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ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS
DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA
PRESSORA CAUDAL
Marcio Vinicius Moreira Vianna
Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, setembro de 2007.
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ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS
DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA
PRESSORA CAUDAL.
Marcio Vinicius Moreira Vianna
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 18/09/2007 por:
___________________________________________________
Prof. Dr. Henrique de Azevedo Futuro Neto - Orientador, UFES.
_____________________________________________
Prof. Dr. Nyam Florencio da Silva – Co-orientador, UFES.
_______________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Maria das Graças Corrêa de Faria, EMESCAM.
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, setembro de 2007.
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Vianna, Marcio Vinicius Moreira, 1976.
Estudo das projeções neuroanatômicas dos núcleos caudais da rafe para a área
pressora caudal. [Vitória] 2007
Viii, 71p., 29,7 cm (UFES, M. Sc., Ciências Fisiológicas, 2007)
Dissertação, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF.
Agradeço a Deus, por ser a fonte de
minhas forças nos momentos mais difíceis.
E dedico este trabalho a minha mãe Olga
Moreira Vianna, a memória de meu pai
Dirley Rody Vianna, minha irmã Márcia e
minhas sobrinhas, que através do amor e
carinho, me incentivaram e me apoiaram
na busca do meu crescimento pessoal e
profissional.
AGRADECIMENTOS
A Deus por sua proteção divina em cada momento de minha vida.
A minha mãe Olga Moreira Vianna, que sempre me apoiou e incentivou, e que
sempre acreditou em mim, fazendo-me crer na minha capacidade e competência.
Agradeço minha irmã Márcia Moreira Vianna da Costa que, apesar da distância que
nos separa, esteve presente nas decisões mais importantes da minha vida. Sempre
com amizade e carinho com seu irmão que tanto te ama.
Ao Prof. Henrique de Azevedo Futuro Neto, ao qual admiro por sua competência e
amizade, e pela oportunidade para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. José Guilherme Pinheiro Pires, pelo seu apoio e amizade, e pela atenção
demonstrada sempre que sua ajuda era solicitada, sendo no desenvolvimento deste
trabalho ou não.
Ao Prof. Nyam Florencio da Silva, companheiro de Laboratório, pela valiosa
colaboração na realização deste trabalho e por superar minhas “teimosias” com
paciência e respeito, sendo capaz de me orientar tanto nos assuntos profissionais
quanto em questões pessoais que levarei comigo por toda a minha vida.
Aos amigos do laboratório de Neurofisiologia com os quais passei importantes
momentos de alegria e descontração e, pela confiança e compreensão que recebi
de cada um.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas,
pela orientação e incentivo dedicado aos alunos, determinando uma boa formação.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação, amigos, colaborando para o êxito
deste trabalho.
SUMÁRIO
• FOLHA DE ROSTO i
• FICHA CATALOGRÁFICA ii
• DEDICATÓRIA iii
• AGRADECIMENTOS iv
• SUMÁRIO v
• RESUMO vi
• ABSTRACT viii
• INTRODUÇÃO 10
• 1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM) 11
• 1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM) 13
• 1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA) 14
• 1.4 NÚCLEOS DA RAFE 16
• 1.5 DESCRIÇÃO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO COM HORSERADISH
PEROXIDASE (HRP) 25
• 2. OBJETIVOS 27
• 2.1. OBJETIVO GERAL 27
• 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27
• 3. MATERIAL E MÉTODOS 28
• 4. RESULTADOS 32
•
••
• 5. DISCUSSÃO 45
•
••
• 6. CONCLUSÃO 51
•
••
• 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFIAS 53
RESUMO
ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS DOS NÚCLEOS CAUDAIS
DA RAFE PARA A ÁREA PRESSORA CAUDAL BULBAR.
Objetivos: Estudos prévios demonstram que as respostas cardiovasculares
induzidas por estimulação de núcleos caudais da rafe são em parte mediadas pela
área pressora caudal (CPA). O presente estudo visa identificar a existência de
projeções eferentes dos núcleos caudais da rafe; Magno (RMg), Pálido (RPa) e
Obscuro (NRO), para a CPA.
Métodos: Seis ratos Wistar machos (270-300 g), anestesiados com cloral hidratado
(0,4g/kg, i.p.), foram posicionados no aparelho estereotáxico para microinjeções
unilaterais na CPA (1,0mm caudal e 1,7mm lateral ao óbex; 2,0mm da superfície
encefálica) do traçador axonal retrogrado horseradish peroxidase (HRP; 20%;
dissolvido em salina; 50nl). Os animais foram mantidos vivos durante dois a três
dias, tempo necessário para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do
traçador. Em seguida os ratos foram profundamente anestesiados e perfundidos
transcardiacamente com 500 ml de solução salina; 500 ml de paraformaldeido 1% e
glutaraldeído 1,25% em tampão fosfato 0,1M (pH 7,6). O tronco cerebral foi retirado
e seccionado (micrótomo de congelamento) com uma espessura de 40 µm e tratado
com Diaminobenzidina a 0,05%. Esta reação promoveu uma coloração marrom no
pericário dos neurônios marcados. As secções foram coradas com vermelho neutro
e os neurônios marcados visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo
suas coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e
Watson, Acadamic Press, 1986).
Resultados: Foram encontrados neurônios marcados em todos os três núcleos da
rafe caudal. A distribuição dos neurônios marcados nos 6 ratos estudados foi a
seguinte:
No RMg foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 2 e 3. Totalizando 10
neurônios marcados.
No RPa foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 3, 4 e 5. Totalizando 14
neurônios marcados nestes animais.
No NRO foram visto neurônios marcados nos ratos 2, 3, 4, 5 e 6. Totalizando 11
neurônios marcados.
No RMg, os neurônios marcados estavam situados de -11,30 mm a -11,60 mm
caudal ao Bregma (10 neurônios), estando a maioria (7 neurônios) em -11,60 mm,
com profundidade entre 10,4 mm e 10,7 mm da superfície externa do crânio. O RMg
foi a região de menor dispersão dos neurônios marcados rostro-caudalmente, visto
que num total de 10 neurônios marcados, 7 estavam a -11,60 mm caudais ao
Bregma. No RPa os neurônios foram encontrados entre -11,30 mm e -12,80 mm
caudal (14 neurônios), com profundidade de 10,8 mm a 11,1 mm, estando o maior
numero a -11,60 do Bregma (5 neurônios). No NRO os neurônios foram marcados
entre -11,60 mm a -12,72 mm caudal ao Bregma (11neurônios), 8 destes entre
-11,60 mm e -11,80 mm, e profundidade variando entre 10,0 mm a 10,8 mm dorso-
ventral. Apenas um neurônio foi encontrado na profundidade de 10,8 mm no NRO a
-11,96 mm do Bregma.
Conclusão: O estudo demonstra a presença de projeções eferentes
monossinapticas dos núcleos RMg, NRO e RPa para a CPA. E que a grande maioria
destas projeções, possuem suas origens entre -11,60 mm a -11,80 mm do Bregma.
Com base nestas evidencias é possível sugerir que estas projeções estejam
relacionadas, pelo menos em parte, com o controle das atividades cardiovasculares
em ratos.
ABSTRACT
NEUROANATOMICAL PROJECTIONS FROM THE CAUDAL RAPHE NUCLEI TO
THE CAUDAL PRESSOR AREA IN THE RAT
Objective: Previous studies have shown that cardiovascular effects induced by
stimulation of caudal raphe nuclei are partially mediated by the caudal pressor area
(CPA). The present study demonstrates the existence of projections from the magnus
(RMg), pallidus (RPa) and obscurus (ROb) raphe nuclei to the CPA.
Methods and Results: 6 Male Wistar rats (270-300 g), anesthetized with chloral
hydrate (0.04 g/kg, i.p.), were put in the estereotaxic set for unilateral microinjections
of horseradish peroxidase (HRP) into the CPA (1.0 mm caudal and 1.7 mm lateral to
the Óbex; 2.0 mm from brain surface). HRP, an retrograde axonal tracer, was
dissolved in saline to 20% and the microinjection volume was 50 nL. The animals
were kept alive for 2-3 days, to allow the intraneuronal retrograde diffusion of the
tracer. The rats were deeply anesthetized and perfused through the left ventricle with
500 mL saline + 500 mL paraformaldehyde 1% plus glutaraldehyde 1.25% in
phosphate tampão 0.1 M (pH 7.6). The brainstem was taken out and sectioned
(freezing microtome) with a thickness of 40 µm and treated with diaminobenzydine
0.05%. This reaction promoted a brown color in the pericarium of the marked
neurons. The sections have been colored with neutral red and the marked neurons
were visualized by optical microscopy. The coordinates were according to the
estereotaxic atlas of Paxinos and Watson. Marked neurons have been found in all
three studied raphe nuclei. In a total of 6 rats, 3 showed markings in the RMg, 4 in
the RPa and 5 in the ROb. In the RMg, the marked neurons were allocated from
-11.30 mm to -11.60 mm caudal to Bregma (10 neurons), being most (7 neurons) in
-11.60 mm, with depth between 10.4 mm and 10.7 mm of the external brain surface.
The RMg has been the region of smaller dispersion of the neurons rostro-caudally
marked, once in a total of 10 neurons marked, 7 were -11.60 mm caudal to the
Bregma. In the RPa the neurons have been found between -11.30 mm and -12.80
mm caudal (14 neurons), with profundity from 10.80 mm to 11.1 mm, being the
biggest number -11.60 mm of the Bregma (5 neurons). In the ROb the neurons
have been marked between -11.60 mm and -12.72 mm caudal to Bregma
(11 neurons), 8 of them between -11.60 mm and -11.80 mm and depth varying from
10.0 mm to 10.80 mm ventral-dorsally.
Conclusion: The study shows the presence of efferent projections from the nuclei
RMg, ROb and RPa to the PCA. Based on these evidences it is possible to suggest
that these projections were related to the cardiovascular effects elicited by stimulation
of these caudal raphe nuclei in rats.
10
1. INTRODUÇÃO
A perfusão sanguínea apropriada é garantida pela manutenção da força
motriz da circulação, ou seja, a pressão arterial em níveis adequados e
razoavelmente constantes ao longo da vida. Desde o final do século XIX, busca-se
demonstrar a localização da(s) estrutura(s) neurais responsáveis pelo controle
cardiovascular e conseqüentemente a manutenção adequada da pressão arterial. Ao
constatar que secção da porção cervical da medula espinhal promovia uma resposta
depressora nos parâmetros cardiovasculares, Claude Bernard em 1863 (apud
Gebber, 1990) relatou a importância do sistema nervoso central no controle
cardiovascular.
