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FABRÍCIO ALANO PAMPLONA
LIPOXINA A
4
: UM MODULADOR ALOSTÉRICO
ENDOCANABINÓIDE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Florianópolis – SC
2010
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II
FABRÍCIO ALANO PAMPLONA
LIPOXINA A
4
: UM MODULADOR ALOSTÉRICO
ENDOCANABINÓIDE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Florianópolis – SC
2010
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Farmacologia do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Santa
Catarina como requisito parcial à obtenção
do título de Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo N. Takahashi
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III
“Evite as multidões e os clichês,
pense por si mesmo, independentemente,
seja o jogador de xadrez e não o peão”.
Ralph Charell
“Se você não erra,
provavelmente não está trabalhando
em problemas suficientemente desafiadores.
E isto sim é um grande erro”.
Frank Wilczek, Prêmio Nobel de Física (2004)
IV
Dedico este trabalho
à mãe natureza,
cujos mistérios nós cientistas
investigamos incansavelmente
com um misto de admiração,
surpresa e incredulidade.
V
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Alfa e Pedro Paulo, que sempre acreditaram em mim e
me apoiaram durante a minha caminhada de formação acadêmica e
evolução pessoal, que trocaram minhas fraldas sabendo que um dia serei
eu a trocar-lhes;
À minha irmã Gabriela, com quem divido o teto e as contas no final do
mês, pela parceria e pelos diversos momentos de alegria que vivemos
juntos desde o seu nascimento;
À minha namorada Izabella, pelo amor e cumplicidade irrestritos e pela
coragem de me acompanhar, enfrentando de peito aberto os desafios que
a vida a dois nos trouxe; a seus pais Mari e Otávio pela compreensão e
apoio;
Ao professor Reinaldo, pelos vários anos de parceria científica, pelas
longas discussões, pela iluminação nos momentos de dúvida e acima de
tudo, por confiar e acreditar no meu potencial;
Aos colaboradores e amigos Juliano Ferreira (UFSM), Octávio Menezes
de Lima Jr. (FIOCRUZ) e Filipe Ferreira Duarte (UFSC) por terem
participado integralmente na concepção deste projeto de doutorado e por
nunca terem medido forças em me ajudar nos momentos em que
precisei;
Aos demais colaboradores que foram se juntando ao longo da
construção deste estudo, professor João Batista Calixto (UFSC) e sua
equipe, em especial a Stefânia e o Alisson, que participaram diretamente
de experimentos desta tese;
Aos pesquisadores Carsten Wotjak (Instituto Max Planck de Psiquiatria,
Alemanha), Giovanni Marsicano e Isabel Matias (Instituto INSERM,
França) por terem aberto as portas de seus laboratórios, e apostarem na
minha proposta de trabalho, estabelecendo uma colaboração
internacional baseada na mais verdadeira transparência e reciprocidade;
VI
Aos professores do Departamento de Farmacologia, aos quais devo uma
parte substancial da minha formação acadêmica, em especial ao
professor Giles Rae (UFSC), que despretensiosamente acompanhou de
muito perto o desenvolvimento deste trabalho com sinceras e valiosas
sugestões;
Aos diversos amigos que fiz nos laboratórios envolvidos direta ou
indiretamente nos experimentos desta tese. Agradeço à professora Rosa
Maria Ribeiro-do-Valle por ter me permitido realizar experimentos em
seu laboratório e à Mari e ao Eduardo que aturaram minhas piadinhas
infames;
Aos amigos do lab, Pablo, Rafael, Thiago, Assini, Cris, Sanmara, que
acompanharam meus passos durante a realização desta tese e foram
sempre fiéis ao espírito de equipe e companheirismo;
Aos amigos do lab "irmão" professor Rui Daniel, Daniel Rial, Filipe,
Aderbal, Xikota, Nelsão, Eduardo e Adalba pelas diversas risadas na
"hora do cafezinho", que influenciaram positivamente meu olhar
científico e não raro resultaram em novos rumos para este e outros
estudos que tenho desenvolvido;
Aos funcionários do Departamento da Farmacologia, todos sempre
muito solícitos;
Ao desenvolvedor do programa gerenciador de referências EndNote,
sem o qual a tarefa de referenciar este documento teria sido
incomparavelmente mais árdua;
À Fundação Hübner por viabilizar financeiramente a minha
permanência por 18 meses como pesquisador convidado no Instituto
Max Planck de Psiquiatria, na Alemanha;
Ao CNPq, CAPES e FAPESC pelo suporte financeiro ao laboratório de
Psicofarmacologia e às minhas atividades acadêmicas como doutorando
do PPG em Farmacologia-UFSC;
À Ilha de Santa Catarina, cuja beleza me encanta e inspira;
Um sincero Muito Obrigado.
VII
SUMÁRIO
SUMÁRIO .......................................................................................... VII
LISTA DE ABREVIAÇÕES .............................................................. IX
LISTA DE FIGURAS ......................................................................... X
LISTA DE TABELAS ....................................................................... XIII
RESUMO ........................................................................................... XIV
ABSTRACT ....................................................................................... XVI
1 – INTRODUÇÃO ........................................................................... 1
1,1-BREVE HISTÓRIA DA DESCOBERTA DOS
ENDOCANABINÓIDES .................................................................... 2
1.2-DISTRIBUIÇÃO NEURONAL DOS RECEPTORES
CANABINÓIDES ............................................................................... 6
1.3-OS ENDOCANABINÓIDES, SÍNTESE E DEGRADAÇÃO ..... 11
1.4- FARMACOLOGIA DOS ENDOCANABINÓIDES .................. 18
1.5-A DINÂMICA DA SINAPSE ENDOCANABINÓIDE ............... 21
1.6-INTERAÇÃO ENTRE OS ENDOCANABINÓIDE E OUTROS
EICOSANÓIDES ................................................................................ 25
1.7-LIPOXINAS: DA PERIFERIA AO CÉREBRO .......................... 27
2-JUSTIFICATIVA .......................................................................... 33
3–OBJETIVO .................................................................................... 34
3.1–GERAL ........................................................................................ 34
3.2–ESPECÍFICOS ............................................................................. 34
4–MÉTODOS .................................................................................... 35
4.1–ANIMAIS ..................................................................................... 35
4.2-SUBSTÂNCIAS UTILIZADAS................................................... 35
4.3-PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .................................... 37
4.3.1-Administração intracerebroventricular ....................................... 37
4.3.2-Procedimentos comportamentais in vivo .................................... 39
4.3.2.1-Testes preditivos para atividade canabimimética .................... 39
4.3.3-Procedimentos funcionais in vitro .............................................. 41
4.3.3.1-Contração de ducto deferente de rato induzida eletricamente . 41
4.3.4-Procedimentos bioquímicos in vitro .......................................... 42
4.3.4.1-Preparação das frações celulares ............................................ 42
4.3.4.2-Ensaio de ligação em receptores canabinóides CB
1
................ 42
4.3.4.3-Atividade enzimática da FAAH, enzima de degradação da
AEA .................................................................................................... 43
4.3.4.4-Atividade enzimática da MAGL, enzima de degradação do
2-AG .................................................................................................... 44
