ads:
MINISTÉRIO DA DEFESA
EXÉRCITO BRASILEIRO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA
INSTITUTO MILITAR DE ENGENHARIA
CURSO DE DOUTORADO EM CIÊNCIA DOS MATERIAIS
MARIA ELISA RODRIGUES COIMBRA
DEGRADAÇÃO DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO), BIOVIDRO E
HIDROXIAPATITA
Rio de Janeiro
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
INSTITUTO MILITAR DE ENGENHARIA
MARIA ELISA RODRIGUES COIMBRA
DEGRADAÇÃO DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO), BIOVIDRO E
HIDROXIAPATITA
Tese de Doutorado apresentada ao Curso de
Doutorado em Ciência dos Materiais do Instituto
Militar de Engenharia, como requisito parcial para
obtenção de título de Doutor em Ciência em
Ciências dos Materiais.
Orientador: Carlos Nelson Elias, D.C
Co-orientador: Paulo Guilherme Coelho, Ph.D.
Rio de Janeiro
2008
ads:
2
c2008
INSTUTUTO MILITAR DE ENGENHARIA
Praça General Tibúrcio, 80 – Praia Vermelha.
Rio de Janeiro – RJ CEP: 22290-270
Este exemplar é de propriedade do Instituto Militar de Engenharia, que poderá incluí-
lo em base de dados, armazenar em computador, microfilmar ou adotar qualquer
forma de arquivamento.
É permitida a menção, reprodução parcial ou integral e a transmissão entre
bibliotecas deste trabalho, sem modificação do seu texto, em qualquer meio que
esteja ou venha a ser fixado, para pesquisa acadêmica, comentários e citações,
desde que sem finalidade comercial e que seja feita referência bibliográfica
completa.
Os conceitos expressos neste trabalho são de responsabilidade do autor e dos
orientadores.
.
C679 Coimbra, Maria Elisa Rodrigues
Degradação de poli (ácido láctico), biovidro e
hidroxiapatita / Maria Elisa Rodrigues Coimbra. – Rio
de Janeiro: Instituto Militar de Engenharia, 2008.
240p.: il.,graf.,tab.
Tese (doutorado) – Instituto Militar de Engenharia,
2008.
1. Biomateriais. 2. Polímeros bioabsorvíveis. 3.
Cerâmicos bioabsorvíveis. 4. Enxerto ósseo. I. Título.
II. Instituto Militar de Engenharia.
CDD 620.11
3
INSTITUTO MILITAR DE ENGENHARIA
MARIA ELISA RODRIGUES COIMBRA
DEGRADAÇÃO DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO), BIOVIDRO E
HIDROXIAPATITA
Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências dos
Materiais do Instituto Militar de Engenharia, como requisito parcial para obtenção de
título de Doutor em Ciência em Ciências dos Materiais.
Orientador: Carlos Nelson Elias, D.C.
Co-orientador: Paulo Guilherme Coelho, Ph.D.
Aprovada em 15 de dezembro de 2008, pela seguinte Banca Examinadora:
___________________________________________________________
Prof. Carlos Nelson Elias, D.C. – IME – Presidente
____________________________________________________________
Prof. Paulo Guilherme Coelho, Ph.D. – Universidade de Nova York – NYU
____________________________________________________________
Prof. Luiz Paulo Mendonça Brandão – D.C. – IME
____________________________________________________________
Prof. João Carlos Miguez Suarez – D.C. – IME
____________________________________________________________
Prof
a
. Ana Maria Bolognese – Ph.D. – UFRJ
Rio de Janeiro
2008
4
Ao meu marido Fernando Antonio, pela
compreensão nos momentos de ausência e
tensão, pelo apoio irrestrito nas horas
difíceis e pelo amor em todos os momentos.
Aos meus pais, Emidio Tadeu e Dora
Cristina, por tudo o que já fizeram e fazem
por mim até hoje.
Ao meu querido irmão Mateus, que sempre
torceu pelo meu sucesso.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto Militar de Engenharia, IME, pela oportunidade e disponibilização
dos meios para realização desta tese.
Ao Departamento de Biomateriais e Biomimética da Faculdade de
Odontologia da Universidade de Nova York, por ter me recebido durante oito meses
para análise dos resultados.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Nelson Elias, por ter acreditado em mim e
me guiado neste novo caminho da pesquisa, demonstrando amizade, competência,
capacidade técnica e inesgotável paciência.
Ao meu co-orientador, Dr. Paulo Guilherme Coelho, pela inestimável
contribuição a este trabalho, não só cientificamente, mas também ensinando o
“caminho das pedras” para a análise dos resultados e tornando minha estadia em
Nova York ainda mais agradável.
Ao Prof. Dr. João Carlos Miguez Suarez, por ter revisado o documento de tese
com toda atenção, dedicando o seu tempo na interpretação dos resultados da parte
relativa ao polímero e no aperfeiçoamento do texto final.
Ao CNPq e à FAPERJ, pelo apoio financeiro através dos projetos 300216/94-7,
452834/03-1, 50016/052003 e 472449/2004-4 (CNPq); e E-26/151.970/2004
(FAPERJ).
À CAPES e à FAPERJ, pela bolsa de estudos concedida no Brasil e à CAPES,
pela bolsa de estudos para realização do Doutorado Sanduíche na Universidade de
Nova York.
À empresa JHS Laboratório Químico LTDA, pela doação da hidroxiapatita
utilizada no presente estudo.
6
Ao Prof. Dr. Claudinei dos Santos, da Faculdade de Engenharia Química da
USP, Campus Lorena, pela doação do biovidro experimental e pela obtenção dos
difratogramas de Difração de Raios X das amostras, auxílio na interpretação dos
resultados, bem como pela amizade.
Ao Prof. Dr. Francisco Krug e a Sra. Iolanda Rufini, do Centro de Energia
Nuclear da USP, Campus Piracicaba, pela realização da moagem criogênica do
material polimérico.
Ao Prof. Dr. Sidnei Paciornik, do Laboratório de Processamento de Imagens
Digital da PUC – Rio, pelo processamento das imagens que forneceram os dados
para análise de distribuição do tamanho de partículas.
À Sra. Márcia Regina Benzi, do Instituto de Macromoléculas da UFRJ, pela
orientação e realização da FTIR do material polimérico.
Ao Dr. Marcus Paulo Foutnier Lessa, do Instituto de Macromoléculas da UFRJ,
pela orientação e realização da Cromatografia por Permeação em Gel para
determinação do peso molecular do material polimérico.
Ao Major Fabio Cano, da Seção de Engenharia Química do Instituto Militar de
Engenharia, pelo auxílio nas análises térmicas.
Ao Prof. Dr. Marcelo Henrique Prado da Silva, do Instituto Militar de
Engenharia, pelo auxílio na interpretação dos resultados de difração de raios X.
À minha amiga de turma de Doutorado, Márcia Gouvêa Bernardes, pela troca
de conhecimentos durante todo o curso, ajuda e apoio, principalmente durante a
fase in vivo da pesquisa. Aprendemos juntas a lidar com as dificuldades de trabalhar
com animais.
Ao veterinário Sr. Paulo Eduardo Mansur Hobaica e a todos os funcionários do
biotério do Departamento de Microbiologia da UFRJ, sempre dispostos a ajudar.
7
Ao Dr. José Henrique Cavalcanti Lima, que espontaneamente, mesmo não
estando diretamente envolvido com a pesquisa, remarcava seu pacientes e ia ao
biotério me ensinar e ajudar nas cirurgias dos animais. Sou eternamente grata.
À Sra. Rosenilde Holanda, do Laboratório de Morfogênese Celular,
Departamento de Anatomia da UFRJ, pelo auxílio com o processamento dos
espécimes ósseos.
Ao Prof. Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade e a Sra. Mair Machado
Medeiros do Laboratório de Biomineralização, do Instituto de Ciências Biomédicas
da UFRJ, pelo auxílio e ensinamentos durante a confecção das amostras
calcificadas.
À Prof
a
Dra Racquel Z. LeGeros, do Departamento de Biomateriais e
Biomimética da Faculdade de Odontologia da Universidade de Nova York, pelos
ensinamentos sobre os materiais biocerâmicos e pela disponibilização de seus
laboratórios para caracterização dos materiais cerâmicos analisados.
Ao Prof. Dr. Timothy G. Bromage, do Departamento de Biomateriais e
Biomimética da Faculdade de Odontologia da Universidade de Nova York, pelo
auxílio no corte e preparo das amostras calcificadas, pela orientação quanto à
utilização dos microscópios e pelos ensinamentos para interpretação dos resultados.
Incansável e persistente para viabilizar melhores imagens das amostras dos
espécimes ósseos.
Ao Prof. Dr. John L. Ricci, do Departamento de Biomateriais e Biomimética da
Faculdade de Odontologia da Universidade de Nova York, pela orientação técnica
no uso do equipamento de microtomografia computadorizada.
À Fang Yao e ao Dindo Mijares, do Departamento de Biomateriais e
Biomimética da Faculdade de Odontologia da Universidade de Nova York, pelo
auxílio na caracterização dos materiais cerâmicos, na análise por microtomografia
computadorizada, bem como na troca de conhecimentos.
8
Ao Sr. Joel Fonseca dos Santos, do Instituto Militar de Engenharia, pela
obtenção das imagens por microscopia eletrônica de varredura das amostras da
pesquisa in vitro.
Ao Dr. José Ricardo Gomes Matheus, ser humano ímpar, sempre disposto a
ajudar, disponibilizando material de estudo, cedendo o seu horário no MEV para que
eu pudesse realizar minhas análises.
Aos professores do curso Ciência dos Materiais, pela importância dos cursos
ministrados, fatores indispensáveis à consolidação do pensamento científico.
Aos amigos e colegas do curso Ciência dos Materiais, pelas horas de estudo em
conjunto, bem como pelas conversas agradáveis nos intervalos.
Aos amigos do Departamento de Biomaterial e Biomimética da Faculdade de
Odontologia da Universidade de Nova York, muito importantes para que minha
estadia nos EUA fosse muito agradável.
À Heloísa, Sandra, Veltri, Edirlene, Hector e demais responsáveis pelas
atividades administrativas, sempre atentos a que não nos distraíssemos ou nos
enganássemos no cumprimento de todas as formalidades.
Ao meu querido marido e companheiro de longa data, Fernando Antonio
Santos de la Riva, que sempre esteve ao meu lado, mesmo nos oito meses em que
estive fora, me incentivando e encorajando a ir em frente e a superar as dificuldades.
Obrigada por tudo e mais um pouco.
À minha família, meus pais, Emidio Tadeu Bouças Coimbra e Dora Cristina
da Silva Rodrigues, meu irmão, Mateus Rodrigues Coimbra, por toda a
contribuição para a formação e consolidação do meu caráter, mostrando a
importância da amizade, da solidariedade e do respeito às diferenças.
À minha segunda família, meus sogros, Fernando Octavio Ramiro de la Riva e
9
Averhoff e Margarida Maria Santos de la Riva e minhas cunhadas, Margarida
Aleida, Marina Alexandra e Maria Angelica Santos de la Riva, por terem me
acolhido como filha e irmã, por todo o incentivo durante todos estes anos de
convívio.
À Família Rodrigues Coimbra e a todos os amigos que contribuíram direta ou
indiretamente para meu crescimento durante estes quatro anos, pela compreensão
da minha ausência neste período.
10
“Aprender é a única coisa que a mente nunca se
cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende.”
LEONARDO DA VINCI
11
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. 14
LISTA DE TABELAS ............................................................................................. 26
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .......................................................... 27
LISTA DE SIGLAS ................................................................................................ 30
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................
33
1.1. Importância ....................................................................................... 33
1.2. Objetivos ........................................................................................... 34
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................ 36
2.1 Estrutura Óssea ................................................................................ 36
2.2 Histodinâmica da Cicatrização da Ferida Óssea .............................. 42
2.3. Biopolímeros ..................................................................................... 48
2.3.1. Poli (ácido lático) ...............................................................................
49
2.3.1.1. Conceitos .......................................................................................... 49
2.3.1.2. Aplicações .........................................................................................
53
2.3.1.3. Degradação ...................................................................................... 56
2.4. Biocerâmicos .................................................................................... 60
2.4.1. Biovidro ............................................................................................. 62
2.4.1.1. Conceitos .......................................................................................... 62
2.4.1.2. Aplicações .........................................................................................
66
2.4.1.3. Degradação ...................................................................................... 69
2.4.2. Hidroxiapatita .................................................................................... 71
2.4.2.1. Conceitos .......................................................................................... 71
2.4.2.2. Aplicações .........................................................................................
77
2.4.2.3. Degradação ...................................................................................... 81
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................
83
3.1. Descrição das fases do trabalho .......................................................
83
3.1.1. Fase in vitro ...................................................................................... 84
3.1.1.1. Processamento das amostras .......................................................... 84
12
3.1.1.2. Degradação das amostras ................................................................
87
3.1.1.3. Distribuição de Tamanho das Partículas (PSD) ............................... 88
3.1.1.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) .....................................
91
3.1.1.5. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) ....................................
91
3.1.1.6. Análise Termogravimétrica (TGA) .................................................... 92
3.1.1.7. Espectroscopia no infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) ................................................................................................
92
3.1.1.8. Difração de Raios X (DRX) ............................................................... 93
3.1.1.9. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) ................................... 93
3.1.2. Fase in vivo .......................................................................................
94
3.1.2.1. Descrição cirúrgica ........................................................................... 94
3.1.2.2. Marcadores ósseos ...........................................................................
101
3.1.2.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) .....................................
102
3.1.2.4. Preparo histológico ........................................................................... 104
3.1.2.4.1. Embutimento das amostras .............................................................. 104
3.1.2.4.2. Montagem das amostras nas lâminas para histologia ......................
105
3.1.2.5. Microscopia Óptica ........................................................................... 108
3.1.2.5.1. Microscopia de Fluorescência (MF) ..................................................
108
3.1.2.5.1. Microscopia de Luz Transmitida (MLT) .............................................
109
3.1.2.6. Microtomografia Computadorizada (µCT) ........................................ 109
3.1.2.7. Análise estatística ............................................................................. 110
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 111
4.1. Fase in vitro ...................................................................................... 111
4.1.1. Distribuição de Tamanho de Partículas (PSD) ................................. 111
4.1.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) .....................................
114
4.1.3. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) ....................................
122
4.1.4. Análise Termogravimétrica (TGA) .................................................... 125
4.1.5. Espectroscopia no infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) ................................................................................................
127
4.1.6. Difração de Raios X (DRX) ............................................................... 133
4.1.7. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) ................................... 137
4.2. Fase in vivo .......................................................................................
141
13
4.2.1. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) .....................................
142
4.2.2. Microscopia Óptica ........................................................................... 159
4.2.3. Microtomografia Computadorizada (µCT) ........................................ 179
4.2.4 Relações entre os Resultados in vitro e in vivo ................................ 188
4.2.4.1 PLDLLA .............................................................................................
189
4.2.4.2 Compósito PLDLLA e Biovidro 1 ...................................................... 190
4.2.4.3 Biovidro 1 e Biovidro 2 ...................................................................... 191
4.2.4.4 Hidroxiapatita .................................................................................... 192
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ......................................................
194
5.1. Conclusões ....................................................................................... 194
5.2. Sugestões ......................................................................................... 195
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................ 197
7. APÊNDICE ....................................................................................... 225
7.1. Parecer do Comitê de Ética .............................................................. 226
7.2. Artigos Publicados ............................................................................ 227
7.2.1. Artigo 1 ..............................................................................................
227
7.2.2. Artigo 2 ..............................................................................................
227
7.3. Artigos a serem submetidos ............................................................. 240
7.3.1. Artigo 1 ..............................................................................................
240
7.3.2. Artigo 2 ..............................................................................................
240
7.3.3. Artigo 3 ..............................................................................................
240
14
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIG. 2.1 Origem e localização das células ósseas ......................................... 37
FIG. 2.2 Amostra de um osso longo cortado longitudinalmente. A porção
externa representa o osso compacto e o interior do osso apresenta
configuração esponjosa ....................................................................
39
FIG. 2.3 Esquema da estrutura organizacional do tecido ósseo .................... 40
FIG. 2.4 Microestrutura do osso cortical ......................................................... 41
FIG. 2.5 Microestrutura do osso medular ....................................................... 41
FIG. 2.6 Desenhos esquemáticos mostrando o processo de reparação da
fratura, por formação de novo tecido ósseo a partir do endósteo e
do periósteo ......................................................................................
47
FIG. 2.7 Estereoisômeros do ácido lático ...................................................... 50
FIG. 2.8 Estrutura química do poli (ácido lático) .............................................
50
FIG. 2.9 Reação de policondensação para obtenção do poli (ácido lático) ... 51
FIG. 2.10 Reação de formação do dímero de ácido lático ............................... 52
FIG. 2.11 Síntese do PLA por abertura do anel ................................................
52
FIG. 2.12 Possibilidade de melhor controle estrutural através da
polimerização do PLA por abertura do anel ......................................
52
FIG. 2.13 Esquema da degradação do PLA e PGA ou de seus copolímeros
in vivo levando a formação dos monômeros GA e LA......................
58
15
FIG. 2.14 Esquema ilustrando a indução da formação de hidroxiapatita em
meio fisiológico pelo biovidro ............................................................
63
FIG. 2.15 Arranjo atômico da HA na célula unitária hexagonal. Os ânions OH
-
localizados nos cantos da célula unitária estão envolvidos por dois
grupos de cátions Ca (II) distribuídos em posições triangulares em
z = 0,25 e 0,75, por dois grupos de [PO
4
]
3+
também distribuídos em
posições triangulares e por cadeia hexagonal de átomos de Ca (I) .
74
FIG. 2.16 Estrutura da HA ao longo do eixo c .................................................. 75
FIG. 3.1 Moinho criogênico de moagem por impacto com barras magnéticas 85
FIG. 3.2 Conjunto de moagem utilizado nos moinhos de moagem por
impacto com barras magnéticas ........................................................
85
FIG. 3.3 Tubo de policarbonato montado com o material no seu interior ........ 85
FIG. 3.4 Tubo posicionado dentro do moinho criogênico ............................... 86
FIG. 3.5 PLDLLA: (a) antes; e (b) depois da moagem ................................... 86
FIG. 3.6 Biovidro 1 (BG1): aspecto macroscópico do material ........................ 86
FIG. 3.7 Biogran
®
(Biovidro 2 – BG2): (a) apresentação comercial; (b)
aspecto macroscópico do material ...................................................
87
FIG. 3.8 HAP – 91
®
(Hidroxiapatita – HAP): (a) apresentação comercial; (b)
aspecto macroscópico do material ...................................................
87
FIG. 3.9 (a) PLDLLA antes da moagem (aumento de 10x); (b) PLDLLA após
a moagem (aumento de 10x); (c) Biovidro 1 (BG1) (aumento de
10x); (d) Biogran
®
(Biovidro 2 – BG2) (aumento de 10x); (e) HAP –
16
91
®
(Hidroxiapatita – HAP) (aumento de 10x) .................................. 89
FIG. 3.10 Coelho macho Nova Zelândia com aproximadamente 3,2 kgf ......... 95
FIG. 3.11 Crânio do coelho com localização dos defeitos cirúrgicos ............... 96
FIG. 3.12 (a) Higienização com iodopovidona; (b) Tricotomia na região da
incisão; (c) Aspecto final após tricotomia ..........................................
97
FIG. 3.13 Posicionamento do animal em decúbito ventral ............................... 97
FIG. 3.14 (a) Incisão de aproximadamente 3,5 cm na pele; (b) Após
exposição do periósteo, incisão do mesmo; (c) Exposição do sítio
ósseo eleito para cirurgia ..................................................................
98
FIG. 3.15 Trefina usada para confecção do defeito ..........................................
98
FIG. 3.16 (a) Criação dos defeitos ósseos cirúrgicos sob constante irrigação;
(b) Remoção do fragmento ósseo; (c) Conferência da integridade
da dura-máter; (d) Os três defeitos criados; (e) Fragmentos ósseos
removidos; (f) Preenchimento dos defeitos com os respectivos
materiais ...........................................................................................
99
FIG. 3.17 (a) Sutura do periósteo com fio reabsorvível de poli (ácido glicólico)
(4-0); (b) sutura do tecido epitelial com fios de nylon (4-0) ...............
99
FIG. 3.18 (a) Fotografia ilustrando a osteotomia inicial; (b) Individualização
dos sítios cirúrgicos ..........................................................................
100
FIG. 3.19 Ilustração de como o corte da amostra foi realizado ........................ 103
FIG. 3.20 Suporte de alumínio utilizado para embutir as peças: (a) montado
e (b) desmontado ..............................................................................
105
17
FIG. 3.21 Amostra embutida no bloco de poli (metacrilato de metila) .............. 105
FIG. 3.22 (a) Conjunto amostra e suporte preso na máquina para o corte; (b)
Amostra cortada no meio ..................................................................
106
FIG. 3.23 (a) e (c) Amostra colada na lâmina de histologia; (b) e (d) Amostra
com o peso sobre a mesma ..............................................................
107
FIG. 3.24 (a) Conjunto suporte, lâmina e amostra preso à máquina; (b)
Lâmina posicionada para um corte da amostra de 1 mm de
espessura .........................................................................................
107
FIG. 4.1 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do
PLDLLA antes da moagem ...............................................................
112
FIG. 4.2 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do
PLDLLA depois da moagem .............................................................
112
FIG. 4.3 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do
BG1 ...................................................................................................
113
FIG. 4.4 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do
BG2 ...................................................................................................
113
FIG. 4.5 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas da
HAP ...................................................................................................
114
FIG. 4.6 Micrografias do PLDLLA antes da moagem: (a) Como recebido
(A1) (100x) (detalhe 1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF
(A2) (100x) (detalhe 1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF
(A3) (100x) (detalhe 2.000x); (d) Após 90 dias em solução de SBF
(A4) (100x) (detalhe 2.000x) .............................................................
115
18
FIG. 4.7 Micrografias do PLDLLA após a moagem: (a) Como recebido (A1)
(100x) (detalhe 1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (A2)
(100x) (detalhe 1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (A3)
(100x) (detalhe 1.500x); (d) Após 90 dias em solução de SBF (A4)
(100x) (detalhe 1.500x) .....................................................................
116
FIG. 4.8 Micrografias do BG1: (a) Como recebido (B1) (100x) (detalhe
1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (B2) (100x) (detalhe
1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (B3) (100x) (detalhe
1.500x); (d) Após 90 dias em solução de SBF (B4) (100x) (detalhe
1.500x) ..............................................................................................
118
FIG. 4.9 Micrografias do BG2: (a) Como recebido (C1) (100x) (detalhe
1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (C2) (100x) (detalhe
1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (C3) (100x) (detalhe
1.500x); (d) Após 90 dias em solução de SBF (C4) (100x) (detalhe
1.500x) ..............................................................................................
119
FIG. 4.10 Micrografias da HAP: (a) Como recebida (D1) (100x) (detalhe
1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (D2) (100x) (detalhe
1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (D3) (100x) (detalhe
1.500x); (d) Após 90 dias em solução de SBF (D4) (100x) (detalhe
1.500x) ..............................................................................................
122
FIG. 4.11 Termogramas de DSC do PLDLLA: (a) Antes e (b) Depois da
moagem ............................................................................................
123
FIG. 4.12 Termogramas da TGA do PLDLLA: (a) Antes da moagem como
recebido; (b) Antes da moagem após 90 dias em solução de SBF;
(c) Depois da moagem como recebido; (b) Depois da moagem
após 90 dias em solução de SBF .....................................................
125
FIG. 4.13 Espectro de FTIR do PLDLLA antes da moagem: (a) Como
19
recebido; (b) Após 30 dias em solução de SBF; (c) Após 60 dias
em solução de SBF; (d) Após 90 dias em solução de SBF ..............
128
FIG. 4.14 Espectro de FTIR do PLDLLA após a moagem: (a) Como recebido;
(b) Após 30 dias em solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução
de SBF; (d) Após 90 dias em solução de SBF .................................
129
FIG. 4.15 Espectro de FTIR do BG1: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90
dias em solução de SBF ...................................................................
130
FIG. 4.16 Espectro de FTIR do BG2: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90
dias em solução de SBF ...................................................................
131
FIG. 4.17 Espectro de FTIR da HAP: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias
em solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após
90 dias em solução de SBF ..............................................................
132
FIG. 4.18 Difratogramas do PLDLLA depois da moagem: (a) Como recebido;
(b) Após 30 dias de imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias
de imersão em solução de SBF; (d) Após 90 dias de imersão em
solução de SBF .................................................................................
134
FIG. 4.19 Difratogramas do BG1: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias de
imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em
solução de SBF; (d) Após 90 dias de imersão em solução de SBF .
135
FIG. 4.20 Difratogramas do BG2: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias de
imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em
solução de SBF; (d) Após 90 dias de imersão em solução de SBF .
136
FIG. 4.21 Difratogramas da HAP: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias de
20
imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em
solução de SBF; (d) Após 90 dias de imersão em solução de SBF .
137
FIG. 4.22 Taxa de diminuição do peso molecular ponderal médio do PLDLLA
(a) antes e (b) após a moagem versus tempo de degradação. 1 –
Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em solução
de SBF ..............................................................................................
138
FIG. 4.23 Taxa de diminuição do peso molecular numérico médio do
PLDLLA (a) antes e (b) após a moagem versus tempo de
degradação. 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90
dias em solução de SBF ...................................................................
139
FIG. 4.24 Análise estatística do peso molecular ponderal médio do PLDLLA.
Antes da moagem: 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4
– 90 dias em solução de SBF; Depois da moagem: 5 – Como
recebido; 6 – 30 dias SBF; 7 – 60 dias; 8 – 90 dias em solução de
SBF ...................................................................................................
140
FIG. 4.25 Análise estatística do peso molecular numérico médio do PLDLLA.
Antes da moagem: 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4
– 90 dias em solução de SBF; Depois da moagem: 5 – Como
recebido; 6 – 30 dias; 7 – 60 dias; 8 – 90 dias em solução de SBF .
140
FIG. 4.26 Análise estatística da polidispersão do PLDLLA. Antes da
moagem: 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias
em solução de SBF; Depois da moagem: 5 – Como recebido; 6 –
30 dias; 7 – 60 dias; 8 – 90 dias em solução de SBF .......................
141
FIG. 4.27 PLDLLA inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de
40x, 1 mm, detalhes: aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias
(aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c)
90 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x,
21
50 µm). (AO – osso antigo; PO – periósteo; P – PLDLLA; O –
osteoblastos; TPO – tecido com potencial osteogênico; TM –
tecido mineralizado) ..........................................................................
144
FIG. 4.28 PLDLLA + BG1 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias
(aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b)
60 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x,
50 µm); (c) 90 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de
1.000x, 50 µm). (PO – periósteo; P – PLDLLA; B1 – BG1; PP –
partícula perdida; O – osteoblastos; TPO – tecido com potencial
osteogênico; TM – tecido mineralizado) ...........................................
148
FIG. 4.29 BG1 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 50x,
1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento
de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias
(aumento de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm). (OA
– osso antigo; PO – periósteo; EO – endósteo; B1 – BG1; CPO –
células com potencial osteogênico; TPO – tecido com potencial
osteogênico; TM – tecido mineralizado; H – hemácias; VS – vaso
sangüíneo) ........................................................................................
150
FIG. 4.30 BG2 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 100x,
500 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento
de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias
(aumento de 100x, 500 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm).
(OA – osso antigo; PO – periósteo; B2 – BG2; TPO – tecido com
potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado; VS – vaso
sangüíneo; D – degradação superficial) ...........................................
153
FIG. 4.31 HAP inserida na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 50x,
1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento
de 50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias
(aumento de 100x, 500 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm).
22
(FEC – face externa da calvária; PO – periósteo; HA – HAP; TPO –
tecido com potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado) ..........
156
FIG. 4.32 Defeito controle da cobaia sem inserção de material: (a) 30 dias
(aumento de 250x, 200 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm)
(b) 60 dias (aumento de 40x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x,
50 µm); (c) 90 dias (aumento de 100x, 500 µm, detalhes aumento
de 1.000x, 50 µm). (PO – periósteo; EO – endósteo; OA – osso
antigo; TPO – tecido com potencial osteogênico; TPOO – tecido
com potencial osteogênico organizado; TM – tecido mineralizado) .
158
FIG. 4.33 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de PLDLLA inserida
na calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90
dias (10x) ..........................................................................................
161
FIG. 4.34 Microscopia de Fluorescência da amostra de PLDLLA inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol –
laranja) ..............................................................................................
162
FIG. 4.35 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de PLDLLA + BG1
inserida na calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x);
(c) 90 dias (10x) ................................................................................
165
FIG. 4.36 Microscopia de Fluorescência da amostra de PLDLLA + BG1
inserida na calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x);
(c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho;
xilenol – laranja) ................................................................................
166
FIG. 4.37 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de BG1 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x) ..................................................................................................
167
23
FIG. 4.38 Microscopia de Fluorescência da amostra de BG1 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol –
laranja) ..............................................................................................
168
FIG. 4.39 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de BG2 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x) ..................................................................................................
169
FIG. 4.40 Microscopia de Fluorescência da amostra de BG2 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol –
laranja) ..............................................................................................
171
FIG. 4.41 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de HAP inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x) ..................................................................................................
173
FIG. 4.42 Microscopia de Fluorescência da amostra de HAP inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias
(10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol –
laranja) ..............................................................................................
175
FIG. 4.43 Microscopia de Luz Transmitida da amostra controle: (a) 30 dias
(10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x) ..........................................
177
FIG. 4.44 Microscopia de Fluorescência da amostra controle: (a) 30 dias
(10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina – amarelo;
alizarina – vermelho; xilenol – laranja) ..............................................
178
FIG. 4.45 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo
PLDLLA: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30
dias, vista interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista
24
externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90
dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna ......................................
181
FIG. 4.46 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo
PLDLLA + BG1: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa;
(c) 30 dias, vista interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista
externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90
dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna ......................................
182
FIG. 4.47 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo
PLDLLA + BG1: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa;
(c) 30 dias, vista interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista
externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90
dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna ......................................
183
FIG. 4.48 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo BG2:
(a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista
interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60
dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90 dias, vista
externa; (i) 90 dias, vista interna .......................................................
185
FIG. 4.49 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo HAP:
(a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista
interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60
dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90 dias, vista
externa; (i) 90 dias, vista interna .......................................................
186
FIG. 4.50 Microtomografia computadorizada dos espécimes do grupo
controle: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30
dias, vista interna; (d) 60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista
externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista lateral; (h) 90
dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna ......................................
187
25
FIG. 4.51 Esquema mostrado a relação ideal da taxa de degradação do
material x regeneração óssea ...........................................................
193
26
LISTA DE TABELAS
TAB. 2.1 Forma, fase e função dos biocerâmicos ........................................... 61
TAB. 2.2 Composições dos vidros por Mol % ..................................................
65
TAB. 3.1 Materiais avaliados na pesquisa .......................................................
83
TAB. 3.2 Divisão dos grupos das amostras imersas em SBF ......................... 88
TAB. 3.3 Divisão dos grupos ........................................................................... 97
TAB. 3.4 Dosagem de aplicação dos marcadores ósseos utilizados no
experimento ......................................................................................
101
TAB. 3.5 Seqüência de administração dos marcadores ósseos durante o
período experimental ........................................................................
102
TAB. 4.1 Diâmetros médios das partículas em diferentes volumes ................ 114
TAB. 4.2 Resultados da DSC .......................................................................... 123
TAB. 4.3 Resultados da TGA ……………………………………………………...
126
TAB. 4.4 Resultados da GPC …………………………………………………….. 138
TAB. 4.5 Resultado da µCT após a análise de reconstrução em 3D .............. 180
TAB. 4.6 Relações entre os resultados in vitro e in vivo após 90 dias ............ 188
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ABREVIATURAS
α-TCP
–
Fosfato tricálcico (α).
β-TCP
–
Fosfato tricálcico (β).
a-CaP – Fosfato de cálcio amorfo
D – Forma dextrógera
DL – Mistura racêmica, mistura 50-50 entre as formas isoméricas D e L
DLPLA – Poli (ácido D,L-lático)
DSC – Calorimetria Diferencial de Varredura
ECD – Diâmetro equivalente circular
FTIR – Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier
GPC – Cromatografia de Permeação em Gel
HA – Hidroxiapatita
HCA – Carbonato apatita
L – Forma levógera
L-PLA – Poli (ácido L-lático)
MBG – Biovidro mesoporoso
Me.PEG – Copolímero de éter monometil e poli (etileno glicol).
MF – Microscopia de Fluorescência.
MLT – Microscopia de Luz Transmitida.
M
n
– Peso molecular numérico médio
M
w
– Peso molecular ponderal médio.
PBS – Solução salina fosfatada tamponada
PCL – Poli caprolactona
PD – Polidispersão
PGA – Poli (ácido glicólico)
PLA – Poli (ácido lático).
PLDLA – Poli (ácido L,D-lático)
PLDLLA – Poli (ácido L-lático-co-ácido D,L-lático)
PLGA – Poli (ácido lático co-ácido glicólico)
28
PLLA – Poli (ácido L-lático)
PMDA – Poli (ácido mandélico)
PSD – Determinação do Tamanho das Partículas.
PTFE – Poli (tetra flúor etileno)
PVPI – Polivinil pirrolidona iodo
SBF – Solução que simula os fluidos corpóreos.
SEM – Microscopia Eletrônica de Varredura
T
g
– Temperatura de transição vítrea
TGA – Análise Termogravimétrica
THF – Tetrahidrofurano
T
m
– Temperatura de fusão
TRIS – (tris(hidroxi metil) amino metano)
TTCP – Fosfato tetracálcico
XRD – Difração de Raios X
SÍMBOLOS
[CO
3
]
2-
– Ânion carbonato
[HCO
3
]
-
– Ânion bicarbonato
[PO
4
]
2-
– Ânion fosfato
Al
2
O
3
– Óxido de alumínio. Alumina
B
2
O
3
– Óxido de boro
C
3
H
6
O
3
–
Ácido lático, ácido 2-hidroxipropanóico, ácido α-hidroxipropanóico
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
Fórmula química da HA estequiométrica
Ca
2+
– Cátion cálcio (II)
CaF
2
– Fluoreto de cálcio
CaO – Óxido de cálcio
Ca-P – Fosfato de cálcio
Cd
2+
– Cátion cádmio (II)
CHCl
3
– Clorofórmio
Cl
-
– Ânion cloreto
Co
2+
– Cátion cobalto (II)
Cu
2+
– Cátion cobre (II)
29
F
-
– Ânion fluoreto
Fe
2+
– Cátion ferro (II) ou cátion ferroso
H
+
– Cátion hidrogênio
H
3
O
+
– Cátion hidrônio
H
4
SiO
4
– Ácido orto-silícico
K
+
– Cátion potássio
K
2
O – Óxido de potássio
KBr – Brometo de potássio
Mg
2+
– Cátion magnésio (II)
MgO – Óxido de magnésio
Na
+
– Cátion sódio
Na
2
O – Óxido de sódio
NaHCO
3
– Bicarbonato de sódio.
OH
-
– Ânion hidroxila
P
2
O
5
– Pentóxido de fósforo.
Pb
2+
– Cátion chumbo (II).
Si – Silício
SiO
2
– Sílica. Dióxido de silício
SiOH – Sílica hidratada
SO
4
2-
– Cátion sulfato
Sr
2+
– Cátion de estrôncio (II)
Zn
2+
– Cátion zinco (II)
30
LISTA DE SIGLAS
ASTM American Society for Testing and Materials
CAUAP Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa
CCS Centro de Ciências da Saúde
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
JCPDS Joint Committee on Powder Diffraction Standard
NYU Universidade de Nova York
PUC Pontifícia Universidade Católica
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
USP Universidade de São Paulo
31
RESUMO
O presente estudo tem como objetivo: caracterizar os materiais, poli(ácido L-
lático-co-ácido D,L-lático), biovidro e hidroxiapatita, na forma de grânulos como
recebido e depois da degradação em solução de SBF por 30, 60 e 90 dias; e avaliar
a formação óssea em defeito crítico, após a inserção dos materiais em coelhos, bem
como a sua degradação in vivo.
Na parte laboratorial, os materiais foram caracterizados com as seguintes
técnicas experimentais: Determinação do Tamanho das Partículas, Microscopia
Eletrônica de Varredura, Calorimetria Diferencial de Varredura, Análise
Termogravimétrica, Espectrofotometria de Infravermelho, Difração de Raios X e
Cromatografia de Permeação em Gel, todas respeitando os tempos de degradação.
Na etapa in vivo, os materiais avaliados laboratorialmente foram introduzidos em
defeitos críticos criados na calvária de coelhos. Após tempos determinados, os
animais sofreram eutanásia para análise do osso neoformado através da
Microscopia Eletrônica de Varredura, Microscopia Óptica de Luz Transmitida e de
Fluorescência e Microtomografia Computadorizada.
Após a obtenção dos resultados pode-se concluir que: a moagem criogênica se
mostrou eficaz para a redução do tamanho das partículas de PLDLLA, mas alterou
suas propriedades físico-químicas, sem modificar a propriedade de osteocondução;
a distribuição de tamanho de partículas apresentou distribuição polimodal para os
cinco materiais; todos os materiais, exceto a HAP, sofreram degradação em solução
de SBF, que aumentou em função do tempo de imersão; o PLDLLA antes da
moagem apresentou aumento na cristalinidade com o decorrer do tempo de
degradação, já o PLDLLA após a moagem apresentou um conteúdo cristalino maior,
que diminuiu com o passar do tempo; ambos os biovidros apresentaram composição
similar, exceto pelo pico de sílica cristalina observado no BG2; os espectros da HAP
apresentados pertencem a hidroxiapatita pura, sem a presença de fases
secundárias.
Os resultados in vivo obtidos para todos os materiais comprovam sua
biocompatibilidade, bem como propriedades osteocondutivas adequadas para
regeneração óssea. O PLDLLA se mostrou eficaz na manutenção da espessura do
defeito e sua degradação foi mínima. A combinação entre o PLDLLA e o BG1 não
melhorou a propriedade osteocondutiva dos materiais e os resultados foram
inferiores aqueles obtidos com o grupo do PLDLLA. O BG1 não foi capaz de manter
a espessura do defeito, devido ao reduzido tamanho das partículas. O BG2 manteve
a espessura do defeito apresentando bons resultados na formação óssea e sua
degradação foi aumentando com o tempo. A HAP, além de manter a espessura do
defeito, foi o único material, que conseguiu unir as bordas do defeito.
32
ABSTRACT
The objective of this study was: to characterize the following materials, poly (L-
co-DL) lactic acid, bioglass and hydroxyapatite, in a particulate form, as received and
after degradation in SBF solution after 30, 60 and 90 days, and to evaluate the bone
regeneration in critical defect of rabbits and the in vivo degradation of materials.
The materials were characterized as received and after degradation with Particle
Size Distribution, Scanning Electron Microscopy, Differential Scanning Calorimetry,
Thermogravimetry Analysis, Fourier Transform Infrared Spectroscopy, X-Ray
Diffraction and Gel Permeation Chromatography. After characterization, critical size
defects were made in rabbit calvaria, filled with one of the grafting materials, and
allowed to heal for periods of 30, 60, and 90 days. The amount of bone filling was
examined using Scanning Electron Microscopy, Light and Fluorescence Microscopy
and Micro Computed Tomography.
According to the results obtained, it was concluded that: the cryogenic milling
was effective to reduce PLDLLA particle size, but it altered the material physico-
chemical properties, without altering the osteoconduction property; the particle size
distribution showed a polydispersed pattern for all materials; all materials, except the
HAP, suffered degradation, and the decomposition increased as a function of
immersion in SBF; the PLDLLA before milling crystallinity increased as function of
time, and the PLDLLA after milling crystallinity decrease as function of time; both
bioglasses had similar composition, except for the silica peak present in BG2; the
HAP spectra were from pure hydroxyapatite without secondary fases.
The in vivo results obtained showed that all materials were biocompatible and
had osseoconductive properties. PLDLLA maintained the defect thickness, but its
degradation was insignificant. The mixture of PLDLLA with BG1 did not enhance their
osseoconductive properties, and the results were worse than those obtained with
PLDLLA. BG1 did not maintain the defect thickness, because of its particle size. BG2
maintained the defect thickness, the bone regeneration was better than the other
materials analyzed, and its degradation increased with time. HAP maintained the
defect thickness and additionally this material has shown uniform bone regeneration
connecting both sides of the defect.
33
1. INTRODUÇÃO
1.1. IMPORTÂNCIA
O osso é um compósito poroso complexo com propriedades de remodelamento
para adaptar sua microestrutura às tensões mecânicas externas. Ele é um dos
tecidos com maior demanda de reconstrução e substituição (HENCH e WILSON,
1993b; SERVICE, 2000). Grandes defeitos podem ser resultantes de trauma,
cirurgia e doenças (CHAPUT et al., 1996).
Existem várias razões para o desenvolvimento de alternativas para a engenharia
tecidual óssea, incluindo a necessidade de melhores materiais de preenchimento
para uso na reconstrução de grandes defeitos ósseos e em implantes ortopédicos.
Há necessidade do desenvolvimento de materiais mecanicamente mais adequados
para o meio biológico no qual são inseridos (BURG et al., 2000). O emprego do
enxerto ósseo é uma técnica cirúrgica usada no reparo de grandes defeitos
esqueléticos, situação em que o organismo pode apresentar dificuldade no reparo
do tecido remanescente (CHAPUT et al., 1996). Neste caso, um arcabouço ou
materiais para enxerto ósseo deve ser posicionado no local do defeito para permitir
que o osso adjacente consiga ter uma ponte sobre a falha criada pelo defeito. Um
dos materiais usados para enxerto é o osso trabecular autógeno retirado, por
exemplo, da crista ilíaca do paciente (SUMMERS e EISENSTEIN, 1989; CHAPUT et
al., 1996). Embora o autoenxerto represente o padrão ouro corrente, materiais
sintéticos para enxerto ósseo são usados. Isso é devido aos problemas intrínsecos
associados ao uso de enxerto autógeno. As limitações dos enxertos autógenos
incluem: risco de rejeição, dor pós-cirúrgica, infecção, hematoma, disponibilidade
limitada de locais doadores (HUTMACHER, 2000), morbidade no sítio doador,
potencial de transmissão viral (HOLLINGER et al., 1996) e cicatrização imprevisível
(SUMMERS e EISENSTEIN, 1989; GADZAG et al., 1995; DEVIN et al., 1996). Em
grandes defeitos, o osso usado para enxerto pode ser reabsorvido pelo organismo
antes que a osteogênese esteja completa (BROWN e CRUESS, 1982).
34
Pesquisas com materiais biodegradáveis e bioabsorvíveis têm recebido atenção
nos últimos anos, devido à ampla aplicação em cirurgias orais, maxilo-faciais e
ortopédicas (CHEN et al., 2003). A maioria dos polímeros sintéticos para
substituição óssea atualmente pesquisada se baseia em polímeros biodegradáveis
(BORDEN et al., 2003). Estes materiais oferecem várias vantagens em relação aos
outros materiais para arcabouços utilizados em engenharia de tecido. As vantagens
incluem a habilidade de associar propriedades mecânicas e controle da cinética de
degradação para se adequar às várias aplicações. Os polímeros sintéticos também
são atrativos porque eles podem ser fabricados em diferentes formas e conter poros
com diferentes tamanhos para facilitar o crescimento tecidual. Além do mais, os
polímeros podem ser criados com grupos funcionais que podem induzir o
crescimento ósseo (GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003).
Os biocerâmicos ou compósitos de biocerâmicos / polímero têm sido aplicados
como matrizes para engenharia de tecido (WANG, 2003). Entre os cerâmicos
destacam-se a hidroxiapatita densa e porosa, fosfato tricálcico, vitro-cerâmicas e
biovidros, os quais podem ser combinados com um grande número de polímeros
(MAQUET et al., 2004). A interação das células com estas matrizes é importante
para a rápida regeneração óssea. As cerâmicas bioativas são conhecidas por
provocarem respostas biológicas específicas na interface do material resultando na
formação de uma forte ligação entre o tecido e os materiais (HENCH e WILSON,
1993b).
1.2. OBJETIVOS
O presente trabalho de pesquisa tem como objetivo realizar ensaios in vitro e in
vivo de materiais para enxerto ósseo na forma de grânulos. Foram analisados
materiais nacionais em fase experimental de desenvolvimento e materiais
comerciais visando:
1. Caracterizar os materiais, poli (ácido L-lático-co-ácido D,L-lático) (PLDLLA),
biovidro e hidroxiapatita como recebidos e após a imersão em solução de
35
SBF;
2. Avaliar a degradação in vitro destes materiais depois de 30, 60 e 90 dias
imersos em solução de SBF;
3. Avaliar a degradação dos materiais in vivo após inserção em cobaias;
4. Avaliar a formação óssea em defeito cirúrgico após a inserção dos materiais
em cobaias.
36
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. ESTRUTURA ÓSSEA
O osso é um tecido conectivo altamente especializado que serve de suporte
para as partes moles do corpo e protege os órgãos vitais dos vertebrados. É um
tecido vivo complexo com uma matriz extracelular mineralizada, que confere rigidez
e força ao esqueleto, ainda mantendo algum grau de elasticidade (MARKS JR. e
HERMEY, 1996), devido à relação entre os seus componentes duros e moles e
possui limite de resistência à compressão maior do que à tração (ERIKSEN et al.,
1994). Adicionalmente, ele ainda participa ativamente na manutenção da
homeostase de cálcio no organismo (MARKS JR. e HERMEY, 1996).
O osso é composto por uma matriz orgânica que é reforçada por depósitos de
sais de cálcio. O colágeno tipo I constitui aproximadamente 95% da matriz orgânica,
os outros 5% são composto por proteoglicanas e numerosas proteínas não
colágenas (osteonectina, osteocalcina, proteína morfogênica óssea, proteoglicanos
ósseos e sialoproteína óssea). Os sais cristalinos depositados na matriz orgânica do
osso sob controle celular são basicamente cálcio e fosfato na forma de hidroxiapatita
(CATE, 1995; MARKS JR. e HERMEY, 1996).
O osso é composto por quatro tipos diferentes de células: osteoblastos,
osteoclastos, células ósseas de revestimento presentes nas superfícies ósseas,
enquanto os osteócitos permeam o interior mineralizado (FIG. 2.1). Os osteoblastos,
osteócitos e as células de revestimento células se originam de células
osteoprogenitoras locais, enquanto os osteoclastos vêm da fusão de precursores
mononucleares, originais de vários tecidos hematopoiéticos (MARKS JR. e
HERMEY, 1996).
37
FIG. 2.1 Origem e localização das células ósseas (MARKS JR. e HERMEY, 1996).
Os osteoblastos são células totalmente diferenciadas responsáveis pela
produção da matriz óssea. Este tipo de célula se dispõe nas superfícies ósseas, lado
a lado, são uninucleadas, cubóides ou poligonais. Eles sintetizam o colágeno tipo I,
proteoglicanas e glicoproteínas. A matriz óssea recém-formada, adjacente aos
osteoblastos ainda não calcificada, é denominada de osteóide. Também regulam a
mineralização desta matriz concentrando fosfato de cálcio. A matriz se deposita ao
redor do corpo da célula e de seus prolongamentos, formando assim lacunas e
canalículos. Uma vez aprisionado pela matriz recém-sintetizada, ele passa a ser
chamado de osteócito. (MARKS JR. e HERMEY, 1996; JUNQUEIRA e CARNEIRO,
2004).
