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ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE LINFÓCITOS DA
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA EM CULTURA BI
E TRIDIMENSIONAL DE ESTROMA DE MEDULA
ÓSSEA
Leandro Dutra Borges de Almeida
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em clinica médica,
Faculdade de Medicina, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Clínica Médica.
Orientadores: Profª. Maria Isabel Doria Rossi
Prof. Nelson Spector
Rio de Janeiro
Dezembro/2007
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ii
ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE LINFÓCITOS DA LEUCEMIA LINFOCÍTICA
CRÔNICA EM CULTURA BI E TRIDIMENSIONAL DE ESTROMA DE MEDULA
ÓSSEA
Leandro Dutra Borges de Almeida
Orientadores:
Profª. Maria Isabel Doria Rossi
Prof. Nelson Spector
Dissertação submetida ao Corpo Docente de curso de Pós-Graduação em Clínica
Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Mestre em Clínica Médica.
Aprovada em _______ de ____________________ de _______
Banca Examinadora:
______________________________________________________
Prof. José Carlos Oliveira de Morais (Presidente)
______________________________________________________
Prof. Hélio dos Santos Dutra
______________________________________________________
Prof. Henrique Couto Teixeira
Rio de Janeiro
Dezembro/2007
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iii
Almeida, Leandro Dutra Borges de
Análise da migração de linfócitos da leucemia linfocítica crônica em
cultura bi e tridimensional de estroma de medula óssea / Leandro Dutra
Borges de Almeida – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina,
2007.
xiii, 90 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Maria Isabel Doria Rossi e Nelson Spector
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina,
Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, 2007.
Referências bibliográficas: f. 59-76
1. Leucemia crônica de células B - fisiopatologia. 2. Células da
medula óssea. 3. Técnicas de cultura de células. 4. Movimento celular.
5. Citometria de fluxo - métodos. 6. Clínica Médica - Tese. I. Rossi,
Maria Isabel Doria. II. Spector, Nelson. III. Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação
em Clínica Médica. IV. Título.
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela minha vida e saúde;
Aos meus Pais, pelos os exemplos;
À Priscila, Antônio e Thomás, os motivos das minhas lutas e das minhas buscas
para melhorar;
Ao Prof. Nelson Spector pela oportunidade de aprender e de conviver com um ícone
da comunidade científica brasileira;
À Profª. Maria Isabel pelos sacrifícios, pela paciência, pela dedicação e pelos
ensinamentos;
À Leandra, Ana Paula e Dani, alunas do laboratório que foram mestras.
v
SUMÁRIO
agradecimentos........................................................................................................iv
sumário...................................................................................................................... v
listas .........................................................................................................................vii
1)Tabelas........................................................................................................vii
2) Figuras....................................................................................................... viii
3) Siglas...........................................................................................................ix
resumo....................................................................................................................... x
abstract.................................................................................................................... xii
1) INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
1.1) Definição................................................................................................... 1
1.2) Histórico.................................................................................................... 3
1.3) Epidemiologia ........................................................................................... 4
1.4) Etiologia da LLC........................................................................................ 6
1.5) LLC Familiar ............................................................................................. 7
1.6) Quadro Clínico.......................................................................................... 7
1.7) Fatores Prognóstico.................................................................................. 8
1.8) Classificação........................................................................................... 11
1.9) Biologia da LLC....................................................................................... 18
2) OBJETIVOS......................................................................................................... 30
2.1) Geral....................................................................................................... 30
2.2) Específicos ............................................................................................. 30
3) Material e método............................................................................................... 31
3.1) Pacientes................................................................................................ 31
3.2) Amostras................................................................................................. 31
3.3) Separação e preparação das células mononucleadas ........................... 31
3.4) Citometria de fluxo.................................................................................. 32
3.5) Cultura de estroma de medula óssea..................................................... 32
3.6) Co-cultura de estroma de medula óssea e células leucêmicas .............. 33
3.7) Análise Estatística................................................................................... 35
4) RESULTADOS..................................................................................................... 36
vi
4.1) Característica dos Pacientes .................................................................. 36
4.2) Avaliação da sobrevida dos linfócitos leucêmicos in vitro....................... 38
4.3) Cinética de migração de células leucêmicas ao longo do tempo em
cultura bidimensional de células de estroma de medula óssea..................... 40
4.4) Cinética de migração de células leucêmicas ao longo do tempo em
sistema tridimensional (esferóide) de cultura de estroma de medula óssea.. 46
4.5) Migração de células leucêmicas em sistema bidimensional
(monocamada) de cultura de células de medula óssea conforme diferentes
concentrações aplicadas................................................................................ 50
4.6) Migração de células leucêmicas em sistema tridimensional (esferóide) de
cultura de células de medula óssea conforme diferentes concentrações
aplicadas........................................................................................................ 51
5) DISCUSSÃO........................................................................................................ 53
6) CONCLUSÃO ...................................................................................................... 57
7) BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 59
8) ANEXOS.............................................................................................................. 77
1) Ficha dos Pacientes................................................................................... 77
2) Termo de Consentimento .......................................................................... 78
3) Exemplo do Experimento de Migração...................................................... 80
4) Pôster apresentado no Congresso Brasileiro de Hematologia e
Hemoterapia de 2005..................................................................................... 83
5) Análise Estatística (SPSS 13.0)................................................................. 84
vii
LISTAS
1) Tabelas
Tabela 1. Taxa de incidência da LLC nos EUA conforme sexo e etnia. (Fonte: SEER,
2007) .......................................................................................................................... 5
Tabela 2. Sistemas de estagiamento clínico da LLC. .............................................. 10
Tabela 3. Correlação entre os estagiamentos de Rai e Binet e estratificação do risco
conforme a sobrevida............................................................................................... 10
Tabela 4. Características dos casos do estudo........................................................ 37
Tabela 5. Cinética de migração das amostras de LLC em monocamada de estroma
de medula óssea humana conforme diferentes intervalos de tempo........................ 42
Tabela 6. Distribuição dos casos conforme algumas variáveis e o percentual
migrado em monocamada........................................................................................ 44
Tabela 7. Correlação entre o potencial de migração na monocamada de estroma de
medula óssea e idade média dos pacientes............................................................. 45
Tabela 8. Cinética de migração das amostras de LLC em esferóides de estroma de
medula óssea humana conforme diferentes intervalos de tempo............................. 48
Tabela 9. Valores da migração em monocamada conforme diferentes concentrações
celulares................................................................................................................... 50
Tabela 10. Valores da migração em esferóide conforme diferentes concentrações
celulares................................................................................................................... 52
viii
2) Figuras
Figura 1. Ilustração comparativa da morfologia celular nos sistemas de cultura
bidimensional e tridimensional.................................................................................. 26
Figura 2. Caracterização fenotípica das células leucêmicas no sangue periférico.. 38
Figura 3. Gráfico da viabilidade das células leucêmicas em cultura ao longo do
tempo. ...................................................................................................................... 39
Figura 4. Fotomicrografia da co-cultura de células leucêmicas com células de
estroma de medula óssea humana .......................................................................... 40
Figura 5. Citometria de fluxo das células leucêmicas marcadas com CFSE e de
células de estroma de medula óssea em co-cultura................................................. 41
Figura 6. Gráficos das migrações das células leucêmicas em monocamada de
células de estroma de medula óssea em relação ao tempo..................................... 43
Figura 7. Correlação entre a capacidade de migrar em monocamada de células de
estroma de medula óssea e a idade dos pacientes.................................................. 45
Figura 8. Morfologia dos esferóides de células de estroma de medula óssea
humana..................................................................................................................... 47
Figura 9. Gráfico das migrações das células leucêmicas em esferóide de células de
estroma de medula óssea em relação ao tempo...................................................... 49
Figura 10. Aspecto morfológico de esferóide de células de estroma de medula
óssea humana co-cultivado com células de LLC-B.................................................. 49
Figura 11. Gráfico da migração de células leucêmicas em monocamada de células
de estroma de medula óssea em relação à concentração celular............................ 51
Figura 12. Gráfico da migração de células leucêmicas em esferóides de células de
estroma de medula óssea em relação à concentração celular................................. 52
ix
3) Siglas
BCL-2, proteína 2 de leucemia/linfoma de células B
CD, cluster de diferenciação
CFSE, 5-(e 6-)-carboxifluoresceína diacetato succinil éster
CXCL, quimiocina da família CXC
CXCR, receptor de quimiocinas da família CXC
DLPC, Doenças Linfoproliferativas Crônicas
HUCFF, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
Ig, Imunoglobulina
IgVH, porção variável da cadeia pesada da imunoglobulina
LBM, Linfocitose B Monoclonal
NLCs, células Nurse-like
PBS, solução salina tamponada com fosfato
SDF-1, fator 1 derivado de estroma
SEER, Surveillance Epidemiology and End Results
sIg, Imunoglobulina de superfície
VCAM-1, Molécula 1 de adesão às células endoteliais
VLA-4, Very Late Antigen 4
ZAP-70, Zeta Associated Protein 70Kd
x
RESUMO
ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE LINFÓCITOS DA LEUCEMIA LINFOCÍTICA
CRÔNICA EM CULTURA BI E TRIDIMENSIONAL DE ESTROMA DE MEDULA
ÓSSEA
Leandro Dutra Borges de Almeida
Orientadores:
Profª. Maria Isabel Doria Rossi
Prof. Nelson Spector
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Clínica Médica.
A leucemia linfocítica crônica (LLC) é uma neoplasia de linfócitos B CD5
+
circulantes, com diferentes padrões de infiltração da medula óssea e diversos graus
de acometimento dos gânglios linfáticos, fígado e baço. Atualmente, acredita-se que
esta leucemia apresenta uma biologia dinâmica, com proliferação e morte celular em
taxas variáveis, que dependem dos estímulos recebidos dos diversos
microambientes, principalmente medular, e da capacidade de resposta do clone
leucêmico a estes estímulos. Uma vez que o microambiente da medula óssea
parece ter papel fundamental na proliferação e inibição da apoptose das células
leucêmicas, é possível que a leucemia seja mantida somente por uma subpopulação
de linfócitos leucêmicos, capazes de interagir com as células do estroma medular e
migrar por entre estas através de uma rede tridimensional formada pelos seus
prolongamentos. O objetivo deste estudo foi avaliar a interação dos linfócitos
leucêmicos com células do estroma de medula óssea humano em sistemas de
cultura bi e tridimensional. Linfócitos leucêmicos do sangue periférico de pacientes
com LLC-B, recém diagnosticada ou não tratada, foram marcados com CFSE e co-
cultivados com células de estroma de medula óssea humana normal organizadas
xi
em monocamadas ou em cultura 3-D do tipo esferóide. O percentual de migração foi
determinado e os resultados comparados com variáveis clínicas e biológicas.
Nossos resultados sugerem que apenas uma subpopulação de linfócitos leucêmicos,
cujo percentual variou de paciente para paciente, foi capaz de migrar para o estroma
e que esta subpopulação foi significativamente menor nos esferóides (1,1% a 49,1%
em monocamada e 0,7% a 3,1% em esferóide). Além disto, o percentual de células
leucêmicas na monocamada de estroma variou com o número de células aplicadas,
enquanto que o percentual de células no esferóide não se alterou. Este resultado
sugere que o modelo de cultura 3-D é capaz de discriminar subpopulações com
maior capacidade de migração, que são potencialmente responsáveis pela
manutenção do clone leucêmico. Finalmente, a análise dos dados sugere que os
linfócitos dos casos aparentemente mais agressivos tendem a migrar mais.
Palavras-chave: 1. Leucemia crônica de células B. 2. Células da medula óssea. 3.
Técnicas de cultura de células. 4. Movimento celular. 5. Citometria de fluxo.
Rio de Janeiro
Dezembro/2007
xii
ABSTRACT
ANALYSIS OF MIGRATION OF CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA CELLS IN A
TWO AND THREE DIMENSION BONE MARROW STROMA CELL CULTURE
Leandro Dutra Borges de Almeida
Orientadores:
Profª. Maria Isabel Doria Rossi
Prof. Nelson Spector
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Clínica Médica.
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a malignancy of circulating CD5
+
B
lymphocytes, with different patterns of the bone marrow infiltration and diverse
degrees of involvement of lymph nodes, liver and spleen. Currently, it is believed that
this leukemia presents a dynamic biology, with a variable index of proliferation and
cell death that depend upon the stimuli received from different microenvironments,
mainly the bone marrow, and the capacity of the leukemic clone to respond to them.
Since the bone marrow microenvironment seems to have a major role in controlling
the proliferation of leukemic cells, as well as in protecting them from apoptosis, it is
possible that the leukemia is maintained by a subpopulation of leukemic cells that are
able to interact with bone marrow stromal cells and migrate through a three-
dimensional net formed by their cytoplasm prolongations. The objective of this study
was to evaluate the interaction of B-CLL cells with human bone marrow stromal cells
in a two and three dimension culture system. Leukemic cells were isolated from the
peripheral blood of patients with a recent diagnostic of B-CLL or that were not
treated. Cells were incubated with CFSE and co-cultured with normal human bone
marrow stromal cells that were organized as monolayers or as a 3-D culture system
called spheroid. The percentage of migration was determined and the results
xiii
compared with clinical and biological variables. Our results suggests that only a
subpopulation of leukemic cells, whose percentage varied from patient to patient,
was able to migrate among the stromal cells and this subpopulation was significantly
smaller in spheroids (1,1% a 49,1% in monolayer and 0,7% a 3,1% in spheroids).
Moreover, the percentage of leukemic cells among the stromal layers varied with the
number of plated cells, while the percentage of cells inside the spheroids did not
change. These results suggest that the 3-D culture model is able to discriminate
subpopulations with higher migratory capacity, which are potentially responsible for
the maintenance of the leukemic clones. Finally, data analysis suggests that cells
from the putative more aggressive cases tend to migrate more.
Key-words: 1. Leukemia, B-Cell, Chronic. 2. Bone marrow cells. 3. Cell culture
techniques. 4. Cell movement. 5. Flow cytometry.
Rio de Janeiro
Dezembro/2007
1
1) INTRODUÇÃO
1.1) Definição
A leucemia linfocítica crônica (LLC) é uma neoplasia hematopoética
caracterizada pelo aumento de pequenos linfócitos monoclonais na medula óssea,
sangue periférico e tecidos linfóides (KEATING, 2002) que também pode se
apresentar apenas como tumor nodal sem linfocitose no sangue periférico sendo
denominado Linfoma Linfocítico (HARRIS et al., 1999). De acordo com National
Cancer Institute Working Group on Chronic Lymphocytic Leukemia, o diagnóstico
clínico requer uma contagem acima de 5 x 10
3
linfócitos maduros por microlitro de
sangue periférico e mais de 30% de linfócitos na medula óssea que persiste por
mais de um mês (CHESON et al., 1996), independente da presença de
linfonodomegalia, hepatomegalia, esplenomegalia, anemia ou plaquetopenia.
Até recentemente acreditava-se que a LLC poderia ter origem tanto da
linhagem B quanto T, contudo avanços no estudo do fenótipo e das alterações
moleculares melhoraram nosso conhecimento sobre o sistema imune e sobre as
neoplasias linfóides e permitiram uma melhor caracterização destas patologias.
Diversas síndromes linfoproliferativas T foram identificadas e hoje são consideradas
entidades clinico-patológicas distintas que fazem parte do diagnóstico diferencial da
LLC. O termo LLC designa uma síndrome linfoproliferativa específica do linfócito B
(HAMBLIN, 2000)
Os linfócitos leucêmicos expressam antígenos específicos da linhagem B
(CD19, CD20 e CD23), mas diferem dos linfócitos B normais pela expressão de
CD5, associada à fraca expressão de CD79b, CD20, CD22 e pela monoclonalidade
na cadeia leve de imunoglobulina (kappa ou lambda). Este perfil fenotípico permite
um diagnóstico preciso de LLC e auxilia na distinção com outras síndromes que
cursam com linfocitose e que compõem, junto com a LLC, as chamadas doenças
linfoproliferativas crônicas (DLPC), tais como leucemia prolinfocítica, tricoleucemia,
linfoma de células do manto e outros linfomas leucemizados que mimetizam a LLC
(DIGHIERO, 2005).
2
Alguns indivíduos apresentam linfocitose monoclonal persistente, com
fenótipo da LLC, mas que não preenchem os critérios diagnósticos para LLC. Estes
casos são denominados de linfocitose B monoclonal (LBM) CD5+ e acometem cerca
de 3,5% da população acima dos 40 anos, com prevalência progressivamente maior
quanto maior a idade da população estudada (RAWSTRON et al., 2002a). Nos
familiares de pacientes com LLC, a LBM foi descrita em 13,5% dos indivíduos
adultos. Na LBM são detectados alguns padrões moleculares semelhante aos
encontrados na LLC e homogeneidade clonal em relação ao gene IgVH na maioria
dos casos, com risco de progressão para diversos tipos de DLPC, principalmente
para LLC, mas não existem evidências de que estas células representem um clone
maligno (RAWSTRON et al., 2002b).
Caso a LBM seja uma alteração precursora a LLC, um número significante de
casos deve regredir ou manter-se estável uma vez que a prevalência da LBM é
maior que a prevalência da LLC. Uma revisão traz os dados de um
acompanhamento de cinco anos que demonstram que 60% dos casos possuem
linfocitose estável ou regressiva, 35% apresentam aumento no número de linfócitos
e 5% necessitarão de tratamento (MARTI et al., 2005).
