( PDF ) Micropropagação, teor e constituição química do óleo essencial de gerânio (Pelargonium graveolens L.)

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS

MICROPROPAGAÇÃO, TEOR E CONSTITUIÇÃO

QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE GERÂNIO

(Pelargonium graveolens L.)

SÍLVIA ÁVILA DE ALMEIDA

2009

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS

SÍLVIA ÁVILA DE ALMEIDA

MICROPROPAGAÇÃO, TEOR E CONSTITUIÇÃO

QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE GERÂNIO

(Pelargonium graveolens L.)

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Sergipe, como parte das

exigências do Curso de Mestrado em

Agroecossistemas, área de concentração

Sustentabilidade de Agroecossistemas,

para obtenção do título de Mestre.

Orientadora

Prof

. Dr

. Maria de Fátima Arrigoni-Blank

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE-BRASIL

2009

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

A447m

Almeida, Sílvia Ávila de

Micropropagação, teor e constituição química do óleo essencial de

grânio (pelargonium graveolens L.) / Sílvia Ávila de Almeida. – São

Cristóvão, 2009.

66 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) – Universidade

Federal de Sergipe, 2009.

Orientador: Profª. Drª. Maria de Fátima Arrigoni Blank

1. Agroecossistemas. 2. Óleos essenciais. 3. Pelargonium graveolens

L. - Gerânio. 4. Biodiversidade. 5. Reguladores de crescimento. I.

Título.

CDU 665.528

SÍLVIA ÁVILA DE ALMEIDA

MICROPROPAGAÇÃO, TEOR E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE GERÂNIO (Pelargonium graveolens L.)

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Sergipe, como parte das

exigências do Curso de Mestrado em

Agroecossistemas, área de concentração

Sustentabilidade de Agroecossistemas,

para obtenção do título de Mestre.

APROVADA em 26 de junho de 2009.

Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank

UFS

Prof. Dr. José Magno Queiroz Luz

UFU

Prof

. Dr

. Maria de Fátima Arrigoni-Blank

UFS

(orientadora)

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE - BRASIL

Aos meus pais e ao meu

irmão, que sempre me

apoiaram.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Deus, Inteligência Suprema e Pai de infinita bondade, pelo dom da vida.

Aos meus queridos pais, Pedro e Sueli, pelo carinho, apoio e dedicação

incondicionais. Ao meu irmão querido, Pedro Júnior (Juninho), por estar sempre ao meu

lado, até nas horas de estresse.

À Universidade Federal de Sergipe (UFS) que, por meio do Mestrado em

Agroecossistemas, propiciou a concretização dessa etapa na minha vida.

Ao CNPq, pela bolsa a mim concedida.

À minha orientadora, Prof

. Dr

. Maria de Fátima Arrigoni-Blank, pela

orientação e confiança em mim depositada.

Ao Prof

. Dr. Arie Fitzgerald Blank, pela colaboração.

Aos professores do Curso de Mestrado em Agroecossistemas, pelos

ensinamentos e troca de experiências.

À Elienai e Euvilásia, por todo o apoio e suporte dispensados a mim.

À Eric, pelo carinho e compreensão.

À amiga Aline Borba, por me escutar nos momentos mais complicados e por me

incentivar sempre.

Aos colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos e Melhoramento Vegetal,

pela boa convivência e troca de experiências.

Aos colegas de mestrado, pelas opiniões e ajudas sempre bem-vindas.

Enfim, a todos aqueles que estiveram comigo nessa jornada!!!

SUMÁRIO

Página

RESUMO ................................................................................................................... i

ABSTRACT .............................................................................................................. ii

CAPÍTULO I .............................................................................................................. 1

1. Introdução Geral ..................................................................................................... 1

2. Referencial Teórico ................................................................................................. 2

2.1. A biodiversidade e os agroecossistemas ............................................................... 2

2.2. Origem, botânica e usos de Pelargonium graveolens L. ........................................ 3

2.3. Cultura de tecidos ................................................................................................. 5

2.3.1. Propagação in vitro ............................................................................................ 6

2.3.1.1. Contaminação in vitro .................................................................................... 7

2.3.1.2. Multiplicação in vitro ..................................................................................... 8

2.3.1.3. Aclimatização ................................................................................................. 9

2.4. Óleo essencial ...................................................................................................... 10

2.4.1.Óleo essencial de gerânio ................................................................................... 12

3. Referências Bibliográficas ...................................................................................... 13

CAPÍTULO II: Estabelecimento e multiplicação in vitro de gerânio

(Pelargonium graveolens L.)....................................................................................... 21

1. Resumo .................................................................................................................. 21

2. Abstract ................................................................................................................. 22

3. Introdução .............................................................................................................. 23

4. Material e Métodos ................................................................................................ 24

4.1. Obtenção dos explantes e local ............................................................................. 24

4.2. Condições de cultivo ............................................................................................ 24

4.3. Efeito de concentrações de hipoclorito de sódio, tempos de imersão e

tratamentos na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens .................. 25

4.4. Efeito de concentrações de cloreto de mercúrio, tempos de imersão e

tratamento na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens .................... 25

4.5. Efeito de diferentes explantes e concentrações de sais do meio MS no

estabelecimento in vitro de gerânio ............................................................................. 26

4.6. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento 6-

benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA).......................................... 26

4.7. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento cinetina e ANA ............ 27

4.8. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento BAP e ácido

indol acético (AIA) ..................................................................................................... 27

4.9. Análise estatística ................................................................................................. 27

5. Resultados e Discussão .......................................................................................... 28

5.1. Efeito de concentrações de hipoclorito de sódio, tempos de imersão e

tratamentos na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens .................. 28

5.2. Efeito de concentrações de cloreto de mercúrio, tempos de imersão e

tratamento na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens .................... 30

5.3. Efeito de diferentes explantes e concentrações de sais do meio MS no

estabelecimento in vitro de gerânio ............................................................................. 32

5.4. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento 6-

benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA).......................................... 34

5.5. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento cinetina e ANA ............ 36

5.6. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento BAP e ácido

indol acético (AIA) ..................................................................................................... 38

6. Conclusões ............................................................................................................. 44

7. Referências Bibliográficas ...................................................................................... 44

CAPÍTULO III: Aclimatização, teor e constituição química do óleo essencial de

gerânio (Pelargonium graveolens L.) ......................................................................... 48

1. Resumo .................................................................................................................. 48

2. Abstract ................................................................................................................. 49

3. Introdução .............................................................................................................. 50

4. Material e Métodos ................................................................................................ 51

4.1. Local .................................................................................................................... 51

4.2. Aclimatização de mudas micropropagadas ........................................................... 51

4.3. Plantio em campo ................................................................................................. 52

4.4. Extração, teor e análise química do óleo essencial ................................................ 52

4.5. Análise estatística ................................................................................................. 53

5. Resultados e Discussão .......................................................................................... 53

5.1. Aclimatização de mudas micropropagadas ........................................................... 53

5.2. Extração, teor e análise química do óleo essencial ................................................ 55

6. Conclusão .............................................................................................................. 57

7. Referências Bibliográficas ...................................................................................... 57

ANEXOS .................................................................................................................... 60

RESUMO

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. Micropropagação, teor e constituição química do óleo

essencial de gerânio (Pelargonium graveolens L.). 2009. 66p. (Dissertação – Mestrado

em Agroecossistemas). Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE.

Muitas espécies vegetais sintetizam e acumulam substâncias orgânicas, tais como os

óleos essenciais, que podem se tornar alternativa de renda para muitos agricultores. O

Pelargonium graveolens L. é uma espécie aromática nativa da África do Sul,

popularmente conhecida como gerânio. Seu óleo essencial é amplamente empregado em

indústrias de perfumes, cosméticos e fragrâncias, além da aromaterapia. Os métodos

convencionais de propagação vegetativa do gerânio não apresentam sucesso

considerável, o que tem dificultado a produção de mudas em larga escala. Dessa forma,

é importante buscar técnicas alternativas de propagação, como a micropropagação,

dessa espécie comercialmente importante. Os objetivos do presente trabalho foram

estabelecer um protocolo de micropropagação e aclimatização da espécie, além de

verificar o teor e a composição química do seu óleo essencial. Foi utilizado o

delineamento inteiramente casualizado. Nos ensaios de micropropagação foram testadas

diferentes concentrações e tempos de imersão de hipoclorito de sódio e cloreto de

mercúrio, diferentes tipos de explantes e concentrações de sais MS, além de testar os

reguladores de crescimento BAP, ANA, cinetina e AIA em diferentes concentrações na

ausência e presença de luz. Para o ensaio de aclimatização foram testados diferentes

substratos. Por fim, para a análise do óleo essencial foram utilizadas plantas propagadas

através da estaquia e micropropagadas. O hipoclorito de sódio a 1,2% por 12 minutos

pode ser usado na desinfestação dos explantes de gerânio, assim como o cloreto de

mercúrio nas concentrações de 0,09 e 0,08% por 12 e 14 minutos, respectivamente. O

explante foliar é o mais eficiente para a micropropagação em meio MS com 39,8% dos

sais. Para a multiplicação in vitro o uso de BAP e AIA proporciona os melhores

resultados para a regeneração e para o número de brotos por explante e na aclimatização

pode-se usar os substratos vermiculita com adição semanal de sais MS, pó de coco +

Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) e pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12

g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) + vermiculita (1:1). Há diferença no teor e composição

química do óleo de gerânio proveniente de plantas propagadas por estaquia e

micropropagadas.

Palavras-chave: Pelargonium graveolens, cultura de tecidos, reguladores de

crescimento, substratos, óleo essencial.

___________________

Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Orientadora), Arie

Fitzgerald Blank – UFS (Co-orientador).

ABSTRACT

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. Micropropagation, essential oil content and chemical

composition of geranium (Pelargonium graveolens L.). 2009. 66p. (Dissertation –

Master Program in Agroecosystems). Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE.

A lot of vegetable species synthesize and accumulate organic substances, such as

essential oils, that can be turned in alternative income for rural producers. Pelargonium

graveolens L. is a native aromatic species from South Africa, commonly known as

geranium. Its essential oil is largely used in perfume, cosmetics and fragrances

industries, besides the aromatherapy. The conventional vegetative propagation methods

of geranium do not present considerable success, which difficult the production of

transplants in large scale. This way it is important to look for alternative production

techniques, such as micropropagation, for this commercially important species. The

aims of this work were to establish a protocol for micropopagation and acclimatization

of geranium, besides investigating of essential oil content and chemical composition.

The completely randomized design was used. For the micropropagation assays were

tested different concentrations and immersion times of sodium hypochlorite and

mercury chloride, different types of explants and MS salts concentrations, besides

testing different concentrations of the plant growth regulators BAP, NAA, kinetin and

IAA at presence and absence of light. For the acclimatization assay different substrates

were tested. To analyze the essential oil we use plants propagated by rooting of cuttings

and by micropropagation. Sodium hypochlorite at 1.2% for 12 minutes can be used for

disinfestation of geranium explants, as well as mercury chloride at 0.09 and 0.08% for

12 and 14 minutes, respectively. The leaf explant is more effective for geranium

micropropagation using MS medium with 39.8% of its salts. BAP and IAA

proportionate the best results for in vitro multiplication and regeneration and number of

shoots per explant. For acclimatization the substrates vermiculite and weekly addition

of solution with salts of MS medium, coconut dust + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) +

lime stone (1 g.L

-1

) and coconut dust + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + lime stone (1

g.L

-1

) + vermiculite (1:1) can be used. There is a difference in geranium essential oil

content and chemical composition between plants obtained from rooted cuttings and

micropropagation.

Keywords: Pelargonium graveolens, tissue culture, growth regulators, substrates,

essential oil.

____________________

Guidance Committee: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Adviser), Arie Fitzgerald

Blank – UFS (Co- Adviser).

CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO GERAL

Durante milhares de anos, o conhecimento do homem acerca das plantas era

apenas de natureza prática e limitado a uma quantidade, relativamente pequena, de

espécies. Conhecia apenas as plantas úteis, valorizadas pelas suas virtudes curativas,

pelas fibras que delas extraía ou pelo alimento que lhe propiciava. Mas, com o passar do

tempo, os conhecimentos foram se aprimorando e o homem passou a utilizar as plantas

mais racionalmente, de forma a usufruir melhor as potencialidades das espécies

vegetais.

As plantas são uma fonte valiosa de compostos químicos. Muitas espécies

vegetais sintetizam e acumulam substâncias orgânicas em quantidades suficientes para

uso econômico. Dentre essas substâncias estão os óleos essenciais, que podem se tornar

alternativa de renda para muitos agricultores, ainda mais quando obtém produtos com

valor agregado. A fonte de renda extra pode ser alcançada com a venda desses óleos

para a indústria farmacêutica, de perfumaria, alimentícia e de agronegócio.

Pelargonium graveolens L. (Geraniaceae) é uma espécie aromática nativa da

África do Sul, popularmente conhecida como gerânio (SIMON, 1984). Por apresentar-

se estável em meio alcalino, o óleo de gerânio é ideal para perfumar sabonetes, sendo

extensivamente aplicado nas indústrias de perfumes, cosméticos e fragrâncias e na

aromaterapia, além de ser usado para o preparo do composto comercial rodinol

(geraniol + citronelol + linalol) (BABU e KAUL, 2005). O óleo de gerânio é

amplamente apreciado em diversos países, de forma que na Índia, por exemplo, a

demanda excede a produção no país (RAO, 2002). Esse óleo está entre os óleos

essenciais importados pelo Brasil para abastecer o mercado interno, num volume de

cerca de 5 t/ano (BRASIL, 2007).

Segundo Charlwood e Lis-Balchin (2002), a propagação de espécies do gênero

Pelargonium com propósito comercial tem sido um problema devido a escassa

produção de sementes e doenças, além de outras particularidades. A propagação por

meio de estaquia não apresenta, até o momento, sucesso considerável, o que tem

dificultado a produção de mudas em larga escala. Dessa forma, torna-se necessário

buscar técnicas alternativas de propagação, como a micropropagação, com o intuito de

se obter uma maior produtividade dessas espécies comercialmente importantes.

Algumas espécies diferentes de Pelargonium já foram micropropagadas,

principalmente ornamentais, com o intuito de produção massal para as principais

colheitas de „gerânios‟ (CHARLWOOD e LIS-BALCHIN, 2002). Diante do exposto, o

objetivo desse trabalho foi estabelecer um protocolo de micropropagação e

aclimatização de gerânio visando à produção de seu óleo essencial.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. A biodiversidade e os agroecossistemas

A biodiversidade está relacionada com a diversidade dos seres vivos e dos

ecossistemas e é representada pala diversidade genética, diversidade de espécies e

diversidade de habitats (RICKLEFS, 2003). Essa diversidade é elemento essencial para

o equilíbrio ambiental planetário, capacitando os ecossistemas a reagirem melhor às

alterações sobre o meio ambiente causadas por fatores naturais e sociais. A

biodiversidade oferece também condições para que a própria humanidade adapte-se às

mudanças operadas em seus meios físico e social e disponha de recursos que atendam

suas demandas e necessidades. Historicamente, dentre as áreas de aproveitamento de

recursos genéticos e biológicos, destacam-se a alimentação, a agricultura e a medicina,

dentre outras aplicações (ALBAGLI, 1998).

