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1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
SUZANA APARECIDA COSTA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE
PRODUTOS SINTÉTICOS E NATURAIS CONTRA LENTIVÍRUS DE
PEQUENOS RUMINANTES
FORTALEZA – CE
2008
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2
SUZANA APARECIDA COSTA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE
PRODUTOS SINTÉTICOS E NATURAIS CONTRA LENTIVÍRUS DE
PEQUENOS RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de
pequenos ruminantes.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva
Teixeira
FORTALEZA-CE
2008
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A662a Araújo, Suzana Aparecida Costa de
Avaliação in vitro da atividade antiviral de produtos sintéticos e
naturais contra lentivírus de pequenos ruminantes/Suzana Aparecida
Costa de Araújo. __ Fortaleza, 2008.
149p.; il.
Orientadora: Profª Drª Maria Fátima da Silva Teixeira
Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) – Universidade
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1.Artrite encefalite caprina. 2. Maedi-Visna. 3. Drogas antivirais.
4. Melia azedarach. 5. Azadirachta indica. I. Universidade Estadual do
Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.39
4
SUZANA APARECIDA COSTA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE PRODUTOS SINTÉTICOS E
NATURAIS CONTRA LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: ____/____/____
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira
Orientadora - UECE
Prof. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro Prof. Dr. Jean Berg Alves da Silva
Examinador-Embrapa Examinador-UFERSA
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha Profa. Dra. Selene Maia de Morais
Examinador-UECE Examinadora-UECE
5
À Eudmar Marcolino, meu esposo, grande
amigo, companheiro e incentivador do meu
desenvolvimento. Obrigada pela compreensão,
convivência, incentivo, torcida e ajuda nas
tomadas de decisões nos momentos mais
difíceis desta jornada e por compartilhar cada
conquista da minha vida.
DEDICO.
6
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por guiar e iluminar todas os meus passos e escolhas.
À Universidade Estadual do Ceará e ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias
(PPGCV) por propiciarem a realização deste trabalho.
Ao CNPQ e a FUNCAP pelo apoio financeiro concedido, que sem dúvida foi imprescindível
para a realização desta pesquisa.
À Embrapa e ao Centro Nacional de Pesquisa em Caprinos pela concessão das condições
técnicas e estruturais, contribuindo de forma incondicional para realização deste trabalho.
Ao Laboratório Farmacêutico do Pernambuco (LAFEPE) e ao Hospital São José de Fortaleza
na pessoa da Dra. Silviane pela concessão dos fármacos antivirais.
Ao Laboratório de química em produtos naturais pela ajuda no processamento dos extratos
vegetais.
A coordenação do PPGCV pelo apoio e incentivo.
À minha família, em especial a minha mãe Alexandrina Madalena da Silva pelo incentivo,
dedicação e carinho que me presta dia a dia. Por me mostrar que tudo é possível quando se
tem dedicação e determinação.
À vovó (Felismina Alves) e vovô João Vicente (in memorian) por terem participado de forma
intensa na minha educação.
À minha tia-mãe Fátima Russo pela dedicação e incentivo. Por estar sempre presente em
todas as fases da minha caminhada pessoal e profissional.
Às minhas irmãs Silvia e Gláucia pelo apoio e estímulo.
Aos meus amados sobrinhos (Jorge Júnior, Vinícius, Tatiane e João Vítor) pela convivência e
momentos de descontração. A vocês um legado da minha persistência em obter
conhecimentos deixando como exemplo “que tudo é possível quando se têm objetivos na
vida”.
À Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira, que além de orientadora foi uma grande amiga.
Obrigada por me oferecer a oportunidade de desenvolvimento acadêmico. Agradeço por ter
me mostrado que o sucesso e o sabor da vitória são resultados de esforços próprios. Valeu o
aprendizado, a convivência, a liberdade para buscar soluções.
Ao prof. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro por ter me acolhido e agraciado com sua confiança,
convivência, amizade e seus ensinamentos inigualáveis. Tentar mostrar minha gratidão em
palavras seria ousar demais, contudo, não tentar, seria pecar por omissão. Obrigada pelo apoio
e sem dúvida pela contribuição imensurável a realização deste trabalho.
7
Ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha pela colaboração e sugestões.
À Profa. Dra. Selene Maia de Morais por disponibilizar sua equipe e laboratório para
realização de parte deste trabalho. Aos integrantes do laboratório de química em produtos
naturais pelos ensinamentos e ajuda.
Ao prof. Dr. Jean Berg Alves da Silva pela amizade, apoio e conselhos.
Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello pela realização da análise dos dados.
À Tânia Maria Leal pela acolhida, ajuda e orientação durante a coleta de M. azedarach.
À minha grande amiga Tânia Valeska que me alegra pelo prazer de ter cruzado o meu
caminho. Meu eterno voto de gratidão pela sua amizade e sinceridade. Obrigada atrasa.
À Keillak, Kethleen, Diego e Tânia, minha segunda família, pelo acolhimento, apoio e acima
de tudo amizade.
Aos amigos Roberta e Leandro minha gratidão pela oportunidade de condecorar-me com a
confiança, amizade e sinceridade de vocês. Obrigada pelos tão necessários momentos de
descontração.
Ao grande amigo Esmaile pelo convívio, preciosas sugestões e comentários, participação,
torcida e incentivos para a conclusão deste trabalho.
Aos amigos do LABOVIR: Valeska, Aracely, Edmara, Tânia, Aryana, Neilson, Richard pelo
apoio, incentivo, convívio. Obrigada por tornarem a caminhada menos árdua. Agradeço
também a Esmaile, Aline, Cynthia, D’Ávila, Igor pela ajuda e momentos agradáveis.
Aos meus amigos de Sobral Ronaldo, Lauana, Ismênia, Osmarilda, Kelma, Ricardo, Roberta,
Leandro, pelos momentos de alegria, convívio, e incentivo na concretização deste trabalho.
Aos meus colegas e amigos do PPGCV: Cláudio, Alexsandra, Micheline, Sthênia, Viviane,
Patrícia, pela amizade e convívio.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da
UECE pela contribuição para o meu crescimento profissional. Em especial, às secretárias
Adriana e Cristina pela presteza, atenção e carinho.
A todos aqueles que mesmo a distância, direto ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
As pessoas entram em nossa vida
por acaso, mas não é por acaso que
elas permanecem.
8
“Quando um obstáculo é intransponível,
ele deixa de ser um obstáculo para se
tornar um ponto de partida”.
(Juzsef Eorvos)
9
RESUMO
Objetivou-se avaliar o efeito antiviral de produtos sintéticos e naturais em fibroblastos
caprinos infectados pelos vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) cepa Cork e Maedi-
Visna (MVV) cepa K1514. Foram utilizados os inibidores da transcriptase reversa:
lamivudina, zidovudina, didanosina, estavudina e efavirenz; os inibidores da protease
lopinavir/ritonavir e atazanavir; além dos extratos hexânico, clorofórmico, acetato de etila e
etanólico da Melia azedarach e Azadirachta indica em diferentes concentrações. A
citotoxicidade foi avaliada pela observação da morfologia celular e pelo teste de viabilidade
celular (MTT) determinando-se a concentração citotóxica média (CC
50
). A atividade antiviral
consistiu na inibição dos efeitos citopáticos (CPE) característicos dos vírus e redução do
MTT. Submeteram-se os dados aos testes de Sharpiro-Wilk e Bartlett para avaliar a
distribuição normal e homogeneidade da variância entre os tratamentos. As médias foram
comparadas pelo teste Student Newman Keuls (SNK). Ocorrendo heterocedasticidade
utilizava-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. A lamivudina, estavudina, zidovudina
e efavirenz apresentaram CC
50
de 500µM, enquanto o atazanavir de 50 µM e o lopinavir/r e a
didanosina de 5,0 µM. Todos os extratos das plantas estudadas apresentaram CC
50
de
25µg/mL. Os inibidores de protease (IP) não apresentaram atividade antiviral enquanto os
fármacos inibidores da transcriptase reversa demonstraram atividade antiviral significativa em
diferentes concentrações. Os extratos hexânico, acetato de etila e etanólico da A. indica
inibiram tanto o CAEVCo quanto o MVVK1514. Quanto aos extratos da M. azedarach o
hexânico, clorofórmico e o etanólico impediram a replicação de ambos os vírus. Portanto, os
produtos naturais e os sintéticos foram eficazes na inibição in vitro dos lentivírus de pequenos
ruminantes.
Palavras – chave: Artrite Encefalite Caprina. Maedi-Visna. Drogas antivirais. Melia
azedarach. Azadirachta indica.
10
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the antiviral effect of natural and synthetic products in
fibroblasts goats infected by Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) strain Cork and
Maedi-Visna (MVV) strain K1514. We used reverse transcriptase inhibitors lamivudine,
zidovudine, didanosine, stavudine and efavirenz; protease inhibitors lopinavir/ritonavir and
atazanavir; in addition to the hexane extracts, chloroform, ethyl acetate and ethanol to Melia
azedarach and Azadirachta indica in different concentrations. The cytotoxicity was
investigated by cell morphology evaluation and cell viability test by MTT assay determining
the average concentration cytotoxic (CC
50
). The potential antiviral properties were
investigated by cytopathic effects inhibition (CPE) assay and MTT method. The data were
first subjected to the tests Sharpiro-wilk e Bartlett to evaluate the normal distribution and
homogeneity of variance between treatments. The averages compared by test Student
Newman Keuls (SNK). In cases of heterocedasticidade the analysis was performed by non-
parametric test Kruskal-Wallis. The lamivudine, stavudine, zidovudine and efavirenz
demonstrated CC
50
of 500µM, already atazanavir of 50µM, lopinavir/r and didanosine of
5.0µM. All extracts showed CC
50
of 25µg/mL. The protease inhibitors did not presents
antiviral activity while other drugs showed significant antiviral efficacy in different
concentrations. The hexane extracts, ethyl acetate and ethanol of A. indica inhibited as much
CAEV-Co as MVVK1514. As to the extracts of M. azedarach the hexane extracts,
chloroform and ethanol prevented the replication of both viruses. Therefore, the natural
products and synthetic been effective in the inhibition of in vitro Lentivirus of Small
Ruminants.
Keywords: Caprine Arthritis Encephalitis. Maedi-Visna. Antiviral drugs. Melia azedarach.
Azadirachta indica.
11
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Representação esquemática dos LVPR ..................................... .................22
FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura gênica do provírus de LVPRs....... 23
FIGURA 3 – Ciclo de replicação do Maedi-Visna vírus ..................................................25
FIGURA 4 – Sincício em cultura primária de fibroblastos caprinos.................................26
FIGURA 5 – Caprino com aumento nas articulações do carpo ........................................ 31
FIGURA 6 – Estrutura química da zidovudina ................................................................38
FIGURA 7 - Estrutura química da didanosina ................................................................. 39
FIGURA 8 - Estrutura química da lamivudina.................................................................40
FIGURA 9 - Estrutura química da estavudina .................................................................41
FIGURA 10 - Estrutura química do atazanavir................................................................42
FIGURA 11 - Estrutura química do lopinavir..................................................................43
FIGURA 12 – Flores e folhas da A. indica ......................................................................49
FIGURA 13 – Fruto do nim ............................................................................................ 50
FIGURA 14 – Flores da M. azedarach ............................................................................52
CAPÍTULO II
FIGURA 1 - Fibroblasts cells stained with violet crystal. .............................. .................81
FIGURA 2 - Virus inhibition assay showing the inhibition of cytopathic effects (CPE) of
CAEVCo in fibroblasts by hexane of A. indica................................................................ 83
CAPÍTULO III
FIGURA 1 - Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre a
viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 24h ........................................101
FIGURA 2 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa e da protease
sobre a viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 24h ............................ 101
12
FIGURA 3 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre a
viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 48h ........................................102
FIGURA 4 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa e da protease
sobre a viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 48h ............................ 102
CAPÍTULO IV
FIGURA 1 – Efeito inibitório dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre o CAEV
.......................................................................................................................................118
FIGURA 2 – Efeito inibitório dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre o
MVV ............................................................................................................................ 118
FIGURA 3 – Efeito inibitório dos fármacos antivirais didanosina e lopinavir/r sobre o CAEV
e MVV. .......................................................................................................................... 119
FIGURA 4 – Efeito inibitório do inibidor de protease atazanavir sobre o MVV e CAEV 119
13
LISTA DE TABELAS
Capítulo II
TABELA 1- Cytotoxicity and antiviral activity of A. indica and M. azedarach using the MTT
assay............................................................................................................................... 90
TABELA 2- Inhibitory concentration of extracts that inhibit the cytopathic effects (CPE) of
SRLV ............................................................................................................................. 91
TABELA 3- Phytochemical of extracts of A. indica and M. azedarach ...........................92
14
LISTA DE ABREVIATURAS
% - Percentagem
Ac – Anticorpo
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AIEV – Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina
AZT - Zidovudina
BHV -1 – Herpesvírus bovino tipo 1
BIV - Vírus da Imunodeficiência Bovina
CA – Capsídeo
CAE – Artrite encefalite caprina
CAEV – Vírus da Artrite Encefalite Caprina
CAEVCo – Cepa CAEV Cork
CC
50
– Concentração citotóxica média
CCR5 – co-receptor para o HIV
CXCR4 - co-receptor para o HIV
CI
50
– Concentração inibitória média
CO
2
– Dióxido de carbono
cm - centímetro
ddC – Zalcitabina
ddAMP – Monofosfato didesoxiadenosina
ddATP – Trifosfato didesoxiadenosina
ddIMP – Monofosfato de didanosina
ddI – Didanosina
d4T – estavudina
3TC - lamivudina
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucléico
CPE – Efeito Citopático
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Embrapa - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
env – Gene que codifica as proteínas do envelope viral
FDA – Food and Drug Administration
FeLV – Vírus da leucemia felina
15
FIV – Vírus da Imunodeficiência Felina
gag - Gene que codifica as proteínas internas do vírus
gp – Glicoproteína
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
HSV-1 – Herpesvirus simples tipo 1
IDGA - Imunodifusão em Gel de Agarose
IN – Inibidor da integrase
IsP – Inibidores da protease
JDV - Vírus da Doença de Jembrana
kD – Kilodaltons
LAFEPE– Laboratório Farmacêutico do Pernambuco
LPV/r – Lopinavir/ritonavir
LTR – Seqüências longas repetidas
LVPR – Lentivírus de Pequenos Ruminantes
MA - Matriz
MEM – Meio Essencial Mínimo
mL - Mililitro
mm – Milímetro
MSC – Membrana Sinovial Caprina
MTT – Brometo de difeniltetrazólio
MV - Maedi-Visna
MVV - Maedi-Visna Vírus
MVV K1514 – Cepa K1514
N
3
– Grupo Azido
NC – Nucleocapsídeo
ηm – Nanômetro
NRTIs – Inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa
NNRTIs – Inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa
o
C – Graus Celsius
OH – Grupo hidroxila
OIE – Organização Internacional de Epizootias
SFB– Soro fetal bovino
PCR - Reação em Cadeia de Polimerase
PMEA - Fosfonilmetoxetil adenina
16
pol - Gene que codifica as enzimas virais
rev - Gene de regulação viral
RNA – Ácido Ribonucléico
SIV - Vírus da Imunodeficiência Símia
SU – Glicoproteína de superfície
tat - Gene de regulação viral
TCID- Dose inoculadora em cultura de tecido
TM – Glicoproteína transmembrânica
TR – Transcriptase reversa
UECE – Universidade Estadual do Ceará
vif - Gene de regulação viral
µl - Microlitro
µg - Micrograma
µM – Micromolar
17
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................... 08
ABSTRACT ................................................................................................................... 09
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................10
LISTA DE TABELAS.................................................................................................... 12
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................ 13
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 18
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................... 20
2.1 Lentivírus de Pequenos Ruminantes ....................................................................... 20
2.1.1 Histórico...........................................................................................................20
2.1.2 Classificação .................................................................................................... 21
2.1.3 Morfologia ....................................................................................................... 21
2.1.4 Organização genômica...................................................................................... 22
2.1.5 Tropismo e replicação viral .............................................................................. 23
2.1.6 Infectividade celular ......................................................................................... 25
2.1.7 Epidemiologia .................................................................................................. 26
2.1.8 Patogenia..........................................................................................................27
2.1.9 Resposta imune ................................................................................................ 28
2.1.10 Sinais clínicos................................................................................................. 29
2.1.11 Diagnóstico .................................................................................................... 31
2.1.11.1 Imunodifusão em gel de agarose ............................................................32
2.1.11.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).....................................32
2.1.11.3 Isolamento em cultivo celular ................................................................33
2.1.11.4 Reação em cadeia de polimerase (PCR) .................................................33
2.1.12 Transmissão.................................................................................. ................. 34
2.1.13 Controle e profilaxia....................................................................................... 34
2.2 Drogas antivirais ....................................................................................................35
2.2.1 Locais de atuação ........................................................................... .................35
2.2.2 Agentes antiretrovirais.................................................................... ................. 36
2.2.2.1 Inibidores da transcriptase reversa ..............................................................36
A) Zidovudina .....................................................................................................38
B) Didanosina ..................................................................................................... 39
C) Lamivudina .................................................................................. .................39
18
D) Estavudina.................................................................................... ................. 40
2.2.2.2 Inibidores da protease ............................................................... .................41
A) Atazanavir...................................................................................................... 42
B) Lopinavir...................................................................................... ................. 43
2.2.2.3 Inibidores da entrada do vírus ................................................... .................43
2.2.2.4 Inibidores da integrase................................................................................ 44
2.2.3 Drogas testadas contra lentiviroses animais ...................................................... 44
2.3 Plantas medicinais.................................................................................................. 46
2.3.1 Plantas medicinais com atividade antiviral........................................................ 47
A) Azadirachta indica ......................................................................................... 48
A.1) Origem ..................................................................................................48
A.2) Taxonomia............................................................................................. 48
A.3) Descrição morfológica e características fenológicas............................... 49
A.4) Composição química.............................................................................. 50
A.5) Utilização dos produtos do nim..............................................................51
A.5.1) Inseticida ......................................................................................... 51
A.5.2) Medicinal.........................................................................................51
B) Melia azedarach ............................................................................................. 52
B.1) Taxonomia.............................................................................................52
B.2) Composição química.............................................................................. 53
3 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 54
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA............................................................................................55
5 OBJETIVOS................................................................................................................ 56
Geral.........................................................................................................................56
Específicos................................................................................................................56
6 CAPÍTULO I ............................................................................................................... 57
7 CAPÍTULO II.............................................................................................................. 74
8 CAPÍTULO III............................................................................................................. 93
9 CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 105
10 CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................................... 120
11 PERSPECTIVAS.......................................................................................................121
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................122
ANEXOS........................................................................................................................ 141
19
1 INTRODUÇÃO
Os vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) e Maedi/Visna (MVV) causam uma
doença progressiva multissistêmica afetando, principalmente, pulmões, articulações, úbere e
sistema nervoso central de caprinos e ovinos (CRAWFORD et al., 1980; NARAYAN et al.,
1980). Esses vírus pertencem à família Retroviridae e gênero Lentivírus e são denominados
lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR). Portanto, possuem a enzima transcriptase reversa
(RT), que permite ao RNA viral dar origem à dupla fita de DNA pró-viral capaz de se
incorporar ao genoma celular. Na seqüência o DNA pró-viral é transcrito em RNA genômico
e em RNA mensageiro (RNAm) sendo transportado para o citoplasma, onde é traduzido em
proteínas virais por meio da enzima protease. Essas são etapas imprescindíveis à replicação
desses vírus.
Esses lentivírus possuem distribuição mundial e disseminam-se rapidamente entre as
espécies susceptíveis, sendo endêmicos em muitas regiões. No Brasil, a primeira descrição
sorológica foi feita em 1986 por Moojen no Rio Grande do Sul, em seguida essas
enfermidades foram descritas por outros autores em diversos estados. Além disso, os LVPR
acarretam severas perdas econômicas nos rebanhos, afetando animais de diferentes raças,
idade e sexo. Os prejuízos se caracterizam por morte de animais jovens, diminuição da
produção láctea e perda de peso dos adultos devido a dificuldades de locomoção. Danos
indiretos importantes decorrem da desvalorização dos rebanhos, reposição precoce de
animais, despesas com medidas de controle e barreiras comerciais para produtos. Porém,
pouca ênfase é dada ao controle das doenças infecciosas, especialmente da Maedi-Visna
(MV) e da Artrite Encefalite Caprina (CAE). Se por um lado a manutenção de animais
infectados no rebanho representa sérios prejuízos econômicos, o sacrifício de todos os animais
infectados é, muitas vezes, inviável, pois grande parte do rebanho pode estar acometida, além
de representar perda de material genético. Ademais, são enfermidades de caráter crônico e
incurável, apresentam alta prevalência em rebanhos nacionais e sua principal forma de
controle consiste no sacrifício de animais soropositivos (CALLADO et al., 2001; ASSIS;
GOUVEIA et al., 1994).
Apesar disso, até o momento não se obteve êxito nas tentativas de desenvolvimento de
vacinas e nos tratamentos instituídos para essas viroses. Portanto, a busca por drogas capazes
de diminuir a severidade das lesões e impedir as ações deletérias dos lentivírus sobre o
organismo de seus hospedeiros torna-se imprescindível. Dentre essas destacam-se os
inibidores da enzima transcriptase reversa e da protease que são utilizadas com êxito no
20
tratamento de outras infecções ocasionadas por vírus RNA como o vírus da imunodeficiência
humana (HIV). Por outro lado, para avaliar a atividade antiviral de novos compostos contra o
HIV torna-se necessário identificar vírus não patogênicos ao homem com susceptibilidade in
vitro a drogas de forma semelhante ao lentivírus humano. Portanto, os LVPR podem ser
propostos como modelo na avaliação de novos compostos antivirais devido à similaridade
existente na organização genômica e nos mecanismos de patogenicidade.
A combinação desses fatores tem estimulado a procura por estratégias alternativas de
controle de doenças virais, com ênfase na utilização de plantas com atividade antiviral. Sabe-
se que as plantas são fontes ricas de princípios com atividades antivirais, antibacterianas e
inseticidas. Prova disso é que elevado número de plantas medicinais têm sido usadas para o
tratamento de infecções víricas no homem e em animais (BARQUERO et al., 1997). Portanto,
tanto a Melia azedarach L. quanto a Azadirachta indica J., que já têm sido descritas como
possuidora de várias propriedades, dentre elas a antiviral (KHAN et al., 2001), podem surgir
como uma alternativa no tratamento dessas doenças. Além disso, ao contrário da vasta
bibliografia a respeito da biologia e das características inseticidas dessas plantas, são poucos
os estudos a respeito da atividade antiviral contra lentivírus e, em especial, os LVPR.
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Lentivírus de Pequenos Ruminantes
2.1.1 Histórico
Maedi-Visna foi o primeiro membro de uma nova categoria de doenças, denominada
infecção lenta (STRAUB, 2004). Ao estudar o vírus Maedi-Visna, Sigurdsson (1954)
designou o termo “vírus lento” ou lentivírus àquelas infecções causadas por retrovírus que
desenvolvem infecções crônicas de evolução lenta, persistente, progressiva e degenerativa.
As primeiras descrições de doenças com sintomatologia semelhante à da Maedi-Visna
foram feitas na África do Sul (MITCHEL, 1915) e, posteriormente, nos Estados Unidos da
América (MARSH, 1923). Inicialmente, Maedi-Visna foi reconhecida como duas entidades
distintas. Os dois nomes são de origem islandesa: Maedi, que significa dispnéia, caracterizada
por pneumonia intersticial progressiva crônica, e Visna, que significa “demência” e
caracteriza-se por leucoencefalomielite (DAWSON, 1980). Quando as primeiras amostras de
vírus foram isoladas de ovinos afetados com Visna (SIGURDSSON et al., 1960) e com Maedi
(SIGURDARDÓTTIR; THORMAR, 1964), tornou-se possível observar similaridade entre
esses vírus.
