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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DE PERICITOS ORIGINADOS
DE PLACENTAS HUMANAS
GUSTAVO ANTONIO PANIM CIOCCA
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ii
ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS
GUSTAVO ANTONIO PANIM CIOCCA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas, Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Morfológicas.
Orientador: Radovan Borojevic
Rio de Janeiro
2008
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iii
Rio de Janeiro
2008
FICHA CATALOGRÁFICA
Ciocca, Gustavo Antonio Panim
ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS. / Gustavo
Antonio Panim Ciocca – Rio de Janeiro, 2008, 67p.
Referências Bibliográficas: f. 54-67
Dissertação (Mestrado em Ciências Morfológicas) – Universidade
Federal do Rio de Janeiro – UFRJ. Centro de Ciências da Saúde,
Instituto de Ciências Biomédicas, 2008
Orientador: Radovan Borojevic
1. Pericito 2. CD146 3. Placenta 4. NG2. I. Radovan Borojevic
(orientador). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de
Ciências da Saúde. Instituto de Ciências Biomédicas.
iv
ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfológicas, Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Morfológicas.
Orientador: Radovan Borojevic
APROVADO EM _______DE_____________________DE_________
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Váleria de Mello Coelho – UFRJ (Membro interno)
Profa. Dra. Cláudia dos Santos Mermelstein – UFRJ (Membro interno)
Prof. Dr. José Mauro Granjeiro – UFF (Membro externo)
Profa. Dra. Márcia Cury El Cheikh – UFRJ (Suplente interno)
Profa. Dra. Maria de Fátima Brandão Pinho – UFF (Suplente externo)
Prof. Dr. Leonardo Rodrigues Andrade – UFRJ (Revisor)
Rio de Janeiro
2008
v
AGRADECIMENTOS
Inicialmente, gostaria de agradecer a Deus, inteligência suprema e causa
primária de todas as coisas, por estar vivo, pela saúde, pela família e por todas as
oportunidades que Ele me proporcionou até agora. Além disso, também sou grato
aos obstáculos que enfrentei durante a minha vida, pois eles me ensinaram a
crescer e me tornar uma pessoa melhor.
Aos meus pais e irmãos, que são as pessoas mais queridas e importantes
pra mim, pois sem o amor, o carinho, a força e os ensinamentos que recebi deles
a minha vida não teria sentido. Todos os dias agradeço a Deus por ter uma família
tão maravilhosa e unida. Amo demais você pai, que sempre foi o exemplo pra
mim; você mãe, sempre carinhosa e irradiando essa sua alegria que me contagia
sempre; e vocês meus queridos irmãos Zé e Neno, amigos eternos e especiais.
À todos os meus outros familiares pelo carinho e apoio. Mesmo longe de
casa sinto sempre a vibração positiva que vocês me passam. Saudades de todos.
Ao professor Radovan Borojevic pela oportunidade e confiança, além dos
valiosos ensinamentos que nunca serão esquecidos.
Ao revisor e membros da banca pela compreensão em relação ao tempo.
Aos grandes amigos de São José do Rio Preto-SP e do Rio de Janeiro, por
todos os momentos de alegria que passamos juntos, sempre rodeado de muito
papo, risada e aquela cervejinha gelada pra relaxar. A amizade de vocês sempre
será peça fundamental na minha vida.
vi
Á todos os integrantes do Laboratório de Proliferação e Diferenciação
Celular que me acolheram da melhor forma possível, sendo na troca de
conhecimento, nas conversas e nos momentos de descontração.
Aos membros do Departamento de Embriologia e Histologia.
Aos amigos Leandra Baptista, Anderson Teodoro, Ronaldo Amaral, Débora
Portilho e Michelle Othen, pela ajuda nos experimentos finais.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Ao professor e amigo Adaumir Castro pela correção ortográfica do texto.
Á todas as outras pessoas que me ajudaram de alguma forma para que
esta dissertação de mestrado pudesse ser concluída.
vii
RESUMO
Os pericitos são células perivasculares essenciais na manutenção das
funções metabólicas, mecânicas e de sinalização nos microvasos. Estas células
respondem a sinais vasoativos, a estímulos angiogênicos, guiam brotos
vasculares, estabilizam capilares neoformados, e produzem fatores importantes
para a sobrevivência da célula endotelial formadora dos vasos. Evidências atuais
sugerem que os pericitos funcionem como células progenitoras tecido-residentes
capazes de se diferenciarem em diferentes tipos celulares, incluindo osteoblastos,
condroblastos e adipócitos. O objetivo do presente estudo foi estabelecer
protocolo de isolamento, proliferação e caracterização in vitro de pericitos
originados de placentas humanas. As células foram isoladas de microvilosidades
de placentas por digestão enzimática seguida de centrifugação em gradiente de
Percoll. As células foram caracterizadas por western-blotting utilizando anticorpos
contra NG2 e desmina, marcadores de pericitos. Resultados de citometria de fluxo
mostraram duas populações distintas, sendo negativas para células
hematopoieticas (CD45, CD34) e endoteliais (CD31). As populações
apresentaram marcações positivas para CD105 (endoglina), CD44 (marcador de
célula-tronco), CD73 (marcador de células progenitoras mesenquimais) e CD146
(marcador de pericito). Ensaios de diferenciação também foram realizados para
confirmar a plasticidade dessas células. Sob meio de cultura condicionado
adipogênico e osteogênico, estas células acumularam lipídeos e depositaram
grânulos de cálcio, respectivamente. Os resultados mostraram que o método de
isolamento testado foi eficaz para obtenção de grande número de pericitos, e que
estas células podem ser utilizadas em protocolos de terapias celulares devido a
sua plasticidade fenotipica.
Palavras chaves: pericito, placenta, CD146, NG2
viii
ABSTRACT
Pericytes are perivascular cells essential in the maintenance of the
metabolic, mechanical and signaling functions in microvessels. These cells
respond to vasoactive signals, angiogenic stimuli, guide vascular sprouts, stabilize
new capillaries, and they produce important factors for the survival of the
endothelial cells. Current evidences suggest that they function as tissue-resident
progenitor cells capable of differentiating into a variety of cell types including
osteoblasts, chondroblasts and adipocytes. The aim of the present study was to
establish protocols of isolation, proliferation and characterization in vitro of
pericytes from human placentas. The cells were isolated from placenta microvilli by
enzymatic digestion followed by centrifugation on a Percoll gradient. The cells were
characterized by western-blotting analyses using antibodies against NG2 and
desmin, which are pericytes markers. Results from flow cytometry showed two
distinct populations, negative for hematopoietic (CD45, CD34) and endothelial
(CD31) cell markers. The populations showed positive labeling for CD105
(endoglin), CD44 (hyaluronte receptor, a stem cells marker), CD73 (mesenchymal
progenitors) and CD146 (pericyte marker). Differentiation assays were done to
confirm the plasticity of these cells. Under culture with adipogenic and osteogenic-
inducing media, these cells accumulated lipids or deposited calcium granules,
respectively. The results showed that the method of pericyte isolation was efficient
for getting great number of pericytes, and that these cells can be used in cellular
therapies protocols due to their phenotypic plasticity.
Key words: pericyte, placenta, CD146, NG2
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACK – tampão cloreto de amônio
-SMA – alfa smooth muscle actin / actina alfa de músculo liso
bFGF – basic fibroblast growth factor / fator básico de crescimento de fibroblasto
BFS – bovine fetal serum / soro fetal bovino
BHE – blood brain barrier / barreira hemato-encefálica
BSA – bovine serum albumin / soro de albumina bovina
BSS – balanced saline solution / solução salina balanceada
DMEM – Dulbecco’s modified eagle’s medium / meio eagle modificado por
Dulbecco
EC – endothelial cells / células endoteliais
ECM – extracellular matrix / matriz extracelular
HMWMAA – high molecular weight melanome associated antigen / antígeno de
alto peso molecular associado a melanoma
NG2 –nerve-glial 2 / nervo-glial 2
PBS – phosphate buffer saline / solução saline fosfatada
PDGF-AA – platelet derived growth factor AA / fator de crescimento AA derivado
de plaqueta
PDGF-B – platelet derived growth factor B / fator de crescimento B derivado de
plaqueta
PDGFR- – platelet derived growth factor receptor beta / receptor beta do fator de
crescimento derivado de plaqueta
PP – pericyte progenitors / progenitores pericíticos
SMC – do inglês smooth muscle cell / célula de músculo liso
TBS – tris buffer saline / tampão salina tris
TGF-1 – transforming growth factor beta 1 / fator de crescimento transformante
beta 1
VEGF – vascular endothelial growth factor / fator de crescimento endotelial
vascular
x
SUMÁRIO
1) Introdução:..........................................................................................................1
Figura 1..........................................................................................................2
Figura 2..........................................................................................................3
Figura 3..........................................................................................................6
Figura 4........................................................................................................12
2) Objetivos:..........................................................................................................14
3) Metodologia:.....................................................................................................15
3.1) Isolamento de células de placenta humana.........................................15
3.1.1) Preparação das vilosidades....................................................15
3.1.2) Digestão das vilosidades.........................................................15
3.1.3) Isolamento dos microvasos.....................................................16
3.1.4) Cultura de células....................................................................16
3.2) Imunofluorescência...............................................................................17
3.3) Western blotting....................................................................................18
3.3.1) Eletroforese em gel de poliacrilamida.....................................18
3.3.2) Immunoblotting.................................................................... 19
3.4) Extração de RNA Total, síntese de cDNA e RT– PCR.........................20
3.5) Citometria de Fluxo...............................................................................22
3.6) Ensaio de diferenciação osteogênico e adipogênico............................22
4) Resultados:.......................................................................................................24
4.1) Microscopia óptica de contraste de fase de células de placenta humana
crescidas in vitro..........................................................................................24
4.2) Células isoladas de placenta humana expressam o marcador nervo-
glial-2 (NG2)................................................................................................24
4.3) Células isoladas de placenta humana expressam as proteínas NG2 e
desmina...................................................................................................... 25
xi
4.4) Células isoladas de placenta humana expressam RNAm para ANG-1
......................................................................................................................25
4.5) Células isoladas de placenta humana apresentam marcação positiva
para marcadores de células progenitores e ausência de marcadores de
células hematopoiéticas e endoteliais..........................................................25
4.6) As células isoladas de placenta humana respondem positivamente às
induções osteogênica e adipogênica.......................................................... 27
Figura 5........................................................................................................28
Figura 6........................................................................................................29
Figura 7........................................................................................................30
Figura 8........................................................................................................31
Figura 9........................................................................................................32
Figura 10......................................................................................................33
Figura 11......................................................................................................34
Figura 12......................................................................................................35
Figura 13......................................................................................................36
Figura 14......................................................................................................37
Figura 15......................................................................................................38
Figura 16......................................................................................................39
Figura 17......................................................................................................40
5) Discussão:.........................................................................................................41
6) Conclusões:......................................................................................................53
7) Referências Bibliográficas:.............................................................................54
1
1. INTRODUÇÃO
No campo das Terapias Celulares, existe sempre uma busca de fontes
alternativas de células multipotentes com habilidade de diferenciação em múltiplas
linhagens. Uma das fontes mais promissoras para a obtenção dessas células
atualmente é a placenta, pois é um órgão que não necessita de procedimentos
invasivos na sua coleta, já que é expelida após o parto. Além disso, não existem
conflitos éticos envolvidos, devido ao fato desse órgão ser descartado como
expurgo hospitalar.