Desde os primórdios, o ser humano interage com a natureza, provocando

profundas transformações no meio ambiente. A necessidade de produção de fibras,

alimentos e riquezas levaram o homem ao aperfeiçoamento do instrumental de

intervenção e modificação das condições ambientais.

No Brasil, os sistemas agrícolas desenvolveram-se não só por meio da expansão

agrícola como também através de ganhos de produtividade (MARQUES, 2001). Isso se

deu pela incorporação, sobretudo a partir da segunda metade do século XX, de um

conjunto de tecnologias ditas “avançadas” ou “modernas” (PAULUS e

SCHLINDWEIN, 2001). A incorporação dessas tecnologias vem provocando, desde o

final da década de 60, uma série de impactos nos agroecossistemas (MARQUES, 2001).

Um agroecossistema é considerado produtivo e saudável quando apresenta um

equilíbrio entre plantas, solos, nutrientes, luz solar, umidade e outros organismos

coexistentes, de forma que o sistema permaneça resiliente de modo a tolerar estresses e

adversidades (FIGUEIREDO, 2002). Além dos aspectos ambientais, sabe-se que os

agroecossistemas envolvem também processos sociais, sendo a agricultura o resultado

da co-evolução de sistemas naturais e sociais (AQUINO e ASSIS, 2007). No entanto, o

que se vê é a manutenção de um sistema político-social que pode perpetuar situações de

distribuição e utilização dos recursos profundamente desiguais (LUCON, 2004).

Nesse contexto, a idéia de agricultura sustentável é amplamente difundida e, de

acordo com a AGENDA 21, isso é um reflexo da insatisfação com o status quo da

agricultura moderna. Indica o desejo social de se adotar práticas que, simultaneamente,

conservem os recursos naturais e forneçam produtos mais saudáveis. Reforçando,

Marzall (2007) afirma que a sustentabilidade nos agroecossistemas só pode ser

alcançada se houver interação entre os diversos fatores de natureza social, econômica e

ambiental.

Desta forma, o modelo de uma agricultura sustentável busca resgatar o homem, o

meio ambiente e o contexto sócio-econômico da realidade rural local, (re) criando um

espaço agrícola diversificado que explore a biodiversidade do meio, usando tecnologias

adaptadas ecológica, econômica e socialmente (CARRIERI, 1997).

É importante que se invista em conhecimento científico e tecnológico que

permita desenvolver sistemas de produção inovadores voltados para o aumento da

produtividade dos recursos naturais, a fim de garantir a sustentabilidade do ambiente e

da estrutura produtiva (SOUZA, 2007). Dentre as mais diversas tecnologias está a

biotecnologia, que, nos últimos anos, tem sido considerada uma área tecnológica com

grandes perspectivas de crescimento e uma solução para diversos problemas, inclusive

no setor agrícola.

Algumas espécies, como o gerânio, apresentam problemas com os métodos

convencionais de propagação, como a propagação por estaquia. Daí surge a necessidade

de buscar técnicas alternativas, como a cultura de tecidos, que, por meio da

micropropagação, permite uma produção rápida de mudas e com ótima qualidade

fitossanitária, o que se torna extremamente importante quando se trata de espécies

comercialmente valorizadas.

2.2. Origem, botânica e usos de Pelargonium graveolens L.

Gerânio é o nome genérico dado às espécies do gênero Pelargonium,

pertencente à família Geraniaceae, que possui cerca de 280 espécies disseminadas pela

Europa, Ásia, América do Norte e África, sendo as mais exploradas por suas

propriedades aromáticas o P. odoratissimim, P. roseum, P. graveolens e P. capitatum

(MILLLER, 2002). É um gênero bem adaptado ao clima das regiões sul e sudeste do

Brasil e que, por apresentar alta capacidade de hibridização, grande parte do material

genético presente no Brasil é fruto de cruzamentos ocorridos naturalmente (MAY et al.,

2007).

Pelargonium graveolens L. é uma das muitas espécies aromáticas do gênero

Pelargonium usadas para extração do seu óleo essencial, sendo vulgarmente conhecida

como malva-rosa ou gerânio (SIMON, 1984) (Figura 1). Originária da África do Sul, é

uma espécie perene, robusta, subarbustiva, podendo chegar a 1,5 m de altura, muito

ramificada com caule pubescente (MILLER, 2002). Possui folhas simples, alternas,

palmatilobadas, com 3,5 ou 7 lóbulos recortados, verde-claras com nervuras salientes e

aromáticas (SIMON, 1984). As flores variam do rosa ao púrpuro claro, com

inflorescência contendo de 5 a 10 flores; as pétalas superiores são pequenas, com pontas

arredondadas ou recortadas, os estames possuem anteras pequenas que raramente

possuem pólen (MILLER, 2002).

FIGURA 1. Gerânio (Pelargonium graveolens L.) cultivado em casa de vegetação

localizada no Departamento de Agronomia (UFS), município de São Cristóvão-SE,

2008.

Um bom desenvolvimento das plantas é obtido em solos bem drenados, férteis e

sob uma umidade relativa elevada. Embora as espécies sejam sensíveis elas possuem

certa tolerância ao frio e a seca, florescendo em condições ensolaradas, em clima

temperado e subtropical (SIMON, 1984).

O P. graveolens é usado, principalmente, para produção de óleos essenciais. Seu

aroma doce e quente, semelhante ao de pétalas de rosas é comercialmente conhecido

como óleo de gerânio e amplamente usado em sabonetes e nas indústrias de perfumaria

e cosméticos (SATYAKALA et al., 1995; SAXENA et. al., 2000; KO et al., 2007),

sendo também utilizado como terapêutico (aromaterapia) para combater problemas da

menopausa, de pele, tensão nervosa e ansiedade (RAO, 2002). Pode também ser usado

como aromatizante em produtos de fumo, em pastas de dente, pomadas e outras

preparações farmacêuticas (MISRA et al., 2005), além de apresentar atividade

antimicrobiana (SHIN, 2003).

2.3. Cultura de tecidos de plantas

A biotecnologia moderna inclui metodologias avançadas de genética, biologia

molecular, engenharia genética, cultura de células e tecidos, clonagem de espécies e

variedades biológicas, para fins produtivos (CARVALHO et al., 2006).

Na técnica de cultura de tecidos vegetais, pequenos fragmentos de tecido vivo,

chamados explantes, são isolados de um organismo vegetal ou obtidos a partir destes,

desinfestados e cultivados assepticamente, por períodos indefinidos em um meio de

cultura apropriado sob condições adequadas (ANDRADE, 2002; AMARAL e SILVA,

2003). Esta técnica se baseia principalmente na totipotencialidade das plantas, ou seja,

no potencial que todas as células vegetais vivas possuem de regenerar uma planta inteira

(RAVEN, 2001).

Existem inúmeras aplicações da técnica de cultura de tecidos. Segundo George

(1996), a cultura de tecidos além de permitir a propagação de espécies com problemas

de propagação sexuada, possibilita a obtenção de plantas isentas de virose e de clones

de genótipos mais produtivos, preservação e intercâmbio de germoplasma e estudos

envolvendo biologia molecular. Já no campo da pesquisa básica, a cultura de tecidos dá

suporte técnico a diversas áreas, como à bioquímica, à fisiologia vegetal, à citogenética

e à fitopatologia (CID, 2001).

Sem dúvida, a cultura de tecidos tem demonstrado grande importância prática e

potencial nas áreas agrícolas, florestal, na horticultura, floricultura, bem como na

pesquisa básica. A multiplicação in vitro de plantas de importância econômica, em larga

escala, tem resultado na instalação de verdadeiras “fábricas de plantas”, as chamadas

biofábricas comerciais, baseadas no princípio de linha de produção (WILLADINO e

CÂMARA, 2007).

2.3.1. Propagação in vitro

A propagação vegetativa in vitro, também denominada de micropropagação

devido ao tamanho dos propágulos utilizados, é a técnica de maior aplicabilidade da

cultura de tecidos e aquela de maior impacto, uma vez que proporciona obtenção de um

grande número de plantas com elevado nível qualitativo (GRATTAPAGLIA e

MACHADO, 1998), sendo apropriado para clonar indivíduos melhorados produzindo

progênies homogêneas, além de ser uma alternativa que possibilita a conservação do

material genético e favorece o melhoramento da espécie (LAMEIRA et. al., 2005).

Diferentes espécies e cultivares possuem características genéticas próprias que

as fazem responder diferentemente ao cultivo in vitro. Segundo Pereira e Fortes (2001),

as diferenças na capacidade de regeneração e multiplicação podem ser explicadas pelo

tipo de explante utilizado. São comuns os efeitos da posição e da idade dos explantes

sobre a regeneração e multiplicação.

Grande parte dos trabalhos de regeneração de plantas do gênero Pelargonium foi

realizada a partir de explantes jovens, tais como hipocótilos (SENARATNA et al.,

1999) ou hipocótilo e cotilédones (MURTH et al., 1996), via embriogênese somática.

Poucas informações estão disponíveis sobre organogênese e regeneração de plantas

usando explantes maduros (HASSANEIN e DORION, 2005). Trabalhando com

Pelargonium x hortorum, Agarwal e Ranu (2000), obtiveram uma alta habilidade de

regeneração de pecíolo foliar, enquanto que Hassanein e Dorion (2005), obtiveram

100% de regeneração direta em P. capitatum e P. graveolens utilizando segmento foliar

e meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) suplementado com 0,5 mg.L

-1

de ácido

naftalenoacético (ANA) em combinação com 1 mg.L

-1

de 6-benzilaminopurina (BAP) e

zeatina na ausência de luz.

Na micropropagação de Curcuma zedoaria Roscoe, uma planta aromática cujo

óleo essencial é bastante explorado comercialmente, obteve-se bons resultados ao

utilizar ápices caulinares em meio MS suplementado com BAP (MELLO et al., 2000).

Já Silva et al. (2005) conseguiram otimizar a micropropagação de Citrus reshni Hort. ex

Tan., uma espécie de características agronômicas superiores em relação à outras

espécies do gênero Citrus, utilizando segmentos de epicótilo em meio de cultura

contendo BAP.

2.3.1.1. Contaminação in vitro

Um dos maiores problemas enfrentados na micropropagação diz respeito à

contaminação por microorganismos, podendo chegar a ser um fator limitante para o

estabelecimento e cultivo in vitro de certos explantes (RIBAS et al., 2003). Para que a

planta formada a partir do cultivo in vitro apresente uma boa qualidade fitossanitária, é

importante que os métodos de desinfestação sejam eficazes, proporcionando ausência

total de agentes contaminantes (NASCIMENTO et al., 2007).

Várias substâncias com ação germicida são utilizadas na desinfestação dos

explantes. Os mais comuns são o etanol e os compostos a base de cloro, tais como

hipoclorito de sódio e de cálcio (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Em

amoreira-preta (Rubus sp.) a contaminação dos explantes foi reduzida com a imersão de

explantes em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 0,5% em diferentes tempos de

imersão (0, 10, 20 e 30 minutos) (AUGUSTO e BIASI, 2002). Em Lippia integrifolia

obteve-se 24% de contaminação, utilizando solução de NaOCl a 1,2% por 30 minutos

(PASSERA e AMBROSETTI, 1999) e em Lippia junelliana (Mold.) Tronc. obteve-se o

controle da contaminação com 10% de NaOCl por 10 minutos (JULIANI JR. et al.,

1999). Outros agentes desinfestantes utilizados incluem o cloreto de mercúrio, o ácido

clorídrico, o cloreto de benzalcônio e a água oxigenada. No caso do uso de cloreto de

mercúrio, foi observada uma boa regeneração em patchouli (Pogostemon cablin)

(KUKREJA et al., 1990) e gerânio (Pelargonium graveolens) (SAXENA et al., 2000).

A concentração dos agentes desinfestantes e o tempo de exposição dos explantes

a estes compostos pode variar de acordo com a espécie (MONTARROYOS, 2000).

Outros fatores determinantes para a escolha do tipo de tratamento de desinfestação são a

idade da planta matriz, a época do ano e o local de coleta (GEORGE, 1996).

2.3.1.2. Multiplicação in vitro

Na fase de multiplicação in vitro tem-se por objetivo a produção do maior

número possível de plantas, em um espaço de tempo relativamente curto. Vários fatores

são importantes na multiplização in vitro, tais como aqueles referentes aos reguladores

de crescimento (CHAVES et al., 2005; RIBEIRO et al., 2007).

Os fitohormônios ou hormônios vegetais são aqueles produzidos pela própria

planta; em baixas concentrações, são biologicamente ativos, podendo promover, inibir

ou modificar o crescimento, geralmente em um local diferente daquele onde foi

produzido. Os reguladores de crescimento são substâncias sintéticas que produzem

efeitos semelhantes aos produzidos pelos hormônios naturais (CARVALHO et al.,

2006). Os fitormônios são classificados em cinco grupos: auxinas, citocininas,

giberelinas, etileno e inibidores. Os reguladores de crescimento mais utilizados na

micropropagação são auxinas, citocininas e giberelinas (CID, 2001).

As auxinas são bastante utilizadas quando se quer induzir o desenvolvimento de

nós, a formação de calos, e o desenvolvimento de raízes adventícias; as auxinas mais

usadas no cultivo in vitro são o ácido indol-3-acético (AIA), o ácido indol-3-butírico

(AIB), o ácido a-naftalenoacético (ANA) e o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

(CARVALHO, 1999).

No que se refere as citocininas, elas são usadas para estimular a divisão celular,

sendo que em concentrações elevadas induzem a formação de brotos adventícios e

inibem a formação de raízes. As mais comuns são a cinetina, zeatina, o BAP e o 2iP

(CARVALHO, 1999).

Atuando conjuntamente com as auxinas, as citocininas tornam-se fundamentais,

pois, promovem alterações na taxa metabólica, atividade enzimática, indução de

formação de órgãos, quebra de dominância apical, mobilização de nutrientes orgânicos

e inorgânicos e aumento de tecidos e órgãos (KERBAUY, 2004). As auxinas e as

citocininas diferem dos demais hormônios vegetais em um aspecto importante: elas são

necessárias para a viabilidade do crescimento e do desenvolvimento do vegetal, ou seja,

para a morfogênese (TAIZ e ZEIGER, 2004).

Na multiplicação do porta-enxerto de macieira M-7 (Malus sp.), o AIB foi mais

eficiente do que AIA e ANA (SILVEIRA et al., 2001). A combinação de cinetina e

ANA promoveu melhores resultados no percentual de sobrevivência e taxa de

multiplicação in vitro da espécie Carica papaya L. (SCHMILDT et al., 2007). Na

micropropagação de amoreira-preta (Rubus sp.) cultivar „Ébano‟, Villa et al. (2005)

concluíram que a adição de 1 mg.L

-1

de BAP promove a multiplicação in vitro.

