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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ISAMIRE SILVA ANDRADE
MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E
CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE
MARCADORES MICROSSATÉLIES
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Julho de 2009
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ii
ISAMIRE SILVA ANDRADE
MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E
CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE
MARCADORES MICROSSATÉLIES
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, para a obtenção
do título de Mestre em Produção Vegetal.
Área de concentração: Melhoramento de
Plantas e Biotecnologia
Orientador: Prof. Ronan Xavier Corrêa
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Julho de 2009
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iii
ISAMIRE SILVA ANDRADE
MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E
CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE
MARCADORES MICROSSATÉLIES
Ilhéus, BA, 14 de julho de 2009
Ioná Santos Araújo - DS
UFERSA
Dário Anhert - PhD
UESC
Ronan Xavier Corrêa - DS
UESC
(Orientador)
iv
DEDICATÓRIA
A minha amada Erika, “luz da minha vida”, pelo o amor e incentivo.
Aos meus pais, Ezaú e Maria, incansáveis lutadores pela minha educação, e a toda
minha família, pela paciência e compreensão pela minha ausência em tantos
momentos, e a todos aqueles que como eu, acreditam que com Fé, perseverança,
capacidade e dedicação é possível chegar lá.
v
AGRADECIMENTO
A Deus, pela infinita bondade, constante proteção e por mais esta graça
concedida.
Ao Prof. Ronan Xavier Corrêa, meu orientador, pessoa singular que tive o
prazer de conhecer, pela confiança depositada e amizade durante toda minha vida
acadêmica.
A Prof
a
. Ioná Santos Araújo, uma das principais responsáveis pela realização
deste trabalho, pela atenção, comprometimento e cuidado.
Ao Prof. Dário Ahnert, pelo planejamento e implantação do experimento de
campo, e pelos ensinamentos que me foram prestados.
A Dra. Regina Celle Rebouças Machado, pela implantação e manutenção do
experimento em campo e pela ajuda na obtenção dos dados fenotípicos.
Ao Dr. Uilson Vanderlei Lopes, pela ajuda e pela colaboração
À Universidade Estadual de Santa Cruz, pela oportunidade e realização do
curso e pela disponibilidade da infraestrutura laboratorial.
À Almirante Cacau, M&M Mars, pela infraestrutura de campo, disponibilidade
de pessoal para condução dos experimentos em campo.
À FAPESB, pela concessão da minha bolsa de estudos e pelo financiamento
do projeto.
Aos colegas do laboratório Mariana, Claudine, Bruna, Jeiza, Willian, Daniela e
Samuel pelo companheirismo e pela ajuda.
vi
A amiga Márcia Cristina da Silva Branco, pela sua dedicação e ajuda nos
trabalhos iniciais desta Dissertação.
Aos colegas mestrandos, pela amizade e colaboração, em especial ao amigo
Lúcio Mauro, pelo companheirismo e incentivo em todo o andamento do curso.
Aos meus amigos, Carlos Augusto, Lucas, Lúcio Mauro, Francisca, Ittana,
pela companhia e convivência, e companeirismo.
Aos queridos amigos de Itajú do Colônia, Jailson, César, Roberto, Marleide,
José Antônio, pelo incentivo e força.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal, Curso
de Mestrado, pelos ensinamentos.
À coordenação e aos funcionários do Colegiado do Programa de Pós-
graduação em Produção Vegetal, pelo imprescindível apoio.
Aos funcionários da Fazenda Almirante, Babito, Nêgo, Ressurreição, Goiano e
em especial Valdevino, pela ajuda incondicional nos trabalhos em campo.
A minha família e a família de minha esposa, pelo apoio durante todo o curso,
pela segurança e pela força nos momentos difíceis.
Enfim, a todas as pessoas que tiveram participação direta ou indireta na
realização deste trabalho.
Obrigado.
vii
ÍNDICE
EXTRATO ............................................................................................................... ix
ABSTRACT ............................................................................................................ xi
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 4
2.1 Origem e dispersão do cacaueiro .................................................................. 4
2.2 Divergência em populações naturais e autoincompatibilidade ...................... 5
2.3 Panorama geral da cacauicultura .................................................................. 8
2.3.1 Distribuição geográfica ........................................................................ 8
2.3.2 Importância sócio-econômica .............................................................. 9
2.3.4 A cacauicultura baiana e a vassoura-de-bruxa ................................. 10
2.4 Aspectos genéticos e botânicos do cacau ................................................... 11
2.5 Biologia floral e sistemas de cruzamento .................................................... 13
2.6 Incompatibilidade genética em plantas ........................................................ 16
2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica ................................................... 18
2.6.2 Autoincompatibilidade esporofítica .................................................... 18
2.7 Sistema de incompatibilidade sexual em cacaueiro .................................... 20
2.7.1 Determinação da compatibilidade sexual .......................................... 24
2.8 Bancos de germoplasma e certificação genética ......................................... 26
2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação ............. 28
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 35
3.1 Material vegetal ........................................................................................... 35
3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual .................. 36
3.3 Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................. 37
3.4 Obtenção de dados moleculares ................................................................. 38
3.4.1 Extração de DNA dos genitores e progênies F
1
................................ 38
3.4.2 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 .................... 39
3.4.2.1 Reações RAPD ......................................................................................... 39
viii
3.4.2.2 Reações microssatélites ........................................................................... 40
3.4.3 Genotipagem da população segregante ........................................... 41
3.4.4 Avaliação do polimorfismo da população segregante e de ligação entre
marcadores e características ........................................................... 41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 43
4.1 Determinação da compatibilidade sexual .................................................... 43
4.2. Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................ 46
4.2.1 Cor do fruto ....................................................................................... 46
4.2.2 Número de sementes por fruto .......................................................... 48
4.3 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 ............................... 51
4.4 Segregação e ligação genética .................................................................... 57
5 CONCLUSÕES.................................................................................................. 63
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 64
ix
EXTRATO
Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, julho de
2009. Mapeamento da autoincompatibilidade sexual do cacau e certificação
genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 por meio de marcadores
microssatélies. Orientador: Ronan Xavier Corrêa.
Os diferentes níveis de compatibilidade sexual apresentado pelo cacaueiro podem
ser responsáveis por grandes alterações dos níveis de produção, pois os cacaueiros
autocompatíveis tendem a apresentar maior produção de frutos que os
autoincompatíveis. O estudo de caracteres relacionados com produção (número de
sementes por fruto), e de características qualitativas poucos influenciadas pelo
ambiente e com alto poder de diferenciar genótipos (cor do fruto), torna-se uma
ferramenta indispensável para o sucesso do programa de melhoramento do
cacaueiro. Nesse sentido, este estudo objetivou caracterizar a progênie de plantas
F
1(TSH-1188xCCN-51)
quanto à pureza clonal de seus genitores, compatibilidade sexual,
cor do fruto e número de sementes por fruto, visando identificar marcadores
microssatélites ligados as essas características. A natureza segregante destas
características foi comprovada nesta população. Amostras de DNA dos dois grupos
de acessos da coleção de germoplasma do Centro de Ciências do Cacau M&MMars
que foram utilizados como genitores da população foram amplificados com quinze
primers microssatélites. Esses acessos de cada grupo mostram-se indistinguíveis
entre si pela genotipagem em 15 locos SSR, confirmando a pureza genética desses
acessos. Uma amostra de 250 plantas tomadas ao acaso foram submetidas a
polinizações artificiais. O uso de um índice de pegamento ajustado ao número de
polinizações artificiais possibilitou a realização de testes de compatibilidade com a
utilização de no mínimo de 15 autopolinizações por planta. As características cor do
x
fruto maduro e compatibilidade sexual segregaram na proporção de 1:1 e de forma
independente nesta população. A característica número de sementes por fruto
distribui-se de forma contínua na população de acordo com um padrão multigênico e
com segregação transgressiva. Os marcadores microssatélites P23
(217)
e P10
(108)
estão ligados à característica de compatibilidade sexual. A característica cor de fruto
não apresentou ligação genética significativa a nenhum dos microssatélites testados.
A existência da segregação da característica compatibilidade sexual e cor do fruto,
possibilita que esta população seja utilizada em estudos de mapeamento genético
para essas características.
Palavras-chave: Theobroma cacao, compatibilidade sexual, marcadores
moleculares, mapeamento genético, número de sementes por fruto, cor do fruto,
polinização artificial.
xi
ABSTRACT
Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, July,
2009. Mapping of the sexual self-incompatible of the cocoa and genetic
certification of the clones TSH-1188 and CCN-51 by microssatélies markers.
Advisor: Ronan Xavier Corrêa.
The different levels of sexual compatibility made by the cocoa may be responsible for
major changes in production levels, because the self compatibility cocoa tend to have
higher fruit production that self-incompatible. The study of traits related to production
(number of seeds per fruit), and few qualitative characteristics influenced by the
environment and with high power to differentiate genotypes (fruit color), it becomes
an indispensable tool for successful breeding program of cocoa. Thus, this study
aimed to characterize the progeny of F
1
plants (TSH-1188xCCN-51) on the clonal
purity of their parents, sexual compatibility, fruit color and number of seeds in order to
identify microsatellite markers linked to these characteristics. The segregating nature
of these features was demonstrated in this population. DNA samples from two groups
of accessions of germplasm collection of the Science Center Cocoa (M&MMars) that
were used as parents of the population were amplified with fifteen microsatellite
primers. These accesses of each group appear to be indistinguishable by genotyping
in 15 SSR loci, confirming the genetic purity of these accesses. A sample of 250
plants taken at random were subjected to artificial pollination. Using a rate of success
set the number of artificial pollination were the basis for compatibility testing with the
use of at least 15 per plant pollination. The characteristics of the ripe fruit color and
sexual compatibility segregated in a 1:1 ratio and independently in this population.
The characteristic number of seeds per fruit is distributed continuously in the
population according to a standard multigenic and transgressive segregation. The
xii
microsatellite markers P23 (
217
) and P10 (
108
) are linked to the characteristic of sexual
compatibility. The characteristic color of fruit did not show significant linkage to any of
the microsatellites tested. The existence of segregation of the trait sexual
compatibility and color of fruit means that this population to be used in genetic
mapping studies for these characteristics.
Key-words: Theobroma cacao, sexual compatibility, molecular markers, genetic
linkage, number of seeds by fruit, fruit color, artificial pollination.
1
1 INTRODUÇÃO
A cacauicultura tem uma grande importância econômica, social e
ambiental nos mais de 50 países produtores, envolvendo aproximadamente
dois milhões de agricultores (KNIGHT, 2000). A produção mundial de cacau na
safra 2007/2008 foi de 3,6 milhões de toneladas, sendo 70% desta produção
oriunda de países do continente Africano, 19% dos países do Sudoeste da Ásia
e Oceania, e 11% provenientes das Américas do Sul e Central (ICCO, 2009). O
Brasil hoje é o sexto principal produtor, participando com 4,4% da produção
mundial de cacau (ICCO, 2009) e tem duas zonas principais de produção: o Sul
da Bahia e a Amazônia (ICCO, 2005).
A Bahia se destaca por ser responsável por 70% da produção de
amêndoas de cacau do Brasil, enquanto que os outros 30% são produzidos
principalmente nos estados do Pará, Espírito Santo e Rondônia (ANUÁRIO
ESTATÍSTICO DO BRASIL, 2003). A cultura do cacau possui um papel
fundamental no desenvolvimento da região sulbaiana, gerando empregos e
destacando o país no cenário econômico internacional, além de representar
uma importante fonte de renda para os produtores, possuindo ainda um caráter
conservacionista, em função de seu plantio ser realizado sob as sombras das
árvores nativas da Mata Atlântica.
Um dos maiores entraves na produção de cacau no Brasil é a vassoura-
de-bruxa, doença causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (AIME &
PHILLIPS-MORA, 2005). Em 1989, com a chegada do fungo nas lavouras da
Bahia, houve uma grande mudança no cenário social da população local.
Nesse estado, os danos causados pela doença, fizeram com que muitos
agricultores abandonassem seus cultivos, provocando demissões em massa de
2
trabalhadores rurais e migrações de pessoas da zona rural para a zona urbana
(TREVIZAN, 1996).
Atualmente, vários esforços integrados estão sendo feitos na tentativa
de recuperar a região cacaueira baiana. A estratégia de piramidização de
genes é uma ferramenta muito promissora e possibilita a obtenção de novas
cultivares com diferentes fontes de resistência a M. perniciosa associada a
características de produtividade, que tem sido um dos principais objetivos dos
programas de melhoramento do cacaueiro nos países da América do Sul
(BARTLEY, 2005).
Os diferentes níveis de compatibilidade sexual apresentados pelo
cacaueiro podem ser responsáveis por grandes alterações dos níveis de
produção (CANTALINO, 2006), e se manifestam de forma acentuada,
influenciando diretamente na quantidade de frutos por planta, bem como no
tamanho e número de sementes por fruto (BARTLEY, 2005). O número de
sementes por fruto de cacau tem influência direta na produtividade,
participando diretamente na determinação de diferentes componente de
produção (DIAS, 2001). A coloração dos frutos tem grande importância na
discriminação dos grupos raciais, além de apresentar a possibilidade de ser
utilizado como um ótimo marcador morfológico relacionado a características
relevantes ao melhoramento.
Nesta perspectiva, foi plantada uma progênie oriunda do cruzamento
interclonal entre TSH-1188 e CCN-51, que segrega para diversas
características, dentre elas a compatibilidade sexual e a cor do fruto. Com base
nesta população e no mapa genético a ser construído, espera-se identificar não
só QTLs relacionados a essas características, mas também para
características de resistência à vassoura-de-bruxa, podridão parda e outras
características agronômicas de interesse.
No presente trabalho, objetivou-se avaliar diferentes características na
população segregante de cacaueiros e identificar marcadores microssatélites
para essas características. Os objetivos específicos consistiram em: (i) Avaliar
as características compatibilidade sexual, cor de frutos e numero de sementes
por fruto em uma amostra de plantas F
1
derivadas dos clones TSH-1188 e
CCN-51; (ii) Certificar a identidade genética dos acessos de TSH-1188 e CCN-
51 utilizados na obtenção da população segregante e oriundos da coleção de
3
germoplasma da Fazenda Almirante Cacau, com base em 15 marcadores
microssatélites; (iii) Identificar marcadores microssatélites potencialmente
ligados a genes de cor do fruto e autoincompatibilidade sexual em cacau.
4
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Origem e dispersão do cacaueiro
O cacaueiro é uma planta neotropical inicialmente descrita como Cacao
fotos por Charles de L´Écluse. Em 1737, foi descrito por Linneu como
Theobroma fructus, sendo que essa classificação permaneceu até 1753,
quando foi definitivamente designado como Theobroma cacao L.
Segundo Hardi (1960) o gênero Theobroma se originou na América do
Sul, possivelmente na bacia amazônica. Para Cheesman (1944), o centro de
origem do T. cacao esta localizado no Alto Amazonas, na região de confluência
dos rios Solimões, Putamaio e Caquetá. Esta área da América do Sul parece
admitir a mais ampla variabilidade, como reportado por Pound (1938), na sua
expedição de coleta de germoplasma de cacau.
O cacau se espalhou em duas principais direções, dando origem a
grupos raciais distintos (CHEESMAN, 1944; CUATRECASAS, 1964; SORIA,
1966; BRAUDEAU, 1969): O grupo dos Crioulos se disseminou em direção à
América Central e sul do México, sendo considerado o primeiro cacau
domesticado; produz frutos grandes, verdes ou vermelhos quando imaturos,
passando a roxos ou amarelos maduros, com casca enrugada, suas sementes
são grandes e arredondadas e de cotilédones brancos ou violeta claro sendo
que produzem o chocolate de melhor qualidade (BARTLEY, 2005). O grupo
dos Forasteiros ou Amazônicos se disseminou subdividindo-se em Forasteros
do Baixo e Alto Amazonas. É responsável por 85% da produção mundial de
cacau e caracterizam-se por possuir frutos ovóides, com casca lisa e coloração
verde quando imaturos, apresenta sementes intensamente pigmentado, e com
5
o seu interior violeta escuro (SOUZA; DIAS, 2001; MOTAMAYOR et al., 2002).
Nesse grupo se apresenta maior diversidade genética e melhor desempenho
agronômico (BARTLEY, 1967; LOCKWOOD, 1976; MARITA, et al. 2001). Um
terceiro grupo, denominado grupo dos Trinitários, é constituído de híbridos
naturais entre Forasteiros e Crioulos (SORIA, 1966; MOTAMAYOR et al.,
2001), encontrados em plantações devastadas por doenças em Trinidade
(CHEESMAN, 1944). Este grupo apresenta uma ampla variação de
características morfológicas dos dois anteriores. Suas sementes apresentam
coloração interna que varia do amarelo até o roxo e o seu produto final é de
qualidade intermediária (BRAUDEAU, 1969).
2.2 Divergência em populações naturais e autoincompatibilidade
As populações naturais de cacau constituem parte do repositório da
variabilidade genética potencial para programas de melhoramento da espécie.
