( PDF ) Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-codificadores intrônicos em células humanas

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

PAULO DE PAIVA ROSA AMARAL

Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-

codificadores intrônicos em células humanas

São Paulo

Data do Depósito na SPG:

20/09/2006

Vinte de Setembro de Dois Mil e Seis

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PAULO DE PAIVA ROSA AMARAL

Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-

codificadores intrônicos em células humanas

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Mestre em Bioquímica

Orientadora: Profa. Dra. Aline Maria da Silva

São Paulo

2006

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO DO CONJUNTO DAS QUÍMICAS

Amaral, Paulo de Paiva Rosa

Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-codificadores intrônicos em

células humanas/ Paulo de Paiva Rosa Amaral; orientadora Aline Maria da Silva.

---São Paulo, 2006.

115 f.

Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Área

de Concentração: Bioquímica) – Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

1. RNA não-codificador. 2. Íntron. 3. Transcrição. 4. Receptor de Andrógeno. 5. RNA

Polimerase II. 6. α-Amanitina.

Paulo de Paiva Rosa Amaral

Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-codificadores intrônicos em células

humanas.

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Mestre em Bioquímica

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

À minha mãe, Dóris, que com amor sempre se doou completa e

incondicionalmente para a felicidade e educação de seus filhos.

A ela devo tudo.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Aline Maria da Silva, que contribuiu decisivamente para esta etapa da

minha formação. Pelo encorajamento, atenção e orientação constantes, e,

especialmente, por sua amizade e generosidade.

Ao Prof. Dr. Sergio Verjovski-Almeida, pela co-orientação e suporte, mas

principalmente por seu entusiasmo científico que me serviu de grande incentivo. Ao

Prof. Dr. Eduardo Reis, cujo apoio e colaboração foram muito importantes para o

desenvolvimento deste trabalho.

Ao Helder Nakaya, grande amigo e companheiro de trabalho, que participou

ativamente em todo o projeto e que tornou minha estada em São Paulo mais

divertida.

Aos amigos do laboratório que me aconselharam, apoiaram e ensinaram durante

esse período: Alexandre, Ana Carolina, Andrea, Daniela Beton, Daniela Gonzalez,

Evelyn, Fernanda, Isabel, Ivone, Juliana, Layla e Renato. Em especial, ao Paulo

Zaini (Paulinho), companheiro de várias iniciativas, Patrícia e Leandro, pelos bons

momentos compartilhados.

Também aos amigos do Lab-Verjo/Edu com quem tive uma convivência diária

agradável e troquei experiências enriquecedoras. Em especial, ao Rodrigo Louro,

parceiro em várias etapas deste projeto, e aos amigos mais próximos Thiago, Júlio,

André e Ana.

Agradeço enormemente aos Professores que cederam equipamentos e espaço de

seus laboratórios: Dr. Armando Ventura (ICB), Dra. Carla Columbano, Dra. Maria

Julia Manso Alves, Dra. Suely Gomes e Dra. Mari Sogayar. Também aos membros

de seus laboratórios, especialmente à Fernanda Festa que contribuiu ativamente

para este trabalho.

Ao Milton e Diorge, que co-habitaram comigo neste período e com amizade e

camaradagem me proporcionaram uma convivência alegre e familiar.

Aos participantes do grupo Ciência com Cerva, com os quais vivi momentos muito

divertidos e instrutivos. Aos PDBs: Blanes, Mineiro, Pererê, Sinistro, Paulinho,

Luquito, Guliver, Mona, Lili, Fernandinha (honoris causa), Pipoca, Rita, Júlio, Gui e

Zé, Murilon, Antero; e também às PDTs Camila, Mari e Irina; por tornarem a pós-

graduação e os congressos muito mais legais do que já são.

Ao Departamento de Bioquímica, pelo ótimo trabalho e estrutura oferecidos. Aos

professores, funcionários e todos os amigos que tive a sorte de conhecer neste

período no Instituto de Química, especialmente ao pessoal do Bloco Zero (Robson,

Stefano, Alex, etc), do Lab-Terra e demais colegas do Bloco 12. Também aos meus

Professores e grandes amigos da Universidade de Brasília.

À Fernanda Ely, por existir.

À minha mãe e aos meus irmãos, Daniela e Walter Júnior, que são meus melhores

amigos e verdadeiros pontos de apoio. À minha avó Maria Leite e ao meu avô Dito

(in memorian), que sempre me deram suporte e carinho. Agradeço muito a todos os

tios, primos e amigos, que me apóiam de todas as formas. Também ao meu pai

Walter (in memorian), cujo exemplo é marcante em minha vida.

A Deus, por me proporcionar a vida para vivê-la e estudá-la.

“Escolha um trabalho que você ama, e nunca terá que trabalhar um dia em sua

vida.”

Confúcio

RESUMO

Amaral, P.P.R. Estudo da biossíntese e regulação de RNAs não-codificadores

intrônicos em células humanas. 2006. 115 f. Dissertação (Mestrado) - Programa

de Pós-Graduação em Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2006.

Recentemente, tem sido demonstrado que a maioria dos RNAs transcritos em

células humanas são RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs) originados de

íntrons ou regiões intergênicas. Em trabalhos anteriores realizados por nosso grupo,

foram descritos longos ncRNAs transcritos de regiões intrônicas de genes

codificadores e cuja expressão foi correlacionada ao grau de diferenciação de

tumores de próstata, apontando para a relevância fisiológica desta classe de

transcritos. Apesar de sua abundância, as propriedades, funções e regulação da

grande maioria dos ncRNAs ainda não foram elucidadas. O objetivo do presente

trabalho foi investigar a biossíntese de ncRNAs intrônicos em células humanas,

primordialmente a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II), bem como aspectos

de sua regulação. Primeiramente, o modelo de regulação da expressão gênica por

hormônio andrógeno foi utilizado para avaliação da participação direta de um fator

de transcrição de RNAP II, o Receptor de Andrógeno (AR), na modulação da

transcrição de ncRNAs intrônicos. Utilizando-se a técnica de imunoprecipitação da

cromatina, foi detectada a ligação do AR ao elemento de resposta a andrógeno

(ARE) presente em um possível promotor de um transcrito intrônico antisenso

(derivado do locus Myo5A), cuja expressão é aumentada em células da linhagem

LNCaP tratadas com o hormônio. A ligação ao ARE foi induzida pelo tratamento,

sugerindo que o efeito do andrógeno na expressão do ncRNA é mediado pelo AR.

Em uma segunda abordagem, o efeito da inibição da transcrição por RNAP II com α-

amanitina por 24 h em células LNCaP foi avaliado com o uso de microarranjos de

oligonucleotídeos representando transcritos total ou parcialmente intrônicos, além de

éxons de genes codificadores. A expressão de menos de 20 % dos transcritos

intrônicos foi afetada, fração significativamente menor que a observada para os

transcritos exônicos (40 %). Ainda que a maioria dos ncRNAs intrônicos

diferencialmente expressos tenha sua abundância diminuída, interessantemente, 13

a 16 % foram aumentados, contrastando com aproximadamente 2 a 3 % de

exônicos que aumentaram. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a

RNAP II atua na transcrição de ncRNAs intrônicos, mas que uma fração

considerável pode ser transcrita por outra RNA Polimerase.

Palavras chave: RNA não-codificador, Íntron, Transcrição, Receptor de Andrógeno,

RNA Polimerase II, α-Amanitina

ABSTRACT

Amaral, P.P.R. Investigation of the biosynthesis and regulation of intronic non-

coding RNAs in human cells. 2006. 115 p. Master’s Thesis - Biochemistry

Graduate Program. Instituto de Química. Universidade de São Paulo.

It has been recently shown that the bulk of the transcription in human cells is

comprised of non-protein-coding RNAs (or noncoding RNAs - ncRNAs) transcribed

from introns and intergenic regions. Previous work from our group has demonstrated

that expression of long intronic ncRNAs can be correlated to the degree of prostate

tumor differentiation, underscoring the physiological relevance of these transcripts.

However, the properties, functions, and regulation of this huge population of ncRNAs

remain largely unknown. The present work aimed to investigate the biosynthesis of

intronic ncRNAs and aspects of its regulation in human cells, focusing on the

contribution of RNA Polymerase II (RNAP II). Initially, the model of regulation of gene

expression by androgen hormone was used in order to evaluate the participation of

the RNAP II transcription factor Androgen Receptor (AR) in the transcriptional

regulation of intronic ncRNAs. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed

the binding of the AR in an androgen response element (ARE) present in a putative

promoter driving the expression of an antisense intronic transcript in Myo5A locus in

LNCaP cells. The interaction occurred in an androgen-inducible fashion, along with

the up-regulation of the transcript, suggesting that hormone activation occurred in a

direct manner mediated by the AR. In a different approach, the effect of RNAP II

inhibition with α-amanitin for 24 h in LNCaP cells was analyzed using an oligoarray

representing totally and partially intronic transcripts, as well as exons of protein-

coding genes. The expression of less than 20 % of the intronic transcripts was

affected by the treatment, contrasting to a significantly higher fraction observed for

exonic messages (40 %). Moreover, most differentially expressed intronic transcripts

were down-regulated, but strikingly 13 to 16 % were up-regulated in cells with

blocked RNAP II, while this fraction for exonic transcripts was about 2 %. The results

described here demonstrate that RNAP II in fact plays a role in intronic transcription

in human cells, but also highlight that another transcriptional system may account for

the biogenesis of a fraction of intronic ncRNAs.

Keywords: Noncoding RNA, Introns, Transcription, Androgen Receptor, RNA

Polymerase II, α-Amanitin

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AR Receptor de Andrógeno

ARE Elemento de Resposta a Andrógeno

AS Antisenso

BSA Albumina de soro bovino

cDNA DNA complementar

cRNA RNA complementar amplificado

ChIP Imunoprecipitação da cromatina

DEPC Dietilpirocarbonato

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

DNase Desoxirribonuclease

dNTP Desoxinucleotídeo

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EST Expressed Sequence Tag

GO Gene Ontology

IgG Imunoglobulina G

kb Quilobase

MOPS Ácido 3-N-morfolino propanosulfônico

mRNA RNA mensageiro

ncRNA RNA não-codificador de proteínas

nt Nucleotídeos

Oligo Oligonucleotídeo

pb Pares de bases

PBS

Solução salina de tampão de fosfato

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PIN Transcrito parcialmente intrônico

PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil

qPCR PCR quantitativo

RACE Rapid Amplification of cDNA Ends

RNA Ácido ribonucléico

RNase Ribonuclease

RNAP RNA Polimerase

RT Transcrição reversa

rpm Rotações por minuto

S/AS Senso/Antisenso

SDS Dodecilsulfato de sódio

SFB Soro fetal bovino

TE Tampão Tris-EDTA

TIN Transcrito totalmente intrônico

Tris Hidroximetil aminometano

U Unidade de atividade enzimática

UV Luz ultravioleta

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................16

1.1. Classes de RNAs em Eucariotos .............................................................................. 16

1.2. Complexidade do Transcritoma Humano.................................................................. 18

1.3. RNAs Não-Codificadores de Proteínas (ncRNAs) .................................................... 22

1.3.1. ncRNAs Pequenos .............................................................................................. 24

1.3.2. ncRNAs Longos .................................................................................................. 28

1.3.2.1. Características Estruturais e Evidência Funcional ........................................ 28

1.3.2.2. Mecanismos de Atuação Funcional............................................................... 32

1.4. Biogênese dos ncRNAs............................................................................................. 39

2. OBJETIVOS.......................................................................................................43

3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .............................................................44

3.1. Linhagens Celulares Humanas e Condições de Cultivo ........................................... 44

3.2. Planejamento dos Oligonucleotídeos........................................................................ 45

3.3. Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP) ................................................................... 46

3.3.1. Identificação Computacional de Possíveis Sítios de Ligação ao Receptor de

Andrógeno (AR)............................................................................................................. 46

3.3.2. Fixação e Fragmentação da Cromatina .............................................................. 47

3.3.3. Imunoprecipitação com Anticorpo anti-Receptor de Andrógeno......................... 49

3.4. Obtenção e Análise de RNA...................................................................................... 50

3.5. Transcrição Reversa Fita-Específica......................................................................... 52

3.6. Ensaio de Atividade de Promotor.............................................................................. 53

3.6.1. Amplificação e Purificação do Fragmento de DNA Genômico............................ 53

3.6.2. Obtenção da construção pGL3_Saf-prom........................................................... 54

3.6.3. Transfecção de Células Jurkat............................................................................ 56

3.6.4. Ensaio da Atividade de Luciferase...................................................................... 56

3.7. Análise da Expressão Gênica com Microarranjos de DNA ....................................... 57

3.7.1. Microarranjos de Oligonucleotídeos (Oligoarrays) .............................................. 57

3.7.2. Hibridação dos Oligoarrays ................................................................................. 59

3.7.3. Tratamento e Análise dos Dados da Hibridação dos Oligoarrays....................... 60

3.7.4. Análise de Enriquecimento de GO ...................................................................... 62

4. RESULTADOS ..................................................................................................63

4.1. Análise da Regulação da Expressão de Transcritos Intrônicos por

Andrógeno..........................................................................................................................63

4.1.1. Busca bioinformática por elementos de resposta a andrógeno .......................... 63

4.1.2. Imunoprecipitação da Cromatina com Anticorpo anti-AR ................................... 65

4.2. Avaliação da Contribuição da RNAP II na Expressão de ncRNAs Intrônicos........... 71

4.2.1. Análise da Expressão do Transcrito Antisenso SAF em Células Jurkat ............. 72

4.2.1.1. Efeito da α-Amanitina na Expressão de SAF ................................................ 72

4.2.1.2. Análise do Possível Promotor de SAF .......................................................... 74

4.2.2. Avaliação do Efeito da α-Amanitina na Transcrição Intrônica Utilizando

Oligoarrays .................................................................................................................... 77

5. DISCUSSÃO......................................................................................................86

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................101

LISTA DE ANEXOS................................................................................................115

1. Introdução

1.1. Classes de RNAs em Eucariotos

Diversos tipos de RNA são encontrados em células eucarióticas

desempenhando diferentes papéis. Na visão clássica, a função da grande maioria

dos RNAs converge para um único processo: síntese de proteínas. Esta concepção

é refletida no chamado “dogma central da Biologia Molecular”, que apresenta o fluxo

da informação genética em todos os seres vivos na forma DNA→RNA→Proteína

(Crick, 1970). De fato, dentre os RNAs melhor caracterizados, os RNAs ribossomais

(rRNAs) são componentes estruturais e catalíticos dos ribossomos, estruturas

ribonucleoprotéicas onde ocorre o processo de tradução; os RNAs mensageiros

(mRNAs) codificam a informação armazenada no DNA que determina a seqüência

de aminoácidos dos polipeptídeos; e os RNAs transportadores (tRNAs) carregam os

aminoácidos para os ribossomos durante a síntese protéica. Outros RNAs pequenos

também são indiretamente importantes para a produção de proteínas, como os

snRNAs (small nuclear RNAs) e snoRNAs (small nucleolar RNAs), os quais atuam

no processo de splicing e na biossíntese de ribossomos, respectivamente

(Bachellerie et al., 2002; Patel & Steitz, 2003). No entanto, além destes, existem

outros RNAs presentes em virtualmente todos os eucariotos, tais como RNA

telomerásico, envolvido na síntese dos telômeros (Chen et al., 2000); SRP RNA,

componente da SRP (Signal Recognition Particle), que atua no direcionamento de

peptídeos nascentes para o retículo endoplasmático (Zwieb et al., 2005); e RNAse P

RNA, componente catalítico da Ribonuclease P (Hartmann & Hartmann, 2003).

Assim, de forma geral, é possível separar os RNAs em dois grupos: os que

contêm a informação que será traduzida em proteínas (os mRNAs) e os que não

contém, denominados RNAs não-codificadores de proteínas ou RNAs não-

codificantes (ncRNAs). Dentre estes últimos, os apresentados acima possuem níveis

de expressão relativamente constantes, desempenham papéis estruturais ou

catalíticos necessários para a viabilidade celular, e, portanto, podem ser chamados

de “ncRNAs constitutivos” (Morey & Avner, 2004).

Os genes que codificam mRNAs e ncRNAs constitutivos ocupam uma fração

muito pequena do genoma em eucariotos superiores (Mattick & Makunin, 2006). O

genoma humano é formado por aproximadamente 3 bilhões de pares de bases (pb),

dos quais menos de 1,5 % (cerca de 34 milhões de pb) fazem parte de seqüências

codificadoras de proteínas (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Em relação às

regiões de eucromatina, esta fração codificadora representa em torno de 2 %

(Consortium, 2004) e, mesmo considerando-se apenas as regiões não-repetitivas do

genoma, não é maior que 2,3 % (Frith et al., 2005).

As regiões não-codificadoras são compostas por seqüências intergênicas, as

quais representam a maior parte do genoma humano, e íntrons. Estes correspondem

a seqüências existentes entre as porções codificadoras (éxons) dos genes e que são

removidas dos pré-mRNAs para a formação dos mRNAs maduros

. Cerca de 92 %

dos genes codificadores de proteínas em humanos possuem íntrons (em média de 8

a 9 por gene) e, enquanto o tamanho médio dos éxons é de ~150 pb, o dos íntrons é

de ~5.500 pb (Fedorova & Fedorov, 2005). Deste modo, os íntrons correspondem a

aproximadamente 95 % do total de pares de bases dos genes codificadores, o que

equivale a um terço do genoma (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Na

verdade, todas as seqüências codificadoras de proteínas, seqüências de ncRNAs

constitutivos, e elementos regulatórios de DNA já conhecidos contabilizam apenas 5

% do tamanho total do genoma humano (Fedorova & Fedorov, 2005). Não obstante,

Em um sentido mais amplo, íntrons podem ser definidos como as porções de transcritos primários

(codificadores ou não) que são removidas pós-transcricionalmente pelo processo de splicing, sendo

flanqueados por éxons (seqüências transcritas que são mantidas no transcrito maduro).

estudos recentes vêm demonstrando que pelo menos 60 % do genoma humano é

transcrito (Carninci et al., 2005). Portanto, em oposição ao “dogma central”

mencionado acima, a maior parte do transcritoma humano é composta por RNAs

não-codificadores de proteínas (Mattick & Makunin, 2006; Pearson, 2006), que não

fazem parte do grupo de ncRNAs constitutivos, mas pertencem a novas classes de

ncRNAs que serão apresentadas adiante.

1.2. Complexidade do Transcritoma Humano

Inicialmente, a composição do conjunto de moléculas de RNA que define o

transcritoma humano foi avaliada com base na anotação do genoma, realizada

principalmente através do mapeamento de mRNAs na seqüência de DNA (Lander et

al., 2001; Venter et al., 2001). Nos últimos anos, contudo, análises de expressão

gênica em larga-escala têm demonstrado que a atividade transcricional do genoma

humano e de outros mamíferos e eucariotos superiores é muito maior do que havia

sido previsto, com a maioria dos transcritos mapeando fora de regiões anotadas do

genoma (para revisão ver Willingham & Gingeras, 2006).

Uma análise pioneira da atividade transcricional dos cromossomos 21 e 22

com microarranjos de alta densidade (tiling arrays) indicou que a diversidade de

transcritos em células humanas é aproximadamente 10 vezes maior do que predito

pela anotação gênica existente (Kapranov et al., 2002). Da mesma forma, Kampa et

al. (2004), em uma análise da atividade dos mesmos cromossomos em 11 linhagens

celulares, detectaram a expressão em 26,5 % dos pontos dos microarranjos, sendo

que apenas 2,6 % representavam genes codificadores (Kampa et al., 2004).

Consistentemente, esta abundância de transcritos em humanos e murinos vem

sendo confirmada por outros experimentos de tiling array cobrindo grandes regiões

genômicas (Bertone et al., 2004; Cheng et al., 2005; Kapranov et al., 2005) e

também por diferentes abordagens experimentais: seqüenciamento de bibliotecas de

cDNA (Okazaki et al., 2002; Numata et al., 2003; Carninci et al., 2005), MPSS

(Massively Parallel Signature Sequencing) (Jongeneel et al., 2005), SAGE (Serial

Analysis of Gene Expression) (Chen et al., 2002; Saha et al., 2002), ou predições

computacionais (Washietl et al., 2005; Glusman et al., 2006).

Com o emprego da tecnologia de tiling arrays, foi possível avaliar a atividade

transcricional de toda a porção não-repetitiva do genoma humano (Bertone et al.,

2004). Utilizando apenas a fração poli(A)+ de RNA de fígado de vários indivíduos,

um total de 13.889 unidades transcricionais de 209 a 3.438 nucleotídeos (nt) foram

detectadas, das quais 64,5 % (8.958) mapeiam em regiões não-anotadas do

genoma. Deste grupo, 3.095 são transcritos que mapeiam inteiramente dentro de

íntrons, sendo que 1.566 (50,6 %) são transcritos na mesma orientação do gene

codificador e a outra metade é transcrita na fita oposta, gerando RNAs antisenso.

Um quadro similar foi revelado com tiling arrays cobrindo 10 cromossomos

humanos, cerca de 30 % do genoma, com uma maior resolução que as análises

anteriores (Cheng et al., 2005). Analisando a transcrição em 8 linhagens celulares

humanas, foi observada uma hibridação de RNAs poli(A)+ de cada linhagem em

aproximadamente 5 % (em média) dos nucleotídeos representados no array, ou,

considerando todas as linhagens celulares, em cerca de 10 %. Notavelmente, 56,7

% dos transcritos correspondem a mensagens não-anotadas, das quais, em média,

31,8 % mapeiam em regiões intergênicas e o restante, em regiões intrônicas. Uma

análise pelo método de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) mostrou

transcritos com tamanho médio de 680 nt, dos quais ~36 % não sofrem splicing.

