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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
Avaliação in vitro dos efeitos do agente etiológico
Nomuraea rileyi no controle biológico do carrapato
Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Andréia Loureiro Musso Terra
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Avaliação in vitro dos efeitos do agente etiológico Nomuraea rileyi no
controle biológico do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
ANDRÉIA LOUREIRO MUSSO TERRA
Sob a Orientação da Professora
Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt
e Co-orientação da Pesquisadora
Áurea Maria Lage de Moraes
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Animal.
Seropédica, RJ
Agosto de 2008
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595.42
T323a
T
Terra, Andréia Loureiro Musso, 1971-
Avaliação in vitro dos efeitos do
agente etiológico Nomuraea rileyi no
controle biológico do carrapato
Rhipicephalus (Boophilus) microplus /
Andréia Loureiro Musso Terra – 2008.
33f. : il.
Orientador: Vânia Rita Elias
Pinheiro Bittencourt.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Curso de Pós Graduação em
Ciências Veterinárias.
Bibliografia: f. 27-33.
1. Carrapato – Controle biológico
– Teses. 2. Rhipicephalus – Controle
biológico – Teses. 3. Boophilus
microplus – Controle biológico –
Teses. 4. Fungos entomopatogênicos –
Teses. I. Bittencourt, Vânia Rita
Elias Pinheiro, 1959- II.
Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro. Curso de Pós Graduação em
Ciências Veterinárias. III. Título.
Dedicatória:
Ao meu marido, Rômulo Reis Terra, grande
incentivador na minha vida profissional. Às
minhas filhas, Ana Beatriz e Maria Clara, a
quem tento demonstrar com exemplos, o
grande valor do estudo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente na conclusão deste
trabalho. A Deus por guiar meus passos na minha longa caminhada. A professora Vânia Rita
Elias Pinheiro Bittencourt que além da orientação dinâmica dispensada se tornou uma grande
amiga, obrigada pela confiança em mim depositada. A Isabele da Costa Angelo pela sua
dedicação integral na execução de todas as etapas desse trabalho, sem sua presença constante
teria sido difícil chegar até aqui, obrigado por tudo!!!. A Ana Paula Rodrigues de Moraes,
responsável pelos momentos de descontração no laboratório e pela sua ajuda constante. Ao
meu marido Rômulo Reis Terra, por propiciar meu crescimento pessoal e profissional nesses
vinte anos de convivência. A minha filha Ana Beatriz Musso Terra, que por muitas vezes não
só me compreendeu, como ajudou e incentivou nos momentos difíceis dessa jornada. Seu
prazer pelos estudos me deixa maravilhada!!! A minha pequenina filha Maria Clara Musso
Terra, que apesar de muito pequena, é sempre motivo de grande alegria na nossa casa. Amo
vocês!!! A Andreza Gomes da Fonseca Carneiro e Josiane Gomes pelo afeto dispensado as
minhas filhas, transmitindo tranqüilidade para que eu me ausentasse de casa. A minha mãe
Janair Loureiro Musso, minhas irmãs, Adriana Musso Rabelo e Mariana Loureiro Musso
Caldas, que mesmo de longe torcem pelo meu sucesso. As minhas lindas e queridas sobrinhas
Jade e Luna Musso Rabelo. Ao meu cunhado e amigo Edson Alves Rabelo Júnior, grande
esteio da nossa família. Ao meu cunhado Marcos Paulo Koller Caldas, recentemente na
família. A minha sogra Nadir Pedrosa Reis Terra, grande incentivadora dos que se
enveredam pelo caminho dos estudos. A amiga e comadre Denise Souza e a amiga Denise
Maria Dias Andretti que sempre me motivaram, não permitindo que eu fraquejasse diante dos
obstáculos encontrados. Ao amigo Éverton Kort Kamp Fernandes, pela ajuda constante ao
longo desse trabalho, mesmo a quilômetros de distância. A Alessandra Nunes Tovar Elias e
Liliane da Costa Figoreli, pelos anos de amizade sincera compartilhada. Ao amigo de
laboratório Wendell Marcelo de Souza Perinotto, sempre pronto a ajudar. A Dra. Áurea Maria
Lage de Moraes, pela sua competência e atenção dispensada, somando de forma positiva na
execução desse trabalho. Aos funcionários da estação Experimental W. O. Neitz pela ajuda
dispensada com os animais durante o experimento. Ao CNPq pela ajuda financeira desse
projeto. A Embrapa Soja por fornecer os isolados fúngicos utilizados no presente estudo. Aos
professores e amigos do curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, por todo o tempo
de convivência. A todos vocês meu muito obrigado!!!
BIOGRAFIA
Andréia Loureiro Musso Terra, filha de Murillo Costa Musso (In memorian) e Janair
Loureiro Musso, nasceu na cidade de Vitória - ES, no dia 30 de abril de 1971.
Cursou o ensino fundamental na Escola de Aplicação Dom Pedro II e de 5ª a 8ª série
no colégio Estadual Maria Ortiz. Concluiu o ensino Médio na Escola de 2º grau Instituto de
Educação Professor Fernando Duarte Rabelo, formando em magistério no ano de 1988.
Prestou concurso público nas Prefeituras Municipais das cidades de Viana e Vitória,
localizadas no estado do Espírito Santo e trabalhou como professora estatutária no período de
1990 a 1994.
Em junho de 1994 mudou-se para Volta redonda –RJ após ter se casado com Rômulo
Reis Terra, funcionário da Companhia Siderúrgica Nacional, situada nesta cidade.
Ingressou na faculdade de Medicina Veterinária em agosto de 1996 e concluiu o curso
em dezembro de 2000, na fundação Educacional Dom André Arco Verde, situada na cidade
de Valença, estado do Rio de Janeiro.
Foi proprietária do consultório Veterinário “Quatro Patas”, em Volta Redonda - RJ,
atuando na clínica de pequenos animais de agosto de 2002 a fevereiro de 2005.
Em março de 2006 iniciou o mestrado no curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, área de concentração em Parasitologia Animal, na Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro.
RESUMO
TERRA, Andréia Loureiro Musso. Avaliação in vitro dos efeitos do agente etiológico
Nomuraea rileyi no controle biológico do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
2008. 33p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária).
Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:Ixodidae) é responsável por grandes perdas
econômicas na pecuária brasileira e atualmente seu controle consiste basicamente no uso de
acaricidas químicos. A sua utilização inadequada tem favorecido o desenvolvimento de cepas
resistentes e a contaminação do meio ambiente. Diversos fungos entomopatogênicos têm sido
estudados no intuito de minimizar os problemas ocasionados por esse artrópode. O objetivo
desse estudo foi testar in vitro os isolados Nr 151 e Nr 177 de Nomuraea rileyi sobre as
diferentes fases de desenvolvimento do carrapato R. (B.) microplus. O fungo foi repicado em
Sabouraud Maltose Ágar com extrato de levedura (SMAY) - modificado e mantido a 25 ± 1ºC
e umidade relativa ≥ 80% por 30 dias. Para o preparo das suspensões, os conídios da
superfície da placa foram raspados, suspensos em solução de água destilada estéril e Tween
0,1% e quantificados em câmara de Neubauer. Após preparo da suspensão 10
8
conídios ml
-1
,
as concentrações 10
7
, 10
6
e 10
5
conídios ml
-1
foram obtidas por diluição seriada. Cada
tratamento foi constituído pela imersão dos espécimes em 1 ml de suspensão durante três
minutos enquanto o grupo controle foi exposto apenas ao diluente sem adição de conídios.
Cada grupo foi formado por 10 repetições. Para avaliação do efeito dos isolados fúngicos
sobre as fêmeas ingurgitadas, os seguintes parâmetros biológicos foram observados: peso de
postura, períodos de pré-postura, postura, incubação e eclosão, além do peso da quenógina,
necessários para a realização dos cálculos do índice nutricional e de produção de ovos. Os
parâmetros utilizados para avaliação dos isolados sobre ovos e larvas foram: percentual diário
de eclosão das larvas e percentual de mortalidade (observado a cada cinco dias até o 20º dia),
respectivamente. Os isolados de N. rileyi não foram capazes de ocasionar alterações
significativas nos parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas, exceto no percentual de
eclosão das larvas, quando a maior concentração de 10
8
conídios ml
-1
foi utilizada, e no
percentual de controle onde se obteve 17,15% e de 27,62% nas concentrações 10
5
e 10
8
conídios ml
-1
, respectivamente. Os ovos tratados com as diferentes concentrações dos isolados
de N. rileyi não apresentou diferença significativa no percentual das larvas eclodidas. O
melhor resultado obtido com o isolado Nr 177 foi sobre larvas não alimentadas, onde todas as
concentrações utilizadas demonstraram um percentual de mortalidade significativo. A
concentração 10
8
conídios ml
-1
do isolado Nr 177 de Nomuraea rileyi foi capaz de promover
um percentual de mortalidade das larvas de 14,5 e 69,5% somente no 15˚ e 20˚dia após o
tratamento, respectivamente. As demais concentrações apresentaram um percentual de
mortalidade significativo, no entanto esses resultados não foram tão satisfatórios quanto aos
obtidos com a maior concentração utilizada. O isolado Nr 151 de Nomuraea rileyi ocasionou
baixo percentual de mortalidade das larvas não alimentadas, entre 10 e 15% quando as
concentações 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
foram utizadas. Dessa forma, esses resultados
demonstram que os isolados de N. rileyi não apresentaram efeitos deletérios significativos ao
carrapato R. (B.) microplus.
Palavras-chave: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Nomuraea rileyi, Controle biológico.
ABSTRACT
TERRA, Andréia Loureiro Musso. Evaluation in vitro of Nomuraea rileyi to control
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick. 2008. 33p. Dissertation (Master of Science in
Veterinary Science, Veterinary Parasitology). Veterinary Institute, Department of Animal
Parasitology, Federal Rural University of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Rhipicephalus (Boophilus) microplus causes severe economic losses to the Brazilian cattle
raising industry. In nowadays, the control of the cattle tick is especially based on the use of
chemical acaricides. The inadequate use of these acaricides allows the development of tick’s
resistant strains and environmental contamination. Several entomopathogenic fungal species
have been investigated to control arthropod populations and, therefore, minimize the damages
caused by them. The current study investigates Nomuraea rileyi isolates (Nr 151 and Nr 177)
to control the three developmental stages of R. (B.) microplus tick. The fungal isolates were
cultivated on modified Sabouraud Maltose Agar with yeast extract (SMAY) at 25 ± 1 °C and
relative humidity (RH) higher or equal to 80% for 30 days. Conidia were harvested from the
SMAY medium surface and suspended in sterile Tween 80 0.1% aqueous solution. The
suspensions were adjusted to 10
8
conidia ml
-1
using the hemacytometer, other conidial
suspensions (10
7
, 10
6
and 10
5
conidia ml
-1
) were obtained by serial dilution (1:10). The
specimens were immersed in 1 ml of conidial suspension for three minutes, while control
groups were immersed in Tween 80 0.1% aqueous solution (no conidia). Each treatment or
control groups were composed of 10 repetitions. The effects of fungal isolates on engorged
female ticks were investigated through the evaluation of the following parameters: pre-
oviposition period, oviposition period, egg production, egg incubation and hatching period,
and dead tick weight. These data were used to calculate the Nutrient Index and Egg
Production Index. The effect of fungal isolates on egg and larva was evaluated by recording
the hatchability daily, and mortality (at every 5-day intervals), respectively. In general, N.
rileyi isolates did not cause significant alteration of engorged females’ parameters; however,
the isolate Nr 177 at 10
8
conidia ml
-1
significantly reduced larvae hatchability. The percentage
of control of engorged females exposed to N. rileyi was 17.15 or 27.62% at 10
5
or 10
8
conidia
ml
-1
, respectively. The percent hatchability of eggs exposed to N. rileyi isolates did not differ
from control group. The best result with the isolate Nr 177 was observed on non-fed larvae,
all conidial suspensions caused significant mortality rates. The isolate Nr 177 at 10
8
conidia
ml
-1
caused 14.5% and 69.5% larva mortality only at day 15 and day 20 after treatment,
respectively. Other fungal suspensions caused significant larva mortality, but the results were
not reasonable as the results observed with the fungal suspension with the highest conidia
concentration. The isolate Nr 151 caused low non-fed larva mortality rates, 10% or 15%, at
10
7
or 10
8
conidial ml
-1
, respectively. These results demonstrate that the N. rileyi isolates
investigated did not cause significant harmful effect to control R. (B.) microplus tick.
