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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS
DA RAIZ DE Operculina macrocarpa (L.) Urb.
(CONVOLVULACEAE)
DANIELE CARVALHO MICHELIN
Araraquara
2004
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DANIELE CARVALHO MICHELIN
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS DA RAIZ DE
Operculina macrocarpa (L.) Urb. (CONVOLVULACEAE)
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
COMISSÃO EXAMINADORA
PROF
a
DR
a
. HÉRIDA REGINA NUNES SALGADO
PROF. DR. JOÃO LUIS CALLEGARI LOPES
PROF. DR. WAGNER VILEGAS
Araraquara, 24 de maio de 2004.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS DA RAIZ DE
Operculina macrocarpa (L.) Urb. (CONVOLVULACEAE)
DANIELE CARVALHO MICHELIN
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Área de
Concentração Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos e
Medicamentos, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP, como parte dos
requisitos para obtenção do Título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Araraquara
2004
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS DA RAIZ DE
Operculina macrocarpa (L.) Urb. (CONVOLVULACEAE)
DANIELE CARVALHO MICHELIN
ORIENTADORA: PROFª. DRA. HÉRIDA REGINA NUNES SALGADO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Área de
Concentração Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos e
Medicamentos, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP, como parte dos
requisitos para obtenção do Título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Araraquara
2004
Realmente
A tempestade espanta. Entretanto, acentuar-nos-à a resistência, se soubermos
recebê-la.
A dor dilacera. Mas aperfeiçoar-nos-à o coração, se buscarmos aproveitá-la.
A incompreensão dói. Contudo, oferece-nos excelente oportunidade de
compreender.
A luta perturba. Todavia, será portadora de incalculáveis benefícios, se lhe
aceitarmos o concurso.
O desespero destrói. Diante dele, porém, encontramos ensejo de cultivar a
serenidade.
A ódio enegrece. No entanto, descortina bendito horizonte à revelação do
amor.
A aflição esmaga. Abre-nos, todavia, as portas da ação consoladora.
O choque assombra. Nele, contudo, encontraremos abençoada renovação.
A prova tortura. Sem ela, entretanto, é impossível a aprendizagem.
O obstáculo aborrece. Temos nele, porém, legítimo produtor de elevação e
capacidade.
André Luiz
Mensagem extraída do livro: Agenda Cristã
Psicografia de Francisco Cândido Xavier
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Luci e Luiz Antonio, pela confiança
em mim depositada e pelo amor incondicional.
Ao meu irmão Danilo, pela força nos momentos
difíceis e pelo constante incentivo.
Amo muito vocês!
i
À Profª. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado,
pela orientação, pela amizade e por
sempre acreditar em mim.
Obrigada por tudo!
ii
A Deus, pela força e pela oportunidade
de realizar mais esse sonho.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Sérgio, pelo amor, carinho e compreensão em todos os momentos.
À toda minha família, especialmente aos meus avós, Anísio (in memorian)
e Judith, Guilherme e Regina, pelas orações que sempre me fortaleceram.
À minha madrinha “Tata” pelo incentivo, pelo carinho e pelos conselhos que
sempre deram certo.
Às “minhas crianças” Nayara, Narlon, Isadora e Isabela, pelo amor e pela
alegria de estarmos sempre juntos.
À minha cunhada Ana Lúcia, pela amizade e pelo seu sorriso contagiante.
À tia Gelza, pelo amor de “mãe” e pelas orações que iluminam o meu
caminho.
À minha querida amiga Miriam Sannomiya, por me apresentar ao mundo da
fitoquímica, pela amizade e pelo seu brilho único que a torna tão especial.
Aos meus amigos Andréa, Arnóbio, Bruna, Cinara, Cristina, Cristiani,
Cynthia, Giselle, Greici, Helen, Keika, Kélia, Ketylin, Luigina, Marlus, Priscila,
Rubiana, Thalita, Thiago e Tina, por todos os momentos que passamos juntos no
laboratório.
Às minhas amigas Ana, Beth, Carol, Dea, Má e Nina, pela amizade e apoio
apesar da distância.
À estagiária Maria Beatriz, pela ajuda e pela amizade.
Ao estagiário José André, pela ajuda nos experimentos com os animais.
Aos técnicos de laboratório Angélica, Fátima, Luciene, Luis Eduardo,
Margarete, Pedro e Valéria, pela ajuda essencial na realização deste trabalho.
iv
Ao Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello, pela colaboração e pelos
ensinamentos científicos.
Ao Prof. Dr. Luis Vitor Silva Sacramento, pela orientação nas análises
botânicas, pelo incentivo e principalmente pela amizade.
Ao Prof. Dr. Wagner Vilegas, pela disponibilização do seu laboratório, para
realização de parte deste trabalho e pela amizade.
À Profª. Dra. Lourdes Campaner dos Santos, pelo apoio e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Iguatemy Lourenço Brunetti, pelas análises bioquímicas.
Ao Prof. Dr. Marco Vinícius Chaud, por ter me apresentado ao mundo da
pesquisa, pelo incentivo e pela amizade.
Aos funcionários da biblioteca, Ana, Irani, Queila e Moacir, pela ajuda e pelo
carinho com que nos atendem.
À Cláudia, Laura e Sônia, da secretaria de Pós-Graduação, pela dedicação
e paciência.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
v
SUMÁRIO
PÁGINA
LISTA DE FIGURAS................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS................................................ xiii
RESUMO.................................................................................................... xv
ABSTRACT................................................................................................. xvi
1. INTRODUÇÃO........................................................................................ 01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................
2.1. A família Convolvulaceae................................................................
2.2. O gênero Operculina........................................................................
2.3. A espécie Operculina macrocarpa...................................................
2.4. Atividade antimicrobiana de fitoterápicos........................................
2.5. Teste sobre a motilidade gastrintestinal..........................................
2.6. Ensaios toxicológicos.......................................................................
2.7. Fitoquímica......................................................................................
06
06
07
08
10
11
12
13
3. OBJETIVOS............................................................................................ 17
4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................
4.1. MATERIAL...........................................................................................
4.1.1. Equipamentos..................................................................................
4.1.2. Solventes, reagentes e soluções.....................................................
4.1.3. Adsorventes.....................................................................................
4.1.4. Material vegetal...............................................................................
4.1.5. Animais............................................................................................
4.1.6. Microrganismos................................................................................
4.2. CONTROLE DE QUALIDADE.............................................................
4.2.1. Testes farmacopéicos.....................................................................
4.2.1.1. Análise macroscópica....................................................................
4.2.1.2. Análise microscópica.....................................................................
4.2.1.3. Prova de identificação...................................................................
4.2.1.4. Impurezas......................................................................................
18
14
14
14
20
21
21
21
22
22
22
22
23
23
vi
4.2.1.5. Doseamento da resina..................................................................
4.2.2. Caracterização fitoquímica preliminar..............................................
4.2.2.1. Identificação de flavonóides..........................................................
4.2.2.2. Identificação de saponinas............................................................
4.2.2.3. Identificação de cardiotônicos.......................................................
4.2.2.4. Identificação de antraquinonas.....................................................
4.2.2.5. Identificação de taninos.................................................................
4.2.2.6. Identificação de alcalóides............................................................
4.3. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS......................................................
4.3.1. Extrato bruto (EB)...........................................................................
4.3.2. Fração diclorometânica (FD), fração acetato de etila (FE),
fração n-butanólica (FB) e fração final (FF)................................................
4.4. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS....................................................
4.4.1. Cromatografia em coluna (CC) da FE..............................................
4.4.1.1. Isolamento dos compostos............................................................
4.4.2. Cromatografia em camada delgada (CCD)......................................
4.5. ANÁLISE ESTRUTURAL.....................................................................
4.6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ....................
4.6.1. Microrganismos................................................................................
4.6.2. Soluções...........................................................................................
4.6.3. Difusão em ágar...............................................................................
4.7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LAXANTE.............................................
4.7.1. Animais.............................................................................................
4.7.2. Teste sobre a motilidade intestinal...................................................
4.7.3. Análise estatística.............................................................................
4.8. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA............................................................
4.8.1. Animais.............................................................................................
4.8.1.Determinação da DL
50.
......................................................................
4.8.2. Toxicidade aguda – dose única........................................................
4.8.2.1. Determinação das transaminases séricas (AST e ALT)................
23
24
24
24
25
26
27
27
29
29
29
30
30
30
33
33
34
34
34
34
35
35
35
36
37
37
37
38
39
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................. 40
vii
5.1. CONTROLE DE QUALIDADE.............................................................
5.1.1. Testes farmacopéicos ....................................................................
5.1.1.1. Análise macroscópica....................................................................
5.1.1.2. Análise microscópica.....................................................................
5.1.1.3. Prova de identificação...................................................................
5.1.1.4. Impurezas.....................................................................................
5.1.1.5. Doseamento da resina..................................................................
5.1.2. Caracterização fitoquímica preliminar..............................................
5.2. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS......................................................
5.3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS....................................................
5.3.1. CC da fração FE...............................................................................
5.3.2. Isolamento dos compostos...............................................................
5.3.2.1. Ácido caféico e ácido protocatecúico............................................
5.3.2.2. Dímero do ácido caféico................................................................
5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA..............................
5.4.1. Difusão em ágar...............................................................................
5.5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LAXANTE.............................................
5.5.1. Teste sobre a motilidade intestinal...................................................
5.6. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA............................................................
5.6.1. Determinação da DL
50.
.....................................................................
5.6.2. Toxicidade aguda – dose única........................................................
5.6.2.1. Determinação das transaminases séricas (AST e ALT)................
41
41
41
42
43
44
44
45
47
49
49
51
51
57
65
65
67
67
71
71
74
77
6. CONCLUSÕES....................................................................................... 78
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 80
8. ANEXOS................................................................................................. 91
viii
LISTA DE FIGURAS
ITEM PÁGINA
Figura 1 Distribuição geográfica da família Convolvulaceae................. 07
Figura 2 Fotografia da O. macrocarpa e O.alata.................................... 08
Figura 3 Fotografia da batata de O. macrocarpa.................................... 09
Figura 4 Estruturas de alguns compostos isolados de espécies da
família Convolvulaceae.............................................................
15
Figura 5 Glicoresina isolada de Ipomoea tricolor (Convolvulaceae)....... 16
Figura 6 Fluxograma de obtenção dos extratos de O. macrocarpa........ 30
Figura 7 Isolamento dos ácidos caféico e protocatéquico..................... 32
Figura 8 Isolamento do dímero do ácido caféico................................... 32
Figura 9 Aspecto macroscópico de O. macrocarpa................................ 42
Figura 10 Aspecto macroscópico do pó de O. macrocarpa...................... 42
Figura 11 Esclereídeos de O. macrocarpa (aumento de 400 x)............... 42
Figura 12 Grãos de amido de O. macrocarpa (aumento de 400 x).......... 42
Figura 13 Drusas de oxalato de cálcio de O. macrocarpa (aumento de
400 x)........................................................................................
43
Figura 14 CCD dos grupos de frações do fracionamento da fração FE
do extrato hidroetanólico de O. macrocarpa.............................
49
Figura 15 Estruturas dos ácidos caféico e protocatecúico....................... 52
Figura 16 Espectro de RMN de
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
) da mistura dos
ácidos caféico e protocatecúico...............................................
53
Figura 17 Espectro de RMN de
13
C (125 MHz, DMSO-d
6
) da mistura
ix
dos ácidos caféico e protocatecúico......................................... 54
Figura 18 Experimento bidimensional HMQC da mistura dos ácidos
caféico e protocatecúico...........................................................
55
Figura 19 Experimento bidimensional HMBC da mistura dos ácidos
caféico e protocatecúico..........................................................
56
Figura 20 Estruturas químicas sugeridas para o dímero do ácido
caféico.......................................................................................
58
Figura 21 Estrutura do dímero do ácido caféico....................................... 60
Figura 22 Espectro de RMN de
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
) do dímero do
ácido caféico...........................................................................
61
Figura 23 Espectro de RMN de
13
C (500 MHz, DMSO-d
6
) do dímero do
ácido caféico...........................................................................
62
Figura 24 Experimento bidimensional HMQC do dímero do ácido
caféico.......................................................................................
63
Figura 25 Experimento bidimensional HMBC do dímero do ácido
caféico.......................................................................................
