( PDF ) "Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Química - Campus Araraquara

Clenilson Martins Rodrigues

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos

secundários em extratos vegetais

Tese apresentada ao Instituto de Química,

Universidade Estadual Paulista, como parte

dos requisitos para a obtenção do título de

Doutor em Química.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas

Co-Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos

Araraquara

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Rodrigues , Clenilson Martins

R696c Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos

vegetais / Clenilson Martins Rodrigues. – Araraquara : [s.n], 2007

197 f. : il.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química

Orientador: Wagner Vilegas

Co-orientador: Lourdes Campaner dos Santos

1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais – Estudo químico.

3. Técnicas hifenadas. . I. Título.

Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara

Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação

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SÚMULA CURRICULAR

Dados Pessoais

Nome: Clenilson Martins Rodrigues

Endereço Profissional: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP,

Instituto de Química, Departamento de Química Orgânica, Laboratório de Fitoquímica

Rua Prof. Francisco Degni s/n. Jd. Quitandinha, CEP: 14800-900.

Telefone: 3301-6600, Ramal: 6792

E-mail: [email protected]

Formação Acadêmica:

Graduação

Bacharelado

Instituição: Universidade Federal de Goiás, UFG, Instituto de Química, Departamento de

Química Analítica, Campus Samambaia

Local: Goiânia - GO

Curso: Química

Período: 1996-2000

Trabalho Orientado em Química: Determinação espectrofotométrica do teor de Cr

couros wet blue e especiação de crômio em efluentes de curtumes empregando a reação de

formação do íon complexo Cr(III)-EDTA ativada por microondas.

Orientador: Prof. Dr. Romualdo Gama

Pós Graduação

Mestrado

Instituição: Universidade Federal de Goiás, UFG, Instituto de Química, Departamento de

Química Analítica, Campus Samambaia

Local: Goiânia - GO

Período: 2001-2003

Bolsista: CAPES

Título da Dissertação: Quantificação do feromônio sexual presente em Anocentor nitens

(Neumann) (Acari: Ixodidae) por GC-MS-SIM.

Orientador: Prof. Dr. Lourival Cardoso de Faria

Co-Orientador: Prof. Dr. Pedro Henrique Ferri

Doutorado

Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Instituto de

Química, Departamento de Química Orgânica, Campus Araraquara

Local: Araraquara - SP

Período: 2003-2007

Bolsista: CAPES

Título da Tese: Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos

vegetais.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas

Co-Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos

Publicações

1. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Santos, L.C.; Montoro, P. Piacente, S.; Pizza, C. Hiruma-

Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Metabolic fingerprinting using direct flow injection

electrospray ionization tandem mass spectrometry for the characterization of

proanthocyanidins from the barks of Hancornia speciosa. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 2007, no prelo.

2. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Montoro, P.; Piacente, S.;

Pizza, C.; Vilegas, W. High-Performance Liquid Chromatographic Separation and

Identification of Polyphenolic Compounds from the Infusion of Davilla elliptica St. Hill.

Phytochemical Analysis, 2007, no prelo.

3. Sannomiya, M.; Cardoso, C.R.P.; Figueiredo, M.E.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.;

Santos, F.V. dos; Serpeloni, J.M.; Colus, I.M.S.; Vilegas, W.; Varanda, E.A. Mutagenic

evaluation and chemical investigation of Byrsonima intermedia A. Juss. leaves extracts.

Journal of Ethnopharmacology, 2007, submetido.

4. Rinaldo, D.; Rodrigues, C. M.; Rodrigues, J.; Sannomiya, M., Santos, L. C. dos; Vilegas,

W. New flavone from the Neea theifera (Nyctaginaceae). Journal of the Brazilian

Chemical Society, 2007, no prelo.

5. Hiruma-Lima, C.A.; Calvo, T.R.; Rodrigues, C.M.; Andrade, F.D.P.; Vilegas, W.; Brito,

A.R.M.S. Antiulcerogenic activity of Alchornea castaneaefolia: Effects on somatostatin,

gastrin and prostaglandin. Journal of Ethnopharmacology, v.104, n.1-2, p.215-224, 2006.

6. Rinaldo, D.; da Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Calvo, T.R.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.;

Kushima, H.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Preparative separation of

flavonoids from the medicinal plant Davilla elliptica St. Hill. by high-speed counter-current

chromatography. Química Nova, v.29, n.5, p.947-949, 2006.

7. Santos, L.C.; Rodrigues, C.M.; da Silva, M.A.; Coelho, R.G.; Sannomiya, M.; Vilegas, W.

Chemical profile of Eriocaulon ligulatum (Vell.) LB Smith (Eriocaulaceae). Biochemical

Systematics and Ecology, v.33, n.11, p.1159-1166, 2005.

8. Sannomiya, M.; Michelin, D.C.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Salgado, H.R.N.; Hiruma-

Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Byrsonima crassa Niedenzu (IK): antimicrobial

activity and chemical study. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v.26,

n.1, p.71-75, 2005.

9. Santos, L.C.; da Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Rodrigues, J.; Rinaldo, D.; Sannomiya,

M.; Vilegas, W. Fast preparative separation of flavones from capitula of Eriocaulon

ligulatum (Vell.) L.B.Smith (Eriocaulaceae) by High-speed countercurrent

chromatography (HSCCC). Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v.26,

n.2, p.101-103, 2005.

10. Rodrigues, C.M.; Borges, L.M.F.; Ferri, P.H.; Faria, L.C. Quantification of sex

pheromone from Anocentor nitens by gas chromatography-mass spectrometry-selected

ion monitoring. Talanta, v.62, n.3, p.637-641, 2004.

11. Sannomiya, M.; Rodrigues, C.M.; Coelho, R.G.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito,

A.R.M.S.; Vilegas, W. Application of preparative high-speed counter-current

chromatography for the separation of flavonoids from the leaves of Byrsonima crassa

Niedenzu (IK). Journal of Chromatography A, v.1035, n.1, p.47-51, 2004.

Formação complementar:

1. Química Forense. Ministrado pelo Prof. Valter Stefani. In: 29ª Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química. (2006). Carga horária: 6 h.

2. Global Positioning System (GPS). Ministrado pelo Prof. Marcos Nalon. In: V Simpósio

e V Reunião de Avaliação do Programa Biota/Fapesp (2005). Carga horária: 5 h.

3. Interação química entre plantas. Ministrado por Adriana Pacheco Barreiro e Tainara

Bortolucci Ferrari. In: IV Workshop de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (2004).

Carga horária: 6 h.

4. Inovações em Instrumentação Analítica para o Seguimento Farmacêutico.

Ministrado por Perkin Elmer do Brasil. In: Institudo de Química, Universidade Federal de

Goiás, UFG (2002). Carga horária: 16 h.

5. Controle da Qualidade das Águas. Ministrado pelo Prof. Roque Passos Pivelli. In: 23ª

Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. (2000). Carga horária: 6 h.

6. Tratamento de Rejeitos Laboratoriais. Ministrado pelo Prof. Wilson de Figueiredo

Jardim. In: XXXIX Congresso Brasileiro de Química (1999). Carga horária: 6 h.

7. Introdução à espectrometria de absorção atômica e emissão em plasma: Impacto

analítico na determinação de traços de metais. Ministrado pelo Prof. Francisco José

Krug. In: XXXIX Congresso Brasileiro de Química (1999). Carga horária: 6 h.

8. Espectrometria de emissão atômica com plasma (ICP - AES). Ministrado pelo Prof.

Nivaldo Baccan. In: XXXIX Congresso Brasileiro de Química (1999). Carga horária: 6 h.

9. Processos avançados de oxidação no tratamento de efluentes industriais.

Ministrado pelo Prof. Enio Leandro Machado. In: 10º Encontro Nacional de Química

Analítica (1999). Carga horária: 6 h.

10. Eletroquímica e Meio Ambiente. Ministrado pelos Prof. Romeu C. Rocha, Edério D.

Bidóia, Rodney Bertazzoli e Luiz A. Avaca. In: 22ª Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química. (1998). Carga horária: 6 h.

11. Automação em Química Analítica. Ministrado pelo Prof. Dr. Célio Pasquini. In: XXXVIII

Congresso Brasileiro de Química (1998). Carga horária: 6 h.

12. Biossegurança em Laboratórios de Química. Ministrado pelas Profª. Maria Gizelda de

Oliveira Tavares e Profª. Leonice Manrique Faustino Tresvenzol (1997). In: Instituto de

Química, Universidade Federal de Goiás, UFG. Carga horária: 20 h.

Trabalhos apresentados em congressos:

1. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Montoro, P.; Piacente, S.;

Pizza, C.; Vilegas, W. Isolamento por HPLC de compostos polifenólicos presentes nas

folhas de Davilla elliptica St. Hill (Dilleniaceae). In: II Simpósio de Cromatografia e

Técnicas Afins. 2006. São Pedro - SP.

2. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Montoro, P.; Piacente, S.; Pizza, C.; Brito, A.R.M.S.;

Vilegas, W. Caracterização por ESI-IT-MS

dos metabólitos secundários presentes na

infusão de Davilla nitida Vahl (Dilleniaceae). In: 29ª Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química. 2006. Águas de Lindóia - SP.

3. Rodrigues, C.M.; Brito, A.R.M.S.; Hiruma-Lima, C.A.; Vilegas, W. Constituintes químicos

das cascas de Hancornia speciosa Gom. (Apocynaceae). In: 29ª Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química. 2006. Águas de Lindóia - SP.

4. Lorenzi, K.C.; Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Almeida, L.F.R.; Brito, A.R.M.S.;

Vilegas, W. Estudo químico das folhas de Byrsonima coccolobifolia Kunth

(Malpighiaceae). In: 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2006.

Águas de Lindóia - SP.

5. Sannomiya, M.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.;

Vilegas, W. Derivados do ácido galoil quínico isolados do chá das folhas de Byrsonima

fagifolia. In: 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2006. Águas de

Lindóia - SP.

6. Rinaldo, D.; Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Tamashiro, J.; Brito,

A.R.M.S.; Vilegas, W. Estudo químico do extrato metanólico das folhas de Neea theifera

Oerst (Nyctaginaceae). In: 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2006.

Águas de Lindóia - SP.

7. Almeida, L.F.R.; Rinaldo, D.; Sannomiya, M.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Vilegas, W.

Constituintes presentes nas folhas de Leonurus sibiricus. In: 29ª Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química. 2006. Águas de Lindóia - SP.

8. Olea, R.S.G.; Vilegas, W.; Rodrigues, C.M. Flavonóides em Calotropis procera R. BR.

(Asclepiadaceae). In: XIX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2006, Salvador - BA.

9. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Olea, R.S.G.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima,

C.A. ; Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Constituintes das folhas de Davilla nitida Vahl

(Dilleniaceae). In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2005. Poços

de Caldas.

10. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A. ; Brito,

A.R.M.S.; Vilegas, W. Determinação por HPLC dos constituintes químicos da infusão das

folhas de Davilla nitida Vahl (Dilleniaceae). In: 28ª Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química. 2005. Poços de Caldas.

11. Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.; de

Almeida, L.F.R.; Vilegas, W. Avaliação química do extrato polar de espécies do gênero

Byrsonima. In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2005. Poços de

Caldas.

12. da Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Vilegas, W.; Santos, L.C. Separação

de flavonas de Eriocaulon ligulatum (Eriocaulaceae) por HSCCC (high speed counter-

current chromatography). In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química.

2005. Poços de Caldas.

13. da Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Vilegas, W. Obtenção de

fração de alcalóides e flavonóides de Strychnos pseudoquina (Loganiaceae) por HSCCC

(high speed counter-current chromatography). In: 28ª Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química. 2005. Poços de Caldas.

14. Sannomiya, M.; Michelin, D.C.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Brito, A.R.M.S.; Vilegas,

W. Compostos fenólicos das folhas de Byrsonima fagifolia. In: 28ª Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química. 2005. Poços de Caldas.

15. Rodrigues, C.M.; Rinaldo, D.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Avaliação

da composição química do extrato polar de Anacardium humile por HPLC-UV-PAD. In: V

Simpósio Brasileiro de Farmacognosia, 2005, Recife - PE, 2005.

16. Rinaldo, D.; Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Olea, R.S.G.; Tamashiro, J.;

Brito, A.R.M.S.; Vilegas, W. Flavonas isoladas das folhas de Neea theifera Oerst.

(Nyctaginaceae). In: V Simpósio Brasileiro de Farmacognosia, 2005, Recife - PE.

17. Calvo, T.R.; Rodrigues, C.M.; Severi, J.; Tamashiro, J.; Brito, A.R.M.S.; Hiruma-Lima,

C.A. . Perfil químico do extrato metanólico das folhas de Alchornea gladulosa

(Euphorbiaceae). In: V Simpósio Brasileiro de Farmacognosia, 2005, Recife - PE.

18. Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.;

Tamashiro, J.; Vilegas, W. SPE e avaliação do perfil cromatográfico dos principais

constituintes presentes nas folhas de Byrsonima crassa (Malpighiaceae). In: XXVI

Congresso Latino Americano de Química e 27ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira

de Química. 2004. Salvador-BA.

19. Rodrigues, C.M.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Brito, A.R.M.S.;

Tamashiro, J.; Vilegas, W. Extração por fase sólida e identificação por HPLC de

catequinas presentes nas cascas de Hancornia speciosa (Apocynaceae). In: XXVI

Congresso Latino Americano de Química e 27ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira

de Química. 2004. Salvador-BA.

20. Rinaldo, D.; Rodrigues, C.M.; Calvo, T.R.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima,

C.A.; Brito, A.R.M.S.; Tamashiro, J.; Vilegas, W. Avaliação do perfil cromatográfico de

espécies do gênero Davilla por HPLC. In: XV Congresso da Sociedade Botânica de São

Paulo. 2004. Ubatuba-SP.

21. Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Vilegas, W. Perfil cromatográfico por CLAE/UV dos

extratos polares de Eriocaulon ligulatun (Eriocaulaceae). In: XXV Reunião Anual Sobre

Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares. 2003. Campos do Jordão - SP.

22. Rodrigues, C.M.; Borges, L.M.F.; Lôbo, A.C.C.; de Paula, J.R.; Ferri, P. H.; Faria, L.C.

Quantificação por SIM-GCMS do feromônio de atração sexual de Anocentor nitens

(Neumann) (Acari: Ixodidae). In: 25ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química.

2002. Poços de Caldas - MG.

23. Rodrigues, C.M.; Lôbo, A.C.C.; Borges, L.M.F.; Ferri, P.H.; Faria, L.C. Identificação e

quantificação do feromônio sexual de Anocentor nitens (Neumann), Acari: Ixodidae. In: III

Encontro Brasileiro de Ecologia Química. 2002. Campinas - SP.

24.

Rodrigues, C.M.; Tavares, M.G.O.; Miyashiro, G. Quantificação de zinco em soro de

crianças subnutridas por absorção atômica em chama com solubilização por irradiação

de microondas. In: 25ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2002. Poços

de Caldas - MG.

25. Rodrigues, C.M.; Faria, L.C. Determinação espectrofotométrica de hipoclorito em

alvejantes por injeção em fluxo. In: XL Congresso Brasileiro de Química. 2000. Recife -

PE.

26. Rodrigues, C.M.; Gama, R.; Faria, L.C. Determinação do teor de crômio total em

efluentes de curtumes empregando a reação de formação do íon-complexo Cr(III)-EDTA.

In: X Encontro Nacional de Química Analítica. 1999. Santa Maria - RS.

27. Rodrigues, C.M.; Gama, R.; Faria, L.C.; Capelato, M.D. Determinação

espectrofotométrica do teor de Cr

em couros Wet Blue com a reação de formação do

íon complexo Cr(III)-EDTA ativada por microondas. In: XXXVIII Congresso Brasileiro de

Química. 1998. São Luís - MA.

Aos meus pais José Martins e Maria

Dalva Rodrigues, aos meus irmãos Cleilton

e Cleomar e a minha esposa Viviane

Cândida da Silva, por terem sempre me

apoiado ao longo de toda essa jornada e

por muito mais...

Dedico este trabalho

AGRADECIMENTOS

Ao prof. Dr. Wagner Vilegas, que mesmo sabendo da minha formação anterior, fora

da área de química de produtos naturais, confiou em abrir as portas do seu laboratório e me

aceitar como seu aluno de Doutorado, mesmo estando, naquela época, com sua cota de

orientados extrapolada. Agradeço por ter disponibilizado os equipamentos de HPLC, bem

como dado a liberdade para que eu aprendesse todos os demais métodos/processos

disponíveis em seu laboratório e empregados no estudo de espécies vegetais. Agradeço

pelo grandioso empenho prestado para o aprendizado das metodologias aqui aplicadas,

bem como no ensinamento das técnicas de caracterização, principalmente a espectrometria

de massas, a qual rendeu longas horas de discussão.

À Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos por sua co-orientação, por sempre estar

disposta a transmitir seus valiosos ensinamentos, tanto no aspecto acadêmico quanto fora

dos muros da academia, principalmente nos ensinamentos relacionados ao valor da vida e

de como transpor as dificuldades que em muitos casos não fazem parte dos nossos planos.

Aos professores, membros da banca, que gentilmente aceitaram o convite de ler este

manuscrito.

Aos professores Dr. Ian Castro-Gamboa e Drª. Lúcia Xavier pela convivência e pelo

aprendizado durante meu Estágio Docência.

Aos demais professores do Departamento de Química Orgânica do Instituto de

Química de Araraquara, por todo o conhecimento transmitido durante suas aulas.

Aos professores Drª. Sonia Piacente e Dr. Cosimo Pizza do Dipartimento di Scienze

Farmaceutiche, Universita degli Studi di Salerno, Salerno, pela realização dos experimentos

de MS.

À Dra. Virginia Carbone do Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e

Biomolecolare, Istituto di Scienze dell' Alimentazione, Avellino, pela realização dos espectros

de massas em tandem e por suas valiosas informações sobre a técnica de MS.

Ao Dr. Nivaldo Boralle, pela realização dos espectros de NMR, por seus valiosos

conhecimentos e ensinamentos e pelos bons momentos de descontração.

À Drª. Miriam Sannomiya pelo incentivo, companheirismo, pelas longas discussões

sobre assuntos pertinentes ao ambiente de trabalho, bem como os aspectos vividos no

cotidiano e principalmente por nossa amizade.

Ao Prof. Dr. Roberto Gallegos Olea pelo excelente convívio durante o seu estágio de

pós-doutoramento e por nossa amizade.

Ao Doutorando Daniel Rinaldo, por toda ajuda prestada desde a época de sua

iniciação científica, pelas boas lembranças dos vários congressos que participamos, pelas

longas discussões sobre os aspectos de nossos trabalhos e por nossa amizade.

Ao Dr. Luiz Fernando Rolim pelo excelente convívio durante a época do seu

doutoramento, pelo seu carisma e por nossa amizade.

À química Kamilla Lorenzi, ex-aluna de iniciação científica, pela valiosa ajuda

prestada para o desenvolvimento de parte deste trabalho e por seu interesse e dedicação.

À Profª. Drª. Claudia J. Nehme pelas sugestões e por toda ajuda prestada.

Aos colegas do Departamento de Química Orgânica: Márcio Andreo, Roberta Coelho,

Marcelo A. da Silva, Tamara Regina, Ana Lúcia Nasser, Juliana Rodrigues, Juliana Severi,

Adriana Cândido, Carolina, Flávia, Hélio Kushima, Luciana de Ávila, Marcelo Telascrea,

Vânia A. F. Formenton, Jonas M. da Silva, Geraldo Humberto Silva, Alberto C. Alécio,

agradeço pela convivência no laboratório e nos corredores do Departamento.

Às funcionárias da Seção de pós-graduação, Vilma A. Pestana, Patrícia F. Ribeiro,

Célia Maria C. V. Coelho e Sandra R. Pavanelli, pela dedicação aos assuntos relacionados à

coordenação do curso de pós-graduação.

À FAPESP pelo apoio financeiro e à CAPES pela bolsa concedida.

À todas as pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização

deste trabalho, deixo o meu sincero reconhecimento.

“Feliz aquele que transfere o que

sabe e aprende o que ensina”.

(Cora Coralina)

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

RESUMO

Este trabalho trata da caracterização química de espécies de plantas

brasileiras usadas no tratamento de disfunções gástricas. Nossa proposta envolve a

investigação de extratos orgânicos polares e infusões por técnicas analíticas.

Extração em fase sólida (SPE) e/ou extração líquido-líquido (LLE) foram utilizadas

na etapa de clean-up para que açúcares livres e oligômeros de proantocianidinas

fossem separados da matriz vegetal bruta. As amostras pré-tratadas foram então

analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HLPC) acoplada com

detector de arranjo de fotodiodos (PAD) ou por espectrometria de massas em

tandem acoplado a um ion trap com interface de ionização por electrospray, usando

o modo de inserção direta da amostra (FIA-ESI-IT-MS). Esta estratégia permitiu

conhecer os metabólitos secundários de plantas pertencentes às famílias

Dilleniaceae (Davilla elliptica e D. nitida: flavonóides, catequinas, isoprenóides e

ácidos fenólicos), Apocynaceae (Hancornia speciosa: catequinas, ácidos fenólicos,

procianidinas e oligômeros de procianidinas C-glucosiladas) e Malpighiaceae

(Byrsonima basiloba, B. coccolobifolia, B. crassa, B. fagifolia e B. intermedia:

flavonóides, biflavonóides, ácidos fenólicos, oligômeros de proantocianidinas e

ácidos galoilquínicos). A determinação quantitativa dos principais metabólitos

secundários também foi realizada, permitindo então a completa caracterização da

composição química dos extratos de plantas. Assim, nossa proposta levou a uma

caracterização química rápida e eficiente de espécies de plantas brasileiras usadas

na medicina popular como antiúlcera. Estes resultados são úteis para um melhor

entendimento das atividades farmacológicas das espécies de plantas acima

mencionadas.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

ABSTRACT

This work deals with the chemical characterization of Brazilian plant species

used to treat gastric disfunctions. Our approach involved the investigation of organic

polar extracts and infusions by using analytical techniques. Solid-phase extraction

(SPE) and/or liquid-liquid extraction (LLE) were used in the clean-up step, so that

free sugars and proanthocyanidin oligomers were separated from the bulk of the

vegetable matrix. The pre-treated samples were then analyzed by using high

performance liquid chromatography (HPLC) coupled to photodiode array (PAD)

detector or by direct flow analysis - electrospray ionization - ion trap - tandem mass

spectrometry (FIA-ESI-IT-MS). This strategy allowed to recognize the secondary

metabolites from plants belonging to the families Dilleniaceae (Davilla elliptica and D.

nitida: flavonoids, catechins, isoprenoids and phenolic acids), Apocynaceae

(Hancornia speciosa: catechins, phenolic acids, procyanidins and C-glycosilated

procyanidins oligomers) and Malpighiaceae (Byrsonima basiloba, B. coccolobifolia, B.

crassa, B. fagifolia and B. intermedia: flavonoids, biflavonoids, phenolics acids,

proanthocyanidins oligomers and galloylquinic acids). Quantitative determination of

the main secondary metabolites was also performed, thus allowing to fully

characterization of the chemical composition of plant extracts. Thus, our approach

led to a fast and efficient chemical characterization of Brazilian plant species used in

folk medicine as antiulcer. These results are useful to the better understanding of the

pharmacological activities of the above mentioned plant species.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

Comprimento de onda

ACN Acetonitrila

Ara Arabinose

i.d. internal diameter (diâmetro Interno)

DCCC Droplet Countercurrent Chromatography (Cromatografia Gotejante em

Contra Corrente)

ESI Electrospray ionization (Ionização por electrospray)

EtOH Etanol

FIA Flow Injection Analysis (Análise por injeção em fluxo ou análise por

inserção direta da amostra)

FIA-ESI-IT-MS Flow Injection Analysis - Electrospray Ionization - Ion Trap - Mass

Spectrometry (Espectrometria de Massas acoplada a um ion-trap com

interface de Ionização por Electrospray e inserção direta da amostra)

Gal Galactose

Gall Galoil

GC Gas Chromatography (Cromatografia Gasosa)

GC-FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (Cromatografia

Gasosa com Detecção por Ionização em Chama)

GC-MS Gas Chromatography - Mass Spectrometry (Cromatografia Gasosa

Acoplada a Espectrometria de Massas)

Gli Glicose

GPC Gel Permeation Chromatography (Cromatografia de Permeação em

Gel)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência)

HPLC-NMR High Performance Liquid Chromatography - Nuclear Magnetic

Resonance (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada com

Ressonância Magnética Nuclear)

HPLC-PAD High Performance Liquid Chromatography - Photodiode Array Detector

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada com Detector de

Arranjo de Fotodiodos)

HRF Heterociclic Ring Fission (Clivagem Heterocíclica)

HSCCC High Speed Counter Current Chromatography (Cromatografia de

Contra Corrente de Alta Velocidade)

IR Infrared (Infravervelho)

Ion Trap

Fator de retenção ou fator de capacidade

LLE Liquid-Liquid Extraction (extração líquido-líquido)

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

LOD Limit of detection (Limite de Detecção)

LOQ Limit of quantification (Limite de Quantificação)

[M – H]

–

Molécula desprotonada

M3OGal miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo

M3OGli miricetina-3-O-β-glicopiranosídeo

M3O(2"Gall)Rha miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo

M3O(3"Gall)Rha miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo

M3ORha miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo

M3O(2"Gall)Gal Miricetina-3-O-(2"-Galoil)-β-galactopiranosídeo

m/z

Relação Massa/Carga

MeOH Metanol

MPLC Medium Pressure Liquid Chromatrography (Cromatografia Líquida de

Média Pressão)

MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Ressonância Magnética Nuclear)

NP/PEG Natural Products/Polyethylene glycol reagent

PAD Photodiode Array Detector (Detector com Arranjo de Fotodiodos)

PTFE Politetrafluoroetileno (Teflon)

Q3OAra quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo

Q3OGal quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo

Q3ORha quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo

Q3O(2"Gall)Gal

quercetina-3-O-(2"-Galoil)-α-arabinopiranosídeo

Q3O(2"Gall)Gal quercetina-3-O-(2"-Galoil)-β-galactopiranosídeo

Q3ORha(1-6)Gal

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosil-(1→6)-O-β-galactopiranosídeo

Q3ORha(1-3)ORha(1-6)OAlo quercetina-3-O-α-rhamnopiranosil-(1→3)-O-[α-rhamnopiranosil-

(1→6)]-O

-β-alopiranosídeo

QM quinone methide (quinona metídeo)

Resolução

RDA retro-Diels-Alder

Fator de Retenção

Rha Rhamnose

RP18 Reversed Fase octadecylsilan (Fase reversa octadecilsilano)

SPE Solid Fase Extraction (Extração em fase sólida)

TFA Ácido Trifluoracético

TLC Thin Layer Chromatography (Cromatografia de Camada Delgada)

Tempo de retenção

UV Ultravioleta

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1.

Hábito, folhas e inflorescências de Hancornia speciosa. Fonte: (LORENZI, 1998)

Figura 1.2.

Frutos e sementes de H. speciosa. Fonte: (LORENZI, 1998).

Figura 1.3.

Perfis cromatográficos do extrato EtOH (A) e do extrato MeOH (B) das cascas

de H. speciosa obtidos por HPLC-PAD. Sistema de eluição gradiente: 5-100%

ACN em 60 min, coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm),

HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm.

Figura 1.4.

Perfil cromatográfico da fração MeOH/H

O 2:8 v/v proveniente do infuso das

cascas de H. speciosa, submetida ao clean-up em LLE e SPE em Sep Pak

RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-

PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja

Tabela 1.1).

Figura 1.5.

A) cromatograma do primeiro eluato da SPE (MeOH/H

O 2:8 v/v). B)

cromatograma do segundo eluato da SPE (MeOH/H2O 1:1 v/v). C)

cromatograma do terceiro eluato da SPE (MeOH 100%). Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL

min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.1 e para processo

de SPE em RP18 veja Esquema 1.2A).

Figura 1.6.

Perfil cromatográfico do eluato MeOH/H

O 2:8 v/v do infuso das cascas de H.

speciosa submetido ao processo de SPE. A) Cromatograma processado em

210 nm e B) cromatograma processado em 325 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL

min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 1.1).

Figura 1.7.

Espectros na região do UV para os principais picos eluídos no cromatograma da

Figura 1.6. Espectros 2, 3 e 5 foram atribuídos à catequina, ácido clorogênico e

à epicatequina, respectivamente.

Figura 1.8.

Avaliação da degradação do conteúdo de catequinas a partir de análises

cromatográficas de uma amostra (eluato MeOH/H

O 2:8 v/v após clean-up em

Sep Pak RP18) submetida à ação de luz e calor. Intervalos: A) 1 dia; B) 15 dias;

C) 30 dias e D) 90 dias. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm

i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 1.1).

Figura 1.9.

A) Separação cromatográfica por HPLC-PAD da infusão submetida aos

processos de LLE e SPE em cartucho Sep Pak de RP18, eluato MeOH/H

O 2:8

v/v, λ = 210 nm. B) Análise cromatográfica de uma alíquota das frações 39-45

provenientes da separação do infuso de H. speciosa com o sistema MPLC, λ =

210 nm. C) Processamento da corrida cromatográfica da alíquota das frações

39-45 em 325 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5

µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja

Tabela 1.1).

Figura 1.10.

Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, da infusão de H.

speciosa avaliado em modo negativo. A) Faixa de íons com m/z de 210-1600

Da. B) Faixa de íons com m/z de 1200-2000 Da. (●) Íons precursores separados

por 288 Da, referentes à primeira série homóloga de procianidinas. (♦) Segunda

série homóloga de procianidinas C-glucosiladas. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.11.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 289, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 1.12.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 273, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.13.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 425, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.14.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 341, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.15.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 353, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.16.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 865, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Figura 1.17.

Espectro de massas de segunda-ordem obtido em modo negativo com energia

de colisão de 30% para o íon precursor de m/z 1027. Para condições

experimentais veja: Parte Experimental.

Figura 1.18.

Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções

em triplicata de soluções padrões de: 1 ácido gálico, 2 (-)-galocatequina, 3 (-)-

epigalocatequina, 4 galato de metila, 5 (+)-catequina, 6 4'-O-metil-

galocatequina, 7 (-)-epicatequina, 8 galato de (-)-galocatequina, 9 galato de

etila, 10 galato de (-)-epicatequina.

Figura 1.18.

Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções

em triplicata de soluções padrões de: 1 ácido gálico, 2 (-)-galocatequina, 3 (-)-

epigalocatequina, 4 galato de metila, 5 (+)-catequina, 6 4'-O-metil-

galocatequina,

7 (-)-epicatequina, 8 galato de (-)-galocatequina, 9 galato de

etila, 10 galato de (-)-epicatequina.

Figura 1.19.

Separação cromatográfica de uma mistura de padrões contendo catequinas e

derivados de ácidos fenólicos. Identificação dos picos eluídos: 1 ácido gálico

(AG), 2 (-)-galocatequina (GC), 3 (-)-epigalocatequina (EGC), 4 galato de metila

(GM), 5 (+)-catequina (C), 6 4'-O-metil-galocatequina (GC4'OMe), 7 (-)-

epicatequina (EC), 8 galato de (-)-galocatequina (GCG), 9 galato de etila (GE),

10 galato de (-)-epicatequina (ECG). Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250

x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0

mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.2).

Figura 1.20.

Separação cromatográfica dos metabólitos secundários encontrados no infuso

das cascas de H. speciosa. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm

i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ

= 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.2).

Figura 1.21.

Separação cromatográfica dos metabólitos secundários encontrados no infuso

das cascas de H. speciosa. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm

i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ

= 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.3).

Figura 1.22.

Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos metabólitos

secundários encontrados no infuso das cascas de H. speciosa. Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 1.3).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 2.1.

Esquerda, folhas frutos e inflorescência de D. nitida. Disponível em:

http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast?imagx=10900112 acesso em:

26/03/2007. Direita, folhas e frutos de D. elliptica. Disponível em:

http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast?name=Davilla+elliptica acesso em:

26/03/2007.

Figura 2.2.

Perfis cromatográficos dos extratos MeOH de D. nitida (A) e D. elliptica (B).

Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD

(Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja

Tabela 2.2).

Figura 2.3.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD do primeiro eluato (MeOH/H

O 14:86,

v/v) do extrato MeOH de D. nitida submetido ao processo de SPE em cartucho

Sep Pak de RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5

µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.3, Sistema 1).

Figura 2.4.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD do segundo eluato (MeOH/H

O 1:1,

v/v) (A) e do terceiro eluato (MeOH 100%) (B) do extrato MeOH de D. nitida

submetido ao processo de SPE em cartucho Sep Pak de RP18. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo

1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.3, Sistema

2).

Figura 2.5.

Efeito da presença do ácido triflouroacético (TFA) na concentração de 0,05 %

v/v durante a separação dos constituintes químicos presentes nos três eluatos

da SPE de D. nitida. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5

µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.4).

Figura 2.6.

Bandas de máximo de absorção na região do UV ilustradas para flavonóides (A)

e taninos condensados (B).

Figura 2.7.

Identificação dos constituintes químicos de D. elliptica eluídos durante as

análises cromatográficas do primeiro eluato da SPE (A) monitorado em 210 nm

e do segundo eluato da SPE (B) monitorado em 360 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

(Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Figura 2.8.

Identificação dos constituintes químicos de D. nitida eluídos durante as análises

cromatográficas do primeiro eluato da SPE (A) monitorado em 210 nm e do

segundo eluato da SPE (B) monitorado em 360 nm. Coluna Phenomenex

Luna

(2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para

condições de eluição veja Tabela 2.4).

Figura 2.9.

Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 210 nm. Análise do

primeiro eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas de

D. nitida (A) e D. elliptica (B). Padrão AG = padrão de ácido gálico (a),

substâncias identificadas (b). Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6

mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição

veja Tabela 2.4).

Figura 2.10.

Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 254 nm. Análise do

segundo eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas

de D. nitida (A) e D. elliptica (B). Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x

4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.4).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 2.11.

Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 254 nm. Análise do

terceiro eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas de

D. elliptica (A) e D. nitida (B). Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6

mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição

veja Tabela 2.4).

Figura 2.12.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD da porção acetato de etila obtida a

partir da LLE do infuso das folhas de D. elliptica e posterior clean-up em Sep

Pak RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm),

HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

Figura 2.13.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD (modo preparativo) da amostra

obtida após etapas de clean-up e enriquecimento empregando os processos de

LLE e SPE no infuso das folhas de D. elliptica. Coluna Varian

Dynamax RP18

(250 x 41,4 mm i.d.; 8 µm), HPLC (Varian

), fluxo 15,0 mL min

-1

, monitorado em

254 nm, Volume injetado: 1 mL.

Figura 2.14.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD dos constituintes químicos

encontrados no infuso das folhas de D. elliptica após os procedimentos de LLE

e SPE. Identificação: 1 ácido gálico; 2 (-)-epicatequina; 3 miricetina-3-O-β-

galactopiranosídeo; 4 miricetina-3-O-β-glicopiranosídeo; 5 miricetina-3-O-(2"-O-

galoil)-β-galactopiranosídeo; 6 (6S,7E)-6,9-diidroxi-4,7-megastigmadien-3-ona; 7

rutina; 8 miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 9 quercetina-3-O-β-

galactopiranosídeo; 10 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo; 11 quercetina-3-

O-α-rhamnopiranosídeo;12 miricetina, 13 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo; 14 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo; 15

quercetina. Em destaque, separação da mistura dos flavonóis 3 e 4

empregando o sistema isocrático com a mistura de 40% de MeOH + TFA 0,05%

(B) em 60% de H

O + TFA 0,05% (A). Coluna Phenomenex

Synergi Hydro

RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 254 nm.

(Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

100

Figura 2.15.

Constituintes químicos isolados a partir da porção acetato de etila proveniente

das etapas de LLE e SPE da infusão feita com as folhas de D. elliptica.

100

Figura 2.16.

Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, da infusão de D.

nitida (A) e da infusão de D. elliptica (B), avaliados em modo negativo. Para

condições espectrométricas veja: parte Experimental.

102

Figura 2.17.

Separação cromatográfica por HLPC-PAD de uma mistura de flavonóides

injetados na concentração de 50,0 µg mL

–1

. 1 miricetina-3-O-β-

galactopiranosídeo; 2 rutina; 3 miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo; 4

quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo; 6

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo; 7 miricetina; 8 miricetina-3-O-(2"-O-

galoil)-α-rhamnopiranosídeo; 9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo; 10 quercetina e 11 amentoflavona. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL

min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

103

Figura 2.18.

Espectros na região do UV para os flavonóides destacados no cromatograma

da Figura 2.18. Identificação: A rutina; B miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo; C quercetina e D amentoflavona.

104

Figura 2.19.

Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções

em triplicata de soluções padrões de: 1 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 2

rutina, 3 (miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 4 quercetina-3-O-β-

galactopiranosídeo, 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo, 6 quercetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo, 7 miricetina, 8 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo, 9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo, 10

quercetina.

105

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 2.19

Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções

em triplicata de soluções padrões de: 1 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 2

rutina, 3 (miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 4 quercetina-3-O-β-

galactopiranosídeo, 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo, 6 quercetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo, 7 miricetina, 8 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo, 9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo, 10

quercetina.

106

Figura 2.20.

Efeito da eficiência de extração do solvente em função do tempo (n = 3). O eixo

y representa a área do pico cromatográfico para o flavonol miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo presente no infuso das folhas de D. elliptica.

109

Figura 2.21.

Representação das massas obtidas por meio dos processos de extração em

MeOH (n = 3). 1) D. nitida primeira coleta, 2) D. nitida segunda coleta e 3) D.

elliptica.

111

Figura 2.22.

Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos flavonóides

presentes no infuso das folhas de D. nitida

e D. elliptica. Identificação dos picos

cromatográficos é a mesma dada na Tabela 2.8. A) D. elliptica, B) D. nitida

coleta: agosto de 2002 e C) D. nitida coleta: março de 2002. Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.5).

114

Figura 2.23.

Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos flavonóides

presentes no extrato MeOH das folhas de D. nitida e D. elliptica. Identificação

dos picos cromatográficos é a mesma dada na Tabela 2.8. A) D. elliptica, B) D.

nitida coleta: agosto de 2002 e C) D. nitida coleta: março de 2002. Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.5).

115

Figura 3.1.

Distribuição geográfica das espécies pertencentes à família Malpighiaceae

(Heywood, 1993).

116

Figura 3.2.

Fotos das espécies do gênero Byrsonima estudadas.

118

Figura 3.3.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH/H

O 2:8 v/v

obtido após clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B.

crassa. Identificação: 1 ácido gálico; 2 galato de metila; 3 catequina; 4

epicatequina; 5 galato de epigalocatequina. Coluna Phenomenex

Luna (2)

RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 1).

120

Figura 3.4.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH/H

O 1:1 v/v

obtido após clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B.

crassa. Identificação: 6 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 7 quercetina-3-O-

(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo; 8 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo; 9

quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-arabinopiranosídeo; 10 quercetina. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo

1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema

2).

121

Figura 3.5.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH 100% obtido

após clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa.

Identificação: 11 amentoflavona. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x

4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 2).

121

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 3.6.

Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH 100% obtido

após clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa.

Avaliação do flavonóide 11 amentoflavona com comprimento de onda

processado em: A) 254 nm; B) 270 nm; C) 330 nm; D) 210 nm e E) 360 nm.

Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC

(Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1,

Sistema 2).

122

Figura 3.7.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD do infuso das folhas de: A) B.

coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia.

Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 3.2, sistema 1).

124

Figura 3.7.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD do infuso das folhas de: A) B.

coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia.

Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 3.2, sistema 1).

125

Figura 3.8.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD de flavonóides presentes no infuso

das folhas de: A) B. coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B.

intermedia; E) B. fagifolia. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm

i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ =

360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 2).

126

Figura 3.8.

Separação cromatográfica por HPLC-PAD de flavonóides presentes no infuso

das folhas de: A) B. coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B.

intermedia; E) B. fagifolia. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm

i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ =

360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 2).

127

Figura 3.9.

Espectros na região do UV para algumas das classes de substâncias

encontradas em B. fagifolia.

129

Figura 3.10.

Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, do: A) infuso de B.

coccolobifolia; B) infuso de B. crassa; C) infuso de B. basiloba; D) infuso de B.

intermedia e E) infuso de B. fagifolia. Para condições espectrométricas veja:

parte Experimental.

133

Figura 3.11.

A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 729, obtido

em modo negativo com energia de colisão de 30%. B) Espectro de massas de

terceira-ordem (MS

) do íon produto de m/z 577, obtido em modo negativo com

energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte

Experimental.

135

Figura 3.12.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 1017, obtido

em modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

135

Figura 3.13.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 609, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

137

Figura 3.14.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 343, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

138

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Figura 3.15.

Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 495, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

138

Figura 3.16.

A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 647, obtido

em modo negativo com energia de colisão de 30%. B) Espectro de massas de

terceira-ordem (MS

) do íon produto de m/z 495, obtido em modo negativo com

energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte

Experimental.

139

Figura 3.17.

A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 799, obtido

em modo negativo com energia de colisão de 30%. B) Espectro de massas de

terceira-ordem (MS

) do íon produto de m/z 601, obtido em modo negativo com

energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte

Experimental.

140

Figura 3.18.

Espectro de massas de segunda-ordem obtido em modo negativo com energia

de colisão de 30% para o íon precursor de m/z 951. Para condições

experimentais veja: Parte Experimental.

141

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1.1.

Etapas envolvidas na obtenção da infusão das cascas de H. speciosa.

Esquema 1.2.

Etapas de extração em fase sólida com cartuchos Sep Pak de fase normal e

fase reversa.

Esquema 1.3.

Rotas de fragmentação de uma possível proantocianidina trimérica

encontrada no infuso das cascas de H. speciosa. Os principais mecanismos

de fragmentação envolvidos são: RDA (retro-Diels-Alder), HRF (clivagem

heterocíclica), e QM (quinona metídeo).

Esquema 1.4.

Íons produtos característicos formados pela clivagem de uma C-hexose (A) e

de uma O-hexose (B). O sinal ± indica os modos de ionização, positivo ou

negativo.

Esquema 1.5.

Rotas de fragmentação de uma possível procianidina trimérica C-glucosilada

encontrada no infuso das cascas de H. speciosa. Os principais mecanismos

de fragmentação envolvidos são: RDA (retro-Diels-Alder), HRF (clivagem

heterocíclica), QM (quinona metídeo),

0,2

0,3

(clivagem interna da

unidade sacarídica).

Esquema 2.1.

Etapas de extração dos constituintes químicos presentes nas folhas de D.

nitida e D. elliptica.

Esquema 2.2.

Etapas de clean-up empregadas nos procedimentos de SPE dos extratos

MeOH de D. nitida e D. elliptica em cartuchos de Sep Pak RP18.

Esquema 2.3.

Estrutura de um flavonol com sistema benzoil e cinamoil.

Esquema 2.4.

Procedimento de produção dos extratos MeOH empregados nas análises de

rotina.

Esquema 2.5.

Etapas realizadas para a obtenção da porção acetato de etila proveniente da

infusão feita com as folhas de D. elliptica.

Esquema 3.1.

Etapas de clean-up empregadas nos procedimentos de SPE do extrato

MeOH de B. crassa em cartuchos de Sep Pak RP18.

119

Esquema 3.2.

Clivagem homolítica entre unidade de galactose e a aglicona quercetina com

formação do íon produto do ânion radicalar ([Y

– H]

• -

137

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1.

Gradiente de eluição cromatográfica empregado na eluição dos metabólitos

secundários encontrados no infuso das cascas de H. speciosa após

procedimentos de clean-up

Tabela 1.2.

