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CARINA TALARICO RIZZI
PARALISIA DO TREM POSTERIOR
CAUSADA POR CROTAMINA - O QUE HÁ
POR TRÁS DISSO?
São Paulo
2006
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CARINA TALARICO RIZZI
PARALISIA DO TREM POSTERIOR
CAUSADA POR CROTAMINA - O QUE HÁ
POR TRÁS DISSO?
Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo, para
a obtenção de Título de Mestre
em Ciências, na Área de
Fisiologia.
Orientador: Prof. Dr. Lanfranco
Ranieri Paolo Troncone
São Paulo
2006
i
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Rizzi, Carina Talarico
Paralisia do trem posterior
causada por crotamina - o que há por
trás disso?
Número de páginas: 57
Dissertação (Mestrado) - Instituto
de Biociências da Universidade de São
Paulo. Departamento de Fisiologia.
1. Palavra-Chave Principal:
crotamina 2. Palavra-Chave
Secundária: canal de sódio I.
Universidade de São Paulo. Instituto de
Biociências. Departamento de
Fisiologia.
Comissão Julgadora
:
________________________ _______________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
________________________ _______________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
______________________
Prof(a). Dr.(a).
Orientador(a)
ii
Para Clóvis
Cujo amor inspirou esta jornada
Para Plinio e Marilena, meus pais
Pelo amor, incentivo e dedicação
Para Pedro, meu querido filho
Por seu amor e seu doce sorriso
iii
Agradecimentos
Ao meu orientador pela confiança, devoção e paciência.
Ao Prof. Dr. José Carlos de Freitas pelo apoio quando da minha entrada no
mestrado e pela colaboração.
Ao Prof. Dr. Isaltino Marcelo Conceição por me acolher em seu laboratório e por
suas valiosas explicações.
Ao Prof. Dr. Enzo Wanke por possibilitar a obtenção de tão preciosos resultados.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola e seu aluno João Luiz de Souza pela
inestimável colaboração de última hora.
Aos meus dedicados e queridos amigos do laboratório, Marina Sorrentino e
Leandro de Magalhães que sempre tornaram tudo possível e melhor.
Ao Prof. Dr. Patrick Spencer, amigo de longa data, pela purificação da crotamina
e por relembrar bons e velhos tempos de festas e lasanha.
À Thalma de Freitas, Bianca Casasco e Ana Beatriz Oliveira pelo constante
apoio, sem falar no bom humor.
Ao pessoal de suporte Joana Padula, Wilson D’Ávila, Wanda Regina da Silva,
Maria Aparecida da Silva, Maria Zelma da Silva, Carlos Roberto Valério e Antônio
Fontes pelos cuidados cotidianos.
Às minhas queridas amigas Fábia Azevedo e Maria Fernanda Miranda pelo
amor, apoio e incentivo constantes.
À Silvia Helena Damiati por todo o apoio, confiança e alegria.
Aos amigos que acompanharam e incentivaram esta jornada: Alexandre
Azevedo, Ana Paola Cottini, Cláudia Pereira, Claudinei Pereira, Evanice Claudino,
Manuela Geronimo, Márcia Menezes (e sua família), Telma Silvério e Wilson Miranda.
Aos companheiros de laboratório Adriana, Aline, Ana Luiza, Camila, Celine,
Carlos, Cristiane, Cristina, Daiane, Elizângela, Gustavo, Geane, Leonardo, Mariana,
Marcela, Marlos, Milene, Neide, Rafaela, Raquel, Renata, Renato, Roseli, Sayuri,
Thaís, Vanessa e Vivian por partilharem as dores e alegrias.
iv
Índice:
Introdução
...........................................................................................................................................................1
Aspectos bioquímicos da crotamina...................................................................................................1
Métodos de purificação..............................................................................................................................5
Aspectos farmacológicos...........................................................................................................................7
Canais de sódio como alvos de toxinas...........................................................................................10
Material e Métodos
...................................................................................................................................14
Purificação da crotamina.........................................................................................................................14
Ensaio comportamental............................................................................................................................16
Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina.............................................................16
Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................18
Eletrofisiologia..............................................................................................................................................19
Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)...........................................................19
Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária.................................................22
Efeito da crotamina sobre as correntes de sódio dos canais de sódio voltagem-dependentes.....................23
Resultados
.........................................................................................................................................................24
Ensaio comportamental............................................................................................................................24
Crotamina..........................................................................................................................................................24
α-Pompilidotoxina e β-Pompilidotoxina..........................................................................................................25
µ-Conotoxina GIIIa...........................................................................................................................................25
BcIII....................................................................................................................................................................26
Tetrodotoxina.....................................................................................................................................................26
Tx2-6...................................................................................................................................................................26
Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina.............................................................27
Curva concentração versus resposta................................................................................................................27
Dose única ..........................................................................................................................................................28
Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................30
Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................31
Eletrofisiologia..............................................................................................................................................32
Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)...........................................................32
Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária.................................................42
Discussão
...........................................................................................................................................................44
Conclusões
.......................................................................................................................................................52
Referências Bibliográficas
.................................................................................................................53
v
Introdução
Aspectos bioquímicos da crotamina
As toxinas que atuam em canais de sódio têm características estruturais
simples, tais como o pequeno tamanho, a presença de pontes dissulfeto, de α hélices e
de folhas β (1). A crotamina apresenta tais características. É, portanto, um peptídeo
fortemente básico, de peso molecular 4887 Da. Compõe-se de 42 aminoácidos (Tabela
1), entre eles: 6 cisteínas , 9 lisinas, 2 argininas, uma tirosina na porção N-terminal e
uma glicina na C-terminal (2). Apresenta ainda, 7 resíduos de aminoácidos aromáticos:
1 tirosina, 2 histidinas, 2 triptofanos e 2 fenilalaninas (3). Dímeros podem ser formados
por pontes dissulfeto Cys
4
- Cys
37
, Cys
11
- Cys
36
e Cys
18
- Cys
30
(4).
Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly His
Cys Phe Pro Lys Glu Lys Ile Cys Leu Pro
Pro Ser Ser Asp Phe Gly Lys Met Asp Cys
Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys Gly
Ser Gly
Tabela 1 - Seqüência de aminoácidos da crotamina (adaptada de Beltran e col., 1990)
(5)
1
Beltran e col., 1985 (6) em estudos de small-angle x-ray scattering (SAXS)
propuseram um formato alongado ou achatado para a crotamina. Entretanto, os
próprios autores ressaltam a insuficiência desses dados para uma conclusão definitiva.
Curiosamente, em um estudo mais recente com a mesma metodologia, Beltran e col.,
1990 (7) propuseram um modelo bilobular, no qual o lobo maior, muito polar, e o lobo
menor, menos polar, ligam-se por uma ponte dissulfeto entre Cys
18
e Cys
30
. Estes
autores sugerem ainda que, devido à sua menor polaridade, o lobo menor deve
interagir com a membrana celular. Essa assertiva, em verdade, abre inúmeras
possibilidades para a pesquisa das interações farmacológicas da crotamina e parece
constituir um dos principais avanços em relação ao trabalho dos mesmos autores
levado a cabo apenas cinco anos antes.
Duas isoformas da crotamina foram isoladas por Toyama e col., 2000 (8): F
2
e
F
3
. Ambas possuem a mesma conformação tridimensional, ainda que possivelmente
difiram em dois ou três aminoácidos, e produzam os mesmos efeitos paralisantes em
ratos. O grupo observou que a F
2
aumenta a liberação de insulina em ilhotas isoladas
de pâncreas de ratos. Estes autores mostraram ainda que as isoformas podem ser
encontradas tanto em estrutura dimérica bem como em monômeros estáveis. Segundo
Teno e col., 1990 (4), quando a crotamina apresenta-se como dímero, tem formato
próximo do esférico, o qual é mantido por pontes dissulfeto entre os monômeros.