Existe ainda um subgrupo de pacientes com LLC que apresentam doença
estável, não progressiva, com sobrevida semelhante à de uma população controle
aos quais têm sido atribuídos os termos linfocitose B monoclonal benigna, LLC
indolente, linfocitose crônica idiopática persistente ou linfocitose monoclonal B de
significado indeterminado (FALCÃO, 2005). Por isso o International Workshop on
CLL recomenda como critério diagnóstico o valor de 10 x 10
3
linfócitos maduros por
microlitro de sangue periférico e >40% de linfócitos na medula óssea, estes valores
provavelmente minimizam a inclusão dos casos de linfocitose B monoclonal benigna
no diagnóstico de LLC (CHESON et al., 1996).
Estes dados contribuem para o conceito de que a LLC é uma neoplasia com
um amplo espectro de carga tumoral, mas o risco para progressão é independente
da massa tumoral no momento da apresentação. Um exemplo disto é a avaliação
clínica dos pacientes com LLC que ainda hoje conta com sistemas de estagiamento
que refletem o padrão de disseminação da doença e a massa tumoral, mas falham
em identificar o subgrupo com risco de progressão. Os benefícios da identificação
precoce dos casos de linfocitose ainda não estão estabelecidos, mas certamente
servirá para identificar os mecanismos para progressão da doença.
3
1.2) Histórico
O momento preciso do reconhecimento da LLC, bem como de todos os outros
tipos de leucemia, é impreciso, mas todos reportam a um mesmo período histórico.
Em 1845, quase simultaneamente, Bennett e Virchow descreveram um grupo de
doenças chamadas por Virchow de leucemias. O próprio Virchow relatou dentre elas
duas formas mais insidiosas, numa das quais os pacientes apresentavam
esplenomegalia, hepatomegalia, linfonodomegalias e aumento de pequenas células
agranulares no sangue que provavelmente correspondiam a LLC (KIPPS, 2001; RAI
& WASIL, 2001).
Em 1903, após a classificação das leucemias em formas agudas e crônicas
por Friedreich (1857) e após a descoberta por Ehrlich (1891) das colorações
histoquímicas que permitiram a classificação das leucemias em mielóide ou linfóide,
Turk descreveu pela primeira vez a LLC como entidade clinica distinta, propôs o
termo linfomatose para agrupar as desordens linfoproliferativas e, devido a sua
natureza indolente, classificou a LLC como uma linfomatose benigna (KIPPS, 2001).
Em 1924, Minot e Isaacs descreveram a historia natural de 98 casos e
mudaram a noção da LLC como processo benigno. Apesar dos inúmeros estudos
nos anos subseqüentes, apenas em 1966 Galton e Dameshek sugeriram que a
principal característica fisiopatológica da LLC fosse o acúmulo progressivo de
linfócitos imortalizados e funcionalmente incompetentes (KIPPS, 2001; RAI &
PATEL, 2000).
Até poucos anos atrás se acreditava nesta teoria de que a LLC era uma
doença caracterizada exclusivamente pelo acúmulo de células devido aos defeitos
na apoptose. Porém, algumas observações recentes sobre as células leucêmicas
colocaram este conceito em cheque, as células leucêmicas apresentam telômeros
mais curtos que os linfócitos B normais, sugerindo que o clone leucêmico tenha
sofrido um número considerável de divisões (DAMLE et al., 2004). Um estudo
utilizando uma técnica para marcar in vivo as moléculas de DNA recém sintetizadas
nas células em divisão demonstrou que a LLC não é uma doença estática que
resulta simplesmente do acúmulo de linfócitos imortalizados, mas sim uma doença
dinâmica na qual as células proliferam e morrem em níveis apreciáveis. Esta
capacidade proliferativa pode compensar a perda clonal que ocorre na periferia e é
responsável por determinar a taxa de crescimento tumoral (MESSMER et al., 2005).
4
1.3) Epidemiologia
Apesar da fácil suspeita clínica diante de uma linfocitose, como o acesso da
população de baixa renda aos exames complementares de rotina é difícil e muitos
casos são assintomáticos, sem requerer tratamento ou internações e como o
diagnóstico de certeza necessita da citometria de fluxo que apenas é encontrada em
grandes centros, os estudos epidemiológicos da LLC na população brasileira são
difíceis de serem realizados e acredita-se que os dados relatados na literatura são
subestimados. Informações sobre a epidemiologia da LLC no Brasil, envolvendo
razoável casuística, não foram encontrados na literatura (YAMAMOTO &
FIGUEIREDO, 2005).
Nos EUA, a incidência da LLC, ajustada para as idades, entre os anos de
2000 e 2004 foi 3,9 casos novos para cada 100.000 indivíduos e a taxa de
mortalidade foi de 1,5 indivíduos para cada 100.000. Para este mesmo período a
mediana da idade ao diagnóstico foi 72 anos, com nenhum caso ocorrendo na faixa
etária abaixo dos 20 anos; 0,3% entre 20 e 34 anos; 1,9% entre 35 e 44 anos; 8,9%
entre 45 e 54 anos; 19% entre 55 e 64 anos; 27% entre 65 e 74anos; 30% entre 75 e
84 anos; e 12,8% na faixa etária acima dos 85 anos. A mediana da idade no óbito foi
78 anos (SEER, Surveillance Epidemiology and End Results, 2007). Esta
distribuição demonstra que a LLC é uma doença predominantemente do idoso com
aumento exponencial na incidência da LLC com o avançar da idade sendo trezentas
vezes mais comum aos 80 anos que aos 40 anos (DIEHL et al., 1999).
Uma estimativa de 15.340 novos casos foi feita para o ano de 2007 com
4.500 óbitos (Cancer Facts and Figures, 2007). O risco de qualquer indivíduo
nascido atualmente desenvolver a LLC durante a sua vida é de 0,45% ou 1 caso em
cada 221 indivíduos (SEER, 2007). A incidência de LLC tem caído 1,9% por ano
desde 1992 (Cancer Facts and Figures, 2006) apesar das melhorias nos métodos
diagnósticos que contribuíram para o diagnóstico precoce. Segundo cálculos
baseados nas mudanças anuais das taxas (APC, Annual Percentage Change), para
os próximos anos há uma tendência de queda de 0,7% e de 1,1% na incidência e
mortalidade da LLC, respectivamente (SEER, 2007).
A LLC representa 22 a 30% de todas as leucemias, aproximadamente 11%
dos linfomas não-Hodgkin e 0,8% de todas as neoplasias, com uma incidência
mundial projetada entre <1 e 5.5 por 100.000 pessoas. Há um predomínio no sexo
5
masculino, apesar de haver variação de acordo com o país. Nos EUA, a incidência
ajustada à idade mostra uma relação M:F de 1,9:1. Além disso, estas taxas variam
grandemente de acordo com a origem étnica, os maiores números de casos são
registrados na Austrália, EUA, Irlanda, Itália, Suíça e Canadá enquanto no Japão,
China e em outros países asiáticos, corresponde a apenas 3% a 5% das leucemias,
com uma incidência 26 vezes menor que no Canadá, por exemplo (RADAELLI et al.,
2004). Além disso, estudos mostram que os chineses, japoneses, índios
americanos, e filipinos residentes nos EUA também apresentam baixa incidência de
LLC (tabela 1).
Tabela 1. Taxa de incidência da LLC nos EUA conforme sexo e etnia.
(Fonte:
SEER, 2007)
Dentre as leucemias, a LLC é a que apresenta maiores índices de sobrevida.
Nos EUA, a taxa de sobrevida global em 5 anos foi 74,2% no período compreendido
entre 1996 e 2003. A sobrevida em 5 anos relacionada ao sexo e à etnia foi 73,5%
para homens brancos, 76,8% para mulheres brancas, 52,9% para homens pretos e
65,8% para mulheres pretas. Com estes dados observamos uma leve diferença na
sobrevida conforme o sexo, mas uma importante diferença conforme a etnia, sendo
significativamente menor na raça negra (SEER, 2007). Diferença na sobrevida
também é documentada nas diversas faixas etárias, sendo maior nos indivíduos
mais jovens, 83% entre os menores de 65 anos e 68% entre os maiores que esta
idade (RADAELLI et al., 2004).
Etnias Homens Mulheres
Todas as raças 5.5 por 100.000 2.8 por 100,000
Brancos 5.8 por 100.000 2.9 por 100,000
Pretos 4.4 por 100.000 2.1 por 100,000
Asiáticos 1.1 por 100.000 0.6 por 100,000
Hispânicos 2.8 por 100.000 1.3 por 100,000
6
1.4) Etiologia da LLC
A causa da LLC é desconhecida. Poucos estudos existem referentes a fatores
ambientais que possam ser atribuídos como causa da LLC e geralmente eles
apresentaram fraca associação ou não foram reprodutíveis (KEATING, 2002). O fato
da incidência da LLC ser diferente conforme os grupos étnicos presentes em uma
mesma área geográfica sugere que fatores ambientais não contribuem para o
desenvolvimento da LLC.
Há observações de maior mortalidade entre profissionais que têm contato
com borracha, solventes e derivados de petróleo. Outros relatos descrevem
incidência aumentada entre tabagistas. Um estudo relatou maior incidência em
população rural, mas não há correlações conhecidas entre LLC e pesticidas, luz
solar, radiação ionizante ou carcinógenos. Alguns estudos epidemiológicos relatam
aumento de LLC em pessoas expostas a campo eletromagnético, mas não está
determinado se essa associação reflete uma relação causal (KEATING, 2002;
SGAMBATI et al., 2001).
Os vírus não parecem desempenhar papel patogênico. Anticorpos específicos
contra o vírus da hepatite C e o DNA viral foram identificados em alguns pacientes,
mas estudos recentes falharam em confirmar esta associação. O HTLV-1, o
citomegalovírus (CMV), o vírus Epstein-Barr (EBV) e o herpesvirus humano 6
(HHV6), relacionados com alguns tipos de neoplasias linfóides, não estão implicados
no surgimento da LLC (KEATING, 2002).
Fatores hereditários parecem contribuir para o desenvolvimento de LLC. Além
das diferentes incidências entre as diversas etnias, muitos casos de LLC ocorrem
dentro de uma mesma família. A LLC é a leucemia mais frequentemente associada
com acometimento familiar. Os parentes em primeiro grau de um paciente com LLC
têm risco três vezes maior de desenvolver LLC ou outra neoplasia linfóide que a
população geral (KIPPS, 2001). Comumente os indivíduos de uma família que
desenvolvem LLC apresentam idades mais jovens, fenômeno denominado de
antecipação, compartilham anormalidades citogenéticas, haplótipos e distúrbios
imunológicos sugerindo que fatores genéticos familiares contribuem para a
leucemogênese. Estes fatores ainda não são conhecidos e nenhum antígeno
leucocitário humano (HLA) tem associação com a LLC (KEATING, 2002; SGAMBATI
et al., 2001).
7
1.5) LLC Familiar
A LLC é denominada familiar quando pelo menos dois membros de uma
mesma família apresentam a doença. Nos EUA, um levantamento mostrou que a
idade ao diagnóstico é menor nos pacientes com história familiar de LLC (57,9 ± 12
anos) do que entre os casos denominados esporádicos (70,1 ± 11,9 anos). Para
exemplificar esta diferença, na LLC familiar a incidência da doença abaixo dos 50
anos é maior do que a encontrada na população geral (31% versus 6%,
respectivamente), a este fato têm-se referido o termo “antecipação da doença”. Não
foi encontrada diferença na incidência conforme o sexo (ISHIBE et al., 2001).
Um outro estudo baseado no banco de dados da população sueca
demonstrou que a incidência de outras neoplasias linfóides também está aumentada
nos membros de famílias com dois ou mais casos de LLC. Neste estudo, o risco
relativo de familiares de pacientes com LLC de desenvolver a doença foi de 7,53, o
risco relativo para o desenvolvimento de LNH foi de 1,45 e para o linfoma de
Hodgkin 2,36 (GOLDIN et al., 2004).
Pelo descrito, a participação de fatores genéticos na patogênese da LLC
parece ter maior influência do que fatores ambientais, a natureza desta
predisposição genética permanece desconhecida, nenhumas das alterações
genéticas descritas na LLC são comuns a todos os casos e muitas são adquiridas
durante a evolução da doença. Diferentemente do que se observa em outras
neoplasias linfóides B, nas quais translocações cromossômicas associam
protoncogenes com genes da molécula de imunoglobulina, na LLC as
anormalidades mais freqüentes são mutações, deleções ou trissomias de significado
biológico também desconhecido (DÖEHNER et al., 2000). Portanto, a patogênese
da doença ainda não está esclarecida.
1.6) Quadro Clínico
Aproximadamente 25% dos pacientes são assintomáticos e muitos são
diagnosticados por linfocitose em exames de rotina ou por linfonodomegalias ou
esplenomegalia no exame físico. Outros pacientes apresentam sintomas leves como
reduzida tolerância a exercícios, fadiga ou mal estar. Menos frequentemente,
quadros infecciosos, geralmente pneumonia, secundários a imunodeficiência, ou
8
exacerbação de comorbidades pré-existentes podem ser as queixas iniciais.
Diferentemente de outros linfomas, a febre, emagrecimento e sudorese noturna,
conhecidos como sintomas B, são menos comuns (JOHNSTON, 1999; KIPPS,
2001).
Os linfonodos acometidos geralmente são pequenos, móveis e de
consistência firme, as cadeias cervicais e supraclaviculares são envolvidas com
maior freqüência que as axilares e inguinais. Quando ocorre esplenomegalia, ela
comumente é pequena a moderada de forma que o infarto esplênico é incomum.
Pode ocorrer hepatomegalia secundária à infiltração leucêmica, mas a conseqüente
alteração da função hepática é leve na maioria das vezes e a icterícia colestática é
rara, a menos que ocorra compressão extrínseca das vias biliares por aumento de
linfonodos. O envolvimento extranodal é freqüente em autópsias, mas raramente
resultam em sintomas e são diagnosticados clinicamente (KIPPS, 2001).
Em fases mais avançadas da doença, os pacientes podem apresentar
sintomas relacionados à anemia ou sangramentos, por trombocitopenia ou distúrbios
da coagulação, que estão relacionadas à infiltração da medula óssea ou à
fenômenos autoimunes como anemia hemolítica autoimune, aplasia, púrpura
trombocitopênica imunológica, doença de von Willeband adquirida ou anticorpo anti-
fator VIII da coagulação (Hemofilia A adquirida). Raramente, os pacientes podem
apresentar síndrome paraneoplásica como síndrome nefrótica, pênfigo
paraneoplásico ou angioedema (JOHNSTON, 1999).
1.7) Fatores Prognóstico
A LLC ainda é considerada uma doença incurável, pois a grande maioria dos
pacientes recai após atingir remissão com o tratamento atualmente disponível,
sendo o transplante alogênico de medula óssea a única terapia potencialmente
curativa, mas como a maioria dos pacientes com LLC é idosa e como esta
modalidade terapêutica apresenta alta morbidade e mortalidade para pacientes
nesta faixa etária, sua aplicação não se justifica (OSCIER et al., 2004)
Apesar das dificuldades terapêuticas, considerando que a maioria dos
pacientes são idosos, a LLC apresenta sobrevida mediana longa, aproximadamente
10 anos, de forma que em muitos casos a causa de mortalidade não está
9
relacionada à LLC. Entretanto, a sobrevida mediana possui pouco valor na avaliação
individual de um paciente, principalmente para os casos de pacientes mais jovens,
pois o curso clínico da LLC é extremamente variável. Enquanto alguns pacientes
apresentam um curso clínico indolente, sem encurtamento da expectativa de vida,
outros apresentam doença rapidamente progressiva, com comportamento agressivo
e sobrevida inferior a 2 anos após o diagnóstico (MONTSERRAT, 2006).
A variabilidade do curso clínico é uma conseqüência da freqüência com que a
doença é diagnosticada em fase pré-clínica e pela diferença na taxa de progressão
entre os casos. A identificação precoce dos casos com tendência para rápida
progressão da doença é de fundamental importância ao diagnóstico para guiar a
conduta médica (OSCIER et al., 2004).
Os sistemas de estagiamento clínico, desenvolvidos por Rai e Binet,
estratificaram os pacientes com LLC em três grupos de risco, com sobrevidas
diferentes (tabela 2 e 3). Contudo, apesar das suas grande aplicabilidade e vasta
utilização para decisão terapêutica na prática médica, estes estagiamentos não
conseguem discriminar os casos com risco de progressão. (DIGHIERO & BINET,
2000). Assim estudos para identificação de marcadores celulares e moleculares que
predizem o comportamento clínico trouxeram progressos a este respeito. Alguns
destes marcadores refletem a da carga tumoral, enquanto outros estão relacionados
a aspectos relevantes da patologia molecular na LLC (DIGHIERO, 2005).
O status mutacional do gene IgVH é atualmente o discriminador mais acurado
da evolução clínica. Pacientes com IgVH não mutado apresentam progressão de
doença três vezes mais rápida do que paciente com IgVH mutado, com sobrevida
mediana de menos de 8 anos para o grupo sem mutação e mais de 24 anos para o
grupo com mutação (DAMLE, 1999; HAMBLIN, 1999). Devido às dificuldades na
utilização do sequenciamento genético para determinação do status mutacional do
gene IgVH como rotina na investigação prognóstica dos pacientes com LLC,
diversos estudos procuraram marcadores preditores do seu status. Dois marcadores
que são fáceis de serem avaliados na rotina laboratorial dos pacientes apresentam
correlação inversa com o status mutacional do gene IgVH: o CD38 de superfície e o
ZAP-70 intracelular.
10
Tabela 2. Sistemas de estagiamento clínico da LLC.
Tabela 3. Correlação entre os estagiamentos de Rai e Binet e estratificação do
risco conforme a sobrevida.
