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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TESE DE DOUTORADO
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Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato
Natal/RN
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Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato
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Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutora em
Engenharia Química, sob a orientação da Profª. Drª.
Gorete Ribeiro de Macedo e a co-orientação da
Profª. Ph.D. Ferda Mavituna.
Natal/RN
Abril/2010
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Catalogação da Publicação na Fonte
UFRN / UFRN / CT / PPGEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.
Lobato, Ana Katerine de Carvalho Lima.
Análise de fluxos metabólicos para otimização da síntese do antibiótico
cosmomicina por Streptomyces olindensis
ICB20 / Ana Katerine de Carvalho
Lima Lobato. – Natal, 2010.
193 f. : il.
Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo.
Co-Orientadora: Ferda Mavituna.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Química.
1. Engenharia Genética - Antibióticos – Tese. 2. Metabolismo - Células –
Tese. 3. Streptomyces olindensis ICB20 – Tese. 4. Cosmomicina.– Antibiót
ico
–
Tese. I. Macedo, Gorete Ribeiro de. II. Mavituna, Ferda. III. Universidade
Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/BSPPGEQ CDU 602.6:577.18(043.2)
LIMA LOBATO, Ana Katerine de Carvalho - Análise de Fluxos Metabólicos para
Otimização da Síntese do Antibiótico Cosmomicina por Streptomyces olindensis ICB20. Tese
de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de
concentração: Engenharia de Processos, Natal-RN, Brasil.
Orientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo (UFRN)
Co-orientadora: Profª. Ph.D. Ferda Mavituna (The University of Manchester)
_________________________________________________________________________________________
RESUMO: A análise de fluxos metabólicos (AFM) é uma importante ferramenta de análise
do metabolismo celular. O seu conhecimento é de extrema importância para entender como
deve ser conduzido às condições de cultivo de um organismo, no sentido de melhorar os
processos de obtenção de produtos de interesse do homem, bem como para entender como
deve ser manipulado o genoma de uma célula possibilitando a otimização do processo para
engenharia genética. Streptomyces olindensis ICB20 é um promissor produtor do antibiótico
cosmomicina, uma potente droga antitumoral, sendo de extrema relevância estudar os fluxos
metabólicos deste micro-organismo com o propósito de otimizar a síntese deste produto do
metabolismo secundário. Vários grupos de pesquisa brasileiros vêm desenvolvendo estudos
na tentativa de otimizar esta produção em biorreatores. Entretanto, nada foi realizado ainda
relativo à análise de fluxos metabólicos. Este trabalho teve como objetivo verificar os fatores
que afetam o metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20, através da análise de fluxos
metabólicos de forma que possa ser aumentada a produção do metabólito secundário,
cosmomicina. Para alcançar esse objetivo foi desenvolvido um modelo metabólico que simula
uma distribuição dos fluxos internos celulares com base no conhecimento das vias
metabólicas, de suas interligações, como também das restrições do micro-organismo em
estudo. A validade do modelo proposto foi verificada através da comparação dos dados
obtidos pelo modelo com dados experimentais da literatura. A partir da análise dos fluxos
intracelulares, obtidos pelo modelo, foi proposto um meio de cultivo ótimo, como também,
identificado pontos chaves do metabolismo com o direcionando o metabolismo de
Streptomyces olindensis para uma maior produção de cosmomicina. Nesse sentido foi
verificado que o incremento na concentração de extrato de levedura é uma proposta de
otimização do meio de cultivo e que a inibição da via biossintética de ácidos graxos é uma
estratégia interessante para manipulação genética. Com o objetivo de comprovar in vitro o
que foi obtido in silico foi testada uma das condições de otimização de meio proposta pelo
modelo metabólico através de ensaios experimentais em incubador rotativo onde foi
constatado que o incremento na concentração de extrato de levedura no meio de cultivo
induziu a um aumento na produção de cosmomicina.
Palavras-chaves: Engenharia Metabólica, Análise de Fluxos Metabólicos, Streptomyces
olindensis ICB20, Cosmomicina.
ABSTRACT
Metabolic flux analysis (MFA) is a powerful tool for analyzing cellular metabolism. In order
to control the growth conditions of a specific organism, it is important to have a complete
understanding of its MFA. This would allowed us to improve the processes for obtaining
products of interest to human and also to understand how to manipulate the genome of a cell,
allowing optimization process for genetic engineering. Streptomyces olindensis ICB20 is a
promising producer of the antibiotic cosmomycin, a powerful antitumor drug. Several
Brazilian researchers groups have been developing studies in order to optimize cosmomycin
production in bioreactors. However, to the best of our knowledge, nothing has been done on
metabolic fluxes analysis field. Therefore, the aim of this work is to identify several factors
that can affect the metabolism of Streptomyces olindensis ICB20, through the metabolic flux
analysis. As a result, the production of the secondary metabolite, cosmomycin, can be
increased
.
To achieve this goal, a metabolic model was developed which simulates a
distribution of internal cellular fluxes based on the knowledge of metabolic pathways, its
interconnections, as well as the constraints of microorganism under study. The validity of the
proposed model was verified by comparing the computational data obtained by the model
with the experimental data obtained from the literature. Based on the analysis of intracellular
fluxes, obtained by the model, an optimal culture medium was proposed. In addition, some
key points of the metabolism of Streptomyces olindensis were identified, aiming to direct its
metabolism to a greater cosmomycin production. In this sense it was found that by increasing
the concentration of yeast extract, the culture medium could be optimized. Furthermore, the
inhibition of the biosynthesis of fatty acids was found to be a interesting strategy for genetic
manipulation. Based on the metabolic model, one of the optimized medium conditions was
experimentally tested in order to demonstrate in vitro what was obtained in silico. It was
found that by increasing the concentration of yeast extract in the culture medium would
induce to an increase of the cosmomycin production.
Keywords: Metabolic Engineering, Metabolic Flux Analysis, Streptomyces olindensis ICB20,
Cosmomycin.
Dedicatória
À Deus por me guiar ajudando a trilhar meu caminho.
À minha avó Mariana Ivonete (in memorian) pelo seu
exemplo de vida, determinação, fé e amor.
À minha mãe Graça Carvalho pelo amor, amizade,
perseverança e apoio incondicional diante de todas as
adversidades.
Ao meu pai Francisco Lima pelo apoio nos momentos
difíceis e pelo reconhecimento da minha consquista.
Ao meu irmão Cláudio Henrique pelo seu exemplo de
determinação.
Ao meu marido Professor Ph.D. Luiz Carlos pelo amor,
compreensão, força e, sobretudo inspiração durante
toda a trajetória.
À minha filhinha Luana pela alegria, amor e carinho
trazendo levesa a essa árdua conquista.
Agradecimentos
A minha orientadora Professora Drª Gorete Ribeiro de Macedo pela amizade, apoio e
colaboração no desenvolvimento do trabalho.
A minha co-orientadora Professora Ph.D. Ferda Mavituna pela acolhida, amizade e
relevantes contribuições durante o estágio de doutorado na Inglaterra.
Aos Professores Dr. Gabriel Padilha, Drª. Renata Furlan, Dr. Leandro Garrido e Drª.
Iara Pinheiro pelas importantes informações e contribuições no desenvolvimento da tese.
Ao Professor Dr. Jackson Oliveira pelo constante interesse e importantes
contribuições no desenvolvimento e direcionamento da tese.
Aos Professores Dr. Everaldo Silvino, Drª. Patrícia Fernandes e Drª. Luciana
Gonçalves pelas importantes contribuições na avaliação do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica pela força, incentivo, energia
positiva e, sobretudo pela amizade. Em especial a Sérgio Oliveira pela indispensável
contribuição na realização da parte experimental.
Aos amigos da The University of Manchester, Khairan, Raul and Saul pelo apoio e
colaboração no desenvolvimento do trabalho.
A CAPES pelo suporte financeiro durante o estágio de doutorado na Inglaterra.
Ao CNPq pelo apoio financeiro na parte do doutorado realizado no Brasil.
Sumário
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................
LISTA DE TABELAS..............................................................................................................
NOMENCLATURA.................................................................................................................
ABREVIATURAS....................................................................................................................
Capítulo 1.................................................................................................................................12
1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................................... 2
Capítulo 2...................................................................................................................................6
2. ASPECTOS TEÓRICOS.................................................................................................... 7
2.1. Introdução a engenharia metabólica.............................................................................7
2.2. Análise de fluxos metabólicos......................................................................................8
2.2.1. Conceitos básicos para AFM..............................................................................11
2.2.1.1. Modelagem metabólica ...............................................................................11
2.2.1.2. Estequiometria das reações celulares - Formulação matemática ................11
2.2.1.3. Velocidades de reação.................................................................................12
2.2.1.4. Dinâmica do balanço de massa ...................................................................14
2.2.1.5. Construção da rede de reações estequiométricas – Balanço metabólico ....17
2.2.1.6. Programação linear......................................................................................20
2.3. Streptomyces olindensis..............................................................................................22
2.3.1. Streptomycetes...................................................................................................22
2.3.1.1. Histórico de Streptomycetes........................................................................22
2.3.1.2. Características .............................................................................................23
2.3.1.3. Ecologia.......................................................................................................23
2.3.1.4. Crescimento.................................................................................................24
2.3.1.5. Streptomyces olindensis ..............................................................................24
2.3.2. Antibióticos e Streptomycetes............................................................................25
2.3.2.1. Produção de antibiótico...............................................................................25
2.3.2.1.1. Antibióticos polipeptídicos ..................................................................27
2.3.2.1.2. Antibiótico produzido por Streptomyces olindensis.............................28
Capítulo 3.................................................................................................................................30
3. ESTADO DA ARTE......................................................................................................... 31
3.1. Análise de fluxos metabólicos....................................................................................31
3.2. Produção de cosmomicina..........................................................................................36
Capítulo 4.................................................................................................................................41
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 42
4.1. Modelagem microbiana..............................................................................................42
4.1.1. Elementos da rede de reações bioquímica..........................................................44
4.1.2. Construção da rede metabólica de Streptomyces olindensis..............................45
4.1.2.1. Metabolismo: Primário e secundário...........................................................46
4.1.2.2. Metabolismo de carboidratos ......................................................................47
4.1.2.2.1. Glicólise ...............................................................................................48
Sumário
4.1.2.2.2. Via das pentoses fosfato.......................................................................49
4.1.2.2.3. Metabolismo do Piruvato.....................................................................50
4.1.2.2.4. Ciclo de Krebs......................................................................................51
4.1.2.2.5. Reações anapleróticas ..........................................................................52
4.1.2.2.5.1. Ciclo do glioxilato.........................................................................52
4.1.2.2.5.2. Suprimento de oxaloacetato ..........................................................53
4.1.2.2.5.3. Enzima málica...............................................................................54
4.1.2.2.5.4. Formação de fosfoenolpiruvato.....................................................54
4.1.2.2.6. Biossíntese de materiais de estocagem de carbono..............................55
4.1.2.2.6.1. Síntese de glicogênio.....................................................................55
4.1.2.2.6.2. Biossíntese e metabolismo de ácidos graxos.................................56
4.1.2.2.6.3. Síntese de triacilgliceróis ..............................................................57
4.1.2.3. Metabolismo de aminoácidos......................................................................58
4.1.2.3.1. Família dos aminoácidos aromáticos ...................................................58
4.1.2.3.2. Família dos aminoácidos aspartatos.....................................................60
4.1.2.3.3. Família dos aminoácidos de cadeias ramificadas.................................61
4.1.2.3.4. Família dos aminoácidos glutamato.....................................................62
4.1.2.3.5. Biossíntese de alanina ..........................................................................63
4.1.2.3.6. Biossíntese de histidina........................................................................64
4.1.2.3.7. Biossíntese de serina e glicina..............................................................64
4.1.2.3.8. Aminoácidos contendo enxofre............................................................65
4.1.2.4. Biossíntese dos nucleotídeos.......................................................................65
4.1.2.4.1. Nucleotídeos pirimidínicos ..................................................................66
4.1.2.4.2. Nucleotídeos purínicos.........................................................................67
4.1.2.5. Metabolismo do nitrogênio .........................................................................69
4.1.2.5.1. Metabolismo de glutamato e glutamina ...............................................70
4.1.2.5.2. Vias de degradação dos aminoácidos...................................................71
4.1.2.6. Metabolismo do enxofre..............................................................................72
4.1.2.7. Reações do ácido fólico...............................................................................73
4.1.2.8. Biossíntese dos fosfoslipídios .....................................................................73
4.1.2.9. Biossíntese de proteínas..............................................................................74
4.1.2.10. Biossíntese dos ácidos ribonucléicos (RNA) ............................................76
4.1.2.11. Biossíntese dos ácidos desoxirribonucléicos (DNA) ................................77
4.1.2.12. Reação de carboidrato...............................................................................78
4.1.2.13. Biossíntese de biomassa............................................................................78
4.1.2.14. Reações de transferência de elétrons e manutenção..................................79
4.1.2.15. Biossíntese de cosmomicina......................................................................79
4.1.3. Considerações e parâmetros do modelo.............................................................82
4.1.4. Modelo computacional de fluxos metabólicos intracelulares............................82
4.1.4.1. Programa computacional.............................................................................83
4.1.4.2. Entradas e saídas do programa....................................................................84
4.1.5. Equacionamento do modelo...............................................................................85
4.1.6. Construção do mapa de fluxos metabólicos.......................................................86
4.1.6.1. Mapa de distribuição de fluxos metabólicos...............................................87
4.2. Cultivo microbiano.....................................................................................................89
4.2.1. Micro-organismo................................................................................................89
4.2.2. Preparo do estoque e conservação da cepa.........................................................89
4.2.3. Meios de Cultura................................................................................................90
Sumário
4.2.4. Preparo do inóculo .............................................................................................91
4.2.4.1. Pré-inóculo..................................................................................................91
4.2.4.2. Inóculo.........................................................................................................92
4.2.5. Cultivos descontinuos ........................................................................................92
4.2.5.1. Procedimento de amostragem .....................................................................92
4.2.6. Metodologias analíticas......................................................................................92
4.2.6.1. Determinação da concentração celular (X)..................................................92
4.2.6.2. Determinação da concentração de glicose (S).............................................93
4.2.6.3. Determinação da concentração de retamicina extracelular (Re).................94
4.2.6.4. Determinação da concentração de retamicina intracelular (Ri) ..................95
Capítulo 5.................................................................................................................................99
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 100
5.1. Validação do modelo metabólico de Streptomyces olindensis ICB20 .....................100
5.1.1. Descrição do meio complexo...........................................................................100
5.1.2. Comparação dos dados computacionais com os experimentais.......................105
5.2. Aplicação da modelagem metabólica.......................................................................108
5.2.1. Análise de fluxos metabólicos em diferentes vazões específicas de
alimentação.................................................................................................................108
5.2.2. Análise de fluxos metabólicos na vazão específica de alimentação 0,05 h
-1
...113
5.2.3. Análise de sensibilidade na vazão específica de alimentação 0,05 h
-1
.............116
5.2.4. Redirecionamento do metabolismo para uma via preferencial de produção
de cosmomicina..........................................................................................................118
5.2.4.1. Relação entre a formação de ácidos graxos e a produção de antibiótico..118
5.2.4.2. A influência da 3-oxoacil-(ACP) sintase III na produção de
cosmomicina...........................................................................................................119
5.2.5. Efeito da limitação de nutrientes na produção de cosmomicina e no
metabolismo de S. olindensis ICB20..........................................................................124
5.2.5.1. Limitação de oxigênio...............................................................................124
5.2.5.2. Limitação de sulfato..................................................................................127
5.2.5.3. Limitação de fosfato..................................................................................130
5.2.6. Análise de fluxos metabólicos para verificar a influência do extrato de
levedura na produção de cosmomicina ......................................................................133
5.2.6.1. In silico......................................................................................................133
5.2.6.2. In vitro.......................................................................................................138
Capítulo 6...............................................................................................................................143
6. CONCLUSÃO................................................................................................................ 144
6.1. Validação do modelo metabólico de Streptomyces olindensis.................................144
6.2. Aplicação da modelagem metabólica.......................................................................145
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 149
APÊNDICE............................................................................................................................ 162
Lista de Figuras
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Fluxos através de diferentes rotas metabólicas de Saccharomyces cerevisiae
durante um cultivo anaeróbico (Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen, 1998, p.
310)............................................................................................................................ 9
Figura 2.2. Estrutura química da cosmomicina produzida por Streptomyces olindensis
(A) e as estruturas referente à parte cetônica (B) e aos açúcares polipeptídicos
(C, D e E)................................................................................................................. 29
Figura 4.1. Passos para promover a análise de fluxos metabólicos. .......................................... 43
Figura 4.2. Via biossintética de produção de cosmomicina....................................................... 80
Figura 4.3. Estrutura do programa computacional..................................................................... 84
Figura 4.4. Mapa metabólico proposto para representar a distribuição de fluxos em
Streptomyces olindensis ICB20............................................................................... 88
Figura 5.1. Concentração celular (X), concentração de glicose (S), concentração de
nitrogênio (NH
4
) e concentração de retamicina (P) em cultivos contínuos de S.
olindensis ICB20, usando meio complexo, sob diferentes vazões específicas de
alimentação (Pamboukian, 2003). 101
Figura 5.2. Velocidades específicas de crescimento celular, computacional e experimental,
em função das vazões específicas de alimentação em cultivos contínuos de S.
olindensis ICB20 sem (G
1
) e com (G
2
) as restrições de taxa de consumo dos
componentes do extrato de levedura e do casaminoácidos. .................................. 106
Figura 5.3. Velocidades específicas de formação de produto, computacional e
experimental, em função das vazões específicas de alimentação em cultivos
contínuos de S. olindensis ICB20 sem (COS
1
) e com (COS
2
) as restrições de
taxa de consumo dos componentes do extrato de levedura e do casaminoácidos. 106
Figura 5.4. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos que
mostraram mudanças significativas (em azul) durante o cultivo nas vazões
específicas de alimentação 0,03, 0,05 e 0,1 h
-1
ao otimizar a velocidade
específica de crescimento celular. ......................................................................... 109
Figura 5.5. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo em diferentes vazões específicas de alimentação quando a velocidade
específica de crescimento celular foi otimizada. As reações referentes aos
números estão no Apêndice C. .............................................................................. 110
Figura 5.6. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos que
mostraram mudanças significativas (em azul) durante o cultivo nas vazões
específicas de alimentação 0,03, 0,05 e 0,1 h
-1
ao otimizar a velocidade
específica de produção de cosmomicina................................................................ 111
Figura 5.7. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo em diferentes vazões específicas de alimentação quando a velocidade
específica de produção de cosmomicina foi otimizada. As reações referentes
aos números estão no Apêndice C......................................................................... 112
Figura 5.8. Mapa de distribuição de fluxos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) durante a
maximização da velocidade específica de crescimento celular (valores em
vermelho) e de produção de cosmomicina (valores em azul) num cultivo
contínuo de S. olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
..................................................... 114
Lista de Figuras
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
Figura 5.9. Sensibilidade da velocidade específica de crescimento celular para mudança
em vários fluxos em termos de valores marginais em uma cultura contínua à D
= 0,05 h
-1
. As reações referentes aos números estão no Apêndice C. ................... 116
Figura 5.10. Sensibilidade da velocidade específica de produção de cosmomicina para
mudança em vários fluxos em termos de valores marginais em uma cultura
contínua à D = 0,05 h
-1
. As reações referentes aos números estão no Apêndice
C. .......................................................................................................................... 117
Figura 5.11. Fluxos metabólicos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) num cultivo contínuo de S.
olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
. ......................................................................... 120
Figura 5.12. Fluxos metabólicos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) num cultivo contínuo de S.
olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
com inibição da via biossintética de ácidos
graxos................................................................................................................... 122
Figura 5.13. Distribuição dos fluxos metabólicos que mostraram mudanças significativas
ao variar a velocidade específica de consumo de oxigênio. Os valores dos
fluxos em vermelho representam a condição 1 e dos fluxos em azul
representam a condição 4. ................................................................................... 126
Figura 5.14. Distribuição dos fluxos metabólicos e as mudanças significativas ao variar a
velocidade específica de consumo de sulfato. Os valores dos fluxos em
vermelho representam a condição 1 e dos fluxos em azul representam a
condição 2............................................................................................................ 129
Figura 5.15. Distribuição dos fluxos metabólicos e as mudanças significativas ao variar a
velocidade específica de consumo de fosfato. Os valores dos fluxos em
vermelho representam a condição 1 e dos fluxos em azul representam a
condição 2............................................................................................................ 132
Figura 5.16. Relação entre a variação da velocidade específica de produção de
cosmomicina e a concentração de extrato de levedura no meio num cultivo
contínuo de S. olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
.................................................. 135
Figura 5.17. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos que
mostraram mudanças significativas durante o cultivo contínuo à D = 0,05 h
-1
nas concentrações de extrato de levedura de 5, 10, 15 e 20 g/L......................... 136
Figura 5.18. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo à D = 0,05 h
-1
nas concentrações de extrato de levedura de 5, 10, 15
e 20 g/L................................................................................................................ 137
Figura 5.19. Concentração de biomassa (X), concentração de glicose (S) e concentração de
retamicina (P), no ensaio 1 utilizando o meio R5Mod com 5 g/L de extrato de
levedura. Com concentração de biomassa inicial (X
0
= 0,67 g/L) e
concentração de glicose inicial (S
0
= 5,93 g/L)................................................... 138
Figura 5.20. Concentração de biomassa (X), concentração de glicose (S) e concentração de
retamicina(P), no ensaio 2 utilizando o meio R5Mod com 20 g/L de extrato
de levedura. Com concentração de biomassa inicial (X
0
= 1,11 g/L) e a
concentração de glicose inicial (S
0
= 4,96 g/L)................................................... 139
Figura 5.21. Velocidade específica de crescimento celular (µ
x
), velocidade específica de
consumo de substrato (µ
s
) e velocidade específica de produção de retamicina
(µ
p
), no ensaio 1 utilizando o meio R5Mod com 5 g/L de extrato de levedura. . 140
Figura 5.22. Velocidade específica de crescimento celular (µ
x
), velocidade específica de
consumo de substrato (µ
s
) e velocidade específica de produção de retamicina
(µ
p
), no ensaio 2 utilizando o meio R5Mod com 20 g/L de extrato de levedura 140
Figura 5.23. Velocidade específica de produção de retamicina (µ
p
), nos ensaios 1 e 2........... 141
Lista de Tabelas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Equações usadas para cálculo das velocidades específicas a partir de dados
experimentais (Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen, 1998, pg. 101).................. 16
Tabela 2.2. Tipos de antibióticos produzidos por Streptomyces............................................ 26
Tabela 4.1. Rotas bioquímicas utilizadas na construção do modelo metabólico de S.
olindensis ICB20................................................................................................. 45
Tabela 4.2. Reações e enzimas envolvidas na via glicolítica................................................. 48
Tabela 4.3. Reações e enzimas envolvidas na via das pentoses fosfato................................ 49
Tabela 4.4. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo do piruvato.............................. 50
Tabela 4.5. Reações e enzimas envolvdas no ciclo de Krebs................................................ 51
Tabela 4.6. Reações e enzimas específicas do ciclo do glioxilato......................................... 53
Tabela 4.7. Reações e enzimas envolvidas no suprimento de oxaloacetato.......................... 53
Tabela 4.8. Reação da enzima málica.................................................................................... 54
Tabela 4.9. Reação e enzima envolvida na formação de fosfoenolpiruvato.......................... 54
Tabela 4.10. Reações e enzimas envolvidas na síntese de glicogênio................................... 55
Tabela 4.11. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos....................... 56
Tabela 4.12. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo de ácidos graxos.................... 57
Tabela 4.13. Reações e enzimas envolvidas na síntese de fosfatidato................................... 58
Tabela 4.14. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de fenilalanina, tirosina e
triptofano........................................................................................................... 59
Tabela 4.15. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de aspartato, asparagina,
treonina e lisina................................................................................................. 60
Tabela 4.16. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de leucina, isoleucina e valina.. 62
Tabela 4.17. Reações envolvidas na biossíntese de prolina e arginina.................................. 63
Tabela 4.18. Reação e enzima envolvida na biossíntese de alanina...................................... 64
Tabela 4.19. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de histidina............................... 64
Tabela 4.20. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de serina e glicina..................... 65
Tabela 4.22. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos nucleotídeos pirimidínicos. 67
Tabela 4.23. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos nucleotídeos purínicos....... 69
Tabela 4.24. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de glutamato e glutamina......... 70
Tabela 4.25. Reações e enzimas envolvidas na degradação de aminoácidos........................ 72
Tabela 4.26. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo do enxofre............................. 72
Tabela 4.27. Reações e enzimas envolvidas com o ácido fólico........................................... 73
Tabela 4.28. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos fosfolipídios....................... 74
Tabela 4.29. Quantidade de aminoácidos necessários para produzir um grama de proteína
(Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983)............................................................... 75
Tabela 4.30. Biossíntese de proteína...................................................................................... 76
Tabela 4.31. Reação envolvida na biossíntese de proteína.................................................... 76
Tabela 4.32. Requerimento de nucleotídeos para formação de RNA.................................... 77
Tabela 4.33. Biossíntese de RNA.......................................................................................... 77
Tabela 4.34. Reação envolvida na biossíntese de RNA......................................................... 77
Tabela 4.35. Requerimento de nucleotídeos para formação de DNA.................................... 78
Tabela 4.36. Biossíntese de DNA.......................................................................................... 78
Tabela 4.37. Reação envolvida na biossíntese de DNA........................................................ 78
Tabela 4.38. Reação de carboidrato....................................................................................... 78
Lista de Tabelas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
Tabela 4.39. Composição da biomassa.................................................................................. 79
Tabela 4.40. Reação envolvida na biossíntese de biomassa.................................................. 79
Tabela 4.41. Sistema de transporte de elétrons...................................................................... 79
Tabela 4.42. Reações de manutenção.................................................................................... 79
Tabela 4.43. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de cosmomicina........................ 81
Tabela 4.44. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos deoxi-açúcares de
cosmomicina..................................................................................................... 82
Tabela 5.1. Dados de cultivo contínuo de S. olindensis ICB20 usando meio complexo
(Pamboukian, 2003)........................................................................................... 101
Tabela 5.2. Composição de aminoácidos em 5 g/L de extrato de levedura (DIFCO)........... 102
Tabela 5.3. Composição de aminoácidos em 0,1 g/L de casaminoácidos (US Biological)... 102
Tabela 5.4. Composição de carboidrato e fosfato em 5 g/L de extrato de levedura.............. 103
Tabela 5.5. Cálculo das taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato e fosfato............... 104
Tabela 5.6. Valores experimentais das velocidades específicas em diferentes vazões
específicas de alimentação no cultivo de S. olindensis ICB20 (Pamboukian,
2003)................................................................................................................... 104
Tabela 5.7. Variação da produção de cosmomicina, do consumo de sulfato e da excreção
de acetato, formato, dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em
diferentes condições de limitação de oxigênio.................................................... 125
Tabela 5.8. Variação da produção de cosmomicina e da excreção de acetato, formato,
dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em condições de não limitação e
limitação do consumo de sulfato......................................................................... 128
Tabela 5.9. Variação da produção de cosmomicina, do consumo de sulfato e da excreção
de acetato, formato, dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em
condições de não limitação e limitação do consumo de fosfato......................... 130
Tabela 5.10. Cálculo das taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato e fosfato baseado
em diferentes concentrações de extrato de levedura a D = 0,05 h
-1
.................. 134
Nomenclatura
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
NOMENCLATURA
N
Conjunto dos substratos
M
Conjunto dos produtos metabólicos
Q
Conjunto dos constituíntes da biomassa
J
Conjunto das reações estequiométricas
K Conjunto dos metabólitos intracelulares
S
i
Concentração do i-ésimo substrato (g/L)
P
i
Concentração do i-ésimo produto extracelular (g/L)
X
macro,i
Concentração do i-ésimo constituinte da biomassa (g/L)
X
met,i
Concentração do i-ésimo constituinte da biomassa referente as K rotas
intermediárias (g/L)
α
,
β
, γ e g
Coeficientes estequiométricos
i
Cada substrato, produto ou metabólito
j
Cada reação
Α, Β, Γ e
G
Matrizes estequiométricas contendo coeficientes estequiométricos das J reações
para os substratos, produtos metabólicos, constituintes da biomassa e rotas
intermediárias respectivamente
is
r
,
Velocidade específica de consumo do i-ésimo substrato
ip
r
,
Velocidade específica de formação de i-ésimo produto metabólico
imacro
r
,
Velocidade específica de formação dos constituintes da biomassa
imet
r
,
Velocidade específica de formação dos metabólitos intracelulares
r
s
Vetor da velocidade específica contendo N velocidades específicas de consumo
de substrato
r
p
Vetor da velocidade específica contendo M velocidades específicas de formação
de produto
macro
r
Vetor da velocidade específica contendo Q velocidades específicas de
constituintes da biomassa
met
r
Vetor da velocidade específica contendo K velocidades específicas de formação
dos metabólitos intracelulares
ν
Velocidade de reação na rede
c
s,i
Concentração do i-ésimo substrato no biorreator (mol.L
-1
)
ip
c
,
Concentração do i-ésimo produto no biorreator (mol.L
-1
)
c
met,i
Concentraçãodo i-ésimo metabólito intracelular no biorreator (mol.L
-1
)
c
f
s,i
Concentração do i-ésimo substrato na alimentação (mol.L
-1
)
f
ip
c
,
Concentração do i-ésimo produto na alimentação (mol.L
-1
)
D
Vazão específica de alimentação (h
-1
)
x
Concentração de biomassa (g célula seca.L
-1
)
X
0
Concentração celular inicial (g/L)
S
0
Concentração de glicose inicial (g/L)
µ
Velocidade específica de crescimento celular (h
-1
)
v Vetor dos fluxos de cada reação (mmol.g célula seca
-1
. h
-1
)
F Grau de liberdade no conjunto de equações algébricas
m Fluxos medidos
Nomenclatura
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
c Fluxos calculados
G
T
Matriz transposta dos coeficientes estequiométricos
Abreviaturas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
ABREVIATURAS
Ac Acetato
AcCoA
AcylCoA
Acetil-CoA
Acil-CoA
ACP Proteína transportadora de acila
AcSer o3-Acetil-L-serina
AdoCys S-Adenosil-L-homocisteína
AdoMet S-Adenosil-L-metionina
ADP Adenosina difosfato
ADPGlc Adenosina difosfato glicose
AGL3P 1-Acilglicerol-3-fosfato
AHB (S)-2-Aceto-2-hidroxibutanoato
AICAR 5-Amino-1-(5-fosfo-D-ribosil) imidazole-4-carboxamida
AIR 5-Amino-1-(5-fosfo-D-ribosil) imidazole
Ak Ácido aclanônico
AkKet Aclavicetona
Akla Aclavinona
AkMet Ácido aclanônico metilester
Ala L-Alanina
Alac 2-Acetolactato
AMP Adenosina monofosfato
Anth Antranilato
APS Adenilsulfato
Arg L-Arginina
ArgSuc (N(omega-L-Arginina)succinato
Asn L-Asparagina
Asp L-Aspartato
AspSA L-Aspartato 4-semialdeído
ATP Adenosina trifosfato
BBMIII Fosforibulosil-formimino-AICAR-fosfato
BIO Biomassa
CbmP Carbomil fosfato
CDP Citidina difosfato
CDPDG Citidina difosfato diacilglicerol
CHO Carboidrato
Chor Corismato
Cit Citrato
Citr L-Citrulina
CMP Citidina-5'-monofosfato dissódico
CO
2
Dióxido de carbono
COS Cosmomicina
CoA Coenzima A
CTP Citidina trifosfato
Cys L-Cisteína
Cyst Cistationina
dADP 2'-Desoxiadenosina 5'-difosfato
dAMP 2'-Desoxiadenosina 5'-monofosfato
Abreviaturas
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DAP LL-2,6-Diaminoheptanedioato
dCDP 2'-Desoxicitidina difosfato
dCin Desoxitimidina 5'-difosfato-L-cinerulose
dCMP 2'-Desoxicitidina 5'-monofosfato
dCTP 2'-Desoxicitidina 5'-trifosfato
DeAk 12-Ácido desoxiaclanônico
dFuc Desoxitimidina 5'-difosfato-L-desoxifucose
dGDP 2'-Desoxiguanosina 5'-difosfato
dGlu Desoxitimidina 5'-difosfato glicose
dGMP 2'-Desoxiguanosina 5'-monofosfato
DHAP Dihidroxicetona fosfato
DHQ3 3-Deidroquinato
DHS3 3-Deidroshikimato
DodGlu 4,6-Didesoxi-4-oxo-desoxitimidina 5'-difosfato-D-glicose
DNA Ácido desoxiribonucleico
DPG 3-Fosfo-D-gliceroil fosfato
DPGro Difosfatidilglicerol (Cardiolipina)
dRodi Desoxitimidina 5'-difosfato-L-rodinose
dRodo Desoxitimidina 5'-difosfato-L-rodosamina
dTDP Desoxitimidina 5'-difosfato
dTMP Desoxitimidina 5'-fosfato
dTTP Desoxitimidina 5'-trifosfato
dUMP 2'-Desoxiuridina 5'-fosfato
dUTP 2'-Desoxiuridina 5'-trifosfato
E4P D-eritrose 4-fosfato
EpyrS Desoxitimidina 5'-difosfato 1-ester com (6S)-5,6-deidro-4-hidroxi-6-metil-5-oxo-
2H pirano
Estpyr Desoxitimidina 5'-difosfato 1-ester com (6R)-5,6-deidro-4-hidroxi-6-metil-5-oxo-
2H pirano
Estul Desoxitimidina 5'-difosfato 1-ester com 2,6-dedosoxi-L-eritro-hexopiranos-3-ulosa
F6P D-Frutose 6-fosfato
FACoA Ácido graxo coenzima A
FAD
+
Flavina adenina dinucleotídeo
FADH
2
Flavina adenina dinucleotídeo reduzida
FAICAR 5-Formamido-1-(5-fosfo-D-ribosil) imidazole-4-carboxamida
FbP D-Frutose 1,6-bifosfato
ForTHF 10-Formiltetrahidrofolato
Form Formato
Fum Fumarato
G1P D-Glicose 1-fosfato
G6P D-Glicose 6-fosfato
GDP Guanosina 5'difosfato
GL3P sn-Glicerol 3-fosfato
Glc D-Glicose
Glco Glicogênio
Gln L-Glutamina
Glu L-Glutamato
GluSA L-Glutamato 5-semialdeido
Abreviaturas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
Glx Glioxilato
Gly Glicina
GMP Guanosina 5'-monofosfato
Gro Glicerol
GTP Guanosina 5'-trifosfato
H Hidrogênio
H
2
S Ácido sulfídrico
Hcy L-Homocisteína
His L-Histidina
Hnohen 9-Hidroxi-3,4,7,11,13,15,17,19-nonaoxo-henocosamoil-[ACP]
HPP 4-Hidroxipropionil-CoA
Hse L-Homoserina
Hypro 3-Hidroxipropionil-CoA
Icit Isocitrato
Ile L-Isoleucina
ImGroP D-Eritro-1-(imidazol-4-yl) glicerol 3-fosfato
IMP5 Inosina 5'-fosfato
Ino Mioinositol
InoP Mioinositol fosfato
Leu L-Leucina
Lys L-Lisina
MaCoA Malonil-CoA
Mal (S)-Malato
mDAP Meso-diaminoheptanedioato
Met L-Metionina
MeTHF 5,10-Metilenotetrahidrofolato
MetTHF 5,10-Meteniltetrahidrofolato
MTHF 5-Metiltetrahidrofolato
NAD
+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
NADP
+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NH
3
Amônia
Nohen 3,5,7,9,11,13,15,17,19-Nonaoxo-henicosanoil-[ACP]
O
2
Oxigênio
OAA Oxaloacetato
OB 2-Oxobutanoato
OdiGlu Desoxitimidina 5'-difosfato-4-oxo-2,6-didesoxi-D-glicose
OG 2-Oxoglutarato
OIV 3-Metil-2-oxobutanoato
OMP Oritidina 5'-fosfato
Orn L-Ornitina
Oro Orotato
Oxpro 3-Oxopropionil-CoA
PAP Adenosina 3',5'-bifosfato
PAPS 3'-Fosfoadenilil sulfato
Pdcar 2,3,4,5-Tetrahidrodipicolinato
PEP Fosfoenolpiruvato
Abreviaturas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
PG2 2-Fosfo-D-glicerato
PG3 3-Fosfoglicerato
PGA3 Gliceraldeido 3-fosfato
PGn6 6-Fosfo-D-gluconato
Phe L-Fenilalanina
Pi Fosfato
Plip Fosfolipídio
PO
4
Fosfato
Ppi Difosfato
PRA 5-Fosfo-D-ribosilamina
PrAt5 N-(5-Fosfo-D-ribosil)-antranilato
PrCoA Propenoil-CoA
Prep Prefenato
Pro L-Prolina
ProCoA Propanoil-CoA
Prot Proteína
PRPP 5-Fosforibosil 1-pirofosfato
Ptd 1,2-Diacil-sn-glicerol 3-fosfato
PtdEtn Fosfatidil-1D-mioinositol
PtdGro 3 (3-sn-Fosfatidil)-sn-glicerol 1-fosfato
PtdIno Fosfatidil-1D-mioinositol
PtdSer 3-O-sn-fosfatidil-L-serina
Pyr Piruvato
Rhod Epsilon-Rodomicinona
R5P D-Ribose 5-fosfato
RNA Ácido ribonucleico
Ru5P D-Ribulose 5-fosfato
S7P Sedoheptulose-7-fosfato
Ser L-Serina
SMal2 (2S)-2-Isopropilmalato
SAla 3-Sulfino-L-alanina
SO
3
Sulfito
SO
4
Sulfato
Suc Succinato
SucCoA Succinil-CoA
SucHse O-Succinil-L-homoserina
TG Triacilglicerol
THF Tetrahidrofolato
Thr L-Treonina
TR-ox Tioredoxina oxidada
Trp L-Triptofano
TR-red Tioredoxina reduzida
Tyr L-Tirosina
UDP Uridina difosfato
UMP Uridina monofosfato
Ure Uréia
UTP Uridina trifosfato
Val L-Valina
Abreviaturas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
XMP Xantosina 5'-fosfato
Xyl5P D-Xilose 5-fosfato
Capítulo 1
Introdução Geral
Introdução Geral
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2
1. INTRODUÇÃO GERAL
Os constantes progressos com genomas e biologia molecular aplicada, junto com a
ênfase crescente em utilização de fontes renováveis para produção química, impulsionaram a
engenharia metabólica à vanguarda de interesse biotecnológico.
Este campo citado emergiu na última década como um campo interdisciplinar que atua
no melhoramento das propriedades celulares utilizando ferramentas genéticas modernas para
modificar as rotas metabólicas. Experimentalmente, as aplicações de engenharia metabólica
focalizaram em modificações de rotas dentro dos sistemas procarióticos e eucarióticos e o
desenvolvimento de novas ferramentas para a introdução de controles genéticos. Métodos
matemáticos têm sido usados para esclarecer as rotas metabólicas e seus controles cinéticos.
Este conhecimento beneficia um posterior desenvolvimento de genomas e novas tecnologias,
como microrrotas de um novo DNA, que tentam a expressão do fenótipo de células.
Muitos problemas industriais pertinentes à biotecnologia são solucionados dentro do
ponto de vista de engenharia metabólica que identifica e elucida rotas desconhecidas em
bioprocessos. A quantificação da magnitude de cada um dos fluxos intracelulares sempre foi
um importante objetivo na engenharia metabólica, principalmente com relação à produção de
metabólitos de interesse comercial (Mendes, 2006). É através da análise quantitativa e do
entendimento das reações biológicas que podem ser feitas modificações genéticas utilizando
modernas ferramentas de biologia molecular aplicada.
A engenharia metabólica estuda o metabolismo de micro-organismos, plantas e animais
usando ferramentas científicas e de engenharia com o objetivo de:
• Compreender melhor as condições normais e anormais (mutantes, alterações
genéticas e anomalias);
• Otimizar quantitativamente meios de cultivo;
• Identificar e testar gargalos metabólicos para a visão de engenharia genética;
• Projetar e modificar geneticamente caminhos metabólicos para aumentar a
formação dos metabólitos desejados e/ou diminuir a formação de metabólitos
indesejados em bioprocessos ou em células, tecidos e órgãos.
A Análise de Fluxos Metabólicos (AFM) e a Análise de Controles Metabólicos (ACM)
são duas ferramentas muito poderosas de engenharia metabólica.
Introdução Geral
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
3
Aspectos analíticos de engenharia metabólica vêm sendo aplicados em E. coli,
leveduras e algumas espécies de bactérias com a atenção focada na formação de biomassa,
produção de metabólitos primários e secundários (Nissen et al., 1997, Takaç et al. 1998,
Naeimpoor, 2001, Sanchez; Bennett; San, 2006). Neste trabalho Streptomyces olindensis,
produtor do antibiótico cosmomicina, foi selecionado para análise de fluxos metabólicos.
O organismo modelo a ser estudado é a linhagem mutante de Streptomyces olindensis
ICB20, produtor do complexo retamicina onde o maior constituinte desse complexo é o
antibiótico cosmomicina D (Furlan et al., 2004, Garrido et al., 2006) classificado como
antraciclina. As antraciclinas são potentes drogas antitumorais usadas mundialmente no
tratamento de várias neoplasias (Salas & Mendez, 1998). Dentre as antraciclinas mais
utilizadas encontra-se a doxorrubicina, considerada o agente quimioterápico mais eficaz em
tratamentos contra o câncer, contudo, sua utilidade clínica é limitada por efeitos colaterais,
dentre estes, o mais destrutivo que é a cardiotoxidade. A cosmomicina possui estrutura e
propriedades físicas e químicas semelhantes à doxorrubicina, tendo alta atividade antitumoral
e relevante atividade microbiana. Apesar de eficaz no tratamento de tumores cancerígenos em
ensaios pré-clínicos realizados (Asfora
;
Santana; Lima, 1972), sua baixa produção pela
linhagem selvagem Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 e seus efeitos colaterais
cardiotóxicos, tornam sua comercialização inviável atualmente.
Recentemente, diversos estudos foram realizados com a linhagem mutante ICB20 com o
objetivo de obter uma maior produção de antibiótico em biorreator, bem como de obter um
produto com maior pureza e menor toxidade. Pamboukian; Guimarães; Facciotti (2002)
utilizaram técnicas de análise de imagem para caracterizar a morfologia de S. olindensis.
Giudici; Pamboukian; Facciotti (2003) proporam um modelo baseado na morfologia para
descrever o comportamento de crescimento celular, consumo de substrato e produção de
retamicina durante cultivos em batelada e contínuo de S. olindensis. Guimarães et al. (2003)
estudaram a influência das fontes de carbono e nitrogênio na produção do antibiótico
retamicina. Guimarães et al. (2004) mostraram que o pH do meio de cultura é uma variável de
grande relevância em cultivos de S. olindensis. Pamboukian & Facciotti (2004) estudaram a
produção de retamicina em cultivos contínuos de S. olindensis com diferentes vazões
específicas de alimentação. Martins et al. (2004) mostraram a relevância do perfil de
concentração de oxigênio dissolvido no crescimento celular e na produção de retamicina em
cultivos de S. olindensis. Inoue et al. (2007) estudaram a influência de diferentes
concentrações de glicose no meio de cultivo na produção do antitumoral. Pinheiro (2007)
Introdução Geral
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
4
investigou a produção do antibiótico antitumoral por células imobilizadas de S. olindensis
ICB20 em biorreatores. Apesar dos vários estudos desenvolvidos na tentativa de otimizar esta
produção em biorreatores, nada foi realizado ainda relativo a análise de fluxos metabólicos.
O objetivo desse trabalho foi verificar os fatores que afetam o metabolismo de
Streptomyces olindensis ICB20, através da análise de fluxos metabólicos propondo estratégias
para aumentar a produção do metabólito secundário, cosmomicina. Para alcançar esse
objetivo foi necessário definir os seguintes objetivos específicos:
• Construir um modelo metabólico que simule a distribuição dos fluxos internos
celulares com base no conhecimento das vias metabólicas, de suas
interligações, como também das restrições do micro-organismo em estudo;
• Verificar a validade do modelo proposto através da comparação dos dados
obtidos pelo modelo com dados experimentais da literatura;
• Utilizar a análise dos fluxos metabólicos para propor um meio de cultivo
ótimo, como também, para identificar pontos chaves do metabolismo com o
objetivo de direcionar o metabolismo de Streptomyces olindensis para uma
maior produção de cosmomicina;
• Comprovar in vitro o que foi obtido in silico testando uma das condições de
otimização de meio proposta pelo modelo metabólico através de ensaios
experimentais.
Esse trabalho foi realizado em duas etapas: a primeira etapa, computacional, referente à
construção do modelo metabólico de análise de fluxos que foi realizada durante o estágio de
doutorado na Inglaterra sob a orientação da Professora Ph.D. Ferda Mavituna na The
University of Manchester. A segunda etapa se refere à utilização do modelo e validação do
mesmo, em caráter experimental, que foi realizada no Laboratório de Engenharia Bioquímica,
do Departamento de Engenharia Química na Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
sob a orientação da Professora Drª. Gorete Ribeiro de Macedo.
A descrição desse trabalho está apresentada em seis capítulos. O capítulo um faz uma
breve introdução sobre o trabalho e apresenta de uma forma sucinta o objetivo da tese. O
capítulo dois aborda os aspectos teóricos relacionados à engenharia metabólica com foco em
análise de fluxos metabólicos, passando por relevantes teorias, formulação matemática do
metabolismo celular e pela ferramenta para solução de modelo matemático. Neste capítulo
também é abordado o histórico de S. olindensis dando ênfase à produção do antibiótico
cosmomicina, como também seu metabolismo com base na rede das reações metabólicas. O
Introdução Geral
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
5
capítulo três mostra, a partir de uma revisão da literatura, como a análise de fluxos
metabólicos está enquadrada no contexto de engenharia metabólica e a importância da
otimização da produção de cosmomicina por S. olindensis. No capítulo quatro é descrito como
foi feita a modelagem microbiana apresentando as reações propostas para descrever o
metabolismo primário e secundário de Streptomyces olindensis ICB20, onde foram levadas
em consideração as rotas metabólicas de Streptomycetes. Esse mesmo capítulo aborda a
metodologia utilizada ao cultivar Streptomyces olindensis ICB20 em incubador rotativo. No
capítulo cinco é mostrado como foi feita a validação do modelo e como esse modelo
metabólico foi aplicado para analisar diferentes condições de cultivo e propor estratégias para
otimizar a produção de cosmomicina. Ainda nesse capítulo é apresentado os resultados
experimentais obtidos ao testar uma das condições de otimização proposta pelo programa. No
capítulo seis são apresentadas as conclusões obtidas nesse trabalho.
Capítulo 2
Aspectos Teóricos
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 7
2. ASPECTOS TEÓRICOS
2.1. Introdução a engenharia metabólica
A engenharia metabólica está relacionada com a análise e modificação de rotas
metabólicas. Este campo emergiu durante a última década e se consolidou através das técnicas
aplicadas a biologia molecular e a engenharia das reações, sendo o foco nas atividades de
pesquisas em engenharia biológica e bioquímica.
Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen (1998) definem engenharia metabólica como uma
forma direcionada de melhorar a formação de produto ou as propriedades celulares através da
modificação de reações bioquímicas específicas ou da introdução de novas reações através do
uso da tecnologia de DNA recombinante. Como em todos os campos da engenharia, a
engenharia metabólica também inclui as partes de análise e síntese. A parte analítica está
relacionada com a identificação de importantes parâmetros na definição da fisiologia celular.
Do ponto de vista sintético, a engenharia metabólica está focada na integração das vias
metabólicas, e não nas reações individuais, baseando-se na análise das redes de reações
bioquímicas em relação às vias de sínteses, viabilidade termodinâmica, fluxos metabólicos e
seus controles.
Uma das mais significantes contribuições de engenharia metabólica está na ênfase dada
aos fluxos metabólicos e seus controles sob condições in vivo. A combinação de métodos
analíticos para quantificar fluxos e seus controles com técnicas de biologia molecular na
implementação de modificações genéticas sugeridas é a essência de engenharia metabólica.
O fluxo é um determinante fundamental na fisiologia celular e o parâmetro mais crítico
de uma rede metabólica. A determinação de fluxos metabólicos in vivo é chamada de análise
de fluxos metabólicos e é de fundamental importância para a engenharia metabólica. Do
ponto de vista de redes metabólicas e fluxos o principal objetivo da engenharia metabólica é
elucidar os fatores e mecanismos responsáveis para o controle dos fluxos metabólicos. Um
melhor entendimento do controle de fluxos serve como base para uma modificação racional
de uma rota metabólica. O processo para uma investigação sistemática dos fluxos metabólicos
e seus controles consiste em três passos. O primeiro passo tem como objetivo observar as
possíveis rotas e medir seus fluxos. Para isso, inicia-se com um simples balanço de materiais
baseado nas medidas de concentrações de metabólitos extracelulares. O segundo passo é
introduzir as perturbações para a rede de biorreações e determinar a rede de fluxos depois do
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 8
relaxamento do sistema no novo estado estacionário. O terceiro e último passo na
determinação do controle de fluxo é a análise dos resultados das perturbações. É de grande
importância compreender como uma perturbação no fluxo, iniciado através tanto da taxa de
uma reação (indução) quanto da introdução de um aumento do fluxo no início de uma rota
metabólica (pulso de substrato), ou outro método, se propagará através do ponto de bifurcação
e continuará através da rota metabólica. Após a determinação dos parâmetros chaves no
controle de fluxo é necessário então implementar essas mudanças, que serão mais efetivas
quando direcionadas à obtenção de um determinado objetivo.
Engenharia metabólica é um campo multidisciplinar, onde a bioquímica prove a base
das rotas metabólicas e valiosas informações sobre os mecanismos das reações bioquímicas,
como também sobre estequiometria, cinética e regulação. Genética e biologia molecular
fornecem as ferramentas aplicadas na construção da base genética, um importante passo no
estudo de controle de fluxo. A fisiologia celular promove uma maior integração na visão das
funções celulares metabólicas, através da definição da plataforma para estudo de taxas de
reações e representação dos estados fisiológicos. Finalmente, a engenharia química é o mais
apropriado caminho para aplicação de uma visão de engenharia no estudo de sistemas
biológicos. De uma maneira geral, esta visão introduz os conceitos de integração,
quantificação e relevância no estudo de sistemas biológicos (Stephanopoulos; Aristidou;
Nielsen, 1998). Mais especificamente, fornece as ferramentas e experiências para análise dos
sistemas onde as condições de processos são limitadas, um campo no qual a engenharia
química tem contribuído fortemente e frequentemente se superado.