64
Figura 26 Peso dos órgãos dos animais tratados com O. macrocarpa.... 76
x
LISTA DE TABELAS
ITEM PÁGINA
Tabela 1 Diluições do extrato para realização do índice de espuma... 25
Tabela 2 Determinação de impurezas em Operculina macrocarpa...... 44
Tabela 3 Caracterização fitoquímica preliminar de O. macrocarpa...... 46
Tabela 4 Quantidade obtida dos extratos preparados de O.
macrocarpa através de maceração em EtOH 70%...............
48
Tabela 5 Frações resultantes do fracionamento da FE em coluna de
Sephadex................................................................................
50
Tabela 6 Deslocamentos químicos de RMN de
1
H (DMSO-d
6
, 500
MHz) e de
13
C (DMSO-d
6
, 125 MHz) do ácido caféico e do
ácido protocatéquico...............................................................
52
Tabela 7 Deslocamentos químicos de RMN de
1
H (DMSO-d
6
, 500
MHz) e de
13
C (DMSO-d
6
, 125 MHz) do dímero do ácido
caféico....................................................................................
60
Tabela 8 Resultados da atividade antimicrobiana do extrato e das
frações de O. macrocarpa em concentrações de 50, 100 e
200 mg/mL..............................................................................
66
Tabela 9 Porcentagem da distância percorrida pelo carvão ativo no
intestino dos camundongos tratados com O. macrocarpa.....
69
Tabela 10 Porcentagem da distância percorrida pelo carvão ativo no
intestino dos camundongos tratados com O. macrocarpa.....
70
Tabela 11 Determinação da DL
50
do extrato e das frações de O.
xi
macrocarpa........................................................................... 71
Tabela 12 Classificação toxicológica de acordo com a DL
50..........................
72
Tabela 13 Peso dos animais no início e final do tratamento................... 75
Tabela 14 Peso dos órgãos dos animais................................................. 75
Tabela 15 Dosagem das transaminases séricas em camundongos
tratados com O. macrocarpa..................................................
77
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcOEt Acetato de etila
HAc Ácido acético
ALT Alanina aminotransferase
AST
ATCC
Aspartato aminotransferase
‘American Type Culture Colection’
BHI ‘Brain Heart Infusion’
CC Cromatografia em coluna
CCD Cromatografia em camada delgada
CONT Controle
d
Dubleto
dd
Duplo dubleto
d.i. Diâmetro interno
DMSO Dimetilsulfóxido
EB Extrato bruto
EtOH Etanol
FD Fração diclorometano
FE Fração acetato de etila
FB Fração n-butanol
FF Fração final
F.Bras. Farmacopéia Brasileira
HMBC ‘Heteronuclear multiple bond correlations’
HMQC ‘Heteronuclear through multiple quantun coherence’
xiii
Hz Hertz
m
Multipleto
MeOH Metanol
RMN de
13
C Ressonância magnética nuclear de carbono
RMN de
1
H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
S
Singleto
v Volume
δ
Deslocamento químico
xiv
RESUMO
Operculina macrocarpa (L.) Urb., Convolvulaceae, popularmente conhecida como batata-
de-purga ou jalapa, é utilizada pela população como laxante e no tratamento da
leucorréia. O objetivo deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana e laxante da raiz
desta planta, realizar ensaios toxicológicos e ainda caracterizar fitoquimicamente da
espécie. Foram realizados testes farmacopéicos, que comprovaram a autenticidade da
amostra. O extrato hidroetanólico e suas frações diclorometano, acetato de etila,
n-butanol e final não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos microrganismos
testados (Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtilis ATCC 9372, Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Candida albicans ATCC
10231). Avaliou-se a atividade laxante de O. macrocarpa através do teste da motilidade
intestinal utilizando o extrato e suas frações, assim como a preparação com o pó da
planta suspenso em água (como utilizado pela população). Verificou-se que as frações
diclorometano, acetato de etila, n-butanol, final e a preparação popular na forma de pó
possuem efeito laxante no modelo experimental adotado. Determinou-se a DL
50
, e os
valores encontrados mostraram que o extrato bruto é moderadamente tóxico, a fração
diclorometano é muito tóxica e as demais, levemente tóxicas assim como a preparação
popular. As frações diclorometano e acetato de etila apresentaram alterações nos níveis
de transaminsases séricas (ALT e AST) sugerindo assim hepatotoxicidade. A fração
acetato de etila foi fracionada por cromatografia de permeação em gel levando ao
isolamento de ácido caféico, ácido protocatecúico e um dímero do ácido caféico,
caracterizados por Ressonância Magnética Nuclear e comparação com dados da
literatura. Outros estudos estão em andamento para avaliar a atividade laxante das
substâncias isoladas.
PALAVRAS-CHAVE: Operculina macrocarpa, Convolvulaceae, batata-de-purga, laxante,
toxicidade, ácido caféico, ácido protocatecúico, dímero do ácido caféico.
xv
ABSTRACT
Operculina macrocarpa (L.) (Urb.), Convolvulaceae, popularly known as 'batata-de-purga',
is used by the population as a laxative and for the treatment of leucorrhea. The aim of this
work was to evaluate the antimicrobial and laxative activity of the root of this plant, to carry
out toxicology assays and phytochemical characterization of this specie. Pharmacopeial
tests had confirmed the authenticity of sample. The extract and its fractions did not present
antimicrobial activity against with tested microorganisms (Escherichia coli ATCC 25922,
Bacillus subtilis ATCC 9372, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 e Candida albicans ATCC 10231). The laxative activity was
evaluated by intestinal motility test using the extract and its fractions as well as the
preparation with the powder of plant suspended in water (as used by population). The
results showed that dichloromethane, ethyl acetate and final fractions and popular
preparation had significant activity in this experimental model. LD50 values determined
showed that the crude extract is moderately toxic, the dichloromethane fraction is very
toxic, and all others, are slightly toxic as well as the plant powder. Dichloromethane and
ethyl acetate fractions had presented alterations in the seric levels of transaminases (ALT
and AST) suggesting hepatotoxicity. Chemical analysis was carried out the separation of
compounds from the ethyl acetate fraction by a chromatography on Sephadex® LH20,
leading to the isolation of cafeic and protocateic acids, and a cafeic acid dimer, whole
characterized by spectroscopic methods by Nuclear Magnetic Resonance and compared
with literature values. Other studies are in progress to evaluate the laxative activity of
isolated substances.
KEYWORDS: Operculina macrocarpa, Convolvulaceae, 'batata-de-purga', laxative,
toxicity, cafeic acid, protocateic acid, cafeic acid dimer.
xvi
Introdução
1. INTRODUÇÃO
Sabe-se que o uso de plantas em terapia data dos primórdios da
humanidade, sendo que estas sempre tiveram um papel preponderante para a
manutenção da saúde das comunidades ao longo do tempo. Nesse sentido, o
Brasil tem enorme biodiversidade, possuindo uma das mais ricas floras do mundo
e os poucos estudos existentes deste material justificam a busca de maior
desenvolvimento nesta área.
Atualmente, produtos naturais são responsáveis diretamente ou
indiretamente por cerca de 40% dos fármacos disponíveis no mercado, sendo
70% antibióticos e antitumorais (YUNES & CALIXTO, 2001).
As informações da medicina popular são de extrema importância quando se
procura obter substâncias ativas de plantas. Dados da literatura revelam que é
muito mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo seu
uso popular do que em plantas escolhidas ao acaso. Como a constituição química,
na maioria dos casos, difere significativamente em relação às distintas partes das
plantas, parece mais viável estudar inicialmente aquela empregada na medicina
popular e, posteriormente, as outras partes, que também podem conter princípios
ativos (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
O grande número de informações sobre o uso popular de centenas de
plantas em diversos lugares do mundo implica na necessidade do
desenvolvimento de métodos que facilitem a tarefa de avaliar cientificamente o
valor terapêutico das espécies.
Daniele Carvalho Michelin
1
Introdução
Assim, a literatura relata inúmeros métodos de extração e isolamento de
compostos de plantas. O número de pesquisas envolvendo a busca de moléculas
ativas em plantas, organismos marinhos, insetos e microrganismos vem
crescendo. Esta observação pode ser vista tanto na área acadêmica como na
industrial. A diversidade molecular encontrada em estudos de plantas é tão grande
que o isolamento e a determinação destas estruturas tornam-se um grande
desafio para os químicos.
No entanto, esta busca por substâncias ativas se torna realmente
interessante quando se trata do isolamento de compostos bioativos e não somente
de uma estrutura de um composto inédito. Tal fato vem ao encontro da
necessidade de estudos fitoquímicos biodirecionados e, portanto, na
multidisciplinaridade que envolve botânicos, químicos, farmacólogos e toxicólogos
(HAMBURGER & HOSTETTMAN, 1991).
A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de alguns de
seus constituintes tem sido objeto de interessantes estudos, onde já foram
comprovadas as ações farmacológicas através de testes pré-clínicos com animais.
Muitas destas substâncias têm grandes possibilidades de futuramente virem a ser
aproveitadas como agentes medicinais (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
Nos últimos anos vem crescendo o interesse pelas terapias alternativas e
por produtos naturais na terapêutica, especialmente aqueles derivados de plantas.
Este interesse é devido a inúmeras razões, dentre elas, encontram-se os efeitos
colaterais da medicina convencional, o uso abusivo e/ou incorreto dos fármacos
sintéticos que também resultam em efeitos colaterais e outros problemas, e ainda
Daniele Carvalho Michelin
2
Introdução
que uma grande parte da população não tem acesso ao tratamento farmacológico
convencional (RATES, 2001).
Dentro das perspectivas atuais e no interesse de conhecer melhor nossa
biodiversidade, buscou-se estudar a espécie vegetal Operculina macrocarpa (L.)
Urb., da família Convolvulaceae, popularmente conhecida como batata-de-purga
ou jalapa, comum no nordeste brasileiro.
A batata-de-purga, cujas primeiras referências remotam há mais de dois
séculos, é amplamente utilizada pela população devido à sua atividade laxante,
purgativa, ‘depurativa’ contra moléstias da pele e no tratamento da leucorréia.
(MATOS, 1982; MARTINS et al., 2000). É usada na forma de refresco preparado
com a batata fresca, ralada com água, ou na forma de pó feito com a fécula
retirada artesanalmente da batata fresca, conhecida localmente como goma-de-
batata ou, ainda, na forma de pílulas feitas manualmente com o resíduo resinoso
extraído da batata (MATOS, 1994; LORENZI, 2002).
Nossa pele é o tecido que separa o meio ambiente dos nossos órgãos
internos e está sujeita a agressão de vários microrganismos que podem causar
doenças como: fungos e bactérias. Existem certos locais do nosso organismo
onde esta agressão é mais freqüente por serem úmidos ou terem uma
temperatura mais elevada como o caso dos órgãos sexuais externos da mulher.
As infecções neste local são chamadas de vulvovaginites (LEUCORRÉIA...).
Entre as leucorréias existem três agentes mais comuns: 1) fungos, entre
eles se destaca a Candida albicans, que produz vulvovaginite muito irritadiça com
forte prurido, dor para urinar e secreção branca; 2) Gardinella vaginalis, um
microrganismo que possui um órgão locomotor, o flagelo, causador de leucorréia
Daniele Carvalho Michelin
3
Introdução
de odor muito forte; 3) Trichomonas vaginalis, que provoca secreção sem prurido
e sem odor forte (LEUCORRÉIA...).
Deve-se tratar todo o tipo de leucorréia, pois sabe-se que sua presença,
além de causar o desconforto, pode facilitar o contágio de outras doenças.
Além de medicamentos comercializados, a população procura como tratamento a
utilização de plantas com atividade antimicrobiana e dentre estas plantas
utilizadas encontra-se a batata-de-purga.
Sabendo que a planta possui atividade laxante, deve-se considerar que a
modificação dos hábitos alimentares gerada pela tecnologia tem introduzido o
consumo de alimentos refinados desprovidos de fibras vegetais, contidas em
maior quantidade nas cascas das frutas e legumes. Por este motivo, existem, nos
países desenvolvidos, elevada incidência de doenças que eram pouco freqüentes
no passado, as chamadas “doenças da civilização”, tal como constipação intestinal
(ANDRE et al., 2000).