O CD38 é uma proteína multifuncional que atua na superfície celular como
ectoenzima e como receptor de membrana. Sua correlação com o status do gene
IgVH não é absoluta, em parte por oscilações na sua expressão ao longo do tempo
e em parte por controvérsias nos critérios e métodos que determinam sua
positividade ou negatividade, são descritos pontos de corte que variam de 5 a 30%
em diferentes estudos, alguns utilizando quantificação por citometria e outros por
densidade antigênica pela capacidade de ligação de anticorpos. Hamblin et al.
(2002) demonstraram que o CD38 possui poder prognóstico independente e Deaglio
et al. (2003) sugerem que o CD38 atue como receptor com potencial patogênico
Estágios Características
Percentual de
casos
Binet
A
<3 áreas linfóides* 60
B
>3 áreas linfóides* 30
C
Hemoglobina <10g/dl ou plaquetas <100x 10
9
/l 10
Rai
0
Apenas linfocitose 30
I
Linfonodomegalias 25
II
Hepato ou esplenomegalia ± linfonodomegalias 25
III
Hemoglobina <11g/dl 10
IV
Plaquetas <100x 10
9
/l 10
* São consideradas cinco áreas linfóides: cervical (unilateral ou bilateral), axilar, inguinal,
fígado e baço.
Risco de
malignidade
Binet Rai
Mediana de
sobrevida
Baixo A 0 > 10 anos
Intermediário B I, II 5 -7 anos
Alto C III, IV 1-3 anos
11
uma vez que são capazes de alterar o influxo d cálcio para o interior da célula,
aumento a proliferação e alteram a morfologia celular quando estimulados.
O ZAP-70 (zeta-associated protein 70Kd) é uma proteína tirosina kinase
descrita em linfócitos T e células natural-killer participante da sinalização intracelular
do receptor de células T. A correlação do ZAP-70 com o status do gene IgVH foi
demonstrado inicialmente em um estudo de assinatura gênica que encontrou um
pequeno número de genes capazes de diferenciar os casos mutados dos não
mutados (ROSENWALD, 2001). Na LLC foi demonstrado que a expressão do ZAP-
70 está associada à maior capacidade da célula leucêmica em responder aos
estímulos externos (CHEN et al., 2005).
Apesar de promissores, a aplicação destes novos marcadores biológicos nas
decisões terapêuticas ainda precisa ser estudada e por enquanto só se justificam
dentro de ensaios clínicos (MONTSERRAT, 2006).
1.8) Classificação
A correta classificação das neoplasias linfóides é importantíssima para que
um diagnóstico adequado e reprodutível, com aplicação clínica que possibilite
estimar sobrevida e guiar a decisão terapêutica seja possível. As diversas
classificações das neoplasias linfóides utilizadas até alguns anos atrás eram
baseadas em diferentes critérios e por isso davam denominações distintas para a
mesma patologia, agrupavam diferentemente as doenças e possuíam diferentes
aplicações na prática clínica.
Em 1997, a Organização Mundial da Saúde (OMS) atualizou e ampliou a
classificação intitulada REAL (Revised Europen and American Classification of
Lymphoid neoplasm) proposta em 1994 pelo grupo internacional de estudos em
linfomas. Esta classificação utiliza parâmetros morfológicos, fenotípicos e genéticos
que procuram correlacionar cada doença com sua célula de origem e suas biologias
com os seus comportamentos clínicos. Assim, várias entidades puderam ser
identificadas e classificadas separadamente evitando as confusões que ocorriam em
decorrência das diferentes classificações (HARRIS et al., 1999).
O entendimento da classificação da LLC, e dos linfomas, requer um
conhecimento básico da ontogenia linfóide normal.
12
1.8.1) Ontogenia B
As células B normais podem ser reconhecidas em cada estágio do
desenvolvimento por características morfológicas, fenotípicas e genotípicas
específicas. Na ontogenia do linfócito B, o processamento, a produção e a
expressão das moléculas de imunoglobulina (Ig) delineiam os estágios de
diferenciação. As moléculas de imunoglobulina são expressas na superfície dos
linfócitos B em conjunção com o CD79a (também chamado de Igα) e o CD79b
(também chamado de Igβ) para formar o complexo BCR (B cell receptor), ou são
secretadas em forma solúvel como anticorpos circulantes (PARHAM, 2001a).
As imunoglobulinas são compostas por duas cadeias pesadas (IgH, H =
heavy) e duas cadeias leves (IgL, L = ligh). Tanto as cadeias pesadas quanto às
cadeias leves possuem uma porção constante (C
H
e C
L
) e uma porção variável (V
H
e
V
L
).
As porções constantes das cadeias pesadas determinam o isotipo e as
propriedades biológicas das moléculas de imunoglobulina: M, D, G, E ou A, que são
formadas pelas seguintes cadeias pesadas, respectivamente, mü (µ), delta (δ),
gama (γ), épsilon (ε). ou alfa (α), que podem estar combinadas a uma das duas
cadeias leves, kappa (κ) ou lambda (λ). As porções variáveis formam o sítio de
ligação ao antígeno e são compostas por diferentes segmentos de gene. Para
compor a região variável das cadeias leves existem os segmentos V
L
(variável) e J
L
(juncional) e, para as regiões variáveis da cadeia pesada existem, além dos
segmentos V
H
e J
H
, o segmento D (diversidade). Há, no nosso genoma,
aproximadamente 51 diferentes genes para o segmento V
H
, seis genes para o
segmento J
H
, vinte e sete genes para o segmento D, quarenta genes para o
segmento V
L
e cinco genes para o segmento J
L
, o que possibilita mais de um milhão
de diferentes combinações (PARHAM, 2001a).
A primeira classe de imunoglobulina expressa é a IgM; tão logo ela aparece
na membrana celular, este linfócito B imaturo sofre na medula óssea um processo
de seleção negativa frente à auto-antígenos denominado deleção clonal. Após esta
etapa, as células B circulam do sangue periférico aos tecidos linfóides secundários
onde se congregam em estruturas organizadas denominadas folículos linfóides
primários. Nestes folículos elas recebem sinais de sobrevivência de células
acessórias denominadas células dendríticas foliculares para novamente retornar ao
sangue via vasos linfáticos. Neste momento do desenvolvimento linfóide, estas
células são denominadas naive (“virgens” - células B maduras que ainda não
13
sofreram estimulação antigênica) e começam a expressar também imunoglobulinas
da classe IgD na superfície (PARHAM, 2001a, 2001b).
Os linfócitos B naive têm meia vida curta e entram em apoptose se não
encontrarem seus antígenos ou se não conseguirem estímulos nos folículos linfóides
primários. Quando ocorre o encontro com antígenos livres (geralmente
polissacarídeos ou lipopolissacarídeos) ou apresentados por células acessórias
(geralmente antígenos protéicos), estes linfócitos são ativados nos órgãos linfóides
secundários (PARHAM, 2001b).
Os tecidos linfóides secundários fornecem os sítios onde as células B naive
encontram o seu antígeno específico. Quando isto ocorre a células B fica retida na
região paracortical (zona do manto - rica em linfócitos T) onde é ativada por células
T CD4 auxiliar para se diferenciar em plasmócito de vida curta secretor de IgM
polireativo, para uma resposta rápida, ou para formar o folículo linfóide secundário
(rico em células B) com um centro germinativo, onde assumem morfologia blástica
(centroblastos) e proliferam. Esses amadurecem em células B que não se dividem
(centrocítos) e que refinam sua molécula de imunoglobulina a fim de aumentar sua
especificidade ao antígeno para uma resposta tardia, porém específica: sofrem troca
de isotipo (troca de classe) e mutação da porção variável da Ig (hipermutação
somática). Aqueles centrocítos que expressam imunoglobulina com maior afinidade
pelo antígeno são selecionados, sofrem nova proliferação para expansão do clone e
migram para a medula óssea onde completam sua diferenciação em plasmócitos de
vida longa, secretores de Ig de alta afinidade, ou migram para outros locais no órgão
linfóide onde se tornam células B de memória com receptores de alta afinidade. As
células de memória persistem em repouso por longos períodos de tempo e, na
recirculação do antígeno, podem ser reativadas produzindo resposta rápida e
específica (PARHAM, 2001b; PASCUAL, 1994).
Os linfócitos B são divididos nos subtipos B-1 e B-2 conforme seu fenótipo,
sua localização anatômica e suas propriedades funcionais. O subtipo B-2, que
representa a maioria dos linfócitos da vida adulta predomina no baço e linfonodos,
surge mais tardiamente na ontogenia e é mantido a partir de precursores
hematopoéticos da medula óssea. Em contraste, os linfócitos B-1 surgem primeiro
na ontogenia linfóide, no omento fetal; no adulto eles representam pequeno
percentual dos linfócitos esplênicos, estão praticamente ausentes no sangue
periférico, medula óssea e linfonodos, mas predominam nas cavidades pleurais e
14
peritoneal. Eles mantêm seu número por auto-renovação, divisão celular de células
maduras (GHIA & CALIGARIS-CAPPIO, 2001).
Os linfócitos B-1 subdividem-se ainda em B-1a e B-1b, que apresentam as
mesmas características funcionais e fenotípicas, diferindo apenas quanto à origem e
à expressão do antígeno CD5. O linfócito B-1a é CD5+ surge de progenitores
peritoneais que diminuem com o avançar da idade e adquirem capacidade de auto-
renovação, o linfócito B-1b é CD5- e surge de precursores da medula óssea que
persistem na vida adulta (GHIA & CALIGARIS-CAPPIO, 2001).
Nos humanos, estes linfócitos B-1 são os primeiros linfócitos B a surgir no
fígado fetal e nos linfonodos em desenvolvimento. Eles representam a maioria dos
linfócitos B circulantes no feto e em neonatos, mas eles vão diminuindo à medida
que envelhecemos. Estes linfócitos B-1 são células que participam da resposta
imune inata por interagirem com antígenos livres da cavidade peritoneal (ou na zona
do manto folicular onde se localizam preferencialmente quando presentes nos
linfonodos), como resultado não sofrem hipermutação da imunoglobulina,
produzindo anticorpos de baixa afinidade, com polireatividade, por vezes auto-
reativos, e que podem causar algumas doenças auto-imunes. Não está claro se em
humanos adultos estas células constituem uma linhagem distinta proveniente de
progenitores próprios remanescentes da vida fetal uma vez que reaparecem durante
o transplante de medula óssea, como ocorre em murinos. Outra hipótese é que a
expressão do CD5 representaria um marcador de ativação uma vez que a expressão
do CD5 pode ser induzida ou diminuída por estímulos exógenos (linfócito B de
memória que foram estimulados localmente a partir de antígenos do trato
gastrintestinal) (GHIA & CALIGARIS-CAPPIO, 2001).
1.8.2) A origem do linfócito leucêmico
Os avanços no conhecimento tanto da ontogenia B quando da biologia da
LLC têm permitido a descoberta de dados que trouxeram progressos na
identificação dos casos com tendência para progressão da doença. Contudo, as
estas novas informações a respeito dos linfócitos leucêmicos, suas interações, seu
microambiente e sua capacidade de responder a estímulos levam a hipóteses que
15
têm alterado totalmente os conceitos sobre a LLC, sua origem celular e seu
mecanismo de sobrevida.
Morfologicamente, o linfócito leucêmico é pequeno e arredondado, o seu
citoplasma é escasso, agranular e cora-se de azul claro enquanto o núcleo aparece
azul escuro (basofílico) na coloração de rotina por ter cromatina densa, raramente
apresenta nucléolos e ocupa quase todo o citoplasma. Pode ser encontrada também
pequena porcentagem de células com morfologia atípica, núcleo clivado, tamanho
grande ou semelhante à prolinfócitos (HAMBLIN, 1997).
Eles possuem em sua superfície os antígenos CD19, CD21, CD24, CD25 e
CD40, porém sua principal característica é a concomitante expressão de CD5 e
CD23 com fraca expressão do CD20, CD22, CD79b e imunoglobulina de superfície
(sIg) e ausência de FMC7 que auxilia na distinção com outras DLPC. As sIg
geralmente são da classe M ou M e D, sem preferências quanto à cadeia leve (κ ou
λ) (JURLANDER, 1998).
Outras características peculiares são a capacidade de formar rosetas com
hemácias de camundongos e a expressão de antígenos mielomonocíticos (CD11). A
maioria dos linfócitos está na fase G0 do ciclo celular e os poucos que entram no
ciclo celular estão na fase G1 como foi identificado pela baixa expressão de Ki67
(HAMBLIN, 1997; JURLANDER, 1998).
Pelas características descritas, os linfócitos leucêmicos se assemelham aos
linfócitos B circulantes que expressam apenas IgM (com ou sem IgD) e que estão
fora do ciclo celular, desta forma a LLC era classificada como uma neoplasia de
linfócitos naive (PASCUAL, 1994). No entanto, o fenótipo CD19/CD21+ e CD23+
sugere um fenótipo de célula ativada o que contradiz o padrão de repouso
apresentado pelo ciclo celular (HAMBLIN, 1997). Da mesma forma que na ontogenia
normal, não está bem estabelecido se a expressão do CD5 na célula leucêmica
representa origem de linfócito B-1 ou mais um marcador de ativação celular (GHIA &
CALIGARIS-CAPPIO, 2001).
Alguns estudos avaliaram o status mutacional do gene da porção variável da
cadeia pesada de imunoglobulina (V
H
) com o objetivo de estabelecer o estágio de
diferenciação dos linfócitos leucêmicos. Eles apresentaram resultados divergentes,
enquanto alguns casos o apresentavam mutado, sugerindo que estes linfócitos
tenham sofrido estimulação antigênica e tenham se originado de células que
passaram pelo centro germinativo onde expressam CD38, IgD, e fazem troca de
16
classe de imunoglobulina e sofrem as mutações somáticas no gene da porção V
H
(DAMLE et al., 2002; FAIS et al., 1998), outros possuíam semelhança com o gene
da linha germinal (não mutado), contribuindo para a idéia da origem em linfócitos
naive ou de linfócitos B-1 da zona do manto folicular que normalmente expressam
CD5, CD23, são negativos para CD38, coexpressam IgM e IgD e utilizam genes V
H
não mutados (SCHROEDER & DIGHIERO, 1994). Uma terceira hipótese sugere que
os linfócitos leucêmicos representem linfócitos B da zona marginal que podem ser
mutados ou não mutados; embora as células da zona marginal não expressem o
CD5, nesta hipótese sua positividade nas células leucêmicas seria conseqüência da
ativação celular (CHIORAZZI & FERRARINI, 2003).
Assim, especulou-se que os dois subtipos poderiam surgir de diferentes
estágios de diferenciação, e alguns autores defendiam a hipótese de que poderia se
tratar de duas patologias distintas uma vez que possuem diferenças epidemiológicas
e de prognóstico e o perfil mutacional dos genes VH estão associados com
alterações genéticas específicas. Entretanto, independentemente do subtipo, os
linfócitos leucêmicos expressam IgM e IgD, CD5 e CD23. E, ao contrário do que
seria esperado, os linfócitos leucêmicos do subtipo não mutado são os que
apresentam predominância na expressão do CD38 (GHIA et al., 2003), na troca de
classe de imunoglobulina e na expressão constitutiva de citidina deaminase, uma
enzima que desempenha papel fundamental nos processos de troca de classe e de
mutação somática do gene V
H
nas células do centro germinativo e não é
normalmente expressa em linfócitos B circulantes (OPPEZZO et al., 2003).
Estudos recentes utilizando microarrays demonstraram que a LLC possui uma
expressão gênica característica (assinatura), que comparado aos diversos estágios
de diferenciação dos linfócitos normais é mais relacionado aos linfócitos de
memória. Quando analisados isoladamente, apenas a expressão de um pequeno
número de genes separa os subtipos mutados dos não mutados de forma que eles
se assemelham mais proximamente um com o outro do que com qualquer linfócito
nos diferentes estágios de diferenciação (KLEIN et al., 2001; ROSENWALD et al.,
2001). Estes resultados sugerem que os casos mutados indolentes e os não
mutados agressivos constituem duas variantes da mesma doença e as razões para
as diferenças na história natural permanecem desconhecidas, assim como se eles
correspondem a diferentes estágios de diferenciação no momento da transformação
17
maligna ou se o subtipo não mutado está em uma forma mais ativada que favorece
o potencial proliferativo do clone maligno.
Os resultados de novos estudos cada vez mais se opõem a hipótese de que
os linfócitos leucêmicos corresponderiam a células naive. Dentro de um mesmo
subgrupo de LLC ocorre o uso preferencial de determinados genes da
imunoglobulina (FAIS et al., 1998), este uso preferencial frente a mais de um milhão
de combinações possíveis fortemente sugere o papel de um antígeno estimulador. O
subgrupo não mutado expressa citidina deaminase (OPPEZZO et al., 2003) que, na
fisiologia normal, é induzida pela estimulação de células apresentadoras de
antígenos via CD40 ligante (CD40L). O fenótipo das células leucêmicas relembra
linfócitos ativados por antígeno com hiperexpressão de marcadores da ativação:
CD23, CD25, CD69, e CD71 e hipoexpressão do CD22, CD79b e da sIg que são
downregulados pela ativação celular (DAMLE et al., 2002). Ademais, o CD27, um
identificador de células de memória, está uniformemente expresso pelos linfócitos
leucêmicos.
