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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIENCIAS MÉDICAS
Sandra de Jesus Pereira
Milrinona: Ações na Microcirculação após
Indução de Endotoxemia em Hamsters
Rio de Janeiro
2008
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ii
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIENCIAS MÉDICAS
Sandra de Jesus Pereira
Milrinona: Ações na Microcirculação após
Indução de Endotoxemia em Hamsters
Dissertação apresentada à Pós –graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
para obtenção do grau de mestre
Orientador: Luiz Guilherme Kraemer
Co orientadora: Eliete Bouskela
Rio de Janeiro
2008
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iii
CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A
P436 Pereira, Sandra de Jesus.
Milrinona: ações na microcirculação após introdução de endotoxemia
em hamsters / Sandra de Jesus Pereira. - 2008.
xvii, 67f.
Orientadores: Luiz Guilherme Kraemer; Eliete Bouskela.
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências
Médicas.
1. Sangue – Circulação – Teses. 2. Endotoxemia – Teses. 3. Microcirculação – Teses. I.
Kraemer, Luiz Guilherme. II. Bouskela, Eliete. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Faculdade de Ciências Médicas. IV.Título.
CDU 612.1
iv
Sandra de Jesus Pereira
Milrinona: Ações na Microcirculação após
Indução de Endotoxemia em Hamsters
Tese apresentada, como requisito para obtenção do
título de Mestre, ao programa de Pós Graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro, área de concentração:
Fisiopatologia
Aprovado em ____________________________________________________
________________________________________________________________
Prof Dr Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar – (Orientador) - Faculdade de Ciencias Médicas da UERJ
______________________________________________________________________
Prof Dra Eliete Bouskela (Co Orientadora) - Faculdade de Ciencias Médicas da UERJ
Banca examinadora
______________________________________________________________________
Prof Dr Nivaldo Villela - Faculdade de Ciencias Médicas da UERJ
_______________________________________________________________________
Prof Dr Erik Svensjö - Faculdade de Biofísica da UFRJ
___________________________________________________________________________
Profa Dra Cristina Ortiz - Faculdade de Ciencias Médicas da UFF
Rio de Janeiro
2008
v
De longe, o maior prêmio que a vida oferece é a chance de
trabalhar muito e se dedicar a algo que valha a pena.
(Theodore Roosevelt)
Aos meus filhos
Arthur e Felipe,
Minha maior motivação
A meus pais
Por tudo que aprendi
Ao Fabiano
Pelo exemplo de trabalho, dedicação ao estudo e amor que me transmitiu
vi
Agradecimentos
Ao meu pai Fernando Pereira que sempre confiou em mim e me deu forças até onde
faltaram as suas
A minha mãe Aurora Pereira que dedicou toda sua vida a nossa criação
A meu marido Fabiano Gouvea que expressou toda paciência, confiança e ajuda
A meus filhos Arthur e Felipe que são a inspiração da minha existência
Ao meu orientador Luis Guilherme Kraemer Aguiar pela motivação constante, pelos
ensinamentos e por estar sempre presente
A minha co orientadora Professora Eliete Bouskela pela orientação e estímulo
A Ana Olímpia pela ajuda e amizade
A Eliane Furtado pela ajuda e trabalho constante na busca dos resultados
Ao Fernando Lencastre Sicuro pelo auxílio epidemiológico e estatístico
Ao Gil Simões pela ajuda inestimável sem a qual não teria terminado minha tese
A quem eu possa ter esquecido e que cooperaram direta ou indiretamente para que o
trabalho viesse a sair a contento
vii
SUMÁRIO
I. Introdução…………………………................…………………….……..…..1
1. Relacionado a sepse…………………………………...........……...……2
2. Relacionado a microcirculação……………………………...............…..3
a. Microcirculação e macrohemodinâmica…………...,.....…..…...6
b. Microcirculação e sepse……………………………....,.......……8
3. Relacionado aos marcadores de perfusão tissular............,,......,...........10
a. Lactato sérico.......................................................,,......,...........10
b. Saturação venosa de oxigênio..............................,......,............11
4. Relacionada ao uso de drogas vasodilatadores na sepse...,....,.............11
5. Relacionada à milrinona....................................................,,..,..............13
6. Relacionado ao modelo.........................................................,,,............14
II. Objetivos…………………………………..............………….…................…16
III. Materiais e métodos………………………….............…….…..................….17
IV. Resultados……………………………………............................…….....……24
1. Medidas diretas………………………………..........................,...............24
a. Densidade Capilar Funcional……..................……......,.….......…24
b. Diametro Arteriolar………………….............…........….......…….28
c. Diametro Venular……………………........................…....…....…30
viii
2. Medidas indiretas………………………………..........................…....…31
a. Pressão Arterial Média………………............…….......…......….31
b. Saturação Venosa de O2………………............…..........…...…..34
c. Lactato……………………………….............……...........…...….35
d. pH………………………………………....................…....…...….36
e. Sobrevida……………………………….........................…...……37
V. Discussão……………………………………..............…...........................…38
1. Modelo....................................................................................................38
2. Análise de parâmetros diretos de perfusão da microcirculação................39
3. Análise de parâmetros indiretos de perfusão da microcirculação.............46
4. Sobrevida ...............................................................................................50
VI. Conclusão…………………………………..………………………….......…..51
VII. Referencias Bibliográficas………………….........................................….…52
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – A microcirculação, as arteríolas e o leito capilar............................... 4
Figura 2– Estrutura do leito capilar e suas células.................................................. 6
Figura 3– Sistema de sinalização na célula do músculo liso arteriolar............. 7
Figura 4- Múltiplos fatores que potencializam a diminuição da perfusão da
microcirculação na sepse..................................................................................... 9
Figura 5- Mecanismos fisiológicos que contam p/ melhorar o transporte de O
2
na microcirculação durante o uso de vasodilatadores............................ 12
Figura 6 - Câmara de titânio ...................................................................................... 18
Figura 7: Hamster com câmara de titânio com detalhe da fixação do cateter
e câmara.................................................................................................................. 19
Figura 8: animal ao microscópio em tubo de acrílico........................................ 20
Figura 9: Esquema do modo de gravação e observação no laboratório................................21
Figura 10: Corte óptico da imagem arteriolar (“image shearing device”)............................22
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Decremento na DCF após administração de LPS nos diferentes grupos. .......25
Tabela 2: Decremento no diâmetro arteriolar após administração de LPS nos diferentes
grupos....................................................................................................................29
Tabela 3: Diâmetro venular após administração de lps nos diferentes grupos.........30
Tabela 4: Decremento da pam após uso do LPS nos diferentes grupos................. 33
Tabela 5: Saturação venosa após LPS nos diferentes grupos. .................................34
Tabela 6: Níveis de lactato após LPS nos diferentes grupos....................................35
Tabela 7: pH após LPS nos diferentes grupos.........................................................36
xi
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Variação da densidade capilar funcional após administração de
LPS nos diferentes grupos...................................................................................26
Gráfico 2 – Comparação entre a densidade capilar funcional, expressa por
porcentual de vasos perfundidos/área, entre os diferentes grupos.........................27
Gráfico 3: Variação da pressão arterial média nos diferentes grupos.....................32
Gráfico 4: Percentual de sobrevida cumulativa nos diferentes grupos tes..............37
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AII – angiotensina II
Ach - acetilcolina
AMPc – adenosina monofosfato cíclica
AV – arterio-venoso
Ca
+
- cálcio
Cap/cm² – capilares por centímetro quadrado
CIVD – coagulação intravascular disseminada
CO
2
– gás carbônico
DC – débito cardíaco
DO
2
– oferta de oxigênio
FDE - fosfodiesterase
GMPc – guanosina monofosfato cíclica
Hb - hemoglobina
IC – índice cardíaco
IL1 – interleucina 1
iNOS – óxio nítrico sintetase induzida
IP3 – inositol trifosfato
LPS – lipopolissacarideo
LPM – laboratório de pesquisas em microcirculação
xiii
NE - noradrenalina
O
2
– oxigênio
ON – oxido nítrico
OPS – orthogonal polarized spectral
P- perfusão
PAM – pressão arterial média
Q - fluxo
ROS – espécies reativas de oxigênio
RVS – resistência vascular sistêmica
Sa O2 – saturação arterial de oxigênio
SIRS – síndrome de resposta inflamatória sistêmica
SvO2 – saturação venosa de oxigênio
TNF-α – fator de necrose tumoral alfa
VO2 – consumo de oxigênio
xiv
RESUMO
Objetivos – Determinar o efeito da Milrinona na microcirculação, na perfusão tecidual e na
estabilidade hemodinâmica em um modelo animal de endotoxemia.
Desenho do estudo – Intervencionista, prospectivo, randomizado, placebo- controlado
Local – Laboratório de pesquisa em microcirculação - UERJ.
Material e métodos – Após anestesia foi realizada a colocação da câmara dorsal em 36
hamsters. Após uma semana, os animais foram novamente anestesiados para colocação de
cateter arterial e venoso para medidas de pressão arterial média e coletas de sangue,
respectivamente na carótida e jugular. Foi feita a visualização direta e gravação da
microcirculação e coletas sanguíneas para mensuração de lactato, pH e saturação venosa
antes e após infusão de LPS. Uma hora após todos os grupos receberam infusão de LPS, 2
mg/kg. O grupo LPS não foi submetido a qualquer intervenção (controle, n=6) recebendo
somente uma infusão de soro fisiológico 0,2 ml em 30 minutos e 0,1 ml/h durante as 4
horas restantes. O grupo LPSRV (n=6) fez ressuscitaçao volumétrica com SF 0,9% 40
ml/kg em 1 hora (aproximadamente 3,2ml/h), seguida da infusão contínua a 0,1ml/h
durante um período de 4 horas, enquanto os o grupo LPSM25 (n=6) e LPSM50 (n=6)
fizeram infusão de milrinona a respectivamente 25 e 50 mcg/kg em 30 min, seguida por
infusão de 0,25 e 0,50 mcg/kg/min respectivamente até completar 6 horas. Os grupos
LPSRV25 (n=6) e LPSRV50 (n=6) foram submetidos a mesma intervenção com
milrinona descrita para os grupos LPSM25 e LPM50, respectivamente associada a
ressuscitação volumétrica 40 ml/kg em 1 hora. Pressão arterial média (PAM) foi
monitorada continuamente e foi colhido sangue venoso para medida de lactato, pH e
saturação venosa antes da intervenção, 4 e 6 horas após. A microcirculação foi avaliada por
visualização direta e realizada contagem de capilares para avaliar densidade capilar
funcional, medida direta de diâmetro arteriolar e venoso.
Resultados –Não houve diferenças entre os seis grupos antes da intervenção. Não houve
queda da PAM nos grupos tratados com milrinona e houve melhora da densidade capilar
funcional nos grupos que fizeram ressuscitação volumétrica e naqueles com somente
milrinona em relação ao grupo controle. As outras variáveis, como diâmetro arteriolar,
venular, PAM, lactato, saturação venosa e pH, não apresentaram alteração com
xv
significância estatística. Além disso, não observamos diferença na sobrevida dos grupos
tratados e não tratados.
Conclusão - Na sepse secundária ao uso de LPS em hamsters, a milrinona, apesar de seus
efeitos vasodilatadores, se mostrou segura não causando hipotensão e foi capaz de melhorar
a perfusão capilar, observada por visualização direta, sem alterar os marcadores de perfusão
tissular ou aumentar sobrevida dos animais tratados.
xvi
ABSTRACT
Study objective - To determine the effects of milrinone on microcirculation, tissue
perfusion and hemodynamic stability in a hamster model of endotoxemia
Design - A prospective, randomized, placebo-controlled, interventional study
in an animal model.
Setting - Research Laboratory on Microcirculation in the Rio de Janeiro State University
Material and Methods – 36 Hamsters were anesthetized and a dorsal skin chamber
prepared. One week later they were again anesthetized and vascular catheters inserted into
carotid artery and jugular vein to respectively measure mean arterial blood pressure and to
collect samples. The microcirculation was direct and visually inspected and video camera
recorded. Venous blood was collected for lactate, pH and central venous saturation. 2
mg/kg of LPS was then infused in every animal and one hour later the hamsters were
randomly assigned to receive Saline 0,9%, 0,2 ml during 30 minutes, followed by 0,1 ml/h
for next four hours (control group n=6), milrinone 25 and 50 mcg/kg bolus followed by an
infusion of 0.25 and 0.50 mcg/kg/min (milrinone group n=6), Saline 0,9% 40 ml/kg during
60 minutes (fluid resuscitation group n=6) or Saline 0,9% plus milrinone (fluid
resuscitation n=6 (FR) and milrinone group n=6). Mean arterial blood pressure was
monitored continuously, and venous blood was collected for measurements of lactate and
venous SVC saturation 4 and 6 hours after the LPS infusion. Microcirculation was
evaluated with direct visualization and direct counting on capillaries was performed to
evaluate functional capillary density as well as arteriolar and venular diameters.
Measurements and main results – No differences were detected among the 6 groups
before treatment. No hypotension occurred during the experiment despite higher doses of
milrinone without resuscitation in some groups and no other vasoactive or inotropic
support. Capillary density was better perfused in almost all groups except for one receiving
low dose of milrinone plus FR. The other variables of direct and indirect measurement of
microcirculation and also survival rate did not have significant differences from control
group.
Conclusions – During endotoxemia in a hamster model, milrinona even with its vasodilator
effects, seemed to be a safe drug to use in sepsis, without inducing hypotension and causing
xvii
beneficial microcirculatory effects as observed by direct visualization, with no changes in
the tissue perfusion markers and improvement in the survival rate of the treated animals.
xviii
VIII. INTRODUÇÃO
A sepse é um problema de saúde pública importante por ser a maior causa de
mortalidade ou morbidade na medicina intensiva. Nela ocorrem alterações da
microcirculação, ou seja, alterações dos mecanismos vasoreguladores e bloqueio ao seu
fluxo provocando hipóxia às células teciduais e disfunção orgânica. Na microcirculação
essa disfunção da microcirculação causa um déficit da extração de oxigênio (O
2
) da
hemoglobina para os tecidos. A perda de perfusão capilar é um dado específico e sensível
no prognóstico da sepse (Sakr et al, 2004). Baseado nesses fatos qualquer fator que
melhore a perfusão tecidual na sepse possivelmente resultaria em melhor prognóstico.