Interessantemente, para 50 % dos transcritos intrônicos, encontrados inteiramente

dentro de íntrons ou com sobreposição com éxons, foi observada a expressão de um

RNA antisenso, apontando para a abundância de pares senso/antisenso (S/AS)

intrônicos (Cheng et al., 2005).

Todas estas observações têm alterado a compreensão da organização e

funcionamento dos genomas eucarióticos. Ao contrário de concentrar toda a

atividade transcricional em uma fração minoritária de genes codificadores, o genoma

parece ser formado por redes intricadas de regiões transcritas, incluindo porções

codificadoras e não-codificadoras, gerando moléculas de RNA que se sobrepõe total

ou parcialmente, na mesma orientação ou em orientações opostas (Carninci et al.,

2005; Kapranov et al., 2005).

Em uma análise das seqüências de 180 mil transcritos de camundongos e

humanos com as extremidades 5’ e 3’ determinadas foi observado que grande parte

do genoma é organizada em regiões transcritas inteiramente em ambas as fitas,

chamadas de “florestas transcricionais”, intercaladas por regiões de desertos

transcricionais (Carninci et al., 2005). Em muitos casos, em um mesmo locus é

observada a expressão de cadeias de pelo menos três transcritos independentes

com sobreposição S/AS ou com promotores bidirecionais (Engstrom et al., 2006).

Mais ainda, dados experimentais indicam que mais de 70 % dos transcritos em

mamíferos possuem sobreposição com um RNA antisenso, que pode ser

sobreposição total, apenas na extremidade 3’ (transcrição convergente) ou apenas

na extremidade 5’ dos transcritos (transcrição divergente), sendo esta a mais

prevalente neste estudo (Katayama et al., 2005). Estas observações somam-se ao

fato de que a maioria dos transcritos possui sítios de iniciação da transcrição, de

terminação e padrões de splicing alternativos (Carninci et al., 2005), aumentando

ainda mais a complexidade do transcritoma.

Recentemente, nosso grupo realizou uma análise da extensão da transcrição

intrônica em humanos, através do mapeamento de seqüências expressas em

regiões intrônicas (Nakaya et al., 2006)

. Após a filtragem e agrupamento de mais de

5 milhões ESTs depositadas em bancos de dados públicos e mapeamento das suas

coordenadas no genoma, foram encontradas aproximadamente 55 mil unidades

transcricionais (representadas por clusters de ESTs), sem evidência de splicing,

otalmente intrônicas (TIN) e 12,6 mil parcialmente intrônicas (PIN) (com

sobreposição com um éxon), cujos tamanhos médios foram mais de quatro vezes

superior ao observado para os clusters exônicos (Figura 1). Uma análise de

potencial codificador indicou que 98 % e 90 % dos transcritos TIN e PIN,

respectivamente, provavelmente correspondem a ncRNAs. Além disso, foi

observado que mais de 74 % dos genes humanos anotados possuem regiões

intrônicas transcricionalmente ativas, ressaltando a abundância dos ncRNAs

intrônicos.

Nakaya et al. (Submetido). ANEXO 1 - incluso no CD-ROM suplementar a esta Dissertação.

% dos transcritos da classe correspondente

Extensão (bases)

Éxon (tamanho médio: 141 bases)

Íntron

ESTs

Cluster Parcialmente Intrônico

(tamanho médio: 719 bases)

Cluster Totalmente Intrônico

(tamanho médio: 573 bases)

Agrupamento das ESTs

Gene RefSeq

% dos transcritos da classe correspondente

Extensão (bases)

Éxon (tamanho médio: 141 bases)

Íntron

ESTs

Cluster Parcialmente Intrônico

(tamanho médio: 719 bases)

Cluster Totalmente Intrônico

(tamanho médio: 573 bases)

Agrupamento das ESTs

Gene RefSeq

Figura 1 - Distribuição de tamanho de unidades transcricionais identificadas em loci

anotados do genoma humano. Os transcritos foram definidos pelo agrupamento (cluster) de

ESTs mapeando totalmente ou parcialmente em íntrons, ou em éxons de genes curados

(RefSeq) (adaptado de Nakaya et al., submetido).

1.3. RNAs Não-Codificadores de Proteínas (ncRNAs)

Como já mencionado, existe uma grande diversidade de ncRNAs não-

constitutivos em células eucarióticas, os quais incluem transcritos que variam de 19

a milhares de nucleotídeos. Embora poucos ncRNAs tenham sido caracterizados, a

maioria não apresenta conservação de seqüência e apresenta baixos níveis de

expressão (Johnson et al., 2005). Estas observações, associadas à enorme fração

de transcritos que os ncRNA representam, têm levantado um debate em torno da

sua funcionalidade e relevância fisiológica (Dennis, 2002; Brosius, 2005; Castillo-

Davis, 2005; Huttenhofer et al., 2005; Johnson et al., 2005).

De um lado, há a hipótese de que ncRNAs representam meramente ruído

transcricional, produzido pelo reconhecimento ilegítimo de promotores pela RNA

Polimerase II, ou apenas produtos secundários de processos de ativação da

transcrição que ocorrem na cromatina para permitir a expressão de genes

codificadores de proteínas (Dennis, 2002; Cawley et al., 2004; Wang et al., 2004;

Kapranov et al., 2005). Por outro lado, tem sido proposto que estes ncRNAs ainda

não caracterizados podem desempenhar funções regulatórias (Mattick, 2003;

Szymanski & Barciszewski, 2003; Reis et al., 2005). Especula-se que ncRNAs

poderiam compor redes de sinalização que controlariam e integrariam processos

celulares, com papel determinante na ontogenia e evolução dos eucariotos (Mattick,

1994; Mattick, 2001). Esta hipótese é baseada em uma série de observações

experimentais e comparações entre os genomas e transcritomas de diversos

organismos, que revelam, por exemplo, que a quantidade de DNA não-codificador e

a razão do número de RNAs não-codificadores/RNAs codificadores aumentam

proporcionalmente à complexidade do organismo, enquanto a mesma correlação

não é observada para o número de genes codificadores (Mattick, 2004; Claverie,

2005; Frith et al., 2005; Amaral & Nakaya, 2006).

De fato, ncRNAs têm sido associados à regulação de uma grande variedade

de processos celulares, tais como splicing alternativo, edição de RNA (conversão de

adenosinas em inosinas), silenciamento gênico, compensação de dose, imprinting

genômico, metilação de DNA e formação de heterocromatina, expandindo o

repertório de papéis dos RNAs (Figura 2) (para revisão ver Mattick & Makunin,

2006).

Figura 2 - Representação esquemática das funções desempenhadas por ncRNAs em células

eucarióticas. São apresentados exemplos de diferentes papéis regulatórios envolvendo

ncRNAs, em contraste com a visão do RNA atuando apenas como intermediário na síntese

rotéica. Os círculos representam as proteínas envolvidas no processamento e vias de

atuação de alguns tipos de ncRNAs (siRNA: short interfering RNA, miRNA: microRNA,

dsRNA: double-

tranded RNA

)

(

extraído de Amaral & Naka

2006

)

1.3.1. ncRNAs Pequenos

Dentre os ncRNAs, os mais estudados e caracterizados pertencem às classes

de pequenos RNAs (small RNAs), com destaque à classe dos microRNAs (miRNAs).

Os miRNAs são em geral originados a partir de unidades transcricionais

independentes, os pri-miRNAs (transcritos primários), que formam estruturas

secundárias características e passam por duas etapas principais de processamento

até formarem miRNAs maduros de cerca de 21 a 23 nt (para revisão ver Bartel,

2004; Mattick & Makunin, 2005). Alguns miRNAs encontrados dentro de regiões

intrônicas de genes podem ser originados de íntrons processados (Rodriguez et al.,

2004).

Os primeiros miRNAs foram detectados em Caenorhabditis elegans

regulando o desenvolvimento larval (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993;

Reinhart & Bartel, 2002) e hoje eles são reconhecidos como uma classe fundamental

de moléculas regulatórias presentes em animais, plantas e vírus (Ruvkun et al.,

2004; Berezikov & Plasterk, 2005). As moléculas de miRNA atuam tipicamente em

trans (sobre RNAs de diferentes loci), como RNAs antisenso, direcionando de forma

específica a degradação ou a inibição da tradução de RNAs alvo que apresentam

complementaridade total ou parcial, respectivamente (Bartel, 2004; Petersen et al.,

2006). O processo envolve a via de “interferência de RNA”, ou RNAi (RNA

interference), no qual os miRNAs se associam a complexos contendo

endonucleases, denominados RISC (RNA induced silencing complex), e direcionam

o silenciamento pós-transcricional de genes específicos (Bartel, 2004).

A maioria dos miRNAs apresenta seqüências conservadas (Lagos-Quintana

et al., 2003) e muitos têm a expressão modulada espacial ou temporalmente

(Krichevsky et al., 2003; Kasashima et al., 2004; Liu et al., 2004; Wienholds et al.,

2005), participando da regulação de uma enorme gama de processos fisiológicos

(Ambros, 2004), inclusive em tumorigênese (Esquela-Kerscher & Slack, 2006). Um

miRNA pode ter muitos alvos e um RNA pode ser alvo de vários miRNAs,

ampliando, assim, sua influência em redes de regulação da expressão gênica (Farh

et al., 2005; Lim et al., 2005). Alguns estudos indicam que aproximadamente 30 %

dos genes em humanos têm a expressão modulada por miRNAs (Krek et al., 2005;

Lewis et al., 2005), sendo que já foram descritos mais de 400 miRNAs (Griffiths-

Jones, 2004) e cerca de mil foram preditos computacionalmente (Berezikov et al.,

2005), com muitos validados experimentalmente (Berezikov et al., 2006).

Além dos miRNAs, existem outras classes já conhecidas, como snoRNAs, e

novas classes de pequenos RNAs que atuam como RNAs regulatórios (Liu et al.,

2005; Mattick & Makunin, 2005). Os snoRNAs possuem de 60 a 300 nt e são

originados a partir do processamento de íntrons excisados ou da clivagem

endonucleolítica de transcritos primários. Sua atuação se baseia no pareamento de

pequenos trechos de sua seqüência com RNAs alvo, em geral envolvidos no

processo de modificação de rRNAs, no qual direcionam a atuação de proteínas que

promovem a pseudouridilação ou metilação de bases específicas (Kiss, 2002). No

ser humano, são encontrados mais de 300 snoRNAs (Liu et al., 2005); contudo,

muitos não possuem alvos conhecidos (chamados de snoRNAs órfãos) e podem

regular outros processos, tendo inclusive mRNAs como alvos (Kiss, 2002; Mattick &

Makunin, 2005). Alguns também não se enquadram na classe de ncRNAs

constitutivos por apresentarem expressão regulada ou tecido-específica (Cavaille et

al., 2000; Cavaille et al., 2002). Por exemplo, o snoRNA cérebro-específico HBII-52

pareia especificamente com o pré-mRNA do receptor de serotonina 5-HT2CRA,

regulando sua edição e splicing alternativo, com importantes implicações fisiológicas

e patológicas (Kishore et al., 2005). Além disso, até mesmo a alguns snRNAs (small

nuclear RNAs), como o U1 e o 7SK, têm sido atribuídos papéis regulatórios (Yang et

al., 2001; Kwek et al., 2002; Haaland et al., 2005).

Os também bem conhecidos siRNAs (short interfering RNAs) constituem uma

família importante de RNAs regulatórios e, similar aos miRNAs, são pequenas

moléculas de em torno de 22 nt, porém produzidas a partir de longas duplas fitas de

RNAs (dsRNA, double-stranded RNA) de origem exógena ou endógena. Estes RNAs

foram descobertos em plantas (Hamilton & Baulcombe, 1999), e em seguida

detectados em diversos eucariotos, nos quais originalmente lhes foi atribuída a

função de direcionamento da degradação de RNAs específicos (por exemplo RNAs

virais ou de transposons) (Hammond et al., 2000). Contudo, hoje se sabe que

siRNAs ocorrem naturalmente e também podem atuar na sinalização para a

degradação e inibição da tradução de RNAs alvo em cis ou em trans (Zeng et al.,

2003; Cullen, 2004a).

Desta forma, reconhece-se que miRNAs e siRNAs possuem muitas

semelhanças, diferenciando-se fundamentalmente em sua biogênese (ver adiante),

sendo que ambos são processados e atuam por vias relacionadas, envolvendo a

maquinaria de RNAi, com algumas etapas e componentes diferentes (especialmente

as proteínas da família Argonauta, componentes centrais dos complexos RISC, que

se associam ao RNA regulatório e promovem o silenciamento do RNA alvo) (Bartel,

2004; Sontheimer & Carthew, 2004). Vale ressaltar que suas funções vão além das

já mencionadas, incluindo regulação ao nível transcricional (Bernstein & Allis, 2005).

Pequenos RNAs e a via de RNAi têm sido associados ao controle da estrutura da

cromatina, por exemplo direcionando modificações de histonas e de DNA essenciais

para o silenciamento da cromatina e dinâmica estrutural dos cromossomos em

animais, plantas, fungos e protozoários (Volpe et al., 2002; Bayne & Allshire, 2005;

Matzke & Birchler, 2005; Mochizuki & Gorovsky, 2005; Wassenegger, 2005).

Na verdade, diversos tipos de siRNAs endógenos e novas classes de

pequenos RNAs têm sido encontradas em diferentes eucariotos (Kim, 2005; Mattick

& Makunin, 2005; Zamore & Haley, 2005). A descoberta recente dos piRNAs (Piwi-

interacting RNAs) constitui a primeira demonstração da ocorrência de RNAs

pequenos endógenos em mamíferos além dos miRNAs e indica que muitos RNAs

regulatórios pequenos ainda estão por ser descobertos. Milhares destes RNAs de 26

a 31 nt (certamente processados de longos transcritos primários) foram encontrados

associados com proteínas Argonauta da subfamília PIWI e, sendo expressos

especificamente e de forma extremamente abundante em testículos de ratos e

camundongos, podem estar envolvidos no processo de espermatogênese em

mamíferos (Aravin et al., 2006; Girard et al., 2006; Grivna et al., 2006; Lau et al.,

2006; Watanabe et al., 2006).

1.3.2. ncRNAs Longos

1.3.2.1. Características Estruturais e Evidência Funcional

Apesar da sua relevância funcional, os pequenos RNAs conhecidos e seus

precursores representam apenas uma pequena parcela do genoma e do

transcritoma humano. Como discutido anteriormente, as análises de tiling arrays e

seqüenciamento em larga escala de cDNAs completos têm detectado transcritos de

tamanho médio maior que 0,5 kb, muitas vezes bem acima de 1 kb, ocorrendo fora

das regiões de éxons de genes anotados e apresentando pouco ou nenhum

potencial codificador. Alguns destes RNAs podem codificar pequenos peptídeos

(Frith et al., 2006), mas para a grande maioria não há evidência de capacidade

codificadora, devendo constituir de fato ncRNAs, dos quais poucos foram

caracterizados. Não se sabe, por exemplo, se (e em qual proporção) estes RNAs

longos podem ser processados e dar origem a novos RNAs regulatórios pequenos.

Muitos ncRNAs longos detectados compartilham características estruturais

com mRNAs, tais como presença de cauda poli(A), cap 5` e splicing, sendo

chamados de mRNA like ncRNAs (Erdmann et al., 2001; Numata et al., 2003).

Porém, estudos recentes demonstram que uma fração majoritária não possui estas

características. Surpreendentemente, foi observado que cerca de metade de todos

os transcritos em células humanas são retidos no núcleo e, mais ainda, que

aproximadamente 44 % dos RNAs nunca são poliadenilados e 37 % são bimórficos,

encontrados nas formas poli(A)+ e poli(A)- (Cheng et al., 2005). É interessante notar

que mais da metade dos RNAs poli(A)- nunca exportada para o citoplasma são

transcritos intrônicos.

Uma grande parcela dos ncRNAs longos encontrados com as metodologias

baseadas em síntese de cDNA com oligo(dT) não correspondem necessariamente a

RNAs pós-transcricionalmente poliadenilados, mas a transcritos ainda maiores

detectados devido à existência de trechos ricos em adeninas em sua seqüência, que

servem de sítios internos de anelamento (internal priming) (Furuno et al., 2006).

Analisando apenas regiões intergênicas, Furuno e colaboradores (2006)

encontraram 66 ncRNAs maiores que 10 kb, chamados de macro ncRNAs, pela

extensão de seqüências de transcritos não-codificadores que haviam sido clonadas

originalmente como cDNAs menores, originados por internal priming de transcritos

mais longos. Dentre estes transcritos, foram encontrados dois macro ncRNAs bem

estudados, XIST (18 kb) e AIR (108 kb) (ver adiante), e é possível que muitos

ncRNAs sejam incluídos nesta classe. Nesta análise, 8.228 (de um total de 20.708)

unidades transcricionais intrônicas presentes no banco de dados original foram

excluídas, a fim de evitar a detecção de pré-mRNAs, mas é provável que muitos

macro ncRNAs intrônicos ocorram naturalmente nas células. É importante destacar

que, apesar de alguns ncRNAs serem detectados como produtos de internal priming,

eles não são produtos de contaminação com DNA genômico durante os

procedimentos de clonagem, mas representam transcritos reais (Ravasi et al., 2006).

Reis et al. (2004) também reportaram a existência de ncRNAs longos

transcritos a partir de íntrons e que são expressos em tumores de próstata humanos.

A caracterização destes transcritos por RACE e Northern blot revelou ncRNAs

totalmente intrônicos de 0,6 a 1,1 kb que não sofrem splicing e são expressos nas

formas antisenso, senso ou em ambas orientações, relativas aos genes em que

mapeiam (Reis et al., 2004). O tamanho destes transcritos é similar ao observado na

recente análise de seqüências expressas que mapeiam em regiões intrônicas

humanas, apresentada na Figura 1. Também em camundongos, das 23.218

unidades transcricionais diferentes definidas como ncRNAs (número superior ao

encontrado para genes codificadores, 20.929), ~37 % aparentemente não sofrem

splicing e sua distribuição de tamanho mostra um pico acima de mil nucleotídeos

(Carninci et al., 2005). Além disso, uma análise da expressão antisenso em

camundongos indica que RNAs antisenso freqüentemente não são poliadenilados

(Kiyosawa et al., 2005).

Consistente com a idéia de que muitos ncRNAs longos têm relevância

fisiológica, tem sido observado que a expressão de um grande número de ncRNAs

em humanos e camundongos ocorre de forma tecido-específica e é regulada em

resposta a sinais externos e mudanças ambientais (Cawley et al., 2004; Kampa et

al., 2004; Reis et al., 2004; Ravasi et al., 2006). Por exemplo, o nível da expressão

de ncRNAs é regulado em células humanas em diferenciação induzida por ácido

retinóico, com uma resposta similar à observada para a população de mRNAs

(Cawley et al., 2004). Resultados similares foram observados por nosso grupo para

ncRNAs intrônicos longos senso e antisenso, cuja expressão foi modulada

temporalmente em células humanas tratadas com hormônio andrógeno (Louro et al.,

2006)

. Também em camundongos, um repertório diferente de ncRNAs foi

observado em vários tecidos e sua expressão em macrófagos foi alterada

dinamicamente em resposta ao estímulo com LPS (Ravasi et al., 2006).

Em Drosophila, análises com tiling arrays representando todo o genoma (nas

quais cerca de 40 % das regiões intrônicas mostraram atividade transcricional)

revelaram ncRNAs com expressão regulada em estágios específicos do

desenvolvimento e que apresentam conservação superior às seqüências não-

transcritas (Stolc et al., 2004). Estudos de genômica comparativa têm também

indicado a relevância funcional das regiões não-codificadoras em humanos,

constatando que em torno de 5 % do genoma estão sobre pressão seletiva, apesar

de apenas 1,5 % serem compostos por seqüências codificadoras (Waterston et al.,

2002; Siepel et al., 2005). Por exemplo, a maior parte das regiões ultraconservadas,

seqüências de pelo menos 200 pb com 100 % de identidade entre o genoma

humano e murino (Bejerano et al., 2004), e também das seqüências preservadas da

inserção de transposons (Simons et al., 2006) são localizadas em regiões intrônicas

e intergênicas.

No entanto, mesmo a baixa conservação observada para muitos ncRNAs não

implica que estes não possuem função, já que muitos ncRNAs funcionais podem

estar evoluindo rapidamente (possivelmente, por seleção positiva) (Pang et al.,

2006), tal como o transcrito XIST (Nesterova et al., 2001). Um exemplo muito

Louro et al. (Submetido). ANEXO 3 - incluso no CD-ROM suplementar a esta Dissertação.

interessante foi observado na análise das seqüências conservadas em vertebrados,

mas com alta divergência entre chimpanzés e humanos, onde foram encontradas 49

regiões denominadas de HAR (Human Accelerated Regions), das quais 96 % estão

em porções não-codificadoras do genoma (Pollard et al., 2006). Dentre estas, a

região que apresentou a maior taxa de variação, HAR1, é transcrita em dois ncRNAs

(HAR1F e HAR1R) com sobreposição S/AS parcial, sendo que HAR1F é expresso

especificamente em neurônios Cajal-Retzius do neocórtex cerebral de embriões e

em cérebro adulto e apresenta estrutura secundária diferente da encontrada em

chimpanzé. Em outro exemplo, foram encontrados milhares de regiões

correspondentes entre os genomas de humanos e camundongos sem similaridade

de seqüência primária e que são fontes de ncRNAs com estruturas secundárias

conservadas (Torarinsson et al., 2006).