É possível definir a constipação intestinal como sendo um distúrbio
caracterizado pela diminuição da freqüência das evacuações em intervalos além
de 48 horas, fato que possibilita aumento da absorção de água pelas paredes do
cólon, acarretando fezes endurecidas (CHICOURI, 2001).
Estudos epidemiológicos demonstraram que 95% da população apresenta
uma freqüência de evacuações que varia desde três vezes ao dia até três vezes
por semana. Desta forma, a definição habitual simplificada de constipação é a
freqüência inferior a três vezes por semana (CHICOURI, 2001).
Daniele Carvalho Michelin
4
Introdução
Existem vários fatores epidemiológicos de risco para o desenvolvimento de
constipação como idade, sexo feminino, baixo nível sócioeconômico, baixo
consumo de fibras na dieta e estilo de vida dos países industrializados.
A constipação intestinal ocorre mais freqüentemente na faixa etária acima
dos 40 anos e a prevalência é três vezes maior na mulher do que no homem
(ANDRE et al., 2000).
A grande maioria pode ser tratada com dieta, reeducação de hábitos e
laxantes. Pacientes com constipação de mais difícil controle devem ser
diferenciados entre os que têm ou não causas orgânicas (ANDRE et al., 2000).
Existem diversos medicamentos sintéticos para o tratamento da
constipação intestinal. Contudo, vários deles possuem efeitos colaterais
(GOODMAN & GILMAN, 1996). Além disso, o custo de alguns desses
medicamentos é elevado e os tornam inacessíveis à população de mais baixa
renda, que procura a batata-de-purga como alternativa terapêutica.
Daniele Carvalho Michelin
5
Revisão da literatura
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. A família Convolvulaceae
O nome desta família deriva do latim convolvo, que significa ‘entrelaçar-se’,
e refere-se, em termos gerais, à forma do seu crescimento, já que um grande
número destas plantas são trepadeiras volúveis, que crescem enroscadas em um
suporte (PEREDA-MIRANDA et al., 2003).
A família Convolvulaceae, constituída por, aproximadamente, 50 gêneros e
cerca de 1.800 espécies, possui distribuição geográfica cosmopolita (Figura 1). Do
ponto de vista econômico, a mais importante espécie é Ipomoea batatas (L.) Lam.
(batata doce). Há centenas de variedades desta espécie, algumas conhecidas,
incorretamente, como inhame, que são cultivadas por todas as regiões tropicais
(HEYWOOD, 1993).
Muitas espécies desta família também possuem usos alimentares,
particularmente nos tempos de fome, e como medicinais. As raízes de
Convolvulus scammonia L. e Ipomoea purga (Wender.) Hayne (jalapa) são usadas
na medicina como catártico. Um grande número de espécies, particularmente do
gênero Ipomoea e Convolvulus são ornamentais, notavelmente a glória da manhã
(Ipomoea purpurea (L.) Roth) (HEYWOOD, 1993).
Uma das características mais marcantes das convolvuláceas é a presença
de fileiras de células secretoras de resinas glicosídicas em tecidos foliares, e
especialmente em suas raízes. Estas resinas constituem uma característica
quimiotaxonômica desta família, e o emprego na medicina tradicional de alguns
Daniele Carvalho Michelin
6
Revisão da literatura
gêneros (Convolvulus, Exogonium, Ipomoea, Merremia e Operculina) está
associado às propriedades purgantes de suas resinas (GARCIA-ARGÁEZ &
PÉREZ-AMADOR, 1997; PEREDA-MIRANDA, 2003).
Figura 1. Distribuição geográfica da família Convolvulaceae
Fonte: HEYWOOD (1993)
2.2. O gênero Operculina
Operculina macrocarpa (L.) Urb. (Convolvulaceae) é popularmente
conhecida como batata-de-purga ou jalapa-do-Brasil. O nome popular de batata-
de-purga corresponde também a outra espécie silvestre, Operculina alata (Ham.)
Urb., muito comum no nordeste brasileiro. Ambas possuem raízes tuberosas,
grandes, amiláceas e lactescentes. São encontradas no comércio para fins
medicinais.
Estas espécies são trepadeiras de aspecto ornamental, especialmente
pelos seus frutos. Cada fruto contém 1 a 4 sementes duras e pretas. A espécie O.
Daniele Carvalho Michelin
7
Revisão da literatura
macrocarpa é bienal, isto é, sua parte aérea morre a cada dois anos, tem folhas
palmatiformes, flores brancas e frutos mais arredondados, enquanto que a espécie
O. alata é anual, tem folhas inteiras, flores amarelas e frutos de forma estrelada e
mais escuros (LORENZI & MATOS, 2002).
A figura 2 apresenta fotografias de ambas as espécies, nas quais observa-
se a coloração diferente das flores.
Figura 2. Fotografias da O. macrocarpa e O.alata
Fonte: MATOS, 2000
2.3. A espécie Operculina macrocarpa
A batata-de-purga é amplamente utilizada pela população devido à sua
atividade laxante, purgativa, “depurativa” contra moléstias da pele (MATOS, 1982;
Daniele Carvalho Michelin
8
Revisão da literatura
MARTINS et al., 2000; LORENZI & MATOS, 2002) e no tratamento da leucorréia
(BATATA...).
É usada na forma de refresco preparado com a batata fresca, ralada com
água, ou na forma de pó feito com a fécula retirada artesanalmente da batata
fresca, conhecida localmente como goma-de-batata ou, ainda, na forma de pílulas
feitas manualmente com o resíduo resinoso extraído da batata (MATOS, 1994;
LORENZI, 2002). A figura 3 apresenta a fotografia da batata.
Figura 3. Fotografia da batata de O. macrocarpa
Fonte: LORENZI & MATOS, 2002
Pílulas preparadas com esta droga são comercializadas largamente no
nordeste e no norte do Brasil por algumas indústrias farmacêuticas de fitoterápicos
(MATOS, 1994; LORENZI & MATOS, 2002).
As doses utilizadas são de 0,1 a 0,4 g de pó como laxante e de 1 a 2 g
como purgante; 0,25 a 0,50 g de resina como purgante e 0,02 a 0,10 g como
laxante (TESKE & TRENTINI, 2001).
Daniele Carvalho Michelin
9
Revisão da literatura
Todas as preparações caseiras ou industriais da batata-de-purga devem ser
usadas com cuidado, pois em doses mais altas do que as recomendadas podem
causar intoxicação severa, traduzida por cólicas fortes e diarréia intensa, com
risco de rápida desidratação (LORENZI & MATOS, 2002).
Apesar de constar em farmacopéias (F. Bras. 1926 e 1959.), seu estudo
fitoquímico ainda está incompleto. Contém como componentes a fécula e 12% de
resina, que é formada pela mistura complexa de substâncias de natureza
glicosídica polimérica, de propriedade purgativa, sendo reconhecida como laxante
ou, em doses maiores, como purgativo drástico e anti-helmíntico (LORENZI &
MATOS, 2002).
2.4. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais
Embora Operculina macrocarpa seja usada popularmente devido a sua
alegada atividade antimicrobiana, não foram encontrados na literatura estudos
avaliando a atividade antimicrobiana desta espécie, porém são muitos os artigos
encontrados na literatura que avaliam a atividade antimicrobiana de extratos
vegetais.
Dentre estes, é importante destacar PÉREZ-AMADOR e colaboradores
(1998) avaliaram a atividade antibacteriana das resinas de quatro espécies da
família Convolvulaceae (Merremia tuberosa (L.) Rendle, Merremia dissecta (Jacq.)
Hallier f., Operculina pinnatifida (Kunth) O'Donell e Turbina corymbosa (L.) Raf.)
contra Escherichia coli e Bacillus subtilis em diferentes concentrações (10, 20 e 30
mg/mL). Os resultados mostraram que as resinas das duas espécies de Merremia
Daniele Carvalho Michelin
10
Revisão da literatura
mostraram pequena atividade antibacteriana, e nenhuma atividade foi observada
com O. pinnatifida e T. corymbosa.
2.5. Teste sobre a motilidade gastrintestinal
Existem poucos estudos na literatura que avaliam os efeitos sobre o trânsito
intestinal de espécies da família Convolvulaceae, porém na literatura encontram-
se inúmeros artigos avaliando os efeitos dos extratos vegetais no trânsito
intestinal.
Este teste foi realizado em 1957 por JANSSEN & JAGENEAU, no qual
avaliaram a inibição da propulsão gastrintestinal com suspensão de carvão em
camundongos. Posteriormente, WONG & WAY (1981) avaliaram o efeito da
aspirina e do paracetamol na inibição da propulsão gastrintestinal induzida por
morfina em camundongos.
RAMESH e colaboradores (1998) compararam o efeito laxativo de uma
preparação líquida contendo 21 espécies vegetais diferentes, dentre elas
Operculina turpethum (L.) J. Silva Manso, comparando com um comprimido
laxante convencional. Não houve diferença estatisticamente significativa no grau
de ação laxante entre a preparação com os extratos e o comprimido convencional.
A preparação líquida contendo os extratos devido ao seu baixo custo é uma
escolha para a profilaxia da constipação induzida por opióides.
Daniele Carvalho Michelin
11
Revisão da literatura
Em estudo realizado por OLAJIDE (1999), o extrato metanólico da raiz de
Securidaca longipedunculata Fressen mostrou ações espasmódicas no trato
gastrintestinal de animais de laboratório, levando a um aumento nos movimentos
propulsivos do conteúdo intestinal e a uma redução no tempo de esvaziamento
gástrico. O número de fezes úmidas aumentou nos animais depois da
administração oral. Contudo, em dose alta, o extrato produziu ulcerações na
mucosa gástrica.
HASHIMOTO e colaboradores (2003) realizaram um estudo no qual
avaliaram a atividade dos compostos de diferentes prescrições chinesas,
utilizando Panax ginseng C.A. Mey. Verificaram que os componentes da raiz desta
planta aceleram o trânsito intestinal em diferentes modelos experimentais.
2.6. Ensaios toxicológicos
Não foram encontrados estudos toxicológicos com plantas da família
Convolvulaceae na literatura pesquisada. Porém, inúmeras pesquisas estão sendo
realizadas a fim de verificar a toxicidade de extratos vegetais.
A toxicidade aguda de Tropaeolum majus L. foi avaliada por ZANETTI e
colaboradores (2003) e os resultados mostraram que a administração em
camundongos, por via oral, dos extratos aquoso e hidroetanólico 70% de folhas e
caules não causou nenhum sinal de toxicidade pelos parâmetros analisados, que
foram número de mortes, atipias e estado geral de comportamento.
Daniele Carvalho Michelin
12
Revisão da literatura
A toxicidade aguda do extrato aquoso das partes aéreas de Cocculus
hirsutus (L.) Diels foi avaliada utilizando camundongos, os quais receberam 100,
200, 400, 800, 1000, 2000 ou 3000 mg/kg do extrato. Os resultados mostraram
que o extrato aquoso produz sedação, aumento de urina e fezes em todas as
doses testadas. Entretanto, não houve mortes em nenhuma das doses
mencionadas até o fim dos 14 dias de observação (GANAPATY et al., 2002).
HABORI et al. (2002) avaliaram o efeito tóxico de folhas de Catha edulis
Forss K. Foi realizada análise do plasma para verificar a concentração de enzimas
do fígado assim como cortes histopatológicos do fígado. Os dados bioquímicos e
histopatológicos demonstraram sinais de toxicidade.
2.7. Fitoquímica
As glicoresinas e os alcalóides ergolínicos são compostos característicos da
família Convolvulaceae (ARGÁEZ & PÉREZ-AMADOR, 1997). Nessa família são
encontrados também uma grande variedade de metabólitos secundários de baixo
peso molecular contendo grupos nitrogenados, tais como: ergolinas, pirrolidinas,
tropanos lipofílicos e hidrofílicos, alcalóides indolizidínicos e pirrolizidínicos,
glicosídeos cianogênicos, diferentes tipos de amidas (SCHIMMING et al., 1998;
TOFERN et al., 1999) e flavonóides (MANN et al., 1999).
Diferentes glicosídeos foram isolados de Operculina aurea (Kellogg) House,
uma convolvulacea originária do México (CANONICA et al., 1976; CANONICA et
al., 1977).
