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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
“CO-EXPRESSÃO DE LEPTINA E RECEPTORES
PARA ESTRÓGENO NA REGIÃO PREÓPTICA-
HIPOTALÂMICA”
BRUNO DEL BIANCO BORGES
Ribeirão Preto
2007
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
“CO-EXPRESSÃO DE LEPTINA E RECEPTORES
PARA ESTRÓGENO NA REGIÃO PREÓPTICA-
HIPOTALÂMICA”
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto-USP para
obtenção do título de Mestre em Ciências-Área de
Concentração: Fisiologia.
Aluno: Bruno Del Bianco Borges
Orientador: Prof. Dr. Celso Rodrigues Franci
Ribeirão Preto
2007
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Del Bianco-Borges, Bruno
Co-expressão de leptina e receptores para estrógeno na região
preóptica- hipotalâmica de ratas .
Ribeirão Preto, 2007.
81p.: il.
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-USP.
Área de Concentração: Fisiologia.
Orientados: Franci, Celso Rodrigues
1. leptina. 2. GnRH. 3. arqueado. 4. receptores para estrógeno. 5. área
preóptica medial.
Dedico este trabalho aos meus pais,
Eurípedes (Piriá) e Cássia, e a minha irmã
Lara que sempre me deram o maior apoio,
incentivo e sempre confiaram em mim. Se não
fosse por todo ensinamento e educação que
vocês me deram, não estaria escrevendo esta
dissertação.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Celso Rodrigues Franci por ter me aceitado em seu laboratório,
por ter confiado em meu trabalho, pela orientação e por sua disposição e paciência
de nos ensinar sempre que necessário.
Aos Profs. Dr. Gilberto Luiz Sanvitto e Dr. Luiz Carlos Navegantes pela
avaliação e pelas sugestões que contribuíram para o aprimoramento deste
trabalho.
A toda minha família e a todos aqueles que me apoiaram, incentivaram e
estiveram comigo nos momentos mais difíceis desde o início.
Aos meus tios Eurípedes e Nadir, a quem devo grande agradecimento e que
me tratam como filho, como muito amor e carinho.
Ao técnico Rogério Rosário Azevedo pelo suporte técnico e pela amizade no
dia a dia, pois “cumpanheiro é cumpanheiro”...
Ao amigo Dr. Waldecy de Lucca Jr. “Bereu” que tanto me ajudou e me
ensinou no início.
Aos amigos do laboratório Leandro, Guillermo, Fernanda, Fabiana, Waldecy,
Carmem, Fábio, Adriana e Cláudia, pela convivência, respeito e alegria de
trabalharmos juntos.
Aos meus grandes amigos Leandro, Patrícia, Márcio, Manuela, Felipe,
Giulianna, pelo convívio, conselhos e nossa amizade.
A Dani pela amizade, por me dar grande apoio e companheirismo nos
momentos extremamente difíceis do final do mestrado e por me ajudar a suportar
todos problemas deste período.
Aos meus amigos Olivaldo “Li” e Reginho que mesmo distantes me dão toda
a força.
A todos amigos de Cássia-MG que torcem por mim
Aos meus primos Lucas “Bolinha”, Júlio “Mudim” e Gabriel “Zói”, pela
amizade, apoio e são como se fossem meus irmãos.
Aos amigos Daniel Zoccal, Matheus, Valter e todos os colegas da pós-
graduação pela convivência, amizade e companheirismo.
Ao Rubinho, pelo suporte técnico na histologia e pela amizade no dia a dia.
A todos os amigos do futebol de todas as quartas-feiras.
Ao Léo e Eduardo, pelo cuidado e manutenção dos nossos animais.
Aos secretários do departamento de Fisiologia, Claúdia, Elisa e Carlos, pela
competência com que realizaram seu trabalho, solucionando problemas dos pós-
graduandos.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP/processo nº 05/53440-1) pelo apoio financeiro.
"Mesmo as noites totalmente sem estrelas podem anunciar a
aurora de uma gr
ande realização"
Martin Luther King
SUMÁRIO
Resumo 03
Abstract 04
Introdução 05
Eixo hipotálamo-hipófise-gonadal
07
Interação balanço energético e reprodução
11
Leptina
12
Interação leptina e reprodução
15
Objetivos 21
Materiais e Métodos 23
Animais e monitoramento do ciclo estral
24
Imunofluorescência
24
Análise dos resultados
26
Protocolo experimental para dosagem de leptina
27
Protocolo experimental para dosagem de RNAm para leptina
30
Análise estatística
33
Resultados 35
Imunofluorescências
39
Expressão gênica de leptina
47
Western Blot 53
Discussão 54
Conclusão 66
Referências Bibliográficas 68
Anexos 79
Lista de abreviaturas
AH: hipotálamo anterior
ARC: núcleo arqueado
BDB: banda diagonal de Broca
BSA: soroalbumina bovina
DTT: ditiotreitol
E
2
: estrógeno
EDTA: ácido etilenodiaminotetracético
ELISA: ensaio imunoenzimático
ER-α: receptor para estrógeno do tipo alfa
ER-β: receptor para estrógeno do tipo beta
FSH: hormônio folículo-estimulante
GnRH: hormônio liberador de
gonadotrofinas
HDM: hipotálamo dorsomedial
HVM: hipotálamo ventromedial
LH: hormônio luteinizante
MBH: hipotálamo mediobasal
EM: eminência mediana
MPOA: área pré-óptica medial
P
4
: progesterona
NPY: neuropeptídeo Y
NO: óxido nítrico
OB-R: receptor para leptina
OVLT: órgão vasculoso da lâmina
terminal
OVX: ovariectomizada
PBS: tampão fosfato salino
PVN: núcleo paraventricular
QRT-PCR: Real time – PCR
RT-PCR: reverse transcription –
polymerase chain reaction
SCN: núcleo supraquiasmático
SDS: dodecil sulfato de sódio
SON: núcleo supraóptico
3
RESUMO
O eixo reprodutivo tem como principal controlador o hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH). O estrógeno age em neurônios sintetizadores de GnRH, direta
e indiretamente, modulando a secreção deste, por meio de seus receptores do tipo-α
(ER-α) ou -β (ER-β). Há interação do eixo reprodutivo com o balanço energético e um
possível mediador desta interação é a leptina, hormônio que age na regulação do
metabolismo, do comportamento alimentar e da reprodução. Animais homozigotos
para o gene “ob” (ob/ob) são incapazes de produzir leptina, tornando-se obesos e
inférteis, efeitos que são revertidos após administração sistêmica de leptina. Além
disso, o estrógeno pode modular a secreção de leptina pelos adipócitos. Assim, os
objetivos deste trabalho foram verificar:1) se neurônios que expressam leptina também
expressam ER-α ou ER-β na área preóptica medial (MPOA) e nos núcleos
hipotalâmicos arqueado (ARC), dorsomedial (HDM) e ventromedial (HVM); 2) se há
variação da expressão gênica e protéica da leptina nessas regiões durante o ciclo
estral ou em animais ovariectomizados (OVX) tratados com estrógeno e da expressão
gênica da leptina na hipófise e no tecido adiposo dos animais OVX tratados com
estrógeno ou veículo. Ratas Wistar (250-280g) com 3 ciclos regulares e OVX tratadas
com estrógeno ou veículo foram utilizadas. Para verificar uma possível co-expressão
realizou-se imunofluorescência para dupla marcação, com confirmação da co-
expressão por meio de microscopia confocal. Para analisar expressão gênica e
protéica foram utilizadas as técnicas de Real Time PCR e Western Blot,
respectivamente. Nossos resultados mostraram co-expressão de leptina e ER-α na
MPOA e HDM, e leptina e ER-β na MPOA, HDM e ARC. Houve expressão gênica de
leptina em metaestro, diestro e proestro na MPOA; metaestro e proestro no ARC;
diestro, proestro e estro no HDM, mas não houve diferença estatística entre as
expressões detectadas em cada área. Também, não houve diferença estatística da
expressão gênica de leptina, na MPOA, no ARC, no HDM, na hipófise e no tecido
adiposo entre animais OVX tratados com estrógeno e com veículo. Não foi possível
detectar a leptina na MPOA, no ARC e no HDM. Em conclusão, os resultados do
presente trabalho indicam que: há expressão de leptina na MPOA, ARC e HDM e o
estrógeno pode modular a síntese de leptina diretamente nestas áreas relacionadas ao
controle da função reprodutiva, possivelmente modulando a síntese de leptina por
meio de mecanismos pós-transcricionais.
4
ABSTRACT
The gonadotropin release hormone (GnRH) is the main regulator of the reproductive
axis. The estrogen acts modulating its secretion through activation of estrogen
receptors of type-α (ER-α) or -β (ER-β), directly or indirectly in GnRH neurons. There
is an interaction between the reproductive axis and the energetic balance. A possible
mediator of this interaction is the leptin, hormone that acts in regulation of
metabolism, feed behavior and reproduction. Animals homozygous for the gene “ob”
(ob/ob) are incapable to produce leptin, these animals are obese and infertile, and
these effects are reversed after systemic administration of leptin. Moreover, the
estrogen can modulate the secretion of leptin by adipocytes. Thus, the objectives of
this work were verify: 1) if the neurons that express leptin will also express ER-α or
ER-β in the medial preoptic medial (MPOA) and hypothalamic nucleus, arcuate
(ARC), dorsomedial (DMH) and ventromedial (VMH); 2) if there is a change of the
gene expression and protein of leptin in these areas during the estrous cycle and in
the ovariectomized (OVX) animals treated with estrogen; as well if there is a change
in the gene expression of leptin of pituitary and of adipose tissue in OVX animals.
Wistar female rats (250-280g) with 3 regular cycles and OVX treated with estrogen or
vehicle were utilized. To verify if exits a possible co-expression was utilized the
immunofluorescence for double stain. For confirmation co-expression was utilized the
confocal microscopy. In analyze of gene expression and protein were used the
techniques of Real Time PCR and Western Blot, respectively. Our results showed co-
expression of leptin and ER-α in the MPOA and in the DMH, as well leptin and ER-β
in MPOA, DMH and ARC. There was gene expression of leptin in metestrous,
diestrous and proestrous in the MPOA; metestrous and proestrous in the ARC;
diestrous, proestrous and estrous in the DMH, but there was no statistical difference
between the expression in each area. Also, there was no statistical difference of
leptin gene expression in the MPOA, DMH, ARC, pituitary and adipose tissue
compared OVX treated with estrogen and with vehicle. It was not possible to detect
the leptin expression in MPOA, DMH and ARC. In conclusion, our results indicate
that there is a expression of leptin in the MPOA, ARC and DMH and the estrogen can
modulate directly the leptin synthesis in these areas related with reproductive
function, possibly modulating the synthesis of leptin through of post-trancriptional
mechanisms.
Introdução
Introdução
6
O processo ovulatório depende da liberação coordenada dos hormônios
sexuais e de diversos fatores moduladores centrais e periféricos e é o evento mais
importante do ciclo reprodutivo em fêmeas, garantindo assim a perpetuação da
espécie. (HILL et al., 2004). Os mecanismos controladores e moduladores desse
processo são bastante complexos e não estão ainda adequadamente esclarecidos.
Embora existam diferenças notáveis no ciclo reprodutivo entre as espécies de
mamíferos, é comum entre elas um período de crescimento folicular no ovário
desencadeado por ação de gonadotrofinas produzidas pela hipófise: hormônio
luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH). Este crescimento folicular é
responsável pelo aumento na concentração plasmática de estrógeno e em menor
escala de progesterona, que irá desencadear um pico pré-ovulatório de
gonadotrofinas, necessário para ocorrer a ovulação (MAHESH; BRANN, 1998).
A maioria dos estudos da função reprodutiva de fêmeas é realizado em ratas,
pelo fato destes animais possuírem um perfil de ciclo reprodutivo muito semelhante
com o das mulheres, embora sejam observadas algumas diferenças.
Resumidamente, o ciclo estral de ratas tem duração média de 4 a 5 dias, sendo
geralmente dividido em 4 fases: metaestro, diestro, proestro e estro. A fase de
proestro se caracteriza pelos eventos hormonais que promovem a ovulação. Esta
fase ocorre antes do estro, fase na qual ocorre a ovulação e a cópula. Se não há
concepção, o estro é seguido das fases de metaestro e diestro, desencadeando um
novo ciclo (KNOBIL, 1994). Para que isso ocorra eficientemente é necessário um
perfeito funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal.
Introdução
7
Eixo hipotálamo-hipófise-gonadal
O controle do ciclo estral em ratas é obtido pela interação complexa de três
fatores principais: a produção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) em
regiões específicas do hipotálamo; a produção de LH e FSH pelos gonadotrofos
hipofisários e a síntese de estrógeno e progesterona
pelos ovários, pela ação do LH
e FSH (FINK, 1986).
Os neurônios sintetizadores de GnRH estão dispersos por várias estruturas
do sistema nervoso central (SNC), entre as quais o septo medial, área preóptica e
hipotálamo. Em ratas, a área preóptica medial e mais especificamente no órgão
vasculoso da lâmina terminal (OVLT) é o local onde há mais corpos celulares de
neurônios GnRH, enquanto na eminência mediana (EM) encontram-se fibras e
terminais de neurônios GnRH onde há a liberação do neuro-hormônio para
circulação porta hipotalâmica-hipofisária. O GnRH através dos vasos sanguíneos
porta hipofisários longos, atinge a adeno-hipófise, onde estimula a secreção de
gonadotrofinas (DUDAS; MERCHENTHALER, 2006; HERBISON, 1998; LANTOS;
GORCS; PALKOVITS, 1995).
A secreção pulsátil de GnRH induz secreção pulsátil de LH e FSH pela
adeno-hipófise. Este padrão de pulsatilidade da liberação do GnRH e das
gonadotrofinas são cruciais para função ovariana normal (HAISENLEDER et al.,
1991; FINK, 1986; GALLO, 1981).
Durante o ciclo estral, na tarde do proestro, estímulos neurogênicos induzem
uma cascata de eventos hipotalâmicos, os quais promovem um aumento maciço na
liberação de GnRH na EM e, conseqüentemente, um pico pré-ovulatório de LH,
entre 16 e 17h, necessário para a ovulação (GALLO, 1981). Dentre os vários fatores
Introdução
8
que influenciam a síntese e a liberação de GnRH, o que exerce maior importância é
o estrógeno (DUDAS; MERCHENTHALER, 2006; HERBISON, 1998).