Finalmente, uma informação importante vem da constatação que muitos

ncRNAs estão envolvidos no desenvolvimento de várias doenças genéticas em

humanos (Costa, 2005; Szymanski et al., 2005). Por exemplo, a expressão de

ncRNAs intrônicos longos foi correlacionada com o grau de diferenciação de tumores

de próstata (Reis et al., 2004); observação semelhante à demonstração de que

microRNAs têm expressão característica em tumores, podendo servir como

classificadores tumorais (Lu et al., 2005).

1.3.2.2. Mecanismos de Atuação Funcional

O mecanismo funcional dos ncRNAs pode basear-se em interações

específicas RNA-RNA, RNA-DNA ou RNA-proteína, tirando proveito da versatilidade

e flexibilidade do RNA, que pode formar estruturas secundárias e terciárias. Os

complexos formados por sua vez podem sinalizar para a atuação de proteínas

efetoras, e a regulação pode dar-se tanto sobre a expressão de genes mapeando no

mesmo locus do ncRNA (cis) quanto em loci diferentes (trans) (Mattick, 2003;

Huttenhofer & Schattner, 2006).

As observações acumuladas de que uma grande parte dos genes possui

expressão antisenso em humanos e outros eucariotos (Yelin et al., 2003; Chen et al.,

2004; Chen et al., 2005; Katayama et al., 2005) sugerem que RNAs antisenso

podem desempenhar funções regulatórias importantes. Mesmo os pares S/AS no

genoma envolvendo apenas genes codificadores são comuns e parecem ter sido

negativamente selecionados durante a evolução dos vertebrados (Dahary et al.,

2005). No entanto, a maioria dos pares envolve ncRNAs e genes codificadores

(Katayama et al., 2005), sendo que uma gama de mecanismos de regulação pelo

antisenso tem sido proposta (Reis et al., 2005a; Munroe & Zhu, 2006).

A ocorrência de RNAs antisenso foi inicialmente reportada em bactérias, onde

são encontrados regulando a expressão gênica tipicamente via pareamento com

mRNAs alvo (Wagner & Simons, 1994; Storz et al., 2005). Em eucariotos, nos quais

são muito mais abundantes, fenômenos de regulação envolvendo interações S/AS

com regiões longas de pareamento certamente devem ocorrer no núcleo, já que a

formação de longos dsRNAs (maiores que 30 pb) no citoplasma de células

eucarióticas pode induzir uma resposta semelhante à resposta ao interferon que

culmina na morte celular (Carmichael, 2003). Uma hipótese imediata é que RNAs

antisenso poderiam parear com RNAs senso no núcleo, formando dsRNAs que

seriam substratos da via de RNAi. Dados que favorecem essa hipótese foram

obtidos em camundongos, onde se observou que a expressão de longos dsRNAs

confinada ao núcleo eventualmente produziu siRNAs e reprimiu a expressão do

gene-alvo (Shinagawa & Ishii, 2003). Contudo, não tem sido observada uma relação

óbvia entre a expressão natural de RNAs antisenso e de RNAs senso

correspondentes.

Cawley et al. (2004) analisaram, com o uso de tiling arrays, a expressão de

um grande número de pares S/AS envolvendo mRNAs e ncRNAs presentes no

citoplasma de células humanas NCCIT e modulados pelo tratamento com ácido

retinóico. Eles observaram uma expressão correlacionada positivamente (S e AS

simultaneamente aumentados ou diminuídos) mais freqüentemente do que o

esperado por acaso, mas encontraram poucos casos de correlação negativa

(esperada em caso do envolvimento da via de silenciamento por RNAi). Entretanto, o

estudo individual da expressão de oito pares envolvendo treze ncRNAs antisenso e

mRNAs (senso) correspondentes afetados temporalmente por LPS em culturas

celulares de macrófagos de camundongos não revelou nenhuma co-regulação

(positiva ou negativa) (Ravasi et al., 2006). Por último, Katayama et al. (2005)

examinaram 15 pares S/AS expressos em uma série temporal em condições

similares às do estudo anterior e observaram co-regulação para 7 pares, incluindo

correlação positiva (3 pares), negativa (2 pares) ou sem relação óbvia. Estes

resultados argumentam contra a hipótese simplista do papel dos RNAs antisenso

apenas como moléculas com atuação negativa em cis.

O pareamento específico de RNAs antisenso com RNAs codificadores pode

ter outras conseqüências funcionais. A região de complementaridade pode envolver

elementos regulatórios presentes nos pré-mRNAs, incluindo sinais de localização

celular, poliadenilação ou elementos de splicing (sítios de splicing, enhancers e

silencers), de forma que o pareamento com um RNA antisenso poderia “mascarar”

estes elementos e controlar estes processos. Esta forma de regulação do splicing

alternativo foi demonstrada para o gene pró-apoptótico FAS. Yan et al. (2005)

mostraram que o transcrito intrônico de 1,5 kb SAF, antisenso ao FAS, ao ser

superexpresso, modula a abundância de uma isoforma dos transcritos de FAS e

aumenta a resistência das células transfectadas ao processo de apoptose mediado

por este gene (Yan et al., 2005).

Alternativamente, um dúplex de dsRNA pode sinalizar para o processo de

edição de RNA com a conversão de adenosinas em inosinas por desaminases

chamadas ADARs (Adenosine Deaminases Acting on RNAs) (Bass, 2002). Esta

edição pode ter diferentes conseqüências como, por exemplo, alterar o potencial

codificador (Bass, 2002), o splicing alternativo (Laurencikiene et al., 2006) e a

formação de estruturas secundárias do mRNA, já que a inosina pareia com citosina

ao invés da uracila; ou até mesmo promover a retenção nuclear do RNA alvo,

considerando que RNAs com alto conteúdo de inosinas são preferencialmente

retidos no núcleo (Zhang & Carmichael, 2001). Deste modo, as células poderiam

regular a expressão de um determinado gene diminuindo o conteúdo citoplasmático

do transcrito senso. Acredita-se que os elementos retrotransponíveis Alu, exclusivos

de primatas e que representam 10 % do genoma humano, podem desempenhar um

papel importante na regulação da expressão gênica, especialmente envolvendo a

edição de RNA, visto que genes contendo inserções Alu em suas porções não-

codificadoras são freqüentes alvos de edição de RNA (Athanasiadis et al., 2004).

Interessantemente, várias ADARs são expressas especificamente no cérebro, onde

o processo de edição de RNA é particularmente ativo (Bass, 2002; Maas et al.,

2003). Além disso, a formação de longos dsRNAs no núcleo poderia afetar a

estrutura da cromatina (ver a seguir), por exemplo na indução da formação de

heterocromatina, similar ao observado para pequenos RNAs e com um possível

envolvimento da maquinaria de RNAi.

Interessantemente, a maioria dos loci gênicos humanos regulados pelo

processo de imprinting genômico, fenômeno de expressão monoalélica dependente

da origem paterna ou materna do alelo, são encontrados em clusters que também

contém longos ncRNAs (também regulados pelo imprinting), freqüentemente

transcritos na fita oposta (Leighton et al., 1995; Wylie et al., 2000; Hatada et al.,

2001). Como exemplo, o ncRNA AIR (Antisense Igf2r RNA) é expresso a partir do

segundo íntron do gene Igf2, estendendo até o gene Mas1, e sua expressão é

relacionada com a repressão de três genes codificados na outra fita (Sleutels et al.,

2002). O processo de imprinting envolve várias modificações epigenéticas que

marcam o alelo silenciado e que podem ser regulados por ncRNAs (Mattick, 2003).

Katayama et al. (2005) sugerem que até 81 % dos transcritos possivelmente

regulados por imprinting formam pares S/AS, indicando uma atuação em cis dos

RNAs antisenso (incluindo RNAs intrônicos) no processo.

Na verdade, não só transcritos antisenso, mas também ncRNAs senso ou

intergênicos, têm o potencial para atuar como moléculas sinalizadoras,

especialmente na modulação das alterações epigenéticas e estrutura da cromatina

(Mattick, 2003; Schmitt & Paro, 2006). Grande parte das proteínas modificadoras e

remodeladoras da cromatina possui domínios de ligação a RNA. Por exemplo, o

domínio conservado cromodomínio (Brehm et al., 2004) está presente em proteínas

das famílias de histona metiltransferases, histona acetiltransferases (HAT), HP1,

Polycomb, RBP1, CDH e SWI3 (Tajul-Arifin et al., 2003). Proteínas que interagem

com RNA também são componentes de sistemas de metilação de DNA em

mamíferos (Jeffery & Nakielny, 2004).

De fato, diversos ncRNAs longos, como AIR e XIST, estão envolvidos em

fenômenos epigenéticos, incluíndo imprinting genômico e inativação do cromossomo

X (Szymanski & Barciszewski, 2003). O transcrito XIST (X-inactivation specific

transcript) é um ncRNA bem conhecido por promover a compensação de dose em

células humanas, através da sinalização para inativação do cromossomo X

(Brockdorff et al., 1992; Brown et al., 1992; Chang et al., 2006). Por sua vez, XIST é

regulado em cis por um ncRNA antisenso de 40 kb, Tsix (Chang et al., 2006).

Recentemente foi demonstrado que Tsix dirige modificações de histonas no

cromossomo X, levando a eventos seqüenciais complexos que culminam na

manutenção da expressão de XIST em apenas um dos dois cromossomos sexuais.

Além disso, também foi observado que Tsix interage especificamente com a de novo

DNA metiltransferase Dnmt3a, sinalizando para a metilação do promotor de XIST

(Sun et al., 2006). Em Drosophila melanogaster, a compensação de dose também é

controlada por ncRNAs longos redundantes, roX1 e roX2 (de RNA on the X), mas

neste caso dirigindo o aumento em duas vezes da atividade do único cromossomo X

em células de machos (Park et al., 2002).

Também em D. melanogaster, o mecanismo de controle da arquitetura da

cromatina dirigido por RNA foi demonstrado para modificações em elementos

regulatórios de DNA TRE (Trithorax Response Elements), que regulam a expressão

de genes homeóticos, como o gene Ultrabitórax. RNAs transcritos a partir dos TRE

interagem diretamente com o DNA em elementos TRE para recrutar a enzima Ash1,

que promove a ativação regional da estrutura da cromatina (Sanchez-Elsner et al.,

2006). Em um estudo mais recente, observou-se que ncRNAs originados de

espaçadores intergênicos (IGS) presentes em regiões de rDNA (DNA ribossomal)

interagem com complexos remodeladores do nucléolo (NoRC), recrutando proteínas

modificadoras da cromatina e DNA metiltransferases para o silenciamento dos loci

de rDNA (Mayer et al., 2006).

Notavelmente, a superexpressão de fragmentos de um RNA antisenso Khps1

resultou na desmetilação de dinucleotídeos CG e metilação de sítios CC(A/T)GG em

uma região do promotor do gene Sphk1, que é sujeito a metilação tecido-específica

diferencial, sugerindo que a sinalização por RNA pode atuar em mais de um modo

(Imamura et al., 2004). Até mesmo o processo de iniciação da transcrição pode ser

regulado de diferentes maneiras por ncRNAs (Goodrich & Kugel, 2006). Por

exemplo, o transcrito não-codificador SRA (steroid receptor activator) é um co-

ativador transcricional que regula a ação do receptor de esteróides SRC-1 (Lanz et

al., 1999). Já o ncRNA TAR liga-se à proteína Tat, que recruta HATs e outras

proteínas necessária para ativação da transcrição do HIV em células humanas

(Pumfery et al., 2003).

A exposição acima torna aparente a heterogeneidade das funções

desempenhadas pelos ncRNAs, mas a descoberta de suas implicações fisiológicas

tem ocorrido de forma pontual em vários eucariotos. Apenas como exemplos,

citamos o RNA antisenso frq que regula o ciclo circadiano em Neurospora crassa

(Kramer et al., 2003); TUG1 que está envolvido na diferenciação da retina em

camundongos (Young et al., 2005); Msx1 que é necessário para o desenvolvimento

crânio-facial e dental em mamíferos (Blin-Wakkach et al., 2001); e PRINS que é um

ncRNA protetor de estresse celular, cuja alteração na expressão está envolvida no

desenvolvimento de psoríase em humanos (Sonkoly et al., 2005). Estratégias

sistemáticas para a determinação da função de ncRNAs em larga escala têm sido

desenvolvidas e podem acelerar o processo de descoberta. Em um estudo piloto

com o uso de bibliotecas de interferência de RNA associado a um ensaio celular,

foram descobertos 8 novos ncRNAs funcionais em células humanas e de

camundongos; dentre eles o transcrito NRON, que reprime a atuação do fator de

transcrição NFAT ao interagir especificamente com proteínas que regulam seu

transporte citoplasma-núcleo (Willingham et al., 2005).

Por fim, também foi proposto que a transcrição em si (e não os ncRNAs

produzidos) pode ter um papel regulatório importante (Chakalova et al., 2005; Reis et

al., 2005). Dentre os mecanismos propostos, destaca-se o modelo de interferência

ou colisão transcricional, pelo qual a transcrição de um ncRNA com sobreposição

(principalmente antisenso) com um gene codificador pode promover o choque físico

ou restrições topológicas entre as maquinarias de transcrição em atividade, levando

à inibição da expressão gênica. Acredita-se que este processo de repressão indireta

ocorra, por exemplo, no caso do ncRNA intergênico SRG1, cuja transcrição leva à

inibição do gene adjacente SER3 em leveduras (Martens et al., 2004; Martens et al.,

2005). Este modelo também foi proposto para explicar o efeito da transcrição do

antisenso AIR no imprinting genômico, já que deleções em porções do transcrito que

sobrepõe com as regiões de imprinting não anulam o silenciamento dos alelos (Seidl

et al., 2006).

1.4. Biogênese dos ncRNAs

Em células eucarióticas, a transcrição do DNA nuclear é atribuída a três RNA

Polimerases (I, II e III). Cada uma é majoritariamente responsável pela síntese de

diferentes classes de RNAs: A RNAP I transcreve rRNAs (5,8S, 18S e 28S), a RNAP

II sintetiza os mRNAs e a RNAP III produz os tRNAs. A RNAP II sintetiza também

alguns snRNAs (U1 a U5) e a RNAP III transcreve o rRNA 5S e também outros

snRNAs (como o RNA U6). No entanto, além destas polimerases, no ano passado

foi mostrado que uma isoforma da RNAP mitocondrial humana é encontrada no

núcleo celular transcrevendo alguns mRNAs e, constituindo a quarta RNAP nuclear,

foi denominada spRNAP IV (single-polypeptide RNAP IV) (Kravchenko et al., 2005).

Verificou-se recentemente que, para a biossíntese de miRNAs, longos

ncRNAs primários (pri-miRNAs) de vários kb são transcritos pela RNA Pol II, os

quais são semelhantes aos mRNAs, possuindo cap e poli-A, e podem originar

múltiplos miRNAs (Lee et al., 2004). Com o emprego da técnica de

imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foi mostrada a associação física da RNAP II

aos seus promotores e a atividade destes foi demonstrada por ensaios de gene

repórter. Além disso, os níveis de expressão de ambos pri-miRNAs e genes

repórteres foram diminuídos pelo inibidor de RNAP II α-amanitina (Lee et al., 2004).

Resumidamente, para síntese dos miRNAs, os transcritos pri-miRNAs formam

regiões intramoleculares de dsRNA (grampos) que são clivadas no núcleo por

complexos contendo Drosha, uma endonuclease RNase III, gerando precursores

(pre-miRNAs) de 65 a 75 nt (Cullen, 2004b). Estes são exportados para o citoplasma

pela Exportina 5 (Yi et al., 2005) (Lund et al., 2004) e são então processados por

uma RNase III Dicer, que gera dúplex de ~22 nt com 2 nt não pareados nas

extremidades 3’ de cada fita (Lee et al., 2003). Os diferentes siRNAs também são

formados por Dicer (ou DCLs, Dicer-like enzymes), porém a partir de longos dsRNAs

(Bernstein et al., 2001), e Drosha não está envolvida no processo. Em diferentes

eucariotos, os dsRNAs longos que são processados pela Dicer podem ter origem na

transcrição de seqüências invertidas em série, transcrição convergente de pares

S/AS ou cópia de um transcrito por uma RNA Polimerase dependente de RNA

(RpRD) (Zamore & Haley, 2005). Para outros pequenos RNAs, como os piRNAs, o

processo de biogênese ainda não foi elucidado (Aravin et al., 2006; Girard et al.,

2006).

Contudo, apesar dos consistentes dados apresentados acima que

demonstram que a maior parte dos transcritos humanos são ncRNAs longos

transcritos de íntrons e de regiões intergênicas, até agora nenhum estudo abordou

direta e sistematicamente o mecanismo de biossíntese destes transcritos. Baseado

na observação de que muitos ncRNAs compartilham características estruturais com

mRNAs, tem sido amplamente assumido que os ncRNAs são transcritos pela RNAP

II (Erdmann et al., 2001; Numata et al., 2003; Willingham & Gingeras, 2006).

Uma série de observações experimentais favorece esta hipótese. Estudos

recentes utilizando a técnica de ChIP associada à interrogação de microarranjos, ou

“ChIP-chip”, revelaram a existência de sítios para ligação de fatores de transcrição

em regiões genômicas distantes de promotores canônicos de genes codificadores

(Martone et al., 2003; Cawley et al., 2004; Euskirchen et al., 2004). Utilizando esta

abordagem com a interrogação de tiling arrays representativos da seqüência

completa dos cromossomos 21 e 22 humanos, Cawley e colaboradores (2004)

verificaram que apenas 22 % dos sítios de ligação para os fatores de transcrição

Sp1, c-Myc e p53 estão localizados em regiões promotoras e que 36 % residem em

regiões internas ou imediatamente vizinhas à porção 3' de genes conhecidos. Outros

24 % dos sítios de ligação identificados para estes fatores residem em regiões

genômicas ainda não anotadas. Em adição, sítios alternativos de ligação para os

fatores de transcrição da família do NF-κB foram identificados no cromossomo 22,

indicando que sua ligação não está restrita às regiões promotoras canônicas

(Martone et al., 2003), e resultados similares foram obtidos no mapeamento dos

sítios de ligação de CREB também no cromossomo 22 (Euskirchen et al., 2004).

Neste caso, a maioria dos sítios de ligação identificados mapeia em íntrons e em

regiões não anotadas. Cabe ressaltar que muitos dos sítios de ligação de fatores de

transcrição associados à transcrição de ncRNAs nos cromossomos 21 e 22

humanos são conservados em camundongos (Dermitzakis et al., 2002; Cawley et al.,

2004).

No entanto, apesar das observações indiretas de ligação de fatores de

transcrição em regiões não-codificadoras, a extensão da participação da RNAP II na

transcrição das abundantes e heterogêneas classes de RNAs humanos permanece

obscura (Kim et al., 2005; Zeng & Schultz, 2005).

2. Objetivos

Este trabalho teve como objetivo o estudo da biossíntese de RNAs não-

codificadores (ncRNAs) intrônicos em células humanas, em particular alguns

aspectos de sua regulação e a participação da RNA Polimerase II (RNAP II) neste

processo. Para isto, foram adotadas duas estratégias diferentes. Na primeira,

investigamos a ligação de um fator de transcrição (Receptor de Andrógeno) a

possíveis seqüências promotoras que estariam dirigindo a expressão de ncRNAs

intrônicos por RNAP II de maneira regulada. Na segunda, analisamos o efeito da

inibição de RNAP II na expressão de diferentes ncRNAs, através da utilização de

microarranjos de oligonucleotídeos (oligoarrays) enriquecidos em seqüências

intrônicas com evidência de atividade transcricional.

3. Procedimentos Experimentais

3.1. Linhagens Celulares Humanas e Condições de Cultivo

As células de linhagens humanas utilizadas neste trabalho foram adquiridas

da ATCC (American Type Culture Collection) e cultivadas a 37 °C em atmosfera de 5

% de CO

em meio de cultura apropriado (Tabela 1). Os meios utilizados, RPMI

(Roswell Park Memorial Institute) e DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)

(Gibco), foram suplementados com SFB (soro fetal bovino) (Cultilab Materiais para

Cultura de Células) 10 %, bicarbonato de sódio 1,2 g/L, e antibióticos penicilina (100

U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL), exceto quando especificado. Para a

manutenção das linhagens em cultura, ao atingirem aproximadamente 80 % da

densidade de saturação, as células foram lavadas com solução salina PBS

(Phosphate Buffered Saline) (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na

HPO

8 mM e KH

1,5 mM, pH 7,2) e subcultivadas com o uso de solução de tripsina 0,1 % (Gibco). Os

estoques celulares foram mantidos no meio de cultivo com DMSO 10 %

(dimetilsulfóxido) estéril em reservatório contendo nitrogênio líquido.

Tabela 1 - Linhagens celulares e os meios de cultivo utilizados neste trabalho.