Gradiente de eluição cromatográfica usado na separação de catequinas e

derivados de ácidos fenólicos

Tabela 1.3.

Gradiente de eluição usado na separação dos metabólitos encontrados na

infusão das cascas de H. speciosa

Tabela 1.4.

Dados de regressão linear para os padrões empregados na elaboração das

curvas analíticas

Tabela 1.5.

Concentrações dos derivados de catequinas encontrados nas cascas de H.

speciosa

Tabela 2.1.

Distribuição de flavonóides em 11 espécies de Davilla

Tabela 2.2.

Gradiente de eluição exploratório empregado na separação dos constituintes

químicos presentes nos extratos MeOH de D. nitida e D. elliptica

Tabela 2.3.

Gradientes de eluição usados na separação dos metabólitos de D. nitida

Tabela 2.4.

Gradiente de eluição usado na separação dos constituintes químicos

presentes nas folhas de D. nitida

Tabela 2.5.

Gradiente de eluição empregado na separação dos constituintes químicos

presentes na fração flavonoídica obtida após os procedimentos de LLE e

SPE do infuso das folhas de D. elliptica

Tabela 2.6.

Condições típicas de operação para colunas de diversas dimensões

Tabela 2.7.

Dados de regressão linear para os flavonóides empregados como padrões

na elaboração das curvas analíticas

107

Tabela 2.8.

Dados quantitativos referentes à concentração individual dos flavonóides

encontrados em fitopreparações (infuso e extrato metanólico) feitas com as

folhas de D. nitida e D. elliptica. Avaliação da eficiência dos modelos de

extração e comparação da variação no teor de flavonóides em períodos

sazonais distintos

113

Tabela 3.1.

Gradientes de eluição empregados na separação por HPLC-PAD dos

metabólitos secundários de Byrsonima crassa

119

Tabela 3.2.

Gradientes de eluição empregados na separação por HPLC-PAD dos

metabólitos secundários presentes em espécies do gênero Byrsonima

123

Tabela 3.3.

Bandas de absorção na região do UV para os metabólitos secundários

identificados nas espécies do gênero Byrsonima

128

Tabela 3.4.

Dados espectrométricos das substâncias identificadas durante os

experimentos de FIA-ESI-IT-MS/MS

131

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

Extração em fase sólida e extração líquido-líquido 30

Padronização de extratos vegetais 32

OBJETIVOS

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

EXPERIMENTAL

Instrumentos

Materiais, Reagentes e Soluções

Material Vegetal

Extrações

Procedimentos Cromatográficos Gerais

Capítulo 1: Hancornia speciosa Gomez (Apocynaceae)

Parte experimental / Resultados e discussões

Investigação dos extratos de H. speciosa 42

Preparação dos extratos utilizados na avaliação do perfil cromatográfico 44

Identificação dos metabólitos secundários 49

Estabilidade da fração MeOH/H

O 2:8 v/v 52

Fracionamento da porção acetato de etila da infusão de Hancornia speciosa 54

Análises por FIA-ESI-IT-MS 55

Avaliação quantitativa da infusão das cascas de H. speciosa 69

Construção das curvas analíticas 69

Aplicação do método quantitativo 75

Capítulo 2: Gênero Davilla (Dilleniaceae)

Parte experimental / Resultados e discussões

Avaliação do perfil cromatográfico de espécies do gênero Davilla 81

Clean-up em SPE 83

Identificação dos metabólitos secundários 89

Comparação dos perfis cromatográficos Davilla nitida e Davilla elliptica 91

Fracionamento da porção acetato de etila da infusão das folhas de Davilla elliptica 94

Preparo da amostra 95

Isolamento por HPLC preparativo 97

Análises por FIA-ESI-IT-MS 101

Análise quantitativa dos infusos e dos extratos MeOH de Davilla nitida e Davilla elliptica 102

Construção das curvas analíticas 104

Procedimento de otimização da extração dos metabólitos secundários 107

Infusão: 107

Extrato MeOH: 109

Preparo das amostras 110

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Aplicação dos métodos de quantificação 111

Capítulo 3: Gênero Byrsonima (Malpighiaceae)

116

Parte experimental / Resultados e discussões

119

Identificação das classes de substâncias presentes em B. crassa 119

Triagem cromatográfica das espécies do gênero Byrsonima 122

Análises por FIA-ESI-IT-MS 130

Preparo das amostras 130

CONSIDERAÇÕES FINAIS

142

REFERÊNCIAS

146

ANEXOS

158

Anexo 1

159

Anexo 2

179

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

INTRODUÇÃO

A utilização de plantas tidas como “medicinais” é uma prática comum na

medicina popular brasileira e está fundamentada no acúmulo de conhecimentos

empíricos sobre a ação dos vegetais por diversos grupos étnicos (GOTTLIEB &

KAPLAN, 1993).

Este potencial das plantas como fonte de novas drogas é ainda pouco

explorado. Estima-se existir entre 250.000-500.000 espécies de plantas em todo o

mundo, das quais uma porcentagem ínfima foi submetida a estudo fitoquímico

(HAMBURGER & HOSTETTMAN, 1991). Diante deste contexto, a elaboração de

métodos de análises que sejam rápidos, precisos e confiáveis torna-se uma

necessidade constante dentro de um laboratório de fitoquímica, ainda mais quando o

objetivo é investigar um conjunto de plantas que apresentem características

morfológicas e etnofarmacológicas semelhantes. Esse tipo de aplicação quando bem

executado pode agilizar os processos de caracterização e minimizar as extenuantes

etapas de fracionamento, isolamento, e elucidação de metabólitos secundários

presentes nos indivíduos que aparentemente possuem a mesma composição

química.

Tradicionalmente, o estudo de produtos naturais de origem vegetal é feito

com a utilização de métodos de isolamento e purificação de substâncias orgânicas,

associado com as principais técnicas espectrométricas e espectroscópicas de

identificação, tais como a espectrometria de massas (MS), a ressonância magnética

nuclear (NMR), Ultravioleta (UV) e o infravermelho (IR) (ROBARDS, 2003; SIMÕES

et al., 2003). No entanto, todas as etapas envolvidas nos processos de obtenção das

substâncias isoladas são muito demoradas e a associação de técnicas empregadas

na fase de caracterização torna a identificação dessas substâncias uma etapa

bastante dispendiosa e na maioria das vezes não permite predizer

concomitantemente a identidade da substância analisada e sua concentração.

Uma das situações com o qual nosso grupo tem se deparado é o estudo de

extratos vegetais polares contendo grandes quantidades de taninos, catequinas,

derivados de ácidos fenólicos, flavonóides e seus respectivos glucosídeos

(ANDRADE, 2002; DOYAMA et al., 2005; ANDREO et al., 2006). Em muitos casos, a

presença de significativas quantidades de compostos poliméricos, como por exemplo,

taninos condensados com alto grau de polimerização, inviabiliza a separação

preparativa dos componentes do extrato, seja por meio de cromatografia de

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

adsorção (sílica gel, alumina, celulose, poliamida, etc.), seja por cromatografia de

permeação em gel (Sephadex LH-20 e similares), ou ainda por cromatografia em

contracorrente (DCCC, HSCCC) (OKUDA et al., 1989; MUELLER-HARVEY, 2001).

Atualmente em nosso grupo, tem-se verificado que, após extenuantes

tentativas de obter os metabólitos secundários, os resultados têm se traduzido no

isolamento de substâncias bastante conhecidas, como alguns flavonóides

glucosilados simples contendo uma ou duas unidades de açúcares, alguns terpenos,

ácidos fenólicos derivados do ácido cinâmico (cafeico, ferúlico, etc.) e principalmente

catequinas (SANNOMIYA et al., 2004; FIGUEIREDO et al., 2005; SANNOMIYA;

FONSECA et al., 2005; SANNOMIYA; MICHELIN et al., 2005; SANNOMIYA;

MONTORO et al., 2005; HIRUMA-LIMA et al., 2006; RINALDO et al., 2006).

Embora nosso objetivo não seja apenas o de obter substâncias novas, mas

sim o de investigar a composição química de extratos, reconhecidamente ativos

(conforme exposto no projeto Biota), o consumo de tempo e os custos têm sido

consideravelmente altos quando se deseja conhecer a constituição química de forma

mais rápida e eficiente. Ainda como desvantagens, após o fracionamento dos

extratos por cromatografia de permeação em gel (que até o momento tem se

mostrado a metodologia mais viável), é necessário realizar o tratamento do material

adsorvente a fim de poder reutilizá-lo; além disso, as quantidades de material puro

obtidas nestes casos têm sido muito pouco recompensadoras uma vez que, quando

são estudadas várias espécies pertencentes a um mesmo gênero, ocorre na maioria

das vezes, o isolamento de substâncias conhecidas.

Exemplos deste tipo de situação são os estudos das espécies do gênero

Hancornia speciosa (Apocynaceae) e Davilla elliptica (Dilleniaceae). Embora os

ensaios biológicos de atividade antiulcerogênica tenham sido extremamente

promissores, o reconhecimento da composição química dessas espécies apenas

pôde ser realizado parcialmente (ANDRADE, 2002).

Outro problema que tem sido recorrente é a necessidade da quantificação dos

metabólitos secundários detectados/isolados. Para que se possa estabelecer uma

possível relação entre a composição química e a atividade biológica observada,

apenas o conhecimento qualitativo do perfil químico não é suficiente. Nem sempre o

metabólito secundário isolado é aquele responsável pela atividade biológica ou nem

sempre é isolado o metabólito secundário presente em maior quantidade, mas sim

aquele cuja técnica aplicada permitiu seu isolamento e ainda, nem sempre a

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

substância majoritária é a responsável pela atividade biológica observada. Note-se

que neste momento não estamos correlacionando quantidades de metabólitos com

atividade biológica, mas sim discutindo possibilidades reais no estudo de espécies

vegetais.

Adicionalmente, revistas conceituadas têm exigido não apenas o

estabelecimento de um perfil qualitativo, mas também a relação quantitativa dos

metabólitos secundários encontrados em extratos ativos. De forma similar, a atual

legislação brasileira exige que, para o registro de um fitoterápico se faça a

padronização dos extratos, procedendo simultaneamente com as análises quali e

quantitativa do material vegetal e que seja especificado o teor de uma substância ou

de um grupo de substâncias denominadas de marcadores (Anvisa, RDC nº48, 2004).

Recentemente, critérios ainda mais rígidos foram estabelecidos pela Anvisa, e

estes preconizam a adequação de testes referentes ao controle de qualidade,

estando todo o processo de acordo com as normas de Boas Práticas de Laboratório

e Boas Práticas de Fabricação e Controle, as quais são muito próximas à NBR

17025 do Inmetro, que recomenda a harmonização de normas e procedimentos.

Essa uniformidade surge como um critério importantíssimo, uma vez que ela reforça

a necessidade de verificar a autenticidade da amostra, evitando colocar em risco a

saúde da população brasileira com medicamentos fitoterápicos de origem duvidosa e

cuja dose pode estar longe de ser a terapêutica, mas próxima à dose tóxica!

Dessa forma, fica evidente que a investigação química de uma espécie

vegetal baseada apenas no isolamento e caracterização estrutural de seus

componentes não é mais suficiente e adequada às atuais condições exigidas pela

Ciência e que resultem em produtos manufaturados viáveis.

Uma forma de tentar solucionar e/ou minimizar os problemas anteriormente

mencionados é empregar o uso de técnicas cromatográficas hifenadas tais como,

HPLC-PAD e a espectrometria de massas em tandem (MS/MS). Estas por sua vez,

permitem uma rápida tipificação da composição da matriz vegetal estudada através

dos tempos de retenção e/ou propriedades espectroscópicas/espectrométricas,

todas associados às características intrínsecas de cada substância, como polaridade,

massa molecular, entre outros (SNYDER et al., 1997, ARDREY, 2003).

Na maioria das vezes, a resposta obtida pelo detector permite a identificação

inequívoca dos metabólitos secundários presentes na matriz (ARDREY, 2003), e

posteriormente pode ser realizada a quantificação com o uso de técnicas de

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

calibração variadas, como por exemplo, adição de padrão, padrão externo e/ou

padrão interno (ROBARDS, 2003).

Uma forma de minimizar os custos relacionados aos processos de

investigação clássicos e maximizar os resultados da análise compreende a utilização,

em uma etapa prévia, da extração em fase sólida (SPE), seguida de análise

cromatográfica. Isso permite a caracterização química de uma matriz complexa com

a eliminação de possíveis interferentes durante o processo de avaliação

cromatográfica (CANNELL, 1998; LANÇAS, 2004). Nesse caso, ocorre a retenção

seletiva dos componentes de interesse presentes numa matriz complexa pelo

suporte usado, ou o contrário. Os interferentes menos retidos são eluídos com um

solvente de baixa força de eluição e os analitos removidos com um solvente forte (k’

~ 0), isso possibilita o uso de pequenos volumes do solvente extrator, resultando no

aumento da sensibilidade do método empregado, pois o nível de diluição passa a

ser muito pequeno (CASS & DEGANI, 2001).

A literatura demonstra que este tipo de abordagem muitas vezes é rápido e

vantajoso sobre os processos da fitoquímica tradicional. KATALINIĆ (1997), por

exemplo, promoveu a identificação por SPE-HPLC do perfil cromatográfico dos

principais flavonóides presentes nos extratos das sementes, talo e do caule de Vitis

vinifera L (Ampelidaceae), onde a (+)-catequina e a (-)-epicatequina foram

empregadas na etapa de quantificação. HUHMAN & SUMNER (2002)

desenvolveram um método de caracterização química de saponinas encontradas em

Medicago sativa e Medicago truncatula (Fabaceae) usando HPLC/UV/PAD e

HPLC/ESI/MS/MS. REZNICEK e colaboradores (1996) reportaram um método

baseado em HPLC, que permitiu a quantificação das principais saponinas presentes

em Solidago gigantea AIT (Asteraceae). CROZIER e colaboradores (1997)

investigaram as espécies Allium cepa L. e Apium graveolens L. (Apiaceae),

identificando e quantificando uma série de flavonóides livres e conjugados. HUCK e

colaboradores (2002) propuseram a avaliação de uma nova fase-reversa hidrofílica

em análises rápidas para a determinação de inúmeros flavonóides encontrados nos

mais diversos extratos de plantas, usando as técnicas de HPLC/UV/PAD e

HPLC/ESI/MS/MS.

Nosso grupo possui alguma experiência nesse tipo de abordagem.

CARDOSO e colaboradores (1997) identificaram os constituintes alifáticos e uma

série de alcalóides indólicos de estruturas complexas de Tabernaemontana hilariana

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

(Apocynaceae). Posteriormente, extrapolaram esta aplicação para a determinação

de triterpenóides e esteróides usando extração em fase sólida seguida por análises

por GC-FID e GC-MS (CARDOSO et al., 1998). A mesma autora identificou uma

série de cumarinas de diversas espécies de Dorstenia (Moraceae) usando GC-FID,

GC-MS (CARDOSO et al., 1999) e HPLC (CARDOSO et al., 2002). Este tipo de

abordagem permitiu também avaliar quantitativamente diversos fitoterápicos

encontrados no comércio local, tanto na forma de cápsulas quanto na forma de

cremes e pomadas (CARDOSO et al., 2000). Outro exemplo é a identificação de

flavonóides glucosilados de Maytenus aquifolium (Celastraceae) (VILEGAS et al.,

1999; VILEGAS et al., 2000) e de Sorocea bomplandii (Moraceae) usando HPLC-

NMR e HPLC-MS-MS (ANDRADE et al., 2002). Ainda, o uso de HPLC-NMR como

ferramenta para identificação rápida de flavonóides glucosilados permitiu formular

considerações sobre a taxonomia de plantas da família Eriocaulaceae (SANTOS,

2001).

Extração em fase sólida e extração líquido-líquido

A maioria das análises que envolvem amostras complexas requer várias

etapas de manipulação antes de se chegar à identificação e/ou a medida da

concentração de um ou mais analitos de interesse (SKOOG et al., 1996). Dentre as

várias etapas envolvidas na análise de amostras complexas, principalmente aquelas

de fontes vegetais, as que mais se destacam são: extração (TREUTTER, 1988;

CHEN et al., 2001), clean-up (SUÁREZ et al., 1996; SCHÜTZ et al., 2004), pré-

concentração, ajuste de concentração/volume entre outras (SUN et al., 1998;

ROBARDS, 2003).

As etapas de clean-up e ajustes de concentração geralmente são as que mais

consomem tempo e são as que mais podem causar erros críticos quando não bem

elaboradas e executadas.

Uma etapa de clean-up é fundamental para eliminar compostos indesejáveis e

que fazem parte da constituição da matriz, principalmente aqueles presentes em

extratos vegetais e matrizes biológicas, como por exemplo clorofila e proteínas, as

quais podem interferir drasticamente no método analítico a ser executado. Além do

mais, a etapa de clean-up pode estar intimamente ligada à longevidade de parte da

instrumentação usada, principalmente quando o objetivo é trabalhar em HPLC

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

usando fase reversa (RP) na avaliação de matrizes que apresentam grande

quantidade de material lipofílico (WELLUM & KIRBY, 1981).

Até bem pouco tempo atrás, a técnica analítica mais empregada no preparo e

eliminação de interferentes da amostra era a extração líquido-líquido (LLE), a qual se

baseia em solubilidade seletiva por parte dos analitos encontrados numa

determinada matriz. No entanto, este procedimento é lento, dispendioso, exige

grandes volumes de solventes orgânicos e praticamente inviabiliza um possível

processo de automação (LANÇAS, 2004).

A técnica denominada extração em fase sólida (SPE) tem se consolidado

nessas últimas décadas e vem sendo introduzida com a finalidade de eliminar

grande parte dos problemas encontrados na LLE (LANÇAS, 2004).

A SPE é uma técnica de separação líquido-sólido baseada nos mecanismos

de separação da cromatografia líquida de baixa pressão. A SPE, em sua forma mais

simples e conhecida, comporta-se como uma cromatografia líquida empregando-se

uma pequena coluna aberta, usualmente denominada cartucho de extração, a qual

contém a fase sólida (fase estacionária) (CASS & DEGANI, 2001).

Atualmente, a SPE utiliza como fase estacionária todos os suportes que

tradicionalmente são usados em cromatografia líquida de coluna, como: sílica gel,

alumina, Florisil, carvão ativo, XAD e fases baseadas em sílica quimicamente

modificada (RP2, RP8, RP18, etc.). Consequentemente, os mecanismos de

separação em SPE são os mesmos da cromatografia líquida (adsorção, partição,

troca iônica e exclusão por tamanho) (SNYDER et al., 1997; LANÇAS, 2004).

No entanto, apesar deste grande número de materiais que podem ser usados

como fase estacionária em SPE, os mais utilizados são as fases baseadas em sílica

quimicamente ligada, principalmente RP18, muito provavelmente devido à

versatilidade que a sílica oferece, seja pela regularidade e tamanho de suas

partículas (NEUE et al., 1999) ou pela gama de reações de funcionalização que ela

permite (SILVA et al., 2003). Estas vantagens se refletem nas inúmeras aplicações e

desenvolvimento de metodologias analíticas baseadas na utilização da SPE RP18

como uma etapa preliminar para o tratamento de amostras (KATALINIĆ, 1997;

POZZEBON et al., 2003). Por esses motivos ela foi efetivamente utilizada no

desenvolvimento deste trabalho, uma vez que reduz o número de etapas de

manipulação da amostra facilitando a análise dos compostos orgânicos presentes

em vegetais (NAMIESNIK & GÓRECKI, 2000).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Padronização de extratos vegetais

A padronização dos extratos obtidos tem sido outro ponto importante, sendo

observada a relação entre material vegetal e o extrato obtido, ou seja, quanto em

peso foi inicialmente utilizado da planta seca para fornecer uma determinada massa

de extrato seco. Normalmente, uma planta seca após extração e filtração fornece um

extrato líquido que, se levado a resíduo por evaporação, fornece uma quantidade de

material sólido (sem adição de excipientes) na proporção de cerca de 30%, havendo

casos em que a variação vai de 5-50% segundo a solubilidade dos seus metabólitos

(GREGÓRIO et al., 2006).

No caso dos 30%, a relação material vegetal-extrato é de 3:1, representando

que foram necessários 3 quilos da planta seca para fornecer 1 quilo de extrato seco;

para a planta que fornece 50% de resíduo, a proporção é de 2:1 e no caso da planta

com 5% a proporção é dez vezes maior, portanto de 20:1 (GREGÓRIO et al., 2006).

Outra forma de padronização envolve o doseamento das substâncias

químicas relacionadas aos efeitos terapêuticos. Na maioria das vezes, este

doseamento é feito para uma ou mais substâncias que ocorrem na espécie vegetal

de maneira mais expressiva em quantidade ou em potência farmacológica. Nos

casos em que é exigida a determinação dos teores dessas substâncias, a

cromatografia líquida de alta eficiência mostra-se como uma das principais técnicas

de análise química, a qual é amplamente empregada em laboratórios de controle de

qualidade da indústria farmacêutica ou em laboratórios de fiscalização sanitária

(GREGÓRIO et al., 2006).

Desta forma, neste trabalho a técnica de HPLC-PAD foi efetivamente utilizada

na tentativa de se estabelecer os teores dos principais metabólitos secundários em

fitopreparações a base de infusos e em outras espécies de extratos vegetais.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho foram:

9 Contribuir para o aumento do conhecimento sobre a composição química de

espécies vegetais pertencentes ao bioma Cerrado;

9 Desenvolver metodologias que permitam reconhecer, de forma rápida e

eficiente, a composição química de extratos vegetais;

9 Traçar o perfil cromatográfico das espécies estudadas com a utilização de

técnicas hifenadas (HPLC-PAD e FIA-ESI-IT-MS/MS);

9 Efetuar a quantificação dos principais metabólitos secundários presentes em

fitopreparações (infuso e/ou extratos).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Este trabalho foi baseado na investigação de uma série de plantas de várias

famílias e gêneros, todas incluídas no projeto temático: “USO SUSTENTÁVEL DA

BIODIVERSIDADE BRASILEIRA: PROSPECÇÃO QUÍMICO-FARMACOLÓGICA

EM PLANTAS SUPERIORES”, incluído no Programa - BIOTA/FAPESP. Desta forma,

o trabalho foi organizado em capítulos, os quais correspondem aos estudos das

espécies vegetais investigadas, incluindo em cada capítulo introdução,

desenvolvimento e discussão.

Espécies dos gêneros Davilla (Dilleniaceae), Byrsonima (Malpighiaceae) e

Hancornia speciosa (Apocynaceae) foram selecionadas com base: 1) na dificuldade

em se realizar o estudo fitoquímico da forma tradicional, 2) pelos resultados positivos

frente às atividades biológicas ensaiadas e 3) para comparar diferentes espécies de

um mesmo gênero.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

EXPERIMENTAL

Instrumentos

As separações cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo líquido

de alta eficiência (analítico, gradiente quaternário) modelo PU-2089 (Jasco

acoplado a um detector de arranjo de foto diodos com faixa de varredura de 195-650

nm e intervalo mínimo de 1 nm, modelo MD-2010 (Jasco

), bem como em um

cromatógrafo líquido de alta eficiência (analítico/preparativo, gradiente binário)

acoplado a um detector de arranjo de foto diodos com faixa de varredura de 190-800

nm e intervalo mínimo de 1 nm, modelo ProStar 210/330 (Varian

Os softwares Star Chromatography Workstation versão 5.31 (Varian

) e

EZChrom Elite Client/Server versão 3.1.7 (Chromatec

) foram utilizados durante a

aquisição e processamentos dos dados cromatográficos.

No modo analítico foram usadas colunas de fase reversa RP18 imobilizadas

com octadecilsilano, modelos Luna 2 (Phenomenex

) de 250 x 4,6 mm i.d.,

apresentando partículas com tamanho médio de 5 µm; Synergi Hydro

(Phenomenex

) de 250 x 4,6 mm i.d.; 4 µm, ambas com coluna de guarda

(Phenomenex

) de 4 x 3 mm i.d. No modo preparativo foi usada uma coluna de fase

reversa RP18, modelo Dynamax (Varian

) de 250 x 41,4 mm i.d.; 8 µm. No modo

semi-preparativo foi usada uma coluna de fase reversa RP18, modelo Luna 2

(Phenomenex

) de 250 x 10 mm i.d.; 10 µm. Amostras e padrões foram injetados

através de um injetor Rheodyne

7125 com um loop de 20 µL (modo analítico), 100

µL (modo semi-preparativo) e 1 mL (modo preparativo).

Os espectros de massas das infusões foram obtidos em um espectrômetro de

massas LCQ Deca (ESI-IT-MS

, Thermo Finnigan

), equipado com um dispositivo

de inserção direta da amostra via análise por injeção em fluxo contínuo (FIA). As

matrizes estudadas foram analisadas no modo de ionização por electrospray (ESI) e

as fragmentações em múltiplos estágios (MS

, MS

) realizadas em uma

interface do tipo ion-trap (IT). As análises por FIA-ESI-IT-MS

foram realizadas junto

aos grupos do Prof. Cosimo Pizza/Sonia Piacente da Università degli Studi di

Salerno e da Profª Virginia Carbone do Istituto di Scienze dell Centro di

Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolare - Itália.

O modo negativo foi escolhido para a geração e análise dos espectros de

massas em primeira-ordem (MS), bem como para os demais experimentos em

múltiplos estágios (MS

), sob as seguintes condições: voltagem do capilar –4 V,

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

voltagem do spray –5 kV, temperatura do capilar 280 °C, gás de arraste (N

) fluxo 60

(unidades arbitrárias). A faixa de aquisição foi m/z 50-2000, com dois ou mais

eventos de varredura realizados simultaneamente no espectrômetro de massas LCQ.

O primeiro evento foi uma varredura completa (full-scan) do espectro de massas

para adquirir os dados dos íons na faixa m/z estabelecida. Os demais eventos foram

experimentos MS

realizados a partir dos dados da primeira varredura para íons

precursores pré-selecionados com energia de colisão entre 25 e 30% da energia

total do instrumento.

O software Xcalibur versão 1.3 (Thermo Finigan

) foi utilizado durante a

aquisição e processamento dos dados espectrométricos.

O sistema MPLC BÄECKSTROM Separo AB, equipado com uma bomba

peristáltica FMI-50 modelo QSY e com uma coluna de vidro BÄECKSTROM de 1,0

cm i.d. e com comprimento regulável, foi usado em experimentos de separação

cromatográfica.

As balanças analíticas Bioprecisa

FA2104N (capacidade 200 g e precisão de

0,1 mg) e Libror AEG-45SM (capacidade para 45 g e precisão de 0,01 mg,

Shimadzu

) foram usadas na pesagem dos extratos, substâncias de referência e dos

padrões comerciais utilizados para preparação das soluções estoque.

As soluções padrão de calibração foram preparadas a partir de alíquotas

retiradas das soluções estoque por meio de micropipetas de alta precisão (Gilson

Pipette

), modelos P20, P200 e P1000. A faixa de transferência de volumes estava

contida no intervalo de amostragem de 2,0 a 1000,0 µL.

Materiais, Reagentes e Soluções

Balões volumétricos, micropipetas, vials com tampa de teflon

e demais

vidrarias usadas no preparo dos extratos e padrões foram imersos por 24 h em

solução de Extran (Merck

) 3% v/v, para remoção de contaminantes. O material foi

enxaguado em água Milli-Q (Millipore

) e seco a temperatura ambiente.

Cartuchos de extração em fase sólida (SPE) de fase normal (SiO

) 360 mg

(55 µm, Classic, Waters

) e fase reversa a base de octadecilsilano (RP18) com 500

mg 6 mL

-1

(33 µm, Supelco

), 500 mg 6 mL

-1

(55 µm, Strata-X, Phenomenex

) e 10

g 60 mL

-1

(55 µm, Strata-E, Phenomenex

) foram usados nas etapas de clean-up

dos extratos, sendo as soluções resultantes filtradas em membranas de PTFE

(politetrafluoroetileno, teflon

Millipore

) com poro de 0,45 ou 0,20 µm.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Miricetina (96%), apigenina (95%), luteolina (98%), kaempferol (96%),

quercetina (95%), rutina (95%), quercetina-3-O-β-glicopiranosídeo (90%),

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo (97%), (+)-catequina (98%), (-)-epicatequina

(98%), (-)-epigalocatequina (98%), galato de (-)-epicatequina (98%), galato de (-)-

epigalocatequina (98%), galato de (-)-galocatequina (98%), ácido clorogênico (95%),

ácido trifuoracético (99,5%) (Sigma Aldrich

), ácido gálico (98%) (Merck

quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo (95%), miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo

(97%) (Extrasynthese

) foram usados como padrões de identificação e nas

subseqüentes etapas de quantificação. Demais metabólitos não disponíveis

comercialmente foram isolados, purificados, caracterizados por

H-NMR,

C-NMR e

fazem parte de um banco de padrões pertencente ao Laboratório de Fitoquímica do

Prof. Wagner Vilegas, o qual é composto por: miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo

(98%), quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo (98%), miricetina-3-O-β-

glicopiranosídeo (95%), miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo, (97%),

(6S,7E)-6,9-diidroxi-4,7-megastigmadien-3-ona, (98%), miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-

α-rhamnopiranosídeo (97%), miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo

(90%), amentoflavona (98%), quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-arabinopiranosídeo

(95%), quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo (90%), quercetina-3-O-α-

rhamnopiranosil-(1→6)-O-β-galactopiranosídeo, quercetina-3-O-α-rhamnopiranosil-

(1→3)-O-[α-rhamnopiranosil-(1→6)]-O-β-alopiranosídeo, rhamnetina (98%),

quercetagetina-7-O-β-glicopiranosídeo (95%). Todos os padrões e amostras foram

armazenados em vials de 2 mL e mantidos em freezer a -18ºC.

Os experimentos de

H-NMR e

C-NMR, obtidos em metanol tretradeuterado

(CD3OD, Sigma Aldrich

) ou em dimetil sulfóxido hexadeuterado (DMSO-d

, Sigma

Aldrich

), foram realizados em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear

de 11,7 T (Varian

Inova), operando em 500 MHz para

H-NMR e 125 MHz para

C-

NMR. Os deslocamentos químicos são dados em δ (ppm) usando tetrametilsilano

(TMS) como padrão interno.

Clorofórmio e diclorometano (Burdick & Jackson

), acetonitrila e metanol

(Baker

), todos de grau HPLC, foram usados na preparação das amostras, padrões,

nas eluições em SPE e como fase móvel em HPLC. Os demais solventes citados no

trabalho são de grau analítico (PA).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Nas triagens das frações foram usadas colunas de camada delgada de

silicagel em suporte de alumínio ou vidro (Merck

, Aldrich

), sendo usados como

reveladores: Anisaldeído/H

, NP/PEG, I

Material Vegetal

Davilla nitida Vahl, D. elliptica A. St. -Hill e Hancornia speciosa Gomez foram

coletadas pela profª. Clélia A. Hiruma-Lima em Palmas-TO. A identificação foi

realizada pela profª. Solange de Fátima Lólis. Exsicatas foram depositadas no

Herbário da Fundação Universidade do Tocantins com os seguintes números de

voucher: D. elliptica St. Hill (Dilleniaceae) TO4593, D. nitida Vahl. (Dilleniaceae)

TO3849, Hancornia speciosa Gom. (Apocynaceae) - TO4064.

Folhas de Byrsonima crassa Niedenzu e B. fagifolia Niedenzu (Malpighiaceae),

foram coletadas na estrada do Brejinho de Nazaré, município de Porto Nacional-TO

pela prof

. Dr

. Clélia Akiko Hiruma-Lima (IBB-UNESP-Botucatu). A identificação foi

feita pelo Dr. Eduardo Ribeiro dos Santos e catalogadas com o número de exsicata

6398 e 3377, respectivamente, sendo que os exemplares se encontram depositados

no herbário da Universidade do Tocantins.

As folhas de B. intermedia A. Juss. e B. basiloba DC. foram coletadas por

Luís Fernando R. de Almeida (IBB-UNESP-Botucatu) no município de Pratânia-SP e

identificadas por José Clemente Campos (IBB-UNESP-Botucatu). As exsicatas de

número 24164 e 24163 encontram-se depositadas no herbário da UNESP-Botucatu.

As folhas de B. coccolobifolia Kunth foram coletadas no município de Itirapina-SP, na

localidade de Cerrado de Graúna. A identificação foi realizada pelo Prof. Dr. Jorge

Tamashiro (IB-UNICAMP). Uma exsicata com frutos imaturos foi depositada no

herbário da Universidade Estadual de Campinas, sob número 1397.

Depois de coletadas, as plantas foram secadas em estufa a 50°C, moídas em

moinhos de facas, sendo posteriormente pesadas, embaladas, etiquetadas e

armazenadas em local seco.

Extrações

Infusões foram utilizadas na preparação de extratos aquosos de folhas e

cascas das espécies vegetais. Os infusos foram preparados na proporção de 10%

(m/v), sendo adicionado ao material vegetal moído água a 80°C (DALLUGE et al.,

1998). O recipiente foi mantido fechado e deixado em repouso por 10 min.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Posteriormente, a solução do infuso foi filtrada em filtro de papel. O sobrenadante

obtido foi filtrado em membrana de PTFE (Millex

) de 0,45 µm e analisado por HPLC

ou ainda concentrado em liofilizador ou em fluxo de nitrogênio para posterior

armazenamento na forma sólida.

Extratos obtidos a partir de solventes orgânicos. Estes foram preparados por

maceração, sendo o processo acelerado por meio de ultra-som. Quantidades

conhecidas das folhas secas e pulverizadas das espécies vegetais foram

primeiramente extraídas com 25 mL CHCl

em quatro etapas, a cada extração o

extrato líquido foi separado e acondicionado em um frasco, ao final da quarta

extração o material vegetal foi seco e submetido às mesmas etapas de extração em

MeOH.

Procedimentos Cromatográficos Gerais

Na etapa de clean-up dos extratos ou infusões, uma pequena massa (1 mg da

amostra para cada 10 mg da fase de RP18 ou SiO

) foi aplicada nos cartuchos SPE.

Em RP18, o cartucho foi previamente ativado com MeOH (4 mL) e depois

ambientado com H

O (5 mL). O material a ser aplicado no suporte de SPE foi

previamente solubilizado em aproximadamente 0,5 mL de MeOH com auxílio de

ultra-som, sendo posteriormente adicionados 2 mL de H

O ou da própria solução

usada na dessorção dos analitos. A eluição nos suportes de RP18 obedeceu à

seguinte ordem geral (MeOH/H

O 2:8 v/v, MeOH/H

O 1:1 v/v e MeOH), porém,

ajustes foram realizados durantes as otimizações. Em SiO

, o cartucho foi

ambientado com CHCl

(4 mL). A amostra foi dissolvida em 0,5 mL de MeOH com

auxílio de ultra-som e adição de 1 mL de CHCl

. A eluição foi realizada na ordem

(CHCl

:MeOH 2:1 v/v, MeOH e MeOH/H

O 1:1 v/v). Em ambas as extrações,

alíquotas de 5 mL foram coletadas para cada composição do eluente empregado na

dessorção dos analitos (LANÇAS, 2004).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Capítulo 1:

Hancornia speciosa Gomez (Apocynaceae)

Popularmente conhecida como mangabeira, mangaba e mangava, H.

speciosa é uma planta originária do Brasil. Apresenta ampla dispersão geográfica,

ocorrendo em diversos ecossistemas do país como Amazônico, Mata Atlântica e

Cerrado. Ela se adapta às mais diferentes altitudes, com ocorrências desde o litoral

Nordestino até áreas de Cerrado do Brasil Central com 1.500 m de altitude. Em

especial, são nas áreas dos Tabuleiros Costeiros, Baixadas Litorâneas e áreas de

Cerrado onde as populações locais fazem seu maior aproveitamento alimentar. Sua

exploração é exclusivamente extrativista, não havendo registro da existência de

áreas sob cultivo homogêneo.

A mangabeira é uma árvore de grande porte, podendo atingir até 15 m de

altura. Possui um tronco tortuoso com ramos lisos e avermelhados. A casca

apresenta um látex branco. As folhas são opostas, simples, pecioladas; limbo com

cerca de 5-6 x 2 cm, elíptico ou oblongo; ápice abruptamente acuminado ou obtuso;

base obtusa ou arredondada; nervura mediana impressa na face ventral e elevada

na face dorsal e as flores são brancas e perfumadas (Figura 1.1, LORENZI, 1998).

Figura 1.1. Hábito, folhas e inflorescências de Hancornia speciosa. Fonte: (LORENZI, 1998).

O fruto apresenta casca amarelada com manchas ou estrias avermelhadas

(Figura 1.2). Possui grande valor nutritivo, a polpa é macia e doce e apresenta mais

vitamina C do que o limão. É geralmente consumida como fruta, ou em forma de

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

sorvetes, doces e geléias, mas o fruto verde é indigesto e purgativo, podendo ser

tóxico (POTT & POTT, 1994). Da casca extrai-se um látex que é matéria-prima para

produção de uma borracha de qualidade inferior ao da seringueira (LORENZI, 1998).

No entanto, existem estudos que empregaram o uso da reação de copolimerização

entre o estireno-butadieno com o látex de H. speciosa para a produção industrial de

uma borracha sintética (FIRESTONE, 1948).

Figura 1.2. Frutos e sementes de H. speciosa. Fonte: (LORENZI, 1998).

Na medicina popular, H. speciosa é usada de várias formas: como decocto da

raiz, junto com o “quiabinho” (Manihot tripartita), para tratar a hipertensão (ALMEIDA

et al. 1998); como infusão das folhas para cólica menstrual e contra gripe; a casca é

indicada para doenças internas (por exemplo, tuberculose, úlceras, doenças do

fígado e baço) e o látex para abscessos internos. Outros usos medicinais são

descritos contra câimbras, doenças do fígado, diabetes e como agente emagrecedor

(POTT & POTT, 1994) e em um estudo preliminar, ANDRADE (2002) verificou a

atividade gastroprotetora do extrato etanólico das cascas de H. speciosa.

Quanto à avaliação da composição química de H. speciosa, SAMPAIO et al.,

(2006) evidenciaram a presença de inúmeros compostos voláteis nos frutos desta

espécie, os quais foram identificados com a utilização da técnica de GC-FID e GC-

MS. O estudo químico realizado com o extrato etanólico das folhas resultou no

isolamento do inositol L-(+)-bornesitol (ENDRINGER et al., 2007) e na identificação

do flavonol rutina realizada por HPLC (FERREIRA et al., 2007). No entanto, até o

presente momento, nenhum outro trabalho encontrado na literatura reporta um

estudo aprofundado sobre a composição química das cascas de H. speciosa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Parte experimental / Resultados e discussões

Investigação dos extratos de H. speciosa

Estudos anteriores realizados por nosso grupo demonstraram promissora

atividade antiulcerogênica de H. speciosa. Na análise inicial realizada por ANDRADE

(2002), apenas o extrato etanólico das cascas foi investigado e devido ao elevado

teor de substâncias polares, aquele autor empregou a técnica de cromatografia

contracorrente de alta velocidade (HSCCC) ao estudo, resultando na obtenção de

frações impuras, onde foram identificados nas misturas o ácido clorogênico,

catequinas e taninos condensados. A complexidade do extrato inviabilizou o estudo

fitoquímico mais aprofundado deste material com a utilização das técnicas

tradicionais de isolamento. Novas tentativas utilizando a cromatografia de

permeação em gel (GPC) usando Sephadex LH-20 não se mostraram eficientes na

separação dos metabólitos secundários de H. speciosa. Fatores como a forte

adsorção dos taninos condensados, a possibilidade de degradação da fase

estacionária ocasionada por esta classe de metabólitos (MUELLER-HARVEY, 2001)

e a necessidade do uso de grandes quantidades de solventes para a eluição dos

metabólitos com subseqüentes etapas para a regeneração do suporte foram motivos

que nos direcionaram para o estabelecimento de uma nova estratégia de

investigação.

Desta maneira, optou-se pelo desenvolvimento de uma metodologia baseada

em análises por HPLC-PAD na tentativa de realizar a identificação direta dos

metabólitos secundários presentes nas matrizes estudadas empregando

experimentos de co-injeção de padrões autênticos e/ou substâncias previamente

isoladas e caracterizadas.

Inicialmente foi realizada a investigação dos extratos EtOH e MeOH das

cascas de H. speciosa, em que 5 mg de cada extrato foi dissolvido em uma mistura

de MeOH/H

O (3:7, v/v), seguido da filtração em membrana de PTFE com poro de

0,45 µm, diluição para 2 mL e injeção de 20 µL em HPLC analítico. As análises

cromatográficas foram feitas com a utilização de uma coluna de RP18 e a fase

móvel utilizada era composta de uma mistura de ACN/H

O. Durante a eluição dos

componentes químicos presentes em cada extrato, o gradiente exploratório de 5-

100% de ACN em 60 minutos com manutenção de 100% de ACN por mais 5

minutos foi empregado na obtenção dos perfis cromatográficos dos extratos.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Avaliação dos perfis cromatográficos obtidos (Fig. 1.3A e 1.3B) mostrou

claramente a complexidade desta matriz, a baixa resolução cromatográfica e a

eluição característica de um pico bastante alargado em cada cromatograma foram

outros indicativos da presença de taninos condensados em H. speciosa e tentativas

de otimização cromatográfica não se mostraram promissoras.

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

150

200

250

300

PDA-210 nm

H speciosa ExEtOH 5mg/2ml GE 60min

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

150

200

250

300

PDA-210 nm

H speciosa ExEtOH 5mg/2ml GE 60min

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

150

200

250

300

PDA-210 nm

H speciosa ExMeOH 5mg2ml GE 60min

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

150

200

250

300

PDA-210 nm

H speciosa ExMeOH 5mg2ml GE 60min

Figura 1.3. Perfis cromatográficos do extrato EtOH (A) e do extrato MeOH (B) das cascas de H.

speciosa obtidos por HPLC-PAD. Sistema de eluição gradiente: 5-100% ACN em 60 min, coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210

nm.

Uma vez constatada a presença de taninos condensados em H. speciosa

(ANDRADE, 2002) e o conhecimento de que esta classe de metabólitos secundários

apresenta labilidade frente à ação de luz e calor (SIMÕES et al., 2003), outras

metodologias de extração usando acetona/água 7:3 v/v (SANTOS et al., 2002) e

acetona/água 1:1 v/v (SIMÕES et al., 2003) seguida da liofilização do material

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

extraído foram testadas na tentativa de se trabalhar com um extrato mais íntegro,

mas os resultados continuaram não sendo promissores.

A falta de resolução e seletividade observadas foi ocasionada provavelmente

não apenas ao elevado número de substâncias ou pela presença de taninos

condensados, mas também pela presença de outros componentes poliméricos, uma

vez que a planta é uma fonte natural de látex (LORENZI, 1998).

Nenhum dos estudos reportados na literatura descreve a natureza química do

látex encontrado nesta espécie. Desta forma, uma etapa de caracterização da parte

apolar de H. speciosa foi realizada com o extrato CHCl

O extrato originado por etapas de maceração foi obtido em uma quantidade

razoável de rendimento (~ 3,4%) e apresentando um aspecto de “goma” com cor

amarelada. Análises do extrato CHCl

por TLC usando vários sistemas eluentes

evidenciaram apenas uma mancha, sugerindo assim a possível presença de uma

única substância.

