( PDF ) Terapia fotodinâmica sobre carcinoma mamário de cadela cultivado in vitro

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA - FAV

TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE CARCINOMA

MAMÁRIO DE CADELA CULTIVADO IN VITRO

MARTHA DE SOUZA TEIXEIRA DA ROCHA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

EM SAÚDE ANIMAL

BRASÍLIA/DF

MARÇO/2010

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE CARCINOMA MAMÁRIO DE CADELA

CULTIVADO IN VITRO

MARTHA DE SOUZA TEIXEIRA DA ROCHA

ORIENTADOR: PAULA DINIZ GALERA

CO-ORIENTADOR: RICARDO BENTES DE AZEVEDO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

EM SAÚDE ANIMAL

PUBLICAÇÃO: 020/2010

BRASÍLIA/DF

MARÇO/2010

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iii

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA E CATALOGAÇÃO

ROCHA, M.S.T.. Terapia fotodinâmica sobre carcinoma mamário de cadela

cultivado in vitro. Brasília:Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

Universidade de Brasília, 2010, 85 p. Dissertação de Mestrado.

FICHA CATALOGRÁFICA 020/2010

Documento formal, autorizando reprodução

desta dissertação de mestrado para

empréstimo ou comercialização,

exclusivamente para fins acadêmicos, foi

passado pelo autor à Universidade de

Brasília e acha-se arquivado na Secretaria

do Programa. O autor reserva para si os

outros direitos autorais, de publicação.

Nenhuma parte desta dissertação de

mestrado pode ser reproduzida sem a

autorização por

escrito do autor. Citações

são estimuladas, desde que citada a fonte.

Rocha, Martha de Souza Teixeira da

Terapia fotodinâmica sobre carcinoma mamário de cadela

cultivado in vitro / Martha de Souza Teixeira da Rocha

orientação de Paula Diniz Galera, co-orientação de Ricardo

Bentes de Azevedo – Brasília, 2010. 85p.: il.

Dissertação de Mestrado (M) –

Universidade de

Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

2010.

1.terapia fotodinâmica, 2.carcinoma mamário, 3.cadela, 4.

alumino-cloro ftalocianina lipossomal.

I. Rocha, M.S.T.. II. Terapia fotodinâmica sobre carcinoma

mamário de cadela cultivado in vitro

CDD ou CDU

Agris / FAO

DEDICATÓRIA

A Deus, meu rochedo, minha salvação e minha fortaleza (Salmo 61.3)

Aos meus amados pais Geraldo Rosalvo e Maria Virgínia e ás minhas irmãs Mariana

e Maria Izabel pelo amor, amizade, paciência e confiança. Sem o apoio incondicional

de vocês, certamente não chegaria até aqui.

Amo vocês

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Aos Profs. Drs. Carolina Madeira Lucci e Ricardo Bentes de Azevedo, agradeço pela

oportunidade dada, sem a qual nada disso seria possível. Obrigada por ajudar não

somente a mim como também, a todos que lhes procuram na busca pelo

conhecimento. Obrigada por acreditarem em seus orientados, co-orientados e

discentes, pelos valiosos ensinamentos e valores morais adquiridos e pelo

companheirismo principalmente nas horas em que nem eu acreditava mais em mim.

Minha admiração e respeito pelos mestres, profissionais, líderes e seres humanos.

vii

AGRADECIMENTOS

Á minha orientadora, Profª Dra. Paula Diniz Galera, pela orientação concedida, pela

confiança, pelos vários anos de convivência e oportunidades. Você é um exemplo

para mim.

Ao Prof.Dr. Carlos Roberto Daleck e Prof Dra. Mônica Pereira Garcia pelo aceite do

convite para compor a minha banca examinadora. Fico honrada com a presença,

correções e considerações dos docentes para a melhoria do presente trabalho.

Ao Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco e equipe pela disponibilidade de envio e

formulação do agente fotossensibilizador.

Ao Prof. Sebastião Willian da Silva pela generosidade de realizar as avaliações do

LED e paciência em ensinar a uma médica veterinária importantes conceitos da

Física.

Aos Profs. Msc, Christine Souza Martins, Prof. Dr. Richard da Rocha Filgueiras e

Prof. Dr. Daniel Gerardi pelos ensinamentos e ajuda nas horas mais difíceis. Mais

que grandes mestres, vocês foram grandes amigos. A admiração e o respeito serão

eternos.

Ao Prof Dr Márcio Botelho de Castro, pela ajuda sincera e desinteressada nas

análises adicionais ao meu projeto. Sei que posso contar a qualquer hora seja com o

docente ou com o amigo. Conhecer essa pessoa tão íntegra e de bom coração foi

um dos grandes presentes que ganhei no mestrado.

Ao Prof. Ricardo Titze pela disponibilidade do laboratório do MMB.

A todos, sem exceção, funcionários, médicos veterinários e residentes do Hospital

Veterinário da UnB, pelo apoio, paciência, solidariedade, e compreensão nos

momentos de ausência. Obrigada especialmente a Equipe da Clínica Cirúrgica e aos

viii

funcionários Alex, Cris, Hugo, Joacir, Monique, Nazaré e Wilson pela ajuda nos

horários mais imprevisíveis.

A equipe do laboratório de Morfologia e Morfogênese da UnB, em especial a Zélia e

aos pesquisadores Camila, Carol, Claúdio, Grazielli, Jaqueline, João, Jú, Larissa,

Leandro, Luis, Maitê, Natália, Patricia, Victoria, por me receberem de braços abertos

e pelas inúmeras ajudas no decorrer de meu mestrado. A cada dia admiro mais a

capacidade científica de cada um de vocês, contem sempre comigo.

A Universidade de Brasília por ter me acolhido desde a graduação. Minha história

profissional sempre estará vinculada a está instituição tão querida.

Aos órgãos de fomento: CNPq, CAPES, Finatec, pelo auxílio financeiro.

A Pós Graduação Saúde Animal - FAV, e especial ao coordenador Prof. Dr Vítor

Salvador Picão e aos funcionários Kelly Cristina e Deuzidete pelo empenho de vocês

sempre quando me foi necessário.

A toda equipe da Microbiologia Veterinária, Patologia Veterinária e Patologia Clínica,

pela boa vontade em todos os momentos.

As médicas-veterinárias: Anahí, Cris, Karla, Marta, Mirna e Vanessa. Não há

palavras para agradecer tanto esforço, tanta amizade e desprendimento. Nesta

trajetória muitas vezes árdua, vocês foram sensacionais.

Ao Laboratório de Reprodução Animal e as mestrandas Luciana e Renata, amigas

adquiridas no laboratório para toda vida. Agradeço pelo companheirismo, seja nas

horas de alegria quando as coisas davam certo ou nas horas de tristezas

decorrentes dos obstáculos enfrentados. Vocês foram fundamentais para meu

equilíbrio.

As Médicas veterinárias, Alexandra, Bruna, Catarina, Etiele e Samara pela valiosa

ajuda nos atendimentos e atenção aos meus pacientes tão especiais da oncologia.

Sem a ajuda de vocês, jamais conseguiria tocar meus projetos.

Ao amigo e médico veterinário Mário Falcão, pelos anos de amizade. A cada dia lhe

admiro mais como ser humano e profissional. Estarei sempre presente quando

precisar.

A Maria Fernanda, “filha”, médica veterinária e minha amiga, pelas palavras corretas

nas horas mais incertas e pelas várias ajudas no decorrer deste trabalho. Obrigada

por me ouvir, e por sempre estar disposta a me ajudar.

A Ana Bárbara, médica veterinária pelo carinho, amizade, cooperação e força no

Hvetinho. Obrigada pelo ombro amigo.

A minha melhor amiga, minha irmã Luiza Quintão pela presença constante mesmo

estando fisicamente distante e pela amizade verdadeira. Obrigada por sempre estar

ao meu lado nos momentos mais importantes, seja torcendo pelo meu sucesso, pela

minha felicidade, seja me protegendo, me consolando ou me aconselhando. Sua

amizade é essencial em minha vida. Como sinto sua falta, mas agora falta bem

pouquinho... Volta logo!!!

Aos meus “filhos”: Brisa, Cocada, Nina e Nikos, pelo amor incondicional. Desculpem

pela falta de tempo principalmente nesta reta final.

Aos meus queridos pacientes e seus respectivos proprietários. Todo esforço,

dedicação, estudos é por amor e dedicação a vocês. Obrigada pela confiança em

meu trabalho e pela paciência nos momentos em que não pude estar presente.

Saudades eternas a Sacha, Layka, Pagu, Kay, Fufu e Bárbara Carolina.

Ao amigo e médico veterinário Levi Fiúza, você faz parte de tudo isso... Saudade

eterna...

“A vida é valor absoluto. Não existe vida menor ou maior, inferior ou

superior. Engana-se quem mata ou subjuga um animal por julgá-lo

inferior. Diante da consciência que abriga a essência da vida, o crime é

o mesmo.”

(Olympia Salete)

SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS

Xii

LISTA DE FIGURAS xiii

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES xv

RESUMO xvi

ABSTRACT xvii

CAPÍTULO I 01

Introdução 01

Referencial Teórico 03

Objetivos

Referências

CAPÍTULO II

Introdução

Material e Métodos

Resultados

Discussão

Conclusões

Referências

CAPÍTULO III

Considerações Finais

ANEXO

xii

LISTA DE QUADROS

Página

QUADRO 1

Classificação Histológica dos Neoplasmas Mamários em Cadelas

segundo a Organização Mundial de Saúde (MISDORP et al.,

1999).

QUADRO 2

Descrição da constituição de cada grupo experimental. As

demarcações em “X” referem-se à aplicação do item em questão

xiii

LISTA DE FIGURAS

Página

FIGURA 1

Ilustração gráfica dos mecanismos fotoquímicos presentes na TFD.

Observa-se transferência de energia e a produção de radicais livres

em diferentes tipos de reações, após a excitação do fármaco FS

devido à irradiação com LED

FIGURA 2

Imagem fotográfica do aparelho LED protótipo utilizado nesta

dissertação, em funcionamento durante TFD. Note a amostra

protegida da luz ambiente

FIGURA 3

Imagem computadorizada da faixa obtida através da cromatografia

de camada delgada (CCD) para identificação da faixa de

comprimento de onda do LED. Observa-se em 580nm percepção do

espectro (luz), em 660nm obtém-se seu maior valor e em 700nm

termina seu espectro

FIGURA 4

Representação esquemática elucidando as etapas envolvidas da

colheita da amostra até o estabelecimento das culturas primárias. A)

cadeia mamária unilateral removida cirurgicamente do paciente

contendo massas tumorais em glândula mamária abdominal cranial

e inguinal; B) excisão do fragmento tumoral para colheita da

amostra; C) diérese do material; D e E) imediatos ciclos de lavagens

da amostra e envio para o laboratório através do meio de transporte;

F) fracionamento da amostra coletada e G) cultivo produzido a partir

dos fragmentos do tumor.

FIGURA 5

Representação do preparo das placas de 24 poços para realização

do experimento com TFD. A) garrafa de cultivo contendo células

aderidas na superfície e confluentes; B) após adição da solução de

tripsina-EDTA e consequente destacamento das células aderidas ao

fundo do frasco de cultura; C) e D) ressuspesão do meio contendo

células soltas e envio para centríuga a 750xg durante 05 minutos

para formação do pellet

. E) descarte do sobrenadante e

ressuspensão do pellete em 1mL de meio e F) transferência de

1x10

células em cada poço para após 24 horas de estufa realização

do experimento.

FIGURA 6

Representação esquemática dos grupos experimentais e análises

realizadas.

FIGURA 7

Viabilidade média (± DP) das células após 24 horas do experimento,

avaliadas pelo ensaio com corante Azul Tripan.

(ab)

Barras com

diferentes letras indicam diferença significativa entre os tratamentos

(P<0,05).

FIGURA 8

Viabilidade média (± DP) das células após 24 horas do experimento

através do método de avaliação MTT.

(abc)

Barras com diferentes

letras indicam diferença significativa entre os tratamentos (P<0,05).

FIGURA 9

Fotomicrografias de flurescência de células cultivadas de carcinoma

mamário de cadela em diferentes grupos experimentais coradas com

xiv

alaranjado de acridina e brometo de etídeo, mostrando células

viáveis (A), em apoptose tardia (B), apoptose (C), e necrose (D).

FIGURA 10

Porcentagem média (± DP) de células vivas, com apoptose e

necrose após 24 horas do experimento através do método de

coloração com alaranjado de acridina e brometo de etídio.

(a,b)

Barras

com diferentes letras indicam diferença significativa entre os

tratamentos (P<0,05).

(**)

Diferença estatisticamente significativa de

células mortas por necrose entre TFD e os demais grupos (P<0,05).