A placenta, órgão transitório encontrado apenas em mamíferos, é o
intermediário das trocas fisiológicas entre mãe e feto e é constituída por uma parte
fetal e uma parte materna. A parte fetal da placenta é formada pelo córion. Consta
de uma placa corial de onde partem vilos coriônicos. Esses vilos são constituídos
por uma parte central conjuntiva, derivada do mesênquima extra-embrionário, e
pelas camadas do citotrofoblasto e de sinciciotrofoblasto. Os vilos coriais podem
ser livres ou fixos e ambos têm a mesma estrutura, porém os livres não atingem a
decídua, ao passo que os fixos se prendem à decídua basal. A superfície dos vilos
é banhada pelo sangue das lacunas da decídua basal (espaços intervilosos da
placenta), e é aqui que ocorrem as trocas de substâncias entre o sangue fetal e o
materno. A parte materna da placenta é a decídua basal, que fornece sangue
arterial para as lacunas situadas entre os vilos secundários e recebe de volta o
sangue tornado venoso nessas lacunas. Embora os vasos sanguíneos se rompam
durante a implantação, os vasos fetais contidos nos vilos secundários mantêm-se
íntegros (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008)
Os pericitos (peri = ao redor; cito = célula) foram descritos há mais de 100
anos como células perivasculares que envolvem os microvasos (arteríolas,
vênulas e capilares) (Fig. 1) (EBERTH, 1871; ROUGET, 1873). Eles também eram
chamados células de Rouget, ou referidos como células murais ou, por causa das
suas fibras contráteis, como células de músculo liso (SMC) vascular (HIRSCHI &
D’AMORE, 1996).
2
Figura 1: Fotomicrografia eletrônica de varredura da microvasculatura.
Pericitos envolvendo uma arteríola pré-capilar (Fujiwara and Uehara, 1984).
As primeiras análises por microscopia eletrônica de transmissão revelaram
as características ultraestruturais dos pericitos. Em geral, pericitos possuem um
formato estrelado, corpo celular com núcleo proeminente e limitado citoplasma
perinuclear, de onde se estendem diversos processos citoplasmáticos, envolvendo
a parede do endotélio abluminal (ALLT & LAWRENSON, 2001; BERGERS &
SONG, 2005). Essas células estão aderidas na membrana basal dos microvasos,
que é formada tanto pelos pericitos quanto por células endoteliais (EC)
(MANDARINO et al., 1993).
Os pericitos não servem unicamente como arcabouço, como historicamente
se pensava; podem se comunicar com as EC por contato físico direto e vias de
sinalização parácrina. Junções comunicantes do tipo “gap” fornecem conexões
diretas entre os citoplasmas dos pericitos e EC, permitindo assim a troca de íons e
pequenas moléculas. As placas de adesão ancoram os pericitos nas EC, enquanto
os contatos “peg-and-socket” (pino e tomada) permitem às células penetrar
3
através de descontinuidades da membrana basal dos vasos e tocarem uma a
outra (RUCKER et al., 2000). Esses complexos juncionais sustentam a
transmissão de forças mecânicas contráteis dos pericitos para o endotélio e
contêm N-caderina, moléculas de adesão celular, junções aderentes baseadas em
β-catenina, e moléculas de matriz extracelular (ECM) como a fibronectina
(GERHARDT et al., 2003) (Fig. 2).
Figura 2: Interações entre endotélio e pericitos nos microvasos. Pericitos
envolvendo as EC compartilham a mesma membrana basal. Contato direto entre
pericitos e endotélio é estabelecido via complexos juncionais localizados nos
contatos “peg-and-socket” nos sítios onde a membrana basal é ausente
(modificado de ARMULIK et al., 2005).
Os pericitos exibem longos processos citoplasmáticos, que não apenas
podem contatar numerosas EC, e assim integrar sinais ao longo do comprimento
dos vasos, mas podem também estender para mais de um capilar na vasculatura
(ALLT & LAWRENSON, 2001). Interessantemente, contatos célula-célula parecem
necessários para a ativação do fator de crescimento de transformação β1 (TGF-
β1), que induz a diferenciação dos pericitos in vitro (ORLIDGE & D’AMORE,
1987), sustentando a noção de que o contato celular direto é uma ferramenta de
comunicação crucial para a formação e manutenção dos vasos. Pericitos ainda
4
exibem um número de características consistentes com atividade de célula
muscular, como expressar actina contrátil de músculo liso, além do envolvimento
na maturação dos vasos (HERMAN & D’AMORE, 1985).
Os desafios em definir molecularmente os pericitos não têm sido fáceis pelo
fato de ainda não se ter encontrado um marcador específico para esse tipo celular.
Existem, entretanto, alguns marcadores moleculares que estão presentes nos
pericitos, embora não exclusivamente, e são comumente usados na sua detecção
(BERGERS & SONG, 2005).
Os principais marcadores utilizados na literatura incluem: desmina e α-
actina de músculo liso (α-SMA), que são proteínas do citoesqueleto; nervo-glial 2
(NG2), um proteoglicano transmembranar de sulfato de condroitina; o receptor
beta do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-β), o gangliosídio 3G5
(BERGERS & SONG, 2005), além do CD146 (SACCHETTI et al, 2007).
Desmina é um filamento intermediário de classe III específico de músculo
encontrado em células musculares maduras esqueléticas, cardíacas e lisas.
Camundongos deficientes em desmina são viáveis e férteis, mas eles
desenvolvem fraqueza muscular progressiva e alterações distróficas em ambos os
músculos cardíacos e esqueléticos (LI et al., 1996; MILNER et al., 1996).
A α-SMA é uma das seis isoformas de mamíferos da proteína actina
citoesquelética. As actinas não musculares beta e gama estão presentes em todas
as células, enquanto que a α-SMA é normalmente restrita às células da linhagem
muscular lisa. Também tem sido mostrado que certas células não-musculares
expressam α-SMA transitoriamente, especificamente fibroblastos, e são referidas
como miofibroblastos (RONNOV-JESSEN & PETERSEN, 1996).
Interessantemente, α-SMA aparece inibindo a migração e mobilização dos
fibroblastos, sugerindo que essa proteína possa promover um fenótipo
diferenciado (RONNOV-JESSEN & PETERSEN, 1996).
O PDGFR-β é uma das moléculas expressas nos pericitos mais
amplamente estudadas. O camundongo deficiente para PDGFR-β ou seu ligante
PDGF-β tem o número de pericitos severamente reduzido e uma subseqüente
hiperdilatação dos vasos sanguíneos, causando assim a formação de edemas,
5
culminando na letalidade embrionária. Entretanto, outros tipos celulares além dos
pericitos também produzem PDGFR-β, como fibroblastos, astrócitos e certas
células tumorais (LINDAHL et al., 1997).
O proteoglicano de sulfato de condroitina NG2 (também chamado de
antígeno associado à melanoma com alto peso molecular, ou HMWMAA; a
derivação para camundongo é denominada AN2) é expresso na superfície dos
pericitos durante os processos de vasculogênese e angiogênese (STALLCUP,
2002). Historicamente, o NG2 foi postulado em ser característico de células
neurais imaturas capazes de se diferenciarem tanto em glia quanto em neurônio e
foi por isso denominado nervo-glial 2. Sustentando essa hipótese, NG2 é
encontrado no sistema nervoso central em células precursoras gliais O-2A, que
originam tanto oligodendrócitos quanto astrócitos tipo II, perdendo a expressão de
NG2 durante o processo de diferenciação (STALLCUP, 2002). O NG2 exerce sua
atividade biológica, em parte, através da ligação com alta afinidade no fator de
crescimento básico de fibroblasto (bFGF), PDGF-AA, plasminogênio e
angiostatina. O camundongo “knockout” para NG2 é viável, mas quando a
angiogênese patológica é induzida no camundongo adulto, como angiogênese
isquêmica na retina do camundongo em resposta à hipóxia ou angiogênese
induzida por bFGF na córnea, a neovascularização é substancialmente reduzida
(OZERDEM AND STALLCUP, 2004). Uma possibilidade adicional é que o NG2
medeie diretamente a comunicação entre pericitos e EC vasculares. O apelo
dessa idéia é aumentado pela observação de que o domínio extracelular do NG2
pode ser liberado proteoliticamente da superfície celular in vitro e in vivo
(NISHIYAMA et al., 1995; JONES et al., 2002). Além disso, NG2 solúvel, liberado
da superfície celular de pericitos, pode estimular o recrutamento de EC para os
sítios de neovascularização (FUKUSHI et al., 2004).
O gangliosídio de membrana 3G5 é expresso na superfície de vários tipos
celulares incluindo células das ilhotas pancreáticas, células foliculares da tireóide,
células glomerulares renais e pericitos (FIEDLER et al., 2004; NAYAK et al.,1988).
STRAMER e colaboradores (2004) demonstraram que o anticorpo monoclonal
3G5 é um marcador de pericitos microvasculares in vitro e in vivo. A expressão
6
desse marcador também foi relatada em pericitos cultivados de retina e coração
(HELMBOLD et al., 2001). Por ser expresso principalmente por células que
possuem processos membranares, esse gangliosídeo pode estar envolvido na
regulação e manutenção da forma celular (STRAMER et al., 2004).
O CD146 é um membro identificado no gene da superfamília de
imunoglobulinas e foi anteriormente chamado por nomes diferentes, devido à sua
identificação em diferentes tecidos, por vários grupos de pesquisa independentes.
Os sinônimos de CD146 incluem MUC18, o antígeno de A32, MCAM, MEL-CAM,
e S-Endo-1 (SHIH, 1999). Atualmente ele é utilizado como marcador de
progenitores mesenquimais e pericitos (SHI & GRONTHOS, 2003; SACCHETTI et
al, 2007; ZANNETTINO et al, 2008).
Os pericitos têm sido associados principalmente aos processos de
estabilização e hemodinâmica dos vasos sanguíneos. Suas funções são,
entretanto, muito mais diversas (Fig. 3). Eles podem, sob estímulo angiogênico,
guiar tubos de brotamento, eliciar funções de sobrevivência endotelial, e até exibir
atividades macrofágicas (BERGERS & SONG, 2005).
Figura 3: Atividades multifuncionais do pericitos nos microvasos. Os
pericitos exercem diversas funções (modificado de EGGINTON et al., 2000).
7
Similar às SMC dos grandes vasos, os pericitos podem produzir
vasoconstrição e vasodilatação dentro da trama de capilares para regular o
diâmetro vascular e o fluxo sanguíneo capilar (RUCKER et al., 2000). A primeira
linha de evidência para essa função veio da identificação de proteínas contráteis
como α-SMA, tropomiosina, e miosina em perictios. Esses filamentos também são
produzidos por SMC e por isso contribuem bastante para a confusão entre a
definição de uma SMC e um pericito (BERGERS & SONG, 2005).
Muitas moléculas que regulam a contração dos pericitos têm sido
identificadas. Por exemplo, pericitos possuem receptores para ambos os
receptores colinérgicos e adrenérgicos (α-2 e β-2). A resposta β-adrenérgica em
pericitos induz o relaxamento, ao passo que a resposta do α-2 é antagonista e
produz contração (RUCKER et al., 2000).