Cameron e Tu (1978) (9) compararam a crotamina à miotoxina α, extraída da
cascavel das pradarias Crotalus viridis viridis, concluindo haver grande similaridade,
tanto química quanto no que se refere aos efeitos biológicos. Foram os primeiros a
reportar os danos causados à musculatura esquelética em preparações histológicas de
2
ratos previamente tratados com crotamina. Seus resultados demostraram a
constituição peptídica de ambas, sendo que a miotoxina-α teria duas pontes dissulfeto
e 39 resíduos de aminoácidos. As diferenças consistiriam em quatro mudanças de
aminoácidos entre a crotamina e a miotoxina-α (3): Lys
16
por Glu, Leu
19
por Ile, Phe
25
por Leu, Arg
33
por Lys. Entretanto, Teno e col., 1990 (4) demonstraram que a
miotoxina-α tem 42 aminoácidos, com apenas três diferenças; exclui-se então, a troca
de Lys
16
por Glu. Mostraram ainda que as 3 pontes dissulfeto da miotoxina-α estão
entre Cys
4
- Cys
36
, Cys
11
- Cys
37
e Cys
18
- Cys
30
. Tal homologia (93%) sugeriria
estruturas terciárias conservadas entre as assim chamadas miotoxinas. Acreditava-se
que a miotoxina-α agisse em canais de sódio de músculo esquelético, causando
despolarização por aumento da permeabilidade ao sódio (10). Entretanto, a miotoxina-
α não age em canais iônicos da membrana plasmática, mas sim diretamente no
retículo sarcoplasmático de células musculares. Trabalhos mais antigos demonstravam
que ela se ligava a Ca
2+
-ATPase do retículo, desacoplando a bomba de cálcio (11)
(12). Mais recentemente Hirata e col., 1999 (13) propuseram que o sítio de ligação da
miotoxina-α seria a proteína de 30 Kda do complexo do receptor de rianodina, no qual
estão ainda: a calseqüestrina, a triadina, a juntina e a mitsugumina 29. Segundo
Katagiri e col., 1997 (14) existem sítios de ligação específicos para miotoxina-α no
cérebro e, quando injetada em concentrações nanomolares pela via
intracerebroventricular, causa um comportamento semelhante a convulsão. Nota-se,
entretanto, que não foram feitos registros eletroencefalográficos.
Estudos realizados com espectroscopia de próton NMR identificaram a estrutura
da crotamina em solução. Compreende as três pontes dissulfeto, uma α−hélice N-
3
terminal e uma pequena fita β tripla, conformação nunca antes vista em toxinas ativas
em canais iônicos (15). Recentemente Fadel e col., 2005 (16), usando um método
similar, descreveram uma estrutura diferente para a crotamina, com uma α−hélice com
os resíduos 1-7, uma fita β dupla anti-paralela com os resíduos 9-13 e 34-38 e três
pontes dissulfeto entre Cys4-Cys36, Cys11-Cys 30 e Cys18-Cys37. Ambos os grupos
destacam a similaridade de sua estrutura terciária com as β−defensinas humanas
(Tabela 2), mesmo com pouca homologia na seqüência de aminoácidos e tendo
atividades biológicas aparentemente distintas.
Crotamina – YKQCHKKGGHCFPK – EKICLPPSSDFGKMDCRWR - WKCCKKGSG
Miotoxina-a – YKQCHKKGGHCFPK – EKICI PPSSDLGKMDCRWK - WKCCKKGSG
β−Defensina– APLSCGRNGGVCIPIR - - - CPVPMR - - QIGTCFGRPVKCCRSW- -
Tabela 2 - Seqüência de aminoácidos da crotamina, miotoxina-α e β-defensina
Oguiura e col., 2005 (17) mapearam o gene da crotamina no final do braço longo
do cromossomo 2 e notaram haver um contraste na intensidade do sinal entre os dois
genes homólogos encontrados, o que sugere uma diferença no número de cópias do
gene que explicaria a variação na quantidade de crotamina presente na peçonha de
diferentes indivíduos. Tal gene tem 1,8 Kpb e está organizado em três exons, o
primeiro codifica 5´- UTR e os 19 aminoácidos do peptídeo sinal, o segundo codifica 42
aminoácidos, três pertencem ao peptídeo sinal e 39 à crotamina madura e finalmente o
exon 3, codifica os 3 últimos aminoácidos da crotamina, a lisina terminal e 3´-UTR .
4
Métodos de purificação
A crotamina foi descrita pela primeira vez por Gonçalves e Polson (1947) (18)
em um trabalho de purificação e análise eletroforética da peçonha da cascavel citada
como Crotalus terrificus e da jararacuçu, Bothrops jararacussu.
Laure, 1975 (2) utilizou para determinação da seqüência de aminoácidos e peso
molecular da crotamina, o seguinte método: filtração do veneno bruto em Sephadex-G-
75, seguida de outra em Sephadex-G-25, finalizando com uma em Sephadex-G-10,
todos acompanhados por espectrometria em 280nm para identificação do pico
correspondente à crotamina, que foi, então, dessalinizada e liofilizada. Beltran e col.,
1985 (6) fizeram uso desta mesma técnica de purificação para estudar sua estrutura e
conformação.
O grupo de Chang (19-21), que trabalhou com crotamina em Taipei na China,
descreve o seguinte método: primeiramente cromatografa-se o veneno em CM-
Sephadex C-25 eluída em acetato de amônia. A fração correspondente à crotamina foi
testada em músculo esquelético. Posteriormente foi feita nova filtração em Sephadex
G-75 e verificação por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato. Os
trabalhos realizados por este grupo avaliaram a ação da crotamina em canais de sódio
em estudos eletrofisiológicos comparando-a à miotoxina α e sua interação com outras
toxinas.
Hampe e col., 1977 (22) utilizaram um método similar ao anteriormente citado.
Entretanto, o veneno foi filtrado em coluna de SP-Sephadex G-75 com posterior
filtragem em SP-Sephadex G-25, utilizando NaCl e formiato de amônia como tampão.
Seus estudos concentram-se na conformação e tipos de associação entre monômeros
5
da crotamina. Beltran e col., 1990 (7) seguiram estes mesmos passos e usaram o
mesmo tampão, com exceção do NaCl. Seus estudos focalizaram a conformação
tridimensional da molécula da crotamina.
Endo e col., 1989 (3) purificaram a crotamina a partir do veneno total, por gel
filtração em coluna Sephadex G-75 usando como tampão bicarbonato de amônia. A
última fração eluída continha a crotamina, que foi dessalinizada e liofilizada. Este grupo
estudou sua estrutura molecular em solução.
Teno e col., 1990 (4) filtraram o veneno bruto em coluna Sephadex G-75-120
com ácido fórmico e obtiveram quatro frações. Tais frações foram injetadas em
camundongos e, através da reação de paralisia das patas traseiras, a porção 4 foi
identificada como sendo crotamina. Em seguida, tal porção foi novamente filtrada, só
que dessa vez em coluna Sephadex G-25-50 com HCl. A amostra purificada foi usada
para demonstrar que a crotamina pode formar dímeros ou oligômeros, ligados por
pontes dissulfeto. Mancin e col., 1997 (23) fizeram uso do mesmo método de
purificação anterior, entretanto seus experimentos focalizam a liberação de histamina
causada pela crotamina e outras toxinas.
Mancin e col., 1998 (24) e Toyama e col., 2000 (8) obtiveram crotamina através
de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) de fase reversa em conjunto com
a análise em espectrômetro de massa. O primeiro grupo encontrou duas isoformas (F
2
e F
3
) da crotamina que foram testadas quanto ao estímulo da secreção de insulina em
células pancreáticas de ratos e camundongos. Como controle usaram a toxina
purificada por filtração em Sephadex G-75. O grupo de Mancin verificou a atividade
analgésica da crotamina com experimentos realizados em camundongos.
6
Em seus estudos sobre a estrutura da crotamina em solução, Nicastro e col.,
2003 (15) utilizaram o mesmo método de purificação descrito por Mancin e col., 1998
(24) e confirmam a pureza e a identidade através de espectrometria de massa MALDI-
TOF.
Aos 600 gramas de veneno bruto seco a vácuo, Kerkis e col., 2004 (25)
adicionaram tampão formiato de amônio 0,25M, pH 3,5, para retirar a crotoxina que,
após centrifugação de baixa velocidade, precipita-se com adição de água gelada. Ao
sobrenadante adicionou-se Tris-base até pH 8,8 e em seguida aplicou-se em uma
coluna CM-Sepharose FF. Depois de lavada com uma solução de equilíbrio, a
crotamina foi recuperada passando-se uma solução diluente de NaCl, em seguida
dialisada, liofilizada e feita análise de aminoácidos, verificando-se pureza superior a
98%.
Aspectos farmacológicos
Quando injetada em ratos, a crotamina provoca uma contração, bastante
característica, da musculatura esquelética. Esse efeito é destacadamente mais
acentuado nos membros posteriores, causando sua hiperextensão (26). Tal fato deve-
se à despolarização da membrana das células musculares causada pelo influxo de
sódio (19;27).
Chang e Tseng (1978) (19), a partir de estudos eletrofisiológicos em junção
neuromuscular do nervo frênico e diafragma de ratos e camundongos, demonstraram
que a crotamina atua em canais de sódio, levando a uma despolarização da membrana
devido ao influxo de sódio nas células musculares. Esta despolarização foi prevenida
através da adição de tetrodotoxina, e pela diminuição da concentração de sódio no
7
meio externo, apontando para uma ação neste tipo de canal iônico. Notou-se ainda que
a despolarização foi irreversível, sugerindo que a toxina liga-se fortemente ao seu sítio.