Em machos, e na maior parte do ciclo estral das fêmeas, o estrógeno exerce
retro-alimentação negativa sobre a secreção de GnRH e de LH. Entretanto, em
determinada fase do ciclo estral em fêmeas, o estrógeno também exerce retro-
alimentação positiva sobre a atividade dos neurônios GnRH e a liberação de LH,
promovendo um pico de secreção de LH e subseqüente ovulação (HERBISON,
1998).
Em um ciclo estral regular, a concentração plasmática de estrógeno é baixa
durante o estro e metaestro, começando aumentar na tarde do diestro. Durante esse
período, o estrógeno
exerce uma retro-alimentação negativa sobre a secreção de
GnRH e de gonadotrofinas. Esse efeito inibitório pode ser comprovado após
remoção dos ovários, a qual promove um aumento das concentrações plasmáticas
basais de LH (TAPPER; NAFTOLIN; BROWN-GRANT, 1972). Quando a
concentração plasmática de estrógeno atinge valores máximos na tarde do proestro,
esse esteróide passa a exercer uma retro-alimentação positiva sobre o GnRH e as
gonadotrofinas, que atingem picos de secreção. Essa retro-alimentação positiva é
comprovada em ratas ovariectomizadas (OVX) tratadas com estrógeno, nas quais é
induzido um pico de secreção de LH, que pode ser amplificado pela administração
de progesterona (KREY; TYREY; EVERETT, 1973). Dessa forma, a liberação cíclica
de LH e FSH resulta de mecanismos de retro-alimentação positiva ou negativa dos
hormônios esteróides sobre o hipotálamo e a hipófise, dependendo da fase do ciclo
estral. Como o estrógeno induz expressão de receptores para progesterona, é
possível que o estrógeno e a progesterona possam exercer ações sinérgicas
Introdução
9
imediatamente antes e durante o pico de GnRH (DUDAS; MERCHENTHALER,
2006).
O estrógeno regula a síntese de GnRH através de dois tipos de receptores:
receptores para estrógeno do tipo alfa (ER-α) e receptores para estrógeno do tipo
beta (ER-β). Estes receptores possuem ampla distribuição rostral-caudal no SNC.
Em ratas ovarectomizadas a expressão de ER-β foi demonstrada por hibridização in
situ em neurônios do bulbo olfatório, núcleo periventricular antero-ventral da área
preóptica, área preóptica medial, núcleo leito da estria terminal, hipotálamo (núcleos
supra-óptico, paraventricular, supraquiasmático, hipotalâmico tuberal, núcleo
arqueado, ventromedial e dorsomedial), locus ceruleus, núcleo trato solitário, núcleo
parabraquial, hipocampo, cerebelo, córtex e glândula pineal (SHUGHRUE; KOMM;
MERCHENTHALER, 1996; SHUGHRUE; LANE; MERCHENTHALER, 1997),
enquanto que a expressão de ER-α foi demonstrada na área pré-optica, hipotálamo
(núcleos arqueado e ventromedial), órgão subfornicial e núcleo talâmico
ventrolateral, amigdala, núcleo leito da estria terminal, locus ceruleus, núcleo trato
solitário, núcleo parabraquial, hipocampo e córtex (SHUGHRUE; LANE;
MERCHENTHALER, 1997; DIANO et al., 1998).
Há dados contraditórios sobre a presença de receptor de estrógeno em
neurônios GnRH. Alguns trabalhos demonstraram que neurônios GnRH em
camundongos fêmeas expressam RNA mensageiro (RNAm) e proteína para ER-β,
enquanto que o mesmo não foi observado para a expressão de ERα (HERBISON;
PAPE, 2001; HRABOVSZKY et al., 2000; LEGAN; TSAI, 2003). Enquanto outros
estudos demonstraram através da técnica de “single cell RT-PCR” a presença de
RNAm de ER-α e ER-β em células que sintetizam GnRH (SKYNNER; SIM;
HERBISON, 1999).
Introdução
10
Dados da literatura sugerem três possíveis mecanismos distintos que são
utilizados pelo estrógeno na regulação da atividade dos neurônios GnRH
(HERBISON, 1998). O primeiro seria ação direta do estrógeno sobre os neurônios
GnRH, possivelmente através de sua ligação em receptores ER-β (HRABOVSZKY
et al., 2000; HRABOVSZKY et al., 2007; HERBISON, 1998; HERBISON; PAPE,
2001) desde que estes neurônios, apresentam pouco ou nenhum ER-α. O segundo
mecanismo seria ação do estrógeno sobre outros neurônios que estimulariam ou
inibiriam a atividade dos neurônios GnRH, ou seja, uma ação transináptica do
estrógeno sobre o neurônio GnRH. O terceiro mecanismo seria através de ação
sobre células gliais, que circundam os corpos celulares e os terminais dos neurônios
GnRH (HERBISON, 1998; HERBISON; PAPE, 2001). Assim, pode-se dizer que os
neurônios GnRH constituem a via final comum para o controle neural da reprodução
e agem como um ponto nodal de integração para inúmeros tipos de projeções,
caracterizando uma complexa rede neuronial para controle da reprodução e da
fertilidade (HERBISON, 1998).
A inicialização e manutenção da função reprodutiva depende de fatores
fisiológicos como nutrição, disponibilidade de reservas energéticas ou balanço
energético e estado metabólico (SCHNEIDER, 2004).
Introdução
11
Interação balanço energético e reprodução
Os mecanismos fisiológicos que controlam a função reprodutiva são
reciprocamente interligados aos que controlam o balanço energético. Estes
mecanismos juntos otimizam o sucesso reprodutivo sob condições metabólicas
flutuantes, pois alterações no estado nutricional e/ou reservas energéticas pode
interferir na liberação de gonadotrofinas e de hormônios gonadais, que são críticos
para a fertilidade. O sistema reprodutivo é capaz de detectar facilmente alterações
de deficiência energética, promovendo um mecanismo eficiente para prevenir
situações que necessitam de uma alta demanda energética, como por exemplo, a
gravidez e conseqüentemente lactação em condições desfavoráveis (CHAN;
MANTZOROS, 2001).
Situações de Anorexia Nervosa e Bulimia Nervosa afetam mais de 5% das
mulheres na idade reprodutiva causando amenorréia e infertilidade. Embora a
subnutrição seja um fator regulatório da atividade reprodutiva, a obesidade também
é uma causa importante de sub-fertilidade em muitas sociedades modernas. Stein e
Leventhal, na primeira metade do século 20, foram os primeiros a reconhecer a
relação entre obesidade e distúrbios reprodutivos, observando pacientes que em
conseqüência da obesidade, apresentavam distúrbios no ciclo menstrual
(amenorréia, oligomenorréia e menorragia), aborto espontâneo, problemas
gestacionais e infertilidade (anovulação) (THE ESHRE CAPRI WORKSHOP
GROUP, 2006)
1
.
Vários hormônios e neuropeptídeos têm sido propostos como mediadores da
interação balanço energético e sistema reprodutivo (SCHNEIDER, 2004). Um destes
fatores é a leptina, a qual atuaria como um hormônio mediador entre o tecido
1
ESHRE: European Society of Human Reproduction and Embryology
Introdução
12
adiposo (reserva energética) e os mecanismos de controle do eixo reprodutivo
(CHAN; MANTZOROS, 2001; SCHNEIDER, 2004). Sabe-se que, mulheres com
anovulação causada por exercício extenuante ou com baixo peso, apresentam
concentrações baixas de leptina, LH e estrógeno (E2). Porém, essas pacientes ao
receberem administração sistêmica de leptina, retomaram as concentrações
plasmáticas normais deste hormônio, tiveram aumento na freqüência de pulsos de
LH em duas semanas, seguido por crescimento dos folículos ovarianos (THE
ESHRE CAPRI WORKSHOP GROUP, 2006).
Leptina
A leptina é um hormônio, descoberto na década de 90, sintetizado pelos
adipócitos na proporção da quantidade destas células e tem como sua principal
função agir como fator de saciedade para a manutenção do balanço energético do
organismo, informando o SNC da quantidade de energia armazenada no tecido
adiposo (ZHANG et al., 1994). É um polipeptídeo com peso molecular de 16 KDa
(SMITH; JACKSON; FOSTER, 2002) e aproximadamente 20x25x45Å de dimensões,
constituída por 4 α-hélices (A, B, C e D) antiparalelas, conectadas por 2 ligações
longas (AB e CD) e uma alça curta (BC). Sua estrutura apresenta duas camadas
com hélices antiparalelas sendo A e D contra B e C e numerosos resíduos
hidrofóbicos expostos, os quais podem ser importantes para ligação com seu
receptor (ZHANG et al., 2005).
Este hormônio age direta e indiretamente no encéfalo, participando na
regulação do metabolismo, no comportamento alimentar, no balanço energético e na
reprodução (AHIMA et al., 2000; HIMMS-HAGEN, 1999). A síntese de leptina ocorre
Introdução
13
principalmente no tecido adiposo, porém ela pode ser sintetizada em outros tecidos,
como placenta humana (LINNEMANN et al., 2000; MASUZAKI et al., 1997), ovário
(CIOFFI et al., 1997), estômago (SOBHANI et al., 2000), glândulas mamárias
(SMITH-KIRWIN et al., 1998), hipófise (JIN et al., 2000; MORASH et al., 1999),
fígado (POTTER et al., 1998; RICHARDS; ASHWELL; MCMURTRY, 2000),
encéfalo (MORASH et al., 1999; UR et al., 2002) e também músculo esquelético
(DULOR et al., 1998), dentre outros.
Estudos demonstraram a presença de RNAm para leptina no córtex cerebral,
hipotálamo e cerebelo (WILKINSON; MORASH; UR, 2000; MORASH et al., 1999) e
por imuno-histoquímica demonstrou-se a expressão de leptina em neurônios do
núcleo arqueado (ARC), córtex piriforme, hipocampo, núcleo supra-óptico (SON) e
paraventricular (PVN). Além disso, neste estudo também observou-se a co-
localização de leptina com ocitocina e vasopressina no SON e PVN, porém há
células nestas áreas que são imunorreativas apenas para leptina (UR et al., 2002).
Estudos in vitro demonstraram também a expressão de RNAm e proteína para
leptina em células gliais (MORASH et al., 1999; MORASH et al., 2000).
A síntese da leptina é codificada pelo gene “ob”, conhecido também como
gene da obesidade, recentemente descrito no cromossomo 6 de camundongos
(ZHANG et al., 1994). A regulação da transcrição e do conteúdo de leptina são
alterados em resposta à alteração da ingestão alimentar a curto prazo. O jejum
resulta em diminuição da secreção de leptina (down-regulation) enquanto que o
excesso de calorias ingeridas resulta em aumento de sua secreção (up-regulation).
Efeitos agudos sobre mRNA e síntese de leptina são observados em respostas a
vários estímulos, tais como glicocorticóides, citocinas e insulina (TARTAGLIA, 1997).
A regulação da expressão gênica de leptina nas células gliais apresentou
Introdução
14
características distintas das observadas nos adipócitos, sendo esta expressão
diminuída pela corticosterona e estimulada pelo aumento de AMP cíclico (cAMP)
intracelular, insulina e IGF-1 (insulin-like growth factor-1) (MORASH et al., 2000).
A leptina age sobre seu receptor (OB-R), que é uma proteína de membrana
com seqüência homóloga da familia de receptores para citocinas de classe l, tendo
predominantemente duas isoformas: o receptor de forma curta (OB-RS), que contém
31 aminoácidos e 5 subunidades (OB-Ra, OB-Rc, OB-Rd, OB-Re e OB-Rf) e o
receptor de forma longa (OB-RL) que contém 302 aminoácidos e apenas uma
subunidade (OB-Rb) (FRUHBECK, 2006). Os receptores são codificados por um
gene conhecido como “db”, encontrado no cromossomo 4 de camundongos
(TARTAGLIA et al., 1995). Neste gene pode ocorrer mutação por troca de uma base
nitrogenada, guanina (G) por timina (T) causando deficiência de expressão do
receptor. Camundongos homozigotos para este gene com mutação (db/db), não
expressam corretamente o receptor para leptina (TARTAGLIA, 1997).
Os OB-R são expressos em vários tecidos (TARTAGLIA, 1997) e em várias
regiões do encéfalo de humanos, camundongos e ratas (COUCE et al., 1997;
ELMQUIST et al., 1998; HUANG et al., 1996; SHIODA et al., 1998). Em
camundongos, as maiores expressões de RNAm para OB-R
S foram encontradas no
plexo coróide, pulmão e rim, enquanto no hipotálamo observou-se expressão maior
de OB-R
L que OB-RS (TARTAGLIA, 1997) a qual também foi detectada por
hibridização in situ nos núcleos arqueado, ventromedial, paraventricular (PVN) e
dorsomedial (MERCER et al., 1996), regiões estas que participam da regulação do
metabolismo, do peso corporal e da reprodução. No núcleo arqueado esses
receptores estão localizados em neurônios contendo neuropeptídeo Y (NPY)
(MERCER et al., 1996) ou pró-opimelanocortina (POMC) (CHEUNG; CLIFTON;
Introdução
15
STEINER, 1997; MERCER et al., 1996). Além disso, foi demonstrado in vitro a
presença destes receptores em células gliais, porém foi observado somente a
presença de suas isoformas curtas, não sendo observado a presença de OB-RL
(MORASH et al., 2000).
A ligação da leptina com o seu receptor resulta no recrutamento e ativação da
proteína JAK2 (Janus Kinase 2), que irá fosforilar múltiplos resíduos de tirosina, e
cada um destes resíduos de tirosina fosforilado produzirá cascatas de sinais
distintos. Estas vias de sinalização ativadas pela leptina incluem JAK2/STAT3, SHP-
2 (SH2-containing phosphatase 2), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteína
quinase ativada pelo AMP (AMPK) (ZHANG et al., 2005; FRUHBECK, 2006). Dentre
estas vias, a mais conhecida é a JAK2/STAT3, a qual resulta na fosforilação da
STAT3 (signal transducer and activator of transcription), dimerização e eventual
translocação para o núcleo, onde a atividade transcricional de vários genes alvo é
modulada (ZHANG et al., 2005).