Linhagem Origem Meio de Cultivo

LNCaP

Adenocarcinoma de próstata metastático RPMI 1640, glicose 4,5 g/L,

piruvato de sódio 1 mM

Jurkat

Linfócito T de paciente com leucemia

aguda

RPMI 1640, glicose 4,5 g/L,

piruvato de sódio 1 mM

MDA-MB 435

Epitélio de câncer de mama humano

metastático

RPMI 1640

DU 145 Carcinoma metastático de próstata DMEM

Para os experimentos de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) (seção 3.3),

cerca de 1 x 10

células LNCaP foram cultivadas em placas P150 (140 cm

) e, após

24 h, o meio foi trocado para meio RPMI contendo SFB 10 % previamente tratado

com carvão ativado. Este pré-tratamento do soro tem a finalidade de eliminar

hormônios esteróides nele presentes e foi realizado pela adição de carvão dextrana

ativado (50 mg/mL), seguindo-se de incubação no gelo sob agitação constante por 1

h. O carvão foi removido após centrifugação a 5.000 rpm por 15 min e filtragem do

sobrenadante (filtro 0,22 µm ). Após 24 h de cultivo, o meio foi substituído pelo

mesmo meio fresco contendo andrógeno sintético R1881 1 nM (NEN - Life Sciences

Products) ou veículo (etanol 0,01 %), seguindo-se uma incubação por 4 h até a

etapa de fixação da cromatina (ver adiante). Para os experimentos de inibição de

RNA Polimerase II, as células foram semeadas (~8 x 10

células LNCaP em placas

P60 (20 cm

) ou ~8 x 10

células Jurkat em frascos de 25 cm

) e cultivadas por 2

dias, quando o meio de cultura foi trocado por meio fresco com ou sem α-amanitina

(Roche) 50 µg/mL.

3.2. Planejamento dos Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos (oligos) utilizados neste trabalho (Tabela 2) foram

planejados utilizando-se o programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi) com parâmetros padrão para os oligos Saf_RT-PCR,

Saf_Prom e pGL3_Sequenc, ou o programa Primer Express versão 2.0 (Applied

Biosystems) para os demais oligos. Os principais parâmetros definidos no uso deste

último foram: tamanho dos fragmentos amplificados entre 100 e 150 pb, conteúdo

CG entre 30 e 80 %, ausência de capacidade de formação de dímeros ou de

estrutura secundária, temperatura de anelamento entre 58 °C e 60 °C, de acordo

com o algoritmo Nearest Neighbor (Breslauer et al., 1986).

Tabela 2 - Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados.

Nome do oligo Seqüência de Nucleotídeos

F: GCTCAGCCTTTGTCTCTGATGA

PSA_ARE_III

R: TGCAAGATGATATCTCTCTCAGATCC

F: TTTGCTGGATAAGGATTCCCA

Myo5A_ARE

R: AGTTCCTTAAACTTTAGCTTAGAAAAAGGA

F: CCCCCAGCCAGCTTTACAC

GAS6_ARE

R: GCCCCGATCTCAGCTGC

F: CCAAAGTAAAAATGAAGGGAGGAA

ITGA_ARE

R: AATAATCCGAGGGACAGAGGG

F: TTGCGTATTAGCCAATTCATTTTC

DNAJC3_ARE

R: GAGGGTAGGCAAACGTGTGTG

F: GACTACAGGTGTGCGCCATCAT

Tub_ChIP

R: TGCCGTGTTCCAGGCAGTAG

F: TCCAGATTGGCAATGCCTG

Tub_RT

R: GGCCATCGGGCTGGAT

F: AGCGCAAAACCAATTTCTGT

Saf_RT-PCR

R: CGTGTTTAAAGCCCGAAGAA

F: GAATACTCGAGGATTGCCTGGCCAATGTC

Saf_Prom

R: GCTGTAAGCTTGCCTTCACGGTTATGTTTTC

F: GGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGT

pGL3_Sequenc

R: TGCAGTTGCTCTCCAGCGGTTCCAT

F = forward, R = reverse

3.3. Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP)

3.3.1. Identificação Computacional de Possíveis Sítios de Ligação ao

Receptor de Andrógeno (AR)

As seqüências no genoma de até 3 kb à montante e à jusante das posições

de mapeamento dos clones de ORESTES depositados no microarranjo (Reis et al.,

2004) e correspondentes aos transcritos com expressão alterada frente ao

tratamento com andrógeno (Louro et al., submetido) foram analisadas quanto à

presença de possíveis sítios de ligação ao Receptor de Andrógeno (AR). Estes

motivos, chamados de ARE (Androgen Response Element), são caracterizados por

2 elementos assimétricos de 6 bases separados por 3 nucleotídeos quaisquer, cujo

consenso é uma seqüência palindrômica com os 2 elementos invertidos

(AGAACAnnnTGTTCT), encontrada no banco de dados TRANSFAC

(

http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html/

) (Matys et al., 2003). Um

programa em linguagem PERL foi utilizado para a seleção de motivos com

identidade de pelo menos 9 das 12 bases presentes no ARE consenso. Para o

planejamento de oligonucleotídeos (flanqueando os AREs candidatos) utilizados nos

experimentos de ChIP, foram escolhidos possíveis AREs identificados próximos aos

transcritos cuja variação na expressão em resposta ao andrógeno havia sido

validada e que também haviam sido estendidos por RACE (ver adiante).

3.3.2. Fixação e Fragmentação da Cromatina

Ao meio de cultura das células LNCaP (tratadas com andrógeno ou veículo)

foi adicionado formaldeído 1 % e as placas foram mantidas à temperatura ambiente

por 10 min, a fim de promover ligações cruzadas para fixação das proteínas

associadas à cromatina. Em seguida, o meio foi incubado com glicina 125 mM por 5

min, para interromper a formação de ligações cruzadas, e, em seguida, removido. As

células foram lavadas por 2 vezes com PBS gelado contendo os inibidores de

proteases PMSF 1 mM, aprotinina 1 µg/mL e pepstatina A 1 µg/mL (Sigma). Após a

adição de 1 mL de PBS com os inibidores, com as placas sobre gelo, as células

foram raspadas e transferidas para tubos de 1,5 mL. As suspensões foram

centrifugadas a 3.000 rpm por 5 min a 4 °C e o sobrenadante foi removido. O

sedimento de células foi ressuspendido em 600 µL de tampão de lise (SDS 1 %;

EDTA 10 mM; Tris 50 mM, pH 8,1; contendo uma mistura comercial (Upstate) de

inibidores de protease) para uma concentração aproximada de 2 x 10

células/100

µL de tampão. Para a fragmentação da cromatina, os extratos celulares foram

submetidos a 15 pulsos de 10 s na intensidade de 11 % do aparelho Sonic

Dismembrator Model 500 (Fischer Scientific). Esta condição foi determinada após a

otimização das condições de fragmentação, descrita a seguir. Para evitar

superaquecimento das amostras, os tubos foram incubados em banho de gelo por 1

min entre cada pulso de sonicação.

Foi necessária a otimização das condições para quebra mecânica da

cromatina por sonicação em fragmentos entre 200 e 1000 pb, faixa de tamanho

adequada para realização da ChIP (Das et al., 2004). Testamos diversas condições

com os sonicadores Branson Sonifier de 450 W e Sonic Dismembrator Model 500,

ambos com sonda intrusiva de 3,2 mm. Na etapa de padronização, utilizamos as

linhagens celulares DU 475 e MDA-MB 436, que apresentam maior taxa de

crescimento que a linhagem LNCaP, facilitando assim a obtenção de quantidade

suficiente de células para todas as condições testadas (Tabela 3).

Para a avaliação da fragmentação do DNA, foi feita a reversão das ligações

cruzadas com 8 µL de solução de NaCl 5 M adicionados a 200 µL das amostras

sonicadas, e a mistura foi mantida a 65 °C por 4 a 6 h. Em seguida, o DNA foi

extraído com fenol/clorofórmio (Sambrook et al., 1989), ressuspendido em TE (Tris-

HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e a distribuição de tamanho dos fragmentos

verificada após eletroforese em gel de agarose 1,4 % corado com brometo de

etídeo. As condições mais apropriadas foram então testadas e refinadas para a

fragmentação da cromatina de células LNCaP.

Tabela 3 – Principais condições de sonicação testadas para padronização da fragmentação da

cromatina

Linhas verticais indicam condição idêntica à condição na célula acima

3.3.3. Imunoprecipitação com Anticorpo anti-Receptor de Andrógeno

Para a realização da imunoprecipitação da cromatina, foi utilizado o kit EZ

ChIP (Upstate), seguindo protocolo recomendado pelo fabricante. Em resumo, após

a lise celular e fragmentação da cromatina, o procedimento inclui as seguintes

etapas: (a) eliminação de ligantes de proteína G inespecíficos, (b) incubação com o

anticorpo de interesse, (c) precipitação do complexo anticorpo-cromatina com

proteína G, (d) lavagens do imunoprecipitado com soluções salinas de estringência

crescente e (e) eluição da cromatina. Segue-se a reversão das ligações cruzadas,

digestão das proteínas da cromatina com Proteinase K, purificação e detecção dos

fragmentos de DNA co-imunoprecipitados (Das et al., 2004).

Para a imunoprecipitação do Receptor de Andrógeno (AR), foi utilizado o

anticorpo policlonal IgG H-280 (Santa Cruz), específico para a região N-terminal do

AR. Alíquotas de 100 µL do extrato celular (obtido após sonicação de células

tratadas com andrógeno ou veículo) foram diluídas em 1 mL de tampão de diluição e

utilizadas para cada imunoprecipitação. Uma fração de 10 µL (0,01 %) das amostras

diluídas foi separada para servir como controle da quantidade inicial de DNA

presente (DNA input), e as imunoprecipitações foram realizadas por 14 h de

incubação com 3 µg do anticorpo H-280 ou com 1 µg de IgG normal de

camundongo, utilizado como controle negativo. O DNA resultante da

imunoprecipitação e o DNA input foram purificados e a imunoprecipitação do

complexo AR-cromatina foi confirmada por PCR com oligos específicos

(PSA_ARE_III F e R) flanqueando o ARE III (Androgen Response Element III)

presente no enhancer do gene PSA (Prostate Specific Antigen) (controle positivo).

Para os outros fragmentos de interesse, a análise por PCR foi realizada utilizando-se

oligos específicos, em reações de 50 µL contendo 2 µL do produto imunoprecipitado.

Como controle da inespecificidade na imunoprecipitação da cromatina, utilizamos

oligos para amplificação de uma seqüência interna do gene da tubulina (oligos

Tub_ChIP) (controle negativo).

3.4. Obtenção e Análise de RNA

Células LNCaP foram cultivadas em frascos apropriados até a confluência

desejada, lavadas com PBS e descoladas da superfície do frasco por tratamento

com 0,1 % tripsina seguido da adição de meio contendo SFB, ou apenas raspadas

com o auxílio de um policial de borracha em PBS. Em seguida, as células foram

sedimentadas por centrifugação a 3.000 rpm a 4 °C por 5 min e o sobrenadante foi

removido. Células Jurkat, cultivadas em suspensão, foram apenas centrifugadas

como descrito acima e o meio de cultura, removido. Os sedimentos foram utilizados

imediatamente ou mantidos a -70 °C até extração do RNA.

RNA total foi isolado utilizando-se o kit RNeasy (Qiagen), segundo

metodologia descrita pelo fabricante, e eluído em um volume de 30 µL de água

tratada com DEPC (Sambrook et al., 1989). As amostras contendo RNA foram

tratadas com DNase I na coluna RNeasy por 15 a 20 min à temperatura ambiente,

durante o procedimento de extração, e/ou foram tratadas com 1 U de Turbo DNase I

(Ambion) por 30 min a 37 °C após a extração e novamente purificadas utilizando-se

o kit RNeasy. Os RNAs purificados foram armazenados em alíquotas a -70 °C.

A quantificação do RNA extraído foi realizada por leitura da absorbância a 260

nm (Abs

260nm

) em espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies),

considerando-se a relação: Abs

260nm

= 1 equivalente a 40 µg/mL de RNA. A pureza

foi avaliada pela razão Abs

260nm

/Abs

280nm

, sendo considerada adequada quando

próxima de 2,0. A qualidade do RNA foi analisada no aparelho Bioanalyzer 2100

(Agilent Technologies) pela observação da integridade das bandas de RNA

ribossomal 28S e 18S (razão 28S/18S > 1,7), utilizando o RNA 6000 Nano LabChip

Kit (Agilent Technologies) com aplicação de 200 ng de RNA total. Alternativamente,

a qualidade do RNA total foi avaliada por eletroforese em gel de agarose em

condições desnaturantes. Os géis desnaturantes foram preparados segundo

(Sambrook et al., 1989), contendo agarose 1,4 %, MOPS 1X (MOPS 20 mM pH 7,0,

acetato de sódio 5 mM, EDTA 0,1 mM) e formaldeído 3,5 %. Para a aplicação, as

amostras contendo 2 µg de RNA total foram diluídas em tampão de amostra (MOPS

20 mM pH 7,0, acetato de sódio 5 mM, EDTA 0,1 mM, formaldeído 3,5 %, formamida

50 %, azul de bromofenol 3,5 µg/mL e brometo de etídeo 0,5 µg/mL), aquecidas a 65

°C por 5 min e imediatamente transferidas para banho de gelo. A eletroforese foi

Figura 3 - Perfil analítico típico de uma preparação de RNA total tratado com DNase I. O painel

da esquerda apresenta o eletroferograma obtido na análise com o aparelho Bioanalyzer (Agilen

Technologies), na qual foram utilizados 200 ng de RNA total isolado de células LNCaP, com os

dois picos maiores representando os rRNAs 18S e 28S (da esquerda para a direita). O painel

central mostra a imagem da eletroforese reconstruída após análise no Bioanalyzer. A image

obtida após separação de 2 µg de RNA total por eletroforese em gel de agarose desnaturante

corado com brometo de etidio está mostrada no painel da direita. As bandas equivalentes aos

rRNAs 18S e 28S estão apontadas por setas, respectivamente de baixo para cima.

procedida com o gel submerso em tampão MOPS 1X a voltagem constante (70V),

por 2 a 3 h. A Figura 3 é representativa da qualidade dos RNAs utilizados neste

trabalho.

3.5. Transcrição Reversa Fita-Específica

Reações de transcrição reversa (RT) foram realizadas com oligonucleotídeos

específicos complementares à fita senso ou antisenso da região genômica na qual

mapeia o transcrito estudado, seguida por PCR. Para as reações de RT, foram

adicionados 2 pmol de oligos senso ou antisenso à solução contendo 2,5 µg de RNA

total previamente tratado com DNase I e a mistura foi incubada a 75 °C por 10 min,

para destruição de estruturas secundárias. As amostras foram então mantidas a 55

°C até adição de 200 U da enzima SuperScript III em tampão próprio contendo

demais reagentes (Invitrogen), previamente aquecido a 55 °C por 2 min, de acordo

com a metodologia descrita pelo fabricante. As reações foram realizadas em um

volume final de 20 µL a 55 °C por 1 h, seguidas de incubação a 70 °C por 15 min

para inativação da enzima. Controles negativos foram realizados sem a adição da

enzima, para verificação de ausência de DNA, e/ou sem adição de

oligonucleotídeos, para a verificação de ausência de DNA contaminante e de auto-

anelamento (self-priming) (Reis et al., 2004). Controles positivos foram realizados

utilizando-se oligos complementares à tubulina (oligos TUB_RT).

3.6. Ensaio de Atividade de Promotor

3.6.1. Amplificação e Purificação do Fragmento de DNA Genômico

Para a amplificação de um segmento de 618 pb contendo o possível promotor

que dirige a transcrição do RNA antisenso SAF (Yan et al., 2005), foi planejado o par

de oligos Saf_prom_R e Saf_prom_F (Tabela 2). O oligo Saf_prom_R mapeia no

genoma humano na posição +69, relativa ao início de transcrição de SAF

determinado por Yan e colaboradores (2005), e inclui sítio para a enzima de

restrição Hind III em sua extremidade 5’. O oligo Saf_prom_F mapeia na posição -

549 desta mesma região e inclui sítio para enzima Xho I. A PCR (50 µL, em 35

ciclos) foi realizada com 250 ng de DNA genômico e Taq Polimerase (Invitrogen),

seguindo as instruções do fabricante. O produto da reação foi submetido à

eletroforese em gel de agarose 1 %, sendo aplicadas em partes diferentes do gel

uma fração de 10 µl e outra de 40 µL da reação. A porção do gel contendo a

primeira fração da reação foi separada e corada em solução de brometo de etídeo

0,5 µg/mL com agitação por 20 min após a eletroforese, para verificação do tamanho

e pureza do amplicon sob luz UV. Em seguida, foi recortada a porção do gel não

incubada com brometo de etídio correspondente ao fragmento observado, contendo

o produto amplificado presente na segunda fração da reação. O fragmento de DNA

foi então purificado com o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (Amersham)

e eluído em 30 µl de água, segundo instruções do fabricante.

3.6.2. Obtenção da construção pGL3_Saf-prom

A amostra (14 µL) do amplicon descrito na seção anterior foi submetida à

digestão com 20 U de Hind III e Xho I (New England Biolabs) em reação de 20 µl a

37 °C por 20 h, na presença de BSA 100 µg/mL. Paralelamente, 2 µg de pGL3 Basic

(Promega) foram digeridos por 1 h com 10 U de Hind III em reação de 10 µl, sendo

em seguida adicionados 10 U de Xho I e BSA 100 µg/mL e a reação incubada por

mais 2 h. Assim, o vetor plasmidial foi linearizado, de modo a gerar-se extremidades

coesivas para a inserção do fragmento de PCR na orientação desejada à montante

do gene repórter luciferase presente no vetor. Antes de serem ligados, o vetor

linearizado e o inserto digerido foram novamente purificados após eletroforese em

gel de agarose, seguindo-se extração com o kit GFX PCR DNA and Gel Band

Purification (Amersham), como descrito na seção anterior. Foram utilizados 3 µL do

eluato (30 µL) contendo vetor, 9 µL de eluato (30 µL) contendo inserto e 5 U de T7

DNA Ligase (Invitrogen) em um volume total de 20 µL de reação de ligação a 16 °C,

para obtenção da construção denominada “pGL3_Saf-prom”. Após 16 h, a enzima

foi inativada por aquecimento a 65 °C por 15 min e a amostra foi microdialisada em

membrana VS de 0,025 µM (Milliipore) por 2 h, antes de ser utilizada para

transformação de células competentes de Escherichia coli cepa DH10B.

A eletroporação da cepa DH10B foi realizada a 2,5 kV, 200 Ω e 25 mF com 6

µL da reação de ligação. Imediatamente após a eletroporação, 400 µL de meio SOC

(bacto-triptona 20 mg/mL, extrato de levedura 5 mg/mL, NaCl 0,584 mg/mL, KCl

0,186 mg/mL, MgCl

10 mM, MgSO

10 mM, glicose 20 mM, pH 7,0) foram

adicionados às células, que foram incubadas a 37 °C por 1 h e então semeadas em

meio LB-ágar (peptona de caseína 1 %, extrato de levedura 0,5 %, NaCl 1 %, ágar

bacteriológico 1,4 %, pH 7,0) contendo carbenicilina (50 µg/mL). As placas foram

mantidas a 37 °C até o aparecimento de colônias, que foram selecionadas para

inoculação em 5 mL de meio LBC (LB contendo carbenicilina 50 µg/mL) e cultivadas

a 37 °C sob agitação a 300 rpm por 9 h. A partir de cada cultura, foram retirados 3

mL para extração de DNA plasmidial, purificado em mini-preparação com o kit

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). A presença de inserto foi verificada por PCR

partir da cultura (diluída 1: 1000) com os oligos Saf_Prom_F e R, e também por

digestão do DNA plasmidial purificado com Hind III e Xho I, seguindo-se análise por

eletroforese em gel de agarose. A confirmação da identidade e da orientação correta

do inserto na construção pGL3_Saf-prom foi obtida por seqüenciamento utilizando

os oligonucleotídeos pGL3_Sequenc F e R (Tabela 2) que flanqueiam o sítio de

inserção do fragmento. O seqüenciamento foi realizado no aparelho ABI PRISM

3100 (Applied Biosystems) conforme recomendações do fabricante, sendo que as

reações de seqüenciamento foram realizadas com Big dye terminator mix (Perkin

Elmer) e 100 ng de DNA plasmidial e oligonucleotídeos (pGL3_Sequenc F ou R) de

acordo com as instruções do fabricante.

Para obtenção de maior quantidade, o DNA plasmidial foi purificado a partir

de 50 mL de cultura bacteriana em midi-preparações, utilizando-se o kit HiSpeed

Plasmid Mid Kit (Qiagen), com eluição do DNA puro em 1 mL de TE.

Os plasmídeos (20 ng) pGL3 Control, pGL3 Basic e pRL-SV40 (Promega)

também foram utilizados na transformação de E. coli DH10B e purificados como

descrito acima, para obtenção de quantidade adequada para os ensaios de atividade

de promotor.

3.6.3. Transfecção de Células Jurkat

Os ensaios de atividade de promotor foram realizados na linhagem Jurkat, na

qual foi detectada a expressão do transcrito SAF (Yan et al., 2005). Células Jurkat

foram semeadas em placas de 24 poços (4 x 10

células / 500 µL de meio sem

antibióticos acrescido de SFB 10 %, previamente aquecido a 56 °C por 1h para

inativação de DNases). As transfecções foram realizadas no mesmo dia pelo método

de lipofecção com o reagente Lipofectamine 2000 (LP 2000), segundo instruções do

fabricante (Invitrogen). Utilizamos 4 µL de LP 2000 para transfecção de 0,8 µg de

DNA, correspondentes a 0,65 µg dos plasmídeos pGL3_Saf-prom, pGL3 Control ou

pGL3 Basic, co-transfectados com 0,125 µg do plasmídeo pRL-SV40. Este último é

utilizado para normalização da eficiência de transfecção (ver a seção seguinte). As

transfecções foram realizadas em triplicata para cada condição.