As drogas vasoativas podem modificar o comportamento da microcirculação. O
aumento da pressão de perfusão e/ou a vasodilatação arteriolar podem levar a melhora da
microcirculação. O aumento da pressão de perfusão tissular ocorre com o aumento do
débito cardíaco (DC) ou com o aumento da pressão arterial sistêmica. O aumento do DC
pode ocorrer devido à melhora na contratilidade cardíaca (inotropismo positivo), melhora
na volemia (pré-carga), diminuição da resistência vascular sistêmica (pós-carga) e
aumento da freqüência cardíaca. O aumento da pressão arterial ocorre pelo aumento do
DC e/ou da resistência vascular sistêmica (RVS). Nesse contexto, drogas que regulam a
RVS tanto aumentando quanto diminuindo, dependendo da necessidade e do momento,
são importantes na melhora da perfusão da microcirculação na sepse.
A sepse é causa de disfunção miocárdica (Rudiger et al 2007), e esta pode levar ao
decréscimo do DC e subseqüente alteração na microcirculação. Drogas com efeito
inotrópico positivo secundário ao seu efeito β2-agonista ou outro, podem ajudar no
recrutamento capilar. No adulto, a sepse habitualmente causa mais vasodilatação e menos
disfunção miocárdica (Bateman, 2003), conseqüentemente são usadas drogas que
aumentem a RVS com pouco efeito na contratilidade miocárdica, o que diminui a
vasodilatação sistêmica e melhora a hipotensão, mas também diminui a perfusão tissular.
Opostamente em crianças é mais comum observarmos mais vasoconstrição com prejuízo
à perfusão tecidual associada à ocorrência mais freqüente de disfunção miocárdica
(Tabbut, 2001). Dessa forma, drogas que atuam na contratilidade miocárdica com
concomitante ação vasodilatadora como a milrinona são benéficas tanto na síndrome de
resposta inflamatória (SIRS) da circulação extracorpórea em pacientes submetidos à
cirurgia cardíaca, os quais podem evoluir para disfunção miocárdica (Chang 1995 e
xix
Bailey 1999), como na sepse. Estudos experimentais com essa droga são poucos e esta
tem sido usada em momentos diferentes (pré-indução da endotoxemia) assim esses
estudos ainda
1. Relacionado à Sepse
A sepse continua sendo um desafio na medicina e muito recurso e empenho são aplicados
para entender a fisiopatologia dessa síndrome. Angus e colaboradores (2001), em um estudo
observacional nos EUA, mostraram a relevância dessa doença pela incidência de três casos de
sepse severa para cada 1000 pessoas, o que implicava em 751.000 casos/ano, dentre os quais
51% recebiam cuidados intensivos. A mortalidade hospitalar era de 28.6%, que representa
215.000 mortes/ano. Estima-se que mais de 750.000 casos de sepse grave ocorrem a cada ano
com aproximadamente 225.000 mortes. Além disso, a incidência de sepse vem aumentando
devido a vários fatores, entre eles a existência de um maior número de pacientes idosos e
imunodeficientes, à resistência aos antibióticos, ao grande número de patógenos e ao aumento do
uso de procedimentos invasivos para diagnóstico e tratamento dos pacientes (Balk, 2000).
Spronk e colaboradores (2006) relatam ser o número de mortes por sepse o mesmo que o de
infarto agudo do miocárdio.
A sepse é caracterizada pela alteração patológica distributiva do sangue, perda da auto-
regulação vasomotora e hipotensão refratária com RVS baixa e DC alto, normal ou diminuído
(principalmente em crianças ou no período inicial). A hipotensão refratária a fluidos e a terapia
vasomotora, pode levar a hipoperfusão tecidual (Sibbald et al, 1991), mas a hipóxia tecidual
pode ser também conseqüência da captação e utilização celular do O
2
inadequadas (Astiz et al,
1995). O organismo responde a essa hipoperfusão tecidual com mecanismos regulatórios
cardiovasculares, aumentando a oferta de O
2
para suprir a maior extração de O
2
. Quando isso
falha, a respiração mitocondrial não é sustentada e ocorre a disóxia tissular. A função da
microcirculação é oferecer nutrientes essenciais e O
2
às células e remover produtos do
metabolismo dos tecidos. Esse distúrbio delicado entre o balanço da oferta e do consumo de O
2
para os tecidos pode ser definido como estado de choque.
A sepse reflete a resposta inflamatória sistêmica à invasão de microorganismos (virus,
bacterias ou fúngos) ou à exo ou endotoxina. Endotoxinas são componentes dos próprios
microorganismos (lipopolissacarídeos da parede das bactérias gram negativas). Exotoxinas são
sintetizadas e secretadas pelos microrganismos (estafilococos). Quando uma infecção não é
xx
documentada, o termo síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) é usado para
classificar a mesma síndrome, que geralmente ocorre por uma doença aguda inflamatória como
queimaduras, grandes cirurgias, cirurgia sob circulação extracorpórea e trauma. A resposta
séptica é uma cascata de eventos extremamente complexa, incluindo o processo proinflamatório,
antiinflamatório, humoral, celular e circulatório (Hotchkiss et al, 2003 e Perl et al, 2006).
No processo inflamatório há liberação de mediadores, como as citocinas interleucina-1
(IL1) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF–α), que estimulam a liberação de outros mediadores
como leucotrienos, fatores de ativação plaquetária e proteases (Carcillo et al, 1997 e Wheeler et
al, 1999). O mecanismo fisiopatológico da sepse grave envolve uma resposta proinflamatória e
procoagulante excessiva que estão intrinsecamente ligados um ao outro (Dellinger, 2003).
Alterações nas vias da trombose e fibrinolíticos podem resultar em coagulação intravascular
disseminada (CIVD). Outros mecanismos presentes na sepse, como as coagulopatias, a
disfunção cardiovascular, a disponibilidade anormal de O
2
, a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS), o edema e a disfunção mitocondrial, contribuem para a disfunção
microcirculatória e colapso circulatório e promovem a formação de desvios arterio-venosos
(AV) de O
2
para os tecidos. Os marcadores de perfusão tissular tornam-se alterados com acidose
metabólica, lactato alto, alterações na medida oferta/consumo de O
2
e saturação venosa mista
baixa pelo alto consumo ou aumento dos desvios AV. Esses marcadores também podem estar
normais nas primeiras horas, por não refletirem ainda um sofrimento microvascular.
Recentemente foi mostrado como o polimorfismo genético codificando importantes
componentes da resposta inflamatória, como TNF-α e receptor antagonista IL1 parecem estar
associados a um maior risco de choque séptico, sugerindo a predisposição genética para sepse e
choque séptico em alguns indivíduos (Wunderink et al, 2003).
Os parâmetros macro-hemodinâmicos como pressão arterial (PA), índice cardíaco (IC),
oferta e consumo de O
2
, na maior parte das vezes não refletem o que ocorre na microcirculação,
e mesmo com bons índices macro-hemodinâmico pode haver má perfusão
tecidual (De Backer et al, 2006). Esses achados tornaram cada vez mais necessários a
visualização ou monitoramento da microcirculação como meta de tratamento. A técnica da
medida do fluxo sanguíneo regional e oxigenação a beira do leito será necessária para o
progresso no desfecho da sepse.
2. Relacionado à Microcirculação
xxi
A microcirculação consiste de vasos sanguíneos muito estreitos (alguns menores do
que o diâmetro da hemácia), conectados ao sistema arterial e venoso (fig. 1), e diminuem
seu calibre à medida que estão mais centrais em relação a esses sistemas. As arteríolas se
iniciam como arteríolas de primeiro grau passando a meta-arteríola e arteríolas terminais
até capilares. Estes representam a porção central e menor (7-12 μm) da rede
microcirculatória. O sangue que ultrapassa essa rede é captado pelas vênulas pós-capilares,
que por sua vez aumentam seu diâmetro até chegar a grandes vênulas. Veias e vênulas
acomodam o maior volume de sangue do sistema cardiovascular, considerados vasos de
capacitância, com volume de sangue submetido à baixa pressão. O sistema circulatório
divide-se em vasos de resistência (artérias e arteríolas), de troca (capilares) e reservatórios
de volume (veias e vênulas).
A microcirculação é composta de células endoteliais, células musculares lisas (a maioria
nas arteríolas), hemácias, leucócitos, e componentes do plasma. As células endoteliais
compõem a parte interna dos vasos e tem papel funcional importante por analisar a pressão
do fluxo, o metabolismo, e outras substâncias que regulam o tônus muscular arteriolar e o
recrutamento capilar (Vallet, 2002). O mecanismo regulatório que controla a perfusão
microcirculatória é classificado como miogênico (percebem o estiramento e estresse),
metabólico (regulação pelo O
2
, CO
2
, lactato, e H
+
), e neuro-humoral.
Figura 1 – A microcirculação, que inclui as arteríolas e o leito capilar. Observe os shunts arteriovenosos, que podem se
abrir e se fechar, aumentando ou diminuindo a quantidade de sangue que passa pelos capilares. Extraído de Opie 1998
xxii
Esse sistema de controle usa as interações endócrinas e parácrinas para regular o fluxo
e determinar as necessidades de O
2
dos tecidos (Ince 2005). Em geral, pressão de entrada de
fluxo, tônus arteriolar, hemorreologia, e patência capilar são os maiores determinantes do
fluxo sanguíneo capilar (Ince 2005). A resposta da microcirculação às mudanças é bastante
integrada através de todo leito microvascular (Duling e Desjardins, 1987 e Segal et al, 1989
e 2005), que pelas células endoteliais vão conduzindo e integrando sinais estimulatórios
(Segal e Dulling, 1987 e 1989 e Dietrich et al, 2000) ou respondem a alterações no fluxo
sangüíneo como transdutores de sinais do estresse por cisalhamento local (Koller 1991).
Para realizar sua função, os capilares têm na sua parede somente uma célula de espessura
(fig. 2 -B).
Existem três possibilidades de trocas através das paredes dos capilares:
1- Pelos poros entre as células,
2- Por pequenos poros dentro das células,
3- Pelas vesículas carreadoras dentro das células.
Gases como O
2
e CO
2
são transportados por difusão pelos poros, assim como pequenas
moléculas, como glicose e lactato. O transporte de moléculas complexas como ácidos
graxos, requer transporte pelas vesículas.
xxiii
Figura 2– Estrutura do leito capilar e suas células. A - O fluxo de sangue para os capilares é regulado pela resistência
arteriolar, pela atividade dos esfíncteres pré-capilares e pelos shunts arteriovenosos. B - As células capilares tem poros
entre as células (1), através das células (2) e vesículas que transportas moléculas mais complexas (3). Opie 1998
modificada de Michel 1988.
A estrutura e função da microcirculação são altamente heterogêneas em diferentes
órgãos. Existem diferentes densidades de capilares e receptores com membranas
interrompidas, fenestradas ou contínuas que levam a um grau diferente de filtração dos
órgãos. Cada órgão tem seu próprio consumo de O
2
e fluxo sangüíneo dependendo das
demandas metabólicas. (O modelo clássico de Krogh (1919) de transporte de O
2
da
microcirculação aos tecidos mostra que a troca de O
2
ocorre principalmente no leito capilar,
mas Elsworth e colaboradores em 1990 mostraram que uma quantidade importante de O
2
é
perdida desses vasos).
a) Microcirculação e macro hemodinâmica
A macro-hemodinâmica permite o melhor entendimento da física da perfusão
tissular. O fluxo sanguíneo (Q) é inversamente proporcional à resistência sistêmica (R) e
diretamente proporcional a pressão de perfusão (P), ou seja, o gradiente entre a rede arterial
xxiv
e venosa (Q= ∆P/R), exceto na perfusão cerebral e renal onde o fluxo se mantém constante
apesar da variação na pressão de perfusão. A maior resistência está nas arteríolas
contribuindo para o controle de distribuição de fluxo para os tecidos. A resistência das
arteríolas é controlada pelos efeitos opostos dos sistemas simpáticos e parasimpáticos. Na
Fig. 3, visualizamos vários mecanismos que desencadeiam esses efeitos nos vasos que
possuem musculatura lisa. Quando o cálcio (Ca
+
) aumenta dentro da célula, ocorre a
contração do músculo arteriolar. A entrada de Ca
+
é ocasionada pela atividade dos
receptores adrenérgicos α-1 e receptores da angiotensina-II (AII), sob a influência da
noradrenalina local. AII e endotelina também são vasoconstrictoras e a ocupação desses
receptores, portanto causa vasoconstrição. O sistema mensageiro para esses receptores
inclui a liberação do IP3 (inositol trifosfato), que aumenta o Ca
+
intracelular. O endotélio
vascular libera o óxido nítrico (ON), um vasodilatador, em resposta à acetilcolina que é
liberada por estímulo colinérgico. O ON aumenta a guanosina monofosfato cíclica (GMPc)
nas células musculares lisas que, por sua vez, diminui o nível de Ca
+
intracelular da
musculatura arteriolar. A adenosina monofosfato cíclica (AMPc) formada pelo estímulo β-
adrenérgico ou estimulação do receptor de adenosina, é vasodilatadora.