2.2. Análise de fluxos metabólicos
Os fluxos metabólicos são um determinante fundamental da fisiologia celular,
basicamente por fornecer uma medida de grau de engajamento entre as várias rotas
metabólicas, do ponto de vista das funções celulares e de processos metabólicos. Uma
quantificação precisa da magnitude dos fluxos metabólicos in vivo é, entretanto, um
importante objetivo para fisiologia celular e para engenharia metabólica, especialmente no
contexto de produção de metabólito, onde o objetivo é converter o máximo de substrato
possível em metabólitos de interesse (Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen, 1998).
A análise de fluxo metabólico é uma metodologia eficiente para a obtenção dos fluxos
metabólicos, onde as reações intracelulares são quantificadas a partir de fluxos extracelulares
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 9
utilizando modelos estequiométricos e técnicas de balanço de massa. Um conjunto de medidas
de fluxos extracelulares é utilizado como entrada para os cálculos, geralmente as velocidades
específica de consumo de substrato e formação de produto. Como saída do cálculo de fluxo
tem-se um mapa de fluxos metabólicos mostrando um diagrama das reações bioquímicas
incluídas nos cálculos. A partir de uma estimativa de estado estacionário, obtem-se os fluxos
de cada reação no diagrama. A Figura 2.1 ilustra uma distribuição de fluxos através de uma
rota catabólica em Saccharomyces cerevisiae durante um crescimento anaeróbico. Todos os
fluxos foram calculados a partir de balanços de material ao redor dos metabólitos
intracelulares e das medidas de fluxos dos componentes entre a célula e seu ambiente. Mapas
de fluxos metabólicos, como o mostrado na Figura 2.1, contêm informações úteis sobre a
contribuição das várias rotas para o processo metabólico na utilização de substrato e formação
de produto. Entretanto, o valor real de cada mapa de fluxo metabólico depende das diferenças
de fluxos que são observadas quando os mapas de fluxos, obtidos com diferentes linhagens de
células, ou sob diferentes condições de cultivo, são comparados. Através dessas comparações
pode-se estimar o quanto um impacto genético ou perturbações no ambiente podem interferir
no metabolismo estudado. Como também determinar a importância de uma rota ou de reações
específicas para um determinado propósito.
Figura 2.1. Fluxos através de diferentes rotas metabólicas de Saccharomyces cerevisiae
durante um cultivo anaeróbico (Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen, 1998, p. 310).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 10
A análise de fluxos metabólicos ainda fornece várias informações adicionais, tais como:
Identificação dos controles dos pontos de bifurcação (nós rígidos) – É possível
determinar e definir a flexibilidade ou rigidez dos pontos de bifurcação através da comparação
dos fluxos em diferentes condições operacionais, como também, com diferentes linhagens ou
mutantes. O conhecimento dessas características da rede metabólica é de extrema importância
na determinação do tipo de mudanças que serão mais eficientes para alterar o rendimento do
produto desejado.
Identificação de rotas metabólicas alternativas – A formulação da estequiometria das
reações, base da AFM, requer um conhecimento detalhado da rota bioquímica, pela qual os
substratos são convertidos em produtos. Isso, entretanto, pode não está definido para muitos
micro-organismos, uma vez que várias rotas alternativas têm sido identificadas em diferentes
micro-organismos e sob diferentes condições. A AFM é importante na identificação das rotas
que podem reproduzir as medidas macroscópicas de fluxos dos metabólitos extracelulares,
como também, na eliminação de rotas alternativas que não são possíveis por virtude de suas
inabilidades para satisfazer os balanços de material.
Cálculo de fluxos extracelulares não medidos – Algumas vezes, o número de fluxos
extracelulares que podem ser medidos é menor que o necessário para calcular os fluxos
desconhecidos. Neste caso, um número infinito de soluções existe para a rede metabólica de
fluxos. É possível obter tais fluxos usando programação linear.
Cálculo dos máximos rendimentos teóricos – O cálculo de rendimentos teóricos é
baseado na estequiometria da rede metabólica configurada para o máximo rendimento de um
produto a partir de um substrato específico. A razão de fluxo pode ser fixada tanto para
maximizar a formação do produto como para restringir o uso de um metabólito intermediário.
O cálculo de rendimento teórico fornece uma referência para o processo real e pode também
identificar rotas alternativas como atrativas propostas para uma determinada aplicação.
Adicionalmente, fornece marcadores de atividade metabólica sob condições de máximo
rendimento que podem ser úteis na obtenção de uma ótima estratégia de controle.
Um aspecto particular da AFM é que a determinação estequiométrica de fluxos
metabólicos intracelulares pode ser baseada tanto em números iguais, quanto maiores ou
menores de balanços de material, dependendo do número de medidas disponíveis. No
primeiro caso não há redundância. Entretanto, com um maior número de medidas disponíveis,
é possível validar o processo. Se poucas medidas estiverem disponíveis, restrições de
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 11
otimização devem ser introduzidas para completar as equações. É aqui que entra os conceitos
de sistema determinado, indeterminado e superdeterminado.
2.2.1. Conceitos básicos para AFM
2.2.1.1. Modelagem metabólica
A modelagem matemática é uma potente ferramenta para interpretação e predição de
processos naturais e seus correspondentes dados experimentais. Uma vez que a maioria dos
processos naturais é complexa, existe uma tendência para simplicar esses processos impondo
algumas suposições. Entretanto, vários modelos podem ser impostos para o mesmo processo
dependendo das suposições feitas. Entre os processos naturais, o metabolismo de células vivas
é um exemplo de um processo complexo, onde uma rede, altamente interconectada, de
reações bioquímicas governa as funções celulares, e o metabolismo celular é sujeito a
mecanismos de controle e regulação. Muitos trabalhos vêm sendo realizados com o objetivo
de elucidar esses mecanismos, mas ainda são baseados em algumas simplificações (Gombert
& Nielsen, 2000).
2.2.1.2. Estequiometria das reações celulares - Formulação matemática
No desenvolvimento do modelo de uma rede de reações bioquímicas envolvidas no
metabolismo de células, considera-se uma rede de J reações estequiométricas, envolvendo K
metabólitos intracelulares, descrevendo como N substratos são convertidos em M produtos
metabólicos e Q constituíntes da biomassa. Baseado nisso, o balanço de massa para j-ésima
reação celular pode ser descrito como na Equação 1.
0
1
,
1
,
11
=Χ+Χ++
∑∑∑∑
====
K
i
imetji
Q
i
imacroji
M
i
iji
N
i
iji
gPS
γβα
(
1)
Onde S é substrato, P é produto extracelular, X
macro
é um constituinte da biomassa e X
met
se refere as K rotas intermediárias. Os coeficientes estequiométricos são representados por
α
,
β
,
γ
e g respectivamente, os subscritos i se refere a cada substrato, produto ou metabólito e os
subscritos j as reações.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 12
Um modelo metabólico é composto por um conjunto de reações contendo uma Equação
(1) para cada J reação celular. Por isso, é conveniente escrever a estequiometria para todas as
reações celulares de uma forma compacta usando a notação de matriz (Equação 2).
0
=
Χ
+
ΓΧ
+
Β
+
Α
metmacro
GPS
(2)
Onde
Α
,
Β
,
Γ
e G são matrizes estequiométricas contendo coeficientes estequiométricos
das J reações para os substratos, produtos metabólicos, constituintes da biomassa e rotas
intermediárias representados pelos vetores S, P, X
macro
e X
met
respectivamente.
Onde:
T
Kmetmetmet
T
Qmacromacromacro
T
M
T
N
XXX
XXX
PPP
SSS
],...,[
],...,[
],...[
],...[
,1,
,1,
1
1
=
=
=
=
Existem algumas simplificações na definição das reações metabólicas. Apenas os
metabólitos intracelulares dos pontos de bifurcação são incluídos no conjunto de reações. As
reações das rotas lineares, entre os pontos de bifurcação, não são incluídas uma vez que todas
essas reações ocorrem na mesma velocidade no estado estacionário. Todos os metabólitos, ao
longo de uma rota linear, devem ser colocados juntos numa reação global para aquela rota
linear. Devem ser incluídos todos os substratos e produtos no conjunto de reações. Os
reagentes têm coeficientes estequiométricos com sinais negativos e os produtos com sinais
positivos. Os conjuntos de cofatores (ex.: ATP/ADP, NAD
+
/NADH, NADP
+
/NADPH) estão
diretamente relacionados, com isso não é necessário considerar ambos. Em todos os casos
apenas um cofator de cada par é considerado no conjunto de reações.
2.2.1.3. Velocidades de reação
A estequiometria define a relação entre os componentes produzidos ou consumidos em
cada J reação intracelular, mas não permite o cálculo das taxas (velocidades) ou da quantidade
relativa na qual os produtos extracelulares são excretados no meio. Para construir um modelo
amplo, abrangente para o metabolismo celular, é necessária a introdução das taxas
(velocidades) das reações individuais, as quais são de grande importância para a AFM. A taxa
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 13
de reação é geralmente expressa por unidade de mol.h
-1
. Nas reações celulares geralmente
introduz-se a biomassa como referência para definir a então chamada velocidade específica, a
qual tem a unidade mol.g célula seca
-1
.h
-1
.
A velocidade específica de consumo do i-ésimo substrato é o somatório de suas
velocidades de consumo em todas as J reações e é representada pela Equação 3.
∑
=
−=
J
j
jjiis
r
1
,
να
(3)
Onde o subscrito
j
se refere a cada reação na rede metabólica e
ν
j
a velocidade da
j
-
ésima reação na rede.
Similarmente, a velocidade específica de formação de
i-ésimo
produto metabólico é
dada pela Equação 4.
∑
=
=
J
j
jjiip
r
1
,
νβ
(4)
Os constituintes da biomassa e os metabólitos intracelulares podem ser descritos pelas
Equações 5 e 6.
∑
=
=
J
j
jjiimacro
r
1
,
νγ
(5)
∑
=
=
J
j
jjiimet
gr
1
,
ν
(6)
Essas velocidades não são tão fáceis de determinar experimentalmente quanto as
velocicades específicas de consumo de substrato e formação de produto. As velocidades nas
Equações 5 e 6 são a resultante da diferença entre as velocidades de consumo e de produção
de um dado composto em todas as
J
reações intracelulares. Essa diferença pode ser
quantificada através das medidas dos componentes intracelulares.
As Equações de 3 a 6 podem ser formuladas na forma matricial (Equações 7 a 10).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 14
vr
T
s
Α−=
(7)
vr
T
p
Β=
(8)
vr
T
macro
Γ=
(9)
vGr
T
met
=
(10)
Onde o vetor da velocidade específica r
s
contém N velocidades específicas de consumo
de substrato, r
p
as M velocidades específicas de formação de produto, etc.
Esse amplo modelo de reações celulares é usado para executar a análise de fluxo
metabólico (Mavituna; Munoz; Lima Lobato, 2008).
2.2.1.4. Dinâmica do balanço de massa
As velocidades de consumo de substrato e formação de produto podem ser obtidas
experimentalmente pelas medidas de concentrações de substratos e de produtos metabólicos.
Para isso é necessário considerar a dinâmica do biorreator onde as medidas foram obtidas. Os
reatores podem ser operados em diferentes modos, os três mais comuns são: descontínuos ou
batelada, contínuos e descontínuos alimentados.
A dinâmica de balanço de massa para o i-ésimo substrato é dada pela Equação 11.
Substrato acumulado = - taxa de consumo de substrato + taxa de adição de substrato –
taxa de remoção de substrato.
)(
,,,
,
is
f
isis
is
ccDxr
dt
dc
−+−= (11)
Onde c
s,i
é a concentração do i-ésimo substrato no biorreator (mol.L
-1
), c
f
s,i
é a
concentração do i-ésimo substrato na alimentação (mol.L
-1
), r
s,i
é a velocidade específica de
consumo do i-ésimo substrato, x é a concentração de biomassa (g célula seca.L
-1
), e D é a
vazão específica de alimentação (h
-1
), na qual para um reator descontínuo é zero e para o
contínuo e descontínuo alimentado repetitivo (quando a estratégia é alimentação em intervalos
de tempo) é dado pela relação F/V.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 15
Similarmente a dinâmica de balanço de massa para os produtos metabólicos é dada pela
Equação 12.
)(
,,,
,
ip
f
ipip
ip
ccDxr
dt
dc
−+= (12)
Para os constituintes da biomassa normalmente usa-se biomassa como referência, isto é,
as concentrações são dadas com biomassa como base. Nesse caso, o balanço de massa é dado
pela Equação 13.
imacroimacro
imacro
r
dt
d
,,
,
Χ−=
Χ
µ
(13)
Onde X
macro,i
é a concentração do i-ésimo constituinte da biomassa e
µ
é a velocidade
específica de crescimento celular (h
-1
).
Apesar do uso de diferentes unidades para a concentração dos metabólitos
intracelulares, biomassa é ainda a base para o balanço de massa desses metabólitos, conforme
pode ser visto na Equação 14.
imetimet
imet
cr
dt
dc
,,
,
µ
−= (14)
Onde c
met,i
é a concentraçãodo i-ésimo metabólito intracelular.
As Equações 11 a 14 descrevem o balanço de massa para os quatro diferentes tipos de
espécies consideradas na estequiometria celular. Esses balanços de massa formam a base para
qualquer tipo de tratamento quantitativo de processo de cultivo celular, do cálculo das
velocidades específicas ao planejamento e simulação de bioprocessos. Para planejamento e
simulação de bioprocessos, é necessário incluir expressões específicas de cinética para as
velocidades de reações em ν, ou seja, fornecer relações funcionais entre as velocidades de
reação e as variáveis do sistema. A combinação das equações estequiométricas com as
expressões cinéticas para as velocidades de reação constitui um modelo cinético. No caso da
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 16
análise de fluxos metabólicos, retorna-se a questão de como usar os dados experimentais para
determinar as velocidades específicas para cada metabólito e constituintes da biomassa.
A Tabela 2.1 mostra diferentes equações usadas para calcular as velocidades específicas
de consumo de substrato, formação de produtos metabólicos, e o conjunto dos componentes
formadores da biomassa (tanto para constituintes da biomassa quanto para metabólitos
intracelulares) em biorreatores sob diferentes modos de operação.
Tabela 2.1. Equações usadas para cálculo das velocidades específicas a partir de dados
experimentais (Stephanopoulos; Aristidou; Nielsen, 1998, pg. 101).
Biorreator Substrato Produtos metabólicos Espécies intracelulares*
Batelada ou
descontínuo
dt
dc
x
r
s
s
1
−=
dt
dc
x
r
p
p
1
=
macro
macro
macro
dt
d
r Χ+
Χ
=
µ
Contínuo
Condições
dinâmicas
Estado
estacionário
( )
−−=
dt
dc
ccD
x
r
s
s
f
ss
1
(
)
s
f
ss
ccD
x
r −=
1
+=
dt
dc
Dc
x
r
p
pp
1
pp
Dc
x
r
1
=
macro
macro
macro
dt
d
r Χ+
Χ
=
µ
macromacro
r Χ=
µ
Descontínuo
alimentado
repetitivo
( )
−−=
dt
dc
ccD
x
r
s
s
f
ss
1
+=
dt
dc
Dc
x
r
p
f
pp
1
macro
macro
macro
dt
d
r Χ+
Χ
=
µ
*Para as espécies intracelulares, apenas foram apresentadas as equações para os constituintes.
As equações para os metabólitos intracelulares são similares.
Pode-se observar pela Tabela 2.1, que com exceção dos biorreatores contínuos no
estado estacionário, a determinação das velocidades específicas requer cálculos de tempos de
derivadas das concentrações. Esse tempo derivativo pode ser obtido pelo gráfico da tangente
da curva das medidas de concentração. Entretanto, uma boa estimativa dos tempos derivativos
é difícil de obter por essa aproximação uma vez que os dados são geralmente espaçados e com
ruídos. Baseado nisso, torna-se claro a vantagem de cultivos contínuos no estado estacionário,
onde podem ser obtidas estimativas precisas de velocidades específicas. No entanto, mais
informações da fisiologia celular são obtidas por cultivos em batelada e cultivos contínuos em
condições dinâmicas. Nesses experimentos, é importante aplicar procedimentos robustos na
obtenção de informações para o cálculo das velocidades específicas.
Outra estimativa é através de uma representação dos dados por uma função, um ajuste
polinomial, por exemplo, através do qual podem se calcular as derivadas e as velocidades
específicas. Essa estimativa também gera uma larga flutuação nas velocidades específicas,
uma vez que é muito difícil encontrar uma função para representar os dados de um cultivo
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 17
experimental. Isso se deve a fase exponencial da maioria dos processos celulares, na qual
ajustes polinomiais não são bem aceitos para representação. Uma melhor estimativa
especialmente para cultivos em batelada é o uso de um modelo cinético simples, como o de
Monod (1949).
Os procedimentos para estimar uma representação funcional de dados experimentais são
aplicados nos casos onde dados suficientes estão disponíveis. Entretanto, os componentes
intracelulares são medidos espaçadamente, tornando-se difícil a obtenção de boas estimativas
das derivadas de tempo. Geralmente para metabólitos intracelulares a hipótese de estado
estacionário pode ser aplicada. Em adição, durante a fase de crescimento exponencial nos
cultivos em batelada, a composição da biomassa intracelular não sofre alteração, ou seja, a
concentração dos constituintes da biomassa fica em estado estacionário, e os elementos de
r
macro
podem ser determinados apenas por uma ou poucas medidas de composição
macromolecular e uma boa estimativa da velocidade específica de crescimento.
2.2.1.5. Construção da rede de reações estequiométricas – Balanço
metabólico
Baseado na Equação 14 pode-se construir uma rede de reações estequiométricas como
ponto de partida para AFM. Iniciando pelo balanço de massa da rota metabólica K,
representada pelas J reações intracelulares, Equação 15.
metmet
met
r
dt
d
Χ−=
Χ
µ
(15)
Onde
X
met
é o vetor para os metabólitos intracelulares (ou rotas intermediárias), e
r
met
é
um vetor contendo o conjunto das velocidades de formação de metabólitos intracelulares nas
J
reações.
Admitindo que exista uma alta regeneração da maioria dos metabólitos, suas
concentrações rapidamente se ajustam aos novos níveis, fazendo com que a hipótese de estado
pseudo-estacionário seja aplicável. Isso implica que não há acumulação de metabólito, ou
seja, que o primeiro termo da Equação 15 seja igual a zero tornando-se:
metmet
r
Χ−=
µ
0 (16)
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 18
O primeiro termo do lado direito da Equação 16 representa o conjunto das velocidades
de síntese da via intermediária das J reações, ou seja, o resumo dos fluxos de entrada e saída
de uma rota metabólica. O segundo termo descreve a diluição do conjunto de metabólitos
devido ao crescimento da biomassa. No entanto, devido ao baixo nível intracelular da maioria
dos metabólitos, tais efeitos de diluição são considerados muito pequenos se comparados com
os fluxos que afetam os mesmos metabólitos. Isso faz com que o segundo termo do lado
direito da Equação 16 seja desprezado. As velocidades de síntese de cada reação podem ser
decompostas como o produto da transposta da matriz estequiométrica e o vetor de todas as
taxas de reação, baseado na Equação 10. Logo, chega-se ao seguinte balanço simplificado
representado pela Equação 17.
vGr
T
met
==0
(17)
A Equação 17 é a base para a AFM e representa K balanços algébricos lineares para K
metabólitos com J fluxos desconhecidos. Onde G
T
representa a transposta da matriz dos
coeficientes estequiométricos, chamada matriz estequiométrica, e ν representa o vetor dos
fluxos de cada reação. Como o número de reações (J) é sempre maior que o número de
metabólitos da via (K), existe sempre certo grau de liberdade no conjunto de equações
algébricas dado por F = J - K. Portanto, para solução do sistema, alguns elementos de ν
devem ser medidos ou conhecidos para que o sistema seja determinado. Se exatamente F
fluxos são medidos, o sistema torna-se determinado e a solução é única. Caso o número de
fluxos medidos seja superior a F, o sistema é superdeterminado, significando que existem
equações extras que podem ser usadas para testar a consistência dos balanços globais. No
entanto, se o número de fluxos medidos é inferior a F, o sistema é subdeterminado, e os
fluxos desconhecidos podem ser apenas determinados se restrições adicionais forem
introduzidas ou se um critério de otimização global for imposto aos balanços metabólicos
(Mavituna; Munoz; Lima Lobato, 2008).
Em um sistema determinado, pode-se obter os fluxos desconhecidos fragmentando a
Equação 17 na Equação 18.
c
T
cm
T
m
T
vGvGvG +==0
(18)
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 19
Onde os índices m e c representam os fluxos medidos e os que se deseja calcular,
respectivamente. Uma vez que F é exatamente igual aos fluxos medidos (sistema
determinado), G
c
é uma matriz quadrada (dimensões K x K) e, portanto, inversível. Os
elementos de ν
c
podem então ser obtidos pela Equação 19.
(
)
m
T
m
T
cc
vGGv
1−
−=
(19)
A Equação 19 mostra os resultados obtidos quando as K equações algébricas lineares
são resolvidas usando notação matricial. Um requerimento para uma única solução é que o
conjunto de equações algébricas seja linearmente independente.
Para os sistemas superdeterminados, a matrix G
c
T
não é quadrática, ou seja, não pode
ser invertida. Com isso a solução para Equação 19 pode ser obtida pelo uso da pseudo-inversa
de Moore-Penrose (Equação 20).
(
)
(
)
c
T
cc
T
c
GGGG
1# −
=
(20)
Onde (G
c
T
)
#
é a pseudo inversa de G
c
T
.
Desta forma a Equação 19 torna-se a Equação 21.
(
)
m
T
m
T
cc
vGGv
#
−=
(21)
A Equação 20 é de grande utilidade quando há um pequeno nível de ruído nas medidas.
Ela representa a estimativa de mínimos quadrados para os fluxos não medidos sob a condição
que os resíduos dos ruídos medidos estão uniformemente distribuídos no sistema, ou seja, que
está estabelecido um balanço pseudo-estacionário para os metabólitos intracelulares.
Entretanto, se um ruído significante estiver presente em apenas alguns fluxos medidos, a
solução da Equação 21 não pode satisfazer o príncipio de conservação dos fluxos e, portanto,
ao balanço de massa de alguns nós. Uma forma tradicional de resolver o problema é fazer
uma reconciliação estatística das medidas. A reconciliação estatística das medidas usa
ferramentas de estatística para que os valores experimentais se adaptem melhor aos balanços
de massa propostos, isto é, os dados experimentais são melhorados.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 20
No caso dos sistemas subdeterminados, onde o número de fluxos medidos é menor que
o grau de liberdade do sistema, existe um número infinito de soluções para a rede de fluxos.
Nesse caso, a programação linear pode ser usada para determinar a distribuição dos fluxos
intracelulares, onde uma função objetivo deve ser introduzida ao sistema (como por exemplo,
maximização da velocidade específica de crescimento celular). Com isso, é possível obter
uma única solução para os fluxos intracelulares pela otimização da função objetivo.
2.2.1.6. Programação linear
A programação linear (PL) é uma ferramenta poderosa de modelagem matemática.
Trata-se de uma técnica de otimização com aplicações amplas e diversificadas em nível de
problemas reais. Desde que o método Simplex foi desenvolvido por George B. Dantzig em
1947 (Gill et al., 2008) a programação linear tem sido extensivamente usada em muitos
campos como planejamento militar, industrial e governamental (Bazaraa; Jarvis; Sherali,
1990). A popularidade da programação linear pode ser atribuída ao fato de poder modelar
problemas grandes e complexos e resolvê-los em um espaço de tempo razoável pelo uso de
um algorítmo eficaz. Embora o termo programação não signifique codificação de computador,
quase todos os problemas práticos solucionados por PL necessitam de implementação
computacional, uma vez que um grande número de equações está envolvido.
A tarefa de PL consiste na maximização ou minimização de uma função linear,
denominada função objetivo, respeitando-se um sistema linear de igualdades ou desiqualdades
que recebem o nome de restrições do modelo. As restrições representam normalmente
limitações de recursos disponíveis ou, então, exigências e condições que devem ser cumpridas
no problema. Essas restrições do modelo determinam uma região denominada de conjunto de
soluções viáveis. A melhor das soluções viáveis, isto é, aquela que maximiza ou minimiza a
função objetivo denomina-se solução ótima. O objetivo da programação linear consiste na
determinação da solução ótima (Bregalda; Oliveira; Bornstein, 1988).
Dois passos são fundamentalmente necessários para a resolução de um problema de PL.
O primeiro passo é a modelagem do problema e o segundo é o método de solução. No caso do
problema de PL, o método mais usado é o Simplex.
Para que o Simplex seja aplicado, é fundamental reduzir o problema de PL à forma-
padrão definida pela Equação 22.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 21
Cada problema de PL consiste em variáveis, equações e desigualdades. A Equação 22
representa um problema de programação linear com r variáveis, r inequações de
desigualdades não-negativas, m inequações de iqualdades, e (p-m) inequações de
desigualdades, onde p é a somatória das inequações de igualdades e desigualdades. A primeira
equação representa a função objetivo, os três últimos conjuntos de equações são as restrições.
Maximize
∑
=
==
r
i
T
ii
xcxcxf
1
)(
Sujeito a
∑
=
=
r
i
jiji
bxa
1
para j = 1,...,m
(22)
e
∑
=
≥
r
i
jiji
bxa
1
para j = m + 1,...,p
e 0
≥
i
x para i = 1,..., r
A solução de um problema de PL deve satisfazer tanto as equações e as desigualdades
quanto obter um extremo da função objetivo. Uma característica de PL é que uma solução
ótima pode não corresponder à realidade de algumas restrições ou da combinação de várias
restrições.
As restrições de igualdades, desigualdades e condições de não negatividades podem ser
representadas por um conjunto de hiperplanos e semi-planos que vão determinar um conjunto
de pontos do espaço denominado de conjunto de soluções viáveis. A função objetivo também
pode ser representada por um conjunto de hiperplanos paralelos entre si. A cada ponto do
conjunto de soluções viáveis está associado, um e somente um hiperplano da função objetivo.
Graficamente, o problema de PL consiste em encontrar, dentre o conjunto de soluções viáveis,
o ponto pelo qual passe um hiperplano da função objetivo que otimize o valor de f(x) a ele
associado. A solução ótima do problema de PL encontra-se sempre em um vértice ou ponto
extremo do gráfico. Cabe, portanto, procurar o vértice que otimize a função objetivo.
O método simplex é um método interativo (algorítmo) utilizado para obter,
algebricamente, a solução ótima de um problema de PL. Baseia-se no fato que o ótimo da
função objetivo é sempre alcançado no vértice da região de soluções viáveis. Dantzig (1963)
desenvolveu esse método através de interações, que gera soluções viáveis básicas cada vez
melhores, até obter a solução ótima.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 22
2.3. Streptomyces olindensis
2.3.1. Streptomycetes
Streptomycetes são micro-organismos unicelulares com a capacidade de produção de
uma grande variedade de produtos naturais complexos, os quais são de extrema importância
particularmente para a indústria farmacêutica como também para agricultura e indústria
alimentícia (Naeimpoor, 2001).
2.3.1.1. Histórico de Streptomycetes
Waksman, Rutgers State University nos Estados Unidos, foi o primeiro a introduzir, em
meados dos anos 40, Streptomycetes num programa sistemático de seleção para novos
antibióticos. Desde que os Actinomycetes atraíram a atenção de muitos pesquisadores para a
produção de novos antibióticos, milhões de Actinomycetes foram isolados e selecionados em
pesquisas de laboratório. Com o aumento de conhecimentos dos aspectos microbiológicos e
bioquímicos, micro-organismos produtores de antibiótico e suas propriedades, no final dos
anos 60, melhoraram qualitativamente o programa de seleção de cepas. Mais tarde, durante os
anos 70 e 80, a introdução de métodos como mutassíntese, fusão celular e manipulação
genética, como também suas aplicações especialmente em Streptomycetes, facilitaram a
descoberta de novos antibióticos.
Nos anos 50 muitos trabalhos foram desenvolvidos com relação aos aspectos genéticos
de Streptomycetes, os quais estão ligados com a compreensão do seu complexo ciclo de vida,
e com a produção de um grande número de produtos naturais ou secundários dessa família de
micro-organismos. Dentre esses trabalhos pode-se mencionar o de Hopwood e seu grupo no
John Innes Institute (Norwich, Inglaterra) com Streptomyces coelicolor A3(2). Essa espécie
tem sido considerada como um micro-organismo modelo e muitos trabalhos foram
desenvolvidos com relação aos aspectos genéticos (Hopwood, 1999). Recentemente, o
metabolismo primário de Streptomycetes foi revisado com foco no metabolismo de carbono e
nitrogênio e seus controles (Hopwood, 1999; Hodgson, 2000).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 23
2.3.1.2. Características
A família dos Streptomycetes faz parte da ordem dos Actinomycetales. Formam um
grupo especial de bactérias filamentosas. São eubactérias Gram-positivas com alta
porcentagem (69-78%) de guanosina e citosina em seus DNA, portanto com uma maior
estabilidade genética (Hodgson, 2000). São obrigatoriamente quimiorganotróficos (utilizam a
fonte de carbono como fonte de energia) e a oxidação final de suas fontes de carbono é
através de condições aeróbicas (Piepersberg, 1993). São provenientes dos Sporoactinomycetes
e apresentam um desenvolvimento do ciclo de vida complexo, formam divisões filamentosas
imóveis na rede celular (micélio) crescendo em cima e dentro de seus substratos,
diferenciando do micélio aéreo e desenvolvendo várias formas de cadeias de artrosporos por
fragmentação de uma hifa aérea (Piepersberg, 1993).
Streptomycetes são classificados como quimioheterotróficos e são geralmente capazes
de crescer em meio composto de sais inorgânicos e glicose (Hirsch & McCann-McCormick,
1985). Sua parede celular consiste de uma rede de peptidoglicano ligada por subunidades
peptídicas de L-alanina, L-ácido glutâmico e L-ácido diaminopolimélico ligados por pontes
de glicina. O tipo predominante de fosfolipídio em Streptomyces é o fosfatidiletanolamina
com ácidos graxos do tipo saturados, anteiso- e iso- (Piepersberg, 1993).
A família dos Streptomycetes é constituída de quatro gêneros: Streptomyces,
Intrasporangium, Kineosporia e Streptoverticillium (Hodgson, 2000) onde Streptomyces tem
sido o mais estudado.
2.3.1.3. Ecologia
O principal habitat de Streptomyces é o solo. Podendo também ocorrer em água fresca,
ambientes marinhos e no ar. Streptomycetes preferem solos com umidade moderada. Solos
muito secos inibem seu crescimento. É interessante notar que o número total de
Streptomycetes na população microbiana, encontrada no solo, pode aumentar de 1-20% em
condições normais, em 70% em solos secos ou até 98% sob condições muito severas de seca
(Hirsch & McCann-McCormick, 1985). Acredita-se que a resistência dos Streptomycetes a
dessecação é devido as suas habilidades na formação de esporos.
As plantas são as principais fontes de nutrientes no solo, então o solo pode ser
considerado um ambiente pobre em nutrientes ou oligotrófico (Morita, 1993; Hodgson, 2000).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 24
O solo é, apesar de rico em carboidratos, relativamente pobre em nitrogênio e fosfato. Com
isso, os Streptomycetes, embora existam em um nível muito baixo, têm que competir com
outros organismos do solo para dispor dos nutrientes. Acredita-se que as bactérias do solo
provavelmente desenvolvem várias estratégias de sobrevivência sob condições de estresse
como a limitação de nutrientes e a flutuação na disponibilidade de nutrientes durante o ano no
ambiente terrestre. Dentre essas estratégias está: um ciclo de vida complexo, a capacidade de
formação de esporos e a indução a proteínas específicas para mudar a fisiologia celular
(Kjelleberg, 1993).
2.3.1.4. Crescimento
Streptomycetes tem um saprofítico ciclo de vida no solo onde precisam excretar enzimas
para digerir polímeros insolúveis como nutrientes e consumir os monômeros para a
biossíntese de constituintes de biomassa (Hodgson, 2000). Como esse processo consome
tempo e também libera uma alta concentração de enzimas digestivas. Acredita-se que um
número de micróbios, como Actinomycetes e fungos filamentosos, têm promovido a formação
do micélio de substrato para resolver esse problema. Esse micélio imóvel está vinculado com
a alta concentração de enzimas digestivas na matriz alimentícia e isso gera uma alta
concentração de produtos digestivos disponíveis para o crescimento celular. Uma
desvantagem desse habitat de crescimento micelar é a exaustão de nutrientes, pois não
existem caminhos de acesso a novos nutrientes levando a morte celular. Actinomycetes vêm
resolvendo esse problema através de fragmentação do pseudo-micélio no final da colônia de
crescimento e pelo desenvolvimento da mobilidade ou imobilidade dos esporos.
Streptomycetes spp. sintetiza esporos no final de seu ciclo de vida a partir de um micélio aéreo
sobreposto ao micélio de substrato.
2.3.1.5. Streptomyces olindensis
Várias linhagens de Streptomyces foram isoladas, na década de 60, pelo departamento
de antibiótico da Universidade Federal de Pernambuco visando identificar linhagens com
potencial capacidade antitumoral. Dentre as linhagens isoladas pode-se citar S. olindensis
DAUFPE 5622 produtora de um complexo policetônico denominado retamicina (Lima et al.,
1969), o qual tem como seu maior constituinte a cosmomicina D (Furlan et al., 2004, Garrido
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 25
et al., 2006). Dentre as características morfológicas desse micro-organismo destaca-se a
esporulação e a pigmentação violeta do micélio, como conseqüência da síntese do antibiótico
e excreção deste para o meio de cultivo. Com o objetivo de aumentar a produtividade em
retamicina, o Laboratório de Genética de Micro-organismos do Instituto de Ciências
Biomédicas da USP (ICB-USP) desenvolveu uma cepa mutante de Streptomyces olindensis,
denominada inicialmente de So20 e posteriormente de ICB20, obtida pela mutagênese
química da linhagem selvagem através da utilização de metil-metano-sulfonato. Essa cepa
apresentou uma produtividade em retamicina significantemente superior à linhagem selvagem
(DAUFPE 5622), em cultivos em incubador rotativo, diferenciando morfologicamente pela
perda da capacidade de esporulação (Furlan, 1997).
2.3.2. Antibióticos e Streptomycetes
2.3.2.1. Produção de antibiótico
Os antibióticos fazem parte do maior grupo de metabólitos secundários. São geralmente
produzidos naturalmente por fungos e Streptomycetes que sobrevivem em circunstâncias
quando a deficiência de fontes de carbono e nutrientes é detectada. O primeiro antibiótico,
penicilina, foi descoberto em 1929 por Sir Alexander Fleming que observou a inibição de
Staphylococci, numa placa de ágar contaminada por um humo de Penicillium. No início dos
anos 40, devido à necessidade de agentes bactericidas durante a segunda guerra mundial,
penicilina foi isolada, purificada e injetada em animais, onde se encontrou não apenas a cura
de infecções, mas também baixa toxicidade nos animais. Esse fato está ligado com uma
procura intensa por agentes antibactericidas similares de baixa toxicidade para animais e que
devem ser úteis em tratamentos de doenças infecciosas. Streptomicina, cloranfenicol e
tetraciclina, além de outros antibióticos, foram rapidamente isolados e usados clinicamente
nos anos 50.
Um grande número de antibióticos tem sido produzido por alguns micro-organismos
industriais incluíndo Penicillium, Cephalosporium, Bacillus e Actinomycetes. A espécie
Streptomyces é a mais versátil e comercialmente importante produtora de antibióticos. A
Tabela 2.2 lista alguns antibióticos produzidos por Streptomyces.
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 26
Tabela 2.2. Tipos de antibióticos produzidos por Streptomyces.
Tipo Antibióticos
Macrólido Tilosina, Eritromicina
Polipeptídeo Actinorodina, Tetracenomicina e Oxitetraciclina, Cosmomicina
Aminoglicosídeo Streptomicina
β-Lactam (β-Lactano)
Penicilina, Cepamicina, Oxipenem, Carbapenema e Nocardicina
Outros antibióticos Metilenomicina, Undercilprodigiosina, Bialafos, Cloranfenicol e
Actinomicina D
A produção de antibióticos em bactérias sempre ocorre após a fase exponencial de
crescimento celular. Argumenta-se que as poucas células presentes no início do crescimento
produzem um nível de inibição do antibiótico na fase inicial, onde as fontes são direcionadas
mais para a produção de biomassa do que para a produção de antibiótico (Chater & Bibb,
1997). Por outro lado, em competição pela fonte nutricional, essa produção deve gerar
conflito com a necessidade de rápido crescimento. Além disso, numa densidade populacional
relativamente alta, uma produção efetiva do antibiótico pode ser obtida a partir de uma porção
pequena da população. Assim, informações da densidade populacional ou viabilidade
nutricional devem ser observadas, interpretadas e usadas pelas células para ativar as vias
metabólicas específicas e relevantes na biossíntese de antibiótico. Streptomycetes cultivados
em meio líquido, geralmente, produzem antibióticos durante a fase estacionária ou em baixas
taxas de crescimento. Neste caso, é possível verificar a produção de antibiótico pelas células
no interior dos pellets micelares, onde a fonte nutricional está limitada, levando as células a
entrarem na fase estacionária.
A produção de antibiótico em Streptomycetes pode ser afetada adversamente pela
quantidade de certos metabólitos como glicose, amônia e fosfato inorgânico. Apesar disso, os
mecanismos básicos são geralmente desconhecidos. Mecanismos de repressão aparentemente
estão envolvidos como a repressão de glicose na produção de actinomicina por S. antibioticus,
a repressão por fosfato na biossíntese de candicina e actinorodina por S. griseus e S.
coelicolor, respectivamente (Chater & Bibb, 1997). Entretanto, não existe um modelo geral
uma vez que diferentes metabólitos secundários utilizam diferentes nutrientes como
precursores.
Na última década, notáveis progressos têm sido feito em análise molecular para
produção de antibiótico por Streptomycetes, principalmente em duas espécies modelos,
Streptomyces griseus, a produtora de streptomicina, e Streptomyces coelicolor A3(2), a
linhagem mais estudada geneticamente. A maioria dos antibióticos produzidos por
Streptomycetes são geralmente antibióticos polipeptídeos, os quais são sintetizados pela
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 27
condensação de unidades de ácido carboxílico. Esse grupo de antibióticos tem atraído a
atenção de pesquisadores devido ao seu pontencial no uso das síntases polipeptídicas (PKSs –
Polyketide Synthases) engenheiradas geneticamente e por produzir, racionalmente, novos
polipeptídeos pela biossíntese combinatória de bancos de dados de moléculas síntéticas
(MacDaniel et al., 1994; Khosla, 1997; Hopwood, 1999; Stachelhaus; Schneider; Marahiel,
1996).
2.3.2.1.1. Antibióticos polipeptídicos
Polipeptídeos são uma grande família de produtos naturais, diversamente estruturados,
com uma extensa faixa de atividades biológicas (McDaniel et al., 1994) e são produzidos
predominantemente por Streptomyces. As polipeptídeos sintases (PKSs) são grandes enzimas
multifuncionais que estão relacionadas mecanicamente e estruturalmente com a ácido graxo
síntase (AGS). A AGS agrega longas cadeias por sucessivas condensações descarboxilativas
de ácidos carboxílico simples com ceto-redução, desidratação e enoil-redução depois da
maioria ou de todos os passos de condensação. Entretanto, na formação do polipeptídeo,
alguns passos de redução são omitidos. Depois da construção da cadeia polipeptídea, os
intermediários submetidos à ação enzimática e as reações químicas de redução, ciclização,
amortização, desidratação e uma variedade de modificações pós-formação conduzem a um
largo espectro de estruturas químicas. Dois diferentes mecanismos foram encontrados para o
controle da especificidade de polipeptídeo. Em um, a sintase promove a separação dos
conjuntos de sítios ativos para cada ciclo de condensação e redução, onde a estrutura do
produto é determinada por um número e pelo arranjamento dos sítios ativos. No outro, cada
sintase contém um simples conjunto de sítios ativos usados interativamente para todos os
ciclos de redução e condensação (McDaniel et al., 1994). Esse último é representado pelo
actinomyceto PKSs para polipeptídeos aromáticos.
Existem dois tipos de polipeptídeos. Os polipeptídeos do tipo I são complexos e são
geralmente construídos com uma vasta série de diferentes unidades de extensão enquanto que
os do tipo II são relativamente simples, construídos com uma série limitada de unidades de
extensão e contém anéis aromáticos. Os polipeptídeos aromáticos naturais, incluíndo as
benzoisocromanoquinonas (actinorodina), antraciclinas (daunomicina) e tetraciclinas são
produzidos por polipeptídeos do tipo II e aparentemente têm similares modos de formação
(Strohl & Connors, 1992).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 28
2.3.2.1.2. Antibiótico produzido por Streptomyces olindensis
Streptomyces olindensis produz um complexo de antibióticos chamado retamicina que
tem como seu maior constituinte a cosmomicina. A cosmomicina é um antibiótico
antitumoral, da classe das antraciclina, que se apresenta sob a forma de um pó vermelho,
pouco solúvel em água e solúvel em álcoois (metanol, etanol, n-propanol e n-butanol),
acetona e clorofórmio, sendo constituído de uma mistura de glicosídeos e antraciclinonas
(Lima et al., 1969; Pamboukian, 2003; Inoue, 2006). Possui forte poder de inibição de
bactérias Gram-positivas, com menor ação sobre as negativas.
As cosmomicinas (Figura 2.2) fazem parte de um grupo muito interessante de
compostos uma vez que apresentam um dos mais complexos modelos de glicolização
encontrados nas antraciclinas, com duas cadeias de trissacarídeos ligadas nos carbonos 7 e 10
(Miyamoto et al., 2002). Inicialmente foi proposto que retamicina consistia de uma aglicona
γ-rodomicinona com um trissacarídeo ligada ao carbono 10 (Bieber et al., 1989). Entretanto,
mais recentemente, foi verificado que alguns dos componentes do complexo retamicina têm a
mesma estrutura de algumas cosmomicinas (Furlan et al., 2004).
A cosmomicina é um antibiótico policetônico aromático e faz parte da família das
antraciclinas. É uma potente droga antitumoral similar a doxorubicina e a daunorubicina. A
sua estrutura consiste de uma tetraciclina aglicona (γ-rodomicinona) e seis deoxi-açúcares
(duas moléculas de 2-L-deoxi-fucose, duas de L-rodosamina e duas de L-rodinose). A
estrutura polipeptída, tetraciclina aglicona, é obtida pela condensação de um propionil-CoA
com 9 acetatos derivados de malonil-CoA devido a ação de um grupo de enzimas conhecido
como policetídeo sintase mínima (minimal PKS). Os açúcares deste tipo de compostos são
derivados de glicose 1-fosfato (Garrido et al., 2006; Lombó et al., 1997).
Uma das interessantes características estruturais da cosmomicina é a existência de uma
cadeia trissacarídea ligada ao carbono 10 da aglicona. Esses carbonos da aglicona não são tão
frequentemente glicosilado como o do carbono 7. O isolamento das glicosiltransferases
promove a ação no carbono 10 da aglicona podendo aumentar a possibilidade de gerar novas
antraciclinas com um novo modelo de glicosilação pela biossíntese combinatória (Garrido et
al.,2006; Lombó et al., 1997).
Aspectos Teóricos
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 29
Figura 2.2. Estrutura química da cosmomicina produzida por Streptomyces olindensis (A) e as
estruturas referente à parte cetônica (B) e aos açúcares polipeptídicos (C, D e E).
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
H
O
O
H
O
H
O
O
O
H
O
C
H
3
R2
O
H
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3
N
C
H
3
C
H
3
N
C
H
3
C
H
3
R1
A
C
D
E
B
Capítulo 3
Estado da Arte
Estado da Arte
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 31
3. ESTADO DA ARTE
3.1. Análise de fluxos metabólicos
A análise de fluxos metabólicos (AFM) é uma metodologia usada para determinação
dos fluxos metabólicos, geralmente em termos de velocidade específica de reação, através de
um modelo estequiométrico das reações celulares usando balanço de massa para metabólitos
intracelulares. A determinação dos fluxos contribui para o conhecimento dos diferentes
caminhos metabólicos e especialmente para o consumo de substrato e formação de produto. A
comparação de diferentes distribuições de fluxos metabólicos pode mostrar o efeito de
diferentes condições genéticas e ambientais e pode indicar estratégias para seleção do meio,
linhagem e aumento da eficiência da formação do produto requerido (Takaç et al., 1998).
Os primeiros trabalhos que fizeram uso de um modelo estequiométrico para a
interpretação de dados experimentais datam de décadas passadas (Aiba & Matsuoka, 1979;
Papoutsakis & Meyer, 1985). No entanto, somente com o trabalho de Holms (1986), a AFM
foi introduzida como uma técnica de análise do metabolismo e mais tarde, com o trabalho de
Vallino & Stephanopoulos (1990), esta técnica foi sistematizada através do uso de álgebra
linear e cálculo matricial (Gombert, 2001).
No início da década de 90, o rápido avanço das técnicas de biologia molecular e,
principalmente, da tecnologia do DNA recombinante, aumentou muito o espectro de
aplicações desta tecnologia em vários setores da biotecnologia, como por exemplo, no
melhoramento de organismos utilizados na obtenção de produtos de interesse para o homem.
Nesta época, o termo engenharia metabólica foi introduzido por Bailey (1991), que o definiu
da seguinte forma: “engenharia metabólica é o melhoramento das atividades celulares através
da manipulação de funções enzimáticas, de transporte e regulatórias das células, fazendo uso
da tecnologia do DNA recombinante”. Quase na mesma época, Cameron & Tong (1993)
definiram engenharia metabólica como “a modificação racional do metabolismo intermediário
utilizando-se técnicas de DNA recombinante”. Mais recentemente, Stephanopoulos;
Aristidou; Nielsen (1998) propuseram a seguinte definição: “engenharia metabólica é o
melhoramento dirigido da formação de produto ou de propriedades celulares através da
modificação de novas reações fazendo uso da tecnologia do DNA recombinante”. Observa-se
assim que a engenharia metabólica envolve análise e modificação de vias metabólicas e que o
resultado final é sempre o metabolismo modificado com um determinado propósito. Definido
Estado da Arte
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 32
o propósito, deve-se estabelecer as modificações genéticas a serem introduzidas no
organismo. Nesta etapa, é essencial realizar uma análise detalhada do metabolismo, lançando
mão de várias ferramentas analíticas e matemáticas, como por exemplo, a análise de
expressão gênica em termos de mRNA, a medida das concentrações de metabolismo
intracelular, a caracterização de proteínas e a análise de vias metabólicas (Ostergaard; Olsson;
Nielsen, 2000).
Para a análise de vias metabólicas, uma das ferramentas mais eficientes é a análise de
fluxos metabólicos (Nielsen, 1998). A AFM traz informações preciosas sobre o
funcionamento do metabolismo de um organismo numa determinada condição e pode ser
utilizada, em conjunto com outras ferramentas analíticas e matemáticas, para se atingir os
objetivos de engenharia metabólica (Gombert, 2001).
Nissen et al. (1997) desenvolveram um modelo estequiométrico para descrever o
metabolismo anaeróbico de Saccharomyces cerevisiae durante o crescimento no meio
definido. O modelo foi usado para calcular os fluxos intracelulares baseados no consumo de
substrato do meio, na excreção de produtos da célula e na velocidade de formação de
biomassa. Em adição, as medidas de composição de biomassa e da atividade das principais
enzimas foram levadas em consideração nesses cálculos. A rede estequiométrica consistiu de
37 reações metabólicas com 43 componentes dos quais 13 foram medidos experimentalmente
(acetato, CO
2
, etanol, glicose, glicerol, NH
4
+
, piruvato, succinato, carboidratos, DNA,
lipídios, proteínas e RNA). O modelo foi usado para calcular as velocidades de produção do
malato e fumarato e o etanol medido foi usado para validar o modelo. Todas as velocidades
medidas foram obtidas a partir de cultivos contínuos com limitação de glicose em biorreatores
de alto desempenho. O balanço de carbono fechou com 98%. Os cálculos compreendem a
distribuição de fluxos nas velocidades específicas de crescimento celular 0,10 e 0,30 h
-1
.
Compararam os fluxos através das reações localizadas ao redor dos pontos de bifurcação do
metabolismo, isto é, entre a divisão das vias pentose fosfato e Embden-Meyerhoff-Parnas. O
modelo também foi usado para mostrar a provável existência de um canal de redução através
da membrana mitocondrial consistindo de reações catalisadas pela mitocôndria e pela
desidrogenase citosólica. Concluiram que a desidrogenase isocitrato citosólica provavelmente
não está presente durante o crescimento em glicose. A importância da análise de fluxos
baseada em medidas precisas foi demostrada através da análise de sensibilidade. Verificaram
que a precisão nas medidas de CO
2
, etanol, glicose, glicerol e proteína foram cruciais para o
cálculo correto da distribuição de fluxos.
Estado da Arte
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 33
Takaç et al. (1998) propuseram uma rede metabólica para uma bactéria ácido glutâmica
a qual foi usada como base estequiométrica no modelo de balanço de fluxos para produção de
L-glutamato. As rotas metabólicas teóricas ligadas a otimização da produção de glutamato
foram determinadas para várias velocidades específicas de crescimento celular onde foram
obtidas as variações de fluxos. As análises extracelulares obtidas pela fermentação em
batelada de Brevibacterium flavum mostraram a acumulação de argenina, aspartato, lisina,
alanina, prolina, lactato, cetoglutarato, succinato, piruvato e gluconato no meio com adição de
glutamato. A distribuição de fluxos metabólicos na célula durante a fermentação foi
determinada usando o modelo em combinação com os dados experimentais dos metabólitos
extracelulares analisados. Os mapas de distribuição de fluxos mostraram que as células
utilizaram parcialmente o ciclo de Krebs e que a rota do glioxilato foi ativada durante a
fermentação. Os resultados também indicaram a importância de via pentose fosfato na
produção do glutamato.