A leptina participa da regulação de múltiplos eixos hipotalâmicos hipofisários,
dentre eles o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (AHIMA et al., 2000).
Interação leptina e reprodução
Uma das primeiras evidências da interação leptina e sistema reprodutor foi a
observação que animais homozigotos para o gene “ob” (ob/ob) eram incapazes de
produzir leptina e apresentavam obesidade e infertilidade (TARTAGLIA, 1997). Além
disso, a administração sistêmica de leptina nestes animais e não somente a
restrição calórica para atingir o peso normal, revertia as disfunções reprodutivas em
ambos os sexos. Isto sugere que somente a obesidade não seria a causa da
Introdução
16
infertilidade e a leptina poderia ser diretamente responsável pelas alterações na
função reprodutiva (CHEHAB; LIM; LU, 1996; MOUNZIH; LU; CHEHAB, 1997).
Outro estudo demonstrou que animais ob/ob tratados com leptina tiveram aumento
da concentração de LH e de peso do útero e ovário em comparação com animais
tratados com salina (BARASH et al., 1996). Além disso, animais que apresentavam
mutações no gene que codifica o receptor para leptina, animais db/db
(camundongos) e fa/fa (ratos), apresentavam as mesmas disfunções reprodutivas
(TARTAGLIA, 1997).
Animais knockout para o OB-R com re-implantação deste receptor, via vetor
viral, no ARC, tiveram normalização do ciclo estral, aumento do desenvolvimento
folicular e diminuição da concentração plasmática da progesterona, além de
diminuição da expressão gênica de NPY e POMC no hipotálamo e aumento da
concentração de GnRH, porém não foram observados estes resultados nos animais
com re-implantação deste receptor no PVN (KEEN-RHINEHART; KALRA; KALRA,
2004).
Sabe-se que em cultura de células de neurônios GnRH detectou-se presença
de RNAm e proteína para receptor da leptina. Além disso, a leptina parece atuar
diretamente em neurônios GnRH, estimulando sua liberação (MAGNI et al., 1999).
Entretanto, estudos com hibridização in situ e imuno-histoquímica demonstraram
que poucos ou nenhum neurônio GnRH expressam receptor para leptina em
roedores e primatas (FINN et al., 1998; HAKANSSON et al., 1998) e o mecanismo
mais provável parece ser por influência indireta da leptina através de neurônios
intermediários que modulam a secreção dos neurônios GnRH. Porém, a
possibilidade de ação direta da leptina sobre neurônios GnRH não pode ser
descartada (CUNNINGHAM; CLIFTON; STEINER, 1999).
Introdução
17
Alguns possíveis neurônios intermediários da ação da leptina sobre o eixo
reprodutivo são descritos, dentre eles, neurônios NPY do ARC que contêm
receptores para leptina e se projetam para os corpos celulares de neurônios GnRH
(MERCER et al., 1996). O NPY inibe a secreção de LH após administração
intracerebroventricular (i.c.v.) em ratas (KALRA, 1993) e ovelhas (BARKER-GIBB et
al., 1995) ovarectomizadas e a leptina pode reduzir a expressão de NPY no núcleo
arqueado desinibindo a secreção de LH (AHIMA et al., 1996).
Outro possível interneurônio é o neurônio sintetizador de POMC, que origina
opióides endógenos, β-endorfina e α-MSH (hormônio estimulador de melanotrofina
alfa). Este último estimula a secreção de GnRH (KALRA, 1993). Há relatos de co-
expressão de OB-R em neurônios que sintetizam POMC no ARC (COWLEY et al.,
2001) e foi demonstrado também que a leptina aumenta a liberação de α-MSH
resultando na estimulação do eixo reprodutivo (CLARKE; HENRY, 1999).
A galanina é um peptídeo expresso em várias regiões do hipotálamo
(TAKATSU et al., 2001). Estudos de imunorreatividade para galanina demonstraram
projeções desses neurônios do arqueado para a área preóptica medial (MPOA) e a
administração i.c.v. de galanina induziu ativação da proteína FOS em neurônios
GnRH na MPOA (MATSUMOTO et al., 2001) e aumentou significativamente a
liberação de GnRH. A maioria dos neurônios secretores de galanina no ARC
possuem co-localização com receptores para leptina (SETH et al., 2004). A galanina
pode agir como um neuropeptídeo intermediário da ação da leptina sobre a secreção
de LH (SMITH; JACKSON; FOSTER, 2002).
Diversas evidências sugerem também que a leptina pode interferir na
produção de óxido nítrico (NO), estimulando sua produção na placenta humana
(WHITE et al., 2006) ou aumentando a atividade da enzima sintase do óxido nítrico
Introdução
18
(NOS) que catalisa a reação da deaminação oxidativa do grupo guanidina da L-
arginina dando origem ao NO, no oviduto de coelha (ZERANI et al., 2005).
Observou-se também, que o inibidor da NOS (N
G
-monometil-L arginina) inibiu o
efeito estimulatório da leptina sobre GnRH e LH in vitro, sugerindo mediação
significante do NO para liberação de GnRH e LH (YU et al., 1997b). A utilização de
outro inibidor da NOS, o L-NAME, também mostrou inibição do efeito estimulatório
da leptina sobre secreção de LH e prolactina (PRL) (WATANOBE; SCHIOTH, 2001).
Em ratas OVX tratadas com estrógeno a microinjeção i.c.v. de leptina, induziu
aumento na concentração plasmática de LH (porém não de FSH) que atingiu um
pico após 50 minutos (YU et al., 1997a). Por outro lado, a microinjeção i.c.v. de
anticorpo contra leptina diminuiu a pulsatilidade, a amplitude e a concentração
plasmática de LH em comparação aos animais microinjetados com soro de coelho
normal, alterando o ciclo estral de ratas, o qual manteve-se em anestro (CARRO et
al., 1997), enquanto a microinjeção aguda deste anticorpo, no inicio da tarde do
proestro, não alterou a secreção e o pico de LH (GONZALEZ et al., 2000) .
A administração central de leptina na MPOA e no núcleo arqueado-eminência
mediana (ARC-ME) não alterou a secreção GnRH, LH e α-MSH em ratas
alimentadas, porém aumentou a secreção desses hormônios em ratas em jejum
(WATANOBE, 2002), enquanto a administração sistêmica de leptina em ratas OVX
tratadas com óleo ou estrógeno preveniu a redução da freqüência de pulsos e da
amplitude do LH causada pelo jejum (Nagatani, et al., 1998).
A leptina também pode estimular diretamente a adeno-hipófise, a qual
expressa OB-RL (ZAMORANO et al., 1997), promovendo a liberação de LH, como
demonstrado em experimentos “in vitro”, onde a adeno-hipófise foi incubada com
Introdução
19
leptina por 3h e verificou-se um aumento na liberação de FSH e LH (YU et al.,
1997a).
A concentração plasmática e a freqüência de pulsos de secreção de leptina
diminuíram, enquanto os intervalos entre os pulsos aumentaram em ratas
ovariectomizadas comparadas com ratas não ovarectomizadas, indicando um
possível efeito do estrógeno sobre a liberação da leptina (BAGNASCO; KALRA;
KALRA, 2002).
O estrógeno administrado em ratas ovarectomizadas, induziu aumento na
secreção de leptina (MACHINAL et al., 1999; SHIMIZU et al., 1997). Além disso, tem
sido demonstrado que receptores para estrógeno (ER) são expressos em adipócitos
humanos (PEDERSEN et al., 1996) e a administração de estrógeno pode estimular a
liberação da leptina pelos adipócitos in vitro (KRISTENSEN; PEDERSEN;
RICHELSEN, 1999).
A administração de 17-β estradiol em ratas imaturas, durante 7 dias, induziu
aumento na concentração plasmática de leptina e de RNAm para leptina no tecido
adiposo, no período da manhã (TANAKA et al., 2001). Além disso, a expressão de
RNAm para leptina no tecido adiposo e a leptina sérica são menores em animais
ovariectomizados tratados com veículo, do que em animais ovariectomizados
tratados com estrógeno, indicando um possível efeito modulador do estrógeno sobre
a síntese de leptina no tecido adiposo (SHIMIZU et al., 1997).
A concentração plasmática de leptina foi menor em mulheres na fase pós-
menopausa, onde há menor concentração de estrógeno, do que em mulheres na
idade fértil (SHIMIZU et al., 1997). Ela foi maior na fase folicular tardia e permaneceu
em platô durante o pico das gonadotrofinas, declinando na fase lútea tardia.
Introdução
20
Entretanto mulheres na menopausa e homens não apresentam diferenças
significantes de leptina durante o mesmo período (RIAD-GABRIEL et al., 1998).
Neurônios imunorreativos para ER-α também foram imunorreativos para OB-
R, em regiões encefálicas como área preóptica medial, núcleo periventricular, região
parvicelular do PVN, núcleo arqueado e núcleo ventromedial, sugerindo que a
leptina pode agir, via alguns circuitos neurais, em mecanismos de controle da função
reprodutiva (DIANO et al., 1998).
Considerando que a leptina está diretamente relacionada com o eixo
reprodutivo e possa agir direta ou indiretamente no neurônio GnRH (alterando a
síntese deste peptitídeo e conseqüentemente o controle do pico pré ovulatório de
gonadotropinas), diretamente na hipófise alterando a liberação de LH e além disso,
que sua secreção pode ser influenciada pelo estrógeno no tecido adiposo, o objetivo
geral deste trabalho foi verificar a influência do estrógeno sobre a síntese de leptina
no SNC.
OBJETIVOS
Objetivos
22
O presente trabalho teve como objetivo verificar a expressão de ER-β e ER-α
em neurônios que sintetizam leptina na área preóptica medial e nos núcleos
hipotalâmicos dorsomedial, ventromedial e arqueado, bem como verificar se houve
alteração de leptina e da expressão gênica do RNAm para leptina, nos núcleos que
apresentaram co-expressão, durante as diferentes fases do ciclo estral de animais
com ciclos regulares e em animais ovariectomizados tratados com cipionato de
estradiol ou veículo (óleo). Além disso, verificou-se também a expressão gênica do
RNAm para leptina na hipófise e no tecido adiposo de animais ovariectomizados
tratados com cipionato de estradiol ou veículo (óleo).
Materiais
e Métodos
Materiais e Métodos
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Animais e monitoramento do ciclo estral.
Foram utilizadas ratas Wistar adultas, pesando 250-280g, mantidas em caixas
plásticas (40x32x17 cm) em grupos de 5 animais por caixa, sob fotoperíodo de 12/12
horas (luz das 06-18 horas), à temperatura de aproximadamente 22°C, com água e
ração ad libitum. Estes animais tiveram o ciclo estral monitorado diariamente pela
verificação do esfregaço vaginal e somente os animais que apresentaram três ciclos
regulares foram utilizados nos experimentos.
Imunofluorescência
Para imunofluorescência os animais nas fases de metaestro e proestro foram
anestesiados entre as 15-16 horas, com Tiopental sódico (Abbot Laboratories, USA)
na dose de 5mg/100g de peso corporal e foram perfundidos com solução de tampão
fosfato 0,1 M salina 0,15 M (PBS), ph 7.4, por 8 minutos, seguido por
paraformoldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (PFA 4%), ph 7.4, por 30 minutos.
Após a perfusão, os encéfalos foram retirados e colocados em recipientes contendo
PFA 4%, onde permaneceram por 12h. Depois foram colocados em solução de
sacarose 30% em tampão fosfato 0,1M, para a crioproteção, onde permaneceram à
temperatura de 4ºC até a saturação do tecido. O tempo de saturação foi de
aproximadamente 48h, sendo que inicialmente o encéfalo flutuava na solução e
após atingir a saturação, precipitava-se ao fundo do recipiente. Após a saturação, os
encéfalos foram congelados em isopentano (+
55°C) e em seguida armazenados à -
70°C.
Materiais e Métodos
25
Secções de 14 μm da área preóptica medial e dos núcleos hipotalamicos
arqueado, dorsomedial e do ventromedial foram obtidas em criostato e colocadas em
lâminas previamente gelatinizadas (em média 8 secções por lâminas) onde foram
realizados os processos para imunofluorescência. As lâminas contendo os cortes
histológicos foram armazenadas em caixas específicas à -70°C.
As secções foram inicialmente lavadas com tampão fosfato 0,1 M salina 0,15 M
(PBS), pH 7.4, por 30 minutos (3 x 10 minutos) e em seguida incubadas em solução de
PBS + glicina 0,1M, por 10 minutos, para o bloqueio de sítios aldeídicos formados por
resíduos do paraformaldeído. Depois as secções foram lavadas com PBS (2 x 5
minutos) e logo após, incubadas por 1h, em solução de PBS + BSA (soro albumina
bovina) 1% + Triton
®
X-100 0,2% para bloqueio das ligações inespecíficas e aumento
da permeabilidade da membrana celular. Após o bloqueio as secções foram incubadas
com os respectivos anticorpos.
Dupla marcação para ER-
β
e leptina
Para a dupla marcação ER-β e leptina, foram utilizados anticorpo monoclonal
produzido em camundongo contra ER-β (Novocastra-UK) na diluição de 1:300 e
anticorpo contra leptina produzido em coelho (Y-20, Santa Cruz-CA) na diluição de
1:1000.
Os anticorpos foram diluídos em solução de PBS contendo 1% de BSA. As
secções foram incubadas por 5 dias com o anticorpo contra leptina e em seguida
foram incubadas com o anticorpo contra ER-β por 16 horas. Ao término da incubação
as secções foram lavadas em PBS (3 x 10 minutos) e incubadas por 1h com
anticorpos secundários apropriados: anti-camundongo conjugado com Alexa Fluor 488
Materiais e Métodos
26
produzido em cabra e anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 594 produzido em
jumento, diluídos em PBS na concentração de 1:1000.
Após a incubação com o anticorpo secundário, as secções foram lavadas por 30
minutos (6 x 5 minutos) em PBS 0,1 M e por último foram mergulhadas 3 vezes em
água destilada para retirar o excesso de sal. As lâminas foram cobertas com lamínulas
usando Fluoromount (Electron Microscopy Science) como meio de montagem e em
seguida foram vedadas com esmalte para evitar o ressecamento.