Estudos comparativos revelaram que tanto Maedi quanto Visna eram doenças
causadas pelo mesmo vírus, originando assim a denominação Maedi-Visna (THORMAR
1965; THORMAR; HELGADOTTIR, 1965). Essa doença foi identificada, mais tarde, em
outras regiões do mundo, sendo caracterizada como a síndrome respiratória de maior
prevalência. Vários nomes foram dados a essa enfermidade, tais como: ZWOERGERZIEKTE
na Holanda (DE BOER, 1975; HOUWERS et al., 1985), JAAGSIEKTE na África do Sul
(VERWOERD et al., 1983) e Doença Pulmonar de Montana ou Pneumonia Progressiva Ovina
(PPO) nos Estados Unidos da América (CUTLIP; LAIRD, 1976).
A Artrite-encefalite caprina (CAE) foi inicialmente descrita nos Estados Unidos da
América, sob a forma clínica de leucoencefalomielite em cabritos e o vírus foi isolado em
1980, por Crawford e colaboradores em explants de membrana sinovial de um caprino adulto
com artrite.
No Brasil, a primeira descrição de lentivírus de pequenos ruminantes foi feita no Rio
Grande do Sul, com identificação de caprinos soropositivos (MOOJEN et al., 1986). A
presença do vírus foi confirmada pelo posterior isolamento viral em caprinos (CASTRO et al.,
22
1999; FEITOSA, 2007; HÖTZEL et al., 1993;) e ovinos (ALMEIDA, 2003; MILCZEWSKI
et al., 1997).
2.1.2 Classificação
Os lentivírus são vírus RNA pertencentes à família Retroviridae, gênero Lentivírus
(ICTV, 2006). Pertencem a esse gênero, os vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e
maedi-visna (MVV); das imunodeficiências felina (FIV), bovina (BIV), símia (SIV) e humana
(HIV-1, HIV-2); da anemia infecciosa eqüina (AIEV) (CLEMENTS; PAYNE, 1994;
HAASE, 1986) e da doença de Jembrana (JDV) (BURKALA et al., 1998).
O CAEV e o MVV eram considerados patógenos espécie-específicos, todavia
evidências indicam que os mesmos são capazes de infectar tanto caprinos quanto ovinos
(LEROUX et al., 1997; PISONI et al., 2005; RAVAZZOLO et al., 2006). Além disso, as
análises filogenéticas entre o CAEV e o MVV indicam uma origem comum (LEROUX et al.,
1997; MSELLI-LAKHAL et al., 2000). Portanto, esses vírus são denominados Lentivírus de
Pequenos Ruminantes (LVPR).
2.1.3 Morfologia
Os LVPR apresentam-se como vírions envelopados de 80 a 100 ηm de diâmetro,
contendo duas moléculas idênticas de RNA, possuem capsídeo cúbico e envelope
ligeiramente esférico constituído por lipídios e glicoproteínas que é resultante da fusão do
vírus à membrana plasmática da célula hospedeira no momento de saída do vírus, um
nucleocapsídeo e uma matriz protéica (FIGURA 1) (CRAWFORD et al., 1980).
Apresenta espículas distribuídas em sua superfície, as quais chegam a 8 ηm de
comprimento. O vírus é composto de proteínas (60%), lipídios (35%), carboidratos (3%) e
RNA (2%) (ICTV, 2006).
23
FIGURA 1 - Representação esquemática dos LVPR (BORDERÍAS, 2004).
2.1.4 Organização genômica
O genoma viral é formado por duas fitas simples de RNA (CHEEVERES et al., 1981)
e apresenta duas regiões terminais não codificantes (“long terminal repeats” ou “LTRs”),
envolvidas na habilidade do vírus realizar replicação em células distintas, contribuindo, assim,
para o estabelecimento do tropismo celular (AGNARSDÓTTIR et al., 2000; CLEMENTS;
PAYNE, 1994). Entre as duas regiões terminais estão os genes codificantes para proteínas
estruturais (gag e env) e enzimas virais (pol), além dos genes acessórios tat, vif e rev,
codificantes de proteínas reguladoras (CLEMENTS; PAYNE, 1994) (FIGURA 2).
O gene gag codifica as proteínas internas não-glicosiladas com determinantes
antigênicos específicos da matriz (MA), do capsídeo (CA) e das nucleoproteínas (NU). A
proteína MA é essencial na produção de vírions infectantes, a proteína CA é a mais abundante
do vírus e elicita a produção de anticorpos durante a infecção e a proteína NC confere
proteção ao RNA viral. O gene pol é o responsável por codificar proteínas de atividade
enzimática: transcriptase reversa, protease, integrase. O gene env é que codifica as
glicoproteínas do envelope, superfície e a transmembranar (QUÉRAT et al., 1990; ZANONI,
1998). O gene acessório tat é essencial para a indução da patogenia e rev e vif participam da
replicação viral (CLEMENTS; ZINK, 1996; HARMACHE et al., 1995; JOAG, 1996).
24
FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura gênica do provírus de LVPR. LTR –
long terminal repeat. Adaptado de Bouzar et al. (2003).
2.1.5 Tropismo e replicação viral
A replicação dos LVPR in vivo ocorre, principalmente, nas células do sistema
monocítico-fagocitário, sendo os macrófagos a grande maioria das células infectadas
(BRODIE et al., 1995; CONCHA-BERMEJILLO, 1997; LUJÁN et al., 1994). De acordo com
Gendelman et al. (1986), a infecção celular depende da presença de receptores para o vírus.
Os autores observaram, também, que poucos monócitos apresentam esses receptores,
entretanto os mesmos aumentam após sua maturação.
O RNA viral foi detectado em células endoteliais, epiteliais, fibroblásticas, várias
células do sistema nervoso (plexo coróide, células microgliais, astrócitos e neurônios) e da
glândula mamária (BRODIE et al., 1995; CAPUCCHIO et al., 2003; LERONDELLE et al.,
1999; MSELLI-LAKHAL et al., 1999; SANNA et al., 1999; ZINK et al., 1990). Estudos
utilizando isolamento viral, imunohistoquímica e hibridização in situ têm mostrado que os
LVPR podem penetrar nessas células, entretanto a infecção produtiva é restrita às células da
linhagem dos macrófagos (CONCHA-BERMEJILLO, 1997).
In vitro os LVPR infectam e replicam em macrófagos (NARAYAN et al., 1983), nas
células fibroblásticas do plexo coróide e da membrana sinovial (NARAYAN et al., 1980;
QUÉRAT et al., 1984), nas células musculares lisas (LEROUX et al., 1995), da glândula
mamária (LERONDELLE et al., 1999; MSELLI-LAKHAL et al., 1999) e em fibroblastos
imortalizados (TEIXEIRA et al., 1997).
Uma importante característica dos retrovírus é a presença da enzima transcriptase
reversa (TR) que permite ao RNA viral dar origem à dupla fita de DNA pró-viral que se
incorpora ao genoma celular. Os lentivírus são capazes de se replicar em células diferenciadas
que não estão se dividindo, ou seja, não dependem da síntese de DNA celular para sua
replicação, o que os difere de outros grupos de retrovírus. Entretanto, essas células precisam
ser ativadas para produzir a progênie viral (CLEMENTS; PAYNE, 1994).
25
O ciclo de replicação dos LVPR pode ser dividido em duas etapas principais: infecção
e expressão. A fase de infecção dá origem ao provírus e a fase de expressão resulta na
produção do RNA viral e formação de vírions (GONDA, 1994). Inicialmente ocorre a ligação
do vírus pelas glicoproteínas do seu envelope aos receptores da superfície celular (adsorção),
fusão do envelope viral à membrana celular e o nucleocapsídeo é liberado intracelularmente
(desnudamento). Essa fusão é mediada por uma porção hidrofóbica da proteína
transmembrânica do envelope que penetra na membrana da célula possibilitando a fusão
(OLIVEIRA, 1994) e a penetração do nucleocapsídeo viral no interior da célula hospedeira. A
enzima viral RT transcreve o RNA genômico viral em uma dupla fita de DNA (transcrição
reversa) que é transportado para o núcleo celular e integrado, como um provírus, ao genoma
da célula por ação da enzima integrase (integração). Poucas moléculas de DNA são
integradas, sendo esse fato importante para a persistência da infecção (HAASE, 1986).
O genoma viral torna-se então parte do DNA celular e é duplicado durante a divisão
celular. Portanto, uma vez infectado pelos LVPR, o animal permanece infectado por toda a
vida. Os lentivírus podem ser isolados de animais soropositivos mesmo anos após a infecção
original (CONCHA-BERMEJILLO, 1997). O DNA pró-viral é transcrito em RNA genômico
e RNA mensageiro (RNAm) que é transportado para o citoplasma, onde é traduzido em
proteínas virais. Seguem, então, as etapas de montagem dos virions e sua liberação da célula,
por brotamento (BROOKS et al., 2000), onde os vírus recebem seu envelope que consiste de
partes da membrana celular e glicoproteínas virais (HARTMANN, 1998). O provírus, uma
vez integrado, é estável não existindo evidência de qualquer mecanismo capaz de removê-lo
do DNA celular, realizar a transposição direta dele para outro sítio ou possibilitar a replicação
independente (COFFIN, 1996). A integração do DNA proviral ao DNA celular não é
essencial à replicação dos lentivírus, mas é fundamental para a persistência da infecção
(HAASE, 1986).
26
FIGURA 3 - Ciclo de replicação do Maedi-Visna vírus. Pinheiro, 2001.
2.1.6 Infectividade celular
Apesar dos LVPR replicarem-se in vivo em células do sistema monocítico-fagocitário,
sendo os macrófagos os preferencialmente infectados (NARAYAN; CLEMENTS, 1989;
BRODIE et al., 1995), os linfócitos também são atingidos sem, contudo, haver multiplicação
viral (ZINK; JOHNSON, 1994). Além disso, os vírus já foram detectados na medula óssea
(fibrócitos, células endotelias e adipócitos) de caprinos positivos para CAEV através da
técnica de imunohistoquímica, porém células hematopoéticas mostraram-se negativas
(GROSSI et al., 2005).
In vitro os LVPR replicam-se preferencialmente em fibroblastos formando os efeitos
citopáticos (CPE) característicos. Cepas de MVV, a exemplo da K1514, induzem a formação
de células multinucleadas denominadas sincícios (FIGURA 4) e lise celular sendo, portanto,
classificadas como líticas. Por outro lado, as cepas de CAEV, como a CAEVCo, formam
sincícios com infecção persistente sendo classificadas como persistentes não líticas (PISONI
et al., 2007).
A detecção do RNA viral e do DNA proviral em secções de tecidos caprinos e ovinos
infectados, revelou que os LVPR poderiam infectar uma gama de tipos celulares como células
dendríticas, linfócitos, plasmócitos, células endoteliais, fibroblastos, adipócitos, células
27
microgliais, bem como, células epiteliais dos brônquios, alvéolos, glândulas mamárias, plexo
coróide, intestino delgado, túbulos renais e terceira pálpebra (ANGELOPOULOU et al., 2006;
BIESCAS et al., 2005; BOLEA et al., 2006; CAPUCCHIO et al., 2003; CARROZZA et al.,
2003; GEORGSSON et al., 1989; PREZIUSO et al., 2004; RYAN et al., 2000; STASKUS et
al., 1991; ZINK et al., 1990).
Por meio da técnica de imunohistoquímica e da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), o MVV foi detectado no fígado e no coração de seis ovinos naturalmente infectados.
Além disso, estes testes revelaram antígenos no citoplasma de hepatócitos e cardiomiócitos
(BRELLOU et al., 2007). Ademais, Lamara et al. (2001) demonstraram que as células da
granulosa são permissíveis a infecção pelo CAEV in vitro, reproduzindo altos títulos virais
quando infectadas com duas cepas virais diferentes.
FIGURA 4 – Sincício (setas) em cultura primária de fibroblastos caprinos. Coloração cristal
violeta 0,1%. 200X. Andrioli et al., 2006.
2.1.7 Epidemiologia
Atualmente, as lentiviroses de pequenos ruminantes se encontram distribuídas
mundialmente. No Brasil, estudos sorológicos têm revelado a ocorrência de lentivírus (MVV
e CAEV) nos estados do Rio Grande do Sul (MOOJEN, 1986), Bahia (ASSIS; GOUVEIA,
1994; FITERMAN, 1988), Ceará (ASSIS; GOUVEIA, 1994; PINHEIRO; GOUVEIA;
28
ALVES, 2001), Paraíba (BANDEIRA et al., 2008), Minas Gerais (ASSIS; GOUVEIA, 1994),
Pernambuco (CASTRO et al., 1994) e Rio de Janeiro (ASSIS; GOUVEIA, 1994).
Em Fortaleza, onde se concentra a maior parte do rebanho caprino leiteiro do estado
do Ceará, encontrou-se uma soroprevalência de 40,7% de CAEV (MELO; FRANK, 1997).
No levantamento sorológico realizado por Almeida et al. (2003), de uma amostra de 60
animais destinados ao abate na região metropolitana de Fortaleza, 31,67% foram
diagnosticados como soropositivos para MV. Araújo et al. (2004), analisando ovinos
provenientes de abatedouros da região metropolitana de Fortaleza, verificaram que 4,96 %
dos 222 animais eram positivos ao MVV. Pinheiro et al. (2004) verificaram que a prevalência
da CAE por propriedade no Ceará foi de 9,2% com 66,7% das propriedades apresentando
animais positivos.
Em 2005, Silva et al. analisaram amostras de soro caprino no estado do Rio Grande do
Norte, verificando, na ocasião, que das 184, 2,71 % foram positivas. Costa et al. (2007)
investigaram a presença de LVPR em 558 soros ovinos no estado de Pernambuco,
identificando a presença de 1,07 % de amostras positivas. Ainda em PE, Oliveira et al. (2006)
analisando, também, amostras de soro caprino e ovino provenientes de abatedouros,
notificaram que 3,8% e 5,2 %, respectivamente eram positivos a CAEV e a MVV.
2.1.8 Patogenia
Os lentivírus causam doença de caráter crônico com grande período de latência, não
sendo, contudo, oncogênicos (CLEMENTS; PAYNE, 1994). Após atingir o organismo,
ocorre uma viremia e os vírus irão infectar as células mononucleares do sangue periférico
(CORK; NARAYAN, 1980). A infecção das células do sistema imune, em especial
macrófagos, é a base para a doença multissistêmica vista em todas as infecções lentivirais. A
disseminação dos vírus em múltiplos órgãos envolvidos na doença se dá via monócitos
infectados que não expressam o vírus. Esses chegam ao cérebro, pulmões, articulações e
outros órgãos, onde maturam em macrófagos. A diferenciação em macrófagos ativa a
expressão do gene viral e os vírus são então produzidos nesses órgãos (CLEMENTS;
PAYNE, 1994). As principais alterações patológicas encontram-se no sistema nervoso central
(SNC), nas articulações, nos pulmões e nas glândulas mamárias (HAASE, 1986).
Os mecanismos desenvolvidos pelos lentivírus para persistência da infecção frente à
resposta imune incluem: capacidade dos monócitos de albergar o provírus integrado ao seu
genoma sem ser detectado pelo sistema imune, uma vez que a expressão do gene viral só é
ativada quando os monócitos maturam para macrófagos (BRODIE et al., 1995); capacidade
29
de infectar persistentemente macrófagos, sem causar lise celular, podendo disseminar o vírus
no próprio hospedeiro, sem a produção de partículas virais, mediante contato com outras
células (NARAYAN et al., 1983); interrupção do ciclo viral pelo processamento incompleto
da glicoproteína de superfície (CHEBLOUNE et al., 1996); replicação de variantes
antigênicos na presença de anticorpos neutralizantes e produção de interferon, que diminui o
índice de replicação e favorece a persistência do estímulo antigênico (BERTONI et al., 1994;
CHEEVERS et al., 1993; NARAYAN et al., 1984; ZINK et al., 1987). A alta mutabilidade do
agente que pode resultar em variantes antigênicas funciona como mecanismo de escape da
resposta celular e humoral (CHEEVERS et al., 1993; KNOWLES et al., 1990;
LICHTENSTEIGER et al., 1993).
2.1.9 Resposta imune
Entre as várias proteínas dos LVPR, duas estão mais diretamente envolvidas com a
produção de anticorpos pelo hospedeiro: uma glicoproteína do envelope, de peso molecular de
135 kD (gp135), e uma nucleoproteína de peso molecular de 28 kD (p28) (GOGOLEWSKI et
al., 1985 ; JOHNSON et al., 1983 ; KNOWLES et al., 1991). A infecção por LVPR é
caracterizada pela indução em intensidade variada de resposta imunológica celular e humoral,
que não protegem contra a replicação viral (BERTONI et al., 1994; CHEEVERS et al., 1993).
Estudos de seqüenciamento têm revelado que a resposta imune é direcionada inicialmente à
proteína do capsídeo; em seguida são produzidos anticorpos para as proteínas do
nucleocapsídeo, matriz, transmembranária e de superfície (CONCHA-BERMEJILLO et al.,
1995). Os anticorpos neutralizantes para as glicoproteínas de superfície são produzidos
tardiamente, em quantidade insuficiente, e são de baixa afinidade, de forma que não
interrompem o ciclo de replicação viral (BERTONI et al., 1994; CHEEVERS et al., 1993;
KENNEDY-STOSKOPF; NARAYAN 1986; NARAYAN et al., 1984).
A resposta celular é caracterizada pela proliferação de linfócitos T CD4
+
(REYBURN
et al., 1992) e T CD8
+
(BLACKLAWS et al., 1994; LICHTENSTEIGER et al., 1993) que são
responsáveis pelo ataque às células infectadas, porém são incapazes de destruir as que não
expressam proteínas víricas. Os anticorpos adquiridos pela ingestão de colostro persistem em
níveis detectáveis no soro de cabritos e cordeiros por menos de seis meses (ADAMS et al.,
1983; CUTLIP et al., 1988; MACKENZIE et al., 1987).
Vários fatores contribuem para a persistência viral, entre eles está o alto grau de
variabilidade genética do vírus, como evidenciado pela geração de uma população
intensamente divergente quanto ao genoma viral em indivíduos infectados (CLEMENTS et
30
al., 1988). Essas variantes escapam da ação do sistema de defesa do hospedeiro (KNOWLES
et al., 1990). Além disso, o vírus é capaz de replicar-se independentemente da síntese de DNA
celular, fazendo com que a célula o hospede por longos períodos (KLEVJER-ANDERSON;
CHEEVERES, 1981).
Jolly et al. (1989), investigando a ação de anticorpos (Ac) neutralizantes sobre a
replicação do MVV em culturas celulares de fibroblastos e de macrófagos, constataram que
quando se acrescentava altas concentrações de anticorpos neutralizantes nas culturas a taxa de
replicação do mesmo era bastante diminuída, porém esse efeito era bem mais significativo na
cultura de fibroblastos, sendo que na cultura de macrófagos os títulos do vírus permaneceram
elevados. A ação menos eficiente dos Ac neutralizantes nos macrófagos pode ser considerado
um dos motivos da persistência da infecção in vivo mesmo na presença de grandes
concentrações de anticorpos neutralizantes circulantes.
Diferentemente das lentiviroses de primatas, que afetam primariamente os linfócitos T
CD4 e macrófagos, determinando uma diminuição da resposta imune principalmente pela
infecção das células CD4 com sua conseqüente morte, o MVV não apresenta afinidade por
esse tipo celular, provavelmente pela ausência de receptores moleculares na superfície dessas
células para que o vírus sofra aderência. Essa ausência de adesão às células CD4 pode
explicar o fato da Maedi-Visna não acarretar uma imunossupressão acentuada como nas
lentiviroses de primatas (GORREL et al., 1992).
2.1.10 Sinais clínicos
A infecção por LVPR pode causar afecção multissistêmica, de evolução geralmente
crônica, com agravamento progressivo das lesões, perda de peso e debilidade até a morte. As
apresentações clínicas têm sido classificadas em quatro formas básicas: artrítica, nervosa,
mamária e pulmonar (DAWSON 1987; NARAYAN; CORK 1985; PERETZ et al., 1993).
A forma artrítica é o quadro clínico mais freqüente da CAE caracteriza-se por uma
artrite degenerativa crônica envolvendo principalmente o carpo e o tarso (PERK, 1988). O
aumento das articulações é freqüentemente visível, às vezes, apresentado manifestações de
dor (FRANKE, 1998). A leucoencefalomielite constitui a forma nervosa, e sua ocorrência é
predominante em animais com idade entre um e quatro meses. Os sintomas incluem: fraqueza
muscular, paresia ou ataxia dos membros posteriores, andar em círculo e inclinação da cabeça
(CORK, 1974; LARA et al., 2005). A glândula mamária é passível de apresentar lesões
características de uma inflamação crônica, determinando uma mamite intersticial com
endurecimento do úbere (LERONDELLE et al., 1989). A forma pulmonar é descrita com
31
menor freqüência, no entanto podem ocorrer lesões no parênquima e interstício pulmonar
causando pneumonia intersticial progressiva (LARA et al., 2005).
Por sua vez, nas infecções pelo MVV a apresentação pulmonar é muito freqüente e
grave em ovinos, os sintomas são: tosse, dispnéia após exercícios físicos, taquipnéia e
consolidação pulmonar (CUTLIP et al., 1988; NARAYAN; CORK 1985). Além dessa
sintomatologia, o animal afetado pode apresentar aumento dos linfonodos, articulações e
tecido periarticular, bem como, uma perda de peso acentuada (LAIRMORE et al., 1988).
A forma mamária não é freqüente e predispõe a infecções secundárias. Os animais
afetados apresentam mamite aguda ou crônica. A aguda é observada no início da lactogênese,
havendo endurecimento não edematoso do órgão, com baixa ou nenhuma produção leiteira. A
crônica instala-se durante a lactação com assimetria e endurecimento da mama e leite de
aspecto normal. Em ambas, há hipertrofia persistente dos linfonodos retromamários. (CUTLIP
et al., 1988; OLIVER et al., 1981).
A sintomatologia nervosa tem sido relatada em ovinos adultos, geralmente como
complicação da forma respiratória (CONSTABLE et al., 1996; NARAYAN; CORK 1985).
Os animais, mesmo mantendo o apetite e estado ativo, apresentam ataxia e paresia uni ou
bilateral dos membros posteriores, que evolui para tetraparesia (CUTLIP et al., 1988;
NARAYAN; CORK 1985).
A presença de artrite é pouco freqüente acometendo animais de dois a três anos,
freqüentemente, como complicação da forma respiratória (OLIVER et al., 1981). As
alterações clínicas em geral, afetam as articulações carpianas, sendo observado aumento da
consistência e do tamanho das articulações (CRAWFORD; ADAMS 1981; CUTLIP et al.,
1988; OLIVER et al., 1981; GONZALEZ et al., 1987).
32
FIGURA 5 – Caprino com aumento nas articulações do carpo. Fonte: Brito, 2008.
2.1.11 Diagnóstico
Em virtude da variação do quadro clínico e freqüente desenvolvimento subclínico da
doença, o diagnóstico clínico não é suficiente para sustentar um parecer definitivo. Existe uma
série de técnicas empregadas no diagnóstico dos LVPR (FRANKE, 1998). Elas dividem-se
em técnicas imunológicas (indiretas) e de detecção do vírus ou isolamento (diretas).
A detecção de anticorpos na fase inicial da doença é amplamente dependente da
sensibilidade e especificidade do teste usado, podendo ser influenciada pela duração da
infecção, níveis de viremia, integridade do sistema imunológico do hospedeiro e do fenótipo
viral, como fatores de virulência e tendência para variação antigênica (CLEMENTS et al.,
1988, LAIRMORE et al., 1988, NARAYAN; CLEMENTS, 1989, BRODIE et al., 1993,
BRODIE et al., 1998). Por outro lado, o diagnóstico da infecção pelo isolamento e
identificação do agente não é rotineiramente empregado por ser demorado e bastante
dispendioso, mesmo havendo disponíveis células de linhagens permissíveis a infecção
(CALLADO et al., 2001).
Atualmente utilizam-se técnicas de diagnóstico que possuam boa especificidade e
sensibilidade, sejam elas sorológicas e/ou virológicas como: isolamento do vírus e sua
identificação morfológica e protéica, provas moleculares como a Reação em Cadeia de
33
Polimerase (PCR), que detecta a presença do material genético do agente etiológico, não
necessitando de nenhuma resposta do organismo hospedeiro (BARLOUGH, 1994).
Dentre as formas de diagnóstico dos LVPR mais utilizadas pode-se citar:
imunodifusão em gel de agarose (IDGA), enzime linked immunosorbent assay (ELISA),
isolamento viral e PCR. Cada método apresenta vantagens e desvantagens e a escolha baseia-
se na análise de cada situação em particular (DE ANDRÉS et al., 2005).
