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Carla Albertina Martins Almeida
Avaliação ultra-estrutural dos vasos da íris,
corpo ciliar e retina em ratos diabéticos
aloxânicos.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Botucatu da
Universidade Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do título
de Doutor em Cirurgia (Área de Concentração: Bases Gerais da
Cirurgia e Cirurgia Experimental)
Orientadora: Prof. Titular Silvana Artioli Schellini
BOTUCATU
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Almeida, Carla Albertina Martins.
Avaliação ultra-estrutural dos vasos da íris, corpo ciliar e retina de ratos
diabéticos aloxânicos / Carla Albertina Martins Almeida. – 2008.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista, 2008.
Orientador: Profª. Drª. Silvana Artioli Schellini
Assunto CAPES: 40102033
1. Diabetes. 2. Íris (olhos). 3. Retina – Vasos sanguíneos. 4. Rato como
animal de laboratório.
CDD 617.71
Palavras-chave: Aloxana; Diabetes; Ratos; Ultra-estrutura; Vasos.
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AGRADECIMENTOS
À Prof. Titular Silvana Artioli Schellini para quem o tempo se
multiplica, as atenções se redobram e a competência flui como um rio perene e,
sem a qual os frutos destes trabalho não existiriam, meus mais sinceros
agradecimentos e estima.
À Prof. Dra. Elisa Aparecida Gregório, pela orientação nas análises
dos resultados histológicos.
Ao Dr. Roberto Augusto de Almeida Torres Júnior, pela execução e
orientação nas análises estatísticas.
À Maria Helena Moreno, funcionária do laboratório de Microscopia
Eletrônica, responsável pelos trabalhos de preparo do material e micrografias das
áreas de estudo, que sempre manteve o profissionalismo e nos incentiva com seu
o exemplo de dedicação.
Aos funcionários do laboratório de Microscopia Eletrônica, Maria
Euleda Lino Peres e Nivalde Antônio Bassa, pelo apoio prestado em certas fases
do trabalho.
Aos funcionários da Cirurgia Experimental, Irene, Cecília e Sônia,
pelos cuidados com os animais objetos deste estudo.
Aos funcionários:
- Setor de pós-graduação: Regina Célia Spadin, Lílian Cristina N.
B. Nunes, Nathanael Pinheiro Sales, Vera Lúcia Aparecida Miguel, Adenice Ruiz
Pedro;
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- Departamento de Cirurgia: Simone Barroso Corvino Camargo;
- Biblioteca: Rosemeire Aparecida Vicente
Pelo tratamento atencioso dispensado durante todos estes anos,
desde o início da realização do Mestrado, o meu muito obrigada.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização
deste trabalho, meus agradecimentos.
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“Ninguém pode construir em teu
lugar as pontes que precisarás
passar, para atravessar o rio da vida;
ninguém, exceto tu, só tu. Existem,
por certo, atalhos sem números, e
pontes, e semideuses que se
oferecerão para levar-te além do rio;
mais isto te custaria tua própria
pessoa; tu te hipotecarias e te
perderias. Existe no mundo um único
caminho por onde só tu podes passar.
Onde leva? Não perguntes, segue-
o!”.
Nietzsche
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 08
1-DIABETES E VISÃO 10
2-AS DESCOBERTAS E O DIABETES 13
3-ESTUDOS EXPERIMENTAIS E EM HUMANOS
PARA ENTENDIMENTO DA DOENÇA DIABÉTICA 14
4-FISIOPATOLOGIA E ESTUDOS MORFOLÓGICOS
DAS LESÕES OCULARES NO DIABETES 15
5-APLICAÇÃO DE MÉTODOS QUANTITATIVOS
EM ESTUDOS MORFOLÓGICOS 22
JUSTIFICATIVA DA PROPOSTA 24
OBJETIVOS 26
MATERIAL E MÉTODO 28
1. Animais utilizados 28
2. Grupos experimentais 28
3. Momentos experimentais 28
4. Parâmetros estudados 29
4.1. Parâmetros clínicos 29
4.2. Parâmetros bioquímicos 29
4.3 Parâmetros morfológicos 30
5. Método empregado para medida da espessura da membrana basal 30
6. Seqüência dos tempos experimentais 32
7. Técnicas utilizadas 32
7.1. Indução do diabetes experimental 32
7.2. Manutenção dos animais 33
7.3. Coleta de material para obtenção dos dados clínico laboratoriais 34
7.4. Exames bioquímicos 34
7.5. Sacrifício dos animais 35
7.6. Preparo dos olhos para exame morfológico 35
7.7. Documentação fotográfica 37
8. Análise estatística 38
RESULTADOS 40
1. Avaliação clínica 40
2. Parâmetros clínicos 41
2.1. Peso 41
2.2. Diurese 43
2.3. Ingestão hídrica 44
2.4. Ingestão alimentar 45
3. Parâmetros bioquímicos 46
3.1. Glicemia 46
3.2. Glicose urinária 47
4. Avaliação ultra-estrutural 48
4.1. Grupo controle 48
4.2. Grupo diabético 54
5. Análise morfométrica da espessura da membrana basal 59
FIGURAS 64
DISCUSSÃO 87
CONCLUSÕES 104
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106
SUMÁRIO 114
ABSTRACT 115
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8
INTRODUÇÃO
Diabetes é uma das mais antigas doenças conhecidas, aparecendo a
frase ‘the passing of too much urine’ em um manuscrito egípcio, escrito por
volta de 1550 antes de Cristo [Aretaeus (81-138 A.D.) De diabete Paris, 1554].
Na realidade, o diabetes é um grupo de síndromes, caracterizadas
por hiperglicemia. É uma doença sistêmica, crônica e evolutiva, que ocorre por
deficiência absoluta ou relativa da secreção de insulina, resistência celular à
ação deste hormônio, ou a combinação destes dois fatores. Ocasiona mudanças
no metabolismo dos carboidratos, lipídios e proteínas com alto risco de
complicações vasculares (1-3).
Característica quase patognomônica do diabetes, conseqüente de
todas as alterações metabólicas, é o espessamento da membrana basal capilar,
com inadequado fluxo sangüíneo em certas regiões críticas do organismo,
levando a alterações decorrentes da macroangiopatia e da microangiopatia (4-
10).
Alterações decorrentes da macroangiopatia são: doença arterial
coronariana, doença vascular periférica (pé diabético) e doença arterial
cerebrovascular. Essas ocorrências podem atingir não diabéticos. No entanto, a
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9
prevalência de infarto agudo do miocárdio (IAM) e acidente vascular cerebral
(AVC) é maior que o dobro em indivíduos diabéticos, quando comparada a
populações não diabéticas (11).
Além disso, a taxa de mortalidade por IAM e AVC é
respectivamente 50% e 15% maior em diabéticos, sendo que as doenças
cardiovasculares representam a principal causa de morte em pacientes diabéticos
do Tipo 2 (12, 13).
As principais alterações decorrentes da microangiopatia são a
nefropatia, a neuropatia e a retinopatia (8, 14).
A nefropatia diabética (ND) ocorre devido ao espessamento da
membrana basal dos capilares dos glomérulos e, também, devido aos depósitos
de glicoproteínas no mesângio, levando a nefroesclerose (7, 8, 11, 15). A
maioria dos casos de ND apresenta também HA. Esta tem particularidades,
quando presente em um ou outro tipo de DM. No tipo 2, a HA faz parte do
espectro da síndrome metabólica, estando presente em cerca de 50% dos
pacientes no momento do diagnóstico do DM. Já, no DM tipo 1, a HA
manifesta-se tardiamente, associando-se ao aparecimento da microalbuminúria,
e torna-se mais intensa e freqüente à medida que a nefropatia progride para as
fases de macroproteinúria e diminuição da função renal (5, 8, 15).
A neuropatia diabética é complicação freqüente e precoce do DM,
podendo atingir, em longo prazo, 80 a 100% dos pacientes, podendo já estar
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10
presente nos pacientes com DM tipo 2 desde o momento do diagnóstico. O
quadro clínico pode variar desde formas assintomáticas, até a presença de muitas
manifestações pouco específicas, somáticas e/ou autonômicas. As alterações
mais comuns são as sensoriais, com perda das sensibilidades dolorosa e térmica
(8, 11). Ainda não foram inteiramente definidos os mecanismos patogênicos
precisos, responsáveis pelas diferentes manifestações da neuropatia diabética.
Todavia, há evidências que implicam vários processos diferentes no seu
desenvolvimento. Os fatores mais importantes parecem ser a alteração da via
metabólica dos polióis e também a isquemia, com redução do fluxo sangüíneo
endoneural (8).
Estudos mostram que é necessário avaliar os vasos retinianos, de
homens e de animais, para se conhecer a gênese das doenças vasculares (16),
sendo a retinopatia diabética (RD) um dos pontos mais importantes da
microangiopatia.
1-DIABETES E VISÃO
O diabetes é importante causador de doença ocular, e a perda
permanente da visão é uma das complicações mais surpreendentes e temidas.
Cerca de 25% de todos os novos casos de cegueira são atribuídos ao diabetes
(17).
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11
Praticamente todas as estruturas oculares podem ser acometidas
pelo diabetes (18, 19), que é uma das poucas doenças sistêmicas com este
potencial efeito deletério sobre os olhos e a visão (6, 19).
Apesar de a doença diabética afetar quase todas as estruturas
oculares, são as alterações retinianas as mais temidas pelo fato de causarem
perda da visão, de maneira progressiva e irreversível, mesmo quando se usa
corretamente o tratamento.
A prevalência de RD em diabéticos difere conforme o tipo de
doença, sendo que 40% dos indivíduos insulino-dependentes (DID) podem
apresentar o problema, enquanto que apenas 20% dos diabéticos não insulino-
dependentes (DNID) possuem RD. A prevalência de RD tem relação ainda com
outros fatores, como a faixa etária e o sexo. Assim, indivíduos entre 30-65 anos
e do sexo feminino são afetados com maior freqüência.
Duke-Elder afirma que sua evolução é previsível, porém não
previnível, e o considera relativamente intratável. Afeta jovens ou idosos e, com
sua evolução arrastada e progressiva, a RD leva à cegueira em grande
porcentagem dos casos (20, 21).
A RD é a segunda causa de cegueira irreversível, precedida apenas
pela degeneração macular relacionada com a idade (22). É a principal causa de
cegueira entre 25 e 75 anos de idade (22, 23).
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12
A RD é, também, importante indício prognóstico. Cinqüenta por
cento dos indivíduos com RD possuem alterações renais, e a sobrevida média de
portadores de RD proliferativa é de cinco anos (24, 25).
A ausência de retinopatia pode ser correlacionada com o aumento
da sobrevida dos diabéticos (26).
Os fatores de risco conhecidos são:
1) Duração do diabetes: é o fator mais importante. Depois de 10
anos de doença, a incidência é de 50%, e depois de 30 anos, é de 90% (27). O
maior tempo de evolução do DM, leva também ao aumento dos casos de RD
proliferativa (28, 29).
2) Controle metabólico: a manutenção de uma normoglicemia não
previne o aparecimento da doença, mas pode retardá-la por alguns anos.
Realmente, não é raro observarmos a progressão da retinopatia, a despeito da
normalização da glicemia. É como se a retinopatia adquirisse um caráter
autonômico na sua evolução (27, 30). Existe forte associação entre o grau do
controle metabólico e o desenvolvimento de retinopatia com potencial piora da
visão (29, 31, 32).
3) Fatores diversos: outros fatores que podem alterar o prognóstico
são: gravidez, anemia, hipertensão arterial sistêmica, tabagismo,
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13
hipomagnesemia, dislipidemia, puberdade e doença renal (proteinúria franca)
(27, 30, 33).
Embora não haja um consenso absoluto na classificação da RD,
diversos autores apresentam propostas de classificar a RD de acordo com fatores
clínicos, prognósticos ou diagnósticos (34-38).
Bastante utilizada é a classificação em: retinopatia não
proliferativa ou “background”, retinopatia proliferativa e maculopatia diabética
(6, 37, 39-44).
2-AS DESCOBERTAS E O DIABETES
Johann Brunner (1653-1727) esteve perto de descobrir que o
diabetes apresenta relação com o pâncreas. Ele removeu o pâncreas de cães e
notou que eles apresentavam extrema sede e poliúria. Estes são os primeiros
experimentos com relação à secreção interna do pâncreas (45).
Matthew Dobson (1731-1784) graduou-se em Edimburgh em 1756
e, foi o primeiro a provar a presença de açúcar na urina de pacientes com
diabetes, após evaporação. Também fez observações cruciais quanto ao excesso
de açúcar no sangue e demonstrou que o diabetes é uma doença sistêmica e não
primária dos rins como se pensava anteriormente (45).
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14
Thomas Cawley foi o primeiro a sugerir correlação entre diabetes e
pâncreas, após verificar que um paciente morto com diabetes apresentava sinais
de dano tecidual pancreático. O significado desta pista vital não foi superado por
cerca de cem anos (45).
3-ESTUDOS EXPERIMENTAIS E EM HUMANOS PARA
ENTENDIMENTO DA DOENÇA DIABÉTICA
A relação da doença diabética com os olhos é importante, sendo a
retina um dos focos principais dos estudos morfológicos, iniciados com
Kuwabara e Cogan, que descreveram pela primeira vez as alterações senis nos
vasos retinianos, com perdas endoteliais e pericíticas e o desenvolvimento de
aneurismas saculares em homem com mais de 50 anos de idade.
Os estudos ultra-estruturais em animais de experimentação
iniciaram-se com o cão, na década de 60 (46-48) e, depois com o rato, na década
de 70 (49-51).
Atualmente existem modelos em camundongos (52), coelhos (53-
55) e macacos (56).
Existem inúmeros modelos de ratos diabéticos para estudo da RD,
utilizados por diferentes autores, tais como:
- alimentação com sucrose originando ratos diabéticos (57, 58).
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15
- ratos com DM induzido por estreptozotocina (58, 59);
- ratos BB Wistar com diabetes espontâneo (60).
- ratos diabéticos aloxânicos, modelo descoberto pelo professor
Shaw Dunn e o aprendiz Mc Letchie (61-65).
- ratos alimentados com galactose (65, 66).
- camundongos modificados por engenharia genética (63).
4-FISIOPATOLOGIA E ESTUDOS MORFOLÓGICOS
DAS LESÕES OCULARES NO DIABETES
Os eventos patogênicos primários subjacentes às alterações da
retinopatia “background” não proliferativa não são claros, mas a perda dos
pericitos capilares de apoio, a proliferação endotelial e a hiperviscosidade com
agregação das hemácias, isolados ou associados, foram todos propostos (6, 17,
40, 67-69).
A microangiopatia que afeta a retina é uma lesão que se estende
por toda a microvasculatura (arteríolas, capilares e vênulas). Os aspectos básicos
são de vazamento para os tecidos retinianos perivasculares e de oclusão
(exclusão capilar), e ambos os eventos convergem para a isquemia do tecido
retiniano. As primeiras manifestações microestruturais são o espessamento da
membrana basal dos vasos e a diminuição do número de pericitos vasculares
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16
(27). Com isso ocorre a fragilização estrutural da rede microvascular, gerando os
microaneurismas e o extravasamento do conteúdo intravascular para o espaço
perirretiniano.