Realização de experimentos de

H-NMR e

C-NMR juntamente com

comparação de dados da literatura (BRANDOLINI & HILLS, 2000) permitiram a

identificação do polímero cis-poliisopreno e a triagem cromatográfica usando TLC

evidenciou a presença deste nos extratos MeOH e EtOH.

Preparação dos extratos utilizados na avaliação do perfil cromatográfico

Confirmada a presença de material polimérico em H. speciosa, foi necessário

minimizar sua extração e ao mesmo tempo possibilitar a identificação dos

componentes polares. Assim, uma alternativa encontrada foi a utilização de infusões

(DALLUGE et al., 1998) feitas a partir das cascas de H. speciosa com remoção de

taninos com elevado grau de polimerização empregando o procedimento adaptado

de HAGERMAN & BUTLER (1980). Esta metodologia consistiu em proceder com

uma extração líquido-líquido (LLE) entre a infusão e acetato de etila, seguida de

extração em fase sólida (SPE) (ROBARDS, 2003) da porção acetato de etila

previamente seca para a remoção dos interferentes poliméricos remanescentes. O

Esquema 1.1 apresenta as etapas seguidas para a obtenção da fração de interesse

da infusão analisada por HPLC.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

H. speciosa

cascas (1 g)

10 mL H

∆ 80°C microondas

Fração aquosa

m = 46 mg

Partição em

AcOEt 3x 50 mL

Infusão

Filtração

Material

sólido

Fração AcOEt

m = 15 mg

10 min

Infusão filtrada

Esquema 1.1. Etapas envolvidas na obtenção da infusão das cascas de H. speciosa.

Análises por TLC em vários sistemas de solventes evidenciaram uma melhora

substancial na resolução cromatográfica com a ocorrência de diversas substâncias

na fração acetato de etila. A fração aquosa apresentou-se como um sólido vermelho

e quebradiço, cuja análise por TLC indicou rastros e grande quantidade de material

retido no ponto de aplicação. Uma vez que a fase acetato de etila mostrou-se mais

promissora, maior ênfase foi dada ao seu estudo.

Na etapa envolvendo a SPE da porção acetato de etila da infusão de H.

speciosa, inicialmente foram avaliados cartuchos SPE de dois suportes: Sep pak de

fase reversa (RP18) e Sep pak de fase normal (SiO

Nos procedimentos que envolveram a otimização das condições analíticas da

SPE, uma série de eluentes foi investigada e misturas em proporções variadas de

ACN/H

O; MeOH/H

O; CHCl

/MeOH e CHCl

/ACN foram usadas na eluição dos

metabólitos adsorvidos nos suportes e os melhores resultados foram obtidos com a

utilização dos eluentes representados no Esquema 1.2.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

7 mg da

porção AcOEt

~0,5 mL MeOH

1 mL MeOH/H

O 1 : 1 v/v

clean-up

Sep Pak RP18

5 ml

O/MeOH

8 : 2 v/v

1ª eluição

2ª eluição

3ª eluição

5 mL

O/MeOH

1 : 1 v/v

5 mL

MeOH

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

amostra solubilizada

em ultrassom

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

7 mg da

porção AcOEt

~0,5 mL MeOH

1 mL CH

Cl/MeOH 1 : 1 v/v

amostra solubilizada

em ultra-som

clean-up

Sep Pak SiO

5 mL

CHCl

/MeOH

2 : 1 v/v

1ª eluição

2ª eluição

3ª eluição

5 mL

MeOH

5 mL

MeOH/H

1 : 1 v/v

análise por

TLC

análise por

TLC

millex 0,45 µm e

análise por HPLC

análise por TLC

Esquema 1.2. Etapas de extração em fase sólida com cartuchos Sep Pak de fase normal e fase

reversa.

Cartuchos de fase reversa (500 mg 6 mL

-1

, Supelco

) foram pré-

condicionados passando sequencialmente 15 mL de MeOH e 10 mL de H

O e os

cartuchos de fase normal (SiO

, 500 mg, Sep Pak Classic, Waters

) foram pré-

condicionados passando 15 mL de CHCl

. Em seguida, a amostra (obedecendo o

limite de carga estabelecido pelo fabricante do suporte ou 1 mg para cada 10 mg de

fase estacionária) previamente solubilizada em um pequeno volume de solução (~1

mL MeOH/H

O 1:1 v/v para RP18 e ~1 mL CHCl

/MeOH 1:1 v/v para SiO

) foi

aplicada nos cartuchos.

Cada eluato representado no Esquema 1.2 foi coletado como uma fração

separada e monitorado por TLC em vários sistemas eluentes, sendo empregando

nesta análise comparativa, catequinas e ácidos fenólicos como substâncias de

referência.

Na eluição em fase normal, ao fim do clean-up o cartucho de SiO

permaneceu impregnado com grande quantidade do material aplicado. A fração

aparentemente mais rica em spots foi a eluída com CHCl

/MeOH 2:1 v/v, mas que

por sua vez evidenciou a presença de componentes apolares. Este eluato foi

preterido para as análises por RP18-HPLC, uma vez que sua composição poderia

comprometer a vida útil da coluna de fase reversa. Análise dos demais eluatos por

TLC também mostrou a presença de rastros ao longo de toda a placa cromatográfica

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

e os resultados obtidos com os cartuchos Sep Pak de SiO

demonstraram baixa

especificidade para os metabólitos de interesse.

No caso do clean-up usando cartuchos de RP18, a análise por TLC mostrou

melhor resolução ao longo das eluições com a presença de manchas de Rf’s

semelhantes aos das substâncias de referência, sugerindo maior concentração na

fração eluída com MeOH/H

O 2:8 v/v. Outro fator importante foi a eliminação do

material apolar, o qual permaneceu retido no cartucho e foi evidenciado por TLC

após completa dessorção do mesmo com CHCl

Assim, as três frações resultantes do clean-up com cartuchos de Sep Pak

RP18 representadas no Esquema 1.2 foram posteriormente analisadas por HPLC.

Inicialmente houve tentativas de realizar a separação cromatográfica dos

constituintes químicos encontrados nas cascas de H. speciosa com alguns dos

sistemas de eluição para HPLC descritos na literatura, os quais envolvem a

separação de catequinas presentes principalmente em folhas de chás verdes, como

no trabalho de Camellia sinensis, em que GOTO e colaboradores (1996)

empregaram um sistema gradiente de eluição com a fase móvel contendo a seguinte

composição: (A) H

O/ACN-85%/H

(95,45 : 4,5 : 0,05, v/v/v); (B) H

O/ACN-

85%/H

(49,95 : 50,0 : 0,05, v/v). Ou ainda misturas ternárias, como a sugerida

no trabalho de PELILLO e co-autores (2001), em que a fase móvel era composta

por: (A) H

O/MeOH/ácido fórmico (74,7 : 25 : 0,3; v/v/v); (B) ACN/ácido fórmico

(99,7/0,3; v/v).

No entanto, não houve êxito nas separações cromatográficas, mesmo

tentando utilizar e reproduzir algumas fases móvies descritas na literatura. Essa

dificuldade foi atribuída ao fato de que a composição química encontrada nas cascas

de H. speciosa apresentava uma composição química muito distinta àquelas

reportadas na literatura, em que na maioria dos trabalhos se observa a avaliação

cromatográfica de catequinas monoméricas encontradas nas folhas de chás verdes

ou chás pretos.

Desta maneira, o uso de sistemas eluentes mais simples baseados em

misturas de MeOH/H

O ou ACN/H

O foram avaliados. Sistemas compostos de

MeOH/H

O além de serem mais viscosos, especialmente na região da proporção de

MeOH/H

O 1:1 v/v (SNYDER et al., 1997), apresentaram menor seletividade e foram

preteridos em etapas posteriores. Assim, o sistema eluente composto de ACN/H

foi otimizado (Tabela 1.1). Em todas as análises o fluxo utilizado foi de 1,0 mL min

–1

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

o volume injetado foi de 20 µL e a detecção monitorada na região do UV,

principalmente em 210 e 280 nm.

Tabela 1.1. Gradiente de eluição cromatográfica empregado na eluição dos metabólitos secundários

encontrados no infuso das cascas de H. speciosa após procedimentos de clean-up

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O ACN

0 5

50 20

60 100

70 100

O cromatograma da Figura 1.4 mostra o perfil de H. speciosa após o

tratamento da amostra por LLE seguida da SPE em Sep pak RP18. Foi possível

notar que houve a remoção de vários interferentes, uma vez que resolução de linha

de base foi alcançada em toda a corrida cromatográfica e conseqüentemente a

obtenção de picos bem resolvidos pelo sistema proposto.

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

22.52

24.14

25.78

27.54

30.42

31.36

32.53

34.45

37.28

37.78

38.30

39.73

43.55

44.53

46.76

47.62

49.94

51.87

58.13

61.81

62.45

65.70

67.12

69.42

Absorbância 210 nm (AU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

22.52

24.14

25.78

27.54

30.42

31.36

32.53

34.45

37.28

37.78

38.30

39.73

43.55

44.53

46.76

47.62

49.94

51.87

58.13

61.81

62.45

65.70

67.12

69.42

Absorbância 210 nm (AU)

Figura 1.4. Perfil cromatográfico da fração MeOH/H

O 2:8 v/v proveniente do infuso das cascas de H.

speciosa, submetida ao clean-up em LLE e SPE em Sep Pak RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2)

RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 1.1).

Embora a análise por TLC tenha indicado a presença de substâncias nos três

efluentes do clean-up em Sep Pak RP18, avaliação dos cromatogramas da Figura

1.5 para os três eluatos permitiu verificar que os constituintes químicos das cascas

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

de H. speciosa se encontravam quase que totalmente no eluato A (MeOH/H

O 2:8

v/v). Processamento em diversos comprimentos de onda, usando o detector PAD,

evidenciou um pico alargado de intensidade relevante com ápice em t

= 61,35 min

no eluato B (MeOH/H

O 1:1 v/v), enquanto que no eluato C (MeOH) foram

registrados apenas ruídos.

Desta forma, os resultados obtidos mostraram que a etapa de clean-up

viabilizou a pré-concentração de alguns dos metabólitos secundários no primeiro

eluato e eliminação do material polimérico presente no infuso de H. speciosa.

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

A) Eluato MeOH/H

O 2:8

B) Eluato MeOH/H

O 1:1

C) Eluato MeOH 100%

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

A) Eluato MeOH/H

O 2:8

B) Eluato MeOH/H

O 1:1

C) Eluato MeOH 100%

Figura 1.5. A) cromatograma do primeiro eluato da SPE (MeOH/H

O 2:8 v/v). B) cromatograma do

segundo eluato da SPE (MeOH/H2O 1:1 v/v). C) cromatograma do terceiro eluato da SPE (MeOH

100%). Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo

1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.1 e para processo de SPE em

RP18 veja Esquema 1.2A).

Uma vez realizada a otimização do sistema de eluição cromatográfico, a

etapa seguinte consistiu na identificação dos constituintes presentes no eluato

MeOH/H

O 2:8 v/v do infuso das cascas de H. speciosa.

Identificação dos metabólitos secundários

Sob a condição de eluição descrita na Tabela 1.1, os principais picos eluídos

nos cromatogramas da Figura 1.6 foram identificados pela comparação dos seus

espectros de UV ou pela comparação dos seus tempos de retenção com o de

padrões comerciais e/ou substâncias isoladas de outras espécies vegetais.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância (AU)

2.0

A) λ: 210 nm

B) λ: 325 nm

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância (AU)

2.0

A) λ: 210 nm

B) λ: 325 nm

Figura 1.6. Perfil cromatográfico do eluato MeOH/H

O 2:8 v/v do infuso das cascas de H. speciosa

submetido ao processo de SPE. A) Cromatograma processado em 210 nm e B) cromatograma

processado em 325 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD

(Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 1.1).

Com o auxílio do detector PAD realizando varredura na faixa espectral de

200-600 nm, duas classes de substâncias foram identificadas no infuso das cascas

de H. speciosa. Catequinas monoméricas e oligoméricas (taninos condensados ou

proantocianidinas) foram facilmente identificadas com base nos seus espectros de

absorção na região do UV. Esses metabólitos secundários exibiram uma banda fraca

em torno de 280 nm, um ombro próximo de 220 nm e máximo entre 205-210 nm

(ROHR et al., 2000; WANG et al., 2000). Os derivados do ácido cafeoilquínico

apresentaram duas bandas de máximo de absorção intensas nas regiões de 217 e

325 nm e dois ombros nas regiões de 245 e 295 nm (ROHR et al., 2000) (Fig. 1.7).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

100

150

200

mAU

200250300350

100

150

200

mAU

200250300350

100

150

200

250

mAU

200 250 300 350

100

150

200

250

mAU

200 250 300 350

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

200 250 300 350

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

100

125

150

mAU

200 250 300 350

100

125

150

mAU

200 250 300 350

100

200

300

mAU

200 250 300 350

100

200

300

mAU

200 250 300 350

Figura 1.7. Espectros na região do UV para os principais picos eluídos no cromatograma da Figura

1.6. Espectros 2, 3 e 5 foram atribuídos à catequina, ácido clorogênico e à epicatequina,

respectivamente.

A identificação de alguns dos metabólitos secundários encontrados na infusão

das cascas de H. speciosa pôde ser feita de forma inequívoca pela realização de

experimentos de co-injeção, em que alíquotas da matriz e padrão foram misturas e

diluídas para um volume conhecido, sendo posteriormente analisadas por HPLC em

mais de um método de eluição (gradiente e/ou isocrático). Assim, os picos 2 (t

27,5 min), 3 (t

= 30,4 min), 5 (t

= 37,8 min) e 7 (t

= 46,7 min) dos cromatogramas

da Figura 1.6 foram identificados como sendo catequina, ácido clorogênico,

epicatequina e galato de epigalocatequina, respectivamente.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Estabilidade da fração MeOH/H

O 2:8 v/v

Catequinas e taninos são substâncias que apresentam instabilidade química

quando submetidas à ação do calor e da luz (SIMÕES et al., 2003). A concentração

desta classe de metabólitos secundários diminui com tempo, devido ao fato destas

substâncias serem instáveis também em condições de pH neutro ou básico (STACH

& SCHMITZ 2001). Podem sofrer transformações químicas tais como oxidação e

principalmente epimerização pela ação de íons metálicos presentes na água ou pela

alteração dos valores de pH (WANG & HELLIWELL, 2000). Tendo em vista que

modificações na composição química são fatores importantes quando se pensa em

atividade biológica, como uma etapa adicional, foi avaliada a degradação da fração

MeOH/H

O 2:8 v/v.

Uma amostra resultante da primeira eluição da SPE em Sep Pak RP18 com

aproximadamente 2 mL foi dividida e acondicionada em dois vials: o primeiro, âmbar,

foi fechado e mantido em freezer a -18°C. O segundo, transparente, foi mantido

fechado em temperatura ambiente e sem proteção contra a luz. Monitoramento das

duas amostras foi realizado nos intervalos de 1, 15, 30 e 90 dias.

Visualmente foi verificado um aumento na tonalidade da cor da solução

mantida sob os efeitos de luz e calor. A solução, inicialmente possuía uma cor

pálido-alaranjada, passando gradativamente para uma tonalidade avermelhada até

chegar à cor marrom ao final dos 90 dias. Essa mudança de coloração pode estar

associada aos mecanismos de oxidação que ocorrem freqüentemente em

compostos fenólicos (SCHIEBER et al., 2001).

A resolução cromatográfica e a intensidade dos picos da amostra mantida sob

refrigeração e protegida da luz permaneceram inalteradas por pelo menos 30 dias.

No entanto, o cromatograma da amostra que permaneceu sob os efeitos externos

apresentou um expressivo decréscimo na resolução cromatográfica e na intensidade

dos picos nos primeiros 15 dias e o desaparecimento de todos os picos

cromatográficos ao final dos 90 dias (Figura 1.8). Estudo semelhante foi realizado

por STACH & SCHMITZ (2001), em que os autores observaram decréscimo de até

21% na concentração de catequinas de chás verdes preparados em meio neutro ou

básico com monitoramento em um intervalo máximo de 60 min.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Absorbância 210 nm (AU)

A) 1 dia

B) 15 dias

C) 30 dias

D) 90 dias

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

0.2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Absorbância 210 nm (AU)

A) 1 dia

B) 15 dias

C) 30 dias

D) 90 dias

Figura 1.8. Avaliação da degradação do conteúdo de catequinas a partir de análises cromatográficas

de uma amostra (eluato MeOH/H

O 2:8 v/v após clean-up em Sep Pak RP18) submetida à ação de

luz e calor. Intervalos:

A) 1 dia; B) 15 dias; C) 30 dias e D) 90 dias. Coluna Phenomenex

Luna (2)

RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 1.1).

Os resultados obtidos nesta investigação são bastante significativos, tanto do

ponto de vista analítico quanto do ponto de vista químico-farmacológico. No aspecto

analítico, cuidados devem ser tomados em etapas quantitativas: tanto amostras

quanto os padrões devem ser protegidos destes efeitos, visto que o

desenvolvimento de uma metodologia e a resposta de um sinal analítico depende da

estabilidade dos analitos empregados nos processos de calibração. No aspecto

químico-farmacológico, estes resultados servem para alertar sobre a integridade dos

produtos e as formulações fitoterápicas que são comercializados. Ou seja, a

ausência de mecanismos que permitam proteger ou estabilizar as matrizes que

contenham esses metabólitos secundários pode alterar as atividades relacionadas a

eles por causa desses efeitos.

Outro aspecto pertinente a este resultado diz respeito à integridade de

extratos vegetais no geral. Em alguns casos, o intervalo de obtenção entre extrato

seco e a realização dos ensaios químico-farmacológicos pode levar algumas

dezenas de dias. Sendo assim, pode ser questionado até que ponto este intervalo

de tempo pode comprometer a atividade de um determinado metabólito secundário?

Ou ainda, até que ponto uma planta (ou extrato) considerada “inativa” teve a sua

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

atividade comprometida devido a um longo intervalo de tempo até ocorrer a sua

avaliação ou a um processo de extração e armazenamento incorretos?

Fracionamento da porção acetato de etila da infusão de Hancornia speciosa

Tendo em vista que as demais substâncias, incluindo aquela aparentemente

majoritária (Fig. 1.6, pico 4), não foram identificadas, uma nova estratégia usada na

tentativa de isolar algumas das substâncias não caracterizadas em H. speciosa foi

realizada empregando a técnica de Cromatografia Líquida de Média Pressão

(MPLC). Como foram obtidos resultados promissores com as etapas de clean-up,

um scale-up do procedimento da SPE em Sep Pak RP18 foi elaborado e a

separação de 300 mg de infusão liofilizada foi efetuada em uma coluna empacotada

com sílica de fase reversa RP18.

A infusão liofilizada foi solubilizada em MeOH/H

O 5:95 v/v, centrifugada e a

solução aplicada na coluna de RP18 (Strata-X 55 µm, Phenomenex) de 1,0 cm i.d. x

10 cm. As eluições foram realizadas em modo gradiente (1,0 mL min

–1

) com o

sistema MPLC BÄECKSTROM separo AB, iniciando-se com 5% de MeOH e

aumentando a força de eluição em 5% a cada 50 mL. As frações eluídas do sistema

MPLC foram coletadas em um coletor automático programado para 6 min/coleta. Um

total de 161 frações foram obtidas e posteriormente reagrupadas após verificação

por TLC empregando catequinas como substâncias de referência.

Análises preliminares por TLC evidenciaram grande quantidade de material

fortemente retido no ponto de aplicação, sendo este material distribuído ao longo de

todas as frações coletadas. Estas observações mostraram que houve dificuldade na

separação dos metabólitos secundários, mesmo usando uma coluna empacotada

com RP18.

As frações 39-45 (16 mg) que apresentaram Rf’s semelhantes, próximos aos

das substâncias empregadas como referência, foram reagrupadas. Uma alíquota foi

filtrada em membrana de PTFE (0,45 µm) e injetada em HPLC (modo analítico) no

sistema descrito na Tabela 1.1. Análise da corrida cromatográfica em vários

comprimentos de onda revelou inúmeras substâncias na fração investigada (Fig. 1.9),

incluindo o ácido clorogênico (3) em t

= 30,4 min (Figura 1.9B) que foi melhor

visualizado em 325 nm (Figura 1.9C) e uma das catequinas não identificadas (4) em

= 34,5 min. Etapas de purificação posteriores resultaram na obtenção da

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

substância (4), mas em quantidade insuficiente para a execução de experimentos de

NMR e por esta razão não foi possível chegar a uma proposta estrutural.

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

-0.2

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 325 nm (mAU)

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

-0.2

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

-0.2

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

100

200

300

400

mAU

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 325 nm (mAU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 325 nm (mAU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 325 nm (mAU)

Figura 1.9. A) Separação cromatográfica por HPLC-PAD da infusão submetida aos processos de LLE

e SPE em cartucho Sep Pak de RP18, eluato MeOH/H

O 2:8 v/v, λ = 210 nm. B) Análise

cromatográfica de uma alíquota das frações 39-45 provenientes da separação do infuso de H.

speciosa com o sistema MPLC, λ = 210 nm.

C) Processamento da corrida cromatográfica da alíquota

das frações 39-45 em 325 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm),

HPLC-PAD (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 1.1).

Tendo em vista a dificuldade de isolamento dos metabólitos secundários de H.

speciosa seja por cromatografia de adsorção, seja por cromatografia de partição ou

por métodos de cromatografia em contracorrente, a etapa seguinte consistiu em

fazer uso da espectrometria de massas em tandem para investigar a constituição

química da infusão desta espécie.

Análises por FIA-ESI-IT-MS

Inúmeros trabalhos descritos na literatura mostram que a espectrometria de

massas (MS), na maioria das vezes acoplada a um sistema HPLC, tem se

destacado como uma poderosa ferramenta em estudos de biodiversidade (ZEEB et

al., 2000). Ela é empregada em aplicações de ordem qualitativa e quantitativa para

analitos de baixo e/ou alto peso molecular, encontrados em matrizes complexas em

que o HPLC é o sistema de separação de escolha e o espectrômetro de massas

fornece a seletividade e sensibilidade para gerar a informação quantitativa e/ou a

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

informação estrutural que não pode ser obtida com outros tipos de detectores

(ARDREY, 2003).

Catequinas e taninos condensados são frequentemente analisados nos

modos positivo (WU et al., 2005) e negativo (GU et al., 2003) e várias são as

interfaces empregadas para a geração desses íons, sendo a ionização por

electrospray (ESI) a interface mais utilizada. Ela é reconhecida como uma técnica de

ionização branda e possibilita a investigação dos mais diversos tipos de matrizes em

fase gasosa, incluindo analitos que exibem alta polaridade, viabilizando assim a

caracterização estrutural com quantidades mínimas de uma determinada amostra

(ARDREY, 2003).

No entanto, taninos condensados com alto grau de polimerização não são

completamente resolvidos durante as separações cromatográficas por HPLC.

Geralmente há necessidade de análises cromatográficas mais longas,

principalmente para garantir que os analitos sejam eluídos do sistema

cromatográfico. Neste caso, o acoplamento de um sistema HPLC com MS configura

uma das desvantagens na utilização desta aplicação (WU et al., 2005; KARONEN et

al., 2006), principalmente quando se busca a obtenção de um real perfil químico da

matriz investigada em um tempo de análise relativamente curto.

Por outro lado, vários trabalhos vêm demonstrando que análises por MS

usando o modo de inserção direta da amostra (FIA), sem a necessidade de

complexas etapas de preparação e clean-up (resguardando apenas as etapas mais

simples que envolvem: filtração, diluição e/ou adição de um modificador para auxiliar

a ionização), tem se destacado como a forma mais representativa e rápida de

estabelecer a composição química de uma determinada matriz e essa abordagem

tem sido empregada no controle de qualidade e na verificação da autenticidade de

diversos tipos de amostras, incluindo bebidas, alimentos e até mesmo extratos de

plantas (MAURI & PIETTA, 2000; GOODACRE et al., 2002; CATHARINO et al.,

2006).

Diante destas observações e conhecendo, em parte, a composição química

da planta, nesta etapa do estudo foi realizada a caracterização dos metabólitos

secundários presentes na infusão das cascas de H. speciosa com a técnica ESI-IT-

MS/MS empregando o modo de inserção direta.

A infusão de H. speciosa foi obtida com 1 g de cascas. O material triturado foi

mantido em contato com 10 mL de água aquecida (80°C) por 10 min. A mistura

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

contendo a solução e o material particulado foi filtrado em papel de filtro e resfriado a

temperatura ambiente, em seguida uma alíquota da solução foi novamente filtrada,

agora em membrana de PTFE com poro de 0,45 µm. A infusão filtrada (500 µL) foi

diluída com MeOH para o volume final de 1 mL e a solução introduzida diretamente

na fonte de ESI por meio de uma seringa de vidro impulsionada por um sistema de

bombeamento em fluxo de 5 µL min

–1

A Figura 1.10 mostra o espectro de massas em full-scan apresentando os

íons precursores das moléculas desprotonadas ([M – H]

–

) da infusão de H. speciosa.

m/z

HSfia #403-416 RT: 6.65-6.94 AV:14 NL: 9.82E5

T: - c Full ms [ 210.00-1600.00]

400 600 800 1000 1200 1400 1600

100

Relative Abundance

576.9

451.0

352.9

739.0

864.9

289.0

536.8

532.8

424.9

865.9

694.8

1026.9

862.9

1152.9

879.0

1314.9 1440.9

1574.2

272.9

341.0

m/z

HSfia #403-416 RT: 6.65-6.94 AV:14 NL: 9.82E5

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400 600 800 1000 1200 1400 1600

100

Relative Abundance

576.9

451.0

352.9

739.0

864.9

289.0

536.8

532.8

424.9

865.9

694.8

1026.9

862.9

1152.9

879.0

1314.9 1440.9

1574.2

272.9

341.0

HSfia #2450-2570 RT: 46.94-48.85 AV: 121 NL: 5.14E4

T: - c Full ms [ 1200.00-2000.00]

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance

1313.7

1314.9

1439.6

1441.0

1442.0

1312.0

1315.9

1602.8

1438.2

1316.7

1729.2

1297.7

1478.2

1217.1

1600.2

1752.81379.5

1726.7

1616.1

1891.1

1911.6

HSfia #2450-2570 RT: 46.94-48.85 AV: 121 NL: 5.14E4

T: - c Full ms [ 1200.00-2000.00]

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance

1313.7

1314.9

1439.6

1441.0

1442.0

1312.0

1315.9

1602.8

1438.2

1316.7

1729.2

1297.7

1478.2

1217.1

1600.2

1752.81379.5

1726.7

1616.1

1891.1

1911.6

♦

•

Figura 1.10. Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, da infusão de H. speciosa

avaliado em modo negativo. A) Faixa de íons com m/z de 210-1600 Da. B) Faixa de íons com m/z de

1200-2000 Da. (●) Íons precursores separados por 288 Da, referentes à primeira série homóloga de

procianidinas. (♦) Segunda série homóloga de procianidinas C-glucosiladas. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Fragmentação de segunda-ordem (MS/MS) para cada um desses íons levou

à identificação de diversos metabólitos, conforme discutido a seguir e a

nomenclatura utilizada seguiu as recomendações sugeridas por MURRAY e co-

autores (2006).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

A estereoquímica dos carbonos C2 e C3 de catequinas monoméricas e

oligoméricas não é diferenciada em experimentos de MS (ZEEB et al., 2000). Para

efeitos de simplicidade, passaremos a denominar fragmentos de m/z 289 como

sendo referente à [epi]catequina.

O íon precursor de m/z 289 corresponde molécula desprotonada da

[epi]catequina. MS/MS deste íon levou ao íon produto de m/z 271 (Fig. 1.11),

referente à perda de uma molécula de água [M – 18 – H]

–

e ao pico base de m/z 137

[M – 152 – H]

–

formado pelo mecanismo de fragmentação retro-Diels-Alder (RDA)

(GU et al., 2003). O conjunto de dados fornecido pelo espectro de massas da Figura

1.11 e a presença do íon precursor de m/z 289 (Fig. 1.10) corroboram com a

presença da catequina e/ou da epicatequina, caracterizadas anteriormente nos

experimentos de co-injeção (Fig. 1.6).

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

100

Relative Abundance

137,0

270,9

172,8

161,1

191,8

HSfia #25-28 RT: 0,53-0,57 AV:4 NL: 7,54E4

T: - c Full ms2 289,00@30,00 [ 120,00-300,00]

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

100

Relative Abundance

137,0

270,9

172,8

161,1

191,8

HSfia #25-28 RT: 0,53-0,57 AV:4 NL: 7,54E4

T: - c Full ms2 289,00@30,00 [ 120,00-300,00]

♦

m/z 289

Figura 1.11. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 289, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Fragmentação em segunda-ordem do íon precursor de m/z 273 sugeriu a

presença de outro monômero, a eliminação de um fragmento neutro de 136 Da e

formação do íon produto de m/z 137 [M – 136 – H]

–

é compatível ao da

[epi]afzelequina (Fig. 1.12). De forma similar, o íon precursor de m/z 425, sugeriu a

presença do galato de [epi]afzelequina. A atribuição para essa catequina (Fig. 1.13)

foi sugerida pela formação do pico base de m/z 255, referente à eliminação

seqüencial do grupo galoíla e água [M – 152 – 18 – H]

–

, conforme sugerido por

ZEEB e co-autores (2000). O íon produto de m/z 137 foi formado a partir da clivagem

do anel C e eliminação do anel B via mecanismo de RDA.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

HS2 #536 RT: 1,03-1,25 AV: 5 NL: 1,21E4

T: - c d Full ms2 272,90@35,00 [ 65,00-300,00]

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

100

Relative Abundance

137,1

HS2 #536 RT: 1,03-1,25 AV: 5 NL: 1,21E4

T: - c d Full ms2 272,90@35,00 [ 65,00-300,00]

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

100

Relative Abundance

137,1

m/z 273

♦

Figura 1.12. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 273, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

HS2 #208 RT: 2,95-3,07 AV: 3 NL: 4,11E2

: - c d Full ms2 424,92@35,00 [ 120,00-500,00]

150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

100

Relative Abundance

255,4

136,9

273,1

237,2

153,1 212,9

193,3

424,9

HS2 #208 RT: 2,95-3,07 AV: 3 NL: 4,11E2

: - c d Full ms2 424,92@35,00 [ 120,00-500,00]

150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

100

Relative Abundance

255,4

136,9

273,1

237,2

153,1 212,9

193,3

424,9

♦

m/z 425

Figura 1.13. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 425, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

MS/MS do íon precursor de m/z 341 resultou no espectro de segunda-ordem

mostrado na Figura 1.14. Os íons produtos de m/z 323 (perda de água), m/z 297

(perda de CO

) e m/z 179 (perda de uma unidade de hexose) foram atribuídos à

fragmentação observada para o ácido cafeoil-O-glucosídeo (SÁNCHEZ-RABANEDA

et al., 2005). Porém, apenas com os experimentos de MS não foi possível

determinar se a unidade de hexose estava ligada na posição 3-O ou 4-O do ácido

cafeico. A possibilidade de um dímero do ácido cafeico foi descartada devido à

presença de fragmentações correspondentes a perdas de moléculas de água, como

por exemplo os fragmentos em m/z 323 e m/z 161.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

HSfia #71-226 RT: 1,12-3,43 AV: 156 NL: 3,69E4

T: - c Full ms2 341,00@30,00 [120,00-400,00]

150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

178,7

217,0

160,7

230,9

297,0

142,8

323,0

189,0

280,8

341,2

HSfia #71-226 RT: 1,12-3,43 AV: 156 NL: 3,69E4

T: - c Full ms2 341,00@30,00 [120,00-400,00]

150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

178,7

217,0

160,7

230,9

297,0

142,8

323,0

189,0

280,8

341,2

♦

m/z 341

Figura 1.14. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 341, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Fragmentação em segunda-ordem do íon precursor de m/z 353 levou à

formação íon produto de m/z 191 [M – 162 – H]

–

. Esse resultado sugere a presença

de uma estrutura que teve uma unidade de ácido cafeico (162 Da) esterificada por

uma unidade de ácido quínico (191 Da) (Fig. 1.15), o que é compatível com a

estrutura do ácido clorogênico, identificado durante os experimentos que envolveram

co-injeção com padrão autêntico (Fig. 1.6).

HSfia #307-355 RT: 5,19-5,95 AV: 49 NL: 2,51E5

: - c Full ms2 352,90@30,00 [120,00-400,00]

150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

191,0

178,9

172,9

135,1

353,0286,7191,7

306,2 334,9230,8 260,5

HSfia #307-355 RT: 5,19-5,95 AV: 49 NL: 2,51E5

: - c Full ms2 352,90@30,00 [120,00-400,00]

150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

191,0

178,9

172,9

135,1

353,0286,7191,7

306,2 334,9230,8 260,5

♦

HO COOH

Figura 1.15. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 353, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

A partir de uma inspeção mais minuciosa do espectro de massas da Figura

1.10, os sinais dos íons precursores observados evidenciaram a presença de uma

série homóloga consistente à proantocianidinas oligoméricas intercaladas por 288

Da. As moléculas desprotonadas representadas por (●) correspondem a

proantocianidinas com grau de polimerização variando de 1-6. Desta forma, esses

sinais foram interpretados como os íons precursores de um monômero (m/z 289),

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

dímero (m/z 577), trímero (m/z 865), tetrâmero (m/z 1153), pentâmero (m/z 1441) e

hexâmero (m/z 1729) da [epi]catequina, respectivamente.

Uma segunda série homóloga, representada por (♦), foi evidenciada pelos

sinais das moléculas desprotonadas de m/z 451, m/z 739, m/z 1027, m/z 1315, m/z

1603 e m/z 1891, as quais são 162 unidades superiores aquelas observadas da

primeira série homóloga, sugerindo assim a presença de um grupo de

proantocianidinas monoglucosiladas.

A verificação dessas evidências foi realizada com base na interpretação dos

espectros de massas dos principais íons precursores observados. Espectros de

segunda-ordem de proantocianidinas podem ser racionalizados em três principais

mecanismos de fragmentação: retro-Diels-Alder (RDA), quinona metídeo (QM) e

clivagem heterocíclica (HRF) (GU et al., 2003). O Esquema 1.3 mostra as principais

rotas de fragmentação ilustradas de um possível trímero encontrado em H. speciosa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Mecanismo de fragmentação

retro-Diels-Alder (RDA)

-152 Da

RDA

OHO

Mecanismo de fragmentação

Quinona metídeo (QM)

m/z 575

m/z 289

-414 Da

(-HRF no anel F)

OHHO

Mecanismo de fragmentação

Clivagem heterocíclica (HRF)

-18 Da (-H

m/z 847

-288 Da

(-QM no anel A)

m/z577

m/z 713

m/z 451

-152 Da

RDA

OHO

m/z 561

m/z 865

OHO

-18 Da (-H

m/z 543

-18 Da (-H

m/z 695

-126 Da

(-HRF no anel C)

m/z 739

-288 Da -152 Da

(-QM no anel A

-RDA no anel F)

m/z 425

-288 Da -152 Da -18 Da

(-QM no anel A

-RDA no anel F

-H

O no anel I)

m/z 407

-126 Da -152 Da

(-HRF no anel C

-RDA no anel F)

m/z 587

m/z 413

m/z 865

Esquema 1.3. Rotas de fragmentação de uma possível proantocianidina trimérica encontrada no

infuso das cascas de H. speciosa. Os principais mecanismos de fragmentação envolvidos são: RDA

(retro-Diels-Alder), HRF (clivagem heterocíclica), e QM (quinona metídeo).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Fragmentação MS/MS do íon precursor de m/z 865 (Fig. 1.16) produziu o pico

base de m/z 577, esse íon foi gerado após a formação do QM (m/z 287) no anel A

da unidade superior do trímero, com conseqüente eliminação da unidade dimérica

contendo os anéis D-F e G-I [M – 288 – H]

–

. Posteriormente, a unidade dimérica

formada (m/z 577) sofreu uma clivagem do tipo RDA no anel F, gerando o íon

produto m/z 425 [M – 288 – 152 – H]

–

, que por sua vez forneceu o íon produto de

m/z 407 [M – 288 – 152 – 18 – H]

–

, interpretado como a eliminação seqüencial de

água no anel I. Os íons produtos de m/z 847 e m/z 289 foram atribuídos à perda de

água ([M – 18 – H]

–

) e à eliminação da molécula da [epi]catequina desprotonada

através da formação do QM no anel D da unidade central do trímero ([M – 576 – H]

–

)

(Esquema 1.3).

HSfia #1413-1520 RT: 25,64-28,01 AV: 108 NL: 1,92E3

T: - c Full ms2 865,30@30,00 [235,00-900,00]

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

m/z

100

Relative Abundance

576,9

694,9

738,9

712,8

586,8

739,8

407,0

846,9

574,9

424,7

288,8

587,9

395,0

675,0

532,8

287,0

363,1

299,0

628,9

♦

542,8

450,8

HSfia #1413-1520 RT: 25,64-28,01 AV: 108 NL: 1,92E3

T: - c Full ms2 865,30@30,00 [235,00-900,00]

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

m/z

100

Relative Abundance

576,9

694,9

738,9

712,8

586,8

739,8

407,0

846,9

574,9

424,7

288,8

587,9

395,0

675,0

532,8

287,0

363,1

299,0

628,9

♦

542,8

450,8

Figura 1.16. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 865, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

O íon produto de m/z 713 [M – 152 – H]

–

pode ser formado pelo mecanismo

RDA no anel C da unidade superior ou no anel F da unidade central com eliminação

do fragmento

1,3

. Nesse caso a fragmentação RDA poderia ocorrer

também na unidade inferior do trímero (

1,3

). No entanto, as eliminações dos

fragmentos

1,3

são mais favoráveis por gerar íons produtos com sistema de

conjugação π – π maior que o esperado para a RDA no anel I da unidade inferior do

trímero.

Logo após a RDA ocorre a formação do íon produto de m/z 695 [M – 152 – 18

– H]

–

, esse íon foi gerado pela perda de uma molécula de água, mais precisamente

devido à eliminação de um grupo 3-OH dos anéis C, F ou I que tenham se mantido

intactos após a RDA para fornecer um íon mais estável com formação de uma

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

ligação dupla

2,3

∆ ou

3,4

∆. Por sua vez, um íon com uma ligação dupla

3,4

∆ é

preferencialmente formado por apresentar um sistema de conjugação mais extenso

que um íon com uma ligação dupla

2,3

∆, (Esquema 1.3). O íon produto de m/z 543 foi

interpretado como as eliminações seqüenciais dos fragmentos

1,3

e perda de

água do anel I [M – 2x152 – 18 – H]

–

O íon produto de m/z 739 foi gerado após a eliminação do anel A como 1,3,5-

triidroxibenzeno ([M – 126 – H]

–

) pela clivagem do anel C da unidade superior do

trímero através do mecanismo de fragmentação HRF. De forma similar, o íon

produto de m/z 451 foi gerado após a eliminação HRF resultante da clivagem do

anel F da unidade central do trímero com a eliminação de um resíduo de 414 Da. O

íon produto de m/z 587 foi gerado pela fragmentação HRF ocorrida no anel C da

unidade superior e na seqüência a eliminação do fragmento

1,3

resultante da RDA

no anel F da unidade central do trímero ([M – 126 – 152 – H]

–

). Esse íon produto

(m/z 587) foi considerado um íon diagnóstico para o trímero encontrado em H.

speciosa, uma vez que somente podem ocorrer mecanismos RDA e HRF

simultâneos com a eliminação de 126 Da na unidade superior do mesmo.

As proantocianidinas que são constituídas exclusivamente de unidades

equivalentes de [epi]catequinas e que apresentam uma ligação interflavonoídica são

denominadas de procianidinas do tipo-B. Assim, os íons precursores de m/z 577,

m/z 865, m/z 1153, m/z 1441 e m/z 1729 são indicativos de procianidinas do tipo-B.

Porém, como ocorre em todas as técnicas de MS, nenhuma diferenciação entre

estereoisômeros foi realizada, bem como nenhuma informação sobre a posição e

estereoquímica da ligação interflavonoídica.

As procianidinas glucosiladas também foram investigadas quanto aos seus

espectros de massas de segunda-ordem e a natureza glucosídica desses derivados

foi evidenciada devido às características da clivagem da unidade do açúcar.

Em flavonóides C-glucosilados, o açúcar é ligado diretamente ao núcleo do

flavonóide por uma ligação C–C, dificilmente clivada; em flavonóides O-glucosilados

a ligação O–C é mais susceptível a clivagem. Análises por ESI-MS/MS fornecem

subsídios que permitem a caracterização de O- e C-glucosídeos em ambos os

modos de ionização (negativo ou positivo). Para flavonóides C-glucosilados, sendo

que a via de fragmentação preferencial é aquela que se baseia na clivagem interna

da unidade sacarídica, enquanto que nos flavonóides O-glucosilados a eliminação

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

intacta do açúcar é favorecida (Esquema 1.4), (CUYCKENS &; CLAEYS, 2004; ES-

SAFI et al., 2005).

C-aglicona

OHHO

0,3

0,2

O-aglicona

OHHO

1,5

0,2

X : [M ± H - 120]

0,3

X : [M ± H - 90]

1,5

X : [M ± H - 134]

: [M ± H - 162]

Esquema 1.4. Íons produtos característicos formados pela clivagem de uma C-hexose (A) e de uma

O-hexose (B). O sinal ± indica os modos de ionização, positivo ou negativo.

Fragmentação MS/MS da molécula desprotonada de m/z 1027 resultou no

espectro de íons produtos mostrado na Figura 1.17, que resume inúmeras

informações estruturais. Um mecanismo baseado na análise de um possível trímero

monoglucosilado encontrado em H. speciosa foi proposto para a formação dos

principais íons produtos verificados (Esquema 1.5).

♦

HSfia #1748-1841 RT: 32,55-34,47 AV: 94 NL: 1,80E2

T: - c Full ms2 1027,00@30,00 [ 280,00-1100,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance

906,7

738,9

857,0

474,7

875,2

767,3

1008,9

576,8

965,1

723,1

422,9

586,7

450,9

574,9

736,8

HSfia #1748-1841 RT: 32,55-34,47 AV: 94 NL: 1,80E2

T: - c Full ms2 1027,00@30,00 [ 280,00-1100,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance

906,7

738,9

857,0

474,7

875,2

767,3

1008,9

576,8

965,1

723,1

422,9

586,7

450,9

574,9

736,8

Figura 1.17. Espectro de massas de segunda-ordem obtido em modo negativo com energia de

colisão de 30% para o íon precursor de m/z 1027. Para condições experimentais veja: Parte

Experimental.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Mecanismo de fragmentação

retro-Diels-Alder (RDA)

-152 Da

RDA

OHO

Mecanismo de fragmentação

Quinona metídeo (QM)

Mecanismo de fragmentação

Clivagem heterocíclica (HRF)

m/z 875

OHO

m/z 723

m/z 1027

-18 Da (-H

m/z 857

-290 Da (-catequina

via QM no anel D)

m/z 737

-288 Da

(-HRF no anel C)

m/z 739

m/z 1027

m/z 449

m/z 577

-18 Da (-H

m/z 1009

m/z 1027

m/z 451

OHHO

m/z 575

-152 Da

(-RDA no anel C)

m/z 423

-288 Da -152 Da

(-HRF no anel C

-RDA no anel F)

m/z 587

-120 Da (-

0,2

X )

m/z 907

-152 Da -18 Da -90 Da

(-RDA -H

O -

0,3

X )

m/z 767

-18 Da -110 Da

(-H

O -catecol)

m/z 747

-152 Da

RDA

0,3

0,2

Esquema 1.5. Rotas de fragmentação de uma possível procianidina trimérica C-glucosilada

encontrada no infuso das cascas de H. speciosa. Os principais mecanismos de fragmentação

envolvidos são: RDA (retro-Diels-Alder), HRF (clivagem heterocíclica), QM (quinona metídeo),

0,2

0,3

(clivagem interna da unidade sacarídica).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Foram postuladas três rotas principais de fragmentação do trímero

glucosilado (Fig. 1.17). Em todas elas, o íon produto de m/z 1009 ([M – 18 – H]

) foi

formado pela eliminação de água a partir da molécula desprotonada ([M – H]

). Além

disso, observa-se a formação do pico base de m/z 907, que foi atribuída à clivagem

0,2

com eliminação de 120 Da. Esse tipo de fragmentação é bastante comum em

flavonóides C-glucosilados (CUYCKENS & CLAEYS, 2004). A ausência do íon

produto de m/z 865 [M – 162 – H]

–

foi um dos primeiros indícios que permitiram

descartar a possibilidade de proposta para uma procianidina O-glucosilada.