Key-words: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Nomuraea rileyi, Biological control.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Suspensões de conídios dos isolados de Nomuraea rileyi utilizados nas
diferentes fases de desenvolvimento de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus........................................................................................................................
Tabela 2. Peso médio, em gramas, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr
177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 3. Média do período de pré-postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 4. Peso médio da postura, em gramas, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 5. Média do período de postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 6. Média do período de incubação, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 7. Média do período de eclosão das larvas, em dias, de fêmeas ingurgitadas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões
conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea rileyi..........................................
Tabela 8. Média do índice nutricional (%) de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr
177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 9. Média do índice de produção de ovos (%) de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 10. Percentual médio de eclosão das larvas oriundas dos ovos de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes
suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
10
14
14
15
16
17
17
18
19
rileyi................................................................................................................................
Tabela 11. Percentual médio de controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr
177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi................................................................................................................................
Tabela 12. Percentual médio de eclosão das larvas oriundas dos ovos de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea rileyi.........................................................
Tabela 13. Percentual médio de mortalidade das larvas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais do isolado Nr
177 de Nomuraea rileyi..................................................................................................
Tabela 14. Percentual médio de mortalidade das larvas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes concentrações conidiais de do isolado
Nr 151 de Nomuraea rileyi.............................................................................................
Tabela 15. Concentrações letais, CL
50
e CL
90
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de
Nomuraea rileyi obtidas através da avaliação do percentual de mortalidade de larvas
não alimentadas de Rhipicephalus (Boophylus)
microplus........................................................................................................................
20
21
22
23
23
24
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Carrapato dos bovinos.............................................................................................
2.2 Controle Biológico – Fungos Entomopatogênicos..................................................
2.3 Nomuraea rileyi.......................................................................................................
2.4 Mecanismos de Penetração dos Fungos Entomopatogênicos .................................
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização do Experimento ...................................................................................
3.2 Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos ......................................................
3.3 Avaliação Morfológica dos Isolados .......................................................................
3.4 Elaboração das Suspensões e Quantificação dos Inóculos ......................................
3.5 Viabilidade das Suspensões de Conídios .................................................................
3.6 Delineamento Experimental .....................................................................................
3.7 Obtenção de Rhipicephalus (Boophilus) microplus .................................................
3.8 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas ........................................................................
3.9 Bioensaio com Ovos..................................................................................................
3.10 Bioensaio com Larvas................................................................................................
3.11 Reisolamento dos Isolados Fúngicos após o Bioensaio.............................................
3.12 Análise Estatística................. ....................................................................................
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação Morfológica dos Isolados ........................................................................
4.2 Viabilidade das Suspensões de Conídios ..................................................................
4.3 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus........
4.3.1 Peso médio das fêmeas ingurgitadas......................................................................
4.3.2 Período de pré-postura ..........................................................................................
4.3.3 Peso da postura......................................................................................................
4.3.4 Período de postura ................................................................................................
4.3.5 Período de incubação ............................................................................................
4.3.6 Período de eclosão das larvas ...............................................................................
4.3.7 Índice nutricional ..................................................................................................
4.3.8 Índice de produção de ovos ...................................................................................
4.3.9 Percentual de eclosão.............................................................................................
4.3.10 Percentual de controle ...........................................................................................
4.4 Bioensaio com Ovos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.............................
4.5 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus..
4.6 Reisolamento Fúngico...............................................................................................
4.7 Considerações Finais.................................................................................................
5 CONCLUSÕES
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
3
3
4
6
8
9
9
9
9
9
10
10
10
10
12
12
12
12
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13
13
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14
14
15
16
16
17
18
19
20
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23
25
25
26
27
1 INTRODUÇÃO
A pecuária bovina apresentou nas últimas décadas um aumento considerável na
produtividade, decorrente principalmente da melhoria genética dos rebanhos, da conversão
alimentar e das técnicas reprodutivas. Junto aos benefícios surgiram também inúmeros
problemas sanitários.
A melhoria das pastagens com maior número de animais por área, o desmame precoce
e a criação de animais confinados, favoreceu largamente os parasitas nas raças bovinas mais
produtivas, a ponto de hoje em dia, não ser mais possível a criação econômica de bovinos sem
um combate sistemático aos seus principais endo e ectoparasitas.
O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus também conhecido no Brasil como
carrapato dos bovinos, originou-se provavelmente na Ásia e se adaptou perfeitamente aos
países tropicais, onde o calor e a umidade propiciam condições favoráveis à sobrevivência e à
manutenção dessa espécie.
Rhipicephalus (Boophilus) microplus é considerado um dos mais importantes
ectoparasitas da pecuária brasileira, pois são responsáveis por perdas econômicas severas
devido à transmissão de patógenos, à desvalorização do couro e à baixa conversão alimentar e
geram gastos no seu controle que giram em torno de dois bilhões de dólares por ano.
O homem desenvolveu vários métodos para o controle do carrapato R. (B.) microplus,
no entanto, nem todos foram capazes de resolver o problema, e a solução imediatista sempre
fora o uso de substâncias químicas acaricidas. Essas drogas determinam o aparecimento de
populações de carrapatos resistentes e a permanência de resíduos em produtos de origem
animal e no meio ambiente, tornando a busca por alternativas para o controle do carrapato
uma questão fundamental em respeito à integridade do ecossistema.
Apesar do progresso alcançado nas décadas anteriores nos programas de controle de
artrópodes utilizando os agentes químicos, esse carrapato ainda representa um risco constante
para a população de bovinos, sendo de fundamental importância o conhecimento da relação
“artrópode - agente patogênico - hospedeiro”, para que dessa forma, haja o desenvolvimento
de um método de controle efetivo.
O controle biológico pode representar uma alternativa mais econômica e viável
quando comparado à utilização de inseticidas químicos, pois a maioria desses acaricidas
apresentam amplo espectro de atuação e acabam por dizimar outros artrópodes
ecologicamente importantes.
Os métodos de controle microbiano utilizando fungos entomopatogênicos apresentam
satisfação do ponto de vista econômico e ecológico, sendo recomendado para controle de
pragas. A maioria desses entomopatógenos são altamente especializados na penetração via
tegumento, o que é uma grande vantagem no caso específico dos carrapatos, já que a infecção
oral é inviável para esses artrópodes hematófagos obrigatórios.
Os principais fungos entomopatogênicos, Beauveria bassiana e Metarhizium
anisopliae, são descritos como agentes patogênicos no controle biológico de insetos e a
eficácia de ambos foi comprovada experimentalmente para os diferentes estágios evolutivos
de carrapatos em diversos estudos. A avaliação de outras espécies de fungos
entomopatogênicos, no entanto, é necessário para selecionar aquela com maior potencial de
controle de carrapatos.
O fungo Nomuraea rileyi apresenta grande contribuição em surtos epizoóticos anuais
sobre populações da lagarta Anticarsia gemmatalis, importante praga na cultura da soja,
ampliando sua atuação como possível agente promissor no controle microbiano de outros
1
artrópodes. Dessa forma, o presente estudo avaliou o efeito in vitro de N. rileyi sobre as
diferentes fases evolutivas do carrapato R. (B.) microplus.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Carrapato dos Bovinos
Os principais carrapatos de importância econômica que ocorrem no Brasil pertencem à
família Ixodidae. Dentre eles está o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Canestrini, 1887, que é uma das espécies mais relevantes para pecuária do nosso país
(BITTENCOURT, 2000).
O carrapato R. (B.) microplus é originário da Ásia e foi introduzido no Brasil junto
com os primeiros bovinos trazidos pelos colonizadores, onde se adaptou perfeitamente ao
nosso clima, distribuindo-se por todo o território nacional, com algumas poucas exceções das
regiões que possuem baixa precipitação pluviométrica (BARCI,1997). É conhecido como
carrapato dos bovinos, mas em altas infestações na pastagem pode parasitar outros mamíferos
como eqüinos, caprinos, ovinos, caninos, o homem (GONZALES, 1975), além de búfalos,
gatos, coelhos, cangurus, porcos e onças (PEREIRA, 1980).
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tem distribuição entre os paralelos 32º Norte e
32º Sul, delimitando ao Norte, o Sul dos Estados Unidos, meio do México e Norte da África,
ao Sul, o extremo Sul do Brasil, meio do Uruguai e da Argentina e Sul da Austrália
(GONZALES, 1995). De acordo com Furlong e Evans (1991), no Brasil, R. (B.) microplus
encontra condições climáticas favoráveis ao seu desenvolvimento, do extremo Sul em direção
ao Norte ou Nordeste, possibilitando-lhe completar de dois, três, quatro e potencialmente até
cinco gerações por ano, em locais com temperaturas médias anuais acima de 17º C.
O ciclo de vida de R. (B.) microplus divide-se em uma fase de vida livre e uma fase de
vida parasitária. A fase de vida livre inicia-se com a queda da fêmea ingurgitada que se
desprende do hospedeiro, caindo ao solo para realizar a postura. O período de pré-postura
dura de dois a três dias passando posteriormente à fase de ovopostura, que dura em torno de
17 dias podendo se estender a mais de 90 e, em seguida, à fase de eclosão que dura em média
de 22 a 30 dias e, após um período de quatro a 20 dias, em condições de umidade e
temperatura favoráveis, as larvas não alimentadas então se tornam infestantes (GONZALES,
1974).
A fase de vida parasitária inicia-se quando a larva infestante instala-se no hospedeiro,
iniciam a alimentação passando por várias ecdises até chegar ao estádio adulto, em que as
fêmeas fecundadas e ingurgitadas se desprendem do hospedeiro e caem ao chão
(GONZALES, 1974). Esse período pode variar em média de 18 a 26 dias na região do Brasil-
Central (FURLONG, 1993).
A temperatura é um importante fator regulador no desenvolvimento do carrapato R.
(B.) microplus. Toda sua biologia é influenciada por esse fator, sendo que os diferentes
tempos de evolução desta espécie são encurtados em temperaturas elevadas, e prolongadas em
temperaturas mais amenas (GLÓRIA et al., 1993). Estações secas severas podem limitar a
sobrevivência do carrapato, podendo ir até a completa paralisação na incubação, postura, e até
mesmo o fracasso desses estágios.
O carrapato dos bovinos é um parasita de alta importância, produzindo perdas diretas e
indiretas pela transmissão de patógenos e pelo custo de seu controle. Ainda hoje, apresenta
alta incidência e prevalência no Brasil e em países desenvolvidos de clima tropical, devido à
complexidade dos fatores envolvidos e ao desconhecimento dos produtores sobre informações
específicas necessárias à adoção de práticas efetivas no controle desse ectoparasito em suas
propriedades (ROCHA et al., 2006).
