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ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO E MORFO-FUNCIONAL DAS ATIVIDADES
EPILEPTIFORMES EM DIFERENTES ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO
HIPOCAMPO DE RATOS
Laila Cristina Moreira Damázio
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTIDISCIPLINAR EM FÍSICA, QUÍMICA E
NEUROCIÊNCIA, DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI,
COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO
GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS EM NEUROFÍSICA.
Aprovada por:
________________________________________________
Prof. Dr. Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
(Presidente)
________________________________________________
Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza
________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Mario Arida
SÃO JOÃO DEL-REI, MG - BRASIL
SETEMBRO DE 2007
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DAMÁZIO, LAILA CRISTINA
MOREIRA
Estudo eletrofisiológico e morfo-
funcional das atividades epileptiformes
em diferentes estágios de maturação do
hipocampo de ratos[MG] 2007
XXIII, 82 p. 29,7cm (FIQUINE/UFSJ,
M. Sc., Neurofísica, 2000)
Dissertação – Universidade Federal
de São João del Rei, FIQUINE
1. Medidas experimentais de Fenômenos
Biológicos
I. FIQUINE/UFSJ II. Título (série)
ii
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À Deus, por iluminar meu caminho e me
permitir concluir este trabalho com saúde e
muita alegria.
Aos meus Pais, Fátima e David, pelo amor,
apoio e preocupação. Que a concretização
deste trabalho seja um motivo de orgulho em
suas vidas.
iii
Agradecimentos
Ao Professor Antônio-Carlos Guimarães de Almeida, por orientar com
dinamismo e sabedoria.
Aos Professores, Antônio Márcio e Gilcélio Amaral da Silveira pelo apoio e
colaboração na elaboração deste trabalho.
Às grandes amigas, Maisinha e Fernanda, por estarem sempre dispostas a me consolar
nas horas mais complicadas.
Aos amigos, Fabrício, Victor, Keite, Lucélia e Maísa pela amizade e colaboração na
elaboração deste trabalho.
Aos funcionários José da Silva, Bioterista, e Dona Dalva pelo apoio e amizade.
À Secretária Simone, pela atenção, amizade, solidariedade e carinho com o qual
sempre me tratou.
Aos amigos do LANEC, Prof. Mário Duarte, Prof. Hewerson, Prof. Emerson,
Lívia, Maristela, Bruno, Bibiana, Mariana, Kelison, Mozar, Celso, Gisele, Gláucio,
Aline, Júlio, David, Flávia, Marco Antônio, Carlos, Luiz, Rafaela, Alexandre que
sempre contribuíram para um ambiente de amizade e companheirismo no laboratório.
Aos meus irmãos Rafael e Danilo, por sempre acreditarem em mim, pelo apoio e
amizade imprescindíveis e por proporcionarem um ambiente agradável em minha casa.
À amiga de infância, Luciléia pelas demonstrações de companheirismo e
amizade, apresentando-se sempre como excelente amiga.
Às minhas tias, Márcia, Ida Darc e Dilene, por sempre incentivarem os meus
estudos.
iv
Resumo da Dissertação apresentada à FIQUINE/UFSJ como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (M. Sc.)
ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO E MORFO-FUNCIONAL DAS ATIVIDADES
EPILEPTIFORMES EM DIFERENTES ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO
HIPOCAMPO DE RATOS
Laila Cristina Moreira Damázio
Setembro/2007
Orientador: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
Co-orientador: Gilcélio Amaral da Silveira
Programa: FIQUINE
A distribuição iônica no meio extracelular do hipocampo interfere intensamente
no comportamento das atividades epileptiformes não-sinápticos, sendo a densidade
celular um fator que pode promover mudanças de fração do volume extracelular (α)
levando à alterações dos parâmetros dos registros eletrofisiológicos. Desta forma, o
objetivo do trabalho é analisar a eletrofisiologia das atividades epileptiformes não-
sinápticas, na camada granular do giro denteado do hipocampo de rato, durante o
desenvolvimento neuronal, e comparar com a quantificação celular por marcação
histoquímica. O estudo constou do registro do potencial elétrico extracelular (PE) de
atividades epileptiformes não-sinápticas, induzidas com o modelo zero-cálcio, em fatias
de hipocampo de 66 ratos da raça wistar (fêmeas) nas seguintes faixas etárias: P09-11,
P21-23, P35-37, P49-51, P70-72, P91-93, P111-112, P125-127 e P139-140 (dias pós-
natal). Feitos os registros, as fatias foram re-seccionadas e coradas pelo método de
Nissl, com o cresil violeta, e posterior quantificação das células no entorno do eletrodo
de registro. Os resultados demonstraram que a densidade celular e a fração volume
podem estar associadas às alterações dos grafo-elementos de registros extracelulares de
atividades epileptiforme não-sináptica, durante as faixas etárias que vão até por volta
dos 21 dias pós-natal. A partir de então, associam-se as formações de circuitarias
neuronais, a confluência de diversos mecanismos inerentes ás essas formações que
devem modular de forma complexa os parâmetros eletrográficos.
v
Abstract of Dissertation presented to FIQUINE/UFSJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Master of Science (M. Sc.)
ELECTROPHYSIOLOGICAL AND MORPHO-FUNCTIONAL STUDY OF THE
EPILEPTIFORM ACTIVITIES IN DIFFERENT MATURATION STAGES OF RAT
HIPPOCAMPUS
Laila Cristina Moreira Damázio
September/2007
Advisor: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
Co-Advisor: Gilcélio Amaral da Silveira
Department: Biomedical Engineering
The ionic distribution in the extracellular space of the hippocampus interferes
intensely in the behavior of the non-synaptic epileptiform activities. The cellular density
is a factor that may promote changes on the extracellular volume fraction taking to
alterations of the electrophysiological registration parameters. Therefore, the aim of this
work was to analyze the electrophysiology of the non-synaptic epileptiform activities in
the granular layer of the Dentate Gyrus of the rat hippocampus, during the neuronal
development, and to compare to the cellular quantification by histochemic demarcation.
The study consisted of the registration of the extracellular electrical potential (EP) of the
non-synaptic epileptiform activities, induced with the zero-calcium model, in
hippocampus slices of 66 wistar rats (females) in the following age groups: P09-11,
P21-23, P35-37, P49-51, P70-72, P91-93, P111-112, P125-127 and P139-140 (postnatal
days). After the registrations, the slices were re-sectioned and colored by the Nissl
method, with violet cresil, and posterior quantification of the cells around the register
electrode. The results demonstrated that the cellular density and the volume fraction
could be associated to alterations of the graph-elements of extracellular registrations of
non-synaptic epileptiform activities, till around 21 days of age. Then, the circuitry
neuronal formation were associated, the confluence of several mechanisms that were
inherent to these formations that should modulate in a complex way the electrographic
parameters.
vi
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO..........................................................................................................1
II – REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................3
II.1–
EPILEPSIA...............................................................................................................3
II.2 – A
ESTRUTURA MORFO-FUNCIONAL DO HIPOCAMPO E AS ATIVIDADES
EPILEPTIFORMES
............................................................................................................ 6
II.3 – C
ONEXÕES NÃO-SINÁPTICAS E O ESPAÇO EXTRACELULAR NA INDUÇÃO DE
ATIVIDADES EPILEPTIFORMES
...................................................................................... 11
II.3.1 - Acoplamento eletrotônico (Gap-Junctions) ................................................11
II.3.2 - Efeito efáptico..............................................................................................12
II.3.3 - Efeito de campo elétrico..............................................................................13
II.3.4 - Flutuações Iônicas.......................................................................................14
II.3.5 - O espaço extracelular................................................................................. 14
II.4 – A
MATURAÇÃO NEURONAL DO HIPOCAMPO DE RATOS ....................................... 17
III – MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 23
III.1 – P
REPARAÇÃO EXPERIMENTAL PARA INDUÇÃO DE ATIVIDADES EPILEPTIFORMES
NA CG DO HIPOCAMPO DE RATOS
................................................................................. 23
III.1.1 - Seleção dos animais.................................................................................. 23
III.1.2 - Dissecação ................................................................................................ 23
III.1.3 - Solução fisiológica.................................................................................... 27
III.1.4 - Procedimento para conservação das fatias.............................................. 28
III.1.5 - Equipamentos utilizados para indução de atividades epileptiformes....... 29
III.5.1.1 - Câmara de perfusão.................................................................... 29
III.5.1.2 - Câmara de interface.................................................................... 30
III.2 –
REGISTRO DO POTENCIAL EXTRACELULAR SOBRE A CG DO GIRO DENTEADO DO
HIPOCAMPO
...................................................................................................................33
III.3 - P
ROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ANÁLISE HISTOQUÍMICA DAS FATIAS DO
REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO
................................................................................... 35
III.3.1 - Preparação da fatia do registro eletrofisiológico..................................... 35
III.3.2 - Coloração das fatias ................................................................................. 37
III.4 -
QUANTIFICAÇÃO NEURONAL...............................................................................39
III.5 -
ANÁLISE QUANTITATIVA DO POTENCIAL ELÉTRICO EXTRACELULAR...................42
III.5.1 - Análise quantitativa da amplitude da componente DC............................. 43
III.5.2 - Análise quantitativa da amplitude dos Populations Spikes ...................... 44
III.5.3 - Análise quantitativa da duração dos eventos de AE's............................... 44
III.5.4 - Análise quantitativa dos intervalos entre os eventos................................ 45
vii
IV – RESULTADOS..................................................................................................... 46
IV.1 - A
NÁLISE EXPERIMENTAL DO REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO DAS ATIVIDADES
EPILEPTIFORMES NÃO
-SINÁPTICAS EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS ........... 46
IV.2 - A
NÁLISE QUALITATIVA DA MORFOLOGIA DA CG DO GD, PELA HISTOQUÍMICA, EM
DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS
....................................................................... 54
IV.3 - A
NÁLISE QUANTITATIVA DAS CÉLULAS NA CG DO GD EM DIFERENTES FAIXAS
ETÁRIAS DE RATOS
....................................................................................................... 56
IV.4 - C
ORRELAÇÃO ENTRE OS PARÂMETROS DO REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO
EXTRACELULAR E A CONTAGEM CELULAR EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE
RATOS
...........................................................................................................................59
V – DISCUSSÃO .......................................................................................................... 61
VI – CONCLUSÃO...................................................................................................... 69
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 70
viii
LISTA DE SÍMBOLOS
Símbolo Descrição
α
Fração do volume do espaço extracelular
A
Área (m
2
)
A
gj
Área da gap-junctions
A
m
Área da membrana
d
n
Distância entre o centro do corpo celular neuronal
gj
j
D
Constante de difusão do íon j nas gap-junctions
i
PADP
K
,
Constantes de dissociação de ADP e fósforo
i
ATP
K
Constantes de dissociação de ATP
i
Na
K e
i
K
K
Constantes de dissociação intracelulares de Na
+
e K
+
o
Na
K e
o
K
K
Constantes de dissociação extracelulares de Na
+
e K
+
λ
Tortuosidade
φ
Fluxo iônico (mM/s)
∇
2
Operador Laplaciano
V
i Potencial intracelular
V
m
Vextra
Vintra
Potencial de membrana
Volume extracelular
Volume intracelular
ix
Símbolo Descrição
V
PA
Potencial elétrico no compartimento
∇
ρ
Operador Gradiente
[X]
y
Concentração do íon X no meio y (y = o, extracelular; y = i,
intracelular). ex: [K
+
]
o
[íon]
o
Concentração do íon no meio extracelular
AE´s
Atividades Epileptiformes
BrdU Análago sintético da timidina
C
Concentração iônica (mM)
CA Corno Ammon
Ca Camada
alveus
CE Córtex entorrinal
CG Camada granular
CM Camada molecular
CME Camada molecular externa
CMI Camada molecular interna
Cml Camada molecular-lacunosa
Co Camada
oriens
Cp Camada piramidal
dn
DCX
Distância entre o centro
Marcador endógeno neuronal
DFT Transformada Discreta de Fourier
x
Símbolo Descrição
D
j
Constante de difusão iônica do íon j (cm
2
/s)
EEC Espaço extracelular
ELT Epilepsia do lobo temporal
ELTM Epilepsia do lobo temporal mesial
F
Constante de Faraday (96,487 C/mMol)
Fi Fímbria
GABA
Ácido γ-aminobutírico
GD Giro denteado
H Hilus
IC
IFT
Intervalo de confiança
Transformada Inversa de Fourier
IP Infra-piramidal
LANEC Laboratório de Neurociência Experimental e Computacional
NDN Neurotransmissão por difusão não-sináptica
OMS Organização Mundial de Saúde
Or
Pás
Osmolaridade relativa
Pára-subículo
PE Potencial elétrico
pH
o
pH extracelular
PrS Pré-subículo
xi
Símbolo Descrição
PS´s Population Spikes
SAE Sistema auxiliar de experimentos
SNC Sistema Nervoso Central
SP Supra-piramidal
Sr Stratum radiatum
Sub Subículo
UFSJ Universidade Federal de São João del-Rei
xii
I – INTRODUÇÃO
A epilepsia é o transtorno neurológico grave mais freqüente e que apresenta
recorrências de crises espontâneas (pelo menos uma) não causadas por insultos graves
do sistema nervoso central
(FISHER et al., 2005). A epilepsia é considerada a segunda
maior causa de procura nos centros de atendimentos neurológicos no mundo, desta
forma, os gastos da Organização Mundial de Saúde (OMS) com pacientes epilépticos
continuam tendo grande impacto social. Estudos com modelos experimentais de
indução de atividades epilépticas têm contribuído para elucidar os mecanismos
neurofisiológicos envolvidos na epilepsia.
O hipocampo de rato tem sido estudado largamente em modelos experimentais de
epilepsia, devido a seu denso empacotamento celular e a capacidade de sustentação das
crises epilépticas. A distribuição iônica no meio extracelular do hipocampo interfere
bruscamente no comportamento dos eventos epileptiformes, sendo a maturação
neuronal do hipocampo, após o nascimento, um fator que pode promover mudanças
morfológicas do tecido, levando este a atividades epileptiformes sustentadas por
conexões não-sinápticas.
Após o nascimento, novos neurônios e neuroglias continuam sendo gerados até a
senescência do rato, e este processo, denominado neurogênese, promove mudanças em
todo o encéfalo do animal (KUHN
et al, 1996). De acordo com ALTMAN (1963), na
camada granular do giro denteado do hipocampo de ratos, ocorre um aumento no
volume devido à proliferação de neuroblastos e este processo pode se prolongar de 3 a
11 meses após o nascimento. Outros autores afirmam que a neurogênese se estende por
toda a vida do animal. (SCHLESSINGER
et al, 1975; GOULD et al, 1998; KUHN et
al
, 1996).
Desta forma, o objetivo deste estudo é analisar a eletrofisiologia e a morfologia
celular das atividades epileptiformes não-sinápticas na camada granular do giro
denteado em diferentes estágios de maturação do hipocampo de ratos. O estudo consta
do registro eletrofisiológico de atividades epileptiformes não-sinápticas induzidas em
nove faixas etárias de ratos.