O fato de que os potenciais miniatura de placa motora (PMPMs) não tenham sido
afetados indicaria uma seletividade da crotamina para canais de sódio em células
musculares.
Foram sugeridas duas explicações para o aumento da corrente de sódio
induzida pela crotamina. Usando o loose patch voltage clamp em musculatura de rã, os
resultados apontaram para um aumento do número de canais de sódio em
funcionamento ou para uma alteração na cinética do canal. A primeira hipótese foi
refutada, já que foi dado um pré-pulso hiperpolarizante de -132mV com duração de 100
ms para impedir a inativação lenta dos canais; o potencial foi mantido em
aproximadamente –93 mV para que houvesse apenas uma porcentagem mínima de
canais inativados; o experimento foi feito a temperatura de 12
o
C, para que novos
canais não fossem inseridos na membrana. Por fim, demonstraram que a segunda
hipótese seria mais provável: a crotamina forçaria os canais de sódio a permanecerem
abertos inibindo a transição direta do modo aberto para o modo inativado, que seria o
esperado fisiologicamente (28).
Um outro efeito atribuído à crotamina é o da mionecrose (9), caracterizada por
uma mudança na ultraestrutura das fibras musculares, levando a vacuolização. Tal fato
deve-se à dilatação do retículo sarcoplasmático, causado pelo desequilíbrio osmótico
decorrente do aumento da permeabilidade ao sódio (27). Desse modo, a aparência
ultraestrutural de células tratadas com crotamina assemelha-se àquela das células que
estão em choque osmótico (28).
8
Uma comparação adequada pode ser feita com a miotoxina-α, que guarda grande
similaridade estrutural com a crotamina. Os danos causados pela miotoxina-α às fibras
musculares esqueléticas são do mesmo tipo daqueles causados pela crotamina (9).
Um estudo farmacológico feito por Mancin e col., 1998 (24), sugeriu mais uma
atividade da crotamina: sua ação analgésica, possivelmente 30 vezes mais potente que
a da morfina. A dose de crotamina que causa analgesia (133,4 µg/kg) em
camundongos é bem menor que a de morfina (4 mg/kg) e parece não afetar os órgãos
nem a musculatura. Embora, estudos de antinocicepção com veneno total sugeriram
que o efeito periférico se deve a ativação de receptores opióides δ e κ, seguida da
estimulação do óxido nítrico e GMPc neuronais com subseqüente abertura de canais
de potássio sensíveis a ATP (29) e, recentemente, Fadel e col., 2005 (16) expuseram
que a atividade analgésica é devida a uma contaminação por crotoxina.
Quanto à interação entre toxinas, é tido que a crotamina potencializa a ação das
toxinas do grupo II (21). Entretanto, quando Chang e col., 1983 (20). empregaram
simultaneamente a crotamina e a toxina do escorpião Leiurus quinquestriatus (QTX),
observaram haver uma ação aditiva na despolarização da membrana das células de
diafragma de ratos e camundongos, mas não uma potencialização. Assim, as
preparações neuromusculares tratadas com QTX apresentaram uma despolarização de
aproximadamente 10 mV, porém, quando a preparação foi tratada com crotamina (0,1
µg/mL), apresentou despolarização de 3 mV e depois, com a adição de QTX, a
despolarização foi acrescida em aproximadamente 9 mV, com um certo retardo. Desta
forma, estes autores propuseram que o sítio de ligação da toxina deste escorpião
poderia se sobrepor em grande parcela ao da crotamina.
9
Kerkis e col. 2004 (25) demonstraram atividades da crotamina bastante diversas
daquelas até então descritas. Quais sejam: penetrar diferentes tipos celulares e
blastocistos de camundongo in vitro; marcar células da medula óssea, baço e líquido
peritoneal in vivo; adentrar ao núcleo tanto de células fixadas quanto não fixadas, ligar-
se aos cromossomos na fase S/G2 quando os centríolos começam a se dividir; ligar-se
aos centrossomos no citoplasma permitindo acompanhar todo o processo de
duplicação e separação do centríolo; marcar células em proliferação ativa; mostrando-
se não tóxica em concentrações micromolares. Todas estas ações pressupõem a
entrada da crotamina nas células.
Canais de sódio como alvos de toxinas
Os canais de sódio são alvos importantes para toxinas animais que têm função
de defesa ou predação. O fato de estes canais exercerem papel importante na biologia
celular e terem sua estrutura molecular bastante conservada no reino animal são
provavelmente as razões para esta preferência (30).
Segundo Catterall, 1980 (31), toxinas ativas em canais de sódio podem ser
classificadas em quatro grupos de acordo com os diferentes sítios de ligação ao canal
e ao modo de ação:
Grupo I - tetrodotoxina, saxitoxina, µ-conotoxina (peptídeo) - guanidinas
heterocíclicas que inibem o potencial de membrana dependente da condutância de
sódio, ou seja, bloqueiam o influxo deste íon. O sítio ao qual elas se ligam encontra-se
na face extracelular do canal iônico.
10
Grupo II - batracotoxina, graianotoxina, veratridina e aconitina - toxinas
lipossolúveis que alteram a voltagem de ativação e inativação ligando-se a um sítio na
porção transmembrânica do canal iônico, prolongando o potencial de ação e a
despolarização.
Grupo III - α−toxina de escorpião e toxinas de anêmona - peptídeos que inibem
a inativação dos canais de sódio ligando-se também a um sítio na face extracelular,
prolongando o potencial de ação e a despolarização celular.
Grupo IV - β-toxina de escorpião - peptídeo muito similar à α−toxina , liga-se com
pouca afinidade ao canal. Atua alterando a voltagem de ativação para valores mais
negativos fazendo com que o canal atinja seu limiar mais facilmente.
Toxinas ativas em canais de sódio foram encontradas em peçonha de aranhas,
escorpiões e serpentes, sem contar os compostos ativos derivados de vegetais.
Apenas para citar alguns exemplos: as toxinas de escorpiões possuem entre 60
e 70 resíduos de aminoácidos e quatro pontes dissulfeto (32). A α-toxina está presente
em escorpiões do Velho Mundo e pode ser considerada a responsável pela toxicidade
da peçonha (33). Já na peçonha do gastrópode marinho Conus geographus é
encontrada a µ-conotoxina, um peptídeo com 22 resíduos de aminoácidos sendo três
hidroxiprolinas, rico em cisteínas que formam três pontes dissulfeto e bloqueia os
canais de sódio voltagem-dependentes. Em seus estudos eletrofisiológicos Cruz e col.,
1985 (34) demonstraram ainda, que a µ-conotoxina não afeta as células nervosas e
sim as musculares, sendo portanto extremamente seletiva. Neste contexto, insere-se a
crotamina, toxina extraída da peçonha da cascavel sul-americana Crotalus durissus
terrificus que não compete pelos sítios de ligação da tetrodotoxina nem com os das
11
toxinas do grupo II. Entretanto, parece afetar alostericamente a ligação de tais toxinas,
aumentando a afinidade pelo sítio, mas não a atividade (21). Acredita-se que a
crotamina seja uma toxina do grupo III, atuando em canais de sódio de maneira
voltagem-dependente de células excitáveis, tais como células cardíacas, nervosas e
musculares (35).
Um dado curioso é que a intoxicação por crotamina causa paralisia espástica
preferencialmente dos membros posteriores, enquanto os anteriores mantêm sua
motilidade. Anatomicamente, os músculos rápidos e lentos apresentam uma
regionalização, ou seja, no trem posterior predominam músculos de contração rápida
com exceção do soleus, de contração lenta (36). Este último apresenta uma baixa
densidade de canais de sódio na placa motora, ao contrário dos músculos de contração
rápida, cuja densidade é bem maior (37). Este mesmo padrão ocorre na membrana
extra juncional, já que fibras de contração rápida requerem uma maior amplitude de
despolarização para iniciar a contração (38). Tal característica desses músculos
poderia estar relacionada à marcante síndrome crotamínica da paralisia dos membros
posteriores, descrita acima.
12
Objetivos
Como exposto acima, o intrigante efeito da crotamina de paralisar seletivamente
os membros posteriores não tem uma explicação adequada. Tendo em vista que a
musculatura destes membros é composta predominantemente por músculos rápidos e
que este tipo muscular apresenta maior densidade de canais de sódio voltagem-
dependente, levantamos a hipótese de que estes músculos seriam mais sensíveis à
crotamina e sofreriam paralisia primeiro que os demais músculos esqueléticos pois a
alta densidade de canais de sódio revela uma grande dependência de sua função.