Figura 3– Sistema de sinalização na célula do músculo liso arteriolar – NE noradrenalina, AII angiotensina 2, ACh
acetilcolina, IP3 inositol trifosfato. Opie 1998
xxv
A inervação simpática que provoca a vasoconstrição e dilatação, só atua até as
arteríolas, e em poucos casos alcança as metarteríolas (Guyton et Hall, 2002). Veias e
vênulas têm inervação simpática vasoconstrictora. A perfusão nos capilares ocorre
dependendo da necessidade do tecido, havendo uma perfusão seletiva baseada em
vasodilatação e vasoconstrição regida pelo sistema simpático.
b) Microcirculação e sepse
Ellis e colaboradores em 2005 examinaram as evidências em trabalhos experimentais
de que a disfunção microvascular que ocorre precocemente na sepse seria o primeiro
estágio na hipóxia tecidual e disfunção orgânica. A microcirculação mantém a oxigenação
tecidual, apesar das limitações da oferta de O
2
do sangue para os tecidos imposta pela
difusão. A densidade dos capilares perfundidos (densidade funcional) é alta o suficiente
para assegurar uma apropriada difusão de O
2,
sendo as arteríolas pré-terminais as
reguladoras da distribuição de O
2
dentro dos órgãos. Os componentes chave desse sistema
regulatório são: o endotélio, que comunica e integra sinais através da rede microvascular e
os eritrócitos, que monitoram diretamente e regulam a oferta de O
2
pela liberação de ON
local. As hemácias têm um papel importante na regulação do fluxo da microcirculação pela
sua habilidade de liberar ON na presença de hipóxia e causar vasodilatação (Cosby et al
2003, Singel et al 2005). Entretanto em algumas horas do inicio da sepse, devido à perda
de capilares funcionais e regulação diminuída da oferta de O
2
, a microcirculação se torna
disfuncional não sendo capaz de manter os níveis de saturação de O
2
capilar o que facilita a
ocorrência de hipóxia tecidual. Habitualmente na sepse do adulto, o aumento do IC mantém
a oferta de O
2
adequada, enquanto os níveis de lactato encontram-se altos, além de outros
marcadores de perfusão tissular alterados, comprovando disóxia tecidual regional. Outra
causa dessa disóxia seria a disfunção mitocondrial devido à fosforização oxidativa
prejudicada (Fink, 1997) ou ainda a combinação de ambas.
A disfunção da microcirculação é caracterizada por anormalidades heterogêneas no
fluxo sanguíneo com alguns capilares sendo hipoperfundidos enquanto outros têm fluxo
anormalmente alto (Bateman et al, 2003, De Backer et al, 2002, Spronk et al, 2004). O
sistema de ON, um componente central no controle autoregulador da patência
microcirculatória, está muito alterado na sepse por expressão heterogênea da óxido nítrico
sintetase induzida (iNOS) em diferentes órgãos, resultando em desvio patológico (Morin et
xxvi
al, 1998, Revelly et al, 1996). Desde que a iNOS não é expressa homogeneamente nos
sistemas orgânicos, áreas sem iNOS têm menos vasodilatação e se tornam hipoperfundidas.
Além disso, as células musculares lisas das arteríolas perdem sua sensibilidade adrenérgica
e tônus na sepse (Baker et Wilmoth, 1984 e Price et al, 1999). Há aumento da viscosidade
sangüínea, além de menor deformabilidade das hemácias e maior capacidade de se
agregarem (Baskurt et al 1997, Piagnerelli et al 2003, Siegemund et al 1999, Astiz et al
1995). Adicionalmente leucócitos ativados pela inflamação têm diminuição da plasticidade
e aumento da agregabilidade devido à supra- regulação das moléculas de adesão, gerando
também ROS, os quais alteram estruturas da microcirculação, das interações celulares e da
coagulação (Linderkamp et al 1998, Cerwinka et al 2003, Martins et al 2003, Victor et al
2004). Muitos fatores são responsáveis pela diminuição da perfusão na sepsis, conforme
mostra o esquema abaixo (fig. 4)
Figura 4- Múltiplos fatores que potencializam a diminuição da perfusão da microcirculação na sepse (Spronk et al 2004)
xxvii
3. Relacionado aos marcadores de perfusão tissular:
saturação venosa e lactato
A sepse envolve uma série de fases hemodinâmicas nas quais lactato e saturação venosa
servem como substitutos para a monitorização do balanço entre demanda e entrega de O
2
sistêmico, para quantificar a gravidade da hipóxia tecidual global (Astiz et al 1986 e 1988;
Rivers et al 2001). Devido à insuficiência circulatória gerada pela hipovolemia ou
depressão miocárdica ou ainda aumento do metabolismo ou anormalidades
vasoregulatórias, há perda do equilíbrio entre a necessidade (DO
2
) e o consumo (VO
2
) de
O
2
, gerando uma hipóxia tecidual global. Ocorre aumento da extração de O
2
na tentativa de
suprir as necessidades teciduais, chegando ao sangue venoso menos O
2
, gerando uma
saturação venosa mista de oxigênio (SvO2) baixa. Entretanto, quando o limite desse
mecanismo compensatório é atingido há produção de lactato, um indicador do metabolismo
anaeróbico. Nessa fase de dependência da oferta de oxigênio, o lactato pode aumentar e
pode ser inversamente proporcional à oferta e a saturação venosa mista de oxigênio (Astiz
et al 1986). Essa fase é uma transição importante entre a sepse e a sepse grave. Se não
reconhecida (com a ajuda de uma avaliação de lactato ou SvO2) e tratada leva o paciente à
morte (Rady 1996, Vincent 1995).
a) Lactato sérico
O método mais antigo e ainda bastante usado como marcador da perfusão tissular é
a medida de déficit de base. Durante o choque ou a hipoperfusão tissular, a acidose
metabólica reflete a geração de excesso de íons hidrogênio quando o limite anaeróbico é
atingido, ou seja, quando há a transição do metabolismo anaeróbico através do ciclo do
ácido tricarboxílico em que o piruvato é transformado em lactato. (Vincent et al 1983). A
capacidade do corpo de manter a produção de energia pela utilização de O
2
e produção de
CO
2
está comprometida. A medida de lactato sérico é um indicador específico da falência
de perfusão e principalmente da falência em manter a oferta de O
2
capilar, com conseqüente
anaerobiose (Weil et al 1986).
xxviii
b) Saturação venosa de oxigênio como medida de
oxigenação dos tecidos.
A saturação venosa de oxigênio (SvO
2
) nos dá uma estimativa da saturação de O
2
do
sangue que retorna ao lado direito do coração e indiretamente se correlaciona com a
extração de O
2
pelos tecidos e sua relação com o consumo de O
2
. Uma queda na saturação
venosa poderia explicar uma diminuição na oferta de oxigênio ou qualquer outro parâmetro
que determina a SvO
2
, como: saturação arterial de oxigênio (SaO
2
), DC, concentração de
hemoglobina e também aumento no consumo de O2. Segundo a Equação de Fick: SvO
2
=
SaO
2
– VO
2
/Q x 1 / (1.36xHb) (Opie, 1998); a SvO
2
tem muitas variáveis, como fluxo (Q),
saturação arterial (SaO
2
) (que pode ser alterada pela hipóxia respiratória), metabolismo
(VO
2
= consumo de oxigênio pelos tecidos) e disponibilidade de um carreador de O
2
(Hb=Hemoglobina). Uma mudança na saturação venosa tem alta sensibilidade e baixa
especificidade. Se há um aumento do metabolismo como ocorre normalmente na sepse, há
uma diminuição da SvO
2
devido ao alto consumo. Entretanto se há disfunção mitocondrial
ou desvio arteriovenoso, a SvO
2
pode estar alta, não sendo possível a distinção entre os
dois eventos, permitindo somente avaliar um mau aproveitamento do O
2
pelos tecidos. Se
ocorrer queda da SvO
2
pode ser por um aumento no consumo (VO
2
) ou diminuição do
fluxo (Q) como pode ocorrer nos pacientes com hemodinâmica prejudicada. Como
avaliação hemodinâmica esse índice tem muita validade, porque se relaciona diretamente
com VO
2
e a DO
2
.
4. Relacionado ao uso de drogas vasodilatadoras na
sepse
A sepse causa efeitos heterogêneos de constrição e dilatação em diferentes órgãos e
diferentes locais da microcirculação (Lush e Kvietys 2000).
A vasodilatação arteriolar provocada por drogas vasodilatadoras como os inibidores
da fosfodiesterase, levaria ao aumento da pressão de entrada da microcirculação causada
pelo desvio do gradiente de pressão ao longo desta (fig. 5), forçando a abertura desses
capilares fechados e levando O
2
a áreas antes excluídas pela disfunção microcirculatória
(Taylor e Moore 1999). Os vasodilatadores provocam também o decréscimo da pós-carga
capilar, o que facilitaria a perfusão dessas unidades e melhoraria os marcadores de disóxia
tecidual (Buwalda e Ince 2002). Em última análise, os desvios arteriovenosos tendem a
diminuir com a vasodilatação e há melhora no fluxo regional.
xxix
Figura 5- Mecanismos fisiológicos que contam p/ melhorar o transporte de O2 na microcirculação durante o uso de
vasodilatadores. O efeito da vasodilatação e vasoconstrição arteriolar no perfil hidrostático da microcirculação é mostrado.
Podemos ver que a vasodilatação aumenta a pressão de entrada para a microcirculação. A vasoconstrição diminui essa
pressão de entrada. (Taylor et al, 1999)
De Backer e colaboradores em 2002 mostraram haver melhora da microcirculação
sublingual aplicando acetilcolina local em pacientes com choque séptico, pela produção de
ON local. Este autor usou a técnica de OPS, para avaliar de forma fidedigna as alterações
de fluxo da microcirculação na sepse, demonstrando diminuição da densidade vascular, um
grande número de pequenos vasos não perfundidos ou perfundidos de forma intermitente, e
uma grande heterogeneidade entre estas áreas. Essas alterações não eram afetadas pelo
estado hemodinâmico global ou pelo uso de agentes adrenérgicos, sendo mais severas em
não sobreviventes, e totalmente reversíveis com o uso de acetilcolina. Essa melhora sugere
que a vasoconstrição tem um papel central e que o estímulo vasodilatador como resposta do
endotélio estava preservado (Furchgott e Zawadski 1980) mesmo na presença de lesão
endotelial. Na revisão de Otero et al, 2006 em que ele reavalia a terapia precoce direcionada
para a sepse foi incluído o uso de vasodilatadores, como a dobutamina, naqueles com PAM
elevada (superior a 90 mmHg) e esta se mostrou benéfica.
Sakr e colaboradores em 2004 mostraram que enquanto a ressuscitação guiada por
pressão era efetiva em restaurá-la, esta medida não conseguiu restaurar a disfunção
microcirculatória. Sob este aspecto, vasopressores devem ser administrados com cuidado e
com monitorização contínua. Em um trabalho usando a vasopressina em um paciente
xxx
séptico, embora com bons resultados para restaurar a pressão e débito urinário, ao avaliar-se
a microcirculação por OPS observou-se uma parada completa do fluxo, constrição da
circulação regional, com óbito do paciente (Albert et al 2004), enquanto outros autores
observaram parada da circulação mesentérica com o uso da vasopressina (Westphal et al,
2004). Com base nesses diversos achados, o uso de uma droga com efeitos inotrópicos
associada a efeitos vasodilatadores, parece ser mais indicado, já que sabemos que o tecido
miocárdico tem um sofrimento importante na sepse (Walley et al, 2003) e a redução da pós-
carga por vasodilatadores reduz o trabalho miocárdico.
5. Relacionado à milrinona
A milrinona é uma droga do grupo dos inibidores da enzima fosfodiesterase. Esta é
a enzima responsável pela metabolização da 3’5’ adenosina-monofosfato cíclica (AMPc). O
inibidor da fosfodiesterase mais comumente usado é específico para a fração III (FDE-III),
que é a forma predominante no músculo cardíaco, mas também presente na musculatura
vascular. Ao inibirem a FDE-III há um aumento do AMPc intracelular com conseqüente
aumento do Ca
+
intracelular ionizado, este estando disponível para a contração miocárdica
com a fosforilação da proteína contrátil. (Ward et al, 1983). A diminuição da concentração
livre de Ca
+
intracelular promove o relaxamento do músculo liso vascular e ocasiona a
vasodilatação (Scholz 1983). O acúmulo de AMPc aumenta a extrusão de Ca
+
através do
sarcolema, diminuindo dessa forma o cálcio intracelular, relaxando assim músculos lisos
arteriais e venosos (Cody et al, 1986). Os inibidores da fosfodiesterase não interagem com
os receptores beta- adrenérgicos, nem são inibidores da atividade sódio-potássio-adenosina
trifosfatase como os glicosídeos digitálicos. Tem efeito direto sobre a contratilidade
miocárdica e musculatura vascular.
Existem várias drogas que são inibidoras da enzima fosfodiesterase III sendo a mais
atual e com menos efeitos colaterais a milrinona. Seu nome químico é lactato de 1,6-
dihidro-2-metil-6 oxo (3,4 bipiridina)-5-carbonitrita. É um agente inotrópico positivo
(aumento da contratilidade cardíaca) e provoca o relaxamento miocárdico na diástole
(lusitropismo). Também ocasiona vasodilatação das arteríolas e veias e possui pouca
atividade cronotrópica (aumento da freqüência cardíaca o que aumenta o trabalho
miocárdico). A milrinona tem uma meia vida de aproximadamente 3 horas e circula 70%
aproximadamente acoplada a proteína e é excretada inalterada pelo rim.
xxxi
Tem sido extensivamente investigada em pacientes adultos e em crianças. Sua melhora
na contratilidade miocárdica é bem complementada pela vasodilatação periférica, gerando
melhora do DC sem haver aumento de consumo de O
2
miocárdico, como ocorre com outras
catecolaminas (Hopkins RA et al 1991)
No miocárdico deprimido, a dose de ataque produz imediata e significativa melhora
do débito cardíaco e volume de ejeção, diminuição da pressão capilar pulmonar e das
pressões de enchimento e da resistência vascular pulmonar e sistêmica sem alteração
significativa na freqüência cardíaca ou consumo de oxigênio miocárdico (Braunwald,
1991). A milrinona é a droga de escolha usada em lactentes e crianças que são submetidos à
cirurgia cardíaca para correção de defeitos congênitos, pelo seu efeito inotrópico e pouco
efeito cronotrópico, pelo seu efeito lusitrópico, que é bastante benéfico quando existe
edema miocárdico, (que conseqüentemente acarreta disfunção diastólica), e pelo seu efeito
vasodilatador, contribuindo para o aumento do DC. (Chang et al, 1995 e Hoffman et al,
2003). Os efeitos hemodinâmicos da milrinona em neonatos após cirurgia cardíaca são bem
evidentes (Chang et al, 1995), assim como em crianças maiores (Sorensen et at, 1996).
Na sepse, a milrinona parece ser benéfica por ser um vasodilatador e com isso
possivelmente melhorar a perfusão da microcirculação, diminuindo desvios arteriovenosos
e melhorando o recrutamento da microcirculação e por ser uma droga inotrópica, pode
melhorar a perfusão tissular. Além disso, sua ação imunomodulatória melhora a reação
inflamatória na sepse (Möllhoff et al 1999).