No mecanismo de fragmentação envolvendo a clivagem QM, a localização do

açúcar na unidade superior da molécula desprotonada foi postulada com base na

clivagem da ligação interflavonoídica entre o anel C da unidade superior e o anel D

da unidade central (Esquema 1.5). Essa fragmentação gera simultaneamente uma

unidade QM glucosilada (m/z 449) no anel A da unidade superior e o íon produto de

m/z 577 [M – 450 – H]

, referente ao dímero contendo os anéis D-I.

Outra evidência de que o açúcar se encontra na unidade superior do trímero é

fornecida pelo íon de m/z 737. Esse íon é o resultado da eliminação da unidade

inferior de catequina (anéis G-I), com a conseqüente formação de um fragmento cuja

unidade superior é uma catequina glucosilada (anéis A,B,C) e a unidade inferior

contém um sistema QM (anéis D,E,F). Tal fragmento não é possível de ser formado

se o açúcar estiver na unidade inferior do trímero.

Numa segunda rota, o íon produto de m/z 739 pode ser justificado pelo

mecanismo de fragmentação HRF com clivagem do anel C da unidade superior e

eliminação do resíduo 1,3,5-triidroxibenzeno glucosilado ([M – 288 – H]

–

). De forma

semelhante, o íon produto de m/z 451 foi atribuído à clivagem do anel F da unidade

central via mecanismo de fragmentação HRF com eliminação de um resíduo (R) de

576 Da. Este resíduo quando fragmentado, fornece o íon produto de m/z 423, o qual

foi formado pela eliminação do fragmento

1,3

via RDA no anel C do resíduo [R –

152 – H]

(Esquema 1.4).

Outra proposta consistente foi usada para explicar a presença do íon produto

de m/z 587, gerado pela fragmentação HRF ocorrida no anel C da unidade superior

com perda do resíduo 1,3,5-triidroxibenzeno glucosilado e na seqüência a

eliminação do fragmento

1,3

resultante da RDA no anel F da unidade central [M –

288 – 152 – H]

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Numa terceira rota, o íon produto de m/z 875 [M – 152 – H]

–

pode ser

explicado pelo mecanismo de RDA com eliminação do fragmento

1,3

. A

eliminação do fragmento

1,3

não é favorecida pelas mesmas razões justificadas

anteriormente para o trímero (Esquema 1.3). Na seqüência, após a RDA ocorre a

formação do íon produto de m/z 857 [M – 152 – 18 – H]

–

. Este íon foi gerado após a

perda de uma molécula de água do anel C, F ou I, que tenha se mantido intacto

após a RDA, com formação da ligação dupla

2,3

∆ e pode ainda ocorrer pela

desidratação do açúcar (WARIDEL et al., 2001). O íon produto de m/z 723 foi gerado

após eliminação RDA simultânea dos fragmentos

1,3

[M – 2x152 – H]

–

O íon produto de m/z 767 foi caracterizado como um íon diagnóstico da

clivagem interna do açúcar. Ele pode ser explicado a partir de uma fragmentação

seqüencial do trímero monoglucosilado, com eliminação de 152 Da via RDA, seguida

da perda de água (18 Da) e posterior clivagem do tipo

0,3

levando à eliminação de

90 Da.

Alguns autores sugerem que é possível diferenciar as posições C6 e C8 do

núcleo de um flavonóide em experimentos MS/MS usando baixas energias de

colisão. Nesse caso, a eliminação de água a partir da desidratação da unidade

sacarídica seria uma fragmentação específica de C6-glucosídeos (WARIDEL et al.,

2001; CUYCKENS & CLAEYS, 2004). Em nosso caso, a atribuição do ponto de

ligação do açúcar (C6 ou C8) na unidade superior da aglicona não foi possível, uma

vez que em proantocianidinas (flavan-3-óis) pode ocorrer a eliminação de água

também a partir da eliminação do grupo 3-OH. Desta forma, a perda de água não

pode ser usada para uma atribuição inequívoca do ponto de ligação do açúcar.

Os experimentos realizados com a técnica FIA-ESI-IT-MS corroboraram com

a proposta inicial da presença de taninos condensados provenientes da

polimerização de catequinas. As fragmentações sugeridas para os íons das duas

séries encontradas revelam a presença de procianidinas oligoméricas do tipo-B e

seus respectivos derivados C-glucosilados, além de outros derivados fenólicos.

Uma discussão mais detalhada para outros íons precursores foi reportada

recentemente por nosso grupo (RODRIGUES; RINALDO; SANTOS et al., 2007

(anexo), em que a análise por FIA-ESI-IT-MS auxiliou a esclarecer a composição

química de uma fitopreparação bastante complexa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Avaliação quantitativa da infusão das cascas de H. speciosa

A grande diversidade de substâncias presentes nas matrizes vegetais em

muitos casos inviabiliza uma quantificação específica para cada um dos

componentes encontrados em uma determinada amostra, pois muitas substâncias

não estão disponíveis comercialmente, outras ainda sequer foram descobertas e

consequentemente não possuem suas estruturas estabelecidas (ROBARDS, 2003).

Vários trabalhos reportam que a quantificação destas substâncias pode ser feita com

base na comparação de um padrão pertencente à classe do analito determinado

(ROBARDS, 2003), e desta forma, os resultados são dados em termos da

substância usada na calibração (SCHÜTZ et al., 2004).

Sendo assim, nesta etapa do trabalho foi usada a metodologia de preparo de

amostra e gradiente de separação cromatográfica similar ao descrito por DALLUGE

e colaboradores (1998). A eluição de um conjunto de catequinas foi otimizada,

concomitantemente com outros derivados de ácidos fenólicos comumente

encontrados em infusões. Curvas analíticas foram construídas a partir de uma

solução estoque e a quantificação dos picos eluídos da amostra realizada de acordo

com a identificação e/ou a similaridade espectral de seus metabólitos secundários

com aqueles dos padrões utilizados na calibração.

Construção das curvas analíticas

Solução estoque contendo a mistura de ácido gálico, (-)-galocatequina, (-)-

epigalocatequina, galato de metila, (+)-catequina, 4'-O-metil-galocatequina, (-)-

epicatequina, galato de (-)-galocatequina, galato de etila e galato de (-)-epicatequina,

cada padrão na concentração de 500,0 µg mL

–1

, foi preparada e solubilizada em

MeOH/H

O 7:3 v/v. A solução estoque foi armazenada em vial âmbar e mantida

refrigerada em freezer a –18ºC.

As soluções padrão cobrindo intervalos lineares com dez níveis de

concentração (0,5; 1; 2; 5; 10; 25; 50; 75; 100 e 200 µg mL

–1

) foram feitas a partir de

diluições das soluções estoque e o volume final das soluções ajustados para 2 mL,

sendo mantidas em freezer até o momento das análises.

Durante a quantificação foi empregado o método de calibração externa. Os

padrões foram analisados por HPLC-PAD. Cada padrão foi injetado em triplicata e a

resposta de absorção obtida em 210 e/ou 280 nm. Ao final, a área sob os picos

cromatográficos dos padrões foi calculada e os valores obtidos interpolados em

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

função da concentração usando regressão linear. Todos os dados foram

apresentados como média ± desvio das injeções (Fig. 1.18).

0 1020304050

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

6x10

Área (contagens) 280 nm

[ácido gálico] µg ml

-1

0 50 100 150 200

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

1,2x10

Área (contagens) 210 nm

[(-)-galocatequina] µg ml

-1

0 1020304050

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

Área (contagens) 210 nm

[(-)-epigalocatequina] µg ml

-1

0 1020304050

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

Área (contagens) 280 nm

[galato de metila] µg ml

-1

0 1020304050

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

Área (contagens) 210 nm

[(+)-catequina]

0 20406080100

-2,0x10

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

1,2x10

1,4x10

Área (contagens) 210 nm

[4'-metoxi (-)-galocatequina] µg ml

-1

Figura 1.18. Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções em

triplicata de soluções padrões de: 1 ácido gálico, 2 (-)-galocatequina, 3 (-)-epigalocatequina, 4 galato

de metila, 5 (+)-catequina, 6 4'-O-metil-galocatequina, 7 (-)-epicatequina, 8 galato de (-)-galocatequina,

9 galato de etila, 10 galato de (-)-epicatequina.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Continuação da Figura 1.18

0 5 10 15 20 25

-1x10

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

6x10

7x10

Área (contagens) 210 nm

[(-)-epicatequina] µg ml

-1

0 1020304050

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

Área (contagens) 210 nm

[galato de (-)-galocatequina] µg ml

-1

0 1020304050

-5,0x10

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

Área (contagens) 280 nm

[galato de etila] µg ml

-1

0 1020304050

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

Área (contagens) 210 nm

[galato de (-)-epicatequina] µg ml

-1

Figura 1.18. Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções em

triplicata de soluções padrões de:

1 ácido gálico, 2 (-)-galocatequina, 3 (-)-epigalocatequina, 4 galato

de metila,

5 (+)-catequina, 6 4'-O-metil-galocatequina, 7 (-)-epicatequina, 8 galato de (-)-galocatequina,

9 galato de etila, 10 galato de (-)-epicatequina.

A Figura 1.19 ilustra a separação de 7 catequinas e 3 derivados de ácidos

fenólicos. A separação usando o gradiente de eluição da Tabela 1.2 resultou em

picos com resolução cromatográfica significativa (Rs = 1,28 entre os picos 8 e 9),

embora os picos 5 e 6 tenham apresentado um valor menor (Rs = 0,62), mas que

não influenciou em análises posteriores pelo fato de não ter sido observado a

presença de catequinas metoxiladas nos experimentos de caracterização do infuso

de H. speciosa por FIA-ESI-IT-MS/MS. Além do mais uma curva analítica individual

usando (+)-catequina foi construída e usada para a avaliação deste metabólito na

matriz estudada.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

4,87

1,02

8,05

0,67

17,05

1,47

19,29

1,29

21,93

0,75

22,49

1,07

29,07

0,93

31,86

0,72

32,79

0,73

36,43

0,90

PDA-210 nm

mix 050ug ml Cat_AciPhe mth ACN Hydro4

Retention Time

Width

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

4,87

1,02

8,05

0,67

17,05

1,47

19,29

1,29

21,93

0,75

22,49

1,07

29,07

0,93

31,86

0,72

32,79

0,73

36,43

0,90

PDA-210 nm

mix 050ug ml Cat_AciPhe mth ACN Hydro4

Retention Time

Width

EGC

GC4’OMe

GCG

ECG

Figura 1.19. Separação cromatográfica de uma mistura de padrões contendo catequinas e derivados

de ácidos fenólicos. Identificação dos picos eluídos:

1 ácido gálico (AG), 2 (-)-galocatequina (GC), 3

(-)-epigalocatequina (EGC), 4 galato de metila (GM), 5 (+)-catequina (C), 6 4'-O-metil-galocatequina

(GC4'OMe), 7 (-)-epicatequina (EC), 8 galato de (-)-galocatequina (GCG), 9 galato de etila (GE), 10

galato de (-)-epicatequina (ECG). Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm),

HPLC-PAD (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de

eluição veja Tabela 1.2).

Tabela 1.2. Gradiente de eluição cromatográfica usado na separação de catequinas e derivados de

ácidos fenólicos

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 8

15 8

30 20

40 40

45 100

50 100

No entanto, apesar de ter ocorrido a separação completa dos padrões

empregados no desenvolvimento da rampa de eluição cromatográfica (Tabela 1.2),

foi verificado que durante a eluição da amostra (infuso das cascas de H. speciosa)

as proantocianidinas com alto grau de polimerização eluíram como uma extensa

banda cromatográfica a partir de t

= 25 min (Fig. 1.20). Esse comportamento

cromatográfico resultou em baixa resolução de linha de base para os picos eluídos

neste intervalo.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

8,053

9,280

13,44

17,26

19,14

21,03

23,21

24,65

25,50

25,98

27,42

28,01

29,49

30,45

31,63

32,03

32,91

34,33

35,94

36,38

36,63

37,25

40,30

49,22

PDA-210 nm

H speciosa infuso

Retention Time

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

8,053

9,280

13,44

17,26

19,14

21,03

23,21

24,65

25,50

25,98

27,42

28,01

29,49

30,45

31,63

32,03

32,91

34,33

35,94

36,38

36,63

37,25

40,30

49,22

PDA-210 nm

H speciosa infuso

Retention Time

Figura 1.20. Separação cromatográfica dos metabólitos secundários encontrados no infuso das

cascas de H. speciosa. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD

(Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja

Tabela 1.2).

Uma nova modificação na rampa de eluição cromatográfica foi implementada

com a finalidade de minimizar esse efeito e facilitar a integração da área dos picos

de interesse. Neste caso, a alternativa encontrada foi aumentar a velocidade de

modificação da concentração do solvente B, reduzindo o tempo de corrida

cromatográfica, adiantando a eluição dos componentes monoméricos e retardando

ao máximo a eluição das proantocianidinas poliméricas. Este resultado foi alcançado

usando a configuração do gradiente ilustrado na Tabela 1.3.

Tabela 1.3. Gradiente de eluição usado na separação dos metabólitos encontrados na infusão das

cascas de H. speciosa

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 5

25 27

30 100

35 100

A partir da avaliação do cromatograma da Figura 1.21, nota-se que ocorreu

uma melhora na resolução cromatográfica para a eluição do infuso das cascas de H.

speciosa. Além de ter ocorrido uma separação mais rápida (35 min) houve ainda

uma maior seletividade na eluição dos taninos condensados que foram eluídos como

um pico simples em t

= 29,93 min.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Minutes

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

9,093

9,847

10,893

12,280

13,060

13,733

13,933

14,960

15,300

15,833

16,380

16,833

17,200

18,200

19,267

19,867

20,127

20,340

21,073

21,920

22,540

23,233

23,507

24,153

24,613

29,933

34,560

PDA-210 nm

H speciosa infuso

Retention Time

Minutes

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

9,093

9,847

10,893

12,280

13,060

13,733

13,933

14,960

15,300

15,833

16,380

16,833

17,200

18,200

19,267

19,867

20,127

20,340

21,073

21,920

22,540

23,233

23,507

24,153

24,613

29,933

34,560

PDA-210 nm

H speciosa infuso

Retention Time

Figura 1.21. Separação cromatográfica dos metabólitos secundários encontrados no infuso das

cascas de H. speciosa. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD

(Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja

Tabela 1.3).

Desta maneira, as curvas analíticas usando os padrões de catequinas e

derivados de ácidos fenólicos foram construídas empregando o gradiente de eluição

da Tabela 1.3.

Os parâmetros estatísticos que definiram as funções lineares para cada uma

das curvas analíticas são mostrados na Tabela 1.4, sendo que todas as curvas

apresentaram coeficientes de correlação (r) superiores a 0,99.

Tabela 1.4. Dados de regressão linear para os padrões empregados na elaboração das curvas

analíticas

Padrões* Coeficiente

linear (a)

Coeficiente

angular (b)

Coeficiente de

correlação (r)**

Faixa linear

(µg mL

–1

)

LOD

(µg mL

–1

)

LOQ

(µg mL

–1

)

AG 4173 108548 0,9998 0,5-50 0,13 0,38

GC 10416 540628 0,9998 0,5-200 0,06 0,19

EGC 2619 35911 0,9997 1-50 0,12 0,35

GM 6887 154989 0,9984 0,5-50 0,14 0,44

C 8628 188710 0,9997 0,5-50 0,15 0,46

GC4'OMe 5619 118836 0,9995 0,5-100 0,16 0,47

EC 10168 273259 0,9995 0,5-25 0,12 0,37

GCG 2920 201663 0,9997 0,5-50 0,05 0,14

GE 3046 62183 0,9992 0,5-50 0,16 0,49

ECG 9889 204399 0,9991 0,5-50 0,16 0,48

* ácido gálico (AG), (-)-galocatequina (GC), (-)-epigalocatequina (EGC), galato de metila (GM), (+)-

catequina (C), 4'-O-metil-galocatequina (GC4'OMe), (-)-epicatequina (EC), galato de (-)-galocatequina

(GCG), galato de etila (GE) e galato de (-)-epicatequina (ECG).

** Todas as curvas analíticas apresentaram significância P > 0,0001.

O limite de detecção (LOD) foi determinado como o sinal equivalente a 3,3

vezes o valor entre a razão do coeficiente linear (a) pelo coeficiente angular (b)

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

(

x3,3

) obtidos pela equação da reta da curva analítica de calibração. O limite de

quantificação (LOQ) foi dado como 10 vezes o valor desta razão (

x10 ) (RIBANI et

al., 2004).

Aplicação do método quantitativo

A determinação da concentração das catequinas presentes nas cascas de H.

speciosa foi realizada diretamente no infuso recém preparado. Desta maneira,

tentou-se chegar a resultados mais representativos com relação a real composição

dos metabólitos secundários e assim, evitar possíveis erros sistemáticos referentes

ao número de etapas e manipulações envolvidas nos procedimentos de LLE e SPE.

Na avaliação da amostra, foi considerada apenas a quantidade de cascas

usada no preparo da infusão e a diluição necessária para garantir que os principais

picos identificados e/ou caracterizados como derivados de catequinas estivessem

contidos no intervalo linear proposto pelas curvas analíticas. Os valores ótimos

encontrados foram 500 mg de cascas para 50 mL de diluição.

O cromatograma da Figura 1.22 ilustra a separação das catequinas e

proantocianidinas poliméricas nas condições ótimas obtidas para a investigação

quantitativa do infuso das cascas de H. speciosa.

Tempo (min)

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Absorbância (mv)

-100

100

200

300

400

500

600

700

800

13,03

13,82

14,83

15,18

15,66

16,70

17,07

17,30

18,03

19,10

19,96

20,88

21,31

22,37

23,26

29,98

34,54

PDA-210 nm

Infuso Hs 500mg/50mL

Tempo (min)

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Absorbância (mv)

-100

100

200

300

400

500

600

700

800

13,03

13,82

14,83

15,18

15,66

16,70

17,07

17,30

18,03

19,10

19,96

20,88

21,31

22,37

23,26

29,98

34,54

PDA-210 nm

Infuso Hs 500mg/50mL

Figura 1.22. Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos metabólitos

secundários encontrados no infuso das cascas de H. speciosa. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro

(250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 1.3).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Os infusos foram preparados em duplicata de extração a partir de

amostragens realizadas no mesmo lote contendo o material vegetal previamente

triturado e homogeneizado. As injeções foram feitas em triplicata e as áreas dos

picos que exibiram espectros de UV típicos de catequinas, banda fraca em torno de

280 nm e máximo entre 205-210 nm (ROHR et al., 2000; WANG et al., 2000), foram

calculadas com auxílio do software EZChrom Elite.

A concentração individual dos picos cromatográficos indicados na Tabela 1.5

foi estabelecida a partir das curvas analíticas obtidas com os padrões de catequinas.

Com o auxílio do detector PDA, cada pico cromatográfico encontrado no infuso das

cascas de H. speciosa teve seu espectro de UV comparado com o dos padrões e a

escolha da curva empregada na quantificação foi estabelecida de acordo com o

máximo de similaridade entre o padrão e o analito quantificado.

Os picos cromatográficos que exibiram baixa reprodutibilidade durante a

etapa de integração de suas áreas foram preteridos e nesta avaliação quantitativa foi

considerada apenas a integração dos picos que apresentaram coeficiente de

variação menor que 10%. O teor das catequinas na matriz foi determinado com base

na seguinte equação:

100

10)(

)(

]/[%)(

xgamostramassa

mLdiluiçãovolume

xmLgteor

Estudos realizados com chás mostram diferenças significativas nos valores de

catequinas totais (PELILLO et al., 2002), principalmente quando vários métodos de

extração são comparados (YAO et al., 2004). Em suma, nos chás verdes são

encontrados altos teores de catequinas, os quais podem chegar até a 70% de sua

composição. Nos chás pretos essa quantidade é bem inferior e supõe-se que a

baixa concentração é ocasionada por processos de oxidação e/ou polimerização, os

quais são promovidos nesse tipo de matriz (PELILLO et al., 2002). Levando em

conta este fator, podemos também sugerir que o baixo valor de 16,26 mg g

–1

encontrado para H. speciosa pode estar associado a esses processos.

Uma aproximação referente à integração da área do pico de t

= 29,98 min

(Fig. 1.22) indicou uma estimativa de concentração superior a 13 mg g

–1

para os

taninos com alto grau de polimerização presentes nas cascas de H. speciosa,

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

indicando que grande parte da composição desta planta é devido à presença desses

polímeros.

Tabela 1.5. Concentrações dos derivados de catequinas encontrados nas cascas de H. speciosa

catequinas

Picos

(min)

[catequinas] ± DP

(µg mL

–1

)

[catequinas] ± DP

(mg g

–1

)

Teor (%) Curva

13,03 3,07 ± 0,06 0,31 ± 0,01 2,00 0,03 (-)-GC

13,82 7,82 ± 0,36 0,78 ± 0,02 4,55 0,08 (+)-C

14,83 8,96 ± 0,10 0,90 ± 0,01 1,16 0,09 (-)-ECG

15,18 (C) 11,30 ± 1,09 1,13 ± 0,05 9,62 0,11 (+)-C

15,66 nq

16,70 24,54 ± 0,47 2,45 ± 0,03 1,93 0,25 (+)-C

17,07 6,36 ± 0,58 0,64 ± 0,03 9,12 0,06 (-)-EC

17,30 10,07 ± 0,04 1,01 ± 0,01 0,44 0,10 (+)-C

18,03 (EC) 9,74 ± 0,12 0,97 ± 0,01 1,21 0,10 (-)-EC

19,10 15,24 ± 0,07 1,52 ± 0,01 0,48 0,15 (-)-EC

19,96 (EGCG) 14,51 ± 0,07 1,45 ± 0,01 0,48 0,15 (-)-GCG

20,88 8,88 ± 0,47 0,89 ± 0,03 5,33 0,09 (-)-GC

21,31 6,55 ± 0,27 0,66 ± 0,03 4,12 0,07 (-)-GC

22,37 26,52 ± 0,77 2,65 ± 0,04 2,89 0,27 (-)-GCG

23,26 6,72 ± 0,20 0,67 ± 0,01 2,95 0,07 (-)-EGC

34,54 2,33 ± 0,13 0,23 ± 0,01 5,66 0,02 (-)-GC

Total de

catequinas

162,61 ± 1,69 16,26 ± 0,08 - 1,64 -

Estimativa de

taninos

poliméricos

131,64 ± 6,51 13,16 ± 0,33 - 1,32 (-)-GCG

DP: desvio padrão para n = 6.

CV: coeficiente de variação.

Curva analítica empregada na quantificação com base na similaridade espectral.

nq: não quantificado (ácido clorogênico).

Quando comparamos o resultado encontrado para H. speciosa com aqueles

publicados na literatura para catequinas presentes em chás, constatamos que H.

speciosa é mais pobre do que, por exemplo, o chá verde das folhas de Camellia

sinensis (45,23 mg g

–1

de folhas) (DALLUGE et al., 1998). No entanto, H. speciosa

apresenta um teor de catequinas totais não poliméricas bem superior àquele descrito

por PELLILO et al. (2002) em chás pretos (3,4 mg g

–1

Em resumo, vários estudos que relacionam o consumo de chás indicam que

catequinas e taninos possuem propriedades medicinais, tais como antiviral,

antibacteriana, antiinflamatória, antiséptica, antitumoral, diurética, contra diarréia e

inibição seletiva da replicação do HIV (NAKASHIMA et al., 1992; KHANBABAEE &

VAN REE, 2001). Sendo assim, acreditamos que a quantidade desses metabólitos

em H. speciosa, principalmente dos taninos condensados, possa resultar em um

efeito similar aquele de plantas reconhecidamente ativas.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Capítulo 2:

Gênero Davilla (Dilleniaceae)

A família Dilleniaceae é composta por 11 gêneros (Acrotrema, Curatella,

Davilla, Didesmandra, Dillenia, Doliocarpus, Hibbertia, Pachynema, Pinzona,

Schumacheria e Tetracera) e existem aproximadamente 400 espécies catalogadas

(GURNI & KUBITZKI, 1981). Os indivíduos pertencentes a essas gêneros são

classificados como árvores, arbustos ou lianas. Apresentam folhas alternas inteiras,

peninérveas, sem estípulas e geralmente com células epidérmicas impregnadas de

sílica o que lhes conferem certa aspereza ao tato (BARROSO et al., 1978, SOARES,

et al., 2005). A ocorrência é predominante nas regiões de Cerrado de todo o mundo.

Dados etnobotânicos revelam que determinadas espécies da família

Dilleniaceae são empregadas na medicina tradicional com diferentes indicações.

Curatella americana L. é empregada como antiinflamatório e antiúlcera (CORRÊA,

1984). D. rugosa Poir. é utilizada como antiinflamatório, antiúlcera, purgativo,

estimulante, afrodisíaco e tônico (CORRÊA, 1984). D. elliptica é empregada como

adstringente, tônico, laxativo, sedativo, diurético (RODRIGUES & CARVALHO, 2001),

no tratamento de hemorróidas, hérnia e diarréia, e em aplicações tópicas como

antisséptico na limpeza de ferimentos (SILVA et al., 2001).

Davilla é um gênero neotropical que consiste de 20 espécies, 11 das quais

foram investigadas por GURNI & KUBITZKI (1981) em um estudo de sistemática

sobre a composição química de flavonóides (Tabela 2.1). Os autores mostraram que

os flavonóides miricetina-3-O-rhamnosídeo e quercetina-3-O-rhamnosídeo possuem

ocorrência predominante em todas as espécies pesquisadas.

Na literatura recente existem poucos relatos sobre o gênero Davilla,

principalmente do ponto de vista químico. DAVID e colaboradores (1996) realizaram

o estudo fitoquímico das folhas de D. flexuosa e isolaram o α-tocoferol do extrato

hexânico. Da porção acetato de etila estes autores obtiveram os flavonóis miricetina,

quercetina, miricetina-3-O-rhamnosideo e miricetina-3'-O-rhamnosídeo.

Com relação às atividades observadas, GUARALDO e colaboradores (2001)

detectaram efeito antiulcerogênico para o extrato hidroalcoólico e em frações

enriquecidas de D. rugosa. Nesta espécie os autores identificaram a presença de

flavonóides e saponinas através de triagem fitoquímica do extrato e frações.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Levantamento etnofarmacológico indicou o uso popular de D. nitida e D.

elliptica (Fig. 2.1) para o tratamento de úlceras gástricas. Desta forma, foi iniciada

uma investigação sobre a composição química destas duas espécies.

Davilla nitida é um arbusto trepador, sendo popularmente conhecida como

sambaibinha ou lixeirinha de rama e ocorre principalmente na borda de mata ciliar.

Davilla elliptica é conhecida como “lixinha”, devido à aspereza de suas folhas.

Floresce de abril a junho e sua época de frutificação é de julho a setembro.

Apresenta porte médio de 1,50 m caracterizando-se como subarbustos. Os tricomas

são unisseriados, as folhas são hipoestomáticas e o mesofilo é isolateral. Depois de

submetida à carbonização, várias células epidérmicas são preservadas, o que indica

uma grande quantidade de sílica em suas paredes (OLIVEIRA & CASTRO, 2003).

Na medicina popular, o infuso das raízes é utilizado como adstringente tônico e

laxativo, possuindo forte efeito purgativo. O banho com folhas frescas é indicado em

caso de linfatismo, inchações e orquites (RODRIGUES & CARVALHO, 2001).

Figura 2.1. Esquerda, folhas frutos e inflorescência de D. nitida. Disponível em:

http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast?imagx=10900112 acesso em: 26/03/2007. Direita, folhas

e frutos de D. elliptica. Disponível em: http://mobot.mobot.org/cgi-

bin/search_vast?name=Davilla+elliptica acesso em: 26/03/2007.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Tabela 2.1. Distribuição de flavonóides em 11 espécies de Davilla

Davillae M Q K M3OAra M3OGal M3ORha Q3OGal Q3OGlc Q3ORha K3ORha M3ORhaSul PD PC PP

D. alata

+ + + - - + + - + + + - + -

D. macrocarpa

+ + + - - + - - + + - + + -

D. cearensis

+ + + - - + + - + + - - + -

D. flexuosa

+ + + - - + - - + - + - + +

D. angustifólia

+ + + - - + - - + + - - + -

D. grandiflora

+ + + - - + - - + + - - + -

D. elliptica

+ + + + + + - + + - - + + -

D. lacunosa

+ + + + + + - - + - - - - -

D. kunthii

+ + + - - + - - + - - - + -

D. nitida

+ + - - + + - - + - - - - -

D. rugosa

+ + + - - + - - + - - - + -

(+) presente, (-) ausente. M = miricetina, Q = quercetina, M3OAra = miricetina-3-O-arabinosídeo, M3OGal = miricetina-3-O-galactosídeo, M3ORha =

miricetina-3-O-rhamnosídeo, Q3OGal = quercetina-3-O-galactosídeo, Q3OGlc = quercetina-3-O-glicosídeo, Q3ORha = quercetina-3-O-rhamnosídeo,

K3ORha = kaempferol-3-O-rhamnosídeo, M3ORhaSul = miricetina-3-O-rhamnosídeosulfato, PP = prodelfinidina, PC = procianidina, PP = propelargonidina.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Parte experimental / Resultados e discussões

Avaliação do perfil cromatográfico de espécies do gênero Davilla

O estudo cromatográfico das espécies do gênero Davilla foi iniciado levando

em consideração a ocorrência de proantocianidinas e dos flavonóides citados no

trabalho de GURNI & KUBITZKI (1981).

As matrizes inicialmente investigadas foram os extratos brutos obtidos nos

processos de maceração, os quais são produzidos pelo contato do material vegetal

triturado com os solventes atualmente empregados no protocolo de obtenção de

extratos vegetais adotado por nosso grupo. O Esquema 2.1 ilustra essas etapas.

Davilla nitida

folhas (500 g)

Extração por maceração

3 L CHCl

/ 1 semana

Extração por maceração

3 L MeOH / 1 semada

Extrato CHCl

m = 6,5 g

Extrato MeOH

m = 58,7 g

Torta seca

(matriz vegetal)

Torta seca

(descartada)

Davilla elliptica

folhas (500 g)

Extração por maceração

3 L CHCl

/ 1 semana

Extração por maceração

3 L MeOH / 1 semada

Extrato CHCl

m = 4,5 g

Extrato MeOH

m = 35,5 g

Torta seca

(matriz vegetal)

Torta seca

(descartada)

Esquema 2.1. Etapas de extração dos constituintes químicos presentes nas folhas de D. nitida e D.

elliptica.

Pequenas quantidades dos extratos MeOH (~10 mg) foram pesadas e

transferidas para balões volumétricos de 5 mL. Cada extrato foi dissolvido em uma

quantidade mínima de MeOH (~0,5 mL) e o material solubilizado ajustado para o

volume final de 5 mL com a mistura MeOH/H

O 3:7 v/v. Alíquotas das soluções dos

extratos MeOH foram filtradas em membranas de PTFE (0,45 µm), o efluente filtrado

foi coletado em vial e mantido refrigerado até o momento das análises.

A primeira avaliação dos perfis cromatográficos dos extratos MeOH das

espécies de Davilla foi feita empregando o gradiente exploratório linear com variação

do solvente orgânico (B) na faixa de composição de 5-100% em 60 min (Tabela 2.2).

A partir das análises observou-se que o comportamento cromatográfico obtido foi

similar ao encontrado para H. speciosa (Capitulo 1), em que a presença de taninos

condensados conduziu à instabilidade da corrida cromatográfica com a formação de

uma banda cromatográfica bastante alargada na região entre t

= 10-35 min.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Tabela 2.2. Gradiente de eluição exploratório empregado na separação dos constituintes químicos

presentes nos extratos MeOH de D. nitida e D. elliptica

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O ACN

0 5

60 100

65 100

Comparação das duas análises também mostrou que D. nitida (Fig. 2.2 A)

exibiu um comportamento cromatográfico menos afetado, quando comparado ao

aspecto cromatográfico de D. elliptica (Fig. 2.2 B), indicando que a concentração de

taninos condensados deve ser menor nesta espécie do que em D. elliptica.

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

200

300

400

500

600

700

800

PDA-210 nm

D nitida ExMeOH 10mg5ml GE 60min

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

200

300

400

500

600

700

800

PDA-210 nm

D nitida ExMeOH 10mg5ml GE 60min

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

PDA-210 nm

D elliptica ExMeOH 10mg5ml GE 60min

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorbância (mv)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

PDA-210 nm

D elliptica ExMeOH 10mg5ml GE 60min

Figura 2.2. Perfis cromatográficos dos extratos MeOH de D. nitida (A) e D. elliptica (B). Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC-PAD (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ =

210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.2).

Acreditamos ainda que o fato do longo tempo entre a produção,

armazenamento e secagem dos extratos contribuiu para a polimerização dos taninos

condensados, conforme discutido no Capitulo 1, e consequentemente na dificuldade

de obtenção de uma análise cromatográfica uniforme. Portanto, para chegar a

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

resultados mais informativos com relação à composição química dos extratos,

iniciou-se as etapas de SPE para os extratos MeOH das duas espécies estudadas.

Clean-up em SPE

Clean-up em cartuchos Sep Pak RP18 foram realizados empregando 10 mg

do extrato MeOH das folhas de D. nitida e/ou D. elliptica, esse procedimento seguiu

as mesmas etapas descritas anteriormente para o estudo de H. speciosa (Esquema

1.2 A). Durante o processo de SPE, cartuchos de 500 mg 6 mL

-1

(Supelco

) foram

pré-condicionados passando sequencialmente 15 mL de MeOH e 10 mL de H

Amostras previamente solubilizadas em um pequeno volume de solução (~0,5

mL MeOH) foram aplicadas nos cartuchos. Cada eluato foi coletado como uma

fração separada e monitorado por TLC em vários sistemas eluentes. As revelações

foram feitas com solução metanólica de anisaldeído : ácido sulfúrico : ácido acético

seguido de aquecimento em estufa (WAGNER et al., 2003), sendo empregando

nesta análise comparativa, catequinas, ácidos fenólicos e flavonóides como

substâncias de referência.

A partir das análises por TLC ficou evidenciado que os derivados de ácidos

fenólicos, spots de cor cinza, além de açúcares livres, haviam sido eluídos

preferencialmente no primeiro eluato. Taninos condensados, spots de cor marrom

escuro, e flavonóides, spots de cor amarelo/alaranjado, foram concentrados

principalmente no segundo eluato, porém havendo constatação da presença de

flavonóides mais polares no primeiro eluato da SPE. No terceiro eluato não foram

observados spots que caracterizassem a presença das substâncias investigadas.

Clorofila, spot de cor verde, foi evidenciada no efluente referente à lavagem dos

cartuchos com CHCl

Para garantir que houvesse uma dessorção seletiva e consequentemente, a

separação completa dos flavonóides em uma única fração durante a SPE, misturas

em diferentes proporções com diminuição da força de eluição para a obtenção do

primeiro eluato foram avaliadas e as condições ótimas encontradas estão

representadas no Esquema 2.2.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

10 mg do

extrato MeOH

~0,5mL MeOH

2 mL MeOH/H

O 14 : 86 (v/v)

clean-up

Sep Pak RP18

5 mL

MeOH/H

14 : 86 (v/v)

1ª eluição

3ª eluição

5 mL

MeOH

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

amostra solubilizada

em ultra-som

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

5 mL

MeOH/H

1 : 1 (v/v)

2ª eluição

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

Esquema 2.2. Etapas de clean-up empregadas nos procedimentos de SPE dos extratos MeOH de D.

nitida e D. elliptica em cartuchos de Sep Pak RP18.

Testes preliminares usando o gradiente empregado para a separação das

catequinas discutido no Capítulo 1 (Sistema 1, Tabela 2.3) mostraram parcial

sobreposição entre os flavonóides presentes no segundo eluato da SPE. Esse

comportamento foi atribuído ao fato de que as substâncias eluídas com MeOH/H

14:86 v/v possuíam polaridade bem distintas daquelas eluídas com MeOH/H

O 1:1

v/v. Portanto, para avaliar a composição química do segundo e terceiro eluatos da

SPE houve a necessidade de aplicar um segundo sistema gradiente de eluição

(Sistema 2, Tabela 2.3).

Tabela 2.3. Gradientes de eluição usados na separação dos metabólitos de D. nitida

Sistema 1

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O ACN

0 5

50 20

60 100

Sistema 2

O ACN

0 20

20 40

55 100

60 100

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

A partir das análises cromatográficas foi possível comprovar as observações

evidenciadas com as triagens realizadas por TLC. Com auxílio do detector PAD

realizando varredura na faixa espectral de 200-600 nm, obteve-se os espectros na

região do UV para os picos eluídos. O cromatograma da Figura 2.3 representa a

análise por HLPC-PAD do primeiro eluato da SPE e um único pico em t

= 13,20 min,

com intensidade significativa, apresentou espectro na região do UV equivalente ao

de um derivado do ácido gálico, com bandas de máximos de absorção intensas em

215 e 271 nm (ROHR et al., 2000; WANG et al., 2000).

Absorbância 210 nm (mAU)

100

150

200

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

SPE 1° eluato MeOH/H

O 14:86 (v/v)

Absorbância 210 nm (mAU)

100

150

200

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

SPE 1° eluato MeOH/H

O 14:86 (v/v)

100

150

200

250

mAU

200 250 300 350

214.98

270.84

100

150

200

250

mAU

200 250 300 350

214.98

270.84

Figura 2.3. Separação cromatográfica por HPLC-PAD do primeiro eluato (MeOH/H

O 14:86, v/v) do

extrato MeOH de D. nitida submetido ao processo de SPE em cartucho Sep Pak de RP18. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.3, Sistema 1).

Outros picos com intensidades relevantes foram obtidos por HPLC após a

análise do segundo eluato da SPE (Fig. 2.4A). Com auxílio do detector PAD foi

verificado que os espectros na região do UV para os picos eluídos em t

= 5,70; 8,34;

14,39; 21,67; 23,53; 35,71 e 47,47 min eram compatíveis com os de flavonóides, os

quais são reconhecidos por apresentarem a Banda II, com máximos na faixa

espectral de 240-290 nm, atribuída ao anel A e da Banda I, com máximos na faixa

espectral de 300-390 nm, atribuída ao anel B (MERKEN & BEECHER, 2000).

A Banda I é associada a absorção do Anel B (sistema cinamoil) e a Banda II é

atribuída ao Anel A, que envolve a absorção do sistema benzoil (Esquema. 2.3).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Sistema Cinamoil

Sistema Benzoil

Esquema 2.3. Estrutura de um flavonol com sistema benzoil e cinamoil.

O pico bastante alargado ao final da análise, com ápice em t

= 51,91 min (Fig.

2.5A), exibiu espectros na região do UV característicos ao logo da sua eluição, com

máximos de absorção intensos em torno de 206 nm e bandas de máximo de

absorção menos intensas próximas de 276 nm, sendo este pico atribuído a presença

dos taninos condensados (DE PASCUAL-TERESA et al., 2000; ROHR et al., 2000).

No cromatograma do terceiro eluato da SPE (Fig. 2.4B) não foram

observados picos com informações espectrais relevantes que resultassem na

indicação de uma classe de metabólito secundário.

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-0.1

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

A) SPE 2° eluato MeOH/H

O 1:1 (v/v)

B) SPE 3° eluato MeOH

8.34

14.39

21.67

23.53

5.70

35.71

47.47

51.91

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-0.1

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 210 nm (AU)

2.0

A) SPE 2° eluato MeOH/H

O 1:1 (v/v)

B) SPE 3° eluato MeOH

8.34

14.39

21.67

23.53

5.70

35.71

47.47

51.91

Figura 2.4. Separação cromatográfica por HPLC-PAD do segundo eluato (MeOH/H

O 1:1, v/v) (A) e

do terceiro eluato (MeOH 100%) (

B) do extrato MeOH de D. nitida submetido ao processo de SPE em

cartucho Sep Pak de RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC

(Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.3, Sistema 2).

Para eliminar parte da interferência causada pela grande quantidade dos

taninos encontrados nos extratos MeOH, foi realizada uma etapa de obtenção dos

extratos em um espaço de tempo menor. Esta estratégia consistiu em realizar a

transposição do protocolo original descrito no Esquema 2.1 para um procedimento

de pequena escala que possibilitasse gerar os extratos diariamente para análises de

rotina, conforme ilustrado no Esquema 2.4.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Ao mesmo tempo, inspeção do cromatograma do segundo eluato (MeOH/H

1:1 v/v) havia ainda revelado que os picos eluídos acima de 18 minutos (Fig. 2.4A)

apresentaram baixa resolução cromatográfica com notável encaudamento e

alargamento dos picos, provavelmente ocasionada pela interação dos compostos

fenólicos com silanóis livres da coluna de fase reversa (KIRKLAND et al., 1997). Ou

ainda, pelo fato dessas substâncias apresentarem um equilíbrio ácido-base em meio

neutro e assim contribuir para o surgimento de efeitos indesejados, como variações

no tempo de retenção, falta de reprodutibilidade entre as análises e baixa eficiência

cromatográfica (SNYDER et al., 1997). Alguns autores reportam que a variação do

pH com o uso de diferentes modificadores ácidos pode minimizar esses problemas

(DALLUGE et al., 1998; SCHIEBER et al., 2001).

Espécie vegetal

folhas (2 g)

Extração em ultra-som (30 min)

3 x 50 mL CHCl

Extração em ultra-som (30 min)

3 x 50 mL MeOH

Extrato CHCl

Extrato MeOH

Torta seca

(matriz vegetal)

Torta seca

(descartada)

Etapas de SPE

Esquema 2.4. Procedimento de produção dos extratos MeOH empregados nas análises de rotina.

Desta forma, optou-se por avaliar o uso de dois modificadores, o ácido

trifluoracético (TFA, pKa = 2) e o ácido fórmico (pKa = 3,8) em conjunto com a fase

móvel empregada na eluição dos metabólitos secundários encontrados nas espécies

investigadas.

A presença de TFA 0,05% v/v ou ácido fórmico 0,2% v/v na fase móvel

promoveu uma melhora na resolução cromatográfica dos metabólitos secundários

eluídos durante as análises cromatográficas, principalmente com redução do

alargamento dos picos. No entanto, optou-se em empregar apenas TFA 0,05% v/v

como modificador ácido para as demais análises realizadas durante o

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

desenvolvimento do trabalho. Esta escolha foi feita levando em consideração que a

concentração mais elevada de ácido fórmico poderia gerar um desgaste mais efetivo

no equipamento de HPLC.