Os microaneurismas são pequenas excrescências (15 a 50 micras
de diâmetro) ao longo dos capilares e são particularmente proeminentes nas
extremidades de áreas de não-perfusão capilar. Também pode haver aneurismas
fusiformes ou dilatação generalizada das alças capilares. As veias retinianas são
freqüentemente tortuosas e dilatadas; a dilatação pode ser segmentar, originando
uma aparência "em contas" ou em "cordão de lingüiça". Os exsudatos podem ser
de dois tipos: (1) exsudatos duros, céreos, variam de brancos a amarelados,
brilhantes, com bordas definidas, mas sem pigmentação circundante. Esses
exsudatos devem-se ao extravasamento de líquido contendo lipídios e proteínas
dos capilares circundantes; (2) Os exsudatos algodonosos, ou moles, são
realmente áreas de não-perfusão, representando microinfartos retinianos e
freqüentemente são circundados por microaneurismas. Do ponto de vista clínico,
o aumento das áreas algodonosas indica fechamento capilar progressivo e é um
sinal de prognóstico sombrio (6, 17, 40, 67-69).
As hemorragias sub-retinianas tendem a ser pequenas,
arredondadas e em forma de manchas, podendo ser reabsorvidas em algumas
semanas. As hemorragias maiores em forma de chama de vela ocorrem nas
camadas superficiais da retina e são reabsorvidas mais lentamente. As
hemorragias pré-retinianas são mais graves e podem comprometer a visão se
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17
forem grandes ou se invadirem a mácula. Após a reabsorção, pode ocorrer
cicatrização e retração do vítreo ou descolamento da retina. O edema da retina
deve-se à permeabilidade capilar anormal e isquemia. Quando existe edema
macular persistente, a visão é gravemente prejudicada, e as formas comuns de
tratamento (fotocoagulação) não são eficazes (6, 17, 40, 67-69).
A característica da retinopatia proliferativa é a formação de novos
vasos ou neovascularização. Essas ramificações ou alças capilares podem
crescer na superfície da retina ou estender-se para o vítreo. Com freqüência, isto
é acompanhado pela proliferação de elementos gliais na região do disco óptico
ou ao longo das novas arcadas de vasos (6, 40, 70).
Finalmente, pode-se desenvolver tração entre o vítreo e os
elementos neovasculares e gliais, levando ao descolamento da retina ou grande
hemorragia no vítreo. Esses eventos levarão à grave perda da visão ou cegueira.
Foi sugerido que a isquemia retiniana é o estímulo para a neovascularização
retiniana e também no ângulo da câmara anterior e na íris, com liberação local
de fatores promotores do crescimento (17).
A presença de mais de um achado dentre os seguintes:
anormalidades venosas, anormalidades microvasculares intra retinianas,
exsudatos algodonosos, evidência de não perfusão à angiografia fluoresceínica,
podem indicar um estágio pré proliferativo, que aumenta a chance de
proliferação fibrovascular (71).
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18
Em pacientes com RD proliferativa, a não perfusão na periferia
média em 50 a 75% desta área, a oclusão capilar nas regiões peripapilar, rafe
temporal e nervo óptico, são fatores de risco para neovascularização no ângulo
de drenagem do aquoso (72).
Existem estudos que demonstram o efeito protetor do glaucoma,
miopia ou estenose unilateral de carótida sobre a RD e a piora do quadro após
extração da catarata. Uma das hipóteses plausíveis para estas ocorrências pode
ser a redução relativa da pressão intra-ocular, causada por persistente ou
intermitente hiperglicemia, o que levaria a certas mudanças morfológicas no
epitélio pigmentar retiniano (73).
No nervo óptico, o principal achado associado à RD proliferativa é
a neovascularização do disco óptico (19). A neuropatia óptica aguda que ocorre
nos diabéticos pode ser de dois tipos: neuropatia óptica isquêmica com atrofia
óptica e as denominadas “papilites” (“papilopatia” diabética), além da
neovascularização associada à RD proliferativa (40, 70).
Schellini, em 1992 estudou alterações morfológicas, ultra-
estruturais e morfométricas dos capilares das camadas superficiais e profundas
da retina de ratos diabéticos aloxânicos com idade entre 3 e 15 meses,
observando estarem presentes lesões principalmente nos animais de 15 meses,
melhor evidenciadas ao exame ultra-estrutural (64).
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19
O enfoque para o mecanismo fisiopatogênico da RD nos estudos
anatômicos é direcionado principalmente para os vasos retinianos (64, 74-76) e
as demais camadas são menos valorizadas.
Entretanto, não só os vasos apresentam alterações estruturais e
ultra-estruturais, como também demonstrado por Schellini, em 1992, onde foi
observado que a camada de cones e bastonetes pode estar alterada em retinas de
ratos diabéticos. Porém, estas alterações não foram especificadas ou
quantificadas. Estas estruturas também apresentaram alterações importantes nos
animais diabéticos, quando comparados a um grupo normal, com
acompanhamento por 12 meses (77).
Outro estudo mostrou que os fotorreceptores tornam-se separados
da coróide, resultando em diminuição da acuidade visual, descolamento da
retina e morte celular (75).
Em 1969, foram relatadas alterações no epitélio pigmentar em
humanos em estudo microscópico (78). Em estudo experimental, em ratos,
foram verificadas alterações na ultraestrutura do epitélio pigmentar da retina e,
através de morfometria, foram mensuradas as invaginações da membrana
plasmática basal (79, 80).
Estudos anteriores mostraram que as células de Müller de retinas
diabéticas apresentam alterações (61, 81). Em ratos diabéticos há, nas células de
Müller, aumento de corpos “lisossomas like” e reação fosfatase ácida aumentada
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20
em complexo de Golgi, retículo endoplasmático liso e corpos eletrodensos. O
significado funcional destas alterações é incerto (81).
As células de Müller da retina diabética apresentam aumento da
dispersão de cromatina, presença de granulações nucleares elétron-densas e
aumento de glicogênio, corpos densos e lisossomas no citoplasma,
principalmente nas células da região perivascular (61).
Outros vasos intra-oculares que não os retinianos, ou seja, os vasos
do corpo ciliar e da íris são menos estudados. Porém, sendo o diabetes uma
doença que atinge todos os vasos do organismo, os outros vasos oculares, como
os localizados na coróide também se alteram, tendo sido observado
espessamento da MB, perda de pericitos, vasodilatação, atrofia capilar,
microaneurismas, usando ratos como modelo experimental, principalmente por
terem estes animais curto ciclo de vida (61, 82, 83).
Alguns estudos ultra-estruturais, realizados em ratos Sprague-
Dawley diabéticos, demonstraram alterações degenerativas nos pericitos
perivasculares da retina, íris e coróide (84-86) .
Von Sallmann e Grimes encontraram em ratos diabéticos, a
presença de dilatação de vasos irianos, além de aumento de vacuolização do
epitélio pigmentar da íris devido ao acúmulo de glicogênio (87).
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21
Kojima et al. (1971) também estudaram ratos diabéticos, tendo
encontrado alterações nos vasos da coróide e da íris.
As células endoteliais de ratos diabéticos apresentam-se
edemaciadas, com espessamento da MB, sendo possível observar neovasos
irianos em estudos com preparações tripsínicas (50).
As alterações acometem também os músculos irianos de ratos
diabéticos, que apresentam gotas lipídicas e aumento de corpos densos,
dependentes da duração e controle da doença (88).
Estudo comparativo entre lesões de vasos retinianos e da íris,
contrariamente ao esperado, mostraram que os pericitos não estão alterados nos
animais de experimentação, como ocorre no ser humano (83).
Verificou-se alterações intensas nos nervos irianos de animais
diabéticos, através de análise ultra-estrutural (89).
Também já foram verificadas alterações morfológicas nos vasos
irianos, tais como: espessamento da membrana basal nas células endoteliais e
pericitos, aumento dos corpos densos, alterações nas células musculares e
fibroblastos perivasculares. Estas alterações ocorreram de maneira mais evidente
em animais diabéticos, sendo verificadas através de microscopia eletrônica (90).
Poucos estudos experimentais foram realizados para avaliação das
lesões ultra-estruturais diabéticas no corpo ciliar, sendo verificadas alterações
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22
nas células endoteliais e nos pericitos (91, 92). Estes autores estudaram ratos
diabéticos aloxânicos com seis meses de doença e encontraram alterações nas
células do corpo ciliar.
Foram observadas alterações no estroma do corpo ciliar,
semelhantes às decorrentes da senilidade, porém de ocorrência mais precoce e
com caráter evolutivo, sendo visto, através de microscopia eletrônica: aumento
de corpos densos e lisossomos em células endoteliais e pericíticas, espessamento
da membrana basal do epitélio ciliar, degeneração em terminações nervosas
amielínicas e sinais de degeneração em fibroblastos e em feixes nervosos
perivasculares, em ratos diabéticos (93).
5-APLICAÇÃO DE MÉTODOS QUANTITATIVOS EM
ESTUDOS MORFOLÓGICOS
Nos estudos morfológicos realizados, é freqüente o uso de critérios
subjetivos como a classificação de determinadas alterações em "leves,
moderadas ou intensas", o que torna difícil a comparação de resultados e a
reprodução de experimentos, impossibilitando a quantificação de elementos
estruturais nas fotomicrografias eletrônicas de transmissão, fundamental para os
estudos experimentais e anátomo-patológicos.
Estudos quantitativos são necessários para que as avaliações se
tornem mais objetivas, tendo sido freqüente e crescente o uso da estereologia,
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23
também chamada por alguns de morfometria, técnica que permite quantificar as
mais variadas estruturas, sejam elas macro ou microscópicas (94-98).
A morfometria consiste em um conjunto de métodos de
quantificação de estruturas morfológicas, sendo um instrumento valioso na
avaliação de resultados de trabalhos experimentais (99-103).
Vários estudos têm mostrado a utilização de programas de desenho
com ajuda do computador, como o AutoCAD (Autodesk, Inc. San Rafael,
California), para realização de medidas diversas em animais e humanos (104-
107). Em oftalmologia alguns trabalhos também tem sido feitos utilizando o
AutoCad como método de medida (108, 109).
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24
JUSTIFICATIVA DA PROPOSTA
Tendo em vista que:
- apesar de a doença diabética afetar todas as partes do olho, o
enfoque das alterações vasculares diabéticas está voltado principalmente para a
presença de lesões nos vasos retinianos;
- estudos de correlação entre alterações vasculares ocorrendo nos
vasos irianos, do corpo ciliar e retina são praticamente inexistentes;
- estudos quantitativos para avaliação objetiva das alterações
ultra-estruturais diabéticas são muito pouco realizados, justifica-se a realização
do presente estudo experimental.
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26
OBJETIVOS
1) Avaliar a ultra-estrutura dos vasos da íris, corpo ciliar e retina de ratos
diabéticos aloxânicos de 1 e 12 meses, comparando-os com controles
normais.
2) Analisar, quantitativamente, a espessura da membrana basal dos vasos da íris,
corpo ciliar e retina de ratos diabéticos aloxânicos de 1 e 12 meses,
comparando-os com controles normais.
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28
MATERIAL E MÉTODO
Foi desenvolvido estudo experimental, de caráter prospectivo,
seguindo os princípios para indução da doença diabética e avaliação dos animais
preconizados pelo Grupo de Estudos do Diabetes Experimental -UNESP,
Botucatu. O protocolo de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética na
Experimentação Animal - UNESP, protocolo No. 159 (27/11/2000).
1. ANIMAIS UTILIZADOS
Foram utilizados 20 ratos da raça Wistar, de ambos os sexos, com
idade de 3 meses, com peso de 200 a 300g. cada e sadios ao exame clínico. Os
ratos foram fornecidos pelo Biotério Central do Campus de Botucatu – UNESP.
2. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os animais foram divididos, por sorteio, em 2 grupos
experimentais, como segue:
- GRUPO CONTROLE (GC) - 10 ratos normais
- GRUPO DIABÉTICO (GD) – 10 ratos diabéticos, que não
receberam qualquer tratamento
3. MOMENTOS EXPERIMENTAIS
Foi considerado, como momento zero (M0), o dia do sorteio dos
ratos para os respectivos grupos experimentais, coincidente com o dia da indução
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29
do diabetes, no GD e como momento1 (M1), o dia do início do seguimento dos
animais, o que ocorreu 15 dias após M0.
Os demais momentos corresponderam aos dias de sacrifício dos
animais e ocorreram como segue:
3.1- M2 – 1 mês após M1
3.2- M3 - 12 meses após M1
Foram sacrificados 5 ratos GC e 5 ratos GD em M2 e M3.
4. PARÂMETROS ESTUDADOS
4.1. PARÂMETROS CLÍNICOS
Diariamente, foram avaliados em todos os animais:
comportamento, atividade, aspecto geral, peso (g), ingestão hídrica (ml/24 hs) e
diurese (ml/24 hs).
4.2. PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
Foi feita pesquisa diária (de manhã e à tarde) da glicosúria e da
cetonúria; mensalmente, foram dosadas a glicemia de jejum (mg%) e a glicose
urinária (mg%).
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30
4.3. PARÂMETROS MORFOLÓGICOS
Os parâmetros morfológicos foram obtidos nos 20 animais, em
cada um dos momentos experimentais.
Foram avaliados os vasos da íris, corpo ciliar e retina, usando
microscopia eletrônica de transmissão, com avaliação quantitativa da espessura
da membrana basal dos vasos e a relação entre grupos e momentos.
5. MÉTODO EMPREGADO PARA MEDIDA DA
ESPESSURA DA MEMBRANA BASAL
As fotografias foram digitalizadas em um scanner HP
Scanjet
2400 para um computador Sony Vaio
VGN-T2XP / S. As medidas foram
realizadas com a utilização do programa AutoCAD2004
(Autodesk, Inc. San
Rafael, California).
O aumento das fotos dentro de cada grupo foi o mesmo e o
tamanho das fotos escaneadas foi mantido em 1290 X 1150 mm. As medições
obedeceram criteriosamente a metodologia aplicada que constou da utilização de
um padrão quadriculado que foi sobreposto às fotografias digitalizadas, medindo-
se a membrana basal nos locais de intersecção completa das linhas com toda a
espessura da membrana, repetindo as medidas com as fotos nas posições
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32
6. SEQUÊNCIA DOS TEMPOS EXPERIMENTAIS
- Sorteio dos animais e administração de Aloxana 2% (J.T. Baker
Chemical Co.), para indução do diabetes experimental (M0);
- Avaliação clínico-laboratorial quinze dias após M0;
- Avaliação clínico-laboratorial mensal a partir do M1;
- Observação diária do aspecto geral, da diurese, da ingestão
hídrica, da glicosúria e da cetonúria a partir do M1;
- Sacrifício dos animais previamente anestesiados, de acordo com
os momentos experimentais;
- Imediata enucleação dos olhos;
- Processamento de um dos olhos para exame ultraestrutural (foi
determinado, por sorteio, o preparo dos olhos esquerdos).
7. TÉCNICAS UTILIZADAS
7.1. INDUÇÃO DO DIABETES EXPERIMENTAL
Para indução do diabetes, os ratos receberam injeção endovenosa
de solução aquosa de Aloxana 2 % (2, 4, 5, 6 tetraoxohexahydropyrimidine), na
dose única de 42 miligramas por quilograma de peso corporal.
