( PDF ) Estudo do ciclo biológico do Toxoplasma gondii em culturas primárias de células de epitélio intestinal de gato doméstico Felis catus (Linnaeus, 1758)

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Doutorado em Biologia Parasitária

Ciclo biológico do Toxoplasma gondii em culturas

de células de epitélio intestinal de gato doméstico

Felis catus (Linnaeus, 1758)

ARCOS DE

SSIS

OURA

Rio de Janeiro

2008

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ARCOS DE

SSIS

OURA

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obtenção do título de

Doutor em Biologia Parasitária

Orientador (es)

Prof. Dr. Helene Santos Barbosa

Prof. Dra. Maria Regina Reis Amendoeira

RIO DE JANEIRO

2008

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III

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Marcos de Assis Moura

Ciclo biológico do Toxoplasma gondii em culturas de células de

epitélio intestinal de gato doméstico

Felis catus (Linnaeus, 1758)

ORIENTADOR (ES): Prof. Dra. Helene Santos Barbosa

Prof. Dra. Maria Regina Reis Amendoeira

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dra. Joseli Lannes Vieira (Presidente) – IOC - Fiocruz

Prof. Dr. Renato DaMatta - UENF

Prof. Dr. Wanderley de Souza – IBFCCF - UFRJ

SUPLENTES:

Prof. Dra. Laís de Carvalho – IHE - UERJ

Prof. Dr. Erick Vaz Guimarães – IOC - Fiocruz

Rio de Janeiro, 01 de Julho de 2008

ÍNDICE

FICHA CATALOGRÁFICA

RESUMO IX

ABSTRACT X

LISTA DE ABREVIATURAS XI

I. INTRODUÇÃO 01

II. REVISÃO DE LITERATURA 03

1. Intestino delgado de mamíferos 03

1.1. Células epiteliais intestinais de mamíferos 05

1.2. Culturas primárias de células intestinais 07

1.3. Linhagens celulares epiteliais intestinais 08

1.4. Linhagens celulares de felídeos 09

2. Toxoplasma gondii e toxoplasmose 10

2.1. Considerações gerais 10

2.2. Formas infectantes do T. gondii

2.2.1. Taquizoítos 12

2.2.2. Bradizoítos e cistos teciduais 13

2.2.3. Esporozoítos 14

2.3. Ciclo biológico 15

2.4. Ciclo enteroepitelial ou sexuado 17

2.4.1. Esquizonte do Tipo A 18

2.4.2. Esquizonte do Tipo B 18

2.4.3. Esquizonte do Tipo C 19

2.4.4. Esquizonte do Tipo D 20

2.4.5. Esquizonte do Tipo E 20

2.4.6. Gametogênese 21

2.4.7. Formação de oocistos 21

2.4.8. Trofozoítos 21

3. Interação parasito-célula hospedeira 22

3.1. Considerações gerais 22

3.2. Aspectos moleculares da adesão e invasão 23

3.3. Vacúolo parasitóforo 24

4. Dinâmica de diferenciação do T. gondii estudos in vitro e in vivo 25

II. OBJETIVOS 29

1. Objetivos gerais 29

2. Objetivos específicos 29

III. MATERIAL E MÉTODOS 30

1. Cultura primária de células intestinais de felinos: obtenção e

manutenção

1.1. Animais 30

1.2. Isolamento e cultivo de células intestinais 30

1.3. Ensaio de viabilidade celular por citometria de fluxo 31

1.4. Acompanhamento, manutenção das culturas de células e sub-culturas 31

2. Caracterização das culturas primárias 32

2.1. Imunofluorescência 32

2.2. Análise ultra-estrutural 33

2.2.1. Microscopia eletrônica de transmissão 33

2.2.2. Microscopia eletrônica de varredura 33

2.2.3. Citoquímica ultra-estrutural 34

3. Experimentos de interação de bradizoítos de T. gondii cepa ME49 com

culturas de epitélio intestinal de felino doméstico

3.1. Obtenção de bradizoítos: isolamento, purificação e rompimento dos

cistos.

3.2. Avaliação da infectividade do T. gondii em CEIF e em duas linhagens

epiteliais

3.3. Interação T. gondii com a célula epitelial intestinal

3.4. Monitoramento dos estágios morfológicos evolutivos do T. gondii

3.5. Análise ultra-estrutural da interação parasito-célula hospedeira 37

3.5.1. Microscopia eletrônica de transmissão 37

3.5.2. Biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo 37

IV. Resultados 39

1. Culturas primárias de epitélio intestinal felino 39

1.1. Características morfológicas durante seu desenvolvimento, in vitro

1.2. Expressão de marcadores intestinais 42

1.3. Caracterização morfológica ultra-estrutural e funcional 45

2. Análise da infectividade de bradizoítos de T. gondii frente a linhagens

epiteliais e cultura de epitélio intestinal de felinos

3. Aspectos morfológicos da interação T. gondii e epitélio intestinal

felino in vitro

3.1. Interação na relação 1:5 (parasito-célula hospedeira) 53

3.2. Interação na relação 1:10 (parasito-célula hospedeira) 55

VII

3.3. Interação na relação 1:20 (parasito-célula hospedeira): Caracterização

do vacúolo parasitóforo e dos estágios enteroepiteliais do T. gondii

3.4. Biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo 61

V DISCUSSÃO 64

1. Cultivo primário de epitélio intestinal de gato doméstico e modelo de

estudo

2. Interação T. gondii com epitélio intestinal felino in vitro 69

VI. CONCLUSÕES 78

1. Modelo de estudo: Cultura primária de epitélio intestinal felino 78

2. Interação T. gondii com epitélio intestinal felino in vitro 78

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80

ANEXO 1:

Establishment and characterization of a primary feline intestinal

epithelial cell culture

M. A. Moura, M. R. R. Amendoeira & H. S. Barbosa

ANEXO 2:

Is it possible to reproduce the sexual cycle of Toxoplasma gondii in

feline enterocytes in vitro?

M. A. Moura, M. R. R. Amendoeira & H. S. Barbosa

125

VIII

ÍNDICE DE ESQUEMAS, GRÁFICOS, TABELAS E FIGURAS

Esquema 1: Intestino delgado de mamíferos 04

Esquema 2: Células do epitélio intestinal de mamíferos 05

Esquema 3:

Ultra-estrutura das formas infectantes de T. gondii

Esquema 4:

Ciclo de vida do T. gondii

Esquema 5:

Ciclo enteroepitelial do T. gondii

Gráfico 1:

Análise de viabilidade por citometria de fluxo do dissociado

celular do intestino delgado de felídeos através da marcação

com Iodeto de propídio (PI)

Figura 1:

Aspectos morfológicos das culturas primárias intestinais de

felino do 1º a 10º dia por microscopia de contraste de fase e

interferencial

Figura 2: Culturas terciárias semi-confluentes de CEIF 43

Figura 3:

Caracterização das CEIF através microscopia de

fluorescência

Figura 4:

Imunoreatividade para revelação de fosfatase alcalina em

CEIF

Figura 5:

Células de CEIF secundárias apresentando aspecto epitelial

pavimentoso

Figura 6:

Microscopia eletrônica de varredura ilustrando a morfologia

epitelial em culturas de CEIF

Figura 7:

Caracterização ultra-estrutural funcional das CEIF com

ferritina cationizada (FC)

Tabela 1:

Resultados da análise da variância das médias percentuais de

células infectadas por bradizoítos de T. gondii cepa ME49 em

células epiteliais intestinais de felino (CEIF) em relação as

linhagens ÏEC-6 e CRFK

Gráfico 2:

Percentual de células infectadas por bradizoítos de T. gondii

cepa ME49 em CEIF em relação as linhagens ÏEC-6 e CRFK

Figura 8:

Interação bradizoítos de T. gondii cepa ME49 com CEIF na

proporção 1:5 parasito-célula hospedeira

Figura 9:

Interação bradizoítos de T. gondii cepa ME49 com CEIF na

proporção 1:10 parasito-célula hospedeira

Figura 10:

Formação de esquizontes precursores dos estágios

enteroepiteliais de T. gondii in vitro após 6 d.p.i

Figura 11: Parasitos em divisão por endodiogenia assincrônica 59

Figura 12:

Tipos morfológicos distintos de T. gondii em CEIF com 6 d.p.i.

Figura 13:

Tipos morfológicos de T. gondii diferenciados

Figura 14:

CEIF pré-incubadas com FC e infectadas por 12h com

bradizoítos de T. gondii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Ciclo biológico do Toxoplasma gondii em culturas de células de epitélio intestinal de

gato doméstico Felis catus (Linnaeus, 1758)

RESUMO

TESE DE DOUTORADO

Marcos de Assis Moura

Culturas primárias de células epiteliais intestinais têm uma importância significativa

para o estudo do desenvolvimento normal e na diferenciação do epitélio intestinal.

Muitos mecanismos envolvidos nas enteropatias ou interações patógeno-hospedeiro

no intestino de felinos não foram ainda elucidados. Este modelo celular

potencialmente se aplica à investigação de processos infecciosos provocados por

enteropatógenos, em particular ao protozoário Toxoplasma gondii, um Coccídeo que

tem o felino como seu hospedeiro definitivo, mantendo seu ciclo sexual no intestino

delgado. As células foram obtidas cirurgicamente do intestino delgado de feto de

felino. A dinâmica e a natureza epitelial das células em culturas foram confirmadas

por critérios morfológicos, utilizando microscopias de luz, confocal, eletrônica de

transmissão e varredura demonstrando: (i) replicação celular; (ii) adesão ao

substrato; (iii) migração celular; (iv) alinhamento das células como demonstrado pela

posição do núcleo indicativo de polarização celular, similar ao epitélio intestinal; (v)

exibição de fenótipo similar a enterócitos pela revelação da expressão de

citoqueratina e fosfatase alcalina. As propriedades funcionais das células epiteliais

intestinais de felinos (CEIF) foram reveladas pela demonstração de sua atividade

endocítica monitorado através da incorporação de ferritina cationizada. Desta forma,

as culturas de CEIF foram infectadas com bradizoítos isolados de cistos

intracerebrais colhetados de camundongos C57BL6. Após 6 dias foi possível

observar por análise ultra-estrutural parasitas com características morfológicas

compatíveis com estágios enteroepiteliais do ciclo sexuado do T. gondii: (i) vacúolos

contendo apenas um parasito dentro de uma matriz vacuolar repleta da rede de

membranas tubulovesicular bem desenvolvida; (ii) grandes vacúolos, contendo

formas multiplicativas desorganizadas, característico de reprodução por

endopoligenia; (iii) parasitos similar a macrogametas apresentando características

estruturais, tais como: complexo membranar interno, núcleo granular, estruturas

citoplasmáticas que se assemelham aos corpos formadores de parede, grânulos

densos, grânulos de amilopectina e mitocôndrias. A introdução do modelo celular de

epitélio intestinal de felino empregado na presente tese mostrou que potencialmente

pode contribuir com novos subsídios sobre a biologia celular do parasito e se

apresenta como uma nova e pioneira metodologia in vitro para o estudo do ciclo

entérico do T. gondii.

Palavras-chave: Toxoplasma gondii; células epiteliais intestinais de felinos; culturas

primárias de felinos; estágios enteroepiteliais, ciclo entérico do T. gondii, in vitro

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Biological cycle of Toxoplasma gondii in cultures of intestinal epithelial cells of

domestic cats Felis catus (Linnaeus, 1758)

ABSTRACT

Marcos de Assis Moura

Primary cultures of the intestinal epithelial cell have significant importance for the

study of the normal development and differentiation of intestinal epithelium. Many

mechanisms involved in the enteropathies or host-pathogen interactions in feline

intestine have not been elucidated yet. This cellular model potentially applies to the

investigation of the infection process provoked by enteropathogenous, in particular to

the protozoan, Toxoplasma gondii, a Coccidian. The sexual life cycle of T. gondii is in

the small gut of the feline, which is its definitive host. Intestinal epithelial cells were

obtained from the small gut of a feline fetus surgically. The dynamic and epithelial

nature of the cells in culture were confirmed by morphological criteria using confocal

and light microscopy and also scanning and transmission electron microscopy

showing: (i) cellular replication; (ii) cell substrate adhesion; (iii) cellular migration; (iv)

cell alignment as demonstrated by the nucleus position indicative of cellular

polarization, like intestinal epithelium; and (v) enterocyte-like phenotype exhibition by

revelation of the cytokeratin and alkaline phosphatase expressions. The functional

properties of the feline intestinal epithelial cells (FIEC) were revealed by

demonstrating their endocytic activity monitored through the incorporation of

cationized ferritin. In this way, FIEC cultures were infected with bradyzoites isolated

from intracerebral cysts colleted from C57BL6 mice. After 6 days it was possible to

observe by ultrastructural analysis, parasites with morphologic characteristics

compatible with enteroepithelial stages of the sexual cycle of T. gondii: (i) vacuoles

containing only one parasite inside a vacuolar matrix full of the well developed

tubulovesicular membrane network; (ii) large vacuoles, containing disorganized

multiplicative forms, characteristic of endopolygeny reproduction; (iii) parasites like

macrogametes presenting structural characteristics such as: inner membrane

complex, granular nucleus, cytoplasmic structures like wall forming bodies, dense

granules, amylopectin granules and mitochondria. The feline intestinal epithelial

cellular model introduced in this present thesis showed that it can potentially

contribute to new research in parasite cellular biology and presents a new and

pioneering methodology in vitro for the study the enteric cycle of T. gondii.

Keywords: Toxoplasma gondii, feline intestinal epithelial cells (FIEC); feline primary

culture; enteroepithelial stages, enteric cycle of T. gondii, in vitro.

LISTA DE ABREVIATURAS

Am Grânulos de amilopectina

BAG1 Antígeno de bradizoíto de Toxoplasma gondii

BSA Albumina sérica bovina

C Celcius

CACO Cacodilato de sódio

CEIF Células epiteliais intestinais de felino

CFP Corpos formadores de parede

CMI Complexo membranar interno

Co Conóide

CR Corpo Residual

d.p.i. Dias pós infecção

DABCO 1,4-diazabicyclo-[2,2,2]-octano-triethylenediamine

DAPI 4’, 6-diamidino-2-phenylindole

DBA Dolichos biflorus aglutinina

DMEM/Hams F12 Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Hams Nutrient F12 (1:1)

DNA Ácido dexorribunucléico

DTT Dithiothreitol

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGF Epidermal growth factor

EGTA Ácido etilenoglicol tetra-acético

FC Ferritina cationizada

FITC Isocianato de fluoresceína

g Força gravitacional

GA Glutaraldeído

GD Grânulos densos

Go Complexo de Golgi

h Hora

h.p.i. Horas pós infecção

IFI Imunofluorescência indireta

IFN-γ Interferon gama

Ig Imunoglobulinas

Li Lipídeos

M Concentração Molar

MET Microscopia eletrônica de transmissão

MEV Microscopia eletrônica de varredura

Mi Mitocôndria

Mie Mitocôndrias eletrondensas

Min Minutos

Mn Micronemas

MVP Membrana do vacúolo parasitóforo

N Núcleo

Cl Cloreto de amônia

Nu Nucléolo

OsO

Tetróxido de ósmio

PAS Ácido periódico de Schiff

PBS Tampão salina fosfato (phosphate buffered saline)

PCR Reação da polimerase em cadeia reversa

PFA Paraformaldeído

XII

PV Vacúolo parasitóforo

RE Retículo endoplasmático

RMT Rede de membranas tubulovesicular

Ro Róptrias

SAG1 Proteína de superfície de taquizoítos de Toxoplasma gondii

SFB Soro fetal bovino

VP Vacúolo parasitóforo

I. INTRODUÇÃO

O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, causador da

toxoplasmose, uma das mais comuns zoonoses parasitárias do mundo com

aproximadamente 25% da população global humana cronicamente infectada. Esse

agravo se reveste de importância em duas situações: (i) na toxoplasmose congênita

que pode acarretar danos severos ao feto, como retardamento mental e cegueira; (ii)

como uma importante infecção oportunista em indivíduos imunocomprometidos,

induzindo à toxoplasmose encefálica que pode ser fatal.

A toxoplasmose é uma das protozoonoses mais disseminadas pelo mundo,

estando presente em todos continentes A ampla distribuição do parasito é

determinada pela possibilidade de apresentar vários mecanismos de transmissão:

ingestão de cistos presentes em carnes cruas ou mal cozidas, ou pela ingestão de

oocistos presentes em fezes de felídeos que contaminam alimentos e água ou

ainda, a manipulação de terra contaminada com oocistos.

O T. gondii pode ser encontrado parasitando diferentes espécies de

vertebrados. Nestes animais, ocorre o processo de reprodução assexuada, que os

caracterizam como hospedeiros intermediários. A reprodução sexuada ocorre

unicamente em gatos e outros felídeos, considerados hospedeiros definitivos, pois

eliminam oocistos imaturos nas fezes.

Com cem anos de sua descoberta a literatura apresenta um enorme número de

artigos científicos abordando a toxoplasmose, o Toxoplasma gondii (9659) e seus

estágios infectivos: taquizoítos (1106), bradizoítos (262) e oocistos (493). Nota-se,

porém, que o conhecimento específico do ciclo entérico do T. gondii em felídeos é

escasso e se limita a 17 artigos, sendo que com relação particularmente à

caracterização morfológica in vivo, esse quantitativo cai para 4 artigos (Frenkel,

1970; Dubey e Frenkel, 1972; Fergunson, 2004 e Speers e Dubey 2005 ). A limitada

caracterização morfológica do ciclo entérico do T. gondii se reflete diretamente na

ausência de medidas de controle da toxoplasmose em felídeos.

A carência de modelos celulares que possibilitem explorar o ciclo entérico do T.

gondii no hospedeiro definitivo foi a motivação para o direcionamento dos objetivos

desta tese. Assim, introduzimos culturas de células intestinais de felídeos, pela

primeira vez, como modelo celular visando o estudo da interação do T. gondii com

essas células oriundas do hospedeiro definitivo, onde ocorre a reprodução sexuada

do parasito. Nossa principal meta é poder contribuir com subsídios da biologia

celular do parasito, possibilitando o desenvolvimento de novas drogas e estratégias

que possam prevenir toxoplasmose.

Considerando os aspectos éticos no uso de animais em ensaios experimentais,

o presente projeto se justifica pela possibilidade de se empregar culturas primárias

de células e de linhagem celular de felídeos para o estudo da sua interação com T.

gondii, minimizando assim, o emprego de felídeos nestes experimentos.

II. REVISÃO DE LITERATURA

1. Intestino delgado de mamíferos

O intestino delgado é dividido em três porções: duodeno, jejuno e íleo. Esta é a

porção do tubo digestivo onde ocorrem os processos finais da digestão, favorecendo

a ação das enzimas digestivas (Cheng e Leblond, 1974). A absorção dos nutrientes

ocorre por meio de mecanismos ativos ou passivos, nas regiões do jejuno e do íleo.

A superfície interna, ou mucosa, das regiões do jejuno e do íleo, apresenta,

além das projeções digitiformes, inúmeras projeções chamadas vilosidades; um

traçado que aumenta a superfície de absorção intestinal. As membranas das

próprias células do epitélio intestinal apresentam, por sua vez, dobras microscópicas

denominadas microvilosidades (Forte e cols, 1980).

A lâmina própria do intestino é formada por tecido conjuntivo, vasos

sangüíneos e linfáticos, fibras nervosas e fibras musculares lisas (esquema 1). A

lâmina própria penetra nas vilosidades intestinais, e suas fibras musculares são

responsáveis pelos movimentos rítmicos das vilosidades intestinais fundamentais

para os processos de absorção (Cheng e Bjerknes, 1983; Bjerknes e Cheng, 1985;

Cheng e cols., 1986).

A submucosa é constituída por um tecido conjuntivo rico em vasos sangüíneos

e linfáticos e se apresenta infiltrada por células linfóides e mastócitos (Friedman e

Cardell, 1977; Friedman e Nylund, 1980). A camada muscular é formada por fibras

dispostas em hélice e orientadas em três direções diferentes: a camada externa é

longitudinal, a média é circular e a interna oblíqua (esquema 1). A camada serosa é

delgada e coberta por mesotélio (esquema 1). As células assim formadas deslizam

em direção aos vilos, desprendendo-se na sua extremidade (Black e cols., 1980;

Moog, 1981; Moog e Wiemerslage, 1981).

Na região da submucosa estão localizadas as glândulas duodenais, que

secretam um muco alcalino (pH 8,2-9,3), responsável pela neutralização do suco

gástrico, tornando o pH ideal para ação das enzimas pancreáticas (Friedman e

Cardell, 1977; Friedman e Nylund, 1980). Os vasos sangüíneos que nutrem as

células intestinais partem da submucosa, formando uma rede capilar complexa em

cada vilosidade logo abaixo do epitélio, onde se encontram os capilares linfáticos

que se dirigem para o plexo de veias da submucosa (Friedman e Cardell, 1977;

Friedman e Nylund, 1980).

Esquema 1: Intestino delgado de mamíferos: A – Corte transversal do intestino delgado de

mamíferos, mostrando as diferentes camadas teciduais que constituem o órgão. B – Corte da região

das vilosidades intestinais com projeções digitioformes. B’ – Detalhe da cripta intestinal mostrando

células caliciformes, células de Paneth e células M. B’’ - Ápice da vilosidade intestinal com células

absortivas e caliciformes e o tecido conmjuntivo com linfócitos e capilares sangüíneos. Adaptado por

M.Moura e H.Barbosa de Junqueira e Carneiro (1995).

A inervação intestinal é formada por duas redes intrínsecas de neurônios: (a) o

plexo nervoso mioentérico, localizado entre as camadas submucosa e muscular

constituído basicamente por neurônios efetores; (b) o plexo submucoso localizado

na submucosa é constituído por neurônios efetores e sensoriais (Friedman e Cardell,

1977; Friedman e Nylund, 1980). Além disso, o intestino possui uma inervação

extrínseca formada por fibras parassimpáticas que estimulam a atividade da

musculatura lisa intestinal e fibras simpáticas que têm como objetivo diminuir a

movimentação da fibra muscular (Friedman e Cardell, 1977; Friedman e Nylund,

1980). O epitélio intestinal tem como função primordial a absorção de nutrientes.

Para o desempenho desta função, é fundamental a movimentação rítmica

involuntária das vilosidades intestinais, que é realizado, não só, pela musculatura

lisa das submucosas, mas também pela rica rede de filamentos de actina das

células epiteliais intestinais (Magney e cols., 1986).

Esquema 2: Células do epitélio intestinal de mamíferos: representação das células que compõem

o intestino delgado de mamíferos. Adaptado por M.Moura e H.Barbosa de Junqueira e Carneiro

(1995).

1.1. Células epiteliais intestinais de mamíferos

O desenvolvimento e funcionamento do epitélio do intestino delgado normal de

mamíferos dependem da regulação entre a proliferação e diferenciação das criptas.

Embora as propriedades morfológicas e de auto-renovação das células das criptas

tenham sido bem caracterizadas, os mecanismos controladores de sua proliferação

e diferenciação em diferentes tipos de células, ainda são pouco conhecidos

(Lavisheva e cols., 1999; Quaroni e cols., 2000).

Após o nascimento, a função digestiva e protetora da mucosa intestinal

depende de uma constante renovação e diferenciação do epitélio superficial.

Resumidamente, os vilos prolongam-se dentro do lúmen intestinal para absorver

nutrientes, sendo as criptas a região proliferativa celular do intestino. Células-tronco

epiteliais situam-se próximas à base de cada cripta e dividem-se em células filhas,

as quais migram em direção à borda superior das criptas, onde são removidas por

um processo envolvendo apoptose (Slorach e cols., 1999).

As células intestinais funcionam como uma barreira, que impede o acesso de

substâncias e microorganismos potencialmente nocivas para células subjacentes da

lâmina própria (Mahida e cols., 1997).

O epitélio das glândulas intestinais e dos vilos é bastante indiferenciado na

porção basal das glândulas e se diferencia gradualmente durante o seu

deslizamento em direção à extremidade do vilo (Cheng e cols., 1986). O epitélio da

mucosa intestinal é formado por vários tipos celulares. As células mais comuns são

as intestinais prismáticas ou absortivas, seguidas pelas células caliciformes, células

de Paneth (células enteroendócrinas produtoras de polípeptídios) e as células M

(Friedman e Cardell, 1977; Friedman e Nylund, 1980).

As células absortivas são colunares prismáticas e se caracterizam pela

presença de uma condensação em sua superfície apical (borda estriada). Ao

microscópio eletrônico essa borda se apresenta como uma camada de microvilus

densamente agrupados (Cheng e Bjerknes, 1983; Cheng e cols., 1986).

As células caliciformes secretam muco que lubrifica e protege a superfície do

epitélio intestinal, distribuindo-se entre as células absortivas. São menos freqüentes

no duodeno e aumentam em número em direção ao íleo (Friedman e Nylund, 1980;

Magney e cols., 1986).

As células de Paneth estão presentes na porção basal das glândulas intestinais

e se caracterizam por serem células exócrinas. Contêm grânulos de secreção

acidófilos na região apical do citoplasma e secretam principalmente a lisozima, que

tem função de regulação da microbiota intestinal (Cheng e Bjerknes, 1983; Cheng e

cols., 1986).

As células M são células epiteliais especializadas que recobrem os nódulos

linfáticos das placas de Peyer e se caracterizam pela presença de invaginações

laterais onde se localizam linfócitos. As células M são fundamentais para a resposta

imune das mucosas intestinais: interiorizam antígenos e permitem a migração de

linfócitos pelo intestino (Black e Moog, 1977; Moog, 1981).

Os tecidos linfóides associados à mucosa intestinal são compostos por

agregados de línfócitos: nas tonsilas, placas de Peyer e em folículos linfóides

dispersos na mucosa intestinal. (Buzoni-Gatel e cols, 2006). O sistema imune celular

no intestino delgado é bastante complexo e inclui populações variadas de linfócitos

intraepiteliais, predominantemente de linfócitos T (TCD4+, TCD8+). Seguidos de

Linfócitos B e Células NK, além dos macrófagos e granulócitos localizados na

submucosa (McDonald, 1999), Desta forma, o sistema imune intestinal apresenta

uma associação da resposta imune celular e da mediada por anticorpos, o que o

torna fundamental para o reconhecimento de moléculas e interação com

microorganismos.

1.2. Culturas primárias de células intestinais

Culturas primárias de células intestinais permitem estudar os mecanismos

envolvidos nas patologias intestinais, incluindo as causadas por agentes infecciosos

que afetam a integridade celular (Evans e cols., 1994).

Culturas primárias intestinais são de difícil obtenção, pois essas células

dependem fundamentalmente da interação célula-célula e/ou célula-matriz, além de

diversos fatores de crescimento (Aldhous e cols., 2001). A falta de fatores de

crescimento ou interações no sistema intestinal in vitro leva à indução de morte

celular dentro de um período muito curto de tempo (Strater e cols., 1996). A

interação do epitélio com o mesênquima é fundamental para regulação, proliferação

e diferenciação do epitélio intestinal (Fukamachi, 1992; Sanderson e cols., 1996).