Outras substâncias vasoativas que se ligam aos pericitos são angiotensina
II e endotelina-1. A expressão de endotelina-1 é induzida por EC, que também
produz óxido nítrico, um potente vasodilatador que promove o relaxamento
vascular por um mecanismo dependente de cGMP (RUCKER et al., 2000). Essas
moléculas funcionam como sinais parácrinos, regulam a contração e o
relaxamento de pericitos, e produzem parte das evidências que EC e pericitos
interagem na regulação do fluxo sanguíneo (RUCKER et al., 2000).
Os níveis de oxigênio também regulam a contração dos pericitos. Tem sido
mostrado que a hiperóxia aumenta a contração de pericitos in vitro, ao passo que
elevados níveis de dióxido de carbono induzem o relaxamento (BERGERS &
SONG, 2005). Esses dados sugerem que os vasos dilatam quando o oxigênio é
necessário, mas comprimem se os níveis forem suficientes, por meio disso ligando
a taxa do fluxo sanguíneo ao estado metabólico (BERGERS & SONG, 2005).
Embora a contração in vivo dos pericitos seja mais difícil de provar, técnicas
morfométricas ultraestruturais têm demonstrado a compressão das membranas
endoteliais por pericitos próximos. A contração dos pericitos foi medida em
resposta a substâncias vasoativas no músculo esquelético (TILTON et al., 1979;
HIRSCHI & D’AMORE, 1996).
8
A densidade dos pericitos difere a respeito da sua função nos vasos e
órgãos em que eles são encontrados. Essas células são muito abundantes nas
vênulas e arteríolas, mas são um tanto escassas nos capilares (SIMS, 2000).
Embora seja desconhecido como os pericitos escolhem sua localização
exata na parede dos vasos, eles não estão localizados ao acaso, mas sim
funcionalmente determinados. Tem sido notado que eles, preferencialmente,
cobrem junções de EC, especificamente durante a inflamação (SIMS, 2000).
A cobertura de pericitos nos vasos sanguíneos também varia entre os
tecidos. Isso não é necessariamente surpreendente, porque células vasculares
adquirem características especializadas em diferentes órgãos, baseadas na
função de cada órgão. Em diversos órgãos, como cérebro, fígado e rins, os
pericitos aparecem executando funções específicas e, por isso, essas células
receberam nomes diferentes em cada órgão (BERGERS & SONG, 2005). A maior
densidade de pericitos no corpo é encontrada nos vasos dos tecidos neurais,
como cérebro e retina. A razão para isso é que as EC no cérebro formam um
endotélio contínuo com junções aderentes complexas, interagindo com os
pedículos dos astrócitos e com numerosos pericitos para criar a barreira hemato-
encefálica (BHE), que protege as células cerebrais de potenciais fatores tóxicos
derivados do sangue (CLEAVER & MELTON, 2003; BALLABH et al., 2004). Os
pericitos possuem um papel essencial na integridade dos vasos estruturais e na
BHE. Tem sido mostrado, in vitro, que essas células protegem o rompimento da
BHE, induzido por hipóxia (HAYASHI et al., 2004).
O mais interessante é que os pericitos do cérebro podem executar
atividades típicas de macrófagos, assim provendo uma defesa imunológica. Esse
fenótipo levantou a hipótese que pericitos possam atuar como células precursoras
de macrófagos no cérebro, existindo ainda outras observações para sustentar esta
idéia (THOMAS, 1999). Como macrófagos, pericitos capturam moléculas solúveis
e pequenas por pinocitose, limpando o fluido extracelular, como parte da BHE. Os
pericitos também têm atividade fagocitária (THOMAS, 1999), sendo que a primeira
evidência dessa atividade nessas células foi revelada quando, seguindo
tratamento histamínico, as células gradualmente capturaram carbono durante um
9
período de muitos meses (MAJNO et al., 1961). Além do mais, os pericitos
expressam receptores Fc, que são essenciais para o reconhecimento do complexo
antígeno-anticorpo, para provocar a fagocitose dependente de anticorpo
(BALABANOV et al., 1996).
Os pericitos também possuem funções especializadas no fígado. As células
hepáticas estreladas, também chamadas de células de Itoh (nomeado após seu
descobridor, Toshio Itoh) (SUEMATSU & AISO, 2002), são os equivalentes dos
pericitos no fígado (SATO et al., 2003). Essas células estão localizadas entre as
placas de células parenquimatosas e as EC sinusoidais. Ao contrário do endotélio
contínuo cerebral, as EC do fígado são altamente fenestradas e descontínuas.
Elas alinham os sinusóides hepáticos e medeiam a troca de metabólitos entre a
veia porta, as células de Kupffer e hepatócitos, no processamento das toxinas
(ABBOTT, 2002).
Nos rins, os pericitos dos capilares glomerulares são chamados células
mesangeais e contabilizam aproximadamente 30% das células glomerulares.
Essas células contribuem para a bifurcação intussusceptiva ou a divisão de um
laço vascular único que invade vários capilares glomerulares, criando assim um
aumento significativo da área da superfície capilar para a ultrafiltração do sangue
(BETSHOLTZ, 2004). A sinalização de PDGFR-β parece ser crítica para o
desenvolvimento das células mesangeais, pois camundongos deficientes em
PDGF-B ou seu receptor PDGFR-β apresentam ausência de células mesangeais
e, por isso, formam glomérulos renais defeituosos que possuem apenas um laço
capilar distendido (BETSHOLTZ, 2004).
Os pericitos não estão apenas envolvidos nos processos hemodinâmicos,
mas também possuem um papel ativo na formação do vaso. Os vasos sanguíneos
desenvolvem-se inicialmente durante a embriogênese e são derivados de
precursores mesodermais chamados angioblastos (CARMELIET, 2004).
Adicionalmente, acredita-se que as EC dividem um precursor comum com as
células hematopoiéticas, sendo esse precursor chamado de hemangioblasto. Essa
hipótese de um precursor comum é sustentada pelas observações de que EC e
células hematopoiéticas em desenvolvimento dividem marcadores de superfície
10
comuns e que as hematopoiéticas podem crescer do principal vaso sanguíneo
embrionário (RIBATTI et al., 2002; CARMELIET, 2004).
O tecido estromal da medula óssea (BM) de mamíferos adultos foi
tradicionalmente examinado, basicamente, quanto ao seu papel bem
documentado no apoio a hematopoiese, isto é, um tecido cuja função principal é
fornecer um microambiente dentro do BM que suporta a proliferação, a
diferenciação e a maturação de células-tronco hematopoiéticas em cada uma das
oito linhagens distintas que compreendem o sistema hematopoiético. Em
contraste, a possibilidade de que o estroma da BM pode ele mesmo ser baseado
em um modelo de célula-tronco e que contenha células estromais multipotentes,
com a capacidade para dar a origem a cada uma das linhagens de células
diferenciadas encontradas no estroma medular, no osso, e na cartilagem, tem
recebido uma atenção relativamente pequena. Contudo, com o progresso rápido
nesta área, é claro agora que as células progenitoras/tronco do tecido esquelético
e estromal da BM, inequivocamente existem em múltiplas espécies mamíferas, e
que BM deve ser vista como um órgão que abriga pelo menos duas população
distintas de células-tronco adultas, cujas várias progênies coexistem em uma
maneira funcionalmente interdependente. (SHORT et al, 2003).
Os pericitos têm uma ontogenia complexa, pois podem desenvolver-se a
partir de várias células, como uma função da sua posição no embrião (BERGERS
& SONG, 2005). Por exemplo, pericitos podem desenvolver-se da crista neural na
parte anterior do cérebro e tratos cardíacos (BERGWERFF et al., 1998).
Mais comumente descrita é sua origem a partir das células-tronco
mesenquimais (CREAZZO et al., 1998). Sob essas circunstâncias, TGF-β1 parece
iniciar a diferenciação dos progenitores pericíticos (PP) PDGFR-β
+
que são então
atraídos quimiotaticamente pelas EC que secretam PDGF-B nos plexus capilares
(HELLSTROM et al., 1999). TGF-β1 parece guiar a diferenciação dos
progenitores, derivados da crista neural ou do mesênquima, em células similares a
SMC (DARLAND & D’AMORE, 2001; CHEN & LECHLEIDER, 2004).
Logo que o plexo capilar primário é montado, o mesmo é refinado em uma
rede funcional por angiogênese, que pode incluir intussuscepção endotelial,
11
junção celular endotelial, brotamento de vasos, ou uma combinação dos três
processos. No brotamento de vasos, fatores angiogênicos, como o fator de
crescimento de endotélio vascular (VEGF), estimulam as EC que, por sua vez,
começam a secretar várias proteases para degradar a membrana basal do vaso.
Isso permite que as EC invadam a ECM ao redor e formem uma coluna de
migração que consiste em EC proliferando e migrando (BERGERS & SONG,
2005). Como demonstrado na retina, essa coluna é guiada por EC que migram na
mesma ponta e se movem em direção a um gradiente de VEGF (GERHARDT et
al., 2003).
Entretanto, estudos em corpo lúteo, retina e tumores têm sugerido que os
pericitos também são capazes de guiar processos de brotamento migrando
adiante das EC e expressando VEGF. Foi observada a ocorrência de tubos de
pericitos, livres de endotélio, tanto na microvasculatura normal quanto na
patológica (REYNOLDS et al., 2000; OZERDEM et al., 2001; OZERDEM &
STALLCUP, 2003). Novos brotamentos formados cessam a proliferação atrás da
zona de migração, aderem uns aos outros e formam um novo vaso contendo
lúmen. As EC então secretam fatores de crescimento, em parte para atrair
pericitos que envolvem a parede vascular, e promovem a maturação do vaso
(BERGERS & SONG, 2005).
Embora muitos fatores como o S1P-1 (esfingosina-1-fosfafo-1) e as
angiopoetinas tenham sido implicados no recrutamento dos pericitos e na
maturação dos vasos (JAIN, 2003), é o PDGF-B que parece ter um papel crucial
no recrutamento dos pericitos para vasos neoformados (BETSHOLTZ, 2004).
Durante a angiogênese em embriões e adultos, PDGF-B é expresso pelas EC dos
brotamentos de capilares, ao passo que seu receptor, PDGFR-β, é localizado nos
pericitos, sugerindo um circuito de sinalização parácrina entre os dois tipos
celulares (HELLSTROM et al., 1999; HIRSCHI et al., 1999; HENGE et al., 2002).
(Fig. 4).
12
Figura 4. Sinalização PDGF-B/PDGFR-β é necessário para o recrutamento de
pericitos durante a angiogênese. PDGF-B é sintetizado e secretado pelas
células da extremidade que lideram o avanço do broto angiogênico. A ligação do
PDGF-B aos proteoglicanos de sulfato de heparan (HSPG) é importante para a
localização do PDGF-B nas proximidades do vaso em desenvolvimento. Pericitos,
que expressam PDGFR-β, são dependentes do PDGF-B derivados do endotélio
para a sua proliferação e migração (modificado de ARMULIK et al., 2005).
Acredita-se que os pericitos, por causa da sua posição abraçando o vaso,
sejam capazes de transferir sinais angiogênicos ao longo do comprimento do vaso
por contatar numerosas EC. As EC e pericitos se comunicam tanto por contato
direto quanto por sinalização parácrina; por meio disso, também afetam a taxa
mitótica um do outro. Pericitos induzem diferenciação endotelial e inibição do
crescimento endotelial (HIRSCHI et al., 1998; SIMS, 2000; GERHARDT &
BETSHOLTZ, 2003).