Os animais foram submetidos a jejum alimentar de 12 horas,
recebendo água "ad libitum". A seguir, para facilitar a observação das veias
caudais, cada animal foi colocado em caixa aquecida por lâmpada elétrica, por
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33
cerca de 10 minutos. Daí, os ratos foram transferidos para uma pequena caixa de
contenção, que permitiu que suas caudas ficassem expostas. Foi usada, então,
uma agulha de calibre 13 x 4 (27G x 33/64) para administração da droga em uma
das veias caudais. Trinta minutos após a injeção, os animais foram realimentados
normalmente.
Após um período de 15 dias, necessário para definição dos animais
portadores de diabetes grave, ou seja, os animais que apresentaram perda de
peso, aumento da ingestão hídrica e do volume urinário, acompanhados de
alterações laboratoriais de glicemia de jejum acima de 200 mg%, glicose urinária
superior ou igual a 3.000 mg% e glicosúria positiva (+++) no teste de fitas
reagentes foi iniciado o seguimento. Os animais que não preencheram os critérios
adotados para definição de diabetes grave, foram descartados ou substituídos.
Foram também substituídos os animais que vieram a morrer antes do período
programado para o sacrifício.
7.2. MANUTENÇÃO DOS ANIMAIS
Os animais foram mantidos em caixas individuais no Laboratório
de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e
Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, sob condições
iguais de temperatura e iluminação.
Os ratos receberam ração Nuvilab CRl (Nuvital Nutrientes e
Produtos Veterinários LTDA – PR) e água "ad libitum".
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34
7.3. COLETA DE MATERIAL PARA OBTENÇÃO DOS
DADOS CLÍNICO-LABORATORIAIS
As avaliações clínico-laboratoriais, foram realizadas quinze dias
após a indução do diabetes e mensalmente, a partir de então, da seguinte forma:
- Os animais foram colocados em gaiolas metabólicas individuais,
durante 24 horas;
- Neste período foi fornecido volume conhecido de água e
quantidade conhecida de ração Nuvilab - CR1;
- Após este período os animais entraram em jejum de 12 horas;
- No final do período de jejum, os animais foram pesados e
avaliados os volumes, tanto de água ingerida (ml/24 hs), como de diurese (ml/24
hs);
- Coletadas amostras de 10 ml da urina de 24 horas para dosagem
de glicose urinária (mg %), seguida da realização de glicosúria e cetonúria;
- Coletadas amostras de 1,5 ml de sangue para dosagem da glicose
plasmática (mg %), cortando-se 0,2 mm da ponta da cauda de cada animal;
- Após a retirada do sangue, a cauda seccionada foi amarrada com
fio de algodão 2.0.
7.4. EXAMES BIOQUÍMICOS
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35
- Dosagem de glicose plasmática e urinária: realizadas,
respectivamente, no Laboratório Clínico do Departamento de Clínica Médica e
no Laboratório de Pesquisa Experimental do Departamento de Pediatria da
Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, sendo empregado o método da
Ortotoluidina (Dubowski, 1962).
- Pesquisa de glicose e de corpos cetônicos na urina: realizadas no
Laboratório de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental da Faculdade de
Medicina de Botucatu - UNESP, sendo empregadas fitas reagentes Gluketur-test
(Boëhringer Mannheim M.B. Bioquímica LTDA-RJ).
7.5. SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
Os animais foram colocados em cubas de vidro, e anestesiados
utilizando-se éter sulfúrico (Tecnion Indústria Química LTDA-RS), administrado
por via inalatória até a perda dos reflexos.
Após a anestesia, foi feita toracotomia, seguida de punção cardíaca
para obtenção de amostras de sangue destinadas aos exames laboratoriais. A
morte do animal ocorreu em função das alterações respiratórias, decorrentes da
toracotomia, e da hipovolemia aguda provocada pela aspiração do sangue
intracardíaco.
7.6 PREPARO DOS OLHOS PARA EXAME
MORFOLÓGICO
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36
7.6.1. Avaliação ultraestrutural
Após a enucleação, o olho esquerdo foi preparado para exame
ultraestrutural como segue:
- Fixação em glutaraldeído 2,5 %, em tampão fosfato 0,1 M, pH
7,3;
- Secção sagital do globo ao nível do equador, usando-se lâmina de
barbear;
- Dissecção do globo ocular, com auxílio de pinças, sob lupa (Karl
Zeiss) com aumento de 2,0 vezes;
- Separação das diversas estruturas oculares, com auxílio de 2
pinças delicadas;
- Recorte da área de estudo, em fragmentos de 3x1 mm, com
lâmina de barbear, sobre cera de dentista rosa, em gota de solução fixadora;
- Coleta dos fragmentos, por meio de pipetas, sendo os mesmos
recolocados em glutaraldeído 2,5 % por um período de 3 horas;
- Pós-fixação em ácido ósmico 1 % , em tampão fosfato 0,1M, pH
7,3;
- Desidratação em série crescente de acetonas (50, 70, 90 e 100%);
- Mergulho dos fragmentos em mistura acetona/Araldite por 12
horas;
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37
- Retirada dos fragmentos da mistura, e inclusão em bloco de resina
Araldite pura por 1 hora, em estufa a 37°C, sendo preparados 6 blocos de cada
local de estudo, de cada animal;
- Colocação em estufa a 60° C por 48 horas, para polimerização;
- Trimagem dos blocos, sob lupa, com auxílio de lâmina de barbear;
- Cortes semifinos, de 1/2 mícron, que foram colocados sobre
lâminas e corados com mistura de 1 : 1 de azul de metileno a 1 % e Azur II a 1 %
;
- Exame em microscópio óptico e escolha dos cortes semifinos
apropriados;
- Cortes ultrafinos (500 Angstrons), feitos a partir dos cortes
semifinos escolhidos;
- Exame em microscópio eletrônico de transmissão Philips EM 301
.
7.7. DOCUMENTACÃO FOTOGRÁFICA
Foram obtidas, ao microscópio eletrônico de transmissão,
micrografias das áreas de estudo. Para as eletromicrografias eletrônicas, foi
utilizando o filme Ektacrome Kodak. O papel fotográfico utilizado foi o
Kodacrome RC Print F3 Kodak.
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38
8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados referentes aos parâmetros clínicos e bioquímicos obtidos
no dia do sacrifício foram submetidos à análise estatística, utilizando-se a técnica
da Análise de Variância para o modelo com dois fatores (grupo e momento),
sendo o procedimento paramétrico, quando os dados apresentaram características
da distribuição normal de probabilidade e não paramétrico, na ausência destas
(Montgomery, 1991; Norman & Streiner, 1994).
Para apresentação dos resultados, considerou-se nas tabelas a
significância apontada com letras, sendo que duas letras iguais mostram não
significância e duas letras diferentes indicam diferença estatisticamente
significativa. As letras minúsculas comparam os grupos e as maiúsculas, os
momentos dentro de um mesmo grupo.
Para os resultados das medidas de espessura da membrana basal, foi
efetuada análise segundo delineamento inteiramente ao acaso com repetições
(ratos). Os tratamentos consistiam de uma arranjo fatorial 2 x 2 de Grupo e
Tempo. Além disso, em cada repetição foram feitas diversas medidas cujo
número é variável de rato para rato. Dessa forma, o experimento não tem um
teste exato como pode ser visto nas esperanças de quadrado médio (Expected
Mean Squares), onde a composição dos efeitos a serem testados, à parte do
componente do efeito em questão, não é exatamente a mesma do resíduo para o
teste estatístico rato (grupo*tempo). Sendo assim todos os teste são aproximados
(SAS Institute Inc., SAS OnlineDoc®, Version 8, Cary, NC: SAS Institute Inc., 1999).
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40
RESULTADOS
1. AVALIAÇÃO CLÍNICA
Os animais tiveram comportamento bastante diferente nos dois
grupos experimentais, sendo possível diferenciá-los pela simples observação do
aspecto clínico. Os ratos do GC eram mais ativos, limpos e tranqüilos que os
ratos diabéticos. Os do grupo GD, eram apáticos, possuíam alterações na
pelagem como queda de pelos, pelos eriçados, com pouco brilho, muitas vezes
com presença de pediculose, piodermites e com coloração amarelada devido ao
fato de que o rato não executava o ritual de limpeza, como o fazem os ratos
normais.
Os ratos do GD também tomavam mais água, apresentavam dor à
manipulação, urinavam mais e a urina possuía odor fétido. Além disso, cresciam
menos e eram mais magros que os do GC, principalmente nos meses iniciais de
seguimento.
Os ratos do GC dificilmente morreram espontaneamente durante o
seguimento. Já, os do GD morriam mais facilmente, principalmente no período
logo após a indução do diabetes ou no início do experimento. Observou-se,
ainda, que alguns animais do GD logo após a indução do diabetes ou no início do
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41
experimento apresentaram reversão do estado diabético espontaneamente. Nas
duas situações, estes animais foram desprezados e/ou substituídos.
2. PARÂMETROS CLÍNICOS
2.1. Peso
Comparando-se GC no M2 com GC no M3, os animais tiveram
média de peso semelhante nos dois momentos experimentais. Também os
animais do GD apresentaram média de peso semelhantes no M2 e no M3.
Os valores médios do peso de ratos do GC foram superiores aos do
GD no M2. Já no M3, os dois grupos apresentaram média de peso
estatisticamente semelhante, apesar do GC ter apresentado valor médio superior
ao GD (Tabela 1).
Tabela 1 - Média e desvio-padrão dos valores de peso (g) dos ratos dos dois
grupos experimentais, nos momentos de sacrifício e respectivos resultados do
teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
329,50 ± 21,91 b 314,03 ± 32,77 a
A A
GD
228,57 ± 29,97 a 264,16 ± 58,97 a
A A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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43
2.2. Diurese
Comparando-se os valores da Mediana de diurese dos animais do
GC, assim como os do GD, não houve diferença estatística significativa nos dois
momentos estudados.
A comparação dos animais do GC com os do GD, mostrou valores
muito superiores de diurese nos do GD, com diferença estatística significativa
nos dois momentos estudados (Tabela 2).
Tabela 2 – Mediana e semiamplitude total dos valores de diurese (ml/24hs) dos
ratos dos dois grupos experimentais, no dia do sacrifício e respectivos resultados
do teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
6,63 ± 3,75 a 5,75 ± 2,47 a
A A
GD
77,00 ±34,88 b 73,75 ± 20,38 b
A A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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44
2.3. Ingestão hídrica
Quando comparados animais de GC em M2 e M3 e de GD em M2
e M3, os valores médios de ingestão hídrica foram semelhantes em ambos os
grupos.
Porém, a comparação da ingestão hídrica dos animais do GD com
os do GC, mostrou valores bastante superiores no GD, nos dois momentos de
estudo (Tabela 3).
Tabela 3 - Média e desvio padrão dos valores de ingestão hídrica (ml/24hs) dos
ratos dos dois grupos experimentais, no dia do sacrifício e respectivos resultados
do teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
46,70 ± 9,07 a 27,93 ± 8,266 a
A A
GD
116,10 ± 31,56 b 98,89 ± 21,69 b
A A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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45
2.4. Ingestão alimentar
Quando comparados animais de GC em M2 e M3 e de GD em M2
e M3, os valores foram semelhantes.
Os animais do GD tiveram valores médios superiores de ingestão
alimentar quando comparados aos do GC, tanto em M2, como em M3. (Tabela
4).
Tabela 4 - Média e desvio padrão dos valores de ingestão alimentar (gramas) dos
ratos dos dois grupos experimentais, no dia do sacrifício e respectivos resultados
do teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
24,50 ± 6,03 a 12,25 ± 8,27 a
A A
GD
37,75 ± 10,98 b 25,29 ± 4,09 b
A A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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46
3. PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
3.1. Glicemia
A Mediana da glicemia dos animais do GC foi semelhante nos dois
momentos experimentais. A comparação dos valores medianos da glicemia nos
animais do GD mostrou que no M2 os valores foram superiores aos observados
no M3.
Comparando-se GC com GD em ambos os momentos
experimentais, os animais diabéticos apresentaram valores superiores aos do GC,
com diferença estatística significativa (Tabela 5).
Tabela 5 - Mediana e semiamplitude total dos valores da glicemia (mg%) dos
ratos dos dois grupos experimentais, nos momentos de sacrifício e respectivos
resultados do teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
114,75 ± 9,50 a 107,88 ± 10,00 a
A A
GD
514,33 ± 104,88 b 362,29 ± 63,44 b
B A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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47
3.2. Glicose urinária
A Mediana da glicose urinária dos animais do GC, assim como dos
do GD, foi semelhante nos dois momentos de estudo.
Comparando-se animais do GC com GD, os valores obtidos nos
animais do GD foram muito acima dos observados no GC, em ambos os
momentos experimentais (Tabela 6).
Tabela 6 - Mediana e semiamplitude total dos valores de glicose urinária (mg%)
dos ratos dos dois grupos experimentais, nos momentos de sacrifício e
respectivos resultados do teste estatístico.
GRUPO MOMENTO
M2 M3
GC
16,00 ± 3,13 a 25,00 ± 45,65 a
A A
GD
5658,75 ± 1980,59 b 5474,38 ± 2182,13 b
A A
GC= Grupo Controle GD= Grupo Diabético
M2 = 1 mês após M1 M3 = 12 meses após M1
Letras maiúsculas comparam momentos Letras minúsculas comparam grupos p<0,05
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48
4. AVALIAÇÃO ULTRA-ESTRUTURAL
4.1. Grupo controle
4.1.1. GC – M2
4.1.1.1. Íris (Figuras 5, 6 e 7).
Os vasos da íris foram observados distribuídos por todo o estroma.
Tratam-se, em geral, de arteríolas e vênulas, havendo também capilares. São
vasos de luz ampla, cujas paredes possuem muitas projeções, saliências e
reentrâncias, constituídas por células endoteliais, distribuídas em camada única, e
por pericitos, dispostos de forma circular e descontínua ao redor das células
endoteliais.
As células endoteliais são envoltas por MB, assim como também os
pericitos, havendo MB entre célula endotelial e pericito e entre o pericito e
células adjacentes. As arteríolas são revestidas por camada de células musculares,
também com sua respectiva MB.
Observaram-se algumas hemácias e granulócitos na luz de alguns
vasos.
Com relação ao conteúdo celular, observou-se que o núcleo das
células endoteliais são alongados, possuem contornos irregulares, contendo
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49
cromatina mais condensada próximo à carioteca, alguns contendo nucléolo
evidente.
O citoplasma das células endoteliais é mais abundante na região
próxima ao núcleo, contendo organelas como mitocôndrias redondas ou ovais,
ribossomos, retículo endoplasmático liso e rugoso, complexo de Golgi, vesículas
pinocitóticas e vacúolos de conteúdo eletron-transparente ou contendo “figuras
de mielina” e corpos densos. Em algumas células, observou-se centríolo.
Afastando-se da região do núcleo, a parede vascular é formada por
segmentos mais estreitos de células endoteliais, onde existe menor quantidade de
organelas citoplasmáticas.
As células endoteliais são unidas por junções íntimas ou
desmossomos, caracterizando os vasos da íris como não fenestrados.