6. Relacionado ao Modelo
A análise dos mecanismos da microcirculação requer métodos sofisticados que
possibilitam a visualização das respostas celulares e moleculares. Os modelos de
visualização da microcirculação cuja preparação é realizada pouco tempo antes da sua
análise, têm o inconveniente de terem o trauma cirúrgico associado, o que pode influenciar
na resposta inflamatória. Alguns modelos são realizados com o animal anestesiado, o que
pode também interferir nessa resposta. Além disso, com a anestesia, a observação se
restringe a poucas horas, caracterizando só a fase aguda e não havendo apreciação de
algumas alterações mais tardias da inflamação. Para observação direta da microcirculação,
o modelo da câmara dorsal transparente no hamster de tamanho pequeno pode ser usado. A
primeira câmara transparente de observação foi implantada há 84 anos na orelha de um
xxxii
coelho (Sandison, 1928). Essa tecnologia foi modificada ao longo dos anos para melhorar a
imagem e visualização. Foi adaptada para camundongo para se utilizar na observação de
implantes tumorais por Algire e colaboradores em 1943 e passou a ser usada como câmara
na pele dorsal no camundongo e também no hamster (Endrich, 1980). A observação da
microcirculação pode ser feita no músculo estriado, no panículo carnoso, no subcutâneo e
na pele. As câmaras dorsais foram primariamente desenvolvidas com materiais metálicos
que, embora com boa visualização, eram pesadas e levavam ao estresse do animal. O
desenvolvimento da câmara não metálica permitiu que o animal permanecesse com ela
vários dias sem haver um grau de estresse maior pelo peso e incômodo. Na câmara dorsal
do hamster, a resposta de inflamação local pelo TNF-α induzido pelo LPS é caracterizada
por recrutamento de leucócitos microvasculares, pela adesão ao endotélio das veias pós-
capilares, falência da perfusão capilar, aumento da permeabilidade microvascular e
iniciação da morte celular por apoptose (Westermann et al 1999). A observação da
microcirculação da pele é mais vantajosa porque pode ser feita em animais não anestesiados
e por um período de até três a quatro semanas, considerado um período crônico. O emprego
desta técnica com o animal acordado elimina os efeitos da anestesia, que influenciam o
sistema nervoso autônomo, com respostas modificadas em relação à resistência vascular
periférica e ao desempenho no DC (Hoffman et al 1991), além de evitarmos alterações nas
relações entre células endoteliais e leucócitos. Menger e colaboradores em 2002 mostraram
que um intervalo de dois a três dias entre a colocação da câmara e sua visualização diminui
o efeito do trauma cirúrgico e da anestesia. Entretanto esta técnica tem a desvantagem de
não visualizar os vasos linfáticos quando comparada a microcirculação mesentérica.
xxxiii
IX. Objetivos
Nossa hipótese é que as unidades microcirculatórias vasoconstritas frente a um
insulto séptico e que, portanto estariam gerando a hipóxia tecidual, se dilatariam com o uso
da milrinona, um agente vasodilatador, com conseqüente melhora na perfusão tecidual
local. Além disso, mesmo que a vasodilatação secundária ao uso desta droga provocasse
um pequeno decréscimo na pressão arterial, o aumento do DC compensaria a diminuição
dos níveis pressóricos com ganho na perfusão tecidual.
Nosso objetivo foi estudar em hamsters com sepse secundária a endotoxemia, as
ações na microcirculação e na pressão arterial da milrinona, uma droga vasodilatadora,
sabidamente com efeitos também no DC e antiinflamatórios.
xxxiv
X. Materiais e Métodos
Hamsters dourados (Mesocricetus auratus), machos, com massa corporal entre 60 e
90 gramas, provenientes do Biotério Central da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ –
CECAL) foram usados em nosso estudo. Aclimatados no Biotério do Laboratório de
Pesquisas em Microcirculação (LPM), Departamento de Ciências Fisiológicas, Instituto de
Biologia Roberto Alcântara Gomes, Centro Biomédico da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro (UERJ), em ambiente com temperatura mantida entre 21 ± 1◦C, com ciclo de
luz/escuridão de 12h, controlados por temporizador e acesso irrestrito à água e ração
própria para a espécie.
Esses animais foram divididos em seis grupos distintos da seguinte forma:
G1 – Grupo de LPS (n= 6)
Preparo da câmara dorsal e 6-7 dias após se faz a canulização arterial e venosa,
seguida no dia seguinte da administração de LPS (lipopolissacarídeo de E. coli sorotipo
055: B5, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) na dose de 2 mg/kg de massa corporal em
infusão de 2 minutos (0,2 ml) utilizando a bomba de infusão (Harvard Apparatus modelo
55 2222, Holliston, USA), logo após a acomodação do animal ao microscópio. Noventa
minutos (1½ hora) após, fazemos a infusão de soro fisiológico de 0,2 ml em 30 minutos e
0,1 ml/h durante as 4 horas restantes.
G2 - Grupo de Ressuscitação ou LPSRV (n=6)
Infusão de LPS em 2 minutos e 1 hora após infusão de soro fisiológico 40 ml/kg em 1
hora (aproximadamente 3,2ml/h), seguida da infusão contínua de soro fisiológico (SF 0,9% -
NaCl a 0,9%) a 0,1ml/h durante um período de 4 horas.
G3 - Grupo de milrinona 25 ou LPSM25 (n=6)
Infusão de LPS e 1 hora e meia após inicia-se a infusão de lactato de milrinona
(Primacor® - Sanofi Winthrop) 25 mcg/kg em 30 minutos diluída num volume de SF 0,9%
de 0,2 ml, seguida de infusão de 0,25 mcg/kg/minutos durante 4 horas (0,1 ml/h).
G4 - Grupo de milrinona 50 ou LPS M50 (n=6)
Infusão de LPS e 1
1/2
hora após inicia-se a infusão de milrinona 50 mcg/kg em 30
minutos, seguida de infusão de 0,50 mcg/kg/min. durante 4 horas (0,1 ml/h).
G5 - Grupo de milrinona 25 com ressuscitação ou LPSRV25 (n=6)
xxxv
Infusão de LPS e 1 h após inicia-se a infusão de SF 0,9% 40ml/kg em 1 hora (40
ml/kg) e após 30 minutos do início desta, inicia-se a infusão de milrinona 25 mcg/kg em 30
minutos, seguida de infusão de 0,25 mcg/kg/min durante 4 horas.
G6 - Grupo de milrinona 50 com ressuscitação ou LPSRV50 (n=6)
Infusão de LPS e de SF 0,9% 40 ml/kg e infusão de milrinona 50 mcg/kg em 30
min., seguida de infusão de 0,50 mcg/kg/min. durante 4 horas.
O tempo das infusões seguiu a seguinte ordem:
H 0 – coleta sangüínea para medida de saturação venosa de oxigênio e lactato, seguida de
infusão do LPS
H 1 – 40ml/kg de SF 0,9% em 1 hora (ressuscitação)
H 1½ - bôlus de milrinona em 30 minutos junto com a metade restante da ressuscitação
H 2 - infusão de 0,1 ml/h de SF 0,9% ou solução de milrinona até H6
H 4 - coleta de sangue – 0,3 ml
H 6 - coleta de sangue – 0,3 ml e término do experimento
Para preparo do dorso, foi feita a injeção intraperitoneal de pentobarbital (CEVA-
Sanofi Santé Animale) na dose de 60mg/kg de massa corporal e a seguir, após remoção do
pelo com creme depilatório e tosqueador, implantou-se a câmara de titânio (figura 6) na
pele do dorso do hamster. Esta possui um orifício central que nos permite a observação da
microcirculação após remoção de pele e dissecção de camada subcutânea com auxílio de
esteromicroscópio (Leica Microscopy Systems, Alemanha, LEICA M651) e colocação de
lamínula de vidro.
Figura 6 - Câmara de Titânio
xxxvi
Posteriormente a implantação da câmara, procedeu-se a sua fixação e o animal foi
reencaminhado ao biotério em gaiolas individuais, com acesso irrestrito a água e ração
próprias.
Após sete dias, o animal foi novamente anestesiado com pentobarbital
intraperitoneal e a artéria carótida foi canulizada para monitorização de pressão arterial
contínua através do BIOPAC Systems (Santa Bárbara - Califórnia USA) enquanto a veia
jugular foi canulizada, através de lupa com aumento de 16 vezes e colocação de cateter de
polietileno (0,28 mmID/0,61mmOD), o qual foi fixado à câmara dorsal para coleta de
material e infusão dos medicamentos. A seguir o animal foi novamente encaminhado ao
biotério onde permaneceu por outras 24h (figura 7).
Figura 7: Hamster com câmara de titânio com detalhe da fixação do cateter e câmara
No oitavo dia do experimento, o animal foi reencaminhado ao laboratório e, sem uso
de anestésico, colocado em um tubo de acrílico com pequenos orifícios laterais para
facilitar a respiração e uma saída transversal por onde a câmara de titânio transpassa,
permitindo a sua visualização ao microscópio (Microscópio intravital, Leitz–Wetzlar,
Alemanha) (figura 8). A visualização é feita por transiluminação com lâmpada de
tungstênio-halogênio de 100 w, alimentada por fonte de 12 v e com aumento de 100 vezes.
Foram usados filtros azuis (OMEC Corporation 51664 e 59814) para melhor visualização
de hemácias circulantes.
xxxvii
Figura 8: Animal ao microscópio em tubo de acrílico
O microscópio foi acoplado a uma câmara de vídeo (SAMSUNG SBC-320, Corea)
ligada ao monitor de TV (B&W Hitron Systems, Cheonan-Corea) e a um vídeocassete
(JVC-Victor Company of Japan, Malásia) o que permitiu a filmagem contínua da
microcirculação in vivo pela microscopia intravital. Esta imagem foi transmitida a um
monitor de TV e possibilitando a observação e gravação da mesma (figura 9). Estas
imagens foram gravadas da seguinte forma:
(1) Diâmetro arteriolar - previamente foi escolhido o melhor campo para visualização
da arteríola o qual foi marcado. Aguardou-se 15 minutos até a acomodação do animal ao
microscópio e gravou-se em vídeo por um período de 1 minuto o mesmo campo nos
seguintes tempos: zero, 1, 3 e 6 horas.
(2) Diâmetro venular - após a escolha repetiu-se os mesmos procedimentos do campo
arteriolar.
(3) Densidade capilar funcional (DCF) - após acomodação do animal ao microscópio
foram escolhidos dois campos com 2 a 5 capilares com fluxo de hemácias, contando-se o
número de capilares funcionantes, ou seja aqueles com hemácias circulantes por unidade
de área. A média dos dois campos nos mesmos tempos anteriores foi anotada
manualmente. A DCF foi definida como os segmentos capilares que tinham trânsito de
hemácias num período de 45 segundos nesses campos.
xxxviii
Figura 9: Esquema do modo de gravação e observação no laboratório
As gravações dos campos arteriolares e venulares foram analisadas e as medidas de
diâmetro foram feitas posteriormente, através do corte óptico da imagem (figura 10),
conforme técnica já utilizada há três décadas e descrita por Intaglietta e Tompkins, 1973
(Image Shearing Monitor Model 908 – San Diego, USA).
xxxix
Figura 10: Corte óptico da imagem arteriolar (“Image shearing device”).
As medidas de pressão arterial sistêmica eram tomadas através do cateter inserido na
carótida utilizando-se do BIOPAC e anotadas a cada 15 minutos manualmente por um
período de 6 horas após início do procedimento.
Estes procedimentos se repetiram em todos os animais e em todos os seis grupos. As
variáveis estudadas foram: pressão arterial média (medidas a cada quinze minutos por um
período de seis horas), diâmetro arteriolar (medido em trinta minutos e com uma, três e
seis horas), diâmetro venular (medido em trinta minutos e com uma, três e seis horas) e a
densidade capilar funcional (medida nos mesmos tempos dos diâmetros arteriolar e
venular).
As medidas de lactato, saturação venosa central e pH foram realizadas por
microtécnica pelo aparelho i-Stat ®1- Abbot, analyser – MN:300 – EUA. Essas medidas
foram realizadas antes da infusão do LPS e depois com quatro e seis horas.
Na análise estatística dos dados, estes são em sua maioria, apresentados com mediana
[1
o
- 3
o
quartil] ou freqüência. Para análise estatística foram usados métodos não–
paramétricos que se tornaram necessários face a não-normalidade das variáveis. Na análise
intragrupo, utilizou-se o teste de Friedman para comparação das variáveis de cada grupo ao
longo do tempo (análise longitudinal), com teste pós-hoc de Dunnet para determinação das
diferenças individuais entre os diversos tempos. As comparações transversais (entre
grupos) foram feitas pelo ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis, posteriormente foi
conduzido o teste post-hoc de Dunn para determinação das diferenças individuais nos
xl
diversos tempos. A comparação de freqüências de vasos na variável DCF foi feita pelo
teste do Chi-quadrado para independência. Para cada variável levou-se em consideração os
seguintes fatores: tratamento, considerando controle e cada dose utilizada, e a interação
entre tempo vs tratamento A sobrevida foi avaliada pelo método de Kaplan-Meier. Foi
considerado estatisticamente significativo, todo o efeito e interação cujo nível de
significância (p) foi menor que 0,05.
xli
XI. Resultados
Após estudo experimental de teste terapêutico com o uso de hamsters com massa
corporal de 84,4 ± 4,27 (60 e 90) gramas, randomizado, prospectivo, foram avaliados seis
parâmetros relativos à perfusão da microcirculação de forma direta e indireta. Para análise
direta (visualização da mesma) usamos a DCF (capilar com visualização de hemácias em
movimento por unidade de área), o diâmetro arteriolar e o venular. Para análise indireta
usamos a PAM, a medida de lactato venoso central, do pH venoso e da saturação venosa
central. Avaliamos também a sobrevida dos hamsters para correlacionar com os achados da
microcirculação.