VIII
4.3.4.5-Determinação da expressão de receptores ALX por Western
blot ....................................................................................................... 44
4.3.5-Procedimentos bioquímicos ex vivo ........................................... 45
4.3.5.1-Dosagem de endocanabinóides no cérebro .............................. 45
4.3.5.2-Dosagem de LXA
4
no cérebro ................................................. 45
4.3.6-Seqüência experimental .............................................................. 46
4.3.6.1-Grupo 1: A LXA
4
induz efeitos similares aos de
canabinóides no sistema nervoso central? ............................................ 46
4.3.6.2-Grupo 2: Em busca de um mecanismo de ação para os efeitos
centrais da LXA
4
.................................................................................. 48
4.3.6.3-Grupo 3: Possível relevância fisiológica da interação entre
derivados da lipoxigenase e endocanabinóides no sistema nervoso
central. .................................................................................................. 50
4.3.6.4-Grupo 4: A 15-epi-LXA
4
gerada pela aspirina compartilha
dos efeitos canabimiméticos observados para a LXA
4
de ocorrência
natural? ................................................................................................. 51
4.4–ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................... 52
5–RESULTADOS .............................................................................. 54
5.1-GRUPO 1: A LXA
4
INDUZ EFEITOS SIMILARES AOS DE
CANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL? .............. 54
5.2-GRUPO 2: EM BUSCA DE UM MECANISMO DE AÇÃO
PARA OS EFEITOS CENTRAIS DA LXA
4
. ..................................... 58
5.3-GRUPO 3: POSSÍVEL RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA DA
INTERAÇÃO ENTRE DERIVADOS DA LIPOXIGENASE E
ENDOCANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL. .... 67
5.4-GRUPO 4: A 15-EPI-LXA
4
GERADA PELA ASPIRINA
COMPARTILHA DOS EFEITOS CANABIMIMÉTICOS
OBSERVADOS PARA A LXA4 DE OCORRÊNCIA NATURAL? . 70
6–DISCUSSÃO ................................................................................... 74
CONCLUSÕES .................................................................................. 103
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................. 104
ANEXO 1 ............................................................................................ 132
ANEXO 2 ............................................................................................ 138
ANEXO 3 ............................................................................................ 140
IX
LISTA DE ABREVIAÇÕES
2-AG – 2 araquidonil glicerol
AEA - anandamida
AMP – adenosina monofosfato
ANOVA – análise de variância
ATP – adenosina trifosfato
CCK – colecistocinina
CMC – carbóxi metil celulose
COX – cicloxigenase
DAG – diacil glicerol
DMSO - dimetil sufóxido
DNA – ácido desoxirribonucleico
FAAH – amido hidrolase de ácidos graxos
HPLC – cromatografia líquida de alta performance
i.c.v. – via intracerebroventricular
i.p. – via intraperitoneal
IL – interleucina
IP3 – inositol trifosfato
LOX – lipoxigenase
LTP – potenciação de longo prazo
LXA
4 –
lipoxina A
4
MAPK – proteína quinase ativada por mitógeno
MAGL – mono acil glicerol lipase
mRNA – RNA mensageiro
NADA – n-araquidonil dopamina
NAPE – n-araquidonil fosfatidil etanolamina
p.o. – via oral
PBS – solução salina tamponada com fosfato
PKC – proteína quinase C
PLA - fosfolipase A
PLC – fosfolipase C
PLD – fosfolipase D
PMSF - fluoreto de fenilmetanosulfonila
PVDF - fluoreto de polivinilideno
SNC – sistema nervoso central
Δ
9
-THC – Δ
9
- tetra hidrocanabinol
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Artigos publicados anualmente (1990-2008) em revistas
científica indexadas com os termos “cannabinoid” (CB),
“endocannabinoid” (eCB), “noradrenaline”(NA) ou
“acetylcholine”(Ach) no título e/ou resumo ........................................ 1
Figura 2 – Grandes marcos na história recente da pesquisa com
derivados da Cannabis, canabinóides e endocanabinóides. ................. 6
Figura 3 – Imunohistoquímica com microscopia eletrônica
demonstrando a localização de receptores CB
1
em subtipos celulares da
região CA1 do hipocampo. .................................................................. 8
Figura 4 – Hibridização in situ para o RNAm dos receptores
canabinóides CB
1
e CB
2
no cérebro (painéis maiores) e baço (painéis
menores) de camundongos. .................................................................. 10
Figura 5 – Representação esquemática das estruturas moleculares dos
endocanabinóides identificados e caracterizados até o momento. ....... 11
Figura 6 – Vias enzimáticas de degradação da anandamida (AEA). .. 17
Figura 7 – Elementos básicos de uma sinapse endocanabinóide. ........ 22
Figura 8 – O processo dinâmico de sinalização retrógrada
endocanabinóide. ................................................................................. 24
Figura 9 - Representação esquemática das vias sintéticas dos
eicosanóides, incluindo seus receptores mais conhecidos. .................. 26
Figura 10 – Árvore filogenética relacionando os receptores ALX com
outros receptores metabotrópicos para lipídeos, incluindo os de
eicosanóides. ........................................................................................ 30
Figura 11 – Localização tecidual dos receptors ALX por técnica de
Western blot. ........................................................................................ 31
XI
Figura 12 - Representação da técnica utilizada para injeções i.c.v.
freehand descrita por Haley e McCormick (1957) e adaptada por
Laursen e Belknap (1986). .................................................................. 38
Figura 13 – Fotografias dos testes comportamentais constituintes do
teste de atividade canabimimética, também chamado de teste da tétrade
canabinóide, como realizado em nossas condições experimentais. ..... 40
Figura 14 – Efeito da LXA
4
no teste da tétrade de efeitos canabinóides.
............................................................................................................. 54
Figura 15 – Participação de receptores canabinóides CB
1
nos efeitos
centrais da LXA
4
. ................................................................................ 56
Figura 16 – Confirmação da ausência de participação de receptores
ALX nos efeitos centrais da LXA
4
. ..................................................... 57
Figura 17 – Confirmação da participação de receptores canabinóides
CB
1
nos efeitos centrais da LXA
4
. ...................................................... 58
Figura 18 – LXA
4
possui baixa afinidade para os receptores CB
1
e baixa
eficácia canabimimética in vitro.......................................................... 60
Figura 19 - Interação da LXA
4
com os endocanabinóides AEA e 2-AG.
.................................................................................................. 61
Figura 20 – LXA
4
não altera o metabolismo dos endocanabinóides AEA
e 2-AG. ................................................................................................ 63
Figura 21 – LXA
4
não altera os níveis de endocanabinóides no cérebro.
.................................................................................................. 64
Figura 22 – LXA
4
aumenta a afinidade da AEA pelos receptores
canabinóides CB
1
, mas bloqueia seu efeito in vitro. ........................... 67
Figura 23 – Quantificação dos níveis endógenos de LXA
4
no cérebro.