FIGURA 11

Fotomicrografias de células do grupo controle em cultivo. Em (A)

observa-

se no aumento de 100X, nível de confluência de

aproximadamente 80%, células justapostas, (B – D) aumento de

200x e 400X, células de diferentes formatos, núcleo, citoplasma

evidentes. Notar escassez ou ausência de células arredondadas e

imersas no sobrenadante.

FIGURA 12

Fotomicrografias de células em cultivo tratadas com terapia

fotodinâmica. (A) observa-se no aumento de 100X, ausência de

confluência, células arredondadas flutuantes no meio de cultivo, (B)

aumento de 400X além das características observadas em (A), há

também poucas células aderidas no fundo da placa, próximas aos

aglomerados celulares de formato arredondado. (C) aumento de

400X verificam-se células poligonais com vacúolos citoplasmáticos

(seta) e em (D) aumento de 600X, observa-se com melhor precisão

as alterações analisadas em (C).

FIGURA 13

Fotomicrografias de células cultivadas em lamínulas com coloração

panótico rápido, grupo controle. (A) aumento de 25X, projeção

espacial da monocamada de células, (B) aumento de 100X, células

com arranjo uniforme, e projeções citoplasmáticas conferindo-lhes

aspecto de estrela. (C) aumento de 200X e (D) aumento de 400X,

observa-

se citoplasma abundante, núcleo preservado e bem

delimitado, presença de inúmeros grânulos citoplasmáticos.

FIGURA 14

Fotomicrografias de células cultivadas em lamínulas com coloração

panótico rápido, grupo TFD. (A – C) - aumento de 400X, células em

processo degenerativo, perda da morfologia padrão, (D) aumento de

100X, fundo da placa com ausência de monocamada e intensa

quantidade de debris celulares

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES

ALA

Ácido Alfa-Linoléico

AlClFt

Alumínio-Cloro-Ftalocianina

AlPCS

Alumínio-Ftalocianina Tetrasulfonada

ANOVA

Análise de Variância

B16F10

Murine Melanoma Cells

CCD

Cromatografia de Câmara Delgada

CHO-KI

Growth in Chinese Hamster Ovary Cells.

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO

Dimetilsulfóxido

DNA

Ácido Desoxiribonucléico

Desvio Padrão Médio

EDTA

Ácido Etilenodiaminotetracético

EROS

Espécie Reativa de Oxigênio.

FAV

Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária

Fotossensibilizador

HEp - 2

Human Epidermoid Cancer Cells

Instituto de Ciências Biológicas

INCA

Instituto Nacional do Câncer

LED

Laser Emissor de Diodo

MCF-7c3

Human Breast Cancer Cell Line

MTT

(brometo de 3(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazólio)

NHIK

Human Cervix Carcinoma

OMS

Organização Mundial da Saúde

OSCC

Oral Squamous Cells Carcinoma

PBS

Solução de Tampão Fosfato

PVPI

Polivinilpirrolidona

TFD

Terapia Fotodinâmica

TNM

Tumor/NóduloLinfonodo/Metástase

UnB

Universidade de Brasília

ZnPc

Zinco-ftalocianina

xvi

RESUMO

O câncer de mama representa o neoplasma maligno mais comum nas

cadelas e o tratamento atualmente consiste na sua excisão, associado ou não à

quimioterapia adjuvante que pode ser eficaz ou não. Conseqüentemente é crescente

a busca por alternativas terapêuticas que cessem ou retardem o crescimento

tumoral. Uma terapia promissora, difundida para o tratamento de alguns tipos de é a

terapia fotodinâmica que se baseia na combinação de um fármaco

fotossensibilizante que quando ativado provoca morte celular. O objetivo do trabalho

foi avaliar a aplicação e citotoxicidade da Terapia Fotofinâmica mediada pelo

Alumínio-Cloro-Ftalocianina em formulação liposomal (TFD-AlClFt) em um sistema

de tratamento experimental in vitro de amostras tumorais extraídas de carcinoma

mamário de cadela submetida ao tratamento cirúrgico tradicional. Para isso foram

formados 04 grupos experimentais: grupo controle, LED, fármaco fotossensibilizador

AlClFt 2,5µM e TFD. O grupo O controle (1) foi aquele em que as células não foram

submetidas a nenhum tratamento; O grupo LED (2) recebeu iluminação com a fonte

de luz LED na intensidade 10 J/cm

e comprimento de onda 660nm. O grupo AlClFt

(3) apenas administração do fármaco AlClFt e grupo TFD (4), que consistiu na

terapia fotodinâmica. Foram analisados viabilidade celular, citotoxicidade, via de

morte celular e possíveis alterações morfológicas através dos ensaios ciitotóxicos;

azul tripan, dupla coloração de alaranjado de acridina e brometo de etídio, MTT e

avaliações morfológicas que evidenciaram efetividade da TFD nas condições

experimentais deste trabalho.

1.terapia fotodinâmica, 2.carcinoma mamário, 3.cadela, 4. alumino-cloro

ftalocianina lipossomal

xvii

ABSTRACT

Breast cancer is the most common malignant neoplasm in dogs and treatment

currently consists of surgical excision, with or without adjuvant chemotherapy.

However, the search for alternative therapies to stop completely or to slow down

tumor growth is increasing. Photodynamic therapy (PDT) is based on the

combination of a photosensitizing agent that once activated causes cell death. The

objective of this study was to evaluate PDT mediated by Aluminum-Chlorine-

Phtalocyanine (AlClPc) in an experimental in vitro treatment system of tumor

samples taken from mammary carcinoma of dogs subjected to surgical excision . The

primary cell culture was divided into four experimental groups: control, LED,

photosensitizer AlClPc 2.5 µM and PDT. The control group (1) represented the cells

which had not undergone any treatment, the LED group (2) was exposed to a LED

light source of 10 J/cm

intensity and wavelength of 660nm. The AlClPc group (3)

was treated with only the photosensitizer agent and the PDT group (4), was the one

that undergone the photodynamic therapy. Cell viability, cytotoxicity and cell death

pathways were evaluated through the cytotoxicity assays: trypan blue, double

staining of acridine orange and ethidium bromide and MTT. Cultures were also

subjected to morphological evaluation by optic microscopy. It can be observed from

the results that the amount of cell death was significantly higher (P <0.05) in the PDT

group when compared to the other groups by all tests, and the cell death was due to

necrosis. It can be concluded that the PDT is an effective treatment in cell culture of

canine mammary carcinoma.

1 photodynamic therapy, 2. mammary carcinoma, 3. dog, 4. aluminium-chlorine-

phtalocyanine

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

O câncer é hoje um dos principais problemas de saúde pública mundial.

Dados epidemiológicos apontam as neoplasias malignas como terceira maior causa

de morte do mundo, sendo a segunda entre as doenças. Estes dados promoveram

uma espécie de corrida mundial para a “cura” do câncer. Grande parte dos atuais

conhecimentos em biologia celular foi desenvolvida a partir de projetos com

interesse em terapêutica para os tumores malignos (INCA, 2008).

O câncer é uma terminologia mundialmente conhecida para uma série de

doenças que possuem em comum a hiperproliferação de populações celulares

específicas, com potencial de invasão de tecidos próximos e/ou distantes. Em

termos patológicos, o câncer é classificado como uma neoplasia maligna, ou seja, é

o desenvolvimento de novos clones celulares com atividade proliferativa superior às

das células vizinhas e com caráter de invasão e destruição tecidual adjacente

acentuada (KNOWLES & SELBY, 2005).

Conforme também observado na medicina, a oncologia é hoje uma das

especialidades que mais evolui dentro da medicina veterinária de animais de

companhia (WHITROW, 2006). Dentro da oncologia, os tumores mamários são, sem

dúvida, os mais estudados (BRODEY, et al., 1983), pois representam os tumores

malignos mais comuns em cadelas e correspondem a 25-50% dentre todas as

neoplasias (JONES et al., 2000). Nos cães observa-se uma incidência

aproximadamente três vezes maior que a do câncer de mama nas mulheres

(RUTTERMAN et al., 2001). O diagnóstico precoce favorece o tratamento, que

atualmente baseia-se na sua excisão, associado ou não à quimioterapia adjuvante

(MOULTON 1990; CEBALLOS et al, 1993; SILVA, 2000, OGILVIE & MOORE, 2001).

Uma alternativa para tratamento de diferentes tipos de câncer é a Terapia

Fotodinâmica (TFD), que pode ser substituta ou adjunta para a cirurgia, radioterapia

e/ou quimioterapia. A grande vantagem da utilização da TFD é a sua alta

seletividade na eliminação dos tecidos neoplásicos (DANIELL & HILL, 1991;

RUSLANDER et al., 1997; MERKEL & BIEL, 2001), tornando-se opção mais recente

e promissora de tratamento clínico contra o câncer (DANIELL & HILL, 1991;

RUSLANDER et al., 1997; MERKEL & BIEL, 2001). O presente estudo pretende

avançar na avaliação do uso da TFD em um sistema de tratamento experimental in

vitro de amostras tumorais extraídas de carcinoma mamário de cadela submetida ao

tratamento cirúrgico tradicional.

REFERENCIAL TEÓRICO

1. Câncer de Mama

A evolução da Medicina Veterinária tem contribuído para a maior longevidade

dos animais. Nutrição balanceada, prevenção a doenças, diagnósticos precisos e

tratamentos adequados permitem uma sobrevivência maior e uma melhor qualidade

de vida. Conseqüentemente, doenças que geralmente acometem animais idosos

tornam-se mais freqüentes. É o caso, por exemplo, dos neoplasmas (OGILVIE &

MOORE, 2001; LANA et al., 2007; MONDIANO & BREEN, 2007).

O aprofundamento dos estudos tem demonstrado que dentre as neoplasias

que acometem as cadelas, as neoplasias da glândula mamária merecem destaque,

sobretudo por sua alta incidência e pela semelhança, em diversos aspectos, aos

tumores de mama em mulheres constituindo assim, modelos apropriados e válidos

ao estudo da biologia tumoral, carcinogênese (MOTTOLLESE et al., 1994; ZUCCARI

et al., 2001),

É relevante citar que dada a apresentação histopatológica e comportamento

biológico similar ao da espécie humana, o câncer de mama em cadelas torna-se um

molde experimental para avaliação de agentes terapêuticos (GILBERTSON et al.,

1983; NERURKAR, 1989; PELETEIRO, 1994; CAVALCANTI & CASSALI, 2006;

TERZIAN et al, 2007).

Os neoplasmas de mama representam 25 a 50% das neoplasias que

acometem as cadelas, e quando se leva em consideração os cães em geral, as

neoplasias mamárias são menos freqüentes apenas que os tumores de pele

(RUTTEMAN, 1995, JONES et al., 2000; LANA et al., 2007). As raças apontadas

como de maior ocorrência de tumor mamário são Cocker Spaniel, Poodle, Labrador

e Dachshund, apesar de estudos relatarem o fato de não haver predisposição racial

(LANA et al., 2007).

As neoplasias mamárias são de grande interesse de patologistas, devido a

sua complexidade, dificuldade de classificação como, também, o exame

histopatológico ser o método eletivo para identificar as características

correlacionadas ao tratamento e ao prognóstico clínico do paciente (LIMA &

MARTINS, 1992; MOTA & OLIVEIRA, 1999; MISDORP, 2002). Somando-se a outros

fatores, o tratamento cirúrgico é o de eleição, pois, em princípio, todos os tumores

deverão ser submetidos a exames histológicos. Mesmo nódulos pequenos, com

aparência de benignidade, podem revelar focos de células malignas, e as biópsias

excisionais são essenciais para o diagnóstico (MISDORP, 2002). A classificação dos

neoplasmas mamários em cadelas segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS

- Misdorp et al., 1999), está disposta no Quadro 1.

Quadro 01 – Classificação Histológica dos Neoplasmas Mamários em Cadelas

segundo a Organização Mundial de Saúde (MISDORP et al., 1999).

I - Neoplasmas Malignos

II - Neoplasmas Benignos

Carcinoma não-infiltrativo (in situ)

Adenoma

Carcinoma Complexo

Adenoma Simples

Carcinoma Simples

Adenoma Complexo

Carcinoma túbulo-papílifero

Adenoma Basalóide

Carcinoma sólido

Fibroadenoma

Carcinoma anaplásico

Baixa celularidade

Tipos específicos de carcinoma

Alta celularidade

Carcinoma de células fusiformes

Tumor misto benigno

Carcinoma de células escamosas

Papiloma Ductal

Carcinoma mucinoso

Carcinoma rico em lipídeos

Carcinossarcomas

Sarcomas

Fibrossarcoma

Osteossarcoma

Outros tipos de sarcomas

Carcinoma em tumores benignos/

Sarcoma em tumores benignos

Fonte: Adaptado de Rutterman & Withrow, 2007.