Entretanto, somente dez anos depois, Dittmar em 1873 (apud Gebber, 1990)
realizando experimentos com transecções coronais sucessivas do eixo neural,
conseguiu demonstrar pela primeira vez, a participação do bulbo na manutenção da
pressão arterial (PA). Realizando transecções do tronco cerebral em níveis
sucessivamente mais caudais em coelhos curarizados, Dittmar observou que a
integridade do bulbo era fundamental para manutenção PA. Além disso, demonstrou
ainda que a destruição da região ventral bulbar era capaz de produzir hipotensão
arterial, e que o mesmo não ocorria quando se destruía a região dorsal do bulbo.
Estes achados sugeriam que as estruturas responsáveis pela manutenção da PA
estavam localizadas na face ventral do bulbo introduzindo, na época, o conceito de
centro vasomotor.
Em 1901, Bayliss, lançou a hipótese da existência de um centro vasomotor,
constituído de áreas pressoras e depressoras que atuariam reciprocamente na
manutenção da PA. Wang & Ranson (1939), com o advento da técnica
estereotáxica, identificaram regiões pressoras e depressoras, esparsamente
situadas em toda formação reticular bulbar, que se estendiam desde a região dorsal
até a ventral do bulbo, resultado posteriormente confirmado por Alexander (1946).
Tais resultados, no entanto, foram obtidos através de estimulação elétrica,
que interferem não somente em corpos celulares como também em fibras de
passagem, não sendo possível, portanto, a afirmação que os neurônios
responsáveis pela manutenção e regulação da PA estavam realmente localizados
nas regiões onde a estimulação havia sido efetuada.
11
Schlaefhe & Loeschke em 1967, estudando o controle da respiração realizado
através da participação do bulbo, observaram que o congelamento de áreas
bastante restritas da superfície ventral bulbar produzia não somente alterações
respiratórias, como também queda da PA. Entretanto, a utilização do congelamento
nestes experimentos não permitiu ainda concluir se a hipotensão observada era
resultante da inativação de células ou de fibras de passagem.
Graças aos experimentos pioneiros de Feldberg & Guertzenstein em 1972,
onde, utilizando substâncias que atuam preferencialmente em corpos celulares
neuronais (não interferem nas fibras de passagem), foi possível observar alterações
da pressão arterial nas áreas descritas anteriormente por Schlaefke & Loeschke.
Estes autores demonstraram que a aplicação de pentobarbital sódico, GABA (ácido
gama-aminobutírico) e glicina, em uma região bastante delimitada da superfície
ventrolateral do bulbo de gatos, produzia queda da PA a níveis semelhantes ao
observados em animais espinais agudos. Tendo a glicina e o GABA uma ação pós-
sináptica, a hipotensão observada durante a aplicação tópica desses aminoácidos
na região rostroventrolateral do bulbo indicava que as células responsáveis pela
manutenção da PA estavam situadas nesta região. Guertzenstein (1973)
demonstrou também que a aplicação de drogas excitatórias como o leptazol e
estricnina nos mesmos sítios produziam aumento da PA.
1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM):
Está região, atualmente conhecida como área rostroventrolateral bulbar (RVLM,
rostroventrolateral medulla), foi caracterizada funcionalmente por Feldberg e
Guertzenstein (1972) e Guertzenstein (1973), localiza-se em uma área restrita,
caudal aos corpos trapezóides e bilaterais à linha média na superfície ventral do
bulbo.
A partir destes estudos, diversos grupos de pesquisadores começaram a
desenvolver pesquisas, buscando entender a participação do RVLM na geração e
manutenção da atividade cardiovascular e as possíveis conexões desta área para
outros centros moduladores da atividade autonômica em diversas espécies.
Posteriormente foi demonstrado que neurônios adrenérgicos do RVLM exerciam
influência excitatória sobre as fibras simpáticas vasomotoras (Ross et al., 1984;
12
Schreihofer et al., 2000). Em ratos, a microinjeção de glutamato (L-Glu) nesta região,
é capaz de evocar respostas pressoras e taquicárdicas (Willette et al., 1982).
A atividade tônica do RVLM foi ainda avaliada em estudos eletrofisiológicos,
onde era possível registrar a atividade espontânea de neurônios do RVLM ou as
modificações em sua atividade pela modificação dos níveis pressóricos (Brown &
Guyenet, 1985; Campos Jr. & McAllen, 1999).
Outros pesquisadores relataram que a inibição do RVLM causava significativa
queda na pressão arterial, demonstrando mais uma vez, como sugerido por
Guertzenstein (1973), a participação desta estrutura no controle tônico da pressão
arterial (Ross et al., 1983; Ruggiero et al., 1985; Guyenet, 1990; Dampney, 1994;
Gordon & Sved, 2002).
Os axônios da maioria dos neurônios do RVLM projetam-se diretamente para a
medula espinhal, em especial para a coluna IML, onde exercem importante
influência tônica sobre os neurônios pré-ganglionares simpáticos (Amendt et al.,
1978; Blessing et al., 1981; Ross et al., 1984; Milner et al., 1988; Jansen et al.,
1995a). Acredita-se que a atividade tônica simpática seja dependente de neurônios
glutamatérgicos. Tais conclusões provêm de estudos, que demonstraram que a
reposta à estimulação elétrica ou química da RVLM era abolida quando se aplicava
antagonista de receptores glutamatérgicos na medula espinhal (Mills et al., 1988;
Bazil & Gordon, 1991, 1993).
Desta forma, o RVLM pode ser considerado um importante centro gerador e
uma estação sináptica para vias descendentes de diferentes respostas autonômicas
(Guertzenstein & Silver, 1974), para respostas viscerais de alerta (Guertzenstein et
al., 1977; McAllen, 1984), para o reflexo baroreceptor (McKitrick & Calaresu, 1996;
Schreihofer & Guynet, 2002) e para a resposta pressora do núcleo fastigial (Chida et
al., 1990). A RVLM é tida como via comum nos ajustes cardiovasculares, pois sua
inibição bloqueia uma série de respostas cardiovasculares centralmente mediadas,
como: as respostas cardiovasculares típicas do comportamento de alerta e a
resposta pressora à estimulação elétrica de núcleos da rafe bulbares (Hilton et al.,
1983; Chida et al., 1990; Campos Jr et al., 1993; Silva et al., 2002).
Diferentes tipos e subtipos de receptores são citados na literatura científica,
atuando na modulação dos neurônios pré-ganglionares simpáticos no RVLM, dentre
os quais vale citar os receptores de endotelina (Mosqueta-Garcia et al., 1995; Ouchi
et al, 1989), aminoácidos excitatórios (Tingley et al., 1990; Hay et al., 1999; Sapru,
13
2002; Sved et al., 2002) e aminoácidos inibitórios (Willette et al., 1984; Araújo et al.,
1999). Adicionalmente, receptores opióides podem ser encontrados em células pré e
pós-sinápticas do RVLM, sendo ativados por hipotensão hemorrágica (Guyenet,
2000; Aicher, 2001; Guyenet et al., 2002) e modulando respostas cardiovasculares à
estimulação muscular (Caringi et al., 1998; Ally et al., 2002).
1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM):
Estes autores, Feldberg & Guertzenstein em 1976, também demonstraram uma
região da superfície ventral bulbar, localizada entre o núcleo ambíguo e o núcleo
reticular lateral (Willette et al., 1983; Li & Blessing, 1990; Masuda et al., 1991), hoje
conhecida como CVLM (Caudal ventrolateral medulla), que quando estimulada pela
nicotina apresentava uma resposta hipotensora. O CVLM é, assim, considerado um
centro simpatoinibitório que contribui para a manutenção da pressão arterial em
níveis normais (Willette et al., 1983; Chalmers & Pilowsky, 1991; Blessing, 1991;
Cravo & Morrison, 1993; Aicher et al., 2000; Schreihofer & Guyenet, 2002).
Estudos das vias neurais relacionadas com o CVLM, com a aplicação de
marcadores anterógrados (biocitina) e retrógrados (horseradish peroxidase)
confirmaram que as células A1 das conexões do CVLM para o RVLM, provenientes
do NTS (Aicher et al., 1995), estão envolvidas no barorreflexo e, por conseguinte, na
modulação do controle tônico da pressão arterial (Cravo et al., 1991; 1993).
Projeções descendentes de diferentes áreas do hipotálamo (Saper et al., 1976;
Badoer et al., 1993; Lovick, 1993), córtex (Ally, 1998) e diversas outras áreas
(Ciriello et al., 1986; Krukoff et al., 1993; Ally et al., 2002) também podem modular a
atividade dos neurônios do CVLM, responsáveis pelo controle tônico da pressão
arterial, modificando a atividade simpática em situações de estresse, contração
muscular e outros estímulos comportamentais.
Dentre as muitas funções fisiológicas atribuídas ao CVLM está a modulação do
arco reflexo ativado pelos baroreceptores (Jeske et al., 1993; Dampney, 1994;
Spyer, 1994; Aicher et al., 2000) e pelo reflexo de Bezold-Jarisch, estimulado por
quimiorreceptores (Vardhan et al., 1993; Gireoba et al., 1995). Estes reflexos,
quando ativados perifericamente, causam primeiramente a liberação de aminoácidos
excitatórios em sinapses de neurônios no NTS (Vardhan et al., 1993; Sved &
14
Gordon, 1994; Ohta et al., 1996; Sapru, 2002), ativando neurônios glutamatérgicos
que se projetam monossinapticamente para o CVLM (Urbanski & Sapru, 1988;
Aicher et al., 1995; Gordon & Sved, 2002). Do CVLM, saem neurônios gabaérgicos
responsáveis pela modulação da atividade das células pré-ganglionares simpáticas
do RVLM (Willette et al., 1984; Sun & Guyenet, 1986; Blessing & Li, 1989; Sapru,
2002), sem, no entanto, projetar-se diretamente para a medula espinhal (Loewi &
McKellar, S., 1981; Ross et al., 1984; Jansen et al., 1995; Gordon & Sved, 2002).
Adicionalmente, existem projeções diretas do CVLM para o núcleo ambíguo
(McKitrick & Calaresu, 1997), que participam do controle da atividade parassimpática
para o coração, demonstrando que as conexões do CVLM não se limitam ao RVLM.
Conexões da área cinzenta periaquedutal para o CVLM (Hilton, 1975; Chen &
Aston-Jones, 1996), podem, por sua vez, estar envolvidas na modulação das
respostas cardiorrespiratórias evocadas por alterações comportamentais de luta e
fuga.
1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA):
Esta região situada caudal a CVLM na transição bulbo-espinal, com atividade
pressora semelhante a RVLM foi descoberta em animais profundamente
anestesiados após a aplicação tópica de leptazol na superfície ventral caudal bulbar
de gatos (Feldberg & Guertzenstein, 1986). Estes autores propuseram uma relação
funcional entre esta área, conhecida como área pressora caudal (CPA) e o RVLM,
uma vez que as respostas hipertensoras produzidas após a aplicação tópica de
leptazol na CPA não ocorriam durante a inibição com injeção de pentobarbital sódico
previamente na RVLM.
