinação de condições
ideais de ionização e fragmentação. Os fragmentos foram designados por letras
arábicas (A-E) indicando cada ponto de clivagem, e cada fragmento foi numerado
com 1 ou 2 para identificar o lado da molécula que reteve a carga (Figura 24).
Contudo, muitos fragmentos não são observados, devido ao fato de que
dependendo do tipo de ionização apenas aqueles fragmentos ligados aos grupos
ionizáveis acabam aparecendo, e o restante se caracteriza em perda neutra.
Tipicamente os fragmentos A2, B2 e C2 não foram observados formando íons em
nenhum dos fosfolipídeos analisados.
Os fosfolipídeos, devido a diferente natureza dos grupos polares ligados ao
glicerol, podem formar íons facilmente em modo negativo, devido à presença do
grupo fosfato. No entanto, em alguns casos, como na fosfatidilcolina (PC), a
ionização ocorre em modo positivo. Isto deve-se ao fato de que a colina é formada
por de amina quaternária, o qual apresenta carga positiva. Entretanto, mesmo os
demais fosfolipídeos podem ser ionizados em modo positivo, dependendo das
condições em que são analisados. Por exemplo, o ácido fosfatídico (PA), foi obtido
em modo positivo pela substituição dos H
+
do fosfato por Na
+
, conseguido através
de um solvente contendo NaOH em pH 10 (Tabela 2).
62
Figura 24 – Fragmentação de um fosfolipídeo
(A) Estrutura geral de um fosfolipídeo, (B) perfil de fragmentação de do fosfatidilglicerol em
modo negativo
TABELA 2 – Análise dos padrões de fosfolipídeos
a
análise em modo negativo (ESI-);
b
análise em modo positivo (ESI+);
c
obtido em solução de NaOH
Fragmentos
Fosfolipídeo
Íon
precursor
A1 B1 C1 D1 E1 D2 E2
Ác. Fosfatídico
a
674 - 79 97 392 418 281 255
c
Ác. Fosfatídico (pH 10)
b
741 - 125 165 460 486 327 301
Fosfatidilcolina
b
761 104 166 184 479 505 - -
liso-Fosfatidilcolina
b
496 104 166 184 - - - -
Fosfatidiletanolanima
b
769 62 125 142 489 461 - -
Fosfatidilserina
b
789 106 169 186 507 507 - -
Fosfatidilisnositol
a
836 - 241 259 - 554 255 281
Fosfatidilglicerol
a
748 - 153 171 492 466 255 281
B1
C1
E1
D1
[M-H]
-
E2
D2
m/z 748 – R = glicerol
B
C
H
3
O
O
O
O
C
H
3
O
P
O
O
O
-
R
B1
A1
A2
B2
E1
E2
D1
D2
C1
C2
A
63
4.2.2. Análise de lipídeos da cifomedusa Phillorhiza punctata
P. punctata é uma espécie invasora de medusa (Filo Cnidária), proveniente
da região do Indo-Pacífico. Sua chegada em águas Brasileiras provavelmente
ocorreu devido à vinda de navios daquela região. Ela pode ter vindo na forma de
pólipo aderida ao casco dos navios, ou então na água de lastro destes. P. punctata é
uma espécie simbiótica fazendo associações com microalgas zooxantelas das quais
ela pode conseguir nutrientes. Durante um trabalho prévio, foram encontrados dois
glicolipídeos, de origem tipicamente vegetal, sendo monogalactosildiacilglicerol
(MGDG) e outro o sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG) atribuídos devido a presença
das microalgas. Estes dois glicolipídeos já foram estudados durante o
desenvolvimento da dissertação de mestrado, na qual também foi encontrado um
ácido graxo poliinsaturado tipicamente de dinoflagelados, o ácido docosahexaenóico
(DHA) (SOUZA, 2003).
No presente trabalho, foi isolado e caracterizado um terceiro lipídeo, presente
na fração Pp-F6, proveniente do fracionamento em coluna de sílica-gel, o qual foi
negativo na TLC quando corado com orcinol-H
2
SO
4
, e, portanto não se tratava de
um glicolipídeo. Contudo, apenas uma banda apareceu quando a TLC foi submetida
à análise com ninhidrina, e também apenas uma banda de mesmo R
f
quando a TLC
foi revelada com o reativo de molibdato (DITTMER e LESTER, 1964). Este resultado
indicou a presença de um lipídeo contendo amina e fósforo na sua composição
química. A seguir este lipídeo foi submetido a uma série de análises de NMR e ESI-
MS para determinação de sua estrutura.
4.2.2.1. Análise do lipídeo presente na fração Pp-F6 por NMR
Como se tratava de um lipídeo contendo fósforo na composição, esta amostra
foi submetida à análise de
31
P-NMR, que forneceu apenas um sinal em δ 21,26.
Como os deslocamentos químicos esperados para fosfolipídeos convencionais
ocorrem tipicamente entre δ -1 e ~3 (ESTRADA et al., 2008), foi possível inferir que
este não era um fosfolipídeo tradicional. Lipídeos de cnidários podem apresentar
grandes concentrações de lipídeos polares, como glicerofosfolipídeos e
64
esfingofosfonolipídeos, já encontrados na medusa Pelagia noctiluca e Aurelia aurita
(NAKHEL et al., 1988; KARIOTOGLOU e MASTRONICOLIS, 2001). Os
esfingofosfonolipídeos foram identificados como ceramidas aminoetilfosfonadas com
alguns análogos metilados. Assim como os fosfolipídeos, os fosfonolipídeos são
elementos estruturais da membrana celular e podem ter função na permeabilidade e
estabilização da membrana (KARIOTOGLOU e MASTRONICOLIS, 2003).
O espectro de
31
P obtido da fração Pp-F6 foi comparado com o espectro de
31
P obtido de um padrão de ácido 2-aminoetil-fosfônico (2-AEP), com deslocamento
δ 20,40. Este resultado sugeria que o grupo fosfato do fosfolipídeo estivesse
diretamente ligado a um carbono na estrutura, similar ao 2-AEP, e, como na
estrutura dos fosfonolipídeos.
Esta estrutura começou a ganhar forma através dos espectros 1D e 2D de
1
H,
13
C, e
31
P e DEPT. Um característico duplete em δ 23,3 e 24,6 foi formado devido ao
seu acoplamento com
31
P, já que os espectros foram obtidos desacoplados apenas
do
1
H. Estes sinais tiveram um constante de acoplamento de J = 132 Hz,
semelhante ao obtido para o 2-AEP, sugerindo similaridade entre eles. Os espectros
de
13
C e
13
C DEPT, mostraram alguns sinais característicos da esfingosina em δ
53,7, 63,5 e 70,8 (Figura 25). Estes sinais foram similares aos encontrados no
espectro de um padrão esfingomielina (Sigma-Aldrich), indicando a presença de um
carbono ligado a nitrogênio (C-2 da esfingosina, δ 53,7), e dois outros ligados a
hidroxilas. Como no espectro de DEPT houve a inversão do sinal em δ 63,5, foi
possível determinar que este era o C-1 e o sinal em δ 70,8 sendo sinal do C-3 da
esfingosina. Os outros sinais invertidos no espectro de DEPT, entre δ 20 e 40,
referem-se aos demais CH
2
da cadeia da esfingosina e do ácido graxo ligado à
estrutura. Com isso foi possível inferir a presença de um esfingofosfonolipídeo.
Outros quatro sinais no espectro de
13
C também foram observados com
deslocamentos químicos em campo de maior energia (maior ppm), em δ 128,9,
129,3, 130,6 e 133,7, característicos de carbonos participando de duplas ligações
65
Figura 25 – Espectro de
13
C-DEPT da fração Pp-F6
Os espectros bi-dimensionais de
1
H/
13
C-HMQC e
1
H/
1
H-TOCSY (Figura 26 A,
B) também foram realizados, fornecendo importantes informações sobre a estrutura,
principalmente a respeito da configuração das duplas ligações, que foi determinada
por suas constantes de acoplamento. Uma dupla ligação foi localizada entre C-4/C-
5, em δ 5.755/133.70 e 5.476/129.30, com J
H-H
= 16,7 Hz e a outra entre C-8/C-9,
em δ 5.480/128.90; 5.430/130.6, com J
H-H
= 18,1 Hz. Estas constantes são
características de configuração trans (FROST e GUNSTONE, 1975), sugerindo que
o lipídeo é uma ceramida 2-aminoetilfosfonato (CAEP), cuja base de cadeia longa
trata-se de um 1,3-dihidroxi-2-amino-4, 8-trans-octadecadieno.
Já o espectro de
1
H/
31
P-HMBC apresentou informações importantes sobre a
ligação C-P, confirmando que a estrutura contém um grupamento aminoetilfosfonato
similar ao 2-AEP (Figura 26 C-E).
C
H
3
O
H
N
H
C
H
3
O
O
P
N
H
3
+
O
-
O
C-1
C-3
C-2
C-2'
C-1'
a,b
CH
3
C-8
C-5
C
-
9
C-4
1
2
3
4
1
5
8
9
1’
2’
66
Figura 26 – Espectros de 2D-NMR da fração Pp-F6
(A) Espectro de
1
H/
13
C-HMQC, (B)
1
H/
1
H-TOCSY, (C)
1
H/
31
P-HMBC da fração Pp-F6, (D)
1
H/
31
P-
HMBC do 2-AEP, e (E) conectividades entre
1
H e
31
P no espectro de HMBC da Fração Pp-F6
4.2.2.2. Análise do lipídeo da fração Pp-F6 por ESI-MS
A fração Pp-F6 foi submetida a análises ESI-MS. A ionização em modo
positivo deu um principal íon quasi-molecular de m/z 644 [M+H]
+
(Figura 27 A), que
foi consistente com a estrutura do CAEP contendo um ácido palmítico (C
16:0
). Outros
íons de maior m/z e menor abundância foram atribuídos ao CAEP com outros ácidos
graxos maiores. Tandem-MS foi realizado e os principais fragmentos foram
observados em m/z 519 que representa a remoção do grupo 2-AEP, m/z 501,
formado pela desidratação do íon anterior (Figura 27 B). Outros fragmentos de m/z
280 e 262 foram atribuídos à porção esfingosina, confirmando a estrutura da base
como 1,3-dihidroxi-2-amino-4,8-trans-octadecadieno.
E
B
A
B
C
D
67
Figura 27 – Espectros positivos de ESI-MS e CID-MS da fração Pp-F6
(A) Espectro de ESI-MS, e (B) fragmentação do ion com m/z 644
Para confirmar a presença de apenas uma estrutura de esfingosina, a
amostra foi hidrolisada segundo Watanabe et al. (2001), e acetilada para injeção em
GC-MS. No entanto, apenas os ácidos graxos C
16:0
(70%), C
17:0
(9%) e C
18:0
(21%)
foram encontrados. O material hidrolisado foi então submetido a análise por ESI-MS,
nos modos de ionização negativo e positivo dando sinais em m/z 403 [M-H]
-
, 405
[M+H]
+
(Figura 28 A), respectivamente. Estes resultados foram consistentes com a
esfingosina ligada ao 2-AEP, devido a hidrólise incompleta, que removeu os ácidos
graxos, mas não o grupo cabeça polar (PHG – polar head group). Contudo, foi
possível inferir que apenas um tipo de esfingosina estava presente no CAEP, sendo
que os demais íons observados eram realmente devido à presença de outros tipos
de ácidos graxos, os quais foram removidos durante a hidrólise. Ambos os íons
formados no modo negativo e positivo foram submetidos à fragmentação, mas
devido as suas características, o modo positivo gerou mais informações estruturais,
C
H
3
O
H
N
H
C
H
3
O
O
P
N
H
3
+
O
H
O
m/z
519
501 [M
-
H
2
O]
+
m/z
280
262 [M
-
H
2
O]
+
A B
68
já que no modo negativo apenas o PHG apareceu, devido à presença do grupo
fosfonato. O principal íon positivo de m/z 405 quando fragmentado gerou íons de
m/z 280 e 262 (Figura 28 B), consistentes com a estrutura da base de cadeia longa
1,3-dihidroxi-2-amino-4,8-trans-octadecadieno, confirmando que as duplas ligações
fazem parte da estrutura da esfingosina e não dos ácidos graxos. Outros íons de m/z
126 e 94 são consistentes com o esperado para o AEP, confirmando assim a
estrutura observada nos espectros de NMR.
Figura 28 – Espectros de ESI-MS e CID-MS em modo positivo, da fração Pp-F6 após
hidrólise
(A) Espectro de ESI-MS e (B) CID-MS em modo positivo da fração Pp-F6 hidrolizada
C
H
3
O
H
N
H
2
O
P
N
H
3
+
O
H
O
m/z
280
26
2 [M
-
H
2
O]
+
m/z
126
A
B
69
4.2.3. Análise dos lipídeos de folhas de Maytenus ilicifolia
Embora M. ilicifolia seja uma planta de grande interesse científico, dado ao
grande número de atividades biológicas atribuídas a ela, os trabalhos publicados no
meio científico não trazem estudos relacionados ao conteúdo de lipídeos presentes
nesta planta. Aqui serão apresentados alguns resultados obtidos com extratos
lipídicos das folhas de M. ilicifolia.
O extrato Mi-EL foi submetido à análises preliminares por ESI-MS em modo
positivo e negativo (Figura 29 A e B) a fim de identificar a presença de lipídeos.
Porém, foi observado um grande conteúdo de flavonóides (que serão descritos mais
tarde). Então optou-se por realizar um particionamento antes de continuar as
análises. Neste aspecto, extrato Mi-EL foi solubilizado em 300 mL de CHCl
3
-MeOH
(2:1, v/v), em seguida foi adicionado 100 mL de H
2
O, obtendo uma razão entre os
solventes de 2:1:1, v/v. A mistura foi vigorosamente agitada, e em seguida mantida
em repouso em geladeira, para que houvesse a formação de duas fases. As fases
foram separadas em funil de separação gerando uma fase inferior (chamada de Mi-
EL-I) contendo os compostos solúveis em CHCl
3
, e outra superior (chamada de Mi-
EL-S), contendo os compostos solúveis em MeOH-H
2
O.
Figura 29 – Espectros ESI-MS do extrato Mi-EL
A
B
(A) ESI
-
MS
em modo negativo, e (B) em modo positivo
70
As duas fases (Mi-EL-I e Mi-EL-S) foram submetidas a análises por ESI-MS,
em modo positivo e negativo (Figura 30 A-D), e foi possível verificar que o
particionamento foi eficiente para remoção dos flavonóides (os quais serão descritos
mais adiante), que ficaram retidos da fase superior (Mi-EL-S), enquanto que os
lipídeos ficaram na fase de CHCl
3
(Mi-EL-I). Com isso, apenas a fração Mi-EL-I foi
utilizada nesta etapa, para identificação de seus lipídeos por tandem-MS.
Figura 30 – Espectros ESI-MS em modo positivo e negativo da fração Mi-EL-S e Mi-EL-I
ESI-MS em modo positivo (A), e negativo (B) da fase superior do particionamento do extrato Mi-
EL; e ESI-MS em modo positivo (C), e negativo (D) da fase inferior.
A
B
C
D
Mi-EL-S ESI+ Mi-EL-S ESI-
Mi-EL-I ESI+ Mi-EL-I ESI-
71
4.2.3.1. Identificação dos lipídeos de Maytenus ilicifolia, presentes na fração
Mi-EL-I por tandem-MS em modo positivo
O principal foco desta etapa são os glicolipídeos vegetais, que são
tipicamente compostos por glicolipídeos neutros, como os galactolipídeos que
apresentam melhor ionização em modo positivo, pois de modo geral necessitam de
um cátion como Na
+
para produzirem íons. Mas, no modo positivo de ionização os
íons mais abundantes não foram referentes aos glicolipídeos e apareceram com m/z
551, 593, 609, 872 e 888. Estes compostos não foram identificados, mas seu perfil
de fragmentação por CID-MS (Figura 31 A-E) sugere que eles apresentam uma
estrutura em comum com diferentes substituintes já que os fragmentos de massa
são semelhantes. Como pode ser visto, o íon precursor de m/z 872 deu origem a um
fragmento de m/z 593, enquanto que o íon precursor de m/z 888 deu origem ao
fragmento de m/z 609. A diferença entre os íons precursores e seus fragmentos é de
279 m.u., a qual é equivalente à perda de um ácido linolêico (C
18:2
).
Embora para a correta determinação destas estruturas seja necessária sua
purificação e análises por NMR, é possível que estas estruturas sejam derivadas de
triterpenos, como os recentemente determinados em M. ilicifolia, que embora não
tenham apresentando ligações com ácidos graxos, continham um ácido 4-metoxi-5-
hidroxi-benzóico ligado a um núcleo triterpenóide, recebendo o nome de Milicifolina
A (GUTIÉRREZ et al., 2007). Esta estrutura poderia formar íons de m/z 609 [M+Na]
+
,
e se acilada pelo ácido linolêico daria o íon de m/z 872. Contudo, quando
fragmentado o íon de m/z 872, ele poderia não gerar o fragmento de m/z 609, mas
sim o fragmento de m/z 593, porque na quebra a Milicifolina A pode estar perdendo
um átomo de oxigênio (Figura 31 A). Os demais compostos observados podem ser
estruturas semelhantes contendo mais hidroxilas, ou então podem ter sido formados
devido à ionização com K
+
.
72
Figura 31 – Espectros de CID-MS em modo positivo dos principais íons da fração Mi-EL-I
*(A) Estrutura meramente especulativa, mostrando a Milicifolina A acilada por um ácido linolêico
(necessita de outros experimentos para confirmação). CID-MS dos em modo positivo dos íons de m/z
593 (A) e 609 (B); notar que estes íons e seu fragmentos se repetem nos espectros de CID-MS dos
íons de m/z 872 (D) e 888 (E).
Na
+
O
H
O
C
H
3
C
H
3
O
C
H
3
O
O
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
O
CH
3
O
C
H
3
m/z
593
NL 279
*A
B
D
C
E
73
Embora as estruturas dos principais íons observados não tenham sido
elucidadas, um íon de m/z 938 [M+Na]
+
, que apareceu no espectro de massas da
fração Mi-EL-I, gerou fragmentos consistentes com a estrutura esperada de um
digalactosildiacilglicerol (DGDG). Os fragmentos que dão suporte a esta conclusão
são Y
1
+
, de m/z 775, B
2
+
de m/z 347 e B
1
+
de m/z 185. O íon de m/z 203 parece ser
proveniente do fragmento C
1
+
, consistente com o esperado para hexoses. Outros
fragmentos que não participam da nomenclatura de Domon e Costello (1988),
também dão suporte à estrutura de um diglicosil-lipídeo, por exemplo os fragmentos
de m/z 660 e 681, consistentes com a remoção de um ácido linolênico (C
18:3
), ou um
ácido palmítico (C
16:0
), respectivamente. Já o fragmento de m/z 405 é consistente
com o dissacarídeo ligado ao esqueleto carbônico do glicerol (Figura 32).
O tipo de ligação interglicosídica e quais monossacarídeos fazem parte desta
estrutura ainda precisam ser confirmados por outras técnicas. Contudo
galactolipídeos são bastante comuns em tecidos vegetais, principalmente nos
cloroplastos, nos quais podem representar a maior parte do conteúdo lipídico, sendo
essenciais para máxima eficiência da fotossíntese (HÖLZL e DÖRMANN, 2007).
Figura 32 – Espectro de CID-MS em modo positivo de um diglicosildiacilglicerol presente na
fração Mi-EL-I
O
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
C
H
3
O
C
H
3
B
1
+
C
1
+
B
2
+
Y
1
+
m/z
681
m/z
660
B
2
+
Y
1
+
B
1
+
C
1
+
Na
+
74
4.2.3.2. Identificação dos lipídeos de Maytenus ilicifolia por tandem-MS em
modo negativo
A fração Mi-EL-I rendeu dois principais lipídeos por ESI-MS em modo
negativo. Lipídeos contendo grupos ácidos como alguns fosfolipídeos são melhor
observados pelo modo negativo, contudo os dois principais íons observados, com
m/z 794 e 816 foram consistentes com sulfonolipídeos, outra classe de glicolipídeos
comuns em tecidos vegetais. Assim como os galactolipídeos, os sulfonolipídeos são
comumente encontrados perfazendo grande parte do conteúdo lipídico dos
cloroplastos, os quais parecem estar envolvidos com complexos protéicos,
juntamente com outros lipídeos carregados (ANDERSON, 1975). Os
sulfonoglicolipídeos apresentam uma unidade de α-quinovose (6-desoxiglucose)
com um grupo sulfonil em C-6, e portando são denominados de
sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG). Por ser freqüentemente encontrado em tecidos
vegetais, o SQDG é referido como o “sulfolipídeo de plantas” (BENSON, 1963).