A transformação neoplásica é multifatorial (MORRIS & DOBSON, 2001). O

desenvolvimento de neoplasia mamária na cadela é dependente, em grande parte,

de hormônios, como o estrógeno, a progesterona e o hormônio do crescimento que

influenciam a carcinogênese (MORRISON, 1998; FONSECA et al., 2000; ZUCCARI

et al., 2001). MacEWEN et al. (1982) e Sartin (1992) identificaram receptores de

estrógenos em 40 a 60% dos casos de câncer de mama em cães. O estrógeno

estimula o aumento da atividade mitótica do epitélio mamário, o que eleva o risco de

aparecimento do tumor. Porém, por si só ele não desencadeia o surgimento do

mesmo, mas associado a outros fatores e em fases distintas da formação do tumor,

pode ter papel determinante, seja na multiplicação ou na transformação genômica

das células (MOULTON, 1990; PELETEIRO, 1994).

A incidência de tumor de mama é de 0,5% com a castração antes do primeiro

cio, 8% após o primeiro ciclo estral e 26% após dois ou mais ciclos, até os dois

primeiros anos (O’KEEFE. 1997; MORRISSON, 1998). No entanto, cadelas

submetidas à ovariossalpingohisterectomia após os dois anos e meio de idade ou

concomitante à mastectomia, não são beneficiadas pelos efeitos profiláticos deste

procedimento (PELETEIRO, 1994; YAMAGAMI et al., 1996; MORRISON, 1998;

FONSECA & DALECK, 2000; RUTTEMAN et al., 2001; GALERA et al., 2002).

É importante salientar as características clínicas e o comportamento biológico

de cada neoplasia, pois elas estarão associadas com o prognóstico desfavorável.

Características como modo e taxa de crescimento, volume total do tumor e

envolvimento dos linfonodos regionais e distantes são fundamentais para determinar

prognóstico e possível tratamento. Conseqüentemente, a abordagem clínica primária

é essencial para o correto estadiamento da enfermidade, que no caso de

neoplasmas mamários em cadelas deve ser voltado para avaliar a fase de evolução

tumoral, bem como as possibilidades de progressão do tumor.

O modo de crescimento de uma neoplasia é freqüentemente o indicador da

sua invasividade relativa. Lesões expansivas, bem circunscritas são mais facilmente

excisadas; tumores infiltrativos com ou sem ulceração ou de tecidos abaixo da

glândula mamária são mais agressivos, apresentando elevada taxa de recidiva no

pós-operatório (LERZIAN, et al., 2007; NELSON & COUTO, 2006). É fundamental,

também, análise dos linfonodos regionais já que tumores com alto potencial

metastático possuem prognóstico desfavorável (DALECK et al., 1998; GALERA et

al., 2002; MORRIS & DOBSON, 2001; QUEIROGA & LOPES, 2002; ZUCARRI et

al., 2005).

Clinicamente os tumores mamários podem ser únicos ou múltiplos. Cerca de

65 a 70% deles acomete as glândulas inguinais e as abdominais caudais,

provavelmente em decorrência do maior volume de tecido mamário (RUTTEMAN et

al., 2001).

Distintos procedimentos cirúrgicos são empregados na conduta terapêutica. A

mastectomia regional baseia-se na drenagem venosa e linfática do tecido mamário.

Há conexão entre as glândulas torácicas craniais e caudais, e entre as abdominais

caudais e as inguinais. As glândulas torácicas craniais e caudais e a abdominal

cranial, e eventualmente a abdominal caudal, drenam para o linfonodo axilar. O

linfonodo inguinal superficial drena as glândulas abdominais craniais e caudais e as

inguinais (ALLEN et al., 1986; MISDORP, 2002; CARVALHO, 2006). Considerando-

se as características anatômicas, é recomendada a extração destas glândulas em

bloco, incluindo o linfonodo adjacente (RUTTEMAN et al., 2001; MISDORP, 2002;).

A excisão cirúrgica completa do tumor, com margem de segurança, é o

tratamento de eleição, conferindo maior sobrevida às cadelas com câncer de mama

(BIRCHARD, 1995 apud DE NARDI, 2007), à exceção dos tumores inoperáveis, a

exemplo dos carcinomas inflamatórios e as metástases para órgãos distantes

(MISDORP, 2002). A escolha da técnica cirúrgica mais adequada é determinada

pelo tamanho, localização e consistência tumorais, grau de infiltração e número de

tumores, achados radiográficos de tórax, e comprometimento ou não dos linfonodos

regionais (MISDORP, 2002). A localização do tumor, considerando-se a drenagem

linfática das glândulas mamárias, determina a opção da técnica cirúrgica a ser

adotada (McCAW,1996; MARTINS & FERREIRA, 2003).

Outros tratamentos podem ser associados ao procedimento operatório tais

como quimioterapia e radioterapia. A aplicação dos tratamentos varia de acordo com

o estágio de desenvolvimento e localização do tumor (McCAW, 1996; QUEIROGA &

LOPES, 2002; FOSSUM et al., 2005).

A radioterapia é um tratamento não-invasivo indicado principalmente para

pacientes submetidas à cirurgia visando evitar a recorrência do tumor. Tal terapia

utiliza raios X ou gama com alta energia que é direcionada para o local do

tumor/cirurgia. A energia empregada deve ser suficiente para causar danos que

garantam a eliminação de todas as células tumorais. No entanto, essa radiação

também incide em células normais (BUCCI et al., 2005). Os principais efeitos

colaterais são ressecamento da mucosa oral, hiperemia na área tratada e fadiga

após o tratamento (NIH, 2005). Esta técnica não é difundida na medicina veterinária

e seus benefícios ainda não foram definidos, de forma que implica em maiores

estudos a cerca de sua eficácia (LANA et al., 2007), sendo portanto, alvo

experimental até dado momento (ZUCCARI et al, 2001; WHITROW, 2007)

A utilização de protocolos de quimioterapia adjuvante tem aumentado nos

últimos anos, proporcionando aumento na qualidade de vida dos animais, porém, os

carcinomas são tumores com baixo grau de quimiosensibilidade (MORRIS &

DOBSON, 2001; RUTTEMAN et al., 2001). A quimioterapia consiste no uso de

fármacos citotóxicos aplicados através das vias endovenosa, oral ou intratumoral e

que atingem preferencialmente células com elevadas taxas de mitose, ou seja, as

células cancerígenas. No entanto, outras células normais do organismo com

elevadas taxas de mitose também podem ser afetadas (FONSECA & DALECK,

2000; ZUCCARI et al., 2001; WEINBERG, 2006). Os efeitos colaterais desse

tratamento variam de acordo com o tipo de fármaco utilizado. Estes efeitos

compreendem a morte de células sangüíneas, alopecia, alterações gastrintestinais

(náuseas, vômito e diarréia) e perda de apetite (FONSECA & DALECK, 2000; NIH,

2005). Os fármacos mais empregados no tratamento para câncer de mama em

cadelas são a doxorrubicina, a ciclofosfamida e o 5-Fluorouracil (FRIMBERGER &

COTTER, 1995; DALECK et al.,1998; DAGLI, 2002; NOVOSSAD, 2003; LANORE &

DELPRAT, 2004). As falhas nos protocolos quimioterápicos são devidas a

resistência celular aos fármacos, provocada pela presença da proteína

transmembrana glicoproteína-P, produzida pelo gene MDR1 (RODRIGUEZ et al.,

1997; DE NARDI et al., 2007).

2. Terapia Fotodinânima

A terapia fotodinâmica (TFD) consiste na administração por via tópica ou

sistêmica de fármacos fotossensibilizantes (FS), que se acumulam

preferencialmente nos tecidos neoplásicos e através da incorporação celular da

substância fotossensibilizadora que é ativada por determinada fonte de luz,

adequado comprimento de onda e oxigênio molecular, acarretando citotoxicidade e

morte celular (DANIELL & HILL, 1991; RUSLANDER et al., 1997; MACHADO,

2000b; MERKEL & BIEL, 2001; SIMPLISIO, 2002).

Ensaios clínicos consideram que a TFD pode se tornar uma opção de

tratamento para o câncer (TEDESCO et al., 2003; TEDESCO et al., 2004, CHEUNG

et al., 2005; PARISSE & BUZAID, 2006; LONGO et al., 2009). A grande vantagem

da utilização da TFD é a sua alta seletividade na eliminação dos tecidos neoplásicos

(DANIELL & HILL, 1991; RUSLANDER et al., 1997; MERKEL & BIEL, 2001),

podendo ser associada a terapias tradicionais com produção mínima de mutilação e

complicações, se comparada ao tratamento cirúrgico tradicional (DANIELL & HILL,

1991). Tais características resultam da seletividade da destruição tecidual da terapia

em decorrência do controle do local tratado, e sem dano extenso às estruturas

normais circunjacentes (DANIELL & HILL, 1991).

Os primeiros passos da avaliação do efeito da aplicação da TFD na medicina

veterinária foram realizados na década de 80 para o carcinoma de células

escamosas com as porfirinas, derivados da hematoporfirina, fármaco

fotossensibilizador de primeira geração (MERKEL & BIEL, 2001). Os principais

efeitos colaterais observados era fotossensibilização tardia e eritema local.

Em seguida, Peaston et al.,1993, utilizaram a TFD em 18 gatos com

carcinoma de células escamosas, com fotossensibilizador, tetrasulfonato

fitalocianina de alumínio. Neste estudo, houve êxito do tratamento em mais de 80%

dos pacientes, e os efeitos colaterais restringiram-se à formação de edema e

eritema local. Os mesmos achados foram descritos por LEACH & PEASTON (1994),

após utilização da TFD com mesmo fotossensibilizador, em estudo com 45 gatos

que apresentavam carcinoma de células escamosas.

Nos últimos anos, outros agentes seletivos de ação fotodinâmica com efeitos

colaterais reduzidos foram desenvolvidos, tais como o ácido alfa-linoléico (ALA) para

tratamento de carcinoma de células escamosas em gatos (STELL et al, 2001;

LUCROY et al, 2003), os agentes lipossomais e as nanopartículas (ANIOLA et al,

2003; OLIVEIRA et al, 2006; BARBOSA, 2008).

Tapajós et al (2008) demonstraram que o fotossensibilizador Alumínio-Cloro-

Ftalocianina apresentou excelentes resultados na aplicação da TFD em modelos de

cultura de células derivadas de Carcinoma Epidermoide Bucal Humano.

Posteriormente, semelhante protocolo de aplicação da TFD foi avaliado em

diferentes modelos experimentais para o câncer de boca em camundongos (LONGO

et al., 2009). Neste estudo, não foram observados efeitos adversos aos animais

tratados de forma sistêmica com o fármaco fotossensibilizador (LONGO et al., 2009).

2.1. Mecanismos da fotossensibilização

O mecanismo de ação da TFD é uma reação fotoquímica promovida pela

irradiação dos FS com fontes de luz em comprimentos de onda adequados, ou seja,

específicos (RUSLANDER et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2006). A absorção de fótons

pelo fármaco promove a sua transformação em uma molécula extremamente

instável que reagirá com o oxigênio presente no meio tecidual formando uma

cascata de espécies reativas de oxigênio e conseqüentemente geração dos efeitos

citotóxicos da terapia sobre as células alvo (LUKSIENE, 2003; PERUSSI, 2007).

Durante a terapia fotodinâmica, na presença de oxigênio encontrado nas

células o fotossensibilizador que se encontra ligado ao tumor é ativado pela luz e

passa do estado fundamental ao estado excitado, denominado estado singlete. As

moléculas excitadas podem retornar ao seu estado fundamental emitindo energia na

forma de calor ou fluorescência, por meio da liberação de fótons, ou progredir na

cadeia de reações químicas, passar a outro estado de excitação menos instável

denominado de estado triplete. Neste estado, eles podem interagir diretamente com

substratos biológicos ou moléculas na sua vizinhança por transferência de elétrons

ou hidrogênio, levando à formação de íons peróxidos, superóxidos e radicais

hidroxilas, gerando uma cascata de espécies reativas de oxigênio (EROs),

denominada reação do tipo I (DANIELL & HILL, 1991; HENDERSON &

DOUGHERTY, 1992; LUKISIENE, 2003, PERUSSI, 2007)..

As moléculas em estado triplete podem, também, transferir sua energia

diretamente para o oxigênio celular e formar o oxigênio singlete altamente reativo e

responsável pela morte celular, chamada de reação tipo II (DANIELL & HILL, 1991;

HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; MACHADO, 2000b, LUKISIENE, 2003,

PERUSSI, 2007). Tais reações são rapidamente descritas na figura 01.

Ambos os caminhos podem levar à morte celular e à destruição do tecido

doente (SKIVKA et al., 2004; PERUSSI, 2007; BUCK, 2009). O oxigênio singlete

reage com quase todos os componentes celulares uma vez que os compostos

orgânicos insaturados são, de forma geral, suscetíveis à ação do oxigênio reativo.