.................................................................................................. 68
Figura 24 - LXA
4
endógena participa dos efeitos centrais do
endocanabinóide AEA. ........................................................................ 69
XII
Figura 25 – Aspirina potencializa os efeitos centrais do endocanabinóide
AEA. ................................................................................................... 70
Figura 26 – Derivado da 5-LOX gerado pela aspirina participa da
potencialização dos efeitos centrais da AEA. ...................................... 71
Figura 27 – A lipoxina gerada pela aspirina potencializa os efeitos
centrais da AEA. .................................................................................. 72
Figura 28 – Receptores canabinóides CB
1
participam dos efeitos centrais
da 15-epi-LXA
4
. ................................................................................... 73
Figura 29 – Ilustração do modelo teórico de múltiplos estados
conformacionais de receptores farmacológicos. .................................. 83
Figura 30 – Ilustração do modelo teórico de alosterismo conforma a
teoria de múltiplos estados conformacionais de receptores
farmacológicos. .................................................................................... 85
Figura 31 – Efeitos da modulação alostérica sobre a afinidade e eficácia
de um agonista total. ............................................................................ 88
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Receptores-alvo para endocanabinóides ............................ 21
Tabela 2 – Efeitos da LXA
4
e AEA no SNC ....................................... 32
Tabela 3 – Mecanismo de ação das substâncias utilizadas no presente
trabalho. ............................................................................................... 36
Tabela 4 - Parâmetros do ensaio competitivo de ligação da lipoxina A
4
contra [
3
H]SR141716A em membranas de cérebro total de
camundongos. ...................................................................................... 59
Tabela 5 – Potência estimada dos ligantes no teste da catalepsia ....... 62
Tabela 6 - Parâmetros do ensaio competitivo de ligação da AEA contra
[
3
H]SR141716A na ausência e na presença de LXA
4
(100 nM) em
membranas de cérebro total de camundongos. .................................... 66
XIV
RESUMO
Lipoxinas e endocanabinóides são eicosanóides endógenos que são
liberados sob demanda em resposta à estimulação neuronal ou injúria
tecidual. A lipoxina A
4
(LXA
4
) ativa receptores ALX e exerce
importante papel na resolução de processos inflamatórios, mas
informações a respeito dos seus efeitos no sistema nervoso central são
escassas. As evidências disponíveis até o momento sugerem que a LXA
4
pode influenciar a atividade cerebral de uma maneira similar aos
canabinóides. Endocanabinóides como a anandamida (AEA) e o 2-
araquidonilglicerol (2-AG) exercem diversos efeitos centrais por
ativação dos receptores canabinóides CB
1
. Apesar dos endocanabinóides
e lipoxinas compartilharem similaridades estruturais e funcionais, ainda
não há descrição de sua relação farmacológica. Desta maneira, o
objetivo deste trabalho foi investigar a participação do sistema
endocanabinóide nos efeitos centrais da LXA
4
. Camundongos Swiss
albinos foram injetados i.c.v. com LXA
4
(0,01-1 pmol / 5 l) ou controle
e 5 min depois avaliados no teste da tétrade canabinóide (catalepsia,
locomoção, analgesia e temperatura retal), considerado preditivo para
atividade canabimimética. A investigação destas respostas prosseguiu
com a injeção do antagonista canabinóide CB
1
SR141716A (1 mg/kg,
i.p.) ou do antagonista de receptores ALX BOC-2 (10 g/kg, i.p.) 50
min antes da injeção i.c.v. de LXA
4
(1 pmol / 5 l). A participação dos
receptores CB
1
nos efeitos da LXA
4
foi confirmada em camundongos
knockout para receptores CB
1
. A interação farmacológica entre LXA
4
e
os endocanabinóides foi abordada pela co-injeção de doses sub-efetivas
de AEA (10 pmol/ 2 l) ou 2-AG (1 pmol/ 2 l) e LXA
4
(0,01 pmol/ 2
l). A ligação da LXA
4
(1 nM – 10 M) nos receptores canabinóides
CB
1
receptores foi avaliada no ensaio competitivo de ligação contra o
[
3
H]SR141716A em membranas de cérebro de camundongos, na
presença e ausência de AEA (1 nM – 10 M). Possíveis efeitos da LXA
4
na degradação dos endocanabinóides foram testados em ensaios in vitro
das respectivas enzimas de degradação para a AEA e o 2-AG. Além do
mais, nós testamos se a 15-epi-LXA
4
, uma lipoxina liberada por ação da
aspirina, também exerce atividade canabimimética como a LXA
4
de
ocorrência natural. LXA
4
(0,1 - 1 pmol) induziu catalepsia,
hipolocomoção, analgesia e hipotermia nos camundongos. Estes efeitos
foram antagonizados pelo antagonista dos receptores canabinóides CB
1
SR141716A, mas não pelo antagonista dos receptores ALX BOC-2,
além de não ocorreram em camundongos knockout para os receptores
XV
CB
1
. A LXA
4
potencializou a catalepsia induzida pela AEA, mas não
pelo 2-AG. A LXA
4
praticamente não inibiu a ligação do
[
3
H]SR141716A às membranas de cérebro de camundongos, mas
aumentou a inibição causada pela AEA. Não houve efeito da LXA4
sobre a atividade das enzimas de degradação de endocanabinóides
FAAH e MAGL (até 10 M). A aspirina potencializou os efeitos da
AEA de uma maneira dependente da enzima 5-LOX e dos receptores
CB
1
, provavelmente porque a 15-epi-LXA
4
também influencia a
afinidade da AEA pelos receptores CB
1
. Os presentes resultados
sugerem que a LXA
4
exerce efeitos centrais via receptores CB
1
interagindo positivamente com o endocanabinóide AEA. Apesar da
LXA
4
não influenciar o metabolismo de endocanabinóides, este trabalho
traz evidências de que a LXA
4
aumenta a afinidade da AEA pelos
receptores CB
1
por um mecanismo de modulação alostérica positiva.
Esta é certamente uma descoberta pioneira na farmacologia do sistema
endocanabinóide.
XVI
ABSTRACT
Lipoxins and endocannabinoids are endogenous eicosanoids that are
released on demand following neuronal stimulation or injury. Lipoxin
A
4
(LXA
4
) activates ALX receptors and has an important role in the
resolution of inflammation, but information about its effects on the
central nervous system is scarce. The available evidence suggests that
LXA
4
may influence brain function in a cannabinoid-like fashion.
Endocannabinoids, such as anandamide (AEA) and 2-
arachidonoylglycerol (2-AG) exert widespread brain effects by
activation of CB
1
cannabinoid receptors. Although endocannabinoids
and lipoxins share structural and functional similarities, the
pharmacological relationship between them has not yet been described.
Hence, this study aimed to investigate the participation of the
endocannabinoid system in the central effects of LXA
4
in mice. Swiss
albino mice were injected i.c.v. with LXA
4
(0.01-1 pmol / 5 l) or
control and 5 min after evaluated in the cannabinoid tetrad test
(catalepsy, locomotion, analgesia and rectal temperature), considered
predictive for cannabimimetic activity. These responses were further
investigated by injecting the CB
1
receptors antagonist SR141716A (1
mg/kg, i.p.) or the ALX receptor antagonist BOC-2 (10 g/kg, i.p.) 50
min before i.c.v. injection of LXA
4
(1 pmol / 5 l). The role of CB
1
receptors on LXA
4
effects was confirmed by the use of CB1 knockout
mice. The pharmacological interaction between LXA
4
and the
endocannabinoids was addressed by co-injecting sub-effective doses of
AEA (10 pmol/ 2 l) or 2-AG (1 pmol/ 2 l) and LXA
4
(0.01 pmol/ 2
l). Binding of LXA
4
(1 nM – 10 M) to CB
1
receptors was tested in a
competitive binding assay against [
3
H]SR141716A in mouse brain
membranes in the presence and absence of AEA (1nM - 10 M ).
Possible effects of LXA
4
on degradation of endocannabinoids were
assessed by in vitro assays of the metabolic enzymes of AEA e 2-AG.
Additionally, we tested whether 15-epi-LXA
4
, an aspirin-triggered
lipoxin, shares the cannabimimetic activity of the naturally-occurring
LXA
4
. LXA
4
(0.1-1 pmol) induced catalepsy, hypolocomotion,
analgesia and hypothermia in mice. These effects were antagonized by
the CB
1
receptor antagonist SR141716A, but not by the ALX receptor
antagonist BOC-2, and were absent in CB
1
knockout mice. LXA
4
potentiated the cataleptic effects of AEA, but not of 2-AG. LXA
4
virtually did not inhibit the binding of [
3
H]SR141716A, but enhanced
the inhibition of [
3
H]SR141716A binding by AEA. There was no effect
XVII
of LXA
4
on the endocannabinoid-degrading enzymes FAAH and
MAGL (up to 10 M). Aspirin potentiated AEA effects via a
mechanism dependent of 5-LOX and CB
1
receptors, presumably
because 15-epi-LXA
4
also influences the affinity of AEA at CB
1
receptors. The present results suggest that LXA4 exerts central effects
via CB
1
cannabinoid receptors and interacts positively with the
endocannabinoid AEA. While we did not find any effect of LXA4 on
endocannabinoid metabolism, this study brings evidence that LXA4
enhances the affinity of AEA for CB
1
receptors through a mechanism of
positive allosteric modulation. This is unmistakably a pioneer finding on
pharmacology of the endocannabinoid system.