Pelo menos a metade dos ácidos graxos ligados ao SQDG está na forma de
ácido palmítico (GOUNARIS e BARBER, 1985), sendo consistente com as estruturas
apresentadas aqui. O íon precursor de m/z 794 (Figura 33 A) gerou fragmentos
indicando que o lipídeo está acilado por duas unidades de ácido palmítico (C
16:0
), já
que produziu apenas um tipo de fragmento decorrente da perda de um ácido graxo,
com m/z 538. O íon precursor de m/z 794 poderia ser formado também por uma
composição de ácidos graxos com cadeias de 14 e 18 carbonos (ácidos mirístico e
esteárico, respectivamente). Contudo seriam esperados fragmentos de m/z 510 e
566, os quais não estavam presentes no espectro. Além disso, o único fragmento
atribuído a um ácido graxo é compatível com o ácido palmítico, com m/z 255.
Os fragmentos do grupo polar são: m/z 283, compatível com a remoção dos
dois ácidos graxos, o fragmento B
1
-
aparece com m/z 225. O grupo sulfonil forma
dois fragmentos, um de m/z 95, quando ligado ao grupo CH
3
proveniente do
monossacarídeo, e outro de m/z 81, formado pela remoção do grupo CH
3
, com
concomitante transferência de um hidrogênio para o fragmento. Outros fragmentos
observados parecem fazer parte das quebras ocorridas no interior do anel
glicosídico, sendo que são observados àqueles fragmentos contendo o grupo
sulfonato (Figura 33 A).
75
O outro íon identificado como proveniente do SQDG, com m/z 816, produziu
fragmentos com m/z 560 pela remoção de um ácido palmítico, e com m/z 538
consistente com a remoção de um ácido linolênico, sendo que ambos os ácidos
graxos foram observados com m/z 255 e 277, respectivamente. Os demais
fragmentos são similares aos já descritos (Figura 33 B).
Figura 33 – Espectro de CID-MS em modo negativo de sulfonoglicolipídeos presentes na
fração Mi-EL-I
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
C
H
3
O
S
O
O
O
-
C
H
3
O
m/z 81
m/z 95
m/z 538
m/z 255
m/z 538
m/z 255
m/z 225
A
277
560
O
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
C
H
3
O
C
H
3
S
O
O
O
-
m/z 81
m/z 95
m/z 538
m/z 277
m/z 560
m/z 255
m/z 225
B
(A) Estrutura e fragmentação do sulfonoglicolipídeo contendo 2 ácidos palmíticos
ligados ao glicerol, e (B) contendo um ácido palmítico e um ácido linolênico.
76
4.2.4. Análise dos lipídeos da arquea Haloarcula marismortui
Lipídeos de arqueas diferem dos demais organismos pela presença de
ligações do tipo éter, formando estruturas chamadas de arqueol, contendo
tipicamente dois grupos fitanil (estruturas contendo 20 carbonos cada) ligados ao
glicerol, cadeias de 15 e 25 carbonos também já foram descritas (MANCUSO et al,
1985). Os maiores lipídeos, contudo, apresentam duas cadeias com 40 carbonos
cada, ligados a duas moléculas de glicerol, pelas duas extremidades, formando os
lipídeos tetra-éter (MACALADY et al., 2004). A primeira descrição dos lipídeos de H.
marismortui por Evans et al. (1980) forneceu informações importantes sobre a
estrutura dos fosfolipídeos. Isto foi, sobretudo, realizado através análises em TLC e
por composição química elementar. Apenas a estrutura de um glicolipídeo neutro foi
determinada por NMR e análises metilação. Mais tarde Klöppel e Fredrickson (1991)
empregando FAB-MS, forneceram mais informações sobre os fosfolipídios, e, além
disso, eles sugeriram a presença de lipídeos contendo cadeias insaturados.
Os lipídeos de H. marismortui foram extraídos com CHCl
3
-MeOH, gerando um
material solúvel de cerca de 200 mg (chamado de Hm-EL), incluindo pigmentos que
puderam ser observados pela intensa coloração avermelhada do extrato. A presença
de fosfolipídios foi acompanhada por TLC, utilizando o reativo de molibdato
(DITTMER e LESTER, 1964). A amostra foi então analisada por ESI-MS em modo
negativo e positivo, confirmando a presença de diversos fosfolipídeos (Figura 34 A,
B).
Figura 34 – Espectros de ESI-MS da fração Hm-EL
(A) ESI-MS em modo negativo e (B) modo positivo.
A B
77
Para facilitar a correlação entre os fragmentos obtidos por CID-MS e as
estruturas dos fosfolipídeos, foi desenvolvida uma nomenclatura específica, na qual
os fragmentos são denominados de α
n
e π
n
, onde α indica fragmentos contendo o
arqueol e π indica os fragmentos contendo o PHG, contando a partir do fosfato
ligado ao arqueol, e o subscrito n indica a posição da quebra (por exemplo, α
4
, π
2
-
Figura 35). Como as diferenças estruturais entre estes lipídeos ocorrem
principalmente na cabeça polar grupo (PHG), as principais diferenças entre os
espectros de massa foram encontrados em fragmentos π
1
e π
2
, que são
característicos de cada fosfolipídeo. Contudo os fragmentos devem ser avaliados
com cautela, devido à formação de fragmentos em m/z 97 e 79, que são
característicos de grupos fosfato e fosfato desidratado, respectivamente, ocorrendo
em todos os fosfolipídeos.
Figura 35 – Nomenclatura para os fragmentos observados nos fosfolipídeos de H.
marismortui
A utilização da nomenclatura também permitiu a fácil identificação dos
fosfolipídeos contendo cadeia insaturadas, pelo cálculo da perda neutra (NL)
referente ao arqueol, que pode ser deduzida subtraindo o fragmento π
2
do íon quasi-
molecular. Com isto foram determinadas três estruturas para os grupos arqueol
presentes nos lipídeos de H. marismortui: àqueles com NL de 653 m.u.,
correspondendo ao arqueol saturado; com NL de 647 m.u., correspondendo ao
arqueol tri-insaturado; e com NL de 641 m.u., correspondendo ao arqueol hexa-
insaturado.
α
3
α
4
α
5
α
6
α
7
π
4
π
5
π
6
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
O
H
P
O
O
H
O
C
H
3
π
1
π
2
π
3
α
1
α
2
78
4.2.4. Análise dos fosfolipídeos da arquea Haloarcula marismortui
4.2.4.1. Arquetidil fosfato (aPA)
O mais simples fosfolipídeo encontrado por ionização negativa, apareceu com
m/z 732 [M-H]
-
, sendo coerente com a estrutura do aPA, que foi confirmado pelo seu
perfil de fragmentação por CID-MS em modo negativo, que indicou a presença de
uma cadeia saturada com NL de 653 m.u. (Figura 36). O aPA não foi observado
formando íon no modo positivo de ionização.
Figura 36 – Estrutura e espectro de CID-MS em modo negativo do arquetidil fosfato
4.2.4.2. Arquetidil fosfoglicerol (aPG)
O aPG apareceu formando íons de m/z 806 [M-H]
-
, com dois análogos
insaturados de m/z 800 [M-H]
-
e 794 [M-H]
-
. Estes íons foram fragmentados por CID-
MS gerando caracteristicamente os fragmentos de m/z 171, 153, e 79, que
correspondem ao glicerofosfato, glicerofosfato desidratado e fosfato desidratado,
respectivamente. O íon de m/z 800 foi identificado como proveniente do aPG tri-
insaturado, produzindo uma NL de 647 m.u., coerente com a estrutura do
dihidrogeranilgeranil-fitanilglicerol, enquanto que aquele com m/z 794 foi identificado
como hexa-insaturado, dando origem a uma NL de 641 m.u., coerente com 2,3-
dihidrogeranilgeranil glicerol (Figura 37 A-C). Além disso, a confirmação da presença
destes lipídeos insaturados foi obtida em ESI-MS positivo dos lipídeos hidrolisados,
pelo aparecimento dos íons sodiados de m/z 670 e 664, os quais correspondem ao
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
CH
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
H
O
-
π
1
π
2
-653
π
1
π
2
79
arqueol tri- e hexa-insaturado, respectivamente. O íon mais abundante refere-se
justamente ao arqueol saturado, com m/z 676 [M+Na]
+
(Figura 37 D).
Assim, em contraste com Klöppel e Fredrickson (1991), que observaram
intensos íons em seus espectros de massa, que foram atribuídos a lipídios
insaturados, aqui foram encontrados apenas íons de baixa abundância,
interpretados como fosfolipídios insaturados.
Figura 37 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo do arquetidil fosfoglicerol
e seus análogos insaturados
Espectros de CID-MS do aPG de cadeia saturada (A), tri-insaturada (B) e hexa-insaturada
(C); ESI-MS em modo positivo do extrato após hidrólise confirmando a presença de arqueol saturado
(m/z 676) tri-insaturado (m/z 670) e hexa-insaturado (m/z 664).
π
1
π
2
[M-H]
-
π
2
π
1
α
4
α
4
-653
π
2
π
1
[M-H]
-
α
4
π
1
π
2
α
4
-641
π
1
π
2
[M-H]
-
π
2
π
1
α
4
α
4
-647
C
D
A
B
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
H
O
H
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
H
O
H
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
H
O
H
80
4.2.4.3. Arquetidil fosfoglicerosulfato (aPGS)
O íon de m/z 886 quando submetido ao tandem-MS originou fragmentos π de
m/z 233 (π
2
), 171 (π
3
), 153 (π
4
), 97 (π
5
), 79 (π
6
) e os fragmentos de α de m/z 732 (α
4
)
e 806 (α
6
), sendo consistentes com a estrutura do ácido fosfoglicerosulfato (Figura
39 A, p. 82). Contudo, uma estrutura análoga contendo um grupo fosfato no lugar do
sulfato, o arquetidil fosfoglicerofosfato (aPGP) já foi descrito na composição de
lipídeos de H. marismortui (EVANS et al, 1980). Estes dois lipídeos são isóbaros, e
apresentam massa molecular média não iônica de 887,19 Da (aPGP) e 887,27 Da
(aPGS). A fim de distinguir entre as duas estruturas um espectrômetro de massas de
alta resolução é necessário. No entanto, foi possível inferir qual estrutura estava
presente no extrato utilizando algumas características que diferem entre os grupos
sulfatos e fosfatos. Como ambas as estruturas podem formar íons com múltiplas
cargas, a primeira característica que pôde ser observada foi a formação de um íon
duplamente carregado, de m/z 443 (m = 886 / z = -2), que por si ainda não foi
suficiente para diferenciar aPGS de aPGP. Mas como o aPGP poderia formar íons
triplamente carregados, poderia se esperar a presença de um íon de m/z 295, o
qual não foi encontrado no espectro. Apenas a ausência de um íon triplamente
carregado não é suficiente para excluir a presença do aPGP, já que a formação
deste íon poderia estar sendo impedida devido a forte repulsão coulômbica causada
por duas cargas negativas em um mesmo grupo fosfato.
Como informação adicionais eram necessárias, outra estratégia foi utilizada
considerando a capacidade destes lipídeos de serem marcados com deutério. Como
eles diferenciam-se na capacidade de assimilar deutério, já que existem 2 sítios
disponíveis para câmbio no aPGS e 3 no aPGP (Figura 38), eles deveriam formar
íons com diferença de massa de 1 Da, esperados em m/z 888 (aPGS) e 889
(aPGP). A amostra foi então marcada com deutério por duas sucessivas
solubilizações em CHCl
3
-MeOD-D
2
O (7:2:1) seguidas de evaporação. A amostra foi
então solubilizada no mesmo solvente deuterado e analisada por injeção direta no
ESI-MS. Conforme o esperado o íon de m/z 888 apareceu no espectro de massas
indicando que a marcação com deutério foi eficiente. Contudo este íon foi seguido
de dois outros de m/z 889 e 890 que referem-se abundância isotópica elementar
natural. Esta abundância isotópica já havia sido observada no espectro da amostra
81
antes da marcação com deutério, através da formação dos íons de m/z 886, 887 e
888 com uma razão entre eles de 1,4:0,7:0,1 (Figura 39 B e C). Como esta relação
se manteve inalterada após a marcação com deutério, foi possível inferir que aPGP
não estava presente, já que seria esperado um aumento principalmente na
proporção do íon de m/z 889. Como este aumento não ocorreu, este íon foi
proveniente apenas do isótopo natural de m/z 887 e não do aPGP.
Figura 38 – Esquema de substituição de H por D nos grupos polares do aPGS e do aPGP
D – indica os pontos onde os H
+
foram substituídos por D
+
Para que não restassem dúvidas quanto a ausência do aPGP, outra
estratégia levando em consideração o grau de ionização dos lipídeos foi utilizada.
Agora os H
+
provenientes dos grupos ácidos dos lipídeos foram trocados por Na
+
pela utilização de solução de NaOH no solvente, até pH 10, e a análise foi realizada
em modo positivo. A fim de garantir que este pH seria suficiente para
desprotonação completa, o solvente foi testado em um padrão de ácido fosfatídico
(PA) (Sigma-Aldrich), o qual havia formado um íon negativo principal de m/z 674,
compatível com PA contendo ácidos palmítico e oléico. Por ESI-MS em modo
positivo utilizando o solvente alcalino, o principal íon foi observado em m/z 741,
consistente com o PA [M-2H+3Na]
+
, e outros íons equivalentes ao PA mono- e di-
sodiado não foram formados, mostrando que nestas condições de análise, todos os
H
+
foram substituídos por Na
+
.
A amostra foi então submetida às mesmas condições de análise do padrão de
PA, e como resultado foi obtido um íon de m/z 954, coerente com o aPGS [M-
2H+3Na]
+
. Por outro lado, o íon para o aPGP [M-3H+4Na]
+
, esperado em m/z 976,
não foi observado no espectro, confirmando a ausência de aPGP. (Figura 39 D).
Além disso, tandem-MS do íon precursor de m/z 954 deu origem a um fragmento de
m/z 799, identificado como sendo de fragmento α
4
, que é equivalente à estrutura do
O
O
P
O
O
O
-
O
P
O
O
O
R
D
D
D
O
O
S
O
O
O
-
O
P
O
O
O
R
D
D
82
aPA triplamente sodiado, o que confirma que estas condições foram suficientes para
causar desprotonação completa dos grupos fosfato. Isto mostra que a ausência de
um íon com m/z 976 é devido à ausência de aPGP, e não por uma desprotonação
incompleta, o que levaria a formação do íon de m/z 954 a partir do aPGP [M-
2H+3Na]
+
.
Uma versão insaturada apareceu com m/z 880 [M-H]
-
, sendo identificado
como contendo arqueol tri-insaturado. Este lipídeo quando marcado com deutério foi
deslocado para m/z 882, e na presença de NaOH, formou sais de sódio com m/z
948 [M-2H+3Na]
+
, mostrando também ser proveniente do aPGS (Tabela 3, p. 86).
Figura 39 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo e positivo do arquetidil
fosfoglicerosulfato
Estrutura e fragmentação do aPGS em modo negativo (A) e positivo em pH 10 (B). ESI-MS em modo
negativo mostrando o íons quasi-moleculares do aPGS na marcado (C) e do aPGS deuterado (D)
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
O
H
S
O
H
O
O
π
5
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
-
O
O
H
S
O
-
O
O
Na
+
Na
+
Na
+
π
2
π
4
π
5
π
6
α
4
α
5
[M-2H+3Na]
+
-
653
π
2
α
4
π
4
α
6
π
3
[M-H]
-
-653
π
5
π
2
α
4
π
4
α
6
π
3
π
2
π
4
π
5
α
4
α
5
A
D
B C
83
4.2.4.4. Arquetidil fosfoglicerofosfato metil éster (aPGP-Me)
Embora os resultados aqui sejam semelhantes aos já obtidos em análises de
lipídeos de H. marismortui o fosfolipídeo encontrado formando íon de maior
intensidade não havia sido descrito previamente por Evans et al. (1980). Este
fosfolipídeo foi identificado como sendo o arquetidil fosfoglicerofosfato metil éster
(aPGP-Me) através dos íons negativos de m/z 450 [M-2H]
2
, 900 [M-H]
-
, e 922 [M-
2H+Na]
-
, assim como os íons positivos em m/z 924 [ M+Na]
+
, 946 [M-H+2Na]
+
, e 968
[M-2H+3Na]
+
(Figura 40 A-E). Este lipídeo tem estrutura similar ao aPGP, e sua
presença parece estar ligada à manutenção da integridade celular, uma vez que
membranas arqueas halofílicas precisam manter a sua estabilidade em altas
concentrações de sal (3-5 M NaCl), enquanto que as membranas das não-
halofílicas, que não apresentam aPGP-Me, são instáveis e permitem vazamentos
em tais condições (TENCHOV et al., 2006).
A estrutura do aPGP-Me foi confirmada através tandem-MS em modo
negativo, que gerou o fragmento de baixa intensidade π
2
de m/z 247 e o íon mais
abundante (íon base) sendo o π
5
de m/z 111, correspondentes aos grupos
fosfoglicerofosfato metil éster, e fosfato metil éster, respectivamente. Além disso,
também gerou o fragmento α
7
de m/z 868 correspondendo à remoção do grupo O-
CH
3
, que juntamente com os demais fragmentos tipo α confirmam a estrutura (Figura
40 A). O íon negativo referente à forma monossódica deste lipídeo (m/z 922),
também foi analisado por tandem-MS, gerando um perfil de fragmentação com íons
de intensidade totalmente diferentes daqueles encontrados anteriormente, com íon
base sendo o fragmento π
2
, de m/z 269. Novamente aqui o importante fragmento α
7
,
indicando a remoção do grupo O-CH
3
foi encontrado com m/z 890 (Figura 40 B).
84
Em modo positivo, o aPGP-Me formou 3 íons pseudo-moleculares com m/z
924 [M+Na]
+
, 946 [M-H+2Na]
+
, e 968 [M-2H+3Na]
+
), que poderiam levar a uma
superestimação do conteúdo lipídico de H. marismortui. Estas diferenças são
formadas devido a capacidade do aPGP-Me formar íons mono-carregados contendo
1, 2 ou 3 unidades de Na
+
, sendo que uma destas unidades está servindo como
adutor (isto é, formando o íon) enquanto que as outras aparecem substituindo os H
+
dos grupos ácidos. Estes íons também foram analisados por tandem-MS, e o que
observou-se foi que cada tipo de íon precursor gerou um perfil de fragmentação
próprio, apresentando fragmentos de massas diferentes devido a presença de Na
+
em quantidades diferentes, mas principalmente por diferenças nas intensidades dos
fragmentos π e α, como por exemplo, o íon base encontrado em cada espectro de
massa foi diferente, π
1
(m/z 289) na forma mono-sódica, π
4
(m/z 199) na forma di-
sódica e π
2
(m/z 315) na forma tri-sódica. Isto poderia colaborar para interpretação
errônea dos espectros, e consequentemente levar a superestimação do conteúdo
lipídico de H. marismortui. Este efeito pôde ser evitado utilizando o NaOH no
solvente para gerar apenas o íon de m/z 968.
85
Figura 40 – Estrutura e espectros de CID-MS em modo negativo e positivo do arquetidil
fosfoglicerofosfato metil éster
(A) Estrutura e fragmentações do aPGP-Me, (B e C) CID-MS em modo negativo; e modo positivo
mono-sódico (D), di-sódico (E), e tri-sódico (F).
α
6
α
7
α
5
π
2
π
1
[M
-
2H+Na]
-
-653
255
[
π
2
– CH
3
]
π
2
π
3
185
95
806
π
5
π
6
α
4
α
7
α
5
α
6
[M
-
H]
-
-
653
π
4
-CH
2
π
1
π
2
π
3
π
4
π
5
α
7
α
2
α
6
α
4
[M+Na
+
]
+
π
1
π
2
π
4
π
5
α
2
[ M-2H+3Na]
+
π
4
-CH
2
π
6
-CH
2
α
4
α
7
α
5
α
6
α
4
+2Na
+
π
1
π
2
π
3
π
4
-CH
2
π
5
[M-H+2Na
+
]
+
α
5
α
6
α
4
α
2
π
6
-CH
2
α
2
α
4
α
5
α
6
α
7
π
3
π
2
π
1
π
4
π
5
π
6
C
H
3
O
C
H
2
C
H
3
O
C
H
C
H
2
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
P
O
O
O
H
O
O
H
P
O
O
H
O
C
H
3
A B
C D
E F
86
TABELA 3 –Tandem-MS dos fosfolipídeos de H. marismortui
a
cadeia saturada;
b
tri-insaturada;
c
hexa-insaturada; IM: íon-molecular (pseudo e quasi); NL: perda
neutra (IM - π
2
) em tandem-MS negativo. * Fragmentos formados a partir do aPGP-Me com a perda
do grupo metil.