Além disso, os linfócitos leucêmicos apresentam telômeros mais curtos do
que os observados em linfócitos B normais. Quando analisados os subtipos de LLC,
os casos não mutados apresentaram telômeros mais curtos do que os casos
mutados e maior atividade de telomerase. Portanto, as células sem mutações
somáticas passam por um número maior de divisões celulares, possivelmente após
múltiplas exposições a estimulação antigênica, que expõem as células não mutadas
a uma gama muito maior de oportunidade para adquirir aberrações cromossômicas,
e, portanto, de apresentar um curso clínico mais agressivo. É possível que as
células com mutação somática, com maiores telômeros e menor atividade de
telomerase, tenham uma menor capacidade de interagir com antígeno, o que
conduziria a célula a um estado de reduzida capacidade de proliferar, ou seja, de
anergia. Dado o menor número de divisões, a chance de que estas células adquiram
aberrações genéticas é menor e, portanto, isto poderia refletir o melhor prognóstico
deste grupo de indivíduos (DAMLE et al., 2004).
Outra característica dos linfócitos leucêmicos que sugere a participação de
antígenos é a fraca expressão de imunoglobulina de superfície (BCR). Ela se
correlaciona com reduzida sinalização intracelular, portanto baixa resposta aos
estímulos externos via BCR (LANHAM et al., 2003; STEVENSON & CALIGARIS-
CAPPIO, 2004). Não está esclarecido se esta fraca expressão do BCR está
18
relacionada ao evento de transformação maligna ou se é um processo de anergia
que normalmente ocorre em conseqüência do cruzamento com auto-antígenos, uma
vez que com freqüência o BCR dos linfócitos leucêmicos são autoreativos. A
elucidação do mecanismo implicado na hipoexpressão do BCR deve ser uma
importante chave para entender a patogênese.
Estudos recentes avaliando a capacidade de sinalização intracelular
revelaram que os casos não mutados tendem a apresentar maior quantidade de
BCR e responder melhor a estimulação (STEVENSON & CALIGARIS-CAPPIO,
2004). Estes resultados sugerem que o subtipo não mutado mantêm a capacidade
de responder aos estímulos externos enquanto os mutados relembram células B
anérgicas. Uma molécula tirosina quinase, denominada ZAP-70, que participa na
transdução de sinais de receptores de membrana em linfócitos T, foi detectada nos
casos não mutados (CRESPO et al., 2003) que são mais aptos a responder aos
sinais após estimulação via IgM. Foi demonstrado que a expressão do ZAP-70
permite sinalização mais efetiva via IgM nos linfócitos leucêmicos, uma característica
que parece contribuir para o curso mais agressivo observado no subtipo não mutado
(CHEN et al., 2005).
1.9) Biologia da LLC
Até recentemente, acreditava-se que a principal característica biológica dos
linfócitos leucêmicos era a resistência à apoptose, como descrito por Galton e
Dameshek em 1966. Diversos estudos demonstraram aumento da relação entre os
inibidores da apoptose, como o BCL-2, e seus indutores, Bax e Bak. Isto condizia
com o quadro clínico indolente da maioria dos casos, nos quais o acúmulo gradual
de linfócitos só manifestaria sintomas em fase tardia da doença caso o diagnostico
não ocorresse acidentalmente em exames de rotina. Curiosamente, esta resistência
a apoptose desaparece quando estas células são semeadas in vitro, onde
rapidamente morrem (COLLINS et al., 1989). Tal fato foi motivo de muitos estudos
que demonstraram que fatores extrínsecos ao linfócito leucêmico influenciam a sua
sobrevivência e nos leva a concluir que as anormalidades da apoptose, antes
descritas como mecanismo patogênico fundamental desta doença, devem ser
19
secundárias aos estímulos recebidos pelos linfócitos leucêmicos (KEATING et al.,
2003).
Ao contrário do que se acreditava, os linfócitos leucêmicos possuem atividade
proliferativa, o maior exemplo desta proliferação é a progressão clínica que cedo ou
tarde ocorre em conseqüência do aumento do número de linfócitos leucêmicos. A
doença progressiva é caracterizada por um rápido aumento do número de linfócitos
leucêmicos que resulta em um tempo de duplicação linfocitária menor que um ano.
Todavia, se os linfócitos leucêmicos encontrados no sangue periférico estão no
estágio G0/G1 do ciclo celular e são negativos para Ki67, estas células devem
possuir um microambiente apropriado onde proliferam (RICHARDSON et al., 2006).
1.9.1) O Microambiente
Diversas quimiocinas desempenham importante papel na proliferação e
sobrevivência do linfócito leucêmico. Linfotoxina-α (KULMBURG et al., 1998), IL-4
(DANCESCU et al., 1992; MAINOU-FOWLER et al., 1994; PANAYIOTIDIS et al.,
1994), IL-8 (DI CELLE et al., 1994), IL-13 (CHAOUCHI et al., 1996), INF-α
(PANAYIOTIDIS et al., 1993; JEWELL et al., 1994) e INF-γ (BUSCHLE et al., 1993)
inibem a apoptose dos linfócitos leucêmicos e prolongam sua sobrevida em cultura
por induzir a expressão da proteína BCL-2. Estas quimiocinas podem ser produzidas
por leucócitos acessórios ou pelas próprias células leucêmicas exercendo um
controle parácrino e autócrino (HOFFBRAND et al., 1993). Entretanto, o soro ou o
plasma dos próprios pacientes não é capaz de sustentar a sobrevida dos linfócitos
leucêmicos in vitro (HAMBLIN, 1997), o que sugere que os fatores humorais que
sustentam estas células in vitro não são responsáveis pela sobrevivência in vivo e
que outros fatores devam exercer esta função.
Alguns estudos demonstraram que as interações com outros tipos celulares
têm um papel importante na prevenção da apoptose do linfócito leucêmico in vitro:
A) Células nurse-like (NLCs) – Células acessórias foram demonstradas em
estudos de co-cultura de células mononucleares do sangue periférico de pacientes
com LLC (BURGER et al., 2000).
O desenvolvimento destas NLCs dependeu da
presença de células CD14+ (monócitos) que sofreram modulação da expressão de
20
algumas moléculas, como regulação negativa do CD14 e CD33 e regulação positiva
do CD68, representando um tipo celular distinto que surge na LLC. Estas células
não expressam o CD106 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), molécula de
adesão das células estromais e dendríticas foliculares pela qual as células B
normais e malignas se ligam via VLA-4 (very late antigen-4), sugerindo mecanismo
especial de interação com o linfócito leucêmico (TSUKADA et al., 2002). As NLCs,
protegem os linfócitos leucêmicos por mecanismo dependente da quimiocina SDF-1
(stromal derived factor-1 ou CXCL12) e seu receptor CXCR4. A adição de SDF-1 em
culturas de linfócitos leucêmicos praticamente inibe a apoptose enquanto a adição
de anticorpos anti-CXCL12 bloqueia a proteção das NLCs (BURGER et al., 2000).
Não está claro como a ligação CXCL12-CXCR4 induz o efeito protetor, mas em
linfócitos T expostos ao CXCL12 ocorre rápida ativação das cinases reguladoras de
sinais extracelulares (ERK) p44/42 que constituem importante via de promoção da
sobrevida celular, esta sinalização depende do ZAP-70, uma tirosina cinase que
participa na transmissão de sinais intracitoplasmático originados na membrana
celular (RICHARDSON et al., 2006). As NLCs já foram identificadas nos órgãos
linfóides de pacientes com LLC, sugerindo que elas desempenham papel na
proteção dos linfócitos leucêmicos in vivo.
B) Interação homotípica - nos linfonodos acometidos pela LLC, os linfócitos
leucêmicos associam-se uns aos outros, sugerindo que interações homotípicas
sejam importantes na sobrevida deles. Um estudo in vitro analisando diferentes
situações de cultura do linfócito leucêmico descreve que as condições de cultura que
permitem melhor aproximação de uma célula com a outra são capazes de manter a
viabilidade por mais tempo (PETTITT et al., 2001). Recentemente, tanto uma
quimiocina quanto o seu receptor foram descritos na superfície do linfócito
leucêmico, sugerindo ação autócrina e parácrina. Esta proteína pertence à família do
TNF (tumoral necrosis factor) e recebe o nome de BAFF (B-cell Ativating Factor of
TNF-Family) por ser essencial para o desenvolvimento das células B e, in vitro, é
responsável pela sobrevida e proliferação de células B (KERN et al., 2004).
C) Linfócitos T e Células Dendríticas Foliculares - A medula óssea e
linfonodos dos pacientes com LLC apresentam um infiltrado linfocitário monomórfico
que distorce a arquitetura normal do tecido (VEGA et al., 2002), mas ocorre também
21
formação de pequenos agregados, chamados pseudofolículos ou centros de
proliferação, composto por células de maior tamanho, com cromatina frouxa e
nucléolo evidente, delimitados por neovascularização. Nestes pseudofolículos, os
linfócitos leucêmicos em proliferação, identificados pela expressão de Ki67, estão
organizados em clusters ao redor de linfócitos T e de células dendríticas foliculares.
Eles diferem dos linfócitos leucêmicos do sangue periférico por apresentarem
positividade mais forte ao CD20 e CD23 e diferem também dos linfócitos B normais
em proliferação no centro germinativo por serem CD10-, BCL-6- e BCL-2+
(CALIGARIS-CAPPIO, 2003).
Um possível mecanismo de trânsito do linfócito leucêmico entre o sangue
periférico, medula óssea e órgão linfóides é via o CCR7 (receptor de quimiocina que
regula a migração de células B, T e dendríticas para os linfonodos) que está
hiperexpresso e resulta em capacidade aumentada dos linfócitos leucêmicos
migrarem em resposta ao CCL21, ligante do CCR7 que é expresso pelas células das
vênulas endoteliais altas (high endotelial venules) dos linfonodos (LÓPEZ-GIRAL et
al., 2004; TILL et al., 2002). Outro estudo demonstrou que linfócitos T CD4+
estimulam os linfócitos leucêmicos via CD40L a liberar as quimiocinas CCL17 e
CCL22 cujo receptor é o CCR4 presente nos linfócitos T CD4+/CD40L+. Estes
dados sugerem que os linfócitos leucêmicos atraem linfócitos T que, por sua vez,
estimulam a proliferação leucêmica, o que induz o recrutamento de mais linfócitos T
promovendo um ciclo de proliferação (GHIA et al., 2002).
Ademais, várias das quimiocinas que podem inibir a apoptose do linfócito
leucêmico são produzidas pelas células T. Granziero et al. (2001) mostraram que a
interação CD40/CD40L está relacionada com a modulação e expressão de survivina
pelos linfócitos leucêmicos in vitro. A survivina é uma proteína da família de
inibidores da apoptose (IAP, inhibitor of apoptosis proteins) que controla a apoptose
e participa da progressão do ciclo celular. Ela é expressa pelos linfócitos dos centros
de proliferação, mas raramente está presente nos linfócitos leucêmicos do sangue
periférico. Nestes casos observou-se doença mais agressiva e, portanto, a
expressão das IAPS pode ter significado prognóstico.
D) Células estromais - Células estromais de diferentes microambientes
também interagem com os linfócitos leucêmicos. Estas interações são responsáveis
por alguns padrões de infiltração tecidual in vivo que refletem a apresentação clínica
22
(HAN et al., 1984; PANGALIS et al., 1984). Alguns casos estão associados a vasto
acometimento ganglionar enquanto o sangue periférico é pouco envolvido.
A migração dos linfócitos leucêmicos depende de mecanismos que controlam
o tráfego entre microambientes distintos e as quimiocinas e seus receptores
participam destes mecanismos. O local preferencial de colonização dos linfócitos
leucêmicos é a medula óssea, de forma que a infiltração medular é obrigatória para
o seu diagnóstico e o grau de infiltração correlaciona-se com o estágio clínico e o
prognóstico (HAN et al., 1984; PANGALIS et al., 1984). Panayiotidis et al. (1996) e
Lagneaux et al. (1998) estudaram a interação entre células estromais e os linfócitos
leucêmicos e mostraram que esta interação é capaz de inibir a apoptose dos
linfócitos leucêmicos in vitro e que isto independe da presença de fatores de
crescimento exógenos, mas requer a adesão dos linfócitos leucêmicos ao estroma.
O estroma medular dos pacientes com LLC produz mais SDF-1 que o
estroma de indivíduos normais (LAGNEAUX et al., 2000). Além disso,
ocorre uma
resposta funcional aumentada ao SDF-1, devido ao aumento da expressão do
CXCR4 (receptor desta quimiocina) nos linfócitos leucêmicos (MOHLE et al, 1999).
Burger et al. (1999) mostraram que a interação SDF-1/CXCR4 media a migração in
vitro dos linfócitos leucêmicos por entre as células estromais que secretam esta
quimiocina.
A migração dos linfócitos leucêmicos para um microambiente propício
depende da interação quimiocina/receptor celular e de moléculas de adesão. Além
do CXCR4, os linfócitos leucêmicos expressam também o CXCR3 (JONES et al.,
2000; TRENTIN et al., 1999), receptor de citocinas inflamatórias normalmente não
expresso em linfócitos B, e o CXCR5, receptor do BCA-1, B-cell attracting
chemokine, que tem importante papel na homeostasia de tecidos linfóides
secundários (BURKLE et al., 2007; CHUNSONG et al., 2006; JONES et al., 2000).
As moléculas de adesão presentes nos linfócitos leucêmicos são: β1 (CD29) e β2
(CD18) integrina (que fazem a interação com o estroma), quantidades variáveis de
α3 integrina (CD49c), α4 integrina (CD49d, que compõe o VLA-4) e α5 integrina
(CD49e), antígeno-1 associado à função leucocitária (LFA-1, integrina αlβ2 ou
CD11a/CD18), molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1 ou CD54), ICAM-2
(CD102), ICAM-3 (CD50), L-selectina (CD62L) e CD44 (CALIGARIS-CAPPIO &
HAMBLIN, 1999).
23
Portanto, as células não neoplásicas desempenham um papel fundamental no
desenvolvimento da doença, de tal forma que a sobrevivência dos linfócitos
leucêmicos depende do contato direto célula-célula. Um microambiente favorável
expõe os linfócitos leucêmicos a sinais adicionais de sobrevida e esta comunicação
tumor-microambiente vem sendo um dos focos de estudo mais ativos na
compreensão da patogênese desta doença. Assim, temos evidências suficientes
para pensar que a LLC é uma doença que depende de um balanço entre
proliferação e apoptose e este balanço é diretamente influenciado pelo
microambiente onde se encontra a célula. Os estímulos oriundos dos
microambientes determinam o comportamento biológico: morte ou proliferação
celular.
1.9.2) O Estroma da medula óssea
A hematopoese ocorre na medula óssea nos espaços extravasculares, entre
os seios venosos, onde as células hematopoéticas se encontram em íntima
associação com o estroma formando o microambiente medular (WEISS, 1976). O
microambiente medular é indispensável para a definição do destino celular ao longo
da diferenciação hematopoética, pois provê a maioria dos fatores requeridos para o
ordenado desenvolvimento das células progenitoras (DORSHKIND, 1990;
VERFAILLIE, 2000). Ele é composto pelas próprias células hematopoéticas e o
estroma. O estroma por sua vez é constituído de células estromais (fibroblastos,
adipócitos, miofibroblastos, células endoteliais, células dendríticas e macrófagos) e a
matriz extracelular (MEC) por elas produzida (VERFAILLIE, 2000). A matriz
extracelular possui proteínas, fatores de crescimentos e quimiocinas livres ou
associadas às proteínas da matriz que se organizam espacialmente de maneira
heterogênea (NILSSON et al., 1998). As diversas linhagens hematopoéticas também
se distribuem em distintos espaços denominados “nichos progenitores” (JACOBSEN
& OSMOND, 1990; NILSSON et al., 2001; QUESENBERRY et al., 1994). Esta
localização diferenciada das linhagens hematopoéticas ocorre porque o contato das
células progenitoras com o microambiente de sustentação induz divisões
assimétricas destes progenitores formando um microambiente compartimentalizado
(PUNZEL et al., 2003).
24
A interação das células hematopoéticas com o estroma medular é mediada
pela ação de quimiocinas e fatores estimuladores de colônias e pelo contato célula-
célula e célula-matriz. Moléculas de adesão e quimiocinas são fundamentais para o
reconhecimento do microambiente adequado, ativação celular, migração para o seu
interior e interação com os componentes celulares, humorais e de matriz extracelular
que caracterizam este microambiente (KUMAR, 1998). Por exemplo, o SDF-1,
produzido pelo estroma, se dispersa no meio extracelular formando um gradiente de
concentração, as células que o captam são ativadas, sofrem alterações do
citoesqueleto e migram para o estroma aonde farão adesão e interiorização,
seguindo este gradiente (BLEUL et al., 1996). O contato célula-célula ocorre através
da expressão de ligantes da família das integrinas (como o VLA-4), da superfamília
das imunoglobulinas (como o VCAM-1), da família das selectinas, de receptores de
heparam sulfato ou de receptores de fatores de crescimento (SCF, stem cell factor)
na superfície celular (PELED et al., 2000).
No caso da linfopoese, os linfócitos B distribuem-se ao longo da medula num
gradiente de diferenciação no qual as células mais imaturas se encontram próximas
à região subendosteal migrando para as regiões centrais à medida que maturam
(JACOBSEN & OSMOND, 1990). O SDF-1 participa diretamente da linfopoese B, de
forma que em cobaias com deficiência deste fator ou de seu receptor ocorre grave
defeito na geração de linfócitos B, mas não de linfócitos T (NAGASAWA et al.,
1996). O SDF-1 regula a linfopoese B por atuar como fator de crescimento para as
células B (NAGASAWA et al., 1994) e por manter os precursores B em íntimo
contato com as células estromais dentro de um microambiente propício, prevenindo
sua liberação prematura na circulação (MA et al., 1999). Na maturação linfóide, o
estroma também tem papel fundamental para a seleção positiva dos linfócitos B que
produziram rearranjo VDJ adequado. Estes linfócitos escapam da apoptose por
interagir com o estroma e expressar proteínas inibidoras da apoptose, tal como o
BCL-2 (MELCHERS et al., 1995; OSMOND et al., 1994).