Essas idéias a respeito da interação entre pericitos e EC são primariamente
baseadas na visão de que o recrutamento de pericitos fica para trás do
brotamento endotelial e que essa janela de ausência de pericitos permite uma
plasticidade vascular, resultando em crescimento, sobrevivência, remodelamento
ou regressão do endotélio, dependendo da presença ou ausência de fatores de
crescimento angiogênicos, como o VEGF (BONDJERS et al., 2003). Em conjunto,
EC e pericitos regulam a formação, a maturação e a especificação dos vasos,
todos os quais necessitam de uma orquestração de muitas moléculas reguladas.
13
Finalmente, a função pluripotencial dos pericitos está ganhando
credibilidade. Existem boas evidências que células com características
pluripotentes estejam presentes em muitos tecidos adultos, incluindo a medula
óssea, pele, músculo esquelético, tecido adiposo e a polpa do dente (BIANCO et
al., 2001; VERFAILLIE, 2002; TUAN et al., 2003). Entretanto a identidade dessas
células precisa ser mais bem definida. Interessantemente, BIANCO e
colaboradores (2001) sugeriram que as células-tronco mesenquimais presentes na
BM poderiam originar-se de pericitos microvasculares, devido ao fato em ambos
expressarem fosfatase alcaline e potencial de diferenciação em linhagens
mesenquimais.
Pelo fato de vários outros tecidos, de onde células pluripotentes são
isoladas, serem também ricos em microvasos, existe a hipótese de que essas
células também possam ter origem vascular (FARRINGTON-ROCK et al., 2004).
Sustentando essa hipótese, vários autores demonstraram que o pericito tem o
potencial de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, SMC,
macrófagos e fibroblastos (SCHOR et al., 1990; DIAZ-FLORES et al., 1991; SIMS,
1991; BRIGHTON et al., 1992; DIAZ-FLORES et al., 1992; DOHERTY et al., 1998;
DOHERTY & CANFIELD, 1999; SIMS, 2000).
Como visto, os pericitos possuem grande potencial de diferenciação na
linhagem mesenquimal, além de estar presente em vários órgãos, abrindo novas
portas para a utilização em terapias celulares, o que justifica o estudo dessas
células.
14
2. OBJETIVO GERAL
Este estudo tem como objetivo principal isolar, proliferar e caracterizar
pericitos humanos in vitro e gerar informações para uso futuro em terapia celular.
2.1 Objetivos Específicos
Estabelecer protocolo de isolamento de pericitos originados de
microvilosidades de placentas humanas;
Caracterizar as células isoladas utilizando marcadores apropriados
utilizando citometria de fluxo;
Confirmar o potencial adipogênico e osteogênico das células isoladas
através de testes de diferenciação.
15
3. METODOLOGIA
3.1 – Isolamento de células de placenta humana:
Placentas humanas frescas foram coletadas assepticamente no Centro
Obstétrico da Maternidade Pró-Matre, Rio de Janeiro, RJ. O material proveniente
de gestações normais e partos naturais foi transportado em bolsa estéril
acomodado em recipiente térmico com gelo até o Banco de Células do Rio de
Janeiro, localizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, onde foi realizado o procedimento de
isolamento das células, mediante autorização do Comitê de Ética do Hospital. A
metodologia utilizada foi modificada de KACÉMI e colaboradores (1997) para ser
utilizada em cultura de células.
3.1.1 – Preparação das vilosidades:
Após a remoção da lâmina corióide e basal, foram retirados alguns
cotilédones placentários, que foram lavados em tampão fosfato salino 0,1M e pH
7,2 (PBS) a 4°C suplementado com os antibióticos penicilina (0,1 mg/mL),
estreptomicina (0,1 mg/mL), anfotericina (1 mg/mL) e ciprofloxacina (1 µg / mL),
para a retirada do excesso de sangue. Os vasos de maior calibre foram extirpados
utilizando-se material cirúrgico apropriado e esterilizado, e as vilosidades retiradas
foram lavadas 4 vezes em solução ACK (cloreto de potássio) para lisar o excesso
de hemácias. Após esse processo, foram separadas para posterior digestão.
3.1.2 – Digestão das vilosidades:
Cinco gramas de microvilosidades placentárias frescas foram digeridas em
25 mL de colagenase IA 0,3% (3mg/mL) (SiGMA) sob agitação branda a 37°C.
Após 2 horas de digestão, o material foi centrifugado por 7 minutos a 600g e o
pellet lavado 3 vezes com 30 mL de PBS.
16
3.1.3 – Isolamento dos microvasos:
Os microvasos foram separados em gradiente de Percoll (SIGMA). O Percoll
foi diluído em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium - SIGMA) para
produzir 50% Percoll, usando Percoll (d = 1,13) em 1,5M NaCl. As microvilosidades
foram bandeadas por centrifugação a 400g por 20 minutos em temperatura
ambiente. Foram utilizados 5 mL de Percoll para cada 35 mL de microvilosidades
suspensas em DMEM. A banda observada entre 0,5 e 2 centímetros do topo do
gradiente foi removida, ressuspendida em 20 mL de DMEM e coletada por
centrifugação.
Para remover o material contaminante (fibras e células estromais) as
microvilosidades foram novamente digeridas em 10 mL de colagenase IA 0,3% por
mais duas horas a 37°C sob agitação branda. Após a digestão, a suspensão foi
centrifugada a 600g por 7 minutos e o pellet lavado 3 vezes com 30 mL de DMEM.
As microvilosidades foram novamente separadas em gradiente de Percoll e
coletadas como descrito anteriormente.
3.1.4 – Cultura de células:
Os fragmentos de microvasos digeridos no processo foram transferidos para
garrafas de cultura de 25 cm
2
e cultivados em DMEM suplementado com 10% de
soro fetal bovino (BFS) (CUTLAB) em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO
2
.
Após a migração e adesão das células na garrafa, as mesmas foram lavadas 3
vezes com PBS suplementado com os antibióticos penicilina (0,1 mg/mL),
estreptomicina (0,1 mg/mL), anfotericina (1 mg/mL) e ciprofloxacina (1 µg / mL)
para retirar o restante do material digerido e evitar a contaminação da cultura
primária por microrganismos. Após 30 dias, a cultura atingiu a confluência, e as
células foram tripsinizadas (0,125%) para posterior utilização em experimentos, e
também congeladas em criotubos, utilizando-se 5% de DMSO (Dimetilsulfóxido)
(SIGMA) + 95% de BFS, em um volume de 1 mL por criotubo. Os criotubos foram
17
colocados em um container apropriado para congelamento contendo álcool
isopropílico. O container contendo os criotubos foi deixado overnight em freezer -
80°C e após isso, armazenado em nitrogênio líquido. As células utilizadas nos
experimentos encontravam-se em terceira passagem.
As células foram analisadas por microscopia de contraste de fases no
microscópio Leica DC 300 e as imagens digitais obtidas utilizando o programa
Leica Image Manager 50.
3.2 – Imunofluorescência:
Antes da utilização do anticorpo NG2 nas células isoladas, foi utilizada,
como controle positivo, uma linhagem de glioma humano denominada U-373.
Utilizou-se também anticorpo contra GFAP (proteína ácida fibrilar glial) (1:500)
(DAKO) para confirmar que as células eram realmente de uma linhagem de glioma.
A linhagem celular e o anticorpo contra GFAP foram gentilmente cedidos pelo Dr.
Vivaldo Moura Neto (ICB-CCS, UFRJ).
As células isoladas a partir da digestão das microvilosidades de placenta
humana e a U-373 foram semeadas (2x10
4
células/poço) em placas de 24 poços
sobre lamínulas de vidro previamente lavadas e esterelizadas, e, após adesão,
foram fixadas com parafolmaldeído 4% não tamponado por 1 hora.
Após 5 lavagens com BSS (solução salina balanceada), as células foram
permeabilizadas com Triton X-100 0,2% por 5 minutos, lavadas 1 vez com BSS e
lavadas com cloreto de amônio 500mM (neutraliza os sítios aldeídicos livres) por 30
minutos. Uma nova lavagem com BSS foi realizada, e então os sítios inespecíficos
foram bloqueados com BSS/BSA (solução saline balanceada/soro de albumina
bovina) 5% (bloqueia as ligações inespecíficas do anticorpo primário) por 30
minutos.
Em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo primário contra
NG2 (1:200, código H-300 policlonal, Santa Cruz Biotechnology, USA) diluído em
BSS/BSA 0,1% overnight a 4°C em câmara úmida. Após a incubação com o
anticorpo primário, as células foram lavadas 3 vezes e, posteriormente, incubadas
18
com o anticorpo secundário acoplado a FITC (Isotiocianato de fluoresceína) (1:200,
Institut Pasteur Production, France) diluído em BSS/BSA 0,1% por duas horas a
temperatura ambiente. Depois desse processo, as células foram lavadas 3 vezes
com BSS, sendo que o excesso de líquido foi retirado com o auxílio de papel filtro.
O mesmo procedimento foi realizado utilizando-se o anticorpo contra GFAP apenas
nas células U-373.
Todos os núcleos celulares foram marcados por DAPI (4',6-Diamidino-2-
fenilindole). As lamínulas contendo as células foram incubadas por 5 minutos em
DAPI (1:8000) (sem luminosidade) e depois lavadas 3 vezes com PBS e por final
lavadas mais 3 vezes com água destilada.
As lamínulas foram montadas sobre lâminas previamente lavadas utilizando-
se o meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, USA). A vedação das
lamínulas foi realizada com esmalte e, após secarem, foram mantidas à 4°C e
posteriormente analisadas em microscópio de fluorescência.
Foram observados 10 campos por lâmina, para verificar se as células, tendo
os núcleos identificados por DAPI, também apresentavam marcação positiva para
NG2.
As células foram analisadas no microscópio de fluorescência Nikon Eclipse
E800 e as imagens obtidas utilizando o programa Image Pro Plus.
3.3 Western blotting:
3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida:
Os procedimentos descritos neste tópico da tese e que se referem a
eletroforese em gel de poliacrilamida e Western Blotting, foram feitos com a
colaboração da aluna de doutorado Débora Morueco Portilho. As células isoladas
foram lavadas 3 vezes com PBS e depois tratadas com 1 volume de tampão de
amostra (SDS 4%, Tris-HCl 125 mM pH 6,8, glicerol 20% e DTT 0,2 mM) para
eletroforese a uma dimensão e fervidas por 5 minutos a 100
o
C. As amostras foram
conservadas a –20
o
C. Géis de corrida desnaturantes de poliacrilamida a 10%
19
(SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970) foram preparados e as amostras na concentração
de 60 µg de proteínas/20µL de volume final. As eletroforeses foram realizadas a
corrente constante (cerca de 15 mA) por 1:30h.
3.3.2 Immunoblotting:
A revelação imunológica da reação imunológica da separação
eletroforética de proteínas em gel desnaturante de poliacrilamida para folha de
PVDF (Polivinilideno fluorado) (Millipore, São Paulo, Brasil), ou immunoblotting, foi
feita de acordo com o descrito por TOWBIN e colaboradores (1979), com
modificações.