No capítulo II é feita uma revisão da literatura onde foi realizado um breve
histórico da epilepsia, os diferentes tipos, alguns dados epidemiológicos no Brasil e no
mundo, além da descrição dos mecanismos envolvidos. A seguir, é descrita a estrutura
1
morfofuncional do hipocampo na sustentação das atividades epileptiformes (AE’s), com
enfoque no giro denteado e suas lâminas supra-piramidal, ápice e infra-piramidal,
descrevendo a relação do espaço extracelular com os mecanismos não-sinápticos
envolvidos na sustentação das AE’s com protocolo de zero-Ca
2+
. Finaliza-se o capítulo
com a descrição da maturação neuronal em diferentes faixas etárias de ratos
relacionando a neurogênese através de estudos com imuno-histoquímica e histoquímica
para caracterização morfológica do tecido neuronal.
No capítulo III, são apresentados com detalhes, os procedimentos experimentais
para o registro eletrofisiológico, os procedimentos para re-secção das fatias no
vibrátomo e coloração pelo método Nissl. Na seqüência, são expostos os métodos de
análise do potencial elétrico, a quantificação neuronal empregada na histoquímica e os
métodos de simulações computacionais.
Os resultados experimentais são apresentados no capítulo IV com a representação
dos valores encontrados na análise do potencial elétrico extracelular de nove faixas
etárias de ratos. Paralelamente são comparados os registros eletrofisiológicos com a
quantificação neuronal e os resultados das simulações computacionais.
No capítulo V, são discutidos os resultados, a partir dos dados encontrados nas
literaturas, além dos resultados referentes às simulações computacionais.
Já no capítulo VI, são apresentadas as conclusões gerais do trabalho e suas
contribuições no campo dos mecanismos não-sinápticos envolvidos na geração e
sustentação das atividades epileptiformes não-sinápticas.
2
II – REVISÃO DA LITERATURA
II.1 – Epilepsia
Em termos epidemiológicos, a incidência anual de epilepsia é alta. Os dados
epidemiológicos de epilepsia demonstram resultados que variam de 1.5/10004 a
57/10005 habitantes (BORGES
et al, 2004). Na cidade de São Paulo, no Brasil,
11.9/1000 dos indivíduos são acometidos com epilepsia (MARINO et al., 1986).
O impacto econômico da epilepsia se tornou um assunto importante, pois,
segundo os dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), depois da depressão, a
epilepsia é a segunda causa mais freqüente de procura por atendimento nos centros
neuropsiquiátricos e é responsável por 1% dos dias perdidos com doenças em todo o
mundo. (VALENTE
et al, 2004).
A epilepsia, descrita desde os primórdios da humanidade, foi vista como
indicativo de possessão demoníaca ou como acúmulo de humores do mal (CANTILINO
e CARVALHO, 2001). Esta situação perdurou até que Hipócrates (460 a 377 a.C.)
propôs que a epilepsia seria uma doença de origem cerebral. Os documentos desta época
são os primeiros a atribuir causas físicas para as doenças neurológicas (GOMES, 1997).
Hoje, a epilepsia é definida como um transtorno neurológico com crises espontâneas
recorrentes (pelo menos uma), não provocadas por febre, insultos agudos do sistema
nervoso central (SNC) ou desequilíbrios tóxico-metabólicos graves (FISHER
et al.,
2005).
A classificação das crises epilépticas se baseia na descrição clínica das crises,
sendo estas parciais ou generalizadas. Alguns autores também classificam a epilepsia
por sua topografia, como por exemplo, a epilepsia do lobo temporal (ELT), epilepsia do
lobo frontal, etc. (MARCHETTI
et al., 2005).
A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia na
população adulta, sendo responsável por 40% de todos os casos (ENGEL e SHIELDS,
1997; GASTAUT
et al, 1975). A ELT é subdividida em mesial e neocortical ou lateral,
de acordo com a origem e semiologia das crises. (ENGEL, 2001).
A epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) é caracterizada pela esclerose
hipocampal e cerca de 50-70% dos pacientes são refratários (não responsivos) ao
3
tratamento medicamentoso (ENGEL e RASSMUSSEN, 1993). Esse tipo de epilepsia
tem seu início na infância tardia ou adolescência (FRENCH
et al.,1993). A incidência
de epilepsia na população pediátrica é grande. Cerca de 75% dos indivíduos com
epilepsia iniciam as crises antes dos 18 anos. As síndromes epilépticas e suas
manifestações clínicas se modificam com a idade. Nos recém-nascidos, por exemplo,
existe uma incapacidade do SNC em desenvolver crises severas, as denominadas tônico-
clônicas. Isto se deve às mudanças dinâmicas do SNC, desde o nascimento até a idade
adulta (HE e CREWS, 2007; AICARDI e CHEVRIE, 1983). Já as crises febris
(convulsões que surgem depois de uma febre alta) aparecem com mais freqüência entre
os seis meses e os cinco anos de idade (AICARDI e CHEVRIE, 1983), mas estas, como
mencionados anteriormente, não são definidos como epilepsias.
Além dos estudos com indivíduos com epilepsia, existem modelos experimentais
utilizando animais que têm contribuído para o conhecimento dos fenômenos na origem
e sustentação das crises epilépticas (CAVALHEIRO,1991). O desenvolvimento de
modelos experimentais tem as vantagens de permitir controlar as variáveis como:
uniformidade genética, idade, circuitos que podem gerar crises epilépticas,
características dos insultos que podem gerar epilepsia, e tempo entre crises epilépticas,
além de alterações funcionais e estruturais (GUEDES
et al, 2005).
A partir de 1982, TAYLOR e DUDEK, bem como JEFFERYS e HASS, ambos
utilizando fatias de hipocampo de ratos, demonstraram a importância das conexões não-
sinápticas na epilepsia, a partir da indução de atividades epileptiformes (AE´s) por
meio de perfusão com solução contendo baixa concentração de Ca
+2
, bloqueando as
conexões sinápticas. Esse tipo de atividade pode ser facilmente induzida no hipocampo
em função de sua estrutura estratificada, com denso empacotamento de células
neuronais nas regiões de CA1, CA2, CA3, CA4 (Corno Ammon) e GD (Giro
Denteado), com destaque para essa última (figura II.1).
4
Figura II.1 – Esquema representativo de um corte transversal do hipocampo de rato. Os
círculos pequenos formando a curva menor com formato de C invertido representam os
corpos celulares do GD. Os triângulos que formam a curva maior, também em formato
de C, constituem a camada de corpos celulares de células piramidais, as quais
caracterizam o Corno Ammon (CA) (retirado de ENGEL, 1989).
Dentre as diversas áreas do hipocampo, o giro denteado é a que apresenta
eventos epileptiformes (oriundos de atividades neuronais síncronas) com maiores
durações e amplitudes, sob condições experimentais de alta concentração extracelular
de K
+
e baixa concentração de Ca
2+
(PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER,
2000; CARVALHO, 2003). Como mostrado na figura II.2, as AE`s típicas da supressão
de conexões sinápticas são caracterizadas por uma salva de espículas, formadas pelo
disparo simultâneo de potenciais de ação, denominadas de “population spikes” (PS),
superpostas a um deslocamento negativo da linha de base. É comum o emprego do
termo inglês “bursts” para esse tipo de evento com salvas de PS’s. Assim, “bursts” não
sinápticos para aqueles oriundos da supressão de Ca
2+
extracelular.
5
Figura II.2 – Registro de eventos epileptiformes não-sinápticos (salva de espículas formadas
por potenciais de ação síncronos, denominadas Population Spikes, superpostas a um
deslocamentos negativo da linha de base) característicos das regiões do hipocampo,
ap’os perfusão com solução sem Ca
2+
e com alta concentração de K
+
. Na região CA1,
eventos epileptiformes, os bursts apresentam PS´s com grandes amplitudes, na região
CA3, os PS´s ocorrem de forma mais estável e com menor intervalo de tempo entre os
eventos. E no GD, há atividade neuronal intensa, com bursts prolongados e
apresentando variação negativa do potencial extracelular, juntamente com a ocorrência
de PS´s de grandes amplitudes (retirado de DUDEK et al., 1998).
II.2 – A estrutura morfo-funcional do hipocampo e as atividades epileptiformes
Em 1937, James Papez propôs que a formação hipocampal processa as
informações do giro do cíngulo e as envia para os corpos mamilares do hipotálamo via
fórnix. James observou que pacientes infectados com o vírus da raiva apresentavam o
hipocampo afetado, por morte neuronal, levando as alterações emocionais e crises de
terror e fúria. Desta forma, o hipocampo foi incluído como uma estrutura do sistema
límbico, pois, está relacionado como o comportamento e as emoções (KANDEL, 2000).
O hipocampo está localizado medialmente no lobo temporal e relaciona-se com
os estados emocionais, memória e coordenação das atividades do hipotálamo e do
córtex cerebral (figura II.3).
6
Giro do Cíngulo
Núcleo anterior
do tálamo
Formação
Hipocampal
Amígdala
Hipotálamo
Corpo
Mamilar
Córtex Pré-frontal
Córtex Associação
A) B)
Figura II.3 – A) A demonstração anatômica do sistema límbico humano e o hipocampo
conectando com o córtex cerebral; B) O circuito neuronal para as emoções proposto por
James Papez (KANDEL, 2000).
Já em 1989, ENGEL, apresentou estudos que confirmavam a importância do
hipocampo na geração e sustentação de crises epilépticas que abrangem todo o córtex
cerebral. Desta forma, estudos experimentais de indução de epilepsia no hipocampo
surgiram para melhorar a compreensão dos mecanismos neurofisiológicos envolvidos
na epilepsia.
O rato é o mamífero que mais contribui para os experimentos de indução da
epilepsia, pois, possui uma anatomia cerebral muito semelhante à humana. O
hipocampo de rato também está localizado medialmente no lobo temporal dos dois
hemisférios cerebrais, como mostrado na figura II.4.
7
Figura II.4 – Representação esquemática tridimensional do cérebro de rato, onde estão visíveis
os dois hipocampos, dispostos medialmente em cada hemisfério cerebral (modificado de
O’MARA et al., 2001).
A formação hipocampal pode ser dividida em quatro regiões: a
fascia dentata ou
giro denteado (dividido em lâmina infra-piramidal, lâmina supra-piramidal e ápice), o
corno de Ammon (CA) ou hipocampo (dividido em CA1, CA2, CA3 e CA4), o
subiculum (S) e o córtex entorrinal (CE) (GUEDES et al, 2006). Mas, a exemplo de
outros trabalhos, a região do giro denteado (GD), CA e S serão agrupados e
denominados hipocampo (figura II.5).
Ápice
Lâmina Supra-Piramidal
Lâmina Supra-Piramidal
Figura II.5 – No desenho da fatia do hipocampo podem ser identificadas as regiões CA1, CA2,
CA3, S, GD (lâmina supra-piramidal, lâmina infra-piramidal e ápice) e CE.
O Corno Ammon (CA) apresenta sete camadas, sendo as seguintes: camada
molecular, camada lacunosa, camada
stratum radiatum, a camada piramidal, camada
oriens, camada alveus e a camada ou zona epitelial. O Corno Ammon é subdividido em
CA1, CA2, CA3 e CA4, sendo esta última região de transição entre o giro denteado e o
Corno Ammon (LOPES DA SILVA, 1990). No giro denteado, existem dois tipos
principais de vias aferentes: uma glutamatérgica, denominada via perfurante, que se
origina na camada II do córtex entorrinal e termina nos dois terços externos da camada
8
molecular-lacunosa do Corno Ammon e na camada molecular do subículo; a outra via é
colinérgica, proveniente do núcleo septal medial e termina de forma difusa. As
principais fibras eferentes do giro denteado são os axônios das células granulares,
denominadas fibras musgosas, que liberam glutamato, zinco, dinorfina e ácido gama-
amino-butírico (GABA). Estas fibras musgosas realizam sinapse com neurônios
piramidais de CA3 e CA4, interneurônios e células musgosas do hilus (ACSÁDY
et al,
1998; CRAWFORD e CONNOR, 1973). Outra via eferente de grande importância no
giro denteado são as fibras musgosas, que têm origem nas células granulares e projetam
conexão até os neurônios da região de CA3 (LOPES DA SILVA
et al, 1990;
CLAIBORNE et al, 1986). SCHARFMAN et al (2002) demonstraram uma assimetria
no giro denteado, onde o brotamento das fibras musgosas aumenta à medida que
percorre a lâmina supra-piramidal, ápice e vai até a lâmina infra-piramidal. Isto sugere
uma diferença na estrutura e funcionalidade das sub-regiões do giro denteado.
PEREIRA (2005) demonstrou uma assimetria funcional da lâmina supra-piramidal para
a lâmina infra-piramidal, principalmente com relação às interconexões neuronais.
A região de CA3 projeta fibras eferentes denominadas sistema colateral de
Schaffer para a região de CA1 (AMARAL et al, 1989; LOPES DA SILVA et al; 1990).
A região de CA1 envia fibras para todas as partes do subículo (AMARAL et al, 1991).
O giro denteado ou fascia dentata cuja estrutura é laminar e curva, composta por
três camadas de neurônios: a camada granular, que apresenta um denso empacotamento
de corpos celulares com curtos dendritos próximos ao pericário e potencial
transmembrânico de repouso mais negativo que - 65 mV (PAN e STRINGER, 1996); a
camada hiliar ou hilus, composta por neurônios polimórficos como os interneurônios
que liberam GABA e neuropeptídeos e as células musgosas, que liberam glutamato
(SORIANO e FROTSCHER, 1994), e a camada molecular, que é composta por
pericários neuronais, é principalmente por fibras e terminais dendríticos, como
representado na figura II.6 (LOPES DA SILVA
et al., 1990; SCHARFMAN et al.,
2002).
9
Figura II.6 - Desenho esquemático, modificado de O’MARA et al. (2001), da formação
hipocampal indicando várias regiões (corno Ammon, complexo subicular e giro denteado)
e camadas (ca, camada alveus; co, camada oriens; cp, camada piramidal; sr, stratum
radiatum; cml, camada molecular - lacunosa; H, hilus; CG, camada granular; CM, camada
molecular e camadas I, II, III, IV, V e VI presentes no complexo subicular).
SCHARFMAN
et al (2002) observou que os registros dos eventos epileptiformes
no lado IP exibiam
Population Spikes de maiores amplitudes e de maior duração. O
autor sugere que a lâmina IP apresenta maior excitabilidade que a lâmina SP. As
diferenças estruturais e funcionais das lâminas SP e IP advêm da produção assíncrona
de neurônios e dos diferentes estágios de maturação neuronal nas duas lâminas.
Estudos como de AMARAL e WITTER (1989) e LOPES DA SILVA
et al (1990)
identificaram uma distribuição lamelar das principais conexões da formação
hipocampal, onde estas estão dispostas de forma transversal, com um ângulo de
aproximadamente 70 graus em relação ao eixo longitudinal.