Os primeiros a estudarem esta região mais caudal na superfície bulbar de
ratos foram Gordon & McCam em 1988. Seus achados confirmaram o trabalho de
Fedberg & Guertzestein 1986, pois em seus resultados estes autores encontraram
uma resposta hipertensora após a aplicação de glutamato nesta mesma região
caudal a CVLM, além de demonstrarem que esta resposta era abolida tanto pela
inibição do RVLM quanto por bloqueio ganglionar, demonstrando que a elevação da
pressão arterial era obtida via aumento da atividade simpática. Estas observações
15
foram confirmadas por Campos Jr. & McAllen (1999), com o registro unitário da
atividade elétrica de células da RVLM, acompanhado da estimulação ou inibição da
CPA. Neste trabalho, ficou comprovado que as variações da CPA alteram a
freqüência de despolarização das células pré-ganglionares simpáticas responsáveis
pela manutenção do tono vasomotor simpático. Recentemente foi proposto que as
vias da CPA para o RVLM envolvem uma ativação de neurônios simpatoexcitatorios
glutamatérgicos na vizinhança da CVLM (Natarajan & norrison, 2000).
Silva (2001) obteve respostas hipertensoras semelhantes às descritas acima
com a aplicação tópica de glutamato na CPA, porem, seus experimentos foram
realizados com animais acordados eliminando assim qualquer influencia que os
anestésicos pudessem causar.
A localização da CPA foi relatada no trabalho de Sun & Panneton em 2002,
através de um mapeamento com a utilização de microinjeções de glutamato na
superfície ventral bulbar, na qual definiram que a CPA está situada em uma região
lateral ao ponto mais caudal do núcleo reticular lateral e ventromedial ao corno
dorsal bulbar no nível da ducussação das pirâmides. Estes autores confirmaram a
existência das projeções da CPA tanto para o RVLM quanto para a CVLM. Horiuchi
& Dampney (2002) propuseram a desinibição indireta dos neurônios
simpatoexcitatórios do RVLM pela CPA, de acordo com o seguinte modelo:
neurônios inibitórios da CPA fariam conexões com neurônios inibitórios da CVLM e
interneuronios inibitórios no proprio RVLM. Desta forma, quando ativada, a CPA
atuaria retirando os potenciais inibitórios sobre o RVLM, aumentando a atividade
pré-ganglionar simpática (figura 1). Entretanto, ainda faltam informações a respeito
de quais as regiões enviam suas eferências para CPA e participam de sua
modulação no controle neural da pressão arterial.
16
Figura 1. RVLM, bulbo rostroventrolateral; CVLM, bulbo caudoventrolateral; CPA, área pressora
caudal; IML, coluna intermediolateral; NTS, núcleo do trato solitário; NCR, Núcleos caudais da rafe.
Figura modificada de Horiuchi & Dampney (2002).
Silva, 2002 demonstrou que o bloqueio dos receptores aminoácido excitatório
feito pelo ácido quinurênico dentro da CPA reduz a pressão arterial e a freqüência
cardíaca, além de praticamente abolir a resposta pressora gerada pela estimulação
do núcleo da rafe obscuro, demonstrando uma suposta projeção eferente entre um
dos importantes núcleos caudais da rafe com a CPA.
1.4 NÚCLEOS DA RAFE:
Além dessas três áreas relevantes no controle cardiovascular, sabe-se que os
núcleos da rafe são de extrema importância no controle da PA (Coote, 1990). Este
termo “núcleos da rafe” indica grupos de neurônios localizados na região
mediossagital do tronco encefálico, que possui um aspecto morfológico de linha ou
sutura, e se estendem desde a parte caudal do bulbo até o mesencéfalo, passando
pela ponte. Esses grupos de neurônios estão organizados de formas distintas em
Inibitório
Excitatório
CPA
17
dois blocos, o rostral (constituído pelos núcleos linear rostral, linear intermédio,
dorsal, mediano e pontino) e o caudal, que se encontram situados na região bulbar
(constituído pelos núcleos magno, obscuro e pálido) (Brodal et al., 1960
a, b), (fig. 2).
Os núcleos da rafe contêm a maior densidade de neurônios serotonérgicos do
sistema nervoso central (Jacobs et al., 2002), fato este que foi inicialmente
observado por Dahlstrom e Fuxe em 1964. Foram descritos sete tipos de receptores
para serotonina (5-HT1 - 5-HT7) e seus subtipos 5-HT1A-1F (exceto 5-HT1C) e 5-
HT1P, 5-HT2A-2C, 5-HT3A-3E, 5-HT4A-4D, 5-HT5A-5B (Côté et al., 2004), que
podem ser encontrados em diversas regiões do sistema nervoso central (Siegel et
al., 1999) ou em tecidos periféricos (Futuro-Neto et al., 1993). Apesar de a
serotonina ser o principal neurotransmissor, existem outros tipos, tais como, as
encefalinas (Bowker et al., 1983; Milhorn et al., 1989), GABA (McCall et al., 1988),
catecolaminas, neuropeptídeos e acetilcolina (Bowker et al., 1983; Fort et al. 1989,
1990; Li et al., 1996; Parent, 1996), que podem ser expressos isoladamente ou em
associação com a serotonina (Bowker et al., 1983; Kachidian et al., 1991; Stamp e
Semba, 1995).
Essa gama de neurotransmissores, adicionada ao fato de que existem vários
subtipos de receptores para serotonina, sugere a participação dos núcleos da rafe
em diferentes atividades fisiológicas, tais como termorregulação (Arancibia et al.,
1996), modulação do sistema digestivo (Ribeiro do Vale, 1997), respiração (Gilbey et
al., 1995), regulação cardiovascular (Coote, 1990) e ciclo sono-vigília (Jacobs &
Fornal, 1991). Como previamente dito, esses núcleos estão agrupados em dois
blocos distintos: o rostral e o caudal. Essa não é simplesmente uma conveniência
anatômica, mas uma classificação morfofuncional que deriva de projeções eferentes
diferentes (Jacobs et al., 2002).
GRUPO ROSTRAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:
O grupo rostral dos núcleos da rafe compreende o núcleo linear rostral, linear
intermédio, dorsal, mediano ou central superior e núcleo pontino da rafe (Brodal et
al., 1960
a, b). Os neurônios destes núcleos localizam-se principalmente na sua
parte central, porém aqueles situados à margem, fundem-se com outros
grupamentos nervosos, dificultando, a exata delimitação lateral (Taber et al., 1960).
18
Esses núcleos do grupo rostral são formados principalmente por neurônios de
tamanho médio, fusiformes, com dendritos de orientação dorso-ventral (Zagon,
1993), que se projetam para áreas suprassegmentares (Brodal et al., 1960 a, b).
Dentre suas projeções, podemos citar o hipotálamo e o núcleo amigdalóide
(Sawchenko et al., 1983), projeções do núcleo pontino para o cerebelo (Taber et al.,
1960), para o córtex frontal (Graeff et al., 1996), além de projeções para a
substância cinzenta periaquedutal (PAG), hipocampo e gânglios da base (Compan
et al. 1996).
Figura 2. Organização anatômica (esquema) dos núcleos da rafe e das projeções serotoninérgicas
no cérebro de um rato (vista lateral). O maior número de projeções desses núcleos (em azul) parte:
dos núcleos caudais (magno, pálido e obscuro) para a medula espinhal, do núcleo pontino para o
cerebelo e dos núcleos rostrais (mediano, paramediano, dorsal e linear) para o prosencéfalo, e há um
feixe dorsal específico (em vermelho) que vai dos núcleos mediano e dorsal para o prosencéfalo.
GRUPO CAUDAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:
O grupo caudal é constituído pelos núcleos rafe magno (RMg), rafe obscuro
(NRO) e rafe pálido (RPa) com disposição rostral, mediana e caudal no bulbo,
respectivamente. Os neurônios dos núcleos bulbares da rafe são fusiformes,
triangulares, quadripolares e às vezes piriformes, com dendritos uni, bi ou
19
multipolares, de orientação dorso-ventral (Zagon, 1993). Suas projeções evidenciam
uma rede interneural complexa, com ligações tanto para a medula espinhal quanto
para centros supramedulares (Jacobs et al., 2002). Brodal et al. (1960 a, b), através
de secções obtidas na medula espinhal e tronco cerebral de gato, provocaram
degeneração neuronais nos núcleos da rafe. Dähsltrom & Fluxe (1965), combinando
a técnica de secção da medula com a de fluorescência em ratos, demonstraram a
participação dos núcleos caudais nas eferências noradrenérgicas e serotonérgicas
para a medula espinhal, confirmando assim os resultados de Brodal et al. (1960a, b)
no gato. Demonstraram ainda que a maioria das eferências dos núcleos caudais é
enviada para a medula espinhal, enquanto que os neurônios dos demais núcleos
suprasegmentares projetam seus axônios principalmente para as regiões cerebrais
superiores.
Outros pesquisadores também identificaram importantes projeções de
neurônios serotonérgicos dos núcleos bulbares para o corno dorsal e para a coluna
intermédio-lateral da medula espinhal (IML) (Loewy, 1981; Loewy & Mckella, 1981;
Bacon et al., 1990; Gilbey et al., 1995), fazendo sinapse, respectivamente, com
neurônios da lâmina I, II e V e com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos
(Amendt et al., 1978, 1979; Antal et al., 1996; Li et al., 1996). A conexão dos núcleos
bulbares da rafe com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula
espinhal, fornece a base anatômica de sua participação na regulação simpática
(Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997). Por outro lado,
a importância de cada um dos núcleos bulbares da rafe no controle e modulações de
vários componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas conexões
suprassegmentares. Sim & Joseph (1992); Lovick (1993a, b); Hudson & Lumb
(1996), Lebars et al. (1980); Schenberg & Lovick (1995) observaram aferências e
eferências para áreas da PAG, que possivelmente estariam envolvidas em
mecanismos supraespinhais de modulação da nocicepção, analgesia e reação de
defesa.
Outros centros cerebrais que também enviam eferências para os núcleos
caudais da rafe são os núcleos paraventricular hipotalâmico, o núcleo pré-óptico
(Nogueira et al., 1996), a área bulbar rostroventrolateral (Zagon, 1995), o núcleo
amigdalóide e o hipotálamo posterior (Hermann et al., 1996). Estas e outras
conexões confirmam a implicação dos núcleos da rafe em processos de modulação
do sistema digestivo (Curzon, 1990; Krowicki & Hornby, 1996; Ribeiro do Valle,
20
1997), respiração (Hosogai et al., 1993; Gilbey et al., 1995; Al-Zubaid et al., 1996),
termorregulação (Aracibia et al., 1996), regulação cardiovascular (Coote, 1990;
Saxena & Villalón, 1990), ciclo sono-vigília (Jouvet, 1967; Dugovic et al., 1989),
atividade da musculatura mastigatória (Ribeiro do Valle, 1997) e em ritmos
circadianos (Morin et al., 1990).