Dupla marcação para ER-
α
e leptina
Foi utilizado o mesmo protocolo da imunofluorescência descrito anteriormente,
alterando apenas na troca do anticorpo contra ER-β pelo anticorpo específico contra
ER-α, sendo utilizado um anticorpo monoclonal produzido em camundongo contra ER-
α (DakoCytomation – Denmark) na diluição de 1:10 e um secundário anti-camundongo
conjugado com Alexa Fluor 488 produzido em cabra diluído em PBS na concentração
de 1:1000.
Análise dos resultados
Todas as secções foram analisadas em microscópio para fluorescência
Axioskop 2 plus (Zeiss) e as imagens capturadas por câmera digital AxioCam HRC
(Zeiss). As secções que apresentaram células com possível co-expressão de leptina
com ER-β e leptina com ER-α foram analisadas em microscópio confocal de varredura
a laser (TCS SP2 AOBS – Leica, Germany) para a confirmação desta co-expressão.
Este microscópio possui um sistema que permite a visualização de cortes virtuais no
tecido em torno de 0,5 micra, possibilitando a verificação de que substâncias distintas
Materiais e Métodos
27
são expressas no mesmo neurônio, descartando a possibilidade de sobreposição de
células e um possível resultado falso positivo.
Protocolo experimental para dosagem de leptina.
As ratas que apresentaram 3 ciclos estrais regulares, foram decapitadas nas
fases de metaestro, diestro, proestro e estro entre as 16-17h e os encéfalos foram
retirados e congelados imediatamente em gelo seco e depois armazenado à -70°C.
Para verificação de ação específica do estrógeno sobre a leptina, foram
utilizadas ratas (ovariectomizadas) tratadas com óleo (0,1 ml/rata) ou cipionato de
estradiol (10 μg/rata) administrado via subcutânea. Na cirurgia para retirada dos
ovários, as ratas foram anestesiadas com hidrato de cloral (35mg/100g de peso
corporal) e submetidas à ovariectomia bilateral, por meio de incisões laterais de 1-2
cm, entre a última costela e a coxa. Após 7 dias da cirurgia as ratas foram tratadas por
3 dias consecutivos, entre as 9-10h, com óleo ou cipionato de estradiol e no terceiro
dia de tratamento as ratas foram decapitadas entre as 16-17h. Os cérebros foram
retirados e congelados imediatamente em gelo seco e depois armazenados à -70°C
para posterior microdissecção de estruturas cerebrais.
Microdissecção de estruturas cerebrais – Técnica de “Punch”
As microdissecções da MPOA, HDM e ARC foram feitas com modificação da
técnica previamente descrita (PALKOVITS, 1973), utilizando como referência o atlas
neuroanatômico (SWANSON LW, 1992). Para a MPOA, fatias de 1.200 μm dos
encéfalos foram retiradas em criostato e o quiasma óptico foi utilizado como limite
Materiais e Métodos
28
anterior do hipotálamo para localização da MPOA e com a utilização de uma agulha
de 2 mm de diâmetro a MPOA foi retirada.
Para o ARC e o HDM foram retiradas fatias de 1.200 μm e em seguida mais
uma fatia de 200 μm para retirar o restante do HDM. O ARC foi retirado utilizando
uma agulha de 1 mm de diâmetro e o HDM utilizado uma agulha de 1,5 mm de
diâmetro. As estruturas retiradas foram imediatamente armazenada à – 70° C.
Protocolo de Western Blot para dosagem do conteúdo de leptina na MPOA, no
HDM e no ARC.
Preparação dos homogeneizados:
O tecido microdissecado da MPOA, HDM e do ARC foi homogeneizado
individualmente em tampão de inibição das proteases, o qual continha Tris-HCl
20mM (pH 7.5), EDTA 1mM, MgCl
2
5mM, DTT 1mM, PMSF 1mM e aprotinina
20ug/mL, com a utilização de um sonicador, ultrasonic na amplitude de 44%. Em
seguida as amostras foram centrifugadas a 4º C, 10.000 rpm por 15 minutos e a
fração sobrenadante foi coletada.
A quantidade de proteínas de cada amostra foi determinada por meio de
técnica espectrocolorimétrica (BRADFORD, 1976) para que fossem aplicadas no gel
de eletroforese, 30μg de proteína para todas amostras.
SDS-PAGE Eletroforese
Tanto o gel de separação (de gradiente linear de concentração de 7-10%)
quanto o de concentração foram feitos de acordo com descrição prévia (LAEMMLI,
1970). A cada amostra aplicada foi adicionado um tampão (q.s.p. 20μl), constituído
Materiais e Métodos
29
por Tris-HCl 0,5M (pH 6,8), SDS (dodecil sulfato de sódio) 2%, glicerol 10%, β-
mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,01%. Essas amostras foram colocadas
em água fervente por 5 minutos e imediatamente transferidas para o gelo antes de
serem aplicadas no gel. Marcadores de peso molecular foram ensaiados nas laterais
do gel.
A eletroforese foi conduzida à temperatura ambiente, sob corrente constante
de
+ 0,12 mA por 3 horas, sendo posteriormente realizado o procedimento de
eletrotransferência. As proteínas do gel foram transferidas à temperatura de 4°C e
umidade mantida, para uma membrana de nitrocelulose (Millipore) de 0,45 μm, pela
passagem de uma corrente de 350mA durante 1:30 horas em tampão de
transferência contendo glicina 400 mM, Tris 25 mM e 50 ml de isopropanol em 1 litro
de solução.
A membrana de nitrocelulose foi corada com solução de Ponceau, para a
confirmação de transferência das proteínas para esta membrana e em seguida
lavada com água milliq até desaparecer toda marcação promovida pelo Ponceau.
Depois a membrana foi incubada, durante a noite, em solução de PBS 0,1M
contendo 5% de leite em pó desnatado (Molico, Nestlé) e 0,1% de Tween, sob
agitação leve à temperatura de 4°C, para o bloqueio de ligações inespecíficas. Após
esta incubação, a membrana foi lavada uma vez em PBS somente para retirar o
excesso de bloqueio e em seguida, incubada com anticorpo primário contra leptina
produzido em coelho (Y-20, Santa Cruz-CA), diluído na proporção de 1:1000 em
tampão PBS contendo 0,1% de Tween e 1% de leite em pó desnatado (Molico,
Nestlé), por 24 horas a 4º C sob agitação leve.
Após incubação a membrana foi lavada 5 vezes com PBS + 0,1% de tween
(PBS-T), sendo uma lavagem rápida, uma de 15 minutos e 3 de 5 minutos. Depois a
Materiais e Métodos
30
membrana foi incubada em PBS-T com 1% de leite desnatado, onde o anticorpo
secundário HPR anti-rabbit (Dako) foi diluído na proporção de 1:3000. Essa
incubação durou 1 hora à temperatura ambiente sob agitação leve.
A membrana foi novamente lavada 5 vezes em PBS-T e incubada por 5
minutos à temperatura ambiente sob agitação leve no Kit ECL de revelação por
quimioluminescência (Amershan-USA). Em seguida a membrana foi colocada em
um cassete e revelada em um filme fotográfico (Kodak-USA). Como controles
positivos foram utilizados: tecido adiposo e a leptina purificada.
Protocolo experimental para dosagem de RNAm para leptina
As ratas que apresentaram 3 ciclos estrais regulares, foram decapitadas nas
fases de metaestro, diestro, proestro e estro entre as 16-17h e os encéfalos foram
retirados e congelados imediatamente em gelo seco e depois armazenados à -70°C.
Para verificação de ação específica do estrógeno sobre a leptina, foram
utilizadas ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (0,1 ml/rata) ou cipionato de
estradiol (10 μg/rata) administrado via subcutânea, como descrito anteriormente. No
terceiro dia de tratamento as ratas foram decapitadas entre as 16-17h, os encéfalos, a
hipófise e o tecido adiposo retroperitoneal foram retirados e congelados
imediatamente em gelo seco e depois armazenados à -70°C. Os encéfalos tiveram a
MPOA e os núcleos ARC e DMH microdissecados, como descrito anteriormente.
Materiais e Métodos
31
REAL TIME – PCR
Os núcleos microdissecados, o tecido adiposo e a hipófise foram macerados
com a utilização de nitrogênio líquido e em seguida foi extraído o RNA total de cada
amostra, conforme o boletim técnico do kit "SV Total RNA Isolation System"
(Promega), para utilização na análise da expressão gênica da leptina, conforme
descrito abaixo.
As estruturas microdissecadas, o tecido adiposo e a hipófise foram
macerados com a utilização de nitrogênio líquido. Em seguida foram colocadas em
tampão de lise, seguindo-se agitação e adição de tampão de diluição de RNA,
contido no kit. Esta solução foi colocada em banho a 70°C por 3 minutos e depois foi
centrifugada a 12-14.000 rpm por 10 minutos. A solução límpida do lisado foi
colocada em um microtubo autoclavado e posteriormente foram adicionados 200 μl
de etanol 95%. Esta solução foi transferida para uma coluna de purificação de
ácidos nucléicos, contendo uma resina presente no kit. Esta coluna foi encaixada
dentro de um microtubo autoclavado e centrifugada em 12-14.000 rpm por 1 minuto.
O líquido passado pela resina depositou-se no fundo do microtubo e foi descartado.
Em seguida foram adicionados 600 μl de Solução de lavagem de RNA (RWA) nesta
coluna que foi centrifugada a 12-14.000 rpm por 1 minuto, sendo descartado depois
o líquido passado pela resina e depositado no fundo do microtubo. Foi preparada
uma solução de incubação com DNase, a qual foi aplicada sobre a resina e
incubada por 15 minutos.
Posteriormente, foi adicionada uma solução de bloqueio da DNase, seguindo-
se centrifugação a 12-14.000 rpm por 1 minuto. O liquido passado pela resina foi
descartado e foram acrescentados 600 μl de tampão de lavagem RWA, para retirar o
Materiais e Métodos
32
excesso de reagentes provenientes da reação da DNAse I, seguindo-se
centrifugação a 12-14.000 rpm por 1 minuto. Os microtubos foram esvaziados e
foram adicionados mais 250 μl de RWA na coluna, seguindo centrifugação a 14.000
rpm por 2 minutos. A coluna contendo a resina foi transferida para um microtubo
novo e autoclavado e o RNA foi eluído em 100uL de água livre de RNAse. Os tubos
foram centrifugados a 12.000 rpm por 2 minutos e o liquido passado pela resina e
agora contendo RNA foi mantido a -70ºC até o uso. Após este procedimento, o
material foi liofilizado e ressuspendido em 15µl de água livre de RNAse para maior
concentração do RNA.
As concentrações de RNA foram estimadas, pelo espectofotômetro, a partir
da medida de absorbância a 260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm
corresponde aproximadamente a 40µg/mL de RNA. O grau de pureza da preparação
foi estimado através da relação entre as leituras a 260 e 280nm, variando entre 1,8-
2,2.
Para o preparo da fita de cDNA foi utilizado o kit ThermoScript
TM
RT-PCR
System (Invitrogen), conforme o protocolo do mesmo. A reação de síntese da
primeira fita de cDNA foi feita em um microtubo contendo oligonucleotídeos
(oligodT), RNA da amostra, 10 mM de dNTP Mix e água livre de RNAse. Esta reação
foi incubada à 65ºC por 5 minutos, para que se obtivesse a desnaturação do RNA e
do oligonucleotídeo. Então, foram adicionados 8µl de uma solução contendo:
tampão de síntese de cDNA, 0,1 M DTT, RNaseOUT
TM
, água livre de RNAse e a
enzima transcriptase reversa presente no kit. Esta solução foi incubada à 50ºC por
1h e depois à 85ºC por 5 minutos para desnaturar a enzima e parar a reação. Depois
foi acrescentado 1µl de RNase H e feita incubação por 20 minutos à 37ºC para
Materiais e Métodos
33
destruir a fita molde de RNA. Por fim, a solução de cDNA foi armazenada à -20ºC
para posterior reação de PCR em tempo real (qPCR).
Desta forma, para a análise do gene de interesse foram desenhados
oligonucleotídeos específicos utilizando a sequência para leptina depositada no
GENBANK com o número de acesso D45862 de acordo com (PURDHAM et al.,
2004) sendo : 5 - GAGACCTCCTCCATGTGCTG - 3 (forward) e 5 -
CATTCAGGGCTAAGGTCCAA - 3 (reverse), e para o controle endógeno foi
desenhado o oligonucleotídeo para enzima Gliceraldeído 3-Fosfato Dehidrogenase
(GAPDH), sendo 5 - TGGAGTCTACTGGCGTCTTC - 3 (forward) e 5 -
GCAGGATGCATTGCTGAC - 3 (reverse).
As reações da qPCR foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green
qPCR SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante e a
quantificação e a análise dos resultados foram conduzidas conforme a programação
contida no aparelho ABI 7900 Applied Biosystems.
Como controle negativo foi feita a reação de qPCR com todos os reagentes,
porém não foi adicionado material biológico, para verificação da pureza dos
reagentes e confirmação que os mesmo não estavam contaminados. Como controle
positivo foi utilizado o tecido adiposo, pois a leptina tem sua maior expressão neste
tecido.
Todos os experimentos foram feitos em duplicata e foram repetidos para a
confirmação dos resultados.
Análise estatística
Os resultados foram representados como média + erro padrão da média
(EPM). O nível de significância considerado foi p<0,05. A análise estatística foi
Materiais e Métodos
34
realizada por meio do programa de estatística SPSS para Windows (Versão 6.0). Foi
feito o teste de levene para verificar a homogeneidade de variâncias.
A expressão gênica relativa de leptina foi comparada pelo teste t de Student
para medidas independentes.
Para a comparação da expressão gênica entre os tecidos foi utilizado o teste
não paramétrico de Kruskal – Wallis seguido de Mann-Witney. Foi considerado um
nível de significância p<0,05.
Resultados
Resultados
36
As figuras 1 e 2 mostram neurônios da área preóptica medial e do núcleo
hipotalâmico dorsomedial (HDM) que sintetizam leptina e expressam ER-α, em
marcação por imunofluorescência e confirmação de co-expressão por microscopia
confocal.