O subículo é uma área cortical localizada entre a região de CA1 e o CE, sendo
dividido em três partes: subículo, pré-subículo e o para-subículo (LOPES DA SILVA
et
al
, 1990). O subículo é considerada a região que mais projeta fibras de saída do
hipocampo e o CE que mais projeta fibras para o hipocampo (LOPES DA SILVA
et al,
1990).
O subículo apresenta três camadas principais: a camada molecular, a camada de
células piramidais e a camada polimórfica. A segunda é formada por um largo e denso
empacotamento de células neuronais acompanhados por interneurônios (LOPES DA
SILVA
et al, 1990; O’MARA et al, 2001).
O córtex entorrinal é subdividido em regiões medial e lateral e projeta fibras
principalmente para o giro denteado (via perfurante) e outras projeções das camadas II e
III do CE para a camada molecular do subículo (WITTER e AMARAL, 1991).
10
II.3 – Conexões não-sinápticas e o espaço extracelular na indução de atividades
epileptiformes
A transmissão do impulso nervoso pode ocorrer por dois mecanismos básicos: as
conexões sinápticas e não-sinápticas. A primeira é mediada pela liberação de
neurotransmissores e a segunda pela interação elétrica (KANDEL, 2000). O hipocampo
possui camadas de corpos celulares compactos que favorecem o efeito das conexões
não-sinápticas, por isso é um bom modelo experimental para o estudo dessas conexões.
Estudos demonstraram que as comunicações não-sinápticas também são suficientes para
a geração e sustentação das atividades epileptiformes (TAYLOR e DUDEK, 1982;
JEFFERYS e HAAS, 1982).
Os modelos experimentais para o estudo das conexões não-sinápticas são
realizados por meio do bloqueio das conexões sinápticas, utilizando solução nutriente
com baixa concentração de Ca
2+
. Com isso, os quatro tipos principais de interações
neuronais são: via campo elétrico,
gap-junctions, por flutuações iônicas e acoplamento
efáptico (JEFFERYS, 1995; DUDEK
et al., 1998; XIONG e STRINGER, 2000;
CARVALHO, 2003).
II.3.1 – Acoplamento eletrotônico (gap-junctions)
Pela primeira vez, em 1959, FURSHPAN e POTTER descreveram as
gap-
junctions
como uma nova transmissão não-sináptica, capaz de transferir rapidamente a
atividade elétrica da membrana pré-sináptica para a membrana pós-sináptica. Já em
1970, BENNETT et al, demonstrou que o acoplamento eletrotônico existe em várias
regiões do encéfalo.
As
gap-junctions são grupos de seis conexinas que formam um anel que interage
entre uma célula e outra. As
gap-junctions ligam as membranas de duas células
adjacentes mantendo uma distância de 3,5nm, enquanto que na sinapse química, à
distância entre as membranas é de 30 a 50 nm. Cada
gap-junction forma um canal de
aproximadamente 1,5nm de diâmetro (JEFFERYS, 1995), como mostrado na figura
II.7.
11
Figura II.7 - Desenho esquemático do modelo de interação entre duas células adjacentes via
gap- junctions (retirado de ALBERTS et al.,1994).
As
gap-junctions permitem a passagem de pequenas moléculas e a passagem de
correntes elétricas em ambas direções e esses fatores influenciam a sincronização
neuronal, por meio de pequenos potenciais despolarizantes entre neurônios
(FURSPHAN e POTTER, 1959).
II.3.2 – Efeito efáptico
Efeito efáptico é um tipo de comunicação elétrica entre dois ou poucos
neurônios muito próximos, entre nervos e axônios desmielinizados justapostos (figura
II.8). Isto acontece pelo intenso potencial extracelular que promove despolarização
transmembrânica de neurônios adjacentes (RAMON e MOORE, 1978). A interação
iônica ocorre por meio de flutuações iônicas pelo restrito volume das efapsias. Com
isso, a atuação desta comunicação sobre as AE´s é provocada pelos efeitos das
flutuações iônicas e interação de campo elétrico.
12
Figura II.8 – Diagrama esquemático da interação efáptica entre axônios gigantes de lula que
foram aproximados e submersos em óleo para reduzir o espaço extracelular (mostrado
ao centro). A: O fluxo iônico durante um potencial de ação produz um potencial
extracelular (V
o
), neste caso maior que o potencial intracelular (V
i
). B: a geração de um
potencial de ação em um axônio induz um potencial “pós-efáptico” na célula vizinha.
(retirado de RAMON e MOORE, 1978).
II.3.3 – Efeito de campo elétrico
O efeito do campo elétrico é mediado por fluxos transmembrânicos no meio
extracelular. A resistividade do espaço extracelular pode variar devido a diferentes
fatores, como no hipocampo, onde a resistividade pode aumentar devido a uma redução
local no espaço extracelular e aumento da tortuosidade (MCBAIN
et al, 1990).
A organização laminar com densos pacotes de células neuronais fornece um
ótimo ambiente para grandes campos elétricos (GARDNER-MEDWIN, 1976).
Estudos como de SNOW e DUDEK, 1986; TAYLOR e DUDEK, 1982,
demonstram que o campo elétrico é mais elevado com a inibição das conexões
sinápticas, utilizando solução de perfusão com zero-Ca
+2
(SNOW e DUDEK, 1986;
TAYLOR e DUDEK, 1982). XION e STRINGER (2000) relataram que bloqueando as
gap-junctions durante a indução das atividades epileptiformes ocorre sustentação das
AE’s pela interação do campo elétrico. Estudos sugerem que o efeito de campo elétrico
ajuda a sustentar a sincronização neuronal das atividades epileptiformes, mas não inicia
os eventos (RODRIGUES, 2003).
13
II.3.4 – Flutuações iönicas
No estudo de LUX
et al (1986) foi demonstrado que o aumento das atividades
neuronais resulta em considerável alteração das concentrações iônicas e do espaço
extracelular, por isso as flutuações iônicas estão sendo investigadas na sincronização de
atividades epileptiformes.
O meio extracelular possui vários íons como, K
+
, Ca
2+
e Mg
2+
. O aumento do K
+
extracelular promove despolarização de células vizinhas e eleva a excitabilidade do
tecido (KONNERTH
et al, 1984; PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER,
2000; CARVALHO, 2003).
Os íons Ca
2+
e Mg
2+
no meio extracelular afetam a excitabilidade neuronal pela
blindagem nos canais iônicos da membrana e isso tende a aumentar a atuação do campo
elétrico através da membrana (JEFFERYS e HAAS, 1982). Com a redução extracelular
dos íons K
+
e Mg
2+
também ocorre uma redução na transmissão sináptica (JEFFERYS e
HAAS, 1982).
Já o íon Na
2+
é capaz de atuar na indução de potenciais de ação e o seu influxo
pelos canais iônicos causa a despolarização do potencial transmembrânico. O íon Na
2+
potencializa o efeito de campo elétrico e o acoplamento eletrotônico (LUX
et al, 1986).
II.3.5 – O espaço extracelular
O espaço extracelular (EEC) é composto por neurotransmissores,
neuromoduladores, componentes metabólicos e íons que mudam dinamicamente
durante atividade neuronal, afetando substancialmente a transmissão de informação no
tecido nervoso. Dessa forma, o EEC é um importante canal de comunicação entre
neurônios e entre os neurônios e as células gliais (NICHOLSON, 1979; NICHOLSON e
RICE, 1991; SYKOVÁ, 1992; SYKOVÁ, 1991).
De acordo com NICHOLSON e SYKOVÁ (1998), o cérebro de uma pessoa
adulta tem o equivalente a 15-25 % de volume do EEC em relação ao volume total do
cérebro. Além disso, os parâmetros de difusão no EEC mudam durante atividades
neuronais, o que afeta o movimento de substâncias neuroativas e a comunicação entre
neurônios e glia.
O EEC é composto principalmente por composição iônica. Um exemplo claro é
a composição do fluido cerebroespinhal que é composto por: 141 mM Na
+2
, 124mM Cl
-
14
, 3mM K
+
, 121 mM HCO
-3
, 1.2 mM Ca
2+
e 2.5 mM Mg
2+
(SYKOVÁ, 1983, 1992,
1997).
Os valores absolutos do volume EEC diminuem com a mudança da geometria do
espaço extracelular e isso foi constatado por NICHOLSON e PHILIPS (1981)
utilizando o método de iontoforese. Esse método determinou que a fração do volume do
EEC (α) é igual ao volume EEC dividido pelo volume total do tecido, a tortuosidade do
tecido (λ) é o aumento do comprimento da passagem de partículas por difusão entre
dois pontos da membrana celular.
Recentes estudos demonstram que o volume do espaço extracelular afeta as
correntes da membrana em resposta a mudanças do pico de voltagem, além das células
gliais serem permeáveis ao íon K
+
, permitindo a despolarização da membrana e
conseqüente efluxo de K
+
para fora da célula (BERGER et al, 1991).
Durante o desenvolvimento pós-natal do cérebro do rato, ocorrem mudanças nos
parâmetros de difusão do espaço extracelular. A fração do volume do espaço
extracelular é maior nos primeiros dias pós-natal e isto pode ser atribuído à incompleta
migração neuronal, gliogêneses, angiogênese e à presença de muitos proteoglicans na
matrix extracelular (VORISEK e SYKOVA, 1997).
No cérebro de ratos ocorrem mudanças relativas na fração de volume do EEC
durante o seu desenvolvimento, e isto interfere na diluição de diversas substâncias e
íons no tecido nervoso.
LEHMENKUHLER
et al, (1993) utilizou ratos Wistar de 2 a 120 dias e analisou
o desenvolvimento das camadas do córtex cerebral. Como mostrado nas figuras II.9 e
II.10, observa-se uma diminuição dos valores de α com o aumento da idade do animal e
em especial a camada de número IV que corresponde à camada granular do neocórtex
do rato.
15
Figura II.9 – Gráfico tridimensional da distribuição da fração do volume em função dos dias
pós-natal e as camadas do neocórtex. As setas indicam a camada granular do neocórtex
do rato (LEHMENKUHLER et al, 1993).
Os parâmetros de difusão do EEC variam de acordo com o avanço da idade do
animal. Na figura II.10 é possível identificar variações nos parâmetros da fração do
volume do espaço extracelular e na tortuosidade do tecido. LEHMENKUHLER
et al,
(1993) observa ainda um aumento em todos os parâmetros de difusão ao comparar ratos
de P3 dias com ratos de P120 dias.
Figura II.10 – Representação dos parâmetros de difusão analisados em seis camadas do córtex
cerebral de ratos jovens e adultos. Observam-se diferentes valores para os parâmetros de
difusão (α, λ) nas faixas etárias de, P3, P11, P21 e P120 dias. Os valores são
respectivamente: 158µm, 1100µm; 167µm, 1300µm; 178µm, 1700µm; 165µm e
1900µm (LEHMENKUHLER et al, 1993).
16
O desenvolvimento pós-natal do cérebro de ratos é mais proeminente durante os
primeiros 30 dias de vida (ARENDER e VELLIS, 1989; EAYRS e GOODHEAD,
1959). A gliogênese ocorre durante os primeiros 14 dias e a proliferação de astrócitos
acontece do nascimento até 15 dias de vida. Em seguinda, até 55 dias ocorre diminuição
da diferenciação dos astrócitos (RIOL
et al, 1992). A proliferação dos astrócitos
correlaciona-se com a diminuição do EEC, com o avanço da idade do animal.
A relação do EEC com o desenvolvimento do cérebro de rato afeta o acúmulo de
íons, metabólitos e substâncias neuroativas no EEC. A diminuição do EEC, com o
avançar da idade do rato, aumenta a concentração de todos os íons e outras substâncias
no meio EEC (PHILLIPS e NICHOLSON, 1979; RICE e NICHOLSON, 1987).
O volume do EEC diminui rapidamente em P14 e P21 e isto se deve ao
extensivo período de mielinização. Após P21 ocorre aumento da maturação cerebral do
rato e aumento do raio entre o volume intracelular e extracelular, com conseqüente
aumento da densidade celular, da migração de células, da proliferação axonal e
dendrítica, além da maturação das células gliais (LEHMENKUHLER
et al, 1993).
A sincronização neuronal e as atividades epileptiformes nas fatias do hipocampo
são promovidas pelo aumento do [K
+
]
e
, com isso o reduzido volume do espaço
extracelular promove aumento da concentração de K
+
em animais adultos e aumenta a
sincronização neuronal (TRAYNELIS e DINGLEDINE, 1989; CARVALHO, 2003).
O SNC de ratos imaturos é diferente de ratos maduros pela distribuição de vasos
sanguíneos e pelas células gliais. A vascularização do sistema nervoso de ratos imaturos
ainda é incompleta e a proliferação glial ainda não é restabelecida por completo, o que
aumenta o volume do espaço extracelular (DOBBING, 1963; HENN
et al, 1972).
HEUMANN
et al, (1978) afirma que ocorre proliferação glial até P180 dias, e que isto
contribui para a diminuição da fração do volume do EEC.
II.4 – Maturação neuronal do hipocampo de ratos
No início do século XX ainda era postulado que o desenvolvimento do Sistema
Nervoso Central (SNC) em seres humanos e mamíferos permanecia fixo e não alterava
sua morfologia após o nascimento (KUHN,
et al., 1996, SCORZA et al, 2005 apud
KOELLIKER, 1896). Já na metade do século XX, foi sugerido por alguns
17
pesquisadores a existência de um processo mitótico no encéfalo de ratos após seu
nascimento (HAMILTON, 1901).
Somente nos anos 90, com o desenvolvimento do bromodesoxiuridina - BrdU
(análago sintético da timidina e substitui a mesma na fase S da divisão celular), foi
possível identificar, com maior clareza, o processo de neurogênese (mitose neuronal
após o nascimento) no SNC de algumas espécies adultas como os roedores (ALTMAN,
1965; NOWAKOWSKI
et al, 1989).
Em ratos, na formação hipocampal, principalmente na zona subgranular do giro
denteado (região de encontro da camada granular com o hilus), existem células
progenitoras mitoticamente ativas que geram novos neurônios para a camada granular
(figura II.11). As células granulares do giro denteado são originárias do hilus (GROSS,
2000).
III ventrículo
Hipocampo
Ventrículo Lateral
esquerdo
Figura II.11 – Regiões ventriculares e subgranulares colaborando para a proliferação neuronal
na camada granular do giro denteando de ratos durante a fase adulta (SILVA e
CAVALHEIRO, 2004).
O processo de neurogênese no SNC de ratos sofre influência de diferentes
fatores, como por exemplo: a desnutrição pré-natal diminui o processo de neurogênese,
animais que vivem em ambientes com mais estímulos externos aumentam este processo,
ratos com modelos de diabetes diminuem a proliferação neuronal, exercício físico
aumenta a proliferação neuronal, inflamação reduz a neurogênese e a maior taxa de
estrógeno em ratas adultas estimula a produção de células granulares no giro denteado
do hipocampo (KEMPERMANN
et al, 1997; DEBASSIO et al, 1996; TANAPAT et al,
1999; VAN PRAAG
et al, 1999; JACKSON-GUILFORD et al, 2000; EKDAHL,
18
2003). Em especial, no giro denteado de ratos, a neurogênese é influenciada por
exercício, envolvimento ambiental, envelhecimento, esteróides, neurotransmissores
glutaminérgicos e a morte natural das células neuronais (GAGE
et al, 1998).