Vários pesquisadores já desenvolveram métodos de cultivo de células

intestinais de diversas espécies animais, a partir de células primárias normais (Rusu

e cols., 2005). Algumas estratégias têm sido utilizadas na tentativa de se estabelecer

um cultivo intestinal homogêneo em monocamadas, empregando células intestinais

obtidas de fragmentos de animais adultos (Macartney e cols., 2000; Aldhous e cols.,

2001) ou células fetais (Quaroni, 1985a; Perreault e Jean-Francois, 1996; Sanderson

e cols., 1996). O principal problema com cultivos de células de animais adultos é que

após a remoção das celulas da membrana basal adjacente, o processo de apoptose

é iniciado dentro de poucas horas, inviabilizando estudos de longa duração (Potten e

cols., 1994; Strater e cols., 1996).

Em culturas primárias de epitélio intestinal obtidas de fetos de ratos de 14 a 15

dias foram observadas células epiteliais cubóides, com localização basal do núcleo e

a presença de vilos em uma face do lúmen (Kedinger e cols., 1987). Áreas de

especialização de membrana foram identificadas com formação de conexões do tipo

zônula de oclusão, zônula de adesão e desmossomos na região subluminal e

microvilos que se projetavam na face do lúmen, indicando que as células em cultura

mantinham a capacidade de absorção (Fukamachi, 1992).

1.3. Linhagens celulares epiteliais intestinais

O estabelecimento de linhagens celulares intestinais de mamíferos é um

processo muito difícil, devido à complexidade celular do intestino, da dependência

do contato entre as células e a necessidade de fatores de crescimento (Strater e

cols., 1996).

Nos últimos anos, culturas celulares epiteliais de cólon, oriundas de neoplasias,

têm sido consideradas como os sistemas intestinais mais favoráveis para o cultivo,

pois podem ser mantidas por um longo período de tempo (3-4 meses). No entanto,

uma série de processos fisiológicos e fisiopatológicos do intestino grosso in vivo, não

é mimetizada nestes sistemas (Bartsch e cols., 2004). Objetivando reproduzir os

eventos celulares que ocorrem in vivo foram estabelecidas culturas primárias de

células epiteliais diferenciadas (adultas) de cólon de camundongos (Booth e cols.,

1995; Tabuchi e cols., 2000), ratos (Ahnen e cols., 1988; Temes e cols., 1991;

Traber e cols., 1991; Schorkhuber e cols., 1998) e homem (Whitehead e cols., 1987;

Baten e cols., 1992; Stauffer e cols., 1995; Pedersen e cols., 2000). A principal

limitação de culturas primárias de células intestinais é o curto período de cultivo (na

maioria dos casos 7 a 14 dias), assim elas não são adequadas, por exemplo, para

estudos de transformação celular (Bartsch e cols., 2004).

Alternativamente, uma série de linhagens celulares derivadas de adenomas de

cólon (Paraskeva e cols., 1984; Van Mouwerik e cols., 1987) e carcinomas (Fogh e

cols., 1977; Leibovitz e cols., 1976) tornaram-se disponíveis. Porém, em função

dessas linhagens serem derivadas de tumores, elas continham diversas alterações

genéticas que impossibilitavam vários estudos comparativos in vitro, como por

exemplo, as linhagens intestinais de adenocarcinoma de cólon humano (HT29,

Caco-2, T84) (Bartsch e cols., 2004).

Linhagens de epitélio de intestino delgado de ratos, amostra fetal, como IEC-6,

IEC-18 e RIE-1 foram estabelecidas há pelo menos três décadas. Estas linhagens

apresentam características morfofisiológicas preservadas do epitélio intestinal in

vivo, trazendo vários avanços nos estudos in vitro da fisiopatologia intestinal

(Quaroni e cols., 1979; Quaroni, 1986; Browning e Lees, 1994).

A introdução de linhagens epiteliais intestinais de origem não neoplásica

representou um avanço nessa linha de pesquisa, pois além da manutenção das

características do tecido original, apresentam um taxa de apoptose inferior às

linhagens derivadas de células do intestino grosso (Potten e Grant, 1998).

1.4. Linhagens celulares de felídeos

Nas últimas décadas, a utilização de linhagens celulares representou um

grande avanço mundial, em vários aspectos: no custo dos experimentos, rapidez na

obtenção dos resultados e ainda, evitando sacrifício de animais (Balls, 2007).

Há uma carência de linhagens celulares de animais de grande porte, animais

silvestres e domésticos, quando comparado às linhagens de animais de laboratório,

mais especificamente quando se considera linhagens de origem intestinal (Golaz e

cols., 2007).

Recentemente, alguns trabalhos relatam o estabelecimento e a caracterização

de cultivos primários intestinais de animais domésticos: intestino de bovinos

(Follmann e cols., 2000; Birkner e cols., 2004; Rusu e cols., 2005; Kaushik e cols.,

2008); intestino delgado de caninos (Weng e cols., 2005; Golaz e cols., 2007) e

intestino de suínos

(Badylak e cols., 1998; Lindberg e Badylak, 2001).

Apesar de vários estudos relacionados à produção de vacinas e cultivos virais

em linhagens celulares de felinos (Lehmann e cols., 1992a; Lehmann e cols.,

1992b), poucas estão disponíveis para uso em pesquisas. Podemos destacar as

linhagens de: macrófagos FCWS-4 (Jacobse-Geels e Horzinek, 1983); linfoblastos:

NCE-F161 (Allison e Gregoriadis, 1990), FeLV-3281 (Donahue e cols., 1988), Fc3Tg

(Nelson-Rees e cols., 1972), MYA-1 (Miyazawa e cols., 1992) e FL74-UCD-1

(Pedersen e cols., 1979); linfócitos T: FeT-J e FeT-1c (Yamamoto e cols., 1998);

células da glia: PG-4 (S+L-) e astrócitos G355-5 (Haapala e cols., 1985).

Na ausência de linhagens intestinais de felinos disponíveis em bancos de

células, linhagens epiteliais são os modelos mais próximos para estudos

comparativos morfofisiopatológicos intestinais, e para isso temos disponível duas

linhagens: epitélio hepático AK-D (Cantin e Woods, 1993) e epitélio renal CRFK

(Crandell e cols., 1973).

Esse conjunto de dados reforça a necessidade do estabelecimento de culturas

de células epiteliais intestinais de felídeos para estudo de diversas enteropatias

intestinais, e principalmente como ferramenta para a reprodução do ciclo

enteroepitelial do T. gondii in vitro, como proposto na presente tese.

2. Toxoplasma gondii e toxoplasmose

2. 1 Considerações gerais

O Toxoplasma gondii é um dos parasitos intracelulares mais disseminados pelo

mundo e aproximadamente 1/3 da população humana mundial encontra-se

cronicamente infectada (Dubey e Welcome, 1988; Miro e cols., 2004; Dubey e cols.,

2004b). O parasito foi descoberto em 1908, simultaneamente, por Splendore em

coelhos, no Brasil, e por Nicolle e Manceaux, no roedor Ctenodatylus gondii, no

Instituto Pasteur da Tunísia, norte da África. Atualmente é bastante extensa a

relação de espécies, entre mamíferos e aves, encontradas naturalmente infectadas

pelo T. gondii (Montoya e Liesenfeld, 2004).

A transmissão do T. gondii pode ocorrer pela ingestão oral de oocistos que

foram liberados no ambiente junto com as fezes dos gatos, ou pela ingestão de

cistos teciduais encontrados em carne ou vísceras (cruas ou mal cozidas) dos

hospedeiros intermediários, ou pela via vertical através da transmissão

transplacentária dos taquizoítos (Dubey e Shen, 1991; Uchoa e cols., 1999; Dubey,

2004). Em muitos hospedeiros os taquizoítos podem também ser transmitidos por

meio do leite (Dubey e Carpenter, 1993). Assim, o parasito circula do hospedeiro

definitivo para o intermediário ou vice-versa, bem como entre os hospedeiros

definitivos e entre os hospedeiros intermediários (Dubey e cols., 2002).

Os gatos domésticos fazem o papel de disseminadores da infecção pelo

T.gondii, uma vez que liberam no ambiente uma grande quantidade de oocistos, que

quando esporulados podem permanecer viáveis por muitos meses ou anos (Frenkel

e Dubey, 1972; Dubey e cols., 2002). Oocistos podem ainda ser disseminados muito

facilmente, por insetos, vermes, água e pelo ar (Kniel e cols., 2002). Apesar dos

felídeos serem fundamentais para a manutenção do T. gondii no ambiente,

recentemente a toxoplasmose foi enquadrada como uma zoonose veiculada pela

água (Hill e Dubey, 2002; Bahia-Oliveira e cols., 2003; Dubey, 2004).

O sucesso do parasitismo por T. gondii em diferentes hospedeiros se deve a

sua rapidez em invadir as células, usando receptores altamente conservados entre

espécies filogeneticamente distantes. Essa característica faz com que praticamente

todos os animais sejam suscetíveis à infecção e atuando potencialmente como

hospedeiros intermediários e disseminadores deste parasito (Dubey e cols., 2002;

Hill e Dubey, 2002; Dubey, 2004).

O parasito apresenta alta infectividade e baixa patogenicidade. O número de

casos clínicos graves é bastante reduzido, devido à existência de numerosas cepas

com diferentes graus de virulência (Dubey e Carpenter, 1993). É estimado que as

diferentes taxas de infecção humana e animal, obtidas nos diversos países do

mundo, se devem a fatores como a localização geográfica, condições ambientais,

hábitos culturais e alimentares dos povos, grau de desenvolvimento do país e infra-

estrutura hídrica e sanitária (Suzuki e cols., 1995; Sobral e cols., 2005). A

distribuição cosmopolita do parasito não tem demonstrado a ocorrência de

resistência ao parasito por parte de nenhum grupo populacional em especial

(Amendoeira e Coutinho, 1981; Dubey, 2004; Sobral e cols., 2005). Na maioria dos

adultos a infecção não apresenta patogenia aparente com cerca de 90% dos

indivíduos infectados assintomáticos. No entanto, cegueira ou retardamento mental

pode ser observado em crianças congenitamente infectadas e em pacientes

imunocomprometidos apresentando clínica neurológica severa (Dubey e Welcome,

1988; Hill e Dubey, 2002).

O hospedeiro infectado vai desenvolver basicamente dois tipos de infecção:

uma aguda provocada por taquizoítos que se multiplicam numa enorme variedade

de células, disseminando a infecção pelo organismo do hospedeiro e, uma crônica,

quando ocorre o encistamento em diversos tecidos, particularmente cérebro e

músculos (Dubey e Frenkel, 1973; Dubey e Welcome, 1988). Cistos teciduais

persistem por toda a vida do hospedeiro, podendo se romper, liberando bradizoítos e

iniciar o processo de reativação da infecção toxoplásmica. Esta reativação pode

ocasionar principalmente, a toxoplasmose encefálica (Luft e Remington, 1992; Hill e

Dubey, 2002; Dubey, 2004). O mecanismo que leva à reativação da infecção pelo T.

gondii é desconhecido, não havendo consenso em relação aos mecanismos de

interconversão bradizoíto-taquizoíto (Bohne e cols., 1994; Sahm e cols., 1997). A

quimioterapia utilizada na toxoplasmose é efetiva contra os taquizoítos, sendo os

bradizoítos menos susceptíveis, fazendo com que os cistos teciduais nos diferentes

tecidos tenham uma grande relevância clínica (Gross e cols., 1996; Bohne e cols.,

1997).

2.2. Formas infectantes do T. gondii

O T. gondii pertence ao filo Apicomplexa, possui uma única espécie T. gondii

com numerosas cepas e é constituído por protozoários com estrutura celular

polarizada e com um complexo de organelas secretoras bem características deste

grupo (micronemas, róptrias e grânulos densos) (Dubey e Welcome, 1988; Dubey e

cols, 1998).

O parasito apresenta três formas evolutivas responsáveis pela transmissão da

toxoplasmose: bradizoítos e taquizoítos, encontrados nos hospedeiros

intermediários e definitivos onde se reproduzem assexuadamente, e esporozoítos

encontrados nos oocistos eliminados pelas fezes dos hospedeiros definitivos, por

meio da reprodução sexuada (Dubey, 2002; Dubey e cols., 1998).

2.2.1. Taquizoítos

O termo taquizoíto (taqui = rápido em grego) é devido à rápida multiplicação do

parasito em diversos tipos celulares. Os taquizoítos possuem formato elíptico (4-8

µm de comprimento e 2-4 µm de largura). São parasitos obrigatoriamente

intracelulares de células nucleadas e são sempre encontrados no interior de

vacúolos parasitóforos (Dubey e cols., 2002). Depois de várias replicações por

endodiogenia, os parasitos rompem a membrana da célula hospedeira e se

disseminam via hematógena para vários tecidos (Dobrowolski e Sibley, 1996; Dubey

e Frenkel, 1998). A forma taquizoíta é responsável pela fase aguda da infecção,

causando forte inflamação, destruição tecidual e manifestações clínicas (Frenkel,

1974).

Ultra-estruturalmente, os taquizoítos apresentam diversos grânulos densos e

micronemas, grânulos de amilopectina raros ou ausentes, arranjo de microtúbulos

subpeliculares, anéis apicais e polares, cinco a oito róptrias (organelas claviformes,

na região anterior entre complexo apical e o núcleo) (de Melo e cols., 2000; de

Souza, 1974; de Souza & Souto-Padrón, 1978; Moreno e cols., 1998). Apresentam

núcleo na região central do corpo do parasito (Dubey e cols 1998).

2.2.2. Bradizoítos e Cistos Teciduais

Bradizoíto (bradi = lento em grego) é a forma encontrada no interior de cistos

teciduais, caracterizando a fase crônica da infecção. Reproduz-se lentamente no

interior do vacúolo parasitóforo na célula hospedeira por endodiogenia e modifica a

membrana do vacúolo formando a parede cística dando origem ao cisto tecidual

(Weiss e Kim, 2000). Os bradizoítos medem aproximadamente de 7-9 µm de

comprimento por 2-4 µm de largura (Mehlhorn e Frenkel, 1980) e são ácido periódico

de Schiff positivo (PAS +). Apresentam o núcleo deslocado para região posterior do

corpo do parasito, e ainda, róptrias bastante eletrondensas, grande número de

micronemas e diversos grânulos de amilopectina (Jacobs e cols., 1960; Guimarães e

cols., 2003).

Cistos teciduais variam de tamanho, os jovens podem medir cerca de 5 µm de

diâmetro e os mais velhos podem conter centenas de organismos alcançando em

média cerca de 60 µm (Dubey e Carpenter, 1993). O tamanho do cisto dependente

de sua idade, do tipo da célula hospedeira e da cepa de T. gondii (Weiss e Kim,

2000).

A parede do cisto tissular é elástica e pouco densa (< 0,5 µm de espessura), e

formada por uma membrana e pela região granular (localizada na face interna desta

membrana). A região granular é formada por um material eletrondenso granuloso

que também preenche os espaços entre os bradizoítos. A parede cística tem sua

origem nas moléculas da célula hospedeira e nas do parasito (Ferguson e

Hutchison, 1987). A parede cística é pouco reativa à marcação ao PAS (Dubey e

Welcome, 1988). A parede cística e a matriz provavelmente protegem os bradizoítos

das condições severas do ambiente e também promovem uma barreira física contra

o sistema imune do hospedeiro (Weiss e Kim, 2000).

A parede dos cistos teciduais é rica em açúcares e outros polissacarídeos

(Speer e cols., 1998; Weiss e Kim, 2000; Guimarães e cols., 2003, 2007), presentes

nos órgãos viscerais, incluindo baço, fígado e rim, e majoritariamente nos tecidos

nervoso e musculares (Speer e cols., 1998 e Weiss e Kim, 2000). Podem persistir

intactos por toda a vida do hospedeiro sem causar uma resposta inflamatória

imunológica, evitando sua destruição (Dubey e Welcome, 1988; Hill e Dubey, 2002).

Por mecanismos ainda desconhecidos os cistos teciduais podem se romper, e com a

transformação de bradizoítos em taquizoítos (interconversão), reinvadem outras

células hospedeiras e novamente se transformam em bradizoítos formando um novo

cisto tecidual (Tenter e cols., 2000).

2.2.3. Esporozoítos

Formas infectantes do T. gondii são encontradas no interior dos oocistos em

número de oito, quatro em cada um dos dois esporocistos. São produzidas no

epitélio intestinal dos felídeos e eliminados, ainda imaturos, junto com as fezes

desses hospedeiros definitivos no meio ambiente, onde sofrem maturação (Dubey e

Frenkel, 1973; Wong e Remington, 1993; Tenter e cols., 2000).

Morfologicamente os esporozoítos representam a forma intermediária entre

taquizoítos e bradizoítos, considerando-se a quantidade de determinadas organelas

(Speer e cols., 1998). Eles apresentam um número intermediário de micronemas, um

número superior de grânulos densos em relação aos taquizoítos e muitos grânulos

de amilopectina como os bradizoítos. Caracterizam-se pela presença de muitos

grânulos lipídicos que parecem ser uma exclusividade dos esporozoítos (Speer e

cols., 1998). Quanto ao perfil de moléculas estágio-específicas expressas pelo

esporozoítos, eles são SAG-1 e BAG-1 negativos (Bohne e cols., 1993; Sahm e

cols., 1997; Ferguson, 2004).

Esquema 3: Ultra-estrutura das formas infectantes de T. gondii. Reproduzido e adaptado de

Dubey J.P., Lindsay DS, Speer CA 1998.

2.3. Ciclo biológico

O T. gondii é um protozoário heteroxeno facultativo, intracelular obrigatório que

pode ser encontrado parasitando diferentes espécies de mamíferos e aves (Dubey e

Welcome, 1988). Nesses animais, ocorre o processo de reprodução assexuada,

caracterizando-os como hospedeiros intermediários (Black e Boothroyd, 2000). A

reprodução sexuada ou ciclo enteroepitelial ocorre exclusivamente em gatos

Anéis apicais

Plasmalema

Róptrias

Micronemas

Anéis polares

Conóide

Complexo membranar interno

Microporo

Amilopectina

Apicoplasto

Complexo de Golgi

Centríolos

Grânulos densos

Núcleo

Mitocôndria

Apicoplasto

Retículo endoplasmático rugoso

Complexo de Golgi

Centríolos

Corpos lipídicos

Núcleo

Amilopectina

Grânulos densos

Poro posterior

Taquizoít

Bradizoíta

Anéis apicais

Plasmalema

Róptrias

Micronemas

Anéis polares

Conóide

Complexo membranar interno

Microporo

Amilopectina

Complexo de Golgi

Centríolos

Núcleo

Mitocôndria

Apicoplasto

Retículo endoplasmático rugoso

Corpos lipídicos

Grân

ulos densos

Poro posterior

Esporozoíta

domésticos e outros felídeos (Dubey e cols., 2004), membros da família Felidae.

Estes são considerados hospedeiros definitivos, nos quais se observa no epitélio

intestinal o processo de esquizogônia, gametogônia e esporogônia resultando na

formação de oocistos imaturos que são eliminados junto com as fezes dos felídeos

(Frenkel e Dubey, 1972; Dubey e Frenkel, 1972; Dubey e Frenkel, 1973; Dubey e

cols., 2002). Gatos domésticos podem excretar milhões de oocistos após ingerirem

apenas um bradizoíto ou um cisto tecidual (Dubey, 1998a). Geralmente, menos de

1% da população de gatos pode ser encontrada liberando oocistos. Os oocistos são

liberados por apenas um curto intervalo de tempo (1-2 semanas) na vida do gato

(Dubey e Welcome, 1988).

As formas evolutivas do parasito, responsáveis pela infecção dos hospedeiros,

são as mesmas para todos: cistos com bradizoítos presentes em carnes, taquizoítos

em diversos tecidos e fluidos corporais e esporozoítos em oocistos esporulados que

podem estar contaminando a água e alimentos. Existem, entretanto, diferenças

quanto à infectividade de cada uma dessas formas de acordo com o hospedeiro. O

cisto contendo os bradizoítos parece ser a forma mais efetiva para infecção de

felídeos, uma vez que culmina com a liberação de oocistos em quase todos os

animais que o ingerirem. Em contrapartida, oocistos e taquizoítos quando ingeridos

por felídeos levam a produção de oocistos em menos de 30% dos animais (Dubey e

Frenkel, 1976).

Nos hospedeiros intermediários ocorrem apenas duas fases de multiplicação

assexuada. Num primeiro momento, logo após a infecção, os taquizoítos

multiplicam-se por endodiogenia rápida no interior de vacúolos parasitóforos em

diversos tipos celulares. Ao que parece, no interior de qualquer célula nucleada.

Caso a infecção ocorra, o parasita passa rapidamente pelas células epiteliais

intestinais e chega por meio da circulação a outros tipos celulares em diversos

tecidos onde segue sua multiplicação intracelular rápida (Dubey, 1998b; Tenter e

cols., 2000).

Resposta imunológica do hospedeiro relacionada à regulação na produção

principalmente das citocinas IL-10, TGF-β, IL27 e IL-12 pelos linfócitos TCD4+,

modulam a patogenese da toxoplasmose sistêmica e local e levam a uma mudança

no ritmo de multiplicação do parasito (Gaddi e Yap, 2007). O processo de

endodiogenia passa a ocorrer de forma lenta pelos bradizoítos (Dubey e Frenkel,

1998; Tenter e cols., 2000). Os cistos são predominantes durante a infecção crônica

(Frenkel, 1974), mas podem começar a ser produzidos ainda durante a fase aguda.

Estes são mais encontrados no sistema nervoso central, retina, musculaturas

esquelética e cardíaca, entretanto, também pode ocorrer mais raramente em

vísceras como pulmão, fígado e rins (Dubey, 1998a; Dubey e cols., 1998; Tenter e

cols., 2000). Alguns estudos têm demonstrado a existência de tropismo maior para

formação de cistos cerebrais em pequenos roedores independentemente da cepa do

T. gondii enquanto para grandes mamíferos como bovinos, ovinos e caprinos os

cistos são predominantemente musculares (Dubey, 1997a; Dubey e cols., 1998).

Esquema 4: Ciclo de vida do T. gondii: Ciclo biológico ilustrado do Toxoplasma gondii mostrando

as vias de transmissão entre os hospedeiros intermediários e definitvos.

2.4. Ciclo enteroepitelial ou Sexuado

Os gatos podem liberar oocistos após ingerir qualquer um dos três estágios

infectantes do T. gondii: taquizoítos, bradizoítos e esporozoítos. O tempo de pré-

patência e a freqüência da liberação de oocistos dependem da forma infectante

ingerida: 3 a 10 dias após ingerir cistos teciduais ou bradizoítos, maior ou igual a 13

dias após a ingestão de taquizoítos e de 18 ou mais dias após ingerir oocistos

(Dubey e Frenkel, 1973; Dubey e Welcome, 1988; Dubey, 2004). Após a ingestão

dos cistos teciduais pelos gatos, sua parede é destruída por enzimas proteolíticas do

estômago e do intestino delgado. Os bradizoítos são liberados e penetram na

parede intestinal iniciando o desenvolvimento de várias gerações de T. gondii

(Dubey e Frenkel, 1972). Ocorrem cinco estágios enteroepiteliais, ou esquizontes

distintos de T. gondii (Tipos: A, B, C, D e E) (Dubey e Frenkel, 1972; Frenkel e

Dubey, 1972).

A microscopia de luz revelou que os esquizontes se localizam entre a

superfície interna e o núcleo dos enterócitos (Dubey e Frenkel, 1972). O esquizonte

do tipo B se multiplica por endodiogenia, forma especializada de multiplicação

assexuada onde duas células-filhas se formam no interior da célula-mãe (Sheffield e

Melton, 1968). enquanto os demais tipos se multiplicam por endopoligenia (forma

especializada de multiplicação assexuada onde várias células-filhas se formam no

interior da célula-mãe) (Sheffield e Melton, 1968; De Souza, 1974).

A microscopia eletrônica de transmissão revela que todos os estágios

enteroepiteliais contêm organelas características do Filo Apicomplexa, incluindo:

conóide, róptrias, micronemas, núcleo e nucléolo, plasmalema, complexo

membranar interno, microtúbulos subpeliculares, anéis apicais e polares, microporo,

complexo de Golgi, retículo endoplasmático, numerosos ribossomos, corpos

lipídicos, grânulos densos, mitocôndrias e grânulos de amilopectina (Dubey e

Frenkel, 1998; Weiss e Kim, 2000).

De acordo com a literatura, principalmente os trabalhos de Dubey e Frenkel

(1972) e Frenkel e Dubey (1972), as características morfológicas dos diferentes

estágios enteroepiteliais do T. gondii, obedece aos seguintes critérios:

2.4.1. Esquizonte do Tipo A

É o primeiro estágio de desenvolvimento observado no intestino dos gatos,

após 12 a 18 horas da ingestão de cistos. Possuem núcleo centralizado, podem ser

corados pelo Giemsa e é ácido periódico de Shiff (PAS) negativo. São observados

em enterócitos superficiais e às vezes na lâmina própria intestinal (Dubey e Frenkel,

1972).

2.4.2. Esquizonte do Tipo B

Ocorre de 12 a 54 horas pós-infecção. Apresentam núcleo centralizado e

alguns grânulos situados na periferia citoplasmática fracamente PAS positivos. A

divisão destes organismos é pleomórfica existindo organismos com três ou mais

núcleos (Dubey e Frenkel, 1972). Localizam-se em um grande vacúolo parasitóforo

(VP) de membrana delgada, constituído por uma rica rede de membranas

tubulovesicular (RMT) (Dubey e Frenkel, 1972). Merozoítos se multiplicam por

endodiogenia e ultra-estruturalmente são muito similares aos taquizoítos, porém

ocorrem exclusivamente em enterócitos felinos, medindo 5.8 x 2.9 µm. Possuem

poucos e pequenos grânulos de amilopectina e róptrias pouco definidas (Dubey e

Frenkel, 1972). Muitos merozoítos do tipo B permanecem no mesmo VP após várias

divisões e formam estruturas grandes multinucleadas. Estas formas multinucleadas

possuem numerosos corpos lipídicos e mitocôndria com matriz eletrondensa

moderada (Dubey e Frenkel, 1972; Speer e cols., 1998).

2.4.3. Esquizonte do Tipo C

Desenvolve-se no citoplasma no interior do vacúolo parasitóforo (VP) em forma

de roseta. Individualmente são alongados com o núcleo subterminal. Os esquizontes

amadurecem entre 24 e 32 horas e são fortemente PAS positivo (Dubey e Frenkel,

1972).

O estágio enteroepitelial tipo C mede cerca de 6.0 µm x 1.5 µm, multiplicando-

se no interior de enterócitos ou linfócitos intraepiteliais por endopoligenia. Os

esquizontes unicelulares dão origem aos esquizontes do Tipo D. Ultra-

estruturalmente os esquizontes do tipo C contêm poucos micronemas, poucos

grânulos densos, muitos corpos lipídicos e pequenas mitocôndrias (Speer e Dubey,

2005). A forma intermediária do esquizonte do tipo C apresenta vários núcleos com

nucléolos evidentes e muitas expansões peliculares encravadas na membrana do

vacúolo parasitóforo (MVP). O VP não contém rede de membranas tubulovesicular

(RMT) e a MVP é intimamente associada à membrana do merozoíto. Os esquizontes

intermediários se desenvolvem internamente por endopoligenia (Speer e Dubey,

1998; Speer e Dubey, 2005). O VP em torno dos esquizontes tipo C maduros

contém pequenos agregados de material granular, a MVP é intimamente associada

à membrana do merozoíta do tipo C que apresenta duas mitocôndrias proeminentes,

róptrias eletrondensas e grânulos de amilopectina (Speer e Dubey, 2005).