Assim, para desafiar esta hipótese nos propusemos a:
Comparar os efeitos da crotamina em músculos de contração rápida (Extensor
Longo dos Dedos) e de contração lenta (Soleus).
Testar a ação da crotamina em um sistema heterólogo expressando as
subunidades α de canais de sódio, cardíacos, neuronais e musculares para verificar se
esta toxina tem preferência por algum sub-tipo de canal de sódio.
13
Material e Métodos
Purificação da crotamina
A crotamina utilizada foi purificada no Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares (IPEN) usando-se o método de cromatografia de exclusão molecular seguido
de troca iônica.
Em cada partida de purificação cerca de 150 mg de veneno total de Crotalus
durissus terrificus (fornecido pelo Instituto Butantan), na forma liofilizada, foram
dissolvidos em 2 mL de tampão formiato de amônio 100mM, pH 3. A solução foi
centrifugada por 10 minutos a 200 G, o sobrenadante foi aplicado a uma coluna de gel
filtração Superdex 75, equilibrada com o tampão de formiato de amônio 100mM pH 3 e
fluxo de 1 mL/minuto. As frações foram coletadas com um coletor automático do
sistema de Cromatografia Líquida Rápida de Proteína (Fast Protein Liquid
Cromatrography - FPLC) com determinação contínua da absorbância em comprimento
de onda de 280 nm (Figura 1). As frações que continham os picos principais foram
acondicionadas em frascos de vidro, congeladas e liofilizadas para posterior uso nas
análises.
A fração correspondente à crotamina semi-purificada, foi ressuspendida em
tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,8 e aplicada em uma resina do tipo Resource S
em sistema FPLC, estabilizada no mesmo tampão. Após a adsorção, a crotamina
ligada à resina foi retirada com a passagem de um gradiente linear salino de 0 a 2 M de
NaCl. A absorbância foi automaticamente lida em 280 nm (Figura 2) e as frações
contendo a crotamina foram agrupadas. Posteriormente a crotamina foi dialisada contra
14
água deionizada em membrana da SIGMA
®
- de capacidade entre 0 e 3000 Da -
congelada, liofilizada e mantida a -24ºC.
20 40 60 80 100
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D.O. 280 nm
Frações (mL)
5
4
3
2
1
Figura 1 - Cromatograma do veneno total de Crotalus durissus
terrificus em coluna de exclusão molecular Superdex 75.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
Frações (mL)
D.O. 280 nm
Figura 2. Recromatografia de crotamina em resina Resource S.
15
Ensaio comportamental
Para avaliar os efeitos comportamentais causados pela crotamina, por toxinas
de canais de sódio do grupo I (tetrodotoxina e µ−conotoxina GIIIa) e do grupo III (α e β-
Pompilidotoxina de vespa, BcIII de anêmona e Tx2-6 da aranha armadeira) foram
usados camundongos Swiss machos pesando entre 25 e 35 g. Todas as toxinas foram
diluídas em solução salina fisiológica e injetadas intraperitonealmente (i.p.) nas doses
descritas em cada experimento. Os animais injetados foram acomodados em caixas de
biotério para observação por um tempo mínimo de duas horas. Quando os sintomas de
intoxicação eram evidentes, os animais eram colocados sobre a bancada e filmados e
fotografados a fim de documentar os principais sintomas da intoxicação. Foram
testadas além da crotamina N=10 (300 µg/kg), as toxinas α-Pompilidotoxina N=3, β-
Pompilidotoxina N=3 (até 300 µg/kg), BCIII N=3 ( 600 µg/kg), Tx2-6 N=10 (7 µg/kg), µ-
CgTxGIIIa N=3 (7 µg/kg) e Tetrodotoxina N=3 (10 µg/kg).
Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina
Utilizaram-se os músculos extensor longo dos dedos (ELD) e Soleus, ambos dos
membros posteriores, de ratos Wistar machos pesando de 180 a 200 g.
Após a eutanásia por decapitação, os músculos foram dissecados e colocados
em uma placa de Petri contendo líquido nutritivo com a seguinte composição (mM):
NaCl 115, KCl 3,5, NaHCO
3
25, NaH
2
PO
4
1, MgCl
2
6, glicose 12, gaseado com
carbogênio.
Foram usadas câmaras de vidro com parede dupla, cujas cubas internas têm 5
mL de capacidade e para as quais uma serpentina, que passa pela câmara externa,
16
fornece a solução nutritiva. Uma bomba de circulação envia água aquecida a 37
0
C para
a câmara externa. Manteve-se um gaseamento constante com carbogênio. Dois
eletrodos ligados a um estimulador S88 Grass foram dispostos dentro das cubas.
O tendão distal de cada músculo foi amarrado com linha a uma haste de aço
inoxidável colocada no interior da cuba, enquanto o proximal foi amarrado a um
transdutor isométrico. O posicionamento do músculo foi feito de maneira a mantê-lo
eqüidistante dos eletrodos. As condições controle e experimental foram realizadas com
músculos retirados do mesmo animal. Foram usadas portanto, duas cubas
experimentais e duas cubas controles contendo respectivamente o Soleus e o ELD.
Inicialmente os músculos foram submetidos a uma tensão basal de 2g; após
estabilização, ligou-se o estimulador com os seguintes parâmetros: estimulação
contínua de 80 V, freqüência 0,2 Hz, duração 8 ms. Os sinais gerados pela contração
isométrica dos órgãos foram enviados a um amplificador, passando, a seguir, a uma
placa conversora analógica/digital acoplada a um microcomputador iMac. A aquisição
foi feita pelo programa Chart 4.2.
Foram empregadas duas abordagens para determinar os efeitos da crotamina
sobre estes músculos. Na primeira, realizou-se uma curva concentração versus
resposta com a crotamina sendo adicionada em lotes sucessivos ao banho nas
seguintes concentrações (µM): 0,001; 0,6; 2; 6,75; 20 e 60. Com a estimativa de
concentração obtida neste experimento elegeu-se a concentração de 6,75 µM para
fazer o bloqueio destes músculos em uma única administração. A concentração foi
escolhida em função de ser a que melhor distinguia a sensibilidade dos dois músculos.
17
Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro
Empregou-se o método de liberação de transmissores marcados como descrito
por Troncone e col., 1995 (39;39). Resumidamente, ratos machos Wistar foram
decapitados e seus estriados, dissecados e colocados em tampão Krebs-Ringer-
bicarbonato (KRB) gelado com a seguinte composição (mM): NaCl 118, NaHCO
3
25,
KCl 4.8, CaCl
2
1.3, KH
2
PO
4
1.2, MgSO
4
, 1.2, glicose 10, pH 7.3, gaseada com
carbogênio. O tecido estriatal foi, então, cortado em prismas, com a utilização de um
McIlwain Tissue Chopper. Cortes de 250 µm foram dispersos com uma pipeta Pasteur
e lavados com 15 mL de KRB gelado, transferidos para um béquer contendo 3 mL de
KRB e incubados em banho a 37ºC por 5 minutos. Adicionou-se, em seguida, o agente
radioativo, 10 µL de [
3
H]-acetilcolina ([
3
H]Ach) (Amersham Bioscience®/ atividade
específica 2.96 TBq/mmol) e incubou-se novamente a 37ºC por 20 minutos. O tecido
foi, então, filtrado e lavado duas vezes com KRB gelado e distribuído em dez câmaras
de perfusão com volume interno de 0,25 mL. A perfusão ocorreu a uma taxa de 0,25
mL/min com uma bomba peristáltica de dez canais por 40 minutos, até obter-se uma
liberação basal estabilizada. Após esse tempo, foram coletadas quatro amostras da
liberação basal com um coletor desenvolvido no próprio laboratório, a intervalos de 3
minutos. Na quinta coleta as câmaras foram perfundidas com uma solução KRB de
estímulo com 20 mM de potássio (na qual se diminuiu a quantidade NaCl para manter a
osmolaridade) durante 2 minutos, após os quais retornou-se à perfusão com KRB
normal. A partir da oitava coleta perfundiu-se o tecido com as seguintes concentrações
de toxinas: crotamina 1 µM e 5 µM , Tx 2-6 0,1 µM, BCIII 0,1 µM e β-pompilidotoxina
18
0,1 µM; todas em KRB normal. Na décima segunda coleta verificou-se o efeito das
toxinas sobre a liberação estimulada pelo KRB com 20 mM de potássio.
Os cálculos da liberação fracional e as demais normalizações foram feitos a
partir do percentual do neurotransmissor liberado sobre o total do neurotransmissor
contido no tecido no momento da liberação (liberação fracional). Os efeitos das toxinas
foram avaliados pelo quociente (S2/S1) entre a liberação estimulada na presença da
toxina (S2) e a liberação estimulada controle (S1)(40). O efeito sobre a liberação basal
foi calculado pelo quociente (B2/B1) entre a liberação basal na presença da toxina (B2)
e a liberação basal controle (B1). A liberação (S) foi obtida subtraindo-se a liberação
basal do total liberado obtido sob estimulação.