O osteócito é o osteoblasto maduro localizado dentro da matriz óssea e é
responsável por sua manutenção (BUCKWALTER et al., 1995). Estas células não só
sintetizam, mas também reabsorvem a matriz até um determinado limite. Cada
osteócito ocupa uma lacuna na matriz e seus prolongamentos estabelecem contatos
através de junções em canalículos por onde passam pequenas moléculas e íons de
um osteócito para outro. Devido à limitada difusão de nutrientes e metabólitos pela
matriz mineralizadas, estes prolongamentos permitem a comunicação entre os
osteócitos vizinhos, superfícies ósseas interna e externa e com vasos sangüíneos
que atravessam a matriz (MARKS JR. e HERMEY, 1996; JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 2004).
As células ósseas de revestimento são planas, alongadas e inativas, que
recobrem as superfícies ósseas, que não estão passando por formação óssea e
38
nem sendo reabsorvidas. Pouco se sabe sobre a função destas células, mas se
especula que elas podem ser precursoras de osteoblastos (MARKS JR. e HERMEY,
1996).
Os osteoclastos são células móveis, grandes e multinucleadas, que podem ter
de seis a 50 ou mais núcleos que reabsorvem o osso. Seu tamanho está
diretamente relacionado com o grau de mineralização da matriz óssea a ser
reabsorvida. Freqüentemente, nas áreas de reabsorção de tecido ósseo encontram-
se porções dilatadas de osteoclastos, localizadas em depressões da matriz
escavada pela atividade dos mesmos e conhecidas como lacunas de Howship
(CATE, 1995; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
Todos os ossos são recobertos por camadas de tecido contendo células
osteogênicas, o periósteo nas superfícies externas e endósteo nas internas. A
camada mais superficial do periósteo contém fibras colágenas e fibroblastos. As
fibras de Sharpey são feixes de fibras colágenas do periósteo que penetram no
tecido ósseo e prendem firmemente o periósteo ao osso. Na sua porção mais
profunda, o periósteo é mais celular e apresenta células osteoprogenitoras,
morfologicamente parecidas com os fibroblastos, que se diferenciam em
osteoblastos. Elas desempenham um papel importante no crescimento dos ossos e
na reparação das fraturas. O endósteo é geralmente constituído por uma camada de
células osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do osso esponjoso, o canal
medular, os canais de Havers e os de Volksmann (JUNQUEIRA e CARNEIRO,
2004).
A distinção entre o tipo e o grau de maturação do tecido ósseo é determinada
pela orientação das fibrilas colágenas. O tecido ósseo imaturo pode ser
embriogênico ou primário e está presente em embriões e crianças em crescimento,
sendo depois substituído pelo tecido maduro ou lamela. No adulto, este tipo de
tecido reaparece quando é necessária uma formação óssea acelerada, para reparar
fraturas por exemplo. Como características destacam-se o arranjo aleatório das
fibras, menor conteúdo mineral, osteócitos maiores e em maior número e ausência
de lamelas. O tecido ósseo primário é semelhante ao embrionário e é formado
durante as aposições ósseas sob o periósteo e o endósteo. Sua principal
característica é a organização das fibrinas de colágeno paralelamente à superfície.
Este padrão organizacional é distinto da organização lamelar do tecido maduro
39
(CATE, 1995).
Morfologicamente existem duas formas de osso: o cortical (compacto) e o
medular (esponjoso) (FIG. 2.2). Ambos são histologicamente idênticos contituídos
por lamelas microscópicas (FIG. 2.3). No osso cortical, fibrinas de colágeno
densamente organizadas formam lamelas concêntricas e as fibrinas nas lamelas
adjacentes se dispõem em planos perpendiculares como um compensado de
madeira. O osso medular possui uma matriz fracamente organizada e porosa
(MARKS JR. e HERMEY, 1996).
FIG. 2.2 Amostra de um osso longo cortado longitudinalmente. A porção externa
representa o osso compacto e o interior do osso apresenta configuração esponjosa
(ROSS et al., 1993).
Diferenças estruturais e funcionais podem ser identificas entre o osso cortical e o
medular. As diferenças na organização estrutura dos dois tipos ósseos estão
relacionadas às suas funções primárias (MARKS JR. e HERMEY, 1996). O osso
cortical apresenta funções mecânicas e de proteção. Ele protege os órgãos vitais,
como os contidos nas caixas craniana e torácica e no canal raquidiano; aloja e
protege a medula óssea, formadora das células do sangue; proporciona apoio aos
músculos esqueléticos e constitui um sistema de alavancas que amplia as forças
geradas na contração muscular (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
As funções metabólicas são desempenhadas pelo osso medular (MARKS JR. e
HERMEY, 1996). Ele é um depósito de cálcio, fosfato e outros íons, armazenando-
40
os e liberando-os de forma controlada para manter constante a concentração destes
importantes íons nos líquidos corporais (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
FIG. 2.3 Esquema da estrutura organizacional do tecido ósseo (JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 2004).
O osso cortical consiste de osteons ou sistemas Haversianos que são mantidos
juntos pelo estroma de tecido duro ou interstício (FIG. 2.4). O interstício não possui
os canais Haversianos e a circulação venosa dos osteons. Comunicações inter-
osteogênicas (canais de Volksmann) transversas ao osso intersticial permite o
aporte sangüíneo para os osteons mais profundos e os osteócitos (SHORS e
HOLMES, 1993). O osso cortical é compacto ou denso, possui aspecto sólido e
circunda um corpo de tecido ósseo esponjoso.
O osso medular difere do cortical por ser esponjoso (FIG. 2.5). O trabeculado
representa os osteons que não estão dispostos na forma de canais como no osso
cortical. As trabéculas ou espículas de tecido mineralizado e espaços vazios entre
41
as mesmas ocupam volume considerável do tecido ósseo (SHORS e HOLMES,
1993).
FIG. 2.4 Microestrutura do osso cortical (SHORS e HOLMES, 1993).
FIG. 2.5 Microestrutura do osso medular (SHORS e HOLMES, 1993).
42
Os ossos apresentam distribuição de osso compacto e medular diferentes,
dependendo da sua localização no corpo e sua função. Nos ossos longos, as
extremidades são formadas por osso esponjoso com uma delgada camada
superficial compacta, a parte cilíndrica é quase totalmente compacta, com pequena
quantidade de osso esponjoso delimitando o canal medular. Os ossos curtos têm o
centro esponjoso, sendo recoberto em toda sua periferia por uma camada compacta.
Nos ossos chatos existem duas camadas de osso compacto, as tábuas interna e
externa, separadas por osso esponjoso (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
2.2. HISTODINÂNICA DA CICATRIZAÇÃO DA FERIDA ÓSSEA
A estrutura do osso humano formado durante a cicatrização de uma fratura
difere daquele formado durante o remodelamento. Isso é visualizado através das
diferenças entre o osso em paliçada e o lamelar. O osso em paliçada é o resultado
do crescimento rápido tanto no embrião, como durante a cicatrização de uma ferida,
enquanto o remodelamento lento resulta, na maioria dos vertebrados, na formação
de osso lamelar. Na cicatrização óssea precoce e nas terapias que focam uma
cicatrização acelerada é evidente que a formação do osso em paliçada é de suma
importância. A matriz óssea formada no arcabouço será de osso em paliçada, que
será substituído durante o remodelamento (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
A fratura óssea pode ser definida como uma lesão no osso que resulta na perda
de continuidade do tecido ósseo no local da lesão (SCHULTZ, 1990). Nos locais da
lesão, ocorre hemorragia, pois vasos sangüíneos são danificados, a matriz óssea é
destruída e células ósseas morrem (DAVIES e HOSSEINI, 2000; JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 2004). A cicatrização de uma lesão óssea é um processo complexo que
envolve múltiplos eventos celulares e extracelulares. Ela é influenciada por vários
fatores que incluem: tipo do osso, localização da lesão, severidade do trauma, grau
de fixação durante a cicatrização, espécie e idades. Nos mamíferos, o osso é o
único tecido que cicatriza sem deixar marcas (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
A hemorragia causada pela lesão resulta na formação de um coágulo sangüíneo
ou hematoma. Este coágulo dura somente alguns dias (FALLSCHÜSSEL, 1986),
43
mas pode persistir por até duas semanas (CORMACK, 1987). Adicionalmente à
formação do coágulo, dois outros mecanismos contribuem para a hemostase.
Primeiro, uma vasoconstricção nas extremidades dos vasos danificados limita a
entrada de sangue no tecido danificado. Segundo, a retração do coágulo condensa o
tampão hemostático e reduz o sítio da ferida (CHAO et al., 1976).
Os eventos iniciais da cicatrização são de considerável importância na
cicatrização da ferida óssea por três razões:
• os componentes biológicos que interagem com material implantado são
proteínas e outras macromoléculas e não células. As células vão interagir
subseqüentemente com a camada de proteínas aderida à superfície do
material (KLINGER et al., 1998);
• a liberação de citocinas e fatores de crescimento das plaquetas em
degranulação no coágulo sangüíneo apresenta efeito estimulante na
regeneração da lesão (EINHORN et al., 1991); e
• a presença de um material tem um profundo efeito nas reações iniciais
das células sangüíneas. A rugosidade do material influencia no número e
no grau de ativação das plaquetas (PARK e DAVIES, 2000).
Como conseqüência da homeostase, a circulação sangüínea é redirecionada
para vasos sanguíneos não danificados próximos através de anastomose. No osso
isso ocorre através dos canais de Volkmann (HAM, 1952). A interrupção da
circulação sangüínea causa uma isquemia e uma necrose locais (HAM e HARRIS,
1971). A necrose é um fenômeno complexo e leva a destruição do coágulo por
leucócitos. Inicialmente, neutrófilos são mais numerosos, mas os macrófagos
rapidamente se tornam predominantes (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
A formação de um tecido de granulação dura três semanas (BRAUN e RÜTER,
1996). A abundância de vasos, que chega até 60% da massa deste tecido, dá o
aspecto granular a ele. A medida que os macrófagos são atraídos para o centro da
ferida, o desenvolvimento da vascularização age como um dreno dos metabólitos e
dos produtos de degradação. A demanda por oxigênio excede o suprimento no
coágulo resultando num meio hipóxico (SILVER, 1973). O metabolismo anaeróbico
resulta no aumento local da concentração de lactase (HUNT e VAN WINKLE, 1979).
Além disso, a destruição do tecido necrótico pelos macrófagos leva à liberação de
mucopolissacarídeos ácidos (LINDNER et al., 1967) e de enzimas lisossômicas. Isto,
44
junto com a alta concentração de lactase diminui o pH (SILVER, 1973). A diminuição
do gradiente de concentração de oxigênio em direção ao centro da ferida dá o sinal
quimiotático para células endoteliais e mesenquimais (ARNOLD e WEST, 1991).
A angiogênese é iniciada predominantemente de vênulas pós-capilares, onde
células endoteliais degradam a membrana subendotelial, migram e proliferam para
formar botões ou brotos de capilares ocos. Finalmente, fibroblastos secretam a
matriz reticular para fornecer o suporte mecânico do sistema vascular que está se
formando (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
A matriz óssea não possui a capacidade de crescer ou se espalhar. Uma vez
formada, ela não se move respeitando o tecido biológico adjacente. O que invade a
câmara óssea ou se espalha sobre a superfície do material é a população de células
osteogênicas migratórias. Uma vez que estas células iniciam a formação da matriz
óssea, elas param de migrar. Na ausência de um implante ou da superfície do osso
antigo, este processo vai resultar na formação de espículas ósseas recobertas por
osteoblastos. Estas células secretam a matriz óssea, mas elas são diferentes da
população das células osteogênicas migratórias. São as células migratórias, que são
conduzidas através da matriz extracelular ou de uma superfície sólida, junto com
células recrutadas como células osteogênicas, que formam a vanguarda das células
que levam ao avanço do crescimento das espículas ósseas (DAVIES e HOSSEINI,
2000).
O crescimento invasivo de osso no sítio de cicatrização endóssea, ou durante o
remodelamento, é o resultado da migração e do recrutamento de células
osteogênicas, que precede a formação óssea. A osteocondução foi descrita como a
infiltração de novos capilares junto com tecido ósseo neoformado do material
implantando em direção e dentro da lesão (EINHORN, 1995), o que implica na
migração de uma população celular osteogênica. Esta definição difere daquela
normalmente utilizada na literatura de biomateriais, onde osteocondução significa o
crescimento ósseo sobre a superfície do implante (JARCHO, 1981). A
osteocondução somente ocorrerá sobre a superfície do material, quando as células
migratórias de vanguarda chegarem à superfície do implante. A matriz óssea será
então depositada sobre a superfície do material, levando a uma continuidade entre a
espícula óssea previamente formada e o osso na superfície do material (DAVIES e
HOSSEINI, 2000).
45
A ênfase na migração celular como o mecanismo crítico na osteocondução é de
considerável importância por duas razões (DAVIES e HOSSEINI, 2000):
• a migração celular durante a cicatrização da ferida está associada ao
fenômeno de contração da ferida, e tem uma implicação importante na
retenção do coágulo à superfície do implante;
• as células que migram não são osteoblastos, mas células com potencial
osteogênico.
O mecanismo de contração da ferida de maneira geral acelera a cicatrização da
ferida em qualquer tecido através da redução do tamanho da lesão. Pode-se
assumir que a migração de células estromais com potencial osteogênico exerce
tração na matriz extracelular da mesma maneira que os fibroblastos durante o
reparo da derme (DAVIES e HOSSEINI, 2000). A força de tração exercida pelos
fibroblastos migratórios causa uma reorganização local e uma deformação da matriz
extracelular fibrosa (HARRIS et al., 1981) e macroscopicamente pode levar ao
encolhimento dos gels de colágeno (EASTWOOD et al., 1996), gels de fibrina
(TUAN et al., 1996), ou contração da ferida (RUDOLPH et al., 1992).
Na cicatrização óssea peri-implantar, a contração do tecido de granulação e a
retração do coágulo de fibrina são ambos transmitidos à superfície do implante e
podem resultar no descolamento das matriz de fibrina ou do tecido cicatricial do
implante. É conveniente que as células osteogênicas gerem forças adicionais
enquanto estão migrando pelo coágulo. Pode-se assumir que forças contráteis
cumulativas devem ser transmitidas para a superfície do implante na qual o coágulo
de fibrina está ancorado. Caso a força contrátil exceda à adesiva, o coágulo irá se
desprender e esta descontinuidade entre o tecido e o material pode comprometer o
processo de cicatrização (DAVIES, 1998).
As características do biomaterial são determinadas pela química e topografia
superficial. A capacidade osteocondutiva da superfície pode ser governada por sua
habilidade de reter um coágulo de fibrina aderente e de resistir às forças retrativas
geradas pela atividade migratória das células osteogênicas em diferenciação
(DAVIES, 1998).
A formação óssea necessita não só do recrutamento e/ou migração de uma
população celular potencialmente osteogênica, mas também da diferenciação desta
população em células secretoras maduras. Na cicatrização de uma lesão, a
46
população celular com potencial osteogênico, oriundas do endósteo, da camada
interna do periósteo e de regiões perivasculares (FIG. 2.6a), vai migrar através do
coágulo sangüíneo e assumindo a retenção do coágulo, vai chegar à superfície dos
fragmentos ósseos. Ao chegarem à superfície sólida do material ou do osso antigo,
as células vão iniciar a síntese de matriz óssea (FIG. 2.6c). Aquelas que se
diferenciarem antes de alcançar à superfície sólida, vão parar de migrar e começar a
secretar matriz extracelular formando espículas ósseas em direção à superfície do
implante ou do osso antigo. Os osteoblastos ativos vão se translocar como resultado
da secreção de matriz ou serão aprisionados na matriz como osteócitos. A formação
óssea tanto na cicatrização como no remodelamento se divide em dois fenômenos
distintos: formação de osso de novo e formação de osso aposicional (DAVIES e
HOSSEINI, 2000).
A formação de osso de novo se dá através de uma cascata de eventos que
ocorrem durante a iniciação da formação óssea por células osteogênicas
recentemente diferenciadas. São estas células, as mais importantes na formação
óssea em lesões sejam causadas por fraturas, ou pela colocação de implantes ou de
arcabouços para engenharia de tecido. A cascata da formação de osso de novo em
superfícies sólidas ocorre em quatro estágios, são eles: adsorção de proteínas
ósseas não colágenas à superfície sólida; iniciação da mineralização pelas proteínas
adsorvidas; mineralização continuada resultante do crescimento de cristais; e
existência de matriz de colágeno revestindo a matriz interfacial mineralizada entre a
matriz de colágeno (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
Embora as células osteogênicas migratórias em diferenciação não são
polarizadas, elas se tornam séssis e depois a polarizadas. O início do crescimento
aposicional é marcado pela polarização das células e pela transição da atividade
migratória pela atividade de secreção. À medida que a produção e secreção de
proteínas se iniciam, o núcleo celular começa a se mover para o lado apical da
célula. O crescimento ósseo aposicional é governado pela secreção de matriz óssea
de colágeno por osteoblastos polarizados. Como resultado do acúmulo de matriz no
seu lado basal, as células passivelmente se deslocam em um sentido apical, quando
isto não ocorre, elas se tornam osteócitos. O crescimento ósseo aposicional está
normalmente associado à formação óssea lamelar, mas ele também pode estar
relacionado à formação óssea em paliçada. A diferença na organização estrutural
47
será devido à velocidade e coordenação da secreção da matriz (DAVIES e
HOSSEINI, 2000). Inicialmente, observa-se a formação de um calo ósseo que
envolve a extremidade dos ossos fraturados. Ele é constituído por um osso imaturo
que une provisoriamente às extremidades do osso lesionado. As trações e pressões
exercidas sobre o osso durante o processo de reparação da lesão e após o retorno
às suas funções normais causam o remodelamento do calo ósseo e sua completa
substituição por tecido ósseo lamelar (FIG. 2.6 d) (JUNQUEIRA e CARNEIRO,
2004).
O crescimento ósseo pode ser separado em dois tipos distintos: primeiro, a
osteocondução associada à formação de osso de novo leva ao crescimento ósseo
sobre a superfície sólida; segundo, o crescimento aposicional resulta no aumento de
massa óssea numa direção perpendicular à superfície (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
O osso medular leva de três a seis meses para sua completa cicatrização e o osso
cortical de quatro a oito meses.
FIG. 2.6 Desenhos esquemáticos mostrando o processo de reparação da fratura,
por formação de novo tecido ósseo a partir do endósteo e do periósteo
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
48
2.3. BIOPOLÍMEROS
Pesquisas realizadas na primeira metade do século 20 com polímeros
sintetizados a partir de ácido glicólico e de outros ácidos α-hidroxi foram
abandonadas, porque os polímeros resultantes eram muito instáveis para o uso
industrial em longo prazo (MIDDLETON e TIPTON, 2000). Entretanto, esta
instabilidade, que levava à biodegradação, se mostrou extremamente importante
para aplicações na Medicina. Polímeros preparados a partir do ácido glicólico e do
ácido lático apresentaram um gama de possibilidades para sua aplicação,
começando com suturas biodegradáveis, que foram aprovadas para uso na década
de 60 (GILDING e REED, 1979). Desde então outros dispositivos médicos baseados
nos ácidos lático e glicólico, bem como outros poliésteres alifáticos, tais como: poli ε-
caprolactona, poli (óxido de etileno) (ASLAN et al., 2000), poli (carbonato de
trimetileno), usados como homopolímeros ou copolímeros, vêm sendo aceitos para
uso na Medicina (BARROWS, 1986).
O critério para a seleção de um polímero para ser utilizado como biomaterial é
de restabelecer as condições de normalidade dos tecidos, enquanto se degrada e
transfere as funções de hemostasia para o tecido em recuperação, sem alteração no
ciclo metabólico (PELTONIEMI et al., 2002). O biopolímero ideal deve ter as
seguintes propriedades (MIDDLETON e TIPTON, 2000):
• não provocar uma resposta inflamatória ou tóxica desproporcional aos
seus efeitos benéficos;
• ser metabolizado pelo organismo após o término de suas funções sem
deixar resíduos;
• ser facilmente processado na sua forma final;
• apresentar uma vida útil de estocagem aceitável;
• ser facilmente esterilizável;
Os biopolímeros utilizados para engenharia de tecido ósseo devem atender a
outros requisitos além dos acima citados. São eles (GUNATILLAKE e ADHIKARI,
2003):
• fornecer suporte mecânico enquanto o tecido cresce;
• habilidade de incorporar células, fatores de crescimento, entre outros;
49
• proporcionar meios osteocondutivos e osteoindutivos.
Entre as famílias dos polímeros sintéticos, os poliésteres se mostram atrativos
para aplicações em suturas reabsorvíveis, sistemas para liberação de drogas,
dispositivos para fixação ortopédica (BEHRAVESH et al., 1999; MIDDLETON e
TIPTON, 2000) e para aplicações em engenharia de tecido ósseo (BURG et al.,
2000), devido a sua fácil degradação pela hidrólise da ligação éster, ao fato dos
produtos de degradação serem reabsorvidos pelos caminhos metabólicos e à
possibilidade de alterar as estruturas para modificar as taxas de degradação
(GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003).
2.3.1. POLI (ÁCIDO LÁTICO)
2.3.1.1. CONCEITOS
O ácido lático é um ácido encontrado em vários produtos de origem natural
(SÖDERGÅRD e STOLT, 2002) e pertence à família dos poliésteres alifáticos
comumente feitos de ácidos α-hidroxi, que incluem o poli (ácido lático) (PLA), poli
(ácido glicólico) (PGA) ou poli (ácido mandélico) (PMDA). Os três estão entre os
materiais bioabsorvíveis mais conhecidos (MIDDLETON e TIPTON, 2000;
ROKKANEN et al., 2000; GARLOTTA, 2001). O PLA é um polímero termoplástico de
alta resistência (GARLOTTA, 2001). Ele pode ser facilmente processado em peças
moldadas, filme ou fibras (HARTMAN, 1998). Os homopolímeros possuem
temperatura de transição vítrea de aproximadamente 55
o
C e de fusão de 175
o
C,
sendo necessário temperaturas de processamento superiores a 185-190
o
C (SPINU
et al., 1996).
O PLA de alto peso molecular é incolor, liso, rígido com propriedades similares
ao poliestireno. O PLA amorfo é solúvel na maioria de solventes orgânicos, tais
como tetrahidrofurano (THF), solventes clorados, benzeno e dioxano. O PLA
cristalino é solúvel em solventes clorados e benzeno em altas temperaturas
(HARTMAN, 1998).
50
O PLA é fabricado a partir do ácido lático (C
3
H
6
O
3
– ácido 2-hidroxipropanóico
ou ácido α-hidroxi-propanóico) (SÖDERGÅRD e STOLT, 2002). O ácido lático é o
hidroxiácido mais simples com um carbono assimétrico ou quiral (GARLOTTA, 2001;
SÖDERGÅRD e STOLT, 2002; PYDA et al., 2004) que possui atividade ótica e
existe sob duas configurações estéreas, ácido L-lático e ácido D-lático (FIG. 2.7)
(SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
FIG. 2.7 Estereoisômeros do ácido lático.
O PLA (FIG. 2.8) possui dois isômeros, o poli (ácido L-láctico) (PLLA ou LPLA) e
o poli (ácido D-lático) (PLDA ou DPLA). A mistura racêmica, 50% de cada um,
destes dois homopolímeros forma o copolímero poli (ácido D,L-lático) (PDLLA ou
PLDLA ou DLPLA) (LEENSLAG et al., 1987a; MIDDLETON e TIPTON, 2000;
GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003). As substâncias oticamente ativas têm a
propriedade de desviar o plano de vibração da luz polarizada, a forma L (levógero) o
desvia no sentido anti-horário e a D (dextrógero) no sentido horário. A mistura
racêmica é um isômero oticamente inativo (CARVALHO, 1997).
FIG. 2.8 Estrutura química do poli (ácido lático)
O PLA pode ser obtido a partir de dois métodos de síntese: policondensação
51
direta do ácido lático e polimerização por abertura de anel do lactídeo, que é o
dímero cíclico do ácido lático (GARLOTTA, 2001; SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
Esse tipo de PLA pode ser composto por somente um esterioisômero ou pela
combinação dos dois em várias proporções, ou pela combinação do ácido lático com
outros hidroxi-ácidos (SÖDERGÅRD e STOLT, 2002). A policondensação direta de
ácido lático apresenta uma desvantagem uma vez que origina um polímero de baixo
peso molecular, frágil e que de uma maneira geral, não pode ser utilizado em
nenhuma aplicação, exceto quando agentes de união externos são adicionados
visando aumentar o peso molecular do polímero (GARLOTTA, 2001; SÖDERGÅRD
e STOLT, 2002). Pesquisas vêm sendo realizadas para obtenção de um polímero de
alto peso molecular (MOON et al., 2001) através, por exemplo, da manipulação do
equilíbrio entre o ácido lático, água e o PLA em solvente orgânico (AJIOKA et al.,
1995). O processo de obtenção o PLA por policondensação pode ser visualizado na
FIG. 2.9 (SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
FIG. 2.9 Reação de policondensação para obtenção do poli (ácido lático)
(SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
A polimerização por abertura de anel se dá a partir do dímero de ácido lático
(MIDDLETON e TIPTON, 2000; SÖDERGÅRD e STOLT, 2002). A reação de
formação do dímero é mostrada na FIG. 2.10. Após a obtenção do dímero, a
polimerização por abertura de anel do lactídeo permite a obtenção de PLA com alto
peso molecular (> 100.000 g/mol) (FIG. 2.11). No processo o poli (ácido lático) é
obtido através de polimerização sob baixa pressão, dando origem a uma mistura que
contém os dois isômeros L e D, em percentagens que dependem da matéria-prima,
52
da temperatura e do catalisador utilizados (MIDDLETON e TIPTON, 2000; RIBEIRO,
2006). Esse tipo de polimerização possibilita um melhor controle estrutural
(FIG. 2.12). Assim, as propriedades dos polímeros resultantes podem ser melhor
padronizadas (SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
FIG. 2.10 Reação de formação do dímero de ácido lático (MIDDLETON e
TIPTON, 2000; GARLOTTA, 2001).
FIG. 2.11 Síntese do PLA por abertura do anel (MIDDLETON e TIPTON, 2000).
FIG. 2.12 Possibilidade de melhor controle estrutural através da polimerização
do PLA por abertura do anel (SÖDERGÅRD e STOLT, 2002).
53
O L-PLA é semicristalino e o DL-PLA é amorfo, que possui uma distribuição
randômica de ambas as formas isoméricas e desta forma é incapaz de se arranjar
em uma estrutura cristalina organizada durante o processo de solidificação
(DANIELS et al., 1990; MIDDLETON e TIPTON, 2000). Devido ao componente mais
cristalino, o L-PLA é mais resistente à hidrólise. Já o DL-PLA é mais sensível à
hidrólise devido a sua estrutura amorfa (DANIELS et al., 1990). Desta forma, o PLA
é normalmente usado como um copolímero dos dois isômeros (MAURUS e
KAEDING, 2004).
A proporção de cada estereoisômero tem influência determinante nas
características do polímero. O isômero D, com uma área amorfa maior e com isso
uma menor área cristalina, apresenta maior entropia, evidenciada, em relação ao
isômero L, por uma menor temperatura de fusão (T
m
). Assim, na mistura, quanto
maior a proporção do isômero D, menor a T
m
(BLACKBURN et al., 2006).
Os fatores que afetam as propriedades mecânicas e o comportamento na
cristalização do PLA dependem da composição, da seleção do iniciador de reação,
das condições de processamento presença de aditivos, do peso molecular e do tipo
de processamento. Esses fatores influenciam a hidrofilicidade, cristalinidade,
temperaturas de transição vítrea e de fusão, peso molecular, distribuição do peso
molecular, grupos terminais e seqüência de distribuição (MIDDLETON e TIPTON,
2000). Quanto maior o grau de cristalinidade, maior serão a densidade, a rigidez, a
resistência e desta forma mais lenta será a degradação.
2.3.1.2. APLICAÇÕES
Os polímeros bioabsorvíveis são empregados em diversas aplicações. Na
década de 60, Kulkarni e colaboradores (KULKARNI et al., 1966; KULKARNI et al.,
1971) foram os primeiros que descreveram o uso de PLA como sutura e hastes para
o reparo de fraturas mandibulares em cães. Depois disso, várias pesquisas
continuaram sendo desenvolvidas para estudo de outras aplicações dos polímeros
bioabsorvíveis (MIDDLETON e TIPTON, 2000).
A ruptura do tendão de Aquiles é uma lesão comum. Alguns profissionais ainda
54
se mostram reticentes à utilização de suturas absorvíveis em locais onde haverá
tensão devido às propriedades mecânicas limitadas das mesmas. Kangas et al
(2001) (KANGAS et al., 2001) compararam dois tipos de sutura absorvível, uma
disponível comercialmente, Maxon
®
fabricada com PGA e outra a base de PLDLA.
Os autores observaram que as suturas de PLDLA apresentaram menor resistência
mecânica do que as Maxon
®
, mas com a manutenção da resistência por um período
de tempo maior. Em conseqüência, concluíram que o PLDLA é um substituto
alternativo ao Maxon
®
no reparo do tendão de Aquiles.
Os polímeros biodegradáveis são materiais de interesse para a fixação de
fraturas ósseas e para a fixação de enxertos ósseos, como alternativa para substituir
os dispositivos metálicos como placas e parafusos (TAMS et al., 1995; FURUKAWA
et al., 2000; SHIKINAMI e OKUNO, 2001; PELTONIEMI et al., 2002; LANDES et al.,
2006). A propriedade, que faz dos dispositivos de fixação biodegradáveis mais
atrativos do que os metálicos, é que não há necessidade de uma segunda
intervenção cirúrgica para remoção do dispositivo após a cicatrização tecidual
(SUURONEN et al., 1998; SURPURE et al., 2001; NORHOLT et al., 2004; YERIT et
al., 2005). O uso de materiais bioabsorvíveis permite a transferência gradativa de
carga ao osso neoformado evitando a osteopenia e os fenômenos de fragilização,
assim como a propensão à fratura no local do implante após a remoção da placa
metálica (BOS et al., 1989; MIDDLETON e TIPTON, 2000).
Fraturas maxilo-faciais são menos comuns em crianças do que adultos, mas
fraturas mandibulares são as mais freqüentes em pacientes pediátricos (KABAN et
al., 1977). A utilização de materiais bioabsorvíveis em crianças e adolescentes nas
cirurgias crânio-faciais também é vantajosa já que são totalmente substituídos por
tecido ósseo (NORHOLT et al., 2004), os dispositivos bioestáveis não absorvíveis,
como as miniplacas e miniparafusos de titânio, têm potencial para interferir no
crescimento ósseo (PAAVOLAINEN et al., 1978). Além disso, translocação passiva
do dispositivo metálico em pacientes em crescimento pode ser observada nos ossos
do crânio em crescimento (HÖNIG et al., 1995).
Outra vantagem destes materiais é que eles não são radiopacos, não
interferindo assim com as técnicas atuais de diagnóstico por imagem, tais como
tomografia computadorizada e ressonância magnética, não criam artefatos nas
imagens radiográficas, não sofrem corrosão, nem liberam íons que podem causar
55
reações alérgicas (BOS et al., 1989; BOUWMAN e TUINZING, 1999; MIDDLETON e
TIPTON, 2000).
Além da utilização como placas e parafusos para a fixação de fraturas ósseas,
os polímeros bioabsorvíveis são empregados na fabricação de âncoras para fixação
de ligamentos ao osso adjacente (DEJONG et al., 2004) e como membranas para
conter enxertos ósseos autógenos no sítio cirúrgico (IP, 2002). As vantagens para
estas aplicações são similares aquelas descritas para utilização de placas e
parafusos bioabsorvíveis (DEJONG et al., 2004).
Outra aplicação para os polímeros bioabsorvíveis se encontra na Engenharia de
Tecidos. O maior problema nesta área tem sido induzir um crescimento celular
tridimensional e não apenas numa única direção, linear, para que a reprodução do
tecido ocorra da melhor maneira possível. O uso de uma matriz polimérica
absorvível como arcabouço (scaffold) para o suporte do crescimento de células
ósseas em conjunto com agentes indutores resolveu este grande problema (SEAL et
al., 2001). Como arcabouço, os polímeros biodegradáveis apresentam várias
vantagens quando comparados com outros materiais. As propriedades mecânicas e
a cinética de degradação podem ser controladas, eles podem ser fabricados em
diversas formas com poros com um tamanho que induza o crescimento tecidual
(GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003). A regeneração tecidual vem sendo pesquisada
para a reparação de vários tipos de tecidos, como ossos (BORDEN et al., 2002;
BORDEN et al., 2003; KOTHAPALLI et al., 2005), pele (REZENDE, 2005),
cartilagens (TEMENOFF e MIKOS, 2000c), vasos sanguíneos, nervos (SEAL et al.,
2001), ligamentos (LU et al., 2005), como implantes em cirurgias de vértebras
(ROBBINS et al., 2004). Os polímeros bioabsorvíveis também podem ser utilizados
na forma de gel para ser usado em defeitos ósseos (RIMONDINI et al., 2005) e em
artroscopias (TEMENOFF e MIKOS, 2000b).
A administração de um fármaco exige, freqüentemente, a sua constante ação ou
que o mesmo atinja áreas remotas do organismo. Micro-esferas biodegradáveis têm
sido amplamente investigadas como sistemas para liberação controlada de drogas
(WOO et al., 2001; CAPAN et al., 2003). As micro-esferas com esta finalidade
diminuem a necessidade de administração freqüente e aumenta a capacidade dos
pacientes de manterem os níveis da droga numa faixa terapêutica (OKADA et al.,
1991). Além das micro-esferas, os fármacos podem ser fabricados sob diversas
56
formas: gel, grânulos (pellets), discos (HUH et al., 2003).
Grampos utilizados para fechar feridas cirúrgicas, sendo fabricados com PGA ou
poli (ácido lático co-glicólico) (PLGA), malhas (redes) de PGA introduzidas para
envolver órgãos internos, como o baço, mantendo sua integridade após terem
sofrido um trauma, permitindo assim um tempo adequado para a cicatrização são
mais algumas aplicações possíveis para os polímeros bioabsorvíveis (GLEASON,
1998).
As extrações dentárias freqüentemente produzem reabsorção do rebordo
alveolar causando um defeito. O uso de uma esponja de PLA para preencher o
alvéolo dentário reduz este fenômeno, previne hemorragias e serve de arcabouço
para o crescimento tecidual e reparação (GLEASON, 1998).
2.3.1.3. DEGRADAÇÃO
Diversos estudos in vitro de degradação de biopolímeros têm sido realizados nos
últimos anos, observando-se ser um processo heterogêneo de degradação do
material. A taxa de degradação é função do peso molecular, tamanho e orientação
das cadeias moleculares, proporção entre os copolímeros, cristalinidade,
porosidade, morfologia e tamanho do material do implante (HARTMAN, 1998;
GUTWALD et al., 2002; GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003). A degradação é
dependente do tempo, temperatura, impurezas de baixo pelo molecular e
concentração do catalisador (JAMSHIDI et al., 1988). Catalisadores e oligômeros
diminuem a temperatura de degradação e aumentam a taxa de degradação do PLA
(GARLOTTA, 2001). Os polímeros de baixo peso molecular têm degradação mais
rápida que os de alto peso (GUTWALD et al., 2002). Quanto maior a cristalinidade
do implante, melhores são suas propriedades mecânicas e maior é o seu tempo de
degradação (MIDDLETON e TIPTON, 2000). O tempo de degradação in vivo é
inferior ao do in vitro, ocorrendo, devido à degradação hidrolítica da região amorfa,
um aumento na fragilidade, tanto in vitro como in vivo (LAITINEN et al., 1992;
LANDES et al., 2006). Outros dois fatores que influenciam a degradação são a
temperatura e o pH. A elevação destes dois parâmetros aceleram o processo de
57
hidrólise e consequentemente a degradação (PROIKAKIS et al., 2005).
O local de inserção do material também tem influência direta com o tempo de
degradação (GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003). O tempo é maior em tecidos
moles do que em tecidos ósseos, provavelmente devido à maior estabilidade destes
últimos (BERGSMA, DE BRUIJN et al., 1995). Implantes submetidos a esforços e
tensões mecânicas apresentam maior taxa de degradação (BOS et al., 1989;
BERGSMA, DE BRUIJN et al., 1995).
O processo de degradação dos polímeros bioabsorvíveis semicristalinos ocorre
em duas fases: a primeira consiste na penetração e na difusão de água nas regiões
amorfas do material e subseqüentemente, cisão hidrolítica das ligações ésteres das
cadeias poliméricas. Por ocorrer na fase amorfa inicialmente, há redução do peso
molecular sem diminuição das propriedades mecânicas já que a matriz polimérica
permanece unida devido às regiões cristalinas (LEENSLAG et al., 1987a;
MIDDLETON e TIPTON, 2000). A segunda fase acontece quando parte considerável
da região amorfa está degradada e a reação prossegue no centro dos domínios
cristalinos. A hidrólise quebra as cadeias poliméricas, o que resulta em menor
resistência e diminuição da estrutura do polímero e de sua estabilidade polimérica.
Iniciam-se processos metabólicos, com infiltração de macrófagos e células gigantes,
que fagocitam e eliminam os fragmentos remanescentes (ROKKANEN et al., 1985;
KONTIO et al., 1998; SURPURE et al., 2001), a ação de enzimas e encapsulamento
por tecido fibroso (KONTIO et al., 1998). A reação de de-esterificação hidrolítica tem
como produto o ácido lático que é, então, oxidado em piruvato catalisado pela
enzima lactase desidrogenase (LAITINEN et al., 1992; GUTWALD et al., 2002). A
metabolização dos fragmentos resulta numa rápida perda de massa (MIDDLETON e
TIPTON, 2000). A degradação in vivo e in vitro produz monômeros de ácido lático e
glicólico, que são metabolizados em dióxido de carbono e água, que são eliminados
subseqüentemente pelos pulmões e rins através do ciclo do ácido tricarboxílico
(SUURONEN et al., 1998; PELTONIEMI et al., 2002; GUNATILLAKE e ADHIKARI,
2003) (FIG. 2.13). Não há relatos de acúmulo significante dos produtos de
degradação do PLA em órgãos vitais (VERT et al., 1984).
Inicialmente, o processo de degradação é homogêneo, gera oligômeros solúveis
em água em toda extensão do material. Os produtos presentes na superfície da
matriz são difundidos para o meio, entretanto, a baixa taxa de difusão dos produtos
58
da reação no interior do material gera um acúmulo de ácidos, fazendo com que
estruturas densas tenham degradação inicial na superfície e apresentam
degradação mais acentuada no centro. No interior do polímero a fluidez é menor, há
menos água, o que, no início, dificulta a hidrólise das cadeias de ésteres, porém,
devido a esta mesma falta de fluidez, inicia-se uma acidificação do meio. Desta
maneira o processo de degradação é catalisado, acelerando a hidrólise das ligações
dos ésteres e assim, tornando a taxa de degradação no interior maior que na
superfície, é o chamado efeito auto-catalítico dos poli(α-hidroxi ácidos)
(MIDDLETON e TIPTON, 2000; WEIR et al., 2004). O processo apresenta cinética
maior nas zonas amorfas do polímero e aumenta o percentual das frações de zonas
cristalinas, mais resistentes ao processo de degradação (MIDDLETON e TIPTON,
2000).
FIG. 2.13 Esquema da degradação do PLA e PGA ou de seus copolímeros in
vivo levando a formação dos monômeros GA e LA (PELTONIEMI et al., 2002).
É um consenso que os implantes bioabsorvíveis devem efetivamente degradar e
eventualmente serem totalmente reabsorvidos ou excretados pelo organismo
(LEENSLAG et al., 1987b; GUNATILLAKE e ADHIKARI, 2003; DEJONG et al.,
59
2004). Isso ocorre primeiro através de perda de peso molecular e depois da perda
de material com o passar do tempo. A degradação destes copolímeros ocorre
através de quebra não específica das ligações ésteres. O ácido lático, um
subproduto normal do corpo humano, é um produto da quebra do PLA que depois é
convertido em água e dióxido de carbono no ciclo do ácido cítrico (ATHANASIOU et
al., 1998). Se o tecido hospedeiro for incapaz de remover os produtos ácidos da
quebra das cadeias, o pH vai cair, levando a uma aceleração da degradação e
possivelmente uma alteração negativa na reação local do tecido. Isto despertou o
interesse dos pesquisadores em incorporar agentes tampões nestes dispositivos
(AGRAWAL e ATHANASIOU, 1997).
A permanência do material por longos períodos pode ser acompanhada de
células inflamatórias. O aumento da cristalinidade e o número de partículas oriundas
da degradação do polímero podem também atrair fluidos por osmose. Dentro da
cápsula fibrosa a quantidade destes fluidos pode aumentar e até formar uma fístula
para a pele ou mucosa. Parece que a reação de corpo estranho está de alguma
maneira relacionada com o grau de degradação (KONTIO et al., 1998).
A velocidade de degradação dos polímeros da família PLA pode variar
grandemente, de semanas a anos, dependendo da aplicação. O polímero amorfo
sofre maior degradação, pois a taxa de hidrólise é influenciada pela concentração de
grupos terminais carboxílicos, pela difusão dos fluidos e pela carga aplicada. A
degradação do PLDLLA caracteriza-se pela perda de massa associada a reabsorção
ou dissolução do material, precedida ou acompanhada pela redução do peso
molecular, mudanças na configuração estrutural do polímero e redução nas
propriedades mecânicas (ATHANASIOU et al., 1996).
A cinética de degradação do PLLA é muito mais lenta do que o do PLDLA. A
degradação completa de PLLA, que é semicristalino foi relatada em estudos in vitro
e in vivo como sendo maior do que 2 anos. Já o PLDLA, que é amorfo, tem um
tempo de degradação entre 12 e 16 meses (BERGSMA, DE BRUIJN et al., 1995).
Copolímeros do isômero L com o ácido glicólico ou com a mistura racêmica DL do
ácido lático foram preparadas para quebrar a cristalinidade do isômero L e com isso
acelerar o processo de degradação (GILDING e REED, 1979).
60
2.4. BIOCERÂMICOS
Durante os últimos 40 anos uma revolução na aplicação dos materiais cerâmicos
ocorreu no sentido de usá-los para melhorar a qualidade de vida dos humanos. Essa
revolução foi o desenvolvimento de componentes especialmente projetados e
fabricados para reparar e reconstruir partes do corpo que sofreram alguma injúria
devido a doenças, traumas ou desgastes (HENCH e WILSON, 1993a; BEST et al.,
2008).
Existe uma gama de materiais biocerâmicos, tais como: cerâmicas
odontológicas, sistemas liberadores de drogas (NETZ et al., 2001), enxertos ósseos,
scaffolds para substituição óssea (RAMAY e ZHANG, 2003). As aplicações clínicas
destes materiais incluem: reparar ossos, articulações e dentes, bem como aumentar
tanto tecidos duros e moles. Eles também são usados para repor parte do sistema
cardiovascular, especialmente válvulas cardíacas e no tratamento de tumores
(HENCH e WILSON, 1993a).
Os materiais biocerâmicos são produzidos em formas e fases variadas e suas
aplicações são resumidas na TAB. 2.1. Eles podem ser confeccionados na forma
porosa ou densa, na forma de um arcabouço, de grânulos ou de recobrimento
(BEST et al., 2008). Aqueles usados com uma forma específica são chamados
implantes, próteses ou dispositivos protéticos. Eles também são usados para o
preenchimento de espaços enquanto os processos naturais restauram a função. Em
outras situações, eles são usados como revestimento de superfícies, ou como uma
segunda fase de um compósito, combinando as características de ambos
produzindo um novo material com propriedades mecânicas e bioquímicas melhores.
O desenvolvimento de compósitos permite combinar polímeros biodegradáveis e
fases inorgânicas, tais como hidroxiapatita e vidros bioativos, na tentativa de
produzir arcabouço reabsorvíveis com propriedades físico-químicas direcionadas
(LAURENCIN e LU, 2000). A combinação de materiais poliméricos e cerâmicos se
mostra atrativa para enxerto ósseo uma vez que ela pode fornecer estruturas
porosas reforçadas com bioatividade aumentada e taxas de reabsorção controladas
(WANG, 2003).
61
TAB. 2.1 Forma, fase e função dos biocerâmicos (HENCH e WILSON, 1993a).
Forma de
apresentação
Fase Função
Pó Vidro policristalino Preenchimento de espaços, tratamento
terapêutico, regeneração de tecidos.
Cobertura Vidro policristalino
Vitro-cerâmico
União com tecido, resistência a trombose e
proteção contra corrosão.
Corpo Cristal único
Vidro policristalino
Vitro-cerâmico
Compósito (multifase)
Reposição e aumento de tecido, reposição
de partes funcionais.
Os materiais biocerâmicos podem ser produzidos em diferentes fases. Eles
podem ser cristais únicos (safira), policristalinos (alumina ou hidroxiapatita), vidro
(Biovidro
®
), vitro-cerâmicos (A/W vitro-cerâmico), ou compósitos (polietileno-
hidroxiapatita). A fase ou fases são usadas dependendo das propriedades e funções
desejadas (HENCH e WILSON, 1993a). Dependendo do tipo de biocerâmico
utilizado e sua interação com o tecido, ele pode ser caracterizado como bioinerte ou
bioativo; e as cerâmicas bioativas podem ser reabsorvíveis ou não (BEST et al.,
2008).
Os materiais biocerâmicos têm sido amplamente estudados para aplicações
ortopédicas e dentais, devido a sua biocompatibilidade e propriedades
osteocondutivas. É um consenso que a bioatividade destes materiais está associada
à habilidade deles induzirem a formação de hidroxiapatita em meio fisiológico
(FUJIBAYASHI et al., 2003). Esta habilidade de formar uma camada de
hidroxiapatita in vivo já está bem documentada (HENCH et al., 1971; OHURA et al.,
1992; DAVIES e BALDAN, 1997).
Na década de 20, de Jong (DE JONG, 1926) foi o primeiro a observar as
similaridades entre os padrões de difração de raios X da parte mineral do osso e um
componente de cálcio e fosfato (Ca-P), a hidroxiapatita. Mais tarde Posner e
colaboradores identificaram a estrutura cristalográfica da parte mineral do osso e da
hidroxiapatita (KAY et al., 1964; POSNER, 1969). Uma série de estudos na década
de 60 revelou que a presença de carbonato, na parte mineral do osso e dos dentes e
da hidroxiapatita pode ser observada diretamente através de espectrofotometria no
infravermelho, na forma de picos fracos entre 870 e 880 cm
-1
e um dubleto forte
entre 1460 e 1530 cm
-1
e também através de alterações nos parâmetros de rede da
62
hidroxiapatita observadas por difração de raios X (LEGEROS, 1965). Os efeitos da
substituição de ânions, tais como F
-
e Cl
-
no lugar de grupos (OH)
-
também foram
relatados como causadores de variações nos parâmetros de rede das estruturas
(ELLIOT e YOUNG, 1967). Estes estudos foram de suma importância no
desenvolvimento das cerâmicas bioativas até os dias atuais (BEST et al., 2008).
2.4.1. BIOVIDRO
2.4.1.1. CONCEITOS
Os vidros bioativos são uma classe de biomateriais geralmente baseado em
compostos amorfos de silicatos (CERRUTI, M. G. et al., 2005), que possuem
excelente osteocondutividade e bioatividade (OONISHI et al., 1997). O
desenvolvimento de vidros do sistema CaO-P
2
O
5
-MgO-SiO
2
tem recebido crescente
atenção, especialmente durante as duas últimas décadas, devido a sua apropriada
aplicação biomédica. Um dos maiores fatores que determinam as propriedades
bioativas dos vidros é a presença da sílica (HENCH e WILSON, 1993b). Muitas
composições têm sido desenvolvidas com o objetivo de melhorar a bioatividade e as
propriedades mecânicas (OLIVEIRA et al., 2000). Estes materiais têm sido usados
clinicamente como materiais para regeneração óssea em aplicações dentais e
ortopédicas (HENCH et al., 1971). Clark e Hench (CLARK et al., 1976) foram os
primeiros a detalhar o número de passos seqüenciais na reatividade in vitro e in vivo
de vidros bioativos que são responsáveis pela habilidade do osso se ligar à
superfície destes materiais.