Como a primeira barreira para esta molécula é a membrana celular que contém

lipídeos insaturados, estes podem ser danificados e tornar a célula inviável. Os

hidroperóxidos resultantes podem levar à formação de EROS através de reações

catalíticas (CARRE et al., 1999; CASTANO et al., 2006). Uma vez que a reatividade

das EROS com moléculas orgânicas não é específica, qualquer macromolécula

dentro da célula pode ser um alvo em potencial para terapia fotodinâmica

(DOLMANS et al., 2003). Assim, a multiplicidade de alvos dificulta o

desenvolvimento de resistência celular sendo essa, juntamente com a citotoxicidade,

uma das vantagens da fotossensibilização (DOLMANS et al., 2003; FEROLLA, 2007;

PERUSSI, 2007; BUCK, 2009).

Figura 01 – Ilustração gráfica dos mecanismos fotoquímicos presentes na TFD.

Observa-se transferência de energia e a produção de radicais livres em diferentes tipos de

reações, após a excitação do fármaco FS devido à irradiação com LED. .

As EROs são radicais livres com alta energia que podem reagir com várias

biomoléculas, acarretando modificações químicas que impedem seu funcionamento

normal. A geração de uma cascata de espécies reativas após a aplicação da TFD é

um fator fundamental para a citotoxicidade causada pela terapia devido a sua alta

capacidade de interações com diferentes biomoléculas (DOLMANS et al., 2003;

CASTANO et al., 2005; LONGO et al., 2009).

2.2. Fatores envolvidos na fotossensibilização

A maioria dos fotossensibilizadores é retida tanto nos tecidos normais como

nos neoplásicos (HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; SKIVKA et al., 2004). O

agente fotossensível, segundo MACHADO (2000b), tende a se concentrar no tecido

lesionado, mas o mecanismo não está totalmente esclarecido. Sharman et al, 1999,

Dolman’s et al, 2003, descrevem que apesar desta retenção não ser claramente

elucidada, alguns fatores são incriminados como responsáveis. A permeabilidade da

membrana das células neoplásicas encontra-se alterada, as fibras colágenas que

interagem no tumor são imaturas e semelhantes às observadas em tecidos

embrionários e em processo de cicatrização recente. Essas fibras imaturas

apresentam grande capacidade de ligação às porfirinas, agente fotossensibilizador,

constituindo um local para retenção e acúmulo do fármaco. Outros fatores como a

rede linfática pouco desenvolvida, a presença de macrófagos e o menor pH

intracelular também favorecem maior concentração do fármaco nas células tumorais

(MOAN & PENG, 2003; NOWIS et al, 2005).

Outro importante componente na TFD é a fonte de luz (HENDERSON &

DOUGHERTY, 1992). As fontes de radiação são, em geral, laser ou laser emissor de

diodo, (MACHADO, 2000a; CARVALHO, 2008). As principais vantagens do laser

como fonte de luz são a estabilidade, coerência e previsibilidade (PARIZE &

BUZAID, 2006); entretanto, este possui um custo elevado (MACHADO, 2000a).

Conseqüentemente, a disponibilidade do laser emissor de diodo (LED) tornou o valor

das fontes de luz mais acessíveis, visto ser um quarto do valor econômico do laser

(DOUGHERTY, et al., 1998; MANG, 2004). O LED, apesar de apresentar potência

inferior ao laser, possui comprimento de onda e características químico-físicas

necessárias para a adequada aplicabilidade da TFD (MACHADO et al., 2000a;

MANG, 2004. CARVALHO, 2008).

Logo, a eficácia da TFD depende da natureza química do fotossensibilizador,

da adequada concentração nos tecidos e da localização celular no momento da

irradiação, seja através do laser ou LED, de radiação luminosa compatível com as

características bioquímicas do fotossensibilizador permitindo que este seja excitado.

Outros fatores que interferem são o tempo entre a administração do FS, das

características anatômicas do neoplasma ou no caso experimental, da linhagem

celular tumoral utilizada e da disponibilidade de oxigênio molecular da célula

tumoral durante todo o processo (WÖHRLE et al., 1998; MACHADO, 2000b;

PERUSSI, 2007)

2.3. Fotossensibilizadores

Conforme elucidado anteriormente, os FSs são os elementos principais na

execução da TFD. Estas estruturas realizam a transferência de energia luminosa

para gerar reações que culminam com a formação de uma série de espécies

químicas altamente reativas, que por sua vez promovem a destruição das células-

alvo. Diversos FSs têm sido desenvolvidos e testados clinicamente para serem

utilizados na TFD. Inicialmente, a literatura classificou os grupos de FSs em

gerações de fármacos de acordo com o período cronológico de desenvolvimento

(DOUGHERTY, et al., 1998). Contrários a classificação cronológica, Allison et al.,

(2004) classificaram os FSs de acordo com suas semelhanças bioquímicas,

classificando-os em famílias de fotossensibilizadores.

A escolha de um FS para a utilização na TFD envolve uma complexa análise

de características até que se possa determinar qual a melhor opção para a

execução da TFD. Dentre os pontos a serem analisados, há as propriedades

específicas como as características fotofísicas, a estruturação química, a toxicidade,

a ação mutagênica e a carcinogenicidade dos fármacos (HENDERSON &

DOUGHERTY, 1992). Devem ser avaliadas ainda a seletividade do fármaco pelas

células alvo; possíveis afeitos adversos decorrentes de exposição à luz branca,

toxicidade no escuro, via de administração, custos, solubilidade e água ou solvente

inócuo, capacidade e tempo de eliminação dos fármacos, comprimento de onda para

ativação e efetividade clínica (ALLISON et al., 2004; CASTANO et al., 2005). A

análise de todos estes fatores muitas vezes se torna complexa, mas é apropriado ter

um fator de efetividade calculado subjetivamente para justificar a escolha de um FS

entre as várias opções terapêuticas (CASTANO et al., 2006).

MACHADO (2000b) citou que a primeira geração de agentes

fotossensibilizadores baseia-se em mistura de derivados porfirínicos. Os fármacos

da segunda geração, como as ftalocianinas e as clorinas, podem ser excitados com

radiação de comprimento de ondas maiores, quando o tecido biológico tem menor

absorção e a profundidade de penetração da luz é maior, e apresentam um período

de eliminação mais curto. O fotossensibilizador pode ser aplicado por via

intravenosa ou tópica (MERKEL & BIEL, 2001).

Os fotossensibilizadores mais utilizados são os de primeira geração, tal como

o Photofrin (MERKEL & BIEL, 2001). Este foi desenvolvido em fins da década de 80,

sendo o primeiro agente fotossensibilizador a ser autorizado por órgãos

governamentais (MACHADO, 2000b). A medicação é ativada com um comprimento

de onda de 630nm (MERKEL & BIEL, 2001). Entre seus efeitos colaterais está a

indução de prolongada fotossensibilidade dérmica e ocular (MACHADO, 2000b).

Entre as famílias de FSs, as ftalocianinas têm despertado grande interesse da

comunidade científica. Estudos clínicos e pré-clínicos envolvendo ftalocianinas têm

apresentado resultados promissores para aplicação na TFD. Como grandes

vantagens, as ftalocianinas são ativadas por luz em comprimentos de onda elevados

(650-750 nm), o que confere maior poder de penetração, além de apresentarem

baixa toxicidade quando empregada na TFD (ALLISON et al., 2004).

Outra importante característica desta classe de FS é serem hidrofóbicos.

Devido a esta característica química, estes fármacos necessitam ser incorporados a

sistemas de liberação de fármacos específicos para que possam circular através do

plasma sanguíneo. Um dos sistemas de liberação descritos para o carreamento de

fármacos lipossolúveis são os lipossomas. Essas estruturas são pequenas vesículas

formadas por paredes fosfolipídicas contendo um compartimento aquoso no seu

interior. Desta forma, esse sistema pode carrear tanto estruturas lipofílicas (na

parede) quando hidrofílicas (interior) (SIBATA et al., 2004).Além da capacidade de

fluir livremente pelo plasma sanguíneo, a associação de ftalocianinas com

lipossomas apresenta outras vantagens, como sua maior captação pelas células

tumorais. A estrutura do lipossomo pode ser modificada pela adição de algumas

substâncias como colesterol. A presença deste lipídio na parede do lipossoma tende

a aumentar a captação dos fármacos pelos tecidos tumorais. Esse aumento se

refere ao fato de existir um aumento de receptores de membrana com afinidade para

colesterol. Esta afinidade química permite que haja uma maior captação de FS pelas

células neoplásicas (DOUGHERTY, et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2006; LONGO et

al., 2009). Estudos experimentais (TAPAJÓS et al., 2008) demonstraram a alta

efetividade da Alumínio-Cloro-Ftalocianina na destruição de células em cultura

derivadas de Carcinoma Epidermóide Bucal Humano. Nesse mesmo estudo, foi

descrita a baixa citotoxicidade do FS quando administrado às células de cultivo na

ausência da iluminação com laser. Corroborando com tais achados, Longo et al.,

(2009) avaliaram a eficiência da TFD mediada por Alumínio-Cloro-Ftalocianina. em

formulação lipossomal sobre a mesma linhagem celular, como em modelos

experimentais in vivo, camundongos imunocompetentes (Swiss) e

imunocomprometidos (nude-Balb/c).com o mesmo neoplasma.

2.4. Morte Celular

A terapia fotodinâmica pode produzir apoptose ou necrose, ou uma

combinação dos dois mecanismos (OLEINICK et al., 2002). Apoptose é uma forma

regulada de morte celular que pode ocorrer em eventos fisiológicos ou patológicos

que é dependente da expressão intrínseca celular, no qual uma cascata da

caspases é induzida (WISING, et al., 2005). Morfologicamente, os elementos

cruciais do processo são condensação da cromatina, encolhimento celular e

produção de corpos apoptóticos os quais são engolfados por células circunvizinhas

e então fagocitados (NOWIS, et al., 2005; OLEINICK et al., 2002).A morte celular

caracterizada por necrose, em geral, está relacionada à presença de um agente

agressor de alta intensidade. Nessas situações, os mecanismos básicos de defesa e

escape celulares da morte são ineficientes devido à grande intensidade do estímulo

agressor como o promovido pela formação de radicais livres após a aplicação da

TFD (OLEINICK et al., 2002; RICH et al., 2000). Uma das características marcantes

da necrose são as alterações funcionais em diferentes regiões subcelulares, com

especial atenção às membranas biológicas que provocam a liberação dos conteúdos

celulares e conseqüente perda de viabilidade. Associada à destruição das

membranas celulares, ocorre a liberação de fosfolipídios de membrana e,

conseqüentemente, a geração de intenso processo inflamatório decorrente dos

produtos gerados na via da lipooxigenase (RICH et al., 2000).

OBJETIVOS

Objetivo Geral

• Avaliar o efeito in vitro da Terapia Fotodinâmica mediada pelo Alumínio-

Cloro-Ftalocianina em formulação liposomal (TFD-AlClFt) sobre culturas primárias

derivadas de carcinoma mamário de cadelas.

Objetivos Específicos

• Obter culturas primárias de carcinoma mamário de cadela;

• Verificar a citotoxicidade provocada AlClFt no escuro e LED, nas condições

utilizadas no trabalho.

• Analisar citotoxicidade, as vias de morte celular e as possíveis alterações

morfológicas causadas pelo tratamento com a TFD-AlClFt.

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CAPÍTULO II

AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE CARCINOMA

MAMÁRIO DE CADELA CULTIVADA IN VITRO.

INTRODUÇÃO

Os tratamentos para o câncer atualmente disponíveis, apesar de

apresentarem bons efeitos terapêuticos, possuem inúmeros efeitos colaterais

adversos. O desenvolvimento de novas terapias que possam ser utilizadas como

forma de tratamento principal ou como terapia adjuvante é fundamental para o

estabelecimento de protocolos terapêuticos mais efetivos contra as diferentes

modalidades de câncer.

A avaliação de eficiência de um protocolo terapêutico para o tratamento do

câncer é extremamente complexa e envolve diversas etapas de avaliação até que se

comprove a sua efetividade clínica. Ensaios clínicos demonstram que a TFD é um

tratamento interessante para o câncer. Suas principais características são de

seletividade obtida pelo acúmulo preferencial do fotossensibilizador na célula

tumoral e a habilidade de reter a ativação deste fármaco através da restrição de

iluminação àquela região específica (MACHADO, 2000; MERKEL & BIEL, 2001);.

Portanto, comparativamente aos métodos atuais de tratamento, a TFD possui a

vantagem de ser mais efetiva e seletiva na destruição das células tumorais,

preservando a integridade das células adjacentes normais. Além disso, trata-se de

uma modalidade de tratamento minimamente invasiva, podendo ser aplicada

repetidamente no mesmo local e usada no tratamento de vários tipos de câncer,

incluindo aqueles que são resistentes às outras terapias. É importante observar que

a utilização da quimioterapia, radioterapia ou cirurgia não impedem a aplicação da

TFD, podendo ser usadas antes ou após o paciente ser submetido a TFD

(FEROLLA, 2007; PASCHOAL, 2009).