1
1 - INTRODUÇÃO
Os últimos anos testemunharam um avanço crescente na
compreensão da importância dos endocanabinóides para o organismo. A
complexidade do que se convencionou chamar “sistema
endocanabinóide” de neuromodulação cresceu do reconhecimento
inicial de que o principal composto psicoativo de plantas do gênero
Cannabis se liga a sítios protéicos específicos no sistema nervoso
central de mamíferos; até os dias de hoje, em que uma gama de enzimas,
receptores e ligantes desse sistema já foram identificados. Este é sem
dúvida um dos sistemas de neuromodulação cujas investigações
científicas têm aumentado dramaticamente nos últimos anos (ver figura
1). Enquanto há uma tendência de estabilização e/ou queda no número
de artigos publicados envolvendo neurotransmissores “clássicos” como
a acetilcolina ou noradrenalina, o número de artigos investigando o
sistema endocanabinóide aumentou consideravelmente.
Figura 1 – Artigos publicados anualmente (1990-2008) em revistas científica
indexadas com os termos “cannabinoid” (CB), “endocannabinoid” (eCB),
“noradrenaline”(NA) ou “acetylcholine”(Ach) no título e/ou resumo, listados
no PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).
Até aproximadamente 20 anos atrás, praticamente não havia
referência ao sistema endocanabinóide na base de dados PubMed (o
termo veio a ser “oficialmente” cunhado entre 1994 e 1995, em artigos
liderados pelo pesquisador italiano Vincenzo di Marzo), quando o termo
2
canabinóide constava em apenas 32 artigos, dos milhares publicados no
ano de 1990. Em 2008, o termo canabinóide estava presente em 729
artigos publicados, uma imponente marca de cerca de 2 artigos / dia,
com crescimento de 2300% nas últimas 2 décadas. No mesmo ano, o
termo endocanabinóide foi utilizado em 398 artigos.
1.1 - UMA BREVE HISTÓRIA DA DESCOBERTA DOS
ENDOCANABINÓIDES
Derivados da planta Cannabis sativa são utilizados na forma de
fibra para fabricação de cordas e têxteis, para extração de seu óleo com
propriedades nutritivas ou para fins medicinais/religiosos há milênios,
de forma que se especula que esta tenha sido uma das primeiras plantas
cultivadas pelo homem (Li, 1973). Os registros arqueológicos e
históricos conhecidos sugerem que a Cannabis era cultivada para
utilização de suas fibras há cerca de 6 mil anos atrás (Li, 1973). Destes,
há pelo menos 2700 anos as inflorescências desta planta vêm sendo
utilizadas pelas suas propriedades psicofarmacológicas, inclusive
constando na farmacopéia chinesa, a mais antiga de que se tem notícia
(Russo et al., 2008). É nesta farmacopéia onde se encontram os
primeiros registros dos efeitos psicofarmacológicos da Cannabis: “...ela
possibilita a comunicação com os espíritos e ilumina o corpo, mas se tomada
em excesso produzirá visões diabólicas...” (tradução livre da descrição em
inglês de Li (1978)). O uso recreacional e medicinal da Cannabis
também eram bastante difundidos na Índia, de maneira que os livros
sagrados dos Vedas – o provável equivalente à bíblia para os cristãos –
referem-se à Cannabis como uma das 5 plantas sagradas, conhecida
como “fonte de felicidade, doador de alegria e carregador da
liberdade”. As recomendações medicinais para a Cannabis eram as mais
diversas, desde analgésico, anticonvulsivante, hipnótico, tranqüilizante a
antibiótico, e antiparasitário, passando por digestivo, afrodisíaco e
expectorante (Touwn, 1981). De fato, algumas destas utilizações foram
comprovadas pela abordagem científica contemporânea, enquanto outras
ainda são alvo de debates acalorados e opiniões controversas, muitas
vezes de cunho mais político do que científico/médico.
No Brasil, o uso da Cannabis foi introduzido em torno do século
16, vindo juntamente com os escravos africanos. O termo maconha,
gíria utilizada para a forma mais popular da planta em nosso país é de
origem angolana, por exemplo. Apesar de conhecida na América do Sul,
os registros sugerem que na Europa a Cannabis era cultivada somente
3
para a utilização de suas fibras na fabricação de têxteis. Seu uso era
provavelmente mal visto pela sociedade aristocrática da época, pois era
associada aos hábitos dos escravos negros. Foi somente no século 19
que a Cannabis se tornou popular na Europa, muito em decorrência dos
trabalhos do médico irlandês William B. O´Shaugnessy e do psiquiatra
francês Jacques-Joseph Toreau, que experimentaram (e trouxeram)
derivados da Cannabis da Índia e Arábia, respectivamente (Fankhauser,
2002). O aval destes dois cidadãos europeus de grande notoriedade
contribuiu para que o uso da Cannabis fumada se disseminasse pela
Europa, virando tanto um hábito entre os intelectuais e artistas, quanto
uma esperança para a cura de diversos males, constando em diversas
farmacopéias, com extratos e tinturas produzidos em larga escala por
laboratórios renomados da Alemanha, Estados Unidos e Inglaterra
(Fankhauser, 2002).
Ao contrário do que se pensa, a restrição legal ao uso da
Cannabis é extremamente recente. A rígida regulação imposta no final
da década de 1930 pelo governo dos Estados Unidos gerou uma onda
proibicionista ao longo do globo terrestre, que culminou com a
classificação da Cannabis como substância controlada classe I na
Convenção Internacional de Substâncias Psicotrópicas, equiparada
erroneamente ao ópio e outras drogas com alto potencial de gerar
dependência (Organização-Das-Nações-Unidas, 1971). Em alguns
países da Europa, como Holanda, Inglaterra, França, Espanha, Suíça e
Dinamarca o uso da Cannabis continuou socialmente aceito, apesar
destes países participarem das convenções internacionais. Hoje em dia,
há forte pressão social em alguns países, principalmente europeus, pela
mudança do status legal da Cannabis, que já foi atenuada para classe II
na convenção internacional de narcóticos. Esta mudança de perspectiva
se deve, em grande parte, pela “redescoberta” do seu potencial
terapêutico e em defesa do interesse de pacientes que relatam poucos
efeitos colaterais e preferem o uso de maconha ao de medicamentos
convencionais para alívio sintomático. Em decorrência disso, a
legislação vem gradualmente mudando, de forma que atualmente
permissões para uso medicinal de Cannabis podem ser obtidas em 14
dos 50 estados dos Estados Unidos, no Canadá e Alemanha.
Dispensários públicos distribuem Cannabis cultivada pelo governo na
Califórnia e Canadá, enquanto que nos outros países a Cannabis é
oriunda da Holanda, onde a planta em formato padronizado para uso
terapêutico pode ser encontrada em farmácias (International-
Association-for-Cannabis-Based-Medicine, 2010).
