( PDF ) Filogeografia de Ctenomys minutus (Rodentia: Ctenomyidae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL – UFRGS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

E BIOLOGIA MOLECULAR

Filogeografia de Ctenomys minutus

(Rodentia: Ctenomyidae)

Carla Martins Lopes

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Genética e Biologia

Molecular da UFRGS como requisito parcial

para a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Orientador: Thales Renato Ochotorena de Freitas

_________________________________________________________________________

Porto Alegre - Outubro de 2007

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INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS:

Este trabalho foi desenvolvido no Departamento de Genética, Laboratório de Citogenética

e Evolução Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), contando

com o auxílio financeiro de:

• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

• Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS)

• Programa Especial de Taxonomia (PROTAX/CNPq)

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AGRADECIMENTOS

As palavras não são suficientes para agradecer todos aqueles que ajudaram a

concluir essa dissertação. Caso eu tivesse de dividí-la com cada um que colaborou durante

todo meu processo de formação, acredito que a menor parte seria minha...

Ao meu orientador Thales de Freitas, pela liberdade que nos concede na forma de

orientar, permitindo assim com que seus orientados tornem-se profissionais mais

independentes, pelo relacionamento sempre muito humano e convivência amigável.

À Lúcia, Deisi, Luciano, Elmo e Ellen pelas ajudas com questões burocráticas ou

não, sempre muito tranqüilos para atender meus momentos de histeria.

À Adriana Gava, Camila Castilho, Lígia Tchaicka e Cristina Freygang pelas coletas

e cariótipos dos espécimes utilizados neste estudo.

Aos amigos que ajudaram no meu início em Porto Alegre, tornando as saudades de

casa e das pessoas queridas menos difíceis de conviver e que sempre vão morar no meu

coração: Jéferson, Tábita, Nice, Vander e Lacinha.

Aos amigos extra laboratoriais, pelas conversas, convívio muitíssimo agradável e

pelas festas animadas: Miltinho, Renata, Binha, Carla morena, Cristine, Guga e Marcinha.

Aos amigos do laboratório: Tati N., Tati T., Gislene, Rodrigo, Fabiano, Pedro,

Loira, Simone, Gabriêla, José, Lívia, Camila, Chico, Nice e Claiton, que formam um time

maravilhoso, fazendo jus ao ditado de que a união faz a força, posso dizer com muita

segurança que amo como irmã cada um de vocês.

Ás amigas Gislene Lopes e Gabriela de Paula Fernández-Stolz, que em todo o

processo do mestrado, desde a bancada até a análise dos dados, me auxiliaram com

inestimável disposição e paciência, muito obrigada.

À minha irmãzinha e segunda mãe Claudia e meus sobrinhos Vinícius e Juninho,

pessoas muito importantes da minha pequena família, mas que preenchem todos os

espaços, mesmo distantes eternamente em meu coração.

Ao homem mais importante da minha vida e futuro progenitor da minha F1, Arthur

de Freitas Brandão, com quem espero ter o prazer de continuar sendo feliz por muito

tempo. Obrigada pelo apoio para alcançar meus objetivos, mesmo que isso custasse nossa

distância, muito compreensivo e companheiro, sempre com um sorriso no rosto, uma

conversa muito agradável e disposição para me ouvir falar de genética e tuco-tucos.

À mulher mais importante da minha vida, minha amada mãe, Elza Martins, por

todo seu investimento na minha educação, por acreditar na minha capacidade e por me

permitir correr atrás de um sonho. Pelo exemplo de coragem, perseverança e força que não

me deixam desistir nunca. Minha eterna gratidão.

SUMÁRIO

1. RESUMO.......................................................................................................................... 6

2. ABSTRACT...................................................................................................................... 7

3. INTRODUÇÃO................................................................................................................ 9

3.1. Roedores.................................................................................................................. 9

3.2. Gênero Ctenomys .................................................................................................... 9

3.3. Ctenomys minutus.................................................................................................. 12

3.3.1. Variações cariotípicas.................................................................................. 13

3.3.2. Zonas híbridas intra e interespecíficas......................................................... 15

3.4. Planície Costeira do Rio Grande do Sul e Santa Catarina: área de ocorrência de

Ctenomys minutus.................................................................................................. 17

3.4.1. Características gerais ................................................................................... 17

3.4.2. Fatores físicos na morfogênese local........................................................... 17

3.4.3. Evolução paleogeográfica da Planície Costeira........................................... 18

3.4.4. Ctenomys minutus e a Planície Costeira ...................................................... 21

3.5. Contexto genético.................................................................................................. 21

3.5.1. Marcadores moleculares em estudos populacionais .................................... 21

3.5.1.1. DNA mitocondrial ......................................................................... 21

3.5.1.2. Loci de microssatélites................................................................... 23

3.5.2. Filogeografia................................................................................................ 24

4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 26

5. CAPÍTULO I .................................................................................................................. 27

6. CAPÍTULO II................................................................................................................. 51

7. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 70

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 73

1. RESUMO

Ctenomys minutus é um roedor subterrâneo que ocorre em uma estreita faixa da

Planície Costeira dos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina, apresentando onze

diferentes números cariotípicos (2n = 42, 46a, 46b, 47a, 47b, 48a, 48b, 49a, 49b, 50a e

50b). Os esforços deste trabalho se concentraram em caracterizar a variabilidade genética e

o fluxo gênico entre diferentes populações de C. minutus em associação com a distribuição

geográfica e os polimorfismos cromossômicos das populações. A estrutura genética

geográfica de C. minutus foi avaliada através de 407pb da região controladora do DNA

mitocondrial (mtDNA), em toda a distribuição geográfica da espécie, e através de cinco

loci de microssatélites para espécimes distribuídos desde as proximidades das cidades de

Mostardas até Jaguaruna. Foram encontrados 34 haplótipos pela análise de 187 indivíduos

através do mtDNA e 65 alelos em 202 espécimes para os dados de microssatélites. Grande

parte dos haplótipos encontrados está retrita a uma única população, sendo que os

compartilhados ocorrem entre populações vizinhas pertencentes a zonas híbridas intra-

específicas. As análises de diferenciação genética foram consistentes com o modelo

simples de isolamento pela distância (r = 46.98%, P = 0.00; r = 34.86%, P = 0.039),

através dos dados de mtDNA e loci de microssatélites, respectivamente. Um possível

padrão de expansão populacional recente foi rejeitado através dos testes de neutralidade de

de Fu e D de Tajima (Fs = - 1.676, P = 0.36; D = 0.696; P = 0.81) e o gráfico de

distribuição de mismatch. Os resultados indicaram que, em geral, as populações

encontram-se fortemente estruturadas, apresentando baixos níveis ou ausência de fluxo

gênico (valor global para mtDNA: F

= 0.8561). Para os dados de microssatélites a maior

parte das comparações de fluxo gênico pareadas entre as populações foram

significativamente divergentes, com 56.36% e 72.72% dos valores de F

e R

maiores do

que 0.15, respectivamente. Os espécimes estudados, provavelmente, não são pertencentes a

uma população panmítica, e as potenciais barreiras geográficas, como rios, encontrados ao

longo da Planície Costeira dos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina parecem

não ter agido, até o momento, como barreiras efetivas ao fluxo gênico entre diferentes

populações de C. minutus de acordo com os dados de mtDNA. Os diferentes cariótipos

compartilhados por esta espécie também parecem não representar barreiras efetivas ao

fluxo gênico, com exceção do sistema “b” (2n = 46b, 47b, 48b, 49b and 50b) que forma

um agrupamento separado, com seus portadores não hibridizando com os de outros

cariótipos. Os resultados obtidos para C. minutus neste estudo confirmam alguns

pressupostos para roedores subterrâneos, como pequenas populações fragmentadas

associadas com baixos níveis de dispersão dos indivíduos com hábitos tipicamente

solitários.

2. ABSTRACT

The subterranean rodent Ctenomys minutus occurs in a narrow stretch of the

Brazilian coastal plain in the states of Rio Grande do Sul and Santa Catarina, showing

eleven different karyotypes (2n = 42, 46a, 46b, 47a, 47b, 48a, 48b, 49a, 49b, 50a and 50b).

In this work the effort was focalized on the genetic variability characterization and gene

flow of different C. minutus populations in association with the geographical distribution

and chromosomal polymorphisms of the populations. The geographical genetic structure of

C. minutus was accessed using 407 pb of the mitochondrial DNA (mtDNA) control region,

for all range distribution of this species, and five microsatellite loci from specimens

distributed from the areas of the town from Mostardas to Jaguaruna. 34 haplotypes were

found in the analysis of 187 individuals for mtDNA, and 65 alleles for the 202 specimens

for the microsatellite data. Most of the haplotypes were exclusive and the shared ones were

observed among populations in the same intra-specific hybrid zone. The analysis of genetic

differentiation were consistent with a simple model of isolation by distance (r = 46.98%, P

= 0.00; r = 34.86%, P = 0.039) accordingly to mtDNA and microssatelite data,

respectively. A pattern of recent population expansion was rejected according to the Fu’s

and Tajima’s D neutrality tests (Fs = - 1.676, P = 0.36; D = 0.696; P = 0.81) and the

mismatch distribution analysis. Results indicated that the most of the populations are

strongly structured, having low levels or absence of gene flow (global mtDNA F

0.8561). For the microsatellite data most of the pairwise population gene flow comparisons

were significantly divergent, with 56.36% and 72.72% of the F

and R

values being

longer than 0.15, respectively. The specimens studied probably do not belong to a

panmictic population, and the potential geographical barriers, like rivers, along the coastal

plain of Rio Grande do Sul and Santa Catarina do not seem to be effective barriers to gene

flow among populations of C. minutus, until this moment, according to the mtDNA.

Likewise, the different karyotypes observed for this species do not represent effective

barriers to reproduction, with the exception of the “b” system (2n = 46b, 47b, 48b, 49b and

50b), which forms a separate cluster and whose carriers do not hybridize with those of the

other karyotypes. These results confirm some predictions for subterranean rodents such as

small and fragmented populations associated with low levels of adult dispersal, with

typically solitary habits.

3. INTRODUÇÃO

3.1. Roedores

Considerado o grupo mais diverso entre os mamíferos, a ordem Rodentia possui

aproximadamente 2000 espécies distribuídas em 29 famílias e 468 gêneros (Nowak, 1999).

Ocorrem em praticamente todos os continentes, ocupando uma grande variedade de

habitats. Podem ter hábitos arborícolas, terrestres, adaptações à vida semi-aquática e

algumas espécies são especializadas à vida subterrânea (Nowak, 1999).

Os vertebrados que permanecem maior parte de sua existência no interior de túneis

fechados sob o solo são considerados fossoriais ou subterrâneos (Lacey et al., 2000). A

ordem Rodentia possui um grande número de espécies escavadoras subterrâneas,

distribuídas em todos os continentes com exceção da Austrália e Antártica (Nevo, 1979;

Lacey et al., 2000). As famílias que apresentam espécies fossoriais são: Bathyergidae

(África); Geomyidae (América do Norte); Muridae (Ásia, leste europeu e África)

Octodontidae e Ctenomyidae (América do Sul) (Nowak, 1999; Lacey et al., 2000).

3.2. Gênero Ctenomys

O gênero Ctenomys Blainville, 1826 (família Ctenomyidae, subordem

Hystricognathi; Woods, 1982), surgiu provavelmente na província de Buenos Aires –

Argentina, onde foram encontrados registros fósseis de Ctenomys em formações do

Terciário (Formação Chapadmalalal, Plioceno Superior), implicando uma antigüidade para

o gênero maior do que 3 milhões de anos (Contreras et al., 1987; Reig et al., 1990; Lessa e

Cook, 1998; Verzi et al., 1999; Verzi, 2002). A partir de então o gênero passou por uma

cladogênese expressiva, e sua especiação é considerada como sendo uma das mais

explosivas dentre os gêneros de mamíferos (Reig et al., 1990; Cook e Lessa, 1998; Lessa e

Cook, 1998).

A alta velocidade de diversificação no clado tem sido sugerida através de estudos

filogenéticos, pela persistência de politomias em filogenias obtidas tanto a partir de

seqüências de citocromo-b do DNA mitocondrial (Cook e Lessa, 1998; Lessa e Cook,

1998, Mascheretti et al, 2000; Slamovits et al., 2001) como a partir de dados provenientes

do DNA nuclear (fragmentos dos genes da rodopsina e vimentina; Castillo et al., 2005).

O gênero é constituído por aproximadamente 56 espécies vivas, amplamente

distribuídas desde elevadas altitudes do Altiplano Andino no sul do Peru e Bolívia até o

nível do mar no Chile e através da Argentina até o leste da região sul do Brasil (Reig et al.,

1990; Lacey et al., 2000).

Popularmente conhecidos como tuco-tucos, os ctenomídeos ocupam habitats

bastante diversos, desde campos mais secos até áreas de florestas, ocorrendo

preferencialmente em regiões abertas de solo pouco compacto (Lacey et al., 2000).

Possuem hábitos fossoriais, ocupando tocas individuais que se localizam próximas

umas das outras formando o que se conhece por tuqueira (Reig et al., 1990; Nowak, 1999;

Lacey et al., 2000). Os espécimes permanecem grande parte de sua existência no interior

dos túneis, escavados sob o solo, dentro dos quais realizam grande parte de suas atividades

biológicas (Reig et al., 1990). A estrutura do túnel consiste de uma galeria principal e

várias ramificações partindo desta, terminando em aberturas ou em um fundo cego. Ao

longo das galerias são encontradas câmaras especializadas para o depósito de comida ou

defecação (Nevo, 1979; Gallardo e Anrique, 1991; Altuna et al., 1999; Busch et al., 2000).