Mimetizando o que ocorre in vivo, o estroma medular sustenta o crescimento
de precursores hematopoéticos e linfóides normais em cultura (KIERNEY &
DORSHKIND, 1987). Whitlock e Witte (1982) desenvolveram um sistema de cultura
de longa duração de células B, denominada de cultura de Whitlock e Witte em
função de seus descobridores, onde a linfopoese é sustentada pelas células
estromais que formam uma monocamada no frasco de cultura. Neste sistema de
25
cultura, as células B migram espontaneamente por entre as células do estroma
medular (pseudo-emperipolese) e podem localizar-se por entre projeções das
membranas destas. Esta migração é mediada principalmente pelo VLA-4, e o
bloqueio deste inibe a migração e a proliferação dos precursores de células B
(WITTE et al., 1987).
Desta forma, o microambiente medular possui características muito
particulares que permitem a manutenção de subpopulações de precursores
hematopoéticos em quiescência e em proliferação e diferenciação. Com base nisto,
é possível imaginar que estas interações sejam importantes nas doenças onco-
hematológicas e contribuam para a manutenção de clones transformados,
principalmente em neoplasias de linhagem linfóide, uma vez que todos os processos
fisiológicos que envolvem as células B normais ocorrem em sítios anatômicos
apropriados e dependem de complexas interações com populações de células
acessórias localizadas em microambientes específicos. Vega et al. (2002)
mostraram que as síndromes linfoproliferativas B crônicas têm diferentes relações
com o estroma medular: modulam diferentemente a expressão de marcadores de
superfície das células estromais, estão associados com variável proliferação
vascular, variável densidade de células estromais e diferenças topográficas na
relação entre linfócito maligno e o estroma e algumas mantêm contato com a
arquitetura estromal preexistente enquanto outros a distorcem, de forma que cada
síndrome linfoproliferativa B crônica pode ser reconhecida pela combinação do
padrão de crescimento e composição celular na análise histopatológica da medula
óssea (HENRIQUE et al., 1999).
1.9.3) Organização tridimensional do microambiente in vitro
Os experimentos de cultura são importantes para entender as bases do
comportamento celular. A técnica de cultivo tradicional, em placas, contribuiu
grandemente para ampliar os conhecimentos de biologia celular e permitiu o
desenvolvimento de várias áreas como bacteriologia, microbiologia e a própria
biologia celular e molecular. No entanto, os modelos de cultivo bidimensional estão
longe de mimetizar o que ocorre in vivo, onde a interação celular com seu
microambiente é complexa, dinâmica, composta por sinalização provenientes do
tecido ao redor em todas as direções da superfície da membrana celular e envolvem
26
modulação de moléculas de adesão, citocinas, enzimas proteolíticas e reguladores
da organização do citoesqueleto. Tanto sinais inibitórios quanto estimulatórios são
recebidos pelas células constantemente e o resultado destes estímulos é a
migração, diferenciação, proliferação ou apoptose (LAMBERT et al., 2001; ROSSI et
al., 2005).
As células estão conectadas às células vizinhas e à matriz extracelular em
uma intrincada rede tridimensional que não é reproduzida nos sistemas
convencionais de análise in vitro (ROSSI et al., 2005). A interação entre células e
matriz é feita por receptores na membrana que ancoram o citoesqueleto dessas
células à matriz extracelular e desencadeiam mudanças conformacionais com
ativação de vias de sinalização e modulação do comportamento da célula em
questão (BOUDREAU & JONES, 1999; SCHWARTZ et al., 1995).
Estas mudanças no formato celular estão restabelecidas nos modelos 3D de
cultura, enquanto nas culturas 2D as células sofrem uma falsa polarização entre a
porção aderida ao plástico e a porção superior em contato com o meio de cultura
(KUNZ-SHUGHART et al., 1999). A Figura 1 ilustra esta polarização que gera um
formato celular espraiado e completamente diferente do encontrado in vivo, ao
contrário do que ocorre nas culturas em 3D, que permitem um formato assimétrico,
próximo do real.
Figura 1. Ilustração comparativa da morfologia celular nos sistemas de cultura
bidimensional e tridimensional.
A cultura bidimensional apresenta uma polarização
X
2D 3D
27
artificial enquanto a cultura tridimensional apresenta formato assimétrico sem polarização
induzida (Fonte: BARROS, A.P.D.N., 2007).
Diversos experimentos têm mostrado resultados distintos entre os estudos em
2D e 3D (FRANKEL et al., 1997; KLUNDER & HÜLSER, 1993; WEAVER et al.,
1997; WOLF et al., 2003), com isso acredita-se que houve grande atraso no
desenvolvimento do conhecimento enquanto os esforços atuais são baseados nas
descobertas dos modelos 2D. Como exemplo, baseados nos conceitos
estabelecidos sobre metástase e migração celular que classicamente depende da
secreção de enzimas que digerem moléculas da matriz (metaloproteinases - MMPs),
muito testes clínicos com administração de inibidores destas enzimas falharam em
encontrar resultado favorável (OVERALL & LÓPEZ-OTÍN, 2002). Em experimento
3D foi observado que na presença destes inibidores as células continuavam
migrando através de movimento amebóide, por entre as fibras de colágeno (WOLF
et al., 2003).
Atualmente, pesquisadores tentam aperfeiçoar sistemas de cultura
tridimensional. Em 2003 o Instituto Nacional do Câncer dos EUA (NCI, National
Cancer Institute) lançou um programa em microambiente celular focado em estudos
3D que já possibilitou o desenvolvimento de tecnologia que permite uma
organização tridimensional das células que favoreça sua diferenciação e formação
de um microtecido com as características morfo-funcionais do tecido original, tais
como cartilagem (HUANG et al., 2004), osso (MAUNEY et al., 2004), tendão (FENG
et al., 2006), enxertos vasculares (ABILEZ et al., 2006), entre outros.
Existem várias técnicas utilizadas atualmente para cultivo em 3D: Gel de
colágeno, gel de matriz extracelular tecidual, matrigel, nanofibras protéicas e
esferóide (MCTS, multicellular tumor spheroids). Esta última técnica possibilita um
modelo de crescimento tumoral in vitro para testes com drogas antitumorais
(observando a penetração, ligação com o alvo e sua ação), radioterapia e novas
combinações de drogas e terapias (KUNZ-SHUGHART, 1999). Alguns experimentos
já mostraram resistência de alguns tumores a terapias utilizando a “conformação
multicelular”. Outros estudos revelaram que a resistência de um tumor murino a suas
drogas pôde ser completamente revertida quando as células foram isoladas e
cultivadas em monocamada e restabelecidas se mantidas em cultura como a de
esferóide.
28
A técnica do esferóide é baseada no princípio de adesão inter-celular. Assim,
através da formação de uma película inerte (não aderente) na superfície de cultivo, a
adesão ao plástico fica impossibilitada e as células aderentes passam a aderir entre
si, formando uma estrutura multicelular arredondada, os esferóides (KUNZ-
SHUGHART, 1999; MUELLER-KLIESER, 1997). Esta estrutura tridimensional
reproduz com maior fidelidade as características encontradas in vivo, pois contém
uma extensiva matriz extracelular que é diferente tanto na quantidade quanto na
disposição dos seus componentes em comparação com a matriz produzida pelas
células em monocamada (KUNZ-SHUGHART, 1999).
Uma grande vantagem deste tipo de cultura é a possibilidade de criar um
ambiente tridimensional com diferentes tipos celulares (co-cultura) e, portanto,
estudar os mecanismos de crescimento, proliferação e diferenciação celulares em
um modelo reprodutível com um ambiente interno ditado pelo metabolismo e pelas
respostas adaptativas das próprias células. Nosso laboratório demonstrou que,
utilizando células do estroma de medula óssea humano, agregados de células se
formam em uma rede de fibronectina e reproduzem um microambiente
tridimensional quiescente. Na ausência de um meio indutor, as células mantiveram a
expressão de α-actina sem formar as fibras de stress observadas em culturas
bidimensionais (BARROS, 2007).
Em resumo, as incertezas na origem celular da LLC ainda são motivos de
muitos estudos. Os fenômenos que explicam sua gênese ainda não são conhecidos,
mas provavelmente são relacionados a lesões genéticas que devem ser comuns aos
dois subgrupos de LLC. O momento da transformação maligna também é incerto,
mas acredita-se que as lesões genéticas e alterações cromossômicas
leucemogênicas provavelmente ocorram em um estágio precoce na maturação dos
linfócitos. Esta especulação se justifica no fato de que alterações na programação
genética de uma célula imatura (pré-B) pode permitir a ativação de determinados
fatores transcripcionais específicos dos linfócitos T, o quê explicaria a expressão de
proteínas de superfície e moléculas de sinalização comumente observada nestes
linfócitos.
A heterogeneidade clínica entre os dois subgrupos da doença deve ser
secundária a capacidade do clone maligno em responder aos sinais promotores
oriundos do microambiente, que sustentam a célula transformada ou em
29
transformação. Pesquisadores têm procurado esclarecer os mecanismos de
interação entre o estroma e a célula tumoral que regulam a sobrevivência das
células neoplásicas na medula. As fortes evidências da influência das condições de
cultura no comportamento celular sugerem que sistemas de cultura tridimensional
podem prover melhor modelo para o que ocorre in vivo e deverá ajudar a elucidar os
mecanismos de interação no microambiente, explicar a fisiopatogenia da doença e
resultar em novos indicadores prognósticos e modalidades terapêuticas.
O propósito deste estudo é avaliar a reprodutibilidade do comportamento dos
linfócitos leucêmicos in vitro, na presença de células do estroma de medula óssea
no modelo bidimensional descrito por Burger et al. (1999) e avaliá-lo no sistema
tridimensional de cultura.
30
2) OBJETIVOS
2.1) Geral
Avaliar a interação, ao longo do tempo, de linfócitos de Leucemia Linfocítica
Crônica-B, com células de estroma de medula óssea normal em sistemas de cultura
bi- e tri-dimensionais, correlacionando-a com variáveis clínicas.
2.2) Específicos
Estabelecer o método de co-cultura entre linfócitos da LLC e o estroma
humano em estrutura tridimensional (esferóide).
Comparar a interação das células leucêmicas com o estroma de medula
óssea nos modelos bi e tridimensionais de cultura.
Avaliar se existe diferença na capacidade de interação com o estroma em
relação às variáveis clínicas, biológicas e individuais.
31
3) MATERIAL E MÉTODO
3.1) Pacientes
Participaram do estudo pacientes do HUCFF com leucemia linfocítica crônica,
diagnosticada segundo critérios clínicos, morfológicos e fenotípicos da classificação
proposta pela da Organização Mundial da Saúde. Foram excluídos os casos em
tratamento ou em recaída pós-tratamento para evitar que alterações na biologia
celular secundárias aos medicamentos fossem analisadas.
Para análise da influência de variáveis sobre a capacidade de migração para
o estroma algumas informações foram coletadas dos prontuários médicos: sexo,
idade no diagnóstico, idade na admissão no estudo, estagiamento clínico ao
diagnóstico, estagiamento clínico na admissão no estudo, tempo de follow-up (tempo
de acompanhamento entre o diagnóstico e a admissão no estudo), presença de
progressão (mudança no estágio clínico do diagnóstico até a admissão no estudo),
contagem de leucócitos na admissão no estudo e expressão do CD38. Infelizmente
nossa instituição não possuía anticorpos para determinação da expressão do ZAP-
70 por ocasião do início do estudo.
3.2) Amostras
Alíquotas do sangue periférico de aproximadamente 10ml foram colhidas em
condições assépticas, com anticoagulante (20 U/ml de heparina de baixo peso
molecular, Liquemine, Roche). Em alguns casos as mostras foram provenientes do
laboratório de diagnóstico por imunofenotipagem em condições de coleta
desconhecidas. As amostras foram manipuladas em um prazo máximo de 12h,
quando mantidas em temperatura ambiente, ou em até 24h, quando mantidas
resfriadas entre 4º e 8ºC.
3.3) Separação e preparação das células mononucleadas
32
A fração de células mononucleares das amostras foi obtida por centrifugação
em gradiente de Ficoll-Paque PlusTM (Pharmacia Amersham). Após a
centrifugação, as células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato
(PBS, phosphate buffered saline) e contadas em câmara de Neubauer. A viabilidade
celular foi determinada pelo método de exclusão com corante azul de Trypan. Estas
células foram congeladas em solução crioprotetora contendo 40% de meio RPMI
(Sigma Chemical Co.), 50% de soro fetal bovino (FCS, fetal calf serum) e 10% de
dimetilsulfóxido para serem utilizadas no momento oportuno.
3.4) Citometria de fluxo
A expressão de moléculas de superfície foi determinada por citometria de
fluxo. Resumidamente, as células foram incubadas por 30 minutos a 4ºC com os
diferentes anticorpos (CD45, clone HI30, CD5, clone UCHT2, ambos da Becton
Dickinson PharMacia, CD19, clone SJ25-C1 e CD38, clone HIT2, ambos da Caltag
Lab.), diretamente conjugados com FITC, R-PE ou biotinilados, nas concentrações
previamente estabelecidas. Após esse período, as células foram lavadas com PBS
contendo 3% de FCS e 0,01% de azida sódica e incubadas por 15 minutos a 4ºC
com estreptoavidina conjugada a PE-Cy7 (Caltag Lab.) para revelar os anticorpos
biotinilados. A lise das hemácias foi feita utilizando a solução de lise da BD (Becton
Dickinson) conforme as especificações do fabricante. A aquisição foi feita em
citômetro FacsCalibur (Becton Dickinson) com software Cell Quest 3.1.
3.5) Cultura de estroma de medula óssea
Para os experimentos de co-cultura, culturas de estroma de medula óssea
humana foram estabelecidas a partir de amostras de doadores voluntários da
Unidade de Transplante de Medula Óssea do Serviço de Hematologia do HUCFF.
As amostras foram submetidas à hemossedimentação com Hespan (hidroxietil de
amido, McGaiy, Irvine, CA, USA) e distribuídas em garrafas de 25 cm2 na
concentração de 1 a 2 x 10
6
/ mL em meio Iscove’s (Gibco Life Tecnologies)
suplementado com 10% de FCS, 100 U/mL de penicilina sódica e 100 µg/mL de
estreptomicina. As culturas foram mantidas a 37ºc com 5% de CO2 em atmosfera
33
úmida e o meio foi trocado periodicamente. Após duas a três semanas, as células
não aderentes, no sobrenadante, foram retiradas e a monocamada de células
aderentes foi lavada com PBS e mantida em estufa até atingir 70% de confluência.
As células aderentes foram então submetidas à digestão enzimática com tripsina
(0,125% de tripsina e 0,78 mM de EDTA) para posterior expansão.
3.6) Co-cultura de estroma de medula óssea e células leucêmicas
3.6.1) Análise da sobrevida das células leucêmicas
Após serem descongeladas, aproximadamente 2 x 10
6
células mononucleares
do sangue periférico foram distribuídas sobre monocamada de células de estroma
de medula óssea humana ou sobre linhagem de estroma de medula óssea murina
que sabidamente é capaz de sustentar a linfopoese B humana (ROSSI et al., 2003)
em garrafas de 25 cm
2
, em meio Iscove’s e α-Mem (Gibco), respectivamente, ambos
suplementados com 10% de FCS. Para avaliação comparativa, o mesmo número de
células mononucleares foi colocado em cultura apenas em meio Iscove’s ou α-Mem
suplementados com 10% de FCS. As culturas foram mantidas a 37ºC com 5% de
CO
2
em atmosfera úmida com trocas semanais do meio de cultura. Periodicamente,
amostras das células no sobrenadante foram retiradas, quantificadas e a viabilidade
foi determinada por azul de Trypan.
3.6.2) Co-cultura de células leucêmicas em monocamada ou esferóide de
células de estroma de medula óssea.
As células de estroma foram distribuídas, 24-48h antes do experimento, em
placas de quatro poços, na concentração de 3 a 5 x 10
5
células por cada poço e
mantidas na estufa. Para estabelecer culturas tridimensionais do tipo esferóide, as
células estromais foram cultivadas em placas de 96 poços com fundo em U
previamente revestido com agarose a 1%. Foram distribuídas 2,5 x 10
4
células de
estroma / poço e as placas foram mantidas na estufa por 3 a 4 dias para formação
dos agregados celulares esferóides.
34
As células mononucleares foram descongeladas no dia do experimento e
marcadas com 5-(e 6-)-carboxifluoresceína diacetato succinil éster (CFSE, Molecular
Probes). Após três lavagens com PBS para remoção das proteínas do meio
sobrenadante, as células foram ressuspensas em PBS com 0,1% BSA (Bovine
Serum Albumin) com 2 µM de CFSE em uma concentração que variou de 2 a 5 x 10
6
células / mL e mantidas sob agitação constante por 10 minutos a 37ºC, protegidas
da luz. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS suplementado com
10% de FCS para remoção do CFSE excedente.
3.6.3) Cinética de migração das células leucêmicas ao longo do tempo em
culturas bi ou tridimensionais de estroma de medula óssea.