4.2.4.4. Estrutura do triglicosilglicerolipídeo di-éter (TGD)
Embora Evans et al. (1980) em suas análises por TLC comentam sobre a
presença de três bandas positivas para glicolipídeos com detecção por 0,5% α-
naftol-H
2
SO
4
, neste trabalho apenas um banda positiva foi encontrado em análise
por TLC utilizando orcinol-H
2
SO
4
na detecção. Em análise por ESI-MS em modo
positivo foi observado um íon de m/z 1162, compatível com a forma sodiada do
triglicosil-arqueol descrito por Evans et al. (1980). Quando o íon de m/z 1162 foi
analisado por CID-MS foi possível confirmar a presença de um trissacarídeo
composto por unidades de hexoses, exibindo o mesmo tipo de comportamento
mostrado pelos oligossacarídeos, que quando fragmentados, resultaram na
CID-MS em modo positivo
Fosfolipídeos IM NL
π
1
π
2
π
3
π
4
π
5
π
6
α
2
α
4
α
5
α
6
α
7
a
aPA [M+Na
+
]
+
756 - 121 - - - - - - - - - -
a
aPG [M+Na
+
]
+
830 - 195 177 - - - - 676 756 - - -
a
aPG [M-H
+
+2Na
+
]
+
852 - - 199 - - - - 676 778 834 - -
c
aPG [M+Na
+
]
+
818 - 195 177 - - - - - - - - -
a
aPGS [M-2H
+
+3Na
+
]
+
954 - 301 - 199 165 125 - 800 835 - -
a
aPGP-Me [M+Na
+
]
+
924 - 289 271 209 191 135 - 676 756 - 830 893
a
aPGP-Me [M-H
+
+2Na
+
]
+
946 - 311 293 231 *199 157 *125 676 778 834 852 913
a
aPGP-Me [M-2H
+
+3Na
+
]
+
968 - 333 315 - *199 178 *125 676 800 834 852 937
CID-MS em modo negativo
a
aPA [M-H
+
]
-
732 653 97 79 - - - - - - - - -
a
aPG [M-H
+
]
-
806 653 171 153 - - - - - 732 - - -
b
aPG [M-H
+
]
-
800 647 171 153 - - - - - 726 - - -
c
aPG [M-H
+
]
-
794 641 171 153 - - - - - 720 - - -
a
aPGS [M-H
+
]
-
886 653 - 233 171 153 97 79 - 732 - 806 -
a
aPGS [M-2H
+
+1Na
+
]
-
908 653 273 255 171 153 97 79 - - - - -
b
aPGS [M-H
+
]
-
880 647 - 233 171 153 97 79 - 726 - 800 -
a
aPGP-Me [M-H
+
]
-
900 653 - 247 185 - 111 95 732 788 806 868
a
aPGP-Me [M-2H
+
+1Na
+
]
-
922 653 287 269 - - - - - - 788 806 890
87
formação dos fragmentos Y
j
, com conseqüente liberação dos monossacarídeos
adjacentes contendo uma dupla ligação entre C-1 e C-2, formada por clivagem β
(DELL, 1987), que aparecem nos espectros como íons sodiados.
A análise por CID-MS resultou na formação dos fragmentos Y
2
+
com m/z 1000
[M-162+Na]
+
, Y
1
+
com m/z 838 [M-324+Na]
+
, e Y
0
+
com m/z 676 [M-486+Na]
+
. As
massas perdidas nos fragmentos Y
j
são todas múltiplos de 162 m.u, indicando
remoção do mono-, di-, e trissacarídeo, respectivamente. Essas massas não foram
consideradas como NL, já que apareceram na forma de fragmentos B
i
sodiados,
observados em m/z 509 (B
3
+
), m/z 347 (B
2
+
), e m/z 185 (B
1
+
), que correspondem aos
grupos mono-, di-, e tri-hexosil, respectivamente. O fragmento Y
0
+
, de m/z 676,
indica que o arqueol apresenta cadeia saturada (Figura 41). Destaca-se que dois
íons observados por ESI-MS em modo negativo são compatíveis com a estrutura do
TGD. Eles aparecem com m/z 1138 [M-H]
-
e 1174 [M+Cl]
-
, contudo não produziram
íons no processo de fragmentação.
Figura 41 – Estrutura sugerida pelo espectro de CID-MS em modo e positivo do arquetidil
triglicosídeo
Y
0
Y
1
Y
2
[M+Na]
+
B
2
B
3
B
1
C
H
3
O
C
H
3
O
O
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
O
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
Y
0
Y
1
Y
2
B
1
B
2
B
3
Na
+
88
O TGD foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica. A eluição
iniciada com CHCl
3
, aumentando as concentrações de MeOH. A baixa polaridade do
solvente inicial permitiu a remoção dos componentes com estruturas mais apolares,
como pigmentos. O TGD foi eluído com CHCl
3
-MeOH (1:1, v /v), contudo análises
de TLC mostraram que a fração ainda continha fosfolipídeos. A amostra foi tratada
com resina aniônica fortemente básica, e então analisada por NMR e GC-MS.
A análise de
13
C-NMR da região anomérica de carboidratos indicou a
presença de unidades de β-Glc em δ 104,25 (J
C-1/H-1
= 158,5 Hz) , α-Glc em δ 99,27
(J
C-1/H-1
= 168,8 Hz) e α-Man em δ 97,38 (J
C-1/H-1
= 168,1 Hz). Sinais consistentes
com ligações, em δ 78,66, indicando substituição no O-2 de uma unidade de Glc, e
em δ 68,18 consistente com substituição em O-6 da unidade de Man. Sinais de CH
3
foram encontrados entre δ 20,32 e 23,09, os quais demonstraram ter conectividade
como os carbonos terciários entre δ 28,78 e 33,64, observados por HMQC-TOCSY,
confirmando a natureza ramificada das cadeias lipídicas do arqueol. Sinais de CH
2
entre δ 25,58 e 40,21, foram atribuídos ao arqueol, juntamente com os sinais de
CH
2
-O entre δ 62,01 e 71,78, que foram confirmados por DEPT (Figura 42) são
compatíveis com a estrutura do arqueol (FERRANTE et al., 1989), e com isso, estes
deslocamentos são consistentes com a estrutura descrita por Evans et al (1980).
A análise de metilação/GC-MS resultou em um cromatograma simples,
contendo picos de razão molar 1:1:1, identificados como 2,3,4,6-Me
4
-Glcp (terminal
de glucose), 2,3,4-Me
3
-Manp, confirmando a ligação em O-6 de manose e 3,4,6-
Me
3
-Glcp, confirmando a ligação em O-2 da unidade de glucose. Contudo a
sequência monossacarídica descrita [β-Glcp-(1→6)-α-Manp-(1→2)-αGlcp-arqueol]
(Figura 41) foi determinada com base no trabalho de Evans et al (1980).
Figura 42 –Espectro de DEPT
13
C NMR do arquetidil triglicosídeo
89
4.3. ANÁLISE ESTRUTURAL DE FLAVONÓIDES DE M. ilicifolia
___________________________________________________________________
4.3.1. Componentes de folhas de Maytenus ilicifolia
Conforme comentado anteriormente, M. ilicifolia é uma importante planta na
medicina popular. Extratos obtidos por infusão de suas folhas mostraram eficientes
no tratamento e prevenção de úlceras de estômago e gastrite (SOUZA-FORMIGONI
et al., 1991, CIPRIANI et al., 2006; CIPRIANI et al., 2008; BAGGIO et al., 2007).
Vários metabólitos com potencial atividade biológica estão presentes nos chás de
folhas de plantas do gênero Maytenus, incluindo flavonóides, triterpenos, e
sesquiterpenos. Além disso, atividade de vaso-relaxamento foi atribuída a
compostos presentes em um extrato de M. ilicifolia no qual foi detectado grande
quantidade de flavonóides (RATTMANN et al., 2006). Além disso, recentemente foi
identificado vários tipos de flavonóis-3-O-glicosídeos, como a rutina, quercitrina,
hiperosídeo, isoquercitrina, assim como outros derivados de quercetina e kaempferol
mono-di-, tri-, e tetra-glicosídeos (SANNOMIYA et al., 1988; VILEGAS et al., 1999;
LEITE et al., 2001; TIBERTI et al., 2007).
4.3.2. Composição geral do extrato Mi-ET-SOL
A fração do extrato aquoso denominada de Mi-ET-SOL, refere-se aos
compostos que permaneceram solúveis após tratamento com etanol. Esta fração foi
inicialmente submetida à análise de ESI-MS, para obtenção de um panorama geral
de sua composição, no qual pode ser observado íons consistentes com flavonóides
livres, glicosídeos e taninos (Figura 43). Em seguida foi analisada por HPLC através
do método 1 (ver pg 48), utilizando detecção por PDA, com varredura entre 200 e
400 nm. Quatro picos principais apareceram no cromatograma (picos 3, 4, 5 e 6), o
quais apresentaram curvas de absorbância UV semelhantes, com λ
max
em 230 e 280
nm (Figura 44 A). Por comparação com padrões autênticos (Sigma-Aldrich),
catequina e epicatequina foram identificadas no cromatograma, correspondendo aos
picos 3 e 5, respectivamente.
90
Figura 43 – Análise de ESI-MS em modo negativo da fração Mi-ET-SOL
A amostra foi analisada por HPLC-ESI-MS em modo negativo (Figura 44 B),
sendo realizada uma busca específica pelos íons de interesse. Inicialmente foi
tentado localizar a catequina e epicatequina, através do m/z 289. Contudo, quatro
picos apareceram com esta mesma relação massa/carga. Íons negativos com
valores de m/z esperados para outros flavonóides livres também foram
selecionados, gerando um cromatograma com 8 picos (nomeados de 1 a 8), os
quais passaram por processos de fragmentação para serem identificados. Como os
demais compostos não foram comparados com seus respectivos padrões, não foi
possível inferir corretamente o tipo de isômero (cis ou trans), mas a identificação do
flavonóide foi possível. Os picos 1 e 2 corresponderam a
1
(epi)-galocatequina, e
foram identificados através do íon de m/z 305 [M-H]
-
e de seus fragmentos (Tabela
4). Os picos 3 ,4 ,5 e 6 apareceram com mesmo m/z 289 [M-H]
-
, sendo que apenas
os picos 3 e 5 foram identificados como catequina e epicatequina, respectivamente.
Os picos 7 e 8, de m/z 273 [M-H]
-
foram identificados como provenientes da (epi)-
afzelequina, pelo seu perfil de fragmentação (Tabela 4) Embora as técnicas de
tandem-MS sejam importantes para a identificação de compostos com a mesma
massa molecular, os picos 3, 4, 5 e 6 não puderam ser distinguidos, já que tanto em
modo negativo quanto em positivo, seus perfis de fragmentação foram idênticos
(Figura 44 C, D). Além disso, esses picos apresentaram a mesma curva de absorção
UV, sugerindo compostos com estruturas similares.
1
Quando o prefixo epi aparecer entre parênteses antes do nome do flavonóide, significa que o tipo de isômero
não foi identificado.
Flavan-3-ol
Glicosídeos
Taninos
Taninos
91
Figura 44 – Análise por HPLC-PAD e HPLC-MS da fração Mi-ET-SOL
Cromatogramas obtidos por HPLC-PDA (A), e por HPLC-MS (B) através da seleção dos íons
negativos de m/z 305, 289 e 273. Fragmentação dos picos 3-6 em modo negativo (C) e positivo (D).
Catequina e epicatequina pertencem à família flavan-3-ols, e para ambas são
relatados a presença de enantiômeros (BAIS et al., 2002). Contudo esta
possibilidade foi descartada, pois a separação cromatográfica de enantiômeros
requer colunas especiais. Embora picos 4 e 6 tenham características semelhantes a
da catequina e epicatequina, sua correta identificação não foi obtida. Outros
flavonóides com estrutura similar, que poderiam geram tais resultados incluem
flavan-4-ols, como luteoforol e epiluteoforol. Luteoforol consiste em um 3',4',4,5,7-
pentahidroxiflavanol, isolado de folhas sorgo e morango (BATE-SMITH, 1969; BATE-
SMITH e CREASSY, 1969, DICKO et al., 2005), com importantes propriedades
biológicas (OKUDA et al., 1991; RAMESH et al., 2001). Sua estrutura difere da (epi)-
catequina por apresentar uma hidroxila em C-4. No entanto, outras possibilidades
devem ser consideradas, uma vez que existe uma grande variedade de estruturas
A
B
C
D
92
de flavonóides, tais como isoflavonóides neoflavonóides, e ainda aqueles que
diferem por posições de outras hidroxilas como o 2’,5’,3,5,7-pentahidroxi-flavanol
(BILIA et al., 1996), que poderiam resultar em uma detecção semelhante no ESI-MS.
A fração Mi-ET-SOL mostrou ser uma mistura complexa de compostos,
observados principalmente por ESI-MS em modo off-line e por HPLC, quando
detectadas por UV-280-360 nm. Portanto, optou-se em realizar um fracionamento
cromatográfico em coluna de sílica-gel. As frações obtidas foram cromatografadas
em placas TLC e devidamente combinadas, dando origem a dez frações (Mi-F1 a
MiF10), das quais as 5 primeiras que foram então analisadas.
4.3.3. Análise de flavonóides livres e taninos condensados
4.3.3.1. Fração Mi-F1
Análises por ESI-MS em modo negativo e positivo geraram apenas um íon
principal de m/z 289 [M-H]
-
e 291 [M+H]
+
(Figura 44). Como estes íons foram
compatíveis com a (epi)-catequina, a fração Mi-F1 foi analisada por HPLC (pelo
método 1, p. 48) para verificar se ambas, catequina e epicatequina, estavam
presentes, bem como os picos não identificados (4 e 6). Como resultado foi obtido
apenas dois picos, identificados como catequina e epicatequina.
De acordo com a Es-Safi et al. (2006), os isômeros catequina e epicatequina
podem ser diferenciados por espectroscopia de
13
C-NMR, uma vez que o
deslocamento químico de C-2 varia de δ 76 (epicatequina) para δ 84 (catequina). Tal
como esperado, quando a fração Mi-F1 foi analisada por NMR, foram encontrados
dois sinais com deslocamentos químicos consistentes com C-2, e adicionalmente,
também foram observadas variações nos deslocamentos químicos de C-3 e C-4,
bem como, dos prótons ligados a esses carbonos, provenientes da catequina e
epicatequina (Figura 45 A-D). Estas diferenças foram confirmadas pela análise de
padrões de catequina e epicatequina.
Com os espectros multi-dimensionais (HMQC e HMQC-TOCSY), foi possível
assinalar as principais diferenças ente os dois isômeros. A catequina apresentou
sinais de deslocamentos químico em δ 4.55/82.1 (H-2/C-2), 3.96/68.1 (H-3/C-3) e
2.82-2.50/27.7 (H- 4
a
-H-4
b
/C-4), enquanto epicatequina apresentou estes sinais em δ
93
4.78/79.1 (H-2/C-2), 4.15/66.7 (H-3/C-3), e 2.82-2.73/28.5 (H-4
a
-H-4
b
/C-4).
Curiosamente, no espectro de HMQC-TOCSY os sinais de conectividade entre H-2 e
H-3/H-4
a,b
da epicatequina não apareceram, diferente da catequina, que exibiu total
conectividade. Porém, no espectro de COSY (Figura 45 D) um pequeno sinal
apareceu em δ 4.15/4.78, consistente com H-3/H-2, o que confirma a fraca
conectividade destes prótons na configuração cis da epicatequina.
Figura 45 – Análise de NMR (HMQC-TOSY, COSY) da fração Mi-F1
Estrutura da catequina e epicatequina mostrando a conectividade entre C-2/H-2, C-3/H-3 and C-
4/H-4
a
-H-4
b
. (A, B e C) Espectro parcial de HMQC-TOCSY, e (D) espectro parcial de COSY.
O
H
O
H
O
H
O
H
H
H
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
H
H
H
O
H
O
H
H-2 /C-4 cat
H-3 /C-4 cat
H-4
b
- H-4
a
/C-4 cat
H-3 /C-4 epicat
H-4
b
-H-4
a
/C-4 epicat
H-2 /C-3 cat
H-3 /C-3 cat
H-4
b
- H-4
a
/C-3 cat
H-3 /C-3 epicat
H-4
b
-H-4
a
/C-3 epicat
H-2 /C-2 cat
H-3 /C-2 cat
H-4
b
- H-4
a
/C-2 cat
H-2 /C-2 epicat
H-3 cat
H-3 epicat
H-3/H-4
b
- H-4
a
cat
H-3/H-4
b
-H-4
a
epicat
H-3/H-2 cat
H-3/H-2 epicat
A
B
C
D
(+)-catequina
(-)-epicatequina
HMQC
TOCSY
94
4.3.3.2. Fração Mi-F2
Em ambos os modos de detecção de íons (positivo e negativo) foi possível
observar que esta fração apresentava uma grande variedade de compostos,
apresentando um espectro semelhante ao do extrato Mi-ET-SOL. Contudo, no modo
negativo a detecção se mostrou mais sensível, apresentando íons dos compostos de
baixa abundância que não foram observados em modo positivo, e, portanto será o
principal foco desta discussão.
A presença de (epi)-catequina foi observada através do íon de m/z 289, a
quercetina em m/z 301. Alguns flavonóides glicosilados apareceram em m/z 463 e
609 similares aos já descritos em M ilicifolia (TIBERTI et al., 2007). Taninos
condensados também foram detectados, variando de dímeros a heptâmeros,
apresentando grande variabilidade estrutural (Figura 46).
Figura 46 – Espectro de ESI-MS em modo negativo da fração Mi-F2
Dímeros foram encontrados na forma de (E)-Afz-(E)-Afz, em m/z 545, e (E)-
Afz-(E)-Cat em m/z 561 (Figura 47 A, B). O íon encontrado em m/z 577 corresponde
a duas unidades de (E)-Cat, confirmada por um fragmento a m/z 289, no entanto,
mesmo com baixa intensidade, fragmentos de m/z 271 e 305 foram detectados, o
que indica a presença de um dímero de (E)-Afz-(E)-Gall (Figura 47 C). O íon em m/z
593 indica o diflavonóide (E)-Cat-(E)-Gall, porém a fragmentação foi diferente da
1.55e6
5.79e4
Dímeros
Tr
ímeros
Tetrâ
meros
Pentâ
mero
ss
Hexâ
meros
Heptâ
meros
95
esperada, com três principais íons em m/z 285, 289 e 301, atribuído ao campferol,
(epi)-catequina e quercetina, respectivamente. Campferol e quercetina podem
formar glicosídeos, com massa molecular resultante de 594 Da, portanto isóbaros
entre si, e também com dímero (E)-Cat-(E)-Gall, os quais serão descritos com
maiores detalhes posteriormente (Figura 47 D).
Figura 47 – Perfil de fragmentação por CID-MS negativo dos dímeros de taninos
Espectros obtidos com energias de 3.5 kV no capilar, 85 V no cone e 20 eV de energia de colisão.
m/z 273
m/z 273
(E)Afz----(E)Afz
m/z 271
m/z 289
(E)Afz----(E)Cat
m/z 272
m/z 305
(E)Afz----(E)Gall
m/z 289
m/z 289
(E)Cat----(E)Cat
m/z 289
m/z 305
(E)Cat----(E)Gall
A
B
C
D
96
Trímeros foram observados através dos íons de m/z 833, correspondendo a
(E)-Afz-(E)-Afz-(E)-Cat e m/z 849, correspondendo a (E)-Afz-(E)-Cat-(E)-Cat e (E)-
Afz-(E)-Afz-(E)-Gall (Figura 48 A, B). Outros trímeros contendo ligações éter foram
observados em m/z 847, constituído por (E)-Afz-(E)-Cat (E)-Cat. Os fragmentos com
m/z 575 e 559 indicaram que a ligação éter pode estar entre duas unidades de (E)-
Cat, entre (E)-Afz-(E)-Cat, e entre (E)-Afz-(E)-Gall (Figura 48 C). O íon de m/z 863 é
compatível com três unidades de (E)-Cat condensadas, e com (E)-Afz-(E)-Cat (E)-
Gall. A ligação éter está localizada principalmente entre duas (E)-Cat (m/z 575), e o
fragmento de m/z 591 indica também a ligação éter entre (E)-Cat-(E)-Gall (Figura 48
D).
97
Figura 48 – Perfil de fragmentação por CID-MS negativo dos trímeros de taninos
Espectros obtidos com energias de 3.5 kV no capilar, 85 V no cone e 20 eV de energia de colisão.