As tocas são mantidas sempre fechadas, a fim de evitar predação e também manter

condições mais estáveis que as do meio externo, com menores flutuações de temperatura,

alto grau de umidade relativa, concentrações de O

entre 15 e 21% e de CO

entre 0,5 e 2%

(McNab, 1966).

As espécies deste gênero apresentam adaptações morfológicas relacionadas ao

hábito fossorial, como corpo e cabeça robustos, maior desenvolvimento da musculatura

(principalmente dos membros anteriores), redução da cauda, pavilhões auditivos e olhos,

abertura bucal atrás dos incisivos e patas munidas de grandes garras que juntamente com

os incisivos auxiliam na escavação das tocas. Alimentam-se basicamente de raízes e folhas

de gramíneas (Reig et al., 1990; Nowak, 1999; Lacey et al., 2000).

São tipicamente solitários e territorialistas, o que determina, em geral, uma baixa

densidade populacional (Pearson, 1959; Pearson et al., 1968; Nevo, 1979; Reig et al.,

1990; Lacey et al., 1998; Bush et al., 2000). No entanto, foram descritas algumas espécies

sociais, como C. sociabilis, com machos e fêmeas compartilhando os mesmos túneis

(Pearson e Christie, 1985) e espécies semi-sociais como C. peruanus e C.porteousi, com

apenas fêmeas compartilhando as tocas, sendo os machos solitários (Pearson, 1959;

Contreras e Maceira, 1970).

Sua estrutura populacional é baseada em pequenas populações semi-isoladas de

distribuição fragmentada e baixa vagilidade dos adultos (Pearson, 1959; Busch et al., 1989;

Reig et al., 1990; Nowak, 1999; Busch et al., 2000; Lacey, 2000).

Entre os ctenomídeos a distribuição fragmentada é bastante evidente, determinada

por condições ecológicas e barreiras geográficas (Nevo, 1979; Reig et al., 1990; Cook et

al., 1990; Steinberg e Patton, 2000). A maioria das espécies apresenta distribuição em

parapatria e alopatria (Pearson, 1984; Reig et al., 1990), embora existam casos de

simpatria (Contreras e Reig, 1965; Malizia et al., 1991; Comparatore et al., 1995).

A baixa vagilidade dos indivíduos parece reforçar o isolamento entre os demes, o

que restringe o fluxo gênico entre os grupos (Pearson et al., 1968; Nevo, 1979; Reig et al.,

1990; Malizia et al.,1995; Freitas, 1995). Segundo Slatkin (1994) o fluxo gênico entre

grupos de indivíduos é um forte determinante de sua estrutura, pois estabelece em que grau

esta população é uma unidade evolutiva independente. No entanto, dados obtidos sobre

taxas de dispersão para espécies de Ctenomys são escassos e o uso de métodos diretos para

determinar tais taxas é bastante limitado pela dificuldade de acesso ao ambiente

subterrâneo (Smith, 1993; Busch et al., 2000; Lacey, 2000).

O uso do método de marcação e recaptura mostrou um maior índice de recaptura de

fêmeas e área de vida maior para machos, indicando que os machos dispersam mais

(Fernández, 2002). Malizia et al. (1995) sugerem que a procura sexual seja o primeiro

determinante na migração dos machos e que outros fatores, como a disponibilidade da

área, influenciem a dispersão das fêmeas. Busch et al. (2000) salientam que baixas taxas de

dispersão descritas podem ser resultantes da dificuldade de documentação para o

movimento dos animais entre populações naturais.

Características como populações reduzidas e semi-isoladas, baixa vagilidade dos

adultos, territorialismo e hábitos solitários associados à ação da deriva genética parecem

favorecer a fixação de rearranjos cromossômicos intra e interespecíficos (Lessa e Cook,

1998).

As espécies deste gênero apresentam grande diversidade cariotípica, com números

cromossômicos que variam entre 2n = 10 em C. steinbachi a 2n = 70 em C. pearsoni (Reig

et al., 1990), sendo que estes rearranjos cromossômicos podem ser uma das possíveis

explicações para tanta diversificação encontrada em Ctenomys (Lessa e Cook, 1998).

Tamanha diversidade desperta o interesse de evolucionistas para a escolha de tuco-

tucos como um modelo para o estudo de processos evolutivos, particularmente com relação

à sua grande diversificação cromossômica, especiação e sociabilidade (Lessa e Cook,

1998).

No Estado do Rio Grande do Sul tem-se atualmente descritas quatro espécies do

gênero Ctenomys. Ctenomys torquatus Lichtenstein, 1830, é a espécie mais amplamente

distribuída e a única que não ocorre na Planície Costeira, habitando a região pampiana, a

Depressão Central e o norte do Uruguai (Freitas, 1995). Ctenomys flamarioni Travi, 1981,

habita a primeira linha de dunas e sua distribuição estende-se desde Arroio Teixeira, ao

norte, até a desembocadura do Arroio Chuí, na divisa com o Uruguai, ao sul (Freitas, 1995;

Fernández-Stolz, 2007). Ctenomys lami Freitas, 2001, ocorre em uma estreita região

conhecida como Coxilha das Lombas, nas proximidades do município de Porto Alegre

(Freitas, 2001). Ctenomys minutus Nehring 1887, alvo de estudo deste trabalho, será

comentado detalhadamente a seguir.

3.3. Ctenomys minutus

A espécie C. minutus (Figura 1) ocorre na Planície Costeira do sul do Brasil, desde

o sul do Estado de Santa Catarina, nas proximidades da praia de Jaguaruna, até o

município de São José do Norte no Estado do Rio Grande do Sul (Figura 2; Freygang et

al., 2004), ocupando uma extensão linear de aproximadamente 500km.

Dentre todas as espécies de tuco-tucos que ocorrem na Planície Costeira, C.

minutus é a mais amplamente distribuída, sendo que ao norte de sua ocorrência habita a

porção oeste da primeira linha de dunas e campos arenosos correspondentes à segunda

linha de dunas e a partir da Lagoa dos Barros em direção ao sul de sua distribuição ocupa

apenas áreas de campos arenosos, interiorizando-se cerca de 2Km da costa (Freitas, 1995).

A primeira linha de dunas corresponde à quarta barreira geográfica, e a segunda linha de

dunas corresponde a terceira e segunda barreiras geográficas, todas elas estabelecidas

durante a formação da Planície Costeira do Rio Grande do Sul (Freitas, 1995, 1997).

Ctenomys minutus habita, preferencialmente, solos secos, que não sejam compactos

e nem alagáveis, ocorrendo geralmente em taludes de estradas ou encostas de dunas (Rui e

Gastal, 1994). Apresenta uma nítida preferência por ambientes abertos, o que pode estar

correlacionado com a ventilação e troca de gases das tocas (Gastal, 1994).

Figura 1. Exemplar de Ctenomys minutus adulto.

3.3.1. Variações cariotípicas

As populações de C. minutus possuem notável variação cariotípica (Gava e Freitas,

2004). Estudos realizados por Freitas (1997), Gava e Freitas (2003) e Freygang et al.

(2004) demonstraram a existência de seis números diplóides com onze cariótipos

diferentes para C. minutus (2n = 42; 2n = 46a; 2n = 46b; 2n = 47a; 2n = 47b; 2n = 48a; 2n

= 48b; 2n = 49a; 2n = 49b: 2n = 50a e 2n = 50b; Figura 2). Os polimorfismos

cromossômicos encontrados são devidos a rearranjos Robertsonianos e fusões in tandem, e

no caso de um mesmo número diplóide, porém com cariótipos descritos como “a” ou “b”,

o que os diferencia são rearranjos em cromossomos distintos (Freitas, 1997; Freygang et

al., 2004).

Os rearranjos cromossômicos envolvidos em cada um dos cariótipos foram

identificados através da técnica de banda G. Partindo-se do cariótipo 2n = 50a, encontrado

no extremo norte da distribuição de C. minutus, pode-se destacar que os cromossomos

identificados como 2, 16, 17, 19, 20, 22, 23 e 24 estão envolvidos em alguma forma de

rearranjo nos outros 10 diferentes cariótipos encontrados para esta espécie (Freygang et al.,

2004; Freitas, 2006). Por exemplo, em todos os espécimes de cariótipo “a” (2n = 46a, 47a,

48a, 49a e 50a) e em 2n = 42 o par cromossômico 2 encontra-se íntegro, enquanto que em

todos os cariomorfos reconhecidos como “b” (2n = 46b, 47b, 48b, 49b e 50b) o par 2

encontra-se fissionado originando dois cromossomos, correspondentes aos braços 2p e 2q,

e o cromossomo correspondente ao braço 2p sofreu uma inversão pericêntrica originando

um cromossomo metacêntrico (Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

Tamanha diversidade de cariótipos revela a ocorrência de polimorfismos

cromossômicos em C. minutus, que podem ser reflexo de um isolamento geográfico entre

diferentes populações desta espécie (Freitas, 1997; Gava e Freitas, 2002, 2003; Freygang et

al., 2004; Freitas, 2006).

Cada cariótipo pode ser designado por uma área geográfica particular tendo

distribuição contígua ou separada por barreiras geográficas. A população com 2n = 46a é

distribuída por 135 km lineares da margem sul do rio Araranguá até o leste da Lagoa dos

Barros, tendo uma distribuição contígua com as populações de 2n = 48a localizadas mais

ao norte, sendo este cariótipo encontrado desde a Lagoa dos Barros até as proximidades do

município de Mostardas (Figura 2; Gava e Freitas, 2003). O cariótipo 2n = 47a se localiza

em uma região restrita entre a transição dos dois cariótipos acima citados. Seguindo em

direção ao sul, são encontrados espécimes com 2n = 42, 120 km ao sul de Mostardas,

seguido pelos cariótipos 2n = 46b e 47b localizados a 150 km ao sul do município de

Tavares, este último formado entre as zonas de contato de 2n = 46b com 2n = 48b, sendo

que espécimes com 2n = 48b são encontrados nas proximidades do município de Bujuru

(Gava, 2003; Freygang et al., 2004). O cariótipo 2n = 49b localiza-se na região de

transição entre 2n = 48b e 2n = 50b, este último pertencente ao extremo sul da distribuição

de C. minutus, no município de São José do Norte (Freygang et al., 2004). Com exceção

dos cariótipos 2n = 49a e 50a que estão distribuídos no extremo norte (praia de Jaguaruna,

SC) e separados das populações 2n = 46a pelo rio Araranguá, os outros cariótipos tem

distribuições contíguas sem qualquer barreira física óbvia atualmente (Figura 2; Gava e

Freitas, 2003).

Freygang et al. (2004) compararam o cladrograma obtido pela distribuição dos

cariótipos com a distribuição geográfica de C. minutus, e inferiram que inicialmente toda a

Planície Costeira era colonizada pelo cariótipo 2n = 50a. O rio Araranguá pode ter dividido

a distribuição de 2n = 50a originando 2n = 50b do lado sul do rio. Também foi inferido,

através do cladrograma, que os cariótipos 2n = 48b, 46b e 48a surgiram do cariótipo 2n =

50b, sendo que duas explicações são possíveis, uma que os cariótipos surgiram

independentemente, e a outra, deduzida por parcimônia, de que o cariótipo 2n = 48b

apareceu inicialmente dentro da área de distribuição de 2n = 50b e através de uma inversão

produziu o cariótipo 2n = 48a e independentemente por uma fusão originou 2n = 46b.

Assim a distribuição das diferentes formas cariotípicas ao longo da distribuição de

C. minutus parece estar relacionada com eventos de formação da Planície Costeira (Freitas,

1997; Freygang et al., 2004).

3.3.2. Zonas híbridas intra e interespecíficas

Dentro da ampla distribuição de C. minutus têm-se a formação de quatro zonas

híbridas intra-específicas entre os cariótipos: a) 2n = 46a x 2n = 48a; b) 2n = 46b x 2n =

48b; c) 2n = 42 x 2n = 48a; d) 2n = 50b e 2n = 48b (Figura 2; Freitas, 1997; Marinho e

Freitas, 2000; Gava e Freitas, 2002, 2003, 2004; Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

Ainda uma região de hibridação interespecífica é relatada entre C. minutus e C. lami (El

Jundi, 2003; Gava e Freitas, 2003).

A zona híbrida melhor estudada é a existente entre os cariótipos 2n = 46a e 2n =

48a com ocorrência do híbrido 2n = 47a, variação no número diplóide que é acompanhada

por pequena variação craniométrica (Marinho e Freitas, 2000; Gava e Freitas, 2002, 2003,

2004).

Gava e Freitas (2004) analisaram várias populações desta área usando seis loci de

microssatélites e observaram uma forte estruturação entre as populações locais, maior do

que a estruturação entre as populações de cariótipos diferentes. Os valores baixos de

divergência inter-citótipo sugerem que o polimorfismo cromossômico não tem agido como

barreira de isolamento.

Figura 2. Mapa da distribuição geográfica de Ctenomys minutus ao longo da Planície

Costeira dos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Os limites norte (Jaguaruna)

e sul (São José do Norte) da distribuição da espécie e a ocorrência de cada um dos 11

cariótipos estão representados no mapa. Os asteriscos indicam os locais de ocorrência de

zonas híbridas intra-específicas.

3.4. Planície Costeira do Rio Grande do Sul e Santa Catarina: área de ocorrência de

Ctenomys minutus

3.4.1. Características gerais

A Planície Costeira na qual estão incluídos os litorais do Rio Grande do Sul (RS),

parte de Santa Catarina (SC) e o Uruguai pertence ao pacote sedimentar Cenozóico. No

Estado do RS a Planície Costeira estende-se através de uma área de aproximadamente

33.000 km

, alcançando em alguns pontos uma largura máxima de 100 km, sendo a

Planície Costeira mais ampla do país (Tomazelli e Villwock, 2000). A atual linha da costa,

praticamente retilínea, possui uma orientação NE-SW e se estende por aproximados 620

km, desde o município de Torres, no extremo norte, até a desembocadura do Arroio Chuí,

no extremo sul (Schwarzbold e Schäfer, 1984; Tomazelli e Villwock, 2000).