Os primeiros passos da avaliação do efeito da aplicação da TFD mediada

pela AlClFt-liposomal foram conduzidos com êxito em sistemas de cultura celular e

em modelos tumorais experimentais em camundongos (TAPAJÓS et al., 2008;

LONGO et al., 2009). O presente estudo pretende avançar na avaliação deste

protocolo terapêutico em um sistema de tratamento experimental in vitro de

amostras tumorais extraídas de carcinoma mamário de cadela submetida ao

tratamento cirúrgico tradicional.

MATERIAIS E MÉTODOS

Esse trabalho, sob o número de processo UNBDOC nº 36972/2008, foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa no Uso Animal (CEUA) do Instituto de

Ciências Biológicas (IB) da Universidade de Brasília (UnB).

1. MATERIAIS

As soluções estoque dos meios, corantes e reagentes foram preparadas em

PBS, ph=7,4 e mantidas a temperatura ambiente, ou quando necessário refrigerado

a 4°C e ao abrigo da luz. Todas as soluções foram esterilizadas por filtração em

membrana de 0,22μm imediatamente antes do uso e armazenadas em frascos de

vidro autoclavados ou aliquotados em micro tubos do tipo eppendorfs.

1.1. Procedência das Amostras Neoplásicas

O estudo foi conduzido no Hospital Veterinário de Pequenos Animais, no

Laboratório de Morfologia e Morfogênese do Instituto de Ciências Biológicas (IB) e

no Laboratório de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária (FAV),

todos pertencente à Universidade de Brasília (UnB), Distrito Federal.

A amostra utilizada foi extraída de um paciente da espécie canina, raça

pitbull, nove anos de idade, com nódulo de aproximadamente 2,5cm de diâmetro na

glândula mamária inguinal esquerda posteriomente diagnosticado com carcinoma

complexo de mama moderadamente diferenciado invasor, através de análise

histopatológica, proveniente do Serviço de Clínica Cirúrgica, setor de oncologia, do

Hospital Veterinário de Pequenos Animais da UnB. O atendimento, a avaliação

clínica e pré-operatória do animal, assim como fornecimento de informações e

recomendações necessárias ao proprietário, foi realizads conforme rotina hospitalar.

O procedimento cirúrgico adotado foi mastectomia radical unilateral esquerda, de

acordo com o estabelecido na literatura (RUTTEMAN et al., 2001; MISDORP, 2002).

O proprietário estava ciente, através de autorização escrita, que continha descritos

os mecanismos e procedimentos utilizados como também, os riscos inerentes

envolvidos em quaisquer procedimentos cirúrgicos e anestésicos.

Vale ressaltar que o animal foi submetido ao procedimento cirúrgico usual e

para o cultivo celular foram utilizadas amostras do material comumente excisado no

procedimento cirúrgico tradicional. A biópsia que geralmente é enviada para análise

histopatológica foi fragmentada e encaminhada para o cultivo celular. O animal foi

acompanhado diariamente até a retirada da sutura e depois semanalmente para

acompanhamento do quadro clínico e evolução quimioterápica conforme conduta do

médico veterinário responsável.

1.2. Fotossensibilizador

1.2.1. Formulação lipossomal de Alumínio-Cloro-ftalocianina (AlClft)

Utilizou-se nos tratamentos deste estudo, amostra de ftalocianinas

lipossomais, na concentração de 5 µM, estocada no escuro, gentilmente cedidas

pelo Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco – USP/ Ribeirão Preto. As demais

concentrações de estudo, 2,5 µM, foram retiradas desta mesma amostra e diluídas

de acordo com a concentração almejada com Solução Tampão Fosfato Salina (PBS)

(LB

Laborclin Ltda., Brasil) estéril em capela com fluxo laminar contínuo horizontal.

1.3. Fonte de Luz

Empregou-se protótipo Laser Emissor de Diodo (LED), (Figura 02),

comprimento de onda de 660 nm, com potência de 75 - 78 mW a distância

determinada de quatro centímetros entre a lente do LED e o objeto experimental.

Tais valores foram determinados através da avaliação física gentilmente realizada

pelo Prof. Dr. Sebastião Willian da Silva – Instituto de Física /UnB. O comprimento

de onda foi calculado através da Cromatografia de Camada Delgada (CCD - Figura

03) e espectofotometria para aferição do espectro. O LED utilizado é formado por

uma banda espectral inserida no espectro vermelho.

Figura 02 – Imagem fotográfica do aparelho protótipo LED em funcionamento

durante TFD. Note a esquerda, amostra envolvida em papel alumínio para ficar protegida da

luz ambiente.

Figura 03 – Imagem computadorizada da faixa obtida através da cromatografia de

camada delgada (CCD) para identificação da faixa de comprimento de onda do LED.

Observa-se em 580nm percepção do espectro (luz), em 660nm obtém-se seu maior valor e

em 700nm termina seu espectro.

Dose (J/cm

) = Potência (watt) X Tempo (segundos)

Área irradiada (cm

)

A potência do LED foi medida em um colimador ligado a uma fonte de

quantificação de concentração fotônica (intensidade medida em watts) e fonte de

energia de 220 volts.

A dosidometria estipulada para o experimento foi obtida através da fórmula:

*Dose: energia necessária para excitação dos fótons dada por J/cm

*Potência: intensidade da fonte de luz a uma determinada distância, medida

em watts.

*Tempo: período em segundos de exposição a fonte de luz necessário para a

excitação dos fótons.

*Área: espaço da amostra a ser irradiada pela fonte de luz medida pela área

da circunferência do fundo da placa.

1.4. Concentração do fotossensibilizador e dosidometria

Inicialmente realizou-se um estudo preliminar da aplicação da TFD in vitro

mediada pela AlClFt-liposomal em diferentes períodos de tratamento para averiguar

o tempo mínimo necessário de exposição ao LED como também, a concentração de

AlClFt.

Após análise destes resultados (dados não mostrados), a concentração

escolhida de AlClFt-liposomal foi de 2,5μM e fonte de luz, LED, com: comprimento

de onda 660nm.,potência entre 75 -78 mW, densidade de energia de 10J/cm

2. METODOLOGIA

2.1. Obtenção das Amostras

Uma vez removido cirurgicamente, os tumores foram imediatamente

seccionados em fragmentos de aproximadamente dois centímetros de diâmetro com

auxílio de lâmina de bisturi nº 10, cabo de bisturi nº 03 e pinça anatômica. Em

seguida, foi novamente excisado em duas partes iguais de um centímetro cada. A

primeira amostra foi armazenada em frasco coletor de amostras biológicas de

capacidade 50mL contendo formol a 10% e encaminhada para avaliação

histopatológica juntamente com o restante da biópsia excisional do paciente. No

outro fragmento foram realizados ciclos de lavagem, através da imersão da amostra

em um tubo falcon 50mL com Polivinilpirrolidona Iodo (PVPI) tópico - LM

Farma,

Brasil, seguidos de quatro lavagens com solução fisiológica NaCl 0,9%, - Equiplex

Brasil, todos estéreis para finalmente armazenagem em tubo falcon contendo meio

de cultivo Dulbeco’s Modified Eagle Medium (DMEM) - GIBCO

EUA, e antibiótico

penicilina (100 μg/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) - Sigma – Adrich

, EUA, o qual

serviu de meio de transporte do material até o laboratório.

A manipulação em todas as etapas deste procedimento foi feita de forma

estéril, e os materiais utilizados foram previamente esterilizados.

2.2. Cultivo Celular

Fragmentos dos tecidos tumorais excisados durante o tratamento cirúrgico

tradicional foram encaminhados para o estabelecimento de culturas celulares

primárias. Após o estabelecimento das culturas primárias derivadas do neoplasma,

foi realizada a aplicação da TFD mediada pela AlClFt-liposomal in vitro e demais

grupos experimentais.

Todos os procedimentos que serão posteriormente descritos foram realizados

em capela de fluxo laminar horizontal - CFLH-12, VECO

, Brasil, com material

estéril. Cabe ressaltar que, sempre antes da utilização da câmara de fluxo laminar,

era realizada limpeza mecânica com álcool a 70% e em seguida, repouso de 30 a 40

minutos sob luz ultravioleta.

2.2.1. Estabelecimento de culturas primárias

As culturas de células de tecidos tumorais foram estabelecidas conforme o

seguinte protocolo: uma vez removido o tecido tumoral de maneira asséptica,

conforme descrito no item 2.1, a amostra foi transportada para o laboratório em 5mL

de meio de transporte. Em seguida, o material foi seccionado em pequenos

fragmentos com aproximadamente 0,5mm de diâmetro (separação mecânica do

material biológico), sob placa de Petri de vidro com auxílio de pinça anatômica e

lâmina de bisturi número 20 acoplado em cabo de bisturi nº 04. Em seguida, o

material foi transferido para placa de 6 poços e garrafa pequena de cultivo contendo

meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino - GIBCO

, Brasil,

penicilina (100μg/mL) e estreptomicina (100μg/mL). As placas e as garrafas foram

colocadas em estufa TE – 399Tecnal

, Brasil, e mantidas a 37,5ºC, em atmosfera

umidificada com 5% de CO

em ar (Figura 04).

Figura 04 – Representação esquemática elucidando as etapas envolvidas da

colheita da amostra até o estabelecimento das culturas primárias. A) cadeia mamária

unilateral removida cirurgicamente do paciente contendo massas tumorais em glândula

mamária abdominal cranial e inguinal; B) excisão do fragmento tumoral para colheita da

amostra; C) diérese do material; D e E) imediatos ciclos de lavagens da amostra e envio

para o laboratório através do meio de transporte; F) fracionamento da amostra coletada e G)

cultivo produzido a partir dos fragmentos do tumor.

Para estabelecimento de subculturas, partindo-se inicialmente da placa de

seis poços e uma garrafa de 25cm

para cultura de células, após atingir 75% de

confluência, as células foram soltas do fundo do frasco por tratamento com solução

de tripsina-EDTA - GIBCO

- Canadá, contendo 2,5 g/L de tripsina (1:250) e 0,38 g/L

de EDTA, por três minutos, a 37º C. Em seguida adicionou-se igual volume de meio

de cultivo com soro fetal bovino para inativação da tripsina, e o volume total

contendo a suspensão de células foi transferido para um tubo de centrífuga,

centrifugado a 750 x g por 5 minutos, para formar um precipitado de células (pellet).

O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em novo meio de

cultivo. Este volume total foi distribuído em placas e garrafas de cultura, as quais

eram acondicionadas na estufa conforme descrito anteriormente.

2.2.3. Manutenção do Cultivo Celular

Os frascos de cultura foram avaliados a cada 48 horas em microscópio

invertido com contraste de fase onde na ocasião era realizada a troca de metade do

volume do meio das placas e das garrafas, ou caso atingissem confluência, a

repicação.

2.3. Delineamento Experimental

Em todos os experimentos aqui realizados, a aplicação do LED e do fármaco

AlClFt-liposomal, seja isolado ou na TFD, foram realizadas em ambiente escuro,

sem luminosidade.

2.3.1. Preparação do Cultivo para os experimentos in vitro

Partindo-se inicialmente de uma garrafa para cultura de células contendo uma

monocamada de células confluentes, outras garrafas foram preparadas similar ao

proferido no estabelecimento de sub-culturas. No entanto, após a centrifugação e

descarte do sobrenadante, o pellet formado era ressuspendido em 01 mL de meio

de cultura suplementado. Após, as células eram contadas em câmara de Neubauer

e plaqueadas para placas de cultura de 24 poços. Todas as passagens celulares

foram realizadas 24 horas antes dos procedimentos experimentais, para que

houvesse a estabilização e adesão celular ao fundo das placas de cultura. Para as

placas de 24 poços foram transferidas 10

células por poço (Figura 05).

O método de cultivo acima descrito foi igual para todos os ensaios realizados.

No entanto, para as placas de 24 poços disponibilizadas para as análises de

morfologia na microscopia de luz, foi adicionada uma lamínula de vidro circular,

estéril, no fundo de cada poço das placas anterior ao plaqueamento de células,

possibilitando o crescimento celular em sua superfície.

Figura 05 – Representação do preparo das placas de 24 poços para realização do

experimento com TFD. A) garrafa de cultivo contendo células aderidas na superfície e

confluentes; B) após adição da solução de tripsina-EDTA e consequente destacamento das

células aderidas ao fundo do frasco de cultura; C) e D) ressuspesão do meio contendo

células soltas e envio para centríuga a 750xg durante 05 minutos para formação do pellet.

E) descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellete em 1mL de meio e F) transferência

de 1x10

células em cada poço para após 24 horas de estufa realização do experimento.

2.3.2. Grupos Experimentais

Foram delineados quatro grupos experimentais: (1) controle; (2) LED; (3)

AlClFt-liposomal 2,5µM; (4) TFD (Quadro 03)

O controle (1) foi aquele em que as células não foram submetidas a nenhum

tratamento e permaneceram em estufa de cultivo com solução de PBS estéril

durante todo o procedimento.