Essas populações representam recursos genéticos com possibilidade de uso
para se obterem variedades mais produtivas, adaptadas às regiões de cultivo e
mais resistentes a pragas e doenças (DIAS, 2001).
Pesquisas sobre avaliação e caracterização morfoagronômica dessas
populações têm evidenciado ampla variabilidade de diversos caracteres
relacionados a frutos, sementes, folhas e flores, além de porte, arquitetura da
planta e autoincompatibilidade (CASTRO; BARTLEY, 1983, 1985; CASTRO et
al., 1989; BARTLEY, 2005; ALMEIDA, et al., 2009), produção e resistência a
doenças (FONSECA; ALBUQUERQUE, 1999; PIRES, 2003; ALMEIDA, et al.,
2009). O conhecimento da variabilidade dessa espécie tem sido ampliado com
a utilização de marcadores moleculares (FALEIRO et al., 2001; MARITA et al.,
2001; PLOETZ et al., 2005; SERENO et al., 2006;), mostrado a importância
dessas populações para coleta de recursos genéticos. Essas pesquisas têm
disponibilizado informações importantes para os melhoristas (BARTLEY, 2005).
E cacau, a presença de sistemas multialélicos de autoincompatibilidade
(KNIGHT; ROGERS, 1955; COPE, 1962), podem acelerar a divergência
genética em populações naturais, pois sabe-se que a estrutura genética de
6
uma população é controlada, em grande parte, pelo modo de reprodução de
seus indivíduos (STEBINS, 1957).
Em populações naturais, admiti-se que cacaueiros autoincompatíveis
predominam no centro de origem da espécie, enquanto os autocompatíveis
estão dispersos nas áreas marginais da distribuição (POSNETTE, 1945;
COPE, 1962; 1976). O que foi contestado devido à presença de cacaueiros
autoincompatíveis encontrados também nas áreas marginais (SORIA, 1978).
Contudo, essa hipótese especulativa apresenta alguma sustentação, na
medida em que a escassez de polinizadores e a redução na densidade da
população cacaueira nas áreas marginais da distribuição podem ter exercido
forte pressão de seleção em favor da autocompatibilidade. Sabe-se que o
sistema de cruzamento em plantas está sob o controle de poucos genes, os
quais, quando mutados, promovem a necessária flexibilidade capaz de
assegurar a reprodução da espécie. A autocompatibilidade teria, então, grande
valor adaptativo nessa situação (DIAS, 2001).
A predominância da autoincompatibilidade no centro de origem e da
autocompatibilidade nas áreas marginais comporta ainda outra explicação
(COPE, 1962). Assumindo que grande número de diferentes alelos de
autoincompatibilidade estivesse presente na população original de cacau, se
somente alguns poucos frutos tivessem sido transportados no período das
migrações humanas através dos Andes, então o número de alelos de
incompatibilidade seria reduzido a cada estágio. Uma vez que o cacaueiro
fosse plantado em grupos de árvores, a autoincompatibilidade não impediria a
frutificação, desde que árvores de compatibilidade cruzada fossem incluídas
como polinizadoras. Finalmente, um estágio ocorreria em que poucos alelos
diferentes de incompatibilidade restariam na população.
Embora o sistema de incompatibilidade possa, em teoria, ser mantido
em populações com apenas dois indivíduos, De Nettancourt (1977), afirma que
a perda de alelos por deriva genética ou por seleção reduzirá o número de
alelos em populações pequenas a valores abaixo do mínimo requerido para o
adequado funcionamento do sistema. Neste sentido, quando Astecas e Maias
selecionaram os Crioulos com base em suas amêndoas despigmentadas para
um melhor chocolate, eles estavam selecionando indiretamente para
autocompatibilidade (DIAS, 2001). Em outras palavras, a seleção consciente do
7
cacau de sementes brancas resultou em seleção automática, inconsciente para
autocompatibilidade (HARLAN et al., 1973).
Essa pode ter sido a outra razão para o predomínio das populações
autocompatíveis de Crioulos na América Central. Essa idéia encontra suporte
no estudo teórico de populações mistas compostas de cacaueiros
autoincompatíveis e autocompatíveis (COPE, 1962), assumindo ausência de
depressão endogâmica. No estudo, os autocompatíveis tenderam ao
predomínio devido à maior frutificação, enquanto os autoincompatíveis
tenderam à eliminação, demonstrando que genótipos autocompatíveis e
autoincompatíveis de cacau não podem coexistir em equilíbrio em população
isolada. Contrariamente, observações de campo feitas em população
abandonada desde 1950, contendo ambos os cacaueiros Trinitários
autocompatíveis e autoincompatíveis, pareceram indicar que a freqüência das
árvores autoincompatíveis aumentou em uma única geração (WARREN;
KALAI, 1995). Contudo, esse resultado pode também estar indicando que a
redução dos cacaueiros autocompatíveis na população mista seja devido à
depressão por endogamia, expressa como estabelecimento comprometido de
plântulas. Esta é uma questão complexa e que demanda mais pesquisas
(DIAS, 2001).
Sabe-se que nos centros de origem são encontrados numerosos
caracteres varietais endêmicos (VAVILOV, 1951). Seguramente alguns
caracteres encontrados em alta expressão nas populações dos Alto
Amazônicos das regiões do alto Amazonas, em comparação aos das
populações dos outros grupos raciais, como a marcante autoincompatibilidade
(POSNETTE, 1945), o mais alto conteúdo de manteiga (PIRES et al., 1998), a
germinação precoce da semente dentro do fruto tão logo a maturação do fruto
ocorra (SANCHEZ; JAFFÉ, 1992) e a mais alta concentração de genes para
resistência à vassoura-de-bruxa (POUND, 1938; CHEESMAN, 1944) são
alguns dos caracteres ancestrais endêmicos que reforçam a origem do
cacaueiro naquelas regiões e que, conseqüentemente, podem ser utilizados na
identificação de populações silvestres.
8
2.3 Panorama geral da cacauicultura
2.3.1 Distribuição geográfica
O cacaueiro é uma típica planta tropical americana, e em condições
espontâneas é encontrado no estrato inferior das florestas, em clareiras e
beirando os grandes rios, onde predominam condições de temperatura e
umidades elevadas, típicas das regiões tropicais que vão da bacia amazônica,
à zona do Caribe e à do Pacífico (CHEESMAN, 1944; CUATRECASAS, 1964;
BARTLEY, 2005). Era uma árvore conhecida e cultivada pelos nativos
americanos, principalmente Maias e Astecas. Do México, onde a propagação
da espécie feita pelos nativos em tempos anteriores ao descobrimento dificulta
especificar se as árvores são de ocorrência espontânea ou não (NOSTI, 1953),
os espanhóis levaram o cacau para outras terras conquistadas, dentre elas, os
países da América Central, a Colômbia, a Venezuela e as ilhas do Caribe. Na
América do Sul, a Venezuela foi um dos primeiros países a cultivar cacau. O
México permaneceu como maior produtor de cacau do mundo até o século
XVII. Com a crescente demanda do produto, o cultivo se estendeu,
rapidamente, para outras regiões, inclusive no Brasil, de onde foi levado para o
Oeste da África por portugueses, se expandindo em Gana, Nigéria, Camarões
e Costa do Marfim, (PAULIN; ESKES, 1995). Atualmente encontram-se
plantações de cacau em diversos países do sudoeste asiático, como a
Indonésia, Malásia, Vietnã, Cingapura, Madagascar entre outoros (WCF, 2009).
As principais regiões produtoras de cacau no mundo situam-se entre 15
o
N e 20
o
S de latitude, uma faixa bastante estreita ao longo do Equador e dentre
os principais países produtores destaca-se o Brasil, onde existem pequenas
áreas de produção em latitudes subtropical (23
o
S), como é o caso do Estado
de São Paulo. No entanto, a maior concentração de plantios está localizada
entre as latitudes de 10
o
acima e abaixo do equador. Em verdade, os maiores
plantios se concentram em regiões onde a temperatura média gira em torno de
22 a 25
o
C e a precipitação pluvial é elevada e bem distribuída ao longo do
ano, algo em torno de 1200 a 2000 mm, com um mínimo mensal variando entre
100 a 130 mm.
A base geográfica da produção mundial compreende três áreas bem
distintas, uma em cada continente. Na América, com ênfase para o Brasil, mais
9
precisamente para o Estado da Bahia; na costa oeste africana, destacando-se
Costa do Marfim, Nigéria, Gana, Libéria e Camarões; e, ultimamente, no
sudeste asiático, uma nova região produtora liderada pela Indonésia, Vietnã e
Filipinas (WCF, 2009).
2.3.2 Importância sócio-econômica
A cadeia produtiva do cacau envolve produtores de amêndoas,
compradores de amêndoas, indústrias e moageiras, empresas de importação e
exportação, indústria chocolateira e de cosméticos, além de várias empresas
fabricantes e distribuidoras de insumos e equipamentos envolvidos em toda a
cadeia de produção (ICCO, 2009). No Brasil, essa cadeia produtiva envolve
investimentos da ordem de 2,3 bilhões de reais, sendo 1,7 bilhões no setor
primário (terra, árvores e benfeitorias). A cultura é responsável por
aproximadamente 300 mil empregos diretos, mas, do cacau, dependem mais
de três milhões de pessoas (DIAS, 2001).
A produção mundial de cacau na safra 2007/2008 foi de 3,6 milhões de
toneladas, sendo 70% desta produção oriunda de países do continente
Africano, 19% dos países do Sudoeste da Ásia e Oceania, e 11% provenientes
das Américas do Sul e Central (ICCO, 2009). A Costa do Marfim lidera, desde a
década de 60, a produção mundial de cacau em amêndoas secas, seguida, na
ordem, por Gana, Indonésia, Nigéria, Camarões, Brasil e Equador. Este rol de
oito países concentra mais de 90% da oferta mundial. Países como o Vietnã,
Libéria e Filipinas aparecem com uma produção emergente, se despontando
como importantes países produtores de cacau. Até a década de 80, o Brasil,
ocupava o 2º lugar desse ranking, hoje aparece em 6º lugar, respondendo por
4,4%, atrás da Costa do Marfim (39,1%), Gana (19,92%), Indonésia (13,65%),
Nigéria (5,46%) e Camarões (5,13%) (ICCO, 2009).
O Brasil, que vinha com sua produção em declínio, entrou em um
processo de recuperação nos últimos anos. O país foi o maior produtor mundial
até meados de 1920 e, entre 1970 e 1980, gerou 3,618 bilhões de dólares em
divisas com as exportações, alcançando sua safra recorde de mais de 400 mil
toneladas logo em seguida, em 1984/85 (DIAS, 2001). Hoje, a produção
10
brasileira ocorre basicamente nos estados da Bahia, Pará, Rondônia, Espírito
Santo e Amazonas, com pequena participação em Mato Grosso e São Paulo.
O principal produtor é a Bahia, com 136.155 toneladas de amêndoa, o que
equivale a 69,41% do total produzido no país, seguido do Pará, com 32.804
toneladas (16,73%), Rondônia com 18.592 (9,48%) e Espírito Santo com 6.944
t (3,54%) (ICCO, 2009).
Além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões
onde é cultivada, a cultura do cacaueiro exerce também um papel importante
na preservação ambiental. Seu cultivo associado com árvores nativas tem
auxiliado na preservação de biomas ameaçados, como a Mata Atlântica e a
Floresta Amazônica. Na Bahia, os fragmentos florestais da mata Atlântica não
se restringem apenas às áreas de declividade acentuada, pelo contrário,
atingem boa parte do litoral sulbaiano. Nessa região, a mata possui os seus
mais significativos remanescentes, os quais fornecem sombra à grande maioria
dos 700 mil ha de cacaueiros, preservando o solo e a água (DIAS, 2001). O
cultivo do cacaueiro nessa região foi, na sua maioria, implantado sob mata
raleada, no sistema cabruca, e sua preservação devem ser perseguidas a
qualquer custo (SILVA, 1997).
2.3.4 A cacauicultura baiana e a vassoura-de-bruxa
Desde 1746, quando o cacau foi introduzido na Bahia, a cacauicultura se
tornou dos principais cultivos nesse estado, levando à Bahia a se destacar no
cenário mundial como uma das principais regiões produtora de cacau (DIAS,
2001). Nesse estado, praticamente 100 municípios têm suas economias
baseadas no cacau, o qual é cultivado principalmente no sistema cabruca, em
aproximadamente 29 mil propriedades, em área equivalente a 700 mil ha
(DIAS, 2001).
Entre as safras de 1980/81 e 1999/00, a cacauicultura brasileira
vivenciou uma queda abrupta de 68% na produção, atingindo o menor volume
dos últimos anos, em torno de 96 mil toneladas, resultado da progressiva
redução da área plantada, queda dos preços internacionais e do padrão
tecnológico adotado como resposta ao alastramento da doença vassoura-de-
bruxa nos cacauais da Bahia. A vassoura-de-bruxa é uma doença causada
11
pelo fungo Moniliophtora (=Crinipellis) perniciosa (Stahel) (AIME e PHILLIPS-
MORA, 2005), e se caracteriza por infectar lançamentos foliares novos, frutos
em desenvolvimento e almofadas florais, podendo até provocar a morte da
planta quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores
bióticos (ANDEBRHAN, 1984; QUEIROZ et al, 2003). Na Bahia, foi detectada
pela primeira vez em 1989 (PEREIRA et al., 1989) onde tomou proporções
devastadoras, devido à susceptibilidade do hospedeiro e condições climáticas
altamente propícias à introdução do patógeno (LUZ et al., 1997). Plantações
comerciais chegaram a perder 100 % da produção causando um dramático
impacto econômico, ecológico e social na região cacaueira baiana
(ANDEBRHAN, 1998; RIOS-RUIZ et al., 2001), o que resultou na falência de
inúmeros produtores, no desemprego de milhares de trabalhadores rurais que
migraram para outras regiões, na erradicação de lavouras em declínio para
substituição por pastagens e café, na depreciação da infra-estrutura e
desvalorização das propriedades rurais e, ainda mais, na exploração
descontrolada de espécies arbóreas de valor ecológico e econômico como
alternativa de complementação da renda dos produtores descapitalizados pela
crise, o que transformando o Brasil em importador cacau em amêndoas na
década de 1990 (DIAS, 2001).
O melhoramento do cacaueiro no Brasil teve início na década de 50
(VELLO, 1972), e atualmente vários esforços integrados estão sendo feitos na
tentativa de recuperar a região cacaueira baiana (DIAS, 2001). O uso de novas
fontes de resistência a M. perniciosa associada a características de
produtividade é uma das prioridades dos programas de melhoramento genético
do cacaueiro nos países da América do Sul (BARTLEY, 2005). No Brasil, por
exemplo, a sobrevivência da lavoura cacaueira na Bahia está, em grande parte,
na dependência do lançamento de cultivares resistente (DIAS, 2001).
2.4 Aspectos genéticos e botânicos do cacau
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta umbrófila de porte
arbóreo e perene pertencente à família Malvaceae, gênero Theobroma
(ALVERSON et al., 1999; APG II, 2003). Chega a atingir 20 m de altura em
12
condições silvestres, mas em condições de cultivo normalmente alcançam ao
redor de 5 metros. Das 22 espécies que compõem o gênero, apenas o cacau e
o cupuaçu (Theobroma grandiflorum) são explorados comercialmente no Brasil
(BARTLEY, 2005). É uma planta diplóide (2n = 20), com tamanho do genoma
estimado em 0,43 ou 0,415 X 10
9
picogramas (FIGUEIRA et al., 1994), e
pertence a classe das dicotiledôneas e, assim sendo, as sementes apresentam
dois cotilédones que representam a parte economicamente aproveitável, sendo
descartados a casca e o gérmen (BARTLEY, 2005).
Ainda segundo Bartley (2005), o cacau possui ampla variabilidade
genética para a maioria dos caracteres, especialmente para o tamanho, forma
e cor dos frutos e das sementes, resistência a doenças e pragas, vigor e
tamanho da árvore, etc. A forma dos frutos pode variar de arredondada a
alongada com diversidade no comprimento e peso que varia de 100 a 2000 g.
A cor do fruto vai de verde a vermelho quando jovens e amarelos a
alaranjados quando maduros. A coloração do fruto imaturo tem grande
importância na discriminação dos grupos raciais, além de se apresentar como
um ótimo descritor para diferenciar genótipos, podendo ser utilizado como um
marcador morfológico, uma vez que é pouco influenciada pelo ambiente (DIAS,
2001). Essa característica é descrita como monogênica, sobre o controle do
gene R, com dois alelos (R e r); e em frutos imaturos a pigmentação vermelha
(RR e Rr) é dominante sobre a verde (rr) (SORIA, 1964). O controle
monogênico, contudo, pode ser complementado pela ação de genes
modificadores, uma vez que ocorrem gradações de cores entre o verde e o
vermelho (DIAS, 2001).
A cor das sementes varia de branca ao roxo intenso, passando por
gradientes de coloração conforme a intensidade de antocianina, e seu peso
pode variar de 0,5 a 5,0 gramas, quando secas (BARTLEY, 2005). O número
de sementes por fruto pode chegar até 50, sendo uma característica importante
na determinação de diversos componentes relacionados com a produção
(DIAS, 2001). É um componente muito variável, e depende diretamente do
número de óvulos e do percentual de fertilização destes (ENGELS, 1983).