Na figura 3 observa-se que não houve co-expressão de ER-α e leptina em
neurônios do núcleo arqueado, verificando-se apenas fibras de neurônios que
expressam leptina muito próximas de células que expressam ER-α.
As figuras de 4 a 6 mostram neurônios da área preóptica medial e dos núcleos
hipotalâmico arqueado e dorsomedial que expressam leptina e ER-β, sendo estas co-
expressões confirmadas por microscopia confocal. Entretanto, no núcleo
hipotalâmico ventromedial não foi observado nenhuma co-expressão de leptina com
ER-α nem com ER-β.
Várias fibras de neurônios sintetizadores de leptina foram localizadas na
eminência mediana (figura 7). A figura 8 mostra os controles negativos para
imunofluorescência com omissão dos anticorpos primários contra leptina, ER-α e ER-
β.
A expressão gênica de leptina foi verificada pela técnica de RT-PCR em
tempo real durante as diferentes fases do ciclo estral nos núcleos hipotalâmicos
arqueado (figura 9) e dorsomedial (figura 10) e na área preóptica medial (figura 11).
Para todas as regiões, foi utilizada a fase de proestro como sendo normalizador da
expressão (100% da expressão gênica), e a expressão gênica relativa de leptina foi
calculada por meio do cálculo do Delta do Delta CT (2
-ΔΔCT
) (LIVAK; SCHMITTGEN,
2001). Assim, os resultados foram descritos calculando a expressão gênica da
leptina de cada fase do ciclo em relação ao valor 1 (100%) do proestro.
Resultados
37
No núcleo arqueado, não houve diferença estatística entre as fases de
proestro e metaestro. Além disso, não foi detectado o produto amplificado que se
refere ao RNAm para leptina, nas fases de diestro e estro, como mostra a figura 9.
No núcleo hipotálamo dorsomedial também não foram observadas diferenças
estatísticas nas fases de estro e diestro comparadas com proestro. Por outro lado,
não foi detectado produto amplificado que se refere ao RNAm para leptina em
metaestro, como mostra a figura 10. Na área preóptica medial, não houve diferença
estatística nas fases de metaestro e diestro comparadas com o proestro. Nesta
região, também não houve amplificação que se refere ao RNAm para leptina em
estro como mostra a figura 11.
Nossos resultados mostram que animais ovariectomizados tratados com
cipionato de estradiol também não tiveram alterações significativas na expressão
gênica de leptina nos núcleos hipotalâmicos arqueado (figura 12) e dorsomedial
(figura 13), na área preóptica medial (figura 14), na hipófise (figura 15) e no tecido
adiposo (figura 16). Nestes estudos foi utilizado como normalizador da expressão os
animais ovariectomizados tratados com óleo. A figura 17 mostra uma comparação da
expressão gênica de leptina nos diferentes tecidos estudados.
O produto amplificado do transcrito para leptina apresentou uma curva de
dissociação com amplificação em torno de 88-89°C (anexo “B”) e começou a
amplificar em torno de 33 ciclos nas áreas encefálicas, 31 ciclos na hipófise e 21
ciclos no tecido adiposo. O transcrito da leptina apresentou um tamanho de 220 pb
em gel de agarose 1,5% (anexo “A”).
Entretanto, não foi possível detectar o conteúdo de leptina através da técnica
de western blot na área preóptica e nos núcleos arqueado e hipotálamo dorsomedial,
Resultados
38
durante as diferentes fases do ciclo estral de ratas com ciclo regular e de ratas
ovariectomizadas tratadas com óleo ou cipionato de estradiol (figura 18).
Resultados
39
Co-expressão de leptina e ER-
α
na MPOA
D
C
A
B
Figura 1: Co-expressão de ER-α (verde) e leptina (vermelho) na área preóptica
medial (MPOA). A figura “A” mostra células que expressam ER-α na MPOA; em “B”
as setas indicam células que sintetizam leptina nessa mesma região; e em “C” com a
sobreposição das figuras A e B, as setas mostram possível co-expressão de leptina e
ER-α na mesma célula na MPOA. Análises em microscopia para fluorescência com
aumento de 20X. Em “D”, a confirmação da co-expressão de leptina e ER-α por meio
de microscopia confocal, descartando a possibilidade de marcações falso-positivas.
Resultados
40
Co-expressão de leptina e ER-
α
no HDM
A
B
C
D
C
Figura 2: Co-expressão de ER-α (verde) e leptina (vermelho) no hipotálamo
dorsomedial (HDM). A figura “A” mostra células que expressam ER-α no HDM; em “B”
a seta indica uma célula que sintetiza leptina nessa mesma região e em “C” a
sobreposição das figuras A e B; a seta mostra a co-expressão de leptina e ER-α na
mesma célula no HDM. Análise em microscopia para fluorescência com aumento de
40X. Em “D”, a confirmação da co-expressão de leptina e ER-α por meio de
microscopia confocal, descartando a possibilidade de marcações falso-positivas.
Resultados
41
Co-expressão de leptina e ER-
α
no ARC
B
A
B
C
Figura 3: Expressão de ER-α (verde) e leptina (vermelho) no núcleo arquedo. A
figura “A” mostra células que expressam ER-α no ARC; em “B” várias fibras de
neurônios que sintetizam leptina nessa mesma região e em “C” a sobreposição das
figuras A e B, mostrando que possivelmente não há co-expressão de leptina e ER-α
no núcleo ARC. Análises em microscopia para fluorescência com aumento de 40X.
Resultados
42
Co-expressão de leptina e ER-
β
na MPOA
B
A
Figura 4: Co-expressão de ER-β (verde) e leptina (vermelho) na MPOA. A figura “A”
mostra células que expressam ER-β na MPOA; em “B” a seta indica uma célula que
sintetiza leptina nessa mesma região e em “C” a sobreposição das figuras A e B e a
seta mostra a co-expressão de leptina e ER-β na mesma célula na MPOA. Análises
em microscopia para fluorescência com aumento de 40X. Em “D”, confirmação da co-
expressão de leptina e ER-β por meio de microscopia confocal, descartando a
possibilidade de marcações falso-positivas.
D
D
C
Resultados
43
Co-expressão de leptina e ER-
β
no ARC
B
D
A
C
Figura 5: Co-expressão de ER-β (verde) e leptina (vermelho) no núcleo arqueado
(ARC). A figura “A” mostra células que expressam ER-β no ARC; em “B” a seta indica
uma célula que sintetiza leptina nessa mesma região e em “C” a sobreposição das
figuras “A” e “B” e a seta mostra a co-expressão de leptina e ER-β na mesma célula
no ARC. Análises em microscopia para fluorescência com aumento de 40X. Em “D” a
confirmação da co-expressão de leptina e ER-β por meio de microscopia confocal,
descartando a possibilidade de marcações falso-positivas.
Resultados
44
Co-expressão de leptina e ER-
β
no HDM
Figura 6: Co-expressão de ER-β (verde) e leptina (vermelho) no Hipotálamo
dorsomedial (HDM). A figura “A” mostra células que expressam ER-β no HDM; em “B”
as setas indicam células que sintetizam leptina nessa mesma região e em “C” a
sobreposição das figuras, a seta mostra a co-expressão de leptina e ER-β na mesma
célula no HDM. Análises em microscopia para fluorescência com aumento de 20X.
Em “D”, a confirmação da co-expressão de leptina e ER-β por meio de microscopia
confocal, descartando a possibilidade de marcações falso-positivas.
3V
D
3V
A
3V
C
B
3V
Resultados
45
Fibras de neurônios sintetizadores de leptina na eminência
mediana.
3V
Figura 7: A seta indica fibras de neurônios sintetizadores de leptina na eminência
mediana.
Resultados
46
Controles negativos para leptina, ER-
α
e ER-
β
. Omissão do
anticorpo primário.
A B
3V
3V
C
3V
Figura 8: Controle negativo das imunofluorescências com omissão do anticorpo
primário contra leptina (A); ER-α (B) e ER-β (C).
Resultados
47
Expressão Gênica de leptina nos núcleos ARC e HDM
durante as diferentes fases do ciclo estral.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3,0
3,5
4
Expressão gênica relativa de leptina
proestro estro metaestro diestro
ica relativa de leptina no núcleo AR
=2 (n=3), metaestro (n=2) e diestro (n=3
sentados como a média +
Figura 9: Expressão gên C durante as fases do
proestro (n ), estro ) do ciclo estral. Os
valores estão repre
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3,0
3,5
Expressão gênica relativa de leptina
4
proestro estro metaestro diestro
EPM em relação d
igura 10: Expressão gênica relativa de leptina no núcleo HDM durante as fases do
oestro (n=2), estro (n=3), metaestro (n=3) e diestro (n=3) do ciclo estral. Os
à fase e proestro.
F
pr
valores estão representados como a média + EPM em relação à fase de proestro.
Resultados
48
Expressão Gênica de leptina na MPOA durante as
diferentes fases do ciclo estral.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3,0
3,5
4
Expressão gênica relativa de leptina
proestro estro metaestro diestro
Figura 11: Expressão gênica relativa de leptina no núcleo MPOA durante as fases
do proestro (n=2), estro (n=3), metaestro (n=2) e diestro (n=2) do ciclo estral. Os
valores estão representados como a média + EPM em relação à fase de proestro.
Resultados
49
Expressão Gênica de leptina nos núcleos ARC e HDM de
animais tratados com estrógeno ou óleo.
0
0,5
1
1,5
2
Expressão gênica relativa de leptina
óleo
cipionato de estradiol
Figura
ovariectomizadas tratadas com cipionato de estradiol (n=3) ou óleo (n=3). Os valores
estão representados como a média
12: Expressão gênica relativa de leptina no núcleo ARC de ratas
+ EPM em relação aos animais tratados com
óleo.
0
0,5
1
1,5
2
Expressão gênica relativa de leptina
óleo
cipionato de estradiol
Figura 13: Expressão gênica relativa de leptina no núcleo HDM de ratas
ovariectomizadas tratadas com cipionato de estradiol (n=3) ou óleo (n=3). Os valores
estão representados como a média + EPM em relação aos animais tratados com
óleo.
Resultados
50
Expressão Gênica de leptina na MPOA de animais tratados
com estrógeno ou óleo.
0
0,5
1
1,5
2
Expressão gênica relativa de leptina
óleo
cipionato de estradiol
Figura 14: Expressão gênica relativa de leptina na MPOA de ratas ovariectomizadas
tratadas com cipionato de estradiol (n=3) ou óleo (n=3). Os valores estão
representados como a média + EPM em relação aos animais tratados com óleo.
Resultados
51
Expressão Gênica de leptina na hipófise e no tecido
adiposo de animais tratados com estrógeno ou óleo.
0
0,5
1
1,5
2
Expressão gênica relativa de leptina
óleo
cipionato de estradiol
Figura 15: Expressão gênica relativa de leptina na hipófise de ratas
ovariectomizadas tratadas com cipionato de estradiol (n=3) ou óleo (n=3). Os valores
estão representados como a média + EPM em relação aos animais tratados com
óleo.
0
0,5
1
1,5
2
Expressão gênica relativa de leptina
óleo
cipionato de estradiol
Figura 16: Expressão gênica relativa de leptina no tecido adiposo retroperitoneal de
ratas ovariectomizadas tratadas com cipionato de estradiol (n=3) ou óleo (n=3). Os
valores estão representados como a média + EPM em relação aos animais tratados
com óleo.
Resultados
52
Comparação da expressão gênica de leptina dentre os
diferentes tecidos.
0
1
2
3
4
1000
1500
2000
2500
3000
Expressão gênica relativa de leptina
Tec. Adiposo
ARC
HDM MPOA Hipófise
*
*
Figura 17: Diferença da expressão gênica relativa de leptina na MPOA (n=3), ARC
(n=3), HDM (n=3), hipófise (n=3) e tecido adiposo (n=3) de ratas ovariectomizadas
tratadas com cipionato de estradiol. Os valores estão representados como a média +
EPM em relação à expressão gênica relativa do ARC (* p<0,05 Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Witney).
Resultados
53
Detecção de leptina por Western Blot em diferentes áreas
encefálicas
ARC MPOA HDM
A) PM O E
2
O E
2
O E
2
Tecido
Adiposo
15 KDa
ARC . MPOA . HDM .
B)
PM
15K
M D P E M D P E M D P E
igura 18: Figuras representativas de Western Blot, utilizando anticorpo anti-leptina
m extratos totais de proteínas da área préoptica medial (MPOA) e dos núcleos
ipotalâmicos arqueado (ARC) e dorsomedial (HDM). Em “A” animais
variectomizados tratados com óleo (O) ou estrógeno (E
2
) e tecido adiposo de
Da
Leptina
purificada
F
e
h
o
animal intacto. Em “B” animais intactos nas diferentes fases do ciclo estral:
metaestro (M); diestro (D); proestro (P); estro (E) e leptina purificada. Peso Molecular
(PM).
Discussão
Discussão
55
Os resultados do presente trabalho mostraram que parte das células que
sintetizam leptina na área preóptica medial (MPOA) e no hip
DM) α α β β
hos de outros laboratórios (DIANO et
al., 1998; SHUGHRUE; KOMM; MERCHENTHALER, 1996; SHUGHRUE; LANE;
MERCHENTHALER, 1997).
Vários estudos têm demonstrado que a leptina possui vários locais de ação
no sistema nervoso central (SNC) (DIANO et al., 1998; MERCER et al., 1996;
SHIODA et al., 1998). A expressão de leptina e de seu RNA mensageiro (RNAm) foi
encontrada em regiões encefálicas como córtex, cerebelo, hipocampo, hipotálamo e
adeno-hipófise. Além disso, a expressão de leptina é verificada tanto em neurônios
quanto em células gliais (MORASH et al., 1999; UR et al., 2002; WILKINSON;
MORASH; UR, 2000; MORASH et al., 2001). No hipotálamo foram observadas
células que expressam leptina nos núcleos ARC, supraóptico (SON), paraventricular
(PVN) (UR et al., 2002; WILKINSON; MORASH; UR, 2000). Nossos resultados
mostraram células com expressão de leptina no núcleo ARC, MPOA e no HDM.