As condições de transfecção foram previamente otimizadas com testes nos

quais se variou a concentração de células, a quantidade de DNA aplicado, a

quantidade de LP 2000 e a proporção DNA/LP 2000. Nesta etapa, foram utilizados

os plasmídeos pGL3 Control (contendo o gene repórter luciferase sob controle do

promotor CMV) e pCMV-EGFP (contendo o gene GFP também sob o controle do

promotor CMV) (Pfeifer et al., 2002).

3.6.4. Ensaio da Atividade de Luciferase

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram transferidas para

tubos de 1,5 mL, sedimentadas por centrifugação a 5.000 rpm por 5 min e o

sobrenadante foi removido. Para avaliação da atividade de promotor, foi utilizado o

sistema Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), segundo instruções do

fabricante. Este método inclui a medição da atividade da enzima “Firefly luciferase”

(enzima do vagalume Photinus pyralis cuja seqüência codificadora está clonada nos

vetores pGL3) pela a adição de substrato (luciferina) específico, seguida da

inativação desta enzima e posterior medição da atividade da “Renilla luciferase”

(enzima do cnidário Renilla reniformis, cuja seqüência codificadora está clonada no

vetor pRL-SV40). Esta segunda medida é utilizada para a normalização dos valores

da atividade “Firefly luciferase”, a fim de reduzir as variações decorrentes de

diferenças nas eficiências de transfecção. As reações foram realizadas em placa

opaca de 96 poços e as medidas de emissão de luz foram obtidas em luminômetro

MicroLumat Plus (Microplate Luminometer LB – Berthold Technologies) com o

programa WinGlow (Berthold Technologies) utilizando-se os seguintes parâmetros:

intervalo de medida 1 de 10 s, intervalo de medida 2 de 1 s e temperatura de 25 °C.

A razão do valor obtido para cada medida das luciferases “Firefly” e “Renilla” de

cada poço foi calculada, assim como a média aritmética da razão de três réplicas da

transfecção com cada plasmídeo.

3.7. Análise da Expressão Gênica com Microarranjos de DNA

3.7.1. Microarranjos de Oligonucleotídeos (Oligoarrays)

Para avaliação do efeito da α-amanitina na expressão de transcritos intrônicos

em larga escala e de forma fita-específica foi utilizada uma plataforma de

microarranjos de DNA construída com a tecnologia de síntese de oligonucleotídeos

in situ (tecnologia SurePrint) (Agilent Technologies). O microarranjo de

oligonucleotídeos (oligoarray) que utilizamos (Nakaya et al., submetido) é composto

por 44.290 oligonucleotídeos (oligos) de 60-mer, sendo que ~42.000 foram

planejados por nosso grupo, seguindo os critérios recomendados pelo fabricante

(Agilent Technologies) e descritos por Hughes e colaboradores (2001) (Hughes et

al., 2001). Os transcritos representados no oligoarray foram definidos após extensiva

análise de mapeamento de seqüências expressas no genoma humano (Nakaya et

al., submetido). Resumidamente, todas as seqüências de ESTs (~5,5 milhões),

mRNAs (~187 mil) e RefSeqs (~25 mil) humanas, depositadas no GenBank e

mapeadas na montagem de maio de 2004 do genoma humano (HG17), disponível

no Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), foram filtradas e as seqüências

expressas com sobreposição foram agrupadas em clusters cujas coordenadas foram

mapeadas no genoma. Os clusters foram definidos como “transcritos” e classificados

quanto à localização e orientação relativa a genes anotados.

Este oligoarray contém seqüências para detecção de diferentes classes de

transcritos definidas pelo mapeamento, como descrito em Nakaya et al. (submetido).

Dentre estas, estão incluídas duas classes representadas por clusters de ESTs

intrônicos que não apresentam evidência de splicing: (1) seqüências que mapeiam

totalmente dentro de íntrons, denominadas TIN (Totalmente Intrônicas), para as

quais foram planejados 15.430 oligos para detecção da expressão da forma senso

ou antisenso (~7.700 oligos para cada) e (2) seqüências que sobrepõe um éxon e

estendem para ambos os íntrons que o flanqueiam, denominadas PIN (Parcialmente

Intrônicas), representadas por 10.578 oligos planejados na região do éxon, para a

detecção das formas antisenso e senso (esta última equivalente ao éxon). Além

destes dois conjuntos, o microarranjo contém 4.927 oligos para detecção de

transcrição em porções de dentro do íntron (fita senso) no qual mapeia um transcrito

PIN (elementos do oligoarray denominados PIN pré-mRNA), 158 oligos para

detecção de transcritos de regiões intergênicas e 1.276 oligos representativos de

transcritos depositados no banco de dados RNAdb (Pang et al., 2005). Também

estão presentes 9.114 oligos para detecção de éxons de genes codificadores de

proteínas e 2.256 oligos utilizados como controles positivos e negativos da lâmina,

idênticos aos oligos controle (IS-44290-1-V1_eQC-V1) presentes no oligoarray

"Agilent 44K Human Whole Genome" (Agilent Technologies). A lista com todos os

oligos presentes no oligoarray que utilizamos será disponibilizada no repositório

Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sobre o número de

acesso GPL4051.

3.7.2. Hibridação dos Oligoarrays

Quantidades iniciais de 500 ng de RNA total pré-tratado com DNase I extraído

de células LNCaP, tratadas ou não-tratadas com α-amanitina por 24 h como

descrito anteriormente (seção 3.1), foram misturadas com 2 µL de RNA sintético

(RNA Spike-In Mix) na diluição especificada pelo fabricante (Agilent Technologies).

O RNA Spike-In Mix contém 10 transcritos poliadenilados derivados do adenovírus

E1A e sintetizados in vitro. Estes transcritos não possuem complementaridade a

seqüências humanas e são otimizados para hibridação em oligos controle presentes

no oligoarray. Estes controles são utilizados na normalização dos dados, como

descrito a seguir.

Em seguida, as amostras de RNA foram usadas em reações de transcrição

reversa, amplificadas e marcadas utilizando-se o kit Low RNA Input Fluorescent

Linear Amplification (Agilent Technologies), o qual emprega transcrição por T7 RNA

Polimerase após a síntese da primeira fita de cDNA com iniciadores oligo(dT) que

incluem a seqüência promotora desta polimerase. (A amplificação e marcação de

cRNA - RNA complementar - utilizando T7 RNA Polimerase é importante neste

experimento, pois ela garante a preservação da orientação do RNA, ao contrário de

metodologias de marcação utilizando Transcriptase Reversa que pode

eventualmente gerar uma segunda fita de cDNA com a orientação oposta do RNA

original (Johnson et al., 2005).) O RNA de cada amostra foi separadamente marcado

com os fluoróforos Cyanine 3-CTP (Cy3) ou Cyanine 5-CTP (Cy5) (Perkin-Elmer Life

Sciences). Para cada condição experimental (células LNCaP, tratadas ou não-

tratadas com α-amanitina) dispúnhamos de quatro réplicas, sendo duas biológicas

(tratamentos com α-amanitina independentes) e duas técnicas (marcação e

hibridação independentes).

Foram realizadas quatro hibridações, sendo que em cada uma foram

utilizadas quantidades iguais (750 ng) de cRNA da mesma amostra marcado com

Cy3 e com Cy5. Para as hibridações utilizamos o kit In situ Hybridization kit-plus

(Agilent Technologies), segundo as especificações do fabricante. As lâminas foram

lavadas com as soluções indicadas no kit e os valores de intensidade de cada ponto

do oligoarray foram obtidos com a utilização do scanner GenePix 4000B (Axon

Instruments) e a extração dos dados foi realizada com o programa ArrayVision

versão 8.0 (Imaging Research Inc.).

3.7.3. Tratamento e Análise dos Dados da Hibridação dos Oligoarrays

Os dados brutos de intensidade dos pontos foram extraídos de cada lâmina e

normalizados (excluindo-se os pontos que servem de controle) utilizando o algoritmo

Lowess implementado no pacote R (www.r-project.org

), para a correção de

variações nas diferenças de marcação e eficiência de detecção entre os dois

fluoróforos Cy3 e Cy5. Em seguida, a intensidade média (calculada após exclusão

dos valores extremos – 20 % maiores e 20 % menores – de intensidade) de 300

pontos correspondentes aos oligos que detectam o RNA sintético presente nas

amostras foi utilizada para normalizar as intensidades de todos os demais pontos.

Esta normalização utilizando um RNA sintético adicionado em igual

quantidade às amostras foi realizada a fim de permitir uma análise comparativa entre

as intensidades de cada transcrito detectado nas lâminas hibridadas com RNA de

células tratadas com α-amanitina versus não-tratadas, visto que a intensidade global

da lâmina é afetada pelo tratamento com o inibidor de transcrição. Paralelamente,

para identificar os pontos com intensidade de hibridação significativa, foi

estabelecido um limite de detecção de expressão mínimo para cada fluoróforo,

baseado na intensidade bruta média de 1.198 controles negativos presentes nas

diferentes lâminas, mais 3 desvios-padrão desta média. Apenas os transcritos cuja

intensidade bruta subtraída do ruído individual (intensidade ao redor do ponto)

estava acima deste limite de detecção em pelo menos 3 das 4 réplicas foram

considerados expressos.

Para análise da expressão diferencial, foram utilizadas as metodologias de

Signal-to-Noise Ratio (SNR) (Golub et al., 1999) com 10.000 permutações (p < 0,05)

e Significance Analysis of Microarray (SAM) (Tusher et al., 2001), utilizando-se os

seguintes parâmetros: two-class unpaired response, 1.000 permutações, K-Nearest

Neighbors Imputer, fold-change ≥ 1,5 e FDR (false discovery rate) de 0,2 % a 3,5 %.

Transcritos identificados por ambas as metodologias foram combinados para

determinação de um grupo cuja expressão em células tratadas com α-amanitina

apresentou variação estatisticamente significativa. Por fim, os valores de expressão

dos transcritos diferencialmente expressos foram agrupados hierarquicamente e

visualizados com o programa Spotfire Decision Site In Function Genomics (Spotfire

Inc.).

3.7.4. Análise de Enriquecimento de GO

Análise de enriquecimento de categoria de função biológica definidas por

termos de GO (Gene Ontology) para genes codificadores de proteínas expressos e

para genes nos quais mapeiam transcritos intrônicos expressos foi realizada

utilizando a ferramenta BiNGO (The Biological Network Gene Ontology plug-in tool)

(Marere et al., 2005) do pacote Cytoscape (http://www.cytoscape.org/). No banco de

referência, foram utilizados os genes representados no oligoarray da seguinte

maneira: na análise para os genes codificadores foram utilizados todos os

identificadores de loci gênicos (Gene_IDs) dos genes presentes no array; e na

análise para os transcritos intrônicos foram utilizados como referência todos os

genes (Gene_IDs) para os quais há ncRNAs intrônicos (TIN ou PIN) representados

no oligoarray. Foi aplicado o teste estatístico Hipergeométrico (com Benjamini &

Hochberg's FDR multiple testing correction) com um nível de significância de 0,05.

4. Resultados

4.1. Análise da Regulação da Expressão de Transcritos Intrônicos por

Andrógeno

Experimentos realizados por nosso grupo demonstraram que a expressão de

RNAs não-codificadores intrônicos é afetada pelo tratamento com o andrógeno

sintético R1881 em células LNCaP (Louro et al., submetido). Com o emprego de

microarranjos de DNA (Reis et al., 2004), foram identificados 39 transcritos intrônicos

cuja expressão variou dinamicamente em uma série temporal, aumentando ou

diminuindo, após o estímulo hormonal. De 13 transcritos cuja orientação em relação

ao gene codificador no qual eles mapeiam foi determinada, 4 foram detectados na

orientação antisenso, 3 na senso e 6 nas formas senso e antisenso. O tamanho de 6

destes transcritos foi avaliado por RACE-PCR ou Northern Blot fita-específico e

variou de 0,5 a 5 kb (Louro et al., submetido). Em face destes resultados, buscamos

no presente trabalho avaliar se a regulação da expressão dos ncRNAs intrônicos por

andrógeno seria mediada pela ação direta do fator de transcrição Receptor de

Andrógeno (AR) sobre possíveis regiões promotoras destes transcritos. Para isto,

foram realizados experimentos de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com

anticorpo anti-AR.

4.1.1. Busca bioinformática por elementos de resposta a andrógeno

Inicialmente, foi realizada uma análise in silico para a identificação de

possíveis motivos de ligação ao AR, chamados de ARE (Androgen Response

Element), em regiões do genoma na vizinhança dos transcritos intrônicos cuja

expressão variou com tratamento com andrógeno, como verificado na análise por

microarranjos de DNA. Detectamos seqüências com mais de 75 % de identidade

com o ARE consenso (Nelson et al., 2002) próximas (até 3 kb) à região de

mapeamento de 27 ESTs representativas de transcritos responsivos a andrógeno.

Estes motivos foram considerados candidatos a elementos regulatórios dirigindo a

expressão dos transcritos intrônicos, tendo sido encontrada uma média de 2,2

candidatos a ARE na região genômica analisada de cada transcrito. Na Figura 4

são mostrados possíveis motivos ARE encontrados para 23 transcritos intrônicos,

cuja seqüência consenso é idêntica ao elemento ARE consenso presente no banco

TRANSFAC (Figura 4B). Para um grupo selecionado de transcritos (ver adiante),

foram sintetizados oligonucleotídeos flanqueando possíveis AREs para a detecção

de fragmentos de DNA ligados ao AR in vivo por experimentos de ChIP.

Gene (1) mRNA (2) Posição (3) Localização Cromossômica %

Identidade

RSNL2 AK024722 AGG ACAGAATGTTT T

-2056

2p23.2 83

NIBP AY190606 AGAAGGTGCTGTTCA

-621

8q24.3 75

GAS6 AK126533 G GAAA A TCATGTTCA

-1528

13q34 75

DST AK023487 AGAACATCTT T TTGC

-799

6p12.1 75

ALMS1 BC050330 G GAC CAGTTT T TTC T

-1091

2p13.1 75

P2RY14 BC034989 AGAACAGCAGG C TCT

-1837

3q25.1 83

DNAJC3 U28424 AGAAT A CCATGTTGC

-1608

13q32.1 75

ACTN4 D89980 G GAACATGAATTTCT

-785

19q13.2 75

ACTN4 D89980 G GAACCACTGGTTCT

-1839

19q13.2 75

ATF2 AY029364 T GAACAGACACTTCT

-920

2q31.1 75

STARD13 AK094704 AGAT CATGTGGTTCT

-2239

13q13.1 83

PDK1 L42450 AGAACAGGTT T TTGA

-2788

2q31.1 75

ADD3 BC043143 T GAC CATGCTGG TCT

-2285

10q25.1 75

MYO5A Z22957 AGT ACATAAT T T A CT

-812

15q21.2 75

PMF1 BC050735 AGAAATTCTTGC TCT

-2104

1q22 75

ERG AY204740 AGAACTGCTT TGTCT

+246

21q22.2 75

KDELR2 X63745 AGAACAGCTGCTTCT

+219

7p22.1 83

PALLD AB023209 AGAC CAGTTT TATCT

-181

4q32.3 75

UBE2V1 BT007382 AGAACAAFATGTTAA

-2786

20q13.13 83

PECAM1 AF393678 AGAG CAGGAAG C TCT

-881

17q23.3 75

SAP18 U96915 AGAC CAGCCTGG TCA

-414

13q12.11 75

C16orf46 AK057264 T GAC CAGGCTGG TCT

-2481

16q23.2 75

ITGA6 X53586 AGAACAAGGT T TTGA

-2788

2q31.1 75

ZNF644 AK024026 AGAATCTACTGTTCC

-283

1p22.2 75

Seqüência consenso

AGAACAn n n TGT TCT

Seqüência do Possível ARE

Figura 4 - Identificação de possíveis ARE (Androgen Response Elements). A) Candidatos

elementos ARE encontrados em regiões genômicas nas proximidades da posição de mapeamento de

23 transcritos intrônicos no genoma. As letras destacadas (fundo em preto) correspondem às bases

idênticas ao consenso utilizado na análise bioinformática. São mostrados o nome do gene (1) e do

mRNA (2) em cujo locus mapeia o transcrito intrônico, a localização no cromossomo, a posição

genômica relativa ao início da EST ("+": a jusante, "-": a montante) e a porcentagem de bases

idênticas ao consenso. B) Consenso gerado pelo programa WEBLOGO

(http://www.bio.cam.ac.uk/seqlogo/) para os possíveis ARE identificados. A altura de cada letra é

roporcional à freqüência do nucleotídeo naquela posição.

4.1.2. Imunoprecipitação da Cromatina com Anticorpo anti-AR

Uma etapa importante nos experimentos de ChIP é a quebra do DNA da

cromatina em fragmentos menores que 1,5 kb, para proporcionar especificidade na

detecção dos fragmentos de DNA imunoprecipitados. Assim, testamos diversas

condições de sonicação (ver Tabela 3, seção 3.3.2.) visando a otimização da

fragmentação do DNA. A Figura 5 mostra a separação dos fragmentos obtidos em

algumas destas condições nos testes para padronização realizados com células das

linhagens DU 475 e MDA-MB 436.

Na etapa de sonicação, pulsos de alta intensidade provocaram a formação de

espuma, devido à presença de detergente SDS (1 %) na solução de lise,

prejudicando a transmissão mecânica das ondas de ultra-som cujo impacto causa a

fragmentação do DNA. Apenas na intensidade mínima dos aparelhos e utilizando

volumes de amostras de pelo menos 600 µL foi possível a realização da sonicação

sem a formação de espuma. Também o formato dos tubos foi importante para este

propósito, sendo que os mais adequados foram tubos de congelamento de células

(Criovials) de 2 mL que possuem fundo largo e chato (ao contrário dos tubos

Eppendorf de 1,5 mL de fundo cônico).

Dentre as condições testadas, a mais eficiente em fragmentar o DNA no

intervalo de tamanho desejado (entre 200 e 1.000 pb) foi a de 15 pulsos de 10 s,

realizada com o sonicador eletrônico Sonic Dismembrator Model 500 (Fischer

Scientific) (Figura 5, poços I). Nesta condição, obtivemos menor quantidade de

fragmentos fora do intervalo desejado, com enriquecimento de fragmentos no

tamanho médio de 500 pb. Esta condição também se mostrou adequada na

fragmentação do DNA de células LNCaP (Figura 6).

Figura 6 - Otimização das condições de fragmentação do DNA da cromatina de células

LNCaP após sonicação com aplicação de diferentes números de pulsos: (A) 7 X 10s, (B) 10

X 10s, (C) 15 X 10s (vide tabela 2). Após a sonicação 200 µL dos lisados foram extraídos

com fenol:clorofórmio e o DNA isolado foi ressuspendido em 50 µL de TE. Para cad

condição, foram aplicados no gel 5, 10 e 20 µL (da esquerda para a direita) do DN

urificado. As linhas delimitam a região de interesse (entre 200 e 1000 pb).

500

200

1000

Figura 5 - Teste de fragmentação da cromatina por sonicação. Extratos contendo

aproximadamente 5 x 10

células/100µL de tampão de lise foram sonicados nas condições

especificadas na Tabela 3. Após a sonicação, o DNA presente em 200 µL dos lisados foi

extraído com fenol:clorofórmio e ressuspendido em 50 µL de TE. Para cada condição, fora

aplicados no gel de agarose 5, 10 e 20 µL (da esquerda para a direita) da amostra de DN

urificado.

Tendo padronizado as condições para fragmentação da cromatina,

realizamos o experimento de ChIP, como esquematizado na Figura 7. Células

LNCaP tratadas com andrógeno R1881 ou com veículo foram fixadas, lisadas e sua

cromatina fragmentada por sonicação. Em seguida, utilizamos anticorpo específico

contra o receptor de andrógeno (AR) e a eficácia da imunoprecipitação foi avaliada

pela detecção do ARE presente no enhancer do gene PSA (Prostate Specific

Antigen), ARE III (Cleutjens et al., 1996; Farmer et al., 2001) (Figura 8). O gene PSA

é diretamente regulado por andrógeno (Jia et al., 2003) e com este controle foi

possível confirmar a indução da ligação do AR pelo tratamento com o andrógeno

R1881, observada na fase linear de amplificação por PCR, como mostrado na Figura

Detecção por PCR (primers

flanqueando os possíveis AREs)

Lise celular

Fragmentação do DNA em 200-1000pb

Ip com 3µg de anticorpo anti-AR

Células LNCaP

em meio com

soro deprivado

Tratamento com

R1881 por 1 ou 4h

Ligações cruzadas na

cromatina (1% formaldeído)

Reversão das ligações cruzadas, tratamento

com proteinase K e purificação do DNA

200pb

1000pb

Detecção por PCR (primers

flanqueando os possíveis AREs)

Lise celular

Fragmentação do DNA em 200-1000pb

Ip com 3µg de anticorpo anti-AR

Células LNCaP

em meio com

soro deprivado

Tratamento com

R1881 por 1 ou 4h

Ligações cruzadas na

cromatina (1% formaldeído)

Reversão das ligações cruzadas, tratamento

com proteinase K e purificação do DNA

Detecção por PCR (primers

flanqueando os possíveis AREs)

Lise celular

Fragmentação do DNA em 200-1000pb

Ip com 3µg de anticorpo anti-AR

Células LNCaP

em meio com

soro deprivado

Tratamento com

R1881 por 1 ou 4h

Ligações cruzadas na

cromatina (1% formaldeído)

Reversão das ligações cruzadas, tratamento

com proteinase K e purificação do DNA

Detecção por PCR (primers

flanqueando os possíveis AREs)

Lise celular

Fragmentação do DNA em 200-1000pb

Ip com 3µg de anticorpo anti-AR

Células LNCaP

em meio com

soro deprivado

Tratamento com

R1881 por 1 ou 4h

Ligações cruzadas na

cromatina (1% formaldeído)

Reversão das ligações cruzadas, tratamento

com proteinase K e purificação do DNA

200pb

1000pb

200pb

1000pb

200pb

1000pb

Figura 7 - Representação esquemática do procedimento de imunoprecipitação da cromatin

(ChIP). O experimento foi realizado para detecção da ocupação de possíveis promotores de

transcritos intrônicos pelo receptor de andrógeno (AR) em células LNCaP tratadas co

andrógeno sintético R1881. A imunoprecipitação (Ip) da cromatina é realizada com anticorpo

anti-AR e a detecção dos fragmentos imunoprecipitados é realizada por PCR co

oligonucleotídeos flanqueando os candidatos a ARE (Androgen Response Element). O gel

direita mostra a separação eletroforética dos fragmentos da cromatina obtidos após

sonicação de lisados de células LNCaP.