O carrapato R. (B.) microplus é também vetor de diversos agentes infecciosos, tais
como: bactérias, protozoários, rickétsias e vírus, sendo o principal vetor do Anaplasma
3
marginale, Babesia bovis e B. bigemina responsáveis por mortes de bezerros ou de animais
adultos que não tenham sido previamente expostos ao carrapato. Essas doenças formam um
complexo conhecido como tristeza parasitária dos bovinos (FERNANDES et al., 2002).
Os animais parasitados apresentam perda de peso, baixa produtividade e
desvalorização de seu couro (BITTENCOURT, 2000). De acordo com Furlong (1993), os
prejuízos causados pelo carrapato aos bovinos se processam de várias maneiras e quanto a
espoliação sanguínea é geralmente causada pelas teleóginas, já que larvas, ninfas e machos
são pequenos e tem como predominância na sua alimentação a linfa e substratos teciduais. |O
volume ingerido por cada fêmea de R. (B.) microplus varia entre 0,5 e 3 ml de sangue
(SEIFER, 1971; GONZALES, 1975).
Estima-se que os prejuízos econômicos ocasionados pelo carrapato R. (B.) microplus
no Brasil seja em torno de 2 bilhões de dólares por ano (GRISI et al., 2002) devido a gastos
com carrapaticidas, mão de obra para sua administração e pela perda na produtividade do
rebanho (HORN; ARTECHE, 1985).
A principal forma de controle até o presente momento consiste no emprego de
acaricidas químicos. No entanto, o uso continuado desses produtos e a utilização de forma
inadequada dos mesmos têm ocasionado problemas quanto à resistência e a contaminação do
meio ambiente (CASTRO et al., 1997). Desde a década de 40, com o surgimento de
indivíduos resistentes aos produtos arsenicais, uma sucessão de produtos de outras bases
químicas foi lançada no mercado mundial para evitar os problemas de resistência que são
emergentes a intervalos cada vez mais curtos (WHARTON E ROULSTON, 1970).
Rocha e Leite (2006) em entrevista a produtores de leite da região de Divinópolis,
MG, demonstraram a falta de conhecimento necessário para a realização de um combate
racional dos carrapatos, assim como os prejuízos que podem ser causados por esses parasitos
no sistema produtivo. Santos Jr et al. (2000) relataram que não existe uma preocupação dos
proprietários com a eficiência dos tratamentos acaricidas, acarretando assim fracassos no
controle e aumento de gastos representado pelo elevado número de tratamentos.
O aumento da resistência de R. (B.) microplus aos pesticidas, seu alto preço, associado
ao crescimento da demanda pública pela segurança em alimentos e à preocupação com um
meio ambiente menos poluído, estão gerando um aumento na procura de meios alternativos
para o controle desse carrapato (SAMISH, 2000), encorajando os pesquisadores a buscarem
continuamente novos métodos de controle e aplicá-los de forma integrada no combate a este
parasita (BARROS; EVANS, 1989).
2.2.Controle Biológico – Fungos Entomopatogênicos
O controle biológico pode ser definido como quaisquer atividades envolvendo a
manipulação de inimigos naturais tais como predadores, parasitas ou patógenos com o
objetivo de reduzir ou suprimir uma população animal ou vegetal que represente uma praga.
Um programa completo de controle biológico cobre uma gama de atividades, desde a simples
conservação de inimigos naturais, através de criteriosa seleção de um pesticida que lhes seja
menos tóxico, até a liberação ou introdução de inimigos naturais numa área onde se
encontram os hospedeiros alvos (MORETTI, 2007).
O uso do controle microbiano apresenta diversas vantagens, incluindo a segurança para
humanos e organismos não alvos, redução de resíduos químicos no meio ambiente e nos
alimentos, preservação de endemias naturais e aumento da biodiversidade em ecossistemas
controlados (LACEY et al., 2001). Além disso, após os patógenos se estabelecerem numa
determinada área de cultivo, a doença pode assumir caráter enzoótico, dificultando o
desenvolvimento dos insetos e impedindo que os mesmos ocasionem danos econômicos à
lavoura. Esse fato pode estar relacionado aos efeitos secundários ocasionados a geração futura
4
da população desses insetos, diminuindo a oviposição, a viabilidade dos ovos e o aumento da
sensibilidade a outros produtos biológicos e químicos (ALVES, 1998).
A conservação e utilização de agentes de controle biológico dentro de
agroecossistemas é uma das principais estratégias adotadas no manejo integrado de pragas e
para que isso ocorra, é necessário conhecer a ação dos produtos fitossanitários de origem
química, sua seletividade e/ou compatibilidade sobre o inimigo natural em questão (FILHO et
al., 2003). Os entomopatógenos ocorrem naturalmente e são considerados como importante
fator regulador nas populações de artrópodes. Muitas espécies são empregadas como agentes
de controle biológico de insetos praga em pomares, gramados, produtos armazenados e para
redução de insetos pestes e vetores de importância médica e veterinária (LACEY et.al., 2001).
A história da pesquisa de fungos patogênicos para invertebrados foi relatada há
milhares de anos, onde a observação de microrganismos em alguns insetos era possível a olho
nu, iniciando assim um amplo campo de estudos na patologia dos invertebrados
(CASTRILHO et al., 2005).
O primeiro pesquisador a comprovar a natureza infecciosa de um fungo como agente
microbiano sobre um inseto foi Agostino Bassi, em 1835, relatando o fungo Beauveria
bassiana como causador da doença “muscardine branca” no bicho-da-seda (ALVES, 1998).
Atualmente cerca de 750 espécies de fungos são conhecidas como patógenos de
artrópodes que habitam o meio aquático, solos e plantas (FUXA, 1987; MCCOY, 1990;
HAJEK; St LEGER, 1994, LACEY et al., 2001). Alguns fungos são conhecidos e utilizados
no controle microbiano de insetos no qual podemos citar: B. bassiana controlando larvas de
mosquitos e moscas; B. brongniartii controlando baratas; M. anisopliae controlando
cigarrinha da cana-de-açúcar (Mahanarva posticata), cigarrinha das pastagens (Deois zulia), a
broca da cana (Diatraea saccharalis), o percevejo da soja (Nezara sp e Piezodorus sp) e
insetos da família Reduviidae; Nomuraea rileyi controlando membros das ordens Coleoptera,
Lepidoptera e Orthoptera e Isaria fumosorosea (= Paecilomyces fumosoroseus) controlando
larvas de mosquitos e moscas (MORETTI, 2007).
Esses entomopatógenos vêm sendo estudados no Brasil há mais de sessenta anos.
Todavia, foi somente depois de 1964, com a ocorrência epizoótica de M. anisopliae sobre as
cigarrinhas da cana-de-açúcar, que os fungos receberam mais atenção dos pesquisadores.
Mais de 50% dos trabalhos publicados no Brasil sobre patologia de insetos e controle
microbiano são sobre fungos entomopatogênicos, sendo que 90% deles foram desenvolvidos
somente nas duas últimas décadas (ALVES, 1998).
Os fungos entomopatogênicos são patógenos de largo espectro e a maioria é altamente
especializada na penetração via tegumento (ALVES, 1998), o que é uma grande vantagem
quando comparado com outros patógenos, pois a infecção oral é praticamente nula para os
artrópodes hematófagos. Além disso, podem infectar diferentes estágios de desenvolvimento
dos hospedeiros, como ovos, pupas e adultos, sendo esta característica desejável e muito
peculiar desse grupo (KAAYA et al.,1991). Muitos dos esporos produzidos pelo fungo no
hospedeiro são carreados através do vento ou da chuva e em contato com outros artrópodes
alvos podem propagar um outro quadro de infecção a longa distância (ALVES, 1998).
Vários inimigos naturais do carrapato R. (B.) microplus são descritos na literatura:
alguns invertebrados como formigas, aranhas e dípteros, e vertebrados como roedores, aves e
anfíbios. Fungos, bactérias e nematóides também são considerados agentes patogênicos que
podem controlar populações desse artrópode (BITTENCOURT, 2000; VERÍSSIMO, 1995).
Atualmente é crescente o número de trabalhos publicados por pesquisadores na área de
controle microbiano (SAMISH; REHACED, 1999). Samish e Rehaced (1999) revisaram mais
de 100 espécies de patógenos e aproximadamente 150 predadores associados com carrapatos,
o que representa um amplo arsenal de espécies com uso potencial como agentes de
biocontrole.
5
A ação de fungos sobre o carrapato R. (B.) microplus foi avaliada pela primeira vez
por Connole (1969), que testou 156 extratos de diferentes fungos mantidos em coleção e
obtidos através de centrifugação. O material obtido foi inoculado na hemocele dos carrapatos
e os resultados mais promissores foram com Arpergillus niger que promoveu a inibição da
postura em 50% dos espécimes testados.
A pesquisa relativa ao uso de microorganismos ainda é incipiente, contudo várias
pesquisas têm sido realizadas através de infecções experimentais utilizando fungos
entomopatogênicos (ATHAYDE et al., 2001). Diversos trabalhos em condições controladas
avaliaram os efeitos das suspensões de vários isolados de B. bassiana ou M. anisopliae sobre
as diferentes fases de desenvolvimento do carrapato R. (B.) microplus (BITTENCOURT et
al., 1992, 1994a, 1994b, 1995).
Alves et al. (1993) compararam um isolado do fungo B. bassiana e um isolado de M.
anisopliae sobre ovos de R. (B.) microplus, e relataram que apesar de B. bassiana ser
patogênica, a eficiência de M. anisopliae havia sido superior.
Bittencourt et al. (1992, 1994a, 1994b) avaliaram a ação de dois isolados de M.
anisopliae sobre o carrapato R. (B.) microplus e observaram as seguintes alterações: aumento
no período de pré-postura e eclosão das larvas, e diminuição do período de postura, índice de
produção de ovos e percentual de eclosão das larvas, demonstrando seu efeito patogênico
sobre R. (B.) microplus. Em outro estudo, Bittencourt et al. (1995) testaram in vitro
suspensões dos isolados 747 e 986 (ESALQ/ USP) do fungo B. bassiana sobre ovos e larvas
da mesma espécie de carrapato e obtiveram redução do percentual de eclosão e aumento na
mortalidade das larvas.
Alguns estudos demonstraram que conídios de Metarhizium sp. formulados em
solução oleosa causaram altas taxas de mortalidade quando comparados com as suspensões
aquosas (CASTENEIRAS et al., 1987; KAAYA et al., 1996; MONTEIRO et al.,1998;
LEEMON; JONSSON, 2007.). A vantagem da utilização da formulação oleosa é sua
excelente adesão à cutícula hidrofóbica de artrópodes (PRIOR et al.,1988), além dos conídios
lipofílicos, como os de Metarhizium sp., serem mais facilmente suspensos em óleo e
manterem sua viabilidade por maior período de tempo (DAOUST et al., 1983). Portanto, é
uma excelente área de estudo para o desenvolvimento de futuros trabalhos ao nível de campo,
buscando a descoberta de um bioacaricida eficaz.
Bahiense (2007) relatou a eficácia dos fungos entomopatogênicos M. anisopliae e B.
bassiana associados a deltametrina sobre uma cepa resistente do carrapato R. (B.) microplus
em teste de estábulo. Essa associação do acaricida com os fungos resultou no controle da cepa
do carrapato, demonstrando que a utilização simultânea dos acaricidas em bovinos infestados
pode ser possível e, além disso, pode atuar como ferramenta para o manejo integrado no
controle desse carrapato. Portanto, a compatibilidade dos fungos entomopatogênicos com
agroquímicos pode melhorar o potencial de controle, já que as substâncias sintéticas podem
atuar como estressantes, facilitando a infecção fúngica (SOSA-GOMEZ, 2005).