Em algumas imagens, a co-expressão de leptina e receptores para estrógeno
foram claramente observadas em neurônios, mas não se pode desconsiderar que
otálamo dorsomedial
(H expressam receptores para estrógeno do tipo (ER- ) e do tipo (ER- ). No
núcleo arqueado (ARC) foi verificada apenas a co-expressão de leptina com ER-β,
não sendo observada a co-expressão de leptina com ER-α. Observou-se apenas a
presença de fibras de neurônios sintetizadores de leptina muito próximas às células
que expressam ER-α. Por outro lado, no hipotálamo ventromedial (HVM), não se
observou nenhum tipo de co-expressão nem proximidade entre as fibras de leptina e
células que expressam ER-α ou -β.
Nossos resultados de expressão de ER-α e ER-β nestas regiões encefálicas
estudadas, estão em concordância com trabal
Discussão
56
ela tam
fisiológicos como nutrição, disponibilidade de reservas energéticas e estado
metab
entração plasmática de leptina e tem-se observado que ratas fêmeas
possu
bém possa ocorrer em células gliais. Experimentos “in vitro” demonstraram a
presença de RNAm para leptina em células gliais (MORASH et al., 1999; MORASH
et al., 2000), que também podem expressar receptores para estrógeno (HERBISON,
1998).
A inicialização e a manutenção da função reprodutiva relaciona-se com
fatores
ólico (SCHNEIDER, 2004; THE ESHRE CAPRI WORKSHOP GROUP, 2006;
FERNANDEZ-FERNANDEZ et al., 2006). Um dos fatores que possivelmente pode
mediar esta interação é a leptina, que age tanto no metabolismo energético do
organismo, principalmente agindo com propriedades anorexígenas, inibindo a
ingestão de alimentos (ZHANG et al., 1994), quanto no eixo hipotálamo-hipófise-
gonadal, estimulando a liberação de GnRH e de gonadotrofinas (CARRO et al.,
1997; YU et al., 1997b). Além disso, em determinadas regiões do encéfalo como
MPOA, PVN, ARC e VMH, alguns neurônios imunorreativos para ER-α também são
para o receptor da leptina (OB-R), sugerindo que a leptina possa agir via alguns
circuitos neuroniais em mecanismos de controle da função reprodutiva (DIANO et al.,
1998).
Por outro lado, em roedores, hormônios esteróides podem exercer influência
na conc
em concentração plasmática de leptina maior do que ratos machos
(FREDERICH et al., 1995; PINILLA et al., 1999; WATANOBE; SUDA, 1999). Além
disso, a concentração plamática de leptina eleva-se muito durante a gestação, fase
na qual ocorre aumento na concentração dos hormônios esteróides (AMICO et al.,
1998).
Discussão
57
Estudos “in vitro” demonstram que nas células do tecido adiposo há
expressão de receptores para estrógeno (KRISTENSEN; PEDERSEN; RICHELSEN,
1999;
células
e neurônios de
PEDERSEN et al., 1996) e como este tecido também é considerado um órgão
endócrino (AHIMA, 2005), o estrógeno possivelmente exerce um efeito direto sobre
os adipócitos, modulando a produção de algumas substâncias, dentre elas a leptina.
Nosso trabalho mostra que parte das células que sintetizam leptina também
expressam receptores para estrógeno, sugerindo que na MPOA e no HDM estas
possivelmente sofram modulação pelo estrógeno tanto por meio do ER-α
quanto do ER-β. Enquanto no núcleo ARC, esta possível modulação pelo estrógeno
seria apenas por meio do ER-β. A leptina liberada nestas regiões pode agir de forma
parácrina sobre seus receptores presentes nas mesmas (DIANO et al., 1998;
MERCER et al., 1996; SHIODA et al., 1998) ou estes neurônios se projetarem para
outras regiões do encéfalo onde a leptina possa exercer sua função. Assim, a
leptina liberada na MPOA possivelmente pode agir diretamente (MAGNI et al., 1999)
ou indiretamente (YU et al., 1997b) nos corpos celulares dos neurônios GnRH. No
ARC a leptina provavelmente pode agir nos terminais dos neurônios GnRH ou
indiretamente através de interneurônios estimulando a secreção de GnRH, enquanto
no HDM os neurônios sintetizadores de leptina podem enviar projeções para MPOA
ou eminência mediana (EM) e estimular a secreção de GnRH (COWLEY et al., 2001;
MERCER et al., 1996; SETH et al., 2004; YU et al., 1997b; YU et al., 1997a). Além
disso, a leptina liberada nestas regiões também pode modular o comportamento
sexual, balanço energético, metabolismo, ingestão alimentar, dentre outras funções
(AHIMA et al., 2000; HIMMS-HAGEN, 1999; ZHANG et al., 1994).
Em nossos resultados, muitas fibras de neurônios que sintetizam leptina
foram observadas na EM. Estas fibras possivelmente provêm d
Discussão
58
regiõe
nosso trabalho
foi ve
stro e metaestro no ARC, além disso, não foi
observ
s encefálicas que se projetam para EM e liberam leptina nesta região. Esta
leptina liberada pode atingir os vasos porta hipofisários e chegar até a adeno-
hipófise, a qual possui receptores para leptina (ZAMORANO et al., 1997) e onde
pode estimular a liberação de LH e FSH (WATANOBE; SCHIOTH, 2001; YU et al.,
1997b; YU et al., 1997a). Sugere-se ainda que a leptina liberada na EM possa agir
diretamente nos terminais dos neurônios GnRH promovendo a liberação de GnRH
para os vasos porta-hipofisários. Também não se pode descartar que parte desta
marcação de leptina observada na EM, seja devida à síntese de leptina em tanicitos,
que são células gliais presentes nesta região, cuja principal função é promover a
comunicação do terceiro ventrículo com as células do hipotálamo. Os tanicitos
possuem imunorreatividade para leptina e talvez possam ser fonte de expressão de
leptina (MORASH et al., 1999; WILKINSON; MORASH; UR, 2000).
Após encontrar a co-expressão de leptina e receptores para estrógeno em
células de determinadas regiões hipotalâmicas, o próximo passo do
rificar se a expressão de RNAm e a expressão protéica de leptina eram
alteradas durante o ciclo estral, no qual ocorre variação significativa da concentração
plasmática de estrógeno (FINK, 1986).
Nossos resultados mostram que não houve diferença estatística na expressão
gênica de leptina entre as fases de proe
ado o produto amplificado do transcrito da leptina nas fases de diestro e estro
neste mesmo núcleo. No HDM, também não foram observadas diferenças
estatísticas nas fases de estro e diestro comparadas com proestro e não foi
observada amplificação no metaestro. Na MPOA, da mesma forma como nos outros
núcleos, não foi observada diferença estatística nas fases de metaestro e diestro
comparadas com o proestro e nesta região não foi observada amplificação no estro.
Discussão
59
Além disso, não foi possível detectar a expressão de leptina pela técnica de Western
Blot, nestas regiões durante as diferentes fases do ciclo estral de ratas com ciclo
regular.
Morash e colaboradores também não conseguiram detectar a leptina no
hipotálamo utilizando a técnica de Western Blot, isto provavelmente se deve ao fato
de exi
contraditórios. Alguns estudos mostraram que não
há di
e proestro, na qual a concentração de estrógeno está elevada,
em re
stir uma proporção pequena de células que expressam este peptídeo neste
tecido (MORASH et al., 1999).
Trabalhos que analisaram a concentração plasmática de leptina durante o
ciclo estral apresentaram dados
ferença significativa na concentração plasmática de leptina durante as
diferentes fases do ciclo estral (BENNETT et al., 1999; BRANN et al., 1999; PINILLA
et al., 1999; WATANOBE; SUDA, 1999). Porém, verificou-se a variação de seu
receptor OB-R no SNC durante o ciclo (BENNETT et al., 1999), indicando alteração
de sensibilidade do SNC à leptina, que pode ser o mecanismo de regulação da ação
da leptina no SNC.
Por outro lado, outros estudos verificaram aumento significativo de leptina
plasmática na fase d
lação ao diestro de ratas com ciclo regular (TANAKA et al., 2001). Também,
mulheres com ciclo menstrual regular apresentaram aumento de leptina plasmática
na fase folicular, que perdurou até a metade da fase lútea (RIAD-GABRIEL et al.,
1998). Entretanto, mulheres com ciclo regular que receberam medicamentos
contendo estrógeno (contraceptivos) não tiveram alteração da concentração de
leptina durante o ciclo, nem diferença da concentração sérica de leptina em relação
a mulheres com ciclo normal que não tomaram contraceptivo (CELLA; GIORDANO;
CORDERA, 2000).
Discussão
60
Um fato interessante observado em nossos resultados foi que nas três
regiões encefálicas estudadas, houve expressão do transcrito da leptina na fase de
proest
necrose tumoral (TNF),
noradr
ógeno,
porém
ro, enquanto nas outras fases, foi alternada a expressão deste transcrito
dependendo da região. No núcleo ARC observou-se que não houve expressão na
fase de diestro e estro. No HDM não foi observada expressão no metaestro,
enquanto na MPOA não foi observada expressão no estro.
Sabe-se que a expressão de leptina no tecido adiposo pode ser modulada por
várias substâncias como glicocorticóides, insulina, fator de
enalina, adrenalina, esteróides gonadais, dentre outras (FRIED et al., 2000),
que podem estimular ou inibir a expressão e secreção de leptina neste tecido. É
possível que alguns destes fatores ou outros fatores diferentes possam modular a
expressão de leptina em diferentes regiões encefálicas, entretanto não há dados na
literatura sobre isto. Além disso, nossos experimentos foram feitos no final da tarde,
período do dia em que a concentração plasmática de leptina tem seus valores mais
baixos (SANCHEZ et al., 2004) e talvez por isso, bem como por influências de
algumas destas substâncias acima citadas, não tenha sido possível detectar o
transcrito em determinadas fases do ciclo dependendo da região encefálica.
Considerando-se a possibilidade do estrógeno alterar a concentração
plasmática de leptina, Kristensen e colaboradores verificaram que o estr
não os hormônios esteróides andrógenos, pode promover aumento na
secreção de leptina pelos adipócitos (KRISTENSEN; PEDERSEN; RICHELSEN,
1999). Dessa forma o próximo passo do nosso trabalho foi verificar se a expressão
de RNAm e a expressão protéica da leptina estariam alteradas em ratas
ovariectomizadas (OVX) tratadas por 3 dias com cipionato de estradiol em
Discussão
61
comparação com ratas OVX tratadas com óleo, na MPOA, nos núcleos ARC e HDM,
na hipófise e no tecido adiposo.
Nossos resultados mostram que não há diferença estatística significativa
entre
OVX tratadas com estrógeno ou estrógeno e progesterona não tiveram
alteraç
e 7
dias, i
ntração
plasmá
os grupos, na MPOA, nos núcleos ARC e HDM. Além disso, como já
observado anteriormente, não foi possível detectar a expressão de leptina
(MORASH et al., 1999) pela técnica de Western Blot nas regiões encefálicas
estudadas.
Ratas
ão da concentração plasmática de leptina em comparação com ratas OVX
tratadas com veículo (WATANOBE; SUDA, 1999). O mesmo foi observado em
bovinos OVX tratados com estrógeno durante 3 dias, nos quais também não houve
alteração do conteúdo de RNAm para leptina nem da concentração plasmática de
leptina em relação aos bovinos OVX tratados com veículo (THORN et al., 2007).
Por outro lado, a administração de 17-β estradiol a ratas imaturas, durant
nduziu aumento de RNAm para leptina no tecido adiposo (TANAKA et al.,
2001). Outros estudos, verificaram que a expressão de RNAm para leptina no tecido
adiposo foi maior nos animais adultos OVX tratados com estrógeno do que nos
tratados com veículo (BRANN et al., 1999; SHIMIZU et al., 1997), além de
experimentos in vitro verificarem aumento de RNAm e secreção de leptina das
células adiposas após incubação com estrógeno (MACHINAL et al., 1999).
Em outro trabalho, foi observada diferença estatística na conce
tica de leptina de animais OVX tratados com estrógeno, somente após 11
dias de tratamento com doses supra-fisiológicas ou após 16 dias com doses
fisiológicas (ALONSO et al., 2007).
Discussão
62
Nosso trabalho verificou também a expressão gênica de leptina na hipófise de
ratas OVX tratadas com estrógeno ou óleo. Os resultados mostraram que não houve
diferença estatística entre os grupos. Akhter e colaboradores (2007) verificaram
aumento de RNAm para leptina na hipófise no diestro, fase na qual começa a
aumentar a concentração de estrógeno, seguido por diminuição no proestro.
Entretanto, foi observada que a expressão protéica de leptina no proestro é maior do
que nas outras fases do ciclo. Este estudo demonstrou também, in vitro, que a
porcentagem de gonadotrofos que expressam leptina não foi alterada quando as
células hipofisárias foram incubadas durante a noite com estrógeno. Porém, quando
as células foram incubadas com estrógeno e depois incubadas por 1h com GnRH,
observou-se aumento na porcentagem de gonadotrofos que expressam leptina, além
disso, quando foi adicionado apenas GnRH nas células hipofisárias verificou-se um
aumento de RNAm e proteína para leptina, sugerindo um efeito estimulatório do
GnRH sobre expressão de leptina na hipófise, porém não foi observado o efeito do
estrógeno sobre a expressão gênica e protéica da leptina na hipófise (AKHTER et
al., 2007).
Nossos resultados mostraram também que não houve diferença estatística na
expressão de leptina no tecido adiposo retroperitoneal de ratas OVX tratadas com
estrógeno em relação a ratas tratadas com óleo, contrariando alguns resultados que
demonstraram aumento de RNAm para leptina no tecido adiposo em animais
castrados e tratados com estrógeno (SHIMIZU et al., 1997; TANAKA et al., 2001).
Uma possível explicação para esta controvérsia pode ser o tempo de tratamento
com estrógeno que em nosso trabalho foi menor do que nos trabalhos que
demonstraram aumento de expressão. Tal explicação é condizente com resultados
mostrando a secreção de leptina relacionada à dose e ao tempo de tratamento com
Discussão
63
estrógeno (ALONSO et al., 2007). Outro fator a ser considerado é o horário no qual
os animais foram sacrificados. Em nosso trabalho os animais foram sacrificados no
final da tarde, pois na fase do proestro ocorre o pico pré-ovulatório de
gonadotropinas induzido por um pico prévio de estrógeno neste período. Porém,
sabe-se que há maior expressão de RNAm no tecido adiposo e concentração sérica
de leptina no período da manhã do que no período da tarde, em roedores
(SANCHEZ et al., 2004).