A ligação dos vidros bioativos ao osso depende da reatividade química do vidro
nos fluidos corporais (HENCH e ANDERSSON, 1993). Um pré-requisito para que os
vidros e os vitro-cerâmicos se unam ao osso é a formação de uma camada de
apatita (KOKUBO, 1991). Como o entendimento da bioatividade implica no estudo e
compreensão do mecanismo de formação da camada de apatita, vários autores
realizaram estudos in vitro de materiais bioativos em meio celular e acelular
63
(HENCH, 1991b; OHURA et al., 1992; CAO e HENCH, 1996; HENCH, 1998;
RANGAVITTAL et al., 2000). Testes in vitro mostraram que o 45S5 Bioglass
®
, que
contém 45% de SiO
2
, 24,5% de Na
2
O, 24,4% de CaO e 6% de P
2
O
5
(HENCH e
ANDERSSON, 1993), o 45 representando 45% em peso de SiO
2
, S sendo o
formador da rede e 5 representando à relação de CaO e P
2
O
5
(BEST et al., 2008),
sofre reações superficiais que ocorrem muito rapidamente. A reação na superfície é
um processo complexo e de multi-estágios (OGINO e HENCH, 1980). Sucintamente,
os passos envolvem a liberação de cátions do vidro levando ao aumento do pH da
solução, formação de uma camada rica de sílica e precipitação de uma camada rica
em Ca-P que depois cristaliza como carbonato apatita (HCA) (FIG. 2.14)
(ANDERSSON e KANGASNIEMI, 1991; HENCH, 1991a; PEREIRA et al., 1994;
CERRUTI, M. G. et al., 2005). Esta fase HCA é química e estruturalmente similar à
fase mineral do osso e desta forma permite a união direta por embricamento do
tecido hospedeiro com os implantes (OGINO e HENCH, 1980).
FIG. 2.14 Esquema ilustrando a indução da formação de hidroxiapatita em meio
fisiológico pelo biovidro.
Acredita-se que o 45S5 Bioglass
®
é capaz de promover a diferenciação de
células mesenquimais em osteoblastos (BOSETTI e CANNAS, 2005). Além disso, já
foi mostrado que os produtos de dissolução do 45S5 Bioglass
®
têm efeito direto na
expressão genética dos osteoblastos, levando a um incremento no crescimento
ósseo (XYNOS et al., 2001). Adicionalmente, pesquisas recentes mostraram que o
material também pode induzir um efeito de neovascularização, promovendo a
formação de vasos sangüíneos in vitro (DAY).
64
Tradicionalmente, os vidros bioativos têm sido usados em aplicações médicas
como estruturas monolíticas (STANLEY et al., 1997) ou em grânulos com diâmetro
maiores que 100 µm como materiais para regeneração óssea (LOVELACE et al.,
1998). Dependendo da sua composição, os vidros bioabsorvíveis também
apresentam capacidade de liberar células (GATTI et al., 1994) e uma biodegradação
controlada (PEREIRA et al., 1994). Mais recentemente, estudos foram realizados
com partículas significantemente menores do que 100 µm (JONES et al., 2001;
SEPULVEDA et al., 2001), estas apresentaram propriedades anti-microbianas e anti-
inflamatórias (ALLAN et al., 2001).
Os componentes básicos da maioria dos vidros bioativos são SiO
2
, Na
2
O, CaO e
P
2
O
5
(TAB. 2.2). A primeira composição e a mais estudada tem designação
comercial Bioglass
®
45S5 (HENCH e ANDERSSON, 1993). Com a formulação
original de Hench, o osso forma uma rápida união quando os níveis de sílica estão
na faixa de 42-53%, vidros com 54-60% de sílica requerem de 2-4 semanas para
união com o osso e não se observa uma união direta com o osso quando são
utilizados vidros contendo mais de 60% de sílica (HENCH, 1991a).
A substituição de óxido de cálcio (CaO) por fluoreto de cálcio (CaF
2
) não
apresenta alteração significativa no comportamento da união com o osso. A adição
de fluoreto, entretanto, diminui a taxa de dissolução. Substituições de MgO por CaO
ou K
2
O por Na
2
O também apresentam pequenos efeitos na união com o osso. B
2
O
3
e Al
2
O
3
também têm sido adicionados aos em biovidros para modificar os protocolos
de processamento e as taxas de dissolução da superfície (HENCH e ANDERSSON,
1993).
A alumina é importante para controlar a durabilidade da superfície do vidro e das
características de fusão e formação. Entretanto, a alumina em contraste com o B
2
O
3
pode inibir a união com o osso. A quantidade controlada de alumina depende da
composição do vidro, mas fica em torno de 1,0 a 1,5% em peso. Mais do que isso
normalmente torna o vidro inativo (HENCH e ANDERSSON, 1993).
O papel do fosfato nos vidros bioativos é interessante. Inicialmente fez-se a
suposição que P
2
O
5
era requerido para o vidro ser bioativo. Entretanto, atualmente
se sabe que vidros livres de fosfato, bem como vitro-cerâmicos com fosfato numa
fase de apatita estável e relativamente insolúvel, são bioativos. O papel do fosfato
no vidro parece ser o de ajudar a nucleação da fase de fosfato de cálcio na
65
superfície, mas não é um componente crítico porque a superfície vai absorver os
íons fosfato da solução (HENCH e ANDERSSON, 1993).
TAB. 2.2 Composições dos vidros por Mol% (HENCH e ANDERSSON, 1993).
Designação SiO
2
Na
2
O CaO CaF
2
P
2
O
5
B
2
O
3
Al
2
O
3
45S5.4F 46,1 24,4 16,2 10,8 2,6 0 0
45S5 46,1 24,4 26,9 0 2,6 0 0
#1(S63.5P6) 65,7 15,0 15,5 0 2,6 0,4 0,6
#9(S53P4) 53,9 22,6 21,8 0 1,7 0 0
#10(S45P7) 46,6 24,1 24,4 0 3,0 1,8 0
52S4.6 52,1 21,5 23,8 0 2,6 - -
55S4.3 55,1 20,1 22,2 0 2,6 - -
60S3.8 60,1 17,7 19,6 0 2,6 - -
42SF 42,1 26,3 17,4 11,60 2,6 - -
46SF 46,1 24,4 16,14 10,76 2,6 - -
49SG 49,1 23,0 15,18 10,12 2,6 - -
52SF 52,1 21,5 14,28 9,52 2,6 - -
55SF 55,1 20,1 13,32 8,88 2,6 - -
60SF 60,1 17,7 11,76 7,84 2,6 - -
49S(gg) 50,0 0 46,0 0 4,0 - -
54S(gg) 55,0 0 41,0 0 4,0 - -
58S(gg) 60,0 0 36,0 0 4,0 - -
63S(gg) 65,0 0 31,0 0 4,0 - -
68S(gg) 70,0 0 26,0 0 4,0 - -
72S(gg) 75,0 0 21,0 0 4,0 - -
77S(gg) 80,0 0 16,0 0 4,0 - -
86S(gg) 90,0 0 6,0 0 4,0 - -
(gg) = gel-glass (LI et al., 1991)
Hench também forneceu um novo entendimento sobre o comportamento
fundamental de materiais bioativos implantados. Ele definiu duas classes de
materiais bioativos (A e B) caracterizados pela taxa de regeneração óssea e pelo
reparo. Os materiais Classe A são aqueles que levam tanto à osteocondução
(crescimento de osso sobre a interface osso-implante) como à osteoprodução como
um resultado das rápidas reações na superfície do implante (WILSON e LOW, 1992;
HENCH e WEST, 1996). A bioatividade Classe B se verifica quando somente a
osteocondução ocorre (OONISHI et al., 1999).
A principal vantagem dos vidros bioativos consiste na sua alta taxa de reação
com a superfície, que leva à rápida união com o osso. As principais desvantagens
são a fragilidade mecânica e a baixa resistência à fratura, devido à rede
bidimensional amorfa do vidro (HENCH e ANDERSSON, 1993).
66
2.4.1.2. APLICAÇÕES
Inicialmente, observou-se resistência ao uso de biovidros como material para
implantes. As propriedades dos vidros são bem conhecidas, normalmente eles são
frágeis e podem quebrar facilmente ou fraturar acidentalmente, gerando partículas
ou pedaços que podem migrar e danificar tecidos e vasos sanguíneos. Entretanto,
eles têm propriedades valiosas. A capacidade de formar uma camada reativa
fornece uma interface favorável entre o material e o tecido (WILSON et al., 1993).
Os biovidros foram testados para aplicações médicas e dentais. As aplicações
requerem diferentes formas do material, entre elas formas sólidas, grânulos com
várias granulometrias, grânulos combinados com partículas de osso autólogo e
grânulos na forma de pasta que podem ser injetados (WILSON et al., 1993).
O primeiro relato de uso com sucesso na forma sólida do 45S5 Bioglass
®
foi a
substituição de ossículos do ouvido médio, no tratamento de perda auditiva
condutiva. A substituição de um ou mais dos ossículos pode restaurar a
continuidade do sistema condutor (WILSON et al., 1993). Em cirurgias orais,
dispositivos de 45S5 Bioglass
®
em forma de cone foram usados para preencher
defeitos na mandíbula criados após extrações dentárias. Na Finlândia, implantes de
vidro bioativos foram usados em injúrias faciais nas quais os ossos que suportam o
olho são danificados (WILSON et al., 1993; AITASALO e PELTOLA, 2007;
AITASALO, 2008; PELTOLA et al., 2008).
Vidros bioativos na forma de grânulos maiores do que 100 µm têm sido usados
no tratamento de doença periodontal (LOVELACE et al., 1998). Neste caso, a área
da gengiva ao redor do dente fica infectada e como conseqüência a união do tecido
mole que sela e suporta o dente é rompida e a infecção chega ao osso que depois é
destruído. Quando o processo se agrava, o dente pode ser perdido. A doença
periodontal é tratada com cirurgia e antibióticos, mas é importante recuperar o osso
perdido e as ligações com os tecidos moles para a manutenção do dente. Os vidros
bioativos têm se mostrado eficiente neste tipo de aplicação (WILSON et al., 1993;
ALLAN et al., 2001). Partículas com tamanho menores do que 100 µm têm se
mostrado efetivas na redução da inflamação gengival (TAI et al., 2004).
Os vidros bioativos têm sido usados para o preenchimento de defeitos ósseos. O
67
reparo de defeitos ósseos é melhorado não só pelas propriedades osteocondutivas
do material, como também pelo efeito osteoestimulador. Este efeito apresenta-se
como uma degradação interna na qual a formação óssea pode ser observada
separada do tecido ósseo externo. As ilhas de osso formadas funcionam como sítios
de nucleação para o subseqüente reparo ósseo. As células mesenquimais entre as
partículas de vidro degradado são estimuladas pelo meio interno para se
diferenciarem em osteoblastos e preencher seu potencial osteogênico (SCHEPERS
et al., 1991; SCHEPERS et al., 1993; FURUSAWA e MIZUNUMA, 1997;
SCHEPERS e DUCHEYNE, 1997).
Camargo et al (2000) avaliaram clinicamente o uso de grânulos de vidro
bioativos combinados com barreira de sulfato de cálcio na preservação do alvéolo
dentário em humanos após a exodontia. Os autores concluíram que o tratamento se
mostrou eficaz na preservação das dimensões do rebordo alveolar após a extração
dentária (CAMARGO et al., 2000).
Melo et al (2005) avaliaram a influência de vidro bioativo e/ou barreira de sulfato
de cálcio na cicatrização óssea em defeitos cirurgicamente criados em tíbias de
ratos. Os autores concluíram que quanto maior o tempo de cicatrização, melhores
eram os resultados para os materiais usados de forma combinada do que quando
usados isoladamente (MELO et al., 2005).
Outra aplicação para o 45S5 Bioglass
®
em grânulos se verifica no tratamento de
pacientes com paralisia de uma das cordas vocais. O material se mantém unido aos
tecidos moles produzindo um aumento na região, que desloca a corda vocal
paralisada para um local onde ela se torna funcional. Esse aumento é mais efetivo
do que o produzido por material injetável de PTFE, que vem sendo usado para esta
finalidade, porque o biovidro se une ao tecido mole e este mantém o material em
posição, não ocorrendo reação granulomatosa ao polímero inerte. O polímero pode
se desprender e causar embolia em algum lugar distante no corpo. Até o presente
momento não foram identificadas partículas de 45S5 Bioglass
®
em outros locais do
organismo, sugerindo que a embolia não seria um problema para sua aplicação
nesta situação (WILSON et al., 1993).
Grânulos, pós e pequenos blocos de vidro bioativo foram combinados com osso
autógeno em pacientes com defeitos ósseos oriundos de cistos ósseos e da
remoção de tumores. Uma vantagem desta aplicação parece ser a flexibilidade de
68
misturar o material em forma de blocos, pó ou grânulos e o osso, o quanto for
preciso e o quanto estiver disponível. Para vários objetivos reconstrutivos, as
propriedades mecânicas do osso usado se mostram secundárias em relação as
propriedades do material de preenchimento dos espaços e ser estável. Um exemplo
seria a reconstrução da mandíbula após a remoção de um tumor ou após um
ferimento pós-traumático. A mandíbula restaurada deve ser tanto estética quanto ser
capaz de suportar a carga da mastigação. Normalmente, o osso de escolha é a
costela, mas às vezes a fíbula pode ser utilizada. Infelizmente, tais ossos raramente
são fortes ou grandes o suficiente para satisfazer os requisitos mecânicos. Nestes
casos, os vidros bioativos são combinados com o osso (WILSON et al., 1993).
A mistura de grânulos de vidro bioativo com fragmentos de osso autógeno
também tem sido usada em situações onde a quantidade de osso é insuficiente para
colocação de implantes dentais, principalmente na região posterior da maxila, sendo
necessário o levantamento do seio maxilar (WILSON et al., 1993).
Os vidros bioativos também podem ser usados em situações que dependam da
adesão do material com tecido mole e que são facilitadas pela capacidade de injetá-
los. O tratamento de dois problemas urológicos, incontinência urinária, devido à
diminuição de resistência uretral e refluxo ureteral, são alguns exemplos deste tipo
de aplicação (WILSON et al., 1993).
Moosvi e Day (2008) avaliaram o efeito do biovidro 45S5 na reconstrução
epitelial usando um modelo de co-cultura de monocamada de células epiteliais
intestinais feridas e miofibroblastos sub-epitelial para simular condições in vivo que
ocorrem em ulcerações superficiais da mucosa. Os resultados sugerem que o vidro
bioativo pode funcionar como um estimulante na rede de sinalização que promove o
rápido reparo epitelial (MOOSVI e DAY, 2008).
Zhu e Kastel avaliaram a propriedade de liberação de drogas de dois
arcabouços com composição de biovidro diferentes. Os resultaram mostraram que o
arcabouço de biovidro mesoporoso foi capaz de carregar mais gentamicina do que o
de biovidro convencional e que a taxa de liberação da gentamicina pelo primeiro foi
mais lenta (ZHU e KASKEL, 2008).
Zhao et al (2008) prepararam biovidros mesoporosos (MBGs) com composições
diferentes e avaliaram o comportamento de liberação de tetraciclina. Os diferentes
comportamento de liberação do antibiótico pelos MBGs foram explicados pela
69
diferença na composição de Ca-P (ZHAO et al., 2008).
2.4.1.3. DEGRADAÇÃO
O estudo da dissolução de vidro tem desafiado os cientistas por mais de
40 anos. Vários modelos diferentes foram propostos, cada um deles mostrando
concordância com algum resultado experimental. Esta variedade de resultados tem
sido observada devido aos diferentes fatores que influenciam o mecanismo e a taxa
de dissolução do vidro, tais como: composição do vidro, pH e força iônica da solução
de lixiviação, área de superfície do vidro em contato com a solução, volume da fase
líquida, rugosidade superficial, características das superfície do vidro, como a
presença de grupos silanol ou de cátions em compostos insaturados (CERRUTI, M.
G. et al., 2005). Os dois modelos mais comumente usados para dissolução do vidro
são o Modelo Heterogêneo (ALKAN e DOGAN, 2004) e o Modelo Homogêneo
(RIMSTIDT e BARNES, 1980). No Modelo Heterogêneo, dois estágios são
identificados durante o ataque do vidro pela água. No primeiro estágio, a extração de
Ca e sílica variam com a raiz quadrada do tempo e a troca do Ca com os prótons
domina a dissolução do vidro. Durante o segundo estágio, a extração é linear com o
tempo e a dissolução da rede predomina (EL-SHAMY e DOUGLAS, 1972; EL-
SHAMY et al., 1972). No Modelo Homogêneo se propõe que o líquido penetre
completamente nas partículas e reage em toda sua extensão o tempo todo. Depois
os produtos sólidos reativos se comportam como se tivessem sido dissolvidos e a
reação de dissolução pode ser modelada como uma reação de primeira ordem
homogênea (RIMSTIDT e BARNES, 1980).
Para vários sistemas nenhum dos dois modelos se mostrou completamente
adequado. Desvios da cinética (t
1/2
) descrita no Modelo Heterogêneo podem ser
observados dependendo do pH e da extensão da hidrólise da rede (BUNKER, 1994)
e a transição clara entre os dois estágios não é visualizada. Outras discrepâncias
entre os modelos de dissolução experimental e teóricos podem ser atribuídos à
formação de uma camada protetora que induz a diminuição da taxa de dissolução
(TECHER et al., 2001). Para resolver estas questões, alguns autores propuseram
70
modelos que são uma combinação dos dois modelos (FENG e PEGG, 1994;
GRAMBOW e MULLER, 2001). Cerruti et al (2005) (CERRUTI, M. G. et al., 2005)
analisaram e modelaram a dissolução de partículas de Bioglass
®
com diferentes
tamanhos de partículas em solução TRIS (tris (hidroxi metil) amino metano)
tamponada. Os autores concluíram que para partículas menores, a liberação de
cátions foi mais rápida, valores maiores de pH foram alcançados e uma camada
mais fina de fosfato de cálcio se formou. A concentração de Si na solução não foi
afetada pelo tamanho das partículas e da amostra inteira e se confirmou que uma
camada de sílica estruturada se formou durante a transformação do Bioglass
®
em
pH 8. O Bioglass
®
foi modelado com o mecanismo de dois estágios. O primeiro
estágio foi descrito pela função da Lei de Potência do tipo C =α*t
b
, onde C é a
concentração do elemento na solução, t o tempo e α e b dois parâmetros
determináveis, o segundo estágio pela função exponencial C = C
0
+ C
lim
(1 – e
-x/
τ
),
onde C
0
é a concentração inicial presente na solução, C
lim
é a concentração máxima
obtida após o processo alcançar o equilíbrio e
τ
o tempo necessário para dissolver
uma quantidade de íons correspondente a 63% de C
lim
. A importância da área
superficial no primeiro estágio de dissolução foi confirmada, mas observou-se que
nos tempos de dissolução mais longos, a velocidade de dissolução não é
diretamente proporcional à relação da área superficial e do volume da solução,
provavelmente devido à diferenças no pH e à variações superficiais.
A base da propriedade de união dos vidros bioativos é a reatividade deles nos
fluidos corpóreos. As reações químicas superficiais resultam na formação de uma
camada de carbonato apatita (HCA) à qual o osso pode se unir. A união ocorre
devido a uma seqüência de reações bioquímicas. Após a imersão do vidro bioativo
em uma solução aquosa três processos ocorrem: lixiviação, dissolução e
precipitação. A lixiviação é caracterizada pela liberação, normalmente pela troca de
cátions com íons H
+
ou H
3
O
+
, de elementos alcalinos. A troca de íons é fácil, porque
estes cátions não fazem parte da rede do vidro, eles somente modificam a rede
através da formação de ligações de oxigênio que não formam pontes. Este processo
de troca iônica resulta em um aumento do pH interfacial para valores maiores que
7,4 (HENCH e ANDERSSON, 1993).
A dissolução ocorre em paralelo através da quebra das ligações -S-O-Si-O-Si-
pela ação de ânions hidroxila (OH)
-
. A quebra da rede ocorre localmente e libera
71
íons de sílica na solução na forma de ácido orto-silícico [H
4
SiO
4
]. A taxa de
dissolução da sílica depende muito da composição do vidro. A taxa de dissolução
diminuiu consideravelmente em composições de vidro com quantidade de SiO
2
maiores que 60%, devido ao grande número de ligações de oxigênio que formam
pontes na estrutura do vidro. A sílica hidratada (SiOH) formada sobre a superfície do
vidro por estas reações se rearranja através da policondensação dos silanois,
resultando em uma camada rica em sílica gel (HENCH e ANDERSSON, 1993).
Na reação de precipitação, íons de cálcio e fosfato liberados do vidro e aqueles
da solução formam uma camada rica em Ca-P na superfície. Quando formada in
vitro, esta camada se localiza em cima da sílica gel, já in vivo, ela se localiza no
interior da camada de sílica gel e a fase de fosfato de cálcio que se acumula na
superfície do gel é inicialmente amorfa (a-CaP). Posteriormente ela cristaliza em
uma estrutura de carbonato apatita (HCA) pela incorporação de ânions carbonato da
solução dentro da fase de a-CaP. O mecanismo de nucleação e crescimento da
camada da HCA parece ser igual tanto in vitro como in vivo e ambos se aceleram
pela presença da sílica hidratada (HENCH e ANDERSSON, 1993).
2.4.2. HIDROXIAPATITA
2.4.2.1. CONCEITOS
O termo APATITA descreve uma família de cerâmicos com estruturas similares,
mas não necessariamente com composição idêntica. Por essa razão, apatita é uma
família de cerâmicos e não um material (LEGEROS e LEGEROS, 1993).
A hidroxiapatita (HA) é o componente inorgânico principal dos tecidos duros,
como ossos e dentes, de animais vertebrados e humanos. Esses tecidos frágeis são
degradáveis por lesões, desgastes, fraturas causando sérios problemas, que
refletem na saúde dos seres humanos. Em vista disso, a HA vem recebendo
atenção considerável nas últimas três décadas como um material para implante,
pela excelente biocompatibilidade (JARCHO, 1981) além da capacidade de se unir
72
diretamente ao osso (HENCH, 1991a). A presença de poros interconectados na
estrutura do arcabouço da HA permite que haja suporte nutricional em seu interior,
favorecendo o aporte celular, formando um arcabouço para o crescimento ósseo
(NETZ et al., 2001).
Cerâmicas a base de fosfato de cálcio, principalmente a hidroxiapatita (HA), têm
sido amplamente utilizadas na substituição de tecido ósseo. Entretanto, suas
aplicações clínicas são limitadas, devido a sua alta fragilidade e conseqüente baixa
confiabilidade mecânica e à dificuldade de obtenção de peças com formas
complexas, similares aos defeitos ósseos (HENCH, 1991a). Outra desvantagem da
HA, quando comparada com vidros bioativos e vitro-cerâmicas, é que a taxa de
união com o osso após a implantação é relativamente baixa (OONISHI et al., 1999)
e isto pode influenciar o pós operatório do paciente (BEST et al., 2008).
O maior desafio na pesquisa desse material é combinar os requisitos
biomecânicos, o ambiente bioquímico e células circundantes de modo a conseguir
uma resposta biomecânica satisfatória. Somente após o reconhecimento da
importância da influência da porosidade no processo, que ocorreram avanços
significativos. A HA pode ser preparada nas formas densa ou macroporosa, com
poros que podem chegar até 500 µm. A densa possui uma microporosidade máxima
de 5% do volume com microporos de aproximadamente 1 µm de diâmetro
(LEGEROS e LEGEROS, 1993).
A estrutura, tal como a porosidade e a distribuição do tamanho dos poros, é um
fator muito importante para várias aplicações em potencial de cerâmicas porosas.
Por exemplo, uma maior porosidade leva a um aumento da permeabilidade de
fluidos e a combinação ideal do tamanho de poro e da porosidade pode aperfeiçoar
a relação entre a permeabilidade e a resistência mecânica (ZHANG et al., 2006).
Quando a solubilidade do Ca-P for mais elevada do que a taxa de regeneração
tecidual, ele só será indicado para uso em cavidades ósseas e preenchimento de
defeitos (BEST et al., 2008).
A melhora das taxas de integração da HA com o osso inclui a incorporação de
sustâncias biológicas, tais como fatores de crescimento, proteínas e células no
implante de HA (MASTROGIACOMO et al., 2005). Como uma alternativa à
modificação da biologia do implante, a HA pode também ser dopada quimicamente
com pequenas quantidades (até 20 mol%) de elementos que são comumente
73
encontrados no osso fisiológico (DRIESSENS, 1980). Estas substituições
influenciam na taxa de dissolução das apatitas e isto melhora a proliferação de
células humanas tipo osteoblastos in vitro e pode estimular a osseointegração
(BEST et al., 2008).
A HA é um composto com uma composição e uma estrutura cristalográfica
definitiva (LEGEROS e LEGEROS, 1993). A fórmula da hidroxiapatita
estequiométrica é Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
, com composição teórica de 39,68% do peso
total de Ca, 18,45% do peso total de P, razão Ca/P peso total de 2,151 e razão
molar Ca/P igual a 1,67 (BEST et al., 2008). Composições estáveis, porém podem
ter esta razão estendida entre aproximadamente 1,5 (FULMER et al., 1992). Caso a
relação Ca/P seja menor que 0,67, α e β fosfato tricálcico podem estar presentes
após o processamento. Se a relação for maior do que 1,67, óxido de cálcio (CaO)
pode estar presente junto com a fase de HA. A HA na forma estequiométrica
apresenta estabilidade elevada em solução aquosa dentro de uma faixa de pH de
4,2 – 8,0 quando comparada com outras cerâmicas a base de fosfato de cálcio
(BEST et al., 2008).
A HA sintetizada em altas temperaturas apresenta boa cristalinidade e cristais
grandes, as produzidas em baixas temperaturas, possuem baixa cristalinidade e
cristais menores, estas últimas apresentam características similares às do tecido
ósseo e dentário (MAVROPOULUS, 1999), sendo de interesse especial para
aplicações em saúde.
A estrutura da HA mostrando as posições atômicas exatas no cristal foi
determinada por Beevers e McIntyre (BEEVERS e MCINTYRE, 1956) para a HA
mineral e depois refinada por Kay et al. (KAY et al., 1964) com a HA sintética. A HA
cristaliza-se no sistema hexagonal, grupo espacial P6
3
/m (KAY et al., 1964). Este
grupo espacial é caracterizado por um eixo c com seis dobras perpendicular com
três eixos a equivalentes (a
1
, a
2
, a
3
) separados entre si por ângulos de 120
o
. A célula
unitária contém a representação completa do cristal de apatita, consistindo de
(Ca)
2+
, [PO
4
]
3+
e grupos (OH)
-
proximamente agrupadas em um arranjo exibido na
FIG. 2.15 (YOUNG e ELLIOT, 1966). As dimensões da célula unitária são
a = b = 9,42 Å e c = 6,88 Å (KAY et al., 1964).
A célula unitária hexagonal da hidroxiapatita contém 10 cátions cálcio em sítios
não equivalentes, quatro no sítio I (Ca
I
) e seis no sítio II (Ca
II
). Os íons cálcio no sítio
74
I estão alinhados em colunas, enquanto os íons cálcio do sítio II estão em triângulos
eqüiláteros perpendiculares à direção c da estrutura. Os cátions do sítio I estão
coordenados a seis átomos de oxigênio pertencentes a diferentes tetraedros de PO
4
e também a três outros átomos de oxigênio distantes. A existência de dois sítios de
íons cálcio traz conseqüências importantes para as HA, que contém impurezas
catiônicas, pois suas propriedades estruturais podem ser afetadas dependendo do
sítio ocupado pelo cátion (YOUNG e ELLIOT, 1966; MAVROPOULUS, 1999).
FIG. 2.15 Arranjo atômico da HA na célula unitária hexagonal. Os ânions OH
-
localizados nos cantos da célula unitária estão envolvidos por dois grupos de cátions
Ca (II) distribuídos em posições triangulares em z = 0,25 e 0,75, por dois grupos de
[PO
4
]
3+
também distribuídos em posições triangulares e por cadeia hexagonal de
átomos de Ca (I) (KAY et al., 1964; YOUNG e ELLIOT, 1966).
Os átomos de cálcio e fósforo formam um arranjo hexagonal no plano
perpendicular ao eixo cristalino de mais alta simetria (eixo c) (FIG. 2.16). Colunas
constituídas pelo empilhamento de triângulos eqüiláteros de íons oxigênio (O
2-
) e de
íons cálcio (Ca
2+
) estão ligados entre si por íons fosfato. Os átomos de oxigênio dos
íons hidroxila estão situados a 0,9 Å abaixo do plano formado pelos triângulos de
cálcio e a ligação OH forma um ângulo de aproximadamente 30º com a direção c.
75
Dos quatro átomos de oxigênio que constituem os grupos fosfatos, dois estão
situados em planos perpendiculares à direção c e os outros dois são paralelos a esta
direção (YOUNG e ELLIOT, 1966; MAVROPOULUS, 1999).
FIG. 2.16 Estrutura da HA ao longo do eixo c (ELLIOT, 1994).
Os tetraedros dos grupos [PO
4
]
3+
estão arranjados de tal forma que possibilitam
a formação de dois tipos de canais perpendiculares ao plano basal. A rede dos
grupos [PO
4
]
3+
fornece a armação esquelética que dá à estrutura da apatita sua
estabilidade. O primeiro canal com diâmetro de 2Å é paralelo aos eixos ternários que
são ocupados por átomos de Ca (I). Em cada célula unitária, encontram-se dois
canais ocupados por íons Ca (I) que estão localizados em z = 0 e z = ½ do
parâmetro cristalino. O segundo canal que tem diâmetro de 3,0 a 3,5 Å é constituído
por íons Ca (II) e estão localizados em z = ¼ e z = ¾. No interior desses canais dá-
se a distinção entre a forma hexagonal e a monoclínica. Na estrutura hexagonal o
grupo hidroxila ocupa apenas 50% das posições estatisticamente possíveis (YOUNG
e ELLIOT, 1966; MAVROPOULUS, 1999).
76
A estrutura da HA permite substituições catiônicas e aniônicas isomorfas com
facilidade. Substituições na estrutura da apatita do (Ca)
2+
, [PO
4
]
3+
ou grupos (OH)
-
resultam em mudanças nas propriedades, isto é, parâmetros de rede, morfologia do
cristal, solubilidade, estabilidade térmica sem mudar significantemente a simetria
hexagonal (LEGEROS e LEGEROS, 1993; BEST et al., 2008). Entretanto, Young e
Elliot (YOUNG e ELLIOT, 1966) mostraram que a substituição pelo Cl
-
leva a perda
da simetria hexagonal tornando a estrutura monoclínica, por causa das posições
alternadas dos átomos de Cl e de um alargamento da célula na direção (b). Por
exemplo, a substituição de F
-
por (OH)
-
, que causa uma contração nas dimensões
do eixo (a) sem mudanças no eixo (c), é normalmente associada com um aumento
na cristalinidade, levando ao aumento no tamanho do cristal e/ou diminuição da
tensão do cristal, que dá uma maior estabilidade à estrutura. A estabilidade
aumentada é um reflexo da observação de que apatitas com substituição do F
-
são
menos solúveis do que as apatitas biológicas e as sintéticas sem F
-
(MORENO et
al., 1977).
O carbonato, [CO
3
]
2-
, pode substituir ou o grupo hidroxila (OH)
-
ou o grupo
fosfato [PO
4
]
3+
, sendo a substituição denominada do Tipo A ou Tipo B,
respectivamente (BEST et al., 2008). Esses dois tipos de substituição têm efeitos
contrários nos parâmetros de rede, nas dimensões do eixo (a) e (c). No caso do Tipo
A, a substituição de grupo [CO
3
]
2-
planar grande por grupo (OH)
-
linear menor, causa
uma expansão nas dimensões do eixo (a) e uma contração no eixo (c), enquanto
que no caso do Tipo B, a substituição do grupo [CO
3
]
2-
planar menor por grupo
[PO
4
]
3+
tetraedral maior, causa uma contração nas dimensões do eixo a e uma
expansão e uma expansão no eixo (c), quando comparadas a apatitas sem [CO
3
]
2-
(LEGEROS e LEGEROS, 1993).
O Ca
2+
pode ser substituído por cátions metálicos tais como o Pb
2+
, Cd
2+
, Cu
2+
,
Zn
2+
, Sr
2+
, Co
2+
, Fe
2+
, entre outros; os grupos fosfatos por carbonatos e vanadatos
(LEGEROS e LEGEROS, 1993) e as hidroxilas por carbonatos, fluoretos e cloretos
(MAVROPOULUS, 1999). Essas substituições podem alterar a cristalinidade, os
parâmetros de rede, as dimensões dos cristais, a textura superficial, a estabilidade e
a solubilidade da estrutura da hidroxiapatita (YOUNG e ELLIOT, 1966; LEGEROS e
LEGEROS, 1993; MAVROPOULUS, 1999). Quando presentes simultaneamente, os
substitutos na estrutura da apatita podem apresentar efeitos sinérgicos ou
77
antagônicos influenciando nas propriedades da apatita. Por exemplo, o Mg
2+
e
[CO
3
]
2-
têm efeitos sinérgicos na cristalinidade e propriedades de dissolução das
apatitas sintéticas, o Mg
2+
e F
-
ou [CO
3
]
2-
e F
-
têm efeitos antagonistas, o efeito do F
-
sendo o mais dominante (LEGEROS e TUNG, 1983).
Do ponto de vista biológico, o flúor é uma das principais impurezas da HA dos
tecidos calcificados. Nas HA de ossos e dentes, os carbonatos ocupam sítios dos
íons fosfato e dos íons OH
-
em uma razão de 10:1. Nas carbonatoapatitas sintéticas
do tipo A, os íons carbonato localizam-se em canais e ocupam os mesmos sítios que
os íons hidroxila. Nas carboapatitas do tipo B, os íons carbonato ocupam os sítios
dos íons fosfatos. As carbonatoapatitas do tipo B apresentam sua composição
similar ao tecido ósseo e dentário (MIYAKE et al., 1990). O grupo carbonato não
altera a cristalinidade da hidroxiapatita, mas pode acelerar os processos de
dissolução da estrutura, o que é verificado nas cáries dentárias e nos processos de
reabsorção óssea (YOUNG e ELLIOT, 1966; MAVROPOULUS, 1999).
2.4.2.2. APLICAÇÕES
A HA é considerada como o molde estrutural para a fase mineral do osso,
dentina e esmalte; e sua forma sintética tem sido amplamente usada na Medicina e
Odontologia devido as suas propriedades de biocompatibilidade e bioatividade
(LEVENTOURI, 2006).
As várias aplicações clínicas dentais e médicas da HA incluem (LEGEROS e
LEGEROS, 1993):
• reparo de defeitos ósseos em aplicações dentais e ortopédicas;
• reposição imediata de raízes dentárias;
• aumento do processo alveolar;
• adjuvante na colocação de implantes metálicos;
• recobrimento pulpar;
• intensificação de regeneração tecidual guiada;
• reconstrução maxilo-facial;
• dispositivos percutâneos;
78
• reconstrução do ouvido médio;
• recobrimento de implantes dentais e ortopédicos. Este método combina a
resistência do metal e a bioatividade e osteocondutividade da HA;
• como bioreatores;
• como sistema para liberação de drogas (NETZ et al., 2001).
O motivo pelo qual a HA é usada como um material para substituição óssea é de
fácil compreensão: o osso natural apresenta 70% de HA no seu peso e 50% no seu
volume. Para desenvolver um implante para osteocondução é necessário mimetizar
a arquitetura do interstício ou osso estromal do osso cortical. Uma vez que os
osteons possuem diâmetro médio de 190 – 230 µm e se interconectam através dos
canais de Volksmann, um substituto ósseo ideal deveria mimetizar o osso cortical e
apresentar um sistema poroso com canais de dimensões equivalentes. Já o
substituto ósseo ideal do osso medular deveria mimetizar o aspecto esponjoso e
possuir uma estrutura fina interconectada por poros de 500 – 600 µm (SHORS e
HOLMES, 1993).
Vários autores (KLAWITTER e HULBERT, 1971; GAUTHIER et al., 1998; HING
et al., 1999; SAIZ et al., 2007) definiram o tamanho mínimo do tamanho dos poros
de estruturas cerâmicas para o crescimento ósseo como sendo de
aproximadamente de 100 µm. Estes poros não devem exceder 400 µm, mas existem
relatos conflitantes na literatura, onde foi observado crescimento ósseo em poros
menores do que 100 µm e maiores do que 500 µm (GAUTHIER et al., 1998; HING et
al., 1999). A porosidade deve ser interconectada para permitir o crescimento de
células, vascularização e difusão de nutrientes (MASTROGIACOMO et al., 2006;
SAIZ et al., 2007).
Para o reparo de defeitos ósseos, a HA pode ser confeccionada na forma de
arcabouço, em grânulos ou na forma de pasta (LEGEROS e LEGEROS, 1993;
CHRIS ARTS et al., 2006). Bucholz e colaboradores realizaram um estudo
prospectivo randomizado de fraturas tibiais com defeitos metafiseal em pacientes,
sendo os defeitos preenchidos com osso autógeno e hidroxiapatita porosa. No
estudo não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos (BUCHOLZ et
al., 1987; BUCHOLZ et al., 1989).
A disponibilidade do material na forma de cimento aumentou as aplicações da
79
HA, devido ao aumento da resistência em compressão e à melhoria na capacidade
de preenchimento de defeitos ósseos. Estudos foram realizados avaliando o seu uso
no aumento ósseo no reparo de fraturas da metasínfise radial distal, platô tibial,
calcanhar, quadril e espinha (DE LONG et al., 2007). Um estudo envolvendo 40
pacientes com fratura radial distal mostrou que os pacientes tratados com o cimento
e imobilização mostraram um ganho mais rápido na presa e faixa de mobilidade
quando comparados com os pacientes com fixação externa (KOPYLOV et al., 1999;
LARSSON e BAUER, 2002).
A HA pode ser preparada em forma de dentes, particulada ou em pastas para
ser usada como reposição imediata de raízes dentárias após extrações para
minimizar a reabsorção do processo alveolar que ocorre após a perda dentária e
para manter a largura e a altura do rebordo (BLOCK e KENT, 1986; LEGEROS e
LEGEROS, 1993; ROTHAMEL et al., 2008).
A HA densa em bloco ou na forma particulada é usada no aumento do rebordo
alveolar para melhor adaptação da prótese total removível ou em cirurgias
ortopédicas (LEGEROS e LEGEROS, 1993).
A forma particulada também tem sido usada no preenchimento de defeitos
ósseos em cirurgias dentais e ortopédicas (KIM et al., 2006), como preenchimento
em associação com a colocação de implantes metálicos ou para o reparo de
implantes dentais metálicos que tiveram insucesso (LEGEROS e LEGEROS, 1993).
Busenlechner et al (2008) avaliaram um modelo de defeitos de uma parede em
mini porcos. Os materiais utilizados foram Bio-Oss
®
(osso bovino) e Ostim
®
(pasta
aquosa de nano HA sintética). Os resultados mostraram diferenças estatisticamente
significantes entre o grupo controle e os materiais, mas esta diferença não foi
observada entre os materiais analisados (BUSENLECHNER et al., 2008).
Durante as décadas de 80 e 90, Bonfield e colaboradores perceberam o
potencial do uso de fosfato de cálcio como um preenchimento em compósitos de
matriz polimérica e este desenvolvimento resultou em um movimento ocorreu para
melhorar o desempenho mecânico das cerâmicas de HA (BONFIELD et al., 1981).
Baseado no conceito de que a estrutura óssea inclui cristais minerais embutidos em
uma matriz de colágeno, um método para a extrusão de parafusos de compósitos
contendo matriz com alta densidade de polietileno e partículas de HA em escala
micrométrica distribuídas homogeneamente foram desenvolvidas. O material foi
80
desenvolvido com sucesso e comercializado com o nome HAPEX
®
e usado como
implante para o ouvido médio (BONFIELD et al., 1998; WANG et al., 2000).
Desde o início da década de 80, os cerâmicos bioativos têm sido empregados
no recobrimento de implantes ortopédicos metálicos, em locais que exigem uma
interface resistente com o osso (haste femoral e acetábulo em caso de fraturas de
fêmur e bacia, componentes tibial e femoral para articulações de joelho). Estes
sistemas são uma melhor alternativa em relação às próteses cimentadas,
especialmente para pacientes jovens e ativos (BEST et al., 2008; CHEVALIER e
GREMILLARD, 2008). Embora o recobrimento por plasma spray apresente sucesso,
às vezes sua espessura poder trazer problemas em relação à força de cisalhamento
interfacial entre o recobrimento e o substrato. Por esta razão, vários métodos de
recobrimento à baixa temperatura e com filmes finos foram investigados. Estas
técnicas incluem eletroforese, sol-gel, eletroquímica, biomimética, deposição por
vaporização eletrohidrodinâmica e recobrimento de apatitas tipo-osso através de
tratamento com solução que simula os fluidos corpóreos (BAUER e SMITH, 2002;
BEST et al., 2008).
O baixo custo e a facilidade de fabricação tornam os materiais cerâmicos
promissores para a liberação de fármacos (HNATYSZYN et al., 1994). A excelente
biocompatibilidade e a estrutura porosa da HA permite sua utilização como um
sistema implantável na liberação de hormônios (ZAFIRAU et al., 1996; GINEBRA et
al., 2006), antibióticos (CALHOUN e MADER, 1997; GINEBRA et al., 2006;
DESCAMPS et al., 2008), fármacos para o tratamento de câncer (YAPP et al., 1997;
ITOKAZU et al., 1998; GINEBRA et al., 2006), vacinas (WALDUCK et al., 1998) e
drogas para o tratamento da AIDS (DHILLON et al., 1998). Netz et al (2001)
avaliaram a técnica de gelcasting na produção da HA para ser utilizada como um
sistema liberador de fármacos e concluíram que a técnica permite a fabricação de
amostras com diferentes porosidades. As porosidades de 58,48 e 76,29% se
mostraram mais adequadas para serem utilizadas na liberação de drogas devido à
regularidade na sua microestrutura (NETZ et al., 2001).
81
2.4.2.3. DEGRADAÇÃO
Dois pontos devem ser lembrados na comparação da dissolução de um implante
de HA in vivo e in vitro. Primeiro, o processo de dissolução in vivo ocorre em um
sistema termodinâmico aberto, existe um fluxo constante dos fluidos corpóreos
através do implante. No sistema fechado, in vitro, a apatita atinge um equilíbrio com
os íons dissolvidos e que estão presentes na solução na qual o mineral está
inserido. No sistema aberto, o equilíbrio não é alcançado. Segundo, devido às
concentrações fisiológicas do Ca e P espera-se que ocorra precipitação e não
dissolução dos íons (VACANTI e VACANTI, 1994).
Fatores que afetam a solubilidade do material incluem: o método de preparo, o
grau de cristalinidade, a densidade e a extensão das substituições iônicas na rede
da apatita (NELSON, 1981; LEGEROS, 1991). Substituições iônicas quebram a
estrutura ou rede e alteram as propriedades de dissolução do material em solução.
O carbonato aumenta a solubilidade da apatita, enquanto o F
-
na rede da apatita
diminui sua solubilidade. Apatitas altamente cristalinas possuem solubilidade
relativamente mais elevada (FULMER et al., 2002).
A dissolução in vitro da HA também depende do tipo e da concentração das
soluções, se estas são tamponadas ou não, do pH, do grau de saturação da solução
e da relação sólido/solução (MORENO et al., 1977; LEGEROS e TUNG, 1983;
MARGOLIS e MORENO, 1992).
No caso da HA sintética, o grau de micro e macro porosidades, de defeitos na
estrutura e a quantidade e tipo de outras fases presentes também têm influência
significante. Para HA contendo outras fases de fosfato de cálcio, a extensão de
dissolução é afetada pelo tipo e quantidade de fases que não seja HA. A extensão
de dissolução decresce na seguinte ordem: Fosfato tetracálcico (TTCP) > Fosfato
tricálcico (α) (α-TCP) > Fosfato tricálcico (β) (β-TCP) > HA (LEGEROS e LEGEROS,
1993).
A dissolução da HA cristalina sintética não ocorre em sítios específicos, i.e., a
dissolução é observada tanto na superfície como no interior do cristal. Já na
dissolução de cristais de apatita biológica existe um sítio específico para esta
ocorrer, preferencialmente no interior do cristal (LEGEROS e LEGEROS, 1993).
82
Uma desvantagem da HA densa é sua mínima degradabilidade (HYAKUNA et
al., 1990). Idealmente, substitutos ósseos devem degradar à medida que a
resistência mecânica do sítio reconstruído é mantida. Uma maneira de lidar com
este problema é incorporar materiais biodegradáveis a HA (SO et al., 2006).
A hidroxiapatita e o fosfato tricálcico têm sido combinados em compósitos
bifásicos de fosfato de cálcio que apresentam uma taxa de reabsorção mais rápida
do que da hidroxiapatita pura (DE LONG et al., 2007).
So et al (2006) confeccionaram HA contendo partículas de vidro e compararam
com a HA pura. Em solução de SBF nenhuma diferença foi observada, mas em
solução salina, vários microporos puderam ser observados na superfície do material
de teste. Estes poros aumentaram em tamanho e se conectaram com os adjacentes
durante o período de observação (SO et al., 2006).
Dois mecanismos, mediados por células e dissolução, participam na
biodegradação e reabsorção da HA no organismo. A atividade de ambos está
diretamente relacionada com a área superficial do implante. Devido à pequena área
superficial, a HA densa apresenta taxas de degradação muito lentas. A HA porosa
pode apresentar grau de degradação significante (SHORS e HOLMES, 1993).
83
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Esta pesquisa foi dividida em duas etapas, uma in vitro e outra in vivo. Na parte
laboratorial, os materiais avaliados foram caracterizados com as técnicas
experimentais específicas para os materiais poliméricos e para os cerâmicos. Uma
degradação in vitro foi realizada para posterior comparação com os resultados in
vivo. Na etapa in vivo, os materiais avaliados laboratorialmente foram introduzidos
como enxertos ósseos em defeitos criados na calvária de coelhos. Após tempos
determinados, os enxertos foram retirados para posterior análise do osso
neoformado.
3.1. DESCRIÇÃO DAS FASES DO TRABALHO
Nesse estudo foram avaliados três tipos de materiais para enxerto ósseo, um
copolímero (poli (ácido L-lático-co-ácido D,L-lático)) e dois cerâmicos (biovidro e
hidroxiapatita). Os nomes comerciais, fabricantes e classe dos materiais que foram
usados são mostrados na TAB. 3.1. Todos os materiais foram submetidos a análises
in vitro e in vivo.
TAB. 3.1 Materiais avaliados na pesquisa.
Material Nome comercial Empresa Classe
Poli (ácido L-lático-
co-ácido D,L-lático)
Purasorb
®
(PLDLLA),
70L/30DL
Purac (Gorinchen –
Holanda)
Polímero
Biovidro 1 Material ainda em
teste não disponível
comercialmente.
Faculdade de
Engenharia Química
(USP – Lorena – Brasil)
Cerâmico
Biovidro 2 Biogran
®
3i Innovations do Brasil
(São Paulo – Brasil)
Cerâmico
Hidroxiapatita HAP – 91
®
JHS (Belo Horizonte –
Brasil)
Cerâmico
84
A composição percentual em peso do Biovidro 1 é de 52,75% de 3CaOP
2
O
5
,
30% de SiO
2
, 17,25% de MgO. Essa composição foi estudada por Oliveira et. al.