Trabalhando com figueira (Ficus carica L.), observou-se que o uso de 2 mg.L

-1

BAP na

ausência de ANA trouxe melhores resultados para o comprimento de raízes e de brotos

(BRUM et al., 2002).

Já as giberelinas induzem o crescimento de nós e de meristemas ou gemas in

vitro, podendo também romper a dormência de embriões isolados ou gemas e inibir a

formação de brotos ou raízes adventícias. A giberelina mais comum é o ácido giberélico

(GA

) (CARVALHO et al., 1999). Na multiplicação in vitro de Ficus carica L., o GA

reduziu a formação e a multiplicação de brotos (FRÁGUAS et al., 2004).

2.3.1.3. Aclimatização

Durante as fases da cultura in vitro, as plantas crescem sob condições especiais

em ambientes fechados, sem trocas gasosas, com alta umidade do ar, baixa intensidade

luminosa e utilizando açúcares do meio como fonte de carbono e energia. O período de

transição da fase in vitro para a ex vitro, conhecida como período de aclimatização, é

uma das etapas mais importantes no processo de obtenção de plantas pela técnica de

cultura de tecidos (PREECE e SUTTER, 1991).

Na aclimatização ocorre a transferência das mudas produzidas in vitro para o

ambiente externo, a casa de vegetação e, posteriormente para o campo. Fatores como

genótipo, estresse hídrico, alteração do metabolismo heterotrófico (in vitro) para o

autotrófico, infecção por patógenos e estresse pela luz, além das variações de

temperatura, interferem no sucesso da aclimatização (SILVA et al., 2003).

Esse processo consiste de modificações morfo-anatômico-fisiológicas

necessárias às plantas para que possam sobreviver em um novo ambiente (CARVALHO

et al., 1999). Essa fase de transição predispõe as plantas a um desequilíbrio hídrico e

nutricional, decorrente de limitações de natureza anatômica e fisiológica, características

das plantas micropropagadas. Tais limitações incluem cutícula pouco espessa,

estômatos não funcionais, nutrição heterotrófica e sistema radicular pouco desenvolvido

(AZCÓN-AGUILAR e BAREA, 1997).

Fatores como substrato, genótipo, estresse hídrico, tipo e a qualidade do sistema

radicular obtidos são importantes para se obter sucesso na sobrevivência das plantas.

Raízes curtas, em geral, são mais desejáveis, pois, além de facilitarem o manuseio no

momento do plantio, normalmente estão numa fase de crescimento ativo, o que facilita

o pegamento da planta (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Quando se trabalha

em grande escala, mesmo com um percentual relativamente pequeno de morte dessas

plantas, isso pode significar um prejuízo econômico considerável devido ao alto

investimento e emprego de mão-de-obra nessa técnica (TERCEIRO NETO et al., 2004).

Na micropropagação de Gypsophila paniculata cultivar Bristol Fairy, é

necessário o enraizamento in vitro. Entretanto, para melhorar a produção de massa

fresca e seca, volume e sobrevivência das plantas durante o período de aclimatização,

recomenda-se a não utilização do ácido indol butírico (AIB) (BOSA et al., 2003).

A escolha do substrato apropriado pode ser decisiva para a aclimatização. O

substrato deve ter baixa densidade, rico em nutrientes, composição química equilibrada

e física uniforme, boa aeração e drenagem, boa coesão entre as partículas e raízes

(HOFFMANN, 2002).

Na aclimatização de mudas micropropagadas do genótipo UFC de Mentha

arvensis os substratos compostos por pó de coco foram os mais eficientes (FONSECA

et al., 2008). Na aclimatização de antúrio, as mudas que apresentaram melhor

crescimento e desenvolvimento foram aquelas aclimatizadas no substrato pó de coco,

seguido do substrato vermiculita (SILVA et al., 2007). Já em trabalhos com gengibre

(Zingiber officinalle), verificou-se que o substrato de casca de arroz carbonizada e areia

(1:1) proporcionou uma condição ótima de pré-estabelecimento a campo das mudas

micropropagadas (DEBIASI et al., 2004). Durante a aclimatização de plantas

micropropagadas do porta-enxerto Mirabolano 29C (P. cerasifera), a composição casca

de arroz carbonizada e substrato comercial plantmax® (1:3, v/v) foi a que propiciou os

melhores resultados no que se refere a porcentagem de sobrevivência, comprimento da

parte aérea e da raiz e peso da matéria fresca e seca da parte aérea e da raiz (COUTO et

al., 2003).

2.4. Óleo essencial

Os produtos do metabolismo secundário de algumas espécies vegetais são

valorizados tanto por suas características aromáticas e terapêuticas quanto por serem

matéria-prima para a indústria, quer como constituinte nas formulações de produtos para

higiene e saúde, quer como ingredientes ativos de sabor e fragrância da indústria de

perfumarias e cosméticos, além de serem muito utilizados na medicina alternativa,

agregando assim importância econômica a esses compostos (GIRARD, 2005).

Os óleos essenciais podem ser chamados de óleos voláteis, óleos etéreos devido

à solubilidade em éter, ou essenciais pelos seus aromas característicos. De acordo com a

ISO (International Standard Organization), óleos voláteis são produtos obtidos de partes

de plantas através de diferentes técnicas de extração, tais como arraste por vapor d‟água,

hidrodestilação, CO

supercrítico, entre outros. A designação de óleos se dá devido a

algumas características físico-químicas como a de serem líquidos de aparência oleosa

em temperatura ambiente, tendo como principal característica a volatilidade (SIMÕES e

SPITZER, 2004).

Dentre as espécies produtoras de óleos essenciais que contribuem

significativamente no volume mundial comercializado, pode-se destacar a menta

(Mentha pipperita), a citronela (Cymbopogon winterianus), o capim-limão

(Cymbopogon flexuosus), o eucalipto (Eucalyptus), a rosa (Rosa damacena), o gerânio

(P. graveolens), a lavanda (Lavandula officinalis), a camomila (Chamomilla recutita), o

sândalo (Santalum album), a manjerona (Origanum majorana) e sálvia (Salvia

officinalis) (GIRARD, 2005).

Os óleos essenciais são uma mistura complexa de algumas centenas de

compostos químicos, sendo que muitos destes podem ser agrupados em grandes classes.

Numa visão geral de importância e dos componentes característicos os compostos são

classificados em 4 grandes grupos: compostos alifáticos, terpenos e terpeno derivados,

benzeno derivados e compostos variados (OYEN e DUNG, 1998). Os constituintes dos

óleos essenciais das plantas se encaixam dentro de duas classes: terpenóides e

fenilpropanóides. Contudo, os terpenos representam a maioria dos componentes,

ocorrendo com maior freqüência e abundância, representados principalmente por

monoterpenos e sesquiterpenos (SANGWAN et al., 2001; ALMEIDA, 2006).

Entre os constituintes do óleo essencial, alguns estão presentes em maior

concentração, sendo conhecidos como componentes principais, enquanto que os

componentes encontrados em baixas concentrações são chamados de componentes traço

(VITTI e BRITO, 2003).

Embora todos os órgãos possam acumular óleos voláteis, sua composição,

características físico-químicas e odores podem variar de acordo com sua localização nos

diferentes órgãos de uma mesma planta. A composição química de um óleo volátil

extraído do mesmo órgão de uma espécie vegetal também pode variar de acordo com

aspectos de cultivo como época de colheita, condições climáticas e de solo (SIMÕES e

SPITZER, 2001). Em trabalhos com dois morfotipos (vermelha e branca) de Croton

cajucara Benth., foi possível observar variações quantitativas e qualitativas na

composição química dos diferentes morfotipos (CHAVES et al., 2006). Já em Mentha

piperita L., a aplicação de GA

durante o cultivo não interferiu no rendimento e

composição do óleo essencial, ao passo que a aplicação de BAP, embora não tenha

afetado o rendimento, alterou a composição do mesmo (SCAVRONI et al., 2006).

Trabalhando com sambacaitá (Hyptis pectinata L. POIT.), Arrigoni-Blank

(2005) verificou que os horários de colheita e a secagem das folhas não influenciaram

no teor do óleo essencial, mas as épocas de colheita contribuíram para as diferenças

quantitativas no teor e nos constituintes químicos. Já em Lippia alba, Gupta et al.

(2001) verificaram que a morfologia e a composição química dos óleos essenciais foram

idênticos em plantas micropropagadas e plantas propagadas vegetativamente, assim

como em plantas de Mentha arvensis L. que mantiveram o teor e a composição química

do óleo essencial mesmo depois de micropropagadas (FONSECA et al., 2008).

2.4.1. Óleo essencial de gerânio

O aspecto do óleo essencial do gerânio é de uma substância líquida, pouco

densa, brilhante, de coloração variando de amarelo pálido a amarelo esverdeado, odor

por vezes de rosa, por vezes de menta (MAY et al., 2007). Geralmente é encontrado em

pêlos glandulares nas duas superfícies da folha ou em tricomas. O óleo comercial de

gerânio é obtido pela destilação de folhas de algumas espécies de Pelargonium, como:

P. graveolens, P. capitatum e P. radula, sendo uma complexa mistura de cerca de 120

monoterpenos e sesquiterpenos (WILLIAMS e HARBORNE, 2002). Vários fatores

podem causar a variação da porcentagem dos componentes de óleo obtido, entre os

quais se destacam: o tipo de solo cultivado, o genótipo, a idade da planta na colheita, a

técnica empregada na operação de destilação, entre outros (MAY et al., 2007).

Há diversos tipos de óleo essencial de gerânio, agrupados de acordo com o lugar

de origem, sendo os principais produtores a Ilha de Reunião (Bourbon), Egito (africano)

e China (chinês) (LIS-BALCHIN, 2002). O óleo egípcio e o Bourbon diferem do óleo

chinês por possuir maiores níveis de geraniol, ésteres de geranila e linalol e quantidades

menores de citronelol e seus ésteres (WILLIAMS e HARBORNE, 2002). O óleo

essencial do genótipo UFS-PEL001 foi classificado pela empresa VENTOS

(www.ventos.com) como sendo do tipo egípcio.

De maneira geral, os óleos de gerânio são caracterizados por altos níveis de

citronelol (19-45%), acompanhados de quantidades menores de geraniol (menos que

24%), linalol (menos que 14%), isomentona, além de uma série de ésteres, como

formato de citronelila, formato de geranila, acetato de geranila, propanoato de geranila,

butirato de citronelila, 2- fenietil, tiglato de citronelila e geranila (JULIANI, 2009).

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99-115.

CAPÍTULO II

ESTABELECIMENTO E MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE GERÂNIO

(Pelargonium graveolens L.)

1. RESUMO

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. Estabelecimento e multiplicação in vitro de gerânio

(Pelargonium graveolens L.). In: Micropropagação, teor e constituição química do

óleo essencial de gerânio (Pelargonium graveolens L.). 2009. 66p. (Dissertação –

Mestrado em Agroecossistemas). Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE.

Este trabalho teve por objetivo o estabelecimento e multiplicação in vitro de P.

graveolens. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado. Utilizou-se, no

primeiro ensaio, esquema fatorial 4 x 4 x 2, testando quatro concentrações de

hipoclorito de sódio (1,0; 1,5; 2,0 e 2,5%), quatro tempos de imersão (8, 10, 12 e 14

minutos) e pulverização com e sem fungicida e antibiótico nas plantas matrizes. No

segundo ensaio utilizou-se esquema fatorial 4 x 4 x 2, testando quatro concentrações de

cloreto de mercúrio (0,06; 0,08; 0,10 e 0,12%), quatro tempos de imersão (8, 10, 12 e 14

minutos) e dois tratamentos na planta matriz (com e sem pulverização). Para o terceiro

ensaio utilizou-se esquema fatorial 4x2, testando quatro concentrações de sais do meio

MS (25%; 50%; 75% e 100%) e dois tipos de explantes (nodal e foliar). Para o quarto

ensaio, foi usado esquema fatorial 4x3x2, testando quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e

2,0 mg.L

-1

) de BAP, três concentrações (0; 0,1 e 0,5 mg.L

-1

) de ANA e duas condições

de luminosidade (presença e ausência). No quinto ensaio utilizou-se esquema fatorial

4x3x2, testando quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de cinetina, três

concentrações (0; 0,1 e 0,5 mg.L

-1

) de ANA e duas condições de luminosidade

(presença e ausência). Para o sexto ensaio foi usado esquema fatorial 4x4x2, testando

quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de BAP, quatro concentrações (0; 0,5;

1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de AIA e duas condições de luminosidade (presença e ausência). As

variáveis avaliadas foram regeneração (%), contaminação (%), número de brotos por

explante e massa seca de parte aérea (mg). O hipoclorito de sódio a 1,2% por 12

minutos foi mais eficiente na desinfestação de explantes de gerânio. As concentrações

de 0,09 e 0,08% de cloreto de mercúrio durante 12 e 14 minutos, respectivamente,

apresentaram melhores resultados no controle da contaminação. O uso de explantes

foliares em meio MS contendo 39,8% dos sais possibilitou maiores taxas de

regeneração de gerânio. Para a micropropagação de P. graveolens a utilização de 1,3

mg.L

-1

de BAP e 0,5 mg.L

-1

de ANA é eficiente na regeneração direta das plantas,

sendo a condição de escuro a mais indicada. O uso de cinetina e ANA na concentração

de 2,0 e 0,1 mg.L

-1

promoveu uma boa multiplicação in vitro de gerânio. O uso de BAP

e AIA proporcionou os melhores resultados para a regeneração e para o número de

brotos por explante de gerânio dentre os reguladores testados.

Palavras-chave: Pelargonium graveolens, estabelecimento in vitro, multiplicação in

vitro, reguladores de crescimento.

__________________

Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Orientadora), Arie

Fitzgerald Blank – UFS (Co-orientador).

2. ABSTRACT

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. In vitro establishment and multiplication of geranium

(Pelargonium graveolens L.). In: Micropropagation, essential oil content and

chemical composition of geranium (Pelargonium graveolens L.). 2009. 66p.

(Dissertation – Master Program in Agroecosystems). Federal University of Sergipe, São

Cristóvão, SE.