Nosso estudo verificou a expressão gênica de leptina entre as áreas
encefálicas estudadas, a hipófise e o tecido adiposo dos animais OVX tratados com
estrógeno. Não houve diferença na MPOA e no HDM em comparação com ARC,
mas a leptina foi 3,5 vezes mais expressa na hipófise do que no ARC e quase 3.000
vezes mais expressa no tecido adiposo do que no ARC, corroborando estudos que
demonstram que o tecido adiposo é a principal fonte de leptina (AHIMA et al., 2000;
CAPRIO et al., 2001).
Nossa técnica de Real Time-PCR para expressão gênica de leptina está de
acordo com as técnicas empregadas em outros trabalhos. O produto amplificado do
transcrito para leptina apresentou uma curva de dissociação com amplificação em
torno de 88-89°C (Anexo B), muito próxima da apresentada em outro trabalho
utilizando a mesma técnica e demonstrando a amplificação do transcrito para leptina
no coração (PURDHAM et al., 2004).
Morash e colaboradores monstraram por meio da técnica de PCR
semiquantitativo, que o produto da amplificação do transcrito para leptina no
hipotálamo começava aparecer em torno de 37 ciclos da PCR, enquanto no tecido
adiposo em torno de 22 ciclos. Neste mesmo estudo, o produto da amplificação do
transcrito para GAPDH no hipotálamo apareceu em torno de 19 ciclos e no tecido
Discussão
64
adiposo, 22 ciclos (MORASH et al., 1999). Nossos experimentos mostraram
amplificação do produto do transcrito para leptina em torno de 33 ciclos nas áreas
encefálicas estudadas e no tecido adiposo em torno de 21 ciclos, enquanto a
amplificação do GAPDH no hipotálamo foi em torno de 16 ciclos e no tecido adiposo
em torno de 19 ciclos. Estas comparações indicam que nossa técnica de Real Time-
PCR funciou bem e a diferença observada deve-se ao fato da técnica de Real Time-
PCR ser mais sensível.
Nossos estudos de imunofluorescência para leptina em determinadas
regiões encefálicas, nos quais foram observadas poucas células com expressão de
leptina, associados aos resultados obtidos por Real Time-PCR, nos quais
verificamos taxa baixa de transcrição do RNAm para leptina nestas regiões,
sugerem que a taxa de tradução de leptina também é baixa. Isto acarretaria na
quantidade protéica muito baixa de leptina, que poderia não ser detectada pela
técnica de Western Blot nestas mesmas áreas.
Embora nosso estudo de expressão gênica da leptina tenha utilizado um
número pequeno de animais em alguns grupos, pode-se sugerir, em conjunto com
outros dados obtidos da literatura, a existência de possíveis mecanismos
regulatórios da síntese de leptina, bem como ações do estrógeno sobre a síntese de
algumas substâncias.
Uma vez que, a leptina sintetizada pode ser estocada, secretada ou
degradada intracelularmente, estados nutricionais e/ou estímulos hormonais podem
afetar qualquer um destes processos para regular a liberação de leptina. Por
exemplo, numa situação de 14 h de jejum, há diminuição na concentração
plasmática de leptina e no conteúdo de leptina estocada no tecido adiposo, em
comparação à situação pós-alimentação. Porém, este período de jejum não afeta a
Discussão
65
expressão gênica da leptina no tecido adiposo. Além disso, animais alimentados
possuem aumento na tradução de leptina sem no entanto, alterar a expressão de
RNAm em comparação com animais em jejum, sugerindo que a leptina possa ter a
regulação pós-transcricional como principal mecanismo de regulação de sua síntese
(LEE; FRIED, 2006).
Assim, estudos demonstraram que o RNAm em células eucarióticas passa
por várias etapas de regulação entre a transcrição e a tradução da proteína, dentre
os quais este RNAm após ser transcrito é processado, transportado, estabilizado e
traduzido (KEENE, 2007). O estrógeno pode atuar na regulação pós-transcricional
de algumas células estabilizando alguns RNAms e desestabilizando outros, algumas
vezes no mesmo tipo celular. Por exemplo, o estrógeno desestabiliza alguns RNAms
do fígado de anfíbios que codificam algumas proteínas como albumina e
transferrina, porém estabiliza RNAm para vitelogenina no mesmo órgão (ROSS,
1995; ING, 2005).
Portanto, como em nossos resultados não foram observadas alterações do
conteúdo de RNAm para leptina nas diferentes áreas hipotalâmicas e tecidos
estudados nos diferentes grupos experimentais, podemos sugerir que nestas regiões
e condições experimentais, o estrógeno possivelmente possa modular a síntese de
leptina por meio de mecanismos pós-transcricionais, que ativariam ou reprimiriam a
expressão protéica dependendo da região.
Conclusão
Conclusão
67
Os resultados do presente trabalho indicam que: há síntese de leptina em
células da área preóptica medial e dos núcleos arqueado e dorsomedial; o estrógeno
pode modular diretamente a síntese de leptina nestas áreas relacionadas ao controle
da função reprodutiva; esta modulação possivelmente ocorre por mecanismos pós-
transcricionais, pois não houve diferença no conteúdo de RNAm para leptina na área
preóptica medial, nos núcleos hipotalâmicos arqueado e dorsomedial, na hipófise e
no tecido adiposo dos diferentes grupos experimentais.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
69
Ahima RS. Central actions of adipocyte hormones. Trends Endocrinol Metab 2005;
16 (7): 307-313.
Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, Qu D, Lowell B, Maratos-Flier E, et al. Role
of leptin in the neuroendocrine response to fasting. Nature 1996; 382 (6588): 250-
252.
Ahima RS, Saper CB, Flier JS, Elmquist JK. Leptin regulation of neuroendocrine
systems. Front Neuroendocrinol 2000; 21 (3): 263-307.
Akhter N, Johnson BW, Crane C, Iruthayanathan M, Zhou YH, Kudo A, et al. Anterior
pituitary leptin expression changes in different reproductive states: in vitro stimulation
by gonadotropin-releasing hormone. J Histochem Cytochem 2007; 55 (2): 151-166.
Alonso A, Fernandez R, Moreno M, Ordonez P, Diaz F, Gonzalez C. Leptin and its
receptor are controlled by 17beta-estradiol in peripheral tissues of ovariectomized
rats. Exp Biol Med (Maywood ) 2007; 232 (4): 542-549.
Amico JA, Thomas A, Crowley RS, Burmeister LA. Concentrations of leptin in the
serum of pregnant, lactating, and cycling rats and of leptin messenger ribonucleic
acid in rat placental tissue. Life Sci 1998; 63 (16): 1387-1395.
Bagnasco M, Kalra PS, Kalra SP. Plasma leptin levels are pulsatile in adult rats:
effects of gonadectomy. Neuroendocrinology 2002; 75 (4): 257-263.
Barash IA, Cheung CC, Weigle DS, Ren H, Kabigting EB, Kuijper JL, et al. Leptin is a
metabolic signal to the reproductive system. Endocrinology 1996; 137 (7): 3144-
3147.
Barker-Gibb ML, Scott CJ, Boublik JH, Clarke IJ. The role of neuropeptide Y (NPY) in
the control of LH secretion in the ewe with respect to season, NPY receptor subtype
and the site of action in the hypothalamus. J Endocrinol 1995; 147 (3): 565-579.
Bennett PA, Lindell K, Wilson C, Carlsson LM, Carlsson B, Robinson IC. Cyclical
variations in the abundance of leptin receptors, but not in circulating leptin, correlate
with NPY expression during the oestrous cycle. Neuroendocrinology 1999; 69 (6):
417-423.
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;
72 248-254.
Referências Bibliográficas
70
Brann DW, De SL, Zamorano PL, Mahesh VB. Regulation of leptin gene expression
and secretion by steroid hormones. Steroids 1999; 64 (9): 659-663.
Caprio M, Fabbrini E, Isidori AM, Aversa A, Fabbri A. Leptin in reproduction. Trends
Endocrinol Metab 2001; 12 (2): 65-72.
Carro E, Pinilla L, Seoane LM, Considine RV, Aguilar E, Casanueva FF, et al.
Influence of endogenous leptin tone on the estrous cycle and luteinizing hormone
pulsatility in female rats. Neuroendocrinology 1997; 66 (6): 375-377.
Cella F, Giordano G, Cordera R. Serum leptin concentrations during the menstrual
cycle in normal-weight women: effects of an oral triphasic estrogen-progestin
medication. Eur J Endocrinol 2000; 142 (2): 174-178.
Chan JL, Mantzoros CS. Leptin and the hypothalamic-pituitary regulation of the
gonadotropin-gonadal axis. Pituitary 2001; 4 (1-2): 87-92.
Chehab FF, Lim ME, Lu R. Correction of the sterility defect in homozygous obese
female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nat Genet 1996; 12
(3): 318-320.
Cheung CC, Clifton DK, Steiner RA. Proopiomelanocortin neurons are direct targets
for leptin in the hypothalamus. Endocrinology 1997; 138 (10): 4489-4492.
Cioffi JA, Van BJ, Antczak M, Shafer A, Wittmer S, Snodgrass HR. The expression of
leptin and its receptors in pre-ovulatory human follicles. Mol Hum Reprod 1997; 3 (6):
467-472.
Clarke IJ, Henry BA. Leptin and reproduction. Rev Reprod 1999; 4 (1): 48-55.
Couce ME, Burguera B, Parisi JE, Jensen MD, Lloyd RV. Localization of leptin
receptor in the human brain. Neuroendocrinology 1997; 66 (3): 145-150.
Cowley MA, Smart JL, Rubinstein M, Cerdan MG, Diano S, Horvath TL, et al. Leptin
activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate
nucleus. Nature 2001; 411 (6836): 480-484.
Cunningham MJ, Clifton DK, Steiner RA. Leptin's actions on the reproductive axis:
perspectives and mechanisms. Biol Reprod 1999; 60 (2): 216-222.
Referências Bibliográficas
71
Diano S, Kalra SP, Sakamoto H, Horvath TL. Leptin receptors in estrogen receptor-
containing neurons of the female rat hypothalamus. Brain Res 1998; 812 (1-2): 256-
259.
Dudas B, Merchenthaler I. Three-dimensional representation of the neurotransmitter
systems of the human hypothalamus: inputs of the gonadotrophin hormone-releasing
hormone neuronal system. J Neuroendocrinol 2006; 18 (2): 79-95.
Dulor JP, Cambon B, Vigneron P, Reyne Y, Nougues J, Casteilla L, et al. Expression
of specific white adipose tissue genes in denervation-induced skeletal muscle fatty
degeneration. FEBS Lett 1998; 439 (1-2): 89-92.
Elmquist JK, Bjorbaek C, Ahima RS, Flier JS, Saper CB. Distributions of leptin
receptor mRNA isoforms in the rat brain. J Comp Neurol 1998; 395 (4): 535-547.
Fernandez-Fernandez R, Martini AC, Navarro VM, Castellano JM, Dieguez C, Aguilar
E, et al. Novel signals for the integration of energy balance and reproduction. Mol
Cell Endocrinol 2006; 254-255 127-132.
Fink G. The endocrine control of ovulation. Sci Prog 1986; 70 (279 Pt 3): 403-423.
Finn PD, Cunningham MJ, Pau KY, Spies HG, Clifton DK, Steiner RA. The
stimulatory effect of leptin on the neuroendocrine reproductive axis of the monkey.
Endocrinology 1998; 139 (11): 4652-4662.
Frederich RC, Hamann A, Anderson S, Lollmann B, Lowell BB, Flier JS. Leptin levels
reflect body lipid content in mice: evidence for diet-induced resistance to leptin
action. Nat Med 1995; 1 (12): 1311-1314.
Fried SK, Ricci MR, Russell CD, Laferrere B. Regulation of leptin production in
humans. J Nutr 2000; 130 (12): 3127S-3131S.
Fruhbeck G. Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem J 2006;
393 (Pt 1): 7-20.
Gallo RV. Pulsatile LH release during periods of low level LH secretion in the rat
estrous cycle. Biol Reprod 1981; 24 (4): 771-777.
Gonzalez LC, Pinilla L, Tena-Sempere M, Dieguez C, Casanueva FF, Aguilar E.
Effect of acute immunoneutralization of endogenous leptin on prolactin and LH
secretion during the afternoon of pro-oestrus or in steroid-treated ovariectomized
female rats. J Reprod Fertil 2000; 118 (1): 39-45.
Referências Bibliográficas
72
Haisenleder DJ, Dalkin AC, Ortolano GA, Marshall JC, Shupnik MA. A pulsatile
gonadotropin-releasing hormone stimulus is required to increase transcription of the
gonadotropin subunit genes: evidence for differential regulation of transcription by
pulse frequency in vivo. Endocrinology 1991; 128 (1): 509-517.
Hakansson ML, Brown H, Ghilardi N, Skoda RC, Meister B. Leptin receptor
immunoreactivity in chemically defined target neurons of the hypothalamus. J
Neurosci 1998; 18 (1): 559-572.
Herbison AE. Multimodal influence of estrogen upon gonadotropin-releasing
hormone neurons. Endocr Rev 1998; 19 (3): 302-330.
Herbison AE, Pape JR. New evidence for estrogen receptors in gonadotropin-
releasing hormone neurons. Front Neuroendocrinol 2001; 22 (4): 292-308.
Hill JW, Urban JH, Xu M, Levine JE. Estrogen Induces Neuropeptide Y (NPY) Y1
receptor gene expression and responsiveness to NPY in gonadotrope-enriched
pituitary cell cultures. Endocrinology 2004; 145 (5): 2283-2290.
Himms-Hagen J. Physiological roles of the leptin endocrine system: differences
between mice and humans. Crit Rev Clin Lab Sci 1999; 36 (6): 575-655.
Hrabovszky E, Kallo I, Szlavik N, Keller E, Merchenthaler I, Liposits Z. Gonadotropin-
releasing hormone neurons express estrogen receptor-beta. J Clin Endocrinol Metab
2007; 92 (7): 2827-2830.