NÚCLEO RAFE MAGNO (NRg):
Este grupo pode ser considerado como um prolongamento rostral da porção
ventral do núcleo rafe obscuro, sua parte rostral estende-se para o nível do pólo
rostral da oliva superior e a região ventral faz limite com a margem do corpo
trapezóide, enquanto a região dorsal apresenta limitações arbitrárias com as bordas
laterais do núcleo pontino da rafe. Em cortes sagitais, observa-se que dorsalmente o
núcleo apresenta-se mais afilado em sua trajetória compreendida entre o corpo
trapezóide e o teto do quarto ventrículo, o núcleo se torna bem mais desenvolvido a
partir da metade ventral desta trajetória. Apesar de apresentar bordas laterais pouco
definidas e citoarquitetura semelhante à formação reticular, a individualização do
núcleo rafe magno pode ser determinada pela organização de suas células, seus
neurônios apresentam-se em vários pontos densamente aglomerados (Taber et al.,
1960).
Utilizando a técnica de traçado anterógrado, Bacon et. al. (1990) demonstraram
que existe uma conexão monossináptica entre os núcleos magno e pálido da rafe e
os neurônios pré-ganglionares simpáticos que irão formar a inervação da adrenal,
demonstrando ainda que os neurônios do núcleo da rafe obscuro não se projetam
para essa região. As vias serotonérgicas do núcleo rafe magno estão relacionadas
com processo de transmissão e modulação dos estímulos nocioceptivos da medula
espinhal (LeBars at al., 1980). A estimulação elétrica desta área produz analgesia
que é parcialmente revertida por naloxone (Oliveras et al., 1975, 1977) e tal
estimulação resulta na inibição de neurônios nocioceptivos no corno dorsal (Beall et
al., 1979; Fields et al., 1977; Gerhart et al., 1981; Rivot et al., 1980). Injeção de
opióides nesta região também produz antinociocepção que está envolvida com
mecanismo serotonérgicos (Dickenson et al., 1979; Liu et al., 1988).
21
NÚCLEO DA RAFE PÁLIDO (RPa):
Ventralmente ao núcleo da rafe obscuro encontra-se um grupo de células do
núcleo rafe pálido. A parte caudal deste núcleo é bem definida e inicia-se na porção
mais medial do núcleo rafe obscuro, com um grupo de células entre as margens
dorso mediais das pirâmides, que ao nível médio olivar, funde-se com grupos
celulares dorsais formando uma massa única que se encaminha para a direção
rostral, enquanto que sua porção mais rostral encontra-se pobremente definida
(Taber et al. 1960). Segundo Taber (1960), na porção mais rostral, os núcleos
reticulares gigantocelulares bulbares aproximam-se da borda dorso laterais do
núcleo rafe pálido. Aproximadamente a um terço da porção rostral do núcleo ocorre
fusão com o núcleo rafe magno. Em muitos pontos as bordas dos dois núcleos
afastam-se, quando então suas células se apresentam densamente agrupadas, o
que dá um contraste com as células bastante dispersa do núcleo rafe magno.
Luppi et. al. (1986) utilizando uma técnica onde combinava a
imunohistoquímica com a técnica de traçado retrógrado, determinaram que o núcleo
rafe pálido recebe aferentes hipotalâmicos que se originam na região peri e
paraventricular das áreas hipotalâmicas anterior e posterior. Três grupos de células
serotonérgicos da linha mediana do tronco cerebral foram identificados e
denominados de B1, B2 e B3, que corresponde aos núcleos rafe pálido, obscuro e
magno respectivamente Dahlstrom e Fuxe (1964). A demonstração de que estes
núcleos pareciam ser os principais centros que continham neurônios serotonérgicos,
levaram as intensas investigações na tentativa de determinar a ação fisiológica
desses núcleos.
NÚCLEO DA RAFE OBSCURO (NRO):
A denominação obscuro decorre do fato de que em muitos níveis do núcleo,
em especial em sua porção dorsal, apresenta uma densidade celular muito pequena
conferindo-lhe um aspecto não muito visível (Taber et al., 1960). Ele ocupa a linha
média da rafe bulbar, estendendo do pólo caudal da oliva inferior ao nível do núcleo
do nervo hipoglosso até a porção cervical da medula espinhal (Brodal et al., 1960).
22
Apesar de o NRO fazer algumas projeções para a coluna dorsal da medula espinhal,
nas lâminas I, II e V (Dahlstrom e Fuxe, 1964; Basbaum e Fields, 1976; Jacobs et
al., 2002), a maioria de suas projeções vão para a coluna intermediolateral (Loewy,
1981; Gilbey et al., 1995) e para o corno ventral da medula (Brodal et al., 1960;
Martín-Cora et al., 2000). As eferências para o corno ventral terminam
principalmente em motoneurônios somáticos (Brodal et al., 1960; Martín-Cora et al.,
2000) e respiratórios (Holtman et al., 1990). Essas projeções podem ser
serotonérgicas e não-serotonérgicas (Skagerberg e Bjorklund, 1985; Martin et al.,
1990).
Zagon (1995) descreveu importante interconexões entre NRO e o RVLM.
Existem também projeções descritas para o núcleo motor dorsal do vago (Maneker
et al., 1995; Hornby et al., 1990), para o núcleo do hipoglosso (Manaker et al., 1992),
para o núcleo do trigêmio e facial (Fort et al., 1989, 1990) e para o colículo superior
(Parent, 1996).
Outras áreas sensoriais do tronco cerebral, como o núcleo do trato solitário
(Palkovits et al., 1986) e núcleo do trigêmio (Li et al., 1996) também recebem
projeções do NRO.
Foi muito explorada a participação desse núcleo nas funções autonômicas,
com especial interesse a modulação simpática, devido a extensas projeções para a
coluna intermediolateral (Loewy, 1981; Coote et. al., 1985).
A atividade simpática pode ser distribuída de forma diferente para cada
regiões especifica do corpo como foi demonstrado durante o período do sono
desincronizado (Futuro-Neto e Coote, 1982 a, b). Neste trabalho pode-se observar
que, durante este período a atividade simpática vasocostritora para o músculo
esquelético estava aumentada, enquanto que, em outros leitos do sistema vascular
estavam inibidas.
Além da possibilidade do NRO participar nas respostas autonômicas através
de projeções espinhais, existem ainda importantes conexões em diversos centros do
tronco cerebral que impedem uma análise simplória do envolvimento deste núcleo
no controle de muitas funções. Existem evidências de que o NRO está envolvido na
modulação central da analgesia, nocicepção e reação de defesa (Schenberg &
Lovick, 1995; Lovick, 1996). Isso explicaria a importância das projeções para o corno
dorsal (Basbaum et al., 1976) e as interconexões entre a substância cinzenta
periaquedutal (Lovick, 1993a).
23
A grande maioria dos estudos de mapeamento dos núcleos da rafe, e sua
participação na regulação cardiovascular foram realizados com a utilização de
técnicas de estimulação elétrica. No gato, a estimulação elétrica promoveu
principalmente respostas depressoras (Adair et al., 1977; Yen et al., 1983). No rato
(Smits et al., 1978; Kuhn et al., 1980; Futuro Neto et al., 1990; Silva et al., 2002), no
cobaio (Almada, 1995; Futuro-Neto et al., 1997) e no hamster (Faria, 1992; Faria et
al., 1996) as respostas foram predominantemente pressoras, enquanto que no
coelho ocorreu quase que um equilíbrio entre respostas pressoras e hipotensoras,
com pequena predominância da primeira (Futuro Neto et al., 1990). Com a utilização
de microinjeções de L-glutamato nos mesmos sítios do NRO, foram observadas
respostas pressoras semelhantes, o que evidencia a ativação de corpos celulares no
núcleo estudado (Dreteler et al., 1991; Faria et al., 1996). Damico et al. (1996)
também observaram que a microinjeção de L-glutamato e agonistas de receptores
glutamatérgicos ionotrópicos no NRO causava elevação da pressão arterial.
A intensa rede interneuronal do NRO para os demais núcleos bulbares
poderia ser a justificativa dos resultados de trabalhos que demonstram o
envolvimento deste núcleo na modulação tônica da atividade simpática (Adair et al.,
1977; Có et al., 1990), na regulação central da respiração (Hotmam et al., 1990;
Lalley et al., 1997) e cardiovascular (Futuro Neto et al., 1990; 1996; Dreteler et al.,
1991, Campos Jr. et al., 1993, Silva et al., 2002). Outros autores partilham desta
idéia onde a regulação cardiovascular e respiratória pode ser sugerida pelas
projeções NRO para a superfície ventral bulbar (Chan et al., 1986; Van Bockstaele et
al., 1989; Nicolas & Hancock, 1990; Zagon, 1993, 1995), onde existem importantes
“centros” integradores das respostas cardiovasculares e respiratórias.
A participação funcional da porção rostral da superfície ventrolateral bulbar na
modulação das respostas pressoras evocadas pela estimulação no NRO foi
demonstrada por Campos Jr. et al. (1993). Estes autores observaram que tanto a
lesão eletrolítica quanto a aplicação tópica de glicina na RVLM, causava o bloqueio
das respostas pressoras obtidas pela estimulação elétrica no NRO, concluindo que a
integridade da RVLM era essencial para a manutenção daquelas respostas
pressoras. Futuro Neto et al. (1996), obtiveram resultados semelhantes com a
microinjeção de glicina na RVLM, mas não conseguiram bloquear as respostas
cardiovasculares e simpáticas com a aplicação de antagonistas serotonérgicos,
sugerindo que os receptores 5-HT
1
(com seus subtipos), 5-HT
2
e 5-HT
3
da RVLM
24
não estariam envolvidos nestas respostas. Alguns estudos sugerem que a CPA pode
estar envolvida no controle das respostas à estimulação elétrica no núcleo rafe
obscuro, podendo-se, a partir daí, supor que a CPA poderia estar relacionada aos
núcleos caudais da rafe no controle de diferentes respostas, comportamentais ou
autonômicas. (Silva et al., 2002).
Os achados existentes até o momento colocam os núcleos caudais da rafe
como importantes participantes dos processos centrais no controle das atividades
autonômicas e somáticas. O esclarecimento sobre suas projeções eferentes, sendo
ou não enviadas para a CPA, assume fundamental importância para o entendimento
deste nível de modulação neural da pressão arterial. Ainda faltam informações a
respeito da função da CPA, e o controle aferente exercido sobre ela por outras áreas
envolvidas na regulação neural da PA como, por exemplo, os núcleos caudais da
rafe. Esta hipótese complementaria as conexões das regiões bulbares sugerida por
Horiuchi & Dampney (2002), nas quais as projeções aferentes para a CPA não foram
demonstradas. Portanto, o mapeamento dos núcleos caudais da rafe no rato vem
adicionar dados que poderão ser comparados aos já existentes e ajudar a
compreender melhor suas participação na manutenção da pressão arterial.