Assim, a adição de TFA na fase móvel, bem como a elaboração de uma nova

rampa de eluição possibilitou analisar os três eluatos da SPE nas mesmas

condições (Tabela 2.4). Adicionalmente, a obtenção recente dos extratos contribuiu

para a minimização dos efeitos causados pela presença taninos condensados.

Essas estratégias levaram à obtenção de picos bem resolvidos com separação de

linha de base e conduziram à visualização de picos que antes estavam co-eluindo

(Figura 2.5).

Tabela 2.4. Gradiente de eluição usado na separação dos constituintes químicos presentes nas

folhas de D. nitida

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + 0,05% TFA ACN + 0,05% TFA

0 32

20 35

60 75

61 100

65 100

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-0.20

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Absorbância 210 nm (AU)

A) Davilla nitida, 3º eluato da SPE

B) Davilla nitida, 1º eluato da SPE

C) Davilla nitida, 2º eluato da SPE

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-0.20

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Absorbância 210 nm (AU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-0.20

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Absorbância 210 nm (AU)

A) Davilla nitida, 3º eluato da SPE

B) Davilla nitida, 1º eluato da SPE

C) Davilla nitida, 2º eluato da SPE

Figura 2.5. Efeito da presença do ácido triflouroacético (TFA) na concentração de 0,05 % v/v durante

a separação dos constituintes químicos presentes nos três eluatos da SPE de D. nitida. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Embora taninos e flavonóides tenham sido dessorvidos em uma mesma

fração, é importante ressaltar que os flavonóides podem ser monitorados sem que

os taninos remanescentes aos processos de preparação das amostras promovam

algum tipo de interferência efetiva, isto é possível devido fato dos flavonóides

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

possuírem uma banda de máximo de absorção que lhes é característica (Fig. 2.6).

Portanto, a escolha de um comprimento de onda que esteja acima da faixa de

absorção dos taninos confere seletividade na avaliação de flavonóides em mistura

com taninos condensados.

Desta forma, os cromatogramas referentes ao primeiro eluato da SPE

(MeOH/H

O 2:8 v/v) foram processados no comprimento de onda de 210 nm,

evidenciando que o procedimento de extração foi seletivo e que todos os flavonóides

permaneceram retidos no suporte empregado na SPE. Por sua vez, os

cromatogramas do segundo eluato da SPE (MeOH/H

O 1:1 v/v) foram processados

em 360 nm, garantido maior especificidade na detecção dos analitos investigados,

fator que conduziu a obtenção de análises cromatográficas com resolução de linha

de base, favorecendo assim a identificação dos picos cromatográficos de menor

intensidade e consequentemente na integração de suas áreas durante as avaliações

quantitativa desta matriz.

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

207.65

252.67

371.14

A) Flavonóide

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

207.65

252.67

371.14

0.25

0.50

0.75

1.00

200 250 300 350

207.65

252.67

371.14

A) Flavonóide

100

200

300

400

500

600

700

mAU

200 250 300 350

203.47

279.37

B) Tanino condensado

100

200

300

400

500

600

700

mAU

200 250 300 350

203.47

279.37

100

200

300

400

500

600

700

mAU

200 250 300 350

203.47

279.37

B) Tanino condensado

Figura 2.6. Bandas de máximo de absorção na região do UV ilustradas para flavonóides (A) e taninos

condensados (B).

Identificação dos metabólitos secundários

Sob a condição de eluição descrita na Tabela 2.4, os principais picos eluídos

durante as análises por HPLC-PAD dos extratos MeOH das duas espécies foram

identificados pela comparação dos seus espectros na região do UV, pela

comparação dos seus tempos de retenção com o de padrões comerciais e/ou

substâncias isoladas de outras espécies vegetais, ou ainda por experimentos de co-

injeção.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Em D. elliptica, os picos: 1 (t

= 3,61 min), 3 (t

= 9,98 min), 4 (t

= 11,00 min),

5 (t

= 11,52 min), 6 (t

= 15,64 min), 8 (t

= 18,43 min), 9 (t

= 24,56 min) e 12 (t

37,30 min) dos cromatogramas das Figuras 2.7A e 2.7B foram identificados como:

ácido gálico, rutina, miricetina-3-O-α-rhamnosídeo, quercetina-3-O-β-galactosídeo,

quercetina-3-O-α-arabinosídeo, quercetina-3-O-α-rhamnosídeo, miricetina e

quercetina, respectivamente.

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

Absorbância 360 nm (mAU)

7.36

9.98

11.00

11.52

15.64

18.43

24.56

25.82

26.96

37.30

17.08

500

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

Absorbância 360 nm (mAU)

7.36

9.98

11.00

11.52

15.64

18.43

24.56

25.82

26.96

37.30

17.08

500

10 20 30 40 50 60

Tempo (mim)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 210 nm (mAU)

700

3.61

10 20 30 40 50 60

Tempo (mim)

100

200

300

400

500

600

Absorbância 210 nm (mAU)

700

3.61

Figura 2.7. Identificação dos constituintes químicos de D. elliptica eluídos durante as análises

cromatográficas do primeiro eluato da SPE (

A) monitorado em 210 nm e do segundo eluato da SPE

(B) monitorado em 360 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC

(Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Em D. nitida, os picos: 1 (t

= 3,60 min), 3 (t

= 9,76 min), 4 (t

= 10,67 min), 6

= 18,28 min), 7 (t

= 24,73 min), e 12 (t

= 37,30 min) dos cromatogramas das

Figura 2.8A e 2.8B foram identificados como: ácido gálico, rutina, miricetina-3-O-

α-

rhamnosídeo, quercetina-3-O-

α-rhamnosídeo, miricetina e quercetina,

respectivamente.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

Absorbância 210 nm (mAU)

3.60

6.17

6.67

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

200

300

400

500

Absorbância 210 nm (mAU)

3.60

6.17

6.67

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

150

200

250

300

Absorbância 360 nm (mAU)

7.12

9.69

18.28

24.73

25.73

26.94

33.91

34.71

37.30

38.06

10.67

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

100

150

200

250

300

Absorbância 360 nm (mAU)

7.12

9.69

18.28

24.73

25.73

26.94

33.91

34.71

37.30

38.06

10.67

Figura 2.8. Identificação dos constituintes químicos de D. nitida eluídos durante as análises

cromatográficas do primeiro eluato da SPE (A) monitorado em 210 nm e do segundo eluato da SPE

(B) monitorado em 360 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC

(Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Comparação dos perfis cromatográficos Davilla nitida e Davilla elliptica

Na seqüência, foi realizada a comparação dos perfis cromatográficos das

duas espécies de Davilla, tendo em vista que foram estabelecidas as condições

ótimas empregadas durante a SPE (Esquema 2.2), bem com a elaboração de um

sistema de eluição cromatográfico (Tabela 2.4) que possibilitou a avaliação dos três

eluatos em condições equivalentes.

Os cromatogramas para o primeiro eluato (MeOH/H

O 14:86 v/v) da SPE de

D. nitida (Fig. 2.9A) e D. elliptica (Fig. 2.9B) revelaram que a composição destas

espécies é relativamente pobre, no que diz respeito a presença de derivados de

ácidos fenólicos e catequinas, destacando apenas a ocorrência predominante do

ácido gálico (t

= 3,6 min).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Absorbância 210 nm (mAU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-45

100

200

300

400

500

600

700

800

3.60

900

Absorbância 210 nm (mAU)

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-45

100

200

300

400

500

600

700

800

3.60

900

100

200

300

400

500

600

700

mAU

200 250 300 350

214.73

270.81

a = Padrão AG

b = Amostras

100

200

300

400

500

600

700

mAU

200 250 300 350

214.73

270.81

a = Padrão AG

b = Amostras

A) Davilla nitida, 1º eluato da SPE

B) Davilla elliptica, 1º eluato da SPE

Figura 2.9. Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 210 nm. Análise do primeiro

eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas de D. nitida (

A) e D. elliptica (B).

Padrão AG = padrão de ácido gálico (

a), substâncias identificadas (b). Coluna Phenomenex

Luna (2)

RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja

Tabela 2.4).

Averiguação, com auxílio do detector PAD em outros comprimentos de onda,

revelou que não houve a eluição em quantidades significativas dos flavonóides,

comprovando que ocorreu seletividade durante o processo de SPE com retenção

desta classe de substância no suporte utilizado e para a mistura de solventes

empregada na primeira dessorção.

Análise dos cromatogramas referentes ao segundo eluato (MeOH/H

O 1:1

v/v) da SPE (Fig. 2.10) para as duas espécies investigadas mostrou evidências de

que os flavonóides são os metabólitos secundários predominantes e que há grande

similaridade quanto ao conteúdo flavonoídico das espécies.

Aparentemente a diferença entre os flavonóides de D. nitida (Fig. 210A) e D.

elliptica (Fig. 2.10B) é de ordem quantitativa, uma vez que visualmente podem ser

notadas disparidades entre as intensidades de absorção dos picos cromatográficos

eluídos. Porém, essa observação será confirmada e discutida mais adiante na etapa

que envolveu as análises quantitativas.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-35

100

200

300

400

500

600

700

Absorbância 254 nm (mAU)

7.36

9.98

11.00

11.52

18.43

24.56

25.82

26.96

37.30

17.08

15.63

A) Davilla nitida, 2º eluato da SPE

B) Davilla elliptica, 2º eluato da SPE

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-35

100

200

300

400

500

600

700

Absorbância 254 nm (mAU)

7.36

9.98

11.00

11.52

18.43

24.56

25.82

26.96

37.30

17.08

15.63

A) Davilla nitida, 2º eluato da SPE

B) Davilla elliptica, 2º eluato da SPE

Figura 2.10. Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 254 nm. Análise do segundo

eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas de D. nitida (A) e D. elliptica (B).

Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

(Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Comparação dos cromatogramas do terceiro eluato (MeOH 100%) da SPE

indicou que não houve perdas significativas por parte dos flavonóides anteriormente

eluídos e, em ambos efluentes (Fig. 2.11A e 2.11B), não foram caracterizados picos

com intensidades significativas que resultassem na aquisição de espectros na região

do UV interpretáveis. Os cromatogramas mostraram a predominância de picos

alargados entre na faixa de t

= 30-45 min, provavelmente referente aos oligômeros

que tenham ficado fortemente retidos e que não foram eluídos durante as

dessorções iniciais.

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-10

-5

Absorbância 254 nm (mAU)

A) Davilla elliptica, 3° eluato SPE

B) Davilla nitida, 3° eluato SPE

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

-10

-5

Absorbância 254 nm (mAU)

A) Davilla elliptica, 3° eluato SPE

B) Davilla nitida, 3° eluato SPE

Figura 2.11. Cromatogramas de separação por HPLC monitorados em 254 nm. Análise do terceiro

eluato obtido após clean-up de 10 mg dos extratos MeOH das folhas de D. elliptica (

A) e D. nitida (B).

Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

(Para condições de eluição veja Tabela 2.4).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Desta forma, os resultados alcançados com as etapas de SPE foram bem

sucedidos, destacando que a mistura dos solventes empregados nas eluições dos

metabólitos secundários presentes nas espécies de Davilla proporcionou uma

separação seletiva entre ácidos fenólicos de taninos/flavonóides mono- e

diglucosilados. No entanto, experimentos realizados com alguns padrões de

biflavonóides e derivados metoxilados da quercetina mostraram que esse tipo de

substância estava sendo eluída entre as frações MeOH/H

O 1:1 v/v e MeOH 100%.

Portanto, para evitar problemas na ordem de recuperação e/ou etapas de

quantificação, optamos em unificar estas duas eluições usando apenas MeOH 100%

como eluente para segunda coleta do efluente da SPE.

Fracionamento da porção acetato de etila da infusão das folhas de Davilla

elliptica

A comparação da triagem cromatográfica entre as espécies de Davilla

evidenciou a ocorrência de flavonóides que não puderam ser identificados pelos

métodos diretos. Com o objetivo de se chegar à caracterização destas substâncias,

uma estratégia foi organizada visando o isolamento por HPLC-PAD preparativo.

Nesta aplicação, D. elliptica foi escolhida pelo fato de ter apresentado uma

composição aparentemente mais concentrada no conteúdo dos seus metabólitos

secundários, principalmente nos flavonóides não identificados (Fig. 2.7). No entanto,

os experimentos anteriores indicaram que os extratos MeOH obtidos de forma

convencional apresentaram grande quantidade de taninos condensados e que esse

tipo de substância poderia interferir na etapa de isolamento.

Tendo em vista que os extratos MeOH provenientes do protocolo do Esquema

2.1 não seriam adequados para uso em uma separação por HPLC preparativo, uma

alternativa encontrada foi empregar a produção e a utilização de infusos.

Esta nova abordagem foi fundamentada no fato de que a amostra vegetal

poderia ser manipulada e preparada em um intervalo de tempo muito inferior ao

utilizado no protocolo do Esquema 2.1. Outra vantagem consistiu na possibilidade de

empregar concomitantemente as técnicas de LLE e SPE, garantindo assim uma

maior integridade da matriz com pré-concentração dos analitos de interesse, antes

dela ser submetida às separações por HPLC.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Preparo da amostra

O infuso de D. elliptica foi feito com 100 g das folhas secas e trituradas. O

material vegetal foi colocado em um erlenmeyer de 2 L e em seguida adicionado 1 L

de água aquecida a 80°C. O solvente foi mantido em contato com o material vegetal

por 10 min sob agitação manual. O material foi posteriormente filtrado em filtro de

papel para remoção de macro partículas e a solução filtrada adicionada em um funil

de separação de 2 L.

Na seqüência, o infuso filtrado foi submetido a uma LLE com acetato de etila.

As fases formadas foram coletadas e avaliadas por TLC. Flavonóides foram

concentrados na porção acetato de etila enquanto que, taninos e açúcares

permaneceram na porção aquosa. A porção acetato de etila foi concentrada

utilizando evaporador rotativo à pressão reduzida, fornecendo 4 g de um sólido de

coloração marrom, Esquema 2.5.

100 g folhas

D. elliptica

1 L H

∆ ~ 80 ºC

agitação

10 min

Filtração

sobrenadante

LLE

2x 500mL (AcOEt)

Obtenção da porção

AcOEt com redução

de inteferentes

Porção

aquosa

Porção

AcOEt

4 g

Esquema 2.5. Etapas realizadas para a obtenção da porção acetato de etila proveniente da infusão

feita com as folhas de D. elliptica.

Posteriormente o sólido obtido pelo processo de LLE foi dissolvido em 50 mL

de MeOH/H

O 7:3 v/v, centrifugado e alíquotas de 10 mL foram submetidas ao

processo de clean-up por SPE em cartucho Sep Pak de RP18 (10 g 60 mL

-1

, 55 µm,

Strata-E, Phenomenex

) previamente condicionado pela passagem seqüencial de

200 mL de MeOH e 100 mL de água. Os analitos de interesse foram dessorvidos

passando 50 mL de MeOH. Ao final da coleta do efluente, o cartucho foi lavado com

100 mL de CHCl

e recondicionado para novas extrações, este processo foi repetido

até completar o clean-up da porção acetato de etila. Os eluatos contendo os analitos

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

de interesse foram agrupados em uma única solução após controle por TLC, sendo

a solução posteriormente concentrada por evaporação a pressão reduzida ou sob

fluxo de nitrogênio, fornecendo assim, 3,5 g de uma fração contendo

majoritariamente flavonóides.

Para confirmar a composição da fração flavonoídica, uma pequena

quantidade (0,5 mg) foi solubilizada em 5 mL da mistura entre MeOH/H

O 3:7 v/v,

filtrada em membrana de PTFE (0,45 µm) e analisada por HPLC nas condições

indicadas na Tabela 2.5.

Tabela 2.5. Gradiente de eluição empregado na separação dos constituintes químicos presentes na

fração flavonoídica obtida após os procedimentos de LLE e SPE do infuso das folhas de D. elliptica

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + 0,05% TFA ACN + 0,05% TFA

0 15

25 22

40 40

45 78

50 78

51 100

55 100

O cromatograma da Figura 2.12 mostra que o processo empregado viabilizou

a remoção dos taninos e permitiu o enriquecimento de uma fração composta

majoritariamente pelos flavonóides presentes em D. elliptica. Nas separações em

escala preparativa, a fração flavonoídica foi resolubilizada em 10 mL de MeOH/H

3:7 v/v, centrifugada, filtrada em membrana de PTFE (0,45 µm) e alíquotas de 1 mL

injetadas no sistema HPLC.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

1400

PDA-210 nm

De pAcOEt infuso

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

1200

1400

PDA-210 nm

De pAcOEt infuso

Figura 2.12. Separação cromatográfica por HPLC-PAD da porção acetato de etila obtida a partir da

LLE do infuso das folhas de D. elliptica e posterior clean-up em Sep Pak RP18. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de

eluição veja Tabela 2.5).

Isolamento por HPLC preparativo

A limitada solubilidade da fração flavonoídica em ACN e a grande quantidade

de água usada inicialmente no gradiente analítico representado na Tabela 2.5 não

possibilitou transpor a mesma fase móvel utilizada nesta separação para a escala

preparativa. Desta forma, com o objetivo de efetuar injeções com grandes volumes

de amostra sem que houvesse a possibilidade de ocorrer precipitação da fração

flavonoídica durante as injeções, optou-se em usar uma fase móvel baseada na

mistura entre H

O (A) e MeOH (B), ambas acidificadas com TFA (0,05%), uma vez

que a fração flavonoídica mostrou ser mais solúvel em MeOH.

O fluxo da fase móvel foi estabelecido com base nas características da coluna

preparativa usada. De acordo com MAJORS (2004), o fator de transposição linear

(scale-up) pode ser obtido pela razão entre as áreas secionais da coluna preparativa

a ser usada e a coluna analítica, conforme a seguinte equação.

analíticacoluna

apreparativcoluna

analíticacoluna

apreparativcoluna

ãotransposiçdeFator ==

Devido à mudança do solvente orgânico, os valores encontrados nas análises,

usando ACN e a coluna analítica de 250 x 4.6 mm i.d., foram incluídos no cálculo

para a separação preparativa usando metanol e uma coluna preparativa de 250 x

41.4 mm i.d. Dessa forma, o fator estimativo de transposição encontrado foi de 81.

Na separação em escala analítica (Figura 2.12) o fluxo foi de 1 mL min

-1

, com o

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

último pico sendo eluído em torno de t

= 40 min. Uma separação em escala

preparativa mantendo a mesma velocidade linear e para manter os mesmos tempos

de retenção dos picos eluídos necessitaria de fluxo de 81 mL min

-1

. Contudo, essa

velocidade encontrava-se acima das limitações instrumentais. Devido à alta pressão

sobre a coluna, avaliada experimentalmente com fluxos de até 30 mL min

-1

, assim

optou-se por usar fluxo cerca de 5 vezes menor do que o calculado, com o

conseqüente aumento do tempo de análise.

A quantidade (massa) de amostra que pode ser injetada em uma coluna

preparativa pode variar amplamente, devido à sua solubilidade no solvente

inicialmente empregado para esta finalidade. Cuidados devem ser tomados para que

a força de eluição do solvente empregado na solubilização seja compatível com a

força de eluição da fase móvel. Se o solvente de injeção é relativamente mais forte

que a fase móvel a amostra tenderá a se espalhar longitudinalmente ao longo da

coluna e a separação ficará prejudicada. A melhor situação é quando o solvente de

injeção é mais fraco que a força de eluição da fase móvel, pois os analitos tendem a

permanecer no topo da coluna, sendo seletivamente eluídos de acordo com a

variação da força de eluição da fase móvel pelo gradiente utilizado (MAJORS, 2004).

A Tabela 2.6 representa uma estimativa de massas e volumes que podem ser

injetados em colunas de fase reversa de várias dimensões.

Tabela 2.6. Condições típicas de operação para colunas de diversas dimensões

Parâmetro Diâmetro interno da coluna*

Comprimento (mm)

4,6 9,4 21,2 30,0 50,0

Massa (mg)

50 1 3-5 30-50 80-100 250-300

100 4-6 15-20 80-90 200-500 500-700

150 8-10 30-40 140-160 300-350 800-900

250 12-15 50-60 200-250 475-525 1200-1400

Volume de injeção (µL)

10-20 50-75 350-400 700-800 1500-2500

Fluxo (mL min

-1

)**

1,0 4,2 21,2 42,5 118

* Os valores destacados representam valores aproximados em quantidade de amostra que pode ser

injetada em colunas com as dimensões sugeridas.

** Fluxo necessário para manter a velocidade linear e tempo de separação.

Assim, após a otimização de todos os parâmetros, a separação dos

constituintes químicos da fração flavonoídica foi realizada com o sistema HPLC

preparativo descrito na parte Experimental. A fase móvel empregada foi: A = H

O +

TFA 0,05% e B = MeOH + TFA 0,05%, em fluxo de 15 mL min

-1

. A rampa de eluição

usada foi: 0-150 min, 33-47% B (gradiente linear); 150-175 min, 47-100% B

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

(gradiente linear); 175-200 min, 100% B (isocrático), retorno para 33% B em 5 min e

recondicionamento da coluna em 55 min. Em cada corrida cromatográfica foram

aplicados aproximadamente 350 mg da fração flavonoídica por injeção. Picos

individuais eluídos da coluna foram coletados por múltiplas injeções da amostra e

concentrados por evaporação a pressão reduzida ou liofilizados. O cromatograma da

Figura 2.13 ilustra a separação em escala preparativa dos constituintes químicos

encontrados na fração flavonoídica proveniente da infusão das folhas de D. elliptica.

25 50 75 100 125 150 175

Tempo (min)

100

200

300

400

500

Absorbância 254 nm (mAU)

600

3+4

25 50 75 100 125 150 175

Tempo (min)

100

200

300

400

500

Absorbância 254 nm (mAU)

600

3+4

Figura 2.13. Cromatograma de separação por HPLC-PAD (modo preparativo) da amostra obtida após

etapas de clean-up e enriquecimento empregando os processos de LLE e SPE no infuso das folhas

de D. elliptica. Coluna Varian

Dynamax RP18 (250 x 41,4 mm i.d.; 8 µm), HPLC (Varian

), fluxo 15,0

mL min

-1

, monitorado em 254 nm, Volume injetado: 1 mL.

Para garantir a pureza dos metabólitos secundários isolados no processo,

cada substância passou por uma etapa adicional de purificação, com a finalidade de

serem utilizadas na etapa de quantificação dos flavonóides presentes nas duas

espécies de Davilla. Desta maneira, as substâncias foram reinjetadas, utilizando

uma coluna semipreparativa de 250 x 10 mm i.d., empacotada com o mesmo

material presente na coluna analítica, e nestas condições foi possível estabelecer e

utilizar o fator de transposição igual a 4,7.

Ao final das etapas de isolamento e purificação, as substâncias

desconhecidas foram caracterizadas usando as técnicas de elucidação estrutural

comumente empregadas, tais como UV, NMR e MS. Uma discussão mais detalhada

sobre esta aplicação foi recentemente descrita por nosso grupo (RODRIGUES;

RINALDO; SANNOMIYA et al., 2007 (anexo).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

100

O cromatograma da Figura 2.14 mostra a identificação das substâncias da

fração flavonoídica eluídas durante a separação cromatográfica e a Figura 2.15

representa as estruturas dos metabólitos secundários isolados e/ou identificados a

partir da infusão das folhas de D. elliptica.

Absorbância (mv)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

200

400

600

800

1000

1200

PDA-254 nm

3+4

Absorbância (mv)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

200

400

600

800

1000

1200

PDA-254 nm

3+4

Minutes

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

100

120

140

PDA-254 nm

flav2 De 40-50-65-100MeOH

Minutes

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

100

120

140

PDA-254 nm

flav2 De 40-50-65-100MeOH

Figura 2.14. Cromatograma de separação por HPLC-PAD dos constituintes químicos encontrados no

infuso das folhas de D. elliptica após os procedimentos de LLE e SPE. Identificação:

1 ácido gálico; 2

(-)-epicatequina; 3 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 4 miricetina-3-O-β-glicopiranosídeo; 5

miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo; 6 (6S,7E)-6,9-diidroxi-4,7-megastigmadien-3-ona; 7

rutina;

8 miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 9 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 10 quercetina-

3-O-α-arabinopiranosídeo; 11 quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo;12 miricetina, 13 miricetina-3-O-

(2"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo; 14 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo; 15

quercetina. Em destaque, separação da mistura dos flavonóis

3 e 4 empregando o sistema isocrático

com a mistura de 40% de MeOH + TFA 0,05% (B) em 60% de H

O + TFA 0,05% (A). Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ =

254 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

OOH

3 R

= OH, R

= Gal

4 R

= OH, R

= Glc

5 R

= OH, R

= (2"-Gall)-Gal

7 R

= H, R

= Glc-Rha

8 R

= OH, R

= Rha

9 R

= H, R

= Gal

10 R

= H, R

= Ara

11 R

= H, R

= Rha

12 R

= OH, R

= H

13 R

= OH, R

= (2"-Gall)-Rha

14 R

= OH, R

= (3"-Gall)-Rha

15 R

= H, R

= H

Figura 2.15. Constituintes químicos isolados a partir da porção acetato de etila proveniente das

etapas de LLE e SPE da infusão feita com as folhas de D. elliptica.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

101

Análises por FIA-ESI-IT-MS

Além dos experimentos envolvendo as análises por HPLC-PAD, também foi

realizada a investigação da composição química das espécies vegetais empregando

a técnica de ESI-IT-MS com inserção direta (FIA) das amostras provenientes de

infusões feitas com as folhas de D. nitida e D. elliptica.

O principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade da técnica FIA em

conjunto com a ESI-IT-MS para produzir informações espectrais sobre a constituição

das matrizes avaliadas de forma rápida e direta, sem a necessidade de etapas de

pré-tratamento e/ou de separações cromatográficas.

As infusões de D. nitida e D. elliptica foram obtidas a partir de 1 g das folhas

trituradas. O material vegetal foi mantido em contato com 10 mL de água aquecida

(80°C) por 10 min. A mistura contendo a solução e o material particulado foi filtrado

em filtro de papel e resfriado a temperatura ambiente, em seguida uma alíquota da

solução foi novamente filtrada, agora em membrana de PTFE com poro de 0,45 µm.

A infusão filtrada (500 µL) foi diluída com MeOH para o volume final de 1 mL e a

solução introduzida diretamente na fonte de ESI por meio de uma seringa de vidro

impulsionada por um sistema de bombeamento em fluxo de 3 µL min

–1

Quando comparado ao modo positivo, o modo negativo conduziu a resultados

mais informativos para a obtenção da composição química das infusões de D. nitida

e D. elliptica. Desta forma, embora o modo positivo tenha sido testado, somente os

resultados em modo negativo serão apresentados e discutidos. Assim, o modo

negativo foi escolhido tendo em vista o conhecimento prévio da composição

flavonoídica destas espécies e que esta classe de metabólitos secundários ionizam

facilmente pela desprotonação das hidroxilas fenólicas, sendo as moléculas

desprotonadas dos flavonóides transferidas eficientemente para a fase gasosa como

íons negativos.

Como mostrado nos espectros de massas da Figura 2.16, uma simples

inspeção visual revelou grande similaridade entre os principais íons precursores ([M

– H]

) obtidos para as duas espécies em questão. Confirmando desta forma a

equivalência entre a composição química das espécies e o íon produto de m/z 463,

de alta abundância relativa, parece ser o principal íon diagnóstico encontrado neste

gênero.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

102

DE #124-142 RT: 2,37-2,56 AV: 11 NL: 7,07E5

T: - c Full ms [ 150,00-1000,00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

100

Relative Abundance

462,9

478,9

446,9

316,0

498,7

614,9

576,9

443,0

317,0

630,9

728,8

301,1

760,9245,0 912,8

820,2

988,6

169,0

191,1

DE #124-142 RT: 2,37-2,56 AV: 11 NL: 7,07E5

T: - c Full ms [ 150,00-1000,00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

100

Relative Abundance

462,9

478,9

446,9

316,0

498,7

614,9

576,9

443,0

317,0

630,9

728,8

301,1

760,9245,0 912,8

820,2

988,6

169,0

191,1

DN #1-24 RT: 0,00-0,57 AV: 24 NL: 1,15E6

T: - c Full ms [ 150,00-1000,00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

100

Relative Abundance

463,1

316,2

615,0

169,0

464,2

191,1

317,3

447,2

576,8

264,8

342,9

500,9

630,9

403,0214,9

744,8659,0

788,9 824,8 912,7

982,7

DN #1-24 RT: 0,00-0,57 AV: 24 NL: 1,15E6

T: - c Full ms [ 150,00-1000,00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

100

Relative Abundance

463,1

316,2

615,0

169,0

464,2

191,1

317,3

447,2

576,8

264,8

342,9

500,9

630,9

403,0214,9

744,8659,0

788,9 824,8 912,7

982,7

Figura 2.16. Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, da infusão de D. nitida (A) e

da infusão de D. elliptica (B), avaliados em modo negativo. Para condições espectrométricas veja:

parte Experimental.

Com a finalidade de garantir maior seletividade e especificidade dos íons

precursores observados e ao mesmo tempo dar uma indicação da natureza química

desta matriz, foram adquiridos espectros de segunda-ordem (MS/MS) dos principais

íons diagnósticos, e uma discussão detalhada sobre a interpretação destes íons foi

reportada recentemente por nosso grupo (RODRIGUES; RINALDO; SANNOMIYA et

al., 2007 (anexo), de modo que os experimentos usando FIA-ESI-IT-MS permitiram

confirmar a presença dos metabólitos secundários anteriormente isolados e/ou

identificados.

Análise quantitativa dos infusos e dos extratos MeOH de Davilla nitida e Davilla

elliptica

Apesar de alguns autores citarem que quantificações de metabólitos

secundários de espécies vegetais por HPLC-PAD possam ser realizadas tendo

como referência de calibração um composto que represente as classes das

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

103

substâncias analisadas (MERKEN & BEECHER, 2000; ROBARDS, 2003), ou mais

especificamente que flavonóides glucosilados possam ser quantificados em termos

de uma calibração feita apenas com suas correspondentes agliconas (CONDE et al.,

1997), durante nossos experimentos foi constatada que a resposta analítica

observada para uma aglicona difere daquela gerada por um mono ou dissacarídeo,

ou ainda por um flavonol acetilado.

Esta verificação foi evidenciada durante a comparação das respostas obtidas

com um padrão contendo uma mistura de 11 diferentes flavonóides na concentração

de 0,50 µg mL

-1

A partir da Figura 2.17 foi possível visualizar as diferenças nas intensidades

de absorção entre todos os padrões resolvidos no cromatograma. Além das

variações nas intensidades, foram observadas diferenças significativas nas áreas de

integração. Desta forma, uma quantificação relativa, conforme sugerido por alguns

autores pode resultar na atribuição de valores com erros superiores a 70%.

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

200

300

400

500

11,600

15,547

16,440

17,293

21,653

24,180

29,313

30,653

31,420

37,893

44,640

PDA-360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

Rutina

Quercetina

Amentoflavona

M3O2”GallRha

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

200

300

400

500

11,600

15,547

16,440

17,293

21,653

24,180

29,313

30,653

31,420

37,893

44,640

PDA-360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

Rutina

Quercetina

Amentoflavona

M3O2”GallRha

Figura 2.17. Separação cromatográfica por HLPC-PAD de uma mistura de flavonóides injetados na

concentração de 50,0 µg mL

–1

. 1 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 2 rutina; 3 miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo; 4 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo; 6

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo; 7 miricetina; 8 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo;

9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo; 10 quercetina e 11

amentoflavona. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

Analisando os espectros na região do UV dos flavonóides destacados no

cromatograma anterior (Fig. 2.18), nota-se que a intensidades de absorção da

quercetina e amentoflavona são bem superiores ao dos demais flavonóides,

indicando que a presença de uma ou mais unidades de açúcares promovem os

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

104

efeitos hipsocrômico e hipocrômico (PAVIA et al., 1996) e que esses efeitos

conduzem a diferentes níveis de sensibilidade.

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

120

140

257

355

Rutina 15,54 min, 52 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

120

140

257

355

Rutina 15,54 min, 52 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

120

140

160

180

210

266

351

M3O2”GallRha 30,66 min, 35 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

120

140

160

180

210

266

351

M3O2”GallRha 30,66 min, 35 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

150

200

250

300

350

400

450

371

256

Quercetina 37,89 min, 172 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

150

200

250

300

350

400

450

371

256

Quercetina 37,89 min, 172 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

100

150

200

250

300

350

400

450

371

256

Quercetina 37,89 min, 172 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

200

400

600

800

1000

1200

335

269

Amentoflavona 45,11 min, 507 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

200

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

200

400

600

800

1000

1200

335

269

Amentoflavona 45,11 min, 507 mV em 360 nm

mix 050 µg ml

-1

ACN Hydro2

Figura 2.18. Espectros na região do UV para os flavonóides destacados no cromatograma da Figura

2.18. Identificação: A rutina; B miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo; C quercetina e D

amentoflavona.

Diante dessas observações optou-se em realizar a quantificação individual

dos principais flavonóides encontrados nas duas espécies a partir da construção de

curvas analíticas de calibração com as substâncias isoladas de D. elliptica e com

padrões comerciais.

Construção das curvas analíticas

Uma solução estoque de 100,0 µg mL

–1

em miricetina-3-O-β-

galactopiranosídeo (M3OGal), miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo

(M3O(2"Gall)Rha), miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo

(M3O(3"Gall)Rha), quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo (Q3OGal), miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo (M3ORha), quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo (Q3OAra),

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo (Q3ORha), miricetina, quercetina, rutina e

amentoflavona (1,0 mg/10 mL) foi preparada e solubilizada em MeOH/H

O 7:3 v/v. A

solução estoque foi armazenada em vial âmbar e mantida em freezer a –18ºC.

Soluções padrão cobrindo o intervalo linear em oito níveis de concentração

(0,4; 1; 5; 10; 25; 50; 75 e 100 µg mL

–1

) foram feitas a partir de diluições da solução

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

105

estoque e o volume final das soluções ajustados para 1 mL. As soluções padrão

foram preparadas no momento das análises e conservadas em freezer até o

momento das injeções.

Na etapa de quantificação foi empregado o método de calibração externa. Os

padrões foram analisados por HPLC-PAD e as áreas dos picos obtidos

correlacionados com as concentrações das curvas analíticas (Fig. 2.19). A mistura

entre miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo + miricetina-3-O-β-glicopiranosídeo foi

avaliada em termos de miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo e a miricetina-3-O-(2"-

Galoil)-β-galactopiranosídeo (M3O(2"Gall)Gal) foi determinada em termos de

(M3O(2"Gall)Rha). Os flavonóides minoritários não identificados foram determinados

de acordo a similaridade dos seus espectros na região do UV com aqueles dos

flavonóis utilizados na calibração.

0 20406080100

-5,0x10

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

Área (contagens)

[miricetina-3-O-β-D-galactopiranosídeo] (µg ml

-1

)

0 20406080100

-2,0x10

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

1,2x10

1,4x10

Área (contagens)

[Rutina] µg ml

-1

0 20406080100

-5,0x10

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

4,0x10

Área (contagens)

Miricetina-3-O-α-L-Rhamnopiranosídeo

0 20406080100

-2,0x10

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

1,2x10

1,4x10

1,6x10

1,8x10

Área (contagens)

[quercetina-3-O-β-D-galactopiranosídeo] (µg ml

-1

)

Figura 2.19. Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções em

triplicata de soluções padrões de:

1 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 2 rutina, 3 (miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo,

4 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo, 6

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 7 miricetina, 8 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo, 9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo, 10 quercetina.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

106

Continuação da Figura 2.19

0 20406080100

-5,0x10

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

Área (contagens)

[quercetina-3-O-arabinopiranosídeo] µg ml

-1

0 20406080100

-5,0x10

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

4,0x10

Área (contagens)

[quercetina-3-O-α-L-rhamnopiranosídeo] µg ml

-1

0 20406080100

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

Área (contagens)

[Miricetina] µg ml

-1

0 20406080100

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

Área (contagens)

[Miricetina-3-O-(2"-O-Galoil)-α-L-Rhamnopiranosídeo] µg ml

-1

0 20406080100

-1x10

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

6x10

7x10

8x10

Áreas (contagens)

[Miricetina-3-O-(3"-O-Galoil)-α-L-Rhamnopiranosídeo] µg ml

-1

0 20406080100

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

Áreas (contagens)

[Quercetina] µg ml

-1

Figura 2.19. Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa a partir de injeções em

triplicata de soluções padrões de:

1 miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 2 rutina, 3 (miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo, 4 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo, 5 quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo, 6

quercetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, 7 miricetina, 8 miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo,

9 miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo, 10 quercetina.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

107

Os parâmetros estatísticos que definiram a função linear para cada uma das

curvas analíticas são mostrados na Tabela 2.7, sendo que todas as curvas

apresentaram um coeficiente de correlação (r) superior a 0,99.

Tabela 2.7. Dados de regressão linear para os flavonóides empregados como padrões na elaboração

das curvas analíticas

Flavonóide Coeficiente

linear (a)

Coeficiente

angular (b)

Coeficiente de

correlação (r)*

Faixa linear

(µg mL

–1

)

LOD

(µg mL

–1

)

LOQ

(µg mL

–1

)

M3OGal 758 30417 0,9992 0,4-100 0,08 0,25

Rutina 627 12392 0,9998 0,4-100 0,17 0,51

M3ORha 1619 35911 0,9995 0,4-100 0,15 0,45

Q3OGal 305 15581 0,9990 0,4-100 0,06 0,20

Q3OAra 1325 28215 0,9994 0,4-100 0,15 0,47

Q3ORha 1354 38614 0,9995 0,4-100 0,12 0,35

Miricetina -2775 40416 0,9975 5-100 0,23 0,68

M3O(2"OGall)Rha -245 9026 0,9998 0,4-100 0,09 0,27

M3O(3"OGall)Rha 387 7749 0,9976 0,4-100 0,16 0,49

Quercetina -2165 38636 0,9980 0,4-100 0,18 0,56

** Todas as curvas analíticas apresentaram significância P > 0,0001.

Procedimento de otimização da extração dos metabólitos secundários

O estudo consistiu na determinação dos metabólitos extraíveis em dois tipos

de preparação: O primeiro na forma de infuso, tradicional modo de administração

empregado pela população no consumo de espécies vegetais consideradas “plantas

medicinais”. A segunda, na forma de extrato orgânico polar, mimetizando as

preparações de extratos comumente obtidos nos laboratórios de fitoquímica e ao

nosso protocolo para de obtenção de extratos (Esquema 2.1).

Infusão: Dois experimentos para a obtenção dos infusos das espécies

estudadas foram avaliados. No primeiro foi considerada a quantidade de amostra

usada no preparo da infusão e a diluição necessária para garantir que os analitos

estivessem contidos na faixa linear de cada curva analítica. No segundo experimento

foi considerado o tempo de contato do material vegetal com o solvente extrator.

Primeiro experimento: Quantidades precisas de 500, 1000 e 2000 mg de D.

elliptica foram colocadas separadamente em erlenmeyers de 125 mL, em seguida

foram adicionados 20 mL de água aquecida a 80ºC. A solução de extração foi

mantida em contato com o material vegetal por 10 min, conforme sugerido pelo

trabalho de DALLUGE e colaboradores (1998). Em seguida a solução foi filtrada em

filtro de papel para remoção de macro partículas, sendo o efluente coletado

diretamente em um balão volumétrico. Uma vez alcançada a temperatura ambiente

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

108

da solução, esta teve o volume final ajustado para 25 mL, sendo que alíquotas foram

filtradas em membranas de PTFE de 0,45 µm e analisadas por HPLC.

Nesse experimento foi verificado que o sinal analítico da solução de 500 mg

25 mL

-1

foi significativo apenas para os picos cromatográficos dos flavonóis de maior

intensidade. Por sua vez, a solução de 2000 mg 25 mL

-1

não apresentou

estabilidade em resolução de linha de base durante a corrida cromatográfica. O

melhor resultado foi obtido com a solução de 1000 mg 25 mL

-1

, em que todos os

picos cromatográficos para os flavonóis identificados na espécie permaneceram

dentro da faixa de calibração das curvas analíticas. Além do mais, não foi observado

o efeito de saturação na coluna cromatográfica (carry-over) em injeções seqüenciais

feitas em branco.

Segundo experimento: Nesse ponto foi avaliada a eficiência de extração do

solvente em função do tempo de contato com a amostra vegetal. Os metabólitos

foram extraídos em quatro tempos diferentes, 0, 5, 10 e 15 min e a área do flavonol

miricetina-3-O-α-rhamnonopiranosídeo (M3ORha) extraído no processo foi usada

como o parâmetro de referência. Todas as análises foram realizadas em triplicata de

extração.

O tempo de 0 min consistiu em apenas passar 20 mL de água aquecida

através de um filtro de papel contendo 1000 mg do material vegetal. Os demais

foram os tempos em que o solvente extrator permaneceu em contato com o material

vegetal no erlenmeyer.

A Figura 2.20 ilustra uma curva que representa o sinal analítico obtido em 360

nm para a integração da área do flavonol M3ORha em função do tempo. A partir da

análise do gráfico, verifica-se que a área de integração permaneceu inalterada após

10 min entre o solvente extrator e o material vegetal, indicando que a extração havia

alcançado o máximo de eficiência após esse tempo de exposição. Desta forma,

mantivemos para todos os experimentos com infusos o tempo de 10 min de contato

entre o solvente extrator e o material vegetal.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

109

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16

1,2x10

1,4x10

1,6x10

1,8x10

2,0x10

2,2x10

2,4x10

2,6x10

2,8x10

3,0x10

3,2x10

Área M3ORha (contagens)

Tempo de extração (min)

Figura 2.20. Efeito da eficiência de extração do solvente em função do tempo (n = 3). O eixo y

representa a área do pico cromatográfico para o flavonol miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo

presente no infuso das folhas de D. elliptica.

Extrato MeOH: O procedimento de obtenção do extrato MeOH seguiu o protocolo

utilizado para obtenção de extratos em nosso laboratório e neste estudo foi levado

em conta a aplicação dos critérios de obtenção discutidos anteriormente.

Uma quantidade conhecida do material vegetal (2,0 g) foi colocado em

erlenmeyer de 125 mL, em seguida foram adicionados 25 mL de CHCl

e a amostra

submetida a ultra-som por 30 min. Esse procedimento foi repetido quatro vezes e

teve a finalidade de remover material lipofílico, além de outros constituintes químicos

de natureza apolar. A cada extração o sobrenadante foi submetido a análises por

TLC para verificar possíveis perdas dos analitos de interesse, não sendo observadas

perdas significativas.

Ao final da quarta extração com CHCl

o material sólido (torta) foi seco e uma

quantidade precisa de 1000 mg foi separada e submetida ao mesmo procedimento

de extração, empregando nesta etapa MeOH como solvente extrator.

A cada extração com MeOH, os sobrenadantes foram analisados por TLC,

filtrados em filtro de papel e reagrupados.

As análises por TLC indicaram que a remoção completa dos flavonóis ocorreu

entre segunda e a terceira extração com MeOH, desta forma optou-se em manter as

quatro extrações de modo a garantir que não houvesse perdas durante esse

processo.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

110

Para remover a clorofila remanescente, o extrato MeOH foi seco sob fluxo de

fornecendo um resíduo, este por sua vez foi redissolvido em um pequeno volume

(3-5 mL) de MeOH/H

O 7:3 v/v e submetido a uma etapa de SPE em cartucho Sep

Pak RP18 (500 mg 6 mL

-1

). Os flavonóis foram eluídos do cartucho com 15 mL de

MeOH, o eluato foi coletado diretamente em um balão volumétrico e o volume final

da solução ajustado com H

O para 25 mL. Alíquotas foram filtradas em membranas

de PTFE de 0,45 µm e analisadas por HPLC.