Apresenta um terreno bastante irregular, tanto nos Estados do RS quanto em SC,

geologicamente caracterizado por eventos de depósitos marinhos e eólicos de distintas

épocas (Villwock et al., 1986). Tais eventos deram origem a um complexo sistema de

lagos, lagoas, rios e dunas que, em alguns casos, podem representar barreiras geográficas

naturais ao fluxo gênico entre diferentes populações das espécies do gênero Ctenomys que

habitam a região (Moreira et al, 1991; Freitas, 2007; Fernández-Stolz, 2007).

Atualmente a Planície Costeira do Rio Grande do Sul e Santa Catarina (até a saída

da Laguna) é interrompida de forma permanente em dois locais: as desembocaduras da

Laguna de Tramandaí e da Lagoa dos Patos (Tomazelli e Villwock, 2000). Apresenta ainda

a desembocadura dos rios Araranguá e Mampituba (Figura 2) e uma área de planície

pantanosa nas proximidades do município de Palmares do Sul. Em sua porção leste

encontra-se uma extensa zona lacustre que se estende desde o município de Torres até a

Lagoa do Peixe nas proximidades do município de Tavares (Figura 2; Freitas, 1995).

3.4.2. Fatores físicos na morfogênese local

O regime de ventos tem um papel fundamental na morfogênese da Planície Costeira

já que, além de determinar a dinâmica de formação e erosão de dunas, é o fator básico que

modula a hidrodinâmica tanto oceânica quanto dos corpos lagunares da região (Tomazelli e

Villwock, 2000). De acordo com Tomazelli (1993) a Planície Costeira encontra-se

submetida a um regime bimodal de ventos de alta energia, sendo predominante o originado

no Anticiclone do Atlântico Sul e, como conseqüência de sua incidência NE, as dunas

eólicas migram no sentido SW.

Quanto ao regime hidrodinâmico, o transporte e deposição de sedimentos na

Planície Costeira estão determinados principalmente pela ação de ondas de longo período

proveniente do SE e por vagas locais provenientes principalmente do E-NE (Tomazelli e

Villwock, 1992).

Estudos geomorfológicos registram um deslocamento predominante das areias na

direção NE, chamado de “deriva litorânea de sedimentos”, confirmado por indicadores

geomorfológicos como as desembocaduras não estabilizadas dos rios, arroios e lagunas que

deságuam no mar e se deslocam no sentido da deriva. Este fenômeno pode ser

exemplificado pela barra da Laguna de Tramandaí que, antes de ser fixada em 1961,

migrava em média 200 m por ano. No extremo norte, a desembocadura do rio Mampituba

também ilustra esta migração para NE (Tomazelli e Villwock, 2000).

3.4.3. Evolução paleogeográfica da Planície Costeira

Acredita-se que a evolução paleogeográfica da Planície Costeira deu-se a partir do

Terciário, através do acúmulo de sedimentos erodidos das terras mais altas adjacentes,

originando um sistema de leques aluviais coalescentes ao longo da parte oeste da Planície.

Estes depósitos teriam sido subseqüentemente retrabalhados por no mínimo quatro ciclos

transgressivo-regressivos ocorridos durante o Quaternário, sendo os três primeiros

associados aos eventos glaciais do Pleistoceno, e o último ao Holoceno, originando quatro

sistemas deposicionais complexos chamados de “laguna-barreira” (I – IV; Figura 3)

(Villwock et al., 1986; Tomazelli e Villwock, 2000).

O primeiro, e mais antigo, ciclo transgressivo-regressivo ocorreu no início do

Pleistoceno, há aproximadamente 400 mil anos, e teria dado origem à região conhecida

como Coxilha das Lombas, com cerca de 250 km de extensão, uma largura de 5 a 10 km e

orientada no sentido NE-SW. A região ocupada pelo sistema lagunar associado a esta

barreira abrange boa parte das bacias do Rio Gravataí e do complexo fluvial do rio Guaíba

e sofreu a influência dos eventos transgressivo-regressivos que se sucederam (Villwock et

al., 1986; Tomazelli e Villwock, 2000).

O segundo e terceiro ciclos (aproximadamente há 325 e 120 mil anos,

respectivamente) deram origem à denominada “Barreira Múltipla Complexa”,

correspondente à segunda linha de dunas, e foram responsáveis pela separação das Lagoas

dos Patos e Mirim. A fase regressiva que caracterizou o terceiro ciclo teria atingido o seu

máximo há 17 mil anos atrás, dando origem a uma ampla planície que atualmente forma

parte da plataforma submarina, retraindo a linha de costa aproximadamente 120m abaixo

do seu nível atual (Villwock et al., 1986; Tomazelli e Villwock, 2000).

O quarto e último evento ocorreu por volta do início do Holoceno, teria atingido

seu máximo há cerca de 5 mil anos, elevando o nível do mar de 2 a 4 m acima do atual

(Tomazelli et al., 2000). A estabilização temporária no final deste evento foi a principal

responsável pela implantação de uma barreira de dimensões reduzidas que foi aumentando

com o acúmulo de areia e sedimentos fornecidos pela ante-praia inferior e pela plataforma

continental interna (Tomazelli e Villwock, 2000). Esta barreira, de natureza dinâmica,

constitui hoje o sistema de dunas costeiras, primeira linha de dunas, que se estende ao

longo de toda a Planície Costeira do Rio grande do Sul. Além disso, este último evento deu

origem a uma depressão lacustre que uniu a Lagoa Mangueira com inúmeras outras lagoas

existentes na época (Villwock et al., 1986; Tomazelli e Villwock, 2000).

Figura 3. Mapa da localização e geologia simplificada da Planície Costeira do Rio Grande

do Sul. Modificado de Tomazelli et al. (2000).

3.4.4. Ctenomys minutus e a Planície Costeira

Atualmente a distribuição de Ctenomys minutus é interrompida pelos rios

Mampituba, Araranguá, por terras baixas e alagadiças da região de Palmares do Sul

(Freitas, 1995) e por diferentes rodovias e áreas urbanizadas. O Rio Araranguá parece

representar uma barreira efetiva ao fluxo gênico entre as populações. Na análise

filogenética dos diferentes cariótipos de C. minutus o número diplóide 2n = 50a, que acorre

à sua margem norte, aparece como o mais ancestral dos cariótipos e bastante separado de

2n=46a localizado à margem sul (Freygang et al., 2004).

O Rio Mampituba apresenta formação recente e atualmente sua desembocadura

encontra-se fixada por molhes para evitar a migração que ocorre para nordeste (Reginato,

1996).

3.5. Contexto genético

3.5.1. Marcadores moleculares em estudos populacionais

A biologia molecular tem proporcionado numerosas técnicas de acesso à

variabilidade genética dos organismos, tanto através de polimorfismos de proteínas quanto

de DNA (Avise, 1994). Tais técnicas permitem a obtenção de um grande número de

marcadores moleculares cobrindo quase todo o genoma do organismo. Métodos estatísticos

acompanham este desenvolvimento e têm permitido a manipulação de enormes

quantidades de dados (Ferreira e Grattapaglia, 1998).

Por serem bastante polimórficos e possuírem altas taxas de mutação, alguns dos

marcadores moleculares mais utilizados em estudos populacionais e filogeográficos são a

região controladora do DNA mitocondrial e os loci de microssatélites.

3.5.1.1. DNA mitocondrial

O genoma mitocondrial dos animais é haplóide e circular, com um comprimento de

15-20kb. Levando-se em consideração que cada célula possui milhares de mitocôndrias, os

organismos apresentam, portanto, milhares de cópias deste genoma (Meyer, 1993; Li e

Graur, 2000).

O DNA mitocondrial (mtDNA) é composto, tipicamente, por 37 genes funcionais,

sendo 22 RNAs transportadores, 2 RNAs ribossômicos e 13 RNAs mensageiros, este

último, o único envolvido na síntese de subunidades protéicas que participam da cadeia

transportadora de elétrons e da fosforilação oxidativa. Considera-se que o arranjo do

genoma mitocondrial não contenha íntrons, e apresente poucos espaçadores intergênicos

(Avise, 2000).

O mtDNA é simples em estrutura e econômico em tamanho, sendo que o único

grande fragmento não codificante (de aproximadamente 1.000 pb) é a região controladora

(Control Region, CR), que tem função regulatória na dinâmica da molécula e é

predominantemente rica em bases AT (Brown, 1985). Nos vertebrados esta região é

referida como D-loop (Displacement-loop), devido à formação de uma estrutura de fita

tripla que gera deslocamentos dinâmicos no começo da replicação do mtDNA (Brown et

al., 1986).

A utilização de seqüências do mtDNA para elucidar relações filogenéticas vem

sendo amplamente empregadas, pois, apresentam certas vantagens em relação aos

marcadores moleculares do DNA nuclear (Avise, 2000). Características como sua herança

matrilinear, a ausência de recombinação, altas taxas evolutivas e tamanho efetivo

populacional quatro vezes menor do que segmentos equivalentes em autossomos fazem

com que o mtDNA seja uma importante ferramenta para os estudos filogenéticos e de

eventos evolutivos relativamente recentes, permite ainda revelar grupos geográficos de

indivíduos relacionados e analisar as relações entre as matrilinhagens dentro de uma

população (Hare, 2001; Alberts et al., 2002). Também pode ser utilizado para traçar

eventos históricos, como gargalo-de-garrafa, ou para analisar zonas híbridas (Avise, 1994).

Várias hipóteses têm sido consideradas na tentativa de explicar sua rápida

evolução: a) o relaxamento das limitações funcionais; b) a alta taxa de mutação devido à

ineficiência dos mecanismos de reparo de DNA mitocondrial em relação ao nuclear; e c) o

fato de não possuir histonas (Avise, 2000).

A herança materna e a não recombinação entre as moléculas faz com que um

genótipo ou haplótipo mitocondrial possa servir para traçar uma genealogia ou mesmo

filogenia materna, o que pode auxiliar na compreensão do modo de dispersão de muitos

organismos e de acasalamentos preferenciais, dentre outras inferências (Arias e Infante-

Malachias, 2001).

Devido às rápidas taxas de substituições de seus nucleotídeos, o mtDNA é

adequado para estudos intra e intergenéricos (Bonvicino e Moreira, 2001). De especial

utilidade para estudos que incluam variação em nível intraespecífico ou de espécies

fortemente relacionadas, é a região controladora. As taxas de substituição de bases

encontram-se acentuadas em duas regiões chamadas de segmentos hipervariáveis (Hiper-

Variable Segment, HVS) HVS1 e HVS2, com extensões aproximadas de 350 pb e

separadas por uma região mais conservada com cerca de 200 pb (Vigilant et al., 1989).

3.5.1.2. Loci de microssatélites

Os microssatélites, também conhecidos como STR (short tandem repeats) ou SSR

(simple sequence repeats), consistem em pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de

comprimento, repetidos in tandem, sendo abundantes no genoma dos eucariotos. Em

mamíferos, estima-se que os motivos de repetição mais comuns (GT/AC) ocorram em

média a cada 30kb (Schlötterer, 1998).

A maioria dos microssatélites encontra-se em cópia simples, facilitando a

identificação dos alelos sem ambigüidade. Apresentam-se como locos altamente

polimórficos, com alelos codominantes e seletivamente neutros. Outra vantagem no uso

deste marcador é que acumulam mutações a uma taxa relativamente constante (Schlötterer,

1998).

As mutações que ocorrem nos microssatélites são mudanças no número de unidades

de repetição, causadas por erros no momento da replicação, caracterizado como DNA

slippage. Durante a fase de replicação, as duas cadeias de DNA homólogas podem ser

facilmente alinhadas fora de fase. Estes erros são responsáveis pela adição ou deleção de

repetições idênticas, mudando o tamanho final do arranjo, conferindo assim o caráter

altamente polimórfico destes locos (Amos e Hoeltzel, 1992; Tautz, 1993; Schlötterer,

1998).

Os alelos dos loci de microssatélites podem ser acessados pela técnica de PCR

(polymerase chain reaction), e por apresentarem alelos menores do que 1Kb, permitem a

utilização de DNA altamente fragmentado ou em pequenas quantidades (Bruford e Wayne,

1993; Bennett et al., 1998).

São variáveis o suficiente para permitir a identificação dos espécimes amostrados e

a realização de inúmeras análises estatísticas de associação dos indivíduos às suas

populações de origem (Hansen et al., 2000).

Com relação a aspectos populacionais, loci de microssatélites são amplamente

utilizados, com diferentes enfoques, em espécies do gênero Ctenomys. São aplicados em

estudos envolvendo estimativas de fluxo gênico entre populações, inferências sobre deriva

genética e migração, diferenciação genética, estrutura populacional, comparações da

variabilidade genética entre espécies e populações, paternidade e parentesco (Lacey, 2001;

Wlasiuk et al., 2003; El Jundi e Freitas, 2004; Gava e Freitas, 2002, 2003 e 2004;

Fernández-Stolz et al., 2007).

3.5.2. Filogeografia

A filogeografia é um campo de estudo baseado nos princípios e processos

responsáveis pela distribuição geográfica de linhagens genealógicas, especialmente aquelas

intra-específicas ou entre espécies relativamente próximas (Avise, 2000). Para que seja

possível analisar e interpretar a forma como são distribuídas as linhagens, um estudo

filogeográfico deve utilizar o máximo de informações possíveis, incluindo dados de

genética molecular, genética de populações, demografia, filogenética, geologia, geografia

histórica, entre outros (Avise, 2000).

Desta forma, a filogeografia constitui-se em um esforço integrativo, entre diversas

disciplinas micro e macroevolutivas. De modo geral, a filogeografia age como uma ponte

de ligação entre as disciplinas de filogenia e genética de populações (Avise et al., 1987).