Daniele Carvalho Michelin
13
Revisão da literatura
No gênero Ipomoea foram encontradas lignanas (PASKA et al., 1999),
antocianinas (GODA et al., 1997; PALE et al., 1998; TERAHARA et al., 2000;
PALE et al., 2003), cianidinas (SAITO et al., 1995), bonaspectinas e
sesquilignanas (TOFERN et al., 2000).
Alguns metabólitos secundários isolados de espécies da família
Convolvulaceae (CANONICA et al., 1977; YAHARA et al., 1994; MANN et al.,
1999; KRAFT et al., 2002; JENETT-SIEMS et al., 2003) são apresentados na
figura 4.
Daniele Carvalho Michelin
14
Revisão da literatura
R
1
O
H
H
CH
2
OH
OR
R=β -glicose, R
1
=β -gentiobiose
N
N
H
COOH
H
O
H
Cuscutamina
OO
H
H
O
O
O
O
OR
R=gli
6
-xil
Cuscutosídeo
OHO
OH O
SO
3
Na
OH
Kaempferol-3-sulfato
Ipobscurina D
OH
H
3
CO
HO
O
OH
O
N
N
O
H
H
Bonaspectina E
H
3
CO
OCH
3
H
3
CO
O
O
O
OCH
3
H
OH
OCH
3
OCH
3
OCH
3
CH
3
Figura 4. Metabólitos secundários isolados de espécies da família Convolvulaceae
Daniele Carvalho Michelin
15
Revisão da literatura
A figura 5 apresenta uma glicorresina isolada de Ipomoea tricolor
(PEREDA-MIRANDA & BAH, 2003).
mba=
CCH
3
CH
2
CO
H
CH
3
Figura 5. Glicoresina isolada de Ipomoea tricolor (Convolvulaceae)
Daniele Carvalho Michelin
16
Objetivos
3. OBJETIVOS
De acordo com o relato popular, a batata-de-purga é amplamente utilizada
devido à sua atividade laxante, purgativa, “depurativa” contra moléstias da pele
(MATOS, 1982; MARTINS et al., 2000; LORENZI, MATOS; 2002) e no tratamento
da leucorréia (BATATA...). Devido à carência de trabalhos científicos, verificou-se
a necessidade de estudar mais profundamente a espécie vegetal.
Tendo em vista a utilização de Operculina macrocarpa para o tratamento
de constipação intestinal e leucorréia, e considerando que existem poucos estudos
na literatura com o referido vegetal, este trabalho tem como objetivos:
Realizar a caracterização botânica de Operculina macrocarpa (L.) Urb.
(Convolvulaceae), a fim de comprovar a originalidade da amostra.
Realizar o controle de qualidade da amostra de O. macrocarpa.
Avaliar a atividade laxante dos extratos de O. macrocarpa através de
ensaios sobre o trânsito intestinal de camundongos.
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos de O. macrocarpa.
Realizar ensaios toxicológicos para determinar a DL
50
e a toxicidade
aguda dos extratos de O. macrocarpa.
Realizar análise fitoquímica da FE do extrato hidoretanólico de O.
macrocarpa.
Daniele Carvalho Michelin
17
Material e Método
s
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. MATERIAL
4.1.1. Equipamentos
- Autoclave vertical PHOENIX
®
- Balança
analítica BEL MARK
®
- Câmara de CO
2
SOLAB
®
- Espectrômetro RMN VARIAN
®
INOVA 500 MHz
- Evaporador rotativo MA 120 – MARCONI
®
- Estufa para esterilização 400/ 5 SD NOVA ÉTICA
®
- Estufa para cultura bacteriológica 1.2 digital ECB ODONTOBRÁS
®
- Microscópio óptico CH 20 OLYMPUS
®
- Micrótomo LEICA
®
- Moinho de facas TECNAL
®
4.1.2. Solventes, reagentes e soluções
Todos os solventes e reagentes, exceto quando especificado, possuíam
grau de pureza pró-análise (p.a.), sendo Merck
®
ou SynthLab
®
.
- Acetato de etila
- Ácido acético
Daniele Carvalho Michelin
18
Material e Método
s
- Ácido clorídrico
- Ácido pícrico
- Ácido sulfúrico
- Agar Mueller-Hinton
- Anidrido acético
- Anisaldeído
- Caldo BHI (Brain Heart Infusion) ODONTOBRÁS
®
- Carvão ativo
- Cetoconazol
- Ciprofloxacino
- Citrato de potássio
- Cloreto férrico
- Clorofórmio
- Diclorometano
- DMSO-d
6
ALDRICH
®
- Discos de papel de filtro CECON
®
- Etanol
- Éter etílico
- Gelatina
- Glicerina
- Hidróxido de amônio
- Hidróxido de potássio
- Hidróxido de sódio
Daniele Carvalho Michelin
19
Material e Método
s
- Iodo platinado
- Historesina LEICA
®
- kit reagente BAYER
®
- Magnésio metálico
- Membrana 0,45 µm MILIPORE
®
- Metanol
- n-butanol
- n-propanol
- Reativo de Dragendorff
- Reativo de Bertrand
- Reativo de Valser-Mayer
- Reativo de Bouchardart
- Sulfato de sódio anidro
4.1.3. Adsorventes
- Cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F
254
MERCK
®
- Sephadex LH-20 PHARMACIA
®
- Sílica gel 60 para cromatografia em coluna (0,063-0,200 mm) MERCK
®
Daniele Carvalho Michelin
20
Material e Método
s
4.1.4. Material vegetal
O material vegetal (raiz seca de O. macrocarpa) foi adquirido no comércio
da cidade de Goiânia, cujo laudo foi assinado pelo farmacêutico Georges F.
Nabahan – CRF-SP 10.994 (Anexo I).
O material adquirido foi coletado no Estado da Bahia no mês de setembro
de 2003 sob o número de lote 0710.
4.1.5. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus), machos, com 30
dias de idade, pesando entre 22 e 30 g para o ensaio do trânsito intestinal, e com
60 dias de idade, pesando entre 45 e 60 g para o ensaio de toxicidade, fornecidos
pelo biotério da Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual
Paulista.
4.1.6. Microrganismos
Foram utilizadas cepas padrão de Escherichia coli (ATCC 25922), B. subtilis
(ATCC 9372), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 27853) e Candida albicans (ATCC10231).
Daniele Carvalho Michelin
21
Material e Método
s
4.2. CONTROLE DE QUALIDADE
4.2.1. Testes farmacopéicos (F. Bras., 1959)
4.2.1.1. Análise macroscópica
A droga vegetal e o pó da droga foram dispostos em placa de Petri e
analisados macroscopicamente.
4.2.1.2. Análise microscópica
Para análise microscópica da espécie foram preparadas lâminas
permanentes através da inclusão do material em historesina.
As batatas foram mantidas em glicerina e água 1:1 (v/v) durante 7 dias e,
foram seccionadas em fragmentos de aproximadamente 0,5 cm de largura e 1,0
cm de altura, que foram submetidos à desidratação conforme a seqüência:
- Etanol 50
o
GL 2 h
- Etanol 70
o
GL 2 h
- Etanol 96
o
GL 2 h
- Etanol absoluto 2 h
Em seguida, o material foi mantido por 2 h em uma mistura de etanol
absoluto/resina líquida (1:1) para pré-infiltração. Para infiltração o material foi
mantido em uma mistura com 0,01 g de pó ativador e 1 mL de resina líquida por
24 h.
Daniele Carvalho Michelin
22
Material e Método
s
Para polimerização foi preparada uma mistura com 15 mL da solução de
infiltração e 1 mL de Hardner (agente endurecedor), que foi colocada nos moldes
de polietileno e os fragmentos dispostos conforme orientação desejada. A placa
de moldes foi levada à estufa a 40 ºC até o endurecimento do material. Retirou-se
o material dos moldes para montagem em blocos de madeira.
Os cortes anatômicos foram obtidos em micrótomo na espessura de 8 µm e
transferidos para lâminas de vidro, as quais permaneceram à temperatura
ambiente até secagem. A coloração foi realizada utilizando-se azul de toluidina.
4.2.1.3. Prova de identificação
Cerca de 0,1 g da droga em pó foi transferida para um tubo de ensaio e
acrescentada de 10 mL de água destilada. O tudo foi agitado energicamente 20
vezes, deixado em repouso por 15 minutos e observou-se a formação de espuma.
4.2.1.4. Impurezas
Foi realizada a determinação do resíduo por incineração e cinzas insolúveis
em ácido de acordo com os procedimentos descritos nos métodos gerais da F.
Bras. (1988).
4.2.1.5. Doseamento da resina
Foram percolados 3 g da droga em pó com etanol até obtenção de 30 mL
de percolado. Destes, 20 mL foram transferidos para funil de separação, os quais
foram adicionados de 10 mL de clorofórmio e de solução preparada com 10 g de
Daniele Carvalho Michelin
23
Material e Método
s
citrato de potássio em 12 mL de água destilada. A mistura foi agitada e deixada
em repouso por 12 horas até completa separação das fases. Após este período, a
camada inferior foi rejeitada e a superior foi filtrada para uma cápsula tarada. O
funil de separação foi lavado com uma mistura de 5 mL de clorofórmio e 10 mL de
etanol e esta foi filtrada para a cápsula. As soluções foram evaporadas em banho-
maria, e o resíduo levado à estufa a 100 ºC até peso constante.
4.2.2. Caracterização fitoquímica preliminar
Para caracterização fitoquímica da planta foram realizados testes clássicos
de identificação, conforme descrito na literatura (MELLO et al., 1997;
FALKENBERG et al., 2003).
4.2.2.1. Identificação de flavonóides
Foram colocados 8 mL de extrato hidroetanólico a 10%, filtrado, em cápsula
de porcelana e evaporado até secura. O resíduo da cápsula foi dissolvido em
etanol 70% e transferido para um tubo de ensaio; foi adicionado um fragmento de
magnésio metálico e, em seguida, foi adicionado 1 mL de HCl concentrado. A
coloração róseo-avermelhada é indicativa da presença de flavonóides.
4.2.2.2. Identificação de saponinas
Foram levados à ebulição 1 g da droga em pó com 10 mL de água. Após
resfriamento, realizou-se a filtração para tubo de ensaio e este foi agitado
Daniele Carvalho Michelin
24
Material e Método
s
vigorosamente. O desenvolvimento de espuma persistente (após 15 min), e que
não desaparece pela adição de HCl 2 N, indica positividade para saponinas.
Índice de espuma: levou-se 2 g da droga em pó com 100 mL de água destilada em
ebulição sob refluxo e após resfriamento filtrou-se para um balão volumétrico e o
volume foi completado até 100 mL. Foi preparada uma série de diluições conforme
a tabela 1.
Tabela 1. Diluições do extrato para realização do índice de espuma
Tubos I II III IV V VI VII VIII IX X
Solução extrativa (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Água destilada (mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -
Volume total (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Cada tubo foi agitado, no sentido do seu comprimento, vedado, durante 15
s. Foram deixados em repouso por 15 min. Em seguida, foi verificado em qual
tubo se formou um anel de espuma persistente, de aproximadamente 1 cm de
altura.
O cálculo do índice de espuma foi realizado com base na diluição do tubo,
tendo observado a formação de anel de espuma persistente de 1 cm de altura.
4.2.2.3. Identificação de cardiotônicos
Foram levados à ebulição, sob refluxo, 5 g da amostra com 30 mL de etanol
a 50% e em seguida foi realizada a filtração através de algodão. O processo de
Daniele Carvalho Michelin
25
Material e Método
s
extração foi repetido por mais duas vezes. Foram adicionados 30 mL de solução
de acetato de chumbo neutro a 10%. Depois do resfriamento foi realizada a
filtração e a adição de 20 mL de água. Esta solução, transferida para funil de
separação, foi extraída com três porções de 10 mL de clorofórmio. Após completa
separação das fases, foi realizada a filtração. A solução clorofórmica foi repartida
em três cápsulas de porcelana e evaporada em banho maria até resíduo. Com
cada cápsula foram realizadas as reações abaixo.