2.1.11.1 Imunodifusão em gel de agarose (IDGA)
Dentre os testes sorológicos disponíveis, o IDGA é o recomendado pela Organização
Mundial de Sanidade Animal para o diagnóstico de LVPR. Apresenta uma ampla utilização
principalmente como teste de triagem em programas de controle devido a sua aplicabilidade e
alta especificidade (VAREA et al., 2001). Apresenta baixo custo, é comercialmente
disponível e de fácil execução, tornando-o assim a técnica de diagnóstico sorológico para
LVPR mais comumente utilizada (BRODIE et al., 1993; KNOWLES et al., 1994; MARCOM
et al., 1992; SIMARD; BRISCOE, 1990).
Entretanto, a identificação de animais na fase inicial da infecção é limitada uma vez
que a técnica apresenta baixa sensibilidade e, nesse momento, observa-se uma reduzida
concentração de anticorpos (BRODIE et al., 1998, CONCHA-BERMEJILLO, 1997).
Souza et al. (2007) fizeram um levantamento sorológico, em Juazeiro na Bahia, da
Maedi-Visna em rebanhos ovinos utilizando a IDGA e, verificaram uma prevalência de 0,5%
sugerindo a implantação de medidas de prevenção e controle da enfermidade.
2.1.11.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Conforme De Andrés et al. (2005) os tipos de ELISA são classificados naqueles que
utilizam o vírus inteiro ou proteínas recombinantes como antígenos, e o ELISA competitivo
que utiliza anticorpos monoclonais contra o vírus.
Dantas et al. (2008) desenvolveram e padronizaram um ELISA indireto para o
diagnóstico do MVV e verificaram que o ELISA detectou um número maior de positivos
quando comparado com IDGA. Enquanto Pinheiro et al. (2006) padronizaram o teste Dot-
Blot (DB) para a detecção de anticorpos, em caprinos, contra o lentivírus caprino, utilizando
antígeno experimental preparado a partir do vírus total, e compararam com IDGA e ELISA
indireto (ELISA-i). Das 327 amostras, observou-se que o ELISA-i detectou 209 caprinos
positivos, o DB detectou 200, enquanto a IDGA detectou 144 animais. Portanto, os autores
concluíram que o DB é um teste mais sensível que a IDGA e comparável ao ELISA-i.
34
2.1.11.3 Isolamento em cultivo celular
O isolamento viral em cultivo celular é a principal técnica utilizada para o diagnóstico
da maioria das infecções virais. Baseia-se na capacidade de demonstrar a propagação dos
vírus em cultura de células, através da observação de alterações morfofisiológicas
apresentadas pela monocamada celular, o chamado efeito citopático (CPE). Essa técnica é
aplicável ao diagnóstico de quase todas as viroses de interesse veterinário inclusive CAE e
MV, capaz de detectar quantidades mínimas de vírus, sendo considerado um teste padrão de
diagnóstico em virologia. No entanto, existem algumas restrições, uma vez que é demorada,
dispendiosa, necessita da implantação de cultivos celulares especiais, além disso, é incapaz de
detectar vírus que não causem efeito citopático (KNOWLES, 1997).
O primeiro relato de CPE dos LVPR foi descrito por Sigurdardóttir; Thormar (1964)
num rebanho afetado por Maedi a partir de pulmões de ovinos. No Brasil, Hötzel et al. (1993)
verificaram CPE característico de lentivírus em cultivo celular de MSC, obtido a partir de um
caprino sorologicamente positivo para o CAEV. Sincícios foram encontrados 14 dias após a
inoculação dos cultivos primários. Milczewski et al. (1997) isolaram o MVV pela primeira
vez no Estado do Paraná a partir das articulações e glândula mamária de um ovino com artrite,
perda de peso progressiva, tosse, corrimento nasal, mamite e sorologia positiva para LVPR.
Almeida (2003) fez isolamento de MVV no Estado do Ceará de animais naturalmente
infectados.
2.1.11.4 Reação em cadeia de polimerase (PCR)
Vários trabalhos têm demonstrado com sucesso o uso da técnica de PCR na detecção
do DNA proviral dos LVPR. A PCR permite a amplificação direta de parte do ácido nucléico
viral de fluidos e tecidos de um animal infectado (REDDY et al., 1993; RIMSTAD et al.,
1993; WAGTER et al., 1998; ZANONI et al., 1990). A PCR tem sido utilizada em alguns
laboratórios de forma mais restrita, pois é um teste caro, no entanto possui alta sensibilidade e
especificidade sendo indicado para animais de alto valor zootécnico e para amostras em que
os resultados de outros testes foram inconclusivos (MOOJEN, 2001).
Devido à alta variabilidade genômica dos lentivírus, a escolha dos primers em genes
relativamente conservados como pol, gag e da LTR, combinado a condições de reação para a
máxima sensibilidade, é decisiva para detecção de um grande espectro de cepas de campo de
ambos CAEV e MVV (ZANONI, 1998).
35
Andrioli et al. (2006) avaliaram a presença do DNA pró-viral do lentivírus caprino em
ejaculados de machos infectados naturalmente através da PCR Nested e isolamento viral. O
vírus foi isolado em 7,1% das amostras, enquanto a PCR identificou o DNA pró-viral em
35,7% do total das amostras.
2.1.12 Transmissão
A principal forma de infecção de rebanhos livres se dá por meio da introdução de
animais portadores oriundos de rebanhos contaminados. Dessa forma, os animais infectados
são reservatórios e fonte de infecção dos LVPR. A transmissão ocorre através de secreções
ricas em células do sistema monocítico-fagocitário, principalmente macrófagos (ROWE et al.,
1992). Apesar de ter um significado menor, a transmissão horizontal, através da saliva e das
secreções respiratórias e urogenitais deve ser considerada, dependendo da situação particular
da criação (CALLADO et al., 2001; PETERSON et al., 2008; PISONI et al., 2007).
A infecção via leite/colostro de fêmeas infectadas é a principal via de transmissão em
cabritos seguido da transmissão horizontal através de secreções infectadas, (BLACKLAWS et
al., 2004; HERRMANN-HOESING, 2007; PETERHANS et al., 2004; PISONI et al., 2007).
Também já foi detectada a presença do vírus no sêmen, em células não espermáticas
presentes no ejaculado de animais infectados, podendo assim a monta natural e a inseminação
artificial representarem um risco potencial para a transmissão do vírus (ANDRIOLI, et al.,
1999; ANDRIOLI, et al., 2006; PAULA, 2008; TRAVASSOS et al., 1999).
Em caprinos, o DNA proviral do CAEV foi detectado no útero, oviduto e ovário
(FIENI et al., 2003), nas células cumulus oophorus (ALI AL AHMAD et al., 2005), em
células do córtex ovariano e em folículos ovarianos pré-antrais (SILVA, 2006) e no fluido
uterino (ANDRIOLI, 2001). Sugerindo o potencial do trato genital na transmissão deste
lentivírus para o embrião ou feto.
A transmissão de forma iatrogênica por meio de fômites contaminados como seringas,
tatuadores, material cirúrgico pode ocorrer (LARA et al., 2003; PETERHANS et al., 2004).
2.1.13 Controle e profilaxia
O controle de doenças como as lentiviroses de pequenos ruminantes requer o
diagnóstico por meio de testes sorológicos anuais de todos os animais, separação dos animais
após o nascimento, fornecimento de colostro termicamente tratado (CALLADO et al., 2001;
SHAH et al., 2004). Como citado por Oliveira et al. (2008) no Brasil encontra-se em fase de
estruturação o Plano Nacional de Vigilância e Controle de Lentiviroses de Pequenos
36
Ruminantes (PNVCLVPR), que integra o Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e
Ovinos (PNSCO) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), que
preconiza o uso da imunodifusão em gel de agarose (IDGA) como teste diagnóstico para
LVPR.
2.2 Drogas antivirais
As pesquisas na área da quimioterapia antiviral efetivaram-se no início da década de
50, quando a investigação de agentes antineoplásicos levou ao desenvolvimento de novos
compostos capazes de inibir a síntese do DNA viral (SAFRIN, 2008).
Os testes in vitro de sensibilidade aos compostos antivirais diferem significativamente
daqueles aplicados a agentes antibacterianos. Como os vírus necessitam de células para
replicarem-se, os sistemas de sensibilidade empregam culturas de células. Em geral, uma
redução maior que 50% nos efeitos virais identifica um agente como ativo contra determinado
vírus (WIGG, 2002).
Muitos compostos antivirais têm atividade in vitro contra muitos vírus diferentes, mas
não são eficazes clinicamente. A distribuição da droga, tempo de infecção e problemas de
administração pode limitar a utilidade de muitos fármacos. Vários agentes são convertidos no
corpo em compostos ativos ou devem estar presentes continuamente para exercer um efeito
antiviral. Os vários testes in vitro de sensibilidade viral não podem reproduzir com exatidão
todas as situações in vivo (HAVLICHEK, 1997; SQUIRES, 2001).
De acordo com Page et al. (2004) a eficácia terapêutica de uma droga antiviral pode
ser avaliada in vitro; no entanto, a inexistência de testes padronizados dificulta interpretações
rigorosas a respeito das associações entre concentração das drogas e seus efeitos antivirais.
2.2.1 Locais de atuação
O ciclo de replicação dos vírus apresenta diversos eventos exclusivamente
relacionados a componentes virais, que podem ser utilizados como alvos para intervenção
quimioterápica. Estudos têm sido realizados com o intuito de encontrar moléculas capazes de
inibir eventos específicos dos vírus, sem interferir no metabolismo normal da célula. Apesar
de ser uma tarefa árdua, existem etapas no ciclo de replicação dos vírus passivas de serem
utilizadas como alvos em potencial dos agentes antivirais (SQUIRES, 2001; STEPHEN et al.,
2002; ZHAO et al., 2004). Essas etapas são as seguintes:
Inativação direta das partículas virais;
37
Interferência na adsorção dos vírus às células e/ou bloqueio de receptores necessários
à ligação dos vírus às células;
Inibição do desnudamento e conseqüente bloqueio da liberação do ácido nucléico;
Inibição da transcrição do ácido nucléico e replicação, através da interferência nas
enzimas virais;
Interferência no processamento de proteínas virais quer seja por inibição da clivagem,
quer por inibição da glicosilação;
Inibição do brotamento.
No entanto, atualmente, estão disponíveis fármacos que agem no processo de fusão do
vírus com a célula hospedeira, no sítio de ligação da enzima transcriptase reversa e na
inibição “competitiva” da enzima protease. Uma resposta clínica eficaz foi alcançada
mediante a combinação de diferentes inibidores de transcriptase reversa e inibidores de
protease. Entretanto, a euforia inicial com os avanços terapêuticos foi rapidamente desfeita
frente à velocidade do aparecimento de cepas resistentes a diferentes combinações dos
fármacos disponíveis (SOUZA; ALMEIDA, 2003).
A terapia combinada emprega drogas que possam atuar em dois ou mais estágios da
replicação viral e tem sido um recurso muito usado atualmente, visando diminuir a toxicidade
e reduzir a chance de seleção de mutantes resistentes (DE CLERCQ, 2001).
A maioria das drogas antivirais liberadas pelo FDA (Food and Drug Administration)
consiste em análogos de nucleosídeos com ação inibidora de algumas polimerases virais. Em
geral, essas moléculas são pró-drogas que passam à forma nucleotídica através da ação de
cinases celulares ou virais, capazes de adicionar fosfatos ao nucleosídeo, transformando-o,
então, em nucleotídeo (WIGG, 2002).
2.2.2 Agentes anti-retrovirais
2.2.2.1 Inibidores da transcriptase reversa
A ausência de enzima análoga à transcriptase reversa (TR) em células humanas e o
conhecimento prévio de inibidores de TR, utilizados no tratamento de retroviroses animais,
tornaram a inibição da TR o alvo terapêutico óbvio para o tratamento da infecção por HIV
(SAFRIN, 2008). Um desses inibidores, o AZT, sintetizado inicialmente como um agente
antineoplásico e apresentando atividade antiretroviral contra vírus de leucemia em murinos,
demonstrou atividade inibitória contra HIV-1 in vitro e tornou-se o primeiro fármaco a ser
aprovado para o tratamento da AIDS (BOOTH, 1992). O sucesso inicial estimulou a avaliação
da atividade de diversos análogos de nucleosídeos, descritos ou recém sintetizados, o que
38
resultou na aprovação dos inibidores de TR nucleosídicos (NRTIs) (BALINT, 2001). Essas
drogas bloqueiam a replicação do ácido nucléico mediante inibição de enzimas das vias
metabólicas das purinas ou pirimidinas ou inibição das polimerases utilizadas na replicação
do ácido nucléico. Além disso, alguns análogos podem ser incorporados ao ácido nucléico e
bloquear sua síntese ou alterar sua função (BROOKS et al., 2000). Os NRTIs disponíveis para
o tratamento da infecção por HIV são: zidovudina (AZT), didanosina (ddI), zalcitabina (ddC),
estavudina (d4T), lamivudina (3TC) e abacavir.
Para tornarem-se ativas essas drogas necessitam sofrer fosforilação intracelular e, ao
serem convertidas à forma 5’-trifosfato, atuam como inibidor competitivo ou um substrato
alternativo da TR (DE CLERCQ, 2005). Se o inibidor for incorporado à cadeia de DNA,
torna-se impossível a continuidade da sua replicação, agindo como terminadores de cadeia
(WITVROUW et al., 2000; BALINT, 2001).
Os NRTIs são derivados de adenosina, citidina, guanosina e timidina. Como tal,
fornecem substrato alternativo para DNA polimerases. A importância da modificação química
desses compostos reside na alteração da estrutura 3’-OH do açúcar desoxirribose, que
normalmente forma a ligação 5’-3’ fosfodiéster com o próximo ácido nucléico. A falta de um
grupo hidroxila viável ou, no caso da zidovudina, uma modificação no grupo azido (N
3
),
previne a ligação do ácido nucléico subseqüente pela DNA polimerase. Portanto, os NRTIs
podem impedir a transcrição tanto pela competição na incorporação dos ácidos nucléicos
quanto pela finalização prematura no elongamento da cadeia. A enzima transcriptase reversa
caracterizada por ser DNA polimerase RNA-dependente mostra-se particularmente sensível
aos efeitos dos NRTIs (BALZARINI, 1994).
Análogos de nucleosídeos, desprovidos da capacidade de serem convertidos em
nucleotídeos, serão fatalmente inativos. Com o objetivo de contornar esse problema foram
desenvolvidos novos análogos acíclicos fosforilados de nucleotídeos. Esses derivados
necessitam apenas de duas etapas de fosforilação para serem convertidos nos trifosfatos ativos
que atuam como terminadores de cadeia (DE CLERCQ, 1998b).
Os mesmos foram qualificados como inibidores de transcriptase reversa não
nucleosídicos (NNRTI), diferindo quimicamente dos NRTIs. Em geral, os NNRTI são um
grupo de compostos hidrofóbicos com diversas estruturas capazes de inibir especificamente a
enzima transcriptase reversa. Atualmente, mais de trinta classes distintas de compostos,
apresentando essa atividade farmacológica, foram identificadas. Os compostos aprovados para
uso clínico incluem a nevirapina, delavirdina, efavirenz e etravirina (SLUIS-CREMER;
TACHEDJIAN, 2008). Nesse contexto, a principal vantagem dos NNRTI sobre os inibidores
39
nucleosídicos da TR consiste na independência relativa a necessidade de uma etapa inicial de
ativação intracelular, fosforilação (PEÇANHA et al., 2002).
A) Zidovudina
A zidovudina (3'-azido-3'desoxitimidina) ou AZT é um análogo da timidina detentora
de um radical azido na posição 3’ da desoxirribose com atividade antiviral contra o HIV-1 e o
HIV-2 (FIGURA 6). O AZT é um inibidor competitivo da enzima viral TR. Após a difusão
para as células hospedeiras, o fármaco é inicialmente fosforilado pela timidina-cinase celular.
A etapa que limita a ação antiviral é a conversão em difosfato pela timidilato-cinase, de modo
que estão presentes nas células altos níveis de monofosfatos, mas níveis muito menores de
difosfatos e trifosfatos. O trifosfato de zidovudina, com tempo de meia-vida de eliminação
intracelular de 3 a 4 horas, inibe competitivamente a transcriptase reversa em relação ao
trifosfato de timidina (TTP). Como o grupamento 3'-azido impede a formação de ligações 5'-
3' fosfodiéster, a incorporação da zidovudina gera a interrupção da cadeia de DNA. A
afinidade da zidovudina pela transcriptase reversa do retrovírus é cerca de 100 - 300 vezes
maior do que pela alfa - DNA polimerase humana, o que permite a inibição seletiva da
replicação viral sem bloquear a replicação celular (CHENG et al., 1987).
De acordo com De Clercq (1998a), o aparecimento da resistência está associado com
mutações puntiformes causadoras de substituições de aminoácidos em múltiplos locais na
transcriptase reversa. As mutações que implicam resistência surgem seqüencialmente e são
necessárias várias mutações para conferir um alto nível de resistência.
FIGURA 6 – Estrutura química da zidovudina (De Clercq, 2004).
40
B) Didanosina
A didanosina (ddI) ou 2’,3’-didesoxiinosina é um nucleosídeo análogo a
desoxiadenosina que encerra um hidrogênio nas posições 2’ e 3’ em lugar de um grupamento
de hidroxila (FIGURA 7). A didanosina é fosforilada em 5’- monofosfato de didanosina
(ddIMP) pela atividade da fosfotransferase associada à enzima 5’ – nucleotidase. O ddIMP é
aminado em ddAMP (didesoxiadenosina-5’-monofosfato) pela ação combinada da
adenilsuccinato sintetase com a adenilsuccinato liase. Como o ddAMP pode ser convertido de
volta ao ddIMP, existe um ciclo entre esses dois metabólitos. O ddAMP é transformado em
ddATP (2’,3’-didesoxiadenosina-5’-trifosfato), que é o metabólito da ddI responsável pela
inibição da replicação viral. (SAFRIN, 2008).
O ddATP, como o AZT, não possui o grupamento 3’-hidroxila e, portanto, quando
incorporado em DNA recentemente sintetizado, sobrevém o término do alongamento da
cadeia. O ddATP possui afinidade maior pela transcriptase reversa do HIV-1 do que pela
DNA-polimerase alfa. Essa diferença entre enzimas virais e celulares pode explicar a
seletividade antiviral da didanosina. A didanosina é eficaz, in vitro e in vivo, contra diversos
retrovírus, inclusive HIV-1 (BOOTH; McDONALD, 1992).
FIGURA 7 – Estrutura química da didanosina (De Clercq, 2004).
C) Lamivudina
A lamivudina ou 3TC é o enantiômero da 2’-desoxi-3’-tiacitidina. Sua estrutura
química β-L-3’-Thia-2’, 3’- dideoxicitidina (3TC) está representada na figura 8. Trata-se de
um análogo nucleosídico no qual o carbono 3’ da ribose é substituído pelo enxofre. Apresenta
atividade contra o HIV-1 e HIV-2, é sinérgico com uma variedade de análogos de
nucleosídios anti-retrovirais, incluindo zidovudina e estavudina, contra cepas de HIV-1 tanto
sensíveis quanto resistentes à zidovudina (HAVLICHEK, 1997).
41
O 3TC inibe a produção da transcriptase reversa, enzima que o vírus necessita para se
incorporar ao material genético da célula CD4+. Se o HIV não pode se incorporar à célula,
não pode se replicar. Embora menos potente que a zidovudina e a zalcitabina em inibir
replicação do HIV-1 e HIV-2 in vitro, a lamivudina tem toxicidade celular muito baixa. A
lamivudina atua inibindo a transcriptase reversa em competição com dCTP. O 5’-monofosfato
também provoca o término da cadeia de DNA (DE CLERCQ, 2001).
FIGURA 8 - Estrutura química da lamivudina (De Clercq, 2004).
D) Estavudina
A estavudina (2’, 3'-didehidro-3'-deoxitimidina), chamada de d4T em sua fase de
desenvolvimento, é um nucleosídeo sintético, análogo da timidina. A figura 9 representa sua
estrutura química que é 2’, 3’-didehidro-2’, 3’-dideoxitimidina (d4T). Esse fármaco é
fosforilado por quinases celulares, para sua forma trifosforilada, derivado esse, responsável
por sua ação antiviral. A forma trifosforilada da estavudina inibe a replicação viral por dois
mecanismos:
1) Atua inibindo a enzima viral transcriptase reversa, por competição com o substrato
fisiológico deoxitimidina trifosfato;
2) Inibe a síntese do DNA viral, interrompendo a elongação das suas cadeias
terminais, pela ausência do grupo hidroxila, na posição 3' em sua molécula, que é
indispensável para elongação da cadeia de DNA.
Depois que penetra na célula infectada, a estavudina é inicialmente fosforilada pela
timidina cinase; em seguida formam-se o di e o trifosfato de estavudina. O trifosfato de
estavudina é um inibidor competitivo da transcriptase reversa, em relação ao trifosfato de
desoxitimidina, causando o término da elongação da cadeia de DNA.
42
FIGURA 9 – Estrutura química da estavudina (De Clercq, 2004).
2.2.2.2 Inibidores da protease
Desde 1995, os inibidores da protease (IsP) têm sido considerados componentes chave
na quimioterapia da infecção pelo HIV-1. No entanto, a eficácia a longo prazo de terapias
antiretrovirais é dificultada pela existência de cepas virais que exibem resistência aos
inibidores de protease (OHTAKA; FREIRE, 2005).
Atualmente, existem nove inibidores da protease em uso clínico que são: indinavir,
saquinavir, nelfinavir, ritonavir, amprenavir, lopinavir e atazanavir (OHTAKA et al., 2002) e
os denominados de segunda geração que são o tipranavir e o darunavir, licenciados em 2005 e
em 2007, respectivamente (HUGHES; BARBER; NELSON, 2008). A perda de sensibilidade
dos inibidores de protease decorre do surgimento de cepas virais resistentes capazes de
codificar moléculas de protease contendo aminoácidos mutantes que diminuem a afinidade
pelos inibidores. Mais de 87 mutações têm sido observadas na protease do HIV-1 e a maioria
dessas expressam resistência para um ou mais inibidor (BODEN; MARKOWITZ, 1998; WU
et al., 2003).
No que diz respeito ao mecanismo de ação, durante os últimos estágios do ciclo de
replicação viral, os produtos gênicos gag e gag-pol são traduzidos em poliproteínas,
transformando-se a seguir, em partículas imaturas de brotamento. A protease é responsável
pela clivagem dessas moléculas precursoras, produzindo as proteínas estruturais finais do
cerne do vírion maduro. Sendo, portanto, essencial na produção de vírions infecciosos
maduros durante a replicação vírica. Dessa forma, ao converter a partícula em uma estrutura
não-infecciosa, os inibidores da protease impedem novos episódios de infecção (SAFRIN,
2008).
Alguns inibidores da protease atuam no estado de transição dos substratos peptídicos.
Outros interagem com resíduos catalíticos e deslocam uma molécula estrutural de água.
43
Quando a clivagem pós-tradução dos polipeptídios é impedida por uma mutação ou por um
inibidor, as partículas do vírus brotam a partir da membrana celular em forma imatura e não
infectante. Os inibidores da protease são os principais agentes capazes de bloquear os estágios
finais do ciclo de replicação dos vírus. Como a ligação inibidora à protease também evita a
infecção de células imunes, a protease se tornou um alvo óbvio para a intervenção
quimioterápica (JEROME, 2005).
Um obstáculo relevante na eficácia das drogas antivirais é a presença de aminoácidos
polimórficos nas moléculas alvo, passivo de ocorrer naturalmente por mutações espontâneas
do vírus ou como resultado de uma pressão seletiva de terapias anti-retrovirais (KOZAL et al.,
1996; BODEN; MARKOWITZ, 1998; SHAFER et al., 1999; HERTOGS et al., 2000; WU et
al., 2003).
Estudos têm demonstrado que nem todos os inibidores da protease respondem
semelhantemente a mutações e polimorfismos de ocorrência natural. Alguns são afetados
mais que outros, sugerindo que características estruturais ou químicas são relacionadas com a
susceptibilidade dos fármacos a mutações associadas com resistência à droga (LUQUE et al.,
1998).