Cerca 2,5 a 5,0 x 10
6
células mononucleares previamente marcadas com
CFSE foram aplicadas sobre monocamadas de estroma enquanto cerca de 10
6
células mononucleares foram distribuídas sobre esferóides de estroma de medula
óssea. As co-culturas foram mantidas em estufa e, após dez minutos, meia hora,
uma hora, duas horas, seis horas e doze horas, as células leucêmicas no meio
sobrenadante e aderidas ao estroma foram retiradas e quantificadas por citometria
de fluxo. Resumidamente, o sobrenadante foi retirado e a monocamada ou os
esferóides foram lavados com PBS e submetidos à digestão enzimática com
tripsina-EDTA. Para quantificação por citometria as células foram rigorosamente
ressuspensas em volume fixo e a aquisição foi feita utilizando uma velocidade
constante por um tempo determinado. O percentual de migração foi calculado
considerando o número de eventos CFSE+ na região de linfócitos na fração de
estroma em relação ao total aplicado na cultura. Para cada intervalo de tempo,
foram realizadas duplicatas ou triplicatas. As médias dos valores de cada intervalo
de tempo foram calculadas.
3.6.4) Migração das células leucêmicas em diferentes concentrações para o
estroma de medula óssea em monocamada e em esferóide
Células mononucleares previamente marcados com CFSE foram aplicadas
sobre culturas de estroma em monocamada e em esferóide em diferentes
concentrações, que variaram de 1 a 100 x10
5
nas co-culturas com monocamada e
35
de 0,5 a 20 x10
5
nas co-culturas com esferóide. No momento do pico de migração
previamente estabelecido para cada amostra, as células leucêmicas foram
quantificadas por citometria como descrito anteriormente. O percentual de células
mononucleares do sangue periférico aderidas ao estroma foi calculado em relação
ao total de células contadas (sobrenadante mais aderidas). Para cada concentração
celular o experimento foi realizado em duplicata ou triplicata. As médias dos valores
de cada concentração foram comparadas.
3.7) Análise Estatística
Os resultados das migrações são expressos como percentual de células
encontradas no estroma em relação ao total de linfócitos leucêmicos contados na
cultura. A média dos valores máximos de migração para cada amostra foi calculada.
Foi utilizada a mediana das idades e do número de leucócitos para divisão dos
casos em duas categorias, maiores ou menores que a mediana.
Para a avaliação da relação entre as diversas variáveis e a capacidade de
migração utilizou-se o teste Chi-square. Foram considerados como estatisticamente
significativos o valores de p inferiores a 0,05 pelo método exato de Fisher.
Para análise estatística foi utilizado o software SPSS 13.0 versão para
windows (setembro, 2004).
36
4) RESULTADOS
4.1) Característica dos Pacientes
Participaram do estudo 18 pacientes com diagnóstico de LLC. Onze pacientes
são do sexo masculino e sete do sexo feminino o que resulta em uma proporção M:F
de 1,6:1. A mediana das idades ao diagnóstico e no início do estudo foi de 70 anos
(43 a 83 anos e 45 a 83 anos, respectivamente). Esta distribuição de sexo e idade é
semelhante à descrita nos levantamentos epidemiológicos (SEER, 2007).
As amostras de sangue para separação das células mononucleares foram
colhidas por ocasião do diagnóstico em 12 casos enquanto 6 amostras foram
obtidas de pacientes virgens de tratamento em consultas de follow-up do HUCFF e
de consultórios particulares. O tempo médio de evolução destes 6 casos foi 42
meses (24 a 108 meses) e 4 casos já apresentavam progressão da doença
(evolução do estágio clínico) neste intervalo. Baseado nas informações dos
prontuários, 8 pacientes foram estagiados como Binet A, 7 casos como Binet B e 3
casos como Binet C ao iniciarem o estudo.
Todos os casos tiveram os diagnósticos confirmados de acordo com o
imunofenótipo (Figura 2) e apresentavam dois ou mais pontos no sistema de score
para o diagnóstico da LLC. A tabela 4 apresenta com detalhes as informações de
cada caso.
37
Tabela 4. Características dos casos do estudo.
a
idade na admissão no estudo
b
estágio clínico de Binet na admissão no estudo, entre parênteses o estágio clínico no
diagnóstico.
c
em células por microlitro de sangue periférico, na admissão no estudo.
d
tempo em meses.
* casos cuja a admissão no estudo foi no mesmo momento do diagnóstico, sem tempo de
folow-up.
Casos Sexo Idade
a
Estágio
Clínico
b
Leucócitos
c
Tempo de
follow-up
d
Fenótipo das
Células B CD5
+
CD38
1 M 78 B (A) 24900 24
CD19
+
CD22
-
CD23
+
42%
2 F 80 A 28500 *
CD19
+
CD22
-
CD23
+
CD79b
+
9%
3 M 66 A 26600 *
CD19
+
CD23
+
CD79b
-
19%
4 F 80 C 32400 *
CD19
+
CD23
+
CD79b-
9%
5 F 56 A 15000 *
CD19+ CD23+
CD79b
-
29%
6 M 83 A 23900 *
CD19
+
CD22
-
CD23
+
CD79b
+
21%
7 F 81 B (B) 16700 24
CD20
+
CD22
+
CD23
+
CD79b
-
48%
8 M 68 A 26000 * CD19
+
CD23
+
27%
9 M 74 B (A) 47200 24
CD19
+
CD23
+
CD79b
-
38%
10 F 72 C (B) 19800 108 CD19
+
CD23
+
-
11 M 63 A 29200 *
CD19
+
CD23
+
CD79b
-
11%
12 M 47 C (A) 40000 48
CD19
+
CD22
+
CD23
+
CD79b
-
-
13 F 81 A 36200 * CD19
+
CD23
+
-
14 F 58 A 22700 * CD19
+
CD23
+
14%
15 M 55 B 10300 *
CD20
+
CD23
+
CD79b
-
-
16 M 71 B 140000 *
CD20
+
CD22
+
CD23
+
CD79b
-
-
17 M 50 B 52600 *
CD22
+
CD23
+
CD79b
-
62%
18 M 45 B (B) 64400 24
CD20
+
CD22
+
CD23
+
CD79b
-
36%
38
Figura 2. Caracterização fenotípica das células leucêmicas no sangue
periférico.
O perfil da amostra 1 mostra monoclonalidade lambda (D, parte inferior) e 42%
dos linfócitos CD19+ e CD5 + são CD38+(C).
4.2) Avaliação da sobrevida dos linfócitos leucêmicos in vitro
Para verificar a função protetora do estroma de medula óssea, uma das
amostras foi cultivada em quatro situações diferentes: com estroma de medula
óssea humana em meio Iscove’s, com estroma de medula óssea murina em meio α-
Mem e apenas com meio de cultura Iscove’s e α-Mem. Verificou-se,
independentemente da situação de cultura, que somente entre 40 e 75% das células
era viável nas primeiras 24h (Figura 3). Nos dias subseqüentes, o estroma de
medula ósseo humano foi capaz de manter a viabilidade celular por até 5 dias. No
39
último dia de cultura, 63% das células leucêmicas estavam vivas no estroma
humano, 40% no estroma murino, 27% em meio Iscove’s e 19% em meio α-MEM.
Figura 3. Gráfico da viabilidade das células leucêmicas em cultura ao longo do
tempo.
As células mononucleadas do sangue periférico de paciente com LLC-B foram
distribuídas em garrafas de cultura na presença ou não de estroma de medula óssea
humana ou de linhagem de estroma de medula óssea murina. A intervalos de tempo
alíquotas das células no sobrenadante foram retiradas, quantificadas e a viabilidade celular
foi determinada pelo método de exclusão com Azul de Tripan.
Verificou-se, ainda, que, como descrito anteriormente (BURGER et al., 1999),
as células leucêmicas migraram por entre as células de estroma de medula óssea
(Figura 4), formando ninhos semelhantes à cobble stones.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (dias)
Viabilidade (%)
a-men
Iscove's
Estroma murino
Estroma humano
40
Figura 4. Fotomicrografia da co-cultura de células leucêmicas com células de
estroma de medula óssea humana.
(A) As células leucêmicas (pequenas,
arrendondadas e refringentes) encontram-se dispersas sobre a monocamada de células do
estroma. Microscopia de contraste de fase. Aumento original 100X. (B) Detalhe da co-cultura
mostrando interação íntima e migração das células leucêmicas que formam ninhos (setas)
por entre as células de estroma da medula óssea. Microscopia de contraste de fase.
Aumento original 320X.
4.3) Cinética de migração de células leucêmicas ao longo do tempo em cultura
bidimensional de células de estroma de medula óssea
Uma vez que se verificou que o estroma de medula óssea humana era capaz
de manter as células leucêmicas e que estas migravam ativamente por entre as
células estromais, a cinética de migração das LLC foi avaliada em relação ao tempo
de co-cultura e à concentração celular nos modelos bi e tridimensional,
monocamada e esferóide respectivamente.
Foram avaliados quatorze casos nos experimentos de migração em
monocamada em diferentes intervalos de tempo. Para tanto as células leucêmicas
previamente marcadas com CFSE foram distribuídas sobre a cultura em
monocamada de células de estroma e, a intervalos de tempo, foram retiradas do
sobrenadante enquanto a monocamada foi lavada e tripsinizada para análise por
citometria de fluxo. Os eventos CFSE+ foram facilmente identificados e
apresentavam distribuição, quanto ao tamanho (FSC) e complexidade (SSC) de
pequenos linfócitos (Figura 5).
41
Figura 5. Citometria de fluxo das células leucêmicas marcadas com CFSE e de
células de estroma de medula óssea em co-cultura.
As células leucêmicas foram
previamente marcadas com CFSE e co-cultivadas com monocamada de estroma de medula
óssea humana normal. O percentual de migração foi determinado calculando-se o número
de eventos CFSE+ na monocamada em relação ao total de eventos CFSE+ num
determinado tempo de aquisição. Distribuição por tamanho e complexidade das células de
estroma (A), das células leucêmicas (B) e da co-cultura (C). Células leucêmicas, CFSE+, (E,
em azul) são distinguíveis das células de estroma nas co-culturas (F) e estão ausentes no
controle da monocamada de estroma (D).
Surpreendentemente, observou-se que as células leucêmicas provenientes
de diferentes amostras apresentaram uma cinética de migração própria (Tabela 5 e
Figura 6). Em 4 casos somente cerca de 1% das células leucêmicas se encontravam
associadas à monocamada a cada intervalo de tempo. As demais amostras
apresentaram um percentual de migração máximo variável (5 a 50%), com pico
variando entre 30 e 60 minutos de co-cultura (Figura 6A e 6B). A média dos valores
máximos de migração foi 11,6% (1,1% a 49,1%).
A análise da figura 6 indica que as amostras capazes de migrar
apresentaram, basicamente, três padrões de migração: estabelecimento de um pico
de migração após 30 (Figura 6A) ou 60 minutos (Figura 6B) de co-cultura e uma
42
progressiva, embora pequena, migração ao longo do tempo sem que se observasse
um pico até 120 minutos (Figura 6C).
Tabela 5. Cinética de migração das amostras de LLC em monocamada de
estroma de medula óssea humana conforme diferentes intervalos de tempo.
ª não estudado
Percentual de migração em cada intervalo de tempo
Amostras
10’ 30’ 60’ 120’ 300’
1 0,4% 1,0% 1,4% 1,9% ª
2 5,0% 10,6% 4,6% 5,9% 5,1%
3 0,7% 5,2% 1,1% 1,0% 1,5%
6 1,4% 6,8% 7,4% 10,2% ª
7 1,7% 9,9% 1,4% 1,8% 1,2%
8 23,6% 4,6% 49,1% 23,2% 3,5%
9 0,6% 1,1% 0,8% 0,4% 0,7%
10 0,2% 0,7% 1,7% 2,8% ª
12 1,1% 2,9% 2,5% 3,1% ª
13 0,5% 1,1% 2,2% 3,9% ª
14 3,6% 12,1% 11,1% 6,8% 10,9%
16 0,3% 0,5% 0,9% 0,9% 1,4%
17 14,4% 16,6% 34,4% 5,2% 9,8%
18 7,8% 5,3% 16,5% 17,7% 8,2%
43
Figura 6. Gráficos das migrações das células leucêmicas em monocamada de
células de estroma de medula óssea em relação ao tempo.
Observamos três
padrões de migração. Pico de migração em 30 minutos (A), pico de migração em 60 minutos
(B), aumento lentamente progressivo da migração ao longo do tempo (C).
Com o propósito de avaliar se o comportamento in vitro tem correlação com a
apresentação clínica da doença algumas variáveis foram analisadas em relação à
capacidade de migração no estroma. Apesar do pequeno número de casos e de
variáveis disponíveis, segregando os casos com migração acima e abaixo da média
dos valores máximos de migração, não observamos diferenças quanto ao sexo,
estágio da doença, o tempo médio de evolução, a presença de progressão, o
número de leucócitos do sangue periférico na admissão no estudo ou expressão de
CD38, mas a idade esteve diferentemente distribuídos nestes dois grupos (Tabela
6).
Avaliando as idades dos pacientes em relação à taxa de migração,
observamos que nenhum caso com idade acima da mediana teve índice máximo de
migração acima da média dos valores máximos de migração, enquanto 67% dos
casos com idade abaixo da mediana das idades tiveram migração acima da média
44
(Tabela 7). Isto sugere que os pacientes mais jovens apresentam maior potencial de
interação da célula leucêmica com o estroma (Figura 7).
Tabela 6. Distribuição dos casos conforme algumas variáveis e o percentual
migrado em monocamada.
Entre parênteses o número absoluto de casos;
#
apenas entre os casos com tempo de evolução;
* mediana dos números de leucócitos no sangue periférico nas admissões no estudo;
a
quatro amostras não possuíam a informação.
Variáveis
Migração acima
de 11,6%
Migração abaixo
de 11,6%
p
Sexo
M (9)
F (5)
33% (3)
20% (1)
67% (6)
80% (4)
0,54
Idade
>70 (8)
≤70 (6)
- (0)
67% (4)
100% (8)
33% (2)
0,015
Estágio
A + B (12)
C (2)
33% (4)
- (0)
67% (8)
100% (2)
0,49
Tempo de folow-up
Não (8)
Sim (6)
37,5%(3)
16,7%(1)
62,5%(5)
83,3%(5)
0,40
(Tempo médio de follow-up
#
) (24 meses) (45,6 meses)
Progressão
Sim (4)
Não (2)
0% (0)
50% (1)
100% (4)
50% (1)
0,33
Leucócitos*
<27550 (7)
>27550 (7)
- (0)
50% (2)
100% (2)
50% (2)
0,45
CD38
a
≥30% (5)
<30% (5)
40% (2)
40% (2)
60% (3)
60% (3)
0,73
45
Tabela 7. Correlação entre o potencial de migração na monocamada de
estroma de medula óssea e idade média dos pacientes.
ª sem amostra para análise
b
a média dos valores máximos de migração de cada amostra foi 11,6%
Figura 7. Correlação entre a capacidade de migrar em monocamada de células
de estroma de medula óssea e a idade dos pacientes.
Cada ponto representa um
caso. A distribuição do percentual de migração em relação à categorização das idades
conforme a mediana mostra que pacientes mais novos apresentam picos de migração
superior.
Casos
Nº de
casos
Migração
média
Idade
Mediana
Acima de 70 anos com migração acima da
média
b
0 -ª -ª
Acima de 70 anos com migração abaixo da
média
8 5,2% 81
Abaixo ou igual a 70 anos com migração
abaixo da média
2 4,27% 66
Abaixo ou igual a 70 anos com migração
acima da média
4 28,3% 54
46
Analisando a presença de progressão e o tempo médio de follow-up dos
casos, observamos que apenas os casos com migração abaixo da média dos
valores máximos de migração apresentaram progressão do estágio clínico e estes
apresentavam 45,6 meses de evolução contra 24 meses do grupo com migração
acima da média. Estes resultados, apesar de não apresentarem significância
estatística, sugerem que os casos mais avançados ou com maior tempo de evolução
possuem menor capacidade de migrar.
4.4) Cinética de migração de células leucêmicas ao longo do tempo em sistema
tridimensional (esferóide) de cultura de estroma de medula óssea.
Uma vez que a migração em monocamada de células aderidas a uma
superfície plástica não é representativa da migração transmedular que as células
devem efetuar no processo de colonização do microambiante da medula óssea,
culturas tridimensionais do tipo esferóide de células de estroma de medula óssea
humana foram desenvolvidos no laboratório e a capacidade das células leucêmicas
de migrar nestes agregados celulares foi testada.
Foi demonstrado anteriormente, que as células de estroma de medula óssea
humana são capazes de formar agregados celulares arredondados (Figura 8A e C),
cujo diâmetro é dependente do número de células (ROSSI et al., 2005). As análises
microscópicas e ultraestruturais realizadas mostraram que no interior do esferóide as
células são poliédricas enquanto que na camada mais externa elas são fusiformes
(Figura 8B). Além disto, as células apresentaram inúmeros prolongamentos,
formando uma rede tridimensional (Figura 8D-F). Verificou-se, comparando-se as
células cultivadas em monocamada e em 3D, modificações na organização do
citoesqueleto (Figura 8G-I). Em ambas as situações as células expressam α-actina
de músculo liso, mas em monocamada houve a formação de fibras de estresse
(Figura 8G), não observadas em 3D (Figura 8I). Em ambos os casos, as células
secretaram fibronectina, mas nos esferóides esta formava uma ampla rede (Figura
8H e J).
Quatro amostras foram testadas no sistema tridimensional de cultura, três
delas foram as que apresentaram maior taxa de migração em monocamada. O
índice de migração apresentado foi significativamente inferior ao índice encontrado
47
pelas mesmas amostras na migração em monocamada com exceção da amostra 12
que já havia migrado pouco no sistema de monocamada.