Reação de Liebermann-Burchard: Foram adicionados 1 mL de anidrido acético,
transferido para um tudo de ensaio e, em seguida, 1 mL de ácido sulfúrico
concentrado vagarosamente, sem agitar. Observou-se o aparecimento de
coloração na zona de contato entre o anidrido acético e o ácido sulfúrico.
As cores azul ou verde provavelmente indicam núcleo esteroidal, enquanto que
as cores vermelha, rosa, púrpura ou violeta, indicam provavelmente núcleo
terpênico.
Reação de Baljet: Na segunda cápsula de porcelana foram adicionadas 2 gotas de
solução de ácido pícrico 0,5% e 2 gotas de hidróxido de potássio 1 N. O
aparecimento de coloração alaranjada indica reação positiva para cardiotônicos.
Reação de Keller-Kiliani: O resíduo da terceira cápsula foi dissolvido em 1 mL de
ácido acético glacial e adicionado de 2 gotas de solução aquosa de cloreto férrico
a 2%. Transferiu-se para um tubo de ensaio e acrescentou-se 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado. A positividade é dada pela formação de coloração
vermelho-acastanhada na zona de contato.
Daniele Carvalho Michelin
26
Material e Método
s
4.2.2.4. Identificação de antraquinonas
Uma amostra de 0,2 g da droga em pó transferida para tubo de ensaio foi
adicionada de quantidade suficiente de éter etílico para cobrir o pó. Depois de
agitação por 2 min, o material foi filtrado para outro tubo de ensaio. Foi adicionado
ao filtrado 1 mL de solução NaOH a 10%. A presença de coloração rosa ou
vermelha indica reação positiva para antraquinonas.
4.2.2.5. Identificação de taninos
O decocto de 5 g da droga pulverizada em 100 mL de água destilada
durante 15 min, filtrado e resfriado, foi denominado solução extrativa A, na qual
foram realizados os testes gerais de identificação.
Reação da gelatina: a 2 mL da solução A juntou-se 2 gotas de HCl diluído e
solução de gelatina a 2,5% gota a gota. A formação de precipitado indica reação
positiva.
Reação com sais de ferro: a 2 mL da solução A, adicionou-se 10 mL de água
destilada e 2-4 gotas de solução de FeCl
3
a 1% em metanol. A formação de cor
azul indica a presença de taninos hidrolisáveis; a cor verde, taninos condensados.
Reação com acetato de chumbo: Em 5 mL da solução A adicionou-se 10 mL de
ácido acético a 10% e 5 mL da solução de acetato de chumbo a 10%. A formação
de precipitado esbranquiçado indica a presença de taninos hidrolisáveis.
4.2.2.6. Identificação de alcalóides
Foram realizadas duas extrações, em meio ácido e básico:
Daniele Carvalho Michelin
27
Material e Método
s
Meio ácido: Cinco gramas da droga em pó foram levados à ebulição durante 15
min com 35 mL de HCl a 10%, filtrou-se e alcalinizou-se com amoníaco. Extraiu-se
com 2 porções de 10 mL de clorofórmio e secou-se com NaSO
4
anidro. Após
filtração, o solvente foi evaporado em banho maria até secura, e o resíduo
dissolvido em HCl a 10%. Foram realizados os testes com os reativos gerais de
alcalóides (Dragendorff, Bertrand, Valser-Mayer e Bouchardat).
Meio básico: foram macerados, durante 30 min, com agitação freqüente, 5 g da
droga em pó com 40 mL de éter etílico, 1,5 mL de NH
4
OH e 1,5 mL de água
destilada. Após filtração, foi realizada extração com HCl a 10% e realizados os
testes com os reativos gerais de alcalóides.
Daniele Carvalho Michelin
28
Material e Método
s
4.3. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
4.3.1. Extrato bruto (EB)
Os tubérculos foram moídos em moinho de facas, e o material vegetal em
pó (1 kg) foi colocado em um recipiente hermeticamente fechado, e adicionado 3
L EtOH 70% . O processo de maceração durou 48 horas e mantido com agitação
ocasional. Este processo foi repetido 3 vezes. O extrato foi concentrado em
evaporador rotatório até a obtenção de 700 mL. Destes, 200 mL foram evaporados
para obtenção do EB e os 500 mL restantes foram submetidos às extrações
descritas a seguir no item 4.3.2.
4.3.2. Fração diclorometânica (FD), fração acetato de etila (FE), fração n-
butanólica (FB) e fração final (FF)
Foram realizadas partições do EB com diclorometano, acetato de etila e n-
butanol (3 x 500 mL), os quais originaram, respectivamente, as frações FD, FE e
FB. A fração restante após as extrações com os solventes foi denominada fração
final (FF) (Figura 6).
Daniele Carvalho Michelin
29
Material e Método
s
Extração por maceração EtOH
70% (3 x 3000 mL) - 48 h
1,0 kg do pó de
Operculina macrocarpa
Partição líquido-líquido
EB
EB
(31,01 g)
FE
(4,84 g)
FB
(6,17 g)
FD
(35,51 g)
Diclorometano
3 x 500 mL
n-butanol
3 x 500 mL
Acetato de etila
3 x 500 mL
FF
(33,36 g)
Figura 6. Fluxograma de obtenção dos extratos de O. macrocarpa
Daniele Carvalho Michelin
30
Material e Método
s
4.4. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Foram empregados alguns métodos cromatográficos para auxiliar na
obtenção de frações semipurificadas e no isolamento dos compostos.
4.4.1. Cromatografia em coluna (CC) da FE
A fração FE (4,0 g) foi fracionada em coluna de Sephadex
®
LH-20 (57 cm X
3,0 cm d.i.) empregando-se como eluente metanol e fluxo de 0,5 mL/min. Foram
coletadas 156 frações de 5 mL, as quais foram reunidas em 28 grupos de frações,
após o monitoramento por CCD (seção 4.4.2).
4.4.1.1. Isolamento dos compostos
Algumas das frações obtidas a partir da FE foram submetidas novamente a
CC em silica gel (0,063-0,200 mm) para o isolamento/purificação dos compostos
(Figuras 7 e 8).
Daniele Carvalho Michelin
31
Material e Método
s
Fr. 17
(25 mg)
26 frações
CCD em sílica gel
FM CHCl
3
/MeOH/H
2
O
43:37:20, v/v
Mistura
de ácido caféico e
protocatecúico
(13 mg)
CC sílica gel (13 cm x 10 cm d.i.)
FM CHCl
3
/MeOH/H
2
O 43:37:20, v/v
Figura 7. Isolamento dos ácidos caféico e protocatecúico
Fr. 25
(163 mg)
18 frações
CCD em sílica gel
FM AcOEt/ HAc/H
2
O,
15: 0,5: 0,1 v/v
CC em sílica gel (12 cm x 10 cm d.i.)
FM AcoEt/ HAc/H
2
O, 15: 0,5: 0,1 v/v
Dímero do
ácido
caféico
(7 mg)
Figura 8. Isolamento do dímero do ácido caféico
Daniele Carvalho Michelin
32
Material e Método
s
4.4.2. Cromatografia em camada delgada (CCD)
A CCD foi realizada a partir das subfrações obtidas das CC (seção 4.4.1),
utilizando cromatoplacas de alumínio de sílica gel 60 F
254
(MERCK
®
), utilizando
como fase móvel CHCl
3
/MeOH/H
2
O (43:37:20, v/v) ou AcOEt/HAc/H
2
O (15:0,5:
0,1, v/v). A detecção dos compostos ocorreu primeiramente sob luz ultravioleta
(254 nm) e depois reveladas com solução de anisaldeído/ácido sulfúrico
(WAGNER et al., 1984).
4.5. ANÁLISE ESTRUTURAL
A determinação estrutural das substâncias isoladas foi realizada por
métodos espectrométricos como RMN de
1
H, RMN de
13
C e experimentos
bidimensionais (HMQC e HMBC). Os espectros obtidos foram comparados com
dados existentes na literatura para auxiliar na elucidação estrutural.
Os espectros de RMN foram obtidos em espectrômetro Varian INOVA 500,
empregando-se solvente deuterado (DMSO-d
6
).
Daniele Carvalho Michelin
33
Material e Método
s
4.6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
4.6.1. Microrganismos
Foram utilizadas cepas padrões de Escherichia coli (ATCC 25922), Bacillus
subtilis (ATCC 9372), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853) e Candida albicans (ATCC10231).
4.6.2. Soluções
Os extratos secos foram reconstituídos em água destilada acrescida de
gotas de polisorbato 80 e filtrados através de membranas com porosidade 0,45 µm
para eliminar possíveis contaminantes microbianos que poderiam interferir nos
resultados.
4.6.3. Difusão em ágar (BAUER et al., 1966)
Culturas desenvolvidas em caldo BHI por 24 horas foram diluídas
convenientemente (cerca de 10
8
bactérias/mL) e semeadas na superfície de ágar
Mueller-Hinton. A seguir, discos de papel de filtro impregnados com 20 µL dos
extratos a serem testados, foram colocadas sobre a superfície do ágar inoculado.
Após incubação por 48 horas a 37
o
C, observou-se os halos de inibição das
amostras. O solventes bem como o diluente utilizado na diluição dos extratos
foram usados como controle negativo, e como controle positivo foram usados
cetoconazol (40 µg/disco) e de ciprofloxacino (5 µg/disco) (SAIRAM et al., 2000;
MURAT et al., 2003; GULÇIN et al., 2004).
Daniele Carvalho Michelin
34
Material e Método
s
4.7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LAXANTE
No ensaio de trânsito intestinal foram utilizados EB, FD, FE, FB, FF e,
ainda, o pó da batata-de-purga, ressuspendidos em solução fisiológica ou solução
fisiológica acrescida de gotas de polissorbato 80 para aquelas frações insolúveis
(FD, FE).
4.7.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus), machos, com 30
dias de idade, pesando entre 22 e 30 g, os quais foram adaptados ao biotério
experimental por 5 dias antes do início dos ensaios biológicos. Os animais,
mantidos em livre acesso à alimentação e à água, foram mantidos em ambiente
com temperatura de 20 ± 1
o
C, umidade monitorada e fotoperíodo de 12 h
claro/escuro. No dia do experimento, os animais foram mantidos em jejum por 3 h
e recebendo água ad libitum.
4.7.2. Teste sobre a motilidade intestinal
Foram constituídos quatro grupos experimentais com 10 animais cada, que
foram tratados com o extrato vegetal (1000 mg/kg), dois grupos que foram
tratados com o extrato vegetal (100 mg/kg), e dois grupos controle, um que
recebeu solução fisiológica (10 mL/kg), e outro que recebeu solução fisiológica
Daniele Carvalho Michelin
35
Material e Método
s
acrescida de gotas de polissorbato 80 (10 mL/kg), os quais receberam as soluções
por via oral através de agulha de gavage.
Após 45 min, os animais receberam a suspensão de carvão ativo 10% em
solução de goma arábica 5%, 0,5 mL/animal, também através de agulha de
gavage.
Após 45 min, os camundongos foram sacrificados em câmara de CO
2
e foi
realizada a extirpação imediata do intestino desde o piloro até o início do ceco.
Assim, foi feita a medida do comprimento total do intestino delgado e da distância
percorrida pela suspensão de carvão ativo. O resultado foi expresso em
porcentagem do comprimento total do intestino delgado. Os intestinos foram
pesados individualmente em balança analítica.
A atividade sobre o trânsito intestinal foi determinada segundo JANSSEN &
JAGENEAU (1957) e WONG & WAI (1981).
Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Unesp – Araraquara através do parecer
nº 12/2003 (Anexo II).
4.7.3. Análise estatística
Os resultados experimentais foram expressos em média ± desvio padrão.
A análise estatística foi realizada pelo teste-t de Student (P < 0,05) (DE MUTH,
1999).
Daniele Carvalho Michelin
36
Material e Método
s
4.8. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA
4.8.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus), machos e fêmeas,
com 60 dias de idade, pesando entre 45 e 60 g, os quais foram adaptados ao
biotério experimental por 5 dias antes do início dos ensaios biológicos. Os
animais, mantidos em livre acesso à alimentação e à água, foram mantidos em
ambiente com temperatura de 20 ± 1
o
C, umidade monitorada e fotoperíodo de 12
horas claro/escuro. No dia do experimento, os animais foram mantidos em jejum
por 3 horas e recebendo água ad libitum.