A perspectiva da utilização de fungos entomopatogênicos contra carrapatos e o
desenvolvimento de novas tecnologias para a aplicação desses produtos biológicos irão
contribuir para melhorias na produção animal e para minimizar os danos ecológicos
(ATHAYDE, et al., 2001).
2.3.Nomuraea rileyi
Os fungos foram os primeiros patógenos de insetos a serem utilizados no controle
microbiano, e a maioria dos gêneros de fungos entomopatogênicos já relatados ocorre no
Brasil, sendo que destes, mais de 20 incidem sobre pragas de importância econômica para a
agricultura.
6
Nomuraea rileyi (Farlow) Samson é um fungo anamórfico pertencente a Classe
Ascomycetes. Segundo Ignoffo (1981), a utilização dessa espécie é segura para humanos e
outros organismos não alvo, facilitando o seu uso no controle de pragas específicas, incluindo
insetos parasitas e predadores. É uma espécie cosmopolita e apresenta potencial para controle
de diversas pragas de insetos de importância econômica.
Esse fungo ocorre naturalmente em mais de 32 espécies de insetos das ordens
Coleoptera, Ortoptera e Lepidoptera em várias regiões do mundo, e cerca de 90% dos
hospedeiros susceptíveis pertencem a essa última ordem, tais como: Helicoverpa armigera
(Hubner), Spodora litura (Fabricius), Plusia sp que atacam plantios de feijão, girassol,
algodão e tomate (VIMALA DEVI et al., 1996). Outras espécies de insetos de importância
agrícola são susceptíveis a N. rileyi, dentre elas estão: Alabama argillacea e Trichoplusia ni
que atacam plantios de algodão, Anticarsia gemmatalis e Plusia sp. no plantio da soja, e
Cirphis latiuscula e Diatraea saccharalis que ocasionam prejuízos no plantio da cana-de-
açúcar (ALVES, 1998).
No Brasil, dentre os hospedeiros susceptíveis destaca-se a lagarta da soja, que pode ser
acometida pela doença branca causada por esse fungo entomopatogênico, considerado o mais
importante agente de controle natural deste inseto. As lagartas são infectadas pelos conídios
do fungo presentes sobre as folhas ou no solo, ficando endurecidas e recobertas por uma
camada branca devido ao desenvolvimento externo do micélio, tornando-se verdes com a
produção dos conídios (GAZZONI; YORINIORI, 1995; SUJII et al., 2001).
Os altos índices obtidos no controle natural da lagarta da soja sugerem N. rileyi ( como
um importante agente a ser usado em programas integrados de pragas. Esse fungo promove
epizootias sob certas condições ambientais, principalmente em períodos chuvosos e sob
temperaturas amenas, sendo capaz de reduzir drasticamente as populações deste inseto
(CORREA & SMITH, 1975; CARNER, 1980; IGNOFFO, 1981; LECUONA, 1990). No
centro-sul do Brasil, a presença do fungo impede que o inseto atinja um nível de dano
econômico, evitando assim a aplicação de defensivos agrícolas contra essa praga (FARIA et
al., 1993).
Testes realizados a campo por Ignoffo (1981) com N. rileyi sobre Trichoplusia ni
mostraram mortalidade de 67% das lagartas e uma redução na capacidade reprodutiva da
população do inseto. A morte do hospedeiro ocorre por volta do sexto dia e o ciclo se
completa com a formação dos conídios, sob temperatura de 25ºC, entre oito a doze dias após o
inicio do quadro de infecção. Estes dados sugerem que N. rileyi pode facilitar o controle
químico, e também ser utilizado como agente profilático antes da ocorrência da praga.
Esse mesmo autor relata experimentos com concentrações de 10
10
a 10
13
conídios/0,4
ha, utilizados na aplicação dos diferentes estádios de desenvolvimento da lagarta Helicoverpa
zea, onde o melhor desempenho ocorreu na redução da população de primeiro e segundo
ínstares expostos às concentrações mais elevadas.
A origem geográfica e as condições de cultivo, envolvendo meios, temperaturas,
umidade etc, podem interferir na patogenicidade dos isolados de N. rileyi e outros fungos
entomopatogênicos. A virulência e o espectro de hospedeiros dos isolados podem ser
previstos com maior exatidão através de bioensaios (IGNOFFO; BOUCIAS, 1992). Estudo
realizado com isolados de B. bassiana de diferentes regiões geográficas do território brasileiro
e norte-americano demonstraram variações genéticas significativa, evidenciando que a
distância geográfica é um fator importante na variabilidade genética (FERNANDES, 2007).
O solo representa um dos maiores reservatórios de inóculos de N. rileyi, cujos
clamidósporos podem permanecer viáveis por até 12 semanas, sendo a temperatura favorável
para o crescimento do fungo em torno de 26°C e a umidade relativa entre 60 a 100%
(PENDLAND, 1982). O fungo pode permanecer viável por períodos maiores, sobre os
7
cadáveres do inseto no solo, na forma de clamidósporos ou hifas, fornecendo o inóculo para
formação dos focos primários da doença no ano seguinte (IGNOFFO, 1981).
2.4. Mecanismos de Penetração dos Fungos Entomopatogênicos
Os fungos entomopatogênicos desenvolvem distintas estratégias para infectar seus
hospedeiros, variando consideravelmente o modo de ação, virulência e especificidade. A
adesão dos conídios na superfície do hospedeiro e a penetração são os eventos iniciais do
processo patogênico e parecem estar envolvidos com mecanismos de adesão não específicos,
mediados pela característica hidrofóbica dos conídios (ARRUDA et al., 2005).
Vinte e quatro horas após o início da infecção ocorrem a adesão e germinação dos
conídios sobre a superfície do hospedeiro. Neste período, o tubo germinativo se diferencia
para formar o apressório, exercendo pressão mecânica e secreção de enzimas hidrolíticas.
Essa combinação de mecanismos físicos e enzimáticos é utilizada pelos fungos
entomopatogênicos para transpor a cutícula do hospedeiro. A produção de quitinases e
proteases é peça chave para penetração que é observada 72 horas após contato com a
superfície do artrópode (ARRUDA et al., 2005). Em seguida, ocorre a colonização do
hospedeiro, onde as hifas que penetraram sofrem um engrossamento e se ramificam na
hemocele (ALVES, 1998).
A colonização do fungo no interior do hospedeiro se dá nos diversos órgãos e
apresenta, provavelmente, a seguinte seqüência: corpos gordurosos, sistema digestivo e tubos
de Malpighi, hipoderme e sistema nervoso, músculos e traquéias, culminando na morte do
hospedeiro. Após 96 horas, a hifa começa a emergir para a superfície da cutícula, iniciando o
processo de conidiogênese. Após a formação dos propágulos infectivos (conídios), estes se
dispersam pelo ambiente, auxiliados por fatores bióticos a abióticos, tais como: vento, chuva,
homem, animais, etc. (ALVES, 1998).
Os fungos também produzem micotoxinas que contribuem para a mortalidade do
hospedeiro, provocando a diminuição do ingurgitamento, da fecundidade e do percentual de
eclosão das larvas. A mortalidade dos carrapatos está relacionada à concentração de conídios,
ou seja, ocorre uma relação entre o percentual de mortalidade e o número de conídios que o
recobre: quanto maior o número de conídios, maior será a taxa de mortalidade (KAAYA et
al., 1996; BITTENCOURT, 2000).
Todas as fases do ciclo das relações patógeno-hospedeiro, principalmente germinação,
penetração e reprodução, são muito dependentes das condições ambientais, como temperatura,
umidade e radiação ultravioleta.
8
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1.Localização do Experimento
A avaliação do efeito do fungo N. rileyi sobre as diferentes fases do carrapato R. (B.)
microplus foi realizada no período entre junho e novembro de 2007, no Laboratório de
Controle Microbiano, localizado na Estação Experimental para Pesquisas Parasitológicas
Wilhemn Otto Neitz (EEPPWON), do Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de
Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, situado em Seropédica - RJ,
entre os paralelos 22º49’ e 22º45’ de latitude sul, e os meridianos 43º38’ e 43º42’ de
longitude oeste de Greenwich, com altitude de 33 metros e clima do tipo subtropical.
3.2.Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos
Os isolados Nr 151 e Nr 177 do entomopatógeno N. rileyi foram cedidos pela
EMBRAPA/Soja ao Laboratório de Controle Microbiano e repicados em placas de Petri
contendo meio de cultura Sabouraud Maltose Agar com Extrato de Levedura (SMAY
modificado) acrescido de 10g de Extrato de Levedura e mantidos em câmara climatizada tipo
BOD sob temperatura de 25 ± 1ºC e umidade relativa ≥ 80% por 30 dias.
O isolado Nr 151 oriundo de Brasília - Distrito Federal, foi originalmente isolado do
hospedeiro Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) em 1996 e o isolado Nr 177,
oriundo de Warta, Londrina – Paraná, foi isolado do mesmo hospedeiro, em 1999.
3.3.Avaliação Morfológica dos Isolados
Os aspectos morfológicos de N. rileyi foram observados 30 dias após o cultivo dos
isolados em placas de Petri, como descrito no item 3.2. A descrição das características
macromorfológicas foi realizada através dos seguintes parâmetros: taxa de crescimento
através da mensuração do diâmetro da colônia, aspecto e coloração das colônias e seus
reversos. As características micromorfológicas foram avaliadas através da técnica de
microcultivo entre lâmina e lamínula (RIVALIER; SEYDEL, 1932), mantidas sob condições
de temperatura e umidade descritas no item 3.2, durante 30 dias. As lâminas foram coradas
com Lactofenol de Amman com azul de algodão segundo Hawksworth (1977).
3.4.Elaboração das Suspensões e Quantificação dos Inóculos
As soluções conidiais foram preparadas a partir do cultivo dos isolados de N. rileyi em
placas de Petri, contendo meio de cultura SMAY modificado. Para o preparo de suspensão
com concentração de 10
8
conídios ml
-1
, a superfície da placa de Petri foi raspada com auxílio
de um cabo e lâmina de bisturi e os conídios suspensos em 30 ml de água destilada estéril e
espalhante adesivo Tween 80 0,1% (LUZ et al., 1998). A suspensão foi quantificada em
Câmara de Neubauer sob microscópio óptico, segundo Alves (1998).
As suspensões 10
7
, 10
6
e
10
5
conídios ml
-1
foram preparadas através de diluição
seriada a partir da suspensão 10
8
conídios ml
-1
. Desse modo, 2 ml da suspensão 10
8
conídios
ml
-1
acrescida de 18 ml de água destilada estéril e Tween 80 0,1%, resultam na concentração
de 10
7
conídios ml
-1
. A mesma metodologia foi utilizada para o preparo das demais
concentrações.
9
3.5.Viabilidade das Suspensões de Conídios
Uma amostra de 0,1 ml da suspensão de 10
5
conídios ml
-1
de cada isolado foi colocada
em placas de Petri contendo meio de cultura SMAY modificado e antibiótico (500mg de
cloranfenicol : 1 litro de meio de cultura)., para avaliação da viabilidade dos conídios de N.
rileyi. Uma outra amostra também foi feita utilizando o mesmo meio de cultura e a mesma
concentração de conídios ml
-1
, porém sem a adição do cloranfenicol, para se avaliar a
influência do antibiótico sobre a germinação fúngica. As placas foram mantidas em câmara
climatizada a 25 ± 1ºC e umidade relativa ≥ 80% e realizada a contagem de conídios
germinados e não germinados diariamente até o 4º dia. A germinação dos conídios foi
observada utilizando microscópio óptico com magnitude de 400X e um número mínimo de
300 conídios por placa foi avaliado. O percentual de conídios viáveis foi calculado através da
divisão do número de conídios germinados pelo número total de conídios contados (Alves,
1998).