Eventualmente, os merozoítos ficam aderidos à superfície do esquizonte

deixando um corpo residual medindo aproximadamente 2 x 3µm, contendo resíduos

de mitocôndria, ribossomos, retículo endoplasmático e grânulos de amilopectina

(Speer e Dubey, 1998).

2.4.4. Esquizonte do Tipo D

Aparece de 32 horas a 15 dias pós-ingestão de cistos teciduais e é bastante

abundante nas células epiteliais da base das vilosidades intestinais. Após 40 horas

começa a se multinuclear, originando os merozoítos, por meio de divisão nuclear

assimétrica que gera organismos de vários aspectos morfológicos (Dubey e Frenkel,

1972).

Ultra-estruturalmente os merozoítos do tipo D (5.8 x 1.3 µm) apresentam

róptrias eletrondensas, preenchidas com material granular e localizadas acima do

complexo de Golgi (Speer e Dubey, 2005).

2.4.5. Esquizonte do Tipo E

Ocorre de 3 a 15 dias pós-infecção e é caracterizado pela presença de um

corpúsculo residual que pode ser identificado quando os merozoítas se organizam

em forma de roseta (Dubey e Frenkel, 1972). Os esquizontes do tipo E surgem a

partir de esquizontes do tipo D que escaparam para células vizinhas. Assim, este

tipo celular apresenta características ultra-estruturais distintas como: MVP

eletrondensa, numerosas e proeminentes mitocôndrias situadas logo abaixo da

película do merozoíto do tipo E (4.5 x 1.1 µm), apresentam róptrias eletrondensas e

diversos corpos granulares, e medem cerca de 300 a 600 nm de diâmetro (Speer e

Dubey, 2005).

As fases evolutivas, tipos A, B, C, D e E, parecem ser exclusivas do ciclo do

Toxoplasma, uma vez que em estudos com outros coccídeos, estes tipos nunca

foram observados (Dubey e Frenkel, 1972).

Os tipos A, B e C acontecem de forma seqüencial, ou seja, o tipo A conduz à

formação dos tipos B e C, estes amadurecem rapidamente e desaparecem conforme

vão surgindo as formas do tipo D. Os gametócitos só são observados na ausência

dos tipos A, B e C. Os tipos D e E ocorrem simultaneamente com os gametas,

sugerindo que estes sejam precursores dos gametas ou variantes do mesmo estágio

biológico evolutivo (Dubey e Frenkel, 1972).

2.4.6. Gametogênese

A gametogênese do T. gondii ocorre nas células superficiais do intestino

delgado, mais comumente encontrada na região jejuno-ileal (Dubey e Frenkel,

1972). A diferença ultra-estrutural entre cada tipo de esquizonte é pequena e

peculiar, sendo necessário associar informações do tempo de infecção e estrutura

do VP na célula hospedeira (Dubey e Frenkel, 1998).

Os microgametas (5.7 x 3.5 µm) possuem o núcleo bastante pequeno,

citoplasma mais claro, comparando-se com as formas dos tipos D e E, e com dois

flagelos (Dubey e Frenkel, 1972). Possuem uma única mitocôndria, núcleo

electrondenso, complexo membranar interno com aproximadamente 12

microtúbulos. O VP é preenchido por material eletronlucente (Speer e Dubey, 2005).

Os macrogametas (8.1 x 6.0 µm) contêm todas as organelas e corpos de

inclusão característicos do gênero. O VP contém material levemente granular,

moderadamente eletrondenso (Speer e Dubey, 2005).

2.4.7. Formação de Oocistos

Os microgametas quando saem das células da parede intestinal, caem na luz

intestinal e são atraídos pelos macrogametas. A fecundação ocorre nas células

intestinais, dando origem ao ovo ou zigoto, que após gerar a parede cística forma o

oocisto que rompe as células intestinais e são liberados para o meio externo junto

com as fezes do felídeo. Durante a formação do oocisto observa-se a formação de

uma parede eletrondensa constituída por quatro membranas e o desaparecimento

da MVP (Speer e Dubey, 2005). A esporogônia ocorre fora do organismo do

hospedeiro de 1 a 21 dias em condições ideais de temperatura e oxigenação

(Dubey, 2004; Montoya e Liesenfeld, 2004). Os oocistos não esporulados têm a

forma ovalada e dupla membrana. A esporulação ocorre fora do corpo do

hospedeiro sob a influência da oxigenação, umidade e temperatura do meio externo

(Hill e Dubey, 2002). Os oocistos esporulados são elípticos, contém dois

esporocistos e cada esporocisto possui quatro esporozoítos (Wong e Remington,

1993; Speer e cols., 1998; Dubey e cols, 1998).

2.4.8. Trofozoítos

Os trofozoítos ocorrem na lâmina própria do intestino delgado dos gatos de 1 a

9 dias pós-ingestão de cistos. Não se sabe o que leva os bradizoítos a dar origem a

trofozoítos e qual a relação destes com a formação dos tipos A-E. Após o seu

aparecimento, os trofozoítos migram por via linfática para outros órgãos, sendo

observados no cérebro 23 dias após a ingestão de cistos pelos felinos (Dubey e

Frenkel, 1972; Speer e cols., 1998).

Esquema 5: Ciclo enteroepitelial do T. gondii: Estágios enteroepiteliais do ciclo do Toxoplasma

gondii nos células epiteliais superficiais do intestino delgado do gato doméstico. Criação e adaptação

por M.Moura e H.Barbosa com base principalmente nos artigos de Fergunson (2004) e Speer e

Dubey (2005).

3. Interação parasito-célula hospedeira

3.1. Aspectos gerais

Estudos com T. gondii têm revelado que a invasão da célula hospedeira é um

processo bastante complexo que ocorre por meio da liberação seqüencial de

proteínas presentes nos micronemas, róptrias e grânulos densos do parasito (Opitz

e Soldati, 2002; Sibley, 2003). Esses eventos moleculares compreendem: ligação

receptor-ligante, transdução de sinais, mobilização do sistema actina-miosina,

regulação da exocitose das organelas secretoras e modificação proteolítica das

proteínas de superfície do parasito (Howell e cols., 2005).

Adesão e invasão na célula hospedeira são eventos cruciais para o

estabelecimento da infecção pelo T. gondii. Inicialmente, por meio do pólo anterior

(conóide) o parasito estabelece contato com a superfície da célula hospedeira

desencadeando a invaginação da membrana celular, o que sugere a participação

ativa do parasito neste processo (Nichols e O'Connor, 1981). O processo de invasão

se inicia com o deslizamento do parasito, por meio de adesão reversível sobre a

superfície da célula hospedeira com a reorientação do corpo do parasito e a

exocitose de proteínas presentes nos micronemas e nas róptrias (Carruthers e

Sibley, 1997; Mordue e cols., 1999; Alexander e cols., 2005).

O fato do T. gondii invadir diferentes tipos celulares sugere a existência de um

receptor específico universalmente distribuído, ou então, a participação de vários

receptores diferentes. Por exemplo, a laminina aumenta a adesão dos taquizoítos à

célula hospedeira e que estes podem reconhecer e se ligar a múltiplos receptores da

laminina como a α6β1 integrina (Furtado e cols., 1992; Furtado e cols., 1992a).

O reconhecimento de múltiplos glicosaminoglicanos sulfatados na superfície da

célula hospedeira também contribui para a adesão e invasão deste parasito em

diferentes tecidos (Chatterton e cols., 2002). Em taquizoítos, SAG1 (p30), principal

proteína de superfície de taquizoítos com 30KDa, é reconhecida por moléculas

glicosilados da célula hospedeira e são importantes durante a adesão do parasito à

célula hospedeira (Smith, 1995; Grimwood e Smith, 1996; Bonhomme e cols., 1999).

3.2. Aspectos moleculares da adesão e invasão

No filo Apicomoplexa as proteínas adesivas são altamente conservadas, como

a proteína MIC em T. gondii (Wan e cols., 1997). Diversas proteínas dos

micronemas formam complexos adesivos com domínios semelhantes aos

encontrados em proteínas de vertebrados (integrinas, EGF, trombospondinas e

lectinas) que reconhecem receptores na superfície das diversas células hospedeiras,

como heparan sulfato, proteoglicanas e laminina (Chatterton e cols., 2002). A

existência destes diferentes complexos sugere que interações moleculares estariam

envolvidas na movimentação do parasito através das barreiras biológicas, enquanto

outros estariam envolvidos na penetração na célula hospedeira, capacitando o

parasito para o reconhecimento de uma variedade maior de receptores, amplificando

assim sua gama de hospedeiros (Chatterton e cols., 2002).

Algumas proteínas da superfície de T. gondii envolvidas na invasão do

parasito, apresentam propriedades proteolíticas, demonstradas pela sensibilidade do

parasito aos inibidores de proteases durante a invasão (Carruthers, 2002). Esse

processo envolve as proteínas adesivas TgMIC2 e TgMIC6 secretadas pelos

micronemas, sendo então translocadas até a superfície do taquizoíto e

posteriormente liberadas, após a clivagem proteolítica dos seus domínios

transmembranas (DTM) (Opitz e Soldati, 2002; Harper e cols., 2006). Por exemplo, a

clivagem da protease-1 do micronema (MPP1), protease transmembranar, é

necessária para o processo de invasão do T. gondii na célula hospedeira (Brossier e

Sibley, 2005; Brossier e cols., 2005).

A secreção coordenada dos micronemas e das róptrias identifica um complexo

de quatro proteínas: TgAMA1, RON2, RON4 e a Ts4705. Pelo menos duas destas

proteínas, a TgAMA1 e a RON4 interagem no processo de invasão, localizando-se

em uma constrição denominada junção móvel (JM), na qual as membranas do

parasito e do hospedeiro ficam em íntimo contato (Alexander e cols., 2005).

Aparentemente, a JM exclui algumas proteínas da membrana plasmática da célula

hospedeira, dando início à formação e modificação da membrana do vacúolo

parasitóforo (Mordue e cols., 1999). A seletividade de componentes da membrana

plasmática durante a invasão do T. gondii na biogênese do vacúolo parasitóforo (VP)

é determinante para o destino intracelular do parasito, como será apresentado no

próximo ítem.

3.3. Vacúolo parasitóforo

Moléculas tanto da célula hospedeira quanto do parasito participam da

formação e desenvolvimento do VP. Esse compartimento atua na proteção do

parasito contra a ação de radicais livres, variações de pH, osmolaridade e evita a

ação do sistema imune do hospedeiro (Nichols e cols., 1983; Sinai e cols, 1997).

Outra característica deste VP é que não se funde com compartimentos da via

endocítica da célula hospedeira (Karsten e cols., 1997; Mordue e cols., 1999).

As róptrias do Toxoplasma fornecem proteínas e lipídeos, através de vesículas,

essenciais para a formação da membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) (Coppens

e Joiner, 2003). Estas organelas são enriquecidas em colesterol e fosfatidilcolina e

descarregam seus conteúdos durante o processo de invasão (Coppens e Joiner,

2003). Ensaios farmacológicos, nos quais o colesterol da membrana plasmática da

célula hospedeira foi depletado antes da infecção, revelaram redução na taxa de

invasão e formação do VP (Sehgal e cols., 2005).

Depois da invasão a MVP é bioquimicamente modificada por uma intensa

exocitose de moléculas das róptrias e grânulos densos (Carruthers, 2002). Durante o

processo de multiplicação do parasito, ocorre um aumento significativo da extensão

da MVP. Alguns autores atribuem este aumento à incorporação de moléculas

provenientes de organelas do hospedeiro como o retículo endoplasmático e

mitocôndria (de Melo e de Souza, 1997; Sinai e cols., 1997).

As proteínas dos grânulos densos participam da modificação do VP e são

secretadas logo após a interiorização dos parasitos (Brossier e Sibley, 2005). As

proteínas GRA2, GRA3 e GRA6 possuem um papel fundamental na formação dos

nanotúbulos, sendo a GRA2 e GRA4 envolvidas na organização de vesículas que

após alongamento darão origem à rede intravacuolar madura, e a GRA6 na

estabilização da rede de membranas tubulovesicular (RMT) (Mercier e cols., 2002).

A GRA7 encontrada na MVP tem sido recentemente relacionada com a formação

dos microtúbulos derivados da invaginação da MVP, que estariam atuando no

transporte de lipídeos, através do espaço vacuolar até o parasito (Coppens e cols.,

2006).

A importância da secreção de grânulos densos durante a estada do parasito no

VP tem sido atribuída ao seu desenvolvimento intracelular resultando, por exemplo,

no intercâmbio de nutrientes via rede de túbulos conectando o T. gondii ao citossol

da célula hospedeira.

4. Dinâmica de diferenciação do T. gondii estudos in vitro e in vivo

A diferenciação em organismos unicelulares é um fenômeno temporal,

freqüentemente associado com a alteração das condições ambientais. Para muitos

protozoários parasitos, a diferenciação é um processo obrigatório, com diferentes

estágios evolutivos dentro do seu ciclo de vida, necessários para o sucesso da

transmissão entre hospedeiros (Dzierszinski e cols., 2004).

Durante a invasão em células hospedeiras, diferenças ocorrem entre as duas

formas evolutivas: taquizoítos formam “tight junction”, com a célula hospedeira, o

mesmo não sendo observado com os bradizoítos. Ambos os estágios infectivos após

a invasão são localizados no interior de um VP (Sasono e Smith, 1998).

Cepas de T. gondii avirulentas do tipo II (cepa VEG, ME49; Beverley,

Prugniaud e NTE), produzem cistos teciduais espontaneamente in vitro com mais

freqüência (Lindsay e cols., 1993; McHugh e cols., 1993) e em maior número

quando comparadas às cepas virulentas do tipo I (cepa RH e BK) (Bohne e cols.,

1994; Bohne e cols., 1999). Os cistos formados

in vitro são menores e em menor

quantidade do que aqueles obtidos in vivo (Tomavo e cols., 1991; Bohne e cols.,

1994; Gross e cols., 1996)

Células HeLa e células L (fibroblastos) infectadas com taquizoítos de T. gondii

cepas RH e Beverley, demonstraram a conversão espontânea de bradizoítos e

formação de cistos teciduais. E ainda, estes cistos foram infectivos para gatos

jovens, levando à produção de oocistos. Esses resultados indicam que cistos

teciduais produzidos in vitro são biologicamente iguais aos produzidos in vivo

(Matsubayashi e Akao, 1963).

A descoberta de antígenos estágio-específico, e conseqüente produção de

anticorpos contra esses antígenos, favoreceu os estudos da cistogênese in vitro,

com cepas avirulentas (tipos II e III) de T. gondii (Weiss e Kim, 2000) e dos

mecanismos de conversão in vitro do parasito (Bohne e cols., 1993; Lindsay e cols.,

1993; McHugh e cols., 1993; Soete e cols., 1993; Bohne e cols., 1994; Gross e

Bohne, 1994; Soete e cols., 1994; Gross e cols., 1996; Sahm e cols., 1997;

Guimarães e cols., 2008).

Em fibroblastos humanos infectados com formas bradizoítos da cepa ME49, os

parasitas intracelulares com 3 d.p.i. foram positivos para BAG-5, que reconhece

especificamente antígenos de bradizoítos, sugerindo que alguns bradizoítos

poderiam formar cistos teciduais diretamente, sem conversão prévia para taquizoítos

(Sahm e cols., 1997).

O emprego de um anticorpo específico para parede cística possibilitou

identificar cistos teciduais em cultura de astróctios e de neurônios de tecido de feto

humano, também com a mesma cepa ME49 (Halonen e cols., 1996). Entretanto,

quando bradizoítos são inoculados em camundongos por qualquer via, o período

mínimo para formação de cistos teciduais biologicamente funcionais é de 6 d.p.i.

(Frenkel e cols., 1976). Em contraste aos resultados in vitro, os ensaios in vivo

demonstraram que todos os bradizoítos tinham convertido para a forma taquizoíta

após 18 h.p.i. e negativos para o antígeno BAG-5 após 48 h.p.i. (Dubey, 1997a). O

emprego de células musculares esqueléticas como modelo de estudo da

cistogênese in vitro, tem demonstrado que a infecção das fibras musculares com

bradizoítos dá origem a vacúolos positivos e negativos para antígenos de bradizoítos

numa mesma célula. Esses dados indicam que alguns bradizoítos seguem

diretamente para a formação de cistos, enquanto outros se transformam em

taquizoítos antes de formar cistos (Guimarães e cols., 2008).

Soete e cols.(1994) detectaram antígenos específicos para bradizoítos (BAG-1)

e formação de estruturas císticas em culturas celulares das linhagens VERO e HFF,

quando submetidas a estresse físico e metabólico infectadas com T. gondii, cepa

RH.

Um modelo celular para o estudo do ciclo sexuado do T. gondii, ainda é um

grande desafio para compreensão os estágios enteroepiteliais, uma vez que a

tentativa de reproduzir esse ciclo em hospedeiros intermediários, não foi ainda

possível. Estudos com camundongos levaram à morte dos animais por uma severa

enterite após a ingestão de oocistos de T. gondii (Dubey e Welcome, 1988; Dubey e

Frenkel, 1998). Um outro experimento infectando camundongos com uma carga

parasitária baixa com esporozoítos mostrou infecção de enterócitos com 3 h.p.i. e

após 5 h.p.i. ocorreu a conversão em taquizoítos com disseminação para a lâmina

basal, infectando fibroblastos, macrófagos, plasmócitos, células endoteliais,

neutrófilos, eosinófilos e células musculares (Bertoli e cols., 1988). O esporozoíto

parece ser capaz de se desenvolver na lâmina basal, mas não em enterócitos. Após

a infecção inicial a maioria dos esporozoítos se converte em taquizoítos,

multiplicando-se rapidamente e desencadeando parasitemia a partir de 3 h.p.i.,

podendo se estender por 61 horas, disseminando-se para diversos outros órgãos

(Dubey, 1998b). Apenas a indução do ciclo sexuado por bradizoítos in vivo foi bem

estudada. Felinos que ingeriram cistos teciduais desenvolveram os estágios

enteroepiteliais e formaram oocistos (Dubey e Frenkel, 1972; Hill e Dubey, 2002). Os

estudos desenvolvidos por Dubey e Frenkel (1998) indicam que o ciclo sexuado é

mais curto e a liberação de oocistos é maior quando os felinos ingerem cistos

teciduais ou bradizoítos quando comparado com a ingestão de outras formas

infectantes.

Estudos de infecção, in vitro em células endoteliais, de traqueia e rim bovinos,

utilizando esporozoítos mostram a formação de dois tipos de vacúolos: o primeiro 10

a 15 vezes maior que o esporozoíto sem a presença da rede de membranas

tubulovesicular (RMT) no espaço intravacuolar, enquanto o segundo, apesar de

menor, apresenta a RMT (Dubey e cols., 1997b; Speer e cols., 1997).

A carência de modelos celulares que possibilitem explorar o ciclo entérico do T.

gondii no hospedeiro definitivo direcionou os objetivos desta tese que serão

apresentados a seguir.

III. OBJETIVOS

1. Objetivos Gerais:

1.1 Estabelecer culturas primárias de células epiteliais intestinais de gato

doméstico.

1.2 Investigar o ciclo biológico do Toxoplasma gondii em culturas primárias de

epitélio intestinal de gato doméstico.

2. Objetivos específicos

2.1 Monitorar o desenvolvimento de culturas primárias de epitélio intestinal de

gato doméstico: aspectos morfológicos e funcionais e a expressão de marcadores

específicos;

2.2 Analisar ultra-estruturalmente o ciclo do Toxoplasma gondii em células

epiteliais intestinais de felinos, in vitro;

2.3 Avaliar a biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo em células

epiteliais intestinais de felinos infectadas com T. gondii, in vitro.

IV. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram executados de acordo com as orientações

estabelecidas pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais, da Fundação Oswaldo

Cruz, Resolução 242/99 através da licença CEUA P0211-04 e com as regras

internacionais de cuidados na manipulação de animais e agentes patogênicos.

1. Cultura primária de epitélio intestinal de felinos: obtenção e manutenção

1.1. Animais

Três fetos de gatos domésticos (Felis catus), entre 60 a 62 dias de gestação

obtidos a partir fêmeas clinicamente saudáveis (sem doença gastrintestinal e

negativa sorologicamente para Toxoplasma gondii, Vírus da Imunodeficiência Felina

e Vírus da Leucemia Felina) foram utilizados nos experimentos. Os animais foram

cedidos pela Clínica Escola de Medicina Veterinária Doutor Paulo Alfredo Gissoni,

com a permissão do conselho de ética na utilização de animais da Universidade

Castelo Branco/RJ.

1.2. Isolamento e cultivo de células intestinais

Imediatamente após eutanásia, foi realizada a necropsia dos fetos e

fragmentos (~5mm

) do intestino delgado (região jujeno-ileal) foram coletados

assepticamente e mantidos em PBS gelado contendo 10% de solução antibiótica

(Sigma-Aldrich). O tecido foi aberto longitudinalmente, lavado três vezes em PBS e

mantido nesta solução com 10% dos antibióticos por 60 min à temperatura

ambiente. Os fragmentos foram divididos em pequenos pedaços (~1mm

) e lavados

novamente em PBS, com 10% antibiótico. Após a lavagem, os fragmentos foram

submetidos a dissociação não enzimática com PBS (pH 7,2) contendo 1 mM EDTA

(Sigma-Aldrich), 1 mM EGTA (Sigma-Aldrich), 0.5 mM DTT (Sigma-Aldrich) e 10%

antibiótico por 20 min sob agitação à temperatura ambiente. O método de

dissociação foi adaptado com ligeiras modificações, a partir de técnicas

desenvolvidas por Perreault e Jean-Francois (1996); Macartney e cols. (2000);

Aldhous e cols. (2001) e Rusu e cols. (2005). Após a dissociação, o epitélio intestinal

foi cuidadosamente recolhido, raspando o intestino com auxílio de um bisturi, e

transferido para uma placa de Petri estéril e novamente fragmentado com o auxílio

de bisturi. Os tecidos muscular e conjuntivo foram descartados. Após a

centrifugação (7 min a 650g a 4°C), os agregados celulares foram lavados com meio

DMEM/Hams F12 (Sigma-Aldrich), contendo 10% solução de antibiótico com 10.000

unidades/ml penicilina G, 10 mg/ml de sulfato de estreptomicina e 25 µg/ml

anfotericina B (Sigma-Aldrich), 1 mM glutamina e 10% SFB (Sanderson e cols.,

1996; Aldhous e cols., 2001; Rusu e cols., 2005; Simon-Assmann e cols., 2007).

Desta forma, os agregados celulares parcialmente dissociados foram re-suspensos

no mesmo meio citado acima e suplementado com EGF (Sigma-Aldrich) na

concentração final de 20ng/ml. Finalmente, as células foram cultivadas em placas de

24 poços sobre lamínulas (2,5 x 10

células/poço).

1.3. Ensaio de viabilidade celular por citometria de fluxo

Para determinar a viabilidade das células intestinais de felino, após dissociação

enzimática, cerca de 1 x 10

células/ml foram incubadas com 30 µg/ml de iodeto de

propídio (PI) (Sigma-Aldrich), durante 15 min. O material foi mantido em gelo até

análise. A aquisição e análise dos dados (total de 10.000 eventos) foram realizadas

utilizando o FACSCalibur flow cytometer (Becton, Dickinson, CA, E.U.A.) equipado

com o software Cell Quest (Joseph Trota, Scripps Research Institute, CA, E.U.A.).

1.4. Acompanhamento, manutenção das culturas de células e sub-culturas

As culturas primárias de células intestinais de felideos foram acompanhadas

por microscopia de contraste de fase e DIC e fotografadas diariamente até 10 dias.

Culturas confluentes, com 7 dias, foram lavadas 2 vezes com PBS e as células

foram removidas utilizando-se uma solução de dissociação (PBS com 0,02% EDTA

e 0,01% tripsina) durante 10 min a 37ºC. Após a dissociação, a suspensão celular foi

colocada a 4ºC em meio de cultura com 10% SFB para inibir a ação da tripsina e

centrifugada (7 min, 650g, 4ºC). Após a dissociação, as células foram cultivadas em

placas de 24 poços sobre lamínulas (2,5 x 10

células/poço). As culturas celulares

após 24, 48, 72 e 96h foram fixadas em álcool a 70% por 5 minutos, lavadas com

água destilada e coradas em solução de Giemsa 10% em PBS durante 60 min. Após

desidratação, as lamínulas foram desidratadas em bateria decrescente de acetona-

xilol e montadas em Permount.

As culturas foram analisadas por microscopia de luz para avaliar a morfologia

celular utilizando o microscópio Zeiss Axioplan 2. As imagens foram capturadas com

Soft Imaging System's ColorView II utilizando uma câmera digital de 3,3 MegaPixel e

analisados com AnalySIS® image-software. As imagens foram processadas usando

o programa Adobe Photoshop versão 7.0.

2. Caracterização das culturas primárias

2.1. Imunofluorescência

Para a caracterização das células intestinais de felideos foram utilizados

separadamente diferentes anticorpos produzidos em camundongo: monoclonal anti-

pancitoqueratina, clone PCK-26 (C1801 Sigma-Aldrich), monoclonal anti-vimentina

clone VIM-13.2 (V5255 Sigma-Aldrich), monoclonal anti-desmina clone DE-U-10

(D1033 Sigma-Aldrich) e anticorpo anti-fosfatase alcalina clone AP-59 (A9549

Sigma-Aldrich). As células intestinais foram fixadas com 4% PFA em PBS durante 20

min a uma temperatura de 4ºC, lavados 3 vezes durante 10 min em PBS e

incubadas por 30 min em 50 mM NH

Cl, para bloquear os radicais aldeído livres.

Após o bloqueio, as células foram permeabilizadas por 20 min com solução de PBS

contendo 0.05% Triton X-100 (Roche) contendo 4% BSA (Sigma-Aldrich), para

bloquear ligações inespecíficas.

Para o ensaio de imunofluorescência indireta, as células foram incubadas

durante 2h a 37ºC com anticorpos primários isolados: anti-vimentina (1:200, 1:400),

anti-citoqueratina (1:50, 1:100; 1:300) e anti-fosfatase alcalina e desmina (1:100,

1:500). Após incubação, as células foram lavadas em PBS contendo 4% BSA e

incubadas durante 1h a 37ºC com anticorpo secundário na diluição de 1:1000 (IgG

anti-camundongo conjugado com FITC (F5262) ou TRITC (T5393) Sigma-Aldrich).

Para a marcação dos filamentos de actina, as culturas de CEIF foram incubadas por

1h a 37ºC com 4 µg/ml faloidina-FITC em PBS (1:400; 1:800) (Phalloidin-FITC-

P5282, Sigma-Aldrich). Em seguida, as culturas foram lavadas 3 vezes por 10 min

em PBS, incubadas durante 5 min com DAPI (Sigma-Aldrich), diluído em PBS

(1:10000). Após a lavagem em PBS, as lamínulas foram então montadas com

DABCO (Sigma-Aldrich) diluído em PBS contendo 50% glicerol, pH 7,2 e seladas

com esmalte incolor. Os controles das reações foram realizados na ausência do

anticorpo primário.