The aim of this work was to realize in vitro establishment and multiplication of P.

graveolens. The completely randomized design was used. A 4 x 4 x 2 factorial scheme

was utilized in the first assay, testing four concentrations of sodium hypochlorite (1.0;

1.5; 2.0 and 2.5%), four immersion times (8, 10, 12 and 14 minutes) and with and

without pulverization with fungicide and antibiotic of the mother plants before

removing explants. In the second assay a 4 x 4 x 2 factorial scheme was utilized, testing

four concentrations of mercury chloride (0.06; 0.08; 0.10 and 0.12%), four immersion

times (8, 10, 12 and 14 minutes) and with and without pulverization with fungicide and

antibiotic of the mother plants before removing explants. For the third assay a 4 x 2

factorial scheme was utilized, testing four concentrations of salts of the MS medium

(25%; 50%; 75% and 100%) and two types of explants (nodal and leaves). For the

fourth assay a 4 x 3 x 2 factorial scheme was used, testing four BAP concentrations (0;

0.5; 1.0 and 2.0 mg.L

-1

), three NAA concentrations (0; 0.1 and 0.5 mg.L

-1

) and two

luminosity conditions (with and without). For the fifth assay a 4 x 3 x 2 factorial scheme

was used, testing four kinetin concentrations (0; 0.5; 1.0 and 2.0 mg.L

-1

), three NAA

concentrations (0; 0.1 and 0.5 mg.L

-1

) and two luminosity conditions (with and

without). For the sixth assay a 4 x 4 x 2 factorial scheme was used, testing four BAP

concentrations (0; 0.5; 1.0 and 2.0 mg.L

-1

), four IAA concentrations (0; 0.5; 1.0 and 2.0

mg.L

-1

) and two luminosity conditions (with and without). The evaluated variables were

regeneration (%), contamination (%), number of shoots per explants, dry weight of the

aerial part (mg). Sodium hypochlorite at 1.2% for 12 minutes was efficient for

disinfestation of geranium explants. The concentrations of 0.09 and 0.08% of mercury

chloride for 12 and 14 minutes, respectively, presented best results for contamination

control. The use of leaf explants in MS medium containing 39.8% of its salts allowed

major regeneration rates of geranium. For P. graveolens micropropagation the use of

1.3 mg.L

-1

of BAP and 0.5 mg.L

-1

of NAA is efficient for direct regeneration of plants,

and the most indicate light condition is without light. Using 2.0 and 0.1 mg.L

-1

kinetin and NAA concentrations proportioned a good multiplication of geranium in

vitro. The use of BAP and IAA proportioned the best results for regeneration and

number of shoots per explants.

Keywords: Pelargonium graveolens, in vitro establishment, in vitro multiplication,

growth regulators.

___________________

Guidance Committee: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Adviser), Arie Fitzgerald

Blank – UFS (Co- Adviser).

3. INTRODUÇÃO

A propagação vegetativa geralmente é utilizada quando a propagação sexuada

não tem sucesso, quando o número de plantas requerido pelo mercado não é suficiente

ou ainda, quando é de interesse a propagação de plantas com características

selecionadas (ROCHA, 2005). A micropropagação é uma das técnicas da cultura de

tecidos que vem sendo bastante empregada para a manutenção de germoplasma, bem

como a propagação comercial de muitas plantas medicinais e aromáticas, com o

objetivo de se obter mudas com qualidades agronômicas desejáveis, indexadas, livres de

patógenos e, com elevado padrão genético para síntese de metabólitos secundários e/ou

produção de óleos essenciais (FRANÇA, 2004).

A propagação in vitro surge como uma alternativa para a propagação de espécies

do gênero Pelargonium, uma vez que a propagação por meio da estaquia não tem sido

muito eficiente para algumas espécies deste gênero. Na micropropagação, um grande

problema encontrado diz respeito à contaminação, que pode causar grandes prejuízos no

processo de cultivo in vitro, deixando o explante inapto para o subcultivo e levando-o à

morte (AUGUSTO, 2001). Dentre os agentes usados para a desinfestação dos explantes

inclui-se o cloreto de mercúrio, o ácido clorídrico, o cloreto de benzalcônico, o peróxido

de hidrogênio e, os mais comumente utilizados, o hipoclorito de cálcio e o hipoclorito

de sódio (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

Outros fatores inerentes à micropropagação são os tipos de meio de cultura

utilizados e a seleção dos explantes. Os meios de cultura desempenham diversas

funções, tais como suporte físico para o explante, fornecimento de nutrientes

necessários à sua sobrevivência e seus componentes podem ser utilizados para dirigir o

crescimento e o desenvolvimento do material vegetal. Há inúmeras formulações dos

meios de cultura, não existindo um meio padrão, embora o mais amplamente difundido

seja o meio idealizado por Murashige e Skoog, conhecido mundialmente como meio

MS (CARVALHO et al., 2006).

A espécie e o tipo de explante utilizado apresentam diferentes respostas à ação

dos variados tipos de reguladores de crescimento utilizados no cultivo in vitro (LIMA et

al., 2002). Os reguladores mais usados na micropropagação pertencem ao grupo das

citocininas e auxinas. As citocininas promovem a divisão das plantas, com consequente

alongamento e diferenciação celular, além de retardar a senescência das plantas,

promoverem a quebra da dominância apical e induzir a produção de gemas axilares. Ao

passo que as auxinas participam da formação e desenvolvimento das raízes adventícias

(BRUM et al., 2002).

Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi testar diferentes métodos de

desinfestação de explantes de gerânio assim como verificar a concentração dos sais do

meio MS e o tipo de explante mais indicado para o estabelecimento in vitro. Além

disso, avaliou-se o efeito da luminosidade e de diferentes reguladores de crescimento na

multiplicação in vitro.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção dos explantes e local

Para a produção das mudas de gerânio (P. graveolens L.) foram utilizadas

estacas apicais de plantas matrizes do acesso UFS-PEL001 provenientes do Banco

Ativo de Germoplasma da UFS, localizado no Horto Medicinal Fazenda Experimental

“Campus Rural UFS”, município de São Cristóvão-SE. As estacas foram plantadas em

sacos de polietileno, utilizando-se o substrato terra preta + esterco bovino + areia na

proporção 1:1:1, e colocadas em ambiente protegido com tela sombrite 50% com

irrigação e nebulização. Aos 30 dias as mudas foram transplantadas para vasos com

capacidade de oito litros, com o mesmo substrato e mantidas em estufa agrícola

localizada no Departamento de Engenharia Agronômica, na Universidade Federal de

Sergipe, São Cristóvão-SE. Os ensaios in vitro foram realizados no Laboratório de

Cultura de Tecidos e Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia

Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS), localizado no município

de São Cristóvão-SE, Brasil.

4.2. Condições de cultivo

Para os ensaios 4.3, 4.4 e 4.5 foi utilizado o meio básico MS (MURASHIGE e

SKOOG, 1962) (Anexo 1A) suplementado com 0,5 mg.L

-1

de BAP e 2,0 mg.L

-1

AIA, acrescidos de 30 g.L

-1

de sacarose e 7 g.L

-1

de ágar. Para os demais ensaios foi

usado o meio de cultura MS com 50% dos sais, acrescidos de 30 g.L

-1

de sacarose e 7

g.L

-1

de ágar. O pH do meio foi ajustado para 6,0 + 0,1, solidificado com ágar e

submetido a autoclavagem por 15 minutos a uma temperatura de 121 + 1

C e pressão de

1,05 atm. Em seguida, com o auxílio de bisturi e pinça, constantemente flambados, os

explantes foram seccionados com cerca de 10 a 15 mm e inoculados em frascos de 250

mL contendo 25 mL de meio de cultura. As culturas foram mantidas em sala de

crescimento com temperatura controlada de 25 + 2

C, fotoperíodo de 12 horas de luz e

intensidade luminosa de 60 mol.m

-2

-1

, proveniente de luz fluorescente branca fria.

4.3. Efeito de concentrações de hipoclorito de sódio, tempos de imersão e

tratamentos na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens

Foram utilizados segmentos foliares provenientes de plantas cultivadas em vasos

e lavados em água corrente por 30 minutos. Posteriormente, em câmara de fluxo

laminar, foram submersos em álcool etílico 70% durante 30 segundos e, em seguida,

submetidos aos tratamentos com solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) sob diferentes

concentrações e tempos de imersão. As soluções de NaOCl foram acrescidas de 2 gotas

de Tween-20 a cada 100 mL de solução, e os segmentos permaneceram sob constante

agitação durante a realização dos tratamentos. Após aplicação dos tratamentos, os

recipientes foram levados à câmara de fluxo laminar, onde os segmentos receberam três

lavagens com água destilada e autoclavada.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 4

x 4 x 2, sendo quatro concentrações de hipoclorito de sódio (1,0; 1,5; 2,0 e 2,5%),

quatro tempos de imersão (8, 10, 12 e 14 minutos) e dois tratamentos na planta matriz

(com e sem pulverização), com cinco repetições sendo cada repetição constituída por

quatro frasco com dois explantes. Aos 30 dias após a implantação do ensaio, foram

avaliadas as variáveis regeneração (%) e contaminação por fungos e/ou bactérias (%).

De acordo com os tratamentos, as plantas matrizes foram pulverizadas dois dias

antes da inoculação, sendo no primeiro dia com 5 g.L

-1

do fungicida comercial

Ridomil

e no segundo dia com 1 g.L

-1

do antibiótico comercial sulfato de

estreptomicina.

4.4. Efeito de concentrações de cloreto de mercúrio, tempos de imersão e

tratamento na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens

Segmentos foliares foram coletados de plantas mantidas em casa de vegetação e

lavados em água corrente por 30 minutos. Em seguida, em câmara de fluxo laminar,

foram submersos em álcool etílico 70% durante 30 segundos e, logo após, imersos em

solução Tween-20 (0,05%) por três minutos e lavagem tripla em água destilada e

autoclavada. Posteriormente foram submetidos aos tratamentos de desinfestação com

cloreto de mercúrio sob diferentes concentrações e tempos de imersão, permanecendo

sob constante agitação. Após aplicação dos tratamentos, os segmentos foram

enxaguados em água destilada e autoclavada por três vezes.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial

4 x 4 x 2, sendo quatro concentrações de cloreto de mercúrio (0,06; 0,08; 0,10 e 0,12%),

quatro tempos de imersão (8, 10, 12 e 14 minutos) e dois tratamentos na planta matriz

(com e sem pulverização), com cinco repetições sendo cada repetição constituída por

quatro frascos com dois explantes. Aos 30 dias após a implantação do ensaio, foram

avaliadas as variáveis regeneração (%) e contaminação por fungos e/ou bactérias (%).

As pulverizações nas plantas matrizes foram idênticas ao descrito no item 4.3.

4.5. Efeito de diferentes explantes e concentrações de sais do meio MS no

estabelecimento in vitro de gerânio

Foram utilizados explantes de plantas estabelecidas in vitro. O delineamento

experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 4x2, sendo

quatro concentrações de sais do meio MS (25%; 50%; 75% e 100%) e dois tipos de

explantes (nodal e foliar) com cinco repetições. Cada unidade experimental foi

constituída de quatro frascos contendo dois explantes. Aos 45 dias foram avaliadas as

variáveis regeneração (%), o número de brotos por explante e massa seca de parte aérea

(mg).

4.6. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento 6-benzilaminopurina

(BAP) e ácido naftalenoacético (ANA)

Foram utilizados segmentos foliares de plantas estabelecidas in vitro. O

delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial

4x3x2, sendo quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de BAP, três concentrações

(0; 0,1 e 0,5 mg.L

-1

) de ANA e duas condições de luminosidade (presença e ausência),

com cinco repetições. Cada unidade experimental foi constituída de quatro frascos. Aos

40 dias após a implantação do ensaio, foram avaliadas as variáveis regeneração (%),

número de brotos por explante e massa seca de parte aérea (mg).

4.7. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento cinetina e ANA

Foram utilizados segmentos foliares de plantas estabelecidas in vitro. O

delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial

4x3x2, sendo quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de cinetina, três

concentrações (0; 0,1 e 0,5 mg.L

-1

) de ácido naftalenoacético (ANA) e duas condições

de luminosidade (presença e ausência) com cinco repetições. Cada unidade

experimental foi constituída de quatro frascos. Aos 40 dias, foram avaliadas as variáveis

regeneração (%), número de brotos por explante e massa seca da parte aérea (mg).

4.8. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento BAP e ácido indol

acético (AIA)

Foram utilizados segmentos foliares de plantas estabelecidas in vitro. O

delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial

4x4x2, sendo quatro concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de BAP, quatro

concentrações (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L

-1

) de AIA e duas condições de luminosidade

(presença e ausência), com cinco repetições. Cada unidade experimental foi constituída

de quatro frascos. Aos 40 dias após a implantação do ensaio, foram avaliadas as

variáveis regeneração (%), número de brotos por explante e massa seca da parte aérea

(mg).

4.9. Análise estatística

Os dados de porcentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada

de X/100 e o número de brotos por explante e massa seca de parte aérea em raiz de X +

0,5. Os dados obtidos foram submetidos a análises de variância pelo teste F e, quando

significativo, foi aplicada regressão polinomial e/ou as médias comparadas pelo teste de

Tukey (p<0,05), utilizando o programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2000).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Efeito de concentrações de hipoclorito de sódio, tempos de imersão e

tratamentos na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens

Para as variáveis regeneração e contaminação houve diferença significativa em

função das concentrações de hipoclorito e tempos de imersão (Tabelas 1 e 2). Já no

tratamento dado à planta matriz apenas a variável regeneração apresentou diferença

significativa (Tabela 3). Na concentração de 1,25% de hipoclorito de sódio observou-se

uma maior porcentagem de regeneração (51,6%) de plantas sendo esta representada por

uma equação cúbica, sugerindo que essa concentração permitiu a sobrevivência e

crescimento dos explantes (Tabela 1). Para a variável contaminação, representada

também por uma equação cúbica, o ponto máximo (14,3%) foi atingido na concentração

de 1,23% de hipoclorito de sódio. Resultados semelhantes foram observados em

Eucalyptus dunnii, onde as concentrações de 1,5% e 2,0% de NaOCl proporcionaram

maiores porcentagens de explantes estabelecidos (ALMEIDA et al., 2008). Já em Lippia

sidoides Cham. a concentração de 0,8% de hipoclorito de sódio durante 16 minutos

proporcionou melhores resultados no controle da contaminação (COSTA et al., 2007).

TABELA 1. Valores médios de regeneração (%) e contaminação (%) de explantes de

gerânio (P. graveolens) em função de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio.

São Cristóvão, UFS, 2008.

Hipoclorito de sódio

(%)

Regeneração (%)

Contaminação (%)

1,0

44,27

20,31

1,5

46,35

19,79

2,0

23,95

36,45

2,5

28,64

14,06

Equação (Y) =

– 239,5833 + 573,4375x –

358,3333x

+ 68,7500x

= 100%

297,9166 – 574,4791x +

371,8750x

- 75,0000x

= 100%

CV (%)

37,27

61,81

Com relação aos tempos de imersão, as variáveis regeneração e contaminação

são representadas por equações quadráticas. A maior regeneração de plantas (44,8%) e

um maior controle da contaminação (13,5%) foram obtidos com a imersão dos

explantes por um tempo de 12 minutos (Tabela 2). Em trabalhos com Ananas comosus

(L.) Merril a concentração de 0,5% a 1,0% de hipoclorito por um período de 10 a 20

minutos foi eficaz na desinfestação dos explantes (TEIXEIRA et al., 2001). Já para a

desinfestação de diferentes cultivares de amoreira-preta (Rubus spp.) foi utilizado o

hipoclorito de sódio na concentração de 1% durante 10 minutos (OLIVEIRA et al.,

2008).

