( PDF ) Caracterização da atividade antitumoral das tiossemicarbazonas derivadas de n(4)-metil-toluil- 2-acetilpiridina e de 2-piridinoformamida e seus complexos metálicos: avaliação do potencial...

Download PDF

ads:

“CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DAS

TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE N(4)-METIL-TOLUIL-

2-ACETILPIRIDINA E DE 2-PIRIDINOFORMAMIDA E SEUS

COMPLEXOS METÁLICOS: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

RADIOFARMACÊUTICO”.

Paulo Roberto Ornelas da Silva

Dissertação apresentada ao em Ciência e Tecnologia das

Radiações, Minerais e Materiais como requisito parcial à

obtenção do Grau de Mestre.

2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Comissão Nacional de Energia Nuclear

CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das

Radiações, Minerais e Materiais

“CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DAS

TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE N(4)-METIL-TOLUIL-2-

ACETILPIRIDINA E DE 2-PIRIDINOFORMAMIDA E SEUS COMPLEXOS

METÁLICOS: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL RADIOFARMACÊUTICO”.

PAULO ROBERTO ORNELAS DA SILVA

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre

em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

Área de concentração: Ciência e Tecnologia das Radiações: Técnicas Nucleares

Aplicadas à Saúde e a Biologia.

Orientadora: Dr

. Raquel Gouvêa dos Santos

Belo Horizonte

2008

ads:

iii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Didicatória iv

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

DEDICO ESTE TRABALHO:

Aos meus pais, Wilson e Doralice, pelo

seu amor, carinho, dedicação, por serem

pessoas honestas e lutadoras, as quais são

meus espelhos para sempre seguir em

frente.

Aos meus tios Herval (in memorian) e

Dinorá (in memorian) pelo carinho e

amor). Sei que certamente estariam (ou

estão!) felizes por mais esta conquista.

Agradecimentos v

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

AGRADECIMENTOS

A Deus, por atender mais este desejo, por estar sempre presente em cada passo da

minha vida, confortando-me e iluminando meu caminho.

A minha família: meus irmãos e irmãs, cunhados e cunhados, primos e primas, pela

união, carinho, amor e pela ajuda nos momentos mais difícies da minha vida.

A meu primo Cláudio, que sempre me incentivou, aconselhou e colaborou com minha

educação e formação profissional.

A Cinthia, meu amor, minha amiga e companheira. Obrigado por me ensinar o lado

mais bonito da vida e por sempre me fazer feliz! Agradeço sua paciência, dedicação,

incentivo, apesar de toda distância.

A Raquel, minha orientadora, por aceitar o meu pedido de orientação, pela sua

dedicação, confiança, ajuda, e por todos seus valiosos ensinamentos.

A Andréia, “minha co-orientadora”, pela sua grande ajuda, por sua grande dedicação e

relevantes ensinamentos. Você entrou no segundo tempo do nosso trabalho, mas marcou

um “golaço”!

A minha avó Zulmira, exemplo de vida, sempre bem humorada apesar das dificuldades

que a vida lhe impôs. Obrigado pela torcida!

A Naízia e Jerfferson, minha sogra e meu sogro, por serem pessoas maravilhosas, pelo

incentivo e carinho.

A meus tios Fernando e Darci pelo amor, carinho e grande apoio nesta jornada.

A minha segunda família em BH: Fernando, Hugo, Rose, Michael e Érica, pelo suporte

em terra mineiras, incentivo, dedicação, companheirismo, amizade, farras!

A professora Heloísa Beraldo e Isolda Mendes, pelo apoio técnico, síntese e

fornecimento dos compostos utilizados neste trabalho.

Ao meu amigo e colega de profissão Danilo, por ter incentivado e indicado o curso de

mestrado do CDTN.

As minhas amigas Marcella e Priscilla Pujatti, pela grande ajuda dada em todos os

experimentos, pelas técnicas ensinadas, pelos momentos de alegria e tristeza

compartilhados. Serei sempre grato a vocês!

A toda equipe do reator: Fausto, Luiz, Paulo, Amir, Rocha, Maria Ângela, Amaral, Pitti,

José Augusto, pela irradiação, contagem, fiscalização, liberação, de todas as amostras

utilizadas neste trabalho. O trabalho de vocês foi fundamental!

Ao amigo Eduardo, pela realização e análise do infravermelho.

Agradecimentos vi

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Ao profº Geovanni e sua aluna Cristina pelo fornecimento das células de Erlich.

Aos amigos da Pós-graduação, Thiago, Paulo Rosado, Nino, Kerley, Alisson, Bruno

Aguiar, Bruno Debien, André, Cassimiro, Soninha, Cinthia, Ligiane, Fred, Hélio, Carol,

Antônio Carlos, Karine, Lílian, pela união, companheirismo, pelos momentos de

alegrias, desabafos, farras, e aprendizagem.

Aos amigos do Laboratório de Radiobiologia, Estefânia, Luciana, Juliana Soprani,

Juliana Lage, Fred, Bárbara, Karine, Márcia, Marina Bicalho, Marina, Luiza, Pryscila

Rodrigues, Rômulo, Thaíssa, Isabela, Larissa, Ludmila, Daniel e Fabrício, pela ajuda

nos experimentos, pelos momentos de alegria, pelo bom relacionamento diário, pelas

farras e congressos.

Ao meu amigo e colega Leonardo pela ajuda na revisão bibliográfica.

A minha amiga e colega Camila pela ajuda com as referências bibliográficas.

Ao amigo Romário, pelo apoio incondicional, companheirismo, atenção, “peladas”,

farras e sábios conselhos. Grande Roma!

A minha turma da Metrologia: Camila, Marcos e Elizabeth, pelos nossos divertidos

relatórios e pelos momentos de aprendizagem. Adoro vocês!

Ao meu amigo e vizinho Alexandros, pela atenção, apoio e companherismo.

Ao meu amigo Franc, grande médico, pelos seus espetaculares ensinamentos e por

transmitir sua paixão pela medicina a mim!

A minha amiga e conselheira Agnes, que sempre me socorreu nos embaraços da minha

vida profissional e pessoal.

Aos meus amigos de Ilhéus: Vladimir, Ramon, Francisco, Marcelo, Boliva, Matteus,

Jaqueline, Ricardo, Jandira, Junior e Ana Paula, pela torcida!

Aos amigos das “peladas do CDTN,” pelos momentos de descontração.

Aos professores Adelina e Javier pela grande atenção dispensada no começo do curso.

Aos professores Téogenes, Maria José, Antero, Max, pelos relevantes ensinamentos.

Ao Zacarias, Dovenir e Teresinha pelo apoio técnico.

A minha amiga Virgínia, pela ajuda na revisão da literatura e no meu processo jurídico.

A Lenira e Nívea, por estarem sempre dispostas a nos ajudar!

As secretárias da Pós-graduação Roseli, Andréia, Cerisa, ao secretário Fugêncio e ao

professor Rubens, pelos relevantes auxílios nas questões pessoais e acadêmicas.

Ao CDTN pelas instalações e apoio financeiro.

Muito Obrigado!

vii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

“

Os pequenos atos que se executam

são melhores que todos aqueles que se

planejam.”

George C. Marshal

Resumo ix

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE

TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE N(4)-METIL-TOLUIL2-

ACETILPIRIDINA E DE 2-PIRIDINOFORMAMIDA E SEUS COMPLEXOS

METÁLICOS: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL RADIOFARMACÊUTICO.

Paulo Roberto Ornelas da Silva

RESUMO

As tiossemicarbazonas têm despertado grande interesse farmacológico por causa de suas

propriedades biológicas, tais como a atividade citotóxica contra várias linhagens de

tumores humanos. A maioria destes compostos sintetizados é baseada na piridina, por

causa da sua semelhança a metabólitos piridoxal que estão presentes na co-enzima B

Os objetivos deste estudo foram a caracterização do efeito antitumoral de

tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-metil-toluil-2-acetilpiridina e 2-

piridinoformamida e o desenvolvimento de um radiofármaco baseado num complexo

metálico de tiossemicarbazona para aplicação na tomografia por emissão de pósitron

(PET).

Na primeira fase deste trabalho foram sintetizadas vinte e uma tiossemicarbazonas,

derivadas de N(4)-metil-toluil-2-acetilpiridina e 2-piridinoformamida, bem como seus

complexos metálicos (Sn, Ga e Cu), para se avaliar seus potenciais citotóxicos e

antiproliferativos in vitro sobre células de tumores cerebrais e mamários. Nossos

resultados mostraram que todas tiossemicarbazonas testadas apresentaram potente efeito

citotóxico e antiproliferativo contra linhagens de células de glioblastoma multiforme e

carcinoma de mama, com valores de IC

(concentração do composto que produziu 50%

de morte celular) na ordem de nanomolar. Além disso, foram observadas alterações

morfológicas como arredondamento celular, redução do volume citoplasmático e

condensação da cromatina, característicos do mecanismo apoptótico. O cloreto de cobre

foi usado como controle e apresentou o valor da IC

na ordem de milimolar, indicando

que a complexação do cobre com tiossemicarbazona foi capaz de aumentar mais de 1

milhão de vezes a potência antitumoral deste metal.

Na segunda etapa deste trabalho, devido a potente atividade antitumoral das

tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-metil-toluil-2-acetilpiridina e das excelentes

Resumo ix

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

propriedades do

Cu (T

1/2

= 12,7 h, decaimento por β

, β

e EC) foi desenvolvido um

novo agente de imagem (radiofármaco) para detecção de tumores através da PET. Os

radiofármacos foram produzidos no reator nuclear TRIGA-IPR-R1 do CDTN, via reação

de captura neutrônica

Cu(n, y)

Cu, do complexo de cobre N(4)-orto-toluil-2-

acetilpiridina tiossemicarbazona (Culac). A maior atividade específica induzida foi 5,55

MBq/mg. Depois de irradiadas, as amostras de

Culac foram analisadas por

espectroscopia de absorção no infravermelho (IV) para se avaliar a integridade estrutural

química. Todos os compostos irradiados mantiveram sua estrutura química íntegra. Em

seguida, foi avaliada a manutenção da atividade antitumoral in vitro do

Culac, pelo

ensaio do MTT, nas linhagens de células RT2 (p53 selvagem), T98 (p53 mutante),

MCF-7 (p53 selvagem), CAE (p53 selvagem). Os resultados mostraram a manutenção

da potente atividade antitumoral do

Culac em todas as células tratadas e apresentou

valores da IC

da ordem de nanomolar. Os estudos de biodistribuição do

Culac,

realizados por injeções via endovenosa caudal, em camundongos implantados nos coxins

plantares com tumor de Ehrlich mostraram captação significativa na pata com tumor

(razão tumor/músculo esquelético de 6,55) em relação ao controle no tempo de 240

minutos após administração deste composto. Estudos histopatológicos revelaram leve

hepatotoxicidade após 144 horas (6 dias) da administração endovenosa de 136 µg/kg do

Culac. Contudo, nesta dose não foi observada letalidade, nem alterações

comportamentais, locomotoras ou nutricionais nos animais.

Os nossos resultados demonstraram que o complexo de cobre-64 N(4)-orto-toluil-2-

acetilpiridina tiossemicarbazona (

Culac) é um promissor radiofármaco para detecção

de tumores sólidos pela tomografia por emissão de pósitrons (PET).

Palavras-chave: Câncer, tiossemicarbazonas,

Culac, radiofármacos.

Abstract x

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

CHARACTERIZATION OF THE ANTITUMURAL ACTIVITY OF THE

THIOSEMICARBAZONES DERIVED FROM N(4)-METHYL-TOLYL-2-

ACETYLPYRIDINE AND 2-PIRIDINOFORMAMIDE AND ITS METAL COMPLEX:

EVALUATION OF THE RADIOPHARMACEUTICAL POTENTIAL.

ABSTRACT

Thiosemicarbazones have attracted great pharmacological interest because of their

biological properties, such as cytotoxic activity against multiple strains of human tumors.

The most studied compounds are pyridine-based because of their resemblance to pyridoxal

metabolites that attach to co-enzyme B

-dependant enzymes. This work aimed the

characterization of the antitumoral effect of N(4)-methyl-tolyl-2-acetilpiridine and 2-

pyridinoformamide–derived thiosemicarbazones and the development of a

radiopharmaceutical based on a thiosemicarbazone metal complex for positron emission

tomography.

In the first phase of this study were synthesized twenty-one thiosemicarbazones, derived

from N(4)methyl-2 acetylpyridine and 2-pyridineformamide, as well as their metal

complexes (Sn, Ga and Cu). Their cytotoxic potential were evaluated against brain and

breast tumor cells in vitro. Our results showed all of them presented powerful cytotoxic

and antiproliferative activities against glioblastoma multiforme and breast adenocarcinoma

at very low concentrations (nanomolar range). Morphological alterations characteristic of

apoptosis, such as cell shrinkage, chromatin condensation were observed. Copper chloride

was used as control and has presented IC50 at milimolar range suggesting that copper

complexation with thiosemicarbazone significantly increases (more than 1 million) the

antitumoral effect of this metal.

Due to the potent antitumoral activity of N(4)-methyl-tolyl-2-acetilpiridine derived

thiosemicarbazones and the excellent properties of

Cu (T

1/2

= 12.7 hours, β

, β

, and EC

decay), at the second part for this work it was developed a new imaging agent

(radiopharmaceutical) for tumor detection by positron emission tomography (PET). The

radiopharmaceuticals were produced in the nuclear reactor TRIGA-IPR-R1 from CDTN,

via neutron capture reaction

Cu (n,γ)

Cu, of the copper complex N(4)-ortho-toluyl-2-

acetylpyridine thiosemicarbazone (Culac). The induced specific activity

Abstract xi

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

was found to be 5.55 MBq /mg. After irradiation

Culac samples were analyzed by the

absorption of infrared spectroscopy (IR) to assess the structural integrity. The irradiated

compound kept its structural integrity. The maintenance of

Culac biological activity

was also evaluated by MTT assay on RT2 (wild p53), T98 (mutant p53), MCF-7 (wild

p53) and CAE cells (wild p53). The results showed that

Culac kept its potent

antitumural activity against all treated cells presenting IC

values at nanomolar range.

Culac biodistribution studies after intravenous injection in mice bearing Erlich tumor

implanted in the paw, showed significant uptake in the tumor paw (tumor/skeletal

muscle ratio= 6.55), 240 minutes after administration. Histopathological studies have

shown mild hepatotoxicity 144 hours (6 days) after intravenous administration of 308

mg/kg of Culac. However, no lethality, behavioural, or feeding changes were observed

at this dose. Our results demonstrate that the complex of copper-64 N(4)-ortho-toluyl-2-

acetylpyridine thiosemicarbazone (

Culac) is a promising radiopharmaceutical for

detection of solid tumors by positron emission tomography (PET).

Keywords: Cancer, thiosemicarbazones,

Culac, radiopharmaceuticals.

Lista de figuras xii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

LISTA DE FIGURAS

FIG.1: Fórmula geral das tiossemicarbazonas (TENÓRIO et al., 2005)...........................1

FIG.2: Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2008, na população brasileira

(MS, INCA, 2008)..............................................................................................................4

FIG.3: Esquema ilustrando o papel das ciclinas-depedentes e dos inibidores da

regulação do ciclo célular (CONTRAN et al., 2000).......................................................11

FIG.4: Caracterização das diferentes alterações morfológicas nos processos de morte

celular por apoptose versus necrose (ANAZETTI et al., 2007).......................................13

FIG.5: Representação esquemática da Via Extrínseca de ativação da Apoptose

(GRIVICICH et al., 2007)................................................................................................15

FIG.6: Representação esquemática da via intrínseca de ativação da apoptose

(GRIVICICH et al., 2007)................................................................................................16

FIG.7: Papel da p53 na regulação e desenvolvimento do câncer (Adaptado de EVAN et

al., 2001)...........................................................................................................................18

FIG.8: Esquema ilustrativo do processo de carcinogênese até a disseminação neoplásica

(Adaptado do MS-INCA, 2007).........................................................................................23

FIG.9: Teoria sistêmica da disseminação do câncer de mama (CAMPOS et al.,

2006).................................................................................................................................28

FIG.10: Teoria Halsted da disseminação do câncer de mama (CAMPOS et al.,

2006).................................................................................................................................28

FIG.11: Esquema ilustrativo da fisiologia do cobre pelas vias administração endovenosa

(I.V) ou oral (TGS) (Adaptado de BLOWER et al.,

1996).......................................................................................................................................37

FIG.12: Representação esquemática da junção de um radionulídeo encapsulado com

uma BAM, via grupo ligante (Adaptado de HOLLAND et al., 2006).............................40

FIG.13: Estrutura das tiossemicarbazonas as conformações sin e anti (TENÓRIO et al.,

2005).................................................................................................................................42

FIG.14: Complexo Cobre-bis(tiossemicarbazona) (VÃVERE et al., 2007)...................43

Lista de Figuras xiii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

FIG.15: (a) Representação esquemática da estrutura da RR; (b) ciclo de reações de oxi-

redução envolvidas na conversão de ribonucleotídeos em desoxi-ribonucleotídeos,

catalisada pela RR (BERALDO, 2003)...............................................................................44

FIG.16: Espectro de nêutrons típico apresentando as regiões de energia (DA COSTA,

2007)....................................................................................................................................46

FIG.17: Vista superior do reator nuclear TRIGA IPR-R1 (Fonte CDTN).........................47

FIG.18: Câmera gama (SILVA, 2003)...............................................................................50

FIG.19: Desenho esquemático do decaimento do carbono para berílio e aniquilação do

pósitron com elétron, formando-se um par de fótons de 511 keV, em direções opostas

(Adaptado de ROBILOTTA, 2006)....................................................................................51

FIG.20: Exemplo de um equipame PET, fechado, à esquerda (Siemens Medical Systems),

e mostrando a estrutura interna de blocos de detectores dispostos em anéis, à direita

(equipamento GE) (POZZO, 2005).....................................................................................53

FIG.21: Câmara de Neubauer.............................................................................................58

FIG.22: Desenho esquemático do MTT sendo reduzido pelas enzimas desidrogenases de

células metabolicamente viáveis e dando origem ao Formazan..........................................61

FIG.23: Núcleo do reator TRIGA-IPR-R1 (Vista Radial)..................................................63

FIG.24: Maquete do reator TRIGA-IPR-R1 onde mostra a Mesa Giratória e o Tubo

Central (Fonte: CDTN)........................................................................................................64

FIG.25: Frascos utilizados para irradiação das amostras....................................................65

FIG.26: Estudo do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas sobre as células

RT2......................................................................................................................................74

FIG.27: Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das células RT2.......................79

FIG.28: Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das células T98........................80

FIG.29: Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das células MCF-7..................81

FIG.30: Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das células CAE......................82

FIG.31: Fotomicrografias das análises das alterações do DNA cromossomal induzidas

pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt nas concentrações de 0,2 a 20 nM sobre

células RT2..........................................................................................................................84

Lista de Figuras xiv

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

FIG.32: Fotomicrografias das análises das alterações do DNA cromossomal induzidas

pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt nas concentrações de 0,2 a 20 nM sobre

células T98...........................................................................................................................85

FIG.33: Fotomicrografias das análises das alterações do DNA cromossomal induzidas

pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt nas concentrações de 0,2 a 20 nM sobre

células MCF-7.....................................................................................................................86

FIG.34: Fotomicrografias das análises das alterações do DNA cromossomal induzidas

pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt nas concentrações de 0,2 a 20 nM sobre

células MCF-7.....................................................................................................................87

FIG.35: Espectro total da tiossemicarbazona Sn1 ativada neutronicamente na Mesa

Giratória do reator TRIGA IPR-R1.....................................................................................88

FIG.36: Espectro total do

Culac, sintetizado em vidro, ativado neutronicamente na Mesa

Giratória (fluxo de nêutrons térmicos de 6,5 x 10

n.cm

-2

-1

) do reator TRIGA IPR-

R1........................................................................................................................................89

FIG.37: Ampliação do inserto do espectro do

Culac irradiado na Mesa Giratória do

reator TRIGA IPR-R1.........................................................................................................90

FIG.38: Comparação entre os tipos de síntese da tiossemicarbazona Culac através da

ativação neutrônica..............................................................................................................91

FIG.39: Comparação entre os tipos de síntese da tiossemicarbazona Culac e a

interferência

Na através da ativação neutrônica...............................................................92

FIG.40: Estrutura da tiossemicarbazona Lac (H2Ac4oT), derivada de 2-

acetilpiridina........................................................................................................................94

FIG.41: Estrutura da tiossemicarbazona Culac [Cu(2Ac4oT)Cl], derivada de 2-

acetilpiridina, complexada com o cobre..............................................................................94

FIG.42: Espectro infravermelho da tiossemicarbazona Culac sintetizada em

teflon....................................................................................................................................94

FIG.43: Espectro infravermelho da tiossemicarbazona Culac sintetizada em teflon e

irradiada por 8 horas no Tubo Central do reator TRIGA-IPR-

R1....................................................................................................................................................94

Lista de Figuras xv

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

FIG.44: Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac sobre células RT2................................................................................................96

FIG.45: Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac sobre células T98.................................................................................................96

FIG.46: Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac sobre células MCF-7............................................................................................97

FIG.47: Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac sobre células CAE...............................................................................................97

FIG.48: Fotomicrografias ópticas das análises morfológica das células RT2, T98, MCF-

7, CAE..............................................................................................................................99

FIG.49: Fotomicrografias das análises das alterações do DNA cromossomal induzidas

pela tiossemicarbazona

Culac nas concentrações de 0,2 a 20 nM sobre células RT2,

T98, MCF-7, CAE..........................................................................................................101

FIG.50: Fotomicrografias das análises histopatológicas do coração (A) e pulmões (B)

dos animais dos grupos controle e tratados com a tiossemicarbazona

Culac...............................................................................................................................103

FIG.51: Fotomicrografias das análises histopatológicas do baço (C) e fígado (D) dos

animais dos grupos controle e tratados com a tiossemicarbazona

Culac...............................................................................................................................104

FIG.52: Fotomicrografias das análises histopatológicas dos rins (E) e ovários (F) dos

animais dos grupos controle e tratados com a tiossemicarbazona

Culac...............................................................................................................................105

FIG.53: Fotomicrografias das análises histopatológicas do córtex cerebral (G) dos

animais dos grupos controle e tratados com a tiossemicarbazona

Culac...............................................................................................................................106

FIG.54: Perfil de biodistribuição da tiossemicarbona

Culac em camundongos swiss

fêmeas implantados com tumor de Ehrlich....................................................................107

FIG.55: Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac no sangue de

animais implantados com tumor de Ehrlich..............................................................108

Lista de Figuras xvi

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

FIG.56: Comparação da captação entre a pata normal e a pata com tumor da

tiossemicarbazona

Culac e do cloreto de cobre (

CuCl

)...........................................108

FIG.57: Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac nos rins de animais

implantados com tumor de Ehrlich ................................................................................109

FIG.58: Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac no fígado de animais

implantados com tumor de Ehrlich.................................................................................110

FIG.59: Verificação in vivo da estabilidade e pureza radioquímica da tiossemicarbazona

Culac............................................................................................................................111

FIG.60: Exemplo de espectro de partículas β+ emitidas por radionuclídeos instáveis por

excesso de prótons (POZZO, 2005)...............................................................................111

FIG.61: Probabilidade relativa dos três tipos de interação de fótons com o meio de

propagação (efeito fotoelétrico, espalhamento Compton e produção de pares) (POZZO,

2005)...............................................................................................................................111

FIG.62: Foto superior do layout do programa WorkStream´s 3D planning para

aquisição de imagens PET/CT........................................................................................165

FIG.63: Foto central do layout do programa WorkStream´s 3D planning para aquisição

de imagens PET/CT........................................................................................................166

Lista de Tabelas xvii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características do decaimento dos Radionuclídeos do cobre (WELCH et al.,

2003).................................................................................................................................31

Tabela 2: Propriedades físicas dos radionucídeos do para imagem ou terapia (Adaptado

de BLOWER et al., 1996)………………………………..…..........................................32

Tabela 3: Dados da produção para os radionuclídeos de cobre (WILLIAMS et al.,

2005).................................................................................................................................33

Tabela 4: Enzimas do sistema biológico que contêm cobre (WELCH et al.,

2003).................................................................................................................................35

Tabela 5: Radiofármacos de perfusão (1ª geração) para diagnóstico clínico tumores

(Adaptado de OLIVEIRA et al., 2006).............................................................................38

Tabela 6: Radiofámarcos (2ª e 3ª gerações) específicos para diagnóstico clínico de

tumores (Adaptado Oliveira et al., 2006).........................................................................38

Tabela 7: Tiossemicarbazonas Livres (ligantes) e complexadas com gálio, estanho e

cobre.................................................................................................................................57

Tabela 8: Atividade antitumoral das tiossemicarbazonas e seus complexos metálicos

contra células RT2............................................................................................................75

Tabela 9: Análise comparativa do efeito citotóxico em diferentes linhagens

tumorais............................................................................................................................76

Tabela 10: Absorção das ligações químicas das tiossemicarbazonas no espectro

infravermelho...................................................................................................................92

Tabela 11: Proporção entre a concentração de

Culac no tumor e órgãos

adjacentes.......................................................................................................................108

Tabela 12: Comparação entre a performance de algumas modalidades de imagens

(SMITH, 2004)...............................................................................................................108

Lista de Abreviaturas e Siglas xix

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

 AAN- Análise por Ativação Neutrônica.

 Apaf1 – Fator de ativação da apoptose.

 ATCC – American Type Cell Collection.

 ATM – Gene mutado da ataxia telangiectasia.

 ATR – Gene da ataxia telangiectasia e relacioando a RAD3.

 Bad – Promotor de morte associado à Bcl-2.

 Bak – Antagonista homólogo de Bcl2.

 Bax – Proteína X associada a Bcl2.

 BAM – Molécula biologicamente ativa.

 BCL-2 – B-linfoma celular 2.

 BFC – Quelante bifuncional.

 Bid – Agonista do domínio de morte.

 BRCA2 –Breast Cancer type 2 susceptilibity protein

 CA 15-3 – Antígeno carcinogênico.

 CAE- células de carcinoma ascítico de Ehrlich.

 CASPASES – Cysteine-dependent aspartate-specific proteases.

 CDK – Quinases ciclina-dependentes.

 CDTN – Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear.

 CEA – Antígeno carcinoembrionário.

 CEBIO – Centro de Biotetrismo.

 ChK – Proteína quinase que regula pontos de checagem.

 c-Myc – c-miolócitomatose.

 CKI – Casein Kinase 1.

 CNEN – Comissão Nacional de Energia Nuclear.

 CNTF – Fator neutrófico ciliar.

 DAPI - 4´,6- diamidina- 2´- fenindole dihidroclorido.

 DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s.

 DMSO – Dimetilsulfóxido.

 DNA – Ácido desoxiribonucleotídeo.

 DNA-PK- Ácido desoribonucletídeo proteína kinase.

 DOTA – Tetraazociclododecano-1,4,7,10-tetraacético.

 DTPA – dietilenotriaminopentaacético ácido.

Lista de Abreviaturas e Siglas xx

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

 EDTA – etilenodiaminotetraacético ácido.

 d-NTP – desoxiribonucleotídeos.

 EC – Captura eletrônica.

 EGF – Fator de crescimento epidérmico.

 E2F – Fator de transcrição eucariótico.

 erb-B2 – erythoroblastic leukemia viral oncongene homolog-2.

 ER – Receptor de Estrogênio.

 FDG – 2-flúor-2-desoxi-D-glicose.

 FGF – Fator de crescimento fibroblastos.

 FIOCRUZ- Instituto Oswaldo Cruz.

 FWHM- Full-Width Half-Maximum.

 GBM – Gliobastoma multiforme.

 HER-2/neu (neu-related protein).

 HPGe- High Purity Germanium.

 INCA – Instituto Nacional do Câncer.

 IPR – Instituto de Pesquisa Radioativas.

 MCF-7 – Células de carcinoma mamário humano.

 MDM2 – Murine Double Minute.

 MMAC1-Mutated multiple advance canceres

 Mre11- Meiotic recombination 11 homolog

 MS – Ministério da Saúde.

 MTT- 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.

 NBS – Nijimegem breakage syndrome.

 NF-B – nuclear factor B.



OMS – Organização Mundial de Saúde.

 PBS – Tampão fostato.

 PDGF – Fator de crescimento derivado das plaquetas.

 PET – Tomografia por emissão de pósitrons.

 pH – Potencial de hidrogênio.

 PIGF – Fator de crescimento placentário.

 PI3K – Phosphoinositide 3-kinase.

 p21 – Proteína 21.

 p27 – Proteína 27.

 p53 – Proteína 53.

Lista de Abreviaturas e Siglas

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

 PTEN – Phosphatase and tensin homolog

 RAD 50 – Disruption of the arabidopisis

 Rb – gene Retinoblastoma.

 rTNF – Receptores de fatores de necrose tumoral.

 ROS – Espécies reativas do oxigênio.

 RMN – Ressonância Magnética Nuclear.

 RR – Ribonucleotídeo redutase.

 RT2 – Células de glioblastoma multiforme murino.

 SFB – Soro fetal bovino.

 Smac/DIABLO - Second mithocondria-derived/Direct IAP-Binding Protein

with Low pI activator of caspases.

 SNC – Sistema nervoso central.

 SOD- Superóxido dismutase.

 SPECT – Tomografia por emissão de fóton único.

 SUS - Sistema Único de Saúde.

 TP53BP1 –Tumor protein p53 binding protein 1

 TC – Tomografia computadorizada.

 TETA – tetra(aminocarboxilato).

 TGF-α – Fator de crescimento tumoral-alfa.

 TGF-β – Inibidor de fator de crescimento tumoral-beta.

 TRIGA – Training Research Isotope General Atomic.

 T98 – Células de glioblastoma multiforme humano.

 UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais.

 VEGF – Fator de crescimento vasoendotelial.

Lista de Símbolos xxi

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

LISTA DE SÍMBOLOS

• %DI - porcentagem de dose injetada.

• µg – micrograma.

• µL – microlitro.

•

B- boro-11.

•

C- carbono-11.

•

Cu – cobre-64.

•

O- oxigênio-15.

•

F- flúor-18.

•

201

Ta- tálio-201.

•

Ga- gálio-67.

•

99m

Tc- tecnécio -99-metaestável.

•

125

Sb – antimônio-125.

•

117m

Sn – estanho-117-metaestável.

•

125m

Sn – estanho-125-metaestável.

•

153

Gd – gadolíneo-153.

• Bq- Becquerel.

• MBq: Megabecquerel.

• Ci- Curie.

• h- horas.

• a – anos.

• d- dias.

• H. E.- Hematoxilina/ Eosina.

• M: Molar.

• min: minutos.

• MO: microscópio óptico.

• nm: nanômetro.

• ºC: graus Celsius.

• CuCl

cloreto de cobre.

• T

1/2

–

meia-vida física.

• T

1/2b

– meia-vida biológica.

• UV-ultravioleta.

Lista de símbolos xxii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

• ppm - parte por milhão.

• R1- reator 1.

• TG – tamanho grande.

• TM- tamanho médio.

• TP- tamanho pequeno.

• θ- abundância isotópica.

• α- partícula alfa.

• σ- secção de choque a nêutrons.

• σth- secção de choque de ativação para nêutrons térmicos

• φ - fluxo de nêutrons.

• φep - fluxo de neutrons epitérmicos.

• φt - fluxo de neutrons térmicos.

• β

- partícula beta negativa – négatron.

• β

- partícula beta positiva – pósitron.

• A

esp

atividade específica.

• C - taxa de contagem para um grama de amostra irradiada sem filtro de cádmio.

• d- dêuteron.

• I- integral de ressonância.

• eV- elétron-volt.

• keV- quiloelétrons-volts.

• MeV- megaelétron-volt.

• n- nêutron.

• N

- número de Avogadro .

• p- próton.

• Ni – Níquel.

• (n, γ) – Captura neutrônica.

• α φ N – Taxa de ativação.

• A

– Peso atômico do elemento.

• m – Massa.

Índice xxv

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

ÍNDICE

RESUMO..................................................................................................................................VIII

ABSTRACT...............................................................................................................................X

LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................XII

LISTA DE TABELAS...........................................................................................................XVII

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................XVIII

LISTA DE SÍMBOLOS..........................................................................................................XXI

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................29

2. OBJETIVOS......................................................................................................................31

2.1. Objetivo geral...............................................................................................................31

2.2. Objetivos específicos................................................................................................31

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................................32

3.1. Câncer.......................................................................................................................32

3.1.1. Definição, dados epidemiológicos............................................................32

3.1.2. Nomenclatura dos tumores.......................................................................34

3.1.3. Classificação do câncer............................................................................35

3.1.4. Biologia Molecular do câncer..................................................................35

3.1.4.1. Ciclo celular e câncer...............................................................37

3.1.4.2. Apoptose celular e câncer........................................................40

3.1.4.3. Proto-oncongenes oncongenes e genes de supressão

tumoral...................................................................................................45

3.1.5. Disseminação do câncer...........................................................................48

3.1.6. Cânceres cerebrais (glioblastoma multiforme).........................................52

3.1.7. Câncer de mama.......................................................................................54

Índice xxvi

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.2. Diagnóstico do câncer: aplicações da Medicina Nuclear.........................................57

3.2.1. Radionuclídeos na medicina nuclear........................................................58

3.3. Radionuclídeos do cobre..........................................................................................59

3.3.1.Produção, propriedades e aplicações dos isótopos do

cobre...................................................................................................................59

3.3.2. Química do cobre......................................................................................61

3.3.3. Bioquímica do cobre.................................................................................62

3.4. Radiofármacos..........................................................................................................65

3.5. Radiofármacos derivados de tiossemicarbazonas.....................................................69

3.6. Produção de radiofármacos em reatores nucleares...................................................73

3.6. Técnicas de aquisição de imagens na Medicina Nuclear.........................................78

4. JUSTIFICATIVAS............................................................................................................82

5. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................85

5.1. Tiossemicarbaonas...................................................................................................85

5.2. Cultivo celular..........................................................................................................86

5.3. Modelo animal..........................................................................................................87

5.3.1.Modelo animal tumoral.................................................................87

5.4. Estudo do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas: avaliação da taxa de

sobrevivência das células tratadas..................................................................................88

5.5. Estudo do efeito das tiossemicarbazonas sobre a proliferação

celular..............................................................................................................................89

5.6.