Naeimpoor (2001) utilizou análise de fluxos metabólicos para estudar o metabolismo de
Streptomyces coelicolor. Nesse trabalho, uma rede de reações bioquímicas foi construída
baseada em dados da literatura. Um modelo metabólico foi prosposto e resolvido via
programação linear por definição de uma função objetivo, onde os fluxos internos e os fluxos
externos, não medidos experimentalmente, foram calculados. Foi investigado o efeito de
vários parâmetros do modelo na distribuição dos fluxos.
Rossa et al. (2002) analisaram o metabolismo do carbono no crescimento de
Streptomyces lividans e na produção dos antibióticos, actinorodina e undecilprodigiosina sob
limitações de fosfato em cultivos contínuos. Aplicaram análise de fluxos, com base num
modelo estequiométrico, para analisar a relação entre a produção do antibiótico, a acumulação
de biomassa, e a distribuição do fluxo de carbono através da maioria das rotas metabólicas
(via Embden-Meyerhoff-Parnas e Pentose fosfato). Verificaram que a distribuição de fluxos
nessas rotas através das vias catabólicas depende tanto da velocidade de crescimento quando
da fonte de carbono (glicose ou gluconato) usada. O aumento da velocidade de crescimento
promove um aumento no fluxo de carbono através da glicólise e da via de pentose fosfato. A
síntese dos antibióticos, tanto de actinorodina quando de undecilprodigiosina, mostraram-se
inversamente proporcional ao fluxo através da via de pentose fosfato.
Pitkänen et al. (2003) estudaram o metabolismo de xilose de uma linhagem de
Saccharomyces cerevisiae super expressando xilose redutase e xilitol desidrogenase de Pichia
stipitis como também a endogeno xilulokinase. A influência de xilose no metabolismo foi
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examinada em níveis baixos de glicose com ênfase em dois potenciais gargalos: requerimento
de cofator e consumo de xilose. Verificaram, pela análise de fluxos metabólicos em cultivos
contínuos, mudanças no metabolismo central devido ao desbalanceamento de cofator devido
aos dois passos da reação de oxirredução de xilose para xilulose. A comparação entre os
cultivos onde utilizaram uma mistura de xilose e glicose como fonte de carbono e cultivos
com apenas glicose revelaram que o fluxo de NADPH a partir de glicose-6-fosfato para
ribulose-5-fosfato foi quase 10 vezes maior quando se utilizou a mistura xilose-glicose que
quando se utilizou apenas glicose. Como consequência os fluxos do ciclo do ácido cítrico
foram reduzidos cerca de 60%. Como o nível de glicose diminuiu para 0,1 g/L os fluxos de
piruvato e do ciclo do ácido cítrico foram reduzidos em 30% e 20%, respectivamente. Os
resultados a partir das medidas do consumo de xilose in vitro e in vivo mostraram que a maior
velocidade específica de consumo de xilose foi obtida utilizando baixos níveis de glicose, 0,1
g/L.
Kim et al. (2004) construiram uma rede metabólica com mais de 400 reações para o
metabolismo primário e secundário de Streptomyces coelicolor e usaram análise de fluxos
metabólicos para investigar alguns fatores que afetam o crescimento celular e a produção de
CDA (calcium dependent antibiotic). Os resultados computacionais indicaram que a produção
de CDA é concomitante com o crescimento. As velocidades específicas de crescimento
computacional foram duas vezes maiores que as velocidades específicas de crescimento
experimental. A distribuição de fluxos metabólicos e a análise de sensibilidade computacional
para várias fases de uma cultura em batelada indicaram que a velocidade específica de
produção de CDA foi afetada pela assimilação de nitrogênio, pela via pentose fosfato, pela
biossíntese de shikimato, e pelos fluxos de oxoglutarato. Consequentemente, essas indicações
foram testadas usando deleções genéticas no modelo, com as quais aumentaram a velocidade
específica de produção de CDA in silico.
Sanchez; Bennett; San (2006) analisaram extensivamente os fluxos metabólicos de
várias linhagens mutantes de Escherichia coli super expressando a piruvato carboxilase de
Lactococcus lactis para a produção de succinato. Nesse estudo, uma análise de redistribuição
de fluxos metabólicos para uma biblioteca de mutantes foi realizado e as diferenças entre os
fluxos dessas linhagens foram comparadas, incluíndo as bifurcações dos principais nós
resultado dessas pertubações genéticas, com o objetivo de elucidar a importância da
fermentação e da rota glioxilato na produção de succinato. Um modelo estequiométrico
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levando em conta a rota glioxilato e restrição de NADH foi implementado com sucesso para
estimar os fluxos intracelulares em várias linhagens produtoras de succinato.
Mendes (2006) desenvolveu e utilizou um pacote de engenharia metabólica para o
MATLAB (ME Toolbox), que integra a maioria das ferramentas e cálculos em análise de
fluxos metabólicos e análise de controle metabólico. Essa ferramenta foi utilizada para
produzir hidrogênio por Clostridium butyricum e para produzir violaceína por
Chromobacterium violaceum. Foi realizada a análise de fluxos metabólicos da bactéria
Clostridium butyricum crescendo em glicose e glicerol, onde foi possível verificar a
sensibilidade das vias metabólicas e comparar os meios de cultura. A análise de fluxos
metabólicos forneceu resultados que indicaram uma rota alternativa pela deleção do gene
produtor da enzima glicerol desidratase. A deleção dessa enzima combinado com a
alimentação com glicerol foi a melhor estratégia para obtenção de uma Clostridium super-
produtora de hidrogênio. A análise de fluxo metabólico para produção de violaceína por
Chromobacterium violaceum indicou que o caminho mais eficiente para mutação genética
seria inibir o gene responsável para produção de isoleucina.
McKinlay & Vieille (2007) utilizaram a análise de fluxos metabólicos para determinar
como os fluxos intermediários em Actinobacillus succinogenes respondem as perturbações de
CO
2
e H
2
. A análise de fluxos foi realizada em cultivos em batelada sob duas diferentes
concentrações de NaHCO
3
, com e sem H
2
, usando uma mistura de [l-
13
C]glicose, [U-
13
C]glicose e NaHCO
3
. A. Succinogenes responde a altas concentrações de CO
2
e H
2
produzindo mais succinato e menos formato, acetato e etanol. Observaram, em todas as
condições estudadas, mudanças nos fluxos através das enzimas málica e/ou oxaloacetato
descarboxilase. Altas concentrações de NaHCO
3
diminui o fluxo de produção de succinato
aumentando a produção de formato, acetato e etanol. Em adição, o fluxo de carboxilação de
piruvato aumenta em altas concentrações de NaHCO
3
. De um modo geral, essas mudanças
nos fluxos metabólicos permitem A. Succinogenes manter constante a velocidade de
crescimento e o rendimento em biomassa em todas as condições.
Oh et al. (2008) construiram um modelo de fluxos metabólicos, baseado em dados
experimentais e em banco de dados, para simular o metabolismo de Citrobacter amalonaticus
Y19 com o objetivo de elucidar a rota metabólica do carbono relacionada com a produção de
hidrogênio. A análise de fluxos metabólicos mostrou que, quando a velocidade específica de
crescimento celular foi definida com função objetivo, o modelo metabólico proposto previu o
fenótipo da cepa estudada durante a produção de hidrogênio. A AFM também indicou que é
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possível obter um fator de conversão de glicose à hidrogênio até cerca de 8,7
molH
2
/molGlicose quando o metabolismo da glicose é direcionado para a via das pentose
fosfato e o NADP
+
ligado a hidrogenase é utilizado na produção de hidrogênio. Nesse estudo
eles definem um limite máximo para produção de hidrogênio numa fermentação microbiana e
sugere um direcionamento para engenharia metabólica em micro-organismos usados para
produção hidrogênio.
Wierchx et al. (2009) utilizaram análise de fluxos metabólicos para observar os efeitos
fisiológicos que mudanças genéticas e transcriptacionais podem causar no metabolismo de
Pseudomonas putida S12. Análises transcriptômicas e genômicas de P. putida S12TPL3
indicaram que mudanças nos genes relacionados ao metabolismo do fosfoenil piruvato,
piruvato e ciclo de Krebs foram introduzidas durante a otimização da produção de fenol em P.
putida S12. Com o objetivo de avaliar as mudanças que essa mutação promoveu no
metabolismo primário dessa cepa fizeram análise com
13
C baseado em análise de fluxos
metabólicos para as cepas S12TPL3 e S12JNNmcs(t). Através da análise de fluxos
metabólicos verificaram mudanças no metabolismo que não foram detectadas pela análise de
transcriptoma. Confirmando assim a importância da interação da análise de fluxos
metabólicos com a análise transcriptômica para obter uma visão mais completa do
metabolismo celular.
3.2. Produção de cosmomicina
A cosmomicina mostrou-se eficaz na inibição de neoplasias como carcino-sarcoma de
Walker 256 e sarcoma de Yoshida, inibindo entre 76% a 79% o desenvolvimento desses tipos
de tumores (Lima et al.,1969; Cotias; Santana; Pinto, 1971; Garrido et al., 2006; Pamboukian,
2003). Apesar de uma possível menor toxidade em relação às antraciclinas atualmente
utilizadas (daunorrubicina e doxorrubicina) alguns efeitos colaterais, como arritmias, foram
observados em estudos realizados com ratos (Cotias; Santana; Pinto, 1971; Garrido et al.,
2006; Pamboukian, 2003). Esses resultados levaram a estudos preliminares do uso de
retamicina em pacientes portadores de leucemias agudas mostrando que, na maioria dos
casos, houve uma regressão nos sintomas e uma melhoria no estado geral dos pacientes.
Porém, este antitumoral apresentou elevada citotoxicidade (Asfora; Santana; Lima, 1972),
confirmando os dados obtidos por Cotias; Santana; Pinto (1971). Posteriormente, Lima et al.
(1992) estudaram os efeitos de citoxicidade e a ação antitumoral do complexo retamicina.
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Bieber et al. (1989) foram os primeiros a determinarem a estrutura dos maiores
constituintes do complexo retamicina. Os dois maiores constituintes E1 e E2 foram isolados
do complexo retamicina. Verificaram que ambos são derivados de γ-rhodomicinona e ligados
glicosilicamente a rodosamina. O constituinte E1 contem duas moléculas de rodinose e o E2
uma de rodinose e outra de desoxifucose. A composição, a sequência e os detalhes
estereoquímicos foram determinados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear
(RMN) e espectrometria de massa com bombardeamento por átomos rápidos (FAB). Os
constituintes E1 e E2 mostraram ser idênticos com cosmomicina A e B.
Na década de 1990 foram retomados os estudos com o complexo retamicina no
Laboratório de Genética de Micro-organismos do Instituto de Ciências Biomédicas da USP
(ICB-USP), com a obtenção de uma cepa mutante capaz de produzir o metabólito secundário
em maior quantidade e apresentando maior estabilidade genética, denominada Streptomyces
olindensis ICB20 (Furlan, 1997). A partir de 1998 iniciaram-se estudos com a cepa mutante
para produção da retamicina em biorreatores no Laboratório de Engenharia Bioquímica do
Departamento de Engenharia Química da Escola Politécnica da USP.
Pamboukian; Guimarães; Facciotti
(2002) aplicaram técnicas de análise de imagens
para caracterizar morfologicamente Streptomyces olindensis em culturas submersas. A
morfologia foi diferenciada em quatro classes: pellets, aglomerados (clumps), hifas
ramificadas e hifas não ramificadas, essa classificação foi baseadas em suas dimensões
(perímetro e perímetro convexo). Verificaram que o critério de classificação morfológica
proposto pela análise de imagem foi aceitável para classificar a porcentagem de cada classe
morfológica durante a fermentação. A análise de imagens mostrou ser uma potente ferramenta
para classificar a morfologia durante cultivos de micro-organismos filamentosos e
correlacionar a produção de antibiótico com a morfologia do micro-organismo. Em 2003,
Pamboukian verificou que o cisalhamento mostrou-se um importante fator no rompimento de
pellets e na formação de clumps e hifas livres, principalmente nos ensaios contínuos, e que, a
maior produção do antibiótico esteve associada a altas porcentagens de clumps no meio de
cultivo.
Giudici; Pamboukian; Facciotti (2003) propuseram um modelo matemático
estruturado morfologicamente para descrever as tendências no crescimento da biomassa, no
consumo de substrato e na produção do antitumoral retamicina durante cultivos em batelada e
batelada alimentada de Streptomyces olindensis. Os filamentos de biomassa são estruturados
em três compartimentos morfológicos (apical, subapical e hifal), e a produção de retamicina
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assumiram está no compartimento subapical da célula. O modelo descreve o efeito da fonte de
glicose como também a fonte complexa de nitrogênio, tanto no crescimento celular como na
produção de retamicina. Dados experimentais de cultivos em batelada e batelada alimentada
foram usados para estimar alguns parâmetros para regressão não-linear. O modelo mostrou
uma boa descrição quantitativa da produção de retamicina, biomassa e glicose residual, tanto
em cultivos em batelada quanto em batelada alimentada e em alguns cultivos contínuo.
Concluíram que o modelo pode ser útil em estudos de processo de otimização e controle.
Pinheiro (2003) comparou a linhagem selvagem de Streptomyces olindensis DAUFPE
5622 e a linhagem mutante Streptomyces olindensis So20, ambas produtoras do complexo
retamicina. Determinou a cinética de crescimento celular das etapas de pré-inóculo e de
inóculo para a linhagem selvagem S. olindensis DAUFPE 5622 em ensaios em incubador
rotativo. Posteriormente, realizou cultivos descontínuos em biorreatores com o objetivo de
estudar a influência de diferentes condições de preparo do inóculo e de transferência de
oxigênio. Posteriormente, realizou cultivos contínuos aplicando-se diferentes condições, entre
elas a que se apresentou como a mais favorável para a produção da retamicina pela linhagem
mutante S. olindensis So20. A produção de retamicina observada no cultivo contínuo com a
linhagem selvagem foi aproximadamente seis vezes menor do que a produção obtida para a
linhagem mutante S. olindensis So20 sob as mesmas condições de cultivo.
Esmanhoto & Kilikian (2004) aplicaram sistema de duas fases aquosas na extração de
retamicina, rubropunctamina e monoascorubramina de culturas de Streptomyces olindensis e
Monascus purpureus. O sistema de duas fases aquosas separa inicialmente pequenas
moléculas hidrofóbicas dos micro-organismos filamentosos. O objetivo desse trabalho foi
oferecer uma alternativa para o método tradicional de purificação de antraciclinas através da
extração em solventes orgânicos e clarificação do meio eliminando os passos de centrifugação
e filtração. Os resultados foram analisados com base no coeficiente de partição de pigmentos
vermelhos e no coeficiente de partição e rendimento de retamicina para o meio de cultura de
M. purpureus sp. e S. olindensis So20, respectivamente. O sistema PEG/fosfato mostrou-se
hábil na extração de retamicina e de pigmentos vermelhos para a fase PEG enquanto que os
micro-organismos filamentosos - S. olindensis e M. Purpureus – se depositam na fase salina.
Guimarães et al. (2004) investigaram o efeito do pH no crescimento celular e na
produção de retamicina em cultivos em batelada de Streptomyces olindensis ICB20. Foram
realizadas fermentações numa faixa de pH entre 6,0 – 8,0. Verificaram que a maior produção
Estado da Arte
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de retamicina, em termos de absorbância, foi obtida no pH 7,0. Esse valor foi superior em 43,
58 e 232% em relação aos obtidos com o pH 7,5, 6,0 e 8,0, respectivamente.
Pamboukian & Facciotti (2004) correlacionaram a produção de retamicina com a
vazão específica de alimentação em cultivos contínuos de Streptomyces olindensis.
Verificaram que a máxima produção de retamicina foi obtida a uma vazão específica de
alimentação de 0,05 h
-1
, enquanto que altas vazões específicas de alimentação diminuem a
produção de antibiótico, a qual cessa completamente na vazão específica de alimentação 0,30
h
-1
. Baseados na análise de imagem verificaram que a morfologia também foi influenciada
pela vazão específica de alimentação. A porcentagem de clumps diminui com o aumento da
vazão específica de alimentação, com um correspondente aumento na porcentagem de pellets.
Martins et al. (2004) estudaram o efeito de dois diferentes modos de controle da
concentração de oxigênio dissolvidos (COD) no crescimento celular e na produção de
retamicina por Streptomyces olindensis So20. Os resultados obtidos revelaram que o controle
da COD em 5% de saturação durante a fase de produção não afetou a produção de retamicina.
Entretanto ao controlar a COD em 100% de saturação durante a fase de crescimento celular
veririfaram uma inibição do crescimento celular e um aumento na produção de retamicina.
Garrido et al. (2006) reportaram a clonagem e sequenciamento de um fragmento de
DNA de 14 kb de Streptomyces olindensis contendo 13 genes envolvidos na biossíntese de
cosmomicina. Dois desses genes, cosG e cosK, codificados pela glicosiltransferase foram
inativados com a geração de cinco novos derivados. A elucidação estrutural desses compostos
mostraram alterações na glicosilação indicando a capacidade de ambas glicosiltransferases de
transferir desoxiaçúcares para ambos os lados da aglicona e a flexibilidade de cosK com
respeito ao desoxiaçúcar doador. Um modelo foi proposto para os passos de glicosilação
durante a biossíntese de cosmomicina.
Inoue et al. (2007) estudaram a influência de diferentes concentrações de glicose no
meio de alimentação sobre a produção de retamicina. Cultivos contínuos variando a
concentração de glicose entre 10 e 25 g/L mostraram que o uso de elevadas concentrações de
glicose resultou na repressão catabólica da biossíntese do antitumoral. A maior velocidade
específica de produção de retamicina, µ
RTM
= 7,8 mg/g.h, foi obtida quando a concentração de
glicose foi de 10 g/L. O menor valor de µ
RTM
, 2,5 mg/g.h, foi observado quando a
concentração de glicose foi de 20 e 25 g/L. A concentração de glicose residual aumentou de 0
a 13 g/L conforme a concentração de glicose na alimentação foi incrementada de 10 a 25 g/L.
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Costa; Taqueda; Facciotti (2007) estudaram, simultaneamente, a influência da
velocidade de agitação, concentração de oxigênio dissolvido e da velocidade específica de
crescimento celular na produção de retamicina por Streptomyces olindensis ICB20 em
cultivos contínuo. Para isso utilizaram um planejamento fatorial com três fatores e dois níveis,
incluíndo seis experimentos no ponto central. Os resultados mostraram que a velocidade
específica de crescimento e a frequência de agitação são as variáveis mais importantes na
faixa estudada seguida da interação dessas duas variáveis. A máxima produção de biomassa
foi à µ
x
= 0,25 h
-1
enquanto que a de retamicina à µ
x
= 0,05 h
-1
. Já a concentração de oxigênio
dissolvido não se mostrou um efeito importante na produção de biomassa assim como na de
retamicina.
Pinheiro & Facciotti (2008) investigaram a produção de retamicina por células
imobilizadas de Streptomyces olindensis ICB20 em biorreatores. O sistema de imobilização
de células utilizou um suporte de alginato de cálcio e foram realizados ensaios em dois tipos
de reatores: tipo cesta e coluna de bolhas. A operação em biorreator tipo cesta em batelada
repetida apresentou os maiores valores de produção de retamicina, entretanto a operação sem
sistema contínuo em biorreator tipo coluna de bolhas mostrou ser o mais adequando por obter
uma maior estabilidade na produção.
Baseado nesses trabalhos publicados verificou-se que nenhum trabalho foi realizado no
ponto de vista de análise de fluxos metabólicos. Sendo este trabalho o primeiro nessa área
utilizando o micro-organismo em questão.
Capítulo 4
Material e Métodos
Materiais e Métodos
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4. MATERIAL E MÉTODOS
Este capítulo está dividido em duas partes: a primeira relativa a parte computacional
abordando a metodologia utilizada na construção do modelo metabólico. E a segunda parte se
refere a parte experimental descrevendo como foi armazenado e cultivado o micro-organismo
em questão como, também, a metodologia analítica que foi seguida para obtenção dos dados
cinéticos.
4.1. Modelagem microbiana
A construção de um modelo metabólico da análise do fluxo em princípio parece ser uma
tarefa simples, exigindo somente as relações estequiométricas da rede bioquímica e as
demandas bioquímicas desta rede. Entretanto, assegurar a consistência do conjunto de
equações escolhidas e do cálculo das taxas não é tão simples assim (Daae & Ison, 1999). O
primeiro problema geralmente encontrado quando se constrói uma rede de reações é o
aparecimento de reações dependentes. Essas reações podem gerar uma indeterminação no
modelo. Quando a dependência é encontrada, as equações de balanço devem ser redefinidas
de tal maneira que a dependência seja removida e que o sistema continue bioquimicamente
correto. Após obter o conjunto de reações estequiometricamente independentes, o número
mínimo de taxas (variáveis) que precisam ser medidas (conhecidas) para solucionar esse
conjunto de equações pode ser calculado baseado na matriz estequiométrica (Noorman;
Heijnen; Luyben, 1991; Noorman et al., 1996). Entretanto, é necessário fazer a escolha das
taxas que devem ser quantificadas para que seja possível resolver esse conjunto de equações.
Após ter definido e classificado a estequiometria desejada, geralmente prossegue-se para a
análise de fluxos metabólicos.
De uma forma simplificada a metodologia utilizada para modelagem microbiana está
ilustrada no fluxograma da Figura 4.1.
Materiais e Métodos
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Figura 4.1. Passos para promover a análise de fluxos metabólicos.
•
Catabolismo central do carbono
• Metabolismo de aminoácidos
• Metabolismo de nucleotídeos
• Metabolismo do nitrogênio
• Metabolismo do enxofre
• Transferência de uma unidade de carbono
• Metabolismo de lipídios
• Formação de biomassa
• Respiração
• Produto secundário
Streptomyces olindensis ICB20
Micro-organismo
Rotas metabólicas
Balanço químico
Reversibilidade das reações
Co-fatores
Composição da biomassa
Estequiometrica
Termodinâmica
Fisiológica
Suposições
Distribuição dos fluxos metabólicos
Visualização gráfica
Análise de Fluxos Metabólicos
Modelo metabólico
Restrições
Modelo de otimização
Tax
a
s positivas
Irreversibilidade
Pseudo-estado
estacionário
0
1
,,
≥=
∑
=
J
j
iijip
r
νβ
0≥
j
v
0
1
,,
==
∑
=
j
J
j
ijimet
gr
ν
Entrada
Saída
Livros de bioquímica
Banco de dados
Artigos
)()( vrvZ
BIOBio
=
)()( vrvZ
CosCos
=
Função objetivo
Parâmetros experimentais
Materiais e Métodos
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Inicialmente foi feita a escolha do micro-organismo baseada na capacidade de produção
de um complexo antitumoral de importante relevância. Na sequência foram definidas as rotas
metabólicas e escolhidas as reações para representar o metabolismo em estudo. A escolha das
rotas do metabolismo primário baseou-se em dados da literatura, em livros de bioquímica e
em banco de dados (como por exemplo, Kegg) relacionados com o gênero de Streptomycetes.
A escolha dos dados referente ao metabolismo secundário baseou-se no trabalho de Garrido et
al. (2006) de seqüenciamento dos genes envolvidos na síntese de cosmomicina. Baseado na
literatura foram feitas algumas suposições com relação à estequiometria (balanço químico), a
termodinâmica (a questão da reversibilidade das reações) e a fisiologia (com respeito aos co-
fatores utilizados e a composição da biomassa).
A partir desses dados construiu-se um modelo metabólico baseado em 245 equações
estequiométricas e no balanço de massa. Para solucionar esse sistema de equações utilizou-se
um modelo de otimização que utiliza a ferramenta matemática de programação linear. Para
isso foi necessário direcionar a otimização definindo uma função objetivo e impondo
restrições ao sistema como: inclusão de parâmetros experimentais, imposição de taxas
positivas para os produtos do metabolismo, de fluxos maior ou igual a zero para as reações
irreversíveis e de pseudo-estado estacionário para os metabólitos intracelulares.
Como solução para esse modelo de otimização obteve-se a distribuição dos fluxos
metabólicos. Esses fluxos metabólicos calculados foram transferidos para o mapa de fluxos
construído para serem melhor visualizados e utilizados para a AFM.
4.1.1. Elementos da rede de reações bioquímica
Na construção da rede de reações bioquímicas de Streptomyces olindensis ICB20 as
principais rotas metabólicas, nas quais utilizam a glicose como substrato (fonte de carbono),
foram usadas para a produção de energia livre e da estrutura de carbono necessária para a
síntese dos metabólitos intermediários, blocos de constituintes e produtos finais. Essa rede
inclui a rota catabólica central do carbono, o qual fornece energia e os precursores necessários
na biossíntese de outros metabólitos. Também envolve as rotas biossintéticas dos 20
aminoácidos comuns, nucleotídeos, fosfolipídios e biossíntese de carboidratos. As principais
vias de catabolismo e anabolismo, como também o metabolismo secundário, de Streptomyces
olindensis ICB20, foram consideradas. O metabolismo secundário envolve a biossíntese de
cosmomicina a partir de moléculas de propanoil-coenzima A e malonil-coenzima A. As
Materiais e Métodos
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reações de assimilação de sulfato também estão ligadas ao metabolismo. A Tabela 4.1
apresenta as rotas bioquímicas usadas na construção do modelo metabólico para Streptomyces
olindensis ICB20. A descrição e escolha das reações envolvidas nessas rotas estão
apresentadas no item 4.1.2.
Tabela 4.1. Rotas bioquímicas utilizadas na construção do modelo metabólico de S. olindensis
ICB20.
Grupo de reações Elementos
Catabolismo central do carbono Via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)
Via das pentoses fosfato
Metabolismo do piruvato
Ciclo do ácido tricarboxílico ou ciclo de Krebs
Reações anapleróticas
Biossíntese de materiais de estocagem de
carbono
Metabolismo de aminoácidos Família dos aminoácidos aromáticos
Família dos aminoácidos aspartatos
Família dos aminoácidos de cadeias ramificadas
Família dos aminoácidos glutamato
Biossíntese de alanina
Biossíntese de histidina
Biossíntese de serina e glicina
Aminoácidos contendo enxofre
Metabolismo de nucleotídeos Nucleotídeos pirimidínicos
Nucleotídeos purínicos
Metabolismo do nitrogênio Biossíntese de glutamato e glutamina
Degradação de aminoácidos
Metabolismo de enxofre Reações de assimilação do enxofre
Transferência de uma unidade de carbono Reações de ácido fólico
Metabolismo de lipídios Biossíntese de fosfolipídios
Formação de biomassa Biossíntese de proteínas
Biossíntese de RNA
Biossíntese de DNA
Biossíntese de carboidrato
Biossíntese de biomassa
Respiração Reações de transporte de elétrons
Produto secundário Biossíntese de cosmomicina
4.1.2. Construção da rede metabólica de Streptomyces olindensis
Uma rede metabólica é formada por sequências de reações onde cada uma desenvolve
uma função particular no metabolismo celular. Essas sequências são chamadas de rotas ou
vias metabólicas. O crescimento celular e a formação de produto estão vinculados a várias
rotas que fornecem os precursores necessários ou blocos de constituintes, como aminoácidos,
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deoxiribonucleotídeos e ribonucleotídeos. Apesar das biorreações envolvidas no crescimento
celular geralmente serem similares em todos os organismos, as de formação de produtos
podem variar. Os produtos formados durante o crescimento celular geralmente não são
específicos para cada micro-organismo. Entretanto, outro grupo de produtos chamado de
produtos secundários (ou produtos naturais), formados durante os períodos de baixo ou
nenhum crescimento microbiano, geralmente são específicos para cada micro-organismo. O
metabolismo pode então ser dividido em duas partes: o metabolismo primário e o secundário.
O metabolismo primário inclui o crescimento celular e a parte de formação de produto o qual
é geralmente similar em todos os micro-organismos, enquanto o metabolismo secundário é
específico para cada micro-organismo. Segue a discussão do metabolismo primário das
células bacterianas com foco em Streptomyces e no metabolismo secundário de Streptomyces
olindensis ICB20.
4.1.2.1. Metabolismo: Primário e secundário
O metabolismo primário é definido como “as reações catabólicas e anabólicas que
resultam em um aumento na biomassa” (Hodgson, 2000). O metabolismo primário dos micro-
organismos é geralmente similar, uma vez que os constituintes de todos os organismos vivos
são praticamente idênticos. Essa parte do metabolismo consiste das reações catabólicas
envolvidas com a fonte de carbono, provendo os metabólitos necessários para as outras vias
metabólicas, reduzindo a energia e ATP das reações envolvidas na biossíntese de pequenas
moléculas, como os precursores, co-enzimas e produtos, além das reações envolvidas com a
biossíntese dos blocos de constituintes e macromoléculas, como proteínas, RNA e DNA. O
metabolismo inorgânico também faz parte do metabolismo primário e é responsável pela
conversão dos compostos inorgânicos a fórmulas apropriadas consumidas pela célula.
Em contraste, o metabolismo secundário é a parte do metabolismo que não apresenta
regra geral no desenvolvimento vegetativo dos organismos. O termo metabolismo secundário
foi primeiro usado para descrever a produção de produtos microbianos que estão geralmente
correlacionados com o fim da fase de crescimento e início da fase estacionária. De acordo
com as regras endógenas e exógenas o metabolismo secundário é responsável pelas seguintes
funções (Kleinkauf & Van Dohren, 1997):
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• Facilitar a adaptação dos metabólitos não balanceados como um tipo de válvula
para remover o excesso de metabólitos endógenos tóxicos que podem ser
acumulados durante a limitação de substrato;
• Fornece os blocos de componentes das células ou de metabólitos reversíveis
que garantem a individualidade e particularidade de uma determinada
linhagem;
• Agir como sinal endógeno para iniciar um estágio particular da morfogênesis e
na mudança de materiais genéticos;
• Agir como sinal interespecífico de comunicação entre os micróbios.
Os metabólitos secundários são formados a partir de poucas moléculas agindo como
precursores, como por exemplo, coenzima A, que é derivada de ácidos graxos (acetil-,
propionil-, etc), mevalonato (também derivado do acetil-CoA), aminoácidos, shikimato,
açúcares e nucleosídeos. Esses precursores são também necessários no metabolismo primário
para a formação dos blocos de componentes.
4.1.2.2. Metabolismo de carboidratos
O metabolismo central do carbono é a parte do metabolismo que prove os precursores
para todas as outras rotas metabólicas (White, 1995). A geração de energia, a redução da força
e os precursores necessários para as funções celulares estão relacionados a esse metabolismo.
O seu ponto inicial é a glicose, como fonte de carbono, seguindo pelas três maiores rotas
metabólicas da célula: as rotas Embden-Meyerhof-Parnas (EMP ou glicólise), pentose fosfato
(PP) e Entner-Doudoroff (ED) que são responsáveis pela conversão de glicose à piruvato. A
primeira etapa dessas rotas metabólicas, referente à conversão de glicose a fosfogliceraldeído,
ocorre através de diferentes rotas. O segundo estágio, onde fosfogliceraldeído é convertido a
piruvato, ocorre através das mesmas reações. O piruvato também pode ser convertido tanto
em acetil-CoA, passando pelo ciclo de Krebs onde é oxidado em dióxido de carbono nos
organismos aeróbicos, quanto em produtos finais como alcoóis e ácidos orgânicos através das
rotas fermentativas nos organismos anaeróbicos. Segundo Hodgson (2000), o catabolismo de
glicose na maioria das Streptomyces ocorre nas rotas de Embden-Meyerhof-Parnas e
hexosemonofosfato ou pentose fostato. Entretanto, Hodgson (2000) reporta a presença de
duas enzimas chaves da rota Entner-Doudoroff em espécies de Streptomyces.
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4.1.2.2.1. Glicólise
A glicólise começa com a fosforilação de glicose à glicose-6-fosfato (G6P) através de
uma reação catalisada por glicoquinase (hexoquinase). Posteriormente, a isomerização da
glicose-6-fosfato a frutose-6-fosfato ocorre por ação de uma isomerase seguida de uma nova
fosforilação irreversível catalisada pela 6-fosfofrutoquinase também usando ATP formando
frutose-1,6-bisfosfato (FbP). A FbP é então clivada em gliceraldeído-3-fosfato (PGA3) e
diidroxiacetona fosfato (DHAP) pela ação de aldolase. A isomerização de diidroxiacetona
fosfato pela ação de uma isomerase específica, a triosefosfato isomerase, resulta em outra
molécula de gliceraldeído-3-fosfato, possibilitando que uma molécula de glicose seja
convertida em duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato utilizando duas moléculas de ATP.
Na próxima etapa PGA3 sofre oxidação por difosfoglicerato (DPG) e um NADH é
produzido por mol de PGA3. Trata-se de uma reação de óxido-redução, fosforilação
completa, catalisada pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. O grupo fosfato da ligação
anidrido do difosfoglicerato é suficientemente rico em energia e sofre a ação da enzima
fosfoglicerato quinase na produção de ATP. Fosfoglicerato mutase catalisa a produção de 2-
fosfoglicerato, o qual é então convertido a fosfoenolpiruvato (PEP). A última reação dessa via
metabólica está relacionada a produção de ATP e piruvato e é catalisada pela piruvato quinase
(Nelson & Cox, 2004).
A Tabela 4.2 mostra as reações e enzimas associadas para rota glicolítica considerada na
reconstrução do metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20.
Tabela 4.2. Reações e enzimas envolvidas na via glicolítica.
Reação Enzima
PGADPATPGlc 6
+
→
+
Glicoquinase
PFPG 66
↔
Glicose-6-fosfato isomerase
ADPFbPATPPF
+
→
+
6
6-fosfofrutoquinase
3PGADHAPFbP
+
↔
Frutose 1,6 bisfosfato aldolase
3PGADHAP
↔
Triosefosfato isomerase
NADHDPGPiNADPGA +↔++
+
3
Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
ATPPGADPDPG
+
↔
+
3
Fosfoglicerato quinase
23 PGPG
↔
Fosfoglicerato mutase
PEPPG
↔
2
Enolase
ATPPyrADPPEP
+
→
+
Piruvato quinase
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4.1.2.2.2. Via das pentoses fosfato
A via das pentoses fosfato é uma via alternativa de oxidação da glicose, que leva à
produção de dois compostos importantes: ribose-5-fosfato e a forma reduzida de nicotinamida
adenina dinucleotídio fosfato (NADPH), uma coenzima com estrutura semelhante à do
NADH. A ribose 5-fosfato é a pentose constituinte dos nucleotídeos que compõem os ácidos
nucléicos e de várias coenzimas (NAD
+
, NADP
+
, FAD
+
, coenzima A, ATP, GTP, etc.) O
NADPH atua como enzima doadora de hidrogênio nas sínteses redutoras e nas reações de
proteção contra compostos oxidantes. São ainda produzidos nesta via outros açúcares
fosforilados, com número variável de átomos de carbono (Marzzoco & Torres, 2007).
A via das pentoses fosfato compreende uma etapa inicial, oxidativa, em que a glicose 6-
fosfato sofre descarboxilação, originando uma pentose fosfato (ribulose 5-fostato) e NADPH,
por meio de duas reações de oxidação catalisadas por desidrogenases intercalada por uma
reação de hidrólise. A etapa subsequente, não-oxidativa, constitui um sistema de rearranjos
moleculares, que forma açúcares fosforilados onde a ribulose 5-fosfato é transformada em
ribose 5-fosfato e/ou em xilulose 5-fosfato por ação de uma isomerase e uma epimerase,
respectivamente. Essas pentoses sofrem, a seguir, uma série de conversões, catalisadas por
duas enzimas: a transcetolase, que transfere grupos de dois carbonos e tem tiamina pirofosfato
como grupo prostético, e a transaldolase que transfere grupo de três carbonos. Todas as
reações da etapa não-oxidativa são reversíveis, permitindo a livre interconversão de açúcares.
A Tabela 4.3 mostra as reações e suas respectivas enzimas associadas com a via das
pentoses fosfato consideradas na reconstrução do metabolismo de Streptomyces olindensis
ICB20.
Tabela 4.3. Reações e enzimas envolvidas na via das pentoses fosfato.
Reação Enzima
NADPHPGnNADPPG +→+
+
66
Glicose 6-fosfato desidrogenase;
6-fosfogliconolactonase
256 CONADPHPRuNADPPGn ++→+
+
6-fosfogliconato desidrogenase
PRPRu 55
↔
Ribose5-fosfato isomerase
PXylPRu 55
↔
Ribulose-fosfato 3-epimerase
PSPGAPRPXyl 7355
+
↔
+
Transcetolase
PEPFPSPGA 4673
+
↔
+
Transaldolase
3645 PGAPFPEPXyl
+
↔
+
Transcetolase
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A via das pentoses fosfato e a glicólise, apesar de terem funções diferentes, são
intimamente relacionadas por apresentarem compostos intermediários comuns: glicose 6-
fosfato, frutose 6-fosfato e gliceraldeído 3-fosfato. O compartilhamento de compostos e a
reversibilidade das reações da etapa não-oxidativa da via das pentoses fosfato tornam possível
o direcionamento dos açúcares fosforilados desta via para a glicólise ou vice-versa.
Adicionalmente, as duas etapas podem ser acionadas em separado, o caminho a ser seguido
pela glicose 6-fosfato na via das pentoses fosfato é determinado pelas demandas celulares de
NADPH ou ribose 5-fosfato.
Cochrane (1961) estudou o metabolismo de Streptomyces coelicolor onde encontrou
que as vias de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) e a hexomonofosfato junto com a pentose
fosfato (Hmp) estão ativos na linhagem de S. coelicolor A1A. Obanye et al. (1996) também
estudou essas vias em S. coelicolor A3(2)(A21) e constatou que EMP estava ativa durante o
crescimento exponencial e Hmp tem sua atividade aumentada quando o metabolismo
secundário está ativo (transição entre as fases de crescimento exponencial e estacionária). O
estudo com isótopos indica que a via Hmp tem o metabolismo de glicose quando micélio
enquanto que a via EMP está ativa na germinação de esporos.
Algumas enzimas importantes da via de EMP foram estudas em Streptomyces.
Fosfoglicerato mutase foi purificada e seu gene clonado e sequenciado em S. coelicolor
A3(2)(A21) por White et al. (1992). Outra enzima, fosfofrutoquinase foi estudada em S.
coelicolor por Alves et al. (1997), onde reportaram a dependência enzimática de ATP.
4.1.2.2.3. Metabolismo do Piruvato
O piruvato é um produto comum na maioria das vias catabólicas de carboidrato. Em
condições aeróbicas, o complexo enzimático piruvato desidrogenase, localizado no citossol,
oxida piruvato à acetil-CoA e CO
2
(Tabela 4.4). O piruvato origina acetil-CoA, por
descarboxilação oxidativa. O processo é irreversível e consiste basicamente na transferência
do grupo acetila, proveniente da descarboxilação do piruvato, para a coenzima A.
Tabela 4.4. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo do piruvato.
Reação Enzima
2
CONADHAcCoACoANADPyr ++→++
+
Piruvato desidrogenase;
Didrolipoamide desidrogenase
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4.1.2.2.4. Ciclo de Krebs
O ciclo de Krebs está presente na maioria das bactérias heterotróficas que crescem
aerobicamente. Cochrane (1961) verificou que o ciclo de Krebs é completo em
Streptomycetes e que é de extrema importância por suprir os precursores do metabolismo
secundário. É uma via metabólica multifuncional o qual gera não apenas redução de energia,
mas também precursores requeridos para a síntese de parte dos aminoácidos nas células. As
reações e enzimas do ciclo de Krebs que foram levadas em consideração no metabolismo de
S. olindensis ICB20 estão descrita na Tabela 4.5.
Tabela 4.5. Reações e enzimas envolvidas no ciclo de Krebs.
Reação Enzima
CoACitOAAAcCoA
+
→
+
Citrato sintase
IcitCit
↔
Aconitase hidratase
2
CONADPHOGNADPIcit ++↔+
+
Isocitrato desidrogenase
2
CONADHSucCoACoANADOG ++→++
+
2 oxoglutarato oxidoredutase
CoAATPSucPiADPSucCoA
+
+
↔
+
+
Succinil-CoA sintetase
2
FADHFumFADSuc +↔+
+
Succinato desidrogenase
MalFum
↔
Fumarate hidratase
NADHOAANADMal +↔+
+
Malato desidrogenase
Esse ciclo inicia com a condensação de acetil-CoA e oxaloacetato, formando citrato,
uma reação catalisada pela citrato sintase. O citrato é isomerado a isocitrato, por ação da
aconitase hidratase. A isocitrato desidrogenase promove a oxidação de isocitrato a 2-
oxoglutarato, com redução de NAD
+
e liberação de CO
2
. O 2-oxoglutarato é transformado a
succinil-CoA, graças à atuação da enzima 2 oxoglutarato oxidoredutase. Trata-se de uma
descarboxilação oxidativa e ligação do grupo succinil à coenzima A, esta reação também
libera CO
2
e reduz NAD
+
. A seguir, a succinil-CoA é convertida à succinato pela ação da
enzima succinil-CoA sintetase. Existem várias isoenzimas da succinil-CoA sintetase que
diferem quanto aos organismos onde são expressas e quanto à especificidade para os
nucleotídeos sobre os quais atuam. A succinil-CoA sintetase encontradas nas bactérias
dependendo da espécie considerada pode formar ATP ou GTP, ou ambos. O succinato é
oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, cujo grupo prostético, FAD
+
, é reduzido a
FADH
2
. O fumarato é hidratado a malato pela fumate hidratase. A malato desidrogenase
oxida o malato a oxaloacetato, reduzindo NAD
+
e fechando o ciclo. Como o oxaloacetato é
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sempre regenerado ao final de cada volta, o ciclo de Krebs pode oxidar acetil-CoA
continuamente, sem gasto efetivo de oxaloacetato.
A maioria das reações do ciclo de Krebs é reversível, mas o sentido do ciclo é
determinado pela irreversibilidade das reações catalisadas pela citrato sintase e 2 oxoglutarato
oxidoredutase.
4.1.2.2.5. Reações anapleróticas
Os compostos intermediários do ciclo de Krebs podem ser utilizados como precursores
em vias biosintéticas. A eventual retirada desses intermediários pode ser compensada pelas
reações anapleróticas que permitem restabelecer o seu nível. Para permitir que o ciclo de
Krebs continue e possibilite o micro-organismo crescer em carboidrato, como única fonte de
carbono, deverá ocorrer um processo celular para gerar os intermediários do ciclo de Krebs a
partir do catabolismo de carboidratos.
Muitos Streptomycetes podem crescer em compostos com dois átomos de carbono ou
compostos alinfáticos. Isso indica que as reações anapleróticas estão ativas. Em bactérias,
essas reações incluem a geração de succinato, a produção de malato, a carboxilação de
piruvato ou fosfoenolpiruvato e a formação de oxaloacetato (Naimpoor, 2001).
4.1.2.2.5.1. Ciclo do glioxilato
Nos vegetais, em leveduras e algumas bactérias, encontra-se uma via alternativa de
metabolismo de acetil-CoA, chamada ciclo do glioxilato, que permite a produção de
intermediários do ciclo a partir de acetil-CoA.
Os seis carbonos do isocitrato originam succinato e glioxilato pela ação da isocitrato
liase. O glioxilato condensa-se com o acetil-CoA, produzindo malato, na reação catalisada
pela maltose sintase (Tabela 4.6). O malato, por sua vez, é responsável pela regeneração do
oxaloacetato. A síntese de succinato viabiliza a conversão dos carbonos da acetil-CoA a
glicose, o succinato por ação das enzimas do ciclo de Krebs e da glicogênese, produz glicose.
O ciclo de glioxilato, desta forma, permite obter glicose a partir de acetil-CoA e, portanto, de
ácidos graxos.
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Tabela 4.6. Reações e enzimas específicas do ciclo do glioxilato.
Reação Enzima
SucGlxIcit
+
→
Isocitrato liase
CoAMalAcCoAGlx
+
→
+
Maltose sintase
Para crescer em substratos com dois carbonos ou ácidos graxos como única fonte de
carbono a maioria das bactérias usam o ciclo glioxilato para converter o acetil-CoA a
carboidratos (Huttner; Mecke; Frohlich, 1997). Um grande número de pesquisadores vem
estudando o crescimento de Streptomycetes em fontes de ácidos graxos que podem ser
degradados por compostos com dois átomos de carbono ou compostos alinfáticos (Hodgson,
2000).
4.1.2.2.5.2. Suprimento de oxaloacetato
O ciclo de Krebs necessita de um nível constante de oxaloacetato. Entretanto, se existir
o consumo desse precursor produzido nessa ou em outra via metabólica, será necessário um
suprimento de oxaloacetato para que o ciclo de Krebs continue ativo. As bactérias usam
piruvato e fosfoenolpiruvato para produzir oxaloacetato (Tabela 4.7).
Tabela 4.7. Reações e enzimas envolvidas no suprimento de oxaloacetato.
Reação Enzima
PiADPOAACOATPPyr ++↔++
2
Piruvato carboxilase
PiOAACOPEP +→+
2
Fosfoenolpiruvato carboxilase
A atividade da piruvato carboxilase permite regular a velocidade do ciclo de Krebs, uma
vez que o ajuste da velocidade de consumo de acetil-CoA, nessa via, é feito pela intervenção
da reação catalisada pela piruvato carboxilase. Esta enzima é fortemente ativada pela própria
acetil-CoA. Desta forma, a glicólise é intensa e grande quantidade de piruvato é transformado
em acetil-CoA. O acúmulo desta coenzima ativa a piruvato carboxilase e o piruvato passa a
originar oxaloacetato. Com concentrações concomitantemente altas de oxaloacetato e acetil-
CoA, a reação catalisada pela citrato sintase, que dá início ao ciclo, pode funcionar a altas
velocidades.
A formação de oxaloacetato pela condensação de fosfoenolpiruvato e CO
2
à ácido
oxoloacético e ortofosfato é pela ação da fosfoenolpiruvato carboxilase em Streptomycetes
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(Hodgson, 2000). Dekleva & Strohl (1988) e Bramwell et al. (1993) purificaram essa enzima,
a qual é a maior enzima anaplerótica em S. coelicolor (Hodgson, 2000).
4.1.2.2.5.3. Enzima málica
A enzima málica catalisa a conversão reversível de malato à piruvato pela liberação de
CO
2
e redução de NADP
+
(Tabela 4.8). Em bactéria, essa enzima é geralmente usada para
geração de NADPH na síntese de ácidos graxos (Hodgson, 2000). A atividade dessa enzima
foi observada em S. aureofaciens por Behal; Cudlin; Vanek (1969) apenas durante a fase
exponencial de crescimento, quando a via metabólica de síntese de ácidos graxos estava ativa
(Hodgson, 2000).
Tabela 4.8. Reação da enzima málica.
Reação Enzima
2
CONADPHPyrNADPMal ++↔+
+
Malate desidrogenase
4.1.2.2.5.4. Formação de fosfoenolpiruvato
Uma vez que o fosfoenolpiruvato é precursor para um determinado número de
metabólitos requeridos para o crescimento celular, deve ser biosintetizado quando ácidos
orgânicos como lactose, piruvato, acetato, succinato, malato e aminoácidos são usados para o
crescimento (White, 1995). Existem duas opções para biossíntese de fosfoenolpiruvato: pela
fosforilação de piruvato ou pela descarboxilação do oxaloacetato. Duas enzimas,
fosfoenolpiruvato sintetase e a piruvato-fosfato diquinase, podem atuar na fosforilação de
piruvato. Redman & Hornemann (1980) encontraram piruvato diquinase em S.
murayamaensis e S. verticillatus. Em S. verticillatus, crescendo em meio contendo piruvato e
alanina, essa enzima foi induzida, isso implica que está envolvida na gluconeogênese
(Hodgson, 2000). Foi incluida no modelo a reação anaplerótica descrita na Tabela 4.9 para
formação de fosfoenolpiruvato catalisada pela enzima piruvato-fosfato diquinase.
Tabela 4.9. Reação e enzima envolvida na formação de fosfoenolpiruvato.
Reação Enzima
PpiAMPPEPPiATPPyr
+
+
→
+
+
Piruvato-fosfato diquinase
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4.1.2.2.6. Biossíntese de materiais de estocagem de carbono
Glicogênio e triglicerídeos são moléculas de estocagem de carbono em
Streptomycetes, onde o glicogênio está associado com o desenvolvimento morfológico
(Hodgson, 2000). A maioria dos ácidos graxos sintetizados ou ingeridos pelos micro-
organismos tem dois caminhos a seguir: podem ser incorporados nos triacilgliceróis para a
estocagem de energia ou incorporados nos fosfolipídios como componentes das membranas.
A divisão entre essas duas rotas depende da necessidade do micro-organismo.
4.1.2.2.6.1. Síntese de glicogênio
O glicogênio é um polímero de glicose e constitui uma forma de reserva deste açúcar. A
vantagem biológica de armazenar glicose polimerizada é a redução da osmolaridade,
resultante do menor número de partículas em solução. O glicogênio é sintetizado pela
glicogênese. A síntese consiste na repetida adição de unidades de glicose às extremidades
não-redutoras de um fragmento de glicogênio. A glicose a ser incorporada deve estar sob uma
forma ativada, ligada a um nucleotídeo de adenosina, constituindo adenosina difosfato glicose
(ADP-Glc). Esse é produzido, a partir da glicose, por uma série de reações: isomerização da
glicose 6-fosfato a glicose 1-fosfato pela fosfoglicomutase e reação desse açúcar com ATP
formando ADP-Glc e pirosfosfato, promovida pela ADP-glicose pirofosforilase (Tabela 4.10).
Existem poucas, mas consistentes informações sobre acumulação de glicogênio em
Streptomycetes. Brana; Manzanal; Hardisson (1980, 1982) constataram acumulação de
glicogênio durante o crescimento de S. viridochromogenes (A27). Essas observações foram
confirmadas usando microscopia eletrônica em S. coelicolor A3(2)(A21) (Plaskitt & Chater,
1995).
Tabela 4.10. Reações e enzimas envolvidas na síntese de glicogênio.