Existem projeções citoplasmáticas das células endoteliais
semelhantes a dedos-de-luva em direção à luz vascular. As projeções
citoplasmáticas presentes na região de união entre células, são conhecidas por
projeções filopoidais. Algumas vezes, estas projeções estiveram unidas umas às
outras em suas porções mais extremas, dando a impressão de formações em arco.
Envolvendo as células endoteliais de forma descontínua existem os
pericitos que possuem núcleo de formato semelhante ao das células endoteliais,
assim como organelas citoplasmáticas semelhantes àquelas.
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50
Nas arteríolas maiores foram observadas as células musculares,
contendo miofibrilas e miofilamentos. Os miofilamentos estão dispostos, em
geral, próximo a MB. Vesículas pinocitóticas são mais numerosas no citoplasma
das células musculares, com localização preferencial próximo à MB.
Os capilares e as vênulas possuem paredes constituídas unicamente
por uma camada de células endoteliais e são distingüidos das arteríolas por
apresentarem estas últimas, o envoltório de células musculares.
Nas arteríolas maiores, as células musculares são também maiores,
além de existir mais de uma camada de células concentricamente dispostas.
Tanto as células musculares, como os fibroblastos, circundam os
vasos, mas não os envolvem totalmente e possuem maior concentração de
organelas citoplasmáticas na região próxima ao núcleo.
Ao redor dos vasos existe disposição concêntrica de fibras
colágenas e fibroblastos, formando a adventícia vascular, que é mais densa
próximo da parede vascular e torna-se mais frouxa mais externamente.
Próximo aos vasos pode-se observar, ainda, feixes nervosos
mielinizados e amielínicos.
4.1.1.2. Corpo Ciliar (Figuras 8, 9 e 10).
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51
Os vasos do corpo ciliar correspondem a capilares fenestrados,
compostos por várias células endoteliais dispostas em camada única. Em um
mesmo capilar, foram observadas fenestrações em algumas regiões, no local de
união entre duas células endoteliais e, em outras, desmossomos. Neste ponto
onde duas células endoteliais se "tocam", existem projeções digitiformes em
direção à luz vascular. Algumas vezes, as projeções digitiformes estiveram
“unidas”, formando figuras semelhantes a arcos. O núcleo das células endoteliais
é alongado, com condensação da cromatina próxima à carioteca e raramente foi
possível encontrar nucléolo. As estruturas citoplasmáticas estão concentradas
principalmente na região próxima ao núcleo e se constituem de aparelho de
Golgi, retículo endoplasmático liso e rugoso, mitocôndrias e inúmeras vesículas,
algumas na face mais próxima da membrana basal, algumas vesículas em
pinocitose.
Externamente às células endoteliais, freqüentemente observou-se
camada descontínua de pericitos. Em algumas regiões, os pericitos estiveram
ausentes. Em outras, havia mais do que uma camada de pericitos envolvendo os
vasos. O fator determinante para esta variação aparentemente foi o diâmetro dos
vasos, uma vez que vasos menores não possuem envoltório pericítico, e os
maiores possuem mais do que uma camada. Também aqui entre os pericitos e as
células endoteliais existem a MB da célula endotelial e a do pericito; entre o
pericito e o estroma existe a MB do pericito. Os pericitos possuem núcleo e
constituintes citoplasmáticos semelhantes aos das células endoteliais.
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52
4.1.1.3. Retina (Figuras 11, 12 e 13).
Os vasos sanguíneos retinianos são capilares do tipo contínuo,
estando as células endoteliais unidas umas às outras por meio de junções íntimas.
Próximo a esta união, há projeção em forma de “dedo de luva”, em direção à luz
vascular. As células endoteliais possuem outras projeções menores, em direção à
luz, não associadas à união intercelular.
As células endoteliais possuem núcleo alongado no sentido da luz
capilar, cromatina condensada, algumas com figuras de macropinocitose. Os
pericitos apresentam citoplasma rico em organelas, eventualmente com
fenômeno micropinocitose.
A MB endotelial está aposta às células gliais, não havendo espaços
perivasculares, apresentando, em algumas posições, intima relação com a MB do
pericito.
Hemácias, células granulocíticas e plaquetas são observadas em
alguns vasos.
4.1.2. GC – M3
4.1.2.1. Íris (Figura 14).
Os vasos irianos de ratos do GCM3 apresentaram a mesma
estrutura e organização celular que o observado no GCM2.
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53
Comparando-se animais de GCM2 com os do GCM3 foi possível
observar que os do GCM3 aparentemente apresentaram maior número de
vesículas citoplasmáticas e de corpos densos nas células endoteliais, nos
pericitos, nas células musculares e, também, nos fibroblastos.
As alterações observadas foram mais freqüentes nos pericitos, nas
células musculares e nos fibroblastos perivasculares. Nestas últimas células, foi
possível observar gotas lipídicas no citoplasma celular.
Principalmente nas arteríolas, observou-se espessamento da MB
das células endoteliais e dos pericitos. O espessamento da MB ocorreu de modo
não homogêneo.
4.1.2.2. Corpo ciliar (Figura 15).
Avaliando-se comparativamente os animais do GCM2 com os do
GCM3, observou-se maior quantidade de corpos densos e “figuras de mielina”
nas células endoteliais nos animais pertencentes ao GCM3.
Também nos pericitos, o GCM3 apresentou mais corpos densos e
lisossomos, que o GCM2.
A MB dos vasos estava mais espessada em relação aos ratos do
GCM2, de maneira não homogênea.
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54
4.1.2.3. Retina (Figura 16).
Comparando-se GCM2 com GCM3, verificamos núcleos com
dispersão de cromatina, gotas lipídicas no citoplasma, mitocôndrias edemaciadas,
acúmulo de glicogênio, corpos densos e lisossomos, vacúolos contendo “figuras
de mielina” e aumento do número de vesículas pinocitóticas. O citoplasma
pericítico mostrou-se mais desorganizado que o de células endoteliais, contendo
mitocôndrias “gigantes”, muitos corpos densos, vacúolos intracitoplasmáticos e
acúmulos de glicogênio. Alguns pericitos com intenso edema citoplasmático e
menor número de organelas também foram observados, podendo chegar à
desorganização e hialinização citoplasmática completa, ficando o compartimento
pericítico preservado, porém totalmente vazio.
4.2. Grupo diabético
4.2.1. GD – M2
4.2.1.1. Íris (Figuras 17 e 18).
Os vasos irianos de ratos do GDM2 apresentaram a mesma
estrutura e organização celular que o observado no GCM2.
Foram observadas nos animais deste grupo alterações semelhantes
e mais acentuadas que as existentes no GCM3, tais como aumento de corpos
densos e vesículas citoplasmáticas nas células endoteliais, pericitos, células
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55
musculares e também nos fibroblastos perivasculares. “Figuras de mielina” e
vacúolos eletron-lucentes também foram vistos nestes animais.
Além disso, as MBs estiveram mais espessadas nos animais deste
grupo. O espessamento ocorreu principalmente na parede de arteríolas, quando a
MB das células endoteliais, pericitos e também das células musculares foram
observadas espessadas, com redução ou ausência do espaçamento entre as
mesmas, havendo por vezes sinais de vacuolização da MB.
4.2.1.2. Corpo ciliar (Figuras 19 e 20).
Comparando-se o GDM2 com o GCM2, verificou-se que as células
endoteliais dos animais do GD apresentaram quantidade maior de estruturas
eletrondensas, vesículas e “figuras de mielina”.
Porém, as alterações mais importantes foram observadas nos
pericitos perivasculares, nos quais foram encontrados pericitos totalmente
preenchidos por corpos densos.
Houve espessamento das membranas basais do endotélio e também
do epitélio pigmentado. Muitas vezes o espaço entre o vaso e o epitélio
pigmentado esteve ausente e totalmente preenchido, em decorrência do
espessamento das membranas basais. Presença de regiões eletrontransparentes de
tamanhos e formas variadas na região das membranas basais espessadas. Em
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56
alguns locais, as membranas basais, tanto do endotélio vascular, quanto do
epitélio pigmentado, estiveram com aspecto semelhante ao GCM3.
As terminações nervosas amielínicas também apresentaram
aumento de corpos densos e de “figuras de mielina”, além de diminuição da
quantidade de neurotúbulos.
4.2.1.3. Retina (Figura 21).
Os animais diabéticos apresentaram alterações evidentes da MB,
com espessamento não homogêneo, mais acentuado na membrana basal externa
(MBE) que reveste os pericitos e nos locais próximos à união entre MBE e
membrana basal interna (MBI). Os acúmulos osmiofílicos no GD foram
observados a partir de M2, sendo mais freqüentes e mais grosseiros que nos
animais do GCM3. As projeções da MBE em direção a células vizinhas
ocorreram, no GD, já em animais de M2 e foram mais freqüentes que no GC.
No lúmen dos vasos observaram-se hemácias, células
granulocíticas e plaquetas.
4.2.2. GD – M3
4.2.2.1. Íris (Figura 22 e 23).
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57
Os vasos irianos de ratos do GDM3 apresentaram a mesma
estrutura e organização celular que a observada no GCM2.
As alterações observadas nos animais de GDM3 foram semelhantes
às observadas no GDM2, porém, com maior intensidade. Assim também nestes
animais foi observado acúmulo de vesículas e de corpos densos, “figuras de
mielina” e vacúolos eletron-lucentes, ocorrendo nas células endoteliais, nos
pericitos, nas células musculares e nos fibroblastos perivasculares.
Muitas vezes, os pericitos apresentaram o compartimento celular
preservado, porém com as organelas totalmente alteradas, reconhecendo-se as
"figuras de mielina" e os corpos densos. Algumas células musculares e alguns
fibroblastos perivasculares também foram visibilizados como contendo organelas
totalmente desestruturadas.
As alterações mais importantes ocorreram nas arteríolas, assim
como o foi observado no GDM2.
Principalmente nas arteríolas, mas ocorrendo também nos capilares,
foi possível observar espessamento da MB das células endoteliais. O
espessamento não foi homogêneo, por vezes, o espaço entre a célula endotelial e
a muscular esteve "preenchido" pela MB espessa. Observou-se também,
vacuolização ou cavitação da MB, principalmente nos lugares onde a mesma
encontrava-se mais espessada.
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58
4.2.2.2. Corpo ciliar (Figuras 24).
Comparando-se o GD no M2 e no M3, observou-se que os animais
do GDM3 apresentaram maior quantidade de corpos densos, vesículas
citoplasmáticas e vacúolos de conteúdo eletrontransparente, ou contendo “figuras
de mielina”, além de mitocôndrias edemaciadas, tanto em células endoteliais
como nos pericitos. Observou-se, ainda, rarefação citoplasmática também nas
células endoteliais e nos pericitos.
Os fibroblastos, assim como os feixes nervosos perivasculares,
também apresentaram aumento dos corpos densos.
A MB do epitélio pigmentar mostrou-se mais espessada que a MB
dos vasos, com as mesmas características que foram observadas no GDM2.
4.2.2.3. Retina (Figura 25 e 26).
Os espaços eletrontransparentes, observados apenas raramente no
GCM3, foram observados mais freqüentemente no GD, principalmente no
GDM3.
Na região perivascular foram evidentes as alterações em
prolongamentos citoplasmáticos de células adjacentes, tais como, edema,
acúmulo de corpos residuais, lisossomos, granulações eletrondensas e glicogênio,
principalmente em animais de M3.
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59
Em M3, observou-se alguns vasos totalmente preenchidos por
debris celulares.
5. ANÁLISE MORFOMÉTRICA DA ESPESSURA DA
MEMBRANA BASAL
Verificando os resultados obtidos na análise estatística, foi possível
observar:
1) Na íris houve efeito significativo de grupos, ou seja, a espessura da MB
foi maior no grupo de ratos diabéticos (Tabelas 7a, 7b e 7c).
2) No corpo ciliar ocorreu efeito da interação, tendo se observado que no
grupo normal a espessura da MB aumentou com a idade, enquanto no
diabético não, uma vez que já em M2 a MB já se encontrava espessada
(Tabelas 8a, 8b e 8c).
3) Na retina não foi detectada diferença estatística entre os grupos ou entre
momentos, ou seja, a espessura da MB não se alterou em decorrência da
idade em ambos ou da presença ou não do diabetes. (Tabelas 9a, 9b e 9c).
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60
Tabela 7a - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da íris de ratos diabéticos e
normais,em mm.
Grupo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético 3.36 0.34
<.0001 *
Normal 1.28 0.23 0.0004
Tabela 7b - Média do quadrado mínimo comparativa entre momentos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da íris de ratos diabéticos e
normais, em mm.
Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
M2 2.22 0.27 <.0001
M3 2.42 0.31 <.0001
Tabela 7c - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos e momentos, com os respectivos
erros-padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da íris de ratos diabéticos
e normais, em mm.
Grupo Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético M2 3.14 0.44 <.0001
Diabético M3 3.58 0.53 <.0001
Normal M2 1.30 0.33 0.0032
Normal M3 1.26 0.33 0.0043
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61
Tabela 8a - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos do corpo ciliar de ratos
diabéticos e normais, em mm.
Grupo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético 2.50 0.26 <.0001
Normal 2.02 0.27 <.0001
Tabela 8b - Média do quadrado mínimo comparativa entre momentos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos do corpo ciliar de ratos
diabéticos e normais, em mm.
Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
M2 2.07 0.27 <.0001
M3 2.45 0.26 <.0001
Tabela 8c - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos e momentos, com os respectivos
erros-padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos do corpo ciliar de ratos
diabéticos e normais, em mm.
Grupo Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético M2 2.82 0.38 <.0001
Diabético M3 2.18 0.34 <.0001
Normal M2 1.31 0.39 0.0057
Normal M3 2.73 0.38
<.0001 *
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62
Tabela 9a - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da retina de ratos diabéticos e
normais, em mm.
Grupo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético 2.94 0.27 <.0001
Normal 2.92 0.24 <.0001
Tabela 9b - Média do quadrado mínimo comparativa entre momentos, com os respectivos erros-
padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da retina de ratos diabéticos e
normais, em mm.
Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
M2 2.81 0.24 <.0001
M3 3.06 0.27 <.0001
Tabela 9c - Média do quadrado mínimo comparativa entre grupos e momentos, com os respectivos
erros-padrão para as medidas da espessura da membrana basal de vasos da retina de ratos
diabéticos e normais, em mm.
Grupo Tempo
Espessura
Média
Erro-Padrão Pr > |t|
Diabético M2 3.02 0.35 <.0001
Diabético M3 2.86 0.42 <.0001
Normal M2 2.60 0.34 <.0001
Normal M3 3.25 0.34 <.0001
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64
FIGURAS
Figura 5: Vaso da íris de rato normal em M2. Célula endotelial (e) com
núcleo alongado (N) e citoplasma contendo mitocôndrias, ribossomos,
retículo endoplasmático, complexo de Golgi, vesículas pinocitóticas e
vacúolos eletron-transparentes (*) e corpos densos (Θ). Pericitos (p)
dispostos de forma circular e descontínua ao redor das células endoteliais.
Projeções citoplasmáticas das células endoteliais em formações em arco em
direção à luz vascular. Hemácea (H) na luz vascular (ME-2900X5).
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65
Figura 6: Vaso da íris de rato normal em M2. Membrana basal (→ ) ao
redor de células endoteliais. União entre células endoteliais (→ branca).