Íons de menor intensidade, com m/z 1106, 1122, 1136 e 1151 foram
identificados como resultantes de tetra-flavonóides, sendo que aqueles de m/z 1136
e 1151 referem-se a proantocianidinas do TipoA (PA-A), e os íons de m/z 1363,
C
a,c
b
c
c
m/z 561
m/z 289
m/z 271
m/z 575
a
(E)Afz----(E)Cat----(E)Cat
O
m/z 543
c
m/z 305
c
m/z 271
m/z 575
c
(E)Afz----(E)Afz----(E)Gall
O
m/z 559
b
m/z 289
m/z 271
m/z 577
(E)Afz----(E)Cat----(E)Cat
O
m/z 577
m/z 289
m/z 289
m/z 575
a
(E)Cat----(E)Cat----(E)Cat
O
m/z 561
b
m/z 305
m/z 271
b
m/z 591
b
(E)Afz----(E)Cat----(E)Gall
O
D
a
b
b b
a
b
B
m/z 561
a
m/z 289
m/z 271
m/z 577
(E)Afz----(E)Cat----(E)Cat
m/z 543
b
m/z 305
m/z 271
m/z 577
(E)Afz----(E)Afz----(E)Gall
m/z 543
m/z 289
m/z 271
m/z 561
(E)Afz----(E)Afz----(E)Cat
A
98
1378, 1394, 1409, 1424, e 1440 foram identificados como penta-flavonóides. Estes
compostos foram ainda analisados através de seus fragmentos, e os resultados
estão resumidos na Tabela 4. Hexa-flavonóides foram observados em m/z 1650,
1666, 1682, 1698, 1713, 1729, e aqueles íons de m/z 1922, 1938, 1954, 1970, 1985
são compatíveis com o hepta-flavonóides, contudo devido a sua baixa abundância,
seus fragmentos não puderam ser observados.
A grande diversidade estrutural dos taninos presentes em M. ilicifolia pode ser
bem observada em análise por HPLC-MS utilizando o método 2, RP-GB (pg 49), o
qual confirmou que os taninos com mesma massa molecular são formados na
realidade por taninos com composição semelhante, porém com várias sequências
diferentes, dado ao grande número de picos que surgiram quando íons de valores
de m/z específicos foram selecionados no cromatograma da fração Mi-F2 (Figura
49).
Figura 49 – Cromatograma obtido por HPLC-MS em modo negativo da fração Mi-F2
99
TABELA 4 – Composição de taninos na fração Mi-F2, por CID-MS
(E)Afz → afzelequina ou epiafzelequina; (E)Cat → catequina ou epicatequina; (E)Gall → galocatequina ou
epigallocatequina. TA → proantocianidina tipo A; A-O-C → ligação éter entre (E)Afz e (E)Cat; C-O-C →
ligação éter entre (E)Cat and (E)Cat; G-O-C ou C-O-G → ligação éter entre (E)Gall and (E)Cat
* indica fragmentos chave para sequência proposta
Composto [M-H]
-
Principais fragmentos
(Epi)Catequina 289 203, 187, 179, 161, 151, 137, 125, 109
Quercetina 301 256, 245, 179, 164, 151, 135, 121, 109
(E)Afz-(E)Afz 544 419, 273, 164, 97
(E)Afz-(E)Cat 561 543, 435, 407, 289, 271, 245, 125, 97
(E)Cat-(E)Cat 577 407, 289, 245, 161, 125
(E)Afz-(E)Gall 577 305, 301, 272, 125
(E)Cat-(E)Gall 593 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat 833 *561, *543, 289, 271
(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 847 *575, 289
(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat (TA) A-O-C 847 *559, 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Gall (TA) A-O-G 847 *543, 305
(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat 849 *577, *561, 289, 271
(E)Afz-(E)Cat-(E)Gall (TA) C-O-G 863 *591, *561, 289, 271
(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 863 *575 , 289
(E)Cat-(E)Cat-(E)Gall (TA) C-O-G 879 *591, *577, 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Afz -(E)Cat 1105 *833, *815, 561, 543, 289, 271
(E)Afz-(E)Cat-(E)Afz-(E)Cat 1121 849, 831, *561, 289, 271
(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat 1121 849, 831, *577, *543, 289, 271
(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 1136 863, 848, 577, *575, *561, 289, 271
(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Gall (TA) G-O-C 1136 863, 832, *591, 561, *543, 289, 271
(E)Afz-(E)Cat-(E)Gall-(E)Cat (TA) G-O-C 1151 879, 863, *591, *561, 289, 271
(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 1151 862, *577, *575, 289
(E)Gall-(E)Gall-(E)Afz-(E)Afz (TA) G-O-C 1151 879, 845, *609, *543, 305, 271
(E)Cat-(E)Afz-(E)Afz-(E)Afz-(E)Afz 1377 *1090, 833, 817, 543, 289, 271
(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Afz-(E)Cat 1393 1121, 1103, *849, *833, 561, *543, 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat 1393 1121, *1103, 849, *577, 543, 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Afz-(E)Gall-(E)Cat (TA) G-O-C 1407 1135, *862, *591
(E)Cat-(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 1407 1118, *846, *832, *575
(E)Cat-(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 1423 1133, *863, *847, *575, 289
(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat-(E)Gall-(E)Cat (TA) C-O-G 1423 1151, *1133, *833, *591, *543, 289
(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat-(E)Cat (TA) C-O-C 1439 1151, *864
(E)Gall-(E)Cat-(E)Afz-(E)Cat-(E)Cat (TA) G-O-C 1439 1151, *878, *849
(E)Gall-(E)Gall-(E)Afz-(E)Afz-(E)Cat (TA) A-O-C 1439 *609, *559
100
Espectros de 1D e 2D NMR também foram realizados com a fração Mi-F2,
fornecendo informações sobre a configuração das unidades que compõem os
taninos. A presença de isômeros cis e trans na fração Mi-F2 ficou clara, uma vez no
espectro de
13
C-NMR foram observados sinais de catequina δ em 82,8, 68,8 e 28,5;
e os de epicatequina δ em 79,9, 67,5 e 29,3. Os sinais de deslocamentos químico da
(epi)-azfelequina e (epi)-galocatequina devem ser próximos aos das (epi)-catequina,
tornando sua análise extremamente difícil devido à presença destas misturas. No
entanto, foi encontrado um importante sinal em
13
C em δ 37,3 que confirma a
presença de C-4 ligado (SANTOS, 2000) (Figura 50). Contudo, outros sinais não
puderam ser atribuídos, considerando que é necessário a purificação destes
compostos para que a análise possa refletir de fato a estrutura correta.
Figura 50 – Espectro de
13
C-NMR da fração Mi-F2
*catequina **epicatequina
4.3.4. Análise de flavonóides glicosilados
Os flavonóides glicosilados encontrados em M. ilicifolia apareceram contendo
campferol, quercetina e miricetina (todos flavonóis), variando de mono-glicosídeos
até tetra-glicosídeos, encontrados da fração Mi-F2 a Mi-F5 (Figura 51 A-D). Como a
ionização e a fragmentação destes glicosídeos pode variar de acordo com as
condições de energia e do tipo de adutores, foi realizada uma padronização antes de
realizar as análises. Como o único padrão disponível foi a rutina [α-Rhap-(1→6)-β-
Glcp-(1→3)-Quer], optou-se por utilizar a fração Mi-F4, a qual continha
C-4 ligado
**
**
*
*
*
**
101
principalmente flavonóis tri-glicosídeos, contendo os três núcleos agliconas, citados
acima, e a fração Mi-F5 contendo um tri-glicosídeo majoritário. Como estruturas
semelhantes a estas já haviam sido descritas (VILEGAS et al, 1999; LEITE et al,
2001), optou-se por utiliza-las na padronização. Nas análises de tandem-MS, os
fragmentos foram assinalados de acordo com a nomenclatura proposta por Domon
e Costello (1988).
Figura 51 – Espectros de ESI-MS em modo negativo das frações Mi-F2 a Mi-F5
(A) Mi-F2, (B) Mi-F3, (C) Mi-F4, e (D) Mi-F5
4.3.4.1. ESI-MS em modo negativo
A fração Mi-F5, contendo principalmente um tri-glicosídeo de massa
molecular de 756 Da (m/z 755 [M-H]
-
), foi solubilizada em MeOH-H
2
O (1:1, v/v)
contendo 5 mM de HCl ou NaCl, e analisada por ESI-MS em modo negativo. Como
a ionização por electrospray é diretamente influenciada pelas energias aplicadas na
fonte, dois ajustes foram realizados.
Como a energia aplicada no capilar não produziu diferenças na ionização,
apenas na intensidade dos íons, ela foi mantida em 2,73 kV. No entanto, foi
observado que mudanças na energia do cone afetavam diretamente o tipo e a
abundância relativa de íons resultantes. Assim, em baixa energia (25 V) dois
principais íons foram produzidos (m/z 791 e 793), resultantes dos adutos isotópicos
de Cl
-
. Ao aumentar a energia do cone para 50 V, houve a formação dos íons de m/z
755 [M-H]
-
e 791 [M+Cl]
-
, com intensidades semelhantes, e com a energia do cone
A
B
C
D
102
em 100 V, o principal íon formado foi resultante da desprotonação da molécula, com
m/z 755 (Figura 52).
Figura 52 – Espectros de ESI-MS em modo negativo mostrando alteração na formação dos
íons de acordo com a energia utilizada no cone
4.3.4.2. Tandem-MS em modo negativo
O comportamento dos glicosídeos frente a diferentes condições de energia
nos processos de fragmentação pode gerar importantes informações quanto ao sítio
de glicosilação no flavonóide. Como os fragmentos provenientes dos precursores
ionizados com Cl
-
não apresentaram diferenças para os formados pela sua
desprotonação dos compostos, apenas os íons desprotonados foram analisados.
Durante os processos de fragmentação em modo negativo, são formados íons
regulares da aglicona desprotonada [Y
0
]
-
, como também ocorre a formação de íons
referentes ao radical da aglicona desprotonada [Y
0
-H]
-•
, devido a possibilidade de
clivagem homolítica entre a o monossacarídeo e a aglicona (HVATTUM et al., 2003;
CUYCKENS e CLAEYS, 2005). Assim, os principais fragmentos observados
referentes à aglicona desprotonada na forma de radical e regular foram com m/z
284-285, coerentes com campferol, e m/z 300-301 coerente com quercetina (Figura
53 A-C). Glicosídeos contendo estes dois flavonóis já haviam sido encontrados
anteriormente em folhas de M. ilicifolia (LEITE et al., 2001; TIBERTI et al., 2007). No
entanto, pelo menos 2 íons precursores geraram fragmentos de m/z 316-317,
indicando que flavonóis glicosídeos de M. ilicifolia podem conter o flavonol miricetina
Aumento da energia do cone
25 V
50 V 100 V
103
como aglicona (Figura 53 A, D). Além disso, a alta intensidade dos fragmentos Y
0
-
e
[Y
0
-H]
-•
formados por CID, é um forte indício de que estes flavonóides são O-
glicosídeos, uma vez que os glicosídeos O-ligados são mais lábeis que os C-ligados,
cuja fragmentação consiste em quebras internas no anel monossacarídico com
resultante desidratações moleculares (CUYCKENS e CLAEYS, 2004), que não
foram observadas.
A formação do íon radical [Y
0
-H]
-•
é dependente do sítio de glicosilação e
diretamente afetada pela energia utilizada durante o CID-MS. Assim, diferentes
flavonóides glicosídeos formam os íons desprotonados referentes à aglicona regular
e radical com diferentes proporções, dependendo da posição onde o açúcar esta
ligado à aglicona, e consequentemete, isto fornece informações úteis sobre os sítios
de glicosilação (CUYCKENS e CLAEYS, 2005). No entanto, nenhuma variação
significativa na razão entre [Y
0
-H]
-•
:Y
0
-
foi observada, e ambas as energias utilizadas
(20 eV e 40 eV) favoreceram a formação do radical aglicona.
Embora a fragmentação em modo negativo sozinha não forneça informação
suficiente sobre o sítio de glicosilação, Cuyckens e Claeys (2005) observaram que
sob certas condições de energia de CID-MS, os íons referentes aos radicais
aglicona eram formados em grande abundância, especialmente para flavonóis 3-O-
glicosídeos, sendo diferentes daqueles obtidos para os glicosídeos ligados nas
posições O-4’, ou O-7. Assim, como os íons [Y
0
-H]
-•
foram formados com maior
intensidade que os íons Y
0
-
(Tabela 5), é possível sugerir que a glicosilação ocorre
em O-3, contudo como será visto mais a frente, outros experimentos foram
realizados para confirmar esta hipótese.
Com relação à detecção de carboidratos neutros, CID-MS em modo negativo
não costuma produzir íons, e, portanto os carboidratos ligados aos flavonóis não
foram detectados por esta forma de ionização. Contudo, é possível determinar a
perda neutra (NL- neutral loss) pela diferença entre o íon quasi-molecular e o íon-
fragmento referente a aglicona, e com isso foi possível inferir que os flavonóides
estão ligados a mono-, di-, tri-, e tetrassacarídeos, e assim, concluir que a
fracionamento em coluna de sílica-gel 60G foi útil para separar os glicosídeos
flavonóides pela sua massa molecular, já que glicosídeos maiores são mais polares
e se prendem mais fortemente à sílica, e consequentemente necessitam de
solventes mais polares para serem removidos.
104
Figura 53 – Estruturas e espectros de CID-MS em modo negativo mostrando a formação de
íons regulares e radicais
Esquema de formação do íon regular e do íon radical (A). CID-MS mostrando mostrando a formação
do íons regulares e radicais: (B) campferol, (C) querecetina e (D) miricetina.
_
_
•
••
•
_
A
[M-H]
-
Y
0
-
[Y
0
-H]
-
•
••
•
[M-H]
-
Y
0
-
[Y
0
-H]
-
•
••
•
R1 = R2 = H
R1 = OH
-
R2 = H
[M-H]
-
Y
0
-
[Y
0
-H]
-
•
••
•
R1 = R2 = OH
C
D
B
O
O
O
H
O
H
O
H
R
1
O
R
2
O
O
O
O
H
O
H
R
1
O
R
2
O
O
O
O
H
O
H
R
1
O
R
2
glicosídeo
Y
0
-
[Y
0
-H]
-
•
••
•
105
TABELA 5 – Perfil de fragmentação dos flavonóis glicosídeos em modo negativo
R: razão entre [Y
0
-H]
-
•
:Y
0
-
; NL: Perdas neutras indicando:
a
monossacarídeo;
b
dissacarídeo;
c
trissacarídeo;
d
tetrassacarídeo.
4.3.4.3. ESI-MS em modo positivo
Para testar os efeitos dos adutores e da energia na ionização e
posteriormente na fragmentação, a fração Mi-F5, dissolvida em MeOH:H
2
O (1:1,
v/v), ou então nesta solução contendo 5 mM de HCl ou NaCl. De forma geral e
simplificada, sob as condições analíticas de baixa energia, os principais íons
observados foram aqueles correspondendo à protonação dos analítos [M+H]
+
,
enquanto que sob altas energias os compostos sodiados [M+Na]
+
foram
predominantes. Com a solução com HCl a ionização seguiu este comportamento de
alternar adutores conforme a energia do cone era aumentada. Em baixa energia (35
V), o principal foi a íon m/z 757 [M+H]
+
, aumentando 63 V ambas as espécies foi
observada, em m/z 757 e m/z 779 [M+Na]
+
e, finalmente, em 85 V, o principal íon
observado foi a forma mais estável em m/z 779 (Figura 54). Em todos os casos, a
energia do capilar foi mantida em 2,6 kV. Contudo, conforme esperado os analitos
dissolvidos na solução contendo NaCl não seguiram o mesmo comportamento, e
MS
1
MS
2
[M-H]
-
[Y
0
-H]
-
•
:Y
0
-
R
NL
417 284 : 285 - 255 227 163 179 151 135 133 121 93 132
a
433 300 : 301 3.9 271 243 163 179 151 135 149 137 108 132
a
447 284 : 285 4.1 255 227 163 179 151 135 133 121 93 162
a
463 300 : 301 4.5 271 243 163 179 151 135 149 137 108 162
a
579 300 : 301 4.3 271 243 163 179 151 135 149 137 108 278
b
593 284 : 285 3.9 255 227 163 179 151 135 133 121 93 308
b
593 300 : 301 3.3 271 243 163 179 151 135 149 137 108 292
b
609 300 : 301 4.2 271 243 163 179 151 135 149 137 108 308
b
625 300 : 301 3.8 271 243 163 179 151 135 149 137 108 324
b
625 316 : 317 - - - 163 179 151 135 165 153 125 308
b
739 284 : 285 3.8 255 227 163 179 151 135 133 121 93 454
c
755 300 : 301 3.6 271 243 163 179 151 135 149 137 108 454
c
771 300 : 301 3.5 271 243 163 179 151 135 149 137 108 470
c
771 316 : 317 3.3 - - 163 179 151 135 165 153 125 454
c
871 284 : 285 4.1 255 227 163 179 151 135 133 121 93 586
d
887 300 : 301 4.3 271 243 163 179 151 135 149 137 108 586
d
901 284 : 285 4.2 255 227 163 179 151 135 133 121 93 616
d
106
mesmo nas energias baixas apenas os íons sodiados eram formados, observados
com m/z 779. Outra característica muito importante foi que os íons protonados
produziram fragmentos diferentes daqueles produzidos pelos íons sodiados.
Figura 54 – Espectros de ESI-MS em modo positivo mostrando alteração na formação dos
íons de acordo com a energia utilizada no cone
4.3.4.4. Tandem-MS dos compostos protonados
A fração Mi-F4 foi solubilizada apenas MeOH-H
2
O (1:1, v/v), em os íons
protonados foram obtidos com a energia do cone mantida em 35 V. Os perfis de
fragmentação foram assinalados seguindo a nomenclatura proposta por Domon e
Costello (1988). Sobre estas condições, foram formados apenas os fragmentos do
tipo Y
j
+
. Estes fragmentos foram importantes para determinar a seqüência de
monossacarídica dos glicosídeos.
A fração analisada continha principalmente dois flavonóis triglicosídeos com
m/z 741 e 757. Assim, quando fragmentado o íon precursor de m/z 741 produziu os
fragmentos Y
2
+
com m/z 595 [M-146]
+
, Y
1
+
em m/z 449 [M-292]
+
, e Y
0
+
em m/z 287
[M-454]
+
. Esta estrutura é compatível com a α-Rhap-(1→6)-[-α-Rhap-(1→2)]-β-Galp-
(1→3)-O-Campferol (VILEGAS et al, 1999; LEITE et al., 2000). O precursor íon em
m/z 757 [M+H]
+
deu origem a fragmentos Y
2
+
com m/z 611 [M-146]
+
, Y
1
+
com m/z
465 [M-292]
+
, e Y
0
+
com m/z 303 [M-454] +, compatível com a α-Rhap-(1→6)-[-α-
Rhap-(1→2)]-β-Galp-(1→3)-O-Quercetina (Figura 55 A-C) (VILEGAS et al, 1999;
LEITE et al., 2000). Além disso, ambos os íons precursores tiveram NL semelhantes,
A B C
Aumento da energia do cone
A
B
C
35 V 63 V 85 V
107
correspondentes a perdas de moléculas de açúcar, o que confirma que ambos têm
estruturas de oligossacarídeos semelhantes.
Em ambos os compostos ocorreu a formação de um íon denominado como
Y*, formado, em m/z 433 (Figura 55 B) e m/z 449 (Figura 55 C). Y* é um íon irregular
que corresponde à perda de uma unidade hexose interna e, consequente rearranjo
com um resíduo ramnose. Estes íons são geralmente observados em condições de
energia de colisão baixa. Embora o íon Y* possa conduzir a uma seqüência
monossacarídica errada, com instrumentação adequada, a relação entre Y
1
:Y* pode
fornecer informações úteis sobre o tipo de flavonóide, bem como pode ser usado
para inferir diferenciação entre neohesperidose e rutinose, dois dissacarídeos
comuns, encontrados em flavonóides (CUYCKENS et al., 2001).
Figura 55 – Espectros de CID-MS em modo positivo mostrando o perfil de fragmentação
dos flavonóis glicosídeos na forma protonada – m/z 741 e 757
(A) Flavonol triglicosídeo contendo galactose e ramnose, (B e C) espectros de CID-MS mostrando a
remoção sequencial dos monossacarídeos até a aglicona.