O material retido no cartucho de SPE foi eluído posteriormente com CHCl

e o

eluato avaliado por TLC, não sendo constatada a presença de flavonóides nessa

fração.

Uma vez estabelecida as condições otimizadas de extração, a próxima etapa

consistiu em realizar a quantificação dos metabólitos secundários nas duas espécies

de Davilla e em ambas as preparações, infuso e extrato MeOH.

Preparo das amostras

Nessa etapa foram avaliadas três amostras: as folhas de D. elliptica coletadas

em março de 2004 e as folhas de D. nitida coletadas nas épocas de agosto de 2002

(primeira coleta) e março de 2004 (segunda coleta). O preparo das amostras,

infusão e extrato MeOH, foi feito em triplicata de extração.

Tento em vista que o processo de padronização de extratos vegetais também

é um critério fundamental para se estabelecer correlações entre a quantidade das

substâncias encontradas e o seu possível efeito terapêutico (GREGÓRIO, 2006),

além da quantificação específica dos flavonóis, foi realizado um balanço de massa

entre os extratos MeOH das espécies investigadas (Fig. 2.21).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

111

123

100

120

140

160

Massa ExMeOH (mg/g folha)

Figura 2.21. Representação das massas obtidas por meio dos processos de extração em MeOH (n =

3).

1) D. nitida primeira coleta, 2) D. nitida segunda coleta e 3) D. elliptica.

Análise da Figura 2.21 mostra que a relação planta-extrato obtido foi de

10,9% e 11,3% para a primeira (1) e segunda coleta de D. nitida (2),

respectivamente e que para D. elliptica (3) esse valor foi de 14,9%. Ou seja, no caso

dos 14,9%, a relação planta-extrato foi de 7:1 representando que são necessários 7

g da planta seca para fornecer 1 g de resíduo do extrato MeOH de D. elliptica. Como

não houve diferença significativa para os valores encontrados entre as duas

coletadas de D. nitida, foi estabelecido o valor médio de 11% no rendimento para o

extrato MeOH obtido, e este valor representa então uma proporção planta-extrato de

9:1.

Aplicação dos métodos de quantificação

Como pode ser visto na Tabela 2.8, miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo, pico

5 dos cromatogramas da Figuras 2.22 e 2.23, caracterizou-se como o flavonol

majoritário em ambas as espécies. Comparação entre os dois períodos de coleta

realizados para D. nitida mostrou um aumento na produção dos flavonóis mais

polares durante o segundo período de coleta, sendo que essas concentrações são

mais expressivas para os flavonóis miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo (1),

miricetina-3-O-(2"-O-Galoil)-β-galactopiranosídeo (2), rutina (4), miricetina-3-O-α-

rhamnopiranosídeo (5) e quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo (6) em ambas as

preparações.

Comparando ainda as duas metodologias de obtenção dos metabólitos

secundários para as espécies estudadas, notamos, através do conteúdo total de

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

112

flavonóides, que ocorreu uma maior eficiência no modelo de extração que emprega

o uso de solvente orgânico. Para as três amostras analisadas foi possível constatar

um rendimento superior a 50% quando comparamos o conteúdo total de flavonóides

obtidos por infusos com aqueles obtidos por extração em MeOH, e esse fato pode

ser atribuído à baixa solubilidade desses metabólitos em água. Esta característica

pode ser facilmente ressaltada se compararmos, por exemplo, os valores de

concentração obtidos das duas preparações para os flavonóis acetilados miricetina-

3-O-(2"-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo (13) e miricetina-3-O-(3"-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo (14) em D. nitida primeira coleta. Nota-se que para o extrato

MeOH as concentrações encontradas foram duas vezes superiores aquelas obtidas

para o infuso.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

113

Tabela 2.8. Dados quantitativos referentes à concentração individual dos flavonóides encontrados em

fitopreparações (infuso e extrato metanólico) feitas com as folhas de D. nitida e D. elliptica. Avaliação

da eficiência dos modelos de extração e comparação da variação no teor de flavonóides em períodos

sazonais distintos

D. nitida Infusão 1ª coleta D. nitida ExMeOH 1ª coleta

Concentração ± DP *

(µg mL

-1

)

Concentração ± DP

(mg kg

-1

) folhas

Concentração ±

DP (µg mL

-1

)

Concentração ± DP

(mg kg

-1

) folhas

1) M3OGal + M3OGli 5,04 ± 0,05 126,12 ± 0,68 7,33 ± 0,03 183,30 ± 0,32

2) M3O(2"OGall)Gal 4,22 ± 0,01 105,54 ± 0,06 5,68 ± 0,01 142,09 ± 0,13

3) NI** 0,97 ± 0,02 24,35 ± 0,24 1,07 ± 0,01 26,77 ± 0,17

4) Rutina 2,35 ± 0,12 55,81 ± 1,55 3,90 ± 0,04 97,59 ± 0,44

5) M3ORha 99,35 ± 0,51 2483,8 ± 6,4 102,33 ± 0,30 2558,2 ± 3,8

6) Q3OGal 2,72 ± 0,48 67,91 ± 5,97 4,77 ± 0,06 119,17 ± 0,80

7) NI 1,18 ± 0,24 29,50 ± 3,05 2,07 ± 0,15 51,70 ± 1,85

8) NI 0,56 ± 0,01 14,05 ± 0,09 0,91 ± 0,13 22,75 ± 1,68

9) Q3OAra 0,83 ± 0,03 20,64 ± 0,33 1,01 ± 0,02 25,36 ± 0,30

10) NI 0,52 ± 0,01 12,95 ± 0,02 0,82 ± 0,03 20,58 ± 0,38

11) Q3ORha 12,78 ± 0,15 319,57 ± 1,86 16,22 ± 0,45 405,45 ± 5,57

12) Miricetina 0,56 ± 0,03 14,05 ± 0,42 1,61 ± 0,31 40,36 ± 3,87

13) M3O(2"OGall)Rha 47,16 ± 0,19 1179,1 ± 2,2 94,84 ± 0,42 2371,1 ± 5,2

14) M3O(3"OGall)Rha 54,41 ± 0,28 1360,1 ± 3,6 101,88 ± 0,88 2547,1 ± 11,0

15) NI 1,61 ± 0,04 40,24 ± 0,56 3,84 ± 0,05 96,12 ± 0,66

16) NI 1,14 ± 0,01 28,51 ± 0,09 2,51 ± 0,05 62,69 ± 0,62

17) quercetina 1,25 ± 0,01 31,28 ± 0,10 3,77 ± 0,08 94,34 ± 0,94

Flavonóides totais

236,66 ± 0,84 5916,5 ± 10,5 354,59 ± 1,18 8864,7 ± 14,8

D. nitida Infusão 2ª coleta D. nitida ExMeOH 2ª coleta

[ ] (µg mL

-1

) [ ] (mg kg

-1

) folhas [ ] (µg mL

-1

) [ ] (mg kg

-1

) folhas

1) M3OGal + M3OGli 20,41 ± 0,04 510,37 ± 0,51 28,41 ± 0,01 710,18 ± 0,16

2) M3O(2"OGall)Gal 7,10 ± 0,03 177,38 ± 0,36 9,21 ± 0,10 230,23 ± 1,21

3) NI 1,16 ± 0,01 29,10 ± 0,10 1,55 ± 0,09 38,71 ± 1,19

4) Rutina 11,57 ± 0,13 289,20 ± 1,64 23,63 ± 0,60 590,76 ± 7,47

5) M3ORha 158,14 ± 0,20 3953,44 ± 2,51 191,39 ± 0,23 4784,76 ± 2,6

6) Q3OGal 9,33 ± 0,17 233,13 ± 2,18 16,00 ± 0,08 399,95 ± 1,01

7) NI 1,87 ± 0,16 46,78 ± 1,95 4,00 ± 0,04 99,90 ± 0,45

8) NI 0,78 ± 0,01 19,53 ± 0,04 1,26 ± 0,11 31,51 ± 1,34

9) Q3OAra 1,52 ± 0,08 38,01 ± 1,00 3,38 ± 0,07 90,87 ± 0,90

10) NI 1,23 ± 0,01 30,79 ± 0,18 2,14 ± 0,04 53,39 ± 0,56

11) Q3ORha 18,54 ± 0,16 463,61 ± 2,03 26,62 ± 0,03 665,52 ± 0,36

12) Miricetina nd*** nd 3,30 ± 0,02 82,61 ± 0,21

13) M3O(2"OGall)Rha 33,00 ± 0,10 825,04 ± 1,23 94,52 ± 0,52 2363,07 ± 6,5

14) M3O(3"OGall)Rha 40,05 ± 0,22 1001,3 ± 2,75 97,81 ± 4,47 2445,32 ± 55,9

15) NI 1,41 ± 0,06 35,15 ± 0,80 4,34 ± 0,20 108,40 ± 2,49

16) NI 0,87 ± 0,03 21,76 ± 0,33 2,37 ± 0,07 59,30 ± 0,87

17) quercetina 1,32 ± 0,10 32,89 ± 1,24 5,39 ± 0,35 134,70 ± 4,38

Flavonóides totais

308,30 ± 0,46 7707,4 ± 5,9 515,81 ± 4,57 12895,2 ± 57,1

D. elliptica Infusão D. elliptica ExMeOH

[ ] (µg mL

-1

) [ ] (mg kg

-1

) folhas [ ] (µg mL

-1

) [ ] (mg kg

-1

) folhas

1) M3OGal + M3OGli 38,28 ± 0,45 956,90 ± 5,6 51,80 ± 0,09 1294,89 ± 1,2

2) M3O(2"OGall)Gal 8,21 ± 0,11 205,37 ± 1,34 9,86 ± 0,08 246,43 ± 0,95

3) NI 4,16 ± 0,02 104,04 ± 0,23 4,24 ± 0,03 106,05 ± 0,32

4) Rutina 23,26 ± 0,46 581,41 ± 5,80 32,07 ± 0,14 801,80 ± 1,78

5) M3ORha 100,34 ± 0,01 2508,5 ± 0,1 121,60 ± 0,70 3040,11 ± 8,8

6) Q3OGal 22,59 ± 1,70 564,76 ± 21,25 30,65 ± 0,10 766,33 ± 1,19

7) NI 1,90 ± 0,42 47,41 ± 5,25 2,86 ± 0,04 71,56 ± 0,56

8) NI 2,14 ± 0,03 53,59 ± 0,37 2,25 ± 0,01 56,35 ± 0,01

9) Q3OAra 5,97 ± 0,05 149,31 ± 0,59 9,40 ± 0,01 234,98 ± 0,06

10) NI 4,17 ± 0,02 104,35 ± 0,31 5,76 ± 0,03 144,10 ± 0,41

11) Q3ORha 28,27 ± 0,29 706,81 ± 3,65 37,73 ± 1,02 943,31 ± 12,70

12) Miricetina 0,98 ± 0,08 24,49 ± 0,98 6,81 ± 0,10 170,26 ± 1,30

13) M3O(2"OGall)Rha 19,76 ± 0,39 494,07 ± 4,87 42,74 ± 0,25 1068,60 ± 3,1

14) M3O(3"OGall)Rha 23,43 ± 1,38 585,79 ± 17,22 32,64 ± 0,13 815,95 ± 1,64

15) NI 2,25 ± 0,05 56,24 ± 0,57 5,53 ± 0,01 138,37 ± 0,04

16) NI 1,07 ± 0,06 26,65 ± 0,74 3,00 ± 0,21 74,92 ± 2,60

17) quercetina 0,72 ± 0,01 18,06 ± 0,14 4,29 ± 0,07 107,27 ± 0,83

Flavonóides totais

287,51 ± 2,38 7187,7 ± 29,7 403,25 ± 1,31 10081,3 ± 16,4

* DP = desvio padrão para n = 6;

** NI = não identificado;

*** nd = não detectado.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

114

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

125

150

175

200

225

PDA-360 nm

D elliptica (1) 2coleta infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

910

13 14 15 16 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

125

150

175

200

225

PDA-360 nm

D elliptica (1) 2coleta infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

910

13 14 15 16 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

350

400

450

PDA-360 nm

D nitida 2coleta (1) infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

910

13 14

15 16 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

350

400

450

PDA-360 nm

D nitida 2coleta (1) infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

910

13 14

15 16 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

PDA-360 nm

D nitida 1coleta (1) infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 001

13 14

15 16 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

PDA-360 nm

D nitida 1coleta (1) infusao 1g 25 ml mth ACN Hydro2 001

13 14

15 16 17

Figura 2.22. Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos flavonóides presentes

no infuso das folhas de D. nitida e D. elliptica. Identificação dos picos cromatográficos é a mesma

dada na Tabela 2.8.

A) D. elliptica, B) D. nitida coleta: agosto de 2002 e C) D. nitida coleta: março de

2002. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

). Volume

injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 2.5).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

115

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

PDA-360 nm

D elliptica (2) 2coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

PDA-360 nm

D elliptica (2) 2coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516 17

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

125

150

175

200

225

PDA-360 nm

D nitida (2) 1coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

125

150

175

200

225

PDA-360 nm

D nitida (2) 1coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

350

400

450

PDA-360 nm

D nitida (1) 2coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

350

400

450

PDA-360 nm

D nitida (1) 2coleta MeOH 1g 25 ml mth ACN Hydro2 002

13 14

1516

Figura 2.23. Separação cromatográfica empregada na etapa quantitativa dos flavonóides presentes

no extrato MeOH das folhas de D. nitida e D. elliptica. Identificação dos picos cromatográficos é a

mesma dada na Tabela 2.8.

A) D. elliptica, B) D. nitida coleta: agosto de 2002 e C) D. nitida coleta:

março de 2002. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC-PAD (Jasco

Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela

2.5).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

116

Capítulo 3:

Gênero Byrsonima (Malpighiaceae)

A família Malpighiaceae compreende aproximadamente 60 gêneros e 1200

espécies, sendo que 50% encontram-se no Brasil. Sua distribuição geográfica é

pantropical com concentração na América do Sul (Fig. 3.1). São árvores, arbustos ou

trepadeiras simples. Seu uso econômico se dá como frutos comestíveis, ornamental

ou como ingrediente chave em misturas alucinógenas desenvolvidas por tribos

indígenas na Amazônia (HEYWOOD, 1993). É o caso do gênero Banisteriopsis,

cujas espécies são empregadas em rituais indígenas e seu efeito alucinógeno está

relacionado com a presença de alcalóides carbolínicos (GHOSAL, 1972). Os

gêneros mais importantes da América meridional são Malpighia e Byrsonima (JOLY,

1977).

No Brasil, membros do gênero Byrsonima são empregados não apenas na

medicina popular, como antiasmáticas, antifebris e no tratamento de infecções

cutâneas (CÁCERES et al., 1993), mas também como fonte alimentícia no preparo

de sucos, geléias e licores, principalmente na região Norte e Nordeste do Brasil

(SANNOMIYA et al., 2004).

Figura 3.1. Distribuição geográfica das espécies pertencentes à família Malpighiaceae (Heywood,

1993).

Até o momento, poucas espécies foram estudadas quimicamente. GOTTLIEB

e colaboradores (1975) isolaram triterpenos do tronco de B. verbascifolia. As folhas

de B. microphylla forneceram triterpenos esterificados com ácidos graxos, quercetina

e galato de metila (MENDES et al., 1999). Vários grupos de pesquisas estudaram

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

117

quimicamente B. crassifolia, da qual foram isolados compostos voláteis dos frutos,

glicolipídeos, triterpenos, catequinas, e flavonóides das folhas (AMARQUAYE et al.,

1994; RASTRELLI et al., 1997) e, do tronco proantocianidinas (GEISS et al., 1995).

No Norte e Nordeste do Brasil, as folhas e troncos de algumas espécies de

Byrsonima são usados popularmente em disfunções gástricas, infecções cutâneas,

contra picadas de cobra e ainda como antidiarréicos (AMARQUAYE et al., 1994). A

literatura relata os efeitos espasmogênicos em ratos (BEJAR et al., 1995), atividade

antifúngica (CÁCERES et al., 1993), bactericida (MARTÍNEZ-VÁSQUEZ et al., 1999)

e antidermatófita de B. crassifolia (CÁCERES et al., 1991).

Apesar do vasto uso popular de espécies deste gênero como medicamento,

na terapêutica contra asmas, contra a febre e no tratamento de infecções cutâneas

(CÁCERES et al., 1991), encontram-se poucos estudos sobre a química e apenas

para algumas das espécies pertencentes a este gênero. Essa incipiência de dados

justificou o trabalho de realizar o estudo de extratos das folhas de B. basiloba, B.

coccolobifolia, B. crassa, B. fagifolia e B. intermedia. (Fig. 3.2).

Dentro deste contexto, cinco espécies do gênero Byrsonima, as quais

possuem indicações etnofarmacológicas como antiúlceras, foram investigadas

quanto à similaridade entre as suas composições químicas através do uso das

técnicas de HPLC-PAD e FIA-ESI-IT-MS.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

118

Byrsonima basiloba A.Juss. Byrsonima intermedia A. Juss.

Byrsonima crassa Nied. Byrsonima fagifolia Nied.

Byrsonima coccolobifolia Kunth

Figura 3.2. Fotos das espécies do gênero Byrsonima estudadas.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

119

Parte experimental / Resultados e discussões

Identificação das classes de substâncias presentes em B. crassa

A avaliação das espécies do gênero Byrsonima iniciou com a investigação por

HPLC-PAD dos metabólitos secundários encontrados nos eluatos provenientes do

clean-up de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa em SPE (Esquema 3.1).

Após as análises cromatográficas, usando os gradientes de eluição descritos na

Tabela 3.1, foi possível identificar algumas das substâncias eluídas. As

identificações foram baseadas na aquisição de dados espectroscópicos na região do

UV, por comparação do tempo de retenção e principalmente por co-injeção com

padrões comerciais ou por aqueles isolados de fontes vegetais.

10 mg do

extrato MeOH

~0,5mL MeOH

2 mL MeOH/H

O 2 : 8 (v/v)

clean-up

Sep Pak RP18

5 mL

MeOH/H

2 : 8 (v/v)

1ª eluição

3ª eluição

5 mL

MeOH

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

amostra solubilizada

em ultra-som

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

5 mL

MeOH/H

1 : 1 (v/v)

2ª eluição

millex 0,45 µm e

análise em HPLC

Esquema 3.1. Etapas de clean-up empregadas nos procedimentos de SPE do extrato MeOH de B.

crassa em cartuchos de Sep Pak RP18.

Tabela 3.1. Gradientes de eluição empregados na separação por HPLC-PAD dos metabólitos

secundários de Byrsonima crassa

Sistema 1

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 23

50 36

60 100

70 100

Sistema 2

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 32

20 38

60 80

61 100

65 100

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

120

No primeiro eluato da SPE foram caracterizadas substâncias pertencentes à

classe de ácidos fenólicos (bandas intensas nas faixas espectrais de 190-220 e 260-

280 nm) e de catequinas (bandas intensas na faixa espectral de 190-220 e bandas

fracas de 270-280 nm) (ROHR et al., 2000; WANG et al., 2000). A partir do

cromatograma da Figura 3.3 foi possível identificar os seguintes metabólitos

secundários: 1 ácido gálico; 2 galato de metila; 3 catequina; 4 epicatequina e 5

epigalocatequina galato.

Absorbância 210 nm (AU)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração H

O/MeOH 8:2 da SPE em C

Absorbância 210 nm (AU)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração H

O/MeOH 8:2 da SPE em C

Figura 3.3. Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH/H

O 2:8 v/v obtido após

clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa. Identificação:

1 ácido gálico; 2

galato de metila; 3 catequina; 4 epicatequina; 5 galato de epigalocatequina. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 1).

No segundo eluato da SPE foi verificada a presença de flavonóides e taninos

condensados. Para evitar a interferência espectral dos taninos condensados, os

flavonóides foram monitorados em 360 nm e deste eluato foi possível identificar

diretamente mais cinco substâncias: 6 quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo; 7

quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo; 8 quercetina-3-O-α-

arabinopiranosídeo; 9 quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-arabinopiranosídeo e 10

quercetina, dos quais três haviam sido descritas por SANNOMIYA e colaboradores

(2004) (Fig. 3.4).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

121

Absorbância 360 nm (mAU)

100

200

300

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração H

O/MeOH 1:1 da SPE em C

Absorbância 360 nm (mAU)

100

200

300

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração H

O/MeOH 1:1 da SPE em C

Figura 3.4. Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH/H

O 1:1 v/v obtido após

clean-up em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa. Identificação: 6 quercetina-3-O-

β-galactopiranosídeo;

7 quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-β-galactopiranosídeo; 8 quercetina-3-O-α-

arabinopiranosídeo; 9 quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-arabinopiranosídeo; 10 quercetina. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 360

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 2).

No terceiro eluato da SPE foi observada a presença de um único pico

cromatográfico. A substância eluída foi também caracterizada como um flavonóide

por apresentar espectro na região do UV com dois máximos de absorção em 268 e

335 nm, máximos que por sua vez são compatíveis com as bandas I e II, referentes

aos anéis B e A de um núcleo flavonoídico (MERKEN & BEECHER, 2000). Após os

experimentos de co-injeção, verificou-se tratar de um biflavonóide: 11 amentoflavona

(Fig. 3.5).

Absorbância 360 nm (mAU)

100

200

300

400

500

600

700

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração MeOH da SPE em C

Absorbância 360 nm (mAU)

100

200

300

400

500

600

700

10 20 30 40 50 60

Tempo (min)

Fração MeOH da SPE em C

Figura 3.5. Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH 100% obtido após clean-up

em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa. Identificação: 11 amentoflavona. Coluna

Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

), fluxo 1,0 mL min

-1

, λ = 360

nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 2).

Averiguação em vários comprimentos de onda, conforme ilustrado no

cromatograma da Figura 3.6, mostrou a ausência de outras substâncias que

apresentassem grupos cromóforos, indicando assim que houve seletividade na

eluição deste flavonóide nas condições empregadas. Portanto, a partir dos

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

122

experimentos que envolveram as etapas de SPE do extrato MeOH das folhas de B.

crassa, nota-se que o procedimento pode ser uma estratégia bastante interessante

se um dos objetivos for o de isolar o biflavonóide 11 em quantidades apreciáveis e

com relativo grau de pureza. Esses fatores são imprescindíveis para a realização de

ensaios químico-farmacológicos, principalmente in vivo. Por outro lado, este aspecto

pode apresentar um fator complicador, visto que a eluição de metabólitos

secundários em todos os efluentes da SPE fragmenta o número de amostras com

conseqüente aumento do número de análises, fator que não é desejável,

principalmente em avaliações de ordem quantitativa. Desta maneira, as etapas de

eluição com MeOH/H

O 1:1 v/v e MeOH durante o procedimento de SPE foram

unificados para que todos os flavonóides fossem coletados em um único eluato.

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

-0.1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Absorbância (AU)

46.01

A) λ = 254 nm

B) λ = 270 nm

C) λ = 330 nm

D) λ = 210 nm

E) λ = 360 nm

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

-0.1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Absorbância (AU)

46.01

A) λ = 254 nm

B) λ = 270 nm

C) λ = 330 nm

D) λ = 210 nm

E) λ = 360 nm

Figura 3.6. Cromatograma de separação por HPLC-PAD do eluato MeOH 100% obtido após clean-up

em SPE de 10 mg do extrato MeOH das folhas de B. crassa. Avaliação do flavonóide

amentoflavona com comprimento de onda processado em:

A) 254 nm; B) 270 nm; C) 330 nm; D) 210

nm e

E) 360 nm. Coluna Phenomenex

Luna (2) RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 5 µm), HPLC (Varian

fluxo 1,0 mL min

-1

. (Para condições de eluição veja Tabela 3.1, Sistema 2).

Triagem cromatográfica das espécies do gênero Byrsonima

Devido ao longo tempo entre a produção dos extratos MeOH das demais

espécies e sua avaliação cromatográfica, foi verificado que a composição referente à

catequinas havia sido comprometida por conta dos efeitos de estabilidade,

discutidos previamente no Capítulo 1. Desta forma, as análises foram inviabilizadas

pela grande quantidade de taninos condensados. Para contornar este problema

optou-se em avaliar a composição química das espécies investigadas a partir de

infusos recém preparados.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

123

O infuso de cada espécie foi feito com 1 g das folhas secas e trituradas. O

material vegetal foi colocado em um erlenmeyer de 125 mL e em seguida adicionado

10 mL de água aquecida a 80°C. O solvente foi mantido em contato com o material

vegetal por 10 min sob agitação manual. O infuso foi posteriormente filtrado em filtro

de papel para remoção de macro partículas e a solução filtrada ajustada em um

balão volumétrico para o volume final de 10 mL. Alíquotas dos infusos foram filtradas

em membranas de PTFE (0,45 µm) e analisadas por HPLC-PAD.

A identificação das substâncias presentes nos infusos nas espécies de

Byrsonima foi efetuada após as análises cromatográficas. Condições otimizadas

foram empregadas na eluição cromatográfica para a avaliação dos derivados de

ácidos fenólicos e catequinas (Sistema 1, Tabela 3.2) e dos flavonóides (sistema 2,

Tabela 3.2). As substâncias encontradas foram comparadas com aquelas presentes

em um banco de padrões e a identificação realizada conforme discutido nos

capítulos anteriores.

Tabela 3.2. Gradientes de eluição empregados na separação por HPLC-PAD dos metabólitos

secundários presentes em espécies do gênero Byrsonima

Sistema 1

Gradiente

Solvente A Solvente B

Tempo (min) %B

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 23

50 36

60 100

70 100

Sistema 2

O + TFA 0,05% ACN + TFA 0,05%

0 32

20 38

60 80

61 100

65 100

Após a avaliação dos espectros na região do UV para as espécies de

Byrsonima foi verificada grande similaridade quanto à composição de derivados de

ácidos fenólicos, catequinas e mesmo trabalhando com infusos houve significativa

presença de taninos condensados em B. crassa, B. coccolobifolia, B. intermedia e

em B. basiloba (Fig. 3.7A-D). Por outro lado, B. fagifolia não apresentou em sua

composição a presença dos flavan-3-óis monoméricos e poliméricos (Fig. 3.7E),

característicos nas outras quatro espécies.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

124

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-200

-100

100

200

300

3,44

4,24

4,78

9,16

14,60

15,04

15,63

17,87

19,49

21,00

23,41

24,84

25,65

26,42

27,63

28,36

29,68

30,43

32,62

39,08

PDA-210 nm

B coccolobifolia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-200

-100

100

200

300

3,44

4,24

4,78

9,16

14,60

15,04

15,63

17,87

19,49

21,00

23,41

24,84

25,65

26,42

27,63

28,36

29,68

30,43

32,62

39,08

PDA-210 nm

B coccolobifolia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

5,08

6,94

14,84

17,58

20,48

23,65

24,46

26,24

28,09

30,75

31,68

32,39

33,36

34,60

35,42

38,65

39,07

40,30

PDA-210 nm

B basiloba mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

200

400

600

800

1000

5,08

6,94

14,84

17,58

20,48

23,65

24,46

26,24

28,09

30,75

31,68

32,39

33,36

34,60

35,42

38,65

39,07

40,30

PDA-210 nm

B basiloba mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-200

-100

100

200

300

400

500

3,48

4,80

15,00

17,90

20,94

23,74

26,44

27,653

28,25

29,22

30,42

35,46

37,04

38,29

49,39

PDA-210 nm

B crassa mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-200

-100

100

200

300

400

500

3,48

4,80

15,00

17,90

20,94

23,74

26,44

27,653

28,25

29,22

30,42

35,46

37,04

38,29

49,39

PDA-210 nm

B crassa mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Figura 3.7. Separação cromatográfica por HPLC-PAD do infuso das folhas de: A) B. coccolobifolia; B)

B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x

4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 1).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

125

Continuação da Figura 3.7

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-100

100

200

300

400

3,41

4,73

5,53

6,05

9,12

11,07

11,92

15,03

15,55

17,96

18,57

19,28

20,78

23,61

26,31

27,52

28,24

29,0

29,64

30,29

31,32

31,77

33,76

34,99

35,40

35,92

36,97

38,21

PDA-210 nm

B intermedia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

-100

100

200

300

400

3,41

4,73

5,53

6,05

9,12

11,07

11,92

15,03

15,55

17,96

18,57

19,28

20,78

23,61

26,31

27,52

28,24

29,0

29,64

30,29

31,32

31,77

33,76

34,99

35,40

35,92

36,97

38,21

PDA-210 nm

B intermedia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

500

1000

1500

2000

2500

3,88

4,53

5,36

5,63

5,96

10,39

11,60

17,16

19,38

20,91

23,09

28,48

29,98

30,50

32,37

33,15

33,79

35,04

35,35

36,36

37,02

37,88

40,58

PDA-210 nm

B fagifolia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Absorbância (mv)

500

1000

1500

2000

2500

3,88

4,53

5,36

5,63

5,96

10,39

11,60

17,16

19,38

20,91

23,09

28,48

29,98

30,50

32,37

33,15

33,79

35,04

35,35

36,36

37,02

37,88

40,58

PDA-210 nm

B fagifolia mth Cat_PheAci ACN Hydro4

Figura 3.7. Separação cromatográfica por HPLC-PAD do infuso das folhas de: A) B. coccolobifolia; B)

B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia. Coluna Phenomenex

Synergi Hydro (250 x

4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL, fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 210 nm. (Para

condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 1).

Comparação entre a composição dos flavonóides evidenciou certo padrão de

ocorrência para alguns desses metabólitos secundários, principalmente para os

flavonóides monoglucosilados (Fig. 3.8). A Tabela 3.3 lista as principais substâncias

encontradas nas espécies de Byrsonima.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

126

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

5,16

6,32

14,63

15,04

15,52

16,72

17,433

18,06

21,00

23,50

25,89

26,71

34,97

PDA-360 nm

B coccolobifolia ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

5,16

6,32

14,63

15,04

15,52

16,72

17,433

18,06

21,00

23,50

25,89

26,71

34,97

PDA-360 nm

B coccolobifolia ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

3,260

9,54

14,56

15,02

16,65

17,38

17,97

18,77

20,94

23,00

26,70

45,07

PDA-360 nm

B basiloba ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

3,260

9,54

14,56

15,02

16,65

17,38

17,97

18,77

20,94

23,00

26,70

45,07

PDA-360 nm

B basiloba ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

16,59

17,32

17,90

18,70

19,66

20,86

22,86

25,82

37,37

45,02

PDA-360 nm

B crassa mth ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

16,59

17,32

17,90

18,70

19,66

20,86

22,86

25,82

37,37

45,02

PDA-360 nm

B crassa mth ACN Hydro2

Figura 3.8. Separação cromatográfica por HPLC-PAD de flavonóides presentes no infuso das folhas

de:

A) B. coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia. Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL,

fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 2).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

127

Continuação da Figura 3.8

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

9,67

14,69

15,14

15,58

16,80

17,53

18,14

18,95

19,91

21,14

26,22

35,66

37,60

PDA-360 nm

B intermedia mth ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

9,67

14,69

15,14

15,58

16,80

17,53

18,14

18,95

19,91

21,14

26,22

35,66

37,60

PDA-360 nm

B intermedia mth ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

120

140

160

4,40

6,28

9,60

14,64

15,38

16,89

17,50

18,07

18,87

19,84

21,01

22,07

23,56

25,96

31,84

35,01

35,57

37,55

38,86

PDA-360 nm

B fagifolia mth ACN Hydro2

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Absorbância (mv)

100

120

140

160

4,40

6,28

9,60

14,64

15,38

16,89

17,50

18,07

18,87

19,84

21,01

22,07

23,56

25,96

31,84

35,01

35,57

37,55

38,86

PDA-360 nm

B fagifolia mth ACN Hydro2

Figura 3.8. Separação cromatográfica por HPLC-PAD de flavonóides presentes no infuso das folhas

de: A) B. coccolobifolia; B) B. crassa; C) B. basiloba; D) B. intermedia; E) B. fagifolia. Coluna

Phenomenex

Synergi Hydro (250 x 4.0 mm i.d.; 4 µm), HPLC (Jasco

). Volume injetado: 20,0 µL,

fluxo: 1,0 mL min

-1

, λ = 360 nm. (Para condições de eluição veja Tabela 3.2, sistema 2).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

128

Tabela 3.3. Bandas de absorção na região do UV para os metabólitos secundários identificados nas

espécies do gênero Byrsonima

Atribuição Bandas de máximo de

absorção (nm)

Presente em (*) Confirmação com

padrão (**)

Ácidos fenólicos

- -

Ácido gálico 215; 271 Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Sim

Galato de metila 216; 272 Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Sim

Ácido elágico 253; 366 Bfa Sim

Catequinas

- -

catequina 203; 230(sh); 278 Bcr, Bba, Bin Sim

epicatequina 203; 229(sh); 278 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Sim

galato de

epigalocatequina

208; 233(sh); 271 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Sim

Flavonóides

- -

Q3ORha(1-3)ORha(1-

6)OAlo

256; 354 Bba, Bin, Bfa Sim

Q3ORha(1-6)Gal 255; 353 Bco, Bin, Bfa Sim

Q3OGal 255; 355 Bco, Bcr, Bba,

Bin, Bfa

Sim

Q3O(2"Gall)Gal 265; 297(sh); 358 Bco, Bcr, Bba,

Bin, Bfa

Sim

Q3OAra 256; 355 Bco, Bcr, Bba,

Bin, Bfa

Sim

Q3ORha 255; 347 Bco Sim

Q3O(2"Gall)Ara 266; 296(sh); 356 Bco, Bcr, Bba,

Bin, Bfa

Sim

Quercetina 254; 370 Bco(***), Bcr,

Bba(***), Bin, Bfa

Sim

Amentoflavona 268; 334 Bcr, Bba, Bin(***) Sim

(*) Bcr (B. crassa); Bba (B. basiloba); Bco (B. coccolobifolia); Bin (B. intermedia) e Bfa (B. fagifolia).

(**) análise de co-injeção por HPLC-PAD;

(***) ausente no infuso, presente no extrato MeOH.

Tendo em vista que os infusos foram produzidos nas mesmas condições,

pode-se inferir que B. coccolobifolia é a espécie que apresentou menor

concentração no conteúdo de flavonóides (Fig. 3.8A). Por sua vez, foi verificado que

apenas nesta espécie há ocorrência do flavonol quercetina-3-O-

α-

rhamnopiranosídeo, pico de t

= 25,00 min.

B. basiloba e B. intermedia apresentaram um flavonóide cuja polaridade era

superior ao da rutina, indicando que este metabólito secundário deveria possuir um

padrão de oxidação superior ou ainda ser um triglucosídeo. Etapas de purificação a

partir do infuso das folhas de B. basiloba possibilitaram o isolamento deste

flavonóide, o qual foi caracterizado como quercetina-3-O-α-rhamnopiranosil-(1→3)-

O-[α-rhamnopiranosil-(1→6)]-β-alopiranosídeo, (trabalho não publicado).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

129

B. crassa, B. intermedia e B. basiloba exibiram um perfil flavonoídico bastante

similar. Nelas foram identificados, em comum, os flavonóides: quercetina-3-O-

galactopiranosídeo; quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-galactopiranosídeo; quercetina-3-O-

arabinopiranosídeo; quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-arabinopiranosídeo; quercetina e

amentoflavona.

B. fagifolia foi a espécie que mais se distinguiu com relação a presença de

flavonóides, a partir da investigação dos espectros na região do UV para os picos

eluídos no cromatograma da Figura 3.8E, foi observado que os flavonóides exibiam

um ombro na região de 299 nm, além das duas bandas referentes aos anéis A e B

do núcleo flavonoídico. Esse perfil espectral é compatível com o de flavonóides

esterificados. Em B. fagifolia, foram identificados os flavonóides quercetina-3-O-(2"-

O-galoil)-galactopiranosídeo (t

= 18,07 min); quercetina-3-O-(2"-O-galoil)-

arabinopiranosídeo (t

= 25,96 min) e quercetina (t

= 37,55 min). Além desses, foi

confirmado ainda a presença do ácido elágico (t

= 15,38 min). A Figura 3.9 ilustra os

espectros na região do UV dos principais picos monitorados em 360 nm.

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

253.14

365.73

Ácido elágico

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

253.14

365.73

Ácido elágico

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

209.10

266.63

357.38

299.13

Flavonóide

esterificado

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

209.10

266.63

357.38

299.13

Flavonóide

esterificado

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

208.24

265.83

355.67

299.72

Q3OGal2"Gall

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

208.24

265.83

355.67

299.72

Q3OGal2"Gall

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

201.28

254.78

370.81

Quercetina

25%

50%

75%

mAU

200 250 300 350

201.28

254.78

370.81

Quercetina

Figura 3.9. Espectros na região do UV para algumas das classes de substâncias encontradas em B.

fagifolia.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

130

Análises por FIA-ESI-IT-MS

Recentemente a técnica de ESI-MS com inserção direta de amostra tem

mostrado ser uma ferramenta rápida, eficiente e de grande sensibilidade. Ela é

capaz de gerar informações específicas sobre a composição química de matrizes

bastante complexas, as quais apresentam substâncias de ampla faixa de peso

molecular, bem como substâncias de média e alta polaridade, tais como ácidos

fenólicos, proantocianidinas, catequinas e flavonóides, comumente encontrados em

extratos polares de espécies vegetais (SAWAYA et al., 2004). Tendo em vista estas

características, nesta etapa foram realizados experimentos de FIA-ESI-IT-MS para a

obtenção e comparação dos perfis dos infusos de cinco espécies do gênero

Byrsonima em modo negativo, o que permitiu estabelecer e confirmar a similaridade

[ou não] da composição química das espécies investigadas.

Preparo das amostras

As infusões foram produzidas na proporção de 10% (m/v), conforme citado

anteriormente. Para cada infusão filtrada, 500 µL foram diluídos com MeOH para o

volume final de 1 mL e a solução introduzida diretamente na fonte de ESI por meio

de uma seringa de vidro impulsionada por um sistema de bombeamento em fluxo de

10 µL min

–1

Averiguação dos espectros de massas em full-scan (Fig. 3.10) revelou a

presença de várias substâncias, as quais são representadas pelos íons precursores

das moléculas desprotonadas ([M – H]

–

) para as infusões das folhas de cinco

espécies de Byrsonima. Com base nas substâncias previamente isoladas de B.

crassa (SANNOMIYA et al., 2004), bem como pela avaliação da composição química

desta espécie, feita pela mesma autora por HPLC-MS (SANNOMIYA; MONTORO et

al., 2005), foi possível estabelecer correlação com a composição química das

demais. A Tabela 3.4 sumariza as principais características sobre os íons produtos

observados durante as análises por FIA-ESI-IT-MS/MS.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

131

Tabela 3.4. Dados espectrométricos das substâncias identificadas durante os experimentos de FIA-

ESI-IT-MS/MS

Atribuição Íon precursor

(m/z)

Íons produtos (MS

)

(m/z)

Presente em

(*)

Confirmação com

padrão (**)

Ácidos fenólicos - - - -

Ácido gálico 169 125 Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Sim

Galato de metila 183 - Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Sim

Ácido quínico 191 - Bcr, Bba, Bin,

Bco

Não

Ácido

monogaloilquínico

343 325; 191; 169 Bco, Bin, Bfa Não

Ácido digaloilquínico 495 477; 343; 325; 169 Bba, Bco, Bin,

Bfa

Não

Ácido trigaloilquínico 647 495; 477; 343; 325 Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Não

Ácido tetragaloilquínico 799 647; 629; 601; 449; 431 Bcr, Bba, Bin,

Bfa

Não

Ácido

pentagaloilquínico

951 799; 647; 629; 601 Bfa Não

Proantocianidinas - - - -

Dímero [epi]catequina

+ [epi]afzelequina

561 - Bcr, Bba, Bin Não

Dímero [epi]catequina 577 559; 451; 425; 407; 289 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Não

Galato do dímero

[epi]catequina

729 711; 577; 559; 451; 425;

407

Bcr, Bba, Bco,

Bin

Não

Digalato do dímero

[epi]catequina

881 755; 729; 577 Bin Não

Trímero [epi]catequina 865 847; 739; 713; 695; 587;

577; 575

Bcr, Bba, Bco,

Bin

Não

Galato do trímero

[epi]catequina

1017 999; 891; 865; 847; 739;

729; 727; 713; 577

Bcr, Bco, Bin Não

Tetrâmero 1153 - Bcr, Bba, Bco Não

Digalato do trímero

[epi]catequina

1169 - Bin Não

Flavonóides - - - -

[epi]catequina 289 137 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Sim

Quercetina 301 - Bcr, Bba, Bco,

Bin, Bfa

Sim

Galato de

[epi]afzelequina

425 - Bcr, Bba Não

Q3OAra 433 301 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Sim

Q3ORha 447 301 Bco Sim

Q3OGal 463 301 Bcr, Bba, Bco,

Bin

Sim

Amentoflavona 537 375 Bcr, Bba Sim

Q3ORha(1-6)Gal 609 463; 301 Bba, Bco Sim

Q3O(2"Gall)Ara 585 433; 301 Bcr, Bci, Bco,

Bin

Sim

Q3O(2"Gall)Gal 615 463; 301 Bcr, Bin, Bfa Sim

Q3ORha(1-3)ORha(1-

6)OAlo

755 609; 301 Bba Sim

(*) Bcr (B. crassa); Bba (B. basiloba); Bco (B. coccolobifolia); Bin (B. intermedia) e Bfa (B. fagifolia);

(**) Confirmação em experimentos de co-injeção por HPLC-PAD.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

132

Os espectros de massas indicaram que há grande similaridade entre os

metabólitos secundários de todas as espécies, com exceção de B. fagifolia (Fig.

3.10E).