Reação Enzima
PGPG 16
→
Fosfoglicomutase
PpiADPGlcATPPG
+
→
+
1
ADP-glicose pirofosforilase
ADPGlcoADPGlc
+
→
ADP-glicose sintase
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4.1.2.2.6.2. Biossíntese e metabolismo de ácidos graxos
A síntese de ácidos graxos consiste na união sequencial de unidades de dois carbonos,
sendo a primeira proveniente de acetil-CoA e as subsequentes, de malonil-CoA. A síntese de
ácidos graxos é catalisada por um sistema enzimático denominado sintase de ácidos graxos.
Faz parte dessa síntese a proteína carregadora de acila ou ACP. A síntese inicia com a
transferência do grupo acetila da acetil-CoA para o ACP, catalisada pela 3-oxoacil-ACP
sintase III. E o grupo malonila da malonil-CoA recebe o ACP formando malonil-ACP, por
ação da ACP S-maloniltransferase. Seguindo de uma condensação dos grupos acetila e
malonila, catalisada pela 3-oxoacil-ACP sintase II, originando um acetoacetil-ACP. Esse β-
cetoacil-ACP de quatro carbonos sofre redução, desidratação e nova redução, catalisadas,
respectivamente, pela 3-oxoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidratase e enoil-ACP
redutase I. As duas redutases usam NADPH como doador de elétrons. Neste ponto, termina o
primeiro ciclo de síntese com a formação de butiril-ACP. Esse ciclo é repetido por mais seis
voltas levando à formação de hexadecanoil-ACP que é reconhecido pela oleoil-ACP
tioesterase que promove a hidrólise liberando o ácido palmítico, o produto mais comum na
síntese de ácidos graxos, conforme pode ser visto na Tabela 4.11 (Marzzoco & Torres, 2007,
www.kegg.com).
Tabela 4.11. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos.
Reação Enzima
CoAAcACPACPAcCoA
+
→
+
3-oxoacil-ACP sintase III
CoAMaACPACPMaCoA
+
→
+
ACP S-maloniltransferase
2
7777
777
CONADNADPACPHexACP
NADHNADPHMaACPAcACP
++++
→
+
+
+
++
3-oxoacil-ACP sintase II,
3-oxoacil-ACP redutase,
3-hidroxiacil-ACP desidratase,
Enoil-ACP redutase I
ACPPalmHexACP
+
→
Oleoil-ACP thioesterase
O gene codificador da enzima 3-oxoacil-ACP sintase III em S. glaucescens foi
superexpressado em E. coli por Han; Lobo; Reynolds (1998). Tais autores sugeriram que essa
enzima é responsável pela iniciação da biossíntese de ácidos graxos em S. glaucescens.
Na degradação, o ácido graxo inicialmente é convertido em uma forma ativada, uma
acil-CoA. Esta etapa prévia é catalisada pela acil-CoA sintetase. As acil-CoA são compostos
ricos em energia. Sua ligação é formada à custa de energia derivada pela clivagem do ATP em
AMP e Ppi. A oxidação da acil-CoA (hexadecanoil-CoA) a uma enoil-CoA à custa da
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conversão de FAD
+
a FADH
2
é catalisada pela acil-CoA desidrogenase. A enoil-CoA sofre
uma hidratação pela ação da enoil-CoA hidratase produzindo uma hidroxiacil-CoA, a qual
sofre uma oxidação do grupo hidroxila da carbonila resultando uma oxoacil-CoA e NADH
pela ação da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase. A cisão da oxoacil-CoA por reação com uma
molécula de CoA formando acetil-CoA e uma acil-CoA com dois carbonos a menos é
catalisada pela acetil-CoA aciltransferase, onde esta acil-CoA refaz o ciclo várias vezes, até
ser totalmente convertida a acetil-CoA, conforme representado na Tabela 4.12 (Marzzoco &
Torres, 2007, www.kegg.com).
Tabela 4.12. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo de ácidos graxos.
Reação Enzima
PpiAMPPalmCoACoAATPPalm
+
+
→
+
+
Acil-CoA sintetase
NADHFADHAcylCoA
CoANADFADPalmCoA
778
777
2
++
→+++
++
Acil-CoA desidrogenase;
Enoil-CoA hidratase;
3-hidroxiacil-CoA desidrogenase;
Acetil-CoA aciltransferase
4.1.2.2.6.3. Síntese de triacilgliceróis
Os triacilgliceróis são sintetizados a partir de acil-CoA derivadas de ácidos graxos e
glicerol 3-fosfato. Inicialmente, os dois grupos hidroxilas do glicerol 3-fosfato sofrem
acilação por duas moléculas de acil-CoA formando fosfatidato. O fosfatidato é um importante
intermediário na biossíntese dos lipídios, pois pode ser convertido tanto em triacilglicerol
quanto em glicerofosfolipídos. Na via biossintética de triacilglicerol, o fosfatidato é
hidrolizado por fosfatidato fosfatase para formar 1,2-diacilglicerol (Tabela 4.13). Os
diacilgliceróis são então convertidos em tracilglicerol por transesterificação com o terceiro
acil-CoA (Nelson & Cox, 2004, Marzzoco & Torres, 2007).
Sabe-se que as bactérias não acumulam lipídios neutros, mas Olukoshi & Packter
(1994) observaram que em S. coelicolor A3(2)(A21), S. griseus (A15) e S. albus (A16)
acumulam triacilglicerol em seus esporos. A acumulação começa na fase exponencial e
continua até o final da fase estacionária.
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Tabela 4.13. Reações e enzimas envolvidas na síntese de fosfatidato.
Reação Enzima
ADPPGLATPGro
+
→
+
3
Glicerol quinase
CoAPAGLAcylCoAPGL
+
→
+
33
Glicerol 3-fosfato aciltransferase
CoAPtdAcylCoAPAGL
+
→
+
3
1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferase
PiDGPtd
+
→
Fosfatidato fosfatase
CoATGAcylCoADG
+
→
+
Diacilglicerol O-aciltransferase
4.1.2.3. Metabolismo de aminoácidos
As células bacterianas consistem de 65-75% de proteínas (Scargg, 1988) as quais são
obtidas a partir de vários aminoácidos. As bactérias geralmente podem sintetizar a maior parte
de seus aminoácidos (Mathews & Van Holde, 1996). O grupo amino é obtido a partir da
amônia, e a cadeia carbônica, a partir de carboidratos. As vias glicolíticas, de pentose fosfato
como também o ciclo de Krebs são fontes para a biossíntese de 20 aminoácidos comuns.
Os aminoácidos são classificados em diferentes famílias (a família dos aromáticos,
aspartato, glutamato, piruvato e serina) de acordo com os intermediários comuns em suas
biossínteses.
4.1.2.3.1. Família dos aminoácidos aromáticos
Os precursores dos aminoácidos aromáticos são o fosfoenolpiruvato e a eritrose 4-
fosfato. Sua condensação forma o 2-ceto-3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato pela
ação da enzima 3-desoxi-7-fosfoheptulosonato sintase, um composto com sete carbonos que
se torna cíclico pela ação da 3-desidroquinato sintase e é convertido a 3-diidroshikimato que
dá origem ao corismato. Os membros dessa família, fenilalanina, triptofano e tirosina, são
todos sintetizados pelo corismato na via metabólica shikimato (Tabela 4.14).
Na síntese de fenilalanina, o corismato é transformado em prefenato através da
corismato mutase. O prefenato sofre uma desidratação e depois é descarboxilado originando o
fenilpiruvato que é transaminado pela aspartato aminotransferase formando fenilalanina.
Na síntese de tirosina, o corismato é convertido em prefenato pela corismato mutase. O
prefenato sofre descarboxilação oxidativa formando 4-hidroxi fenilpiruvato pela ação da
enzima prefenato dehidrogenase. O 4-hidroxi fenilpiruvato é então transaminado pela ação da
aspartato aminotransferase formando a tirosina.
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A glutamina cede uma amina de sua cadeia lateral para o corismato, esta reação libera
piruvato e forma o antranilato. O antranilato se condensa com o PRPP (fosforribosil
pirofosfato) pela ação da enzima antranilato fosforribosil transferase formando o N-5-
fosforribosil antranilato. Este composto sofre então um rearranjo, uma desidratação e uma
descarboxilação gerando o indol 3-glicerol fosfato. O indol 3-glicerol fosfato reage com a
serina formando o triptofano e liberando gliceraldeído 3-fosfato.
A triptofano sintase é a enzima que catalisa as duas reações finais da biossíntese do
triptofano. Sua estrutura é um tetrâmero a2β2. A subunidade a cliva o indol-3-glicerol fosfato
em indol e gliceraldeído-3-fosfato. A subunidade β junta o indol com a serina para formar o
triptofano. A triptofano sintase possui um canal que liga suas subunidades catalíticas
permitindo que o indol seja difundido através da enzima, ou seja, o indol formado não sai da
enzima quando a serina está presente e as duas reações parciais são coordenadas. Este
processo é chamado de canalização do substrato e é extremamente vantajoso, pois assim, além
de aumentar mais de dez vezes a taxa catalítica global, ele previne a perda de um
intermediário da síntese do triptofano.
Tabela 4.14. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de fenilalanina, tirosina e
triptofano.
Reação Enzima
PiDHQPEPPE 234
+
→
+
3-desoxi-7-fosfoheptulosonato sintase;
3-desidroquinato sintase
33 DHSDHQ
→
Desidroquinato desidratase
Pi
ADP
NADP
Chor
PEP
ATP
NADPH
DHS
2
3
+
+
+
→
+
+
+
+
Shikimato 5-desidrogenase
;
Shikimato quinase;
3-fosfatoshikimato 1-carboxivinil transferase;
Corismato sintase
epChor Pr
→
Corismato mutase
2
Pr COOGPheGluep ++→+
Prefenato desidratase;
Aspartato aminotransferase
2
Pr CONADHHPPNADep ++→+
+
Prefenato desidrogenase
OGTyrGluHPP
+
→
+
Aspartato aminotransferase
PyrGluAnthGChor
+
+
→
+
ln
Antranilato sintase
PpiAtPRPPAnth
+
→
+
5Pr
Antranilato fosforribosil transferase
2
35Pr COPGATrpSerAt ++→+
Fosforribosilantranilato isomerase;
Indol 3-glicerol fosfato sintase;
Triptofano sintase subunidade alfa;
Triptofano sintase subunidade beta
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Keller, B.; Keller, E.; Lingens (1985), Lowe & Westlake (1972), Speedie & Park
(1980), Hua; Yang; Shimizu (1999), citados em Hodgson (2000) estudaram algumas enzimas
envolvidas na via de shikimato em Streptomycetes. A biossíntese de tirosina em quase todos
os Streptomycetes foi testada e, diferente de Pseudomonas e de algumas bactérias onde o
arogenato é o precursor da tirosina, em Streptomycetes o precursor é 4-hidroxifenilpiruvato
(Hodgson, 2000). Os genes envolvidos na biossíntese de triptofano foram estudas em S.
coelicolor A3(2)(A21) (Engel & Watkins; Smithers & Engel, 1974).
4.1.2.3.2. Família dos aminoácidos aspartatos
O aspartato é sintetizado pelo oxaloacetato por transaminação do ácido com o
glutamato. A asparagina é sintetizada por amidação do aspartato. Esses aminoácidos são não-
essenciais e suas vias biossintéticas simples são encontradas em todos os organismos. O
aspartato dá origem à metionina, à treonina e à lisina. O ponto de bifurcação ocorre no nível
do aspartato β-semialdeído, um intermediário das três vias na altura da homosserina, um
precursor da treonina e da metionina. As reações e enzimas envolvidas nessa via metabólica
para S. olindensis ICB20 estão descritas na Tabela 4.15.
Tabela 4.15. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de aspartato, asparagina, treonina e
lisina.
Reação Enzima
OGAspGluOAA
+
→
+
Glutamato oxaloacetato transaminase
GluPpiAMPAsnGATPAsp
+
+
+
→
+
+
ln
Asparagina sintetase
PiNADPADPAspSA
NADPHATPAsp
+++
→
+
+
+
Aspartoquinase;
Aspartato semi-aldeído desidrogenase
+
+→+ NADPHseNADPHAspSA
Homosserina desidrogenase
PiADPThrATPHse
+
+
→
+
Homosserina quinase;
Treonina sintase
+
+→++ NADPPdcarNADPHPyrAspSA
Diidropicolinato sintase;
Diidropicolinato redutase
SucOGCoADAP
GluSucCoAPdcar
+++
→
+
+
2,3,4,5 tetrahidropiridina 2-carboxilato;
Succinil diaminopimelato aminotransferase;
Succinil diaminopimelato dessuccinilase
mDAPDAP
→
Diaminopimelato epimerase
2
COLysmDAP +→
Diaminopimelato descarboxilase
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Existem poucas informações na literatura sobre a síntese de asparagina e aspartato.
Entretanto, Fisher (1989) verificou a presença da enzima glutamato oxaloacetato transaminase
(GOAT) em S. coelicolor A3(2)(A21). A enzima mostrou-se insensível a natureza da fonte de
nitrogênio no meio de crescimento microbiano. Foram desenvolvidos poucos trabalhos
também sobre a biossíntese de treonina, entretanto Mendelovits & Aharonowitz (1982)
estudaram as enzimas envolvidas nessa via metabólica em Streptomycetes. Eles reportaram
informações sobre a regulação dos genes. A via da biossíntese da lisina é uma das precursoras
do metabolismo secundário por isso vem sendo estudada extensivamente. Existem dois
caminhos para a biossíntese da lisina: aminoadipato (AAA) e a diaminopimelato (DAP) os
quais usam aspartato como um precursor. A produção de lisina pela via DAP foi observada
em bom número de Streptomycetes: S. griseus, S. venezuelae, S. lipmanii, S. clavaligerus e S.
lavendulae (citado em Hodgson, 2000).
4.1.2.3.3. Família dos aminoácidos de cadeias ramificadas
Essa família consiste de leucina, isoleucina e valina. Os metabólitos obtidos a partir da
biossíntese de leucina e isoleucina são precursores de muitos antibióticos polipeptídeos em
Streptomycetes (Reynolds; O’Hagan; Robinson, 1988).
A treonina é um dos precursores da isoleucina, as vias de valina e isoleucina
compartilham quatro enzimas (acetolactato sintase, acetoidroxiácido isômero redutase,
diidroxiácido deidratase e aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada). O piruvato
dá origem à valina e à isoleucina em vias que começam com a condensação de dois carbonos
do piruvato com outra molécula de piruvato (via da valina) ou com o α-cetobutirato (via da
isoleucina). Um intermediário na via de valina, o α-cetoisovalerato (OIV) é o ponto de partida
de ramificação para a via biossintética de leucina (Tabela 4.16).
A biossíntese de leucina começa pela formação do isopropil malato a partir de α-
cetoisovalerato e acetil coenzima A, catalisada por 2-isopropilmalato sintase. Então a 3-
isopropilmalato deidratase, 3-isopropilmalato desidrogenase e a aminotransferase catalisam as
reações até a leucina. Stieglitz & Clavo (1974) verificaram a presença de 3-isopropilmalato
desidrogenase em S. violaceoruber (A21) (Hodgson, 2000).
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Tabela 4.16. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de leucina, isoleucina e valina.
Reação Enzima
2
2 COAlacPyr +→
Piruvato desidrogenase;
Acetolactato sintase
+
+→+ NADPOIVNADPHAlac
Acetoidroxiácido isômero redutase;
Diidroxiácido deidratase
OGValGluOIV
+
→
+
Aminotransferase de aminoácidos de cadeia
ramificada
CoASMalAcCoAOIV
+
→
+
2
2-isopropilmalato sintase
2
2
CONADHOGLeu
GluNADSMal
+++
→++
+
3-isopropilmalato deidratase;
3-isopropilmalato desidrogenase;
Aminotransferase de aminoácidos de cadeia
ramificada
3
NHOBThr +→
Treonina deidratase
2
COAHBPyrOB +→+
Acetolactato sintase
OGNADPIle
GluNADPHAHB
++
→
+
+
+
Acetoidroxiácido isômero redutase;
Diidroxiácido deidratase;
Aminotransferase de aminoácidos de cadeia
ramificada
4.1.2.3.4. Família dos aminoácidos glutamato
Este tópico aborda o metabolismo de prolina e arginina, o metabolismo de glutamato e
glutamina, devido as suas importâncias no metabolismo do nitrogênio, serão abordados
posteriormente.
A
prolina é um derivado ciclizado do glutamato, a sua síntese inicia com a reação do
ATP com o grupo
γ
-carboxila do glutamato para formar um acil-fosfato, o qual é reduzido
pelo NADPH para formar glutamato-5-semi-aldeído. Esse intermediário é ciclizado de forma
espontânea e reduzido para liberar a prolina.
Nos animais, a arginina é sintetizada do glutamato via ornitina e no ciclo da uréia. A
ornitina pode também ser sintetizada a partir do glutamato-5-semi-aldeído, que ocorre na via
da prolina. Esta é uma reação rápida e espontânea que impede um suprimento suficiente desse
intermediário para a síntese de ornitina. As bactérias possuem uma via biossintética para
ornitina (e, consequentemente, para arginina) que em alguns passos é pararela à via da
prolina, mas que inclui dois passos adicionais para bloquear a ciclização espontânea do grupo
amino do glutamato 5-semialdeído. No início, o grupo amino do glutamato é bloqueado por
acetilação em uma reação que envolve o acetil-CoA. Depois do passo da transaminação, o
grupo acetila é removido para liberar a ornitina. As reações e enzimas envolvidas na
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biossíntese de prolina e arginina, levadas em consideração no metabolismo de S. olindensis
ICB20, estão descritas na Tabela 4.17.
Tabela 4.17. Reações envolvidas na biossíntese de prolina e arginina.
Reação Enzima
PiNADPADPGluSA
NADPHATPGlu
+++
→
+
+
+
Glutamato 5-quinase;
Glutamato 5-semi-aldeído desidrogenase
+
+→+ NADPoNADPHGluSA Pr
Pirolina 5-carboxilato redutase
CoAADPNADPPiOGAcOrn
NADPHATPAcCoAGlu
++++++
→
+
+
+
+
2
Acetilglutamato sintase;
Acetilglutamato quinase;
Acetilglutamato 5-semialdeído desidrogenase;
Acetilornitina aminotrasferase;
Acetilornitinase
PiCitrCbmPOrn
+
→
+
Ornitina carbamil transferase
PpiAMPArgSucAspATPCitr
+
+
→
+
+
Argininossuccinato sintetase
FumArgArgSuc
+
→
Argininossuccinase
A biossíntese de prolina em S. coeliclor foi estudada por Hood et al. (1992), que
verificou a presença de glutamato quinase, glutamato semi-aldeído desidrogenase e pirolina
carboxilato redutase. A biossíntese de arginina é similar a de prolina, mas requer a presença
de oito enzimas. Foi verificada a presença das enzimas: acetilglutamato sintase,
acetilglutamato quinase, ornitina carbamil transferase e acetilornitinase em S. griseus por
Udaka (1966) (citado em Hodgson, 2000). Os genes de argininossuccinato sintetase e
argininossuccinase, responsáveis pelas últimas duas reações dessa via metabólica vêm sendo
estudados em um grande número de Streptomycetes.
4.1.2.3.5. Biossíntese de alanina
O catabolismo de alanina pode ser através de duas reações. Em uma reação a alanina é
formada pela via de dependência de NADH para aminação de piruvato, sendo essa reação
catalisada por alanina desidrogenase (ADH). Já a outra reação é catalisada pela alanina
aminotrasferase (AOAT), onde a alanina é formada pela transaminação de piruvato a
glutamato. Entretanto, existem estudos que verificam a presença de AOAT em
Streptomycetes. Já a presença de ADH em Streptomycetes é evidenciada em muitos estudos.
Hodgson (2000) assume que na maioria dos casos a enzima que catalisa a reação em
Streptomycetes é a ADH. A reação e a enzima levada em consideração na biossíntese de
alanina para S. olindensis ICB20 está descrita na Tabela 4.18.
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Tabela 4.18. Reação e enzima envolvida na biossíntese de alanina.
Reação Enzima
+
+→++ NADAlaNHNADHPyr
3
Alanina desidrogenase
4.1.2.3.6. Biossíntese de histidina
A via de histidina em vegetais e bactérias é diferente em vários aspectos das vias
correspondentes dos outros aminoácidos. A histidina é derivada de três precursores: o PRPP
(5-fosforribosil-1-pirosfosfato) que fornece cinco carbonos, o anel da purina do ATP que
fornece um nitrogênio e um carbono, e o segundo nitrogênio da histidina que vem da
glutamina. Os genes da biossíntese da histidina foi encontrado em S. coelicolor A3(2)(A21)
(Hodgson, 2000). As reações e enzimas envolvidas na síntese de histidina estão apresentadas
na Tabela 4.19.
Tabela 4.19. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de histidina.
Reação Enzima
PpiBBMIIIATPPRPP 2
+
→
+
Fosforribosil transferase;
Fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase;
Fosforribosil-AMP cicloidrolase;
Fosforribosilformimino-5-
aminoimidazol carboxamida
isomerase;
AICARGluGroPGBBMIII
+
+
→
+
Imln
Amidotransferase
PiOGNADHHisNADGluGroP +++→++
+
22Im
Imidazol glicerol-fosfato desidratase;
Histidinol fosfato aminotransferase;
Histidinol fosfatase;
Histidinol desidrogenase
4.1.2.3.7. Biossíntese de serina e glicina
A biossíntese de serina pode ser através tanto de uma via não-fosforilada quanto de
uma via fosforilada, dependendo do micro-organismo (Madelstam et al., 1982). Entretanto, a
via fosforilada é preferencial em bactérias Gram-Positivas (Sonenshein; Hoch; Losick, 1993).
Essa via envolve a oxidação do grupo hidroxila do 3-fosfoglicerato por uma desidrogenase,
seguida da transminação com o glutamato e hidrólise pela fosfosserina fosfatase liberando a
serina (Tabela 6.20). A serina é o precursor da glicina, a qual é obtida pela remoção de um
carbono da serina pela glicina hidroxiltransferase. Parada (1981) estudou o efeito inibitório de
serina na biossíntese de glicina e metionina em S. aureofaciens (A14) e S. rimosus (B24).
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Tabela 4.20. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de serina e glicina.
Reação Enzima
PiOGNADHSerGluNADPG +++→++
+
3
D-3-fosfoglicerato desidrogenase;
Fosfosserina aminotransferase;
Fosfosserina fosfatase
GlyMeTHFTHFSer
+
↔
+
Glicina hidroximetiltransferase
4.1.2.3.8. Aminoácidos contendo enxofre
As bactérias produzem o enxofre reduzido necessário para a síntese de cisteína e de
metionina a partir de sulfatos encontrados no meio ambiente. O sulfato é empregado na
síntese de cisteína a partir de serina. A biossíntese de cisteína começa com a reação de serina
e acetil-CoA (Tabela 4.21) catalisada pela serina acetiltransferase. A atividade dessa enzima
em S. phaeochromogenes foi descrita por Nagasawa; Kanzaki; Yamada (1984).
A metionina tem como precursor a homosserina (derivada do aspartato) e o succinil-
CoA (derivado do oxaloacetato). É sintetizada através da metilação da homocisteína pelo
metiltetraidrofolato. Em S. coelicolor A3(2)(A21) a homoserina é precursor de metionina
(Hopwood et al., 1973). A metionina, por sua vez, forma adenosilmetionina (AdoMet), um
importante grupo doador de metil e precursor da síntese de cosmomicina.
Tabela 4.21. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de cisteína e metionina.
Reação Enzima
CoAAcSerAcCoASer
+
→
+
Serina acetiltransferase
AcCysSHAcSer +→+
2
Cisteína sintase
CoASucHseSucCoAHse
+
→
+
Homoserina succiniltransferase
SucCystCysSucHse
+
→
+
Cistationina sintase
3
NHPyrHcyCyst ++→
Cistationina β-liase
THFMetMTHFHcy
+
→
+
Metionina sintase
PpiPiAdoMetATPMet
+
+
→
+
Adenosilmetionina sintetase
4.1.2.4. Biossíntese dos nucleotídeos
Os nucleotídeos desempenham vários papéis importantes na célula. Eles são
precursores de DNA e do RNA. Os nucleotídeos são componentes dos co-fatores NAD
+
,
FAD
+
, S-adenisilmetionina e coenzima A, como também dos intermediários biosintéticos
ativados, como UDP-glicose e CDP-diacilglicerol.
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4.1.2.4.1. Nucleotídeos pirimidínicos
Os nucleotídeos pirimidínicos comuns são a citidina 5’-monofosfato (CMP;citidilato)
e a uridina 5’-monofosfato (UMP; uridilato), que contêm as pirimidinas citosina e uracil. São
sintetizados a partir de aspartato, PRPP e carbamil fosfato (obtido a partir da glutamina).
O primeiro passo da biossíntese desses nucleotídeos é a síntese do carbamil fosfato a
partir de CO
2
e NH
4
+
catatisada pelo carbamil fosfato sintetase
.
O próximo passo é a formação
do anel pirimídico com seis átomos e ligação deste com a ribose-5-fosfato. Nesse processo é
necessária a presença de carbonil fosfato. A ribose 5-fosfato é adicionada ao anel pirimídico
completado pela orotato fosforribosil transferase formando o orotidilato (OMP). O orotidilato
é então carboxilado para liberar o uridilato e este é fosforilado para UTP.
O DNA contém timina e a via da síntese de timina envolve apenas os
desoxirribonucleotídeos. O precursor imediato do timidilato (dTMP) é o dUMP. Nas
bactérias, a via para dUMP começa com a formação de dUTP pela desaminação de dCTP. O
dCTP é obtido a partit de CDP. O dUTP é convertido em dUMP pela dUTP difosfatase. A
conversão de dUMP para dTMP é catalisada pela enzima timidilato sintase. O CTP é formado
do UTP pela ação da CTP sintase.
O dissulfeto da tiorredoxina é reduzido por NADPH em uma reação catalisada pela
tiorredoxina redutase.
A biossíntese de pirimidina em Streptomycetes é similar a de outras bactérias
(Hodgson, 2000). As reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos nucleotídeos
pirimídicos estão descritas na Tabela 4.22.
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Tabela 4.22. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos nucleotídeos pirimidínicos.
Reação Enzima
GluPiADPCbmPCOATPG +++→++ 22ln
2
Carbamil fosfato sintetase;
PiNADHOroNADAspCbmP ++→++
+
Aspartato transcarbamilase;
Diidroorotase;
Diidroorotase desidrogenase
PpiOMPPRPPOro
+
→
+
Orotato fosforribosil transferase
2
COUMPOMP +→
Orotodilato descarboxilase
ADPUDPATPUMP
+
→
+
Citidilato quinase
ADPUTPATPUDP
+
→
+
Nucleosídeo difosfato quinase
PiADPCTPNHATPUTP ++→++
3
CTP sintase
ATPCDPADPCTP
+
↔
+
Nucleosídeo difosfato quinase
oxTRdCDPredTRCDP
−
+
→
−
+
Ribonucleotídeo difosfato redutase
ADPdCTPATPdCDP
+
→
+
Nucleosídeo difosfato quinase
3
NHdUTPdCTP +→
dCTP desaminase
PpidUMPdUTP
+
→
dUTP difosfatase
THFFADdTMPMeTHFFADHdUMP ++→++
+
2
Timidilato sintase
ATPCMPADPCDP
+
↔
+
Citidilato quinase
+
+−→+− NADPredTRNADPHoxTR
Tiorredoxina redutase (NADPH)
ATPdCMPADPdCDP
+
→
+
Desoxicitidina trifosfatase
4.1.2.4.2. Nucleotídeos purínicos
Os dois nucleotídeos purínicos antecessores dos ácidos nucléicos são adenosina 5-
monofosfato (AMP; adenilato) e guanosina 5-monofosfato (GMP; guanilato). Esses
nucleotídeos contêm as bases purínicas adenina e guanina, respectivamente.
A síntese de purina requer aspartato, glicina, dióxido de carbono e uma unidade de
carbono do estado de oxidação do ácido fórmico. Os grupos dos carbonos simples são obtidos
pela derivação do ácido tetrahidrofólico (THF).
A síntese das purinas começa com o fosforribosilpirofosfato (PRPP), o qual é obtido
pela ação da ribose fosfato pirofosfoquinase. No próximo passo um grupo amino, doado pela
glutamina, é ligado no carbono 1 do PRPP resultando na fosforribosilamina. Três átomos do
aminoácido glicina são adicionados onde para cada um deles um ATP é consumido para
ativar o grupo carboxila da glicina nessa reação de condensação. O grupo amino da glicina
adicionado é então formilado pelo N-formiltetraidrofolato e um nitrogênio é doado pela
glutamina, antes da desidratação e do fechamento do anel de cinco membros imidazol do
núcleo da purina, que é liberado como 5-aminoimidazol ribonucleotídeo (AIR). Para
completar o processo ocorre carboxilação. O aspartato então entrega seu grupo amino para o
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imidazol, onde a formação de uma ligação amida é seguida pela eliminação do esqueleto
carbônico do aspartato na forma de fumarato. O carbono final é cedido pelo N-
formiltetraidrofolato (ForTHF) e um segundo fechamento do anel ocorre para liberar o
segundo dos anéis fundidos do núcleo purínico. O primeiro intermediário a ter anel purínico
completo é o inosinato (IMP).
O guanilato é formado pela oxidação do inosinato usando NAD
+
, seguido pela adição de
um grupo amino derivado da glutamina. O ATP é rompido em AMP e Ppi no passo final.
Os desoxirribonucleotídeos, as unidades estruturais do DNA, são derivados dos
ribonucleotídeos correspondentes por meio de reações nas quais o átomo de carbono 2 da
porção de D-ribose dos ribonucleotídeos é diretamente reduzido para formar o derivado 2-
desoxi. Essas reações são catalisadas pelo ribonucleotídeo redutase.
Yamada; Hayashida; Ogata (1990) reportaram três enzimas da biossíntese de adenina
(fosforribosil aminoimidazol carboxilase, fosforribosil aminoimidazol succinocarboxamida
sintase e adenilossucinato liase) em S. azureus. Ogata et al. (1991) também verificaram o
acúmulo de fosforribosil aminoimidazol succinocarboxamida sintase. Isso indica que a via de
purina em Streptomycetes é similar a outras bactérias (Hodgson, 2000) e é mostrada na Tabela
4.23.
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Tabela 4.23. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos nucleotídeos purínicos.
Reação Enzima
PRPPAMPATPPR
+
→
+
5
Ribose fosfato pirofosfoquinase
PpiGluPRAGPRPP
+
+
→
+
ln
Fosforribosil pirofosfato
amidotransferase
GluTHFPiADPAIR
GForTHFGlyATPPRA
++++
→
+
+
+
+
33
ln3
Glicinamida ribonucleotídeo sintetase;
Glicinamida ribonucleotídeo
transformilase;
Formilglicinamida ribonucleotídeo
amidotransferase;
Formilglicinamida ribonucleotídeo
ciclase
Fum
Pi
ADP
AICAR
AspATPCOAIR
+
+
+
→
+
+
+
2
Fosforribosil aminoimidazol carboxilase;
Fosforribosil aminoimidazol
succinocarboxamida sintase;
Adenilossucinato liase
THFFAICARForTHFAICAR
+
→
+
Aminoimidazol carboxamida
ribonucleotídeo transformilase;
5IMPFAICAR
→
Inosinato cicloidrolase
NADHXMPNADIMP +→+
+
5
Inosinato desidrogenase
PpiGluAMPGMPGATPXMP
+
+
+
→
+
+
ln
Guanilato sintetase
ADPGDPATPGMP
+
→
+
Guanilato quinase
ADPGTPATPGDP
+
→
+
Nucleotídeo difosfato quinase
oxTRdGDPredTRGDP
−
+
→
−
+
Ribonucleotídeo redutase
oxTRdADPredTRADP
−
+
→
−
+
Ribonucleotídeos redutase
ATPdAMPADPdADP
+
→
+
Adenilato quinase
ATPdGMPADPdGDP
+
→
+
Guanilato quinase
4.1.2.5. Metabolismo do nitrogênio
O único caminho de incorporar nitrogênio inorgânico no interior da célular é através das
vias biossintéticas de glutamato e glutamina. Por isso a biossíntese desses dois aminoácidos é
de extrema importância para o crescimento celular. No caso onde a fonte de nitrogênio no
meio de cultura não é um sal de amônia, como nitrato e uréia, o nitrogênio inorgânico deve
primeiro ser convertido à amônia para servir como grupo amina no glutamato e glutamina. O
glutamato é doador do grupo amina para a maioria dos aminoácidos, enquanto que a
glutamina é doadora do grupo amina para histidina, triptofano, asparagina e nucleosídeos
(Naeimpoor, 2001).
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4.1.2.5.1. Metabolismo de glutamato e glutamina
As vias biosintéticas até glutamato e glutamina são simples e parecem ser similares em
todas as formas de vida (Nelson & Cox, 2004).
Existem duas alternativas para a via de síntese de glutamato, dependendo da
concentração de amônia no meio. Quando as células crescem em meio rico de amônia, a
enzima glutamato desidrogenase catalisa a reação onde o glutamato é formado pela reação de
α-cetoglutarato e o NH
4
+
e a força redutora é fornecida pelo NADPH (Shapiro, 1989). Em
meio com limitação de amônia ou na presença de fontes de nitrogênios não preferenciais,
bactérias usam duas enzimas: glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase (glutamina
cetoglutarato aminotransferase ou GOGAT) (Shapiro, 1989). Como foi mencionado
anteriormente, o glutamato é um doador do grupo amina para compostos como pirimidinas e
purinas. Assim, GS é uma enzima vital para o crescimento celular se o meio não contém
glutamina. Ao contrário da GS, glutamato desidrogenase não é necessária para o crescimento
celular porque o organimo pode sintetizar glutamato via a reação catalisada por GOGAT. A
arginina é convertida em glutamato pelo ciclo da uréia, onde primeiro é convertida a ornitina
e esta é transaminada em glutamato semialdeído. As enzimas e reações envolvidas na
biossíntese de glutamato e glutamina estão descritas na Tabela 4.24.
Tabela 4.24. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de glutamato e glutamina.
Reação Enzima
+
+→++ NADPGluNHNADPHOG
3
Glutamato desidrogenase
PiADPGNHATPGlu ++→++ ln
3
Glutamina sintetase
+
+→++ NADGluOGNADHG 2ln
Glutamato sintase
Fisher (1989) concluiu que a glutamina sintase (GS) e a glutamato sintase (GOGAT)
são reguladas pelo metabolismo de nitrogênio em S. coelicolor A3(2)(A21). O autor mostrou
que a atividade da enzima GOGAT era sete vezes menor quando S. coelicolor crescia em
meio tendo como fonte de nitrogênio a alanina do que quando crescia em meio complexo de
nitrogênio. Essas observações foram opostas ao que Xia & Jiao (1986) obtiveram quando
demostraram que em S. hygroscopicus (A32) a atividade enzimática de GOGAT foi reduzida
em meio contendo amônia como fonte de nitrogênio. Ambos os estudos demostraram que a
regulação da GOGAT está relacionada com a fonte de nitrogênio.
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Fisher (1989) também reportou a presença de glutamato desidrogenase (GDH) em S.
coelicolor. O excesso de amônia no meio de cultivo induziu a repressão da enzima GDH. A
enzima mostrou-se dependende de NAD
+
.
4.1.2.5.2. Vias de degradação dos aminoácidos
O conjunto das vias catabólicas dos aminoácidos não apresenta alta atividade como a da
glicólise e da oxidação dos ácidos graxos. Os fluxos dessas vias também variam de forma
considerável, dependendo do equilíbrio entre as necessidades para os processos biossintéticos
e as quantidades disponíveis de um dado aminoácido. As 20 vias metabólicas convergem para
formar apenas cinco produtos e todos eles entram no ciclo do ácido cítrico. Há, entretanto, um
padrão seguido na oxidação dos aminoácidos: inicialmente ocorre remoção do grupo amino e,
a seguir, oxidação da cadeia carbônica remanescente. O grupo amino da maioria dos
aminoácidos é obtido inicialmente com o glutamato e esse pode ser convertido a aspartato
e/ou amônia. Foram incluídas no modelo apenas as reações relacionadas com a produção de
amônia e glutamato.
Os esqueletos carbônicos de 10 aminoácidos liberam acetil-CoA, o qual entra no ciclo
do ácido cítrico ou é empregado na biossíntese de lipídios. Cinco desses aminoácidos são
degradados até acetil-CoA via piruvato, que pode ser empregado na biossíntese da glicose.
Dentre os aminoácidos que entram via piruvato está a serina. Essa é convertida em piruvato
pela serina desidratase onde ambos, o grupo β-hidroxila e o grupo α-amino da serina, são
removidos nessa única reação.
Dentre os aminoácidos que entram no ciclo do ácido cítrico por meio do α-cetoglutarato
estão a arginina, a hisditina, o glutamato e a glutamina.
A conversão de glutamina em glutamato é realizada pela ação da glutaminase no qual
ela libera o seu nitrogênio amina. A transaminação ou desaminação do glutamato produz o α-
cetoglutarato (OG). A conversão catabólica de arginina e histidina em glutamato é um pouco
mais complexa. A arginina é convertida em glutamato pelo ciclo da uréia. Onde primeiro é
convertida à ornitina e esta é transaminada em glutamato semialdeído. A conversão de
histidina em glutamato ocorre em uma via de muitos passos pela ação de três enzimas. As
enzimas e reações envolvidas na degradação de aminoácidos levada em consideração na
análise de fluxos de Streptomyces olindensis ICB20 estão descritas na Tabela 4.25.
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Tabela 4.25. Reações e enzimas envolvidas na degradação de aminoácidos.
Reação Enzima
UreOrnArg
+
→
Arginase
32
2NHCOUre +→
Urease
GluSAOGOrn
→
+
Ornitina aminotrasferase
NADHGluNADGluSA +→+
+
Piroline desidrogenase
3
NHNADHOGNADGlu ++↔+
+
Glutamato desidrogenase
GluNHG +→
3
ln
Glutaminase
3
NHPyrSer +↔
Serina desidratase
232
2
2
1
CONHGluOHis ++→+
Histidina amônia liase;
Urocanato hidratase;
Oxidoredutase
4.1.2.6. Metabolismo do enxofre
As bactérias produzem o enxofre reduzido necessário para a síntese de cisteína a partir
de sulfatos encontrados no meio ambiente. O sulfato é ativado em dois passos e produz 3-
fosfoadenosina 5’-fosfossulfato (PAPS). As enzimas responsáveis por essas reações são a
ATP sulfurilase e a adenosilsulfato quinase. Posteriormente, fosfoadenosina fosfossulfato
redutase catalisa a redução de PAPS a sulfeto com excreção de PAP, o qual é hidrolisado e
transformado em AMP e Pi. O elétron doador nessa reação é o tioredoxina (TR-red). O sulfeto
é, então, empregado na síntese de cisteína a partir da serina em uma via de dois passos,
conforme apresentado na Tabela 4.21. O sulfeto também pode ser reduzido pela sulfeto
redutase à ácido sulfídrico usando NADPH como redutor de energia. As enzimas e reações
envolvidas no metabolismo do enxofre levadas em consideração na reconstrução do
metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20 estão descritas na Tabela 4.26.
Tabela 4.26. Reações e enzimas envolvidas no metabolismo do enxofre.
Reação Enzima
PpiAPSATPSO +→+
4
ATP sulfurilase
ADPPAPSATPAPS
+
→
+
Adenosilsulfato quinase
3
SOoxTrPAPredTRPAPS +−+→−+
Fosfoadenosina fosfossulfato redutase
+
+→+ NADPSHNADPHSO 33
23
Sulfeto redutase
PiAMPPAP
+
→
Fosfoadenilato nucleotidase
Em Streptomyces griseus, a biossíntese de cisteína é iniciada por sulfato, o qual é
reduzido serialmente para forma de sulfeto (Hodgson, 2000).
Materiais e Métodos
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4.1.2.7. Reações do ácido fólico
As vias catabólicas de aminoácidos requerem a presença de co-fatores enzimáticos. Um
dos tipos comum de reação no catabolismo de aminoácidos é a transferência de unidades de
carbono, ou unidades monocarbônicas. A transferência dessas unidades, em geral, envolve a
presença de co-fatores como tetraidrofolato (THF). O THF transfere unidades
monocarbônicas em estado de oxidação intermediário, algumas vezes como grupo metila. O
tetraidrofolato é sintetizado em bactérias. A unidade monocarbônica está ligada ao N-5 ou ao
N-10, ou a ambos. As diferentes formas do tetraidrofolato são interconversíveis e servem
como doadoras de unidades monocarbônicas em uma variedade de reações biossintéticas. A
maior fonte de unidades monocarbônicas para o tetraidrofolato é o carbono removido na
conversão de serina à glicina, produzindo N
5
,N
10
-metilenotetraidrofolato (Tabela 4.20).
O tetraidrofolato (THF) pode ser tanto oxidado, formando o formil tetraidrofolato
(ForTHF), quanto reduzido à metil tetraidrofolato (MTHF). As bactérias podem também usar
formato para produzir ForTHF em uma reação dependente de ATP (Tabela 4.27).
Tabela 4.27. Reações e enzimas envolvidas com o ácido fólico.
Reação Enzima
PiADPForTHFATPFormTHF
+
+
→
+
+
N
10
-formil-tetraidrofolato sintetase
ForTHFMetTHF
↔
Meteniltetraidrofolato cicloidratase
+
+↔+ NADPMeTHFNADPHMetTHF
Metilenotetraidrofolato desidrogenase
+
+→+ NADPMTHFNADPHMeTHF
Metilenotetraidrofolato redutase
4.1.2.8. Biossíntese dos fosfoslipídios
Os fosfolipídios são um dos maiores constituintes das membranas celulares, sendo os
glicerofosfolipídios uma de suas principais classes. São construídos pela combinação de
ácidos graxos e grupos cabeça polares com os esqueletos do glicerol, por exemplo, e usando
como precursor o ácido fosfatídico. A primeira estratégia para ligação do grupo cabeça está
descrita pela síntese da fosfatidilserina (PtdSer), fosfatidiletanolamina (PtdEtn) e
fosfatidilglicerol (PtdGro), baseado no metabolismo da E. coli (Nelson & Cox, 2004). O
diacilglicerol é ativado pela condensação do ácido fosfatídico com CTP para formar CDP-
diacilglicerol, com a eliminação de pirofosfato. Posteriormente, fosfatidilserina,
fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol são gerados pela reação de CDPDG com serina, glicerol-
3-fosfato e inositol, respectivamente. A descaboxilação de fosfatidilserina está ligada à
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geração de fosfatidiletanolamina (PtdEtn). O difosfatidilglicerol (DpGro) é biossíntetizado
pela condensação de dois moles de PtdGro com liberação de glicerol (Tabela 4.28).
No modelo, assumiu-se que a membrana celular de S. olindensis ICB20 é constituída
dos seguintes glicerofosfolipídios: 50,80% de fosfatidiletanolamina, 19,44% de
difosfatidilglicerol e 33,13% de fosfatidilinositol. Os valores foram baseados no trabalho de
Naeimpoor (2001) e adapatado através da simulação do modelo.
Tabela 4.28. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos fosfolipídios.
Reação Enzima
PpiCDPDGCTPPtd
+
→
+
CDP-diacilglicerol sintase
CMPPtdSerSerCDPDG
+
→
+
Fosfatidilserina sintase
2
COPtdEtnPtdSer +→
Fosfatidilserina descarboxilase
PiCMPPtdGroPGLCDPDG
+
+
→
+
3
Fosfatidilglicerol fosfato sintase
DpGroGroPtdGro
+
→
2
Difosfatidilglicerol sintase
InoPPG
→
6
Inositol fosfato sintase
PiInoInoP
+
→
Inositol fosfatase
CMPPtInoCDPDGIno
+
→
+
Fosfatidilinositol sintase
)(3313,01944,05085,0 gPlipPtdInoDPGroPtdEtn
→
+
+
Olukoshi & Packter (1994) verificaram que a maioria dos lipídios em S. lividans, S.
griseus, S. albus e S. colicolor eram fosfolipídios. Durante a fase estacionária de crescimento
celular os fosfolipídios contidos nas células permaneciam constantes. Khuller; Verma; Grover
(1981) estudaram o metabolismo do fosfolipídio em Streptomyces griseus e verificaram a
presença de fosfatidiletanolamina, difosfatidilglicerol e fosfatidilinositol como principais
fosfolipídios. Similarmente, fosfatidiletanolamina, difosfatidilglicerol e fosfatidilinositol
também foram reportados como fosfolipídios em Streptomyces por Packter; Flatman; Lucock
(1985).
4.1.2.9. Biossíntese de proteínas
A biossíntese de proteínas ocorre basicamente em todas as bactérias através de dois
passos. No primeiro passso, o qual é chamado de transcrição, uma molécula complementar de
RNA é sintetizada usando um padrão de DNA. O segundo passo, chamado translação,
transfere-se moléculas de RNA (tRNA), com aminoácidos atachados, para o RNA mensageiro
(mRNA, o produto da transcrição) e as informações contendo no mRNA são convertidas a
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uma sequência de aminoácidos. A biossíntese de proteínas na célula necessita de
aproximadamente 20 aminoácidos encontrados naquela célula, requerendo energia para ativar
cada molécula de aminoácido e sua incorporação dentro da proteína, como também energia
para síntese de mRNA.
A quantidade de precursores necessários para produzir um grama de proteína baseou-se
em dados da E. coli (Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983) (Tabela 4.29). A energia total
requerida por aminoácido nas proteínas foi obtida pela conversão de dois moles de GTP à
GDP, um mol de ATP à AMP e 0,33 moles de ATP à ADP, baseado na energia de
polimerização da E. coli (Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983) (Tabela 4.30). A reação para
formar um grama de proteína a partir de aminoácidos está descrita na Tabela 4.31.
Tabela 4.29. Quantidade de aminoácidos necessários para produzir um grama de proteína
(Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983).
Aminoácidos mmol.grama de proteína
-1
Ala 0,8873
Arg 0,5109
Asn 0,4164
Asp 0,4164
Cys 0,1582
Glu 0,4545
Gln 0,4545
Gly 1,0582
His 0,1636
Ile 0,5018
Leu 0,7782
Lys 0,5927
Met 0,2655
Phe 0,3200
Pro 0,3818
Ser 0,3727
Thr 0,4382
Trp 0,0982
Tyr 0,2382
Val 0,7309
SUM (Prot) 9,2382
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Tabela 4.30. Biossíntese de proteína.
Reação
)(Pr33,233,0233,1
2Pr
ln
201918171615141312
1110987654321
gotnPpiPinADPnAMPnGDPnATP
nGTPValaTyraTrpaThraSeraoaPheaMetaLysa
LeuaIleaHisaGlyaGluaGaCysaAspaAsnaArgaAlaa
+++++→
++++++++++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
i
a
=
Média do número de moles do aminoácido
i
em um grama de proteína.
∑
=
=
20
1i
i
an
Tabela 4.31. Reação envolvida na biossíntese de proteína.
Reação
)(Pr2382,95250,210486,32382,94764,182868,12
4764,187309,02382,00982,04382,03727,0Pr3818,0
3200,02655,05927,07782,05018,01636,00582,1
4545,0ln4545,01582,04164,04164,05109,08873,0
gotPpiPiADPAMPGDPATP
GTPValTyrTrpThrSero
PheMetLysLeuIleHisGly
GluGCysAspAsnArgAla
+++++→
+++++++
+++++++
+
+
+
+
+
+
+
4.1.2.10. Biossíntese dos ácidos ribonucléicos (RNA)
O RNA é construído com base nos monofosfatos nucleotídeos (AMP, GMP, UMP e
CMP), os quais têm que ser convertidos em trifosfato nucleotídeos. Essa conversão requer 2
moles de ATP para cada nucleotídeo. Depois da transcrição, aproximadamente 20% dos
transcritos primários são removidos e hidrolisados à monofosfato nucleotídeos, a reativação
desses nucleotídeos requer 0,4 moles de ATP extra por monofosfato ribonucleotídeos
(Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983). Com isso, a incorporação de um monofosfato
ribonucleotídeos requer um total de 2,4 moles de ATP.
Assumiu-se ser o mesmo da
E.coli
a quantidade de precursores necessária para produzir
um grama de RNA (Tabela 4.32). Como também, a energia de polimerização necessária pra
formar RNA (Tabela 4.33). A reação para formar um grama de RNA a partir de
mononucleotídeos é mostrada na Tabela 4.34.
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Tabela 4.32. Requerimento de nucleotídeos para formação de RNA.
Ribonucleotídeos mmol.grama de RNA
-1
ATP 0,8049
GTP 0,9902
CTP 0,6146
UTP 0,6146
SUM (RNA) 3,0243
Tabela 4.33. Biossíntese de RNA.
Reação
mPimADPgRNAmATPCMPbUMPbGMPbAMPb 4,24,2)(4,2
4321
++→++++
i
b
=
Média do número de moles do nucleotídeo i em um grama de RNA.
∑
=
=
4
1i
i
bm
Tabela 4.34. Reação envolvida na biossíntese de RNA.
Reação
PiADPgRNA
ATPCMPUMPGMPAMP
2583,72583,7)(
2583,76146,06146,09902,08049,0
++→
+
+
+
+
4.1.2.11. Biossíntese dos ácidos desoxirribonucléicos (DNA)
A biossíntese de DNA requer monofosfatos deoxinucleotídeos (dAMP, dGMP, dTMP e
dCMP), os quais inicialmente são convertidos em trifosfato deoxinucleotídeos utilizando
como requerimento energético 2 moles de ATP para cada nucleotídeo. Antes da replicação do
DNA ocorre o distensionamento da estrutura de dupla hélice do DNA. Isso ocorre devido à
presença de uma enzima especial que quebra as pontes de hidrogênios entre as bases a um
custo energético de um mol de ATP por nucleotídeo. Em adição, 0,4 ATP por nucleotídeo são
requeridos (Ingraham; Maaloe; Neidhardt, 1983). No total, a incorporação de uma
monofosfato deoxiribonucleotídeo no DNA custa 3,4 ATP.
A quantidade de precursores requeridos para produção de um grama de DNA foi
assumida ser a mesma da E. coli (Tabela 4.35). A Tabela 4.36 mostra a energia de
polimerização necessária pra formação de DNA baseado na E. coli (Ingraham; Maaloe;
Neidhardt, 1983). A reação para formar um grama de DNA a partir de
deoximononucleotídeos é mostrada na Tabela 4.37.