TABELA 2. Valores médios de regeneração (%) e contaminação (%) de explantes de

gerânio (P. graveolens) em função de diferentes tempos de imersão em hipoclorito de

sódio. São Cristóvão, UFS, 2008.

Tempo (minutos)

Regeneração (%)

Contaminação (%)

25,00

32,81

35,93

19,27

44,79

13,54

37,50

25,00

Equação (Y) =

– 121,8489 + 27,3828x - 1,1393x

= 95,07%

219,9479 – 35,8333x + 1,5625x

= 97,84%

CV (%)

37,27

61,81

Com relação ao tratamento dado à planta matriz, as plantas que não foram

pulverizadas apresentaram uma maior taxa de regeneração de plantas (Tabela 3). Isso se

deve, possivelmente, ao fato de as substâncias aplicadas à planta matriz de gerânio

apresentarem efeito tóxico, o que ocasionou uma redução na sobrevivência e

regeneração dos explantes. Foi o que aconteceu na micropropagação de Jatropha

elliptica (Pohl) Müll. Arg., onde testes preliminares mostraram que a aplicação de

fungicida duas vezes por semana causou prejuízo às folhas das plantas-matrizes, que se

apresentavam enrugadas e menores (CAMPOS et al., 2007). Já no estabelecimento in

vitro de porta enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba, o tratamento com fungicida e

bactericida na planta matriz durante duas vezes por semana foi eficiente para reduzir a

contaminação dos explantes e não influenciou a sobrevivência dos mesmos (ROCHA et

al., 2007).

TABELA 3. Valores médios de regeneração (%) de explantes de gerânio (P.

graveolens) em função de diferentes tratamentos na planta matriz. São Cristóvão, UFS,

2008.

Tratamento na planta matriz

Regeneração (%)

Com pulverização

23,69

Sem pulverização

47,91

CV (%)

37,27

5.2. Efeito de concentrações de cloreto de mercúrio, tempos de imersão e

tratamento na planta matriz no estabelecimento in vitro de P. graveolens

Houve interação entre as concentrações de cloreto de mercúrio e os tempos de

imersão na regeneração de plantas e porcentagem de contaminação de explantes

(Tabelas 4 e 5). A maior regeneração de plantas (47,7%) foi observada na concentração

de 0,08% de cloreto de mercúrio e um tempo de imersão de 12,7 minutos (Tabela 4).

Em peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron) o uso de 0,05% de HgCl

durante

10 minutos foi eficiente na desinfestação dos explantes, permitindo 84,1% de

sobrevivência (RIBAS et al., 2003). Para otimizar o protocolo de micropropagação de

Pfaffia tuberosa, o uso sucessivo de soluções com detergente comercial (2 gotas/100

mL por 2 minutos), etanol (70% por 10 segundos), hipoclorito de sódio + detergente

comercial (1% + 2 gotas/100mL por 10 minutos) e HgCl

(0,1% por 5 minutos) na etapa

de desinfestação dos explantes foram eficazes tanto para a limpeza quanto para

regeneração de plantas. No entanto, foram observados alguns danos nos explantes de P.

tuberosa causados pelo uso de cloreto de mercúrio, o que não comprometeu o

desenvolvimento das plantas (FLORES et al., 2006). Cada espécie se comporta de

maneira diferente ao tratamento dado, seja pela parte da planta utilizada seja pela

concentração dos agentes desinfestantes. No caso do gerânio, pode-se dizer que à

medida que se aumenta a concentração e o tempo de exposição ao tratamento com

cloreto de mercúrio há uma queda na taxa de sobrevivência e regeneração dos explantes,

possivelmente por causa da toxicidade causada por essa substância no tecido foliar da

planta.

Já para a variável contaminação, um maior controle foi observado nas

concentrações de 0,09% e 0,08% de HgCl

e tempos de imersão de 12 e 14 minutos,

respectivamente (Tabela 5). No processo de desinfestação de segmentos nodais de

ginseng brasileiro [Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen], o uso de 0,1% de cloreto de

mercúrio por 5 minutos foi eficiente para a obtenção de plântulas livres de

contaminação (NICOLOSO et al., 2001). Já na desinfestação de Daphne cneorum L. a

concentração de 0,1% de HgCl

durante 20 minutos proporcionou a eliminação dos

agentes contaminantes (MALÁ e BYLINSKÝ, 2004), enquanto que na

micropropagação de Salvia broussonetii Benth. a mesma solução e o tempo de 15

minutos foi efetivo na desinfestação dos explantes (MEDEROS-MOLINA, 2006).

TABELA 4. Valores médios de regeneração (%) de explantes de gerânio (P. graveolens) em função da interação entre concentrações de cloreto de

mercúrio e tempos de imersão. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cloreto de

Tempo (minutos)

Mercúrio (%)

Equação (Y) =

0,06

20,83

33,33

4,16

37,50

– 2529,1666 + 742,3611x –

70,3125x

+ 2,1701x

= 100%

0,08

16,66

4,16

41,66

25,00

2650,0000 – 761,1111x +

71,3541x

- 2,1701x

= 100%

0,10

29,16

20,83

12,50

4,16

62,5000 - 4,1666x

= 100%

0,12

33,33

25,00

16,66

4,16

72,5000 - 4,7916x

= 98,88%

Equação (Y)=

- 1508,3333 + 52708,3333x –

583333,3333x

+ 2083333,3333x

= 100%

72,0833 – 604,1666x

= 89,95%

CV (%)

111,44

TABELA 5. Valores médios de contaminação (%) de explantes de gerânio (P. graveolens) em função da interação entre concentrações de cloreto

de mercúrio e tempos de imersão. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cloreto de

Tempo (minutos)

Mercúrio (%)

Equação (Y) =

0,06

54,16

45,83

75,00

41,66

0,08

45,83

70,83

45,83

37,50

0,10

54,16

37,50

79,16

0,12

54,16

37,50

62,50

41,66

Equação (Y) =

333,1250 – 6322,9166x +

33854,1666x

= 99,08%

1579,1666 – 57187,5000x +

682291,6666x

- 2604166,6666x

= 100%

CV (%)

53,19

5.3. Efeito de diferentes explantes e concentrações de sais do meio MS no

estabelecimento in vitro de gerânio

Houve interação significativa entre o tipo de explante e a concentração de sais na

regeneração dos explantes de gerânio (Tabela 6). A maior porcentagem de regeneração

é representada por uma equação quadrática, sendo o explante foliar e a concentração

39,8% de sais MS o que promoveu a maior taxa de regeneração (94,9%) (Figura 2). Em

trabalho com diferentes espécies do gênero Prunus sp. verificou-se que a maior

porcentagem de estabelecimento dos explantes se deu com o meio MS 75% dos sais

(RODRIGUES et al., 2003). Já em trabalhos com macieira (Malus domestica, Borkh.)

cv. Gala, os explantes foliares apresentaram maior potencial regenerativo que os

entrenós (SCHUCH e PETERS, 2002). Apenas na concentração 100% de sais MS o

explante nodal foi superior ao foliar quanto à regeneração (85%). Esta mesma tendência

foi observada em espécies de maracujazeiro (Passiflora giberti N. E. Brown, P. edulis

Sims e P. laurifolia L.), onde a utilização do meio de cultura MS completo e os

segmentos nodais propiciaram melhores taxas de regeneração in vitro (FARIA et al.,

2007).

FIGURA 2. Efeito do tipo de explante e concentração de sais MS (25%) no

estabelecimento in vitro de gerânio (P. graveolens). Explante nodal (A) e explante foliar

(B).

TABELA 6. Valores médios de regeneração (%) in vitro de explantes de gerânio (P.

graveolens) em função da interação entre a concentração de sais MS e tipo de explante.

São Cristóvão, UFS, 2008.

Concentração de sais

Tipo de explante

MS (%)

Foliar

Nodal

95,00 a

45,00 b

85,00 a

67,50 a

87,50 a

85,00 a

100

45,00 b

85,00 a

Equação (Y) =

74,3750 + 1,0350x - 0,0130x

= 89,10%

36,2500 + 0,5500x

= 87,55%

CV (%)

23,26 %

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

Quanto ao número de brotos, houve diferença significativa apenas quanto ao tipo

de explante utilizado. O explante foliar apresentou uma média de 19 brotos por

explante, ao passo que o nodal apresentou 9,3 brotos por explante (Tabela 7).

Resultados diferentes foram observados na micropropagação de ginseng brasileiro

[Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen] onde o segmento nodal apresentou-se mais

viável para a clonagem in vitro (NICOLOSO et al.,2001), e em macieira (Malus sp.) cv.

„Marubakaido‟ o uso de segmentos de origem basal proporcionou um maior número de

brotações (12,0 brotos por explante) quando comparado aos explantes de origem apical

(7,4 brotos por explante) (PEREIRA e FORTES, 2001).

TABELA 7. Valores médios de número de brotos por explante e massa seca de parte

aérea (mg) de gerânio (P. graveolens) em função do tipo de explante. São Cristóvão,

UFS, 2008.

Tipo de explante

Número de brotos por explante

Massa seca de parte aérea (mg)

Foliar

19,24 a

77,59 a

Nodal

9,31 b

30,19 b

CV (%)

20,23

20,28

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

Para a variável massa seca de parte aérea (MSPA), os fatores concentração de

sais MS e o tipo de explante foram significativos. Com relação ao tipo de explante, a

maior MSPA foi obtida quando utilizado o explante foliar (Tabela 7). Para a

concentração de sais MS essa variável é representada por uma equação linear, de forma

que o aumento na concentração resulta num aumento da MSPA (Tabela 8).

Segundo Peres (2002), a organogênese in vitro pode ser considerada um

processo empírico onde são testados para cada espécie, ou mesmo para variedades

dentro de uma mesma espécie, as seguintes condições: fonte de explante; composição

mineral do meio de cultura; balanço hormonal e condições ambientais. Dessa forma,

quanto à fonte de explante, normalmente há maior sucesso quando são utilizados tecidos

jovens, os quais possuem maior competência organogenética.

TABELA 8. Valores médios de massa seca de parte aérea (mg) de gerânio (P.

graveolens) em função da concentração de sais MS. São Cristóvão, UFS, 2008.

Concentração de sais MS

(%)

Massa seca de parte aérea (mg)

19,79

52,41

62,80

100

80,56

Equação (Y) =

5,7257 + 0,7707x

= 94,94%

CV (%)

20,28

5.4. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento 6-benzilaminopurina

(BAP) e ácido naftalenoacético (ANA)

Houve interação entre BAP e ANA e luminosidade na regeneração de plantas e

número de brotos por explante de gerânio a partir de segmentos foliares (Tabelas 9 e

10).

TABELA 9. Valores médios de regeneração (%) in vitro de gerânio (P. graveolens) em

função da interação de BAP x ANA x luminosidade. São Cristóvão, UFS, 2008.

BAP (mg.L

-1

)

ANA (mg.L

-1

)

0,0

0,1

0,5

-------------------------------------------- Luz ---------------------------------------------

0,0

0,00 aA

0,00 aB

0,5

0,00 bB

41,67 aB

1,0

0,00 aB

50,00 aB

2,0

25,00 aA

25,00 aB

41,67 aB

Equação (Y) =

3,863 + 22,803x

-2,272x²

= 79,79%

0,681-10,6818x +

11,3636x

= 98,79%

2,045 + 84,6212x

-32,5757x

= 94,54%

----------------------------------------- Escuro --------------------------------------------

0,0

0,00 bA

41,67 aA

58,33 aA

0,5

25,00 bA

58,33 abA

83,33 aA

1,0

16,7 bA

91,67 aA

83,33 aA

2,0

41,7 aA

66,67 aA

75,00 aA

Equação (Y) =

5,00 + 18,0952x

= 79,34%

37,803 + 77,1970x -

31,0606x

= 79,57%

60,151 + 46,515x -

19,6970x

= 91,74%

CV (%)

32,76

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas e maiúsculas entre luminosidades, não diferem estatisticamente entre si

pelo teste de Tukey (p<0,05).

Na presença de luz, a maior porcentagem de regeneração é representada por uma

equação quadrática, sendo a concentração de 1,3 mg.L

-1

de BAP e 0,5 mg.L

-1

de ANA,

o que promoveu a maior regeneração de plantas (50%). Entretanto, na ausência de

luminosidade, houve uma maior porcentagem de regeneração de plantas (85,7%),

quando utilizado 1,2 mg.L

-1

de BAP associado com 0,1 mg.L

-1

de ANA (Tabela 9).

Resultados semelhantes foram obtidos com Pelargonium x hortorum (95%),

suplementado com 0,2 mg.L

-1

de ANA em combinação com 0,5 mg.L

-1

de BAP e

zeatina na ausência de luz, e com P. capitatum (100%) suplementado com 0,5 mg.L

-1

de ANA e 1,0 mg.L

-1

de BAP e zeatina na condição de escuro (HASSANEIN e

DORION, 2005).

TABELA 10. Valores médios do número de brotos por explante de gerânio (P.

graveolens) em função da interação de BAP x ANA x luminosidade. São Cristóvão,

UFS, 2008.

BAP (mg.L

-1

)

ANA (mg.L

-1

)

0,0

0,1

0,5

------------------------------------------- Luz ----------------------------------------------

0,0

0,00 aA

0,5

0,00 aA

0,00 aB

4,91 aB

1,0

0,00 bA

0,00 bB

14,16 aA

2,0

3,50 aB

0,00 bB*

3,16 abA

Equação (Y) =

0,095 + 1,495x + 1,590x

= 98,79%

-1,159 + 23,659x -

10,651x²

= 85,22%

---------------------------------------- Escuro ---------------------------------------------

0,0

0,00 aA

0,5

5,00 bB

16,83 aA

13,22 aA

1,0

0,67 bA

18,33 aA

12,13 aA

2,0

11,50 abA

12,61 aA

5,00 bA

Equação (Y) =

1,295 - 0,962x + 2,924x²

= 75,59%

1,016 + 33,072x -

13,722x²

= 93,92%

1,035 + 24,534x -

11,362x²

= 88,77%

CV (%)

34,38

Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas e maiúsculas entre luminosidades, não diferem estatisticamente entre si

pelo teste de Tukey (p<0,05).

*Início da regeneração, não possibilitando contagem de brotos.