4
Apesar desta longa relação entre a humanidade e a Cannabis, o
conhecimento atual sobre a química e a farmacologia dos canabinóides é
primariamente decorrente de pesquisas científicas conduzidas nas
últimas cinco décadas. As primeiras buscas pelos ingredientes
psicoativos da Cannabis ocorreram em torno do século 19, mas foi
muito mais recentemente que o componente psicoativo majoritário Δ
9
-
tetrahidrocanabinol (Δ
9
-THC) foi isolado, caracterizado e sintetizado no
laboratório do pesquisador israelense Rafael Mechoulam (Gaoni e
Mechoulam, 1964). Depois deste, mais de 60 outros canabinóides foram
identificados nas inflorescências de plantas do gênero Cannabis, além de
diversos outros componentes não canabinóides com efeitos
farmacológicos centrais e periféricos (Mechoulam e Hanus, 2000).
Embora a identificação do Δ
9
-THC não tenha explicado completamente
os efeitos da Cannabis no organismo humano, essa descoberta
impulsionou dramaticamente a pesquisa científica na área dos
canabinóides. Foi nessa época que o teste comportamental da tétrade de
canabinóides foi idealizado pelo pesquisador americano Billy Martin
para triagem farmacológica de atividade canabimimética. Este teste foi
inicialmente realizado em cachorros e consistia na observação
simultânea de supressão de atividade locomotora, analgesia, hipotermia
e catalepsia (Martin, 1985).
Os efeitos comportamentais do Δ
9
-THC foram seguidos de
diversos testes com membranas de tecido cerebral in vitro que
identificaram alguns efeitos biológicos desta molécula, assim como a
dependência de ativação de proteínas G, mas não conseguiram
identificar um sítio de ação específico utilizando o Δ
9
-THC marcado
radioativamente (Howlett, 1987). O principal empecilho era a alta
lipossolubilidade do Δ
9
-THC, que o fazia se ligar indiscriminadamente
nas membranas celulares (Roth e Williams, 1979). Foi necessária a
colaboração entre pesquisadores do grupo de Allyn Howlett e a
companhia farmacêutica Pfizer para o desenvolvimento de um derivado
estrutural do Δ
9
-THC (CP-55,940) marcado radioativamente e com
maior hidrosolubilidade, para que finalmente se descobrissem os sítios
específicos de ligação para o Δ
9
-THC no cérebro de ratos (Devane et al.,
1988). Este primeiro receptor canabinóide foi identificado em uma lista
prévia de receptores metabotrópicos órfãos e denominado “receptor
canabinóide tipo 1”, ou simplesmente CB
1
. A clonagem definitiva deste
receptor e elucidação de sua estrutura molecular (Matsuda et al., 1990)
foi prontamente seguida pela clonagem de outro tipo de receptor
canabinóide, identificado por homologia estrutural. Estes receptores
5
foram denominados receptores CB
2
(Munro et al., 1993). Recentemente
descobriu-se que outros receptores previamente considerados
“receptores órfãos”, como o GPR55 (Ryberg et al., 2007), o GPR18
(Kohno et al., 2006) e o GPR119 (Overton et al., 2006) também
parecem constituir novos tipos de receptores canabinóides. Este tópico
merece uma discussão mais aprofundada nas próximas sessões deste
trabalho, pois ainda não há consenso por parte dos pesquisadores da área
quanto à classificação destes receptores.
A descoberta dos receptores CB
1
foi o marco inicial para o estudo
do sistema endocanabinóide. No entanto, foi a identificação de um
lipídeo extraído do cérebro de porcos que se ligava com boa afinidade
aos receptores CB
1
que iria mudar a história da farmacologia nos anos
seguintes, elevando o sistema endocanabinóide ao status de mais
abundante modulador de atividade sináptica conhecido. Atualmente se
sabe que os receptores CB
1
são os mais abundantes receptores acoplados
à proteína G expressos no cérebro de mamíferos (Herkenham et al.,
1990). Então, como parecia pouco lógico que estes receptores seriam
expressos no cérebro somente para a ligação dos compostos da
Cannabis, o próximo passo na investigação científica dos canabinóides
foi a tentativa de identificar o seu ligante endógeno. Um canabinóide
sintético (HU-243) marcado radioativamente foi utilizado em ensaios
competitivos de ligação para a identificação do primeiro agonista
endógeno dos receptores canabinóides, descoberto por um grupo
liderado pelos mesmos pesquisadores que anteriormente haviam
identificado os receptores CB
1
(Devane et al., 1992). O agonista
endógeno em questão é a etanolamida do ácido araquidônico,
anandamida (AEA), cujo nome foi gerado pela combinação de sua
função química com o termo ananda, que significa algo como
“satisfação plena, felicidade” em sânscrito. O 2-araquidonil glicerol (2-
AG) foi descoberto poucos anos depois por dois grupos independentes
de pesquisadores (Mechoulam et al., 1995; Sugiura et al., 1995). Sugere-
se que outras moléculas endógenas derivadas do ácido araquidônico
como a oleamida (Leggett et al., 2004), a O-araquidonil etanolamina
(virodamina) (Porter et al., 2002), o 2-araquidonil gliceril éter (noladin)
(Hanus et al., 2001) e a N-araquidonil dopamina (NADA) (O'Sullivan et
al., 2004) também exerçam atividade canabinóide. Estes ligantes
endógenos dos receptores canabinóides são coletivamente denominados
de endocanabinóides. Conforme ilustrado na figura 2 abaixo, o
pesquisador italiano Vincenzo DiMarzo classifica as “eras” científicas
em: era da Cannabis (desde os tempos ancestrais até o início da
6
elucidação dos componentes químicos da planta), era dos canabinóides
(após o descobrimento do Δ
9
-THC) e era dos endocanabinóides (após o
descobrimento dos receptores canabinóides e seus ligantes endógenos).
O marco da era atual (endocanabinóides) seria a aplicação do
conhecimento sobre este sistema no desenvolvimento de novos
fármacos terapeuticamente e comercialmente viáveis.
Figura 2 – Grandes marcos na história recente da pesquisa com derivados da
Cannabis, canabinóides e endocanabinóides. Utilizada há milênios no oriente
para fins recreacionais e medicinais/religiosos, a Cannabis só passou a receber
atenção de cientistas ocidentais a partir do século 19. A partir de então, a
pesquisa científica na área foi bastante impulsionada pela identificação dos
constituintes químicos da Cannabis, destaque para o Δ9-THC, e a
caracterização de um complexo sistema endocanabinóide de receptores,
ligantes e suas enzimas metabólicas. Os últimos anos testemunharam o
lançamento dos primeiros medicamentos oriundos das pesquisas em Cannabis
no mercado farmacêutico. Δ9-THC: Δ9-tetrahidrocanabinol; AEA: anandamida
(endocanabinóide); 2-AG: 2-araquidonilglicerol (endocanabinóide); FAAH:
amido hidrolase de ácidos graxos, enzima de metabolismo da anandamida.
(Figura baseada em Di Marzo (2006)).
1.2 - DISTRIBUIÇÃO NEURONAL E CEREBRAL DOS
RECEPTORES CANABINÓIDES
Como mencionado na sessão anterior, a identificação dos
receptores canabinóides só foi possível graças ao desenvolvimento de
ligantes canabinóides menos hidrofóbicos. Da mesma maneira, estas
ferramentas farmacológicas foram utilizadas na investigação histológica
da localização dos receptores canabinóides no cérebro, e ainda mais
especificamente, sua localização neuronal. Os estudos iniciais de
autoradiografia com o ligante [
3
H]CP-55,940 revelaram que a expressão
dos receptors CB
1
no cérebro é extremamente alta, comparáveis aos
7
níveis de receptores ionotrópicos de neurotransmissores clássicos como
GABA e glutamato (Herkenham et al., 1990). De fato, os receptores
CB
1
são atualmente considerados os receptores metabotrópicos de maior
expressão no cérebro de mamíferos. Além disso, descobriu-se que a
distribuição dos receptores CB
1
no sistema nervoso central é consistente
com o que se esperaria levando em consideração os efeitos psicoativos
característicos do Δ
9
-THC em humanos e animais (Howlett et al., 2002).