As amostras foram analisadas com o microscópio de varredura confocal a laser

(Axiovert 510, META, Zeiss, Alemanha) usando o laser 543 Hélio (LP560 filtro), laser

488 Argônio /criptônio (Ar / Kr) (filtro LP515) e o laser 405 Diiod (LP 420 filtro).

2.2. Análise ultra-estrutural

2.2.1. Microscopia eletrônica de transmissão

As culturas de CEIF em diferentes períodos de cultivo (1, 3, 6 e 9 dias) foram

lavadas 3 vezes com PBS por 10 min e fixadas por 1h a 4ºC com 2,5% glutaraldeído

(GA) diluído em 0,1 M de tampão cacodilato de sódio (CACO) contendo 3,5%

sacarose e 2,5 mM CaCl

(pH 7,2). Após a fixação, as CEIF foram lavadas no

mesmo tampão e, em seguida, pós-fixadas por 30 min, a temperatura ambiente, em

1% de tetróxido de ósmio (OsO

), diluído em 0,1 M de tampão CACO. As células

foram então lavadas no mesmo tampão, destacadas do substrato com “rubber

policeman” a 4ºC e centrifugadas por 5 min a 10,000g. Posteriormente, as células

foram desidratadas em concentrações crescentes de acetona e emblocadas em

resina Epoxi. Cortes ultrafinos foram contrastados em acetato de uranila e citrato

chumbo e finalmente, examinados nos microscópios eletrônicos de transmissão

Zeiss EM10C e Jeol JEM-1011.

2.2.2. Microscopia eletrônica de varredura

As lamínulas contendo as culturas de CEIF após cultivo de 24, 48, 72 e 96h

foram fixadas por 30 min em 2,5% GA diluído em 0,1M de tampão CACO contendo

3.5% de sacarose e 2,5 mM de CaCl

(pH 7,2) a temperatura ambiente. Após a

lavagem, no mesmo tampão, as células foram pós-fixadas por 30 min a temperatura

ambiente em 1% OsO

desidratadas em bateria crescente de acetona e a secagem

das amostras foi realizada pelo método do ponto crítico. As lamínulas foram

montadas com cola de prata em suportes de alumínio e revestidos com uma camada

de ouro na espessura de 20 nm. As amostras foram analisadas no microscópio

eletrônico de varredura Zeiss DSM 940.

2.2.3. Citoquímica ultra-estrutural

A ferritina cationizada (FC) foi utilizada para a detecção de sítios aniônicos na

superfície e monitoramento do seu destino intracelular nas CEIF. Após 24h de

cultivo, as células intestinais foram incubadas por 20 min a 4ºC em 200 µg/ml FC

diluída em meio de cultura DMEM/Hams F12 (Sigma-Aldrich) contendo 10% solução

antibiótica (Sigma-Aldrich) e 1 mM glutamina, pH 7.2. Em seguida, as células foram

lavadas três vezes em PBS para a remoção de partículas de FC que não aderiram à

superfície das células e incubadas com o mesmo meio a 37ºC. O tráfego intracelular

dos sítios aniônicos foi monitorado após a incubação das células com FC nos

períodos de 1, 4 e 12h. As CEIF foram fixadas por 1h a 4ºC em 2,5% GA diluído em

0,1M de tampão CACO contendo 3,5% de sacarose, pH 7.2.

As amostras foram então lavadas no mesmo tampão, três vezes durante 10

min e pós-fixadas por 1h em 1% OsO

diluído em 0,1 M de tampão CACO a

temperatura de 4ºC. Após a lavagem o material foi desidratado em bateria crescente

de acetona e emblocado em resina Epoxi. Cortes ultrafinos foram contrastados em

acetato de uranila e citrato chumbo e finalmente, examinados aos microscópios

eletrônicos de transmissão Zeiss EM10C e Jeol JEM-1011.

3. Experimentos de interação de bradizoítos de T. gondii cepa ME49 com

culturas de epitélio intestinal de felino doméstico

3.1. Obtenção de bradizoítos: isolamento, purificação e rompimento dos

cistos. Protocolo de acordo com Guimarães e cols. (2007)

Camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 pesando 12-18 gramas foram

inoculados por via intraperitoneal com 50/100 cistos teciduais, purificados a partir de

cérebros de camundongos previamente infectados com T. gondii da cepa avirulenta

ME49 (Cedida pelo Dr. RICARDO T. GAZZINELLI , Laboratório de Imunopatologia,

Instituto René Rachou, Belo Horizonte, MG, Brasil). Esta cepa apresenta uma alta

capacidade de encistamento reproduzindo a infecção crônica. Assim, 4-12 semanas

pós-infecção, os cistos teciduais foram isolados e purificados do cérebro dos

camundongos.

Em resumo, os cérebros dos camundongos foram isolados, lavados e

homogeneizados em PBS colocados em um gradiente de 25% de Dextran, para que

os cistos fossem separados dos debris celulares e utilizados nos experimentos. Para

obtenção de formas intracísticas foi utilizada uma solução aquosa de pepsina ácida

diluída na proporção pepsina ácida: cistos de 1:5 (v/v). Os cistos foram incubados,

sob agitação, seguido da neutralização da atividade enzimática com solução final de

1% carbonato de sódio. Imediatamente após a neutralização, o meio DMEM/Hams

F12 (Sigma-Aldrich) foi adicionado. Em seguida, as amostras foram centrifugadas e

ressuspensas no mesmo meio. Uma alíquota da suspensão de parasitos foi

colocada em câmara de Neubauer para determinação do número de parasitos

isolados. Após a quantificação, os parasitos foram imediatamente usados nos

experimentos de interação T. gondii-célula hospedeira.

3.2. Avaliação da infectividade do T. gondii em CEIF e em duas linhagens

epiteliais

Culturas secundárias de CEIF foram infectadas com bradizoítos de T. gondii,

usando a relação de 1:10 (parasito-célula hospedeira) e utilizadas para a avaliação

da cinética de infecção. Considerando-se que o ciclo enteroepitelial do T. gondii

ocorre exclusivamente no epitélio intestinal de felídeos, seus hospedeiros definitivos,

foram utilizadas duas linhagens epiteliais: IEC-6 do epitélio normal do intestino

delgado de Rattus norvegicus (rato) (BCRJ Nº AP003) e CRFK de epitélio normal de

córtex renal de Felis catus (gato doméstico) (BCRJ Nº CR0268) adquiridas do Rio de

Janeiro Cell Bank (http://www.bcrj.hucff.ufrj.br) para um estudo comparativo com

CEIF. O desenho experimental objetivou avaliar se o tipo celular ou a origem das

células (felino) era capaz de modular a infecção.

CRFK e IEC-6 foram plaqueadas na concentração de 1,0 x 10

/ml em garrafas

de cultura celular de 25cm

(Gibco BRL, UK), em meio DMEM/Hams F12 (Sigma-

Aldrich), contendo 10% solução de antibiótico (Sigma-Aldrich), 1 mM glutamina e

10% SFB, As células foram mantidas em estufa úmida a 5% de CO

e 95% de O

temperatura de 37ºC. A cada dois dias, metade do meio era descartada e o mesmo

volume de meio fresco era adicionado. As células foram cultivadas até atingirem

aproximadamente 80% de confluência. Neste ponto, as células foram tratadas com

solução de dissociação (PBS com 0,02% EDTA e 0,01% tripsina) durante 10 min a

37ºC. Depois da dissociação, a suspensão celular foi colocada em meio de cultura a

4ºC com 10% SFB para inibir a ação da tripsina, centrifugada durante 7 min, a 650g

a temperatura de 4ºC. Após a dissociação, as células foram cultivadas em placas de

24 poços sobre lamínulas (2,5 x 10

células/poço).

Assim, as três culturas foram submetidas aos mesmos procedimentos

experimentais, avaliadas pelos mesmos parâmetros e análises estatísticas. As

culturas foram fixadas com solução de Bouin e coloradas com Giemsa. A análise foi

realizada a partir de seis experimentos independentes nos tempos de 24, 48, 72 e

96h de interação, em triplicata, considerando-se o percentual de células infectadas.

A partir dos resultados foram calculados: Média (M) e o Desvio padrão (DP) e a

análise estatística foi obtida pelo emprego do teste t de Student’s com um Intervalo

de confiança ao nível de significância de 0,5%.

3.3. Interação T. gondii - célula epitelial intestinal

Culturas secundárias de CEIF com confluentes foram infectadas com

bradizoítos de T. gondii. Os ensaios de interação foram realizados na proporção de

1:5, 1:10 ou 1:20 (parasito-célula hospedeira) durante períodos que variaram de 1, 2,

3, 4, 5 e 6 d.p.i. Após lavagem em PBS, as amostras controles e infectadas foram

fixadas de acordo com os experimentos a serem desenvolvidos.

3.4. Monitoramento dos estágios morfológicos evolutivos do T. gondii

A caracterização dos estágios evolutivos de T. gondii em culturas de CEIF

infectadas com formas bradizoítas [relação 1:5 e 1:10 (parasito-célula hospedeira)]

foi feita pela sua monitoração por meio de sondas. Para identificação de taquizoítos

por imunomarcação foi utilizado o anticorpo anti-SAG-1 (Formecido pelo Dr. José

Roberto Mineo (Laboratorio de Imunoparasitologia, Universidade Federal de

Uberlândia, MG,Brazil) e para identificação de cistos de T. gondii a lectina DBA

conjugada a TRITC (L6533 Sigma-Aldrich), que se liga a grupamentos N-acetil-

galactosamina (Zhang e cols. 2001). Inicialmente, as células intestinais foram

fixadas nos períodos de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 dias com 4% PFA em PBS durante 20 min a

uma temperatura de 4ºC, lavados 3 vezes durante 10 min em PBS e para bloquear

os radicais aldeídos livres foram incubadas por 30 min em 50 mM cloreto amônia.

Após o bloqueio, as células foram permeabilizadas por 20 min com solução de

PBS contendo 0,05% Triton X-100 (Roche) e 4% BSA (Sigma-Aldrich) para bloquear

ligações inespecíficas. Para o ensaio de imunofluorescência indireta, as CEIF foram

incubadas durante 2h a 37ºC com anticorpo primário anti-SAG-1 (1:200, 1:500).

Após incubação as células foram lavadas com PBS contendo 4% BSA e incubadas

durante 1 hora a 37º C com anticorpo secundário na diluição de 1:1000 (IgG anti-

camundongo conjugado com FITC-F5262) ou TRITC (T5393 Sigma-Aldrich). Para

fluorescência direta foi utilizada a lectina DBA-TRITC (1:200, 1:400).

Em alguns ensaios, para a marcação dos filamentos de actina, as culturas de

células foram incubadas com 4 µg/ml faloidina-FITC (P5282 Sigma-Aldrich) em PBS

(1:400; 1:800) por 1h a 37°C. Em seguida, as culturas foram lavadas 3 vezes por 10

min em PBS, incubadas durante 5 min com DAPI diluído em PBS 1:10000. Após a

lavagem em PBS, as lamínulas foram então montadas com DABCO, em PBS

contendo 50% glicerol, pH 7,2 e seladas com esmalte incolor.

Os controles das reações foram realizados na ausência do anticorpo primário e

para a lectina DBA foi realizada uma reação de competição com a adição de 50 mM

de N-acetil-galactosamina (GalNAc). As amostras foram analisadas com o

microscópio de varredura confocal a laser (Axiovert 510, META, Zeiss, Alemanha)

usando o laser 543 Hélio (LP560 filtro), laser 488 Argônio / Krypton (Ar/Kr) (filtro

LP515) e o laser 405 Diiod (LP 420 filtro).

3.5. Análise ultra-estrutural da interação parasito-célula hospedeira

3.5.1. Microscopia eletrônica de transmissão

Para análise ultra-estrutural culturas secundárias de CEIF semi-confluentes

foram lavadas 3 vezes com PBS por 10 min e infectadas na relação 1:20 (parasito-

célula hospedeira) com formas bradizoítos de T. gondii por períodos de 1, 3, 6 e 9

dias. As culturas infectadas foram então fixadas por 1 h a 4ºC com 2,5% GA diluído

em 0,1M de tampão CACO contendo 3,5% de sacarose e 2,5 mM CaCl

(pH 7,2) e

processadas como descrito anteriormente no item 2.2.1. As amostras foram

examinadas ao microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM-1011.

3.5.2. Biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo

Para análise da biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo de culturas

secundárias de CIEF, as células foram previamente incubadas por 20 min a 4ºC com

200 µg/ml de ferritina cationizada (FC) diluída em meio de cultura DMEM/Hams F12

contendo 10% solução antibiótica (Sigma) e 1 mM glutamina sem soro, pH 7,2. Após

esse período, as culturas foram lavadas em solução de Ringer para retirar as

partículas de FC não associadas à membrana de CEIF e infectadas com bradizoítos

de T. gondii na relação de 1:20 (parasito-célula hospedeira). As células foram então

fixadas por períodos de 1, 4 e 12 h.p.i. com 2,5% de GA e processadas como de

rotina para microscopia eletrônica de transmissão, como descrito anteriormente no

item 2.2.1. As amostras foram examinadas ao microscópio eletrônico de transmissão

Jeol JEM-1011.

V. Resultados

1. Culturas primárias intestinal de felino

1.1. Características morfológicas durante seu desenvolvimento, in vitro

Culturas primárias de células intestinais de felino obtidas a partir de tecidos

fetais, por meio de dissociação não enzimática, apresentaram um percentual de

viabilidade celular em torno de 32%, como demonstrado por citometria de fluxo

(Gráfico 1).

Inicialmente, foi estudado o desenvolvimento das culturas monitorando-se a

morfologia e a diferenciação celulares. Pequenos fragmentos de intestino delgado

fetal aderiram ao substrato em até 24 horas de cultivo, apresentando migração

celular heterogênea, que mais tarde se colapsou formando um tubo fechado,

semelhante ao tecido intestinal (Fig. 1A). Paralelamente, a partir desta migração

celular, ocorreu a formação de uma monocamada constituída por células poligonais,

como observado nas figuras 1B-D. Durante os 3 primeiros dias de cultivo foi possível

também observar células proliferando ao redor do foco de adesão, que se

estenderam e continuaram a se expandir, aumentando a área da cultura, com

camadas concêntricas, formando pequenas ilhotas de células epitelioides

condensadas (Fig. 1E). Durante a primeira semana de cultivo, a superfície do

substrato foi progressivamente coberta por uma monocamada de células poligonais

homogêneas com aspecto típico de epitélio pavimentoso (Fig. 1E e F). A

monocamada de células epiteliais permaneceu com a mesma morfologia até 10 dias

de cultivo (Fig. 1G e H) e algumas vezes, pode ser visto sobre a monocamada

celular, fragmento remanescente do tecido intestinal original (Fig. 1G).

Gráfico 1: Análise da viabilidade por citometria de fluxo do dissociado celular do intestino

delgado de felídeos através da marcação com iodeto de propídio (PI). (A) Gráfico de plotagem de

pontos representando a morfologia típica observada pós-dissociação; (B) histograma demonstrando

população CD3- em R1; (C) histograma da população CD3+ localizada em R2; (D) histograma

representativo da viabilidade em R1 após dissociação não-enzimática. Seta representa as células

viáveis CD3- (32%)

Figura 1: Aspectos morfológicos das culturas primárias intestinais de felino do 1º ao 10º dia

por microscopia de contraste de fase e interferencial. (A) Cultura celular com 24h mostrando uma

estrutura tubular semelhante ao tecido intestinal. (B-D) Detalhe da migração celular a partir do

explante intestinal e início da formação de monocamada com células poligonais à semelhança do

epitélio pavimentoso. (C e D) Detalhe da vilosidade intestinal preservada (cabeça de seta). (E)

Culturas de CEIF com 3 dias mostrando crescimento de uma monocamada a partir do foco de adesão

(*). (F) Maior aumento da figura E mostrando células poligonais. (G) Com 10 dias, ainda é observado

um fragmento remanescente do tecido original (seta). (H) Em maior aumento podemos observer em

detalhe a cultura homogênea epitelial característica. [Barras: 20µm]

As CEIF mantiveram a característica epitelial pavimentosa até a sétima

passagem, após repiques a cada cinco dias (na proporção 1:2 ou 1:3). Nas culturas

confluentes de terceira passagem, as células adquiriram aspecto (Fig. 2A). Melhor

visualizado pela revelação de filamentos de actina alinhados com faloidina (Fig. 2B)

e núcleos no mesmo plano, organizados lado a lado, como bem demonstrados pela

coloração de Giemsa na figura 2C e pela marcação com DAPI na figura 2D,

semelhante ao epitélio intestinal.

Com o repique, as células novamente adquiriam o aspecto poligonal e sem

grandes alterações na morfologia. Após a sétima passagem, as células foram

progressivamente diminuindo a taxa de proliferação até a cessação da divisão

celular e morte.

1.2. Expressão de marcadores intestinais

A natureza epitelial das CEIF foi confirmada por imunofluorescência, através da

marcação específica de filamentos intermediários do citoesqueleto, empregando o

anticorpo anti-pan-citoqueratina, que reconhece algumas citoqueratinas (1, 5, 6, 8 e

10) e pela expressão de fosfatase alcalina (enzima secretada pelo epitélio intestinal).

A análise por microscopia confocal de varredura a laser mostrou que as

culturas primárias de CEIF preservaram as características morfológicas e funcionais

de enterócitos imaturos. As células mantiveram constante a forte marcação positiva

da expressão de citoqueratina durante todo o curso do experimento, com maior

concentração ao redor do núcleo, indicando a natureza epitelial dessas células (Fig.

3A, B-D). Após 2 até 15 dias de cultivo, mais de 95% das células poligonais ainda

expressavam citoqueratina, caracterizada pela distribuição de uma rede de

filamentos no citoplasma (Fig. 3B-D).

Figura 2: Culturas terciárias semi-confluentes de CEIF; (A) Aspecto fusiforme das CEIF através de

microscopia de fase; (B) Alinhamento dos filamentos de actina revelada com faloidina-FITC

observada através de microscopia de fluorescência; (C-D) Núcleos localizados no mesmo plano

corados com Giemsa observados por microscopia de luz e marcação pelo DAPI confirmando a

organização celular à semelhança do tecido epitelial intestinal. [Barras: 20µm]

Figura 3: Caracterização das CEIF através microscopia de fluorescência; (A) Culturas

secundárias de CEIF com morfologia epitelial característica revelada através de dupla marcação

actina-FITC em verde e citoqueratina-TRITC em vermelho. (B-D) Expressão de citoqueratina com

localização ao redor do núcleo. (E-G) Organização dos filamentos de actina revelada pela faloidina

em CEIF mostrando a morfologia das células e a sua maior concentração nas áreas de adesão focal

ao substrato. [Barras: 20µm]

A dupla marcação das células com faloidina-FITC identificando

simultaneamente filamentos de actina e a expressão de citoqueratina mostrou que

não houve sobreposição das duas proteínas (Fig. 3A). A distribuição de filamentos

de actina foi majoritariamente, nos pontos de adesão da membrana celular ao

substrato (Fig. 3 E-G). A expressão de fosfatase alcalina, um outro marcador de

células epiteliais, foi inicialmente detectada com 5 dias de cultivo (Fig. 4A). Um

aumento progressivo do acúmulo desta enzima foi observado no período de 7 a 9

dias pós-plaqueamento (Fig. 4B e C). Filamentos de vimentina (Fig 4 D-E) e desmina

(Fig 4 E-F) não foram observados nas culturas até 9 dias de cultivo.

Após a primeira passagem, as CEIF mantiveram o aspecto homogêneo

pavimentoso formado por células poligonais apresentando citoplasma abundante,

núcleo central (Fig. 5A-D), positividade para citoqueratina (Fig. 5C) e vários pontos

de adesão focal como observados pela revelação de filamentos de actina

empregando faloidina, (Fig. 5D) típico de células epiteliais.

1.3. Caracterização morfológica ultra-estrutural e funcional

A análise ultra-estrutural por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das

culturas primárias de CEIF confirmou a sua característica epitelial. Após 24 horas de

plaqueamento as células apresentaram morfologia poligonal e adesão ao substrato

mostrando expansão da membrana plasmática, estabelecendo pontos de adesão

focal (Fig.6A). Foram observados numerosos filopódios ou microvilosidades na

superfície celular (Fig. 6A-C). Após 96 horas foi possível observar grandes áreas das

membranas celulares em contato, indicativo da formação de áreas de especialização

de membrana, semelhante às junções celulares (Fig. 6C), observado em maior

detalhe na figura 6D.

Figura 4: Imunoreatividade para revelação de fosfatase alcalina em CEIF após incubação com

anitcorpo conjugado à TRITC. A atividade de fosfatase alcalina aumentou progressivamente nas

células em função do tempo da cultura (5-9 dias). A morfologia das CEIF é visualizada através da

revelação de filamentos de usando faloidina-FITC. (A) 5 dias; (B) 7 dias e (C) 9 dias após o

plaqueamento. Controles negativos para: Desmina (D) 5 dias e (E) 9 dias; e para Vimentina (F) 5 dias

e (G) 9 dias [Barras: 20µm]

Figura 5: Células de CEIF secundárias apresentando aspecto epitelial pavimentoso: Células de

aspecto poligonal; núcleo central e citoplasma abundante e ainda vários pontos de adesão ao

substrato; (A) Microscopia eletrônica de varredura; (B) Microscopia de luz, coloração pelo Giemsa e

(C e D) Microscopia de imufluorescência: Coloração em vermelho para expressão de citoqueratina,

em verde para filamentos de actina e para revelação do núcleo coloração em azul com DAPI. [Barras:

20µm]

Figura 6: Microscopia eletrônica de varredura ilustrando a morfologia epitelial em culturas de

CEIF. (A) Célula com 24 horas de plaqueamento mostra expansões da membrana plasmática com

pontos de adesão focal (setas) [Barra: 2µm]. (B) Microvilosidades longas e finas são vistos (cabeças

de seta). [Barra: 2µm]; (C) Após 96 horas observa-se a formação de áreas de especialização de

membrana, tipo junções celulares (dupla seta) [Barra: 5µm]; (D) Detalhe em maior aumento das

junções celulares [Barras: 2µm]

Para análise funcional das CEIF foi empregada a ferritina cationizada (FC),

um derivado eletrondenso policatiônico da ferritina nativa ionizada a pH fisiológico,

que permite ensaios com células vivas. A FC foi utilizada em nossos estudos como

sonda para visualização de sítios aniônicos de superfície de células intestinais de

culturas primárias de CEIF e para examinar o seu destino intracelular. A incubação

das células vivas aderidas ao substrato com FC durante 20 min a 4°C e

subseqüente elevação da temperatura para 37°C durante 30 min revelou a

distribuição da FC sobre a superfície celular e nas interdigitações (Fig. 7A). Esses

dados indicam que membrana plasmática das células intestinais é carregada

negativamente. A FC foi acessível somente à região da membrana exposta ao meio

de cultura contendo a FC (Fig. 7A-D). Após a incubação das CEIF por 1h com CF a

37°C, a interação de sítios aniônicos com o traçador mostrou uma mobilidade

translacional da membrana celular induzindo à formação de agregados de ferritina

em algumas regiões (Fig. 7B). A análise das células incubadas por 4 e 12 horas

mostrou que sob essas condições, partículas FC foram incorporadas pela membrana

celular por endocitose, como demonstrado na figuras 7C. Na seqüência, vesículas

de diferentes diâmetros e túbulos contendo partículas de ferritina foram localizadas

logo abaixo da membrana celular e no citoplasma (Fig. 7D). Após 12 h o traçador

não foi mais visualizado aderido à membrana plasmática, porém grande quantidade

de FC foi encontrada em vesículas intracelulares de tamanhos e formas variadas,

além de grandes vacúolos (endosomes) repletos de FC distribuídos pelo citoplasma

(Fig. 7 E-F).

Figura 7: Caracterização ultra-estrutural funcional das CEIF com ferritina cationizada (FC); (A)

CEIF mostrando a distribuição de FC após a incubação com FC por 30 min a 4ºC e subseqüente

elevação da temperatura para 37ºC durante 30 min. As partículas de FC são vistas sobre a superfície

celular e nas interdigitações; (B) CEIF após 1h de incubação com CF a 37ºC demonstrou uma

mobilidade translacional da membrana induzindo a formação de agregados de FC (Seta); (C e D)

Células incubadas por 4h revelaram a incorporação do traçador pela membrana celular, via

endocitose; (E) CEIF após 12h de incubação mostrou ausência da FC na membrana e intensa

incorporação do traçador pela membrana celular e sua posterior localização em grande quantidade

em vesículas intracelulares de tamanhos e formas variadas (cabeça de seta) e (F) Grandes vacúolos

(endosomes) são vistos repletos de FC distribuídos pelo citoplasma (Seta dupla) [Barras: 500 nm]

2. Análise da infectividade de bradizoítos de Toxoplasma gondii frente a

linhagens epiteliais e cultura primária de epitélio intestinal de felinos

O modelo de células epiteliais intestinais de felino doméstico estabelecido in

vitro no nosso laboratório, possibilitou o emprego de culturas secundárias de CEIF

para o estudo da biologia celular da interação de T. gondii e a célula hospedeira.

Assim, as culturas foram infectadas com bradizoítos de T. gondii cepa ME49,

usando a relação de 1:10 (parasito-célula hospedeira). Para avaliação do potencial

infectivo de bradizoítos fronte as culturas de CEIF e as linhagens celulares IEC-6 e

CRKF foram fixadas nos períodos 24, 48, 72 e 96 h.p.i. e quantificadas quanto ao

percentual de células infectadas.

Aos resultados obtidos aplicou-se o teste t de Student, com intervalo de

confiança ao nível de significância de 5% e foi possível verificar que as médias

apresentavam diferenças estatísticas (p<0,05), pois não houve superposição entre

os intervalos. Desta forma, em relação ao percentual médio de infecção das células,

foi possível verificar que a infecção das CEIF foi significativamente maior do que as

demais células estudadas (p<0,05) em todos os tempos avaliados (Tabela 1 e

Gráfico 2). Estes resultados confirmam estatisticamente que as CEIF apresentam

maior infectividade por bradizoítos de T. gondii, quando comparadas às linhagens de

IEC-6 e CRFK.

Gráfico 2: Percentual de células infectadas por bradizoítos de T. gondii cepa ME49

em CEIF em relação as linhagens IEC-6 e CRFK

3. Interação Toxoplasma gondii e epitélio intestinal felino in vitro

CEIF infectadas com bradizoítos de T. gondii cepa ME49, obtidos de cistos

intracerebrais de camundongos C57BL6, utilizando as relações de 1:5, 1:10 e 1:20

(parasito-célula hospedeira) mostraram diferentes destinos intracelulares, como será

descrito a seguir.

3.1. Interação na relação 1:5 (parasito-célula hospedeira)

A análise da interação parasito-célula hospedeira na relação 1:5, demonstrou

que os parasitos inoculados se mantiveram como bradizoítos no interior do vacúolo

parasitóforo (VP) por 24 h.p.i., como bem demonstrado na Fig. 8A por microscopia

de contraste de fase. A imunomarcação mostrou a negatividade para a revelação de

taquizoítos, utilizando os anticorpos anti-SAG1 e anti-filamentos de actina, com o

uso de faloidina-FITC, a dupla marcação, mostrou a visualização da estrutura celular

(Fig. 8B), enquanto a coloração por Giemsa revela a presença dos parasitos

intracelulares (Fig. 8C).

A conversão bradizoíto-taquizoíto foi observada com 48 h.p.i. (Fig. 8D-F),

quando vacúolos contendo parasitas expressaram positividade após incubação com

anticorpo anti-SAG1 associada à visualização dos filamentos de actina da célula

hospedeira (Fig. 8E). Essa análise revelou também que as formas de T. gondii

intracelulares eram (SAG-1+), como observado na Fig. 8E. Após 72 h.p.i. (Fig. 8G-I)

os VP apresentaram um aumento considerável de tamanho, contendo

exclusivamente taquizoítos, visualizados pela marcação com anticorpo anti-SAG-1 e

pela revelação de filamentos de actina (Fig. 8H), permitindo observar que os VP

adquiriam a forma das CEIF sem comprometer seu alinhamento e polarização (Fig.