Em relação ao número de brotos por explante, a condição de escuro favoreceu o

maior número de brotos, sendo todos os tratamentos representados por equações

quadráticas, exceto quando foi utilizado 0,1 mg.L

-1

de ANA e em todas as

concentrações de BAP, na presença de luz, onde apesar de apresentar regeneração de

plantas (Tabela 9), não foi possível a contagem do número de brotos em virtude do

tamanho dos mesmos (menores de 2 mm) (Tabela 10). A utilização de 0,1 mg.L

-1

ANA e 1,2 mg.L

-1

de BAP, na ausênia de luz, proporcionou 20,9 brotos por explante, ao

passo que a utilização de 0,5 mg.L

-1

de ANA e 1,0 mg.L

-1

de BAP não apresentou

diferenças significativas entre as duas condições de luminosidade, proporcionando uma

média de 13 brotos por explante. Resultados diferentes foram obtidos em trabalhos com

Pelargonium x hortorum, onde o meio contendo 10 mg.L

-1

de BAP e 1 mg.L

-1

de ANA

proporcionou uma média de 4,9 + 2,5 brotos por explante (GÓMEZ, 2002). Já em

trabalhos com o P. graveolens, Hassanein e Dorion (2005) obtiveram cerca de 7,3

brotos por explante, utilizando 0,5 mg.L

-1

de ANA e 1,0 mg.L

-1

de BAP e zeatina, na

ausência de luz. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram-se superiores,

quando comparados aos resultados obtidos pelos autores acima citados, uma vez que foi

possível obter números maiores de brotos por explante utilizando concentrações

menores de reguladores de crescimento. Resultados assim são úteis no que diz respeito

à redução dos custos de produção comercial das mudas.

5.5. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento cinetina e ANA

Para a variável regeneração houve interação significativa entre os reguladores de

crescimento cinetina e ANA, cinetina e luminosidade e ANA e luminosidade. As

maiores taxas de regeneração foram observadas na faixa de 2,0 mg.L

-1

de cinetina e 0,1

mg.L

-1

de ANA (cerca de 60%) (Tabela 11). Resultados diferentes foram obtidos por

Gill et al. (2006) que, utilizando segmentos foliares, obtiveram 83,12% de regeneração

dos explantes em meio MS suplementado com de 5,0 mg.L

-1

de ANA e 0,5 mg.L

-1

cinetina.

Com relação à interação cinetina e luminosidade, os melhores resultados foram

obtidos quando utilizados 1,80 mg.L

-1

de cinetina na ausência de luz (Tabela 12).

TABELA 11. Valores médios de regeneração (%) in vitro de gerânio (P. graveolens)

em função da interação cinetina x ANA. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cinetina (mg. L

-1

)

ANA (mg. L

-1

)

0,1

0,5

8,33 a

4,16 a

0,5

4,16 a

12,50 a

4,16 a

1,0

8,33 b

50,00 a

25,00 b

2,0

4,16 b

62,50 a

58,33 a

Equação (Y=)

0,0757 + 51,5909x –

9,8484x

= 91,51%

– 2,5000 + 29,0476x

= 94,08%

CV (%)

56,13

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

A interação ANA e luminosidade mostrou que na ausência de luz a maior

porcentagem de regeneração foi obtida quando utilizados 0,1 mg.L

-1

de ANA (Tabela

13). Já na presença de luz, as maiores taxas foram obtidas quando utilizados 0,1 e 0,5

mg.L

-1

de ANA. De maneira geral, em todas as concentrações de cinetina e ANA a

condição de escuro propiciou melhores resultados com relação a taxa de regeneração in

vitro de gerânio.

TABELA 12. Valores médios de regeneração (%) in vitro de gerânio (P. graveolens)

em função da interação cinetina x luminosidade. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cinetina (mg. L

-1

)

Luminosidade

Claro

Escuro

11,11 a

0,00 b

0,5

0,00 b

13,88 a

1,0

11,11 b

44,44 a

2,0

36,11 a

47,22 a

Equação (Y)

9,3636 – 17,1464x + 15,4040x

= 94,70%

- 2,9545 + 57,3989x – 15,9090x

= 93,38%

CV (%)

56,13%

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

TABELA 13. Valores médios de regeneração (%) in vitro de gerânio (P. graveolens)

em função da interação ANA x luminosidade. São Cristóvão, UFS, 2008.

ANA (mg. L

-1

)

Luminosidade

Claro

Escuro

6,25 bA

6,25 cA

0,1

20,83 aB

43,75 aA

0,5

16,66 aB

29,16 bA

CV (%)

56,13%

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste

de Tukey (p<0,05)

Para as variáveis número de brotos por explante e massa seca de parte aérea,

houve interação significativa entre os reguladores de crescimento cinetina e ANA

(Tabela 14 e 15). O maior número de brotos por explante foi obtido quando foi usado

2,0 mg.L

-1

de cinetina e 0,5 mg.L

-1

de ANA, cerca de 6 brotos por explante (Tabela 14).

Em trabalhos com Cissus sicyoides L., Abreu et al.(2003) observaram que os explantes

in vitro foram melhor estabelecidos e multiplicados em meio de cultura suplementado

com cinetina e ANA, que proporcionaram maior indução de gemas e crescimento em

altura das plantas. Em P. graveolens cultivar Hemanti (tipo algeriano) o meio MS

suplementado com 5,0 mg.L

-1

de cinetina e 1,0 mg.L

-1

de ANA foi eficiente para na

regeneração direta a partir de explantes foliares, ao passo que a concentração de 8,0

mg.L

-1

de cinetina e 1,0 mg.L

-1

de ANA propiciou o maior número de brotos por

explante a partir de segmentos nodais (SAXENA et al., 2000).

Diante do exposto, fica evidente a importância da presença de reguladores de

crescimento para o melhor resultado dessas variáveis, já que os resultados menos

viáveis foram verificados na ausência ou na baixa dosagem de cinetina e ANA. Soma-se

a isso a importância das respostas dadas pelas plantas quando se usa diferentes tipos de

explantes e genótipos na multiplicação in vitro.

TABELA 14. Valores médios do número de brotos por explante de gerânio (P.

graveolens) em função da interação cinetina x ANA. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cinetina (mg. L

-1

)

ANA (mg. L

-1

)

0,1

0,5

0,00 a

0,5

0,16 a

1,16 a

0,33 a

1,0

1,66 ab

2,97 a

1,00 b

2,0

1,00 b

4,85 a

6,86 a

Equação (Y)

0,0893 + 2,4683x

= 98,29%

0,0961 – 1,1735x +

2,2696x

= 99,64%

CV (%)

38,97

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

TABELA 15. Valores médios de massa seca de parte aérea (mg) de gerânio (P.

graveolens) em função da interação cinetina x ANA. São Cristóvão, UFS, 2008.

Cinetina (mg. L

-1

)

ANA (mg. L

-1

)

0,1

0,5

0,00 a

0,5

0,00 a

3,25 a

0,35 a

1,0

24,98 ab

14,87 a

1,83 b

2,0

1,43 b

20,20 a

24,22 a

Equação (Y)

- 4,0490 + 38,4524x –

17,5181x

= 55,64%

0,2333 + 10,6841x

= 91,55%

- 4,3377 + 12,5018x

= 82,21%

CV (%)

79,62

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

5.6. Efeito da luminosidade e dos reguladores de crescimento BAP e ácido indol

acético (AIA)

Houve interação significativa entre BAP e AIA e luminosidade na regeneração in

vitro dos explantes (Tabela 16). Na presença de luz, a maior taxa de regeneração é

representada por uma equação quadrática, onde a concentração de 0,5 mg.L

-1

de BAP e

1,45 mg.L

-1

de AIA propiciou 97,5% de regeneração dos explantes. Já na ausência de

luz, a maior porcentagem de regeneração (100%) foi obtida quando foi utilizada a

concentração de 1,36 mg.L

-1

de BAP e 1,0 mg.L

-1

de AIA. Em trabalho com Solanum

paludosum, Beltrão et al. (2008) obtiveram a regeneração de até 40% dos fragmentos de

folhas e 100% dos fragmentos de hipocótilo utilizados em meio MS suplementado com

0,1 mg.L

-1

de AIA e 2,2 mg.L

-1

de BAP. Resultado diferente foi encontrado por

Arockiasamy et al. (2002) que obtiveram 80% de regeneração de explantes foliares de

Eryngium foetidum L. utilizando 1,0 mg.L

-1

de BAP e 0,1 mg.L

-1

de AIA. Na

multiplicação in vitro de Kaempferia galanga, as maiores taxas de regeneração e

número de brotos foram obtidas utilizando meio MS suplementado com 0,5 mg.L

-1

AIA e 2,5 mg.L

-1

de BAP (SWAPNA et al., 2004).

Os resultados mostram que as duas condições de luminosidade possibilitam boas

taxas de regeneração, sendo a combinação entre os reguladores de crescimento o fator

decisivo para a obtenção de melhores resultados.

O número de brotos por explante apresentou resposta significativa em função da

interação BAP x AIA x luminosidade (Tabela 17). A faixa de 0,5 – 2,0 mg.L

-1

de BAP e

2,0 mg.L

-1

de AIA propiciou os melhores resultados para o número de brotos por

explante na presença de luz, ao passo que os piores resultados foram encontrados em

todas as doses de BAP na ausência de AIA. Na condição de escuro, a concentração de

0,5 mg.L

-1

de BAP na faixa de 0,5 – 2,0 mg.L

-1

de AIA resultou nos melhores

resultados para o número de brotos por explante (Tabela 17) (Figura 3). Já em trabalhos

com Averrhoa carambola Through, o meio MS suplementado com 1,0 mg.L

-1

de BAP e

0,5 mg.L

-1

de AIA propiciou a melhor resposta em relação ao número de brotos por

explante (10 + 0,2) (ROY et al., 2007). Em trabalhos com Withania somnifera Dunal, a

concentração de 1,5 mg.L

-1

de BAP e 1,5 mg.L

-1

de AIA propiciou uma média de 22

brotos por explante (SIVANESAN e MURUGESAN, 2008), ao passo que em Zehneria

scabra (L.f.) Sonder, obteve-se de 8 a 10 brotos por explante quando utilizado explante

nodal em meio MS suplementado com 5,0 mg.L

-1

de BAP e 0,5 mg.L

-1

de AIA

(ANAND e JEYACHANDRAN, 2004).

TABELA 16. Valores médios de regeneração (%) in vitro de gerânio (P. graveolens) em função da interação BAP x AIA x luminosidade. São

Cristóvão, UFS, 2008.

BAP (mg.L

-1

)

AIA (mg.L

-1

)

0,0

0,5

1,0

2,0

Equação (Y) =

--------------------------------------------------- Luz ---------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

44,00 a

88,00 a

84,00 a

92,00 a

48,363 + 67,6363x – 23,2727x

= 84,32%

1,0

0,00 a

64,00 b

0,00 b

76,00 a

354,0000x – 550,0000x

196,0000x

= 100%

2,0

20,00 a

44,00 b

52,00 b

84,00 a

23,2000 + 30,6285x

= 97,91%

Equação (Y)=

238,0000x – 362,0000x

124,0000x

= 100%

9,9272 + 132,4727x –

58,5454x

= 71,13%

456,6666x – 698,0000x

241,3333x

= 100%

9,9272 + 136,4727x

– 50,5454x

= 77,78%

--------------------------------------------------- Escuro --------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

22,50 b

90,00 a

85,00 a

77,50 b

28,5000 + 113,5000x –

45,0000x

= 84,99%

1,0

7,50 a

85,00 a

92,50 a

82,50 a

12,5454 + 145,9545x –

55,9090x

= 93,46%

2,0

15,00 a

70,00 a

90,00 a

50,00 b

15,6818 + 134,3181x –

58,6363x

= 99,81%

Equação (Y)=

107,5000x – 150,0000x

50,0000x

= 100%

7,6363 + 155,3636x –

62,7272x

= 86,34%

5,8636 + 155,6363x –

57,2727x

= 92,99%

4,7727 + 152,7272x

– 65,4545x

= 93,51%

CV (%)

29,37

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

TABELA 17. Valores médios do número de brotos por explante de gerânio (P. graveolens) em função da interação BAP x AIA x luminosidade.

São Cristóvão, UFS, 2008.

BAP (mg.L

-1

)

AIA (mg.L

-1

)

0,0

0,5

1,0

2,0

Equação (Y) =

------------------------------------------------------------- Luz -------------------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

13,60 a

39,20 a

48,10 a

82,30 a

17,0000 + 32,9142x

= 98,01%

1,0

0,00 a

36,60 a

0,00 b

76,20 a

207,9000x – 330,9000x

123,0000x

= 100%

2,0

8,90 a

20,30 a

29,00 a

83,80 a

10,1409 + 6,0590x +

15,2818x

= 99,43%

Equação (Y)=

3,1172 + 71,3627x –

31,6454x

= 87,87%

261,3666x – 399,3000x

+ 137,9333x

= 100%

7,7727 + 131,2272x –

47,2545x

= 85,01%

------------------------------------------------------------ Escuro -------------------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

1,70 b

15,00 b

12,66 b

10,49 b

1,0

0,70 a

5,30 b

6,20 a

8,10 b

2,0

1,60 b

3,90 b

5,40 b

3,60 b

Equação (Y)=

CV (%)

35,28

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Para a variável massa seca de parte aérea, a presença de luz favoreceu o aumento

da massa em todas a concentrações de BAP e AIA, exceto na ausência dos dois

reguladores e nas concentrações 1,0 mg.L

-1

de BAP sem AIA e 1,0 mg.L

-1

BAP e 1,0

mg.L

-1

de AIA. Na ausência de luz, houve um maior acúmulo de massa nas

concentrações de 0,5 mg.L

-1

de BAP na faixa de 0,5 – 2,0 mg.L

-1

de AIA (Tabela 18).

FIGURA 3. Brotações de gerânio (P. graveolens) na presença (A) e ausência (B) de

luz.

TABELA 18. Valores médios de massa seca de parte aérea (mg) de gerânio (P. graveolens) em função da interação BAP x AIA x luminosidade.

São Cristóvão, UFS, 2008.

BAP (mg.L

-1

)

AIA (mg.L

-1

)

0,0

0,5

1,0

2,0

Equação (Y) =

------------------------------------------------------------- Luz -------------------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

42,86 a

82,12 a

84,77 a

73,97 a

45,4223 + 75,0703x –

30,6112x

= 92,83%

1,0

0,00 a

36,36 a

0,00 b

71,75 a

205,8783x – 326,7550x

120,8766x

= 100%

2,0

39,26 a

22,55 a

33,26 a

123,49 a

38,8921 – 55,0843x +

48,7231x

= 99.97%

Equação (Y)=

235,1652x – 362,5628x

127,3976x

= 100%

369,016x – 486,4350x

153,7833x

= 100%

457,6511x – 694,7933x

+ 237,1422x

= 100%

7,7660 + 102,4626x

– 22,9466x

= 90,49%

------------------------------------------------------------ Escuro -------------------------------------------------------------

0,0

0,00 a

0,5

1,88 b

17,28 b

17,39 b

16,38 b

1,0

0,84 a

11,62 b

7,64 a

9,38 b

2,0

2,46 b

4,75 b

5,92 b

3,84 b

Equação (Y)=

CV (%)

36,62

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

6. CONCLUSÕES

O hipoclorito de sódio a 1,2% por um tempo de 12 minutos foi mais eficiente na

desinfestação de explantes de gerânio;

As concentrações de 0,09 e 0,08% de HgCl

durante 12 e 14 minutos,

respectivamente, apresentaram melhores resultados no controle da contaminação;

O uso de explantes foliares em meio MS contendo 39,8% dos sais possibilitou

maiores taxas de regeneração no estabelecimento de P. graveolens;

A utilização dos reguladores de crescimento BAP e AIA proporcionou os

melhores resultados para a regeneração das plantas e para o número de brotos por

explante de gerânio dentre os reguladores testados, sendo a presença de luz a condição

mais indicada.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO III

ACLIMATIZAÇÃO, TEOR E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE GERÂNIO (Pelargonium graveolens L.)