(1997) e apresenta total biocompatibilidade e elevada bioatividade (OLIVEIRA et al.,
1997). O Biovidro 2 é o biovidro desenvolvido por Hench e sua composição contém
45% de SiO
2
, 24,5% de Na
2
O, 24,4% de CaO e 6% de P
2
O
5
(HENCH e
ANDERSSON, 1993). A HA (Ca
10
[PO
4
]
6
(OH)
2
utilizada foi uma HA porosa, cristalina,
biocompatível, de alta pureza e de razão molar Ca/P igual a 1,67 segundo o
fabricante (ELZ, 2006).
3.1.1. FASE IN VITRO
3.1.1.1. PROCESSAMENTO DA AMOSTRA
Após o recebimento do PLDLLA, parte dele foi transformada em pó com
partículas homogêneas para adequar o seu tamanho para utilização em enxertos
ósseos. A moagem criogênica foi o procedimento de escolha para redução do
tamanho das partículas (DE BOER e MAESSEN, 1980; KOGLIN et al., 1997;
KAMOGAWA et al., 2001; GOUVEIA et al., 2002; WILCZEK et al., 2004; SANTOS
JR et al., 2006) e foi realizada no Centro de Energia Nuclear da USP (Piracicaba,
Brasil). Para isso foi utilizado o Moinho Criogênico 6800 (SPEX CertiPrep, Nova
Jérsei, EUA) (FIG. 3.1), um aparelho de moagem por impacto com barras
magnéticas (FIG. 3.2).
O material foi colocado em um tubo de policarbonato com uma barra
ferromagnética de aço inoxidável em seu interior. Posteriormente, esse tubo foi
vedado com tampas também de aço inoxidável (FIG. 3.3).
O tubo foi colocado no moinho criogênico (FIG. 3.4) para moagem do material,
sendo o sistema resfriado a –196
o
C com nitrogênio líquido, que foi pré-congelado
por cinco minutos e depois três ciclos de moagem de quatro minutos foram
realizados para redução e homogeneização do tamanho das partículas de PLDLLA
(FIG. 3.5).
85
FIG. 3.1 Moinho criogênico de moagem por impacto com barras magnéticas.
FIG. 3.2 Conjunto de moagem utilizado nos moinhos de moagem por impacto
com barras magnéticas.
FIG. 3.3 Tubo de policarbonato montado com o material no seu interior.
86
FIG. 3.4 Tubo posicionado dentro do moinho criogênico.
FIG. 3.5 PLDLLA: (a) antes e (b) depois da moagem.
Os demais materiais foram utilizados como recebido e são mostrados nas FIG.s
3.6, 3.7 e 3.8. Nenhum preparo adicional foi realizado.
FIG. 3.6 Biovidro 1 (BG1): aspecto macroscópico do material.
87
FIG. 3.7 Biogran
®
(Biovidro 2 – BG2): (a) apresentação comercial; (b) aspecto
macroscópico do material.
FIG. 3.8 HAP – 91
®
(Hidroxiapatita – HAP): (a) apresentação comercial; (b)
aspecto macroscópico do material.
3.1.1.2. DEGRADAÇÃO DA AMOSTRA
O PLDLLA como recebido e após a moagem, ambos os biovidros e a
hidroxiapatita foram colocados em tubos de polipropileno Tipo Falcon de fundo
cônico com capacidade de 50 mL (TPP, Trasadingen, Suíça) em solução de SBF
(simulated body fluid) a 37
o
C para a degradação, que foi realizada no Laboratório de
Biomateriais do IME (Rio de Janeiro, Brasil). A solução de SBF tinha o pH de 7,40
com concentrações de íons equivalente àquelas encontradas no plasma sangüíneo
humano (Na
+
= 142,0; K
+
= 5,0; Ca
2+
= 2,5; Mg
2+
= 1,5; Cl
-
= 147,8; [HCO
3
]
-
= 1,0; e
88
SO
4
2-
= 0,5 mM) (KOKUBO et al., 1990; KOKUBO e TAKADAMA, 2006). Os
materiais foram submersos em relação solução / volume de material de 5:1. Após
30, 60 e 90 dias na solução, as amostras foram lavadas com água destilada durante
10 minutos e secas com filtro de papel. A classificação das amostras é mostrada na
TAB. 3.2 e as seguintes técnicas experimentais foram utilizadas para caracterização
dos materiais: Determinação do Tamanho das Partículas (PSD – Particle Size
Distribution), Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM – Scanning Electron
Microscopy), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC – Differential Scanning
Calorimetry), Análise Termogravimétrica (TGA – Thermogravimetry Analysis),
Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR – Fourier
Transform Infrared Spectroscopy), Difração de Raios X (XRD – X-Ray Diffraction) e
Cromatografia por Permeação em Gel (GPC – Gel Permeation Chromatography),
todas respeitando os tempos de degradação in vitro.
TAB. 3.2 Divisão dos grupos das amostras imersas em SBF.
PLDLLA Tempos
Como
recebido
Após
moagem
BG1
BG2
HAP
0 dia A1 A5 B1 C1 D1
30 dias A2 A6 B2 C2 D2
60 dias A3 A7 B3 C3 D3
90 dias A4 A8 B4 C4 D4
* A – PLDLLA; B – Biovidro 1; C – Biovidro 2; D – Hidroxiapatita.
3.1.1.3. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS (PSD)
Para todos os materiais determinou-se a distribuição de tamanho das partículas.
Para tal uma pequena quantidade de grânulos dos materiais foi espalhada sobre um
tecido preto. As amostras foram observadas em microscopia óptica (Zeiss Stemi
2000-C, Alemanha) com aumento de 10 vezes e ao todo 15 imagens de campos
diferentes de cada amostra foram captadas por uma câmera digital (PixeLink, PL-
A662, Canadá) (FIG. 3.9). As imagens foram adquiridas no Laboratório de
Microscopia do Departamento de Ciência dos Materiais do IME (Rio de Janeiro,
89
Brasil).
FIG. 3.9 (a) PLDLLA antes da moagem (aumento de 10x); (b) PLDLLA após a
moagem (aumento de 10x); (c) Biovidro 1 (BG1) (aumento de 10x); (d) Biogran
®
(Biovidro 2 – BG2) (aumento de 10x); (e) HAP – 91
®
(Hidroxiapatita – HAP)
(aumento de 10x).
Uma rotina específica de análise de imagem foi desenvolvida utilizando o
software KS400 (Carl Zeiss Vision, Alemanha). A rotina seguiu uma seqüência típica
de aquisição, pré-processamento, segmentação, pós-processamento e medição
90
(PACIORNIK e MAURICIO, 2004). A análise das imagens foi realizada no
Laboratório de Processamento de Imagens Digital da PUC – Rio (Rio de Janeiro,
Brasil).
Na etapa de pré-processamento um filtro passa alta foi utilizado para corrigir a
iluminação não uniforme. As partículas foram diferenciadas pelo seu brilho em um
procedimento de segmentação por limiar típico. Entretanto, as imagens binárias
resultantes das segmentações apresentaram vários artefatos, tais como: vazios nas
partículas, objetos espúrios ao fundo, e partículas que se uniam ou com contorno
indefinido. Esses artefatos foram corrigidos na etapa de pós-processamento. As
pequenas partículas espúrias foram descartadas através de um limiar de tamanho.
Os vazios foram eliminados invertendo a imagem binária, usando um limiar
separador de tamanho e invertendo novamente o resultado. Esse procedimento
forneceu um melhor controle da eliminação de vazios do que a função
“preenchimento de vazios” que poderia tratar como vazios as pequenas regiões ao
redor de partículas em contato. O método divisor de águas (watershed) foi utilizado
para separar as partículas em contato ou que parcialmente se encobriam.
Evidentemente, se a superposição fosse substancial, o contorno detectado seria
uma aproximação do verdadeiro contorno da partícula. Como as etapas de pós-
processamento não foram capazes de corrigir todos os defeitos, uma condição de
tamanho e forma foi aplicada à imagem final para eliminar regiões imperfeitas que
poderiam comprometer a medição das partículas relevantes. Dessa forma, as
partículas maiores que a média e/ou aquelas que apresentavam uma forma anormal
foram descartadas.
Finalmente, o diâmetro equivalente circular (ECD) de cada partícula foi medido.
O diâmetro foi obtido supondo um círculo com a mesma área da partícula. Embora a
maioria das partículas não fosse circular, o ECD pode ser interpretado como o
diâmetro médio.
Histogramas de tamanho de partículas e curvas de distribuições cumulativas
revelando o tamanho de partícula em 10%, 50% e 90% do volume total foram
gerados.
91
3.1.1.4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Todos os materiais foram observados no microscópio eletrônico de varredura. A
amostra de cada material recebeu três camadas de ouro em uma câmara a vácuo
(Balzers Union Sputtering Device, Principado de Liechtenstein) para torná-lo
condutor, então foi levado ao microscópio eletrônico de varredura JEOL JLM 5800
(Tóquio, Japão) utilizando-se um feixe de 20 kV. As amostras foram analisadas no
Laboratório de Microscopia do Departamento de Ciência dos Materiais do IME (Rio
de Janeiro, Brasil) com aumentos entre 27 e 2.000 vezes para avaliar o tamanho das
partículas, o acabamento superficial antes da imersão em SBF, bem como a
degradação sofrida após imersão na solução.
3.1.1.5. CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC)
Com este ensaio objetivou-se identificar a temperatura de transição vítrea (T
g
), a
temperatura de fusão (T
m
) e o calor específico (c) para avaliar o grau de
cristalinidade do copolímero. Cinco amostras de aproximadamente 5 mg do PLDLLA
antes e após a moagem no estado como recebido e de 30, 60 e 90 dias em solução
de SBF foram colocadas em um cadinho de alumínio para análise térmica no
equipamento SHIMADZU DSC 50 (Kyoto, Japão), calibrado com índio, tendo um
sistema computadorizado de análise, de acordo com a norma ASTM D3417
[NORMA ASTM D3417-99]. A atmosfera de nitrogênio foi usada com fluxo de
20,00 ml/min. A temperatura inicial da análise foi a temperatura ambiente, que foi
aumentada em uma taxa de 10
o
C/min atingindo uma temperatura final de 320
o
C. A
análise térmica foi realizada na Seção de Engenharia Química do IME (Rio de
Janeiro, Brasil).
92
3.1.1.6. ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA)
A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada em um equipamento Shimadzu
modelo TGA-50 (Kyoto, Japão) controlado por computado, dispondo de um par
termoelétrico de cromel-alumel. A calibração do termopar foi executada com alumel
(T
m
= 163
º
C), níquel (T
m
= 354
º
C) e perkalloy (T
m
= 596
º
C). Cinco amostras de
aproximadamente 5 mg do PLDLLA, antes e após a moagem, no estado como
recebido e após 90 dias de imersão em solução de SBF, foram colocadas em
cadinhos de platina e submetidas, sob nitrogênio, a um ciclo de aquecimento com a
temperatura variando de 30
º
C até 500
º
C, na razão de aquecimento de 20
º
C/min.
Determinou-se a menor temperatura em que pode ser detectada o início da variação
de massa da amostra (onset) e a perda de massa total para cada grupo de
avaliação. A análise térmica foi realizada na Seção de Engenharia Química do IME
(Rio de Janeiro, Brasil).
3.1.1.7. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER (FTIR)
O PLDLLA antes e após a moagem no estado como recebido e após 30, 60 e 90
dias em solução de SBF foi diluído em 3 a 4 gotas de clorofórmio para obtenção de
um filme. Essa solução foi vazada sobre uma célula de KBr aguardando a
evaporação do clorofórmio. Após obtenção desse filme a espectroscopia no
infravermelho por Transformada de Fourier foi realizada no Instituto de
Macromoléculas da UFRJ (Rio de Janeiro, Brasil) no equipamento Perkin-Elmer
1720X – Infrared Fourier Transform Spectrometer (Massachusetts, USA) visando
determinar os grupos funcionais do material, as moléculas, assim como os grupos
de átomos. Os espectros foram coletados à temperatura ambiente com uma
resolução nominal de 2,00 cm
-1
e o número de varreduras foi de 20. Os espectros
foram registrados na faixa de 400 – 4000 cm
-1
.
93
A análise do Biovidro 1, Biovidro 2 e hidroxiapatita por espectroscopia no
infravermelho por Transformada de Fourier foi realizada no Laboratório de
Biomateriais e Biomimética da Faculdade de Odontologia da NYU (Nova York, EUA)
no equipamento Magna-IR 550 Spectrometer Series II (Nicolet, Madison, WI, USA).
Um miligrama de cada amostra (BG1, BG2 e HAP no estado como recebido, 30, 60
e 90 dias em solução de SBF) foi misturado em 250 mg de KBr. Após a mistura, uma
pastilha foi confeccionada para análise. A pastilha de KBr e do material foi
posicionada no equipamento e os espectros foram coletados à temperatura
ambiente com uma resolução nominal de 4,00 cm
-1
e número de varreduras foi de
1000. Os espectros foram registrados na faixa de 400 – 4000 cm
-1
.
3.1.1.8. DIFRAÇÃO DE RAIOS X (DRX)
Difratogramas dos pós do PLDLLA após a moagem, BG1, BG2 e HAP no estado
como recebido e após 30, 60 e 90 dias em solução de SBF foram obtidos, utilizando
radiação Cu-K
α1
, com filtro de Ni, tensão de 40 kV, corrente de 30 mA, varredura
entre 20
o
e 85
o
(2θ), e passo angular de 0,05
o
com 2 s de contagem por ponto. As
medidas foram realizadas no laboratório de difratometria de raios X do
Departamento de Engenharia dos Materiais da Escola de Engenharia de Lorena da
USP (Lorena, Brasil) utilizando o Difratômetro de raios-X, XRD-6000 Lab X,
Shimadzu (Kyoto, Japão). A identificação dos picos foi realizada comparando os
difratogramas com os padrões do Joint Committee on Powder Diffraction Standard
(JCPDS) da ASTM.
3.1.1.9. CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL (GPC)
Para acompanhar a degradação do PLDLLA antes e após a moagem no estado
como recebido e após 30, 60 e 90 dias em solução de SBF foram determinadas a
94
massa molar média através da técnica de GPC. Para isso três amostras de
aproximadamente 4 mg de cada grupo foram utilizadas. Após a pesagem, cada
amostra foi solubilizada em 0,3 mL de clorofórmio (CHCl
3
), para então ser acrescido
tetrahidrofurano (THF) até completar um volume total de 2 ml (0,2% P/V).
Após duas horas, os 2 mL de cada solução (material + CHCl
3
+ THF) foram
filtrados em filtros de teflon 0,45 mesh. Após a filtragem, 0,5 mL de cada solução foi
injetado a temperatura ambiente no equipamento Water™ 150-CV plus Gel
Permeation Chromatograph (Waters Corp, Milford, Massachusetts, EUA), equipado
com as colunas 50A (Phenomenex, Utrecht, Holanda) e Styragel HR4 (Waters Corp,
Milford, Massachusetts, EUA), bem como um detector refratométrico diferencial do
Instituto de Macromoléculas da UFRJ (Rio de Janeiro, Brasil). O THF foi usado como
eluente numa taxa de 1,0 mL/min e os pesos moleculares foram calibrados com
padrão de poliestireno (Tosoh Corp, Tóquio, Japão).
3.1.2. FASE IN VIVO
3.1.2.1. DESCRIÇÃO CIRÚRGICA
Trinta e seis coelhos machos jovens de aproximadamente 5 meses de idade, o
que corresponde à faixa de adulto jovem, apresentando, em média, 3,2 kgf, da raça
Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus) e boas condições de saúde foram
selecionados para a realização da pesquisa (FIG. 3.10) (MACNEILL et al., 1999;
HOLY et al., 2000; RIMONDINI et al., 2005). Os mesmos foram igualmente divididos
em três grupos experimentais correspondentes a 30, 60 e 90 dias.
Na calvária de cada um, foram confeccionados três defeitos ósseos de tamanho
crítico de 8,0 mm de diâmetro (FIG. 11) (HOLY et al., 2000). Cada defeito foi
preenchido com um determinado tipo de material, sendo eles: PLDLLA; o compósito
confeccionado pela mistura de PLDLLA e o Biovidro 1, na proporção de 1:1;
Biovidro 1, Biovidro 2; Hidroxiapatita e coágulo sangüíneo (grupo controle)
(TAB. 3.3). Algumas gotas de soro fisiológico foram adicionadas aos diferentes
95
materiais para torná-los uma pasta facilitando sua inserção no defeito.
O protocolo de experimentação animal foi aprovado pela Comissão de Avaliação
do Uso de Animais em Pesquisa (CAUAP) do Centro de Ciências da Saúde (CCS)
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), por estar de acordo com as
recomendações éticas e legais do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA).
Os animais passaram pelo período de aclimatação de 40 dias, sendo
submetidos à avaliação sistêmica de um médico veterinário. Durante o experimento,
foram mantidos no Biotério do Departamento de Microbiologia do CCS da UFRJ (Rio
de Janeiro, Brasil); tendo sido alocados em gaiolas individuais, forradas com raspas
de madeira, trocadas duas vezes por semana, o que lhes proporcionou condições
sanitárias adequadas. A dieta foi mantida à base de ração apropriada para coelhos
(Pellets para coelhos, Purina
®
) e água ad libitum. Assim que chegaram ao Biotério,
todos os animais foram pesados em balança digital para controle inicial do peso
corporal.
FIG. 3.10 Coelho macho Nova Zelândia com aproximadamente 3,2 kgf.
96
FIG. 3.11 Crânio do coelho com localização dos defeitos cirúrgicos.
TAB. 3.3 Divisão dos grupos.
Grupos
Número de coelhos Descrição
6 defeitos PLDLLA
6 defeitos PLDLLA + Biovidro 1
6 coelhos
6 defeitos Biovidro 1
6 defeitos Biovidro 2
6 defeitos Hidroxiapatita
1
30 dias
12
6 coelhos
6 defeitos Controle
6 defeitos PLDLLA
6 defeitos PLDLLA + Biovidro 1
6 coelhos
6 defeitos Biovidro 1
6 defeitos Biovidro 2
6 defeitos Hidroxiapatita
2
60 dias
12
6 coelhos
6 defeitos Controle
6 defeitos PLDLLA
6 defeitos PLDLLA + Biovidro 1
6 coelhos
6 defeitos Biovidro 1
6 defeitos Biovidro 2
6 defeitos Hidroxiapatita
3
90 dias
12
6 coelhos
6 defeitos Controle
Após o período de ambientação, os animais foram anestesiados com soluções
intramusculares de 50 mg/kg de cloridrato de quetamina a 5% (Vetanarcol, König,
Santana de Parnaíba, Brasil) e 5 mg/kg de cloridrato de xilazina a 2% (Kensol,
König, Santana de Parnaíba, Brasil) em passo único. Com os animais já sedados,
97
uma higienização com iodopovidona a 10% em solução aquosa com 1% de iodo
ativo (PVPI) e água foi realizada entre as orelhas para posterior execução da
tricotomia (FIG. 3.12). Os animais foram posicionados em decúbito ventral sobre a
mesa cirúrgica (FIG. 3.13) e uma anti-sepsia epitelial com solução de álcool iodado
10% na região a ser operada foi realizada.
Para a realização do ato cirúrgico, seguiu-se o mesmo protocolo para todos os
animais. Para promover hemostasia local foi administrado em ambiente estéril o
anestésico local cloridrato de lidocaína a 3% com bitartarato de norepinefrina
1:50.000 (Lidostesim 3%, Dentsply, Probem Laboratório de Produtos Farmacêuticos
e Odontológicos S/A, Catanduva, Brasil). Uma incisão de aproximadamente 3,5 cm,
com lâmina de bisturi número 10, foi realizada na pele até a exposição do periósteo,
que também foi incisionado. Depois o periósteo foi afastado expondo assim
completamente o sítio ósseo de eleição (FIG. 3.14).
FIG. 3.12 (a) Higienização com iodopovidona. (b) Tricotomia na região da
incisão. (c) Aspecto final após tricotomia.
FIG. 3.13 Posicionamento do animal em decúbito ventral.
98
FIG. 3.14 (a) Incisão de aproximadamente 3,5 cm na pele. (b) Após exposição
do periósteo, incisão do mesmo. (c) Exposição do sítio ósseo eleito para cirurgia.
Sob constante irrigação com solução de cloreto de sódio (NaCl 0,9%) para
minimizar o aquecimento e remover o debri formado, o defeito ósseo foi realizado
em baixa rotação com uma trefina com 8,0 mm de diâmetro (FIG. 3.15) tomando-se
o cuidado de não romper a dura-máter (SCHMITZ e HOLLINGER, 1986)
removendo-se completamente o osso da calota craniana. Após a criação do defeito
o mesmo foi preenchido com cada um dos materiais em questão (FIG. 3.16). Os
animais dos grupos controles não receberam material algum, o defeito foi
preenchido apenas com coágulo sanguíneo.
FIG. 3.15 Trefina usada para confecção do defeito.
O fechamento do sítio cirúrgico foi realizado em duas etapas: primeiro o
periósteo foi suturado com fio reabsorvível de poli (ácido glicólico) (4-0). Em
segundo ato, procedeu-se a sutura do tecido epitelial com fios de nylon (4-0) e
posteriormente nova anti-sepsia com solução de álcool iodado 10% (FIG. 3.17).
99
FIG. 3.16 (a) Criação dos defeitos ósseos cirúrgicos sob constante irrigação; (b)
remoção do fragmento ósseo; (c) conferência da integridade da dura-máter; (d) os
três defeitos criados; (e) fragmentos ósseos removidos; (f) preenchimento dos
defeitos com os respectivos materiais.
FIG. 3.17 (a) Sutura do periósteo com fio reabsorvível de poli (ácido glicólico) (4-
0); (b) sutura do tecido epitelial com fios de nylon (4-0).
100
Ao final dos procedimentos, foram administrados 1,0 mL de benzilpenicilina
benzatina 1.200.000 U (Benzetacil, Eurofarma Laboratórios LTDA, São Paulo, Brasil)
intramuscular em dose única e 1,1 mg/kg do antiinflamatório veterinário flunixina
neglumina a 1% (Banamine injetável, Schering-Plough, Rio de Janeiro, Brasil) por
via sub-cutânea a cada 24 horas durante 3 dias, para prevenir infecção e dor pós-
operatória.
Os animais foram mantidos em observação até completa recuperação
anestésica. Posteriormente, foram encaminhados às suas gaiolas e mantidos com
água ad libitum, e refeição normal após 12 horas de pós-cirúrgico.
O cálculo da dosagem dos anestésicos e medicamentos foi realizado em função
do peso corporal de cada animal, tomado imediatamente antes de sua respectiva
cirurgia. Para esta finalidade todos os animais foram pesados seguindo-se o mesmo
critério adotado para este registro no início do período de aclimatação.
A eutanásia foi realizada decorridos os períodos de 30, 60 e 90 dias e foi
procedida após pesagem e anestesia dos animais, segundo o mesmo protocolo
utilizado para a cirurgia. Constatando-se a ausência de reflexo motor e corneano,
realizou-se punção intracardíaca e injeção de 10 mg/kg de cloreto de potássio a 10%
(aproximadamente 4,0 mL). Imediatamente, iniciou-se o preparo das peças
anatômicas com a dissecação da pele e do periósteo da calota craniana e, a seguir,
osteotomia, com auxílio de disco diamantado dupla face cuidando-se para deixar
margem de segurança de, aproximadamente, 1,0 mm ao redor dos defeitos ósseos
(FIG 3.18 a e b). Os espécimes ósseos foram colhidos e imediatamente imersos em
solução fixadora de paraformaldeído 4% (PBS), pelo período de 24 horas.
FIG. 3.18 (a) Fotografia ilustrando a osteotomia inicial; (b) individualização dos
sítios cirúrgicos.
101
3.1.2.2. MARCADORES ÓSSEOS
Para avaliação do remodelamento ósseo durante o período de cicatrização foi
realizado um protocolo seqüencial de marcadores ósseos. A administração
seqüencial de marcadores ósseos permite que o pesquisador acompanhe a direção
e a localização topográfica da nova formação óssea. Durante o processo de
mineralização, os marcadores fluorescentes são incorporados no fronte de
mineralização por quelação (KNÖFLER et al., 1990).
Durante o período experimental, dois animais de cada grupo receberam os
seguintes marcadores ósseos: oxitetraciclina (Ourotetra L.A., Ouro Fino
Agronegócios, Cravinhos, São Paulo, Brasil), complexo alizarina (Sigma, Buchs,
Suíça), azul de calceína (Fluka, Buchs, Suíça) e xilenol laranja (Sigma, Buchs,
Suíça), para visualizar o aspecto de mineralização do tecido ósseo neoformado nos
sítios cirúrgicos controles e experimentais. Foi realizada injeção intramuscular
dessas substâncias no aspecto posterior da pata traseira, nas dosagens indicadas
na TAB. 3.4. Os marcadores, exceto a oxitetraciclina foram administrados em
solução de NaHCO
3
2% (NKENK et al., 2002; VEHOF et al., 2002). A seqüência de
administração dos marcadores ósseos é apresentada na TAB. 3.5.
TAB. 3.4 Dosagem de aplicação dos marcadores ósseos utilizados no experimento.
CORANTE DOSAGEM
Oxitetraciclina (OXI) 15 mg/kg
Complexo Alizarina (ALI) 30 mg/kg
Azul de Calceína (CAL) 30 mg/kg
Xilenol Laranja (XIL) 90 mg/kg
102
TAB. 3.5 Seqüência de administração dos marcadores ósseos durante o período
experimental.
Dias
Grupos
0
2 7 14 23 28 30 46 60 64 90
30 dias Ø
OXI ALI CAL XIL Ø
60 dias Ø
OXI
ALI CAL XIL Ø
90 dias Ø
OXI OXI ALI CAL XIL Ø
Ø = cirurgia, OXI = oxitetraciclina, ALI = complexo alizarina, CAL = Azul de calceína, XIL = xilenol
laranja, Ø = eutanásia.
3.1.2.3. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Após fixação durante 24 horas em paraformaldeído 4%, preparada com solução
tampão de fosfato de sódio 0,9%, 0,1 M e pH 7,2 (PBS), três amostras de cada
grupo foram imersas em PBS por 10 minutos. O processo de imersão foi repetido
pelo mesmo intervalo de tempo em nova solução. Ao todo 216 espécimes foram
obtidos. Os tecidos moles ainda presentes foram então cuidadosamente removidos
(HADDAD, 1998).
As amostras foram desidratadas inicialmente em solução de álcool etílico a 50%
durante 30 minutos. A desidratação seguiu com imersão total em soluções de álcool
de porcentagem crescente (70, 80 e 90%) por 30 minutos. Em seguida, a imersão
em álcool anidro (PA) foi realizada por duas vezes com tempo de 30 minutos cada.
O processo de desidratação foi realizado no Laboratório de Biomineralização do
Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ.
As amostras foram secas até a obtenção do ponto crítico, permitindo completa
remoção de remanescentes hídricos em meio rico em CO
2
gasoso e sob alta
pressão. O processo de secagem até obtenção do ponto crítico (BAL-TEC CPD 030
Critical Point Dryer, Schalksmühle, Alemanha) envolveu a substituição do etanol por
CO
2
líquido em baixa temperatura em câmara fechada e foi realizado no
Departamento de Microbiologia da UFRJ. O processo de secagem se iniciou em
P = 50 bar e T = 10
o
C, e o ponto crítico foi de P = 73,8 bar e T = 31
o
C. Sob estas
103
condições, o CO2 líquido foi sublimado e eliminado com mínima deformação da
amostra.
As peças foram clivadas no Laboratório de Biomineralização do Instituto de
Ciências Biomédicas da UFRJ em quatro partes utilizando uma lâmina e um martelo
odontológico (SSWhite Duflex, Rio de Janeiro, Brasil). Assim, a amostra final
consistiu de um quarto de um círculo, compreendendo tecido ósseo neoformado e
tecido ósseo antigo (FIG. 3.19).
FIG. 3.19 Ilustração de como o corte da amostra foi realizado.
Os fragmentos ósseos foram posicionados nos suportes do microscópio
eletrônico de varredura de tal forma que a face interna, a face externa e o corte
sagital da amostra pudessem ser observados. Os fragmentos receberam três
camadas de ouro (EMITECH K650, Kent, Reino Unido). Em seguida, avaliações
morfológicas da reorganização e neo-formação tecidual foram realizadas usando o
microscópio eletrônico de varredura HITACHI S3500N (Japão) do Departamento de
Biomateriais e Biomimética da Faculdade de Odontologia da NYU (Nova York, EUA)
com voltagem de 15 kV. As análises foram realizadas com magnificações de 50 até
3.000x.
104
3.1.2.4. PREPARO HISTOLÓGICO
3.1.2.4.1. EMBUTIMENTO DAS AMOSTRAS
Duas peças de cada grupo foram preparadas para as análises histológicas
totalizando 36 amostras. Os blocos ósseos foram submetidos às mesmas etapas de
desidratação procedidas para as amostras destinadas à microscopia eletrônica de
varredura, até a imersão em álcool absoluto. As amostras foram incluídas em poli
(metacrilato de metila) (Technovit 7100, Haerous Kulzer, Hanau, Alemanha) no
Laboratório de Biomineralização do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ.
Inicialmente, uma pré-infiltração foi realizada com solução de metacrilato e
etanol em parte iguais por duas horas a temperatura ambiente, para então a
infiltração ser realizada.
A solução de infiltração foi preparada com 100 mL de resina acrescida de um
grama de hardner 1 (Technovit 7100, Haerous Kulzer, Hanau, Alemanha). Cada
amostra foi infiltrada por 12 horas, por imersão total nesta solução. Posteriormente,
as amostras foram incluídas em solução composta por 1 mL de hardner 2 (Technovit
7100, Haerous Kulzer, Hanau, Alemanha) para cada 15 mL de solução de infiltração.
O suporte para inclusão foi confeccionado em alumínio, consistindo em um bloco
retangular com oito cavidades em formato também retangular e com bordas
arredondadas (FIG. 3.20a). A base do dispositivo era unida ao corpo por seis
parafusos de modo que fosse removível (FIG. 3.20b), facilitando a retirada das
amostras após a polimerização.
Em todo o dispositivo foi aplicada uma fina camada de vaselina em pasta com
auxílio de um pincel e as peças foram dispostas de modo que a face externa do
osso da calvária ficasse voltada para o fundo do suporte.
A solução de inclusão foi adicionada em volume aproximado de 3,0 mL por
cavidade do dispositivo, onde permaneceram em processo de polimerização por
2 horas. Após esse período os blocos de resina com cada amostra embutida foram
removidos do suporte (FIG. 3.21).
105
FIG. 3.20 Suporte de alumínio utilizado para embutir as peças: (a) montado e (b)
desmontado.
FIG. 3.21 Amostra embutida no bloco de poli (metacrilato de metila).
3.1.2.4.2. MONTAGEM DAS AMOSTRAS NAS LÂMINAS PARA HISTOLOGIA
O preparo das lâminas para histologia foi realizado no Departamento de
Biomateriais e Biomimética da Faculdade de Odontologia da NYU (Nova York, EUA).
Inicialmente, o bloco de poli (metacrilato de metila) com a amostra foi preso no
suporte e o conjunto foi fixado à máquina para corte das amostras (Low Speed Saw
Isomet, Buelher Ldt., Lake Bluff, EUA) de tal forma que o defeito ósseo pudesse ser
visualizado. O bloco foi posicionado de tal maneira que a resina foi cortada primeiro.
O corte foi realizado no meio do defeito (FIG. 3.22).
106
FIG. 3.22 (a) Conjunto amostra e suporte preso na máquina para o corte. (b)
Amostra cortada no meio.
Para o corte, foi utilizada a lâmina de 4 polegadas (Diamond Wafering Blade,
Series 15HC Diamond, Arbor Size ½” 12,7 mm, 4” Dia x 0.0012”, 10,2 cm x 0,3 mm,
Buelher Ldt., Lake Bluff, EUA). O meio utilizado para o corte da resina Technovit
7100 (Haerous Kulzer, Hanau, Alemanha) foi o etileno glicol. A lâmina foi mantida
sempre sob irrigação.
Após a divisão da amostra em dois blocos, a face que ficou em contato com a
lâmina foi polida com lixa d’água (240, 320, 400, 600 e 1200) (Handimet 2 – Roll
Grinder, Buelher Ldt., Lake Bluff, EUA) usando o etileno glicol como meio para
manter a amostra sempre úmida. Todas as vezes que a lixa foi trocada, a amostra
foi lavada com etileno glicol. Após a última lixa a amostra foi novamente lavada com
etileno glicol e seca com papel toalha.
Com a amostra já polida e seca, uma pequena camada da cola Instant Krazy
Glue
®
(etil cianoacrilato, Columbus, Ohio, EUA) foi aplicada na lâmina de histologia e
na amostra seguida pela prensagem uma contra a outra. Em seguida, um peso foi
colocado sobre a amostra para que a mesma ficasse bem aderida à lâmina de
histologia (FIG. 3.23).
Após 24 horas o conjunto, lâmina e amostra, foi fixado com cera pegajosa em
um suporte próprio para prender a lâmina de vidro. Esse novo conjunto, suporte,
lâmina e amostra, foi preso à máquina para corte de amostras mineralizadas. O
micrometro da máquina foi ajustado de forma a obter cortes de 1 mm (FIG. 3.24).
107
FIG. 3.23 (a) e (c) Amostra colada na lâmina de histologia. (b) e (d) Amostra com
o peso sobre a mesma.
FIG. 3.24 (a) Conjunto suporte, lâmina e amostra preso à máquina. (b) Lâmina
posicionada para um corte da amostra de 1 mm de espessura.
108
O polimento final foi feito da mesma forma que o polimento inicial. Para finalizar
o polimento, um disco de nylon e uma suspensão de 1,0 µm de diamante (Buehler
Metadi Diamond Suspension, No. 40-6528, Buelher Ldt., Lake Bluff, EUA) e etileno
glicol na polidora automática (Ecomet 3, Buelher Ldt., Lake Bluff, EUA) com uma
rotação de 100 rpm. O espécime final ficou com aproximadamente 30 µm de
espessura.
Após o polimento do espécime, a lâmina para análise foi lavada com etileno
glicol para remoção da suspensão de diamante. Então, a mesma foi seca com lenço
de papel tomando cuidado de não arranhar a amostra. A lâmina histológica pronta
foi guardada em embalagem própria sem contato com a luz para os marcadores não
serem perdidos. Setenta e duas lâminas histológicas foram obtidas ao final do
processo.
3.1.2.5. MICROSCOPIA ÓPTICA
3.1.2.5.1. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (MF)
Após o preparo das amostras, as mesmas foram analisadas em microscopia
óptica de fluorescência no Departamento de Biomateriais e Biomimética da
Faculdade de Odontologia da NYU (Nova York, EUA) utilizando o microscópio Leica
DM RXE (Wetzlar, Alemanha) com aumento de 10x. Filtro com comprimentos de
onda entre 450-490 nm (filtro azul) foi utilizado. Fotografias digitais foram obtidas
(JVC, 3CCD, modelo KY-F55BE, Japão) de toda a lâmina e com auxílio do software
Syncroscopy Montage Explorer (Syncroscopy, Frederick, MD, EUA) as imagens
foram superpostas e fundidas, de tal forma que ao final, uma imagem igual ao que
se observava no microscópio fosse obtida.
Após a análise em microscopia de fluorescência as peças foram coradas em
azul de toluidina a 2% em água destilada para análise em microscopia de luz
transmitida.
109
3.1.2.5.2. MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA (MLT)
Após as lâminas serem coradas com azul de toluidina a 2% em água destilada,
as mesmas foram analisadas em microscopia de luz transmitida utilizando o
microscópio Leica DM RXE (Wetzlar, Alemanha) com aumento de 10x no
Departamento de Biomateriais e Biomimética da Faculdade de Odontologia da NYU
(Nova York, EUA). Fotografias digitais foram obtidas (JVC – 3CCD, modelo KY-
F55BE, Tóquio, Japão) de toda a lâmina e com auxílio do software Syncroscopy
Montage Explorer (Syncroscopy, Frederick, MD, EUA) as imagens foram
superpostas e fundidas, de tal forma que ao final, uma imagem igual ao que se
observava no microscópio fosse obtida.
3.1.2.6. MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µCT)
Após o embutimento dos espécimes ósseos em metacrilato (Technovit 7100,
Haerous Kulzer, Hanau, Alemanha) e antes dos blocos serem recortados para o
preparo das lâminas, a quantidade de preenchimento ósseo de uma amostra de
cada defeito foi examinada utilizando a microtomografia computadorizada (µCT)
(µCT 40, Scanco Medical, Basserdorf, Suíça) no Departamento de Biomateriais e
Biomimética da Faculdade de Odontologia da NYU (Nova York, EUA) com resolução
de 18 µm por corte. Ao todo 18 varreduras foram realizadas.
Aproximadamente 297 cortes de µCT foram feitos nas calvárias com nível de
energia de raios X de 70 kVp, e corrente de 114 µA. O tempo de integração foi de
150 ms com tempo total de varredura de 31,3 min. A reconstrução 3-D do osso da
calvaria foi feita com auxílio de template para delimitar a área do defeito.
110
3.1.2.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Nas análises onde n ≥ 3, análises descritivas foram calculadas separadamente
para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela Análise de
Variância, seguida pelo teste post hoc de Tukey nos casos em que a análise de
variância sugeriu diferença estatisticamente significante entre os grupos (p<0,05).
111
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. FASE IN VITRO
A resposta celular a materiais em forma de pó utilizados como enxerto ósseo
para regeneração óssea guiada é influenciada pela composição química do material
bem como pela topografia superficial. Desta forma, para o desenvolvimento de
materiais utilizados com esta finalidade, é crucial que as propriedades físico-
químicas dos materiais sejam controladas e caracterizadas em laboratório, antes da
realização de testes in vivo e clínicos. Devido a esta razão, uma seqüência de
ferramentas analíticas foram utilizadas para caracterização dos materiais, antes da
fase in vivo da pesquisa.
4.1.1. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS (PSD)
A distribuição de tamanho de partículas mostrou um padrão polimodal para os
cinco materiais. Os diâmetros médios foram 673,98 µm, 259,60 µm, 65,60 µm,
437,60 µm e 576,20 µm para o PLDLLA antes da moagem, PLDLLA depois da
moagem, BG1, BG2 e HAP, respectivamente. Observou-se diferença estatística
entre todos os materiais avaliados (p<0,05). Pode-se observar nas curvas de
distribuição cumulativa mostradas nas FIG.s 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 o tamanho médio
das partículas das amostras. Na TAB. 4.1 são apresentados os tamanhos médios
das partículas para 10%, 50% e 90% do volume total.
O tamanho das partículas e a distribuição dos poros são parâmetros importantes
na confecção de materiais para enxerto ósseo na forma de pó, uma vez que o
comportamento in vivo está relacionado com a capacidade do pó de preencher o
defeito, empacotamento e cinética de dissolução (HENCH e WILSON, 1993b).
112
FIG. 4.1 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do PLDLLA
antes da moagem.
FIG. 4.2 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do PLDLLA
depois da moagem.
113
FIG. 4.3 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do BG1.
FIG. 4.4 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas do BG2.
114
FIG. 4.5 Curva de distribuição cumulativa do tamanho das partículas da HAP.
TAB. 4.1 Diâmetros médios das partículas para diferentes volumes analisados.
Valores dos diâmetros obtidos (µm)
Quantidade de
amostras % vol
PLDLLA
antes da
moagem
PLDLLA
depois da
moagem
BG1
BG2
HAP
D 10% 500,00 19,05 17,65 354,54 376,92
D 50% 676,32 290,48 66,18 437,50 576,92
D 90% 847,37 461,90 114,71 525,00 769,23
4.1.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Uma micrografia do PLDLLA antes da moagem é apresentada na FIG. 4.6a (A1).
As partículas na FIG. 4.6a mostram regiões com morfologia lisa e granular. Após
30 dias em solução de SBF (A2), as partículas apresentaram um aumento das
irregularidades na superfície e regiões com uma configuração fibrosa, confirmando a
degradação inicial do material no meio (FIG. 4.6b). A FIG. 4.6c é representativa das
partículas antes da moagem após 60 dias em solução de SBF (A3). A parte granular
115
do material apresentou bordas arredondadas comparadas com as partículas sem
degradação (FIG. 4.6a). A porção lisa do polímero apresentou delaminações na
superfície (FIG. 4.6c). A morfologia da partícula após 90 dias em solução de SBF
(A4) pode ser observada na FIG. 4.6d. Níveis de degradação maiores foram
observados no grupo A4 quando comparados aos outros grupos. Nas superfícies
originalmente lisas, mas delaminações e irregularidades indicam a progressão da
degradação do material. O aparecimento de bolhas na superfície do material indica
que as camadas mais profundas foram expostas iniciando a degradação nessas
regiões. A porção granular manteve o mesmo padrão de degradação daquele
observado nos grupos A2 e A3 (FIG.s 4.6b e 4.6c).
FIG. 4.6 Micrografias do PLDLLA antes da moagem: (a) Como recebido (A1)
(100x) (detalhe 1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (A2) (100x) (detalhe
1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (A3) (100x) (detalhe 2.000x); (d) Após
90 dias em solução de SBF (A4) (100x) (detalhe 2.000x).
Após a moagem criogênica a superfície do material apresentou deformação
plástica (A5) (FIG. 4.7a). Entretanto, o material manteve a morfologia parcialmente
116
lisa com regiões rugosas como observada nas partículas antes da moagem
(FIG. 4.7a). As partículas após a moagem (A6) apresentaram superfícies lisas e
regiões com delaminações indicando a degradação após 30 dias em solução de
SBF (FIG. 4.7b). A FIG. 4.7c é representativa da morfologia da partícula após a
moagem após 60 dias em solução de SBF (A7). A superfície se mostrou mais
irregular e apresentou maior quantidade de trincas, indicando que o processo de
degradação estava mais avançado quando comparado com os grupos A5 e A6
(FIG.s 4.7a e 4.7b). Vazios indicando aumento da degradação do material foram
possíveis de se observar em maiores magnificações. As amostras que
permaneceram 90 dias em solução de SBF (A8) mostraram padrões de degradação
diferentes, as superfícies possuíam aparência globular (FIG. 4.7d). Conexões
fibrosas entre as irregularidades das partículas puderam ser observadas em maiores
magnificações (FIG. 4.7d).
FIG. 4.7 Micrografias do PLDLLA após a moagem: (a) Como recebido (A1)
(100x) (detalhe 1.500x); (b) Após 30 dias em solução de SBF (A2) (100x) (detalhe
1.500x); (c) Após 60 dias em solução de SBF (A3) (100x) (detalhe 1.500x); (d) Após
90 dias em solução de SBF (A4) (100x) (detalhe 1.500x).
117
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que a degradação do
PLDLLA antes e depois da moagem iniciou após 30 dias de imersão em solução de
SBF e que o processo continuou até os 90 dias. As imagens sugerem que a
degradação tenha se iniciado na região amorfa do polímero e resultando na
exposição de uma camada cristalina mais profunda (FIG.s 4.6 e 4.7), como descrito
anteriormente na literatura (RIBEIRO et al., 2005; LANDES et al., 2006).
A degradação observada no presente estudo não foi completa após 90 dias e foi
mais lenta do que a observada por Vert, o qual observou a degradação completa da
mistura 50:50 do ácido poli-L-lático e do ácido poli-D-lático após 60 dias em solução
de SBF (VERT et al., 1984). Possivelmente, a cinética de degradação mais
acelerada observada por Vert ocorreu devido à composição do copolímero utilizado
(VERT et al., 1984).
De acordo com Middleton e Tipton, a taxa de degradação depende da
quantidade de cada homopolímero L-lático e D-lático (MIDDLETON e TIPTON,
2000). O tempo de degradação do PLLA é muito maior quando comparado com o
PLDLA e requer mais de dois anos para ocorrer em humanos (BERGSMA, ROZEMA
et al., 1995). Em geral, aumentando a quantidade do homopolímero D-lático a
cinética de degradação do material aumenta, este comportamento está associado à
quantidade do homopolímero amorfo presente no copolímero. No presente estudo, a
mistura foi 70:30 poli (ácido L-lático) e poli (ácido DL-lático) e por esse motivo a
degradação ocorreu de forma mais lenta.
As micrografias do BG1 mostraram que o material como recebido possuía uma
superfície rugosa e a superfície se tornou lisa com o passar do tempo. Este
comportamento pode ser associado à maior energia das arestas presentes na
superfície (FIG.s 4.8a, 4.8b, 4.8c e 4.8d). A micrografia do BG1 (B1) como recebido
observada na FIG. 4.8a mostra que o material apresentou partículas de tamanhos
variados, desde partículas muito pequenas até outras de tamanho maiores. O
formato das partículas se mostrou irregular, não esférico. Este resultado está de
acordo com o de Blaker et al (2005) (BLAKER et al., 2005). Pode-se observar no
detalhe da FIG. 4.8a que a superfície do material era rugosa. Após 30 dias em
solução de SBF (B2) a superfície das partículas ficou mais lisa. Ainda foi possível
observar partículas com diversos tamanhos e formas (FIG. 4.8b). Esse padrão de
degradação do material se manteve após 60 dias (B3) imerso em solução de SBF
118
(FIG. 4.8c). Após 90 dias de imersão em solução de SBF (B4) observa-se que as
partículas menores não estavam mais presentes (FIG. 4.8d). A superfície do material
se apresentava mais lisa quando comparada com o material no estado como
recebido (FIG. 4.8d detalhe).
FIG. 4.8 Micrografias do BG1: (a) Como recebido (B1) (100x) (detalhe 1.500x);
(b) Após 30 dias em solução de SBF (B2) (100x) (detalhe 1.500x); (c) Após 60 dias
em solução de SBF (B3) (100x) (detalhe 1.500x); (d) Após 90 dias em solução de
SBF (B4) (100x) (detalhe 1.500x).
A micrografia do BG2 como recebido (C1) mostrou que o material apresenta sua
superfície levemente mais lisa quando comparado com o BG1 (B1) (FIG. 4.9a).
Pode-se também observar na FIG. 4.9a que o tamanho das partículas era mais
uniforme do que o do BG1, mas o formato das partículas também era irregular, não
esférico, como observado por Blaker et al (2005) (BLAKER et al., 2005). Após 30
dias em solução de SBF (C2), a superfície de algumas partículas apresentou
rachaduras em algumas regiões (ZHANG et al., 2008) e em outras pode-se observar
119
a degradação de uma das fases do material (FIG. 4.9b). Possivelmente, houve a
degradação da região amorfa, permanecendo a morfologia cristalina do material.
Este padrão de degradação se manteve nos grupos de 60 dias (C3) e 90 dias (C4)
em solução de SBF (FIG.s 4.9c e 4.9d).
FIG. 4.9 Micrografias do BG2: (a) Como recebido (C1) (100x) (detalhe 1.500x);
(b) Após 30 dias em solução de SBF (C2) (100x) (detalhe 1.500x); (c) Após 60 dias
em solução de SBF (C3) (100x) (detalhe 1.500x); (d) Após 90 dias em solução de
SBF (C4) (100x) (detalhe 1.500x).
O padrão de dissolução observado no presente estudo foi diferente daquele
observado por Li et al (2008) (LI et al., 2008). Neste caso, as superfícies de ambos
os materiais ficaram mais lisas e no relato da literatura, as mesmas ficaram mais
rugosas. As trincas observadas no BG2 podem ter aparecido devido a uma
concentração de tensões em locais específicos da partícula do BG2 e nestes pontos
observou-se uma dissolução preferencial, este resultado corrobora o descrito na
literatura (LI et al., 2008).
120
O tamanho das partículas do BG1 foi estatisticamente menor do que o das
partículas de BG2, isso aumenta a área superficial das partículas do BG1 em
contato com a solução de SBF. O volume da solução foi de 20 ml para todos os
materiais pesquisados e a relação partícula / volume de solução de 1/5. Como a
área de superfície do vidro em contato da solução é um fator que influencia no
mecanismo e na taxa de dissolução deste tipos de material cerâmico (CERRUTI, M.