Figura 8. Morfologia dos esferóides de células de estroma de medula óssea
humana.
(A) Microscopia de contraste de fase. Microscópio invertido. (Aumento original
100X). (B) Aspecto microscópico dos esferóides. (H-E; aumento original 400X). (C-E)
Microscopia eletrônica de varredura. Células na superfície mostram-se achatadas com
inúmeras projeções. (Aumento original 280X, 2000X e 5000X, respectivamente). (F)
Microscopia eletrônica de transmissão mostrando espaços intercelulares. (Aumento original
48
16000X). (G-J) As células de estroma de medula óssea foram cultivadas por 10 dias em
monocamada (G-H) ou em esferóide (I-J) e incubadas com anticorpo específico para α-
actina de músculo liso (G e I) ou fibronectina (H e J) e analisadas em microscópio de
fluorescência. (Aumento original 1000X). (Fonte: Barros, APDN et al., 2004. 3rd International
Symposium on Extracellualr Matrix. Angra dos Reis, RJ. Almeida, LDB et al., 2005).
Assim como nas co-culturas em monocamada, as amostras apresentaram
uma cinética de migração própria sem um padrão comum de migração apesar das
poucas amostras estudadas neste modelo. Novamente, observamos três
comportamentos, um pico de migração em 120 minutos (Amostra 8), um pico mais
precoce aos 30 minutos média dos valores máximos de migração (Amostra 12) e
uma migração quase constante, com pequena tendência de elevação ao longo do
tempo, mas sem formação de um pico (Amostras 17 e 18). Estes resultados diferem
daqueles encontrados pelas mesmas amostras no sistema bidimensional, pois
naquele modelo as mesmas amostras apresentaram, respectivamente, um pico de
migração em momento diferente (Amostra 8), um aumento progressivo, sem
formação de pico (Amostra 12) e, finalmente, as amostras que em 3D migraram de
forma linear, na monocamada apresentaram pico de migração (Amostra 17 e 18). A
média dos valores máximos de migração no esferóide foi 1,82%, a maior migração
foi 3,1% e a menor foi 0,7%. A Tabela 8 e a Figura 9 mostram os resultados
enquanto a Figura 10 ilustra um corte histológico de uma das co-culturas.
Tabela 8. Cinética de migração das amostras de LLC em esferóides de estroma
de medula óssea humana conforme diferentes intervalos de tempo.
ª não estudado
Percentual de migração em cada intervalo de tempo
Amostras
10’ 30’ 60’ 120’ 300’
8 ª 1,44% ª 3,14% 0,95%
12 1,56% 2,77% 1,60% 1,60% ª
17 ª 0,23% 0,61% 0,54% 0,70%
18 ª 0,75% 0,64% 0,60% 1,15%
49
Figura 9. Gráfico das migrações das células leucêmicas em esferóide de
células de estroma de medula óssea em relação ao tempo.
Observe o pico em 30
minutos da amostra 12, o pico em 120 minutos da amostra 8 e a gradual elevação no
percentual migrado das amostras 17 e 18. Os pequenos percentuais na escala do eixo
vertical demonstram que raras células foram capazes de migrar no microtecido.
Figura 10. Aspecto morfológico de esferóide de células de estroma de medula
óssea humana co-cultivado com células de LLC-B.
As células de estroma de
medula óssea formaram agregados celulares tridimensionais do tipo esferóide, mas as
células leucêmicas não são identificadas. (A) H-E. Aumento original 100X. (B) H-E. Aumento
original 400X. Nota-se que no interior do esferóide as células são poliédricas enquanto que
na camada mais externa elas são fusiformes.
0,0%
0,5%
1,0%
1,5%
2,0%
2,5%
3,0%
3,5%
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Tempo (minutos)
% de migração
Amostra 8
Amostra 17
Amostra 12
Amostra 18
50
4.5) Migração de células leucêmicas em sistema bidimensional (monocamada)
de cultura de células de medula óssea conforme diferentes concentrações
aplicadas
Três casos, cujos perfis de migração eram conhecidos, foram avaliados nos
experimentos de migração em monocamada, aonde diferentes concentrações de
células leucêmicas foram co-cultivadas com o estroma. Verificou-se uma variação no
percentual de migração em função da concentração celular aplicada sobre a
monocamada em duas das três amostras testadas enquanto a terceira amostra
migrou muito pouco e com pequenas variações nas diferentes concentrações
celulares. A tabela 9 demonstra os valores encontrados.
Tabela 9. Valores da migração em monocamada conforme diferentes
concentrações celulares.
- não estudado
A amostra 18 apresentou valores de migração muito próximos nas menores
concentrações: 1,71% com 1 x 10
5
cél./poço; 1,9% com 5 x 10
5
cél./poço, 0,94%
com 10 x 10
5
cél./poço e 1,39% com 50 x 10
5
cél./poço, e uma elevação súbita para
5,07% na maior concentração (100 x 10
5
). A amostra 2 apresentou migração de
4,98% das células aplicada na menor concentração, 0,3% na concentração
intermediária e 1,11% na maior concentração. Este perfil curiosamente demonstra
uma relação invertida na qual a maior migração esteve relacionada com a menor
concentração celular. Por fim, a amostra 7 também apresentou uma relação
invertida entre concentração celular e migração. Houve um máximo de migração de
1,87% das células aplicadas na menor concentração, um mínimo de 0,73% na
concentração intermediária e 1,22% na maior concentração. Observamos que a
Concentração celular aplicada (x 10
5
/poço)
Amostras
1 5 10 50 100
2 4,98% 0,30% 1,11% - -
7 1,87% 0,73% 1,22% - -
18 1,71% 1,90% 0,94% 1,39% 5,07%
51
variabilidade desta amostra foi muito pequena de forma que não podemos atribuir
um pico de migração, mas sim considerar que ocorreu uma migração constante
independente da concentração celular aplicada. A figura 11 ilustra o comportamento
das três amostras.
Figura 11. Gráfico da migração de células leucêmicas em monocamada de
células de estroma de medula óssea em relação à concentração celular.
Observe o máximo migrado com as amostras 2 e 18, respectivamente na menor
concentração e na maior concentração, enquanto a amostra 7 não apresentou diferenças.
Note, que o percentual migrado é muito pequeno.
4.6) Migração de células leucêmicas em sistema tridimensional (esferóide) de
cultura de células de medula óssea conforme diferentes concentrações
aplicadas
Duas amostras foram testadas quanto à capacidade de migração em
esferóide, dependente da concentração celular. Verificamos que, ao contrário do
observado em monocamada, em nenhum dos dois casos analisados houve um pico
de migração em função da concentração celular aplicada (Tabela 10 e Figura 12).
Curiosamente, a amostra 8 apresentou um percentual de migração muito acima do
verificado anteriormente neste sistema. Havíamos observado que neste caso
específico, a camada celular mais externa dos esferóides não se apresentava
4,98%
1,87%
1,71%
0,30%
0,73%
1,90%
1,11%
1,22%
0,94%
1,39%
5,07%
0%
1%
2%
3%
4%
5%
% de migração
1 5 10 50 100
Concentração celular (x10
5
)
Amostra 2
Amostra 7
Amostra 18
52
fusiformes, o que conferia um aspecto frouxo aos mesmos (não mostrado) que pode
ter favorecido a migração.
Tabela 10. Valores da migração em esferóide conforme diferentes
concentrações celulares
Figura 12. Gráfico da migração de células leucêmicas em esferóides de células
de estroma de medula óssea em relação à concentração celular. Observe que
não há grandes variações do percentual sugerindo que um percentual constante de
células tenha capacidade para migrar. A amostra 18 apresentou valores de migração
muito pequenos, enquanto a amostra 8 apresentou valores elevados secundário à
alteração no esferóide.
Concentração celular aplicada (x 10
5
/poço)
Amostras
0,5 1 5 10 20
8 15,2% 21,7% 19,2% 24,2% 22,5%
18 3,7% 5,8% 4,2% 1,9% 5,8%
15,2%
3,7%
21,7%
5,8%
19,2%
4,2%
24,2%
1,9%
22,5%
5,8%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
% de migração
0,5 1 5 10 20
Concentração celular (x10
5
)
Amostra 8
Amostra 18
53
5) DISCUSSÃO
A sobrevivência das células leucêmicas na LLC-B parece depender de sua
interação com o estroma da medula óssea, que as protege do efeito dos
quimioterápicos (PANAYIOTIDIS et al., 1996). Uma vez que esta interação entre
células leucêmicas e estroma medular é importante na biologia das leucemias,
levantou-se a hipótese de que a capacidade de migrar por entre células de estroma
in vitro poderia estar ligada à agressividade e progressão da leucemia. Este estudo
procurou investigar a migração dos linfócitos leucêmicos na monocamada de células
do estroma de medula óssea, comparando-a com a migração em modelo de cultura
tridimensional, que mimetiza com melhor fidelidade a organização estrutural
encontrada in vivo. Com este novo método, intensionávamos avaliar se o
comportamento dos linfócitos leucêmicos no sistema tridimensional difere do
comportamento encontrado na cultura bidimensional, o que pode refletir diferentes
mecanismos de interação a serem explorados em novos estudos.
Inicialmente, confirmamos o papel protetor das células do estroma de medula
óssea ao observar que a taxa de morte celular in vitro é menor na presença delas.
Após 5 dias em cultura 63% das células leucêmicas estavam vivas no estroma
humano, 40% no estroma murino, 27% em meio Iscove’s e somente 19% em meio
α-men. Além disto, tanto no estroma murino, quanto no humano, as células de LLC-
B migraram por entre as células do estroma. Estes resultados confirmam estudos
anteriores que demonstraram o papel protetor do estroma de medula óssea
(CALIGARIS-CAPPIO, 2003; LAGNEAUX et al., 1998).
A seguir, investigamos a cinética de migração das células de LLC-B derivadas
do sangue periférico na monocamada de estroma de medula óssea humana, ao
longo do tempo. Obtivemos resultados que diferem daqueles descritos anteriormente
(BURGER et al., 1999). Observamos que os linfócitos leucêmicos migraram para o
estroma em intervalos de tempo e quantidade que variaram de amostra para
amostra. Em 64% das amostras testadas (9 casos) houve um padrão de migração
unimodal: após um máximo de migração ocorreu um decréscimo no percentual de
migração. Os 36% restantes (5 casos) apresentaram um padrão de ascensão
gradual no percentual de migração ao longo do tempo, apesar deste percentual ser
discreto.
54
Burger et al. (1999), em seus estudos de co-cultura de linfócitos leucêmicos
com estroma murino, descreveram este último perfil de migração, no qual quanto
maior o intervalo de tempo de interação, maior o número de células leucêmicas
aderidas ao estroma. O padrão unimodal que encontramos na maioria das nossas
amostras não confere com os dados de Burger (1999). Contudo, este padrão nos
possibilita especular, já que não verificamos morte celular, em variação no número
total de células, que alguns dos linfócitos leucêmicos que migraram para o estroma,
após um período de interação, se soltam do estroma e retornam ao sobrenadante.
Este modelo coincide com o descrito em co-culturas com progenitores linfóides B,
aonde uma interação dinâmica foi observada e in vivo, no qual os linfócitos
leucêmicos migram para a medula óssea ou órgãos linfóides, estabelecem contato
com células acessórias, recebem estímulo proliferativo e anti-apoptótico e voltam a
circular na corrente sanguínea (STEVENSON & CALIGARIS-CAPPIO, 2004).
A análise da influência de algumas variáveis clínicas (leucometria, estágio da
doença e progressão prévia), biológica (expressão do CD38) e individual (sexo e
idade) demonstrou que apenas a idade esteve diferentemente distribuída quando
separamos os casos que migraram com índice acima e abaixo da média das
migrações máximas.
A distribuição das variáveis tempo médio de evolução e presença de
progressão parecem estar diferentemente distribuídas em entre os dois grupos, mas
como o número de amostras com estas informações foi pequeno, a possibilidade de
erro é considerável e nova análise com maior amostra é necessária. Contudo, os
resultados encontrados parecem refletir uma tendência a uma menor migração nos
casos com maior tempo de evolução (tempo médio de evolução de 45,6 meses para
os casos abaixo da média e 24 meses para os casos acima da média) ou presença
de progressão (100% dos casos com progressão tiveram migração abaixo da
média).
Estes achados são surpreendentes visto que em doenças em estágios
tardios, portanto provavelmente mais agressivas, os linfócitos leucêmicos
apresentam maior potencial de transitar entre os tecidos onde sofrem mais divisões
e a participação do estroma nesta proliferação leucêmica neste processo é crucial
(STEVENSON & CALIGARIS-CAPPIO, 2004). Tal fato pode conduzir a hipótese de
que nas doenças mais agressivas, como observado em outras doenças onco-
hematológicas (KUEHL & BERGSAGEL, 2002), os linfócitos leucêmicos se tornem
55
independentes do contato com o estroma. Contudo, no caso específico de LLC-B, a
literatura descreve que a capacidade dos linfócitos de sobreviver in vitro é diminuída
(COLLINS et al., 1989). Acreditamos que a interpretação correta para os dados
encontrados é que os casos com maior tempo de follow-up são os mesmos que
apresentam progressão, e que eles provavelmente representam casos com
evolução indolente, com baixa taxa proliferativa e progressão lenta e que possuem
sobrevida prolongada uma vez que ainda não requereram tratamento até o momento
do ingresso no estudo.
A idade dos pacientes ao ingressarem no estudo também esteve
diferentemente distribuída entre os grupos com pico de migração acima ou abaixo
da média. Os casos mais jovens apresentaram taxas de migração mais elevadas.
Corroborando com a suspeita acima, acreditamos que os pacientes mais idosos são
aqueles com doença mais antiga e com maior probabilidade de progressão devido
ao longo tempo de doença, enquanto os pacientes mais jovens representam os
casos recém diagnosticados, dentre os quais alguns serão agressivos e outros
indolentes. No entanto, a influência do envelhecimento sobre as células leucêmicas
podem justificar os achados e uma avaliação com outros estudos é necessária.
In vivo, as células leucêmicas migram para a medula óssea, onde se
localizam em nichos específicos (VEGA et al., 2002). Pode-se imaginar que esta
migração compreenda as etapas descritas (NILSSON et al., 2006), ou seja,
migração transendotelial, migração transmedular e fixação no nicho. Os mecanismos
envolvidos na migração transmedular são menos conhecidos, mas as células
migrariam em contato com um continuum tridimensional formado pelas células do
estroma da medula óssea, que não é reproduzido no sistema de cultura
bidimensional. Assim, investigamos se a capacidade de migração das células
leucêmicas na monocamada e num modelo tridimensional de cultura de células de
estroma de medula seria comparável.
Comparando os resultados obtidos nos dois sistemas de co-cultura,
observamos que o perfil e o percentual de migração eram diferentes, ressaltando
que somente um pequeno percentual das células leucêmicas foi capaz de migrar no
modelo 3D (Figura 9). Este resultado pode estar associado ao fato dos esferóides de
células estromais formarem uma estrutura mais densa e compacta que a
monocamada, exigindo mecanismos adicionais para penetração que selecionaria
uma subpopulação de linfócitos leucêmicos. Por outro lado, levantamos a hipótese
56
de saturação do sistema em função do número de células leucêmicas adicionado a
cada esferóide. Para testar esta hipótese, diferentes concentrações de células
leucêmicas foram distribuídas para cada esferóide e o percentual de migração foi
determinado num momento específico. Verificou-se, nas duas amostras testadas,
que somente um percentual das células foi capaz de migrar nos esferóides,
independentemente da concentração celular (Figura 12). O mesmo não foi
observado nas culturas bidimensionais, aonde uma variação no percentual de
migração ocorreu dependendo da concentração celular (Figura 11). Estes resultados
apontam para existência de uma subpopulação de linfócitos leucêmicos apta a
migrar num sistema tridimensional. Esta hipótese está em acordo com a recente
proposta de existência de uma subpopulação de células leucêmicas, que tem sido
denominada de célula-tronco leucêmica (LSC, Leukemic Stem Cells), responsável
pela manutenção das leucemias (HUNTLY & GILLILAND, 2005; PARDAL et al.,
2003; PASSEGUÉ et al., 2003). Considerando este conceito e levando em conta que
as células utilizadas neste modelo são derivadas do sangue periférico, pode-se
imaginar que apenas uma pequena população celular do sangue periférico seja
capaz de migrar para a medula óssea, aonde se localizaria recirculando
periodicamente e mantendo a leucemia.
Neste estudo, devido ao pequeno número de amostras e às poucas variáveis
disponíveisl, não foi possível determinar se o comportamento in vitro refletiria a
apresentação clínica da doença. Maior amostra para análise multivariada, com a
inclusão de mais variáveis tais como a expressão do ZAP-70 e o status mutacional
da IgV
H
são fundamentais para correlacionar o comportamento in vitro e in vivo.
Mesmo assim, os dados encontrados apontam para a possibilidade de que os casos
mais indolentes tenham menor capacidade de migrar para o estroma e,
consequentemente, nos permite especular que os casos mais agressivos consigam
interagir mais com o estroma de medula óssea. Isto confirma a importância do
estroma de medula óssea na patogênese da doença. Além disto, é a primeira vez
que a capacidade de células de LLC-B de migrar em um sistema tridimensional foi
estudada e os resultados preliminares sugerem que este modelo pode ser utilizado
para avaliar os mecanismos envolvidos na migração transmedular que somente uma
subpopulação celular apresentou.