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Tabela 4.35. Requerimento de nucleotídeos para formação de DNA.
Deoxiribonucleotídeos
mmol.gram of DNA
-1
dATP 0,7968
dGTP 0,8194
dCTP 0,8194
dTTP 0,7968
SUM (DNA) 3,2324
Tabela 4.36. Biossíntese de DNA.
Reação
kPikADPgDNAkATPdTMPcdGMPcdCMPcdAMPc 4,34,3)(4,3
4321
++→++++
i
c
=
Média do número de moles do deoxinucleotídeo i em um grama de DNA.
∑
=
=
4
1i
i
ck
Tabela 4.37. Reação envolvida na biossíntese de DNA.
Reação
PiADPgDNA
ATPdTMPdGMPdCMPdAMP
9902,109902,10)(
9902,107968,08196,08194,07968,0
++→
+
+
+
+
4.1.2.12. Reação de carboidrato
Carboidrato é um dos componentes da biomassa, e este foi assumido ser composto de
glicogênio. A reação envolvida na biossíntese de 1 grama de carboidrato é descrita na Tabela
4.38 (Naeimpoor, 2001).
Tabela 4.38. Reação de carboidrato.
Reação
)(1728,6 gCHOGlco
→
4.1.2.13. Biossíntese de biomassa
Assumiu-se que a biomassa é composta por proteína, RNA, DNA, fosfolipídios e
carboidratos. As frações mássicas de proteína, RNA e DNA assumiu-se ser igual a de S.
coelicolor obtidos por Shahab et al. (1996). A quantidade de fosfolipídios por peso seco de S.
olindensis ICB20 baseou-se em dados para Streptomycetes (Olukoshi & Packter, 1994) e
assumiu-se que o resto da biomassa consiste em carboidratos (Naeimpoor, 2001) (Tabela
4.39). A reação para produção de biomassa é mostrada na Tabela 4.40.
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Tabela 4.39. Composição da biomassa.
Componentes Fração mássica (g)
Proteína 0,432
RNA 0,100
DNA 0,042
Fosfolipídios 0,033
Carbohidratos 0,393
Tabela 4.40. Reação envolvida na biossíntese de biomassa.
Reação
)(393,0033,0042,0100,0Pr432,0 gBioCHOPlipDNARNAot
→
+
+
+
+
4.1.2.14. Reações de transferência de elétrons e manutenção
A relação fósforo e oxigênio (P/0) assumi-se ser 3 nas reações de oxidação de NADH
e 2 nas reações de oxidação de FADH
2
, Voet & Voet (1995), como mostrado na Tabela 4.41.
Em adição, reações de manutenção foram incluídas no modelo para excretar o excesso de
ATP e Ppi (Tabela 4.42).
Tabela 4.41. Sistema de transporte de elétrons.
Reação
+
+→+++ NADATPOPiADPNADH 35,033
2
+
+→+++ FADATPOPiADPFADH 25,022
22
Tabela 4.42. Reações de manutenção.
Reação
ADPAMPATP 2
→
+
ADPAMPATP 2
→
+
ManutençãoATP
→
PiPpi 2
→
NADHNADPNADNADPH +→+
++
4.1.2.15. Biossíntese de cosmomicina
A rota de produção de cosmomicina (Figura 4.2) foi proposta por Garrido et al. (2006).
A biossíntese desse antibiótico é similar as vias biosíntéticas de formação das antraciclinas de
diferentes micro-organismos.
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AcCoA
Acetil-CoA carboxilase
G1P
dTDP-glicose sintase
MaCoA
Enoil-CoA hidratase dGlu dTTP dTDP
Nucleotídeo fosfato quinase
PrCoA dTDP-glicose 4,6 desidratase
DodGlu
Acil-CoA desidratase
PKS 2,3 desidratase
ProCoA Nohen Estpyr Estul
5-epimerase Transaminase
Ketoredutase 3-oxoredutase 4-oxoredutase N.N-dimetiltransferase
HNohen 3,5 epimerase OdiGlu
4-oxoredutase
dRodo
Ciclase
dFuc
3,5 epimerase
DeAk Desidratase
dCin
Oxidase
Ak
dRodi
Metiltransferase
AkMet
Ácido aclanônico metilester ciclase
AkKet
Aclavicetona redutase Hidrolase
Akla Hidroxilase
Glicosiltransferase
Hidrolase
Rhod Cos
Figura 4.2. Via biossintética de produção de cosmomicina.
A biossíntese de cosmomicina começa com a reação catalisada pela enzima acetil-CoA
carboxilase que converte de forma irreversível o acetil-CoA em malonil-CoA por uma reação
dependente de ATP. A formação da estrutura polipeptídica, antraciclína com 20 carbonos, é
obtida pela ação de um grupo de enzimas chamado de polipeptídeo sintase mínimal (Cetoacil
sintase α, cetoacil sintase β e proteína carregadora de acilas-ACP). A biossíntese das
antraciclinas ocorre através de repetidas condensações de unidades de acil catalisadas pela
enzima polipeptídeo sintase mínimal (PKS). O primeiro intermediário estável é o ácido
aclanônico. O ácido aclanônico necessita, em adição a PKS mínimal, cetoredutase, ciclase e
oxidase, que estão envolvidas com o fechamento de três anéis quinonas presente na
cosmomicina. Imediatamente após o fechamento desses anéis, este ácido é metilado pela ação
de uma metiltransferase preparando, assim, a ação da enzima subseqüente, ácido aclanônico
metilester ciclase, que promove a ciclização do quarto anel quinona, formando a aclavicetona.
A aclavicetona é reduzida no carbono 7 formando a aclavinona, em seguida ocorre uma
preparação para que o carbono 10 possa ser atacado pelas glicosiltransferases. O último passo
para a formação da ε-rodomicinona é catalisado pela ação de uma hidrolase, a qual retira o
grupo carboxil do carbono 10 e posteriormente insere uma hidroxila nesta posição (Räty et al.,
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2002) (Tabela 4.43). Assim a aglicona (ε-rodomicinona) está pronta para sofrer a ação das
glicosiltransferases (Garrido et al., 2006; Saenz, 2007).
Tabela 4.43. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese de cosmomicina.
Reação Enzima
PiADPMaCoACOATPAcCoA ++→++
2
Aceti-CoA carboxilase
2
ONADPHOxproNADPMaCoA ++↔+
+
Espontânea
+
+↔+ NADPHyproNADPHOxpro
Espontânea
CoAHypor Pr
↔
Enoil-CoA hidratase
+
+↔+ FADoCoAFADHCoA PrPr
2
Acil-CoA desidratase
2
9109Pr
COCoANohenACPMaCoAoCoA ++→++
Cetoacil sintase α;
Cetoacil sintse β;
Proteína carregadora de acilas-ACP
+
+→+ NADHNohenNADHNohen
Cetoredutase
ACPDeAkHNohen
+
→
Ciclase
AkODeAk →+
2
Oxidase
AdoCysAkMetAdoMetAk
+
→
+
Metiltransferase
AkKetAkMet
→
Ácido aclanônico metilester ciclase
+
+→+ NADPAklaNADPHAkKet
Aclavicetona redutase
+
+→++ NADPRhodONADPHAkla
2
Hidrolase
2
6
2
2
2
COdTDPCos
dRodi
dRodo
dFuc
Rhod
++→
+
+
+
Hidrolase;
Hidroxilase;
Glicosiltransferase
Os açúcares presentes na molécula de cosmomicina D são obtidos pela biossíntese dos
deoxi-açúcares (Tabela 4.44). Esses açúcares são derivados da glicose-1-fosfato, os quais são
primeiramente ativados com a transferência de uma timidina difosfato para o carbono 1 a
partir de uma timidina trifosfato. O açúcar ativado sofre a ação de uma enzima dTPD-glicose
4,6 desidratase, que forma a 4,6-Didesoxi-4-oxo-desoxitimidina 5’-difosfato-D-glicose
(DodGlu). O DodGlu sofre a ação das enzimas 2,3 desidratase e 3-oxoredutase para formação
do intermediário comum da biossíntese de 2 açúcares presentes nas moléculas de
cosmomicina, desoxitimidina 5’-difosfato-4-oxo-2,6-didesoxi-D-glicose(OdiGlu). A partir
desse intermediário pode-se sintetizar 2-desoxi-L-fucose diretamente da redução do grupo
ceto do carbono 4, mas para a formação de L-rodinose deve ser retirada a hidroxila do
carbono 3 antes da redução do grupo ceto do carbono 4. A síntese da rodosamina é um pouco
mais complexa, havendo primeiramente a necessidade de uma isomerização, seguida de uma
transaminação do grupo ceto. Na sequência esta amina é dimetilada formando L-rodosamina
(Garrido et al., 2006; Saenz, 2007).
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As enzimas glicosiltransferases são responsáveis pela incorporação dos açúcares (2-
deoxi-L-fucose, L-rodosamina e L-rodinose) nos carbonos 7 e 10 da aglicona durante a
biossíntese de cosmomicina D, Garrido et al. (2006).
Tabela 4.44. Reações e enzimas envolvidas na biossíntese dos deoxi-açúcares de
cosmomicina.
Reação Enzima
ADPdTTPATPdTDP
+
→
+
Nulceotídeo fosfato quinase
PpidGludTTPPG
+
→
+
1
dTDP-glicose sintase
NADHDodGluNADdGlu +→+
+
dTPD-glicose 4,6 desidratase
EstpyrDodGlu
→
2,3 desidratase
+
+→+ NADPOdiGluNADPHEstpyr
3-oxoredutase
+
+→+ NADPdFucNADPHOdiGlu
3,5 epimerase;
4-oxoredutase
EpyrSEstpyr
→
5-epimerase
EstulEpyrS
→
4-oxoredutase
AdoCysdRodoNHAdoMetEstul +→++
3
Transaminase;
N,N-dimetiltransferase
dCinOdiGlu
→
3,5 epimerase;
Desidratase
+
+→+ NADdRodiNADHdCin
Cetoredutase
4.1.3. Considerações e parâmetros do modelo
Baseado nos dados experimentais de Pamboukian (2003), a glicose foi o substrato usado
como fonte de carbono. Assumiu-se que as fontes de fosfato e enxofre são fosfato e sulfato,
respectivamente. A fonte de nitrogênio é proveniente dos aminoácidos presentes no extrato de
levedura (Saccharomyces cerevisiae) e no casaminoácido, componentes do meio de cultura. O
cálculo da composição do extrato de levedura e do casaminoácido está descrito no Capítulo 5.
Assumiu-se que o meio era composto por vitaminas, glicose, glicerol, fosfato, sulfato, amônia
e aminoácidos. Assumiu-se como produtos do metabolismo: piruvato, adenosil-homocisteína,
acetato, formato, dióxido de carbono, hidrogênio, amônia, aminoácidos e cosmomicina.
4.1.4. Modelo computacional de fluxos metabólicos intracelulares
O modelo estequiométrico proposto neste trabalho foi construído utilizando dois
softwares, o EXCEL e o GAMS (The General Algebraic Modelling System).
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Uma vez identificadas às reações do modelo (item 4.1.2), foi construída uma matriz
com os coeficientes estequiométricos de todas as reações no EXCEL. As colunas na matriz se
referem às reações e as linhas aos metabólitos. Os valores dos coeficientes estequiométricos
para cada metabólito foram inseridos na célula correspondente de cada reação. Foi definida
uma convenção de sinais para definir os metabólitos em cada reação em relação ao consumo e
a produção. O metabólito consumido numa determinada reação recebeu o sinal negativo no
valor do coeficiente estequiométrico. No caso do metabólito ter sido produzido o coeficiente
estequiométrico recebeu o sinal positivo. Obteve-se uma matriz com 245 colunas (reações) e
247 linhas (metabólitos).
Essa matriz foi exportada para o programa GAMS utilizando um programa criado no
EXCEL via Visual Basic (Apêndice A). Esse programa cria um arquivo no formato de texto o
qual pode ser copiado e colado no GAMS. Desta forma, a matriz criada originalmente no
EXCEL, foi incorporada ao algorítimo no GAMS.
O modelo computacional para otimizar a velocidade específica de crescimento celular
e de produção de cosmomicina foi programado em GAMS (Apêndice B).
A rede de reações bioquímicas selecionada, composta por 245 equações e 247
metabólitos, gerou um sistema de equações com um número maior de variáveis do que de
equações. Com isso o sistema se torna indeterminado, podendo ser resolvido por programação
linear através do GAMS. As funções objetivo utilizadas nesse trabalho foram velocidade
específica de crescimento ou velocidade específica de produção de cosmomicina. Assim o
direcionamento da otimização foi para maximização de crescimento da biomassa ou para
produção de cosmomicina, respectivamente.
4.1.4.1. Programa computacional
O GAMS (General Algebraic Modelling System), usado para resolver a modelagem
metabólica, é um ambiente desenvolvido para resolver grandes problemas de programação
matemática. É provido de uma linguagem de alto nível para uma representação compacta de
um modelo complexo, além de permitir a mudança na especificação do modelo de forma
simples e segura (Brooke; Kendrick; Meeraus, 1992). Esse programa é de livre acesso na
internet (www.gams.com) onde a versão utilizada foi a 2.0.31.8.
A estrutura geral do programa é representada na Figura 4.3. O programa é dividido em
três partes: os dados, o modelo e a solução.
O programa inicia com a declaração e atribuições
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dos conjuntos de dados incluíndo parâmetros e escalares. A segunda parte inclui os elementos
do modelo: as variáveis, as atribuições de tipo e, onde necessário, atribuições de limites e
valores iniciais das variáveis. Cada equação do modelo recebe uma especificação e deve ser
declarada antes de ser usada no modelo. No modelo, tem uma equação que expressa a função
objetivo como uma função de variável do modelo. Nesta equação uma variável livre foi usada
para representar o valor da função objetivo. Definindo as equações do modelo metabólico
como um modelo GAMS, o modelo pode então ser resolvido especificando a direção da
otimização. A partir dessa etapa, um arquivo automático é gerado com uma lista de todos os
ítens declarados, como também das variáveis calculadas, além de outras informações, como
dados para análise de sensibilidade. As variáveis obtidas otimizadas e calculadas pelo
programa precisam ser tratadas antes de serem usadas para análise de fluxos metabólicos. O
programa computacional está no Apêndice B. Uma vez que os arquivos de saída do GAMS
não foram convenientes para transferir os resultados otimizados em mapa de distribuição de
fluxos, os resultados foram transferidos para um arquivo no Excel onde foi criado um arquivo
ligando a matriz com os dados dos fluxos e o mapa de fluxos metabólicos para que se possa
direcionar melhor a análise de fluxos metabólicos, conforme detalhado no ítem 4.1.6.1.
Figura 4.3. Estrutura do programa computacional.
4.1.4.2. Entradas e saídas do programa
As entradas e saídas do programa variaram de acordo com a definição do problema. As
entradas incluem os parâmetros do modelo como as velocidades específicas de consumo e/ou
excreção de certos compostos. A velocidade específica de crescimento celular também pode
Conjunto de declarações e restrições
Definições de declarações dos parâmetros
Atribuições
Exposição
Dados
Declaração das variáveis
Delaração das equações
Definições das equações
Definição do modelo
Modelo
Solução
Saídas
Solução
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ser uma entrada para o programa. Uma das saídas do programa, a qual é de extrema
importância na análise de fluxos metabólicos, é a maximização ou minimização dos valores
da função objetivo. Onde esta pode ser a maximização da velocidade específica de
crescimento celular ou da produção de cosmomicina ou ainda a maximização ou minimização
do requerimento energético de manutenção. Os fluxos das reações bioquímicas são as saídas
mais importantes do programa. As velocidades específicas de consumo de oxigênio, sulfato,
fosfato, amônia como também as velocidades específicas de excreção de dióxido de carbono e
outros produtos como cosmomicina podem ser outras saídas do programa.
4.1.5. Equacionamento do modelo
O modelo metabólico construído propõe resolver 247 balanços algébricos lineares para
os 247 metabólitos. Esses balanços estão representados por 245 reações metabólicas, na forma
de matriz estequiométrica, onde as 247 linhas se referem aos metabólitos e as 245 colunas aos
fluxos (reações metabólicas). Construída a matriz estequiométrica incluíram-se as restrições
no modelo definindo-se que, dentre esses 247 metabólitos, 186 referem-se aos metabólitos
intermediários, que estão em pseudo-estado estacionário, 29 referem-se aos produtos do
metabolismo e 30 referem-se aos substratos presentes no meio de cultivo.
A termodinâmica foi levada em consideração através da reversibilidade dos fluxos.
Considerou-se que 33 fluxos eram reversíveis e 212 irreversíveis (especificação no Apêndice
B), através da imposição da Equação 23 para os fluxos irreversíveis.
0
≥
j
v
(23)
O pseudo-estado estacionário foi imposto para os metabólitos intermediários e regido
pela Equação 24, impondo taxa zero para essas reações.
0
1
,,
==
∑
=
j
J
j
ijimet
gr
ν
(24)
Para os produtos do metabolismo foi levado em consideração que as taxas dessas
reações são positivas ou iguais a zero, conforme Equação 25.
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0
1
,,
≥=
∑
=
J
j
iijip
r
νβ
(25)
Para os substratos presentes no meio de cultivo foram impostas restrições de igualdades
baseado nas velocidades específicas de consumo de cada um dos substratos na condição
estudada (parâmetros experimentais).
Foram estudadas duas condições de otimização, maximização do crescimento celular e
maximização da produção de cosmomicina. Ao maximizar o crescimento celular foi imposta
uma restrição de igualdade para a velocidade específica de produção de cosmomicina e vice
versa, baseado em dados da literatura. Além das restrições de igualdade um modelo difere do
outro pela definição da função objetivo.
Uma vez formuladas as retrições gerais no modelo, definiram-se as funções objetivo
específicas para cada modelo.
No modelo que prioriza o crescimento celular a definição da função objetivo foi dada
pela Equação 26.
)()( vrvZ
BIOBio
=
(26)
E no modelo que prioriza a produção de cosmomicina a definição da função objetivo foi
dada pela Equação 27.
)()( vrvZ
CosCos
= (27)
4.1.6. Construção do mapa de fluxos metabólicos
Com o objetivo de elucidar a distribuição de fluxos dentro dessa rede de reações
metabólicas e de facilitar a análise de fluxos metabólicos, um mapa de fluxo foi projetado
usando Excel. Nesse mapa, o fluxo de materiais (iniciando do substrato) para vários
intermediários, biomassa e produtos dentro da rede metabólica foi descrito. Este mapa pode
fornecer os relevantes fluxos metabólicos calculados (resultados do programa) e assim revelar
o grau de comprometimento de cada rota no processo metabólico em geral. Entretanto, o
mapa de fluxo é uma representação compacta do metabolismo celular em uma determinada
condição.
Materiais e Métodos
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4.1.6.1. Mapa de distribuição de fluxos metabólicos
Um mapa metabólico foi projetado para elucidar as rotas e suas interconecções na rede
de reações bioquímicas. Como existem muitas reações na rede bioquímica, a apresentação de
todas as rotas metabólicas necessita de um grande espaço. Com o objetivo de resolver
parcialmente esse problema, algumas reações foram agrupadas dentro das rotas metabólicas.
Mesmo assim foi impossível mostrar todas as rotas no mapa. A Figura 4.4 mostra o mapa de
fluxos metabólicos proposto para ser utilizado na análise de fluxos metabólicos de
Streptomyces olindensis ICB20. Esse mapa inclui as reações envolvidas na rota glicolítica,
biossíntese de carboidratos, via das pentoses fosfato, reações do ácido fosfórico, unidades dos
açúcares polipeptídicos, biossíntese de ácidos graxos, biossíntese da família dos aminoácidos
histidina, aromáticos, serina, aspartato, alanina e glutamina, ciclo de Krebs, transferência de
elétrons e fosforilação oxidativa como também a de biossíntese de cosmomicina.
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Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA
NH3
v8 v7 v6 v5 v4 v3 v2 v1 v11...v28 v9
Glco ADPGlc
Glicólise Biossíntese de
His
v65 v64
Histidina
v113
G1P v31 PRPP
v63
Biossíntese de carboidratos
v42 v43
G6P Ru5P
Açúcares
v44 v139
polipeptídicos
Reações de ácido fólico
v32 v47
G1P THF Form MTHF R5P
v211 v169 v170 v171 v172 F6P S7P
v216 ForTHF MetTHF MeTHF v34 v45
EstPyr
PGA3 XyL5P
v212
Biossíntese
v37
v213
família do
Gly v115 Ser v46
OdiGlu
Serina
v114 PG3 E4P
v218 Cys v117
Pentose fosfato
v162 v39
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc
dRodo
Biossíntese Aromáticos
Phe
família do Aspartato
v79 v80 v81
Adomet Ile PEP Chor Prep
v122 v103 v60 v62 v83
C
Met Thr v40 v84 v86 Tyr
O
v121 v120 v91 Pyr Trp
S
Rhod Hcy Hse v59
M
MaCoA v95 v90 v110 Ala Leu
O
v206 Lys AspSA v61 v48 v97 v100
M
v207 ProCoA v88 v89 OIV
I
Asn Asp AcCoA
Biossíntese
v98
C
v198 v87 v194
família do Alanina
Val
I
MaCoA
N Biossíntese da
A Cos
v67 v66 OAA Cit v50 Icit
família do Glutamato
v49 GluSA Pro
Biossíntese de
v56 v51 v104 v105
Ácidos graxos
MaACP AcACP Mal Glx v161
Palm HexACP v58 v57 OG Glu Gln
v69 v68 v55 AcCoA v52 v153 v154
v106
NADH v189 v188 Fum Suc SucCoA Orn
ATP ADP v54 v53 v107
FADH2 v190
Ciclo do ácido tricarboxílico
Transporte de elétrons
Citr Arg
e fosforilação oxidativa
v109
Fluxos de saída
v186 v219 v221 v222 v223 v224 v225 v226 v220
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 4.4. Mapa metabólico proposto para representar a distribuição de fluxos em
Streptomyces olindensis ICB20.
Materiais e Métodos
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4.2. Cultivo microbiano
4.2.1. Micro-organismo
A linhagem mutante de Streptomyces olindensis, ICB20, utilizada nos cultivos foi
fornecida pelo Laboratório de Engenharia Bioquímica do Departamento de Engenharia
Química da Escola Politécnica da Universidade de São Paulo (LEB/DEQ/POLI/USP) e
pertence ao Laboratório de Genética de Micro-organismos do Instituto de Ciências
Biomédicas da USP (LG/ICB/USP).
A cultura estoque foi mantida congelada sob a forma de micélio em glicerol 20% p/v
em nitrogênio líquido. Esta cultura foi obtida a partir de cultivos realizados em incubador
rotativo, utilizando-se o meio R5 modificado (R5Mod) descrito no item 4.2.3 (Guimarães,
2005).
4.2.2. Preparo do estoque e conservação da cepa
O estoque de células de Streptomyces olindensis ICB20 foi obtido a partir da
metodologia definida por Guimarães (2000) com algumas modificações. O meio de cultivo
utilizado durante o preparo do estoque foi o meio R5Mod.
O preparo do estoque e a conservação da linhagem mutante ICB20 foram realizados
da seguinte forma:
• O micélio congelado de Streptomyces olindensis ICB20, mantido em
nitrogênio líquido, foram utilizados como inóculo em placas de petri contendo
meio glicosado sólido, descrito no item 4.2.3.1;
• Os tubos foram mantidos em estufa a 27°C por um período de 10 dias;
• As culturas de S. olindensis ICB20 contidas nas placas de petri foram então
ressuspendas em 5 mL de glicerol 20%;
• Os Erlenmeyers de 500 mL contendo 45 mL de meio R5Mod foram inoculados
com 5 mL de suspensão de células provenientes das placas de petri;
• Os Erlenmeyers foram inoculados em agitador rotativo, por 16 horas a 200 rpm
e 30 °C;
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• Os conteúdos de todos os Erlenmeyers foram transferidos para um único
Erlenmeyer e 50 mL desta suspensão de células foram transferidas para frascos
de 2000 mL, contendo 450 mL de meio R5Mod;
• Os frascos foram inoculados em incubador rotativo, por 24 horas a 30 °C e 200
rpm;
• Após esse período de incubação, as células foram lavadas duas vezes com
solução salina e ressuspensas em solução de glicerol 20% (p/p), na proporção
de 60 mL de glicerol para 100 mL de suspensão de células
• As células foram mantidas a – 20 °C, em tubos de ensaio contendo 10 mL de
células cada.
4.2.3. Meios de Cultura
4.2.3.1. Meio Glicosado Sólido
Esse meio foi utilizado para o preparo do estoque. A composição do meio glicosado
está descrita a seguir em g/L:
Glicose ..............................................................10,0
Extrato de carne ..................................................3,0
Peptona ................................................................5,0
O meio de cultura foi preparado dissolvendo-se os nutrientes em água destilada e o pH
foi ajustado em torno de 5,5 com solução de HCl 2N. Posteriormente, foram adicionados 20,0
g/L de ágar.
4.2.3.1. Meio líquido R5Mod
No preparo do estoque de células e nos pré-cultivos realizados em incubador rotativo
foi utilizado o meio líquido R5Mod, um meio complexo contendo a seguinte composição
(g/L) (Furlan, 1997); (Guimarães, 2000); (Martins, 2001) e (Pamboukian, 2003):
Materiais e Métodos
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Glicose ...................................................................10,00
Extrato de levedura ..................................................5,00
Casaminoácidos .......................................................0,10
Tris(hidroximetil)aminometano ..............................3,09
K
2
SO
4
......................................................................0,25
MgCl
2
. 6H
2
O .........................................................10,12
Após esterilização em autoclave por 20 minutos a 120°C, foram adicionadas as
seguintes soluções (mL em 250mL): KH
2
PO
4
0,5 % p/v (2,5); CaCl
2
5M (1,0) e elementos-
traço (0,5).
Estas soluções também foram preparadas, dissolvendo-se os reagentes em água
destilada e acertando o volume para obter-se a concentração desejada.
A esterilização das soluções de CaCl
2
e KH
2
PO
4
foi realizada em autoclave por 20
minutos a 120 °C e a esterilização da solução de elementos-traço foi realizada por filtração a
vácuo em câmara de fluxo laminar, utilizando conjunto de filtração com membrana Millipore
0,20 µm, também esterilizado em autoclave a 120 °C por 20 minutos.
A composição da solução de elementos-traço consiste de (em 1000 mL): 40 mg ZnCl
2
,
200 mg FeCl
3
.6H
2
O, 10 mg CuCl
2
.2H
2
O, 10 mg MnCl
2
.4H
2
O, 10 mg Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O, 10 mg
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O.
4.2.4. Preparo do inóculo
O inóculo foi preparado em duas etapas, de acordo com a metodologia proposta por
Guimarães (2000) onde a primeira parte se refere ao pré-inóculo e a segunda ao inóculo.
4.2.4.1. Pré-inóculo
Erlenmeyers de 1L, contendo 90 mL de meio de cultura (meio R5 Mod) foram
inoculados com 10 mL de uma suspensão de células conservadas sob congelamento em
solução de 20% de glicerol (v/v) a -20°C. Os Erlenmeyers foram mantidos em incubador
rotativo por 16 horas, a 30°C e 200 rpm. Ao final, os conteúdos dos dois frascos foram
reunidos para utilização na segunda etapa.
Materiais e Métodos
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4.2.4.2. Inóculo
Erlenmeyers de 1 L, contendo 180 mL de meio de cultura (meio R5 Mod), foram
inoculados com 20 mL da suspensão de células obtidas na primeira etapa. Os Erlenmeyers
foram mantidos em incubador rotativo por 24 horas, a 30°C e 200 rpm. Ao final, os conteúdos
dos dois frascos foram reunidos para inoculação dos Erlenmeyers que foram para o incubador
rotativo.
4.2.5. Cultivos descontinuos
Foram realizados dois cultivos descontínuos. No ensaio 1 foi empregado o meio R5
Mod e no ensaio 2 o meio R5 Mod com uma maior concentração de extrato de levedura (20
g/L) a fim de verificar o aumento da produção de cosmomicina baseado na proposta do
modelo metabólico de análise de fluxos.
Os ensaios descontínuos foram realizados em incubador rotativo (Tecnal TE-421), em
Erlenmeyers de 250 mL, nas seguintes condições: agitação de 200 rpm e temperatura de
30°C. Foram incubados 12 Erlenmeyers nos quais foram adicionados 180 mL de meio e 20
mL de inóculo.
4.2.5.1. Procedimento de amostragem
Foram retiradas amostras de 4 em 4 horas durante as primeiras 20 horas de cultivo, de
2 em 2 horas entre 20 e 24 horas de cultivo, de 4 em 4 horas entre 24 e 32 horas de cultivo e
de 12 em 12 horas entre 32 e 44 horas de cultivo com a finalidade de acompanhar o
crescimento celular, o consumo de glicose e a produção do complexo retamicina.
4.2.6. Metodologias analíticas
4.2.6.1. Determinação da concentração celular (X)
Durante os cultivos, a concentração celular do micro-organismo, em termos de massa
seca, foi determinada da seguinte forma (Guimarães, 2000 adaptado):
Materiais e Métodos
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Amostras de 20 g foram retiradas do incubador rotativo e colocadas em tubos de
centrífuga, previamente pesado (M
ts
). Essas amostras foram pesadas (M
a
), e após
centrifugadas por 20 minutos a 5000 rpm e 5°C em uma centrífuga refrigerada, foi retirado o
sobrenadante. As amostras foram ressuspensas em água destilada com repetição desta
operação por duas vezes. As lavagens foram feitas com o objetivo de retirar parte das
impurezas contidas no meio. Após a segunda lavagem, as amostras foram colocadas na estufa
à 85°C por 24 horas. As células secas foram resfriadas em dessecador por 15 minutos e
pesada até peso constante (M
as
).
A concentração celular, em termos de massa seca, foi determinada pela Equação 28.
(
)
a
tsas
M
dMM
X
.
−
= (28)
Onde:
d = densidade da amostra (considerada 1000 g/L);
M
a
= massa da amostra (g);
M
ts
= massa do tubo seco (g);
M
as
= massa do tudo contendo a massa seca de células (g);
X = concentração celular, em termos de massa seca (g/L).
4.2.6.2. Determinação da concentração de glicose (S)
A dosagem de glicose das amostras foi realizada pelo método de DNS baseado na
redução do ácido dinitro-salicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico ao mesmo tempo em que
o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico, com o desenvolvimento da
coloração avermelhada, lida espectofotometricamente em 590 nm (Miller, 1959).
Para essa determinação foram utilizadas amostras com 1 mL dos sobrenadantes obtidos
no item 4.2.6.1. A essas amostras foram adicionados 1 mL do reagente DNS (ver Apêndice D)
e levaram-se os tubos para o banho termostatizado a 100°C por 5 minutos. Após as amostras
serem retiradas do banho foram deixadas por 3-5 minutos em banho de gelo. Ao atingirem a a
temperatura ambiente foram adicionados 8 mL de água destilada, depois foram agitadas em
vortex e feita a leitura da absorbância a 590 nm, utilizando-se como branco uma amostra com
1mL de água destilada no lugar de 1mL da amostra.
Materiais e Métodos
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Uma curva de calibração foi construída e apresentada no Apêndice D, a qual
correlaciona a concentração de glicose com a leitura de absorbância através da Equação 29.
138,0.114,8
−
=
ABSS ( 9985,0
2
=R ) (29)
4.2.6.3. Determinação da concentração de retamicina extracelular (Re)
A determinação da concentração de retamicina extracelular durante os cultivos foi
realizada utilizando a metodologia desenvolvida por Guimarães (2000), da seguinte forma:
• Uma alíquota de 5 mL do sobrenadante obtido (item 4.2.6.1) foi transferido
para um Becker de 50 mL;
• O pH da alíquota foi ajustado para 6,3 com HCl 0,02 N;
• A alíquota foi transferida quantitativamente para um balão volumétrico de 10
mL completando-se o volume com água destilada, obtendo uma diluição de 2:1
(volume total: volume da amostra);
• Cerca de 3 mL da amostra foi transferida para uma cubeta de quartzo;
• A absorbância foi lida em espectrofotômetro digital de UV-visível da Thermo
Spectronic modelo Genesys 10uV, a 547 nm;
• A concentração de retamicina extracelular foi determinada a partir de uma
curva de calibração obtida pelo Laboratório de Química de Produtos Naturais
do Instituto de Química da USP, conforme as Equações 30 e 31.
0116,0.7326,2Re
*
−= ABS ( 9980,0
2
=R ) (30)
Dil.ReRe
*
= (31)
Onde:
ABS = absorbância a 547 nm;
Dil = fator de diluição da amostra (Dil = 2);
Re = concentração de retamicina na amostra do incubador rotativo (g/L);
Re
*
= concentração de retamicina na amostra diluída (g/L).
Materiais e Métodos
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A utilização dessa curva se deve ao fato de não se possuir um produto comercial puro, a
curva de calibração foi levantada a partir do complexo retamicina parcialmente purificado.
Portanto, essa curva de calibração superestima a concentração de retamicina, embora
proporcione a obtenção de resultados comparativos entre os ensaios.
Na obtenção dessa curva empregou-se soluções de diferentes concentrações do
complexo retamicina parcialmente purificado, a pH 6,3, em metanol. A curva é válida para
faixa de absorbância entre 0,2 e 0,8 e para pH 6,3. Devido ao fato das antraciclinas serem
compostos com propriedade de indicadores de pH (Arcamone, 1969), possuindo coloração
vermelha em meio ácido e violeta em meio básido, foi necessário o ajuste de pH para 6,3, a
fim de se evitar erro na determinação.
4.2.6.4. Determinação da concentração de retamicina intracelular (Ri)
A determinação da concentração de retamicina intracelular foi realizada utilizando-se a
metodologia desenvolvida por Guimarães (2000), com as alterações propostas por Silva et al.
(2000) da seguinte forma:
• Foram retiradas amostras do incubador rotativo e pesadas com cerca de 30 g
em balança analítica em um tubo de centrífuga previamente pesado;
• As amostras foram centrifugadas por 20 minutos a 5000 rpm e 5°C em uma
centrífuga refrigerada;
• Os sobrenadantes foram descartados e as células ressuspensas em água
destilada (etapa de lavagem das células, para retirada do resíduo de retamicina
extracelular);
• As amostras foram novamente centrifugadas por 20 minutos a 5000 rpm e 5°C
em uma centrífuga refrigerada;
• Os sobrenadantes foram descartados e os tubos da centrífuga pesados com as
células úmidas;
• As células úmidas foram ressuspensas em metanol na proporção de 16 mL de
metanol por grama de células úmidas, como mostram as Equações 32 e 33.
tstuu
MMM −= (32)
umet
MV .16= (33)
Materiais e Métodos
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Onde:
M
ts
= massa do tubo de centrífuga (g);
M
tu
= massa do tubo de centrífuga com as células úmidas (g);
M
u
= massa das células úmidas (g);
V
met
= volume de metanol para ressuspender as células (mL).
• As células com metanol foram mantidas em banho de ultra-som por 25
minutos, para promover a extração da retamicina intracelular;
• A seguir, as células suspensas em metanol foram mantidas sob agitação em
incubador rotativo a 200 rpm e 30°C por uma hora;
• Após o período de incubação as células foram centrifugadas por 20 minutos a
5000 rpm e 5°C;
• Amostras de cerca de 3 mL do sobrenadante foram transferidas para uma
cubeta de quartzo;
• A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 547 nm;
• Os sedimentos foram secados em estufa a 85ºC por 24 horas, tempo necessário
para se obter massa constante;
• Os tubos de centrífuga com as células foram resfriados em dessecador por 15
minutos e pesados com as células secas em balança analítica.
A concentração de retamicina intracelular, expressa por volume de meio, foi calculada
da seguinte forma:
Cálculo da massa de células secas:
tstcsc
MMM −= (34)
Onde:
M
c
= massa das células secas (g);
M
ts
= massa do tubo de centrífuga (g);
M
tcs
= massa do tubo de centrífuga com as células secas (g);
Materiais e Métodos
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Cálculo do volume de água contida nas células úmidas:
água
cu
água
d
MM
V
)(
−
=
(35)
Onde:
d
água
= densidade da água (1,0 g/mL);
M
c
= massa das células secas (g);
M
u
= massa das células úmidas (g);
V
água
= volume de água contida nas células úmidas (mL).
Cálculo do volume total de líquido na extração com metanol:
águametlíq
VVV += (36)
Onde:
V
água
= volume de água contida nas células úmidas (mL);
V
líq
= volume total de líquido na extração com metanol (mL);
V
met
= volume de metanol para ressuspender as células (mL).
Cálculo da massa de retamicina no líquido após a extração:
−=
1000
).0116,0.7326,2(
líq
Ri
V
ABSM
(37)
Onde:
ABS = absorbância a 547 nm;
M
Ri
= massa de retamicina no líquido após a extração (g);
V
liq
= volume total de líquido na extração com metanol (mL).
Materiais e Métodos
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Cálculo da concentração de retamicina intracelular por volume de meio:
a
Ri
i
V
M
R =
(38)
Onde:
M
Ri
= massa de retamicina no líquido após a extração (g);
V
a
= volume da amostra, aproximadamente igual à massa da amostra pesada
inicialmente, considerando-se sua densidade igual a 1,0 g/mL (mL).
Capítulo 5
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 100
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Validação do modelo metabólico de Streptomyces olindensis ICB20
Baseado na escolha das reações descritas no item 4.1.2 e nos conceitos de análise de
fluxos metabólicos propõe-se um modelo metabólico para simular a natureza do metabolismo
de Streptomyces olindensis ICB20. Com o intuito de verificar se o modelo proposto é
preditivo, obteve-se a distribuição de fluxo para dois diferentes objetivos: maximização do
crescimento celular e maximização da produção do produto secundário, cosmomicina. A
validação do modelo foi feita comparando-se os resultados obtidos pelo modelo (resultados
computacionais) com os experimentais obtidos por Pamboukiam (2003) em cultivo contínuo.
5.1.1. Descrição do meio complexo
A utilização de meio complexo pode induz a um aumento no rendimento de processos
fermentativos, uma vez que contém precursores que podem ser usados diretamente dentro das
rotas anabólicas, reduzindo o requerimento energético para sua produção (Hahn-Hägerdal et
al., 2005). No que diz respeito à modelagem desses processos, a utilização desses meios pode
gerar problemas, uma vez que as exatas concentrações iniciais de carbono e nitrogênio não
estão bem definidas. Entretanto, ainda é possível modelar e obter interessantes predições se
forem feitos alguns ajustes ou restrições. Nesse trabalho, a velocidade específica de
crescismento celular e a taxa de produção de antibiótico em cultivo de S. olindensis ICB20 em
meio complexo foram investigadas.
As simulações foram baseadas nos dados experimentais de Pamboukian (2003), que
utilizou o meio complexo R5Mod descrito no item 4.3.2.1, meio esse que serviu de base para
os ensaios experimentais realizados.
Alguns resultados experimentais de cultivos contínuos são mostrados na Tabela 5.1 e
Figura 5.1.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 101
Tabela 5.1. Dados de cultivo contínuo de S. olindensis ICB20 usando meio complexo
(Pamboukian, 2003).
Vazão específica de alimentação (h
-1
) X (g/L) S (g/L)
P(g/L)
NH
4
(g/L)
0,03 4,53 0,10 2,72 0,0041
0,05 4,89 1,53 3,82 0,0025
0,10 5,39 3,70 1,28 0,0044
0,20 3,86 4,80 0,40 0,0005
0,30 2,41 7,00 0,00 0,1472
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
0
1
2
3
4
5
6
7
X S P NH
4
Vazão específica de alimentação (h
-1
)
Concentração X, S, P (g/L)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Concentração de NH
4
(g/L)
Figura 5.1. Concentração celular (X), concentração de glicose (S), concentração de nitrogênio
(NH
4
) e concentração de retamicina (P) em cultivos contínuos de S. olindensis ICB20, usando
meio complexo, sob diferentes vazões específicas de alimentação (Pamboukian, 2003).
Para a simulação algumas informações adicionais foram necessárias. Como o meio
complexo usado para fermentação contém extrato de levedura de Saccharomyces cerevisiae,
foi necessário conhecer sua composição (Tabela 5.2) e a composição de casaminoácidos,
outro componente do meio (Tabela 5.3). Essas composições foram obtidas convertendo a
porcentagem de cada aminoácido para mmol.L
-1
através da Equação 39.
L
g
mol
mmol
gPM
mol
L
mmol
5
1
1000
)(
1
100
%
×××
=
(39)
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 102
Tabela 5.2. Composição de aminoácidos em 5 g/L de extrato de levedura (DIFCO).
Aminoácidos % PM mmol AA.L
-1
Alanina 5,36 89 3,0112
Arginina 3,02 174 0,8678
Ácido aspártico 6,69 133 2,5150
Cistina 0,74 121 0,3058
Ácido glutâmico 14,20
147 4,8299
Glicina 3,25 75 2,1667
Histidina 1,20 155 0,3871
Isoleucina 3,23 131 1,2328
Leucina 4,69 131 1,7901
Lisina 5,15 146 1,7637
Metionina 1,05 149 0,3523
Fenilalanina 2,53 165 0,7667
Prolina 2,60 115 1,1304
Serina 2,84 105 1,3524
Treonina 2,95 119 1,2395
Triptofano 1,36 204 0,3333
Tirosina 1,20 181 0,3315
Valina 3,79 117 1,6197
http://www.voigtglobal.com/Anonymous/DIFCO_Yeast_Agar_Formulations.pdf
Tabela 5.3. Composição de aminoácidos em 0,1 g/L de casaminoácidos (US Biological).
Aminoácidos % PM mmol AA.L
-1
Alanina 2,80 89 0,0315
Arginina 3,60 174 0,0207
Ácido aspártico 6,30 133 0,0474
Cistina 0,30 121 0,0025
Ácido Glutâmico
21,10 147 0,1435
Glicina 2,20 75 0,0293
Histidina 2,70 155 0,0174
Isoleucina 5,60 131 0,0427
Leucina 8,40 131 0,0641
Lisina 7,50 146 0,0514
Metionina 2,70 149 0,0181
Fenilalanina 4,60 165 0,0279
Prolina 9,90 115 0,0861
Serina 5,60 105 0,0533
Treonina 4,20 119 0,0353
Triptofano 1,10 204 0,0054
Tirosina 6,10 181 0,0337
Valina 5,00
117
0,0427
http://www.usbio.net/Product.aspx?ProdSku=C2080
Além de aminoácidos, o extrato de levedura também contém uma porcentagem de
carboidrato e fosfato. Os quais também foram usados como dados de entrada no programa. A
Tabela 5.4 mostra esses valores.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 103
Tabela 5.4. Composição de carboidrato e fosfato em 5 g/L de extrato de levedura.
Componentes
% PM mmol.L
-1
Carboidrato 17,50
162
5,4012
Fosfato 3,27
95
1,7211
A quantidade de fosfato total no meio de cultura foi obtida somando a quantidade de
fosfato da solução de KH
2
PO
4
e do extrato de levedura (1,7211 + 0,3676 = 2,0887
mmolPO
4
.L
-1
).
Sabe-se que a quantidade de nitrogênio total no extrato de levedura é de 10.9%
(DIFCO), ou seja, 38,9286 mmolN.L
-1
. Como apenas 33,9857 mmolN.L
-1
é proveniente dos
aminoácidos do extrato de levedura, 4,9429 mmolN.L
-1
é proveniente de alguma outra fonte de
nitrogênio no extrato de levedura. Este então é usado como dado de entrada de concentração
de nitrogênio (M
NH
3
).
Com essas informações as taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato e fosfato
foram calculadas para as vazões específicas de alimentação 0,03, 0,05 e 0,10 (Tabela 5.5). A
escolha dessa faixa de diluição se deu por apresentar os maiores valores de produção de
cosmomicina. A exclusão das outras vazões específicas de alimentação (0,2 e 0,3) no estudo
ocorreu devido à brusca queda no crescimento celular quando a vazão específica de
alimentação (D) tende a esses valores. Provavelmente devido a D se aproximar do valor de
µ
máx
e do valor da concentração de glicose tender ao máximo (S = S
0
) caracterizando um
estado estacionário de lavagem. Situação no qual ocorre um arraste das células do reator
gerando uma região de instabilidade de operação do reator.
As taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio foram obtidas
multiplicando-se a concentração (mmol.L
-1
) de cada componente pela vazão específica de
alimentação (h
-1
) e dividindo-se pela quantidade de biomassa (g/L), Equação 41 (Atkinson &
Mavituna, 1991). Deduzida pela Equação 40 que rege o sistema estacionário em sistemas
contínuos, supondo que esses substratos são totalmente consumidos.
0)(
,,,
=−−
is
f
isis
ccDxr
(40)
Ou seja,
x
cD
r
is
is
)(
,
,
=
(mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) (41)
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 104
Tabela 5.5. Cálculo das taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato e fosfato.
D (h
-1
) 0,03 0,05 0,10
X (g/L)
4,53 4,89 5,39
Componentes do extrato de
levedura e do casaminoácidos
C (mmol.L
-1
)
r (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
)
Alanina 3,0427 0,0198
0,0287
0,0553
Arginina 0,8885 0,0058
0,0084
0,0162
Ácido aspártico 2,5624 0,0167
0,0242
0,0466
Cistina 0,3083 0,0020
0,0029
0,0056
Ácido glutâmico 4,9735 0,0324
0,0469
0,0904
Glicina 2,1960 0,0143
0,0207
0,0399
Histidina 0,4045 0,0026
0,0038
0,0074
Isoleucina 1,2756 0,0083
0,0120
0,0232
Leucina 1,8542 0,0121
0,0175
0,0337
Lisina 1,8151 0,0118
0,0171
0,0330
Metionina 0,3705 0,0024
0,0035
0,0067
Fenilalanina 0,7945 0,0052
0,0075
0,0144
Prolina 1,2165 0,0079
0,0115
0,0221
Serina 1,4057 0,0092
0,0133
0,0256
Treonina 1,2748 0,0083
0,0120
0,0232
Triptofano 0,3387 0,0022
0,0032
0,0062
Tirosina 0,3652 0,0024
0,0034
0,0066
Valina 1,6624 0,0108
0,0157
0,0302
Carboidrato 5,4012 0,0352
0,0510
0,0982
Fosfato 2,0887 0,0136
0,0197
0,0380
Nitrogênio 4,9429 0,0322
0,0466
0,0899
As taxas de consumo desses substratos foram usadas como dados de entrada no
modelo computacional em GAMS. Outras restrições, como velocidade específica de
crescimento celular, velocidade específica de consumo de glicose, oxigênio e nitrogênio,
como também velocidade específica de formação de produto, foram obtidas por Pamboukian,
2003 (Tabela 5.6) e utilizadas como dados de entrada no modelo.
Tabela 5.6. Valores experimentais das velocidades específicas em diferentes vazões
específicas de alimentação no cultivo de S. olindensis ICB20 (Pamboukian, 2003).
D
(h
-1
)
µ
µµ
µ
x
(h
-1
)
µ
µµ
µ
s
(mmol.gcél
-1
.h
-1
)
µ
µµ
µ
p
(mmol.gcél
-1
.h
-1
)
r
O
2
(mmol.gcél
-1
.h
-1
)
r
NH
3
(mmol.gcél
-1
.h
-1
)
0,0300
0,0300 0,3333 0,0168 0,9000 0,0014
0,0500
0,0500 0,5000 0,0303 2,5000 0,0013
0,1000
0,1000 0,6111 0,0210 2,5000 0,0006
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 105
5.1.2. Comparação dos dados computacionais com os experimentais
Os valores experimentais foram usados no modelo com o objetivo de comparar as
velocidades específicas de crescimento e de produção de antibiótico observadas
experimentalmente, em diferentes vazões específicas de alimentação, com as obtidas pelo
modelo computacional.
A otimização (maximização) da velocidade específica de crescimento celular (G)
(Figura 5.2) e de formação de produto (COS) (Figura 5.3) foram simuladas em GAMS para as
duas situações a seguir:
• G
1
e COS
1
– Não se utilizaram as restrições com referência aos componentes de
extrato de levedura e do casaminoácidos, mas levou-se em consideração que esses
substratos são ricos em aminoácidos, ou seja, todas as velocidades de consumo de
aminoácidos foram deixadas livres para o programa calcular. Em adição, não foram
levadas em consideração as velocidades de consumo de carboidrato, de amônia
excedente e fosfato proveniente do extrato de levedura (r
CHO
=0, r
NH
3
*=0, r
PO
4
= 0);
• G
2
e COS
2
– Onde todas as restrições com relação aos componentes do extrato de
levedura e do casaminoácidos foram usadas como entradas no programa (r
AA
, r
CHO
,
r
NH
3
*, r
PO
4
).
Conforme pode ser visto nas Figuras 5.2 e 5.3, os resultados obtidos
computacionalmente mostram que para o caso sem restrições (G
1
e COS
1
) foram obtidos
maiores valores, teóricos, de crescimento celular e produção de antibiótico. Já no caso onde se
levaram em consideração as restrições (G
2
e COS
2
), uma situação mais realista, tanto o
crescimento quanto a produção do antibiótico foram muito similar aos valores experimentais.
Quando foi permitido que as velocidades específicas de consumo de aminoácidos fossem
calculadas pelo modelo, foram obtidos valores de fluxos muito distantes dos valores
experimentais, entretanto isso pode ser um indicativo da máxima capacidade do micro-
organismo em obter esses rendimentos. Esses resultados indicam que a composição de
aminoácidos no meio de cultivo é uma variável importante tanto para o crescimento celular
quanto para a produção de cosmomicina.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 106
0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
µ
x
Experimental µ
x
Computacional G
1
µ
x
Computacional G
2
Velocidade específica de crescimento celular (h
-1
)
Vazão específica de alimentação (h
-1
)
Figura 5.2.Velocidades específicas de crescimento celular, computacional e experimental, em
função das vazões específicas de alimentação em cultivos contínuos de S. olindensis ICB20
sem (G
1
) e com (G
2
) as restrições de taxa de consumo dos componentes do extrato de
levedura e do casaminoácidos.