Análise das alterações do DNA cromossomal, induzidas pelas

tiossemicarbazonas Lac, Lacm, Lacpt e Culac, através da coloração com

DAPI.............................................................................................................................90

Índice xxvii

Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5.7. Produção de radiofármaco via ativação neutrônica no reator TRIGA-IPR-

R1.....................................................................................................................................91

5.8. Avaliação do comportamento químico da tiossemicarbazona

Culac, após

irradiação no reator TRIGA IPR-R1, através da espectroscopia de absorção no

infravermelho (IV). Comparação com os compostos Culac (não-irradiado) e Lac

(ligante)............................................................................................................................95

5.9. Avaliação da toxicidade produzida pela tiossemicarbazona culac in vivo...............96

5.10. Estudo do perfil de biodistribuição e detecção de sítios tumorais in vivo da

tiossemicarbazona

Culac...............................................................................................96

5.11. Manipulação

de radioisótopos................................................................................97

5.12. Cálculos farmacocinéticos......................................................................................99

5.13. Análise estatística...................................................................................................99

6. RESULTADOS..................................................................................................................100

6. 1. Triagem das tiossemicarbazonas com atividade antitumoral sobre células tumores

cerebrais (RT2)..............................................................................................................100

6.1.1. Estudo do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac,

Lacm, PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6, Galac, Galacm, Gal 1, Gal 2,

Gal 3. Avaliação sobre a taxa de sobrevivência...............................................100

6.1.2. Estudo do efeito das tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac, Lacm, PH,

ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6, Gal 1, Gal 2, Gal 3, Galac,

Galacm, sobre

a proliferação celular .......................................................................................101

6.1.3. Avaliação geral das atividades citotóxica e antiproliferativa das

tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac, Lacm, PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5,

Sn6, Gal 1, Gal 2, Gal 3, Galac, Galacm em células de RT2...........................102

6.2. Avaliação do efeito antitumoral das tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm e Lacpt

sobre células tumorais...................................................................................................104

Índice xxviii

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

6.3. Análise morfológica das células tumorais submetidas ao tratamento com as

tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt...................................................................105

6.4. Análise das alterações do DNA cromossomal, induzidas pelas tiossemicarbazonas

Lac, Lacm, Lacpt, Culac, através da coloração com DAPI...............................................110

6.5. Produção de radiofármaco via ativação neutrônica no reator TRIGA IPR-

R1.......................................................................................................................................115

6.5.1. Análise do comportamento químico da tiossemicarbazona

Culac pela

técnica do infravermelho após irradiação no reator TRIGA IPR-R1. Comparação

entre a Culac não-irradiada e seu ligante.........................................120

6.5.2. Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac ativada neutronicamente no reator TRIGA IPR-R1.................................122

6.5.3. Análise morfológica das células tumorais submetidas ao tratamento com a

tiossemicarbazona

Culac ativada neutronicamente no reator TRIGA IPR-

R1..........................................................................................................................125

6.5.4. Análise das alterações do DNA cromossomal induzidas pela

Culac, ativada

neutronicamente no reator TRIGA IPR-R1..........................................................127

6.6. Avaliação da toxicidade produzida pela tiossemicarbazona Culac in

vivo.....................................................................................................................................129

6.7. Estudo do perfil de biodistribuição e detecção de sítios tumorais in vivo da

tiossemicarbazona

Culac. Determinação dos parâmetros fármacocinéticos...................123

7. DISCUSSÃO..........................................................................................................................140

8. CONCLUSÕES......................................................................................................................149

9. PERSPECTIVAS...................................................................................................................150

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................151

APÊNDICE A: Princípios Físicos da Medicina Nuclear.................................................169

ANEXO1

ANEXO 2

Introdução

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

1-INTRODUÇÃO

As tiossemicarbazonas foram sintetizadas pela primeira vez em 1960 e logo demonstraram

efeitos citotóxicos em vários tipos de células tumorais (BLOWER et al., 1996). Estes

compostos são formados pela reação de condensação quimiosseletiva de

tiossemicarbazidas com aldeídos e/ou cetonas e recebem a denominação da classe

tiossemicarbazona após o nome do respectivo aldeído ou cetona condensado (FIG. 1)

(TENÓRIO et al., 2005).

As tiossemicarbazonas α(N)heterocíclicas derivadas de acetilpiridina apresentam como

principal característica a inibição do crescimento de tumores in vitro e in vivo (JALILIAN

et al., 2006), provavelmente por causa da presença do grupo funcional na posição N(4),

que aumenta a sua lipolifilicidade (MENDES et al., 2006), ou pelo fato delas se ligarem a

metais endógenos comportando-se como agentes quelantes, ou pela inibição de enzimas

(TENÓRIO et al., 2005).

Devido à versatilidade farmacológica e pela facilidade de síntese com metais ou

radionuclídeos (complexação metálica), as tiossemicarbazonas são objetos de estudo para

o desenvolvimento de novos agentes antitumorais, antimicrobianos, antiparasitários, bem

como de novos radiofármacos (JALILIAN et al., 2006).

Recentemente, vem crescendo o interesse da medicina nuclear pelo desenvolvimento de

radiofármacos derivados de tiossemicarbazonas, complexados com o cobre, para uso na

oncologia (VÃVERE et al., 2007), visto que os radionuclídeos do cobre oferecem uma

FIGURA 1 - Fórmula geral da tiossemicarbazonas. Os radicais

, R

e R

são formados pelo hidrogênio ou por elementos dos

grupamentos Aquil e Aril (TENÓRIO et al., 2005).

Introdução

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

seleção de isótopos para o diagnóstico (

Cu,

Cu) e tratamento (

Cu,

Cu)

do câncer (ANDERSON et al., 1999). Dentre estes radionuclídeos, os mais

freqüentemente usados na medicina nuclear são o

Cu e

Cu, pois possuem boas

propriedades físicas, tais como meia-vida curta (T

1/2

: 9,76 min e 12,7h, respectivamente)

e tipo de decaimento (emissores de pósitrons). Eles também podem ser produzidos tanto

nos aceleradores de partículas (cíclotron) como em reatores nucleares (WILLIAMS et al.,

2005). Além disso, avanços nas técnicas de imagens tumorais como a tomografia por

emissão de pósitrons (PET/CT) permitiu uma maior sensibilidade na detecção de tumores

com uso destes radionuclídeos (SMITH, 2004).

Os complexos de cobre (II) associados a tiossemicarbazonas podem também ser usados na

terapia molecular, de acordo com diversos estudos demonstrando a potente atividade

antiproliferativa destas moléculas em tumores experimentais (VÃVERE et al., 2007).

O objetivo deste projeto foi realizar uma triagem de tiossemicarbazonas, livres e

complexadas com metais, com potencial antitumoral nas linhagens celulares dos cânceres

de mama e cerebral in vitro. Posteriormente, foi selecionada uma tiossemicarbazona

complexada com o cobre para produção de um radiofármaco, via ativação neutrônica, no

reator de pesquisa TRIGA-IPR-1. Em seguida, foram avaliados parâmetros toxicológicos,

farmacocinéticos, atividade citotóxica in vitro (potencial radioterapêutico) e capacidade

para detecção de tumores in vivo deste radiofármaco.

Objetivos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

2-OBJETIVOS

2.1 - Objetivo Geral:

• Identificar e caracterizar o efeito antitumoral de tiossemicarbazonas, derivadas de

N(4)-toluil-2-acetilpiridina e 2-piridinoformamida, e seus complexos metálicos sobre

diferentes tumores malignos, bem como desenvolver um radiofármaco emissor de

pósitron para aplicação em diagnóstico por imagem molecular.

2.2 - Objetivos Específicos

• Avaliar os efeitos citotóxicos de diferentes tiossemicarbazonas sobre a proliferação

celular e o metabolismo células tumorais humanas e murinas;

• Avaliar o mecanismo de ação do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas:

alterações morfológicas, alterações da cromatina (detecção de apoptose);

• Desenvolver e caracterizar um radiofármaco, emissor de pósitrons, derivado de

tiossemicarbazona. Realizar o controle de qualidade do radiofármaco produzido:

o Avaliação radioquímica: determinação da atividade específica;

o Avaliação do comportamento químico;

o Avaliar a manutenção da atividade citotóxica in vitro do radiofármaco em células

tumorais humana e murina;

o Avaliar o efeito toxicológico do radiofármaco através da histopatologia.

o Avaliar a capacidade do radiofármaco derivado de tiossemicarbazona na detecção

de sítios tumorais em modelos animais de tumor de Ehrlich.

o Determinar os parâmetros farmacocinéticos do radiofármaco.

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 – CÂNCER

3.1.1 - Definição, dados epidemiológicos.

O câncer é a designação dada ao conjunto de manifestações patológicas que se

caracterizam pela perda de controle da proliferação celular, ganho de capacidade de

invadir tecidos adjacentes ou de sofrer metástases para tecidos distantes (MONTESANO

et al., 2001).

A origem do câncer é devido ao acúmulo de mutações nos genes que controlam o

crescimento (ciclo celular) e a diferenciação celulares (BORGES-OSÓRIO et al., 2001).

Tais mutações ocorrem em decorrência à exposição a fatores químicos, físicos e

biológicos, bem como podem ser hereditárias ou adquiridas somaticamente

(MONTESANO et al., 2001).

A palavra “câncer” é a tradução latina da palavra grega carcinoma (de karkinos =

crustáceo, caranguejo) (FILHO et al., 2004), presumivelmente pelo fato de um câncer

aderir a qualquer parte e agarrar-se de modo persistente, como o caranguejo (CONTRAN

et al., 2000).

O termo neoplasia significa crescimento novo e esse novo crescimento é denominado

neoplasma (CONTRAN et al., 2000). Na prática, as neoplasias são chamadas de tumor

(FILHO et al., 2004). O termo tumor foi originalmente aplicado ao inchaço causado pela

inflamação, entretanto o uso não-neoplásico do termo tumor foi abandonado, sendo que,

atualmente, o termo é sinônimo de neoplasia (CONTRAN et al., 2000).

O câncer é um dos problemas mais comuns e intensos da medicina. As estatísticas

mostram que o câncer atinge mais de um terço da população mundial, provoca mais de

20% das mortes e, nos países desenvolvidos, é responsável por mais de 10% do custo total

da assistência médica. (LYNN et al., 2004).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2008, válidas também até o ano de 2009, apontam

que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção do

câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão, no sexo

masculino, e os cânceres de mama e de colo do útero, no sexo feminino, acompanhando o

mesmo perfil da magnitude observada no mundo (INCA, 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

De acordo com estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCA), no ano de 2008, são

esperados 231.860 casos novos, para o sexo masculino, e 234.870 para o sexo feminino.

Estima-se que o câncer de pele do tipo não melanoma (115 mil casos novos) será o mais

incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (49 mil), de mama

feminina (49 mil), de pulmão (27 mil), de cólon e reto (27 mil), de estômago (22 mil) e de

colo do útero (19 mil) (FIG. 2).

FIGURA 2 - Tipos de câncer mais incidentes, estimados para o ano de 2008, na

população brasileira (MS, INCA, 2007).

Atualmente se discutem as principais causas do câncer. Alguns apontam o processo de

urbanização como fator responsável por cerca de 80% dos casos, principalmente por trazer

consigo o processo de industrialização e, consequentemente, a poluição (PEREIRA,

2001). O aumento da expectativa de vida da população mundial representa também, maior

possibilidade de desenvolvimento dessa doença (MONTESANO et al., 2001).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.2 – Nomenclatura do Câncer

A uniformização da nomenclatura dos tumores é importante para que os dados de

freqüência, evolução, tratamento e prevenção obtidos em regiões geográficas diferentes

possam ser comparados. A Organização Mundial de Saúde (OMS) elaborou várias

publicações sobre nomenclatura e classificação dos tumores de diferentes partes do

organismo (FILHO et al., 2004). Atualmente, a designação dos tumores baseia-se na sua

histogênese e histopatologia (MS, 2002), ou seja, a neoplasia é identificada pelos tipos de

células ou tecidos proliferativos. Nesse sentido, algumas regras são importantes: o sufixo

“oma” é empregado na denominação de várias neoplasias, benignas ou malignas. A

palavra “carcinoma” indica tumor maligno que reproduz epitélio de revestimento; o termo

“sarcoma” se refere a uma neoplasia maligna mesenquimal; a palavra “blastoma” pode ser

usada como sinônimo de neoplasia e, quando empregada como sufixo, indica que o tumor

reproduz estrutura com características embrionárias. (FILHO et al., 2004).

Para denominar um tumor toma-se o nome da célula, do tecido ou do órgão oriundo e

acrescentam-se os sufixos “oma” ou “sarcoma”. Como exemplos: lipoma (tumor benigno

dos lipócitos), condrosarcoma (tumor maligno de origem cartilaginosa), nefroblastoma

(tumor originário das células renais), neuroblastoma (tumor com origem nas células

nervosas) etc. Além desses elementos básicos, o nome de um tumor pode conter outros

termos para indicar certas propriedades da lesão: carcinoma epidermóide (o epitélio

neoplásico tem diferenciação semelhante à da epiderme); adenocarcinoma (o epitélio

neoplásico tem diferenciação semelhante a tecidos glandulares). Nem sempre esses

elementos são usados na denominação da lesão, sendo comuns o uso de alguns epônimos,

como tumor de Wilms (tumor renal), linfoma de Hodgkin (câncer de origem linfóide),

linfoma de Burkitt (câncer de origem hematopoética) (DEVITA et al., 1997).

Do mesmo modo como acontece para os tecidos em geral, nas neoplasias é possível

distinguir um parênquima e um estroma. O parênquima é constituído pelas células

neoplásicas (MS, 2002), definindo a natureza do tumor (FILHO et al., 2004). O estroma é

constituído pelos tecidos de sustentação e pelos vasos sanguíneos (MS, 2002).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.3 - Classificação do Câncer

O câncer pode ser classificado de acordo com vários critérios: pela origem da neoplasia

(critério histogenético); pelo comportamento (critério clínico), pelo aspecto microscópico

(critério histomorfológico). (FILHO et al., 2004).

Quanto à origem da neoplasia há três formas principais de classificação da neoplasia:

sarcomas, nos quais o tumor originou-se do tecido mesenquimal; carcinomas, que se

originam no tecido epitelial; e neoplasias hematopoéticas e linfóides, como leucemias e

linfomas (FILHO et al., 2004).

Quanto ao comportamento e evolução clínica, as neoplasias são divididas em duas grandes

categorias: benignas e malignas (FILHO et al., 2004). Células de tumores benignos são

muito parecidas em forma e função com as células normais (PAUWELS et al., 1998), por

isso, podem evoluir durante muito tempo e não colocar em risco a vida de seu portador

(FILHO et al., 2004). Os malignos, ao contrário, têm em geral crescimento rápido (FILHO

et al., 2004) e possuem a habilidade de invadir tecidos vizinhos e consequentemente

espalhar através do corpo (PAUWELS et al., 1998).

As células das neoplasias benignas em geral são bem diferenciadas e podem até ser

indistinguíveis das células normais correspondentes. As atipias celulares e arquitetura são

discretas, ou seja, o tumor reproduz bem o tecido que lhe deu origem. Como a taxa de

divisão celular é pequena (baixo índice mitótico), o tumor tem crescimento lento (FILHO

et al., 2004).

Nos tumores benignos, as células crescem unidas entre si, não infiltram os tecidos vizinhos

e formam uma massa geralmente esférica. Esse crescimento é dito expansivo e provoca

compressão das estruturas adjacentes, que podem sofrer hipotrofia. (CHAO et al., 1998).

O crescimento lento do tumor permite o desenvolvimento adequado de vasos sanguíneos,

assegurando boa nutrição das células. Desse modo, degenerações, necroses e hemorragias

são pouco comuns. Por essa razão e pelo fato de não infiltrar ou destruir os tecidos

vizinhos, o tumor benigno não leva à ulceração (PEREZ et al., 1997).

Quando células normais ou benignas se diferenciam em malignas, pela expressão do fator

de crescimento tumoral-TGF-α, por exemplo, novas funções bioquímicas e morfológicas

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

podem ser desenvolvidas e funções específicas podem desaparecer (PAUWELS et al.,

1998).

Um novo mecanismo usado pelas células malignas é o processo chamado angiogênese.

Neste processo ocorre a formação de novos vasos sanguíneos devido a estimulação do

fator de crescimento vasoendotelial (VEGF) ou fator de permeabilidade vascular, que é

uma família de elementos designados de VEGF, VEGF-B, VEGF-C e fator de crescimento

placentário (PIGF), os quais garantem o aporte sanguíneo durante o crescimento da massa

tumoral (LODISH et al., 2004). Contudo, como a taxa de multiplicação das células

malignas é elevada (índice mitótico alto), o câncer usualmente tem crescimento muito

rápido. O mesmo não acontece com o estroma e os novos vasos sanguíneos, que se

desenvolvem mais lentamente, resultando em degenerações, necroses, hemorragias e

ulcerações (CHAO et al., 1998).

Geralmente, as células malignas utilizam-se da sinalização autócrina para levar à formação

da massa tumoral (LODISH et al., 2004). Neste processo, as células respondem as

substâncias que elas mesmas secretam (FILHO et al., 2004). Quando a mesma célula

produz um fator de crescimento e seu receptor correspondente, pode estabelecer uma alça

autócrina, muitas das quais super-expressam os fatores de crescimento (fator de

crescimento epidérmico-EGF/TGF-α, fator de crescimento dos fibroblastos-FGF e o fator

de crescimento derivado das plaquetas-PDGF) que estimulam a sua proliferação

inapropriada e desregulada, bem como das células não-tumorais adjacentes (LODISH et

al., 2004).

Em razão da perda da diferenciação celular, as células malignas apresentam atipias

variadas, desde discretas até muito intensas. Neste caso, elas perdem seus aspectos

morfológicos específicos dificultando saber a origem da lesão. Por causa das atipias de

grau variado na população tumoral, há também atipias arquiteturais ou histológicas, pois

as células neoplásicas não se organizam segundo a orientação própria do tecido normal

(FILHO et al., 2004).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.4 – Biologia Molecular do Câncer

A proliferação celular em condições normais é atividade complexa, dependente da atuação

coordenada de vários genes, os quais controlam o processo em resposta a estímulos

externos e internos (PEREZ et al., 1997). Um tumor apresenta um crescimento autônomo

de suas células e se torna independente dos controles externos como resultado de

mutações ou ativações irregulares de uma classe específica de genes que controlam o ciclo

celular (PAUWELS et al., 1998).

No núcleo, a síntese de DNA ocorre com a participação das enzimas dihidrofolato

redutase, DNA polimerase-α, ribonucleotídeo redutase, nucleosídeo redutase e inicia o

processo de amplificação do material genético da célula para preparação da divisão celular

(PAUWELS et al., 1998). Os eventos como a replicação do DNA, segregação

cromossômica, mitose ocorrem de forma periódica e sincronizada durante o ciclo celular.

A coordenação exata e unidirecional desses estágios é essencial para garantir a integridade

e sobrevida da célula. Perda na regulação apropriada do ciclo celular pode levar a

instabilidade genômica, a qual desempenha um papel fundamental na etiologia de vários

cânceres hereditários ou genéticos. (CHO et. al., 1998).

3.1.4.1 - Ciclo Celular e Câncer

Durante o processo de divisão celular, a replicação de uma célula geneticamente idêntica à

célula-mãe depende de duas fases funcionais e duas fases preparatórias. As fases

funcionais dividem-se em S (síntese), onde acontece a replicação do DNA, e a fase M

(mitose), onde ocorre a segregação dos cromossomos duplicados entre as células filhas. Já

nas fases preparatórias G

(gap-1) G2 (gap-2),

as células preparam-se bioquimicamente

para fase S e M, respectivamente. Células que não estão se dividindo são removidas do

ciclo celular e classificadas no estado G

(gap-0). Esses eventos sofrem uma regulação

molecular a cada ciclo celular (DEVITA et al., 1997).

Sabe-se que existem dois tipos de controles moleculares que regulam esses eventos: (1)

uma cascata de vias protéicas, envolvendo um grupo de proteínas denominadas ciclinas; e

(2) um conjunto de pontos de controle que monopolizam a conclusão dos eventos

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

moleculares e, se necessário, retardam a progressão para a fase seguinte do ciclo

(CONTRAN et al., 2000).

Alterações transitórias na progressão do ciclo celular, após exposição a vários agentes

mutagênicos, são observadas em vários tipos de células de mamíferos. Estas alterações

lesam o DNA, contudo podem ser otimamente reparadas antes de reiniciar a replicação do

DNA (parada em G

) ou no início da mitose (parada em G

). Falhas no reparo do DNA

antes da replicação podem resultar na fixação e propagação das mutações, o que contribui

para transformação neoplásica celular (KUERBITZ et al., 1992).

A entrada e a progressão das células através do ciclo celular são controladas por mudanças

nos níveis e nas atividades das ciclinas. Os níveis de várias ciclinas (denominadas A, B, D

e E) atingem um pico durante fases específicas do ciclo celular; a seguir, sofrem rápida

degradação quando a célula passa para a fase seguinte do ciclo celular. As ciclinas

desempenham suas funções ao formarem complexos com um grupo de proteínas

constitutivamente expressas, denominadas quinases ciclina-dependentes (CDK).

Diferentes combinações de ciclinas e CDK estão associadas a cada uma das transições

importantes no ciclo celular. Quando a célula passa para a fase G2, ocorre síntese da

ciclina B que se liga à CDK1 constitutiva, criando o complexo ciclina B/CDK1, cuja

atividade é necessária para a entrada das células na fase M. O complexo é ativado por

fosforilação, e a quinase ativa fosforila, então, uma variedade de proteínas envolvidas na

mitose, replicação do DNA, despolimerização da lâmina nuclear e formação do fuso

mitótico. Após a divisão mitótica, as ciclinas relevantes (nesse caso, a ciclina B) são

degradadas pela via ubiquitina-proteassoma. Nessa via, as proteínas são inicialmente

conjugadas ao co-fator protéico ubiquitina, e a proteína modificada é especificamente

reconhecida e degradada no interior do proteassoma, um grande complexo proteolítico de

múltiplas subunidades. Além das sínteses e degradação, os complexos de CDK ativos são

regulados através de sua ligação a inibidores da CDK, como p21 e p27, bem como por

outras quinases e fosfatases. Os inibidores controlam o ciclo celular ao equilibrarem a

atividade das CDK. A interação desses sinais opostos ajuda a determinar se uma célula irá

progredir através do ciclo celular. As alterações nos níveis desses inibidores, como aquelas

que podem ocorrer em alguns tumores ou, possivelmente, em células senescentes, podem

alterar a progressão normal do ciclo celular (FIG. 3) (COTRAN et al., 2000).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A interfase G 1 – S constitui outra interseção importante no ciclo celular. Nessa etapa, a

célula é comprometida para a replicação do genoma ou para um estado quiescente ou de

diferenciação (ou ambos). Um dos principais controles dessa transição é obtido pelo

estado de fosforilação da proteína do retinoblastoma (Rb), esta proteína sofre mutação

numa variedade de cânceres. Normalmente, a Rb seqüestra membros da família do fator de

transcrição E2F. Por sua vez, o E2F ativado ativa a transcrição de vários genes necessários

para a entrada na fase S (COTRAN et al., 2000).

Um segundo modo de regulação do ciclo celular é realizada nos pontos de controle por

proteínas sensoras, tais como: ATM/ATR, DNA-PK e RAD 50/Mre11/NBS, as quais

FIGURA 3 - Esquema ilustrando o papel das cíclinas-dependentes e dos inibidores

na regulação do ciclo celular. A – O exemplo mostra a da atividade da CDK-1-

quinase pela ciclina B. A ligação da ciclina B recém sintetizadas à CDK1-quinase

inativa no início da fase G

resulta num complexo que pode ser ativado po

fosforilação. Após a mitose, a ciclina B dissocia-se do complexo e sofre degradação,

deixando a CDK-1-quinase inativa, que pode novamente entrar no ciclo, na próxima

fase G

. B – Regulação das quinases-dependentes de ciclina e alguns inibidores

(COTRAN et al., 2000).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

fornecem um mecanismo de vigilância para garantir a ocorrência de transições críticas na

seqüência correta do DNA (NORBURY et al., 2001). Os pontos de controle identificam os

problemas na replicação do DNA, no reparo do DNA, e na segregação dos cromossomas

(COTRAN et al., 2000). Assim, por exemplo, quando os pontos de controle são ativados

por lesão ou replicação deficiente do DNA, são enviados sinais através dos transdutores

ATM/ATR para a maquinaria do ciclo celular, mediados por efetores como o Chk1, Chk2,

MDM2, p53, TP53BP1 e Mre11/RAD50, resultando na sua interrupção (NORBURY et

al., 2001). Ao retardar a progressão através do ciclo celular, os pontos de controle

permitem um maior tempo para o reparo, diminuindo a possibilidade de mutações

(COTRAN et al., 2000).

3.1.4.2 - Apoptose celular e Câncer

O desenvolvimento e a manutenção dos organismos multicelulares dependem de uma

interação entre as células que o constituem (GRIVICICH et al., 2007), sendo que a vida e

a morte das células devem ser devidamente balanceadas num determinado tecido ou órgão,

mantendo-se a homeostase. As células têm um mecanismo intrínseco de autodestruição

chamado de morte celular programada ou apoptose (IGNEY et al., 2002). Diversos fatores

podem desencadear a apoptose (morte celular programada), entre eles a ligação de

moléculas a receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, toxinas,

lesões no DNA, choque térmico, redução do pH, deprivação de fatores de crescimento,

baixa quantidade de nutrientes e níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio

(ROS) (ZIEGLER et al., 2004). Alterações na coordenação desse tipo de morte celular

podem resultar na carcinogênese (GRIVICICH et al., 2007).

Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas características

morfológicas e bioquímicas em: apoptose, autofagia, necrose, mitose catastrófica e

senescência. A apoptose pode ser reconhecida por características morfológicas muito

marcantes e coordenadas (GRIVICICH et al., 2007), diferente da morte por necrose, que

provoca uma resposta inflamatória lesiva (ZIEGLER et al., 2004) (FIG. 4). De um modo

geral, a apoptose é um fenômeno bastante rápido: ocorre uma retração da célula que causa

perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas celulares

mantêm a sua morfologia, com exceção, em alguns casos, das mitocôndrias, que podem

apresentar ruptura da membrana externa. A cromatina sofre condensação e se concentra

junto à membrana nuclear, que se mantém intacta. A seguir, a membrana celular forma

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

vesículas (blebs) e o núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana nuclear.

As vesículas da membrana celular aumentam de número e tamanho e se desligam,

originando estruturas que envolvem o conteúdo celular. Estas porções celulares envoltas

pela membrana celular são denominadas corpos apoptóticos (GRIVICICH et al., 2007). Os

corpos apoptóticos são rapidamente retirados do tecido por macrófagos (ANAZETTI et

al., 2007) e rapidamente fagocitados sem causar um processo inflamatório (FIG. 4)

(GRIVICICH et al., 2007); esta sinalização ocorre devido à translocação da

fosfatidilserina do lado interno para o lado externo da membrana sinalizando as células

que deverão ser fagocitadas (ANAZETTI et al., 2007). Outra característica muito

marcante da morte por apoptose é a fragmentação internucleossômica do DNA, a qual

possui um padrão característico. Uma endonuclease é ativada e produz fragmentos de

DNA de tamanhos variáveis, mas sempre múltiplos de 200 pares de base. Já a necrose é

um tipo de morte na qual as células sofrem um insulto que resulta no aumento do volume

celular, agregação da cromatina, desorganização do citoplasma, perda da integridade da

membrana plasmática e conseqüente ruptura celular (FIG. 4). Durante a necrose, o

conteúdo celular é liberado, causando dano às células vizinhas e uma reação inflamatória

no local. É considerada uma resposta passiva à injúria celular, entretanto estudos recentes

sugerem que a necrose também pode ser regulada geneticamente (GRIVICICH et al.,

2007).

FIGURA 4 - Caracterização das diferentes alterações morfológicas nos processos de morte celular

por apoptose versus necrose. A necrose (a) é caracterizada pela perda de integridade de membrana

lasmática, floculação da cromatina, inchaço seguido de lise celular com extravasamento do conteúdo

intracelular e desintegração de organelas. O processo apoptótico (b) envolve alteração de

ermeabilidade de membranas, condensação da cromatina, encolhimento celular, formação de corpos

apoptóticos sem desintegração de organelas (ANAZETTI et al., 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A apoptose é um programa de morte celular extremamente regulado e de grande

eficiência, que requer a interação de inúmeros fatores. As alterações morfológicas

observadas são conseqüências de uma cascata de eventos moleculares e bioquímicos

específicos e geneticamente regulados (GRIVICICH et al., 2007).

Muitos genes que controlam o ciclo celular (p. ex, P53, RB, c-Myc) estão envolvidos no

processo de morte programada celular (RICCI et al., 2006). Proteínas da Família Bcl-2,

família de proteínas indutoras e repressoras de morte por apoptose, também participam

ativamente da regulação da apoptose (ZIMMERMANN et al., 2007). Sendo que

homeostasia é mantida pelo controle da quantidade de proteínas antiapoptóticas e pró-

apoptóticas. Estímulos, como dano ao DNA, levam ao aumento na expressão das proteínas

pró-apoptóticas. Esse desequilíbrio induz à apoptose. Entre as proteínas mais estudadas,

desta família, estão a Bax (pró-apoptótica) e a Bcl-2 (anti-apoptótica). Vários estudos

demonstraram que a Bcl-2 é superexpressa em adenomas e carcinomas colorretais

(GRIVICICH et al., 2007).

A ativação da apoptose pode ser iniciada de duas diferentes maneiras: pela via extrínseca

(citoplasmática) ou pela via intrínseca (mitocondrial) (IGNEY et al., 2002).

A via extrínseca é desencadeada pela ligação de ligantes específicos a um grupo de

receptores de membrana da superfamília dos receptores de fatores de necrose tumoral

(rTNF) (GRIVICICH et al., 2007). Esta ligação é capaz de ativar a cascata das caspases

(STRASSER et al., 2000). As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)

pertencem à família das cisteínas proteases (possuem uma cisteína no sítio ativo) que têm

a capacidade de reconhecer e clivar substratos que possuam resíduos de aspartato. As

caspases sinalizam para a apoptose e clivam esses substratos levando à condensação e

fragmentação nuclear, externalização de fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para

estas células serem fagocitadas por macrófagos. São conhecidas 14 caspases humanas,

sendo que seis (caspases -3, -6, -7, - 8, -9, -10) participam da apoptose. As caspases -1, -4,

-5, -11, -12, -13, -14 estão envolvidas na maturação de citoquinas, e sua contribuição na

apoptose permanece não esclarecida. As caspases são sintetizadas como precursores

inativos denominados zimogênos. Após um sinal de morte celular, as caspases são

ativadas por clivagem proteolítica. Essas enzimas podem interagir com receptores de

membrana ou moléculas adaptadoras que contenham domínios de morte (death domain),

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

pois esses domínios também existem nas caspases e a presença deles permite essa

interação (GRIVICICH et al., 2007).

As caspases também podem ser classificadas de acordo com seu pró-domínio e seu papel

na apoptose. Caspases iniciadoras possuem pró-domínios longos, envolvidas na iniciação

da cascata proteolítica. Caspases efetoras apresentam pró-domínios curtos ou inexistentes,

responsáveis pela clivagem de substratos. Entre os diversos substratos das caspases pode-

se citar a mdm-2 (murine double minute), uma proteína que se liga à p53, mantendo-a no

citoplasma. Ao ser clivada pelas caspases, essa proteína libera a p53 que se transloca para

o núcleo, ativando a transcrição de genes pró-apoptóticos como o Bax (GRIVICICH et al.,

2007).

A via intrínseca é ativada por estresse intracelular ou extracelular como a deprivação de

fatores de crescimento, danos no DNA, hipóxia ou ativação de oncogenes. Os sinais

que são transduzidos em resposta a estes insultos convergem principalmente para a

mitocôndria. A mitocôndria é o principal mediador dessa via. Essa organela integra os

estímulos de morte celular, induzindo a permeabilização mitocondrial (GRIVICICH et al.,

2007) e conseqüente liberação de moléculas pró-apoptóticas nela presentes como as da

família BCL-2 (Bad, Bax, Bid e Bak) (ZIMMERMANN et al., 2007). Ao se ligarem à

superfície da mitocrôndia, as proteínas pró-apoptóticas inativam as proteínas

antiapoptóticas (BCL-2) induzindo a formação de poros transmembranares na mitocôndria

e consequentemente, a liberação de citocromo c. No citoplasma, a citocromo c se liga à

FIGURA 5 – Representação esquemática da Via Extrínseca de

ativação da Apoptose (GRIVICICH et al., 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

APAF-1 (fator de ativação da apoptose) e a pró-caspase 9 formando um complexo

chamado apoptossoma. O apoptossoma ativa caspase 9 que, por sua vez, ativa a caspase 3.