57
6) CONCLUSÃO
Este estudo é o primeiro a avaliar a interação dos linfócitos leucêmicos da
LLC com células do estroma de medula óssea humana organizadas em um sistema
tridimensional. Também avaliamos, concomitantemente, o comportamento dos
linfócitos leucêmicos em sistemas bidimensionais. Nossos resultados no modelo
bidimensional são conflitantes com os resultados descritos em estudo anterior
(BURGER et al., 1999) e diferem também dos resultados que encontramos no
modelo 3D. Provavelmente, este estudo é mais um a constatar que o
comportamento celular nos modelos 2D e 3D são distintos.
Nossas análises indicam que apenas uma subpopulação de linfócitos
leucêmicos apresenta capacidade de migrar para o estroma de medula óssea.
Baseado no conhecimento atual, a capacidade de migrar demonstrada in vitro
provavelmente é secundária à necessidade da célula em interagir com outro
elemento celular em busca de estímulos para sobrevida. A taxa de migração
encontrada depende do tamanho desta subpopulação “ávida” pelo estroma e o
tamanho desta subpopulação deve ser diretamente proporcional à taxa proliferativa
desta doença, ou seja, à agressividade.
Nossos resultados contribuem para esta hipótese. Com os poucos dados que
temos descrevemos que as leucemias dos pacientes mais jovens interagiram mais
com o estroma e encontramos uma tendência dos casos supostamente indolentes
(com maior tempo de follow-up, alguns já com progressão do estágio clínico, mas
que não requereram tratamento até o momento do estudo) em migrarem menos.
Esta análise é baseada nos experimentos em monocamada, infelizmente não
tivemos número suficiente de experimentos em sistema 3D para fazer levantamento
semelhante.
Independentemente do tamanho desta subpopulação, se apenas um
percentual de células leucêmicas apresenta capacidade para migrarem, as células
que constituem este grupo devem possuir características biológicas distintas das
células sem capacidade para migrar tais como moléculas de adesão, receptores de
quimiocinas, vias de sinalização e outros. Conhecer estas diferenças biológicas será
fundamental para o entendimento da patogênese da doença e pesquisa de possíveis
alvos terapêuticos.
58
Estes mecanismos poderão ser analisados in vitro pelos sistemas de co-
cultura com o estroma de medula óssea e com outras células acessórias à LLC. Um
dos primeiros passos para esta investigação será comparar a subpopulação que
migra com a subpopulação que não migra e para isso a técnica de co-cultura com o
estroma de medula torna-se uma forma de segregar estas subpopulações.
Acrescer a este método novas técnicas como a cultura tridimensional, a
presença de outras células acessórias e um invólucro endotelial no esferóide
transformará este microambiente in vitro mais próximo daquele encontrado in vivo e
mais fidedignas serão as descobertas.
59
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leukemia: Epidemiological, Familial and Genetic Aspects. In: CHESON, B.D. Chronic
Lymphoid Leukemias. 2nd ed. New York: Marcel Dekker Inc, 2001. Cap.3, p.33-62.
118. STEVENSON, F.K., CALIGARIS-CAPPIO, F. Chronic lymphocytic
leukemia: revelations from the B-cell receptor. Blood, v.103, p.4389-4395, 2004.
119. SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGY AND END RESULTS. NATIONAL
CANCER INSTITUTE. Disponível em: <http://seer.cancer.gov>. Acesso em 25 set.
2007.
75
120. TILL, K.J., LIN, K., ZUZEL, M., CAWLEY, J.C. The chemokine receptor
CCR7 and alpha4 integrin are important for migration of chronic lymphocytic
leukemia cells into lymph nodes. Blood, v.99, p.2977-2984, 2002.
121. TRENTIN, L., AGOSTINI, C., FACCO, M., PIAZZA, F., PERIN, A.,
SIVIERO, M., GURRIERI, C., GALVAN, S., ADAMI, F., ZAMBELLO, R., et al. The
chemokine receptor CXCR3 is expressed on malignant B cells and mediates
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122. TSUKADA, N., BURGER, J.A., ZVAIFLER, N.J., KIPPS, T.J. Distinctive
features of "nurselike" cells that differentiate in the context of chronic lymphocytic
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123. VEGA, F., MEDEIROS, L.J., LANG, W.H., MANSOOR, A., BUESO-
RAMOS, C. JONES, D. The stromal composition of malignant lymphoid aggregates
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Br J Haematol., v.117, p.569-576, 2002.
124. VERFAILLIE, C.M. Anatomy and Physiology of Hematopoiesis. In:
HOFFMAN, R., BENZ, E.J., SHATTIL, S., FURIE, B., COHEN, H.J., SILBERSTEIN,
L.E., MCGLAVE, P. Hematology – Basic Principles and Practice. 3
rd
ed. New York:
Churchill Livingstone, 2000. Cap. 13, p. 139-154.
125. WEAVER, V.M., PETERSEN, O.W., WANG, F., LARABELL, C.A.,
BRIAND, P., DAMSKY, C., BISSELL, M.J. Reversion of the malignant phenotype of
human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking
antibodies. J Cell Biol., v.137, p.231-245, 1997.
126. WEISS, L. The hematopoietic microenvironment of the bone marrow: an
ultrastructural study of the stroma in rats. Anat Rec., v.186, n.2, p.161-184, Oct.
1976.
76
127. WHITLOCK, C.A., WITTE, O.N. Long-term culture of B lymphocytes and
their precursors from murine bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA., v.79, p.3608-
3612, 1982.
128. WITTE, P.L., ROBINSON, M., HENLEY, A., LOW, M.G., STIERS, D.L.,
PERKINS, S., FLEISCHMAN, R.A., KINCADE, P.W.. Relationships between B-
lineage lymphocytes and stromal cells in long-term bone marrow cultures. Eur J
Immunol., v.17, p.1473-1484, 1987.
129. WOLF, K., MAZO, I., LEUNG, H., ENGELKE, K., VON ANDRIAN, U.H.,
DERYUGINA, E.I., STRONGIN, A.Y., BRÖCKER, E.B., FRIEDL, P. Compensation
mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking
of pericellular proteolysis. J Cell Biol., v.160, p.267-277, 2003.
130. YAMAMOTO, M., FIGUEIREDO, V.L.P. Epidemiologia da leucemia
linfocítica crônica e leucemia linfocítica crônica familiar. Rev. Bras. Hematol.
Hemoter., v.25, p.229-232, 2005.
77
8) ANEXOS
1) Ficha dos Pacientes
Identificação:
Nome: ________________________________________________________________
Instituição: ____________________________________ Matrícula: _______________
Médico: _______________________________ Data da admissão: _______________
Sexo: ( )M ( )F Idade:________ Data do diagnóstico:______________
Dados clínicos e laboratoriais:
Estagiamento: Binet ____ no diagnóstico, Binet ____ na admissão
Leucócitos: ______ /mm³ no diagnóstico, ______ /mm³ na admissão
Tempo de duplicação: ______ b2-microglobulina: ______
Fenótipagem:
Data:____/____/______, laboratório: ______________
Ig: ___% classe ___ CD19: ___% CD38: ___% Outros:
Κ: ___% CD20: ___% CD49d: ___% __________________
λ: ___% CD22: ___% CD79b: ___% __________________
CD2: ___% CD23: ___% FMC-7: ___% __________________
CD5 ___% CD27: ___% ZAP-70: ___% __________________
Ensaios:
Viabilidade em cultura Ensaio de migração
( )2D ( )3D
Data Total Viabilidade
Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3
Tempo ou
concentração
Sob. Ad. Sob. Ad. Sob. Ad.
Ensaio de migração
( )2D ( )3D
Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3
Tempo ou
concentração
Sob. Ad. Sob. Ad. Sob. Ad.
78
2) Termo de Consentimento
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CLEMENTINO FRAGA FILHO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você, paciente em tratamento de Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), no Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, está sendo
convidado a participar do estudo “ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE LINFÓCITOS DA
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA-B EM CULTURA BI- E TRI-DIMENSIONAL DE
ESTROMA DE MEDULA ÓSSEA”, executado pelo Dr. Leandro Dutra Borges de Almeida
sob orientação dos Profs. Maria Isabel Doria Rossi e Nélson Spector.
A LLC é uma doença caracterizada pelo aumento de linfócitos maduros na medula
óssea e sangue periférico podendo causar aumento dos gânglios, do fígado e do baço,
anemia e diminuição das plaquetas. O mecanismo de transformação do linfócito normal em
linfócito leucêmico não está esclarecido, entretanto os estudos sobre estes linfócitos
demonstram que ele rapidamente morre quando isolados em cultura. A adição de alguns
tipos celulares a esta cultura permite que o linfócito leucêmico sobreviva por tempo maior.
Este dado demonstra que o comportamento do linfócito leucêmico depende do ambiente
onde ele se encontra.
Neste estudo, as células da leucemia presentes no sangue serão obtidas por coleta
de 10ml sangue (por punções semelhantes às de exames de sangue). Elas serão
armazenadas na forma congelada para serem utilizadas por ocasião da realização dos
testes. Em momento oportuno, as células da leucemia serão cultivadas juntamente com
células do estroma de medula ósseo humano para avaliar o papel o estroma na proteção à
morte celular da leucemia. O objetivo deste estudo é ajudar a esclarecer os mecanismos da
doença.
Nenhuma modificação do tratamento será exigida, os participantes não serão
expostos a nenhum risco, exceto àqueles advindos de uma coleta de sangue, não será
cobrado nenhum tipo de benefício pelos custos do estudo e as células armazenadas serão
utilizadas apenas para os propósitos deste estudo.
(frente)
79
Eu, ___________________________________________, declaro ter sido
suficientemente informado a respeito das informações do estudo acima. Os detalhes sobre
este estudo foram analisados comigo e recebi uma cópia deste documento. Em particular,
fui informado dos seguintes aspectos:
1. Tenho ampla liberdade de recusar-me a participar do estudo ou retirar meu
consentimento em qualquer fase deste, sem penalização ou prejuízo da
continuidade do meu tratamento;
2. Tenho garantia de receber esclarecimentos sobre o estudo, mesmo durante o seu
decorrer;
3. Tenho a garantia de sigilo que assegure a minha privacidade quanto aos dados
confidenciais envolvidos no estudo, quando da sua divulgação ou publicação
científica;
4. Tenho garantia de acesso ao médico responsável pelo estudo a ao respectivo
comitê de ética institucional, quando necessário. O médico responsável é o Dr.
Leandro Dutra Borges de Almeida que pode ser localizado através do telefone 32
3211-3591 ou e-mail [email protected]m.br, e na sua ausência os seguintes
membros do Serviço de Hematologia: Prof. Nelson Spector, Prof. Wolmar Pulcheri,
Prof. Márcio Nucci, Prof. Ângelo Maiolino, Prof. Rodrigo Portugal, Profa. Monique
Morgado, Prof. Rony Schaffel, Profa. Irene Biasoli, que podem ser localizados
através dos seguintes telefones: 2562-2711, 2562-2460.
Portanto, concordo em participar do estudo autorizando a equipe médica
responsável, à coleta de sangue para exames, coleta dos dados e se necessário o
armazenamento do material biológico.
_________________________________ __________________________________
Paciente Médico
_________________________________ __________________________________
Testemunha Data
(verso)
80
3) Exemplo do Experimento de Migração
Amostra 17
Tempo 10’, Aderente 1
R1 = 28719 eventos em 102,4”
Tempo 10’, Aderente 2
R1 = 28119 eventos em 102,4”
Tempo 10’, Aderente 3
R1 = 29174 eventos em 102,4”
Tempo 10’, Sobrenadante 1
R1 = 158610 eventos em 102,4”
Tempo 10’, Sobrenadante 2
R1 = 173630 eventos em 102,4”
Tempo 10’, Sobrenadante 1
R1 = 178234 eventos em 102,4”
R1 = LLC
Estroma
LLC sem CFSE
81
Tempo 30’, Aderente 1
R1 = 51031 eventos em 102,4”
Tempo 30’, Aderente 2
R1 = 19732 eventos em 102,4”
Tempo 30’, Aderente 3
R1 = 33234 eventos em 102,4”
Tempo 30’, Sobrenadante 1
R1 = 158844 eventos em 102,4”
Tempo 30’, Sobrenadante 2
R1 = 172598 eventos em 102,4”
Tempo 30’, Sobrenadante 3
R1 = 183640 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Aderente 1
R1 = 32852 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Aderente 2
R1 = 55272 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Aderente 3
R1 = 64694 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Sobrenadante 1
R1 = 138371 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Sobrenadante 2
R1 = 108706 eventos em 102,4”
Tempo 60’, Sobrenadante 3
R1 = 119507 eventos em 102,4”
82
Tempo 120’, Aderente 1
R1 = 37773 eventos em 102,4”
Tempo 120’, Aderente 2
R1 = 9756 eventos em 102,4”
Tempo 120’, Aderente 1
R1 = 9031 eventos em 102,4”
Tempo 120’, Sobrenadante 1
R1 = 147828 eventos em 102,4”
Tempo 120’, Sobrenadante 2
R1 = 169555 eventos em 102,4”
Tempo 120’, Sobrenadante 3
R1 = 174343 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Aderente 1
R1 = 16995 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Aderente 2
R1 = 20307 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Aderente 3
R1 = 3201 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Sobrenadante 1
R1 = 183687 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Sobrenadante 2
R1 = 162056 eventos em 102,4”
Tempo 300’, Sobrenadante 3
R1 = 199259 eventos em 102,4”
83
4) Pôster apresentado no Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia
de 2005
84
5) Análise Estatística (SPSS 13.0)
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Sexo * % MÁXIMO
MIGRADO EM
MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
Sexo * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
F 4 1 5 Sexo
M 6 3 9
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square ,280(b) 1 ,597
Continuity
Correction(a)
,000 1 1,000
Likelihood Ratio ,290 1 ,590
Fisher's Exact Test 1,000 ,545
N of Valid Cases 14
a Computed only for a 2x2 table
b 3 cells (75,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 1,43.
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Idade na admisão
categorizada * %
MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
85
Idade na admisão categorizada * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
a 2 4 6 Idade na admisão
categorizada
b 8 0 8
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square 7,467(b) 1 ,006
Continuity
Correction(a)
4,557 1 ,033
Likelihood Ratio 9,113 1 ,003
Fisher's Exact Test ,015 ,015
N of Valid Cases 14
a Computed only for a 2x2 table
b 3 cells (75,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 1,71.
Case Processing Summary
Cases
Included Excluded Total
N Percent N Percent N Percent
Tempo de follow-up da
doença (meses) * %
MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
6 42,9% 8 57,1% 14 100,0%
Report - Tempo de follow-up da doença (meses)
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA Mean N Std. Deviation
n 45,60 5 36,398
s 24,00 1 .
Total 42,00 6 33,728
86
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
tempo de follow-up
categorizado * %
MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
tempo de follow-up categorizado * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
n 5 3 8
tempo de follow-up
categorizado
s 5 1 6
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square ,729(b) 1 ,393
Continuity
Correction(a)
,066 1 ,798
Likelihood Ratio ,760 1 ,383
Fisher's Exact Test ,580 ,406
N of Valid Cases 14
a Computed only for a 2x2 table
b 3 cells (75,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 1,71.
Case Processing Summary
87
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Estágio na admissão * %
MÁXIMO MIGRADO EM
MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
Estágio na admissão * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
A 4 2 6
B 4 2 6
Estágio na
admissão
C 2 0 2
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Pearson Chi-Square ,933(a) 2 ,627
Likelihood Ratio 1,475 2 ,478
N of Valid Cases 14
a 6 cells (100,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,57.
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Estágio na admissão * %
MÁXIMO MIGRADO EM
MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
Estágio na admissão * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
88
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
A+B 8 4 12 Estágio na
admissão
C 2 0 2
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square ,933(b) 1 ,334
Continuity
Correction(a)
,015 1 ,904
Likelihood Ratio 1,475 1 ,225
Fisher's Exact Test 1,000 ,495
N of Valid Cases 14
a Computed only for a 2x2 table
b 3 cells (75,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,57.
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Progressão * %
MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
6 42,9% 8 57,1% 14 100,0%
Progressão * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
n 1 1 2 Progressão
s 4 0 4
Total 5 1 6
Chi-Square Tests
Value df Asymp. Sig. Exact Sig. Exact Sig.
89
(2-sided) (2-sided) (1-sided)
Pearson Chi-Square 2,400(b) 1 ,121
Continuity
Correction(a)
,150 1 ,699
Likelihood Ratio 2,634 1 ,105
Fisher's Exact Test ,333 ,333
N of Valid Cases 6
a Computed only for a 2x2 table
b 4 cells (100,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,33.
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Leuco categorizado
conforme a média * %
MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
14 100,0% 0 ,0% 14 100,0%
Leuco categorizado conforme a média * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
a 7 2 9 Leuco categorizado
conforme a média
b 3 2 5
Total 10 4 14
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square ,498(b) 1 ,480
Continuity
Correction(a)
,008 1 ,930
Likelihood Ratio ,487 1 ,485
Fisher's Exact Test ,580 ,455
N of Valid Cases 14
a Computed only for a 2x2 table
b 3 cells (75,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 1,43.
90
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
CD38 * % MÁXIMO
MIGRADO EM
MONOCAMADA
10 71,4% 4 28,6% 14 100,0%
CD38 * % MÁXIMO MIGRADO EM MONOCAMADA
Crosstabulation
% MÁXIMO MIGRADO
EM MONOCAMADA
Count
n s
Total
n 3 2 5 CD38
s 3 2 5
Total 6 4 10
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square ,000(b) 1 1,000
Continuity
Correction(a)
,000 1 1,000
Likelihood Ratio ,000 1 1,000
Fisher's Exact Test 1,000 ,738
N of Valid Cases 10
a Computed only for a 2x2 table
b 4 cells (100,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 2,00.
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