Eletrofisiologia
Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)
Cultura de Células
Linhagens celulares Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK) expressando os
canais de sódio Na
V
1.1, 1.2, 1.3, 1.5 e 1.6; (cultivadas em meio Dulbecco modificado a
partir do meio Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino) foram obtidas por
transfecção a partir seus respectivos vetores de expressão pCIN5 (41) e
posteriormente selecionados por sua resistência a G418. Os vetores de pCIN5-hNa
V
1.3
e 1.6 foram gerados como descrito por Chen e col., 2000 (42) e Burbidge e col., 2002
(43). O vetor pCIN5-hNa
V
1.2 foi obtido a partir do clone de cADN hNa
V
descrito por Xie
e col., 2001 (44); o vetor pCIN5-hNa
V
1.1 foi gerado usando-se o cADN retirado de
clones parciais isolados de bibliotecas de cADN de cerebelo e medula de humanos
19
adultos e o vetor pCIN5-hNa
V
1.5 de clones parciais isolados de uma biblioteca de
cADN de coração humano. Células expressando Na
V
1.4 foram obtidas após
transfecção provisória de um plasmídeo contendo hNa
V
1.4 (cedido gentilmente pela
Prof
a
Diana Conti-Camerino, Universidade de Bari).
Registros eletrofisiológicos
A toxina foi dissolvida na solução extracelular padrão, com a seguinte
composição (mM): NaCl 70, NMDG 67, CaCl
2
2, MgCl
2
2, HEPES-NaOH 10, pH = 7.4,
imediatamente antes dos experimentos. A solução usada para preenchimento da pipeta
tinha a seguinte composição: (mM) K
+
- aspartato 130, NaCl 10, MgCl
2
2, EGTA-KOH
10, Hepes-KOH 10, pH = 7.3 com KOH.
Na presença de correntes de potássio contaminantes usou-se tetrodotoxina
(Sigma) 100 nM nas correntes de Na
V
1.1 a 1.4 e 1.6, os traços obtidos foram
subtraídos dos traços controle para obter as correntes sensíveis à tetrodotoxina. O
clone Na
V
1.5, que tem uma LD50 muito maior que 100 nM, não mostrou correntes de
potássio significativas em potenciais de teste.
A solução foi aplicada empregando-se
um posicionador linear por controle remoto com nove posições que permitiu um tempo
médio de resposta entre 2 e 3 s colocado junto à célula em estudo.
Aquisição e análise dos dados
As correntes foram medidas em temperatura ambiente por MultiClamp 700A
(Axon Instruments) como descrito por Faravelli
e col., 1996 (45) com uma pipeta de
resistência 1,5 a 2,2 MΩ. Os erros de capacitância e resistência em série da célula
foram cuidadosamente compensados em 85 a 90% antes de cada experimento de
fixação de voltagem para reduzir os erros de voltagem a 5% do pulso de protocolo.
20
Foi empregado rotineiramente o procedimento de P/N leak. A inativação
estacionária (steady-state de inativação) voltagem dependente foi determinada através
de um protocolo de pulso duplo, no qual o pulso condicionante foi aplicado de um
potencial fixado de –80 mV para uma série de potenciais de –110 a –10 mV com
incrementos de 10 ou 15 mV por 450 ms seguido imediatamente por um pulso teste
para –10 mV. As correntes de ativação estacionária (steady-state de ativação)
voltagem-dependentes foram desencadeadas por despolarizações graduais para testar
a abrangência dos potenciais de –60 a 0 mV a partir de um potencial imposto de –120
mV. As amplitudes do pico das correntes durante os testes foram normalizadas de
acordo com o primeiro pulso e projetadas contra o potencial do pulso condicionante. A
aquisição e a análise dos dados foram feitas pelos programas pClamp 8.2 (Axon
Instruments) e Origin 7 (Microcal Inc.).
Nos clones expressando Na
V
1.4 (canal de sódio muscular) foram feitas
perfusões intra e extracelulares com a toxina.
A toxina TX2-6 da aranha Phoneutria nigriventer, conhecida por agir em canais
de sódio retardando a inativação (46), foi utilizada como controle positivo nos clones
Na
V
1.4 e Na
V
1.1 (neuronal) com perfusão extracelular.
Todos os experimentos de eletrofisiologia envolvendo os canais de Na
V
1.1 a 1.6
foram realizados no laboratório do Dr Enzo Wanke, Universidade Milano-Bicocca, Itália
na forma de colaboração.
21
Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária
Cultura de células
Ratos com um dia de vida foram sacrificados por decapitação. Gânglios da raiz
dorsal de toda a extensão da espinha dorsal foram dissecados. Os gânglios foram
picotados, tratados com tripsina e dispersados mecanicamente. Após a dispersão as
células foram semeadas em recortes de lamínulas tratadas com poli-lisina e mantidas
em meio de cultura adicionado com soro fetal bovino e antibiótico. As células foram
utilizadas para os registros entre dois e três dias após a dispersão.
Registros eletrofisiológicos
Para os registros de correntes de sódio em canais de sódio voltagem-
dependentes, utilizou-se a técnica de patch clamp, configuração whole-cell. Durante o
experimento, as células foram observadas em microscópio invertido com um aumento
de 400x. As micropipetas utilizadas foram de vidro borossilicato estiradas em estirador
vertical e polidas em microforja. As micropipetas foram preenchidas com uma solução
com a seguinte composição, em mM: NaCl, 10; CsF, 150; TEACl, 10; MgCl2, 4,5;
EGTA, 9; Hepes, 10. Com o polimento, essas micropipetas apresentaram uma
resistência de ponta de 1,5 a 2,0 MOhms quando mergulhadas na solução de banho da
câmara de registros, que tinha a seguinte composição, em mM: NaCl, 50; cloreto de
colina, 82; MgCl2, 1,2; CaCl2, 1,8; CoCl2, 1; KCl, 4,0; Hepes, 10. Após a formação do
giga selo, a configuração whole cell pôde ser atingida pelo rompimento do patch
circunscrito pela ponta da micropipeta. O transiente de corrente capacitiva foi
cancelado em aproximadamente 90% e a resistência em série compensada em, no
mínimo, 80%.
22
Efeito da crotamina sobre as correntes de sódio dos canais de sódio voltagem-
dependentes.
A crotamina foi testada no pico das correntes de sódio e na curva de ativação e
inativação estacionária das correntes de sódio. Para o teste no pico das correntes,
utilizou-se um protocolo que consistia de uma série de vinte pulsos de 50 ms de
duração e de 0 mV, partindo de um potencial de membrana fixado em -110 mV.
Durante a série, alternou-se a condição controle e a condição teste (presença da
crotamina). Para o teste na ativação da condutância pela voltagem utilizou-se um
protocolo que consistia de uma série temporal de 30 pulsos despolarizantes partindo
sempre de um potencial de membrana de -110 mV. Durante a série, o pulso
despolarizante era adicionado de um delta de +5 mV a cada pulso, o que o fazia iniciar-
se em -65 mV e chegar a +80 mV no último pulso. Nesse teste, iniciou-se a perfusão
da célula em experimentação com crotamina um minuto antes do início da série. Para o
teste na curva de inativação estacionária, utilizou-se um protocolo de fixação de
voltagem que consistia de uma série temporal com 30 pulsos partindo sempre de um
potencial de membrana de -110 mV. Cada pulso consistia de um período de 50 ms que
variava de -145 a 0 mV com um delta de +5 mV a cada pulso, seguido de um período
de 10 ms em 0 mV comum a todos os pulsos da série. A crotamina também foi
apresentada 1 minuto antes do início do teste.
Os experimentos de eletrofisiologia com cultura de células do gânglio da raiz
dorsal foram realizados no laboratório do Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola, ICB-USP,
na forma de colaboração.
23
Resultados
Ensaio comportamental
Crotamina
De quinze a vinte minutos após a injeção de crotamina o animal começa a
apresentar os primeiros sinais da intoxicação. Altera-se o padrão de deambulação e
exploração de modo que o animal passa mais tempo parado que andando. Logo se
instala a paralisia dos membros posteriores (Fotografia 1), que parece envolver certa
hipertonia de alguns grupos musculares e hipotonia de outros. Os dedos permanecem
flácidos e sem reflexo de preensão, mas as pernas se apresentam distendidas
posteriormente. O animal responde a estímulos dolorosos aplicados aos membros
paralisados, sugerindo que apenas a motricidade está comprometida. No auge da crise
observa-se certa dificuldade respiratória ou mesmo uma parada dos movimentos
torácicos que retornam em seguida em aparente hiperventilação. Os membros
anteriores movem-se normalmente, levando a um deslocamento por arraste do corpo.