Depois de ativada, a caspase 3 atua sobre substratos específicos que levam a célula à

morte apoptótica (ZIMMERMANN et al., 2007). Durante a apoptose, as proteínas

antiapoptóticas são removidas por uma proteína liberada da mitocôndria denominada

Smac/DIABLO (second mithocondria-derived activator of caspases/ Direct IAP-Binding

Protein with Low pI). Após dano mitocondrial, a Smac/DIABLO é liberada do espaço

intermembrana para o citoplasma, juntamente com o citocromo c. A Smac/DIABLO

remove as proteínas antiapoptóticas de sua ligação inibitória com as caspases (IGNEY et

al., 2002).

A apoptose na prática clínica é alvo para um potencial uso terapêutico contra o câncer ou

para a compreensão dos mecanismos de resistência à radioterapia e à quimioterapia. A

elucidação de alguns dos mecanismos moleculares da apoptose abriram perspectivas de

modulação desses processos (GRIVICICH et al., 2007). As estratégias se baseiam em

induzir a morte nas células tumorais através da estimulação de genes que regulam a

apoptose, tais como os c-Myc, p53, pRb, Ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-B, CDK, ciclinas e

CKI, ou ainda a substituição de função desses genes com o uso de moléculas

recombinantes (ANAZETTI et al., 2007).

FIGURA 6 - Representação esquemática da via intrínseca de ativação da

apoptose (GRIVICICH et al., 2007)

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.4.3 -Proto-oncogenes, Oncogenes e Genes de supressão tumoral.

Os genes que contribuem para o processo de transformação e carcinogênese são divididos

em duas classes: os proto-oncongenes e os genes supressores tumorais. A primeira classe

de genes são reguladores do processo de crescimento em células normais (PAUWELS et

al., 1998). Já os genes de supressão tumoral (ou antioncogenes) regulam o crescimento

normal, inibindo-o (BORGES-OSÓRIO et al., 2001). Mutações nos proto-oncongenes

podem resultar num crescimento descontrolado das células, pois eles desempenham um

papel distinto nas vias estimulatórias do crescimento, ou seja, nas vias de sinalização da

superfície da célula para seu núcleo (PAUWELS et al., 1998).

As vias de sinalização consistem em proteínas sinalizadoras codificadas pelos proto-

oncongenes e de receptores específicos na membrana da célula. Quando ocorrem

mutações nos proto-oncogenes, eles tornam-se oncogenes, assim, desse modo, continuam

sempre a enviar sinais estimulatórios do crescimento e estes permanecem ativos

(PAUWELS et al., 1998). Os oncogenes derivam, portanto, de genes celulares normais

expressos sob uma forma alterada e atuam sinergiticamente. Sendo que uma única cópia

de um oncogene é necessária para contribuir ao processo de múltiplas etapas na formação

de um tumor (BORGES-OSÓRIO et al., 2001).

Os sinais bioquímicos que as células recebem, processam e interpretam, permitem que elas

continuem a multiplicar-se ou não, diferenciando-se em células especializadas, são

devidos a diversos fatores como: a) fatores de crescimento, que têm a capacidade de

estimular ou inibe a multiplicação celular, como os fatores de crescimento plaquetário

(PDGF), fatores de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento tumoral (TGF),

dentre outros; b) receptores de fatores de crescimento, localizados na superfície celular, os

quais, por estes ativados, iniciam um processo conhecido como transdução de sinal, ou

seja, emissão de moléculas (em geral proteíno-quinases) que desencadeiam uma série de

reações de fosforilação no interior da célula, enviando, assim, mensagens ao núcleo da

célula; c) fatores de transcrição nuclear, que regulam a atividade dos genes controladores

do crescimento e proliferação celular e interagem com os componentes da cascata de

eventos da transdução de sinal. Existem vários fatores de transcrição nuclear, como os

produtos dos genes fos, jun, myb e myc (BORGES-OSÓRIO et al., 2001).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Os oncogenes podem ser ativados por mutações pontuais, sendo o oncogene ras o melhor

representante deste processo (CONTRAN et al., 2000). O proto-oncogene ras pode se

transformar em um oncogene por uma única substituição de base: GGC => GTC, isto

acarreta na troca do 12° aminoácido, glicina, por valina, causando carcinoma de bexiga

(BORGES-OSÓRIO et al., 2001). O oncongene ras é provavelmente um dos mais

conhecidos oncogenes e suas proteínas estão presentes em aproximadamente 25% de todos

os tumores humanos (PAUWELS et al., 1998). Ele está presente em 90% dos

adenocarcinomas de pancreáticos e coloangiocarcinomas, 50% dos cânceres de cólon,

endométrio e da tireóide, e em 30% dos adenocarcinomas de pulmão (CONTRAN et al.,

2000). Contudo, são praticamente inexistentes no carcinoma de mama, sendo ainda

presentes em lesões pré-malignas (BORGES-OSÓRIO et al., 2001).

Os oncogenes também podem ser ativados por amplificação gênica, que corresponde ao

aumento do número de cópias dos proto-oncogenes (BORGES-OSÓRIO et al., 2001), o

que acarreta uma hiperexpressão de seus produtos, resultando na reduplicação e

amplificação de suas seqüências de DNA. Essa amplificação pode produzir várias

centenas de cópias do proto-oncogene na célula tumoral (CONTRAN et al., 2000).

A amplificação de oncogenes específicos parece ser característica de certos tumores e é

freqüentemente vista na família gênica myc. Por exemplo, o oncogene N-myc está

amplificado em aproximadamente 30% dos neuroblastomas, um dos tumores mais comuns

na infância, elevando-se para 50% dos tumores nos estágios mais avançados e estando

associado a mau prognóstico. A amplificação dos proto-oncogenes e-neu ou erb-B2 é

típica de 20% dos carcinomas de mama (DEVITA et al, 1997).

Os genes de supressão tumoral ou genes supressores de tumor são genes recessivos no

nível celular cuja função normal é reprimir a divisão celular, como um mecanismo normal

de controle da mesma. Por deleção ou mutação pontual, sua função pode ser perdida ou

alterada. Portanto, contribuem para o desenvolvimento do câncer quando estão deletados

ou alterados por mutações. A perda das proteínas supressoras (produtos dos genes

supressores de tumor) desregula o crescimento celular, podendo levar à formação de tu-

mores (BORGES-OSÓRIO et al., 2001).

O gene de supressão tumoral p53 constitui o alvo mais comum de alteração genética dos

tumores humanos. Pouco mais de 50% dos tumores humanos contêm mutações nesse

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

gene. A perda homozigoto do gene p53 é encontrada em praticamente qualquer tipo de

câncer, como em carcinomas de pulmão, cólon e mama. Na maioria dos casos, as

mutações de inativação que afetam ambos os alelos p53 são adquiridas em células

somáticas. Com menos frequência alguns indivíduos herdam um alelo p53 mutante

(CONTRAN et al., 2000).

A proteína normal p53 desempenha um papel primordial na prevenção do

desenvolvimento do câncer pela ação de fatores de transcrição que induzem a parada do

ciclo celular ou apoptose. Existem muitos fatores estressantes que podem iniciar a

estabilização, acumulação e ativação da p53 (FIG 7). Estes incluem danos no DNA,

diminuição dos níveis de dNTP, hipóxia, perda da diminuição das sinais de sobrevivência

celular, ativação oncogênica, encurtamento dos telômeros, crescimento anormal celular e

quelação do ferro. Uma vez ativada, a p53 pode iniciar a transcrição e consequetemente

expressão de genes que são responsáveis pela diferenciação celular ou senescência (LE et

al., 2002).

O tipo selvagem de p53 acumulado liga-se ao DNA e estimula a transcrição de vários

genes que atuam como mediadores dos dois principais efeitos da p53: parada do ciclo

celular e apoptose. A interrupção do ciclo celular induzido por p53 ocorre tardiamente na

fase G

, sendo causada pela transcrição p53-dependente do inibidor da CDK, p21. O gene

p21 inibe os complexos de ciclina/CDK e, portanto, impede a fosforilação da pRb

necessária para entrada das células na fase S. Essa pausa no ciclo celular é favorável, visto

que permite que a célula tenha tempo suficiente para reparar a lesão do DNA, causado

pelo agente mutagênico. A p53 também ajuda diretamente neste processo a induzir a

transcrição GADD45, uma proteína envolvida no reparo do DNA. A GADD45 também

atua na parada em G

através de mecanismos desconhecidos. Se o reparo da lesão do DNA

for bem-sucedido, a p53 ativa uma proteína denominada mdm2(murine double minute),

cujo produto se liga à p53, exercendo uma regulação de excremento, com frequente

liberação do bloqueio do ciclo celular. Se, durante a pausa na divisão celular, não for

possível proceder a um reparo bem-sucedido do DNA danificado, a p53 normal, talvez

como último recurso, induz a ativação de genes indutores da apoptose. Em condições

fisiológicas, a p53 possui meia-vida curta (20 minutos), presumidamente devido a

proteólise mediada pela ubiquitina (CONTRAN et al., 2000).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.5 - Disseminação do Câncer.

As células cancerosas apresentam alterações na membrana plasmática, que as tornam

menos aderentes entre si e facilitam seu deslocamento da colônia neoplásica. Com isso,

elas podem se movimentar, infiltrar os tecidos adjacentes, penetrar em vasos sangüíneos e

linfáticos e, a partir destes, serem levadas para locais distantes onde podem originar

metástases (CHAO et al., 1998).

Existem dois tipos de disseminação do câncer: a invasão local e a metástase. As células

malignas disseminam primeiramente pela invasão local, pois como elas são menos coesas

e têm mobilidade podem invadir os tecidos adjacentes (PEREZ et al., 1997). Para atingir

uma via de disseminação, as células malignas precisam atravessar a matriz extracelular, a

qual tem dois componentes básicos: a membrana basal e o conjuntivo intersticial. De

acordo com a constituição bioquímica e a resistência mecânica desses elementos, as

células penetram neles com maior ou menor facilidade. Vasos linfáticos e veias, por causa

de sua parede mais fina e da escassez de fibras elásticas, são mais facilmente penetráveis

pelas células malignas do que as artérias. Por ação de colagenases liberadas, as células

neoplásicas podem infiltrar o tecido conjuntivo, onde a maior resistência é oferecida pelas

FIGURA 7 – Papel da p53 na regulação e desenvolvimento do câncer. Muitos fatores

contribuem para a progressão tumoral, contudo a p53 ativada conduz à apoptose ou parada do

crescimento celular. Perda da habilidade ou função da p53 tem considerável impacto no

sucesso do processo de carcinogênese, bem como no aumento das chances do tumo

sobreviver em condições adversas

(

Ada

tado de EVAN et al., 2001

)

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

fibras elásticas. O tecido cartilaginoso é o mais resistente à invasão por células malignas

(DEVITA et al., 1997).

O tecido conjuntivo é constituído predominantemente por colágeno, sobretudo do tipo I,

que fica misturado com quantidade variada de elastina, proteoglicanos e glicoproteínas, de

modo particular a fibronectina. A capacidade das células neoplásicas de se ligarem à

fibronectina tem relação com o aparecimento de metástases (FILHO et al., 2004).

A membrana basal é uma estrutura laminar de distribuição universal que se localiza

principalmente entre células epiteliais ou endoteliais e o tecido conjuntivo subjacente. É

constituída predominantemente por colágeno tipo IV, laminina e proteoglicano. Assim

como a fibronectina, a laminina é uma glicoproteína que tem grande atividade de adesão

entre células e componentes do interstício. A habilidade das células de se ligarem à

laminina está relacionada com sua capacidade de migração através dos tecidos ou da

parede vascular. Nos tumores, existe uma correlação entre o número de receptores de

laminina por célula maligna com sua capacidade de originar metástases. (PEREZ et al.,

1997).

Um outro processo de disseminação neoplásica são as metástases (do grego metástatis =

mudança de lugar, transferência) significa a formação de uma nova lesão tumoral a partir

da primeira, mas sem continuidade entre as duas. Isso implica que as células cancerosas se

desprendem da colônia primária, caminham através do interstício, ganham uma via de

disseminação, são levadas para um local distante e lá continuam seu crescimento (FILHO

et al., 2004).

As vias de disseminação metastáticas consistem da via linfática e sangüínea. A via

linfática é a principal via de disseminação inicial dos carcinomas. Como regra geral, o

primeiro sítio das metástases é o linfonodo mais próximo do tumor primário. Após o

comprometimento da cadeia linfonodal mais próxima, outros linfonodos situados

imediatamente adiante podem ser acometidos. Outras vezes, no entanto, as metástases

aparecem em linfonodos não relacionados topograficamente com a sede do tumor

(DEVITA et al., 1997).

Os linfonodos com metástases em geral encontram-se aumentados de volume e às vezes se

tornam confluentes, formando massas volumosas. Linfonodos ou massas podem ser

palpados se localizados nas cadeias superficiais ou detectados por imagens (tomografia,

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

PET, SPECT) quando nas cadeias profundas. Como produtos antigênicos dos tumores são

levados aos linfonodos, estes reagem através de uma hiperplasia, às vezes pronunciada,

que também resulta em aumento de volume do órgão (FILHO et al., 2004).

Já na via sangüínea, as células cancerosas atravessam a parede de capilares ou de vênulas,

que oferecem pouca resistência à sua penetração, e caem na corrente venosa, a partir da

qual podem ser levadas a qualquer parte do corpo. O número de células malignas que

conseguem penetrar em um vaso sanguíneo é muito maior do que o número daquelas que

originam metástases. Aliás, a presença de células malignas na circulação não indica

obrigatoriamente a formação de metástases. Pois, aproximadamente, noventa por cento das

células cancerosas presentes na circulação morrem em conseqüência da resposta

imunitária do hospedeiro, da defesa não imunitária (macrófagos, células Natural Killer) e

do choque mecânico que sofrem com a parede vascular. A sobrevida das células

neoplásicas na circulação é maior quando formam agregados entre elas e com plaquetas,

linfócitos e fibrina (FILHO et al., 2004).

A última etapa na formação das metástases consiste na chegada das células neoplásicas a

um setor do organismo e sua proliferação (FIG. 8). Não são totalmente conhecidos os fato-

res que determinam o local preciso onde as células malignas devem deixar o vaso e se

implantar em um órgão. Contudo, como certos tumores dão metástases preferencialmente

em determinados órgãos, supõe-se que fatores inerentes à célula neoplásica e aos vasos

sanguíneos das diferentes partes do organismo devem desempenhar um papel importante.

De um lado, sabe-se que clones diferentes de uma neoplasia têm preferência para dar

metástases em órgãos distintos. De outro, há evidências de que células malignas aderem

seletivamente ao endotélio de certos órgãos, o que pode explicar perfeitamente a

preferência das metástases em determinadas sedes. Em outras palavras, parece haver

alguma forma de reconhecimento ou de tropismo para certos órgãos. Subpopulações

celulares parecem ser capazes de reconhecer especificamente determinados componentes

desse órgão (PEREZ et al. 1997).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Mudança

Genética

Explosão

Clonal

Seletiva

Mudança

Genética

FIGURA 8 - Esquema ilustrativo do processo de carcinogênese até a

disseminação neoplásica. Danos nos genes de uma única célula (mutação)

provocados por agentes químicos, radiação ou vírus podem levar ao surgimento de

células mutadas. Ocasionalmente, as células mutadas podem se tornar cancerosas,

multiplicando-se rapidamente e sem controle. As metástases ocorrem quando as

células cancerosas de um tumor se espalham para diferentes partes do corpo,

formando tumores satélites, distantes ou não do tumor original. (Adaptado do MS-

INCA, 2007)

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.6 – Cânceres cerebrais (Glioblastoma multiforme)

Embora sejam percebidos como doença rara, os tumores de cérebro vêm ganhando

importância no cenário da epidemiologia do câncer devido ao aparente aumento da sua

incidência e por sua alta letalidade. Mais de 90% dos tumores que atingem o sistema

nervoso ocorrem no cérebro ou nas suas proximidades. Raramente são observados tumores

nas células nervosas propriamente ditas; os tumores de cérebro desenvolvem-se,

principalmente, nas células da glia, que formam a estrutura de sustentação das células

nervosas. Entre os adultos, os tumores intracranianos mais freqüentes são gliomas,

meningiomas e neuromas. Os gliomas são classificados em subtipos, de acordo com a

semelhança histológica entre as células tumorais e as células gliais, e podem ser:

astrocitomas, glioblastomas (tumores astrocíticos), oligodendrogliomas e ependimomas

(PEREIRA et al., 2001)

O glioblastoma multiforme (GBM) é a neoplasia de mais alto grau na classificação dos

tumores astrocíticos. É o tumor primário do sistema nervoso central (SNC) mais comum

no adulto. Geralmente, acomete homens em torno de 50 anos de idade, sendo menos

freqüentes abaixo dos 30 anos e também nas mulheres. Apresenta-se tipicamente com

sintomas clínicos relacionados à hipertensão intracraniana ou convulsões. Quanto à

localização, são mais comuns nos lobos frontal e temporal, podendo envolver mais de um

lobo. Em crianças, a localização preferencial é infratentorial, correspondendo à quarta

neoplasia mais comum abaixo dos dois anos de idade (FERREIRA et al., 2004). Em

virtude do seu rápido crescimento, da destruição de extensas áreas de tecido nervoso e do

edema intenso que provoca, seu prognóstico é sombrio, e a maioria dos pacientes não

sobrevive um ano e meio após o diagnóstico (GIROLAMI et al., 2000).

O GBM é caracterizado histologicamente por seu polimorfismo celular com células gliais

imaturas e gigantes, apresentando imagens de mitose. Estes tumores têm uma aparência

histológica semelhante à do astrocitoma anaplástico, com as características adicionais de

necrose e proliferação de células vasculares ou endoteliais - tufos de células vasculares

empilhadas que se projetam para a luz vascular. O aspecto peculiar de hipercelularidade

destes tumores é traduzido pela proliferação de células imaturas, pequenas, arredondadas,

com citoplasma de limites imprecisos. A microscopia eletrônica mostra lesões infiltrativas

no tecido cerebral que rodeia o tumor, característica sempre presente nestes tumores

(GIROLAMI et al., 2000).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Uma alteração comum em gliomas de todos os graus é a superprodução de fatores de

crescimento como FGF (fator de crescimento fibroblástico), CNTF (fator neurotrófico

ciliar) e PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) e seus receptores, por outros

mecanismos além das mutações genéticas. Dentre 30 a 50% dos GBM apresentam

mutações ou amplificações ativas do gene EGF (Fator de crescimento epidérmico). Um

excesso de fatores de crescimento ou receptores é produzido, o que resulta em estimulação

autócrina e em aumento da atividade das vias de sinalização, como a ativação da RAS

(HOLLAND, 2001).

O segundo grupo de mutações encontradas em gliomas inclui aquelas que interrompem as

vias que mantém as células na restrição G1 do ciclo celular. A maioria destas mutações

são deleções no gene INK4A ou no inibidor de ciclina-dependente-quinase 2A

(CDKN2A), que possuem duas proteínas p16 e p14. Estas duas proteínas controlam as

vias que levam a regulação de proteínas críticas para processos como proliferação e

apoptose, que são o Retinoblastoma (RB), que mantém as células em G1, e p53, que tanto

pára as células em G1 ou induz à apoptose (HOLLAND, 2001).

Dentre as anormalidades mais freqüentes dos GBM estão as deleções no cromossoma 10,

que contém o gene MMAC1 ou PTEN, um gene supressor tumoral que tem sido

encontrado mutado em gliomas malignos (ALEMANY et al., 1999). A perda da expressão

do PTEN pode levar a uma elevação da atividade de AKT (HOLLAND, 2001). Já nos

astrocitomas de baixo grau, dentre as alterações mais comumente encontradas, estão à

inativação de p53 e a hiperexpressão de PDGF-A e seu receptor. A transição para um

astrocitoma de grau mais alto está associada à ruptura adicional de genes supressores

tumorais quais sejam, o gene RB, o gene p16/CDKN2A e um suposto supressor tumoral

no cromossoma 19q (GIROLAMI et al., 2000).

O tratamento de primeira linha para os tumores cerebrais consiste em cirurgia que pode

proporcionar uma sobrevida média de 14 semanas, associada à radioterapia (utilizando

feixes externos ou esteriotáxica) que aumenta a média de sobrevida para 36 semanas,

seguida ou não de quimioterapia que pode acarretar um posterior aumento da sobrevida

média para 51 semanas (BRANDES et al., 2000).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.1.7 – Câncer de mama

O câncer de mama se constitui na primeira causa de morbidade e mortalidade entre as

mulheres acima de 45 anos no mundo (CAMPOS et al., 2006). A Organização Mundial da

Saúde estima que, por ano, ocorram mais de 1.050.000 casos novos de câncer de mama em

todo o mundo, o que o torna o câncer mais comum entre as mulheres (INCA, 2004).

Os fatores de risco relacionados à vida reprodutiva da mulher (menarca precoce,

nuliparidade, idade da primeira gestação a termo acima dos 30 anos, anticoncepcionais

orais, menopausa tardia e terapia de reposição hormonal) estão bem estabelecidos em

relação ao desenvolvimento do câncer de mama. Além desses, a idade continua sendo um

dos mais importantes fatores de risco (DEVITA et al., 1997).

Alguns estudos apontam para dois tipos de câncer de mama relacionados com a idade: o

primeiro tipo ocorre na pré-menopausa e é caracterizado por ser mais agressivo e

estrogênio receptor (ER) negativo; o segundo ocorre na pós-menopausa e está associado

com características indolentes e principalmente por ser ER positivo. As variações

morfológicas também estão relacionadas ao ER, como os carcinomas medulares em ER–

negativos – e os carcinomas tubulares e lobulares em ER–positivos. Com relação aos

carcinomas medulares, pode-se dizer ainda que eles estejam associados às mutações no

gene BRCA1 e são mais freqüentes em populações de baixo risco, como as mulheres

japonesas. Por outro lado, os carcinomas tubulares e lobulares têm associação com as

mutações do gene BRCA2 e são mais comuns em populações de alto risco, como as

mulheres dos Estados Unidos (INCA, 2007).

A prevenção primária dessa neoplasia ainda não é totalmente possível devido à variação

dos fatores de risco e às características genéticas que estão envolvidas na sua etiologia

(DEVITA et al., 1997). No Brasil, o Ministério da Saúde recomenda como principais

estratégias de rastreamento populacional um exame mamográfico, pelo menos a cada dois

anos, para mulheres de 50 a 69 anos de idade, e o exame clínico anual das mamas, para

mulheres de 40 a 49 anos de idade. Para mulheres de grupos populacionais considerados

de risco elevado para o câncer de mama (com história familiar de câncer de mama em

parentes de primeiro grau), recomenda-se o exame clinico da mama e a mamografia,

anualmente, a partir de 35 anos de idade (INCA, 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

No câncer de mama, os sítios mais comuns de metástases incluem a parede ipislateral

toráxica e os lifonodos regionais (metástases regionais ou recorrentes), bem como fígado,

pulmões, pleura, trato grastrointestinal, ossos e sistema nervoso central (CAMPOS et al.,

2006). As metástases ósseas ocorrem em 70% a 85% dos pacientes, com sobrevida de

20% em 5 anos. Dor local, fratura patológica, hipercalcemia ou complicações neurológicas

são as características clínicas freqüentes.

Raramente apresentam-se isoladas ou como foco

único por tempo prolongado, sendo as regiões mais atingidas: vértebras (60%), bacia

(41%), fêmur (25%), crânio (14%), membros superiores (15%). No diagnóstico por

imagem utilizam-se os raios X, a cintilografia óssea e a tomografia computadorizada,

demonstrando lesões líticas, blásticas ou mistas. Os marcadores tumorais, embora não

específicos, auxiliam no diagnóstico e na monitorização da paciente durante e após o

tratamento, sendo esperado que 30% a 40% dos pacientes apresentem elevação destes, de

3 a 18 meses antes de alguma manifestação clínica. Os dois marcadores mais

freqüentemente utilizados são o CA 15-3 e o CEA (antígeno carcinoembrionário). Os

marcadores específicos dos genes produtores de células tumorais são mais promissores,

tais como os receptores proteicos de estrógeno e progesterona, receptores de fatores de

crescimento (EGF e IGF-1), HER-2/ neu (neu-related protein), anticorpo contra p-53 e

catepsina D (SPIRANDELI et al., 1999).

A medicina nuclear pode avaliar variações metabólicas decorrentes de fenômenos

orgânicos, através de marcadores tumorais (específicos ou inespecíficos), com

cintilografias planigráficas ou tomografias em gama-câmaras, ajudando no diagnóstico

precoce de prováveis focos tumorais (SPIRANDELI et al., 1999).

No câncer de mama, o tratamento de escolha para os estádios iniciais é a cirurgia

conservadora da mama (quadrantectomia) seguida de radioterapia externa no restante da

mama. Nos estádios mais agressivos a opção é mastectomia, com esvaziamento axilar,

seguida de radioterapia e quimioterapia. Apesar de ser considerado um câncer de

relativamente bom prognóstico, se diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de

mortalidade por câncer de mama continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente

porque a doença ainda é diagnosticada em estádios avançados (INCA, 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Cérebro

Linfonodos

axilares

Câncer primário

da mama

Fígado

Osso

Primária

Metástase

(Local e

distante)

Cérebro (distante)

Linfonodos

supraclaviculares

(regional)

Linfonodos axilares

(local)

Câncer primário da

mama

Fígado (distante)

osso (distante)

Primário

Local

Regional

Distante

FIGURA 9 – Teoria sistêmica da

disseminação do câncer de mama.

Esta teoria sugere que o câncer de mama

torna-se metastático muito

recocemente durante seu curso, uma

vez que invasão da membrana basal do

ducto ou lóbulo já tenha ocorrido

(CAMPOS et al, 2003).

FIGURA 10 – Teoria Halsted da

disseminação do câncer de mama.

Esta teoria sugere que o câncer origina-

se na mama, eventualmente dissemin

ara a pele e/ou linfonodos e então

ultimamente afeta órgãos distantes

(CAMPOS et al., 2003).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.2 – Diagnóstico do Câncer: aplicações da Medicina Nuclear

A medicina nuclear é um ramo da imagem médica que usa radionuclídeos emissores de

pósitron (partículas com a mesma massa do elétron, porém com carga oposta) e raios gama

para gerar uma imagem da distribuição in vivo do radiofármaco (BLOWER, 2005). As

imagens são obtidas através da administração de radiofármacos e medindo externamente a

radiação emitida, ao contrário das técnicas radiológicas convencionais, que medem a

absorção da radiação aplicada externamente (OLIVEIRA et al., 2006). Diversos fármacos,

radionuclídeos, técnicas de obtenção de imagens (imageamento) e análise das informações

têm sido empregados em medicina nuclear, sendo o tecnécio metaestável (

99m

Tc) o

radioisótopo mais utilizado na rotina diagnóstica, através de sua associação aos fármacos

que são fisiologicamente concentrados ou eliminados por determinados órgãos (DA

SILVA, 2003).

Como especialidade de diagnóstico por imagem, a medicina nuclear se fundamenta na

detecção da distribuição biológica de substâncias farmacológicas acopladas a

radionuclídeos (radiofármacos) (COUTINHO, 2004), com o objetivo de obter informações

através da aquisição de imagens cintilográficas por equipamentos de detecção

denominados câmaras gamas ou pela tomografia por emissão de pósitrons (PET) (SILVA,

2003). Outro aspecto, é que a dose do radiofármaco necessária para o exame do paciente é

muito mais baixa do que a de agentes de contraste utilizadas em outras técnicas de

diagnóstico, tais como a radiografia e a ressonância magnética nuclear (RMN). Desse

modo, na medicina nuclear não ocorrem efeitos colaterais farmacológicos. Do ponto de

vista do paciente, as técnicas são simples e apenas requerem administração endovenosa,

oral ou inalatória de um radiofármaco (OLIVEIRA et al., 2006).

A oncologia sempre representou uma parte importante na prática da medicina nuclear, mas

nos últimos anos, com o avanço na imagem e terapia dos tumores, se transformou na área

de maior crescimento. Em parte, devido ao aumento no uso e na disponibilidade de vários

radionuclídeos, tais como o gálio-67 (

Ga), tálio-201 (

201

Ta), iodo-123 (

123

I) cobre-64

(

Cu), fluordesoxiglicose (

F-FDG), dentre outros (THRALL et al., 2003).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.2.1 - Radionuclídeos na medicina nuclear.

A medicina nuclear emprega radionuclídeos e técnicas de física nuclear no diagnóstico e

tratamento de doenças. Para tanto, tais radionuclídeos são associados a alguns fármacos,

que se apresentam como marcadores fisiológicos para determinados órgãos e sistemas

(SILVA, 2003).

Embora as terminações nuclídeo e isótopo sejam usados mutuamente, nuclídeo é um termo

mais geral. Nuclídeos podem ser estáveis, não apresentando decaimentos espontâneos e

possuem meia-vida (T

1/2

) da ordem de 10

anos; ou instáveis, sofrendo decaimento

espontâneo. Atualmente, são conhecidos cerca de 2300 nuclídeos instáveis e 280 estáveis,

com meias-vidas que variam de segundos até milhares de anos. Quando um isótopo

instável decai espontaneamente, libera energia na forma de ondas eletromagnéticas ou

mesmo na forma de partículas gerando radiação e são denominados radionuclídeo.

(WELCH et al., 2003).

Muitos nuclídeos radioativos (radionuclídeos) são produzidos artificialmente pela

transformação de um nuclídeo estável em um nuclídeo instável, seja pelo

bombardeamento com nêutrons, prótons, deutêrons, partículas alfa, raios gama, ou outras

partículas. As origens dessas partículas de bombardeamento podem estar num

radionuclídeo natural, em um reator nuclear, ou em aceleradores de partículas (cíclotron,

Van de Graaf, etc.). A grande maioria dos radionuclídeos é produzido em reatores

nucleares de pesquisa. A diversidade de radionuclídeos criados a partir dessas técnicas

permitiu um aumento significativo de suas aplicações na física, geologia, biologia e

medicina (WELCH et al., 2003).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.3 – Radionuclídeos do Cobre.

3.3.1 - Produção, propriedades físicas e aplicações dos isótopos do

Cobre.

O cobre oferece um grande número de isótopos radioativos, os quais são potencialmente

adequados para o uso no diagnóstico por imagem e/ou em radioterapia, são eles o

Cu,

Cu e

(TAB 1). Esses radionuclídeos apresentam propriedades nucleares

diversas, tais como o alcance de suas meias-vidas (que podem variar de 10 minutos a 62

horas), e o tipo de decaimento (emissão de pósitron-β

e/ou beta menos-β

,captura

eletrônica-EC). Além disso, a biodistribuição destes radionuclídeos nos tecidos e órgãos

pode ser facilmente avaliada externamente pelos aparelhos de tomografia por emissão de

pósitrons (PET) e pela gama-câmara (WELCH et al., 2003).

Dois dos radioisótopos de cobre, o

Cu e

Cu, têm uma longa história de aplicações

como traçadores biomédicos, particularmente na absorção, metabolismo e excreção. Eles

também são usados para avaliação de pacientes com doença de Wilson e no diagnóstico de

tumores malignos (WELCH et al., 2003).

TABELA 1 - Características do decaimento dos Radionuclídeos do cobre.

Isótopo T

1/2

MeV (%) β

MeV (%)

(%)

γ MeV (%)

23,4 min

3,32 h

9,76 min

12,8 h

62,0 h

0,573 (39,6 %)

0,577 (20 %)

0,484 (35 %)

0,395 (45 %)

3,92 (6 %)

3,00 (18 %)

2,00 (69 %)

1,22 (60 %)

2,91 (97 %)

0,655 (19,3

7,4 %

40 %

2 %

41%

0,85 (15 %)

1,33 (80 %)

1,76 (52 %)

2,16 (6 %)

0,248 (12 %)

0,38 (3 %)

0,511 (120 %)

0,511 (194 %)

1,35 (0,6%)

0,511 (38,6%)

0,184 (40 %)

0,092 (23 %)

Fonte: WELCH et al., 2003.

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Os nuclídeos

Cu,

Cu e

Cu são ricos em prótons e decaem para seus respectivos

isótopos de níquel através da combinação do decaimento pósitron e captura eletrônica.

Todos eles podem ser produzidos em um ciclotron utilizando reações com próton ou

deutério, ou ainda enriquecendo os alvos com níquel (

Ni,

Ni e

Ni). O

Cu também

pode ser produzido indiretamente em geradores através do radionuclídeo

(WILLIAMS et. al., 2005).

TABELA 2 - Propriedades físicas dos radionucídeos do cobre

para imagem ou terapia (Adaptado de BLOWER et al., 1996).

Radionuclídeo Ep

(KeV)

Enp

(KeV)

Anp

(mm)

Produção

Cu 511

1332

873 4,4 Ciclotron

Cu 511

283

527 2,6 Ciclotron

Cu 511 1315 6,6 Gerador/Ciclotron

Cu 511

1346

278

190

1,4

0,95

Reator/Ciclotron

Cu 93 121 0,61 Reator/Ciclotron

Cu é um isótopo excepcional por causa dos seus três tipos de decaimento: pósitron,

beta menos e captura eletrônica (WILLIAMS et al., 2005). Um dos métodos de produção

Cu no reator nuclear é pela reação do

Zn(n,p), utilizando nêutrons rápidos (WELCH

et al., 2003), ou pela reação

Cu(n,γ)

usando o cobre natural (

Cu) (WILLIAMS et al.,

2005). Através da reação

Zn(n,p) pode-se conseguir uma alta atividade específica, o

mesmo não acontece na reação

Cu(n,γ), por causa da seção de choque do

Cu (4,5 barn).