3.6. Delineamento Experimental
Para realização do experimento foram preparadas quatro suspensões conidiais nas
concentrações 10
5
, 10
6
, 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
e uma solução controle sem adição de
conídios. No grupo controle foi utilizado somente uma solução de água destilada e Tween 80
a 0,1%. Cada grupo foi formado por dez repetições. As concentrações utilizadas nos
bioensaios de cada fase de desenvolvimento de R. (B.) microplus estão demonstradas na
Tabela 1.
Tabela 1. Suspensões de conídios dos isolados de Nomuraea rileyi utilizados nas diferentes
fases de desenvolvimento de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Fêmeas ingurgitadas Ovos Larvas
1,5 × 10
8
con. ml
-1
4,3 × 10
8
con. ml
-1
2,9 × 10
8
con. ml
-1
Nr 177
1,0 × 10
8
con. ml
-1
4,8 × 10
8
con. ml
-1
5,6 × 10
8
con. ml
-1
Nr 151
3.7.Obtenção de Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Dois bezerros foram infestados artificialmente na Estação Experimental com larvas
oriundas de 300mg de ovos, durante três dias consecutivos. As fêmeas ingurgitadas foram
coletadas do piso da baia e após a coleta, as fêmeas foram levadas ao Laboratório de Controle
Microbiano, lavadas em água corrente e posteriormente imersas em uma solução de
hipoclorito de sódio a 1% por três minutos para assepsia da cutícula. Após serem secas em
papel toalha estéril, parte das fêmeas foi submetida ao tratamento e outra parte mantida em
placas de Petri em câmara climatizada a 27 ±1 ºC e umidade relativa ≥ 90% para obtenção de
ovos e larvas.
3.8. Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas
Para a homogeneização do peso das fêmeas ingurgitadas destinadas ao tratamento, o
número de classes foi calculado através da fórmula de Yule (SAMPAIO, 2002) em função do
número de observações (n). O intervalo de classe utilizado foi de 8 mg sendo o valor mínimo
para o peso das fêmeas 200 mg e o valor máximo para a mesma variável 280 mg.
10
Para a formação dos grupos, uma fêmea de cada classe foi escolhida aleatoriamente,
formando grupos com dez repetições. Após formação desses grupos, procedeu-se a pesagem
individual das fêmeas, seguida pela sua identificação e seu respectivo tratamento.
As fêmeas ingurgitadas foram imersas em 1 ml de suspensão conidial, em tubos de
ensaio por um período de três minutos. As fêmeas do grupo controle foram imersas em 1 ml
de solução de água destilada estéril e Tween 80 0,1%. Após o tratamento, o excesso da
suspensão foi retirado com ajuda de um papel toalha e, as fêmeas, devidamente identificadas,
foram fixadas em fita dupla face adesiva, em placas de Petri, e mantidas em câmara
climatizada sob condições ideais já descritas no item 3.7.
A massa de ovos oriunda de cada fêmea foi coletada e pesada diariamente, armazenada
em pequenos frascos de vidro vedados com algodão hidrófilo e mantidos em câmara
climatizada sob condições já descritas. O percentual de eclosão das larvas foi acompanhado
diariamente.
Os parâmetros biológicos utilizados para avaliar o efeito dos isolados de N. rileyi sobre
fêmeas ingurgitadas foram: peso inicial das fêmeas (relativo ao peso de cada fêmea antes de
submetê-la ao tratamento), período de pré-postura (período de dias compreendido entre o
desprendimento da fêmea ingurgitada e o início da postura), peso de postura (somatório dos
pesos diários das posturas), período de postura (período compreendido entre o primeiro e
último dia da postura), período de incubação (período de dias compreendido entre o início da
postura e a eclosão das primeiras larvas), período de eclosão (dias compreendido entre o
início e o término da eclosão), percentual de eclosão das larvas (estimativa visual do
percentual de larvas eclodidas em relação à massa de ovos), peso da quenógina (peso de cada
fêmea três dias após o término de sua postura).
Esses parâmetros foram observados para permitir o cálculo dos Índices de Produção de
Ovos (IPO) e Nutricional (IN), que foram obtidos através das equações a seguir, segundo
Bennett (1974):
IPO = peso da massa de ovos (g) × 100
peso inicial da fêmea ingurgitada (g)
IN = peso da massa de ovos (g) × 100
peso da teleógina (g) – peso da quenógina (g)
Para a obtenção do Percentual de controle de R. (B.) microplus exercido pelo fungo N.
rileyi, foi calculada a Reprodução Estimada (RE). Ambos os cálculos foram realizados de
acordo com Drummond et al., (1971) e obtidos através das seguintes equações:
RE = peso da massa de ovos (g) × % eclosão larvas × 20000
peso da teleógina (g)
Percentual de controle = média RE (controle) – média RE (tratado) × 100
média RE (controle)
11
3.9. Bioensaio com Ovos
No décimo dia de postura das fêmeas não tratadas (mantidas incubadas para postura),
os ovos foram pesados, separados em alíquotas de 50 mg e acondicionados em tubos de
ensaio devidamente vedados com algodão hidrófilo. Para realizar o tratamento, os ovos foram
imersos em 1 ml de suspensão conidial por 3 minutos, e cada grupo era formado por 10
repetições . Após o tratamento, os tubos de ensaio foram mantidos em câmara climatizada sob
condições de umidade e temperatura descritas no item 3.7, e o percentual de eclosão das
larvas foi avaliado diariamente.
3.10. Bioensaio com Larvas
Parte da postura das fêmeas foi pesada e separada em alíquotas de 50 mg no décimo
dia de postura. Os ovos foram acondicionados em tubos de ensaio, mantidos em câmara
climatizada até a completa eclosão das larvas. Os tubos de ensaio que não apresentaram
eclosão superior a 95% não foram utilizados no bioensaio. O tratamento ocorreu no 15º dia
após o início da eclosão das larvas e a metodologia utilizada para o bioensaio com as larvas de
R. (B.) microplus foi a mesma descrita para fêmeas ingurgitadas e ovos. A estimativa do
percentual de mortalidade das larvas foi observada a cada cinco dias, até o 20º dia após a
realização do tratamento das mesmas.
3.11. Reisolamento dos Isolados Fúngicos após o Bioensaio
As quenóginas do grupo controle e dos grupos tratados com as suspensões conidiais
foram colocadas em câmara úmida e incubadas em câmara climatizada sob temperatura de 27
±1 ºC e umidade relativa ≥ 90% para facilitar o desenvolvimento de N. rileyi. Após 30 dias, as
quenóginas foram transferidas para meio de cultura SMAY modificado em placas de Petri
com para posterior confirmação das características macro e micromorfológicas.
3.12. Análise Estatística
Para análise dos dados referentes ao peso inicial das fêmeas, período de pré-postura,
peso de postura, período de postura, período de incubação, período de eclosão e peso da
quenógina foi realizada a análise de variância, seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls
(SNK) para comparação entre as médias, com nível de significância de 5% (p≤0,05).
Para análise dos dados referentes ao percentual de eclosão das larvas oriundas dos
ovos de fêmeas tratadas, da eclosão das larvas oriundas dos ovos submetidos ao tratamento e
do percentual de mortalidade das larvas, foi realizada a análise de Kruskal Wallis, seguida
pelo teste t de Student para comparação entre as ordenações médias, com nível de
significância de 5% (p≤0,05) (SAMPAIO, 2002).
O cálculo das concentrações letais, CL
50
e CL
90
, foi realizado pelo método de análise
de próbites segundo Finney (1971), e os cálculos foram realizados com o auxilio do programa
”Probit or Logit Analysis”.
12
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação Morfológica dos Isolados
Em meio de cultura SMAY modificado, Nomuraea rileyi apresentou colônias verdes,
e fiálides com aspecto de “garrafa”, engrossadas na base e com um pequeno pescoço, onde se
originou conídios unicelulares. Na placa de Petri foram visualizados inúmeros conídios com
formato elipsóide ou cilíndrico, bastantes hifas e pouquíssimos conidióforos. Essas
características estão de acordo com as descritas por ALVES (1998).
Os aspectos macromorfológicos da colônia foram avaliados no 30º dia de incubação
apresentando tamanho de 1,5 cm de diâmetro, margens irregulares, aspecto convexo,
pulverulenta e de coloração esverdeada. O reverso da colônia apresentou coloração
amarelada. Essas características estão de acordo com Samson (1974).
4.2 Viabilidade das Suspensões de Conídios
Os conídios dos isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi apresentaram 100% de
germinação, sob temperatura de 25 ± 1ºC e umidade relativa ≥80%, porém somente após um
período de 96 horas, quando acrescido ou não de cloranfenicol.
Os resultados demonstraram que a germinação dessa espécie de fungo ocorre mais
tardiamente quando comparado a outras espécies de fungo entomopatogênicos. Como
descritos por diversos autores. Bahiense et al. (2007), testaram os fungos B. bassiana e M.
anisopliae sobre cepa de R. (B.) microplus resistente a deltametrina em teste de estábulo;
Angelo (2007) avaliou o efeito dos fungos Isaria farinosa, I. fumosorosea, Paecilomyces
lilacinus e Lecanicillium lecanii sobre as diferentes fases de desenvolvimento do mesmo
carrapato, e Fernandes (2007) testou 53 isolados de B. bassiana sobre larvas de R. (B.)
microplus. Em todos esses estudos, os isolados apresentaram germinação próxima a 100% em
um período de 24 horas.
A velocidade do processo de germinação dos fungos depende do isolado, das
condições ambientais e do passado térmico dos conídios. Pekrul e Grula (1979), Jackson et
al., (1985) apud ALVES (1998) relataram que os conídios dos isolados mais virulentos de B.
bassiana, I. fumosorosea (=P. fumosoroseus) e Verticillium lecanii apresentaram maior
velocidade de germinação quando comparado aos isolados menos virulentos da mesma
espécie. No entanto, outros estudos demonstraram que o isolado mais virulento de N. rileyi foi
o que germinou mais lentamente (BOUCIAS; PENDLAND, 1984). apud ALVES (1998).
Experimentos realizados por Sujii et al. (2002), em nível de campo, demonstraram que
a viabilidade dos conídios de N. rileyi pode permanecer elevada (acima de 75%) sobre a
superfície de cadáveres da lagarta A. gemmatalis por um período de até 10 dias. Isso
comprova que os conídios do isolado CG 859 de N. rileyi foram capazes de resistir às
condições ambientais, além de atuarem como fonte de inóculo durante este período. Embora
esses conídios tenham apresentado elevado percentual de germinação em condições não
controladas, esta ocorreu de forma lenta, confirmando o atraso na germinação de conídios de
N. rileyi quando comparado a germinação de conídios de outros fungos entomopatogênicos.
13
4.3 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus
4.3.1 Peso médio das fêmeas ingurgitadas
O peso médio das fêmeas utilizadas no grupo controle e nos grupos tratados com as
diferentes concentrações dos isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi se encontram na tabela 2 e
são similares aos descritos por Bennett (1974).