Este quadro dura de 2 a 4 minutos quando sobrevém uma aparente recuperação dos
movimentos mas nova crise tem lugar após 2 a 4 minutos, com a reinstalação dos
sintomas descritos. A intoxicação segue se aprofundando com crises mais freqüentes
até que em uma parada respiratória prolongada, o animal morre. A aplicação de doses
maiores de crotamina leva à morte mais rapidamente e não permite observar muitos
dos detalhes aqui descritos.
24
Fotografia 1 – Típica paralisia do trem posterior de
camundongos causada pela injeção intraperitoneal de
crotamina (300 µg/Kg)
α-Pompilidotoxina e β-Pompilidotoxina
Estas toxinas não eliciaram uma síndrome comportamental clara, mesmo
quando injetadas na dose de 600 µg/kg. O único comportamento apresentado pelos
animais foi uma corrida acompanhada de vocalização sugestiva de dor intensa,
imediatamente após a injeção das doses maiores. O comportamento cessou em
poucos segundos após a injeção e nenhum outro sinal de intoxicação foi observado. Os
animais sobreviveram por pelo menos 24 horas, quando, então, foram sacrificados.
µ-Conotoxina GIIIa
Os animais não conseguem sustentar o peso do corpo, nem sustentar a cabeça.
Apresentam intensa dificuldade respiratória, exoftalmia intensa e espasmos
25
respiratórios. A cauda permanece tensa e com movimentos em chicote contra o
substrato. O quadro evolui para morte em poucos minutos, com movimentos espásticos
de todos os membros, e possíveis espasmos inspiratórios.
BcIII
O comportamento de auto-limpeza repetitivo devido a cialorréia é o primeiro
sintoma a aparecer. Seguem-se reações hiper-reflexivas ao toque. O camundongo se
debate descoordenadamente quando tocado por um bastão de vidro em um dos
flancos. Após alguns minutos o animal posta-se com os membros anteriores estirados,
a cabeça elevada, abrindo e fechando a boca à semelhança de um cão latindo. A morte
sobrevém possivelmente por parada respiratória.
Tetrodotoxina
O animal se debate contra o substrato, tem fortes espasmos dos membros
posteriores (saltos), a cauda permanece tensa, chicoteando; poucos segundos após o
aparecimento dos sintomas, seus olhos tornam-se esbranquiçados. Apresenta
dificuldade respiratória, vindo a morrer em seguida.
Tx2-6
São observados os seguintes sintomas: ereção, salivação, tremor, piloereção e
morte. O quadro tem instalação lenta e pode levar mais de uma hora para o
aparecimento dos sintomas. A evolução é lenta e progressiva sendo a ereção peniana
um dos primeiros sintomas, seguido de cialorréia e piloereção. A cialorréia faz com que
o animal faça muita auto-limpeza e a ereção peniana pode ser parcial ou completa,
26
com exposição total da glande, o que impõe ao animal um caminhar alterado com
elevação do abdômen para evitar o contato do membro com o substrato. A morte
ocorre dentro de duas horas e raramente após este período. Só então a ereção
peniana cede. Os animais que sobrevivem à dose empregada não apresentam
seqüelas visíveis.
Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina
Curva concentração versus resposta
A curva concentração versus resposta (Figura 3) mostra um padrão nitidamente
diferente entre o ELD e o Soleus. O primeiro apresenta acentuada diminuição da força
de contração com as primeiras doses de toxina, chegando a uma abolição completa
das contrações com 60 µM. Já o segundo mostra-se bastante resistente às primeiras
doses e suas contrações não são abolidas, mesmo com o dobro da concentração de
crotamina que paralisa o ELD, ou seja, 120 µM .
27
-6 -5 -4 -3 -2
0
50
100
ELD
Soleus
Figura 3 - Curva concentração de crotamina versus resposta para os músculos
ELD e Soleus. A ação da crotamina na inibição das contrações musculares
evocadas eletricamente avaliada utilizando-se as seguintes concentrações da
toxina ( µM): 0,001; 0,6; 2; 6,75; 20; 60 e 120.N= 9 para cada concentração
testada.
[Crotamina µM]
% da contração inicial
Dose única
Logo após a administração da crotamina verificou-se um discreto aumento da
força de contração em ambos os músculos por poucos minutos (Figuras 4 e 5). Em
seguida observou-se uma diminuição na força das contrações tanto do ELD quanto do
Soleus que, decorridos 30 minutos da adição da toxina, decaiu 57% no primeiro e 14%
no último.
Verificou-se, nos controles do Soleus, uma perda espontânea da força de
contração durante o experimento de cerca de 30%, enquanto que o ELD não apresenta
perda. Portanto, os cálculos foram feitos descontando-se tal perda.
28
Força da contração
4
3
2
40,2
Minutos
Força da contração
8
6
4
2
0
33,231,4
30,0
28,2
41,4
Minutos
0
1
42,241,0
A
B
Figura 4 - Contrações estimuladas eletricamente do músculo Soleus.
N=8. A - Condição controle. B - Ação da crotamina na concentração
de 6,75 µM após período de estabilização.
29
Força da contração
32,231,4
30,5
6
4
0
2
A
Minutos
Força da contração
B
Minutos
5
3
1
35,0
31,4 33,2
Figura 5 - Contrações estimuladas eletricamente do músculo
ELD. N=8. A - Condição controle. B - Ação da crotamina na
concentração de 6,75 µM após período de estabilização.
30
Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro
Dentre as toxinas testadas, apenas a Tx 2-6 modificou sensivelmente a liberação
de acetilcolina no corpo estriado de ratos (Figura 6). Sua ação aumentou a liberação de
acetilcolina na
ordem de três vezes acima dos valores basais, atingindo um platô em
cerca de 9 minutos, após os quais o estímulo com potássio 20 mM teve um efeito
aditivo sobre a liberação. As toxinas BCIII e β-Pompilidotoxina, apesar de sua
conhecida ação nos canais de sódio, também foram inefetivas neste modelo de
liberação de acetilcolina.
Figura6-
Liberação fracional de acetilcolinapor tecido nervoso
estriatal estimulada por 20 mM de KCl na 5ª e 12ª . A concentração
de 0,1 µM das seguintes toxinas Tx2-6, BcIII e β-Pompilidotoxina a
partir da 8ª coleta. N=3 para todas as toxinas testadas
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Amostras
Liberação fracional (%)
Controle
Tx 2-6 0,1 uM
BCIII 0,1 uM
Pompilidotoxina 0,1 uM
31
A crotamina falhou em alterar a liberação desse neurotransmissor nas
concentrações de 1 e 5 µM, mesmo após 9 minutos de incubação (Figura 7).
Figura 7 -
Liberação fracional de acetilcolina por tecido nervoso
estriatal estimulada por 20 mM de KCl na 6ª e 12ª coletas. A
crotamina nas concentrações de 1
µ
Me5
µ
M foi adicionada a
partir da 8ª coleta. N=3 para ambas as concentrações da toxina.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Amostras
Liberação fracional (%)
Controle
Crotamina 1 uM
Crotamina 5 uM
Eletrofisiologia
Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)
Nos registros eletrofisiológicos de
patch clamp as correntes de sódio dos canais
neuronais Na
V
1.1 (Figuras 8 e 9), Na
V
1.2 (Figuras 10 e 11), Na
V
1.3 (Figuras 12 e 13),
Na
V
1.6 (Figuras 20 e 21), muscular Na
V
1.4 (Figuras 14 e 15) e cardíaco Na
V
1.5
(Figuras 18 e 19) não foram alteradas pela crotamina. A perfusão intracelular de 3µM
da toxina no clone Na
V
1.4 por vinte minutos também não gerou mudanças na corrente,
32
nem no tempo de inativação (Figura 16). Tampouco se alteraram a ativação e a
inativação estacionárias dos clones Na
V
1.4 (Figura 17).
B
A
Figura 8 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.1 N=3.
A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de
perfusão extracelular.
B
A
Figura 9 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.1 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um
minuto de perfusão extracelular.
33
B
A
B
Figura 10 - Registro eletrofisiológico de Ativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.2 N=3. A -Controle. B - Crotamina 1 µM após um
minuto de perfusão extracelular.
B
A
Figura 11 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.2 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um
minuto de perfusão extracelular.
34
Figura 12 - Registro eletrofisiológico de Ativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK
expressando Na
V
1.3 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1
µM após um minuto de perfusão extracelular.
B A
Figura 13 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.3 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um
minuto de perfusão extracelular.