0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
µ
p
Experimental
µ
p
Computacional COS
1
µ
p
Computacional COS
2
Velocidade específica de produção de cosmomicina
(mmol/gcel.h))
Vazão específica de alimentação (h
-1
)
Figura 5.3. Velocidades específicas de formação de produto, computacional e experimental,
em função das vazões específicas de alimentação em cultivos contínuos de S. olindensis
ICB20 sem (COS
1
) e com (COS
2
) as restrições de taxa de consumo dos componentes do
extrato de levedura e do casaminoácidos.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 107
O modelo com as restrições de aminoácidos (G
2
e COS
2
) mostrou habilidade para
predizer o metabolismo celular de Streptomyces olindensis em diferentes condições de
cultivo. Essa habilidade permitiu a verificação da validade do modelo de fluxo metabólico e
mostrou sua utilidade para o planejamento de bioprocessos.
Propoe-se então trabalhar com o modelo metabólico proposto utilizando as restrições
descritas na condição 2 para proseguir o estudo de análise de fluxos metabólicos de
Streptomyces olindensis ICB20.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 108
5.2. Aplicação da modelagem metabólica
Com o objetivo de analisar os fluxos metabólicos obtidos pelo modelo foram realizados
diferentes tipos de simulações. Ao estudar o metabolismo de Streptomyces olindensis
variando a vazão específica de alimentação foram identificados quais os fluxos que
mostraram mudanças significativas ao direcionar o metabolismo para o crescimento celular ou
para produção de cosmomicina. Diante da melhor condição de produção de cosmomicina,
obtida por Pamboukian (2003), foi realizado um estudo mais detalhado da distribuição dos
fluxos identificando os fluxos mais importantes, como também os mais sensíveis as variações,
ao mudar a função objetivo. A partir desse estudo, foram identificados pontos do metabolismo
que podem ser modificados para aumentar a produção de cosmomicina e essa proposta foi
testada in silico. Outra simulação foi feita com o objetivo de verificar como a limitação de
diferentes substratos pode interferir na produção de cosmomicina. A influência do extrato de
levedura também foi verificada utilizando análise de fluxos metabólicos. Com o objetivo de
validar experimentalmente a proposta feita pela modelagem, foram realizados experimentos
em incubador rotativo.
5.2.1. Análise de fluxos metabólicos em diferentes vazões específicas de
alimentação
Utilizando o modelo metabólico proposto, obteve-se a distribuição de fluxo em
diferentes vazões específicas de alimentação (0,03, 0,05, 0,1 h
-1
). Ao analisar essa distribuição
foi verificado que apenas alguns fluxos mostraram mudanças significativas ao variar as
condições de cultivo. Os valores desses fluxos metabólicos mais significantes são mostrados
nas Figuras 5.4 e 5.5, quando o crescimento celular foi utilizado como função objetivo para
otimização, e nas Figuras 5.6 e 5.7, quando a produção de cosmomicina foi maximizada.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 109
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2
0,9
H Gro GLC FACoA ACP AA
NH3
v8 v7 v6 2,5 v5 v4 v3 v2 v1 v11...v28 v9
2,5
Glco ADPGlc
Glicólise Biossíntese de
His
v65 v64
Histidina
v113
G1P v31 PRPP
v63
Biossíntese de carboidratos
v42 v43
G6P Ru5P
Açúcares
v44 v139
polipeptídicos
Reações de ácido fólico
v32 v47
G1P THF Form MTHF R5P
v211 v169 v170 v171 v172 F6P S7P
v216 ForTHF MetTHF MeTHF v34 v45
EstPyr PGA3 XyL5P
v212
Biossíntese
v37
v213
família do
Gly v115 Ser v46
OdiGlu
Serina
v114 PG3 E4P
v218 Cys v117
Pentose fosfato
v162 v39
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc
dRodo
Biossíntese Aromáticos
Phe
família do Aspartato
v79 v80 v81
Adomet Ile PEP Chor Prep
v122 v103 v60 v62 v83
C
Met Thr v40 v84 v86 Tyr
O
v121 v120 v91 Pyr Trp
S
Rhod Hcy Hse v59
M
MaCoA v95 v90 1,18 v61 v48 v110 Ala Leu
O
v206 Lys AspSA 3,62 0,71 v97 v100
M
v207 ProCoA v88 v89 4,13 1,91 OIV
I
Asn Asp AcCoA 3,37
Biossíntese
v98
C
v198 v87 v194
família do Alanina
Val
I
MaCoA
N Biossíntese
A Cos
v67 v66 OAA Cit v50 Icit
família do Glutamato
v49 0,00 GluSA Pro
Biossíntese de
v56 v51 0,00 v104 v105
Ácidos graxos
MaACP AcACP Mal Glx -1,60 v161
Palm HexACP v55 0,00 v58 0,00 v57 OG Glu Gln
v69 v68 1,07 0,00 AcCoA 0,00 v52 v153 v154
1,07 3,16 1,63 1,63 v106
NADH v189 2,20 v188 3,07 Fum Suc SucCoA Orn
0,69 3,08 ATP ADP v54 v53 v107
FADH
2
2,74 v190
Ciclo do ácido tricarboxílico
1,87
Transporte de elétrons
Citr Arg
e fosforilação oxidativa
v109
1,35
Fluxos de saída
v186 v219 v221 3,59 v222 v223 v224 v225 v226 v220
Biomassa Ac CO2
3,51
Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.4. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos que
mostraram mudanças significativas (em azul) durante o cultivo nas vazões específicas de
alimentação 0,03, 0,05 e 0,1 h
-1
ao otimizar a velocidade específica de crescimento celular.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 110
Quando o crescimento celular foi utilizado como função objetivo do programa de
otimização (Figuras 5.4 e 5.5) a análise de fluxos metabólicos indicou que a mudança na
vazão específica de alimentação afeta a disponibilidade de acetil-CoA, precursor tanto de
cosmomicina quanto de componentes da biomassa. O maior fluxo através da via metabólica
do piruvato foi observado na mais alta vazão específica de alimentação estudada (0,1 h
-1
). O
fluxo de produção de oxoglutarato a partir do isocitrato foi invertido na vazão específica de
alimentação de 0,1 h
-1
, e zero nas vazões específicas de alimentação de 0,03 e 0,05 h
-1
.
Indicando que a produção de isocitrato é importante para o crescimento celular. A via do
glioxilato mostrou atividade apenas na vazão específica de alimentação de 0,1 h
-1
. A produção
de energia, o balanço redox como também o consumo de oxigênio e produção de CO
2
sofreram importantes mudanças.
0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Fluxos com mudanças significativas
(mmol/gcel.h)
Vazão específica de alimentação (h
-1
)
v6 v48 v51 v55 v57 v58
v61 v189 v190 v221
Figura 5.5. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo em diferentes vazões específicas de alimentação quando a velocidade específica de
crescimento celular foi otimizada. As reações referentes aos números estão no Apêndice C.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 111
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2
0.00
H Gro GLC FACoA ACP AA
NH3
v8 v7 v6 2,50 v5 v4 v3 v2 v1 v11...v28 v9
2,50
Glco ADPGlc
Glicólise Biossíntese de
His
v65 v64
Histidina
v113
G1P v31 PRPP
v63
Biossíntese de carboidratos
v42 v43
G6P Ru5P
Açúcares
v44 v139
polipeptídicos Reações de ácido fólico
v32 v47
G1P THF Form MTHF R5P
v211 v169 v170 v171 v172 F6P S7P
v216 ForTHF MetTHF MeTHF v34 v45
EstPyr PGA3 XyL5P
v212
Biossíntese
v37
v213
família do
Gly v115 Ser v46
OdiGlu
Serina
v114 PG3 E4P
v218 Cys v117
Pentose fosfato
v162 v39
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc dRodo
Biossíntese
Aromáticos
Phe
família do Aspartato
v79 v80 v81
Adomet Ile PEP Chor Prep
v122 v103 v60 v62 v83
C
Met Thr v40 v84 v86 Tyr
O
v121 v120 v91 v59 Pyr Trp
S
Rhod Hcy Hse
M
MaCoA v95 v90 1,72 v61 v48 v110 Ala Leu
O
v206 Lys AspSA 4,78 1,35 v97 v100
M
v207 ProCoA v88 v89 4,41 3,54 OIV
I
Asn Asp AcCoA 3,53
Biossíntese
v98
C
v198 v87 v194
família do Alanina
Val
I
MaCoA
N Biossíntese
A Cos
v67 v66 OAA Cit v50 Icit
família do Glutamato
v49 GluSA Pro
Biossíntese de
v56 v51 v104 v105
Ácidos graxos
MaACP AcACP Mal Glx v161
Palm HexACP 1,07 v58 v57 OG Glu Gln
v69 v68 3,15 v55 AcCoA v52 v153 v154
v189 1,23 3,09 v106
NADH 2,67 v188 Fum Suc SucCoA Orn
0,53 3,09 ATP ADP v54 v53 v107
FADH2 2,27
Ciclo do ácido tricarboxílico
v190 1,84
Transporte de elétrons
Citr Arg
e fosforilação oxidativa
v109
1,38
Fluxos de saída
v186 v219 v221 3,60 v222 v223 v224 v225 v226 v220
Biomassa Ac CO2
3,60
Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.6. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos que
mostraram mudanças significativas (em azul) durante o cultivo nas vazões específicas de
alimentação 0,03, 0,05 e 0,1 h
-1
ao otimizar a velocidade específica de produção de
cosmomicina.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 112
Quando a produção de cosmomicina foi utilizada como função objetivo do programa de
otimização (Figuras 5.6 e 5.7) a análise de fluxos metabólicos indicou que o consumo de
glutamina é uma variável importante para produção de cosmomicina uma vez que o maior
valor para esse fluxo foi encontrado a vazão específica de alimentação de 0,05 h
-1
, condição
de cultivo essa onde ocorreu a maior produção de cosmomicina. O fluxo através do
metabolismo do piruvato também foi maior a essa vazão específica de alimentação, indicando
sua importância na disponibilidade de acetil-CoA, precursor de cosmomicina. A maior
conversão de fumato à malato foi observada na melhor condição de cultivo para produção de
cosmomicina resultando num aumento no fluxo da reação anaplerótica de ressarcimento de
piruvato a partir do malato.
0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
Fluxos com mudanças significativas
(mmol/gcel.h)
Velocidade específica de alimentação (h
-1
)
v6 v29 v48 v55 v61
v189 v190 v221
Figura 5.7. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo em diferentes vazões específicas de alimentação quando a velocidade específica de
produção de cosmomicina foi otimizada. As reações referentes aos números estão no
Apêndice C.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 113
5.2.2. Análise de fluxos metabólicos na vazão específica de alimentação 0,05 h
-1
Com o objetivo de analisar a distribuição dos fluxos na condição de maior
produtividade em cosmomicina, vazão específica de alimentação 0,05 h
-1
, o crescimento da
cepa Streptomyces olindensis ICB20 foi simulado utilizando como função objetivo a
velocidade específica de crescimento celular ou a velocidade específica de produção de
cosmomicina. Ambas as condições são de extrema importância para o estudo do metabolismo
de S. olindensis. A maximização da velocidade específica de crescimento celular direciona o
micro-organismo a trabalhar na sua capacidade máxima, otimizando o metabolismo primário
e com isso disponibilizando uma maior quantidade de biomassa. Já a maximização da
velocidade específica de produção de cosmomicina direciona o micro-organismo a restringir o
metabolismo primário à condição de manutenção celular e a produção dos precursores
necessários para o metabolismo secundário.
Essas funções objetivo foram maximizadas durante a otimização. Quando a velocidade
específica de crescimento celular foi usada como função objetivo µ
s
, r
O
2
, r
NH
3
, µ
p
como
também r
AA
, r
CHO
, r
PO
4
,
r
NH
3
*
(baseado na composição do extrato de levedura e de
casaminoácidos) foram usadas como restrições na solução do modelo. Quando a velocidade
específica de produção de cosmomicina foi usada como função objetivo µ
s
, r
O
2
, r
NH
3
, µ
x
como
também r
AA
, r
CHO
, r
PO
4
, r
NH
3
*
(baseado na composição do extrato de levedura e de
casaminoácidos) foram usadas como restrições para cálculo dos fluxos (Oh et al., 2008).
Como resultado da otimização, obteveram-se os fluxos metabólicos intracelulares
representados no mapa de distribuição de fluxos para ambas as situações (Figura 5.8). Os
valores dos fluxos são dados em mmol.g célula seca
-1
.h
-1
, onde os sinais negativos indicam
que a reação se processa na direção oposta da seta.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 114
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
Glco ADPGlc Glicólise
0,55
Biossíntese de His
0,13 0,13 0,13 0,55
Histidina
0,00
0,13
G1P PRPP
0,01
0,31 0,00
Biossíntese de carboidratos
0,31 0,00 0,01 0,01
G6P Ru5P
Açúcares
0,24 -0,01 -0,01 0,02
Polipeptídicos
Reações de ácido fólico
0,24 -0,01 -0,01 0,02
G1P THF Form
-0,01
MTHF
0,09
R5P
0,18 0,06 0,00 0,01 0,01 -0,01 0,09 0,23
F6P S7P
0,00
0,18 0,06 0,00
ForTHF
MetTHF MeTHF
0,23 0,00
EstPyr PGA3 XyL5P
0,12 0,06
Biossíntese
0,11 0,45
0,12 0,06
família da Gly
0,10
Ser
0,44 0,00 0,00
OdiGlu Serina
0,09 0,00
PG3 E4P
0,06
Cys
0,09 0,00
Pentose fosfato
0,06 -0,2 0,45 0,00
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc dRodo Biossíntese do
-0,2 0,44 0,00
Aromáticos
0,00
Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00
0,09
Adomet Ile
0,00
PEP Chor Prep
0,00
0,09 0,00 0,45 0,00 0,00 0,00 0,00
C Met Thr
0,00 0,00 0,44 0,00 0,00 0,00
Tyr
O
0,09 0,09 0,09 0,00
Pyr
0,00
Trp
S Rhod
0,09
Hcy Hse
0,09 1,62
M MaCoA
0,03 0,00 0,00 0,09 1,58 0,00
Ala
0,00
Leu
0,00
O
0,03
Lys
AspSA
0,09 3,62 1,89 0,00 0,00 0,00
M
0,03
ProCoA
0,01 0,01 0,09 4,78 3,54
OIV
i
0,03 0,03
Asn Asp
1,59
AcCoA Biossíntese
0,00
C
0,03 1,59 1,54
família do Alanina Val
0,00
I MaCoA
1,05
Biossíntese
N família do Glutamato
A Cos
1,24 0,18
OAA Cit
0,00
Icit
0,00 0,00
0,75 0,11 -0,48 0,00 0,00 0,00
GluSA Pro
Biossíntese dos
0,01 0,00 0,00 -1,65 0,00 0,00
Ácidos Graxos MaACP AcACP Mal Glx
1,56 0,00
Palm HexACP
0,00 1,65 1,65
OG Glu Gln
0,18 0,11 0,18 0,11 3,14
AcCoA
1,64 0,00 1,49 0,00
3,15 0,00 0,00 1,50 0,00
NADH
2,18 2,28
Fum Suc SucCoA Orn
2,67
ATP ADP
1,64 1,55 1,49
FADH2
2,75 2,27 2,21 1,65 -0,09 1,50
Transporte de elétrons
Ciclo do ácido tricarboxílico Citr Arg
e Fosforilação oxidativa
1,49 1,50
0,05 1,58 3,59 0,03 0,00 0,33 0,00 0,00 0,09
Fluxos de saída
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.8. Mapa de distribuição de fluxos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) durante a maximização
da velocidade específica de crescimento celular (valores em vermelho) e de produção de
cosmomicina (valores em azul) num cultivo contínuo de S. olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 115
Comparando as duas condições de otimização foi verificado que as distribuições dos
fluxos internos revelam importantes mudanças com relação à produção de energia e ao
balanço redox (NADH, NADPH e ATP) quando o direcionamento do metabolismo é mudado,
baseado na definição da função objetivo, do crescimento celular para produção de
cosmomicina. Uma mudança importante nos fluxos do ciclo do ácido tricarboxílico também
foi verificada. Durante a maximização do crescimento não foi observada a conversão de
isocitrato à oxoglutarato, entretanto quando a cosmomicina foi maximizada esse fluxo foi
invertido, o oxoglutarato é convertido a isocitrato.
O ciclo do glioxilato mostrou-se ativo quando cosmomicina foi maximizada, enquanto
que na maximização da biomassa o fluxo através desse ciclo foi zero. Algumas linhagens de
Streptomycetes como, S. coelicolor e S. hygroscopicus vêem mostrando atividade nas enzimas
referentes a esse ciclo (Takebe et al., 1991). Entretanto, a atividade dessas enzimas não foi
detectada em outros tipos de Streptomycetes com S. lividans e S. aurofaciens (Dekleva &
Strohl, 1988).
Outra importante observação foi no fluxo de acetil-CoA no metabolismo do piruvato.
Uma maior conversão de piruvato à acetil-CoA foi verificada durante a maximização da
cosmomicina. No entanto, uma maior conversão de acetil-CoA à malonil-CoA foi observada
ao maximizar o crescimento celular. O malonil-CoA é um precursor tanto da biossíntese de
ácido graxos quanto da produção de cosmomicina. Ao maximizar o crescimento celular o
metabolismo foi direcionado para a biossíntese de ácidos graxos uma vez que os ácidos
graxos são responsáveis pela produção de fosfolipídios, importante componente da membrana
celular.
Essas observações confirmam a importância de incluir no meio de cultivo precursores
do antibiótico (como o acetil-CoA) e/ou do crescimento celular (como os ácidos graxos) com
o objetivo de obter um maior rendimento no processo.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 116
5.2.3. Análise de sensibilidade na vazão específica de alimentação 0,05 h
-1
A análise de sensibilidade é um meio sistemático para quantificar a relação entre os
parâmetros do modelo e os resultados obtidos pelo modelo.
Uma das vantagens do GAMS quando usado para otimizar o modelo de fluxos
metabólicos é o cálculo dos valores marginais dos metabólitos intermediários. O valor
marginal se refere à sensibilidade da função objetivo para mudança em uma variável. Os
valores marginais referentes aos fluxos intracelulares, quando as velocidades específicas de
crescimento celular e de produção de cosmomicina foram maximizadas, estão representados
pelas Figuras 5.9 e 5.10, respectivamente.
v
4
9
v
7
5
v
8
1
v
8
4
v
9
3
v
9
8
v
1
0
0
v
1
0
3
v
1
5
8
v
2
2
6
v
2
3
0
v
2
3
9
v
2
4
4
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Valores marginais
Reações metabólicas
Figura 5.9. Sensibilidade da velocidade específica de crescimento celular para mudança em
vários fluxos em termos de valores marginais em uma cultura contínua à D = 0,05 h
-1
. As
reações referentes aos números estão no Apêndice C.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 117
v
7
5
v
8
1
v
8
4
v
1
0
0
v
1
5
8
v
2
3
0
v
2
3
9
v
2
4
4
v
2
4
5
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Valores marginais
Reações metabólicas
Figura 5.10. Sensibilidade da velocidade específica de produção de cosmomicina para
mudança em vários fluxos em termos de valores marginais em uma cultura contínua à D =
0,05 h
-1
. As reações referentes aos números estão no Apêndice C.
Analisando esses valores marginais, pode-se observar que os fluxos mais sensíveis ao
maximizar o crescimento celular ou a produção de cosmomicina estão relacionados com a
biossíntese de materiais de estocagem (fosfatidato) (v75) e de alguns aminoácidos como
tirosina (v244), fenilalanina (v81) e glutamato (v81, v84 e v100). Isso pode indicar que os
aminoácidos estão sendo usados para produção de oxoglutarato, o qual pode entrar no ciclo de
Krebs e produzir acetil-CoA, o precursor de cosmomicina. A partir dessa análise propõe-se
um estudo mais aprofundado do efeito desses aminoácidos no meio de cultura.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 118
5.2.4. Redirecionamento do metabolismo para uma via preferencial de produção
de cosmomicina
Os metabólitos secundários são geralmente sintetizados por vias biossintéticas
específicas, mas estas vias não são totalmente independentes do metabolismo primário devido
ao uso de precursores específicos e alguns co-fatores provenientes do metabolismo primário.
Apesar da dificuldade e complexibilidade de promover uma correlação entre o metabolismo
primário e secundário, esta correlação tem sido observada por alguns autores (Bibb, 2005;
Borondina et al., 2008). A deleção de genes em espécies de Streptomycetes, induzindo a
eliminação ou diminuição da atividade de determinadas enzimas, leva a um aumento na
produção de metabólitos secundários pelo aumento da disponibilidade de precursores (Li &
Townsend, 2006; Chouayekh & Virolle, 2002 e Ghorbel et al., 2006).
Com o objetivo de aumentar a produção de cosmomicina, como também de contribuir
com o estudo de engenharia metabólica, a ferramenta de análise de fluxos metabólicos foi
utilizada para estudar o efeito da repressão da rota biossintética de ácidos graxos na produção
de cosmomicina por S. olindensis ICB20. Através da regulação genética in silico do gene
FabH foi avaliado o efeito da 3-oxoacil-(ACP) sintase III. Essa enzima é catalisadora da
reação que converte acetil-CoA em acetil-ACP atuante como precursor da via biossintética
dos ácidos graxos.
5.2.4.1. Relação entre a formação de ácidos graxos e a produção de
antibiótico
A formação de ácidos graxos compete com a produção de antibiótico uma vez que
ambas utilizam os mesmos precursores, acetil-CoA e o malonil-CoA (Arabolaza et al., 2008).
A formação de ácidos graxos utiliza uma molécula de acetil-CoA com sete moléculas de
malonil-CoA na biossíntese de ácido palmítico, enquanto que o corpo cetônico de antibiótico
cosmomicina, rodomicinona, utiliza uma molécula de acetil-CoA e nove moléculas de
malonil-CoA. Indicando assim uma possível relação entre essas duas vias metabólicas.
Baseado nessa observação foi proposto uma modificação genética in silico na cepa de
S. olindensis visando reprimir a rota de produção de ácidos graxos com o intuito de aumentar
à disponibilidade de acetil-CoA e malonil-CoA e consequentemente a produção de
cosmomicina.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 119
Os ácidos graxos têm um papel importante na produção de um componente da
membrana celular, o fosfolipídio, se fazendo essencial para viabilização celular. Ao deletar a
via biossintética de ácidos graxos é necessário disponibilizar no meio de cultivo ácidos graxos
(Bogdawa, 2005) para viabilizar o crescimento celular. Outra opção para suprir essa
necessidade celular seria utilizar inibidores enzimáticos, para a enzima 3-oxoacil-(ACP)
sintase III. A regulação de expressão gênica para o gene FabH (Nelson, 2004), é outra
alternativa que pode ser utilizada in silico, com o intuito de reprimir o fluxo na via
biossintética de ácidos graxos sem comprometer a viabilidade celular e ao mesmo tempo
disponibilizar uma quantidade maior de precursores para a biossíntese de cosmomicina.
5.2.4.2. A influência da 3-oxoacil-(ACP) sintase III na produção de
cosmomicina
O mapa de fluxo, baseado no modelo metabólico proposto, representado pela Figura
5.11 mostra como ocorre à distribuição dos fluxos internos de S. olindensis ICB20 em um
cultivo contínuo, a uma vazão específica de alimentação D = 0,05 h
-1
, no meio complexo
descrito no item 4.2.3.1.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 120
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,09
Glco ADPGlc Glicólise Biosíntese de His
0,12 0,12
Histidina
0,01
G1P
0,55
PRPP
0,3
Biosíntese de carboidratos
0,00 0,01
G6P Ru5P
Açúcares
-0,01 0,02
polipeptídicos Reações de ácido fólico
0,25 -0,01
G1P THF Form MTHF R5P
0,18 0,00 0,01 -0,01 0,09
F6P S7P
0,06
ForTHF MetTHF MeTHF
0,24 0,00
EstPyr PGA3 XyL5P
0,12
Biosíntese
0,47
0,06
família do Gly
0,10
Ser
0,00
OdiGlu Serina
0,00
PG3 E4P
0,06
Cys
0,09
Pentose fosfato
-0,2 0,47
Biosíntese dos AA
dRodi dFuc dRodo Biosíntese Aromáticos Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00
Adomet Ile PEP Chor Prep
0,09 0,00 0,00 0,00 0,00
C Met Thr
0,47 0,00 0,00
Tyr
O
0,09 0,09 0,00
Pyr Trp
S Rhod Hcy Hse
1,56
M MaCoA
0,00 0,09 0,00
Ala Leu
O
0,03
Lys AspSA
4,75 3,57 0,00 0,00
M
0,03
ProCoA
0,01 0,09
OIV
I Asn Asp AcCoA Biosíntese
0,00
C
0,03 1,62 1,00
família do Alanina Val
I MaCoA
N Biosíntese
A Cos
0,70 0,10
OAA Cit
0,00
Icit família do Glutamato
0,00
GluSA Pro
Biosíntese
0,06 -1,65 0,00 0,00
Ácidos graxos MaACP AcACP Mal Glx
0,00
Palm HexACP
1,65 1,65
OG Glu Gln
0,10 0,10 3,17
AcCoA
0,00 0,00 0,00
1,52
NADH
2,72 2,24
Fum Suc SucCoA Orn
ATP ADP
1,65 -0,09 1,52
FADH2
2,22
Ciclo do Ácido Tricarboxílico
Transporte de elétrons Citr Arg
e fosforilação oxidativa
1,52
Fluxos de saída
0,05 1,61 3,60 0,03 0,00 0,24 0,00 0,00 0,09
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.11. Fluxos metabólicos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) num cultivo contínuo de S.
olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 121
Analisando a Figura 5.11, foi verificado que o acetil-CoA produzido pelo metabolismo
do piruvato é utilizado no ciclo do ácido tricarboxílico, na biossíntese dos ácidos graxos e na
produção de cosmomicina. Pode-se observar também que o malonil-CoA produzido pelo
acetil-coA é utilizado tanto na produção de cosmomicina quanto na produção de ácidos
graxos. Indicativo que a biossíntese de ácidos graxos realmente concorre com a produção de
cosmomicina.
Quando as vias metabólicas, os metabólitos e os fluxos são estudados em conjunto
com as enzimas catalisadoras das reações tem-se a base para propor algumas manipulações
genéticas que redirecione o metabolismo dessa cepa para aumentar a produção de
cosmomicina.
Foi então escolhido a biossíntese de ácidos graxos como alvo para manipulação
genética in silico. A síntese de ácidos graxos é catalisada por um sistema enzimático
denominado sintase de ácidos graxos. A síntese é iniciada com a transferência do grupo
acetila da acetil-CoA para o ACP, catalisada pela 3-oxoacil-(ACP) sintase III, mesma enzima
responsável pela condensação do acetil-ACP com malonil-ACP. Essa enzima tem uma grande
importância tanto na iniciação e regulação da biossíntese de ácidos graxos quanto na produção
de cosmomicina (He & Reynolds, 2002).
A regulação dessa via metabólica através da manipulação in silico do fluxo da reação
AcCoA + ACP → AcACP + CoA promove um redirecionamento do acetil-CoA para a via de
produção de cosmomicina. A manipulação in silico do fluxo foi obtida impondo a redução de
50% no fluxo dessa reação (Figura 5.12). Essa imposição simulou uma proposta de regulação
da expressão genética do gene FabH.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 122
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,00 0,02 2,50 0,21 0,00 0,50 0,00 0,00 0,09
Glco ADPGlc Glicólise Biossíntese de His
0,12 0,12
Histidina
0,01
G1P
0,55
PRPP
0,4
Biossíntese de carboidratos
0,00 0,01
G6P Ru5P
Açúcares
-0,01 0,02
polipeptídicos
Reações de ácido fólico
0,15 -0,01
G1P THF Form MTHF R5P
0,28 0,00 0,01 -0,01 0,00
F6P S7P
0,09
ForTHF MetTHF MeTHF
0,14 -0,01
EstPyr
PGA3 XyL5P
0,19
Biossíntese
0,27
0,09
família do Gly
0,01
Ser
-0,01
OdiGlu
Serina
0,00
PG3 E4P
0,09
Cys
0,00
Pentose fosfato
0,00 0,27
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc dRodo Biossíntese Aromáticos Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00
Adomet Ile PEP Chor Prep
0,14 0,00 0,00 0,00 0,00
C Met Thr
0,27 0,00 0,00
Tyr
O
0,00 0,00 0,00
Pyr Trp
S Rhod Hcy Hse
0,68
M MaCoA
0,00 0,00 0,00
Ala Leu
O
0,05
Lys AspSA
2,13 1,88 0,00 0,00
M
0,05
ProCoA
0,01 0,00
OIV
I Asn Asp AcCoA Biossíntese
0,00
C
0,05 2,24 0,81
família do Alanina
Val
I MaCoA
N Biossíntese
A Cos
0,35 0,05
OAA Cit
0,00
Icit família do Glutamato
0,00
GluSA Pro
Biossíntese
1,57 0,00 0,00 0,00
Ácidos graxos MaACP AcACP Mal Glx
0,00
Palm HexACP
0,00 0,00
OG Glu Gln
0,05 0,05 3,7
AcCoA
1,46 0,00 0,00
1,41
NADH
3,15 2,97
Fum Suc SucCoA Orn
ATP ADP
1,46 1,46
FADH2
1,76
Ciclo do ácido tricarboxílico
Transporte de elétrons Citr Arg
e fosforilação oxidativa
2,24
Fluxos de saída
0,05 1,41 3,38 0,05 0,00 0 0,00 -0,16 0,14
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.12. Fluxos metabólicos (mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) num cultivo contínuo de S.
olindensis ICB20 à D = 0,05 h
-1
com inibição da via biossintética de ácidos graxos.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 123
Analisando a distribuição dos fluxos obtidos pelo modelo metabólico, pode-se
comparar os fluxos nas duas condições e verificar o que mudou no metabolismo de S.
olindensis ICB20. A mudança mais importante ocorreu na biossíntese de cosmomicina, onde
foi verificado um aumento em cerca de 60%. Mudança que ocorreu devido a uma maior
disponibilidade de um dos principais precursores, acetil-CoA. Apesar do acetil-CoA
teoricamente está mais disponível, foi notado um decréscimo no fluxo de produção de acetil-
CoA, devido a uma diminuição no requerimento desse metabólito pelo metabolismo de S.
olindensis. Isso induziu a uma mudança nos fluxos da via glicolítica diminuindo a produção
de piruvato (precursor de acetil-CoA) e aumentando o fluxo de glicose 1 fosfato, precursor
dos deoxiaçúcares polipeptídeos de cosmomicina. A princípio era esperado um aumento do
fluxo de acetil-CoA, o que não aconteceu. Apesar disso, foi possível entender o aumento da
produção de cosmomicina. A molécula de cosmomicina é composta por um corpo cetônico,
onde o precursor é o acetil-CoA, e por deoxiaçúcares, que tem como precursor a glicose 6
fosfato. O aumento de requerimento de acetil-CoA promovido pela produção de ácidos graxos
faz com que a glicose disponível no meio seja direcionada para produção de piruvato e
consequentemente de acetil-CoA. Uma vez que a biossíntese de ácidos graxos foi reprimida
essa necessidade de disponibilidade de acetil-CoA diminuiu. Isso promoveu uma maior
disponibilidade de glicose 6 fosfato para ser utilizada como precursor na formação dos
deoxiaçúcares, os quais estavam sendo requisitado devido ao aumento do fluxo de acetil-CoA
na biossíntese de cosmomicina.
Essa mudança na distribuição dos fluxos promoveu um aumento da produção de
cosmomicina por Streptomyces olindensis ICB20 nas condições de cultivo estudadas. Isso
demonstra a importância da ferramenta de análise de fluxos metabólicos para determinação de
alvos para manipulação genética.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 124
5.2.5. Efeito da limitação de nutrientes na produção de cosmomicina e no
metabolismo de S. olindensis ICB20
O crescimento microbiano e a formação de produtos metabólicos são condicionados à
disponibilidade de nutrientes no meio de cultivo. Em condições de limitação de nutrientes,
onde os recursos não puderam ser totalmente direcionados para o crescimento celular, uma
variedade de produtos pode ser produzida para balancear o consumo de nutrientes.
Streptomycetes spp. são conhecidas por produzirem uma variedade de produtos secundários e
por terem um excedente metabólico sob condições de excesso de carbono levando a excreção
de alguns compostos orgânicos. A excreção desses compostos orgânicos depende da natureza
da limitação nutricional e da fisiologia da espécie estudada (Naeimpoor, 2001).
O efeito de várias limitações nutricionais na produção de cosmomicina foi investigado
através da simulação do modelo de análise de fluxos. A estratégia utilizada foi a maximização
da velocidade específica de produção de cosmomicina, fixando os valores das velocidades
específicas de consumo de glicose e dos componentes do extrato de levedura e reduzindo,
uma de cada vez, as velocidades específicas de consumo dos outros nutrientes, os quais não se
encontravam em condições de limitação (oxigênio, sulfato e fosfato).
5.2.5.1. Limitação de oxigênio
Com o intuito de verificar como as células de S. olindensis ICB20 podem lidar com
condições de stress de oxigênio, foram consideradas as condições descritas na Tabela 5.7. A
primeira condição, situação de não limitação de oxigênio, utiliza a velocidade específica de
consumo de oxigênio obtida por Pamboukian (2003), as condições de 2 a 7 referem-se as
condições de limitações dessa variável. Esses valores foram utilizados como entradas no
programa. Em todas as condições, as velocidades específicas de consumo de glicose (obtidas
por Pamboukian, 2003) e dos componentes do extrato de levedura e casaminoácidos
(calculadas e apresentadas na Tabela 5.5) também foram usadas como entrada para o
programa e o modelo foi direcionado para maximização da velocidade específica de produção
de cosmomicina. Os resultados obtidos foram comparados considerando como parâmetros a
produção de cosmomicina, o consumo de sulfato e a excreção de acetato, formato, dióxido de
carbono e adenosil-homocisteína.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 125
Tabela 5.7.
Variação da produção de cosmomicina, do consumo de sulfato e da
excreção de acetato, formato, dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em diferentes
condições de limitação de oxigênio.
Condições r
O
2
µ
p
r
SO
4
r
CO
2
r
Ac
r
Form
r
Adocys
1
2,5 0,0301
0,0923
3,5971
1,5930
0,0000
0,0903
2
1,25 0,0301
0,0923
1,9238
0,7543
0,0000
0,0903
3
0,5 0,0279
0,0856
0,7396
0,1145
0,1193
0,0837
4
0,2 0,0097
0,0311
0,1797
0,0327
0,1160
0,0292
5
0,1 0,0024
0,0093
0,0488
0,0109
0,0632
0,0073
6
0,08 0,0009
0,0049
0,0226
0,0065
0,0527
0,0030
7
0,07 0,0002
0,0027
0,0095
0,0044
0,0474
0,0008
Comparando os resultados obtidos verificou-se que a velocidade específica de
consumo de oxigênio obtida por Pamboukian, 2003 (2,5 mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) representa
realmente uma condição de não limitação desse nutriente para produção de cosmomicina, uma
vez que a redução de 50% dessa taxa (1,25 mmol.g célula seca
-1
.h
-1
) não implicou em redução
na velocidade específica de produção de cosmomicina. Apesar disso, foi verificado redução
na excreção de dióxido de carbono e de acetato. Apenas a partir da redução em cerca de 90%
da variável em estudo (condição 4) que foi verificado reduções significativas na produção de
cosmomicina, a partir de 68%. Outras variáveis em estudo também sofreram mudanças
significativas seguindo a mesma tendência de redução, que foram as velocidades específicas
de consumo de sulfato e dióxido de carbono, como também as velocidades específicas de
excreção de acetato e adenosil-homocisteína. A variável que apresentou um comportamento
não linear, nessas condições de variação, foi a velocidade específica de excreção de formato.
Verificou-se um aumento na excreção desse metabólico a uma taxa de aeração de 0,5 mmol.g
célula seca
-1
.h
-1
e a partir desse ponto, em condições de maior limitação de oxigênio, essa
variável sofreu reduções.
Comparando as condições 1 e 4, verificou-se uma diferença na distribuição dos
fluxos intracelulares. A Figura 5.13 mostra os fluxos que mostraram mudanças significativas
ao variar a velocidade específica de consumo de oxigênio.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 126
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
0,03 0,02 0,20 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
Glco ADPGlc Glicólise
0,55
Biossíntese de His
0,13 0,13 0,13 0,55
Histidina
0,01
0,13
G1P PRPP
0,00
0,31 0,00
Biossíntese de carboidratos
0,19 0,00 0,01 0,01
G6P Ru5P
0,02
Açúcares Reações de ácido fólico
0,24 -0,01 -0,01 0,02
Polipeptídicos THF Form MTHF
0,36 -0,01 -0,01
G1P
0,00 0,01 -0,01 0,09
R5P
0,18 -0,12 0,13 -0,13 0,03
F6P S7P
0,06 0,06
ForTHF MetTHF MeTHF
0,23 0,00
EstPyr
0,02 0,35
PGA3
0,00
XyL5P
0,12
Biossíntese
0,10 0,44
0,04 0,06
família da Gly
0,16
Ser
0,69 0,00 0,00
OdiGlu
0,02
Serina
0,00
PG3 E4P
0,06
Cys
0,09 0,00
Pentose fosfato
0,02 0,03 -0,2 0,44
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc
dRodo
Biossíntese do
-0,2 0,69
Aromáticos Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00 0,00
Adomet Ile
0,00
PEP Chor Prep
0,00
0,09 0,00 0,00 0,44 0,00 0,00
C
0,03
Met
0,09
Thr
0,00 0,00 0,69 0,00 0,00 0,00
Tyr
O
0,09 0,03 0,00
Pyr
0,00
Trp
0,00
S Rhod
0,03
Hcy Hse
0,09 1,58
M MaCoA
0,03 0,00 0,00 0,03 0,17 0,00
Ala
0,00
Leu
0,00
O
0,01
Lys AspSA
0,09 4,78 3,54 0,41 0,00 0,00
M
0,03
ProCoA
0,01 0,01 0,03 0,18 0,20
OIV
i
0,01 0,03
Asn Asp
1,59
AcCoA Biossíntese
0,00
C
0,01 0,04 1,05
família do Alanina
Val
0,00
I MaCoA
0,17
Biossíntese
N família do Glutamato
A Cos
0,75 0,11
OAA Cit
0,00
Icit
0,00 0,00
0,07 0,01 0,01 0,00 0,00
GluSA Pro
Biossíntese dos
-0,12 0,00 -1,65 0,00 0,00
Ácidos Graxos Mal Glx
0,00 0,00 0,00
Palm HexACP
1,65 1,65
OG Glu Gln
0,11 0,01 0,11 0,01 3,15 0,00 0,00 0,00 0,00 1,50 0,00
0,05
AcCoA
0,04 0,00 0,00 0,00
NADH
2,67 2,21
Fum Suc SucCoA Orn
0,38
ATP ADP
1,65 -0,09 1,50
FADH2
2,27 0,34 0,04 0,01 0,00
Transporte
0.00
Ciclo do ácido tricarboxílico Citr Arg
de elétrons e Fosforilação oxidativa
1,50 0,00
0,05 1,59 3,60 0,03 0,00 0,23 0,00 0,00 0,09
Fluxos de saída
0,05 0,03 0,18 0,01 0,12 0,39 0,00 0,00 0,03
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
AcACPMaACP
Figura 5.13. Distribuição dos fluxos metabólicos que mostraram mudanças significativas ao
variar a velocidade específica de consumo de oxigênio. Os valores dos fluxos em vermelho
representam a condição 1 e dos fluxos em azul representam a condição 4.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 127
Na condição de limitação de oxigênio (condição 4) foi verificado um aumento da
conversão de G6P a F6P, levando a um aumento no fluxo da via glicolítica e uma diminuição
na conversão de G6P a G1P em torno de 39%. Essa redução não mostrou influência na
biossíntese de carboidratos, mas promoveu alteração na via biossintética dos açúcares
polipeptídicos reduzindo o fluxo em torno de 67%. A redução do fluxo na via biossintética
dos açúcares polipeptídicos afetou diretamente a taxa de produção de cosmomicina, uma vez
que esses açúcares fazem parte da estrutura do antibiótico. A limitação de oxigênio também
comprometeu a produção do outro precursor da biossíntese de cosmomicina, o acetil-CoA,
verificada pela significativa redução no metabolismo do piruvato. O ressarcimento do
piruvato se dá pelas reações anapleróticas, mais especificamente pela atividade da enzima
málica que converte malato a piruvato. O malato é produzido pelo ciclo de Krebs podendo ser
a partir do fumato, do oxaloacetato e/ou do glioxilato. A limitação de oxigênio inativou o
ciclo do glioxilato e reduziu a conversão de fumato a malato. O malato foi produzido a partir
do oxaloacetato pela reação reversa consumindo NADH. Essas mudanças no ciclo de Krebs
induziram a uma diminuição no ressarcimento de piruvato pela reação anaplerótica que
converte malato a piruvato. Também foi verificada uma redução na produção e,
consequentemente, no consumo de ATP. A redução no metabolismo dos aminoácidos
provavelmente se deu devido a essa diminuição na demanda de energia. Tendo em vista que
maior parte dos aminoácidos está presente no meio de cultivo a viabilidade celular não foi
comprometida.
5.2.5.2. Limitação de sulfato
Com o objetivo de verificar como a limitação em sulfato pode afetar a velocidade
específica de produção de cosmomicina e o metabolismo de S. olindensis ICB20, foram
consideradas duas condições. A primeira condição representa uma situação de não limitação
de sulfato, onde a velocidade específica de consumo de sulfato está apresentada na Tabela 5.7.
A segunda condição representa uma condição de limitação dessa variável, onde foi reduzido a
metade a taxa de consumo de sulfato (0,046 mmol.g célula seca
-1
.h
-1
). Esses valores foram
utilizados como entradas no programa. Em ambas as condições, as velocidades específicas de
consumo de glicose (obtidas por Pamboukian, 2003) e dos componentes do extrato de
levedura e casaminoácidos (calculadas e apresentadas na Tabela 5.5) também foram usadas
como entrada para o programa e o modelo foi resolvido para maximização da velocidade
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 128
específica de produção de cosmomicina. Os resultados obtidos, e apresentados na Tabela 5.8,
foram comparados em relação a produção de cosmomicina e excreção de acetato, formato,
dióxido de carbono e adenosil-homocisteína.
Tabela 5.8.
Variação da produção de cosmomicina e da excreção de acetato, formato,
dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em condições de não limitação e limitação do
consumo de sulfato.
Condições r
SO
4
µ
p
r
CO
2
r
Ac
r
Form
r
Adocys
1
0,0923 0,0301 3,5971
1,5930 0,0000
0,0903
2
0,0462 0,0147 3,4537
2,0284 0,0000
0,0442
Comparando os resultados obtidos verificou-se que o sulfato é um metabólito
importante para a produção de cosmomicina, uma vez que a limitação desse substrato no meio
de cultivo provocou uma redução em cerca de 50% na velocidade específica de produção do
antibiótico. Em relação às outras variáveis estudadas foi verificado que: a excreção de dióxido
de carbono foi levemente afetada pela limitação de sulfato; nenhuma mudança foi observada
em relação a excreção de formato; houve um aumento da excreção de acetato e uma redução
na taxa de excreção de adenosil-homocisteína.
Comparando as condições 1 e 2, foi verificado uma diferença na distribuição dos
fluxos intracelulares. A Figura 5.14 mostra a distribuição dos fluxos e os fluxos que
mostraram mudanças significativas ao variar a velocidade específica de consumo de sulfato.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 129
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
0,05 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
Glco ADPGlc Glicólise
0,55
Biossíntese de His
0,01
0,13 0,13 0,13 0,13 0,55
Histidina
0,01
G1P PRPP
0,31 0,00
Biossíntese de carboidratos
0,22 0,00 0,01 0,01
G6P Ru5P
Açúcares Reações de ácido fólico
0,24 -0,01 -0,01 0,02
Polipeptídicos THF Form
0,33 -0,01 -0,01 0,02
G1P
0,00 0,01 -0,01
MTHF
0,09
R5P
0,18 0,06 0,00 0,01 -0,01 0,05 0,23
F6P S7P
0,00
0,09 0,03
ForTHF MetTHF MeTHF
0,32 0,00
EstPyr PGA3 XyL5P
0,12 0,06
Biossíntese
0,10 0,44
0,06 0,03
família da Gly
0,05
Ser
0,63 0,00 0,00
OdiGlu Serina
0,00
PG3 E4P
0,06
Cys
0,09 0,00 0,44
Pentose fosfato
0,03 0,05 -0,2 0,63
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc dRodo Biossíntese do
-0,1
Aromáticos
0,00
Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00
0,09
Adomet Ile
0,00
PEP Chor Prep
0,04 0,00 0,00 0,44 0,00 0,00 0,00 0,00
C
0,09
Met
0,09
Thr
0,00 0,63 0,00 0,00 0,00
Tyr
O
0,05 0,05 0,00
Pyr Trp
S Rhod Hcy Hse
0,09 1,58
M MaCoA
0,03 0,00 0,00 0,05 3,59 0,00
Ala Leu
0,00
O
0,01
Lys
AspSA
0,09 4,78 3,54 0,00 0,00 0,00
M
0,03
ProCoA
0,01 0,01 0,05 5,19 2,18 0,00
OIV
i
0,01 0,03
Asn Asp
1,59 1,05
AcCoA Biossíntese
0,00
C
0,01 2,03 0,17
família do Alanina
Val
0,00
I MaCoA Biossíntese
N família do Glutamato
A Cos
0,75 0,11
OAA Cit
0,00
Icit
0,00 0,00
0,07 0,01 0,01 0,00 0,00 -1,65
GluSA Pro
Biossíntese dos
-1,56 0,00 0,00 0,00 0,00
Ácidos Graxos MaACP AcACP Mal Glx
0,00 0,00
Palm HexACP
1,65 1,65
OG Glu Gln
0,11 0,01 0,11 0,01 3,15 0,00 0,00 0,00 0,00 1,50 0,00
2,67 3,63
AcCoA
1,65 1,98 0,00
NADH
3,38 2,21
Fum Suc SucCoA Orn
ATP ADP
1,65 -0,09 1,50
FADH2
2,27 2,40 1,65 1,60 1,98
Transporte de elétrons
1,59
Citr Arg
e Fosforilação oxidativa Ciclo do ácido tricarboxílico
1,50 1,98
0,05 1,59 3,60 0,03 0,00 0,23 0,00 0,00 0,09
Fluxos de saída
0,05 2,03 3,45 0,01 0,00 0,23 0,00 0,00 0,04
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.14. Distribuição dos fluxos metabólicos e as mudanças significativas ao variar a
velocidade específica de consumo de sulfato. Os valores dos fluxos em vermelho representam
a condição 1 e dos fluxos em azul representam a condição 2.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 130
Na condição de limitação de sulfato (condição 2) foi verificado um aumento no fluxo
da via glicolítica em torno de 38% e uma redução do fluxo de produção de G1P em 29%. A
menor disponibilidade de G1P induziu a uma redução na produção dos deoxi-açúcares,
precursores da produção de cosmomicina. A taxa de produção de outro precursor importante
de cosmomicina, o acetil-CoA, também sofreu alteração devido à limitação de sulfato. Houve
uma diminuição na disponibilidade desse metabólico devido provavelmente a uma redução,
em torno de 38%, no fluxo referente ao metabolismo do piruvato. Apesar dessa redução, foi
verificado um aumento nos fluxos relacionados às reações anapleróticas indicando que o
ressarcimento do piruvato se deu através do malato e do oxaloacetato. Essas mudanças
induziram a uma inativação da via do glioxilato. A produção de energia também foi afetada,
onde foi observada uma maior conversão de ATP a partir de NADH e uma menor conversão
de ATP via FADH
2
.
5.2.5.3. Limitação de fosfato
Outra variável importante também foi avaliada através da simulação do modelo
metabólico, a limitação da fonte de fosfato. Com o objetivo de verificar a influência da fonte
de fosfato, no metabolismo de S. olindensis ICB20 e na produção de cosmomicina, o
programa de análise de fluxos foi utilizado para simular a distribuição de fluxos ao otimizar a
produção de cosmomicina. Um estudo comparativo foi realizado simulando duas condições:
de não limitação, onde a velocidade específica de consumo de fosfato é igual a 0,0197
mmol.g célula seca
-1
.h
-1
(Tabela 5.5) e limitação, onde restringiu-se o fluxo de fosfato para
zero.
Os resultados obtidos, e apresentados na Tabela 5.9, foram comparados em relação à
produção de cosmomicina, consumo de sulfato e excreção de acetato, formato, dióxido de
carbono e adenosil-homocisteína.
Tabela 5.9. Variação da produção de cosmomicina, do consumo de sulfato e da
excreção de acetato, formato, dióxido de carbono e adenosil-homocisteína, em condições de
não limitação e limitação do consumo de fosfato.
Condições r
PO
4
r
SO
4
µ
p
r
CO
2
r
Ac
r
Form
r
Adocys
1
0,0197 0,0923 0,0301 3,5971
1,5930
0,0000 0,0903
2
0,0000 0,0923 0,0301 3,5971
1,5930
0,0000 0,0903
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 131
Baseado nesses resultados foi verificado que a limitação na fonte de fosfato não
interferiu na produção de cosmomicina como também no consumo de sulfato e na excreção
dos metabólitos em estudo.
Apesar da análise macromolecular não ter mostrado variação comparando as duas
condições de cultivo, através da análise de fluxos foi verificado que houve uma discreta
mudança na distribuição dos fluxos, como apresentado na Figura 5.15.
Uma discreta mudança no ciclo de Krebs foi observada provavelmente devido a uma
redução na produção de oxaloacetato via malato. Para suprir a demanda de oxaloacetato
houve um aumento nos fluxos das reações anapleróticas de produção de oxaloacetato via
piruvato e da produção de piruvato via malato. A limitação de fosfato no meio induziu a um
ligeiro aumento na biosíntese e no metabolismo de ácidos graxos podendo ser devido a uma
maior disponibilidade de NADPH produzido na conversão de malato a piruvato. Outro ponto
importante de mudança no metabolismo diz respeito à produção de AMP e da reação que
utiliza AMP para converter ATP em ADP, onde foi verificada uma redução nesses fluxos.