Dados da produção dos radionuclídeos de cobre estão resumidos na tabela 1

(WILLIAMS

et al., 2005).

Ep = Energia penetrante mais abundante da radiação (γ) emitida pelo

decaimento correspondente; Enp = Média da energia não-penetrante mais

abundante da radiação (β

/β

); Anp = Média do alcance da radiação não-

enetrante no tecido.

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

TABELA 3 - Dados da produção para os radionuclídeos de cobre (WILLIAMS et al., 2005).

Produção

Isótopo Reação Energia do

feixe

incidente

(MeV)

Enriquecimento

do alvo (%)

Seção

Choque

(σ) em

barns

Rendimento

( MBq/mg)

Ciclotron

Ni(p,n)

Cu 11 DN 370

Ciclotron

Ni(p,n)

Cu 19 88.8 573ª

Ciclotron

Ni(p,n)

Cu 5 – 14 97.0 19800ª

Ciclotron

Ni(p,n)

Ni(d,2n)

Zn(p,xn)

94.8

96.4

Zn natural

243

388

Ciclotron

Zn/

Cu(p,2n)

Zn 34, 37 Cu natural 417

Gerador

Cu(p,4n)

Zn 58

Reator

Zn(n,p)

Cu(n,γ)

1.8

(nêutons

rápidos)

99.9

Cu natural

0,7

4,5

14.5

DN- Dados não avaliados; a- Rendimento previsto; b- Resultado máximo; c- Total para três alvos

pósitron; d- Resultado médio; e- Energia aproximada mínima do nêutron.

3.3.2 - Química do Cobre

Os radioisótopos do cobre têm atraído amplo interesse para sínteses de novos

radiofármacos pelo fato deles possuírem a versatilidade química dos elementos de

transição (WELCH et al., 2003), contudo, não apresentam grande variação no estado de

oxidação como, por exemplo, o tecnécio e o rênio (estados de oxidação variam de I a VII).

A química do cobre é dominada por apenas dois estados de oxidação I e II, pois o estado

de oxidação III é bastante oxidante e instável, além disso, só pode ser formado em certas

condições bioquímicas (VÃVARE et al., 2007).

O equilíbrio redox, governado preferencialmente pelos estados de oxidação 0, I, II, é

controlado pela natureza química do meio. Sendo assim, na presença de ligantes altamente

covalentes e polares como as tioetéres, nitrilas, íons iodetos, fosfinas, o Cu (I) é estável e

forma complexos estáveis com estes ligantes. Onde existe disponibilidade de interação

com espécies menos polares e covalentes (H

O, ClO

), Cu(I) é desprotonado

favorecendo a formação do Cu(0) e Cu(II). Nestas condições, a estabilidade dos estados I

e II pode ser controlada pelo tipo de doador dos seus ligantes (BLOWER et al., 1996).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

O cobre (I) é o mais baixo estado de oxidação geralmente, formam-se complexos sem cor

(ou amarelos) e dimagnéticos. A depender do tipo de ligantes podem-se obter uma

geometria e coordenação numérica principalmente estérica e conformacional. Os números

de coordenação podem ser 2 (linear), 3 (plano trigonal), e 4 (tetraédrica). O Cu (I) tem

preferência por ligações polares com grupos doadores, como as tioéster, fosfinas, nitrilas,

isonitrilas, alquenos, iodetos, cianidas, tiolatos. O tipo de ligação pode ser aniônica, neutra

ou ambas (BLOWER et al., 1996).

No estado de oxidação II o cobre possui a configuração do subnível d

, portanto é

paramagnético. Este paramagnetismo pode deixar de existir quando houver interações

metal-metal nos complexos polinucleares. A camada d insaturada provoca a estabilização

do campo energético no ligante, induzindo o metal a exibir uma preferência esterioquímica

que pode competir com outros ligantes. A prioridade do Cu (II) é para os números de

coordenação quatro, cindo e seis. O complexo de cobre com o número de coordenação

quatro apresenta uma estrutura quadrática planar e tetraédrica. A configuração d

causa

formação do complexo com 6 coordenações octaédricas e 4 coordenações tetraédricas

conhecidas como distorções de Jahn-Teller. Um exemplo é o CuCl

(BLOWER et al.,

1996).

O cobre (III) requer estabilização particularmente pelas ligações fortes π através das

doações ligantes aniônicos. Muitos exemplos contêm ligantes amidas nitrogenadas

desprotonadas. Usualmente requerem alto pH para minimizar a competição por prótons,

desde que os ligantes tenham pK

alto. A geometria é quadrática planar e configuração d

(BLOWER et al., 1996).

3.3.4 -Bioquímica do Cobre

O cobre é o terceiro metal natural mais abundante no corpo humano, após o ferro e zinco

(BLOWER et al., 1996). É um metal essencial no sistema biológico e possui,

freqüentemente, um comportamento catalítico (WELCH et al., 2003).

Um grande número de proteínas e enzimas contêm cobre na sua composição química,

sendo que algumas destas enzimas contribuem para reações de oxidação-redução

(WELCH et al., 2003) (TAB 4).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Devido à radiação de fundo presente nos radiofármacos originados a partir do cobre,

torna-se necessário o conhecimento dos mecanismos envolvidos na sua fixação,

distribuição, metabolismo e excreção (BLOWER et al., 1996). O cobre in vivo está quase

que completamente ligado a proteínas e petídios (BLOWER et al., 1996), ou ainda a

moléculas menores (WELCH et al., 2003). O Cu(II) encontra-se ligado a albumina,

ceruloplasmina, transcupreína, histidina, para fins de transporte; ou complexado a

citocromo oxidase, superóxido dismutase, lisil oxidase, dopamina β hidrolase e outras

metaloenzimas para uso nas funções biológicas. Já os aglomerados Cu(I)-tiolato são

seqüestrados pela metalotionina. Alguns complexos com cobre podem imitar a ação de

proteínas ou enzimas, como por exemplo, a superóxido dismutase (SOD) (WELCH et al.,

2003).

TABELA 4 - Enzimas do sistema biológico que contêm cobre (WELCH et al., 2003).

Proteína ou Enzima Origem Função

Citocromo Oxidase

Superóxido dismutase

Dopamina hidrolase

Ceruloplasmina

Amina oxidase

Lisina oxidase

Óxido Nitroso redutase

Tirosinase

Mitocôndria

Citosol

Adrenal

Plasma

-------------

Aorta

Bactéria

Pele

Redução do oxigênio

para H

+ O

Oxidação da Dopamina para Noradrenalina

Oxidação do Fe(II) para Fe(III)

Transporte de Ferro

Remoção de hormônios (Adrenalina)

Oxidação do colágeno

Redução do NO para N

Oxidação da tirosina para melanina

As reações enzimáticas geralmente utilizam-se das propriedades de oxi-redução do cobre,

como a transferência de elétrons do ciclo do estado de oxidação (Cu(I)/Cu(II) e

Cu(II)/Cu(III)); ou da transferência do oxigênio que encontra-se ligado ao dioxigênio ou

de outras espécies reativas do oxigênio (ROS) (BLOWER et al., 1996).

A forma de administração dos isótopos do cobre na medicina nuclear é de fundamental

relevância para entendimento da fisiologia do cobre. O Cu(II) administrado

endovenosamente ou absorvido pelo trato gastrointenstinal superior (TGS), após uma dose

oral, liga-se imediatamente a proteínas transportadoras do soro, como a albumina e

transcupreína. Uma pequena fração também se liga a aminoácidos e pequeno peptídeos

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

(especialmente a histidina) (FIG. 11). Estas ligações ocorrem em condições instáveis, com

transferência e distribuição de proteínas para as células via intermediários de baixo peso

molecular. Assim, quando a albumina é marcada com radionuclídeos do cobre para

investigação dos seus sítios de ligação, a radioatividade é rapidamente depurada do

sangue, apesar da longa meia-vida da albumina no soro, e depositada no fígado. O mesmo

não acontece quando a albumina é radiomarcada com cobre e um quelante bifuncional,

como o derivado do tetra(aminocaboxilato)-TETA ou de uma bis(tiossemicarbazona), a

radioatividade permanece na circulação por um período prologando. Assim, embora a

maioria do cobre esteja no soro (65%), ligado a ceruloplasmina, uma boa parte encontra-se

ligado a albumina. Desta maneira, pode fornecer um método de imagem conveniente para

investigações hematológicas (BLOWER et al., 1996).

A albumina e transcupreína transferem o cobre para os hepatócitos através de aminoácidos

pequenos (especialmente a histidina), provavelmente intermediado pelo complexo ternário

cobre-albumina-aminoácido. A albumina não transfere o cobre diretamente para as

células, ao contrário disso, ela inibe a fixação do cobre na forma do complexo histidina

(BLOWER et al., 1996).

O cobre internalizado pelos hepatócitos pode ser utilizado nas seguintes situações: a) na

síntese de metaloenzimas; b) na síntese de ceruloplasmina, a qual é transportada pelo

sangue para outros órgãos; c) seqüestrado na forma de metalotionina (que pode servir

como estoque temporário ou proteção contra excesso de cobre); d) ou preparado para

excreção biliar (BLOWER et al., 1996).

O cobre quando administrado via endovenosa não se liga inicialmente com

ceruloplasmina, mas quando ocorre uma nova síntese de ceruloplasmina no fígado e assim

é formando o complexo cobre-ceruloplasmina. Este complexo sofre uma lenta depuração

pelos rins e parte é transferido para outros tecidos e órgãos, absorvidos por receptores na

superfície das células (BLOWER et al., 1996).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.5 – Radiofármacos

Os radiofármacos utilizados para diagnóstico são classificados em radiofármacos de

perfusão (ou primeira geração) (TAB. 5) e radiofármacos sítios-específicos (ou segunda

geração) (OLIVEIRA et al., 2006). Os radiofármacos alvos-específicos ou receptores-

específicos são da terceira geração (FERRO-FLORES et al., 2006). Os radiofármacos de

perfusão são transportados no sangue e atingem o órgão alvo na proporção do fluxo

sangüíneo. Não têm locais específicos de ligação e pensa-se que são distribuídos de acordo

com tamanho e carga do composto (OLIVEIRA et al., 2006).

Os radiofármacos sítios-específicos são direcionados por moléculas biologicamente ativas,

como, por exemplo, anticorpos e peptídeos, que se ligam a receptores celulares ou são

transportados para o interior de determinadas células (OLIVEIRA et al., 2006) (TAB 6).

Outros

Tecidos

SORO

Ceruloplasmina

Transcupreína-Cu

Albumina-Cu + MBP Cu

↓↑

Rins

FÍGADO

Excreção

Aminoácidos

Açúcares

Metalotioneina

Citocromo

Oxidase

Superóxido

dismutase

Síntese de

Ceruloplasmina

Administração

I.V. do Cobre

Bile

Administração Oral do Cobre

TGS

Excreção

FIGURA 11- Esquema ilustrativo da fisiologia do cobre pelas vias administração

endovenosa (I.V) ou oral (Trato Gastrointestinal Superior) (Adaptado de

BLOWER et al., 1996).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

TABELA 5- Radiofármacos de perfusão (1ª geração) para diagnóstico clínico

tumores.

RADIOFÁRMACOS APLICAÇÕES

Tc-Pertecnetato de sódio Carcinoma da tiróide e metástases.

Ga-Citrato de gálio Tumores primários como linfoma Hodgkin,

linfomas, tumores pulmonares, melanoma.

F-Flourdexoglicose (FDG) Tumores de cabeça e pescoço, linfomas,

tumores pulmonares e metástases, tumores

esofágicos, câncer de mama.

(Adaptado de OLIVEIRA et al., 2006).

Em geral, os radiofármacos receptores-específicos são compostos de três partes: o

radiometal, o quelante bifuncional e um fragmento-alvo bioativo. Os radiofármacos da

terceira geração são os únicos com a habilidade para monitorar a ligação a enzimas e sítios

específicos in vivo (FERRO-FLORES et al., 2006). A capacidade da biomolécula

reconhecer os receptores vai determinar a fixação do radiofármaco no tecido pretendido e

não deverá ser alterada com a incorporação do radionuclídeo (OLIVEIRA et al., 2006).

TABELA 6 - Radiofámarcos (2ª e 3ª gerações) específicos para diagnóstico clínico de

tumores.

RADIOFÁRMACO APLICAÇÕES

111

In-pentetreonida

(Receptor de somatostina)

Tumores neuroendócrinos e metástases,

como gastrinoma, neuroblastoma, adenoma

de pituitária, carcinoma medular da

pituitária, tumores pulmonares.

131

I ou

123

I –MIBG

(Receptor Adrenérgico pré-sináptico)

Tumores neuroendócrinos, feocromocitona

e neuroblastoma.

99m

Tc-arcitumomabe

(Anticorpo Monoclonal)

Carcinoma de cólon e reto e metástases

99m

Tc-nofetumomabe

(Anticorpo Monoclonal)

Tumor de pequenas células pulmonares

111

In-satumomabe pendetida

(Anticorpo Monoclonal)

Tumores coloretal e dos ovários

111

In-capromabe pendetida

(Anticorpo Monoclonal)

Tumores primários da próstata e

mestástases

(Adaptado Oliveira et al., 2006).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A medicina nuclear também tem uma aplicação terapêutica quando utiliza radionuclídeos

emissores de partículas, acoplados a fármacos, ocasionando uma dose de radiação

citotóxica nos tecidos alvo selecionados (BLOWER, 2005). Os radionuclídeos que emitem

partículas ionizantes (partículas beta ou elétrons Auger) são indicados para tratamento de

tumores. O tipo de partícula a ser utilizada depende do tamanho do tumor, da distribuição

intratumoral e farmacocinética do radiofármaco, apesar da sua deposição nos tecidos alvo

(tumores) ser heterogênea (OLIVEIRA et al., 2006).

A síntese de um radiofármaco requer uma meticulosa otimização de dois componentes: o

radionuclídeo e seu sistema carreador devem ir preferencialmente direto para o tumor,

sendo que a radiação emitida tenha alta probabilidade de ser depositada dentro da

população de células malignas; além disso, os carreadores físicos (por exemplo,

lipossomas) criados devem isolar as cavidades do corpo que são utilizadas para confinar o

fármaco radiomarcado (VÉRTIS, 2003). Outro componente, é que o mecanismo pelo qual

uma droga administrada tende a localizar-se em diferentes tipos de tecidos depende das

propriedades dos radiofármacos, como por exemplo, a lipofilicidade, peso molecular,

planaridade, pKa e potencial redox. A relação entre a estrutura-atividade fornece subsídios

para um projeto racional de radiofármacos sítio-específicos (HOLLAND et al., 2007).

Um importante conceito freqüentemente citado no contexto da química dos radiofármacos

é a Bioconjugação, que se trata do acoplamento de um radionuclídeo metálico a uma

molécula biologicamente ativa (BAM), por exemplo, um peptídeo, anticorpos ou uma

proteína, através do uso de quelante bifuncional (BFC), tais como o EDTA, DOTA, via a

um átomo ou grupo ligante (FIG. 12). Esta metodologia envolve sutileza entre a síntese e o

projeto de cada complexo de sistemas bioinorgânicos. Dentre eles, inclui a escolha do

radionuclídeo, a construção e a natureza do ligante, complexação do metal, seqüência de

reações, tipo de acoplamento químico usado para combinar o radionuclídeo com o BAM

escolhido. Cada projeto deve ser governado pela pretensão de se atingir o alvo desejado

(HOLLAND et al., 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Quando um radiofármaco é administrado a um paciente, ocorre, de modo geral, processos

de distribuição, metabolização e excreção como qualquer outro fármaco. A excreção do

radiofármaco faz-se por meio dos mecanismos fisiológicos existentes (excreção renal,

biliar, ou outro) e segue uma lei exponencial semelhante ao decaimento do radionuclídeo.

Quando o organismo elimina metade do radiofármaco chama-se meia-vida biológica. Num

sistema biológico, o desaparecimento de um radiofármaco deve-se ao decaimento físico do

radionuclídeo e à eliminação biológica do radiofármaco. A combinação destes dois

parâmetros é designada meia-vida efetiva. Pretende-se uma meia-vida efetiva

suficientemente curta para minimizar a exposição do paciente à radiação, mas

suficientemente longo para permitir adquirir e processar as imagens (OLIVEIRA et al.,

2006). A maioria dos radiofármacos tem a propriedade altamente desejável de não

perturbar a função biológica (THRALL, 2003).

A química inorgância (incluindo a química de organometálicos) desempenha um papel

chave no desenvolvimento de radiofármacos, porque muitos dos radionuclídeos são

metálicos como, por exemplo, o cobre, o gálio e o zircônio (BLOWER, 2005).

O radionuclídeo mais empregado em medicina nuclear é o tecnécio-99 metaestável

(

99m

Tc). O tecnécio foi o primeiro elemento produzido artificialmente, tendo sido isolado

por Carlo Perrier e Emilio Segrè, em 1937 (SILVA, 2003).

Molécula

Biologicamente

Ativa (BAN)

Quelante Bifuncional (BFC)

Radionuclídeo

Grupo Ligante

FIGURA 12 - Representação esquemática da junção de um radionulídeo

encapsulado com uma BAM via grupo ligante (Adaptado de HOLLAND et al.,

2006).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.6 - Radiofármacos derivados de Tiossemicarbazonas.

As tiossemicarbazonas são compostos de considerável interesse científico devido às suas

importantes propriedades biológicas, tais como as atividades anti-tumoral, anti-bacteriana,

anti-viral, citotóxica, dentre outras (BERALDO, 2004). Outra propriedade destes

compostos é que podem ser facilmente complexados com radionuclídeos, demonstrando

grande potencialidade para desenvolvimento de radiofármacos para o diagnóstico e terapia

de tumores (BERALDO, 2003). Um dos primeiros radionuclídeos usados na complexação

com as tiossemicarbazonas foi o tecnécio-99m. No ano 1982, Yokohama e colaboradores

relataram que o complexo

99m

tecnécio-(bis)tiossemicarbazona acoplada a estrutura da

glicose poderia penetrar a barreira hematoencefálica em animais de laboratório. Eles

relataram também que o complexo

99m

Tc-ditiossemicarbazona ligado a um grupo amino

terciário ou quaternário apresentava um tropismo para o miocárdio. Esses achados

encorajaram novos esforços no desenvolvimento de radiofármacos sintetizados a partir de

tiossemicarbazonas para mapear as funções miorcárdicas e cerebral, bem como na

detecção de tumores nestes órgãos (ARANO, 2002).

As tiossemicarbazonas são sintetizadas, em geral, de duas formas: pela obtenção direta,

que consiste na reação quimiosseletiva de aldeídos e/ou cetonas com as

tiossemicarbazidas; e pela obtenção indireta, que exige a preparação prévia das

tiossemicarbazidas, usando hidrazina (NH

-NH

) e diferentes reagentes, seguida de

condensação com o derivado carbonilado. Na obtenção direta, as tiossemicarbazidas são

adquiridas comercialmente. Esta síntese é descrita pela condensação equimolar de um

derivado carbonilado, do tipo aldeído ou cetona, com tiossemicarbazidas em meio

alcoólico sob refluxo e quantidades catalíticas de ácido. Esta reação é bastante conhecida

por sua alta quimiosseletividade, versatilidade e rapidez, apresentando geralmente altos

rendimentos (TENÓRIO et al., 2005).

Segundo Tenório e colaboradores (2005), as tiossemicarbazonas apresentam estrutura

básica, C=N-NHCS-NH

, aproximadamente planar, com o átomo de enxofre em posição

anti em relação ao átomo de nitrogênio da função imina. Fatores eletrônicos e estéricos

contribuem para este arranjo estrutural, porém, possivelmente o fator mais importante é

que o átomo de enxofre em posição anti possibilita a ocorrência de ligação de hidrogênio

intramolecular entre o nitrogênio da imina e os hidrogênios da tioamida. Por outro lado,

Revis

___

isse

este

na p

áto

A c

cont

exe

is(t

os c

espe

200

enzi

atra

com

cert

prop

redu

enco

o Bibliográfi

_______

tação de Mest

arranjo est

sição N-4,

o de enxof

mplexação

a uma a

plo é

ossemicar

mplexos d

íficos par

odo gera

as, atravé

és de inter

lexos met

s enzimas

iedades te

ase (VA

ntra

-se e

_______

ado

aulo

utural mu

favorecen

e 13 (FIG.

das tiosse

pla varie

ativida

azona) em

cobre lig

tecidos

, pode-se

s da compl

ções com

licos com

(BERALD

apêuticas

SA et al,

tre os inib

FIGURA

conforma

_______

oberto Ornela

a significa

o a confor

13).

icarbazon

ade de ne

e antine

tumores s

dos às bis(

om hipóxi

izer que

exação de

o DNA ou

estes ligan

O, 2003).

enéficas e

2005). S

es mais

13 - Estru

ões sin e

_______

da Silva

– C

ivamente s

mação sin

s com met

plasias m

plásica d

lidos de

iossemica

e para d

iossemicar

etais end

da inibiçã

es apresen

s tiosse

células

gundo B

potente da

ura das ti

nti (TEN

_______

TN/CNE

e grupos s

ntre o áto

is apresen

alignas (C

cobre-I

nimais (B

azonas) s

tecção de

azonas a

genos ou

da síntese

am a habi

icarbazona

umanas pe

raldo (20

atividade

ossemicar

RIO et al.

_______

bstituintes

o de nitro

a propried

ANDRA

a 3

RALDO,

o usados c

tumores (

em, seja c

través de

do DNA.

idade de

heterocíc

a inibição

4) estas

ibonucletí

azonas as

2005)

_______

forem adi

gênio da i

des carcin

et al, 20

etoxi-2-ox

004). Atu

mo radiof

OLLAN

omo inibi

eações re

lém disso

imetizar a

icas exerc

da ribonuc

iossemicar

eo redutas

ionados

ina e o

státicas

5). Um

butiral-

lmente,

rmacos

et al.,

ores de

ox, seja

, alguns

ação de

m suas

eotídeo

azonas

(RR).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A ribonucleotídeo redutase (RR) é um enzima citossólica que desempenha um papel chave

tanto na síntese do DNA como na catálise da biossíntese de desoxiribonucleotídeos. Para

realizar esta reação a RR utiliza radicais livres orgânicos, os quais são estocados por ela

até serem requisitados para a catálise (EKLUND et al., 2001). Esta enzima existe em todas

as células vivas e é constituída por duas subunidades conhecidas como R1 e R2. A

subunidade R2 contém um radical livre tirosila, que é estabilizada por um centro de ferro

não heme. Ambos, o ferro e o grupo tirosila, são essenciais para a atividade catalítica (FIG

15a) (TENÓRIO et al., 2005).

Não existe nenhuma via alternativa para síntese de desoxiribonuclídeos, pois toda a síntese

é catalizada pela ribonuclídeo redutase (RR). Ribonucleotídeos são sintetizados a partir de

aminoácidos, derivados de tetrahidrofolatos, amina, gás carbônico e 5-ribosil-pirofosfato.

A RR reduz todos os quatro principais ribonucleotídeos para seus desoxiribonucleotídeos

correspondentes (EKLUND et al., 2001). O ciclo de reações redox envolvido na conversão

de ribonucleotídeos a desoxirribonucleotídeos catalisada pela RR é mostrado na FIG. 15b.

No ciclo, os elétrons são transportados da nicotinamida adenina dinucleosídeo fosfato

(NADPH) para o ribonucleotídeo através de uma cadeia envolvendo a flavoproteína

flavina adenina dinucleosídeo (FAD), a tiorredoxina redutase (TR), a tiorredoxina (T) e a

RR. Tiorredoxina redutase, tiorredoxina e RR contêm dissulfetos que participam das

reações de transporte de elétrons. A tiorredoxina reduzida não cede diretamente um átomo

de hidrogênio ao substrato, mas realiza antes a redução do dissulfeto da enzima. Mesmo

fazendo parte do sítio enzimático, o grupo SH não reduz diretamente os ribonucleosídeos,

mas interage antes com um outro intermediário ativado, que é o radical tirosila presente na

estrutura da RR (BERALDO, 2004).

FIGURA 14 - Complexo Cobre-bis(tiossemicarbazona)

(VÃVERE et al., 2007).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

De acordo com Le e colaboradores (2002) a atividade da RR é dependente de ferro, desde

que a subunidade R2 contém um radical tirosila que necessita do ferro para sua

estabilização. Muitos estudos têm mostrado que os efeitos anti-proliferativo da

degeneração do ferro em células cancerosas in vivo e in vivo em vários ensaios clínico,

devido a ação quelante das tiossemicarbazonas. A enzima ribonucletídeo redutase (RR)

vem sendo relacionada como um alvo promissor na terapia do câncer pelas

tiossemicarbazonas (TENÓRIO et al., 2005).

FIGURA 15 – (a) Representação esquemática da estrutura da

RR; (b) ciclo de reações de oxi-redução envolvidas na conversão

de ribonucleotídeos em desoxi-ribonucleotídeos, catalisada pela

RR (BERALDO, 2003).

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.7 – Produção de radiofármacos em reatores nucleares.

Um reator consiste em uma quantidade de material físsil aglomerado, como o Urânio-235

(natural ou enriquecido), Plutônio-239 ou Urânio-233, onde se controla a reação em cadeia

(FIG. 16). O urânio-235 é geralmente unido em pastilhas ou varetas e fundido em tubos de

metais de zircônio. A fissão de Urânio-235 produz em média 2,4 nêutrons, 2,5 massas

nucleares (produtos de fissão com massas médias entre 100 e 140 u.m.a.) e libera 200

MeV. Essa fissão é melhor induzida com a energia de nêutrons lentos, utilizando-se um

moderador (geralmente água), diminuindo dessa forma a emissão de nêutrons. Outros

nêutrons são absorvidos pelo moderador e materiais estruturais. Desse modo, a reação em

cadeia pode ser mantida se um dos nêutrons causarem outra fissão do Urânio-235. Esta

condição é expressa como o fator de multiplicidade K e é chamado de fator crítico quando

o K= 1 (WELCH et al., 2003).

Para produção nos reatores dos radionuclídeos utilizados na síntese ou conjugação de

radiofármacos são usadas diferentes tipos reações: a) captura neutrônica (n, γ); b) captura

neutrônica seguida pelo decaimento; c) fissão. A reação mais rotineiramente usada é a

captura neutrônica com nêutrons térmicos (WELCH et al., 2003).

A ativação neutrônica é a irradiação de um núcleo com nêutrons para produzir espécies

radioativas ou radionuclídeos, numa reação de captura neutrônica (n, γ). O número de

radionuclídeos produzidos dependerá do número de núcleos alvo, do número de nêutrons e

de um fator chamado seção de choque (σ) (PARRY, 2003). A seção de choque determina

a probabilidade de ocorrência de uma reação nuclear com nêutrons e é proporcional a área

efetiva que cruza seccionalmente o alvo da partícula incidente. A unidade da seção de

choque é o barn = 10

-24

. Cada reação nuclear tem sua própria seção de choque (σ) que

pode ser fortemente dependente da energia cinética da partícula incidente (WELCH et al.,

2003).

As vantagens deste processo de produção é sua simplicidade e quase sempre com alto

rendimento. Além disso, podem ser usados muitos elementos como alvo e em alguns casos

não se exige nenhuma separação química. A desvantagem é que podem surgir

radioimpurezas durante a captura neutrônica, como a formação de outros isótopos ou

impurezas químicas nos alvos usados (WELCH et al., 2003).

Revis

___

isse

cara

que

reat

a m

de f

regi

Inici

reat

é d

mod

perd

dist

aix

com

term

ocor

16),

m.s

o Bibliográfi

_______

tação de Mest

êutrons uti

terizados

s nêutron

res nuclea

ioria se en

ssão. A en

es: nêutro

almente, a

r para as e

rápidos,

radores (

ndo ener

ncia do ce

egião de

s energias

os átomos

alizados.

erá quand

sendo que

. Já a reg

_______

ado

aulo

izados na

or energia

entram e

es de pesq

ontra em u

rgia dos

s térmicos,

reação de

tremidade

orém co

gua leve

ia e se to

tro do reat

êutrons té

geralment

do meio

onsideran

os nêutro

nesta ener

ão interm

FIGUR

as re

iõ

_______

oberto Ornela

tivação ne

distintas

equilíbri

isa, os nê

ma faixa e

êutrons se

epitérmico

issão do

. Próximo

os contí

grafite)

nando ma

r (PARRY

micos, a c

abaixo d

oderador

o-se uma

s atingire

ia, a velo

diária cor

16 – Esp

s de ener

_______

da Silva

– C

trônica nã

ue depend

com o m

trons pode

érgica de

distribui f

s e rápidos

U fornec

ao centro

uos choq

ue envolv

s termaliz

, 2003).

mponente

0,5 eV. E

o reator,

emperatur

uma ener

idade mais

esponde a

ectro de n

ia (DA C

_______

TN/CNE

apresenta

m das inte

io, se diz

alcançar

té 2 MeV,

rmando u

(FIG. 16) (

nêutrons

contribuiç

es desses

m o centr

dos. Esta

do fluxo

tes nêutro

endo deno

de 20º C

gia média

provável

fluxo d

utrons tí

STA, 200

_______

uma ene

ações co

ue eles sã

energias d

ue são os

espectro

A COST

ue se orie

o maior n

nêutrons

o do reato

termalizaç

constituí

s estão e

inados ta

, o proces

e 0,025 e

ara esses

nêutrons

ico aprese

_______

gia singula

o meio. À

termaliza

15 MeV,

hamados

consistind

, 2007).

ntam do c

fluxo de

os el

r, os mes

o aument

a por nêu

equilíbrio

bém de

o de term

(máximo

êutrons é

epitérmico

tando

, sendo

medida

os. Em

ontudo

êutrons

de três

ntro do

êutrons

mentos

os vão

com a

rons de

térmico

êutrons

lização

na FIG.

e 2200

ou de

Revis

___

isse

ress

nêut

flux

rápi

Qua

núcl

ime

vari

A pr

o nú

ativ

pod

)

o Bibliográfi

_______

tação de Mest

nância. N

rocesso d

ons epitér

térmico.

os. Nessa

(DA COS

do um al

os ativado

iatamente

com a ati

dução de

ero de nú

ção será di

ntanto, o

ser dado

multiplica

_______

ado

aulo

sta região,

e termaliz

icos em u

última r

egião os

A, 2007).

o absorve

será dimi

pós a ativ

ação e o d

adionuclíd

leos alvos

etamente

úmero de

ela razão e

o pela ma

FIGU

TRIG

_______

oberto Ornela

os nêutron

ção com

reator d

egião a se

êutrons ap

nêutrons e

uído devi

ção do pri

caimento d

os aumen

presentes

roporciona

Taxa de

núcleos pr

tre o núm

sa (m) do

A 17 - Vi

-R1

(

_______

da Silva

– C

têm energ

s átomos

pesquisa

abordada

esentam u

isótopos

o ao fenô

eiro núcle

os núcleos

a com a in

a amostra

(

a φ e N e

tivação

∝

sentes na

ro de Avo

esmo ele

ta superio

(

Fonte CD

_______

TN/CNE

ias na faix

do eleme

ípico corre

correspon

a energia

adioativos

eno de dec

. Assim, a

(

PARRY,

ensidade d

(

N) (DA C

ode ser re

amostra pa

adro (N

)

ento (PA

r do reato

N).

_______

de 0,5 eV

to moder

sponde a c

e à comp

alta, em g

são origin

imento ra

atividade i

003):

fluxo de

STA, 200

resentada

ra um dete

e o peso at

RY, 2003)

nuclear

_______

a 0,5 Me

dor. No

rca de 2 a

nente de

eral maior

dos, o nú

ioativo, qu

duzida na

êutrons (φ

)

). Assim,

or:

rminado el

mico do e

e estão

uxo de

5 % do

êutrons

que 0,5

ero de

ocorre

amostra

)

, e com

taxa de

)

emento,

emento

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Taxa de ativação

∝

φ m N

/ A

(2)

Porém, para nuclídeos que apresentam dois ou mais isótopos, deve ser adicionada na

equação anterior, a abundância isotópica (θ) do núcleo original:

Taxa de ativação

∝

φ m N

θ / A

(3)

A relação entre a taxa de ativação, o fluxo de nêutrons e o número de núcleos alvo de um

elemento, é expresso pela secção de choque (σ), assim (PARRY, 2003):

Taxa de ativação = σ φ m N

θ / A

(4)

A taxa de ativação total deve conter a contribuição de cada tipo de nêutron, tais como as

seções de choque e os fluxos para cada componente dos nêutrons. Como a componente

dos nêutrons rápidos é pouco significativa para a reação (n, γ), a equação de ativação é

representada da seguinte forma:

Taxa de ativação = σ

m N

θ / A

+ I φ

m N

θ / A

(5)

Onde:

∝

- proporcionalidade

θ - abundância isotópica.

σ - secção de choque a nêutrons.

secção de choque de ativação para nêutrons térmicos.

I - integral de ressonância.

φ - fluxo de nêutrons.

- fluxo de nêutrons epitérmicos.

- fluxo de nêutrons térmicos. .

(n, γ)- reação de captura radioativa.

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

3.8 - Técnicas de aquisição de imagens na medicina nuclear.

Na medicina, a tomografia pode ser obtida, dentre outras formas, com informações

contidas nas aquisições de raios X que atravessaram um paciente, ou de radiações γ

emitidas por um composto administrado a um paciente. No primeiro caso, da radiologia, a

interação dos raios X com os tecidos e órgãos de diferentes composições e densidades

resulta em mudanças nas características iniciais destes, tais como energia e trajetória.