R =H
R =OH
-
Gal
-
Rha
-
Rha
-
Gal
-
Rha
-
Rha
Y
0
+
A
Y
2(α
αα
α)
+
O
O
O
H
O
H
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
R
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
Y
2(β
ββ
β)
+
Y
1
+
108
4.3.4.5. Tandem-MS dos compostos sodiados
Quando uma energia maior foi aplicada ao cone (≥ a 85 V), a formação de
íons mais estáveis foi favorecida, os quais foram encontrados na forma de adutos de
Na
+
. Íons sodiados formados a partir destes glicosídeos são mais estáveis, e
precisam de mais energia para produzir fragmentos, quando comparados aos íons
protonados. Curiosamente, na análise de CID-MS destes íons, foram produzidos
fragmentos com perfil completamente diferente daqueles obtidos a partir dos íons
protonados. Enquanto que os íons protonados produziram fragmentos do tipo Y
j
+
, os
íons sodiados formados pelos mesmos glicosídeos produziram principalmente
fragmentos do tipo B
i
+
, ou seja, aqueles contendo apenas a porção carboidrato.
Por exemplo, a fração Mi-F4 deu origem a 2 grandes íons com m/z 763
[M+Na]
+
e m/z 779 [M+Na]
+
. Ambos os íons produziram CID-fragmentos similares,
característicos da porção sacarídica, com m/z 477 [B
3
+Na]
+
, mostrando que os dois
glicosídeos apresentam um trissacarídeo similar ligado à aglicona e não
monossacarídeos ligados a diferentes sítios. Também foram observados fragmentos
com m/z 331 [B
2
+Na]
+
, e outros com m/z 169 [B
1
+Na]
+
, e 185 [B
X
+Na]
+
(Figura 56 A-
C). B
X
foi utilizado para designar o íon referente ao monossacarídeo que esta
diretamente ligado à aglicona (Tabela 6).
Assim como observado para os íons formados a partir dos glicosídeos
desprotonados quando analisados por CID-MS, os íons sodiados também
produziram os fragmentos referentes à aglicona na forma regular e radical. Mais
uma vez a razão entre [Y
0
-H]
•+
:Y
0
+
é dependente do sítio de glicosilação e muda de
acordo com a energia de colisão utilizada. Cuyckens e Claeys (2005) avaliaram a
possibilidade de aplicar a razão entre os íons [Y
0
-H]
•+
:Y
0
+
para determinar os sítios
de glicosilação flavonóides mono-glicosídeos, empregando alta energia de colisão.
Para verificar a possibilidade de aplicar esta técnica nos flavonóides
glicosídeos de M. ilicifolia, dois ajustes de energia de colisão foram testados, sendo
40 eV, chamada baixa energia, e uma variação entre 60-80 eV chamada de alta
energia. Em baixa energia de colisão, a razão entre [Y
0
-H]
•+
:Y
0
+
foi sempre próxima
de 1. Por outro lado, utilizando CID com alta energia, a formação dos íons da
aglicona na forma de radical foi 3-4 vezes maior do que seu íon regular (Figura 56 B,
C).
A formação do íon radical com intensidade tão maior que o íon regular é uma
forte evidência de flavonóides 3-O-glicosídeos, uma vez que é distinta daquela
109
observada para os flavonóides 7-O-glicosídeos, que exibem uma razão próxima de
1. Contudo, apenas o razão entre [Y
0
-H]
•+
:Y
0
+
não é suficiente para diferenciar entre
os flavonóides 3-O-glicosídeos e flavonóides 4'-O-glicosídeos, uma vez que formam
íons radicais e regulares com razões semelhantes. Caracteristicamente os
flavonóides 4'-O-glicosídeos formam fragmentos correspondentes ao anel B
contendo as moléculas de carboidratos a ele ligado (CUYCKENS e CLAEYS, 2005),
os quais não foram observados nos espectros. Além disso, vale a pena lembrar que
a razão entre o íon radical e o regular observada em modo negativo foi algo em
torno de 3-4, e que flavonóides 4’-O-glicosídeos apresentam esta razão menor que
1. Como pode ser visto na tabela 6, todos os flavonóis glicosídeos estudados aqui
apresentaram características muito semelhantes a estes presentes em Mi-F4, assim,
estes resultados sugerem fortemente que os flavonóides de M. ilicifolia são 3-O-
glicolisados.
Figura 56 – Espectros de CID-MS em modo positivo mostrando o perfil de fragmentação
dos flavonóis glicosídeos na forma sodiada - m/z 763 e 779
(A) Estrutura do flavonol triglicosídeo mostrando como ocorre sua fragmentação com o adutor Na
+
; (B
e C) espectros de CID-MS dos íons sodiados, mostrando a formação dos fragmentos do tipo B
i
+
, e do
alteração na razão entre íon aglicona regular e radical em 40 e 60 eV.
R = H
B
2
+
α
αα
α
/
β
ββ
β
B
x
+
[M+Na]
+
Y
0
+
Y
0
+
B
1
+
α
/
β
B
B
3
+
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
B
3
+
B
2
+
α
αα
α
/
β
ββ
β
B
1
+
α
/
β
B
x
+
C
[M+Na]
+
R = OH
Y
0
+
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
Y
0
+
O
O
O
H
O
H
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
R
O
C
H
3
OH
O
H
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
B
3
+
[Y
0
– H]
+
•
••
•
/ Y
0
+
O
O
O
H
O
H
O
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
Na
+
B
2(
α
)
B
2(
β
)
+
B
1(
β
)
+
B
1(
α
)
+
A
110
TABELA 6 – Perfil de fragmentação dos flavonóis glicosídeos sodiados
R: razão entre Y
0
+
•
: Y
0
+
4.3.4.6. Análise dos flavonóis glicosídeos por HPLC-UV-ESI-MS
Através das análises de ESI-MS foram obtidas informações importantes sobre
as estruturas dos flavonóis glicosídeos de M. ilicifolia. Tiberti e colaboradores (2007)
relataram a presença de isômeros de glicosídeos, os quais não seriam diferenciados
por análises de ESI-MS em modo off-line. Assim, os resultados foram melhorados
empregando análises por LC-MS, uma vez que por métodos cromatográficos foi
possível analisar separadamente os glicosídeos e confirmar a presença de isômeros
nas frações.
Os procedimentos de análise foram estabelecidos utilizando a coluna C-18
(Supelco), com detecção por UV-360 nm, comprimento de onda que favorece a
detecção dos flavonóis glicosídeos. Após o estabelecimento das melhores condições
de separação, as análises foram realizadas em modo on-line. Com a energia do
cone em 50 V e os solventes ácidos utilizados na separação cromatográfica, houve
MS
1
MS
2
[M+Na]
+
Y
0
+
•
: Y
0
+
R B
X
+
B
1
+
α
B
1
+
β
B
2
+
α
B
2
+
β
B
3
+
α
B
3
+
β
B
4
+
441 308:309 - 155 - - - - - -
457 324:325 5.1 155 - - - - - -
471 308:309 4.9 185 - - - - - -
487 324:325 4.5 185 - - - - - -
603 324:325 4.8 169 155 - 301 - - - -
617 308:309 4.5 185 169 - 331 - - - -
617 324:325 4.9 169 169 - 315 - - - -
633 324:325 4.8 185 169 - 331 - - - -
649 324:325 5.2 185 185 - 347 - - - -
649 340:341 - 185 169 - 331 - - - -
763 308:309 3.8 185 169 169 331 331 477 - -
779 324:325 3.4 185 169 169 331 331 477 - -
795 324:325 3.6 185 169 185 331 347 493 - -
795 340:341 3.8 185 169 169 331 331 477 - -
895 308:309 3.4 185 169 155 331 301 477 463 609
895 308:309 3.4 169 169 185 315 317 447 463 609
911 324:325 3.3 185 169 155 331 301 477 463 609
911 324:325 3.3 169 169 185 315 317 447 463 609
925 308:309 3.4 185 163 185 331 331 477 493 639
111
favorecimento dos íons protonados, observados por detecção positiva. Além disso,
nestas condições, a ionização promoveu fragmentação in-source, fornecendo
fragmentos semelhantes aos obtidos por CID-MS dos precursores protonados, nas
análises off-line.
Considerando que a fragmentação dos íons protonados ocorre por remoção
seqüencial das unidades de monossacarídeos, a fragmentação in-source poderia
levar a uma falsa interpretação dos glicosídeos, como por exemplo um triglicosídeo
pode gerar um fragmento in-source que seja semelhante ao íon quasi-molecular de
um diglicosídeo. Para contornar esta situação, os glicosídeos foram detectados em
modo negativo (o qual não produziu fragmentação in-source), e os cromatogramas
obtidos em modo positivo e negativo foram comparados. Se por um lado a
fragmentação in-source ocorrida na detecção positiva poderia levar a uma
identificação equivocada, por outro lado, ela forneceu a seqüência de
monossacarídeos de cada um dos glicosídeos detectados.
Como a detecção em modo negativo produziu somente os íons quasi-
moleculares, foi possível fazer uma varredura nos cromatogramas a fim de localizar
cada um dos glicosídeos. Mesmo com o fracionamento em coluna de sílica-gel, foi
observado que as frações ainda apresentavam misturas bastante complexas. A alta
complexidade das frações pode ser notada pelo elevado grau de isomerismo, como
por exemplo, o íon de m/z 609 [M-H]
-
, que formou 4 picos no cromatograma. Para os
demais íons selecionados, pelo menos dois picos apareciam nos cromatogramas.
No estudo anterior de Tiberti et al (2007) alguns isômeros de flavonóis glicosídeos
foram identificados, e apresentaram mesmo o sítio de glicosilação, na posição O-3.
Assim, se os glicosídeos eram ligados à aglicona pela mesma hidroxila, o
isomerismo só poderia consistir no tipo de açúcar, ou no tipo de ligações
interglicosídicas presentes. Para identificar com segurança os glicosídeos, seria
então necessária sua purificação para posteriores análises. Contudo, devido à
complexidade das amostras, inúmeras sobreposições de picos ocorreram, tornando
sua purificação inviável, mesmo por HPLC, utilizando somente colunas de fase
reversa.
Como pode observado na Figura 57, a cromatografia em fase reversa
proporcionou a separação da maioria dos isômeros entre si, sendo o maior problema
encontrado a sobreposição de picos referentes a glicosídeos de massa molecular
diferentes, tipicamente aqueles diferenciando-se apenas por uma unidade
112
monossacarídica, como por exemplo, a sobreposição dos picos referentes aos tri-, e
tetraglicosídeos, de m/z 739 com 871, e de m/z 755 com 887 (Figura 58). Como
parecia não haver um único método cromatográfico que fosse capaz de resolver
todos os compostos das frações, optou-se por desenvolver um método de
cromatografia líquida bi-dimensional (2D-LC).
Figura 57 – HPLC-UV e HPLC-MS das frações Mi-F3 e Mi-F5
Cromatogramas obtidos da fração Mi-F3 por UV – 360 nm (A1), e por seleção de íons obtidos
por HPLC-MS (A2 - A8); Cromatogramas obtidos por UV – 360 nm das frações Mi-F4 (B1) e Mi-F5
(B2), e por seleção de íons obtidos por HPLC-MS da fração Mi-F5 (B3 – B8).
113
Figura 58 – Cromatograma da fração Mi-F5 mostrando a sobreposição dos compostos de
m/z 755 e 739 com aqueles de m/z 887 e 871, respectivamente.
4.3.4.7. Desenvolvimento do método de 2D-LC-UV-MS a partir de Mi-ET-SOL
O fracionamento em silica-gel foi bastante importante para obtenção de
frações mais limpas, contudo não foi eficiente na separação de muitos glicosídeos
que permaceram na mesma fração dificultando sua análise por RP-HPLC. Como a
maioria das sobreposições ocorreu entre compostos de massa molecular diferentes,
a estratégia adotada foi separar estes compostos primeiramente em coluna de
cromatografia por exclusão estérica (SEC – size exclusion chromatography), para
que depois de separados por tamanho na primeira dimensão, fosse possível resolvê-
los na segunda dimensão por RP-HPLC, pelo método conhecido como heart-cutting.
Como o objetivo da SEC era similar ao resultado obtido na coluna de silica-gel,
optou-se por realizar as análises diretamente do extrato Mi-ET-SOL, já que os
glicosídeos se repetiam entre as frações, e também para obter um cromatograma bi-
dimensional que abrangesse todos os glicosídeos, evitando assim o consumo de
tempo com injeções de várias frações.
114
4.3.4.8. Primeira dimensão: SEC
Como principal objetivo da utilização de SEC como primeira dimensão era de
se obter um cromatograma com cerca de 4 picos, representativos de cada grau de
glicosilação apresentado pelos flavonóis, ou seja, um pico para os monoglicosídeos,
um para os diglicosídeos e assim por diante, sem a distinção do tipo de glicosídeo. A
cromatografia por SEC proporcionou resultados surpreendentemente melhores do
que o esperado. Não só foram separados os glicosídeos com uma unidade de
monossacarídeo de diferença, como também a coluna foi capaz de resolver vários
dos isômeros presentes no extrato. Embora a separação dos glicosídeos por SEC
tenha ocorrido usando um solvente isocrático (Figura 59 A) composto dos solventes
A (1% AcOH em H
2
0) e B (H
2
O-CH
3
CN-AcOH, 49:50:1, v/v) na proporção de 1:1
(v/v), com a utilização de gradiente (SEC-GA, p. 49) a separação foi melhorada, uma
vez que a migração de flavonóis glicosídeos foi diretamente afetada pelas
concentrações dos solventes (Figura 59 B).
Figura 59 – Perfil de separação dos compostos da fração MI-ET-SOL por cromatografia de
exclusão estérica na primeira dimensão
(A) modo isocrático, e (B) gradiente
100
0
200
mAbs
min
A
B
115
Como esperado, os compostos foram eluídos em ordem decrescente de peso
molecular, e 16 picos apareceram no cromatograma e nomeados de P1 a P16,
consecutivamente. Embora os mecanismos cromatográficos envolvendo a
separação dos glicosídeos não estejam claros, isto ocorreu principalmente em
função das diferenças entre os epímeros de monossacarídeos. No entanto, parece
que as moléculas de aglicona desempenharam um papel importante, tendo em vista
que uma análise semelhante foi realizada com diferentes padrões oligossacarídeos
livres de diferentes pesos moleculares e também com isômeros. Entretanto a total
separação não foi alcançada, tanto a partir dos diastereoisomeros, como a partir de
oligossacarídeos com diferentes pesos moleculares.
A solubilidade dos flavonóis glicosídeos no solvente poderia ser um caminho
para explicar tal separação, já que quanto maior cadeia de oligossacarídeo, melhor
será sua solubilização em baixas concentrações de solvente orgânico, como ocorre
no início dos gradientes. No entanto, apenas solubilidade não explica a separação
ocorrida principalmente entre os picos P8, P9, P10 e P11. Quando analisados em
modo on-line, tanto P8 e P10 renderam o mesmo íon quasi-molecular, com m/z 609
[M-H]
-
, enquanto que P9 e P11 renderam íons de m/z 593 [M-H]
-
, com 16 unidades
de massa (m.u.) menores do que a de P8 e P10. Com isso foi possível verificar que
mesmo compostos de menor massa, como P9 de 594 Da, foram eluídos antes que
compostos de massa molecular maior, como P10 de 610 Da (Figura 60), indicando
que algum tipo de interação entre a coluna e os glicosídeos ocorreu.
Figura 60 – Perfil de cromatográfico por SEC dos compostos de m/z 609 e 593 [M-H]
-
116
4.3.4.8. Segunda dimensão: RP
Os 16 picos presentes no cromatograma de SEC foram coletados e secos sob
fluxo de nitrogênio, em seguida dissolvidos em MeOH-H
2
O (1:1, v/v), e re-injetados
na segunda dimensão, baseada na cromatografia do tipo heart-cutting. A segunda
dimensão foi realizada em uma coluna C-18, com o método 2 e gradiente RP-GB (pg
49), o que rendeu picos altamente resolvidos. Pelo menos dois outros picos surgiram
na segunda dimensão, resultante de cada pico obtido na primeira dimensão, sendo a
única exceção de pico P6, que deu um único pico com m/z 739, [M-H]
-
, mas seu
isômero estava junto como o pico P5, que mostrou os compostos de m/z 739 e 755
[M-H]
-
. Os picos obtidos na segunda dimensão receberam uma letra adicional para
poder distingui-los, por exemplo, P1A, P1B e P1C, indicando que surgiram de 3
novos picos a partir de P1 (Figura 61).
A utilização da separação baseada em SEC na primeira dimensão permitiu o
aparecimento de composto em baixas concentrações, que passaram despercebidos
na cromatografia uni-dimensional. Assim, vários destes flavonóis glicosídeos
puderam ser observados na segunda dimensão, sendo possível confirmar a
presença dos vários isômeros, sem a interferência das sobreposições de picos
ocorridas na cromatografia uni-dimensional. Com isso foi possível realizar a técnica
de derivatização pós-coluna, para gerar mais informações sobre o sítio de
glicosilação de cada um dos picos, como também coletar os picos individualmente,
para determinação das ligações interglicosídicas, realizada por análises de
metilação-GC-MS.
117
Figura 61 – Perfil de cromatográfico bi-dimensional da fração Mi-ET-SOL
4.3.4.9. Segunda dimensão como derivatização pós-coluna
O sítio de glicosilação dos flavonóis foi inferido com base na fragmentação de
cada um dos íons precursores, que levavam a formação de íons da aglicona na
forma regular e na forma de radical. Contudo, esta análise não levou em
consideração a presença dos isômeros, já que em análises off-line eles não são
distinguidos. Uma das técnicas que podem ser utilizadas para inferir a posição dos
carboidratos em flavonóides é a utilização de regentes de deslocamento do espectro
P-1A
P-1B
P-1C
P-2A
P-2B
P-2C
P-3C
P-3B
P-3A
P-7A
P-7B
P-4A
P-6A
P-5A
P-8A
P-8B
P-9A
P-9B
P-10A
P-10B
P-11A
P-11B
P-12B
P-12A
P-13A
P-13B
P-13C
P-14A
P-14B
P-16B
P-16A
P-15A
P-14C
P-16C
P-16D
P-4B
118
de absorbância no UV, que podem deslocar para região de maior energia
(hipsocrômico) ou então região de menor energia (batocrômico).
De acordo com o tipo e a intensidade do deslocamento pode ser determinado
o sítio de glicosilação (DUCREY et al., 2005; SANNOMIYA et al., 1998, TIBERTI et
al., 2007). Apesar da técnica ter sido desenvolvida para análise em
espectrofotômetros convencionais, utilizando compostos purificados, ela tem sido
aplicada com sucesso através da derivatização pós-coluna, em HPLC-PAD. A
grande vantagem é não haver necessidade de purificar os compostos, já que eles
serão eluídos e derivatizados individualmente, obtendo o espectro de UV para cada
pico.
Dois reagentes de deslocamento foram escolhidos, NaOH e AlCl
3
, devido seu
efeito sobre rutina (Sigma-Aldrich), um padrão para flavonol 3-O-glicosídeos. Os
picos observados na segunda dimensão apresentaram curvas de absorbância
semelhantes às da rutina, sem adição dos reagentes, com λ
max
variando entre 350-
365 e 255-265 nm, nas bandas I e II, respectivamente. No entanto, com adição de
NaOH, houve um deslocamento batocrômico na banda I, que passou a ter λ
max
entre
398 a 406 nm, com surgimento de um ombro em ~325 nm (Figura 62 A-C). Estas
mudanças foram observadas devido à capacidade de bases fortes em reagir com
todos os grupos fenólicos, exceto com OH-5, em posição periférica ao carbono
carbonílico (C-4). Este intenso deslocamento batocrômico, com aproximadamente
40 nm foi encontrado como indicador de que a hidroxila 4’, presente no anel B, não
está participando de nenhum tipo de ligação (DUCREY et al., 1995).
Com a adição de AlCl
3
, também foi verificado um deslocamento batocrômico
na banda I, principalmente nos glicosídeos identificados posteriormente como
contendo quercetina, que variaram de 30 a 50 nm (λ
max
360-410 nm) (Figura 62 A-
B). No entanto, glicosídeos contendo campferol exibiram apenas um pequeno ombro
perto de 400 nm (Figura 62 C). O Al
3+
pode formar complexos com hidroxilas em
posição orto (ex. catecol), bem como com carbonos cetônicos contendo hidroxilas
periféricas, como os presentes na maioria dos flavonas, incluindo quercetina e
campferol.