Fragmentação dos principais íons precursores em múltiplos estágios

evidenciou que flavonóides, proantocianidinas e derivados de ácidos fenólicos foram

as principais classes de metabólitos encontrados em B. coccolobofolia (Fig. 3.10A),

B. crassa (Fig. 3.10B), B. basiloba (Fig. 3.10C) e em B. intermedia (Fig. 3.10D). Por

sua vez, em B. fagifolia (Fig. 3.10E) não foi observada a presença de íons

precursores característicos de proantocianidinas, indicando que esta espécie não

apresenta taninos condensados em sua composição química, o que de fato foi

observado durante os experimentos de triagem cromatográfica por HPLC-PAD.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

133

BFFia #396-402 RT: 6,63-6,76 AV: 7 NL: 5,21E5

T: - c Full ms [ 135,00-1500,00]

200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

646,9

798,9

183,0

495,0

661,0

334,8

799,9

168,9

950,8

670,4

614,9

301,1

342,9

836,8

965,7

1102,4

1180,8 1346,6 1432,0

BFFia #396-402 RT: 6,63-6,76 AV: 7 NL: 5,21E5

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m/z

100

Relative Abundance

646,9

798,9

183,0

495,0

661,0

334,8

799,9

168,9

950,8

670,4

614,9

301,1

342,9

836,8

965,7

1102,4

1180,8 1346,6 1432,0

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

447,2

300,2

495,1

609,3

433,2

271,3

647,1

577,2

343,2

729,2

865,2

1017,2

1401,7

1106,1

1153,3

1338,2

1438,8

717,1425,1

Bco cha' neg msms #75-85 RT: 1,59-1,86 AV: 11 NL: 8,70E5

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

447,2

300,2

495,1

609,3

433,2

271,3

647,1

577,2

343,2

729,2

865,2

1017,2

1401,7

1106,1

1153,3

1338,2

1438,8

717,1425,1

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

Relative Abundance

799,1

647,1

495,2

729,1

301,2

615,1

801,1

648,1

1017,1

577,2

1335,9

463,2 881,0

1169,1

289,2

1018,2

433,2 1305,2

511,1

1457,4

919,0

713,1

1048,4

271,2

Bi cha' neg msms #57-91 RT: 1,48-2,35 AV: 34 NL: 4,47E6

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

Relative Abundance

799,1

647,1

495,2

729,1

301,2

615,1

801,1

648,1

1017,1

577,2

1335,9

463,2 881,0

1169,1

289,2

1018,2

433,2 1305,2

511,1

1457,4

919,0

713,1713,1

1048,4

271,2

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

577,1

289,2

433,2

481,0

729,1325,0

865,1

578,1

383,0

1017,1730,1

1329,8

723,1

1153,1

1011,0

799,1

271,3

1019,2 1305,0

1332,2

1441,9

537,0

Bcr cha' neg msms #10-65 RT: 0,21-1,35 AV: 55 NL: 2,11E6

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200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

577,1

289,2

433,2

481,0

729,1325,0

865,1

578,1

383,0

1017,1730,1

1329,8

723,1

1153,1

1011,0

799,1

271,3

1019,2 1305,0

1332,2

1441,9

537,0

Bba cha' neg msms #25-30 RT: 0,64-0,77 AV: 6 NL: 2,49E5

T: - c ESI ms [ 200,00-1500,00]

200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

382,9

577,1

865,2

609,2

799,0

755,3

300,1

463,2

301,1

1153,0

561,2

713,1

289,2

1001,3

1450,3

1257,5

931,1

1305,9

370,9

209,2

537,2

Bba cha' neg msms #25-30 RT: 0,64-0,77 AV: 6 NL: 2,49E5

T: - c ESI ms [ 200,00-1500,00]

200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

100

Relative Abundance

382,9

577,1

865,2

609,2

799,0

755,3

300,1

463,2

301,1

1153,0

561,2

713,1

289,2

1001,3

1450,3

1257,5

931,1

1305,9

370,9

209,2

537,2

Figura 3.10. Espectro de massas de primeira-ordem, em modo full-scan, do: A) infuso de B.

coccolobifolia;

B) infuso de B. crassa; C) infuso de B. basiloba; D) infuso de B. intermedia e E) infuso

de B. fagifolia. Para condições espectrométricas veja: parte Experimental.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

134

Numa primeira classe de metabólitos secundários, os íons precursores de

procianidinas formadas pela ligação interflavonoídica entre unidades da

[epi]catequina de m/z 577 (dímero), m/z 865 (trímero) e m/z 1153 (tetrâmero) foram

facilmente encontrados nos espectros de massas em full-scan das Figuras 3.10A-

3.10D. Outras proantocianidinas mais complexas, formadas pela ligação

interflavonoídica de unidades de catequinas distintas também foram sugeridas pela

presença de íons característicos visualizados no modo full-scan, como por exemplo,

os íons precursores de m/z 729 (dímero entre [epi]catequina e galato de

[epi]catequina), m/z 1017 (trímero entre duas unidades de [epi]catequina e uma

unidade do galato de [epi]catequina), além de outros íons precursores de menor

intensidade, como os íons de m/z 561, 881, 1169 e 1305.

Fragmentação MS/MS do íon precursor de m/z 729 (Fig. 3.10B) produziu o

pico base de m/z 577, esse íon foi gerado pela eliminação do grupo galoíla [M – 152

– H]

da unidade do galato de [epi]catequina deste dímero (Fig. 3.11A). Essa

fragmentação pode ser sustentada pela avaliação do espectro de terceira-ordem

(MS

) do íon produto de m/z 577 (Fig. 3.11B). A formação do pico base em m/z 451

ocorre apenas pela fragmentação do tipo HRF com eliminação do grupo 1,2,3-

triidroxibenzeno, conforme mencionado no Capítulo 1, que necessariamente ocorre

na unidade superior a partir do dímero formado no experimento MS

. A presença dos

íons produtos minoritários de m/z 439 e m/z 441 (Fig. 3.11A) sugere que ocorre os

dois tipos de dímeros, com a unidade do galato de [epi]catequina estando na base e

no topo de cada uma das proantocianidinas possíveis.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

135

Bcr cha' neg msms #168-180 RT: 6,29-6,53 AV: 13 NL: 4,47E5

T: - c ESI Full ms2 729,10@28,00 [200,00-750,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

m/z

100

Relative Abundance

577

559

407

425

603

451

711

541

289

269

729685313245 329

395 515483381 619585 653229

Bcr cha' neg msms #168-180 RT: 6,29-6,53 AV: 13 NL: 4,47E5

T: - c ESI Full ms2 729,10@28,00 [200,00-750,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

m/z

100

Relative Abundance

577

559

407

425

603

451

711

541

289

269

729685313245 329

395 515483381 619585 653229

Bcr cha' neg msms #181-192 RT: 6,69-6,92 AV: 12 NL: 8,50E4

T: - c ESI Full ms3 729,10@28,00 577,00@28,00 [200,00-750,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

m/z

100

Relative Abundance

451

425

407

559

289

299

577

533287

245 467

381 449

229 515

331 367

Bcr cha' neg msms #181-192 RT: 6,69-6,92 AV: 12 NL: 8,50E4

T: - c ESI Full ms3 729,10@28,00 577,00@28,00 [200,00-750,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

m/z

100

Relative Abundance

451

425

407

559

289

299

577

533287

245 467

381 449

229 515

331 367

♦

Figura 3.11. A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 729, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. B) Espectro de massas de terceira-ordem (MS

) do

íon produto de m/z 577, obtido em modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Fragmentação de segunda-ordem da molécula desprotonada de m/z 1017

resultou no espectro de íons produtos mostrado na Figura 3.12 que ilustra inúmeras

informações estruturais, compatíveis com uma proantocianidina trimérica.

Bi cha' neg msms #195-203 RT: 8,25-8,48 AV: 9 NL: 6,22E3

T: - c ESI Full ms2 1017,10@25,00 [280,00-2000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance

1017,0

998,9

865,0

847,1

891,0

729,0

726,9

577,0

738,9

829,1

676,9

543,0449,3

600,7

377,1 918,8 972,4

Bi cha' neg msms #195-203 RT: 8,25-8,48 AV: 9 NL: 6,22E3

T: - c ESI Full ms2 1017,10@25,00 [280,00-2000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance

1017,0

998,9

865,0

847,1

891,0

729,0

726,9

577,0

738,9

829,1

676,9

543,0449,3

600,7

377,1 918,8 972,4

♦

Figura 3.12. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 1017, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

136

O íon produto de m/z 999 [M – 18 – H]

–

é referente à perda de uma molécula

de água do trímero pela eliminação do grupo 3-OH livre de uma das unidades

monoméricas. O íon produto de m/z 891 foi gerado após a eliminação do anel A

como 1,3,5-triidroxibenzeno ([M – 126 – H]

–

) pela clivagem do anel C da unidade

superior do trímero através do mecanismo de fragmentação HRF. O íon produto de

m/z 865 é gerado preferencialmente pela eliminação do grupo galoíla [M – 152 – H]

seguido da eliminação de uma molécula de água para formar o íon de m/z 847 [M –

152 – 18 – H]

(ZEEB et al., 2000). Esse mesmo íon produto poderia também ser o

resultado da clivagem RDA da molécula desprotonada. No entanto, a energia para

romper uma ligação C-C é superior à energia necessária para quebrar uma ligação

do tipo C-O, e desta forma, a eliminação do grupo galoíla é favorecida.

Os demais íons produtos formados após o fragmento de m/z 865 são

referentes às rotas de fragmentação do trímero ilustrado no Esquema 1.3 do

Capítulo 1. Neste caso, não houve a formação de um íon diagnóstico que permitisse

sugerir a localização do grupo galoíla em uma das três unidades de [epi]catequinas.

Uma segunda classe de metabólitos secundários, comuns a todas as

espécies investigadas foi atribuída à presença de flavonóides. Fragmentação MS/MS

dos seus íons precursores (Tabela 3.4) permitiu sugerir que estes eram derivados da

quercetina. Esta observação foi fundamentada pela formação do íon diagnóstico de

m/z 301 e ao ânion-radical de m/z 300, formado por uma clivagem homolítica em

derivados O-glucosilados da quercetina (Esquema 3.2) (CUYCKENS & CLAEYS,

2004, ES-SAFI et al., 2005). O espectro de segunda-ordem para o íon precursor do

flavonol quercetina-3-O-

α-rhamnosil-(1→6)-O-β-galactopiranosídeo de m/z 609

exemplifica a formação do ânion-radical [Y

– H]

• -

(Fig. 3.13).

Em B. crassa e em B. basiloba, além dos derivados da quercetina foi também

observado a presença da biflavona (amentoflavona) de m/z 537 (Fig. 3.10B e 3.10C).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

137

OOH

m/z 609

- H]

m/z 300

Esquema 3.2. Clivagem homolítica entre unidade de galactose e a aglicona quercetina com formação

do íon produto do ânion radicalar ([Y

– H]

• -

Bco cha' neg msms #135-143 RT: 4,63-4,83 AV: 9 NL: 3,80E5

T: - c ESI Full ms2 609,10@28,00 [165,00-1500,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

100

Relative Abundance

609,1

301,1

463,0

300,1

447,1

343,0

271,2 608,3

179,2 565,0489,1373,1213,2 521,1 610,0412,6

Bco cha' neg msms #135-143 RT: 4,63-4,83 AV: 9 NL: 3,80E5

T: - c ESI Full ms2 609,10@28,00 [165,00-1500,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

100

Relative Abundance

609,1

301,1

463,0

300,1

447,1

343,0

271,2 608,3

179,2 565,0489,1373,1213,2 521,1 610,0412,6

♦

OOH

m/z 301

m/z 447

m/z 463

Figura 3.13. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 609, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Uma terceira classe de metabólitos secundários foi atribuída à presença de

derivados do ácido galoilquínico. Eles são formados pela esterificação das hidroxilas

livres do ácido quínico por uma ou mais unidades do ácido gálico. Desta forma, os

íons precursores de m/z 343; m/z 495; m/z 647; m/z 799 e m/z 951 correspondem a

uma série composta de monômeros a pentâmeros. Porém, apenas com os

experimentos de MS não foi possível estabelecer a caracterização completa para

essas substâncias, visto que existem inúmeras possibilidades de isômeros

posicionais e as estruturas mostradas juntamente com os espectros de massas

constituem exemplos para ajudar a entender as possíveis rotas de fragmentação.

Os ácidos monogaloilquínicos foram observados pelas seguintes

fragmentações. MS/MS do íon precursor de m/z 343 (Fig. 3.14) gerou o íon produto

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

138

[M – 152 – H]

de m/z 191, este íon é formado pela eliminação do grupo galoil. O íon

[M – 174 – H]

é referente à eliminação do ácido quínico com formação da molécula

desprotonada do ácido gálico de m/z 169, que por sua vez gera o íon produto de m/z

125 [M – 174 – 44 – H]

com eliminação seqüencial de CO

Bco cha' neg msms #127-134 RT: 4,21-4,40 AV: 8 NL: 1,27E5

T: - c ESI Full ms2 343,10@28,00 [ 90,00-400,00]

100 150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

169,1

191,1

125,1

343,1

173,2

325,0168,2

307,0191,8 237,0 293,3252,2224,8

Bco cha' neg msms #127-134 RT: 4,21-4,40 AV: 8 NL: 1,27E5

T: - c ESI Full ms2 343,10@28,00 [ 90,00-400,00]

100 150 200 250 300 350 400

m/z

100

Relative Abundance

169,1

191,1

125,1

343,1

173,2

325,0168,2

307,0191,8 237,0 293,3252,2224,8

♦

COOH

OHHO

m/z 169 H

m/z 174

m/z 152

m/z 191

Figura 3.14. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 343, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Os derivados do ácido digaloilquínico exibiram padrão de fragmentação

similar. Espectro de segunda-ordem para o íon precursor de m/z 495 (Fig. 3.15)

mostrou eliminação de água a partir de desidratação do núcleo do ácido quínico com

formação do íon produto de m/z 477; formação do pico base de m/z 343 pela perda

de uma unidade galoíla com subseqüente eliminação de água para formar o íon de

m/z 325 e o íon de m/z 169 foi interpretado como a uma molécula desprotonada do

ácido gálico.

BFFia #288-352 RT: 4,75-5,88 AV: 65 NL: 4,00E3

T: - c Full ms2 495,00@40,00 [135,00-500,00]

150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

100

Relative Abundance

342,9

324,8

168,8

154,8

344,1

192,9 476,7

280,8

244,9

201,9

306,9

401,1

BFFia #288-352 RT: 4,75-5,88 AV: 65 NL: 4,00E3

T: - c Full ms2 495,00@40,00 [135,00-500,00]

150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

100

Relative Abundance

342,9

324,8

168,8

154,8

344,1

192,9 476,7

280,8

244,9

201,9

306,9

401,1

♦

COOH

Gall

OHHO

Gall = Grupo galoil

Figura 3.15. Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 495, obtido em modo

negativo com energia de colisão de 30%. Para condições espectrométricas veja: Parte Experimental.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

139

Os derivados do ácido trigaloilquínico apresentaram a seguinte fragmentação,

MS/MS do íon precursor de m/z 647 (Fig. 3.16A) produziu os íons produtos de m/z

495 [M – 152 – H]

e m/z 477 [M – 152 – 18 – H]

. Fragmentação de terceira-ordem

para o íon de m/z 495 (Fig. 3.16B) comprovou as eliminações seqüenciais de duas

unidades galoílas [M – 2 x 152 – H]

e desidratação do núcleo do ácido quínico [M –

2 x 152 – 18 – H]

♦

Bi cha' neg msms #119-130 RT: 4,08-4,34 AV: 12 NL: 1,04E6

T: - c ESI Full ms2 647,10@25,00 [175,00-700,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z

100

Relative Abundance

646,9

495,0

477,0

646,1

325,0

343,0

600,9306,9 476,3262,7 514,9 585,1404,0 647,8193,2 245,1

Bi cha' neg msms #119-130 RT: 4,08-4,34 AV: 12 NL: 1,04E6

T: - c ESI Full ms2 647,10@25,00 [175,00-700,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z

100

Relative Abundance

646,9

495,0

477,0

646,1

325,0

343,0

600,9306,9 476,3262,7 514,9 585,1404,0 647,8193,2 245,1

Bi cha' neg msms #131-139 RT: 4,56-4,75 AV: 9 NL: 5,54E5

T: - c ESI Full ms3 647,10@25,00 495,00@25,00 [135,00-700,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z

100

Relative Abundance

495,0

343,0

325,0

477,0

193,1

448,9

368,8211,2 495,9

Bi cha' neg msms #131-139 RT: 4,56-4,75 AV: 9 NL: 5,54E5

T: - c ESI Full ms3 647,10@25,00 495,00@25,00 [135,00-700,00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z

100

Relative Abundance

495,0

343,0

325,0

477,0

193,1

448,9

368,8211,2 495,9

♦

COOH

Gall

OHHO

Gall = Grupo galoil

Gall

Figura 3.16. A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 647, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%.

B) Espectro de massas de terceira-ordem (MS

) do

íon produto de m/z 495, obtido em modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Os derivados do ácido tetragaloilquínico apresentaram o padrão de

fragmentação esperado, com eliminações seqüenciais de grupos galoílas e

moléculas de água. A principal diferença nesta série foi a presença do pico base de

m/z 601, o qual foi interpretado como a eliminação de ácido gálico seguida da perda

de CO [M – 152 – 18 – 28 – H]

(Fig. 3.17A). Fragmentação de terceira-ordem do

pico base de m/z 601, observado no experimento MS

, mostrou que este íon sofre

nova fragmentação com eliminação de outra molécula de ácido gálico, interpretada

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

140

como as perdas seguidas do grupo galoil (152 Da) de m/z 449 e água (18 Da) de

m/z 431 (Fig. 3.17B).

♦

Bci cha' neg msms #117-124 RT: 6,40-6,61 AV: 8 NL: 6,75E4

T: - c ESI Full ms2 799,10@25,00 [220,00-900,00]

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

m/z

100

Relative Abundance

601

629

799

477

647

600

781

755

709536510431 655 800

Bci cha' neg msms #117-124 RT: 6,40-6,61 AV: 8 NL: 6,75E4

T: - c ESI Full ms2 799,10@25,00 [220,00-900,00]

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

m/z

100

Relative Abundance

601

629

799

477

647

600

781

755

709536510431 655 800

Bci cha' neg msms #125-132 RT: 7,00-7,21 AV: 8 NL: 2,10E4

T: - c ESI Full ms3 799,10@25,00 601,00@27,00 [165,00-900,00]

200 300 400 500 600 700 800 900

m/z

100

Relative Abundance

431

601

449

261

169

279217

387

Bci cha' neg msms #125-132 RT: 7,00-7,21 AV: 8 NL: 2,10E4

T: - c ESI Full ms3 799,10@25,00 601,00@27,00 [165,00-900,00]

200 300 400 500 600 700 800 900

m/z

100

Relative Abundance

431

601

449

261

169

279217

387

COOH

Gall

OHHO

Gall = Grupo galoil

Gall

Figura 3.17. A) Espectro de massas de segunda-ordem do íon precursor de m/z 799, obtido em

modo negativo com energia de colisão de 30%. B) Espectro de massas de terceira-ordem (MS

) do

íon produto de m/z 601, obtido em modo negativo com energia de colisão de 30%. Para condições

espectrométricas veja: Parte Experimental.

Analogamente, os derivados do ácido pentagaloilquínico mostraram

eliminações características, MS/MS do íon precursor de m/z 951 produziu o pico

base de m/z 799 [M – 152 – H]

, este íon exibiu nova eliminação de um grupo galoíla

[M – 2 x 152 – H]

com formação do íon produto de m/z 647. A ausência dos

fragmentos de m/z 933 [M – 18 – H]

e m/z 907 [M – 44 – H]

indicam que todas as

hidroxilas presentes no ácido quínico foram esterificadas por unidades de ácido

gálico (Fig. 3.18).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

141

♦

m/z

BFFia #1967-2030 RT: 36,65-37,87 AV: 64 NL: 1,31E4

T: - c Full ms2 950,80@30,00 [260,00-1000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000

100

Relative Abundance

798,8

799,8

646,9

648,0

628,9

601,0 752,8

950,5

m/z

BFFia #1967-2030 RT: 36,65-37,87 AV: 64 NL: 1,31E4

T: - c Full ms2 950,80@30,00 [260,00-1000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000

100

Relative Abundance

798,8

799,8

646,9

648,0

628,9

601,0 752,8

950,5

BFFia #1967-2030 RT: 36,65-37,87 AV: 64 NL: 1,31E4

T: - c Full ms2 950,80@30,00 [260,00-1000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000

100

Relative Abundance

798,8

799,8

646,9

648,0

628,9

601,0 752,8

950,5

COOGall

Gall

OHHO

Gall = Grupo galoil

Gall

Figura 3.18. Espectro de massas de segunda-ordem obtido em modo negativo com energia de

colisão de 30% para o íon precursor de m/z 951. Para condições experimentais veja: Parte

Experimental.

Assim, os experimentos empregando a técnica de FIA-ESI-IT-MS/MS

forneceram informações importantes sobre a caracterização das classes de

substâncias presentes nas cinco espécies estudadas. Os experimentos mostraram

que B. crassa, B. coccolobifolia, B. intermedia e B. basiloba são constituídas por três

classes principais de metabólitos secundários: flavonóides, proantocianidinas e

derivados do ácido galoilquínico. B. fagifolia não apresentou a ocorrência de

proantocianidinas em sua composição. Os resultados obtidos foram complementares

aos alcançados com a técnica de HPLC-PAD, confirmando a presença de alguns

dos metabólitos secundários identificados nos experimentos de co-injeção.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

142

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A aplicação do trabalho proposto demonstrou ganho de tempo por parte do

fitoquímico que venha realizar as etapas de purificação de compostos

preestabelecidos após a triagem cromatográfica. Esse fator pode impedir a

realização de tarefas extenuantes que resultem no isolamento de substâncias

repetidas.

O trabalho contribuiu ainda para a diminuição da carga de resíduos gerados

pela utilização de solventes orgânicos empregados nas etapas de preparo de

extratos e fracionamento cromatográfico. Apresentou benefícios econômicos, uma

vez que experimentos que possuem alto custo, como NMR 1D e principalmente 2D,

podem ser realizados apenas para as substâncias não identificadas pelos métodos

propostos.

Tendo em vista que em nosso trabalho o estudo fitoquímico de uma

determinada espécie parte das informações etnofarmacológicas, maior ênfase foi

dada ao estudo de infusões, pois este tipo de amostra é o que mais se assemelha

com as fitopreparações empregadas pela população. Assim, uma abordagem que

por muito tempo tem sido evitada pelos fitoquímicos mostrou-se muito promissora,

uma vez que a preparação desse tipo de amostra é bastante simples, possui um

custo extremamente baixo e o número de etapas de manipulação da amostra é

menor (parâmetro imprescindível para se obter dados exatos e precisos,

principalmente em etapas de avaliações quantitativas).

A utilização de infusos propiciou significativa redução no tempo de obtenção

dos extratos, além de apresentar características de cunho ambiental e sustentável.

Essa abordagem requer apenas a utilização de água como solvente extrator, que é

facilmente descartada após as etapas de preparação. Como vantagem adicional,

necessita de pequenas quantidades do material vegetal.

Embora possa se considerar que nesse tipo de preparação ocorra uma maior

incidência de interferentes, etapas envolvendo a LLE e a SPE mostraram-se

estratégias importantes para a eliminação de substâncias indesejáveis e,

consequentemente, a obtenção de frações quase que totalmente livres de

interferentes, como açúcares e principalmente taninos condensados.

Nas espécies de Davilla, as análises cromatográficas por HPLC-PAD

forneceram informações valiosas quanto à obtenção de seus perfis. Essa aplicação

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

143

contribuiu para uma avaliação rápida sobre a composição química dessas espécies,

possibilitando identificar substâncias conhecidas e presentes em um banco de

padrões. Além da presença do ácido gálico, foram encontrados flavonóis

monoglucosilados derivados na miricetina e quercetina. A literatura recente não

reporta a presença dos flavonóis miricetina-3-O-(2”-O-Galoil)-β-galactopiranosídeo,

miricetina-3-O-(2”-O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo e miricetina-3-O-(3”-O-galoil)-α-

rhamnopiranosídeo (DAVID et al., 1996; GUARALDO et al., 2001) encontrados em

ambas espécies. Nem mesmo o estudo de variabilidade química dos flavonóides

encontrados na família Dilleniaceae realizado por GURNI & KUBTZKI (1981) indicou

a presença desses metabólitos secundários, sendo desta forma o primeiro relato

desses flavonóis, tanto na família quanto no gênero.

Por outro lado, esses flavonóis são conhecidos. O flavonol miricetina-3-O-(2”-

O-galoil)-α-rhamnopiranosídeo foi isolado pela primeira vez por NICOLLIER &

THOMPSOM (1983) em Desmanthus illionensis (Leguminosae). Nesse mesmo

trabalho os autores descreveram que esse flavonol exibiu atividades alelopática e

antibacteriana significativas, sugerindo ainda que essas atividades estavam

relacionadas à importância da ligação do grupo galoíla na posição 2" da rhamnose.

Posteriormente, LEE e colaboradores (2000) descreveram em Acacia confusa

(Leguminosae) a presença desses monogaloilrhamnosídeos, bem como a presença

de um digaloilrhamnosídeo esterificado nas posições 2" e 3" da rhamnose.

Avaliação quantitativa indicou ainda que D. nitida e D. elliptica possuem um

teor significativo de flavonóides totais e, que desta forma, essas espécies

representam promissoras fontes de constituintes polifenólicos, as quais podem ser

usadas como antioxidantes naturais.

As duas espécies , quando avaliadas por HPLC-PAD, exibiram o mesmo perfil

flavonoídico, porém apresentaram diferenças significativas na concentração de

alguns flavonóis, como por exemplo, miricetina-3-O-β-galactopiranosídeo +

miricetina-3-O-β-glicopiranosídeo; quercetina-3-O-β-galactopiranosídeo e

quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo. Da mesma forma, o perfil químico obtido por

FIA-ESI-IT-MS comprovou não só a semelhança entre a composição flavonoídica,

mas a de outros constituintes. Conforme sugerido por GURNI & KUBTZKI (1981), as

duas espécies de Davilla podem ser caracterizadas pela presença predominante da

miricetina-3-O-α-rhamnopiranosídeo.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

144

Em H. speciosa, o emprego dos procedimentos de LLE e SPE seguido da

avaliação cromatográfica por HPLC-PAD resultou na visualização de catequinas

monoméricas e do ácido clorogênico em uma espécie extremamente complexa. A

partir dos experimentos de comparação cromatográfica realizados chegou-se na

identificação do ácido clorogênico, catequina, epicatequina e do galato de

epigalocatequina.

A utilização da técnica FIA-ESI-IT-MS/MS possibilitou formular considerações

importantes sobre a real composição química desta espécie. Foram observadas

duas séries homólogas de proantocianidinas com grau de polimerização variando de

1 a 6. Na primeira série foram observadas diferenças de 288 Da entre os íons

precursores obtidos nos experimentos. Essa característica indicou que as

substâncias eram formadas por uma ligação entre unidades monoméricas de

[epi]catequinas, constituindo desta forma procianidinas do tipo-B. O aspecto mais

significativo da utilização desta técnica ocorreu com a visualização da segunda série

de proantocianidinas, que apresentaram íons precursores 162 Da superiores

àqueles da primeira série. Avaliação desses íons em múltiplos estágios gerou

subsídios que sustentaram propostas para a existência de procianidinas do tipo-B C-

glucosiladas.

O estudo comparativo entre as espécies do gênero Byrsonima evidenciou que

flavonóides derivados da quercetina, derivados do ácido galoilquínico e

proantocianidinas do tipo-B são os metabólitos secundários de comum ocorrência

entre as espécies de B. crassa, B. coccolobifolia, B. basiloba e B. intermedia. Em B.

fagifolia não foi constatada a presença de proantocianidinas. Nessa espécie, os

derivados do ácido galoilquínico são as substâncias predominantes. A partir das

análises de FIA-ESI-IT-MS/MS foi constatada a presença de uma série constituída

com derivados do ácido mono-, di-, tri-, tetra- e pentagaloilquínico. Essas evidências

foram observadas a partir da investigação do perfil espectral e confirmadas através

de experimentos MS em múltiplos estágios.

Em suma, os procedimentos de preparação de amostras vegetais envolvendo

etapas de LLE e SPE demonstraram inúmeras vantagens, conforme indicado a

seguir:

 O clean-up em cartuchos Sep Pak de RP18 viabilizou eluição seletiva dos

componentes presentes nas plantas estudadas. Foi possível trabalhar tanto

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

145

com substâncias de maior polaridade - principalmente catequinas e derivados

de ácidos fenólicos provenientes do eluato MeOH/H

O 14:86 v/v, quanto com

substâncias de média polaridade - flavonóides, encontrados nos eluatos

seguintes;

 Taninos condensados foram eliminados quase que em sua totalidade após

LLE entre água e acetato de etila, como conseqüência, durante as análises

por HPLC-PAD, foram obtidas separações com linha de base estável para os

sistemas de eluição empregados nas eluições cromatográficas;

 A presença de TFA na fase móvel contribuiu para a obtenção de picos bem

resolvidos, eliminando interações indesejáveis;

 O processo de SPE permitiu a concentração dos analitos e desta forma,

pequenas quantidades do material vegetal foram usadas nas avaliações da

composição química das matrizes estudadas. Adicionalmente, a retenção de

material lipofílico, principalmente clorofila, nos cartuchos de SPE configurou-

se como uma medida de preventiva, evitando a necessidade de extensos

gradientes que resultassem na dessorção desse tipo de substância e

consequentemente reduzindo e tempo de recondicionamento da coluna para

injeções subseqüentes.

Finalmente, esperamos que a abordagem proposta neste trabalho possa

contribuir para o estudo de outras famílias de espécies vegetais, propiciando uma

estratégia rápida e importante para o reconhecimento da composição química de

plantas comumente empregadas na medicina tradicional. Adicionalmente, novos

parâmetros podem ser avaliados, principalmente quando se pensa na ocorrência

das outras classes de substâncias encontradas em matrizes vegetais, desta forma,

abrem-se aqui perspectivas para futuros estudos.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

146

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Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

158

ANEXOS

RODRIGUES, C. M.; RINALDO, D.; SANTOS, L. C.; MONTORO, P.; PIACENTE, S.; PIZZA,

C.; HIRUMA-LIMA, C. A.; BRITO, A. R. M. S.; VILEGAS, W. Metabolic fingerprinting using

direct flow injection electrospray ionization tandem mass spectrometry for the

characterization of proanthocyanidins from the barks of Hancornia speciosa. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2007 (no prelo).

RODRIGUES, C. M.; RINALDO, D.; SANNOMIYA, M.; SANTOS, L. C.; MONTORO, P.;

PIACENTE, S.; PIZZA, C.; VILEGAS, W. High-Performance Liquid Chromatographic

Separation and Identification of Polyphenolic Compounds from the Infusion of Davilla elliptica

St. Hill. Phytochemical Analysis, 2007 (no prelo).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

159

Metabolic fingerprinting using direct flow injection electrospray ionization tandem

mass spectrometry for the characterization of proanthocyanidins from the barks

of Hancornia speciosa

Short Title: Proanthocyanidins from Hancornia speciosa

Clenilson M. Rodrigues,

Daniel Rinaldo,

Lourdes C. dos Santos,

Paola Montoro,

Sonia Piacente,

Cosimo Pizza,

Clélia A. Hiruma-Lima,

Alba R. M. Souza Brito

and

Wagner Vilegas

UNESP, São Paulo State University, Institute of Chemistry, Organic Chemistry

Department, CP 355, CEP 14800-900, Araraquara, SP - Brazil.

Università degli Studi di Salerno, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, via Ponte

Don Melillo, 84084 Fisciano (SA) - Italy.

UNESP, São Paulo State University, Institute of Bioscience, Physiology Department,

CP 355, CEP 18618-000, Botucatu, SP - Brazil.

UNICAMP, State University of Campinas, Institute of Biology, Physiology and

Biophysics Department, CP 6109, CEP 13083-970, Campinas, SP - Brazil.

ABSTRACT

Direct flow injection/electrospray ionization/ion trap tandem mass spectrometry

techniques were used to investigate the polyphenolic compounds present in the infusion

from the barks of

Hancornia speciosa Gom. (Apocynaceae), a native Brazilian plant

popularly known as “mangabeira”, used as nutritious source and against gastric

disorders. After an easy sample pretreatment based on filtration procedures the

characteristic fingerprint of the infusion was performed in negative ion mode in few

minutes. At low capillary-voltage activation, the deprotonated molecules ([M – H]

–

)

were observed and using collision-induced dissociation MS/MS product ion, the

fragmentation pattern obtained evidenced the presence of a homologous series of B-type

proanthocyanidins, as well as another series containing their respective

C-glycosylated

derivatives, with degree of polymerization from 1 up to 6 units of interlinked catechins.

Therefore, direct flow injection allowed identifying the key-compounds without

preparative isolation of the components.

Keywords: infusion analysis; fast typification; Apocynaceae; Hancornia speciosa;

natural products;

C-glycosylated procyanidins.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

160

*Address correspondence to W. Vilegas, Instituto de Química, Departamento de

Química Orgânica, Universidade Estadual Paulista. Tel.: +55-16-3301-6668, fax: +55-

16-3301-6692. E-mail: vilegasw@gmail.com

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

161

INTRODUCTION

Hancornia speciosa known as “mangaba”, “mangabeira” and “mangava” is a Brazilian

tropical fruit tree common in the Cerrado region with an exotic flavor and aroma. The

fruit is an important and rich source of vitamin C. The pulp is eaten fresh or used to

make juices. It is also consumed as ice cream, jellies, confectionery and liquor, and it is

greatly appreciated by the local population.

In folk medicine the infusion from the

barks is used to protect against gastric disorders and the latex is used to treat

tuberculosis.

Many investigations have shown that secondary metabolites are key-

molecules that may be correlated to the pharmacological activities observed.

Therefore,

research on the constitution of medicinal plants is essential, in order to determine the

health benefits or risks. However, despite the popular use of

Hancornia speciosa as a

medicinal plant, there are no data about the chemical composition of this species or

about its phytopreparations used by the population.

Infusions prepared from barks usually have a high amount of proanthocyanidins,

also known as condensed tannins, the second most abundant class of natural phenolic

compounds after lignin.

Proanthocyanidins existing in many foods possess potential

healthpromoting effects, such as antioxidant, anticarcinogenic and antiinflammatory

effects.

2,3

They are oligomeric and polymeric proanthocyanidins formed from at least

two flavan-3-ol (catechin) units, proanthocyanidins containing the single interflavan

linkages are B-type and they are linked mainly through C4—C8 or C4—C6 bonds.

Alternatively, they can also be esterified by groups linked to the hydroxyl group at C3.

Those containing two interflavan linkages with additional ether bond between C2—O7

are assigned to the A-type proanthocyanidins (Fig.1).

The molecular weight of proanthocyanidins expressed as degree of

polymerization (DP) is one of the most important properties of this class of compounds,

since the increase of the DP is directly related to the increase of the observed biological

activities.

It has also been reported that proanthocyanidins with low DP are usually

present in plant tissues in relatively lower concentrations compared to oligomers or

polymers with high DP.

4,5

Due to its characteristics, high performance liquid chromatography (HPLC) is

the technique of choice used to investigate secondary metabolites founded in infusions,

as these compounds are frequently highly polar molecules. Coupled to photodiode array

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

162

detector (PAD), HPLC-PAD allows the separation and recognition of a large number of

compounds from plant origin.

Many studies showed that HPLC coupled to tandem

mass spectrometry is a powerful tool to analyze proanthocyanidins present in complex

natural samples, since they can give more information about the structure of the

analyzed compounds. Techniques as matrix assisted laser desorption/ionization-time of

flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), electrospray ionization-mass

spectrometry (ESI-MS) and atmospheric-pressure chemical ionization-mass

spectrometry (APCI-MS) are frequently employed.

7-9

However, in some cases this

approach fails in establishing the total chemical profile. As an example, the

proanthocyanidin homologues are hardly separated and gave unresolved peaks at the

HPLC chromatograms, due to the similarity in their structures and also due to the large

number of phenolic groups.

10,11

This can be a problem mainly when the technique is

intended to be used in routine analyses. Moreover, standard compounds are not

commercially available as references for this class of secondary metabolites.

On the other hand, direct flow injection ESI-MS can overcome such limitations

when the main objective is a fast typification of complex mixtures. This approach has

been used in the quality control and in the verification of the authenticity and/or

adulteration of plant extracts,

olive oils,

propolis,

whisky,

beers

and wines.

The present study investigates the ability of ESI-IT-MS/MS, without prior

chromatography separation, as an analytical tool to determine proanthocyanidins present

in the infusion from the barks of

H. speciosa by direct injection analysis mode.

EXPERIMENTAL

Chemicals

HPLC-grade methanol was purchased from JT Baker (Baker Mallinckrodt, Phillipsburg,

NJ, USA). (+)-catechin and chlorogenic acid were purchased from Sigma Co. (Saint

Louis, MO, USA). HPLC-grade water was prepared using a Millipore (Bedford, MA,

USA) Milli-Q purification system.

Sample preparation

Barks of H. speciosa Gomez were collected in August 2002 at Palmas city, Tocantins

State, Brazil and authenticated by Solange de Fátima Lólis, from the Institute of

Biosciences of the Tocantins University. A

voucher specimen (Nr. 4064) was deposited

at the Herbarium of the Tocantins University.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

163

The dried powdered barks of

H. speciosa (1 g) were infused with boiling water

(10 mL) for 10 min. The mixture was further filtered on filter paper to remove macro

particles, cooled to room temperature and filtered through a 0.45 µm membrane of

nylon filter. The infusion (500 µL) was diluted with methanol up to final volume of 1

mL and the solution introduced by flow injection at 5 µL min

–1

directly in the ESI

source by using a syringe pump.

Mass spectrometric analysis

Analyses were performed using a Thermo Finnigan LCQ Deca ion trap mass

spectrometer (San Jose, CA, USA) equipped with an electrospray interface. To tune the

LCQ, the voltages on the lenses were optimized in the TunePlus function of the

software provided by the manufacturer. The MS and MS/MS analyses in negative ion

mode were selected after calibration infusing a standard solution of (+)-catechin (1 µg

–1

in methanol) at a flow rate of 5 µL min

–1

and working under the following

conditions: capillary voltage –5 V, capillary temperature 220°C. Nitrogen was used both

as drying gas at a flow rate 60 (arbitrary units) and as nebulizing gas. Ion spray voltage

5 kV and the tube lens offset was –55 V. The nebulizer temperature was set at 280ºC,

and a potential of –4 V was used on the capillary. Negative ion mass spectra were

recorded in the range

m/z 50-2000. The first event was a full-scan mass spectrum to

acquire data on ions in the

m/z range. The second scan event was an MS/MS experiment

performed by using data-dependent scan that was carried out on deprotonated molecules

from the compounds at collision energy of 30% and activation time of 30 ms.

Polyphenols and proanthocyanidins were analyzed under the same conditions and with

the same optimized parameters. Data acquisition and processing were performed using

the Xcalibur software.

RESULTS AND DISCUSSION

The isolation of the compounds originating from polar plant extracts are traditionally

performed by chromatography gel permeation. However, using Sephadex LH20, some

labile oligomeric tannins can be degraded during separation and purification. It is well

known, although seldom mentioned, that Sephadex LH20 tends to strongly absorb large

molecular weight condensed tannins, so that they cannot be eluted during the

purification process.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

164

Moreover, matrices containing mixtures of proanthocyanidins with high DP are

hardly fractionated even using partition chromatographic techniques, as high-speed

countercurrent chromatography (HSCCC). In this case, literature often reports only the

isolation of low molecular weight dimers or trimers.

19-21

Therefore, the identification and characterization of the chemical composition of

extracts containing proanthocyanidins with DP higher than 3 is still underexplored.

The HPLC-PAD chromatographic profile (not shown) of the infusion from

speciosa barks showed that, even using an acidified gradient elution system, the

secondary metabolites were not appropriately separated, with peak tailing, no baseline

separation and an unresolved peak at the end of the chromatogram. The features of the

UV spectra with bands of maximum of absorption at 205-215 nm and 270-285 nm

suggested the presence of polymeric proanthocyanidins.

8,22

In order to get qualitative information about the chemical composition, the

infusion from the barks of

H. speciosa was directly injected into the ESI-IT-MS source.

Both positive and negative ionization were tested. For the analyses of the

proanthocyanidins present in the infusion negative ionization was used, since it has been

demonstrated to be more sensitive and selective than the positive mode. This fact is

explained due to the acidity of the phenolic hydrogens, a fact that was also reported by

other researchers.

23,24

Figure 2 shows the ESI-IT-MS spectra of the precursor ions in

full scan mode for the secondary metabolites present in the infusion.

Peak at

m/z 289 was assigned to the deprotonated molecule of [epi]catechin.

Second order fragmentation led to the base peak at

m/z 137 [M – 152 – H]

–

which

represents the C-ring cleavage through a retro-Diels-Alder mechanism (RDA).

10,25

minor product ion at

m/z 271 [M – 18 – H]

–

was due to the loss a water molecule with

double bond formation. The chirality of the C3 on the flavan-3-ols cannot be

differentiated by MS experiments. Designations of the epimer configuration are

generally based on the relative abundance of the “epi” configuration as polyphenolic

components of tea infusions and extracts.

26,27

In our case, we designated the compounds

as [epi]catechins.

Close inspection of the deprotonated molecule at

m/z 273 suggested the presence

of another monomer, corresponding to one unit of [epi]afzelechin.

Similarly, the

deprotonated molecule at

m/z 425 suggested the presence of [epi]afzelechin gallate. The

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

165

second-generation product ion spectrum of the precursor ion at

m/z 425 produced the

catechin-specific RDA ion product at

m/z 137 and the ion product [M – 152 – 18 – H] at

m/z 255, due to the sequential elimination of the galloyl moiety and water.

The second order fragmentation of the deprotonated molecule at

m/z 341

produced the product ions at

m/z 323 [M – 18 – H]

–

(loss of water), at m/z 297 [M – 44

– H]

–

(loss of CO

) and at m/z 179 [M – 162 – H]

–

(loss of an hexose moiety), which

were tentatively assigned to the fragmentation of the caffeic acid-

O-glycoside.

It is not

possible, however, to determine if the hexose moiety is bounded to position C3 or C4 of

the caffeic acid core.

The second-generation product ion spectrum of the deprotonated molecule at

m/z 353 produced the product ion at m/z 191 (quinic acid) due to the elimination of the

caffeoyl moiety [M – 162 – H]

–

from the chlorogenic acid, which presence was

confirmed through HPLC analysis with the commercially available standard compound

(data not shown).

Further examination of the ions in Figure 2 evidenced the presence of an

homologous series of proanthocyanidins intercalated by 288 Da. Major peaks at

m/z 289,

577, 865, 1153, 1441 and 1729 correspond to the deprotonated molecules of the

monomer, dimer, trimer, tetramer, pentamer and hexamer of the [epi]catechin,

respectively.

A second series of homologous compounds was evidenced by the peak signals at

m/z 451, 739, 1027, 1315, 1603 and 1891, which are 162 mass units higher than those

described before, thus suggesting the presence of a group of monoglycosylated

proanthocyanidins.

In order to verify the results described above, second order ESI-IT-MS/MS

experiments for the main observed peaks were performed. The tandem mass spectra in

second order for the homologous series of proanthocyanidins can be rationalized by

three main fragmentation mechanisms: the retro-Diels-Alder (RDA), quinone methide

(QM) and the heterocyclic ring fission (HFR) mechanisms.

10,25,30

Figure 3 shows the

fragmentation pathway of the dimer found in

H. speciosa, similar to that reported by Gu

et al.

Aglycone fragments were denoted in a similar way to the nomenclature proposed

for flavonoids by Ma

et al.

Shortly, the

i,j

–

and

i,j

–

labels are used to designate ions

containing intact A and B rings, respectively, in which the superscripts

i and j indicate

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

166

the bonds in the heterocyclic ring that have been broken. An additional subscript 0 to

the right of the letter is used to designate product ions originated from precursor ions

containing a sugar unit.

The product ions from glycoconjugates were designated

according to the nomenclature previously introduced by Domon and Costello.

Ions

containing the aglycone are labeled

k,l

–

, where the superscripts k and l indicate the

internal cleavages in the carbohydrate ring.

The second-generation product ion spectrum of the deprotonated molecule at

m/z 577 (Fig. 4) produced the base peak at m/z 425 [M – 152 – H]

–

, which is formed due

to the RDA fragmentation and loss of the

1,3

B fragment (Fig. 3).

The RDA reaction

could take place on the upper unit or on the base unit of the dimer. However,

elimination of ring B on the upper unit gives rise to a product ion with a larger π – π

conjugated system than RDA on the base unit.

10,23

In the sequence, the RDA originates

the product ion at

m/z 407 [M – 152 – 18 – H]

–

due to the loss a water molecule, most

likely due to the elimination of the 3OH to form a conjugated ion with a

2,3

∆ or

3,4

∆

double bond. A ion with a

3,4

∆ double bond is preferred, since it has a more extended

conjugation than the ion with a

2,3

∆ double bond. The product ion at m/z 451 is formed

due to the elimination of the upper unit of the dimer by HRF fragmentation pathway

(Fig. 3). HRF on the base unit of the dimer is not favored for the same reason as RDA.