Essas alterações são processadas e usadas para formar as tomografias por transmissão,

cuja escala de cinza revela os diferentes coeficientes de atenuação e, conseqüentemente,

diferentes densidades de órgãos e tecidos. No segundo caso, da medicina nuclear, a

informação procurada é dada pela presença ou não de um traçador ou radiofármaco em um

órgão ou tecido de interesse. Desta maneira, as projeções das distribuições do traçador ou

radiofármacos podem ser usadas para formar as tomografias por fixação de raios gama ou

pósitrons (POZZO, 2005).

A aquisição de imagens em medicina nuclear denomina-se aquisição cintilográfica, em

função dos detectores de radiação empregados na aquisição das imagens serem cristais

cintiladores, principalmente o iodeto de sódio ativado com tálio (NaI(Tl)). As imagens

cintilográficas são atualmente obtidas em equipamentos de detecção de campo largo

(utilizam um grande cristal detector), também denominadas câmaras gama de Anger

(SORENSON et al., 1987) ou simplesmente câmaras gama (FIG 18) (SILVA, 2003).

Sucintamente, a câmara-gama ou SPECT é constituída essencialmente por detector de

iodeto de sódio ativado com tálio (NaI(Tl). Da interação da radiação com estes detectores

resultam sinais luminosos, os quais são captados por válvulas fotomultiplicadores. A

câmara-gama também possui um colimador de chumbo que seleciona a qualidade dos

feixes de radiação. Existem diferentes tipos de colimadores, concebidos de forma a serem

utilizados para uma determinada faixa de energia com resolução e sensibilidade bem

determinadas. A sua função é limitar o campo da radiação, limitando, portanto, a

qualidade da radiação que chega ao detector. A seleção do tipo de colimador depende da

energia gama do radionuclídeo usado no estudo clínico. Esta técnica produz uma imagem

tomográfica, que mostra a distribuição do radionuclídeo, acoplado ou não a um fármaco,

no corpo do paciente, à medida que o detector vai giranda até 180º ou 360º à sua volta. Por

esta técnica é possível a obtenção de imagens nos diversos planos anatômicos

(OLIVEIRA, et al., 2006). Nas imagens tumorais, “pontos quentes” são detectados pela

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

gama câmara quando o processo concentra radioatividade no tumor e “pontos frios”

ocorrem quando os tumores deslocam tecidos e estruturas normais, como, por exemplo,

nas lesões hepáticas expansivas (DEVITA et al., 2003).

FIGURA 18 – Câmera gama (SILVA, 2003).

O acoplamento de computadores aos sistemas de detecção, presente em todas as câmeras

gama, fez do processo de avaliação funcional por imagens a principal escolha nos

procedimentos em medicina nuclear, tornando possível a obtenção de uma série de

parâmetros funcionais úteis ao diagnóstico e tratamento (SILVA, 2003).

Outra técnica utilizada em medicina nuclear é a tomografia por emissão de pósitron (PET),

que é um exame não invasivo cujo princípio fundamental baseia-se na utilização de

compostos biológicos marcados com elementos de elevada instabilidade nuclear como os

emissores de pósitrons, por exemplo, o flúor-18, cobre-64, carbono-11, nitrogênio-13,

oxigênio-15. Estes radionuclídeos têm uma meia-vida que varia 2,07 (oxigênio) minutos a

12,7 h (cobre). Esta radiação liberada é detectada, processada por computador e a seguir

transformada em imagens (FILHO et al, 2000).

O pósitron é uma partícula estável, porém sua existência está limitada devido à interação

elétron-pósitron, ao serem combinadas com elétrons são aniquiladas, sua massa é

transformada em energia, resultando na emissão de dois fótons de 511 keV emitidos em

direção oposta, a 180º (POZZO, 2005).

Segundo a teoria dos buracos de Dirac, o pósitron pode interagir com o meio de

propagação por colisão elástica. Ao perder quase toda sua energia cinética, pode interagir

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

com um elétron (négatron) e formar um análogo do átomo de hidrogênio, com um pósitron

no lugar de um próton: o positrônio (FIG.19) (POZZO, 2005).

FIGURA 19 – Desenho esquemático do decaimento do carbono para boro e

aniquilação do pósitron com elétron, formando-se um par de fótons de 511 keV, em

direções opostas (Adaptado de ROBILOTTA, 2006).

Fótons de 511 keV podem interagir com o meio que os cerca através de efeito fotoelétrico

e espalhamento Compton. Cada um desses efeitos pode ocorrer em função do número

atômico efetivo (Z) do meio. Para um número atômico próximo ao da água, o processo

dominante é o espalhamento Compton. Como o corpo humano é composto de 70% - 80%

de água, este é o principal processo de interação de fótons de aniquilação com o corpo do

paciente (POZZO, 2005).

A PET produz imagens tridimensionais e tomográficas da distribuição no organismo de

radioisótopos emissores de pósitrons. As aplicações iniciais da PET foram direcionadas às

doenças neurológicas e cardiológicas. Atualmente, a PET é indicada principalmente em

cardiologia e oncologia, resultado do sucesso da aplicação do FDG (2[18F]-fluor-2-

desoxi-D-glicose) no diagnóstico, estadiamento e seguimento de vários tipos de câncer. O

FDG é um análogo da glicose marcado com o flúor-18, radioisótopo emissor de pósitrons,

que permite o estudo do metabolismo da glicose, através de sua maior fixação em tecidos

com maior atividade glicolítica. O diferencial da PET em relação às outras técnicas de

imagem é sua maior da sensibilidade na detecção de tumores e suas metástases.

(BOMBARDA et al., 2002).

511 keV

Positrônio

Revisão Bibliográfica

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Para adoção da PET como recurso clínico é necessária a construção de uma estrutura

específica como os cíclotrons, para servir aos hospitais e serviços de medicina nuclear, o

que requer um constante fluxo de investimentos dos setores público e privado (BLOWER,

2005).

Existem algumas diferenças básicas entre os radionuclídeos usados rotineiramente na

Medicina Nuclear e os de PET. Uma delas é que, no primeiro caso, cada radionuclídeo

usado emite radiações γ com valores bem determinados de energia, o que os torna

identificáveis. Com emissores de pósitrons isto não ocorre, uma vez que as radiações

detectadas são provenientes da aniquilação elétron-pósitron e, portanto, têm sempre a

mesma energia de 511 keV (POZZO, 2005).

FIGURA 20 – Exemplo de um equipamento PET, fechado, à esquerda

(Siemens Medical Systems), e mostrando a estrutura interna de blocos

de detectores dispostos em anéis, à direita (equipamento GE)

(POZZO,2005).

Justificativas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

4 - JUSTIFICATIVAS

O câncer continua sendo o maior desafio da ciência médica, embora imensos recursos

financeiros, tecnológicos, científicos e humanos estejam à disposição da pesquisa. Essa

doença tem sido responsável por grande parte das causas de morte no mundo. A

Organização Mundial de Saúde (OMS) estima a ocorrência de mais dez milhões de

novos casos de câncer por ano, sendo esperado, próximo de 2020, o diagnóstico anual

de mais de quinze milhões de novos casos. Conforme dados dessa organização, o câncer

causa seis milhões de mortes todo ano, ou seja, 12 % das mortes mundiais (CHUBACI,

2005).

A aplicação de radionuclídeos na medicina configura-se como uma ferramenta de

grande valor, seja na terapia assim como no diagnóstico do câncer (SILVA, 2003).

Recentemente, avanços no desenvolvimento de radiofármacos complexados com

radionuclídeos metálicos têm gerado intenso interesse para a síntese de novos agentes,

tanto para o diagnóstico (através de imagens médicas) quanto na terapia antitumoral em

sítios-específicos (HOLLAND et al., 2007). Nesse sentido, as tiossemicarbazonas e

seus complexos derivados de radionuclídeos metálicos demonstram grande

potencialidade como radiofármacos com propósitos para diagnóstico e terapia do

câncer. Um exemplo é o

Cu-ATSM (

Cu-diacetil-bis(N

-metil)tiossemicarbazonas),

que é usado na medicina nuclear como radiofármaco para formação de imagens PET

nos tumores com hipóxia. O seu complexo radioativo,

, apresenta alto nível de

seletividade nas células com hipóxia. Outro complexo, o

Cu-PTSM

(

Cu-

Piruvaldeído bis(N

-metil)tiossemicarbazonas) é radiofármaco usado na radioterapia,

principalmente contra tumores de cólon (Beraldo, 2004).

Outra grande vantagem dos complexos bis(tiossemicarbazonas) é a fácil e rápida

radiomarcação química, permitindo seu uso com radionuclídeos de meias-vidas, curta e

média, como o Flúor-18 (T

1/2

110 min), Cobre-62 (T

1/2

9 min), Cobre-64 (T

1/2

=12,7h) Desse modo, minimiza-se a dose para o radiofarmacêutico, o desperdício

devido a marcação ineficiente, bem como a contaminação microbiológica do

radiofármaco (BLOWER, 2005).

Atualmente, a busca pela otimização de radiofármacos, mais seletivos na detecção de

tumores, torna-se cada vez mais essencial, pelo fato de que os radiofármacos usados na

Justificativas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

medicina nuclear, tais como o gálio-67, tálio-201,

99m

Tc-sestamibi,

99m

Tc-tetrofosmim e

F-FDG, são, em sua maioria, marcadores de presença de atividade metabólica elevada,

o que pode resultar em falso positivo quando um processo inflamatório estiver

instalado. Os únicos radiofármacos específicos para diagnóstico clínico de tumores são

derivados de anticorpos monoclonais (por exemplo, o

111

In-satumomabe pendetida) e ou

dos peptídeos, como a somatostatina (THRALL, 2003). Neste contexto, os

radionuclídeos de cobre, devido a sua diversidade na coordenação química, podem ser

explorados no projeto do radiofármaco específicos para detecção de tumores sólidos ou

de origem linfática (WELCH et al., 2003). Estes radionuclídeos também apresentam

muitas vantagens: são mais estáveis quimicamente do que outros radionuclídeos (por

exemplo, o

99m

Tc); a sua química é restrita a dois principais estados de oxidação (I e II),

o seu potencial redox é bem estabelecido; a sua bioquímica e metabolismo em humanos

são bem conhecidos; (VÃVERE et al., 2007). Além disso, recentes pesquisas para o

desenvolvimento de novos radiofármacos complexados com o cobre têm sido

estimuladas devido à evolução das técnicas de produção destes radionuclídeos

(produção em cíclotrons); a viabilidade técnica dos radionuclídeos emissores beta

menos (β

), com meia-vida curta ou média, utilizados para radioterapia; ao crescimento

no uso dos tomógrafos por emissão de pósitrons (PET) (WELCH et al., 2003).

Segundo dados de 2007 da Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN), existem,

no território brasileiro, mais de 297 serviços de medicina nuclear, com um número

similar de câmeras SPECT, das quais 75% estão localizadas nas regiões Sudeste e Sul.

Em 1998, entrou em operação, na cidade de São Paulo, o primeiro tomógrafo por

emissão de pósitron (PET), sendo que, hoje em dia, além da cidade de São Paulo, Rio

de Janeiro, Brasília, Belo Horizonte, Salvador, também possuem clínicas que oferecem

estudos de PET. Entretanto, apenas três destas cidades (São Paulo, Rio de Janeiro) são

centros produtores de radiofármacos, tanto para as técnicas de PET e SPECT. Este fato

limita a difusão da modalidade de imagem PET a outras regiões do território,

principalmente, considerando-se que o radiofármaco mais usado na imagem PET é o

F-FDG, o qual possui meia-vida física muito curta (ROBILOTTA, 2006). Em virtude

deste problema, os radiofármacos derivados do cobre-64 apresentam uma grande

vantagem, pois possuem meia-vida física de 12,7 h, o que facilita seu acesso a regiões

mais distantes (WELCH, et al., 2003).

Justificativas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Nesta conjuntura, em se tratando das aplicações médicas dos radionuclídeos, este

trabalho têm como finalidade o desenvolvimento de radiofármacos, derivados de

tiossemicarbazonas, mais específicos para a detecção e tratamento de cânceres

humanos, visando à obtenção de um maior número de subsídios para diagnóstico ou

maior desempenho das práticas terapêuticas com uma menor dose para o paciente.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5- MATERIAIS e MÉTODOS

5.1 – Tiossemicarbazonas

Vinte compostos de tiossemicarbazonas derivadas 2-metil-toluil-acetilpiridina e 2-

piridinoformamida (TAB. 7) foram sintetizados pelo Laboratório de Química Inorgânica

da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e gentilmente cedidas ao

Laboratório de Radiobiologia do Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear-

CDTN. Primeiramente, os compostos foram sintetizados utilizando-se de vidrarias

laboratoriais, posteriormente foi usado o teflon com o objetivo de reduzir possíveis

contaminações.

Em todas as atividades biológicas in vitro e in vivo, as tiossemicarbazonas foram

solubilizadas em DMSO na concentração de 0,5%.

TABELA 7 - Tiossemicarbazonas Livres (ligantes) e complexadas com gálio,

estanho e cobre.

Nº Tiossemicarbazonas (fórmula molecular) Códigos Peso Molecular

1 H2Am4DH L1 195,14 g/mol

2 H2Am4Me L2 209,16 g/mol

3 H2Am4Et L3 223,18 g/mol

4 H2Ac4pH PH 270,35 g/mol

5 H2AcoClpH CLPH 304,80 g/mol

6 H2Ac4oT Lac 284,38 g/mol

7 H2Ac4mT Lacm 284,38 g/mol

8 H2Ac4pT Lacpt 284,38 g/mol

9 [Ga(H2Ac4oT)

](NO

)

Galac 1108,88 g/mol

10 [Ga(H2Ac4mT)

](NO

)

Galacm 1108,88 g/mol

11 [Ga(2Am4DH)

] NO

. H

O Gal 1 538,22 g/mol

12 [Ga(2Am4Me)

] NO

. HNO

Gal 2 674,28 g/mol

13 [Ga(2Am4Et)

]NO

Gal 3 576,31g/mol

14 (Sn(2Am4DH)(n-but)Cl

(Sn(2Am4DH)(n-but)Cl

)

Sn 1 1554,61 g/mol

15 (Sn(2Am4Me)(n-but)Cl

) Sn 2 454,99 g/mol

16 (Sn(2Am4Et)(n-but)Cl

) Sn 3 469,02 g/mol

17 (Sn(H2Am4Ph)(n-but)Cl

) Sn 4 572,95 g/mol

18 (Sn(2Am4Me)Cl

) Sn 5 433,33 g/mol

19 (Sn(2Am4Me)(n-but)

) .

(Sn(2Am4Me)(n-but)2Cl)(Sn(n-but)2Cl

)

Sn 6 1254,15 g/mol

20 (Cu)(H2Ac4oT)Cl Culac 382.37 g/mol

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5.2 - Cultivo celular

As linhagens de células de glioblastoma multiforme murino (RT2), status p53 selvagem,

e de glioblastoma multiforme humano (T98), status p53 mutante, foram, gentilmente

cedidas pelo Departamento de Neurocirurgia da MCV-VCU (Medical College of

Virginia, Virginia Commonwealth University) . As linhagens de células de carcinoma

mamário humano (CF-7), status p53 selvagem, e carcinoma mamário ascítico de Ehrlich

(CAE), status p53 selvagem, foram, respectivamente, cedidas pela Fundação Oswaldo

Cruz (FIOCRUZ), e pelo Departamento de Patologia Comparada do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Todas as células foram cultivadas em estufa de CO

(5% CO

Cole Parmer)

com

atmosfera úmida à 37ºC, em meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) suplementado

com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (meio DMEM

completo). Ao atingirem 80% de confluência, as células foram tripsinizadas e a

viabilidade celular foi avaliada através da exclusão do azul de Tripan.

O azul de Tripan é um corante de alto peso molecular que só é capaz de entrar em

células mortas ou que possuem a permeabilidade de membrana aumentada. A avaliação

da viabilidade celular através da exclusão do azul de Tripan consiste em incubar as

células por 1 minuto com este corante e quantificá-las com o auxílio de uma câmara de

Neubauer (FIG. 21). Células vivas em perfeito estado (membrana impermeável)

permanecem incolores e células mortas ou com a permeabilidade de membrana

aumentada são visualizadas em azul. As células viáveis (incolores) foram utilizadas nos

experimentos (Faixa de passagem: 5-20).

FIGURA 21: Câmara de Neubauer

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A manutenção das culturas foi garantida através do congelamento (-80 e -197ºC) de

alíquotas contendo 5x10

células em DMEM, acrescido de 50% de soro fetal bovino

(SFB), 1% de penicilina/estreptomicina e 10% de DMSO.

Os reagentes utilizados no cultivo celular foram obtidos da Gibco® e Cultilab®.

5.3 – Modelo Animal

Todos os experimentos com animais foram feitos de acordo com o Manual sobre os

cuidados no uso de animais de laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources –

Comission on Life Sciences – National Research Council – Washington D.C.), como

recomendado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação animal (COBEA).

Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas, pesando de 25-30g, obtidos no Centro de

bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Minas Gerais (UFMG).

Os camundongos foram acondicionados em gaiolas pequenas (30x20x15cm) com um

número máximo de 5 animais, recebendo ração e água potável ad libitum, em ambiente

com temperatura mantida à 25ºC e com ciclos dia-noite (12/12 horas)(estante ventilada

Alesco). Ao final dos experimentos os animais foram sacrificados pelo método da

guilhotina.

5.3.1 – Modelo animal tumoral.

A capacidade de detecção de sítios tumorais in vivo da tiossemicarbazona Culac-64 foi

avaliada em camundongos implantados com tumor de Ehrlich ascítico (CAE). Este tipo

de tumor possui alto índice mitótico e se caracteriza pela presença de poucas células

inflamatórias, estroma escasso e presença de células anaplásicas. Além disso, é

facilmente induzido em animais saudáveis, que não sejam imunossurprimidos, através

do transplante direto de células tumorais retiradas de um animal que já possua a

neoplasia desenvolvida. O tumor de Ehrlich foi mantido através do transplante

intraperitoneal seriado em camundongos Swiss, fêmeas, realizado em intervalos de 7

dias. Para obtenção do modelo tumoral de Ehrlich foram retirados 3 mL do fluido

ascitico. Este fluido foi centrifugado (2500 rpm) e lavado 3 vezes em solução salina

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

fisiológica para a obtenção de um líquido denso e claro, correspondente a uma

suspensão celular, com o mínimo de fibrina e hemáceas. Em seguida, as células do

tumor de Ehrlich foram contadas e analisadas quanto a sua viabilidade. A viabilidade

celular foi avaliada através da exclusão pelo azul de Tripan. Células do tumor de

Ehrlich viáveis (1,5×10

) foram implantadas entre coxins plantares do membro posterior

esquerdo dos camundongos Swiss, fêmeas, pesando de 25-30g, para obtenção do tumor

na forma sólida. Após sete dias do implante do tumor, os animais foram divididos em 7

grupos, contendo 4 animais cada, e utilizados no experimento de biodistribuição.

5.4 – Estudo do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas: avaliação da taxa

de sobrevivência das células tratadas.

A atividade citotóxica das tiossemicarbazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-piridina

foi avaliada através do ensaio com o MTT. O MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-

diphenyl-2H-tetrazolium bromide)] é um sal de coloração amarela capaz de captar

elétrons da cadeia transportadores de elétrons, em uma reação de oxi-redução. O MTT

ao ser reduzido por enzimas desidrogenases de células metabolicamente viáveis forma

cristais de coloração roxa, o Formazan (FIG. 22). Esses cristais são insolúveis em água

e apresentam pico de absorção em 570 nm.

As células tumorais RT2, T98, MCF-7 (500 células/poço), Ehrlich (1500 células/poço),

foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e incubadas por 24 horas para

aderência. Decorrido esse tempo, diferentes concentrações das tiossemicarbazonas

(20fM a 20µM),

foram adicionadas as células aderidas. Em seguida, as células foram

novamente incubadas por mais 48 horas. Após este tempo, as células foram incubadas

com o MTT (0,5 mg/mL) durante 4 horas, ao abrigo da luz. Posteriormente, o

sobrenadante contendo MTT foi retirado e 100 µl de DMSO foram colocados em cada

poço para solubilizar os cristais de Formazan. As amostras foram medidas por

espectrofotometria em um leitor de microplaca UV-visível (Molecular Devices) a 570

nm. A fração de sobrevivência foi calculada como porcentagem do controle

(Absorbância no controle =100% de sobrevivência). Os experimentos foram feitos em

quadruplicatas. O valor do IC50 (concentração do composto que produziu 50% de

morte celular) dos compostos Culac, Lac, Lacm, Lacpt, foram determinados

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

graficamente usando o programa Graphpad Prism. Os aspectos morforlógicos das

células MCF-7, Ehrlich, RT2 e T98 foram analisados pela observação ao M.O das

células controle e das tratadas com essas tiossemicarbazonas.

Foram realizados, em paralelo, testes usando dimetilsulfóxido (DMSO) como controle

negativo, pois as tiossemicarbazonas foram pré-dissolvidas em DMSO a 0,5%.

FIGURA 22: Desenho esquemático do MTT sendo reduzido pelas enzimas

desidrogenases de células metabolicamente viáveis e dando origem ao Formazan.

5.5 – Estudo do efeito das tiossemicarbazonas sobre a proliferação celular.

Células tumorais RT2 foram incubadas em placas de Petri de 40 mm (65 células/placa)

por 24h para aderência. Posteriormente, as células foram tratadas com as

tiossemicarbazonas de códigos L1, L2, L3, L4, PH, Lac, Lacm, Lacpt, Galac, Galacm,

Gal 1, Gal 2, Gal 3, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6 (TAB. 7) e depois incubadas por um

período de sete dias para permitir a formação de colônias isoladas. Após esse período,

as placas foram lavadas em PBS e então coradas pelo Giemsa. Este método de

coloração consiste em incubar as placas primeiramente com metanol (100%) em

temperatura ambiente por 15-30 minutos. Em seguida, o metanol é descartado e

quantidade suficiente de solução Giemsa (0,074%) é acrescentado. A incubação com

N N

N CH

NAD

NADH

FORMAZAM MTT

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Giemsa também ocorre à temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após a

incubação as placas foram lavadas para posterior contagem das colônias isoladas. A

porcentagem de capacidade proliferativa (clonogenicidade) foi calculada dividindo-se o

número de colônias nas placas tratadas pelo número de colônias nas placas controle. Os

experimentos foram realizados em triplicata.

5.6-Análise das alterações do DNA cromossomal, induzidas pelas

tiossemicarbazonas Lac, Lacm, Lacpt e Culac, através da coloração com DAPI.

O DAPI (4´,6- diamidine- 2´- phenindole dihydrocloride) é um corante fluorescente,

capaz de se ligar especificamente às fitas duplas do DNA cromossomal (KUBOTA et

al., 2000).

Após a fase inicial de triagem, as tiossemicarbazonas Lac, Lacm, Lacpt e Culac foram

selecionadas para estudo mais detalhado do mecanismo de ação. Para análise das

alterações do DNA cromossomal, células RT2, T98, MCF-7, Ehrlich, foram semeadas

em placas de 96 poços e, após 24h, foram tratadas com as tiossemicarbazonas de

códigos Lac, Lacm, Lacpt, Culac, Culac-64 (ativada neutronicamente), na concentração

de 0,2 µM. Após 48h de tratamento, as células foram lavadas 1x com PBS e fixadas em

metanol (gelado) por 20 minutos. Após fixação, as células foram lavadas novamente 1x

com PBS e incubadas por 30 minutos com DAPI (SIGMA – Chemical Co.) na

concentração de 400 ng/mL, diluído em PBS. Após o período de incubação, o

sobrenadante contendo DAPI foi retirado e as células foram lavadas 5x com PBS.

Núcleos das células corados com DAPI foram visualizados em microscópio de

fluorescência (Nikon- 385-410 nm).

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5.7 – Produção de radiofármaco via ativação neutrônica no reator TRIGA-

IPR-R1.

As tiossemicarbazonas de códigos Sn1 e Culac foram irradiadas na mesa giratória e

tubo central, respectivamente, por 8 horas, no núcleo do reator nuclear de pesquisa

TRIGA MARK I IPR-RI, fabricado pela GENERAL ATOMIC COMPANY e que

opera atualmente a uma potência de 100 kW.

O núcleo do reator TRIGA MARK I IPR-RI forma um cilindro com 91 posições onde

estão instalados 63 elementos combustíveis-moderadores. O combustível usado é o

235

U, sendo que cada núcleo de

235

U que sofre fissão produz em média 2,5 nêutrons e

um fluxo máximo em torno de 10

nêutrons.cm

-2

-1

. A FIG. 23 mostra um diagrama do

atual núcleo do reator TRIGA-IPR-R1.

FIGURA 23: Núcleo do reator TRIGA-IPR-R1 (Vista Radial).

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

O reator TRIGA possui quatro dispositivos principais para irradiação de amostras: Tubo

Central, Mesa Giratória com 40 posições, e dois terminais pneumáticos TP1 e TP2.

O Tubo Central consiste de um tubo de alumínio que é capaz de penetrar a região

central do núcleo o que possibilita a irradiação de amostras sob fluxos neutrônicos mais

intensos (FIG.24). Atualmente, o fluxo nêutrons térmicos máximo é de

4,3 x 10

n.cm

².s

-1

a 100 kW (CTORP, 2004).

A Mesa Giratória aloja-se numa cavidade, em forma de anel, do refletor de grafite.

Contém 40 tubos cilíndricos nos quais são inseridas as amostras. Estas, por sua vez, são

colocadas em frascos de plástico ou de alumínio com formato cilíndrico e são

introduzidas na Mesa Giratória através de um pick-up magnético que desce por um

canal de acesso (FIG. 24). O fluxo de nêutrons térmicos na mesa giratória é de

6,5 x 10

n.cm

-2

-1

a 100 kW (CTORP, 2004).

Todas as irradiações realizadas neste trabalho foram feitas no Tubo Central e na Mesa

Giratória, para tanto, as amostras foram acondicionadas em tubos de polietileno médio,

TM (FIG. 25C). Estes foram colocados em tubos de polietileno maiores, TG (FIG.

25B), que por sua vez foram colocados em frascos de poliestireno denominados “porta

amostra”, sem o filtro de cádmio (FIG. 25A).

Tubo Central

Mesa Giratória

FIGURA 24 – Maquete do Reator TRIGA onde mostra

a Mesa Giratória e o Tubo Central (Fonte: CDTN)

Tubo Central

Mesa

Giratória

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Amostras das tiossemicarbazonas de códigos Culac e Sn1, pesando 3 mg cada, foram

irradiadas, através das reações de capturas neutrônicas:

Cu(n, γ)

Cu para o cobre-63,

com abundância isotópica de 69%, seção de choque de 4,50 barn;

112

Sn(n, γ)

113

Sn,

abundância isotópica 0,0097%, seção de choque 0,54 barn.

Depois de irradiados no reator TRIGA-IPR-R1, as amostras das tiossemicarbazonas de

códigos Sn1 e Culac foram analisadas por espectrometria gama para determinação de

suas atividades específicas e concentrações elementares.

Para análise das tiossemicarbazonas através da espectrometria gama foram utilizados

dois sistemas de contagem do Laboratório de Radioquímica do CDTN. O primeiro deles

(sistema de contagem 1) conta com um detector HPGe (Hiper Pure Germanium)

modelo CANBERRA GC 1518 (eficiência de contagem: 15%; resolução: FWHM (Full-

Width Half-Maximum) 1,85 keV para a energia 1332 keV do Co

). O programa

computacional para aquisição e tratamento de espectros neste sistema é o Maestro, EG

& G ORTEC. O segundo (sistema de contagem 2) conta com um detector HPGe modelo

CANBERRA 5019, (eficiência de contagem: 50%; resolução: FWHM 1,85 keV para a

energia 1332 keV do Co

) e o programa computacional Gennie 2000 v2.0,

CANBERRA. Estes dois sistemas de contagens permitiram a aquisição de espectros e

FIGURA 25 – Frascos utilizados para irradiação das amostras. Frasco A:

porta amostra; frasco B: tubo grande (TG) e frasco C: tubo médio

(TM), com todas as medidas em milímetros (DA COSTA, 2007).

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

conseqüentemente a análise de fotopicos com suas energias determinadas em keV.

Desse modo, foi possível determinar e caracterizar os isótopos presentes nas amostras,

assim como suas atividades específicas.

O cálculo das atividades específicas das amostras foi determinado pela relação entre

área de contagem, geometria de contagem, tempo de irradiação, tempo de contagem t

- t

, ( t

é o instante do início da medida e t

do final da mesma), meia-vida dos

isótopos (T

1/2

), correção do decaimento, eficiência do detector e rendimento gama (Y

)

dos isótopos, seguindo os cálculos das equações abaixo.

A taxa de contagem dos fotopicos )(tC

no espectrômetro gama é proporcional à

atividade da amostra (KASTNER et al., 2005):

Ċ (t) = g A(t) (7)

onde a constante de proporcionalidade g é dada por:

g = ε

(8)

sendo ε

é a eficiência de contagem e Y

é o rendimento gama.

Integrando-se (7), obtém-se a contagem total durante o intervalo de medida:

()

(

)

eeeNYC

λτ

γγ

φσ

−

−−

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−

= 1

(9)

Onde N é o número de núcleos alvos na amostra,

é a sessão de choque para captura

neutrônica do elemento alvo,

é o fluxo total de nêutrons térmicos no reator,

é a

constante de decaimento do radioisótopo (

=ln2/T

1/2

, sendo T

1/2

a meia-vida do

radioisótopo).

A atividade induzida A do cobre-64 foi calculada, sabendo-se que:

γγ

A =

(10)

A atividade específica Aesp. do cobre-64 foi calculada pela equação abaixo:

Aesp =.

(11)

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

Sendo A é atividade induzida e m é a massa em gramas do composto.

O cálculo das concentrações dos elementos presentes nas amotras das

tiossemicarbazonas irradiadas foi realizado pelo método paramétricro K

5.8 – Avaliação do comportamento químico da tiossemicarbazona

Culac,

após irradiação no reator TRIGA IPR-R1, através da espectroscopia de absorção

no infravermelho (IV).

O objetivo da espectroscopia de absorção no infravermelho (IV) é a determinação dos

grupos funcionais de um dado material. O princípio desta técnica é que cada grupo

absorve uma freqüência característica de radiação na região do IV. Assim, pode-se obter

um gráfico de intensidade de radiação versus freqüência, o espectrograma de IV, o qual

permite caracterizar os grupos funcionais de um padrão ou de um material

desconhecido.

Para esta avaliação através da espectroscopia de absorção no infravermelho (IV) foi

utilizado o Espectrofotômetro FTIR, marca ABB Bomen, modelo MB 102. O material

utilizado para o preparo das amostras foi o KBr por ser relativamente barato e não

possuir banda de absorção na região analisada. As condições do ensaio foram:

- Número de varreduras: 128;

- Resolução: 4 cm

-1

;

- Foram feitas pastilhas de KBr e secadas a 300 graus centígrados por três horas. Esse

procedimento permitiu eliminar toda a água presente no KBr, já que este material é

bastante higroscópico.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5.9 - Avaliação da toxicidade produzida pela tiossemicarbazona culac in

vivo.

A tiossemicarbazona Culac foi administrada intravenosamente em camundongos Swiss

fêmeas, saudáveis, com objetivo de se avaliar a toxicidade ocasionada por este

composto, bem como assegurar a integridade fisiológica dos animais nos estudos de

biodistribuição a serem realizados posteriormente. Para tanto, utilizou-se a mesma dose

de 136 µg/Kg estipulada para se avaliar o perfil de biodistribuição do composto ativado

neutronicamente. Nove camundongos, pesando de 25-30g, foram separados em dois

grupos experimentais contendo 2 animais no grupo controle, injetados (via intravenosa,

caudal) com solução salina estéril (0,9%), e 7 animais no grupo tratado, injetados (via

intravenosa caudal) com a tiossemicarbazona Culac, dissolvidas em salina tamponada

contendo DMSO (0,5%). Os animais foram sacrificados, pelo método da guilhotina, 24

e 144 horas após tratamento e os órgãos como encéfalo, coração, pulmão, fígado, baço,

rins, ovários foram dissecados para confecção das lâminas histológicas (coradas com

hematoxilina-eosina) e posterior análise histopatológica no laboratório de Patologia

Comparada, da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

5.10 – Estudo do perfil de biodistribuição da tiossemicarbazona

Culac e de

sua capacidade para detecção de sítios tumorais in vivo .

A interação da tiossemicarbazona de código

Culac com células tumorais in vivo foi

realizada em animais com tumor de Ehrlich, com o objetivo de avaliar o potencial desta

molécula ativada neutronicamente como radiofármaco para detecção de tumores

sólidos.

A biodistribuição foi realizada injetando-se a tiossemicarbazona

Culac (18,7 KBq)

diluída em 200 µL salina (contendo 0,5% DMSO) nos animais, por via intravenosa (i.v.)

caudal. Após diferentes tempos de injeção (10, 30, 60, 240, 1440, 2880 min.), os

animais foram sacrificados pelo método do guilhotinamento (guilhotina Insight, modelo

EB271) e depois coletadas amostras de sangue (50 µL). Os órgãos (tiróide, coração,

pulmões, fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino, bexiga, rins, músculo esquelético,

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

ossos, cérebro, aparelho reprodutor), patas também foram removidos para avaliação do

perfil de biodistribuição, bem como da interação com o tumor. A radioatividade

(emissão gama) em cada órgão foi determinada no contador gama, tipo poço,

automático, modelo 1480 Wizard 3´´ (Janela de 511 keV, com eficiência do aparelho de

89% para o cobre-64).

Os resultados foram expressos como percentual da dose injetada por grama de cada

órgão (%DI/g) e analisados no programa Graphpad Prism. Os valores da dose injetada

foram ajustados através da subtração da radioatividade remanescente na cauda do

animal.