De acordo com ISGOR e SENGELAUB (1998) tem sido demonstrado que o
tratamento com estrógeno durante o desenvolvimento afeta o volume das regiões de
CA1 e CA3 do hipocampo. TANAPAT
et al (1999) evidenciou um maior número de
células marcadas com BrdU em ratas adultas em comparação com ratos. Este aumento
no número de células da camada granular do giro denteado de ratas adultas é mais
evidente na fase de proestro (fase de elevação nos níveis de estrógeno) do ciclo
hormonal (figura II.12).
(A)
(B)
Figura II.12 – (A)Estimativa do número de células marcadas com BrdU no giro denteado de
ratas e ratos adultos após dois dias de injeção; (B) Número de células marcadas com
BrdU em ratas adultas fêmeas nas três fases do ciclo hormonal: diestro, proestro e estro.
(TANAPAT et al, 1999).
Por meio de estudos com autoradiografia foi possível demonstrar que a maioria
dos neurônios destinados ao GD são gerados dentro de um período de tempo bem
definido. Mas ainda existem dúvidas sobre o pico da neurogênese e quando este
processo cessa no encéfalo de roedores (ECKENHOFF e RAKIC, 1988).
Vários estudos sugerem que a neurogênese no giro denteado continua a se
estender por toda a vida das espécies de roedores e que mais de 1000 novas células são
geradas por dia na camada granular de roedores adultos (KAPLAN e BELL, 1983;
CRESPO
et al, 1986; BOSS et al, 1985). ALTMAN (1963) afirma que o aumento no
volume da camada granular se deve ao aumento na proliferação de neuroblastos e este
processo pode se prolongar de 3 a 11 meses depois do nascimento. KAPLAN e BELL
19
(1983) confirmam que a proliferação celular na camada granular do GD promove
mudanças na morfologia do tecido no primeiro ano de vida dos ratos.
Em mamíferos, 85% das células da camada granular do GD são geradas no
período pós-natal (ALTMAN e BAYER, 1990). De acordo com SCHLESSINGER
et al
(1975), o pico da neurogênese na camada granular do giro denteado de ratos ocorre nos
primeiros 7 dias pós-natal e continua com intensidade até as três primeiras semanas pós-
natal. Após este período, a neurogênese continua, mas diminui drasticamente
(SCHLESSINGER
et al, 1975; GOULD et al, 1998; KUHN et al, 1996).
No trabalho realizado por HEATHER
et al, (2005) com injeções de BrdU em
ratos jovens até a meia idade foi observado um aumento na proliferação celular da
camada granular do GD com 7 dias pós-natal e diminuição progressiva até 60 dias
(figura II.13).
Figura II.13 – Média do número de células marcadas com BrdU do GD de ratos jovens e de
meia-idade (HEATHER et al, 2005).
A contribuição de células da região ventricular e da zona subgranular ocorre em
ratos com período médio de vida de P58 e P90. (DUFFY e RAKIC, 1983). A partir de
P90, a produção de células (neurônios e glia) é proveniente apenas da zona subgranular
(NOWAKOWSKI e RAKIC, 1981; ECKENHOFF e RAKIC, 1983) A zona subgranular
é progenitora das células granulares através de dois precursores importantes, o primeiro
colabora com a proliferação de neurônios e o segundo com a de células gliais (astrócitos
e oligodendrócitos).
Alguns trabalhos realizados com primatas e roedores demonstram diferenças
abruptas no processo de neurogênese de ambas espécies. Isto pode ser esclarecido pela
20
variação na definição de adulto entre as duas espécies. O hipocampo de primatas
diferencia-se do hipocampo de ratos (KAPLAN e HINDS, 1977; KAPLAN e BELL,
1984). A literatura propõe que a fase adulta de roedores é por volta dos dois meses de
vida (KAPLAN e HINDS, 1977; KAPLAN e BELL, 1984)
A remodelação neuroquímica e neuroanatômica do hipocampo de ratos acontece
até a vida adulta, mas estudos usando modelos de roedores adolescentes têm
demonstrado um aumento na produção de axônios e sinapses durante a adolescência,
isto é devido ao mecanismo natural de plasticidade do cérebro de ratos nesta etapa da
vida (GIEDD
et al, 1999; ANDERSEN et al, 2000; ANDERSEN e TEICHER, 2004).
De acordo com HERRERA et al, 2003, a neurogênese no hipocampo de ratos diminui
drasticamente da adolescência até a fase adulta. No estudo de HE e CREWS (2007) três
espécies de camundongos transgênicos apresentaram aumento do número de células na
camada granular do GD na fase da adolescência em comparação com a fase adulta
(figura II.14).
Figura II.14 – Número de células marcadas com BrdU nas células da camada granular do giro
denteado em camundongos adultos e adolescentes de três espécies diferentes (HE e
CREWS, 2007)
Neste estudo injeções de BrdU em camundongos adolescentes e adultos na
camada granular do giro denteado do hipocampo mostraram um aumento no número de
células dos camundongos adolescentes em comparação com os adultos (figura II.15).
Aplicando outro método da imuno-histoquímica com o marcador endógeno neuronal
(DCX), os camundongos apresentaram, após 30 dias da aplicação um maior número de
neurônios em comparação com os de 120 dias de aplicação. (figura II.16).
21
Figura II.15 – Representação das células marcadas com BrdU no giro denteado do hipocampo
de camundongos. (A) hipocampo de adolescentes em 10X; (B) hipocampo de adultos
em 10X; (C) hipocampo adolescentes em 60X; (D) hipocampo de adultos em 60X (HE
e CREWS, 2007).
(A) (B)
Figuras II.16 – Marcação neuronal no hipocampo de camundongos. (A) após 30 dias de
aplicação; (B) após 120 dias de aplicação.
A partir de estudos de neurogênese no hipocampo de ratos adultos, tem sido
proposto que a neurogênese também continua no cérebro de humanos (KAPLAN, 1985;
NOTTEBOHM, 1985), e que a adição de novos neurônios pode contribuir para o
entendimento dos mecanismos envolvidos no aprendizado, memória e até mesmo na
epilepsia (KAPLAN e BELL, 1984; NOTTEBOHM, 1984, 1985).
22
III – MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos consistiram na indução de
bursts epileptiformes, utilizando o
protocolo de baixo cálcio e alto potássio extracelular, nos quais foi analisado o registro
eletrofisiológico, a histoquímica e a simulação computacional referente a nove faixas
etárias de ratos.
III.1 – Preparação experimental para indução de atividades epileptiformes na CG do
giro denteado
III.1.1 – Seleção dos animais
Para a realização do estudo foram selecionados ratas da raça
wistar, nos quais
foram realizados 66 experimentos, as faixas etárias foram distribuídas da seguinte
forma: P09-11 ( 7 de 9, 10 e 11 dias); P21-23 ( 6 de 21, 22 e 23 dias); P35-37 ( 6 de 35,
36 e 37 dias); P49-51 ( 8 de 49, 50 e 51 dias); P70-72 ( 11 de 70, 71 e 72 dias); P91-93
(7 de 91, 92 e 93 dias); P111-113 ( 8 de 111, 112 e 113 dias); P125-127 ( 6 de 125, 126
e 127 dias); P139-141 ( 7 de 139, 140 e 141 dias).
Os animais, provenientes do Biotério da Universidade Federal de São João Del
Rei, obedeceram a um ciclo claro-escuro de 12 horas (claro: 07:00-19:00), com a
temperatura ambiente constante entre 21 e 22°C. Os ratos foram mantidos em gaiolas
apropriadas, onde tiveram acesso livre à água e comida.
III.1.2 – Dissecação
Dois conceitos são necessários para uma boa preparação das fatias: uma técnica
suave e rápida na dissecação do cérebro, a qual não deve exceder 5 minutos para a
23
retirada de cada hipocampo, e uma adequada acomodação das fatias em solução
nutriente devidamente balanceada em constante oxigenação e sob temperatura
controlada (TEYLER, 1980). A importância da oxigenação já foi ressaltada por
LIPTON e WHITTINGHAM (1979), os quais verificaram que potenciais sinápticos
registrados no GD do hipocampo se extinguem após a exposição das fatias a meios
pouco oxigenados. NICHOLSON e HOUNSGAARD (1983) apontam também a
espessura como fator limitante na oxigenação das fatias. Os cálculos da difusão do O
2
sobre o tecido sugerem que as fatias devem ter no máximo 400 µm de espessura. A
temperatura não tem influência tão crucial durante as preparações (DINGLEDINE et
al
., 1980), mas é comum a utilização de solução semicongelada durante o procedimento,
principalmente para evitar um aumento na intensidade das atividades do tecido e,
conseqüentemente, uma excitotoxicidade. Temperaturas mais elevadas, entre 34 e 36ºC,
podem ter importante relação na conservação das fatias, podendo alterar suas
características de morfologia e influenciar o registro das atividades.
Essas informações sugerem procedimentos indispensáveis à obtenção de fatias
viáveis para o estudo
in vitro.
Diferentes tipos de anestésicos podem ser utilizados e, sempre que possível,
devem ser de rápida reversibilidade, evitando interferências sobre as medidas
experimentais. Com esse intuito, a exemplo de outros trabalhos (GLOVELI. T.
et. al.,
1995 e WIESSINGER F.
et. al., 2000) foi utilizado o éter etílico (comercial), que além
de ser de fácil acesso, tem efeito rápido e eficaz. O éter é aplicado por inalação e produz
respostas rápidas (2 min de administração são suficientes para anestesiar o animal em
plano profundo).
Depois de anestesiados, os animais foram decapitados. Utilizando-se um bisturi,
foi aberto o escalpo de modo a visualizar a parte superior do crânio. O osso occipital,
sobre o cerebelo, foi cortado com ajuda de uma tesoura fina e pontiaguda em ratos
menores de 10 semanas (P70-72). Já em ratos acima de 10 semanas utilizou-se um
alicate específico para o corte da calota craniana. O corte foi então estendido mediana e
lateralmente como mostrado na figura 3.1. Uma pinça foi utilizada para levantar e partir
os ossos cranianos superiores que envolvem o encéfalo. Em seguida, uma espátula
flexível foi inserida por sua base para separá-lo do sistema respiratório medular. Após
ser cuidadosamente retirado, foi, então, depositado em um recipiente contendo solução
24
de perfusão (Ringer Normal – tabela 3.1) oxigenada e resfriada (0 a 2
o
C). A seguir, foi
transferido para uma placa de Pétri contendo filtro de papel, onde foi constantemente
banhado por solução normal, enquanto era dissecado com auxílio de um bisturi
cirúrgico. O cerebelo foi retirado, figura III.2, itens A, B e C, e um corte mediano
ficando separados os dois hemisférios, itens D e E. Enquanto um dos hemisférios foi
dissecado, o outro foi mantido em solução de Ringer gelado. Com um corte inclinado
separou-se a parte frontal do córtex cerebral. Utilizando micro-espátulas especiais, o
tálamo foi removido, figura III.2 item F. Nesse ponto, foi possível distinguir o
hipocampo que fica, em parte, coberto pelo tálamo. As micro-espátulas foram
introduzidas por baixo e nas laterais do tecido, de forma bastante suave e, com
movimentos laterais, pôde-se separá-lo do resto do córtex, figura III.2 itens G, H, I. O
mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério.
Figura III.1 – A remoção do cérebro de rato da cavidade craniana. A) abertura do escalpo; B) o
sentido de corte para a abertura do crânio; C) abertura da calota craniana; D) retirada do
cérebro da cavidade craniana; E) remoção do cérebro para um Becker contendo solução
nutriente resfriada. F) Materiais cirúrgicos necessários para a retirada do cérebro da
25
cavidade craniana e para o isolamento do hipocampo do restante do cérebro de rato.
(modificado de PEREIRA, 2005).
Com o cérebro transportado para uma placa de Pétri, coberta com papel filtro,
iniciou-se o procedimento de isolamento dos hipocampos. Sempre sob banho constante
de toda a estrutura com solução de Ringer normal (descrita no item III.1.3), o cerebelo e
os dois hemisférios cerebrais foram separados utilizando um bisturi. Para dissecação do
primeiro hemisfério, manteve-se sempre o segundo em um recipiente com solução de
Ringer gelada. O procedimento de dissecação foi iniciado com um corte para separação
do córtex frontal, seguido do posicionamento do hemisfério sobre a face de corte. A
seguir, utilizando-se duas micro-espátulas especiais para a remoção do tálamo,
permitindo a visualização da estrutura hipocampal. Introduzindo, cuidadosamente, as
micro-espátulas por baixo e pelas laterais, o hipocampo foi desligado do restante do
córtex. O mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério cerebral. Na figura
III.2, são apresentadas fotos de cada etapa do procedimento descrito.
A)
B)
C)
E) F
D)
H)
I)
G)
Figura III.2 – Preparação de fatias de hipocampo em cérebro de rato. Os itens A, B, C,
D e E mostram os cortes realizados para facilitar a dissecação. No item F é
mostrado um detalhe da separação do tálamo, com ajuda de micro-espátulas. Em
26
G, H e I o hipocampo é isolado do restante do córtex (maiores detalhes no texto)
(Retirado de CARVALHO, 2003).
Após devidamente isolado, o hipocampo, com a face alveolar disposta para
cima, foi levado ao fatiador, onde foi depositado sobre filtros de papel umidecidos com
solução de ringer normal e gelada. Com ajuda de um pincel fino, o hipocampo foi
posicionado de forma a se obter fatias em ângulos de aproximadamente 70º em relação
ao eixo da fimbria. De acordo com TEYLER (1980), cortes nesse ângulo preservam as
conexões intrínsecas do hipocampo (fibras mossy,
Schaffer colateral e axônios da CA1)
intactas, uma vez que em ratos as lamelas (fatias) estão dispostas transversalmente, com
um ângulo de 70
o
, em relação ao eixo longitudinal do hipocampo. Após cada corte,
fatias de 400 µm de espessura foram retiradas do terço médio do hipocampo e colocadas
em uma câmara contendo solução de Ringer normal oxigenado à temperatura de
aproximadamente 32
o
C. É importante que a lâmina do fatiador esteja bem ajustada, de
forma que seu corte alcance metade da espessura do filtro de papel, permitindo um corte
preciso das fatias. Através desse procedimento, entre 15 a 25 fatias foram conseguidas
na preparação de cada hipocampo.
III.1.3 – Solução fisiológica
Para a sustentação das atividades metabólicas do tecido foi utilizada a solução de
perfusão (Ringer Normal). A indução de atividades epileptiformes foi obtida elevando-
se a concentração de K
+
e zerando-se a concentração de Ca
2+
da solução normal. No
presente texto, denominaremos a segunda solução de “solução de indução” (tabela 3.1).
27
Tabela 3.1 – Composições das soluções de perfusão e de indução utilizadas nos
experimentos com hipocampo de rato (valores em mM).