A) Atazanavir
É um azapeptídeo inibidor da enzima protease. A fórmula molecular desse fármaco é
C
38
H
52
N
6
O
7•
H
2
SO
4
correspondendo ao peso molecular de 802,9 cuja estrutura química
encontra-se representada na figura 10. É um inibidor de protease (IP) de dose única diária
(ROBINSON et al., 2000) e com potência antiretroviral comparável a do nelfinavir. A
ocorrência de resistência, consequente de mutações, não interfere na sensibilidade a outros
IsP(COLONNO et al., 2002).
FIGURA 10 – Estrutura química do atazanavir (De Clercq, 2004).
44
B) Lopinavir
O lopinavir/ritonavir (LPV/r) era conhecido como ABT-378/R sendo aprovado para
uso clínico pela FDA em setembro de 2000. A figura 11 apresenta sua estrutura química. O
lopinavir/r inibe a atividade da enzima protease (KEMPF et al., 2001). A inibição dessa
enzima evita a clivagem de poliproteínas, conduzindo a produção de partículas virais imaturas
e não infecciosas. A combinação do lopinavir com o ritonavir aumenta os níveis plasmáticos
de lopinavir uma vez que ocorre inibição do metabolismo de lopinavir, culminando em níveis
elevados de lopinavir viáveis para inibir a protease viral (PORCHE, 2001).
Enquanto em 2001 a venda mundial do produto original movimentou US$ 292
milhões. Em 2007, a movimentação girou em torno de US$1.32 bilhões. A maioria das
patentes relacionadas ao ritonavir também cobrem a combinação LPV/r. A patente principal
do LPV foi depositada pelo laboratório farmacêutico Abbott em 1996. Adicionalmente, a
Abbott entrou com pedidos de patentes mais específicas referentes às cápsulas gelatinosas
moles de LPV/r em 1997, que expirarão em 2017. Também foram depositados pedidos de
patentes, em 2004, para proteger a formulação de comprimidos termoestáveis que, caso
concedidas, vigorarão até 2024 (HUGHES; BARBER; NELSON, 2008).
FIGURA 11 – Estrutura química do lopinavir (De Clercq, 2004).
Atualmente as etapas de entrada, integração e maturação do processo de replicação dos
retrovírus são alvos preferenciais para o desenvolvimento de novas drogas antiretrovirais.
Estas novas classes de fármacos apresentam representantes que foram aprovados
recentemente para uso clínico.
2.4. Inibidores da entrada do vírus
Novos fármacos cujo alvo seja a etapa de entrada do vírus na célula hospedeira
representam a mais recente conquista no arsenal de agentes antiretrovirais. Duas novas drogas
45
pertencentes a essa classe foram aprovadas para uso clínico: o inibidor de fusão T20
(Enfuvirtida, fuzeon ou DP178), um peptídeo sintético de 36 aminoácidos cuja aprovação
ocorreu em 2003, e o antagonista do co-receptor CCR5 denominado maraviroc aprovado em
2007. Faz-se necessário frisar que a entrada do vírus na célula hospedeira é essencial para se
estabelecer uma infecção produtiva sendo, portanto, essa etapa um alvo potencial na
prevenção da infecção e transmissão (HUGHES; BARBER; NELSON, 2008).
A aquisição dessa perspectiva deve-se às pesquisas básicas dos mecanismos
moleculares envolvidos no ingresso do vírus a nível celular. O evento central dessa etapa é a
fusão entre as membranas celular e viral, com a liberação do genoma viral no interior da
célula. O componente viral responsável por esse mecanismo é o complexo de glicoproteínas
do envelope, cuja forma ativa é composta por um heterotrímero contendo três moléculas da
glicoproteína de superfície gp120 e da glicoproteína transmebranar gp41. Inicialmente a
gp120 sofre mudanças conformacionais antes de interagir com o co-receptor da célula alvo.
Os co-receptores predominantemente usados pelo vírus in vivo são CCR5 e CXCR4
(ADAMSON; FREED, 2008).
2.2.2.3 Inibidores da integrase
A enzima viral integrase (IN) tem sido alvo de inúmeras pesquisas visando o
desenvolvimento de novas drogas antiretrovirais. Raltegravir foi o primeiro inibidor da
integrase aprovado pela FDA em 2007. Além dele, o elvitegravir encontra-se em fase
avançada de testes. A IN catalisa a integração do genoma viral ao genoma da célula
hospedeira. O genoma viral integrado, provírus, serve como molde para a síntese de RNA
viral (NAIR; CHI, 2007).
2.2.3 Drogas testadas contra lentiviroses animais
Trabalhos cujo objetivo consiste em testar drogas com atividade antiviral contra
lentivírus animais ainda são escassos. Dentre os lentivírus que acometem os animais o FIV é o
mais utilizado como modelo animal para o estudo da patogênese e terapia da infecção pelo
HIV (MAK et al., 2003).
Hartmann et al. (1992) avaliaram a eficácia terapêutica de dois compostos
antiretrovirais, a zidovudina e PMEA (9-fosfonilmetoxetil adenina), em gatos naturalmente
infectados com FIV e com o vírus da leucemia felina (FeLV) e verificaram que o composto
PMEA foi mais eficaz na regressão da estomatite e na melhora do quadro clínico geral. Além
disso, ambos foram capazes de induzir uma melhora no estado imunológico dos gatos
46
infectados com FIV. No entanto, o PMEA apresentou severos efeitos hematológicos não
sendo, portanto indicado para o tratamento prolongado dessas enfermidades nas doses
avaliadas.
Philpott et al. (1992) também determinaram a eficácia profilática da PMEA em gatos
infectados com FIV e observaram que apesar do fármaco não prevenir a infecção ele limitou a
replicação viral, uma vez que, os níveis de genoma viral continuaram baixos nos animais
tratados mesmo após o término do tratamento.
Outro composto avaliado in vitro contra o FIV foi o D4API ou 9-[(2R,5R-2,5-dihidro-
5-phosphonomethoxi)-2-furanyl] adenina e demonstrou um efeito inibitório significativo
quando comparado com PMEA. No que diz respeito a citotoxicidade também foi menor que
da PMEA no período de 7 dias, porém foi mais tóxica no período superior a 10 dias
(HARTMANN et al., 1997).
Le et al. (2001) analisaram in vitro a atividade antiviral de inibidores da protease
previamente sintetizados contra o FIV e HIV, verificando que todos os fármacos
proporcionaram inibição competitiva com as enzimas dos dois vírus evidenciando maior
potência contra a protease do HIV. Além disso, um dos compostos denominado VLE776 foi o
inibidor mais efetivo exibindo potente atividade antiviral em cepas resistentes. Os autores
sugerem o desenvolvimento de inibidores bifuncionais, ou seja, a combinação de um inibidor
de protease com o inibidor de outra enzima viral em uma única molécula. Mak et al. (2001;
2003) também avaliaram a atividade antiviral de uma série de inibidores da protease e
observaram atividade inibitória contra a protease do HIV e do FIV, bem como, a eficácia em
algumas cepas virais resistentes.
Bisset et al. (2002) examinaram um protocolo de combinação de fármacos contra o
FIV e concluíram que o uso combinado do abacavir, análogo nucleosídico inibidor da TR,
com a zidovudina e lamivudina foi capaz de inibir de maneira sinérgica a replicação in vitro
do FIV. Nesse mesmo ano Arai; Earl; Yamamoto analisaram in vitro e in vivo a eficácia
terapêutica e profilática da zidovudina (AZT), lamivudina (3TC) e da combinação entre elas
(AZT/3TC) contra o FIV. Os resultados in vitro demonstraram que os fármacos quando
combinados evidenciaram sinergismo na atividade anti-FIV o que não foi verificado nas
células infectadas cronicamente. O mesmo foi observado in vivo, uma vez que o tratamento
não foi eficaz nos gatos com infecção crônica. Portanto, a combinação AZT/3TC é efetiva na
profilaxia, mas não para uso terapêutico em animais cronicamente infectados.
Thormar et al. (1995) avaliaram agentes com ação anti-HIV comprovada contra a
replicação do maedi-visna vírus (MVV) através da análise do efeito citopático em cultivo de
47
células do plexo coróide, sendo possível verificar que os análogos nucleosídeos acíclicos, bem
como, o 2’,3’-dideoxinucleosídeos apresentaram ação anti-MVV significativa. Em 2001,
Salvatori et al. testaram análogos da citidina e outros fármacos com potencial ação antiviral
e/ou antileucêmico sobre a replicação do MVV, observando que essas classes de drogas
desempenharam uma efetiva inibição do MVV. Outros fármacos, como análogos
deoxinucleosídeos e alguns nucleosídeos, tiveram sua atividade antiviral testada contra o
MVV e o herpesvírus bovino 1 (BHV-1) e foi possível constatar que todos os compostos
proporcionaram boa atividade antireplicativa (SALVATORI et al., 2002).
Outro lentivírus utilizado como modelo para análise da eficácia de drogas antivirais é
o SIV. Black et al. (1996) analisaram a atividade antiviral in vitro de inibidores da protease
contra o SIV. Esses compostos foram capazes de inibir a replicação dos vírus nas culturas
celulares.
2.3. Plantas Medicinais
Nos últimos anos tem-se observado um interesse crescente no uso de produtos
naturais, principalmente os derivados de plantas. As informações existentes sobre a magnitude
do mercado de compostos de origem vegetal são pouco precisas. Por um lado, afirma-se que o
mercado mundial de drogas de origem vegetal é estimado em 12,4 bilhões de dólares.
Fitoterápicos e fitofármacos são responsáveis por 25% das prescrições nos países
desenvolvidos e 80% nos países em desenvolvimento. Outras estimativas revelam que o
mercado mundial de produtos farmacêuticos movimenta 320 bilhões de dólares por ano, dos
quais 20 bilhões são originados de substâncias ativas derivadas de plantas (GUERRA;
NODARI, 2007).
Alguns exemplos de drogas obtidas a partir de plantas são a digoxina da Digitalis spp.,
a quinina e quinidina obtidas da Cinchona spp, vincristina e vinblastina oriundas da
Catharanthus roseus, atropina oriunda de Atropa belladona e a morfina e codeína proveniente
de Papaver somniferum (RATES, 2001).
A importância da medicina alternativa, em especial no Brasil, baseada em plantas
medicinais, deve-se ao elevado custo do desenvolvimento de compostos sintéticos, visto que
uma parcela significativa das matérias primas é importada, inviabilizando dessa forma, sua
aquisição pela população. Vale salientar que a utilização de plantas medicinais traz vantagens
ambientais, pois são produtos biodegradáveis e seu suprimento é auto-sustentável devido à
diversidade da flora medicinal (RATES, 2001). Além disso, o Brasil é o primeiro país em
48
riqueza de espécies e biodiversidade com 56 mil espécies de plantas das 256 mil existentes no
mundo. Portanto, o Brasil possui grande potencial como fonte de compostos biologicamente
ativos provenientes de plantas medicinais, sendo elas conhecidas ou não (MATIAS et al.,
2002).
2.3.1. Plantas medicinais com atividade antiviral
Em todo mundo, é crescente o número de pesquisas com plantas que apresentam
atividade contra vírus, bactérias, fungos e parasitos, não sendo diferente na medicina
veterinária cujas pesquisas com plantas medicinais objetivam a redução de problemas
sanitários no controle de várias doenças que comprometem a produtividade dos animais
(RATES, 2001). No Brasil, as plantas medicinais são largamente utilizadas tanto nas áreas
rurais como urbanas, sendo empregadas em formulações de remédios caseiros, como chás,
xaropes, tinturas, pós ou no desenvolvimento da indústria farmacêutica em cápsulas e pílulas
(MATOS, 1997).
Várias plantas foram descritas como possuidoras de atividade antiviral. O nim
(Azadirachta indica Juss) apresenta propriedades antiinflamatória, antipirética, hipoglicêmica
(MURTHY et al., 1978) e antimicrobianas (SAI RAM et al., 2000). Apesar de diversas
propriedades medicinais de diferentes partes do nim já terem sido bem documentadas, a
avaliação das propriedades antivirais é limitada. No entanto, a eficácia antiviral dessa planta
vem sendo bastante estudada, sendo relatada a ação sobre o vírus do sarampo (GOGATE;
MARATHE, 1989), o herpesvírus simples e o HIV (PREMNATHAN et al., 1996).
Parida et al. (2002) observaram que o extrato aquoso, obtido das folhas de
Azadirachta indica, foi capaz de inibir, tanto in vitro quanto in vivo, a replicação do vírus da
dengue do tipo 2.
Barrio; Parra (2000) verificaram atividade antiviral do extrato aquoso das folhas de
Phyllanthus orbicularis sobre o herpesvírus bovino tipo I e o herpesvírus simples tipo 2.
Resultados satisfatórios com uma planta do mesmo gênero, Phyllanthus amarus, foram
obtidos sobre o vírus da imunodeficiência humana (NOTKA et al., 2003).
Schmitt et al. (2001) investigaram a atividade antiviral dos extratos aquoso e
metanólico obtidos da Hypericum connatum, Hypericum caprifoliatum, Hypericum
polyanthemum contra o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e observaram que o extrato
aquoso de todas as plantas foi tóxico nas diversas concentrações testadas, fato esse não
observado com o extrato metanólico. O extrato metanólico do H. connatum foi o mais eficaz,
uma vez que o sobrenadante das células tratadas com o mesmo apresentou baixo número de
49
partículas víricas. Outras plantas têm apresentado efeito antiviral sobre o FIV como Urtica
dioica, parietaria diffusa e Sambucus nigra (MANGANELLI et al., 2005).
Gonçalves et al. (2005) avaliaram a capacidade de 12 espécies de plantas medicinais de
inibir in vitro rotavírus humano e símio. Foi possível constatar que em concentrações não
tóxicas os extratos da casca de Artocarpus integrifolia e das folhas de Spondias lutea
apresentaram atividade antiviral contra os dois vírus, com inibição de 99,2% e 97%,
respectivamente, para o rotavírus humano e 96,4% e 96,2% para o rotavírus símio. Os
extratos das sementes de Myristica fragrans e da casca de Spondias lutea inibiram o rotavírus
humano. Enquanto os extratos das folhas de Anacardium occidentale e da Psidium guajava
mostraram atividade apenas contra o rotavírus símio.
Kim et al. (1999) identificaram composto extraído do fruto de M. azedarach com ação
antiviral sobre o herpesvírus simples do tipo 1. Este apresentou uma concentração inibitória
média (CI
50
) de 1,46 µg/mL.
Diversos trabalhos têm demonstrado a ação antiviral de M. azedarach. Além disso, tem
sido relatado que extratos de folhas dessa planta exercem amplo efeito antiviral em vírus
DNA e RNA (WACHSMAN et al., 1987).
A) Azadirachta indica
A.1) Origem
Segundo Mitra (1922) citado por Saxena (1999), a real idade da espécie nim
(Azadirachta indica A. Juss) é incerta. No entanto, existem relatos de que uma folha
fossilizada de nim foi encontrada em uma caverna do período Eoceno em Rajastham, Índia.
Acredita-se que o nim é originário de Burma, um país do sudeste asiático cujo ponto central
localiza-se a 22°N e 96°E. Outros atribuem sua origem às regiões áridas da Índia, Paquistão,
Sri Lanka, Malásia, Indonésia, Tailândia e Burma (SAXENA, 1999).
Atualmente essa espécie está distribuída também nas áreas tropicais e subtropicais da
África, Américas e Austrália (SCHMUTTERER, 1990). Jacobs (1961), citado por Lauridsen;
Kanchanaburagura; Boonsermsuk (1991), o nim é natural de Myanmar Superior e cultivado
em toda a Índia, Sri Lanka, Península Indochina (exceto Malásia) e se estendendo desde Java
Oriental até as Ilhas de Sumbawa.
A.2) Taxonomia
O nim (Azadirachta indica A. Juss) pertence à família Meliaceae. Segundo a
classificação taxonômica De Jussieu (1830) citada por Biswas et al. (2002) o nim é
50
classificado como pertencente à ordem Rutales, subordem Rutinae, família Meliaceae,
subfamília Melioideae, tribo Melieae, gênero Azadirachta e espécie indica.
A.3) Descrição Morfológica e Características Fenológicas
De acordo com Schmutterer (1990), essa é uma planta perene ou decídua, bastante
resistente e de crescimento rápido, podendo, caso haja condições edafoclimáticas favoráveis,
atingir até 25 metros de altura. Possui uma copa atraente de folhagem verde escuro que pode
atingir até 10 m de diâmetro e flores com odor de mel (SAXENA, 2001a). As folhas são
compostas e imparipenadas aglomeradas nos extremos dos ramos, simples e sem estípulas. As
flores são de coloração branca e reunidas em inflorescências densas (FIGURA 12), com
estames crescentes formando um tubo, actinomórficas, pentâmeras e hermafroditas (LOPES,
1993).
FIGURA 12 – Flores e folhas da A. indica. Fonte: Araújo, 2008.
A semente consiste em um pericarpo carnudo com uma concha moderadamente macia
no seu interior, a qual armazena em seu cerne o tão cobiçado óleo. O pericarpo contém uma
massa resinosa e enrugada quando seca (KOUL et al., 1990). Os frutos são produzidos
normalmente uma vez ao ano, às vezes duas. Possuem forma oval medindo de 1,4 a 2,4 cm de
comprimento (FIGURA 13) e quando maduro apresentam uma polpa doce amarelada e
tegumento branco contendo um óleo marrom no interior de uma semente
(SCHUMUTTERER, 1990).
51
FIGURA 13 – Detalhe da forma do fruto do nim (Azadirachta indica A. Juss). Fonte: Araújo,
2008.
O cultivo de nim (Azadirachta indica A. Juss), árvore originária da Índia, tem sido
implantado nas regiões Norte, Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil. O principal
produto desta espécie é o óleo retirado das sementes, o qual contém inúmeros compostos
ativos, sendo a azadiractina o mais importante (NEVES, 2004).
Por possuir múltiplos usos, o nim tem atraído muita atenção e seus produtos têm sido
cada vez mais utilizados na agricultura, pecuária, medicina e na fabricação de cosméticos.
Onde praticamente todas as partes da planta são utilizáveis.
A.4) Composição Química
O nim possui cerca de 40 ingredientes ativos, sendo o principal grupo constituído de 3
ou 4 compostos bastante semelhantes. Os principais compostos ativos pertencem a uma
classe de produtos naturais conhecidos como triterpenos, mais especificamente, os
limonóides. Os mais conhecidos e com maior atividade pesticida são a azadirachtina,
salanina, meliantriol, nimbidina e a nimbina. Dentre esses compostos a azadirachtina é o
composto inseticida de maior quantidade encontrado em sementes e em folhas (MULLA;
TIANYUN SU, 1999).
A azadarachtina foi um dos primeiros princípios ativos a serem isolados atribuindo-se
a este composto cerca de 90% dos efeitos causados nos insetos. Existe uma variação nos
isômeros que variam de AZ-A (azadiractina-A) a AZ-G (azadiractina-G). A azadiractina-A é
o componente encontrado em maior quantidade, porém a azadiractina-E é o análogo com
52
maior atividade inseticida. A azadiractina-B está presente em concentrações de até 15%. Os
demais análogos encontram-se em quantidades menores (MULLA; TIANYUN SU, 1999).
Atualmente existem outros compostos ativos identificados e isolados como o
nimbidol, gedunim, nimbinato de sódio, quercentina, dentre outros, extraídos de diferentes
partes da planta (CONRICK, 1994). Esses compostos podem ser extraídos por muitos
métodos. O arraste com água é o método mais antigo e ainda utilizado para extrair
seletivamente a azadiractina. Utiliza-se também a extração por meio de solventes não polares
como, hexano e diclorometano e solventes polares como etanol e metanol que são utilizados
para obtenção do conjunto de compostos químicos existentes na planta (MATIAS et al.,
2002).
A.5) Utilização dos produtos do nim
A.5.1.) Inseticida
A propriedade inseticida do nim é conhecida há mais de dois mil anos na Índia
misturando-se folhas secas de nim a grãos armazenados ou entre as roupas como forma de
repelir insetos (KOUL et al., 1990). Recentemente, diversos estudos têm sido realizados
descrevendo as formas com que os princípios ativos do nim atuam no combate e controle de
pragas. Dentre essas formas pode-se citar: ação inseticida repelente, anti-alimentar, inibidora
de crescimento, antiovopositora, anti-hormonal e no controle do nim sobre a fertilidade de
uma vasta gama de insetos.
A.5.2) Medicinal
De acordo com BISWAS et al. (2002) o nim tem sido utilizado na etnomedicina
indiana a centenas de anos, sendo as folhas, frutos e a casca da árvore as principais fontes
medicinais descritas. Dentre as enfermidades tratadas por esta medicina popular está a
Hanseníase, problemas intestinais, desordens respiratórias, constipação, reumatismo, sífilis
crônica, úlceras, infecções de pele e escabiose.
No entanto, além desses usos populares existem numerosas pesquisas sobre as
atividades biológicas e farmacológicas baseadas em modernas investigações cientificas
(BISWAS et al., 2002). Estudos recentes têm sido propostos com o objetivo de comprovar a
eficácia das propriedades antifúngicas, antibacterianas e antivirais do nim.
53
B) Melia Azedarach
Melia azedarach é uma árvore exótica, introduzida há séculos no Brasil. Caracteriza-
se por alcançar mais de 10m de altura com folhas alternadas, longo-pecioladas, glabras,
bipinadas, com folíolos ovais ou lanceoladas, agudos. Possui flores pequenas, em grandes
panículas eretas e multiflorais, cheirosas, lilases na cor e de anteras amarelas (FIGURA 14).
Natural do sul da Ásia, hoje subespontânea em quase todos os países tropicais. É conhecida
como Jasmim de soldado, flor de viúva e jasmim de viúva, em Pernambuco; sabonete de
soldado, na Bahia; Cinamomo no Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul e também
viuvinha, inclusive no Ceará. Seus frutos são vistosos, globosos e de cor amarelada. É uma
planta facilmente diferenciada de outros membros da família Meliaceae pelo aspecto de suas
folhas, pendulosas e com ramos firmes. Uma de suas principais características é a alta
produção de folhas e frutos (BRAGA, 1976).
FIGURA 14 – Flores da M. azedadach. Fonte: Antonie Van Den Bos, 2004.
Diversas propriedades terapêuticas têm sido atribuídas a M. azedarach. Barquero et al.
(1997) relataram que extratos dessa planta têm sido usados para várias finalidades médicas,
incluindo o tratamento de infecções virais tais como herpes (HSV-1).
B.1) Taxonomia
O cinamomo (Melia azedarach L.) pertence à família Meliaceae. Segundo Cronquist
(1981) essa planta é classificada como pertencente à ordem Sapindales, família Meliaceae,
gênero Melia e espécie azedarach.
54
B.2) Composição química
M. azedarach apresenta atividades medicinal e inseticida, atribuídas aos limonóides,
como azadiractina, um limonóide que possui ação antialimentar em insetos (HUANG et al.,
1995), classificado como um dos compostos mais promissores sendo extraído de Azadirachta
indica e M. azedarach. Os limonóides são tetranotriterpenóides, têm como precursor um
triterpeno que perde quatro carbonos ao originá-lo. Esses compostos são capazes de inibir o
crescimento ou a alimentação de insetos (MATIAS et al., 2002).
Além disso, os extratos de folhas e de sementes de nim e cinamomo contêm cerca de
quatro compostos ativos, dos quais, azadiractina, salanina, meliantriol e nimbim são os
principais e que possuem comprovada ação inseticida. Segundo Matias et al. (2002) além dos
limonóides, outras classes de metabólitos (triterpenóides e esteróides, alcalóides, proteínas,
fenóis e fitoesteróis) também estão presentes nos órgãos de M. azedarach.
55
3 JUSTIFICATIVA
As lentiviroses de pequenos ruminantes apresentam caráter crônico, estão presente em
vários Estados brasileiros causando significativas perdas econômicas. Uma vez que, o
controle baseia-se na detecção e sacrifício dos animais infectados, levando a perda de material
genético. Além disso, até o momento, não se obteve êxito nas tentativas de desenvolvimento
de vacinas e tratamentos para essas enfermidades. Portanto, a busca por alternativas que
reduzam essas perdas é imprescindível. Nesse contexto destaca-se o uso das plantas
medicinais, com atividade antiviral já descrita, capazes de atenuar as ações deletérias dos
LVPR. Dessa forma, esse trabalho justifica-se por avaliar in vitro uma forma economicamente
viável de tratamento utilizando plantas medicinais. Permitindo a avaliação da viabilidade do
tratamento in vivo que justificasse a utilização do material genético de animais infectados.