O cloreto de cobre ativado (

CuCl

) foi usado como controle e injetado nas mesmas

condições do

Culac, sendo que os animais foram sacrificados após 4 horas.

5.11 - Cálculos farmacocinéticos.

A caracterização do perfil farmacocinético de uma nova molécula pode ser obtida do

cálculo de parâmetros matemáticos calculados a partir de dados de biodistribuição. Os

principais parâmetros são a área sob a curva (ASC), o volume de distribuição (Vd), a

depuração (ou clearance), a meia-vida e a biodisponibilidade.

Para simplificação dos cálculos realizados neste trabalho foi assumido que o perfil

farmacocinético correspondia ao modelo monocompartimental, no qual o corpo é

considerado um compartimento único. Este modelo descreve adequadamente as

alterações sofridas ao longo do tempo na concentração plasmática e na via de excreção

de fármacos que após a administração se distribuem rapidamente para os tecidos.

A biodisponibilidade diz respeito à quantidade de uma substância que, introduzida no

organismo, ganha a circulação e torna-se disponível para exercer sua atuação

terapêutica. O cálculo deste parâmetro é dispensável quando a via de administração é a

endovenosa, pois 100% da droga está disponível na circulação.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

A ASC foi calculada a partir do gráfico de cinética sanguínea das moléculas e foi

utilizada para determinação dos tempos de meia-vida, volume de distribuição e

depuração.

A depuração indica o volume de líquido biológico (sangue/ plasma) totalmente livre do

fármaco em uma determinada unidade de tempo. Na verdade, é a medida da eficiência

do corpo na eliminação da molécula. A depuração plasmática (C

) foi calculada pela

equação:

= D/ASC (mL/min)

Onde:

D = massa da droga administrada

ASC = área sob a curva no gráfico que descreve a concentração da molécula na

circulação sanguínea.

O volume de distribuição é a constante de proporcionalidade que descreve a relação

entre a quantidade de fármaco em todo o organismo e a quantidade existente no sangue

ou plasma e foi calculado pela equação:

Vd = D/Cp (mL)

Onde:

Vd = volume de distribuição aparente

D: massa da droga administrada

Cp: concentração sanguínea após completa administração.

O tempo de meia-vida no plama é o intervalo de tempo durante o qual um fármaco tem

sua concentração plasmática reduzida em 50%. A meia vida também pode ser calculada

independentemente para cada órgão no qual a molécula se acumula. Os valores de meia-

vida foram determinados diretamente a partir dos gráficos de cinética, para cada órgão

de interesse.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

5.12 - Manipulação de radioisótopos.

Após 12 h da irradiação da tiossemicarbazona Culac no reator TRIGA-IPR-1, as

amostras foram acondicionadas em “castelos” (blindagens) de chumbo, e em seguida

monitoradas. A liberação das amostras foi feita seguindo-se a norma da CNEN-NE-

6.02.

Todos os experimentos foram realizados obedecendo-se aos cuidados de radioproteção,

de acordo com a norma CNEN-NE-3.01, tais como, uso de blindagem de chumbo e

acrílico revestido com chumbo para o cobre-64; uso dos equipamentos de proteção

individual (EPI), tais como luvas cirúrgicas descartáveis, óculos de segurança, jalecos,

dosímetros individuais; bancadas devidamente forradas com plásticos e papéis toalha;

monitorações de superfícies com o detector Geiger-Müller.

Os rejeitos radioativos foram separados quanto ao tipo material (sólido ou líquido) e

acondicionados em sacos plásticos, lixeiras blindadas e bombonas de polipropileno até

o completo decaimento. Após o decaimento, os rejeitos foram recolhidos pelo setor de

rejeitos do CDTN.

Após os experimentos com animais, as carcaças e órgãos foram embalados em sacos

plásticos (cor branca), identificados (data e tipo de isótopo) e acondicionados em freezer

-20ºC por um período suficiente para permitir o decaimento do isótopo de cobre.

Posteriormente, foram monitorados com o detector de exposição de dose RADIATON

SURVEY METER PRM 301 e aqueles classificados como lixo não radioativo foram

descartados como resíduo de serviço de saúde.

5.13 -Análise estatística.

Todos os experimentos foram realizados em quadruplicatas, inclusive os respectivos

grupos controles. Os resultados foram expressos como a média e desvio padrão de, pelo

menos, três experimentos. Os dados foram analisados pelo teste t de Student não

pareado; foram considerados significativos aqueles dados com p<0,05.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

6 - RESULTADOS

6.1 – Triagem das tiossemicarbazonas com atividade antitumoral sobre

células tumores cerebrais (RT2).

6.1.1 – Avaliação do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas L1, L2,

L3, Lac, Lacm, PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6, Galac, Galacm, Gal 1, Gal

2, Gal 3.

O estudo do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas foi avaliado pela medida da taxa

de sobrevivência das células em relação ao controle, através do ensaio com sal tetrazólio

MTT.

A FIG. 26 apresenta o efeito das tiossemicarbazonas de códigos L1, L2, L3, Lac, Lacm,

PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6, Galac, Galacm, Gal 1, Gal 2, Gal 3, sobre a

sobrevivência celular nas células RT2, após 48 horas do tratamento. Todas as

tiossemicarbazonas testadas foram capazes de produzir forte redução (>60% de redução,

p<0,001) da sobrevivência celular na concentração de 10 µg/mL (5-82µM). Além disso,

a complexação metálica com o ligante produziu um aumento da atividade antitumoral,

como se pode observar pelo efeito dos complexos de estanho e gálio.

Os controles realizados na presença do solvente DMSO a 0,5% não apresentaram

alterações significativas.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

100

L1 L2 L3 Lac Lacm PH ClPH Sn1 Sn2 Sn3 Sn4 Sn5 Sn6 Galac

alac

Gal 1 Gal 2 Gal 3

100

Tiossemicarbazonas

Sobrevivência

(% controle)

FIGURA 26 – Avaliação do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas sobre as

células RT2. Células RT2 foram semeadas em placas de 96 poços numa densidade de

500 céls/poço e incubadas por 24 h. Após este período, as tiossemicarbazonas foram

adicionadas na concentração de 10 µg/mL diluídas em DMEM. A sobrevivência celular

foi avaliada pelo ensaio do MTT. O maior efeito citotóxico encontrado foi da

tiossemicarbazona complexada com estanho (Sn6) e ocasionou a sobrevivência de

apenas 0,55 ± 0,50% das células tratadas (n=4, p <0,001).

6.1.2 – Avaliação do efeito das tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac, Lacm,

PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5, Sn6, Gal 1, Gal 2, Gal 3, Galac, Galacm, sobre

a proliferação celular.

A avaliação do efeito das tiossemicarbazonas sobre a proliferação celular de células

RT2 foi realizado através do teste clonogênico. Células foram semeadas em placas de

Petri de 40 mm e tratadas com diferentes tiossemicarbazonas por um período de 48 h.

Após período de incubação de 7 dias, as placas de células foram coradas pelo Giemsa

para posterior contagem de colônias. Apenas colônias com mais de 50 células foram

consideradas. As tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac, Lacm, Sn1, Sn4, Sn5, Sn6,

Galac, Galcm, Gal 1, Gal 2, Gal, com exceção da Sn2 (86,4 + 2,4%) e Sn3 (11,2 + 0,8%),

inibiram totalmente (100 ± 0,0%) a formação de colônias das células de glioblastoma

multiforme em relação ao controle, na concentração de 10µg/mL (n=3, p< 0,05).

Os controles realizados na presença do solvente (0,5% de DMSO) não apresentaram

alteração significativa na proliferação.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

101

6.1.3 – Avaliação geral das atividades citotóxica e antiproliferativa das

tiossemicarbazonas L1, L2, L3, Lac, Lacm, PH, ClPH, Sn1, Sn2, Sn3, Sn4, Sn5,

Sn6, Gal 1, Gal 2, Gal 3, Galac, Galacm em células de RT2.

Os resultados da atividade antitumoral das tiossemicarbazonas sobre células de

glioblastoma multiforme são descritos na TAB. 8. Os efeitos antiproliferativo e

citotóxico destes compostos, na concentração de 10 µg/mL, foram avaliados,

respectivamente, pelo teste Clonogênico e ensaio do MTT, como descrito em métodos.

Os dados mostram que todos os compostos testados foram altamente ativos contra

células de RT2. O mecanismo da atividade antitumoral observada envolveu tanto

mecanismos citotóxicos quanto antiproliferativos. O composto que apresentou maior

atividade citotóxica (99%) foi o complexo de estanho SN6 que também produziu a

completa inibição da taxa de proliferação. Dos dezoito compostos avaliados, o

composto Sn4 foi o menos ativo produzindo 45% de citotoxicidade, contudo inibiu

completamente a proliferação.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

102

Tiossemicarbazonas

(códigos)

% Morte Celular*

(Ensaio MTT)

% Inibição da

Proliferação*

(Teste Clonogênico)

L1 89,6 + 0,6 100 + 0,0

L2 85,1 + 1,8 100 + 0,0

L3 21,9 + 7,9 100 + 0,0

Lac 87,3 + 1,7 100 + 0,0

Lacm 90,0 + 0,7 100 + 0,0

PH 89,9 + 1,3 100 + 0,0

ClPH 72,1 + 9,0 100 + 0,0

Sn1 77,2 + 4,6 100 + 0,0

Sn2 70,1 + 5,6 86,4 + 2,4

Sn3 81,9 + 4,7 11,2 + 0,8

Sn4 45,8 + 8,5 100 + 0,0

Sn5 73,4 + 6,0 96,8 + 0,2

Sn6 99,4 + 0,5 100 + 0,0

Galac 87,5 + 0,6 100 + 0

Galacm 88,7 + 1,4 100 + 0,0

Gal 1 89,5 + 0,8 100 + 0,0

Gal 2 87,6 + 7,8 100 + 0,0

Gal 3 88,2 + 4,3 100 + 0,0

* Resultados expressos pela média de 4 experimentos e seus desvios padrão absoluto.

6.2 - Avaliação do efeito antitumoral das tiossemicarbazonas derivadas 2-

piridinoformamida e seus complexos de estanho

Após triagem de todos os compostos da TAB. 8, alguns foram selecionados para

caracterização mais detalhada da atividade antitumoral observada e avaliação do

potencial radiofarmacêutico. Avaliação do efeito tumoral foi realizada pelo ensaio do

MTT e obtida através da análise das curvas de sobrevivência celular. Células de RT2

foram semeadas em placas de 96 poços e após 24h tratadas com diferentes

concentrações (2 nM a 0,2 mM) das tiossemicarbazonas L1,L2,L3, Sn1, Sn2 e Sn3..

TABELA 8 - Atividade antitumoral das tiossemicarbazonas contra

células RT2.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

103

Os valores da IC

(concentração do composto que produziu 50% de morte celular)

foram calculados plotando-se a porcentagem de sobrevivência celular versus

concentração dos compostos, através do programa Graphpad Prism.

Os resultados obtidos mostraram que as tiossemicarbazonas ligantes (L1, L2, L3) e as

complexadas com estanho (Sn1, Sn2 e Sn3), derivadas da 2-piridinoformamida, foram

citotóxicas para as células RT2, como mostrado nos valores da IC

na TAB 9. A

tiossemicarbozona L3 apresentou menor ação citotóxica, com valor da IC

80 vezes

menor que as tiossemicarbazonas L1 e L2. Contudo, quando complexada com estanho

(Sn3), sua atividade citotóxica aumentou 53 vezes. Dessa forma, pode-se constatar que

a complexação metálica com estanho aumentou a potência citotóxica.

TABELA 9 – Análise comparativa do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas

derivadas de 2-piridinoformamida nas células RT2.

Código COMPOSTOS IC

RT2 (p53 selvagem)

L1 H2Am4DH

6,79 µM

L2 H2Am4Me

17,80

µM

L3 H2Am4Et

243,00 µM

Sn1 (Sn(2Am4DH)(nbut)Cl

)

5,83

µM

Sn2 (Sn(2Am4Me)(n-but)Cl

)

2,89 µM

Sn3 (Sn(2Am4Et)(n-but)Cl

)

3,78 µM

6.3 - Avaliação do efeito antitumoral das tiossemicarbazonas derivadas da

N4-orto-toluil 2--acetilpiridina e seu complexo de cobre sobre células tumorais.

Após triagem de todos os compostos da TAB. 8, alguns foram selecionados para

caracterização da atividade antitumoral observada e avaliação do potencial

radiofarmacêutico. Avaliação do efeito tumoral foi realizada pelo ensaio do MTT.

Células de RT2 (p53 selvagem), T98 (p53 mutante), MCF-7 (p53 selvagem) e CAE

(p53 selvagem) foram semeadas em placas de 96 poços e após 24h tratadas com

diferentes concentrações (20 fM a 0,2 mM) das tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm e

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

104

Lacpt. A avaliação dos efeitos antitumorais foi obtida através da análise da curvas de

sobrevivência celular. Os valores da IC

(concentração do composto que produziu

50% de morte celular) foram calculados plotando-se a porcentagem de sobrevivência

celular versus concentração do composto, através do programa Graphpad Prism.

Os resultados obtidos mostraram que as tiossemicarbazonas ligantes (Lac, Lacm, Lacpt)

e complexada com cobre (Culac), derivadas da N4-toluil-2-acetilpiridina, foram

citotóxicas para as células RT2, T98, MCF-7 e CAE, como mostrado na TAB 10. Esses

efeitos foram independentes do status da p53. Pela análise dos valores das IC

dos

ligantes, a posição orto, meta ou para, no tolueno, não interferiu na potência do

composto assim como a sua complexação metálica. O cloreto de cobre (CuCl

) foi

usado como controle e os valores das IC

nas células tratadas variaram de 1,27 a 1,4

mM.

TABELA 10 - Análise comparativa do efeito citotóxico das tiossemicarbazonas

derivadas de N(4)-toluil-acetilpiridina em diferentes linhagens tumorais.

IC50*

Compostos

RT2

(p53 selvagem)

T98

(p53 mutante)

MCF-7

(p53 selvagem)

CAE

(p53 selvagem)

Culac

0,014** ±

0,001

0,023

0,006 0,039

0,003 0,052 ± 0,009

Lac

0,018 ± 0,007 0,034

0,003 0,023

0,001 0,039 ± 0,003

Lacm

0,024 ± 0,002 0,050

0,005 0,052

0,009 0,096 ± 0,004

Lacpt

0,017 ± 0,001 0,037

0,003 0,024

0,005 0,034 ± 0,009

*Resultados expressos em µM.** Média e desvio padrão absoluto.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

105

6.4 – Análise morfológica das células tumorais submetidas ao tratamento

com as tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-toluil-acetilpiridina: Lac, Culac,

Lacm, Lacpt.

As análises morfológicas foram realizadas, com o auxílio de uma câmera fotográfica

digital acoplada ao microscópio óptico (M.O.). As células tumorais RT2, T98, MCF-7,

CAE, submetidas ao tratamento com as tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt,

em diferentes concentrações (20 fM a 0,2 mM) foram visualizadas e fotografadas. As

alterações sofridas pelas células tumorais tratadas na concentração de 2µM podem ser

observadas nas FIGs. 27-30. Todos os compostos testados demonstraram potente

atividade citotóxica nas células tumorais tratadas, pois foram observados

arredondamento celular, redução no número de células, redução do volume

citoplasmático, formação de vesículas (blebs) na membrana plasmática, característicos

do processo de morte celular programada (apoptose). Não foram observadas alterações

celulares no grupo controle (DMSO a 0,5%).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

106

Controle

Lacm

acpt

Lac

Culac

FIGURA 27 - Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das

células RT2. As alterações morfológicas sofridas pelas células RT2, após

48 h de tratamento com as tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt, na

concentração de 2 µM, revelaram redução do volume celular

(encolhimento), arredondamento e formação de vesículas (blebs) na

membrana plasmática, característicos do processo apoptótico. Imagens

adquiridas em Câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500,

acoplada ao M.O. (aumento 200x).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

107

Controle

Lacm

Lacpt

Lac Culac

FIGURA 28- Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das

células T98. As alterações morfológicas sofridas pelas células T98, após

48 h de tratamento com as tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt, na

concentração de 2 µM, revelaram redução do volume celular

(encolhimento), arredondamento e formação de vesículas (blebs) na

membrana plasmática, característicos do processo apoptótico. Imagens

adquiridas em Câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500,

acoplada ao M.O. (aumento 200x).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

108

Controle

Culac

Lacpt

Lacm

Lac

FIGURA 29 - Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das

células MCF-7. As alterações morfológicas sofridas pelas células MFC-7,

após 48 h de tratamento com as tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm,

Lacpt, na concentração de 2 µM, revelaram redução do volume celular

(encolhimento), arredondamento e formação de vesículas (blebs) na

membrana plasmática, característicos do processo apoptóticos. Imagens

adquiridas em Câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500,

acoplada ao M.O. (aumento 200x).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

109

Controle

Lacm Lac

Lac

Culac

FIGURA 30 - Fotomicrografias ópticas da análise morfológica das

células CAE. As alterações morfológicas sofridas pelas células CAE, após

48 h de tratamento com as tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt, na

concentração de 2 µM, revelaram redução do volume celular

(encolhimento), arredondamento e formação de vesículas (blebs) na

membrana plasmática, característicos do processo apoptóticos. Imagens

adquiridas em Câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500,

acoplada ao M.O. (aumento 200x).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

110

6.5-Análise das alterações do DNA cromossomal, induzidas pelas

tiossemicarbazonas Lac, Lacm, Lacpt, Culac, através da coloração com DAPI.

Células tumorais RT2, T98, MCF-7 e CAE foram semeadas em placas de 96 poços e

após 24h tratadas com as tiossemicarbazonas de códigos Lac, Lacm, Lacpt, Culac, na

concentração de 0,2 nM, próxima ao IC

(concentração do composto que produziu 50%

de morte celular, estabelecidas nos ensaios citotóxicos). Depois de 48h, as células foram

reveladas através da coloração DAPI.

Nas células controle se observa uma coloração mais homogênea compatível com a

ausência de pontos de condensação de DNA. As células tratadas apresentam pontos de

condensação de DNA, visualizados por pontos brilhantes focais, fragmentação

perinuclear e formação de corpos apoptóticos. Os resultados mostram que a coloração

DAPI permitiu avaliar não só a fragmentação do DNA, bem como outras características

da apoptose como a condensação da cromatina, formação de corpos apoptóticos, em

todas as linhagens de células tratadas (FIGs 31-34) . Todas as alterações morfológicas

observadas no DNA cromossomal são características do processo de morte celular

programada, o que demonstra grande potencial destas tiossemicarbazonas para induzir à

apoptose. No entanto, para se caracterizar melhor o mecanismo de ação e para se definir

com maior exatidão os tipos de morte celular desencadeados por estes compostos outros

ensaios mais especificos ainda deverão ser realizados.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

111

Controle

Lacm Lacpt

Lac Culac

FIGURA 31 - Fotomicrografias das análises das alterações do DNA

cromossomal induzidas pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm,

Lacpt nas concentração de 0,2 nM sobre células RT2 . Nas células

tratadas foram observados condensação da cromatina (setas grossas),

fragmentação (asterisco), formação de corpos apoptóticos (setas finas)

(M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

112

Controle

Corpos

Apoptóticos

Necrose

secundária

Lacpt

Lac

Lacm

Culac

FIGURA 32 - Fotomicrografias das análises das alterações do DNA

cromossomal induzidas pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm,

Lacpt na concentração de 0,2 nM sobre células T98. Nas células

tratadas foram observados condensação da cromatina (setas grossas),

fragmentação (asterisco), formação de corpos apoptóticos (setas finas)

(M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

113

Controle

Lacpt

Lac

Culac

Lacm

FIGURA 33 - Fotomicrografias das análises das alterações do DNA

cromossomal induzidas pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm, Lacpt

na concentração de 0,2 nM sobre células MCF-7 . Nas células tratadas

foram observados condensação da cromatina (setas grossas),

fragmentação (asterisco), formação de corpos apoptóticos (setas finas)

(M.O, aumento de 400x-Nikon).

Controle

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

114

Controle

Culac

Lacpt

Lac

Lacm

FIGURA 34 - Fotomicrografias das análises das alterações do DNA

cromossomal induzidas pelas tiossemicarbazonas Lac, Culac, Lacm,

Lacpt na concentração de 0,2 nM sobre células CAE . Nas células

tratadas foram observados condensação da cromatina (setas grossas),

fragmentação (asterisco), formação de corpos apoptóticos (setas finas)

(M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

115

6.6 - Produção de radiofármaco baseado em complexos metálicos derivados

de 2- piridinoformamida e N(4)orto-toluil-2-acetilpiridina tiossemicarbazona via

ativação neutrônica no reator TRIGA IPR-R1.

Amostras das tiossemcarbazonas Culac e Sn1 foram irradiadas, por 8 horas, na Mesa

Giratória e no Tubo Central do reator TRIGA IPR-R1. Em seguida, os compostos foram

analisados por espectrometria gama nos sistemas de contagem 1 e 2, descritos na

metodologia. A partir da análise os espectros dos compostos foi possível determinar as

áreas dos fotopicos e, conseqüentemente, as atividades específicas induzidas dos

radioisótopos presentes nos compostos, através das equações 9 e 10, na página 94.

Como mostrado na FIG. 35 a irradiação da tiossemicarbazona Sn1 (

112

Sn), pela reação

de captura neutrônica

112

Sn(n, γ)

113

Sn resultou em interferências isotópicas como a do

153

Sm , T

1/2

de 46,2 h, com energia gama de 103, 18 keV;

117m

Sn, T

1/2

de 13,6 d, com

energia gama de 158,56 keV; além do

125

Sb, T

1/2

2,73 a, com energia de 427,89 keV,

como produto do decaimento do

125

Sn, impossibilitando seu uso como radiofármaco.

0 500 1000 1500 2000 2500

1000

2000

3000

4000

Sb125

113

Sm153

117m

Contagem Gama

Energia (keV)

FIGURA 35 – Espectro total da tiossemicarbazona Sn1 ativada

neutronicamente na Mesa Giratória do reator TRIGA IPR-R1. O

espectro total mostra os fotopicos do

153

Sm,

127m

Sn,

113

Sn,

125

Sb.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

116

A produção de

Culac por ativação neutrônica não exigiu nenhum processo de

separação radioquímica, uma vez que a produção do

Cu foi realizada via reação de

captura neutrônica,

Cu(n, γ)

Cu e não foi observada nenhuma interferência isotópica.

Desse modo, permitiu que os compostos

Culac fossem usados nos ensaios biológicos

logo após irradiação.

Na análise dos espectros gama da tiossemicarbazona

Culac, sintetizada em vidraria

comum, foram encontrados o fotopico de 511 keV, área líquida de 508.000 ± 0,13%, o

fotopico de 1346 keV, área líquida de 3600 ± 1,6%, característicos do radioisótopo

e o fotopico 1368 keV, área líquida de 1400 ± 2,8%, do radioisótopo

Na (FIG. 36). A

presença do radioisótopo

Na no composto indica alguma contaminação ocorrida

durante a síntese deste composto, ou durante as manipulações para o preparo das

irradiações no reator (FIG. 37).

Nesta técnica de produção dos radiofármacos foi possível determinar as concentrações

dos diferentes elementos presentes nas amostras irradiadas pelo método paramétrico k

Para tanto, amostras da tiossemicarbazona Culac foram irradiadas juntas com padrões

de Na

por 8 horas, na Mesa Giratória do reator TRIGA IPR-R1. A espectrometria gama

foi realizada no sistema de contagem-1 e as análises dos fotopicos de 1346 keV (cobre)

e 1368 keV (sódio), indicaram as concentrações de 18 ± 1% para o Cu e 700 ± 20 ppm

para o Na. O valor obtido para a concentração de Cu da tiossemicarbazona Culac está de

acordo com a estequiometria do composto ((Cu)(H2Ac4oT)Cl).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

117

0 500 1000 1500 2000 2500

20000

40000

60000

80000

1340 1350 1360 1370 1380

200

400

600

800

1000

Na-24

Cu-64

Contagem gama

Energy (keV)

Contagem gama

Energy (keV)

1340 1350 1360 1370

300

600

900

1200

Na-24

Cu-64

Contagens gama

Energia (keV)

FIGURA 37 – Ampliação do inserto do espectro do

Culac irradiado na Mesa

Giratória do reator TRIGA IPR-R1. Os espectros mostram o segundo fotopico do

Cu à esquerda do gráfico na energia de 1346 keV, com área líquida igual a 3600 ±

1,6% e o fotopico do

Na, à direita do gráfico, na energia de 1368 keV, com área

líquida igual a 2400 ± 2,8%, resultante de contaminações. Tais picos correspondem a

concentrações de 700 ± 20 ppm de Na e 18 ± 1% de Cu na amostra de 3 mg.

FIGURA 36 – Espectro total do

Culac, sintetizado em vidro, ativado

neutronicamente na Mesa Giratória (fluxo de nêutrons térmicos de 6,5 x 10

n.cm

-2

-1

)

do reator TRIGA IPR-R1.

O espectro total mostra o fotopico principal do

Cu à

esquerda do gráfico no valor 511 keV, com área líquida igual a 508.000 ± 0,13%, e dois

fotopicos menores, destacados no inserto à direita, nos valores 1346 keV e 1368 keV,

que são respectivamente do

Cu e

Na.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

118

O cálculo das atividades induzidas do

Cu nas amostras do composto

Culac foi

realizado a partir das informações: área líquida dos fotopicos; geometria de contagem:

10 ou 20 cm da fonte; tempo de irradiação: 8 horas; tempo de contagem: entre 10 a 20

minutos; meia-vida do radioisótopo (T

1/2

): 12,7 h; correção do decaimento; eficiência do

detector: 15 e 50%; rendimento gama: 5% para o fotopico de 1345 keV. A partir destes

dados, foram determinadas as atividades específicas induzidas nos valores de

0,77MBq/mg e 5,55 MBq/mg de

Culac, para a Mesa Giratória e Tubo Central,

respectivamente.

Pelo fato da síntese inicial em vidraria ter apresentado contaminação expressiva de

Na, a qual poderia interferir nos parâmetros farmacocinéticos deste composto Culac,

tentamos uma via de síntese em teflon, com o objetivo de se eliminar este contaminante.

A FIG. 38 mostra os espectros gama da análise comparativa das duas vias de síntese da

tiossemicarbozona Culac, onde foi possível determinar as interferências isotópicas dos

compostos sintetizados em vidrarias laboratoriais ou teflon. Pela análise dos espectros

demonstrou-se que a síntese em teflon reduziu significamente a interferência espectral

(contaminação) de outros radioisótopos no composto como o

Na, enquanto a síntese

em vidrarias revela vários fotopicos (557 a 1315 keV), característicos do radioisótopo

Br (T

1/2

1,47 dias) e 700 ppm de

Na (FIG. 38 e 39). A pequena contaminação de

Na (23 ppm) ainda presente nas amostras sintetizadas em teflon não interferiu

significativamente sobre os experimentos in vitro e in vivo.

A partir destes dados, foi determinado que complexo de cobre para produção de

radiofármaco

Culac seria sintetizado em teflon para realização dos ensaios in vitro e in

vivo.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

119

600 900 1200

100

150

200

250

Contagem Gama

Energia (keV)

vidro

teflon

1365 1368 1371

400

Na-24

Contagem Gama

Energia (keV)

vidro

teflon

FIGURA 38 – Comparação entre os tipos de síntese da tiossemicarbazona Culac

através da ativação neutrônica. A tiossemicarbazona Culac foi irradiada por 8 h, na

Mesa Giratória, do reator TRIGA-IPR-R1 para avaliar a interferências isotópicas. O

composto Culac foi sintetizado utilizando-se de vidrarias laboratoriais e teflon. A linha

espectral (cor preta) representa a síntese em vidrarias, onde são mostrados vários

fotopicos, com energias entre 557 a 1315 keV, característicos do radioisótopo

Br (T

1/2

35,3 h), os quais não foram observados na síntese em teflon (linha azul).

FIGURA 39 – Comparação entre os tipos de síntese da tiossemicarbazona Culac e

a interferência do

Na através da ativação neutrônica. A tiossemicarbazona Culac

foi irradiada por 8 h, na Mesa Giratória, do reator TRIGA-IPR-R1 para avaliar a

interferências isotópicas. O composto Culac foi sintetizado utilizando-se de vidrarias

laboratoriais e teflon. A linha espectral (cor preta) representa a síntese em vidrarias,

onde mostra o fotopico do

Na, T

1/2

14,7 h, com energia de 1368 keV. Na síntese em

teflon (linha azul) não foi observado o fotopico do

Na.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

120

6.6.1 – Análise da integridade estrutural química da tiossemicarbazona

Culac pela técnica do infravermelho após irradiação no reator TRIGA IPR-R1..

O modo composto ν(C=C)+(C=N) observado a 1608-1554 cm

-1

no espectro da

tiossemicarbazona livre (LAC) desvia para 1602–1536 cm

-1

no espectro do complexo

metálico Culac, indicando coordenação do nitrogênio N

azometino (MENDES et al.,

2006). A absorção ν(C=S) a 870-821 no espectro da tiossemicarbazona não complexada

é observada a 763 cm

-1

no complexo Culac, de acordo com a coordenação através de

um enxofre tiolato. Este desvio observado após complexação é compatível com a

coordenação de uma tiossemicarbazona aniônica. O modo de deformação no plano

piridina a 639-595 cm

-1

no espectro do ligante Lac desviou para 604 cm

-1

no complexo

Culac, sugerindo coordenação do nitrogênio heteroaromático (MENDES et al., 2006).

Em adição, novas absorções a 460 e 346 cm

-1

tem sido atribuídas a ν(Cu=N) e

ν(Cu=Npi), respectivamente, e bandas a 329 cm

-1

tem sido atribuídas a ν(Cu=S).

Análise do complexo

Culac após ativação neutrônica não apresentou nenhuma

alteração significativa em relação ao Culac nativo. Em resumo, os dados da análise de

infravermelho indicam coordenação das tiossemicarbazonas através do sistema quelante

Npi-N-S e que o processo de ativação neutrônica para gerar o radiofármaco

Culac, não

altera sua estrutura molecular.

TABELA 11 - Absorção das ligações químicas das tiossemicarbazonas no espectro

infravermelho.

Compostos

ν(C=C)+(C=N)

ν(C=S)

ρ(py)

ν(Cu=N

)

ν(Cu=N)

ν(Cu=S)

Lac

1608–1564 cm

-1

870–821 cm

-1

639-595 cm

-1

-- -- --

Culac

1602–1536 cm

-1

763 cm

-1

604 cm

-1

346 cm

-1

460 cm

-1

329 cm

-1

Culac

1602–1536 cm

-1

763 cm

-1

604 cm

-1

346 cm

-1

460 cm

-1

329 cm

-1

ν =estiramento.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

121



4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

0,0

100,0

cm-1

3427

2848

2727

2317

2020 1892

1864

1785

1681

1589

1563

1537

1505

1455

1376

1337

1312

1293

1257

1199

1169

1156

1116

1104

1080

1042

1020

996

969

928

900

850

784

764

FIGURA 42 – Espectro infravermelho da tiossemicarbazona Culac

sintetizada em teflon.

FIGURA 40 – Estrutura da

tiossemicarbazona Lac (H2Ac4oT),

derivada de 2-acetilpiridina.

FIGURA 41 – Estrutura da

tiossemicarbazona Culac [Cu(2Ac4oT)Cl],

derivada de 2-acetilpiridina, complexada

com o cobre.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

122

6.6.2 – Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da tiossemicarbazona

Culac ativada neutronicamente no reator TRIGA IPR-R1.

Uma vez determinada a integridade estrutural do

Culac, foi realizada a avaliação da

manutenção da atividade antitumoral deste composto contra as células de RT2 (p53

selvagem), T98 (p53 mutante), MCF-7 (p53 selvagem) e CAE (p53 selvagem), pelo

ensaio do MTT. As células tumorais foram semeadas em placas de 96 poços e após 24h

tratadas com diferentes concentrações (20 fM a 0,2 mM) das tiossemicarbazonas

Culac e Culac. A comparação dos efeitos antitumorais dos dois compostos foi obtida

através da análise das curvas de sobrevivência celular.

Nossos resultados mostraram potente ação citotóxica das tiossemicarbazonas testadas,

de maneira dose-dependente, contra as células RT2, T98, MCF-7, CAE, independente

do status da p53. Os valores das IC

(FIGs 44-47) das tiossemicarbozonas Culac e

Culac não demonstraram variação expressiva nas linhagens celulares tratadas,

provavelmente, devido baixa atividade específica da

Culac (56,54 Ci/mol). Contudo, o



4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000

0,0

82,0

3427

2852

2728

2020 1864

1785

1589

1563

1537

1505

1455

1376

1337

1312

1293

1257

1199

1169

1156

1116

1104

1080

1042

1020

996

969

928

900

850

FIGURA 43 – Espectro infravermelho da tiossemicarbazona Culac

sintetizada em teflon e irradiada por 8 horas no Tubo Central do reator

TRIGA IPR-R1.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

123

potente efeito antitumoral da tiossemicarbazona

Culac foi preservado após irradiação

por 8 horas no reator TRIGA IPR-R1, confirmando a manutenção da estrutura e função

desta molécula. Assim, constatou-se que a molecula radioativa

Culac estava adequada

para realização dos testes farmacocinéticos e de biodistribuição.

O cloreto de cobre ativado neutronicamente (

CuCl

) foi usado como controle e os

valores do IC

nas células tratadas variaram de 0,91 a 1,35 mM. Não ocorreu um

aumento significativo do valor da IC

da cloreto irradiado para o não-irradiado.