Substância Solução de
Perfusão (Normal)
Solução de
Indução
NaCl 127,0 127,0
KCl 2,0 7,0
MgSO
4
*
1,5 1,5
NaHCO
3
26,0 26,0
KH
2
PO
4
1,1 1,1
Glicose 10,0 10,0
CaCl
2
*
2,0 0,0
*
sais adicionados após o ajuste do pH em 7,4
Para evitar floculação, o pH foi ajustado para 7,4, por meio de borbulhamento
com carbogênio (95% O
2
e 5% CO
2
), antes da adição de sais contendo íons divalentes.
Após a adição desses, é feita a correção final para o volume perfundido e a solução é
mantida continuamente borbulhada com carbogênio.
III.1.4 – Procedimento para conservação das fatias
Determinados procedimentos podem ser adotados para uma melhor conservação
das fatias. Variações de temperatura, por exemplo, acima de 32
o
C, são críticas e devem
ser evitadas ou corretamente empregadas no decorrer do experimento. Destoante à etapa
de dissecação, onde foram empregadas temperaturas relativamente baixas, próximas de
0
o
C
, o restante do experimento foi realizado em temperaturas mais elevadas, entre 31 e
34
o
C. Para contornar esse problema e amenizar os efeitos causados pela temperatura,
preservando as características morfológicas do tecido, alguns procedimentos foram
adotados.
28
Após o fatiamento, as fatias foram conduzidas para a câmara de perfusão, onde
foram mantidas rigorosamente sob temperatura de 31,5
o
C, durante 40 minutos, como
referenciado no item III.1.5.1. Em seguida, as mesmas foram transferidas para a câmara
de interface (item III.1.5.2.), onde as atividades epileptiformes foram induzidas. A
temperatura na câmara de interface foi previamente igualada à temperatura da câmara
de perfusão. Um detalhe importante deve ser mencionado: como as fatias foram
transferidas de um recipiente a outro, normalmente com auxílio de conta-gotas, esse
instrumento deve também ser mantido à mesma temperatura, a fim de evitar choque
térmico.
Iniciada a perfusão, com solução em alto K
+
e zero-Ca
2+
, a temperatura foi
elevada gradativamente até 33,5
o
C, ao longo de 60 min, novamente, a fim de evitar
choque térmico.
Outro fator importante observado na prática experimental: ao se transferir as
fatias para a câmara de interface, foi necessário elevar o nível da solução acima do nível
da membrana que a sustenta. O tecido fica, então, submerso por até 15 min, antes de se
iniciar o registro das atividades. Em seguida, o nível da solução foi reduzido novamente
de modo a ajustá-lo ao nível da rede. Esse procedimento evita que as fatias fiquem
precocemente ressecadas e acelera os efeitos da solução de interesse sobre o tecido
(CARVALHO, 2003).
III.1.5 – Equipamentos utilizados para indução de atividades epileptiformes
III.1.5.1 – Câmara de perfusão
A câmara de perfusão é um recipiente intermediário para repouso das fatias. A
câmara foi fabricada com conexões e tubos em PVC, os quais são arranjados formando
uma estrutura em U (figura III.3). A região de maior diâmetro consiste em um
compartimento subdividido por uma rede de nylon, sobre a qual as fatias descansam.
Todo o sistema foi preenchido com solução normal continuamente oxigenada, com
fluxo que foi estabelecido pelo borbulhamento com carbogênio, que permitiu uma
perfusão suave e adequada das fatias. O pH da solução foi também mantido constante,
29
em torno de 7,4, devido à saturação promovida pelo carbogênio. As fatias foram
mantidas submersas nessa câmara por no mínimo 40 min. Após esse período, as fatias
estavam aptas ao protocolo de indução da atividade epileptiforme na câmara de
interface.
Solu
ç
ão
Rede de
nylon
Água com
temperatura
controlada
Entrada de
carbogênio
Figura III.3 – Diagrama esquemático da câmara de perfusão montada com tubos e conexões
em PVC. A câmara é preenchida com solução de perfusão, mantida sob temperatura e
oxigenação constante. As fatias são depositadas no ramo de maior diâmetro sobre uma
rede de nylon.
III.1.5.2 – Câmara de Interface
A indução da atividade epileptiforme, bem como os registros, foram feitos em
uma câmara de interface. Existe uma ampla variedade de câmaras de interface. A
câmara utilizada nos experimentos de indução de atividade epileptiformes foi a mesma
utilizada por CARVALHO, 2003. A câmara (figura III.4) consiste de dois módulos
acopláveis: a cuba (figura III.5) e o banho-maria conectados a uma mesa estática . O
banho-maria é composto de 4 resistores cerâmicos de 5 Ω, 20 W de dissipação, ligados
em paralelo, encerrados em invólucros de vidro, e dois borbulhadores que dispersam
carbogênio no interior do recipiente (figura III.4). Os resistores são submetidos a
tensões contínuas até 12 V que fornecem o aquecimento da água do banho. As tensões
são controladas via software desenvolvido em plataforma LABVIEW 6.1 (NATIONAL
INSTRUMENTS), através de um programa desenvolvido especialmente para esse tipo
30
de controle. A intensidade da tensão foi calculada de acordo com a temperatura
desejada. A interface, software/módulo, foi estabelecida por meio de uma placa AD/DA
(modelo PCI-6071E – NATIONAL INTRUMENTS) e um módulo de controle
eletrônico (vide apêndice). O equipamento é capaz de manter temperaturas constantes
no entorno de 32
o
C. A água contida no banho-maria aquece as paredes do tubo,
enrolado ao cilindro central no interior do recipiente, que conduz a solução normal para
a cuba, permitindo a perfusão das fatias com a temperatura da solução devidamente
controlada. Tubos de silicone conduzem o oxigênio ao interior do banho-maria. Os
borbulhadores dispersam o carbogênio dentro da água, sendo assim aquecido e
umidificado para, a seguir, ser direcionado sobre a face superior das fatias mantidas na
cuba.
A cuba é composta por 2 cilindros e uma base em acrílico, acoplada
superiormente ao banho-maria (figura III.5). O cilindro central, onde se encontra a rede
de nylon para deposição das fatias, possui um volume bem reduzido, de
aproximadamente 0.34 ml, permitindo que toda a solução em contato com as fatias seja
constantemente renovada. O nível da solução pode ser controlado por meio de sucção
com ajuda de uma bomba peristáltica (modelo PD5002 – HEIDOLPH). A base em
acrílico apresenta alguns pequenos orifícios para que o carbogênio, depois de atravessar
o banho maria, possa, já umidificado, atingir as fatias.
Uma tampa em forma de disco encobre o ambiente em torno das fatias,
permitindo uma melhor oxigenação e contribuindo para homogeneizar a temperatura no
interior da cuba. A tampa contém um orifício central que permite a inserção dos
eletrodos de medida e de estimulação, bem como a exaustão do carbogênio. São comuns
problemas com a condensação na superfície interna da tampa e na ponta do eletrodo de
medição. Precipitações do condensado sob a tampa podem alterar a osmolaridade do
meio e prejudicar a manutenção das fatias. O mesmo pode ocorrer com o eletrodo de
medição. A formação de gotas de água na ponta da micropipeta, que compõe o eletrodo,
prejudica a aquisição do sinal e pode até, caso venha a escorrer, lesionar localmente o
tecido. Para solucionar esse problema, filtros de papel são colocados sob a tampa e
enrolados nos eletrodos de aquisição de modo a conter a condensação.
31
101
9
2
4
5
6
8
7
3
1
Figura III.4 – Diagrama esquemático da câmara de interface (banho-maria e cuba). Em 1, tem-
se a repesentação do tubo de silicone que conduz o carbogênio para o interior da
câmara, em 2 , um dos dois borbulhadores de oxigênio existentes na câmara, em 3, está
representada uma das quatro resistências envolvidas em envólucros de vidro, em 4 tem-
se o tubo de silicone que conduz a solução até as fatias. Em 5 está representada a cuba
que pode ser vista em maiores detalhes na figura 3.5, em 6, a rede de nylon que sustenta
as fatias, em 7 tem-se o tubo para sucção da solução, em 8, o terra da solução, em 9 o
disco de acrílico com um orifício ao centro, que recobre a cuba e finalmente em 10
estão representadas as lentes do microscópio posicionadas ao centro da câmara de
interface.
32
1
2
4
7
6
3
5
Figura III.5 – Esquema da cuba utilizada para indução das atividades epileptiformes. As fatias ,
em 1, são sustentadas por uma rede de nylon posicionada sobre o cilindro central
representada em 2 . Em 3, tem-se a representação dos orifícios na base da cuba, que
permitem que o oxigênio, depois de umidificado e aquecido, atinja as fatias, em 4, está
representado o canal por onde a solução chega às fatias, em 5 , o tubo por onde ocorre a
sucção da solução. Em 6 tem-se a representação do fio terra da solução, e finalmente,
em 7 tem-se a representação do têrmometro que controla a temperatura da solução que
chega às fatias.
III.2 – Registro do potencial extracelular sobre a CG do giro denteado do hipocampo
Para aquisição dos sinais do potencial elétrico extracelular (PE), foi utilizado um
eletrodo formado por filamentos de prata e micropipeta de vidro (modelo THINWALL,
TW150F-3 – WPI). A pipeta foi estirada em um puxador de pipetas (modelo DMZ
UNIVERSAL PULLER – ZEITZ-INSTRUMENTS) e preenchida com solução de NaCl 1,0 M,
com impedância final de 5 a 10 MΩ, suficiente para proporcionar um baixo nível de ruído. Os
filamentos de prata foram cloretados para se evitar o efeito de bateria provocado pela
acumulação de cargas na interface metal-líquido. Após cloretado, o eletrodo foi conectado a
uma headstage (modelo AI 402 х 50, ULTRALOW NOISE AMPLIFIER – AXON
INSTRUMENTS) interligada a um amplificador (modelo CYBERAMP 380 – AXON
INSTRUMENTS) para a aquisição do sinal. O programa SAE (Sistema Auxiliar de
33
Experimentos), desenvolvido no LANEC (SILVA, 2000), foi utilizado para controle do
amplificador, digitalização, exibição em tempo real e armazenamento em arquivos. A
amostragem do sinal é feita na taxa de 10.000 amostras por segundo, o sinal é amplificado 500
vezes e é utilizado um filtro para redução do ruído de fundo. O processamento do sinal é então
feito off-line. O programa MATLAB 6.0 (MATHWORKS) é utilizado como saída gráfica. O
computador empregado na aquisição e processamento dos sinais é um Pentium III de 1 GHz e
512 MB de RAM..
Um microscópio estereoscópico (modelo PZMTII-L – WPI), que possui várias oculares
e um par de objetivas, permitindo uma ampliação de até 225х, foi utilizado para visualização
das fatias. A distância focal e o campo de visão máximo são de 314 mm e diâmetro 110 mm,
respectivamente. No intuito de manter a câmara de interface fixa, a montagem do microscópio é
feita sobre uma mesa XY, independente da câmara, permitindo ajustar o campo visual, sem
mover a câmara. Dessa forma, o microscópio varre toda a extensão da membrana onde se
encontram as fatias, permitindo uma melhor visualização de suas camadas, sem o inconveniente
de deslocar o eletrodo, quando da mudança do campo visual.
Uma luz gerada na parte inferior do microscópio, abaixo da câmara de interface,
atravessava esta, atingindo as fatias, permitindo uma melhor visualização das camadas. O
posicionamento do eletrodo sobre o tecido foi feito com o auxílio de um micro-manipulador
mecânico (modelo KITE-L – WPI), permitindo a inserção do eletrodo na fatia e na posição de
interesse (no caso, o giro denteado), com o mínimo de lesão.
Para minimizar as vibrações mecânicas durante os experimentos, utiliza-se uma mesa
anti-vibração, que consiste em um tampo de pedra suspenso por câmaras de ar, onde são
dispostos os equipamentos. As câmaras de ar permitem ajustar o nível de trabalho da mesa. No
intuito de isolar os equipamentos de possíveis interferências eletromagnéticas, a mesa é
envolvida por uma gaiola de Faraday.
A captura das imagens, para obtenção do sinal óptico intrínseco, contou com a seguinte
montagem experimental: a luz branca, gerada na parte inferior do microscópio por uma lâmpada
(PHILIPS – Projection Lamp, 6 V e 20 ou 30 W), passava por dentro da câmara de interface e
atingia a fatia do hipocampo. Uma binocular acoplada à câmera de CCD (modelo COOLSNAP
PROcf) foi responsável pela captação da luz transmitida (luz que atravessa a fatia). As imagens
captadas pela câmera de CCD foram gravadas em fitas de vídeo, por meio de um vídeo cassete
(PHILCO – Hi-Fi Stereo, 7 head) conectado a uma televisão (LG – modelo CP-14K40). A taxa
de amostragem do vídeo é de 30 imagens por segundo.
Para observar as AE´s, o ganho do microscópio foi ajustado de forma que o giro
denteado da fatia preenchia o máximo possível o campo visual. Para os diversos ganhos do
34
microscópio, foram registradas imagens de uma régua graduada para determinar a densidade de
pixels por mm. Na figura III.6, está representado o conjunto acima descrito.
Figura III.6– Diagrama esquemático do setup experimental para o registro simultâneo do PE e
do IOS durante as AE´s e a DA em fatias do hipocampo. O PE é registrado a partir do
posicionamento do eletrodo de registro no GD. O eletrodo é conectado a uma headstage
por meio de um holder. A headstage é interligada a um amplificador biológico. Os
sinais são armazenados em um computador. Para o registro do IOS, as fatias são
iluminadas pela luz gerada na base do microscópio. Uma binocular acoplada à câmara
de CCD captura a luz transmitida. As imagens são gravadas em fitas de vídeo.
III.3 –Procedimentos experimentais para análise histoquímica das fatias do registro
eletrofisiológico
III.3.1 – Preparação da fatia do registro eletrofisiológico
A fatia do registro eletrofisiológico foi transferida depois do experimento para
uma solução contendo paraformaldeído (4%) por 12 horas. O paraformaldeído permite a
fixação das estruturas morfológicas do tecido.
Para preparar o paraformaldeído foi necessário manter sob agitação, até
dissolver, a solução formada por 170 ml de água destilada e 4,10g de fosfato de sódio
35
dibásico Na
2
HPO
4
.2H
2
0. Depois que a solução dissolveu, foi adicionado 8,0 g de
paraformaldeído, a qual foi aquecida até 58ºC. Logo em seguida, foi adicionado 1,24g
de NaH
2
PO
4
.H
2
O dissolvido em 30ml de água destilada. A solução foi coada e mantida
sob temperatura de 4
o
C.
Após a fixação da fatia, a mesma foi lavada 2 vezes por 5 minutos em solução de
tampão fosfato (PBS 0,1M) constituído por: 11,4g Fosfato de sódio dibásico
(Na
2
HPO
4
.2H
2
0), 2,6g de Fosfato de sódio monobásico (NaH
2
PO
4
.H
2
O), 0,2g de KCl e
8,0g de NaCl, dissolvidas em 500ml de água destilada e posteriormente completada
para 1000ml.