100

R1881 +- +-+-

Anti-AR

Input

OR1881 +- +-+-

Anti-AR

Input

200

Figura 8 - ChIP utilizando anticorpo anti-AR (+) ou IgG Normal de camundongo (-) a partir de

extrato de células LNCaP tratadas com andrógeno R1881 ou com veículo por 1 h. Partindo de 2

µL do produto imunoprecipitado, foi amplificada a região flanqueando o ARE III do enhancer

do gene PSA (181 pb) em PCR de 20 ciclos seguidos por mais 20 ciclos a partir de 1 µL da

rimeira reação. Input: 0,01 % do DNA total presente nos lisados celulares antes da

imunoprecipitação, purificado e eluído em 50 µL.

A ligação do AR a possíveis AREs identificados no genoma a 5’ da posição de

mapeamento de transcritos intrônicos dos genes ITGA, MYO5A, GAS6 e DNAJC3 foi

analisada, após o procedimento de ChIP, por PCR com oligonucleotídeos

específicos, planejados a partir das seqüências que flanqueiam os possíveis AREs.

Estes transcritos foram escolhidos para esta análise porque a variação na sua

expressão em resposta ao tratamento com andrógeno havia sido confirmada por RT-

qPCR (PCR quantitativo precedido por transcrição reversa) bem como seus

tamanhos prováveis haviam sido determinados por RACE-PCR (transcritos ITGA,

MYO5A e DNAJC3) ou Northern blot fita-específico (transcrito GAS6) como descrito

na Tabela 4 (Louro et al., submetido).

Tabela 4 - Características dos transcritos cujas possíveis regiões promotoras fora

analisadas por ChIP.

Identificação do gene no qual

mapeia o transcrito intrônico

Tamanho do

fragmento

depositado no

microarranjo

(# bases)

Resposta na

expressão ao

tratamento

com

andrógeno

Tamanho do

transcrito

determinado

por RACE ou

Northern Blot

(# bases)

Orientação

do RNA (S:

senso, AS:

antisenso)

DNAJC3

(DnaJ (Hsp40),

subfamily C,

member 3)

328 Aumentado 1.132 S

ITGA

(Integrin, alpha 6) 202 Aumentado 834 AS

GAS6

(Growth arrest-

specific 6)

274 Diminuído ~5.000 AS

MYO5A

(Myosin heavy chain

12)

427 Aumentado 610 AS

A Figura 9A mostra um fragmento de DNA imunoprecipitado com anticorpo

anti-AR e que foi amplificado por PCR utilizando-se oligonucleotídeos flanqueando o

possível ARE encontrado no íntron do gene MYO5A. Assim como verificamos para o

controle positivo, ARE III do gene PSA, a reação de imunoprecipitação é específica

para as amostras tratadas com anticorpo anti-AR e não é observada na região

gênica da tubulina, indicando que não houve imunoprecipitação inespecífica

significativa de fragmentos genômicos. O ARE em questão, presente no fragmento

amplificado, está localizado a 798 pb à montante da posição de mapeamento da

extremidade 5’ determinada para o transcrito intrônico antisenso ao gene MYO5A

(Figura 9B). De forma importante, a ligação detectada é estimulada em células

tratadas com andrógeno, em congruência com o aumento na expressão do RNA

antisenso de 0,6 kb observado originalmente nas análises de microarranjos de DNA

e validadas por RT-qPCR. Este resultado demonstra a ligação do AR em uma

possível região promotora que dirige a expressão do RNA antisenso intrônico,

sugerindo uma regulação da expressão do transcrito intrônico pelo recrutamento da

RNAP II (Shang et al., 2002).

Para os outros três transcritos selecionados (ITGA, GAS6 e DNAJC3), não

detectamos a ligação do AR nos AREs candidatos nos experimentos de ChIP

seguidos da tentativa de amplificação da região por PCR. Este resultado pode ter

sido observado por diversos fatores, discutidos adiante.

R1881

IgG anti-AR

IgG Normal de

Camundongo Input

ARE Myo5A

ARE III PSA

TUBB

Posição no Genoma

Produto do ChIP-PCR

Transcrito Intrônico

Gene Myo5A

Posição no Genoma

Produto do ChIP-PCR

Transcrito Intrônico

Gene Myo5A

R1881

IgG anti-AR

IgG Normal de

Camundongo Input

ARE Myo5A

ARE III PSA

TUBB

R1881

IgG anti-AR

IgG Normal de

Camundongo Input

ARE Myo5A

ARE III PSA

TUBB

Posição no Genoma

Produto do ChIP-PCR

Transcrito Intrônico

Gene Myo5A

Posição no Genoma

Produto do ChIP-PCR

Transcrito Intrônico

Gene Myo5A

Figura 9 - Ligação do AR em possível seqüência promotora dirigindo a expressão do transcrito

intrônico antisenso MYO5A em células LNCaP. A) ChIP utilizando anticorpo anti-AR ou IgG

ormal de camundongo, realizado a partir de lisados de células LNCaP tratadas com andrógeno

R1881 ou com veículo por 4 h. O ARE III do PSA e o promotor da tubulina são utilizados como

controles positivo e negativo, respectivamente. Input: 0,01 % do DNA total presente nos extratos

celulares foi purificado e eluído em 50 µL antes da etapa de imunoprecipitação. B) Representação

esquemática da região no cromossomo 15 na qual mapeia o transcrito intrônico, entre os éxons 19

e 20 (barras azuis) do gene MYO5A, e o produto de PCR flanqueando o ARE encontrado. O

resultado é representativo de dois experimentos de ChIP independentes.

4.2. Avaliação da Contribuição da RNAP II na Expressão de ncRNAs

Intrônicos

Na segunda parte deste trabalho, α-amanitina foi aplicada em células

humanas em cultura e seu efeito na expressão de ncRNAs foi avaliado. A α-

amanitina é um octapeptídeo bicíclico, extraído a partir do cogumelo Amanita

phalloides, que inibe fortemente a atividade da RNAP II, impedindo a sua

translocação sobre o DNA para o processo de elongação da transcrição (Bushnell et

al., 2002). Primeiramente, o seu efeito foi analisado individualmente na expressão do

transcrito intrônico antisenso SAF, recentemente encontrado por Yan et al. (2005)

em células linfóides humanas da linhagem Jurkat. Este transcrito foi escolhido para

esta análise inicial porque constitui um dos primeiros ncRNAs intrônicos

caracterizados ao nível molecular e funcional. SAF atua na regulação do splicing

alternativo do pré-mRNA de FAS, alterando o comportamento celular de apoptose

(Yan et al., 2005). Posteriormente, investigamos o efeito da α-amanitina na

transcrição de ncRNAs intrônicos com o uso de microarranjos de oligonucleotídeos

(oligoarrays).

4.2.1. Análise da Expressão do Transcrito Antisenso SAF em Células

Jurkat

4.2.1.1. Efeito da α-Amanitina na Expressão de SAF

Inicialmente, foi realizada RT-PCR fita específica para confirmação da

presença de SAF em células Jurkat. Além da forma antisenso (SAF), também foi

observada a presença de um transcrito na orientação senso (Figura 10), o qual não

foi detectado por Yan e colaboradores (2005). Em seguida, células Jurkat foram

tratadas com α-amanitina por 12 h e a presença de SAF analisada por RT-PCR fita-

específica (Figura 11). Nas amostras tratadas com α-amanitina, nota-se que o nível

do mRNA da tubulina diminuiu, mas a detecção não foi abolida, certamente, devido

à estabilidade do mRNA. Contudo, nestas amostras não é possível detectar o

transcrito SAF, indicando que este RNA antisenso também é sintetizado pela RNAP

II e apresenta uma estabilidade menor que a tubulina.

RTase + - + - H

Senso Anti-senso

RTase + - + - H

Senso Anti-senso

Figura 10 - Presença das formas senso e antisenso dos transcritos intrônicos ao gene FAS e

células Jurkat. A detecção foi realizada por RT-PCR fita-específica a partir de 2 µg de RNA total

tratados com DNase I. Foram realizados 35 ciclos de PCR, utilizando 2 µL do produto da reação

de RT, realizada com (+) ou sem (-) Transcriptase Reversa (RTase), ou apenas com água.

RTase-0,1µL 1µL 2µL 0,1µL 1µL 2µL

Saf

Tubulina

α-amanitina -

cDNA:

α-amanitina +

RTase-0,1µL 1µL 2µL 0,1µL 1µL 2µL

Saf

Tubulina

α-amanitina -

cDNA:

α-amanitina +

Figura 11 - Inibição da expressão de SAF pelo tratamento com α-amanitina (50 µg/mL) por 12 h

em células Jurkat. Foram utilizados 2 µg de RNA total para síntese de cDNA de forma fita-

específica e diferentes volumes (0,1, 1 e 2 µL) da reação de RT em PCR de 35 ciclos.

4.2.1.2. Análise do Possível Promotor de SAF

Yan e colaboradores (2005) determinaram experimentalmente a extremidade

5’ do transcrito SAF por 5’ RACE e extensão de oligonucleotídeo (primer extension),

encontrando elementos característicos de promotor da RNAP II, incluindo um TATA

box, na região genômica proximal à montante do transcrito. Aqui, procuramos

demonstrar experimentalmente a existência de um promotor dirigindo a transcrição

de SAF. A partir de DNA de células humanas, amplificamos um fragmento de 618 pb

cobrindo a região de –549 a +69, relativo ao provável início de transcrição do

antisenso SAF apontado por Yan e colaboradores (2005). Este amplicon foi ligado

no vetor pGL3 Basic (Promega) de forma direcionada, na mesma orientação

correspondente à encontrada no genoma em relação ao transcrito SAF, como

esquematizado na Figura 12. A autenticidade e integridade da construção resultante,

pGL3_Saf-prom, foram confirmadas pela amplificação por PCR do inserto com

tamanho esperado, pela liberação do inserto após digestão com as enzimas Hind III

e Xho I, bem como por seqüenciamento (dados não apresentados).

Para o ensaio de atividade de promotor, a construção pGL3_Saf-prom e os

plasmídeos controle pGL3 Control e pGL3 Basic foram utilizados na transfecção de

células, sempre co-transfectados com iguais quantidades de pRL-SV40. O pGL3

Control é utilizado como controle positivo e contém o gene da luciferase sob o

controle do promotor do vírus SV-40, altamente ativo em células de mamíferos; o

pGL3 Basic não possui seqüência promotora à montante do gene da luciferase,

servindo como controle negativo; e o pRL-SV40 codifica uma luciferase distinta

(“Renilla luciferase”) sob controle do promotor SV-40, cuja atividade é utilizada para

1- Saf_Prom_F (

Xho

I) GAATACTCGAGGATTGCCTGGCCAATGTC

2- Saf_Prom_R (

Hind

III) GCTGTAAGCTTGCCTTCACGGTTATGTTTTC

Saf

1,5 kpb

-549

+69

Saf-prom

618pb

Hind III

Xho I

pGL3 Basic

Sinal de

Poliadenilação

Saf_prom

Hind III

Xho I

pGL3 Basic

Sinal de

Poliadenilação

Saf_prom

1- Saf_Prom_F (

Xho

I) GAATACTCGAGGATTGCCTGGCCAATGTC

2- Saf_Prom_R (

Hind

III) GCTGTAAGCTTGCCTTCACGGTTATGTTTTC

Saf

1,5 kpb

-549

+69

Saf-prom

618pb

1- Saf_Prom_F (

Xho

I) GAATACTCGAGGATTGCCTGGCCAATGTC

2- Saf_Prom_R (

Hind

III) GCTGTAAGCTTGCCTTCACGGTTATGTTTTC

Saf

1,5 kpb

-549

+69

Saf-prom

1- Saf_Prom_F (

Xho

I) GAATACTCGAGGATTGCCTGGCCAATGTC

2- Saf_Prom_R (

Hind

III) GCTGTAAGCTTGCCTTCACGGTTATGTTTTC

Saf

1,5 kpb

-549

+69

Saf-prom

Saf

1,5 kpb

-549

+69

Saf-prom

618pb

Hind III

Xho I

pGL3 Basic

Sinal de

Poliadenilação

Saf_prom

Hind III

Xho I

pGL3 Basic

Sinal de

Poliadenilação

Saf_prom

Figura 12 - Clonagem do possível promotor de SAF. A) Esquema da amplificação do fragmento

de 618 pb correspondendo à seqüência à montante do início de transcrição de SAF, utilizando-se

oligonucleotídeos contendo sítios de restrição Hind III e Xho I para clonagem no vetor pGL3

Basic (B). Amp

: gene que confere resistência a amplicilina em Escherichia coli; ori: origem de

replicação em E. coli; luc+: gene codificador da enzima luciferase derivada do vagalume. As setas

em “B” indicam a direção da transcrição. C) Visualização da separação eletroforética do veto

GL3 intacto (1), linearizado com Hind III e Xho I (2), e do fragmento de PCR “Saf-prom”

digerido com as mesmas enzimas (3). M: marcador de tamanho 100 pb (Fermentas).

normalização pelas diferenças nas eficiências de transfecção, permitindo a

comparação entre as condições.

A atividade da luciferase foi medida para cada condição em um luminômetro e

normalizada pelo valor da “Renilla luciferase”. Na comparação entre as condições, o

fragmento (Saf-prom) analisado não apresentou atividade acima do controle

negativo (pGL3 Basic) nas condições testadas (Figura 13). No entanto, a atividade

obtida com o extrato de células transfectadas com o controle positivo (pGL3 Control)

foi cerca de 40 vezes maior que a atividade residual do controle negativo (ver

discussão adiante).

0.5

1.5

2.5

3.5

pGL3_Saf-prom pGL3 Control pGL3 Basic

Plasmídeo Transfectado

Atividade de Luciferase (U.L.)

Figura 13 - Ensaio da atividade de promotor da região genômica à montante do transcrito SAF.

Células Jurkat foram coletadas 48 h após a transfecção com os plasmídeos pGL3_Saf-prom,

GL3 Control ou pGL3 Basic, a atividade da luciferase presente nos extratos celulares foi

medida (sendo representada pela unidade arbitrária U.L. - unidade de luz) e o valor, dividido

ela atividade da Renilla luciferase para normalização. São apresentadas as médias e os desvios-

adrão dos valores normalizados de três réplicas. Os valores são representativos de dois

experimentos independentes.

4.2.2. Avaliação do Efeito da α-Amanitina na Transcrição Intrônica

Utilizando Oligoarrays

Para avaliarmos de uma forma mais ampla a participação da RNAP II na

expressão de transcritos não-codificadores, o efeito da sua inibição foi analisado

utilizando-se microarranjos de DNA. Primeiramente, comparamos os níveis de

expressão de ncRNAs em células LNCaP tratadas e não-tratadas com α-amanitina

por 24 h, utilizando microarranjos de cDNA construídos por nosso grupo, contendo

3.355 elementos e enriquecidos em seqüências intrônicas (822 elementos) (Reis et

al., 2004). Este estudo preliminar revelou que todos os genes housekeeping

detectados tiveram seus níveis de expressão reduzidos (em média 3 vezes),

incluindo actina B, tubulina, GAPDH e hCyPB, assim como os marcadores

prostáticos PSA, KLK-1 e RPL17. Estes dados indicaram que o tratamento com α-

amanitina por 24 h inibiu eficientemente a transcrição por RNAP II. Esta avaliação

inicial também revelou que uma fração significativa dos ncRNAs representados nos

microarranjos não teve sua expressão reduzida frente ao tratamento com o inibidor

de RNAP II, enquanto que outra fração de ncRNAs, surpreendentemente,

apresentou um aumento em seus níveis (dados não apresentados). Apesar da

relevância destas observações, optamos por descartar estes dados iniciais, visto que

tivemos acesso a uma plataforma de microarranjos de oligonucletídeos (oligoarray)

mais adequada e robusta (Nakaya et al., submetido). Assim, os tratamentos das

células LNCaP com α-amanitina por 24 h foram repetidos e o RNA total isolado foi

utilizado na hibridização dos oligoarrays.

Esta nova plataforma proporciona uma detecção fita-específica, ou seja,

discrimina a orientação senso ou antisenso dos transcritos, em maior escala e com

maior sensibilidade. A construção do oligoarray foi baseada no mapeamento de

seqüências expressas depositadas em bancos de dados públicos no genoma

humano (Nakaya et al., submetido). Oligonucleotídeos presentes no microarranjo

representam transcritos intrônicos senso e antisenso, nos quais foi concentrada a

presente análise, que mapeiam totalmente dentro de íntrons, denominados TIN

(Totalmente Intrônicos), ou que apresentam sobreposição com éxons de genes

codificadores, denominados PIN (Parcialmente Intrônicos). É importante lembrar que

uma avaliação com o programa ESTScan (Iseli et al., 1999)

(http://www.ch.embnet.org/software/ESTScan2.html) revelou que 98% e 90% dos

transcritos TIN e PIN antisenso, respectivamente, apresentam pouco ou nenhum

potencial para codificação de proteínas, sendo, portanto, prováveis ncRNAs (Nakaya

et al., submetido). Além destas classes, este oligoarray contém elementos que

representam transcritos exônicos (detectados por oligos “exônicos” e PIN senso),

que foram usados na análise comparativa com os transcritos intrônicos.

Para o experimento, quantidades iguais de RNA total de células LNCaP

tratadas ou não (em duplicata para cada condição) com α-amanitina por 24 h foram

então marcados e utlizados em hibridações (quatro réplicas de cada condição).

Comparando-se as intensidades obtidas com as hibridações das réplicas em lâminas

diferentes, foram observados altos índices de correlação (em média R

> 0,9),

apontando para a boa reprodutibilidade das hibridações e robustez da plataforma de

oligoarrays.

A intensidade média detectada para os transcritos exônicos expressos em

células LNCaP não-tratadas foi consideravelmente maior que para as outras classes

de transcritos (Tabela 4), corroborando dados observados por outros laboratórios

com experimentos de microarranjo que transcritos não-codificadores em geral

apresentam intensidades mais baixas que os mRNAs (Kampa et al., 2004; Ravasi et

al., 2006). Além disso, com o critério de análise utilizado, 47 % de todos transcritos

representados no oligoarray foram expressos (com intensidade acima do limite de

detecção estipulado), porém, novamente considerando apenas os transcritos

exônicos, uma proporção significativamente maior é observada (73,15 %).

Para a avaliação do efeito da inibição da RNAP II na abundância dos RNA

das diferentes classes representadas no oligoarray, os transcritos expressos foram

submetidos a uma análise estatística combinando os métodos de SAM e SNR para

determinação do conjunto de transcritos diferencialmente expressos (ver seção

3.7.3). Cerca de 40 % (2.606) dos transcritos exônicos expressos apresentaram

variação significativa com o tratamento (Tabela 5), fração virtualmente igual à de

transcritos representados por oligos PIN senso. Notavelmente, uma parcela

consideravelmente menor de transcritos intrônicos não-codificadores é afetada: esta

fração cai para 16 %, 18 % e 19 % para os transcritos TIN antisenso (416), senso

(486) e PIN antisenso (523), respectivamente. Este contraste também é observado

na magnitude da inibição das diferentes classes. Enquanto a redução da intensidade

média dos transcritos exônicos diferencialmente expressos em células com RNAP II

inibida por 24 h é superior a 50 % (e para os representados pelos oligos PIN senso é

de aproximadamente 42 %), para os transcritos TIN antisenso, senso e PIN

antisenso esta redução é inferior: apenas 17 %, 25 % e 28 %, respectivamente.

Claramente, portanto, a resposta à inibição da transcrição por RNAP II por 24 h é

diferente entre transcritos exônicos e transcritos intrônicos não-codificadores de

proteínas.

Tabela 5 - Análise da expressão em LNCaP de cada classe de transcrito presente no

experimento de oligoarray e efeito do tratamento com α-amanitina por 24 h.