G. et al., 2005), este fato explicaria porque as partículas menores do BG1 foram
desaparecendo gradualmente, possivelmente sendo dissolvidas, com o decorrer do
tempo de imersão. A taxa de dissolução é inversamente proporcional ao raio da
partícula (HENCH et al., 2002), quanto menor a partícula, maior a taxa de dissolução
da mesma.
O estudo de dissolução de materiais cerâmicos in vitro normalmente é realizado
em um sistema fechado, onde pode se observar um equilíbrio dos íons dissolvidos
na solução na qual eles foram inseridos (VACANTI e VACANTI, 1994). Inicialmente,
observa-se um aumento do pH da solução para valores maiores que 7,4 (HENCH e
ANDERSSON, 1993; CERRUTI, M. et al., 2005; CERRUTI, M. G. et al., 2005), que
foi o valor inicial da solução de SBF e esta elevação no valor do pH aumenta a
estabilidade da precipitação de Ca-P, que forma uma camada protetora que induz a
diminuição da taxa de dissolução (TECHER et al., 2001). Esta camada protetora
poderia explicar a razão das partículas maiores não sofreram alterações superficiais
significativas, como diminuição do tamanho das partículas com o tempo de
degradação e porque a superfície das partículas ficaram mais lisas. No BG2
observou-se trincas, onde a degradação foi mais intensa, sugerindo que a camada
protetora formada sobre as superfícies não foi uniforme nestas regiões levando a
uma degradação mais intensa.
A taxa de dissolução do vidro depende muito do percentual de sílica (HENCH e
ANDERSSON, 1993; CERRUTI, M. et al., 2005; CERRUTI, M. G. et al., 2005), isto
poderia explicar a diferença no padrão de dissolução dos materiais analisados, uma
vez que suas composições eram diferentes, um biovidro era do sistema 3CaO.P2O5
– SiO2 – MgO e o outro Bioglass
45S5.
A hidroxiapatita, HAP, como recebida (D1) apresentou superfície rugosa e
porosa, com tendência a se aglomerar (FIG. 4.10a), similar com aquela pesquisada
por Ramay e Zang (2003), Cyster et al (2005), Russias et al (2006) e Saiz et al
121
(2007) (RAMAY e ZHANG, 2003; CYSTER et al., 2005; RUSSIAS et al., 2006; SAIZ
et al., 2007), bem diferente da observada no BG1 e BG2. O processo de degradação
do material foi diferente quando comparado ao dos biovidros. Após 30 dias em
solução de SBF (D2) as partículas ficaram menores em relação com aquelas no
estado como recebido. A superfície do material se manteve rugosa e porosa da
mesma forma que no grupo D1 (FIG. 4.10a e 4.10b). Esse padrão continuou da
mesma maneira nos grupos D3 (60 dias em solução de SBF) (FIG. 4.10c) e D4 (90
dias em SBF) (FIG. 4.10d), sugerindo que os agregados foram se separando depois
da imersão em solução de SBF. O material esfarelava quando imerso na solução.
Estes resultados observados no processo de degradação da HAP estão de acordo
com os obtidos por So et al (SO et al., 2006). Em solução de SBF nenhuma
alteração na superfície do material pode ser observada, como observada no
presente estudo.
O mesmo princípio de sistema fechado descrito anteriormente pode ser aplicado
à HAP, a apatita atinge um equilíbrio com os íons que foram dissolvidos e estão
presentes na solução na qual o mineral está inserido (VACANTI e VACANTI, 1994;
FULMER et al., 2002). A dissolução in vitro da HA também depende do tipo e da
concentração das soluções, se estas são tamponadas ou não, pH, grau de
saturação da solução e relação sólido/solução (MORENO et al., 1977; LEGEROS e
TUNG, 1983; MARGOLIS e MORENO, 1992).
A HAP utilizada foi uma porosa, que apresenta um grau de dissolução maior do
que a densa, mas segundo o fabricante, ela era cristalina. Isso pode explicar porque
os aglomerado diminuíram, mas não sofreram alterações superficiais. A solução de
SBF também pode ter influenciado na manutenção da superfície do material. Em
pesquisas descritas na literatura, outras soluções foram utilizadas, tais como:
solução salina (SO et al., 2006), solução TRIS-tamponada (DUCHEYNE et al., 1993;
FULMER et al., 2002). As condições de pH e de temperatura da solução utilizadas
na presente pesquisa foram igual àquelas utilizadas em outros estudos encontrados
na literatura (DUCHEYNE et al., 1993; FULMER et al., 2002; SO et al., 2006).
122
FIG. 4.10 Micrografias da HAP: (a) Como recebida (D1) (100x) (detalhe 1.500x);
(b) Após 30 dias em solução de SBF (D2) (100x) (detalhe 1.500x); (c) Após 60 dias
em solução de SBF (D3) (100x) (detalhe 1.500x); (d) Após 90 dias em solução de
SBF (D4) (100x) (detalhe 1.500x).
4.1.3. CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC)
Os termogramas obtidos na DSC estão apresentados na FIG. 4.11. A análise
térmica por DSC permitiu verificar a ocorrência de cristalinidade no PLDLLA, a
temperatura de transição vítrea (T
g
) e a temperatura de fusão (T
m
).
Observam-se dois picos endotérmicos: o primeiro relacionado ao fenômeno de
aparente fusão associada à (T
g
), atribuído a um alívio de tensões, decorrente da
liberação por aquecimento, das tensões acumuladas no material, em virtude das
alterações macromoleculares provenientes do processamento, da manipulação ou
da história térmica do mesmo (MOTHÉ e AZEVEDO, 2002), e o segundo
relacionado à (T
m
).
123
FIG. 4.11 Termogramas de DSC do PLDLLA: (a) Antes e (b) Depois da moagem.
Os resultados médios da (T
g
), (T
m
) e (c) estão apresentados na TAB. 4.2. A (T
g
)
do PLDLLA antes e após a moagem foi da ordem de 61,5
o
C e 66
o
C, e a (T
m
) de
125
o
C e 120
o
C, respectivamente. Em geral, as (T
g
) das amostras depois da
moagem foram maiores do que antes da moagem e as (T
m
) das amostras depois da
moagem foram menores do que antes da moagem.
TAB. 4.2 Resultados da DSC.
Grupos T
g
(
o
C) /
Desvio Padrão
T
m
(
o
C) /
Desvio Padrão
c (J/g) /
Desvio Padrão
Antes da Moagem
Como
recebido
A1
60,6 / 1,1
a
124,7 / 0,8
a
8,8 / 0,6
a
30 dias A2
61,9 / 0,2
a
124,0 / 1,0
a
8,5 / 0,6
a
60 dias A3
61,8 / 1,0
a
124,5 / 0,7
a
8,4 / 0,6
a
90 dias A4
61,5 / 0,8
a
124,7 / 1,0
a
8,2 / 0,5
a
Depois da Moagem
Como
recebido
G5
60,6 / 1,0
a
120,3 / 0,5
b
6,1 / 0,2
b
30 dias G6
65,9 / 0,4
b
119,9 / 0,3
b
6,7 / 0,9
b
60 dias G7
66,2 / 0,4
b
119,8 / 0,3
b
5,8 / 0,2
b
90 dias G8
66,0 / 0,5
b
119,9 / 0,2
b
6,2 / 0,4
b
a
– sem significância (p>0,05) /
b
– significante (p<0,05)
124
Nenhuma diferença significante (p>0,05) na (T
g
) e na (T
m
) foi observada em
função do tempo da imersão do PLDLLA antes da moagem. Variações significantes
na (T
g
) em função do tempo de imersão foram observadas no PLDLLA depois da
moagem (p<0,05). Os materiais dos grupos antes e depois da moagem
apresentaram diferenças significativas da (T
g
) e da (T
m
) (p<0.05).
As temperaturas de transição primárias para copolímeros da família do PLA são
dependentes da razão entre o homopolímero L e o copolímero DL, diminuindo de
valores de (T
g
) da ordem de 63
o
C para 56
o
C
e de (T
m
) de 178
o
C para 125
o
C da
razão de 100/0 para 80/20 do PLDLLA, conforme reportado por Garlotta
(GARLOTTA, 2001).
De acordo com Daniels et al (1990) (DANIELS et al., 1990) a temperatura de
fusão do PLLA é de 175-178
o
C e a temperatura de transição vítrea de 60-65
o
C, De
acordo com Bergsma et al (1993) (BERGSMA et al., 1993) a (T
m
) do PLLA é de
aproximadamente 174-184
o
C e a (T
g
) de 57
o
C. Ferreira et al (2003) (FERREIRA et
al., 2003) determinou como sendo 54
o
C a (T
g
) do PLLA e a (T
m
) 178
o
C. A (T
g
)
obtida no presente estudo está de acordo com os resultados apresentados na
literatura, mas os resultados descritos na literatura para a (T
m
) foram maiores do que
os obtidos no presente estudo. Entretanto, pode-se notar que as composições dos
copolímeros são diferentes e as rotas de processamento dos materiais também se
mostraram diferentes nas diversas pesquisas.
O calor específico (c) foi de aproximadamente 8,5 J/g e 6,2 J/g para o PLDLLA
antes e depois da moagem, respectivamente. Nenhuma diferença significante em c
foi observada em função do tempo de imersão do PLDLLA antes e depois da
moagem. Entretanto, variações significantes em c em função do processo de
moagem foi observada entre os materiais (TAB. 4.2). Os polímeros com menor calor
específico são mais cristalinos do que aqueles com calor específico maior (PYDA et
al., 2004). Com isso o PLDLLA depois da moagem apresentou um conteúdo
cristalino maior do que o PLDLLA antes da moagem. Como descrito previamente na
literatura, o processo de moagem criogênica pode ter resultado na quebra das
cadeias poliméricas longas iniciais o que aumentou o conteúdo cristalino do
polímero devido à reorganização das cadeias após a quebra (REZENDE e DUEK,
2003).
125
4.1.4. ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA)
Os resultados da TGA são mostrados na FIG. 4.12 e na TAB. 4.3. Os valores
médios de onset determinados computacionalmente para as amostras: antes da
moagem como recebida (A1); antes da moagem após 90 dias de degradação (A4);
depois da moagem como recebida (A5) e depois da moagem após 90 dias de
degradação (A8) são 365,64
o
C, 360,30
o
C, 363,49
o
C e 359,83
o
C, respectivamente.
Na FIG. 4.12 são apresentados os termogramas mais representativos de cada grupo
avaliado. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os resultados das
amostras antes e após a moagem (FIG. 4.12a e 4.12c) e entre os resultados das
amostras como recebida e após 90 dias de imersão em SBF (FIG. 4.12a e 4.12b e
FIG. 4.12c e 4.12d) (p>0,05).
FIG. 4.12 Termogramas da TGA do PLDLLA: (a) antes da moagem como
recebido; (b) antes da moagem após 90 dias em solução de SBF; (c) depois da
moagem como recebido; (b) depois da moagem após 90 dias em solução de SBF.
126
TAB. 4.3 Resultados da TGA.
Grupos
Onset médio * (
o
C) /
Desvio Padrão
Perda de Massa (mg / %)
/ Desvio Padrão
Como
recebido
365,64 / 4,4
a
98,87 / 0,6
a
Antes da
moagem
90 dias de
degradação
360,30 / 3,9
a
98,61 / 0,8
a
Como
recebido
363,49 / 4,4
a
98,54 / 0,2
a
Depois da
moagem
90 dias de
degradação
359,83 / 2,2
a
98,64 / 0,2
a
* - determinado computacionalmente /
a
– sem significância (p>0,05)
Comparando os onsets de degradação do presente estudo (359,8-365,6
o
C) com
os resultados de Chen et al (2003) (CHEN et al., 2003), estes encontraram valores
menores do que os encontrados no presente estudo enquanto caracterizavam
blendas poliméricas de PLA biodegradáveis (315,5 – 290,3
o
C). No presente estudo
o PLDLLA 70/30, antes e depois da moagem, “como recebidos” e após diferentes
tempos de imersão em solução de SBF, enquanto os autores (CHEN et al., 2003)
avaliaram a degradação em função da porcentagem de cada homopolímero, desde
o PLLA puro até o PLDLA puro. Os valores menores encontrados pelos autores
podem ser explicados pelos possíveis processos de síntese das misturas nos
estudos, uma vez que as características morfológicas do polímero são afetadas
pelas taxas de solidificação (domínio do conteúdo cristalino), pela morfologia das
superfícies, e pela estrutura volumétrica do material. No presente estudo foi utilizado
um produto comercial e nenhuma informação adicional foi fornecida pelo fabricante.
A estabilidade térmica do PLDLLA antes e após a moagem, variando de
365,6
o
C para 360
o
C e 363,5
o
C para 359,8
o
C, respectivamente, diminuiu em
função do tempo de imersão. Essa diminuição ocorreu provavelmente devido a
degradação do homopolímero PLDA, presente no copolímero PLDLA, que
teoricamente ocorre primeiro do que a quebra do homopolímero PLLA. Após a
degradação completa do PLDA, cuja estabilidade é menor do que a do PLLA, a
diminuição da estabilidade térmica deve ocorrer de forma mais lenta, uma vez que o
PLLA é mais estável do que o PLDA. Esses resultados estão de acordo com os
obtidos por Rezende et al (2003) (REZENDE e DUEK, 2003).
127
4.1.5. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER (FTIR)
Os espectros de FTIR foram obtidos para verificar a presença de bandas
características dos materiais analisados, bem como avaliar se o processo de
degradação alterou de alguma maneira os espectros.
A FIG. 4.13 mostra os espectros de FTIR do PLDLLA antes da moagem. O
PLDLLA é um poliéster alifático que apresenta picos característicos (CHEN et al.,
2003). Bandas referentes ao estiramento do –CH, podem ser visualizadas em 2997
e 2985 cm
-1
(COPINET et al., 2004). Podem-se observar as bandas características
referentes ao estiramento do C=O em 1753 cm
-1
e ao estiramento simétrico do C-O
em 1094 cm
-1
(GARLOTTA, 2001; DRUMOND et al., 2004). As bandas equivalentes
a –CH
3
puderam ser visualizadas em 1375 e 1450 cm
-1
(NEJATI et al., 2008). Além
dessas bandas, a equivalente ao C-O-C em 1175 cm
-1
e ao C-C em 1200 cm
-1
também puderam ser observadas (CHEN et al., 2003). Verifica-se ainda a ocorrência
de uma banda em 869 cm
-1
, relacionada à característica amorfa do PLDLLA
(GARLOTTA, 2001) e uma banda em 797 cm
-1
, referente à característica cristalina
no PLDLLA (CHEN et al., 2005).
A intensidade dos picos referentes ao estiramento de –CH, –CH
3
e à banda
característica da fase cristalina do PLDLLA ficou mais intensa após 30 dias em
solução de SBF. Nos demais tempos, as alterações foram insignificantes. Estas
alterações podem sugerir que o material ficou mais cristalino com o decorrer do
tempo de degradação. Os demais picos não sofreram alterações significantes.
128
FIG. 4.13 Espectro de FTIR do PLDLLA antes da moagem: (a) Como recebido;
(b) Após 30 dias em solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após
90 dias em solução de SBF.
– Estiramento do –CH, 2997 e 2985 cm
-1
; – Estiramento do C=O, 1753 cm
-1
;
– –CH
3
, 1450 cm
-1
, 1375 cm
-1
; – C-C, 1200 cm
-1
;
– C-O-C, 1175 cm
-1
; – Estiramento simétrico do C-O, 1094 cm
-1
;
– Característica amorfa, 869 cm
-1
; – Característica cristalina, 797 cm
-1
.
A FIG. 4.14 mostra os espectros de FTIR do PLDLLA após a moagem no estado
como recebido, 30, 60 e 90 dias em solução de SBF. Estes mostram que o material
não sofreu alterações significantes com o processo de moagem, uma vez que os
mesmos picos puderam ser identificados.
Os espectros foram muitos parecidos com aqueles obtidos a partir das amostras
antes da moagem criogênica, exceto pelos picos que foram mais intensos na
amostra como recebida, sugerindo que ela teria um conteúdo cristalino maior que
tendeu a diminuir como o tempo de degradação. Estes resultados estão de acordo
com os obtidos na análise de DSC.
129
FIG. 4.14 Espectro de FTIR do PLDLLA após a moagem: (a) Como recebido; (b)
Após 30 dias em solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90
dias em solução de SBF.
– Estiramento do –CH, 2997 e 2985 cm
-1
; – Estiramento do C=O, 1753 cm
-1
;
– –CH
3
, 1450 cm
-1
, 1375 cm
-1
; – C-C, 1200 cm
-1
;
– C-O-C, 1175 cm
-1
; – Estiramento simétrico do C-O, 1094 cm
-1
;
– Característica amorfa, 869 cm
-1
; – Característica cristalina, 797 cm
-1
.
Os espectros do BG1 e BG2 podem ser observados nas FIG.s 4.15 e 4.16,
respectivamente. A análise por FTIR revelou que ambos os biovidros apresentaram
composição similar.
A banda em 3470 cm
-1
presente em ambos os materiais refere-se à água
absorvida (NAVARRO et al., 2005) e esta foi aumentando com o tempo de imersão
do material em solução de SBF. Para ambos os biovidros, as bandas C-H-CH
2
(2883 cm
-1
) podem ser oriundas de contaminação por óleo da prensa na hora da
confecção das pastilhas de KBr e dos materiais ou devido ao manuseio das
amostras com as mãos sem o uso de luvas. As bandas recíprocas em torno de 2350
cm
-1
são relacionadas as do CO
2
da atmosfera.
Os espectros (FIG.s 4.15 e 4.16) mostram bandas características para ligações
Si-O-Si em 1040 e 468 cm
-1
(CERRUTI, M. et al., 2005; CERRUTI, M. G. et al.,
130
2005; ZHU e KASKEL, 2008; ZHU et al., 2008). A banda em 468 cm
-1
, equivalente a
da sílica pura (BUNKER et al., 1988), nos espectros do BG2 foi ficando mais intensa
depois de 30, 60 e 90 dias em solução de SBF. A complexa banda na região de
1200 – 900 cm
-1
inclui absorções devido a ambos os grupos PO e SiO (CERRUTI,
M. et al., 2005).
FIG. 4.15 Espectro de FTIR do BG1: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90 dias em solução
de SBF.
– H
2
O, 3470 cm
-1
; – C-H-CH
3
, 2998 cm
-1
; – C-H-CH
2
, 2883 cm
-1
;
– CO
2
, 2350 cm
-1
; – C-O, 1187 cm
-1
; – Si-O-Si e PO
4
, 1040 cm
-1
;
– ν
4
PO
4
, 601 cm
-1
; – ν
symm
SiOSi, 468 cm
-1
;
– Grupos PO e SiO, banda larga entre 900 e 1200 cm
-1
.
Os picos em 1040, 960, 601 e 573 cm
-1
estão relacionados às bandas cristalinas
do P-O (ZHU e KASKEL, 2008; ZHU et al., 2008), todas podendo ser visualizadas no
BG2 como recebido. Após 30, 60 e 90 dias imerso em solução de SBF, os picos em
131
601 e 573 não foram mais identificados. Nos espectros do BG1, somente os picos
em 1040 e 601 cm
-1
estavam presentes e estes não sofreram alterações com a
degradação. Picos perto de 620, 600, 575, 560 e 530 cm
-1
(no domínio ν
4
PO
4
)
normalmente estão associados à fase do Ca-P ou da HA (REY et al., 1996).
Para o BG2, o dubleto próximo a 1450 cm
-1
recíproco é característico da ligação
C-O devido ao carbonato, este pico não foi observado nas amostras de BG1 em
nenhum tempo de teste.
FIG. 4.16 Espectro de FTIR do BG2: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90 dias em solução
de SBF.
– H
2
O, 3470 cm
-1
; – C-H-CH
3
, 2998 cm
-1
; – C-H-CH
2
, 2883 cm
-1
;
– CO
2
, 2350 cm
-1
; – C-O, 1187 cm
-1
; – CO
3
- carbonato menor, 1400 cm
-1
;
– Si-O-Si e PO
4
, 1040 cm
-1
; – ν
1
PO
4
, 960 cm
-1
; – ν
4
PO
4
, 601 cm
-1
;
– Grupo PO
4
3-
, 573 cm
-1
– ν
symm
SiOSi, 468 cm
-1
;
– Grupos PO e SiO, banda larga entre 900 e 1200 cm
-1
.
Os espectros de FTIR da HAP como recebida, 30, 60 e 90 dias em solução de
132
SBF são apresentados na FIG. 4.17 e foi possível observar que não ocorreram
alterações na composição do material, uma vez que os picos identificados
praticamente não mudaram. A análise das bandas confirma que os espectros
apresentados pertencem a hidroxiapatita (LEGEROS, 1991; CHEN et al., 2002;
PANDA et al., 2003; RAMAY e ZHANG, 2003; KUMTA et al., 2005; HING et al.,
2006).
FIG. 4.17 Espectro de FTIR da HAP: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90 dias em solução
de SBF.
– OH estrutural, 3570 cm
-1
; – H
2
O absorvida, 3470 cm
-1
;
– CO
2
(ν
3
) solúvel, 2300 cm
-1
; – H
2
O absorvida (ν
2
), 1650 cm
-1
;
– Grupo CO
3
-
(ν
3
), 1460 cm
-1
; – Dobra PO
4
(ν
3
), 1030 cm
-1
;
– Estiramento PO
4
(ν
1
), 985 cm
-1
; – OH estrutural, 630 cm
-1
;
– Dobra PO
4
(ν
4
), 603 e 570 cm
-1
.
As bandas em 3570 e 630 cm
-1
estão relacionadas à hidroxila estrutural. As
133
bandas em 3470 e 1650 cm
-1
referem-se à água absorvida. Em 2300 cm
-1
observa-
se uma banda associada ao CO
2
(ν
3
) solúvel, que praticamente não pode ser mais
identificada no espectro de 90 dias após imersão em solução de SBF. As bandas de
absorção em 1030, 985, 603 e 570 cm
-1
estão relacionadas à vibração do grupo
[PO4]3
-
, sendo as 1030, 603 e 570 cm
-1
atribuídas à vibração de dobra do fosfato,
enquanto a banda em 985 cm
-1
à vibração de estiramento do ânion fosfato. A banda
em 1460 cm
-1
é indicativa da substituição iônica de carbonato.
4.1.6. DIFRAÇÃO DE RAIOS X (DRX)
A DRX foi realizada para determinar a cristalinidade dos materiais. A FIG. 4.18
representa os difratogramas obtidos das amostras do PLDLLA depois da moagem.
Pode-se observar um pico em 17
o
em todos os quatro tempos de análise, como
recebidos e após 30, 60 e 90 dias de imersão em solução de SBF. Este pico é
característico do PLLA puro (NEJATI et al., 2008), ou seja, o componente cristalino
da amostra pesquisada. O homopolímero D da mistura racêmica DL, que é amorfo,
não foi visualizado.
A DRX mostrou que o BG2 era composto por fases de silicatos amorfos, com
aspecto vítreo (CANNILLO et al., 2008; CHEN et al., 2008), não apresentando fase
cristalina (FIG. 4.20). Já os difratogramas do BG1 mostram um pico de sílica (FIG.s
4.19). Ambos os materiais apresentaram uma reflexão larga em 2θ = 15
o
– 35
o
(NAVARRO et al., 2005; ZHU e KASKEL, 2008), característica de material no estado
amorfo.
134
FIG. 4.18 Difratogramas do PLDLLA depois da moagem: (a) Como recebido; (b)
Após 30 dias de imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em
solução de SBF; (d) Após 90 dias de imersão em solução de SBF.
A composição dos vidros bioativos pesquisados é diferente. O conteúdo de sílica
no BG1 é de 30% e no BG2 de 45%. Isto não explicaria a presença do pico de sílica
cristalina (quartzo) (2θ = 22
o
) (RAINER et al., 2008) observado nas amostras do
BG1. A formação desta fase cristalina poderia ser explicada devido ao resfriamento
do material, que não foi rápido o suficiente e permitiu a organização estrutural do
mesmo, formando uma fase cristalina (DAGUANO et al., 2007; LEFEBVRE et al.,
2008).
135
FIG. 4.19 Difratogramas do BG1: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias de
imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em solução de SBF; (d)
Após 90 dias de imersão em solução de SBF.
Os difratogramas da HAP como recebida, após 30, 60 e 90 dias em solução de
SBF podem ser observados na FIG. 4.21. Os resultados das análises de DRX nos
quatro grupos pesquisados apresentaram padrões de difração semelhantes ao da
hidroxiapatita (HA), identificada pela ficha JCPDS 090432 (FONSECA, 2007).
Nenhuma fase secundária, tipo αTCP, βTCP, pode ser identificada (LANDI et al.,
2008).
136
FIG. 4.20 Difratogramas do BG2: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias em
solução de SBF; (c) Após 60 dias em solução de SBF; (d) Após 90 dias em solução
de SBF.
Observa-se a estabilidade do material, uma vez que foram determinadas
variações insignificantes. Pode-se identificar um pico de alumínio nos quatro grupos,
este pico refere-se ao suporte da amostra do equipamento utilizado.
137
FIG. 4.21 Difratogramas da HAP: (a) Como recebido; (b) Após 30 dias de
imersão em solução de SBF; (c) Após 60 dias de imersão em solução de SBF; (d)
Após 90 dias de imersão em solução de SBF.
4.1.7. CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL (GPC)
A degradação dos PLDLLA antes e após a moagem foi avaliada pela perda de
peso molecular. Pela GPC foi determinado o peso molecular ponderal médio (M
w
),
peso molecular numérico médio (M
n
) e a polidispersão (PD) dos materiais. Estes
resultados podem ser visualizados na TAB. 4.4 e FIG.s 4.22, 4.23.
O processo de moagem criogênica praticamente não alterou o peso molecular
do PLDLLA (TAB. 4.4), mas os resultados sugerem que o conteúdo do material após
o procedimento de diminuição do tamanho das partículas ficou mais cristalino, uma
vez que a diminuição do peso molecular pouco se alterou após 30 e 60 dias em
138
solução de SBF (FIG.s 4.22 e 4.23), só sendo mais intenso após 90 dias de
degradação.
TAB. 4.4 Resultados da GPC.
PLDLLA
M
w
(g/mol) /
Desvio Padrão
M
n
(g/mol) /
Desvio Padrão
PD (M
w
/M
n
) /
Desvio Padrão
Como recebido 430.631 / 29.236
a
339.795 / 37.358
a
1,2736 / 0,0572
a
30 dias 397.534/ 16.200
a
305.075/ 25.187
a
1,3076 / 0,0552
a
60 dias 364.280 / 13.268
b
262.871 / 23.356
a
1,3935 / 0,0947
a
Antes da
Moagem
90 dias 331.776 / 16.638
b
221.799 / 18.382
b
1,5003 / 0,0550
a
Como recebido 428.796 / 10.102
a
335.722 / 14.358
a
1,2783 / 0,0280
a
30 dias 428.985 / 5.367
a
337.413 / 8.673
a
1,2718 / 0,0183
a
60 dias 424.936 / 1.805
a
327.308 / 862
a
1,2983 / 0,0087
a
Depois da
Moagem
90 dias 390.975 / 34.167
a
299.077 / 54.797
a
1,3317 / 0,1342
a
a
– sem significância (p>0,05) /
b
– significante (p<0,05)
FIG. 4.22 Taxa de diminuição do peso molecular ponderal médio do PLDLLA (a)
antes e (b) após a moagem versus tempo de degradação. 1 – Como recebido; 2 –
30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em solução de SBF.
139
Pode-se observar que tanto para o M
w
como para M
n
a diminuição do peso
molecular dos materiais antes da moagem ocorreu de forma gradual. Conforme
aumentava o tempo de degradação em solução de SBF, menor o peso molecular
dos materiais. Já para as amostras depois da moagem criogênica, praticamente não
houve alteração no peso molecular nos três primeiros tempos de avaliação.
Somente após 90 dias de imersão em solução de SBF, que a diminuição do peso
molecular pode ser observada.
Diferenças estatísticas foram ser observadas somente nas amostras antes da
moagem entre os grupos como recebido e 60 dias e como recebido e 90 dias para o
M
w
e entre os grupos como recebido e 90 dias para o M
n
. Nas demais comparações
entre médias não foram observadas diferenças estatisticamente significante
(TAB. 4.4 e FIG.s 4.24, 4.25 e 4.26).
FIG. 4.23 Taxa de diminuição do peso molecular numérico médio do PLDLLA (a)
antes e (b) após a moagem versus tempo de degradação. 1 – Como recebido; 2 –
30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em solução de SBF.
140
33333333N =
VAR01
8,007,006,005,004,003,002,001,00
95% CI MW
600000
500000
400000
300000
200000
FIG. 4.24 Análise estatística do peso molecular ponderal médio do PLDLLA.
Antes da moagem: 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em
solução de SBF; Depois da moagem: 5 – Como recebido; 6 – 30 dias SBF; 7 – 60
dias; 8 – 90 dias em solução de SBF.
33333333N =
VAR01
8,007,006,005,004,003,002,001,00
95% CI MN
500000
400000
300000
200000
100000
FIG. 4.25 Análise estatística do peso molecular numérico médio do PLDLLA.
Antes da moagem: 1 – Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em
solução de SBF; Depois da moagem: 5 – Como recebido; 6 – 30 dias; 7 – 60 dias; 8
– 90 dias em solução de SBF.
141
33333333N =
8,007,006,005,004,003,002,001,00
95% CI PD
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
,8
FIG. 4.26 Análise estatística da polidispersão do PLDLLA. Antes da moagem: 1
– Como recebido; 2 – 30 dias; 3 – 60 dias; 4 – 90 dias em solução de SBF; Depois
da moagem: 5 – Como recebido; 6 – 30 dias; 7 – 60 dias; 8 – 90 dias em solução de
SBF.
Os resultados encontrados no presente estudo estão de acordo com aqueles
descritos para família do PLA (GARLOTTA, 2001), mas não podem ser comparados
com outras pesquisas de degradação, uma vez que os resultados encontrados na
literatura para o M
w
, M
n
e PD apresentam variações (LUCKE et al., 2000; CHEN et
al., 2003; COPINET et al., 2004; CHEN et al., 2005; NAVARRO et al., 2005;
BARAÚNA et al., 2007; MOTTA e DUEK, 2008). Estas variações podem ser devido
à forma do material (filmes, partículas ou scaffolds), devido à composição do poli
(ácido lático), que pode ser do isômero L, do isômero D ou da mistura racêmica
entre os dois isômeros (DL), bem como devido à variação na proporção dos
isômeros, ou também devido a misturas confeccionadas com outros polímeros, tais
como PCL, PGA, Me.PEG.
4.2. FASE IN VIVO
Após a caracterização dos materiais avaliados in vitro, a parte in vivo da
142
pesquisa foi realizada com dois objetivos: avaliar a resposta celular e analisar o
comportamento dos materiais na forma de pó utilizados como enxerto ósseo para
regeneração óssea guiada. Os períodos de 30, 60 e 90 dias foram selecionados
para que os eventos de remodelamento ósseo, correspondente a 42 dias, fossem
analisados (ROBERTS et al., 1989). A escolha pelos coelhos foi justificada pelo fácil
manejo, semelhança entre o seu metabolismo e a fisiologia óssea humana
(RUELLAS, 1999; HOLY et al., 2000; TORRICELLI et al., 2002). A calvária foi o local
de eleição, uma vez que é composta exclusivamente de osso intramembranoso,
apresenta limitado suprimento sangüíneo, possui pobres propriedades de
cicatrização espontânea e permite a preparação de defeitos de tamanho crítico
(SCHMITZ e HOLLINGER, 1986). O controle na confecção de defeitos de tamanho
crítico, que teoricamente não cicatrizam sozinhos durante a vida do animal, feitos na
calvária, é de mais fácil realização e reprodução (SCHMITZ e HOLLINGER, 1986;
SCHMITZ et al., 1990). O defeito confeccionado na calvária, quando comparado
com outros defeitos ósseos experimentais, é um modelo conveniente ao estudo de
materiais para regeneração óssea, inclusive por não precisar de fixação (SCHMITZ
e HOLLINGER, 1986).
4.2.1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Os resultados da observação das amostras no SEM são mostrados nas
FIG.s 4.27 a 4.32. A FIG. 4.27a representa o grupo de 30 dias do PLDLLA e mostra
uma visão geral do espécime ósseo observado pela face externa. Pode-se identificar
o osso antigo e a área de enxerto. A linha contínua na FIG. 4.27a demarca a
fronteira entre os dois. Observa-se que o periósteo está cobrindo todos os tecidos
subjacentes, mas em alguns pontos, as partículas de PLDLLA estão expostas.
No detalhe superior da FIG 4.27a, é mostrado em um maior aumento, uma
partícula exposta de PLDLLA próxima à fronteira osso antigo / defeito, com
osteoblastos aderidos a ela. Os osteoblastos provavelmente são oriundos do
periósteo, uma vez que os prolongamentos das células unem a partícula e o
periósteo (BORDEN et al., 2003; RIBEIRO, 2005). Um maior aumento de uma região
143
mais profunda do defeito é mostrado no detalhe inferior da FIG 4.27a, destacando
uma observação do tecido ainda não organizado. A morfologia identificada indica o
recrutamento e migração de células imaturas de forte potencial osteogênico
provenientes do periósteo (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
Na FIG. 4.27b mostra-se uma micrografia em corte sagital da calvária de coelho
do grupo de 60 dias, sendo a parte superior a face externa da calvária e a parte
inferior a parte interna. Observam-se partículas de PLDLLA envolvidas por tecido
com potencial osteogênico. No detalhe superior da FIG 4.27b, o grânulo do material,
que foi cortado no meio, está unido com o tecido adjacente, confirmando o potencial
osteocondutor deste tipo de material bioabsorvível (VERRIER et al., 2004; RIBEIRO,
2005; PASOLINI, 2006). No detalhe inferior da mesma figura, observa-se uma
partícula de PLDLLA colonizada por osteoblastos com seus prolongamentos unindo
vários pontos da partícula (GRINNELL e HAYS, 1978; BORDEN et al., 2003; WAN et
al., 2005).
Uma micrografia representativa do grupo de 90 dias é apresentada na
FIG. 4.27c. Através do corte sagital é possível observar a presença de várias
partículas de PLDLLA. O material praticamente não sofreu degradação, este
resultado está de acordo com o obtido in vitro, diferentemente do que foi observado
por Ribeiro em 2005 (RIBEIRO, 2005). Esta divergência poderia ser explicada pelo
local de inserção do material, acesso à vascularização (TEMENOFF e MIKOS,
2000a), forma e processamento do material. No presente estudo, a implantação foi
na calvária e na pesquisa de Ribeiro, o experimento foi realizado na tíbia que
apresenta osso cortical e medular em maior quantidade e a vascularização também
é mais rica. O material utilizado no presente estudo na forma de grânulos sofreu
moagem criogênica, que alterou pouco as propriedades do PLDLLA, como foi
observado nos resultados in vitro. Já no estudo realizado por Ribeiro, o material na
forma de grânulos foi injetado a quente para confecção de parafusos, que foram
utilizados na pesquisa. O material no presente estudo manteve a espessura do
defeito equivalente com a do osso antigo. O meio do defeito não sofreu colapso. Os
grânulos estão em íntima relação com o tecido com potencial osteogênico.
144
FIG. 4.27 PLDLLA inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 40x,
1 mm, detalhes: aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento de 50x, 1 mm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes
aumento de 1.000x, 50 µm). (AO – osso antigo; PO – periósteo; P – PLDLLA; O – osteoblastos;
TPO – tecido com potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado).
Fronteira OA
Enxerto
P
P
PO
P
O
TPO
TM
PO
P
P
P
P
TPO
P
O
P
P
P
P
P
TPO
TM
O
145
O detalhe superior da FIG. 4.27c mostra uma região do defeito, onde uma
partícula do material foi perdida. Observa-se, na parte anterior e a esquerda, o
tecido com potencial osteogênico ainda bastante desorganizado e que o osso ainda
não sofreu remodelamento (DAVIES e HOSSEINI, 2000). Já no canto superior
direito, as células osteogênicas estão espalhadas e seus prolongamentos unidos. As
células já secretaram a matriz óssea, uma vez que placas podem ser identificadas.
No detalhe inferior da figura, a superfície de uma partícula de PLDLLA está coberta
por células osteogênicas. No canto superior esquerdo, observa-se uma quantidade
maior destas células.
Os resultados obtidos para os três grupos, de 30, 60 e 90 dias confirmam que o
PLDLLA apresenta a propriedade de osteocondução de acordo com os dados
reportados por outros pesquisadores (KOKUBO et al., 2003; RIBEIRO, 2005;
PASOLINI, 2006; JENSEN et al., 2007). O material foi capaz de estimular a
migração e proliferação dos osteoblastos, como foi descrito anteriormente na
literatura (ISHAUG et al., 1996; ISHAUG et al., 1997; ISHAUG-RILEY et al., 1998).
No sentido de utilizar as propriedades osteocondutiva, osteoindutiva e bioativa
dos biovidros, estes materiais cerâmicos foram combinados com materiais
poliméricos na fabricação de compósitos para engenharia tecidual óssea
(LAURENCIN e LU, 2000), como foi feito no presente estudo. Existem três razões
para esta combinação, são elas:
(1) os compósitos são preparados para utilizar a habilidade única do vidro
bioativo de formar uma camada superficial de Ca-P e conseqüentemente,
desenvolver um compósito bioativo que pode se unir ao osso in vivo;
(2) os materiais são combinados para neutralizar os produtos de degradação dos
poliésteres biodegradáveis, tais como PLA, PLGA e PGA, que degradam em ácido
lático e glicólico. Estes produtos podem causar uma diminuição significativa do pH
local e levar à respostas inflamatórias indesejáveis (SUGANUMA e ALEXANDER,
1993). Através da combinação dos materiais para formar um compósito, espera-se
que os produtos ácidos e básicos de degradação se neutralizem mantendo-se o pH
fisiológico; e
(3) com a combinação dos materiais pode-se confeccionar estruturas com
propriedades mecânicas melhoradas (AGRAWAL e ATHANASIOU, 1997;
LAURENCIN e LU, 2000).
146
Na FIG. 4.28a, observa-se uma amostra de PLDLLA combinado com BG1 do
grupo de 30 dias em um corte sagital. A seta preta contínua indica o periósteo
cobrindo o espécime ósseo, abaixo dele encontra-se a área do defeito ósseo. Nesta
área, é possível visualizar algumas partículas de PLDLLA. Pode-se dizer que estas
representam o material polimérico, devido ao tamanho. Como foi determinado pela
distribuição do tamanho das partículas, as partículas de BG1 eram quatro vezes
menores do que as de PLDLLA. No espaço vazio localizado na metade superior da
amostra, provavelmente estava uma partícula de PLDLLA, que foi perdida durante o
corte do espécime.
O detalhe superior da FIG. 4.28a mostra uma micrografia de uma partícula do
material polimérico com sua superfície alterada, devido à proliferação de tecido com
potencial osteogênico. É difícil precisar o limite entre o tecido e o material. No
detalhe inferior da FIG. 4.28a, observa-se outra partícula de PLDLLA com tecido
com potencial osteogênico e mineralizado aderido a ela (canto superior direito) e
sobre a superfície do grânulo, células osteogênicas espalhadas e sinais de
mineralização (canto inferior esquerdo). Este tecido com potencial osteogênico foi
formado em feixes de fibras direcionadas que foram mineralizadas. Estes resultados
são similares com os do grupo de PLDLLA sem estar associado ao BG1. Nesta
amostra não foi possível identificar partículas de BG1.
A micrografia da FIG. 4.28b é a mais representativa do grupo PLDLLA + BG1 de
60 dias. É possível visualizar partículas de PLDLLA de diversos tamanhos
integradas com o tecido. Na região sinalizada com a seta branca contínua, observa-
se que uma partícula de PLDLLA foi perdida. O tecido se mostra mais organizado,
indicando que o material apresenta certa osteocondutividade. Este resultado difere
de alguns relatados na literatura, os quais citam que os ácidos poli α-hidroxi não
possuem uma superfície favorável para a adesão e proliferação celular, devido à
falta de sinais específicos para o reconhecimento celular (SCHLIEPHAKE et al.,
1994; NEJATI et al., 2008), mas está de acordo com o obtido por outros
pesquisadores (RIBEIRO, 2005; RIMONDINI et al., 2005; PASOLINI, 2006).
Após a implantação de um biomaterial, ocorre a formação de um trombo ou
coágulo sanguíneo. As proteínas e outras macromoléculas deste sangue
extravasado interagem com a superfície do biomaterial, formando uma camada de
proteínas e é esta camada que irá interagir com as células e não diretamente sobre
147
a superfície do biomaterial (ANDERSON, 2000; DAVIES e HOSSEINI, 2000;
HOSSEINI et al., 2000). Células osteogênicas são recrutadas e migram através da
superfície tridimensional do material. A partir do momento que essas células se
diferenciam e começam a secretar matriz óssea, elas param de migrar e esta matriz
fica depositada na superfície do material. Esta seqüência de fenômenos poderia
explicar as propriedades osteocondutivas observadas no PLDLLA.
No detalhe superior da FIG. 4.28b é possível visualizar uma partícula de BG1
integrada com o tecido que a circunda, confirmando a bioatividade do material
(ROETHER et al., 2002; ZHANG et al., 2002; ZHANG et al., 2004). Pode-se afirmar
que a partícula é de BG1 devido ao seu tamanho, a mesma não é identificada no
tecido adjacente quando observada em menor aumento. Observa-se tecido com
potencial osteogênico aderido ao material. No detalhe inferior da figura, observa-se
uma partícula de PLDLLA com tecido com potencial osteogênico aderido a sua
superfície.
Mostra-se na FIG. 4.28c uma amostra de PLDLLA combinada com BG1 do
grupo de 90 dias em um corte sagital. A seta contínua indica o periósteo externo.
Observam-se várias partículas de material, provavelmente de PLDLLA, identificadas
pelo tamanho das mesmas, não sendo observada degradação significante. Este
resultado é similar àquele descrito no grupo de 90 dias com o PLDLLA usado
sozinho no preenchimento do defeito. Nesta situação, o material também manteve a
espessura do defeito equivalente com a do osso antigo. O meio do defeito não
sofreu colapso. Os grânulos estão em íntima relação com o tecido com potencial
osteogênico, que está organizado na forma de feixes circundando os grânulos do
material.
No detalhe superior da FIG. 4.28c mostra-se o tecido formado entre as partículas
de PLDLLA, o tecido apresenta potencial osteogênico e percebe-se algum sinal de
mineralização. É possível visualizar uma partícula de BG1, integrada ao tecido
adjacente, sendo difícil determinar a partícula e o tecido neoformado. Ela apresenta
algumas fendas, sugerindo que o processo de degradação esteja em curso. No
detalhe inferior da figura, pode-se visualizar células osteogênicas aderidas à
superfície da partícula de PLDLLA (seta branca pontilhada), a qual apresenta
irregularidades, sugerindo que o processo de degradação está ocorrendo.
148
FIG. 4.28 PLDLLA + BG1 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de
50x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento de 50x, 1 mm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes
aumento de 1.000x, 50 µm). (PO – periósteo; P – PLDLLA; B1 – BG1; PP – partícula perdida; O
– osteoblastos; TPO – tecido com potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado).
PO
P
P
PP
P
P
TPO
TPO
P
P
P
PP
B1
TM
PO
B1 TPO
TPO
P
B1
TPO
B1
P
P
P
P
TPO
PO
TPO
P
149
Com um aumento de 50x tem-se uma visão geral do grupo de 30 dias do BG1
em um corte sagital (FIG. 4.29a). Observa-se um tecido com potencial osteogênico
com alguma mineralização e algumas partículas de BG1, que podem ser melhor
visualizadas nos detalhes com um aumento maior. No detalhe superior da figura,
observa-se o grânulo de BG1 bem integrado com o tecido adjacente e sua superfície
apresenta sinais de degradação, devido à irregularidade superficial. No detalhe
inferior da figura observa-se uma partícula de BG1 em íntimo contato com o tecido
adjacente. As fibrinas de tecido com potencial osteogênico estão bem aderidas à
superfície do material.
Na FIG. 4.29b mostra-se uma micrografia do grupo de 60 dias do BG1 em um
corte sagital. A seta contínua indica o periósteo recobrindo a amostra e a pontilhada
o endósteo. É possível determinar a fronteira entre o osso do hospedeiro (no lado
esquerdo da figura) e a área enxertada (no lado direito). Observa-se que a
neoformação óssea está ocorrendo da borda para o centro do defeito (KAMAKURA
et al., 1999; MOON et al., 2006). Os feixes fibrosos de tecido com potencial
osteogênico estão direcionados neste sentido. Poucas partículas de BG1 podem ser
identificadas, as mesmas devem ter degradado ou foram fagocitadas por
macrófagos, em virtude do pequeno diâmetro dos grânulos, tornando-se tóxicas às
células (DAVIES e HOSSEINI, 2000; VOGEL et al., 2001; RODRIGUES et al., 2003;
HSU et al., 2005; XIA et al., 2006). Os grânulos devem ser maiores do que 100 µm
de diâmetro para serem usados como materiais para formação óssea (LOVELACE
et al., 1998). O material não foi capaz de manter a espessura do defeito similar com
aquela do osso antigo da calvária. O meio do defeito sofreu colapso o que pode não
ser favorável à completa cicatrização do defeito cirúrgico (MOON et al., 2006).
No detalhe superior da FIG. 4.29b, observa-se o tecido com o potencial
osteogênico com feixes de fibras dispostos em três direções e bastante compactos.
No detalhe inferior da figura, é possível visualizar uma partícula de BG1, cuja
superfície apresenta trincas e sinais de degradação do material. A seta branca
contínua indica células com potencial osteogênico aderidas e espalhadas sobre a
superfície, comprovando a osteocondutividade e bioatividade do material (CLARK et
al., 1976; OONISHI et al., 1997; XYNOS et al., 2001; BOSETTI e CANNAS, 2005).
150
FIG. 4.29 BG1 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 50x,
1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento de 50x, 1 mm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento de 50x, 1 mm, detalhes
aumento de 1.000x, 50 µm). (OA – osso antigo; PO – periósteo; EO – endósteo; B1 – BG1;
CPO – células com potencial osteogênico; TPO – tecido com potencial osteogênico; TM – tecido
Fronteira
OA
Enxerto
B1
TM
TPO
PO
TPO
TPO
TPO
TPO
B1
B1
B1
EO
B1
TM
B1 CPO
Fronteira
Enxerto
OA
TM TPO
H
VS
151
mineralizado; H – hemácias; VS – vaso sangüíneo).
A FIG. 4.29c mostra um espécime do grupo de 90 dias do BG1 visto pelo lado
externo. O periósteo foi removido para se alcançar a visualização. A linha contínua
marca a fronteira entre o osso do hospedeiro e a área do defeito criado
cirurgicamente. Observa-se um degrau entre o osso antigo e o defeito; e este está
preenchido por um tecido fibroso. Nesta situação o material não foi capaz de manter
a mesma espessura entre os dois, provavelmente porque as partículas do material
não estão mais presentes, ou não houve total preenchimento durante a colocação
do compósito no sítio cirúrgico.
No detalhe superior FIG. 4.29c, observa-se uma região próxima a fronteira no
meio do defeito, que apresenta vários planos de fibras com tecido mineralizado
depositado sobres os feixes fibrosos. Este resultado significa que ainda não ocorreu
a coalescência deste tecido mineralizado formando planos ósseos. Observam-se
também vasos sangüíneos e hemácias (seta pontilhada) entremeadas com os feixes
de tecido com potencial osteogênico. No detalhe inferior desta figura, pode-se
identificar um emaranhado de fibras recobertas com tecido mineralizado. Observa-se
ainda fibras e glóbulos de osso sobre estas fibras. Estes glóbulos estão coalescendo
formando glóbulos maiores.