1. RESUMO

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. Aclimatização, teor e constituição química do óleo

essencial de gerânio (Pelargonium graveolens L.). In: Micropropagação, teor e

constituição química do óleo essencial de gerânio (Pelargonium graveolens L.).

2009. 66p. (Dissertação – Mestrado em Agroecossistemas). Universidade Federal de

Sergipe, São Cristóvão, SE.

Pelargonium graveolens L. é uma espécie aromática nativa da África do Sul, cujo óleo

essencial é muito apreciado pelas indústrias de perfumaria e cosmético, além da

aromaterapia. Este trabalho teve por objetivo identificar o melhor substrato na

aclimatização de mudas micropropagadas, assim como avaliar o teor e a composição

química do óleo essencial de gerânio proveniente de plantas propagadas através da

estaquia e micropropagadas. O delineamento experimental foi o inteiramente

casualizado, testando-se quatro substratos: pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) +

calcário (1 g.L

-1

) (PCBC); pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

) + vermiculita (1:1) (PCBCV 1:1); pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) +

calcário (1 g.L

-1

) + vermiculita (PCBCV 2:1); e vermiculita com adição semanal de sais

MS (VS), distribuídas em quatro repetições, com cinco plantas cada uma. Foram

avaliadas as variáveis sobrevivência (%), altura da planta (cm), número de brotos,

comprimento da raiz (cm), número de folhas, peso de massa seca e fresca da parte aérea

(g). As amostras dos óleos essenciais foram analisadas utilizando CG/EM. As maiores

porcentagens de sobrevivência de plantas foram obtidas quando utilizados os substratos

vermiculita, PCBC e PCBCV (1:1), ao passo que para o comprimento de raiz, número

de brotos e folhas e massa seca de parte aérea não houve diferenças significativas entre

os substratos. Para os dois tipos de propagação, os óleos essenciais foram constituídos

principalmente por citronelol com 33,13% e 34,67%, o geraniol com 20,02% e 16,93%

e formiato de citronelila com 16,31% e 15,68%, nas plantas não micropropagadas e

micropropagadas, respectivamente. De maneira geral, os melhores substratos para

aclimatização de mudas de gerânio micropropagadas foram VS, PCBC e PCBCV 1:1.

Houve diferença no teor e composição química do óleo de gerânio proveniente de

plantas propagadas por estaquia e micropropagadas.

Palavras-chave: Pelargonium graveolens, micropropagação, substratos, óleo essencial.

__________________

Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Orientadora), Arie

Fitzgerald Blank – UFS (Co-orientador).

2. ABSTRACT

ALMEIDA, Sílvia Ávila de. Acclimatization, essential oil content and chemical

composition of geranium (Pelargonium graveolens L.). In: Micropropagation,

essential oil content and chemical composition of geranium (Pelargonium

graveolens L.). 2009. 66p. (Dissertation – Master Program in Agroecosystems). Federal

University of Sergipe, São Cristóvão, SE.

Pelargonium graveolens L. is a native aromatic species from South Africa, which

essential oil is used in perfume and cosmetic industries, besides the aromatherapy. The

aim of this work was to identify the best substrate for acclimatization of

micropropagated transplants, as well as to evaluate geranium essential oil content and

chemical composition derived from plants produced with rooted cuttings and

micropropagated plants. The completely randomized design was used with four

replications and five plants per replication, testing four substrates: coconut dust +

Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + lime stone (1 g.L

-1

) (PCBC); coconut dust + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + lime stone (1 g.L

-1

) + vermiculite (1:1) (PCBCV 1:1); coconut dust

+ Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + lime stone (1 g.L

-1

) + vermiculite (PCBCV 2:1); and

vermiculite and weekly addition of solution with salts of MS medium (VS). The

evaluated variables were survival (%), plant height (cm), number of shoots, root length

(cm), number of leaves, dry and fresh weight of aerial part (g). The samples of essential

oil were analyzed with GC/MS. The highest survival percentages of plants were

obtained when the substrates vermiculite, PCBC and PCBCV (1:1) were used. For root

length, number of shoots and leaves, and weight of the aerial part there were no

significative differences between substrates. The essential oils were principally

constituted by 33.13% and 34.67% citronellol, 20.02% and 16.93% geraniol and

16.31% and 15.68% citronellyl formate, respectively from not micropropagated and

micropropagated plants. Generally, the best substrates for acclimatization of geranium

micropropagated plants were VS, PCBC and PCBCV 1:1. There were differences for

essential oil content and chemical composition derived from plants produced with

rooted cuttings and micropropagated plants.

Keywords: Pelargonium graveolens, micropropagation, substrates, essential oil.

____________________

Guidance Committee: Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Adviser), Arie Fitzgerald

Blank – UFS (Co- Adviser).

3. INTRODUÇÃO

Um fator importante envolvido no processo de aclimatização diz respeito ao

substrato utilizado na preparação das mudas, uma vez que ele pode facilitar ou impedir

o crescimento das plantas conforme suas propriedades físico-químicas (SKREBSKY et

al., 2006). Do ponto de vista econômico, social e ambiental, alguns autores vêm

destacando a importância da utilização de matérias-primas regionais, tais como casca de

arroz, bagaço de cana, fibra de coco e até mesmo o resíduo de algodão proveniente da

indústria têxtil (BACKES e KÄMPF, 1991; FLYNN et al., 1995; CHONG, 1999;

SAINJU et al., 2001).

Devido às propriedades aromáticas que muitos óleos essenciais apresentam, são

muito utilizados na perfumaria, na indústria de alimentos, de cosméticos, de higiene e

limpeza, além de apresentarem atividades biológicas, principalmente antimicrobianas,

sendo muito utilizados na indústria farmacêutica (MOREL, 2003).

A produção nacional de óleo essencial pode significar um novo nicho de

negócios para a agroindústria minifundiária, já que o Brasil importa a maior parte dos

óleos essenciais que a indústria nacional utiliza. Nos últimos anos, importou, em média,

U$ 10,8 milhões, contra U$ 2,2 milhões em exportação. Assim, os indicativos de

mercado dão conta de que há uma real possibilidade para a produção nacional neste

campo econômico, com vantagens em termos de custo e qualidade (SERAFINI e

CASSEL, 2001).

Os maiores produtores de óleo de gerânio são a China, Egito (tipo norte

africano), Algeria, Marrocos e Ilha Reunion (tipo Bourbon), além da Índia (JULIANI,

2009; GOMES, 2009). O óleo de cada região apresenta composição química única o

que, consequentemente, determina seu valor comercial. O tipo Bourbon é considerado o

de melhor qualidade e, portanto, apresenta maior preço no mercado (ARAYA, 2009).

O geraniol, citronelol e linalol juntos tipificam as diferentes qualidades desse

óleo. O citronelol é usualmente encontrado em maiores proporções no óleo chinês (38-

40%) e no óleo egípcio (31-33%) do que no óleo Bourbon (19-21%), ao contrário do

geraniol e linalol que apresentam maiores porcentagens no Bourbon (16-19%/7-10%) e

menores no egípcio (13-15%/5-6%) e chinês (7-10%/2-3%); no entanto, variações

dessas porcentagens podem ocorrer de acordo com a variedade em cultivo (DEMARNE,

2002).

Diante do exposto, o presente trabalho objetivou verificar o melhor substrato na

aclimatização de mudas micropropagadas, assim como avaliar o teor e a composição

química do óleo essencial de gerânio proveniente de plantas propagadas

convencionalmente e micropropagadas.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Local

O ensaio de aclimatização foi conduzido no Departamento de Engenharia

Agronômica (DEA), na Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão-SE. Já

os ensaios envolvendo a extração do óleo essencial foram realizados no Laboratório de

Fitotecnia do Departamento de Engenharia Agronômica e os de caracterização química

no Laboratório de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade

Federal de Sergipe.

4.2. Aclimatização de mudas micropropagadas

Mudas de gerânio micropropagadas do genótipo UFS-PEL001 foram retiradas

dos frascos e lavadas com água para remover os resíduos do meio de cultura aderido às

raízes e, posteriormente, transferidas para bandejas de poliestireno expandido com 72

alvéolos, contendo diferentes tratamentos. O experimento foi conduzido em ambiente

protegido com tela sombrite de 50% e sistema de nebulização intermitente garantindo

alta umidade relativa.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, utilizando-se

quatro substratos: pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

)

(PCBC); pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) + vermiculita

(1:1) (PCBCV 1:1); pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) +

vermiculita (PCBCV 2:1) e vermiculita e adição semanal de sais MS (VS), distribuídas

em quatro repetições. Cada unidade experimental foi constituída por cinco plantas.

Aos 40 dias foram avaliadas as variáveis sobrevivência (%), altura da planta

(cm), número de brotos, comprimento da raiz (cm), número de folhas, peso de massa

seca e fresca da parte aérea (g).

4.3. Plantio em campo

Plantas micropropagadas e aclimatizadas e as provenientes de estaquia foram

transferidas para canteiros localizados no Horto de Plantas Medicinais da Fazenda

Experimental "Campus Rural" da UFS, localizada no município de São Cristóvão – SE,

para extração e análise química do óleo essencial.

Plantas antes e após a micropropagação foram coletadas para extração do óleo

essencial. Parte aérea de plantas foram colhidas aos 90 dias do plantio em campo e secas

a 40°C em estufa de secagem com circulação de ar forçada (Marconi - MA035/5) por

cinco dias.

4.4. Extração, teor e análise química do óleo essencial

O óleo essencial de folhas secas do genótipo UFS-PEL001 de P. graveolens

foram obtidos por hidrodestilação através de aparelho do tipo Clevenger (GUENTHER,

1972) por aproximadamente 160 minutos. Os teores foram estimados com base no peso

da matéria seca (mL.100 g

-1

) e obtidos utilizando-se três amostras de 75 g (ASTA,

1968).

Amostras dos óleos essenciais foram analisadas utilizando-se cromatografia

gasosa em equipamento Shimadzu QP5050A interfaceada com espectroscopia de massa

(CG/EM), dotada de coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m) nas seguintes

condições: gás de arraste hélio (fluxo 1,0 mL.min-1); tipo de injeção split a 250

(1/20); detector a 280

C, programação da coluna 80

C durante 1,5 minuto, com

aumento de 4

C por minuto para 180

C, seguido de 10

C por minuto até 300

finalizando com 10 min. de isoterma a 300

C. Os espectros de massas foram obtidos por

impacto eletrônico a 70 eV. A identificação dos constituintes foi determinada com base

na comparação do índice de retenção (VAN DEN DOOL e KRATZ, 1963) relativo a

uma série de n-alcanos homólogos obtido pela co-injeção de amostras do óleo com uma

mistura linear de hidrocarbonetos, bem como com o banco de dados NIST21 e NIST107

da biblioteca do CG/EM e publicação de espectro de massas (ADAMS, 2007).

4.5. Análise estatística

Os dados de porcentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada

de (X/100) e o número de brotos, altura das plantas (cm), comprimento da raiz (cm),

número de folhas e massa seca e fresca de parte aérea em raiz de (x + 0,5). Os

resultados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e, quando significativos,

as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05), utilizando o programa estatístico

Sisvar (Ferreira, 2000).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Aclimatização de mudas micropropagadas

As variáveis sobrevivência, altura de planta, massa fresca de parte aérea e seca

de raiz foram afetadas significativamente pelas misturas de substratos utilizados na

aclimatização de gerânio. Já o comprimento de raiz, número de brotos, número de

folhas e massa seca de parte aérea não houve diferenças significativas entre os

substratos (Tabelas 19 e 20).

As maiores porcentagens de sobrevivência de plantas foram obtidas quando

foram utilizados os substratos vermiculita, PCBC e PCBCV (1:1) (Tabela 19) (Figura

4). Na aclimatização de plântulas de coqueiro-anão as maiores taxas de sobrevivência

(58,33%) foram observadas na mistura areia lavada e pó de casa de coco seco (LÉDO et

al., 2007). O uso de pó da casca de coco é de grande utilidade, uma vez que o

aproveitamento de resíduos da agroindústria surge como uma solução para problemas

econômicos, sociais e ambientais (SILVEIRA et al., 2002).

Em relação à altura de plantas, o maior valor foi proporcionado pela utilização

de vermiculita, não diferenciando significativamente dos substratos PCBCV (1:1) e

PCBCV (2:1) (Tabela 19). Esta mesma tendência foi observada em relação à massa

fresca de parte aérea (Tabela 20). Trabalhando com violeta africana (Saintpaulia

ionantha Wendl), Terceiro Neto et al. (2004) observaram que os melhores resultados

foram obtidos nas mudas aclimatizadas nos substratos comerciais plantagro e bioplant,

seguidos pelo pó de coco seco e vermiculita. Resultados diferentes foram obtidos na

aclimatização de mudas micropropagadas de porta-enxerto de macieira `Marubakaido´,

que ao contrário do obtido com gerânio, a vermiculita mostrou-se o substrato menos

eficiente (HOFFMANN et al., 2001).

TABELA 19. Valores médios de sobrevivência (%), altura de planta (cm),

comprimento de raiz (cm), número de folhas e brotos na aclimatização de plantas

degerânio (P. graveolens) em diferentes misturas de substratos. São Cristóvão-SE, UFS,

2008.

Substrato

Sobrevivência

(%)

Altura de

planta (cm)

Comprimento

de Raiz (cm)

Número de

Brotos

Número de

folhas

PCBC

55,0 ab

2,5 b

7,4 a

0,90 a

7,1 a

PCBCV 1:1

85,0 ab

4,1 ab

10,2 a

1,75 a

13,0 a

PCBCV 2:1

45,0 b

3,6 ab

7,4 a

1,23 a

9,0 a

95,0 a

6,3 a

13,0 a

1,90 a

14,3 a

CV (%)

37,05

39,35

35,50

44,88

37,09

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey

(p<0,05).

PCBC = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1g.L

-1

); PCBCV (1:1) = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12

g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) + vermiculita (1:1); PCVCV (2:1) = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1g.L

-1

) +

vermiculita (2:1) e VS = vermiculita + sais MS.

FIGURA 4. Altura de mudas de gerânio (P. graveolens) em diferentes substratos. (A)

pó de coco + Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

), (B) pó de coco +

Biosafra

(3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1 g.L

-1

) + vermiculita (1:1), (C) vermiculita

com adição semanal de sais MS .