4.8.1.Determinação da DL
50
Os animais foram divididos em grupos de 5 animais de cada sexo por dose
e mantidos em jejum de 4 h antes da administração.
Para estudo da dose letal 50% (DL
50
) foram administrados níveis
crescentes de doses (100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 e 5000 mg/kg de
peso animal). A DL
50
foi obtida de acordo com LITCHFIELD & WILCOXON (1949).
Os extratos foram classificados como supertóxicos, extremamente tóxicos, muito
tóxicos, moderadamente tóxicos ou levemente tóxicos de acordo com STACEY
(1993).
Daniele Carvalho Michelin
37
Material e Método
s
4.8.2. Toxicidade aguda – dose única
Os animais foram divididos em nove grupos de sete animais machos cada.
O grupo controle recebeu solução fisiológica (2 mL/kg) (GANAPATY et al., 2002).
Os outros grupos receberam diferentes doses do extrato, levando em conta a
DL
50
. Após a administração, os animais foram observados 0,5; 1; 2; 4; 12 e 24 h
em relação à alteração de pêlos, pele e mucosas, sistemas respiratório e
circulatório, sistemas nervosos central e periférico, atividade somatomotriz,
comportamento e especial atenção a sintomas, tais como: tremores, convulsões,
salivação, diarréia, letargia e coma (BRITO, 1996).
Os animais foram pesados no início e ao fim do experimento.
No 14º dia os animais de cada grupo foram sacrificados por decaptação,
em seguida foi coletado 1 mL de sangue de cada animal para dosagem das
transaminases séricas (AST e ALT) realizada no Laboratório de Bioquímica Clínica
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, pelo Prof. Dr. Iguatemy Lourenço
Brunetti.
Foi realizada ainda a pesagem dos órgãos dos animais, tais como coração,
pulmão, fígado, rins e pâncreas.
A análise estatística foi realizada pelo teste-t de Student (P < 0,05) (DE
MUTH, 1999).
Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta
faculdade através do parecer 05/2004 (Anexo III).
Daniele Carvalho Michelin
38
Material e Método
s
4.8.2.1. Determinação das transaminases séricas (AST e ALT)
Aspartato aminotransferase (AST) foi determinada de acordo com método
cinético descrito por BERGMEYER e colaboradores (1977), utilizando kit reagente
BAYER
®
.
Alanina aminotransferase (ALT) foi determinada por método cinético
descrito por WRÓBLENSKI & LADUE (1956) e RECOMENDATION (1972),
utilizando kit reagente BAYER
®
.
A análise estatística foi realizada pelo teste-t de Student (P < 0,05) (DE
MUTH, 1999).
Daniele Carvalho Michelin
39
Resultados e Discussão
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fitoterapia vem crescendo muito nos últimos anos e com isso aumentam
também os riscos da utilização das plantas medicinais, pois muitas destas ainda
não passaram por estudos de eficácia e segurança, colocando assim em risco a
saúde da população.
O emprego de plantas medicinais na medicina tradicional existe há muitos
anos, e o grande problema é que os vegetais são utilizados indiscriminadamente
pela população e, muitas vezes, essas plantas não têm ação comprovada e
podem também apresentar riscos de toxicidade.
A maioria das pessoas não tem conhecimento de que plantas também
podem causar danos à saúde. Por exemplo, a Digitalis purpurea L., que contém
glicosídeos cardiotônicos e é utilizada para tratamento de insuficiência cardíaca,
possui dose terapêutica muito próxima da dose tóxica. Uma dose um pouco mais
elevada que a terapêutica pode causar intoxicação e provocar até a morte por
parada cardíaca (GALINA, 2003).
Muitos estudos vêm sendo realizados no sentido de garantir a eficácia e a
segurança dos fitoterápicos. Uma grande dificuldade na identificação das plantas
medicinais é o uso do nome popular ao invés do nome científico, pois uma mesma
espécie pode apresentar diferentes nomes populares e dificultar sua identificação.
No caso da espécie em estudo, Operculina macrocarpa é popularmente
conhecida como batata-de-purga ou jalapa, mas outra espécie, O. alata, também é
conhecida com os mesmos nomes populares (LORENZI & MATOS, 2002). A
Daniele Carvalho Michelin
40
Resultados e Discussão
jalapa também pode se referir a Ipomoea purga (HEYWOOD, 1993; LINAJES et
al., 1994; ARGÁEZ & PÉREZ-AMADOR, 1997; PEREDA-MIRANDA et al., 2003).
Dessa forma, o presente trabalho possui como um dos seus objetivos a
análise botânica da espécie em estudo, visando garantir a autenticidade da
amostra de O. macrocarpa adquirida no comércio para realização deste trabalho.
5.1. CONTROLE DE QUALIDADE
5.1.1. Testes farmacopéicos
5.1.1.1. Análise macroscópica
Na análise macroscópica foi observado que as túberas apresentam-se
cortadas em rodelas transversais, a cor nas superfícies da secção aparece
branco-acinzentada, e para dentro do súber observam-se 3 a 8 círculos estreitos e
escuros como apresentado na figura 9. Os resultados obtidos estão de acordo
com as especificações da monografia da batata-de-purga, o que indica a
identidade da droga.
Na análise macroscópica, o pó da batata-de-purga apresenta-se fino e de
cor castanho-clara como mostrado na figura 10.
Daniele Carvalho Michelin
41
Resultados e Discussão
9cm
9cm
Figura 9. Aspecto macroscópico Figura 10. Aspecto macroscópico
de O. macrocarpa do pó de O. macrocarpa
5.1.1.2. Análise microscópica
Na análise microscópica realizada com a batata-de-purga foram
encontrados esclereídeos (Figura 11), grãos de amido simples e compostos
(Figura 12), em geral, agrupados em duas ou três e até doze unidades, além de
grãos gêmeos, com uma fenda em forma de til, os quais são característicos.
Foram encontradas também drusas de oxalato de cálcio (Figura 13) e fileiras de
células secretoras de resina.
15 µm 15
µ
m
Figura 11. Esclereídeos de Figura 12. Grãos de amido de O.
O. macrocarpa (aumento de 400 x) macrocarpa (aumento de 400 x)
Daniele Carvalho Michelin
42
Resultados e Discussão
15 µm
Figura 13. Drusas de oxalato de cálcio de O. macrocarpa
(aumento de 400 x)
Na análise microscópica do pó da batata-de-purga foram encontrados os
mesmos elementos, porém fragmentados.
As estruturas encontradas nas lâminas conferem com descrição
microscópica da monografia (F. Bras., 1959), o que garante a autenticidade da
amostra.
5.1.1.3. Prova de identificação
Plantas medicinais produzem diferentes substâncias químicas e o fazem
em diferentes proporções, influenciadas por vários fatores ambientais, tais como:
habitat, regime de chuvas, de insolação, solo, entre outras. Entretanto, ocorrem
princípios ativos característicos nos vegetais, sendo que estes podem servir de
parâmetro para identificação (GALINA, 2003).
Daniele Carvalho Michelin
43
Resultados e Discussão
O teste previsto na F. Bras. (1959) para identificação de O. macrocarpa
verifica a formação de espuma persistente com a adição de um ácido diluído, ou
seja, é um teste para identificação de saponinas.
O resultado mostrou-se positivo, uma vez que houve a formação de
espuma persistente, contribuindo também para identificação da planta em estudo.
5.1.1.4. Impurezas
Os resultados obtidos na determinação do resíduo por incineração e cinzas
insolúveis em ácido são apresentados na tabela 2, e revelam que a amostra
analisada está de acordo com os limites encontrados na monografia da planta (F.
Bras., 1959).
Tabela 2. Determinação de impurezas em Operculina macrocarpa
Teste Valor encontrado Limite F. Bras. (1959)
Resíduo pela incineração 7,32% no máximo 14%
Cinzas insolúveis em ácido 0,85% no máximo 3%
5.1.1.4. Doseamento da resina
De acordo com a F. Bras. (1959) o resultado deveria ser de, no mínimo,
15% de resina. Porém, a média dos resultados obtidos foi de 9,85%. Essa
variação pode ser devido a fatores ambientais, uma vez que estes podem interferir
na biosíntese dos metabólitos secundários, tais como clima, tipo de solo, época da
coleta, entre outros (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
Daniele Carvalho Michelin
44
Resultados e Discussão
Além disso a amostra foi adquirida comercialmente e no laudo do
fornecedor não há informações a respeito do local de coleta e do método de
secagem. Esses fatores podem estar relacionados com valor encontrado no
doseamento da resina abaixo do especificado na F. Bras. (1959).
5.1.2. Caracterização fitoquímica preliminar
Os resultados da análise química do material são apresentados na tabela 3
e demonstram a presença de compostos saponínicos, com índice de espuma
equivalente a 11.
Apesar de os alcalóides serem característicos de convolvuláceas (ARGÁEZ
& PÉREZ-AMADOR, 1997), o teste mostrou-se negativo em todos os ensaios. Tal
fato pode ter ocorrido devido a um resultado “falso negativo”, já que a reação de
Dragendorff, por exemplo, pode ser negativa na presença de alcalóides (MARINI-
BÉTOLO et al., 1981). Outra possibilidade seria a baixa concentração dos
alcalóides, abaixo do limite de detecção dos ensaios.
Daniele Carvalho Michelin
45
Resultados e Discussão
Tabela 3. Caracterização fitoquímica preliminar de O. macrocarpa
Teste Resultados
Flavonóides -
Saponinas +
Cardiotônicos -
Antraquinonas -
Taninos -
Alcalóides -
(-) negativo (+) positivo
Daniele Carvalho Michelin
46
Resultados e Discussão
5.2. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
Vários relatos da literatura mostram que, para a grande maioria das plantas,
a extração a frio com etanol/água (50:50 ou 70:30) por maceração prolongada,
possibilita uma extração bastante exaustiva, capaz de extrair distintas categorias
de princípios ativos, incluindo substâncias de diferentes graus de polaridade
(YUNES & CALIXTO, 2001).
Uma vez que se obteve um extrato bruto, os métodos de partição entre
solventes possibilitam um pré-fracionamento das substâncias presentes. Quando
se utiliza esse método combinado com testes biológicos obtêm-se, rapidamente,
frações com maior concentração do componente desejado (HOSTETTMAN et al.,
2003).
O pó da planta (1000 g) foi submetido à extração por maceração em 3 L
EtOH 70% e, em seguida, a sucessivas partições com diclorometano, acetato de
etila e n-butanol, respectivamente. Após a evaporação dos solventes em
evaporador rotatório foram obtidos extrato bruto (EB), fração diclorometano (FD),
fração acetato de etila (FE), fração n-butanólica (FB) e fração final (FF) (Tabela 4).
Daniele Carvalho Michelin
47
Resultados e Discussão
Tabela 4. Quantidade obtida dos extratos preparados de O. macrocarpa através
de maceração em EtOH 70%
Extrato Quantidade obtida (g) Rendimento (%)
EB 31,01 10,85
FD 35,51 4,97
FE 4,84 0,68
FB 6,17 0,86
FF 33,36 4,67
Daniele Carvalho Michelin
48
Resultados e Discussão
5.3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
5.3.1. CC da fração FE
Foram obtidas frações de aproximadamente 5 mL cada, as quais foram
reunidas em 28 grupos de frações após análises cromatográficas por CCD,
empregando como fase móvel a mistura de CHCl
3
/MeOH/H
2
O 43:37:20, v/v
(Figura 14 e Tabela 5).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Figura 14. CCD dos grupos de frações do fracionamento da fração FE do
extrato hidroetanólico de O. macrocarpa
Cromatoplaca de alumínio (sílica gel F
254
MERCK
®
)
FM: CHCl
3
/MeOH/H
2
O 43:37:20 (v/v)
Agente revelador: anisaldeído sulfúrico
Daniele Carvalho Michelin
49
Resultados e Discussão
Tabela 5. Frações resultantes do fracionamento da FE em coluna de sephadex
Frações Massa
(mg)
Tubo
(inicial-final)
Substância isolada ou
identificada
Quantidade
(mg)
1 42 1
2 80 2
3 112 3
4 164 4
5 82 5
6 51 6
7 257 7-11
8 40 12-13
9 24 14-15
10 13 16
11 23 17
12 212 18
13 260 19-31
14 31 32
15 108 33-37
16 94 38-41
17 25 42-48 Mistura de ácido caféico e
ácido protocatecúico
13,0
18 68 49-54
19 30 55-57
20 24 58-59
21 90 60-65
22 190 66-78
23 76 79-83
24 102 84-94
25 163 95-126 Dímero do ácido caféico 7,0
26 25 127-150
27 20 151-153
28 10 154-156
Daniele Carvalho Michelin
50
Resultados e Discussão
5.3.2. Isolamento dos compostos
5.3.2.1. Ácido caféico e ácido protocatecúico
O fracionamento sucessivo da fração 17 (25 mg) em coluna de sílica gel
resultou no isolamento de 13,0 mg de uma mistura de compostos. Essa mistura
quando revelada em anisaldeído sulfúrico produzia uma única mancha amarela.