Paralelo a isso os LVPR surgem como modelo experimental, de baixo custo, para pesquisa e
desenvolvimento de novas drogas antiretrovirais.
56
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Da mesma forma que os fármacos antivirais, os extratos da Melia azedarach e da
Azadirachta indica apresentam efeito inibitório contra os lentivírus de pequenos ruminantes.
57
5 OBJETIVOS
Geral
Avaliar o efeito antiviral in vitro de produtos naturais e sintéticos em cultivos de
fibroblastos infectados por lentivírus de pequenos ruminantes.
Específicos
1) Analisar a citotoxicidade dos extratos das plantas através da concentração
citotóxica média (CC
50
);
2) Avaliar a atividade in vitro dos extratos das plantas Melia azedarach e Azadirachta
indica contra o CAEV;
3) Avaliar a atividade in vitro dos extratos das plantas Melia azedarach e Azadirachta
indica contra o MVV;
4) Verificar o efeito citotóxico das drogas: Lamivudina, Didanosina, Estavudina,
Zidovudina, (3’-azido-2’3’-desoxitimidina; AZT), efavirenz, lopinavir/r e
atazanavir sobre células fibroblásticas de caprinos;
5) Averiguar a atividade das drogas: Lamivudina, Didanosina, Estavudina,
Zidovudina, (3’-azido-2’3’-desoxitimidina; AZT), efavirenz, lopinavir/r e
atazanavir sobre o CAEV em cultivo de células fibroblásticas;
6) Verificar a atividade das drogas: Lamivudina, Didanosina, Estavudina,
Zidovudina, (3’-azido-2’3’-desoxitimidina; AZT), efavirenz, lopinavir/r e
atazanavir sobre os efeitos citopáticos do MVV em cultivo de células
fibroblásticas.
58
6 CAPÍTULO I
AÇÕES FARMACOLÓGICAS E USOS POTENCIAIS DA MELIA AZEDARACH L.
(MELIACEAE): UMA REVISÃO
(Pharmacological actions and potential uses of Melia azedarach L. (Meliaceae): a review)
Artigo aceito para publicação no periódico Arquivos do Instituto Biológico (v.76, n.1)
59
Ações farmacológicas e usos potenciais da Melia azedarach L. (Meliaceae): uma revisão
S.A.C. de Araújo
1
*; M.F.S. Teixeira
1
; T.V.M. Dantas
1
; V.S.P.
de Melo
1
; F.E.S. Lima
1
; A.R.F.
Ricarte
1
; E.C. Costa
1
; Miranda, A.M
1
.
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará -
UECE. Faculdade de Veterinária – FAVET. Laboratório de Virologia. Av. Paranjana 1700,
Itaperi, Fortaleza, Ceará. Brasil. CEP 60740-000. E-mail: suzanaraujo@msn.com
Resumo
Há muito tempo, diversas plantas têm sido utilizadas como medicinais. Além disso, inúmeras
pesquisas são realizadas com o intuito de validar os seus princípios ativos. A Melia azedarach
que apresenta uma ampla utilização popular, já teve muitos princípios ativos isolados e várias
ações farmacológicas testadas e comprovadas. Entre estas ações destacam-se a atividade
antiviral, antimicrobiana, antimalarial, antiparasitária, inseticida, contraceptiva e
antifoliculogênica e citotóxica devidamente comprovadas. Portanto, visando contribuir para
um maior conhecimento a respeito desta planta apresentamos um levantamento enfocando
suas principais ações farmacológicas, biológicas e químicas. Evidenciando desta forma o seu
potencial medicinal e fitoquímico, portanto sua utilização na medicina popular.
Palavras-chave: Melia azedarach; farmacologia; medicina tradicional
Abstract:
Uses potentials of Melia azedarach L. (Meliaceae): a raise. Different plants have been using
as medicinal plants for many years. Moreover, various researches are carrying out to validate
its principles active. The Melia azedarach present a wide popular use and it has already had
diverse isolated active principles and some pharmacological actions tested and proven. These
actions are antiviral, antimicrobial, antimalarial, antiparasitic, insecticide, contraceptive and
antifolliculogenese activity proven. Therefore, we present a raise about the main
pharmacological, biological and chemical actions of Melia azedarach to contribute with a
great knowledge the respect of this plant, evidencing thereby its medicinal potential and
phytochemistry and therefore the use of plant in the popular medicine.
Key words: Melia azedarach; pharmacology; traditional medicine
60
Introdução
O uso de plantas medicinais tem sido significativo nos últimos tempos. As
informações existentes sobre a magnitude do mercado de compostos de origem vegetal são
pouco precisas. Sabe-se que os fitoterápicos e fitofármacos são responsáveis por 25% das
prescrições nos países desenvolvidos e 80% nos países em desenvolvimento (GUERRA;
NODARI, 2007). Existem diversos fármacos oriundos exclusivamente de plantas, como por
exemplo: digoxina de Digitalis spp da família Scrophulariaceae, vincristina de Catharanthus
roseus (L.) G. Don da família Apocynacenae, entre outras (RATES, 2001).
Em todo o mundo é crescente o número de pesquisas com plantas que apresenta
atividade contra vírus, bactérias, fungos e parasitos, não sendo diferente na medicina
veterinária onde as pesquisas por plantas medicinais objetivam a redução de problemas
sanitários no controle de várias doenças que comprometem a produtividade dos animais
(NIEZEN et al., 1996).
São diversos os fatores que colaboram no desenvolvimento de práticas de saúde que
incluam plantas medicinais, principalmente econômicos e sociais. Atualmente pesquisas vêm
sendo realizadas com o intuito de se avaliar cientificamente as drogas originárias das plantas.
Melia azedarach L., membro da família Meliaceae, comumente conhecida por lírio,
lilás da Índia ou cinamomo, tem sido cultivada há muitos anos (GUHA; NIJI, 1965) e usada
frequentemente como medicinal. É uma árvore com altura superior a 10m, com folhas
alternadas, longo-pecioladas, glabras, bipinadas, com folíolos ovais ou lanceolados e agudos.
Flores pequenas, em grandes panículas eretas e multifloras, cheirosas, lilases na cor e de
anteras amarelas (BRAGA, 1976). Cresce rapidamente, quer por semente, quer por estaca. Em
certas regiões da Índia é forragem comum dos bovinos, ovinos e caprinos. Nativa da região
nordeste da Índia, hoje se encontra distribuída em quase todos os países tropicais (BURKS,
1997).
Diversos trabalhos têm descrito esta planta como possuidora de inúmeras
propriedades. Como, atividade antifúngica (CARPINELLA et al., 1999), inseticida (GAJMER
et al., 2002), antiviral, antimalárica (KHAN et al., 2001) e anti-helmíntica (MCGRAW et al.,
2000; JOSHI; JOSHI, 2000). Na medicina popular suas raízes, caule, folhas, frutos e flores
têm sido amplamente empregados contra uma variedade de doenças. Suas folhas e flores são
usadas para aliviar dores de cabeça, e mais especificamente, suas folhas são utilizadas como
anti-helmíntico, antilítico, diurético na Índia e na China (OELRICHS et al., 1983). É utilizada
também em doenças de pele, dor estomacal, desordens intestinais, doenças uterinas e cistites,
61
bem como diurético e febrífugo (KHAN et al., 2001). Além disso, M. azedarach tem sido
avaliada também contra Rhodnius prolixus Stäl (CABRAL et al., 1996), Triatoma infestans
Klug (VALLADARES et al., 1999) Oncopeltus fasciatus Dallas (CABRAL et al., 1999) e
parasitos gastrintestinais (HAMMOND et al., 1997). Portanto, esta revisão objetiva analisar as
principais propriedades inseticidas, antiparasitárias, antimicrobianas e medicinais da M.
azedarach focando os principais estudos realizados com a mesma.
Fitoquímica
Segundo SRIVASTAVA; GUPTA (1985) M. azedarach apresenta atividades
medicinal e inseticida, atribuídas aos limonóides, como azadiractina, um limonóide que
possui ação antialimentar em insetos (HUANG et al., 1995), classificado como um dos
compostos mais promissores sendo extraído de Azadirachta indica A. Juss e M. azedarach.
Os limonóides são tetranotriterpenóides que tem como precursor um triterpeno, que perde
quatro carbonos ao originá-lo (SIMÕES et al., 2007). Estes compostos são capazes de inibir o
crescimento ou a alimentação de insetos (MATIAS et al., 2002). As plantas que possuem
limonóides apresentam, além da atividade inseticida, muitas outras aplicações como
antitumorais, antifúngicas, bactericidas e antivirais, o que sugere o papel deles na defesa das
plantas contra determinados microrganismos (CHAMPAGNE et al., 1992). Além disso, os
extratos de folhas e de sementes de nim e cinamomo possuem cerca de quatro compostos
ativos, dos quais, azadiractina, salanina, meliantriol e nimbina são os principais e possuem
comprovada ação inseticida, antitumoral, citotóxica, antihelmíntica e antiviral (TAKEYA et
al., 1996). As salaninas são triterpenóides que têm sido descritas como composto
biologicamente ativo em insetos, encontrados em plantas da família Meliaceae, como A.
indica e M. azedarach (YAMASAKI et al., 1988). Segundo MATIAS et al. (2002) além dos
limonóides, outras classes de metabólitos (triterpenóides e esteróides, alcalóides, proteínas,
fenóis e fitoesteróis) também estão presentes nos órgãos de M. azedarach.
CABRAL et al. (2000) avaliaram o extrato metanólico de sementes de M. azedarach
sobre ninfas de Rhodnius prolixus (Hemiptera) e Oncopeltus fasciatus verificando ação sobre
a muda do inseto, tendo como substâncias responsáveis os fitoesteróis, lignanas e triterpenos.
a) Taninos
Os taninos compreendem um grande grupo de substâncias complexas muito
disseminadas no reino vegetal; em quase todas as famílias botânicas há espécies que contêm
taninos. Quando ocorrem em grandes quantidades geralmente se localizam em determinados
órgãos da planta como as folhas, os frutos, o córtex ou o caule. Costumam ser divididos em
duas classes químicas, com base na identidade dos núcleos fenólicos existentes e na maneira
62
como se unem. Como ésteres são facilmente hidrolisados, produzindo ácidos fenólicos e
açúcar, são conhecidos como taninos hidrolisáveis. Os taninos condensados compõem a
segunda classe. Os taninos precipitam proteínas e podem combinar-se a elas, tornando-as
resistentes às enzimas proteolíticas (ROBBERS et al., 1997).
Os frutos de M. azedarach são conhecidos por conterem o alcalóide azaridina, taninos
e ácidos benzóicos (CARROTOLA 1939 citado por OELRICHS et al., 1983). Dentro deste
contexto, MADIBELA; KELEMOGILE (2008) verificaram que algum destes componentes,
em associação ou não, podem ser responsáveis pelos efeitos verificados na produção de
oocistos em caprinos infectados naturalmente com espécies de Eimeria.
MACIEL et al. (2006) analisando a atividade larvicida e ovicida da Melia azedarach
no Haemonchus contortus Rudolphi, verificaram após análise fitoquímica a presença de
taninos condensados, triterpenos e alcalóides.
Testes in vitro realizados com extratos ricos em taninos ou com taninos puros têm
identificado diversas atividades biológicas dessa classe de substâncias. Dentre essas
atividades podem-se citar: ação bactericida e fungicida, antiviral, moluscicida, inibição de
enzimas e ação antitumoral (SIMÕES et al., 2007). Taninos condensados
(ATHANASIADOU et al., 2001) e hidrolisáveis (COSTA et al., 2002) também são descritos
na literatura como prováveis possuidores de atividade anti-helmíntica.
Segundo experimentos realizados a curto e longo prazo em animais de laboratório, os
taninos condensados extraídos de plantas como da Vitis vinifera L.(uva) pertencente à família
Vitaceae e Camellia sinensis L. (chá verde) família Theaceae, são isentos de toxicidade.
Entretanto, outros ensaios clínicos são necessários para resolver problemas no que diz respeito
à segurança e eficácia dos taninos condensados como agentes terapêuticos (ROBBERS,
1997).
b) Triterpenos e esteróides
Os limonóides são tetranotriterpenóides e talvez os maiores representantes dessa classe
como substâncias inseticidas, no entanto, os monoterpenos simples, como o limoneno e
mirceno desempenham um papel de proteção contra insetos nas plantas que os produzem. Os
limonóides são também conhecidos como meliacinas e são assim denominados devido ao seu
sabor amargo. Tais substâncias foram isoladas de plantas pertencentes às famílias Meliaceae,
Rutaceae e Cneoraceae. Sua rota biossintética em plantas prevê como precursor um triterpeno
que no final, dá origem aos tetranotriterpenóides pela perda de quatro átomos de carbono do
precursor original. Os limonóides são conhecidos pelo fato de apresentarem atividade contra
63
insetos, seja interferindo no seu crescimento, seja pela inibição na ingestão de alimentos
(SIMÕES et al., 2007).
Existe uma grande diversidade de limonóides isolados da família Meliaceae, entre eles
azedarachinas (HUANG et al., 1995), sendaninas e trichilinas (TAKEYA et al., 1996), além
dos que apresentam o anel C-seco, como a azadiractina que é o principal composto. SIMÕES
et al. (2007) citam que a azadiractina foi isolada inicialmente por Buterworth e Morgan em
1968. Em 1975, Zanno e sua equipe propuseram sua estrutura que, posteriormente, foi
corrigida por Kraus em 1985. Estes compostos podem ser encontrados em todos os tecidos
das plantas, no entanto, os órgãos podem individualmente produzir diferentes tipos de
limonóides (NAKATANI et al., 1996). Os limonóides com anel C-seco se restringe aos
gêneros Azadirachta sp e Melia sp. (CHAMPAGNE et al., 1992). Estas substâncias são
comuns naquelas plantas que têm maior atividade inseticida. Estes compostos possuem o anel
C do núcleo dos tetranotriterpenóides aberto como pode ser observado na azadiractina, que é
o maior representante desta classe. Azadiractina e outros compostos bioativos do nim podem
exercer múltiplas ações afetando a alimentação, crescimento e desenvolvimento de patógenos
e seus vetores (MULLA; TIANYUN, 1999).
c) Alcalóides
Os alcalóides são compostos nitrogenados farmacologicamente ativos, encontrados
predominantemente em angiospermas. Alcalóides podem ser encontrados em todas as partes
de um vegetal, contudo em um ou mais órgãos haverá acúmulo preferencial dessas
substâncias. Em geral, os alcalóides presentes em plantas da família Meliaceae são
quinazolônicos, diterpênicos ou mistos. O amplo espectro das atividades biológicas reportado
aos alcalóides pode ser relacionado com sua variedade natural (SIMÕES et al., 2007). A
atividade anti-helmíntica dos alcalóides também tem sido descrita. Paraherquamida é um
alcalóide, reportado como um potente nematodicida. Este alcalóide inibiu em 50% a
motilidade de larvas de terceiro estágio L3 de Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus
colubriformis e H. contortus após 72 horas de exposição, nas concentrações de 0,033; 0,058 e
2.7µg/mL (GILL; LACEY, 1993). SHOOP et al. (1992), dosificaram bovinos com
paraherquamida e observaram que nas doses de 1,0 a 4,0 mg/kg 95% dos parasitos foram
removidos, dentre eles, Haemonchus placei, Ostertagia ostertagi, Trichostrongylus axei e
Oesophagostomum radiatum.
64
Propriedades farmacológicas da Melia azedarach
a) Atividade antiviral
WACHSMAN et al. (1998) observaram que a Meliacina (MA), peptídeo isolado das
folhas da Melia azedarach, inibiu a multiplicação do vírus da febre aftosa em células BHK-
21. A MA inibiu, in vitro, a multiplicação do vírus junin em células Vero (CASTILLA et al.,
1998). Em outro estudo, a MA mostrou eficácia contra o vírus herpes simples do tipo 1 (HSV-
1) tanto isolada quanto em associação com o fármaco antiviral aciclovir (BARQUERO et al.,
1997). PIFARRÉ et al. (2002) verificaram inibição da multiplicação in vitro do HSV-1 ocular
pela MA, composto com atividade antiviral presente em extratos de folhas da M. azedarach.
KIM et al. (1999) analisaram a atividade antiviral de um composto purificado do fruto
da M. azedarach, identificado como 28-deacetilsendanin (28-DAS) e concluíram que este
composto foi capaz de inibir a replicação do HSV-1, reduzindo a síntese de timidina quinase e
conduzindo à formação de nucleocapsídeo defeituoso. Em 2003, ALCHÉ et al. também
verificaram ação in vitro de composto isolado, 1-cinnamoyl-3,11-dihidroximeliacarpina, das
folhas de M. azedarach sobre os vírus herpes simples (HSV-1) e da estomatite vesicular com
IC
50
de 20 e 6µM, respectivamente. O isolado tetranortriterpenoide 1-cinnamoyl-3,11-
dihidroximeliacarpin (CDM), extraído de folhas da Melia azedarach reduziu a multiplicação
tanto do vírus da estomatite vesicular quanto do HSV-1 (BARQUERO et al., 2006).
b) Atividade antimicrobiana
KHAN et al. (2001) testando a atividade antimicrobiana dos extratos das folhas, caule
e raiz da M. azedarach observaram um alto espectro de atividade antibacteriana do extrato
metanólico contra Bacillus coagulans, Enterobater aerogenes, Proteus mirabillis,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi. A atividade aumentou com o
fracionamento, particularmente na fração diclorometano extraída do caule. Porém, não foi
verificada atividade contra os fungos testados.
O extrato etanólico obtido dos frutos maduros da M. azedarach apresentou ação
fungistática e fungicida contra Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme, Microsporum canis
e Candida abicans (CARPINELLA et al., 1999).
c) Atividade antimalarial
Os extratos metanólicos de folhas e sementes, da M. azedarach, foram testados contra
o Anopheles stephensi Liston e mostraram ação contra larva, pupa, adultos e ovos. O extrato
metanólico obtido das sementes demonstrou elevada bioatividade em todas as doses testadas,
sendo capaz de suprimir a fase adulta do A. stephensi com uma dose de 0,5%, enquanto o
65
obtido das folhas apresentou-se ativo apenas nas doses maiores de 1 e 2% (NATHAN et al.,
2006).
d) Atividade antiparasitária
Extratos do caule são utilizados como anti-helmíntico na ilha de Mauritius e na China.
Além disso, na Argélia a planta é utilizada como tônico e antipirético, e no sul da África no
tratamento da lepra, eczema e para alívio de ataques asmáticos (OELRICHS et al., 1983).
CARPINELLA et al. (1999) avaliaram a atividade antifúngica desta planta e relataram
que o extrato etanólico obtido de frutos maduros apresentou atividade fungiostática e
fungicida para diversos fungos patogênicos como Candida albicans, Aspergillus flavus e
Microsporum canis. Existem ainda outros empregos para os farmacógenos do cinamomo: na
China são usadas cascas, folhas e frutos como anti-helmínticos e tratamento de micoses, na
África para tratar malária, e na Coréia a casca do caule é usada na forma de decocto para
tratar vermes intestinais (MATIAS et al., 2002). KHAN et al. (2001) avaliaram a atividade
antimicrobiana de M. azedarach sobre diversos tipos de bactérias, protozoários e fungos como
Bacillus coagulans, Enterobater aerogenes, Proteus mirabillis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Salmonella typhi, e Trichomonas vaginalis, obtendo ótimos resultados.
No Rio de Janeiro, CABRAL et al. (1996) relataram que o extrato metanólico de
sementes de M. azedarach constitui-se uma ferramenta importante no controle de Rhodnius
prolixus, vetor da doença de Chagas. VALLADARES et al. (1999) avaliaram a ação desta
planta sobre T. infestans e demonstraram que os extratos obtidos dos frutos mostraram
atividade repelente contra ninfas deste inseto. De acordo com DANTAS et al. (2000), o
decocto de folhas de M. azedarach tem sido utilizado como carrapaticida, já estando
comprovada a existência de princípio ativo, presente nesta planta, sobre Rhipicephalus
microplus Canestrini.
MACIEL et al. (2006) avaliaram a atividade ovicida e larvicida dos extratos das
sementes e folhas sobre o H. contortus e observaram que o extrato etanólico das sementes e
folhas foi mais ativo sobre os ovos e desenvolvimento larval, respectivamente.
CARPINELLA et al. (2007) verificaram a atividade ovicida e pediculicida in vitro, de
um extrato e óleo extraído dos frutos da M. azedarach e observaram que os dois, tanto
individualmente quanto em associação, mostraram elevado nível de mortalidade nos
Pediculus humanus capitis L. adultos.
e) Atividade inseticida
Plantas da família Meliaceae são conhecidas por conter uma variedade de compostos
descritos como inseticidas, antialimentar, e regulador do crescimento (NAKATANI et al.,
66
2004). Atualmente, alguns produtos disponíveis no mercado como inseticidas contêm
azadirachtina como componente principal. Esta substância tem sido isolada de várias plantas
da família Meliaceae tais como A. indica e M. azedarach (VIEGAS-JÚNIOR, 2003). A
azadiractina interfere no funcionamento das glândulas endócrinas que controlam a
metamorfose em insetos, impedindo o desenvolvimento da ecdise, apresentando, ainda,
atividade fagoinibidora, além de antialimentar, repelente e inseticida (SIMÕES et al., 2007).
HUANG et al. (1996) isolaram limonóides das raízes de M. azedarach e testaram a
inibição da alimentação dos insetos Spodoptera eridania Stoll. Os compostos salanal e
meliacarpinina E mostraram a melhor atividade. Outros compostos como, salanina, di-
acetilsalanina, nimbolinina e ninbolidina B também foram isolados, todavia com menor
atividade.
NAKATANI et al. (1998) pesquisaram o extrato das partes aéreas, raízes e do caule de
M. azedarach e obtiveram os seguintes compostos: azedaralide e 12-hidroxiamoorastatina. O
azedaralide apresentou atividade ictiotóxica e antialimentar sob Oryzias latipes e larvas de
Spodoptera littoralis Boisduval, respectivamente.
Em 1999, BOHNENSTENGEL et al. isolaram constituintes das folhas de M.
azedarach com atividade inseticida, derivados da meliacarpina que foram denominados 1,3-
dicinnamoyl-11-hidroximeliacarpin, 1-cinnamoyl-3-methacrilil-11-hidroximeliacarpina e 1-
cinnamoyl-3-acetil-11-hidroximeliacarpin. As propriedades inseticidas das meliacarpinas
foram testadas sob larvas de Spodoptera litorallis e comparadas com a atividade da
azadiractina, apontando serem prejudiciais à metamorfose larval.
NATHAN et al. (2006) testaram o extrato metanólico de sementes de M. azedarach
em diferentes concentrações sobre pupas e adultos de Anopheles stephensi e obtiveram na
concentração de 2% um percentual de mortalidade de 92 e 90%, respectivamente.
Os limonóides são provavelmente os maiores representantes da classe dos terpenos
com atividade inseticida, e suas principais fontes são espécies das famílias Meliaceae e
Rutaceae (VIEGAS-JUNIOR, 2003). ANSARI et al. (2000) avaliaram a ação do óleo de
Mentha piperita L. sobre larvas de Ae. aegypti, A. stephensi e Culex quinquefasciatus e
observaram 100% de mortalidade das larvas na de 3 mL/m
2
. ANSARI et al. (2005) avaliaram
o óleo de Pinus longifolia sobre larvas de Ae. aegypti, A. stephensi e C. quinquefasciatus
observando 96, 84 e 88% de mortalidade das larvas na concentração de 200 ppm.
CHOOCHOTE et al. (2004) avaliaram o extrato etanólico das sementes de Apium graveolens
sobre A. aegypti e obtiveram 96,2% de mortalidade das larvas na concentração de 120mg/L.
67
Os dados citados demonstram as possibilidades da utilização de plantas no controle de
insetos.