O grupo tratado somente com LED (2) permaneceu somente com solução

PBS estéril semelhante ao grupo controle, porém recebeu iluminação com LED na

mesma intensidade e comprimento de onda que o grupo da TFD. Objetivo deste

grupo foi avaliar se a fonte de luz apresentava toxicidade celular se utilizada

isoladamente. O grupo tratado com AlClFt (3) possuiu metodologia semelhante ao

grupo tratado com TFD (4), porém sem iluminação com LED, apenas administração

do fármaco durante 30 minutos e em seguida descarte e manutenção com o PBS. A

finalidade deste grupo foi avaliar a citotoxicidade do fármaco sem fotoativação.

Enfim, o objetivo almejado na criação destes dois grupos foi certificar inocuidade dos

fatores FS e fonte de luz, aumento assim confiabilidade da TFD.

E finalmente, grupo TFD (4), que consistiu no tratamento das culturas

celulares com solução liposomal de AlClFt em uma concentração de 2,5 µM. Após

30 minutos de exposição em estufa de cultivo celular, a solução fotossensibilizadora

foi descartada e uma solução de PBS estéril foi aplicada nos poços para que fosse

procedida a aplicação de LED com energia total de 10 J/cm

Quadro 02 – Descrição da constituição de cada grupo experimental. As

demarcações em “X” referem-se à aplicação do item em questão.

AlClFt

LED

GRUPOS

2,5μM

10J/cm

1 (Controle)

2 (LED)

3 (AlClFt)

4 (TFD)

Após 24 horas da execução destes procedimentos, as placas de cultura foram

processadas para as diferentes análises. Todas as análises foram conduzidas em

quadruplicatas, ou seja, realização de quatro poços de tratamento para cada grupo

experimental em cada análise proposta.

Figura 06 – Representação esquemática dos grupos experimentais e análises

realizadas.

2.4. Ensaios Citotóxicos

2.4.1. Análise da Viabilidade Celular pelo método de Exclusão por Azul

Tripan

Esse teste de viabilidade tem como princípio a avaliação do grau de

comprometimento estrutural da membrana plasmática através da detecção de

células com perda de integridade de membrana citoplasmática sendo, assim,

consideradas inviáveis. Tal fato pode ser evidenciado em razão do corante ser uma

macromolécula, não absorvido pela membrana plasmática de células viáveis

(STROBER, 2003). Contudo, quando a membrana plasmática sofre alterações

estruturais e se torna permeável ao corante, as células são coradas em azul.

Para tal, decorridas 24 horas do protocolo experimental (tratamentos), foi

retirado o meio DMEM suplementado de cada poço e adicionados 300µl de tripsina-

EDTA e mantido em estufa de cultivo durante dois minutos. Após a incubação, foi

adicionado igual volume de DMEM com 10% de soro fetal bovino e o volume total foi

ressuspendido e transferido para tubos de microcentrifugação do tipo eppendorfs,

devidamente numerados e identificados com o nome do grupo experimental. Em

seguida o material foi centrifugado a 750xg durante cinco minutos e o sobrenadante

formado, descartado. Do pellet obtido fez-se ressuspensão com um mililitro de meio

de cultivo DMEM e de cada uma das amostras, retirou-se 100μL da suspensão de

células de cada poço, aos quais foram adicionados 100 μL do corante azul tripan

(0,4%) - Sigma - Aldrich

, EUA. Após homogeneização da mistura, dez μL foram

transferidos ao hematocitômetro - C.A.Hausser & Son, EUA e o número de células

viáveis (não coradas) e não viáveis (coradas em azul) foi determinado. A contagem

celular realizada com auxílio do microscópio óptico modelo MO BX 41- Olympus,

EUA, foi feita no período máximo de cinco minutos para evitar a evaporação do

líquido e a morte celular por exposição prolongada ao corante. Para a determinação

do número de células na câmara de Neubauer foi utilizada a fórmula a seguir.

Nº de células por mL = nº de células nos 4 quadrantes x fator de diluição x 10

Um número absoluto de células por mililitros foi obtido neste ensaio. A média

da contagem de 4 poços em cada grupo 24 horas após os diferentes tratamentos

levou ao resultado obtido desta etapa do experimento.

2.4.2. Viabilidade Celular pelo método de MTT

Esse ensaio de citotoxidade consiste em um teste colorimétrico que quantifica

a redução do sal tetrazolium MTT (brometo de 3(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-

tetrazólio) em um composto conhecido como formazan (1-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-

3,5- diphenylformazan), pela ação de desidrogenases mitocondriais e mediada pela

enzima intracelular succinato-desidrogenase. O resultado do teste é dependente,

portanto, da população celular viável, capaz de metabolizar o formazan (DENIZOT et

al 1986 apud MACHADO et al., 2008). Ou seja, a presença de desidrogenases

mitocondriais ativas é um indicativo de viabilidade celular. Os cristais do corante roxo

de formazan formados pela redução do MTT são quantificados por técnicas de

espectofotometria.

Para a realização dessa análise, decorridas 24 horas após o período de

incubação, o meio de cultivo foi substituído por outro adicionado de solução estoque

de MTT (5 mg/mL) na proporção 50 μL / 450 μL de meio de cultura. Tal solução foi

armazenada protegida da luz e em temperatura de 4°C. Em seguida, incubaram-se

as placas na estufa de cultivo de maneira rotineira, mas ao abrigo da luz. Após três

horas de incubação com o meio de cultura adicionado com o corante MTT, esse

meio foi removido e adicionados 300 μL de solução dimetilsulfóxido (DMSO) - Sigma

- Aldrich

; EUA, em cada poço para a dissolução dos cristais de formazan. Após 10

minutos de repouso, os cristais de formazan foram dissolvidos e a leitura e

quantificação das quadruplicatas foram feitas com o aparelho espectrofotômetro

digital (Bio-Rad Model 3550 – UV microplate reader) em comprimento de onda 595

nm. O gráfico foi plotado no Programa Origin versão 6.0 e a interpretação dos

resultados foi obtida através da análise das absorvâncias. Absorvância menor que a

lida no grupo controle não tratado é indicativo de morte celular.

2.4.3. Viabilidade celular e distinção entre as vias de morte celular por

meio do ensaio de coloração com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídio

Este ensaio consiste em um teste de viabilidade celular que utiliza uma dupla

coloração fluorescente. Os corantes então utilizados têm a capacidade de se

intercalarem com ácidos nucléicos, sendo que o brometo de etídio exposto a

radiação ultravioleta emite fluorescência em vermelho ou vermelho-alaranjado

quando se intercala ao DNA (SILVA et al., 2001) e o alaranjado de acridina emite

fluorescência em verde quando se intercala a esse ácido nucléico (LIU et al., 2008).

Esses dois corantes também possuem a capacidade de penetrar a membrana

plasmática de forma diferenciada. Enquanto o alaranjado de acridina consegue

penetrar as células com membrana íntegra, o brometo de etídio só penetra as

células com perda de integridade de membrana. Ou seja, quando a célula encontra-

se viável, será corada de verde uniformemente, com citoplasma de tamanho normal

e núcleo preservado se destacando com verde mais claro. No caso de apoptose

inicial, mas com preservação de sua membrana plasmática, haverá entrada somente

do corante alaranjado de acridina e as células serão coradas em verde, no entanto,

o núcleo estará com formatos irregulares e possíveis condensações e fragmentação

da cromatina. Na apoptose tardia, como as células já perderam parcialmente a

integridade da membrana, parte do bromteo de etídio sobressairá sobre a alarnajado

de acridina, corando o núcleo de cor laranja. Além disso, a célula poderá apresentar

formação de corpos apoptóticos, caracteristica de apoptose, em coloração verde.

Será ainda possível observar o formato celular padrão (HEWITT & NEBE-VON-

CARON, 2001). Na necrose, como não há mais integridade de membrana, haverá

predominio do corante brometo de etídio e a identificação de células ocorrerá na

emissão uniforme de fluorescência vermelha ou alaranjada intensa com células

intumescidas e ausência de arranjo celular normal (SILVA et al., 2001).

Para a execução do ensaio de viabilidade com a dupla coloração alaranjada

de acridina e brometo de etídio - VETEC

Química Fina, Brasil, 24 horas após os

tratamentos descritos no item 3.3.4., as células aderidas ao frasco foram

tripsinizadas com a solução tripsina-EDTA, coletadas, centrifugadas a 750 x g

durante cinco minutos e ressuspendidas em 100μL de meio de cultura. De cada

amostra, foram retirados 20 μL, aos quais foram adicionados 2 μL de uma mistura

recém preparada da dupla coloração em uma proporção de 1:1, a partir da

concentração de 100 μg/ml de cada corante. O material corado foi então colocado

sobre lâminas de microscopia de vidro e imediatamente após montagem com

lamínula de vidro (24 mm x 24 mm), a morfologia celular foi observada e analisada

em microscópio de fluorescência invertido Axiophot, Zeiss.26.

De cada grupo experimental, foram contadas e avaliadas cerca de 200 a 100

células, quando possível, em cada uma das quadruplicatas.

2.4.4. Análise Estatística

As percentagens adquiridas entre células viáveis e não-viáveis, bem como a

percentagem de células apresentando as diferentes vias de morte celular, foram

comparadas entre os tratamentos. Os dados foram transformados e submetidos à

análise de variância (ANOVA) e Teste de Tukey (StartView

para Windows, SAS

Institute Inc., Cary, NC, USA). Os valores foram considerados estatisticamente

significativos quando P <0,05.

2.5. Avaliação do cultivo celular através do microscópio invertido

Decorridas 24 horas dos ensaios experimentais, as placas de 24 poços foram

retiradas da estufa de cultivo e cuidadosamente levadas para o microscópico

contraste de fase – TS 1000 Nikon Eclipse – EUA, para avaliação da aderência das

células à placa de cultivo pós-tratamento, morfologia celular se acaso as células se

encontram com formas poligonais e aderidas no fundo do recipiente, ou se

encontram arredondas não aderidas, móveis e dispersas no meio de cultivo, o que

constitui inviabilidade celular e por fim, multiplicação celular através do

preenchimento de espaços vazios na placa, formando monocamada celular e o nível

de confluência celular. Essas características foram também analisadas

subjetivamente e comparadas entre os grupos experimentais.

Após análise, foi acoplada câmera fotográfica digital DCM35 – Microstatone

Infotech para obtenção de imagens.

2.6. Avaliação morfológica das células dos grupos experimentais

Para a análise da morfologia celular, lamínulas de microscopia circulares

estéreis 25 mm de diâmetro foram posicionadas no fundo de placas de cultura com

24 poços. Com isso, células do cultivo primário proliferaram nas lamínulas, aderindo-

se a essa superfície. Decorridas 24 horas do tratamento, foi retirado o meio de

cultivo existente e lavado demasiadamente com PBS. Foram realizadas no total três

lavagens para certificação da retirada completa do meio de cultivo anteriormente

existente. Em seguida, as células foram fixadas e coradas com panótico - LB

Laborclin, Brasil , de forma convencional e imediatamente analisadas no microscópio

óptico - MO BX 41 Olympus, EUA, nos aumento de 100X, 200X e 400X procurando-

se principalmente avaliar comparativamente os padrões morfológicos e arranjo

celular dos diferentes grupos. Na mesma ocasião, as micrografias foram realizadas

em microscópio de luz, sendo as imagens capturadas no programa Axio Vison 40v

O intuito da avaliação morfológica foi observar através da microscopia de luz,

alterações estruturais ocorridas nas células.

RESULTADOS

3. Resultados experimentais in vitro da Aplicação da TFD no cultivo

primário de carcinoma mamário de cadela.

3.1. Resultados do método de exclusão do Azul Tripan

A avaliação da efetividade da aplicação da TFD nos cultivos primários foi

realizada por meio de diferentes experimentos, envolvendo aspectos qualitativos e

quantitativos relacionados com a viabilidade celular. A figura 7 apresenta os

resultados dos ensaios com o corante Azul Tripan. Observa-se que o grupo TFD

apresentou uma porcentagem de viabilidade celular significativamente menor do que

todos os demais grupos (P<0,05) e não houve diferença significativa entre os outros

tratamentos e controle. Ou seja, após a TFD o cultivo celular apresentou apenas

12% de células vivas, o grupo controle, LED e AlClftalo apresentaram

respectivamente 94%, 90% e 95% de células vivas..

Figura 7. Viabilidade média (± DP) das células após 24 horas do experimento,

avaliadas pelo ensaio com corante Azul Tripan.

(ab)

Barras com diferentes letras indicam

diferença significativa entre os tratamentos (P<0,05).