Tabela 2. Peso médio, em gramas, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 de
Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
Nr 177
0,2403 a 0,2400 a 0,2390 a 0,2389 a 0,2397 a
Nr 151
0,2403 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
Bennett (1974) descreveu que fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus com pequeno
tamanho são menos eficientes na produção de ovos quando comparadas a fêmeas com peso
entre 160 e 300 mg. No presente estudo, o peso médio das fêmeas dos grupos controle ou
tratado com as diferentes concentrações conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 do fungo N.
rileyi se enquadram nessa faixa ideal de peso, dando confiabilidade as amostras de R. (B.)
microplus selecionadas, e indicando que houve homogeneização das amostras em todos os
grupos avaliados.
4.3.2 Período de pré-postura
O período de pré-postura não demonstrou diferença significativa dos grupos tratados
com as diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 do fungo N. rileyi
quando comparados com o grupo controle (Tabela 3).
Tabela 3. Média do período de pré-postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com suspensões conidiais de diferentes suspensões dos
isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea rileyi*.
0,2388 a 0,2394 a 0,2411 a 0,2400 a
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
2,2 ab 2,2 ab 2 b 2,1ab 2,5 a
Nr 177
Nr 151
2,2 a 2,2 a 2 a 2,1 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
Davey et al (1984) relataram que o período de pré-postura em R. (B.) microplus se
mantém dentro de uma faixa de variação de um a seis dias sob temperaturas de 22 a 27ºC
corroborando os dados encontrados no grupo controle do presente bioensaio. As fêmeas
tratadas foram mantidas em câmara climatizada sob temperatura de 27ºC de acordo com o
2,1 a
14
Dipeolu (1984), pois essa temperatura se encontra dentro da faixa considerada ideal para
espécies do gênero Boophilus.
Nomuraea rileyi não foi capaz de ocasionar alteração no período de pré-postura, fato
esse que pode ser atribuído a ausência de conídios sobre a superfície das quenóginas, quando
as mesmas foram colocadas em placa de Petri em meio SMAY modificado para ser realizado
o isolamento fúngico.
Angelo (2007) utilizou diferentes concentrações conidiais dos fungos
entomopatogênicos P. lilacinus, I. farinosa, I. fumosorosea e Lecanicillium lecanii e avaliou
seus efeitos in vitro sobre diferentes parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas do
carrapato R. (B.) microplus. O autor não observou redução significativa do período de pré-
postura dos grupos tratados com as suspensões conidiais, independente da espécie do fungo e
da concentração de conídios utilizadas.
Bittencourt et al. (1994) avaliaram a ação do fungo M. anisopliae (isolados mãe e Bm)
sobre fêmeas de R. (B.) microplus e observaram aumento no período de pré-postura quando
utilizaram ambos isolados nas concentrações 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
. Esses dados demonstram
o potencial desse entomopatógeno no controle biológico de fêmeas ingurgitadas de R. (B.)
microplus.
4.3.3 Peso da postura
No presente trabalho, os isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi não demonstraram
alterações no peso da postura de fêmeas ingurgitadas tratadas com as diferentes suspensões
conidiais, quando estas foram comparadas entre si ou com o grupo controle. (Tabela 4).
Tabela 4. Peso médio da postura, em gramas, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
0,1222 a 0,1380 a 0,1323 a 0,1177 a
Nr 177
0,1297 a
0,1297 a 0,1250 a 0,1422 a 0,1226 a
Nr 151
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
0,1233 a
Fernandes et al., (2002) ao avaliarem esse parâmetro biológico de fêmeas ingurgitadas
de R. (B.) microplus submetidas ao tratamento com três isolados de M. anisopliae (Ma01,
Ma02 e Ma04) e um isolado de B. bassiana (Bb30) também observaram que esses fungos não
provocaram alteração significativa no peso total da postura.
Os trabalhos supracitados diferem dos resultados encontrados por Bittencourt et al.,
(1992) que, ao utilizarem suspensões nas concentrações 10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
sobre fêmeas da mesma espécie de carrapato observaram uma quantidade de massa de ovos
inferior ao do grupo controle, independente da concentração conidial utilizada nos diferentes
tratamentos. Esses resultados evidenciaram a patogenicidade de M. anisopliae sobre essa fase
não parasitária de R. (B.) microplus.
15
4.3.4 Período de postura
As diferentes supensões de N. rileyi utilizando os isolados Nr 177 e Nr 151 não
apresentaram alterações significativas do período de postura de fêmeas de R. (B.) microplus
(tabela 5).
Glória et al. (1993) descreveram que as fêmeas de R. (B.) microplus mantidas na
temperatura de 27 ± 1ºC apresentaram períodos de postura com duração de 3 a 16 dias. Esse
período foi compatível com o observado no grupo controle do presente trabalho, em média 11
dias, garantindo assim a validade da amostra de R. (B.) microplus utilizada no bioensaio.
Esses resultados foram similares aos obtidos por Angelo (2007), que utilizou os
isolados CG 202 e CG 36 dos fungos I. fumosorosea e P. lilacinus, respectivamente, sobre
fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus e não observou redução significativa desse
parâmetro. Porém, os isolados CG 420 de L. lecanii e CG 198 de I. farinosa causaram
diminuição significativa do período de postura das fêmeas quando foram utilizadas as
concentrações 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
de L. lecanii e 10
8
conídios ml
-1
de I. farinosa.
Tabela 5. Média do período de postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
11,9 a 11,5 a 11 a 10,7 a 11,8 a
Nr 177
Nr 151
11,9 a 11,1 a 12,3 a 11,1 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
10,3 a
Outro trabalho também demonstrou redução significativa no período de postura das
fêmeas de R. (B.) microplus quando diferentes suspensões conidiais de M. anisopliae (10
4
, 10
5
10
6
, 10
7
e 10
8
conídios ml
-1
) foram testadas (BITTENCOURT et al., 1994). Esta redução foi
inversamente proporcional à concentração do fungo utilizada, demonstrando sua eficácia
quando utilizado no controle biológico dessa espécie de carrapato.
4.3.5 Período de incubação
O período de incubação foi um dos parâmetros avaliados para identificar o efeito dos
isolados entomopatogênicos Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi sobre a fase não parasitária de R.
(B.) microplus, não demonstrando redução significativa desse parâmetro nos grupos tratados,
independente da concentração de conídios utilizada (Tabela 6).
16
Tabela 6. Média do período de incubação, em dias, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
23,0 a 23,2 a 23,1 a 23,1 a 23,4 a
Nr 177
Nr 151
23,0 a 23,2 a 23,3 a 23 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
Segundo Glória et al. (1993), o período de incubação de ovos de R. (B.) microplus
variou de 24 a 27 dias quando as fêmeas foram colocadas na temperatura de 27 ± 1ºC e
umidade relativa de 80 ± 10%. No entanto, no presente estudo, sob as mesmas condições de
temperatura e umidade, esse parâmetro variou entre 23 e 23,4 dias, apresentando maior
proximidade com os dados encontrados por Bittencourt et al. (1994), em que o grupo controle
apresentou 22,47 dias.
Bittencourt et al. (1994) descreveram um aumento no período de incubação dos ovos
provenientes de fêmeas ingurgitadas dessa mesma espécie de carrapato tratadas com as
concentrações 10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
e 10
8
de M. anisopliae. Esse aumento foi diretamente
proporcional ao aumento da concentração de conídios utilizada.
Fernandes et al., (2002) relataram não haver qualquer diferença nesse parâmetro
quando os isolados Ma01, Ma02 e Ma04 de M. anisopliae e o isolado Bb30 de B. bassiana
foram testados sobre fêmeas de R. (B.) microplus, diferindo dos trabalhos realizados
anteriormente por Bittencourt et al. (1994, 1997).
Perinotto et al.,(2006), ao avaliarem os efeitos do isolado Nr 138 do fungo N. rileyi
sobre fêmeas de R. (B.) microplus, observaram diferenças significativas nesse parâmetro
quando compararam os grupos tratados com o grupo controle. Porém, o resultado foi inferior
aos obtidos com outros fungos entomopatogênicos como M. anisopliae (BITTENCOURT et
al.,1994) e B. bassiana (BITTENCOURT et al.,1997).
4.3.6 Período de eclosão das larvas
As diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi não
causaram diminuição significativa do período de eclosão das larvas, conforme mostrados na
tabela 7.
Tabela 7. Média do período de eclosão das larvas, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos
isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea rileyi*.
23,2 a
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
6,1 a 4,8 a 5,5 a 5,5 a 5,3 a
Nr 177
Nr 151
6,1 a 5,7 a 7,9 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
6,5 a 6,7 a
17
Perinotto et al.,(2006) ao avaliarem o mesmo parâmetro em fêmeas de R. (B.)
microplus utilizando o isolado Nr 138 de N. rileyi, observaram que a concentração 10
8
conídios ml
-1
foi capaz de reduzir o período de eclosão das larvas oriundas da postura das
fêmeas que foram submetidas ao tratamento. Esse período foi de 4,7 dias enquanto que no
grupo controle foi de 8,8 dias. Esses dados demonstram que diversos isolados podem
apresentar resultados diferentes para uma mesma espécie de carrapato e que novos estudos
devem ser realizados com o objetivo de testar a ação de outros isolados de N. rileyi.
No trabalho realizado por Angelo (2007), o período de eclosão das larvas foi reduzido
significativamente somente com a concentração 10
8
conídios ml
-1
do isolado CG 36 de P.
lilacinus. Os isolados CG 198 de I. farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 420 de L.
lecanii não foram capazes de causar redução significativa desse parâmetro.
4.3.7 Índice nutricional
Os isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi não causaram diminuição significativa do
índice nutricional das fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus, independentemente da
concentração de conídios utilizada (tabela 8).
Esses resultados diferem dos encontrados por Perinotto et al.,(2006) que ao utilizarem
o isolado Nr 138 de N. rileyi observaram redução significativa nesse parâmetro, porém
somente com a maior concentração testada (10
8
conídios ml
-1
), no qual o índice nuticional foi
de 52%. O autor relata que apesar de ter apresentado um bom resultado, outras espécies de
fungos entomopatogênicos, como B. Bassiana e M. anisopliae, apresentam resultados mais
promissores para o controle biológico de carrapatos.
Tabela 8. Média do índice nutricional (%) de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
73,10 a 66,25 a 75,23 a 74,91 a 67,81 a
Nr 177
Nr 151
73,10 a 74,43 a 78,16 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
Bahiense et al. (2007) relataram que o fungo M. anisopliae na concentração 10
8
conídios ml
-1
reduziu o índice nutricional de fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus tratadas
sobre bovinos em teste de estábulo. Essa redução foi considerada significativa quando
comparado ao grupo controle nos dias +2 e +25 pós-tratamento.
67,37 a 68,27 a
Em estudos realizados com outras espécies de fungos, Angelo (2007) observou que I.
fumosorosea demonstrou redução significativa do índice nutricional de fêmeas ingurgitadas
de R. (B.) microplus. Esses valores foram 59,02% no grupo tratado com a concentração 10
8
conídios ml
-1
enquanto que no grupo controle, esse valor foi de 69,65%. O isolado de L.
lecanii também demonstrou redução nesse parâmetro quando as duas maiores concentrações
conidiais (10
8
e 10
7
conídios ml
-1
) foram utilizadas, enquanto que somente a concentração de
10
8
conídios ml
-1
do isolado de I. farinosa foi capaz de causar diminuição significativa do
índice nutricional das fêmeas. O isolado CG 36 de P. lilacinus não causou redução desse
parâmetro, similarmente aos resultados encontrados no presente estudo.
18
4.3.8 Índice de produção de ovos
Nomuraea rileyi (isolados Nr 177 e Nr 151) não demonstrou potencial patogênico para
as fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus, pois não ocasionou diminuição significativa no
índice de produção de ovos, independente da concentração de conídios utilizada (Tabela 9).