25
1.5 DESCRIÇAO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO HISTOQUIMICA COM A
UTILIZAÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):
A técnica Histoquímica com a utilização do Horseradish Peroxidase (HRP) foi
introduzida por Straus, 1957 (apud Mesulan, 1978) e aplicada para o sistema
nervoso periférico por Kristensson e Olsson, 1971 (apud Mesulan, 1978) e
posteriormente para o sistema nervoso central por LaVail e LaVail, 1972. Desde
então, a técnica neurohistoquimica tornou-se um dos mais frequentes métodos para
tracejamento neuronal conectivo dentro do SNC.
Os estágios sucessivos da técnica neurohistoquimica consistem de: injeção
intracerebral do HRP, endocitose neuronal (uptake neuronal), transporte
axoplasmatico e visualização histoquímica da enzima. O Processo de visualização
histoquímico é alcançado através da incubação e fixação do tecido em um meio
contendo H
2
O
2
e um cromogem amina aromática (percussor de um pigmento). Esse
cromogem polimeriza e assume uma coloração intensa quando oxidado. Portanto,
no local do HRP ativado, ou seja, o complexo [HRP. H
2
O
2
], oxida o cromogem e
resulta na precipitação do produto dessa reação que, atua como um marcador, pela
ativação da enzima HRP como demonstrada na fotomicrografia da figura 3
(mesulam, 1978; Mesulam, 1976).
O sucesso de um experimento histoquímico com HRP depende de um grande
numero de variáveis. Essas podem ser classificadas em dois grandes grupos:
Variáveis Dinâmicas e Variáveis histoquímicas. As dinâmicas incluem a endocitose
e o transporte do HRP e a histoquímicas incluem parâmetros como o tipo de fixação,
a escolha do cromogem e a composição do meio de incubação. Além disso, ao
contrario da maioria das variáveis dinâmicas, que usualmente independem da
manipulação, quase todos os parâmetros histoquímicos podem facilmente ser
regulados pelo experimentador. Na verdade, este segundo grupo de variáveis
determina não apenas a visibilidade do produto da reação, mas também, a
sensibilidade que o transportador (HRP) pode ser detectado. Em outras palavras,
uma conexão neural que é prontamente visualizada quando ótimos parâmetros
histoquímicos estão envolvidos, pode ser perdida em experimentos que utilizam
excessiva fixação, cromogem de inferior visibilidade (Mesulam & Rosene, 1977) ou
parâmetros de incubação inapropriados (Mesulam, 1976).
26
A utilização do HRP no presente trabalho nos permite buscar uma conexão
direta, para tentarmos esclarecer a existência ou não de projeções eferentes
enviadas pelos núcleos caudais da rafe para a área pressora caudal.
Figura 3. As setas indicam as células marcadas. A) Três células marcadas na substância inonimata
com o produto da reação do HRP, visível com uma objetiva 20x, após aplicação de HRP no córtex
motor. B) Duas células marcadas com HRP no núcleo dorsolateral talâmico de macaco, seguido à
aplicação prévia de HRP no hipocampo. Duas células não marcadas também são vistas no quanto
superior direito da imagem, Objetiva 40x. C) uma célula marcada no lobo parietal inferior após uma
injeção de HRP no lobo parietal inferior contralateral, objetiva 100x. D) Duas células marcadas na
substância inonimada de um macaco após a injeção de HRP no córtex premotor. (Mesulam, 1976).
27
2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GERAL
:
•
Investigar através da técnica histoquímica de transporte axonal retrogrado
(horseradish peroxidase, HRP), a existência de projeções neuronais
eferentes, formando uma via direta, entre os núcleos caudais da rafe e a área
pressora caudal.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
:
•
Além da existência destas vias dos núcleos caudais da rafe para a CPA,
identificar a exata localização rostro-caudal dos neurônios marcados com
HRP dentro dos núcleos caudais da rafe que estão se projetando para a CPA.
• Avaliar em que profundidades da superfície do crânio encontram-se os
neurônios dos núcleos caudais da rafe que se projetam para a CPA.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS:
ANIMAIS
No experimento foram utilizados ratos Wistar machos adultos (270 – 300
gramas), fornecidos pelo biotério do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo os quais eram mantidos em
gaiolas de polietileno e alimentados com ração comercial e água ad libitum. O
controle de luminosidade era próximo às condições naturais, com ciclo de 12 horas.
ANESTESIA E PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS INICIAIS
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais eram
anestesiados com hidrato de cloral (0,4g/kg i.p.). A temperatura retal foi mantida a
37C utilizando para tanto uma manta aquecida. Foi necessário encontrar um ato
cirúrgico adequado e pouco traumático que nos apresentasse um bom prognostico
pós-operatório, permitindo assim a sobrevivência dos animais por dois a três dias
após os procedimentos. Além do ato cirúrgico, as coordenadas para atingir
precisamente a CPA também tiveram que ser adequadas. Após a anestesia os
animais foram posicionados em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico para
pequenos animais (Stoelting), com a barra incisiva 11 mm abaixo da linha interaural.
O Óbex foi utilizado como ponto de referência para as coordenadas
estereotáxicas, sua exposição foi realizada através de procedimento cirúrgico onde
se fazia uma incisão na região posterior da cabeça do animal promovendo a
visualização e o afastamento da musculatura que se sobrepunha a está região,
permitindo assim uma visualização completa do óbex e acesso à CPA. Foram
utilizados treze animais até que o melhor procedimento fosse encontrado.
As coordenadas foram confirmadas através de registros hemodinâmicos após
a aplicação do aminoácido excitatório (Glutamato, 20nmol/50 nl), através de uma
cânula de metal (agulha gengival tamanho 30G curta) conectada via cânula de
polietileno PE-10 a uma microseringa Hamilton introduzida unilateral no bulbo.
29
Associado ao Glutamato foi utilizado um marcador (Pontamine Sky Blue, 2%) que
permitiu uma visualização macro e microscópica da região aplicada.
REGISTROS HEMODINÂMICOS:
A pressão arterial foi registrada apenas com o objetivo de auxiliar na confirmação da
localização exata da APC. Através de uma pequena incisão na região femoral
ventral, dissecava-se a artéria femoral esquerda para inserção de cateteres de
polietileno PE-50, preenchidos com solução salina-heparina (0,09%, 100:1UI,
respectivamente) e tendo uma de suas extremidades obstruída com um pino de
metal. A pressão arterial era monitorada pelo cateter, conectado a um transdutor de
pressão (Statham-Spectramed, P23XL) e a um amplificador (Pressure Processor,
Gould 20-4615), sendo registrada em um polígrafo (Gould RS3400), previamente
calibrado. A freqüência cardíaca medida com um frequencímetro (Biotach, Gould 13-
64615) a partir da onda de pulso da pressão arterial. Os registros da pressão arterial
pulsátil, pressão arterial média e frequência cardíaca eram digitalizados (Biopac
MP100) e armazenados no disco rígido de um computador PC (Digital). A aplicação
da droga (Glutamato) nas coordenadas adequadas permitia visualizar uma resposta
pressora no momento de sua aplicação. Estas respostas associadas à análise
histológica nos permitiram confirmar a exata localização da APC, que se
assemelham às existentes na literatura científica e escolher o melhor sitio para a
aplicação do HRP.
As coordenadas testadas variaram de 0,5 a 1,5 mm caudal ao Óbex e de 1,5
a 2,0 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície
dorsal do tronco cerebral do animal, sendo do escolhido como sitio de aplicação do
HRP, aquele que demonstrou uma melhor resposta pressora (1,0 mm caudal ao
Óbex e 1,7 mm lateral à linha média) como observado na figura 4.
30
Figura 4. Representação esquemática indicando o local da microinjeção do HRP dentro da CPA. O
circulo em vermelho representado pela letra F representa o ponto de injeção do HRP, com 1,0 mm
caudal ao Óbex, 1,7 mm lateral a linha medial e 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do
rato. Figura modificada de Sun W. and Panneton W. M.
MICROINJEÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):
Uma vez definido o melhor procedimento cirúrgico e as coordenadas
adequadas para atingir a CPA o experimento com a utilização do HRP foi iniciado.
Para a utilização do HRP como marcador neuronal retrogrado, desde sua aplicação
até o ponto de ser revelado, corado e analisado no microscópio, nos levou a tentar
adequar esta técnica aos materiais já existentes e utilizados rotineiramente em
nosso laboratório, até chegar-mos à sua adequada utilização. Diferentes formas de
perfusões, concentrações variadas de HRP, tentativa de utilização do formaldeido
para fixação do tecido (freqüentemente utilizado em nosso laboratório), ou seja,
vários experimentos tiveram que ser realizados com o objetivo de adequar a técnica
de revelação do HRP com as drogas e os equipamentos já utilizados em nosso
laboratório. Para estes experimentos foram necessários à utilização de onze animais
até que a revelação do tecido com HRP pudesse ser realizada com sucesso, e
consequentemente, boa visualização dos grânulos de HRP no pericário do neurônio
pudesse ser observada como será descrito no decorrer do texto.
Com o mesmo procedimento utilizado na aplicação do glutamato e o
marcador para confirmar as coordenadas estereotáxicas adequadas, era aplicado na
CPA unilateral, um volume de 50nl de solução contendo o traçador horseradish
peroxidase a 20% (SIGMA-ALDRICH, Switzerland), diluído em água destilada
(Mesulam, 1978). Após a injeção do HRP a cânula permanecia no local alvo por 20
min para evitar perda do traçador no trajeto da cânula durante a retirada.
31
Realizado este procedimento a incisão cirúrgica era suturada e o animal
mantido vivo durante dois a três dias no biotério da instituição, tempo necessários
para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do traçador. Após este
período, o animal era profundamente anestesiado com cloral hidratado (0,4g/kg, i.p.),
seguindo-se a uma abertura da região torácica para exposição do coração e
perfusão via artéria aorta com 500ml de solução salina, seguida por 500ml de
paraformaldeido a 1% e 1,25% de glutaraldeido em tampão fosfato 0,1M. O tronco
cerebral era removido, fixado por 24h à 4
o
C em uma solução de sacarose a 10% e
então seccionado coronalmente com espessura de 40 micrometros utilizando um
micrótomo de congelamento.