A incompatibilidade gamética é um mecanismo genético evolutivo, de
certo modo complexo, que favorece a alogamia ou fecundação cruzada (DE
NETTANCOURT, 2000). Desta forma, existem na população de cacaueiros
13
tanto genótipos autocompatíveis (capazes de se autofertilizar com pólen da
própria planta), como genótipos autoincompatíveis, ou seja, incapazes de se
autofertilizar e, por isso, necessitam pólen de flores de outras plantas com as
quais são compatíveis. Esta característica é responsável por grandes
alterações dos níveis de produção, e considerado como um gargalo tecnológico
da cadeia produtiva do cacau no Sul da Bahia, devido em diversas áreas os
clones autoincompatíveis não estão produzindo de acordo com o preconizado
quando foram liberados (CANTALINO, 2006). Estudos indicam que a baixa
produtividade em algumas plantações comerciais de cacau se deve a uma
polinização pouco efetiva (LEAL, 2005), e que esta característica depende de
condições ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982).
Considerando a genealogia do material híbrido cultivado no sul da Bahia,
que tem como seus progenitores os clones Sca-6, Sca-12 e IMC-67 e outros
acessos Alto Amazônicos que são materiais autoincompatíveis e não possuem
alelos para autocompatibilidade, esperava-se que muitos desses híbridos
selecionados nas fazendas da região sul baiana fossem autoincompatíveis.
Porém um número considerável de seleções com genótipos autocompatíveis
foi identificado nesses cultivos (YAMADA, 2005). A maioria das variedades
clonais em uso pelos produtores é autoincompatível, e testes de
intercompatibilidade necessitam ser realizados para avaliar o grau de
compatibilidade entre elas (BARTLEY, 2005). Mesmo em plantios policlonais, é
necessário que os clones utilizados apresentem um alto grau de
compatibilidade entre eles, caso contrário, os efeitos da incompatibilidade
gamética sobre a produção irão se manifestar de forma acentuada, traduzindo-
se em desuniformidade em tamanho e número de sementes por fruto, como
também na quantidade de frutos por planta. A inclusão de clones
autocompatíveis certamente reduz os efeitos negativos da incompatibilidade
(BARTLEY, 2005).
2.5 Biologia floral e sistemas de cruzamento
O cacaueiro é uma espécie monóica, tipicamente cauliflora, pois as
inflorescências se formam ao longo do tronco e ramificações secundárias e
terciárias mais desenvolvidas, em estruturas denominadas almofadas florais.
14
As almofadas florais não sendo danificadas por tratos culturais ou doenças
podem produzir frutos por vários anos. As flores são hermafroditas e
pentâmeras, apresentando pétalas, sépalas, estames e estaminódios ou falsos
estames. No pistilo, o ovário apresenta de 30 a 70 óvulos. Os órgãos
reprodutivos (estame e pistilo) encontram-se isolados na flor por duas barreiras
físicas: a coroa de estaminódios e as próprias pétalas que envolvem as
anteras. A presença dessas barreiras favorece a polinização cruzada, mesmo
em cacaueiros autocompatíveis, embora nesses a taxa de autofecundação seja
relativamente alta. Quando a planta é jovem, as flores são produzidas
principalmente no tronco. Em plantas adultas, elas surgem por toda planta, em
maior quantidade nos ramos com mais de 1 cm de diâmetro. Plantas
autocompatíveis apresentam uma menor quantidade de flores que as plantas
autoincompatíveis, porém a porcentagem de frutos nestas plantas é maior e
esses frutos (COPE, 1939). Um cacaueiro adulto pode produzir mais de 100 a
150 mil flores por ano, das quais menos de 5% é polinizada, e somente 0,5 a
5% resulta na produção de frutos (COPE, 1976; ANEJA, et al., 1999). Isto é em
parte devido ao fato de que a taxa efetiva de autofertilização em árvores
autoincompatíveis é baixa, enquanto que árvores autocompativeis pode
alcançar até 43% (YAMADA; GURIES, 1998).
O pólen é pegajoso, formando pequenos grumos o que favorece a sua
aderência à superfície de insetos, que comumente são os agentes
polinizadores das flores. A flor não polinizada nas primeiras 8 a 10 horas após
a emergência cai; esse aborto ocorre normalmente nas 24 a 36 horas
subseqüentes (ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O tempo
que transcorre entre a germinação do pólen no estigma e a fecundação é de
aproximadamente seis horas (CHEESMAN, 1938). Se a polinização é realizada
e a fecundação ocorre, o ovário e o pedicelo aumentam de tamanho, e a coroa
murcha e se deteriora (ANEJA et al, 1999).
Em cacaueiros, a abscisão floral pode ser uma conseqüência da reação
de rejeição com o reconhecimento precedendo as primeiras mudanças
detectáveis no ambiente hormonal que pode conduzir à abscisão floral (ANEJA
et al., 1994; BAKER, et al., 1997). A abscisão é um processo de regulação
hormonal que envolve o órgão da planta e a zona de abscisão. O etileno e o
acido indol acético (AIA), uma auxina, têm um papel primário no controle da
15
abscisão. O primeiro é o principal promotor da abscisão e o segundo pode inibir
ou aumentar a produção do primeiro e prevenir ou acelerar a reação de
abscisão (ANEJA et al, 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O acido
abscísico aumenta nos tecidos em abscisão e participa do processo.
O sistema de reprodução é componente importante da estrutura
genética de populações. A distribuição da variação genética dentro de
progênie, entre indivíduos da população e entre subdivisões da população, é
regulada pelo sistema de reprodução da espécie (HAMRICK, 1982). Apesar de
o cacaueiro apresentar flores hermafroditas e homógamas, sua polinização se
limita quase que exclusivamente ao concurso de algumas espécies de
micromoscas forcipomyia, pois só elas conseguem depositar de 35 a 40 grãos
de pólen viáveis, quantidade mínima para a formação de um fruto
desenvolvido, embora insetos, tais como trips, formigas e afídeos possam
promover polinização acidental (CHAPMAN; SORIA, 1983). Segundo
Kaufmann, (1975) tais micromoscas são supostamente atraídas pelas partes
coloridas da flor, especialmente pelas linhas guias das pétalas e pelos
estaminódios, o que diverge da opinião de Soria et al, (1982), que acreditam
que o comportamento desses insetos independa da coloração das flores. As
anteras das flores dos cacaueiros encontram-se revestidas por um
prolongamento das pétalas, em forma côncava, denominado "cógula" ou
"cuculo" e o ovário é envolvido por um círculo de estaminódios inférteis. Essa
estrutura complexa de flor exige a participação de insetos para proceder à
polinização e representa uma adaptação de T. cacao a atividade de seu
principal agente polinizador (SORIA et al., 1975).
O cacaueiro é considerado uma planta alógama (95% fecundação
cruzada), apesar de que também ocorre uma taxa de autogamia
(autofecundação) relativamente alta. A ocorrência desse elevado grau de
fecundação cruzada é característico dessa espécie, cujas taxas de cruzamento
natural variam de 50 a 100%. Esse fato contribui para que as populações
formadas a partir de sementes obtidas sem controle de polinização apresentem
elevada heterogeneidade (VELLO; NASCIMENTO, 1971; TOXOPEUS, 1972)
ou para que as populações locais, mesmo que tenham evoluído em condição
de isolamento, representem um grupo mais ou menos heterogêneo formado
por indivíduos heterozigóticos (CHEESMAN, 1944). O modo de polinização em
16
cacau contribui para que ocorra, freqüentemente, a deposição da mistura de
pólen da própria planta e das plantas vizinhas sobre o estigma (VOELCKER,
1940). No entanto, a presença de sistemas de incompatibilidade na população
pode limitar a fecundação natural e restringir o fluxo de genes, bem como o
rendimento de plantas autoincompatíveis, embora tais plantas apresentem,
freqüentemente, cruzamento compatível entre si. Esse mecanismo de
incompatibilidade é exclusivo de T. cacao, pois associa durante a
microsporogênese, fatores gametofíticos e esporofíticos no controle do fenótipo
de incompatibilidade do pólen (BARTLEY, 2005).
2.6 Incompatibilidade genética em plantas
O fenômeno da autoincompatibilidade (AI) tem sido definido de diversas
maneiras ao longo do tempo e tem sido um assunto de grande interesse para
geneticistas e melhoristas de plantas (DE NETTANCOURT, 2000). O conceito
de maior consenso atualmente é o de Lundqvist (1964), referendado por De
Nettancourt (1977; 2000). Para os autores, AI é a incapacidade de uma planta
fértil hermafrodita produzir zigotos após a autopolinização. Resulta do fracasso
dos grãos de pólen da mesma planta de aderirem ou germinarem no estigma
ou no fracasso dos tubos polínicos de penetrarem ou crescerem através do
estigma. Esta definição elimina os fracassos devidos a diversas formas de
esterilidade (genética, fisiológica etc.), ou outras barreiras reprodutivas, assim
como os efeitos causados pela endogamia (DE NETTANCOURT, 1977; 2000).
É um mecanismo fisiológico, com base genética, que favorece a
alogamia, promovendo, desta forma, a manutenção da variabilidade genética.
Por isto é considerada como um dos fatores mais importantes para o sucesso
evolutivo das fanerógamas (BREWBAKER, 1957; HESLOP-HARRISON, 1983).
Por outro lado, a AI pode, em alguns casos, levar a uma certa ineficiência
reprodutiva. Sutherland & Delph (1984), comparando 316 espécies, verificaram
que a média de formação de frutos em espécies autocompatíveis era de 72,5%
contra 22,1% em espécies autoincompatíveis. Da mesma forma, em Lótus, o
desenvolvimento dos óvulos é mais uniforme nas espécies autocompatíveis do
que nas autoincompatíveis (BUBAR, 1958). E, sabe-se ainda, por exemplo, que
os cacaueiros autocompatíveis tendem a apresentar maior produção de frutos
17
e de amêndoas secas que os auto-incompatíveis (LOCKWOOD, 1977 e
MORERA et al., 1994).
A autoincompatibilidade ocorre em uma ampla gama de famílias e
gêneros de angiospermas, inclusive em várias plantas de interesse econômico
(BREWBAKER, 1957) como em espécies de Nicotiana, Brassica, Medicago,
Trifolium, Secale, Lotus, Helianthus e Theobroma. Os trabalhos publicados
sobre o assunto abrangem desde aspectos morfológicos, fisiológicos, aplicação
no melhoramento até a biologia molecular e genética da autoincompatibilidade
(BREWBAKER, 1957; DE NETTANCOURT, 2000).
Existem dois tipos principais de AI, a gametofítica (AIG), em que a
especificidade do pólen é gerada pelo alelo S do genoma haplóide do grão do
pólen (gametófito), e a esporofítica (AIE), em que a especificidade é gerada
pelo genótipo diplóide da planta adulta (esporófito) que deu origem ao grão de
pólen. A reação da AI engloba desde o impedimento da germinação do pólen
até o rompimento do tubo polínico (HESLOP-HARRISON, 1983; DE
NETTANCOURT, 1977; 2000).
Devido à sua ampla distribuição entre as angiospermas, a AI teria
surgido precocemente, antes que houvesse divergência evolutiva
(WHITEHOUSE, 1951), ou teria havido um surgimento recorrente durante a
evolução (BATEMAN, 1952). A AIG é o sistema mais comum entre as plantas,
e supõe-se que seja o mais primitivo. (HESLOP-HARRISON, 1983; NEWBIGIN
et al., 1993; DE NETTANCOURT, 1997; 2000). Estudos de seqüenciamento
gênico indicam que os locos para AI evoluíram a partir de origens
independentes, diversas vezes, na evolução das plantas com flores
(CHARLESWORTH; AWADALLA, 1998).
Além da AI, existe também o que se chama de pseudo-compatibilidade,
que é a ocorrência de autocompatibilidade em espécies normalmente auto-
incompatíveis. Nesse caso, ocorre formação de sementes sob algumas
condições fisiológicas e ambientais especiais. Sabe-se que está sob controle
genético, mas tem sido pouco estudada (DE NETTANCOURT, 1977; 2000).
18
2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica
Na AIG, os tubos polínicos só irão crescer e só irá ocorrer fecundação se
o alelo presente no grão de pólen não estiver presente no tecido diplóide do
estilete. Por exemplo, nos seguintes cruzamentos, envolvendo progenitores
com diversos genótipos para os alelos S (alelos da AI):
a) S
1
S
2
(feminino) x S
1
S
2
(masculino) grãos de pólen serão S
1
e S
2
tubos polínicos não irão crescer não haverá progênie;
b) S
1
S
2
(feminino) x S
1
S
3
(masculino) grãos de pólen serão S
1
e S
3
apenas tubos polínicos S
3
irão crescer progênie será S
1
S
3
e S
2
S
3
;
c) S
1
S
2
(feminino) x S
3
S
4
(masculino) grãos de pólen serão S
3
e S
4
todos os tubos polínicos irão crescer progênie será S
1
S
3
, S
1
S
4
, S
2
S
3
e
S
2
S
4
; portanto, os cruzamentos compatíveis só ocorrerão quando o alelo
S do pólen for diferente de qualquer alelo presente no estilete diplóide.
Nesse processo, o grão de pólen germina e a reação de
incompatibilidade ocorre entre o tubo polínico e o estilete. Supõe-se que a ação
dos genes S seja ativada após a meiose. Há envolvimento de RNAses e
glicoproteínas (NEWBIGIN et al., 1993).
Muito ainda precisa ser estudado em relação à genética da reação da
AIG. Sabe-se que os tubos polínicos compatíveis apresentam estrutura normal,
com deposição reticulada de calose, e os auto-incompatíveis desenvolvem um
depósito irregular de calose, mas ainda não está claro o que é causa e o que é
conseqüência (DE NETTANCOURT, 2000).
A herança da AIG é em geral monofatorial, ou seja, regulada por um só
loco com número variável de alelos (BURGOS et al., 1997). A estrutura do
loco-S é bastante complexa, provavelmente envolvendo genes separados,
controlando as funções do pólen e do pistilo (MC CUBBIN; KAO, 1999; DE
NETTANCOURT, 2000).
2.6.2 Autoincompatibilidade esporofítica
Na AIE, a especificidade do pólen é determinada pelo genótipo diplóide
do esporofíto, isto é, da planta mãe. Portanto, o que determinará a ocorrência
19
ou não de AI não será o alelo que o pólen carrega, mas sim os alelos presentes
no tecido diplóide da planta. Por exemplo, nos seguintes cruzamentos,
envolvendo progenitores com diversos genótipos para os alelos S,
considerando S
1
dominante em relação a S
2
e S
3
e S
3
dominante em relação a
S
4
:
a) S
1
S
2
(feminino) x S
1
S
2
(masculino) grãos de pólen portarão alelos
S
1
ou S
2
, mas expressarão sempre o S
1
tubos polínicos não irão
crescer não haverá progênie;
b) S
1
S
2
(feminino) x S
1
S
3
(masculino) grãos de pólen portarão alelos
S
1
ou S
3
, mas expressarão sempre o S
1
tubos polínicos não irão
crescer não haverá progênie;
c) S
1
S
2
(feminino) x S
3
S
4
(masculino) grãos de pólen portarão alelos
S
3
ou S
4
, mas expressarão sempre o S
3
todos os tubos polínicos irão
crescer progênie será S
1
S
3
, S
1
S
4
, S
2
S
3
e S
2
S
4
.
A reação de AIE ocorre no estigma e as espécies que a apresentam são
aquelas do tipo em que o pólen é liberado na forma trinucleada. Os alelos S
têm como sítio de ação as células das papilas do estigma. A reação de
incompatibilidade é rápida e precoce e a capacidade de discriminar entre o
pólen da mesma planta e um pólen diferente é afetada pelo estádio de
desenvolvimento do estigma. A síntese dos produtos dos alelos-S ocorre
supostamente antes do fim da meiose (NEWBIGIN et al., 1993; DE
NETTANCOURT, 2000).
A AIE pode, às vezes, estar associada a polimorfismos florais. Quando
isto não ocorre, diz-se que a AIE é homomórfica, ou seja, plantas com
diferentes genótipos para incompatibilidade são morfologicamente idênticas.
Quando há ligação entre polimorfismos florais e genótipos para
incompatibilidade, diz-se que a AIE é heteromórfica. Neste caso, as diferenças
na morfologia floral estão associadas a tipos de incompatibilidade. Em geral,
estas diferenças envolvem diferentes comprimentos de estiletes e estames.
Espécies distílicas são aquelas em que uma das formas florais tem estiletes
longos e anteras curtas e a outra forma tem estilete curto e anteras longas. As
polinizações compatíveis ocorrem apenas entre anteras e estigmas do mesmo
comprimento, ou seja, entre diferentes formas florais (DE NETTANCOURT,
1977; 2000; RICHARDS, 1997).