35
B A
Figura 14 - Registro eletrofisiológico de Ativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.4 N=7. A - Controle. B - Crotamina 3 µM após oito
minutos de perfusão extracelular.
B
A
Figura 15 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.4 N=7. A -
Controle. B - Crotamina 3 µM após oito minutos de perfusão
extracelular.
36
B
A
Figura 16 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.4 N=7. A
- Controle. B - Crotamina 3 µM após vinte minutos de injeção
intracelular.
controle
aplicação de crotamina 3
µ
M
extracelular por 8 minutos
controle
aplicação de crotamina 3
µ
M
extracelular por 8 minutos
Figura 17 - Curvas de Ativação e Inativação
Estacionárias de células HEK expressando Na
V
1.4.
Aplicação extracelular de crotamina a 3 µM por oito
minutos a partir do início do experimento.
37
B
A
Figura 18 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.5 N=3.
A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão
extracelular.
B
A
Figura 19 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.5 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um
minuto de perfusão extracelular.
38
B
A
Figura 20 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.6 N=3.
A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão
extracelular.
B
A
Figura 21 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.6 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto
de perfusão extrcelular.
39
Os experimentos com a toxina Tx2-6 registraram um claro aumento da corrente
de sódio aliado a um retardo na inativação dos canais nos clones Na
V
1.1(Figuras 22 e
23) e Na
V
1.4 (Figuras 24 e 25) com apenas um minuto de perfusão. Tais efeitos foram
mais pronunciados no clone Na
V
1.1.
B A
Figura 22 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária
da corrente sódio em células HEK expressando Na
V
1.4 N=4.
A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de aplicação
extracelular.
B
A
Figura 23 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.4 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de
perfusão extrcelular.
40
B A
Figura 24 - Registro eletrofisiológico de Ativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.1 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto
de perfusão extrcelular.
B
A
Figura 25 - Registro eletrofisiológico de Inativação
Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando
Na
V
1.1 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de
perfusão extrcelular.
41
As toxinas foram empregadas em doses crescentes e os gráficos aqui
apresentados foram registrados com a maior concentração usada.
Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária
A crotamina não provocou mudanças na corrente de sódio em células de cultura
primária da raiz do gânglio dorsal (Figura 26). A ativação (Figura 27) e inativação
(Figura 28) estacionárias também não foram alteradas. N=3.
média I/Imáx
crotamina
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Episódios
Figura 26 - Representação do valor da corrente/corrente máxima de sódio em
células do gânglio da raiz dorsal. A crotamina 1 µM esteve presente do episódio
6 ao 15, conforme assinalado pela barra.
42
Legend
controle
crotamina
Ajuste controle
Ajuste crotamina
Vm (mV)
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
10
20
30
condutância relativa
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Figura 27 - Curvas de ativação estacionária de células do gânglio da raiz dorsal
de ratos. Aplicação de crotamina na concentração de 1 µM.
Legend
controle
crotamina
Fitted controle
Fitted crotamina
Vm pré-pulso (mV)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
0.2
0.4
0.6
0.8
1
condutância relativa
Figura 28
- Curvas de inativação estacionária de células do gânglio da raiz
dorsal de ratos. Aplicação de crotamina na concentração de 1 µM.
43
Discussão
Os resultados obtidos nos experimentos ora realizados com músculos isolados
demonstram que os músculos Soleus e ELD respondem de maneira diferente à
crotamina. Na curva concentração
versus resposta a adição sucessiva de alíquotas da
crotamina ao banho permitiu o delineamento de curvas sigmóides típicas. Tendo em
vista que este tipo de experimento é demorado e a crotamina pode ter sua ação
modificada pela longa incubação, realizamos os testes com a administração de uma
única concentração de crotamina, escolhida com base nos efeitos observáveis nas
curvas sigmóides. Os resultados corresponderam em grande parte ao esperado,
descartando possíveis efeitos ligados à longa duração dos experimentos. Assim, esta
observação corrobora a hipótese inicial segundo a qual a crotamina bloquearia
inicialmente os músculos de contração rápida, levando ao quadro de paralisia dos
membros posteriores.
Por este raciocínio, os membros posteriores dos ratos são constituídos por
músculos que apresentam majoritariamente fibras de contração rápida, tais como o
ELD. A única exceção é o Soleus no qual 80% das fibras são de contração lenta (47)
(36). A maior susceptibilidade do ELD à crotamina observada seria, então, devida à
maior dependência dos canais de sódio apresentada por ele para contrair. Da mesma
forma, o Soleus necessita de menor amplitude de despolarização para contrair e a
crotamina não se mostra tão eficiente em bloquear sua contração. No entanto, como
passamos a discutir abaixo, as razões para estas diferenças são ainda desconhecidas.
Chang e Tseng (1978) (19) foram os primeiros a descrever a crotamina como
toxina que age em canais de sódio. Eles avaliaram o influxo de sódio radioativo em
44
preparações de diafragma isolado de camundongo e rato de ambos os sexos, pré-
tratados por 30 minutos com 10 µg/ml de crotamina a 37°C. Estes resultados revelaram
a presença de cinqüenta por cento ou mais de sódio marcado no músculo dos animais
controles, contra sessenta e sete por cento de sódio marcado nos grupos
experimentais. Os resultados mostraram que a quantidade de sódio no diafragma de
ratos foi discretamente aumentada pela presença da crotamina, mas não esclarecem
as questões intrínsecas relacionadas com este fenômeno.
Assumindo ainda como verdadeira a premissa de que a crotamina age em
canais de sódio, passamos a investigar se esta toxina apresenta alguma preferência
por canais musculares de modo a assim, explicar a síndrome crotamínica. No entanto,
os experimentos de fixação de voltagem em células, expressando clones de diferentes
tipos de subunidades α de canais de sódio, falharam redondamente em mostrar
qualquer efeito da crotamina sobre estes canais, como descrevemos abaixo.
Em experimentos eletrofisiológicos, empregando diafragmas isolados de
camundongos e ratos, Chang e col., 1983 (20) compararam a interação entre as ações
da crotamina, QTX e toxina II de anêmona. Para tanto, o tecido foi incubado com as
toxinas por mais de uma hora e, no caso da crotamina (0,2 µg/ml) especificamente,
foram requeridos 17 minutos de incubação para atingir cinqüenta por cento da
despolarização. Em nossos experimentos de fixação de voltagem, mesmo após 20
minutos da introdução da toxina (3µM), nenhuma alteração de corrente foi registrada.
Matavel e col., 1998 (28) observaram consideráveis aumentos na corrente de
sódio adquirida através de
loose patch clamp em preparações de músculo
semitendíneo de rã. No entanto, a metodologia empregada na verificação da pureza da
45
toxina é questionável. Após os procedimentos cromatográficos, a pureza foi avaliada
por eletroforese, seguida de uma análise de aminoácidos e verificação por exclusão, ou
seja, ausência dos aminoácidos alanina, valina e treonina. Concluíram então, que não
havia contaminantes na preparação de crotamina. Tais perfis não excluem possíveis
contaminantes não protéicos ou outros peptídeos que não apresentem estes
aminoácidos. Há que se considerar ainda outra contradição, pois Chang e Tseng
(1978) (19) relataram que músculos esqueléticos de rãs não são sensíveis à crotamina.
As poucas publicações relacionadas com o mecanismo de ação da crotamina
(discutidas acima) apresentam apenas evidências indiretas da ligação desta toxina em
canais de sódio (19;20;28). Estes estudos baseiam-se no acúmulo de sódio no tecido
ou no aumento da corrente de sódio, mas, em nenhum momento os canais
propriamente ditos foram testados. A fim de elucidar esta questão, neste trabalho
realizamos experimentos eletrofisiológicos em células HEK, expressando as
subunidades α de canais de sódio cardíacos (Na
V
1.5), neuronais (Na
V
1.1, Na
V
1.2,
Na
V
1.3 e Na
V
1.6) e musculares (Na
V
1.4), nos quais foi possível uma medida direta da
atividade desta toxina. Surpreendentemente, não houve alteração da corrente nesses
canais. Para descartar a possibilidade de que a toxina testada estivesse degradada,
uma alíquota desta mesma amostra foi injetada em um camundongo e observou-se o
aparecimento da paralisia do trem posterior, o que confirmou sua atividade. Portanto,
ao contrário de toda a literatura pertinente ao assunto, evidenciou-se que ela não agiu
nas subunidades α dos canais de sódio testados. Ainda, como controle positivo, testou-
se uma toxina ativadora de canais de sódio do grupo III, a Tx2-6, em células com
Na
V
1.1 e Na
V
1.4. Desta feita ocorreu um aumento na corrente de sódio, bem como um
46
retardo na inativação dos canais, mais pronunciados nos clones neuronais que nos
musculares. Desta forma, não restam dúvidas sobre a integridade da toxina e a
validade do sistema para detecção de alterações na corrente de sódio. Curiosamente,
em experimentos eletrofisiológicos, Fletcher e col., 1996 (48) demonstraram uma
diminuição na corrente de sódio em cultura primária de células musculares humanas na
presença de 0,5 µM de crotamina extracelular. O grupo interpreta estes resultados
vislumbrando a possível necessidade de internalização da crotamina, mediada por uma
proteína que estaria ausente nas células da cultura estudada. Apenas com a
internalização seria possível obter-se o aumento da corrente de sódio observado em
outros estudos (20;28).