1. Medidas Diretas:
a) Densidade Capilar Funcional
Em todos os grupos observamos diferença ao compararmos os percentuais de
decremento após o uso do LPS, com redução da DCF ao longo das 6 horas (tabela 1 e
gráfico 1). No grupo de LPS essa diferença foi observada aos compararmos os tempos 3ª e
6ª hora com o basal respectivamente (23,6 [11,5-42,5] vs. 148,0 [113,7-156,4] cap/cm
2
, p
<0,05 e 27,3 [13,6-35,6] vs. 148,0 [113,7-156,4] cap/cm
2
, p < 0,05), enquanto no grupo
LPSRV essa redução foi significativa somente entre a 6ª hora e o basal (28,8 [0,0-55,4] vs.
148,9 [145,6-150,4] cap/cm
2
, p<0,05). No grupo LPSM25, as alterações foram
significativas nas 3ª e 6ª hora ao compará-las com o basal, respectivamente (53,1[40,6-
91,5] vs. 138,5[137,1-149,5] cap/cm
2
, p <0,05 e 21,3[0,0-35,6] vs. 138,5[137,1-149,5]
cap/cm
2
, p<0,05) e na 3ª hora em relação à 1ª hora (53,1[40,6-91,5] vs. 108,3[73,1-133,6]
cap/cm
2
, p<0,05). No grupo LPSM50 só houve alteração significativa entre a 3ª hora e o
basal 56,8[0,0-145,1] vs. 165,1[152,4-189,5] cap/cm
2
, p<0,05). No grupo LPSRV25
observamos decremento da DCF entre os tempos 3ª e 6ª hora ao compará-los com o basal,
respectivamente (75,5[30,5-101,9] vs. 171,7[150,8-183,7] cap/cm
2
, p< 0,05 e 70,0[0,0-
82,4] vs. 171,7[150,8-183,7] cap/cm
2
, p<0,05). De forma semelhante o grupo LPSRV50
apresentou decremento entre os tempos 3ª e 6ª hora em comparação com o basal,
respectivamente (65,0[12,5-85,4] vs. 155,5[140,8-185,3] cap/cm
2
, p< 0,05 e 54,8[35,2-
75,2] vs. 155,5[140,8-185,3] cap/cm
2
, p< 0,05).
xlii
Tabela 1: Decremento na DCF após administração de LPS nos diferentes grupos.
DENSIDADE CAPILAR FUNCIONAL (cap/cm
2
)
GRUPOS BASAL 1 HORA 3 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS
148,0
[113,7-156,4]
62,1
[40,2-75,8]
23,6
[11,5-42,5]
27,3
[13,6-35,6]
< 0,001
LPSRV
148,9
[145,6-150,4]
88,5
[25,4-116,4]
61,8
[5,6-85,2]
28,8
[0,0-55,4]
< 0,001
LPSM25
138,5
[137,1-149,5]
108,3
[73,1-133,6]
53,1
[40,6-91,5]
21,3
[0,0-35,6]
< 0,001
LPSM50
165,1
[152,4-189,5]
98,4
[22,5-139,5]
56,8
[0,0-145,1]
88,0
[0,0-153,7]
< 0,02
LPSRV25
171,7
[150,8-183,7]
88,9
[51,5-116,5]
75,5
[30,5-101,9]
70,0
[0,0-82,4]
< 0,01
LPSRV50
155,5
[140,8-185,3]
112,8
[65,3-133,2]
65,0
[12,5-85,4]
54,8
[35,2-75,2]
< 0,01
Ao compararmos os diferentes grupos, não observamos diferenças nos percentuais de
decremento na DCF entre os diversos tempos, entretanto na avaliação da freqüência de vasos
perfundidos observou-se diferença entre os grupos LPSRV, LPSM25, LPSM50, LPSRV50
comparados com o grupo LPS. Esses dados demonstram melhora da DCF, observado pela
freqüência de vasos com perfusão, em todos os grupos com exceção do grupo de LPSRV25
quando comparados ao LPS (gráfico 2).
xliii
BASAL 1 HORA 3 HORAS 6 HORAS
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
DCF (cap/cm
2
)
LPS (p<0,001)
LPSRV (p<0,001)
LPSM25 (p<0,001)
LPSM50 (p<0,02)
LPSRV25 (p<0,01)
LPSRV50 (p<0,01)
Gráfico 1 – Variação da densidade capilar funcional após administração de LPS nos
diferentes grupos.
xliv
Gráfico 2 – Comparação entre a densidade capilar funcional, expressa por porcentual de
vasos perfundidos/área, entre os diferentes grupos.
1 hora
4 hora
6 hora
1 hora
4 hora
6 hora
1 hora
4 hora
6 hora
1 hora
4 hora
6 hora
1 hora
4 hora
6 hora
1 hora
4 hora
6 hora
0
10
20
30
40
50
60
70
80
p=0,05
p<0,01
p<0,02
p=0,06
p<0,03
LPS
LPSRV LPSM25 LPSM50 LPSRV25 LPSRV50
%
xlv
b) Diâmetro arteriolar
Em relação ao diâmetro arteriolar nos grupos LPS, LPSRV, LPSM25, LPSM50,
LPSRV25 e LPSRV50 demonstrou-se que existe uma diminuição deste presente em todos
os grupos que receberam LPS (tabela 2). Essas alterações analisadas pelo teste de post –
hoc de Dunnet foram significativas no grupo LPS e LPSRV na 3ª e 6ª hora comparado com
o basal, respectivamente (65,1[57,8-69,3] vs 84,0[69,5-108,7] μm, p< 0,05 e 44,6[42,1-
60,9] vs 84,0[69,5-108,7] μm, p< 0,05 e 85,2[82,2-104,2] vs 129,1[124,6-137,6] μm, p<
0,05 e 69,7[61,5-74,6] vs 129,1[124,6-137,6]) μm, p< 0,05 e na 6ª hora comparado com a
1ª hora (44,6[42,1-60,9] vs 76,3[67,0-84,5] μm, p< 0,05 e 69,7[61,5-74,6] vs 109,6[99,1-
118,8] μm, p< 0,05). Nos grupos LPSM25 e LPS RV50 as alterações foram significativas
na 6ª hora comparado com o basal, respectivamente (55,7[42,1-74,7] vs 101,1[99,0-102,2]
μm, p< 0,05 e 51,2[45,8-61,3] vs 101,0[87,9-114,5] μm, p< 0,05). No grupo LPSM50
ocorreu alteração na 6ª hora comparada com o basal (59,1[44,5-69,0] vs 97,2[95,1-113,6]
μm, p< 0,05) e com a 1ª hora (59,1[44,5-69,0] vs 95,4[86,4-99,5] μm, p< 0,05) e
finalmente no grupo LPSRV25 as alterações foram significativas na 3ª e 6ª hora
comparadas com o basal, respectivamente (70,5[49,2-83,6] vs 102,8[83,0-107,2] μm, p<
0,05 e 42,8[39,5-45,0] vs 102,8[83,0-107,2] μm, p< 0,05).
Ao compararmos os percentuais de decremento entre os grupos LPS, LPSRV,
LPSM25, LPSM50, LPSRV25 e LPSRV50 não observamos diferenças, respectivamente
nos tempos 1
a
, 3
a
e 6
a
hora.
xlvi
Tabela 2: Decremento no diâmetro arteriolar após administração de LPS nos
diferentes grupos.
DIAMETRO ARTERIOLAR (μm)
GRUPOS BASAL 1 HORA 3 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS
84,0[69,5-108,7] 76,3[67,0-84,5] 65,1[57,8-69,3] 44,6[42,1-60,9] < 0,01
LPSRV
129,1[124,6-137,6] 109,6[99,1-118,8] 85,2[82,2-104,2] 69,7[61,5-74,6] < 0,01
LPSM25
101,1[99,0-102,2] 73,5[69,5-82,5] 69,7[62,2-92,0] 55,7[42,1-74,7] < 0,01
LPSM50
97,2[95,1-113,6] 95,4[86,4-99,5] 87,5[58,0-98,0] 59,1[44,5-69,0] < 0,01
LPSRV25
102,8[83,0-107,2] 83,9[75,0-100,3] 70,5[49,2-83,6] 42,8[39,5-45,0] < 0,01
LPSRV50
101,0[87,9-114,5] 88,5[68,7-97,1] 71,6[69,5-82,8] 51,2[45,8-61,3] < 0,01
xlvii
c) Diâmetro venular:
Em relação ao diâmetro venular nos grupos LPS, LPSRV, LPSM25, LPSM50,
LPSRV25 e LPSRV50 demonstrou-se que não há diminuição deste nos grupos analisados
após o uso do LPS ao longo das 6 horas (tabela 3).
Na análise intergrupo quando comparamos os percentuais de decremento entre os
grupos LPS, LPSRV, LPSM25, LPSM50, LPSRV25 e LPSRV50 não observamos
diferenças, respectivamente nos tempos 1
a
, 3
a
e 6
a
hora.
Tabela 3: Diâmetro venular após administração de LPS nos diferentes grupos.
DIAMETRO VENULAR (μm)
GRUPOS BASAL 1 HORA 3 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS
147,4
[120,8-192,7]
154,4
[112,5-201,3]
158,9
[144,9-217,3]
153,6
[124,9-167,7]
0,06
LPSRV
176,3
[123,6-216,7]
183,6
[133,7-234,2]
178,6
[135,5-231,5]
164,1
[127,8-210,6]
0,29
LPSM25
158,9
[124,3-193,2]
175,3
[114,5-201,4]
175,7
[128,8-192,2]
155,9
[127,2-170,5]
0,14
LPSM50
118,8
[109,4-201,5]
162,1
[116,1-190,1]
176,5
[133,4-203,1]
114,1
[108,0-153,1]
0,17
LPSRV25
183,3
[129,4-197,8]
184,5
[132,2-210,3]
192,8
[135,4-208,5]
137,4
[112,4-202,4]
0,53
LPSRV50
153,5
[112,4-181,4]
149,0
[132,6-187,5]
147,8
[138,4-184,1]
149,0
[126,6-156,0]
0,71
xlviii
1. Medidas Indiretas:
a) Pressão Arterial Média
Ao compararmos os percentuais de decremento nos grupos LPS, LPSRV, LPSM25,
LPSM50, LPSRV25 e LPSRV50 houve importante redução da PAM ao longo das 6 horas
após o uso do LPS (tabela 4). No grupo LPS, a diferença foi observada na 5ª e 6ª hora
comparada com o basal, respectivamente (65,0 [60,0-69,0] vs 110,0 [102,0-120,0] mmHg,
p< 0,05 e 61,5 [59,0-68,0] vs 110,0 [102,0-120,0] mmHg, p< 0,05) e também na 5ª e 6ª
hora comparada com a 1ª hora, respectivamente (65,0[60,0-69,0] vs 108,0[91,0-108,0]
mmHg, p< 0,05 e 61,5[59,0-68,0] vs 108,0[91,0-108,0], mmHg, p< 0,05). No LPSRV e
LPSRV50 ocorreu também na 5ª e 6ª hora comparada com o basal, respectivamente (82
[74-90] vs 96,0[90,0-120,0] mmHg, p< 0,05 e 81[74-96] vs 96,0[90,0-120,0]) mmHg, p<
0,05 e (79,0[78,0-81,0] vs 112,0[108,0-113,0] mmHg, p< 0,05 e 77,0[76,0-80,0] vs
112,0[108,0-113,0] mmHg, p< 0,05). No LPSM25, se expressou na 3ª, 4ª, 5ª e 6ª hora
comparada ao basal, respectivamente (67,0[61,0 -71,0] vs 102,0[88,0-110,0] mmHg, p<
0,05 e 69,5[60,0-78,0] vs 102,0[88,0-110,0] mmHg, p< 0,05 e 72,0[49,0-72,0] vs
102,0[88,0-110,0] mmHg, p< 0,05 e 63,0[44,0-75,0] vs 102,0[88,0-110,0] mmHg, p< 0,05)
e na 6ª hora comparada com a 1ª hora (63,0[44,0-75,0] vs 83,0[82,0-90,0] mmHg, p< 0,05).
No grupo de LPSM50, essa alteração ocorreu na 3ª, 5ª e 6ª hora comparado com o basal,
respectivamente (74,5[66,0-80,0] vs 99,0[93,0-105,0] mmHg, p< 0,05 e 68,0[63,0-79,0] vs
99,0[93,0-105,0] mmHg, p< 0,05 e 73,5[58,0-78,0] vs 99,0[93,0-105,0] mmHg, p< 0.,05) e
na 5ª hora comparada com a 1ª hora (68,0[63,0-79,0] vs 85,0[85,0-87,0] mmHg, p< 0,05) e
no grupo LPSRV25 ocorreu na 4ª e 6ª hora comparada com o basal (77,5[61,0-82,0] vs
108,0[101,0-120,0] mmHg, p< 0,05 e 73,5[68,0-84,0] vs 108,0[101,0-120,0] mmHg, p<
0.05).
Na avaliação entre os grupos não houve alterações da PAM entre os grupos LPS,
LPSRV, LPSM25, LPSM 50, LPSRV25 e LPSRV50. Entretanto ressaltamos que houve do
ponto de vista biológico, nos grupos LPSRV25 e LPSRV50 uma aparente atenuação da
redução da PAM a partir da 4ª hora em relação ao observado nos outros grupos (gráfico 3).
xlix
BASAL 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 4 HORAS 5 HORAS 6 HORAS
60
70
80
90
100
110
120
mmHg
LPS
LPSRV
LPSM25
LPSM50
LPSRV25
LPSRV50
Gráfico 3: Variação da pressão arterial média nos diferentes grupos
l
Tabela 4: Decremento da pressão arterial média após uso do LPS nos diferentes
grupos.
PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (mmHg)
GRUPOS BASAL 1
a
HORA 2
a
HORA
3
a
HORA
4
a
HORA
5
a
HORA
6
a
HORA
p
valor
LPS
110,0
[102-120]
108,0
[91-108]
95,0
[83-98]
82,0
[75-87]
72,0
[70-85]
65,0
[60-69]
61,5
[59-68]
<0,05
LPSRV
96,0
[90-120]
85,0
[71-92]
82
[62-84]
81
[67-93]
72,0
[74-89]
82
[74-90]
81
[74-96]
<0,05
LPSM25
102,0
[88-110]
83,0
[82-90]
76,5
[66-88]
67,0
[61-71]
69,5
[60-78]
72,0
[49-72]
63,0
[44-75]
<0,05
LPSM50
99,0
[93-105]
85,0
[85-87]
75,0
[72-79]
74,5
[66-80]
72,5
[69-81]
68,0
[63-79]
73,5
[58-78]
<0,05
LPSRV25
108,0
[101-120]
88,0
[65-95]
80,0
[53-99]
79,5
[62-88]
77,5
[61-82]
74,5
[70-89]
73,5
[68-84]
<0,05
LPSRV50
112,0
[108-113]
94,0
[91-102]
88,5
[83-93]
83,5
[81-87]
80,0
[78-85]
79,0
[78-81]
77,0
[76-80]
<0,05
li
b) Saturação Venosa de Oxigênio – SVO2
Somente o grupo LPSM25 apresentou diferença na saturação venosa de O
2
ao longo
do tempo (tabela 5). Neste grupo observou-se melhora da saturação venosa de O
2
na 4ª hora
ao compará-la com o basal (42,5[33,0-47,0] vs. 27,0[22,0-33,0]%, p< 0,05). Ao
compararmos os grupos nos diferentes tempos, observamos diferença na saturação venosa
de O
2
entre os grupos LPSRV25 e LPS no período basal (23,0[15,0-31,0] vs. 48,5 [38,0-
58,0]%, p<0,05).
Tabela 5: Saturação venosa após LPS nos diferentes grupos.
SATURAÇÃO VENOSA (%)
GRUPOS BASAL 4 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS
48,5 [38,0-58,0] 42,0 [32,0-48,0] 44,5 [40,0-49,0] 0,55
LPSRV
34,0 [31,0-44,0] 37,5 [29,0-41,0] 28,0 [33,0-62,0] 0,37
LPSM25
27,0 [22,0-33,0] 42,5 [33,0-47,0] 34,0 27,0-34,0] < 0,05
LPSM50
22,0 [18,0-39,0] 31,5 [29,0-32,0] 36,5 [33,0-45,0] 0,72
LPSRV25
23,0 [15,0-31,0] 28,0 [20,0-37,0] 29,0 [26,0-30,0] 0,33
LPSRV50
33,0 [25,0-48,0] 38,5 [27,0-51,0] 47,0 [36,0-50,0] 0,07
lii
c) Lactato
Em relação ao lactato nos grupos LPS, LPSRV, LPSM25, LPSM 50, LPSRV25 e
LPSRV50 demonstrou-se que existe um aumento na produção do mesmo ao longo do
tempo nos grupos LPS, LPSM25, LPSM50 e LPSRV25, o que não ocorreu nos grupos
LPSRV e LPSRV50 (tabela 6). Observa-se que o aumento desse metabolito nos grupos
LPS, LPSM50 e LPSRV25 ocorreu quando comparamos os seus níveis na 6ª hora com o
período basal, respectivamente (2,63 [1,91-3,18] vs. 1,65 [1,37-1,94] mmol/L, p< 0,05;
2,72 [2,18-4,04] vs. 1,58 [1,25-2,12], p<0.05 e 2,42 [1,81-3,07] vs. 1,63 [1,54-2.23],
mmol/L, p< 0,05). No grupo LPSM25 esta diferença foi observada entre a 4ª hora e o nível
basal (3,49 [2,96-3,68] vs. 2,39 [1,77-2,84], mmol/L, p< 0,05).
Entre os grupos, não observamos diferença significativa nos níveis de lactato nos
diferentes tempos testados.
Tabela 6: Níveis de lactato após LPS nos diferentes grupos.
LACTATO (mmol/L)
GRUPOS BASAL 4 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS
1,65 [1,37-1,94] 2,09 [1,89-2,33] 2,63 [1,91-3,18] < 0,03
LPSRV
2,47 [1,48-3,96] 2,02 [1,66-2,96] 2,28 [2,07-3,37] 0,25
LPSM25
2,39 [1,77-2,84] 3,49 [2,96-3,68] 3,32 [2,77-3,40] < 0,03
LPSM50
1,58 [1,25-2,12] 2,52 [1,93-3,45] 2,72 [2,18-4,04] < 0,04
LPSRV25
1,63 [1,54-2.23] 1,85 [1,79-2,18] 2,42 [1,81-3,07] < 0,02
LPSRV50
2,93 [2,25-3,11] 2,73 [1,79-2,95] 2,93 [2,25-2,97] 0,55
liii
d) pH
Observou-se diminuição do pH ao longo do tempo após uso de LPS em alguns
grupos (tabela 7). Estas diferenças foram notadas na 4ª hora ao compararmos os níveis de
pH com o período basal nos grupos LPS (7,30 [7,25-7,32] vs. 7,38 [7,35-7,38], p<0,05),
LPSRV (7,26 [7,23-7,31] vs. 7,37 [7,32-7,37], p<0,05) e LPSRV25 (7,27 [7,23-7,29] vs.
7,34 [7,31-7,37], p<0,05), e na 6ª hora em relação ao basal no grupo LPSM25 (7,23 [7,19-
7,31] vs. 7,36 [7,33-7,36], p<0,05) . O pH não se alterou nos grupos LPSM50 e LPSRV50
ao longo do tempo.
Ao compararmos os grupos, não observamos diferenças nos níveis de pH nos
diferentes tempos testados.
Tabela 7: pH após LPS nos diferentes grupos.
pH
GRUPOS BASAL 4 HORAS 6 HORAS
p valor
LPS H
7,38 [7,35-7,38] 7,30 [7,25-7,32] 7,27 [7,27-7,34] < 0,02
LPS RV
7,37 [7,32-7,37] 7,26 [7,23-7,31] 7,28 [7,25-7,32] < 0,02
LPS M25
7,36 [7,33-7,36] 7,29 [7,27-7,31] 7,23 [7,19-7,31] < 0,02
LPS M50
7,33 [7,31-7,38] 7,31 [7,30-7,37] 7,32 [7,31-7,33] 0,28
LPS SRV25
7,34 [7,31-7,37] 7,27 [7,23-7,29] 7,27 [7,25-7,31] < 0,03
LPS SRV50
7,36 [7,33-7,40] 7,30 [7,26-7,31] 7,29 [7,28-7,34] 0,06
liv
e) Sobrevida
Na análise de sobrevida (tabela 8) dos animais estudados observamos que não houve
diferença de tempo de sobrevida independente do tratamento de cada grupo analisado.
(gráfico 4).
Gráfico 4: Percentual de sobrevida cumulativa nos diferentes grupos testados.
lv
XII. Discussão
A sepse é hoje uma entidade bastante estudada pela sua importância epidemiológica
devido a sua alta morbi-mortalidade, apesar do uso de recursos avançados no seu
tratamento. Cada vez mais se comprova que a microcirculação é a base fisiopatológica da
sepse e que esta deve ser monitorada durante o tratamento do choque séptico. A avaliação e
tratamento da sepse geralmente são feitos baseando-se em parâmetros macro-
hemodinâmicos. Entretanto hoje alguns trabalhos (De Backer et al 2006) já mostram que
terapias que melhoraram a macro-hemodinâmica são algumas vezes lesivas à
microcirculação, o que demonstra a importância deste sítio vascular de forma direta e/ou
indireta.
Pensando-se no fato de que a vasoconstrição ocorre em várias unidades da
microcirculação levando a hipóxia tecidual, alguns trabalhos foram feitos com o intuito de
analisar drogas vasodilatadoras capazes de melhorar a perfusão tecidual (Cerra et al 1978 ;
Furchgott e Zawadzki 1980 ; Bihari et al 1987; Svensjö et al 1993; Bouskela et al 1995 ;
Radermacher et al 1995; Barton et al 1996; Schmidt et al 2000 ; Silver et al 2001 ;
Buwalda et al 2002 ; Cosby et al 2003 ; Spronk et al 2006 ; De Backer et al 2006 ; Liet et
al 2005; Schwarte et al 2005; Spronk et al 2002). Entretanto a análise da perfusão na
maioria desses trabalhos foi feita através de métodos macro-hemodinâmicos ou através de
marcadores de perfusão tissular, havendo poucos (Svensjö et al 1993; Bouskela et al
1995; Furchgott et al 1980S; Schmidt et al 2000; Spronk et al 2006) com análise direta da
microcirculação e seu comportamento em resposta ao uso de drogas. Em nosso estudo, a
microcirculação foi avaliada por métodos indiretos que se relacionam com a perfusão
tecidual, além de medidas diretas de visualização da microcirculação. Existem restrições ao
uso de drogas vasodilatadoras na sepse porque esta, por si só, já provoca hipotensão e o uso
destas drogas pode aumentar esse risco. Optamos então, por usar uma droga vasodilatadora,
mas que tenha também outros efeitos benéficos na sepse.
Modelo
O animal empregado no experimento foi o hamster de aproximadamente cinco a seis
semanas de vida, de baixo peso corporal, aproximadamente 80 gramas, que pela sua massa
corporal permite uma melhor visualização da microcirculação (Menger 2002).
lvi
Optamos pelo uso da câmara dorsal de titânio para visualização direta da
microcirculação com o animal acordado não havendo portanto, interferência da anestesia.
Essa câmara é colocada uma semana antes da visualização da microcirculação, já que é uma
câmara leve, para que não houvesse também interferência da inflamação pelo trauma
cirúrgico. O uso da câmara dorsal de uso em hamsters descrita por Endrich e colaboradores
em 1980 propiciou nas duas ultimas décadas um número considerável de estudos
experimentais no campo da microcirculação. A microscopia intravital representa uma
técnica sofisticada de estudar a microcirculação na presença de doença ou não e permite
analisá-la por tempo prolongado. É possível por este modelo observar-se a reatividade
vascular com drogas vasoativas, por exemplo a milrinona, sem ter os efeitos associados de
vasodilatação de alguns anestésicos, prejudicando essa avaliação. O sucesso desse modelo é
confirmado pelo número de publicações no campo da pesquisa com microcirculação,
incluindo sua fisiologia, inflamação e sepse, isquemia e reperfusão, angiogênese e
transplante (Funk et al 1985; Menger et al 1989 e 1990). Com esse modelo foram estudados
diferentes peptídeos vasoativos na microcirculação como: angiotensina II, vasopressina,
polipeptídio intestinal vasoativo, fator atrial natriuréico e substância P (Gerstberger 1988);
observando-se vasoconstricção com a angiotensina II, ausência de efeitos com o fator atrial
natriurético e o polipeptídeo intestinal e ainda dilatação arteriolar com a substância P. Além
disso, a câmara dorsal serve para o estudo de dilatação e constrição espontânea arteriolar
(Funk 1983), atendendo portanto ao propósito do nosso estudo de avaliar a ação na
dinâmica microvascular associada a milrinona. Hoffman e cols também descreveram o uso
deste modelo de câmara dorsal para avaliar a microcirculação na inflamação pelo uso
sistêmico de LPS, com conseqüente deterioração da perfusão capilar (Hoffman 1999).
Análise de parâmetros diretos de perfusão da microcirculação
Devido ao uso do LPS houve redução significativa da densidade capilar funcional em
todos os grupos, independente da medicação administrada posteriormente, demostrando
que a endotoxemia altera a perfusão microvascular (Hoffman 1999). Entretanto, na
avaliação da freqüência de vasos com perfusão, observou-se melhora da DCF em todos os
grupos em relação ao grupo LPS, com exceção do grupo LPSRV25. No entanto, este
último apresentou um resultado estatístico limítrofe. Essa diferença mostra que tanto a
milrinona quanto a ressuscitação volumétrica ofereceram proteção à perfusão da
microcirculação através da manutenção dos capilares funcionantes. A ressuscitaçao
volumétrica tem seus efeitos já confirmados na sepse com benefícios comprovados por
lvii
parâmetros clínicos, medidas da macrohemodinâmica e por marcadores da perfusão
tissular, além de comprovada melhora na sobrevida (Rivers 2001; Otero et al 2006). Na
microcirculação essa comprovação é mais recente, tornando-se hoje um dos objetivos
terapêuticos na sepse (Funk 1995; Bateman 2005), já que algumas vezes um benefício na
macrohemodinâmica não se reproduz exatamente em melhora na perfusão tecidual. Tal
fato pode levar a lesão tissular importante, muitas vezes irreversível. De Backer e cols em
2006 demonstraram em seu trabalho com dobutamina que as alterações da microcirculação
avaliadas por OPS não estavam correlacionadas com o IC e a pressão arterial, mas que a
melhora da perfusão tissular estava inversamente relacionada com a queda do lactato.
Ressaltamos que os grupos do nosso trabalho que não foram submetidos a ressuscitação
volumétrica (LPSM25 e LPSM50) foram beneficiados unicamente pelo efeito da droga.
Não houve, entretanto diferença significativa entre os grupos da milrinona e o grupo da
ressuscitação, o que mostraria haver benefícios adicionais no uso dessa droga em relação à
ressuscitação volumétrica somente, já que pelo seu efeito vasodilatador arteriolar haveria
portanto aumento no fluxo na entrada dos capilares. Talvez a menor pressão arteriolar
associada ao uso da droga ou a ausência de dilatação arteriolar adequada, em desacordo
com o esperado, não tivesse melhorado esse fluxo em relação à ressuscitação volumétrica.
Como a ressuscitação volumétrica tem seus benefícios mais do que comprovados na sepse,
esperávamos benefícios adicionais quando esse tratamento estivesse associado a milrinona.
Entretanto mesmo com o emprego isolado da milrinona, foram comprovados efeitos
benéficos em relação ao grupo controle. Outros trabalhos mostram seu benefício, mas
avaliaram só a macrocirculação e marcadores indiretos da perfusão (Liet 2005). O trabalho
experimental de Liet e cols em 2005, demonstra efeito benéfico em coelhos com sepse
induzida por infusão de Pseudomonas aeruginosa após infusão de milrinona, com melhora
nas medidas de índice cardíaco, saturação venosa central, lactacidemia e creatinemia.