Por exemplo, altos níveis destes receptores são encontrados em áreas
relacionadas ao controle do movimento, como os gânglios da base e
cerebelo (possível substrato neural para os efeitos de hipolocomoção e
catalepsia). Altos níveis de receptores CB
1
em áreas cortico-límbicas
como o córtex cingulado, córtex frontal, amígdala e hipocampo refletem
a importância dos endocanabinóides na modulação da emocionalidade e
cognição. Além disso, expressão moderada destes receptores é
observada no tronco dorsal da medula espinhal, substância cinzenta
periaquedutal, áreas corticais relacionadas ao processamento
nociceptivo (substratos para o efeito analgésico) e hipotálamo (substrato
dos efeitos neuroendócrinos e termoreguladores). No entanto, baixos
níveis de receptores CB
1
são encontrados no tálamo e centros não
eméticos do tronco cerebral, como aqueles envolvidos no controle da
respiração, de maneira consistente com a desprezível toxicidade dos
canabinóides sobre as funções vegetativas essenciais (Herkenham et al.,
1990).
Estudos mais detalhados de hibridização in situ demonstraram
que ambas as sinapses excitatórias e inibitórias podem apresentar
receptores CB
1
, com padrões distintos de expressão (ver figura 3 acima).
Enquanto interneurônios GABAérgicos inibitórios apresentam altos
níveis de mRNA para os receptores CB
1
organizados em grumos bem
definidos (Marsicano e Lutz, 1999; Bodor et al., 2005), neurônios
glutamatérgicos excitatórios apresentam uma expressão mais baixa, com
padrão pontuado, fracamente granulado (Marsicano e Lutz, 1999;
Domenici et al., 2006; Kawamura et al., 2006; Monory et al., 2006).
Mais especificamente, a alta expressão de receptores CB
1
foi associada a
um subgrupo de interneurônios GABAérgicos que expressam
colecistocinina (CCK), mas não aos interneurônios GABAérgicos que
expressam parvalbumina no prosencéfalo basal (Katona et al., 1999;
Hajos et al., 2000; Bodor et al., 2005). No estriado, no entanto, a
expressão de receptores CB
1
também foi encontrada nos interneurônios
positivos para parvalbumina, enquanto que em certos núcleos
hipotalâmicos estes receptores estão expressos apenas em neurônios
8
glutamatérgicos principais (Marsicano e Lutz, 1999), o que ilustra a
complexa variabilidade na expressão de receptores CB
1
dependendo da
região cerebral e o tipo celular. Em nível subcelular, a imensa maioria
dos receptores CB
1
está localizado nos axônios, especialmente em
terminais pré-sinápticos; baixíssimos níveis de receptores CB
1
foram
encontrados em partes proximais do axônio, dendritos ou no corpo
celular (Nyiri et al., 2005; Leterrier et al., 2006).
Figura 3 – Imunohistoquímica com microscopia eletrônica demonstrando a
localização de receptores CB1 em subtipos celulares da região CA1 do
hipocampo. A presença de receptores canabinóides CB1 em sinapses inibitórias
(esquerda) e excitatórias está demonstrada nos paineis superiores. Cabeças de
seta e setas inteiras indicam sinapses simétricas (inibitórias) e assimétricas
(excitatórias), respectivamente. S: sinapse, In: inibitória, Ex: excitatória, PyD:
células piramidais, CB1-/-: camundongo knock-out CB1, WT: camundongo
selvagem (controle). A quantificação demonstra que há muito mais receptores
canabinóides CB1 em sinapses inibitórias do que em excitatórias na região
CA1 do hipocampo. Camundongos knock-out para os receptores CB1
apresentam a deleção gênica em ambos os tipos celulares. Escala de 100 nm.
(Figura modificada de Kano et al.,( 2009)).
9
Por muito tempo, houve uma divisão bastante clara no conceito
da distribuição dos receptores canabinóides: enquanto os receptores CB
1
eram tidos como expressos especialmente em tecidos neuronais (mas
também em outros), aceitava-se que os receptores CB
2
eram expressos
exclusivamente em tecidos periféricos e células do sistema
imunonológico (Howlett et al., 2002). Conseqüentemente, os receptores
CB
1
foram chamados de “neuronais”, enquanto os CB
2
eram chamados
de “periféricos” (ver figura 4 abaixo). No SNC, imaginava-se que os
receptores CB
2
estavam restritos a células gliais (Galiegue et al., 1995;
Buckley et al., 1998). Os estudos pioneiros de Van Sickle et al. (2005) e
Onaivi et al. (2006) acabaram com esta dicotomia. O primeiro estudo
demonstrou a presença de receptores CB
2
funcionais no tronco cerebral,
córtex e cerebelo de ratos (Van Sickle et al., 2005). Importante, o nível
de mRNA dos receptores CB
2
nestas regiões do cérebro foi de cerca de
1-2% dos níveis tradicionalmente encontrados no baço. Esta relativa
baixa expressão provavelmente explica porque a expressão de
receptores CB
2
no cérebro havia sido anteriormente negligenciada, e só
foi observada anos depois com a utilização da técnica de PCR em tempo
real. Contrariando as expectativas provocadas pelas evidências
anteriores, os receptores CB
2
foram encontrados em células neuronais,
mas não em células gliais do cérebro (Van Sickle et al., 2005). Onaivi et
al. (2006) confirmaram a presença de receptores CB
2
no tronco cerebral,
córtex e cerebelo de ratos utilizando diversas técnicas de biologia
molecular, como PCR em tempo real, hibridização in situ, Western blot
e imunohistoquímica com microscopia óptica e eletrônica. Além disso, o
uso de um novo anticorpo permitiu identificar a expressão de receptores
CB
2
em diversas áreas cerebrais de camundongos do tipo selvagem
(estriado, substância nigra, hipotálamo, córtex, amígdala, hipocampo
entre outros), que não foi observada no cérebro de camundongos knock-
out para os receptores CB
2
. Segundo estes autores, a expressão de
receptores CB
2
no tronco cerebral é de cerca de 100 vezes menor do que
a expressão de receptores CB
1
na mesma região. A imunohistoquímica
com microscopia eletrônica permitiu elucidar a localização
ultraestrutural dos receptores CB
2
no cérebro. Em contraste com os
receptores CB
1
, os CB
2
parecem ser expressos prioritariamente em
processo dendríticos (densidades pós-sinápticas) e no corpo celular de
neurônios (Onaivi et al., 2006).
Efeitos residuais do agonista sintético WIN55212-2, do agonista
endógeno AEA e de antagonistas CB
1
em camundongos knock-out para
receptores CB
1
sugerem a existência de pelo menos um terceiro tipo de
10
receptores canabinóides. Este receptor seria sensível ao antagonista
SR141716A (rimonabant) e insensível ao antagonista AM251 (Begg et
al., 2005; Brown, 2007). No entanto, o suposto “CB
3
” ainda não foi
conclusivamente caracterizado. Estas e outras evidências de novos
receptores canabinóides serão discutidas posteriormente.
Figura 4 – Hibridização in situ para o RNAm dos receptores canabinóides CB1
e CB2 no cérebro (painéis maiores) e baço (painéis menores) de camundongos.
Note a alta expressão de receptores canabinóides CB1 no cerebelo, hipocampo,
córtex, hipotálamo bulbo olfatório e prosencéfalo basal. Níveis baixíssimos de
receptores canabinóides CB2 são expressos no cérebro. De maneira inversa, os
11
receptores CB2 são bastante expressos em tecidos linfóides periféricos. Escala
de 1 mm. (Figura adaptada de Howlett et al., (2002).