20
A herança da AIE é variável, podendo ser controlada tanto por um único
loco ou até por muitos locos (GOODWILLIE, 1997). A AIE é considerada um
sistema bastante complexo e que pode abranger diversos tipos de mecanismos
fisiológicos e genéticos (HESLOP-HARRISON, 1983; DE NETTANCOURT,
1977; 1997; 2000; RICHARDS, 1997). Os genes-S do sistema de AIE são
superfamílias de genes. O grande polimorfismo existente para o número de
alelos S tanto nos sistemas de AIG e AIE, bem como a manutenção deste
polimorfismo, é explicado pela ação da seleção que favoreceria diferentes
alelos, assegurando a fertilidade da população. Alelos raros teriam uma
vantagem de fertilidade, pois os grãos de pólen que os portassem não seriam
rejeitados pelas plantas receptoras e estes alelos tenderiam a aumentar em
freqüência (CHARLESWORTH; GUTTMAN, 1997).
Muitas questões ainda estão para serem resolvidas, porém os estudos
envolvendo o processo de autoincompatibilidade ao nível molecular em plantas
contribuíram grandemente para o entendimento atual sobre o processo de
reconhecimento e rejeição dos grãos incompatíveis pelo estigma. Apesar de
alguns detalhes ainda serem desconhecidos, o volume de conhecimentos
acumulados para as diferentes espécies, nos permite uma visão bastante
ampla do processo.
A utilização da AI no melhoramento de plantas é feita há bastante
tempo, mas existe uma lacuna entre o conhecimento teórico da AI e a
aplicação destes conhecimentos no melhoramento genético (DE
NETTANCOURT, 1997). A ocorrência de AI em espécies de interesse
econômico pode ter uma importância muito grande, sendo muito positiva em
alguns casos e um empecilho em outros, dependendo da parte da planta que é
colhida e do tipo de reprodução da mesma (DE NETTANCOURT, 1977).
2.7 Sistema de incompatibilidade sexual em cacaueiro
O sistema de autoincompatibilidade do cacaueiro é considerado único
porque a expressão do gene S (gene de reconhecimento) aparentemente
ocorre apenas no ovário, quando o tubo polínico e o óvulo entram em contato e
a reação de rejeição resulta na abscisão da flor e não na deposição de calose
21
no tubo polínico (DE NETTANCOURT, 1977). O tipo de controle genético é
polifatorial gameto-esporofítico e, apesar de este ser o exemplo mais marcante,
existem referências à inibição ovariana em outras espécies (DE
NETTANCOURT, 2000). A auto-incompatibilidade em plantas que produzem
flores, a exemplo do cacau, nada mais é que um processo bioquímico de
reconhecimento e rejeição que impede a autofertilização (singamia). Estão
envolvidas as interações entre o grão de pólen e o pistilo (estigma ou estilete).
E o tubo polínico, que se origina com a germinação do pólen, pode ser inibido
tanto no estigma quanto no estilete.
A primeira vez que se mencionou a existência de incompatibilidade em
cacaueiros foi em 1925, quando Harland, em Trinidad, observando cacaueiros
sadios e de mesmo desenvolvimento vegetativo, notou que havia uma
acentuada diferença entre eles quanto ao número de frutos, e que alguns deles
nem chegavam a produzir. Porém, coube a Pound (1932), realizar os primeiros
estudos sobre a incompatibilidade do cacaueiro, o qual verificou que
determinadas plantas não se autofecundavam, ou seja, eram
autoincompatíveis. Observou ainda que flores de árvores incompatíveis tinham
também a característica de seu pólen não fecundar outras plantas
incompatíveis (POUND, 1935a) e que, o pólen proveniente de uma planta
autocompatível é viável sobre qualquer estigma, porém quando provém de
plantas autoincompatíveis sua viabilidade se restringe aos estigmas de
cacaueiros autocompatíveis (POUND, 1935b).
Cheesman (1938) confirmou a existência de incompatibilidade em
plantações de Trinidad e classificou as plantas em: 1) Plantas autocompatíveis,
que frutificam ao serem polinizadas por pólen de outras plantas
autocompatíveis; 2) plantas autocompatíveis que podem frutificar quando
polinizadas com pólen de plantas autoincompatíveis; 3) plantas
autoincompatíveis que frutificam ao serem polinizadas com pólen de outras
árvores autoincompatíveis; 4) Plantas autoincompatíveis que não frutificam ao
serem polinizadas por pólen de outras plantas autoincompatíveis.
Outros investigadores vieram, posteriormente, a estudar este
mecanismo (KNIGHT; ROGERS 1953; 1955; COPE 1958; 1959; 1962) e
mostraram que uma polinização incompatível não resulta da inibição da
germinação do pólen ou do crescimento do tubo polínico, como foi postulado
22
por Posnette (1938), eles demonstraram que isso ocorre devido a uma falha na
fusão do núcleo espermático do grão-de-pólen com a oosfera numa
percentagem de óvulos após uma polinização incompatível, tendo como
conseqüência o aborto das flores.
Knight & Rogers (1955), propuseram uma hipótese genética para
explicar as incompatibilidades do cacaueiro baseados no fato de que a
fertilização estaria sendo controlada por uma série de alelos múltiplos S, de
natureza esporofítica, em número de cinco com a seguinte ordem: S
1
> S
2
= S
3
> S
4
> S
5
, e que a incompatibilidade ocorre depois que o tubo polínico penetra
no óvulo, sendo a reação esporofítica e determinada pela constituição diplóide
dos genitores.
Cope (1962), demonstrou que as incompatibilidades em T. cacao estaria
controlada pelo sistema genético da fusão e não fusão dos óvulos, repousando
nisto o sucesso ou o fracasso da singamia. Sugeriu ainda que a hipótese
formulada por Knight & Rogers (1955), na qual uma série de alelos “S” de ação
esporofítica estaria governando as incompatibilidades seria inadequada para
explicar os resultados obtidos em seu trabalho. Cope postulou ainda a
existência de um novo alelo S
6
na série de alelos múltiplos de
incompatibilidades e de dois locos complementares A e B, independentes,
porém complementares aos genes S. Estes acessórios teriam a função de
produzir um substrato, que ausente, impediria as incompatibilidades de se
manifestarem. Os locos A e B atuariam antes da meiose expressando ação de
dominância e produzindo um precursor inespecífico para os alelos S após a
meiose. Se presentes na forma dominante concorrem para que os alelos atuem
em base esporofítica, porém, se tais locos estivessem na forma recessiva,
todas as formas de S seriam autocompatíveis. Neste mesmo trabalho, Cope
(1962), propôs fórmulas genotípicas de incompatibilidades para a série de
cultivares por ele estudado e estabeleceu que os alelos S teriam a seguinte
ordem de dominância: Sa = Sb = Sc > Sd > Sf. O padrão de segregação dos
locos A, B e S e a distribuição dos fenótipos após cruzamentos entre
cacaueiros auto-incompatíveis e autocompatíveis, em todas as possibilidades,
foram apresentados por Bartley & Cope, (1973).
O crescimento do tubo polínico em polinização incompatível é
comparável ao da polinização compatível normal, com os anterozóides
23
atingindo normalmente o saco embrionário. Entretanto, a anormalidade surge
no saco embrionário e se processa por impedimento da singamia: a fusão dos
gametas masculinos com os femininos carregando o mesmo alelo dominante.
De modo que, em polinizações incompatíveis, podem ocorrer 25%, 50% e até
100% de abortos (Cope, 1958 e 1962), demonstrando que o fenômeno exibe
gradações em sua expressão. Essa gradação na expressão da auto-
incompatibilidade tem sido também confirmada com marcadores bioquímicos.
Lanaud et al., (1987), por exemplo, utilizando marcadores isoenzimáticos,
observaram que a percentagem de sementes autofecundadas, em clones auto-
incompatíveis, variou de 0 a 89%, enquanto Yamada (1991), verificou taxas de
endogamia, em clones autoincompatíveis, que variaram apenas de 3 a 8%.
Levando em consideração resultados encontrados em autofecundações
de clones autocompatíveis, Coral (1970) propôs a hipótese da existência de
clones com diferentes graus de autocompatibilidade, e que tal fenômeno
poderia ser explicado pela introdução de dois pares de genes independentes, X
e Z, complementares e modificadores do gene S de incompatibilidade.
Adicionalmente, o cruzamento entre determinados clones autocompatíveis
pode gerar progênies parcialmente ou totalmente autoincompatíveis. Estudos
mostraram que algumas progênies de clones como PA-150 (YAMADA et al.,
1988), UF-613 (BARTLEY; YAMADA, 1982) e TSH (ICS-1x Sca-6) podem
segregar para autocompatibilidade (DIAS, 2001; YAMADA et al., 2005).
Pandey, 1960, reconheceu a natureza genética do sistema de
incompatibilidade em cacau, porém criticou a interpretação genética
desnecessariamente complexa dada a ele. Para justificar a ocorrência de
híbridos auto-incompatíveis gerados de genitores autocompatíveis, este autor
utilizou-se da interação alélica competitiva, descartando a postulação dos locos
independentes A e B proposta por Cope (1958, 1962). A interação competitiva
entre alelos S, ao impedir a expressão completa de qualquer deles
isoladamente, explicaria o evento. Um cacaueiro tendo dois alelos S
interagindo competitivamente, não produziria a substância específica de
incompatibilidade em quantidade suficiente para crescimento de pólen, para
qualquer dos dois alelos e seria completamente autocompatível. Não obstante,
a progênie do cruzamento entre dois desses cacaueiros poderia ser então
auto-incompatível. De modo que as árvores autocompatíveis e auto-
24
incompatíveis na progênie poderiam surgir nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 e
esta hipótese de Pandey explicaria bem o evento com base somente nos alelos
S. A ação de dominância de um alelo sobre o outro e a ação de independência
de ambos os alelos já haviam sido adequadamente utilizadas na teoria de
Knight & Rogers (1953, 1955) para explicar o funcionamento dos alelos do loco
S. E, realmente, os estudos de incompatibilidade (CORAL, 1970; CARLETTO;
SORIA, 1973) têm demonstrado que o fenômeno em T. cacao é melhor
explicado pela teoria do loco S de Knight & Rogers (1953, 1955), do que pela
teoria dos locos independentes A, B e S de Cope (1958, 1962).
Existem também estudos mostrando que o reconhecimento da
autocompatibilidade ocorre antes do contato do pólen com óvulo. Aneja et al.,
(1994), verificaram que no clone IMC 30, auto-incompatível, o seu pólen não
germinou. Entretanto, com a aplicação de CO
2
a reação de
autoincompatibilidade foi inibida em flores autopolinizadas, indicando que o
sistema de autoincompatibilidade em cacaueiros pode ser um resultado de dois
processos: Primeiramente com um aumento na quantidade de ácido abscísico
em resposta à interação pólen-estigma. A segunda resposta afeta os níveis de
AIA e etileno, após o contato do tubo polínico com o óvulo, estabelecendo as
condições hormonais que determinam o aborto da flor (ANEJA et al., 1994;.
ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001) Assim, a abscisão parece
ocorrer se altos níveis de etileno e de ácido abscísico estão presentes, o que é
observado em flores incompatíveis polinizadas. Por outro lado, é possível
retardar ou até mesmo inibir a abscisão com a aplicação tanto de CO
2
quanto
de auxinas sintéticas ou de outros compostos que aumentem os níveis de
auxinas ou diminuam os níveis de acido abscísico e, ou etileno (ALMEIDA;
VALLE, 2007).
2.7.1 Determinação da compatibilidade sexual
Os estudos da reação de compatibilidade são realizados por meio de
autopolinizações controladas. Ressalte-se que uma única polinização gera
entre 40 e 45 sementes e que, em polinizações incompatíveis, as flores são
abortadas dentro de 3 a 4 dias, e as avaliações são feitas geralmente no
25
terceiro, sétimo e 15º dias após as polinizações (TERREROS et al., 1982;
YAMADA et al., 1982; YAMADA; BARTLEY, 1984; PINTO et al., 1998).
Dois critérios são comumente empregados para se testar a reação de
incompatibilidade de dado genótipo. Pelo primeiro, o número mínimo de flores
retidas nas autopolinizações e nos cruzamentos, com uma ou mais
testemunhas para declarar a compatibilidade, é estimado empregando-se o
qui-quadrado para testar a proporção de 1:1, a 5% de probabilidade com 1 grau
de liberdade (TERREROS et al., 1982). Pelo segundo critério, a
compatibilidade sexual de um material é determinada pela retenção de flores
(índice de pegamento) no 15º dia após as polinizações. López (1982) considera
que um material é autocompatível se este apresentar um índice de pegamento
de no mínimo 2%. Já autores como Bartley & Cope (1973), Terreros et al.,
(1982), Lopes & Carletto (1995) e León (2000), consideram que esse índice de
pegamento deva ser superior a 5%, enquanto que para Pinto et al., (1998) é
necessário um índice de pegamento de pelo menos 10%, pois ocasionalmente
plantas autoincompatíveis podem produzir um ou outro fruto nas polinizações.
Alguns autores ainda recomendam valores como, 14% (LEAL 2005) e até 40%
(CASTILHO, 2005), acreditando que em polinizações artificiais o pólen
colocado diretamente no estigma da flor facilite o pegamento das polinizações.
Segundo Lopes & Carletto (1995), este segundo critério parece superestimar a
autocompatibilidade mais que o primeiro, pois o tamanho amostral reduzido
influencia grandemente os resultados comprometendo assim as inferências.
Os resultados confusos e contraditórios obtidos nos estudos da reação
de incompatibilidade mostram claramente a deficiência dos procedimentos
adotados na abordagem do fenômeno. A abscisão das flores, por exemplo,
pode ser causada tanto pela ineficiência na mecânica de polinização quanto
por reações fisiológicas e sazonais ocorridas no órgão reprodutor. Também os
critérios adotados para declaração de incompatibilidade são discutíveis.
Existem variações, desde oito (LEAL, 2005), 10 e (CARLETTO, 1972) até 15
dias (PINTO et al., 1998), no período pós-polinização para tal declaração, o
que impede a comparação de resultados obtidos por diferentes autores. O
tamanho amostral utilizado nestes estudos é também altamente variável, com
alguns autores realizando apenas 15 (BARTLEY; COPE 1973)
autopolinizações e polinizações cruzadas, enquanto outros empregam até 40
26
(PINTO et al., 1998). Segundo Lopes & Carletto (1995), para cada cacaueiro,
utiliza-se entre 15 e 40 flores para autopolinização e polinizações cruzadas,
sendo 26 o número médio ótimo. Como se não bastasse, as várias teorias
propostas para a reação são complexas, particularizadas por genótipos, e,
portanto, não se aplicam a todas as situações (DIAS, 2001).
2.8 Bancos de germoplasma e certificação genética
Segundo IBPGR (1983), atual Bioversity International, germoplasma é o
material que constitui a base física da herança e se transmite de uma geração
para outra através de células reprodutivas. Numa visão mais ampla,
germoplasma pode ser considerado a soma total dos materiais hereditários de
uma espécie. Os bancos de germoplasma (BAG) têm como objetivos evitar a
perda de recursos genéticos, conservar fontes genéticas para futuro uso em
melhoramento e colecionar, identificar e caracterizar genótipos para uso no
melhoramento (BARBIERI, 2003). Devido à recalcitrância das sementes, que
são pouco adaptadas para armazenamento em longo prazo, os recursos
genéticos de cacaueiros devem ser mantidos em coleções de campo de
plantas vivas (DIAS, 2001). Usualmente, coleções de germoplasma de
Theobroma cacao são muito grandes e ocupam áreas muito extensas,
tornando-se onerosas e difíceis para o manejo apropriado, demandando muito
trabalho com várias práticas culturais.
No Brasil, a CEPLAC possui dois grandes bancos de germoplasma de
cacau. O maior deles encontra-se estabelecido na região norte, no município
de Marituba, no Estado do Pará. O outro está localizado em Ilhéus, Bahia,
sendo considerado como mais diversificado geneticamente (BARTLEY, 2005).
Em conjunto, os dois bancos de germoplasma possuem cerca de 3.000 tipos
diferentes de acessos clonais e 17.000 acessos seminais com ampla
variabilidade para a maioria dos caracteres de importância genética e
agronômica como produção, resistência a doenças, compatibilidade gamética,
forma e tamanho de frutos e sementes, porte, arquitetura, flor, etc (BARTLEY,
2005). Ainda na Bahia, na cidade de Barro Preto, outro BAG com cerca de 600
acessos clonais encontra-se localizado na Fazenda Almirante Cacau, atual
27
Centro de Ciências do Cacau (Regina Celle Rebouças Machado, informação
pessoal).
Nestas coleções, cada tipo de cacaueiro (acesso clonal ou seminal) é
individualmente representado por várias plantas (normalmente 10) que são
repetições do mesmo genótipo, o que garante e facilita a sua manutenção,
caracterização e avaliação. Esses bancos nada mais são que depósitos
naturais de genes, representando a variabilidade natural da espécie
Theobroma cacao.
É de fundamental importância à realização da caracterização molecular
e morfológica dos acessos que compõem as coleções visando conhecer as
potencialidades das mesmas, identificando assim a variabilidade entre e dentre
as populações. Essas são as ferramentas indispensáveis aos fitomelhoradores
do programa de melhoramento do cacaueiro, que através de cruzamentos
apropriados, possam explorar a variabilidade genética e promover a criação de
cultivares com características superiores para uso comercial (BARTLEY, 2005).