Intensidade Média

Expressos

Intensidade Média

Diferencialmente

Expressos

Classe

#Total de

Elementos

Oligoarray

#Expressos

(% spots)

#Diferencialmente

Expressos

(% Expressos)

Não-

Tratadas

Não-

Tratadas

Exônico 9.114 6.667 (73,15) 2.606 (39,09) 1148,7 818,5 1394,8 682,4

PIN senso 5.289 2.477 (46,83) 1.013 (40,90) 493,4 388,7 904,5 521,3

TIN senso 7.991 2.750 (34,41) 486 (17,67) 344,6 309,4 601,1 495,9

TIN antisenso 7.990 2.555 (31,98) 416 (16,28) 250,4 240,6 504,1 380,8

PIN antisenso 5.289 2.708 (51,20) 523 (19,31) 236,7 228,0 320,3 229,1

Intergênico 158 87 (55,06) 42 (48,28) 279,8 221,4 407,4 260,8

PIN pré-mRNA 4.927 2.103 (42,68) 429 (20,40) 344,6 319,9 430,1 352,3

ncRNA RNAdb 1.276 542 (42,48) 184 (33,95) 511,3 477,0 632,6 384,1

Total / Média 42.034 17.412 (47,00) 4.686 (28,65) 510,8 412,3 937,2 521,6

Esta resposta distinta é também evidenciada quando o perfil de expressão

dos transcritos significativamente afetados é analisado (Figura 14). Como esperado,

a expressão da maioria dos exônicos (97 %) e dos PIN senso (98 %) é reduzida,

mas, interessantemente, a parcela pequena restante é encontrada aumentada com

o tratamento. Considerando os oligos de transcritos exônicos e PIN senso como

representativos de éxons de genes codificadores de proteínas (“Exônicos”), são

totalizados 110 transcritos aumentados dentre 3.619 diferencialmente expressos

frente à inibição com α-amanitina por 24 h. Se considerados apenas aqueles com

aumento de duas vezes ou mais, são encontrados 44 transcritos “exônicos” (Tabela

6), similar à fração encontrada por Kravchenko et al. (2005), que detectaram 70

mRNAs aumentados duas vezes ou mais em células humanas HeLa tratadas com α-

amanitina, utilizando uma plataforma de microarranjo Affimetrix representando

~20.000 genes codificadores de proteínas (Kravchenko et al., 2005).

Contudo, para os transcritos TIN senso e antisenso e PIN antisenso, a fração

de transcritos diferencialmente expressos com abundância aumentada em células

tratadas é consideravelmente superior à observada para as classes codificadoras:

13% (61/486), 15% (62/416) e 12% (65/523), respectivamente (Figura 15).

Por fim, foi realizada uma análise das categorias funcionais dos genes em

cujos loci foi detectada expressão (exônica ou intrônica) em células LNCaP.

Interessantemente, observa-se um enriquecimento significativo (p < 0,05) na

categoria de GO (Gene Ontology) “Regulação da Transcrição” (regulation of

trancription, DNA-dependent, GO:006355) apenas para loci com expressão de

transcritos intrônicos não-codificadores (TIN senso e antisenso ou PIN antisenso)

aumentada no tratamento com α-amanitina (Figura 16). Dos 188 transcritos

intrônicos aumentados destas classes, 40 mapeiam em genes relacionados a

funções regulatórias (Tabela 7), incluindo genes codificando histona desacetilase,

fatores de transcrição com domínios “zinc-finger”, bromodomínio, cromodomínio,

receptores nucleares e fatores de elongação de RNAP II. A possível relevância

desse resultado será tratada a seguir na seção “Discussão”. Nenhuma categoria

funcional foi encontrada significativamente enriquecida para os genes expressos ou

diferencialmente expressos associados a qualquer outra classe de transcrição.

Oligo #

Tipo de

Oligo

Lócus

Símbolo

do Gene

Descrição do Gene

log

Razão

10094 Exônico 59 ACTA2 actin, alpha 2, smooth muscle, aorta 4,3

17019 Exônico 79949 C10orf81 chromosome 10 open reading frame 81 3,5

42924 Exônico 6876 TAGLN transgelin 3,4

22166 Exônico 83857 TMTC1 transmembrane and tetratricopeptide repeat containing 1 3,1

21022 Exônico 220164 DOK6 docking protein 6 3,1

17225 Exônico 79949 C10orf81 chromosome 10 open reading frame 81 3,0

14956 Exônico 83938 C10orf11 chromosome 10 open reading frame 11 3,0

31726 Exônico 3494 IGHA2 immunoglobulin heavy constant alpha 2 (A2m marker) 2,8

16996 Exônico 3118 HLA-DQA2 major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 2 2,4

7727 Exônico 81033 KCNH6 potassium voltage-gated channel, subfamily H, member 6 2,4

8035 Exônico 1311 COMP cartilage oligomeric matrix protein precursor 2,4

19138 Exônico 5176 SERPINF1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade F, member 1 2,2

8551 Exônico 91353 LOC91353 hypothetical protein LOC91353 2,2

31186 Exônico 5858 PZP pregnancy-zone protein 2,2

19392 Exônico 64167 LRAP leukocyte-derived arginine aminopeptidase 2,1

14215 Exônico 3117 HLA-DQA1 major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1 2,0

20312 PIN Senso 83872 HMCN1 hemicentin 1 1,9

9007 Exônico 26509 FER1L3 fer-1-like 3, myoferlin (C. elegans) 1,6

30354 Exônico 7975 MAFK v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog K 1,6

26521 PIN Senso 23358 USP24 ubiquitin specific protease 24 1,4

17214 Exônico 143903 LAYN layilin 1,4

5952 PIN Senso 5602 MAPK10 mitogen-activated protein kinase 10 1,4

7285 PIN Senso 7038 TG thyroglobulin 1,3

29460 Exônico 10586 MAB21L2 mab-21-like 2 (C. elegans) 1,3

8177 PIN Senso 53616 ADAM22 a disintegrin and metalloproteinase domain 22 1,3

7743 Exônico 89927 C16orf45 chromosome 16 open reading frame 45 1,3

17119 PIN Senso 84162 KIAA1109 KIAA1109 1,2

39032 Exônico 1384 CRAT carnitine acetyltransferase 1,2

14627 Exônico 5320 PLA2G2A phospholipase A2 group IIA 1,2

22172 Exônico 64582 GPR135 G protein-coupled receptor 135 1,2

22029 Exônico 3371 TNC tenascin C (hexabrachion) 1,2

17099 Exônico 162417 NAGS N-acetylglutamate synthase 1,2

28619 Exônico 3914 LAMB3 laminin, beta 3 1,1

22234 Exônico 3687 ITGAX integrin, alpha X (antigen CD11C (p150), alpha polypeptide) 1,1

13880 Exônico 6347 CCL2 chemokine (C-C motif) ligand 2 1,1

23450 Exônico 8635 RNASET2 ribonuclease T2 1,1

33940 Exônico 23043 TNIK TRAF2 and NCK interacting kinase 1,0

4430 Exônico 976 CD97 CD97 antigen isoform 3 precursor 1,0

38299 Exônico 4354 MPP1 membrane protein, palmitoylated 1, 55kDa 1,0

16393 Exônico 114819 BC033082 KIAA1922 protein 1,0

19806 PIN Senso 57609 DIP2B DIP2 disco-interacting protein 2 homolog B 1,0

40163 Exônico 1672 DEFB1 defensin, beta 1 1,0

11968 Exônico 84467 FBN3 fibrillin 3 1,0

38730 Exônico 2835 GPR12 G protein-coupled receptor 12 1,0

Tabela 6 - Genes codificadores de proteínas com expressão aumentada em células

tratadas com α-amanitina (RNAP II inibida).

# Os genes são representados por oligos mapeando em seus éxons e que detectaram transcritos co

intensidade aumentada duas ou mais vezes em células LNCaP tratadas com α-amanitina por 24 h. *O

aumento na abundância é indicado pelo Log

da razão das intensidades médias de expressão de cada

transcrito observadas em células tratadas / não-tratadas.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Diferencialmente Expressos (%)

# Diminuídos

2517 992 425 354 458 41 423 180

# Aumentados

89 21 61 62 65 1 16 4

% Diminuídos

96,6 97,9 87,4 85,1 87,6 97,6 98,6 97,8

% Aumentados

3,4 2,1 12,6 14,9 12,4 2,4 3,7 2,2

Exônico PIN senso TIN senso

TIN

antisenso

Intergênico

PIN pré-

mRNA

ncRNA

RNAdb

Figura 14 - Resposta da expressão das diferentes classes de transcritos no tratamento de células

LNCaP com α-amanitina por 24 h. Os transcritos considerados diferencialmente expressos fora

determinados por uma análise combinada de SAM (FDR de 0,2% a 3,5%) e SNR (p ≤ 0,05).

Tabela 7 - Genes codificadores de proteínas nos quais mapeiam transcritos intrônicos com

expressão aumentada após tratamento com α-amanitina, enriquecidos na categoria funcional

“Regulação da Transcrição”

Oligo # Tipo de Oligo Lócus

Símbolo

do Lócus

Anotação do Lócus

16847 TIN senso 10608 MXD4 MAX dimerization protein 4

36503 TIN senso 51701 NLK nemo like kinase

3110 TIN senso 84441 MAML2 mastermind-like 2 (Drosophila)

31464 TIN senso 23512 SUZ12 suppressor of zeste 12 homolog (Drosophila)

13137 TIN senso 11083 DATF1 death associated transcription factor 1

17140 TIN senso 51341 ZBTB7A zinc finger and BTB domain containing 7A

7820 TIN senso 2034 EPAS1 endothelial PAS domain protein 1

23986 TIN senso 3607 FOXK2 forkhead box K2

12415 TIN senso 22823 MTF2 metal response element binding transcription factor 2

33974 TIN senso 4149 MAX MYC associated factor X

24586 TIN senso 7936 RDBP RD RNA binding protein

27454 TIN senso 11177 BAZ1A bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1A

31194 TIN antisenso 4084 MXD1 MAX dimerization protein 1

13268 TIN antisenso 5087 PBX1 pre-B-cell leukemia transcription factor 1

15195 TIN antisenso 22936 ELL2 elongation factor, RNA polymerase II, 2

35320 TIN antisenso 2309 FOXO3A forkhead box O3A

23226 TIN antisenso 23261 CAMTA1 calmodulin binding transcription activator 1

20871 TIN antisenso 9611 NCOR1 nuclear receptor co-repressor 1

25266 TIN antisenso 57178 RAI17 retinoic acid induced 17

39410 TIN antisenso 9759 HDAC4 histone deacetylase 4

12811 TIN antisenso 54796 BNC2 basonuclin 2

43764 TIN antisenso 2969 GTF2I general transcription factor II, i

44275 TIN antisenso 3899 LAF4 lymphoid nuclear protein related to AF4

30361 TIN antisenso 6095 RORA RAR-related orphan receptor A

30666 TIN antisenso 6920 TCEA3 transcription elongation factor A (SII), 3

23755 TIN antisenso 9612 NCOR2 nuclear receptor co-repressor 2

40265 PIN antisenso 2119 ETV5 ets variant gene 5 (ets-related molecule)

41908 PIN antisenso 3659 IRF1 interferon regulatory factor 1

43556 PIN antisenso 3661 IRF3 interferon regulatory factor 3

23247 PIN antisenso 7701 ZNF142 zinc finger protein 142 (clone pHZ-49)

44065 PIN antisenso 4929 NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2

28191 PIN antisenso 7633 ZNF79 zinc finger protein 79 (pT7)

36767 PIN antisenso 1106 CHD2 chromodomain helicase DNA binding protein 2

15410 PIN antisenso 9819 TSC22D2 TSC22 domain family, member 2

40067 PIN antisenso 166 AES amino-terminal enhancer of split

29019 PIN antisenso 6721 SREBF2 sterol regulatory element binding transcription factor 2

43464 PIN antisenso 405 ARNT aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator

21997 PIN antisenso 10589 DRAP1 DR1-associated protein 1 (negative cofactor 2 alpha)

16215 PIN antisenso 29128 UHRF1 ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1

29734 PIN antisenso 8570 KHSRP KH-type splicing regulatory protein (FUSE binding protein 2)

Análise das categorias de GO (Gene Ontology) de genes em cujos loci foram detectados transcritos

intrônicos TIN senso, antisenso ou PIN antisenso com abundância aumentada em células tratadas com α-

amanitina (RNAP II inibida) revelou enriquecimento significativo (p < 0,05) da categoria “

egulation o

Transcription, DNA-dependent” (GO: 006355).

Exônicos TIN Antisenso

TIN Senso

PIN Antisenso

Desvios-Padrão em

relação à média

controle

α-amanitina

Figura 15 - Efeito do tratamento com α-amanitina por 24 h em células LNCaP observado po

oligoarray. A variação da expressão de diferentes classes de transcritos representadas no

oligoarray foi avaliada com uma análise combinada de SAM (FDR < 0,2% to 3,5%) e SNR (p ≤

0,05). Aqui os “Exônicos” incluem os transcritos detectados pelos oligos Exônicos e PIN senso.

PIN - Parcialmente Intrônico, TIN - Totalmente Intrônicos. Cada coluna representa uma réplica e

cada linha um transcrito diferente. Para cada transcrito, a diferença de expressão é apresentada

como o número de desvios-padrão acima (vermelho) ou abaixo (verde) da média de todas as suas

ré

licas das duas condi

ões.

Figura 16 - Categorias funcionais enriquecidas entre os genes com expressão intrônica aumentada

em células com RNAP II inibida. Análise com o programa BiNGO foi utilizada para identificar as

categorias definidas por termos de GO (Gene Ontology) significativamente (p < 0,05)

enriquecidas dentre os genes em cujos loci mapeiam transcritos intrônicos PIN antisenso e TIN

senso e antisenso com expressão aumentada em células LNCaP tratadas com α-amanitina por 24

h. É apresentada a saída original do programa, incluindo (à direita) a representação do

enriquecimento em barra de cor em escala logarítmica.

5. Discussão

Um caminho para melhor compreendermos a relevância biológica das

diferentes classes de ncRNAs é o estudo dos mecanismos envolvidos em sua

biossíntese e modulação em resposta a sinais intracelulares e ambientais. No

presente trabalho, investigamos um mecanismo envolvido na modulação da

expressão de ncRNAs pertencentes à classe de transcritos totalmente intrônicos que

não sofrem splicing previamente descrita por nosso grupo (Reis et al., 2004), bem

como a participação da RNAP II na expressão de um grande número de RNAs

mapeados em íntrons.

Ligação do Receptor de Andrógeno a Possível Promotor Intrônico

O ponto de partida deste estudo foi a observação que longos ncRNAs

intrônicos têm a expressão regulada por andrógeno em células humanas da

linhagem de carcinoma prostático LNCaP (Louro et al., submetido). A sinalização por

andrógeno desempenha um papel importante na regulação de diversos processos

em células de próstata normal e neoplásica, incluindo proliferação e diferenciação

celular, quiescência, apoptose e várias vias do metabolismo celular (Isaacs et al.,

1992; Geck et al., 1997; Swinnen & Verhoeven, 1998), e é marcada pela alteração

na expressão de um conjunto específico de genes relacionados a esses processos

(DePrimo et al., 2002; Nelson et al., 2002). Da mesma forma, a modulação da

expressão de ncRNAs frente ao tratamento com andrógeno evidencia a

funcionalidade e a participação destes transcritos em processos fisiológicos nas

células (Cawley et al., 2004).

Alguns autores, no entanto, argumentam que a alteração na expressão

destes transcritos poderia ser apenas conseqüência de modificações na estrutura da

cromatina promovida por um estímulo específico, favorecendo ou reprimindo a

ocorrência de transcrição espúria em alguns loci (Johnson et al., 2005). Contudo, a

observação de elementos promotores específicos e da ligação funcional de fatores

de transcrição regulando a expressão de ncRNAs contraria esta hipótese.

Neste trabalho, procuramos observar o mecanismo da regulação da

expressão de alguns ncRNAs por andrógeno em células LNCaP. Esta linhagem

expressa Receptores de Andrógeno (AR), constituindo-se em um dos principais

modelos de estudo da ação de hormônios androgênicos em células humanas

(Nelson et al., 2002). A regulação da transcrição induzida por andrógeno envolve a

interação direta do hormônio esteróide com o AR no citoplasma, promovendo sua

dimerização e translocação para o núcleo, onde se liga a seqüências regulatórias de

DNA (AREs) proximais ou distais e leva à modulação positiva ou negativa da

expressão dos genes-alvo pela interação com a maquinaria basal da RNAP II e co-

reguladores, incluindo proteínas modificadoras da cromatina (Heinlein & Chang,

2002; Shang et al., 2002; Shaffer et al., 2004).

Investigamos a ligação do AR em AREs candidatos identificados à montante

de quatro ncRNAs intrônicos, os quais foram selecionados para esta análise por

termos uma indicação de sua provável extremidade 5’ (Louro et al., submetido). Para

um destes transcritos (ncRNA intrônico antisenso ao gene Myo5A), a análise por

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) mostrou que o AR liga-se ao provável

promotor que controla a transcrição induzida por andrógeno. Este resultado coincide

com o observado para o gene PSA, sabidamente ativado pelo hormônio pela ligação

do AR à sua região promotora.

No entanto, a ligação do AR não foi observada para os outros três transcritos

estudados. Uma possível explicação seria que a extremidade 5’ real destes

transcritos se estendesse mais à montante e que o fragmento que selecionamos

para os ensaios de ligação não corresponda à região promotora. Alternativamente, a

ativação da transcrição destes RNAs pode ser decorrente de uma resposta

secundária ao tratamento com andrógeno e não derive diretamente da ligação de

AR aos AREs putativos que identificamos.

Os experimentos que levaram à identificação dos ncRNAs responsivos a

andrógeno incluíram apenas tempos longos, com pelo menos 6 h de estimulação

(Louro et al., submetido). A resposta a hormônios esteróides é em geral rápida e,

apesar da resposta primária mediada pelo AR ser mantida durante um longo período

de estímulo com andrógeno (Jia et al., 2003), a variação na expressão de vários

genes e ncRNAs pode refletir efeitos secundários decorrentes das vias de

sinalização celular ativadas por andrógeno, em particular após um período longo de

exposição. Ademais, embora a detecção computacional de candidatos a ARE tenha

sido importante para o planejamento dos oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de

ChIP, é provável que maioria dos AREs identificados não represente elementos

funcionais. Isto se deve ao pequeno tamanho da seqüência consenso do ARE e ao

critério de identificação de candidatos, que aceita 75 % de identidade ao consenso

(observado para muitos AREs funcionais - Nelson et al., 2002), que se refletiu na alta

incidência de candidatos a ARE encontrados nas vizinhanças dos transcritos (média

de ~2 por transcrito). De fato, experimentos preliminares mostraram que a inibição

da síntese protéica por cicloheximida abole a modulação da expressão de alguns

transcritos em células tratadas com andrógeno (dados não mostrados), indicando

que a resposta ao hormônio observada para estes transcritos pode ser secundária.

Por outro lado, nossos dados de que a expressão do RNA intrônico antisenso

ao gene MYO5A ocorre de forma regulada, e que aparentemente envolve a RNAP II

modulada por um fator de transcrição, apontam para uma semelhança com o

mecanismo de transcrição de genes codificadores. Como evidência adicional,

Pandey e colaboradores (2004) investigaram a influência do fator de transcrição NF-

Y na expressão do ncRNA antisenso kcnq1ot1 e demonstraram a sua ligação na

seqüência à montante do transcrito. Neste caso, a funcionalidade da ligação foi

verificada com experimentos de deleção dos sítios de ligação a NF-Y que afetaram

negativamente a expressão do transcrito (Pandey et al., 2004). Além disso, Cawley

et al. (2004) mostraram que muitos sítios de ligação dos fatores c-Myc, p53, Sp1 e

CREB no genoma coincidem com as posições de mapeamento de ncRNAs poli(A)+

(cujo tamanho varia de 0,8 a 9 kb dentre os transcritos analisados), sugerindo que os

fatores de transcrição podem estar guiando a maquinaria de transcrição da RNAP II

para a biossíntese de ncRNAs.

O RNA intrônico antisenso ao gene MYO5A, mencionado acima, é transcrito a

partir do íntron 19 deste gene. MYO5A codifica uma proteína com funções motoras

mediadas pela interação com actina, atuando no tráfico intracelular e exocitose

(Rudolf et al., 2003; Tyska & Mooseker, 2003; Varadi et al., 2005; Watanabe et al.,

2005). Interessantemente, este gene codifica isoformas tecido-específicas

determinadas pelo uso alternativo de éxons, às quais, acredita-se, modulam a

especificidade e direcionamento do transporte de diferentes cargas dentro das

células (Au & Huang, 2002; Westbroek et al., 2003). Assim, é interessante especular

que o RNA intrônico antisenso possa atuar regulando o splicing alternativo de

MYO5A, e que a modulação na sua expressão por andrógeno provavelmente afete a

abundância relativa de diferentes isoformas. De forma semelhante, tem sido

proposto que o controle da expressão da cadeia pesada da miosina de músculo

cardíaco em diferentes situações fisiológicas e patológicas é mediado por um RNA

antisenso cis-atuante (Haddad et al., 2003; Haddad et al., 2006). Cabe lembrar que

o mecanismo de regulação do splicing alternativo já foi demonstrado para o

transcrito intrônico antisenso SAF (Yan et al., 2005).

Análise da Expressão do Antisenso SAF

Em células Jurkat, além do transcrito antisenso SAF, nós detectamos um

transcrito intrônico senso, que pode corresponder a uma unidade transcricional

independente ou simplesmente a uma forma imatura de FAS. Observamos que a

expressão de SAF é inibida em células tratadas por 12 h α-amanitina, um inibidor da

RNAP II. Utilizando esta mesma abordagem, foi demonstrado que a RNAP II é

responsável pela biossíntese de alguns ncRNAs longos, como o transcrito PRINS,

de pelo menos 1,48 kb, e o enorme transcrito AIR, de 108 kb, cuja expressão é

reprimida em células humanas tratadas com α-amanitina (Sonkoly et al., 2005; Seidl

et al., 2006).

Recentemente, foi demonstrado que um promotor típico de RNAP II dirige a

expressão de um ncRNA de 7 kb (AncR-1) de Apis mellifera em ensaio de gene

repórter em células de Drosophila (Sawata et al., 2004). Este promotor contém um

sítio TATA Box que ocorre na posição canônica a ~30 pb do sítio de iniciação da

transcrição. O ncRNA AncR-1 é, à semelhança dos mRNAs, poliadenilado e

apresenta diversas isoformas de splicing (Sawata et al., 2004).