1.3 - OS ENDOCANABINÓIDES, SÍNTESE E DEGRADAÇÃO
Os endocanabinóides AEA e 2-AG foram prontamente
identificados, poucos anos após a clonagem dos receptores canabinóides
CB
1
e CB
2
. Ao longo dos anos subseqüentes, diversos outros lipídeos
foram “candidatos” a endocanabinóides, principalmente impulsionados
pelo desconfiança de que 2 receptores e 2 ligantes endógenos parecia
um número um pouco limitado para explicar a complexidade e
importância deste sistema de modulação neuronal. A figura 5 abaixo
traz uma visão atualizada deste assunto, listando cinco moléculas que
reconhecidamente interagem com receptores canabinóides, portanto
considerados endocanabinóides.
Figura 5 – Representação esquemática das estruturas moleculares dos
endocanabinóides identificados e caracterizados até o momento. Outras
moléculas têm sido estudadas, e o número de endocanabinóides pode chegar a
mais de oito. (Figura modificada de Bisogno et al., 2005).
12
As vias de síntese de apenas dois endocanabinóides são
conhecidas. O primeiro ponto importante a ser destacado é que os
endocanabinóides não são sintetizados e armazenados em vesículas,
como neurotransmissores clássicos, mas são sintetizados e liberados sob
demanda após estimulação (Di Marzo e Deutsch, 1998). Uma
similaridade estrutural entre os endocanabinóides é a sua natureza
lipídica, sendo constituídos por uma cadeia de ácido graxo
poliinsaturado derivado do ácido araquidônico e um grupamento polar,
que pode ser etanolamina no caso da AEA ou glicerol no caso do 2-AG.
Apesar de estruturalmente e algumas vezes funcionalmente similares, os
dois endocanabinóides melhor caracterizados até hoje são produzidos
por rotas biosintéticas distintas, ainda que não totalmente independentes.
O metabolismo de endocanabinóides é um tema em constante
investigação, mas nesta sessão estão descritos os modelos mais aceitos
para a síntese e degradação da AEA e 2-AG.
Uma regra geral para a síntese dos endocanabinóides é que eles
são sintetizados a partir de fosfolipídeos de membrana que são
hidrolisados por fosfolipases às respectivas formas finais dos
neurotransmissores. A AEA é formada em conseqüência da mobilização
de fosfolipídeo de membrana (neste caso fosfatidil-araquidonato) que
pela ação de uma N-acil-transferase é transformado em um N-
araquidonil fosfatidil etanolamina (NAPE). Uma enzima fosfolipase D
específica (NAPE-PLD) transforma a NAPE em AEA (Di Marzo et al.,
1994). Uma via alternativa envolve a formação de N-araquidonil liso
fosfatidil etanolamina por uma fosfolipase A
2
(PLA
2
) e a formação de
AEA por uma liso-PLD (Di Marzo et al., 1994; Sugiura et al., 1996). Os
níveis de AMPc e de Ca
+2
modulam a atividade da enzima N-acil-
transferase, e por conseqüência, os níveis de substrato disponíveis para a
síntese de AEA (Cadas et al., 1996). Além disso, a ativação de
receptores dopaminérgicos D
2
, muscarínicos M
1
/M
3
ou metabotrópicos
de glutamato mGluR
1
podem deflagrar a síntese de AEA (Giuffrida et
al., 1999; Varma et al., 2001; Kim et al., 2002; Ohno-Shosaku et al.,
2003). A síntese de 2-AG pode ocorrer por duas vias independentes,
provavelmente refletindo o fato de que esta molécula também participa
de processos do metabolismo celular, além da neurotransmissão
(Sugiura et al., 1995; Stella et al., 1997). Uma das vias sintéticas para o
2-AG envolve o segundo mensageiro diacilglicerol (DAG), que é
produzido pela hidrólise de fosfolipídeos de membrana via fosfolipase C
(PLC). O DAG é convertido a 2-AG por uma diacilglicerol lipase
dependente de Ca
+2
(DAG lipase) (Farooqui et al., 1989). Assim como
13
para a AEA, esta é uma via dependente de Ca
+2
(Stella et al., 1997).
Uma via alternativa envolve a formação de um liso-fosfolipídeo por
uma fosfolipase A
1
(PLA
1
), que é convertido a 2-AG por uma liso-PLC.
Uma característica comum à síntese destes dois endocanabinóides é a
dependência do aumento dos níveis intracelulares de Ca
+2
e/ou da
ativação de receptores metabotrópicos, o que concorda com a hipótese
de síntese e liberação sob demanda em decorrência de estimulação
neuronal.
Além das diversas possibilidades de rotas biosintéticas para os
endocanabinóides, propõe-se que microdomínios membranares de
constituição lipídica especializada, conhecidos como cavéolas e
“jangadas” lipídicas, tenham participação na síntese de
endocanabinóides (Placzek et al., 2008). As “jangadas” lipídicas ("lipid
rafts") são microdomínios enriquecidos em colesterol, esfingolipídeos e
ácido araquidônico (Brown e London, 2000; Pike et al., 2002); as
cavéolas, além da constituição fisico-química similar às “jangadas”,
também expressam proteínas estruturais conhecidas como caveolinas
que promovem invaginações localizadas na membrana plasmática (Pike
et al., 2002; Razani et al., 2002). O papel das “jangadas” lipídicas e
cavéolas na biosíntese dos endocanabinóides ainda não está claramente
definido, mas há evidências de que a composição lipídica da membrana
influencia a atividade das enzimas de síntese, o transporte celular
(Mcfarland e Barker, 2004; Mcfarland et al., 2004), assim como a
ligação dos endocanabinóides aos receptores canabinóides CB
1
(Bari et
al., 2005). A existência de vias sintéticas diferentes para AEA e 2-AG
sugere que estes endocanabinóides operam independentemente. Embora
isso possa ser verdade em um grande número de casos, evidências
recentes sugerem um refinado mecanismo de regulação orquestrada de
biosíntese entre as vias sintéticas da AEA e 2-AG (Maccarrone et al.,
2008). Considerando que os precursores moleculares dos
endocanabinóides e suas enzimas sintéticas se encontram na superfície
celular, combinado com a natureza lipídica destas moléculas, parece
aceitável que estes neurotransmissores lipídicos sejam gerados na
própria membrana celular e liberados dos neurônios para a fenda
sináptica por difusão passiva ou facilitada por proteínas carreadoras de
lipídeos (Piomelli, 2003).
Após a liberação e interação com os respectivos receptores, a
ação dos endocanabinóides é terminada por captação neuronal e glial
(Beltramo et al., 1997; Hillard et al., 1997). Supõe-se que a captação de
endocanabinóides ocorra via um transportador protéico, cuja identidade
14
ainda não foi desvendada molecularmente. O que se sabe até o momento
é que este processo é seletivo, saturável e dependente de temperatura,
sensível à inibição farmacológica e compartilhado pela AEA, 2-AG e os
outros endocanabinóides (Di Marzo et al., 1994; Beltramo et al., 1997;
Hillard et al., 1997; Beltramo e Piomelli, 2000; Bisogno et al., 2001;
Bisogno et al., 2005). Além disso, a captação de endocanabinóides é
dependente de energia (ATP) e independente de Na
+
extracelular, de
acordo com um modelo de difusão facilitada através da membrana
celular (Di Marzo et al., 1994; Beltramo et al., 1997; Hillard et al.,
1997). Diversas famílias de transportadores lipídicos rápidos e seletivos
que seguem este modelo já foram caracterizadas, de maneira que a
identificação do transportador endocanabinóide parece ser uma mera
questão de tempo e paciência (Schaffer e Lodish, 1994; Hirsch et al.,
1998; Abumrad et al., 1999). Após ser recaptada, a AEA é
principalmente metabolizada a ácido araquidônico e etanolamina pela
enzima amidohidrolase de ácidos graxos (FAAH) e o 2-AG é
principalmente metabolizado a ácido araquidônico e glicerol pela lipase
de monoacil glicerol (MAGL), e com baixa eficácia, também pela
FAAH (Cravatt et al., 1996; Cravatt et al., 2001; Dinh et al., 2002).