Essa redução interferiu no transporte de elétrons diminuindo a produção de ATP por NADH e
aumentando produção de ATP por FADH
2
. Essas mudanças na disponibilidade de ATP
induziram uma redução do gasto energético na manutenção celular.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 132
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
0,09 0,02 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
0,09 0,00 2,50 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,05
Glco ADPGlc Glicólise
0,55
Biossíntese de His
0,01
0,13 0,13 0,13 0,55
Histidina
0,01
0,13
G1P PRPP
0,31 0,00
Biossíntese de carboidratos
0,31 0,00 0,01 0,01
G6P Ru5P
0,02
Açúcares Reações de ácido fólico
0,24 -0,01 -0,01 0,02
Polipeptídicos THF Form
0,24 -0,01 -0,01
G1P
0,00 0,01 -0,01
MTHF
0,09
R5P
0,18 0,06 0,00 0,01 -0,01 0,09 0,23
F6P S7P
0,18 0,06
ForTHF MetTHF MeTHF
0,23 0,00
EstPyr
0,10
PGA3
0,00
XyL5P
0,12 0,06
Biossíntese
0,10 0,44
0,12 0,06
família da Gly Ser
0,44 0,00 0,00
OdiGlu
Serina
0,09 0,00
PG3 E4P
0,06
Cys
0,09 0,00
Pentose fosfato
0,06 -0,19 0,44
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc
dRodo
Biossíntese do
-0,19 0,44 0,00
Aromáticos
0,00
Phe
família do Aspartato
0,00 0,00 0,00 0,00
0,09
Adomet Ile
0,00
PEP Chor Prep
0,09 0,00 0,00 0,44 0,00 0,00
C Met
0,09
Thr
0,00 0,00 0,44 0,00 0,00 0,00 0,00
Tyr
O
0,09 0,09 0,00
Pyr
0,00
Trp
0,00
S Rhod
0,09
Hcy Hse
0,09 1,58
M MaCoA
0,03 0,00 0,00 0,09 1,59 0,00
Ala
0,00
Leu
0,00
O
0,03
Lys AspSA
0,09 4,78 3,54 0,00 0,00 0,00
M
0,03
ProCoA
0,01 0,01 0,09 4,79 3,54
OIV
i
0,03 0,03
Asn Asp
1,59 1,05
AcCoA Biossíntese
0,00
C
0,03 1,59 1,06
família do Alanina
Val
0,00
I MaCoA Biossíntese
N família do Glutamato
A Cos
0,75 0,11
OAA Cit
0,00
Icit
0,00 0,00
0,76 0,11 0,01 0,00 0,00
GluSA Pro
Biossíntese dos
0,00 0,00 -1,65 0,00 0,00
Ácidos Graxos MaACP AcACP Mal Glx
-1,65 0,00 0,00
Palm
0,11
HexACP
0,11 1,65 1,65
OG Glu Gln
0,11 0,11 3,15 1,65 1,65 0,00 0,00 1,50 0,00
2,67 3,15
AcCoA
0,00 0,00 1,50 0,00
NADH
2,66 2,21
Fum Suc SucCoA Orn
ATP ADP
1,65 -0,09 1,50
FADH2
2,27 2,19 1,65 -0,09 1,50
Transporte de elétrons
2,28
Ciclo do ácido tricarboxílico Citr Arg
e Fosforilação oxidativa
1,50 1,50
0,05 1,59 3,60 0,03 0,00 0,23 0,00 0,00 0,09
Fluxos de saída
0,05 1,59 3,60 0,03 0,00 0,26 0,00 0,00 0,09
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.15. Distribuição dos fluxos metabólicos e as mudanças significativas ao variar a
velocidade específica de consumo de fosfato. Os valores dos fluxos em vermelho representam
a condição 1 e dos fluxos em azul representam a condição 2.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 133
5.2.6. Análise de fluxos metabólicos para verificar a influência do extrato de
levedura na produção de cosmomicina
5.2.6.1. In silico
A simulação do modelo metabólico proposto (item 5.1) mostrou indícios de que a
concentração de aminoácidos no meio de cultura é uma variável importante tanto para o
crescimento celular quanto para produção de cosmomicina. A adição de aminoácidos puros no
meio de cultivo pode tornar o processo inviável economicamente devido ao alto custo desses
reagentes. Uma alternativa interessante para verificar, qualitativamente, como a adição de
aminoácidos pode influenciar na produção de cosmomicina é variar a composição do extrato
de levedura no meio de cultivo, uma vez que o extrato de levedura tem em sua composição a
maioria dos aminoácidos.
Com o objetivo de verificar a influência do extrato de levedura na produção de
cosmomicina foi realizado um estudo de análise de fluxos através de simulações variando a
concentração do extrato de levedura em 0,5, 5, 10, 15 e 20 g/L. A utilização de concentrações
superiores a 20 g/L poderia inviabilizar economicamente o processo.
Inicialmente foram calculadas, para cada concentração de extrato de levedura, as taxas
de consumo de cada um dos seus componentes (aminoácidos, carboidrato, nitrogênio
excedente e fosfato) utilizando a Equação 41 e levando em consideração os dados de
Pamboukian (2003) para o cultivo contínuo a uma vazão específica de alimentação de 0,05. A
Tabela 5.10 mostra os valores obtidos.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 134
Tabela 5.10. Cálculo das taxas de consumo de aminoácidos, carboidrato e fosfato baseado em
diferentes concentrações de extrato de levedura a D = 0,05 h
-1
.
Concentração de extrato de levedura (g/L)
0,05 5 10 15 20
Componentes do extrato de
levedura e do casaminoácidos
r(mmol.g célula seca
-1
.h
-1
)
Alanina 0,0031
0,0287
0,0571
0,0855
0,1139
Arginina 0,0010
0,0084
0,0166
0,0248
0,0329
Ácido aspártico 0,0028
0,0242
0,0479
0,0716
0,0954
Cistina 0,0003
0,0029
0,0058
0,0087
0,0116
Ácido glutâmico 0,0059
0,0469
0,0925
0,1381
0,1836
Glicina 0,0023
0,0207
0,0412
0,0616
0,0820
Histidina 0,0005
0,0038
0,0075
0,0111
0,0148
Isoleucina 0,0016
0,0120
0,0237
0,0353
0,0469
Leucina 0,0023
0,0175
0,0344
0,0513
0,0682
Lisina 0,0021
0,0171
0,0338
0,0504
0,0670
Metionina 0,0005
0,0035
0,0068
0,0101
0,0135
Fenilalanina 0,0010
0,0075
0,0147
0,0220
0,0292
Prolina 0,0019
0,0115
0,0221
0,0328
0,0435
Serina 0,0018
0,0133
0,0260
0,0388
0,0515
Treonina 0,0015
0,0120
0,0237
0,0354
0,0471
Triptofano 0,0004
0,0032
0,0063
0,0095
0,0126
Tirosina 0,0006
0,0034
0,0066
0,0097
0,0128
Valina 0,0019
0,0157
0,0310
0,0462
0,0615
Carboidrato 0,0047
0,0466
0,0933
0,1399
0,1865
Fosfato 0,0051
0,0510
0,1019
0,1529
0,2038
Nitrogênio 0,0197
0,0343
0,0359
0,0522
0,0684
As taxas de consumo desses substratos, como também as velocidades específicas de
crescimento celular, as velocidades específicas de consumo de glicose, oxigênio e nitrogênio,
obtidas por Pamboukian (2003) para uma vazão específica de alimentação igual a 0,05 h
-1
(Tabela 5.5), foram utilizadas como dados de entrada no modelo computacional em GAMS
tendo como função objetivo a maximização da produção de cosmomicina.
Ao simular as cinco condições propostas foi verificado que o aumento da concentração
de extrato de levedura no meio de cultivo induziu a um aumento na velocidade específica de
produção de cosmomicina, como mostra a Figura 5.16.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 135
0,0 0,5 5 10 15 20
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Velocidade específica de produção de cosmomicina
(mmol.g célula seca
-1
.h
-1
)
Concentração de extrato de levedura (g/L)
Figura 5.16. Relação entre a variação da velocidade específica de produção de cosmomicina e
a concentração de extrato de levedura no meio num cultivo contínuo de S. olindensis ICB20 à
D = 0,05 h
-1
.
A limitação da concentração de extrato de levedura no meio de cultivo, através da
redução de sua concentração de 5 g/L a 0,5 g/L, levou a uma redução, em torno de 28%, da
velocidade específica de produção de cosmomicina. Entretanto, ao aumentar a concentração
de extrato de levedura de 5 g/L para 10, 15 e 20 g/L foi verificado um incremento nas
velocidades específicas de produção de cosmomicina em torno de 20, 37 e 53%,
respectivamente.
Analisando a distribuição dos fluxos intracelulares nas concentrações de extrato de
levedura que induziram a um aumento na produção de cosmomicina pode ser verificado que
houve mudanças significativas em alguns fluxos. As Figuras 5.17 e 5.18 mostram onde
ocorreram essas mudanças.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 136
Fluxos de entrada
SO4 PO4 O2 H Gro GLC FACoA ACP AA NH3
v8 v7 v6 v5 v4 v3 v2 v1 v11...v28 v9
Glco ADPGlc Glicólise Biossíntese de His
v65 v64
Histidina
v113
G1P
v31
PRPP
v63
Biossíntese de carboidratos
v42 v43
G6P Ru5P
Açúcares
v44 v139
polipeptídicos
Reações de ácido fólico
v32 v47
G1P THF Form MTHF R5P
v211 v169 v170 v171 v172
F6P S7P
v216
ForTHF MetTHF MeTHF
v34 v45
EstPyr
PGA3 XyL5P
v212
Biossíntese
v37
v213
família do Gly
v115
Ser
v46
OdiGlu
Serina
v114
PG3 E4P
v218
Cys
v117
Pentose fosfato
v162 v39
Biossíntese dos AA
dRodi dFuc
dRodo
Biossíntese Aromáticos Phe
família do Aspartato
v79 v80 v81
Adomet Ile PEP Chor Prep
v122 v103 v60 v62 v83
C Met Thr
v40 v84 v86
Tyr
O
v121 v120 v91
Pyr Trp
S Rhod Hcy Hse
v59
M MaCoA
v95 v90 v110
Ala Leu
O
v206
Lys AspSA
v61 v48 v97 v100
M
v207
ProCoA
v88 v89
OIV
I Asn Asp AcCoA Biossíntese
v98
C
v198 v87 v194
família do Alanina
Val
I MaCoA
N
0,75
Biossíntese da
A Cos
v67 0,63 v66
OAA Cit
v50
Icit família do Glutamato
0,55 v49
GluSA Pro
Biossíntese de
0,47 v56 v51 v104 v105
Ácidos graxos MaACP AcACP Mal Glx
v161
Palm HexACP
v58 v57
OG Glu Gln
v69 v68 v55
AcCoA
v52 v153 v154
v189 2,27 v106
NADH
2,12 v188
Fum Suc SucCoA Orn
2,67 2,02
ATP ADP
v54 v53 v107
FADH2
2,80 v190 1,91
Ciclo do ácido tricarboxílico
2,90
Transporte de elétrons
Citr Arg
3,00
e fosforilação oxidativa
v109
Fluxos de saída
v186 v219 v221 v222 v223 v224 v225 v226 v220
Biomassa Ac CO2 Cos Form H NH3 Pyr Adocys
Figura 5.17. Mapa de distribuição dos fluxos metabólicos com os valores dos fluxos
que mostraram mudanças significativas durante o cultivo contínuo à D = 0,05 h
-1
nas
concentrações de extrato de levedura de 5, 10, 15 e 20 g/L.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 137
5 10 15 20
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Fluxos com mudanças significativas
(mmol.g célula seca
-1
.h
-1
)
Concentração de extrato de levedura (g/L)
v67 v189 v190
Figura 5.18. Valores dos fluxos que mostraram mudanças significativas durante o cultivo
contínuo à D = 0,05 h
-1
nas concentrações de extrato de levedura de 5, 10, 15 e 20 g/L.
A maior disponibilidade no meio de cultivo de aminoácidos, carboidrato, fosfato e
nitrogênio excedente, componentes presentes no extrato de levedura, induziram a uma
repressão da via biossintética de ácidos graxos verificada pela redução na conversão de
malonil-CoA a malonil-ACP (reação v67). Como a via biossintética dos ácidos graxos
compete com a via biossintética de cosmomicina a redução do fluxo na reação v67 levou a um
aumento na produção de cosmomicina por disponibilizar maior quantidade de malonil-CoA a
ser convertido a propanoil-CoA, precurssor da biossíntese do antibiótico em estudo.
Mudanças foram observadas nos fluxos de transporte de elétrons com relação à
produção de ATP, a maior disponibilidade de extrato de levedura no meio de cultivo induziu a
um aumento da produção de ATP pelo co-fator FADH
2
(v190)e uma redução na produção de
ATP pelo co-fator NADH (v189). Isso pode ser explicado pelo fato do co-fator NADH ser
mais requisitado na produção de cosmomicina do que o FADH
2
.
Assim pode ser concluído que o extrato de levedura é um componente importante no
meio de cultivo quando se pretende estudar a produção de cosmomicina e que o aumento de
sua disponibilidade no meio é uma proposta de otimização desse processo. Baseado nessa
conclusão, obtida pela simulação do modelo metabólico em estudo, foi proposto uma parte
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 138
experimental para verificar in vitro, condição controlada de processo, o que foi obtido in
silico, condição simulada pelo modelo metabólico.
5.2.6.2. In vitro
Foram realizados dois ensaios experimentais em incubador rotativo para verificar a
hipótese de aumento da produção de cosmomicina ao aumentar a concentração de extrato de
levedura no meio de cultivo. O ensaio 1 foi realizado com o meio R5Mod, onde a
concentração de extrato de levedura foi de 5 g/L. O ensaio 2 foi realizado com o meio R5Mod
mudando apenas a concentração de extrato de levedura para 20 g/L.
Os ensaios experimentais tiveram duração de 68 horas. Durante esse período foram
retiradas amostras para análise de produção de biomassa, consumo de glicose e síntese de
cosmomicina, através da quantificação do complexo retamicina, como também para obtenção
dos dados cinéticos. As Figuras 5.19 e 5.20 mostram os perfis de concentração celular (X), de
consumo de glicose (S) e de concentração de retamicina total (P) nos ensaios 1 e 2.
0 10 20 30 40 50
0,5
1,0
1,5
X
Tempo (h)
0,1
0,2
0,3
0,4
P
Produção de retamicina total (g/L)
1
2
3
4
5
6
7
S
Consumo de glicose (g/L)
Crescimento celular (g/L)
Figura 5.19. Concentração de biomassa (X), concentração de glicose (S) e concentração de
retamicina (P), no ensaio 1 utilizando o meio R5Mod com 5 g/L de extrato de levedura. Com
concentração de biomassa inicial (X
0
= 0,67 g/L) e concentração de glicose inicial (S
0
= 5,93
g/L).
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 139
0 10 20 30 40 50
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
X
Consumo de glicose (g/L)
Tempo (h)
Crescimento celular (g/L)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
P
Produção de retamicina total (g/L)
1
2
3
4
5
6
7
S
Figura 5.20. Concentração de biomassa (X), concentração de glicose (S) e concentração de
retamicina(P), no ensaio 2 utilizando o meio R5Mod com 20 g/L de extrato de levedura. Com
concentração de biomassa inicial (X
0
= 1,11 g/L) e a concentração de glicose inicial (S
0
= 4,96
g/L).
Ao analisar os dois ensaios foi verificado que as maiores concentrações do antibiótico
foram obtidas na fase estacionária de crescimento celular. As maiores concentrações de
cosmomicina foram obtidas quando o substrato glicose atingiu um patamar próximo a
exaustão. A concentração celular máxima no ensaio 1 foi cerca de 1,4 (g/L) enquanto que no
ensaio 2 atingiu um valor cerca de 2 (g/L). Em relação ao substrato (glicose), no ensaio 1 a
glicose atingiu um patamar próximo a exaustão em torno de 25 horas de cultivo. No ensaio 2
a glicose atingiu esse patamar um pouco mais cedo em torno de 15 horas de cultivo. A maior
concentração de retamicina total foi obtida no ensaio 2, em torno de 1 g/L, uma vez que no
ensaio 1 a maior concentração de retamicina total foi observada apenas a 0,32 g/L.
As velocidades específicas foram calculadas a partir da interpolação dos dados
experimentais no Origin e utilização da planilha proposta por Zajic Le Duy (Schmidell et al.,
2001). Os perfis das velocidades específicas nos ensaios 1 e 2 são mostrados nas Figuras 5.21
e 5.22.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 140
-10 0 10 20 30 40 50
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
µ
x
Velocidade específica de consumo de glicose (g.g célula
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Velocidade específica de crescimento celular (h
-1
)
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
µ
p
Velocidade específica de produção de retamicina total
(g.g célula seca
-1
.h
-1
)
0,0
0,1
0,2
0,3
µ
s
Figura 5.21. Velocidade específica de crescimento celular (µ
x
), velocidade específica de
consumo de substrato (µ
s
) e velocidade específica de produção de retamicina (µ
p
), no ensaio 1
utilizando o meio R5Mod com 5 g/L de extrato de levedura.
-10 0 10 20 30 40 50
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
µ
x
Velocidade específica de crescimento celular (h
-1
)
Tempo (h)
Velocidade específica de consumo de substrato (g.g célula seca
-1
.h
-1
)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
µ
p
Velocidade específica de produção de retamicina total
(g.g célula seca
-1
.h
-1
)
0,00
0,05
0,10
0,15
µ
s
Figura 5.22. Velocidade específica de crescimento celular (µ
x
), velocidade específica de
consumo de substrato (µ
s
) e velocidade específica de produção de retamicina (µ
p
), no ensaio 2
utilizando o meio R5Mod com 20 g/L de extrato de levedura.
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 141
Ao analisar os perfis de velocidades específicas de crescimento celular e de produção
de cosmomicina foi verificada uma defesagem entre essas curvas caracterizando um processo
de produção de metabólito secundário, como esperado. A velocidade específica máxima de
crescimento celular ficou em torno de 0,10 h
-1
no ensaio 1 e de 0,06 h
-1
no ensaio 2, em torno
de 20 e 10 horas de cultivo, respectivamente. A mudança no meio de cultivo, para um meio
mais rico em extrato de levedura, induziu a célula a desviar o seu metabolismo para a síntese
do produto cosmomicina reduzindo a velocidade máxima de crescimento celular.
Provavelmente utilizando o substrato do meio para manutenção celular e disponibilizando
assim uma maior porção de substrato para o metabolismo secundário. Esse comportamento
pode ser visualizado pelas curvas das velocidades específicas de produção de retamicina nos
dois ensaios como mostrado na Figura 5.23.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
Velocidade específica de produção de retamicina total
(g.g célula seca
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
µ
p
E
1
µ
p
E
2
Figura 5.23. Velocidade específica de produção de retamicina (µ
p
), nos ensaios 1 e 2.
A velocidade específica de produção de retamicina atingiu os valores máximos em
torno de 0,01 h
-1
e 0,02 h
-1
, nos ensaios 1 e 2 respectivamente. Comparando os dois ensaios
foi verificado que a mudança na composição do meio em termos de concentração de extrato
de levedura induziu a um incremento em torno de 100% na velocidade específica de produção
de retamicina. Isso reproduz, experimentalmente, o que o foi simulado pelo modelo
metabolólico proposto. No experimento in silico foi obtido um incremento de apenas 53%, já
no experimento in vitro o incremento ficou em torno de 100%, a diferença quantitativa entre
esse dois valores poderá ser devido ao fato que o experimento in silico toma como base os
Resultados e Discussão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 142
dados de um cultivo em biorreator em condição de processo contínuo e o experimento in vitro
foi realizado em incubador rotativo em condição de processo descontínuo. A realização de
experimentos em biorreatores em condições contínua de processo poderá prover dados
quantitativos para as comparações de eficiências.
A escolha por realizar os experimentos de forma descontínua de processo nos deu a
base para o conhecimento da cinética do processo. Revelando importantes dados com relação
à máxima capacidade do micro-organismo e de seus parâmetros de transformação nas
condições estudadas.
Capítulo 6
Conclusão
Conclusão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 144
6. CONCLUSÃO
Com base nos conceitos de análise de fluxos metabólicos foi construído um modelo
metabólico, composto por 245 reações, que simula a natureza do metabolismo de
Streptomyces olindensis ICB20 incluíndo as principais rotas do metabolismo primário e a via
secundária de produção do antibiótico cosmomicina. Com esse modelo obteve-se a
distribuição dos fluxos intracelulares e extracelulares.
6.1. Validação do modelo metabólico de Streptomyces olindensis
Para verificar se o modelo era preditivo foram realizadas simulações em diferentes
condições de otimização (maximização do crescimento celular e maximização da produção de
cosmomicina) e de restrições (com e sem restrição das velocidades específicas de consumo de
aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente). Os resultados das simulações
foram comparados com os dados da literatura e a condição na qual restringe as velocidades
específicas de consumo dos componentes do meio complexo (extrato de levedura e
casaminoácidos) mostrou habilidade em predizer os dados experimentais da literatura em
diferentes condições de otimização.
As restrições impostas para as velocidades específicas de consumo de aminoácidos,
carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente se basearam na composição do meio complexo
(R5Mod). A descrição desse meio foi de extrema importância para obtenção de um modelo
preditivo.
Com a simulação da condição sem restrição das velocidades específicas de consumo de
aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente foram obtidos valores de fluxos
muito distantes dos valores experimentais podendo ser um indicativo da máxima capacidade
do micro-organismo em obter esses rendimentos. Levando a acreditar que a composição de
aminoácidos no meio de cultivo é uma variável importante tanto para o crescimento celular
quanto para a produção de cosmomicina por Streptomyces olindensis ICB20.
Conclusão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 145
6.2. Aplicação da modelagem metabólica
Ao aplicar a modelagem metabólica para obter a distribuição dos fluxos foram obtidas
interessantes conclusões em relação ao metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20 e a
produção de cosmomicina.
Ao analisar a distribuição dos fluxos, otimizando o crescimento celular, em diferentes
vazões específicas de alimentação (0,03, 0,05, 0,1 h
-1
) foi verificado que o incremento nessa
taxa induziu a uma maior disponibilidade de acetil-CoA, precursor da biossíntese de ácidos
graxos. Essa variação gerou mudanças na produção de oxoglutarato, na via do glioxilato, na
produção de energia, no balanço redox como também no consumo de oxigênio e na produção
de CO
2
.
Ao analisar a distribuição dos fluxos, otimizando a produção de cosmomicina, em
diferentes vazões específicas de alimentação (0,03, 0,05, 0,1 h
-1
) foi verificado que o consumo
de glutamina, o metabolismo de piruvato e a produção de malato são variáveis importantes
para a produção de cosmomicina.
Baseado no trabalho de Pamboukian (2003) foi identificado que a condição de maior
produtividade em cosmomicina foi a uma vazão específica de alimentação igual a 0,05 h
-1
.
Essa condição foi utilizada para fazer um estudo mais detalhado da distribuição dos fluxos
metabólicos obtidos pelo modelo em duas condições de otimização, otimização do
crescimento celular e otimização da produção de cosmomicina. Ao comparar os dois mapas
de distribuição de fluxos foi verificado que houve importantes mudanças com relação a
produção de energia, ao balanço redox, ao consumo de oxigênio, geração de dióxido de
carbono, aos fluxos no ciclo de Krebs incluindo a via do glioxilato. A produção de acetil-CoA
foi maior ao maximizar a produção de cosmomicina e o direcionamento do acetil-CoA para
biossíntese de ácidos graxos foi maior ao otimizar o crescimento celular. Com esse estudo foi
verificado a importância de incluir no meio de cultivo precursores do antibiótico (como o
acetil-CoA) e/ou do crescimento celular (como os ácidos graxos) como objetivo de diminuir a
competição por precursores em comum e assim aumentar o rendimento no processo.
Com a análise de sensibilidade das funções objetivo pode ser concluído que a
biossíntese de materiais de estocagem (fosfatidato) e de alguns aminoácidos (tirosina,
fenilalanina e glutamato) foram identificados como fluxos mais sensíveis para provocar
mudanças tanto no crescimento celular quanto na produção de cosmomicina.
Conclusão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 146
Ao identificar os precursores em comum nas vias de produção de cosmomicina e de
produção de ácidos graxos foi realizado um estudo avaliando o efeito da repressão da via
biossintética de ácidos graxos na produção de cosmomicina. Foi realizado uma simulação
propondo uma modificação genética, regulação da expressão gênica do gene FabH. Essa
regulação foi obtida através da manipulação in silico do fluxo da reação catalisada pela
enzima 3-oxoacil- (ACP) sintase III. Ao reduzir a velocidade específica de conversão de
acetil-CoA a AcACP em 50 % foi obtido um incremento em 60% na produção de
cosmomicina.
A limitação de substrato mostrou ser um fator importante quando se quer otimizar a
produção de cosmomicina. A limitação de oxigênio induziu a uma redução na produção de
cosmomicina a partir de 68%. A limitação de sulfato induziu a uma redução de 50%
entretanto a de fosfato não interferiu na produção de cosmomicina.
A concentração de extrato de levedura também mostrou ser uma variável importante
quando o objetivo é otimizar a produção de cosmomicina. Ao utilizar o modelo metabólico
proposto para simular diferentes concentrações do extrato de levedura (0,5, 5, 10, 15 e 20 g/L)
foi verificado uma interferência na produção de cosmomicina. A limitação da concentração de
extrato de levedura no meio de cultivo, reduzindo sua concentração de 5 g/L a 0,5 g/L, levou
a uma redução da velocidade específica de produção de cosmomicina em torno de 28 %.
Entretando, o aumento da concentração de extrato de levedura de 5 g/L para 10, 15 e 20 g/L
levou a um incremento nas velocidades específicas de produção de cosmomicina em torno de
20, 37 e 53 %, respectivamente. Esse incremento foi induzido pela inibição da via
biossintética de ácidos graxos, disponibilizando uma maior quantidade de malonil-CoA para a
biossíntese de cosmomicina. A produção de ATP também foi influenciada por essa mudança
no meio de cultivo, sendo maior representada pela conversão de FADH
2
a FAD
+
.
Disponibilizando uma maior quantidade de NADH para ser utilizado no metabolismo
secundário de Streptomyces olindensis ICB20.
Isso leva a uma indicação que o extrato de levedura é um componente importante no
meio de cultivo quando se pretende estudar a produção de cosmomicina e que o aumento de
sua disponibilidade no meio é uma proposta de otimização desse processo.
Baseado nessa conclusão, obtida pela simulação do modelo metabólico em estudo, foi
realizada uma parte experimental para verificar in vitro o que foi obtido in silico. Para isso
foram realizados dois ensaios experimentais, em incubador rotativo, para verificar a hipótese
de aumento da produção de cosmomicina ao aumentar a concentração de extrato de levedura
Conclusão
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ 147
no meio de cultivo. O ensaio 1 foi realizado com o meio R5Mod, onde a concentração de
extrato de levedura era de 5 g/L. E o ensaio 2 foi realizado com o meio R5Mod mudando
apenas a concentração de extrato de levedura para 20 g/L. Ao comparar os dois ensaios foi
verificado que uma mudança na composição do meio em termos de concentração de extrato
de levedura induziu a um incremento em torno de 100% na velocidade específica de produção
de retamicina. Isso reproduz experimentalmente, de uma forma qualitativa, o que o foi
simulado pelo modelo metabolólico proposto o qual obteve um incremento em 53%. A
realização de experimentos em biorreator em condições contínua de processo poderá fornecer
dados quantitativos para essas comparações.
O modelo metabólico construído permitiu integrar vários tipos de informações do
metabolismo de Streptomyces olindensis, tanto experimentais quanto teóricas, num único
quadro, fornecendo uma representação estruturada dos dados disponíveis sobre a cepa
estudada. A metodologia utilizada nesse trabalho pode servir para compilação de muitos
dados disponíveis na literatura com intuito de propor rotas metabólicas e assim poder fazer
um estudo mais aprofundado no metabolismo a ser estudado. A utilização de modelos
metabólicos é de extrema importância quando se pretende apontar estratégias e propor
modificações no metabolismo minimizando as medidas experimentais e reduzindo tempo e
custo de operação.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
149
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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STROHL, W. R.; CONNORS, N. C. Significance of anthraquinone formation and the cloning
of actinorhodin genes in heterogeneous Streptomycetes. Molecular Microbiology, v. 6(2), p.
147-152, 1992.
TAKAÇ, S. et al. Metabolic flux distribution for the optimized production of L-glutamate.
Enzyme and Microbial Technology, v. 23, p. 286-300, 1998.
TAKEBE, H. et al. Relationship between sugar consumption and tricarboxylic acid cycle
enzyme activity in a high bialaphos-producing strain. Journal of Fermentation and
Bioengineering, v.71, p.110-113, 1991.
UDAKA, S. Pathway-specific pattern of control of are, inine biosynthesis in bacteria. The
Journal of Bacteriology, v. 91, p. 617-621, 1966.
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applications to lysine fermentations. Ed. Frontier in Bioprocessing. Boca Raton, CRC Press,
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Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
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http://www.usbio.net/Product.aspx?ProdSku=C2080
http://www.genome.jp/kegg/
http://www.gams.com
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
162
APÊNDICE
APÊNDICE A
Programa para exportar os dados da matriz estequiométrica
Sub Export_Data()
Workbooks.Add
Range("D2").Select
ActiveCell.Formula = "='[M2_WONH3 modificado 6 ICB20.xls]MATRIX'!D2"
Range("D2").Copy
Range("D2:IN2").Select
ActiveSheet.Paste
Range("C4").Select
ActiveCell.Formula = "='[M2_WONH3 modificado 6 ICB20.xls]MATRIX'!C4"
Range("C4").Copy
Range("C4:IN250").Select
ActiveSheet.Paste
Range("C4:C250").Select
Selection.NumberFormat = "000000"
Range("D4:IN250").Select
With Selection
.HorizontalAlignment = xlRight
.VerticalAlignment = xlBottom
End With
Selection.NumberFormat = "[<0]-0.00000;0.000000"
ChDir "C:\Users\Kate\Documents\UFRN\Doutorado_2008\Execução das propostas
de aplicação do modelo"
ActiveWorkbook.SaveAs Filename:= _
"C:\Users\Kate\Documents\UFRN\Doutorado_2008\Execução das propostas de
aplicação do modelo", FileFormat:=xlText, CreateBackup:=False
ActiveWorkbook.Save
ActiveWindow.Close
End Sub
Programa para importar os fluxos metabólicos calculados pelo GAMS
Sub Import_Fluxes()
Import_Fluxes Macro
ActiveWindow.SmallScroll Down:=248
Range("A4").Select
Selection.QueryTable.Refresh BackgroundQuery:=False
Range("A4:A248").Select
Selection.Copy
Range("D3").Select
Selection.PasteSpecial Paste:=xlPasteAll, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=True
End Sub
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
163
APÊNDICE B
B. 1. Programa em GAMS para otimização da velocidade específica de crescimento
celular
* METABOLIC FLUX ANALYSIS FOR STREPTOMYCES OLINDENSIS
$Offlisting
* List of Metabolites
Sets
Metabolite
/MVit,MFACoA,MGlc,MGro,MH,MO2,MPO4,MSO4,MNH3,MCHO,MAla,MArg,MCys,M
Asp,MTrp,MGlu,MGly,MHis,MIle,MLeu,MLys,MMet,MPhe,MPro,MSer,MThr,MTyr,MVal
,MGln,MAsn,AcExt,AdoCysExt,CO2Ext,CosExt,FormExt,Hext,NH3ext,TGExt,PyrExt,Main
t,AlaExt,ArgExt,CysExt,AspExt,TrpExt,GluExt,GlyExt,HisExt,IleExt,LeuExt,LysExt,MetExt
,PheExt,ProExt,SerExt,ThrExt,TyrExt,ValExt,BIO,CHO,DNA,Plip,Prot,RNA,Ac,AcACP,Ac
CoA,ACP,AcSer,AdoCys,Adomet,ADP,ADPGlc,AGL3P,AHB,AICAR,AIR,Ak,AkKet,Akla,
AkMet,Ala,Alac,AMP,Anth,APS,Arg,ArgSuc,Arog,Asn,Asp,AspSA,ATP,BBMIII,BMIII,Cb
mP,CDP,CDPDG,Chor,Cit,Citr,CMP,CO2,COS,CTP,Cys,Cyst,dADP,dAMP,DAP,dCDP,dCi
n,dCMP,dCTP,DeAK,dFuc,DG,dGDP,dGlu,dGMP,DHAP,DHQ3,DHS3,DodGlu,DPG,DPGr
o,dRodi,dRodo,dTDP,dTMP,dTTP,dUMP,dUTP,E4P,EpyrS,EstPyr,Estul,F6P,FACoA,FADH
2,FAICAR,FbP,FGAM,FGAR,Form,ForTHF,Fum,G1P,G6P,GAR,GDP,Glc,Glco,GL3P,Gln,
Glu,GluSA,Glx,Gly,GMP,Gro,GTP,H,H2S,HexACP,Hcy,His,Hnohen,HPP,Hse,Hypro,Icit,Il
e,ImGroP,IMP5,Ino,InoP,Leu,Lys,MaACP,MaCoA,Mal,mDAP,Met,MeTHF,MetTHF,MTHF
,NADH,NADPH,NH3,Nohen,O2,OAA,OB,OdiGlu,OG,OIV,OMP,Orn,Oro,Oxpro,Palm,Pal
mCoA,PAPS,PDcar,PEP,PG2,PG3,PGA3,PGn6,Phe,Pi,PO4,Ppi,PRA,PrAt5,PrCoA,Prep,Pro,
ProCoA,PRPP,Ptd,PtdEtn,PtdGro,PtdIno,PtdSer,Pyr,Rhod,R1P,R5P,Ru5P,S7P,Ser,SMal2,SO
3,SO4,Suc,SucCoA,SucHse,TG,THF,Thr,Trp,TR-
red,Tyr,UDP,UMP,Ure,UTP,Val,XMP,Xyl5P/;Alias(Metabolite,m);
Sets
* List for the Pseudo-steady-state
i(m)/CHO,DNA,Plip,Prot,RNA,Ac,AcACP,AcCoA,ACP,AcSer,AdoCys,Adomet,ADP,
ADPGlc,AGL3P,AHB,AICAR,AIR,Ak,AkKet,Akla,AkMet,Ala,Alac,AMP,Anth,APS,Arg,A
rgSuc,Arog,Asn,Asp,AspSA,ATP,BBMIII,BMIII,CbmP,CDP,CDPDG,Chor,Cit,Citr,CMP,C
O2,COS,CTP,Cys,Cyst,dADP,dAMP,DAP,dCDP,dCin,dCMP,dCTP,DeAK,dFuc,DG,dGDP,
dGlu,dGMP,DHAP,DHQ3,DHS3,DodGlu,DPG,DPGro,dRodi,dRodo,dTDP,dTMP,dTTP,dU
MP,dUTP,E4P,EpyrS,EstPyr,Estul,F6P,FACoA,FADH2,FAICAR,FbP,FGAM,FGAR,Form,F
orTHF,Fum,G1P,G6P,GAR,GDP,Glc,Glco,GL3P,Gln,Glu,GluSA,Glx,Gly,GMP,Gro,GTP,H,
H2S,HexACP,Hcy,His,Hnohen,HPP,Hse,Hypro,Icit,Ile,ImGroP,IMP5,Ino,InoP,Leu,Lys,MaA
CP,MaCoA,Mal,mDAP,Met,MeTHF,MetTHF,MTHF,NADH,NADPH,NH3,Nohen,O2,OAA,
OB,OdiGlu,OG,OIV,OMP,Orn,Oro,Oxpro,Palm,PalmCoA,PAPS,PDcar,PEP,PG2,PG3,PGA
3,PGn6,Phe,Pi,PO4,Ppi,PRA,PrAt5,PrCoA,Prep,Pro,ProCoA,PRPP,Ptd,PtdEtn,PtdGro,PtdIno
,PtdSer,Pyr,Rhod,R1P,R5P,Ru5P,S7P,Ser,SMal2,SO3,SO4,Suc,SucCoA,SucHse,TG,THF,Th
r,Trp,TR-red,Tyr,UDP,UMP,Ure,UTP,Val,XMP,Xyl5P/
* List of Extracelular Products and acumulated metabolites
j(m)/AcExt,AdoCysExt,CO2Ext,CosExt,FormExt,Hext,NH3ext,TGExt,PyrExt,Maint,A
laExt,ArgExt,CysExt,AspExt,TrpExt,GluExt,GlyExt,HisExt,IleExt,LeuExt,LysExt,MetExt,Ph
eExt,ProExt,SerExt,ThrExt,TyrExt,ValExt/
* List of Fluxes
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
164
Set
Flux /v1*v245/; Alias(Flux,n);
* List of reversible fluxes
Set
reversible_Flux
(n)/v32,v34*v39,v43*v47,v50,v51,v53*v56,v59,v61,v105,v115,v130,v136,v160,v162,v169*
v171,v195*v198/;Alias(reversible_Flux,nr);
* List of irreversible fluxes
Set
irreversible_Flux(n)/v1*v31,v33,v40*v42,v48,v49,v52,v57,v58,v60,v62*v104,v106*v1
14,v116*v129,v131*v135,v137*v159,v161,v163*v168,v172*v194,v196*v245/;Alias
(irreversible_Flux,nir);
* Stoichiometric Matrix
Table S(m,n) = inserir tabela com os coeficientes estequiométricos construída no Excel.
VARIABLES
* Metabolic Fluxes
v(n) Metabolic Fluxes
* Linear programing objective Function for BIO maximization
Z_Bio Bio Objective Function;
* FLuxes boundaries
v.lo(nir)=0;
* Experimental Growth rate
Parameter Mu;
*Mu= inserir valor correspondente;
EQUATIONS
GLC_Flux equation1
QO2_Flux equation2
QNH3_Flux equation3
COS_Flux equation4
Ala_Flux equation5
Arg_Flux equation6
Asp_Flux equation7
Cys_Flux equation8
Glu_Flux equation9
Gly_Flux equation10
His_Flux equation11
Ile_Flux equation12
Leu_Flux equation13
Lys_Flux equation14
Met_Flux equation15
Phe_Flux equation16
Pro_Flux equation17
Ser_Flux equation18
Thr_Flux equation19
Trp_Flux equation20
Tyr_Flux equation21
Val_Flux equation22
CHO_Flux equation23
PO4_Flux equation24
Asn_Flux equation25
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
165
MNH3_Flux equation26
ACP_Flux equation 27
* Pseudo-Steady-State rates
r_PSS(i) equation28
* Positive fluxes constrain
r_P(j) equation29
Bio_function equation30;
* Initial Flux
GLC_Flux..v('v3')=E= inserir valor correspondente;
QO2_Flux..v('v6')=E= inserir valor correspondente;
QNH3_Flux..v('v225')=E= inserir valor correspondente;
COS_Flux..v('v222')=E= inserir valor correspondente;
Ala_Flux..v('v11')=E= inserir valor correspondente;
Arg_Flux..v('v12')=E= inserir valor correspondente;
Asp_Flux..v('v14')=E= inserir valor correspondente;
Cys_Flux..v('v13')=E= inserir valor correspondente;
Glu_Flux..v('v16')=E= inserir valor correspondente;
Gly_Flux..v('v17')=E= inserir valor correspondente;
His_Flux..v('v18')=E= inserir valor correspondente;
Ile_Flux..v('v19')=E= inserir valor correspondente;
Leu_Flux..v('v20')=E= inserir valor correspondente;
Lys_Flux..v('v21')=E= inserir valor correspondente;
Met_Flux..v('v22')=E= inserir valor correspondente;
Phe_Flux..v('v23')=E= inserir valor correspondente;
Pro_Flux..v('v24')=E= inserir valor correspondente;
Ser_Flux..v('v25')=E= inserir valor correspondente;
Thr_Flux..v('v26')=E= inserir valor correspondente;
Trp_Flux..v('v15')=E= inserir valor correspondente;
Tyr_Flux..v('v27')=E= inserir valor correspondente;
Val_Flux..v('v28')=E= inserir valor correspondente;
CHO_Flux..v('v10')=E= inserir valor correspondente;
PO4_Flux..v('v7')=E= inserir valor correspondente;
Asn_Flux ..v('v30')=E= inserir valor correspondente;
MNH3_Flux..v('v9')=E= inserir valor correspondente;
ACP_Flux..v('v1')=E= inserir valor correspondente;
* Set of Constrains for the pool of metabolites in Pseudo-Steady-State
r_PSS(i)..sum(n,S(i,n)*v(n))=E=0;
* Set of Constrains for the primary metablism products
r_P(j)..sum(n,S(j,n)*v(n))=G=0;
* Objective function for LP problem, Maximize Bio Production
Bio_function..sum(n,S('BIO',n)*v(n))=E=Z_Bio
* Equation taken into account in the Optimization Model
MODEL MFA_LP_Bio /All/;
Option Decimals=8;
*Options limrow=100000;
*Options limcol=100000;
* Metabolic Flux Analysis Solved in a linear programming fashion
*Maximizing Biomass formation
SOLVE MFA_LP_Bio USING LP Maximizing Z_Bio;
Display Z_Bio.L,Z_Bio.M,r_P.L,v.L,v.M;
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
166
file results_LP_Bio /Kate_Fluxes_LP_Bio.txt/;
put results_LP_Bio;
*put 'MFA_LP_Bio Results'//;
loop(n, put v.l(n):18:12;put /;);
putclose results_LP_Bio
B. 2. Programa em GAMS para otimização da velocidade específica de produção de
cosmomicina
* METABOLIC FLUX ANALYSIS FOR STREPTOMYCES OLINDENSIS
$Offlisting
* List of Metabolites
Sets
Metabolite
/MVit,MFACoA,MGlc,MGro,MH,MO2,MPO4,MSO4,MNH3,MCHO,MAla,MArg,MCys,M
Asp,MTrp,MGlu,MGly,MHis,MIle,MLeu,MLys,MMet,MPhe,MPro,MSer,MThr,MTyr,MVal
,MGln,MAsn,AcExt,AdoCysExt,CO2Ext,CosExt,FormExt,Hext,NH3ext,TGExt,PyrExt,Main
t,AlaExt,ArgExt,CysExt,AspExt,TrpExt,GluExt,GlyExt,HisExt,IleExt,LeuExt,LysExt,MetExt
,PheExt,ProExt,SerExt,ThrExt,TyrExt,ValExt,BIO,CHO,DNA,Plip,Prot,RNA,Ac,AcACP,Ac
CoA,ACP,AcSer,AdoCys,Adomet,ADP,ADPGlc,AGL3P,AHB,AICAR,AIR,Ak,AkKet,Akla,
AkMet,Ala,Alac,AMP,Anth,APS,Arg,ArgSuc,Arog,Asn,Asp,AspSA,ATP,BBMIII,BMIII,Cb
mP,CDP,CDPDG,Chor,Cit,Citr,CMP,CO2,COS,CTP,Cys,Cyst,dADP,dAMP,DAP,dCDP,dCi
n,dCMP,dCTP,DeAK,dFuc,DG,dGDP,dGlu,dGMP,DHAP,DHQ3,DHS3,DodGlu,DPG,DPGr
o,dRodi,dRodo,dTDP,dTMP,dTTP,dUMP,dUTP,E4P,EpyrS,EstPyr,Estul,F6P,FACoA,FADH
2,FAICAR,FbP,FGAM,FGAR,Form,ForTHF,Fum,G1P,G6P,GAR,GDP,Glc,Glco,GL3P,Gln,
Glu,GluSA,Glx,Gly,GMP,Gro,GTP,H,H2S,HexACP,Hcy,His,Hnohen,HPP,Hse,Hypro,Icit,Il
e,ImGroP,IMP5,Ino,InoP,Leu,Lys,MaACP,MaCoA,Mal,mDAP,Met,MeTHF,MetTHF,MTHF
,NADH,NADPH,NH3,Nohen,O2,OAA,OB,OdiGlu,OG,OIV,OMP,Orn,Oro,Oxpro,Palm,Pal
mCoA,PAPS,PDcar,PEP,PG2,PG3,PGA3,PGn6,Phe,Pi,PO4,Ppi,PRA,PrAt5,PrCoA,Prep,Pro,
ProCoA,PRPP,Ptd,PtdEtn,PtdGro,PtdIno,PtdSer,Pyr,Rhod,R1P,R5P,Ru5P,S7P,Ser,SMal2,SO
3,SO4,Suc,SucCoA,SucHse,TG,THF,Thr,Trp,TR-
red,Tyr,UDP,UMP,Ure,UTP,Val,XMP,Xyl5P/;Alias(Metabolite,m);
Sets
* List for the Pseudo-steady-state
i(m)/CHO,DNA,Plip,Prot,RNA,Ac,AcACP,AcCoA,ACP,AcSer,AdoCys,Adomet,ADP,
ADPGlc,AGL3P,AHB,AICAR,AIR,Ak,AkKet,Akla,AkMet,Ala,Alac,AMP,Anth,APS,Arg,A
rgSuc,Arog,Asn,Asp,AspSA,ATP,BBMIII,BMIII,CbmP,CDP,CDPDG,Chor,Cit,Citr,CMP,C
O2,COS,CTP,Cys,Cyst,dADP,dAMP,DAP,dCDP,dCin,dCMP,dCTP,DeAK,dFuc,DG,dGDP,
dGlu,dGMP,DHAP,DHQ3,DHS3,DodGlu,DPG,DPGro,dRodi,dRodo,dTDP,dTMP,dTTP,dU
MP,dUTP,E4P,EpyrS,EstPyr,Estul,F6P,FACoA,FADH2,FAICAR,FbP,FGAM,FGAR,Form,F
orTHF,Fum,G1P,G6P,GAR,GDP,Glc,Glco,GL3P,Gln,Glu,GluSA,Glx,Gly,GMP,Gro,GTP,H,
H2S,HexACP,Hcy,His,Hnohen,HPP,Hse,Hypro,Icit,Ile,ImGroP,IMP5,Ino,InoP,Leu,Lys,MaA
CP,MaCoA,Mal,mDAP,Met,MeTHF,MetTHF,MTHF,NADH,NADPH,NH3,Nohen,O2,OAA,
OB,OdiGlu,OG,OIV,OMP,Orn,Oro,Oxpro,Palm,PalmCoA,PAPS,PDcar,PEP,PG2,PG3,PGA
3,PGn6,Phe,Pi,PO4,Ppi,PRA,PrAt5,PrCoA,Prep,Pro,ProCoA,PRPP,Ptd,PtdEtn,PtdGro,PtdIno
,PtdSer,Pyr,Rhod,R1P,R5P,Ru5P,S7P,Ser,SMal2,SO3,SO4,Suc,SucCoA,SucHse,TG,THF,Th
r,Trp,TR-red,Tyr,UDP,UMP,Ure,UTP,Val,XMP,Xyl5P/
* List of Extracelular Products and acumulated metabolites
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
167
j(m)/AcExt,AdoCysExt,CO2Ext,CosExt,FormExt,Hext,NH3ext,TGExt,PyrExt,Maint,A
laExt,ArgExt,CysExt,AspExt,TrpExt,GluExt,GlyExt,HisExt,IleExt,LeuExt,LysExt,MetExt,Ph
eExt,ProExt,SerExt,ThrExt,TyrExt,ValExt/
* List of Fluxes
Set
Flux /v1*v245/;Alias(Flux,n);
* List of reversible fluxes
Set
reversible_Flux
(n)/v32,v34*v39,v43*v47,v50,v51,v53*v56,v59,v61,v105,v115,v130,v136,v160,v162,v169*
v171,v195*v198/;Alias(reversible_Flux,nr);
* List of irreversible fluxes
Set
irreversible_Flux(n)/v1*v31,v33,v40*v42,v48,v49,v52,v57,v58,v60,v62*v104,v106*v1
14,v116*v129,v131*v135,v137*v159,v161,v163*v168,v172*v194,v196*v245/;Alias
(irreversible_Flux,nir);
* Stoichiometric Matrix
Table S(m,n) = inserir tabela com os coeficientes estequiométricos construída no Excel.