A presença de erros na identificação de acessos em vários bancos de
germoplasma parece ser mais comum do que se espera e, nesse sentido, visto
a grande importância dos bancos de germoplasma, um esforço internacional é
necessário para a caracterização de todas as coleções de germoplasma de
cacaueiro do mundo (FALEIRO et al., 2002). Dentro do escopo do projeto
Internacional “Conservação e Utilização de Germoplasma de Cacaueiro”,
financiado pela parceria CFC/ICCO/IPGRI, Risterucci et al (2000b) avaliaram
148 indivíduos de 28 clones, amostrados em várias coleções nacionais,
empregando 10 locos de microssatélites, e identificaram cerca de 30% dos
indivíduos com erros de identificação. Figueira (1998) demonstrou por meio de
marcadores RAPD, diferenças na identificação de acessos de cacau entre os
bancos de germoplasma do Brasil e da Malásia. De um estudo com 20
genótipos avaliados com 19 SSRs, Risterucci et al (2001) sugeriu que 15 locos
microssatélites são suficientes para verificação da identidade e Swanson et al
(2003) sugeriu que 11 SSRs podem ser suficientes para a genotipagem de
acessos de cacau. A identificação de acessos por genotipagem molecular, ao
contrário da caracterização morfo-agronômica, independe da idade da planta,
do estádio de desenvolvimento em que ela se encontra e mesmo do ambiente
em que é cultivada.
28
2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação
Os polimorfismos genéticos em nível do DNA são abundantes nos
genomas vegetais e podem ser detectados por diferentes técnicas de biologia
molécular, gerando marcadores moleculares informativos. Marcadores
moleculares baseados na amplificação de fragmentos de DNA pela reação em
cadeia da polimerase (PCR) têm sido largamente empregados nos programas
de melhoramento de plantas, como na caracterização de populações,
construções de mapas de ligação e detecção de QTL entre outras aplicações
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Na construção de mapas de ligação normalmente são empregados
grande número de marcadores moleculares, sejam eles loco-específicos
dominantes (como RAPD – DNA polimórfico amplificado ao acaso; AFLP –
polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados) ou loco co-
dominante (como microssatélites; RFLP – polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição obtidos por cortes aleatórios da fita dupla de DNA).
Presentes na maioria dos genomas dos organismos eucariotos, os
marcadores moleculares do tipo microssatélites (Simple Sequence Repeats -
SSR) consistem de seqüências curtas de 2-5 nucleotídeos repetidas em
tandem, flanqueadas por seqüências únicas não repetidas, sendo os elementos
repetidos mais comuns os di-nucleotídeos AT e CA. A variação alélica em locos
de microsatélites pode ser facilmente detectada por PCR usando primers
flanqueadores específicos. O polimorfismo baseado na variação do número de
seqüências repetidas dos microssatélites é provavelmente ocasionado por
escorregamento da DNA polimerase na replicação do DNA ou por troca de
partes desigual entre os cromossomos (HANCOCK, 2000).
Os marcadores microssatélites tornaram-se rapidamente os mais
utilizados pelos geneticistas de humanos, para o desenvolvimento de mapas de
ligação e para a identificação de indivíduos. Em plantas, os microssatélites são
muito freqüentes e distribuídos ao acaso ao longo do genoma, também sendo
amplamente utilizados nos estudos de diversidade genética, caracterização de
germoplasma, construção de mapas genéticos e localização de QTLs. Esses
29
marcadores têm sido amplamente utilizados em muitas espécies de plantas por
serem abundantes, com freqüência média de um a cada 50 mil pares de bases,
possuírem alto grau de polimorfismo, serem loco-específicos, apresentarem
reprodutibilidade dos resultados, baixa quantidade de DNA requerida nas
análises, serem detectados facilmente utilizando gel de agarose, poliacrilamida
ou através de sequenciamento automático (PUGH et al., 2004). Atualmente
existem mapeados muitos locos de microssatélites para o cacaueiro
distribuídos ao longo dos 10 cromossomos (LANAUD et al., 1995; PUGH et al.,
2004; BROWN et al., 2005; SCHNELL et al., 2007).
O mapeamento genético teve início após o reconhecimento do
fenômeno da ligação genética (MORGAN, 1910). Ele toma como base a
hipótese de que a co-segregação de dois marcadores indica proximidade entre
eles, e que a probabilidade de ocorrer permutas genéticas entre esses dois
marcadores é menor, quanto menor for à distância entre eles. Dessa forma, é
possível ordenar linearmente a informação genética ao longo dos
cromossomos. A grande disponibilidade de marcadores moleculares e
metodologias estatísticas eficientes fizeram com que, atualmente, estejam
disponíveis mapas genéticos saturados para a maioria das espécies cultivadas,
dentre elas a soja (CORRÊA, 1995), o café (PEARL et al., 2004), o milho
(BRUNELLI et al., 2002), o eucalipto (GRATTAPAGLIA; SEDEROFF, 1994), o
feijão (FALEIRO et al., 2003), além do cacaueiro, onde os diferentes mapas
construídos (LANAUD et al., 1995; CROUZILLAT et al., 1996; RISTERUCCI et
al., 2000; CROUZILLAT et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; QUEIROZ et al.,
2003; CLÉMENT, 2003; RISTERUCCI et al., 2003; LANAUD et al., 2004),
culminou com o estabelecimento do primeiro mapa consenso para o cacau
(PUGH et al., 2004), além disso diversos outros mapas foram construídos
visando obter informações relevantes aos diversos programas de
melhoramento do cacaueiro desenvolvidos em todo o mundo (LANAUD et al.,
1995; MOTIAL et al., 2000; ARAÚJO, 2002; BROWN et al., 2005; FALEIRO et
al., 2006; SCHNELL et al., 2007), e pelo menos 13 outros mapas de ligação já
foram desenvolvidos e utilizados principalmente para identificar regiões
genômicas associadas com componentes de produção, vigor e resistência a
várias espécies e isolados de Phytophthora que atacam o cacaueiro em todas
30
as partes do mundo e também para resistência a M. perniciosa (FIGUEIRA;
CASCARDO, 2001; FIGUEIRA; ALLEMANO, 2005).
Segundo Ahnert (2000), a construção de mapa genético saturado é
relevante para obter informações importantes sobre estrutura genética da
espécie, desde a associação com caracteres qualitativos, localização dos
mesmos grupos de ligação e identificação de regiões genômicas associadas a
caracteres quantitativos. A utilização desses mapas favorece um maior estudo
da cultura, pois a cobertura e análise completa de genomas; a decomposição
de características genéticas complexas nos seus componentes mendelianos; a
localização das regiões genômicas que controlam caracteres de importância; a
quantificação do efeito destas regiões genômicas que controlam caracteres de
importância; facilitar o melhoramento assistido por marcadores e clonagem
baseada em mapa (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Os mapas genéticos são construídos pela análise de co-segregação dos
marcadores genéticos nos produtos da meiose, em progênies originadas de
cruzamentos entre genitores contrastantes para um determinado caráter (LIU,
1998). Os marcadores localizados em diferentes cromossomos devem
segregar independentemente e os marcadores localizados no mesmo
cromossomo são transmitidos conjuntamente, a menos que esta ligação seja
quebrada por uma recombinação no gameta genitor. A construção de mapas
genéticos e posterior localização de QTLs associados a características de
interesse agronômico baseia-se em diferentes metodologias estatísticas que
possibilitam associar as informações da segregação de marcas moleculares às
características fenotípicas que se desejam mapear (LIU, 1998).
O desenvolvimento de mapas genômicos envolve a seleção da
população mais apropriada para mapear; o cálculo das freqüências de
recombinação em pares, usando esta população; o estabelecimento de grupos
de ligação; a estimativa das distâncias no mapa entre marcas e a determinação
da ordem linear por marcadores, de forma a minimizar os eventos de
recombinação (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). A escolha de genitores
para desenvolvimento de mapas genômicos é crítica em plantas perenes
arbóreas e o tipo de marcador a ser utilizado deve ser considerado. Os
genitores devem ser importantes no programa de melhoramento, apresentar
nível satisfatório de polimorfismo para o tipo de marcador a ser usado, além de
31
segregar para várias características qualitativas e quantitativas de importância
(componentes de produção e resistência à doença, etc.) e de qualidade do
produto, para maximizar a obtenção de informações (FIGUEIRA; CASCARDO,
2001).
Em geral, os mapas genéticos do cacaueiro vêm sendo gerados a partir
de progênies F
1
, F
2
, ou pseudo test cross, derivadas de cruzamentos entre
genitores heterozigotos (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1988). Para
construções destes mapas utilizam-se marcadores dominantes, explorando a
configuração de pseudo-testcross e marcadores co-dominantes (LANAUD et
al., 1995; RISTERUCCI et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; CLÉMENT et al.,
2003; PUGH et al., 2004; BROWN et al., 2005). São construídos dois mapas,
sendo um para cada genitor, baseado na segregação de marcadores co-
dominantes, como RFLPs, microssatélites e isoenzimas, que permitem a fusão
dos diversos mapas, ou ainda a comparação direta com o mapa de referência
estabelecido para o cacaueiro (PUGH et al., 2004). Os marcadores dominantes
(RAPDs e AFLPs), mais abundantes, foram usados para saturar esses mapas
genéticos. Para o cacaueiro, comumente um genótipo altamente heterozigótico
é cruzado com um genótipo mais homozigoto, tal como o mutante albino
‘Catongo’. Alternativamente, já foi utilizada para mapeamento uma população
de retrocruzamento, derivada de uma única planta F
1
retrocruzada com o
genitor mais homozigoto (CROUZILLAT et al., 1996), enquanto que em outros
casos específicos, populações F
2
foram especialmente geradas e usadas para
a identificação de regiões genômicas associadas com sabor de chocolate e
qualidade da semente (CROUZILLAT et al., 2001; ARAÚJO, 2002) e
resistência à M. perniciosa (QUEIROZ et al., 2003; BROWN et al., 2005;
FALEIRO et al., 2006).
O primeiro mapa de ligação do cacaueiro foi desenvolvido para a
população F
1
de 100 indivíduos do cruzamento entre os clones UPA 402 x UF
676 (LANAUD et al., 1995). Foram formados dez grupos de ligação, cobrindo
759 cM e contendo 193 locos, incluindo cinco de isoenzimas, 160 de RFLPs,
sendo 101 de cDNA, 55 de sondas genômicas e quatro de genes de funções
conhecidas e 28 locos de RAPD. Este mapa foi posteriormente saturado com
marcadores adicionais, tendo sido incluídos mais 18 locos de RFLP (três
sondas de cDNA, dez genômicos, dois genes de funções conhecidas, e três
32
sondas teloméricas); dois locos de RAPD; 191 locos de AFLP e 20 de
microssatélites, totalizando 424 marcadores, englobando 885,4 cM com
espaçamento médio entre marcadores de 2,1 cM (RISTERUCCI et al., 2000).
Pugh et al., (2004) realizaram a mais recente saturação do mapa consensual
do cacaueiro acrescentando mais 35 indivíduos à população F
1
originalmente
utilizada por Lanaud et al., (1995). A versão mais atualizada do mapa
consensual do cacaueiro conta com dez grupos de ligação, cobrindo 782,8 cM
e contendo 465 locos, dos quais 268 são de microssatélites, 176 de RFLPs,
cinco de isoenzimas e 16 de Rgenes-RFLP. A média de distância entre cada
marcador é de 1,7 cM.
Para identificação de regiões genômicas associadas à resistência a M.
perniciosa, um mapa genético foi desenvolvido no Brasil para uma população
de 82 indivíduos F
2
derivados da autofecundação do genótipo ‘TSH-516’, um
híbrido selecionado do cruzamento de ‘ICS1‘ x ‘Scavina 6’ (QUEIROZ et al.,
2003). O mapa genético continha 124 marcadores RAPD e 69 AFLP em 25
grupos de ligação, cobrindo 1.713 cM, e permitiu a identificação de um loco
principal de QTL, responsável por cerca de 35% da variância fenotípica para
resistência a M. perniciosa, avaliada sob condições de campo por dois anos.
Esse mapa genético foi recentemente saturado para um total de 343
marcadores (232 RAPD; 77 AFLP; e 33 microssatélites), perfazendo 16 grupos
de ligação com um total de 670 cM (FALEIRO et al., 2006). Novas avaliações
de resistência foram conduzidas num período de seis anos, permitindo a
confirmação do QTL descrito por Queiroz et al, (2003). Na saturação do mapa,
três locos de microssatélites (P02, P01 e L09) foram mapeados nessa mesma
região do QTL sendo que esses locos já haviam sido mapeados no
cromossomo 9 do mapa consensual (RISTERUCCI et al., 2000; KUHN et al.,
2003). Um novo mapa para a população F
2
de autofecundação de ‘TSH-516’ foi
recentemente construído por Brown et al., (2005). Neste mapa 146 indivíduos
foram genotipados com 182 marcadores sendo 170 microssatélites, oito genes
homólogos de resistência (RGH) e quatro genes candidatos relacionados a
estresse (WRKY). O comprimento total do mapa foi estabelecido em 671,9 cM.
Dois QTLs foram encontrados, um no grupo de ligação 9, como já descrito por
Queiroz et al. (2003) e Faleiro et al. (2006), e outro no grupo I, com
porcentagem de variação fenotípica de 51% e 6%, respectivamente. O QTL do
33
grupo de ligação I foi localizado próximo das marcas mTcCIR22, mTcCIR264 e
RGH11, enquanto que o QTL do grupo IX foi próximo das mTcCIR24,
mTcCIR35 e mTcCIR157. Ambos os QTLs tiveram efeito de dominância para
resistência a M. perniciosa, sendo que o QTL de maior efeito do grupo IX foi
originário do ‘SCA 6’ e o de menor efeito do grupo I foi herdado de ‘ICS 1’.
Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao
número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,
5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso
(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1 (Trinitário), S 52 (Trinitário) e
IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da
variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones
DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo
de ligação 4, enquanto que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca
mTcCIR18.
Albuquerque (2006) detectou três QTLs associados à resistência à
vassoura-de-bruxa, um no grupo de ligação 8 de ICS 39 x CAB 0208 e dois no
mapa de ICS 39 x CAB 0214, sendo um no grupo de ligação 4 e outro no grupo
9. A relação genética entre os dois clones CAB genitores das populações
contrastantes e 81 genótipos de cacaueiro utilizados como fontes de
resistência a M. perniciosa foram baseadas nas freqüências alélicas de 20
locos de microssatélites. A não existência de relação de parentesco e a alta
dissimilaridade genética encontrada entre o clone Sca 6 e os CAB 0208 e CAB
0214 reforça a possibilidade destes acessos possuírem diferentes genes de
resistência a M. perniciosa. Três QTLs associados à resistência do cacaueiro a
P. palmivora foram encontrados também no grupo de ligação 4, em regiões
muito próximas de onde foi localizado o QTL associado à resistência M.
perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um
destes QTLs foi encontrado por Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar
13,2% da variação fenotípica da resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro).
Dois QTLs foram encontrados por Clement et al. (2003b) associados aos
clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs foram capazes de explicar 22,6% e 10,1%
respectivamente, da variação fenotípica da resistência à podridão em frutos
com base em dados de campo acumulados por mais de seis anos.
34
No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado
por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F
1
do mapa de
referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes
alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos
dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde
foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT
et al., 2003b), à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’
(ALBUQUERQUE, 2006) associados ao número de óvulos por ovário
(CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
As amostras utilizadas neste trabalho foram obtidas numa progênie de
600 plantas de origem interclonal oriunda do cruzamento de TSH-1188 x CCN-
51 foi utilizada para obtenção das amostras utilizadas neste trabalho. As
plantas encontram-se na Fazenda Almirante Cacau, localizada no município de
Barro Preto, BA, plantadas no ano 2000. O cruzamento, os tratos culturais e as
avaliações agronômicas e fitopatológicas encontram-se descritas por Santos
(2007) e Bahia (2007). O clone TSH-1188 ("Trinidad Selected Hybrids")
originou-se de cruzamentos envolvendo os clones IMC-67, ICS-1, Sca 6 e P-
18. Produz frutos vermelhos e com rugosidade áspera (CEPEC, 1987), é
autoincompatível e apresenta resistência à vassoura-de-bruxa (LUZ et al.,
1997). O CCN-51 ("Colección Castro Naranjal") é oriundo de uma planta F
1
do
cruzamento entre ICS-95 x IMC-67, cruzada com um clone nativo do oriente
equatoriano denominado "Canelos" (BARTLEY, 1986). O CCN-51 produz frutos
vermelho-arroxeados quando imaturos, passando a amarelo-alaranjados
quando maduros, com casca levemente enrugada e sementes com coloração
interna púrpura clara. Ele é autocompatível, possui resistência mediana à
vassoura-de-bruxa e apresenta alta produtividade (CAMPO; ANDÍA, 1997).