A ferramenta molecular mais usada neste tipo de abordagem é a análise de mtDNA,

que permite o acompanhamento de rastros genealógicos além dos limites genéticos entre as

populações, espécies e grupos taxonômicos mais elevados. O sucesso da filogeografia

baseada no DNA mitocondrial deve-se principalmente à descrição aperfeiçoada da

distribuição geográfica, relações filogenéticas, distâncias genéticas e tempos de

divergência entre linhagens evolutivas de animais (Bermingham e Moritz, 1998; da Silva e

Patton, 1998).

Isto levou a melhor compreensão de biogeografias regionais e áreas de endemismo,

auxiliando na elaboração de propostas prioritárias para a conservação das biodiversidades

taxonômicas e locais (Rojas, 1995; Bermingham e Moritz, 1998; da Silva e Patton, 1998;

Firestone et al., 1999).

Estudos filogeográficos utilizando as espécies C. pearsoni (Tomasco e Lessa,

2007), C. australis (Mora et al., 2006), C. talarum (Mora et al., 2007) e C. flamarioni

(Fernández-Stolz, 2007), baseados em seqüências da região controladora do mtDNA, têm

sido realizados com sucesso devido à possibilidade de melhor descrição dos padrões de

distribuições geográficas, de relações filogenéticas e de distâncias genéticas e fluxo gênico

entre as diferentes linhagens de cada uma das espécies.

4. OBJETIVOS

• Analisar a variabilidade genética de Ctenomys minutus ao longo de toda sua

distribuição geográfica na Planície Costeira do Rio Grande do Sul (RS) e Santa

Catarina (SC), utilizando como marcador molecular uma seqüência da região

controladora do mtDNA;

• Analisar através de cinco loci de microssatélites a variabilidade genética de

populações de C. minutus, localizadas desde o extremo norte da distribuição da

espécie, na praia de Jaguaruna em SC até as proximidades do município de

Mostardas no RS;

• Verificar a existência de fluxo gênico entre os diferentes citótipos e as diferentes

populações de C. minutus através dos marcadores moleculares acima citados;

• Inferir os padrões filogeográficos de C. minutus relacionando os resultados obtidos

pelos dois marcadores (mtDNA e loci de microssatélites) com a existência de

barreiras geográficas e os citótipos dos espécimes;

• Contribuir com a compreensão taxonômica e sistemática do gênero Ctenomys

dentro do Rio Grande do Sul, através da caracterização molecular das diferentes

linhagens de C. minutus.

5. CAPÍTULO I

PHYLOGEOGRAPHY OF Ctenomys minutus (RODENTIA: CTENOMYIDAE)

Carla Martins Lopes

1,2

& Thales R. O. de Freitas

1,3,4

1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Genética,

Prédio 43323, P. O. BOX 15053, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

91501-970, Rio Grande do Sul, Brazil

2 Phone: +55-51-3308-6733; E-mail: [email protected]

3 Departamento de Genética, Prédio 43323, P. O. BOX 15053, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, 91501-970, Rio Grande do Sul, Brazil

4 (Phone: +55-51-3308-6733; E-mail: [email protected])

Artigo em preparação

Abstract

Eleven different karyotypes are found within populations of the subterranean rodent

Ctenomys minutus, along a narrow stretch of the Brazilian coastal plain in the states of Rio

Grande do Sul and Santa Catarina. We examined the geographical genetic structure of this

species using mitochondrial DNA (mtDNA) control region sequences. 34 haplotypes were

found in the analysis of 407 pb sequences in 187 individuals. Shared haplotypes were

observed between populations in the same intra-specific hybrid zone. Genetic

differentiation was consistent with a simple model of isolation by distance (r = 46.98%; P

= 0.00), and a pattern of recent population expansion was rejected according to the Fu’s

-test (Fs = - 1.676, P = 0.36), Tajima’s D-test (D = 0.696; P = 0.81) and the mismatch

distribution analysis. Results indicate that most of the populations are strongly structured,

with little or no gene flow among them (global F

= 0.8561). Potential geographical

barriers along the coastal plain of Rio Grande do Sul and Santa Catarina do not seem to be

effective barriers to gene flow among populations of C. minutus. Likewise, the different

karyotypes observed for this species do not represent effective barriers to reproduction,

with the exception of the “b” system (2n = 46b, 47b, 48b, 49b and 50b), which forms a

separate cluster and whose carriers do not hybridize with those of other karyotypes.

Keywords: subterranean rodents, mitochondrial DNA, control region, karyotypes, geographical

barriers

Introduction

Subterranean rodents, specifically tuco-tucos (Ctenomyidae), are exciting

organisms for testing hypotheses about evolutionary processes, particularly with regard to

chromosomal diversification, divergence of lineages, and speciation (Patton et al., 1996;

Lessa and Cook, 1998; Mora et al., 2007). The species of this genus generally occur in

relatively small and fragmented populations, have low levels of adult dispersal, and

typically solitary habits. Probably because of these characteristics, they show extensive

karyotypic variation and commonly occur in small genetic units where genetic variation is

low and interpopulation divergence is high (Patton and Smith, 1990; Reig et al., 1990;

Smith, 1998; Nowak, 1999; Wlasiuk et al., 2003; Mora et al., 2006). In general, local

differentiation under limited gene flow is expected to characterize species of subterranean

rodents (Patton, 1985; Wlasiuk et al., 2003; Alvarez-Castañeda and Patton, 2004; El Jundi

and Freitas, 2004; Mora et al., 2006). An assessment of population structure and processes,

especially estimation of critical population parameters such as gene flow could be the key

to understanding the evolutionary dynamics of the group (Wlasiuk et al., 2003).

The species of the genus Ctenomys inhabit the southern part of the Neotropical

realm, from 17°S to 54°S latitude and from the Andes to the Atlantic Ocean (Reig et al.,

1990). This is the most speciose group of all subterranean rodents, and they are among the

most geographically variable mammals (Reig et al., 1990; Cook and Lessa, 1998; Lessa

and Cook, 1998; Lessa, 2000; Slamovits et al., 2001; Castillo et al., 2005).

Ctenomys minutus Nehring, 1887, occurs in southern Brazil, along a 500 km stretch

of the coastal plain from Jaguaruna Beach in the state of Santa Catarina to the city of São

José do Norte in the state of Rio Grande do Sul (Figure 1; Freygang et al., 2004). This

species occupies second, third, and fourth barrier-lagoon systems, formed during the

Pleistocene-Holocene periods in the course of four transgressive-regressive changes in the

level of the Atlantic Ocean (Villwoock et al., 1986). In the northern portion of its

distribution, it occupies sandy fields and dunes (first dunes line), while to the south near

Barros Lake, the animals live only in sandy fields (second dunes line) (Freitas, 1995). The

landscape of the coastal plain of Rio Grande do Sul and Santa Catarina is characterized by

lakes, lagoons, rivers, and dunes that can sometimes represent natural geographical barriers

to gene flow between different populations of Ctenomys that inhabit this region (Moreira et

al., 1991; Freitas, 2007; Fernández-Stolz, in prep.).

The populations of C. minutus have a notable chromosomal variation. Studies by

Freitas (1997), Gava and Freitas (2003), and Freygang et al. (2004) demonstrated the

existence of eleven different karyotypes for C. minutus (2n = 42, 46a, 46b, 47a, 47b, 48a,

48b, 49a, 49b, 50a and 50b). The chromosomal polymorphisms found are due to

Robertsonian rearrangements and tandem fusions. In the case of the same diploid number

with karyotypes described as “a” or “b”, the difference is based on rearrangements in

different chromosomes and a pericentric inversion in one chromosome for the “b” system

(Freitas, 1997; Freygang et al., 2004).

The distribution of these karyotypes is interesting, because the 2n = 50 is found at

both ends of the geographical range. However, at the center of the chromosomal range it is

reduced to 2n = 42 through chromosomal rearrangements, suggesting that this distribution

only occurs because the coastal plain of southern Brazil is narrow (Freitas, 1997; Freygang

et al., 2004) (see Figure 1).

Among these eleven karyotypes, there are intra-specific hybrids between: a) 46a x

48a; b) 42 x 48a; c) 46b x 48b; d) 48b x 50b (Freitas, 1997; Marinho and Freitas, 2000;

Gava and Freitas, 2002, 2003, 2004; Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

These characteristics reveal that the chromosomal polymorphisms in C. minutus

may reflect geographical isolation among different populations of this species (Freitas,

1997; Gava and Freitas, 2002, 2003; Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

The goals of this study were to analyze the genetic variation and gene flow of

different C. minutus populations throughout its entire distribution, using sequences of the

mtDNA control region. Specifically, we correlated these results with the occurrence of

hypothetical geographical barriers to gene flow and to the different karyotypes described

for this species.

Material and Methods

Sample collection

The tissue samples (organs or a biopsy of ear and tail, preserved in 95% ethanol and

stored at -20°C) were obtained from 187 individuals of C. minutus. All individuals were

collected and karyotyped previously in other studies (Freitas, 1997; Freygang et al., 2004).

Samples comprised between 1 to 20 individuals from each of 31 localities along the entire

distributional range of the species (see Table 1).

Laboratory techniques

DNA extraction followed the protocol of Medrano et al. (1990). A fragment of the

mtDNA control region was amplified by polymerase chain reaction using the primers

TucoPro (5’ - TTC TAA TTA AAC TAT TTC TTG - 3’; Tomasco and Lessa, 2007) and

TDKD (5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG - 3’; Kocher et al., 1989). Amplification

was carried out in a total volume of 20.0 µL containing the following components: 2.0 µL

of DNA ( 10 – 50 ng/µL) used as a template, 0.2 µM of each primer, 0.2 µM dNTP, 1x

PCR buffer, 1.5 mM MgCl

and 1.0 unit of Taq DNA polymerase (GIBCO-BRL Life

Sciences/ Invitrogen, Carlsbad, California). Polymerase chain reaction amplifications were

performed with an initial denaturation of 1 min at 94°C, followed by 35 cycles of 1 min of

denaturation at 94°C, 1 min of annealing at 48°C, and 1 min of extension at 72°C, and a

final extension of 5 min at 72°C (following Tomasco and Lessa, 2007). PCR products were

purified using Exonuclease I and Shrimp Alkaline Phosphatase (GIBCO-BRL Life

Sciences/Invitrogen, Carlsbad, California), performed following the guidelines of the

suppliers, and sequenced in an ABI Prism 3100 (Applied Biosystem) automated sequencer,

using the TucoPro primer used in the PCR.

Statistical analysis and population genetic structure

Sequence electropherograms were visually inspected using C

HROMAS 2.31

(http://www.technelysium.com.au/chromas.html), and aligned using the C

LUSTAL W

algorithm with default options, implemented in MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004). The

ambiguous sequences were reamplified as many times as needed to obtain a clean

electropherogram. Alignments were checked and edited by hand if necessary. We used

DNAsp 4.10.9 (Rozas et al., 2003) to assess the polymorphic sites, to define haplotypes and

to estimate haplotype diversity (Hd – Nei, 1987), and A

RLEQUIN 3.11 (Excoffier and

Schneider, 2005) to determine gene diversity (h, the probability that two randomly chosen

mtDNA lineages were different in the sample), nucleotide diversity (π per nucleotide site,

the probability that two randomly chosen homologous nucleotides were different in the

sample) and neutrality tests such as Tajima’s D (Tajima, 1989) and Fu’s F

(Fu, 1997) at

global and within population levels.

The program A

RLEQUIN 3.11 was used for computing global and pairwise estimates

of gene flow (Hudson et al., 1992). Genetic differentiation between populations was

characterized by estimating pairwise F

(Weir and Cockerham, 1984). Sequential

Bonferroni corrections were applied to correct for multiple comparisons (Rice, 1989), with

α = 0.05 to adjust the statistical significance levels. With this same program we calculated

the mean number of migrants per generation (Nm).

An analysis of molecular variance (AMOVA – Excoffier et al., 1992) was

performed with

ARLEQUIN 3.11 to estimate the partitioning of genetic variation and to test

the hypothesis that the present geographical barriers provide a good explanation for the

genetic divergence observed in C. minutus. Two different tests were considered. First, the

samples were separated into 5 groups considering karyotypes and possible geographical

barrier characteristics: i) the population from Jaguaruna and Jaguaruna Beach localities,

isolated on the northern edge by the Araranguá River; ii) populations from Passo de

Torres, Gaivotas Beach, and Morro dos Conventos Beach, isolated on the north by the

Mampituba River and on the south by the Araranguá River; iii) populations from Barco

Beach and Guarita, which inhabit only the dunes line; iv) all populations from Mostardas

to Traíras and Caieiras lakes, which inhabit only sandy fields without any apparent

geographical barrier, and v) only specimens with the “b” karyotype, which have a

inversion on chromosome 2 and do not show a hybrid zone between them and the other

karyotypes. The second test also considered 5 groups, but separated according to the

results of the phylogenetic tree, minimum spanning tree, and the proximity of the

populations: i) specimens from Morro dos Conventos Beach to Jaguaruna and Jaguaruna

Beach; ii) populations from Barco Beach to Gaivotas Beach; iii) populations from

Palmares do Sul to Traíras and Caieiras lakes; iv) specimens from Mostardas to Km 53 on

the Capivari-Tavares road; and, v) only specimens with the “b” karyotype.

To test for positive correlations between gene flow estimates and geographical

distances (Slatkin, 1993), a Mantel nonparametric test (Mantel, 1967), implemented in

RLEQUIN 3.11, was used to examine patterns of isolation by distance. The logarithmic

values of pairwise F

and geographical distances were plotted on a graph. Statistical

significance was tested using 10.000 random permutations.