Como não houve uso de outras drogas inotrópicas nem ressuscitação volumétrica essa
melhora foi atribuída à droga usada. Embora não tivesse avaliado a microcirculação por
visualização direta, os marcadores de perfusão refletem a oxigenação das células teciduais
e são considerados um bom índice para a avaliação de perfusão tecidual (Vicent et al 1983;
1995). Tal fato nos faz supor qu os achados de Liet e cols (2005) estão parcialmente em
concordância com os encontrados neste estudo. O uso de doses maiores de milrinona
(50mcg/kg) no grupo LPSRV50 teve melhor resultado do que as menores (25 mcg/kg) do
grupo LPSRV25. Isso possivelmente ocorreu por ser a milrinona uma droga vasodilatadora
e inotrópica positiva gerando, portanto um volume sistólico melhor e diminuindo a pós-
lviii
carga. Esses dois fatores vão melhorar o débito cardíaco, fator importante para a melhora
da perfusão tecidual. Hipoteticamente podemos supor que maiores doses gerariam maior
DC e menor resistência vascular sistêmica ou pós-carga. Estudos posteriores com o
emprego de doses de 75 e 100 mcg/kg para avaliar esses efeitos poderá esclarecer essa
possibilidade.
O choque séptico nos estágios iniciais apresenta um estado hiperdinâmico com
aumento do DC e diminuição da RVS. Se progredir evolui para baixo DC com
hipotensão, hipoperfusão tecidual e acidose metabólica (Silver, 2001). As alterações
hemodinâmicas decorrentes da depressão miocárdica e vasoplegia em alguns segmentos
da microcirculação ocorrem pela alteração da sensibilidade dos beta e alfa receptores
(desensibilização adrenérgica), e pelos efeitos de mediadores humorais e intracelulares
incluindo o TNF-α e a IL1, os quais podem também levar a depressão dos cardiomiócitos
( Kumar 2007, Carpati et al 1999, Parrillo et al 1993, Giroir 2000). Atingir a perfusão
tecidual adequada pode ser um desafio. Nos pacientes pediátricos, por exemplo, após a
ressuscitação fluídica alguns deles podem continuar em choque por baixo DC, secundário
à depressão miocárdica (choque séptico refratário). Esse choque se apresenta como a fase
hipodinâmica, com vasoconstrição periférica e baixo DC. Essa progressão é de
importância considerável para o médico intensivista pediátrico, porque há necessidade de
mudar a estratégia terapêutica de grandes quantidades de liquido e vasopressores para
restrição hídrica, inotrópicos e vasodilatadores como: a milrinona; com o intuito de
diminuir a pós–carga, isto é, impedância ao volume ejetado pelo coração (Ceneviva et al
1998). Entretanto, existem outros fatores que podem impedir que o fluxo sangüíneo
chegue a microcirculação como: o edema intersticial pelo extravasamento capilar gerando
compressão dos vasos e a oclusão dos capilares em decorrência da ativação da cascata de
coagulação com deposição de fibrina e formação de microtrombos (Diaz 1998). Esse
impedimento ao fluxo na microcirculação não seria resolvido pela droga em estudo. Já
em relação ao capacidade inotrópica da droga não questionamos sua ação na melhora do
DC e da perfusão tissular.
A disfunção miocárdica biventricular tem sido bem descrita na sepse (Parrillo et al
1990; Vincent et al 1992; Parker et al 1984). Causas potenciais incluem diminuição da
responsividade ou da densidade de receptores adrenérgicos, diminuição da atividade da
adenilciclase, e alteração do metabolismo do cálcio intracelular (Marsh et al 1980; Hung
et al 1993). Parrilo em 1990 e Parker em 1984 e respectivos colaboradores, observaram
que a contratilidade do ventrículo esquerdo estava diminuída e houve dilatação do mesmo
lix
nos pacientes estudados. Também houve importante defeito no relaxamento diastólico
ativo e passivo. A síndrome da disfunção do ventrículo esquerdo se inicia nas 24 horas e
se resolve em 7 a 10 dias, se o paciente sobrevive. A disfunção do VD é similar. Vincent
e colaboradores em 1992 observaram maior fração de ejeção do ventrículo direito nos
pacientes que sobreviveram ao insulto séptico. Atualmente é recomendado na sepse o uso
de drogas vasoativas agonistas beta-adrenérgicas como a dopamina e a dobutamina, que
exercem sua ação através de receptores beta-adrenérgicos aumentando o AMPc e o cálcio
intracelular (Rivers 2001). Entretanto em uma revisão recente (Müllner 2004), concluiu-
se que não há evidência que demonstre maior segurança e efetividade de uma
catecolamina em comparação com a outra. Apesar da literatura médica sugerir para o
manejo prático da sepse o uso de catecolaminas (Mullner et al, 2004) ressaltamos que
existe um déficit na resposta miocárdica às catecolaminas durante o choque séptico e
drogas como dopamina e dobutamina, além de apresentarem resposta diminuída também
apresentam efeitos adversos. São eles:
1. Efeito cronotrópico (aumento de freqüência cardíaca) excessivo que acarreta um
maior consumo de oxigênio miocárdico (Chang et al 1995);
2. Aumento da pós-carga ou resistência vascular sistêmica e pulmonar, levando a um
maior trabalho cardíaco e diminuição do DC;
3. Infraregulação dos beta-receptores ocasionado pela sepse ou pelo uso contínuo dessas
drogas (taquifilaxia) com diminuição da sua eficácia ( Unverferth et al 1980);
4. Efeito termogênico da dobutamina com aumento do consumo de oxigênio sistêmico e
miocárdico (↑VO
2
e MVO
2
) quando comparado ao efeito termogênico da amrinona
(Ruttimann et al 1994 e Uusaro et al
1995).
As vantagens dos inibidores da fosfodiesterase (FDE) sobre as catecolaminas incluem
sua ação independente da ativação dos receptores beta-adrenérgicos. Esses agentes também
podem agir de forma sinérgica com as catecolaminas, conforme estudos experimentais e
clínicos (Jones et al 1995). Barton et al 1996, fez o primeiro estudo, controlado e duplo
cego, dos efeitos cardiovasculares da milrinona em crianças com choque séptico e
determinou seus efeitos hemodinâmicos não hiperdinâmicos, demonstrando aumento do
DC, do volume sistólico (VS), da DO
2
e diminuição da RVS ao compará-los com o grupo
controle.
Em nosso estudo a melhora do DCF na avaliação entre os grupos medicados e
controle ao longo do tempo, com exceção do grupo de LPSRV25, demostra, portanto
melhora na microcirculação tanto com a ressuscitação volumétrica quanto com o uso da
lx
droga. Outros estudos comprovam nossos achados de melhora na sepse embora não sejam
achados relacionados com a microhemodinâmica (Barton et al 1996, Lindsay et al 1998,
Liet et al 2005).
Estudos com a milrinona têm sua comprovação na sepse pediátrica na avaliação
macro-hemodinâmica, principalmente quando há necessidade do uso de inotrópicos, por se
saber como já foi citada, que na sepse ocorre uma dessensibilização adrenérgica e com
prejuízo no uso de drogas adrenérgicas como a dopamina, dobutamina e adrenalina,
gerando o choque refratário a drogas. Esse benefício, porém não tem comprovação micro-
hemodinâmica, gerando uma controvérsia no tratamento, embora tenha sido usada em
pacientes com sepse de diferentes etiologias (Barton et al, 1996 e Lyndsay et al, 1998) e
seja uma das drogas recomendadas pelo American College of Critical Care Medicine
(Carcillo et al, 2002) no choque séptico em pacientes com baixo DC, normotensos e com
aumento da RVS, a fim de melhorar a função cardíaca sem causar hipotensão. Estudos em
animais são poucos e ainda assim usados em momentos diferentes, como na pré-indução da
endotoxemia e, portanto, ainda não conclusivos.
Quando analisamos a variação do diâmetro arteriolar percebemos uma
vasoconstrição em todos os grupos após o uso do LPS como já foi anteriormente descrito
em trabalhos de microcirculação e sepse (Hinshaw et al 1996) . A sepse por conta da
agressão endotelial causa efeitos heterogêneos de constrição e dilatação em diferentes
órgãos e em distintos locais da microcirculação (Lush, 2000), levando a uma desregulação
da vasomotricidades com prejuízo à oxigenação tissular, Tudo isso ocorrendo em um
momento em que o metabolismo aumenta e as células necessitam de mais O
2
. Quando
usamos a milrinona no nosso trabalho não houve qualquer mudança no diâmetro arteriolar.
Devido a alterações dos receptores adrenérgicos e outras não bem compreendidas,
segmentos da microcirculação na sepse estão vasoconstritos, apesar da vasodilatação na
maioria dos segmentos com diferenças reológicas e de resistência vascular, levando a um
fluxo heterogêneo,com conseqüente formação de unidades fracas que seriam as primeiras a
sofrer durante a isquemia, choque e sepse e as últimas a se recobrarem durante a
reperfusão. Essas unidades foram demonstradas em estudos histológicos e fisiológicos
[Hersch, 1990; Avontuur, 1995; Avontuur, 1997; Ince, 1999; Siegemund, 1999]. Drogas
vasoconstrictoras podem ter importância fundamental nos pacientes irresposivos a
reposição volumêmica, frente à grande produção de ON na sepse com conseqüente
hipotensão, por vasodilatação e vasoplegia e ainda por perda de volume para o espaço
extravascular. Entretanto, sob o enfoque microcirculatório, o uso de vasoconstritores pode
lxi
piorar a perfusão. Como descrito anteriormente atualmente o uso dos vasoconstrictores na
sepse tem por objetivo a correção da macrohemodinâmica (pressão arterial) sem, no
entanto, avaliar a microhemodinâmica que é o principal fator de persistência do choque e
de mortalidade (Bateman et al 2005). Várias evidências suportam que a ressuscitação da
pressão arterial e do débito cardíaco não são suficientes para ressuscitar a microcirculação.
LeDoux e colaboradores em 2000, examinaram vários parâmetros hemodinâmicos, assim
como medidas de oxigenação em pacientes tratados com noradrenalina no choque séptico.
A noradrenalina foi titulada para manter a pressão arterial média em 65 mmHg e
posteriormente em 75 e 85 mmHg. Com isso, observaram aumento da FC e DC e
substancial aumento do índice de trabalho ventricular e tendência ao aumento da
resistência vascular sistêmica (RVS), sugerindo que do ponto de vista hemodinâmico, a
noradrenalina foi benéfica, embora tenha aumentado o trabalho miocárdico. Entretanto ao
observar as evidências de alterações de função orgânica e oxigenação tecidual adequada,
notou-se uma diminuição do débito urinário, além de um fluxo capilar com tendência a
diminuição e ausência da melhora da velocidade das hemácias, sugerindo que como
estratégia terapêutica, a ressuscitação da PAM e do débito cardíaco não são suficientes.
Esses resultados levaram a especulação de qual seria a causa do déficit de extração pelos
tecidos, se isso ocorreria secundário a um mau aproveitamento do O
2
pela mitocôndria
(Fink et al 1997) ou se haveria outra causa, já que a oferta de O
2
aos tecidos era
considerada adequada. Entretanto, essa oferta adequada poderia estar sendo inadequada em
algumas áreas da microcirculação e essa hipóxia tecidual regional estar causando a
disfunção celular havendo ainda o que melhorar em termos de ressuscitação regional. Os
procedimentos de dilatação e recrutamento da microcirculação têm como objetivo a
melhora da função microcriculatória nos órgãos e do estresse tecidual. A vasodilatação
nesses casos melhoraria o fluxo microcirculatório, enquanto a vasoconstrição causaria uma
redução (Taylor et al 1999). Apesar de aparentemente paradoxal o emprego de um
vasodilatador em uma doença com baixa resistência vascular sistêmica, devido a um
distúrbio da autoregulação vasomotora que resulta em uma distribuição de fluxo irregular,
nos parece lógico que a vasodilatação dessas unidades beneficie a microcirculação. Spronk
e cols em 2002 usaram nitroglicerina após ressuscitação volêmica em oito pacientes num
período de 6 meses com melhora no fluxo da microcirculação avaliada por OPS. Todos
apresentavam quadro de vasoconstrição periférica com extremidades frias, enchimento
capilar lentificado e pele marmórea. Schmidt e colaboradores em 2000 usando microscopia
intravital na porção do íleo aberta mostraram a melhora do fluxo sanguíneo nas vilosidades
lxii
intestinais nos animais que usaram milrinona, com avaliação de parâmetros micro-
hemodinâmicos, ou seja, o diâmetro médio de arteríolas centrais e a velocidade média das
hemácias nas arteríolas. Houve restabelecimento do fluxo no grupo que usou milrinona
pré-endotoxemia, porém este não foi completo. A necrose de pele e amputação de
extremidades é a maior causa de morbidade da sepse meningocócica. Rich e colaboradores
em 2003 demonstraram o beneficio do uso da milrinona em reduzir o risco de isquemia
possivelmente pela vasodilatação arteriolar, com menor necrose tecidual. Buwalda e
colaboradores (2002) foram pesquisar na literatura para corroborar sua idéia de que o
sofrimento da microcirculação e desvioas AV são componentes fisiopatológicos da sepse
passíveis de correção com o uso de vasodilatadores. Supuseram que o desvio do sangue
oxigenado das regiões afetadas, pela vasoconstrição hipóxica é o responsável pela menor
perfusão tecidual e a terapêutica com vasodilatadores, que aumenta o gradiente de pressão
na microcirculação, facilitaria o fluxo sanguíneo por recrutar as unidades
microcirculatórias e melhorar a oxigenação tecidual. Existem poucos estudos clínicos e
com algumas variáveis que complicam a conclusão desses, como a melhora da adesividade
leucocitária e agregação plaquetária de algumas drogas o que causaria melhora da
hemoreologia. Também alguns desses estudos se basearam na avaliação da
macrohemodinâmica deixando os efeitos da microhemodinâmica em caráter especulativo.
Poucas técnicas estavam disponíveis para acessar o estado funcional da microcirculação,
mesmo nos trabalhos experimentais. A avaliação também se tornava difícil, porque cada
trabalho tinha um objetivo final diferente, o que dificultava sua comparação. Foram
selecionados trabalhos experimentais e clínicos, mas somente julgados aqueles em que os
efeitos da terapia vasodilatadora eram analisados por medidas regionais, variáveis de
transporte de oxigênio (variáveis de extração de O
2
, isquemia regional, fluxo
microcirculatório ou medidas de oxigenação tecidual (Bihari et al 1987, De Backer et al
1993, Zhang et al, 1997, Siegemund et al 2000). Foram usadas drogas como prostaciclina,
doadores de ON, pentoxifilina, N-acetilcisteina, sendo as duas primeiras as mais usadas em
trabalhos de sepse experimental, mostrando melhora da perfusão tecidual e da extração de
O2 (Bihari et al 1987, De Backer et al 1993, Hanneman et al 1994). Trabalhos mais
recentes com o emprego do OPS mostraram recrutamento da microcirculação com
doadores de ON em pacientes sépticos hemodinamicamente ressuscitados (Spronk et al
2002). De Baker e cols em 2002, mostraram haver melhora da microcirculação sublingual
aplicando acetilcolina local em pacientes com choque séptico, pela produção de ON local.