VARIABLES
* Metabolic Fluxes
v(n) Metabolic Fluxes
* Linear programing objective Function for COS maximization
Z_COS COS Objective Function;
* FLuxes boundaries
v.lo(nir)=0;
* Experimental Growth rate
Parameter Mu;
Mu= inserir valor correspondente;
EQUATIONS
GLC_Flux equation1
QO2_Flux equation2
QNH3_Flux equation3
*COS_Flux equation4
Ala_Flux equation5
Arg_Flux equation6
Asp_Flux equation7
Cys_Flux equation8
Glu_Flux equation9
Gly_Flux equation10
His_Flux equation11
Ile_Flux equation12
Leu_Flux equation13
Lys_Flux equation14
Met_Flux equation15
Phe_Flux equation16
Pro_Flux equation17
Ser_Flux equation18
Thr_Flux equation19
Trp_Flux equation20
Tyr_Flux equation21
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
168
Val_Flux equation22
CHO_Flux equation23
PO4_Flux equation24
Asn_Flux equation25
MNH3_Flux equation26
ACP_Flux equation 27
* Pseudo-Steady-State rates
r_PSS(i) equation28
* Positive fluxes constrain
r_P(j) equation29
* Biomass Lower limit
BIO_Y equation30
*COS rate
COS_function equation31;
* Initial Flux
GLC_Flux..v('v3')=E=inserir valor correspondente;
QO2_Flux..v('v6')=E= inserir valor correspondente;
QNH3_Flux..v('v225')=E= inserir valor correspondente;
*COS_Flux..v('v222')=E=;
Ala_Flux..v('v11')=E= inserir valor correspondente;
Arg_Flux..v('v12')=E= inserir valor correspondente;
Asp_Flux..v('v14')=E= inserir valor correspondente;
Cys_Flux..v('v13')=E= inserir valor correspondente;
Glu_Flux..v('v16')=E= inserir valor correspondente;
Gly_Flux..v('v17')=E= inserir valor correspondente;
His_Flux..v('v18')=E= inserir valor correspondente;
Ile_Flux..v('v19')=E= inserir valor correspondente;
Leu_Flux..v('v20')=E= inserir valor correspondente;
Lys_Flux..v('v21')=E= inserir valor correspondente;
Met_Flux..v('v22')=E= inserir valor correspondente;
Phe_Flux..v('v23')=E= inserir valor correspondente;
Pro_Flux..v('v24')=E= inserir valor correspondente;
Ser_Flux..v('v25')=E= inserir valor correspondente;
Thr_Flux..v('v26')=E= inserir valor correspondente;
Trp_Flux..v('v15')=E= inserir valor correspondente;
Tyr_Flux..v('v27')=E= inserir valor correspondente;
Val_Flux..v('v28')=E= inserir valor correspondente;
CHO_Flux..v('v10')=E= inserir valor correspondente;
PO4_Flux..v('v7')=E= inserir valor correspondente;
Asn_Flux ..v('v30')=E= inserir valor correspondente;
MNH3_Flux..v('v9')=E= inserir valor correspondente;
ACP_Flux..v('v1')=E= inserir valor correspondente;
* Set of Constrains for the pool of metabolites in Pseudo-Steady-State
r_PSS(i)..sum(n,S(i,n)*v(n))=E=0;
* Set of Constrains for the primary metablism products
r_P(j)..sum(n,S(j,n)*v(n))=G=0;
*Constrain for Biomass Production
BIO_Y..v('v186')=E=Mu;
* Objective function for LP problem, Maximize Cos Production
COS_function..sum(n,S('CosExt',n)*v(n))=E=Z_COS
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
169
* Equation taken into account in the Optimization Model
MODEL MFA_LP_COS /All/;
Option Decimals=8;
*Options limrow=100000;
*Options limcol=100000;
* Metabolic Flux Analysis Solved in a linear programming fashion
*Maximizing Cosmomycin production
SOLVE MFA_LP_COS USING LP Maximizing Z_Cos;
Display Z_Cos.L,Z_Cos.M,r_P.L,v.L,v.M;
file results_LP_Cos /Kate_Fluxes_LP_Cos.txt/;
put results_LP_Cos;
*put 'MFA_LP_Cos Results'//;
loop(n, put v.l(n):18:12;put /;);
putclose results_LP_Cos
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
170
APÊNDICE C
Reações metabólicas
Fluxos de entrada
v11
AlaMAla
→
v12
ArgMArg
→
v13
CysMCys
→
v14
AspMAsp
→
v15
TrpMTrp
→
v16
GluMGlu
→
v17
GlyMGly
→
v18
HisMHis
→
v19
IleMIle
→
v20
LeuMLeu
→
v21
LysMLys
→
v22
MetMMet
→
v23
PheMPhe
→
v24
ooM
PrPr
→
v25
SerMSer
→
v26
ThrMThr
→
v27
TyrMTyr
→
v28
ValMVal
→
v29
lnln
GMG
→
v30
AsnMAsn
→
Glicólise
v1
ACPMvit
→
v2
FaCoAMFaCoA
↔
v3
GlcMGlc
→
v4
GroMGro
↔
v5
HMH
↔
v6
22
OMO ↔
v7
44
POMPO ↔
v8
44
SOMSO ↔
v9
33
NHMNH ↔
v10
GlcMCHO
→
v31
PGADPATPGlc
6
+
→
+
v32
PFPG
66
↔
v33
ADPFbPATPPF
+
→
+
6
v34
3
PGADHAPFbP
+
↔
v35
3
PGADHAP
↔
v36
NADHDPGPiNADPGA +↔++
+
3
v37
ATPPGADPDPG
+
↔
+
3
v38
23
PGPG
↔
v39
PEPPG
↔
2
v40
ATPPyrADPPEP
+
→
+
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
171
Via das pentose fosfato
v41
NADPHPGnNADPPG +→+
+
66
v42
256 CONADPHPRuNADPPGn ++→+
+
v43
PRPRu 55
↔
v44
PXylPRu 55
↔
v45
PSPGAPRPXyl 7355
+
↔
+
v46
PEPFPSPGA 4673
+
↔
+
v47
3645 PGAPFPEPXyl
+
↔
+
Metabolismo do piruvato
v48
2
CONADHAcCoACoANADPyr ++→++
+
Ciclo do Ácido tricarboxílico
v49
CoACitOAAAcCoA
+
→
+
v50
IcitCit
↔
v51
2
CONADPHOGNADPIcit ++↔+
+
v52
2
CONADHSucCoACoANADOG ++→++
+
v53
CoAATPSucPiADPSucCoA
+
+
↔
+
+
v54
2
FADHFumFADSuc +↔+
+
v55
MalFum
↔
v56
NADHOAANADMal
+
↔
+
Reações anapleróticas
v57
SucGlxIcit
+
→
v58
CoAMalAcCoAGlx
+
→
+
v59
PiADPOAACOATPPyr
+
+
↔
+
+
2
v60
PiOAACOPEP +→+
2
v61
2
CONADPHPyrNADPMal ++↔+
+
v62
PpiAMPPEPPiATPPyr
+
+
→
+
+
Biossíntese de materiais de estocagem
v63
PGPG
16
→
v64
PpiADPGlcATPPG
+
→
+
1
v65
ADPGlcoADPGlc
+
→
v66
CoAAcACPACPAcCoA
+
→
+
v67
CoAMaACPACPMaCoA
+
→
+
v68
2
7777777 CONADNADPACPHexACPNADHNADPHMACPAcACP ++++→+++
++
v69
ACPPalmHexACP
+
→
v70
PpiAMPPalmCoACoAATPPalm
+
+
→
+
+
v71
NADHFADHAcylCoACoANADFADPalmCoA 778777
2
++→+++
++
v71
ADPPGLATPGro
+
→
+
3
v73
CoAPAGLFACoAPGL
+
→
+
33
v74
CoAPtdFACoAPAGL
+
→
+
3
v75
PiDGPtd
+
→
v76
CoATGAcylCoADG
+
→
+
Metabolismo de aminoácidos
v77
PiDHQPEPPE 234
+
→
+
v78
33 DHSDHQ
→
v79
PiADPNADPChorPEPATPNADPHDHS 23 +++→+++
+
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
172
v80
epChor Pr
→
v81
2
Pr COOGPheGluep ++→+
v82
2
Pr CONADHHPPNADep ++→+
+
v83
OGTyrGluHPP
+
→
+
v84
PyrGluAnthGChor
+
+
→
+
ln
v85
PpiAtPRPPAnth
+
→
+
5Pr
v86
2
35Pr COPGATrpSerAt ++→+
v87
OGAspGluOAA
+
→
+
v88
GluPpiAMPAsnGATPAsp
+
+
+
→
+
+
ln
v89
PiNADPADPAspSANADPHATPAsp +++→++
+
v90
+
+→+ NADPHseNADPHAspSA
v91
PiADPThrATPHse
+
+
→
+
v92
+
+→++ NADPPdcarNADPHPyrAspSA
v93
SucOGCoADAPGluSucCoAPdcar
+
+
+
→
+
+
v94
mDAPDAP
→
v95
2
COLysmDAP +→
v96
2
2
COAlacPyr +→
v97
+
+→+ NADPOIVNADPHAlac
v98
OGValGluOIV
+
→
+
v99
CoASMalAcCoAOIV
+
→
+
2
v100
2
2
CONADHOGLeuGluNADSMal +++→++
+
v101
3
NHOBThr +→
v102
2
COAHBPyrOB +→+
v103
OGNADPIleGluNADPHAHB ++→++
+
v104
PiNADPADPGluSANADPHATPGlu +++→++
+
v105
+
+→+ NADPoNADPHGluSA Pr
v106
CoAADPNADPPiOGAcOrnNADPHATPAcCoAGlu ++++++→+++
+
2
v107
PiCitrCbmPOrn
+
→
+
v108
PpiAMPArgSucAspATPCitr
+
+
→
+
+
v109
FumArgArgSuc
+
→
v110
+
+→++ NADAlaNHNADHPyr
3
v111
PpiBBMIIIATPPRPP 2
+
→
+
v112
AICARGluGroPGBBMIII
+
+
→
+
Imln
v113
PiOGNADHHisNADGluGroP +++→++
+
22Im
v114
PiOGNADHSerGluNADPG +++→++
+
3
v115
GlyMeTHFTHFSer
+
↔
+
v116
CoAAcSerAcCoASer
+
→
+
v117
AcCysSHAcSer +→+
2
v118
CoASucHseSucCoAHse
+
→
+
v119
SucCystCysSucHse
+
→
+
v120
3
NHPyrHcyCyst ++→
v121
THFMetMTHFHcy
+
→
+
v122
PpiPiAdoMetATPMet
+
+
→
+
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
173
v123
GluPiADPCbmPCOATPG +++→++ 22ln
2
v124
PiNADHOroNADAspCbmP ++→++
+
v125
PpiOMPPRPPOro
+
→
+
v126
2
COUMPOMP +→
v127
ADPUDPATPUMP
+
→
+
v128
ADPUTPATPUDP
+
→
+
v129
PiADPCTPNHATPUTP ++→++
3
v130
ATPCDPADPCTP
+
↔
+
v131
oxTRdCDPredTRCDP
−
+
→
−
+
v132
ADPdCTPATPdCDP
+
→
+
v133
3
NHdUTPdCTP +→
v134
PpidUMPdUTP
+
→
v135
THFFADdTMPMeTHFFADHdUMP ++→++
+
2
v136
ATPCMPADPCDP
+
↔
+
v137
+
+−→+− NADPredTRNADPHoxTR
v138
ATPdCMPADPdCDP
+
→
+
v139
PRPPAMPATPPR
+
→
+
5
v140
PpiGluPRAGPRPP
+
+
→
+
ln
v141
GluTHFPiADPAIRGForTHFGlyATPPRA
+
+
+
+
→
+
+
+
+
33ln3
v142
FumPiADPAICARAspATPCOAIR +++→+++
2
v143
THFFAICARForTHFAICAR
+
→
+
v144
5
IMPFAICAR
→
v145
NADHXMPNADIMP +→+
+
5
v146
PpiGluAMPGMPGATPXMP
+
+
+
→
+
+
ln
v147
ADPGDPATPGMP
+
→
+
v148
ADPGTPATPGDP
+
→
+
v149
oxTRdGDPredTRGDP
−
+
→
−
+
v150
oxTRdADPredTRADP
−
+
→
−
+
v151
ATPdAMPADPdADP
+
→
+
v152
ATPdGMPADPdGDP
+
→
+
v153
+
+→++ NADPGluNHNADPHOG
3
v154
PiADPGNHATPGlu ++→++ ln
3
v155
+
+→++ NADGluOGNADHG 2ln
v156
UreOrnArg
+
→
v157
32
2NHCOUre +→
v158
GluSAOGOrn
→
+
v159
NADHGluNADGluSA +→+
+
v160
3
NHNADHOGNADGlu ++↔+
+
v161
GluNHG +→
3
ln
v162
3
NHPyrSer +↔
v163
232
2
2
1
CONHGluOHis ++→+
Reações envolvendo a assimilação de sulfato
v164
PpiAPSATPSO +→+
4
v165
ADPPAPSATPAPS
+
→
+
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
174
v166
3
SOoxTrPAPredTRPAPS +−+→−+
v167
+
+→+ NADPSHNADPHSO 33
23
v168
PiAMPPAP
+
→
Reações de ácido fólico
v169
PiADPForTHFATPFormTHF
+
+
→
+
+
v170
ForTHFMetTHF
↔
v171
+
+↔+ NADPMeTHFNADPHMetTHF
v172
+
+→+ NADPMTHFNADPHMeTHF
Biossíntese de fosfolipídios
v173
PpiCDPDGCTPPtd
+
→
+
v174
CMPPtdSerSerCDPDG
+
→
+
v175
2
COPtdEtnPtdSer +→
v176
PiCMPPtdGroPGLCDPDG
+
+
→
+
3
v177
DpGroGroPtdGro
+
→
2
v178
InoPPG
→
6
v179
PiInoInoP
+
→
v180
CMPPtInoCDPDGIno
+
→
+
v181
)(3313,01944,05085,0 gPlipPtdInoDPGroPtdEtn
→
+
+
Biossíntese de proteínas
v182
)(Pr2382,95250,210486,32382,9
4764,182868,124764,187309,02382,0
0982,04382,03727,0Pr3818,03200,02655,0
5927,07782,05018,01636,00582,14545,0
ln4545,01582,04164,04164,05109,08873,0
gotPpiPiADPAMP
GDPATPGTPValTyr
TrpThrSeroPheMet
LysLeuIleHisGlyGlu
GCysAspAsnArgAla
++++
+→+++
++++++
++++++
+
+
+
+
+
+
Biossíntese de RNA
v183
PiADPgRNA
ATPCMPUMPGMPAMP
2583,72583,7)(
2583,76146,06146,09902,08049,0
++→
+
+
+
+
Biossíntese de DNA
v184
PiADPgDNA
ATPdTMPdGMPdCMPdAMP
9902,109902,10)(
9902,107968,08196,08194,07968,0
++→
+
+
+
+
Biossíntese de carboidrato
v185
)(1728,6 gCHOGlco
→
Biossíntese de biomassa
v186
)(393,0033,0042,0100,0Pr432,0 gBioCHOPlipDNARNAot
→
+
+
+
+
Transferência de elétrons e manutenção
v187
PiPO →
4
v188
ADPAMPATP 2
→
+
v189
+
+→+++ NADATPOPiADPNADH 35,033
2
v190
+
+→+++ FADATPOPiADPFADH 25,022
22
v191
NADHNADPNADNADPH +→+
++
v192
ManutençãoATP
→
v193
PiPpi 2
→
Biossíntese de cosmomicina
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
175
v194
PiADPMaCoACOATPAcCoA ++→++
2
v195
2
ONADPHOxproNADPMaCoA ++↔+
+
v196
+
+↔+ NADPHyproNADPHOxpro
v197
CoAHypor Pr
↔
v198
+
+↔+ FADoCoAFADHCoA PrPr
2
v199
2
9109Pr
COCoANohenACPMaCoAoCoA ++→++
v200
+
+→+ NADHNohenNADHNohen
v201
ACPDeAkHNohen
+
→
v202
AkODeAk →+
2
v203
AdoCysAkMetAdoMetAk
+
→
+
v204
AkKetAkMet
→
v205
+
+→+ NADPAklaNADPHAkKet
v206
+
+→++ NADPRhodONADPHAkla
2
v207
2
6222 COdTDPCosdRodidRododFucRhod ++→+++
v208
ADPdTTPATPdTDP
+
→
+
v209
PpidGludTTPPG
+
→
+
1
v210
NADHDodGluNADdGlu +→+
+
v211
EstpyrDodGlu
→
v212
+
+→+ NADPOdiGluNADPHEstpyr
v213
+
+→+ NADPdFucNADPHOdiGlu
v214
EpyrSEstpyr
→
v215
EstulEpyrS
→
v216
AdoCysdRodoNHAdoMetEstul +→++
3
v217
dCinOdiGlu
→
v218
+
+→+ NADdRodiNADHdCin
Fluxos de saída
v219
AcExtAc
→
v220
AdoCysExtAdoCys
→
v221
ExtCOCO
22
→
v222
CosExtCos
→
v223
FormExtForm
→
v224
HExtH
→
v225
ExtNHNH
33
→
v226
PyrExtPyr
→
v227
TGExtTG
→
v228
AlaExtAla
→
v229
ArgExtArg
→
v230
CysExtCys
→
v231
AspExtAsp
→
v232
TrpExtTrp
→
v233
GluExtGlu
→
v234
GlyExtGly
→
v235
HisExtHis
→
v236
IleExtIle
→
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
176
v237
LeuExtLeu
→
v238
LysExtLys
→
v239
MetExtMet
→
v240
PheExtPhe
→
v241
oExto
PrPr
→
v242
SerExtSer
→
v243
ThrExtThr
→
v244
TyrExtTyr
→
v245
ValExtVal
→
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
177
APÊNDICE D
DNS
Preparo de 1L da solução de DNS
Solução 1 – Dissolvia-se 16 g de NaOH em aproximadamente 200 mL de água
destilada e deixava-se esfriar à temperatura ambiente. A dissolução era feita com auxílio de
um agitador mecânico e o resfriamento era acelerado colocando-se o Becker em um banho-
maria contendo água à temperatura ambiente.
Solução 2 – Dissolvia-se 10 g de DNS (Ácido dinitro-salicílico) em aproximadamente
500 mL de água destilada. Dissolvia-se o mais completamente possível. Inicialmente num
Becker pequeno e transferia-se para um Becker maior com agitador magnético.
Solução 3 – Adicionava-se a solução 1 na solução 2 até completa dissolução.
Solução 4 – Adicionava-se a solução 3 300 g de sal de Rochelle (tartarato duplo de
sódio e potássio) e misturava-se até dissolver completamente. Completava-se o volume para 1
litro com água destilada no balão volumétrico.
Filtrava-se a solução 4 em funil de vidro de fundo sinterizado.
Guardava-se a solução de DNS em frasco inerte, escuro, em condições mínimas de luz
com papel de alumínio.
A padronização, cosntrução da curva padrão, deverá ser feita 10 dias após a preparação
da solução.
D.2. Preparo da curva padrão de glicose
Uma solução de glicose era preparada contendo 10 g de glicose/litro de solução.
Pesava-se 10 g de glicose, dissolvia-se em água e deixava-se em repouso na geladeira por 3
horas antes do uso.
A curva padrão de glicose era preparada de acordo com a metodologia indicada na
tabela abaixo.
Tubo Solução (mL) Água (mL) Concentração (mg/mL)
1
0,0 4,0 0
2
0,4 3,6 1
3
0,8 3,2 2
4
1,2 2,8 3
5
1,6 2,4 4
6
2,0 2,0 5
7
2,4 1,6 6
8
2,8 1,2 7
9
3,2 0,8 8
10
3,6 0,4 9
11
4,0 0,0 10
De cada tubo (1 a 11) retirava-se 1 mL. Fazia-se esse procedimento em duplicata.
Adicionava-se 1 mL de solução de DNS e tampava-se os tubos.
Levava-se os tubos para um banho termostatizado à 100°C por 5 minutos.
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
178
Retirava-se do banho e colocava-se em banho de gelo até temperatura ambiente e
deixava-se esfriar durante 3-5 minutos.
Adicionava-se 8 mL de água destilada.
Agitava-se em vortex e lia-se a absorbância a 590 nm, zerando o aparelho com o branco
da amostra (tubo 1).
Construia-se um gráfico de absorbância em função da concentração de glicose
(mg/mL). Encontrava-se assim, a equação de ajuste por regressão linear.
Concentração (mg/mL)
ABS
1
ABS
2
ABS
média
0 0,000 0,000 0,000
1 0,131 0,149 0,140
2 0,252 0,254 0,253
3 0,386 0,397 0,392
4 0,507 0,524 0,516
5 0,604 0,728 0,666
6 0,762 0,758 0,760
7 0,894 0,893 0,894
8 0,994 1,003 0,999
9 1,124 1,129 1,127
10 1,214 1,228 1,221
A curva padrão resultante foi 138,0*114,8
cos
−= ABSC
egli
com coeficiente de
correlação de 9985,0
2
=R .
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
179
APÊNDICE E
Publicações
Capítulos de livros publicados
1.
MAVITUNA, F.; MUNOZ-HERNADEZ, R.; LIMA LOBATO, A. K. C. Applications
of Metabolic Flux Balancing in Medicine. In: Andriani Daskalaki. (Org.). Handbook
of Research on Systems Biology Applications in Medicine. Hershey, PA: IGI Global,
2008.
(Apêndice F)
Resumos publicados em anais de congressos
1.
MUNOZ-HERNADEZ, R.; LIMA LOBATO, A. K. C.; BUM, K. H.; MAVITUNA, F.
Metabolic Flux Analysis to study the production of a non-ribosomal lipopeptide, CDA, by
Streptomyces coelicolor. In: BioSysBio - Systems Biology, Bioinformatics Synthetic
Biology Conference, 2007, Manchester.
2.
LIMA LOBATO, A. K. C.; MUNOZ-HERNADEZ, R.; FURLAN, R. L. A.; PADILLA,
G.; GARRIDO, L. M.; MACEDO, G. R.; MAVITUNA, F. Metabolic flux analysis for
directing metabolism of Streptomyces olindensis from growth to anti-tumor drug
(cosmomycin) production. In: BioSysBio - Systems Biology, Bioinformatics Systhetic
Biology Conference, 2007, Manchester.
3.
MUNOZ-HERNADEZ, R.; LIMA LOBATO, A. K. C.; BUM, K. H.; MAVITUNA, F.
Industrially relevant applications of Metabolic Engineering a study of CDA production by
Streptomyces coelicolor. In: The consortium for Post-Genome Science - Genomes to
Systems 2006 Conference, 2006, Manchester.
4.
LIMA LOBATO, A. K. C.; MUNOZ-HERNADEZ, R.; FURLAN, R. L. A.; PADILLA,
G.; GARRIDO, L. M.; MACEDO, G. R.; MAVITUNA, F. Metabolic flux balancing as a
potential tool for the design and optimization of Cosmomycin production by
Streptomyces olindensis ICB20. In: 14th Annual International Conference on Intelligent
Systems for Molecular Biology, 2006, Fortaleza.
5.
MUNOZ-HERNADEZ, R.; LIMA LOBATO, A. K. C.; MAVITUNA, F. Metabolic flux
analysis to study the production of CDA by Streptomyces coelicolor. In: 14th Annual
International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 2006, Fortaleza.
Trabalho completo em anais de congresso
1. LIMA LOBATO, A. K. C.; MUNOZ-HERNADEZ, R.; BEZERRA, M. S.; ASSIS, C. F.;
MAVITUNA, F.; MACEDO, G. R. Redirecionamento do metabolismo de Streptomyces
olindensis ICB20 para uma via preferencial de produção de cosmomicina. In: XVII
Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2009, Natal.
APÊNDICE F
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
180
Applications of Metabolic Flux Balancing in Medicine
Ferda Mavituna
1
, Raul Munoz-Hernandez
1
and Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato
2,3
1
The School of Chemical Engineering and Analytical Science, The University of Manchester
Sackville St, PO Box 88, Manchester, M60 1QD, UK.
Telephone: + 44 (161) 306 4372
Fax: +44 (161) 306 4399
Email: ferda.[email protected]c.uk,
raul.munozhernandez@postgrad.manchester.ac.uk
2
Department of Post-graduation in Chemical Engineering, Federal University of Rio Grande do Norte, Campus
universitário, Natal, CEP 59072-970, Brazil.
Telephone: +55 (84) 94183504
Fax: +55 (84) 215-3770
Email: katecarval[email protected].br
3
Current affiliation:
Oil and Gas Department, Potiguar University, Rua João da Escóssia, 1561, Nova Betânia, Mossoro, RN, CEP
59607-330, Brazil.
Telephone: +55 (84) 33238232
Fax: +55 (84) 33238220
Email: katecarval[email protected]
Abstract:
This chapter summarizes the fundamentals of metabolic flux balancing as a computational tool of
metabolic engineering and systems biology. It also presents some examples from the literature for its
applications in medicine. These examples involve mainly liver metabolism and antibiotic production.
Metabolic flux balancing is a computational method for the determination of metabolic pathway fluxes
through a stoichiometric model of the cellular pathways, using mass balances for intracellular
metabolites. It is a powerful tool to study metabolism under normal and abnormal conditions with a
view to engineer the metabolism. Its extended potential in medicine is emphasized in the future trends.
Keywords: Metabolic flux balancing, metabolic engineering, flux distributions, liver, antibiotic,
computational.
Introduction
Systems biology studies simultaneously the complex interaction of the many cell components using many levels
and forms of biological information and data in order to understand how they work together or not. After the
single cell, the natural challenge for the systems biology is to understand the integrated functioning of the
tissues, organs and the whole organism such as the human body.
In systems biology, metabolism is the final manifestation of the integrated functioning, regulation and control of
genes, transcription, translation and enzyme action. The effects of some genetic alterations cannot always be
observed in the phenotype but the genetic effects can be observed in the physiology or metabolome. Metabolism
is the fundamental determinant of cell physiology and the chemical engine that drives the living process.
Metabolic engineering is the study of metabolism using scientific and engineering tools in order to understand it
better under normal and abnormal conditions such as disease, injury, stress or mutation. Metabolic engineering is
therefore an important component of systems biology and metabolic flux balancing is a powerful tool of
metabolic engineering (Stephanopoulos et al, 1998; Palsson, 2006).
The objectives of this chapter are to introduce the fundamentals of metabolic flux balancing and show its
potential as a tool of systems biology through its applications in medicine.
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
181
Fundamentals of Metabolic Flux Balancing
Metabolism converts substrates into metabolic energy, redox potential and metabolic end products that are
essential for cellular function. Several independent reactions that govern the synthesis and organisation of the
macromolecules into a functioning cell can be classified as fueling reactions, biosynthetic reactions,
polymerisation reactions and assembly reactions.
Characteristics of metabolic pathways can be summarized as follows:
• Almost all metabolic reactions are reversible.
• Metabolic pathways however, are irreversible.
• Every metabolic pathway has a first committed step.
• All metabolic pathways are regulated.
• Metabolic pathways in eukaryotic cells occur in specific cellular locations.
• Different metabolic pathways are connected by metabolites that participate in more than one
pathway by pathway branching. These metabolites, therefore, connect one reaction sequence with
another.
• Co-factors like ATP, NADH and NADPH also take part in pathway integration because of their
central roles in biosynthetic reactions. Biosynthetic reactions continuously form and utilise these
co-factors and hence connect individual reactions both within the same pathway and between
different pathways.
While cell composition may vary with cell-type and physiological and environmental conditions, a typical cell
can be assumed to contain: protein, RNA, DNA, lipids, lipopolysaccharides, peptidoglycan, glycogen and free
amino acids. The 12 precursor metabolites formed in the biosynthetic pathways are used to synthesize about 75-
100 building blocks, coenzymes and prosthetic groups needed for cellular synthesis. The major biosynthetic
pathways involved in cell growth include the biosynthesis of amino acids, nucleotides, sugars, amino sugars and
lipids. The building blocks produced in biosynthetic reactions are sequentially linked into long branched or
unbranched polymeric chains during polymerisation reactions. These long polymeric chains are called the
macromolecules of cellular biomass and can be grouped into ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid
(DNA), proteins, carbohydrates, free amino acids and lipids.
Metabolic flux balancing is a computational method for the determination of metabolic pathway fluxes (specific
rates of reactions) through a stoichiometric model of the cellular pathways, using mass balances for intracellular
metabolites.
A very important assumption used in almost all of the large scale metabolic flux balancing applications is the
metabolic pseudo-steady state concept. In this context, the steady state refers to the condition at which all the
concentrations of the metabolites, the metabolic reactions rates and the biomass composition are constant during
the snapshot study of the metabolism. In practice, this is usually achieved by constant extracellular metabolite
concentrations in a continuous bioreactor or chemostat cultures. Furthermore, one of the characteristics of living
organisms is their ability to maintain a relatively constant composition whilst continually taking in nutrients
from the environment and returning excretory products which is called homeostasis.
The concept of metabolic steady state corresponds to a dynamic equilibrium. The dynamics of metabolic
reactions can also be expressed by their characteristic times. Various reactions of cell metabolism operate at
different time scales so when considering a reaction pathway, only reactions with comparable time scales need
be considered. The assumption of pseudo-steady state in the metabolism is therefore valid considering the
critical times/relaxation times of individual reactions compared to the organism’s response to changes in the
physico-chemical environment and frequency and sensitivity of observation/monitoring.
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
182
Figure 1. A hypothetical metabolic pathway involving metabolites A – C. The boundary for the purposes of
mass balances may represent the cell or a sub-cellular compartment. Metabolites A, B D and E are transported
across the boundary. r represents the fluxes (specific reaction rates).
Mass balances on metabolites is illustrated below using the hypothetical metabolic pathway of Figure 1. In
Figure 1, r
i
where i = 1 – 6, represents the specific reaction rate for the formation or consumption of a
metabolite, and r
A
, r
B
, r
D
and r
E
are the transport reactions for the metabolites between the cell (or cell
compartment) and its environment. These specific reactions are the metabolic fluxes. Referring to Figure 1, the
steady state mass balances for the individual metabolites are:
A:
0
1
=− rr
A
Eq. 1
B:
0
21
=−−
B
rrr
Eq. 2
C:
0
4352
=−−+ rrrr
Eq. 3
D:
0
63
=−+
D
rrr
Eq. 4
E:
0
654
=−−−
E
rrrr
Eq. 5
These metabolite balances are rearranged so that transport fluxes are presented separately from the internal
fluxes as shown in the matrices of Figure 2 and Eq. 6.
−
=
−−+
++
+−−+
−+
−
⇒
⇒
⇒
⇒
⇒
⇓⇓⇓⇓⇓⇓
E
D
B
A
r
r
r
r
r
r
r
r
r
r
EMetabolite
DMetabolite
CMetabolite
BMetabolite
AMetabolite
rrrrrr
0
111000
100100
011110
000011
000001
6
5
4
3
2
1
654321
Stoichiometric matrix, M Internal fluxes, v Transport Fluxes, b
Figure 2. Mass balances for the metabolites of the pathway of Figure 1, represented in matrix formalism.
A
B
C
D
E
r
1
r
3
r
2
r
4
r
5
r
6
r
A
r
B
r
D
r
E
Boundary for
mass
balances
Apêndice
Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato - Tese de Doutorado – UFRN - PPGEQ
183
These balances are then expressed in matrix formalism as shown in Figure 2. The elements of the stoichiometric
matrix M represent the stoichiometric coefficients of the metabolites participating in a particular reaction. If the
metabolite is produced in a particular reaction, then its stoichiometric coefficient is positive, if consumed
negative. A zero stoichiometric coefficient indicates that the metabolite does not participate in that particular
reaction. Note that this stoichiometric matrix M is written in transposed form of the stoichiometric matrices
introduced later in the text.
At steady state;
bMv
=
Eq. 6
Let’s assume that we can measure two transport fluxes, such as r
A
and r
D
.
Total number of internal fluxes = 6
Total number of transport fluxes = 4
Total number of fluxes = 6 + 4 = 10
Total number of known fluxes = 2
Total number of unknown fluxes = 8
Total number of linearly independent equations = 5 (metabolite balances)
Degrees of freedom = 8 - 5 = 3
There are three possible solutions for this metabolic network. Alternatively, if we could measure three more
fluxes, the degrees of freedom would be zero meaning that we could then calculate the remaining five unknown
fluxes using five metabolite balance equations.
Computational metabolic flux analysis via metabolic flux balancing involves the following steps:
1- Cell composition: measuring and/or compiling data on the macromolecular, metabolite, elemental
composition of the cells
2- Data compilation on constraints: measuring and /or compiling data on kinetic, operational, technological and
biological parameters and constraints. These include experimental specific growth, substrate uptake and product
formation rates.
3- Construction of the metabolism in matrix formalism: a matrix of stoichiometrically balanced biochemical
reactions of the metabolic pathways of interest is constructed using the metabolic pathway topology available
from the literature and databases such as; the Boehringer Mannheim table of metabolic pathways (Michal, 1993;
http://us.expasy.org/cgi-bin/show_thumbnails.pl) and KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html):
Stoichiometry is written such that a compound used in the forward reaction (as reactant) has a negative
stoichiometric coefficient, and a compound formed in the forward reaction has a positive stoichiometric
coefficient. For generalisation, following the nomenclature used in Stephanopoulos et al, (1998) and as shown in
Table 1, the stoichiometric coefficients will be termed as
α
for substrates,
β
for metabolic products,
γ
for
biomass compounds and
g
for intracellular metabolites. For the purpose of formulating a general stoichiometry
for cellular reactions we consider a system where
N
substrates are converted to
M
metabolic products and
Q
biomass constituents. The conversions are carried out in
J
reactions in which
K
intracellular metabolites also
participate as pathway intermediates. The reaction number and the compound are indicated by a two-numbered
index on the stoichiometric coefficient, e.g.
α
ji
is the stoichiometric coefficient for the
i
th
substrate in the
j
th
reaction. The substrates are termed
S
i
, the metabolic products
P
i
, the biomass constituents
X
macro,i
and the
K
pathway intermediates
X
met,i
. With these definitions, the stoichiometry for the
j
th
cellular reaction can be
written as
0
1
,
1
,
11
=+++
∑∑∑∑
====
K
i
imet
ji
Q
i
imacro
ji
M
i
i
ji
N
i
iji
X
g
XP
S
γβ
α
Eq. 7
Apêndice
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184
There is an equation like this for each of the
J
cellular reactions so it is convenient to write the stoichiometry for
all
J
reactions in a compact form using matrix notation:
0
=
+
Γ
+
+
metmacro
GXXBPAS
....Eq. 8
The matrices A, B, Γ
ΓΓ
Γ and G are stoichiometric matrices containing stoichiometric coefficients in the J reactions
for the substrates S, metabolic products P, biomass constituents X
macro
, and pathway intermediates X
met
,
respectively. It should be noted that the stoichiometric coefficients may be positive, negative or zero.
In these matrices rows represent reactions and columns metabolites which is different from the matrix in Figure
2 Following the rules of multiplication of a matrix by a vector, the stoichiometric matrices A, B, Γ
ΓΓ
Γ and G will
have to be transposed in step 4 which then converts them to the form used in Figure 2, that is in the transposed
matrices A
T
, B
T
, Γ
ΓΓ
Γ
T
and G
T
rows represent metabolites and columns reactions.
Table 1. Nomenclature used in the representation of metabolite mass balances following Stephanopoulos et al
(1998) in matrix formalism. Metabolic components and stoichiometric coefficients are the elements of the
metabolic and stoichiometric matrices, respectively in J metabolic reactions.
Metabolic Stoichiometric System Elements Total
Number
Component Matrix Coefficient Matrix
Metabolic Reactions J j (reaction)
v(rates)
N.A. N.A.
Substrates N S
S
α
A
Metabolic Products M P
P
β
B
Macromolecular Biomass
Components
Q X
macro
X
macro
γ
Γ
ΓΓ
Γ
Intracellular Metabolites
(pathway intermediates)
K X
met
X
met
g
G
4- From stoichiometry to reaction fluxes: The stoichiometry defines the relative amounts of the compounds
produced or consumed in each of the J intracellular reactions, but does not allow us to calculate the rates (fluxes)
at which metabolic reactions proceed, substrates are taken up and metabolic products are secreted in to the
medium. This can be done by introducing the rates of the individual reactions and further coupling them in order
to determine the overall rates.
For cellular reactions, the biomass is often used as a reference to define specific rates. Then, the cellular reaction
rates can be expressed as the specific rate of reaction (fluxes) with the units of (mmol metabolite) (g dry weight)
-
1
h
-1
.
The forward rate (or velocity, or flux), v, defines the rate of a chemical reaction, so a compound that has a
stoichiometric coefficient, β is formed at the rate vβ. The forward reaction rates of the J reactions are then
collected in the rate vector v.
The net specific uptake rate for the i
th
substrate is written as the sum of its consumption rate in all J reactions as
∑
=
−=
J
j
jji
is
v
r
1
,
α
Eq. 9
and the equation for the net specific rate of formation of the i
th
metabolic product is written as
∑
=
=
J
j
j
ji
ip
vr
1
,
β
Eq. 10
Apêndice
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185
Similarly, for macromolecular components
∑
=
=
J
j
j
ji
imacro
r
1
,
ν
γ
Eq. 11
and for intermediary metabolites
∑
=
=
J
j
j
ji
imet
g
r
1
,
ν
Eq. 12
By performing mass balances for each intracellular metabolite under pseudo-steady state assumption the steady
state balance equation is written as:
r
s
= A
T
v Eq. 13
r
p
= B
T
v Eq. 14
r
macro
= Γ
ΓΓ
Γ
T
v Eq. 15
r
met
= G
T
v Eq. 16
where v is the vector of fluxes, and r is the vector of net specific reaction rates. A
T
is the transpose of A.
5- Metabolic flux distributions: The equation for r
met
forms the basis for computational metabolic flux analysis,
i.e., the determination of the unknown pathway fluxes in the intracellular rate vector v:
∑
=
=
J
j
j
ji
imet
g
r
1
,
ν
Eq. 12
There are K number of intracellular metabolites. If the rate r
met,i
is positive there is a net formation of the i th
intracellular metabolite. If the rate r
met,i
is negative there is a net consumption of this metabolite. If the rate is
zero, the rates of formation and consumption exactly balance out in the J reactions.
6- Calculation of unknown fluxes: The metabolic reaction network matrix is solved for the unknown fluxes using
all the collated experimental and literature data on cell composition and any of the specific metabolic rates
(fluxes).
The vector equation represents K linear algebraic balances for the K intracellular metabolites with J unknowns
(the pathway fluxes). There is a certain degree of freedom in the set of algebraic equations given by F = J – K ,
because the number of reactions (J) is always greater than the number of pathway metabolites (K ). Therefore,
some of the elements in v have to be measured in order to allow the determination of the remaining.
The system is determined, with a unique solution, if exactly F fluxes (or reaction rates) in v are experimentally
measured or known. In such a determined system, the solution yields fluxes of the individual metabolic
reactions.
If more than F fluxes are measured, the system is overdetermined. If fewer than F fluxes are measured, the
system is underdetermined and the unknown fluxes can only be determined if additional constraints are
introduced or an overall optimization criterion is imposed.
Since a metabolite can take part in more than one metabolic reaction, and since there are many metabolites like
this, the number of reactions is usually greater than the number of metabolites. This means that the number of
unknown fluxes will be greater than the number of metabolite balance equations. This situation results in an
underdetermined system of linear algebraic equations which has infinite solutions. By using linear programming
with various stoichiometric, physiological and experimental constraints, an objective function can be defined and
Apêndice
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186
optimised (maximised or minimised). The objective function can be for example, the specific growth, or
substrate uptake or product formation rate. The optimised solution not only gives the optimised value of the
objective function but also the corresponding metabolic fluxes.
An example of a metabolic flux distribution is given in Figure 3 for Streptomyces coelicolor with the objective
function of the maximization of the antibiotic production. This figure shows a summary of the computed results
involving about 400 metabolic fluxes. The specific glucose uptake rate and the specific growth rate were given
as constraints to the programme.
Figure 3. Computed metabolic fluxes in Streptomyces coelicolor optimised for the maximum production of the
antibiotic actinorhodin with a specific growth rate (Mu in the figure) of 0.0253 h
-1
and a specific glucose uptake
rate of 0.29 (mmol) (g dw)
-1
h
-1
. Numbers in boxes next to the arrows indicate the flux value in (mmol) (g dw)
-1
h
-1
.
Pentose Phos
Serine Family A A
Histidine Family A
A
Nucleotides
Act
Aromatic A A
Pyruvate Family A A
Aspartate Family A A
TCA Cycle
Glutamate Family A A
Glc
Mu
O2
G6P
DGP
PEP
Pyr
AcCoA
OA
Cit
Icit
OG
SucCoA
Mal
Suc
Fum
PGA3
R5P
Shik
E4P
Prep
MaCoA
ATP
NADH
F
ADH2
CO2
NADH NAD
FADH2 FAD
CO2
Act
0.008
0.2949 0.0253 0.2613
0.235
0.000
0.000
0.007
0.007
0.447
0..077
0.392
0.000
0.298
-0.258 0.020
0.020
0.020
0.000
-0.009
0.017
0.000
1.519 0.000 0.307 0.795
0.3068 0.0135
-0.275
Apêndice
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187
Applications of Metabolic Flux Balancing in Medicine
Metabolic flux balancing is a powerful tool of metabolic engineering and can be applied for the following in
general:
• Quantification of various metabolic fluxes inside cells
• Identification of possible rigid branch points (nodes) in the pathways
• Calculation of non-measured extracellular fluxes
• Investigating the influence of alternative pathways on the distribution of fluxes
• Calculation of maximum theoretical yields
• Optimum growth and production media design
• Selecting the physico-chemical conditions for improved bioprocesses
• Extending the substrate and product range in bioprocesses by designing new metabolic pathways to
use new, novel substrates, achieve novel biotransformations
• Designing metabolic pathways to increase the formation of desired metabolites and decrease the
formation of unwanted metabolites
• Identification and testing of the important bioreactions and bottlenecks in the metabolism for
targeted genetic manipulations
• Comparison of the sets of admissible routes for the wild type (normal) and the
mutant/defective/genetically altered cells
As a tool of metabolic engineering, metabolic flux balancing has an important potential in medicine as shown by
the literature review given in this section. Most of the general applications listed above are still valid in the
medical field. The most valuable application of metabolic flux balancing is in the understanding of the
metabolism of the cells, organ and the body as an integrated system using a genome-scale metabolic reaction
network based on the known genomes. This is particularly useful to find out whether a single target for drug
development such as an enzyme or a gene is sufficient in the treatment of a particular medical condition. Often,
there is no guarantee that the manipulation of a single metabolic reaction will result in the desired systematic
response in the human body. The applications of metabolic flux balancing and other metabolic engineering tools
can therefore lead to savings in time and cost by contributing to the rational selection of targets for medical
treatment.
The current applications of metabolic flux balancing in medicine in particular, can be listed as:
• Study of the metabolism of cells, tissues, organs and the whole body using genome-scale metabolic
reaction networks under
o normal conditions
o diseased, injured, mutated or genetically altered (such as gene therapy) conditions
• More efficient industrial production of pharmaceuticals such as;
o Antibiotics
o Antitumor, anticancer compounds
o Antiparasitic compounds
o Antiviral compounds
Some examples of the applications of metabolic flux balancing in the study of human cell and organ metabolism
are summarized in Table 2. Table 3 on the other hand summarizes some examples of the application to the
production of antibiotics.
Apêndice
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188
Table 2. Some examples of application of metabolic flux balancing in the study of mammalian cell cultures.
Reference Application Model Metabolism studied
Si et al, 2007 Differentiating 3T3-L1
preadipocytes
MATLAB
Primary, Adipocyte
production
Chan et al, 2003a Primary rat hepatocytes 76 reactions
Primary,
Albumin
Banta et al, 2007 Metabolic network model
for liver
72 reactions
45 metabolites
Least-square
Banta et al, 2005 Effects of DHEA in liver
metabolism following a burn
injury
72 reactions
45 metabolites
Least-square
Central carbon, Nitrogen,
Energy
Yokoyama et al, 2005 Two liver models:
Gluconeogenic state (I)
Glycolytic state (II)
64 reactions
MATLABRN
Primary
Gluconeogenesis(I)
Glycolysis (II)
Nolan et al, 2006 Liver central carbon
metabolism
60 reactions
MATLAB
Primary
Calik and Akbay, 2000 Liver cells, focusing on
fibrosis
125 reactions
83 metabolites
GAMS 2.25
Primary
Collagen Palmitate
Chan et al, 2003b Rat hepatocytes in response
to low-insulin and amino
acid supplementation
76 reactions Primary:
Gluconeogenesis (plasma
cultures) Glycolysis
(medium cultures)
Albumin
Chan et al , 2003c Hepatocytes in response to
hormone and amino acid
supplementation
76 reactions Primary:
Gluconeogenesis (plasma
cultures) Glycolysis
(medium cultures)
Lee et al, 2000 The effect of injury on liver 61 reactions
35 metabolites
Primary
Lee et al, 2003 Hepatic hyper metabolism 60 reactions
Primary
Gambhir et al, 2003 Hybridoma cells
compared in three distinct
metabolic states.
30 reactions
32 metabolites
BIONET
Primary
Antibody
Apêndice
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189
Table 3. Application of metabolic flux balancing to the production of antibiotics.
Reference Application Computational
Model
Metabolism Studied
Rossa et al, 2002 Streptomyces lividans 38 Reactions
47 Compounds
BioNet
Biomass
Actinorhodin
Undecylprodigiosin
Bushell et al, 2006 Streptomyces clavuligerus 57 Reactions
Flux Analyzer
Clavulanic acid
Gonzalez-Lergier et al,
2006
Escherichia coli 933 Reactions
625 Comp.
Polyketides biosynthesis
Erythromycin
Naeimpoor and
Mavituna, 2001
Effect of different nitrogen
sources Streptomyces
coelicolor metabolism
237 reactions,
GAMS
Primary & Secondary
Actinorhodin
Kim et al, 2004 Streptomyces coelicolor
metabolism
400 Reactions
GAMS
Primary & Secondary CDA
Kleijn et al, 2007 Penicillium chrysogenum MNAv3.0 Penicillin-G
Thykaer et al, 2002 Penicillium chrysogenum Glucose uptake
Biomass
AA pattern
Adipoyl-7-ADCA
Primary
Adipate pathway Adipoyl-7-
ADCA
Van Gulik et al, 2000 Penicillium chrysogenum 195 Reactions
SPAD it
Primary &
Penicillin-G
Daae and Andrew,
1999
Streptomyces lividans 53 Metabolites 57
Reactions
Matlab/ Excel
Primary metabolism
Kiviharju et al, 2007 Streptomyces peucetius 515 Reactions
624 Reactions
Matlab/ Flux
Analyzer 5.2
Rhodomycinone
production
Naeimpoor and
Mavituna, 2000
Effect of nutrient limitations
on Streptomyces coelicolor
metabolism
200 reactions
GAMS
Primary metabolism &
Actinorhodin
Henriksen at al, 1996 Flux distribution for
different cultivation
conditions
Penicillin
72 reactions
77 metabolites.
Jin et al, 1997 S. cerevisiae metabolic flux
distributions
24 reactions Primary Heterologous
protein
Apêndice
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190
Future Trends
Metabolic flux balancing will show its full potential in medicine with the following applications some of which
are already developing in to exciting research topics:
• Drug development, delivery and drug testing in silico
o Identifying targets for drug development by studying host/pathogen and host/parasite
metabolic interactions in order to identify weak points in the metabolism of the pathogen or the
parasite without affecting the host
o Effects of drugs on the metabolism of the pathogen, parasite and host
o Drug metabolism in the host especially side effects, drug degradation, by-products and end
products of degradation
o Interpretation of experimental or clinical drug testing results, adjustment (scale-up) of drug
dosage from experimental animals to the patient
o The timing and dosing of the drug delivery intended to work on the pathogen or parasite but
which will be simultaneously degraded by the patient’s metabolism
• Environmental effects of chemicals such as organic and inorganic wastes, hormones or hormone
analogues, xenobiotics on the human metabolism
o Interactions
o Their degradation
o Investigation for potential treatments
• Gene therapy
o Suggestion of metabolic pathway synthesis
o Testing the metabolism’s response to genetic manipulations especially by consideration of
bypasses in the metabolic pathways
• Tissue engineering Metabolic models to study and simulate in vitro
o Growth of cells/tissues/organs in vitro (Grafts)
o Stem cell cultures
o Differentiation
o Apoptosis
• Symbiotic relationships between host and other organisms such as; probiotic and prebiotic foods
associated microbial cultures and their interactions with the human metabolism
• Similar applications as above in veterinary medicine
Metabolic flux balancing is a computational modelling tool which needs verification by in vivo and in vitro
experiments. Using isotope labelled substrates, metabolic intermediates in experiments, non-invasive techniques
such as NMR, genetic deletions in comparison with wild types, metabolic inhibitors, environmental
perturbations should all help in model verification, development and refinement. The results of optimised
solution reflect the theoretical capability of the metabolism and the cell and may not always be identical to the
experimental numerical values of the measured fluxes. If more experimental data are collected and more fluxes
are measured, the degree of freedom in the solution of the metabolic network reduces and the optimised results
approach
The fundamental assumption of pseudo-state in the construction of mass balances for metabolites in metabolic
flux balancing can be replaced with dynamic balances for small scale pathways but it will be more difficult for
genome-scale metabolic networks. As simpler models get verified, and our understanding of metabolism and
related cell functions increases, we should incorporate the aspects of compartmentalisation, regulation and
control of the metabolism in the cells, tissues, organs and the whole body.
Conclusions
In this chapter, the fundamentals of metabolic flux balancing as a computational tool of metabolic engineering
and systems biology have been introduced. Some examples summarized from the literature show its application
in medicine either through the study of metabolism of cell/tissue and organ cultures or through the increased
efficiency of the production of pharmaceuticals. Metabolic flux balancing provides valuable information about
metabolic pathway utilization, the extent of participation of metabolites and parts of the metabolism in the
overall system and metabolic physiology under different environmental conditions. Metabolic flux balancing not
only gives the individual metabolic reaction rates in the metabolism but also the secondary calculations can be
used to obtain sensitivity analysis based on the individual metabolic reaction rates. Using metabolic flux
balancing, metabolic bottlenecks, genetic deletions and amplifications can be tested in silico in order to develop
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a rational strategy to perform genetic changes/modifications. It can also be used to test different operating
conditions in order to improve the production of pharmaceuticals. More exciting applications in medicine, as
summarized in the future trends, will evolve as metabolic flux balancing gets integrated with other advances in
biotechnology, medicine and other related disciplines.
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Key Terms and Their Definitions
Metabolic Pathways: A metabolic pathway is any sequence of feasible and observable biochemical reaction
steps catalysed by enzymes and connecting a specified set of input and output metabolites.
Substrate: A substrate is a compound that is present in a sterile culture medium and can either be further
metabolized by, or directly incorporated into, the cell. The substrate could therefore, range from carbon,
nitrogen, and energy sources to various minerals, vitamins essential for cell function.
Metabolic product: A metabolic product is a compound produced by the cells and is excreted to the
extracellular medium. It could be produced in the primary metabolism, e.g. carbon dioxide, ethanol, acetate, or
lactate, or a more complex one, e.g. a secondary metabolite or a heterologous protein secreted to the extracellular
medium.
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Biomass: In this context, it means cells, tissues, organs. It is often measured and expressed as the concentration
of dry biomass (dry weight).
Volumetric reaction rate: It is defined as
time)itvolume)(Un(Unit
consumedorproduced compoundaofAmount
rateVolumetric ≡
Specific reaction rate:
The specific rate of a microbial activity is equal to the volumetric rate for that activity
divided by the cell concentration performing that activity.
ionconcentratBiomass
rateVolumetric
rateSpecific ≡
Substituting the definition of volumetric rate in to this equation, the specific reation rate becomes
biomass) ofentration time)(Concitvolume)(Un(Unit
consumedorproduced compoundaofAmount
rateSpecific ≡
Flux:
In this context, the metabolic flux is identical to the specific metabolic reaction rates. The most frequently
used units are: (mmol metabolite) (g dry wt biomass)
-1
(h)
-1
Matrix:
In mathematics, a matrix is a table of elements. These elements, members or entries, may be numbers of
any abstract quantities that can be added and multiplied. Matrices are useful in describing the linear equations in
a short format. They are also used to keep track of the coefficients of linear algebraic operations.
Transpose of a matrix:
In linear algebra, the transpose of a matrix A is another matrix AT obtained by writing
the rows of A as the columns of AT and the columns of A as the rows of AT .
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