Primeiramente, foi feita uma eletroforese unidimensional em gel
desnaturante de poliacrilamida das amostras contra as quais se quis fazer um
reconhecimento imunológico. Ao final da eletroforese, o gel foi colocado no tampão
de transferência (Tris 25 mM, glicina 191 mM e metanol 20%), por 20 minutos. A
folha de PVDF foi lavada por 10 segundos em metanol 100%, colocada em água
destilada por 5 minutos (sob agitação) e depois por 10 minutos em tampão de
transferência. A seguir, as proteínas foram transferidas eletroforeticamente para
essa folha, durante 19 horas, a 25 mA e à 4
o
C. A eficiência da transferência foi
analisada pela solução de vermelho ponceau (VP) (VP 0,1% e ácido acético 5%),
que serve para confirmar se as proteínas do gel foram transferidas para a
membrana, assim testando-se a eficiência da transferência.
As proteínas imobilizadas na membrana foram imediatamente bloqueadas
por 1 hora à temperatura ambiente por uma solução de 5 % de leite em pó
desnatado Molico em tampão TBS-Tween (tampão Tris-HCl salino com Tween 20)
(0,001%) e após, a membrana foi lavada 3 vezes por 5 minutos cada, com TBS-
Tween. A PVDF então, foi incubada com os anticorpos primários contra NG2
(1:200, Santa Cruz Biotechnology, USA) e desmina (1:100, Sigma Chemical Co.,
USA), diluído adequadamente nesse mesmo tampão, overnight, à 4
o
C e sob
agitação. Após a incubação, a membrana foi lavada mais 5 vezes, por 3 minutos
cada, com TBS-Tween. A seguir, incubou-se com o anticorpo secundário
20
conjugado à peroxidase devidamente diluído, por 1 hora, à temperatura ambiente e
sob agitação. Após 4 lavagens de 10 minutos cada, com TBS-Tween, a PVDF foi
submetida à revelação pelo Kit ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK) e todo o
procedimento foi feito segundo protocolo da Amersham.
Para verificar outra proteína presente nessa mesma folha de PVDF, a
mesma foi tratada com tampão de Striping (SDS 2%, 2-mercaptoetanol 100 mM e
Tris 62,5 mM pH 6,7) por 40 minutos a 60
o
C, lavada 4 vezes em TBS-Tween 20 e
bloqueada novamente. Depois, a membrana foi incubada com anticorpo primário
devidamente diluído em TBS-Tween e o procedimento a seguir se deu da mesma
forma descrita anteriormente.
3.4 – Extração de RNA Total, síntese de cDNA e Reação em Cadeia da
Polimerase via Transcriptase Reversa (RT– PCR), Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction):
Os procedimentos descritos neste tópico da tese foram feitos com a
colaboração do doutor Anderson Teodoro. Para avaliação da expressão gênica
das células do processo de isolamento, foram realizados ensaios de RT-PCR nas
seguintes condições:
Foi adicionado 1 mL de solução de TRIzol Reagent
TM
(Gibco) a cada inserto,
homogeneizando a solução e posteriormente, adicionando-se 200 µL de
clorofórmio para separação do mRNA, conforme o protocolo do fabricante. Por
espectrofotometria, o RNA total foi quantificado. Para a síntese de cada cDNA, foi
utilizado a mesma quantidade de RNA (1 µg de RNA total), para possibilitar uma
comparação mais fidedigna entre as diferentes amostras. A este, se adicionou 0,5
µg de oligo-(dT) (Gibco), incubando-se a 65°C por 10 minutos.
A 4°C foi adicionado 4 µL de tampão (5 vezes concentrado), 1 µL de DTT
(0,1 mM), 1 µL de dNTPs (10 mM), 200 unidades de MLV (transcriptase reversa)
(todos da Gibco) e 1 µL de água DEPC (dietilpirocarbonato). As amostras foram
incubadas por 1 hora a 37°C e, ao final desse período, a temperatura foi elevada
21
até 95°C por 10 minutos. Foi adicionada água, a 4°C, até o volume de 100 µL a
cada tubo de reação.
O cDNA foi amplificado utilizando-se primers para 18S e ANG1, Para cada
reação de PCR, foram utilizados 2,5 µL de cDNA, 0,5 U de Taq polimerase, 1,5
mM de MgCl
2
, 0,5 µL de dNTP (10 mM) e 0,1 µg do senso e do anti-senso de
primer. A temperatura de anelamento variou de acordo com o par de primers a ser
utilizado, seguindo as especificações do fabricante.
Após a amplificação, as amostras foram misturadas com 5 µL do tampão de
corrida (azul de bromofenol + TBE (tris + ácido bórico + EDTA) + glicerol) e
adicionadas a um gel de agarose 2% em uma cuba contendo TBE 0,5 vezes, para
análise por eletroforese. Foi utilizado padrão de peso molecular de 100 pares de
bases (Gibco). Em uma cuba, a corrida das amostras foi feita a 100mA.
Após eletroforese, o gel foi incubado em solução de brometo de etídeo
[0,17 μg/mL de TAE (Tris-Acetato-EDTA)] e posteriormente lavado em água
corrente por 5-10 minutos para remoção do excesso do corante. O gel foi
analisado em transiluminador de luz ultravioleta (Pharmacia) e o registro foi feito
através de imagem digitalizada.
As seqüências dos primers (Gene Link
TM
) utilizados para o PCR foram:
Primers
Seqüências
Número
de pares
de bases
GAPDH
senso 5’-CACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’
anti-senso 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’
600 pb
ANG-1
senso 5’GTGGAATCTGTCATATACTGTGAA3’
anti-senso 3’ACTGTGCAGATGTATATGAAGC5’
326pb
22
3.5 – Citometria de fluxo:
Os procedimentos descritos neste tópico da tese foram feitos com a
colaboração da doutora Leandra Baptista. As células foram tripsinizadas e
distribuídas nos tubos em quantidades desejadas (5 x 10
5
a 1 x 10
6
/tubo). Após a
suspensão das células, elas foram lavadas em tampão de FACS [PBS (solução
salina fosfatada) contendo 3% de SFB (soro fetal bovino) e 0,1% de azida sódica]
e incubadas por 20 minutos a 4ºC com anticorpos monoclonais conjugados aos
fluorocromos PE (695nm), PerCP-Cy5 (490nm), e APC (660nm). Foram
analisados os seguintes marcadores de superfície: CD34 (clone 8G12; Becton &
Dickinson, Franklin Lakes, NJ), CD45 (clone H130; Becton & Dickinson), CD31
(clone L133.1; Becton & Dickinson), CD146 (clone P1H12; Becton & Dickinson),
CD105 (clone 166707; R & D Systems), CD44 (clone G44-26; Becton & Dickinson)
e CD73 (clone AD2; Becton & Dickinson). Após a incubação, a suspensão celular
foi lavada com tampão de FACS e analisada em citômetro FACScanto (BD
Biosciences, US), equipado com o programa FACS Diva Software 4.0.
3.6 – Ensaio de diferenciação osteogênica e adipogênica:
Em ambos os ensaios, as células isoladas foram plaqueadas (5x10
4
células/poço) em placas de 24 poços, tendo como meio controle DMEM
suplementado com 10% de BFS, penicilina (0,1 mg/mL) e estreptomicina (0,1
mg/mL). Para indução osteogênica foi adicionado ao meio controle 50 μM ácido
ascórbico, 10 mM β-glicerolfosfato e 0,1 μM dexametasona. A cultura foi mantida
por 28 dias, sendo ambos os meios (controle e indutor) trocados 2 vezes por
semana. Após o final do tempo estipulado foi utilizada a coloração Nuclear Fast
Red (Chroma), que revela a presença de depósitos de cálcio produzidos pelas
células.
Para indução adipogênica foram adicionados 3-Isobutil-1-metilxantina
(IBMX) 0,5 mM, insulina 10 μM, indometacina 200 μM e dexametasona 1 μM. A
cultura foi mantida por 14 dias sendo o meio trocado 2 vezes por semana. Ao final
23
do tempo estipulado foi utilizada a coloração Oil-Red-O (Sigma), que mostra se há
ou não acúmulo de lipídeos pelas células cultivadas. As células foram analisadas
no microscópio de contraste de fases Leica DC 300 e as imagens obtidas utilizando
o programa Leica Image Manager 50.
24
4. RESULTADOS
4.1 – Microscopia óptica de contraste de fase de células de placenta humana
crescidas in vitro:
No estabelecimento do protocolo de isolamento de pericito a partir de
microvilosidades de placenta humana foram realizados testes relacionados ao tipo
de plaqueamento dos microvasos digeridos. No plaqueamento do tecido digerido
foi utilizada principalmente a técnica de explante. Entretanto, também foi testado o
plaqueamento do material em suspensão no meio, sendo utilizados volumes
diferentes.
Tanto o explante como a adição de 2mL de material digerido foram bem
sucedidos, o que não ocorreu quando foi adicionado 4mL de material digerido.
Nos primeiros 10 dias de cultura, observou-se uma migração das células do
tecido explantado para a parede da garrafa de cultura, sendo lenta a proliferação
das células nesse intervalo de tempo (Figs. 5A – 5C). Após a migração e
proliferação das células na garrafa, as mesmas foram lavadas para retirar o
restante do explante (Figs. 5D e 5E). A partir daí, observou-se a proliferação de
diversos grupos de células distantes um dos outros. Com a continuidade da cultura,
esses grupos celulares se confluíram, formando grupos maiores até ser atingida a
confluência da garrafa em 30 dias (Figura 5F). O número total de células
conseguidas na tripsinização foi de aproximadamente 5x10
6
células para cada 5
gramas de microvilosidades.
4.2 – Células isoladas de placenta humana expressam o marcador nervo-glial-2
(NG2):
Nas células controles U-373 foi observada marcação positiva para o
proteoglicano de membrana NG2 (Fig. 6A) e GFAP (Fig. 6B).
Foram realizados então ensaios de imunofluorescência nas células isoladas
de placenta humana utilizando-se o anticorpo para o proteoglicano NG2. As células
25
apresentaram marcação positiva para NG2 (Figs. 7A e 7B). Não houve, no controle
negativo, sinal de marcação inespecífica pelo anticorpo secundário, o que mostra a
especificidade da reação (Fig. 7C). Nos campos observados nas lâminas, todas as
células marcadas com DAPI foram também positivas para NG2.
4.3 – Células isoladas de placenta humana expressam as proteínas NG2 e
desmina:
As células isoladas da placenta foram submetidas a análises moleculares
para investigar a presença de proteínas expressas nessas células. Foi observada
nas células isoladas de placentas humanas a expressão do proteoglicano NG2 e
também do filamento intermediário desmina (Fig. 8).
4.4 – Células isoladas de placenta humana expressam RNAm para ANG-1:
A extração do DNA foi confirmada pela presença do DNA constitutivo 18S.
As células isoladas da placenta apresentaram marcação positiva para Ang-1 (Fig.