To assess the demographic history of populations, we did an analysis of mismatch

distribution

(Rogers and Harpending, 1992) in ARLEQUIN 3.11, with 1000 random

permutations of bootstrap, to check for the occurrence of past events affecting the

population size, such as contractions or expansions. This result was compared with the

result from the neutrality tests.

Phylogenetic analysis

To determine the appropriate model of nucleotide sequence evolution, we used the

Akaike Information Criterion (AIC) as implemented in M

RMODELTEST 2.2 (Nylander,

2004), which is a modified version of David Posada's Modeltest 3.6, used to choose among

24 different models the appropriate one to apply in a phylogenetic Bayesian inference. The

substitution model that provided the best fit to our datasets was Hasegawa-Kishino-Yano

(HKY; Hasegawa et al., 1985), with a proportion of invariable sites (I) = 0.7381, and the

correction gamma value (G) = 0.6011. A phylogenetic analysis using Bayesian inference

was performed with M

RBAYES 3.1.2 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001). A Markov chain

Monte Carlo search was performed with 2.000.000 simulations, sampling trees every 1.000

generations. The first 500 trees (burn-in) were discarded. Homologous sequences of other

species of this genus (C. rionegrensis and C. torquatus) were used as a outgroups in the

phylogenetic tree.

The topological relationship between the control region haplotypes was estimated

using the minimum spanning tree (MST) approach (Figure 3; Excoffier and Smouse, 1994)

implemented in A

RLEQUIN 3.11.

Results

Genetic diversity

We obtained 407 pb of the control region sequenced from 187 specimens with: 44

variable sites, 1 singleton, 41 parsimony informative sites, and a total of 47 mutations.

Only one gap (insertions–deletions) was found among sequences in the site 159. For the

analysis of phylogenetic relationships, all 187 sequences were used. For population

analysis, samples were pooled together from localities no more than 20 km distant in

continuous regions (between km 96 and km 115 on the Capivari-Tavares road, for

example) with no obvious geographical barriers that could restrict gene flow, or no more

than 7 km distant in regions with apparent geographical barriers or human disturbance

(between Fortaleza and Suzana lakes, for example). These joinings among localities were

done to consider a single population (see Table 1).

Population divergence

We found 34 different haplotypes for C. minutus (Gene Bank accession numbers

XXXX to XXXX). Eight were shared among neighboring populations located in the hybrid

zones between karyotypes 46a x 48a or between karyotypes 48a x 42 (see Figure 3). The

longest distance between two populations that shared haplotypes (H9) was 49 km between

the localities km final and km 96 of the Capivari-Tavares road (see Figure 3 and Table 1).

The other 26 haplotypes were exclusive. The total haplotype diversity was (Hd) = 0.958.

Measures of genetic variability, including haplotype diversity (Hd) and nucleotide

diversity, for all populations sampled are shown in Table 2.

The gene flow estimates among all 20 populations yielded a high F

value

(0.8561). However, for the 190 pairwise F

combinations obtained, only 27 showed non-

significant P values (α

= 0.0002631), ranging from -0.1026 between EB and CT

populations to 1.000 in 15 different comparisons (population abbreviations given in Table

1). The largest values of the pairwise comparisons showed F

up to 0.25, considered high

values, and suggested absent or reduced gene flow among a large part of the C. minutus

populations.

The Nm values supported this pattern of reduced gene flow between the C. minutus

populations. 92.63% of the Nm pairwise estimates values were between 0.00 to 0.80, the

other Nm values were between 0.82 to 2.15, and only one comparison showed a high value

(Nm = 12.58) between populations MR and FR (population abbreviations given in Table

1).

The two AMOVA tests showed that a large percentage of genetic variation was

explained among the considered groups, 42.96% (F

= 42.96; P = 0.00) in the first

structure, and 52.02% (F

= 59.44; P = 0.00) in the second. The second test demonstrated

a higher percentage of genetic variation for the comparisons among groups compared to

the first. These results can be interpreted as the second group subdivision being more

realistic to explain the partition of genetic variation in C. minutus geographical distribution

(Table 3).

Mantel’s test detected a significant, positive correlation between genetic and

geographical distances for the set of sequences (r = 46.98%; P = 0.00). This pattern of

isolation by distance was also detected in the plot of pairwise geographical distances and

estimates (Figure 4).

The neutrality tests showed differences in global values and significances. The

global Fs-test was negative and non-significant (Fs = - 1.676; P = 0.36). The overall

Tajima’s D*-test was both positive and non-significant (D = 0.696; P = 0.81). The majority

of the localities showed positive and non-significant values (Table 2).

The mismatch distribution analysis not recovered a recent history of population

expansion (Figure 5).

Phylogenetic relationships among haplotypes

The Bayesian phylogenetic tree (Figure 2) showed a polytomy at the origin of four

clusters, each one corresponding to a geographical region. Each cluster contained neighbor

population haplotypes, with the exception of haplotype 23 (H23) present in specimens

from East Barros Lake and Traíras Lake, which grouped in the cluster formed by

specimens from the first dunes line. Polytomies may be the result of insufficient or

conflicting data, and therefore a technique artifact, or they may indicate a real event,

practically simultaneous, of cladogenesis, in more than two lineages within the same

species, which seems to be the case for the different C. minutus lineages. The haplotypes

H32 from MC Beach and H33 from population Jg remained together and formed a separate

branch from H34 formed by Jg population specimens.

The minimum spanning tree resembled a tree pattern: haplotypes linked among

neighbor population haplotypes, showing a biased relationship with the geographical

distribution (Figure 3). However, haplotypes H33 and H34, from the same population (Jg),

were linked in extremely different parts of the network. Haplotype 23 was newly grouped

with haplotypes formed by individuals that live in the first dunes line.

Discussion

Ctenomys minutus has a linear-like geographical distribution along the coastal plain

of Santa Catarina and Rio Grande do Sul States in Brazil. When species have a linear

distribution, the dispersal and gene flow will be restricted or limited to a single direction.

This feature, when associated with the low vagility characteristic of subterranean rodents

including tuco-tucos (Smith and Patton, 1984; Lacey, 2000), can cause a pattern of

isolation by distance. Species of tuco-tucos that inhabit coastal areas, such as C. pearsoni

(Tomasco and Lessa, 2007), C. flamarioni (Freitas, 1994; Fernández-Stolz et al., 2007), C.

australis (Contreras and Reig, 1965; Vassallo et al., 1994, Mora et al., 2006), and C.

talarum (Mora et al., 2007), also show a strong association with a narrow coastal dune

habitat, with a predominant linear distribution. In the cases of C. pearsoni, C. flamarioni,

and C. talarum, the pattern of isolation by distance, associated with its nearly linear

geographical distribution, was described. In addition, these species also have populations

showing a regime of local differentiation under limited gene flow (see Tomasco and Lessa,

2007; Mora et al., 2007; Fernández-Stolz, in prep.).

The significance of Mantel’s test, the Bayesian tree topology, the pairwise gene

flow and Nm estimates, the plot of geographical distances versus estimates of gene flow,

and the linear distributional range corroborate these expectations in the case of C. minutus.

In Table 1 and in the MST topology (Figure 3), only eight haplotypes of a total of

34 found, are shared among neighbor populations, which was considered a low value

compared with other species of this genus, which generally have many shared haplotypes

among different populations (see Mora et al., 2006; Tomasco and Lessa, 2007; Fernández-

Stolz et al., in prep.).

Most of the 190 pairwise combinations showed high values of F

(> 0.25). Only 27

combinations showed significant P-values, demonstrating the absence of or limited gene

flow among these populations. This fact can be explained by at least three factors: a) a

technique artifact, because some populations have few individuals (n = 3), which can

distort the analysis; b) most of the haplotypes are not shared among populations; and c)

mtDNA is a maternally inherited marker, and the results should be interpreted as an

indication of low levels of female dispersion rather than truly limited gene flow.

The analyses performed to assess the possibility that the populations of C. minutus

have experienced a recent population expansion fail to reject a scenario of constant

population size.

Significant negative values of a neutrality test are indicative of an excess of low

frequency and recent mutations, under the standard neutral model, which suggests a recent

population expansion. Tajima’s D-test was positive and non-significant (D = 0.465; P >

0.10) and the more sensitive Fu’s F

-test of neutrality for the entire set of C. minutus

populations demonstrated a negative non-significant value (Fs = - 1.676; P = 0.36).

If a recent population expansion has occurred, the haplotype tree topology is star-

like, with one haplotype at high frequency connected to a low-frequency haplotypes, by a

few changes. However, the MST topology for C. minutus presents balanced frequencies of

haplotypes, connected, in general, for two or more mutations by difference (Figure 3).

A scenario of recent population expansion is also not compatible with the results

obtained in the Mantel’s test and in the global mismatch distribution. The first, suggest that

C. minutus populations are differentiating under a model of isolation by distance, possibly

evidencing an equilibrium between gene flow and local genetic drift. The second, a multi-

modal mismatch distribution (Figure 5), suggest a constant population size and/or

sustained subdivision for a long time.

The Bayesian phylogenetic tree showed some polytomies. Polytomy was also

observed by Lara et al. (1996) in Echimyidae rodents. This was confirmed for Ctenomys by

Lessa and Cook (1998), Mascheretti et al. (2000), Slamovits et al. (2001), Mora et al.

(2006), and Tomasco and Lessa (2007), who observed that several basic relationships

between species of the genera are poorly understood and suggested that the polytomy is

due to simultaneous radiation events.

Freygang et al. (2004) constructed a consensus tree obtained from the chromosome

banding data for the distribution of parental karyotypes (2n = 42, 46a, 46b, 48a, 48b, 50a,

and 50b) of C. minutus, using C. lami as the outgroup. This cladogram also demonstrates a

polytomy giving rise to four branches, one originating the karyotypes 46a and 42, and the

other three branches originating the karyotypes 48a, 46b, and 48b. They inferred that,

initially, the entire coastal plain was colonized by the 2n = 50a karyotype. The Araranguá

River may have divided the distribution of the 2n = 50a karyotype to form the 2n = 50b on

the southern side, and then the other karyotypes were formed, directly or indirectly, by

rearrangements from 2n = 50b. The 50a and 50b karyotypes were outside of the polytomy,

and 50a was the outermost karyotype in the cladogram.

In the phylogenetic tree (Figure 2), haplotype H34 appears near the outgroups,

occupying a basal position, suggesting an earlier cladogenesis condition. H34 corresponds

to the Jaguaruna and Jaguaruna Beach localities, having 2n = 49a and 50a, which

corroborates the hypothesis suggested by Freygang et al. (2004) that the entire coastal plain

was possibly colonized by the 2n=50a karyotype.

The Mampituba and Araranguá rivers do not seem to be effective geographical

barriers to gene flow among C. minutus populations. In the case of the Mampituba River,

populations were sampled on the left bank, PsT, and the right bank, Gua. When the

Bayesian tree is observed, we can see that the haplotypes from these populations (PsT:

H28, H29, and H30; Gua: H26 and H27) remain together in the same cluster. In the MST

topology, H28 and H29 are linked in H26, separated by 3 mutations.

Considering the Araranguá River, gene flow was observed between the populations

from both banks, MC on the right and Jg on the left. Although the Jaguaruna locality is far

from the left bank, the H32 from MC and H33 from Jg remained together in the Bayesian

tree, with a posterior probability equal to 1.00 and in MST with two mutations by

difference.

These results, allied with the results from A

MOVA tests, confirmed that these two

rivers, up to the present, could not act as an effective geographical barrier. One possible

cause to explain this pattern is the low discharge and the transient status of the mouths of

these rivers (Tomazelli and Villwock, 2000; S. Dillenburg, personal communication). The

low discharge results in shifting of the river mouths, which sometimes allows contact

between the populations from opposite banks. Recently the banks of both rivers were fixed

(S. Dillenburg, personal communication), and the time since this was done apparently was

not sufficient to isolate the populations on the different sides.

The A

MOVA results showed that genetic variation was evenly distributed among

hierarchical levels, and corresponded with geographical distances. However, the first test,

considering characteristics such as karyotypes and geographical barriers, did not provide

the best explanation for the subdivisions of groups, suggesting that the Araranguá and

Mampituba rivers could not act as effective geographical barriers to gene flow among the

C. minutus populations. The second test, structured to consider the results of the Bayesian

tree, MST and the proximity of the populations, could explain better the hierarchical

genetic variation subdivision and is discussed above.

The highly significant fixation indices indicated that genetic structuring is as strong

among populations within the groups as among all populations. The first group was formed

by the Jg and MC populations, located at the extreme northern limit of the C. minutus

distribution. The second group was formed by populations from Gai to Bar with only

individuals that live in the first dune line, all of them with the 46a karyotype. The third

included the populations from CT to Pal with individuals that show karyotypes 46a, 47a

and 48a, and live in the second dunes line located near the intra-specific hybrid zone

between 2n = 46a and 2n = 48a. The probable geographic separation between the second

and third groups is the environmental discontinuity between the second and first dunes

lines. Environmental characteristics such as soil hardness influence morphological

differences in the specimens, principally in the anterior and posterior limbs and in the

cranium, because they are burrowers. Differences in skull morphology in this same region,

within individuals with 2n = 46a, were observed by Freitas (2005).

The fourth group was formed by populations from IR, MR, and FR with 2n = 42

and 48a, living near the intra-specific hybrid zone between karyotypes 42 x 48a. Finally,

the last group included only the “b” karyotypes (46b, 47b, 48b, 49b, 40b), with populations

from TvC to SJN. One possible reason for the separation between this and the fourth group

may be the incompatibility between karyotypic forms. In all the “a” system karyotypes (2n

= 46a, 47a, 48a, 49a, and 50a) and in 2n = 42, chromosome pair 2 was found entire;

whereas in all of the “b” karyotypic system (2n = 46b, 47b, 48b, 49b and 50b) the same

chromosome pair was found fissioned, originating two chromosomes, corresponding to the

2p and 2q arms; and the chromosome corresponding to the 2p arm underwent a pericentric

inversion, forming a metacentric chromosome (Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

Probably this inversion makes it difficult to recognize homologue pairs and can act as a

postzygotic isolation mechanism to avoid the occurrence of hybrid zones and gene flow

among carriers of the different karyotype systems.