3.2. Resultados do método de avaliação de viabilidade celular pelo MTT

Os resultados decorridos deste método de avaliação de citotoxicidade

encontram-se dispostas na figura 8. Por meio do ensaio pelo MTT observa-se que o

controle tem significativamente mais células viáveis (100%) que os outros

tratamentos (P<0,05), e a TFD tem significativamente menos células viáveis que

todos os outros tratamentos (P<0,05). O uso do LED e da medicação sozinhos não

diferiram entre si, apresentando 83% e 84% respectivamente de viabilidade celular.

Nota-se que há grande eficiência na redução da viabilidade das células cultivadas

após a aplicação da TFD sendo demonstrada pela morte celular de mais de 93% do

total de células no ensaio de MTT.

Figura 8. Viabilidade média (± DP) das células após 24 horas do experimento

através do método de avaliação MTT.

(abc)

Barras com diferentes letras indicam diferença

significativa entre os tratamentos (P<0,05).

3.3. Resultados do ensaio de citotoxicidade pela coloração com

Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídio

A análise morfológica de citotoxicidade das células cultivadas após a

aplicação da TFD com o ensaio de coloração Alaranjado de Acridina e Brometo de

Etídio permitiu a distinção entre as células vivas, necróticas e apoptóticas como

descrito na metodologia, em cada um dos grupos experimentais.

As células cultivadas consideradas viáveis tratadas ou não, se apresentavam

com coloração verde, com forma regular esférica ou oval e sem projeções

citoplasmáticas aberrantes (Figura 9A). As consideradas apoptóticas apresentavam

alterações como condensação, fragmentação de núcleo e da cromatina e liberação

de corpos apoptóticos, podendo se mostrar de coloração verde ou laranja (Figura 9B

e C). As células necróticas eram visualizadas como células intumescidas, se

apresentando com coloração avermelhada, dada a total perda de integridade de

membrana (Figura 9D).

Figura 09. Fotomicrografias de flurescência de células cultivadas de carcinoma

mamário de cadela em diferentes grupos experimentais coradas com alaranjado de acridina

e brometo de etídeo, mostrando células viáveis (A), em apoptose com presença de corpos

apoptóticos (seta) (B), apoptose, (C), e necrose (D

Os resultados obtidos pela coloração com Alaranjado de Acridina e Brometo

de Etídio permitiu quantificar células necróticas e apoptóticas em cada um dos

grupos experimentais e os resultados podem ser visualizados na figura 10. Como se

pode observar, o grupo da TFD apresentou menos células viáveis (13%) diferindo

significativamente de todos os demais grupos (P<0,05), e não houve diferença entre

os outros tratamentos, resultado semelhante ao observado com a coloração azul

tripan. Avaliando-se as vias de morte celular, nota-se que para a percentagem de

células em necrose a TFD apresentou um maior número de células necróticas (87%)

que os demais tratamentos (P<0,05); no entanto, não houve diferença entre os

outros tratamentos. Já para via de morte celular por apoptose, os resultados obtidos

foram reduzidos e não diferiram entre si. Nota-se, então, que a TFD causou morte

celular significativa, quando comparada aos outros grupos de tratamento, e que a

mesma decorreu de necrose celular.

Figura 10. Porcentagem média (± DP) de células vivas, com apoptose e necrose

após 24 horas do experimento através do método de coloração com alaranjado de acridina

e brometo de etídio.

(a,b)

Barras com diferentes letras indicam diferença significativa entre os

tratamentos (P<0,05).

(**)

Diferença estatisticamente significativa de células mortas por

necrose entre TFD e os demais grupos (P<0,05).

3.4. Análise do cultivo celular após tratamentos experimentais, através

do microscópio invertido com contraste de fase

As placas contendo os cultivos celulares foram analisadas decorridas 24

horas do experimento sob microscopia de contraste de fase nos aumentos de 100X,

400X e 600X. O grupo controle foi o modelo de comparação entre os diversos

tratamentos.

As imagens observadas no grupo controle (Figura 11) demonstraram

confluência e aderência celular (Figura 11A, B e C), células com formatos poligonais

variando de formas mais alongadas (Figura 11C) a formas mais quadrangulares

(Figura 11D) a depender do nível de confluência da placa, ou seja, da concentração

celular aderida no fundo da placa. Observaram-se poucas células arredondadas ou

imersas no sobrenadante do meio de cultivo. As imagens obtidas nos grupos LED e

nos grupos com o fármaco fotossensibizador isolado foram similares aos observados

no grupo controle.

Nas imagens obtidas no grupo da TFD (Figuras 12) observou-se escasso

número de células aderidas ao fundo da placa, perda do arranjo celular e ausência

de confluência. Ainda, elevado número de células arredondadas e imersas no meio

de cultivo (Figura 12A e B), evidenciadas como pontos radioluscentes. Era possível

observar também células aderidas, entretanto, com grande número de vacúolos

citoplasmáticos (Figura 12C e D), inferindo processo de degeneração e morte

celular.

Figura 11. Fotomicrografias de células do grupo controle em cultivo. Em (A) observa-se no

aumento de 100X, nível de confluência de aproximadamente 80%, (B) aumento de 400X,

observa-se monocamada com células justapostas com arranjo uniforme, (C) aumento de

400X, verifica-se em outro campo visual as mesmas caracteríticas analisadas em (B); (D)

aumento de 400X, células de diferentes formatos, núcleo (seta) e citoplasma evidentes.

Notar escassez ou ausência de células arredondadas e imersas no sobrenadante.

Figura 12. Fotomicrografias de células em cultivo tratadas com terapia fotodinâmica. (A)

observa-se no aumento de 100X, ausência de confluência, células arredondadas flutuantes

no meio de cultivo, (B) aumento de 400X além das características observadas em (A), há

também poucas células aderidas no fundo da placa, próximas aos aglomerados celulares de

formato arredondado. (C) aumento de 400X verificam-se células poligonais com vacúolos

citoplasmáticos (seta) e em (D) aumento de 600X, observa-se com melhor precisão as

alterações analisadas em (C).

3.5. Análise da morfologia celular após tratamentos experimentais, por

meio de microscopia de luz

As alterações analisadas da morfologia celular em todos os grupos

experimentais foram comparadas ao observado no grupo controle. A microscopia de

luz das culturas celulares submetidas aos tratamentos com o LED e à AlClFt

isoladamente apresentaram morfologia semelhante àquela observada no grupo

controle (Figura 13). Nesses grupos evidenciaram-se células com projeções

citoplasmáticas que lhe conferiram aspecto de “estrela” (Figura 13A), as quais

ligavam uma célula à outra (Figura 13B), e grande quantidade de células com

formas poligonais (Figura 13C e D). Verificou-se integridade de membrana,

citoplasma abundante, presença de grânulos e núcleo, e cromatina bem evidente

(Figura 13D).

Já a análise à microscopia de luz do grupo submetido à TFD demonstra

hipocelularidade e intensas alterações morfológicas das células cultivadas, como

perda do conteúdo citoplasmático, condensação nuclear, fragmentação de núcleo e

ruptura de membrana plasmática (Figuras 14A, B e C). Em determinados campos de

visualização a presença intensa de debris celulares dificultou uma análise mais

precisa (Figura 14D).

Figura 13. Fotomicrografias de células cultivadas em lamínulas com coloração

panótico rápido, grupo controle. (A) aumento de 25X, projeção espacial da monocamada de

células, (B) aumento de 100X, células com arranjo uniforme, e projeções citoplasmáticas

conferindo-lhes aspecto de estrela. (C) aumento de 200X e (D) aumento de 400X, observa-

se citoplasma abundante, núcleo preservado e bem delimitado, presença de inúmeros

grânulos citoplasmáticos.

Figura 14. Fotomicrografias de células cultivadas em lamínulas com coloração

panótico rápido, grupo TFD. (A – C) - aumento de 400X, células em processo degenerativo,

perda da morfologia padrão. Em D, aumento de 100X, fundo da placa com ausência de

monocamada e intensa quantidade de debris celulares.

DISCUSSÃO

O câncer de mama representa o neoplasma maligno mais comum nas

cadelas e corresponde a 25-50% dentre todas as neoplasias (JONES et al., 2000;

GOLDSCHMIDT & HENDRICK, 2002). A condução deste experimento, embasado

na linha de pesquisa de cultivo primário de células cancerígenas e terapia

fotodinâmica in vitro justifica-se pela elevada incidência de neoplasias mamárias

malignas em cadelas (GORMAN & DOBSON, 1995; KITCHELL, 1995; OGILVIE &

MOORE, 1995; MORRISON, 1998; ZUCCARI, 2005) como, também, na

necessidade e segurança ética de se realizar primeiramente uma terapia não

convencional em modelos apropriados in vitro que mimetizem a realidade in vivo

(MACHADO, 2000; MERKEL & BIEL, 2001).

Ao se tratar de neoplasmas mamários, o tratamento atualmente consiste na

sua excisão, que ocorre de formas distintas de acordo com o grau de envolvimento

glandular, podendo estar associado ou não à quimioterapia adjuvante (MOULTON

1990, CEBALLOS et al, 1993; SILVA, 2000, OGILVIE & MOORE, 2001). A escolha

do tratamento é dependente não somente do estadiamento do tumor, mas do grau

de disponibilidade e aceitação do proprietário com relação ao período pós-

operatório, aos custos financeiros, às mudanças estéticas e aos possíveis efeitos

colaterais das sessões quimioterápicas (OGILVIE & MOORE, 2001). Vale ressaltar

que dependendo do grau de acometimento do câncer, e presença de possíveis

metástases, muitas vezes o tratamento cirúrgico não é recomendado, cabendo ao

médico veterinário determinar alternativas paliativas para controle da dor e melhoria

na qualidade de vida e bem estar do paciente oncológico.

Elucidadas tais dificuldades de cura e, muitas vezes, da finalização dos

tratamentos convencionais para o câncer de mama, suscita-se a busca por

alternativas terapêuticas que cessem ou retardem o crescimento tumoral, o que

torna o modelo experimental aqui proposto uma ferramenta útil para a busca de tais

alternativas. Sabe-se que as terapias antineoplásicas são de suma importância no

aumento da expectativa de vida do paciente, mas, se mal planejadas, podem

comprometer sua sobrevivência (BARBOSA, 2008).

Uma alternativa promissora, difundida para o tratamento de alguns

neoplasmas cutâneos, como carcinoma de células escamosas (MERKEL & BIEL,

2001), câncer de próstata em cachorros (LUCROY et al., 2003), ou no caso de

ocorrência em humanos, do carcinoma bucal (MACHADO, 2000; TAPAJÓS, 2008), é

a TFD.

Estudos sobre o uso de ftalocianina em Terapia Fotodinâmica de câncer de

animais de companhia são reduzidos na literatura (ROBERTS et al., 1991;

PEASTON et al. 1993; LEACH & PEASTON, 1994; STELL & DOBSON, 2001;

OLIVEIRA et al., 2006; BORGATTI-JEFFREYS et al., 2005). Adicionalmente,

estudos de TFD em câncer de mama em cadelas com AlClFt lipossomal não foram

encontrados, até dado momento, nas bases de dados internacionais consultadas,

dificultando comparações de metodologias e resultados. No entanto, Tapajós e

colaboradores (2008) demonstraram que o fotossensibilizador AlCFt-lipossomal

apresentou excelentes resultados na aplicação da TFD em modelos de cultura de

células derivadas de carcinoma epidermoide bucal humano. Longo et al., (2009)

observaram diferentes graus de eficiência deste protocolo terapêutico no tratamento

de modelos experimentais em camundongos, com mínimo efeito colateral. E na

eminência de se obter um agente fotossensibilizador próximo ao considerado ideal

(OLIVEIRA et al., 2006), tais achados, acima descritos, suscitaram a pesquisa com o

fármaco fotossensibilizador AlClFt lipossomal.

Os resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade com cultivo celular

primário de carcinoma mamário de cadela demonstraram claramente a eficácia da

TFD mediada pela AlClFt em formulação lipossomal na destruição destas células

tumorais em sistemas de cultura celular. Tapajós et al., (2008) obtiveram resultados

semelhantes, demonstrando que o fotossensibilizador AlClF-lipossomal apresentou

excelentes resultados na aplicação da TFD em modelos de cultura de células

derivadas de Carcinoma Epidermoide Bucal Humano. Neste estudo, foi demonstrado

que 24 horas após a aplicação da terapia, aproximadamente 90% das células

apresentaram perda da viabilidade celular. Verificou-se, ainda, que o tratamento com

o fármaco fotossensibilizador de forma isolada não apresentava efeitos citotóxicos e

genotóxicos às células em cultura. Posteriormente, o protocolo de aplicação da TFD

mediada pelo fotossensibiizador AlClFt-lipossomal foi avaliado em diferentes

modelos experimentais para o câncer de boca em camundongos (LONGO et al.,

2009). Também foram observados diferentes graus de eficiência deste protocolo

terapêutico no tratamento dos modelos experimentais em camundongos. Assim

como nos modelos in vitro, nos estudos in vivo não foram observados efeitos

adversos nos animais tratados de forma sistêmica com o fármaco fotossensibilizador

(LONGO et al., 2009).