Projeção filopoidal (f). Núcleo (N). Pericito (p) contendo mitocôndrias
(m),corpo denso (Θ) e vacúolos de conteúdo eletron-transparentes(*). Feixe
nervoso amielínico (n) (ME-2900X5).
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66
Figura 7: Vaso da íris de rato normal em M2. Os componentes
citoplasmáticos das células endoteliais são mais presentes na região
próxima ao núcleo. Mitocôndria (m). Corpo denso (Θ). Membrana basal
(→ ) externamente à parede vascular. Pericito (p). Fibras colágenas
longitudinais ou transversais e fibroblastos no estroma (F). (ME-2900X5).
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68
Figura 9: Vaso do corpo ciliar de rato normal em M2. Observar
organelas nas células endoteliais, como retículo endoplasmático,
mitocôndrias(m), complexo de Golgi e poucos corpos densos (Θ).
Projeções digitiformes em direção à luz vascular (→ ).Membrana Basal (⇒ ).
Pericito (p) e respectiva membrana basal (⇒ branca). Fibroblastos (F) (ME-
4200X5).
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69
Figura 10: Vaso do corpo ciliar de rato normal em M2. Células
endoteliais com inúmeras vesículas citoplasmáticas (*). Golgi (G).
Observar detalhe da membrana basal (→ ) da célula endotelial (e) e
membrana basal (⇒ ) do pericito (p). Fibroblasto (F). União entre células
endoteliais(♦)(ME-4200X5).
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70
Figura 11: Vaso retiniano de rato normal em M2. Células endoteliais (e)
unidas por junções íntimas (♦), contendo núcleo (N) alongado e com
cromatina próxima a carioteca. Pericito (p). Membrana basal (⇒ ) .Projeções
endoteliais (→ ) em direção a luz vascular (L) (ME-3400X5).
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72
Figura 13: Vaso retiniano de rato normal em M2. Detalhe do núcleo (N)
de pericito e citoplasma rico em retículo endoplasmático liso e rugoso.
Figuras de macropinocitose em célula endotelial (→ ) e micropinocitose em
célula pericítica (⇐ ) (ME-3400X5).
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75
Figura 16: Vaso da retina de rato normal em M3. Células endoteliais
com mitocôndrias (m) edemaciadas, corpos densos (Θ) e aumento do
número de vesículas pinocitóticas (v). As alterações são mais evidentes nos
pericitos que apresentam desorganização de organelas, aumento de
vesículas citoplasmáticas e de vacúolos (*) . A membrana basal parece
espessada(ME-3400X5).
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77
Figura 18: Vaso da íris de rato diabético em M2. Observar aumento de
corpos densos e vesículas citoplasmáticas no citoplasma de células
endoteliais, pericitos e nos fibroblastos. Membrana basal mais espessa e
com sinais de vacuolização (→ ). Gota lipídica (L) (ME-2900X5).
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85
Figura 26: Vaso retiniano de rato diabético em M3. As células
endoteliais possuem aumento de corpos densos (seta) e de vesículas (v).
Mitocôndria (m). É notável a alteração citoplasmática que ocorre nos
pericitos, onde não é possível identificar organelas citoplasmáticas, exceto
pela presença de vacúolos (*) e vesículas. Membrana Basal espessa (ME-
3400X5).
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87
DISCUSSÃO
1- Modelo experimental e análises clínicas e
bioquímicas.
Os modelos experimentais ajudam no entendimento fisiopatogênico
de doenças, sendo muito úteis para o estudo do diabetes. Alguns animais
desenvolvem alterações que não são idênticas às que ocorrem no homem, como
os ratos (64, 83, 110, 111), ou desenvolvem lesões morfologicamente idênticas,
como os cães (83, 112). Entretanto, nestes últimos, o tempo de evolução das
alterações é muito longo, o que dificulta a sua utilização, acrescendo-se o fato de
que estes animais atualmente estão com uso em experimentação extremamente
questionáveis.
Tendo em vista a dificuldade de manuseio e os custos de uma
pesquisa muito prolongada, além de fatores como: fácil manuseio (alimentação,
higiene e acomodação); ciclo biológico curto, o que permite obtenção de
alterações crônicas e degenerativas em pouco tempo; utilização de pouco espaço,
possibilitando o trabalho simultâneo com vários grupos experimentais;
desenvolvimento de alterações retinianas do diabetes com pouco tempo de
indução, os ratos têm sido largamente utilizados como modelos para diabetes
experimental e muitos estudos utilizam o rato como animal de experimentação
para avaliação de alterações decorrentes do diabetes.
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88
Acresce-se a estes fatores, o fato de Arthur Roquete de Macedo ter
desenvolvido na Faculdade de Medicina de Botucatu, o diabetes experimental em
rato Wistar, de forma semelhante à Orloff (1975)(113), incentivando o
desenvolvimento de projetos de pesquisa nesta linha. Desde 1986, foi formado
um grupo de estudos nesta Instituição, para estudo dos efeitos do diabetes sobre o
organismo como um todo, grupo ativo até a data atual, já tendo sido publicados
inúmeros trabalhos utilizando o mesmo modelo experimental, o que determinou
um bom domínio das técnicas (64, 114-119), sendo totalmente padronizado o
modo de indução, assim como os cuidados a serem tomados para que a pesquisa
seja válida.
Utiliza-se, neste modelo, a Aloxana, um derivado do ácido úrico
que destrói as células beta do pâncreas, provocando diabete do tipo 1, insulino
dependente, de longa duração em muitas espécies de animais (120). Apesar de
críticas quanto ao uso desta droga, a grande experiência do grupo, além do menor
custo em relação aos outros métodos, como a Estreptozotocina (121), fizeram
com que não fossem efetuadas alterações no modelo original. Acresce-se a este
facilitador, o fato de que a Aloxana é ainda bastante utilizada em estudos
experimentais na área oftalmológica e não oftalmológica até os dias atuais (122-
124).
Tendo por base os estudos já concluídos, foram seguidos os
mesmos passos quanto às diversas variáveis no uso da Aloxana: dose a ser
utilizada, modo de emprego, necessidade de jejum antes da sua aplicação, via a
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89
ser utilizada para a injeção, sistema idealizado para a aplicação, além do
acompanhamento dos animais durante o estudo (114-119).
Estes estudos mostraram, também, que existe a necessidade de
controles clínicos e bioquímicos para o acompanhamento dos animais, uma vez
que, após a injeção da droga, são várias as possibilidades: o não desenvolvimento
do diabetes, a morte por doença extremamente grave e o desenvolvimento da
doença diabética por certo período, principalmente períodos próximos à indução,
com a posterior regressão espontânea do estado diabético (118). Assim, os
parâmetros do seguimento são extremamente importantes para assegurar que
realmente os animais estudados são portadores de diabetes e que a doença
persiste grave ao longo de todo o período experimental (114-119).
O óbito ocorre por descompensações importantes do metabolismo,
tendo sido verificada uma taxa de 38,9% até o 14º dia após a indução do diabete
segundo Spadella (118), que observou óbito em 38,9% dos animais até o 14º dia
após a indução da doença.
Pela possibilidade de óbito dos animais após a indução da doença e
também pela possibilidade de reversão do estado diabético ao longo do tempo, é
conduta do grupo de estudo do diabetes experimental da Faculdade de Medicina
de Botucatu, realizar a indução da doença em número sempre superior ao que se
pretende estudar, visando à reposição dos animais. Com isto, evita-se o risco de
uma amostra não representativa, optando-se por ter os grupos com o mesmo
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90
número de participantes até o final do experimento, realizando a reposição dos
animais que, por qualquer motivo, não satisfaçam os parâmetros necessários.
A expectativa de vida do rato hígido é de 3 anos. Quando eles se
tornam diabéticos, torna-se difícil mantê-los vivos por mais que um ano e meio
(112). Neste modelo, os animais iniciam com 3 meses de vida, devido à
necessidade de se ter animais pós-desmame e também porque ratos com menos
do que 200 a 300 gramas de peso corporal são muito sensíveis à injeção da
Aloxana e a taxa de óbito poderia ser mais elevada.
Pelo nosso protocolo, os animais são observados em três
momentos, dentro de um período de 12 meses e 15 dias. A primeira observação
(M1) foi 15 dias após a indução do diabetes pela Aloxana, período necessário
para confirmação da instalação do quadro de diabetes grave (64, 118).
A segunda observação foi em M2, quando 5 animais dos grupos
GC e GD foram sacrificados, 1 mês após a instalação do quadro de diabetes
grave, com o intuito de analisar as alterações iniciais do diabetes nos vasos. Este
período está baseado em Caldwell et al. (125), que encontraram alterações em
olhos de ratos diabéticos três semanas após a indução do diabetes experimental.
A terceira observação ocorreu em M3, onde os animais dos GC e
GD foram sacrificados após 12 meses de M1, tempo este suficiente para produzir
alterações crônicas significativas secundárias ao diabetes induzido
experimentalmente (64, 126).
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91
O aspecto geral dos animais diabéticos foi bastante diferente dos
animais do grupo controle, com piora no decorrer do acompanhamento, sendo
estes aspectos clínicos observados, compatíveis com diabetes grave (64, 118).
Quanto ao peso dos animais do grupo controle, observou-se que
não houve variações durante o período de acompanhamento, o que era esperado,
uma vez que os animais estavam saudáveis. Já, os animais diabéticos,
apresentaram médias de peso inferiores ao grupo de animais normais nos dois
momentos estudados. Entretanto, em M2, apresentaram-se com peso
acentuadamente reduzido, com diferença estatisticamente significativa em
relação ao grupo controle. Este fato é similar à evolução clínica em humanos e
também a dados da literatura que mostram perda aguda e acentuada de peso no
início do desenvolvimento do diabetes (127). Em M3, não foram encontradas
diferenças significativas entre as médias de peso dos dois grupos. Neste
momento os animais, apesar do catabolismo acentuado próprio do diabetes,
poderiam estar em fase de melhor equilíbrio metabólico que na fase aguda, pelo
próprio tempo de evolução da doença (113, 118, 119, 128-133).
Os animais dos grupos-controle mantiveram valores de glicemia
compatíveis com dados da literatura sobre animais normais da mesma espécie
(113, 116, 129, 134, 135). Nos animais dos grupos diabéticos, tanto a glicemia,
quanto a glicose urinária estiveram acima dos valores observados nos animais do
grupo controle, nos três momentos de observação, o que foi importante,
juntamente com as manifestações clínicas, para caracterizar o quadro diabético
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92
desencadeado e mantido ao longo do experimento (8, 136). Os valores de
glicemia nos animais diabéticos, estiveram acentuadamente elevados no início do
experimento, lembrando que e flutuações glicêmicas podem ocorrer por vários
fatores, ligados a estresse, ingestão alimentar, entre outros. A glicosúria, que
também ocorre com freqüência no diabetes (8, 127), ocorreu de forma ainda mais
acentuada, pois a Aloxana é, por si só, nefrotóxica. (87).
2- Avaliação ultra-estrutural
Os vasos da íris, corpo ciliar e retina dos ratos, nos grupos
estudados, apresentaram distribuição das camadas celulares e organelas
semelhantes às descritas para os olhos humanos (137).
Tanto a estrutura dos vasos, formados por camada única de células
endoteliais, revestidos por pericitos e adventícia perivascular, como as organelas
citoplasmáticas contidas nas células endoteliais e pericíticas, foram similares nos
vasos da íris, corpo ciliar e retina. Esta observação foi válida para os animais
normais e diabéticos, nos dois momentos experimentais.
As células endoteliais dos vasos dos ratos mostraram características
semelhantes na íris, no corpo ciliar e na retina, assim como observado também
em células endoteliais de outras localizações do olho (64, 93, 138).
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93
Entretanto, algumas pequenas características diferenciam os vasos
destas três regiões de estudo. As diferenças, sem dúvida, estão relacionadas com
a função das estruturas. Assim, a íris, por ser o “diafragma” do olho, precisa ser
formada por tecido que possa ser sujeito a grande movimentação, ou que permita
alterações da forma, fato que ocasiona a grande quantidade de saliências e
reentrâncias observadas na parede dos vasos, comparativamente com os vasos
retinianos e do corpo ciliar (93, 137). Devido à movimentação grande dos tecidos
irianos, o estroma é frouxo, com a adventícia vascular também acompanhando
este padrão. Por outro lado, os vasos retinianos possuem como característica não
terem espaços na região perivascular, estando sempre envoltos por células
retinianas.
A característica mais marcante que diferencia os vasos das três
regiões seria a união entre as células endoteliais. Foram observados, na íris, vasos
não fenestrados, assim como os vasos da retina. Ao contrário do que ocorre na
coróide (138) e no corpo ciliar (93), onde os vasos não possuem uniões selantes
entre as células endoteliais. Estes detalhes estabelecem que haja profundas
diferenças na função e atividade dos vasos destas regiões estudadas, ou seja, onde
existem junções selantes, as trocas devem ocorrer por transporte
transcitoplasmático. Ao passo que nos que possuem junções não selantes, a
passagem pode se dar através dos espaços existentes na parede vascular,
mecanismo que existe no corpo ciliar e que está envolvido na produção do humor
aquoso (139).
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94
Interessante observar as projeções citoplasmáticas em direção à luz
vascular, já descritas anteriormente (92), presentes não só na íris, mas também na
coróide e na retina. Uma das possíveis origens para estas projeções seriam pregas
digitiformes unidas por seus ápices e que podem dar origem à macropinocitose
(92, 93).
De modo geral todos os vasos estudados são ricos em organelas
citoplasmáticas, motivo do intenso gasto de energia que ocorre nos tecidos
oculares.
Desta forma, alguma doença que interfira no metabolismo, como o
diabetes, pode levar a profundas alterações na parede vascular.
Assim, já é conhecido que, com efeito, as alterações do diabetes
ocorrem em toda a microvasculatura ocular (140). Nos vasos não fenestrados,
como os da íris e retina, a ruptura das junções celulares, gera complicações do
diabetes, como o edema macular retiniano (141-143).
Observou-se neste estudo, como já foi descrito anteriormente no diabetes,
algumas alterações comuns aos três grupos de vasos, como: aumento na
vacuolização citoplasmática, alterações degenerativas do pericito, espessamento
da membrana basal, degeneração de organelas, com desestruturação completa
nos casos mais avançados (144).
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95
As vesículas citoplasmáticas são relacionadas ao transporte de
substâncias seguindo a via transcitoplasmática. O aumento do número de
vesículas implica em maior utilização deste meio de transporte nos vasos de
animais do GN em M3 e nos animais do grupo diabético, principalmente nos
animais do GDM3. Estas alterações se repetiram nos três grupos vasculares.
Portanto, a variação da quantidade de vesículas pode estar relacionada tanto ao
processo de senilidade, quanto às alterações degenerativas decorrentes da doença
diabética. Já haviam sido observadas na íris e no corpo ciliar, alterações nas
vesículas (90, 92, 93), similares às observadas neste estudo.
Também foi verificado nos animais do GNM3 e nos animais do
GD, estruturas elétron-densas em maior quantidade. Foi aqui utilizada esta
denominação de estrutura elétron-densa para estruturas que poderiam
corresponder a lisossomos ou corpos densos e foi preferida esta nomenclatura,
uma vez que não se fez a identificação dos vacúolos digestivos.