8H-I). Com 96 h.p.i. (Fig. 8J-M) ocorreu o rompimento das CEIF com a liberação de

taquizoítos no meio, caracterizando o ciclo lítico de T. gondii. A reação citoquímica

com a lectina DBA, que reconhece moléculas da parede cística não foi positiva

durante o experimento (Fig 8 N-Q).

Figura 8: Interação bradizoítos de Toxoplasma gondii cepa ME49 com CEIF na proporção 1:5

parasito-célula hospedeira. (A e C) 24 h.p.i., início da formação de vacúolos parasitóforos (VP)

contendo bradizoítos, confirmado por imunomarcação utilizando anticorpo anti SAG-1/TRITC;

Faloidina-FITC e DAPI como visto na figura B (SAG1-). (D-F) 48 h.p.i. mostra a formação de VP

organizados e a conversão de bradizoítos em taquizoítos demonstrado por imunomarcação em E

(SAG1 +). (G-I) 72 h.p.i. nota-se a presença VP contendo exclusivamente taquizoítos bem

organizados sem comprometimento da polarização das CEIF; (J-M) 96 h.p.i. rompimento das CEIF

com a liberação de taquizoítos; Controles negativos para DBA (N) 24 h.p.i; (O) 48 h.p.i; (P) 72 h.p.i; e

(D) 96 h.p.i [Barra 20mm]

3.2. interação na relação 1:10 (parasito-célula hospedeira)

A utilização da relação de 1:10 (parasito-célula hospedeira) permitiu a

observação da formação de estruturas semelhantes a cistos intracelulares com 3

d.p.i. (Fig. 9A-B) e com 6 d.p.i. (Fig. 9C-D). A marcação citoquímica com a lectina

DBA conjugada a TRITC revelou que estas estruturas com 6 d.p.i. reagiram

positivamente, indicando o estabelecimento da cistogênese, in vitro (Fig. 9E).

Adicionalmente, a incubação dessas células neste período de interação com as

mesmas condições experimentais com o anticorpo anti-SAG-1 mostrou que alguns

desses cistos apresentavam no seu interior formas taquizoítas, se caracterizando

assim, como cistos mistos, como bem observados nos cortes seriados obtidos por

microscopia confocal (Fig. 9Ea-f). A análise por microscopia de luz de culturas

coradas com Giemsa em 6 d.p.i., possibilitou a observação de VPs

morfologicamente diferentes, com estruturas no seu interior à semelhança de

sincícios (Fig. 9D).

3.3. Interação na relação 1:20 (parasito-célula hospedeira): Caracterização do

vacúolo parasitóforo e dos estágios enteroepiteliais do Toxoplasma gondii

A análise ultra-estrutural de culturas de CEIF, 6 d.p.i. com bradizoítos de

T.gondii na proporção de 1:20 (parasito-célula hospedeira) mostrou: diferentes tipos

morfológicos intracelulares (no interior de vacúolos parasitóforos) à semelhança dos

estágios enteroepiteliais que ocorrem no intestino delgado do hospedeiro definitivo

(felinos), in vivo. A caracterização desses tipos morfológicos foi avaliada inicialmente

com relação à estrutura do VP, que se apresentou de aspecto frouxo, com uma RMT

bastante extensa e bem desenvolvida, ocupando toda a matriz do vacúolo (Fig. 10A-

E). RMT pode ser vista em maior detalhe na Figura 10B. Essas características

apresentam grande semelhança aos VP ocupados pelo tipo morfológico B

(esquizonte tipo B) descrito em enterócitos de felinos, in vivo (Fig. 10A-C). Esses

vacúolos, na sua maioria, apresentavam somente um parasito no seu interior (Fig.

10A e C).

Figura 9: Interação bradizoítos de Toxoplasma gondii cepa ME49 com CEIF na proporção 1:10

parasito-célula hospedeira. Formação de estruturas císticas após 3 d.p.i. (A - microscopia

interferencial e B – coloração por Giemsa – microscopia de luz) e após 6 d.p.i.(C-D). (D) VP com

parasitas em formação sincicial (cabeça de seta); (E) Presença de cistos de T. gondii (lectina

DBA/TRITC) em CEIF 6 d.p.i., cortes seqüenciais (Ea-Ef) demonstram a formação de cisto misto com

presença de bradizoítos e taquizoítos (SAG/FITC +). [Barra 20mm]

Figura 10: Formação de esquizontes precursores dos estágios enteroepiteliais de Toxoplasma

gondii in vitro após 6 d.p.i.. (A-C) VP frouxo, repleto da rede de membranas tubulovesicular (RMT).

Nota-se a MVP associada a perfis de retículo endoplasmático (RE), Mi e lipídeos (Li); (B) Detalhe em

grande aumento da característica morfológica do VP apresentando RMT bem desenvolvida no seu

interior; (C) VP contendo um parasito com grande quantidade de RMT e a associação estreita de Li e

RE à MVP; (D) Em maior aumento a região posterior do parasito e intima associação da MVP com

RE, mostrando o complexo membranar interno (CMI) ondulado; (E) Detalhe da associação de Li e RE

à MVP. [Barra 500nm]

Perfis de retículo endoplasmático, mitocôndrias e corpos lipídicos da célula

hospedeira foram observados associados à membrana do VP (Fig. 10A, C-E). O

vacúolo parasitóforo se mostrou constituído por uma membrana única (Fig. 10B, D e

E) e na Figura 10D é observado o complexo membranar interno, com aspecto

ondulado. Além da caracterização ultra-estrutural de esquizontes do tipo B, foi

possível a observação de esquizontes em divisão do tipo endodiogenia assincrônica,

típica da fase assexuada dos estágios enteroepiteliais (Fig. 11A-C). Os merozoítos

desorganizados são vistos no interior de VP sem a formação característica de

rosetas típicas, imersos na rede de membranas tubulovesicular bastante

desenvolvida (Fig. 11A-C). Neste estágio organelas da célula hospedeira são ainda

observadas associadas à MVP (Fig. 11A-C).

Paralelamente, a análise dessas culturas mostrou algumas células com VP

apresentando uma RMT desenvolvida, porém sua distribuição não ocupava todo o

espaço vacuolar (Fig. 12A-E). Os parasitos no interior desses vacúolos

apresentavam dois tipos de mitocôndrias: as típicas (Fig. 12 A-B e D) e com matriz

eletrondensa (Fig. 12A-B e D); núcleo descentralizado (Fig. 12A-C); róptrias

eletrondensas (Fig. 12C) ou com aspecto de labirinto (Fig. 12A); presença de

número variado de grânulos densos e de amilopectina (Fig. 12 A-E). Esses vacúolos

mantiveram a associação com organelas da célula hospedeira como o RE à MVP

(Fig. 12 A, D e E) e ainda, mitocôndrias justapostas ao RE (Fig. 12 A e D). Vários

corpos lipídicos foram vistos aderidos ao RE (Fig. 12 A-C e E) ou em contato direto

com a MVP (Fig. 12 C e E). Algumas imagens mostram lipídeos estabelecendo

conexão direta com a matriz do vacúolo (Fig. 12C e E).

Figura 11: Parasitos em divisão por endodiogenia assincrônica. (A) VP contendo 5 parasitos (P)

em processo de divisão no interior de VP rico em RMT com associação de RE e Li à MVP. (B) Outra

célula mostrando número ímpar de parasitos no VP (n=9) indicativo de divisão assincrônica; (C) Corte

longitudinal de VP frouxo, rico em RMT contendo parasitos (n=5). [Barra 500nm]

Figura 12: Tipos morfológicos distintos de Toxoplasma gondii em CEIF com 6 d.p.i.; (A) VP com

MVP, contendo pouca RMT, associado a RE com Mi e Li justapostos. merozoítas mostrando grânulos

densos (GD), N descentralizado com agregados de cromatina (Nu), mitocôndrias típicas (Mi) e

eletrondensas (Mie) e róptrias em labirinto (Ro1); (B) VP contendo RMT e merozoítos apresentando

GD, micronemas (Mn), Mi e Mie e núcleo descentralizado. (C) Merozoíta com N, GD, róptrias

eletrondensas (Ro2) e CMI. No detalhe (cabeça de seta) observa-se corpo lipídico em contato direto

com a matriz vacuolar. (D) VP contendo 4 merozoítos, presença de RMT, circundado por RE. (E) VP

bastante frouxo com RMT distribuída pela matriz vacuolar. RE e Li se mantém associados à MVP.

[Barra 500nm]

A ultra-estrutura permitiu ainda observar outros tipos morfológicos de T. gondii

em desenvolvimento em CEIF vacúolos parasitóforos com uma redução acentuada

da rede de membranas tubulovesicular, com esquizontes em divisão celular do tipo

endopoligenia. Esse tipo de divisão celular é compatível com o processo de

gametogênese do parasito, apresentando merozoítos com grandes inclusões

lipídicas unidos ainda por um corpo residual, contendo organelas como: grânulos

densos, grânulos de amilopectina e mitocôndrias. Os merozoítos apresentavam

núcleo bem desenvolvido, ocupando grande parte do citoplasma do parasito (Fig.

13A).

Diferentes estágios em desenvolvimento foram observados nesse período de

interação equivalente a 6 d.p.i., incluindo formas evolutivas semelhantes à

macrogamontes, associados aos lipídeos da célula hospedeira (Fig. 13B e C). Estes

parasitos apresentavam características morfológicas compatíveis como às

previamente descritas nas análises do ciclo entérico do T. gondii em gatos

domésticos, a saber: núcleo de aspecto granular, estruturas eletronlucentes com

conteúdo eletrondenso, denominados de corpos formadores de parece e vários

grânulos de amilopectina. Além de complexo de Golgi, corpos lipídicos, mitocôndrias

e complexo membranar interno (Fig. 13 B e C).

3.4. Biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo

Objetivando analisar a biogênese da membrana do vacúolo parasitóforo (MVP),

CEIF foram pré-incubadas com ferritina cationizada a uma temperatura de 4°C,

seguida da infecção com bradizoítos cepa ME49 utilizando a relação 1:20 (parasito-

célula hospedeira) por períodos de 1, 3 e 12h a 37ºC. A análise ultra-estrutural

demonstrou a ausência de partículas de FC no vacúolo parasitóforo (Fig. 14A).

Independente do longo período de interação parasito-célula hospedeira (até 12h),

nenhuma marcação da MVP ou do espaço vacuolar foi observada apesar de

vesículas marcadas serem visualizadas no citoplasma (Fig. 14B e C).

Figura 13: Tipos morfológicos de Toxoplasma gondii diferenciados; (A) esquizontes em divisão

do tipo endopoligenia. Os merozoítos apresentando grandes corpos lipídicos são observados unidos

pelo corpo residual (CR) que contem no seu interior organelas como GD, Am e Mi; (C-D) Formas

semelhantes a macrogamontes, associados a Li. Os parasitos apresentam núcleo granular (N),

corpos formadores de parede (CFP), Go, Mi, Am e CMI. [Barra 500nm]

Figura 14: CEIF pré-incubadas com FC e infectadas por 12h com bradizoitos de Toxoplasma

gondii. (A) Partículas de FC não são vistas na membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) que

circunda o bradizoíto nem no interior do VP. (B) Ausência de partículas de FC na MVP mostrando

endossomos repletos de FC (cabeça de seta) no citoplasma de CEIF; (C) Detalhe do VP da figura A.

(N) núcleo do parasito; (Nu) nucléolo; mitocôndria (Mi), complexo de Golgi (Go); grânulos de

amilopectina (Am); núcleo da célula hospedeira (NCH). [Barra 500nm]

VI DISCUSSÃO

1. Cultivo primário de epitélio intestinal de gato doméstico como modelo de

estudo

Culturas primárias de intestino delgado representam um excelente modelo para

estudos fisiológicos e patológicos intestinais, sendo que células diferenciadas têm

maior similaridade com os eventos que ocorrem in vivo. A obtenção e manutenção

destas células apresentam diversas dificuldades, muitas vezes, inviabilizando a

realização de estudo (Evans e cols., 1994; Aldhous e cols., 2001).

O intestino delgado é um órgão multi-tecidual, onde tecidos de origem

embrionária distintas e/ou funções metabólicas particulares, interagem para a

manutenção da homeostase do órgão (Cheng, 1974). A ausência ou a má função de

algum tipo celular específico impossibilita o seu funcionamento ou diminui a sua

viabilidade (Friedman e Cardell, 1977). Desta forma, o cultivo de células intestinais,

não alteradas, se torna um grande desafio, considerando-se que na maioria das

vezes há a necessidade de se realizar culturas mistas, co-culturas ou utilização de

suplementos; como matriz extracelular, associando-se ainda, alguns fatores de

crescimento como: insulina e hidrocortisona (Whitehead e cols., 1987), EGF

(Aldhous e cols., 2001; Rusu e cols., 2005; Golaz e cols., 2007), dentre outros.

Nossos estudos iniciais realizados para obtenção de cultura primária de epitélio

intestinal, através de biópsia endoscópica de fragmentos intestinais de felinos

adultos, foram realizados sem sucesso. Segundo Quaroni e cols. (1979) algumas

variáveis podem impossibilitar a realização e reprodutibilidade dos experimentos,

tais como: amostras excessivamente contaminadas, dificuldade de adesão das

células diferenciadas ao substrato e baixa viabilidade dos enterócitos adultos in vitro.

A microbiota intestinal, rica e diversificada, é fundamental para o metabolismo

do epitélio intestinal. In vitro, tal contaminação deve ser evitada ou removida, pois

durante o cultivo ocorre crescimento exacerbado desta microbiota, comprometendo

a viabilidade das culturas (Cheng e Leblond, 1974; Cheng e cols., 1986). Desta

forma, foram realizados diversos protocolos de descontaminação in vitro. Embora

fosse possível controlar o crescimento da microbiota no epitélio intestinal in vitro, as

células se mostraram com um alto índice de apoptose, observações estas

previamente relatadas por Evans e cols. (1994) e Strater e cols. (1996).

Outro fator importante para experimentação com epitélio intestinal é a baixa

adesão celular, uma vez que esta é uma importante característica epitelial in vivo.

Porém, após a dissociação, as células adultas (diferenciadas) apresentaram uma

baixa adesão aos substratos testados, muito embora os substratos utilizados

tivessem sido recomendados por diversos autores (Perreault e Jean-Francois, 1996;

Aldhous e cols., 2001; Rusu e cols., 2005; Golaz e cols., 2007). Mesmo aderidas, as

culturas primárias de epitélio intestinal adulto apresentavam um período de

viabilidade muito curto. Trabalhos relatam que a adesão e a viabilidade do epitélio

intestinal in vitro, assim como in vivo, são dependentes da inter-relação do epitélio

com tecido conjuntivo imediatamente adjacente. Este representaria o substrato ideal

para o desenvolvimento e manutenção da viabilidade intestinal (Mahida e cols.,

1997; Slorach e cols., 1999).

Os resultados inicialmente obtidos com tecido intestinal fetal de felino, em

relação à viabilidade e proliferação celular foram excelentes. Além de nos permitir

desenvolver, comparar e aperfeiçoar diferentes técnicas de isolamento de células,

condições de cultivo e meios de cultivo e suplementos, foi possível adaptar as

metodologias já descritas na literatura com células intestinais de origem humana

(Perreault e Jean-Francois, 1996; Sanderson e cols., 1996; Aldhous e cols., 2001),

de ratos (Evans e cols., 1994; Tryphonopoulos e cols., 2004; Quinlan e cols., 2006),

de camundongos (Sorg e Magistretti, 1991; Athman e cols., 2005); de bovinos

(Follmann e cols., 2000) e de cães (Weng e cols., 2005; Golaz e cols., 2007).

Com base no sucesso metodológico das técnicas utilizadas por estes autores,

culturas primárias de CEIF obtidas a partir de tecido epitelial intestinal de felinos

neonatos foram cultivadas por 15 dias e apresentaram boa viabilidade, com

manutenção de sua capacidade proliferativa, características morfológicas e

propriedades funcionais.

O epitélio do intestino delgado é um sistema altamente dinâmico,

particularmente bem adaptado para a avaliação de fenômenos celulares chave, tais

como proliferação, migração, diferenciação e apoptose celulares. Assim, dentro da

sua unidade funcional, a cripta, o epitélio é espacialmente separado por células

intestinais, proliferativas e diferenciadas, situadas respectivamente nas regiões

inferior e superior da cripta intestinal e as células funcionais presentes nas

vilosidades (Potten e cols., 1994; Perreault e Jean-Francois, 1996). Enterócitos in

vivo, principal tipo de célula do intestino delgado, são gerados na base da cripta

intestinal e, progressivamente amadurecem durante a migração ao longo da

vilosidade até atingir o ápice intestinal. Estas células são altamente polarizadas

devido ao seu contato com a membrana basal e células mesenquimais adjacentes,

presentes nas microvilosidades (Simon-Assmann e cols., 2007).

Várias tentativas de se estabelecer culturas intestinais de células epiteliais de

animais adultos, ou estabelecer linhagens celulares intestinais derivadas de

enterócitos não alterados, não têm sido bem sucedidas (Mehran e cols., 1997).

Neste sentido, nós somos pioneiros a isolar e manter culturas primárias de epitélio

intestinal felino, abrindo novas perspectivas para a realização de estudos não só

com Toxoplasma gondii, mas também com outros enteropatógenos in vitro. O

sucesso das culturas de CEIF neste estudo foi dependente de uma série de fatores.

Em primeiro lugar, o uso do tecido fetal intestinal de felino, essencial para a geração

de células epiteliais proliferativas em cultura. Em segundo lugar, a dissociação do

epitélio intestinal, através da utilização de dissociação não enzimática, nos permitiu

obter células viáveis capazes de contribuir para o crescimento e a viabilidade das

CEIF por períodos mais longos. Em terceiro lugar, a atividade sinergística com fator

de crescimento epdermal (EGF) também contribuiu para a manutenção do

crescimento das CEIF, como proposto anteriormente por Kedinger e cols. (1987).

A alta sensibilidade das células epiteliais intestinais a danos durante a

dissociação, em comparação com outras células epiteliais, é um dos fatores

limitantes para obtenção de seu completo isolamento. Com o objetivo de minimizar

esta dificuldade, foram empregados dos métodos simultâneos de dissociação,

mecânicos e não enzimático (Whitehead e cols., 1987; Follmann e cols., 2000;

Aldhous e cols., 2001), que provou ser rápido e eficiente para os fragmentos

intestinais fetais. A viabilidade celular foi boa como indicado por análise por

citometria de fluxo, em comparação com as metodologias enzimáticas habituais,

utilizando colagenase, tripsina e/ou EDTA (Evans e cols., 1994; Potten e cols., 1994;

Potten e Grant, 1998). As células isoladas ou pequenos fragmentos do tecido

aderiram com sucesso em diferentes superfícies, tais como plástico ou vidro,

revestido ou não com substratos. Após a adesão as CEIF começaram a proliferar

até formar monocamadas confluentes.

No decorrer deste trabalho, com o objetivo de reduzir as variáveis na

composição do meio de cultura, foram utilizados apenas como suplemento 10% SFB

e 20 ng/ml da EGF, recomendados para estimular a multiplicação e diferenciação

celular in vitro de células intestinais (Baten e cols., 1992; Evans e cols., 1994; Potten

e cols., 1994; Potten e Grant, 1998). Esta composição do meio de cultivo foi

suficiente para estabelecer um microambiente favorável para a manutenção das

CEIF por 15 dias em cultura.

A polarização das células epiteliais depende de condições externas

específicas, tais como, a formação de contatos entre as células e interações das

células ao substrato. Sabe-se que esse estado morfológico polarizado é adquirido

gradualmente em cultivo e envolvendo inúmeros nutrientes, fatores de crescimento e

moléculas da matriz extracelular (Sanderson e cols., 1996; Simon-Assmann e cols.,

2007). No presente trabalho, foi demonstrado, através da marcação dos filamentos

de actina que a polarização é uma característica inerente das células do epitélio

intestinal, considerando-se que as células in vitro apresentaram o aspecto de

alinhamento e polarização sem qualquer suplementação específica de moléculas da

matriz. No entanto, no nosso sistema outras características do epitélio intestinal, tais

como, microvilosidades e tigth junction foram pouco observadas. Esses eventos têm

sido justificados por alguns autores (Levy e Bendayan, 2000; Oriolo e cols., 2007)

descrevendo que enterócitos ao longo do tempo em cultura formam uma

monocamada colunar parecendo enterócitos maduros e afirmam que a presença de

interdigitações, microvilosidades e complexos juncionais são mais evidentes entre

20 e 30 dias das células em cultura. Outro fator que provavelmente pode ter

interferido em nossas culturas foi a ausência de hidrocortisona no meio de cultura,

que tem sido descrito como um promotor de diferenciação celular, formação de tigth

junction e formação de microvilosidades (Quaroni e cols., 1999). Embora a formação

de tigth junction tenha sido prejudicada em nosso modelo, por microscopia eletrônica

de varredura foi possivel observar que nas culturas mantidas até 9 dias, a maioria

das células estavam aderidas ao substrato, formando inúmeros filopódios e

interdigitatações, que frequentemente estabeleciam contatos com outras células,

confirmando os dados descritos por Steimer e cols. (2006).

Outro aspecto a ser considerado são as características morfológicas das de

CEIF, que mostraram ser uma população homogênea de células epiteliais, com:

aspecto poligonal, citoplasma abundante, núcleos centrais e crescimento em

monocamada coesa, como descrito anteriormente em outros sistemas por Quaroni

(1985b) e Baten e cols. (1992).

Citoqueratinas são os principais componentes da rede de filamentos

intermediários das células epiteliais, que constituem uma classe heterogênea de

aproximadamente 30 polipeptídios estruturalmente relacionados (Moll e cols., 1982).

A caracterização morfofisiológica da cultura de CEIF incluiu imunoensaios para

demonstrar a presença de citoqueratina. As culturas analisadas foram positivas e a

detecção de citoqueratina foi independente do seu estado de diferenciação, ou

período de cultivo, como proposto por Quaroni (1985a); Baten e cols. (1992) e

Quinlan e cols. (2006). Nossos resultados mostraram que culturas secundárias de

CEIF expressaram citoqueratina por até 2 semanas, não adquirindo características

de outros tipos de células, demonstrando então, a sua natureza epitelial, de acordo

com Macartney e cols. (2000). Para a caracterização funcional, foi detectada a

presença da enzima fosfatase alcalina nas CEIF a partir de 5 até 9 dias de cultivo,

que também foi observado após 2 dias por Sanderson e cols. (1996); 6 dias por

Follmann e cols. (2000) e 7 dias por Quinlan e cols. (2006).

As células puderam ser sub-cultivadas através de dissociação com solução de

tripsina/EDTA (Follmann e cols., 2000) e as passagens sucessivas foram mantidas

por 30-45 dias. Após este tempo, a maioria das culturas começou a demonstrar

sinais de senilidade, com acentuada diminuição dos pontos de adesão, vacuolização

perinuclear e eventual morte celular, impossibilitando novas passagens. A

suplementação do meio com L-glutamina como proposto anteriormente por

Chapman e cols. (1998) e Aldhous e cols. (2001) não aumentou a longevidade

destas culturas.

Absorção intestinal é um processo complexo, que implica numa estreita

coordenação entre o trânsito intestinal e a função celular dos enterócitos (Levy e

Bendayan, 2000). O presente estudo demonstrou que as células epiteliais intestinais

em cultura mantiveram a capacidade de se ligar a traçadores catiônicos revelando a

natureza aniônica da sua membrana plasmática. O tipo de ligação de partículas de

ferritina cationizada sobre as CEIF mostrou a presença de grupos carboxila ou

glicoproteínas expostos na sua superfície. A distribuição de FC em células vivas

ocorreu em agregados ao longo de toda a superfície celular, demonstrando uma

migração lateral e redistribuição de sítios receptores induzida pela FC, como já

descrito em outros tipos celulares (Jersild e Crawford, 1978; Meirelles e cols., 1986;

Contreras e cols., 1988; Guimarães e cols., 2007). Tal como previsto, moléculas

catiônicas foram internalizadas rapidamente em grandes quantidades e

concentradas em vacúolos (endossomos) no citoplasma. Estes eventos

demonstraram que a atividade endocítica das células intestinais foi preservada in

vitro.

No conjunto, os dados aqui apresentados mostram que a cultura primária

epitelial intestinal de felino pode ser gerada a partir de fragmentos de intestino

delgado fetal, mantendo as características fisiológicas e funcionais do órgão de

origem. O modelo de estudo se constitui assim, como potencialmente capaz de ser

empregado na análise de drogas, transporte de nutrientes, no metabolismo intestinal

e para estudos de interação epitélio intestinal com diversos microorganismos, dentre

eles, o Toxoplasma gondii.

2. Interação Toxoplasma gondii e epitélio intestinal felino in vitro

O segundo bloco deste trabalho mostra o monitoramento da infecção de

bradizoítos de T. gondii em células epiteliais intestinais de felino, in vitro. A escolha

de formas bradizoítas de T. gondii como o estágio infectivo para interagir com as

CEIF se justifica por representar uma das principais vias de transmissão do parasito,

através do consumo de carne crua por animais carnívoros ou mal passada pelos

humanos. O emprego de bradizoítos como fonte de infecção in vitro é pouco

utilizado, muito provavelmente pela metodologia de seu isolamento e purificação ser

um processo longo e envolver um número razoável de animais. Excluindo essas

limitações, o fato do baixo emprego dessas formas infectantes como modelo de

estudo da toxoplasmose experimental, restringe os estudos que possam contribuir

para o desenvolvimento de novas drogas e estratégias que possam interferir na fase

crônica da toxoplasmose. Um outro ponto chave desta discussão é a introdução de

células de felino, pela primeira vez como modelo celular, visando o estudo do ciclo

entérico do T. gondii.

O emprego de sondas que identificam os estágios intracelulares do parasito

demonstrou que a carga parasitária infectante de bradizoítos cepa ME49 pode gerar:

(i) o desenvolvimento do ciclo lítico do parasito, utilizando a relação 1:5 (parasito-

célula hospedeira), com a conversão de bradizoítos em taquizoítos, culminando com

a sua proliferação intensa, provocando a lise da célula hospedeira; (ii) manutenção

da forma bradizoíta e estabelecimento da cistogênese, com a formação de cistos

intracelulares e, (iii) o desenvolvimento de diferentes estágios/tipos morfológicos do

T. gondii, com a reprodução parcial, porém inédita, do ciclo enteroepitelial do

parasito, utilizando a relação 1:20 (parasita-célula hospedeira).