Quando comparado com outras variedades locais do Equador, tem
demonstrado ser resistente à vassoura-de-bruxa. A sua suscetibilidade à
podridão-parda é menor quando comparada à outra enfermidade comum no
Equador, a monilíase (CAMPO; ANDÍA, 1997). No Brasil, a resistência do CCN-
51 à vassoura-de-bruxa foi confirmada por Pires (2003).
36
3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual
As autopolinizações artificiais foram realizadas em 250 plantas da
progênie e nos seus genitores entre janeiro de 2007 a maio de 2009, de acordo
com a disponibilidade de flores nas plantas. As polinizações artificiais
propriamente ditas foram feitas segundo as recomendações de Pinto et al.,
(1998), seguindo os procedimentos descritos a seguir, modificando-se
frequência de verificações: a) Os botões florais entumecidos, prestes a abrir no
dia seguinte, foram analisados sempre no dia anterior da polinização artificial, e
protegidos com um pequeno tubo de vidro transparente (1,4 cm de diâmetro
por 7 cm de comprimento) com uma de suas extremidades cobertas por uma
tela fina (para evitar a passagem de insetos), e a outra extremidade aberta era
fixada na planta por finas borrachas, a fim de proteger os botões. b) Na manhã
do dia seguinte, entre 6 e 12 horas, as flores protegidas foram polinizadas
artificialmente apenas as flores que se abriam durante a noite. Depois da
retirada do tubo, realizava-se o corte dos estaminóides da flor receptora, com a
pinça, para facilitar a polinização e a identificação da flor polinizada; Algumas
flores da mesma planta foram selecionadas como doadoras, desde que suas
anteras estivessem soltando pólen. Com a pinça, esfregava-se o pólen
diretamente no estigma da flor receptora, a qual foi novamente protegida,
datada e identificadas por fitas. As proteções foram retiradas três dias após a
polinização, quando foi realizada a primeira verificação para tomada de dados.
Outras verificações foram feitas aos 5, 8, 15 e 30 dias após as polinizações. As
verificações complementares foram realizadas no 30º apenas para confirmação
do índice de pegamento.
A caracterização da compatibilidade sexual foi feita com base na
retenção de flores, observada no 15º dia após as polinizações e determinadas
pelo índice de pegamento (IP), que é a razão entre do número de flores
vingadas (FV) e o número de flores polinizadas (FP) numa planta (IP =
(FV/FP)100). Neste trabalho, utilizou-se um IP de pelo menos 10% como
referência para determinar a autocompatibilidade das plantas que atingiram o
tamanho amostral de 26 polinizações artificiais. Esse número de polinizações é
37
considerado como ótimo, podendo ser reduzido a 15 polinizações (LOPES;
CARLETTO, 1995). As plantas que alcançaram um tamanho amostral mínimo a
partir de 15 autopolinizações também foram avaliadas quanto à compatibilidade
sexual e a determinação da autocompatibilidade foi feita baseado num IP (%)
ajustado em função do número de flores polinizadas. Desta forma, foram
consideradas autocompatíveis as progênies que apresentaram esse índice
maior ou igual a 20% em plantas com o mínimo de 15 autopolinizações, IP
igual a 15% em plantas que atingiram de 20 a 25 autopolinizações e IP igual a
10% para as plantas com o mínimo de 26 autopolinizações.
A distribuição da freqüência para o número de flores polinizadas foi
analisada em uma amostra de 250 plantas polinizadas. Os coeficientes de
correlação de Pearson foram determinados para as variáveis flores polinizadas
(FP) e índice de pegamento (IP) a partir das 60 plantas que apresentaram
acima de 15 flores polinizadas. A análise de segregação da característica
compatibilidade sexual na amostra de 60 plantas da população foi realizada
com base no teste qui-quadrado a 5% de significância. Todas as análise
estatísticas foram realizadas com o software Bioestat 5.0 (AYRES et al., 2007).
3.3 Caracterização morfo-fisiológica dos frutos
A cor do fruto foi determinada em observações realizadas durante as
colheitas dos anos de 2007, 2008 e 2009, em frutos em estágio de completa
maturação e classificados em roxos (R) e amarelos (A). A segregação da
característica da cor do fruto na amostra de 60 plantas foi testada com base no
teste qui-quadrado a 5% de significância.
A caracterização dos frutos quanto ao número médio de sementes foi
realizada de acordo com dados obtidos nas colheitas realizadas nos anos de
2007, 2008 e 2009, onde os frutos sadios de 60 árvores individuais foram
colhidos e suas sementes contadas. O número médio de sementes por fruto e
o número médio de sementes chochas por fruto foram determinados,
possibilitando demonstrar a distribuição de freqüências para essas
características em uma amostra de 60 indivíduos dessa população.
38
As medidas de correlação de Pearson foram calculadas entre a
característica de compatibilidade sexual e as características morfo-fisiológicas
dos frutos para uma amostra de 60 plantas da progênie.
3.4 Obtenção de dados moleculares
3.4.1 Extração de DNA dos genitores e progênies F
1
Amostras de DNA de oito indivíduos CCN-51 e 24 indivíduos TSH-1188,
que foram utilizados nos cruzamentos, e de 44 plantas F
1
foram extraídas pelo
método de CTAB modificado (DOYLE; DOYLE, 1990; CORRÊA et al., 1999;
ARAÚJO et al., 2007). Dentre as 44 plantas F
1
, 20 foram avaliadas em campo
como autocompatíveis e 24 como autoincompatíveis. Amostras de
aproximadamente 300 mg de tecido de folha de cada indivíduo foram
maceradas em presença de nitrogênio líquido e polivinilpirrolidona (PVP),
sendo posteriormente transferidas para tubos Ependorff® de 2 mL,
adicionando-se aos mesmos 800 µL de tampão [tris-HCl 100 mmol.L
-1
, pH 8,0;
EDTA 20 mmol.L
-1
, pH 8,0; NaCl 1,4 mol.L
-1
; 0,2% (v/v) β- mercaptoetanol, 2%
CTAB, e 0,1 mg de proteinase K]. Após 60 min em banho-maria a 65
o
C, os
tubos foram centrifugados a 14.000 g por 7 min e os sobrenadantes
transferidos para novos tubos. Aos sobrenadantes adicionaram-se 800 µL de
24:1 clorofórmio: álcool isoamílico, agitando por cinco min, seguindo de
centrifugação a 14.000 g por 7 min. Esta etapa foi repetida por duas vezes. Os
sobrenadantes transferidos para novos tubos receberam isopropanol gelado,
na proporção de 1:1 (isopropanol: sobrenadante), e centrifugados a 14.000 g
por cinco min. Descartaram-se os sobrenadantes e os precipitados foram
lavados com 1 mL de solução 70% de etanol por 2 vezes. Após as lavagens, os
precipitados foram secos ao ar por 12 h e ressuspensos em solução de TE (10
mmol.L
-1
, Tris-HCl, EDTA 1 mmol.L
-1
, pH 8,0) contendo RNAse na
concentração final de 40 µg e incubados em banho-maria a 37º C por 60 min.
Para verificar a integridade do DNA extraído, uma alíquota de 3 µL de cada
amostra, adicionada de 3 µL do corante tipo IV (Bromofenol Blue a 0,25%,
sacarose 40%) aplicada em gel de agarose a 0,8%, utilizando como tampão de
corrida o TBE 1X (EDTA 2 mol.L
-1
; Tris-borato 9 mol.L
-1
).
39
A corrida eletroforética foi realizada com 80 V, durante 1 hora. Os géis
foram corados com brometo de etídio a 10 mg.mL
-1
, fotodocumentados sob luz
ultra violeta (UV). A concentração do DNA de cada amostra dos genitores foi
estimada pelo espectrofotômetro a 260 nm Cary Winv 50, utilizando-se o
software RNA&DNA (SAMBROOK et al., 1989) e, em seguida diluída para 10
ng.µL
-1
. A qualidade do DNA foi avaliada tanto por gel de agarose 1% como por
espectrofotometria, considerando a razão A
260
/A
280
.
3.4.2 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51
3.4.2.1 Reações RAPD
Amostras de DNA dos genitores foram amplificadas pela técnica de
RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA (WILLIAMS et al., 1990). Nas
amplificações foram empregados dois primers decâmeros, identificados como:
AX15 e D20. As reações de amplificação foram feitas em um volume total de
25 µL, contendo 3,0 µL de DNA a 10 ng.µL
-1
de DNA genômico, 2,0 µL de
dNTP’s a 2,5 µmol.L
-1
, 3,0 µL de MgCl
2
a 50 mmol.L
-1
, 0,2 µL de Taq DNA
polimerase a 5 U.µL
-1
, 3,0 µL de primer a 10 µmol.L
-1
, 2,5 µL tampão 10X e
11,3 µL de H
2
O mili-Q autoclavada. As amplificações foram realizadas em um
termociclador, programado para 40 ciclos, cada um com a seguinte seqüência:
2 min a 92 °C; 40 ciclos (1 min a 94 °C; 1 min a 35 °C; 1 min a 72 °C); uma
extensão final de 5 min a 72 °C e finalmente, a temperatura foi reduzida para
15°C. Após a amplificação foram adicionadas, a cada amostra, 3 µl de uma
mistura de azul de bromofenol (0,25%), glicerol (60%) em água. Essas
amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,2% submerso em tampão TBE
1X (Tris-Base, Ácido Bórico, EDTA). A separação eletroforética foi de
aproximadamente duas horas, a 100 volts, em gel de agarose a 3%, corado
com brometo de etídio e fotografado sob luz ultravioleta.
40
3.4.2.2 Reações microssatélites
As amostras de DNA de cada planta foram amplificadas pela técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando 15 primers microssatélites ou
simple sequence repeats – SSR. As sequências dos primers microssatélites
utilizados foram isolados e caracterizados previamente por: (i) Araújo et al.
(2007) – UENF/CEPLAC 16; UENF/CEPLAC 66; UENF/CEPLAC 69;
UENF/CEPLAC102; UENF/CEPLAC110; UENF/CEPLAC118;
UENF/CEPLAC121; UENF/CEPLAC129; (ii) Lanaud et al., (1999), Pugh (2004)
– mTcCIR10; mTcCIR18; mTcCIR21; mTcCIR24; mTcCIR30; mTcCIR129;
mTcCIR131. As temperaturas de anelamento empregadas foram aquelas
recomendadas na caracterização dos primers microssatélites (LANAUD et al.,
1999; PUGH et al., 2004; ARAUJO et al., 2007)
As reações de amplificação foram feitas em um volume total de 20 µL
contendo 10 ng de DNA genômico por passo, cada um dos desoxinucleotídeos
(dATP, dTTP, dGTP e dCTP) a 2,5 mmol.L
-1
, MgCl2 50 mmol.L
-1
, tampão para
PCR 1X (Tris-HCl a 10 mmol.L
-1
, KCl a 50 mmol.L
-1
, MgCl2 a 1,5 mmol.L
-1
, pH
8,3), 2,5 µL de DNA, cada par de primer (forward e reverse) a 0,2 µmol.L
-1
e 1
unidade da enzima Taq DNA polimerase (Fermentas). As amplificações foram
realizadas em termociclador (Gene AMP PCR System 9700 – PERKIN ELMER)
programado de acordo com o seguinte programa: 2 min a 96 ºC + 30 ciclos (1
min a 94 ºC + temperatura de anelamento específica de cada par de primers
por 1 min + 72 ºC por 1 min), finalizando com um passo a 72 ºC por 7 min.
Após as amplificações, a separação dos fragmentos foi realizada por
eletroforese em gel de agarose a 3,0%. Foram adicionadas, a cada amostra, 3
µL de uma mistura de azul de bromofenol (0,25 %) e glicerol (60 %) em água.
O gel foi submerso em tampão TBE 1X (Tris-Base, Ácido Bórico, EDTA) e a
separação eletroforética foi de, aproximadamente, duas horas a 100 volts em
gel de agarose a 3%, corado com brometo de etídio e fotografado sob luz
ultravioleta. Para determinar o comprimento dos fragmentos utilizou-se o
padrão de peso molecular conhecido, DNA do fago lambda digerido com
enzima de restrição em fragmentos múltiplos de 100 pb. Após a obtenção dos
géis de agarose, foi observada a presença ou ausência de polimorfismo entre
os clones de cada genitor.
41
3.4.3 Genotipagem da população segregante
Os 39 primers microssatélites utilizados para amplificar o DNA das 44
plantas da progênie e de dois genitores foram desenvolvidos previamente
(LANAUD et al., 1999; PUGH et al, 2004), porém, por motivo de sigilo
provisório, serão apresentados de forma codificada neste trabalho (L para os
caracterizados por Lanaud et al., (1999) e P para os caracterizados em Pugh et
al., (2004).
A comprovação das amplificações foi realizada por eletroforese em gel
de agarose e a separação dos fragmentos amplificados foi em géis de
poliacrilamida, utilizando o seqüenciador automático ABI 3730. Após a
obtenção dos géis os dados foram avaliados utilizando-se o programa
GENEMAPPER
®
. Realizou-se a análise de dados, extraindo os
eletroferogramas dos géis e determinando o tamanho dos fragmentos, em
pares de bases, utilizando-se padrão de peso molecular (ROX400). As
informações armazenadas nesse projeto foram analisadas com base na
presença/ausência de fragmentos, gerando-se, assim, uma matriz de dados
binários.
3.4.4 Avaliação do polimorfismo da população segregante e de ligação
entre marcadores e características
As marcas polimórficas indicadas a serem utilizadas na construção do
mapa de ligação foram identificadas quanto à presença em um parental e
ausência no outro. Alguns marcadores detectavam duas marcas exclusivas
para um único genitor, indicando que um ou ambos os genitores eram
heterozigotos para os referidos locos. Contudo, foi realizado o artifício de
duplicar o marcador e inverter a denominação, a fim de identificar a origem das
bandas, como proposto por Al-Janabi et al. (1993). Dessa forma, os fragmentos
42
presentes nos genitores TSH-1188 e CCN-51 tiveram suas origens
determinadas e também puderam ser utilizados nas análises subseqüentes.
Dentre as 60 plantas que atingiram o mínimo de 15 autopolinizações,
somente as 44 foram genotipadas com os primers microssatélites. Cada alelo
SSR exclusivo de TSH-1188 foi analisado quanto à segregação na proporção
1:1 pelo teste qui-quadrado; procedimento idêntico foi realizado com os alelos
exclusivos de CCN-51. A codificação dos dados foi realizada de acordo com
Lander et al. (1987). Portanto, a matriz com os comprimentos de alelos foi
transformada em uma matriz de A e H e os genótipos nos locos contendo
alelos exclusivos para pelo menos um dos genitores foram padronizados.
As características cor do fruto e compatibilidade foram incluídas nessa
análise, codificando-as da seguinte forma: (i) para testar a hipótese de ligação
entre características e alelos exclusivos de TSH-1188, progênies com fruto
roxo foram codificadas como H e fruto amarelo como A, enquanto que
progênies autoincompatíveis como H e autocompatíveis como A; (ii) para testar
a hipótese de ligação entre características e alelos exclusivos de CCN-51,
progênies com fruto amarelo foram codificadas como H e fruto roxo como A,
enquanto que progênies autocompatíveis como H e autoincompatíveis como A.
A análise pelo teste de multipontos, empregando-se LOD > 3,5 e r ≤ 0,5
foi feita com auxílio dos comandos “group”, "Compare" e "Map" do programa
MAPMAKER/EXP 3.0.b. (LANDER et al., 1987; LINCOLN et al., 1992). Além do
comando básico de mapeamento pelo teste multipontos, testes de ligação
adicionais foram utilizados para quantificar os valores de LOD e distancia
genética relativos a hipóteses de ligação das características com o conjunto de
marcadores, utilizando-se o comando "Try" do Mapmaker.
43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Determinação da compatibilidade sexual
Dentre as 250 plantas da progênie que foram polinizadas artificialmente,
somente 60 (24%) atingiram o número mínimo de 15 autopolinizações durante
os dois anos de avaliação (Figura 1). Segundo Lopes & Carletto (1995), para
cada cacaueiro, deve-se utilizar entre 15 e 40 flores para autopolinização e
polinizações cruzadas, sendo 26 o número médio ótimo. A baixa
disponibilidade de flores apresentada pelas plantas durante o experimento
pode ter sido uma resposta fisiológica da planta as condições climáticas
atípicas apresentadas no ano de 2007. Esse período foi caracterizado por um
excesso de chuva apresentada nos primeiros meses de 2007, seguido por
longas estiagens e elevadas temperaturas, o que comprometeu a floração
subsequente.
Apesar de a roça ser nova e a recomendação de poda ser restrita a um
mínimo necessário para a boa formação da árvore e um perfeito arejamento da
cultura, o presente cultivo encontra com um alto índice de alto sombreamento,
causado pela ausência de podas e fechamento dos ramos. Portanto, esse
aspecto pode ter influenciado o baixo índice de floração apresentado durante o
período de avaliação, uma vez que essas condições podem favorece a
estabilidade da temperatura e da umidade no ambiente, fatores que tem
influência negativa na floração e produção de frutos no cacau. Além disso,
observa-se que em plantações tecnicamente podadas, a produção de flores e
de frutos aumenta significativamente, em relação às não podadas (DIAS,
44
2001). Desta forma, espera-se nos próximos anos de avaliação, alcançar um
maior número de polinizações por planta.