As chamadas “figuras de mielina” se referiram aos detritos
celulares que estão dentro do citoplasma celular e que, provavelmente, são
originários de morte de organelas que estão em degradação. Os vacúolos
identificados muitas vezes estiveram, também, opticamente vazios.
Todos estes eventos podem representar morte de organelas, que
estão sendo removidas do citoplasma. Este aumento de corpos densos foi
caracteristicamente observado em animais idosos (M3) e diabéticos, tendo sido
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96
descrito anteriormente nas células irianas (50, 90), nas células endoteliais da
retina (64), da coróide (138) e do corpo ciliar (93) de ratos diabéticos aloxânicos.
Todas as alterações citoplasmáticas observadas nas células
endoteliais, ocorreram também nos pericitos, com intensidade mais acentuada
nestes últimos, em todos os grupos de vasos e nos dois momentos de observação.
Os pericitos são estruturas cuja função provável está relacionada ao controle do
fluxo sanguíneo, possuindo função de suporte, auxiliando na contração da parede
vascular e com participação na fagocitose (145-147).
Anteriormente já foram verificadas acentuadas alterações em pericitos
retinianos de ratos diabéticos, quando os mesmos mantiveram apenas o seu
envoltório e tiveram as organelas todas destruídas, tendo sido chamados de
“pericitos fantasmas” (64, 148, 149). Alterações similares também já foram
descritas em pericitos do corpo ciliar que, apresentaram-se mais alterados do que
o próprio endotélio vascular (93) e igualmente nos vasos irianos (90).
Portanto, foi possível observar que os pericitos estão sujeitos a profundas
alterações em decorrência do estado diabético e que estas alterações ocorrem
tanto nos vasos irianos, como no corpo ciliar e na retina, fazendo supor que os
vasos diabéticos tenham perda do seu tônus, produzindo lentidão de escoamento
vascular, assim como fraqueza na parede dos vasos. Estas alterações
morfológicas levam a suposição de alterações hemodinâmicas.
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97
A literatura suporta esta idéia. Acredita-se que a origem das alterações
vasculares diabéticas esteja relacionada a fatores metabólicos e hemodinâmicos,
que interagem e estimulam fatores de crescimento e citocinas. Fatores de
crescimento endotelial, como o fator R-2, são responsáveis pelo acúmulo de
matriz extracelular que ocorre nos vasos. Há perda da elasticidade vascular,
espessamento da parede e redução acentuada do fluxo sanguíneo. Cita-se que
rigoroso controle metabólico protegeria parcialmente contra este dano vascular
(150, 151).
Ressalta-se a não observância de microaneurismas na parede vascular de
ratos diabéticos em nenhum dos três sítios de estudo, ou seja, não foram
observados microaneurismas em vasos da íris, corpo ciliar e retina.
Os microaneurismas estão presentes e são achados constante na retinopatia
diabética em humanos (152, 153). Os vasos da coróide também desenvolvem
microaneurismas em humanos (154). Entretanto, os vasos da íris e corpo ciliar
não figuram entre os possíveis sítios de desenvolvimento desta afecção.
Já, nos olhos de roedores diabéticos, os microaneurismas não foram
anteriormente descritos (64).
O maior achado anatômico no diabetes de longa evolução é o
espessamento da íntima das arteríolas menores, primariamente por acúmulo de
colágeno do tipo IV(relacionado com a membrana basal), o que compromete o
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98
fluxo sanguíneo periférico. Este fenômeno ocorre unânime e precocemente no
DM, e é muito reproduzido em estudos experimentais (150, 151).
Desta forma, a maioria dos estudos morfológicos que versam sobre
diabetes, estão relacionados com o espessamento da MB que parece preceder
outras alterações, inclusive as perdas de pericitos (83).
Mesmo quando se avalia lesões que ocorrem precocemente em
decorrência do estado diabético, o espessamento da MB é tido como evidente
(78, 155, 156).
O modelo experimental utilizado no presente estudo também reproduziu o
espessamento da membrana basal vascular, observado tanto ao redor das células
endoteliais, como dos pericitos.
A causa do espessamento da MB ainda não é totalmente conhecida.
Entretanto, sabe-se que o espessamento provoca alteração da função celular e/ou
da difusão de oxigênio e reduz o contato entre os pericitos e a célula endotelial,
contribuindo para as alterações vasculares dos diabéticos (151).
O acúmulo de detritos celulares por lesão diabética, poderia ser um dos
fatores de origem deste espessamento e já foram verificados acúmulos de
material PAS positivo nas paredes vasculares, com espessamento progressivo da
MB (50). E também neste sentido, o presente estudo pode dar uma contribuição
para o esclarecimento do espessamento da MB, quando foi possível observar nos
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ratos diabéticos mais velhos a presença de material osmiofílico na MB que
poderia ser resultado de depósitos de detritos.
Outros estudos sugerem que fatores metabólicos podem originar o
espessamento da MB, sendo utilizados medicamentos que, de acordo com os
resultados observados, são capazes de reduzir seu surgimento nos animais
diabéticos, em vasos renais, com uso de uma droga inibidora do receptor da
Angiotensina II, o Losartan (157). Estudos na aorta, com o uso de perindopril,
um inibidor da enzima conversora de angiotensina, mostraram redução nos níveis
de endotelina 1 plasmática, e efeito protetor sobre a célula endotelial em animais
diabéticos (158). Ou seja, já são conhecidos alguns medicamentos que podem
prevenir o espessamento da MB em grandes vasos. Pelas diferenças enormes que
existem entre pequenos e grandes vasos, haveria necessidade de se desenvolver
estudos experimentais para avaliação destas drogas sobre os capilares oculares.
Interessante o encontro de vacuolização da MB nos vasos dos
animais do presente estudo. Ou seja, além do espessamento da MB,
espessamento da MB, alterações outras como algumas áreas de vacuolização,
foram observadas a partir do GC em M3. Este encontro, pela análise qualitativa
realizada, foi mais acentuado nos animais do GD em M2 e GD em M3. A
explicação para este fato poderia ser que o diabetes está mais relacionado a este
fenômeno. Outra hipótese seria que alterações involutivas poderiam ser
agravadas e ocorrerem mais precocemente no diabetes (50). A ligação da
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100
vacuolização da MB com a senilidade já foi apontada por outros autores em
humanos (137) e também em ratos diabéticos (64).
Outra importante observação foi o fato do espessamento da MB
ter sido não homogêneo, nos três grupos de vasos e nos dois momentos de
avaliação e a este fato voltaremos mais adiante.
A avaliação morfométrica da MB, mostrou que houve aumento
significativo da espessura da MB apenas nos vasos irianos, não ocorrendo o
mesmo nos vasos do corpo ciliar e da retina, apesar dos valores médios
observados terem sido sempre maiores nos animais mais velhos e diabéticos.
A não homogeneidade do espessamento da MB pode ser um dos fatores
que interferiram no resultado de não significância. Tal fato já impossibilitou
outros autores de efetuarem a morfometria por outros métodos, tanto nos vasos
irianos, como nos do corpo ciliar (90, 93).
Avaliações quantitativas já haviam sido efetuadas em vasos retinianos,
mostrando que o espessamento ocorre em ratos diabéticos (64).
Yanof(78) também relatou o espessamento difuso em olhos humanos
cegos, provenientes de indivíduos diabéticos, ocorrendo também em idosos não
diabéticos, de maneira não homogênea, fragmentada e irregular.
Desta forma, há evidências de que o espessamento da MB seja freqüente
em olhos diabéticos. Porém, ocorre de maneira não homogênea. Devido ao fato
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da heterogeneidade de ocorrência, a análise morfométrica poderia ter gerado
dados de não significância estatística.
Outro fator poderia ser relacionado à metodologia aqui empregada. O
método do AutoCad nos pareceu bastante adequado, permitindo estabelecer
medidas não tendenciosas, com avaliação aleatória de vasos. Entretanto, devido à
necessidade de se ter como os locais de avaliação o cruzamento completo das
linhas do quadriculado com a MB, o número de observações variou de um
animal para outro, dependendo do formato, tamanho e local de corte de cada vaso
avaliado. Ou seja, podem haver quantidades maiores ou menores de medidas de
determinado animal cujos valores interfiram na média. Como não foi o objetivo
do presente estudo verificar a variação entre os ratos, todas as medidas foram
analisadas conjuntamente, sendo interessante em estudos futuros, uma melhor
apuração nestes valores, eventualmente rato a rato.
Interessante notar que nos vasos irianos houve espessamento da MB com
significância estatística. Porém, nos vasos do corpo ciliar e retina não. Este
achado é de difícil explicação. Na realidade, a avaliação mais trabalhosa foi
justamente a feita nos vasos da íris, pela existência de tantas Saliências e
reentrâncias que existe na parede dos vasos desta região. A primeira hipótese
poderia ser que há maior chance de erro neste tipo de avaliação, o que não se
confirma pela observação dos desvios-padrão, que foram semelhantes em todos
os grupos, denotando que as medidas foram homogêneas.
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As análises morfométricas devem sempre ser buscadas. Poderiam ser
realizadas também para outros eventos que ocorreram aqui neste estudo,como
para avaliação da quantidade de vesículas citoplasmáticas ou de corpos densos.
Entretanto, quando se trata de microscopia eletrônica, são estudos extremamente
complexos. Ainda, mesmo que efetuados com rigor científico podem não trazer a
realidade do que se passa no nível celular, uma vez que as alterações bioquímicas
antecedem em muito as alterações morfológicas.
Assim, valorizando as observações ultra-estruturais, pode-se inferir que
alterações vasculares relacionadas com a doença diabética são importantes.
Ocorrem nos vasos da íris, do corpo ciliar e da retina. Afetam as células
endoteliais e pericíticas, levando ao aumento de vesículas, corpos densos e ao
espessamento não homogêneo da MB.
Novos estudos devem ser providenciados procurando outros meios de
quantificar os achados.
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CONCLUSÕES
Frente às condições experimentais empregadas e aos resultados
obtidos pode-se concluir que:
Ø Os animais diabéticos diferiram dos animais normais quanto à avaliação
ultra-estrutural dos vasos da íris, corpo ciliar e retina, demonstrando que o
estado diabético provoca alterações vasculares nestas localizações.
Ø Há evidentes alterações ultra-estruturais na membrana basal de células
endoteliais e pericíticas nos três tipos de vasos estudados. O espessamento
da membrana basal é mais evidente em animais diabéticos, apesar da
avaliação morfométrica comprovar este achado apenas nos vasos irianos.
Ø Os vasos dos animais normais de 12 meses diferiram dos de um mês,
podendo-se sugerir que as alterações observadas sejam decorrentes de
processo involutivo.
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106
REFERÊNCIAS
1. Waife So. Definition and Diagnosis of Diabetes. In: ___ Diabetes Mellitus 7 ed.
1967;1:1 -11.
2. Bennett Ph. Definition, Diagnosis, and Classification of Diabetes Mellitus and
Impaired Glucose Tolerance. In: KAHN, CR, WEIR, GC (Eds)Joslin's diabetes
mellitus. 1994;13.ed:193-200.
3. Alberti Kg, Zimmet Pz. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus and Its Complications. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus, Provisional Report of a Who Consultation. Diabet Med. 1998;15:539-53.
4. Craitoiu S, Mocanu C, Olaru C, Rodica M. Retinal Vascular Lesions in Diabetic
Retinopathy. Oftalmologia. 2005;49(1):82-7.
5. Felig P, Bergman M. The Endocrine Pancreas: Diabetes Mellitus. In: FELIG, P,
BAXTER, JD, FROHMAN, LA (Eds) Endocrinology and metabolism. 1995:1107-250.
6. Nelson Lb, Martyn Lj. In Metabolic Diseases Affecting the Eye. In: TASMAN,
W, JAEGER, EA (Eds) Duane's foundations of clinical ophthalmology. 1998;54.
7. Foster Dw. Diabetes Melito. 14 ed. FAUCI AS, BRAUNWALD, E.,
ISSELBACHER, K.J., editor. Rio de Janeiro: Mc Graw Hill Interamericana do Brasil;
1998.
8. Sherwin Rs. Diabetes Mellitus. GOLDMAN L, BENNETT, J.C., editor.; 2000.
9. Pietryga M, Biczysko W, Wender-Ozegowska E, Brazert J, Bieganska E,
Biczysko R. [Ultrastructural Examination of the Placenta in Pregnancy Complicated by
Diabetes Mellitus]. Ginekol Pol. 2004 Feb;75(2):111-8.
10. Satoh I, Saito M, Kinoshita Y, Shomori K, Suzuki H, Yamada M, et al. Effects
of Cyclohexenonic Long-Chain Fatty Alcohol on Diabetic Rat Trachea. Life Sci. 2005
Sep 2;77(16):2030-9.
11. Saudek Cd. Diabetes Mellitus. HARVEY AM, JOHNS, R.J., CKUSICK, V.A.,
OWENS, A.H., ROSS, R.S., editor.: Norwalk: Appleton & Lange; 1988.
12. Panzram G. Mortality and Survival in Type 2 (Non-Insulin-Dependent) Diabetes
Mellitus. Diabetologia. 1987;30:123-31.
13. King H, Rewers Mm. Who Ad Hoc Diabetes Reporting Group Global Estimates
for Prevalence of Diabetes Mellitus and Impaired Glucose Tolerance in Adults.
Diabetes Care. 1993;16:157-77.
14. Suetsugu M, Takebayashi K, Aso Y. Association between Diabetic
Microangiopathy and Vascular Endothelial Function Evaluated by Flow-Mediated
Vasodilatation in Patients with Type 2 Diabetes. Int J Clin Pract. 2007 Jun;61(6):920-6.
15. Leys Am. The Eye and Renal Diseases. 1998 [updated 1998; cited v.5 chapter
31]; Available from.
16. Hogan Mj, Feeney L. The Ultrastructure of the Retinal Vessels-Vascular Glial
Relationships. J Ultrastruct Res. 1963;9:47-64.
17. Olefsky J. Diabete Melito. In: WINGARDEN & SMITH Cecil: tratado de
medicina interna. 1990;231:1198-216.
18. Grey Rh, Malcolm N, O'reilly D, Morris A. Ophthalmic Survey of a Diabetic
Clinic. I: Ocular Findings. Br J Ophthalmol. 1986;70:797-803.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
107
19. Aiello Lm, Cavallerano Jd. Ocular Complications of Diabetes Mellitus. In:
KAHN, CR, WEIR, GC (Eds) Joslin's diabetes mellitus 13ed Philadelphia: Lea &
Febiger. 1994:771-93.
20. Duke-Elder S. Diabetic Retinopathy. In: Duke-Elder S System of
Ophthalmology. 1967:410-48.
21. Hirata Ce, Fang T, Casella Amb, Et Al. Prevalência De Retinopatia Em Uma
População De Diabéticos. Arq Bras Oftalmol. 1986;49:31-3.
22. Vilela M, Saadi A, Pletsch L, Giacomet A. Inquérito Entre Pacientes E Médicos
Sobre as Estratégias Aplicadas Na Prevenção E Tratamento Da Retinopatia Diabética.
Arq Bras Oftalmol. 1997;60:152-5.