Estudos anteriores demonstraram as diferentes propriedades de M. azedarach como a
atividade repelente e inseticida dos extratos das folhas e frutos desta planta, contra os ovos e
ninfas do Triatoma infestans e verificaram que o extrato do fruto imaturo foi repelente para o
1º e 4º estágios ninfais. Já o extrato do fruto maduro apresentou um fraco efeito, enquanto que
o extrato das folhas foi ineficaz (VALLADARES et al., 1999).
A busca por novos compostos tem sido intensa contra Aedes aegypti L., vetor do vírus
da dengue, doença endêmica nas Américas Central e do Sul, Ásia e África. Neste contexto, o
extrato etanólico, das sementes de frutos maduros da M. azedarach e da Azadirachta indica,
foi eficaz contra as larvas do Aedes aegypti. Verificando que os dois extratos no combate as
larvas (WANDSCHEER et al., 2004). Enquanto CORIA et al. (2007) analisaram o efeito dos
extratos obtidos das folhas e dos frutos da M. azedarach sobre o Ae. aegypti e verificaram
uma atividade tanto larvicida quanto ovicida.
Atividade supressora do crescimento larval foi observada com o extrato da semente
meliácea contra o Cnaphalocrocis medinalis (Guenée) (Lepidoptera: Pyralidae), maior inseto
do arroz (Oryza sativa L.) (NATHAN, 2006). O efeito do extrato aquoso da M. azedarach foi
avaliado sobre a traça-do-tomateiro, Tuta absoluta Meyrick foi possível constatar que as
folhas foram a estrutura vegetal com maior bioatividade sobre a traça, vindo em seguida os
frutos verdes, ramos e frutos maduros (BRUNHEROTTO; VENDRAMIM,2001).
Analisando os efeitos de lignanas e neolignanas na inibição da ecdise da larva de
Rhodnius prolixus, CABRAL et al. (2000) verificaram que o pinoresinol, isolado da M.
azedarach, apresentou o maior efeito inibitório da ecdise quando administrado oralmente na
dose de 100µg/mL.
VALLADARES et al. (1997) testaram o extrato etanólico dos frutos de M. azedarach
sobre Xanthogaleruca luteola Müller, havendo eficácia em diferentes concentrações. Sobre
este mesmo inseto, DEFAGÓ et al. (2006) testaram extratos de folhas e frutos e verificaram
atividade antialimentar.
Isômeros obtidos a partir do fracionamento sistemático de extrato de M. azedarach
apresentaram atividade antialimentar, tanto quanto azadiractina, contra Epilachna paenulata
Germ. (Coleoptera:Coccinellidae) e Spodoptera eridania (Lepidoptera:Noctuidae) nas
concentrações de 4µg/cm
2
e 1µg/cm
2
, respectivamente (CARPINELLA et al., 2002).
Alguns autores pesquisaram a atividade carrapaticida dos extratos de M. azedarach.
BORGES et al. (1994) relatam que o extrato oleoso do fruto desta planta apresentou inibição
68
da postura variando de 65,7% a 99,8%, enquanto que a inibição da eclodibilidade variou de
84,2% a 100,0%. No que diz respeito à eficácia, as médias foram de 99,1%; 99,2% e 100,0%
para as diluições de 0,25%, 0,50% e 1%, respectivamente. Além destes, SOUSA et al. (2008)
avaliaram a ação de extratos hexânicos do fruto de M. azedarach sobre fêmeas ingurgitadas e
larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e verificaram uma mortalidade de 100% das
larvas e controle eficaz das fêmeas.
f) Atividade contraceptiva
KESHRI et al. (2003) testaram à ação do extrato etanólico de raízes da M. azedarach
sobre a gestação de ratas adultas e, verificaram uma interrupção da gestação de 60% e 75%
quando administradas as doses de 250 e 500 mg/kg diariamente. No fracionamento, a
atividade foi localizada na fração clorofórmica do extrato etanólico, que mostrou atividade de
80-100% na dose diária de 250 mg/Kg.
g) Atividade antifoliculogênica
ROOP et al. (2005) investigaram a ação dos extratos de A. indica e M. azedarach
sobre os aspectos quantitativos do desenvolvimento folicular em ratas albina e verificaram
uma redução significativa no número normal de folículos, bem como nos folículos em vários
estágios do desenvolvimento folicular em todos os grupos tratados.
h) Atividade citotóxica
AHN et al. (1994) estudaram a casca do caule da M. azedarach visando elucidar o uso
popular desta planta como antitumoral, para tanto isolaram limonóides tóxicos para cinco
linhagens celulares tumorais humanas sendo estas adenocarcinoma de cólon, ovário, pulmão,
melanoma maligno e carcinoma do Sistema Nervoso Central. Foram identificados os
seguintes compostos: 12-hidroxiamoorastatona com menor atividade, 12-
hidroxiamoorastatina e 12-acetoxiamoorastatina com maior atividade citotóxica.
Os limonóides isolados de M. azedarach por TAKEYA et al. (1996) apresentaram
atividade citotóxica in vitro contra células da leucemia linfocítica (P388).
No ano de 2005 ZHOU et al. isolaram quatro novos limonóides do extrato metanólico
de frutos da M. azedarach. Dentre os limonóides isolados, dois apresentaram atividade
citotóxica significante contra linhagem celular Hela S3 (câncer epitelial humano).
Desta forma, diante do exposto a presente revisão envolvendo as ações
farmacológicas, biológicas e químicas da M. azedarach, evidencia o seu potencial medicinal e
fitoquímico, uma vez que a mesma apresenta atividade inseticida e antimicrobiana além de
outros usos justificando a utilização na medicina popular.
69
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75
7 CAPÍTULO II
CYTOTOXIC AND ANTIVIRAL ACTIVITIES IN VITRO OF AZADIRACHTA
INDICA A. JUSS AND MELIA AZEDARACH L. AGAINST SMALL RUMINANT
LENTIVIRUS
(Citotoxicidade e Atividade antiviral in vitro da Azadirachta indica A. Juss e Melia azedarach
L. contra lentivírus de pequenos ruminantes)
Periódico: Small Ruminant Research (Submetido em novembro de 2008)
76
In vitro cytotoxic and antiviral activities of Azadirachta indica A. Juss and Melia azedarach
L. against small ruminant lentivirus
Suzana Aparecida Costa de Araújo
1*
; Raymundo Rizaldo Pinheiro
2
; Tânia Valeska Medeiros
Dantas
1
; Alice Andrioli
2
; Francisco Esmaile Sales Lima
1
; Aryana Lushese Vasconcelos Lima
Feitosa
1
; Edmara Chaves Costa
1
; Ronaldo Pereira Dias
2
; Valeska Shelda Pessoa de Melo;
Aracely Rafaele Fernandes Ricarte; Selene Maia de Morais
1
; Cláudio Cabral Campello
1
;
Maria Fátima da Silva Teixeira
1
.
1
State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
2
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Sobral, CE, Brazil.
*Corresponding address:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
Laboratório de Virologia
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi.
Fortaleza – CE – Brazil. CEP: 60740-000
Tel.: +55-85-3101-9849; Fax number: +55-85-3101-9849
E-mail adress: suzanaraujo@msn.com (Suzana Aparecida Costa de Araújo)
77
Resumo
Produtos naturais representam uma fonte inesgotável de compostos com atividades
farmacológicas promissoras incluindo ação antiviral. Melia azedarach e Azadirachta indica
têm sido utilizadas em doenças virais, bacterianas e fúngicas. Portanto, o objetivo deste
trabalho foi avaliar o efeito citotóxico e o potencial inibidor de extratos obtidos da Melia
azedarach e Azadirachta indica na replicação dos lentivírus de pequenos ruminantes. A
citotoxicidade foi estudada mediante a avaliação da morfologia celular e por meio do teste de
viabilidade celular utilizando a redução do MTT. A atividade antiviral foi analisada através da
pesquisa de inibição dos efeitos citopáticos e pela prova do MTT. A concentração citotóxica
que causou uma redução em 50% da monocamada celular (CC
50
) foi 25 µg/mL. Os extratos
hexânico, acetato de etila e etanólico da A. indica inibiram eficazmente tanto o CAEV-Cork
quanto o MVVK1514. No que diz respeito aos extratos da M. azedarach o hexânico,
clorofórmico e o etanólico impediram a replicação de ambos os vírus. Os extratos
clorofórmico e acetato de etila da A. indica e M. azedarach, respectivamente, não
demonstraram atividade antiviral. A análise fitoquímica dos extratos revelou a presença de
taninos condensados, flavonóides, alcalóides e esteróides.
Palavras-chave: citotoxicidade; antiviral; Melia azedarach; Azadirachta indica; lentivírus de
pequenos ruminantes.
78
Abstract
Natural products are an inexhaustible source of compounds with promising pharmacological
activities including antiviral action. Melia azedarach and Azadirachta indica are being used
against certain fungal, bacterial and viral diseases. The objective of the present study was to
evaluate the cytotoxic effect and inhibitory potential of extract of M. azedarach and A. indica
on the replication of small ruminant lentivirus. The cytotoxicity was investigated by cell
morphology evaluation and MTT assay. The potential antiviral properties were investigated
by the cytopathic effects inhibition assay and MTT method. The cytotoxic concentration
which caused destruction in 50% of the monolayer cells (CC
50
) was 25µg/mL. The hexane,
ethyl acetate and ethanol extracts of A. indica effectively inhibited both the CAEV-Cork as
MVVK1514. With regard to the extracts of the M. azedarach the hexane, chloroform and
ethanol prevented the replication of both viruses. The extracts chloroform and ethyl acetate of
A. indica and M. azedarach, respectively, demonstrated no antiviral activity. Phytochemical
analysis of the extracts revealed the presence of condensed tannins, flavonoids, alkaloids and
steroids.
Keywords: cytotoxicity; antiviral; Melia azedarach; Azadirachta indica; small ruminant
lentivirus.
79
Introduction
Natural products have been used for curative and therapeutic purposes for a long time.
However, the higher potential use of plants as sources of new drugs is still poorly explored
but currently there has been growing interest in the use of natural products, especially those
derived from plants, as an alternative method to the conventional chemical control (Devienne
et al., 2004).
During the last few years efforts have been made to increase the number of substances
with antiviral activity along with high efficacy, low toxicity and minor side effects. Natural
products have been an abundant source of compounds which have proved to be useful in
antiviral chemotherapy (Bedoya et al., 2001) especially those originating from plant extracts
which provide compounds directly useful as drugs or as leads for the synthesis of new
medicines (Nielsen, 2002).
Worldwide, there is an increasing amount of research with plants showing activity
against viruses, bacteria, fungi and parasites and which is also true for veterinary medicine
where medicinal are searched for plants to reduce health problems in the control of various
diseases that damage animal productivity (Rates, 2001).
In the context of small ruminant lentivirus (SRLV), caprine arthritis encephalitis
(CAEV) and maedi-visna virus (MVV) there is worldwide distribution, rapid dissemination
among species and they are endemic in many regions. The characteristic lentiviruses have
chronic development and lead to later death. To date, attempts at developing vaccines and
established treatments for these diseases have not been successful. However alternative
strategies have been sought to control for instance, the use of plants with antiviral activity. It
is known that plants act as source of antivirals, antibiotics and insecticides, as they are used in
the treatment of viral infections in humans and animals (Barquero et al., 1997). For instance,
both Melia azedarach L. and Azadirachta indica J., have been described as having several
properties, including the antiviral one (Khan et al., 2001). These plants have already been
described in various studies with various properties such as anti-inflammatory, antipyretic,
hypoglycemic, antimicrobial (Sai Ram et al., 2000) and antiparasitic (Maciel et al., 2006;
Costa et al., 2008). Despite several medicinal properties, different parts of this plant have
already been well documented, but the evaluation of antiviral properties is still limited. The
antiviral efficacy has been reported against the measles virus (Gogate; Marathe, 1989),
herpesvirus simplex and human immunodeficiency virus (Premnathan et al., 1996), Dengue
virus type -2 (Parida et al., 2002), herpesvirus simplex (Barquero et al., 1997; Kim et al.,
1999; Pifarré et al., 2002), Junin virus (Castilla et al., 1998), foot and mouth disease virus
80
(Wachsman et al., 1998), and vesicular stomatitis virus (Barquero et al., 2006). Thus the
possibility is proposed of using them as an alternative to the treatment of small ruminant
lentiviruses.
The aim of this study was to assess the cytotoxicity and the potential antiviral activity
of extracts obtained from A. indica and M. azedarach against SRLV.
Materials and methods
Plants
Leaves of A. indica were collected in Eusébio city, Ceará state, Brazil. Canopy parts of
M. azedarach were collected in Teresina city, Piauí state, Brazil. Plants were identified by
botanists at the Prisco Bezerra Herbarium of the Federal University of Ceará, Brazil. A
voucher specimen of each plant was deposited under number 34623 and 38576, respectively.
Plants extract preparation
The plant parts collected were dried at room temperature and then mixed with ethanol
(90%) for 1 week. After filtration, the solvent was evaporated using a rotary evaporator to
obtain the ethanol extract. This extract was mixed with silica gel at a 1:1 ratio and the mixture
was placed in a Buchner funnel and submitted to vacuum filtration and eluted with the organic
solvents hexane, chloroform, ethyl acetate and ethanol, resulting in the respective fractions.
The solvents were evaporated until the extracts were dry. The extracts were kept at room
temperature until use. To test the biological activity, the extracts were dissolved in dimethyl
sulfoxide 2,5% (DMSO, Sigma) and were placed in cell culture medium to a concentration of
100µg/mL.
Phytochemical study of plants
Phytochemical tests to detect the presence of phenols, tannins, leucoantocianidins,
flavonoids, steroids, triterpens and alkaloids were performed and accomplished following
Matos (1997) methodologies. These tests are based on visual observation of color
modification or formation of precipitates after adding specific reagents.
Virus
Maedi-Visna virus strain K1514 (Sigurdsson et al., 1960) and caprine arthritis
encephalitis virus strain CAEV Cork (Cork et al., 1974) were used throughout the experiment.
The viral strains had a titre of 10
4.2
and 10
5.3
TCID
50
/mL, respectively.
Virus titration
Viral infectivity was titrated by inoculating 10-fold dilutions of the virus suspension
into fibroblast cell monolayer in 96-well microtiter tissue culture plates. One-tenth milliliter
81
of virus dilution was placed in each well in quadruplicate. The plates were incubated in a
CO
2
-controlled incubator at 37°C with 5% CO
2
and were examined for cytopathic effect
(CPE) at 14 days post infection. Virus titers were calculated by the method by Reed and
Muench (1938).
Cell culture
Caprine synovial membrane primary cells were obtained by explanting a carpal joint
collected at a slaughterhouse. The tissue came from an animal that was confirmed negative for
SRLV by serology. Cells were cultivated in minimum essential medium (MEM) containing
antibiotics, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). After a monolayer of cell
culture grew, the cells were treated with a solution of trypsin and incubated in 25cm
2
flasks at
37
o
C. After four passages, the cells were frozen and stored in liquid nitrogen. The serum
concentration was reduced to 2% when the culture was subjected to virus inoculation.
Cytotoxicity assay
Fibroblast cells were trypsinized and adjusted to 2x10
5
cells per mL in MEM
supplemented with 10% FBS. Aliquots of 0.1 mL were used to seed each well of 96 well
tissue culture plates; the plates were then incubated at 37
o
C in a humidified 5% CO
2
atmosphere. Twenty four hours later, the culture medium was removed, and fresh medium
containing serial dilutions from 0.39 to 100 µg/mL of each extract were inoculated using four
wells of the plate for each dilution and 100 µL of inoculum per well. For cell controls 100 µL
of MEM without added extract were used. The plates were incubated at 37
o
C in a humidified
5% CO
2
atmosphere for 24, 48, 72, 96 and 120 hours.
To evaluate the cytotoxicity of the extracts under study, the following methods were
applied:
Cell morphology evaluation by inverted light microscopy
Monolayers were prepared as above and incubated with different concentrations of the
extracts prepared as mentioned. The cytotoxicity was evaluated by crystal violet 0.1%
staining to facilitate the visualization of cell morphology. Cell morphology was observed
daily for microscopically detectable morphological alterations, such as loss of confluence, cell
rounding and shrinking, and cytoplasm granulation and vacuolization. Morphological changes
were scored and CC
50
values were estimated (concentrations required to cause visible
alterations in 50% intact cells). The following scores were given: 0 when there were no
changes in the cell monolayer (Fig. 1A), score 1 in the presence of partial destruction (Fig.
1B) and score 2 when there was total destruction (Fig. 1C).
82
Figure 1 – Fibroblast cells stained with violet crystal. Figures 1A, 1B and 1C represent the
increase in the cytotoxicity of extracts from A. indica and M. azedarach.152X
Cell viability test by 3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)
method
The cells were prepared and extracts disposed as described above. Medium was
removed from all wells and 50 µL of MTT (Sigma, 1mg/mL) solution prepared in MEM and
filtered through a 0.2 µm filter, added to each well and the plates were incubated for 4h at
37
o
C in a humidified 5% CO
2
atmosphere. The MTT solution was removed without
disturbing the cells and 100 µL of DMSO was added to each well to dissolve formazan
crystals. After gently shaking the plates for 5 minutes, whereby crystals were completely
dissolved, the absorbance was read on a multiwell spectrophotometer (Bio-Rad, Model 680,
US) at wavelength 490nm. The percentage of cytotoxicity was calculated as [(A-B)/Ax100],
where A and B are the absorbances of control and treated cells, respectively. The CC
50
was
defined as the concentration that reduced the absorbance of treated cells to 50% when
compared to cell controls (Andrighetti-Fröhner et al., 2003).
Antiviral assay
Cytopathic effects (CPE) inhibition assay
For this test, monolayer cells were seeded in 96-well plates; 24h later they were
inoculated with 3 x 10
5
TCID
50
/mL
of the virus in an inoculum of 0.025 mL per well. After 1h
incubation at 37
o
C, eight wells of the plates were inoculated with each of the following
concentrations of the extract: 0.39; 0.78; 1.56; 3.12; 6.25; 12.5 µg/mL, in an inoculum of
0.025 mL per well. Finally, 0.05 mL of the culture medium was added to each well and the
plates were incubated at 37
o
C. The readings were made when CPE were complete in the
controls, after 7 days of incubation.
A B C
83
MTT method
Cell cultures (2x10
5
cells/mL) were prepared in 96-well tissue culture plates, and the
extract dilutions, as described above, were added just after inoculating 100 µL of each virus
used before. Plates were incubated for 7 days. The same method was followed used to
evaluate cell viability with MTT as described above. The protection percentages were
calculated spectrophotometrically as [(AB)/(C-B) x100], where A, B and C indicate the
absorbances of extract, virus and cell controls, respectively.
In all tests to evaluate the antiviral properties, extracts were used in non-cytotoxic
concentrations 0.39; 0.78; 1.56; 3.12; 6.25; 12.5 µg/mL. Moreover, negative the control group
consisted of cells and viruses without the addition of extracts and the positive control of the
virus without the addition of extracts.
Statistical analysis
All experiments were performed in quadruplicate and the results shown represent
mean ± standard error of the values in four different experiments. The data were first
subjected to the Sharpiro-wilk and Bartlett tests to evaluate the normal distribution and
homogeneity of variance between treatments. When met the conditions necessary for analysis
of variance was performed using the GLM procedure of the SAS program (1999) and the
means were compared by the Student Newman Keuls test (SNK). In cases of
heterocedasticidade, even after logarithmic transformation, angled or root of the data, the
analysis was performed by the non-parametric Kruskal-Wallis test.
Results
The inhibitory potential of A. indica and M. azedarach was evaluated by cytotoxicity
studies to detect the CC
50
for virus inhibition assay. The cytotoxicity of the tested extracts is
expressed in µg according Table 1. The CC
50
value obtained with extracts of A. indica and M.
azedarach was ≤ 25 µg/mL considered the highest concentration which did not cause
significant damage in fibroblasts, regardless of method of analysis used, the incubation period
and type of statement. It was found that the cytotoxicity increased gradually with increase in
its concentration.
The inhibitory effect of extracts from A. indica against CAEVCo and MVVK1514
showed that except for the chloroform extract all had significant antiviral activity against both
viruses when the method of assessment was reduced by MTT. The hexane extract
demonstrated the highest percentage of inhibition activity for both CAEV and the MVV at the
concentration of 6.25 µg/mL. Among the M. azedarach extracts only the chloroform showed
inhibitory activity against CAEVCo at the concentration of 6.25 µg/mL with an inhibition
84
percentage of 64.13% and the ethanol extract at the concentration of 0.39 µg/mL presented
59.37% inhibitor MVV K1514.
The present studies undertaken to explore the in vitro inhibitory potential of A. indica
and M. azedarach exhibited the protective effect on CAEV and MVV by inhibiting the virus
replication in fibroblasts as indicated by the absence of CPE in infected cells. According to
the results shown in Table 2, the hexane, ethyl acetate and ethanol extracts of the A. indica
effectively inhibited CPE both the CAEV-Cork as MVVK1514. With regard to the extracts of
the M. azedarach the hexane, chloroform and ethanol prevented the replication of SRLV. The
extracts chloroform and ethyl acetate of A. indica and M. azedarach, respectively,
demonstrated no antiviral activity. Comparing the results of MTT tests with the detection of
CPE inhibition a higher concentration was usually required a higher concentration in the MTT
test to inhibit viral replication. In addition, the hexane extract of M. azedarach showed
antiviral activity in search of CPE inhibition, which was not checked when the evaluation
method was the MTT test.
Table 3 shows the results of phytochemical screening. It can be observed that the
steroids were found in all extracts of both plants, while alkaloids were not only detected in the
hexane extract of A. indica. Most extracts that had shown antiviral activity presented tannins
and flavonoids, compounds that presents as one of its shares to antiviral. The absence of
limonoid azadirachtin, often composed isolated of Meliaceas, due to the qualitative character
of the phytochemical analysis. The Figure 2 shows that the hexane extract of A. indica at its
maximum concentration (6.25µg/mL) inhibited replication of the whole range of virus
concentration employed in the present study, as indicated by the absence of CPE.
Figure 2 – Virus inhibition assay showing the inhibition of cytopathic effects (CPE) of
CAEVCo in fibroblasts by hexane of A. indica. A – Fibroblasts without virus and extracts.
B – CPE of CAEVCo. C – CPE Inhibition of CAEVCo in fibroblasts treated with hexane of
A. indica (6.25µg/mL). 300X.
C
B
A
85
Discussion
Assessment of cytotoxicity is clearly an important part of the evaluation of potential
antiviral agents since a useful compound should show neither acute nor longterm toxicity
against the host. Such a compound should be completely selective for virus specific processes
with no or few effects on cellular metabolism (Simões et al.1999). Many methods have been
developed for determining the antiviral activity of compounds in cell culture. Cytotoxicity is
usually evaluated in vitro by using cell viability assays, such as the uptake of a dye by dead
cells after breakdown of the cellular permeability barrier such as Trypan blue or
mitochondrial function as MTT, but other parameters, such as changes in cell morphology
under microscopic examination have also been used as indicators of compound toxicity.
These endpoints have been established for many years and in many cell types (Vlietinck et al.
1997, Eisenbrand et al. 2002).
MTT are probably the most commonly used colorimetric indicators of cell viability
and they have been used to evaluate cytotoxicity quantitatively in contrast to cell morphology
evaluation by inverted light microscopy which is qualitative and more subjective (Smee et al.
2002).
Both M. azedarach and A. indica have been used traditionally as curatives against
certain fungal and bacterial diseases. Despite the enormous antimicrobial potential of these
trees with versatile attributes, the research on antiviral properties has been confined to only a
few viruses such as measles, HSV, Junin and Dengue virus.
Several authors have determined the cytotoxicity of M. azedarach isolates in different
cell types to evaluate the antiviral activity. However, in these cases it is not common to use
crude extracts. Meliacine (MA), a purified peptide exhibits antiviral activity against a range of
enveloped animal viruses (Villamil et al., 1995). The M. azedarach isolate is most used in
tests of antiviral activity. The cytotoxic concentration 25µg/mL found was less than that
reported by other authors such as Barquero et al. (1997) who used MA on Vero cells with no
cytotoxic effect at all on the concentrations tested for antiviral activity. Wachsman et al.