9)
4.5 – Células isoladas de placenta humana apresentam marcação positiva para
marcadores de células progenitores e ausência de marcadores de células
hematopoiéticas e endoteliais:
As células analisadas na citometria de fluxo possuiam morfologia
fibroblastóide e encontravam-se em terceira passagem. A população de células
isoladas das microvilosidades placentárias se mostrou heterogênea. Duas
populações puderam ser evidenciadas, uma P1 e P2, sendo que as células da
primeira possuíam um tamanho maior que as da segunda (Fig. 10A). Foram
realizados controles da auto-fluorescência, sendo que neste não foi detectado
sinal dos fluorocromos PerCP-Cy5 (Fig. 10B), PE (Fig. 10C) e APC (Fig. 10D),
evitando assim um resultado falso positivo.
26
Não foram encontradas, em nenhuma das duas populações, células
positivas para CD31 (Fig. 11A), mostrando a ausência de células endoteliais nas
células analisadas. Além disso, também não foram encontradas nas populações,
células positivas para CD45 (Fig. 11B) e também para CD34 (Fig. 11C),
descartando assim a presença de células hematopoiéticas e de células-tronco
hematopoiéticas, respectivamente, nas células analisadas.
Algumas populações de células apresentaram marcações positivas para
CD105 (endoglina), CD44 (marcador de célula-tronco), CD73 (marcador de células
progenitoras mesenquimais) e CD146 (marcador de pericito).
Cada marcador foi analisado individualmente e os resultados foram os
seguintes:
CD 105
Foram encontradas 37,9% de células positivas (Fig. 12A) em ambas as
populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 79% (Fig.
12B), enquanto que na P2 esse número cai para 11,4% (Fig. 12C).
CD 44
Foram encontradas 65,9% (Fig. 13A) de células positivas em ambas as
populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 96,6% (Fig.
13B), enquanto que na P2 esse número cai para 58% (Fig. 13C).
CD 73
Foram encontradas 56,6% de células positivas (Fig. 14A) em ambas as
populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 89.5% (Fig.
14B), enquanto que na P2 esse número cai para 43,9% (Fig. 14C).
27
CD146
Das células analisadas, 17,8% foram positivas para CD146 (Fig 15A).
Quase todas essas células se encontravam na população 1, sendo quase
desprezível a quantidade de células positivas na população 2. Se formos
considerar apenas a população P1, o número de células positivas para CD146
sobe para 29,4% (Fig 15B).
Os dados analisados mostraram que uma maior quantidade de células
CD146
+
CD73
+
CD44
+
CD105
+
estão presentes na P1, porém podemos também
encontrar, em uma quantidade menor, estes tipos celulares na P2. Esses
resultados mostraram que foi possível obter das microvilosidades placentárias,
uma população que expressa vários marcadores de progenitores mesenquimais,
incluindo pericitos.
4.6 – As células isoladas de placenta humana respondem positivamente às
induções osteogênica e adipogênica:
Com base na literatura que mostra que o pericito possui características de
células multipotentes, e é capaz de se diferenciar em outros tipos celulares, foram
realizados dois testes de diferenciação, sendo um deles osteogênico e o outro
adipogênico, para confirmar se as células isoladas também possuíam tais
características.
Em ambos os testes, as células sob indução responderam de forma
esperada. Nas células induzidas com meio osteogênico foi observada uma
deposição de cálcio, marcada pela coloração Nuclear Fast Red (Fig. 16A), sendo
negativa a coloração nas células cultivada apenas com meio suplementado com
soro fetal bovino (Fig. 16B). Essa diferença também pode ser observada
macroscopicamente na placa de cultura (Fig. 16C). Nas células induzidas com
meio adipogênico foi observado um acúmulo de lipídeos em vacúolos, marcado
pela coloração Oil-Red-O (Fig. 17A), sendo negativa a coloração nas células
cultivada apenas com meio suplementado com soro fetal bovino (Fig. 17B).
28
Figura 5. Cultura primária de pericitos humanos isolados de microvilosidades de
placenta observadas por microscopia óptica de contraste de fase. As células
migraram a partir de microvasos digeridos explantados na garrafa de cultura (A
– C). Após lavagem com tampão PBS, o material digerido foi removido (D e E).
Após 30 dias as células alcançaram a confluência (F). Barras: A/D = ~2 m;
B/E/F = ~4 m e C = ~6 m.
29
Figura 6. Controle positivo para NG2. Marcação imunofluorescente mostrando
reconhecimento do antígeno pelo anticorpo policlonal NG2 em células da
linhagem de glioma humano U-373 (A). Estas células também apresentaram
marcação imunofluorescente positiva para GFAP (B), confirmando serem de
uma linhagem de glioma. Barras: A/B = ~8 m.
30
Figura 7. Caracterização do pericito. Marcação imunofluorescente mostrando a
expressão de NG2 pelos pericitos em A e B. O controle, utilizando somente
anticorpo secundário, mostra células não marcadas em C. Os núcleos em azul
foram marcados com DAPI. Barras: A/C = ~8 m; B = ~3 m.
31
Figura 8. Caracterização molecular do pericito por wester-blotting mostrando a
expressão de NG2 (A) e desmina (B) pelas células isoladas de placenta humana.
A
B
270-300 kDa
52 kDa
32
Figura 9. Expressão de ANG-1 nas células isoladas da placenta (HPP). O RNA
total das células expandidas foi isolado, e o cDNA amplificado com primer
específico. O produto do RT-PCR foi analisado por gel de agarose corado por
brometo de etídeo. As células apresentaram marcação positiva (seta). Células de
tecido adiposo (TA) foram utilizado como controle negativo.
TA
HPP
ANG 1
326 pb
300 pb
200 pb
100 pb
400 pb
500 pb
600 pb
33
Figura 10. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Vermelho = células menores; Azul = células maiores (A)
Tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) das células de placenta. As análises foram
realizadas nas populações 1 e 2. (B-D) Controle de autofluorescência. Eixo X =
número de eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
A
B
D
C
34
Figura 11. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Histograma mostrando a ausência de expressão dos
marcadores CD31 (A), CD 45 (B) e CD 34 (C) em ambas as populações. Eixo X =
número de eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
A
B
C
35
Figura 12. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD105 em
ambas as populações (A), apenas na P1 (B) e apenas na P2 (C). A população
positiva está contida entra as duas barras paralelas verticais (P3), mostrando a
porcentagem de células positivas em cada população. Eixo X = número de
eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
37,9
%
A
79
%
B
11,4
%
C
36
Figura 13. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD44 em
ambas as populações (A), apenas na P1 (B) e apenas na P2 (C). A população
positiva está contida entra as duas barras paralelas verticais (P3), mostrando a
porcentagem de células positivas em cada população. Eixo X = número de
eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
65,9%
A
96,6%
B
58%
C
37
Figura 14. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD73 em
ambas as populações (A), apenas na P1 (B) e apenas na P2 (C). A população
positiva está contida entra as duas barras paralelas verticais (P3), mostrando a
porcentagem de células positivas em cada população. Eixo X = número de
eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
89,5
%
56,6
%
A
43,9
%
C
38
Figura 15. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de
placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD146 (A)
sendo a expressão existente apenas em células da população 1 (B). A população
positiva está contida entra as duas barras paralelas verticais (P3), mostrando a
porcentagem de células positivas em cada população. Eixo X = número de
eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.
17,8
%%
A
29,4%
B
39
meio
osteogênico
controle
Figura 16. Diferenciação osteogênica de pericitos. Pericitos foram cultivados em
meio osteogênico (DMEM suplementado com SFB 10%, dexametasona 0.1 μM,
ácido ascórbico 50 μM e β-glicerol-fosfato 10 mM) (A) e na presença de DMEM
suplementado com SFB 10% (B). As células foram cultivadas por 28 dias e o
depósito de cálcio foi corado com Nuclear Fast Red. Visão macroscópica da
placa de cultura em C. Barras: A/B = ~4 m.
40
Figura 17. Diferenciação adipogênica de pericitos. Pericitos foram cultivados
em meio adipogênico (DMEM suplementado com SFB 10%, IBMX 0,5mM,
insulina 10 μM, indometacina 200 μM e dexametasona 1 μM) (A) e na presença
de DMEM suplementado com SFB 10% (B). As células foram cultivadas por 14
dias e o acúmulo de lipídios citoplasmáticos foi corado com Oil-Red-O. Barras:
A/B = ~4 m e inserto = 250X
41
5. DISCUSSÃO
O protocolo utilizado para o isolamento de pericitos das microvilosidades
placentárias é parecido com o realizado por KACÉMI e colaboradores, (1997),
diferenciando-se nos seguintes pontos: A primeira diferença foi a utilização do
ACK, pelo nosso grupo, para lisar as hemácias (não utilizado por eles), fazendo
com que o excesso de sangue seja lavado e descartado no sobrenadante, obtendo
assim uma melhor digestão pela enzima. Segundo, nosso grupo utilizou apenas
colagenase como enzima digestora (eles utilizam um mix de enzimas), diminuindo
assim o custo do isolamento, sem perder a eficiência. Terceiro, para separar as
microvilosidades digeridas, não utilizamos uma série decrescente de membranas
de aço inoxidável de 420 µm, 250 µm, 70 µm (o que eles fizeram), evitando custos
com material e manuseio desnecessário, sem perder também a eficiência.
Os pericitos possuem múltiplas origens, possuindo assim uma ontogenia
muito complexa. Uma origem mesodermal tem sido sugerida para as células
murais que envolvem vasos em desenvolvimento da placa lateral e axial do
mesênquima (HUNGERFORD & LITTLE, 1999). Já as células murais dos vasos
coronários podem derivar de células epicardiais, que são derivadas do
mesoderma esplânquinico (VRANCKEN PEETERS et al., 1999).
Geralmente, os pericitos são descritos possuindo uma origem
mesenquimal, mas transdiferenciação a partir de EC também tem sido sugerida,
apesar de não ser a maior rota de formação dessas células, durante o
desenvolvimento normal. Acredita-se, através de evidências in vivo, que o
endotélio embrionário pode originar células mesenquimais que expressam α-SMA
(DERUITER et al., 1997).
A origem a partir da crista neural tem sido demonstrada para parte dos
pericitos do cérebro. O compartimento dorsal/posterior depende do mesoderma
paraxial cefálico para todos os componentes da parede do vaso sanguíneo,
enquanto o compartimento ventral/anterior deriva seus pericitos e parede músculo-
conjuntiva inteiramente a partir de células da crista neural. A parte mais externa do
cérebro e a retina são irrigadas por capilares combinando origem mesodermal e
42
também a partir da crista neural, sendo que a cooperação entre o mesoderma
cefálico e a crista neural é necessária para construir a árvore vascular da cabeça
(ETCHEVERS et al., 2001).
Evidências sobre a origem de células murais a partir da medula óssea (BM)
têm sido apresentadas recentemente (RAJANTIE et al., 2004; OZERDEM et al.,
2005; LAMAGNA & BERGERS, 2006). Células derivadas da BM, que se
desenvolvem em pericitos, foram identificadas em tumores e tecidos injuriados,
envolvendo a vasculatura em desenvolvimento (LAMAGNA & BERGERS, 2006).
Um dos primeiros estudos que propuseram a existência de progenitores periciticos
(PP) derivados da BM mostrou que células hematopoiéticas CD11b e CD45,
expressando o marcador pericítico NG2, foram detectados em grande proximidade
dos vasos sanguíneos, em um modelo de melanoma subcutâneo B16-F1. Nesse
estudo, foi observado um grande número de células periendoteliais GFP+
derivadas da BM, tanto em vasos induzidos por VEGF quanto os induzidos por
tumores. Essas células estavam freqüentemente em contato muito próximo com
as EC adjacentes (RAJANTIE et al., 2004).