Procuramos, também, demonstrar a ocorrência de um promotor específico

dirigindo a transcrição do ncRNA SAF em um segmento de ~600 pb à montante de

seu sítio de iniciação de transcrição, previamente determinado por 5’ RACE e primer

extension (Yan et al., 2005). Ainda que este segmento possua elementos

característicos de um promotor de RNAP II, como o TATA Box, não observamos

atividade promotora em ensaios de gene repórter. Uma explicação para nossos

resultados poderia ser que o sítio de iniciação da transcrição previamente

determinado não é o correto, o que implicaria na incorreta designação do promotor

proximal estudado. Entretanto, a metodologia utilizada por Yan e colaboradores na

determinação do início transcrição é bastante confiável.

Intrigantemente, uma busca por promotores funcionais em 1 % do genoma

humano revelou que menos de um terço (31,6 %) dos candidatos a promotores de

transcritos sem evidência de splicing apresentaram atividade em ensaios de gene

repórter (Cooper et al., 2006). Para modelos gênicos com múltiplos éxons, sendo a

maioria mRNAs, a fração de promotores com atividade é mais de duas vezes maior

(~66 %). Pelo menos metade dos transcritos no primeiro modelo gênico (sem

evidência de splicing) correspondem a ncRNAs, os quais representam uma fração

muito menor no segundo (múltiplos éxons). Os autores argumentaram que este

contraste poderia refletir que os transcritos não-anotados representam artefatos das

bibliotecas (ou produtos de transcrição espúria), ou que eles têm promotores

diferentes, com propriedades não bem avaliadas por esses ensaios de atividade de

promotor, nos quais apenas uma porção genômica imediatamente à 5’ do transcrito

é clonada à montante do gene repórter (Cooper et al., 2006).

Como exposto acima, a funcionalidade do ncRNA intrônico SAF (que não

sofre splicing) já foi demonstrada e, certamente, este transcrito não representa um

produto de transcrição espúria por RNAP II. De forma especulativa, é possível supor

diferentes explicações para nossos resultados, tais como: o funcionamento do

promotor de SAF pode depender de elementos regulatórios positivos não incluídos

no fragmento analisado; o contexto da cromatina pode ser fundamental para sua

atividade; ou no fragmento clonado pode haver um elemento regulatório negativo

cujo efeito fora do ambiente da cromatina é preponderante, uma vez que

aparentemente cerca de 55 % dos promotores possuem elementos negativos na

região de –1.000 a –500 capazes de reduzir consideravelmente (até praticamente

abolir, como para o promotor do gene SPAG4) a sua atividade em ensaios de gene

repórter (Cooper et al., 2006).

Por fim, cabe ressaltar que já foram demonstrados promotores ativos para

diversos tipos de ncRNAs (como os mencionados acima), inclusive antes da

descoberta da abundância destes transcritos. Como exemplos, descobertas

eventuais mostraram a ocorrência de um promotor dirigindo a expressão de um

ncRNA senso originado no primeiro íntron de P53 (Reisman et al., 1988; Reisman &

Rotter, 1989); de um elemento iniciador Inr, ocorrendo a 242 pb à jusante do início

de transcrição do gene eIF-2α, capaz de dirigir a síntese de um transcrito antisenso

(Silverman et al., 1992; Noguchi et al., 1994); além da demonstração da expressão

de um RNA antisenso ao gene c-MYC em núcleos de células de camundongo por

experimentos de run-on (Nepveu & Marcu, 1986).

Efeito da Inibição da RNAP II na Transcrição Intrônica

Neste trabalho, também avaliamos o efeito da inibição da RNAP II na

abundância de mensagens codificadoras e de transcritos intrônicos em células

humanas, utilizando oligoarrays. De encontro com a noção predominante da

transcrição de ncRNAs por RNAP II, observamos uma diminuição significativa na

abundância da maior parte dos transcritos intrônicos diferencialmente expressos em

células LNCaP tratadas por 24 h com alta dose de α-amanitina (50 µg/mL). Este

resultado também é consistente com o modelo da transcrição de ncRNAs intrônicos

por RNAP II, proposto a partir da observação da sua regulação por andrógeno, como

discutido acima.

Contudo, uma grande fração de ncRNAs não compartilha características

estruturais com mRNAs (por exemplo, poliadenilação e splicing) e a participação da

RNAP II em sua transcrição não está clara. No presente estudo, observamos que

uma fração significativa de transcritos totalmente ou parcialmente intrônicos

(antisenso) apresentou, após a inibição com α-amanitina, uma resposta distinta da

apresentada por transcritos mapeando em éxons de genes codificadores de

proteínas. Não apenas uma parcela pelo menos duas vezes menor destes

transcritos não-codificadores (16 a 19 %) expressos foi afetada pela inibição da

RNAP II por 24 h em relação aos exônicos (40 %), mas, notavelmente, muitos dos

diferencialmente expressos (12 a 15 %) tiveram a abundância significativamente

aumentada nesta condição, uma fração de 4 a 5 vezes maior que a observada para

transcritos exônicos.

A proporção de ncRNAs intrônicos com expressão insensível ou estimulada

frente à inibição da RNAP II pode ser ainda maior que a aqui reportada. O critério de

análise dos dados de hibridação dos oligoarrays envolvendo dois métodos

estatísticos combinados foi utilizado para definição de um conjunto robusto e

estatisticamente confiável de transcritos diferencialmente expressos, porém mais

restrito. A análise utilizando microarranjos de cDNA representando mais de 3 mil

transcritos (incluindo cerca de 800 intrônicos) revelou, por outro lado, maiores

proporções de transcritos intrônicos aumentados, porém sem a distinção da

orientação senso ou antisenso dos transcritos detectados (dados não mostrados).

Nestes experimentos, a proporção de exônicos afetados pela inibição da RNAP II foi

similar à observada nos experimentos em que utilizamos oligoarrays. De qualquer

modo, estendendo os resultados aqui apresentados para toda a população de

ncRNAs encontrados em células humanas, milhares de transcritos intrônicos devem

apresentar este comportamento frente à inibição da RNAP II. Considerando apenas

os ~55 mil clusters de ESTs intrônicos encontrados por Nakaya et al. (submetido),

em uma extrapolação da fração cuja abundância foi aumentada em células com

RNAP II bloqueada com α-amanitina por 24 h, estimamos que mais de mil serão

aumentados, se pelo menos 13 % forem diferencialmente expressos.

Estas observações evidenciam que a transcrição por RNAP II pode não

explicar a expressão de uma fração considerável de ncRNAs intrônicos. Uma forte

indicação a favor dessa hipótese pode ser extraída do estudo de Kim et al. (2005),

que utilizaram a estratégia de ChIP-chip para mapear os promotores ocupados pela

RNAP II em toda seqüência não-repetitiva do genoma humano. Estes autores

mostraram que apenas 13 % dos Pré-Complexos de Iniciação (PIC) da RNAP II

estão localizados em regiões a mais de 2,5 kb dos sítios de início de transcrição de

genes codificadores. Estes possíveis promotores em regiões não anotadas podem

estar dirigindo a expressão de ncRNAs, contudo esta proporção não é suficiente

para responder pela expressão do grande número de transcritos não-codificadores

observados em células humanas (Kim et al., 2005). À luz destes dados, é provável

que muitos dos sítios de ligação de fatores transcrição em regiões não-codificadoras,

determinados por ChIP-chip com tiling arrays genômicos, sejam elementos

regulatórios distais (como enhancers ou silencers) e não promotores proximais de

ncRNAs transcritos por RNAP II (Cawley et al., 2004).

Ao correlacionar a expressão de 14.437 transcritos com a ocupação pelo PIC

em células humanas, a transcrição pela RNAP II pode explicar a expressão de

apenas 75 % dos RNAs, sugerindo que um mecanismo ainda não conhecido deve

ser responsável pela biossíntese da fração restante (Kim et al., 2005).

Intrigantemente, diversos estudos têm sugerido a existência de propriedades

distintas para promotores de ncRNAs. Embora tenha sido mostrado (Cooper et al.,

2006) que muitos promotores de transcritos sem splicing e não-anotados não

apresentaram atividade em ensaio de gene repórter, também foi observado que eles

têm uma conservação média semelhante à dos promotores ativos de genes

anotados (muito superior à conservação média do genoma), o que é um indicativo

de funcionalidade. Ainda mais marcante, uma análise em maior escala das regiões

promotoras de transcritos de camundongo e humanos cujas extremidades 5’ foram

determinadas mostrou que as regiões à montante de ncRNAs são em geral muito

mais conservadas (e por um trecho maior) que os promotores de genes

codificadores (Carninci et al., 2005). Por outro lado, Kimura e colaboradores (2006),

estudando as seqüências dos sítios de iniciação da transcrição de cDNAs completos

clonados pelo método oligo-capping (Suzuki & Sugano, 2003), notaram que a

composição de bases dos sítios de iniciação de genes RefSeq (bem anotados,

curados manualmente) é significativamente diferente do observado para transcritos

não incluídos nos RefSeq, na maior parte constituídos de ncRNAs. Face a estes

resultados, esses autores sugeriram que a natureza do mecanismo de iniciação da

transcrição deve ser diferente entre genes codificadores de proteínas e ncRNAs

(Kimura et al., 2006). Coletivamente, estas descobertas indicam que pode haver

diferenças fundamentais na base dos processos de biossíntese de mRNAs e

ncRNAs. Uma das possibilidades é que outra RNAP também esteja envolvida na

transcrição de ncRNAs.

As três RNA polimerases nucleares de eucariotos foram originalmente

diferenciadas com base em sua sensibilidade à α-amanitina, que inibe fortemente a

RNAP II, mas não afeta a atividade da RNAP I e em altas concentrações inibe a

RNAP III (Jacob et al., 1970; Kedinger et al., 1970; Lindell et al., 1970).

Interessantemente, a quarta RNAP nuclear, descrita em células humanas, spRNAP

IV, apresenta atividade aumentada em células tratadas com α-amanitina

(Kravchenko et al., 2005). Como já destacado, a pequena fração de transcritos

exônicos que identificamos que aumenta acima de duas vezes em células com

RNAP II inibida é semelhante à encontrada por Kravchenko e colaboradores em uma

análise de um conjunto diferente de genes. A ocorrência de transcritos mapeados

em éxons de genes codificadores (alguns bem anotados) com expressão aumentada

com α-amanitina, é intrigante e deve ser estudada em maior detalhe. Considerando

a abundância de transcrição que ocorre em muitos loci complexos em células

humanas, é possível que alguns destes transcritos aumentados e classificados como

“exônicos” correspondam a ncRNAs com sobreposição a éxons na mesma

orientação.

Naturalmente, a spRNAP IV é uma boa candidata para a atuação na síntese

dos ncRNAs intrônicos aumentados com α-amanitina. Experimentos de interferência

de RNA visando à inibição desta polimerase estão em curso em nosso grupo e

deverão revelar se ela atua na biossíntese de transcritos intrônicos. Também será

importante a caracterização das seqüências promotoras reconhecidas por esta

enzima e dos fatores que regulam sua atividade transcricional.

Na verdade, o fato de uma fração pequena (duas vezes menor do que a

observadas para os exônicos) de transcritos intrônicos expressos terem sido

afetados pela inibição da RNAP II é bastante sugestivo de que esta polimerase pode

não estar envolvida na transcrição de um conjunto de ncRNAs. Contudo, o

mecanismo de aumento da expressão induzido por α-amanitina permanece mais

obscuro. Entretanto, vale destacar que α-amanitina pode promover alterações

drásticas na estrutura da cromatina em células humanas (Haaf & Ward, 1996), o que

poderia levar ao aumento da abundância de RNAs transcritos por uma polimerase

insensível à α-amanitina que teria uma maior acessibilidade a regiões contendo

promotores de ncRNAs.

Uma segunda hipótese seria que o aumento na expressão (abundância) de

RNAs exônicos e intrônicos poderia ser devido a uma estabilização destes

transcritos em células tratadas com α-amanitina. Em leveduras, foi mostrado que a

deleção de Rrp6p, componente da forma nuclear do exossomo, leva ao acúmulo de

RNAs intergênicos, chamados de RNAs crípticos (Wyers et al., 2005). Esta

observação indica a ocorrência de transcrição de ncRNAs instáveis que são

normalmente degradados no núcleo de leveduras. Contudo, desconhecemos

qualquer evidência da existência de um mecanismo que favoreça a estabilidade de

RNAs não-codificadores senso e antisenso em relação a mRNAs em células

humanas, o qual poderia explicar a diferença observada entre as proporções de

transcritos exônicos e intrônicos não afetados ou aumentados frente à inibição da

RNAP II. Assim, parece improvável a ocorrência de tal sistema de degradação

preferencial de ncRNAs, cuja depleção em células com inibição da RNAP II por

apenas 24 h seria responsável pelo aumento observado na abundância destes

transcritos.

A possibilidade de que novas polimerases desempenhem funções como a

transcrição de diferentes ncRNAs em células eucarióticas é bastante atrativa. Além

da spRNAP IV, muito recentemente, outras duas novas RNA polimerases nucleares

eucarióticas foram descobertas. Exclusivas de plantas, a RNAP IVa e RNAP IVb

são responsáveis pela transcrição de pequenos RNAs que atuam dirigindo a

formação de heterocromatina e silenciamento de transposons (Herr et al., 2005;

Onodera et al., 2005; Pontier et al., 2005). Tem sido considerado que até mesmo

uma RNA Polimerase dependente de RNA (RpRD) ativa poderia existir em células

humanas, assim como ocorre em fungos, animais invertebrados, plantas e diversos

vírus de RNA (Zamore & Haley, 2005; Wassenegger & Krczal, 2006). Esta hipótese

é baseada na observação de que alguns RNAs são perfeitamente complementares a

outro RNA (antisenso) em toda sua extensão, inclusive com a mesma estrutura de

splicing (naturalmente, invertida), ou seja, são transcritos especulares cuja origem é

explicável pela cópia por uma RpRD (Cheng et al., 2005; Kapranov et al., 2005). As

RpRDs descritas em eucariotos desempenham um papel importante na geração de

siRNAs secundários e manutenção do processo de RNAi, mas, apesar de a via

existir em humanos e outros mamíferos, a atividade desta polimerase ainda não foi

detectada nestes organismos (Stein et al., 2003).

Além da caracterização da biossíntese e regulação, será muito importante

definir as funções biológicas destes transcritos. É relevante notar que no nosso

estudo sobre o efeito da inibição da RNAP II observamos uma similaridade entre a

resposta da expressão dos transcritos totalmente intrônicos senso e antisenso. Estes

apresentaram proporções de transcritos não afetados e aumentados quase

idênticas, as quais foram muito diferentes da observada para os transcritos exônicos.

Este resultado sugere fortemente que os transcritos intrônicos senso não são

artefatos originados dos pré-mRNAs ou ruído produzido pela RNAP II transcrevendo

genes codificadores (Dennis, 2002; Brosius, 2005; Castillo-Davis, 2005; Huttenhofer

et al., 2005; Johnson et al., 2005; Kapranov et al., 2005).

Uma boa indicação da possível relevância funcional dos ncRNAs é dada pela

sua distribuição não randômica no genoma. Interessantemente, os transcritos

intrônicos de todas as classes não-codificadoras (TIN senso e antisenso e PIN

antisenso) com expressão aumentada em células com RNAP II inibida apresentaram

um enriquecimento significativo em loci de genes envolvidos com regulação da

transcrição. Esta observação soma-se aos resultados obtidos por Nakaya e

colaboradores (submetido) que, utilizando a mesma plataforma de oligoarray,

mostraram que os transcritos intrônicos antisenso mais abundantes em diferentes

tecidos (próstata, rim e fígado) mapeiam preferencialmente em genes pertencentes a

esta classe regulatória.

A identificação de regiões genômicas não-codificadoras que estão sobre forte

pressão seletiva, incluindo regiões intrônicas, tem sido realizada com diferentes

abordagens: identificação de seqüências “ultraconservadas” (Bejerano et al., 2004);

de seqüências conservadas em múltiplas espécies (Sironi et al., 2005); seqüências

conservadas entre vertebrados, mas altamente divergentes entre chimpanzés e

humanos (Pollard et al., 2006); pequenos blocos de seqüência com múltiplas cópias

(pyknons) (Rigoutsos et al., 2006); ou ausência de inserção de transposons (Simons

et al., 2006). É extremamente interessante que todas estas regiões identificadas

estão fortemente associadas com genes envolvidos com regulação da transcrição,

sobre os quais provavelmente exercem papéis regulatórios importantes (Bejerano et

al., 2004; Sironi et al., 2005; Pollard et al., 2006; Rigoutsos et al., 2006; Simons et

al., 2006). É possível que nossa observação do mapeamento de transcritos

intrônicos nestes genes represente um mecanismo adicional de regulação dos

reguladores, constituindo um sistema elaborado de controle fino da expressão

gênica em células humanas.

100

Em conclusão, neste trabalho mostramos que a RNAP II desempenha um

papel importante na transcrição intrônica e que esta pode ocorrer de forma regulada

por fatores de transcrição, da mesma forma como ocorre a expressão de genes

codificadores. Por outro lado, também observamos que uma fração significativa de

ncRNAs intrônicos apresenta propriedades diferentes dos transcritos codificadores

de proteínas. A expressão refratária ou mesmo estimulada de transcritos intrônicos

observada em células humanas com RNAP II bloqueada suscita a possibilidade de

que outra polimerase atue em sua transcrição, o que contraria a visão

preponderante, mas abre novas perspectivas para o entendimento de sua

biossíntese. A elucidação deste aspecto da biologia dos ncRNAs será importante

para a compreensão das diferentes classes de RNAs e de suas funções em

humanos e outros eucariotos.

101

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Wyers, F., Rougemaille, M., Badis, G., Rousselle, J.C., Dufour, M.E., Boulay, J., Regnault,

B., Devaux, F., Namane, A., Seraphin, B., Libri, D. & Jacquier, A. (2005) Cryptic pol

II transcripts are degraded by a nuclear quality control pathway involving a new

poly(A) polymerase. Cell, 121, 725-737.

114

Wylie, A.A., Murphy, S.K., Orton, T.C. & Jirtle, R.L. (2000) Novel imprinted DLK1/GTL2

domain on human chromosome 14 contains motifs that mimic those implicated in

IGF2/H19 regulation. Genome Res, 10, 1711-1718.

Yan, M.D., Hong, C.C., Lai, G.M., Cheng, A.L., Lin, Y.W. & Chuang, S.E. (2005)

Identification and characterization of a novel gene Saf transcribed from the opposite

strand of Fas. Hum. Mol. Genet., 14, 1465-1474.

Yang, Z., Zhu, Q., Luo, K. & Zhou, Q. (2001) The 7SK small nuclear RNA inhibits the

CDK9/cyclin T1 kinase to control transcription. Nature, 414, 317-322.

Yelin, R., Dahary, D., Sorek, R., Levanon, E.Y., Goldstein, O., Shoshan, A., Diber, A., Biton,

S., Tamir, Y., Khosravi, R., Nemzer, S., Pinner, E., Walach, S., Bernstein, J., Savitsky,

K. & Rotman, G. (2003) Widespread occurrence of antisense transcription in the

human genome. Nat. Biotechnol., 21, 379-386.

Yi, R., Doehle, B.P., Qin, Y., Macara, I.G. & Cullen, B.R. (2005) Overexpression of exportin

5 enhances RNA interference mediated by short hairpin RNAs and microRNAs. Rna,

11, 220-226.

Young, T.L., Matsuda, T. & Cepko, C.L. (2005) The noncoding RNA taurine upregulated

gene 1 is required for differentiation of the murine retina. Curr Biol, 15, 501-512.

Zamore, P.D. & Haley, B. (2005) Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 309,

1519-1524.

Zeng, F. & Schultz, R.M. (2005) RNA transcript profiling during zygotic gene activation in

the preimplantation mouse embryo. Dev Biol, 283, 40-57.

Zeng, Y., Yi, R. & Cullen, B.R. (2003) MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit

mRNA expression by similar mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 9779-9784.

Zhang, Z. & Carmichael, G.G. (2001) The fate of dsRNA in the nucleus: a p54(nrb)-

containing complex mediates the nuclear retention of promiscuously A-to-I edited

RNAs. Cell, 106, 465-475.

Zwieb, C., van Nues, R.W., Rosenblad, M.A., Brown, J.D. & Samuelsson, T. (2005) A

nomenclature for all signal recognition particle RNAs. Rna, 11, 7-13.

115

LISTA DE ANEXOS

Anexos inclusos no CD-ROM suplementar a esta Dissertação

Anexo 1: Nakaya, H.I., Amaral, P.P., Louro, R., Lopes, A., Fachel, A.A., Moreira,

Y.B., El-Jundi, T.A., da Silva, A.M., Reis, E.M. & Verjovski-Almeida, S. (2006)

Expression Analyses of Human Intronic Noncoding RNAs Reveal Tissue-Specific

Patterns and Enrichment in Genes Related to Regulation of Transcription.

(Submetido)

Anexo 2: Amaral, P.P. & Nakaya, H.I. (2006) DNA não-codificador: o lixo que vale

ouro? Ciência Hoje, 38, 36-42.

Anexo 3: Louro, R., Nakaya, H.I., Amaral, P.P., Festa, F., Sogayar, M.C., da Silva,

A.M., Verjovski-Almeida, S. & Reis, E.M. (2006) Androgen responsive intronic non-

coding RNAs. (Submetido).

Anexo 4: Súmula Curricular.

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