(1998) measured cytotoxicity using MTT and observed no cytotoxic effect of MA up to
100µg/mL. Castilla et al. (1998) analyzed the effect of MA on cell growth and no cytotoxic
effect was observed as determined by recording the number of viable cells at the end of
treatment with a range of concentrations from 0.048 to 50µg/mL. Similarly, the compound
purified from the M. azedarach fruit was identified as 28-deacetylsendanin (28-DAS) on Vero
cells with no cytotoxic effect at 400µg/mL (Kim et al., 1999).
86
Parida et al. (2002) evaluated the inhibitory potential of crude aqueous extract of neem
leaves and pure neem compound Azadirachtin (Aza) and reported that pure Aza is more toxic
both in “in vitro” and “in vivo” systems as compared to crude aqueous extract. The in vitro
maximum non-toxic dose (MNTD) for Aza was ≤ 0.48 mg/mL as compared to ≤ 3.125
mg/mL in in vivo systems. The MNTD for crude aqueous extract was ≤1.875 mg/mL and ≤
120 mg/mL in in vitro and in vivo systems, respectively.
Various cell culture-based assays are available and can be successfully applied for the
antiviral determination of synthetic or natural compounds (Vlietinck; Vanden Berghe 1998)
which include visual quantification of antiviral activity based upon the inhibition of the virus
induced cytopathic effect (CPE) (Simões et al., 1999, Semple et al., 2001, Li et al. 2002,) or
by less subjective measures, such as the colorimetric MTT assay (Takeuchi et al., 1991;
Betancur-Galvis et al., 2002).
MTT was first applied to quantify cellular proliferation (Mosmann, 1983) and is now
widely used for screening antitumoral (Betancur-Galvis et al., 2002) and antiviral (Bedard et
al., 1999; Takahashi et al., 2001) activities of a large number of natural products. This assay
has several advantages: it is easy to perform, the evaluations are objective, it can be
automated using a personal computer, and the cytotoxicity evaluation can be made in parallel
with antiviral activity evaluation (Takeuchi et al., 1991).
For viruses that cause microscopically discernable CPE in cells, visual scoring of CPE
inhibition is performed more frequently because it is quick, and allows a number of
compounds to be evaluated together using 96-well microplates (Smee et al., 2002).
Different isolates from M. azedarach and A. indica inhibited the multiplication of
various virus such as Junin virus (Castilla et al., 1998), Herpes simplex virus type 1 (Barquero
et al., 1997; Kim et al., 1999; Pifarré et al., 2002), Foot and mouth disease virus (Wachsman
et al., 1998), vesicular stomatitis virus and herpes simplex type 1 (Alché et al., 2003;
Barquero et al., 2006) and Dengue virus type-2 (Parida et al., 2002) at different
concentrations. These studies differ from the effective concentrations in this study because the
concentrations tested, cell type and viruses used also differed.
The classes found in constituent phytochemical analysis of the ethanol extract of M.
azedarach were similar to those observed by Maciel et al. (2006). The presence of tannins and
flavonoids in some extracts may be responsible for the antiviral activity since a number of
biological properties have been described for various flavonoids and tannins. The antiviral
effect against several DNA and RNA viruses of plant-derived flavonoids has also been
reported elsewhere (Narayana et al., 2001). These include antiviral activity against bovine
87
herpesvirus type 1 (Akula et al., 2002), parainfluenza type 3 (Li et al., 2002), influenza A
H1N1 (Wei et al., 2004) and human cytomegalovirus (Evers et al., 2005).
The extracts of leaves and seeds have about four active compounds, of which limonoid
azadirachtin is the principal. Limonoids have attracted much attention because of the marked
insect antifeedant and growth regulating properties, cytotoxic and antiviral activities (Takeya
et al., 1996). According to Matias et al. (2002) than those in addition to the limonoids, other
classes of metabolites (triterpenoids, steroids, alkaloids, proteins, phenols and phytosterols)
are also present in the bodies of M. azedarach.
Testing in vitro made with extracts rich in tannins or with pure tannins has identified
several biological activities of this class of substances. These activities include bactericide and
fungicide action, antiviral, molluscicide, enzymes inhibition and antitumour action (Simões et
al., 2007).
In conclusion, this study has given a scientific basis to the ethnoveterinary use of the
M. azedarach and A. indica, by effective antiviral concentrations of extracts in vitro as well as
by determining the relative cytotoxicity of such extracts for cells in vitro and by the
identifying of several chemical compounds present which are likely to contribute to the
antiviral effects seen. Therefore it is necessary to continue the research with the aim of
isolating the active principles in statements and clarify action mechanism.
Acknowledgements
This research was supported by National Research Council (CNPq) and Ceará
Foundation to Support Scientific and Technological Development (FUNCAP). The authors
would like to thank National Goat Research Center in Sobral city, State of Ceará, Brazil and
Laboratory in natural products chemistry.
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91
Table 1 – Cytotoxicity and antiviral activity of A. indica and M. azedarach using the MTT
assay.
Species
Extracts
CC
50
(µg/mL)
CAEVCo MVVK1514
IC
50
(µg/mL)
CAEVCo MVVK1514
% inhibition
Hex 25 6.25 6.25 96.23 97.22
Cl 25 NA NA 0 0
Ac 25 0.78 0.78 64.84 76.47
A. indica
Et 25 6.25 0.78 94.38 73.75
Hex 25 NA NA 0 0
Cl 25 6.25 NA 64.13 0
Ac 25 NA NA 0 0
M. azedarach
Et 25 NA 0.39 0 59.37
Control ZDV 12.6 0.12 1.26 62.8 69.7
CC
50
– 50% cytotoxic concentration; CI
50
– 50% inhibitory concentration of the viral effect;
NA- no activity; Hex – hexane; Cl- chloroform; Ac- ethyl acetate; Et- ethanol; ZDV-
Zidovudine.
92
Table 2 – Inhibitory concentration of extracts that inhibit the cytopathic effects (CPE) of
SRLV.
Species
Extracts
IC
50
inhibiting CPE of virus (µg/mL)
CAEVCo MVV K1514
Hexane 3.12 3.12
Chloroform _ _
Ethyl Acetate 3.12 3.12
A. indica
Ethanol 1.58 0.78
Hexane 3.12 1.56
Chloroform 1.56 _
Ethyl Acetate _ _
M. azedarach
Ethanol _ 0.39
Control Zidovudine 0.12 1.26
93
Table 3 – Phytochemical of extracts of A. indica and M. azedarach
Species Extracts Tannins Flavonoids Steroids Alkaloids
A. indica Hex
Cl
Ac
Et
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
M. azedarach Hex
Cl
Ac
Et
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Hex – hexane; Cl- chloroform; Ac- ethyl acetate; Et- ethanol.
94
8 CAPÍTULO III
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE DROGAS ANTIVIRAIS
EM FIBROBLASTOS CAPRINOS
(In vitro evaluation of the cytotoxic activity of antiviral drugs in goat fibroblasts)
Artigo aceito para publicação no periódico: Ciência Animal
95
Avaliação in vitro da atividade citotóxica de drogas antivirais em fibroblastos caprinos
(In vitro evaluation of the cytotoxic activity of antiviral drugs in goat fibroblasts)
Suzana Aparecida Costa de Araújo*, Maria Fátima da Silva Teixeira, Tânia Valeska Medeiros
Dantas, Aline Mesquita Miranda, Francisco Esmaile Sales Lima, Valeska Shelda Pessoa de
Melo, Aracely Rafaele Fernandes Ricarte, Edmara Chaves Costa.
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/ Universidade Estadual do Ceará
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito citotóxico das drogas antivirais em cultivos de
fibroblastos que foram isolados por explantation da membrana sinovial de caprinos
soronegativos para a presença de anticorpos para lentivírus de pequenos ruminantes. As
células eram mantidas em cultivo, para posterior utilização nos testes de citotoxicidade,
contendo Meio Essencial Mínimo (MEM) acrescido de SFB 10%, antifúngico, antibióticos e
glutamina. Para o teste de citotoxicidade das drogas, alíquotas de 0,1mL de fibroblastos, na
concentração de 2x10
5
células/mL, foram depositadas em microplacas de 96 poços, incubadas
por 24 e 48h com posterior troca do meio por outro contendo diluições de 0,005µM, 0,05µM,
0,5µM, 5µM, 50 µM e 500 µM de cada droga, que foram: zidovudina (AZT), estavudina,
lamivudina, didanosina, efavirenz, atazanavir e lopinavir. Após 24 horas de incubação o meio
foi desprezado e acrescentou-se 100 µL de azul de tetrazólio (MTT) a uma concentração de
5mg/mL. As microplacas foram incubadas por 4h/37
o
C. Posteriormente, adicionou-se 100 µL
de uma solução de 95% de isopropanol e 5% de ácido fórmico. A análise espectrofotométrica
foi medida em um leitor de ELISA a uma absorbância de 600nm. A partir dos valores das
densidades ópticas determinou-se a concentração da droga capaz de reduzir em 50% as
células viáveis. Dessa forma, a zidovudina e a didanosina na concentração de 0,05µM e a
estavudina e a lamivudina nas concentrações de 0,5µM e 500µM, respectivamente, não
apresentaram efeitos tóxicos. Concluindo-se que essas drogas mostram potencial para o
desenvolvimento de testes capazes de mensurar sua atividade antiviral frente aos lentivírus de
pequenos ruminantes (SRLV – small ruminant lentivirus).
Palavras-chave: fibroblastos caprinos, citotoxicidade, drogas antivirais
96
ABSTRACT
The main goal of this work was to evaluate the cytotoxic effect of antiviral drugs in cultured
fibroblasts isolated by explantation of synovial membrane from small ruminant lentivirus
seronegative goat. The cells were grown in MEM supplemented with 10% fetal bovine serum,
antifungic, antibiotics e glutamine. Drug cytotoxicity assay was performed in 0,1mL of
fibroblasts with 2x10
5
cells per mL, cultivated in 96 well microplates, incubated for 24h and
submitted to dilutions of 0.005µM, 0.05µM, 0.5µM, 5µM, 50 µM e 500 µM of each drug:
zidovudine, stavudine, lamivudine, didanosine, efavirenz, atazanavir and lopinavir. After a 24
hours period of incubation the medium was removed and replaced by with100 µL of MTT
solution (5mg/mL) for 4h at 37ºC. Then, the MTT solution was removed and 100 µL of a
solution of 95% of isopropanol and 5% of acid formic was added in order to dissolve the
crystals. The absorbance was read on a multiwell spectrophotometer at 600nm. With the
values of the optic densities it was determined the concentration of the drug capable to reduce
in 50% the viable cells. In this way, the zidovudine and the didanosine in the concentration of
0.05µM and the stavudine and the lamivudine in the concentrations of 0.5µM and 500µM had
not been toxic. In conclusion, these drugs could be evaluated as antivirals to small ruminant
lentiviruses.
Key-words: goat fibroblasts; cytotoxicity; antiviral drugs
97
INTRODUÇÃO
A utilização de testes in vitro, por meio de ensaios de viabilidade celular, constitui o
primeiro passo para a avaliação da compatibilidade biológica de uma substância e pode
fornecer elementos importantes para a análise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
(ROGERO et al., 2003).
Para ser aprovado no teste de citotoxicidade in vitro, um produto não deve ocasionar a
morte das células nem afetar suas funções celulares. Assim sendo, com o uso de técnicas de
cultura de células, os testes podem detectar a ocorrência de lise das células, de inibição do
crescimento celular e de outros efeitos que possam ser desencadeados nas mesmas
(DAGUANO et al., 2007).
Os testes in vitro de sensibilidade a compostos antivirais diferem significativamente
daqueles destinados a agentes antibacterianos. Como os vírus precisam de células para se
replicar, os sistemas indicadores de sensibilidade fazem uso de culturas de células. Em geral,
uma redução maior que 50% na formação da monocamada celular por uma determinada
concentração classifica um agente como ativo contra determinado vírus (SAFRIN, 2001).
Os lentivírus de pequenos ruminantes (SRLV – Small Ruminant Lentivirus), que
incluem os vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e Maedi-Visna (MVV), são causadores
de doença progressiva, multissistêmica, afetando, principalmente, articulações, úbere,
pulmões e sistema nervoso central (HAASE, 1986). Esses retrovírus possuem a enzima
transcriptase reversa (RT), permitindo ao RNA viral dar origem à dupla fita de DNA proviral
capaz de incorporar ao genoma celular, além da enzima protease, responsável pela produção
de vírions infecciosos maduros durante a replicação. Essas enzimas funcionam como alvos
potenciais dos agentes antivirais (SAFRIN, 2001).
Apesar disso, até o presente momento as vacinas e os tratamentos instituídos para
essas enfermidades têm se mostrado ineficazes fazendo com que o controle tenha como base a
eliminação dos animais soropositivos. Por outro lado, drogas utilizadas com êxito no
tratamento de infecções por vírus DNA e RNA podem proporcionar um resultado satisfatório
contra os SRLV. Dentre essas estão os nucleosídeos inibidores da enzima RT como a
zidovudina, lamiduvina; os não nucleosídeos inibidores da RT como o efavirenz; os inibidores
da enzima protease como o lopinavir e o atazanavir. No tratamento de lentiviroses animais, a
zidovudina tem demonstrado resultados positivos contra o vírus da imunodeficiência felina
(HARTMANN, 1998).
Trabalhos que objetivam avaliar o potencial das drogas com atividade antiviral contra
os SRLV ainda são escassos. Há trabalhos que demonstram agentes com ação anti-HIV
98
comprovada contra a replicação do maedi-visna vírus (MVV) através da análise do efeito
citopático em cultivo de células do plexo coróide (THORMAR et al., 1995), verificando que
os análogos nucleosídeos acíclicos bem como o 2’, 3’-dideoxinucleosídeos apresentaram ação
anti-MVV significativa. Análogos da citidina e outros fármacos com potencial ação antiviral
e/ou antileucêmico foram testados sobre a replicação do MVV (SALVATORI et al., 2001)
observando que estas classes de drogas desempenharam uma efetiva inibição do MVV.
A avaliação da citotoxicidade é essencial na fase inicial de desenvolvimento de drogas
antivirais, uma vez que permite determinar a priori a concentração a ser utilizada bem como
fornecer informações quanto aos danos celulares. A citotoxicidade é normalmente verificada
pelos testes de viabilidade celular. A prova do azul de tetrazólio (MTT) é uma das mais
empregadas como indicadora colorimétrica da viabilidade celular, avaliando a função
mitocondrial da célula. Nesse sentido, objetivou-se avaliar o efeito citotóxico de drogas
antivirais em cultivos de fibroblastos.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo celular
Foram utilizadas células fibroblásticas caprinas isoladas da membrana sinovial de
caprinos obtida pela técnica de explantation descrita por CRAWFORD et al (1980). As
células foram mantidas, por 24 horas, em garrafas de cultivo de 25 cm
2
, contendo Meio
Essencial Mínimo (MEM) com antibióticos e antifúngico (2% de estreptomicina + penicilina,
1% de anfotericina B) enriquecido com 20% de soro fetal bovino (SFB). As garrafas eram
incubadas em estufa a 37
o
C com atmosfera de 5% de CO
2
. Após as primeiras 24 horas eram
adicionados cerca de 2 mL de MEM acrescido de 10% de SFB. A adesão e o crescimento
celular foram acompanhados pela observação em microscópio invertido. Após
aproximadamente sete dias, ao evidenciar-se adesão e crescimento celular, o meio de cultivo
passou a ser trocado integralmente a intervalos de quatro dias. Não ocorrendo o aparecimento
de nenhum efeito citopático ou indícios de contaminação era realizada tripsinização e após
quatro passagens subseqüentes, realizava-se a contagem das células em câmara de Neubauer.
A contagem permitia a obtenção de suspensões de células a concentrações de
2x10
5
células/mL de MEM, para a execução do teste de citotoxicidade.
Drogas utilizadas
As drogas utilizadas no teste de citotoxicidade foram: zidovudina, didanosina,
lamivudina, estavudina, efavirenz, atazanavir e lopinavir tendo sido gentilmente cedidas pelo
99
Laboratório Farmacêutico do Pernambuco (LAFEPE) e pelo Hospital São José (Fortaleza -
CE).
Teste de citotoxicidade
A citotoxicidade foi avaliada de acordo com o descrito por Andrighetti-Fröhner et al.,
(2003), por meio do método que se baseia na medida da atividade da enzima desidrogenase
mitocondrial, a qual quando ativa é capaz de metabolizar o reagente MTT (brometo de 3-
(4,5)-dimetiltialzolil -2,5 difeniltetrazólio) em um composto colorido denominado formazan.
Para isso, alíquotas de 0,1 mL de células fibroblásticas, a uma concentração de 2x10
5
células
por mL de MEM acrescido de 10% de SFB e antibióticos foram depositadas em microplacas
de 96 poços. Após vinte e quatro horas de incubação em estufa a 37
o
C, com 5% de CO
2
, o
meio de cultivo foi removido e meio fresco contendo diluições seriadas de 0,005µM, 0,05µM,
0,5µM, 5µM, 50 µM e 500 µM de cada droga foi adicionado. Foram utilizados dois poços da
microplaca para cada diluição e 0,1 mL de inóculo por poço, ademais, dois controles
negativos que consistiram de meio sem a adição dos fármacos. As microplacas foram
incubadas em estufa a 37
o
C, com 5% de CO
2
por 24 e 48 horas. Após esse período, o meio foi
desprezado e acrescentou-se 100 µL de azul de tetrazólio (MTT) a uma concentração de
5mg/mL. As microplacas foram incubadas por 4h/37
o
C para a incorporação do MTT e
formação dos cristais de formazan. Posteriormente, esses foram solubilizados pela adição de
100 µL de uma solução de 95% de isopropanol e 5% de ácido fórmico. A análise
espectrofotométrica foi realizada em um leitor de ELISA a uma absorbância de 600nm. Com
os valores das densidades ópticas determinou-se a concentração da droga capaz de reduzir em
50% as células viáveis.
Análise dos dados
Todos os experimentos foram realizados em duplicata e os resultados evidenciados
reproduzem a média± desvio padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As provas de citotoxicidade são essenciais para as fases iniciais de desenvolvimento
de drogas antivirais, uma vez que definem a concentração a ser utilizada em etapas posteriores
de avaliação. Além disso, evitam danos celulares e asseguram a seletividade dos vírus in vitro
(EISENBRAND et al., 2002). A prova do MTT é um dos indicadores colorimétricos de
viabilidade celular mais utilizados, sendo capaz de avaliar a função celular mitocondrial de
100
acordo com a redução enzimática do sal de tetrazólio pelas desidrogenases mitocondriais nas
células viáveis (MOSMANN, 1983).
A avaliação da citotoxicidade dos diferentes fármacos sobre as células fibroblásticas
de caprinos demonstrou que os nucleosídeos inibidores da RT, lamivudina, estavudina e
zidovudina não foram tóxicos na maior concentração utilizada que foi de 500µM, tanto no
período de 24h quanto de 48h. Enquanto a didanosina só pode ter sua atividade citotóxica
testada até a concentração de 5,0µM para ambos os tempos analisados (Fig. 1 e 3). O
efavirenz, não nucleosídeo inibidor da transcriptase reversa, não foi tóxico para os
fibroblastos na concentração de 500 µM. O inibidor de protease lopinavir não apresentou-se
citotóxico nas concentrações de 50 µM e 5,0 µM nos períodos de 24 e 48h, respectivamente.
Já o atazanavir, demonstrou uma concentração citotóxica ao nível de 50% de 500 µM com
24h de contato com as células e de 50 µM com 48h (Fig. 2 e 4).
A avaliação citotóxica, de compostos derivados da zidovudina e da didanosina, em
células sanguíneas e MT2 demonstrou que os primeiros são dose dependente e que no caso da
didanosina as concentrações não tóxicas foram de 12 e 50µM (TURK et al., 2002;
LALANNE et al., 2007). Estes resultados diferem dos encontrados no presente trabalho, uma
vez que as concentrações citotóxicas observadas para a zidovudina e didanosina foram de 500
e 5,0 µM, respectivamente. Esta diferença pode ser explicada pelo tipo de célula utilizada e
pela metodologia empregada para avaliar a viabilidade celular. Visto que, além da técnica de
MTT eles utilizaram também a prova do azul de tripan.
CHÁVEZ et al (2006) utilizando o teste do MTT avaliaram a citotoxicidade de vinte e
quatro compostos fenólicos e derivados em células McCoy e observaram que os ésteres do
ácido gálico não mostraram citotoxicidade, já os demais ésteres testados mostraram
concentração citotóxica variando de 113 a 645µM. Estes compostos tiveram seu potencial
antiviral in vitro, contra o vírus rábico, avaliado. Neste contexto, as máximas concentrações
citotóxicas observadas pelos autores foram superiores as verificadas no presente trabalho.
Apesar da técnica utilizada para avaliar a citotoxicidade ter sido a mesma, os compostos, as
concentrações e os tipos celulares diferiram.
SALES et al (2001) determinaram, através do MTT, a citotoxicidade da zidovudina
em cinco diferentes linhagens celulares, verificando maior citotoxicidade em relação ao
monofosfato de zidovudina, principal metabólito da zidovudina, não sendo evidenciado com o
trifosfato, caracterizado como metabólito ativo. Além disso, não foi evidenciada toxicidade
nas mitocôndrias isoladas. A metodologia empregada no presente trabalho não diferenciou a
101
atividade citotóxica do mono ou do trifosfato de zidovudina, e foi possível verificar que este
fármaco não foi tóxico para as células na maior concentração testada, ou seja, de 500µM.
A ausência de citotoxicidade de alguns fármacos é constatada em muitos trabalhos
como, o desenvolvido por SALVATORI et al. (2001) nos quais os autores analisaram a
citotoxicidade in vitro de análogos β-D e β-L citidina em células do plexo coróide de ovinos,
chegando à conclusão que até a concentração de 300µM não houve efeitos citotóxicos. A
maior concentração citotóxica verificada no presente trabalho foi de 500µM, que pode ser
justificada pela diferença existente no tipo de célula e fármacos utilizados.
Analisando a atividade antiviral de alguns compostos anti-HIV contra o MVV,
THORMAR et al (1995) verificaram que os análogos nucleosídeos acíclicos bem como o 2’,
3’-dideoxinucleosídeos apresentaram ação anti-MVV significativa. Além disso, observaram,
por meio da análise da morfologia celular, que algumas substâncias polianiônicas e um
inibidor não competitivo da RT foram eficazes, no entanto, apresentaram uma concentração
citotóxica mínima de 200µg/mL e 1,6mM, respectivamente. Sendo estas concentrações
bastante superiores às observadas no presente trabalho, podendo ser justificado pela diferença
existente entre o tipo celular e a técnica utilizada para avaliar a citotoxicidade dos fármacos.
Como verificado no gráfico 4, alguns fármacos apresentaram viabilidade celular
menor mesmo quando utilizadas concentrações intermediárias, sugere-se, portanto que nestas
concentrações a quantidade de células presente era maior, e conseqüentemente, a redução do
MTT também ou esta redução foi ocasionada por desidrogenases não mitocondriais como
relata BURDON et al (1993).
102
0
10
20
30
40
50
60
70
0,005 0,05 0,5 5 50 500
Inibição celular (%)
Lamivudina
Didanosina
Estavudina
Zidovudina
Controle
Figura 1 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre a viabilidade celular
de fibroblastos caprinos no período de 24h.
0
10
20
30
40
50
60
0,005 0,05 0,5 5 50 500
Inibição celular (%)
Efavirenz
Atazanavir
Lopinavir
Controle
Figura 2 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa e da protease sobre a
viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 24h.
Concentração (
µ
µµ
µ
M)
Concentração (
µ
µµ
µ
M)
103
0
10
20
30
40
50
60
70
0,005 0,05 0,5 5 50 500
Inibição celular (%)
Lamivudina
Didanosina
Estavudina
Zidovudina
Controle
Figura 3 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre a viabilidade celular
de fibroblastos caprinos no período de 48h.
0
10
20
30
40
50
60
70
0,005 0,05 0,5 5 50 500
Inibição celular (%)
Efavirenz
Atazanavir
Lopinavir
Controle
Figura 4 – Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa e da protease sobre a
viabilidade celular de fibroblastos caprinos no período de 48h.
Concentração (
µ
µµ
µ
M)
Concentração (
µ
µµ
µ
M)
104
CONCLUSÃO
As drogas zidovudina, didanosina, lamivudina, estavudina, efavirenz, atazanavir e
lopinavir, utilizadas nas concentrações de 0,005 a 500µM, poderão ter sua atividade antiviral
avaliada contra os SRLV.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho teve o apoio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e da
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP).