23. Nehemy M. Retinopatia Diabética. Arq Bras Oftalmol. 1998;61:366-70.
24. Caird Fi, Pirie A, Ramsell Th. Diabetes and the Eyes. Oxford: Blackwells.
1969:81-7.
25. Kohner Em, Oakley Nw. Progress in Endocrinology and Metabolism.
Metabolism. 1975; 24:1085-102.
26. Oakley N, Hill Dw, Joplin Gf, Et Al. Diabetic Retinopathy: The Assessment of
Severity and Progress by Comparison with a Set of Standard Fundus Photographs.
Diabetologia. 1967; 3:402-5.
27. Kansky J. Clinical Ophtalmology. 1994;3rd edition:344-57.
28. Phillips Wb. Ocular Manifestations of Diabetes Mellitus. J Ophthalmic Nurs
Tecnol. 1994;13:255-61.
29. Lovestam–Adrian M, Agardh E, Agardh Cd. The Temporal Development of
Retinopathy and Nephropathy in Type 1 Diabetes Mellitus During 15 Years Diabetes
Duration. Diabetes Res Clin Pract. 1999;45:15-23.
30. Ribeiro-Gonçalves E, Barsante C. Retinopatia E Maculopatia Diabética. In: Dias
JFR Ribeiro-GonçaIves E, Barsante C Diabetes e Hipertensão Arterial. 1984;1ª
edição:1-25.
31. Klein R, Klein Bek, Moss Se, Et Al. The Wisconsin Epidemiologic Study of
Diabetic Retinopathy. Xiv. Ten Year Incidence and Progression of Diabetic
Retinopathy. Arch Ophthalmol. 1994; 112:1217-28.
32. The Diabetes Control and Complication T. N Engl J Med. 2000;342:381-9.
33. Prevención De Ia Ceguera En Ia Retinopatia Diabetica E. Revista Clínica
Espafiola. 1998;198.
34. Fukuda M. Clinical Arrangement of Classification of Diabetic Retinopathy.
Tohoku J ExMed. 1983;141:331-5.
35. Haut J, Redor Jy, Abboud E, Al E. Classification of Diabetic Retinopathy.
Ophthalmologica. 1987;195:145-55.
36. Matsui M, Sato Y. Classification of Diabetic Retinopathy and Application
Standard of Photocoagulation. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1989;93:803-8.
37. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (Etdrs). Early Photocoagulation for
Diabetic Retinopathy. Ophtalmology. 1991;98:766-85.
38. Munteanu G. The Classification of Diabetic Retinopathy. Oftalmologia.
1993;37:207-9.
39. American Diabetes Association. Guide to Diagnosis and Classification of
Diabetes Mellitus and Other Categories of Glucose Intolerance. Diabetes Care.
1997;20(1):21-7.
40. Benson We. Diabetic Retinopathy. 1998 [updated 1998; cited v3. chapter 30];
Available from.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
108
41. Smith Sc. Diabetic Retinopathy. Nurse Pract Forum. 1998;9:13-8.
42. Garcia-Serrano Jl, Serrano-Laborda D, Lopez-Pozas M, Cabello-Aparicio C,
Castro-Rosales L. [the Granada Diabetic Retinopathy Study. Direct Screening of 8,244
Patients. I]. Arch Soc Esp Oftalmol. 2007 Nov;82(11):681-9.
43. Fauser S, Krohne Tu, Kirchhof B, Joussen Am. Diabetic Maculopathy -
Classification and Therapy. Klin Monatsbl Augenheilkd. 2003 Aug;220(8):526-31.
44. Hori S. [Chronic Complications Due to Diabetes Mellitus: Diabetic
Retinopathy--Classification, Diagnosis, Treatment]. Nippon Rinsho. 2002 Oct;60 Suppl
10:147-54.
45. Library Exhibitions. Edinburgh: Royal College of Physicians; 2008 [updated
2008; cited 2008 24/01]; Available from:
http://www.rcpe.ac.uk/library/exhibitions/diabetes/diabetes.php.
46. Engerman Rl, Bloodworth Jr. Jmb. Experimental Diabetic Retinopathy in Dogs.
Arch Ophthalmol. 1965;73:205-10.
47. Bloodworth Jr. Jmb, Molitor Dl. Ultrastructural Aspects of Human and Canine
Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol. 1965;4: 1037-48.
48. Bloodworth Jr. Jmb, Engerman Rl, Powers Kl. Experimental Diabetic
Microangiopathy: Basement Membrane Statistics in the Dog. Diabetes. 1969;18:455-8.
49. Leuenberger Pm, Cameron D, Stauffacher W, Et Al. Ocular Lesions in Rats
Rendered Chronically Diabetic with Streptozotocin. Ophthalmic Res. 1971;2:189-204.
50. Babel J, Leuenberger P. A Long Term Study on the Ocular Lesions in
Streptozotocin Diabetic Rats. Albrecht Von Graefes Arch Klin Ex Ophthalmol.
1974;189:191-209.
51. Duhault J, Lebon F, Boulanger M. Microangiopathie Diabetique-Etude
Comparative Chez L’homme Et L’animal. Biorheology. 1974;11:167-78.
52. Rodrigues M, Currier C, Yoon J. Electron Microscopy of Renal and Ocular
Changes in Virus-Induced Diabetes Mellitus in Mice. Diabetologia. 1983;24:293-9.
53. Takahashi Y. Optic Nerve Head Circulation in Alloxan-Induced Diabetic
Rabbits. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1995;99:166-72.
54. Mac Gregor Lc, Matschinsky Fm. Experimental Diabetes Mellitus Impairs the
Function of the Retinal Pigmented Epithelium. Metabolism Clin Ex. 1986;35:28-34.
55. De Juan E, Humayun Ms, Hatchell Dl, Wilson D. Histopathology of
Experimental Preretinal Neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1989;30:1495-
503.
56. Buchi Er, Kurosawa A, Tso Mo. Retinopathy in Diabetic Hypertensive
Monkeys: A Pathologic Study. Albrecht Von Graefes Arch Klin Ex Ophthalmol.
1996;234:388-98.
57. Engerman Rl. Animal Models of Diabetic Retinopathy. Trans Am Acad
Ophthalmol Otolaryngol. 1976;81:710-5.
58. Papachristodoulou D, Heath H, Kang Ss. The Development of Retinopathy in
Sucrose-Fed and Streptozotocin-Diabetic Rats. Diabetologia. 1976;12:367-74.
59. Robison Wg, Mc Caleb Ml, Feld Lg, Et Al. Degenerated Intramural Pericytes
(“Ghost Cells”) in the Retinal Capillaries of Diabetic Rats. Curr Eye Res. 1991;10:339-
50.
60. Sima Aa, Garcia-Salinas R, Basu Pk. The Bb Wistar Rat: An Experimental
Model for the Study of Diabetic Retinopathy. Metabolism. 1983;32:136-40.
61. Schellini Sa, Gregorio Ea, Spadella Ct, Machado Jl, De Moraes-Silva Ma.
Muller Cells and Diabetic Retinopathy. Braz J Med Biol Res. 1995;28:977-80.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
109
62. Mcletchie Ng. Alloxan Diabetes: The Sorcerer and His Apprentice.
Diabetologia. 1982;23:72-5.
63. Kern Ts, Engerman Rl. A Mouse Model of Diabetic Retinopathy. Arch
Ophthalmol. 1996;114:986-90.
64. Schellini Sa. Retinopatia Diabética Experimental: Estudo Estrutural,
Ultraestrutural E Morfométrico Da Retina De Ratos Normais, Diabéticos E Diabéticos
Tratados. Botucatu. 1992:160p.
65. Kern Ts, Engerman Rl. Comparison of Retinal Lesions in Alloxan-Diabetic Rats
and Galactose-Fed Rats. Curr Eye Res. 1994;13:863-7.
66. Robison Jr. Wg, Nagata M, Tillist N, Et Al. Aldose Reductase and Pericyte-
Endothelial Cell Contacts in Retina and Optic Nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci.
1989a;30:2293-9.
67. Yanoff M, Fine Bs. Diabetes Mellitus. In: YANOFF, M Patologia ocular.
1991a:187-95.
68. Yanoff M, Fine Bs. Retina. In: ___ Patologia ocular. 1991b;11:131-52.
69. Lieth E, Barbera J, Xu B, Et Al. Glial Reactivity and Impaired Glutamate
Metabolism in Short-Term Experimental Diabetic Retinopathy. Diabetes. 1998;47:815-
20.
70. Kincaid Mc. Pathology of Diabetes Mellitus. 1998 [updated 1998; cited v.3
chapter 18]; Available from.
71. Moiser Ma, Gottner Mj. Identification of the Pre-Proliferative Diabetic Eye.
Metab Pediatr Syst Ophthalmol. 1985;8:150-3.
72. Hamanaka T, Akabanem N, Yajima T, Et Al. Retinal Ischemia and Angle
Neovascularization in Proliferative Diabetic Retinopathy. Am J Ophthalmol.
2001;132:648-58.
73. Verma D. Pathogenesis of Diabetic Retinopathy-the Missing Link? Med
Hypotheses. 1993;41:205-10.
74. Robison Jr. Wg, Tillist N, Laver N, Et Al. Diabetes-Related Histopathologies of
the Rat Retina Prevented with an Aldose Reductase Inhibitor. ExEye Res. 1990;50:355-
66.
75. Bazan Ng, Gordon Nc, Marcheselli Vl, Et Al. Experimental Models and Their
Use in Studies of Diabetic Retinal Microangiopathy. Therapie. 1997;52:447-51.
76. Ishibashi T. Cell Biology of Intraocular Vascular Diseases. Nippon Ganka
Gakkai Zasshi. 1999;103:923-47.
77. Almeida Cam. Estudo Das Alterações Estruturais E Ultra-Estruturais Da
Camada De Fotorreceptores Da Retina De Ratos Diabéticos Aloxânicos. Botucatu:
Universidade Estadual Paulista
2002.
78. Yanoff M. Ocular Pathology of Diabetes Mellitus. Am J Ophthalmol.
1969;67:21-38.
79. Jorge Ec. Retinopatia Diabética: Estudo Ultraestrutural E Morfométrico Do
Epitélio Pigmentar De Ratos Normais E Aloxânicos; 1996.
80. Jorge Ec, Trindade Jcs. Retinopatia Diabética: Estudo Ultraestrutural E
Morfométrico Do Epitélio Pigmentar De Ratos Normais E Aloxônicos. Rev bras
oftalmol. 1997;56(7):461-78.
81. Hori S, Mukai N. Ultrastructural Lesions of Retinal Peripcapillary Muller Cells
in Streptozotocin-Diabetic Rats. Albrecht Von Graefes Klin ExOphthalmol.
1980;213:1-9.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
110
82. Rodrigues Acl, Schellini Sa, Spadela Ct, Gregório Ea, Padovani Cr. Alterações
Vasculares Na Coróide De Ratos Diabéticos Tratados E Não Tratados. Arquivos
Brasileiros de Oftalmologia. 2007;70:433-40.
83. Tilton R, Larose L, Kilo C, Jr W. Absence Ofdegenerative Changes in Retinal
and Uveal Capillary Pericytes in Diabetic Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci.
1986;27(5):716-21.
84. Dryden Rm. Central Vein Oclusions and Chronic Simple Glaucoma. Arch
Ophthalmol. 1965;73:659-63.
85. Gartner S, Henkind P. Neovascularization of the Iris(Rubeosis Iridis). Surv
Ophthalmol. 1978;22:291-312.
86. Wand M. Neovascular Glaucoma. In: In: RITCH R, SHIELDS, M.B., KRUPIN,
T., editor. The Glaucomas. 2.ed. ed: St. Louis: Mosby; 1996. p. 1073-129.
87. Von Sallmann L, Grimes P. Eye Changes in Streptozotocin Diabetes in Rats.
Am J Ophthalmol. 1971;1:312-9.
88. Fujii T, Ishikawa S, Uga S. Ultrastructure of Iris Muscles in Diabetes Mellitus.
Ophthalmologica. 1977;174(4):228-39.
89. Spirandelli P, Schellini S, Gregório E, Padovani C. Ultrastructural and
Morphometric Alterations in Iris Nerves of Diabetic Rats. Invest Ophthalmol.
1999;40:s446.
90. Pinto Ft. Alterações Morfológicas Nos Vasos Da Íris De Ratos Normais E
Diabéticos Aloxânicos. Botucatu: Universidade Estadual Paulista; 2002.
91. Kojima K Hy, Hirata K. Electron Microscopic Findings of the Ocular Tissues in
Alloxan Rats - on the Vessels of the Iris and Ciliary Body. Nippon Ganka Kiyo.
1972;23:191-203.
92. Kojima K, Hasegawa Y, Hirata K. Electron Microscopic Findings of the Ocular
Tissues in Alloxan Rats - on the Vessels of the Iris and Ciliary Body. Nippon Ganka
Kiyo. 1972;23:191-203.
93. Bosso E. Alterações Morfológicas No Estroma Do Corpo Ciliar De Ratos
Normais E Diabéticos Aloxânicos. Botucatu: Universidade Estadual Paulista; 2002.
94. Elias H, Hyde D. A Guide to Pratical Stereology. Basileia: Karger; 1983.
95. Gundersen H, Bendtsen T, Korbol, Marcussen N, Moller A, Nielsen K, et al.
Some New, Simple and Efficient Stereological Methods and Their Use in Pathological
Research and Diagnosis. APMIS. 1988;96:379-94.
96. Aherne W, Dunhill M. Morphometry. São Paulo
Edward Arnold; 1982.
97. Baar J, Oort J. A Manual of Morphometry in Diagnostic Pathology. Berlin;
1983.
98. Mandarim-De-Lacerda C. Métodos Quantitativos Em Morfologia. Rio de
Janeiro: EdUERJ; 1995.
99. Baddeley A, Gundersen H, Cruz-Orive L. Estimation of Surface Area from
Vertical Sections. J Microsc. 1986;142:259-76.
100. Chalkley H, Cornfield I, Park H. A Method for Estimating Volume-Surface
Ratios. Science. 1949;110:295-7.
101. Weibel E, Gomez D. A Principle for Counting Tissue Structures on Random
Sections. J Appl Phisiol. 1962;17:343-48.
102. Lopes-Paulo F. Emprego Da Estereologia Em Pesquisas Colorretais. Rev bras
coloproct. 2002;22(2):73-6.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
111
103. Figueiredo Mtbjap. Morphometric Analysis of Shank-to-Flute Ratio in Rotary
Nickel Titanium Files. International Endodontic Journal. 2004;37(6):353.
104. Masiero A, Barletta F. Effectiveness of Different Techniques for Removing
Gutta-Percha During Retreatment. International Endodontic Journal. 2005;38(1):2-7.
105. Chi F, Liang Q. The Quantification of Endolymphatic Hydrops in an
Experimental Animal Model with Guinea Pigs. Journal of Oto-Rhino-Laryngology & its
Related Specialties. 2004;66(2):56-61.
106. Yu Y, Ye X, Shou L. The Therapy with Rhvegf Gene for Ischemic Tram Flap in
Rats. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi. 2003;19(5):373-6.
107. Sanchez Perez A, Honrubia Lopez F, Larrosa Poves J, Polo Llorens V, Melcon
Sanchez-Frieras B. The Autocad System for Planimetric Study of the Optic Disc in
Glaucoma: Technique and Reproducibility Study. Archivos de la Sociedad Espanola de
Oftalmología. 2001;76(9):551-8.