Para o re-seccionamento da fatia de 400µm em fatias de 10µm, esta precisa ser
emblocada em ágar.
O ágar foi preparado com 1,25g de ágar e 25ml de água destilada,
mantido sob agitação e aquecimento (150
o
C) até transformar-se em uma substância
gelatinosa. A fatia foi posicionada sob uma lâmina de alumínio até que o ágar resfriasse
um pouco. Após o resfriamento, a fatia foi coberta com o ágar, formando um bloco
compacto (fig. III.7).
Figura. III.7. – Fatia do registro eletrofisiológico emblocada em ágar.
O vibrátomo da marca
Leica foi utilizado para o re-seccionamento das fatias de
400µm em fatias de 10 µm. O bloco, contendo a fatia, foi fixado por meio da substância
Cyanacryla (Gefahr), em um porta blocos posicionado dentro da câmara, à frente da
lâmina de corte do vibrátomo, como mostrado na fig. III.8.
Dentro da câmara do vibrátomo foi colocada a solução de tampão fosfato (4ºC)
e, ao redor, cubos de gelo para manutenção de baixas temperaturas.
36
Figura III.8 – Equipamento vibrátomo (marca Leica) com a câmara envolvida com cubos de
gelo e a fatia posicionada à frente da lâmina de corte do equipamento.
Em média, seis fatias de 10µm foram posicionadas, com cuidado, por um pincel, na
lâmina histológica previamente gelatinizada.
Para a preparação das lâminas gelatinizadas, foi necessário banhá-las em solução de
gelatina histológica contendo: 3,0g de gelatina e 0,30g de cromopotássio de sulfato
dodecaidrato (kromalium) diluído em 600 ml de água destilada, mantida sob agitação na
temperatura de 60º C. Logo, a solução foi filtrada e esfriada.
As lâminas histológicas foram posicionadas em cestinhas de vidro e mergulhadas na
solução de gelatina histológica. Antes de serem utilizadas, as mesmas permaneceram secando
por, respectivamente, 24 e 12 horas, em temperatura ambiente, na capela (Sppencer).
III.3.2 – Coloração das fatias
O processo de coloração pelo método nissl consiste na imersão da lâmina com as
fatias histológicas em solução de cresil violeta para marcação dos nucléos e nucléolos
neuronais.
37
Inicialmente, a lâmina com as fatias foi posicionada na cestinha para posterior
imersão nas soluções. Foram preparadas oito cubetas contendo 200 ml das respectivas
soluções: água destilada, acetato de cresil violeta (synth), álcool etílico absoluto 70% –
PA (synth), álcool etílico absoluto 95% - PA (synth), álcool etílico absoluto 100% - PA
(synth) e xilol – PA (synth), como mostrado na fig. III.9.
Figura III.9 – Capela (Sppence) com as cubetas contendo 200ml das substâncias utilizadas nos
procedimentos de hidratação, coloração, desidratação e diafanização.
A cestinha, contendo as lâminas, foi imersa, por 5 minutos, na água destilada
para hidratação e 35 minutos no cresil violeta para coloração dos núcleos e nucléolos.
Em seguida, foi mergulhada 2 vezes no álcool 70%, 7 vezes no álcool 95%, 7 vezes no
álcool 100%-1 e 7 vezes no álcool 100%-2 para desidratação. Posteriormente, 1 minuto
no xilol – 1 e 5 minutos no xilol – 2 para diafanização (fig. III.10). Finalizando, as
lâminas, contendo o material histológico corado, foram protegidas com a deposição da
lamínula fixada pelo entellan (Merck).
Figura III.10 – Imersão da cestinha com a lâmina histológica na cubeta contendo 200ml de
xilol-PA (synth).
38
Após a fixação da lamínula, a lâmina permaneceu secando por 12 horas dentro
da capela (figura III.9). Todo o procedimento de coloração foi realizado dentro da
capela com o exaustor (sppencer) ligado.
III.4 – Quantificação Neuronal
A quantificação neuronal foi realizada a partir de um programa para contagem
de células elaborado no LANEC (Laboratório de Neurociência Experimental e
Computacional) no programa Matlab 7.0. No fluxograma apresentado na figura III.11, é
demonstrada, de forma resumida, a ordem com que foram aplicados os procedimentos
para contagem de células.
Inicialmente, a imagem de cada secção do registro eletrofisiológico, capturada
pela câmara de CCD e gravada em fitas de vídeo VHS (capturadas numa taxa de
amostragem de 30 Hz, a uma resolução de 640x480 pixels), foi digitalizada por meio do
programa Pinnacle Studio (versão 8.10) e, subseqüentemente extraído o quadro em
formato JPEG. Em seguida, realizou-se o ajuste do foco da lâmina na base do
microscópio e preenchem-se os dados do experimento a ser quantificado. Seguiu-se a
captura, sobreposição das imagens, seleção da região do eletrodo e centralização do
mesmo, como demonstrado na fig. III.12. O aumento do microscópio é alterado para
40x, centralizou-se novamente a imagem na TV, retornou-se o aumento para 5x, e com
o mouse selecionou-se o centro de referência. A imagem da secção ajustada no
microscópio, inicialmente com um aumento de 5x, foi retornada para o aumento de 40x.
O motor de passo do microscópio é acionado no momento que a imagem é
ajustada ao ponto zero da contagem. Essa ferramenta possibilitou avançar ou retroceder
dentro da fatia com maior precisão.
39
MARCAÇÃO
DAS
CÉLULAS
EMISSÃO
DO RELATORIO
DA
CONTAGEM
CONTAGEM
DE
CÉLULAS
CAPTURA
DA IMAGEM
PREENCHIMENTO
DOS DADOS
PARA O
RELATÓRIO
PROGRAMA
CONTAGEM
DE
CÉLULAS
Figura III.11 – Fluxograma que indica a ordem em que foram aplicados os procedimentos para
a contagem de células.
Percorreu-se a espessura especificada anteriormente (40µm) e em cada foco (4
focos de 10µm) ocorreu a gravação de uma imagem. Uma área de raio de 50µm foi
selecionada pelo programa. Esta área foi ampliada e dividida em quatro quadrantes, para
subseqüente marcação dos nucléolos das células com o mouse (fig. III.13).
40
(A)
(B)
Figura III.12 – Esquema da captura das imagens para marcação do local de registro do
eletrodo. (A) Microscópio e a imagem capturada pela câmara de CCD. (B) Imagem
capturada da fita de vídeo VHS e posteriormente digitalizada pelo programa Pinnacle
Studio, e subseqüente marcação do local da ponta do eletrodo.
(B)
(A)
Figura III.13 – (A) Imagem de um raio de 50µm selecionada e dividida em quatro quadrantes
pelo programa para a contagem de células. (B) Imagem ampliada de um quadrante com
as células grandes marcadas com círculos vermelhos, células médias marcadas com
quadrados azuis e células pequenas marcadas com cruzes pretas.
41
O programa permitiu ampliar cada quadrante, para marcação das células
coradas, classificadas de acordo com seus tamanhos em: grandes, médias e pequenas.
As células grandes foram demarcadas com círculos vermelhos, as células médias com
quadrados azuis e as células pequenas com cruzes pretas. Em seguida, o programa
permitiu quantificar as células demarcadas, com emissão do relatório final da contagem
(Fig. III.14).
Figura III.14 – Relatório final da quantificação neuronal de uma secção de 10µm de um rato de
P21-23 dias pós-natal
A partir da contagem do número de células, foi possível obter a densidade no
entorno do eletrodo (50µm), dividindo o número de células pelo volume do tecido. Para
calcular o volume do tecido, multiplicou-se a área de contagem pela espessura da fatia.
III.5 – Análise quantitativa do potencial elétrico extracelular
Para análise quantitativa do PE, foram observados parâmetros como: amplitude
da componente DC, amplitude dos populations spikes, duração dos eventos de AE´s e
intervalo entre eventos dos quatro primeiros arquivos de cada experimentos. Isto se
deve ao fato de ocorrerem mudanças nos eventos epileptiformes ao logo do
42
experimento, mudando a conformação dos mesmos com o tempo. O período de latência
das AE´s também foi medido a partir do intervalo entre o início da perfusão das fatias
na câmara de interface com solução de alta concentração de K
+
e baixa concentração de
Ca
+2
(solução de indução) até o início dos registros das atividades epileptiformes.
Com a ajuda do MATLAB, versão 6.5, foram desenvolvidos no LANEC
programas para leitura e análise dos arquivos contendo os potenciais elétricos
registrados durante os experimentos, conforme procedimentos descritos a seguir.
III.5.1- Análise quantitativa da amplitude da componente DC
A Transformada Discreta de Fourier (DFT) foi utilizada como ferramenta e
aplicada ao sinal do potencial extracelular, para separar a componente DC dos PS´s, que
juntas formam os burst`s epileptiformes.
Assim, a partir do cálculo da DFT do sinal elétrico (exemplo ilustrado pela fig.
III.15), foi possível cortar a freqüência baixa, abaixo de 10 Hz, que corresponde à
componente DC, pois o sinal, cujos componentes têm freqüência alta, corresponde aos
eventos population spikes. Posteriormente, fazendo a Transformada Inversa de Fourier
(IFT), foi obtido o sinal contendo apenas a componente DC, sem os PS`S.
Figura III.15- Procedimento para obtenção da componente DC. A) O sinal completo de um
burst contendo a componente DC e os PS´s. B) O sinal elétrico após a aplicação da
Transformada de Fourrier, indicando o espectro de frequência amplitude. A
frequência foi cortada abaixo de 10 Hz. C) O sinal elétrico da componente DC livre
dos PS´s. A componente DC é a variação máxima do sinal em relação a linha de base
(linha pontilhada).
43
Uma vez obtida a componente DC, a linha de base foi determinada pela média
de um trecho do PE antes do evento. Assim, a amplitude da componente DC foi obtida
como sendo a variação máxima do sinal em relação à linha de base.
III.5.2- Análise quantitativa da amplitude dos Populations Spikes
Para o cálculo da amplitude dos PS´s, foi feita a subtração do sinal completo,
que corresponde ao burst ( DC + PS´s), pelo sinal sem os PS´s (sinal da componente
DC). Restando apenas o sinal correspondente à alta freqüência, calculou-se seu módulo
e depois a integral, obtendo-se assim, os valores de contribuição dos PS´s nos burst`s.
Na figura III.16 tem-se a ilustração desses procedimentos. A partir do cálculo dos PS’s
foi obtida a amplitude do maior PS (PSmax.).
Figura III.16- Representação do procedimento adotado para obtenção da amplitude dos PS`S.
Em A) observa-se o sinal completo, em B) observa-se o sinal da componente DC,
que será subtraído do sinal completo e, em C), observa-se o resultado da subtração,
que é o sinal referente aos PS`s.
III.5.3- Análise quantitativa da duração dos eventos de AE´s
A partir da linha de base e do sinal da componente DC, a duração dos eventos
foi calculada. Para isso, foram adotados os instantes tfinal e tinicial, que estão
representados na figura III.17. Sendo que, o instante de tempo inicial foi considerado
quando o sinal atingiu uma variação de 20 % da amplitude máxima, em relação à linha
de base, e, o instante de tempo final, quando o sinal retornou a 20 % da amplitude
máxima em relação a linha de base. Subtraindo-se tfinal de tinicial, foi o obtida a
duração do evento.
44
Figura III.17- Exemplo da técnica utilizada para o cálculo da duração do evento. Subtraindo-se
o instante tfinal pelo instante tinicial (maiores detalhes no texto), encontra-se a
duração do evento de atividade epileptiforme.
III.5.4- Análise quantitativa dos intervalos entre os eventos
Para o cálculo do intervalo entre os eventos foram adotados os mesmos
parâmetros de identificação do instante de tempo inicial e do instante de tempo final dos
eventos, tfinal e tinicial, já mencionados no item anterior. Dessa forma, o intervalo entre
os eventos foi considerado como sendo a distância entre o instante em que ocorre o fim
de um evento, tfinal, até o instante em que se inicia o próximo evento, tinicial. A figura
III.18 ilustra esse
procedimento.
Figura III.18- Representação do procedimento adotado para obtenção do intervalo entre os
eventos. Considerando tinicial, quando o sinal atinge uma variação de 20% em
relação a linha de base, e tfinal, quando este sinal retorna a 20% em relação à linha de
base. Os intervalos entre os eventos foram obtidos como sendo a distância entre o
instante tfinal, de um evento, e o instante tinicial, do evento subseqüente.
45
IV - RESULTADOS
Os resultados foram divididos em quatro etapas de análise experimental e uma
etapa de análise computacional. A primeira etapa se refere à análise dos registros
extracelulares dos eventos epileptiformes na CG do GD. A segunda etapa à análise
qualitativa do ponto de vista morfológico. A terceira trata da análise quantitativa do
número de células na CG do GD, pelo método de coloração de Nissl, onde os nucléolos
são corados com cresil violeta. E a quarta etapa consta da correlação entre os
parâmetros do registro eletrofisiológico e a contagem celular na CG do GD.
IV.1 – Análise experimental do registro eletrofisiológico das atividades epileptiformes
não-sinápticas em diferentes faixas etárias de ratos
Foram analisados os registros eletrofisiológicos das AE´s de 66 ratas da raça
wistar, distribuídos nas seguintes faixas etárias: P09-11 (7 animais de 9, 10 e 11 dias);
P21-23 (6 animais de 21, 22 e 23 dias); P35-37 (6 animais de 35, 36 e 37 dias); P49-51
(8 animais de 49, 50 e 51 dias); P70-72 (11 animais de 70, 71 e 72 dias); P91-93 (7
animais de 91, 92 e 93 dias); P111-113 (8 animais de 111, 112 e 113 dias); P125-127 (6
animais de 125, 126 e 127 dias); P139-141 (7 animais de 139, 140 e 141 dias). Para
cada faixa, foram calculados o valor médio e o desvio padrão para cada variável de
análise dos registros. Comparações entre as faixas foram realizadas utilizando o método
de comparações múltiplas e análise de variância, com nível de significância de 5% (α
=0.05). As variáveis de análise do potencial elétrico extracelular foram a componente
DC (mV), duração do evento (DE), intervalo entre eventos epileptiformes (IE),
amplitude média dos
population spikes (PS), tempo de latência (TL) e amplitude
máxima dos
population spikes (max.PS).
Em relação ao número de eventos epileptiformes ou
bursts em cada faixa etária,
foram analisados, 233
bursts de P09-11, 112 bursts de P21-23, 81 bursts de P35-37, 114
bursts de P49-51, 158 bursts de P70-72, 129 bursts de P91-93, 156 bursts de P111-113,
79
bursts de P125-127 e 142 bursts de P139-141.
A análise do potencial elétrico extracelular das AE´s, demonstrou diferenças
morfológicas e estruturais dos bursts nas diferentes faixas etárias de ratos. Isto pode ser
observado na figura IV.1, onde a partir dos valores médios das variáveis (DC, DE, IE,
46
PS e PS max.) foram escolhidos os sinais com características que mais se aproximam
desses valores, permitindo, então, a apresentação dos
bursts típicos de cada faixa etária.