Figura 1. Histograma de número de plantas autopolinizações artificiais 250
plantas F
1
do cruzamento TSH-1188 x CCN-51.
Não houve alteração na proporção esperada de segregação da
característica na população quando respeitado o número mínimo de 15
autopolinizações por planta utilizando um índice de pegamento ajustado ao
número de autopolinizações (Tabela 1). A correlação entre índice de
pegamento e número de flores polinizadas foi não significativa (r = -0,069),
possibilitando a utilização das plantas com até 15 autopolinizações nas
análises, sem superestimar a determinação da característica (LOPES:
CARLETTO, 1995). Observa-se que ao utilizar um número inferior a 15
autopolinizações controladas, a segregação da característica sofreu uma
grande distorção, resultando em um qui-quadrado significativo em relação à
segregação 1:1. Embora seja recomendado de 15 até 40 polinizações (LOPES:
CARLETTO, 1995; PIRES, 1998), o presente resultado evidencia que, nessas
condições, se for adotado índice de pegamento ajustado ao número de
45
polinizações, esse número de polinizações artificiais pode ser reduzido até o
mínimo utilizado neste trabalho.
Tabela 1. Relação entre o número de autopolinizações e o índice de
pegamento na determinação da compatibilidade sexual do cacaueiro e
verificação da segregação da característica pelo teste qui-quadrado
Autopolinizações
Índice de
Pegamento
(%)
Nº de
Plantas
(E)
AC: AI
(O)
AC: AI
Qui-
quadrado
p
≥ 26 10 43 1:1 22:20 0,095 0,758
ns
20 a 25 15 3 1:1 1:2 0,333 0,564
ns
15 a 19 20 14 1:1 7:7 0,000 1,000
ns
10-14 25 16 1:1 2:14 9,000 0,003*
ns
Não significativo e as frequências observadas (O) de plantas autocompatíveis (AC) para
plantas autoincompatíveis (AI) não diferem estatisticamente da razão esperada (E) de
segregação 1:1 pelo teste qui-quadrado a 5% de probabilidade.
* Significativo e as frequências observadas (O) de plantas AC para plantas AI diferem
estatisticamente da razão esperada (E) de segregação 1:1 pelo teste qui-quadrado a 5% de
probabilidade.
A segregação genética da característica compatibilidade sexual na
população estudada no presente trabalho foi consistente com padrão de
retrocruzamento (Figura 2). Dentre as 60 plantas para as quais foi alcançado
um mínimo de 15 autopolinizações, 29 apresentaram foram classificadas como
autocompatíveis e 31 como autoincompatíveis, uma segregação tipicamente
1:1 (comprovado pelo teste de qui-quadrado a 5% de significância: X
2
= 0,067;
p= 0,796). Os genitores são contrastantes para essa característica: CCN-51 é
autocompatível e TSH-1188 é autoincompatível (BARTLEY, 2005). Portanto, a
natureza heterozigota deste loco no clone CCN-51 é demonstrada no presente
trabalho. Desta forma, denominando-se o alelo de incompatibilidade de i,
recessivo, têm-se: CCN-51, Ii; e TSH-1188, ii. Isso implica que as plantas
selecionadas nesta população como autocompatíveis serão heterozigotas.
46
Figura 2. Número de plantas observado e esperado para a característica da
autocompatibilidade (AC) e autoincompatibilidade (AI), em 60 plantas F
1
do
cruzamento TSH-1188 x CCN-51.
4.2. Caracterização morfo-fisiológica dos frutos
4.2.1 Cor do fruto
A segregação genética da característica cor do fruto maduro nesta
população foi compatível com a segregação 3:1 para frutos roxos (43 plantas) e
verdes (17 plantas) (X
2
= 0,356; p = 0,551, teste qui-quadrado a 5% de
significância para 60 plantas). A cor do fruto em cacaueiro na fase imatura é
verde ou roxa nesta população. Ao amadurecerem, os frutos de cor verde
tornam-se amarelos. Contudo, os frutos de cor roxa podem tornar alaranjados
ou permanecer roxos. Essa característica é descrita como monogênica, sobre o
controle do gene R, com dois alelos (R e r); e em frutos imaturos a
pigmentação vermelha (RR e Rr) é dominante sobre a verde (rr) (SORIA,
1964). Ambos o genitores dessa população em estudo apresentam frutos roxos
quando imaturos, com os frutos CCN-51 tomando uma coloração alaranjada
quando maduros, porém, a segregação de 3:1 observada na progênie para
frutos imaturo de coloração roxa (genótipos RR ou Rr) e verde (genótipo rr),
comprova que ambos genitores são heterozigotos (Rr) para essa característica.
47
A análise da segregação conjunta das características cor do fruto e
compatibilidade sexual (Figura 3), apresentou uma proporção de 3:3:1:1, para
as classes fenotípicas: 1) plantas autoincompatívels com frutos roxo (21
plantas); 2) plantas autocompatíveis com fruto roxo (22 plantas); 3) plantas
autocompatíveis com fruto verde (7 plantas); e 4) plantas autoincompatíveis e
fruto verde (10 plantas).
Estes resultados esta compatível com o produto das probabilidades de
independência dos dois locos, nos quais se observou a segregação 3:1 para
cor do fruto imaturo e 1:1 para compatibilidade sexual. Essa proporção dos
fenótipos sugere que essa características segregam independentemente uma
da outra, podendo também ser também confirmado pela baixa correlação (r =
0,090; p = 0,494), encontrada em 60 plantas entre essas características.
Figura 3. Frequências esperadas (colunas sólidas) e observadas (colunas
rachuradas) das classes fenotípicas (1) plantas autoincompatívels com frutos
roxo; (2) plantas autocompatíveis com fruto roxo; (3) plantas autocompatíveis
com fruto verde; e (4) plantas autoincompatíveis e fruto verde) distribuídas em
60 plantas da progênie em estudo. Qui-quadrado não significativo (X
2
= 0,977 e
p = 0,8066 a 5% de probabilidade e 3 graus de liberdade).
48
4.2.2 Número de sementes por fruto
O histograma de freqüências observadas para o número de sementes
por fruto e o número de sementes chochas por fruto configurou-se
aproximadamente em uma distribuição normal (Figura 4A e 4B), sugerindo a
existência de vários genes controlando essas características. Na distribuição
de freqüência do número médio de sementes por fruto observou-se que as
maiores produções e as menores quantidades de sementes inviáveis (chochas)
concentraram-se em um maior número de plantas, evidenciando que a
característica de produtividade de ambos os genitores foi transferida para
indivíduos da progênie. O número médio de sementes por fruto na progênie
variou entre 20 e 52, com uma média de 39,7 sementes por fruto nessa
progênie.
Figura 4. Histograma de freqüência de 60 plantas F
1
do cruzamento TSH-1188
x CCN-51, relativa ao número de sementes por fruto (A) e número médio de
sementes chochas por fruto (B).
Dos 60 indivíduos da progênie avaliados para número de sementes por
fruto, foram identificados 25% de plantas (15 plantas, cuja média foi de 48,20
sementes por fruto) com número de sementes superior ao genitor de maior
média (45,6 sementes por fruto). O número de sementes chochas variou de
zero a três sementes por fruto, e esteve presente em 73,3% das plantas, das
B
A
49
quais 51,2% (21 plantas) apresentaram média inferior ao genitor de menor
média de sementes chochas (0,7).
Essa tendência de segregação transgressiva, ou seja, o aparecimento,
em gerações segregantes, de indivíduos que estão fora do intervalo dos
genitores no que se refere à dada característica, também foi observado nesta
população quanto ao número de óvulos por ovário (BAHIA, 2006).
As médias das variâncias estimadas para o caráter número de sementes
por fruto mostraram que essa característica tem alta herdabilidade nesta
progênie (Tabela 2). No entanto, a presença de sementes inviáveis mostrou-se
fortemente influenciada pelo ambiente (herdabilidade baixa) e corresponde a
uma baixa percentagem do número total de sementes por fruto. Estudos
posteriores poderão ser realizados no sentido de verificar a performance
desses clones quanto ao peso médio por semente e produção.
Tabela 2. Médias e variâncias estimadas para as frequências de número de
sementes por fruto (A) e número de sementes inviáveis por fruto (B) nos
genitores e na progênie
A
Popu
lação
Média
a
Extremos
Var. Fen.
Var. Amb.
b
Var. Gen.
c
H
a
CCN-51 39,00 38 e 40 1,00 1,00 - -
TSH-1188 45,60 44 e 50 6,30 6,30 - -
Progênie 39,81 20 e 52 62,08 3,65 58,33 0,94
B
População
Média
a
Extremos
Var. Fen.
Var. Amb.
b
Var. Gen.
c
H
a
CCN-51 1,00 0,0 e 2,0 0,50 0,50 - -
TSH-1188 0,60 0,0 e 2,0 0,80 0,80 - -
Progênie 0,59 0,0 e 3,0 0,44 0,65 -0,21 -0,48
a
As médias dos genitores e da progênie foram diferentes entre si pelo teste t a 5% de
probabilidade.
b
Var. Amb. da progênie = (CCN-51 + TSH-1188)/2.
c
Var. Gen. = Var. Fen. –
Var. Amb. H
a
= Var. Gen. / Var. Fen.
A taxa de conversão de óvulos em sementes foi superior a 70% nesta
progênie (Tabela 3). Curiosamente, CCN-51 apresentou uma conversão de
apenas 67% bem como um maior número de sementes chochas. Mesmo tendo
o maior número de óvulos por ovário, apresentou menor número de sementes
por fruto. A maior produtividade conferida ao clone CCN-51 em relação ao
clone TSH-1188, pode ser atribuída ao fato do CCN-51 ser autocompatível e
produzir um maior número de frutos por planta que o TSH-1188 que é
50
autoincompatível (BARTLEY, 2005). Pois mesmo tendo um menor número de
sementes por fruto em relação ao TSH-1188, o CCN-51 possui sementes
grandes e mais pesadas, compensando o menor número de sementes por fruto
e a menor taxa de conversão de óvulos em sementes mostrados nesse
trabalho. É relatada na literatura uma correlação negativa entre quantidade e
tamanho de semente por fruto (ENGELS, 1983).
Tabela 3. Relação entre o número médio de óvulos e número médio de
sementes dos genitores e progênie
Genótipos Número médio de
óvulos (BAHIA, 2006)
Número médio de
sementes
Taxa de conversão de
óvulos em sementes
CCN-51 58,6 39,0 0,67
TSH-1188 53,5 45,6 0,85
Progênie 54,5 39,8 0,73
Normalmente, a polinização com maior quantidade de pólen resulta em
frutos com maior número de sementes e menor possibilidade de aborto
(STEPHENSON et al., 1988). Esse processo de abortamento pode ser
considerado um mecanismo pelo qual as plantas podem influenciar a qualidade
de suas sementes (LEE, 1984).
Falque et al. (1995), estudando as relações entre a intensidade de
polinização e número de sementes por fruto em clones Forasteiros Alto
Amazônicos, na Costa do Marfim, verificou uma estreita correlação entre essas
características. Porém, sabe-se que o número de sementes por fruto depende
do número de óvulos (NEPI; PACINI, 1993) e de sua fertilização (BARTLEY,
2005). Uma leve correlação negativa foi observada entre número médio de
sementes por fruto e número médio de sementes chochas por fruto, o que
mostra que além da fertilização dos óvulos e da intensidade de polinização,
outros aspectos fisiológicos devem influenciar o preenchimento das sementes.
As correlações destas características com compatibilidade sexual foram
de modo geral próximas de zero (Tabela 4). Contudo, visto serem aspectos
relevantes para o caráter produtividade, é necessário verificar aspectos da
biologia reprodutiva, visando elucidar mecanismos da fertilização e formação
das sementes, pois se sabe que estas características dependem de condições
51
ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982). Segundo Leal
(2005), a baixa produtividade em algumas plantações comerciais se deve em
parte a uma polinização pouco efetiva, tratos culturais inadequados e
condições ambientais desfavoráveis e outros aspectos fisiológicos.
Tabela 4. Coeficientes de correlação de Pearson entre as características
avaliadas em 60 plantas F
1
de TSH-1188 x CCN-51
Características
CS SP ScP CF
Compatibilidade sexual (CS) 1 -0,051 0.107 -0,090
Número médio de sementes por fruto (SP) 1 -0,169 0,110
Número médio de sementes chochas por fruto (ScP) 1 0,017
Cor do fruto maduro (CF) 1
4.3 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51
As amostras de DNA apresentaram concentrações variando de 35,0 a
629,8 ng/µl que foram suficientes para a realização de todas as reações
necessárias para a análise (Tabela 5). A razão A
260
/A
280
variou entre 2,1 e 10,3,
indicando que as amostras encontram-se com algumas contaminações,
supostamente proteínas. No entanto, essas contaminações não interferiram no
andamento das reações PCR.
Tabela 5. Identificação dos indivíduos, relação das absorbâncias das amostras
de DNA a 260 nm e 280 nm e quantificação das concentrações de DNA com
base em três repetições
Nº
Indivíduo A(260) A(280) A(260)/A(280)
Conc. (ng/
µ
l)
01 CCN-51 P02 0,691 0,135 8,038 317,7
02 CCN-51 P03 0,663 0,173 7,086 281,3
03 CCN-51 P04 0,414 0,126 8,200 164,3
04 CCN-51 P05 0,705 0,440 7,463 151,8
05 CCN-51 P06 0,599 0,367 10,280 127,8
06 CCN-51 P07 0,846 0,218 7,097 365,3
07 CCN-51 P08 0,951 0,425 3,300 358,3
08 CCN-51 P10 0,768 0,145 8,691 352,5
09 TSH-1188 P01/L05 0,478 0,279 3,211 144,3
10 TSH-1188 P01/L07 1,043 0,496 4,091 360,7
11 TSH-1188 P01/L08 0,102 0,052 3,381 35,0
52
12 TSH-1188 P01/L09 0,261 0,820 6,265 106,5
14 TSH-1188 P02/L02 0,324 0,083 7,179 139,7
15 TSH-1188 P02/L03 0,598 0,167 7,952 247,0
16 TSH-1188 P02/L04 1,155 0,775 2,720 303,3
17 TSH-1188 P02/L05 0,870 0,068 8,438 67,7
18 TSH-1188 P02/L06 0,450 0,175 5,825 166,2
19 TSH-1188 P02/L07 1,199 0,708 3,054 368,2
20 TSH-1188 P02/L08 0,262 0,125 4,044 90,5
21 TSH-1188 P02/L09 1,881 0,995 3,375 629,8
22 TSH-1188 P03/L03 0,805 0,492 3,204 228,0
23 TSH-1188 P03/L04 0,598 0,167 7,952 247,1
24 TSH-1188 P03/L05 1,155 0,775 2,720 303,4
25 TSH-1188 P03/L06 0,870 0,068 8,438 67,8
26 TSH-1188 P03/L07 0,450 0,175 5,825 166,2
27 TSH-1188 P04/L06 0,629 0,518 2,067 108,8
O DNA extraído apresentou-se íntegros ou com baixa proporção de
fragmentação (Figura 5). Apenas algumas amostras apresentaram leve arraste
e em todas as amostras foi observada a formação de uma banda nítida de
DNA. A presença de amostra retida no poço de aplicação e entre ele até a
banda de DNA é outra indicativa de presença de proteínas ou outras
macromoléculas misturadas ao DNA, o que foi também indicado pelos altos
valores de relação de absorbância 260 por 280.
Figura 5. Padrão eletroforético das amostras de DNA genômico total,
separadas em gel de agarose 1 % e coradas com Brometo de Etídio. Foram
aplicados 2 µL de DNA + 2 µL de corante tipo lV por canaleta.
As amplificações com primers RAPD ocorreram com sucesso (Figura 6),
o que garantiu um DNA de qualidade para a continuidade dos trabalhos com os
marcadores microssatélies. Neste estudo, o uso de apenas dois primers RAPD,
escolhidos aleatoriamente, teve como único objetivo verificar se DNA extraído
apresentava condições ideais para as reações de amplificação, visto que esta é
uma técnica bastante simplificada além de requerer pouca quantidade de DNA
por análise (GOULÃO et al., 2001).
53
Como informação, o resultado dos dois primers consistiu em bandas
monomórficas entre todos os indivíduos analisados em cada grupo. Esse
padrão monomórfico evidencia que os indivíduos são geneticamente
homogêneos para esses dois primers utilizados. Embora apenas dois primers
não sejam suficientes para essa finalidade, os marcadores RAPD podem ser
úteis para testar a pureza genética e discriminar cultivares em certas situações.
Figueira et al. (1998), usando marcadores RAPD para analisar a similaridade
genética entre acessos mantidos em duplicatas em coleções do
CEPEC/CEPLAC (CEPEC, 2005) e BAL Plantations (Malásia), considerou
como não-idênticas essas plantas. De acordo com os autores, 3 (27,3%) dos
11 acessos não mostraram a mesma identidade genética nas duas coleções.