108. Wang N, Lai M, Chen X, Zhou W. Quantitative Real Time Measurement of Iris
Configuration in Living Human Eyes. Chung-Hua Yen Ko Tsa Chih [Chinese Journal
of Ophthalmology]. 1998;34(5):369-72.
109. Weynand B, Jonckheere A, Frans A, Rahier J. Diabetes Mellitus Induces a
Thickening of the Pulmonary Basal Lamina. Respiration. 1999;66:14-9.
110. Heath H. Experimentally Induced Retinopathies in Relation to the Problem of
Diabetes. Br Med Bull. 1970;26:151.
111. Engerman R, Finkelstein D, Aguirre G, Et Al. Ocular Complications. Diabetes.
1982;31, suppl.1, pt.2:82-8.
112. Frank Rn. Etiologic Mechanisms in Diabetic Retinopathy. St. Luois: Mosby;
1989.
113. Orloff Mj, Lee S, Charters Ac, Et Al. Long-Term Studies of Pancreas
Transplantation in Experimental Diabetes Mellitus. Ann Surg. 1975;182:198-206.
114. Macedo Ar, Skivolocki Wp, Thompson Kr, Et Al. Morphometric Electron -
Microscopy Study of the Whole Pancreas Transplantation on Alloxan Diabetic
Neuropathy. Surg Forum. 1981;32:379-80.
115. Macedo Cs, Greenleaf Ge, Syers Hj, Et Al. Effect of Whole Pancreas
Transplantation on Long-Stablished Kidney Lesions in Diabetes. Surg Forum.
1985;36:346-8.
116. Macedo Cs, Mercadante Mcs, Macedo Ar. Controle Do Diabetes Por Meio Do
Transplante De Ilhotas De Langerhans Preparadas Sem O Emprego Da Digestão
Enzimática - Estudo Experimental No Rato. Re Hos Clin Fac Med S Paulo. 1986;
41:55-60.
117. Macedo Cs, Riyuzo Mk, Mercadante Mcs, Et Al, editors. Nefropatia Diabética
Em Ratos. Estudo Comparativo Entre a Diabetes Induzida Pela Aloxana E Pela
Estreptozotocina. JORNADA BRASILEIRA DE NEFROLOGIA PEDIÁTRICA; 1987;
Rio de Janeiro. Sociedade Brasileira de Pediatria.
118. Spadella Ct. Avaliação Funcional Do Transplante Pancreatoduodenal No Rato
Diabético. Botucatu: Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Medicina de
Botucatu; 1989.
119. Breim Lc. Estudo Comparativo Entre O Transplante Total De Pâncreas,
Transplante De Ilhotas De Langerhans, E O Tratamento Convencional Com Insulina No
Controle Das Manifestações Clínicas Do Diabetes Aloxânico Do Rato. Botucatu.
1990:127p.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
112
120. Dunn Js, Sheehan Hl, Mcletchie Ngb. Necrosis of Islets of Langerhans Produce
Experimentally. Lancet. 1943;1:484.
121. Robison Wg, Jr., Kador Pf, Kinoshita Jh. Retinal Capillaries: Basement
Membrane Thickening by Galactosemia Prevented with Aldose Reductase Inhibitor.
Science. 1983 Sep 16;221(4616):1177-9.
122. Gul N, Ozsoy N. The Ultrastructure of the Capillaries in the Gingiva of Alloxan-
Induced Diabetic Rats. Cell Biochem Funct. 2003 Dec;21(4):311-5.
123. Zhou Bq, Hu Sj, Wang Gb. The Analysis of Ultrastructure and Gene Expression
of Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium Handling Proteins in Alloxan-Induced
Diabetic Rat Myocardium. Acta Cardiol. 2006 Feb;61(1):21-7.
124. Galagudza Mm, Nekrasova Mk, Syrenskii Av, Nifontov Em. Resistance of the
Myocardium to Ischemia and the Efficacy of Ischemic Preconditioning in Experimental
Diabetes Mellitus. Neurosci Behav Physiol. 2007 Jun;37(5):489-93.
125. Caldwell Rb, Slapnick Sm, Mclaughlin Bj. Quantitative Freeze - Facture and
Filipin - Binding Study of Retinal Pigment Epithelial - Cell Basal Membranes in
Diabetic Rats. ExEye Res. 1987;44:245-59.
126. Machado Jlm. Neuropatia Diabética Experimental. Estudo Morfológico E
Morfométrico Do Nervo Ciático De Ratos Diabéticos. Botucatu. 1993:109p.
127. Clarson C, Daneman D, Martin J. Subclinical Diabetes Mellitus in the Bb Rat.
Diabetes Res. 1986;3:237-40.
128. Lee S, Chandler Jg, Krubel R, Nakaji Nt, Rosen H, Orloff Mj. Relief of Diabetes
Mellitus by Heterotopic Transplantation of the Whole Pancreas in Inbred Rats. Surg
Forum. 1971;22:75-7.
129. Ueda T, Lee S, Sotrck G, Et Al. Metabolic Effect of Alloxan Diabetic Rats
before and after Pancreas Transplantation. Proc Anat Microsurg Soc. 1979;3:423-4.
130. Brekke Ib, Gullesen I, Refsum Sb, Flatmark A. Long-Term Endocine Function
of Duct-Ligated Pancreas Isotransplants in Rats. Eur Surg Res. 1980;12:167-78.
131. Rossi G, Heldstab A. Morphometric Studies of Pancreatic Islets and Retina
Vessels of Rats with Streptozotocin - Induced Latent Diabetes. Diabete Metab.
1981;7:77-86.
132. Calderon Imp. Modelo Experimental Em Ratos Para Estudo Do Binômio
Diabete E Gravidez. Botucatu. 1988:125p.
133. Karasik A, Menczer J, Pariente C, Kanety H. Insulin-Like Growth Factor-I (Igf-
I) and Igf-Binding Protein-2 Are Increased in Cyst Fluids of Epithelial Ovarian Cancer.
J Clin Endocrinol Metab. 1994 Feb;78(2):271-6.
134. Reddi As. Collagen Metabolism in the Retina of Normal and Diabetic Rats.
ExEye Res. 1985;41:345-52.
135. Vinores Sc, Campochiaro Pa, May Ee, Et Al. Progressive Ultrastructural
Damage and Thickening of the Basemente Membrane of the Retinal Pigment
Epithelium in Spontaneously Diabetic Bb Rats. ExEye Res. 1988;46:545-58.
136. Jonasson J, C.W., Bauman C, Et Al. The Pathophysiology of Experimental
Insulin-Deficient Diabetes in the Monkey: Implications for Pancreatic Transplantation.
Ann Surg. 1985;201:27-39.
137. Hogan Mj, Alvarado Ja, Weddell Je. Retina. In: Hystology of the human eye.
1971;9:393-519.
138. Rodrigues Ac. Coroidopatia Diabética. Estudo Ultraestrutural Da Coróide De
Ratos Normais E Diabéticos Aloxânicos. Dissertação Botucatu. 2000:135.
PDF Creator - PDF4Free v2.0 http://www.pdf4free.com
113
139. Candia Oa, To Ch, Gerometta Rm, Zamudio Ac. Spontaneous Fluid Transport
across Isolated Rabbit and Bovine Ciliary Body Preparations. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2005 Mar;46(3):939-47.
140. Jariyapongskul A, Rungjaroen T, Kasetsuwan N, Pathumraj S, Niimi H. Chronic
Changes of the Iris Microvasculature of Streptozotocin-Induced Diabetic Rats Using
Fluorescence Videomicroscopy. Clin Hemorheol Microcirc. 2006;34(1-2):283-93.
141. Hirschi Kk, D'amore Pa. Control of Angiogenesis by the Pericyte: Molecular
Mechanisms and Significance. EXS. 1997;79:419-28.
142. Ishibashi T, Inomata H. Ultrastructure of Retinal Vessels in Diabetic Patients. Br
J Ophthalmol. 1993 Sep;77(9):574-8.
143. Polak M, Newfield Rs, Fioretto P, Czernichow P, Marchase R. Pathophysiology
of Diabetic Complications. Diabetologia. 1997 Oct;40 Suppl 3:B65-7.
144. Bosco A, Lerario Ac, Soriano D, Dos Santos Rf, Massote P, Galvao D, et al.
[Diabetic Retinopathy]. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2005 Apr;49(2):217-27.
145. Kuwabara T, Cogan Dg. Retinal Glicogen. Arch Ophthalmol. 1961;66:96-104.
146. Kuwabara T, Cogan Dg. Studies of Retinal Vascular Patterns-Normal
Architeture. Arch Ophthalmol. 1960;64:904-11.
147. Fisher Rf. Comparison of the Size of Pericytes of the Retinal Capillaries in the
Normal and Diabetic State. Trans Ophthalmol Soc U K. 1980 Apr;100(Pt 1):90-5.
148. Vom Hagen F, Feng Y, Hillenbrand A, Hoffmann S, Shani M, Deutsch U, et al.
Early Loss of Arteriolar Smooth Muscle Cells: More Than Just a Pericyte Loss in
Diabetic Retinopathy. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2005 Dec;113(10):573-6.
149. Kakehashi A, Saito Y, Mori K, Sugi N, Ono R, Yamagami H, et al.
Characteristics of Diabetic Retinopathy in Sdt Rats. Diabetes Metab Res Rev. 2006
Nov-Dec;22(6):455-61.
150. Mcmillan De. Development of Vascular Complications in Diabetes. Vasc Med.
1997;2(2):132-42.
151. Cooper Me, Bonnet F, Oldfield M, Jandeleit-Dahm K. Mechanisms of Diabetic
Vasculopathy: An Overview. Am J Hypertens. 2001 May;14(5 Pt 1):475-86.
152. Stitt Aw, Gardiner Ta, Archer Db. Histological and Ultrastructural Investigation
of Retinal Microaneurysm Development in Diabetic Patients. Br J Ophthalmol. 1995
Apr;79(4):362-7.
153. Cunha-Vaz J. Characterization and Relevance of Different Diabetic Retinopathy
Phenotypes. Dev Ophthalmol. 2007;39:13-30.
154. Fryczkowski Aw, Hodes Bl, Walker J. Diabetic Choroidal and Iris Vasculature
Scanning Electron Microscopy Findings. Int Ophthalmol. 1989 Jul;13(4):269-79.
155. Yanoff M, Fine Bs. Ocular Pathology. Hagerstown: Harper & Row. 1975:565-
85.
156. Yamashita T, Becker B. The Basement Membrane in the Human Diabetic Eye.
Diabetes. 1961 May-Jun;10:167-74.
157. Zhoung Hj, Zhang Dm, Zhou M. [Effects of Losartan on Renal Ultrastructure in
Diabetic Rats]. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2001 Jun 28;26(3):200-2.
158. Zhou M, Zhong Hj, Wu Xy. [Changes of Ultrastructure and Function of the
Aortic Endothelium in Streptozotocin-Diabetic Rats and Effect of Perindopril]. Hunan
Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2001 Feb 28;26(1):41-4.
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114
ALMEIDA, C.A.M. Avaliação ultra-estrutural dos vasos da íris, corpo ciliar e
retina em ratos diabéticos aloxânicos. Botucatu, 2008. p.115 Tese (Doutorado em
Cirurgia) – Faculdade de Medicina, Campus de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista – UNESP.
RESUMO
O objetivo do estudo foi avaliar a influência do diabetes sobre os vasos da
íris, corpo ciliar e retina. Para isto, foi realizado estudo experimental,
utilizando 20 ratos da raça Wistar, divididos em dois grupos: Grupo
Controle (GC) e Grupo Diabético (GD). A indução do diabetes foi feita
por injeção de aloxana, 42 mg/Kg de peso. Os animais foram observados
em 3 momentos experimentais: M1-15 dias após a indução do diabetes,
M2 -1 mês após M1 e M3 -12 meses após M1. Foram considerados para o
estudo os animais do GD que em M1 apresentavam diabetes grave.
Realizou-se acompanhamento diário de parâmetros clínicos (peso, diurese,
ingestão hídrica e ingestão alimentar) e avaliação mensal de glicemia e
glicose urinária. Nos momentos experimentais M2 e M3 foram realizadas
enucleação e preparo dos olhos para avaliação sob microscopia eletrônica
de transmissão. Os resultados obtidos mostraram que os animais diabéticos
tiveram importante redução de peso, aumento de ingestão hídrica, aumento
de ingestão alimentar e aumento de diurese, em relação aos animais
controle. Na avaliação morfológica os três grupos de vasos tiveram
alterações similares, com espessamento da membrana basal nas células
endoteliais e pericitos, maior número de corpos densos, lisossomos,
vesículas, vacúolos e "figuras de mielina", que estavam presentes em
GCM2 e foram mais acentuadas nos grupos diabéticos. Não foram
observados microaneurismas na parede vascular. A análise morfométrica
mostrou aumento significativo na espessura da membrana basal de vasos
irianos nos animais diabéticos. Concluí-se que os vasos da íris, corpo ciliar
e retina sofrem a influência do estado diabético. As alterações são
progressivas, afetando tanto as células endoteliais, como as pericíticas.
Palavras-chave: Diabetes; Aloxana; Ratos; Ultra-estrutura; Vasos.
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115
ALMEIDA, C.A.M. Ultra-structural evaluation of the of the iris, ciliary’s body
and retina vessels in aloxanic diabetic rats. Botucatu, 2008. p.115 Tese (Doutorado
em Cirurgia) – Faculdade de Medicina, Campus de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista – UNESP.
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the influence of diabetes on
vessels of iris, ciliary’s body and retina. For this, prospective experiment
was accomplished, using 20 Wistar rats, divided in two groups: Control
Group (CG) and Diabetic Group (DG). The diabetes induction was made
by aloxana injection, 42 mg/Kg of weight. The animals had been observed
at 3 experimental moments: M1-15 days after the diabetes induction, M2 -
1 month M1 and M3 -12 months after M1. They were considered for the
study the animals of the DG that presented serious diabetes in M1. Clinical
parameters had daily been followed (weight, diuresis, water ingestion and
alimentary ingestion) and monthly evaluation of glycemia and urinary
glucose. At the experimental moments M2 and M3 it was realized
enucleation and preparation of the eyes for optic microscopy and
electronic transmission microscopy evaluation. The gotten results had
shown that the diabetic animals had had important weight reduction, water
ingestion increase, alimentary ingestion increase and diuresis increase,
compared to the animals of the CG. In the morphologic evaluation it has
been observed that the three groups of vessels have had similar alterations,
with thickening of the basal membrane in the endothelial cells and
pericytes, greater number of dense bodies, lysosomes, vesicles, vacuoles
and "myelin figures” that they were in GCM2 and had been accentuated in
diabetic groups. Microaneurysms in the vascular wall had not been
observed. The morphometric analysis showed significant increase in the
thickness of the basal membrane of iris vessels in diabetic animals. We
conclude that iris, ciliary’s body and retina vessels suffer the influence
from the diabetic state. The alterations are gradual, affecting in such a way
the endothelial cells, as the pericytes.
Keywords: Diabetes; Aloxana; Rats; Ultra-structure; Vessel.
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