TABELA 20. Valores médios de massa fresca de parte aérea (g) e massa seca de

parte aérea e raiz na aclimatização de plantas de gerânio (P. graveolens) em diferentes

misturas de substratos. São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Substrato

Massa fresca de

Massa seca (g)

parte aérea (g)

Parte aérea

Raiz

PCBC

55,84 ab

8,30 a

0,06 b

PCBCV 1:1

86,26 ab

11,92 a

0,10 b

PCBCV 2:1

45,68 b

8,62 a

0,05 b

96,47 a

14,89 a

0,19 a

CV (%)

35,28

34,88

40,22

*Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

PCBC = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1g.L

-1

); PCBCV (1:1) = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12 g.L

-1

) +

calcário (1g.L

-1

) + vermiculita (1:1); PCVCV (2:1) = pó de coco + Biosafra (3-12-6) (12 g.L

-1

) + calcário (1g.L

-1

) + vermiculita (2:1)

e VS = vermiculita + sais MS.

5.2. Extração, teor e análise química do óleo essencial

Dos compostos presentes no óleo essencial de plantas propagadas por estaquia e

micropropagadas, 30 constituintes foram identificados e encontram-se listados de

acordo com a ordem de eluição (Tabela 21). Para os dois tipos de propagação, os óleos

essenciais foram constituídos principalmente por citronelol com 33,13% e 34,67%, o

geraniol com 20,02% e 16,93% e formiato de citronelila com 16,31% e 15,68%, nas

plantas não micropropagadas e micropropagadas, respectivamente (Tabela 21). Quanto

ao teor, a micropropagação alterou esta variável, sendo as plantas propagadas

convencionalmente as que apresentaram um maior teor (0,83%) (Tabela 21). Em

trabalhos com a cultivar „Sunshine‟ de vetiver também foram verificadas diferenças

entre o rendimento e composição do óleo essencial de plantas micropropagadas e não

micropropagadas, sendo observado maior rendimento e maior número de compostos

nestas últimas. Isso se deve à ação de microorganismos endofíticos que provocam

transformações químicas nas plantas não micropropagadas, ao passo que as plantas

propagadas in vitro estão livres de qualquer microorganismo (ADAMS et al., 2004).

Os resultados do presente trabalho superam os obtidos por Shin (2003), que

trabalhando com o P. graveolens obteve 17,40% de citronelol e 5,89% de geraniol,

sendo estes os principais componentes identificados. Em Pérez et al. (2007) a extração

do óleo de plantas de P. graveolens com 6 e 12 meses de idade resultou em citronelol

como o composto presente em maior quantidade, seguido do formiato de citronelila e

geraniol. Comparando áreas de cultivo de gerânio localizados no norte e sul da Índia,

Jain et al. (2001) constataram que os maiores constituintes do óleo foram citronelol

(33.6% e 26.7%), geraniol (20.2% e 24.1%), formiato de citronelila (6.6% e 8.2%),

linalol (5.3% e 6.7%), entre outros.

TABELA 21. Teor e composição química do óleo essencial de plantas de gerânio (P.

graveolens) genótipo UFS-PEL 001. São Cristóvão, UFS, 2008.

Composto

Porcentagem nas plantas

Plantas não

micropropagadas

Plantas

micropropagadas

Tricicleno

931

0,09 + 0,09

0,06 + 0,06

Óxido de linalol

1069

0,10 + 0,06

0,23 + 0,12

Linalol

1098

8,27 + 0,38

7,54 + 0,78

Óxido de rosa

1124

0,39 + 0,06

1,74 + 0,04

Isomentona

1162

1,38 + 0,18

1,96 + 0,15

-Terpineol

1192

0,32 + 0,16

0,44 + 0,06

Nerol

1222

0,21 + 0,10

0,11 + 0,06

Citronelol

1224

33,13 + 0,98

34,67 + 0,50

Neral

1236

0,48 + 0,24

0,75 + 0,09

Geraniol

1248

20,02 + 1,53

16,93 + 0,35

Geranial

1265

1,09 + 0,09

1,16 + 0,01

Formiato de citronelila

1270

16,31 + 1,08

15,69 + 0,26

Formiato de geranila

1295

6,48 + 0,66

4,61 + 0,04

Acetato de citronelila

1348

0,18 + 0,10

0,00 + 0,00

Acetato de geranila

1376

0,18 + 0,11

0,00 + 0,00

-Bourboneno

1381

0,20 + 0,10

0,15 + 0,08

- Cariofileno

1419

0,62 + 0,31

0,72 + 0,06

Propionato de citronelila

1438

0,17 + 0,09

0,00 + 0,00

6,9-Guaiadieno

1440

3,63 + 0,60

4,23 + 0,20

- Humuleno

1455

0,12 + 0,06

0,04 + 0,04

Propionato de geranila

1467

0,67 + 0,16

0,44 + 0,04

Germacreno D

1479

0,54 + 0,27

0,80 + 0,05

Biciclogermacreno

1494

0,04 + 0,04

0,00 + 0,00

-Cadineno

1516

0,16 + 0,08

0,27 + 0,02

n-Butirato de citronelila

1522

0,35 + 0,18

0,14 + 0,14

n-Butirato de geranila

1554

1,01 + 0,18

0,32 + 0,32

(E)-2-Tiglato de feniletila

1581

0,77 + 0,39

1,37 + 0,05

1-10-di-epi-Cubenol

1614

0,03 + 0,03

0,00 + 0,00

1-epi-Cubenol

1627

0,04 + 0,04

0,00 + 0,00

Cubenol

1641

0,05 + 0,05

0,00 + 0,00

Monoterpenos (%)

90,83

86,79

Sesquiterpenos (%)

6,20

7,58

Total Identificado (%)

97,03

94,37

Teor (%)

0,83 + 0,08

0,64 + 0,02

Indice de Kovats.

* Média + Erro padrão da média

Por outro lado, trabalhando com Mentha arvensis L. foi possível observar que

não há diferenças no teor e composição química do seu óleo essencial quando

propagadas vegetativamente ou micropropagadas (FONSECA et al., 2008). Diante do

exposto, é possível verificar que cada espécie se comporta de maneira diferente

dependendo do lugar e tempo de cultivo, do genótipo utilizado, do tipo de destilação,

entre outras coisas, o que pode afetar seu metabolismo e, consequentemente, a produção

de óleo essencial.

Comparando os dois tipos de propagação, foi possível observar que a

micropropagação promoveu uma maior porcentagem de citronelol ao passo que

diminuiu a porcentagem de geraniol. Sendo a razão citronelol:geraniol o fator

determinante para a qualidade e, dessa forma, o valor comercial do óleo, pode-se dizer

que para esse genótipo a propagação convencional por estaquia é a mais indicada

quando se observa a composição quantitativa e qualitativa deste óleo.

6. CONCLUSÃO

De maneira geral, os substratos VS, PCBC e PCBCV 1:1 apresentaram melhores

resultados na aclimatização de mudas micropropagadas de gerânio;

Houve diferença no teor e composição química do óleo essencial de gerânio

proveniente de plantas propagadas por estaquia e micropropagadas.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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vetiver root essential oils from cleansed (bacteria- and fungus-free) versus non-cleansed

(normal) vetiver plants. Biochemical Systematics and Ecology, v. 32, n. 12, p. 1137-

1144, dez. 2004.

ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas

chromatograpy/mass spectroscopy. 4. ed. Illinois: Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, 2007, 469 p.

ARAYA, H. T. Response of herbage yield, essential oil yield and composition of south

african rose-scented geranium (Pelargonium sp.) to conventional and organic nitrogen.

Journal of Essential Oil Research, Carol Stream, v. 18, jan./fev. 2006. Disponível em:

< http://findarticles.com/p/articles/mi_qa4091/is_200601/ai_n17173921/ >. Acesso em:

18 Mai. 2009.

ASTA. Official analytical methods of the American Spice Trade Association.

Englewood Cliffs: ASTA, 1968. p. 8-11.

BACKES M. A.; KÄMPF A. N. Substratos à base de composto de lixo urbano para a

produção de plantas ornamentais. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 26, n.

5, p. 753-758, maio 1991.

CHONG, C. Experiences with the utilization of wastes in nursery potting mixes and

field soil amendments. Canadian Journal of Plant Science, Ottawa, v. 79, n. 1, p. 139-

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DEMARNE, F. E. „Rose-scented geranium‟ a Pelargonium grown for the perfume

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including linear temperature programmed gas-liquid artitionchromatography. Journal

of Chromatography, Netherlands, v. 11, p. 463-471, ago. 1963.

ANEXOS

ANEXO A Página

TABELA 1A Composição do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) ........... 62

TABELA 2A Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de

regeneração (%) e contaminação (%) de gerânio (P.

graveolens) in vitro, em função de concentrações de

hipoclorito de sódio, tempo de imersão e tratamento na planta

matriz. São Cristóvão-SE, UFS, 2008. . ............................................. 63

TABELA 3A Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de

regeneração (%) e contaminação (%) de gerânio (P.

graveolens) in vitro, em função de concentrações de cloreto de

mercúrio, tempo de imersão e tratamento na planta matriz. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008. ................................................................. 63

TABELA 4A Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%),

número de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea

(MSPA) de explantes de gerânio (P. graveolens) in vitro, em

função de concentrações de sais MS e tipo de explante. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008. ................................................................. 64

TABELA 5A Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%),

número de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea

(MSPA) de explantes de gerânio (P. graveolens) in vitro, em

função de concentrações de BAP, ANA e luminosidade. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008... ............................................................... 64

TABELA 6A Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%),

número de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea

(MSPA) de explantes de gerânio (P. graveolens) in vitro, em

função de concentrações de cinetina, ANA e luminosidade.

São Cristóvão-SE, UFS, 2008. .......................................................... 65

TABELA 7A Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%),

número de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea

(MSPA) de explantes de gerânio (P. graveolens) in vitro, em

função de concentrações de BAP, AIA e luminosidade. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008... ............................................................... 65

TABELA 8A Resumo da análise de variância das variáveis sobrevivência

(%), altura de plantas (cm), comprimento de raiz (cm), número

de brotos por explante e número de folhas de mudas de gerânio

(P. graveolens) aclimatizadas em diferentes substratos. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008. ................................................................. 66

TABELA 9A Resumo da análise de variância das variáveis massa fresca de

parte aérea (g), massa (g) seca de parte aérea e raiz de mudas

de gerânio (P. graveolens) aclimatizadas em diferentes

substratos. São Cristóvão-SE, UFS, 2008. ......................................... 66

TABELA 2A. Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de

regeneração (%) e contaminação (%) de gerânio (P. graveolens) in vitro, em função de

concentrações de hipoclorito de sódio, tempo de imersão e tratamento na planta matriz.

São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Contaminação

Hipoclorito de sódio (H)

2996,419

2224,392

Tempo (T)

1603,190

1625,434

Pulverização (P)

14077,148

6,510

H x T

389,359

191,695

H x P

183,919

210,503

T x P

222,981

245,225

H x T x P

542,715

512,876

Resíduo

247,395

252,278

CV (%)

37,27

61,81

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 3A. Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de

regeneração (%) e contaminação (%) de gerânio (P. graveolens) in vitro, em função de

concentrações de cloreto de mercúrio, tempo de imersão e tratamento na planta matriz.

São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Contaminação

Cloreto de mercúrio (C)

232,204

284,288

Tempo (T)

249,565

110,677

Pulverização (P)

4746,093**

51569,010**

C x T

1401,186*

1673,177*

C x P

1152,343

2089,843

T x P

475,260

388,454

C x T x P

376,880

538,917

Resíduo

651,041

878,906

CV (%)

111,44

53,19

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 4A. Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%), número

de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea (MSPA) de explantes de gerânio

(P. graveolens) in vitro, em função de concentrações de sais MS e tipo de explante. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Número de

brotos

Massa seca de

parte aérea

Concentração de sais MS (C)

838,541

59,718

6518,154**

Tipo de explante (E)

562,500

986,764**

22465,561**

C x E

3489,583**

38,225

1550,530

Resíduo

308,593

23,570

423,273

CV (%)

23,26

20,23

20,28

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 5A. Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%), número

de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea (MSPA) de explantes de gerânio

(P. graveolens) in vitro, em função de concentrações de BAP, ANA e luminosidade.

São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Número de

brotos

Massa seca de

parte aérea

BAP (B)

0,770**

211,125**

335,313**

ANA (A)

1,827**

111,168**

306,433**

Luminosidade (L)

5,713**

604,708**

417,569**

B x A

0,143**

81,228**

115,033**

B x L

0,111*

81,781**

64,776

A x L

0,559*

172,988**

206,007

B x A x L

0,124**

36,764*

20,571

Resíduo

0,032

20,014

16,138

CV (%)

32,76

34,38

52,56

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 6A. Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%), número

de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea (MSPA) de explantes de gerânio

(P. graveolens) in vitro, em função de concentrações de cinetina, ANA e luminosidade.

São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Número de

brotos

Massa seca de

parte aérea

Cinetina (C)

5448,495**

64,060**

1184,722**

ANA (A)

4175,347**

16,840**

71,004*

Luminosidade (L)

2508,680**

17,820**

696,266

C x A

1663,773**

14,716**

548,039**

C x L

1490,162**

3,040

350,198

A x L

789,930*

6,242

162,167

C x A x L

292,245ns

8,553

478,887

Resíduo

112,847

4,189

337,374

CV (%)

56,13

38,97

79,62

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 7A. Resumo da análise de variância das variáveis regeneração (%), número

de brotos por explante, massa (mg) seca de parte aérea (MSPA) de explantes de gerânio

(P. graveolens) in vitro, em função de concentrações de BAP, AIA e luminosidade. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de variação

Regeneração

Número de

brotos

Massa seca de

parte aérea

BAP (B)

38679,205**

5474,506**

12876,373**

AIA (A)

17022,539**

6190,542**

4932,136**

Luminosidade (L)

2231,289**

20587,068**

40794,790**

B x A

2667,955**

966,300**

1890,475**

B x L

3000,039**

2570,937**

7249,651**

A x L

3801,705**

4945,559**

3575,354**

B x A x L

1116,566**

785,893**

1590,011**

Resíduo

156,230

174,905

287,216

CV (%)

29,37

35,28

36,62

1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);

2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste

de F.

TABELA 8A. Resumo da análise de variância das variáveis sobrevivência (%), altura

de plantas (cm), comprimento de raiz (cm), número de brotos por explante e número de

folhas de mudas de gerânio (P. graveolens) aclimatizadas em diferentes substratos. São

Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de

variação

Sobrevivência

Altura de

planta

Comprimento

de raiz

Número

de brotos

Número

folhas

Substratos

(S)

0,662

13,028

35,863

1,068

57,452

Resíduo

0,154

2,628

11,335

0,420

16,176

CV (%)

37,05

39,35

35,50

44,88

37,09

* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F.

TABELA 9A. Resumo da análise de variância das variáveis massa fresca de parte aérea

(g), massa (g) seca de parte aérea e raiz de mudas de gerânio (P. graveolens)

aclimatizadas em diferentes substratos. São Cristóvão-SE, UFS, 2008.

Fonte de

variação

Massa fresca de parte

aérea

Massa seca de parte

aérea

Massa seca de

raiz

Substratos (S)

2087,657

0,096

0,0009

Resíduo

316,640

0,033

0,0001

CV (%)

35,28

34,88

40,22

** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.

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