Em termos gerais, o sucesso da Terapia Fotodinâmica depende dentre outros

fatores, da fonte de luz, do tipo de agente fotossensibilizador, da sua concentração e

localização intracelular. A morte celular, causada pelo agente citotóxico oxigênio

singlete, pode ser promovida tanto por necrose quanto por apoptose, reações

inflamatórias e estimulação de reações imunes do paciente (DOLMANS et al, 2003).

De maneira suscinta, a apoptose é uma forma regulada de morte celular

fisiológica, dependente da autodestruição intrinseca celular (WISING et al., 2005). A

necrose se caracteriza pelo conjunto de alterações morfológicas que se seguem à

morte celular, num tecido ou órgão vivo, resultante de ação degradativa por parte de

enzimas sobre uma célula letalmente agredida (JONES et al., 2000).

Os achados morfológicos observados com o uso de Terapia Fotodinâmica

com AlClFt lipossomal em cultura primária de carcinoma mamário são sugestivos de

um mecanismo de morte celular por necrose. Tais resultados assemelham-se aos

descritos por Longo et al., (2009), os quais, utilizando o mesmo protocolo

experimental com células de linhagem de carcinoma epidermóide bucal humano,

OSSC, demonstraram a ocorrência de necrose celular com alterações morfológicas

muito semelhantes às apresentadas no presente estudo. Além da morte celular

induzida por necrose, verificou-se que o perfil de viabilidade celular dos grupos

tratados apenas com luz ou com o fármaco fotossensibilizador AlClFt, isoladamente,

foram semelhantes àqueles descritos por outros autores (TAPAJÓS et al., 2008;

LONGO et al., 2009), demonstrando a reprodutibilidade dos resultados em diferentes

linhagens celulares.

As alterações morfológicas observadas no presente trabalho também foram

descritas por Darvish et al. (2006) para linhagem celular de carcinoma de laringe

humano (B16F10) submetidas a TFD com Ácido 5-Aminolevulínico (ALA), Mijan et al

(2006) para o tratamento de linhagens distintas de carcinoma bucal por TFD com

alumínio-ftalocianina tetrasulfonada (AlPcS

) e Martins et al., (2007) para tratamento

in vitro de linhagens celulares de carcinoma de laringe humana (HEp-2) através da

utilização da TDF com o fármaco AlPcS

Diversos estudos têm demonstrado que a aplicação da TFD promove a morte

celular das células tumorais tanto por mecanismos de necrose (DARVISH et al. 2000

MIJAN et al., 2006; MARTINS et al., 2007; TAPAJÓS et al., 2008; LONGO et al.,

2009) quanto por apoptose (MARTINES et al.,2007; PAZOS & NADER, 2007;

PASCHOAL, 2009) e a caracterização destas mortes celulares pode ser obtida a

partir de análises morfológicas e bioquímicas. Baseados na estimulação ou não do

sistema imunológico, há trabalhos que discutem as vantagens e desvantagens da

ocorrência da morte celular tumoral preferencialmente por necrose ou por apoptose

(LAVIE et al., 1999; CASTANO et al., 2006). A necrose estimularia melhor a resposta

imune que os eventos apoptóticos. E esse estímulo imunológico poderia gerar

eventos inflamatórios clinicamente desfavoráveis. No entanto, estes mesmos

eventos, estimulariam o desenvolvimento de respostas imunes específicas contra os

tumores tratados promovendo através do estímulo imune, o controle da progressão

tumoral (CASTANO et al., 2006).

Correlacionando os resultados obtidos nos diferentes ensaios citotóxicos,

observou-se interligação entre eles, atribuindo coerência aos achados. Na avaliação

pela coloração azul tripan, que possui a finalidade de observar integridade de

membrana e conseqüentemente inviabilidade celular, os resultados sugerem

viabilidade celular no grupo controle e nos grupos onde foram adotados somente

aplicação do LED ou do fármaco, contrariamente ao observado no grupo tratado

com TFD. O mesmo pode ser observado nos testes de coloração com alaranjado de

acridina e brometo de etídio, sendo que neste último a morte celular por necrose foi

evidente. O ensaio com alaranjado de acridina é relatado como um teste acurado

(RENVOISÉ et al., 1998), permitindo distinção das células em processo de necrose

ou apoptose, e de células viáveis. Associando-se os resultados dos testes de dupla

coloração à análise morfológica através da microscopia de luz, pode-se atribuir

eficácia e seletividade à TFD.

Por outro lado, os resultados do teste MTT, cujo composto tem afinidade

mitocondrial (DENIZOT et al 1986 apud MACHADO et al., 2008), mostraram grande

perda de viabilidade celular ocasionada pela TFD, e também evidenciaram diferença

significativa entre o grupo controle e os grupos tratados com LED ou com o fármaco,

isoladamente. No entanto, a perda celular constatada nestes dois grupos foi mínima

(cerca de 15% das células), se comparada ao grupo TFD (cerca de 93%).

Face ao exposto acima, uma hipótese sugerida para tais resultados pode ser

fundamentada sobre a atividade celular ou sobre o sítio de ação de cada teste. Os

ensaios com azul tripan, dupla coloração com alaranjado de acridina e brometo de

etídio possuem como principal característica avaliar citotoxicidade através de

integridade de membrana plasmática. Por outro lado, o teste MTT avalia atividade

mitocondrial (MAGAUD et al., 1998).

Os resultados obtidos no teste MTT ensejam algumas considerações. A

redução da atividade mitocondrial pode ser decorrente, inclusive, do momento em

que a avaliação foi conduzida; ou seja, a sua atividade estar reduzida nos grupos

LED e fármaco, isoladamente. Rodal et al., (1998) observaram presença de ZnPc

em mitocôndrias de células NHIK 3025 e Usuda et al.(2002) descreveram que as

ftalocianinas interagem preferencialmente na membrana mitocondrial, no retículo

endoplasmático e no complexo de Golgi de linhagens celulares de câncer de mama

humano MCF-7c3. As ftalocianinas podem interagir com as enzimas mitocondriais

(FERREIRA et al., 2004), mas somente acarretarão a morte celular mediante altas

concentrações ou através de sua ativação pela TFD (RODAL et al., 1998; USUDA et

al.2002, USUDA, et al., 2003), fato este comprovado em nosso experimento.

Alguns estudos discutem a ação da fonte de luz sobre a atividade celular. Yu

et al., (1997) trabalhando com fotomodulação com diferentes lasers de baixa-

intensidade em células hepáticas de ratos, bem como Karu (1999) e Carnevalli

(2003) com cultura de fibroblastos (CHO-K1), observaram que a fonte de luz em

baixa potência (2 a 4 J/cm

) pode acarretar em bioestimulação das células

cultivadas. Verificaram, em ambos os trabalhos, aumento na síntese de ATP destas

linhagens. Por outro lado, concluíram que a energia da fonte de luz, em doses

elevadas, pode causar destruição celular. Estudos adicionais devem ser

incentivados.

Embora tenha sido observada pequena discrepância entre os grupos LED e

fármaco, isoladamente, nos testes de MTT, comparativamente ao grupo controle,

acredita-se que a soma dos demais resultados atribuam baixa ou ausência de

toxicidade celular a estas duas variáveis. Houve preservação da arquitetura celular e

proliferação celular durante o cultivo pós-experimento.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos com os tratamentos realizados com Terapia

Fotodinâmica mediada pelo Alumínio-Cloro-Ftalocianina em formulação lipossomal

sobre culturas primárias derivadas de carcinoma mamário de cadela, nos permite

concluir pela efetividada da mesma, por mecanismo de necrose celular, nas

condições experimentais deste trabalho.

É possível o estabelecimento, manutenção e proliferação de cultura celular a

partir de células de carcinomas mamários de cadelas.

O laser emissor de diodo e a Alumínio – Cloro - Ftalocianina em formulação

lipossomal, ambos de forma isolada, não causam citotoxicidade no modelo

experimental proposto.

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CAPÍTULO III

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Perante a confiabilidade do experimento e dos resultados obtidos, instigam-se

novos projetos experimentais com modelos in vivo, dada a elevada ocorrência do

câncer de mama em cadelas e sua subseqüente importância seja ela clínica para o

médico veterinário, ou como modelo experimental para a mesma afecção em

humanos, pois é crescente a busca por terapias antineoplásicas que proporcionem a

cura ou melhores resultados e com reduzidos efeitos colaterais perante os

tratamentos convencionais hoje já realizados contra o câncer.

ANEXOS

1.1. Materiais de Consumo

1.1.1. Soluções, Reagentes e Corantes

Material

Fabricante/Origem

Água Destilada

Filtro QUIMIS

, Brasil

Água Deionizada Milli-Q

Millipore Corporation

, EUA

Alaranjado de Acridina

VETEC

Química Fina, Brasil

Álcool hidratado 99,3°

Zulu Ltda

, Brasil

Azul Tripan 0,4%

Sigma - Aldrich

, EUA

Brometo de Etídio

VETEC

Química Fina, Brasil

Dimetilsulfóxido (DMSO) minimum 99,5% GC

Sigma - Aldrich

; EUA

Dulbeco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

GIBCO

EUA

Formol a 10%

Sigma – Adrich

, EUA

Kit Panótico Rápido

Laborclin, Brasil

Penicilina/Estreptomicina 1% v/v (100μg/mL)

Sigma – Adrich

, EUA

Polivinilpirrolidona Iodo (PVPI 10% de Iodo Ativo)

Farma, Brasil

Soro Fetal Bovino (Foetal Bovine Serum)

GIBCO

, Brasil

Solução Fisiológica NaCl 0,9% 500mL

Equiplex

Brasil

Solução Tampão Fosfato Salina (PBS) pH = 7,2

Laborclin Ltda., Brasil

Tripsina-EDTA (0,125% tripsina e 0.02% EDTA)

GIBCO

- Canadá

1.1.2. Instrumentos e Equipamentos.

Material

Fabricante/Origem

Agitador Magnético com Aquecimento

Nova Técnica

, Brasil

Autoclave Vertical AV Plus

Phoenix Germany - Alemanha

Balança de Precisão

Shimadzu AUW220D, Europa

Béquer graduado (50mL; 500mL) vidro

J.Prolab

, Brasil

Cabo de bisturi n° 03 e 04

Edlo

, Brasil

Câmara de fluxo laminar horizontal CFLH-12

VECO

, Brasil

Centrífuga

Centrobio

, Brasil

Digital Camera for Microscopy DCM35

Microstatone Infotech, EUA

Erlenmeyer graduado (1000mL) vidro

J.Prolab

, Brasil

Espectrofotômetro Digital

Bio-Rad Model 3550 – UV

Microplate Reader, EUA

Estufa Incubadora CO

para Cultivo TE – 399

Tecnal

, Brasil

Frasco alemão 500mL e 1000mL

BOECO

, Alemanha

Coletor universal de amostra biológica 50mL

J.Prolab.

, Brasil

Garrafas de Cultivo Poliestireno

25cm

(60mL) e 75cm

(270mL)

BOECO

, Alemanha

Hematocitômetro (Câmara de Neubauer)

C.A.Hausser & Son, EUA

Lâminas de bisturi nº 10 e 20

MedBlade EUA

Lâminas para Microscópio de vidro

Exacta, Brasil

Lamínulas de vidro circulares 25mm diâmetro

VWR Scientific

, EUA

Lamínulas de vidro (24 mm x 24 mm)

VWR Scientific

, EUA

Membrana para filtro de 0,22μm

Millex GV – Millipore

EUA

Micropipetas de 1 - 20 μm; 50 - 200 μm; 200 a 1000 μm

Pipetman Gilson

, França

Microscópio Optico Axiophot

Zeiss Alemanha

Microscópio Optico MO BX 41

Olympus, EUA

Microscópio de fluorescência invertido Axiophot

Zeiss.26 - Alemanha

Microscópio invertido - TS1000

Nikon Eclipse - EUA

Microtubos para centrífuda do tipo eppendorfs

graduados (2,0 e 1,5mL)

Axygen EUA

Parafilm Pechiny Plastic Packaging

Menasha WI, EUA

PHmetro SC-09

QUIMIS

, Brasil

Pinça anatômica

Edlo

- Brasil

Placas de cultivo poliestireno 6, 24 e 96 poços tampa

TPP

, EUA

Placas de Petri de vidro 90X15 mm lisa

J.Prolab

, Brasil

Ponteiras descartáveis para micropipetas

Axygen EUA

Refrigerador e congelador Dynamic Coolin 36

Bosch EUA

Seringas plásticas 20 mL, 20G 1” 0,7x25

Plascalp

, Brasil

Sistema de Filtração de Soluções de vidro

BOECO

, Alemanha

Tubos Falcon 15 e 50 mL

TPP

, EUA

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