Os resultados dos três grupos do BG1, 30, 60, 90 dias são similares aqueles
encontrados nos três grupos controle.
O segundo grupo de biovidros, BG2, pode ser observado na FIG. 4.30. A
micrografia apresentada na FIG. 4.30a é uma vista superior externa do defeito
criado. Em um aumento de 100x é possível observar o periósteo cobrindo a área do
defeito e deixando algumas partículas de BG2 expostas. Ao redor dos grânulos
pode-se visualizar tecido com potencial osteogênico. No detalhe superior da figura
observa-se a região da interface entre o material e o tecido adjacente. É possível
visualizar que o tecido justaposto ao BG2 apresenta-se mais compacto, denso (seta
contínua). Este fato sugere que as propriedades de osteocondução e bioatividade
relatados na literatura se relacionam aos materiais vítreos ativos (CLARK et al.,
1976; OONISHI et al., 1997; XYNOS et al., 2001; BOSETTI e CANNAS, 2005). Já o
tecido mais afastado da partícula de BG2 apresenta falhas, indicando que a
formação óssea se dá a partir do material. Em ambas as regiões, observa-se que já
152
ocorreu alguma deposição de tecido mineralizado.
No detalhe inferior da FIG. 4.30a, é possível visualizar uma partícula de BG2.
Sua superfície apresenta trincas e uma grande área erodida (identificada com um
círculo), indicando que o material está sofrendo degradação após 30 dias in vivo.
A micrografia apresentada na FIG. 4.30b é uma vista superior externa do defeito
criado, mas neste caso o periósteo foi removido para melhorar a visualização do que
estava ocorrendo no interior do defeito. A linha contínua delimita a região de
fronteira entre o osso antigo e a área do defeito, que possui várias partículas de
BG2. Provavelmente, a diferença entre a espessura da borda e do meio do defeito
não é mesma, porque o periósteo foi removido. É possível identificar que as fibras
foram rompidas com a remoção do mesmo.
No detalhe superior da FIG. 4.30b observa-se uma placa de tecido mineralizado
envolvido com tecido com potencial osteogênico e alguns vasos sangüíneos (seta
contínua). Esta região se encontra próxima à borda do defeito, perto da fronteira
entre este e o osso antigo. Nesta região a vascularização é mais intensa, como já foi
mostrado no grupo do BG1, indicando que o processo de cicatrização da ferida está
ocorrendo da borda para o centro do defeito e também ao redor da partícula de BG2
(KAMAKURA et al., 1999; MOON et al., 2006).
No detalhe inferior da FIG. 4.30b, observa-se uma partícula de BG2 envolvida
com tecido com potencial osteogênico. Osteoblastos podem ser visualizados sobre a
superfície do grânulo (seta pontilhada), que apresenta alterações na sua superfície,
indicando que o processo de degradação está em curso.
A FIG. 4.30c representa o grupo do BG2 de 90 dias. Observa-se uma massa
bastante compacta constituída de BG2, fibras e tecido ósseo neoformado. As
partículas de BG2 estão unidas ao tecido adjacente, indicando a osteocondutividade
e bioatividade do material (CLARK et al., 1976; OONISHI et al., 1997; XYNOS et al.,
2001; BOSETTI e CANNAS, 2005).
153
FIG. 4.30 BG2 inserido na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 100x,
500 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento de 50x, 1 mm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento de 100x, 500 µm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm). (OA – osso antigo; PO – periósteo; B2 – BG2; TPO –
TPO
PO
B2
Fronteira
Enxerto
OA
B2
B2
B2
B2
D
TM
TPO
TPO
TPO VS
TPO
O
TM TPO
B2
B2
TM
TPO
TPO
B2
154
tecido com potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado; VS – vaso sangüíneo; D – degradação
superficial).
O detalhe superior da FIG. 4.30c mostra uma partícula de BG2 com trincas e
unidas ao tecido que as circunda. A área mais globular mostra deposição mineral
sobre a superfície do material. No detalhe inferior da figura pode-se visualizar outra
partícula de BG2 também unida ao tecido ósseo neoformado adjacente. Observa-se
uma densa trama de tecido com potencial osteogênico do lado esquerdo da imagem
(seta contínua). No canto superior direito da figura, pode-se visualizar uma fenda
entre o grânulo de BG2 e o tecido com potencial osteogênico. Esta fenda pode ter
sido criada na hora do corte da amostra para prepará-la para observação no MEV.
A FIG. 4.31a, mostra uma micrografia do grupo de 30 dias da HAP em um corte
sagital. A seta contínua indica a face externa da calvária. O periósteo foi removido
na hora do preparo da amostra e isto poderia ter causado o aspecto irregular da
mesma, diferente do observado na face interna, que apresenta um tecido mais
uniforme envolvendo partículas de HAP. A seta pontilhada indica uma região onde
um grânulo de HAP foi perdido durante o processo de preparo da amostra. Pode-se
observar que o tecido com potencial osteogênico se formou no local da partícula
perdida. Duas partículas no centro da imagem podem ser visualizadas, a da
esquerda foi seccionada durante o corte na amostra e a da direita encontra-se
inteira. Sobre a superfície das duas, observa-se fibras aderidas a sua superfície,
podendo-se observar melhor estas fibras na partícula da esquerda.
Um maior aumento da partícula da direita pode ser visualizado no detalhe
superior da FIG 4.31a. A superfície a HAP que era bastante porosa (FIG. 4.10)
apresenta maior uniformidade, possivelmente devido à deposição de tecido
mineralizado sobre ela, confirmando a osteocondutividade e bioatividade do material
(CLARK et al., 1976; OONISHI et al., 1997; XYNOS et al., 2001; BOSETTI e
CANNAS, 2005). No detalhe inferior da figura, observa-se tecido com potencial
osteogênico mais desorganizada. Os feixes de fibras não estão compactos como os
observados na imagem em menor aumento.
A micrografia representativa do grupo da HAP de 60 dias (FIG. 4.31b) é similar à
de 30 dias (FIG. 4.31a). Partículas de HAP envoltas por tecido com potencial
osteogênico. Em algumas áreas o tecido apresenta maior organização e em outras
155
menor. No detalhe superior da FIG. 4.31b, é possível visualizar uma partícula de
HAP totalmente integrada com o tecido circundante. As fibras colágenas estão ao
redor da partícula (seta pontilhada) e no meio da imagem, pode-se observar tecido
mineralizado já depositado sobre o grânulo de HAP (seta segmentada). O detalhe
inferior da figura mostra a mesma partícula de HAP, mas uma região diferente, do
outro lado daquela do detalhe superior da imagem. Observa-se um feixe de fibras do
tecido com potencial osteogênico todos na mesma direção ao redor do grânulo do
material em teste (seta pontilhada). Do lado esquerdo deste feixe orientado é
possível visualizar fibras desorganizadas. Na região indicada pela seta contínua não
é possível diferenciar o material do tecido ósseo neoformado.
A FIG. 4.31c representa um dos espécimes do grupo da HAP de 90 dias. A
amostra foi posicionada para permitir a visualização da sua face superior. A seta
contínua indica o periósteo que foi parcialmente removido. No meio da imagem é
possível visualizar pequenas partículas de HAP, que provavelmente pertenciam a
uma partícula maior que se esfarelou corroborando os resultados in vitro. O tecido
neoformado encontra-se abaixo das partículas de HAP. A presença destas
partículas entre o tecido neoformado e o periósteo poderia ser explicada pelo
deslocamento e migração dos grânulos, processo que já foi descrito na literatura
(MEHLISCH, 1989; GABRIELLI, 1999).
O detalhe superior da FIG. 4.31c comprova que a partícula se dividiu em outras
menores após sua inserção no defeito criado na calvária. No detalhe inferior da
figura, observa-se a deposição de tecido mineralizado sobre a superfície do material,
sendo este mais uniforme do lado esquerdo do espécime e mais irregular do lado
direito.
Os resultados obtidos nos três grupos da HAP (30, 60 e 90 dias) estão de
acordo com os obtidos por Bertoli (BERTOLI, 2007). A propriedade osteocondutora
da HA foi confirmada neste estudo, o que está de acordo com inúmeros relatos da
literatura (MINABE et al., 1988; MEHLISCH, 1989; KLINGER et al., 1998; HALLMAN
et al., 2001; TACHIBANA et al., 2003; CARDAROPOLI et al., 2005; GOSAIN et al.,
2005; HSU et al., 2005; RIBEIRO et al., 2005; SILVA et al., 2005).
156
FIG. 4.31 HAP inserida na calvária de coelho: (a) 30 dias (aumento de 50x,
1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias (aumento de 50x, 1 mm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento de 100x, 500 µm,
detalhes aumento de 1.000x, 50 µm). (FEC – face externa da calvária; PO – periósteo; HA –
HAP; TPO – tecido com potencial osteogênico; TM – tecido mineralizado).
FEC
PP
HA HA
HA TPO
TPO
TPO
HA
HA
TPO
HA HA
TPO
TM
TPO
HA e TM
HA
HA
PO
TPO
HA
HA
HA
TPO
HA
TM
157
Mostra-se na FIG. 4.32 as micrografias representativas do grupo controle de 30,
60 e 90 dias. Na FIG. 4.32a, pode-se observar uma região no centro do defeito e
outra próxima à fronteira osso antigo / defeito, com tecido com potencial
osteogênico, que ainda está se organizando em vários planos. É possível visualizar
a deposição de minerais sobre o feixe de tecido fibroso. O detalhe superior da figura
mostra uma região da fronteira entre o osso antigo e o defeito. Observa-se um tecido
mais organizado, uma vez que o processo de cicatrização está vindo das paredes do
defeito. No detalhe inferior da figura, observa-se um tecido com potencial
osteogênico ainda não muito organizado, com feixes de fibras direcionados e
dispostos em planos diferentes.
Na FIG. 4.32b, o espécime ósseo foi cortado sagitalmente e é possível visualizar
que o tecido com potencial osteogênico está vindo do osso medular antigo da
calvária (seta contínua) e do periósteo (seta pontilhada) que foi cuidadosamente
afastado durante o procedimento cirúrgico e depois reposicionado. Mais para o
interior do defeito, observa-se seu colapso corroborando os resultados relatados na
literatura (NARANG e LASKIN, 1976; KAMAKURA et al., 1999; MOON et al., 2006;
BERTOLI, 2007). Os detalhes em maior aumento desta figura mostram as fibras,
que estão originando o tecido com potencial osteogênico para a neoformação óssea
do defeito criado. O detalhe superior apresenta as fibras do periósteo e o inferior,
aquelas do tecido ósseo esponjoso antigo.
Na FIG. 4.32c mostra-se uma região central do grupo controle de 90 dias. Nela é
possível visualizar áreas com osso já formado e outras com muito tecido com
potencial osteogênico unindo as placas de tecido mineralizado. O tecido ainda está
se organizando para formação óssea. No detalhe superior da figura observa-se
fibras que formam feixes e que estão calcificando. O detalhe inferior da figura mostra
uma região onde a calcificação já ocorreu, podendo-se observar um tecido bastante
compacto, apresentando vários glóbulos que coalesceram.
158
FIG. 4.32 Defeito controle da cobaia sem inserção de material: (a) 30 dias
(aumento de 250x, 200 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm) (b) 60 dias
(aumento de 40x, 1 mm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm); (c) 90 dias (aumento
de 100x, 500 µm, detalhes aumento de 1.000x, 50 µm). (PO – periósteo; EO – endósteo;
OA – osso antigo; TPO – tecido com potencial osteogênico; TPOO – tecido com potencial
TPO
TPOO
TPO
PO
TPO
EO
TPO
TPO
TPO
TM
TM
TM TM
TPO
TPO
TPO
TM
OA
Defeito
159
osteogênico organizado; TM – tecido mineralizado).
4.2.2. MICROSCOPIA ÓPTICA
A análise por microscopia óptica de luz transmitida das secções da calvária de
coelho obtidas após a inserção dos materiais durante 30, 60 e 90 dias mostrou
vários níveis de formação óssea. Não foram identificados sinais de resposta
inflamatória adversa, nem de qualquer tipo reação aos materiais (FIG.s 4.33, 4.35,
4.37, 4.39, 4.41 e 4.43). Todas as amostras foram posicionadas no microscópio de
forma que a face externa da calvária ficasse voltada para baixo.
Os quatros marcadores ósseos utilizados facilitaram a visualização e análise das
amostras avaliadas. Entretanto, a utilização do filtro para detecção de comprimentos
de onda de 450-490 nm (espectro azul) impediu a visualização da banda marcada
por azul de calceína (FIG. 4.34, 4.36, 4.38, 4.40, 4.42 e 4.44). Esta banda de
fluorescência foi observada com o filtro para detecção de comprimento de onda de
340-380 nm (espectro violeta), mas para fins comparativos da taxa de deposição
mineral este marcador não foi utilizado, pela necessidade da presença de pelo
menos dois marcadores diferentes na mesma imagem (SERRA, 2007).
A microscopia de fluorescência mostrou aumento gradual de depósitos dos
marcadores. Após 30 dias, pode-se visualizar um osso fracamente marcado. Os
grupos de 90 dias mostraram marcadores bem definidos. Estes resultados estão de
acordo com aqueles apresentados na literatura (BERTOLI, 2007; SERRA, 2007).
Na FIG. 4.33 mostra-se o grupo do PLDLLA observado por microscopia de luz
transmitida. O material preencheu bem o defeito, deixando poucos espaços vazios e
foi capaz de manter a espessura do defeito criado após os três tempos analisados,
mas a formação óssea não foi intensa, resultado confirmado pela microscopia de
fluorescência (FIG. 4.34). Nesta figura pode-se observar que as ilhas de formação
óssea ainda não tinham coalescido. O processo de cicatrização ocorreu das bordas
do defeito para centro, conforme relatado na literatura (NARANG e LASKIN, 1976;
KAMAKURA et al., 1999; MOON et al., 2006; BERTOLI, 2007). Na parte mais central
do defeito, observa-se tecido conjuntivo unindo as bordas do defeito e as partículas.
160
Inúmeros estudos relataram a ocorrência de efeitos colaterais decorrentes da
biodegradação dos biopolímeros alifáticos, tais como: formação de granulomas,
reações alérgicas e de corpo estranho, assim como a presença de cápsula fibrosa
envolvendo o material implantado (BERGSMA et al., 1993; HASEGAWA et al.,
2002). No presente estudo, os cortes histológicos revelaram ausência de células
inflamatórias e reações de corpo estranho ao redor das partículas do PLDLLA.
Foi predominante a presença de células ósteo-progenitoras ao redor dos
grânulos de material implantado. Algumas partículas próximas à borda do defeito se
encontravam englobadas por tecido ósseo. Nas regiões localizadas mais ao centro,
o tecido mineralizado ainda não pode ser identificado nos três tempos avaliados.
Tais achados refletem a perfeita sincronia do processo regenerativo, uma vez que
células inflamatórias, especificamente neutrófilos, só deveriam ser encontradas
durante as primeiras 48 horas após o procedimento cirúrgico. Este infiltrado
representa o primeiro exército de células inflamatórias e são substituídos pelos
macrófagos que eventualmente participam do processo final de degradação dos
cristais remanescentes (BERGSMA et al., 1993). Os tempos avaliados neste
trabalho não permitiram tal constatação, já que a morfologia dos grânulos se
encontrava ainda preservada, sem sinais de degradação.
No ciclo regenerativo ósseo, a liberação de fatores de crescimento estimula a
angiogênese, que favorece a manutenção do pH local pela drenagem dos
metabólitos a partir do 21º dia pós-injúria (DAVIES e HOSSEINI, 2000). As figuras
mostradas indicam que o desenvolvimento de osso medular garantiu a
vascularização durante o período experimental. Essa infra-estrutura de capilares
atua como via de drenagem para os produtos de degradação, provenientes do
metabolismo anaeróbio na área em regeneração, assim como favorece a migração
de células mesenquimais a partir da medula e do periósteo, que regulam
diretamente a regeneração óssea (DAVIES, 1998; JUNQUEIRA e CARNEIRO,
2004).
161
FIG. 4.33 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de PLDLLA inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
A FIG. 4.34a mostra um espécime ósseo após 30 dias preenchido com PLDLLA.
Os marcadores ósseos estão fracamente definidos, mas é possível observar a
marcação da oxitetraciclina (amarelo pouco definido) e alizarina (vermelho). O
162
xilenol não foi observado, por ter sido o último marcador a ser administrado e a
deposição mineral não ter ocorrido, a eutanásia ocorreu poucos dias depois.
FIG. 4.34 Microscopia de Fluorescência da amostra de PLDLLA inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
(oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol – laranja).
Na FIG. 4.34b pode-se observar os três marcadores fluorescentes mais
intensos, oxitetraciclina (amarelo), alizarina (vermelho) e xilenol (laranja). Nesta
163
imagem, percebe-se que a formação óssea além de ocorrer das bordas do defeito
para o centro, ela também aconteceu ao redor das partículas do PLDLLA, sugerindo
que o material apresenta osteocondutividade. Também é possível identificar vários
osteócitos nas margens do defeito. Esta situação se manteve no grupo de 90 dias
(FIG. 4.34c).
As células mesenquimais, de alto potencial osteogênico e migratório, são
conduzidas ao longo da matriz extra-celular rica em colágeno até a superfície dos
grânulos do material (LIMA, 2004). O potencial migratório da osteocondução se
restringe ao inicio da síntese protéica quando as células mesenquimais se
diferenciam em osteoblastos, células maduras (DAVIES e HOSSEINI, 2000).
Nas FIG.s 4.35 e 4.36 mostram-se os cortes histológicos do PLDLLA associado
com o BG1, observados por microscopia de luz transmitida e de fluorescência. Neste
grupo percebe-se que a manutenção da espessura da calota craniana não foi
mantida, como ocorreu no grupo do PLDLLA utilizado sozinho. Isso poderia ser
explicado pelo fato das partículas de BG1 terem sido degradadas ou fagocitadas
pelos macrófagos (DAVIES e HOSSEINI, 2000; VOGEL et al., 2001; CERRUTI, M.
G. et al., 2005; XIA et al., 2006). Relatos na literatura têm demonstrado que
partículas com diâmetro menor do que 100 µm apresentam uma fraca resposta de
regeneração óssea (MOON et al., 2006). Já as partículas de do biopolímero
apresentaram sua morfologia ainda preservada, sem sinais aparentes de
degradação.
Os materiais foram misturados em uma proporção de 1:1 e durante a cirurgia, o
defeito foi totalmente preenchido pelos dois materiais. As partículas de PLDLLA
podem ser claramente identificadas (partículas maiores), mas as de BG1 são de
mais difícil identificação (partículas quatro vezes menores do que as do material
polimérico). Após a dissolução do vidro bioativos, o espaço entre os grânulos de
PLDLLA ficou maior e foi preenchido por tecido conjuntivo. Esta situação se manteve
similar para os três tempos avaliados (30, 60 e 90 dias).
Mostra-se na FIG. 4.34 mostra o grupo do PLDLLA + BG1 observados pela
microscopia de luz transmitida. Ilhas de formação óssea também foram observadas
e estas ainda não tinham coalescido. O processo de cicatrização ocorreu das bordas
para o meio do defeito (NARANG e LASKIN, 1976; KAMAKURA et al., 1999; MOON
et al., 2006; BERTOLI, 2007). Estes resultados foram confirmados pela microscopia
164
de fluorescência.
Como observado nos grupos anteriores (PLDLLA 30, 60 e 90 dias) os cortes
histológicos revelaram ausência de células inflamatórias e reações de corpo
estranho ao redor das partículas. As células ósteo-progenitoras puderam ser
identificadas ao redor dos grânulos, tanto de PLDLLA como das poucas partículas
de BG1 presentes. Algumas partículas mais próximas à borda do defeito se
encontravam englobadas por tecido ósseo. Naquelas localizadas mais ao centro, o
tecido mineralizado ainda não pode ser identificado nos três tempos avaliados.
Os resultados obtidos com a inserção do compósito se mostraram inferiores aos
do PLDLLA utilizado sozinho. A intenção ao misturar o material polimérico e o
cerâmico foi tentar neutralizar os subprodutos ácidos da degradação do biopolímero
pela ação básica dos subprodutos do vidro bioativo, mantendo o pH próximo ao nível
fisiológico, bem como melhorar as propriedades osteocondutoras do biopolímero
(AGRAWAL e ATHANASIOU, 1997; LAURENCIN e LU, 2000). As propriedades
entretanto não foram melhoradas e sim pioraram, devido ao tamanho da partícula do
BG1, que também pode ter ajudado a diminuir o pH do local, dificultando assim a
regeneração óssea.
Como no grupo anterior, a microscopia de fluorescência mostrou um aumento
gradual de depósitos dos marcadores. Após 30 dias, pode-se visualizar um osso
fracamente marcado. O grupo de 90 dias mostrou marcadores fluorescente bem
definidos, mas as marcação foram mais identificadas nas bordas do defeito. Os
osteócitos foram visualizados nas bordas.
Mostra-se nas FIG.s 4.37 e 4.38 os cortes histológicos do BG1, observados por
microscopia de luz transmitida e de fluorescência. Neste grupo percebe-se que a
manutenção da espessura da calota craniana foi parcialmente preservada, mas esta
manutenção foi devido ao tecido conjuntivo. O material, devido ao tamanho das
partículas, não conseguiu restaurar a resistência mecânica similar ao osso antigo.
Parte das partículas de BG1 foi mantida, enquanto parte foi perdida (DAVIES e
HOSSEINI, 2000; VOGEL et al., 2001; CERRUTI, M. G. et al., 2005; XIA et al.,
2006).
165
FIG. 4.35 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de PLDLLA + BG1
inserida na calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
166
FIG. 4.36 Microscopia de Fluorescência da amostra de PLDLLA + BG1 inserida
na calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
(oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho; xilenol – laranja).
Como nos grupos anteriores, a cicatrização do defeito ósseo ocorreu das bordas
para o meio. Foi possível identificar ilhas de tecido ósseo originadas a partir da
bioatividade e osteocondutividade do vidro bioativo, conforme relatado na literatura
(SCHEPERS et al., 1991; WILSON e LOW, 1992; SCHEPERS et al., 1993; HENCH
e WEST, 1996; FURUSAWA e MIZUNUMA, 1997; SCHEPERS e DUCHEYNE,
1997; XYNOS et al., 2001; BOSETTI e CANNAS, 2005). Os osteócitos também
foram identificados, demonstrando maturação óssea ocorrendo da borda para o
centro.
167
FIG. 4.37 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de BG1 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
O BG2 foi capaz de manter a espessura do defeito na calvária dos coelhos.
Após 30 dias, esta manutenção foi mais eficaz. Após este tempo, o material não
sofreu degradação (FIG. 4.39a). Após 60 dias, algumas partículas de BG2
diminuíram de tamanho e outras desapareceram, devido ao processo de
degradação. A calvária deste animal também era mais fina do que dos outros
animais (FIG. 4.39b). Após 90 dias um menor número de partículas foi visualizado
(FIG. 4.39c).
168
FIG. 4.38 Microscopia de Fluorescência da amostra de BG1 inserida na calvária
de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina –
amarelo; alizarina – vermelho; xilenol – laranja).
Como nos grupos anteriores a regeneração óssea após 90 dias ocorreu das
bordas para o centro dos defeitos e do periósteo. Ilhas de tecido ósseo foram
identificadas ao redor das partículas, comprovando a bioatividade e
osteocondutividade do material relatada anteriormente na literatura (SCHEPERS et
al., 1991; WILSON e LOW, 1992; SCHEPERS et al., 1993; HENCH e WEST, 1996;
FURUSAWA e MIZUNUMA, 1997; SCHEPERS e DUCHEYNE, 1997; XYNOS et al.,
2001; BOSETTI e CANNAS, 2005). O osso neoformado ainda se apresentou
bastante desorganizado, mesmo após 90 dias in vivo (FIG.s 4.39a, b, c).
169
FIG. 4.39 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de BG2 inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
Mostra-se na FIG. 4.40a um espécime ósseo de 30 dias após o preenchimento
com BG2. Os marcadores ósseos estão fracamente definidos, mas é possível
observar a marcação da oxitetraciclina (amarelo pouco definido) e alizarina
(vermelho). O xilenol não foi observado, por ter sido o último marcador a ser
170
administrado e a deposição mineral não ter ocorrido, a eutanásia ocorreu poucos
dias depois. Os resultados foram semelhantes aos do PLDLLA
No corte histológico do espécime ósseo do BG2 após 60 dias inseridos na
calvária de coelho (FIG. 4.40b), pode-se observar os três marcadores fluorescentes
mais intensos, oxitetraciclina (amarelo), alizarina (vermelho) e xilenol (laranja). Nesta
figura, visualiza-se que a formação óssea além de ocorrer das bordas do defeito
para o centro, também ocorreu ao redor das partículas do BG2, sugerindo que o
material apresenta osteocondutividade e bioatividade corroborando os resultados da
literatura (SCHEPERS et al., 1991; WILSON e LOW, 1992; SCHEPERS et al., 1993;
HENCH e WEST, 1996; FURUSAWA e MIZUNUMA, 1997; SCHEPERS e
DUCHEYNE, 1997; XYNOS et al., 2001; BOSETTI e CANNAS, 2005). Também é
possível identificar vários osteócitos nas margens do defeito. Esta situação se
manteve no grupo de 90 dias, mas a alizarina foi melhor identificada (FIG. 4.40c).
A caracterização dos biovidros testados mostrou que ambos os materiais
apresentaram composições similares. A morfologia das partículas do BG2 se
mostrou representativa em termos de forma e distribuição de tamanho para
utilização em regeneração óssea em cirurgias maxilo-faciais. Os resultados estão de
acordo com Kim et al (KIM et al., 2007). As pequenas diferenças identificadas in vitro
podem explicar os resultados in vivo diferentes. As partículas de BG1 eram
significantemente menores do que as do BG2 e estas pequenas partículas podem
ter levado a uma resposta hospedeiro-material inapropriada.
A HAP sintética porosa foi o último material a ser pesquisada. Após 30 dias
(FIG. 4.41a), foi possível identificar intensa formação óssea, bem como a presença
de várias partículas do material. Além do processo da regeneração óssea ocorrer
das bordas para o centro do defeito, observa-se um processo mais acentuado
advindo do periósteo. Foi possível identificar ilhas ósseas ao redor de alguns
grânulos de HAP e partículas envolvidas por tecido conjuntivo. Este resultado difere
do encontrado por Bertoli (BERTOLI, 2007). O material utilizado no relato da
literatura foi uma hidroxiapatita de origem bovina associada ao colágeno do tipo I,
isto poderia explicar a diferença nos resultados. Os resultados do presente estudo
também foram evidentes na microscopia de fluorescência (FIG. 4.42a). Os
marcadores ósseos foram identificados nas bordas do defeito, próximo ao periósteo
e ao redor das partículas do material.
171
FIG. 4.40 Microscopia de Fluorescência da amostra de BG2 inserida na calvária
de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina –
amarelo; alizarina – vermelho; xilenol – laranja).
O corte histológico representando o grupo de 60 dias é apresentado na
172
FIG. 4.42b. Neste caso como no grupo de 60 dias do BG2, a espessura da calvária
foi mais fina quando comparada com outros grupos. Mesmo padronizando o modelo
animal, pode-se observar diferenças entre cada indivíduo e isto poderia explicar a
diferença na espessura da calvária. Neste grupo foi possível identificar osteócitos
presentes nas ilhas no interior do defeito, bem como nas bordas do defeito. Além do
processo da regeneração óssea ocorrer das bordas para o centro do defeito e do
periósteo (FIG. 4.42b). Foi possível identificar ilhas ósseas ao redor de alguns
grânulos de HAP, que estavam em menor quantidade, quando comparado com o
grupo de 30 dias, mas em quantidade equivalente ao grupo de 90 dias.
O grupo de 90 dias foi o que apresentou maior formação óssea, e foi possível
observar que o tecido ósseo neoformado oriundo das bordas e do periósteo se uniu
no centro do defeito. Este ainda se mostrava desorganizado, porque as ilhas ósseas
observadas nos grupos de 30 e 60 dias cresceram de tal forma, que uma entrou em
contato com a outra. Algumas partículas de HAP ainda estavam presentes após 90
dias (FIG. 4.41c). Estes resultados também foram evidentes na microscopia de
fluorescência (FIG. 4.42c). Os marcadores ósseos foram identificados ao longo de
todo o defeito e ao redor das partículas do material.
Nas amostras de HAP usadas como suporte para a formação óssea foi possível
confirmar sua propriedade osteocondutora, propriedade esta confirmada, por meio
da análise com microscopia de luz transmitida. Verificou-se a proliferação rápida de
tecido conjuntivo em todos os sítios que receberam o enxerto e, em maior ou menor
quantidade, ocorreu formação óssea ao redor das partículas de HAP. Este fato foi
confirmado na análise das secções pela microscopia de fluorescência, pois as linhas
demarcadas pela oxitetraciclina, alizarina e pelo xilenol estavam presentes ao redor
da HA, o que está de acordo com inúmeros relatos na literatura (MINABE et al.,
1988; MEHLISCH, 1989; KLINGER et al., 1998; HALLMAN et al., 2001; TACHIBANA
et al., 2003; CARDAROPOLI et al., 2005; GOSAIN et al., 2005; HSU et al., 2005;
RIBEIRO et al., 2005; SILVA et al., 2005). Com os resultados histológicos obtidos,
não foi possível afirmar se a formação óssea ocorreu somente devido à
osteocondução ou se houve a liberação de alguma substância química
osteoindutora.
173
FIG. 4.41 Microscopia de Luz Transmitida da amostra de HAP inserida na
calvária de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
174
FIG. 4.42 Microscopia de Fluorescência da amostra de HAP inserida na calvária
de coelho: (a) 30 dias (10x); (b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina –
amarelo; alizarina – vermelho; xilenol – laranja).
Os maiores atrativos biológicos da HA são a biocompatibilidade, ausência de
toxicidade local e sistêmica, ausência de resposta inflamatória e capacidade de
ligação direta e natural ao tecido ósseo (JARCHO, 1981; THORWARTH,
175
SCHULTZE-MOSGAU et al., 2005); fatores que foram confirmados, do ponto de
vista clínico e histológico, no desenvolvimento desta pesquisa. Na análise com
microscopia de luz, não se evidenciou a presença de células inflamatórias, nem
reação de corpo estranho, no tecido conjuntivo existente entre as partículas de HA
em quaisquer dos sítios examinados, o que está de acordo com inúmeras citações
na literatura (HARVEY et al., 1985; HOLMES, R. E. e HAGLER, H. K., 1988;
MEHLISCH, 1989; REZENDE et al., 1996; KLINGER et al., 1998; STUANI, 2003;
TACHIBANA et al., 2003; GOSAIN et al., 2005; SCULEAN et al., 2005; JENSEN et
al., 2006).
Os resultados do grupo controle podem ser observados nas FIG. 4.43 e 4.44. A
neoformação óssea não foi expressiva no grupo de 30 dias, sendo somente
identificada, em pequena quantidade, nas bordas do defeito, e em pequenas ilhas de
osso próximo às bordas. O interior do defeito sofreu colapso. As bordas foram
unidas por tecido conjuntivo (FIG. 4.43a e 4.44a).
Após 60 dias, a quantidade de osso formado foi mais expressiva do que aquela
observada após 30 dias. A formação óssea foi mais evidente do lado do periósteo e
a partir das bordas. O tecido conjuntivo que unia as bordas do defeito se
apresentava mais denso. Foi possível identificar ilhas de osso neoformado, do lado
esquerdo do corte histológico, a mesma já estava integrada com o osso oriundo da
borda (FIG. 4.43b e 4.44b).
A neoformação óssea observada após 90 dias foi maior do que aquela presente
nos grupos de 30 e 60 dias. As projeções ósseas das bordas, bem como as ilhas se
encontram mais numerosas, mas ainda não estão integradas como foi observado no
grupo de 90 dias da HAP. O novo osso apresentou espaços medulares numerosos e
grandes (FIG. 4.43c). Estes resultados também foram evidentes na microscopia de
fluorescência (FIG. 4.44c). Apesar de o defeito ter sido confeccionado no tamanho
crítico, o periósteo foi mantido integro e foi reposicionado após a cirurgia. Isto
explicaria porque ocorreu a regeneração óssea do grupo controle de 90 dias.
Com os cuidados clínicos durante e após os procedimentos cirúrgicos
experimentais, com o uso de antibioticoterapia e o controle de infecção, obteve-se
cicatrização normal em todos os sítios enxertados, bem como nos sítios controle,
sem qualquer sinal clínico ou histológico de inflamação. Isto demonstra a
biocompatibilidade dos materiais utilizados, conforme já relatado na literatura
176
(JARCHO, 1981; HARVEY et al., 1985; HOLMES, R. e HAGLER, H., 1988;
MEHLISCH, 1989; REZENDE et al., 1996; KLINGER et al., 1998; TACHIBANA et al.,
2003; GOSAIN et al., 2005; SCULEAN et al., 2005; THORWARTH, SROUR et al.,
2005; JENSEN et al., 2006). Outro fator de grande relevância que contribuiu para a
cicatrização tecidual completa foi a preservação do periósteo durante a cirurgia, bem
como o recobrimento completo da ferida com a sutura realizada em camadas:
periósteo, tecido muscular, tecido subcutâneo e pele (RESENDE et al., 2006). O
periósteo constitui membrana fundamental durante o processo de cicatrização, pois
fornece capilares e células para o reparo ósseo (COTTRELL e WOLFORD, 1998;
KLINGER et al., 1998; STUANI, 2003; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Esse dado
foi confirmado na análise histológica dos resultados, verificando-se que, na maioria
dos sítios avaliados, tanto controle como experimentais, havia concentração maior
de osso neoformado adjacente ao periósteo do que no lado da membrana dura-
máter; fato também já observado por outros autores (KLINGER et al., 1998).
Além da influência do controle de infecção, da integridade do periósteo e
proteção da ferida cirúrgica, outro fator considerado para a cicatrização tecidual
favorável, em todos os defeitos, foi a confecção dos defeitos ósseos sob intensa
refrigeração. O aquecimento excessivo durante esse procedimento pode ocasionar
necrose e dificultar a neoformação óssea (PETTERSON, 1998; STUANI, 2003).
Os sítios cirúrgicos experimentais foram preenchidos de modo completo pelos
materiais de enxerto. Todos os defeitos apresentaram maior espessura do que nos
sítios controle; além da consistência sólida e perfeitamente aderida ao osso
adjacente, confirmada pela palpação firme do local, exceto o grupo do BG1 que se
apresentou similar ao grupo controle. Os sítios controle mostraram-se com uma
espessura muito fina e bem distinguida do tecido ósseo hospedeiro. A manutenção
do volume local é uma propriedade desejável, em especial nas cirurgias para
aumento do rebordo alveolar (DEEB e ROSZKOWSKI, 1988; 1989; TAYLOR e
HELFRICK, 1989; RIBEIRO et al., 2005).
A superfície dos materiais pesquisados também poderia explicar as diferenças
dos resultados obtidos anteriormente. É um consenso geral que a rugosidade da
superfície dos biomateriais exerce um papel importante nos estágios iniciais da
cicatrização de feridas, onde a dinâmica molecular e a adesão celular podem levar a
diferentes cinéticas de cicatrização. Especificamente, para materiais para enxerto
177
ósseo, pesquisas anteriores relataram que superfícies mais ásperas favorecem a
adesão de osteoblastos. Estudos in vitro e in vivo mostraram que superfícies
ásperas foram capazes de permitir a formação de maior volume ósseo pouco tempo
após a inserção de biomateriais (HENCH e WILSON, 1993b; DAVIES, 2007).
Pesquisas recentes com biomateriais têm sido realizadas no sentido de aprimorar a
textura superficial deles, bem como criar modificações químicas nelas, para
melhorar seus resultados nos estágios iniciais do processo de cicatrização. Nesta
fase o biomaterial fica exposto a um meio de cicatrização da ferida / defeito mais
agressivo (ALBREKTSSON T, WENNERBERG A., 2004; ALBREKTSSON T,
WENNERBERG A, 2004).
FIG. 4.43 Microscopia de Luz Transmitida da amostra controle: (a) 30 dias (10x);
(b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x).
178
FIG. 4.44 Microscopia de Fluorescência da amostra controle: (a) 30 dias (10x);
(b) 60 dias (10x); (c) 90 dias (10x). (oxitetraciclina – amarelo; alizarina – vermelho;
xilenol – laranja).
O tamanho das partículas é outro fator importante na extensão de formação de
osso novo. Os efeitos do tamanho das partículas de materiais para enxerto ósseo já
foram bem documentados e foram mostrados com vários materiais com diferentes
composições (GAUTHIER et al., 1998; MOON et al., 2006). Mankani e
colaboradores (MANKANI et al., 2001) avaliaram Ca-P bifásico variando de 44 –
2000 µm associado com células mesenquimais de osso trabecular. O pico de
formação óssea foi com partículas entre 100 – 250 µm e nenhuma formação óssea
179
foi observada abaixo do limiar de 44 µm. Os resultados de estudo realizado por
Moon e colaboradores (MOON et al., 2006) mostraram que as partículas de Ca-P
maiores (400 µm) foram mais eficazes na formação ósseo, com mínima resposta
inflamatória quando comparados com partículas de 40 µm.
4.2.3. MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µCT)
Nos últimos anos, a µCT tem sido utilizada para investigar quantitativamente a
estrutura óssea trabecular em 3D nos meios fisiológicos e patológicos (GAUTHIER
et al., 2005). Em vários estudos, os resultados obtidos com µCT apresentam alta
correlação com a histologia convencional para imagens e quantificação da estrutura
de osso trabecular de biópsias ósseas humanas e do osso trabecular animal
(MULLER e RUEGSEGGER, 1997; MULLER et al., 1998). Esta técnica também tem
sido utilizada para avaliar procedimento de regeneração óssea em cicatrização de
fraturas (GABET et al., 2004), alterações no osso trabecular em diferentes condições
experimentais (GAUTHIER et al., 2005), bem como em estudos in vivo em modelos
animais (DAVID et al., 2003).
Estudos anteriores in vivo em animais testando materiais para enxerto ósseo
usando a µCT como uma análise 3D foram realizados na porção distal do fêmur de
coelhos (GAUTHIER et al., 2005; VAN LENTHE et al., 2007), na mandíbula de
coelho (LU e RABIE, 2003), em ratos (DAVID et al., 2003; ABE et al., 2007), na
órbita de porcos (ROHNER et al., 2003) ou em crânios de cachorros (ITOKAWA et
al., 2007). Os tempos de cicatrização também foram diferentes daqueles utilizados
no presente estudo. Todos os estudos feitos com coelhos apresentaram somente
um tempo de cicatrização, de 6 semanas (GAUTHIER et al., 2005; VAN LENTHE et
al., 2007) ou 3 meses (LU e RABIE, 2003). Os estudos desenvolvidos com tempos
de cicatrização diferentes, não foram no mesmo modelo animal (DAVID et al., 2003;
ABE et al., 2007; ITOKAWA et al., 2007). Com isso, uma comparação direta entre os
resultados obtidos no presente estudo e aqueles descritos na literatura não pode ser
feita.
As reconstruções em 3D e os resultados do preenchimento ósseo dos defeitos
180
cirurgicamente confeccionados obtidos com os diferentes materiais são mostrados
na TAB. 4.5 e nas FIG.s 4.45 até 4.50. Todos os grupos exceto o grupo controle
mostraram uma diminuição na formação óssea com 60 dias. Isto poderia ser
explicado devido à remodelação óssea do coelho que é de 42 dias (ROBERTS et al.,
1989).
TAB. 4.5 Resultado da µCT após a análise de reconstrução em 3D.
Grupos Volume
total
Volume
ósseo
VO / VT
Preenchimento
Ósseo%
30 dias 157,74 34,39 0,22 21,80
PLDLLA 60 dias 140,53 19,22 0,14 13,68
90 dias 206,54 37,51 0,18 18,16
30 dias 221,05 55,04 0,25 24,90
PLDLLA + BG1 60 dias 196,87 15,80 0,08 8,02
90 dias 193,56 27,61 0,14 14,26
30 dias 169,24 33,47 0,20 19,78
BG1 60 dias 182,52 13,81 0,08 7,57
90 dias 190,11 27,20 0,14 14,31
30 dias 182,29 93,93 0,52 51,53
BG2 60 dias 184,07 28,21 0,15 15,32
90 dias 175,50 61,09 0,35 34,81
30 dias 191,21 60,09 0,31 31,43
HAP 60 dias 229,04 33,16 0,15 14,48
90 dias 169,21 58,20 0,34 34,40
30 dias 173,07 17,62 0,10 10,18
CONT 60 dias 227,40 37,07 0,16 16,30
90 dias 165,87 32,34 0,20 19,50
O material que resultou em uma maior formação óssea com 30 dias foi o BG2,
seguido pela HAP, PLDLLA + BG1, BG1 e grupo controle. Após 60 dias de
implantação, a maior quantidade de formação óssea foi observada no grupo
controle, seguido pelo BG2, HAP, PLDLLA, PLDLLA + BG1 e BG1. Após 90 dias de
experimento, o BG2 foi novamente o material com maior formação óssea, seguido
pela HAP, Controle, PLDLLA, BG1 e PLDLLA + BG1.
181
FIG. 4.45 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo PLDLLA:
(a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d) 60
dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias,
vista lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
Os estudos com apenas um tempo de avaliação mostraram que após 60 dias foi
possível observar o desenvolvimento osso “de novo” dentro dos defeitos
experimentais (GAUTHIER et al., 2005; VAN LENTHE et al., 2007). Este osso novo
cresceu em perfeita continuidade com o osso trabecular adjacente do hospedeiro e
se espalhou homogeneamente para o interior do volume do defeito. No presente
182
estudo, foi também observado que o osso formado estava em perfeita continuidade
com o osso trabecular adjacente e que também havia formação óssea nos defeitos
(FIG.s 4.45 a 4.50).
FIG. 4.46 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo PLDLLA +
BG1: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d)
60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias,
vista lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
183
Apesar do primeiro tempo de análise da regeneração óssea no presente
trabalho ter sido de 30 dias, todos os materiais induziram a formação óssea, sendo o
grupo controle aquele que apresentou a menor quantidade de preenchimento ósseo.
Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que analisaram a
regeneração após 45 dias depois a cirurgia (GAUTHIER et al., 2005; VAN LENTHE
et al., 2007).
FIG. 4.47 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo PLDLLA +
BG1: (a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d)
60 dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias,
vista lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
184
Após 60 dias, todos os materiais induziram menor formação óssea em relação
aos grupos de 30 dias (TAB. 4.5). Pode-se especular que neste tempo, a interação
hospedeiro / biomaterial possivelmente resultou em aumento da resposta
inflamatória, que pode ter resultado em aumento de produtos ácidos da degradação
dos materiais na região da ferida. Tal aumento dos subprodutos levou à diminuição
temporária do pH, mudando drasticamente a dinâmica de reparo ósseo na área
enxertada (AGRAWAL e ATHANASIOU, 1997). Este resultado é suportado pelo fato
de somente o grupo controle ter apresentado aumento na quantidade de osso em
60 dias quando comparado com o grupo de 30 dias. Outra explicação poderia ser o
tempo de remodelação óssea do coelho, que é de 42 dias (ROBERTS et al., 1989).
Com o remodelamento ósseo menor percentual de osso pode ser observado.
Após 90 dias de cicatrização, todos os grupos mostraram maior preenchimento
ósseo em relação aos grupos de 60 dias. Entretanto, o único material que induziu
mais formação óssea quando comparado com os grupos de 30 dias foi a HAP
(TAB. 4.5).
Os melhores resultados para o BG2 e a HAP pode ser devido ao tamanho de
suas partículas (TAB. 4.1). O tamanho médio das partículas de PLDLLA foi de
259,6 µm, tamanho este dentro do intervalo entre os valores do tamanho médio das
partículas dos materiais pesquisados mais elevado e mais baixo. O BG1 foi o
material com o menor tamanho de partículas (TAB. 4.1), por causa do pequeno
diâmetro, as partículas degradaram mais rapidamente ou foram fagocitadas pelos
macrófagos e os resultados foram similares aos do grupo controle. Estes resultados
foram confirmados nas outras análises dos resultados in vivo onde partículas de
BG1 não foram observadas (FIG.s 4.28, 4.29, 4.32, 4.34, 4.35, 4.38, 4.40, 4.41 e
4.44) (DAVIES e HOSSEINI, 2000; VOGEL et al., 2001; XIA et al., 2006).
Tradicionalmente os biovidros têm sido utilizados em aplicação médicas ou na forma
de estrutura (STANLEY et al., 1997) ou em grânulos maiores do que 100 µm de
diâmetro como materiais para formação óssea (LOVELACE et al., 1998).
185
FIG. 4.48 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo BG2: (a)
30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d) 60 dias,
vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista
lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
Nas imagens dos grupos do PLDLLA + BG1, somente as partículas do PLDLLA
foram observadas (FIG. 4.28, 4.34 e 4.40). Nestes grupos, as partículas de BG1
também degradaram mais rapidamente do que deveriam. As imagens de todos os
outros grupos mostraram que as partículas dos materiais ainda estavam presentes
no defeito e precisariam de mais tempo para ser reabsorvidas.
186
FIG. 4.49 Microtomografia computadorizada dos espécimes contendo HAP: (a)
30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d) 60 dias,
vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias, vista
lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
Pode se observar que para todos os grupos de materiais e para os três tempos
avaliados, o processo de cicatrização óssea ocorreu das bordas para o centro do
defeito, mas ilhas de osso puderam ser observadas no interior dos defeitos. A
formação óssea foi mais intensa do lado externo do que do lado interno. O periósteo
se mostrou mais eficaz na cicatrização do defeito do que o endósteo. Isso poderia
187
ser explicado devido ao periósteo ser fonte de células mesenquimais que se diferem
em células com potencial osteogênico e osteoblastos (HOLY et al., 2000; BERTOLI,
2007).
FIG. 4.50 Microtomografia computadorizada dos espécimes do grupo controle:
(a) 30 dias, vista lateral; (b) 30 dias, vista externa; (c) 30 dias, vista interna; (d) 60
dias, vista lateral; (e) 60 dias, vista externa; (f) 60 dias, vista interna; (g) 90 dias,
vista lateral; (h) 90 dias, vista externa; (i) 90 dias, vista interna.
188
4.2.4. RELAÇÕES ENTRE OS RESULTADOS IN VITRO E IN VIVO
As relações entre os resultados in vitro e in vivo estão resumidas na TAB. 4.6.
TAB. 4.6 Relações entre os resultados in vitro e in vivo após 90 dias.
Material Tamanho das
Partículas
Cristalinidade
(Ensaio)
Rugosidade
superficial (Ensaio)
Degradação in vitro / in
vivo (Ensaio)
Biocompatibilidade /
Osteocondução (Ensaio)
Regeneração
óssea * (Ensaio)
PLDLLA após a
moagem
Favorável à
regeneração óssea.
Sim
(DSC, FTIR, DRX,
GPC).
Sim, favorecendo a
colonização por células
osteogênicas (MEV).
Insignificante (MEV, GPC) /
Insignificante (MEV, MF,
MLT).
Sim / Sim
(MEV, MF, MLT)
Sim - 2
(MF, MLT, µCT)
PLDLLA após a
moagem + BG1
PLDLLA – favorável à
regeneração óssea.
BG1 – desfavorável à
regeneração óssea.
PLDLLA – Sim
(DSC, FTIR, DRX,
GPC).
BG1 – Não (DRX)
Sim, favorecendo a
colonização por células
osteogênicas (MEV).
PLDLLA – Insignificante
(MEV, MF, MLT).