Estes autores usaram a técnica de OPS, para avaliar de forma fidedigna as alterações de
lxiii
fluxo microcirculatório na sepse e observaram diminuição da densidade vascular, um
grande número de pequenos vasos não-perfundidos ou perfundidos de forma intermitente,
e uma grande heterogeneidade entre as áreas. Essas alterações não eram afetadas pelo
estado hemodinâmico global ou pelo uso de agentes adrenérgicos, sendo mais graves em
não–sobreviventes e totalmente reversíveis com o uso de acetilcolina. Essa melhora sugere
que a vasoconstrição tem um papel central e que o estímulo vasodilatador como resposta
do endotélio estava preservada (Furchgott e Zawadski, 1980) mesmo havendo alguma
lesão endotelial. Entretanto em nosso estudo experimental esses achados nos diâmetros
arteriolares não ocorrearam.
Quando analisamos o diâmetro vênular verificamos que não houve qualquer
variação do mesmo em nosso experimento. Normalmente as veias sofrem dilatações
quando existe congestão venosa secundária a falência miocárdica pela sepse, o que não
ocorreu nos nossos animais. Também devido à distribuição heterogênea de receptores para
P-selectina no endotélio venular pós-capilar existe uma diferença de comportamento da
vênula. Se ocorrer muita adesão, e extravasamento capilar a venula diminui por compresão
externa (pelo edema), se ocorre muita rolagem e formação de trombo a venula aumenta por
pressão interna (Kim et al 2004). Como o objetivo do nosso trabalho não foi avaliar
rolamento ou adesividade, observamos só o comportamento venoso, o qual não se
modificou ao longo do tratamento
Análise de parâmetros indiretos de perfusão da microcirculação
Na avaliação de cada grupo de pressão arterial média (PAM) houve redução desta na 5ª
e 6ª hora, ocorrendo de forma mais precoce nos grupos que usaram a milrinona, mesmo
sem a demonstração de dilatação arteriolar significativa. No entanto, na análise entre os
diversos grupos mostramos que essa alteração não é diferente. Entretanto a PAM
continuou a diminuir no grupo LPS e se estabilizou nos outros grupos com exceção do
grupo LPSM25. A pequena redução da PAM, sem significância estatística só teve aparente
significância biológica nos grupos que não usaram milrinona em dose mais altas, o que
suporta nossa hipótese de que a melhora do débito cardíaco secundária ao efeito inotrópico
da milrinona, mantém uma pressão arterial aparentemente melhor (biologicamente) ao
compará-los com grupos que usaram pouca ou nenhuma milrinona (gráfico 3).
lxiv
A maior parte dos trabalhos de tratamento da sepse procura manter, como objetivo
terapêutico, a pressão arterial sistêmica (Rivers et al 2001, Otero et al 2006) e muitas
drogas são testadas para esse fim. Bouskela E e cols 1995, mostraram que o uso de
iloprost, um análogo da prostaciclina, preveniu a hipotensão e parte da vasoplegia gerada
por doses altas de LPS, melhorando a diminuição do fluxo sanguíneo arteriolar e reduzindo
a vasodilatação. Quando o iloprost foi combinado com a LW- nitro-L-arginine, um
bloqueador de ON, não houve melhora adicional nos resultados.
A disfunção miocárdica que ocorre na sepse, por fatores inflamatórios, de
autoregulação das artérias coronárias, por microtrombos coronarianos e por outras
condições que levam a diminuição da performance cardíaca, com redução do volume
sistólico e quando associado a vasodilatação leva a hipotensão. Ao empregarmos um agente
inotrópico de ação beta adrenérgica, a disregulação desses receptores secundária ao quadro
séptico pode não permitir uma resposta adequada e não melhorar o DC. O uso de uma
droga que atue independente de receptores beta-adrenérgicos, pode ajudar na melhora da
contratilidade miocárdica com conseqüente melhora do DC e manutenção da pressão
arterial.
Kumar e colaboradores em 1999, no intuito de comprovar que o TNF-α produz um
defeito na sinalização de transdução beta-adrenérgica nos miócitos utilizaram um ensaio in
vitro do cardiomiócito neonatal de rato incubado em TNF-α. Dessa forma demonstraram
que os inibidores da fosfodiesterase no choque séptico refratário a catecolaminas exercem
um efeito inotrópico significante por um mecanismo independente da geração de AMPc e
que há um aumento da resposta inotrópica do tecido miocárdico aos inibidores da PDE. Os
cardiomiócitos diminuem sua resposta a epinefrina após serem expostos ao TNF-α e o
tratamento com amrinona reverteu esse efeito. Entre nossos objetivos pudemos comprovar
que o uso da milrinona não aumenta o risco de hipotensão na sepse experimental, já que
não houve diferença estatística entre o grupo controle e os que usaram milrinona. Nosso
trabalho reflete o mesmo resultado de Liet e cols (2005) que empregou milrinona em
coelhos sépticos e mesmo sem ressuscitação volumétrica ou o uso de outra droga vasoativa
não teve redução da pressão arterial.
O lactato não teve aumento significativo ao longo do tempo nos grupos LPSRV e
LPSRV50, mostrando uma manutenção de seus níveis. Apesar disso, na comparação entre
os grupos não houve diferença estatística, mostrando que nem a ressuscitação volumétrica
nem a milrinona foram diferentes nesse método de avaliação indireta de perfusão tecidual.
Nosso achado está de acordo com outros em pacientes com ressuscitação volumétricaca,
lxv
pois o lactato sendo marcador de perfusão está cada vez mais associado à disfunção de
oxigenação tissular e usado como fator prognóstico (Bakker et al, 1996 e Nguyen et al
2004). A medida do lactato não é específica para o metabolismo anaeróbio, já que outros
problemas metabólicos podem elevá-lo, como na disfunção da enzima piruvato-
desidrogenase ou ainda por um aumento da atividade Na
+
-K
+
adenosina trifosfato
secundária a adrenalina ou por diminuição do seu clearance pela disfunção hepática
(Bakker 2001). De Backer 2003 considera a interpretação do lactato incerta e difícil, já que
sofre influências de diversos fatores. Existe uma relação direta entre os níveis altos de
lactato no paciente com choque circulatório e seu prognóstico. Nível de lactato maior ou
iguais a 4 mmol/L é um preditor da mortalidade (Broder et al 1964; Shapiro et al 2005).
Mesmo hemodinamicamente compensados, pacientes com lactato alto, condição conhecida
como choque compensado, estão sob maior risco de morte (Blow et al 1999, Meregalli et al
2004). Quando suas concentrações ultrapassam e permanecem por 4h ou mais a valores de
6 mmol/L ou mais, a mortalidade alcança percentuais de 80-90%. Também relacionado à
morbidade observa-se que quanto mais rápido é seu clearence mais rápida é a recuperação
do paciente. Nguyen e colaboradores em 2004 em concordância com De Backer e
colaboradores em 2003, associam o aumento do clearance nas primeiras 6 horas da sepse
com significativa preservação da função orgânica e melhora da sobrevida. Na emergência
do hospital, eles acompanharam a evolução do lactato sérico em pacientes com sepse grave
durante as primeiras 6 horas de tratamento, demonstrando que um decréscimo de 10% do
lactato sérico esteve relacionado com uma diminuição de 11% na mortalidade. Alem
disso, 29% daqueles sem o decréscimo nos níveis de lactato, apesar de não terem
hipotensão, sua mortalidade excedeu 55%. Howell e colaboradores em 2007, avaliaram o
valor prognóstico de uma única medida de lactato coletada, logo após a admissão do
paciente, com suspeita clínica de infecção e demostraram que este tem valor preditivo para
mortalidade dos primeiros 28 dias, independente de níveis de pressão arterial e outras
medidas relacionadas a macrohemodinâmica. No choque circulatório, Vincent e
colaboradores em 1995, mostraram que com 20 minutos de ressuscitação fluídica os não
sobreviventes eram distinguidos dos sobreviventes pela dosagem de lactato. Nossos
achados na melhora da perfusão tissular não se reproduziram em melhores níveis de lactato.
Não observamos mudança na saturação venosa central na comparação entre todos os
grupos tratados com LPS independente do uso ou não da milrinona associada ou não a
ressuscitação volumétrica. Na avaliação intragrupo, o grupo LPSM25 apresentou melhora
estatística na 4ª hora comparado com o basal. Tal fato pode ser possivelmente explicado por
lxvi
ser a saturação venosa um método com alta sensibilidade, mas baixa especificidade devido
a suas múltiplas variáveis já descritas anteriormente. Qualquer alteração no DC, na
hemoglobina, na saturação arterial de O
2
, pode alterar seus resultados. Além disso, como
este parâmetro avalia o consumo de O
2
dos tecidos se houver um desvio AV na
microcirculação essa medida ficara superestimada. A disfunção mitocondrial, como ocorre
na sepse, também pode explicar este fato já que a célula não usa o O
2
e este retorna para a
vênula. Reinhart 2005 demonstrou em seu estudo que a terapia direcionada e precoce para
pacientes com sepse que inclua como meta a PAM, a pressão venosa central e a saturação
venosa central foi capaz de aumentar a sobrevida. A saturação venosa mista verdadeira
(SvO2) é a da artéria pulmonar, mas devido a dificuldades na cateterização da artéria
pulmonar, a mesma foi substituída pela saturação venosa de veia cava superior (SvcO2).
Essa não tem a mesma equivalência numérica, com um percentual um pouco maior
(Chawla et al 2004), em torno de 5% devido ao deságüe do seio coronariano no AD e tem
sido mais usada em crianças e nas emergências. Reinhart e cols 2004 mostraram boa
correlação entre SvO
2
com ScvO
2
, apesar de ainda haver controvérsias (Reinhart et al 1989
e 2004; Ladakis et al 2001; Chawla et al 2004, Varpula et al 2006, Rivers et al., 2006). O
cateter venoso profundo de veia cava superior pode ser facilmente colocado tanto no
paciente adulto quanto pediátrico e nos dá uma boa indicação da oxigenação tecidual do
individuo. A reomendação da Campanha de Sobrevivência à Sepse (The Surviving Sepsis
Campaign) (Dellinger et al 2004) tem conhecimento da diferença numérica entre SvO
2
e
ScvO
2
, mas reconhece a utilidade clínica baseada em evidências que recomenda uma SvO
2
> 65% e uma ScvO
2
> 70% no protocolo de ressuscitação da sepse severa e choque séptico
(Chawla et al 2004 e Dellinger et al 2004).
Analizando-se o pH observou-se que os grupos que usaram doses mais altas de
milrinona LPSM50 e LPSRV50 não tiveram queda do pH ao longo do tempo, e
mantiveram um pH próximo do normal ao final do experimento. Já na avaliação intergrupo
apesar de não haver diferença estatística, os grupos de doses mais baixas de milrinona ou só
com ressuscitação volumétrica ou ainda os não tratados, tiveram um pH baixo com uma
diferença biológica importante, expressando uma acidose não compensada. Apesar de o pH
ser uma medida mais fácil de ser realizada, mas ainda merecer diversos questionamentos,
Wira e colaboradores em 2004 mostraram que alguns pacientes (22.2%) tinham
gasometrias normais com níveis de lactato de 4 a 6,9 mmol/L. Em níveis mais altos de
lactato, isto é mais que 10mmol/L, isso não foi observado, demonstrando que em todos
aqueles com acidose metabólica grave, o lactato é mais sensível e confiável na evolução do
lxvii
quadro clínico do paciente. Como não houve avaliação do bicarbonato sérico essa medida
de pH pode também expressar uma acidose respiratória.
Sobrevida
Não houve diferença na sobrevida dos grupos tratados ou não, contrariando a maioria
dos trabalhos de sepse e ressuscitação que mostra melhora da sobrevida com a ressuscitação
volumétrica (Rivers et al 2001; Dellinger et al 2004). De forma semelhante o uso da
milrinona também não melhorou a sobrevida de hamsters com sepse por LPS, independente
de reposição volumétrica. Está descrito que o aumento do lactato tem repercussão negativa
na sobrevida, entretanto como nossos animais não tiveram essa alteração não pudemos
fazer a correlação dos níveis de lactato e sobrevida. Porém é importante ressaltar que os
níveis de lactato tem variações importantes já descritas anteriormente e talvez o emprego de
milrinona, apesar de melhorar a perfusão tissular expressa por método direto, não mostra
melhora em parâmetros indiretos, como por exemplo o lactato, o que pode em última
análise repercutir negativamente na sobrevida.
lxviii
XIII. Conclusão
Em nosso trabalho observamos que o emprego da droga milrinona no modelo
melhorou a densidade capilar funcional de animais com endotoxemia induzida por LPS
observada através da metodologia da contagem de capilares perfundidos por área. O fato de
ser um método de análise direta da perfusão tecidual, não sofrendo interferências de outros
mecanismos como ocorre nos métodos de avaliação indireta da microcirculação, torna esse
resultado importante. Entretanto esse achado não se reflete em outros parâmetros de
medida indireta de perfusão, como o lactato e a saturação venosa central. Alem disso outros
achados de visualização direta da microcirculação como os diâmetros arteriolares e venosos
não mostraram melhora com o emprego da milrinona. Observamos na macro-
hemodinâmica um dado positivo relacionado à ausência de diminuição nos níveis de
pressão arterial mesmo nas doses maiores de milrinona, uma droga sabidamente
vasodilatadora. Todos estes achados nos permitem concluir que a milrinona em hamsters
com sepse por LPS, além de ser uma droga segura, demonstrou benefícios na
microcirculação com melhora da perfusão tecidual. Na sepse experimental secundária ao
emprego do LPS, mais estudos devem ser feitos para avaliar a resposta microcirculatória
direta e indireta, assim como na sobrevida, em grupos maiores, com doses maiores e por
tempo de uso mais prolongado.
lxix
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