Hrabovszky E, Shughrue PJ, Merchenthaler I, Hajszan T, Carpenter CD, Liposits Z,
et al. Detection of estrogen receptor-beta messenger ribonucleic acid and 125I-
estrogen binding sites in luteinizing hormone-releasing hormone neurons of the rat
brain. Endocrinology 2000; 141 (9): 3506-3509.
Huang XF, Koutcherov I, Lin S, Wang HQ, Storlien L. Localization of leptin receptor
mRNA expression in mouse brain. Neuroreport 1996; 7 (15-17): 2635-2638.
Ing NH. Steroid hormones regulate gene expression posttranscriptionally by altering
the stabilities of messenger RNAs. Biol Reprod 2005; 72 (6): 1290-1296.
Jin L, Zhang S, Burguera BG, Couce ME, Osamura RY, Kulig E, et al. Leptin and
leptin receptor expression in rat and mouse pituitary cells. Endocrinology 2000; 141
(1): 333-339.
Referências Bibliográficas
73
Kalra SP. Mandatory neuropeptide-steroid signaling for the preovulatory luteinizing
hormone-releasing hormone discharge. Endocr Rev 1993; 14 (5): 507-538.
Keen-Rhinehart E, Kalra SP, Kalra PS. Leptin-receptor gene transfer into the arcuate
nucleus of female Fatty zucker rats using recombinant adeno-associated viral vectors
stimulates the hypothalamo-pituitary-gonadal axis. Biol Reprod 2004; 71 (1): 266-
272.
Keene JD. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet
2007; 8 (7): 533-543.
Knobil EaNJD. The Neuroendocrine Control of the ovarian cycle of the rat. In:
Freeman M.E. (Eds.). The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press;
1994. Cap. 46, p. 613-658.
Krey LC, Tyrey L, Everett JW. The estrogen-induced advance in the cyclic LH surge
in the rat: dependency on ovarian progesterone secretion. Endocrinology 1973; 93
(2): 385-390.
Kristensen K, Pedersen SB, Richelsen B. Regulation of leptin by steroid hormones in
rat adipose tissue. Biochem Biophys Res Commun 1999; 259 (3): 624-630.
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 1970; 227 (5259): 680-685.
Lantos TA, Gorcs TJ, Palkovits M. Immunohistochemical mapping of neuropeptides
in the premamillary region of the hypothalamus in rats. Brain Res Brain Res Rev
1995; 20 (2): 209-249.
Lee MJ, Fried SK. Multilevel regulation of leptin storage, turnover, and secretion by
feeding and insulin in rat adipose tissue. J Lipid Res 2006; 47 (9): 1984-1993.
Legan SJ, Tsai HW. Oestrogen receptor-alpha and -beta immunoreactivity in
gonadotropin-releasing hormone neurones after ovariectomy and chronic exposure
to oestradiol. J Neuroendocrinol 2003; 15 (12): 1164-1170.
Linnemann K, Malek A, Sager R, Blum WF, Schneider H, Fusch C. Leptin production
and release in the dually in vitro perfused human placenta. J Clin Endocrinol Metab
2000; 85 (11): 4298-4301.
Referências Bibliográficas
74
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25 (4): 402-
408.
Machinal F, Dieudonne MN, Leneveu MC, Pecquery R, Giudicelli Y. In vivo and in
vitro ob gene expression and leptin secretion in rat adipocytes: evidence for a
regional specific regulation by sex steroid hormones. Endocrinology 1999; 140 (4):
1567-1574.
Magni P, Vettor R, Pagano C, Calcagno A, Beretta E, Messi E, et al. Expression of a
leptin receptor in immortalized gonadotropin-releasing hormone-secreting neurons.
Endocrinology 1999; 140 (4): 1581-1585.
Mahesh VB, Brann DW. Regulation of the preovulatory gonadotropin surge by
endogenous steroids. Steroids 1998; 63 (12): 616-629.
Masuzaki H, Ogawa Y, Sagawa N, Hosoda K, Matsumoto T, Mise H, et al.
Nonadipose tissue production of leptin: leptin as a novel placenta-derived hormone in
humans. Nat Med 1997; 3 (9): 1029-1033.
Matsumoto H, Noguchi J, Takatsu Y, Horikoshi Y, Kumano S, Ohtaki T, et al.
Stimulation effect of galanin-like peptide (GALP) on luteinizing hormone-releasing
hormone-mediated luteinizing hormone (LH) secretion in male rats. Endocrinology
2001; 142 (8): 3693-3696.
Mercer JG, Hoggard N, Williams LM, Lawrence CB, Hannah LT, Morgan PJ, et al.
Coexpression of leptin receptor and preproneuropeptide Y mRNA in arcuate nucleus
of mouse hypothalamus. J Neuroendocrinol 1996; 8 (10): 733-735.
Morash B, Johnstone J, Leopold C, Li A, Murphy P, Ur E, et al. The regulation of
leptin gene expression in the C6 glioblastoma cell line. Mol Cell Endocrinol 2000; 165
(1-2): 97-105.
Morash B, Li A, Murphy PR, Wilkinson M, Ur E. Leptin gene expression in the brain
and pituitary gland. Endocrinology 1999; 140 (12): 5995-5998.
Morash B, Wilkinson D, Murphy P, Ur E, Wilkinson M. Developmental regulation of
leptin gene expression in rat brain and pituitary. Mol Cell Endocrinol 2001; 185 (1-2):
151-159.
Mounzih K, Lu R, Chehab FF. Leptin treatment rescues the sterility of genetically
obese ob/ob males. Endocrinology 1997; 138 (3): 1190-1193.
Referências Bibliográficas
75
Palkovits M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain
Res 1973; 59 449-450.
Pedersen SB, Fuglsig S, Sjogren P, Richelsen B. Identification of steroid receptors in
human adipose tissue. Eur J Clin Invest 1996; 26 (12): 1051-1056.
Pinilla L, Seoane LM, Gonzalez L, Carro E, Aguilar E, Casanueva FF, et al.
Regulation of serum leptin levels by gonadal function in rats. Eur J Endocrinol 1999;
140 (5): 468-473.
Potter JJ, Womack L, Mezey E, Anania FA. Transdifferentiation of rat hepatic stellate
cells results in leptin expression. Biochem Biophys Res Commun 1998; 244 (1): 178-
182.
Purdham DM, Zou MX, Rajapurohitam V, Karmazyn M. Rat heart is a site of leptin
production and action. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287 (6): H2877-H2884.
Riad-Gabriel MG, Jinagouda SD, Sharma A, Boyadjian R, Saad MF. Changes in
plasma leptin during the menstrual cycle. Eur J Endocrinol 1998; 139 (5): 528-531.
Richards MP, Ashwell CM, McMurtry JP. Quantitative analysis of leptin mRNA using
competitive reverse transcription polymerase chain reaction and capillary
electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis 2000; 21
(4): 792-798.
Ross J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiol Rev 1995; 59 (3): 423-450.
Sanchez J, Oliver P, Pico C, Palou A. Diurnal rhythms of leptin and ghrelin in the
systemic circulation and in the gastric mucosa are related to food intake in rats.
Pflugers Arch 2004; 448 (5): 500-506.
Schneider JE. Energy balance and reproduction. Physiol Behav 2004; 81 (2): 289-
317.
Seth A, Stanley S, Jethwa P, Gardiner J, Ghatei M, Bloom S. Galanin-like peptide
stimulates the release of gonadotropin-releasing hormone in vitro and may mediate
the effects of leptin on the hypothalamo-pituitary-gonadal axis. Endocrinology 2004;
145 (2): 743-750.
Shimizu H, Shimomura Y, Nakanishi Y, Futawatari T, Ohtani K, Sato N, et al.
Estrogen increases in vivo leptin production in rats and human subjects. J Endocrinol
1997; 154 (2): 285-292.
Referências Bibliográficas
76
Shioda S, Funahashi H, Nakajo S, Yada T, Maruta O, Nakai Y. Immunohistochemical
localization of leptin receptor in the rat brain. Neurosci Lett 1998; 243 (1-3): 41-44.
Shughrue PJ, Komm B, Merchenthaler I. The distribution of estrogen receptor-beta
mRNA in the rat hypothalamus. Steroids 1996; 61 (12): 678-681.
Shughrue PJ, Lane MV, Merchenthaler I. Comparative distribution of estrogen
receptor-alpha and -beta mRNA in the rat central nervous system. J Comp Neurol
1997; 388 (4): 507-525.
Skynner MJ, Sim JA, Herbison AE. Detection of estrogen receptor alpha and beta
messenger ribonucleic acids in adult gonadotropin-releasing hormone neurons.
Endocrinology 1999; 140 (11): 5195-5201.
Smith GD, Jackson LM, Foster DL. Leptin regulation of reproductive function and
fertility. Theriogenology 2002; 57 (1): 73-86.
Smith-Kirwin SM, O'Connor DM, De JJ, Lancey ED, Hassink SG, Funanage VL.
Leptin expression in human mammary epithelial cells and breast milk. J Clin
Endocrinol Metab 1998; 83 (5): 1810-1813.
Sobhani I, Bado A, Vissuzaine C, Buyse M, Kermorgant S, Laigneau JP, et al. Leptin
secretion and leptin receptor in the human stomach. Gut 2000; 47 (2): 178-183.
Swanson LW. Brain Maps. Structure of the rat brain1992.
Takatsu Y, Matsumoto H, Ohtaki T, Kumano S, Kitada C, Onda H, et al. Distribution
of galanin-like peptide in the rat brain. Endocrinology 2001; 142 (4): 1626-1634.
Tanaka M, Nakaya S, Kumai T, Watanabe M, Tateishi T, Shimizu H, et al. Effects of
estrogen on serum leptin levels and leptin mRNA expression in adipose tissue in
rats. Horm Res 2001; 56 (3-4): 98-104.
Tapper CM, Naftolin F, Brown-Grant K. Influence of the reproductive state at the time
of operation on the early response to ovariectomy in the rat. J Endocrinol 1972; 53
(1): 47-57.
Tartaglia LA. The leptin receptor. J Biol Chem 1997; 272 (10): 6093-6096.
Referências Bibliográficas
77
Tartaglia LA, Dembski M, Weng X, Deng N, Culpepper J, Devos R, et al.
Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 1995; 83 (7):
1263-1271.
The ESHRE Capri Workshop Group. Nutrition and reproduction in women. Hum
Reprod Update 2006; 12 (3): 193-207.
Thorn SR, Meyer MJ, Van Amburgh ME, Boisclair YR. Effect of estrogen on leptin
and expression of leptin receptor transcripts in prepubertal dairy heifers. J Dairy Sci
2007; 90 (8): 3742-3750.
Ur E, Wilkinson DA, Morash BA, Wilkinson M. Leptin immunoreactivity is localized to
neurons in rat brain. Neuroendocrinology 2002; 75 (4): 264-272.
Watanobe H. Leptin directly acts within the hypothalamus to stimulate gonadotropin-
releasing hormone secretion in vivo in rats. J Physiol 2002; 545 (Pt 1): 255-268.
Watanobe H, Schioth HB. Nitric oxide mediates leptin-induced preovulatory
luteinizing hormone and prolactin surges in rats. Brain Res 2001; 923 (1-2): 193-197.
Watanobe H, Suda T. A detailed study on the role of sex steroid milieu in determining
plasma leptin concentrations in adult male and female rats. Biochem Biophys Res
Commun 1999; 259 (1): 56-59.
White V, Gonzalez E, Capobianco E, Pustovrh C, Martinez N, Higa R, et al. Leptin
modulates nitric oxide production and lipid metabolism in human placenta. Reprod
Fertil Dev 2006; 18 (4): 425-432.
Wilkinson M, Morash B, Ur E. The brain is a source of leptin. Front Horm Res 2000;
26 106-125.
Yu WH, Kimura M, Walczewska A, Karanth S, McCann SM. Role of leptin in
hypothalamic-pituitary function. Proc Natl Acad Sci U S A 1997a; 94 (3): 1023-1028.
Yu WH, Walczewska A, Karanth S, McCann SM. Nitric oxide mediates leptin-induced
luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) and LHRH and leptin-induced LH
release from the pituitary gland. Endocrinology 1997b; 138 (11): 5055-5058.
Zamorano PL, Mahesh VB, De Sevilla LM, Chorich LP, Bhat GK, Brann DW.
Expression and localization of the leptin receptor in endocrine and neuroendocrine
tissues of the rat. Neuroendocrinology 1997; 65 (3): 223-228.
Referências Bibliográficas
78
Zerani M, Boiti C, Dall'Aglio C, Pascucci L, Maranesi M, Brecchia G, et al. Leptin
receptor expression and in vitro leptin actions on prostaglandin release and nitric
oxide synthase activity in the rabbit oviduct. J Endocrinol 2005; 185 (2): 319-325.
Zhang F, Chen Y, Heiman M, Dimarchi R. Leptin: structure, function and biology.
Vitam Horm 2005; 71 345-372.
Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. Positional
cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994; 372
(6505): 425-432.
Anexos
Anexos
80
Gel de agarose mostrando o produto amplificado da leptina
e do GAPDH
PM M D P E M D P E M D P E
ARC
MPOA HDM
Controle
negativo
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
PM M D P E M D P E M D P E
ARC
MPOA HDM
Controle
negativo
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
PM M D P E M D P E M D P E
ARC
MPOA HDM
Controle
negativo
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
PM O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
ARCMPOA
HDM
Hipófise
Tecido
Adiposo
Controle
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
PM O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
ARCMPOA
HDM
Hipófise
Tecido
Adiposo
Controle
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
PM O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
O E
2
ARCMPOA
HDM
Hipófise
Tecido
Adiposo
Controle
Leptina
GAPDH
200 pb
200 pb
Anexo A: Gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, mostrando o produto
amplificado no PCR em tempo real da leptina e do GAPDH nos diferentes grupos
experimentais, M (metaestro), D (diestro), P (proestro), E (estro), O (óleo), E2
(estrógeno), e tecidos, com os respectivos controles negativos. PM (peso molecular).
Anexos
81
Curva de dissociação da leptina e do GAPDH
A)
CONTROLE
NEGATIVO
B)
CONTROLE
NEGATIVO
nexo B: Curva de dissociação, em “A” curva de dissociação da leptina em torno de A
88-89°C e em “B” curva de dissociação do GAPDH em torno de 86°C, com seus
respectivos controles negativos.
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