Análise do espectro de RMN de
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
, Figura 16) indicou
que se tratava de uma mistura. O composto majoritário apresentou dubletos em
δ
7,02 (J = 2,5 Hz) e em
δ
6,76 (J = 8,5 Hz) e um duplo dubleto em
δ
6,95 (J = 8,5 e
2,5 Hz), os quais indicavam a presença de um anel aromático 1,3 e 4 substituído.
Os dubletos em
δ
6,17 (J = 16,0 Hz) e
δ
7,38 (J = 16,0 Hz) auxiliaram a
caracterização do composto como sendo o ácido caféico (Tabela 6 e Figura 15)
(PALE et al., 2003). Os dados de RMN de
13
C (Figura 17) corroboraram a
estrutura proposta.
O composto minoritário apresentou o mesmo padrão de substituição do anel
aromático (500 MHz, DMSO-d
6
) (Figura 16) através dos sinais em
δ
7,34 (1H, d, J =
2,5 Hz),
δ
7,29 (1H, dd, J = 8,5 e 2,5 Hz) e
δ
6,78 (1H, d, J = 8,5 Hz). No espectro de
RMN
13
C (125 MHz, DMSO-d
6
) (Figura 17) detectou-se 7 sinais, sendo que um deles
correspondente a uma carbonila (
δ
168,7). As análises dos espectros dos
experimentos bidimensionais HMQC (Figura 18), HMBC (Figura 19) permitem indicar
o composto minoritário como sendo o ácido protocatecúico (Tabela 6 e Figura 15) .
Daniele Carvalho Michelin
51
Resultados e Discussão
Tabela 6. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H (DMSO-d
6
, 500 MHz) e de
13
C
(DMSO-d
6
, 125 MHz) do ácido caféico e do ácido protocatecúico
Ácido caféico Ácido protocatecúico
Posição
δ
C
(ppm) δ
H
(ppm) δ
C
(ppm) δ
H
(ppm)
1 126,4 - 115,3 -
2 115,3 7,02 (1H, d, J = 2,5 Hz) 117,3 7,34 (1H, d, J = 2,5 Hz)
3 146,3 - 145,6 -
4 148,8 - 151,2 -
5 116,5 6,76 (1H, d, J = 8,5 Hz) 116,0 6,78 (1H, d, J = 8,5 Hz)
6 121,8 6,95 (1H, dd, J = 8,5 e 2,5 Hz) 122,5 7,29 (1H, dd, J = 8,5 e 2,5 Hz)
COOH
168,7 - 168,7 -
α
116,0 6,17 (1H, d, J = 16,0 Hz) - -
β
145,1 7,38 (1H, d, J = 16,0 Hz) - -
OH
HO
HO
O
1
2
3
4
5
6
6
5
4
3
2
1
HO
HO
OH
O
α
β
Ácido caféico
Ácido protocatecúico
Figura 15. Estruturas dos ácidos caféico e protocatecúico
Daniele Carvalho Michelin
52
Resultados e Discussão
Figura 16. Espectro de RMN de
1
H da mistura dos ácidos caféico e protocatecúico
(500 MHz, DMSO-d
6
)
Daniele Carvalho Michelin
53
Resultados e Discussão
Figura 17. Espectro de RMN de
13
C da mistura dos ácidos caféico e
protocatecúico (125 MHz, DMSO-d
6
)
Daniele Carvalho Michelin
54
Resultados e Discussão
Figura 18. Experimento bidimensional HMQC da mistura dos ácidos caféico e
protocatecúico
Daniele Carvalho Michelin
55
Resultados e Discussão
Figura 19. Experimento bidimensional HMBC da mistura dos ácidos caféico e
protocatecúico
Daniele Carvalho Michelin
56
Resultados e Discussão
5.3.2.2. Dímero do ácido caféico
O fracionamento sucessivo da fração 25 (163 mg) em coluna de sílica gel
resultou no isolamento de um composto, o qual produziu uma mancha amarela
após revelação em anisaldeído sulfúrico.
A análise do espectro de RMN de
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
, Figura 22)
mostrou a presença de sinais de prótons com deslocamentos químicos e
constantes de acoplamentos bastante similares aos do ácido caféico. No entanto,
estes se encontram duplicados.
Através da integração dos sinais juntamente com a análise dos espectros
de RMN de
13
C (Figura 23) e experimentos bidimensionais HMBC (Figura 24) e
HMQC (Figura 25) pôde-se identificar a substância como sendo o dímero do ácido
caféico ligado pelas posições 3 da unidade I com a 4’ da unidade II (Tabela 7 e
Figura 21).
Os sinais em δ 7,04 (d, J = 2,5 Hz),
δ
6,76 (d, J = 8,5 Hz) e
δ
6,90 (m) referem-
se aos prótons H-2, H-5 e H-6, respectivamente do anela aromático da unidade I .
Estas atribuições podem ser efetuadas através das correlações observadas no
espectro de HMBC (Figura 24). Os hidrogênios α e β da dupla em trans desta mesma
unidade I podem ser atribuídos através dos sinais em
δ
6,24 (d, J = 16,0 Hz) e
δ
7,48
(d, J = 16,0 Hz), consecutivamente. A confirmação de que estes sinais pertenciam a
unidade I foram dadas através das correlações entre
δ
6,24 e
δ
7,48 (H-α e H-β) com
um sinal de uma carbonila em
δ
166,1, assim como a correlação existente entre o
hidrogênio β da dupla (
δ
7,48) com C-6 de
δ
121,0. Estas correlações permitiram a
atribuição inequívoca dos demais sinais da mesma unidade I .
Daniele Carvalho Michelin
57
Resultados e Discussão
A parte aromática da unidade II pôde ser averiguada através dos sinais em
δ
7,34 (d, J = 2,5 Hz),
δ
6,78 (d, J=8,5 Hz) e
δ
6,90 (m), os quais referem-se aos
prótons H-2, H-5 e H-6, respectivamente. Os sinais em
δ
7,45 (1H, d, J = 16,0 Hz) e
δ
6,18 (1H, d, J = 16,0 Hz) correlacionados com o sinal em
δ
165,6 confirmam que
estes referem-se à dupla da unidade II do dímero do ácido caféico. Analogamente à
unidade I, pôde-se atribuir todos os sinais através das análises dos espectros de
RMN de
1
H e
13
C, assim como os experimentos bidimensionais (HMBC e HMQC)
(Figuras 22-25). Desta forma, pode-se sugerir as seguintes estruturas ilustradas na
figura 20.
c
b
a
OH
O
OH
O
OH
HO
O
OH
O
HO
O
HO
OH
O
O
O
OH
O
HO
O
OH
O
HO
O
OH
OHO
d
Figura 20 . Estruturas químicas sugeridas para o dímero do ácido caféico
Daniele Carvalho Michelin
58
Resultados e Discussão
Os isômeros (a), (b) e (c) forneceriam espectros de RMN de
1
H e
13
C com
sinais sobrepostos, uma vez que todos possuem um plano de simetria em sua
molécula. O único composto que apresentaria um espectro como os observados
para o dímero em questão, é o (d). Desta forma, pôde-se identificar o dímero do
ácido caféico ligado pelas posições 3 da unidade I e 4 da unidade II (Tabela 7 e
figura 21).
Daniele Carvalho Michelin
59
Resultados e Discussão
Tabela 7. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H (DMSO-d
6
, 500 MHz) e de
13
C
(DMSO-d
6
, 125 MHz) do dímero do ácido caféico
Unidade I Unidade II
Posição
δ
C
(ppm) δ
H
(ppm) δ
C
(ppm) δ
H
(ppm)
1 125,5 - 125,6 -
2
114,8
7,04 (1H, d, J = 2,5 Hz) 114,6 7,34 (1H, d, J = 2,5 Hz)
3 145,5 - 145,5 -
4 148,2 - 144,9 -
5 115,8 6,76 (1H, d, J = 8,5 Hz) 115,7 6,78 (1H, d, J = 8,5 Hz)
6 121,0 6,90 (m) 121,3 6,90 (m)
COOH
166,1 - 165,6 -
β
144,6 7,48 (1H, d, J = 16,0 Hz) 144,9 7,45 (1H, d, J = 16,0 Hz)
α
114,7 6,24 (1H, d, J = 16,0 Hz) 114,2 6,18 (1H, d, J = 16,0 Hz)
HO
O
OH
OOH
OHO
Unidade I
Unidade II
1
2
3
4
5
6
1
'
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
α
β
β
α
Figura 21. Estrutura do dímero do ácido caféico
Daniele Carvalho Michelin
60
Resultados e Discussão
Figura 22. Espectro de RMN de
1
H do dímero do ácido caféico (500 MHz,
DMSO-d
6
)
Daniele Carvalho Michelin
61
Resultados e Discussão
Figura 23. Espectro de RMN de
13
C do dímero do ácido caféico (125 MHz,
DMSO-d
6
)
Daniele Carvalho Michelin
62
Resultados e Discussão
Figura 24. Experimento bidimensional HMQC da mistura do dímero do ácido
caféico
Daniele Carvalho Michelin
63
Resultados e Discussão
Figura 25. Experimento bidimensional HMBC da mistura do dímero do ácido
caféico
Daniele Carvalho Michelin
64
Resultados e Discussão
5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Atualmente existe um grande interesse na descoberta de novos fármacos
antimicrobianos, devido à resistência que vem sendo desenvolvida pelos
microrganismos frente aos antibióticos utilizados. Assim cresce também o
interesse em plantas com atividade antimicrobiana.
A utilização popular da batata-de-purga no tratamento da leucorréia e a
inexistência de estudos relacionados, motivaram a realização de ensaios para
determinação da atividade antimicrobiana dos extratos.
5.4.1. Difusão em ágar
O. macrocarpa não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos
microrganismos testados em nenhuma das concentrações testadas, (Tabela 8).
Daniele Carvalho Michelin
65
Resultados e Discussão
Tabela 8. Resultados da atividade antimicrobiana do extrato e das frações de O.
macrocarpa em concentrações de 50, 100 e 200 mg/mL
Extrato
(50,100 ou 200 mg/mL)
Controles
Microrganismos
BR FD FE FB FF PÓ CONT. CET. CIPRO.
E. coli ATCC 25922 + + + + + + + NT 22
B. subtilis ATCC 9372 + + + + + + + NT 20
S. aureus ATCC 25923 + + + + + + + NT 25
P. aeruginosa ATCC 27853 + + + + + + + NT 22
C. albicans ATCC 10231 + + + + + + + + NT
( - ) inibição ( + ) crescimento
diâmetro do halo de inibição (mm)
NT: não testado
CONT: controle negativo
CET: Cetoconazol (40
µg/disco)
CIPRO: Ciprofloxacino (5
µg/disco)
Daniele Carvalho Michelin
66
Resultados e Discussão
5.5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LAXANTE
Tendo em vista que O. macrocarpa é usada pela população como laxante,
avaliamos essa atividade como descrito abaixo.
5.5.1. Teste sobre a motilidade intestinal
O ensaio foi realizado segundo modelo experimental desenvolvido por
JANSSEN & JAGENEAU (1957) e WONG & WAY (1981).
Devido a problemas de solubilidade dos extratos EB, FF, FB e o pó da
planta foram ressuspensos em solução fisiológica (Tabela 9), enquanto que os
extratos FD e FE foram ressuspensos em solução fisiológica acrescida de gotas
de polisorbato 80 (Tabela 10).