Figura IV.1 – Representação dos eventos epileptiformes ou bursts característicos em cada
faixa etária de rato.
Nas figuras IV.2 e IV.3(A) é possível identificar os valores médios e os
respectivos desvios padrão (SEM) da componente DC, duração do evento (DE) e
intervalo entre eventos (IE), com o nível de significância de 5 % e, utilizando o método
de comparações múltiplas, obtém-se um valor de
p-value=0,01x10
-11
, demonstrando
diferenças estatisticamente significantes entre as faixas etárias de análise.
Na figura IV.2(A) pode-se observar que para a amplitude média da componente
DC ocorreu um máximo absoluto na faixa etária de P21-23, máximos locais em P49-51
e P139-141, observando-se que este último se trata do extremo direito do conjunto de
intervalos estudados. O mínimo absoluto ocorreu na faixa P09-11, extremo esquerdo do
conjunto de faixas estudadas e ocorreu, ainda, um mínimo local em P91-93.
47
A análise do intervalo de confiança (IC) entre as médias da componente DC,
demonstrou diferenças estatisticamente significante entre todas as faixas etárias, exceto,
entre as médias das respectivas faixas etárias, P35-37, P49-51, P70-72, P111-113 e
P125-127.
Na figura IV.2(B), observa-se que o evento com maior duração ocorreu na faixa
etária de P21-23, a partir de onde ocorreu uma diminuição progressiva até a faixa etária
de P111-112, mínimo absoluto das faixas estudadas, voltando a crescer até P139-141,
extremo esquerdo do conjunto das faixas.
O intervalo de confiança da DE possibilitou identificar diferenças
estatisticamente significantes entre todos os intervalos em estudo, exceto, os seguintes,
P09-11/P49-51, P21-23/P35-37, P111-113/P125-127, P111-113/P139-141 e P125-
127/P139-141.
48
(B)
(A)
Figura IV.2 – Valores médios, desvio padrão (SEM) e intervalo de confiança (IE) para: (A)
componente DC e (B) DE (p<0.05).
Para a análise do tempo de latência das atividades epileptiformes (TL), ou tempo
entre o início da perfusão com solução de zero Ca
+2
e alto K
+
e início das atividades,
49
identifica-se diferença estatisticamente significante (p-value=0,046316x10
-5
) entre os
valores médios das faixas etárias em análise. As maiores médias dos IEs epileptiformes
são observadas nas faixas etárias P35-37 e P125-127. O menor valor médio foi
observado em P09-11 (figura IV.3(A)). Com nível de significância de 5% é possível
identificar diferenças estatisticamente significantes entre as médias do IEs
epileptiformes, exceto nos intervalos de P21-23/111-113, P21-23/139-141, P35-37/70-
72, P35-37/125-127, P49-51/70-72, P49-51/125-127, P49-51/139-141, P70-72/125-127,
P91-93/139-141 e P111-113/139-141.
O TL das atividades epileptiformes aumenta de forma progressiva até a faixa
etária de P91-93, a partir de quando permanece aproximadamente estável (fig. IV.3(B)).
No IC entre as médias do TL são observadas diferenças significantes nos
seguintes intervalos, P09-11/49-51, P09-11/70-72, P09-11/91-93, P09-11/111-113, P09-
11/125-127, P09-11/139-141, P21-23/49-51, P21-23/70-72, P21-23/91-93, P21-23/111-
113, P21-23/125-127 e P21-23/139-141.
50
(A)
(B)
Figura IV.3 – Valores médios, desvio padrão (SEM) e Intervalo de confiança (IC) dos: (A) IEs,
epileptiformes, em segundos, e (B) TLs, em minutos (p < 0.05).
Com relação à amplitude dos population spikes (PS) e a amplitude máxima dos
population spikes (max.PS), cujos valores estão apresentados na figura IV.4, também
51
ocorreram diferenças estatisticamente significantes, com nível de significância de 5%
p-value = 0,01x10
-11
.
A comparação entre as médias da amplitude dos PS não identificou diferenças
estatisticamente significantes entre os seguintes intervalos: P21-23/49-51, P21-23/111-
113, P21-23/125-127, P35-37/111-113, P35-37/125-127, P35-37/139-141, P49-51/111-
113, P49-51/125-127, P70-72/91-93 e P111-113/125-127.
A amplitude média máxima dos
population spikes foi encontrada nas faixas
etárias de P70-72 e P91-93 e a amplitude mínima na faixa etária de P09-11 dias (figura
IV.4(A)). A amplitude média máxima do maior
population spikes ocorreu na faixa
etária de P21-23 dias pós-natal e a menor média na faixa etária de P09-11 dias (figura
IV.4(B)).
A amplitude máxima dos PS apresentou diferenças entre todas as médias em
análise, exceto nos intervalos citados na análise dos PS, acrescentando P21-23/35-37,
P21-23/70-72, P35-37/91-93, P49-51/70-72, P49-51/139-141, P70-72/111-113 e P91-
93/111-113.
52
(A)
(B)
Figura IV.4 – Valores médios, desvio padrão (SEM) e intervalo de confiança (IE) para: (A)
amplitude dos PS e (B) amplitude máxima dos PS (p < 0.05).
53
IV.2 – Análise qualitativa da morfologia da CG do GD, pela histoquímica, em
diferentes faixas etárias de ratos
A análise qualitativa ou morfológica da estrutura celular assumida pelas lâminas
supra, infra-piramidal e ápice da camada granular do GD, durante o desenvolvimento do
hipocampo de ratos, foi examinada usando o método de nissl, com marcação dos
nucléolos pelo cresil violeta.
Na figura IV.5.(A), observa-se que a morfologia das secções de 10µm do
hipocampo de ratos de P09-11 dias apresenta a camada granular arredondada e
homogênea ao longo das lâminas supra, infra-piramidal e ápice. A camada granular
nesta faixa etária não é bem definida e apresenta células dispersas na região hiliar.
A histoquímica das secções de P21-23 dias demonstra uma camada granular
mais definida e diferenciada, que se apresenta mais espessa nas lâminas supra-piramidal
e ápice, enquanto a lâmina infra-piramidal diminui a sua espessura. A região do ápice
nesta faixa etária é mais côncava. Também é possível identificar um aumento no
comprimento de toda CG em relação às secções de P09-11 dias.
À medida que o animal fica mais velho, as lâminas supra e infra-piramidal ficam
cada vez mais finas e o ápice mais côncavo e espesso. As extremidades das lâminas
tendem a afinar e a camada granular fica cada vez maior e mais definida (figura IV.5).
(A) P09-11 Exp.32
Exp.74
Exp. 53
(B) P21-23 Exp.37
Exp.49
Exp.42
(C) P35-37 Exp.43
Exp.44
Exp.36
54
(D) P49-51 Exp.57
Exp.50
Exp.52
(E) P70-72 Exp.63
Exp.71
Exp.72
(F) P91-93 Exp.46
Exp. 76
Exp.47
(G) P111-113 Exp.41
Exp.73
Exp.69
(H) P125-127 Exp.59
Exp.56
Exp.55
(I) P139-140 Exp.66
Exp.38
Exp.70
Figura IV.5 – Fotomicrografia das secções de 10µm do hipocampo de ratos. (A-I) Secções do
hipocampo e da camada granular do giro denteado com marcação dos nucléolos pelo
cresil violeta (método de nissl) em diferentes faixas etárias. (A) P09-11, (B) P21-23, (C)
P35-37, (D)P49-51, (E) P70-72, (F) P91-93, (G) P111-113, (H) P125-127, (I) P125-127
dias pós-natal. Escala: 480 x 640 pixels.
55
IV.3 – Análise quantitativa das células na CG do GD em diferentes faixas etárias de
ratos
A quantificação celular, na CG do GD, foi realizada em fatias de 10 µm e 40 µm
coradas pelo método de Nissl. A análise quantitativa da densidade de células foi
realizada por um examinador, com o auxílio de um programa para contagem de células
utilizando do software Matlab 7.0.
Foram quantificados 54 experimentos, distribuídos da seguinte forma: 8 animais
de 9, 10 e 11 dias; 5 animais de 21, 22 e 23 dias; 6 animais de 35, 36 e 37 dias; 8
animais de 49, 50 e 51 dias; 10 animais de 70, 71 e 72 dias; 7 animais de 91, 92 e 93
dias; 3 animais de 111, 112 e 113 dias; 4 animais de 125, 126 e 127 dias; 3 animais de
139, 140 e 141 dias, sendo que para cada experimento foram obtidas cerca de 3 secções
de 10 e 3 secções de 40 µm.
Os valores médios da densidade total das células do foco2 e do foco3
(secções de 40µm) apresentaram correlação com os valores médios da densidade total
das secções de 10µm, apresentando um coeficiente de correlação linear de 0,6492
(figura IV.6).
y = 0,4683x + 0,5685
R
2
= 0,6492
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,1 1,3 1,5 1,7 1,9
Densidade total das secções de 10mm (x10
-3
)
Densidade total das secções de
40mm-F2,F3 (x10
-3
)
Figura IV.6. – Correlação linear entre a média da densidade total de células no foco1 e foco2
das secções de 40µm e a densidade total de células das secções de 10µm.
A correlação entre a densidade total das secções de 10µm e 40µm possibilitou
estimar os dados referentes ás secções de 10µm a partir dos valores de 40µm. Essa
56
estimativa foi feita utilizando a equação de correlação e substituindo o valor de x pelo
valor médio da densidade total das secções de 40µm.
O método de comparações múltiplas e análise de variância, com nível de
significância de 10% (α =0.1), demonstrou diferenças estatisticamente significantes
entre as médias da densidade de células no entorno do eletrodo (raio de 50µm) entre os
intervalos de P35-37/70-72 e P70-72/125-127. Com o nível de significância de 20% foi
possível identificar diferenças significantes entre os intervalos de P21-23/49-51, P21-
23/70-72, P35-37/49-51 e P70-72/91-93.
As maiores médias da densidade total das células são observadas em P49-51 e
P70-72 e os menores valores em P91-93 e P125-127 (figura IV.7).
Figura IV.7 – Estimativa da densidade total no entorno do eletrodo (raio de 50µm) da CG do
GD em diferentes faixas etárias de ratos. Representação da média ± SEM da densidade
total das secções de 10µm e 40µm. Um asterisco indica diferença significante entre as
médias (*, p < 0.1) e dois asteriscos indicam diferença significante entre as médias (**,
p < 0.2).
Com relação á análise da área total, da CG do GD, nas secções de 40µm e 10µm,
foram identificadas alterações significantes nas diferentes faixas etárias. Observa-se na
figura IV.8, um aumento crescente na área total da CG de P09-11 até P91-93 dias. A
partir de quando se evidencia uma queda em P111-113 e P139-141.
57
A análise do IC da área total das secções de 40µm demonstra diferenças entre as
médias dos intervalos de P09-11/21-23, P09-11/35-37, P09-11/49-51, P09-11/70-72,
P09-11/91-93, P09-11/111-113, P09-11/125-127, P09-11/139-141 e P91-93/111-113.
A análise da área total da CG das secções de 10µm apresentou um máximo na
faixa etária de P91-93 dias e um mínimo nas faixas etárias que correspondem a P09-11,
P111-113 e P125-127 dias (fig. IV.8).
O IC entre as médias das secções de 10µm identificou diferenças significantes
entre os intervalos de P09-11/21-23, P09-11/35-37, P09-11/70-72, P09-11/91-93, P09-
11/111-113, P09-11/125-127, P09-11/139-141, P21-23/91-93, P35-37/91-93, P70-
72/91-93, P70-72/111-113, P91-93/125-127, P91-93/139-141 dias.
Figura IV.8 – Área total da CG do GD em diferentes faixas etárias de ratos. Representação da
média ± SEM da área total das secções de 10µm e 40µm (p < 0.05).
58
IV.4 – Correlação entre os parâmetros do registro eletrofisiológico extracelular e a
contagem celular em diferentes faixas etárias de ratos
O coeficiente de correlação linear (R
2
) e a correlação entre os parâmetros do
registro eletrofisiológico (componente DC, duração do evento, amplitude dos
population spikes, tempo de latência, intervalo entre eventos, amplitude do maior
population spikes) e a densidade das células no entorno do eletrodo da camada granular
do giro denteado não demonstraram correlação linear estatisticamente significante,
sendo os coeficientes de correlação linear (R
2
) os seguintes, respectivamente: 0,0015;
0,0026; 0,0046; 0,0064; 0,0218 e 0,0009 (figura IV.9).
y = 0,0034x + 1,3585
R
2
= 0,0015
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20
Componente DC (mV)
Densidade total das secções de
10mm (x10
-3
)
(A)
y = -0,002x + 1,4282
R
2
= 0,0026
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0102030405060
Duração do evento (s)
Densidade total das secções de
10mm (x10
-3
)
(B)
y = -0,0977x + 1,4067
R
2
= 0,0046
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Amplitude dos Population Spikes (mV)
Densidade total das secções de
10 mm (x10
-3
)
(C)
y = 0,0006x + 1,3324
R
2
= 0,0064
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200 250 300
Intervalo entre eventos (s)
Densidade total das secções de
10mm (x10
-3
)
(D)
y = 0,002x + 1,2428
R
2
= 0,0218
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200
Tempo de latência (min.)
Densidade total das secções de
10 mm (x10
-3
)
(E)
y = 0,0027x + 1,3648
R
2
= 0,0009
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20
Amplitude do maior Population Spikes (mV)
Densidade total das secções de
10mm (x10
-3
)
(F)
Figura IV.9 – A correlação e o coeficiente de correlação linear dos parâmetros do registro
eletrofisiológico e a densidade total celular do entorno do eletrodo de registro. (A)
Correlação entre a componente DC (mV) e a densidade de células; (B) Correlação entre
a duração do evento (s) e a densidade de células; (C) Correlação entre a Population
Spikes (mV) e a densidade de células; (D) Correlação entre intervalo entre eventos (s) e
a densidade de células; (E) Correlação entre o tempo de latência (min.) e a densidade de
células; (F) Correlação entre a amplitude do maior Population Spikes (mV) e a
densidade de células.
59
A correlação entre os parâmetros do registro eletrofisiológico e a área da CG do
giro denteado não demonstraram correlação estatisticamente significante, sendo os
coeficientes de correlação linear (R
2
), os seguintes respectivamente: 0,0019; 0,0047;
0,0377; 0,0005; 0,098 e 0,0479 (figura IV.10).
y = 0,0329x + 5,7788
R
2
= 0,0019
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
7 12172227323742
Área total da camada granular
Componente DC (mV)
(A)
y = -0,1415x + 28,346
R
2
= 0,0047
0
10
20
30
40
50
60
7 12172227323742
Área total da camada granular
Duração do evento (s)
(B)
y = 0,0081x + 0,1199
R
2
= 0,0377
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
7 12172227323742
Área total da camada granular
Amplitude dos Population
Spikes (mV)
(C)
y = -0,2076x + 74,5
R
2
= 0,0006
0
50
100
150
200
250
300
7 12172227323742
Área total da camada granular
Intervalo entre eventos (s)
(D)
y = 1,6505x + 37,85
R
2
= 0,098
0
20
40
60
80
100
120
140
160
7 12172227323742
Área total da camada granular
Tempo de latência (min.)