A análise da infectividade de CEIF e das linhagens celulares epiteliais

disponíveis (CRFK e IEC-6) como potenciais modelos para o estudo do ciclo

sexuado do T. gondii demonstraram que estatisticamente as CEIF apresentam maior

susceptibilidade por bradizoítos. Esse dado poderia ser interpretado pelas

características moleculares e fisiológicas preservadas do tecido original, nas células

provenientes de culturas primárias, quando comparadas às linhagens celulares. E

ainda, esses resultados sugerem a restrição para o emprego de linhagens celulares

objetivando definir aspectos moleculares e celulares da interação parasito-célula

hospedeira. Nossos dados apontam para a possibilidade do modelo celular ser um

dos fatores determinantes do ciclo intracelular do T. gondii, como demonstrado

recentemente, no modelo de culturas primárias de músculo esquelético, o

desenvolvimento da cistogênese (Guimarães e cols., 2008, revisto em Ferreira-da-

Silva e cols., 2008) e ainda, em culturas primárias de tecido cerebral (Fischer e cols.,

1997; Kurz e cols., 1998; Lüder e cols., 1999). Assim sendo, a maior afinidade dos

parasitos pelas CEIF deve refletir os mecanismos moleculares que ocorrem in vivo,

determinando o destino intracelular do parasito, para o desenvolvimento do ciclo

lítico, da cistogênese ou do ciclo sexual do parasito.

Tem sido demonstrado que em experimentos in vivo, independente da forma

infectante (taquizoítos, esporozoítos ou bradizoítos), alguns parasitos inicialmente se

replicam rapidamente como taquizoítos, como forma de amplificação da infecção, de

acordo com o descrito por Dubey (1997c). Infectando as CEIF com bradizoítos de

cepa ME49, na relação 1:5 parasito-célula hospedeira foi observada a conversão de

bradizoítos em taquizoítos em 48 h.p.i. através da detecção de SAG-1 em mais de

95% das formas parasitárias intracelulares, semelhante aos resultados in vivo

obtidos por (Dubey, 1997b). A diferenciação de bradizoítos em taquizoítos é um

processo natural a partir de 15 h.p.i. em culturas de células sem adição de

substâncias imunomoduladoras (Gross e cols., 1996). A evasão dos taquizoítos com

rompimento de CEIF as 96 h.p.i. como demonstrado aqui, caracteriza o ciclo lítico do

T. gondii, ratificando os resultados obtidos por (Dzierszinski e cols., 2004) que

observaram lise celular de 72 a 96 h.p.i. em linhagens celulares infectados com

taquizoítos cepa VEG.

O fato de altos índices de conversão e o estabelecimento da cistogênese in

vitro ser dependente de manobras experimentais, como por exemplo, aumento de

temperatura ou alteração de pH foi proposto inicialmente por Soete e cols. (1994) e

confirmado por Dzierszinski e cols. (2004). Por outro lado, alguns autores

consideram que a cistogênese espontânea seja um evento dependente da cepa de

T. gondii, tendo as cepas avirulentas, como a ME49, a capacidade de naturalmente

formar cistos em culturas celulares de mamíferos (McHugh e cols., 1993; Darde e

cols., 1989; Lindsay e cols., 1991). Essa questão ainda não foi totalmente

respondida, muito embora uma revisão recente envolvendo nosso grupo tenha

aberto a discussão se o tipo celular seria um dos fatores determinantes do destino

intracelular do parasito, a partir da nossa experiência com culturas de células

musculares esqueléticas revisto em Ferreira-da-Silva e cols. (2008). Nossos

resultados mostraram que a princípio, diminuindo a carga parasitária para 1:10

(bradizoíto-célula hospedeira) ocorre a formação de cistos intracelulares bem

definidos, com 6 d.p.i. espontâneamente, sem qualquer modulação física, química

ou imunológica das culturas. Esses dados introduzem um novo aspecto na interação

do T. gondii com a célula hospedeira sem, no entanto, descartar a hipótese que o

tipo celular possa ser um dos indutores da cistogênese.

Um outro aspecto evidenciado dentro do nosso sistema foi a ocorrência,

também após 6 d.p.i., de cistos mistos, contendo taquizoítos e bradizoítos. Esse

dado foi obtido pela marcação das culturas com a lectina DBA revelando a matriz

cística, como previamente demonstrada por Matsubayashi e Akao (1963), Weiss e

Kim (2000) e Dzierszinski e cols. (2004) e pela revelação simultânea de taquizoítos

de T. gondii com o anticorpo anti-SAG-1. Essa observação tem sido também descrita

por outros autores (Gross e Pohl, 1996; Sahm e cols., 1997) considerando que após

a infecção com formas bradizoítas da cepa ME49, alguns bradizoítos formam cistos

teciduais diretamente, sem conversão transitória para taquizoítos, enquanto outros

se transformam em taquizoítos antes de formar cistos (Ferreira-da-Silva e cols.,

2008; Guimarães e cols., 2008). Com base nestas observações, nossos dados

remetem à opinião de que a cistogênese in vitro é um evento dependente de vários

fatores, dentre esses a cepa, a carga parasitária e o tipo celular ou ainda, a

interação desses fatores, que poderiam ser considerados como cruciais para o

estabelecimento do ciclo intracelular do T. gondii.

Uma outra abordagem explorada neste trabalho foi a biogênese do vacúolo

parasitóforo durante a interação de bradizoítos de T. gondii com a célula intestinal

epitelial de felinos. O estudo demonstrou que sítios aniônicos da membrana de

CEIF, revelados com partículas de ferritina cationizada, não foram internalizados

junto com os bradizoítos, ficando excluídos da composição da membrana do vacúolo

parasitóforo. Estes dados estão em concordância com prévios ensaios empregando

células endoteliais de cordão umbilical humana infectadas com taquizoítos (Stumbo

e cols., 2002), mas foram diferentes daqueles que demonstraram que partículas de

FC presentes na superfície de macrófagos são incorporadas junto com o T. gondii

durante sua invasão (de Carvalho e de Souza, 1990). Essas observações indicam

que células hospedeiras, não fagocíticas profissionais e as profissionais, apresentam

vias diferentes de interiorização de sítios aniônicos durante a formação do VP. Esta

proposta tem apoio nos estudos anteriores que descreveram que algumas enzimas

(de Carvalho e de Souza, 1989) ou resíduos de açúcar (de Carvalho e de Souza,

1990; Pacheco-Soares e De Souza, 2000) presentes na membrana plasmática de

macrófagos não são localizados na membrana do vacúolo parasitóforo de T. gondii.

Nossa experiência demonstra que a incorporação de componentes da membrana

plasmática da célula hospedeira não é determinada pelo estágio infectivo do

parasito, pois resultados semelhantes aos que foram apresentados aqui têm sido

obtidos durante a infecção de células musculares esqueléticas com formas

taquizoítas (Barbosa, HS, comunicação pessoal).

Análise de cortes ultrafinos de CEIF infectadas revelou a presença constante

de organelas da célula hospedeira em estreita associação à MVP. Os estudos

clássicos de (Jones e cols., 1972) descrevem que em macrófagos, somente

vacúolos contendo T. gondii vivos são circundados por mitocôndrias e retículo

endoplasmático (revisto em Sinai e cols., 1997 e em De Souza, 2005). Esses dados

corroboram as imagens obtidas no presente trabalho, mostrando parasitos no

interior de vacúolos totalmente preenchidos com as RMT, a manutenção da

associação de RE e mitocôndria e ainda, de lipídios indicando que esses parasitos

estavam metabolicamente ativos. O papel funcional dessas associações, em

particular do RE parece estar vinculado ao significativo aumento da membrana do

vacúolo parasitóforo durante o processo de multiplicação do parasito (de Melo e de

Souza, 1997; Sinai e cols., 1997; Magno e cols., 2005). De qualquer forma,

independente do tipo e origem das células, como demonstrado aqui, com células de

felino, essa associação parece ser um processo desencadeado pelo parasito,

orquestrado molecularmente durante o seu processo de invasão e estada no seu

nicho. A alta incidência de associação de mitocôndrias e em particular de inclusões

lipídicas imediatamente próximas ao VP observada nos nossos estudos, não indica

que essa associação seja acidental, como sugerido por Magno e cols., (2005).

Podemos fomentar essa discussão, com as imagens ilustrando a inserção, muitas

vezes observada, de inclusões lipídicas em contato direto com a matriz vacuolar

(Fig. 11 e 12). Para entender esse processo, tem sido proposto que a membrana

associada à mitocôndria (MAM) medeia a associação RE-mitocôndria e o tráfego de

lipídeos (Trotter e Voelker, 1994; Vance e Shiao, 1996). Assim, sítios de organelas

associadas a MVP poderiam ser um ponto de contato para a transferência de grande

quantidade de lipídios num modo análogo à transferência de fosfolipídio mediado

pela MAM entre a mitocôndria e o RE (Sinai e Joiner, 1997; Sinai e cols., 1997). Eles

sugerem que como T. gondii não é capaz de sintetizar fosfatidilcolina, o seu

requerimento nutricional deveria ser suprido pela célula hospedeira, com

participação de mitocôndrias e RER como fontes para aquisição de lipídios ou

precursores de lipídeos. Coppens e cols. (2000) demonstraram que o T. gondii é

depende do colesterol da célula hospedeira derivado de LDL endocitado e não da

síntese endógena. Os estudos da atividade de acil-CoA colesterol aciltransferase

(ACAT) uma enzima chave para manutenção da homeostase intracelular de

colesterol, através da formação de ésteres de colesterol (que podem ser estocados

na forma de inclusões lipídicas citoplasmáticas) demonstraram que ACAT e ésteres

de colesterol têm um papel crucial na replicação do T. gondii (Sonda e cols., 2001).

Esse conjunto de dados nos permite concluir que a associação de organelas da

célula hospedeira a MVP descrita em todos os tipos celulares investigados até o

momento, é independente do estágio infectivo empregado (bradizoíto ou

taquizoítos), da origem do tipo celular desafiada (até mesmo de felino) e do ciclo

celular que o parasito irá seguir (ciclo lítico ou cistogênese). O parasito demonstra

utilizar as mesmas estratégias para completar seu ciclo intracelular, até mesmo em

enterócitos felinos, como apresentado aqui.

No presente estudo, um dos principais indicadores morfológicos de que o ciclo

entérico do T. gondii estivesse realmente sendo reproduzido in vitro, foi a rede de

membranas tubulovesicular extremamente desenvolvida. Já a partir do trabalho de

(Jones e cols., 1972) foi observada a presença desta rede e mais tarde, os grânulos

densos foram identificados como a organela responsável pela secreção das

proteínas localizadas no interior do VP e associadas às RMT, assim que o parasito

está completamente no interior do vacúolo (Sibley e cols., 1986; Cesbron-Delauw,

1994). As funções das proteínas dos grânulos densos ainda não foram totalmente

elucidadas, em parte por falta de homologia significante com proteínas de função

conhecida. Apesar disso, várias evidências fortemente sugerem que os as proteínas

dos grânulos densos estejam envolvidas com a construção da RMT (Sibley e cols.,

1995). A hipótese atual se direciona em favor do papel da RMT nas trocas

metabólicas entre o parasito e a célula hospedeira, assim como no trânsito de

pequenas moléculas do citosol da célula hospedeira para o parasito ou a exportação

de proteínas e/ou lipídeos do parasito para a MVP e/ou célula hospedeira (revisto

em Mercier e cols. 2005). Consistente com o papel das GRA na sobrevivência

intracelular do parasito, a RMT só é produzida pelo parasito vivo imediatamente

após a invasão celular ativa (Sibley e cols., 1986), estando ausente nos parasitos

mortos pelo calor ou opsonizados (Jones e cols., 1972; Nichols e O'Connor, 1981).

Esse dado confirma então, que os parasitos identificados no interior de vacúolos em

CEIF, estariam participando ativamente na formação da RMT bastante desenvolvida,

ocupando todo o espaço vacuolar e permitindo a associação do RE, mitocôndria e

lipídeos ao VP. Com base em imagens obtidas por microscopia eletrônica de

varredura de emissão de campo (Magno e cols., 2005) propuseram uma função

alternativa para a RMT, como suporte estrutural para a manutenção dos parasitos,

durante a sua multiplicação celular, no arranjo característico de roseta no interior do

vacúolo durante a infecção de células MDCK com taquizoítos. Essa proposta é

inovadora, porém no caso específico de CEIF interagindo com bradizoítos como

fonte de infecção, a presença de um único parasita já evidencia uma rede

absolutamente desenvolvida, o que não corrobora a idéia de função mecânica

estrutural. Outro fator que não apóia a proposta apresentada por Magno e cols.

(2005) é a ausência de rosetas durante a proliferação dos estágios intermediários do

ciclo entérico do parasito. Em revisão recente, Mercier e cols. (2005) propõem que a

expressão conservada das proteínas dos grânulos densos em todos os estágios do

parasito, possa ser o elemento chave para o desenvolvimento da cistogênese.

Frente à análise desenvolvida no presente trabalho, entendemos que essa sugestão

tem um caráter limitador/restringente. A demonstração pela primeira vez da

interação de T. gondii e células de felino in vitro e ainda, infectadas com bradizoítos,

se reveste de importância, até mesmo para reavaliar a proposição de Mercier e cols.

(2005). A RMT tão desenvolvida no interior de PV, como a descrita aqui com célula

epitelial intestinal de felino, não tem precedente em nenhum modelo celular de outro

mamífero, até agora estudado. Daí se pode especular que essa característica única,

indicaria uma maior atividade de secreção dos grânulos densos para a indução dos

estágios sexuais do parasito no intestino de felinos.

Associada a evidenciação de formação de cistos com a carga parasitária de

1:10 (parasito-célula hospedeira) no nosso modelo celular, foi possível também

observar com 6 dias de infecção a presença de formas sinciciais. Essa evidência

permitiu o direcionamento para os estudos ultra-estruturais, utilizando uma carga

parasitária de 1:20, a fim de explorar o potencial do modelo CEIF na reprodução e

caracterização dos estágios enteroepiteliais do T. gondii. Nossos resultados ainda

que iniciais, permitiram remeter a hipótese da mimetização dos estágios entéricos do

T. gondii in vitro, como será discutido a seguir.

Um dado importante que pode ter contribuído para o conjunto de dados

descritos na presente tese, (além da baixa relação parasito-célula hospedeira) foi o

emprego de bradizoítos recém isolados de cistos intracerebrais de camundongos

com alta infectividade, pois estudos descrevem que eles preservam a capacidade de

interconversão em felinos (Frenkel e cols., 1976; Weiss e Kim, 2000). O outro fator

que foi incontestável e determinante nos experimentos, aqui desenvolvidos, foi a

utilização de culturas primárias de gato doméstico (hospedeiro definitivo do T.

gondii). Vários estudos têm demonstrado que diferentes modelos celulares são

ineficazes na tentativa de reproduzir o ciclo enteroepitelial dos hospedeiros

definitivos in vitro (Dubey e Welcome, 1988; Dubey e Frenkel, 1998). Dessa forma, a

reprodução de alguns estágios enteroepiteliais de T. gondii in vitro ratifica a hipótese

de que este ciclo deva ser orquestrado e modulado por moléculas presentes nos

enterócitos de felinos, tendo em vista o alto grau de especificidade do parasito pelo

hospedeiro definitivo, o que pode ter sido um fator crucial para os resultados

originais obtidos nesse trabalho.

A observação ultra-estrutural de culturas de CEIF infectadas a partir da relação

1:20 (parasito-célula hospedeira) com formas bradizoítas revelou características

morfológicas que decididamente diferem das descritas até o momento com outros

tipos celulares que foram: (i) vacúolos contendo apenas um parasito dentro de uma

matriz vacuolar repleta da rede de membranas tubulovesicular bem desenvolvida,

indicativo de que alterações metabólicas acentuadas dessa matriz estariam

ocorrendo. Esse dado é um forte indício de que a sinalização ou modulação

molecular estaria desencadeamento a diferenciação de bradizoítos/esquizonte tipo A

para o tipo B, à semelhança do que foi recentemente descrito no intestino de gatos

in vivo, 3-6 dias pós-infecção (Speer e Dubey, 2005). Esta característica pode

realmente representar a primeira evidenciação de reprodutibilidade do ciclo entérico

do T. gondii in vitro, a partir da descrição in vivo de Speer e Dubey (2005); (ii)

vacúolos contendo mais de 2 parasitos (indicativo de proliferação celular) com a

manutenção da intensa rede de membranas tubulovesicular, sugerem o

estabelecimento do esquizonte tipo B, in vitro; (iii) vacúolos contendo parasitos em

proliferação por endodiogenia assincrônica que é observada na fase assexuada do

ciclo sexual (Hu e cols., 2002) e em cistos teciduais, porém com reduzida rede de

membranas tubulovesicular, sugerem que modificações na matriz vacuolar estão

ocorrendo e que podem estar relacionadas com a diferenciação dos esquizontes tipo

B para tipo C; (iv) grandes vacúolos, contendo formas multiplicativas

desorganizadas, característico de divisão celular por endopoligenia, podem

representar estágios precursores da gametogênese, como por exemplo, o

esquizonte tipo E. Essa hipótese é apoiada pelas características morfológicas dessa

estrutura demonstrando desorganização, corpos lipídicos e corpo residual rico em

organelas celulares, em concordância com os estudos do desenvolvimento entérico

do T. gondii em intestino de gatos in vivo, desenvolvidos por Speer e Dubey (2005);

(v) presença de estruturas apresentando muita semelhança com os macrogametas

(Ferguson, 2004; Ferguson e cols., 1974; Ferguson e cols., 1975; Speer e Dubey,

2005) é indicativo de que a gametogênese foi estabelecida in vitro. As

características morfológicas que sustentam essa hipótese se baseiam nas

dimensões da estrutura, o complexo membranar interno, núcleo granular, estruturas

citoplasmáticas que se assemelham aos corpos formadores de parede, grânulos

densos, grânulos de amilopectina e mitocôndrias.

O conjunto de estratégias experimentais aplicadas na presente tese teve como

premissa básica reproduzir in vitro o desenvolvimento do parasito nas células

intestinais epiteliais do hospedeiro definitivo, o gato doméstico. A introdução do

modelo celular de epitélio intestinal de felino empregado neste estudo mostrou que

potencialmente pode contribuir com novos subsídios sobre a biologia celular do

parasito. Numa outra vertente, se apresenta como uma metodologia alternativa para

o melhor entendimento do ciclo entérico do T. gondii em condições controladas,

abrindo campo para a investigação dos aspectos moleculares desta interação que

possam contribuir, por exemplo, para o desenvolvimento de novas estratégias

visando à intervenção numa das principais vias de disseminação da toxoplasmose.

VI CONCLUSÕES

1. Modelo de estudo: Cultura primária de epitélio intestinal felino

O estabelecimento de cultura primária de epitélio intestinal felino com a

manutenção das características fisiológicas e funcionais do órgão de origem indica

sua adequação para estudos envolvendo a análise de drogas, o transporte de

nutrientes ou ainda, o metabolismo intestinal. Esse sistema pode ser também

aplicado como modelo de estudo durante processos infecciosos provocados por

enteropatógenos dentre eles, o T. gondii.

2. Interação T. gondii com epitélio intestinal felino in vitro

O modelo de culturas primárias de CEIF a partir da infecção com formas

bradizoítas de T. gondii, representa a primeira evidenciação de reprodutibilidade do

ciclo entérico do parasito, in vitro. A estratégia do emprego de bradizoítos como

fonte de infecção se reveste de importância porque mimetiza a principal via de

infecção natural de felinos.

O ciclo intracelular do parasito parece ser dependente da carga parasitária

induzindo ao ciclo lítico, a cistogênese ou ao ciclo sexuado do parasito em CEIF.

A reprodução de alguns estágios enteroepiteliais de T. gondii in vitro ratifica a

hipótese de que este ciclo deva ser orquestrado e modulado por moléculas

presentes nos enterócitos de felinos, tendo em vista o alto grau de especificidade do

parasito por esse único hospedeiro definitivo.

A seletividade de incorporação de componentes da membrana de CEIF segue

a tendência observada em outros tipos celulares com relação aos sítios aniônicos,

(excluindo os macrófagos), demonstrando que existem diferentes vias de

interiorização de sítios aniônicos durante a formação do VP contendo T. gondii.

Com relação à associação de organelas da célula hospedeira a MVP podemos

inferir que em todos os tipos celulares investigados até o momento, essa associação

é independente do estágio infectivo empregado (bradizoíto ou taquizoítos), da

origem do tipo celular desafiado (até mesmo de felino) e do ciclo celular que o

parasito irá seguir (ciclo lítico ou enteroepitelial ou cistogênese). O parasito

demonstra utilizar as mesmas estratégias para completar seu ciclo intracelular, até

mesmo em enterócitos felinos, como apresentado aqui.

A introdução desse modelo celular na investigação do ciclo entérico do T.gondii

abre perspectivas: (i) de se substituir gradativamente o modelo animal para esses

estudos; (ii) de potencialmente poder contribuir com novos subsídios sobre a

biologia celular do parasito; (iii) de possibilitar a exploração dos aspectos

moleculares desta interação que possam contribuir, por exemplo, para o

desenvolvimento de novas estratégias visando à intervenção numa das principais

vias de disseminação da toxoplasmose.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO 1:

Establishment and characterization of a primary feline

intestinal epithelial cell culture

M. A. Moura, M. R. R. Amendoeira & H. S. Barbosa

Research article

Establishment and characterization of a primary feline intestinal epithelial

cell culture

Marcos de Assis Moura

, Maria Regina Reis Amendoeira

and Helene Santos Barbosa

Address:

Laboratório de Biologia Estrutural and

Laboratório de Toxoplasmose, Instituto Oswaldo

Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, RJ, 21045-900, Brazil

e-mail: Marcos de Assis Moura - mmoura@ioc.fiocruz.br; Maria Regina Reis Amendoeira -

amendoei@ioc.fiocruz.br; Helene Santos Barbosa*

- [email protected].br

*Corresponding author

BSTRACT

ACKGROUND

RIMARY CULTURES OF THE FELINE INTESTINAL EPITHELIAL CELL HAVE

SIGNIFICANT IMPORTANCE FOR THE STUDY OF THE NORMAL DEVELOPMENT AND

DIFFERENTIATION OF INTESTINAL EPITHELIUM

ANY MECHANISMS INVOLVED IN THE

PATHOGENESIS OF CHRONIC ENTEROPATHIES OR HOST

PATHOGEN INTERACTIONS IN FELINE

INTESTINE HAVE NOT BEEN ELUCIDATED YET

HIS CELLULAR MODEL POTENTIALLY APPLIES

TO THE INVESTIGATION OF THE INFECTION PROCESS PROVOKED BY ENTEROPATHOGENOUS

IN PARTICULAR TO THE PROTOZOAN

OXOPLASMA GONDII

OCCIDIAN WHICH HAS THE

FELINE AS ITS DEFINITIVE HOST

AND WHICH MAINTAINS ITS SEXUAL LIFE CYCLE IN THE FELINE

GUT

ESULTS

HE CELLS WERE OBTAINED FROM THE SMALL GUT OF A FELINE FETUS

SURGICALLY

HE DYNAMIC AND EPITHELIAL NATURE OF THE CELLS IN CULTURE WAS

CONFIRMED BY MORPHOLOGICAL CRITERIA USING CONFOCAL AND LIGHT MICROSCOPY AND

ALSO SCANNING AND TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPY SHOWING

(

)

CELLULAR

REPLICATION

;

(

)

CELL SUBSTRATE ADHESION

;

(

III

)

CELLULAR MIGRATION

;

(

)

CELL

ALIGNMENT AS DEMONSTRATED BY THE NUCLEUS POSITION INDICATIVE OF CELLULAR

POLARIZATION

SIMILAR INTESTINAL EPITHELIUM

;

(

)

ENTEROCYTE

LIKE PHENOTYPE

EXHIBITION BY REVELATION OF CYTOKERATIN AND ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION

HE FUNCTIONAL PROPERTIES OF THE FELINE INTESTINAL EPITHELIAL CELLS WERE REVEALED

BY DEMONSTRATING ITS ENDOCYTIC ACTIVITY MONITORED THROUGH THE INCORPORATION OF

CATIONIZED FERRITIN

Conclusion: The establishment of a primary feline intestinal epithelial cell culture is 25

potentially important for the investigation of the complex intestinal physiology and 26

pathology, especially as a model during infectious processes provoked by 27

enteropathogenous. Additionally, these cells can be applied to the study of a large 28

range of events in cell biology including endocytic activity through intestinal cells, as 29

well as for screening pharmacological effects of new drugs. 30

Keywords: Feline intestinal epithelial cells; primary culture; cellular adhesion; 32

epithelial differentiation; endocytic activity; epithelial markers. 33

100

Background 35

Intestinal cells act as a barrier preventing the access of potentially harmful 36

substances and the migration of the underlying cells into the lamina propria [1]. 37

Primary intestinal culture has been difficult to establish since these cells depend on 38

cell-cell or cell-matrix interaction and require many growth factors [2]. The lack of 39

growth factors or interaction within these systems and the extracellular matrix leads 40

to the induction of cell death within a very short time period [3]. Knowledge of the 41

cellular and molecular biology of enterocyte development and differentiation has 42

evolved over recent decades, owing to experimental approaches that allow in vitro 43

differentiation [4]. Several investigators have already established culture methods for 44

intestinal cells of different animal species that mimic normal intestinal development 45

[5]. Some strategies have been used to try to culture intestine monolayer cells 46

obtained from intestinal explants of the adult individual [2, 6] or utilizing fetal cells [7, 47

8, 9]. The main problem with adult cells is that once intestinal cells are removed from 48

the basement membrane and underlying stroma, apoptosis is initiated within a few 49

hours, hampering study for longer time periods [3, 10]. The embryonic intestinal 50

epithelium in early phases of development is composed of a multi stratified 51

endodermal cell layer surrounded by the mesenchyme. Three cell types of 52

differentiated cells (enterocytes, goblet cells and endocrine cells) appear before the 53

initiation of crypt formation that starts shortly before birth [4]. The intestinal cell 54

cultures allow the study of the mechanisms involved in pathologies, including those 55

caused by infectious agents that affect the intestinal cellular integrity as well as 56

studies concerning the interaction of the intestinal cell with enteroparasites [11]. 57

Consequently cultured cells must remain viable and at the same time, must exhibit 58

phenotypical and functional properties reminiscent to the normal intestinal epithelium 59

[12]. As, in the present study primary cultures from cells isolated from feline fetal 60

intestinal epithelium were established, aiming to characterize the morphological, 61

physiological and functional aspects of cells maintained in culture over a certain 62

period of time. 63

Methods 65

The experiments were carried out in accordance with the guidelines established by 66

the Fundação Oswaldo Cruz Committee of Ethics for the Use of Animals, resolution 67

101

242/99 by license CEUA P0211-04 and by the Guidelines on the Care and Use of 68

Animals for Experimental Purposes (NACLAR). 69

Animals, epithelial cell isolation and primary culture 71

Three fetuses obtained from a clinically healthy pregnant domestic cat, 2 days before 72

birth, (no gastrointestinal disease and negative serologically for T. gondii, Feline 73

Immunodeficiency Virus and Feline Leukemia Virus) were taken at the necropsy 74

immediately after euthanasia. Full thickness samples of small intestine, 75

corresponding to the jejunum-ileum region (~5 cm), were excised and collected 76

aseptically in ice-cold sterile phosphate-buffered saline (PBS) with 10% antibiotic 77

solution (Sigma Chemical Co.). The tissue was opened longitudinally, washed three 78

times in PBS and maintained in this solution with a 10% antibiotic solution for 60 min 79

at room temperature. The fragments were divided into small pieces (1cm) and 80

washed in PBS with 10% antibiotic solution. After washing, the fragments were 81

placed in a nonenzymatic dissociation solution (pH 7.2) containing 1mM EDTA 82

(Sigma Chemical Co.), 1mM EGTA (Sigma Chemical Co.), 0.5 mM dithiothreitol 83

(DTT, Sigma Chemical Co.) and 10% antibiotic solution for 20 min under agitation at 84

room temperature [2, 5, 6, 7]. After cell dissociation the endoderm was carefully 85

collected, spread on a sterile Petri dish and the luminal surface was scraped gently 86

with a sterile scalpel blade. The conjunctive tissue was discarded. After centrifugation 87