Diferentemente de RAJANTIE e colaboradores (2004), em nossos
experimentos, não encontramos nenhuma população que expressasse CD 45,
sendo toda a população CD45, sabendo-se que população isolada das
microvilosidades são também NG2+. Os dados obtidos por RAJANTIE e
colaboradores (2004) fornecem uma explicação alternativa para os trabalhos que
descrevem a existência de precursores de EC derivadas da BM, embora não seja
possível concluir, incondicionalmente, que essas células não possam existir.
Pericitos estão freqüentemente em contato muito íntimo com as EC adjacentes
onde, ocasionalmente, um espaço extremamente fino (menores até que 1 μm) das
EC separa os pericitos do lúmen vascular (MORIKAWA et al., 2002). Apenas um
escaneamento confocal de cortes pode separar a co-localização dos marcadores
de uma sobreposição de EC e células periendoteliais. Pelo fato de as células
murais estarem em contato tão próximo uma das outras, e também do lúmen
vascular, é impossível separar com confiança, utilizando microscopia óptica
convencional, EC e periendoteliais murais (RAJANTIE et al., 2004).
43
Os resultados de RAJANTIE e colaboradores (2004) aumentam a
possibilidade de que a maioria das supostas EC derivadas da BM, descritas
anteriormente em muitas publicações (ASAHARA et al., 1997; CROSBY et al.,
2000; EDELBERT ET AL., 2002; URBICH et al., 2003) possam na realidade ser
células semelhantes a pericitos e/ou células hematopoiéticas periendoteliais que
foram, por causa da sua extrema proximidade com o lúmen vascular, mal
interpretadas como EC. Esses autores concluem que células adultas derivadas da
BM participam da angiogênese, e que uma pequena subpopulação se diferencia
em células periendoteliais murais vasculares, morfologicamente indistinguíveis de
pericitos (RAJANTIE et al., 2004).
Mais adiante, outro estudo mostrou que os precursores vasculares
derivados da BM contribuem apenas para a formação de pericitos, mas não de EC
vasculares, na neovascularização da córnea. A investigação revelou que uma
fração significante dos pericitos neovasculares da córnea deriva de células
progenitoras hematopoiéticas derivadas da BM, ao invés de vasos pré-existentes,
sugerindo um papel abrangente para a BM e vasculogênese, na
neovascularização da córnea (OZERDEM et al., 2005).
Três observações no estudo realizado por OZERDEM e colaboradores
(2005) são dignas de atenção especial. Primeiro, os pericitos dos novos vasos da
córnea possuem duas origens: BM (vasculogênese) e capilares preexistentes do
limbo (angiogênese), sendo que mais pericitos se originam a partir da BM do que
dos capilares preexistentes. Os resultados obtidos por esses autores sugerem
que, apesar da maioria dos pericitos derivados da BM, na neovascularização
corneal, derivarem de células precursoras hematopoiéticas, uma pequena fração
(4% - 8%) dessas células deriva de células não hematopoiéticas da BM. Essas
células progenitoras não-hematopoiéticas podem representar células estromais ou
células-tronco mesenquimais. Esses achados estabelecem a BM, com seus
elementos hematopoiéticos e não-hematopoiéticos, como um importante órgão
manipulador nas desordens da córnea associado com neovascularização.
Segundo, as diversas origens dos pericitos e sua proximidade espacial entre eles
nos brotos neovasculares aumentam as possibilidades de um mecanismo de
44
neovascularização composto tanto por angiogênese quanto por vasculogênese.
Por definição, angiogênese e vasculogênese referem-se à formação de vasos
sanguíneos a partir de outros vasos preexistentes e células-tronco,
respectivamente (OZERDEM et al., 2005). Isso sugere a possibilidade de uma
sinergia ou uma sobreposição dos dois mecanismos, operando simultaneamente
nos mesmos brotos neovasculares, ao invés de uma progressão independente da
angiogênese a partir da vasculogênese. Estudos adicionais são necessários para
esclarecer os mecanismos de migração dos PP circulantes derivados BM através
do endotélio preexistente e a camada de pericitos (barreira) nos brotos
neovasculares. Esses processos de migração podem envolver extensivos
processos de adesão e extravasamento (emigração) pericito-endotélio e pericito-
pericito, junto com o enfraquecimento dos complexos juncionais entre esses dois
tipos celulares (OZERDEM et al., 2005).
Os resultados obtidos por OZERDEM e colaboradores (2005), junto com
trabalhos anteriores (RAJANTIE et al., 2004; OZERDEM et al., 2002; OZERDEM
et al., 2001; OZERDEM & STALLCUP, 2003), também corroboram os achados de
outros autores, revelando a participação de pericitos nascentes durante os
estágios iniciais da neovascularização (GERHARDT & BETSHOLTZ, 2003;
REDMER et al., 2001).
A habilidade em detectar a contribuição precoce dos pericitos no
desenvolvimento microvascular depende bastante do uso do proteoglicano NG2 e
do PDGFR-β como marcadores dessas células em um estágio inicial de
desenvolvimento (GERHARDT & BETSHOLTZ, 2003; MCDONALD & CHOYKE,
2003). O proteoglicano NG2 nos pericitos possui um papel funcional na
angiogênese e sua inibição extrínseca (farmacológica) ou intrínseca (genética)
está associada a uma diminuição significante na angiogênese e queda na razão
de investimento na neovascularização (OZERDEM & STALLCUP, 2004;
OZERDEM, 2004). Esse proteoglicano transmembranar de sulfato de condroitina,
associado aos pericitos nascentes ativos mitoticamente, exibe diversas
propriedades que sugerem um papel funcional na neovascularização (OZERDEM
et al., 2002; OZERDEM & STALLCUP, 2004). NG2 parece servir como co-receptor
45
para ambos bFGF e PDGF (GORETZKI et al., 1999; GRAKO & STALLCUP,
1995), podendo também ligar-se a componentes da ECM tais como colágenos tipo
V, VI e II, tenascina e laminina (TILLET et al., 1997; BURG et al., 1996). Terceiro,
as investigações de OZERDEM e colaboradores (2005) também identificaram um
investimento descontínuo da parede capilar linfangiogênico por células
periendoteliais derivadas da BM, em linfangiogênese induzido por bFGF. Esses
pericitos podem abastecer as paredes vasculares com um suporte físico
temporário até que o endotélio linfático possa estabelecer uma conexão direta
com a ECM. As mesmas células podem também representar um estágio
transicional de precursores derivados da BM, antes que eles se transdiferenciem
em endotélio linfático.
Esses estudos fornecem evidências de que pericitos derivados da BM
contribuem para as fases iniciais da formação dos brotos neovasculares, durante
neovascularização patológica e linfangiogênese. Possuindo um importante papel
na neovascularização, os precursores derivados da BM representam um alvo
adicional nos tratamentos projetados para regular negativamente a
neovascularização na córnea (OZERDEM et al., 2005).
A existência de PP derivados da BM foi comprovada também pela
identificação de PP PDGFR-β+ em um modelo endógeno de tumorigênese
pancreática em camundongos (SONG et al., 2005). É importante notar que nesses
tumores apenas as células perivasculares expressam PDGFR-β, enquanto as EC
secretam o ligante PDGF-B, lembrando que a mesma situação é encontrada na
formação dos vasos embrionários (LAMAGNA & BERGERS, 2006). Nesses
tumores, PP foram capazes de se diferenciar em pericitos maduros, expressando
os marcadores NG2, α-SMA, e desmina, assim como regular a estabilidade e a
sobrevivência vascular nos tumores (RAJANTIE et al., 2004). É interessante que,
enquanto PP PDGFR-β+ induziram NG2 e α-SMA quando cultivadas sozinhas, co-
culturas de PP PDGFR-β+ com EC foram essenciais para promover o
desenvolvimento de pericitos desmina+. Isso sugere a necessidade de vias de
sinalização parácrina entre as EC e pericitos para permitir a indução de desmina.
É intrigante que, num subconjunto de PP PDGFR-β+, foram encontradas células
46
sendo recrutadas da BM para sítios perivasculares dentro dos tumores. Essas
células derivadas da BM expressaram marcadores hematopoiéticos tal como
antígeno-1 de células-tronco (Sca-1) e CD11b, embora ainda seja confuso afirmar
se PP são de origem hematopoiética ou mesenquimal (LAMAGNA & BERGERS,
2006).
Existem muitas indicações de que o recrutamento de PP não está apenas
limitado aos tumores. PP derivados da BM também foram encontrados infiltrando
no cérebro após a oclusão da artéria cerebral média, em um modelo experimental
de derrame em camundongos. PP foram observados ao redor de vasos
sanguíneos em desenvolvimento nas áreas isquêmicas, e se desenvolveram em
pericitos desmina+, na qual expressam TGF-β e VEGF (KOKOVAY et al., 2006).
Além disso, células derivadas da BM foram encontradas em vasos angiogênicos
da córnea após neovascularização induzida por bFGF e se diferenciaram em
células periendoteliais NG2+/ PDGFR-β+ (OZERDEM et al., 2005).
É importante notar que existem diversos trabalhos descrevendo a presença
de células derivadas da BM que exibem localização perivascular em tumores, mas
que não são pericitos. Dentre elas, células hematopoiéticas e monomielocíticas
provavelmente representam a maior população de células derivadas da BM
(KOPP et al., 2006). DE PALMA e colaboradores (2003) descreveram uma
população Sca-1+/CD45+/CD11b+ de células mielóides que se infiltram em
tumores que expressam o receptor de angiopoetina Tie2 [monócitos expressando
Tie2 (TEMs)], o que promove angiogênese tumoral. Quando co-injetadas com
células tumorais de mama, TEMs aumentam o número de leucócitos CD45+
infiltrantes e pericitos NG2+. Entretanto, mesmo quando TEMs exibem uma
localização perivascular similar à dos pericitos, elas não expressam os
marcadores de pericitos NG2 e α-SMA.
Semelhantemente, GRUNEWALD e colaboradores (2006) descreveram o
recrutamento de células CXCR4+ derivadas da BM, localizadas em grande
proximidade dos vasos sanguíneos, porém essas células parecem não contribuir
para a população de pericitos.
47
Desde BIANCO & COSSU (1999), considerava-se a possibilidade de se
estar emergindo, de um nicho perivascular e de uma identidade pericítica, células
precursores estromais no tecido hematopoiético. Esses autores diziam que a
pesquisa de precursores mesodérmicos multipotentes em outros tecidos deveriam
começar por estas células.
BADOO e colaboradores (2003) usaram uma combinação de aderência ao
plástico e culturas in vitro (essencialmente a metodologia originalmente descrita
por FRIEDENSTEIN e colaboradores) para estabelecer pela primeira vez culturas
de células estromais e subsequentemente removeu células hematopoiéticas
contaminantes, pela seleção negativa usando anticorpos para CD45, CD34 e
CD11b. As células estromais resultantes desta metodologia exibiram um potencial
de diferenciação adipogênico, osteogênico e condrogênico in vitro e expressavam
os marcadores CD29, CD44 e CD106, mas não marcadores hematopoiéticos ou
de células endotelais vasculares.