(E)
y = 0,1638x + 1,6601
R
2
= 0,0479
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
7 12172227323742
Área total da camada granular
Amplitude do
Population Spikes Máximo
(mV)
(F)
Figura IV.10 – A correlação e o coeficiente de determinação dos parâmetros do registro
eletrofisiológico com a área total da CG do GD. (A) Correlação entre a componente DC
(mV) e a área total; (B) Correlação entre a duração do evento (s) e a área total; (C)
Correlação entre a Population Spikes (mV) e a área total; (D) Correlação entre intervalo
entre eventos (s) e a área total; (E) Correlação entre o tempo de latência (min.) e a área
total; (F) Correlação entre a amplitude do maior Population Spikes (mV) e a área total.
60
V – DISCUSSÃO
A presente dissertação foi motivada pelos achados de RESENDE (2006), que
realizou também medidas de parâmetros neurofisiológicos de atividades epileptiformes
não-sinápticas, induzidas no giro denteado de fatias de hipocampo de rato. As
constatações de algumas alterações ao longo do desenvolvimento, tais como a de um
abrupto incremento da componente DC e um decréscimo também momentâneo dos
PS's, no entorno de P21, motivou a investigação de possíveis alterações na densidade de
células. Para tanto, simultaneamente ao estudo dos parâmetros eletrográficos para mais
faixas etárias, no presente estudo foram realizadas contagens de células para
determinação da densidade no entorno do eletrodo de medida, para cada fatia de
hipocampo investigada.
Os parâmetros eletrográficos medidos confirmam o comportamento observado
por RESENDE (2006). Novamente, observou-se o incremento abrupto da componente
DC na faixa de P21-23. Entretanto, para essa faixa, a densidade de células mostrou-se
significativamente igual às faixas imediatamente anterior e posterior, indicando que a
alteração não corresponde um incremento da densidade celular. Por outro lado, ao invés
do decremento na amplitude dos PS's, encontrado por RESENDE (2006), verificou-se
um aumento proeminente desse parâmetro. Visando verificar o procedimento de
quantificação dos PS's, foram quantificados os maiores PS's de cada evento
(fig.IV.4(B)). A quantificação mostrou-se consistente com a medida dos PS's médios,
validando a avaliação do parâmetro. Embora não se possa propor uma explicação para a
discrepância entre as medidas realizadas por RESENDE (2006) e as do presente
trabalho, a análise qualitativa das lâminas marcadas sugere uma alteração de forma da
camada granular. A partir de P21-23, até P91-93, as imagens mostram um aumento na
largura da camada granular. Após esse período, a porção infra-piramidal parece alongar
e afinar. Portanto, embora não se tenha observado um aumento da densidade, as
imagens das lâminas marcadas sugerem um aumento do número de células ao redor do
eletrodo de medida, favorecendo a contribuição dos campos populacionais medidos para
a formação dos PS's. Além disso, LEHMENKUHLER
et al (1993), demonstraram que
ocorre diminuição de α em P14-21 dias devido ao extensivo período de mielinização e
proliferação de astrócitos. A neurogênese das células granulares do giro denteado é mais
proeminente no período pós-natal. A maioria delas passa para a última fase da síntese de
61
DNA durante os primeiros dias após o nascimento, atingindo a taxa máxima de geração
entre os 5 e 7 dias pós-natais, ficando no entorno de 50.000 neurônios por dia
(SCHLKESSINGER
et al, 1975). Esses neuroblastos pós-mitóticos, então, migram da
zona de proliferação da área hiliar para o estrato granuloso, ao longo de direções radiais
(RICKMAN
et al, 1987). Logo após chegarem nesse estrato, os neurônios jovens
possuem uma superfície lisa e uma arborização dendrítica bem rudimentar (COWAN
et
al
, 1980). Posteriormente, os dendritos invadem a camada molecular e desenvolvem
espinhas (COWAN
et al, 1980 e RIHN e CLAIBORNE, 1990). As sinapses da camada
molecular chegam a aumentar em número em cerca de oito vezes entre os 10 e 21 dias,
sendo que a maioria dessas novas sinapses faz contatos com espinhas sinápticas
(COWAN
et al, 1980). Portanto, há evidências de alterações de estrutura, que podem
influenciar na funcionalidade do giro denteado, que se associam à faixa P21-23 dias.
Entretanto, os dados são ainda insuficientes para buscar uma interpretação biofísica
definitiva para o que foi observado.
Ainda com relação à componente DC, as faixas mais avançadas, a partir de P70-
72, mostram um suave decréscimo na amplitude do parâmetro, com mínimo em P91-93,
voltando a aumentar a partir de P111-113. O mesmo comportamento se observa para o
parâmetro duração dos eventos. Entretanto, com mínimo em P111-113. Para o
parâmetro intervalo inter-eventos, observa-se um mínimo também na mesma faixa,
contudo, um aumento abrupto se manifesta em P125-127, parecendo retornar o curso
normal em P139-141.
Já o parâmetro PS, exibe uma tendência de crescimento até P91-93, a partir de
quando a tendência é decrescer. Assim, formular uma teoria que explique todas essas
variações ao longo de todas as faixas etárias não parece ser possível. De forma geral,
pode-se supor que há a concorrência de diversos fatores, estruturais e funcionais, que
contribuem para as alterações morfológicas dos grafo-elementos no curso do
desenvolvimento. Particularmente com relação à densidade de células, pode-se observar
que a tendência de crescimento de todos os parâmetros para as faixas mais jovens deve
associar-se também ao incremento da densidade celular, que, obviamente, importa no
crescimento da expressão da densidade de mecanismos subcelulares e, portanto, da
atividade neuronal.
O parâmetro latência, dentre todos os parâmetros analisados, foi o único que
manteve sua tendência ao longo das novas faixas analisadas, ou seja, a partir de P70-72.
Há uma constância no tempo para indução das crises, demonstrando que os fatores
62
responsáveis pelas alterações observadas nos outros parâmetros não influenciam na
predisposição que o giro denteado tem para deflagrar as atividades epileptiformes não-
sinápticas.
Para uma melhor interpretação da evolução dos parâmetros eletrográficos em
comparação com as respectivas densidades de células, que, como se pode prever, deva
envolver uma dependência não-linear, ambas medidas foram relacionadas por meio de
simulação computacional, incluindo-se as observações feitas por LEHMENKUHLER
et
al
(1993) para a evolução da fração de volume extracelular (α) com o desenvolvimento.
Para tanto, utilizou-se simulação computacional a partir do modelo eletroquímico das
atividades epileptiformes não-sinápticas, desenvolvido no Lanec (ALMEIDA et al, em
fase de submissão para publicação). Com o modelo foram simuladas as atividades para
as diferentes faixas etárias considerando-se a fração de volume e a densidade celular
relacionadas da seguinte forma: V
extra
= (1 - α) / densidade e V
.intra
= α / densidade. Essa
relação pode ser deduzida considerando-se a definição matemática de α e a densidade
de células num determinado volume de tecido.
As simulações, apresentadas nas figuras V.2(D), permitem observar que o
parâmetro latência assume um comportamento semelhante ao que foi verificado no
presente trabalho. Da mesma forma que observado em RESENDE (2006), as
simulações sugerem que a reduzida latência para animais mais jovens advém do
acúmulo de cloreto intracelular. Esse acúmulo é sustentado pelo equilíbrio dinâmico
estabelecido pelos mecanismos de co-transporte KCC, para o volume extracelular
correspondente. Como o aumento da concentração de cloreto intracelular resulta em
uma redução do potencial de Nernst desse íon, o nível de excitabilidade neuronal
aumenta, fazendo com que a latência reduza. Consubstanciando essa evidência,
observações feitas por LUHMAN e PRINCE (1991) demonstram a existência de
mecanismos que promovem a extrusão de cloreto em função da maturidade neuronal.
Uma inspeção desse mecanismo (fig.V.1) indica que o aumento da extrusão de cloreto
com a redução do volume extra se deve também ao aumento da eficiência da bomba de
sódio-potássio com a redução desse volume. Assim, se de forma mais eficiente a bomba
consegue controlar os níveis de potássio extracelular, então, mais eficientemente serão
restabelecidos os gradientes de concentração intracelular desse íon, favorecendo o
aumento da concentração de KCl e, portanto, da saída desse composto para o meio
extracelular, em função de seu gradiente de concentração.
63
Figura V.1 – Curvas de tendência das concentrações intracelular de Cl
-
e extracelular de K
+
,
estimadas durante os intervalos inter-eventos. Os quadrados indicam animais mais
jovens e os círculos animais mais velhos.
Na figura V.2, são apresentadas as medidas de parâmetros, análogas àquelas dos
dados experimentais, porém realizadas com os sinais simulados. Para uma melhor
comparação, na figura V.3 são apresentadas curvas que caracterizam o comportamento
de cada parâmetro ao longo do tempo, tanto para os dados experimentais, curva
superior, quanto para as simulações, curva inferior. Para facilitar as identificações de
diferenças, na curva dos dados experimentais (curva superior) acrescentou-se uma linha
pontilhada que reproduz a tendência prevista pela corresponde simulação, visando
destacar as discrepâncias mais marcantes.
O comportamento da componente DC, quando comparado ao simulado,
demonstra similaridade nas faixas etárias a partir de P35-37, sugerindo que nessas
faixas as alterações, como a pequena redução da componente em P91-93, devam ser
moduladas pela fração volume e densidade celular. O incremento abrupto em P21-23,
dissimilar ao incremento acelerado, porém com transição suave, nas faixas etárias mais
juvenis (P09-11 e P21-23), não se deve a alterações desses parâmetros. No que concerne
à duração do evento, a comparação entre os dados experimentais e a simulação mostram
64
que as duas faixas etárias iniciais apresentam um comportamento de crescimento que
deve ser também modulado pela fração volume e a densidade celular. A partir de P35-
37, a comparação indica que o suave decremento da duração dos eventos até P111-113,
com posterior incremento, não se explica por qualquer alteração promovida pela fração
de volume ou densidade celular. Já o intervalo entre eventos e amplitude da componente
DC parece sofrer influência das alterações na fração de volume e na densidade celular,
ao longo de todas as faixas etárias, a menos de uma pequena dissimilaridade nas faixas
P49-51 e P70-72, quando os experimentos mostraram um pequeno decréscimo do
parâmetro durante o período. Pode-se, portanto, suspeitar que algum outro fator
concorrente às interferências da fração de volume e da densidade celular deva superar a
influência dessas alterações estruturais, promovendo o aumento dos parâmetros
medidos.
Em síntese, analisando em particular as alterações observadas na faixa etária
P21-23, onde a componente DC e os PS's apresentaram valores destoantes da tendência
de evolução, pode-se identificar nos demais parâmetros que a essa alteração
correspondem alterações no comportamento da evolução temporal. A partir de P21-23,
a duração do evento inicia um comportamento decrescente, que se prolonga até P111-
113, o intervalo entre eventos manifesta um pequeno aumento da taxa de incremento e a
latência, que se mantém no mesmo comportamento da faixa etária anterior (P09-11),
começa a aumentar até P49-51, a partir de quando permanece estável.
O período pós-natal que vai até por volta de 21 dias é um período no qual
existem os constituintes necessários ao substrato de sustentação de sincronizações
mediadas por conexões não-sinápticas, ou seja o empacotamento de corpos celulares
neuronais, como ocorre na camada granular do GD. A quase ausência de circuitarias
neuronais implica na ausência de mecanismos inibitórios eficientes, tais como os
mediados pelas sinapses inibitórias. Isso, portanto, tem, como efeito global, um
aumento da excitabilidade neuronal, que pode traduzir-se na redução do período de
latência ou, em outras palavras num aumento da susceptibilidade à deflagração de
eventos epileptiformes. Com isso, podem-se apontar alguns fatores que contribuem de
forma importante para essa susceptibilidade à indução de crises nesse período: a
aumentada concentração de cloreto intracelular, a pobre circuitaria neuronal e o
empacotamento de corpos celulares na lamina granular. Esses fatores podem, em termos
sistêmicos, implicar na necessidade de mecanismos mais eficientes para o
restabelecimento dos gradientes iônicos. Parece que é exatamente isso o que ocorre.
65
FERNANDES et al., (1999), observou que, com a idade, há uma redução da atividade
das enzimas de Na-K-ATP-ase, em hipocampo de ratos.
Posteriormente a esse período, passam a ser viáveis processos que envolvem a
circuitaria neuronal. Ou seja, sincronizações mediadas por sinapses podem ocorrer. O
modelo da pilocarpina, um modelo amplamente difundido como uma reprodução
experimental de epilepsia do lobo temporal, tem a circuitaria neuronal como um dos
constituintes indispensáveis de seu substrato. Como já mencionado anteriormente,
somente a partir do entorno dos 21 dias é quando essas circuitarias começam a se
formar, então, podemos entender porque a indução de
status epilepticus com pilocarpina
só é viável a partir de ratos na faixa etária P18-23 (PRIEL et al., 1996). Portanto, a
confluência de diversos fatores associados ao desenvolvimento da circuitaria neuronal,
pode modular de forma complexa os parâmetros eletrográficos medidos, dificultando a
identificação de suas gêneses.
66
Figura V.2 – Simulação computacional dos parâmetros do registro do potencial elétrico extracelular
das atividades epileptiformes não-sinápticas em função das faixas etárias dos ratos. Em (A) a
componente DC; (B) a duração dos eventos; (C) o intervalo entre eventos; (D) Amplitude dos
Populations Spikes (PS’s) e tempo de latência.
67
(A)
(B)
(C) (D)
(E)
Figura V.3 – Representação do comportamento dos parâmetros do potencial elétrico
extracelular das atividades epileptiformes não-sinápticas em função das faixas etárias
dos ratos. Na curva superior estão representadas as morfologias dos dados
experimentais e, na curva inferior, das simulações computacionais. Em (A) a
componente DC; (B) a duração dos eventos; (C) o intervalo entre eventos; (D)
Amplitude dos Populations Spikes (PS’s) e (E) tempo de latência.
68
VI - CONCLUSÃO
O presente estudo mostrou que a densidade celular e a fração volume podem
estar associadas às alterações dos grafo-elementos de registros extracelulares de
atividades epileptiforme não-sináptica, em fatias de hipocampo de rato, durante as
faixas etárias que vão até por volta dos 21 dias. A partir de então, quando se associam as
formações de circuitarias neuronais, a confluência de diversos mecanismos inerentes ás
essas formações devem modular de forma complexa os parâmetros eletrográficos.
Propostas para continuação do trabalho:
- Investigação da distribuição de fibras nervosas no espaço extracelular a partir da
marcação pelo método de Neo Timm;
- Estudo da neurogênese em diferentes faixas etárias de ratos através da marcação
com BrdU;
- Investigação, por meio do mesmo protocolo descrito no presente trabalho, para
um grupo animais machos.
69
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