(7 min, 650 g, 4°C), the cell aggregates were washed with DMEM/Hams medium 88

(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Hams Nutrient F12 (1:1) (Sigma Chemical Co.) 89

containing 10% antibiotic solution, 1 mM glutamine and 10% bovine fetal serum [2, 90

9]. Finally, the cellular aggregates were re-suspended in the culture medium 91

supplemented with 20 ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF, Sigma Chemical Co.) in 92

the final concentration. The cultures were maintained at 37°C incubated in a 5% CO

atmosphere and the culture medium was renewed every two days. Cell growth and 94

morphology were assessed by inverted and phase contrast microscopy. 95

Viability assays by flow cytometry 97

To determine the viability of isolated cells (1 x 10

cells/mL) just after non enzymatic 98

dissociation, they were incubated with 30 µg/mL propidium iodide (PI) (Sigma-99

Aldrich) for 15 min. The material was kept on ice until analysis. Data acquisition and 100

analysis were performed using a FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson, 101

102

CA, USA) equipped with the Cell Quest software (Joseph Trotter, Scripps Research 102

Institute, CA, USA). A total of 10,000 events were acquired. 103

104

Accompaniment, maintenance of the cell cultures and sub-cultures 105

After 7 days, the confluent intestinal cell cultures were washed 2 times with PBS and 106

removed from the substrate using a dissociation solution (PBS, 25% EDTA and 25% 107

trypsin) for 10 min at 37

C. After that, the cellular suspension was maintained at 4

C 108

in the same DMEM/Hams culture medium to inhibit any trypsin action, centrifuged 109

and seeded on different substrates (glass and plastic both treated or not with gelatin 110

or poly-L-Lysin). After the dissociation the cells were grown in 24-well plates on glass 111

slides (2.5 x 10

cells/well) or on plastic disks of 35mm

(5.0 x 10

cells/disk). The cell 112

cultures at different times were fixed in alcohol 70% for 5 min, washed with distilled 113

water, stained with Giemsa solution in PBS (1:10) for 60 min, dehydrated in graded 114

acetone-xylol and mounted in Permount. The cultures were analyzed every day by 115

light microscopy to assess viability, morphology and proliferation of the cells under a 116

Zeiss Axioplan 2 microscope. The images were captured with Soft Imaging System’s 117

ColorView II and a 3.3 MegaPixel color camera for the light-microscopy field and 118

analyzed with AnalySIS® image-analytical software. The images were cropped and 119

arranged using Adobe Photoshop 7.0. 120

121

Epithelial cells characterization by immunolabeling 122

For characterization of the feline intestinal cultures different monoclonal antibodies 123

were employed: anti-pan-cytokeratin clone PCK-26 (Sigma - C1801), anti-vimentin 124

clone VIM-13.2 (Sigma - V5255), anti-alkaline phosphatase clone AP-59 (Sigma – 125

A9579) and anti-desmin Clone DE-U-10 (Sigma - D1033). Prior to immunolabeling, 126

intestinal cells were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at 4ºC, 127

washed 3 times for 10 minutes in PBS and incubated for 30 min in 50 mM 128

ammonium chloride to block free aldehyde groups. Cells were then permeabilized by 129

incubation for 20 min with a block solution containing 0.05% Triton X-100 (Roche) 130

dissolved in PBS with 4% bovine serum albumin (BSA, Sigma Chemical Co.) to block 131

non-specific binding. For the assay of indirect immunofluorescence, the cells were 132

incubated for 2 hours at 37 ºC with primary antibodies: anti-vimentin (1:200, 1:400), 133

anti-cytokeratin (1:50, 1:100; 1:300) and anti-alkaline phosphatase and anti-desmin 134

(1:100; 1:500). The cells were washed with PBS + 4% BSA and incubated for 2h 135

103

with secondary antibody diluted 1:1000 (mouse anti-IgG conjugated with FITC or 136

TRITC) (Sigma Chemical Co). For the detection of actin filaments, the cell cultures 137

were incubated for 1h at 37°C with 4 µg/ml Phalloidin-FITC in PBS (1:400; 1:800) 138

(Sigma P5282). Afterwards, the cultures were washed 3 times for 10 min in PBS, 139

incubated for 5 min with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, a intercalate of DNA, 140

Sigma) diluted 1:10000 in PBS. After washing in PBS, the coverslips were then 141

mounted on slides with DABCO (1,4-diazabicyclo-[2,2,2]-octane-triethylenediamine 142

antifading, Sigma) in PBS containing 50% glycerol, pH 7.2. Controls were performed 143

by omission of the primary antibody. The samples were examined under a confocal 144

laser scanning microscope (CLSM Axiovert 510, META, Zeiss, Germany) using a 543 145

Helium laser (LP560 filter), laser 488 Argon/Krypton (Ar/Kr) (filter LP515) and a 405 146

Diiod laser (LP 420 filter). 147

148

Ultrastructural analysis 149

Scanning electron microscopy 150

151

The intestinal cell cultures were seeded for periods from 24, 48, 72 and 96 h and 152

then fixed for 30 min at room temperature in 2.5% glutaraldehyde (GA) diluted in 0.1 153

M sodium cacodylate buffer (pH 7.2). After washing in the same buffer, the cells were 154

post-fixed for 30 min at room temperature in 1% OsO4 diluted in 0.1 M sodium 155

cacodylate buffer (pH 7.2).. The material was dehydrated in an ascending acetone 156

series, dried by the critical point method mounted with silver cellotape on aluminum 157

stubs and coated with a 20-nm thick gold layer. The samples were examined under a 158

Zeiss DSM 940 scanning electron microscope. 159

160

Transmission electron microscopy 161

The intestinal cell cultures after different periods of seeding (1, 3 and 6 days), were 162

washed 3 times for 10 min with PBS and fixed for 1 hr at 4° C in 2.5% GA diluted in 163

0.1 M sodium cacodylate buffer containing 3.5% sucrose and 2.5 mM CaCl2 (pH 164

7.2). After fixation, the cells were washed in the same buffer and then post-fixed for 165

30 min at room temperature in 1% osmium tetroxide (OsO4), diluted in 0.1 M 166

cacodylate buffer. Following, the cells were washed in the same buffer and scraped 167

at 4° C from the plastic dish and centrifuged for 5 min at 10,000 g. Thereafter, the 168

cells were dehydrated in graded acetone and embedded in Epoxy resin. Thin 169

104

sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and then examined under 170

Zeiss EM10C and Jeol JEM-1011 transmission electron microscopes. 171

172

Detection and fate of anionic sites 173

The cationized ferritin (CF) was used to verify the presence of anionic sites on the 174

feline intestinal cell surface and its intracellular fate. After seeding, the cells were 175

incubated for 20 min at 4 °C with 200 µg/ml CF in DMEM/Hams (Dulbecco's Modified 176

Eagle's Medium/Hams Nutrient F12 (1:1) containing 10% antibiotic solution and 1 177

mM glutamine without serum (pH 7.2). The intracellular traffic of anionic sites was 178

monitored by the posterior incubation of the cells for 1, 4 and 12 h at 37 °C. Then, the 179

cells were washed three times in PBS for the removal of free ferritin particles that did 180

not adhere to the surface of the cells. The cells were fixed and processed as routine 181

for transmission electron microscopy and then examined under Zeiss EM10C and 182

Jeol JEM-1011 transmission electron microscopes. 183

184

Results 185

Morphological features during development of intestinal feline fetal tissue in 186

vitro 187

Primary cultures of feline intestinal epithelial cells (FIEC) obtained from fetus tissue, 188

non-enzymatically dissociated, presented a good preservation of cellular viability: 189

~32% as demonstrated by flow cytometry (Fig. 1). Initially, the cellular development 190

was investigated in vitro focusing on morphology and differentiation of the cells. 191

Small fragments of fetal intestine adhered to substrate, after 24 hours, presented a 192

heterogeneous cellular migration that later collapsed forming a sealed-tube-like 193

intestinal tissue (Fig. 2A). Parallelly, the formation of a monolayer composed of 194

polygonal cells surrounding the explant was observed, as seen in the Figures 2B-D. 195

During the three first days of seeding it was also possible to observe cells 196

establishing circular proliferation surrounding the adhesion foci which extended and 197

continued to expand, increasing the area of the culture with concentric layers, 198

forming small islets of condensed epithelial cells, like an organoid (Fig. 2E). During 199

the first week in culture, the substrate surface progressively became covered by a 200

homogeneous cellular polygonal monolayer presenting typical aspects of the 201

pavement epithelium (Fig. 2E and F). The epithelial cellular monolayer remained with 202

the same morphology for 10 days and sometimes reminiscent fragments of original 203

105

tissue could be seen on the monolayer, (Fig. 2G and H). The FIEC retained the 204

pavement epithelial characteristic to the 7

passage, after subcultives every 5 days 205

(rate 1:2 or 1:3). In the confluent cultures of the 3

passage, changes in the cellular 206

morphology from polygonal to fusiform form (Fig. 3B) occurred. These alterations 207

were clearly visible due to the actin filaments arranged using phalloidin--FITC (Fig. 208

3B), nucleus on the same plan organized side by side, as demonstrated by Giemsa 209

staining in the Figure 3C and also by labeling with DAPI (Fig. 3D), similar the 210

organization of enterocytes that constitute the intestinal epithelium. During the 211

following passages, the cells acquired a polygonal aspect, without major changes of 212

cell morphology. After the 7

passage of the culture, the cell proliferation rate 213

progressively slowed down until cessation of the cellular division. 214

215

Expression of intestinal markers in the feline epithelium 216

The epithelial nature of FIEC was confirmed by immunofluorescence, showing 217

specific labeling of cytoskeleton intermediate filaments, by using an anti-pan-218

cytokeratin antibody, which recognizes a range of cytokeratins (1, 5, 6, 8 and 10) and 219

by the expression of alkaline phosphatase (an enzyme secreted by intestinal 220

epithelium). 221

The analysis by confocal laser scanning microscopy showed that the primary cultures 222

of FIEC preserve the morphological and functional characteristics of immature 223

enterocytes. The FIEC cultures notably sustained a strong expression of cytokeratin 224

during the course of experiments, concentrated around the nuclei, indicating that 225

these cells were truly epithelial in nature (Fig. 4A, B-D). After 2 to 15 days of seeding, 226

more than 99% of the polygonal cells still expressed cytokeratin, characterized by a 227

distribution of filament networks in the cytoplasm (Fig. 4 B-D). The double staining, 228

employing phalloidin-FITC for identification of actin filaments and antibody anti-229

cytokeratin showed that the co-localization of the two proteins (Fig. 4 B-D) did not 230

occur. The location of actin filaments was mostly at the focal adhesion points of the 231

cellular membrane with the substrate (Fig. 4 E-G). The expression of alkaline 232

phosphatase, another marker of epithelial cells, was initially detected after 5 days of 233

cultivation (Fig. 5 A). The labeling showed a progressive increase of enzyme 234

concentration in cells between 7 to 9 days post seeding (Fig. 5 A-C). Vimentin and 235

desmin did not express in primary FIEC after 15 days in culture (data not shown). 236

106

After the first passage, the FIEC maintained the homogeneous pavement-like aspect 237

formed by polygonal cells which presented abundant cytoplasm, central nucleus (Fig. 238

6 A-D), positivity for cytokeratin (Fig. 6C) and various focal adhesion points as 239

observed by the revelation of the actin filaments using phalloidin (Fig. 6 D), typical for 240

epithelial cells. 241

242

Ultrastructural morphological and functional characterization of FIEC 243

Ultrastructural analysis by scanning electron microscopy of the FIEC cultures 244

confirmed the abortive characteristics of the cells. After 24 h of seeding the cells 245

presented polygonal morphology, adhesion on the substrate showing expansions of 246

the plasmatic membrane, establishing focal adhesion points (Fig. 7 A). Long and 247

slender microvilli were numerous over the cell surface, which often established 248

cellular contacts (Fig. 7 B-D). After 96 h, the cells established extensive 249

cytoplasmatic contacts indicative of the formation of specialized membrane areas like 250

cellular junctions (Fig. 7 C), and as can be seen in higher magnification in Figure 7 D. 251

The analysis of the ultra fine section of FIEC by transmission electron microscopy 252

demonstrated that epithelial cells in culture retained a great number of cytological 253

features typical of intestinal epithelial cells. 254

For functional analysis of the FIEC, cationized ferritin (CF), an electrondense 255

polycationic derivative of native ferritin ionized at physiological pH that allows 256

experiments with living cells, was employed. The CF was used in our studies as a 257

visual probe of surface anionic sites of intestinal cell from primary cultures of FIEC 258

and to examine its intracellular fate. The incubation of the living cells attached to the 259

substrate with CF for 20 min at 4 °C and subsequent elevation of temperature to 37 260

°C for 30 min revealed the distribution of CF on the cell surface, including in the 261

interdigitations (Fig. 8 A). These data indicate that the intestinal cell membrane is 262

negatively charged. The accessibility for binding CF only on the cell surface directed 263

toward the culture medium (in contact with the medium solution) (Fig. 8 A-D) was 264

observed. Cells incubated for 1h with CF at 37°C showed that the interaction of 265

anionic sites with the tracer induced a translational mobility at the membrane surface 266

forming clusters into discrete patches in some areas (Fig. 8 B). Under these 267

conditions, the cells maintained for periods of 4 and 12 h incorporated the CF 268

particles, taking them into the cell by endocytosis, as demonstrated in Figure 8 C. In 269

sequence, vesicles of different diameters and tubules containing ferritin particles 270

107

were localized right below the cell membrane and in the cytoplasm (Fig. 8D). After 12 271

h no more CF particles were seen adherent at the cell plasma membrane and large 272

amounts of CF were found in intracellular vesicles of various sizes and shapes and 273

also, abundant large vacuoles (endosomes) with accumulation of the CF distributed 274

in the cytoplasm (Fig. 8 E-F). 275

276

Discussion 277

Primary cultures of FIEC obtained from feline neonatal intestinal epithelial tissue 278

were cultivated for 15 days and presented good cellular viability maintaining their 279

proliferative ability, morphological characteristics and functional properties. The 280

epithelium of the small intestine is a highly dynamic system particularly well suited for 281

analyzing key biological phenomena such as cell proliferation, migration, 282

differentiation and apoptosis. Indeed, within its functional unit, the crypt-villus axis, 283

the epithelium is spatially separated into proliferative and differentiating intestinal 284

cells, located respectively in the lower and upper crypt regions and functional cells 285

lying on the villus [10, 13]. Enterocytes in vivo, generated at the base of the crypt, 286

progressively differentiate as they migrate along the length of the crypt and are the 287

main cell type in the differentiated small intestine. These cells are highly polarized 288

due to their contact with the basement membrane and with the adjacent cells, 289

composed at the apical region of well-organized microvilli [4]. Various attempts to 290

either culture intestinal epithelial cells from adult animals or to establish cell lines 291

derived from normal enterocytes have not been very successful [14]. In this sense, 292

we are the first group to isolate and maintain primary culture of FEIC for several 293

days, opening up new perspectives for studies with enteropathogenous in vitro. The 294

success of the small FIEC cultivation in this study was dependent on a number of 295

factors. First, the use of fetal feline intestinal tissue, essential for generating 296

proliferative epithelial cells in culture. Second, the digestion of intestinal epithelium by 297

using non enzymatic dissociation allowed us to obtain viable cells and small 298

fragments forming explants capable of contributing to the FIEC growth and viability. 299

Third, the synergistic activity of growth factors such as epidermal growth factor also 300

contributed to sustain the growth of FIEC, as proposed previously by Kedinger and 301

Haffe (1987). 302

Intestinal epithelial cells are susceptible to damaged during the dissociation of the 303

tissue, in comparison to other epithelial cells, which is one of the limiting factors for 304

108

obtaining these isolated cells. Aiming to minimize this drawback we employed two 305

methods simultaneously, mechanical and nonenzymatic dissociation [2, 16, 17] 306

which proved to be quick and efficient for intestinal fetus fragments. The cellular 307

viability was good as indicated by flow cytometry analysis, in comparison to the usual 308

enzymatic methods using collagenase, trypsin and/or EDTA [10, 11, 18]. The isolated 309

cells or small tissue fragments successfully established themselves on different 310

surfaces such as plastic or glass, coated or noncoated with substances. These cells 311

were capable of adhering and then began to proliferate until forming confluent 312

monolayers as previously described by Whitehead et al. (1987). In the course of this 313

work aiming to reduce the variables of the culture medium composition, we only used 314

10% SFB and 20ng/ml of EGF, recommended for stimuli of cellular multiplication and 315

differentiation as supplements [10, 11, 18, 19]. This medium composition was 316

sufficient to establish a microenvironment favorable to maintain the cells in culture 317

from 9 to 15 days. The polarization of epithelial cells depends on specific external 318

conditions such as the formation of cell contact structures and cell substratum 319

interactions. It is known that this polarized state is acquired gradually and involves 320

numerous nutrients and growth factors and extracellular matrix molecules [4, 9]. In 321

the present work, it was demonstrated through the labeling of actin filaments that the 322

cellular polarization is an inherent characteristic of intestinal epithelial cells, 323

considering that the cell aligned in vitro is without any utilization of specific matrix 324

molecules. However, in our system other epithelial intestinal characteristics such as 325

microvilli and the tight junction were little observed. These events have been 326

explained by some authors [20, 21] that enterocytes along with time in culture form a 327

polarized columnar monolayer of mature-appearing enterocytes and that the 328

presence of interdigitations, microvilli and junctional complexes became more evident 329

between 20 and 30 days of the cells in culture. Another factor that probably could 330

have interfered in our culture was the absence of hydrocortisone in the culture 331

medium that has been described as a promoter of cell differentiation, the apparition 332

of tight junctions and the formation of microvilli [22]. Although the formation of tight 333

junction was hampered in our model by scanning electron microscopy it was easy to 334

observe that in cultures maintained for up to 9 days the majority of the cells adhered 335

to the substrate and formed numerous filopodia and interdigitations which frequently 336

established contact with other cells, confirming the data described by Steimer et al. 337

(2006). Another aspect to be considered is the characteristics morphological of the 338

109

intestinal epithelial cultures analyzed here showing a homogeneous population of 339

epithelial-like cells with large cytoplasm, central nuclei and growing as tight colonies 340

of polygonal monolayers as previously described in others systems by Baten et al. 341

(1992) and Quaroni (1985b). 342

Cytokeratins are the main components of the intermediate filament network of 343

epithelial cells constituting a heterogeneous class of approximately 30 structurally 344

related polypeptides [25]. The morpho-physiological characterization of the FIEC 345

cultures included immunoassays to demonstrate the presence of cytokeratin. The 346

cultures were positive and the cytokeratin detection was independent of their state of 347

differentiation as proposed by Baten et al. (1992), Quaroni (1985a) and Quinlan et al. 348

(2006). Our results showed that more than 95% of the intestinal cells in culture 349

expressed cytokeratin for 2 weeks (with intensity comparable to freshly isolated 350

epithelial cells) and did not acquire the characteristic of other cell types, 351

demonstrating then, their epithelial nature in accordance to Macartney et al (2000). In 352

contrast, vimentin (found in fibroblasts and neural cells) (data not shown) and desmin 353

(data not shown) were detected in less than 5% of cells obtained prior to plating. Also 354

in terms of physiological characterization, an enterocyte marker was detected. This 355

was an alkaline phosphatase that persisted for the duration of the culture period 356

analyzed (9 days) and was also seen after 2 days by Sanderson et al. (1996); 6 days 357

by Follmann et al. (2000) and 7 days by Quinlan et al. (2006). 358

The cells could be subcultivated after their detachment with trypsin/EDTA solution 359

[17] and could be maintained for 30-45 days. After this time, most cultures began to 360

demonstrate signs of senescence with marked flattening and enlargement, 361

perinuclear vacuolization, failure to subculture and eventual cell death. 362

Supplementation of the medium with L-glutamine as proposed previously by Aldhous 363

et al. (2001) and Chapman et al. (1998) did not increase the longevity of these 364

cultures. Intestinal absorption is a complex process, which involves a tight 365

coordination between luminal and cellular function [20]. The present study 366

demonstrated that epithelial intestinal cells in culture maintained the ability to bind 367

with cationic traces revealing the anionic nature of its plasma membrane. The binding 368

pattern of CF on FEIC showed the presence of exposed carboxyl groups of 369

membrane proteins or glycoproteins over its surface. The distribution of CF in living 370

cells occurred largely as patches along the cell surface, demonstrating a lateral 371

migration and redistribution of receptor sites induced by CF or another ligand and 372

110

antibodies that have been described in various cell types [28, 29, 30, 31]. As 373

anticipated, cationic molecules were internalized rapidly in relative large amounts and 374

concentrated intracellularly. These events demonstrated that endocytic activity of 375

intestinal cells was preserved in vitro. 376

Taken together, the data presented here show that primary culture of feline epithelial 377

intestine can be generated from the fetal small intestine and maintains the 378

physiological and functional characteristics in vitro. It is potentially applied for 379

analysis of drug and nutrient transport and metabolism and for study of 380

microorganism-intestinal epithelial cell interactions. 381

382

Conclusions 383

Only a few researchers have employed primary cultures of gut epithelium because of 384

their inherent difficulties. Consequently development of reproducible techniques for 385

gut epithelium has been timid. The culture system of FEIC introduced in this paper 386

was established to serve as a model system for studies representing the intestinal 387

epithelium. Cell lines that are often used for in vitro experiments have lost several 388

organ specific functions because of their differentiated status. Primary cultures are 389

able to retain specific functions for a limited period when culture conditions are 390

optimized and such models are more likely to be capable of reflecting the in vivo 391

situation than cell lines. 392

The results presented here, indicate that in vitro FEIC can conserve several cell 393

specific functions maintaining their morphological, physiological and functional 394

properties. In summary, the feline intestinal epithelial cells can differentiate into 395

functional enterocyte cells and serve as a useful model for the study of a large panel 396

of cellular biologic events, approaches of cell–enteropathogenous interactions, as 397

well as contribute to new therapeutic applications such as drug screening. 398

399

111

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114

UTHORS

CONTRIBUTIONS

HSB conceived of the study and supervised its execution. MAM and HSB designed

experimental assays. MAM carried out all the experiments, the culture protocols and

cellular biology methods. MRRA participated in the design of the study. The

manuscript was mostly written by HSB and MAM, with input from MRRA. All authors

read and approved the final manuscript.

Acknowledgements

We are grateful to Sandra Maria de Oliveira Souza, Marielle Moreira and Genesio

Lopes de Faria for their technical assistance and to David Straker for the English

revision. This work was supported with grants from the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho

de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação Oswaldo Cruz

(Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde – PAPES IV) and Instituto

Oswaldo Cruz/FIOCRUZ.

115

Legends

Figure 1. Viability analysis of FIEC by flow cytometry after non-enzymatic cellular dissociation.

Labeling with propidium iodide (PI). Arrow indicates the viable population. Typical representative

histogram of at least three independent experiments.

Figure 2. Morphological aspects of primary cultures of FIEC from 1 to 10 days under phase contrast

and interferential microscopies. (A) Cell culture after 24h showing an intestine-like structure forming a

tube. (B-D): Details of the cells migrating out from the edges of explant surface. The monolayer is

composed by polygonal cells. In C and D note the epithelial villus-like spreading out from explant

(arrowhead). (E) The cells establish circular proliferation surrounding the adhesion foci which

extended and continued to expand, increasing the area of the culture with concentric layers, forming

small islets of condensed epithelial cells (*). (F) Higher magnification of the Figure E showing the

polygonal cells. (G) At 10 days, reminiscent fragment of original tissue is visible on the confluent

pavement-like epithelial tissue. (H) Details of the epithelial tissue can be observed at higher

magnification. All bars: 20µm

Figure 3: Semi-confluent tertiary cultures of FIEC. (A) Fusiform aspect of cells seen by phase contrast

microscopy. (B) Actin filaments alignment and the fusiform aspect of cells revealed with phalloidin-

FITC by fluorescence microscopy. (C and D) Nuclei of

cells located in the same plan stained with Giemsa and labeling with DAPI, like organization of

intestinal epithelium. [Bar: 20µm]

Figure 4: Characterization of the FIEC cultures by fluorescence microscopy. (A) Secondary culture of

FIEC presenting epithelial morphology revealed by double labeling: actin filaments in green and

cytokeratin-TRITC in red. (B-D) Cytokeratin expression localized around the nucleus. (E-G) Actin

filaments organization revealed

by phalloidin in FIEC showing the cell morphology and its major concentration at the focal adhesion

points.

Figure 5: Alkaline phosphatase immunoreactivity in FIEC after its incubation with antibody conjugated

to TRITC. The alkaline phosphatase activity progressively increased in cells as a function of the

culture time (5-9 days). The FIEC morphology is visualized by actin filaments revelation using

phalloidin-FITC. (A) 5 days; (B) 7 days and (C) 9 days post-seeding. [Bar: 20µm]

Figure 6: Secondary FIEC cultures presenting epithelial pavement aspect: Polygonal forms of the cell,

central nucleus and abundant cytoplasm and still various adhesion points at the substrate. (A)

116

Scanning electron microscopy. [Bar: 10µm]; (B) Light microscopy, stained with Giemsa. [Bar: 10µm];

and (C and D) Immunofluorescence microscopy: in red cytokeratin expression, in green actin filaments

and in blue the nuclei. [Bars: 20µm]

Figure 7: Scanning electron microscopy illustrating the epithelial morphology of FIEC cultures. (A)

After 24 h the culture presented numerous membrane expansions with focal adhesion points (arrows).

[Bar: 2µm]. (B) Long and slender microvilli were seen (arrowhead) [Bar: 2µm]; (C) After 96 h of

cultivation, specialization areas of membrane are formed, like cellular junction. [Bar: 5µm]; (D) Detail in

higher magnification of the cellular junction. [Bar: 2µm].

Figure 8: Functional ultrastructural characterization of FIEC incubated with cationized ferritin (CF). (A)

FIEC showing the distribution of CF after its incubation for 30 min at 4°C and subsequent elevation of

temperature to 37°C for 30 min. The CF particles are seen on the cell surface and into interdigitations.

(B) FIEC after 1h at 37°C showed a translation mobility of the membrane inducing the cluster

formation of ferritin (arrows). (C and D) Cells incubated for 4 h revealed the CF particles incorporation

by cellular membrane, via endocytosis. (E) FIEC after 12 h of incubation showed absence of CF on

the cell membrane and intense incorporation of tracer by cell membrane and its posterior localization

in great quantities in intracellular vesicles of different forms and sizes (arrowhead). (F) Large vacuoles

(endosomes) are seen filled with CF distributed by the cytoplasm (double arrows) [Bar: 500 nm].

117

118

119

120

121

122

123

124

125

ANEXO 2:

Is it possible to reproduce the sexual cycle of Toxoplasma

gondii in feline enterocytes in vitro?

M. A. Moura, M. R. R. Amendoeira & H. S. Barbosa

126

IS IT POSSIBLE TO REPRODUCE THE SEXUAL CYCLE OF TOXOPLASMA

GONDII IN FELINE ENTEROCYTES IN VITRO?

Moura, M. A.

*; Amendoeira, M.R.R.

; Barbosa, H.S.