Ducrey et al. (1995), também atribuíram um deslocamento batocrômico de 42
nm na banda I, como resultado da complexação entre Al
3+
com os oxigênios de C-4
e C-5, obtidos sem neutralizar a fase móvel utilizada no HPLC. Por outro lado, eles
obtiveram um deslocamento maior, de 56 nm, decorrente da complexação
119
envolvendo o Al
3+
com os oxigênios ligados aos C-4 e C-5, mas também com
aqueles na posição orto-dihidroxi (ou seja, com catecol), obtido após a neutralização
da fase móvel. Segundo os autores a neutralização foi necessária, uma vez que
complexos com grupos orto-dihidroxi são instáveis em meio ácido.
Contudo, nos experimentos apresentados neste trabalho, foi demonstrado
que os glicosídeos contendo quercetina resultam em um deslocamento batocrômico
maior do que aqueles que contendo campferol, mesmo sem neutralizar a fase
móvel. Esta diferença observada aqui só pode ser resultado da diferença estrutural
entre quercetina e o campferol, que ocorre justamente no anel B, sendo que a
quercetina apresenta hidroxilas na posição orto, C-3’ e C-4’, enquanto o campferol
apresenta apenas uma hidroxila na posição C-4’. Assim, pode ser inferido que grupo
de orto-dihidroxil da quercetina é o maior responsável pela batocrômico, e que este
ocorreu sem neutralizar o solvente do HPLC.
Os deslocamentos observados foram de 40-45 nm na presença AlCl
3
, o que
foi previamente determinado como sendo resultado de flavonóis com configuração 5-
hidroxi-3-O-substituído (SANNOMIYA et al., 1998), o que esta em pleno acordo com
os resultados obtidos por CID-MS. Como todos os picos do cromatograma renderam
deslocamentos semelhantes, na presença de NaOH ou AlCl
3
, foi possível inferir que
os glicosídeos de M. ilicifolia estudados aqui apresentam como sítio de glicosilação a
hidroxila 3 do anel C, em total concordância com resultados de outros autores
(SANNOMIYA et al., 1998; VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001; TIBERTI et al,
2007).
Figura 62 – Espectro de ultravioleta dos flavonóis glicosídeos de M. ilicifolia.
(A) rutina, (B) glicosídeos contendo quercetina; (C) glicosídeos contendo campferol
120
4.3.4.10. Descrição estrutural dos flavonóis glicosídeos de folhas de Maytenus
ilicifolia
As moléculas de aglicona foram confirmadas como campferol, quercetina e
miricetina segundo seus espectros de CID-MS em modo negativo (Tabela 5, pg 105)
e positivo, comparando os fragmentos obtidos com os resultados disponíveis na
literautura (MA et al., 1997; JUSTESEN, 2000; WOLFENDER et al., 2000; HUGHES
et al., 2001; MARCH e MIAO, 2004). A composição monossacarídica foi realizada
após hidrólise/reduação/acetilação e análise por GC-MS, revelando a presença de
arabinose 6% (Ara), ramnose (Rha) 16%, galactose (Gal) 65% e glucose (Glc) 13%
na fração Mi-ET-SOL. As ligações interglicosídicas foram obtidas a partir dos
compostos purificados na segunda dimensão das análises de HPLC, através das
análises de metilação/GC-MS (Tabela 7, pg 121). A identificação dos derivados
parcialmente metilados foi realizada por comparação de seus perfis de fragmentação
por EI-MS, como descrito por Sassaki et al (2005). Como nem todos os glicosídeos
foram isolados em quantidades suficientes para análises de metilação, eles tiveram
apenas sua seqüência determinada por CID-MS em modo positivo. Neste aspecto,
suas ligações glicosídicas foram atribuídas de acordo com a literatura, quando
disponível. Já que só um tipo de pentose apareceu na composição, toda vez em que
a massa de íon foi equivalente a pentose, foi atribuído à arabinose, o mesmo
acontecendo com a ramnose. Como duas hexoses estavam presentes (galactose e
glucose) somente com o resultado da metilação elas foram identificadas. Os sítios
de glicosilação foram atribuídos como sendo O-3, de acordo com os resultados
obtidos por CID-MS e de deslocamento obtidos com derivatização pós-coluna, como
discutido anteriormente (Figura 62, Tabela 8 pg 140). Suas configurações
anoméricas não foram determinadas, pois devido a grande complexidade, as
amostras não foram obtidas em quantidades suficientes para análises de NMR. Os
glicosídeos serão descritos de acordo com a sua eluição na cromatografia bi-
dimensional, portando iniciando pelos tetra-glicosídeos.
121
TABELA 7 – Análise de metilação dos flavonóis glicosídeos de Maytenus ilicifolia
PMAAs: alditóis acetates parciamente metilados (partially methylated alditol acetate)
Alguns compostos não estão presentes devido a sua baixa abundância. Os valores estão representados como razão molar entre os derivados.
Picos
PMAAs
P2
B
P3
B
P4
A
P4
B
P5
A
P6
A
P8
A
P8
B
P9
A
P9
B
P10
A
P10
B
P11
A
P11
B
P12
A
P12
B
P14
A
P14
B
P14
C
P15
A
P16
A
P16
B
2,3-Me
2
-Ara - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - -
2,3,4-Me
3
-Ara 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1
2,3,5-Me
3
-Ara - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 -
2,4-Me
2
-Rha 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
2,3,4-Me
3
-Rha 1 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - - - - - -
3,4-Me
2
-Glc - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - -
2,3,4-Me
3
-Glc - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - -
3,4,6-Me
3
-Glc - - - - - - - - - - 1 - - 1 - - - - - - - -
2,3,4,6-Me
4
-Glc - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 - 1 - -
3,4-Me
2
-Gal 1 1 1 - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - -
2,3,4-Me
3
-Gal
- - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - -
3,4,6-Me
3
-Gal
- - - - - - 1 - - 1 - - - - - - - - - - - -
2,3,4,6-Me
4
-Gal - - - - - - - - - - - - - - - 1 - 1 - - -
122
4.3.4.11. Estrutura de flavonóis tetra-glicosídeos
Pico-1A – Como este glicosídeo foi observado apenas em análises on-line
não foi possível obtê-lo na forma de aduto de Na
+
. Sua forma protonada gerou um
íon com m/z 919 [M+H]
+
, compatível com a estrutura já descrita Glcp-(1→3)-Rhap-
(1→6)-[Rhap-(1→2)]-Galp-(1→3)-Quer (VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001). A
fragmentação in-source ocorrida confirmou a molécula de aglicona como quercetina,
pelo fragmento Y
0
+
de m/z 303. No entanto, os fragmentos Y
1
+
de m/z 465 e Y
2
+
β
de
m/z 627 mostram uma seqüência compsota por duas hexoses ligadas entre si, e o
fragmento de Y
2
+
α
de m/z 611 mostra que também uma ramnose esta ligada à
hexose indicando que o monossacarídeo ligado à aglicona é di-substituído. O
fragmento Y
3
+
α/β
de m/z 773 indica a remoção de uma unidade terminal de ramnose,
e como outro fragmento decorrente da remoção de uma unidade de glucose não
apareceu, pode-se inferir que esta estrutura apresenta uma seqüência diferente da
anteriormente descrita (Figura 63). Não foi possível determinar por metilação as
ligações interglicosídicas, nem o tipo de hexose presente.
Figura 63 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 919 [M+H]
+
Pico-1B – A estrutura deste tetra-glicosídeo apresentou íon quasi-molecular
de m/z 903 [M+H]
+
. Assim como o P-1A, sua análise de metilação não foi possível,
contudo sua fragmentação in-source indicou uma seqüência monossacarídica similar
àquela do P-1A, mas contendo campferol como aglicona, tal como observado pelos
- Rha
- Hex
- Hex
- Rha
- Rha
- Hex
[M+H]
+
Y
3
+
α,β
Y
2
+
β
Y
2
+
α
Y
1
+
Y
0
+
Quer – Hex – Hex – Rha
Rha
Y
0
+
Y
2
+
α
Y
3
+
α
Y
1
+
Y
3
+
β
Y
2
+
β
123
fragmentos Y
0
+
de m/z 287, Y
1
+
de m/z 449 Y
2
+
α
de m/z 595, Y
2
+
β
de m/z 611, Y
3
+
α/β
de m/z 757 (Figura 64).
Figura 64 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 903 [M+H]
+
Pico-1C – Com íon quasi-molecular de m/z 933 [M+H]
+
, este tetra-glicosídeo
pode ter uma estrutura semelhante a isoramnetina-di-ramno-hexobioside,
encontrado em Maytenus aquifolium por Tiberti et al. (2007). Sua seqüência
monossacarídica parece similar à de P-1A e P-1B, no entanto não pôde ser
totalmente identificada devido sua pequena abundância, pois não foi possível gerar
fragmentos consistentes (Figura 65).
Figura 65 – Perfil de fragmentação in-source do tetra-glicosídeo de m/z 933 [M+H]
+
[M+H]
+
Y
3
+
α,β
Y
2
+
β
Y
2
+
α
Y
1
+
Y
0
+
Isorha – Hex – Hex – Rha
Rha
Y
0
+
Y
2
+
α
Y
3
+
α
Y1
+
Y
3
+
β
- Rha
- Hex
- Hex
- Rha
- Rha
- Hex
[M+H]
+
Y
3
+
α,β
Y
2
+
β
Y
2
+
α
Y
1
+
Y
0
+
Camp – Hex – Hex – Rha
Rha
Y
0
+
Y
2
+
α
Y
3
+
α
Y
1
+
Y
3
+
β
Y
2
+
β
124
Picos-2 B e C – O íon de m/z 889 [M+H]
+
, observado em modo off-line já
indicava a presença de duas estruturas como seqüências monossacarídicas
diferentes (Figura 66, Tabela 8 , pg 140), sendo confirmada pela análise on-line, com
o aparecimento de dois picos com mesmo valor de m/z. O isômero majoritário (P-
2B) já teve sua estrutura previamente caracterizada como Arap-(1→3)-Rhap-(1→2)-
[Rhap-(1→6)]-Galp-(1→3)-O-Quer (VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001), o que
foi confirmado pelos fragmentos Y
0
+
m/z 303, Y
1
+
m/z 465, Y
2
+
α/β
m/z 611, Y
3
+
β
m/z
743 e Y
3
+
α
m/z 757, com as ligações confirmadas por metilação.
O composto minoritário (P-2C) não apresentou rendimento suficiente para
gerar boa fragmentação in-source, e também não foi possível sua análise de
metilação. Contudo no espectro de CID-MS obtido em modo off-line, é possível
observar a presença minoritária de fragmentos que indicam sua seqüência
monossacarídica, através dos íons Y
0
+
m/z 303, Y
1
+
m/z 449 - indicando uma
ramnose ligada à quercetina, Y
2
+
β
m/z 581 e Y
2
+
α
595 – indicando uma arabinose e
outra ramnose, respectivamente, ligadas à primeira ramnose, e os fragmentos Y
3
+
α
m/z 727 e Y
3
+
β
m/z 743. O fragmento de m/z 727 corresponde à perda de um
terminal hexose o que confirma a seqüência como sendo diferente do P-2B, que
apresenta Ara e Rha nos terminais. Um importante fragmento foi observado na
forma de íon sodiado, B
2
+
de m/z 315 que indica duas unidades de ramnose ligadas,
sendo consistente com a seqüência proposta (Figura 66).
125
Figura 66 – Perfil de fragmentação por CID-MS dos tetra-glicosídeos de m/z 889 [M+H]
+
e
m/z 911 [M+Na]
+
Rha – Ara – Glc
Rha
*B
1
+
β
*B
1
+
α
*B
2
+
β
*B
3
+
α
*B
2
+
α
Na
+
*B
3
+
β
B
4
+
Quer – Rha – Ara – Glc
Rha
[Y
0
– H]
+
•
••
•
/ Y
0
+
B
4
+
*Y
2
+
α
*Y
3α
*Y
1
+
*
Y
3
+
β
*Y
2
+
β
B
B
2
+
α
αα
α
B
3
+
α
B
x
+
B
1
+
β
B
2
+
β
B
3
+
β
B
4
+
[M+Na]
+
*B
3
+
β
*B
3
+
α
B
1
+
α
*B
2
+
α
- Quer
- Ara
- Rha
- Hex
- Rha
- Ara
- Rha
- Hex
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
Y
3
+
α
Y
3
+
β
Y
2
+
α
/
β
*
Y
2
+
α
*
Y
2
+
β
*Y
3
+
α
*Y
1
+
*Y
3
+
β
- Ara
- Rha
- Hex
- Hex
- Ara
- Rha
- Rha
- Hex
- Rha
- Rha
- Ara
- Rha
B
3
+
α
B
3
+
β
B
2
+
α
B
2
+
β
B
1
+
α
B
1
+
β
B
4
+
Y
3
+
α
Y
2
+
α
Y
3
+
β
Y
2
+
β
Y
1
+
[Y
0
–
H]
+
•
••
•
/ Y
0
+
CID-MS dos íons Na
+
Na
+
A
O
O
O
H
O
H
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
C
H
3
O
H
O
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
O
C
H
3
O
H
O
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
OH
O
H
O
H
Na
+
(A) Estrutura principal P2-B, (B) estrutura minoritária P2-C, indicada nos espectros de CID-MS por asteriscos
126
Pico-3 B e C – Suas estruturas são respectivamente similares às descritas
anteriormente (P-2 B e C), contudo o campferol esta presente como aglicona no
lugar da quercetina, produzindo um íon quasi-molecular de m/z 873 [M+H]
+
.
Também como descrito anteriormente, o composto majoritário (P-3B) já teve sua
estrutura descrita como Arap-(1→3)-Rhap-(1→2)-[Rhap-(1→6)]-Galp-(1→3)-O-Quer
(VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001) e foi confirmada aqui por metilação
(Tabela 7, pg 121), e pelos fragmentos obtidos por CID-MS de Y
0
+
m/z 287, Y
1
+
m/z
449, Y
2
+
α/β
m/z 595, Y
3
+
β
m/z 728 e Y
3
+
α
m/z 741 (Figura 67).
Novamente, a estrutura do pico minoritário (P-3C) não pode ser totalmente
elucidada devido a sua baixa abundância, tendo apenas sua seqüência
monossacarídica determinada pelos fragmentos Y
0
+
m/z 287, Y
1
+
m/z 433, Y
2
+
β
m/z
565, Y
2
+
α
m/z 579.
O espectro de CID-MS dos compostos sodiados também confirmou estas
duas seqüências monossacarídicas. Os principais íons que dão suporte a estas
seqüências são os fragmentos B
2
+
, encontrados em m/z 301 – correspondente a
uma arabinose ligada a uma ramnose, podendo ter sido gerado por ambas as
estruturas; já o fragmento de m/z 315 indica duas unidades de ramnose ligadas
entre si, e só pode ter sido originado a partir da estrutura do composto P-3C, já que
na estrutura do composto P-3B as unidade de ramnose estão separadas; m/z 331
corresponde a uma unidade ramnose ligada a uma de hexose, sendo proveniente do
composto P-3B. Os demais fragmentos do tipo B também dão suporte para ambas
as sequências (Figura 67).
127
Figura 67 – Perfil de fragmentação por CID-MS dos tetra-glicosídeos de m/z 873 [M+H]
+
e
m/z 895 [M+Na]
+
Rha – Ara – Glc
Rha
*B
1
+
β
*B
1
+
α
*B
2
+
β
*B
3
+
α
*B
2
+
α
Na
+
*B
3
+
β
B
4
+
Camp – Rha – Ara – Glc
Rha
[Y
0
– H]
+
•
••
•
/ Y
0
+
B
4
+
*Y
2
+
α
*Y
3
+
α
*Y
1
+
*Y
3
+
β
*Y
2
+
β
B
B
4
+
[M+Na]
+
B
3
+
α
αα
α
*B
3
+
β
ββ
β
B
2
+
α
αα
α
B
2
+
β
ββ
β
B
1
+
α
αα
α
B
1
+
β
ββ
β
B
3
+
β
ββ
β
*B
2
+
α
αα
α
*B
3
+
α
αα
α
B
x
+
-Camp -Rha
-Hex
-Ara
-Ara
-Rha
-Hex
-Ara
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
*Y
1
+
Y
2
+
α
αα
α/β
ββ
β
*Y
2
+
β
ββ
β
Y
3
+
β
ββ
β
Y
3
+
α
αα
α
*Y
2
+
α
αα
α
-Ara
-Rha
-Rha
-Ara
-Hex
-Rha
-Ara
-Rha
-Rha
-Hex
m/z
B
4
+
Y
3
+
α
Y
2
+
α
Y
3
+
β
Y
2
+
β
Y
1
+
[Y
0
–
H]
+
•
••
•
/ Y
0
+
CID-MS dos íons Na
+
Na
+
A
B
3
+
α
B
3
+
β
B
2
+
β
B
1
+
α
B
1
+
β
B
2
+
α
O
O
O
H
O
H
O
O
C
H
3
O
H
O
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
OH
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
C
H
3
O
H
O
O
H
O
C
H
3
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
(A)
E
strutura principal
P3
-
B
, (B) estrutura minoritária
P3
-
C
, indicada nos espectros de CID
-
MS por asteriscos
128
4.3.4.12. Estrutura de flavonóis tri-glicosídeos
Picos-2A e 3A – Dois compostos formando íon quasi-molecular de m/z 771 [M-H]
-
,
foram encontrados. O espectro de CID-MS em modo negativo já havia fornecido a
diferença entre os dois compostos, através da formação dos fragmentosY
0
-
, de m/z
301 e 317, consistentes com a estrutura da quercetina e da miricetina,
respectivamente. As duas agliconas foram confirmadas por seus fragmentos de
massa em modo negativo (Tabela 5, pg 105), enquanto a seqüência glicosídica foi
determinada por CID-MS em modo positivo.
O composto mais abundante (P-2A) gerou fragmentos protonados
consistentes com quercetina (m/z 303), Quer-Hex (m/z 465), Quer-Hex-Hex (m/z
627), Quer-Hex-Rha (m/z 611) com seu íon precursor de m/z 773 sendo então
consistente com a estrutura Quer-Hex-(Hex)-Rha (Figura 68 A), semelhante a uma já
encontrada em M. aquifolium (TIBERTI et al., 2007). A fragmentação deste
composto na forma de adutos de Na
+
confirmou a estrutura do oligossacarídeo, pela
presença dos fragmentos B
3
+
de m/z 493, indicando um trissacarídeo composto de
Hex-Hex-Rha, B
2
+
α
de m/z 347 que indica duas hexoses interligadas e de m/z B
2
+
β
331 consistente com Hex-Rha, o que confirma a sequência descrita pela
fragmentação do composto na forma de adutos de H
+
(Figura 68 C, D).
A estrutura do composto P-2B pode ser diferenciada facilmente da estrutura
anterior (seu isóbaro) por apresentar uma molécula de aglicona diferente, a
miricetina que forneceu fragmento protonado de m/z 319 e sodiado de m/z 341
(Figura 68 B). Glicosídeos contendo miricetina ainda não haviam sido descritos em
M. ilicifolia e possivelmente esta seja a primeira descrição para o gênero Maytenus.
De acordo com os fragmentos obtidos em modo positivo do íon precursor protonado,
a miricetina esta ligada a uma unidade de hexose evidenciada pelo fragmento Y
1
+
de
m/z 481. Esta unidade de hexose é provavelmente di-substituida por duas outras de
ramnose, seguindo o mesmo perfil de outros glicosídeos de M. ilicfolia, o fragmento
Y
2
+
de m/z 627 indica uma ramnose ligada à hexose, mas não confirma o padrão de
di-substituição. Contudo, na forma sodiada foi possível inferir este padrão de di-
substituição, primeiro pela formação do fragmento B
3
+
de m/z 477 indicando um
trissacarídeo, e sabendo que a hexose esta ligada à miricetina, a formação de
apenas um tipo de fragmento B
2
+
, de m/z 331 indicando o dissacarídeo Hex-Rha
confirma a di-substituição da hexose por duas unidades de ramnose, já que se o
129
trissacarídeo fosse linear (Hex-Rha-Rha) deveria aparecer um fragmento de m/z 315
que seria compatível com duas unidades de ramnose ligadas, o que não aparece no
espectro (Figura 68 C, D).
Contudo, devido a baixa abundância de ambos os compostos, não foi
possível realizar sua análise por metilação e, portanto não tiveram suas ligações
interglicosídicas elucidadas, nem o tipo de hexose presente.