O grupo controle apresentou índice de produção de ovos semelhantes aos
demonstrados em estudos prévios realizados em condições similares de temperatura (27 ±1ºC)
(Glória et al., 1993). Portanto, a cepa de R. (B.) microplus testada no presente estudo
apresentou resultados condizentes com os descritos na literatura.
Tabela 9. Média do índice de produção de ovos (%) de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
54,49 a 50,33 a 58,14 a 55,72 a 49,22 a
Nr 177
Nr 151
54,49 a 53,20 a 59,19 a 50,50 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
Diferentemente dos resultados obtidos no presente estudo, outros estudos têm
demonstrado resultados mais promissores ao testarem outras espécies de fungos
entomopatogênicos. Angelo (2007) relatou que o fungo L. lecanii reduziu significativamente
esse índice quando as quatro diferentes concentrações de conídios foram testadas sobre
fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus. Gindin et al. (2001) obtiveram resultados similares
aos encontrados por Angelo (2007), pois ao utilizarem a concentração 1 × 10
7
conídios ml
-1
de L. lecanii sobre B. annulatus, R. sanguineus e Hyalomma excavatum, obtiveram redução
da massa de ovos das fêmeas ingurgitadas. Dessa forma, pode-se sugerir que as gerações
futuras do carrapato estarão comprometidas, uma vez que L. lecanii foi capaz de interferir na
postura das fêmeas ingurgitadas.
Bahiense (2007) ao testar o potencial de M. anisopliae sobre R. (B.) microplus em
teste de estábulo descreveram que houve redução no índice de produção de ovos no segundo
dia após as fêmeas terem sido submetidas ao tratamento com suspensão aquosa do fungo na
concentração 10
8
conídios ml
-1
.
51,81 a
O índice de produção de ovos de R. (B.) microplus tratados com dois isolados de M.
anisopliae (isolado mãe ou isolado Bm) foi de 5% a 38% e 4,7% a 34,5% respectivamente,
enquanto que o grupo controle apresentou índices maiores, variando de 54,9% e 55,4%. Em
ambos os isolados testados, a concentração 10
8
conídios ml
-1
apresentou melhores resultados
quando comparada com as demais concentrações utilizadas (Bittencourt et al.,1994).
Pirali-Kheirabadi et al. (2007), ao avaliarem a patogenicidade dos isolados de M.
anisopliae (IRAN 437 ou DEMI 001), B. bassiana (IRAN 403 C), L. psalliotae (IRAN 468 C
e IRAN 518 C) sobre as diferentes fases de desenvolvimento de R.(B.) annulatus observaram
que todos os isolados testados provocaram diminuição significativa na eficiência reprodutiva
das fêmeas tratadas. Os isolados IRAN 437 de M. anisopliae e IRAN 468 C de L. psalliotae
quando testados na maior concentração, 10
7
conídios ml
-1
, ocasionaram uma diminuição de
88,69% e 78,15% neste parâmetro, respectivamente. A eficiência reprodutiva desses dois
isolados mostrou ser inversamente proporcional à concentração conidial utilizada.
19
4.3.9 Percentual de eclosão
O isolado Nr 177 de N. rileyi ocasionou diminuição significativa do percentual de
eclosão das larvas oriundas da postura de fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus tratadas
com a suspensão 10
8
conídios ml
-1
. As demais concentrações desse isolado, assim como todas
as suspensões do isolado Nr 151, não foram capazes de ocasionar tal redução quando
comparados com o grupo controle (tabela 10).
Tabela 10. Percentual médio de eclosão das larvas oriundas dos ovos de fêmeas ingurgitadas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos
isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
91,0 ac 75 bc 94,2 a 86,1 ab 68,5 b
Nr 177
Nr 151
91,0 a 73,7 a 90,1 a 74,3 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
82,8 a
Resultados mais promissores foram obtidos por Perinotto et al., (2006) ao utilizarem o
isolado Nr 138 do fungo N. rileyi, ocasionando uma redução significativa de 36% nesse
parâmetro, quando a maior concentração conidial (10
8
conídios ml
-1
) foi utilizada.
Isaria fumosorosea foi capaz de reduzir o percentual de eclosão de larvas, porém
somente quando se utilizou as concentrações 10
6
e 10
7
conídios ml
-1
no tratamento de fêmeas
ingurgitadas. No entanto, com os isolados de I. farinosa, P. lilacinus e L. lecanii tal redução
não foi demonstrada nas diferentes concentrações conidiais utilizadas (Ângelo, 2007).
Bittencourt et al. (1994) obtiveram melhores resultados com as concentrações 10
8
conídios ml
-1
de dois isolados de M. anisopliae (isolado mãe e isolado Bm) sobre femeas
ingurgitadas de R. (B.) microplus, porém as demais concentrações (10
4
, 10
5
, 10
6
e 10
7
conídios
ml
-1
) também apresentaram redução significativa desse parâmetro.
Bittencourt et al., (1992) relataram que o percentual de eclosão das larvas oriundas dos
ovos de fêmeas de R. (B.) microplus tratadas com os mesmos isolados de M. anisopliae
descritos no parágrafo acima, foi bem inferior ao do grupo controle. Esses índices ficaram
entre 0 e 60% de acordo com as suspensões conidiais utilizadas, enquanto que o índice obtido
com o grupo controle foi superior a 90% de eclosão, demonstrando o potencial de M.
anisopliae no controle desse artrópode.
Bittencourt et al. (1997) ao verificarem a patogenicidade in vitro dos isolados 986 e
747 de B. bassiana em fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus observaram que os valores
desse percentual decresceram progressivamente de acordo com o aumento das concentrações
de conídios utilizadas em cada tratamento. Esses dados foram similares aos encontrados por
Bittencourt et al. (1995) e Peralva et al., (1996), que testaram os mesmos isolados de B.
bassiana sobre as diferentes fases do desenvolvimento de R. (B.) microplus.
Fernandes et al., (2002) avaliaram três isolados de M. anisopliae (Ma01, Ma02 e
Ma03) e um isolado de B. bassiana (Bb30) quanto a sua patogenicidade para fêmeas
ingurgitadas de R. (B.) microplus. Esses autores observaram redução significativa do
percentual de eclosão das larvas em pelo menos um dos grupos tratados com os diferentes
isolados.
O fungo B. bassiana foi utilizado em infecção experimental de fêmeas de Ixodes
ricinus por Boycev e Rizvanov, (1960), mantidas a temperatura de 25ºC e umidade relativa de
20
90%. Esses autores observaram um percentual de eclosão das larvas de apenas 6,5%,
demonstrando que esse entomopatógeno exerce controle sobre a população de carrapatos da
espécie I. ricinus.
Kaaya et al. (1996) evidenciaram em testes in vitro com B. bassiana e M. anisopliae,
que a concentração 10
8
conídios ml
-1
inibiu a eclosão das larvas de Amblyomma variegatum.
As larvas provenientes dos ovos das fêmeas tratadas com M. anisopliae apresentaram um
índice de eclosão de 3,9%; não sendo evidenciada eclosão quando as fêmeas foram tratadas
com B. bassiana, demonstrando assim, uma grande redução desse parâmetro, já que no grupo
controle o percentual de eclosão foi de 68,3%.
Os resultados do presente estudo não foram tão promissores quanto os obtidos pelos
autores supracitados. Essas diferenças podem ser atribuídas tanto às espécies de carrapatos
quanto aos diferentes fungos entomopatogênicos estudados.
4.3.10 Percentual de controle
Ao tratar as fêmeas de R. (B.) microplus com o isolado Nr 177 de N. rileyi, foi obtido
um percentual de controle de 17,15 e 27,62% nas concentrações 10
5
e 10
8
conídios ml
-1
respectivamente. O isolado Nr 151 foi capaz de ocasionar um pequeno percentual de controle
nas diferentes concentrações testadas, exceto na concentração 10
6
conídios ml
-1
, como
demonstrado na tabela 11.
Tabela 11. Percentual médio de controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico
10
5
conídios ml
-1
10
6
conídios ml
-1
10
7
conídios ml
-1
10
8
conídios ml
-1
Nr 177
17,15 -16,66 -3,06 27,62
Nr 151
15,90 -13,92 15,39 3,25
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
As diferentes concentrações de ambos os isolados de N. rileyi testados no presente
experimento apresentaram resultados menos satisfatórios que os observados em outros
estudos, nos quais foram utilizadas outras espécies de fungos entomopatogênicos sobre o
carrapato R. (B.) microplus.
Perinotto et al.,(2006) ao avaliarem a ação do isolado Nr 138 de N. rileyi sobre fêmeas
ingurgitadas do carrapato R. (B.) microplus, obtiveram um percentual de controle de 67,36%.
Esses resultados foram mais satisfatórios que os obtidos neste estudo.
Estudos realizados por Angelo (2007) calculou o percentual de controle de diversos
isolados a 10
8
conídios ml
-1
e relatou os seguintes resultados: L. lecanii ocasionou 41,02%, I.
farinosa 25,15%, I. fumosorosea 59,19%. Esses resultados foram bem melhores do que os
obtidos no presente estudo, exceto o isolado CG 36 de P. lilacinus que apresentou resultados
similares ao presente estudo, mostrando percentuais variando entre 4,28% e 13,5%.
O percentual de controle obtido com o isolado Ma 959 de M. anisopliae sobre o
carrapato R. (B.) microplus foi de 96,60%, resultado esse bem superior aos isolados testados
de N. rileyi (Bittencourt et al., 1992). Vale ressaltar que a ação patogênica do fungo M.
anisopliae vem sendo amplamente estudada nos últimos anos sobre vários gêneros de
carrapatos, e até mesmo sobre outros gêneros de artrópodes.
21
Bittencourt et al. (1992) observaram que o percentual de controle nos grupos tratados
com a suspensão Mãe variou de 38,5 a 97,4% e com a suspensão Bm variou de 40,1 a 96,6%
em função da concentração conidial utilizada. Esse percentual de controle elevado
demonstrou o potencial desse entomopatógeno no controle do carrapato dos bovinos.
Nomuraea rileyi é considerado um fungo entomopatogênico com potencial para
controle biológico da lagarta Anticarsia gemmatalis. Seja em condições naturais ou quando
testado em condições laboratoriais, o percentual de controle obtido é bastante satisfatório.
4.4 Bioensaio com Ovos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus
As diferentes suspensões conidiais testadas nos bioensaios com os isolados Nr 177 e
Nr 151 de N. rileyi não foram capazes de reduzir o percentual de eclosão de larvas quando os
ovos de R. (B.) microplus foram submetidos ao tratamento (Tabela 12).
Tabela 12. Percentual médio de eclosão das larvas oriundas dos ovos de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus tratados com diferentes suspensões conidiais dos isolados Nr 177 e Nr
151 de Nomuraea rileyi*.
Isolado Fúngico Controle 10
5
conídios ml
-1
10
6
conídios ml
-1
10
7
conídios ml
-1
10
8
conídios ml
-1
Nr 177
98,2 a 98,6 a 98,4 a 97,4 a 98,1 a
Nr 151
98,2 a 98,5 a 98,2 a 98,5 a 98,3 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
O trabalho de Perinotto et al.,(2006) apresentou diferentes resultados com o isolado Nr
138 de N. rileyi, pois obtiveram uma redução de 50% no percentual de eclosão das larvas de
R. (B.) microplus quando utilizaram a concentração 10
8
conídios ml
-1
. Esses dados não foram
tão relevantes quanto os demonstrados por Bittencourt et al. (1996), que ao testarem dois
isolados de B. bassiana (Bb 986 e Bb 747) sobre os ovos desse mesmo carrapato, obtiveram
uma variação no percentual de eclosão entre 20 e 86,6% nos grupos tratados e de 93,3% no
grupo controle.