As células isoladas da placenta não precisaram de uma seleção negativa
para que todas as células em terceira passagem fossem negativas para CD34 e
CD45. Como observado por BADOO e colaboradores (2003), também obtivemos
células CD44+ e ausência de células endoteliais (CD31-) e hematopoiéticas
(CD45- e CD34-), além das células da placentas também exibiram um potencial de
diferenciação osteogênico e adipogênico.
Em um trabalho em que MUSINA e colaboradores (2005) comparam
células-tronco mesenquimais de diversos tecidos humanos (pele, tecido adiposo,
timo e inclusive placenta), a caracterização das células foi similar a nossa. No
trabalho de MUSINA e colaboradores (2005), todas as células foram
caracterizadas utilizando marcadores para CD44, CD90, CD105, CD13, CD10,
CD31, CD34 e CD45 e utilizadas células até décima passagem. A expressão dos
marcadores de MSC (CD44, CD90, CD105 e CD13) foi similar em todas as células
estudadas. A expressão dos genes foi elevada e não mudou ao longo das
passagens. A expressão de CD31, CD45 e CD34 foram negativas para todas as
populações com exceção do CD34 para as células do timo. Esses resultados são
muito semelhantes aos encontrados por nosso grupo nas células isoladas das
48
microvilosidades da placenta. As células isoladas da placenta, no trabalho de
MUSINA e colaboradores (2005), cresceram devagar e atingiram 80% da
confluência depois de 3-4 semanas o que acontece também nas células isoladas
pelo nosso grupo, podendo sugerir que sejam a mesma linhagem utilizada,
lembrando somente que em nenhum momento do trabalho, os autores sugerem
que as células isoladas por eles sejam pericitos.
Em outro trabalho, XU e colaboradores (2004) mostraram que os perfis de
antígeno de superfície de MSC humanos obtidos pela citometria de fluxo foram
positivos para CD13, CD19, CD44, CD71, e negativas para CD3, CD14, CD15,
CD33, CD34, CD38, CD45, e HLA-DR. Essas células originárias da BM humana
adulta podem se diferenciar em cardiomiócitos in vitro. Esses mesmos autores
publicaram que nas células utilizadas por eles, da passagem 2 a 6 o cariótipo foi
normal, os ciclos celulares foram similares, sendo que estes dados indicam que
MSC adultas têm habilidade de auto-renovação e estabilidade genética in vitro
(XU et al., 2004).
SARUGASER e colaboradores (2005) isolaram uma população perivascular
de cordão umbilical que também apresentaram os mesmo marcadores CD34-,
CD45-, CD44+, CD105+, CD73+. As células isoladas por SARUGASER et al.,
eram muito semelhantes com as células que isolamos das microvilosidades
placentárias, e também exibiam uma morfologia fibroblastóide e corpo estrelado,
estendendo longos processos citoplasmáticos em torno de 100 a 300 µm. Os
comprimentos dos processos citoplasmátivos não foram medidos no nosso
trabalho. Essas células marcavam positivamente para α-SMA, desmina, vimentina
(não testada nas células de placenta) e o anticorpo monoclonal 3G5, um marcador
de pericito, resultados iguais aos nossos. A não marcação para CD45 mostra que
foi eliminada qualquer contaminação por precursores hematopoiéticos do sangue
de cordão umbilical, além de serem testadas as populações resultantes por uma
série de marcadores que são característicos de fenótipos embrionário e
mesenquimal. Além disso, devido a marcação por α-SMA, desmina e a reatividade
positiva para o marcador 3G5, os autores sugerem que as células perivasculares
49
do cordão umbilical parecem ser similares a outro precursor perivascular
mesenquimal, como o pericito.
KAISER et al., 2007 publicou que células mesenquimais estromais isoladas
da BM humana adulta, expressam as moléculas de superfície CD44, CD90, SH2
(CD105) e SH3 (CD73) e são negativas para CD34 e o marcador hematopoiético
CD45. Essas células podem se diferenciar em adipócitos e osteócitos, sendo que
as células derivadas de placenta isoladas por nosso grupo também se comportam
da mesma maneira.
Para acabar com a confusão, o Comitê das Células-tronco Teciduais e
Mesenquimais da Sociedade Internacional de Terapia Celular propuseram critérios
mínimos para definir uma célula-tronco mesenquimal humana (DOMINICI et al.,
2006). Primeiro, MSC devem ser aderentes ao plástico quando mantidas em
condições padrão de cultura. Segundo, MSC devem expressar CD105 (SH2),
CD73 (SH3) e CD 90 (Thy-1), e ausência de expressão de CD45, CD34, CD14,
CD11b, CD79alpha e moléculas de superfície de HLA-DR. Terceiro, elas devem
se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro. Os autores
acreditam que esse padrão mínimo criará uma caracterização mais uniforme das
MSC e facilitará a troca de dados entre os pesquisadores (DOMINICI et al., 2006).
As células isoladas das microvilosidades placentárias exibem vários
marcadores listados nos critérios mínimos para MSC descritos por DOMINICI e
colaboradores (2006) como por exemplo o CD105 e CD73, além de possuírem
uma ausência de expressão de CD45 e CD34
Resumindo, existem evidências emergentes que células derivadas da BM
possuem um papel crucial na formação dos vasos sanguíneos no adulto por
incorporação na vasculatura em desenvolvimento, localizando-se adjacentes a ela,
ou envolvendo a vasculatura, para servirem como células de sustentação
perivasculares (LAMAGNA & BERGERS, 2006).
Mais recentemente, SACHETTI e colaboradores (2007) mostraram que
células estromais subendoteliais da BM humana que expressavam CD146 são
capazes de transferir sobre transplantação sítios do microambiente
hematopoiético para sítios heterotópicos, coincidente com o estabelecimento de
50
células subendoteliais idênticas, dentro de um órgão ósseo em miniatura.
Estabelecimento de células subendoteliais estromais no desenvolvimento de BM
heterotópica in vivo ocorre via interações específicas e dinâmicas com os
sinusóides em desenvolvimento (SACHETTI et al., 2007). As células estromais
subendoteliais que residem na parede sinusoidal são as principais produtoras de
angiopoetina-1 (uma molécula fundamental do nicho da célula-tronco
hematopoiética envolvida no remodelamento vascular). Os dados desses autores
revelaram as relações funcionais entre o estabelecimento do microambiente
hematopoiético in vivo, o estabelecimento de progenitores esqueléticos nos
sinusóides da medula óssea, e angiogênese.
O interessante é que as células isoladas das placentas humanas também
expressam o marcador CD 146 e são positivas para Ang-1, nos levando a
suspeitar de que se trata do mesmo tipo celular, em lugares diferentes do corpo,
mas que tem funções semelhantes nos diversos órgãos.
Muitas vezes é assumido que a expressão de certa gama de marcadores
definem vários tipos de culturas de célula como MSCs, mas na verdade, a maior
parte desses marcadores são expressos por culturas de células fibroblásticas de
qualquer tecido. Além do mais, a maioria, se não todos os marcadores são
altamente modulados na cultura, que sublinha a futilidade de esforços para
caracterizar culturas de células estromais por si. Em contraste, a indagação
original sobre marcadores putativos não hematopoiéticos de célula-tronco da BM
concentrou-se naqueles que poderiam identificar as CFU-F entre as células da
BM. Junto com o clássico epítopo STRO-1, um número de outros marcadores
pode ajudar no enriquecimento de CFU-Fs, como por exemplo, MCAM (CD 146) e
CD105 (BIANCO et al., 2008). Os marcadores CD146 e CD105 citados por Bianco
e colaboradores (2008), foram encontrados por nosso grupo nas células isoladas
de placentas humanas.
Na BM humana, MCAM marcam células reticulares adventícias
(SACCHETTI et al., 2007), um tipo celular estromal classicamente conhecido,
residindo numa posição subendotelial por cima da superfície abluminal dos
sinusóides da BM (WESTEN E BAINTON, 1979). Em outros tecidos, MCAM é
51
expresso por pericitos (LI et al., 2003), um tipo celular reconhecido pela sua
anatomia e posição e não por algum fenótipo precisamente definido. Como células
reticulares adventícias, pericitos residem na superfície abluminal de células
endoteliais na microvasculatura de cada tecido conjuntivo. Considerando esta
ampla distribuição, e que pericitos podem representar a contraparte in situ das
CFU-Fs da BM, pode-se concluir que pericitos são as MSCs encontrado em
diferentes tecidos. A utilização de MCAM (CD 146) para identificar a população de
pericito ajudará na determinação de que CFU-Fs de tecidos não hematopoiéticos
são de fato pericitos. Nesse caso, é possível testar a hipótese de que MSCs
existem em todos os tecidos conjuntivos, e determinar se a sua capacidade para
funcionar em ensaios clonogênicos e in vivo é consistente, apesar do seu tecido
de origem. Neste sentido, pericitos isolados de músculo esquelético é
espontaneamente miogênico in vitro (DELLAVALLE et al., 2007) e não
osteogênico in vivo, em contraste com as CFU-Fs de BM e com células
subendoteliais da BM, apesar da sua coincidente localização anatômica. Assim,
evidências atuais quanto aos pericitos em diferentes tecidos parecem refletir um
sistema de progenitores órgão-específico com potencial órgão-específico.
Todavia, estudos da biologia dos pericitos podem fornecer pistas quanto à origem
do desenvolvimento de células progenitoras/tronco pós-natais em tecidos não
hematopoiéticos (BIANCO et al., 2008).
Devido a sua multipotencialidade, a utilização dos pericitos em terapias
celulares tem ganhado força ultimamente. Estudos recém publicados em distrofia
muscular discutem que, em protocolos clínicos futuros, a distribuição sistêmica
parece ser uma escolha obrigatória, já que uma distribuição intramuscular pode
requerer um excessivo número de injeções (DELLAVALLE et al., 2007). Células
humanas derivadas de pericitos expressam algumas das proteínas que os
leucócitos utilizam para aderir e atravessar o endotélio (integrinas β2 e α4), e,
dessa forma, podem difundir-se para o interior do interstício do músculo
esquelético quando injetados via intra-venosa (DELLAVALLE et al., 2007).
Nosso estudo mostrou que pericitos derivados de placenta podem ser
isolados e expandidos in vitro, sendo comprovado o potencial de diferenciação
52
dessas células, provando que a placenta pode ser uma rica e atrativa fonte de
pericitos. Os dados referentes ao potencial de diferenciação são promissores,
sendo que importantes utilizações terapêuticas, aproveitando-se os pericitos,
podem vir a existir no futuro.
A utilização dessa fonte extremamente acessível de células multipotentes
em futuros experimentos e aplicações clínicas é um grande desafio e precisa ser
mais bem investigado.
53
6. CONCLUSÕES
- A metodologia utilizada é eficiente para o isolamento de células a partir de
microvilosidades de placenta humana.
- O cultivo e a expansão das células isoladas in vitro são viáveis porque pode-se
isolar as células de um órgão de fácil acesso e tem uma boa expansão em garrafas
de cultura.
- Parte das células isoladas foram caracterizadas como pericitos através de
marcadores apropriados, como NG2, CD146 e desmina, além da ausência de
expressão dos marcadores CD45, CD34 e CD31
- Os pericitos responderam com sucesso aos testes de diferenciação adipogênica e
osteogênica, confirmando o potencial de diferenciação para essas linhagems.
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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