Laboratório de Biologia Estrutural e

Laboratório de Toxoplasmose, Instituto

Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, RJ,

21045-900, Brasil

e-mail: [email protected]

127

128

129

Abstract 1

Primary cultures of the feline intestinal epithelial cell have significant importance for 2

the study of the normal development and differentiation of intestinal epithelium. This 3

cellular model potentially applies to the investigation of the infection process 4

provoked by enteropathogenous, in particular to the protozoan, Toxoplasma gondii, a 5

coccidian which has the feline as its definitive host, and which maintains its sexual 6

life cycle in the feline gut. In this way, primary cultures of feline epithelial intestinal 7

cells were infected with bradyzoites isolated of intracerebral cysts colleted of C57BL6 8

mice. After 6 days it was possible to observe for ultrastructural analysis, parasites 9

with morphologic characteristics compatible with enteroepithelial stages of the sexual 10

cycle of T. gondii: (i) vacuoles containing only one parasite inside of a vacuolar 11

matrix full of the well developed network of membranous nanotubes (RMNT); (ii) big 12

vacuoles, containing disorganized multiplicative forms, characteristic of endopoligeny 13

reproduction; (iii) parasites like macrogametas with presence of characteristic 14

structures with intern membranar complex, granular nucleus, cytoplasmic structures 15

like wall forming bodies, dense granules, amilopectin granules and mitochondria. The 16

feline intestinal epithelal cellular model introduced in this present thesis showed that 17

this model can potentially contribute with new researches on the parasite cellular 18

biology and presents a new and unique methodology in vitro for study the enteric 19

cycle of T. gondii. 20

Keywords: Toxoplasma gondii, feline intestinal epithelial cells; feline primary 21

culture; enteroepithelial stages, enteric cycle of T. gondii, in vitro. 22

1. Introduction 23

Toxoplasma gondii it is an intracellular protozoan, parasite of different species of 24

mammals and birds (Dubey, 1998a). In these animals, occurs asexual reproduction 25

of parasite, characterizing them as intermediate hosts (Black and Boothroyd, 2000; 26

Lehmann et al., 2000). The sexual cycle or enteroepithelial stage of T. gondii occurs 27

exclusively in domestic cats and other felides (Dubey et al., 2004). These are 28

considered definitive hosts, in which is observed in the intestinal epitélio the process 29

of schizogony, gametogony and sporogony resulting in the formation of immature 30

oocistos that are eliminated together with excrements of the felines (Dubey and 31

Frenkel, 1972; Dubey, 1973; Dubey and Frenkel, 1973). 32

Domestic cats can shed millions of oocysts after to ingest only one tissue cyst 33

(Dubey, 1998b, a). Generally, less than 1% of the population of cats can be found 34

130

liberating oocysts. The oocysts are set free for only one short interval of time (1-2 35

weeks) in the life of the cat (Dubey and Welcome, 1988). 36

The parasite presents three infective forms for the transmission of toxoplasmosis: 37

bradyzoites and tachyzoites found in the intermediate hosts and definitive where it 38

realize asexual reproduction and the sporozoites originate through the sexual 39

reproduction found in the oocysts (Cole et al., 2000; Dubey, 2000). 40

The wall of tissue cysts is rich in sugars and other polisacharides (Weiss and Kim, 41

2000; Guimaraes et al., 2003; Speer and Dubey, 2005). The cysts are found in 42

several organs, including spleen, liver and kidney, with predilection for the nervous 43

and muscular systems (Guimaraes et al., 2008). They can persist unbroken for all the 44

life of the host without causing inflammatory immunological response, preventing its 45

destruction (Weiss and Kim, 2000; Hill and Dubey, 2002). For mechanisms still 46

unknown the tissue cysts can be breached, occurring interconvertion and the 47

bradyzoites transforming in tachyzoites, infecting other cells and again they changed 48

into bradyzoites forming a new tissue cyst (Tenter et al., 2000). 49

The cats can liberate oocystes after to ingest any infect form of T. gondii: tachyzoites, 50

bradyzoites and sporozoites. The time to eliminate oocystes after the infection and 51

the frequency of the release of oocysts depend on the infect form ingested: the 3 to 52

10 days after to ingest tissue cysts, 13 days after ingestion tachyzoites and 18 or 53

more days for ingestion of oocysts (Frenkel and Dubey, 1972; Dubey and Frenkel, 54

1973; Dubey and Welcome, 1988). After the ingestion of the tissue cysts, the wall is 55

destroyed by proteolitics enzymes of the stomach and intestine. The bradyzoítes are 56

released and penetrate in the intestinal cells initiating the development of some 57

generations of T. gondii (Dubey and Frenkel, 1972). Exclusively in felines, occurs five 58

distinct of morphological types, enteroepithelial stages or schizonts of T. gondii 59

(Types:A, B, C, D and E). The schizonts multiplied exclusively in the superficial 60

epithelial cells, enterocytes of the small gut, giving origin to the merozoites, before 61

the beginning of gametogenesis (Dubey and Frenkel, 1972; Frenkel and Dubey, 62

1972). Following up, the microgametes are liberate in small gut and are attracted to 63

the macrogamontes. The immature oocyst is formed in the intestinal epithelium of 64

felines and eliminated, still immature, together with the excrements of the definitive 65

hosts in the environment, where they had suffered to maturation, and eigth 66

sporozoites are formed in the interior of the oocysts (Dubey and Frenkel, 1973; 67

Lindsay et al., 1991; Tenter et al., 2000). 68

131

The transmission electron microscopy showed that the enteroepithelial stages 69

contain all organelles characteristic of the Apicomplexa phylum, including: conoid, 70

rhoptries, micronemes, nucleus, plasmalemm, inner membrane complex, 71

subpellicular microtubules, apical and polar rings, micropore, Golgi complex, 72

endoplasmatic reticulum, numerous ribossomes, dense granules, mitochodrion and 73

amylopectin granules (Weiss and Kim, 2000; Speer and Dubey, 2005). Each type of 74

schizonte and merozoite differs in occurrence and presence from the structures. The 75

host cell also shows ultrastructural differences with relation to the parasitophorous 76

vacuole morphology (Dubey et al., 1998; Weiss and Kim, 2000; Speer and Dubey, 77

2005). 78

Felines after ingested tecidual cysts with bradyzoites developed the enteroepitheliais 79

stages of and liberate oocistos (Dubey and Frenkel, 1972; Hill and Dubey, 2002). 80

The mechanisms of induction of the sexual cycle sexual for tachyzoites and oocystes 81

still are unknown. The shed oocysts for cats infected with bradyzoites is shorter that 82

induction with tachyzoites or sporozoites (Dubey et al., 1988). 83

Actually, the morphologic (Dubey and Frenkel, 1972; Ferguson et al., 1974; 84

Ferguson et al., 1975) and molecular characterization (Koyama et al., 2000; 85

Ferguson, 2004) of the enteroepithelial stages of T. gondii sexual cycle, described 86

on literature was realized in vivo studies, using the domestic cats neonates. This 87

work is pionner and shows by the first time the ultrastructural development of 88

parasites similar to schizontes in vitro. 89

2. Material and Methods 90

The experiments were carried out in accordance with the guidelines established by 91

the Fundação Oswaldo Cruz Committee of Ethics for the Use of Animals, resolution 92

242/99 by license CEUA P0211-04 and of the International Guidelines of the Care in 93

the Manipulation of Animals and infectious agents. 94

2.1. Primary cultures of feline intestinal cells 95

Three fetuses obtained from clinically healthy pregnance domestic cat (no 96

gastrointestinal disease and negative sorologically for Toxoplasma gondii, Feline 97

Immunodeficiency Virus and Feline Leukemia Virus) were taken at necropsy 98

immediately after euthanasia. Full thickness samples of small intestine were 99

collected aseptically corresponding to jejunum-ileum region

(5 cm), excised and 100

collected in ice-cold in sterile phosphate-buffered saline (PBS) with 10% of antibiotic 101

solution (Sigma Sigma-Aldrich). After washing, the fragments were placed in 102

132

nonenzymatic dissociation (pH 7,2) containing 1mM EDTA (Sigma Sigma-Aldrich), 103

1mM EGTA (Sigma), 0,5 mM dithiothreitol (DTT, Sigma-Aldrich) and 10% antibiotic 104

solution for 20 min under agitation at room temperature (Perreault and Jean-105

Francois, 1996; Macartney et al., 2000; Aldhous et al., 2001; Rusu et al., 2005). The 106

cell agregates were plated with DMEM/Hams medium (Dulbecco's Modified Eagle's 107

Medium/Hams Nutrient F12 (1:1) (Sigma-Aldrich) containing 10% antibiotic solution 108

(Sigma-Aldrich), 1 mM glutamin and 10% bovine fetal serum and 20 ng/ml Epidermal 109

Growth Factor (EGF, Sigma-Aldrich) (Sanderson et al., 1996; Aldhous et al., 2001). 110

The cultures were maintained at 37°C incubated in a 5% CO

atmosphere, and the 111

culture medium was renewed every two days. 112

2.2. Transmissions electron microscopy analyses 113

The secondary feline epithelial intestinal cells (FEIC) cultures were infected with 114

bradyzoites of T. gondii ME49 strain obtained of tissue cysts purified of brains of 115

mice strain C57/Bl6 (for details, see (Guimaraes et al., 2007) in the relationship of 116

1:20 (parasites-host cells). After different periods of seeding (1, 3, 5, 7 e 9 days), 117

were washed 3 times for 10 min with PBS and fixed for 1 h at 4º C in 2.5% 118

glutaraldehyde (GA) diluted in 0.1 M sodium cacodylate buffer containing 3.5% 119

sucrose and 2.5 mM CaCl2 (pH 7.2). After fixation, the cells were washed in the 120

same buffer and then post-fixed for 30 min at room temperature in 1% osmium 121

tetroxide (OsO4), diluted in 0.1 M cacodylate buffer. Following, the cells were 122

washed in the same buffer and scraped at 4º C from the plastic dish and centrifuged 123

for 5 min at 10,000 g. Thereafter, the cells were dehydrated in graded acetone and 124

embedded in Epoxy resin (PolyBed 812). Thin sections were stained with uranyl 125

acetate and lead citrate and then examined under a Jeol JEM1011 transmission 126

electron microscope. 127

For analysis of parasitophoros vacuole membrane (PVM) biogenesis was used 128

cationized ferritin (CF) to verify the internalization of anionic sites on the FEIC surface 129

and its intracellular fate. After seeding, the cells were incubated for 20 min at 4 °C 130

with 200 µg/ml CF in DMEM/Hams (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Hams 131

Nutrient F12 (1:1) containing 10% antibiotic solution and 1 mM glutamine without 132

serum (pH 7.2). After this period, the cultures had been washed with ringer solution 133

for remove CF particles not associates to membrane of cells and the FEIC were 134

infected with bradizoites of T. gondii in relation of 1:20 (parasite-host cell). The cells 135

133

with 1, 4 and 12 h.p.i. were fixed and processed as routine for electronic microscopy 136

of transmission, as described previously. 137

3. Results 138

The structural analysis of infected FEIC cultures, showed: in the vacuole 139

parasitophoros (VP) with parasites like enteroepithelial stages oh T. gondii that 140

occurs in feline intestine. The parasitophoro vacuole (VP) was presented weak 141

aspect, with a large and well developed network of membranous nanotubes (NMN), 142

occupying the entire vacuole matrix (Fig. 1A-E). NMN can be seen in detail in the 143

Figure 1B. The parasite morphologic characteristics were similarity with type B 144

schizont described in feline enterocytes, in vivo (Fig. 1A-C). These vacuoles normally 145

presented only parasite (Fig 1A and C). Was common to observe endoplasmatic 146

reticulum (ER) profiles, mitochondria and lipids bodies of the host cell associates to 147

the MVP (Fig 1A, C-E). Parasitophoro vacuole showed constituted of unique 148

membrane (Fig 1B, D and E) and in the Figure 1D observed the undulating internal 149

membrane complex (IMC). These parasites showed asynchronous division, typical 150

endodiogeny like the assexual reproduction of the enteroepithelial stages (Fig 2A-C). 151

The disorganized merozoites were seen in the VP without typical formation of 152

rosettes, immersed in the NMN (Fig 2A-C). 153

Others analysis showed to some cells with VP presenting a developed NMN, 154

however its distribution did not occupy all vacuole space all (Fig. 3A-E). The 155

parasites in the interior of these vacuoles presented two types of mitochondrias: 156

typical (Fig. 3 A-B and D) and with eletrondense matrix (Fig. 3A-B and D); 157

decentralized nucleus (Fig. 12A-C); eletrondense rhoptries (Fig. 3C) or with labyrinth 158

aspect (Fig. 3A); presence of varied number of dense granules and amilopectin (Fig. 159

3 A-E). These vacuoles had tight association with host cells organells as the ER, 160

MVP (Fig. 3, D and E) and mitochondrias associate to the ER (Fig. 3 and the D). Till 161

some lipid bodies had been seen adhered to the ER (Fig. 3 A-C and E) or in direct 162

contact with the MVP (Fig. 3 C and E). Some images show to lipids establishing 163

direct connection with the vacuole parasitophoro matrix (Fig. 3 C and E). 164

The ultrastructural analisys allowed to observe other morphologic types of T. gondii 165

in CEIF: VP with an accented reduction of the NMN, schizonts showed endopoligeny, 166

compatible with the process of gametogeny, presenting merozoites with lipids 167

inclusions; a great residual body contends some organelles as: dense granules, 168

amilopectin granules and mitochondrias. The merozoites presented nucleus well 169

134

developed, occupying great part of the cytoplasm parasite (Fig. 4A). These analyses 170

include similar evaluative forms to macrogamontes, associates the host cell lipids 171

(Fig. 4B and C). The in vitro macrogamontes presented morphologic characteristics 172

compatible as previously described in the analyses of the enteric cycle of T. gondii in 173

domestic cats: nucleus with granular aspect, eletronlucentes structures with 174

eletrondense content, called of wall forming bodies and some granules of 175

amilopectin. Beyond Golg complex, lipids bodies, mitochondria and internal 176

membrane complex (Fig. 4 B and C). 177

Objectifying to analyze biogenesis of the of vacuole parasitophoros membrane 178

(MVP), CEIF had been incubated with cationized ferritin for 20 min. at 4ºC followed of 179

the infection with bradizoites ME-49 strain using the 1:20 relation (parasite-host cell) 180

for 1, 3 and 12h periods at 37ºC. The ultrastructural analysis demonstrated to the 181

absence of FC particles in interior of VP, (Fig. 5A). Independent of the period of 182

interaction parasite-host cell, no marking of the MVP or the space to vacuolar was 183

observed

despite marked vesicles visualized in the cytoplasm (Fig. 5B and C). 184

4. Discussion 185

This work shows the infection of bradizoítos of T. gondii with feline ephitelial intestinal 186

(FEIC) cells in vitro. The choice of bradizoítas of T. gondii as the infectivo form to 187

interact with the FEIC is justifies for representing one natural ways of T, gondii 188

transmission for cats, through the consumption of raw meat for carnivorous animals 189

or by the human. The infection with bradizoites in vitro is little used, probably 190

because methodology of isolation and purification to be a long process and involve a 191

reasonable number of animals. Excluding these limitations, the utilization of these 192

infectants forms as model of experimental toxoplasmosis studies can contribute for 193

the development of new drugs that can intervene with the chronic phase of 194

toxoplasmosis. One another point key of this discussion is the introduction of feline 195

cells, for the first time as cellular model, aiming at the study of the enteric cycle of T. 196

gondii. 197

Another boarding explored in this work was the vacuole parasitophoros biogenesis 198

during the interaction of bradizoites of T. gondii with FEIC. The study it demonstrated 199

that aniônicos sites of the membrane of CEIF revelated with particles FC had not 200

been internalized together with bradizoites, being excluded of PVM composition. 201

These data are in agreement with previous assays using human endotelial umbilical 202

cells infected with taquizoites (Stumbo et al., 2002), but different of demonstrated for 203

135

(de Carvalho and de Souza, 1990). Where CF particles of surface of macrophages 204

was incorporated together with T. gondii during invasion These comments indicate 205

that host cells, phagocytes or not f, present different ways of anionic sites 206

internalization during the VP formation. This proposal has support in the previous 207

studies that they had described that some enzymes (de Carvalho and de Souza, 208

1989) or sugar residues (de Carvalho and de Souza, 1990; Pacheco-Soares and De 209

Souza, 2000) presents in the membrane of macrophages not located in the 210

membrane of T. gondii VP. Our experience demonstrates that the incorporation of 211

host cell membrane components is not determined by the infective stage of the 212

parasite, therefore resulted similar to that had been presented here has been gotten 213

during the infection of skeletal muscular cells with forms taquizoites (Barbosa, HS, 214

personal communication). 215

FEIC infecteded disclosed to the constant presence of host cell organelles in narrow 216

association to the vacuole parasitophoros membrane (VPM). The classic studies of 217

(Jones et al., 1972) describes that macrophages, only vacúolos contend T. gondii are 218

surrounded by mitochondrias and endoplasmatic reticulum (ER) (Sinai et al., 1997; 219

de Souza, 2005);. These data corroborate the images gotten in the present work, 220

showing the interior of VP total filled with NMN, the maintenance of the ER 221

association and mitochondria, lipidis indicates that these parasites were metabolically 222

active. The functional sign of these associations, in particular with ER seems to be 223

entailed to the significant increase of the VPM during the process of parasite 224

multiplication (Melo and de Souza, 1997; Sinai et al., 1997)Independent of the type 225

and origin of the cells, this association seems to be a process unchained molecularly 226

for the parasite, during its process of invasion. The high incidence of mitocôndrias 227

association and in particular with lipidics inclusions to the VP observed in our studies, 228

does not indicate that this association is accidental, as suggested for (Magno et al., 229

2005). We can foment this discussion, with the images illustrating the insertion many 230

times lipidics inclusions was observed in direct contact with the vacuolar matrix (Fig. 231

3 and 3). To understand this process, had been considered that membrane 232

associated with mitochondria (MAM) is mediated the ER association and the traffic of 233

lipids (Trotter and Voelker, 1994; Vance and Shiao, 1996). Thus sites of organelles 234

associates to the MVP could be a point of contact for the transference of great 235

amount of lipids, analogous way to the transference of phospholipids mediated for 236

MAM between the mitochondria and ER (Sinai and Joiner, 1997; Sinai et al., 1997). 237

136

They suggest that as T. gondii it is not capable to synthesize phosphatidilcolin and 238

this nutritional petition would have to be supplied by the host cell, with mitochondrial 239

participation and RER as sources for lipids or lipids precursors acquisition (Coppens 240

et al., 2000) demonstrated that T. gondii is depends on the host cell cholesterol 241

derived from LDL endocytosis and not from the endogenous synthesis. The studies 242

of the activity of acil-CoA: cholesterol aciltransferase (ACAT) an enzyme key for 243

homeostasis of intracellular cholesterol maintenance, through the cholesterol ester 244

formation (storaged in the form of lipids cytoplasmic inclusions) had demonstrated 245

that cholesterol ACAT and esters have a crucial function in the T. gondii response 246

(Sonda et al., 2001)This results allows to conclude that the association of host cell 247

organelles with the MVP, described in all cellular types investigated until the moment, 248

is independent of the infective form used (bradizoites or taquizotes), the cellular 249

origin or the cellular cycle that the parasite will go to follow (lytic cycle or 250

cistogenesis). The parasite demonstrates that use the same strategies to complete 251

its intracellular cycle, even though in felinos enterócitos, as presented here. 252

In the present study, one of the main morphologic pointers that the enteric cycle of T. 253

gondii it was really being reproduced in vitro, it was the extremely developed network 254

of membranous nanotubes (NMN). (Jones et al., 1972) observed the presence of this 255

net and later, the dense granules had been identified as organelle responsible for the 256

secretion of proteins that located in the interior of the PV, and associates to the NMN 257

as soon as the parasite is completely in the interior of vacúolo (Sibley et al., 1986; 258

Cesbron-Delauw, 1994). The functions of dense granules proteins had been not yet 259

elucidated, in part because absence of homology with proteins of known function. 260

Although this, some evidences suggest that the dense granules proteins (GRA) are 261

involved with the construction of the NMN (Sibley et al., 1995). The current 262

hypothesis if directs for the function of the NMN in the metabolic exchanges between 263

the parasite and the host cell, as well as in the transit of small molecules of host cell 264

citosol for the parasite or the exportation of proteins and/or lipids parasite for the 265

MVP and/or cell hostess (Mercier et al., 2005). The NMN is produced by the parasite 266

living immediately after the cellular invasion (Sibley et al., 1986), being absent in 267

dead or opsonized (Jones et al., 1972; Nichols and O'Connor, 1981). This data 268

confirm that the parasites identified in the interior of vacuoles in FEIC, would be 269

participating actively in the NMN formation. With base in images gotten for scanning 270

electronic microscopy. (Magno et al., 2005) had considered an alternative function for 271

137

the NMN, as structural support for the maintenance of the parasites during the 272

cellular multiplication in the rosette arrangement in the interior of vacuole 273

parasitophoros during MDCK cells infection with taquizoites. This proposal is 274

innovative, however in the specific case of FEIC interacting with bradizoites during 275

infection, the presence of only one parasite already presented developed NMN, what 276

it does not corroborate with this function structural mechanics. Another factor that do 277

not support the proposal presented by (Magno et al., 2005)is the absence of rosettes 278

during the proliferation in the enteric cycle of the parasite. In recent revision, (Mercier 279

et al., 2005) considers that the conserved expression of proteins of dense granules in 280

all the periods of stages of the parasite can be fundamental for the development of 281

cistogenesis. The first demonstration of the interaction of T. gondii and feline cells in 282

vitro infected with bradizoites coated with importance, even though to reevaluate the 283

proposal of (Mercier et al., 2005). The hypertrophy NMN in the PV described in FEIC, 284

does not have precedent in other mammal cellular model studied. This way we can 285

speculate that this only characteristic would indicate a bigger activity of secretion of 286

dense granules for the induction of the sexual cycle of the parasite in the feline 287

intestine. 288

The ultra-structural observation of FEIC cultures from the relationship 1:20 (parasite-289

host cell) with bradyzoites revealed morphological characteristics decidedly different 290

from that described in other cell types like: (i) vacuoles containing only one parasite 291

within a vacuolar matrix full of network membranous nanotubes (NMN) well 292

developed, indicating metabolic changes occurring on the matrix. This finding is a 293

strong indication that signal or modulation molecular is beginning to trigger the 294

differentiation of bradyzoites / schizont type A to type B, as was recently described in 295

the cat intestine of in vivo, 3-6 days post-infection (Speer and Dubey, 2005). This 296

feature can really represent the first disclosure of reproducibility of the enteric cycle 297

of T. gondii in vitro (ii) vacuoles containing more than two parasites (indicative of cell 298

proliferation) with the maintenance of intense network membranous nanotubes 299

(NMN), suggest the establishment of schizont type B, in vitro, (iii) vacuoles containing 300

parasites in proliferation by asynchronous endodiogeny which is observed during 301

asexual stage of sexual cycle (Hu et al., 2002) and tissue cysts, but with reduced 302

NMN, suggest that changes are occurring in the vacuolar matrix may be related to 303

the differentiation of schizonts type B to type C, (iv) large vacuoles, containing 304

reproduction characteristic of process by endopoligeny, may represent stages 305

138

precursors of gametogenesis such as the schizont type E. This hypothesis is 306

supported by morphological characteristics of this structure showing disorganization, 307

lipid bodies and residual body in cellular organelles, in agreement with the studies of 308

the development of the enteroephitelial stages of T. gondii in the cat intestine in vivo, 309

developed by (Speer and Dubey, 2005), (v) presence of structures like 310

macrogametas (Ferguson et al., 1974; Ferguson et al., 1975; Ferguson, 2004); 311

Speer and Dubey, 2005) indicate that gametogenesis was established in vitro. The 312

morphological characteristics that support this hypothesis is based on the dimensions 313

of the structure, the internal membranar complex, granular nucleus, cytoplasmic 314

structures similar to the wall forming bodies, dense granules, amylopectin granules 315

and mitochondria. 316

The experimental strategies implemented in this work reproduced in vitro the natural 317

microenvironment established during development of the parasite in the definitive 318

host intestines, the domestic cat. The introduction of feline epithelial intestinal as 319

cellular model employed in this study showed that potentially can contribute new 320

subsidies on the cell biology of the parasite. In another instance, the FEIC is 321

alternative methodology for better understanding the enteric cycle T. gondii under 322

controlled conditions, open field for investigation into the molecular aspects of this 323

interaction that can contribute for example, the developing a new strategies aimed at 324

intervention in one of the main routes of spread of toxoplasmosis 325

326

139

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142

Figure 1: Formation of schizonts precursors of enteroephitelial stages of Toxoplasma gondii in

vitro after 6 d.p.i.. (A-C) PV flabby, full of network of membranous nanotubes. (NMN). Note the

vacuole parasithophoros membrane (VPM) associate to endoplasmtic reticulum (ER) profile,

mitochondria (Mi) end lipids (Li); (B) Detail of morphologic characteristic of PV presenting developed

NMN; (C) PV I contend a parasite with NMN and strict association of ER to the MVP; (D) The posterior

region of the parasite showing the internal membranar complex (IMC) undulating; (E) Detail of the

association of Lipids (Li) and ER to the VPV. [Bar 500nm]

Figure 2: Parasites on asynchronous endodiogeny. (A) VP contends five parasites (P) on division

into PV full of NMN with association of ER and Li to MVP. (B) Onother cell showed uneven number of

parasites into VP (n=9) indicate asynchronous division; (C) Longitudinal cut of PV flabby, full NMN

contend five parasites (n=5). [Bar 500nm]

Figure 3: morphological different types of Toxoplasma gondii in CEIF with 6 dpi, (A) PV and

MVP, containing fell NMN, associate with the RE, Mi and. Merozoites showing dense granules (DG),

decentralized nucleus (N) with clusters of chromatin (Nu), typical mitochondria (Mi) and eletrondense

(Mie) and labirinte rhoptris (Ro1), (B) PV containing NMN and merozoites presenting GD, micronemes

(Mn), Mi and Mie and decentralized nucleus. (C) Merozoit with GD, eletromdense rhoptris (Ro2) and

IMC. In detail (head of arrow) there is body lipid in direct contact with the vacuolar matrix. (D) PV

containing four merozoites, presence of NMN, surrounded by ER. (E) VP with NMN distributed in

vacuolar matrix. RE and Li remains associated with the PVM. [Bar 500nm]

Figure 4: Types of morphological Toxoplasma gondii, (A) schizonts on endopoligeny. The

merozoítes presenting large lipid bodies in the residual bodies (RB) contains organelles as GD, Am

Mi, (C-D) forms like to macrogamontes, associated with Li The parasites have The parasites have

granular nucleus (N), wall forming bodies (WB), Go, E, and IMC Am. [Bar 500nm]

Figure 5: FEIC incubated with CF and infected with bradizoitos of Toxoplasma gondii for 12h.

(A), FC particles are not seen in the membrane parasitophoro vacuole (PVM). (B) Absence of particles

of CF in PVM showing endossomes with FC (head of arrow) in the cytoplasm of FEIC, (C) Details PV

of Figure A. (N) nucleus of the parasite, (Nu) nucleolus; Mi, Golgi complex (Go); Am; host cell nucleus

(NCH). [Bar 500nm]

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FIGURE 1

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FIGURE 2

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FIGURE 3

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FIGURE 4

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FIGURE 5

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