BG1 – Ausência de
partículas menores (MEV,
MLT) e erosão das
partículas maiores (MEV).
Sim / Sim
(MEV, MF, MLT)
Sim - 3
(MF, MLT, µCT)
BG1 Desfavorável à
regeneração óssea.
Não (DRX) Sim, favorecendo a
colonização por células
osteogênicas (MEV).
Ausência de partículas
menores. Superfície mais
lisa das partículas maiores
(MEV) / Ausência de
partículas menores (MEV,
MLT) e erosão das
partículas maiores (MEV).
Sim / Sim
(MEV, MF, MLT)
Sim – 3
(MF, MLT, µCT)
BG2 Favorável à
regeneração óssea.
Não (DRX) Sim, favorecendo a
colonização por células
osteogênicas (MEV).
Superfície mais lisa com
trincas e exposição de outra
fase do material (MEV) /
Gradual com o decorrer do
tempo (MF, MLT).
Sim / Sim
(MEV, MF, MLT)
Sim – 1
(MF, MLT, µCT)
HAP Favorável à
regeneração óssea.
Resultados
sugerem baixa
cristalinidade
(DRX, MF, MLT).
Sim, favorecendo a
colonização por células
osteogênicas (MEV).
Redução do tamanho dos
aglomerados (MEV). In vivo,
degradação equivalente à
taxa de regeneração óssea
(MF, MLT).
Sim / Sim
(MEV, MF, MLT)
Sim – 1
(MF, MLT, µCT)
* - 1 – Maior preenchimento ósseo; 2 – Preenchimento ósseo intermediário; 3 – Menor preenchimento ósseo.
189
4.2.4.1. PLDLLA
O copolímero PLDLLA utilizado na presente pesquisa foi composto pelo
homopolímero poli (ácido L-lático) (PLLA) e pelo copolímero poli (ácido DL-lático)
(PLDLA) na proporção de 70/30, conforme especificação do fabricante. A
composição do material em estudo com uma fração de 70% do homopolímero
semicristalino confere ao material um grau de cristalinidade maior do que aquele
observado em amostras compostas exclusivamente de PLDLA (GARLOTTA, 2001).
A caracterização do copolímero realizada pelas análises de DSC, FTIR e DRX
confirmou esta cristalinidade. A moagem criogênica aumentou o grau de
cristalinidade como mostrado pelas análises de DSC, FTIR e GPC.
O tempo de degradação de um polímero semicristalino é maior do que o de um
polímero amorfo, devido ao maior grau de organização da rede cristalina, conforme
relatado na literatura por diversos autores (DANIELS et al., 1990; BERGSMA, DE
BRUIJN et al., 1995; MIDDLETON e TIPTON, 2000; GARLOTTA, 2001;
SÖDERGÅRD e STOLT, 2002), podendo o material permanecer in vivo sem
alterações significantes durante meses ou até anos (BERGSMA, DE BRUIJN et al.,
1995; ATHANASIOU et al., 1996). Esta cristalinidade do material observada nos
ensaios in vitro aponta na direção de que o material in vivo apresente tempo de
degradação elevado, o que se verificou efetivamente. Nas análises por MEV, por MF
e por MLT pode-se observar que as partículas do PLDLLA apresentaram pouco sinal
de degradação, estando presentes após 90 dias, mantendo a espessura do defeito
ósseo criado cirurgicamente.
Laitine et al. (1992) e Landes et al. (2006) determinaram tempos de degradação
do PLDLLA in vivo inferiores ao in vitro (LAITINEN et al., 1992; LANDES et al.,
2006), o que não foi observado nos resultados de MEV in vitro e in vivo do presente
estudo.
A propriedade de osteocondução e a biocompatibilidade foram observadas nos
três grupos experimentais, de 30, 60 e 90 dias (KOKUBO et al., 2003; RIBEIRO,
2005; PASOLINI, 2006). Como a degradação do PLDLLA foi lenta, seus produtos
que poderiam diminuir o pH local e serem um fator negativo para regeneração óssea
(SUGANUMA e ALEXANDER, 1993), contaram com tempo suficiente para serem
190
porabsorvidos pelas células de defesa do organismo e aquelas com potencial
osteogênico puderam colonizar sua superfície. Supõe-se que a superfície do
material foi propícia à colonização por osteoblastos, devido à sua rugosidade
superficial. A rugosidade foi comprovada na análise por MEV in vitro.
Na análise por GPC, observou-se que o peso molecular do polímero foi
praticamente constante até os 60 dias, só decaindo após 90 dias. Este resultado é
interessante para aplicação in vivo, porque, nos primeiro 60 dias no organismo, o
material sofre os maiores ataques. Esta estabilidade do material também foi
observada pela µCT. Em situações, tais como cirurgia de coluna, fixação de fraturas
ósseas (BOS et al., 1989; BERGSMA, DE BRUIJN et al., 1995; LAINE et al., 2004;
ROBBINS et al., 2004), onde seja necessária a manutenção das propriedades
mecânicas do polímero, a degradação mais lenta do material seria muito vantajosa e
mais indicada.
4.2.4.2. COMPÓSITO DE PLDLLA E BIOVIDRO 1
O PLDLLA e o BG1 foram misturados na proporção de 50/50 visando melhorar
as propriedades de ambos os materiais. Segundo alguns autores o PLDLLA não
possui uma superfície propícia à colonização por osteoblastos (SCHLIEPHAKE et
al., 1994; NEJATI et al., 2008), esperando-se então, que a sua mistura com o
biovidro formasse uma camada superficial de Ca-P e conseqüentemente,
desenvolvesse um compósito bioativo que pudesse não só se unir ao osso
(LAURENCIN e LU, 2000), como também neutralizar os produtos de degradação do
PLDLLA, mantendo o pH local no valor fisiológico (SUGANUMA e ALEXANDER,
1993), melhorando assim a resposta tecidual óssea.
Infelizmente isto não foi observado nos resultados in vivo. O preenchimento
ósseo após 90 dias foi inferior aos grupos do PLDLLA e BG1 utilizados sozinhos,
como mostrado pela µCT, possivelmente devido ao pequeno tamanho das partículas
do BG1, uma vez que o PLDLLA manteve o mesmo padrão de comportamento do
observado no grupo do PLDLLA utilizado sozinho, como foi mostrado por MEV, MF,
MLT. O defeito também não foi completamente preenchido pelo material, somente
191
as partículas de PLDLLA puderam ser visualizadas.
Em vez de neutralizar os produtos, as partículas do BG1 se dissolveram ou
foram fagocitadas, contribuindo para uma alteração do pH local e conseqüentemente
prejudicando a neoformação óssea. Desta forma, o compósito criado no presente
estudo não foi tão eficaz no seu propósito devendo ser reformulado e novamente
testado. Na forma proposta, os resultados não foram satisfatórios para recomendar a
sua aplicação como um material para enxerto ósseo.
4.2.4.3. BIOVIDRO 1 E BIOVIDRO 2
Os biovidros utilizados na presente pesquisa possuíam composições diferentes,
o BG1 apresentando uma quantidade de SiO
2
menor do que a do BG2. A sílica está
diretamente relacionada com a bioatividade do material. Quando os níveis de sílica
estão entre 42 – 53% observa-se uma união mais rápida do material com o osso
(HENCH e WILSON, 1993b). O BG2 possuía 45% de sílica, enquanto o BG1 30%. A
recomendação descrita na literatura é que o conteúdo deste componente não
ultrapasse 60%, uma vez que acima desta quantidade não ocorre uma direta união
com o osso. Ambos os biovidros possuíam a propriedade de bioatividade, mas não
foi possível determinar a velocidade de união entre o material e o osso, uma vez que
não era o objetivo do estudo.
Outra diferença na composição dos materiais é a presença de MgO no BG1 e
Na
2
O no BG2. Apesar de a composição ser diferente, a função destes componentes
no vidro bioativo é similar, ou seja, ambos apresentam pequenos efeitos na união do
material com o osso (HENCH e ANDERSSON, 1993). A quantidade de fosfato nos
biovidros também é diferente. Nos primeiros estudos, acreditava-se que o fosfato era
um componente crítico, uma vez que ele ajuda na nucleação de fosfato de cálcio na
superfície do material, mas depois se observou que vitro-cerâmicas com fosfato
numa fase estável, também se apresentam bioativas. Estas diferenças na
quantidade de fosfato não devem ter influenciado nos resultados in vivo.
O tamanho das partículas de um material para utilização em regeneração óssea
é outro fator importante na sua aplicação in vivo (KLAWITTER e HULBERT, 1971;
192
GAUTHIER et al., 1998; LOVELACE et al., 1998; SAIZ et al., 2007). O tamanho das
partículas do BG1 e sua distribuição se mostraram inadequados para neoformação
óssea. Partículas menores do que 100 µm podem ser fagocitadas por macrófagos
(KLEIN et al., 1991) ou serem dissolvidas mais rapidamente. A taxa de dissolução
de SiO
2
aumenta quanto menor o conteúdo deste componente. Isto explicaria
porque a maioria das partículas de BG1 não estava mais presentes após 90 dias,
como foi observado na MEV, MF, MLT. Quanto menores as partículas do vidro
bioativo, maior a liberação de cátions e conseqüentemente um aumento no valor do
pH pode ocorrer deixando o meio básico (HENCH e ANDERSSON, 1993; CERRUTI,
M. et al., 2005), este pH diferente do fisiológico poderia explicar os resultados
obtidos para o BG1 em relação a neoformação óssea MF, MLT, µCT.
Nenhum dos dois biovidros pesquisados resistiu aos ataques iniciais do
organismo, como pode ser observado na µCT, mas proporcionalmente o BG2 foi o
que mais sofreu este ataque. Houve uma redução de 3,4 vezes no preenchimento
ósseo para o BG2, enquanto que para o BG1 a redução foi de 2,6 vezes.
O BG1 não se mostrou adequado na cicatrização do defeito criado
cirurgicamente (MEV, MF, MLT e µCT), apesar de possuir as propriedades
importantes para neoformação óssea (FTIR, DRX). No entanto, ele poderia ser
utilizado no tratamento da doença periodontal, quando se necessita um meio básico
para a neutralização dos produtos ácidos produzidos pelas bactérias causadoras da
doença. Com partículas menores do que 100 µm, os vidros bioativos possuem ação
anti-microbiana e anti-inflamatória (ALLAN et al., 2001; JONES et al., 2001; TAI et
al., 2004).
4.2.4.4. HIDROXIAPATITA
A hidroxiapatita foi incluída no presente estudo, porque ela é o constituinte
inorgânico principal dos ossos (CATE, 1995; MARKS JR. e HERMEY, 1996). A HAP
utilizada foi um material poroso com razão molar Ca-P de 1,67 sem fases
secundárias como observado nas análises por MEV, FTIR e DRX, possivelmente de
baixa cristalinidade para sua aplicação na área de saúde, como visualizada por MF,
193
MLT (MAVROPOULUS, 1999).
A razão molar de 1,67 confere à HA uma estabilidade elevada em solução
aquosa dentro de uma faixa de pH de 4,2 – 8,0 (BEST et al., 2008). A estabilidade
da HAP foi comprovada nas análises in vitro (MEV, FTIR, DRX) e nas in vivo (MF e
MLT).
O tamanho das partículas da HAP foi ligeiramente maior do que aquele
considerado ideal pelos diversos autores, mas se encontrava no limite superior da
faixa considerada ideal (GAUTHIER et al., 1998; HING et al., 1999). As partículas
formavam vários aglomerados, que em solução aquosa foram esfarelando, ficando
no tamanho recomendado na literatura.
A HA é normalmente indicada para o preenchimento de defeitos e em cavidades
ósseas, principalmente quando a solubilidade do Ca-P for mais elevada do que a
taxa de regeneração tecidual (BEST et al., 2008), não atendendo a relação ideal
taxa de degradação versus regeneração óssea, como mostrado na FIG. 4.51. A HAP
apresentou uma taxa de degradação aparentemente equivalente à taxa de
regeneração óssea (MF, MLT), se mostrando o material ideal para o defeito criado
(LU et al., 2002). Como vantagem adicional, os grânulos não reabsorvidos serão
incorporados à estrutura do novo osso formado, sofrendo remodelamento junto com
a estrutura óssea (KLEIN et al., 1991).
FIG. 4.51 Esquema mostrado a relação ideal da taxa de degradação do material
x regeneração óssea. Adaptado do site da empresa Curasan Regenerative Medicine
(CURASAN, 2008).
194
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES
5.1 CONCLUSÕES
Após a análise dos resultados da caracterização e da degradação dos materiais
in vitro e in vivo pode-se concluir que:
1. A moagem criogênica se mostrou eficaz para a redução do tamanho das
partículas de PLDLLA, induziu deformação plástica e causou alterações na (T
g
), (T
m
)
e no calor específico (c). Nenhum composto inorgânico foi incorporado ao material, e
estas alterações não influenciaram nas propriedades osteocondutivas do material,
como pode ser observado nos resultados in vivo.
2. A distribuição de tamanho de partículas apresentou distribuição polimodal
para os cinco materiais.
3. Pode-se observar uma leve degradação do PLDLLA antes e após a moagem
em solução de SBF. A degradação tendeu a aumentar em função do tempo de
imersão. A FTIR indicou que o PLDLLA antes da moagem apresentou um aumento
na cristalinidade com o decorrer do tempo de degradação. A moagem criogênica
aumentou o conteúdo cristalino do PLDLLA e observou-se uma tendência de
redução da degradação com o tempo. In vivo o PLDLLA se mostrou eficaz na
manutenção da espessura do defeito, mas sua degradação foi insignificante,
resultado este corroborado pelos obtidos nas análises por GPC, FTIR e da µCT.
4. A degradação dos biovidros testados aumentou em função do tempo de
imersão em solução de SBF e se mostrou similar para os dois biovidros. In vivo,
estes resultados puderam ser observados pela gradual diminuição do tamanho das
partículas enquanto o tecido ósseo foi formado. A análise por FTIR indicou que
ambos os biovidros apresentaram composição similar, diferentemente do que foi
obtido por DRX, que mostrou um pico de sílica cristalina no BG2. Os resultados
diferentes do BG1 e do BG2 na neoformação óssea podem ser explicados pelo
tamanho das partículas e pela composição ligeiramente diferente dos dois materiais.
O BG1 não manteve a espessura do defeito. O comportamento deste material foi
195
equivalente ao grupo controle. O BG2 manteve a espessura do defeito e apresentou
bons resultados quanto à formação óssea.
5. A hidroxiapatita não sofreu degradação, mas os aglomerados apresentaram
separação e esfarelamento. A análise por FTIR e por DRX indicou que o material se
tratava da HA pura sem a presença de fases secundárias, os espectros da HAP
apresentados pertencem a hidroxiapatita, explicando porque o material não sofreu
degradação. Ela, além de manter a espessura do defeito, foi o único material, que
conseguiu unir as bordas do defeito. As partículas diminuíram de tamanho com o
tempo, comportamento similar àquele observado in vitro, devido ao esfarelamento
das mesmas.
6. Os resultados in vivo mostraram que todos os materiais apresentaram
biocompatibilidade, bem como propriedades físico-químicas osteocondutivas
adequadas para regeneração óssea, mas esta propriedade se mostrou diferente
para os diversos materiais nos diferentes tempos avaliados. Todos eles podem ser
indicados para utilização em regeneração tecidual, respeitando o problema a ser
tratado. Nenhum material é melhor ou pior do que os outros para recomendação
porque a aplicação depende do problema a ser tratado e da resposta que se deseja.
7. A combinação entre o PLDLLA e o BG1 não melhorou a propriedade
osteocondutiva do compósito e os resultados foram inferiores aos obtidos com o
grupo do PLDLLA. No compósito, o PLDLLA praticamente não sofreu degradação e
as partículas de BG1 foram fagocitadas ou degradaram.
8. O grupo controle apresentou bons resultados, possivelmente pela
manutenção do periósteo e pela qualidade do trans e pós operatório.
5.2 SUGESTÕES
Uma vez que as propriedades dos materiais, tais como: composição, tamanho e
distribuição das partículas, capacidade de preenchimento do defeito por elas e
superfície do material desempenham, papéis significantes na resposta da região
enxertada pelo hospedeiro, algumas sugestões para trabalhos futuros podem ser
feitas:
196
1. Alterar a proporção do homopolímero L e do copolímero DL, desde 100%
L até 100% DL e avaliar a resposta in vivo destes materiais, identificando
qual a melhor proporção para regeneração óssea;
2. Aumentar os tempos de avaliação até se obter a completa degradação do
copolímero;
3. Associar fármacos ao copolímero que melhorem as propriedades de
osteocondução e osteoindução.
4. Em relação ao compósito, testar os mesmos materiais, mas com o
tamanho das partículas do copolímero e do BG1 equivalentes;
5. Confeccionar um arcabouço do copolímero e do BG1 com poros
interconectados. Este arcabouço poderia ser com o copolímero como
base revestida pelo BG1, vice versa, ou uma matriz do copolímero com
partículas de BG1, em escala micrométrica, distribuídas
homogeneamente;
6. Variar o tamanho das partículas do BG1 para identificar qual o ideal para
neoformação óssea.
7. Desenvolver um material com custos de produção reduzidos que atenda
os requisitos necessários para sua aplicação em regeneração óssea,
acelerar a resposta do hospedeiro.
197
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABE, Y., M. TAKAHATA, M. ITO, et al. Enhancement of graft bone healing by
intermittent administration of human parathyroid hormone (1-34) in a rat spinal
arthrodesis model. Bone, Jul 13. 2007.
AGRAWAL, C. M. e K. A. ATHANASIOU. Technique to control pH in vicinity of
biodegrading PLA-PGA implants. J Biomed Mater Res, v.38, n.2, Summer,
p.105-14. 1997.
AITASALO, K. M., KINNUNEN, I., PELTOLA, M.J. Bioactive glass in fronto-orbital
and skull surgery. Journal of Cranio- Maxillofacial Surgery, v.36, n.1, p.152.
2008.
AITASALO, K. M. e M. J. PELTOLA. Bioactive glass hydroxyapatite in fronto-orbital
defect reconstruction. Plast Reconstr Surg, v.120, n.7, Dec, p.1963-72;
discussion 1973-4. 2007.
AJIOKA, I., K. ENOMOTO, K. SUZUKI, et al. The basic properties of poly(lactic acid)
produced by the direct condensation polymerization of lactic acid. J Environ
Polym Degrad, v.3, n.4, p.225-34. 1995.
ALBREKTSSON T, W. A. Oral implant surfaces: Part 1--review focusing on
topographic and chemical properties of different surfaces and in vivo responses to
them. Int J Prosthodont., v.17, n.5, Sep-Oct, p.536-43. 2004.
______. Oral implant surfaces: Part 2--review focusing on clinical knowledge of
different surfaces. Int J Prosthodont., v.17, n.5, Sep-Oct, p.544-64. 2004.
ALKAN, M. e M. DOGAN. Dissolution kinetics of colemanite in oxalic acid solutions.
Chem Eng Process, v.43, p.867-72. 2004.
ALLAN, I., H. NEWMAN e M. WILSON. Antibacterial activity of particulate bioglass
against supra- and subgingival bacteria. Biomaterials, v.22, n.12, Jun, p.1683-7.
2001.
ANDERSON, J. M. The cellular cascades of wound healing. In: J. E. Davies (Ed.).
Bone Engineering. Toronto, Canada: em squared incorporated, 2000. The
cellular cascades of wound healing, p.81-93
ANDERSSON, O. H. e I. KANGASNIEMI. Calcium phosphate formation at the
surface of bioactive glass in vitro. J Biomed Mater Res, v.25, n.8, Aug, p.1019-
30. 1991.
ARNOLD, F. e D. C. WEST. Angiogenesis in wound healing. Pharmacol Ther, v.52,
n.3, Dec, p.407-22. 1991.
198
ASLAN, S., L. CALANDRELLI, P. LAURIENZO, et al. Poly (D,L - lactic acid) / poly (∈
- caprolactone) blend membranes: Preparation and morphological
characterization. J Mater Sci, v.35, n.7, p.1615-1622. 2000.
ATHANASIOU, K. A., C. M. AGRAWAL, F. A. BARBER, et al. Orthopaedic
applications for PLA-PGA biodegradable polymers. Arthroscopy, v.14, n.7, Oct,
p.726-37. 1998.
ATHANASIOU, K. A., G. G. NIEDERAUER e C. M. AGRAWAL. Sterilization, toxicity,
biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid
copolymers. Biomaterials, v.17, n.2, Jan, p.93-102. 1996.
BARAÚNA, G. S., A. PIERUCCI, A. OLIVEIRA, et al. Estudo da degradação in vivo
de poli(L-co-D,L-ácido láctico) aplicado como prótese para regeneração nervosa
periférica. Revista Matéria, v.12, n.2, p.298-306. 2007.
BARROWS, T. H. Degradable implant materials: a review of syntheic absorbable
polymers and their applications. Clin Mater, v.1, n.4, p.233-57. 1986.
BAUER, T. W. e S. T. SMITH. Bioactive materials in orthopaedic surgery: overview
and regulatory considerations. Clin Orthop Relat Res, n.395, Feb, p.11-22.
2002.
BEEVERS, C. A. e D. B. MCINTYRE. The atomic structure of fluorapatite and its
relation to that of tooth and bone mineral. Miner Mag, v.27, p.254-259. 1956.
BEHRAVESH, E., A. W. YASKO, P. S. ENGEL, et al. Synthetic biodegradable
polymers for orthopaedic applications. Clin Orthop Relat Res, n.367 Suppl, Oct,
p.S118-29. 1999.
BERGSMA, E. J., F. R. ROZEMA, R. R. M. BOS, et al. Foreign body reactions to
resorbable poly(L-lactide) bone plates and screws used for the fixation of
unastable fractures. J Oral Maxillofac Surg, v.51, n.6, Jun, p.666-670. 1993.
BERGSMA, J. E., W. C. DE BRUIJN, F. R. ROZEMA, et al. Late degradation tissue
response to poly(-lactide) bone plates and screws. Biomaterials, v.16, n.1, p.25-
31. 1995.
BERGSMA, J. E., F. R. ROZEMA, R. R. BOS, et al. In vivo degradation and
biocompatibility study of in vitro pre-degraded as-polymerized polyactide particles.
Biomaterials, v.16, n.4, Mar, p.267-74. 1995.
BERTOLI, F. M. P. Reparo ósseo com enxerto de hidroxiapatita associada ao
colágeno do tipo I. (Mestrado). Ortodontia, Faculdade de Odontologia. UFRJ,
Rio de Janeiro, 2007. 85 p.
BEST, S. M., A. E. PORTER, E. S. THIAN, et al. Bioceramics: Past, present and for
the future. Journal of the European Ceramic Society, v.28, p.1319-1327. 2008.
199
BLACKBURN, R. S., X. ZHAO, D. W. FARRINGTON, et al. Effect of d-isomer
concentration on the coloration properties of poly(lactic acid). Dyes and
Pigments, v.70, n.3, p.251-258. 2006.
BLAKER, J. J., V. MAQUET, R. JEROME, et al. Mechanical properties of highly
porous PDLLA/Bioglass composite foams as scaffolds for bone tissue
engineering. Acta Biomater, v.1, n.6, Nov, p.643-52. 2005.
BLOCK, M. S. e J. N. KENT. A comparison of particulate and solid root forms of
hydroxylapatite in dog extraction sites. J Oral Maxillofac Surg, v.44, n.2, Feb,
p.89-93. 1986.
BONFIELD, W., M. D. GRYNPAS, A. E. TULLY, et al. Hydroxyapatite reinforced
polyethylene--a mechanically compatible implant material for bone replacement.
Biomaterials, v.2, n.3, Jul, p.185-6. 1981.
BONFIELD, W., M. WANG e K. E. TANNER. Interfaces in analogue biomaterials.
Acta Mater, v.46, n.7, p.2509-2518. 1998.
BORDEN, M., M. ATTAWIA, Y. KHAN, et al. Tissue engineered microsphere-based
matrices for bone repair: design and evaluation. Biomaterials, v.23, n.2, Jan,
p.551-9. 2002.
BORDEN, M., S. F. EL-AMIN, M. ATTAWIA, et al. Structural and human cellular
assessment of a novel microsphere-based tissue engineered scaffold for bone
repair. Biomaterials, v.24, n.4, Feb, p.597-609. 2003.
BOS, R. R., F. R. ROZEMA, G. BOERING, et al. Bone-plates and screws of
bioabsorbable poly (L-lactide)--an animal pilot study. Br J Oral Maxillofac Surg,
v.27, n.6, Dec, p.467-76. 1989.
BOSETTI, M. e M. CANNAS. The effect of bioactive glasses on bone marrow stromal
cells differentiation. Biomaterials, v.26, n.18, Jun, p.3873-9. 2005.
BOUWMAN, J. P. e D. B. TUINZING. Biodegradable osteosynthesis in mandibular
advancement: a pilot study. Br J Oral Maxillofac Surg, v.37, n.1, Feb, p.6-10.
1999.
BRAUN, W. e A. RÜTER. Frakturheilung. Unfallchirurg, v.99, p.59-67. 1996.
BROWN, K. L. B. e R. L. CRUESS. Bone and cartilage transplantation surgery. J
Bone Jt Surg Am, v.64, n.A, p.270-9. 1982.
BUCHOLZ, R. W., A. CARLTON e R. HOLMES. Interporous hydroxyapatite as a
bone graft substitute in tibial plateau fractures. Clin Orthop Relat Res, n.240,
Mar, p.53-62. 1989.
BUCHOLZ, R. W., A. CARLTON e R. E. HOLMES. Hydroxyapatite and tricalcium
phosphate bone graft substitutes. Orthop Clin North Am, v.18, n.2, Apr, p.323-
200
34. 1987.
BUCKWALTER, J. A., M. J. GLIMCHER, R. R. COOPER, et al. Bone biology. Part I.
structure, blood supply, cells, matrix and mineralization. J Bone Joint Surg, v.77,
n.A, p.1256-75. 1995.
BUNKER, B. C. Molecular mechanisms for corrosion of silica and silicate glasses. J
Non-Cryst Solids, v.179, p.300-8. 1994.
BUNKER, B. C., D. R. TALLANT, T. J. HEADLEY, et al. The structure of leached
sodium borosilicate glass. Phys Chem Glasses, v.29, p.106-20. 1988.
BURG, K. J., S. PORTER e J. F. KELLAM. Biomaterial developments for bone tissue
engineering. Biomaterials, v.21, n.23, Dec, p.2347-59. 2000.
BUSENLECHNER, D., S. TANGL, B. MAIR, et al. Simultaneous in vivo comparison
of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials, v.29,
n.22, Aug, p.3195-200. 2008.
CALHOUN, J. H. e J. T. MADER. Treatment of osteomyelitis with a biodegradable
antibiotic implant. Clin Orthop Relat Res, n.341, Aug, p.206-14. 1997.
CAMARGO, P. M., V. LEKOVIC, M. WEINLAENDER, et al. Influence of bioactive
glass on changes in alveolar process dimensions after exodontia. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v.90, n.5, Nov, p.581-6. 2000.
CANNILLO, V., F. PIERLI, S. SAMPATH, et al. Thermal and physical
characterization of apatite/wollastonite bioactive glass-ceramics. Journal of the
European Ceramic Society, v.in press,
n.doi:10.1016/jeurceramsoc.2008.06.034, p.1-9. 2008.
CAO, W. e L. L. HENCH. Bioactive Materials. Ceramics international, v.22, p.493-
507. 1996.
CAPAN, Y., G. JIANG, S. GIOVAGNOLI, et al. Preparation and characterization of
poly(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres for controlled release of human
growth hormone. AAPS PharmSciTech, v.4, n.2, p.E28. 2003.
CARDAROPOLI, G., M. ARAUJO, R. HAYACIBARA, et al. Healing of extraction
sockets and surgically produced - augmented and non-augmented - defects in the
alveolar ridge. An experimental study in the dog. J Clin Periodontol, v.32, n.5,
May, p.435-40. 2005.
CARVALHO, G. C. D. Química Moderna: Ed Scipione LTDA. 1997. 688 p.
CATE, T. A. R. Histologia Bucal. Rio de Janeiro: Editora Guanabara S.A. 1995. 395
p.
CERRUTI, M., D. GREENSPAN e K. POWERS. Effect of pH and ionic strength on
201
the reactivity of Bioglass 45S5. Biomaterials, v.26, n.14, May, p.1665-74. 2005.
CERRUTI, M. G., D. GREENSPAN e K. POWERS. An analytical model for the
dissolution of different particle size samples of Bioglass in TRIS-buffered solution.
Biomaterials, v.26, n.24, Aug, p.4903-11. 2005.
CHAO, F. C., D. SHEPRO, J. L. TULLIS, et al. Similarities between platelet
contraction and cellular motility during mitosis: role of platelet microtubules in clot
retraction. J Cell Sci, v.20, n.3, May, p.569-88. 1976.
CHAPUT, C., A. SELMANI e C. H. RIVARD. Artificial scaffolding materials for tissue
extracellular matrix repair. Curr Opin Orthop, v.7, p.62-68. 1996.
CHEN, C., L. DONG e M. K. CHEUNG. Preparation and characterization of
biodegradable poly(L-lactide)/chitosan blends. European Polymer Journal, v.41,
p.958-966. 2005.
CHEN, C. C., J. Y. CHUEH, H. TSENG, et al. Preparation and characterization of
biodegradable PLA polymeric blends. Biomaterials, v.24, n.7, Mar, p.1167-73.
2003.
CHEN, F., Z. C. WANG e C. J. LIN. Preparation and characterization of nano-sezed
hydroxyapatite particles and hydroxyapatite/chitosan nano-composite for use in
biomedical materials. Mater Lett, v.57, p.858-61. 2002.
CHEN, X., Y. MENG, Y. LI, et al. Investigation on bio-mineralization of melt and sol-
gel derived bioactive glasses. Applied Surface Science, v.255, p.562-64. 2008.
CHEVALIER, J. e L. GREMILLARD. Ceramics for medical applications: A picture for
the next 20 years. Journal of the European Ceramic Society, v.Article in press,
n.doi:10.1016/j.jeurceramsoc.2008.08.025, p.1-11. 2008.
CHRIS ARTS, J. J., N. VERDONSCHOT, B. W. SCHREURS, et al. The use of a
bioresorbable nano-crystalline hydroxyapatite paste in acetabular bone impaction
grafting. Biomaterials, v.27, n.7, Mar, p.1110-8. 2006.
CLARK, A. E., L. L. HENCH e H. A. PASCHALL. The influence of surface chemistry
on implant interface histology: a theoretical basis for implant materials selection. J
Biomed Mater Res, v.10, n.2, Mar, p.161-74. 1976.
COPINET, A., C. BERTRAND, S. GOVINDIN, et al. Effects of ultraviolet light (315
nm), temperature and relative humidity on the degradation of polylactic acid
plastic films. Chemosphere, v.55, n.5, May, p.763-73. 2004.
CORMACK, D. H. Bone. In: D. H. Cormack (Ed.). Ham's Histology. Philadelphia,
Pa: Lippincott, 1987. Bone, p.273-323
COTTRELL, D. A. e L. M. WOLFORD. Long-term evaluation of the use of coralline
hydroxyapatite in orthognathic surgery. J Oral Maxillofac Surg, v.56, n.8, Aug,
202
p.935-41; discussion 941-2. 1998.
CURASAN. Bone Regeneration Principles 2008.
http://www.curasan.de/usa/professionals/bone_regeneration/bone_regeneration.p
hp acessado em 26.01.2009.
CYSTER, L. A., D. M. GRANT, S. M. HOWDLE, et al. The influence of dispersant
concentration on the pore morphology of hydroxyapatite ceramics for bone tissue
engineering. Biomaterials, v.26, n.7, Mar, p.697-702. 2005.
DAGUANO, J. K. M. F., C. SANTOS, M. R. OLIVEIRA, et al. Análise preliminar da
influência da temperatura de tratamento térmico nas propriedades mecânicas de
vitrocerâmicos do sistema 3CaO.P2O5-SiO2-MgO. no prelo. 2007.
DANIELS, A. U., M. K. CHANG e K. P. ANDRIANO. Mechanical properties of
biodegradable polymers and composites proposed for internal fixation of bone. J
Appl Biomater, v.1, n.1, Spring, p.57-78. 1990.
DAVID, V., N. LAROCHE, B. BOUDIGNON, et al. Noninvasive in vivo monitoring of
bone architecture alterations in hindlimb-unloaded female rats using novel three-
dimensional microcomputed tomography. J Bone Miner Res, v.18, n.9, Sep,
p.1622-31. 2003.
DAVIES, J. E. Mechanisms of endosseous integration. Int J Prosthodont, v.11, n.5,
Sep-Oct, p.391-401. 1998.
______. Bone bonding at natural and biomaterial surfaces. Biomaterials, v.28, n.34,
Dec, p.5058-67. 2007.
DAVIES, J. E. e N. BALDAN. Scanning electron microscopy of the bone-bioactive
implant interface. J Biomed Mater Res, v.36, n.4, Sep 15, p.429-40. 1997.
DAVIES, J. E. e M. M. HOSSEINI. Histodynamics of Endosseous Wound Healing In:
J. E. Davies (Ed.). Bone Enginnering. Toronto, Canada: em squared
incorporated, 2000. Histodynamics of Endosseous Wound Healing p.1-14
DAY, R. M. Biomactive material for use in stimulating vascularization. Worldwide
patent. WO2004071542.
DE BOER, J. L. M. e F. J. M. J. MAESSEN. Optimum experimental conditions of the
brittle fracture technique for homogenisation of biological materials. Analytica
Chimica Acta, v.177, p.371-375. 1980.
DE JONG, W. F. Le substance minerale dans le os. Rec Trav Chim, v.45, p.445-
450. 1926.
DE LONG, W. G., JR., T. A. EINHORN, K. KOVAL, et al. Bone grafts and bone graft
substitutes in orthopaedic trauma surgery. A critical analysis. J Bone Joint Surg
Am, v.89, n.3, Mar, p.649-58. 2007.
203
DEEB, M. e M. ROSZKOWSKI. Hydroxyapatite granules and blocks as an
extracranial augmenting material in rhesus monkeys. J Oral Maxillofac Surg,
v.46, p.33-40. 1988.
DEJONG, E. S., T. M. DEBERARDINO, D. E. BROOKS, et al. In vivo comparison of
a metal versus a biodegradable suture anchor. Arthroscopy, v.20, n.5, May,
p.511-6. 2004.
DESCAMPS, M., J. C. HORNEZ e A. LERICHE. Manufacture of hydroxyapatite
beads for medical applications. Journal of the European Ceramic Society, v.in
press, n.doi:10.1016/j.jeurceramsoc.2008.06.008, p.7. 2008.
DEVIN, J., M. ATTAWIA e C. T. LAURENCIN. Developmental 3-dimensional polymer
for bone repair. J Biomed Sci, p.661-669. 1996.
DHILLON, B., A. KAMAL e C. LEEN. Intravitreal sustained-release ganciclovir
implantation to control cytomegalovirus retinitis in AIDS. Int J STD AIDS, v.9, n.4,
Apr, p.227-30. 1998.
DRIESSENS, F. C. M. The mineral in bone, dentin and tooth enamel. Bull Soc Chim
Belg, v.89, p.663-689. 1980.
DRUMOND, W. S., S. H. WANG e C. G. MOTHÉ. Síntese e caracterização do
copolímero poli (ácido lático-B-glicol etilênico). Polímeros: Ciência e
Tecnologia, v.14, n.2, p.74-79. 2004.
DUCHEYNE, P., S. RADIN e L. KING. The effect of calcium phosphate ceramic
composition and structure on in vitro behavior. I. Dissolution. J Biomed Mater
Res, v.27, n.1, Jan, p.25-34. 1993.
EASTWOOD, M., R. PORTER, U. KHAN, et al. Quantitative analysis of collagen gel
contractile forces generated by dermal fibroblasts and the relationship to cell
morphology. J Cell Physiol, v.166, n.1, Jan, p.33-42. 1996.
EINHORN, T. A. Enhancement of fracture-healing. J Bone Joint Surg Am, v.77, n.6,
Jun, p.940-56. 1995.
EINHORN, T. A., R. J. MAJESKA, C. G. BOSCH, et al. The production of
cytokines by fractures. ORS 37th annual meeting. Anaheim, California, 1991. p.
EL-SHAMY, T. M. e R. W. DOUGLAS. Kinetics of the reaction of water with glass.
Glass Technol, v.13, p.77-80. 1972.
EL-SHAMY, T. M., J. LEWIS e R. W. DOUGLAS. The dependence of the pH of the
decomposition of glasses by aqueous solutions. Glass Technol, v.13, n.81-7.
1972.
ELLIOT, J. C. Structure and chemistry of the apatites and other calcium
204
orthophosphates. Studies in inorganic chemistry. Amsterdam: Elsevier
Science B.V, v.18. 1994. 404 p.
ELLIOT, J. C. e R. A. YOUNG. Convertion of single crystals of chlorapatite into single
crystals of hydroxyapatite. Nature, v.214, p.904-906. 1967.
ELZ. Produtos, HAP-91 2006.
ERIKSEN, E. F., D. W. AXELROD e F. MELSEN. Bone Histomorphometry. New
York Raven Press. 1994. 74 p.
FALLSCHÜSSEL, G. K. H. Das Lagergewebe dentaler Implantate. In: G. K. H.
Fallschüssel (Ed.). Zahnärtzliche Implantologie, Wissenschaft und Praxis.
Berlin, Germany: Quintessence-Verlag, 1986. Das Lagergewebe dentaler
Implantate., p.34-85
FENG, X. e I. L. PEGG. A glass dissolution model for the effects of S/V on leachate
pH. J Non-Cryst Solids, v.175, p.281-93. 1994.
FERREIRA, B. M. P., C. A. C. ZAVAGLIA e E. A. R. DUEK. Thermal, morphologic
and mechanical characterization of poly (L-lactic acid) / poly (hydroxybutyrate-co-
hydroxyvalerate) blends. Revista Brasileira de Engenharia Biomédica, v.19,
n.1, 28/01/2003, p.21-27. 2003.
FONSECA, F. M. Biocerâmicas porosas bifásicas e trifásicas à base de
hidroxiapatita produzidas por gelcasting. Ciência dos Materiais, Instituto
Militar de Engenharia (IME), Rio de Janeiro, 2007. 103 p.
FUJIBAYASHI, S., M. NEO, H. M. KIM, et al. A comparative study between in vivo
bone ingrowth and in vitro apatite formation on Na2O-CaO-SiO2 glasses.
Biomaterials, v.24, n.8, Apr, p.1349-56. 2003.
FULMER, M. T., I. C. ISON, C. R. HANKERMAYER, et al. Measurements of the
solubilities and dissolution rates of several hydroxyapatites. Biomaterials, v.23,
n.3, Feb, p.751-5. 2002.
FULMER, M. T., R. I. MARTIN e P. W. BROWN. Formation of calcium deficient
hydroxyapatite at near-physiological temperature. Journal of Material Science:
Materials in Medicine, v.3, p.299-305. 1992.
FURUKAWA, T., Y. MATSUSUE, T. YASUNAGA, et al. Histomorphometric study on
high-strength hydroxyapatite/poly(L-lactide) composite rods for internal fixation of
bone fractures. J Biomed Mater Res, v.50, n.3, Jun 5, p.410-9. 2000.
FURUSAWA, T. e K. MIZUNUMA. Osteoconductive properties and efficacy of
resorbable bioactive glass as a bone-grafting material. Implant Dent, v.6, n.2,
Summer, p.93-101. 1997.
GABET, Y., R. MULLER, E. REGEV, et al. Osteogenic growth peptide modulates
205
fracture callus structural and mechanical properties. Bone, v.35, n.1, Jul, p.65-73.
2004.
GABRIELLI, M. A. G., G.; OKAMOTO, T.; GABRIELLI, M. F. R.; HOUCHULI-VIEIRA,
E. Avaliação de um complaxo de hidroxiapatita-colágeno como material para
aumento de contorno ósseo em implantes subperiosteais. Estudo histologico em
ratos. Rev. Odontol. UNESP, v.28, n.2, p.345-358. 1999.
GADZAG, A. R., J. M. LANE, D. GLASER, et al. Alternative to autogenous bone
graft: efficacy and indication. J Am Acad Orthop Surg, v.3, p.1-8. 1995.
GARLOTTA, D. A literature review of poly(lactide acid). J Polym Environment, v.9,
n.2, p.63-84. 2001.
GATTI, A. M., G. VALDRE e O. H. ANDERSSON. Analysis of the in vivo reactions of
a bioactive glass in soft and hard tissue. Biomaterials, v.15, n.3, Feb, p.208-12.
1994.
GAUTHIER, O., J. M. BOULER, E. AGUADO, et al. Macroporous biphasic calcium
phosphate ceramics: influence of macropore diameter and macroporosity
percentage on bone ingrowth. Biomaterials, v.19, n.1-3, Jan-Feb, p.133-9. 1998.
GAUTHIER, O., R. MULLER, D. VON STECHOW, et al. In vivo bone regeneration
with injectable calcium phosphate biomaterial: a three-dimensional micro-
computed tomographic, biomechanical and SEM study. Biomaterials, v.26, n.27,
Sep, p.5444-53. 2005.
GILDING, D. K. e A. M. REED. Biodegradable polymers for use in surgery -
polyglycolic / poly(lactic acid) homo- and copolymers: 1. Polymer, v.20, n.12,
December 1979, p.1459-1464. 1979.
GINEBRA, M. P., T. TRAYKOVA e J. A. PLANELL. Calcium phosphate cements as
bone drug delivery systems: a review. J Control Release, v.113, n.2, Jun 28,
p.102-10. 2006.
GLEASON, W. B. Bioabsorbable polymers. 1998.
GOSAIN, A. K., P. A. RIORDAN, L. SONG, et al. A 1-year study of hydroxyapatite-
derived biomaterials in an adult sheep model: III. Comparison with autogenous
bone graft for facial augmentation. Plast Reconstr Surg, v.116, n.4, Sep 15,
p.1044-52. 2005.
GOUVEIA, S. T., G. S. LOPES, O. FATIBELLO-FILHO, et al. Homogenization of
breakfast cerelas using cryogenic grinding. Journal of Food Engineering, v.51,
p.59-63. 2002.
GRAMBOW, B. e R. MULLER. First-order dissolution rate law and the role of surface
layers in glass performance assessment. J Nucl Mater, v.298, p.112-24. 2001.
206
GRINNELL, F. e D. G. HAYS. Induction of cell spreading by substratum-adsorbed
ligands directed against the cell surface. Exp Cell Res, v.116, n.2, Oct 15, p.275-
84. 1978.
GUNATILLAKE, P. A. e R. ADHIKARI. Biodegradable synthetic polymers for tissue
engineering. European Cells and Materials, v.5, p.1-16. 2003.
GUTWALD, R., R. SCHON, N. C. GELLRICH, et al. Bioresorbable implants in
maxillo-facial osteosynthesis: experimental and clinical experience. Injury, v.33
Suppl 2, Aug, p.B4-16. 2002.
HADDAD, A. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicada às ciências
biológicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia. 1998. 179 p.
HALLMAN, M., A. CEDERLUND, S. LINDSKOG, et al. A clinical histologic study of
bovine hydroxyapatite in combination with autogenous bone and fibrin glue for
maxillary sinus floor augmentation. Results after 6 to 8 months of healing. Clin
Oral Implants Res, v.12, n.2, Apr, p.135-43. 2001.
HAM, A. W. Some histophysiological problems peculiar to calcified tissues. J Bone
Joint Surg Am, v.24-A-3, Jul, p.701-28. 1952.
HAM, A. W. e W. R. HARRIS. Repair and transplantation of bone. In: G. H. Bourne
(Ed.). The Biochemestry and Physiology of Bone. New York, NY: Academic
Press, v.3, 1971. Repair and transplantation of bone, p.337-399
HARRIS, A. K., D. STOPAK e P. WILD. Fibroblast traction as a mechanism for
collagen morphogenesis. Nature, v.290, n.5803, Mar 19, p.249-51. 1981.
HARTMAN, M. H. High Molecular Weight Polylactic Acid Polymers. In: D. L. Kaplan
(Ed.). Biopolymers from reweable resources. Berlin: Springer-Verlag, 1998.
High Molecular Weight Polylactic Acid Polymers, p.367-411
HARVEY, W. K., J. L. PINCOCK, V. J. MATUKAS, et al. Evaluation of a
subcutaneously implanted hydroxyapatite-avitene mixture in rabbits. J Oral
Maxillofac Surg, v.43, p.277-80. 1985.
HASEGAWA, Y., S. SAKANO, T. IWASE, et al. The long-term behavior of poly-L-
lactide screws in a minipig fracture model: preliminary report. J Biomed Mater
Res, v.63, n.6, p.679-85. 2002.
HENCH, J. L. e J. K. WEST. Biological applications of bioactive glasses. Life Chem
Rep, v.13, p.187-241. 1996.
HENCH, L. L. Bioceramics: From Concept to Clinic. Journal of the American
Ceramic Society, v.74, n.7, p.1487-1510. 1991a.
______. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc., v.74, p.1487-510.
1991b.
207
______. Biomaterials: a forecast for the future. Biomaterials, v.19, n.16, Aug,
p.1419-23. 1998.
HENCH, L. L. e Ö. ANDERSSON. Bioactive Glasses. In: L. L. Hench e J. Wilson
(Ed.). An Introduction to Bioceramics. Advanced Series in Ceramics.
Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, v.1, 1993. Bioactive Glasses,
p.41-62
HENCH, L. L., J. R. JONES e P. SEPULVEDA. Bioactive materials for tissue
engineering scaffolds. In: J. M. Polak, Hench,L.L., Kemp,P (Ed.). Future
Strategies for Tissue and Organ Replacement. London: Imperial College
Press, 2002. Bioactive materials for tissue engineering scaffolds, p.3 - 24
HENCH, L. L., R. J. SPLINTER, W. C. ALLEN, et al. Bonding mechanisms at
interface of ceramic prosthetic materials. J Biomed Mater Res Symp, v.2, n.Part
I, p.117-41. 1971.
HENCH, L. L. e J. WILSON. Introduction. In: L. L. Hench e J. Wilson (Ed.). An
Introduction to Bioceramics. Advanced Series in Ceramics. Singapore: World
Scientific Publishing Publishing Co. Pte. Ltd., v.1, 1993a. Introduction, p.1-24
______. An Introduction to Bioceramics. Advanced Series in Ceramics.
Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, v.1. 1993b. 386 p.
HING, K. A., S. M. BEST e W. BONFIELD. Characterization of porous
hydroxyapatite. J Mater Sci Mater Med, v.10, n.3, Mar, p.135-45. 1999.
HING, K. A., P. A. REVELL, N. SMITH, et al. Effect of silicon level on rate, quality
and progression of bone healing within silicate-substituted porous hydroxyapatite
scaffolds. Biomaterials, v.27, n.29, Oct, p.5014-26. 2006.
HNATYSZYN, J. H., N. KOSSOVSKY, A. GELMAN, et al. Drug delivery sistems for
the future. J Pharm Sci Technol, v.48, p.247-254. 1994.
HOLLINGER, J. O., J. BREKKE, E. GRUSKIN, et al. Role of bone substitutes. Clin
Orthop Relat Res, n.324, Mar, p.55-65. 1996.
HOLMES, R. e H. HAGLER. Porous hydroxyapatite as a bone graft substitute in
maxillary augmentation. An histometric study. J Craniomaxillofac Surg, v.16,
n.5, Jul, p.199-205. 1988.
HOLMES, R. E. e H. K. HAGLER. Porous hydroxyapatite as a bone graft substitute
in cranial reconstruction: a histometric study. Plast Reconstr Surg, v.81, n.5,
May, p.662-71. 1988.