Além disso, a administração da FD e FE na dose de 1000 mg/kg provocou
diarréia intensa nos animais em menos de 15 minutos, levando a uma rápida
eliminação do marcador, o que impediu a medida real da distância percorrida pelo
carvão ativo. Por este motivo FD e FE foram testadas em doses de 100 mg/kg
(Tabela 10).
Os resultados obtidos nos ensaios demonstraram o aumento significativo da
motilidade intestinal provocado FD, FE, FB, FF e pela preparação popular nas
doses testadas.
Daniele Carvalho Michelin
67
Resultados e Discussão
Apesar de os resultados da atividade laxante confirmarem a informação
popular do uso de O. macrocarpa como laxante, a literatura reporta casos de
intoxicações provocadas por esta planta (LORENZI & MATOS, 2002). Por este
motivo o próximo passo foi determinar a DL
50
e avaliar a toxicidade aguda dos
extratos de O. macrocarpa.
Daniele Carvalho Michelin
68
Resultados e Discussão
Tabela 9. Porcentagem da distância percorrida pelo carvão ativo no intestino dos
camundongos tratados com O. macrocarpa
Tratamento Dose
(mg/kg)
Distância percorrida
pelo carvão ativo (%)
± desvio padrão
Peso dos
intestinos (média)
± desvio padrão
Controle 1 10 mL/kg
47,82 ± 34,68 1,32 ± 0,24
EB 1000
69,99 ± 16,83 1,09 ± 0,28
FF 1000
90,32 ± 9,71 * 1,10 ± 0,23*
PÓ 1000
74,56 ± 17,75* 1,01 ± 0,22*
FB 1000
89,53 ± 7,61* 2,25 ± 0,36*
Controle 1: solução fisiológica
n = 10
P < 0,05
Daniele Carvalho Michelin
69
Resultados e Discussão
Tabela 10. Porcentagem da distância percorrida pelo carvão ativo no intestino dos
camundongos tratados com O. macrocarpa
Tratamento Dose
(mg/kg)
Distância percorrida
pelo carvão ativo (%)
± desvio padrão
Peso dos
intestinos (média)
± desvio padrão
Controle 2 10 mL/kg
52,79 ± 30,39 1,11 ± 0,23
FD 100 mg/kg
80,41 ± 11,64 * 2,19 ± 0,29*
FE 100 mg/kg
85,42 ± 9,85 * 2,09 ± 0,36*
Controle 2: solução fisiológica + polissorbato 80
n = 10
P < 0,05
Daniele Carvalho Michelin
70
Resultados e Discussão
5.6. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA
5.6.1. Determinação da DL
50
Os valores de DL
50
encontrados são apresentados na
tabela 11, e de
acordo com a classificação de STACEY (1993) ilustrada na tabela 12, o EB foi
considerado moderadamente tóxico, a FD foi considerada muito tóxica e as
demais, mostraram-se levemente tóxicas.
Tabela 11. Determinação da DL
50
do extrato e das frações de O. macrocarpa
Tratamento DL
50
(mg/ mL) Limite superior Limite inferior
EB 3800 7030 2057
FD 450 697,5 290,3
FE >5000 - -
FB >5000 - -
FF >5000 - -
PÓ >5000 - -
Daniele Carvalho Michelin
71
Resultados e Discussão
Tabela 12. Classificação toxicológica de acordo com a DL
50
Classificação DL
50
oral (mg/ kg)
supertóxica < 5
extremamente tóxica 5-50
muito tóxica 50-500
moderadamente tóxica 500-5000
levemente tóxica > 5000
Fonte: STACEY, 1993.
A administração dos extratos em diferentes doses levou à morte das
fêmeas em aproximadamente 1 dia e dos machos em aproximadamente 3 dias.
Esse resultado é relevante pois mostra a diferente susceptibilidade dos
animais de acordo com o sexo. Este resultado é particularmente importante
quando lembramos que O. macrocarpa é usada no tratamento da leucorréia, ou
seja, usado preponderantemente por mulheres.
Ainda é reconhecido que a prevalência da constipação intestinal é três
vezes maior na mulher do que no homem (ANDRE et al., 2000).
Assim, esses resultados em conjunto evidenciam a importância da
continuidade dos estudos de O. macrocarpa.
Daniele Carvalho Michelin
72
Resultados e Discussão
O fato de a preparação popular ser feita a partir de uma solução aquosa
pode, em parte, levar a um produto com menor toxicidade, tendo em vista que as
substâncias mais tóxicas aparentemente são lipossolúveis e presentes na FD.
Contudo, substâncias hidrofílicas ou lipofílicas podem ser metabolizadas
pelo fígado gerando produtos eventualmente mais tóxicos do que aqueles
presentes na espécie vegetal.
Por isso, avaliamos a toxicidade aguda e, em seguida, o efeito dos extratos
sobre os níveis de transaminases séricas.
Daniele Carvalho Michelin
73
Resultados e Discussão
5.6.2. Toxicidade aguda – dose única
Os animais não apresentaram sinais de toxicidade de acordo com os
parâmetros observados durante os 14 dias de experimento. Os grupos tratados
com FD e FE apresentaram diarréira logo após a administração.
O peso dos animais no início e ao final do tratamento são apresentados na
tabela 13 e não houve nenhuma diferença significativa em relação ao peso dos
animais do grupo controle.
A pesagem dos órgãos dos animais está representada na tabela 14 e na
figura 26. Os resultados mostram que os grupos tratados com EB, FD e FE
apresentaram peso abaixo do normal para os pulmões. Para fígado, os grupos FD,
FE e FB apresentaram peso acima do normal quando comparados com o grupo
controle. Os grupos tratados com FD, FE e FF apresentaram ainda valores abaixo
do normal para o pâncreas quando comparados com o grupo controle.
As alterações observadas nos grupos tratados com extratos de O.
macrocarpa podem estar relacionadas com a administração dos extratos,
sugerindo assim sinais de toxicidade nos animais. Esses resultados indicam a
necessidade de estudos mais aprofundados nesse sentido.
Daniele Carvalho Michelin
74
Resultados e Discussão
Tabela 13. Peso dos animais no início e final do tratamento
Peso dos animais (g)
± desvio padrão / n = 7
Tratamento
1º dia 14º dia
EB
54,98
± 5,33 53,29 ± 5,77
FD
57,19
± 8,98 57,49 ± 7,74
FE
52,49
± 3,72 53,73 ± 4,06
FB
52,47
± 3,55 54,31 ± 7,40
FF
52,90
± 4,94 52,97 ± 3,29
PÓ
55,03
± 7,23 53,16 ± 4,88
CONT
47,86
± 5,44 46,57 ± 5,52
Tabela 14. Peso dos órgãos dos animais
Tratamento Peso dos órgãos (g)
± desvio padrão
Coração Pulmões Rins Fígado Pâncreas
EB
0,22 ± 0,03 0,36 ± 0,03 * 0,71 ± 0,05 2,53 ± 0,08 0,18 ± 0,03
FD
0,21
± 0,03 0,36 ± 0,03 * 0,68 ± 0,04 2,87 ± 0,07 * 0,16 ± 0,04 *
FE
0,20
± 0,03 0,37 ± 0,03 * 0,63 ± 0,08 2,84 ± 0,07 * 0,17 ± 0,02 *
FB
0,21 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,70 ± 0,08 2,89 ± 0,08 * 0,26 ± 0,07
FF
0,24
± 0,04 0,44 ± 0,04 0,66 ± 0,09 2,47 ± 0,09 0,18 ± 0,03 *
PÓ
0,26
± 0,03 0,49 ± 0,03 0,73 ± 0,05 2,74 ± 0,09 0,26 ± 0,08
CONT
0,21
± 0,02 0,45 ± 0,02 0,62 ± 0,11 2,62 ± 0,07 0,29 ± 0,09
n = 7
* P < 0,05
Daniele Carvalho Michelin
75
Resultados e Discussão
CORAÇÃO
0
0,1
0,2
0,3
0,4
peso (g)
EB
FD
FE
FB
FF
PO
CONT
PULMÕES
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
peso (g)
EB
FD
FE
FB
FF
PO
CONT
RINS
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
peso (g)
EB
FD
FE
FB
FF
PO
CONT
FÍGADO
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
peso (g)
EB
FD
FE
FB
FF
PO
CONT
PÂNCREAS
0
0,1
0,2
0,3
0,4
peso (g)
EB
FD
FE
FB
FF
PO
CONT
* * *
* * *
***
Figura 26. Resultados da pesagem dos órgãos dos animais tratados com O.
macrocarpa
Daniele Carvalho Michelin
76
Resultados e Discussão
5.6.2.1. Determinação das transaminases séricas (AST e ALT)
Os resultados obtidos na determinação das transaminases séricas
mostraram que FD apresentou diferença significativa nos níveis de AST enquanto
FD e FE alteraram significativamente os níveis de ALT, quando comparados com
o grupo controle (Tabela 14).
Esses resultados indicam uma possível metabolização das substâncias de
O. macrocarpa pelo fígado.
Tabela 15. Dosagem das transaminases séricas em camundongos tratados com
O. macrocarpa
Tratamento AST (U/L)
± desvio padrão
ALT (U/L)
± desvio padrão
EB 215 ± 84,05 69 ± 35,36
FD 137 ± 22,23 * 33 ± 2,89 *
FE 203 ± 55,05 83 ± 9,01 *
FB 181 ± 28,36 73 ± 7,50
FF 220 ± 44,97 54 ± 4,50
PÓ 198 ± 30,51 72 ± 15,59
CONT 223 ± 30,02 47 ± 14,97
n = 7
* P < 0,05
Daniele Carvalho Michelin
77
Conclusões
6. CONCLUSÕES
A análise macroscópica permitiu a identificação botânica da espécie
vegetal, tratando-se dessa forma de Operculina macrocarpa (L.) Urb. Tal
conclusão baseou-se, principalmente, nas características macroscópicas do
tubérculo do vegetal, pela observação dos círculos escuros característicos da
espécie.
De acordo com a análise microscópica, os grãos de amido com fendas em
forma de til são indicativos de O. macrocarpa, assim como as células resiníferas,
auxiliando na identificação da espécie e evitando possíveis alterações.
Na caracterização fitoquímica, observou-se a presença de saponinas.
Foram isoladas e identificadas três substâncias a partir da fração acetato de
etila, os ácidos caféico e protocatecúico e um dímero do ácido caféico.
Diversos compostos fenólicos apresentam atividade antimicrobiana,
entretanto O. macrocarpa não apresentou atividade antimicrobiana em
concentrações de 50, 100 e 200 mg/mL frente aos microrganismos testados (E.
coli ATCC 25922, B. subtilis ATCC 9372, S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa
ATCC 27853 e C. albicans ATCC 10231). Esse fato pode ser devido à baixa
concentração ou disponibilidade dessas substâncias. Outros ensaios serão
realizados com estas substâncias no futuro.
Os ensaios sobre a motilidade gastrintestinal de camundongos mostraram
que as frações diclorometano, acetato de etila, n-butanol, final e o pó da planta
possuem atividade laxante. O efeito laxante de O. macrocarpa pode ser associado
ao
seu efeito propulsor da motilidade intestinal. Os resultados mostram que a
batata-de-purga possui efeito laxante para este modelo experimental,
Daniele Carvalho Michelin
78
Conclusões
comprovando a atividade do seu uso etnomedicinal. Entretanto, a literatura não
reporta esse tipo de atividade para os constituintes químicos isolados de O.
macrocarpa. Assim, essas substâncias serão avaliadas futuramente.
Do ponto de vista toxicológico, o extrato bruto mostrou-se moderadamente
tóxico, a fração diclorometânica, muito tóxica e as frações acetato de etila, n-
butanólica, final e o pó da planta apresentaram-se levemente tóxicas. As frações
diclorometano e acetato de etila apresentaram alterações nos níveis das
transaminases séricas (ALT e/ou AST) quando comparadas com o grupo controle.
Os resultados desse trabalho mostram correlação com o uso popular de O.
macrocarpa. Contudo, a toxicidade dos extratos e sua ação sobre o fígado são um
alerta para que os estudos sejam cuidadosamente aprofundados.
Daniele Carvalho Michelin
79
Referências Bibliográficas
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Daniele Carvalho Michelin
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