Loss of the

1,4

A fragment of 126 Da indicates that the A-ring of the upper unit has a

1,3,5-trihydroxybenzene structure (Fig. 3). Formation of the product ion at

m/z 451 also

indicates that there are two hydroxyl group located at the C3’ and C4’ position of the B-

ring. Hence, the upper and base units of this dimer were identified as [epi]catechin.

Other minor product ions were observed at

m/z 559 [M – 18 – H]

–

due to the loss a

water molecule from the dimer, and the product ions at

m/z 289 [M – 288 – H]

–

and at

m/z 287 [M – 290 – H]

–

are resulting from the cleavage of the interflavan linkage

through the QM mechanism (Fig. 3). The proanthocyanidins that consist exclusively of

[epi]catechin are called procyanidins and the peak ion at

m/z 577 is indicative of the B-

type procyanidin dimer, that is, a procyanidin containing singly linked units. However,

as with other mass spectrometric techniques no differentiation between stereoisomers is

possible and no information about the position and stereochemistry of the interflavanoid

linkage (4→6 or 4→8) is available.

Since literature reports that procyanidins with

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

167

4→8 linkages are stereochemically favored

we designated the compounds present in

the infusion of

H. speciosa as represented in Fig. 3.

The higher homologous compounds presented deprotonated molecules at

m/z

865, 1153, 1441 and 1729, with diagnostic product ions (not shown) nearly identical to

those displayed in Figure 4.

The second-generation product ion spectra of the monoglycosylated

procyanidins were also investigated. The glycosidic nature of these derivatives was

indicated due to characteristic cross-ring cleavages. Second order fragmentation of the

deprotonated molecule at

m/z 739 (Fig. 5) illustrate the product ion spectrum containing

specific structural information on various portions of this structure. A mechanism based

on the analysis of the monoglycosylated dimer in

H. speciosa (Fig. 6) is proposed for

the formation of the main product ions observed.

The second-generation product ion spectrum of the deprotonated molecule at

m/z 739 (Fig. 5) produced the base peak at m/z 587 [M – 152 – H]

–

, which is formed due

to the RDA fragmentation and loss of the

1,3

fragment, and the diagnostic ions

0,3

–

[M – 90 – H]

–

at m/z 649 and

0,2

–

[M – 120 – H]

–

at m/z 619 in the product ion

spectrum, which are characteristic of the cross-ring cleavages of a

C-glycoside

residue.

Besides, the low intensity of the peak corresponding to the product ion at m/z

577 is not compatible with an

O-glycosyde residue.

33,34

The location of the sugar moiety

in the upper-unit of the dimer was proposed based on the cleavage of the interflavan

bond, which gives rise to the formation of the glycosylated quinone methide at

m/z 449

[M – 290 – H]

–

, and subsequent cleavages of the hexose unit yielded the product ions

0,2

–

at m/z 329 [M – 290 – 120 – H]

–

and

0,3

–

at m/z 359 [M – 290 – 90 – H]

–

(Fig. 6).

The fragmentation pattern of an isomeric compound with the sugar unit in the base-unit

would produce the ions

1,5

–

at m/z 317 [M – 288 – 134 – H]

–

0,2

–

at m/z 331 [M –

288 – 120 – H]

–

and

0,3

–

at m/z 361 [M – 288 – 90 – H]

–

. Hence the base unit was

identified as an intact unit of [epi]catechin, which forms the product ion at

m/z 289.

Other signals also support the

C-glycosidic nature of the compounds included in this

series. The presence of the ions at

m/z 449 and at m/z 435 were interpreted as the

fragments

0,2

–

[M – 152 – 18 – 120]

–

and

1,5

–

[M – 152 – 18 – 134]

–

, respectively,

probably originated from the peak at

m/z 569 [M – 152 – 18 – H]

–

, formed due to the

elimination of a water molecule from the base peak at

m/z 587. Formation of the

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

168

product ion at

m/z 451 [M – 288 – H]

–

through the HRF mechanism with neutral loss of

the

1,4

fragment from the glycosylated A-ring corroborates with the suggested

structure of a B-type

C-glycosylated procyanidin (Fig. 6).

Waridel

et al.

described that the differentiation between C6 and C8 flavonoid

C-glycosides can be based on low-energy negative ion mode CID-IT-MS/MS spectra, in

which loss of water (

−

E ) is specific to C6 C-glycosides. However, to the best of our

knowledge, discrimination between C6 and C8 C-glycosides proanthocyanidins is not

described in the literature. In this class of secondary metabolites loss of water is also

possible through elimination of the 3OH, and therefore the fragment

−

E can not be

used for an unambiguous identification.

The higher monoglycosylated homologous, from trimer to hexamer, presented

deprotonated molecular peaks at

m/z 1027, 1315, 1603 and 1891, and led to

fragmentation patterns analogous to those described above. To the best of our

knowledge, only a dimeric glycosylated procyanidin was described in the literature.

Therefore, the monoglycosylated proanthocyanidins here described might be new

compounds.

It is well known that polymeric procyanidins can form multiply charged ions,

leading to additional signals in the MS spectrum.

10,25

However, procyanidins with high

DP may originate ions with close mass-to-charge ratios, which cannot be solved by a

medium resolution mass spectrometer. Therefore, the identification of these polymers

usually is only speculative.

Our results demonstrate that noteworthy characteristics of the infusion from the

barks of

H. speciosa were the presence of proanthocyanidin oligomers, including

compounds containing [epi]catechin sub-units (i.e. procyanidins) with B-type linkages,

as well as their respective

C-glycosylated derivatives.

The presence of proanthocyanidins in this phytopreparation is particularly

significant. In fact, Iwasaki

et al.

recently reported that proanthocyanidins inhibited

gastric mucosal injury by strengthening mucosal protection. Besides, the recognized

antioxidant activity of these compounds may also contribute to its antiulcer activity.

Therefore, it is possible that the traditional antiulcer use of

H. speciosa is due, at least in

part, to the high content of proanthocyanidins.

CONCLUSIONS

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

169

ESI-IT-MS using direct flow injection of the infusion from

Hancornia speciosa led to

the detection of phenolic compounds and two series of oligomeric proanthocyanidins.

ESI-IT-MS/MS experiments allowed structural recognition of B-type proanthocyanidins

as well as their respective

C-glycosylated derivatives. The technique also allowed to

overcome the problem associated to the occurrence of polymers and showed to be very

simple, rapid, efficient, and provided a unique fingerprint of the secondary metabolites

content in the infusion, since it is not necessary a previous chromatographic separation.

As result, no extensive and time-consuming sample pretreatment was necessary.

Therefore, direct flow injection ESI-IT-MS showed its potential as a standard

analytical tool for the determination of polyphenols in complex mixtures like infusions,

which may have a profound impact on the study of biodiversity, including the fast

obtaining of metabolomic profiling and dereplication of vegetable species. The

analytical procedure demonstrated in this work proved to be a very efficient and simple

screening method that is able to provide information on different components. As a

routine application, the procedure could potentially be of great value in the investigation

of black or green tea samples, wines or other matrices based on the proanthocyanidin

core.

Acknowledgements

The authors gratefully acknowledge the financial support of the BIOTA/FAPESP

Program (Proc. Nº. 02/05503-6). To Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq) for grants to W.V. and A.R.M.S.B. and Coordenadoria de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) to a fellowship to C.M.R.

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Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

172

Figure 1. Chemical structures of dimeric B-type proanthocyanidins: 1 epicatechin-

(4β→8)-catechin,

2 epicatechin-(4β→6)-catechin and dimeric A-type proanthocyanidin:

3 epicatechin-(2β→7;4β→8)-epicatechin.

Figure 2. Typical direct flow injection ESI-IT-MS fingerprint spectra obtained in

negative ion mode of the infusion from the barks of

H. speciosa. A) Normal mass scan

in the range of

m/z 210 to 1600 and B) high mass scan in the range of m/z 1200 to 2000.

▼) Ions signals separated by 288 Da and corresponding to the first procyanidins

homologous series. ♦) Second monoglycosylated procyanidins homologous series.

Figure 3. Main fragmentation pathways of B-type proanthocyanidins illustrated for the

dimer identified in the infusion from the barks of

H. speciosa.

Figure 4. Product ion spectrum of the precursor ion [M – H]

at m/z 577 of a dimeric B-

type procyanidin identified in the infusion from the barks of

H. speciosa in collision

energy of 30%.

Figure 5. Product ion spectrum of the precursor ion [M – H]

at m/z 739 of a dimeric B-

type

C-glycosylated procyanidin identified in the infusion from the barks of H. speciosa

in collision energy of 30%.

Figure 6. Main fragmentation pathways of B-type proanthocyanidins proposed for the

monoglycosylated dimer identified in the infusion from the barks of

H. speciosa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

173

HO OH

Figure 1. Chemical structures of dimeric B-type proanthocyanidins: 1 epicatechin-

(4β→8)-catechin,

2 epicatechin-(4β→6)-catechin and dimeric A-type proanthocyanidin:

3 epicatechin-(2β→7;4β→8)-epicatechin.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

174

m/z

HSfia #403-416 RT: 6.65-6.94 AV:14 NL: 9.82E5

T: - c Full ms [ 210.00-1600.00]

400 600 800 1000 1200 1400 1600

100

Relative Abundance

576.9

451.0

352.9

739.0

864.9

289.0

536.8

532.8

424.9

865.9

694.8

1026.9

862.9

1152.9

879.0

1314.9 1440.9

1574.2

272.9

341.0

HSfia #403-416 RT: 6.65-6.94 AV:14 NL: 9.82E5

T: - c Full ms [ 210.00-1600.00]

400 600 800 1000 1200 1400 1600

100

Relative Abundance

576.9

451.0

352.9

739.0

864.9

289.0

536.8

532.8

424.9

865.9

694.8

1026.9

862.9

1152.9

879.0

1314.9 1440.9

1574.2

272.9

341.0

HSfia #2450-2570 RT: 46.94-48.85 AV: 121 NL: 5.14E4

T: - c Full ms [ 1200.00-2000.00]

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance

1313.7

1314.9

1439.6

1441.0

1442.0

1312.0

1315.9

1602.8

1438.2

1316.7

1729.2

1297.7

1478.2

1217.1

1600.2

1752.81379.5

1726.7

1616.1

1891.1

1911.6

HSfia #2450-2570 RT: 46.94-48.85 AV: 121 NL: 5.14E4

T: - c Full ms [ 1200.00-2000.00]

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance

1313.7

1314.9

1439.6

1441.0

1442.0

1312.0

1315.9

1602.8

1438.2

1316.7

1729.2

1297.7

1478.2

1217.1

1600.2

1752.81379.5

1726.7

1616.1

1891.1

1911.6

▼

▼▼

▼

♦

▼

Figure 2. Typical direct flow injection ESI-IT-MS fingerprint spectra obtained in

negative ion mode of the infusion from the barks of

H. speciosa. A) Normal mass scan

in the range of

m/z 210 to 1600 and B) high mass scan in the range of m/z 1200 to 2000.

▼) Ions signals separated by 288 Da and corresponding to the first procyanidins

homologous series. ♦) Second monoglycosylated procyanidins homologous series.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

175

retro-Diels-Alder (RDA)

fragmentation

- 152 Da

- RDA

- 18 Da

- H

OHO

m/z 577

m/z 425

m/z 407

Quinone methide (QM)

fragmentation

m/z 287

m/z 289

m/z 577

- 126 Da

- HRF

OHHO

m/z 451

Heterocyclic ring fission (HRF)

fragmentation

m/z 577

Figure 3. Main fragmentation pathways of B-type proanthocyanidins illustrated for the

dimer identified in the infusion from the barks of

H. speciosa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

176

HSfia #1047-1082 RT: 19.00-19.38 AV: 24 NL: 2.62E4

T: - c Full ms2 577.00@30.00 [ 155.00-600.00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600

m/z

100

Relative Abundance

424.8

407.0

450.9

289.0

558.9

298.8

287.0

245.1

203.,0 381.1

335.2 534.2

497.0

♦

HSfia #1047-1082 RT: 19.00-19.38 AV: 24 NL: 2.62E4

T: - c Full ms2 577.00@30.00 [ 155.00-600.00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600

m/z

100

Relative Abundance

424.8

407.0

450.9

289.0

558.9

298.8

287.0

245.1

203.,0 381.1

335.2 534.2

497.0

♦

Figure 4. Product ion spectrum of the precursor ion [M – H]

at m/z 577 of a dimeric B-

type procyanidin identified in the infusion from the barks of

H. speciosa in collision

energy of 30%.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

177

HSfia #1244-1362 RT: 22.44-24.55 AV:119 NL: 8.19E3

T: - c Full ms2 739.00@30.00 [ 200.00-800.00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

m/z

100

Relative Abundance

586.9

451.0

569.0

434.8

289.0

628.9

338.9

721.0

618.9

648.8

417.1

477.0

695.0

358.8

490.9286.9 542.9

328.7244.7

448.9

♦

HSfia #1244-1362 RT: 22.44-24.55 AV:119 NL: 8.19E3

T: - c Full ms2 739.00@30.00 [ 200.00-800.00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

m/z

100

Relative Abundance

586.9

451.0

569.0

434.8

289.0

628.9

338.9

721.0

618.9

648.8

417.1

477.0

695.0

358.8

490.9286.9 542.9

328.7244.7

448.9

♦

Figure 5. Product ion spectrum of the precursor ion [M – H]

at m/z 739 of a dimeric B-

type

C-glycosylated procyanidin identified in the infusion from the barks of H. speciosa

in collision energy of 30%.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

178

0,2

X m/z 329

0,3

X m/z 359

m/z 289

m/z 449

0,3

0,2

m/z 739

m/z 587

m/z 569

1,5

0,2

m/z 435

m/z 449

0,2

1,5

0,3

0,2

m/z 649

m/z 619

- 18 Da (- H

O) m/z 721

m/z 739

- 110 Da (- catechol) m/z 629

- 110 Da (- catechol) m/z 339

retro-Diels-Alder (RDA)

fragmentation

Quinone methide (QM)

fragmentation

Heterocyclic ring fission (HRF)

fragmentation

m/z 451

m/z 287

m/z 739

- 152 Da

- RDA

- 18 Da

- H

- 288 Da

- HRF

Figure 6. Main fragmentation pathways of B-type proanthocyanidins proposed for the

monoglycosylated dimer identified in the infusion from the barks of

H. speciosa.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

179

High-performance liquid chromatographic separation and identification of

polyphenolic compounds from the infusion of Davilla elliptica St. Hill

Short Title: Polyphenolic compounds from Davilla elliptica

Clenilson M. Rodrigues

, Daniel Rinaldo

, Miriam Sannomiya

, Lourdes C. dos Santos

Paola Montoro

, Sonia Piacente

, Cosimo Pizza

and Wagner Vilegas

UNESP, São Paulo State University, Organic Chemistry Department, CP 355, CEP

14800-900, Araraquara, São Paulo - Brazil.

Università degli Studi di Salerno, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, via Ponte

Don Melillo, 84084 Fisciano (SA) - Italy.

Abstract: The isolation of polyphenolic compounds from an infusion of the Brazilian

plant

Davilla elliptica (Dilleniaceae), used as tea by virtue of its digestive properties, is

described. An improved preparative HPLC method was used in order to isolate pure

polyphenols from the complex mixture. Liquid-liquid extraction and solid-phase

extraction were employed to minimize the interference of polymeric compounds and to

provide an enriched fraction of the compounds of interest. The identification of the

isolated compounds was performed using analytical HPLC as well as direct injection

electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry (ESI-IT-MS/MS). The high

flavonoid content suggests that

D. elliptica may be a promising source of compounds to

produce natural phytomedicines.

Keywords: Preparative HPLC; solid-phase extraction; infusion analysis; flavonoids;

Davilla elliptica; Dilleniaceae

*Address correspondence to W. Vilegas, Instituto de Química, Departamento de

Química Orgânica, Universidade Estadual Paulista. Tel.: +55-16-3301-6668, fax: +55-

16-3301-6692. E-mail: vilegasw@gmail.com

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

180

INTRODUCTION

Dilleniaceae is a plant family found in tropical and subtropical regions of the world. The

native Brazilian representatives are predominantly species of the genera

Davilla,

Tetracera, Curatella and Dolicarpus (David et al., 1996).

Davilla is a Neotropical genus consisting of twenty species, eleven of which

have been botanically studied (Gurni and Kubitzki, 1981). Some species of this genus

are used by local populations as medicinal plants (data not published). Despite the

popular use of these species in folk medicine, there are only a few reports about their

pharmacological activities on the gastric intestinal system or their possible toxic effects.

D. rugosa was investigated owing to its anti-ulcerogenic activity (Guaraldo et al., 2001).

Moreover, the chemical composition of this and of other species it is still under

explored. There are, however, literature reports of the presence of kaempferol, myricetin

and quercetin as well as their rhamnoside derivatives in the leaves of

D. flexuosa and D.

rugosa (David et al., 1996; Guaraldo et al., 2001). Previous pharmacological evaluation

of the methanol extracts from the leaves of

D. elliptica indicated that they did not

present acute toxicity and promoted gastric protection in

in vivo assays in mice

(unpublished data), thus representing a promising source of new phytomedicines. In

addition, Michelin

et al. (2005) described the antimicrobial activity of the crude

methanol extract of the aerial parts of

D. elliptica.

Flavonoids are widespread compounds commonly found in the daily diet; they

are resistant to boiling and fermentation and display a broad range of biological and

pharmacological properties (Hollman and Katan, 1998). It has been reported that

flavonoids and phenolic compounds display hydrogen-donating and radical scavenger

capacities, especially those with an

ortho-dihydroxy group such as quercetin, and gallic

acid derivatives, which can be related to some anti-ulcer mechanisms (Havsteen, 2002).

This represents, therefore, an important reason to study the chemical composition of

medicinal plants with traditional use in gastric diseases.

During the investigation of complex matrices, efficient separation and fast

identification methods are required to assess the chemical composition of medicinal

plants. Although there are different approaches to the separation and analysis of

secondary metabolites from herbal extracts, HPLC is by far the most widely used

technique for the separation of complex mixtures of polyphenolic compounds in plant

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

181

extracts (Merken and Beecher, 2000; Robards, 2003; Rayyan

et al., 2005). However,

when the concentration of tannins is high, it usually leads to a significant decrease in

chromatographic resolution, which makes unfeasible the separation of the compounds

by HPLC. The literature also reports that the separation of mixtures containing tannins

and flavonoids using gel permeation chromatography (GPC) over Sephadex LH-20

produces poor results (Mueller-Harvey, 2001). In our studies, the use of high-speed

counter-current chromatography (HSCCC) to fractionate the ethanol extract of

elliptica led only to the isolation of myricetin-3-O-rhamnoside and quercetin-3-O-

rhamnoside (Rinaldo

et al., 2006). Thus, in order to achieve good separations, it is often

necessary to perform a clean-up of the sample.

The present work deals with the isolation and identification of secondary

metabolites present in the infusion from the leaves of

Davilla elliptica St. Hill

(Dilleniaceae). Since most of the compounds present in infusions are known to be polar

compounds, methods were developed based on reversed-phase (RP) HPLC. Gradient

preparative and analytical HPLC methods coupled with photodiode array detection

(PAD) were applied simultaneously to separate flavonoids, both glycosides and

aglycones, and phenolic compounds. Negative mode ESI-IT-MS/MS analyses were

used to characterize the structure of these compounds.

EXPERIMENTAL

Plant Material. Aerial parts of D. elliptica were collected in March 2004 at Palmas,

Tocantins State, Brazil and authenticated by Solange de Fátima Lólis. A voucher

specimen Nº 4593 was deposited at the Herbarium of the Tocantins University.

Reagents and Standard Solutions. HPLC-grade methanol and acetonitrile were

purchased from J.T. Baker (Baker-Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, USA). Standards of

quercetin, myricetin, quercetin-3-

O-β-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-α-L-

rhamnopyranoside, rutin, (-)-epicatechin and trifluoroacetic acid (TFA) were purchased

from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), and quercetin-3-

O-β-D-

galactopyranoside and myricetin-3-

O-α-L-rhamnopyranoside were from Extrasynthese

(Genay, France). HPLC-grade water (18 MΩ.cm) was obtained using a Direct Q5 Milli-

Q purification system (Millipore Co., Bedford, MA, USA). Sep-Pak RP18 cartridges

(20 g/60 mL) for solid-phase extraction (SPE) were purchased from Phenomenex Co.

(Torrance, CA, USA).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

182

Extraction. The dried powdered leaves of D. elliptica (100 g) were infused with boiling

water (1 L) for 10 min. The mixture was filtered through filter paper to remove macro

particles, cooled to room temperature and submitted to liquid-liquid extraction (LLE)

between ethyl acetate and water (1:1, v:v). Both layers were checked by TLC (Si gel

plates, chloroform : methanol :

n-propanol : water (5:6:1:4, v:v), organic phase) and

visualized with anisaldehyde sulphuric acid reagent (Wagner

et al., 2003). Flavonoids

(yellow spots) and gallic acid derivatives (grey spots) were concentrated in the ethyl

acetate fraction, whereas tannins and free sugars remained in the aqueous layer. The

ethyl acetate layer was vacuum-evaporated to dryness to give a brown solid (4.0 g).

The brown residue obtained from LLE was dissolved in 50 mL methanol : water

(7:3, v:v) and aliquots (10 mL) were applied to a Sep-Pak RP18 cartridge,

preconditioned with methanol (2 x 100 mL) and water (100 mL), to remove lipid

material. The cartridge was eluted with 100% methanol (50 mL) affording a fraction

containing mainly flavonoids. In order to remove adsorbed lipids, carotenoids and

chlorophyll, the cartridge was further washed with chloroform (100 mL). This process

was repeated and the methanol fractions were combined. The solvent was evaporated

under a stream of nitrogen to give a flavonoid rich fraction (FRF, 3.5 g). The solid was

redissolved in 10 mL methanol : water (7:3, v:v), filtered through a 0.45 µm

polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane filter and aliquots submitted to preparative

HPLC.

Isolation of the components. The FRF was separated using a Varian (Walnut Creek,

CA, USA) ProStar 210/330 HPLC system equipped with a Dynamax RP18 preparative

column (250 x 41.4 mm i.d.; 8 µm) and a Rheodyne (Cotati, CA, USA) 7125 sample

injector with a 1 mL sample loop. The mobile phase consisted of water (eluent A) and

methanol (eluent B), both containing 0.05% of TFA. Elution was: 33-47% B, linear

gradient (150 min); 47-100% B, linear gradient (25 min); 100% B isocratic (25 min).

The flow rate was 15 mL/min and the total run time was 200 min. Data were monitored

at 270 nm for general aromatics, 330 nm for myricetin and quercetin monoglycosides,

and 360 nm for flavonoid aglycones (Merken and Beecher, 2000). Individual peaks

from multiple injections were collected as they eluted from the column and concentrated

by evaporation. When necessary, the fractions obtained were purified by multiple HPLC

separation on a Phenomenex Luna C18 semi-preparative column (250 x 10 mm i.d.; 10

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

183

µm) using a Rheodyne 7125 sample injector with a 100 µL sample loop. The gradient

elution was 36 to 42% of eluent B in 15 min, with a linear increase to 100% in 30 min,

followed by 5 min isocratic elution and a return to 36% at 40 min: the flow rate was 4.7

mL/min.

Infusion Analyses by HPLC-PAD. The chromatographic profile of the sample

obtained from SPE was established using a Jasco (Tokyo, Japan) liquid chromatograph

equipped with a PU-2089 quaternary solvent pump, a MD-2010 PAD and a Rheodyne

7725 sample injector with a 20 µL sample loop. The analytical column was a

Phenomenex Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 µm) equipped with a

Phenomenex security guard column (4.0 x 2.0 mm i.d.). The mobile phase composition

was: water (eluent A) and acetonitrile (eluent B) both containing 0.05% of TFA. The

gradient program was as follows: 15-22% B (25 min), 22-40% B (15 min), 40-78% B (5

min), 78-100% B (5 min) and 100% B isocratic (5 min). The flow rate was 1.0 mL/min

and the total run time was 55 min. EZChrom Elite Data System software (Chromatec,

Idstein, Germany) was used for both the operation of detector and for data processing.

Identification of compounds was performed by retention time and by spiking with

standards and isolated compounds under the same conditions.

Analyses by ESI-IT-MS and ESI-IT-MS/MS. ESI-MS in the negative ion mode was

performed using a Finnigan (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) LCQ Deca ion trap

instrument equipped with Xcalibur software. Samples were dissolved in methanol and

infused in the ESI source using a syringe pump; the flow rate was 3 µL/min. The

capillary voltage was -5 V, the spray voltage was 5 kV, and the tube lens offset was -55

V. The capillary temperature was 220ºC. Nitrogen was used both as drying gas at a flow

rate of 350 L/min and as nebulizing gas. The nebulizer temperature was set at 280ºC,

and a potential of –4 V was used on the capillary. Negative ion mass spectra were

recorded in the range

m/z 50-1500. Two scan events were prescribed to run in the LCQ

mass spectrometry. The first event was a full-scan spectrum to acquire data on the

deprotonated compounds within the scan range. The second scan event was a MS/MS

experiment performed using a data-dependent scan on deprotonated molecule [M –

at a collision energy of 25% of the instrument maximum.

RESULTS AND DISCUSSION

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

184

In order to assess the chromatographic profile, the infusion was investigated by

analytical HPLC-PAD. The preparation of the sample prior to HPLC analysis was

performed using LLE partitioning of the infusion between ethyl acetate and water.

Mixtures of methanol : water and acetonitrile : water in different proportions

were tested as mobile phase for HPLC analyses, as were the effects of adding formic

and trifluoroacetic acids to adjust the pH value and solvent strength over the separation.

The best results were obtained using gradient elution with acetonitrile : water. A

significant improvement in the separation of the peaks was also observed after adding

trifluoroacetic acid. As a result, under the optimized conditions a baseline separation

was achieved within 40 min, with symmetrical, sharp and well-resolved peaks for

almost all analytes including the minor components (Fig. 1). The identification of

analytes was based on the comparison of the retention time and UV spectra of the peaks

with those of the available reference standards and confirmed by spiking FRF with

standards or isolated compounds. With PAD scanning from 200-600 nm it was possible

to obtain the UV spectra of each peak, which permitted the selection of a suitable

wavelength at which to maximize the detection of the constituents of FRF thus

minimizing any interference. According to their corresponding UV absorbance, a

wavelength of 254 nm was determined to be the most appropriate to ensure maximum

detection for the simultaneous analyses of all compounds present in FRF. The UV

spectra of the peaks corroborated the presence of flavonoids (peaks

3 to 5 and 7 to 15

with bands at 240-285 nm and 300-380 nm) and gallic acid derivatives or catechins

(peaks

1 and 2 with bands at 210-278 nm) (Merken and Beecher, 2000).

Unfortunately, owing to the large amount of water (85%) present at the start of

the gradient, the optimized conditions for analytical separation could not be directly

transported to the preparative scale for separation of the FRF in order to isolate analytes

in amounts sufficient for spectral characterization. Hence, in view of the greater

solubility of the FRF in methanol, several solvent systems were evaluated as mobile

phase in order to separate the maximum number of compounds. The flow rate and the

FRF loading onto the column were also optimized to obtain the largest number of the

minor compounds with the highest purity in a single chromatographic run. The best

result was achieved using gradient mixtures of methanol : water, starting with 67%

water, at a flow rate of 15 mL/min and detection at 254 nm (Fig. 2). This system led to

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

185

the separation of fifteen compounds (Fig. 3) in amounts sufficient to perform spectral

characterization (Table 1). The isolated compounds were identified by their NMR

spectral data and compared to those reported in the literature (Agrawal, 1989; Harborne,

1994). The purity of compounds was determined by NMR and by HPLC under different

experimental conditions and was found to be higher than 90%.

In order to confirm these results, direct injection ion trap electrospray tandem

mass spectrometry analyses of the infusion was also performed. Figure 4 shows the

negative spectral profile of the infusion of

D. elliptica submitted to direct injection into

the ESI-IT-MS source. The signal at

m/z 169 corresponds to gallic acid whilst that at

m/z 191 suggests the presence of quinic acid; these compounds are widely distributed in

plants. The identification of the other compounds was mainly performed on the basis of

their fragmentation patterns in the MS/MS experiments. Figure 5 presents the MS/MS

fragmentation of representative compounds from

D. elliptica and Figure 6 displays the

most common aglycone fragmentation of flavonoids designated according to the

nomenclature previously proposed by Ma

et al., (1997). The product ions from the

glycoconjugates were denoted according to the nomenclature introduced by Domon and

Costello (1998). The second-generation ion product spectrum of the precursor ion at

m/z

447 (Fig. 5a) produced the base peak

−

Y at m/z 301 [M – 146 – H]

–

, due to the loss of a

deoxyhexose, and the minor product ion

−

2,0

at m/z 343 [M – 104 – H]

–

, thus

corroborating the presence of quercetin-3-

O-α-rhamnopyranoside (11). The second-

generation ion product spectrum of the precursor ion at

m/z 463 [M – H]

–

(Fig. 5b)

produced the product ion

−

Y at m/z 317 [M – 146 – H]

–

, due to the loss of a

deoxyhexose unit, and the minor product ions

−

2,0

at m/z 359 [M – 104 – H]

–

−

Z at

m/z 301 [M – 162 – H]

–

, as well as the product ion

−

3,1

A resulting from the retro-Diels-

Alder (RDA) elimination of ring B at

m/z 151, which confirms the presence of

myricetin-3-

O-α-rhamnopyranoside (8). The second-order fragmentation of the

precursor ion [M – H]

–

at m/z 479 (Fig. 5c) produced the product ion

−

Y at m/z 317 [M

– 162 – H]

–

, and also the product ion

−

2,0

at m/z 359 [M – 120 – H]

–

, supporting the

presence of the myricetin hexoside (

3 or 4). The second-generation ion product

spectrum of the precursor ion at

m/z 615 (Fig. 5d) produced product ion

−

Y at m/z 463

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

186

[M – 152 – H]

–

(due to the loss of a galloyl moiety), the product ion

−

Y at m/z 317 [M –

152 – 146 – H]

–

(corresponding to the loss of the galloyl and a deoxyhexose moiety),

together with the minor product ion

−

B at m/z 299 and

−

Z at m/z 301, thus confirming

the presence in

D. elliptica of the two acylated flavonol glycosides myricetin-3-O-(2"-

O-galloyl)-α-rhamnopyranoside (13) and myricetin-3-O-(3"-O-galloyl)-α-

rhamnopyranoside (

14). The aglycones quercetin (15) and myricetin (12) gave low

intensity peaks at

m/z 301 [M – H]

–

and at m/z 317 [M – H]

–

, respectively. The presence

of the acylated flavonol glycoside myricetin-3-

O-(2"-O-galloyl)-β-galactopyranoside

(

5) at m/z 631 [M – H]

–

could also be observed. The second-generation ion product

spectrum of the odd-electron ion (radical anion) at

m/z 316 [M]

–•

(Fig 5e) produced the

radical anion at

m/z 271 [M – 45]

–•

, due to the loss of a COOH unit, while the radical

anions at

m/z 203 [M – 113]

–•

and at m/z 222 [M – 94]

–•

could be ascribed to the loss of

the terminal C

COOH (3-methyl-2,4-pentadienoic acid) and C

COOH (3-methyl-

2-butenoic acid) units and further recombination with hydrogen atoms. This kind of

fragmentation matches with those of oxoretinoic acids (Wingerath

et al., 1999).

However, the occurrence of rearrangements,

cis/trans isomers and positional isomers

prevented the unequivocal identification of this compound.

Our results reveal that the approach used in this work permits a fast and efficient

analysis and preparative separation of the phenolic compounds present in a highly

complex matrix such as an infusion from the leaves of

D. elliptica.

The clean-up steps were simple and efficient. The combination of LLE followed

by SPE using Sep-Pak RP18 cartridge was able to separate the analytes from co-

extractives, such as tannins, free sugars and lipid material. The clean-up led to a

considerable minimization of the interferences and allowed the preconcentration of the

main metabolites found in this infusion, with advantages in terms of sample preparation

and selective separation of the secondary metabolites.

The optimized analytical HPLC method has shown to be useful for the reliable

identification of 15 compounds present in the infusion of

D. elliptica, including gallic

acid, one catechin and flavonoid glycosides, and established the chemical profile of this

plant species. Following the general procedure here described, it could also be used for

quantitative determination and quality control of this plant species.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

187

Concerning the HPLC separation of the compounds on a preparative scale, under

the conditions used the method allowed the isolation and the detailed identification of

several compounds, including minor flavonoid glycosides, which allowed the full

characterization of the chemical composition of the infusion.

Direct flow injection ESI-IT-MS of the infusion of the aerial parts of

D. elliptica

led to the detection of phenolic acids, one oxoretinoic acid as well as a series of

flavonoid

O-glycosides and their acyl derivatives. The technique has shown to be very

simple, rapid, efficient, and provided a qualitative fingerprint of the secondary

metabolites content in the infusion. The uses of ESI-IT-MS point toward the possibility

of identifying key-compounds directly from crude infusion, without the need of

extensive clean-up. Moreover, by performing a limited number of experiments, a

significant gain in terms of time and reliability was achieved.

Flavonoids and their glycosides are responsible for a large number of

pharmacological properties. They are also known for their radical scavenging and

antioxidant capabilities (Aaby

et al., 2004) and these properties are closely related to the

anti-ulcer activity due to protective effect, including gastric and esophageal injuries or

liver protection (Oh

et al., 2001; Galati et al., 2003; Speroni et al., 2003).

Therefore, the detailed description of the chemical composition of the infusion

D. elliptica showed the presence of groups of secondary metabolites that may be

involved in the pharmacological activities observed. Due to the scarce literature data on

the secondary metabolites of plants present in Dilleniaceae, our results may also

contribute to the taxonomy of the family.

Further studies are now in process in order to clarify the biological activities of

these compounds in the infusion, which may evidence [or not] the folk utilization of

elliptica

as a medicinal plant to treat gastric diseases.

Acknowledgments

The authors wish to thank the Biota FAPESP Program of the Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for financial aid and for fellowships to D.R.

and M.S. We also thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) for grants to W.V. and CAPES for a fellowship to C.M.R.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

188

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Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

190

Figure 1. Analytical HPLC-PAD chromatogram recorded at 254 nm of the compounds

isolated from leaves of

D. elliptica. Peak identification: 1 gallic acid, 2 (–)-epicatechin,

3 myricetin-3-O-β-D-galactopyranoside, 4 myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside, 5

myricetin-3-

O-(2"-O-galloyl)-β-D-galactopyranoside, 6 (6S,7E)-6,9-dihydroxy-4,7-

megastigmadien-3-one,

7 rutin, 8 myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside, 9 quercetin-3-

O-β-D-galactopyranoside, 10 quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside, 11 quercetin-3-O-α-

L-rhamnopyranoside, 12 myricetin, 13 myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-

rhamnopyranoside,

14 myricetin-3-O-(3"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside, 15

quercetin. For chromatographic conditions see Experimental section.

Figure 2. Preparative HPLC-PAD chromatogram of the compounds isolated from

leaves of

D. elliptica. For peak identification see Fig. 1 and for chromatographic

conditions see conditions see Experimental section.

Figure 3. Compounds found in the leaves of the D. elliptica. Gal: galactoside; Glc:

glucoside; Gall: galloyl; Rha: rhamnoside; Ara: arabinoside.

Figure 4. Typical direct flow injection ESI-MS spectrum, in full scan mode, of the

infusion from the leaves of

D. elliptica. For spectrometric conditions see Experimental

section.

Figure 5. Second-generation product ion spectra obtained for the main precursor ions

produced in the ESI-MS experiment and the proposed corresponding fragmentations.

For peak assignments see Fig. 6.

Figure 6. Ion nomenclature adopted for flavonoid glycoside fragmentation (illustrated

on myricetin-3-

O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside).

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

191

Table 1. Spectral (UV and electrospray ionization MS) and chromatographic (HPLC)

data of the compounds

1-15 isolated from the flavonoid rich fraction (FRF) obtained

after clean-up procedures on the infusion of

D. elliptica.

On line HPLC-PAD

Compound

(isolated

amount, mg)

ESI-MS

[M – H]

–

(m/z)

max

(nm)

Retention

time (min)

1 (210) 169 272; 216 3.34

2 (5) 289 279; 231(sh); 204 7.89

3 (73) 479 358; 258 10.64

4 (25) 479 358; 258 10.64

5 (53) 631 363; 300(sh); 266 11.05

6 (60) 223 241 11.60

7 (6) 625 354; 257 14.05

8 (350) 463 350; 260 15.08

9 (22) 463 353; 255 15.92

10 (5) 443 355; 257 20.10

11 (140) 447 348; 257 22.43

12 (6) 317 372; 254 27.90

13 (6) 615 350; 299(sh); 266 29.04

14 (5) 615 351; 300(sh); 266 30.08

15 (16) 301 371; 256 37.22

Peak numbering as in Fig. 1: for the proposed structures and nomenclature of

compounds see Fig. 3.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

192

Absorbance (mv)

Time (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

200

400

600

800

1000

1200

PDA-254 nm

3+4

Absorbance (mv)

Time (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

200

400

600

800

1000

1200

PDA-254 nm

3+4

Figure 1

. Analytical HPLC-PAD chromatogram recorded at 254 nm of the compounds

isolated from leaves of

D. elliptica. Peak identification: 1 gallic acid, 2 (–)-epicatechin,

3 myricetin-3-O-β-D-galactopyranoside, 4 myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside, 5

myricetin-3-

O-(2"-O-galloyl)-β-D-galactopyranoside, 6 (6S,7E)-6,9-dihydroxy-4,7-

megastigmadien-3-one,

7 rutin, 8 myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside, 9 quercetin-3-

O-β-D-galactopyranoside, 10 quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside, 11 quercetin-3-O-α-

L-rhamnopyranoside, 12 myricetin, 13 myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-

rhamnopyranoside,

14 myricetin-3-O-(3"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside, 15

quercetin. For chromatographic conditions see Experimental section.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

193

25 50 75 100 125 150 175

Time (min)

100

200

300

400

500

Absorbance (mAU)

600

3+4

25 50 75 100 125 150 175

Time (min)

100

200

300

400

500

Absorbance (mAU)

600

3+4

Figure 2. Preparative HPLC-PAD chromatogram of the compounds isolated from

leaves of

D. elliptica. For peak identification see Fig. 1 and for chromatographic

conditions see conditions see Experimental section.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

194

OOH

3 R

= OH, R

= Gal

4 R

= OH, R

= Glc

5 R

= OH, R

= (2"-Gall)-Gal

7 R

= H, R

= Glc-Rha

8 R

= OH, R

= Rha

9 R

= H, R

= Gal

10 R

= H, R

= Ara

11 R

= H, R

= Rha

12 R

= OH, R

= H

13 R

= OH, R

= (2"-Gall)-Rha

14 R

= OH, R

= (3"-Gall)-Rha

15 R

= H, R

= H

Figure 3. Compounds found in the leaves of the D. elliptica. Gal: galactoside; Glc:

glucoside; Gall: galloyl; Rha: rhamnoside; Ara: arabinoside.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

195

DE # 426-448 RT: 7.26-7.52 AV: 13 NL: 3.28E5

T: - c Full ms [150.00-1000.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

100

Relative Abundance

462.9

478.9

446.9

614.9

576.8

301.1

728.8

432.9

630.8

778.4

896.9

988.7

169.0

191.0

316.1

317.1

Figure 4. Typical direct flow injection ESI-MS spectrum, in full scan mode, of the

infusion from the leaves of

D. elliptica. For spectrometric conditions see Experimental

section.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

196

100 150 200 250 300 350 400

100

271.0

270.0

316.0

221.7

202.7

DE # 9-54 RT: 0.20-1.00 AV: 46 NL: 7.09E3

T: - c Full ms2 31[email protected] [85.00-400.00]

−

][M

•

[M –45]

–

•

[M –94]

–

•

[M – 113]

–

COOH

100 150 200 250 300 350 400

100

271.0

270.0

316.0

221.7

202.7

100 150 200 250 300 350 400

100

271.0

270.0

316.0

221.7

202.7

DE # 9-54 RT: 0.20-1.00 AV: 46 NL: 7.09E3

T: - c Full ms2 31[email protected] [85.00-400.00]

−

][M

•

−

][M

•

[M –45]

–

•

[M –94]

–

•

[M –94]

–

•

[M – 113]

–

•

[M – 113]

–

COOH

m/z

150 200 250 300 350 400 450

100

301.0

300.0

428.9

342.6

150.9

447.2

DE # 408-417 RT: 7.19-7.33 AV: 10 NL: 5.87E4

T: - c Full ms2 [email protected] [120.00-450.00]

−

− ][ HM

OOH

OHOH

−

3,1

−

2,0

150 200 250 300 350 400 450

100

301.0

300.0

428.9

342.6

150.9

447.2

DE # 408-417 RT: 7.19-7.33 AV: 10 NL: 5.87E4

T: - c Full ms2 [email protected] [120.00-450.00]

−

− ][ HM

OOH

OHOH

−

3,1

−

2,0

150 200 250 300 350 400 450 500

100

315.9

317.0

231.0

358.8

300.9

444.8

462.8

150.8

DE # 110-121 RT: 2.02-2.24 AV: 12 NL: 1.44E5

T: - c Full ms2 [email protected] [125.00-500.00]

−

− ][ HM

OOH

OHOH

−

3,1

−

2,0

−

150 200 250 300 350 400 450 500

100

315.9

317.0

231.0

358.8

300.9

444.8

462.8

150.8

DE # 110-121 RT: 2.02-2.24 AV: 12 NL: 1.44E5

T: - c Full ms2 [email protected] [125.00-500.00]

−

− ][ HM

OOH

OHOH

−

3,1

−

2,0

−

Relative Abundance

150 200 250 300 350 400 450 500

100

315.9

316.7

178.9

359.0

388.7

264.8

479.0

461.0

DE # 143-183 RT: 2.58-3.24 AV: 41 NL: 4.28E3

T: - c Full ms2 [email protected] [130.00-500.00]

−

− ][ HM

OOH

−

2,0

Relative Abundance

150 200 250 300 350 400 450 500

100

315.9

316.7

178.9

359.0

388.7

264.8

479.0

461.0

DE # 143-183 RT: 2.58-3.24 AV: 41 NL: 4.28E3

T: - c Full ms2 [email protected] [130.00-500.00]

−

− ][ HM

OOH

−

2,0

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

100

317.0

462.9

299.0

614.9

596.8

301.0

−

− ][ HM

DE # 665-689 RT: 11.01-11.65 AV: 35 NL: 6.48E2

T: - c Full ms2 [email protected] [225.00-700.00]

OOH

OHO

−

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

100

317.0

462.9

299.0

614.9

596.8

301.0

−

− ][ HM

DE # 665-689 RT: 11.01-11.65 AV: 35 NL: 6.48E2

T: - c Full ms2 [email protected] [225.00-700.00]

OOH

OHO

−

Figure 5. Second-generation product ion spectra obtained for the main precursor ions

produced in the ESI-MS experiment and the proposed corresponding fragmentations.

For peak assignments see Fig. 6.

Caracterização quali e quantitativa de metabólitos secundários em extratos vegetais

197

0,2

0,4

1,3

0,4

1,3

Figure 6. Ion nomenclature adopted for flavonoid glycoside fragmentation (illustrated

on myricetin-3-

O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside).

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