Agradecer ao Laboratório Farmacêutico do Pernambuco (LAFEPE) e ao Hospital São José de
Fortaleza-CE pela concessão dos fármacos.
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106
9 CAPÍTULO IV
INIBIÇÃO DOS LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES POR DROGAS
ANTIVIRAIS
(Inhibition of small ruminant lentivirus for antiviral drugs)
Periódico: Pesquisa Agropecuária Brasileira (Submetido em novembro de 2008)
107
Inibição dos lentivírus de pequenos ruminantes por drogas antivirais
Suzana Aparecida Costa de Araújo
(1)
, Raymundo Rizaldo Pinheiro
(2)
, Tânia Valeska
Medeiros Dantas
(1)
, Alice Andrioli
(2)
, Francisco Esmaile Sales Lima
(1)
, Ronaldo Pereira Dias
(3)
, Cláudio Cabral Campello
(1)
, Edmara Chaves Costa
(1)
, Aracely Rafaele Fernandes Ricarte
(1)
, Valeska Shelda Pessoa de Melo
(1)
, Benedito Neilson Rolim
(1)
, Jean Berg Alves da Silva
(4)
e Maria Fátima da Silva Teixeira
(1)
(1)
Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-000,
Fortaleza-CE, Brasil. E-mail: s[email protected]m, taniavet@yahoo.com.br,
mfteixeira@hotmail.com
(2)
Pesquisador Embrapa Caprinos, Fazenda Três Lagoas - Estrada Sobral Groaíras, Km 4.
Caixa Postal D10 - CEP 62011-970 - Sobral - CE – Brasil. E-mail: rizaldo@cnpc.embrapa.br,
alice@cnpc.embrapa.br
(3)
Universidade Estadual Vale do Acaraú – UVA, Av. da Universidade, 850. CEP 62040-370.
Sobral – CE. Brasil. ronaldodias01@yahoo.com.br
(4)
Professor adjunto da Universidade Federal Rural do Semi-árido – UFERSA, BR 110 - Km
47. Bairro Pres. Costa e Silva. CEP 59.625-900. Mossoró – RN, Brasil.
jean_berg2@yahoo.com.br
108
Resumo - Inibidores da enzima transcriptase reversa e da protease foram avaliados quanto ao
seu efeito inibitório na replicação do vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) cepa CAEV
Cork e do vírus Maedi-Visna (MVV) cepa K1514 cultivados em células fibroblásticas de
caprinos. Os fármacos utilizados foram: lamivudina, didanosina, estavudina, zidovudina,
efavirenz, atazanavir e lopinavir/ritonavir. A maior concentração utilizada para lamivudina,
estavudina, zidovudina e efavirenz foi 500µM, para atazanavir foi 50 µM e 5,0 µM para
lopinavir/r e didanosina. A atividade antiviral in vitro foi pesquisada por meio da avaliação da
viabilidade celular através da redução do MTT e pela pesquisa de inibição dos efeitos
citopáticos (CPE) dos vírus. A replicação dos vírus só não foi completamente bloqueada pelos
inibidores de protease (IP) atazanavir e lopinavir/r. Enquanto os demais apresentaram eficácia
antiviral significativa em diferentes concentrações. Os IP juntamente com o efavirenz não
mostraram atividade antiviral quando foram avaliados pela técnica de redução do MTT. Esses
dados indicam que os fármacos inibidores da transcriptase reversa lamivudina, didanosina,
estavudina e zidovudina são eficazes na inibição in vitro dos lentivírus de pequenos
ruminantes.
Termos para indexação: Maedi-Visna, Artrite Encefalite Caprina, inibidores da transcriptase
reversa, inibidores da protease.
109
Inhibition of small ruminant lentivirus for antiviral drugs
Abstract
Inhibitors of the reverse transcriptase and protease enzymes were evaluated for their
inhibitory effect on the replication of Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) strain
CAEV Cork and of the Maedi-Visna Virus (MVV) strain K1514 cultured in fibroblastic cells.
The drugs lamivudine, didanosine, stavudine, zidovudine, efavirenz, atazanavir and
lopinavir/ritonavir used were. The highest concentration used for lamivudine, stavudine,
zidovudine and efavirenz was 500 µM, for atazanavir it was 50 µM and 5.0 µM for lopinavir/r
and didanosine. The in vitro antiviral activity was investigated by evaluating the cell viability
test by reducing the MTT and the search for inhibition of cytopathic effects (CPE) of the
virus. The replication of the virus was not completely inhibited only by the protease inhibitors
atazanavir and lopinavir/r in search for CPE, while the others drugs showed significant
antiviral efficacy in different concentrations. The protease inhibitors together with the
efavirenz did not show antiviral activity when they were assessed by the reduced MTT
technique. These data showed that the reverse transcriptase inhibitor drugs lamivudine,
didanosine, stavudine and zidovudine were effective in the in vitro inhibition of small
ruminant lentivirus.
Index terms: Maedi-Visna, Caprine Arthritis Encephalitis, inhibitors of the reverse
transcriptase, inhibitors of the protease.
110
Introdução
Os lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) são constituídos pelos vírus da artrite
encefalite caprina (CAEV) e Maedi-Visna (MVV) (Haase, 1986). Esses vírus causam
enfermidades que apresentam caráter crônico e são responsáveis por significativas perdas
econômicas, uma vez que sua principal forma de controle baseia-se na eliminação dos animais
soropositivos. Esses retrovírus possuem a enzima transcriptase reversa (RT), permitindo ao
RNA viral dar origem à dupla fita de DNA proviral capaz de incorporar ao genoma celular,
além da enzima protease, responsável pela produção de vírions infecciosos maduros durante a
replicação. Essas enzimas funcionam como alvos potenciais dos agentes antivirais (Peçanha et
al., 2002; Souza & Almeida, 2003). No entanto, até o presente momento as vacinas e os
tratamentos para essas enfermidades têm se mostrado ineficazes.
Tem-se visto que a maioria das pesquisas com drogas antivirais visa ação contra as
lentiviroses de primatas, que incluem os vírus da imunodeficiência humana (HIV) e símia
(SIV) e em menor grau o vírus da imunodeficiência felina (FIV). Poucos estudos têm sido
realizados com compostos ativos contra as lentiviroses em ungulados que abrange o CAEV, o
MVV e o vírus da imunodeficiência bovina (BIV). Contudo, é possível se verificar um
interesse cada vez maior em comparar a susceptibilidade destes vírus a drogas anti-HIV visto
que os mesmos apresentam similaridade molecular e biológica.
Por outro lado, drogas utilizadas com êxito no tratamento de infecções por vírus DNA
e RNA podem proporcionar um resultado satisfatório contra os LVPR. Dentre essas
encontram-se os nucleosídeos inibidores da enzima RT como a zidovudina, lamiduvina; os
não nucleosídeos inibidores da RT como o efavirenz; os inibidores da enzima protease como
o lopinavir/ritonavir e o atazanavir. No tratamento de lentiviroses animais, a zidovudina tem
demonstrado resultados positivos contra o vírus da imunodeficiência felina (Hartmann, 1998).
É possível encontrar na literatura alguns trabalhos que demonstram ação de drogas
anti-HIV contra a replicação do MVV através da análise do efeito citopático em cultivo de
células do plexo coróide (Thormar et al., 1993; 1995), verificando que os análogos
nucleosídeos acíclicos bem como o 2’, 3’-dideoxinucleosídeos apresentaram ação anti-MVV
significativa. Análogos da citidina e outros fármacos com potencial ação antiviral e/ou
antileucêmico foram testados sobre a replicação do MVV (Salvatori et al., 2001) observando
que estas classes de drogas desempenharam uma efetiva inibição do MVV.
Diante do exposto, objetivou-se avaliar o efeito antiviral in vitro de fármacos antivirais
contra os LVPR.
111
Material e Métodos
Drogas
As drogas antivirais utilizadas foram: os inibidores da transcriptase reversa zidovudina
ou AZT (3’-azido-3’- desoxitimidina), a didanosina (2’,3’-didesoxiinosina ou ddI), a
lamivudina (3TC), a estavudina (2’, 3'-didehidro-3'-deoxitimidina ou D4T), o efavirenz, os
inibidores da protease atazanavir e o lopinavir/ritonavir gentilmente cedidas pelo Laboratório
Farmacêutico de Pernambuco (LAFEPE) e pelo Hospital São José (Fortaleza-CE).
Vírus
Foram utilizadas amostras dos lentivírus CAEV Cork (Cork et al., 1974) e Maedi-
Visna K1514 (Sigurdsson et al., 1960), apresentando títulos de 10
5,3
e 10
4,2
TCID
50
/mL,
respectivamente.
Titulação do vírus
A infectividade viral foi titulada pela inoculação da suspensão viral, ao décimo, em
monocamada celular de fibroblastos em placas de 96 poços. Adicionou-se 100 µL da diluição
do vírus em cada poço. A placa foi incubada em estufa a 37
o
C com 5% de CO
2
e os efeitos
citopáticos (CPE) foram avaliados com 14 dias após a infecção. Os títulos virais foram
calculados pelo método de Reed & Muench (1938).
Cultivo celular
Células primárias da membrana sinovial caprina foram obtidas por explantation da
articulação carpal de um animal sorologicamente negativo pela imunodifusão em gel de
agarose (IDGA) para LVPR. As células foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM)
contendo penicilina, estreptomicina e anfotericina B, suplementado com 10% de Soro Fetal
Bovino (SFB). Após formação da monocamada celular, as células foram tripsinizadas e
mantidas para uso após 3ª passagem. A concentração do SFB foi reduzida para 2% quando a
cultura foi submetida à inoculação viral.
Teste de citotoxicidade
O efeito dos fármacos antivirais na proliferação dos fibroblastos foi determinado
anteriormente por Araújo et al. (2008) através do método de redução do MTT (brometo de 3-
(4,5)-dimetiltialzolil -2,5 difeniltetrazólio) (Sigma, EUA).
Atividade antiviral
Em todos os testes de avaliação antiviral os fármacos foram utilizados nas
concentrações não citotóxicas determinadas a priori. A maior concentração utilizada para
lamivudina, estavudina, zidovudina e efavirenz foi 500 µM, para atazanavir foi 50 µM e 5,0
112
µM para lopinavir/r e didanosina. Para pesquisar a atividade antiviral dos fármacos foram
realizados os seguintes testes:
a) Avaliação da viabilidade celular pela redução do MTT
Foram utilizadas microplacas de 96 poços, sendo que em cada poço depositou-se
100µL de uma suspensão celular a uma concentração de 2x10
5
céls/mL contendo MEM com
10% de SFB. Após adesão das células e formação da monocamada, o meio de cultivo foi
retirado, sendo então adicionada em cada poço alíquotas do vírus na concentração de 10
TCID
50
(Dose Infectante para Cultura de Tecido 50%). Essas células ficaram incubadas a
37
o
C, por 1 hora, para que ocorresse a adsorção viral. Após esse período, o meio de cultivo foi
substituído por MEM suplementado com 2% de SFB e com as diferentes concentrações dos
fármacos a serem testados, exceto o grupo controle negativo que recebeu apenas MEM e o
controle positivo no qual se adicionou o vírus e o meio sem adição dos fármacos. As placas
foram incubadas a 37
o
C em estufa de CO
2
por 7 dias. No tocante a metodologia de redução do
MTT, essa foi realizada de acordo como descrito por Andrighetti-Fröhner et al. (2003). A
absorbância foi lida em espectrofotômetro (Bio-Rad, Modelo 680, EUA) com o comprimento
de onda de 490nm. O percentual de proteção teve seu cálculo baseado na seguinte fórmula:
[(A-B)/(C-B)x100]
Onde A, B e C indicam a absorbância do extrato, vírus e controle celular,
respectivamente.
b) Pesquisa de Inibição dos efeitos citopáticos
A preparação das placas de 96 poços e a adição dos vírus foi semelhante à descrita para
a realização da prova de redução do MTT. Após o período de incubação de 7 dias, o
sobrenadante foi descartado e as monocamadas das placas coradas com Cristal Violeta, para
avaliação dos CPE em microscópio invertido.
Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em quadruplicata e os resultados representam
a media ± desvio padrão. Inicialmente os dados foram submetidos aos testes de Sharpiro-wilk
e Bartlett para avaliar a distribuição normal e homogeneidade da variância entre os
tratamentos. Quando atendidas as condições necessárias para análise de variância esta foi
executada através do procedimento GLM do programa SAS (1999) e as médias comparadas
pelo teste Student Newman Keuls (SNK). Nos casos de heterocedasticidade, mesmo após
transformação logarítmica, angular ou radicial dos dados, as análises foram realizadas por
meio do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis.
113
Resultados e Discussão
Para simular o tratamento de uma infecção estabelecida, as drogas antiretrovirais
foram adicionadas após infecção das células fibroblásticas com as cepas CAEVCo e
MVVK1514 e o resultado da inibição dos CPE avaliado após 7 dias de incubação. Na
determinação da citotoxicidade verificou-se que a lamivudina, a estavudina, a zidovudina e o
efavirenz apresentaram concentração citotóxica média (CC
50
)
de 500 µM. A CC
50
para
lopinavir/r e didanosina foi 5 µM e para o atazanavir de 50 µM (Araújo et al., 2008). Portanto,
essas representam às maiores concentrações utilizadas para avaliação da inibição dos LVPR
in vitro em fibroblastos.
Os análogos nucleosídicos inibidores da transcriptase reversa (NRTIs) lamivudina,
didanosina, estavudina e zidovudina, bem como, o não nucleosídeo efavirenz, inibiram o
lentivírus caprino. A lamivudina, didanosina e efavirenz com concentração inibitória média
(CI
50
)
de 0,05 µM. Enquanto a estavudina e a zidovudina apresentaram CI
50
de 50 µM.
Quanto à ação de inibição do lentivírus ovino, esses fármacos também foram eficazes,
demonstrando CI
50
de 0,05 µM para lamivudina e efavirenz. A didanosina expressou CI
50
de
0,5 µM, a estavudina de 50 µM e a zidovudina de 500 µM. Por outro lado, os inibidores de
protease, atazanavir e lopinavir/r, não foram capazes de inibir os CPE dos LVPR. Esses dados
corroboram com os resultados encontrados por Thormar et al. (1993) nos quais verificam que
a zidovudina e a estavudina inibiram a replicação do MVV cepa K796 e diferem daqueles
encontrados por Dahlberg et al. (1987) que constataram que fármacos, altamente eficazes
contra o HIV, como a zidovudina e a estavudina não demonstraram atividade contra a
replicação do CAEV, enquanto alguns dideoxinuclesídeos foram altamente eficazes. Estes
autores sugerem que estes achados podem decorrer da diferença existente entre o CAEV e o
HIV quanto à susceptibilidade aos fármacos ou pela diferença entre os tipos celulares
utilizados em cada experimento.
As divergências na atividade antiviral dos NRTIs em tipos celulares diversos depende
da afinidade desses fármacos com as quinases que estão envolvidas na conversão metabólica
do composto para a forma de trifosfato (Witvrouw et al., 2000; Balint, 2001).
Os NRTIs inibem a replicação do ácido nucléico através da inibição de enzimas das
vias metabólicas das purinas ou pirimidinas pela inibição das polimerases utilizadas na
replicação do ácido nucléico. Além disso, alguns análogos podem ser incorporados ao ácido
nucléico e bloquear sua síntese ou alterar sua função (Brooks et al., 2000). Esses análogos
nucleosídeos, para ficarem ativos, necessitam sofrer fosforilação intracelular que se
converterem à forma 5’-trifosfato atuando como inibidor competitivo ou substrato alternativo
114
para a transcriptase reversa (De Clercq, 2005). Se o inibidor for incorporado à cadeia de
DNA, torna-se impossível a continuidade do seu crescimento. Assim, os NRTIs funcionam
como terminadores de cadeia (Witvrouw et al., 2000; Balint, 2001). Análogos de nucleosídeos
incapazes de serem convertidos em nucleotídeos são fatalmente inativos.
Quando a forma de avaliação da atividade antiviral foi a redução do MTT, a
lamivudina, a estavudina e a zidovudina inibiram significativamente o CAEV na concentração
de 0,005µM com um percentual de inibição acima de 70%. Por sua vez o efavirenz não foi
capaz de inibir esse vírus nas concentrações avaliadas (Figura 1). No que diz respeito à ação
desses fármacos contra o MVV, observa-se que a lamivudina e a zidovudina apresentaram
ações significativas nas concentrações de 0,005 e 50µM, respectivamente. Apesar da
estavudina apresentar uma inibição de 63% na concentração de 5,0 µM, essa não foi
significativa. O efavirenz à semelhança dos resultados para o CAEV, não mostrou ação
significativa sobre o lentivírus ovino (Figura 2).
A didanosina não inibiu significativamente o CAEV apesar da inibição de 52% na
concentração de 0,005 µM, porém nessa mesma concentração verificou-se uma inibição
significativa contra o MVV (Figura 3). De forma análoga ao teste de inibição dos CPE o
lopinavir/r (Figura 3) e atazanavir não indicaram atividade antiviral expressiva contra os
LVPR. Apesar desse fármaco apresentar 59% de inibição do CAEV na concentração de 5 µM
(Figura 4). Como os inibidores de protease atuam na fase final do ciclo de replicação viral, a
falta de atividade antiviral dos inibidores de protease lopinavir/r e atazanavir sugere que os
LVPR encontravam-se nas células infectadas na forma pró-viral. Visto que a protease, enzima
alvo desses fármacos é responsável pela clivagem das poliproteínas virais produzindo as
proteínas estruturais finais dos LVPR (Le et al., 2001; Mak et al., 2003; Ohtaka & Freire,
2005; Safrin, 2008).
Entre os testes utilizados na avaliação da atividade antiviral observa-se uma
similaridade entre os resultados, com exceção do fármaco efavirenz que, ao contrário dos
resultados apresentados na prova de pesquisa de inibição dos CPE não mostrou eficácia contra
os LVPR quando avaliado pela técnica de redução do MTT. Ademais, comparando os
resultados obtidos em ambas as técnicas verifica-se que as concentrações eficazes foram
diferentes para alguns fármacos. Essas diferenças na atividade antiviral podem ser explicadas
pela utilização de uma técnica de avaliação subjetiva como na pesquisa de inibição dos CPE.
Smee et al. (2002) afirmam que, algumas vezes, a técnica do MTT pode mascarar a
ação de certas substâncias, uma vez que à exigência de conversão enzimática pelas células
viáveis é possível que certos compostos inibam esse processo fazendo com que alguns
115
compostos sejam mais ou menos ativos do que eles realmente são. Além disso, as
discrepâncias entre os efeitos inibitórios desses fármacos provavelmente refletem as
diferenças na conversão metabólica em células fibroblásticas.
Com exceção da multiplicidade de pesquisas existentes com o HIV, os estudos que
visam avaliar a ação de fármacos contra as lentiviroses em animais ainda são escassos. No
entanto, Thormar et al. (1993) analisaram o efeito inibitório in vitro de análogos fosfonato
nucleosídeo acíclico na replicação do Maedi-Visna verificando que a maioria dos fosfonatos
nucleosídeo acíclico inibiram a replicação do MVV e que existe formação de CPE nas
concentrações entre 0,2 a 1,8µM. Em 1995, Thormar et al. avaliaram outros agentes com ação
anti-HIV comprovada contra a replicação do Maedi-Visna vírus (MVV) através da análise do
efeito citopático em cultivo de células do plexo coróide, sendo possível constatar que os
análogos nucleosídeos acíclicos, bem como o 2’, 3’-dideoxinucleosídeos mostraram ação anti-
MVV significativa. Em 2001, Salvatori et al. testaram análogos da citidina e outros fármacos
com potencial ação antiviral e/ou antileucêmico sobre a replicação do MVV, observando que
essas classes de drogas desempenharam uma efetiva inibição do MVV. Outros fármacos como
análogos deoxinucleosídeos e alguns nucleosídeos tiveram sua atividade antiviral testada
contra o MVV e o herpesvírus bovino 1 (BHV-1) e foi possível averiguar que todos os
compostos apresentaram boa atividade antireplicativa (Salvatori et al., 2002).
Conclusões
1) Os inibidores da enzima transcriptase reversa inibiram in vitro a replicação dos LVPR.
2) Os inibidores da enzima protease não impediram a multiplicação dos LVPR.
3) Os resultados alcançados representam o alicerce para descoberta de uma terapêutica
eficaz para a infecção ocasionada pelos LVPR, sendo imprescindível a avaliação in
vivo da eficácia desses fármacos.
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e a Fundação Cearense de Apoio ao
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo apoio financeiro. Ao Laboratório
Farmacêutico de Pernambuco (LAFEPE) e ao Hospital São José de Fortaleza-CE pela
concessão dos fármacos e a Embrapa-CNPC pelo fornecimento das condições técnicas e
estruturais.
116
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119
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6
Inibição (%)
Lamivudina Estavudina Zidovudina Efavirens
Figura 1. Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre o CAEV.
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6
Inibição (%)
Lamivudina Estavudina Zidovudina Efavirens
Figura 2. Efeito dos fármacos inibidores da transcriptase reversa sobre o MVV.
Concentração (
µ
M)
0,005 0,05 0,5 5 50 500
Concentração (
µ
M)
0,005 0,05 0,5 5 50 500
120
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4
% Inibição
Didanosina x MVV Lopinavir/r x MVV
Didanosina x CAEV Lopinavir/r x CAEV
Figura 3. Efeito inibitório dos fármacos antivirais didanosina e lopinavir/r sobre o CAEV e o
MVV.
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5
% Inibição
ATV x CAEV ATV x MVV
Figura 4. Efeito antiviral do inibidor de protease atazanavir sobre o MVV e o CAEV.
0,005 0,05 0,5 5 50
Concentração (
µ
M)
0,005 0,05 0,5 5
Concentração (
µ
M)
121
10 CONCLUSÕES GERAIS
A Melia azedarach apresenta propriedades farmacológicas, biológicas e químicas que
justificam sua utilização na medicina popular.
Extratos tanto da M. azedarach quando da A. indica inibiram in vitro a replicação dos
vírus da Artrite Encefalite Caprina e da Maedi-Visna.
As células fibroblásticas caprinas foram eficazes na avaliação da citotoxicidade dos
fármacos antivirais e dos extratos.
Fármacos antivirais e extratos de ambas as plantas, em concentrações não tóxicas,
podem ter sua atividade antiviral analisada.
Fármacos inibidores da enzima transcriptase reversa mostraram ação in vitro contra o
CAEV e o MVV.
Fármacos inibidores da protease não impediram a replicação dos LVPR.
122
11 PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos forneceram informações a respeito da ação de fármacos
antivirais e extratos de plantas na replicação in vitro do CAEV e do MVV. Contudo, são
necessárias pesquisas adicionais que visem isolar o princípio ativo dos extratos que
apresentaram atividade antiviral, bem como determinar seu possível mecanismo de ação e
realizar avaliação in vivo da atividade antiviral das substâncias mais promissoras. Além disso,
efetivar estudos que demonstrem a utilização dos lentivírus de pequenos ruminantes como
modelo experimental in vitro na avaliação de novos compostos antivirais.
123
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142
ANEXOS
COMPROVANTE DE ACEITE DO ARTIGO REFERENTE AO CAPÍTULO I
PERIÓDICO: Arquivos do Instituto Biológico
143
144
CARTA DE SUBMISSÃO DO ARTIGO REFERENTE AO CAPÍTULO II
Periódico: Small Ruminant Research
Submission Confirmation for Small Ruminant Research
Quarta-feira, 12 de Novembro de 2008 11:53
De: "RUMIN" <rumi[email protected]m>
Para: suzyvet2@yahoo.com.br
Title: In vitro cytotoxic and antiviral activities of Azadirachta indica A. Juss and Melia azedarach L.
against small ruminant lentivirus
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Thank you for submitting your work to our journal.
Kind regards,
Gio Bakker
Editorial Office
Small Ruminant Research
145
146
147
COMPROVANTE DE ACEITE DO ARTIGO REFERENTE AO CAPÍTULO III
PERIÓDICO: Ciência Animal
148
149
CARTA DE SUBMISSÃO DO ARTIGO REFERENTE AO CAPÍTULO IV
Periódico: Pesquisa Agropecuária Brasileira
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