Figura 68 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-hexobiosídeo e
miricetina di-ramno-hexosídeo - m/z 773 [M+H]
+
e m/z 795 [M+Na]
+
Isômeros contendo diferentes agliconas, (A) quercetina em P2-A e (B) miricetina em P3-A, indicada
por asteriscos nos espectros de CID-MS
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
A
Hex
Hex
Rha
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
/Y
0
+
Y
2
+
α
Y
2
+
β
Y
1
+
B
3
+
B
Hex
Rha
Rha
* [Y
0
-
H]
+
•
••
•
/Y
0
+
*Y
2
+
α
*Y
2
+
β
*Y
1
+
*B
3
+
Hex
Hex
Rha
B
1
+
β
B
1
+
α
B
2
+
β
B
2
+
α
B
X
+
Hex
Rha
Rha
*B
1
+
β
*B
1
+
α
*B
2
+
β
*B
2
+
α
*B
X
+
B
3
+
*B
3
+
Na
+
Na
+
[M+Na]
+
*B
3
+
B
3
+
B
2
+
β
*B
2
+
α
/
β
B
2
+
α
B
1
+
β
*B
1
+
α
/
β
*B
x
B
+
D
-Mir
-Quer
-Hex
-Rha
-Rha
Y
0
+
*Y
0
+
[M+H]
+
*Y
1
+
Y
2
+
β
Y
2
+
α
*Y
2
+
α
/
β
C
Y
1
+
-Hex
-Rha
-Hex -Hex
-Hex
-Rha
-Rha
*[Y
0
-H]
+
•
••
•
[Y
0
-H]
+
•
••
•
130
Picos-4 A e B – Estes dois compostos constituem isômeros de que apareceram com
m/z 755 [M-H]
-
, 757 [M+H]
+
, 779 [M+Na]
+
. A estrutura do isômero mais abundante
(P-4A) foi previamente caracterizada como Rhap-(1→2)-[Rhap-(1→6)]-Galp-(1→3)-
O-Quer (VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001), e foi indistinguível da estrutura P-
4B nos espectros de massa, que apresentaram os mesmos tipos de fragmentos
desprotonados, Y
0
-•
m/z 300, protonados Y
0
+
m/z 303, Y
1
+
m/z 465 e Y
2
+
α/β
m/z 611 e
sodiados B
2
+
α/β
m/z 331 e B
3
+
m/z 477 (Figuras 55 e 56, pgs 107 e 109).
Se por um lado as análises off-line indicavam apenas um composto, por outro
lado as análises on-line confirmavam a presença de dois picos com mesmas
características de fragmentação in-source. Como neste caso os compostos
apresentaram bom rendimento após coleta no HPLC, ambos foram analisados por
metilação, que forneceu a informação que faltava para a identificação dos
compostos. O composto P-4A foi confirmado com a estrutura previamente descrita,
contendo galactose ligada à quercetina e di-substituida por duas unidades de
ramnose nas posições O-2 e O-6. Com estrutura muito similar, o composto P-4B
apresentou um derivado acetato parcialmente metilado de 3,4-Me
2
-glucitol, o que
confirmou as duas estruturas como diastereoisômeros, uma contendo galactose e a
outra glucose ligadas à quercetina. A glucose também apresenta-se di-substituída
por duas unidades de ramnopiranose.
Picos-5A e 6A – Novamente dois diastereoisômeros contendo galactose e glucose
como os descritos anteriormente, contudo contendo campferol no lugar da
quercetina. A análise de massa de ambos forneceu os mesmos íons de m/z 739 [M-
H]
-
, 741 [M+H]
+
, 763 [M+Na]
+
(Figura 55 e 56, pgs 107 e 109). A estrutura do
isômero mais abundante (P-6A) foi previamente caracterizada como Rhap-(1→2)-
[Rhap-(1→6)]-Galp-(1→3)-O-Camp (VILEGAS et al., 1999; LEITE et al., 2001),
enquanto que a estrutura do composto menos abundante (P-5A) é similar, porém
contendo glucose no lugar da galactose, como mostrado por análise de metilação,
pelo aparecimento do derivado acetato de 3,4-Me
2
-glucitol. Os fragmentos de massa
que confirmam a estrutura são: desprotonados, Y
0
-•
m/z 284, protonados Y
0
+
m/z
287, Y
1
+
m/z 449 e Y
2
+
α/β
m/z 595 e sodiados B
2
+
α/β
m/z 331 e B
3
+
m/z 477, indicando
que os trissacarídeos são iguais aos dos compostos P-4 A e B.
131
4.3.4.13. Estrutura de flavonóis di-glicosídeos
Picos 7A e B – Foram encontrados dois isóbaros com íons desprotonados de m/z
625 [M-H], protonados de m/z 627 [M+H]
+
e sodiados de m/z 649 [M+Na]
+
. A
exemplo dos isóbaros P-2 e 3A, sua diferenciação pode ser observada mesmo por
CID-MS em modo negativo, que forneceu dois principais fragmentos [Y
0
–H]
-•
de m/z
300 e 316, consistentes com quercetina e miricetina como agliconas. Contudo
devido a sua baixa abundância, o composto contendo miricetina não foi localizado
nos cromatogramas, e portando não foi analisado por metilação. Sua estrutura foi
determinada pelos fragmentos observados em modo off-line, do precursor protonado
gerando fragmento de m/z 481 (Y
1
+
), que indica uma unidade de hexose ligada à
miricetina, e os fragmentos sodiados de m/z 331 (B
2
+
) e 169 (B
1
+
), que confirmam a
presença do dissacarídeo Hex-Rha.
Em modo on-line, os compostos P-7A e B foram identificados como
quercetina-hexobioside, como indicado pela presença dos fragmentos protonados de
m/z 303 (Y
0
+
), e m/z 465 (Y
1
+
) equivalentes a quercetina e a Quer-Hex,
respectivamente, e no modo off-line o fragmento sodiado de m/z 347 (B
2
+
), foi
consistente com grupo hexobiosil. Devido a baixa abundância destes picos na
segunda dimensão, eles foram coletados juntos diretamente da primeira dimensão
para serem então analisados por metilação, a qual mostrou uma mistura de PMAAs,
indicando uma mistura de isômeros, contendo glucose e galactose ligada à
quercetina. Por está análise, Glcp foi encontrada como resíduo terminal, e podendo
estar ligada à galactose ou outra glucose por ligações O-glicosídicas 1→2 ou 1→6
(Figura 69 A, B), contudo esta fração precisa ser melhor purificada para confirmar
todos estes isômeros.
132
Figura 69 – Perfil de fragmentação por CID-MS da miricetina ramno-hexosídeo e quercetina
hexobiosídeo - m/z 627 [M+H]
+
e m/z 649 [M+Na]
+
P7 A e B, contendo isômeros ligados à quercetina (A). Um outro composto isóbaro apareceu apenas
em modo off-line contendo miricetina indicada por asteriscos nos espectros de CID-MS
Pico-8A/B e 10A/B – Quatro compostos foram encontrados formando os mesmo
íons, e com as mesmas fragmentações. Estes compostos apresentaram íons quasi-
moleculares de m/z 611 [M+H]
+
e pseudo-moleculares de m/z 633 [M+Na]
+
. Os
fragmentos protonados Y
0
+
de m/z 303 e Y
1
+
de m/z 465, bem como os sodiados B
1
+
de m/z 169, B
x
+
de m/z 185 e B
2
+
de m/z 331 são compatíveis com a estrutura da
rutina [α-Rhap-(1→6)-β-Glcp-(1→3)-O-Quer] (Figura 70 A, B). Como os quatro picos
apresentaram bom rendimento após serem isolados no HPLC (segunda dimensão)
foi possível realizar suas análises de metilação (Tabela 7, pg 121), e com isso
identificá-los. O composto P-8A foi identificado como Rhap-(1→2)-Galp-(1→3)-O-
Quer, pela presença do derivado PMAA 3,4,6-Me
3
-galactitol, enquanto o composto
[M+H]
+
Y
0
+
*Y
0
+
*Y
1
+
Y
1
+
[M+Na]
+
B
2
+
*B
2
+
B
1
+
*B
1
+
-Rha
-Hex
-Hex
-Hex
-Mir
-Quer
B
Hex – Rha
*Y
1
+
*B
2
+
*B
1
+
*[Y
0
-H]
+
•
••
•
/Y
0
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
A
Hex – Glc
B
2
+
B
1
+
[Y
0
-H]
+
•
••
•
/Y
0
+
Y
1
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
[Y
0
-H]
+
•
••
•
133
P-8B como Rhap-(1→6)-Galp-(1→3)-O-Quer, pelo derivado acetato de 2,3,4-O-Me
3
-
galactitol. Similarmente, o composto P-10A foi identificado como Rhap-(1→2)-Glcp-
(1→3)-O-Quer pela presença do derivado PMAA 3,4,6-Me
3
-glucitol; e o composto P-
10B identificado como rutina através do derivado PMAA 2,3,4-O-Me
3
-glucitol. Em
todos estes compostos o terminal de ramnopiranose foi confirmado pela presença do
derivado PMAA 2,3,4-O-Me
3
-ramnitol (Tabela 7, pg 121).
Figura 70 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-hexisídeo - m/z 611
[M+H]
+
e m/z 633 [M+Na]
+
Compostos formando isômeros indistiguíveis por ESI-MS, contendo ramnose ligada à galactose ou à
glucose por ligações 1→2 (A) ou 1→6 (B).
Pico-9A/B e 11A/B – Estes compostos também formaram 4 picos no cromatograma
bi-dimensional, e foram identificados com estruturas similares aos anteriormente
descritos, com ramnose ligada à galactose ou glucose por ligações 1→2 ou 1→6,
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
[M+Na]
+
B
1
+
B
x
+
B
2
+
-Quer
-Rha
-Hex
O
H
O
O
H
O
H
C
H
3
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
/
Y
0
+
B
2
+
B
1
+
Y
1
+
B
x
+
[Y
0
-
H]
•
••
•
+
/Y
0
+
B
2
+
B
1
+
Y
1
+
B
x
+
A
B
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
C
H
3
O
H
[Y
0
-H]
+
•
••
•
134
porém com campferol como aglicona no lugar da quercetina. Contudo, em modo off-
line alguns fragmentos indicam a presença de um quinto composto, não observado
no HPLC. Na análise de CID-MS em modo negativo, o íon precursor de m/z 593
gerou o fragmento Y
0
+
esperado para o campferol, de m/z 287, mas também outro
fragmento de m/z 303, consistente com a quercetina. Como a diferença destas duas
agliconas é uma hidroxila a mais presente na quercetina, os dissacarídeos ligados a
elas deveriam ser diferente. Isto foi demonstrado através da fragmentação dos íons
sodiados (m/z 617), que deu origem a sinal intenso de m/z 331 (B
2
+
) do dissacarídeo
Hex-Rha, e um pequeno fragmento de m/z 315, compatível com o dissacarídeo Rha-
Rha, que esta ligado à quercetina (Figura 71 A, B).
Figura 71 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campferol ramno-hexisídeo e quercetina
ramnobiosídeos - m/z 595 [M+H]
+
e m/z 617 [M+Na]
+
(A) Estrutura contendo ramnose ligada à galactose ou glucose por ligações 1→2 com campferol como
aglicona. Ligações 1→6 também foram encontradas. (B) estrutura minoritária contendo duas
unidades ramnose ligadas à quercetina, obsevada apenas em modo off-line.
A B
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
/
Y
0
+
B
2
+
B
1
+
Y
1
+
Rha – Rha
*[Y
0
-
H]
•
••
•
+
/ Y
0
+
*B
2
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
C
H
3
B
x
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
*Y
1
+
*B
1
+
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
[M+Na]
+
*B
1
+
B
x
+
B
2
+
-Camp
-Rha
-Hex
-Quer
*B
2
+
-Rha
*
Y
0
+
*
Y
1
+
[Y
0
-H]
+
•
••
•
135
Pico-12A e B – Com m/z 581 [M+H]
+
e 603 [M+Na]
+
, dois novos glicosídeos foram
identificados em M. ilicifolia, sendo indistinguíveis entre si pelos métodos utilizados.
Estas estruturas foram caracterizadas como contendo ramnose terminal e arabinose
ligada à quercetina, observado através dos fragmentos protonados Y
0
+
de m/z 303 e
Y
1
+
em m/z 435. A análise de metilação confirmou a estrutura, no entanto, não foi
possível obter as ligações interglicosídicas precisamente, considerando que os
derivados PMAAs encontrados na análise foram de 2,3,4-Me
3
-ramnitol e 2,3-Me
2
-
arabinitol, mostrando que a ramnose pode estar ligada à arabinose em O-4 ou O-5,
já que derivado acetato de 2,3-Me
2
-arabinitol não permite distinguir entre
arabinofuranose e arabinopiranose. Como estes compostos formaram dois picos no
cromatograma, as duas estruturas parecem estar presentes: Rhap-(1→ 4)-Arap e
Rhap-(1→5)-Araf (Figura 72 A, B).
Figura 72 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina ramno-arabinosídeo - m/z 581
[M+H]
+
e m/z 603 [M+Na]
+
Glicosídeos contendo arabinopiranose (A) e arabinofuranose (B). Ambos produzem os mesmos
derivados acetatos parcialmente metilados, contudo dois picos foram observados nos cromatogramas
de LC-MS indicando que as duas estruturas estão presentes no extrato.
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
[M+Na]
+
B
1
+
B
x
+
B
2
+
-Quer
-Rha
-Ara
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
/
Y
0
+
B
2
+
B
1
+
Y
1
+
B
x
+
O
O
H
O
H
O
H
C
H
3
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
B
2
+
B
1
+
Y
1
+
B
x
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O
H
C
H
3
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
/
Y
0
+
A B
136
Pico-13C – Este flavonol di-glicosídeo foi identificado apenas por análise on-line
apresentando íons quasi-moleculares de m/z 563 [M-H]
-
, e 565 [M+H]
+
. Sua
estrutura foi identificada como Rha-Ara-Camp, sendo compatível com a dos
compostos P-12 A e B, contendo campferol no lugar da quercetina. Sua
fragmentação in-source confirmou a presença do campferol com m/z 287 (Y
0
+
) e a
arabinose ligada ao campferol com m/z 419 (Y
1
+
) (Figura 73). Uma estrutura
semelhante já foi previamente descrita em M. ilicifolia (TIBERTI et al., 2007).
Figura 73 – Perfil de fragmentação in-source do campferol ramno-arabinosídeo - m/z 565
[M+H]
+
4.3.4.14. Estrutura de flavonóis mono-glicosídeos
Picos-13A e B – Dois picos referentes flavonóis mono-glicosídeos com mesmos
íons quasi-moleculares de m/z 479 [M-H]
-
e m/z 481 [M+H]
+
foram observados
apenas nas análises on-line. Estes dois flavonóis renderam fragmentação com íon
chave de m/z 319 (Y
0
+
), sendo compatível com a miricetina, com NL de 162 m.u.
indicando a perda de uma unidade de hexose (Figura 74). Como dois picos
apareceram no cromatograma, é possível que sejam referentes à glicosídeos com
galactose e com glucose, como tem sido comum aos flavonóis glicosídeos de M.
ilicifolia. Estes dois glicosídeos ainda não haviam sido relatados em M. ilicifolia.
[M+H
]
+
Y
0
+
Y
1
+
-Rha
-Ara
Y
0
+
Y
1
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
Ara
-
-
Rha
137
[M+H]
+
Y
0
+
[M+Na]
+
B
1
+
-Hex
-Hex
-Quer
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
B
1
+
Y
0
+
/ [Y
0
-
H]
+
•
••
•
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
Figura 74 – Perfil de fragmentação in-source da miricetina-hexosídeo - m/z 481 [M+H]
+
Picos-14 A e B – Estes dois compostos de m/z 465 [M+H]
+
e m/z 487 [M+Na]
+
,
apresentam quercetina como aglicona, com fragmento protonado de m/z 303 e
sodiado de m/z 324. A formação do fragmento sodiado de m/z 185 foi consistente
com uma hexose (Figura 75). Estes dois compostos foram analisados por metilação,
e mostraram os derivados PMAA 2,3,4,6-Me
4
-Galp (P-14A), e 2,3,4,6-Me
4
-Glcp (P-
14B), sendo coerentes com a estrutura do hiperosídeo e da isoquercitrina, ambos já
relatados em M . ilicifolia (TIBERTI et al., 2007).
Figura 75 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina-hexosídeo - m/z 465 [M+H]
+
e
m/z 487 [M+Na]
+
- Hex
D
[M+H]
+
Y
0
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
B
1
+
Y
0
+
138
Picos-14C e 15A – Estes dois compostos de m/z 449 [M+H]
+
apresentaram
estruturas semelhantes ao hiperosídeo e à isoquercitrina, porém contendo campferol
como aglicona conforme indicado pelo fragmento protonado Y
0
+
de m/z 287 (Figura
76). Ambos geraram os mesmos derivados PMAA dos picos P-14C e P-15A (Tabela
7, pg 121).
Figura 76 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campeferol-hexosídeo - m/z 449 [M+H]
+
e m/z 471 [M+Na]
+
Picos-16A e B – Estes dois compostos de m/z 435 [M+H]+ mostraram quercetina na
sua composição (Y
0
+
de m/z 303). Sua NL de 132 m.u. indica que uma pentose esta
ligada à aglicona, o que foi confirmado pelo fragmento sodiado B
1
+
de m/z 155
(Figura 77). Análise de metilação indicou a presença de Araf e Arap (Tabela 7, pg
121), ambos ainda não haviam sido descritos em M. ilicifolia.
[M+H]
+
Y
0
+
[M+Na
]
+
B
1
+
-Hex
-Hex
-Camp
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
B
1
+
Y
0
+
/ [Y
0
-
H]
+
•
••
•
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
139
Figura 77 – Perfil de fragmentação por CID-MS da quercetina-arabinosídeo - m/z 435
[M+H]
+
e m/z 457 [M+Na]
+
Pico-16 C e D – Dois picos foram observados com m/z 419 [M+H]
+
no
cromatograma da segunda dimensão. Estes já haviam sidos detectados em análise
off-line formado íon pseudo-molecular de m/z 441 [M+Na]
+
. Seus fragmentos
protonados de m/z 287 (Y
0
+
), e sodiado de m/z 155 (B
1
+
) mostram uma unidade de
arabinose ligada ao campferol (Figura 78). Como formam dois picos no
cromatograma (LC-MS) é possível que estes sejam formados por Araf e Arap, como
os compostos P-16A e B, contudo não apareceram na análise de metilação.