Metarhizium anisopliae e B. bassiana também demonstraram resultados satisfatórios
nos tratamentos com ovos de R. (B.) microplus, ao reduzirem o percentual de eclosão quando
foram utilizadas as concentrações de 10
8
conídios ml
-1
(PAIÃO et al., 2001).
Angelo (2007) ao utilizar os fungos entomopatogênicos L. lecanii e I. farinosa obteve
resultados significativos reduzindo o percentual de eclosão das larvas pelo menos em uma das
concentrações utilizadas, porém o isolado CG 36 de P. lilacinus não foi capaz de causar
redução desse parâmetro. Os melhores resultados foram obtidos com I. fumosorosea, que
reduziu significativamente a eclosão das larvas em praticamente todas as concentrações, com
exceção da concentração 10
6
conídios ml
-1
. Esse resultado também foi demonstrado em outra
etapa do mesmo estudo, quando se observou que I. fumosorosea foi capaz de reduzir a eclosão
das larvas provenientes dos ovos das fêmeas ingurgitadas tratadas.
Monteiro et al., (1998a, b) testaram a patogenicidade dos isolados 747 e 986 de B.
bassiana e os isolados 959, E9 e 319 de M. anisopliae sobre o carrapato R. sanguineus e
obtiveram excelentes resultados. Vinte dias após o tratamento, e utilizando a concentração de
10
8
conídios ml
-1
não havia ocorrido eclosão das larvas em 95% dos ovos que foram
submetidos ao tratamento. Além disso, Bittencourt et al. (2000) ao testarem três isolados de
M. anisopliae e um isolado de B. bassiana sobre ovos do carrapato Anocentor nitens
22
observaram uma redução do percentual de eclosão das larvas variando de 30 a 90%. Esses
dados demonstram a patogenicidade desses fungos sobre outras espécies de carrapatos.
4.5 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus
No presente estudo, os melhores resultados obtidos com N. rileyi foram sobre as larvas
não alimentadas de R. (B.) microplus. A concentração 10
8
conídios ml
-1
do isolado Nr 177 de
N. rileyi foi capaz de promover um percentual de mortalidade das larvas de 14,5 e 69,5% no
15º e 20º dia após o tratamento, respectivamente. As demais concentrações apresentaram um
percentual de mortalidade significativo, no entanto esses resultados não foram tão
satisfatórios quanto aos obtidos com a maior concentração testada. Esses dados são
relevantes, pois não houve mortalidade das larvas no grupo controle, evidenciando que a
mortalidade nos diferentes tratamentos, mesmo que tardiamente, se deve a patogenicidade do
isolado fúngico (Tabela 13).
Tabela 13. Percentual médio de mortalidade das larvas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus tratados com diferentes suspensões conidiais do isolado Nr 177 de Nomuraea
rileyi*.
Nomuraea rileyi
(Nr 177)
Controle 10
5
con. ml
-1
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
15º dia
0 (a) 4,6 cd 3,5 bd 5,5 bc 14,5 b
20º dia
0 (a) 33,5 b 5,8 b 7,5 b 69,5 c
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
O isolado Nr 151 de N. rileyi não apresentou um percentual de mortalidade esperado
sobre as larvas não alimentadas de R. (B.) microplus, quando estas foram submetidas ao
tratamento com as diferentes suspensões conidiais. Ao utilizar a maior concentração (10
8
conídios ml
-1
), o percentual de mortalidade ficou entre 10 e 15%, somente no 15º e 20º dia
após o tratamento.
Tabela 14. Percentual médio de mortalidade das larvas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus tratadas com diferentes suspensões conidiais do isolado Nr 151 de Nomuraea
rileyi*.
Nomuraea rileyi
(Nr 151)
Controle 10
5
con. ml
-11
10
6
con. ml
-1
10
7
con. ml
-1
10
8
con. ml
-1
15º dia
0 a 0 a 0 a 5 a 10 a
20º dia
0 a 0 a 0 a 10 a 15 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de t de
Student (p≤ 0,05).
Perinotto et al., (2006), ao avaliarem o isolado Nr 138 de N. rileyi, não obtiveram
resultados satisfatórios quanto à mortalidade das larvas de R. (B.) microplus no 10º dia após o
tratamento com as diferentes suspensões conidiais (10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
conídios ml
-1
). Isso pode
ser atribuído ao fato da germinação completa dos conídios dos isolados Nr 177 e Nr 151 de N.
23
rileyi ocorrer lentamente, por volta de 96 horas, retardando assim o processo de infecção. No
presente estudo, o isolado Nr 177 somente provocou mortalidade das larvas a partir do 15º
dia.
Bittencourt et al. (1996) ao verificarem a patogenicidade dos isolados 986 e 747 de B.
bassiana sobre larvas não alimentadas de R. (B.) microplus observaram um maior percentual
de mortalidade das larvas dos grupos tratados com as suspensões fúngicas de diferentes
concentrações, variando entre 18,8 e 88%; enquanto que no grupo controle esse percentual
variou entre 13 e 16,5%.
Bahiense et al. (2003) também obtiveram bons resultados ao testarem o isolado Bb
LCM 01 de B. bassiana sobre larvas de R. (B.) microplus. O percentual de mortalidade foi de
6, 14, 27, 55 e 93% nas concentrações 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
e 10
9
conídios ml
-1
, respectivamente,
dez dias após tratamento. Esses resultados demonstram o elevado potencial carrapaticida de
B. bassiana sobre larvas não alimentadas do carrapato R. (B.) microplus.
Castro et al. (1997) ao utilizarem o isolado 959 de M. anisopliae sobre adultos, ninfas
e larvas de R. (B.) microplus em teste de estábulo, obtiveram os seguintes resultados: a
concentração 10
8
conídios ml
-1
ocasionou um percentual de mortalidade de 41, 69,4 e 47,7%,
respectivamente. Em relação à mortalidade das larvas, os melhores resultados foram
observados logo após a infecção fúngica, demonstrando haver uma maior atividade do fungo
sobre as fases evolutivas do carrapato imediatamente após as mudas, pois o quadro de
infecção inicial nesses artrópodes ocorre através da colonização e penetração de seu
tegumento.
Ao testaram a patogenicidade dos isolados 747 e 986 de B. bassiana sobre ovos e
larvas de R. sanguineus, Monteiro et al., (1998a, b) observaram redução do percentual de
eclosão e na sobrevivência das larvas conforme foram utilizadas as maiores concentrações
conidiais. Monteiro et al., (2000), ao avaliarem a ação do isolado 986 de B. bassiana sobre
ovos, larvas e fêmeas ingurgitadas de A. nitens, obtiveram os melhores resultados com larvas
não alimentadas. Esses dados, foram similares aos encontrados no presente estudo com o
isolado Nr 177 de N. rileyi, embora as espécies de fungo e carrapatos testados por Monteiro et
al., (1998 a, b; 2000) tenham sido distintas.
As concentrações letais, CL
50
e CL
90
, obtidas com os isolados Nr 177 e Nr 151de N.
rileyi sobre larvas não alimentadas estão demonstradas na tabela 15. Esses valores indicam a
concentração de conídios necessária para causar mortalidade de 50% (CL
50
) e 90% (CL
90
) da
população de larvas de carrapatos submetida ao tratamento.
Tabela 15. Concentrações letais, CL
50
e CL
90
dos isolados Nr 177 e Nr 151 de Nomuraea
rileyi obtidas através da avaliação do percentual de mortalidade de larvas não alimentadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Dias após o tratamento
Fungos
15
o
dia 20
o
dia
CL
50
2,43 × 10
13
con. ml
-1
2,54 × 10
9
con. ml
-1
Nomuraea rileyi
(Nr 177)
1,12 × 10
18
con. ml
-1
2,95 × 10
13
con. ml
-1
CL
90
1,78 × 10
12
con. ml
-1
l 1,29 × 10
13
con. ml
-1
CL
50
Nomuraea rileyi
(Nr 151)
2,36 × 10
15
con. ml
-1
1,06 × 10
18
con. ml
-1
CL
90
24
Bittencourt et al. (1997) ao testarem o isolado 747 de B. bassiana obtiveram os valores
de CL
50
e CL
90
de 3,21 x 10
6
conídios ml
-1
e 8,74 x 10
8
conídios ml
-1
, respectivamente.
Concentrações letais menores foram obtidas quando os autores utilizaram o isolado 986 de B.
bassiana: CL
50
de 2,23 x 10
6
conídios ml
-1
e CL
90
de 1,41 x 10
8
conídios ml
-1
. Com base
nesses baixos valores obtidos nas concentrações letais, os isolados de B. bassiana foram
considerados patogênicos para larvas de R. (B.) microplus. Valores próximos dessas
concentrações letais foram obtidos no presente estudo, com exceção do isolado Nr 177 de N.
rileyi no 15º dia após o tratamento, portanto os isolados utilizados no presente estudo
apresentam patogenicidade sobre a mesma fase de desenvolvimento desse carrapato.
4.6 Reisolamento Fúngico
As amostras de quenóginas, ovos e larvas não alimentadas de R. (B.) microplus
submetidas ao tratamento com as diversas concentrações dos isolados fúngicos de N. rileyi,
assim como as amostras utilizadas no grupo controle não apresentaram desenvolvimento de
colônias após 20 dias de incubação em câmara úmida.
Gindin et al. (2001) utilizaram suspensões de nove fungos sobre as diferentes fases de
desenvolvimento de B. annulatus, nos quais somente cinco fungos foram patogênicos: B.
bassiana, M. anisopliae, M flavoviride, I. fumosoroseus e V. lecanii. Os autores relataram que
os carrapatos submetidos ao tratamento com M. anisopliae e M flavoviride apresentaram as
superfícies dorsais e ventrais colonizadas pelo fungo e os que foram submetidos ao tratamento
com B. bassiana e I. fumosoroseus, a colonização fúngica ocorreu de forma diferente, através
das aberturas naturais. Verticillium lecanii mesmo mostrando sua patogenicidade sobre este
artrópode, não colonizou a superfície dos espécimes tratados, pois não apresentou sinais
típicos da infecção fúngica. O mesmo ocorreu com os isolados de N. rileyi testados no
presente estudo.
4.7 Considerações Finais
Mais de 90% dos hospedeiros susceptíveis a N. rileyi são pertencentes a Ordem Lepidoptera,
e as variações quanto ao tempo da germinação dos conídios sobre suas cutículas, variam de
acordo com cada espécie hospedeira implicada. A germinação de conídios no tegumento de S.
litura ocorre entre 46 e 48h e é bem similar aos relatados para Heliothis zea e Spodoptera
frugiperda. No entanto, esse processo ocorre em até 8 horas em Pseudoplusia includens e
entre 6 e 18 horas na Anticarsia gemmatalis. Essas diferenças no tempo de germinação podem
ser atribuídas as variações na composição do tegumento das diferentes larvas. É possível que
isso ocorra devido a similaridade entre os componentes de superfície de N. rileyi e células de
insetos susceptíveis, permitindo assim, o desencadeamento no quadro de infecção
(SRISUKCHAYAKUL et al., 2005). Certamente essa mesma relação parasita – hospedeiro
não ocorreu entre N. rileyi e R. (B.) microplus, demonstrando que essa espécie de carrapato
não é susceptível aos isolados fungicos testados no presente estudo.
25
5 CONCLUSÃO
● Os isolados Nr 177 e Nr 151 de N. rileyi não apresentam patogenicidade para fêmeas
ingurgitadas, ovos e larvas não alimentadas de R. (B.) microplus.
26
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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