Within each karyotype system, “a” plus 2n = 42 or “b”, the different diploid

numbers cannot act as effective barriers to avoid gene flow among C. minutus populations.

The same population sometimes contains individuals with different diploid numbers, as in

the case of East Barros Lake (see Table 1). Alternately, in some cases the same haplotype

is shared between two different karyotypes, such as H9, which is shared between 2n = 42

and 2n = 48a (see Table 1). This demonstrates that different karyotypes do not seem to

represent effective barriers to reproduction, with the exception of the two karyotype

systems, since no hybrid zones were recorded between carriers of the neighboring 2n = 42

x 2n = 46b, as mentioned above.

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Figure 1. Distribution of Ctenomys minutus on the coastal plain of the states of Santa

Catarina and Rio Grande do Sul in Brazil, showing the distribution of the karyotypes.

Asterisks indicate intra-specific hybrid zones. Sample localities: Jg: Jaguaruna; Jgb:

Jaguaruna Beach; MC: Morro dos Conventos Beach; Gai: Gaivotas Beach; PsT: Passo de

Torres; Gua: Guarita Beach; Bar: Barco Beach; Cai: Caieira Lake; Traí: Traíras Lake;

Osó: Parque Marechal Osório; Emb: Emboaba Lake; For: Fortaleza Lake; Suz: Suzana

Lake; Barr: Barros Lake; Pass: Passinhos; Pit: Pitangueira; PalS: Palmares do Sul; km53:

Capivari-Tavares road km 53; km64: Capivari-Tavares road km 64; km96: Capivari-

Tavares road km 96; km101: Capivari-Tavares road km 101; km108: Capivari-Tavares

road km 108; km115: Capivari-Tavares road km 115; km125: Capivari-Tavares road km

125; km final: Capivari-Tavares road km final; Cem: Cemitério road; Tv: Tavares; Bj1:

Bujuru 1; Bj2: Bujuru 2; and SJN: São José do Norte.

Cluster 5

Cluster 4

Cluster 3

Cluster 2

Cluster 1

Figure 2. Bayesian tree of 34 mitochondrial DNA haplotypes for Ctenomys minutus. Accession numbers for the outgroups: C. torquatus (F.

A. Fernandes, personal communication) and C. rionegrensis (AY755461). The posterior probabilities are given on the branches.

Correspondence among haplotypes and populations (see Table 1 and Figure1): cluster 1 - formed by individuals from MC and Jg

populations in the northernmost part of the C. minutus distribution; cluster 2 – formed by individuals that inhabit dunes from Gai to Bar,

with 2n = 46a and H23 correspond to specimens from populations CT and EB; cluster 3 - formed by individuals involved in the contact

zone between 2n = 46a and 2n = 48a, for populations from CT to Pal; cluster 4 - individuals involved in the contact zone between 2n = 48a

and 2n = 42, for populations from IR to FR; and cluster 5 – individuals with “b” karyotypes.

Figure 3. Minimum spanning tree topology for 34 mitochondrial control region haplotypes

of Ctenomys minutus. Circle areas are proportional to haplotype frequencies. Haplotype

numbers and population abbreviations correspond to those of Table 1. The colors represent

different populations, as indicated on the upper left side of the figure. Population

abbreviations correspond to those of Table 1.

Figure 4. Relantionships among pairwise geographical distances and estimates of F

based

on mitochondrial control region sets of sequences.

Figure 5. Observed and expected mismatch distributions for Ctenomys minutus. Open

circles: expected distributions; solid circles: observed distributions.

Table 1. Localities (with abbreviations) where samples of Ctenomys minutus were

obtained, number of sequences per locality (NºS), number of individuals per karyotype

(N°K), number of specimens per haplotype (N°H) and population abbreviation (P).

Locality N°S N°K N°H P

Jaguaruna (Jg) 4 50a = 4 H33 = 3 / H34 = 1

Jaguaruna Beach (Jgb) 8 50a = 3 / 49a = 5 H33 = 6 / H34 = 2

Morro dos Conventos Beach (MC) 5 46a = 5 H32 = 5 MC

Gaivota Beach (Gai) 6 46a = 6 H31 = 6 Gai

Passo de Torres (PsT) 3 46a = 3 H28=1/ H29=1/H30=1 PsT

Guarita Beach (Gua) 6 46a = 6 H26 = 5 / H27 = 1 Gua

Barco Beach (Bar) 5 46a = 5 H24 = 3 / H25 = 2 Bar

Caieira Lake (Cai) 1 46a = 1 H22 = 1

Traíras Lake (Traí) 2 46a = 2 H21 = 1 / H23 = 1

Parque Marechal Osório (Osó) 5 46a = 5 H21 = 2 / H22 = 3

Emboaba Lake (Emb) 4 46a = 4 H16 = 3 / H22 = 1

Fortaleza Lake (For) 9 47a = 4 / 48a = 5 H18 = 1 / H20 = 8

Suzana Lake (Suz) 3 47a = 1 / 48a = 2 H16 = 1 / H20 = 2

East Barros Lake (Barr) 7 46a=3 / 47a=1 / 48a=3 H19 = 5 / H23 = 2 EB

South Barros Lake (Barr) 8 47a = 1 / 48a = 7 H18 = 8

Passinhos (Pass) 4 48a = 4 H18 = 4

SBP

Pitangueira (Pit) 5 48a = 5 H16 = 3 / H17 = 2 Pit

Palmares do Sul (PalS) 7 48a = 7 H15=5 / H16=1 / H17=1 Pal

Capivari-Tavares road km 53 (km53) 5 48a = 5 H12=2 / H13=2 /H14=1

Capivari-Tavares road km 64 (km64) 3 48a = 3 H11 = 2 / H12 = 1

Capivari-Tavares road km 96 (km96) 4 48a = 4 H9 = 4

Capivari-Tavares road km 101 (km101) 2 48a = 2 H9 = 2

Capivari-Tavares road km 108 (km108) 5 42x48a = 5 H8 = 5

Capivari-Tavares road km 115 (km115) 3 42 = 3 H8 = 2 / H9 = 1

Capivari-Tavares road km 125 (km125) 2 42 = 2 H10 = 2

Capivari-Tavares road km final (km final) 14 42 = 14 H8 = 6 / H9 = 6 / H10 = 2

Cemitério road (Cem) 4 46b = 4 H4 = 4

Tavares (Tv) 20 46b = 17 / 47b = 3 H4=12/H5=1/H6=6/H7=1

TvC

Bujuru 1 (Bj1) 12 48b = 12 H3 = 12 Bj1

Bujuru 2 (Bj2) 9 49b = 7 / 50b = 2 H2 = 9 Bj2

São José do Norte (SJN) 12 50b = 12 H1 = 12 SJN

Total 187 34 haplotypes 20

Table 2. Number of sequences (N°S), haplotype diversity (Hd), nucleotide diversity (π),

and Tajima’s D-test and Fu’s F

-test values for populations of Ctenomys minutus.

Abbreviations for the populations are given in Table 1. Asterisk indicates populations for

which Tajima’s D and Fu’s F

tests were not calculated because they have only one

haplotype.

Tajima’s D Fu’s F

Population NºS Hd π

D p F

12 0.4091 0.1301 1.0043 0.8570 9.1498 0.9990

5 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

Gai

6 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

PsT

3 1.0000 0.0909 0.0000 0.7780 0.1335 0.2810

Gua

6 0.3333 0.0075 -0.9330 0.2510 -0.0027 0.2320

Bar

5 0.6000 0.0409 1.5727 0.9770 2.4285 0.8720

3 1.0000 0.1969 0.0000 0.6650 0.9568 0.4350

9 0.7222 0.0341 1.3712 0.9230 1.1520 0.7600

12 0.3182 0.0213 -1.0227 0.1820 0.5598 0.5840

7 0.4762 0.1082 0.8943 0.8340 5.9549 0.9900

SBP

12 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

Pit

5 0.6000 0.0136 1.2247 0.9360 0.6261 0.5140

Pal

7 0.5238 0.0281 0.0503 0.5960 0.4064 0.5340

8 0.8214 0.1169 1.0599 0.8600 2.2705 0.8330

14 0.5385 0.0244 1.93304 0.9820 2.7485 0.8860

16 0.7000 0.0400 1.5901 0.9540 2.4966 0.8980

TvC

24 0.5109 0.0323 0.1761 0.6440 1.0694 0.7390

Bj1

12 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

Bj2

9 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

SJN

12 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 * *

Table 3. Hierarchical analysis of molecular variance considering the phylogenetic tree,

minimum spanning tree and the proximity of the populations. The fixation indices (F-

statistics) and their respective variance components are shown. Asterisks indicate statistical

significance, P = 0.00.

Source of

variation

d.f.

Sum of

squares

Variance

components

Percentage of

variation

Fixation

indices

Among

groups

4 535.468 3.3106 59.44 F

= 0.5944*

Among

populations

15 205.154 1.4577 26.17 F

= 0.6453*

Within

populations

167 133.800 0.8012 14.39 F

= 0.8562*

6. CAPÍTULO II

POPULATION GENETIC STRUCTURE OF THE SUBTERRANEAN RODENT

Ctenomys minutus (RODENTIA: CTENOMYIDAE)

Carla Martins Lopes

1,2

& Thales R. O. de Freitas

1,3,4

1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Genética,

Prédio 43323, P. O. BOX 15053, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

91501-970, Rio Grande do Sul, Brazil

2 Phone: +55-51-3308-6733; E-mail: [email protected]

3 Departamento de Genética, Prédio 43323, P. O. BOX 15053, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, 91501-970, Rio Grande do Sul, Brazil

4 (Phone: +55-51-3308-6733; E-mail: [email protected])

Artigo em preparação

Abstract

This paper characterizes the variation at five microsatellite loci among populations

of Ctenomys minutus with variable degrees of chromosomal divergence distributed

parapatrically along the coastal plain of southeastern Brazil. A molecular survey of 202

specimens was carried out to assess the genetic relationships among populations and

chromosomal polymorphisms (2n = 42, 46a, 47a, 48a, 49a and 50a). Most of the pairwise

population comparisons were significantly divergent, with 56.36% and 72.72% of the F

and R

values greater than 0.15. These results concord with the pairwise estimates of

migrant numbers showing high structure. The specimens studied cannot be regarded as

belonging to a panmictic population. Mantel’s test indicated the hypothesis that

geographical distances are responsible for the genetic differentiation (r = 34.86%; P =

0.039). The molecular analysis of variance demonstrated that the main percentage of

variation is explained at the individual level (61.82%). Our data confirmed some

predictions for subterranean rodents, such as small and fragmented populations associated

with low levels of dispersal and typically solitary habits.

Key words: Ctenomys minutus, subterranean rodent, microsatellites, chromosomal

polymorphism, population differentiation

Introduction

Ctenomys minutus, Nehring, 1887, occurs in southern Brazil, along a 500 km

stretch of the coastal plain from Jaguaruna Beach in the state of Santa Catarina to the city

of São José do Norte in Rio Grande do Sul (Figure 1; Freygang et al., 2004). In general,

this region has a landscape characterized by lakes, lagoons, rivers, and dunes that can

sometimes form natural geographical barriers to gene flow among different local

populations of Ctenomys (Moreira et al, 1991; Freitas, 2007; Fernández-Stolz, in prep.).

Ctenomys minutus posses a striking chromosomal variation, with eleven different

karyotypes (2n = 42, 46a, 46b, 47a, 47b, 48a, 48b, 49a, 49b, 50a and 50b) distributed

among polymorphic populations (see Figure 1; Freitas, 1997; Gava and Freitas, 2003;

Freygang et al., 2004). The chromosomal polymorphisms found are due to Robertsonian

rearrangements and tandem fusions, and in the case of the same diploid number with

karyotypes described as “a” or “b”, the difference is based on rearrangements in different

chromosomes and a pericentric inversion in the 2p arm chromosome for the “b” system

(Freitas, 1997; Freygang et al., 2004).

Among these eleven karyotypes, four intra-specific hybrid zones have been

described. The two best characterized are 2n = 46a x 2n = 48a forming 2n = 47a, occurring

from Barros Lake to Suzana Lake (Gava and Freitas, 2002, 2003, 2004), and the other

between karyotypes 42 x 48a near the town of Mostardas, showing intermediate karyotypic

forms with 25 different fundamental numbers (Castilho et al., in prep). Two more

karyotype intra-specific hybrid zones have been described: 46b x 48b = 47b and 48b x 50b

= 49b (see Figure 1; Freitas, 1997; Marinho and Freitas, 2000; Gava and Freitas, 2002,

2003, 2004; Freygang et al., 2004; Freitas, 2006).

The species of tuco-tuco (Ctenomyidae) commonly occur in small genetic units

where genetic variation is low and interpopulation divergence is high. Some species can

show extensive karyotypic variation. The probable causes are related to common

characteristics such as their occurrence in relatively small and fragmented populations,

associated with low levels of dispersal, and typically solitary habits (Patton and Smith,

1990; Reig et al., 1990; Smith, 1998; Nowak, 1999; Wlasiuk et al., 2003; Mora et al.,

2006). An assessment of population structure and processes, especially estimation of

critical population parameters, such as gene flow, could be the key to understanding the

evolutionary dynamics of the group (Wlasiuk et al., 2003).