Apesar de Hong e Chang (1983) (21) considerarem improvável que a crotamina
penetrasse na célula, Kerkis e col., 2004 (25) demonstraram que ela penetra em
fibroblastos e linfoblastos humanos
in vitro. Portanto, para verificar a possibilidade de a
crotamina alterar a corrente de sódio pelo lado interno da membrana, ela foi adicionada
à solução da pipeta nos estudos eletrofisiológicos, ficando em contato com o meio
intracelular de células HEK expressando canais de sódio musculares (Na
V
1.4). A
corrente foi registrada por 20 minutos, novamente sem alteração.
Considerando que as células HEK transfectadas como descrito expressam
apenas as subunidades α dos canais de sódio, testamos a crotamina em células do
gânglio da raiz dorsal em cultura primária cujos canais e toda a maquinaria celular
associada a eles está íntegra. Entretanto, ainda assim, não houve alteração da
corrente de sódio mensurada nessas células. Tendo em vista que algumas toxinas
47
apresentam seletividade entre canais, resta a possibilidade de que a ação da toxina
esteja ligada à subunidade β do canal de sódio muscular.
Nossos resultados de liberação de acetilcolina na presença de crotamina
contradizem os resultados obtidos por Camillo e col., 2001 (49). Utilizamos a mesma
metodologia descrita pelos autores e nem a concentração de 5 µM resultou em
alteração na cinética de liberação de acetilcolina pelo tecido estriatal. Tal discrepância
pode ser devida à presença de contaminantes na toxina utilizada nestes experimentos,
cuja pureza era de aproximadamente 80%. Para fins comparativos, testamos várias
toxinas ativas em canais de sódio neste mesmo modelo. A Tx2-6 (100 nM) levou a uma
liberação da ordem de três vezes acima dos valores basais, parecendo não alterar o
estímulo por KCl, enquanto que a β− pompilidotoxinas (0,1 µM), e a toxina de anêmona
BcIII (0,1µM.) nada fizeram. Diante dos conhecimentos atuais sobre a atuação dos
canais de sódio na despolarização da célula nervosa e o acoplamento deste processo
com a liberação de neurotransmissores, é difícil explicar os resultados obtidos. Muitos
estudos complementares seriam necessários para compreender a ação destas toxinas
neste modelo, mas esta tarefa foge muito da finalidade deste estudo.
Trabalhos recentes chamam atenção para a semelhança estrutural da crotamina
com as β-defensinas. Elas também são peptídeos catiônicos que apresentam três
pontes dissulfeto, no entanto possuem pouca homologia com a crotamina quanto à
seqüência de aminoácidos (25) (17) (16). Um estudo realizado por Lichtenstein e col.,
1988 (50) sugere que a citotoxicidade mediada pelas defensinas requer a ligação
destas moléculas a alvos extracelulares específicos, seguida por uma translocação ou
internalização deste complexo. Tal fato pode ser um indício da semelhança entre a
48
crotamina e as defensinas quanto ao mecanismo de ação. Outros estudos, utilizando
diferentes abordagens experimentais, serão necessários para esclarecer esta questão.
A ação mionecrótica da crotamina foi avaliada em um estudo realizado por
Cameron e Tu (1978) (9) no qual ela é comparada à miotoxina-α da serpente
Crotalus
viridis viridis.
Nesse estudo, ambas as toxinas foram injetadas por via intramuscular nos
membros posteriores de camundongos e amostras dos músculos foram analisadas em
microscopia óptica observando-se uma vacuolização qualitativamente similar.
Recentemente alguns autores demonstraram que a ação da miotoxina-α é intracelular,
atuando na homeostase do cálcio (11) (12) (13). Toyama e col., 2003 (51) testaram a
miotoxicidade das isoformas de crotamina, F22 e F32, em diafragma de camundongos
incubados com as toxinas. Ambas causaram padrões semelhantes de danos
morfológicos. Em vista desse panorama, no qual vemos que a crotamina causa danos
estruturais em fibras musculares, não age em canais de sódio e, frente às semelhanças
estruturais, poderia ser aventada a hipótese de que seu mecanismo de ação seja
semelhante ao da miotoxina-α, alterando a liberação ou mesmo a recaptação de cálcio
do retículo sarcoplasmático. De fato, Fletcher e col., 1996 (48) sugeriram que a
crotamina aumenta o cálcio intracelular pela via do receptor de rianodina em
preparações de retículo sarcoplasmático. Nessa mesma linha de raciocínio, há que se
pensar que se o alvo de uma toxina estiver localizado no interior da célula, as
respostas tendem a ser mais tardias, pois dependeriam de sua internalização e
posterior ligação ao receptor. Em vista disso, a demora na obtenção de despolarização
(19;20) sugere uma atuação intracelular, posto que toxinas de canais iônicos
localizados na membrana plasmática eliciam respostas geralmente imediatas. Neste
49
sentido, o aumento do cálcio citoplasmático, eventualmente causado pela crotamina,
poderia levar à ativação de enzimas que, por sua vez, alterariam os canais de sódio por
outros mecanismos.
A estrutura da crotamina vem sendo exaustivamente estudada desde a sua
purificação por Gonçalves e Polson (1947) (18). Seu peso molecular, localização das
pontes dissulfeto, fitas beta, dímeros e isoformas estão bem caracterizados. Entretanto,
trabalhos sobre farmacologia relacionados a esta toxina são relativamente raros; mais
escassos ainda aqueles tratando de sua ação em canais de sódio: são apenas três.
Todos os outros autores que se referem à crotamina como toxina de canais de sódio,
admitem que ela aja desta maneira baseados nestas poucas e antigas publicações (19-
21;28). Sua ação mionecrótica também foi pouco investigada (9), ao contrário da
miotoxina-α, para a qual existem mais trabalhos sobre mecanismo de ação e poucos
estudos sobre estrutura (11) (12) (14) (13).
Em nossos experimentos comportamentais, os efeitos observados após a
injeção das toxinas em camundongos foram bastante diversos. A tetrodotoxina e a µ-
conotoxina são toxinas do grupo I, bloqueadoras do canal de sódio (52); em
conseqüência, desencadearam quadros de intoxicação bastante semelhantes. Todas
as outras toxinas (BcIII, Tx2-6, α e β-Pompilidotoxina) são do grupo III, peptídeos que
prolongam o potencial de ação e a despolarização, retardando a inativação dos canais
de sódio. Isto posto, seria de se esperar que causassem síndromes comportamentais
semelhantes. Entretanto, não foi o que observamos. A Tx2-6 causou ereção peniana,
cialorréia, piloereção e morte; a BcIII, causou cialorréia e também hiper-reflexia e
estranhamente α e β Pompilidotoxina não causaram nenhuma intoxicação observável,
50
o que talvez indique uma ação espécie-específica. Como ponderado acima, a
explicação para estas diferenças tão grandes, foge ao escopo deste estudo.
Por fim, neste estudo observamos que muito há por ser feito em relação ao
estudo de toxinas ativas em canais de sódio e sobre as diversas funções destes.
Encontramos aqui um bom exemplo do papel fundamental das toxinas no estudo e
conhecimento da fisiologia da neurotransmissão e na função nervosa, com ênfase na
diversidade estrutural destes canais tanto intra quanto inter-específica.
51
Conclusões
Com base nos resultados obtidos neste estudo concluímos que:
1 - A paralisia seletiva dos membros posteriores pode, sim, ser atribuída a uma
sensibilidade maior dos músculos de contração rápida à crotamina, conforme proposto
em nossa hipótese de trabalho;
2 - A sensibilidade maior dos músculos rápidos à crotamina não está relacionada
à densidade de canais de sódio, como previsto em nossa hipótese, pois esta toxina não
tem ação em canais de sódio musculares ou neuronais, expressos em células
heterólogas ou em células neuronais em cultura primária;
3 - Tendo em vista que a crotamina pode penetrar a membrana celular, não se
pode descartar uma ação sobre sítios intracelulares ainda por descrever;
4 - O mecanismo de ação da crotamina permanece desconhecido, mas
observam-se claras semelhanças entre esta toxina e sua parente a miotoxina-α.
52
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