As secções foram colocadas em uma solução com 250ml de tampão fosfato (pH 7,6)
e tratadas com Diaminobenzidina a 0,05%. As secções permaneciam nesta solução
sendo agitados por dez minutos, após este tempo, era adicionado à solução H
2
O
2
numa concentração de 0,01% e agitado por mais dez minutos. O produto desta
reação promove uma coloração escura no ponto de injeção da droga e no interior do
corpo celular dos neurônios marcados retrogradamente. O local da microinjeção do
HRP foi examinado microscopicamente para verificar a localização exata dentro da
CPA. Em seguida as secções foram organizadas em lâminas histológicas e coradas
com o corante vermelho neutro, permitindo assim uma melhor visualização do corpo
celular dos neurônios marcados com o HRP dentro dos núcleos caudais da rafe.
Estes neurônios foram visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo suas
coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e Watson,
Acadamic Press, 1986).
Um total de seis ratos com marcações positivas de HRP dentro da CPA foram
utilizados para determinar os objetivos deste trabalho.
As imagens dos neurônios marcados foram capturadas através de uma
câmera de vídeo acoplada ao microscópio, digitalizadas e armazenadas no
computador. Os dados dos animais em que não foi possível a visualização
histológica positiva para a CPA foram desconsiderados e descartados.
32
4. RESULTADOS:
Dois a três dias após a microinjeção de HRP na CPA, foram observados
neurônios marcados em todos os três núcleos caudais da rafe, estando distribuídos
de forma dispersa em cada um deles. Ao ser aplicada, a solução contendo o HRP se
espalha pelo tecido do sistema nervoso e, após ser revelado, produz uma coloração
marrom por toda extensão em que se difundiu. O pequeno volume da solução de
HRP aplicado (50nl) permitiu que apenas o núcleo estudado (CPA) fosse circundado
com a droga, como demonstrado na fotomicrografia abaixo (figura 5). Com isto
evitando encontrar corpos neuronais marcados retrogradamente cuja seus botões
terminais não estejam presentes nesta região.
De uma maneira geral, os neurônios marcados com HRP nos núcleos caudais
da rafe, nos seis ratos estudados, estavam distribuídos da seguinte maneira: Foram
encontradas marcações com HRP dentro do núcleo RMg nos ratos 1, 2 e 3,
somando um total dez neurônios marcados nestes animais. Para o núcleo RPa,
foram vistas marcações nos ratos 1, 3, 4, e 5, totalizando quatorze neurônios
marcados. E por ultimo, neurônios com HRP no núcleo NRO estavam presente nos
ratos 2, 3, 4, 5 e 6, representando um somatório de onze neurônios marcados nestes
animais.
Figura 5. A) fotomicrografia demonstra o local de aplicação do HRP dentro da CPA do rato, secção
de 40 µm; objetiva 10x.
A
CPA
33
As coordenadas de acesso a CPA utilizadas para aplicação do HRP, demonstraram
um aumento da pressão arterial e freqüência cardíaca quando estimuladas pela
aplicação do glutamato. A figua seis representa os registros hemodinâmicos antes e
após a microinjeção do L-glu.
Figura 6. Respostas cardiovasculares da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL)
na área pressora caudal (CPA), (A) Registros de pressão arterial (PA), pressão arterial média (PAM)
e frequência cardíaca (FC); (B) cortes coronal e sagital representativos do sítio de microinjeção. O
triângulo representa a microinjeção.
L
-
glu
A
900 950
1000
1050
1100
seconds
0
50
100
150
200
mmHg
PA
0
50
100
150
200
mmHg
PAM
0
100
200
300
400
bpm
FC
34
Na análise estatística dos registros de cinco animais, observou-se um aumento na
PAM após a microinjeção de L-glu (102 ± 2,3 mmHg), significativamente maior que
os registros controle (80 ± 3 mmHg; p< 0,01), como demonstrado na figura 7, nas
coordenadas 1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média, com uma
profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal. Sendo
este o sítio escolhido para a aplicação do HRP.
Variação da pressão arterial média
após a microinjeção de L-glu na APC
Cont L-glu
0
25
50
75
100
125
Cont
L-glu
**
PAM
mm Hg
Figura 7. Efeitos da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na CPA, sobre as
respostas de pressão arterial média (PAM) em ratos. Cont, controle antes da microinjeção do L-glu
nos ratos *P<0,01 (teste t de Student; n = 5).
35
Neurônios marcados retrogradamente no RMg após microinjeção de HRP na
CPA:
Neste núcleo observou-se a menor dispersão celular no sentido rostro-caudal
dos neurônios marcados com HRP, estas células estavam situadas entre -11,30 mm
e -11,60 mm caudais ao Bregma (fig. 8).
Figura 8. A) Fotomicrografia mostrando dois neurônios densamente marcados com HRP dentro do
RMg a -11,30 mm do Bregma, com profundidade de 10,60 mm da superfície do crânio, objetiva 4x. B)
Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP no neurônio, objetiva 10x.
Dos dez neurônios encontrados marcados no núcleo RMg, três estavam a
exatamente -11,30 mm, e os outros sete neurônios a -11,60 mm caudais ao Bregma.
Estes últimos neurônios estavam situados com profundidade variando apenas entre
10,4 mm a 10,7 mm em relação à superfície dorsal do crânio (fig. 9).
Figura 9. Rato 1, dois neurônios marcados com HRP dentro do núcleo RMg a -11,60 mm do Bregma,
com 10,60 mm e 10,70 mm de profundidade; canto superior esquerdo (seta). A) Demonstra os dois
neurônios com um aumento numa objetiva 4x. B) Maior aumento de A, objetiva 10x. Pode ser
observado também um neurônio marcado no RPa, canto inferior direito.
A
RMg
B
RMg
A
RMg
B
RMg
36
A quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro
do RMg e seus respectivos posicionamentos tanto rostro-caudais quanto a
profundidade da superfície do crânio são demonstrados na tabela abaixo (tab. 1).
Tabela 1. Total de neurônios marcadas com HRP no RMg e suas respectivas localizações rostro-
caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,40
–
10,70
-
11,30 /
-
11,60
10
Geral
10,40
–
10,70
-
11,60
7
Marcações
10,60 -11,30 3
Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal ao
Bregma (mm)
Número de
Neurônios
RMg
37
Neurônios marcados retrogradamente no RPa após microinjeção de HRP na
CPA:
Os quatorze neurônios marcados dentro do núcleo RPa nos animais
estudados estavam distribuídos rostro-caudalmente entre -11,30 mm a -12,80 mm
caudais ao Bregma, com uma profundidade variando entre 10,80 mm a 11,10 mm
em relação à superfície dorsal do crânio. No rato 1 foram encontrados três neurônios
marcados a aproximadamente -11,30 mm do Bregma, dois deles com profundidades
de 10,80 mm e um a 10,90 mm da superfície craniana (figura 10).
Figura 10: Rato1, neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm caudais ao Bregma. A)
apresenta um neurônio marcado dentro do RPa com uma profundidade de 10,80 mm da superfície do
crânio, objetiva 10x. B) outro neurônio marcado no RPa com 10,80 mm de profundidade (seta), além
de outros dois no núcleo RMg, objetiva 10x. C) um único neurônio a 10,90 mm de profundidade no
RPa, objetiva 10x.
A aproximadamente -11,60 mm do Bregma, mais cinco neurônios foram marcados
com HRP no núcleo da RPa, dois deles são demonstrado na figura abaixo com
profundidade de 10,80 mm e 11,00 mm da superfície dorsal. Puderam ser
observados também na parte superior esquerda da figura, neurônios marcados no
núcleo RMg (figura 11). Dos outros três neurônios encontrados no Núcleo RPa,
Núcleo RPa
A
RPa
B
RPa
C
RPa
38
porém não visualizados aqui, dois estavam com profundidade igual a 11,00 mm e
um com 10,90 mm da superfície dorsal.
Figura 11. Rato 1; Neurônio marcado com HRP no núcleo RPa a -11,60 mm do Bregma, objetiva 10x.
A) A seta indica uma célula marcada com profundidade de 10,80 mm dorso-ventral no RPa. Duas
células marcadas podem ser observadas no canto superior esquerdo, núcleo RMg. B) Um neurônio
marcado a 11,00 mm de profundidade no núcleo RPa, a -11,60 mm do Bregma.
Quatro neurônios marcados com HRP foram encontrados a -11,80 mm do
Bregma, com profundidade variando entre 10,80 mm e 11,00 mm dorso-ventral. O
nível mais caudal do núcleo RPa onde foi encontrado neurônio marcado foi a -12,80
mm caudal ao Bregma, nesta região foram encontrados apenas dois neurônios
marcados com HRP, estando estas células localizadas a 10,80 mm da superfície
dorsal do crânio (figura 12).
Figura 12. Rato 5; A) neurônio marcado com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma com
10,80 mm de profundidade da superfície craniana, objetiva 4x. B) Outro neurônio com HRP no núcleo
RPa, a -12,80 mm do Bregma e 10,80 mm de profundidade, objetiva 10x.
B
RPa
A
RPa
B
RPa
A
RPa
39
O total de neurônios encontrados com grânulos de HRP dentro do RPa e seus
respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto a profundidade da
superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 2).
Tabela 2. Total de neurônios marcadas com HRP no RPa e suas respectivas localizações rostro-
caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,80 a 11,10
-
11,30 a
-
12,80
14
Geral
10,80
-
12,80
2
Marcações
10,80
-
10,90
-
11,80
4
Marcações
10,80 - 11,00 -11,60 5 Marcações
10,80
-
10,90
-
11,30
3
Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal
ao Bregma(mm)
Número de
neurônios
RPa
40
Neurônios marcados retrogradamente no NRO após microinjeção de HRP na
CPA:
Quatro dos onze neurônios contendo grânulos de HRP encontrados nos NRO
nos animais estudados, estavam a uma distancia de -11,60 mm do Bregma (figura
13) e outros quatro a -11,80 mm do Bregma, com a profundidade destes oito
neurônios em relação à superfície do crânio variando apenas entre 10,00 mm a
10,60 mm. Apenas um único neurônio foi encontrado com distancia dorso-caudal do
Bregma de -11,96 mm. Porém, sua profundidade foi a maior encontrada de todos os
neurônios marcados com HRP dentro do NRO, sendo ela de 10,80 mm da superfície
craniana.
D
Figura 13. Fotomicrografias demonstram a presença de neurônios marcados com HRP dentro do
NRO à -11,60 mm do Bregma. A) Dois neurônios marcados situados a -11,60 mm caudais ao Bregma
no rato 2, com 10,00 mm e 10,10 mm da superfície do crânio; objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A
mostrando os grânulos de HRP dentro do neurônio; objetiva 10x. C) Marcação com HRP em dois
neurônios no NRO a -11,60 mm do Bregma com profundidade de 10,10 mm e 10,20 mm do crânio;
objetiva 4x. D) Maior aumento de C mostrando densos grânulos de HRP no interior dos neurônios;
objetiva de 10x.