-15.0 -12.5 -10.0 -7.5 -5.0 -2.5

100

125

150

64-Culac

Culac

Log [Molar]

Sobrevivência

(% controle)

FIGURA 44 – Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da

tiossemicarbazona

Culac sobre células RT2. A comparação da ação antitumoral

Culac e Culac mostrou que estes compostos foram significativamente

citotóxicos, de maneira dose-dependente, com os valores das

de 0,040 ± 0,007

µM, para o

Culac e 0,014 ± 0,001 µM para o Culac (n=4, p <0,001). A atividade

antitumoral foi preservada após irradiação no reator TRIGA-IPR-R1.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

124

-15.0 -12.5 -10.0 -7.5 -5.0 -2.5

100

125

150

64-Culac

Culac

Log [Molar]

Sobrevivência

(% Controle)

-15.0 -12.5 -10.0 -7.5 -5.0 -2.5

100

125

150

64-Culac

Culac

Log [Molar]

Sobrevivência

(% controle)

FIGURA 45 – Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da

tiossemicarbazona

Culac sobre células T98. A comparação da ação antitumoral da

Culac e Culac mostrou que estes compostos foram significativamente citotóxicos, de

maneira dose-dependente, com os valores das IC

de 0,023

0,005 µM, para o

Culac e 0,023

0,006 µM para o Culac. A atividade antitumoral foi preservada após

irradiação no reator TRIGA-IPR-R1.

FIGURA 46 – Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da

tiossemicarbazona

Culac sobre células MCF-7. A comparação da ação antitumoral

Culac e Culac mostrou que estes compostos, foram significativamente citotóxicos,

de maneira dose-dependente, com os valores das

de 0,049 ± 0,004 µM, para o

Culac e 0,039 ± 0,003 µM. A atividade antitumoral foi preservada após irradiação no reator

TRIGA-IPR-R1.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

125

-15.0 -12.5 -10.0 -7.5 -5.0 -2.5

100

125

150

64-Culac

Culac

Log [Molar]

Sobrevivência

(% controle)

6.6.3- Análise morfológica das células tumorais submetidas ao tratamento

com a tiossemicarbazona

Culac ativada neutronicamente no reator TRIGA IPR-

R1.

As análises morfológicas foram realizadas, com o auxílio de uma câmera fotográfica

digital acopladas ao microscópio óptico (M.O.). As células tumorais RT2, T98, MCF-7,

CAE, submetidas ao tratamento, em diferentes concentrações (20 fM a 0,2 mM), com a

tiossemicarbazona

Culac, irradiada no Tubo Central, por 8 horas, no reator TRIGA

IPR-R1, foram visualizadas e fotografadas. A manutenção da atividade citotóxica foi

confirmada pelas alterações das células tumorais tratadas na concentração de 2 µM

(FIG. 48). A análise demonstrou arredondamento celular, redução no número de células,

redução do volume citoplasmático, formação de vesículas (blebs) na membrana

plasmática, característicos do processo de morte celular programada (apoptose), como

também observado pelo tratamento com Culac não-irradiado (FIGs.27-30). Não foram

observadas alterações celulares significaticas no controle (DMSO a 0,5%).

FIGURA 47 – Avaliação da manutenção da atividade antitumoral da

tiossemicarbazona

Culac sobre células CAE. A comparação da ação antitumoral da

Culac e Culac mostrou que estes compostos foram significativamente citotóxicos, de

maneira dose-dependente, com os valores das IC

de 0,023

0,008 µM, para o

Culac

e 0,052 ± 0,009 µM para o Culac (n=4, p <0,001). A atividade antitumoral foi preservada

após irradiação no reator TRIGA-IPR-R1.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

126

Culac Controle-MCF-7

Controle-CAE

Culac

Controle-T98

Controle-RT2

Culac

FIGURA 48 - Fotomicrografias ópticas das análises morfológica das

células RT2, T98, MCF-7, CAE. As alterações morfológicas sofridas

pelas células tumorais, após 48 h de tratamento com a tiossemicarbazona

Culac, na concentração de 2 µM, demostraram que a atividade

citotóxica do composto foi preservada, pois revelaram redução do

volume celular (encolhimento), arredondamento e irregularidades na

membrana plasmática, característicos do processo apoptótico. Imagens

adquiridas em câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500,

acoplada ao M.O. (aumento 200x).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

127

6.6.4 – Análise das alterações do DNA cromossomal induzidas pela

Culac,

ativada neutronicamente no reator TRIGA IPR-R1.

Células tumorais RT2, T98, MCF-7 e CAE foram semeadas em placas de 96 poços e

após 24h tratadas com a tiossemicarbazonas de códigos

Culac, nas concentrações de

0,2 a 20 nM, próximas a IC

. Depois de 48h, as células foram reveladas através da

coloração DAPI.

Os resultados mostraram que o efeito de Culac sobre o DNA foi preservado após a

ativação neutrônica.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

128

Culac

Controle-MCF-7

Culac

Controle-CAE

Culac

Controle-T98

Controle

RT2

Culac

FIGURA 49 - Fotomicrografias das análises das alterações do DNA

cromossomal induzidas pela tiossemicarbazona

Culac na

concentração de 0,2 nM sobre células RT2, T98, MCF-7, CAE . Nas

células tratadas foram observados condensação da cromatina (setas

grossas), fragmentação (asterisco), formação de corpos apoptóticos

(setas finas) (M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

129

6.7 - Avaliação da toxicidade produzida pela tiossemicarbazona Culac in

vivo.

Após caracterização das tiossemicarbazonas derivadas de acetilpiridina, selecionamos

um complexo metálico derivado da tiossemicarbazona Lac, a Culac, para investigar o

seu potencial radiofarmacêutico para detecção específica de tumores. A seleção foi

fundamentada pelo fato do cobre (Cu) possuir vários radioisótopos com meia vida e

energias adequadas para serem aplicados tanto para terapia como diagnóstico, como já

descrito na introdução. Para o desenvolvimento de qualquer fármaco é fundamental se

avaliar a toxicologia do mesmo, sendo assim avaliamos primeiramente os parâmetros

toxicológicos de Culac in vivo para determinarmos se este composto seria adequado

para o desenvolvimento de um radiofármaco.

A tiossemicarbazona Culac foi administrada intravenosamente, na concentração de 136

µg/kg, em camundongos Swiss fêmeas, saudáveis. Os animais foram observados

diariamente por um período de 144 h para se avaliar alterações comportamentais e

fisiológicas. Depois de transcorridos os tempos de 24 e 144 horas após administração

i.v., os animais foram sacrificados, pelo método da guilhotina e os órgãos como o

coração, pulmão, fígado, baço, rins, ovários, encéfalo foram dissecados para confecção

das lâminas histológicas (coradas com hematoxilina-eosina). Posteriormente, foram

analisadas pelo laboratório de Patologia Comparada da Universidade Federal de Minas

Gerais (UFMG).

Os cortes histológicos do coração, baço, rins, ovários, encéfalo, dos animais tratados

com o composto Culac, revelaram arquitetura e morfologia celulares normais, sem

alterações no volume ou forma, com núcleos preservados, sem sinais de condensação da

cromatina e contração nuclear, nos tempos de 24 e 144 horas administração i.v. (FIGs.

50-53). No fígado, os cortes histológicos revelaram alterações no tempo de 144 horas

após administração i.v., visto que, foram observados perda da morfologia celular,

núcleos com redução do volume e aumento da basofilia, homogenizados, característicos

da cariopicnose. Além disso, foi observada a formação de vacúolos, como conseqüência

direta de processo degenerativo, como a necrose (FIG.52). Nos cortes histológicos

pulmonares foram observadas dilatação dos brônquios e presença de hemácias,

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

130

provavelmente devido ao tipo de sacrifício (guilhotinamento) aplicado aos animais

(FIG.51)

Apesar da hepatoxicidade causada nos animais pela administração do composto Culac

não foram observadas alterações comportamentais, locomotoras e nutricionais até as

144 h após administração i.v.

Controle

Culac-24h Culac-144h

FIGURA 50 – Fotomicrografias das análises histopatológicas do

córtex cerebral (A) dos animais dos grupos controle e tratados

com a tiossemicarbazona Culac. A histomoforlogia do córtex

cerebral permaneceu inalterada após administração do composto

Culac (136 µg/kg) até os tempos de sacrifícios de 24 e 144h. (M.O,

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

131

Controle

Culac-24h Culac-144h

Controle

Culac-24h

Culac-144h

FIGURA 51 – Fotomicrografias das análises histopatológicas do

coração (B) e pulmões (C) dos animais dos grupos controle e

tratados com a tiossemicarbazona Culac. A histomorfologia do

coração permaneceu inalterada após administração do composto

Culac (136 µg/kg) até os tempos de sacrifício de 24 e 144h. Nos

pulmões foram observados dilatação dos brônquios e presença de

hemácias (M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

132

Controle

Culac-144h

Formação

de Vacúolos

Núcleos

Picnóticos

Culac-24h

Controle

Culac-24h Culac-144h

FIGURA 52 – Fotomicrografias das análises histopatológicas do

baço (D) e fígado (E) dos animais dos grupos controle e tratados

com a tiossemicarbazona Culac. A histomoforlogia do baço

permaneceu inalterada após administração do composto Culac (136

µg/kg) até os tempos de sacrifício de 24 e 144h. Já na

histomoforlogia do fígado foram encontradas núcleos picnóticos e

formação de vacúolos (M.O, aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

133

Culac-144h

Controle

Culac-24h

Controle

Culac-24h Culac-144h

FIGURA 53 – Fotomicrografias das análises histopatológicas dos

rins (F) e ovários (G) dos animais dos grupos controle e tratados

com a tiossemicarbazona Culac. As histomoforlogias dos rins e

ovários permaneceram inalteradas após administração do composto

Culac (136 µg/kg) até os tempos de sacrifício de 24 e 144h (M.O,

aumento de 400x-Nikon).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

134

6.8 - Estudo do perfil de biodistribuição e detecção de sítios tumorais in vivo

da tiossemicarbazona

Culac. Determinação dos parâmetros fármacocinéticos.

O perfil de biodistribuição da tiossemicarbazona

Culac em camundongos Swiss

fêmeas implantados com tumor de Ehrlich, nos tempos de 10, 30, 60, 240, 1440, 2880

minutos, é mostrado na FIG. 54.

Os resultados mostraram que a maior concentração do composto

Culac no sangue foi

alcançada no tempo de 10 minutos (1,86 ± 0,61% DI/g) e em seguida reduzida

gradativamente, tornando-se desprezível no tempo de 2880 minutos (0,01 ± 0,0% DI/g).

Os valores de meia-vida biológica (T

1/2b

)

no sangue foram de 3,50 ± 0,59 min. para a

fase rápida (distribuição) e 1080,40 ± 330,63 min. para a fase lenta (eliminação). A

depuração plasmática (C

) do

Culac foi 0,48 mL/min., calculada dividindo-se a massa

da droga administrada pela área sob a curva do gráfico da biocinética sanguínea (FIG.

55). O volume de distribuição aparente foi 0,32 mL.

A alta fixação do

Culac no fígado nos tempos de 10 min (5,75 ± 3,28 % DI/g) até 240

min (9,01 ± 3,32% DI/g) demonstrou evidente acumulação e retenção do composto

neste órgão, corroborando com sua função de metabolização e eliminação deste

composto. No cérebro foi observada uma baixa fixação após 10 minutos (0,09 ± 0,03%

DI/g), mantendo-se em média de 0,07 ± 0,03% DI/g nos demais tempos.

San

ue Cérebro Tireóide Cora

ão Pulmões Fí

ado Pâncreas Ba

o Rins Intestino Osso Músculo

10 min.

30 min

60 min.

240 min.

1440 min.

2880 min.

% DI/g

FIGURA 54 – Perfil de biodistribuição da tiossemicarbona

Culac em

camundongos swiss fêmeas implantados com tumor de Ehrlich.

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

135

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

%DI

Tempo após injeção (min.)

A melhor fixação na pata com tumor de Ehrlich foi alcançada nos tempos de 60 min.

(0,47 ± 0,18 % DI/g) e 240 min (0,44 ± 0,02% DI/g) após administração i.v. do

Culac.

A FIG. 56 mostra que, ao contrário do

CuCl

(cloreto de cobre), o

Culac se

concentra preferencialmente no sítio tumoral, sendo, portanto capaz de diferenciar a

pata normal da pata com tumor. A capacidade do composto

Culac discriminar entre o

tumor e órgãos adjacentes é mostrado na TAB. 12.

Pata Normal Pata Tumor

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

CuCl2

64-Culac

%DI/g

FIGURA 56 – Comparação da fixação entre a pata normal e a pata com tumor

da tiossemicarbazona

Culac e do cloreto de cobre (

CuCl

). A fixação na pata

com tumor foi significativamente maior para o composto

Culac do que para cloreto

de cobre (n=3, p=0,001).

FIGURA 55 – Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac no

sangue de animais implantados com tumor de Ehrlich. O pico de fixação do

Culac no sangue foi observado no tempo de 10 min. após administração i.v. e

diminuiu significativamente nos primeiros 30 min. (T

1/2b

=3,50 ± 0,59 min. na

fase rápida e 1080,40 ± 330,63 min. para a fase lenta).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

136

TABELA 12 - Proporção entre a concentração de

Culac no tumor e órgãos

adjacentes.

Tumor/Pata normal Tumor/Sangue Tumor/Músculo Tumor/Osso

Proporção* 1,60 ± 0,42% 1,53 ± 0,50 6,55 ± 1,37% 3,30 ± 1,58%

*Tempo de 240 min. após administração i.v.

A fixação nos rins demonstra que excreção do composto

Culac foi realizada,

primeiramente no tempo de 10 min. pela via renal 75,51% e após 30 minutos (61,06%)

pela via hepatobiliar, logo após sofrer metabolização hepática (biotransformação). No

tempo de 240 min foi de 29,78% pelos rins e 31,46% hepatobiliar. Esses achados

podem ser justificados pela observação da fixação intestinal (FIG. 54). Após 2280

minutos o

Culac foi quase completamente eliminado, pois foram encontrados apenas

3,01% na via renal e 1,65% na via hepatobiliar. Os valores de T

1/2b

nos rins foram de

62,61 ± 19,64 min. para a fase rápida e 1205,74 ± 288,70 min. para a fase lenta. Já no

fígado T

1/2b

o T

1/2b

foi de 726,59 ± 51,61 min. para a fase lenta. Os valores dos T

1/2b

dos

rins e fígado (média e desvio padrão) da fase lenta são semelhantes ao T

1/2b

do sangue,

indicando que estes dois órgãos foram os responsáveis pela eliminação do composto.

Ao contrário da excreção do

Culac, o cloreto de cobre (

CuCl

) foi excretado quase

que pela via renal (86,85 ± 9,40 %) e apenas 13,14 ± 4,90 % via hepatobiliar no tempo

de 240 min. após administração i.v.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

%DI/g

Tempo após injeção (min.)

FIGURA 57 – Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac nos

rins de animais implantados com tumor de Ehrlich. O pico de fixação do

Culac

nos rins foi observado no tempo de 10 min. após administração i.v. e diminuiu

significativamente nos primeiros 60 min (

1/2b

=62,61 ± 19,64 min para a fase lenta

e 1205,74 ± 288,70).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

137

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

%DI/g

Tempo após injeção (min.)

A FIG. 59 mostra o perfil de biodistribuição do

Culac comparado com o

CuCl

, no

sangue, cérebro, tireóide, coração, pulmões, fígado, pâncreas, intestino, rins, osso e

músculo esquelético, após 240 minutos da administração intravenosa. Foi possível

verificar, pela análise comparativa dos perfis de biodistribuições dos compostos, bem

como pela análise da biocinética sangüínea do

Culac (FIG. 51), a manutenção da

estabilidade e da pureza radioquímica in vivo do

Culac, uma vez que a rápida

depuração do

Culac sangue indicou que não ocorreu dissociação do complexo

metálico (cobre) do ligante, dessa forma manteve-se estável in vivo. Visto que, a

Culac

seguiu o perfil de biodistruição diferente ao do

CuCl

, sofrendo, desse modo, desvios

de fixação, indicando a integridade molecular. Ou seja, não ocorreu dissociação da

tiossemicarbazona e o cobre da molécula. Já a pureza radionuclídica do

Culac foi

constatada pelo fato que todas as amostras foram analisadas na janela de energia de 511

kev, correspondente ao

Cu, do detector gama e não ter sido visto nada em outra janela

não relacionada a esta energia confirmando a inexistência de interferências isotópicas

decorrente da ativação neutrônica.

FIGURA 58 – Biocinética da concentração da tiossemicarbazona

Culac

no fígado de animais implantados com tumor de Ehrlich. A captação

hepática do composto manteve-se alta até o tempo de 240 min. após

administração i.v. (9,01 ± 3,32%DI/g) (T

1/2b

= 726,59 ± 51,61 min).

Resultados

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

138

San

ue CérebroTireóideCora

ão

ulmõe

Fí

ado

âncrea

o Rins

ntestin

Osso

úscul

64-CuCl2

64-Culac

% DI/g

FIGURA 59 – Verificação in vivo da estabilidade e pureza radioquímica da

tiossemicarbazona

Culac. Comparação dos perfis de biodistribuição da

tiossemicarbazona

Culac e cloreto de cobre (

CuCl

) após 240 min. de administração

I.V. (n=3, *p<0,05).

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

139

7- DISCUSSÃO

A expansão clonal de uma célula transformada depende do descontrole da sua

capacidade proliferativa e de uma crescente incapacidade de morrer por apoptose.

Apesar da enorme variabilidade do câncer, evidências demonstram que a resistência à

apoptose é uma das características mais marcantes da maioria dos tumores malignos. De

fato, a análise do processo de carcinogênese revela que a capacidade de resistir à morte

pode ser adquirida por diferentes mecanismos e acontecer em vários momentos do

desenvolvimento tumoral (GRIVICICH et al., 2007).

A demonstração de que a apoptose é um mecanismo inato de defesa antineoplásica e

que vários agentes quimioterápicos quanto radioterápicos agem através da indução

desse tipo de morte celular, nos incentivou a uma intensa investigação e seleção das

tiossemicarbazonas com ação antineoplásica, pela indução da apoptose. Atualmente,

vários estudos mostram que as tiossemicarbazonas são efetivas como agentes indutores

da apoptose, demonstrando potente atividade antitumoral em linhagens de células de

tumores sólidos ou de origem hematopoiética, dos cânceres humanos e murinos

(MILLER et al., 1998).

Segundo Beraldo e colaboradores (2004), em 1963 foram formuladas duas hipóteses

sobre o modo de ação das tiossemicarbazonas α(N)-heterocíclicas com atividade

antitumoral. A primeira hipótese foi que elas agem como ligantes tridentados (N-N-S).

Já a segunda sugere que a modificação do seu anel estrutural enquanto retêm o ligante,

poderia melhorar sua atividade e diminuir a toxicidade. Outras características como à

densidade eletrônica, substituintes e geometria dos compostos também teriam efeitos

sobre sua atividade. Alguns pesquisadores consideram que suas propriedades

antitumorais são devidas à capacidade de formar complexos com cátions metálicos,

formandos quelatos. Este comportamento como agente quelante resulta da flexibilidade

das tiossemicarbazonas, as quais possuem dois grupos eletronegativos, que formam

ligações coordenadas covalentes estáveis com um átomo do metal catiônico. Por outro

lado, Greenhaum e colaboradores sugeriram que o mecanismo de ação das

tiossemicarbazonas é ainda complexo e deve acontecer através da inibição de múltiplos

alvos (TENÓRIO et al., 2005).

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

140

As propriedades antitumorais das tiossemicarbazonas também são freqüentemente

relacionadas à sua complexação metálica. Primeiramente, devido à modificação da

lipofilicidade na membrana celular pela coordenação metálica, ou ainda, pelo fato do

complexo metálico ser mais ativo do que do ligante livre, ou funcionar como um

veículo para ativação do ligante como agente citotóxico (BERALDO et al., 2004)

Os nossos resultados mostraram que, durante a fase de avaliação das tiossemicarbazonas

derivadas de N(4)-toluil-2-acetilpiridina e 2-piridinoformamida (ligantes e

complexadas) pelos seus potenciais citotóxicos e antiproliferativos in vitro sobre células

de glioblastoma multiforme, todos os compostos demonstram potente ação antitumoral

na concentração de apenas 10 µg/mL. Ainda nesta fase inicial de triagem, também

detectamos que o composto L3 (H2Am4Et) foi o composto derivado de 2-aminopridina

menos potente. A presença do grupo etila, mais volumoso que o DH ou metila das

tiossemicarbazonas L1 (H2Am4DH) e L2 (H2Am4Me), provavelmente interfere

negativamente com a interação desta molécula com seu alvo de ação celular (MENDES

et al., 2007). No entanto, através da complexação do L3 com o metal estanho (Sn), foi

possível obter um composto com potencial antitumoral maior que o ligante de origem.

Estes dados reforçam dados da literatura que demonstram aumento de potência de

complexos metálicos, seja por um efeito aditivo do metal ao composto ligante, seja pelo

fato do ligante servir como uma molécula capaz de liberar o metal tóxico

especificamente no local a ser tratado, neste caso a célula tumoral. Estes resultados

culminaram na apresentação de trabalho em congresso e na publicação do artigo que

está no anexo 1.

O fato dos complexos de estanho aumentarem a potência da tiossemicarbazonas livres

(ligantes), na linhagem RT2 testada, nos incentivou a tentar desenvolver e produzir (via

ativação neutrônica) um radiofármaco específico para terapia de tumores, baseado neste

complexo metálico. Contudo, após irradiação, no reator TRIGA IPR-R1, do complexo

Sn1 ((Sn(2Am4DH)(n-but)Cl

).(Sn(2Am4DH)(n-but)Cl

)), detectamos, pela

espectrometria gama, o surgimento de interferências isotópicas indesejadas, como o

samário e antimônio, inviabilizando o uso deste novo radiofármaco nos ensaios

biológicos in vivo.

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

141

Durante a avaliação da atividade antitumoral da tiossemicarbazona N(4)-toluil-orto-2-

acetilpiridina Culac (complexo metálico) não foi observado um aumento significativo

da citotoxicidade (IC

entre 14 e 52 nM) comparada ao seu ligante, o Lac (IC

entre 18

a 39 nM) em todas as células testadas, , apesar de sua potente atividade antitumoral.

Estes achados carecem de mais investigações dos mecanismos envolvidos no aumento

da atividade citotóxica pelas tiossemicarbazonas complexadas com metais, bem como

do processo de internalização do cobre pelas células por estes compostos.

Na segunda fase de nossos experimentos foram usadas linhagens de células RT-2, status

p53 selvagem e T-98, p53 status mutante, MCF-7, p53 selvagem, CAE, p53 selvagem,

para analisar o potencial antitumoral das tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-toluil-2-

acetilpiridina e seu complexo de cobre (Lac, Lacm, Lacpt, Culac) e a influência da p53

na regulação do crescimento das células tumorais após o tratamento.

A potência antitumoral das tiossemicarbazonas foi avaliada obtendo-se os valores da

concentração do composto que produziu 50% de morte celular (IC

). Nesta avaliação,

as tiossemicarbazonas Lac, Lacm, Lacpt, Culac apresentaram valores da IC

entre 14 a

96 nM nas células tumorais tratadas. Estes valores demonstraram que as

tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-toluil-2-acetilpiridina e seu complexo de cobre

são muito mais potentes que a hidroxiuréia (HU), um inibidor da ribonucleotídeo

redutase (RR), que é usado na clínica médica como um agente quimioterápico e

apresenta a IC

de 140 µM em células de linfoma de Burkitt (EASMON et al., 2001).

Novamente, quando comparadas com as tiossemicarbazonas 1-piridina-2-carbaldeído

(HFoTsc) e 1-piridina-2-iletan-1 (HAcTsc), que apresentaram valores da IC

de 0,55 e

3,29 µM, respectivamente, contra células MCF-7 (KOVALA-DEMERTZI et al., 2006),

observa-se que as Lac, Lacm, Lacpt, Culac são bastante citotóxicas. Já na avalição da

ação da p53 foi constatado que estas tiossemicarbazonas exibiram potente atividade

citotóxica em todas as células tratadas, independente do status da p53.

De acordo com Linke e colaboradores (1996), inibidores da ribonucletídeo redutase,

como as tiossemicarbazonas, levam a parada do ciclo celular na fase-S (síntese de

DNA) independente da ação da p53. Sabe-se que a p53 desempenha um importante

papel na regulação crescimento e morte das células. Em resposta a alguns fatores, os

níveis de p53 aumenta, induzindo a parada em G

ou provocando a apoptose (LIS et al.,

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

142

2004). Estudos demonstram que a p53 pode ativar vias apoptóticas por mecanismos

tanto dependentes quanto independentes do seu potencial de transativação

(O´CONNOR, 1997). O efeito citotóxico independente do status p53 sugere que os

compostos analisados possam atuar downstream de p53 (atuar sobre moléculas que

estão após a sinalização p53), comprometendo o reparo e a síntese de DNA (NAKANO

et al., 2000). Um novo gene, induzido por p53, codificador de uma proteína relacionada

à ribonucleotídeo redutase foi identificada recentemente e denominada p53R2. Esta

proteína pode ser ativada mesmo em células p53 mutantes (NAKANO et al., 2000). Se a

ribonucletideo redutase é o alvo destes compostos ainda terá que ser investigado. No

caso dos gliomas, aproximadamente 2/3 possuem defeitos na via p53. Sendo assim, a

capacidade de afetar células independentemente do status p53 aumenta os tipos de

tumores que podem ser tratados por estes compostos (ALEMANY, 1999).

As análises morfológicas das células tumorais revelaram alterações na membrana,

encolhimento celular e grande redução no número de células em relação ao controle,

característicos do mecanismo de morte celular programada, sugerem fortemente que a

tiossemicarbazonas derivadas de N(4)-toluil-2-acetilpiridina avaliadas neste trabalho

atuam, pelo menos parcialmente, através da indução da apoptose. Estes achados foram

corroborados pela análise do DNA cromossomal de todas as células tumorais coradas

com o DAPI.

Atualmente, a tiossemicarbazona 3-aminopiridina-2-carboxaldeído (Triapina

)

encontra-se na fase I dos ensaios clínicos e demonstra ser um potente inibidor da

ribonucleotídeo redutase (RR) (GOJO, et al., 2007), com o valor do IC

1.3 µM em

células leucêmicas humanas (L1210) no testes in vitro (LI et al, 2001). A toxicidade da

Triapina

foi obtida pela análise dos pacientes que foram submetidos a estes estudos

pré-clínicos, os quais manifestaram desordens gastrointestinais, como náusea, vômitos,

diarréias, anorexia, mucosites e também toxicidade hepática, entre 2 horas até 19 dias,

após a administração intravenosa da dose 96 mg/m

(equivalente a aproximadamente 25

mg/kg nos camundongos) (GOJO, et al., 2007). Os nossos resultados demonstraram que

a tiossemicarbazona N(4)-orto-toluil-2-acetilpiridina Culac também provocou

hepatoxicidade nos camundongos Swiss fêmeas, após 6 dias da administração

intravenosa na dose de 136 µg/kg. Contudo, os animais mantiveram suas funções

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

143

locomotoras e nutricionais preservadas. Desse modo, foi possível realizar nossos

experimentos de biodistribuição nos camundongos, visto que, a tiossemicarbazona

Culac não provocou nenhuma letalidade ou incapacidade funcional nos animais

tratados. O processo de desenvolvimento de radiofármacos é longo, muitos compostos

potentes ficam no meio do caminho exatamente por serem muito tóxicos, ou se

demonstrarem insolúveis no plasma. Assim, estes resultados toxicológicos

demonstraram que a tiossemicarbazona Culac poderia seguir para próxima etapa do

nosso projeto.

Na terceira fase deste projeto, nós associamos os excelentes resultados terapêuticos da

tiossemicarbazona, derivada de N(4)-orto-toluil-2-acetilpiridina, (Cu)(H2Ac4oT)Cl),

sobre as células tumorais, com a versatilidade e boas propriedades físicas dos isótopos

do cobre, para desenvolver um novo radiofármaco emissor de pósitron, via ativação

neutrônica, uma vez que o reator TRIGA-IPR-R1 dispunha de condições técnicas e

operacionais adequadas para a irradiação das amostras. Além disso, hoje em dia, a

tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma importante ferramenta na

oncologia e muitos radiofármacos emissores de pósitrons têm sido desenvolvidos para o

diagnóstico de tumores malignos e suas metástases (OBATA et al., 2003). Embora

outras técnicas de imagem como a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância

magnética nuclear (RMN) tenham um resolução espacial superior ao PET (menor que

1mm versus 3-10 mm da PET), elas têm uma baixa sensibilidade e, geralmente,

requerem o uso agentes de contraste em concentrações que podem ser tóxicas para o

paciente. (HOLLAND et al., 2007). A alta sensibilidade da PET é decorrente da

detecção de dois fótons de raios gama coincidentes, com a energia de 511 keV. Desse

modo, as concentrações de radiofármacos necessárias para obtenção da imagem do

paciente são da ordem de nanomolar. Além disso, é possível obter informações

fisiológicas correlacionando a observação do perfil de biodistribuição do radiofármaco

com a bioquímica celular.

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

144

TABELA 13-Comparação entre a performance de algumas modalidades de imagens.

Modalidade Resolução Espacial

(mm)

Concentração dos agentes

de imagem (M)

Dose de

Radiação

Toxicidade

TC 1 10

-4

Sim Sim

RMN

-5

Não Sim

SPECT 8-20 10

-6

Sim Não

PET 3-10 10

-8

-10

Sim Não

a-A resolução espacial apresentado nesta tabela é aproximada e a imagem pode variar significativamente

de acordo com o equipamento usado (Adaptado de SMITH, 2004).

Nesse sentido, os radiofármacos derivados de tiossemicarbazonas, complexados com o

cobre-64 (

Cu), despontam como promissores para o diagnóstico e tratamento de

tumores, uma vez que, apresentam excelentes propriedades farmacológicas. A

lipofilicidade, tanto das tiossemicarbazonas quanto do complexo com cobre, é sem

dúvida umas das mais importantes propriedades farmacológicas, pois garante a

passagem do radiofármaco através da membrana celular, e consequentemente fácil

dissociação. Este mecanismo de dissociação envolve uma reação redox com tióis

intracelulares, presumivelmente, com a glutationa, que está presente em concentração

milimolar dentro das células, mas em concentração micromolar no plasma. Dessa

forma, os complexos cobre-tiossemicarbazonas agem como um transportador do cobre

para dentro das células (OBATA et al., 2003).

Alguns complexos cobre bis(tiossemicarbazonas), como o

Cu-ATSM, demonstram

também a capacidade de formar imagens de tumores com hipóxia (OBATA et al.,

2003). Sabe-se que a hipóxia é uma condição patológica, onde a concentração do

oxigênio encontra-se abaixo de 1000 ppm e geralmente está associada a injúrias

cardíacas e certos tipos de câncer (HOLLAND et al., 2007). Os tumores sólidos contêm

freqüentemente regiões de hipóxia, visto que durante o curso da progressão tumoral, as

células localizadas no interior da massa tumoral têm seu aporte sanguíneo restrito,

tornando-se hipóxicas e na maioria das vezes mais lesionadas (OBATA et al., 2003). O

mecanismo de internalização das tiossemicarbazonas complexadas com o cobre-64 nos

tumores com regiões de hipóxia envolve a reação redox do Cu

para Cu

pelo

grupamento metil presente na molécula das tiossemicarbazonas (MCQUADE et al.,

2005).

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

145

Hoje, na prática da medicina nuclear, o

FDG (

F-2-desoxi-2-flúor-D-glicose) é o

radiofármaco mais amplamente usado para detecção e formação de imagens tumorais.

Entretanto, por causa da heterogenicidade dos tumores malignos, o

FDG pode gerar

imagens com resultados falso-positivos, devido a sua incapacidade de distinguir entre

massas tumorais viáveis/residuais e massas resultantes de tecido necrótico ou cicatricial

(OBATA et al., 2003). Além disso, a fixação do FDG pelo tecido tumoral é dependente

do nível da glicose no plasma, visto que, o FDG compete com a glicose. A falsa-

positividade também é vista pelo fato que vários tecidos do corpo, de acordo com a

demanda energética, metabolizam a glicose para gerar adenosina trifosfato (ATP)

(VALLABHAJOSULA, 2007). A especificidade do

FDG no diagnóstico dos tumores

também se torna limitada quando ocorre um processo inflamatório onde se concentra

uma alta taxa acumulativa da glicose, devido ao metabolismo dos macrófagos e células

inflamatórias. Já nos tumores cerebrais, a dependência exclusiva pela glicose no

metabolismo normal do cérebro, dificulta o diagnóstico específico. Assim, a fixação

absoluta do FDG pelos tumores depende de muitos fatores e pode não refletir

necessariamente a agressividade e a taxa proliferativa das células tumorais

(VALLABHAJOSULA, 2007).

Por outro lado, o

Cu também poderia ser um eficiente radionuclídeo para o tratamento

de tumores, devido a seus múltiplos modos de decaimento (decaimento β

e β

, captura

eletrônica). Além disso, quando complexado com drogas (p.ex. tiossemicarbazonas),

permite que a concentração regional da droga seja monitorada em tempo real pela

técnica PET. Recentemente, tem sido proposto que os danos causados ao DNA pelo

Cu são devidos às emissões dos elétrons auger, com alta transferência linear energia,

resultantes do decaimento por captura eletrônica. Vários estudos mostram que a

penetração no tecido dos elétrons Auger, emitidos pelo

Cu, alcança 5 µm. Assim,

quanto menor for o diâmetro das células tumorais maior será a radiotoxicidade

provocada pelos elétrons Auger, uma vez que eles se localizarão mais próximo ao DNA.