Figura 6. Padrão de bandas RAPD separadas em gel de agarose a 1,2 % e
corado com Brometo de Etídio. Amplificações com os primers: AX15 a partir
das amostras de DNA dos 16 indivíduos de TSH-1188 (A) e das amostras dos
oito indivíduos de CCN-51 (B); D20, 16 indivíduos de TSH-1188 (C) e oito de
CCN-51 (D). M = corresponde ao padrão de tamanho de fragmento de DNA do
fago Lambda 100 Kb.
54
Nenhum dos 15 primers microssatélites evidenciou diferenças entre os
acessos de mesmo genitor, utilizados nos cruzamentos, como pode ser
ilustrado com bandas evidentes e monomórficas para cada grupo de genitor
(Figura 7). O padrão das amplificações mostrado nessa figura referente a esse
marcador retrata bem os resultados obtidos com os 15 marcadores, onde a
diferença de padrão bandas entre TSH-1188 e CCN-51 revela polimorfismo
entre esses dois clones para esse loco (duas bandas na figura 8A para o TSH-
1188 e uma banda na figura 8B para o CCN-51). A homogeneidade dentro de
cada clone que é representada pela ausência de diferenças alélicas entre os
indivíduos de mesmo clone, indicando uma pureza varietal nos clones
estudados neste trabalho. Portanto, esses resultados indicam que os genótipos
de todos os clones mostram-se indistinguíveis entre si, não existindo mistura
varietal, com base nestes 15 locos microssatélites. No entanto, nas reações de
amplificação utilizando géis de agarose, o tipo de eletroforese pode ter
influenciado na determinação do número de alelos, uma vez que o poder de
resolução de géis de agarose permite distinguir fragmentos que diferem acima
de 3 pb ao passo que o de poliacrilamida permite distinguir fragmentos que
diferem em um pb. Ferreira e Grattapaglia (1998) recomendam o uso de matriz
de alta resolução para a visualização dos fragmentos, pois dependendo do
número de nucleotídeos do elemento repetido no microssatélite, a visualização
em gel de agarose pode não ser possível. Embora as diferenças de até 3 pb
não poderem ser detectadas em gel de agarose, esse tipo de polimorfismo não
compromete este estudo, visto que para estes genitores, dos 36 primers
polimórficos, apenas 4 (11%) apresentaram diferenças alélicas inferiores a 4
nucleotídeos.
55
Figura 7. Padrão de bandas de DNA amplificado com primers microssatélites
separadas em gel de agarose a 3 % e corado com Brometo de Etídio.
Amplificações com o primer microssatélite: UENF/CEPLAC 129 a partir das
amostras de DNA dos 24 indivíduos de TSH-1188 (A) e das amostras dos oito
indivíduos de CCN-51 (B); UENF/CEPLAC 118, 24 indivíduos de TSH-1188 (C)
e oito de CCN-51 (D). M = corresponde ao padrão de tamanho de fragmento de
DNA do fago Lambda 100Kb.
A ausência de alelos exclusivos na progênie em relação aos genitores é
mais uma evidência da pureza clonal desses acessos, visto que, todos os
alelos encontrados na população estavam presentes também nos acessos
utilizados neste trabalho como genitores.
A análise dos comprimentos dos alelos dos genitores amplificados por
15 primers SSR utilizados pode-se verificar que a maioria dos locos (71,43%)
apresenta dois alelos em cada indivíduo, confirmando a natureza heterozigota
dos genitores. Além disso, pode-se comprovar que todos esses primers
apresentam polimorfismo entre os genitores em, pelo menos, um alelo por loco.
O número de locos a ser testado depende do grau de pureza das
amostras. Para os casos em que são encontradas diferenças, as análises
terminam quando as diferenças são detectadas (SCHUSTER et al., 2004). O
estudo sobre identidade e variabilidade genética em geral e de certificação
clonal de acessos de cacaueiro de banco de germoplasma tem sido feito com
cerca de 8 a 9 locos SSR, sendo idealmente utilizados 15 locos SSR para a
diferenciação satisfatória de acessos fortemente relacionados geneticamente
(RISTERUCCI et al., 2000b; 2001; GILMOUR, 2001). Saunders et al. (2000),
56
baseado na análise das características de diferentes tipos de marcadores de
DNA, propôs o estabelecimento de um protocolo de caracterização molecular
de acessos de cacau usando 15 locos microssatélites. De acordo com Zhang et
al. (2006), trabalhos de diversidade genética utilizando 15 locos SSRs permite
alcançar uma probabilidade de identificação de 1 em 10000 , ou seja, um nível
de confiança de 99,99%, fornecendo um alto rigor estatístico na identificação
de acessos de cacau. Andrade (2006), em estudos de diversidade genética de
cacaueiros, mostrou que a utilização de 15 primers microssatélites eram
suficientes para eliminar incongruências presentes em dendrogramas oriundos
de análises de agrupamento gerados com dados de 8 primers microssatélites.
Em um estudo para diferenciação de cultivares de soja, Priolli et al.
(2002) relataram que 12 locos microssatélites não foram suficientes para
diferenciar os cultivares de soja avaliados, e atribuíram esse impedimento a
estreita base genética dos programas brasileiros de melhoramento de soja.
Além disso, outras regiões do genoma com grande variabilidade podem não ter
sido amostradas. Por outro lado, Garcia et al (2007) relatou que 10 locos SSR
foram suficientes para identificação adequada de cultivares de soja.
Devido à genealogia de TSH-1188 e CCN-51 incluírem clones
geneticamente distintos e com alta heterozigosidade, a utilização de 15 primers
microssatélites mostra-se suficientemente segura para certificação da
identidade genética dos acessos desses clones neste trabalho.
Tabela 6. Tamanho estimado dos alelos identificados (pb) na análise de
39 locos de microssatélites da em 44 indivíduos da progênie ‘TSH-1188 x CCN-
51, em comparação à localização nos grupos de ligação do mapa consensual
do cacaueiro (PUGH et al., 2004) e alelo clonado (LANAUD et al., 1999)
Loco
Grupo de
ligação
Alelo clonado
(pb)
Alelos observados (pb)
Nº de
alelos TSH-1188 CCN-51
L03 1 254 232 232 232 250 2
P21 1 139 116 141 130 116 3
L08 1 289 286 286 286 286 1
P28 1 192 196 206 196 206 2
P29 1 - 142 144 142 144 2
P30 1 - 185 187 185 187 2
P14 2 129 123 135 123 127 3
57
L06 2 376 371 371 352 371 2
P9 2 112 114 114 109 114 2
P15 3 - 205 213 205 211 3
L07 3 - 142 153 140 153 3
P13 4 - 191 195 191 191 2
P19 4 175 175 177 175 175 2
L04 4 271 271 281 271 281 2
L05 4 345 116 141 116 130 3
P23 4 220 219 221 217 219 3
P26 4 - 112 145 112 114 3
P10 4 139 120 136 108 136 3
L02 5 208 203 205 203 210 3
P12 5 105 92 102 92 93 3
P27 5 190 189 189 189 189 1
P05 6 - 147 153 133 145 4
L01 6 274 185 187 185 187 2
P16 7 - 209 215 209 215 2
P20 7 288 283 291 281 283 3
P04 7 265 192 202 184 202 3
P06 7 234 231 231 226 231 3
P07 7 354 328 362 352 362 3
P22 8 - 150 152 150 161 3
P25 8 193 192 192 192 192 1
P17 9 - 115 118 113 118 3
P18 9 288 291 291 291 295 2
L09 9 198 184 184 184 192 2
P01 9 182 180 180 171 180 2
P02 9 235 237 237 232 237 2
P08 9 226 235 257 262 262 3
P24 10 307 315 323 309 309 3
P03 10 150 146 176 133 153 4
P11 10 - 185 187 185 187 2
4.4 Segregação e ligação genética
De modo geral, os tamanhos dos fragmentos de microssatélites obtidos
nas amplificações corroboraram os valores relatados por Lanaud et al. (1999) e
Pugh et al. (2004) (Tabela 6). Foram identificados 97 alelos nos 39 locos que
exibiram produtos de amplificação, e o número de alelos por microssatélite
variou de 1 a 4 (média de 2.49 alelo por loco), o que está de acordo com o
esperado para essa população, que envolve seis clones diferentes em sua
58
genealogia. Os genitores TSH-1188 e CCN-51 apresentaram respectivamente
71,79% e 82,50% dos locos heterozigotos, confirmando sua natureza
heterozigota, sendo, portanto adequados para estudos de mapeamento
genético.
Dos 39 microssatélites analisados, os alelos exclusivos de cada genitor
segregaram de acordo com a proporção mendeliana 1:1 em 28 microssatélites,
sendo 20 desses marcadores comuns para ambos os genitores (Tabela 7).
Essa segregação é típica de retrocruzamentos. Dos 11 locos microssatélites
não utilizados na construção do mapa de ligação, um apresentou problemas e
codificação (P30), três foram monomórficos (L08, P25 e P27) e sete
demonstraram outros padrões de segregação típicos de
intercruzamentos (L04, L05, P11, P12, P16, P28 e P29). Os marcadores com
tais desvios de segregação foram descartados no presente estudo. Tal medida
foi adotada pelo fato de que os mesmos alteraram a construção dos grupos de
ligação, gerando, portanto, grupos desuniformes, o que não retrata a realidade
de um grupo de ligação genético. Nesse caso, os programas utilizados para
calcular a freqüência de recombinação levam em consideração a segregação
1:1. A utilização desses marcadores pode aumentar a probabilidade de erro, ou
seja, assumir como verdadeira uma associação entre dois locos não ligados.
Do total de 28 marcas utilizadas para construção do mapa, 13 não
permaneceram agrupadas e mostraram-se independentes aos grupos de
ligação formados e os demais possibilitaram evidenciar grupos de ligação
correspondentes a regiões genômicas de 5 grupos de ligação do cacau (Figura
8). Os alelos exclusivos de TSH-1188 possibilitaram identificar dois locos
ligados à característica de compatibilidade: P23, cuja banda exclusiva de TSH-
1188 está ligada em repulsão com a autoincompatibilidade; P10, cuja banda
exclusiva do TSH-1188 está ligada em acoplamento com autoincompatibilidade
(Figura 8). De fato, a maioria das progênies auto-incompatíveis possui alelos
de P10 exclusivo de TSH-1188.
Tabela 7. Marcadores microssatélites que segregaram na proporção
esperada (1:1) para os alelos exclusivos de cada genitor (CCN-51 e TSH-
1188), e o valor do quí-quadrado significativo a P > 0,05 (X
2
< 3,846)
59
Marcador
CCN-51
Marcador
TSH-1188
X
2
P
X
2
p
L02 0,701 0,402 L02 1,140 0,286
P12 0,972 0,324 P12 0,581 0,446
P14 0,015 0,902 P14 0,220 0,639
P15 2,304 0,129 P15 3,789 0,052
P17 2,833 0,092 P17 0,095 0,758
P20 0,701 0,402 P20 0,022 0,881
P21 0,015 0,904 P21 1,884 0,170
P22 1,457 0,227 P22 1,455 0,228
L07 0,059 0,808 L07 0,095 0,758
P23 0,159 0,690 P23 1,400 0,237
P03 0,505 0,477 P03 0,818 0,366
P04 0,014 0,906 P04 0,364 0,546
P05 0,069 0,793 P05 1,000 0,317
P07 0,368 0,544 P07 0,023 0,879
P10 0,396 0,529 P10 2,077 0,150
L01 2,833 0,092 L01 0,023 0,879
P19 0,130 0,719 P09 0,243 0,622
P13 0,132 0,717 L03 0,095 0,758
P24 0,229 0,632 P18 0,209 0,647
P08 3,409 0,065 L06 1,524 0,217
L09 0,022 0,881
P01 0,000 1,000
P02 0,818 0,366
P06 0,000 1,000
A característica cor de fruto não apresentou ligação genética significativa
a nenhum dos microssatélites testados. Por tentativa de ligação (comando “Try”
do Mapmaker), foi demonstrada uma hipótese fraca de associação entre a
característica cor de fruto e o GL7 (P07 com Cor: 57,9 cM; LOD 0,76).
Contudo, esses dados indicam a necessidade de testar um maior número de
locos visando identificar marcadores mais fortemente associados a essa
característica.
O ordenamento das marcas nos grupos de ligação onde foram
detectados, de uma maneira geral, apresentou semelhança com o observado
nos grupos de ligação do mapa consensual para o cacaueiro publicado por
Pugh et al. (2004).
60
Observam-se também pequenas diferenças de distância calculada entre
algumas marcas nos diferentes grupos de ligação, relativamente aqueles
obtidos por Pugh et al. (2004), o que pode ser explicado pelo reduzido número
de indivíduos e marcadores empregados no presente estudo. Além disso, cada
genitor pode ter diferentes taxas de recombinação nas diferentes posições do
genoma. A baixa saturação destes grupos de ligação construídos a partir de
alelos exclusivos de TSH-1188 e CCN-51 dificultou a integração entre eles.
Mesmo assim, quando comparado com o mapa consensual (PUGH et al.,
2004) e havendo locos com bandas informativas simultaneamente entre os dois
genitores, foi possível evidenciar a integração entre grupos de ligação.
Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao
número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,
5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso
(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1(Trinitário), S 52 (Trinitário) e
IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da
variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones
DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo
de ligação 4 e distantes em torno de 61,15 cM da marca mTcCIR76, enquanto
que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca mTcCIR18, situado 16,1
cM da marca mTcCIR76.
61
Figura 8. Grupos de ligação determinados a partir de 26 alelos exclusivos de
TSH-1188 e 24 de CCN-51, bem como das características cor de fruto e
compatibilidade sexual, com base na população F
1
derivada desses clones.
GL1, 2, 4, 7 e 9 correspondem ao mapa integrado por Pugh et al. (2004).
P04
P06
P07
P20
10,0
P04
P07
7,5
57,5
7,3
Cor
P21
L03
27,7
L06
P14
14,8
GL2
GL9
GL7
GL4
TSH
TSH
CCN
TSH
P10
Incomp.
14,8
P23
P19
9,4
12,8
P10
P23
Comp.
21,0
CCN
TSH
TSH
P18
P02
L09
P01
10,0
12,9
7,5
GL1
TSH
62
Albuquerque (2006) localizou um QTL relacionado à resistência a VB no
grupo de ligação 4, tendo como marcas cofatores o mTcCIR18 a esquerda e
mTcCIR76 a direita, explicando 41,9% da variação fenotípica das progênies
quanto a resistência a M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’. Três
QTLs associados à resistência do cacaueiro a P. palmivora foram encontrados
também no grupo de ligação 4, em regiões muito próximas de onde foi
localizado o QTL associado à resistência M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x
CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um destes QTLs foi encontrado por
Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar 13,2% da variação fenotípica da
resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro). Dois QTLs foram encontrados
por Clement et al. (2003b) associados aos clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs
foram capazes de explicar 22,6% e 10,1% respectivamente, da variação
fenotípica da resistência à podridão em frutos com base em dados de campo
acumulados por mais de seis anos.
No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado
por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F
1
do mapa de
referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes
alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos
dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde
foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT
et al., 2003b), QTL associado a resistência à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39
x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006) e QTLs associados ao número de óvulos
por ovário (CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.
O grupo de ligação 9, apresentou quatro marcas com 30,4 cM,
mostrando apenas pequenas diferenças de posicionamentos em relação ao
mapa consenso (PUGH, 2004). Apesar deste estudo não levar em
consideração aspectos de resistência a vassoura-de-bruxa, este grupo de
ligação é de extremo interesse, pois nele foi localizado o principal QTL para
resistência a essa doença, oriundo do genótipo ‘Scavina 6’ (QUEIROZ, et al.,
2003; FALEIRO et al., 2006), que esta presente na genealogia dos dois
genitores desta população de estudo.
63
5 CONCLUSÕES
O uso de um índice de pegamento ajustado ao número de polinizações
artificiais por planta possibilita a realização de testes de compatibilidade com a
utilização de um número reduzido de no mínimo de 15 autopolinizações por
planta sem superestimar a determinação da característica.
As características compatibilidade sexual e cor do fruto segregaram na
proporção de 1:1 e 3:1, respectivamente, e de forma independente nesta
população.
O número de sementes por fruto distribui-se de forma contínua na
população de acordo com um padrão multigênico e com segregação
transgressiva, assim como o número de sementes inviáveis por fruto.
Os acessos que representam os clones TSH-1188 e CCN-51 na coleção
de germoplasma do Centro de Ciências do Cacau M&MMars, são
geneticamente puros. Os acessos de cada grupo mostram-se indistinguíveis
entre si pela genotipagem em 15 locos SSR.
As marcas microssatélites P23 e P10 (não divulgadas por motivos de
sigilo de pesquisa) estão ligados à característica de compatibilidade sexual. A
característica cor de fruto não apresentou ligação genética significativa a
nenhum dos microssatélites testados. A existência da segregação da
característica compatibilidade sexual e cor do fruto, possibilita que esta
população seja utilizada em estudos de mapeamento genético para essas
características.
64
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