Nesta mesma região, ou seja, a -11,96 mm caudal ao Bregma, pode-se
observar a presença de dois outros neurônios marcados dentro do núcleo reticular
D
NRO
A
NRO
B
NRO
C
NRO
41
gigantocelular ventral (GiV), com profundidade semelhante à do neurônio
encontrado no NRO (figura 14), ambos com 10,80 mm da superfície craniana.
Figura 14. A) Neurônio impregnado com grânulos de HRP no NRO a -11,96 mm do Bregma com
10,80 mm de profundidade dois dias após ser injetado na CPA, (seta preta). Alem do neurônio
marcado no NRO podem-se observar outros dois neurônios (seta azul) sitiados no GiV a 10,70 mm
de profundidade, com presença do marcador HRP; objetiva 4x. B) Maior aumento do neurônio no
NRO da foto A; objetiva 10x.
B
NRO
A
NRO
A
42
A região mais caudal do NRO que pôde ser observado a presença de
neurônios marcados após a aplicação do HRP na área pressora caudal foi a -12,72
mm do Bregma, neste nível foi encontrado um neurônio marcado no rato 3 e um
neurônio marcado no rato 5 com profundidades de 10,40 mm e 10,50 mm
respectivamente da superfície do crânio (figura 15).
Figura 15. A) Neurônio marcado no NRO a -12,72 mm do Bregma e 10,40 mm de profundidade;
objetiva 4x. B) Fotomicrografia de um neurônio marcado com HRP dentro do NRO a -12,75 mm do
Bregma com 10,50 mm de profundidade, objetiva 4x.
A
NRO
B
NRO
43
A quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro
do NRO e seus respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto à
profundidade da superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 3).
Tabela 3. Total de neurônios marcadas com HRP no NRO e suas respectivas localizações rostro-
caudais e profundidades da superfície do crânio.
Neurônios marcados com HRP em outras regiões bulbares:
Além dos neurônios marcados dentro dos núcleos caudais da rafe, outras
regiões bulbares como núcleo oliva inferior dorsal (IOD), núcleo oliva inferior medial
(IOM), núcleo reticular gigantocelular (Gi), núcleo reticular gigantocelular alfa (GiA),
núcleo reticular gigantocelular ventral (GiV) e tracto piramidal (Py) também
demonstraram neurônios marcados retrogradamente com HRP após a microinjeção
na CPA (figura 16). Quase todos os neurônios encontrados nestes núcleos estavam
situados a uma distancia caudal ao Bregma entre -11,60 mm e -11,80 mm. Porem
três neurônios com marcações de HRP foram encontrados a -11,96 mm caudal ao
Bregma, sendo um deles encontrado no núcleo Gi, com profundidade de 10,30 mm
da superfície craniana, e dois no núcleo GiV, com 10,60 mm de profundidade da
superfície do crânio. Apenas um neurônio foi encontrado no núcleo IOD situado a
-11,80 mm caudal ao Bregma com 10,60 mm de profundidade e dois no núcleo IOM
com -11,60 mm e -11,80 mm do Bregma, e profundidade de 11,00 mm da superfície
craniana. Quatro neurônios com HRP intracelular foram encontrados no núcleo GiA,
três estavam -11,30 mm e um -11,60 mm caudais ao Bregma. A profundidade em
relação à superfície do crânio era de 10,70 mm aproximadamente, ou seja, na
superfície ventral bulbar.
Outros quatro neurônios foram observados no núcleo GiV entre -11,80 mm e
-11,96 mm do Bregma estando com aproximadamente 10,50 mm de profundidade
da superfície craniana. Por ultimo dois neurônios marcados com HRP foram
10,00
-
10,80
-
11,30 a
-
12,80
11
Geral
10,40
-
10,50
-
12,72
2
Marcações
10,80
-
11,96
1
Marcações
10,10
-
10,60
-
11,80
4
Marcações
10,00
-
10,20
-
11,60
4
Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal
ao Bregma(mm)
Número de
Neurônios
NRO
44
observados dentro do tracto piramidal bulbar, ambos a -11,60 mm caudais ao
Bregma, com 11,10 mm e 11,20 mm de profundidade do crânio.
Figura 16. Neurônios marcados com HRP em varias regiões bulbares. Neurônios marcados no
núcleo IOM são demonstrados nas fotomicrografias A e B, objetiva 4x. C) Uma única célula foi
encontrada no núcleo Gi, objetiva 10x. Em D, E e F neurônios marcados com HRP no núcleo GiA,
objetiva 4x. Em G um maior aumento de F, objetiva 10x. F) Dois neurônios marcados no tracto
piramidal (seta), objetiva 10x.
D
GiA
A
IOM
Gi
C
GiA
G
IOM
B
H
Py
E
GiA
F
GiA
45
5. DISCUSSÃO:
Os resultados encontrados neste trabalho nos permitem visualizar uma
importante comunicação neuroanatômica entre os núcleos caudais da rafe, áreas
descritas como envolvidas no controle cardiovascular, e uma segunda região
também responsável por este controle, à área pressora caudal. A partir dos
trabalhos publicados por Guertzenstein et al. (1973, 1974, 1977), diferentes linhas
de pesquisas começaram a enfocar a participação de diversos grupos de neurônios
da superfície bulbar na manutenção dos níveis basais de atividade tônica simpática
para os vasos sanguíneos e coração, regulando a pressão arterial e a freqüência
cardíaca. Estes centros participam da modulação momento a momento da pressão
arterial, principalmente a partir de baro’ e quimiorreceptores, ligados por aferências
ao núcleo do trato solitário (NTS), que origina e recebe projeções tanto da superfície
ventral bulbar, quanto de regiões supra-bulbares, principalmente o hipotálamo
(Guyenet, 1990; Dampney, 1994 a; Dampney et al., 2002). Na superfície ventral
bulbar, estas projeções estariam ligadas a dois principais centros de controle
cardiovascular: a área simpatoexcitatória e a área simpatoinibitória (conhecidas
como RVLM e CVLM, respectivamente), principais responsáveis pela manutenção
do tono vasomotor.
Quando procuramos entender anatomofuncionalmente às áreas que
participam conjuntamente do controle cardiovascular, não podemos deixar de
mencionar a importância dos núcleos serotonérgicos da rafe, com atenção especial
neste trabalho, para os três núcleos caudais bulbares (Núcleo rafe magno, pálido e
obscuro). Ao analisar o sistema eferente dos núcleos da rafe, pode-se observar que
os núcleos caudais apresentam neurônios cuja maioria de seus axônios se projeta
para a medula espinhal, enquanto que os neurônios dos demais núcleos
suprasegmentares projetam seus axônios principalmente para as regiões cerebrais
superiores (Dahlstrom e Fuxe, 1965). Estes autores descreveram ainda que os
axônios dos núcleos caudais da rafe que descendem pelo tronco cerebral penetram
na medula espinhal, através do funículo dorso lateral encaminhando-se para o corno
dorsal e para a cadeia simpática intermédio lateral tóraco-lombar fazendo sinapses
com neurônios pré-ganglionares simpático. Essa conexão dos núcleos caudais da
rafe com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinhal,
fortalecendo sua participação na regulação simpática, também foi relatada por outros
autores (Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997). Por
46
outro lado, a importância de cada um dos núcleos bulbares da rafe no controle e
modulações de vários componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas
conexões suprassegmentares. Alguns pesquisadores relatam que a participação na
regulação cardiovascular e respiratória destes núcleos pode ser parcialmente
explicada pelas projeções para a superfície ventral bulbar (Chan et al., 1986; Van
Bockstaele et al., 1989; Nicholas & Hancock, 1990; Zagon, 1993, 1995; Silva et al.,
2002), onde existem importantes centros integradores das respostas
cardiovasculares e respiratórias. A interconexão entre o NRO e o RVLM foi descrita
por Zagon em 1995. O bloqueio dos receptores de aminoácidos excitatórios no
RVLM e na CPA altera as respostas cardiovasculares à estimulação elétrica do
núcleo rafe obscuro, podendo-se a partir daí, supor uma relação entre estas áreas
no controle de diferentes respostas comportamentais ou autonômicas (Silva et al.,
2002).
No presente trabalho procurou-se entender as conexões anatomofuncionais
entre os núcleos caudais da rafe (núcleo magno, pálido e obscuro) com a CPA,
região descrita como fundamental integrante, entre os núcleos da superfície ventral
bulbar, para o controle cardiovascular. Como demonstrado nos resultados, foi
observada a existência de conexões eferentes monossinápticas entre todos os três
núcleos caudais da rafe com a área pressora caudal. Isto demonstra que os
neurônios dos núcleos caudais da rafe, além de se projetarem em direção à medula
espinha, com projeções destinadas à coluna IML como descrito por Dahlstrom e
Fuxe em 1965, pelo menos uma parte destes neurônios, também fazem sinapse
com a CPA. Horiuchi & Dampney em 2002, propuseram uma desinibição direta e
indireta dos neurônios simpatoexcitatórios do RVLM pela CPA como já relatado na
introdução. As marcações encontradas com HRP nos núcleos caudais da rafe
demonstram uma via eferente monossináptica destes núcleos sobre a CPA,
apontando uma ligação direta entre estas regiões, o que sugerem novas influencias
sobre a CPA e conseqüentemente no controle da pressão arterial, ampliando ainda
mais o circuito descrito por Horiuchi & Dampney, 2002. Neste circuito as aferências
para a CPA não foram relatadas por estes autores, sendo demonstradas em nossos
resultados, que pelo menos uma boa parte dessas, possui origem nos núcleos
caudais da rafe.
47
Provavelmente, parte desta via para a CPA (com origem no NRO) envie
projeções eferentes, cuja neurotransmissores responsáveis pela estimulação, sejam
aminoácidos excitatórios como sugerido por Silva et al. em 2002 quando relatou que
o bloqueio destes receptores na CPA impede a elevação da pressão arterial
decorrente da estimulação do NRO. Este mesmo autor demonstrou ainda que o
bloqueio destes receptores na RVLM também altera suas respostas
cardiovasculares. Futuro Neto et al. (1996), obtiveram resultados onde a
microinjeção de glicina na RVLM alteravam as respostas cardiovasculares, porem,
não conseguiram bloquear estas respostas com a aplicação de antagonistas
serotonérgicos, sugerindo que os receptores 5-HT
1
(com seus subtipos), 5-HT
2
e 5-
HT
3
da RVLM não estariam envolvidos nestas respostas.
O núcleo rafe magno, o mais rostral dos três núcleos caudais da rafe, começa
a aparecer no tronco cerebral, de acordo com o Atlas de coordenadas estereotáxica
de Watson & Paxinos (1986), a partir de -9,16 mm caudal ao bregma, e se estende
rostro-caudalmente ate -11,60 mm desta região. Os resultados deste trabalho
demonstraram que os neurônios marcados retrogradamente com HRP no RMg, após
microinjeção desta droga na CPA, encontram-se numa área bastante restrita e com
a menor dispersão celular encontrada dos três núcleos da rafe estudados,
compreendida entre -11,30 mm a -11,60 mm do bregma. Sete, dos dez neurônios
marcados nesta região, foram encontrados no limite caudal deste núcleo, ou seja, a
-11,60 mm do bregma (figura 17). Isso nos mostra que apenas a porção mais caudal
do núcleo RMg projeta seus axônios para a CPA.