Já a penetração das partículas β

Cu, com energia de 278 keV, alcança no tecido

em média 1,4 mm. Por esta razão, o efeito citotóxico das partículas β

pode alcançar não

só uma célula, que tenha captado o

Cu, mas também todas as células ao redor

(OBATA et al. 2005). Em nossos resultados, apesar dos compostos Culac (não-

irradiado) e o

Culac (irradiado) demonstrarem potente ação citotóxica em todas as

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

146

células tumorais testadas, não ocorreu aumento significativo da ação antitumoral in vitro

Culac, provavelmente, por causa da baixa atividade específica induzida do

(56,54 Ci/mol) obtida através da produção de

Cu no reator de pesquisa TRIGA-IPR-

R1 , ou pelo fato de que trabalhamos com cultura em monocamda , onde a dimensão do

tumor é demasiadamente pequena para serem atingidas pelas partículas β

de 278 keV,

as quais poderiam atravessar a monocamada de células sem, no entanto, transferir a

energia necessária para matá-las. Estudos em modelos tumorais animais poderão

solucionar esta questão. No entanto, pode-se obter uma atividade específica bem mais

alta utilizando-se da produção do

Cu em reatores mais potentes dedicados à produção

de radionuclídeos para uso como radiofármacos ou em cíclotrons. A reação nuclear

comumente usada para obtenção do

Cu com alta atividade específica (10.000

Ci/mmol) é

Ni (p,n)

Cu, utilizando-se o cíclotron como ferramenta (WELCH et al.,

2003).

Recentemente, alguns pesquisadores têm investigado algumas aplicações para o cobre

livre ou fracamente quelado, usando o citrato de cobre como radiofármaco. Os estudos

baseiam-se na exploração de anormalidades encontradas durante a biodistribuição do

cobre. Os primeiros estudos foram centrados na doença de Wilson. Os pacientes com

suspeita da doença de Wilson mostram aumento da fixação hepática em comparação aos

controles. Já quando os sintomas desta doença começam a aparecer, a absorção no

fígado é retardada após a administração oral ou intravenosa do cloreto de cobre

radioativo, e em 2 h é diminuída. Ao mesmo tempo, a fixação extra-hepática ocorre

especialmente nos rins. A progressão da doença torna a fixação hepática ainda mais

lenta, enquanto aumenta a fixação extra-hepática. Este tipo de varredura é útil para o

acompanhamento da evolução da doença, bem como para observação dos efeitos da

terapia com quelantes (BLOWER et al., 1999).

Nos estudos de biodistribuição a alta fixação no fígado é considerada um problema para

as tiossemicarbazonas complexadas com cobre por causar citotoxicidade aos

hepatócitos (OBATA et al., 2005) e por prejudicar as imagens do miocárdio (SMITH et

al., 2004). O acúmulo dos complexos cobre-tiossemicarbazonas no fígado é em parte

justificado pelo fato destes compostos serem seletivos por ambientes com hipóxia, uma

vez que 75% do sangue que entra no fígado é pela veia porta e apenas 25% pela artéria

hepática (OBATA et al., 2005). Outra justificativa se deve ao grande número de

Discussão

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

147

metaloenzimas presentes no fígado que necessitam do Cu

na suas subunidades

estruturais para desempenhar suas funções. Dentre elas, a superóxido dismutase (SOD),

que contem em cada subunidade um átomo de cobre ou zinco, os quais se ligam ao

grupamento imidazol desta enzima. A SOD é uma enzima amplamente distribuída no

citosol das células eucarióticas e são abundantes no fígado, rins, adrenal e hemácias. O

papel desta enzima no corpo é servir como mecanismo de defesa contra radicais livres

(peróxido de hidrogênio) e também quebrar os complexos de cobre no fígado (SMITH

et al., 2004). Os nossos ensaios de biodistribuição mostraram uma maior fixação

hepática da

Culac (9,01 ± 3,32% DI/g). Já a fixação na pata com tumor de Ehrlich foi

em parte comprometida, pelo fato do tumor não ter atingindo um tamanho superior.

Entretanto, apesar da baixa fixação, nos tempos de 60 min. (0,47 ± 0,18 %DI/g) e 240

min (0,44 ± 0,02%DI/g), foi possível verificar que a

Culac é mais seletiva e específica

para diagnóstico de tumores quando comparada ao

CuCl

. A baixa fixação no cérebro

é justificada pelo fato que pequena parte do composto pode ter sido absorvida pela zona

de gatilho quimiorreceptora (KATSUNG, 2005). Em geral, fármacos mais lipofílicos e

de baixo peso molecular, como as tiossemicarbazonas, têm seu volume de

biodistribuição maior, dada a sua maior facilidade em atravessar membranas

(KATZUNG, 2005).

Assim, este projeto, contribuiu para o desenvolvimento de uma ferramenta para

aplicação em imagens multimodais, como a imagem molecular, o que é considerado

essencial para a oncologia, uma vez que o

FDG não é específico para o diagnóstico de

tumores.

Conclusões

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

148

8- CONCLUSÕES

• Todas as tiossemicarbazonas, derivadas de (N4)-orto-toluil-2-acetilpiridina e 2-

piridinoformamida, bem como seus complexos metálicos possuem potente

atividade antitumoral contra células de tumores malignos cerebrais e mamários.

• As células RT2, T98, MCF-7, CAE foram bastante sensíveis ao tratamento com

as tiossemicarbazonas Culac, Lac, Lacm, Lacpt, independente do status da p53.

• O mecanismo de morte celular programada (apoptose) foi desencadeado pelas

tiosssemicarbazonas testadas em todas as células tumorais malignas tratadas.

• A produção do radiofármaco

Culac, através do uso do reator TRIGA-IPR-R1,

foi desenvolvido com sucesso.

• A integridade estrutural do radiofármaco

Culac foi mantida, mesmo depois das

8 horas de irradiação no Tubo Central, do reator TRIGA-IPR-R1.

• A alta citotoxicidade in vitro do radiofármaco

Culac foi observada em todas as

células tumorais tratadas.

• A fixação no tumor de Ehrlich do radiofármaco

Culac foi mais efetiva do que o

sal de cobre (

CuCl

), no tempo de 240 min. após administração i.v. indicando

o potencial desta tiossemicarbazona como agente de detecção tumoral

• O reator TRIGA-IPR-R1 constituiu uma boa ferramenta para desenvolvimento

de radiofármaco Culac experimentalmente, contudo a sua baixa potência de 100

kW produziu radiofármacos com baixa atividade específica. Este fato acarretou

no aumento da concentração química da droga administrada nos camundongos.

• Os resultados indicam que as tiossemicarbazonas dervadas de N4-orto-toluil-

2acetilpiridina complexadas como o cobre são agentes promissores para

detecção de sítios tumorias in vivo pela técnica PET (vide anexo 3).

Perspectivas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

149

9-PERSPECTIVAS

• Avaliar os mecanismos de interação das tiossemicarbazonas com a

ribonucleotídeo redutase.

• Avaliar os estudos de biodistribuição do radiofármaco

Culac, através da

técnica de imagem PET, em camundongos swiss fêmeas.

• Avaliar novos estudos de biodistribuição em outros modelos tumorais.

• Produção do

Cu, com maior atividade específica, utilizando-se do

cíclotron.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

150

10-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALEMANY, R. et al.; J. Gene Therapy for Gliomas: molecular targets, adenoviral

vectors, and oncolytic adenoviruses. Exp. Cell Res., v. 252, p. 1-12, 1999.

ANAZETTI, M. C.; MELO, P. S. Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e

molecular. Metrocamp Pesquisa, v. 1, p. 37-58, 2007. Disponível em:

www.metrocamp.com.br/pesquisa. Acessado em: 12/12/2007.

ANDERSON, C. J.; WELCH, M. J.Radiometal-Labeled Agents (Non-Technetium) for

Diagnostic Imaging. American Chemical Society, Chemical Reviews, v. 99, p. 2219-

2234, 1999.

APAC/SUS – Autorização para procedimentos de alta complexidade/ Sistema único de

saúde. Ministério da Saúde. On line. 2002. Disponível em:

http://www.fesehf.org.br/documentos/tabelas/manual.onco.htm. Acessado em:

02/03/2008.

ARANO, Y. Recent advances in

99m

Tc radiopharmaceuticals. Annals of Nuclear

Medicine, vol. 16, nº. 2, p.79–93, 2002

BERALDO, H.; GAMBINO, D. Wide Pharmacological Versatility of Semicarbazones,

thiosemicarbazones and Their Metal complexes, Mini Reviews in Med. Chemistry, v.

4, p. 159-165, 2003.

BERALDO, H. Semicarbazonas e tiossemicarbazonas: o amplo perfil farmacológico e

usos clínicos. Rev. Quimíca Nova, v. 27, p. 461-471, 2004.

BLOWER, P.J.; LEWIS, J.S.; ZWEIT, J.; Copper Radionuclides and

Radiopharmaceuticals in Nuclear Medicine. Nucl Med & Biol, v. 23, p. 957-980, 1996.

BOMBARDA, S.; JUNIOR, J.S.; FILHO, M.T. Estudo do metabolismo da glicose na

tuberculose pulmonar ativa utilizando a tomografia por emissão de pósitrons (18F-FDG

– PET). J. Pneumol, p. 270-276, 2002.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

151

BORGES-OZÓRIO, M. R. et al., Genética Humana. Editora Artmed. 2ª ed. São Paulo

– SP, 2001, p.364-368.

BRANDES, A. A.; PASETTO, L. M.; MONFARDINI, S. New drugs in recurrent high

grade gliomas. Rev. Anticancer Research, v.20, p. 1913-1920, 2000.

CAMPOS, S. M.; HAYES, D. F. Atlas of diagnostic oncology. In: Breast cancer, 3.

ed,

Elsevier Science, 2003, p 9-25

CHANDRA, S.; GUPTA, L. K. Spectroscopic and biological studies on newly

sythesized nickel (II) complexes of semicarbazones and tiosemicarbazones,

Spectrochimica Acta Part A, v. 62, p. 1089-1094, 2005.

CHAO, K. S. C; PEREZ, C. A.; BRADY, L. W. Radiation Oncology Management

Decisions. Lippincott: Raven Publishers, 1998. 578-654p.

CHO, R. J. et al.; A Genome-Wide Transcriptional Analysis of the Mitotic Cell Cycle.

Molecular Cell, v.2, p.65–73, 1998.

CHUBACI, R Y. S.; MERIGHI, M. A. B.; Exame para detecção precoce do câncer

cérvico-uterino: vivência de mulheres das cidades de Kobe e Kawasaki, Japão e São

Paulo, Brasil. Revista Brasileira Saúde Materno Infantil, v 5, p.471-481, 2005.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Patologia Estrutural e Funcional . 6.

ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000, 225-357p.

COUTINHO, A. Avaliação da relevância de imagens simultâneas de fusão: SPECT

com

99m

Tc-MDP e Tomografia Computadorizada aplicada no diagnóstico das

Disfunções Temporomandibulares, Dissertação de Mestrado, 81f, Universidade de

São Paulo-USP, São Paulo, 2004.

DA COSTA, L. Análise por ativação neutrônica: estudo de interferências primárias

nas determinações de alumínio, magnésio, manganês e sódio. Dissertação de

Mestrado, 121f, Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear – CDTN, Minas

Gerais, 2007.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

152

DA SILVA, J.W.E.. Modelo de Conversão MAG3-DMSA para avaliação da função

renal em imagens cintilográficas por redes neurais artificiais. Tese de Doutorado,

180f., Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, Rio de Janeiro, 2003.

DEVITA, V. T.; HELLMAN, S.; ROSEMBERG, S. A. Cancer: principles e practice

of oncology. Lippincott – Raven Publishers, 5

ed. v.1, Philadelphia – New York, 1997.

79-349p.

EASMON, J. et al., 2-benzoxazolyl and 2-benzimidazolyl hydrazones derived from 2-

acetylpyridine: A novel class of antitumor agents, J. Cancer, v. 94, p 89-96, 2001.

EKLUND, H. et al. Structure and function of the radical enzyme ribonucleotide

Reductase. Progress in Biophysics & Mol. Biology, v.77, p.177–268, 2001.

EVAN, G.I.; VOUSDEN, K.H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer.

Macmillan Magazines Ltd, Nature , v.411, P. 342-348, 2001.

FERREIRA, N. F. et al. Estudo através da ressonância magnética de 67 casos de

glioblastoma multiforme e a ocorrência de metástases. Arq. Neuropsiquiatria v. 62,

n.3, p. 695-700, 2004.

FERRO-FLORES, G.; MURPHY, C. A.; ALAFORT, L. M. Third generation

radiopharmaceuticals for imaging and targeted herapy. Curr. Pharm. Anal. v. 2, p

339-352, 2006.

FILHO, G.B. et al. In: Distúrbios do cresimento e da diferenciação celular. Bogliolo

Patologia. 6.

. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan., 2000. p 144-187.

FRANCO, M. B.; Levantamento de Parâmetros Nucleares do Reator Triga Mark I

IPR R1 com configuração concêntrica visando a aplicação da Técnica de Ativação

Neutrônica Paramétrica . Tese de Doutorado, 176 f. Universidade Estadual de

Campinas-UEC, Campinas, 2006.

GIROLAMI, V.; COTRAN R.S.; KUMAR, V.; ROBBINS, C. Patologia estrutural e

funcional. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p. 1198-1202

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

153

GOJO, I. et al.; Phase I and pharmacokinetic study of Triapine, a potent ribonucleiotide

reductase inhibitor, in adults with advanced hematoligic malignances. Leukemia Res.

v.31, p. 1165-1173, 2007.

GRIVICICH, I. R, REGNER A., ROCHA. A. B. Morte Celular por Apoptose. Rev.

Bras. de Cancerologia, v.53, p.335-343, 2007.

HOLLAND, E. C. Gliomagenesis: genetic alterations and mouse models. Rev. Nature,

v. 2, p.120-129, 2001.

HOLLAND, J. P. et al.; Functionalized Bis(thiosemicarbazonato) Complexes of Zinc

and Copper: Synthetic Platforms Toward Site-Specific Radiopharmaceuticals. J.

Inorganic Chemistry, v.46, p, 2007.

IGNEY, F.H.; KRAMMER, P.H. Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis.

Nature Reviews Cancer, v.2, P. 277-288, 2002.

INCA - Estimativas 2008: Incidência de Câncer no Brasil. Ministério da Saúde, 2007,

On line. 2002. Disponível em: http://www.inca.org.br/esimativas/2008. Acessado em:

01/01/2008.

JALILIAN, A.R.; ROWSHANFARZAD, P.; SABET, M.; SHAFIEE,A. Preparation of

[61Cu]-2-acetylpyridine thiosemicarbazone complex as a possible PET tracer for

malignancies. Applied Radiation and Isotopes, v.64, p. 337–341, 2006.

JALILIAN, A. R.; SADEGHI, M.; YARI-KAMRANI, Y.; ENSAF, M. R. Development

of [103Pd]-2-acetylpyridine 4N-methyl thiosemicarbazone complex for targeted

therapy. J. Radioanalytical Nucl. Chemistry, v.268, p. 605-611, 2006.

JORDE, L. B; CAREY, J. C; WHITE, R. L. Genética Médica. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 1996. 324-465p.

KASTNER, G. F., FERREIRA, A.V. Avaliação da aplicabilidade de técnica de análise

por ativação neutrônica. In: International Atlantic Conference, 2005, Santos.

Associação Brasileira de Energia Nuclear, 2005.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

154

KATZUNG, B. G. Farmacologia Básica & Clínica. 9ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2005. p. 1-53

KUBOTA Y.; KUBOTA K.; TANI S. DNA binding properties of Dapi (4´,6-diamino-

2-phenylindole) analogs having an imidazoline ring or a tetrahydropylindole ring:

Groove-biding and intercalation. Nucleic Acids Symposium. v 44, p.53-54, 2000.

KUERBITZ, S.J.; PLUNKETT, B.S.; WALSH, W.V.; KASTAN, M.B.. Wild-type p53

is a cell cycle checkpoint determinant following irradiation. Proc. Natl. Acad. Sci.,

p.7491-7495, 1992.

LE, N.T.V.; RICHARDSON, D.R. The role of iron in cell cycle progression and the

proliferation of neoplastic cells. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1603, p. 31–46,

2002.

LINKE, S. P. et al.; Reversible, p53-dependent G

cell cycle arrest induced by

ribonucleotide depletion in the absence of detectable DNA damage. Gene Dev., v. 10,

p. 934-94, 1996.

LI, J. et al.; Syntheses and Antitumor Activities of Potent Inhibitors of Ribonucleotide

Reductase: 3-Amino-4-Methylpyridine-2-Carboxaldehyde-Thiosemicarbazone (3-

Amp), 3-Amino-Pyridine-2-Carboxaldehyde-Thiosemicarbazone (3-Ap) and its Water-

Soluble Prodrugs, Curr. Med.Chemistry, v. 8, p. 121-133, 2001.

LIS, A. et al.; 2-Methoxyestradiol inhibits proliferation of normal and neoplastic glial

cells, and induces cell death, in vitro, Cancer Letters, v. 213, p. 57–65, 2004.

LODISH, H. et al.; Molecular Cell biology. 5

ed. New York: W.H. Freeman and

Company, 2004, p 534-596.

LOVEJOY, D. B.; RICHARDSON, D. R.; Novel ¨hybrid iron chelators derived from

aroylhydrazones and thiosemicarbazones demonstrate selective antiproliferative activity

agaisnt tumor cells. J. Blood, v. 100, p321-325, 2002.

MACDONALD, F.; FORD, CHJ. Molecular Biology of Cancer. Oxford: BIOS

Scientific , 2000. p. 1-34.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

155

MCQUADE, P. et al., Investigation into

Cu-labeled Bis(selenosemicarbazona) and

Bis(thiosemicarbazone) complexes as hipóxia imaging agents. J. Nucl. Med. Bio. v. 32,

p. 147-156, 2005.

MENDES; I.C. et al.; H. N(4)-tolyl-2-benzoylpyridine Thiosemicarbazones and their

Copper(II) Complexes with Significant Antifungal Activity. Crystal Structure of N(4)-

para-tolyl-2-benzoylpyridine Thiosemicarbazone. J. Braz. Chem. Soc., v. 17, p. 1571-

1577, 2006.

MIGUEL, R. A.; Otimização da Técnica de Análise por Ativação Neutrônica

Instrumental e Adequação do Software “k

Labsue” Método Paramétrico k

Dissertação de Mestrado, 96f. Universidade Federal de Minas Gerais-UFMG, Belo

Horizonte, 2003.

MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application

to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol Methods, v 16, p 55-63, 1983.

MONTESANO, R; HALL, J. Environmental causes of human cancer. Eur. J. Cancer,

v. 37, p. 67-67, 2001.

NAKANO K., BALINT E., ASHCROFT, M. VOUSDEN, K.H. A ribonucleotide

reductase gene is a transcriptional target of p53 and p73. Oncogene, v. 19, p. 4283 –

4289, 2000.

NORBURY, C.J.; HICKSON, I.D.. Cellular Responses to DNA Damage. Annu. Ver.

Pharmacol. Toxicol. v. 41, p. 367-401, 2001.

OBATA, A. et al.; Basic characterization of

Cu-ATSM as a radiotherapy agent. J.

Nucl. Med. Bio. v. 32, p. 21-28, 2005.

O´CONNOR, P.M. et al. Characterization of the p53 tumor suppressor pathway in cell

lines of the National Cancer Institute anticancer drug screen and correlations with the

growth-inhibitory potency pf 123 anticancer agents. Cancer Res.v. 57, p. 4285-4300,

1997.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

156

OLIVEIRA, R., et al., Preparações radiofarmacêuticas e suas aplicações. Rev. Bras.

Cienc. Farm.., v. 42, p. 150-165, 2006.

PARRY, S.J. Handbook of neutron activation analysis. Woking: Viridian Publishing,

2003, p 8-39.

PAUWELS, E. K. J.; MCCREADY, V. R.; STOOT, J. H. M.B.; DEURZEN, D. F. P.

The mechanism of accumulation of tumor-localising radiopharmaceuticals. Eur. J.

Med. Nucl. v. 25, p. 277-305, 1998.

PEREIRA, R. A.; KOIFMAN, S. Associação entre fatores da dieta e tumores de cérebro

em adultos: uma revisão da literatura Cad. Saúde Pública. v.17(6), p.1313-1334, 2001.

PEREZ, C. A.; BRADY, L. W.; ROTI, J. L. Principles and practice of radiation

oncology. 3

th.

Philadelphia: Raven Publishers, 1997, 1112-1307p

POZZO, L. Tomografia por Emissão de Pósitrons com Sistemas PET/SPECT: Um

Estudo da Viabilidade de Quantificação. Tese de Doutorado. 186f, Universidade de

São Paulo – USP, São Paulo, 2005.

RICCI M. S.; ZONG W. Chemotherapeutic Approaches for Targeting Cell Death

Pathways. Oncologist. v. 11, p.342-357, 2006.

ROBILOTTA, C.C. A tomografia por emissão de pósitrons: uma nova modalidade na

medicina nuclear brasileira. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health. v.

20(2/3), p. 134-142, 2006.

SALVAJOLI, J. V. et al., Radioterapia em Oncologia. Ed. Med. Rio de Janeiro – RJ,

1999, p 70-150.

SHAO, J. et al; Ribonucleotide reductase inhibitors and future drug design. Current

Cancer Drug Targets. v.6, p.409-431, 2006.

SMITH, S. V. Molecular imaging with copper-64. J. Inorg. Biochem. v. 98, p. 1874–

1901, 2004.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

157

SORENSON, J.A., PHELPS, M.E., Physics in Nuclear Medicine. 2

th.

. Philadelphia,

W.B. Saunders Company, 1987, p.37-48.

STRASSER A.; O´CONNOR L.; DIXIT V. M. Apoptosis signaling. Annual Rev

Biochem v.69, p. 217-245, 2000.

SPIRANDELI, J. M. B et al. Metástase Isolada de Câncer da Mama:

Valor da Dosagem do CA 15-3 e do Mapeamento com 18 – FDG, Rev. Bras.

Cancerol., v. 5, p.20-32, 1999.

TENÓRIO, R. P.; GÓES, A. J. S., Tiossemicarbazonas: métodos de obtenção,

aplicações e importância biológica. Quim. Nova, v. 6, p. 1030-1037, 2005.

THRALL, J.H.; ZIESSMAN, H.A, Medicina nuclear, 2ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2003, p. 35-193.

VATSA, G.; PANDEY, O. P.; SENGUPTA, S. K. Sythesis, spectroscopic and toxicity

studies of Titanocene Chelates of Isatin-3-Thiosemicarbazones. Rev. Bioinorganic

Chemistry and Applications, v. 3, p. 150-160, 2005.

VALLABHAJOSULA, S. F-Labeld Positron Emission Tomographic

Radiopharmaceuticals in Ocology: An Overview of Radiochemistry and Mechanisms of

tumor Localization. Semin. Nucl. Med. v. 37, p. 400-419, 2007.

VÃVERE, A.L.; LEWIS, J.S. Cu–ATSM: A radiopharmaceutical for the PET imaging

of hypoxia. Royal Society of Chemistry J. v. 10, p. 4893–4902, 2007.

VÉRTES, A.; NAGY, S.; KLENCSÁR, Z.. Handbook of nuclear chemistry.

Radiochemical and radiopharmaceutical chemistry in life sciences. Dordrecht:

Kluwer Academic, 2003, v.4

WELCH, J. M.; REDVANLY, C S. Handbook of Radiopharmaceutical:

radiochemistry and applications . London: John Willey, 2003, p 87-119.

WELCH, J. M.; REDVANLY, C S. Handbook of Radiopharmaceutical:

radiochemistry and applications . London :John Willey, 2003, p 401-423.

Referências Bibliográficas

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

158

WILLIAMS, H. A. et al. Comparison of PET imaging characteristics of various copper

radioisotopes. Eur. J. of Nucl. Med. Mol. Imaging, v. 32, p. 1473-1480, 2005.

WÜNSCH, V. F; MONCAU, J. E. Mortalidade por câncer no Brasil 1980-1995:

padrões regionais e tendências temporais. Rev. Ass. Med. Bras., v. 45, p. 250-257,

2002.

ZIEGLER U.; GROSCURTH P. Morphological Features of Cell Death. News Physiol.

Sci. v. 19, p. 124-128, 2004.

ZIMMERMANN K.C.; BONZON C.; GREEN D.R. The machinery of programmed

cell death. Rev. Pharmacology & Therapeutics. v.92, p. 57-70, 2001.

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

159

APÊNDICE A

Princípios Físicos na Medicina Nuclear

Decaimento Radioativo

Emissão de Partículas Alfa

A emissão de partículas alfa é o único tipo de decaimento radioativo espontâneo que

emite partículas pesadas, excetuando-se a fissão. Isso tanto para as espécies naturais

como para as produzidas artificialmente. O processo de decaimento alfa para um núcleo

pode então ser descrito como na equação 12:

→

−

(12)

Onde, Z é o número atômico, A é o número de massa, e X e Y simbolizam diferentes

espécies nucleares.

Uma partícula alfa tem então uma massa igual a 4 vezes a massa do próton (ou 7000

vezes a massa do elétron), e carrega duas unidades de carga elétrica positiva.

Os produtos do decaimento (núcleos filhos) de um núcleo obtidos por emissão de

partículas alfa, podem ou não ser radioativos. As partículas alfa correspondem a uma

dada transição entre o núcleo pai e o núcleo filho possuem energias características e

discretas, portanto, sempre têm a mesma energia cinética (SALVAJOLLI et al., 1999)

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

160

Emissão de Partículas Beta

A emissão da radiação beta é um processo mais comum entre os núcleos leves ou de

massa intermediária, que possuem um excesso de nêutrons ou de prótons em relação à

estrutura estável correspondente. Radiação beta é o termo usado para descrever elétrons

de origem nuclear, carregados negativamente (e

), ou positivamente (e

Existem três formas de emissão beta: β

, β

e Captura de Elétrons (EC). A radiação β

consiste de elétrons (também chamados négatrons) de alta energia que se originam no

núcleo. Esses elétrons nucleares têm propriedades idênticas aos elétrons atômicos, e

assim sua massa é (1/1840) uma, e carregam uma unidade de carga negativa. Um núcleo

instável porque tem poucos prótons, e então apresenta excesso de nêutrons tenderá a se

estabilizar aumentando sua carga nuclear, ou seja, emitindo elétrons. Assim, numa

análise rápida, o decaimento β

se reduz na transformação do nêutron em próton, como

por exemplo:

→

1−

. Isso pode ser ilustrado na equação 13.

(13)

Diferentemente das partículas alfa, observou-se que as partículas beta negativas, de

núcleos idênticos, são emitidas com continuidade de energia, variando de zero até uma

energia máxima característica do núcleo pai. Assim, no núcleo do átomo saem

partículas com todas as energias possíveis e o núcleo resultante não poderá ter uma

energia definida. Devido a este problema, Pauli, em 1933, postulou a emissão de uma

segunda partícula para acompanhar cada emissão beta. Essa segunda partícula

carregaria a diferença de energia entre a partícula beta e a máxima em cada caso

(SCAFF, 1997).

Contudo, desde que a energia e a carga elétrica sejam conservadas na emissão beta, esta

segunda partícula não poderia ter carga nem massa. Desse modo, esta partícula

hipotética recebeu o nome de neutrino (pequeno nêutron), com o símbolo v, cuja

existência foi confirmada experimentalmente em 1956. Reines e Cowan, também em

→

Z 1+

1−

___

isse

195

neut

radi

elétr

pósi

A p

que

deca

pósi

Este

(SA

_______

tação de Mest

, consegu

ino somen

outra for

ção consis

ca positiv

ron, que é

rtícula β

sofre uma

mento β

eja, um p

ron, que é

ontínuo, c

fenômeno

VAJOLI,

_______

ado

aulo

ram detec

e na direçã

a de decai

e de partí

. A partícu

antipartíc

emitida p

transmuta

ode ser re

óton se tr

mitido ju

m uma en

IGU

A 60

adionuclíde

em interes

t al., 1999

)

_______

oberto Ornela

ar antineu

o do seu sp

ento beta

ulas de

a do decai

la do elétr

r um radio

ão e pass

resentado

nsforma e

tamente co

rgia médi

Exemplo

os instáveis

e fundam

)

_______

da Silva

– C

rinos (

)

n (SALV

foi descob

assa igual

ento β

n (POZZ

uclídeo de

a a ter n

elas equa

um nêut

m um neut

e uma ene

e espectro

por excess

ntal na det

→

−

= n + β

_______

TN/CNE

sendo qu

JOLI, et al

rta por C.

à massa d

um elétron

, 2005).

origem (p

mero atô

ões 14 e 1

on (que p

ino. Por is

gia máxim

e partícula

de próton

cção de ra

−

_______

o antine

., 1999).

. Andres

elétron,

positivo, t

i), com ex

ico Z-1.

(POZZO,

rmanece

o, o espec

, como m

β+ emitid

(POZZO,

ioisótopos

_______

trino dife

n em 1932

as tendo

mbém cha

esso de pr

ste proce

2005).

o núcleo)

ro energét

stra a FIG.

s por

2005)

emissores

161

e do

Esta

carga

ado

tons,

so, o

e um

co de

60.

de β

(14)

(15)

___

isse

Fóto

foto

aind

a pr

(Z)

FIG

mei

par

núm

corp

Obs

de 5

com

aniq

A te

aniq

orbi

_______

tação de Mest

s de 511

létrico

e e

interagir

babilidade

o meio (P

RA 61 -

de prop

s). Na reg

ro atômic

humano (

rva-se no

1 keV, o p

osto de 7

ilação co

ceira form

ilação de

al. Ele pod

_______

ado

aulo

keV pode

palhament

ormando u

de ocorrer

ZZO, 200

Probabili

ação (ef

ão corresp

em torno

POZZO, 2

ráfico que,

rocesso do

% - 80%

o corpo d

de decai

arga do pr

ser ilustra

_______

oberto Ornela

interagi

Compto

par de p

um proces

ade relat

ito fotoel

ndente ao

de 9,7, qu

05).

para um n

inante é o

e água, est

paciente (

ento beta

ton, transf

do na equa

_______

da Silva

– C

com o

. Fótons d

rtículas

o ou outro

va dos trê

trico, esp

retângulo

correspon

mero atô

espalhame

é o princ

OZZO, 2

oi descob

rmando-o

ão 16:

_______

TN/CNE

eio que

energia

téria e ant

em função

tipos de

lhamento

cinza se c

e ao Z da

ico próxi

to Compt

pal proces

05).

rta por Al

em nêutro

_______

s cerca a

cima de 1

matéria).

do númer

nteração

Compton

ncentram

água, mai

o ao da ág

n. Como o

o de intera

arez, em 1

, pela capt

_______

ravés de

02 MeV p

FIG. 61

atômico e

e fótons

e produç

substância

r constitui

a (9,7) e e

corpo hu

ção de fót

38, e env

ra de um e

162

feito

odem

ost

etivo

om o

o de

com

te do

ergia

ano é

lve a

étron

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

163

1−

Z 1−

+ ν (16)

Quando um elétron é removido do orbital por sua captura pelo núcleo atômico, o lugar

que fica vazio é imediatamente preenchido por algum elétron que esteja num orbital de

energia mais alta. Durante esse processo nenhuma partícula é emitida, e só fica

caracterizada a sua existência porque um elétron, ao saltar de um orbital de energia mais

alta para um orbital de energia mais baixa, emite uma energia característica, que é o

raios-X. Entretanto, a captura de elétrons orbitais pelo núcleo atômico pode vir

acompanhada, algumas vezes, da emissão de elétrons atômicos, denominados elétrons

Auger. Isso acontece quando o raios-X emitido colide com um dos elétrons que

permaneceram nos orbitais atômicos. Nessa colisão, o raios-X cede energia ao elétron,

que é então deslocado do orbital para fora do átomo, passando a ser observável

(POZZO, 2005).

Emissão Gama

Em alguns casos, após a emissão da partícula pelo núcleo, o processo radioativo se

completa; mas, em muitos casos, o núcleo filho ainda contém certa quantidade de

energia, permanecendo “excitado”. Os núcleos formados em tais estados excitados

podem emitir o excesso de energia na forma de fótons chamados de raios gama, os quais

apesar de se originarem do núcleo, são de natureza eletromagnética. Pode-se dizer assim

que a emissão dos raios γ é a energia de excitação do núcleo filho (CHRISTIAN et al.,

2007).

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

164

ANEXO 1

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

165

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

166

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

167

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

168

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

169

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

170

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

171

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

172

ANEXO 2

FIGURA 62 – Foto superior do layout do programa WorkStream´s 3D plannin

para

aquisição de ima

ens PET/CT. A fi

ura mostra ima

ens dos frascos utilizados para

irradiação das amostras (tubos porta-amostras-C) contendo

CuCl

Culac, ativados

neutronicamente no reator TRIGA IPR-R1.

CuCl

Culac

_____________________________________________________________

Dissertação de Mestrado - Paulo Roberto Ornelas da Silva – CDTN/CNEN

173

ANEXO 3

CuCl

Culac

FIGURA 63 – Foto central do layout do programa WorkStream´s 3D

plannin

para aquisição de ima

ens PET/CT. A fi

ura mostra ima

ens dos

frascos utilizados para irradiação das amostras (tubos porta-amostras-C)

contendo

CuCl

Culac, ativados neutronicamente no reator TRIGA

IPR-R1.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 