Microsatellites are a class of genetic markers that are propitious for the analysis of

intra-specific populations because they exhibit high levels of polymorphisms. They have

been used in a diverse array of applications in tuco-tucos, including: estimates of gene flow

among populations, inferences about genetic drift and migration, genetic differentiation

among species and populations, population structure, paternity, and kinship relationships

(Lacey, 2001; Gava and Freitas, 2002, 2003; Wlasiuk et al., 2003; El Jundi and Freitas,

2004; Gava and Freitas, 2004; Fernández-Stolz et al., 2007).

Here, we describe microsatellite analysis among and within populations that are

fixed or polymorphic for different chromosomal rearrangements of the “a” system (2n =

46a, 47a, 48a, 49a and 50a) plus 2n = 42, in order to assess their genetic variation.

Material and Methods

Sample collection

The tissue samples (organs or a biopsy of ear and tail, preserved in 95% ethanol and

stored at -20°C) were obtained from 202 individuals of C. minutus, located between the

towns of Mostardas and Jaguaruna on the coastal plain of the states of Rio Grande do Sul

and Santa Catarina. Tissue samples were deposited in the collection of the Cytogenetics

and Molecular Evolution Laboratory, Genetics Department, Federal University of Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.

All individuals were collected and karyotyped previously for other studies (Freitas,

1997; Freygang et al., 2004). The samples comprised of from 2 to 21 individuals from each

of 27 localities (see Table 1 and Figure 1).

Laboratory techniques

DNA extraction followed the protocol of Medrano et al. (1990). Molecular genetic

analysis was performed with 5 polymorphic microsatellite loci, isolated from the

Argentinean species C. haigi, with two (Hai2, Hai 3, Hai 4, and Hai 6) and three (Hai 12)

base-pair motifs (Lacey et al., 1999).

PCR amplifications were carried out in a reaction volume of 20 µL containing the

following components: 2.0 µL of DNA (10 – 50 ng/µL); 0.2 µM of each primer, 0.2 µM

dNTP; 1x PCR buffer; 1.5 mM MgCl

and 1.0 unit of Taq DNA polymerase (GIBCO-BRL

Life Sciences/ Invitrogen, Carlsbad, California). Polymerase chain reaction amplifications

were performed with an initial denaturation at 94ºC for 5 min, followed by 35 cycles of

denaturing at 94ºC for 30 s, annealing at 52-60ºC (according to the primer, see Lacey et al.

1999) for 30 s, extension at 72ºC for 45 s, and a final extension at 72ºC for 1 min. The

products were run in non-denaturing 8% polyacrylamide gels, and the products were

visualized with silver-nitrate stain. Differences of 1 base-pair motif could be resolved, and

alleles were scored from heteroduplex patterns using a 25 base-pair ladder as reference.

Allele sizes were tentatively scored in the first samples analyzed and compared with those

obtained by Lacey et al. (1999). The remaining samples were scored using an allelic ladder

constructed with the previously obtained alleles.

Statistical analysis

Analysis of linkage disequilibrium and deviations from the Hardy-Weinberg

equilibrium were performed with the exact test based on the Guo and Thompson (1992)

method, using A

RLEQUIN 3.11 (Excoffier and Schneider, 2005) and GENEPOP 3.4

(Raymond and Rousset, 1995). Sequential Bonferroni corrections were applied to correct

for multiple simultaneous comparisons (Rice, 1989), with α = 0.05 to adjust the statistical

significance levels.

The gene diversity within each population was quantified through the number of

alleles at each locus (N), per locus per population (Ni), the mean number of alleles per

locus (allele richness, A), percentage of polymorphic loci (%P), and the observed and

expected heterozygosis (Ho and He) from Hardy-Weinberg (HW) proportions (H

– Nei,

1978). These tests were implemented in A

RLEQUIN 3.11. Differences among populations in

the number of alleles per locus and expected heterozygosis were assessed using

Wilcoxon’s signed ranks test.

Wright’s F-statistics, based on the variance in the allele frequencies, were used to

analyze within (F

) and between (F

) population structure, according to Weir and

Cockerham (1984), using A

RLEQUIN 3.11. Sequential Bonferroni corrections were applied,

with α = 0.05, to adjust the statistical significance levels. As an alternative measure of

population differentiation based on the variance in allele size under the stepwise mutation

model, an R

estimator was used (Michalakis and Excoffier, 1996), using GENEPOP 3.4.

Estimates of migrant numbers (Nm) were calculated as Nm = (1 - F

) / (2/F

) using

RLEQUIN 3.11.

An analysis of molecular variance (AMOVA – Excoffier et al., 1992) was designed

to test the partitioning of genetic variation. The population groups were: i) specimens from

Mostardas to km 35 on the Capivari-Tavares road; ii) populations from Palmares do Sul to

Marechal Osório Park; iv) populations from Barco Beach to Gaivotas Beach; and v)

specimens from Jaguaruna and Jaguaruna Beach. This subdivision was made by

considering results for the mitochondrial DNA control region from the entire distribution

of C. minutus populations (unpublished data). All calculations were performed using

RLEQUIN 3.11.

To test positive correlations between gene flow estimates and geographical

distances (Slatkin, 1993), a Mantel nonparametric test (Mantel, 1967), implemented in

RLEQUIN 3.11, was used to examine patterns of isolation by distance, and the logarithmic

values of pairwise F

and geographical distances were plotted on a graph. Statistical

significance was tested using 1000 random permutations.

In spite of the current geographical separation among the nearest populations, a

Bayesian Markov Chain Monte Carlo (MCMC) approach was used in order to examine the

distinctiveness of populations and the clustering of individual genotypes, using the

program

STRUCTURE 2.2 (Pritchard et al., 2000). This test was processed considering each

individual associated with one of the 11 populations assumed here. For the MCMC

approach, 1.000.000 repetitions were utilized. The highest likelihood log were considered

the indicator of the number of genetically distinct populations in the data.

Results

Statistical analysis

Seven populations showed significant deviations from the Hardy-Weinberg

equilibrium (HWE), at least in 1 and at most in 4 loci, after the Bonferroni correction for

multiple tests (Table 2). The expected values (H

) for each locus ranged from 0.10 for Hai

4 (FS) to 0.90 for Hai 4 (Jg). Likewise, the observed values (H

) ranged from 0.07 for Hai

4 to 0.81 for Hai6 at Gua. The He and Ho values per population per locus and per

population for all loci are given in Table 2. The population abbreviations correspond to

those in Table 1.

The test for heterozygosity deficit produced non-significant P-values (P < 0.05) in

four populations (Jg, SWBP, PP, MR), and all loci showed significant P-values = 0.00.

Pairwise comparisons of allele frequencies revealed non-significant linkage disequilibrium

among any pair of loci at any population, after α-levels were corrected for multiple tests.

All loci in the data were polymorphic. The total number of alleles per population

were: Jg, n = 27; GaiP, n = 32; Gua, n = 22; OEW, n = 29; EB, n = 28; SWBP, n = 25; FS,

n = 24; PP, n = 20; IR, n = 39; MR, n = 38 and FR, n = 37, whereas the allelic richness (A),

calculated as the mean number of alleles across populations, showed the lowest value for

PP (4.00) and the highest for IR (7.80) (see Table 2; the population abbreviations

correspond to those in Table 1). The number of alleles detected per locus ranged from 9 in

Hai 2 to 19 in Hai 6 (Table 2).

Population structure

Estimates of intra-population structure calculated using the inbreeding coefficient

) indicated positive and significant values for eight populations (Table 2).

From analysis of molecular variance (AMOVA), the highest proportion of the

genetic variation apportioned was within individuals (61.82%). Variation among groups

explained only a small part of the genetic variation (6.28%). Overall, the F-statistic values

were moderately to highly significant: (F

= 0.0628 to F

= 0.3818) (see Table 3).

The F

and R

values revealed high levels of genetic differentiation among almost

all populations, and the F

significance was detected in most of the pairwise

combinations. The pairwise F

between FS and IR was lowest and non-significant, and

the highest significance was between Gua x SWBP; 56.36% of the values were > 0.15,

considered high or very high. The R

pairwise values were lowest in IR x SWBP and

highest in EB x Gua, with 72.72% of the values > 0.15 (Table 4). These results for F

are

in concordance with the numbers of migrants per generation calculated using Slatkin’s

private alleles method for pairwise populations (Table 5).

The Mantel’s test detected significant correlation between gene flow and

geographical distance, revealing a pattern of isolation by distance (r = 34.86%; P = 0.039).

This pattern of isolation by distance was also detected in a plot of pairwise geographical

distances and estimates of R

(Figure 2).

The Bayesian analysis considering the range of 10 to 14 potential populations, after

five independent simulations, recovered 13 groups (ln likelihood = - 2753.8), two more

than the number of populations considered in this study. The IR population was divided in

three groups, according to the results. As shown in Figure 3, there was relatively high

concordance between the population of origin and the group from which the largest

proportion of individuals was estimated to be derived.

Discussion

The hypothesis of chromosomal speciation was based on the principle that different

rearrangements present distinctive biologic units, considering that new rearrangements act

as postzygotic reproductive barriers (Lande, 1984). The situation in C. minutus seems to be

incompatible with this prediction. This species shows intra-specific hybrid zones among

different diploid numbers, producing intermediate forms, present in the same population.

Gava and Freitas (2003) suggested that the chromosomal polymorphisms present in C.

minutus can be neutral and can act as a transitory polymorphism, and the role of the

chromosome variability as a reproductive barrier and thus as the main causative factor in

speciation of the genus is still controversial.

Despite the significantly high values of pairwise F

and R

, some comparisons of

populations demonstrated the presence of gene flow, such as between neighbor populations

FS x IR, which have different diploid numbers (2n = 47a, 48a and 48a, respectively) or

between PP x IR, which have the same diploid number (2n = 48a; see Table 3).

The exact test of the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) under the assumption of

heterozygosity deficit revealed significant values in seven populations. This deficit of

heterozygotes was suggested by the significant positive values of F

obtained in some

populations (Table 2). Several possibilities may account for the observed deviation from

the HWE and positive significant values of F

, such as nonrandom mating, inbreeding,

null alleles, and population structure (e.g., the Wahlund effect).

Levels of microsatellite variability in populations of C. minutus were high

compared with other species of Ctenomys. In C. minutus we detected 70 alleles for the 5

polymorphic loci analyzed, with a mean of 14 (ranging from 9 to 19) per locus (Table 2).

Mean numbers of alleles per locus reported for other species are: 2.5 (range 2 to 3) for C.

lami (El Jundi and Freitas, 2004), 8.3 (range 6 to 14) for C. rionegrensis (Wlasiuk et al.,

2003), 7.5 (range 3 to 13) for C. haigi (Lacey, 2001), 4.2 (range 3 to 6) for C. flamarioni

(Fernández-Stolz et al., 2007), 2.3 (range 1 to 3) for C. sociabilis (Lacey, 2001), and 2.3 in

C. talarum (range from 2 to 9; Cutrera et al., 2006).

The pattern of isolation by distance, suggested by the significant Mantel’s test (r =

34.86%; P = 0.039) and by the plot (Figure 2) can probably be explained by several

characteristics of C. minutus. This species has a linear-like geographical distribution along

the coastal plain of southern Brazil. When species have a linear distribution, dispersal and

gene flow will be restricted or limited to a single direction. This feature, when associated

with low vagility such as in subterranean rodents, as is the case for tuco-tucos (Smith and

Patton, 1984; Lacey, 2000), can promote the pattern of isolation by distance found here.

The hierarchical analysis of the microsatellite variation suggested that 61.82% of

variation should be attributed to differences among individuals, whereas 6.28% of

variation occurs among groups. This may suggest shared ancestral polymorphisms due to

relatively recent isolation. Alternatively, some shared allele states may be homoplasic.

The results obtained in the present study must be considered with caution because

of the small local sample sizes, such as from the PP population. Nevertheless, the overall

results may truly reflect some characteristics of tuco-tucos, such as the propensity to be

distributed into many, relatively small populations, the use of exclusive territories at the

individual or colony level, limited dispersal, and patchy occupation of the habitat that may

lead to strong geographical structure with variation being partitioned among, rather than

within, populations (Lacey, 2000; Patton and Smith, 1990; Reig et al., 1990; Smith, 1998;

Nowak, 1999; Wlasiuk et al., 2003; Mora et al., 2006).

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Figure 1. Distribution of Ctenomys minutus on the coastal plain of the states of Santa

Catarina and Rio Grande do Sul, Brazil. The distribution of the karyotypes is given.

Asterisks indicate the intra-specific hybrid zones. SJN is the city of São José do Norte.

Sample localities: Jg: Jaguaruna; Jgb: Jaguaruna Beach; Gai: Gaivotas Beach; PsT: Passo

de Torres; Gua: Guarita Beach; Osó: Marechal Osório Park and Weber Ranch; Emb:

Emboaba Lake; For: Fortaleza Lake; Suz: Suzana Lake; Barr: Barros Lake; Pass:

Passinhos; Pit: Pitangueira; PalS: Palmares do Sul; km35: Capivari-Tavares road km 35;

km48: Capivari-Tavares road km 48; km50: Capivari-Tavares road km 50; km53:

Capivari-Tavares road km 53; km64: Capivari-Tavares road km 64; km96: Capivari-

Tavares road km 96; km101: Capivari-Tavares road km 101; km108: Capivari-Tavares

road km 108; km115: Capivari-Tavares road km 115; km125: Capivari-Tavares road km

125 and km final: Capivari-Tavares road km final.

Figure 2. Relationships among pairwise geographical distances and estimates of R

based

on the analysis of five microsatellite loci from C. minutus populations.

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

12345678910111213

Groups recovered

Relative percentage of association

for each population

SWBP

OEW

Gua

GaiP

Figure 3. Results of the structure of groups recovered for the analyses performed in

TRUCTURE 2.2, according to the eleven populations considered in this study. Most of each

group corresponds to a single population. Population abbreviations correspond to those in

Table 1.