HOLY, C. E., J. A. FIALKOV, M. S. SHOICHET, et al. In vivo models for bone tissue-
engineering constructs. In: J. E. Davies (Ed.). Bone Engineering. Toronto,
Canada: em squared incorporated, 2000. In vivo models for bone tissue-
208
engineering constructs, p.496-504
HÖNIG, J. F., H. A. MERTEN e H. G. LUHR. Passive and Active Intracranial
Translocation of Osteosynthesis Plates in Adolescent Minipigs. Journal of
Craniofacial Surgery, v.6, n.4, July, p.292-298. 1995.
HOSSEINI, M. M., J. SODEK, R. P. FRANKE, et al. The structure and composition of
bone-implant interface. In: J. E. Davies (Ed.). Bone Engineering. Toronto,
Canadá: em squared incorporated, 2000. The structure and composition of bone-
implant interface, p.295-304
HSU, F. Y., S. W. TSAI, C. W. LAN, et al. An in vivo study of a bone grafting material
consisting of hydroxyapatite and reconstituted collagen. J Mater Sci Mater Med,
v.16, n.4, Apr, p.341-5. 2005.
HUH, K. M., Y. W. CHO e K. PARK. PLGA-PEG Block Copolymers for Drug
Formulations. Drug Delivery Technology, v.3, n.5, July/August, p.1-10. 2003.
HUNT, T. K. e W. J. VAN WINKLE. Normal repair. In: T. K. Hunt e J. E. Dunphy
(Ed.). Fundamentals of Wound Menagement. New York: Appleton-Century-
Crofts, 1979. Normal repair, p.2-67
HUTMACHER, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.
Biomaterials, v.21, n.24, Dec, p.2529-43. 2000.
HYAKUNA, K., T. YAMAMURO, Y. KOTOURA, et al. Surface reactions of calcium
phosphate ceramics to various solutions. J Biomed Mater Res, v.24, n.4, Apr,
p.471-88. 1990.
IP, W. Y. Polylactide membranes and sponges in the treatment of segmental defects
in rabbit radii. Injury, v.33 Suppl 2, Aug, p.B66-70. 2002.
ISHAUG-RILEY, S. L., G. M. CRANE-KRUGER, M. J. YASZEMSKI, et al. Three-
dimensional culture of rat calvarial osteoblasts in porous biodegradable polymers.
Biomaterials, v.19, n.15, Aug, p.1405-12. 1998.
ISHAUG, S. L., G. M. CRANE, M. J. MILLER, et al. Bone formation by three-
dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds. J
Biomed Mater Res, v.36, n.1, Jul, p.17-28. 1997.
ISHAUG, S. L., R. G. PAYNE, M. J. YASZEMSKI, et al. Osteoblast migration on
poly(alpha-hydroxy esters). Biotechnol Bioeng, v.50, n.4, May 20, p.443-51.
1996.
ITOKAWA, H., T. HIRAIDE, M. MORIYA, et al. A 12 month in vivo study on the
response of bone to a hydroxyapatite-polymethylmethacrylate cranioplasty
composite. Biomaterials, v.28, n.33, Nov, p.4922-7. 2007.
ITOKAZU, M., T. SUGIYAMA, T. OHNO, et al. Development of porous apatite
209
ceramic for local delivery of chemotherapeutic agents. J Biomed Mater Res,
v.39, n.4, Mar 15, p.536-8. 1998.
JAMSHIDI, K., S.-H. HYON e Y. IKADA. Thermal characterization of polylactides.
Polymer, v.29, n.12, December, p.2229-2234. 1988.
JARCHO, M. Calcium phosphate ceramics as hard tissue prosthetics. Clin Orthop
Relat Res, n.157, Jun, p.259-78. 1981.
JENSEN, S. S., N. BROGGINE, E. HJORTING-HENSEN, et al. Bone healing and
graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and b-tricalcium phosphate. A
histologic and histomorphometric study in tha mandibles of minipigs. Clin Oral
Implants Res, v.17, p.237-43. 2006.
JENSEN, S. S., A. YEO, M. DARD, et al. Evaluation of a novel biphasic calcium
phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric
study in the mandibles of minipigs. Clin Oral Implants Res, v.18, n.6, Dec,
p.752-60. 2007.
JONES, J. R., P. SEPULVEDA e L. L. HENCH. Dose-dependent behavior of
bioactive glass dissolution. J Biomed Mater Res, v.58, n.6, p.720-6. 2001.
JUNQUEIRA, L. C. e J. C. CARNEIRO. Tecido ósseo. In: L. C. Junqueira e J. C.
Carneiro (Ed.). Histologia Básica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
Tecido ósseo, p.136-153
KABAN, L. B., J. B. MULLIKEN e J. E. MURRAY. Facial fractures in children: an
analysis of 122 fractures in 109 patients. Plast Reconstr Surg, v.59, n.1, Jan,
p.15-20. 1977.
KAMAKURA, S., Y. SASANO, H. HOMMA, et al. Implantation of octacalcium
phosphate (OCP) in rat skull defects enhances bone repair. J Dent Res, v.78,
n.11, Nov, p.1682-7. 1999.
KAMOGAWA, M. Y., A. R. A. NOGUEIRA, L. M. COSTA, et al. A new strategy for
preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-
amines medium. Spectrochimica Acta Part B, v.56, p.1973-1980. 2001.
KANGAS, J., S. PAASIMAA, P. MAKELA, et al. Comparison of strength properties of
poly-L/D-lactide (PLDLA) 96/4 and polyglyconate (Maxon) sutures: in vitro, in the
subcutis, and in the achilles tendon of rabbits. J Biomed Mater Res, v.58, n.1,
p.121-6. 2001.
KAY, M. I., R. A. YOUNG e A. S. POSNER. Crystal structure of hydroxyapatite.
Nature, v.204, 12 Dec 1964, p.1050-1052. 1964.
KIM, S. S., K. M. AHN, M. S. PARK, et al. A poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite
composite scaffold with enhanced osteoconductivity. J Biomed Mater Res A,
v.80, n.1, Jan, p.206-15. 2007.
210
KIM, S. S., M. SUN PARK, O. JEON, et al. Poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite
composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, v.27, n.8, Mar,
p.1399-409. 2006.
KLAWITTER, J. J. e S. F. HULBERT. Application of porous ceramics for the
attachment of load bearing orthopedic applications. J Biomed Mater Res Symp,
v.2, p.161. 1971.
KLEIN, C. P., P. PATKA, H. B. VAN DER LUBBE, et al. Plasma-sprayed coatings of
tetracalciumphosphate, hydroxyl-apatite, and alpha-TCP on titanium alloy: an
interface study. J Biomed Mater Res, v.25, n.1, Jan, p.53-65. 1991.
KLINGER, M. M., F. RAHEMTULLA, C. W. PRINCE, et al. Proteoglycans at the
bone-implant interface. Crit Rev Oral Biol Med, v.9, p.449-463. 1998.
KNÖFLER, W., H. L. GRAF, T. GRÖSCHEL, et al. Bone reaction caused by
biomaterials. Zeitschrift für Zahnärztliche Implantologie, v.6, p.145-52. 1990.
KOGLIN, D., F. BACKHAUS e J. D. SCHLADOT. Particle size distribution in ground
biological samples. Chemosphere, v.34, p.2041-2047. 1997.
KOKUBO, T. Bioactive glass-ceramics: Properties and applications. Biomaterials,
v.12, p.155-163. 1991.
KOKUBO, T., H. M. KIM e M. KAWASHITA. Novel bioactive materials with different
mechanical properties. Biomaterials, v.24, n.13, Jun, p.2161-75. 2003.
KOKUBO, T., H. KUSHITANI, S. SAKKA, et al. Solutions able to reproduce in vivo
surface-structure changes in bioactive glass-ceramic A-W. J Biomed Mater Res,
v.24, n.6, Jun, p.721-34. 1990.
KOKUBO, T. e H. TAKADAMA. How useful is SBF in predicting in vivo bone
bioactivity? Biomaterials, v.27, n.15, May, p.2907-15. 2006.
KONTIO, R., A. SALO, R. SUURONEN, et al. Fibrous wound repair associated with
biodegradable poly-L/D-lactide copolymer implants: study of the expression of
tenascin and cellular fibronectin. J Mater Sci Mater Med, v.9, n.10, Oct, p.603-9.
1998.
KOPYLOV, P., K. RUNNQVIST, K. JONSSON, et al. Norian SRS versus external
fixation in redisplaced distal radial fractures. A randomized study in 40 patients.
Acta Orthop Scand, v.70, n.1, Feb, p.1-5. 1999.
KOTHAPALLI, C. R., M. T. SHAW e M. WEI. Biodegradable HA-PLA 3-D porous
scaffolds: effect of nano-sized filler content on scaffold properties. Acta
Biomater, v.1, n.6, Nov, p.653-62. 2005.
KULKARNI, R. K., E. G. MOORE, A. F. HEGYELI, et al. Biodegradable poly(lactic
211
acid) polymers. J Biomed Mater Res, v.5, n.3, May, p.169-81. 1971.
KULKARNI, R. K., K. C. PANI, C. NEUMAN, et al. Polylactic acid for surgical
implants. Arch Surg, v.93, n.5, Nov, p.839-43. 1966.
KUMTA, P. N., C. SFEIR, D. H. LEE, et al. Nanostructured calcium phosphates for
biomedical applications: novel synthesis and characterization. Acta Biomater,
v.1, n.1, Jan, p.65-83. 2005.
LAINE, P., R. KONTIO, C. LINDQVIST, et al. Are there any complications with
bioabsorbable fixation devices? A 10 year review in orthognathic surgery. Int J
Oral Maxillofac Surg, v.33, n.3, Apr, p.240-4. 2004.
LAITINEN, O., P. TORMALA, R. TAURIO, et al. Mechanical properties of
biodegradable ligament augmentation device of poly(L-lactide) in vitro and in vivo.
Biomaterials, v.13, n.14, p.1012-6. 1992.
LANDES, C. A., A. BALLON e C. ROTH. In-Patient versus In vitro Degradation of
P(L/DL)LA and PLGA. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater, v.76B, 19
May 2005, p.403-411. 2006.
LANDI, E., F. VALENTINI e A. TAMPIERI. Porous hydroxyapatite/gelatine scaffolds
with ice-designed channel-like porosity for biomedical applications. Acta
Biomater, v.4, n.6, Nov, p.1620-6. 2008.
LARSSON, S. e T. W. BAUER. Use of injectable calcium phosphate cement for
fracture fixation: a review. Clin Orthop Relat Res, n.395, Feb, p.23-32. 2002.
LAURENCIN, C. T. e H. H. LU. Polymer-ceramic composites for bone-tissue
engineering. In: J. E. Davies (Ed.). Bone Engineering. Toronto, Canada: em
sqared incorporated, 2000. Polymer-ceramic composites for bone-tissue
engineering, p.463-72
LEENSLAG, J. W., A. J. PENNINGS, R. R. BOS, et al. Resorbable materials of
poly(L-lactide). VI. Plates and screws for internal fracture fixation. Biomaterials,
v.8, n.1, Jan, p.70-3. 1987a.
______. Resorbable materials of poly(L-lactide). VII. In vivo and in vitro degradation.
Biomaterials, v.8, n.4, Jul, p.311-4. 1987b.
LEFEBVRE, L., L. GREMILLARD, J. CHEVALIER, et al. Sintering behaviour of 45S5
bioactive glass. Acta Biomater, v.4, n.6, Nov, p.1894-903. 2008.
LEGEROS, R. Z. Effect of carbonate on the lattice parameters of apatite. Nature,
v.205, p.403-404. 1965.
______. Calcium phosphates in oral biology and medicine. Monographs in Oral
Science, v.15, p.1-201. 1991.
212
LEGEROS, R. Z. e J. P. LEGEROS. Dense Hydroxyapatite. In: L. L. Hench e J.
Wilson (Ed.). An Introduction to Bioceramics. Singapore: World Scientific,
1993. Dense Hydroxyapatite, p.139-180
LEGEROS, R. Z. e M. S. TUNG. Chemical stability of carbonate- and fluoride-
containing apatites. Caries Res, v.17, n.5, p.419-29. 1983.
LEVENTOURI, T. Synthetic and biological hydroxyapatites: crystal structure
questions. Biomaterials, v.27, n.18, Jun, p.3339-42. 2006.
LI, D., F. YANG e NYCHKA. Indentation-induced residual stresses in 45S5 bioglass
and the stress effect on the material dissolution. Engineering Fracture
Mechanics, v.75, p.4898-4908. 2008.
LI, R., A. E. CLARK e L. L. HENCH. An investigation of bioactive glass powders by
sol-gel processing. J Appl Biomater, v.2, n.4, Winter, p.231-9. 1991.
LIMA, F. M. Regeneração tecidual guiada entre duas superfícies ósseas
aproximadas por distração ostoegênica - in vivo. (Mestrado). Ortodontia,
UFRJ, RIo de Janeiro, 2004. 65 p.
LINDNER, J., K. GRASEDYCK, G. BESTE, et al. On the temporal course of wound
healing with special reference to the synthesis of ground substance and fibrils.
Symp Biol Hung, v.7, p.35-56. 1967.
LOVELACE, T. B., J. T. MELLONIG, R. M. MEFFERT, et al. Clinical evaluation of
bioactive glass in the treatment of periodontal osseous defects in humans. J
Periodontol, v.69, n.9, Sep, p.1027-35. 1998.
LU, H. H., J. A. COOPER, JR., S. MANUEL, et al. Anterior cruciate ligament
regeneration using braided biodegradable scaffolds: in vitro optimization studies.
Biomaterials, v.26, n.23, Aug, p.4805-16. 2005.
LU, J., M. DESCAMPS, J. DEJOU, et al. The biodegradation mechanism of calcium
phosphate biomaterials in bone. J Biomed Mater Res, v.63, n.4, p.408-12. 2002.
LU, M. e A. B. RABIE. Microarchitecture of rabbit mandibular defects grafted with
intramembranous or endochondral bone shown by micro-computed tomography.
Br J Oral Maxillofac Surg, v.41, n.6, Dec, p.385-91. 2003.
LUCKE, A., J. TESSMAR, E. SCHNELL, et al. Biodegradable poly(D,L-lactic acid)-
poly(ethylene glycol)-monomethyl ether diblock copolymers: structures and
surface properties relevant to their use as biomaterials. Biomaterials, v.21, n.23,
Dec, p.2361-70. 2000.
MACNEILL, S. R., C. M. COBB, J. W. RAPLEY, et al. In vivo comparison of synthetic
osseous graft materials. A preliminary study. J Clin Periodontol, v.26, n.4, Apr,
p.239-45. 1999.
213
MANKANI, M. H., S. A. KUZNETSOV, B. FOWLER, et al. In vivo bone formation by
human bone marrow stromal cells: effect of carrier particle size and shape.
Biotechnol Bioeng, v.72, n.1, Jan 5, p.96-107. 2001.
MAQUET, V., A. R. BOCCACCINI, L. PRAVATA, et al. Porous poly(alpha-
hydroxyacid)/Bioglass composite scaffolds for bone tissue engineering. I:
Preparation and in vitro characterisation. Biomaterials, v.25, n.18, Aug, p.4185-
94. 2004.
MARGOLIS, H. C. e E. C. MORENO. Kinetics of hydroxyapatite dissolution in acetic,
lactic, and phosphoric acid solutions. Calcif Tissue Int, v.50, n.2, Feb, p.137-43.
1992.
MARKS JR., S. C. e D. C. HERMEY. The Structure and Development of Bone. In: J.
P. Bilezikian, L. G. Raisz, et al (Ed.). Principles of Bone Biology. San Diego:
Academic Press, v.1, 1996. The Structure and Development of Bone, p.3-14.
MASTROGIACOMO, M., A. MURAGLIA, V. KOMLEV, et al. Tissue engineering of
bone: search for a better scaffold. Orthod Craniofac Res, v.8, n.4, Nov, p.277-
84. 2005.
MASTROGIACOMO, M., S. SCAGLIONE, R. MARTINETTI, et al. Role of scaffold
internal structure on in vivo bone formation in macroporous calcium phosphate
bioceramics. Biomaterials, v.27, n.17, Jun, p.3230-7. 2006.
MAURUS, P. B. e C. C. KAEDING. Bioabsorbable implant material review. Oper
Tech Sports Med, v.12, p.158-160. 2004.
MAVROPOULUS, E. A hidroxiapatita como absorvedor de metais. Escola
Nacional de Saúde Pública, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 1999. 105
p.
MEHLISCH, D. R. Collagen/hydroxylapatite implant for augmenting deficient alveolar
ridges: a 24-month clinical and histologic summary. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol, v.68, n.4 Pt 2, Oct, p.505-14, discussion 514-6. 1989.
MELO, L. G. N., M. J. H. NAGATA, L. L. G. RIBEIRO, et al. Bone healing in surgically
created defects treated with either bioactive glass particles, a calcium sulfate
barrier, or a combination of both materials. A histological and histometric study in
rat tibias. Clin Oral Implants Res, v.16, p.683-691. 2005.
MIDDLETON, J. C. e A. J. TIPTON. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic
devices. Biomaterials, v.21, n.23, Dec, p.2335-46. 2000.
MINABE, M., A. SUGAYA, H. SATOU, et al. Histological study of the hydroxyapatite-
collagen complex implants in periodontal osseous defects in dogs. J Periodontol,
v.59, n.10, Oct, p.671-8. 1988.
MIYAKE, M., K. WATANABE, Y. NAGAYAMA, et al. Synthetic carbonate apatites as
214
inorganic cátion exchangers. J. Chem. Soc., Faraday Trans., v.86, n.12, p.2303-
2306. 1990.
MOON, H. J., K. N. KIM, K. M. KIM, et al. Effect of calcium phosphate glass on bone
formation in calvarial defects of Sprague-Dawley rats. J Mater Sci Mater Med,
v.17, n.9, Sep, p.807-13. 2006.
MOON, S.-I., C.-W. LEE, I. TANIGUCHI, et al. Melt/solid polycondensation of L-lactic
acid: an alternative route to poly(L-lactic acid) with high molecular weight.
Polymer, v.42, p.5059-62. 2001.
MOOSVI, S. R. e R. M. DAY. Bioactive glass modulation of intestinal epithelial cell
restitution. Acta Biomater, Aug 26. 2008.
MORENO, E. C., M. KRESAK e R. T. ZAHRADNIK. Physicochemical aspects of
fluoride-apatite systems relevant to the study of dental caries. Caries Res, v.11
Suppl 1, p.142-71. 1977.
MOTHÉ, C. G. e A. D. AZEVEDO. Análise Térmica Diferencial / Calorimetria
Exploratória Diferencial (DTA / DSC). In: C. G. Mothé e A. D. Azevedo (Ed.).
Análises Térmicas de Materiais. São Paulo: ieditora, 2002. Análise Térmica
Diferencial / Calorimetria Exploratória Diferencial (DTA / DSC), p.113-223
MOTTA, A. C. e E. A. R. DUEK. Estudo inicial da degradação in vitro de poli (L-co-
DL ácido lático) sintetizado em laboratório. Revista Matéria, v.13, n.2, p.1-13.
2008.
MULLER, R. e P. RUEGSEGGER. Micro-tomographic imaging for the nondestructive
evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform, v.40,
p.61-79. 1997.
MULLER, R., H. VAN CAMPENHOUT, B. VAN DAMME, et al. Morphometric analysis
of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological
sections and micro-computed tomography. Bone, v.23, n.1, Jul, p.59-66. 1998.
NARANG, R. e D. M. LASKIN. Experimental osteogenesis at fracture sites and gaps.
J Oral Surg, v.34, p.225-31. 1976.
NAVARRO, M., M. P. GINEBRA, J. A. PLANELL, et al. In vitro degradation behavior
of a novel bioresorbable composite material based on PLA and a soluble CaP
glass. Acta Biomater, v.1, n.4, Jul, p.411-9. 2005.
NEJATI, E., H. MIRZADEH e M. ZANDI. Synthesis and characterization of nano-
hydroxyapatite rods/poly(L-lactide acid) composite scaffolds for bone tissue
engineering. Composites: Part A, v.39, p.1589-1596. 2008.
NELSON, D. G. The influence of carbonate on the atomic structure and reactivity of
hydroxyapatite. J Dent Res, v.60 Spec No C, Aug, p.1621-9. 1981.
215
NETZ, D. J., P. SEPULVEDA, V. C. PANDOLFELLI, et al. Potential use of gelcasting
hydroxyapatite porous ceramic as an implantable drug delivery system. Int J
Pharm, v.213, n.1-2, Feb 1, p.117-25. 2001.
NKENK, E., F. KLOSS, J. WILTFANG, et al. Histomorphometric and fluorescence
microscopic analysis of bone remodeling after installation of implanst using an
osteotome technique. Clin. Oral Impl. Res., v.13, p.595-602. 2002.
NORHOLT, S. E., T. K. PEDERSEN e J. JENSEN. Le Fort I miniplate
osteosynthesis: a randomized, prospective study comparing resorbable
PLLA/PGA with titanium. Int J Oral Maxillofac Surg, v.33, n.3, Apr, p.245-52.
2004.
OGINO, M. e L. L. HENCH. Formation of calcium phosphate films on silicate glasses.
J Non-Cryst Solids, v.38, 39, p.673-678. 1980.
OHURA, K., T. NAKAMURA, T. YAMAMURO, et al. Bioactivity of CaO.SiO2 glasses
added with various ions. J Mater Sci Mater Med, v.3, p.95-100. 1992.
OKADA, H., Y. INOUE, T. HEYA, et al. Pharmacokinetics of once-a-month injectable
microspheres of leuprolide acetate. Pharm Res, v.8, n.6, Jun, p.787-91. 1991.
OLIVEIRA, J. M., R. N. CORREIA e M. H. FERNANDES. Effect of SiO2 on
amorphous phase separation of CaO- P2O5- SiO2-MgO glasses. Journal of
Non-Crystalline Solids, v.273, p.59-63. 2000.
OLIVEIRA, J. M., M. H. FERNANDES e R. N. L. CORREIA. Development of a New
Glass Ceramic in the System MgO-3CaO.P205-SiO2. Bioceramics, v.5, p.7-14.
1997.
OONISHI, H., L. L. HENCH, J. WILSON, et al. Comparative bone growth behavior in
granules of bioceramic materials of various sizes. J Biomed Mater Res, v.44,
n.1, Jan, p.31-43. 1999.
OONISHI, H., S. KUSHITANI, E. YASUKAWA, et al. Particulate bioglass compared
with hydroxyapatite as a bone graft substitute. Clin Orthop Relat Res, n.334,
Jan, p.316-25. 1997.
PAAVOLAINEN, P., E. KARAHARJU, P. SLATIS, et al. Effect of rigid plate fixation on
structure and mineral content of cortical bone. Clin Orthop Relat Res, n.136,
Oct, p.287-93. 1978.
PACIORNIK, S. e M. H. P. MAURICIO. Digital Imaging. In: G. F. Vander Voort (Ed.).
ASM Handbook - Metallography and Microstructures: ASM International,
Materials Park, 2004. Digital Imaging, p.368-402
PANDA, R. N., M. F. HSIEH, R. J. CHUNG, et al. FTIR, XRD, SEM and solid state
NMR investigation of carbonate-containing hydroxyapatite nano-particles
synthesized by hydroxide-gel technique. J Phys Chem Solids, v.63, p.193-9.
216
2003.
PARK, J. Y. e J. E. DAVIES. Red blood cell and platelet interactions with titanium
implant surfaces. Clin Oral Implants Res, v.11, n.6, Dec, p.530-9. 2000.
PASOLINI, I. J. Regeneração de Defeitos Ósseos com Utilização do Polímero
PLLA-co-PDLLA: Estudo Experimental em Coelhos. (Mestrado). Ortodontia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2006. 70 p.
PELTOLA, M., I. KINNUNEN e K. AITASALO. Reconstruction of orbital wall defects
with bioactive glass plates. J Oral Maxillofac Surg, v.66, n.4, Apr, p.639-46.
2008.
PELTONIEMI, H., N. ASHAMMAKHI, R. KONTIO, et al. The use of bioabsorbable
osteofixation devices in craniomaxillofacial surgery. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod, v.94, n.1, Jul, p.5-14. 2002.
PEREIRA, M. M., A. E. CLARK e L. L. HENCH. Calcium phosphate formation on sol-
gel-derived bioactive glasses in vitro. J Biomed Mater Res, v.28, n.6, Jun, p.693-
8. 1994.
PETTERSON, L. J. Oral and Maxillofacial Surgery. Saint Louis: Mosby. 1998. 797
p.
POSNER, A. S. Crystal chemistry of bone mineral. Physiol Rev, v.49, n.4, Oct,
p.760-92. 1969.
PROIKAKIS, C. S., N. J. MAMOUZELOS, T. P. A., et al. Swelling and hydrolytic
degradation of poly(D,L-lactid acid) in aquaeous solutions. Polymer Degradation
and Stability, v.91, n.3, March 2006, p.614-619. 2005.
PYDA, M., R. C. BOPP e B. WUNDERLICH. Heat capacity of poly(lactic acid). J
Chem Thermodynamics, v.36, n.9, Sep, p.731-42. 2004.
RAINER, A., S. M. GIANNITELLI, F. ABBRUZZESE, et al. Fabrication of bioactive
glass-ceramic foams mimicking human bone portions for regenerative medicine.
Acta Biomater, v.4, n.2, Mar, p.362-9. 2008.
RAMAY, H. R. e M. ZHANG. Preparation of porous hydroxyapatite scaffolds by
combination of the gel-casting and polymer sponge methods. Biomaterials, v.24,
n.19, Aug, p.3293-302. 2003.
RANGAVITTAL, N., A. R. LANDA-CANOVAS, J. M. GONZALEZ-CALBET, et al.
Structural study and stability of hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate: two
important bioceramics. J Biomed Mater Res, v.51, n.4, Sep 15, p.660-8. 2000.
RESENDE, A. C., L. R. CUNHA, S. SASKA, et al. Analise biológica da hidroxiapatita
após implantação em tíbias de ratos. Rev Bras Ortop, v.41, n.4, apr, p.132-6.
2006.
217
REY, C., H. M. KIM, L. GERSTENFELD, et al. Characterization of the apatite crystals
of bone and their maturation in osteoblast cell culture: comparison with native
bone crystals. Connect Tissue Res, v.35, n.1-4, p.343-9. 1996.
REZENDE, C. A. e E. A. R. DUEK. Blendas de poli(ácido lático-co-glicólico)/poli
ácido lático: degradação in vitro. Polímeros: Ciência e Tecnologia, v.13, n.1,
p.36-44. 2003.
REZENDE, C. A., LUCHESI, C, BARBO, M.L.P., DUEK, E.A.R. Membranas de poli
(ácido lático-co-ácido glicólico) como curativos para pele: degradação in vitro e in
vivo. Polímeros, v.15 n.3, jul./set., p.232-238. 2005.
REZENDE, M., I. MESQUITA, S. RIBAK, et al. Nova técnica para obtenção de
enxerto de osso esponjoso Estudo anátomo-clínico*. Revista Brasileira de
Ortopedia, v.31, n.5, p.419-423. 1996.
RIBEIRO, A. A. Reações histológicas e morfológicas na biodegradação de
parafusos de ácido poli-láctico (PLDLA) utilizados para fixação interna
rígida - Estudo em coelhos. (Mestrado). Ortodontia, UFRJ, Rio de Janeiro,
2005. 85 p.
RIBEIRO, A. A., C. N. ELIAS, M. T. S. ARAÚJO, et al. Degradação de placas
bioabsorvíveis usadas em fixações internas de cirurgias buco-maxilo-faciais.
Revista Brasileira de Implantodontia, v.11, n.4, Out-Dez, p.8-12. 2005.
RIBEIRO, R. P. Efeito da radiação gama no comportamento in vitro de um
copolímero bioabsorvível. (Mestrado). Ciência dos Materiais, IME - Instituto
Militar de Engenharia, Rio de Janeiro, 2006. 115 p.
RIMONDINI, L., N. NICOLI-ALDINI, M. FINI, et al. In vivo experimental study on bone
regeneration in critical bone defects using an injectable biodegradable PLA/PGA
copolymer. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v.99, n.2, Feb,
p.148-54. 2005.
RIMSTIDT, J. D. e H. L. BARNES. The kinetics of silica-water reactions. Geochim
Cosmochim Acta, v.44, p.1683-99. 1980.
ROBBINS, M. M., A. R. VACCARO e L. MADIGAN. The use of bioabsorbable
implants in spine surgery. Neurosurg Focus, v.16, n.3, Mar, p.1-7. 2004.
ROBERTS, W. E., F. R. HELM, K. J. MARSHALL, et al. Rigid endosseous implants
for orthodontic and orthopedic anchorage. Angle Orthod, v.59, p.247-56. 1989.
RODRIGUES, C. V. M., P. SERRICELLA, A. B. R. LINHARES, et al. Characterization
of a bovine collagen-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue
engineering. Biomaterials, v.24, p.4987-97. 2003.
ROETHER, J. A., A. R. BOCCACCINI, L. L. HENCH, et al. Development and in vitro
218
characterisation of novel bioresorbable and bioactive composite materials based
on polylactide foams and Bioglass for tissue engineering applications.
Biomaterials, v.23, n.18, Sep, p.3871-8. 2002.
ROHNER, D., D. W. HUTMACHER, T. K. CHENG, et al. In vivo efficacy of bone-
marrow-coated polycaprolactone scaffolds for the reconstruction of orbital defects
in the pig. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, v.66, n.2, Aug 15, p.574-80.
2003.
ROKKANEN, P., O. BOSTMAN, S. VAINIONPAA, et al. Biodegradable implants in
fracture fixation: early results of treatment of fractures of the ankle. Lancet, v.1,
n.8443, Jun 22, p.1422-4. 1985.
ROKKANEN, P. U., O. BOSTMAN, E. HIRVENSALO, et al. Bioabsorbable fixation in
orthopaedic surgery and traumatology. Biomaterials, v.21, n.24, Dec, p.2607-13.
2000.
ROSS, M. H., E. J. REITH e L. J. ROMRELL. Osso. In: M. H. Ross, E. J. Reith, et al
(Ed.). Histologia: Texto e Atlas. São Paulo: Editora Médica Panamericana,
1993. Osso, p.141-80
ROTHAMEL, D., F. SCHWARZ, M. HERTEN, et al. Dimensional ridge alterations
following socket preservation using a nanocrystalline hydroxyapatite paste. A
histomorphometrical study in dogs. Int J Oral Maxillofac Surg, v.37, n.8, Aug,
p.741-7. 2008.
RUDOLPH, R., J. VANDE BERG e H. P. EHRLICH. Wound contraction and scar
contracture. In: I. K. Cohen, R. F. Diegelmann, et al (Ed.). Wound Healing:
Biomechanical and Clinical Aspects. Philadelphia, Pa: Saunders, 1992. Wound
contraction and scar contracture, p.96-114
RUELLAS, A. C. O. Influência do uso de anovulatórios na movimentação
ortodôntica - estudo em coelhos. Ortodontia, Faculdade de Odontologia -
UFRJ, Rio de Janeiro, 1999. 159 p.
RUSSIAS, J., E. SAIZ, R. K. NALLA, et al. Fabrication and mechanical properties of
PLA/HA composites: A study of in vitro degradation. Materials Science and
Engineering: C, v.26, p.1289-1295. 2006.
SAIZ, E., L. GREMILLARD, G. MENENDEZ, et al. Preparation of porous
hydroxyapatite scaffolds. Materials Science and Engineering: C, v.27, n.3,
April, p.546-550. 2007.
SANTOS JR, D., A. C. TOMAZELLI, F. J. KRUG, et al. Moagem criogênica para
preparo de amostras em técnicas analíticas. VI Workshop sobre Preparo de
Amostras, p.57-68. 2006.
SCHEPERS, E., M. DE CLERCQ, P. DUCHEYNE, et al. Bioactive glass particulate
material as a filler for bone lesions. J Oral Rehabil, v.18, n.5, Sep, p.439-52.
219
1991.
SCHEPERS, E. J. e P. DUCHEYNE. Bioactive glass particles of narrow size range
for the treatment of oral bone defects: a 1-24 month experiment with several
materials and particle sizes and size ranges. J Oral Rehabil, v.24, n.3, Mar,
p.171-81. 1997.
SCHEPERS, E. J., P. DUCHEYNE, L. BARBIER, et al. Bioactive glass particles of
narrow size range: a new material for the repair of bone defects. Implant Dent,
v.2, n.3, Fall, p.151-6. 1993.
SCHLIEPHAKE, H., F. W. NEUKAM, D. HUTMACHER, et al. Enhancement of bone
ingrowth into a porous hydroxylapatite-matrix using a resorbable polylactic
membrane: an experimental pilot study. J Oral Maxillofac Surg, v.52, n.1, Jan,
p.57-63. 1994.
SCHMITZ, J. P. e J. O. HOLLINGER. The critical size defect as an experimental
model for craniomandibulofacial nonunion. Clin Orthop, v.205, p.299-308. 1986.
SCHMITZ, J. P., Z. SCHWARTZ, J. O. HOLLINGER, et al. Characterization of rat
calvarial nonunion defect. Acta Anat, v.138, p.185-192. 1990.
SCHULTZ, R. J. The Language of Fractures. Baltimore: Williams and Wilkins.
1990. 1-333 p.
SCULEAN, A., G. C. CHIANTELLA, P. WINDISCH, et al. Healing of intra-bony
defects following treatment with a composite bovine-derived xenograft (Bio-Oss
Collagen) in combination with a collagen membrane (Bio-Gide PERIO). J Clin
Periodontol, v.32, n.7, Jul, p.720-4. 2005.
SEAL, B. L., T. C. OTERO e A. PANITCH. Polymeric biomaterials of tissue and
organ regeneration. Materials Science and Engineering: R: Reports, v.34, n.4-
5, 10 October 2001, p.147-230. 2001.
SEPULVEDA, P., J. R. JONES e L. L. HENCH. Characterization of melt-derived
45S5 and sol-gel-derived 58S bioactive glasses. J Biomed Mater Res, v.58, n.6,
p.734-40. 2001.
SERRA, G. G. Desempenho de Mini-implantes Ortodônticos Submetidos à
Carga Imediata. Estudo “In Vivo”. (Doutorado). Departamento de Ciência dos
Materiais, Instituto Militar de Engenharia, Rio de Janeiro, 2007. 166 p.
SERVICE, R. F. Tissue engineers build new bone. Science, v.289, n.5484, Sep 1,
p.1498-500. 2000.
SHIKINAMI, Y. e M. OKUNO. Bioresorbable devices made of forged composites of
hydroxyapatite (HA) particles and poly L-lactide (PLLA). Part II: practical
properties of miniscrews and miniplates. Biomaterials, v.22, n.23, Dec, p.3197-
211. 2001.
220
SHORS, E. C. e R. E. HOLMES. Porous Hydroxyapatite. In: L. L. Hench e J. Wilson
(Ed.). An Introduction to Bioceramics. Singapore: World Scientific Publishing
Co. Pte. Ltd, 1993. Porous Hydroxyapatite, p.181-198
SILVA, R. V., J. A. CAMILLI, C. A. BERTRAN, et al. The use of hydroxyapatite and
autogenous cancellous bone grafts to repair bone defects in rats. Int J Oral
Maxillofac Surg, v.34, n.2, Mar, p.178-84. 2005.
SILVER, I. A. Local and systemic factors which affect the proliferation of fibroblasts.
In: E. Kulonen, Pikkarainen, J. (Ed.). Biology of Fibroblasts. London, England:
Academic Press, 1973. Local and systemic factors which affect the proliferation of
fibroblasts., p.507-519
SO, K., S. FUJIBAYASHI, M. NEO, et al. Accelerated degradation and improved
bone-bonding ability of hydroxyapatite ceramics by the addition of glass.
Biomaterials, v.27, n.27, Sep, p.4738-44. 2006.
SÖDERGÅRD, A. e M. STOLT. Properties of lactic acid based polymers and their
correlation with composition. Progress in Polymer Science, v.27, n.6, Jul,
p.1123-1163. 2002.
SPINU, M., C. JACKSON, M. Y. KEATING, et al. Material Design in Poly(Lactic Acid)
Systems: Block Copolymers, Star Homo- and Copolymers, and Stereocomplexes.
Journal of Macromolecular Science, Part A. Pure and Applied Chemistry,
v.33, n.10, October, p.1497-1530. 1996.
STANLEY, H. R., M. B. HALL, A. E. CLARK, et al. Using 45S5 bioglass cones as
endosseous ridge maintenance implants to prevent alveolar ridge resorption: a 5-
year evaluation. Int J Oral Maxillofac Implants, v.12, n.1, Jan-Feb, p.95-105.
1997.
STUANI, A. S. Aspectos histológicos do periodonto no lado de pressão de
dentes, quando submetidos à força ortodôntica. (Mestrado). Odontopediatria
e Ortodontia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003. 159
p.
SUGANUMA, J. e H. ALEXANDER. Biological response of itramedullary bone to
poly-L-lactic acid. J Appl Biomater, v.4, n.1, p.13-27. 1993.
SUMMERS, B. N. e S. M. EISENSTEIN. Donor site pain from the ilium. A
complication of lumbar spine fusion. J Bone Joint Surg Br, v.71, n.4, Aug, p.677-
80. 1989.
SURPURE, S. J., K. S. SMITH, S. M. SULLIVAN, et al. The use of a resorbable
plating system for treatment of craniosynostosis. J Oral Maxillofac Surg, v.59,
n.11, Nov, p.1271-5; discussion 1275-6. 2001.
SUURONEN, R., T. POHJONEN, J. HIETANEN, et al. A 5-year in vitro and in vivo
221
study of the biodegradation of polylactide plates. J Oral Maxillofac Surg, v.56,
n.5, May, p.604-14. 1998.
TACHIBANA, Y., S. NINOMIYA, Y. T. KIM, et al. Tissue response to porous
hydroxyapatite ceramic in the human femoral head. J Orthop Sci, v.8, n.4, p.549-
53. 2003.
TAI, B. J., M. Q. DU, H. JIANG, et al. Anti-gingivitis efficacy of a dentifrice containing
bioactive glass (NovaMin) particulate. J Dent Res, v.83, n.Special Issue A,
p.1545. 2004.
TAMS, J., C. A. JOZIASSE, R. R. BOS, et al. High-impact poly(L/D-lactide) for
fracture fixation: in vitro degradation and animal pilot study. Biomaterials, v.16,
n.18, Dec, p.1409-15. 1995.
TAYLOR, T. D. e J. F. HELFRICK. Technical considerations in mandibular ridge
reconstruction with collagen/hydroxylapatite implants. J Oral Maxillofac Surg,
v.47, n.4, Apr, p.422-5. 1989.
TECHER, I., T. ADVOCAT, J. LANCELOT, et al. Dissolution kinetics of basaltic
glasses: control by solution chemestry and protective effect of the alteration film.
Chem Geol, v.176, p.235-63. 2001.
TEMENOFF, J. S. e A. G. MIKOS. Bone-tissue engineering using synthetic
biodegradable polymer scaffolds. In: J. E. Davies (Ed.). Bone Engineering.
Toronto, Canada: em squared incorporated, 2000a. Bone-tissue engineering
using synthetic biodegradable polymer scaffolds, p.454-461
______. Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering.
Biomaterials, v.21, n.23, Dec, p.2405-12. 2000b.
______. Review: tissue engineering for regeneration of articular cartilage.
Biomaterials, v.21, n.5, Mar, p.431-40. 2000c.
THORWARTH, M., S. SCHULTZE-MOSGAU, P. KESSLER, et al. Bone regeneration
in osseous defects using a resorbable nanoparticular hydroxyapatite. J Oral
Maxillofac Surg, v.63, n.11, Nov, p.1626-33. 2005.
THORWARTH, M., S. SROUR, E. FELSZEGHY, et al. Stability of autogenous bone
grafts after sinus lift procedures: a comparative study between anterior and
posterior aspects of the iliac crest and an intraoral donor site. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v.100, n.3, Sep, p.278-84. 2005.
TORRICELLI, P., M. FINI, G. GIAVARESI, et al. Characterization of bone defect
repair in young and aged rat femur induced by xenogenic demineralized bone
matrix. J Periodontol, v.73, n.9, Sep, p.1003-9. 2002.
TUAN, T. L., A. SONG, S. CHANG, et al. In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell
growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels. Exp Cell
222
Res, v.223, n.1, Feb 25, p.127-34. 1996.
VACANTI, C. A. e J. P. VACANTI. Bone and cartilage reconstruction with tissue
engineering approaches. Otolaryngol Clin North Am, v.27, n.1, Feb, p.263-76.
1994.
VAN LENTHE, G. H., H. HAGENMULLER, M. BOHNER, et al. Nondestructive micro-
computed tomography for biological imaging and quantification of scaffold-bone
interaction in vivo. Biomaterials, v.28, n.15, May, p.2479-90. 2007.
VEHOF, J. W. M., M. T. U. HAUS, A. E. DE RUIJTER, et al. Bone formation in
transforming growth factor beta-I-loaded titanium fiber mesh implants. Clin. Oral
Impl. Res., v.13, p.94-102. 2002.
VERRIER, S., J. J. BLAKER, V. MAQUET, et al. PDLLA/Bioglass composites for
soft-tissue and hard-tissue engineering: an in vitro cell biology assessment.
Biomaterials, v.25, n.15, Jul, p.3013-21. 2004.
VERT, M., P. CHRISTEL, F. CHABOT, et al. Bioresorbable plastic materials for bone
surgery. In: G. W. Hasting e P. Ducheyne (Ed.). Macromolecular Biomaterials.
Boca Raton, FL: CRC Press, 1984. Bioresorbable plastic materials for bone
surgery, p.120-42
VOGEL, M., C. VOIGT, U. M. GROSS, et al. In vivo comparison of bioactive glass
particles in rabbits. Biomaterials, v.22, n.4, Feb, p.357-62. 2001.
WALDUCK, A. K., J. P. OPDEBEECK, H. E. BENSON, et al. Biodegradable implants
for the delivery of veterinary vaccines: design, manufacture and antibody
responses in sheep. J Control Release, v.51, n.2-3, Feb 12, p.269-80. 1998.
WAN, Y., Y. WANG, Z. LIU, et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like
cells on micro- and nano-scale topography structured poly(L-lactide).
Biomaterials, v.26, n.21, Jul, p.4453-9. 2005.
WANG, M. Developing bioactive composite materials for tissue replacement.
Biomaterials, v.24, n.13, Jun, p.2133-51. 2003.
WANG, M., N. H. LADIZESKY, K. E. TANNER, et al. Hydrostatically extruded
HAPEX®. J Mater Sci, v.35, p.1023-1030. 2000.
WEIR, N. A., F. J. BUCHANAN, J. F. ORR, et al. Processing, annealing and
sterilisation of poly-L-lactide. Biomaterials, v.25, n.18, Aug, p.3939-49. 2004.
WILCZEK, M., J. BERTLING e D. HINTEMANN. Optimised technologies for
cryogenic grinding. International Journal of Mineral Processing, v.74S,
p.S425-S434. 2004.
WILSON, J. e S. B. LOW. Biactive ceramics for periodontal treatment: Comparative
studies. J Appl Biomater, v.3, p.123-129. 1992.
223
WILSON, J., A. YLI-URPO e R. HAPPONEN. Bioactive Glasses: Clinical
Applications. In: L. L. Hench e J. Wilson (Ed.). An Introduction to Bioceramics.
Advanced Series in Ceramics. Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte.
Ltd, v.1, 1993. Bioactive Glasses: Clinical Applications, p.63-73
WOO, B. H., G. JIANG, Y. W. JO, et al. Preparation and characterization of a
composite PLGA and poly(acryloyl hydroxyethyl starch) microsphere system for
protein delivery. Pharm Res, v.18, n.11, Nov, p.1600-6. 2001.
XIA, Z., L. M. GROVER, Y. HUANG, et al. In vitro biodegradation of three brushite
calcium phosphate cements by a macrophage cell-line. Biomaterials, v.27, n.26,
Sep, p.4557-65. 2006.
XYNOS, I. D., A. J. EDGAR, L. D. BUTTERY, et al. Gene-expression profiling of
human osteoblasts following treatment with the ionic products of Bioglass 45S5
dissolution. J Biomed Mater Res, v.55, n.2, May, p.151-7. 2001.
YAPP, D. T., D. K. LLOYD, J. ZHU, et al. Tumor treatment by sustained intratumoral
release of cisplatin: effects of drug alone and combined with radiation. Int J
Radiat Oncol Biol Phys, v.39, n.2, Sep 1, p.497-504. 1997.
YERIT, K. C., S. HAINICH, G. ENISLIDIS, et al. Biodegradable fixation of mandibular
fractures in children: stability and early results. Oral Surg Oral Med Oral Pathol
Oral Radiol Endod, v.100, n.1, Jul, p.17-24. 2005.
YOUNG, R. A. e J. C. ELLIOT. Scale bases for several properties of apatites. Arch
Oral Biol, v.11, p.699-707. 1966.
ZAFIRAU, W., D. PARKER, W. BILLOTTE, et al. Development of a ceramic device
for the continuous local delivery of steroids. Biomed Sci Instrum, v.32, p.63-70.
1996.
ZHANG, D., M. HUPA e L. HUPA. In situ pH within particle beds of bioactive glasses.
Acta Biomater, v.4, n.5, Sep, p.1498-505. 2008.
ZHANG, F., T. KATO, M. FUJI, et al. Gelcasting fabrication of porous ceramics using
a continuous process. Journal of the European Ceramic Society, v.26, p.667–
671. 2006.
ZHANG, K., Y. MA e L. F. FRANCIS. Porous polymer/bioactive glass composites for
soft-to-hard tissue interfaces. J Biomed Mater Res, v.61, n.4, Sep 15, p.551-63.
2002.
ZHANG, K., Y. WANG, M. A. HILLMYER, et al. Processing and properties of porous
poly(L-lactide)/bioactive glass composites. Biomaterials, v.25, n.13, Jun, p.2489-
500. 2004.
ZHAO, L., X. YAN, X. ZHOU, et al. Mesoporous bioactive glasses for controlled drug
224
release. Micropor. Mesopor. Mater., v.109, p.210-215. 2008.
ZHU, Y. e S. KASKEL. Comparison of the in vitro bioactivity and drug release
property of mesoporous bioactive glasses (MBGs) and bioactive glasses (BGs)
scaffolds. Micropor. Mesopor. Mater., v.Article in Press,
n.doi:10.1016/j.micromeso.2008.08.046. 2008.
ZHU, Y., C. WU, Y. RAMASWAMY, et al. Preparation, characterization and in vitro
bioactivity of mesoporous bioactive glasses (MBGs) scaffolds for bone tissue
engineering. Micropor. Mesopor. Mater., v.112, p.494-503. 2008.
225
7. APÊNDICES
226
7.1. PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA
227
7.2. ARTIGOS PUBLICADOS
7.2.1. Artigo 1
Coimbra, M.E.R., Elias, C. N., Coelho, P.G. In vitro degradation of Poly-L-D-lactic
acid (PLDLA) pellets and powder used as synthetic alloplasts for bone grafting. J.
Mater. Sci: Mater. Med., v.19, n.10, p.3227-3234. 2008.
7.2.2. Artigo 2
Coimbra, M.E.R., Elias, C. N., Coelho, P.G. In vitro characterization / degradation
of two bioglasses used as synthetic alloplasts for bone grafting. Key Engineering
Materials, v.396-398, p.23-26. 2009.
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
7.3. ARTIGOS A SEREM SUBMETIDOS
7.3.1. Artigo 1
PLDLA characterization with XRD, FTIR, and chromatography.
7.3.2. Artigo 2
In vivo Bone Regeneration with Four Particulate Grafting Materials: A Three-
Dimensional Micro-Computed Tomographic Study.
7.3.3. Artigo 3
In vivo Bone Regeneration with Four Particulate Grafting Materials: A
Fluorescence and Light Microscopy Study.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