Figura 78 – Perfil de fragmentação por CID-MS do campferol-arabinosídeo - m/z 435
[M+H]
+
e m/z 457 [M+Na]
+
[M+H]
+
Y
0
+
[M+Na
]
+
B
1
+
-Ara
-Ara
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
Y
+
•
-Quer
B
1
+
Y
0
+
/ [Y
0
-
H]
+
•
••
•
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
B
1
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
H
Y
0
+
/
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
Y
+
•
[M+H]
+
Y
0
+
[M+Na]
+
B
1
+
-Ara
-
Hex
-Camp
[Y
0
-
H]
+
•
••
•
Y
+
•
140
TABELA 8 – Resultado obtido por 2D-LC-MS com derivatização pós-coluna
R
t
(min) ESI-MS em modo positivo (fragmentação in-source)
λ
max
(nm)
Pico
SEC RP
[M-H]
-
[M+H]
+
Y
0
+
Y
1
+
Y
2
+
α
Y
2
+
β
Y
3
+
α
Y
3
+
β
Branco NaOH AlCl
3
Identificação dos compostos
P1A 13.89 8.13 917 919 303 465 611 611 - 773 256 – 354 270 - 325 - 406 265 – 401
Rha-(1→)-Hex-(1→)-[Rha-(1→)]-Gal-(1→)-Quer
P1B 13.89 9.09 901 903 287 449 595 611 757 757 255 – 361 273 - 326 - 405 270 – 352
Rha-(1→)-Hex-(1→ )-[Rha-(1→ )]-Gal-(1→)-Camp
P1C 13.89 9.51 931 933 317 479 625 641 787 787 256 – 355 271 - 326 - 406 268 – 356
Rha-(1→)-Hex-(1→ )-[Rha-(1→ )]-Gal-(1→)-Isorhamnetin
P2A 21.09 12.06 771 773 303 303 465 611 627 - 255 – 354 273 - 325 - 405 268 – 400
Hex-(1→ )-[Rha-(1→ )]-Gal-(1→)-Quer
P2B 21.09 13.22 887 889 303 465 611 611 757 743 255 – 354 270 - 329 - 400 269 – 403
Arap-(1→3)-Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Galp-(1→3)-Quer
P2C 21.09 13.52 887 889 303 449 595 581 727 743 255 – 355 270 - 325 - 402 270 – 404
Hex-(1→)-Ara-(1→ )-[Rha-(1→)]-Rha-(1→3)-Quer
P3A 22.41 10.88 771 773 319 319 481 627 - - 255 – 354 272 - 327 - 405 271 – 406
Rhap-(1→)-[Rhap-(1→)]-Galp-(1→3)-Myr
P3B 22.41 14.63 871 873 287 449 595 595 741 727 256 – 364 275 - 325 - 406 265 – 355
Arap-(1→3)-Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Galp-(1→3)-Camp
P3C 22.41 15.17 871 873 287 433 565 579 711 727 255 – 356 271 - 326 - 398 268 – 358
Hex-(1→)-Ara-(1→ )-[Rha-(1→)]-Rha-(1→3)-Camp
P4A 23.58 13.17 755 757 303 465 611 611 - - 255 – 355 273 - 327 - 401 268 – 403
Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Galp-(1→3)-Quer
P4B 23.58 13.49 755 757 303 465 611 611 - - 254 – 354 273 - 325 - 402 267 – 403
Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Glcp-(1→3)-Quer
P5A 24.42 15.06 739 741 287 449 595 595 - - 255 – 363 270 - 325 - 405 269 – 356
Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Glcp-(1→3)-Camp
P6A 25.65 14.68 739 741 287 449 595 595 - - 256 – 358 271 - 328 - 404 267 – 355
Rhap-(1→ 6)-[Rhap-(1→ 2)]-Galp-(1→3)-Camp
P7A 28.24 12.10 625 627 303 465 - - - - 265 – 361 273 - 326 - 404 273 – 404
Glcp-(1→2/6)-Gal/Glc-(1→3)-Quer
P7B 28.24 12.40 625 627 303 465 - - - - 255 – 354 272 - 325 - 406 269 – 405
Glcp-(1→2/6)-Gal/Glc-(1→3)-Quer
P8A 30.66 13.83 609 611 303 465 - - - - 255 – 361 271 - 325 - 405 267 – 405
Rhap-(1→ 2)-Galp-(1→3)-Quer
P8B 30.66 14.23 609 611 303 465 - - - - 255 – 354 271 - 325 - 405 268 – 406
Rhap-(1→ 6)-Galp-(1→3)-Quer
P9A 32.13 15.40 593 595 287 449 - - - - 254 – 354 271 - 326 - 402 270 – 355
Rhap-(1→ 6)-Galp-(1→3)-Camp
P9B 32.13 15.85 593 595 287 449 - - - - 255 – 355 273 - 325 - 401 270 – 356
Rhap-(1→ 2)-Galp-(1→3)-Camp
P10A 33.72 14.74 609 611 303 465 - - - - 255 – 355 273 - 327 - 404 268 – 403
Rhap-(1→ 2)-Glcp-(1→3)-Quer
P10B 33.72 15.20 609 611 303 465 - - - - 264 – 358 275 - 325 - 405 269 – 401 Rhap-(1→ 6)-Glcp-(1→3)-Quer (rutina)
P11A 34.70 16.44 593 595 287 449 - - - - 255 – 356 270 - 325 - 405 265 – 355
Rhap-(1→ 6)-Glcp-(1→3)-Camp
P11B 34.70 17.43 593 595 287 449 - - - - 255 – 358 273 - 325 - 403 266 – 353
Rhap-(1→ 2)-Glcp-(1→3)-Camp
P12A 36.88 16.22 579 581 303 435 - - - - 256 – 354 271 - 325 - 403 267 – 401
Rhap-(1→ 4/5)-Ara-(1→3)-Quer
P12B 36.88 16.48 579 581 303 435 - - - - 255 – 365 271 - 325 - 403 268 – 399
Rhap-(1→ 4/5)-Ara-(1→3)-Quer
P13A 39.77 12.63 479 481 319 - - - - - 255 – 356 274 - 325 - 406 268 – 404
Hex-(→)-Mir
P13B 39.77 12.84 479 481 319 - - - - - 256 – 356 271 - 329 - 403 265 – 403
Hex-(→)-Mir
P13C 39.77 18.45 563 565 287 419 - - - - 261 – 357 271 - 325 - 404 267 – 354
Rha-(→)-Ara-(→)-Camp
P14A 41.50 15.03 463 465 303 - - - - - 255 – 355 273 - 326 - 405 267 – 408
Galp-(1→3)-Quer (hiperosídeo)
P14B 41.50 15.51 463 465 303 - - - - - 254 – 355 272 - 325 - 405 270 – 405
Glcp-(1→3)-Quer (isoquercetrina)
P14C 41.50 16.91 447 449 287 - - - - - 250 – 355 272 - 326 - 404 269 – 356
Galp-(1→3)-Camp
P15A 42.36 17.86 447 449 287 - - - - - 255 – 356 271 - 325 - 406 265 – 351
Glcp-(1→3)-Camp
P16A 44.98 16.09 433 435 303 - - - - - 255 – 354 273 - 325 - 406 267 – 401
Araf-(1→3)-Quer
P16B 44.98 16.47 433 435 303 - - - - - 255 – 354 274 - 325 - 405 268 – 400
Arap-(1→3)-Quer
P16C 44.98 17.80 417 419 287 - - - - - 255 – 356 273 - 325 - 402 268 – 356
Ara-(1→)-Camp
P16D 44.98 18.27 417 419 287 - - - - - 258 – 362 270 - 327 - 405 269 – 353
Ara-(1→)-Camp
141
4.3.4.15. Diferenciação parcial entre galactosídeos e glucosídeos por ESI-MS
em modo off-line
A isomeria apresentada pelos flavonóis glicosídeos de M. ilicifolia deve-se em
grande parte à presença de galactose ou glucose ligada à aglicona. Os
monossacarídeos galactose e glucose constituem-se de dois epímeros, contendo
apenas a hidroxila 4 com configuração diferente (equatorial na glucose e axial na
galactose). Esta diferença permite que ambos os monossacarídeos tenham
propriedades de formação de derivados isopropilidenos diferentes através da
acetalação, já que a posição mais favorável para que ocorra a acetalação é em
hidroxilas vicinais com configuração cis, como em OH-3,4 da galactose. Contudo,
quando não há substituição em C-6 da glucose, ocorre a acetalação nas posições
OH-4,6, bem como na galactose.
Como forma de controle a derivatização foi realizada com a rutina, que
contém uma unidade glucose com C-6 substituído por ramnose. Como era
esperado, a reação foi positiva apenas para unidade de ramnose, e o ganho de
massa foi de 40 m.u., gerando dois íons, um de m/z 651 [M+H]
+
, e outro de m/z 673
[M+Na]
+
. O rendimento da reação foi calculado em triplicata, através de
quantificação por HPLC-UV-MS, o qual demonstrou que 95% da ramnose
encontrava-se derivatizada.
Os principais flavonóis diglicosídeos de M. ilicifolia, apresentam cadeias de
dissacarídeos, com galactose ou glucose ligadas à aglicona e substituídas em OH-2
ou OH-6 por unidades de ramnose (Figura 79 A e D). Através da acetalação, foi
possível determinar a presença de rutina e do campferol-rutinosídeo, já que ambos
apresentam glucose com substituição em OH-6, impedindo a formação de
isopropilideno em OH-4,6, como observado no padrão. A análise de CID-MS
confirmou a estrutura de ambos, através dos fragmentos protonados Y
1
+
, de m/z 449
(Figura 79 B) e 465, indicando a ligação de uma hexose não derivatizada (glucose)
ao campferol e à quercetina, respectivamente, enquanto que a hexose na forma de
isopropilideno rendeu fragmentos Y
1
+
de m/z 489 (Figura 79 E) e 505. Os fragmentos
sodiados também mostraram a presença dos íons Y
1
+
indicando a glucose não
marcada ligada ao campferol ou à quercetina, mas confirmou isto principalmente
pela presença dos fragmentos B
1
+
e B
x
, sendo possível confirmar que a unidade de
142
hexose em m/z 185 para a não derivatizada (Figura 79 C), enquanto em m/z 225
para hexose na forma e isopropilideno (Figura 79 F). Interessantemente, a
fragmentação do íon precursor protonado gerou um íon de m/z 187, compatível com
o fragmento B
1
+
, referente à ramnose isopropilideno, porém através da formação do
íon oxônio (DELL, 1987; DOMON e COSTELLO, 1988), também ocorrendo no
fragmento de m/z 203, consistente com a Gal/Glc isopropilideno. Estes íons são
decorrentes da formação de oxônio, os quais não apareceram nos glicosídeos não
derivatizados.
Figura 79 – Perfil de fragmentação por CID-MS de di-glicosídeos na forma de
isopropilidenos
(A) Estrutura do campferol contendo ramnose ligada em O-6 da glucose, na qual não ocorre
acetalação, como mostrado nos espectros de CID-MS (B e C). (D) Campferol contendo ramnose
ligada em O-6 da galactose, na qual ocorre a formação de 2,3 isopropilideno, como mostrado nos
espectros de CID-MS (E e F).
[M+Na]
+
[M+H]
+
Y*
Y
1
+
Y
0
+
B
1
+
B
1
+
B
X
Y
0
+
B
2
+
Y
1
+
B
X
B
2
+
[M+Na]
+
[M+H]
+
Y*
Y
1
+
Y
0
+
B
1
+
B
1
+
B
X
Y
0
+
B
2
+
Y
1
+
Y
1
+
B
2
+
B
1
+
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
O
O
O
O
H
C
H
3
C
H
C
H
H
Y
0
+
3
3
O
O
O
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
H
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
H
Y
1
+
B
2
+
B
1
+
Y
0
+
B
E
C
F
A
D
143
Se por um lado a técnica parece funcionar bem na identificação dos flavonóis
rutinosídeos, por outro sua limitação foi encontrada na diferenciação dos glicosídeos
contendo galactose substituída em O-2 ou O-6, já que o isopropilideno se forma nas
hidroxilas 3 e 4, não permitindo sua distinção. Como os glicosídeos contendo
glucose substituída apenas em O-2 também permitem a formação de derivado
isopropilideno em OH-4,6, os três flavonóis diglicosídeos apareceram com as
mesmas massas nas análises de ESI/CID-MS. Esta limitação pode ser superada
através da derivatização seletiva da hidroxila 6, o que evitaria a formação de
isopropilideno na glucose, e ainda permitiria distinguir entre os dois tipos de ligação
interglicosídica apresentadas por estes glicosídeos.
Embora a técnica tenha apresentado limitações na determinação dos
flavonóis diglicosídeos, os 4 principais tri-glicosídeos presentes em M. ilicifolia
puderam ser perfeitamente distinguidos como galactosídeos e glucosídeos, já que
em ambos os casos a hidroxila 6 estava bloqueada. Estes tri-glicosídeos também
são formados por campferol e quercetina, e quando ligados à glucose (a qual esta
substituída em O-2,6) tem um ganho de 80 m.u. decorrentes da acetalação das duas
unidades de ramnose. Contudo quando a flavonol está ligado à galactose o ganho
de massa passa para 120 m.u., decorrentes da acetalação das duas unidades de
ramnose e da unidade de galactose. Assim foram observados íons referentes ao
campferol di-ramnoglucosídeo com m/z 821 [M+H]
+
e 843 [M+Na]
+
, com fragmentos
Y
1
+
indicando a glucose ligada ao campferol, com m/z 449, e a galactose com m/z
489, enquanto que o campferol di-ramnogalactosídeo apareceu com m/z 861 [M+H]
+
e 883 [M+Na]
+
. Resultados similares foram obtidos para a quercetina di-
ramnoglucosídeo com m/z 837 [M+H]
+
e 859 [M+Na]
+
e quercetina di-
ramnogalactosídeo com m/z 877 [M+H]
+
e 899 [M+Na]
+
. (Figura 80 A-F)
144
Figura 80 – Perfil de fragmentação por CID-MS de tri-glicosídeos na forma de
isopropilidenos
(A) Estrutura do campferol contendo triglicosídeo contendo glucose, na qual não ocorre acetalação,
como mostrado nos espectros de CID-MS (B e C). (D) Campferol triglicosídeo contendo galactose, na
qual ocorre a formação de 2,3 isopropilideno, como mostrado nos espectros de CID-MS (E e F).
[M+Na]
+
[M+H]
+
Y*
Y
2
+
Y
0
+
B
1
+
Y
0
+
B
2
+
Y
2
+
B
2
+
[M+Na]
+
[M+H]
+
Y*
Y
2
+
Y
0
+
B
1
+
B
1
+
B
X
Y
0
+
B
2
+
Y
2
+
Y
1
+
B
3
+
B
3
+
B
2
+
B
3
+
Y
1
+
O
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
CH
3
O
O
O
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
O
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
CH
3
O
O
O
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
B
3
+
B
1
+
β
B
1
+
α
Y
2
+
β
Y
2
+
α
Y
0
+
Y
1
+
B
3
+
B
1
+
β
B
1
+
α
Y
2
+
β
Y
2
+
α
Y
0
+
Y
1
+
B
E
C
F
A D
145
5. CONCLUSÕES
146
• Diversos tipos de biomoléculas de baixa massa molecular foram analisadas por
espectrometria de massas, utilizando fonte do tipo electrospray, com analisador
do tipo triplo-quadrupólo. As biomoléculas foram oligossacarídeos, lipídeos e
flavonóides, especialmente flavonóis glicosídeos.
• A ionização pode ocorrer em modo positivo ou negativo dependendo das
características do analito. Como oligossacarídeos neutros dificilmente formam
íons em modo negativo, eles foram analisados em modo positivo, adicionando às
amostras os adutores desejados. Foram testados sais de Li
+
, Na
+
e K
+
. Foi
determinado o Li
+
foi o adutor que apresentou os melhores resultados, pois foi
capaz de gerar mais fragmentos que os demais adutores.
• Diversos tipos de lipídeos puderam ser caracterizados por ESI-MS, tanto em
modo positivo quanto em modo negativo. Em alguns casos, mesmo quando a
análise em modo negativo era favorecida pela presença de grupos ácidos, como
nos fosfolipídeos, foi possível realizar a análise em modo positivo através da
suplementação no solvente de diluição da amostra com NaOH, para forçar a
desprotonação do fosfato e consequente formação de sais de Na
+
. Desta forma,
fragmentos de moléculas que não formam íons em modo negativo podem ser
observados em modo positivo.
• Um esfingolipídeo foi encontrado no extrato lipídico da cifomedusa Phyllorhiza
punctata. Sua caracterização estrutural revelou um lipídeo com origem
tipicamente de invertebrados marinhos. Ele foi identificado como ceramida
aminoetilfosfonato através dos espectros de NMR e ESI-MS-MS.
• Dois tipos de glicolipídeos foram encontrados em Maytenus ilicifolia, um neutro
analisado em modo positivo apresentou resultados compatíveis com a estrutura
do digalactosildiacilglicerol (DGDG). O outro glicolipídeo foi encontrado por
ionização em modo negativo, o que já sugeria a presença de um grupo
negativamente carregado. Ele foi identificado como sulfoquinovosildiacilglicerol
(SQDG), através de seu espectro de CID-MS. Embora ambos MGDG e SQDG
não tenham sido analisados por outras técnicas para confirmação de seus
monossacarídeos, eles estão entre os mais abundantes glicolipídeos vegetais,
147
sendo muito improvável que outros lipídeos apresentem resultados similares a
ambos.
• Quatro principais fosfolipídeos foram encontrados em Haloarcula marismortui,
uma arquea isolada do Mar Morto. Estes lipídeos foram arquetidilfosfato (aPA),
arquetidilfosfoglicerol (aPG), arquetidilfosfoglicerosulfato (aPGS) e
arquetidilfosfoglicerofosfato metil éster (aPGP-Me). Um lipídeo isóbaro ao aPGS
já foi encontrado em H. marismortui, o arquetidilfosfoglicerofosfato (aPGP)
(EVANS et al., 1980). Ambos são difíceis de serem diferenciados por análise de
massa, pois apresentam fragmentação semelhante. Para diferencial-los duas
estratégias foram adotadas: 1) a troca de H por D, já que aPGP apresenta um
sítio a mais que o aPGS para entrada de deutério, e com isso deveria ficar com 1
Da a mais; 2) pelo mesmo princípio, foi feita a troca de H
+
por Na
+
nos grupos
ácidos, e com isso ganhar-se-ia 23 Da a mais no aPGP. Os resultados foram
compatíveis apenas com a presença do aPGS.
• Diversos tipos flavonóides foram indentificados em folhas de Maytenus ilicifolia,
como flavonóides livres do tipo flavan-3-ols, (epi)-catequina, (epi)-galocatequina
e (epi)-afzelequina. Flavonóis livres foram identificados como campferol e
quercetina. Todos eles foram analisados por CID-MS em modo positivo e
negativo. Vários taninos condensados também foram identificados,
principalmente por CID-MS em modo negativo, que forneceu melhor
sensibilidade que o modo positivo. Foram identificados taninos de 2 a 7
unidades, os quais ainda apresentaram grande variabilidade na sua sequência,
com pôde ser observado pelas análises de MS2, que indicaram a presença de
mais de uma sequência possível para cada íon precursor analisado.
• M. ilicifolia também demonstrou a habilidade de sintetizar uma grande
variabilidade de flavonóis glicosilados. Estes apresentaram-se compostos
principalmente de campferol e quercetina como agliconas, mas em pequena
quantidade também foi encontrada a miricetina. Os monossacarídeos
encontrados foram galactose, glucose, ramnose e arabinose, formando
estruturas variando de mono a tetra-glicosídeos. Os glicosídeos mais abundantes
148
no extrato foram os tri-glicosídeos compostos por duas unidades de ramnose
ligadas a uma galactose, e esta ligada ao campferol ou à quercetina. Os
flavonóis di-glicosídeos também foram encontrados em grande abundância,
contendo ramnose ligada a galactose ou glucose.
• A posição na qual o monossacarídeo esta ligado à aglicona, chamado de sítio de
glicosilação, foi determinado através de razões específicas entre os fragmentos
formados pela aglicona, que pode produzir íons regulares ou radicais em
proporções que dependem do sítio de glicosilação. Outro método foi utilizado nas
análises de HPLC-PDA, nas quais um reagente que causa deslocamento no
espectro de UV foi adicionado pós-coluna. De acordo com os resultados obtidos
tanto pela razão entre o íon radical e regular quanto pelo deslocamento no
espectro de UV provocado por NaOH e AlCl
3
, indicaram que os flavonóis de M.
ilicifolia apresentam-se glicosilados na posição O-3, e estes resultados estão de
acordo com os já descritos na literatura.
• A presença de vários flavonóis contendo galactose ou glucose ligados à aglicona
foram encontrados na maioria dos glicosídeos de M. ilicifolia, formando isômeros
difíceis de serem identificados por ESI-MS. Para tentar resolver este problema,
dois tipos de fracionamento foram realizados: 1) realizado em coluna de bancada
preenchida com sílica-gel 60G, forneceu um separação razoável, obtida em
função do tamanho dos glicosídeos, como conseqüência do aumento da
polaridade quanto maior o grau de glicosilação. Contudo não foi tão eficiente, não
separando tetra-glicosídeos de tri-glicosídeos. 2) realizado em HPLC utilizando
coluna de separação por exclusão estérica, onde além de separar os glicosídeos
em função de seus tamanhos moleculares, ainda foi capaz de separar alguns
isômeros. Esta cromatografia foi utilizada em primeira dimensão, e seu efluente
coletado e re-injetado em uma coluna de fase reversa, na qual os glicosídeos
foram identificados.
• A fim de identificar os isômeros de galactose e glucose em análise off-line, foi
utilizada a acetalação dos glicosídeos. Esperava-se que com isso a galactose
fosse marcada. Entretanto, quando o OH-6 da glucose estava livre a acetalação
com acetona também ocorreu entre OH-4 e OH-6, impedindo a correta
149
identificação do glicosídeos. Mesmo assim foi possível identificar a rutina
misturada com mais 3 isômeros. Também foi possível identificar o tri-glicosídeos,
já que estes não apresentavam o OH-6 livre, e a acetalação ocorreu apenas na
galactose e com isso foi obtido íons com 40 Da a mais para os glicosídeos
contendo galactose em relação aos contendo glucose ligados à aglicona.
150
6. REFERÊNCIAS
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162
ANEXOS
163
Anexo I
Phyllorhiza punctata von Lendenfeld, 1884
Filo: Cnidária
Classe: Scyphozoa
Ordem: Rhizostomeae
Família: Magistiidae
Fonte da imagem:
www2.bishopmuseum.org/HBS/invertguide/species
_pdf/phyllorhizapunctata.pdf
Haloarcula marismortui
Super-reino: Archaea
Filo: Euryarchaeota
Classe: Halobacteria
Ordem: Halobacteriales
Família: Halobacteriaceae
Maytenus ilicifoia (espinheira-santa)
Divisão: Angiospermae
Classe: Dicotyledoneae
Subclasse: Archichlamydeae
Ordem: Celastrales
Família: Celastraceae
Fonte da imagem:
Thales R. Cipriani, Tese de doutorado
164
Anexo II
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