A profundidade em que foram encontrados os neurônios no núcleo rafe
magno também variou muito pouco, estando entre 10,40 mm e 10,70 mm da
superfície dorsal do crânio. Esta pequena variação, tanto no sentido rostro-caudal
quanto dorso-ventral, sugere a existência de subdivisões ou subnúcleos dentro do
núcleo rafe magno, enviando suas projeções axônais para diferentes regiões
encefálicas, para grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula
espinhal, e outras regiões do tronco cerebral fornecendo a base anatômica de sua
participação na regulação simpática, como demonstrado em trabalhos anteriores
(Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997).
A substancia cinzenta pereaquedutal está envolvida nas respostas
cardiovasculares à dor, e foi demonstrado, que o RMg serve como um rele para
estas alterações (Rachel et. al., 1997).
48
Foi observado que a ativação dos neurônios do NRO é semelhante à do RMg
após estimulo dolorosos cutâneos (Dantas et. al., 1990). Podemos sugerir que o
aumento da atividade nestes núcleos após estímulos dolorosos pode estar
relacionada, pelo menos em parte, com as alterações cardiovasculares encontradas
na presença da dor, através da ligação destes núcleos com a CPA.
O núcleo rafe pálido, quando comparado com os outros dois núcleos caudais
da rafe, é o que possui a localização mais ventral dentro do tronco cerebral. Ele se
encontra numa posição intermediaria rostro-caudalmente em relação ao núcleo rafe
magno e o núcleo rafe obscuro segundo o Atlas de Watson & Paxinos (1986), sua
localização está entre -9,80 mm e -14,08 mm caudal ao Bregma, o que nos mostra
uma extensão bem maior que a do núcleo da rafe magno descrito anteriormente. Os
neurônios contendo os grânulos de HRP dentro deste núcleo, com projeções
axônais para a CPA, estão distribuídos a uma distancia entre -11,30 mm a -12,80
mm caudais ao Bregma, com suas profundidades da superfície dorsal craniana
variando de 10,60 mm a 11,10 mm. Foi encontrado um total de 14 neurônios
contendo grânulos de HRP nesta área com projeções eferentes para a CPA, este foi
o maior numero de neurônios marcados com HRP em um mesmo núcleo quando
comparado com os outros dois núcleos estudados, sendo que, nove neurônios
estavam situados entre -11,60 mm e -11,80 mm do Bregma (figura 17). Este achado,
ou seja, um aglomerado de neurônios (nove neurônios), todas com praticamente a
mesma coordenada estereotáxica, e o fato de apresentar o maior numero de
neurônios marcados, reforça o trabalho de Taber (1960), que descreve o núcleo da
rafe pálido como sendo o que apresenta a maior densidade neuronal dos núcleos
caudais da rafe. Três neurônios com grânulos de HRP foram encontrados a -11,30
mm e apenas dois neurônios marcados com HRP foram encontrados mais
caudalmente a -12,80 mm de distancia do Bregma com 10,60 mm de profundidade.
Como descrito na introdução, o núcleo rafe pálido recebe aferentes
hipotalâmicos com origem na região peri e paraventricular da área hipotalâmica
anterior e posterior (Luppi et al. 1986). Esta interligação entre o hipotálamo e o
núcleo da rafe pálido e deste para a CPA, nos fornece uma forte base anatômica
para a atuação em conjunto destas áreas no controle cardiovascular. Além do
controle cardiovascular, a regulação da temperatura feita pelo hipotálamo também é
mediada por neurônios que passam pelo RPa e, portanto dependem de sua
integridade. Isto foi demonstrado por Cao et. al. (2004) após demonstrarem que a
49
inibição dos neurônios do RPa com muscinol aboliu o aumento da temperatura
induzido pela desinibição dos neurônios do núcleo hipotalâmico dorsomedial.
O núcleo da rafe obscuro possui um posicionamento rostro-caudal dentro do
tronco cerebral que se estende de -11,60 mm a 14,30 mm do Bregma (segundo
Atlas de Watson & Paxinos, 1986), portanto sua porção rostral tem inicio no limite
caudal do núcleo RMg. Os grânulos de HRP, previamente injetado na CPA, foram
encontrados dento de onze neurônios no NRO situados a uma distancia de -11,60
mm a -12,72 mm caudal ao bregma. É possível observar que uma porção especifica
desde núcleo tem suas projeções enviadas em maior numero pra a CPA que
qualquer outra parte do mesmo, pois, oito dos neurônios encontrados no NRO
estavam presentes entre -11,60 mm e -11,80 mm do Bregma, que, portanto é a
mesma localização dos neurônios marcados no RMg e RPa, com uma profundidade
entre 10,00 mm e 10, 60 mm da superfície dorsal do crânio (figura 17). Estes
neurônios ocupam a linha média da rafe bulbar como descrito por Brodal, 1960. A
resposta cardiovascular nessa área do NRO com maior aglomerado de neurônios
(aproximadamente a -11,80 mm do Bregma), é conhecida por trabalhos previamente
desenvolvidos no Laboratório de Neurofisiologia da UFES, que apontam para
resposta de hipertensão, bradicardia e apnéia, após a estimulação química (com
glutamato) ou elétrica em ratos. No hamster, Faria, 1992; Faria et al. (1996)
encontraram respostas cardiovasculares variadas durante a estimulação no NRO,
com predominância de respostas pressoras, acompanhadas de pequenas
bradicardias e apnéia. Almada, 1995; Futuro-Neto et al. (1997) observaram
predominância de respostas pressoras, no cobaio, que foram acompanhadas de
bradicardia e apnéia.
Foi demonstrado por Campos Jr. et al. (1993) que o bloqueio da região
simpatoexcitatória bulbar, o RVLM, impede as respostas pressoras decorrentes da
estimulação elétrica do NRO.
Um único neurônio foi encontrado no NRO a -11,96 mm caudal ao Bregma,
porem este foi o neurônio mais profundo encontrado dentro deste núcleo estando a
10,80 mm da superfície dorsal do crânio. Como descrito acima, o limite mais caudal
onde foram encontrados neurônios com projeções para a CPA oriundas do NRO foi -
12,72 mm do Bregma, nesta região foram marcados dois neurônios com os grânulos
de HRP, dois dias após sua microinjeção na CPA. A profundidade que se
50
encontravam estes neurônios dentro do NRO era de 10,40 mm e 10,50 mm da
superfície craniana do rato.
É importante relatar que, em todos os três núcleos caudais da rafe estudados, o
ponto de origem da maior parte das projeções eferentes dos neurônios via a CPA
eram de -11,60 mm a -11,80 mm caudais ao Bregma, demonstrando uma região
especifica de saída destes neurônios para a CPA (figura 17).
Figura 17. Corte representativo da linha média demonstrando as projeções dos neurônios
encontrados no núcleo da rafe magno (RMg), pálido (RPa) e obscuro (NRO), para a área pressora
caudal.
No presente trabalho, pode-se observar que além do envolvimento fisiológico
relatado previamente por diversos autores, sobre os núcleos caudais da rafe com as
áreas da superfície ventral bulbar, existe uma relação neuroanatômica
monossináptica entre todos os três núcleos da rafe estudados (RMg, Rpa e NRO) e
uma área bastante especifica da região ventral bulbar do rato, chamada de área
pressora caudal, demonstrando uma comunicação direta entre estas duas regiões.
Ainda nos resta saber se estas projeções são recíprocas, ou seja, vindas agora no
sentido da CPA para os núcleos caudais da rafe, mantendo uma interligação direta
entre estes núcleos.
RMg
RPa
NRO
CPA
51
6. CONCLUSÃO:
O presente trabalho demonstrou a existência de projeções monossinápticas entre
três áreas classicamente serotonérgicas dos núcleos da rafe situadas na região
bulbar, com um outro núcleo encontrado na intercessão bulbo-espinhal descrita por
apresentar relevância no controle cardiovascular denominada área pressora caudal.
Segue abaixo a descrição individual de cada um destes núcleos e suas projeções
para a CPA:
1- O núcleo da rafe magno, que possui uma localização mais rostral na região
bulbar quando comparado aos outros dois núcleos da rafe estudados, foi
claramente marcado retrogradamente com a presença dos grânulos de HRP
no corpo celular de seus neurônios, demonstrando a existência de uma via
direta de suas projeções axonais com a CPA.
2- Um segundo núcleo estudado foi o núcleo da rafe pálido, com uma
localização intermediaria entre os outros dois núcleos caudais da rafe,
demonstrou também uma forte presença com o marcador neuronal retrogrado
(HRP) nos corpos celulares de seus neurônios evidenciando seu contato
monossinaptico com a CPA.
3- O núcleo com um posicionamento mais caudal ao nível do bulbo e por isso
localizado mais proximamente a CPA que foi avaliado no presente trabalho,
foi o núcleo da rafe obscuro que, como os dois núcleos mencionados
anteriormente, também demonstrou fazer parte desta via direta para a CPA
por apresentar em seus corpos celulares uma intensa marcação com os
grânulos de HRP que foram microinjetados na CPA.
A imensa rede de comunicação realizada pelos núcleos caudais da rafe com
diversas regiões do sistema nervoso como medula espinhal, tronco encefálico e
áreas suprasegmentares do sistema nervoso central, nos permite propor uma
enorme gama de funções realizadas por esta região na manutenção da homeostasia
do corpo através de diversos mecanismos de atuação. Porem, estas amplas vias de
intercomunicação não nos permite uma analise simplória de sua participação no
controle destas diversas funções. A atuação destes núcleos no controle
cardiovascular vem sendo bastante demonstrada já há algum tempo.
52
Ficou claro que a grande maioria dos neurônios que se projetam para a CPA está
situada entre -11,60 mm a -11,80 mm do Bregma, demonstrando que estas
projeções estão concentradas em uma área bastante especifica dentro do tronco
cerebral.
As vias encontradas neste trabalho ajudam a reforçar a participação dos núcleos
caudais da refe no controle cardiovascular, aja visto que a CPA também demonstra
um claro envolvimento neste controle, principalmente por suas interligações com os
demais núcleos situados na região ventrolateral bulbar. Entretanto, apesar de
demonstrado a existência destas vias entre duas áreas envolvidas na manutenção
da homeostasia cardiovascular, e que parte dela pareça atuar através de receptores
de aminoácidos excitatórios (NRO para a área pressora caudal), faz-se necessários
estudos futuros que confirmem a participação especifica dos receptores e
neurotransmissores envolvidos nestes processos.
53
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