Table 1. Localities (with abbreviations) where samples of Ctenomys minutus were

obtained, number of specimens genotyped per locality (N°S), number of individuals per

karyotype (N°K) and population considered abbreviation (P).

Locality N°S N°K P

Jaguaruna (Jg) 4 50a = 4

Jaguaruna Beach (Jgb) 8 50a = 3 / 49a = 5

Gaivota Beach (Gai) 19 46a = 19

Passo de Torres (PsT) 3 46a = 3

GaiP

Guarita Beach (Gua) 17 46a = 17 Gua

Marechal Osório Park (Osó) 4 46a = 4

Weber Ranch (Osó) 16 46a = 16

Emboaba Lake (Emb) 3 46a = 3

OEW

East Barros Lake (Barr) 19 46a = 10 / 47a = 3 / 48a = 6 EB

South Barros Lake (Barr) 17 46a = 3 / 47a = 1 / 48a = 13

West Barros Lake (Barr) 4 48a = 4

Passinhos (Pass) 4 48a = 4

SWBP

Fortaleza Lake (For) 8 47a = 3 / 48a = 3

Suzana Lake (Suz) 2 47a = 1 / 48a = 1

Pitangueira (Pit) 5 48a = 5

Palmares do Sul (PalS) 6 48a = 6

Capivari-Tavares road km 35 (km35) 4 48a = 4

Capivari-Tavares road km 48 (km48) 4 48a = 4

Capivari-Tavares road km 50 (km50) 7 48a = 7

Capivari-Tavares road km 53 (km53) 5 48a = 5

Capivari-Tavares road km 64 (km64) 3 48a = 3

Capivari-Tavares road km 96 (km96) 4 48a = 4

Capivari-Tavares road km 101 (km101) 3 48a = 3

Capivari-Tavares road km 108 (km108) 7 42 x 48a = 7

Capivari-Tavares road km 115 (km115) 3 42 = 3

Capivari-Tavares road km 125 (km125) 2 42 = 2

Capivari-Tavares road km final (km final) 21 42 = 21

Total 202 11

Table 2. Microsatellite genetic variation in C. minutus. Populations (Pop); population sample size (n); mean number of alleles per locus (A);

percentage of polymorphic loci (%P); mean observed heterozygosity per population (Ho) and mean expected heterozygosity per population

(He). Values per locus for each population: number of alleles per population (N

), observed heterozygosity (H

) and expected

heterozygosity (H

). Asterisks indicate statistical significance (P < 0.05). The abbreviations for populations are given in Table 1.

Hai 2 (N = 9) Hai3 (N = 14) Hai 4 (N = 17) Hai 6 (N = 19) Hai 12 (N = 11)

Pop n

A %P F

Ho He

Ni Ho He Ni Ho He Ni Ho He Ni Ho He Ni Ho He

12 5.40 100 0.19 0.53 0.67 4 0.50 0.70 4 0.33 0.48 9 0.75 0.90 5 0.58 0.58 5 0.50 0.70

GaiP

22 6.40 100

0.20* 0.51* 0.74 5 0.70 0.70 6 0.40* 0.78 7 0.25* 0.76 7 0.75* 0.64 7 0.45* 0.81

Gua

17 4.40 100 0.36* 0.30* 0.67 5 0.23* 0.78 5 0.27* 0.79 4 0.07* 0.47 4 0.81 0.61 4 0.14 0.71

OEW

23 5.80 100 0.30* 0.45* 0.74 3 0.43 0.52 6 0.32* 0.76 5 0.52 0.78 10 0.70* 0.87 5 0.30* 0.79

19 5.60 100 0.30* 0.50* 0.67 3 0.31 0.48 4 0.63 0.68 6 0.42 0.73 8 0.42 0.64 7 0.73* 0.80

SWBP

25 5.0 100 0.07 0.54 0.59 3 0.44 0.49 4 0.28 0.32 7 0.48* 0.70 4 0.78 0.73 7 0.72 0.72

10 4.80 100 0.37* 0.40* 0.68 2 0.10 0.52 4 0.70 0.74 8 0.50 0.86 7 0.60 0.84 3 0.10 0.43

11 4.00 100 0.15 0.53 0.66 3 0.54 0.51 3 0.45 0.61 6 0.63 0.83 6 0.73 0.81 2 0.30 0.52

23 7.80 100 0.35* 0.56* 0.82 4 0.17* 0.67 8 0.68 0.83 10 0.50* 0.88 10 0.73* 0.89 7 0.74 0.80

17 7.60 100 0.16* 0.68 0.69 6 0.53 0.77 7 0.70 0.86 10 0.75 0.83 8 0.65 0.70 7 0.76 0.85

23 7.40 100 0.20* 0.54* 0.67 4 0.22 0.34 4 0.39 0.46 10 0.74 0.83 12 0.65* 0.87 7 0.69 0.85

Table 3. Hierarchical analysis of molecular variance for the microsatellite data, for the C.

minutus populations sampled, considering the results for the mitochondrial DNA control

region. The fixation indices (F-statistics) and their respective variance components are

shown. Asterisks indicate statistical significance, P < 0.05.

Source of variation d.f.

Sum of

squares

Variance

components

Percentage

of variation

Fixation

indices

Among

groups

3 51.974 0.09915 6.28 F

= 0.0628*

Among populations

within groups

7 60.400 0.19058 12.08 F

= 0.1289*

Among individuals

within populations

191 305.717 0.31268 19.82 F

= 0.3818*

Within individuals

202 190.000 0.97525 61.82 F

= 0.2428*

Table 4. Gene flow pair estimates based on F

(lower component) and R

(upper component) based on five microsatellite loci for the C.

minutus populations analyzed. Population abbreviations are given in Table 1. Asterisks indicate statistical significance (α < 0.05).

Population Jg GaiP Gua OEW EB SWBP FS PP IR MR FR

0.3000 0.3445 0.0638 0.2164 0.2480 0.2801 0.3566 0.0632 0.2827 0.3086

GaiP

0.21996*

0.3191 0.0767 0.4108 0.3010 0.3861 0.2103 0.2112 0.4263 0.2269

Gua

0.27075* 0.08151* 0.1760 0.5006 0.4172 0.3577 0.2683 0.2203 0.4792 0.3163

OEW

0.15934* 0.07306* 0.12610* 0.2360 0.1313 0.1648 0.1461 0.0398 0.2482 0.1845

0.16287* 0.21354* 0.25760* 0.11468* 0.0975 0.2813 0.3135 0.0750 0.3851 0.4215

SWBP

0.15467* 0.29728* 0.34648* 0.22886* 0.12270* 0.1253 0.1467 0.0344 0.3315 0.2761

0.08220 0.15897* 0.20878* 0.10524* 0.10983* 0.14151* 0.1307 0.0626 0.2063 0.1381

0.13550* 0.16654* 0.27073* 0.10501* 0.12186* 0.16726* 0.05605 0.1307 0.3919 0.1979

0.11489* 0.12290* 0.16456* 0.07032* 0.09980* 0.16143* 0.02854 0.03670 0.1819 0.2303

0.20532* 0.13946* 0.17250* 0.12074* 0.23202* 0.29311* 0.13789* 0.18628* 0.08721* 0.1572

0.27292* 0.14519* 0.29021* 0.18345* 0.25323* 0.34219* 0.18956* 0.21554* 0.16112* 0.17728*

Table 5. Pairwise estimates of the mean number of migrants per generation (Nm) among eleven Ctenomys minutus populations based on

five microsatellite loci.

Population Jg GaiP Gua OEW EB SWBP FS PP IR MR

GaiP

0.88659

Gua

0.67336 2.81697

OEW

1.31893 3.17166 1.73256

1.28498 0.92075 0.72051 1.93006

SWBP

1.36639 0.59095 0.47154 0.84237 1.78749

2.79122 1.32261 0.94741 2.12542 2.02621 1.51664

1.59499 1.25115 0.67342 2.13079 1.80158 1.24471 4.21008

1.92607 1.78413 1.26921 3.30507 2.25506 1.29867 8.50914 6.56230

0.96758 1.54260 1.19927 1.82064 0.82749 0.60292 1.56307 1.09204 2.61654

0.66603 1.47189 0.61143 1.11279 0.73723 0.4806 1.06881 0.90986 1.30161 1.16018

7. DISCUSSÃO

Através deste estudo a variabilidade genética de C. minutus foi caracterizada

permitindo inferências a respeito da distribuição espacial das linhagens filogenéticas

encontradas, e a associação destas com fatores geográficos e polimorfismos

cromossômicos que poderiam propiciar a divergência genética tanto nas populações locais

quanto num contexto filogeográfico.

Ctenomys minutus apresenta uma distribuição geográfica dita como linear, ou seja,

restrita a uma direção. Tal característica quando associada a baixas taxas de dispersão,

como no caso da maioria dos roedores subterrâneos, impõe importantes restrições ao fluxo

gênico, favorecendo a migração apenas entre populações vizinhas, promovendo assim um

padrão de isolamento pela distância (Slatkin e Barton, 1989; Smith e Patton 1984;

Hutchinson e Templeton, 1999; Lacey, 2000).

Para os dados de seqüências da região controladora do DNA mitocondrial

(mtDNA) e para os cinco loci de microssatélites o teste de Mantel apresentou valor

significativo corroborando com o pressuposto de isolamento das populações pela distância.

Estimativas de baixo fluxo gênico, que também apoiam este padrão, têm sido

obtidas para praticamente todas as populações de C. minutus analisadas neste trabalho,

tanto em estimativas utilizando mtDNA quanto para microssatélites.

Levando-se em consideração os valores significativos das estimativas pareadas de

para as populações avaliadas, percebe-se que os valores encontrados para os dados

gerados com as seqüências de mtDNA são, em média, maiores quando comparados com

aqueles dos loci de microssatélites, sendo que para mtDNA a maioria se encontra acima de

0.70 e para microssatélites grande parte dos valores ficam entre 0.10 e 0.34. Este fator

pode revelar uma maior taxa de dispersão dos machos em relação às fêmeas, uma vez que

o mtDNA é sabidamente de herança materna e os loci de microssatélites por serem

nucleares possuem um padrão de herança biparental.

Fernández-Stolz et al. (2007) considerando 3 populações de C. flamarioni

provenientes de toda sua distribuição geográfica encontrou, a partir de estimativas de

divergência entre populações por sexo, valores de F

não significativos para os machos

(entre as populações de Xangri-lá e Remanso), sugerindo que apesar de ambos os sexos

dispersarem, os machos o fazem em maior proporção. Isto poderia ser explicado pelo fato

que, para espécies de distribuição linear (com fluxo gênico restrito entre populações), os

padrões de dispersão diferenciais entre machos e fêmeas são mais fáceis de serem

identificados em populações mais próximas, onde é minimizado o efeito da distância na

divergência genética (Goudet et al., 2002). Na maioria dos mamíferos, os machos

constituem o sexo dispersante e as fêmeas o filopátrico (Greenwood, 1980).

A árvore filogenética reconstruída através da inferência Bayesiana demonstrou

alguns eventos de politomia. Politomias foram anteriormente observadas em outras árvores

filogenéticas utilizando diferentes espécies de ctenomídeos por Lessa e Cook (1998),

Mascheretti et al. (2000), Slamovits et al. (2001), Mora et al. (2006) e Tomasco e Lessa

(2007). Tais autores sugeriram que politomias são devidas à maioria das linhagens terem

sido formadas simultaneamente, passando por um processo de radiação adaptativa.

A observação de que as espécies de tuco-tucos possuem especificidade cariotípica

inicialmente sugeriu um papel de barreira reprodutiva para a diversidade cromossômica.

Contudo, as espécies de tuco-tucos possuem uma distribuição, em geral, parapátrica e,

segundo Steinberg e Patton (2000), o cenário da diversificação em roedores subterrâneos é

o de alopatria. Dessa forma, a evolução cromossômica não seria o fator principal de

diferenciação, mas sim a vicariância. No entanto, polimorfismos cromossômicos foram

descritos em populações de C. perrensi no noroeste da Argentina por Ortells et al. (1990),

Ortells (1995) e Garcia et al. (2000), e segundo estes autores, o polimorfismo em C.

perrensi ocorre de forma neutra e não parece estar relacionado a barreiras reprodutivas. O

mesmo parece ocorrer com C. minutus.

Zonas híbridas intra-específicas entre diferentes cariótipos são recorrentes para a

espécie, e diferentes números cariotípicos ocorrem muitas vezes dentro de uma mesma

população, compartilhando haplótipos de mtDNA. As únicas formas cariotípicas que

parecem atuar como barreiras ao fluxo gênico encontram-se entre os sistemas

caracterizados como “a” (2n = 42, 46a, 47a, 48a, 49a e 50a) e o sistema “b” (2n = 46b,

47b, 48b, 49b e 50b), onde uma inversão pericêntrica no braço curto do cromossomo 2,

encontrada em todo o sistema “b”, parece ser responsável por um possível mecanismo de

isolamento pré-zigótico.

As potenciais barreiras ao fluxo gênico como os rios Araranguá e Mampituba

parecem não exercer esta função, ao menos até o presente momento. A característica de

baixo volume de água associada ao status transitório de suas desembocaduras pode

promover o contato entre populações de margens opostas dos rios, permitindo assim o

fluxo gênico entre elas. Atualmente as desembocaduras dos dois rios encontram-se fixadas

por molhes, porém o tempo transcorrido parece não ter sido suficiente para isolar as

populações dos dois lados.

Os resultados globais obtidos através deste estudo parecem refletir algumas

características associadas aos tuco-tucos, por exemplo, a ocorrência de populações

fragmentadas de tamanho reduzido com espécimes apresentando baixa vagilidade e hábitos

tipicamente solitários (Patton e Smith, 1990; Reig et al., 1990; Smith, 1998; Nowak, 1999;

Lacey, 2000; Wlasiuk et al., 2003; Mora et al., 2006).

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