Ambas as enzimas de degradação são amplamente expressas em tecidos
neuronais e em localização bastante próxima a dos receptores CB
1
. As
semelhanças terminam por aí, enquanto a FAAH é encontrada em
estruturas pós-sinápticas, a MAGL é encontrada nos terminais nervosos
pré-sinápticos (Cravatt et al., 1996). Além disso, há evidências recentes
de metabolismo oxidativo de endocanabinóides via enzimas
cicloxigenases, lipoxigenases e citocromos P450 (Kozak e Marnett,
2002; Van Der Stelt et al., 2002), sugerindo a existência de interação
entre as vias metabólicas dos endocanabinóides, lipoxinas e
prostaglandinas (Bisogno et al., 2005).
A ciclooxigenase (COX) 2 é responsável pela catálise da
oxidação da AEA e 2-AG em vários derivados de prostaglandinas
oxigenadas, nomeados de prostaglandina-etanolamidas (prostamidas) e
ésteres de prostaglandina-glicerol (Woodward et al., 2008). Esta via
oxidativa parece ser primariamente uma via de inativação, visto que a
geração das prostamidas PGE
2
-EA, PGA
2
-EA e PGB
2
-EA reduzem
drasticamente a ligação da AEA aos receptores CB
1
(Pinto et al., 1994).
A AEA é metabolizada pela COX-2 purificada ou expressa em cultura
celular em altas concentrações de substrato (100 µM in vitro) e com
baixa afinidade (Km=24-60 µM in vitro), e não é metabolizada pela
COX-1 (Yu et al., 1997). O 2-AG também é metabolizado
15
exclusivamente pela COX-2 em uma reação que físico-quimicamente se
assemelha muito à oxidação do próprio ácido araquidônico por esta
enzima (Kozak et al., 2000; Kozak et al., 2001). A oxidação do 2-AG
pela COX-2 geralmente leva à produção da PGH2-G e do HETE-G,
ambos lipídeos sem atividade biológica conhecida (Kozak et al., 2000;
Kozak et al., 2001). As evidências listadas acima sugerem que a
oxidação pode representar uma via metabólica de inativação para os
endocanabinóides. Contudo, a relevância biológica da oxidação dos
endocanabinóides pela COX-2 necessita ser confirmada, em especial
para a AEA, cujos níveis endógenos são na faixa de nM e afinidade por
esta enzima é particularmente baixa (Yu et al., 1997; Di Marzo, 1999).
Há maior expectativa de que esta via de inativação oxidativa seja
fisiologicamente relevante para o 2-AG, já que os níveis endógenos
deste endocanabinóide são muito mais altos do que os da AEA e a
COX-2 possui uma alta eficiência catalítica para esta molécula (Kozak
et al., 2000). Na verdade o 2-AG é o substrato preferencial para a COX-
2 dentre uma grande lista de ésteres de araquidonato (Kozak e Marnett,
2002). Mesmo se a conclusão final for que esta via oxidativa não possui
grande importância em condição de equilíbrio fisiológico, é tentador
pensar no seu possível papel em condições particulares onde ocorre uma
super-expressão da COX-2 como nos processos inflamatórios. Além do
mais, abre-se a possibilidade de que os famosos anti-inflamatórios não-
esteroidais inibidores da COX-2 exerçam seus efeitos de analgesia e
antipirese indiretamente pelo aumento do tônus endógeno de
endocanabinóides, já que se sabe que os endocanabinóides controlam a
temperatura corporal e modulam a nocicepção (Martin, 1985).
Ao contrário da proposta de que a oxidação promovida pela
COX-2 seria uma via de inativação, o metabolismo dos
endocanabinóides pela via das LOX gera derivados estruturais que
mantêm atividade biológica considerável (Edgemond et al., 1998; Craib
et al., 2001; Kozak e Marnett, 2002). As enzimas LOX apresentam uma
afinidade razoável para os endocanabinóides, sendo que a 15-LOX
possui maior atividade oxigenase, a 12-LOX uma atividade
intermediária e a 5-LOX é praticamente inativa (Ueda et al., 1995). A
AEA metabolizada pela 12-LOX mantém afinidade pelos receptores
CB1, enquanto o derivado resultante da metabolização pela 15-LOX não
se liga a receptores canabinóides, mas inibe a FAAH (Edgemond et al.,
1998; Van Der Stelt et al., 2002). Outros derivados hidroxilados da
AEA ainda não completamente identificados agem via receptores
TRPV
1
(Craib et al., 2001). Por outro lado, o metabolismo do 2-AG pela
16
15-LOX gera um derivado hidroxilado que ativa receptores PPARα
(Kozak e Marnett, 2002). Interessante notar que estudos estruturais
recentes demonstram que a 12-LOX é expressa em neurônios nas
proximidades de receptores TRPV
1
(Cristino et al., 2008) e
possivelmente também de CB
1
, dada a alta co-localização de receptores
vanilóides e canabinóides (Cristino et al., 2006). O 2-AG é um substrato
preferencial da 12-LOX de leucócitos (Kozak e Marnett, 2002). A via
lipoxidativa de metabolismo dos endocanabinóides possui maior ou
menor relevância dependendo do tipo celular. Em plaquetas, por
exemplo, onde a expressão de FAAH e COX-2 é praticamente
desprezível, há evidência de que o metabolismo dos endocanabinóides
ocorra prioritariamente sob responsabilidade das enzimas LOX (Kozak
e Marnett, 2002). É razoável imaginar que um fenômeno similar possa
ocorrer em outros tipos celulares.
O metabolismo dos endocanabinóides por citocromos P450 foi
raramente estudado, mas há evidências sugerindo a geração de
derivados não oxigenados da AEA por esta via, ainda sem função
biológica definida (Bornheim et al., 1995). A exemplo do que já se sabia
para o ácido araquidônico, foi identificado que os citocromos P450
microssomais podem transformar os endocanabinóides em diversos
outros derivados lipídicos, por reações enzimáticas complexas
envolvendo epoxidação, ω-hidroxilação, lipoxigenação ou oxidação
(Capdevila e Falck, 2001). Para a AEA, esta gama de possibilidades
metabólicas pode resultar em até 20 diferentes lipídeos polarizados
(Bornheim et al., 1993; 1995). A figura 6 abaixo resume as vias
metabólicas para a AEA.
Apesar da imensa maioria dos estudos abordarem a
metabolização dos endocanabinóides por vias que envolvam a
modificação estrutural da porção araquidonil destes lipídeos, tanto a
AEA quanto o 2-AG possuem grupamentos polares hidrofílicos que
teoricamente poderiam ser alvo de metabolismo oxidativo. A
investigação desta possibilidade resultou na descoberta de um derivado
polar da AEA chamado de N-araquidonil glicina, que inaugurou a classe
dos lipoaminoácidos (Burstein et al., 2000). Os autores do estudo
sugeriram que a N-araquidonil glicina seja formada por uma oxidação
seqüencial envolvendo enzimas álcool e aldeído desidrogenases. A
investigação deste derivado estrutural é bastante promissora pois a N-
araquidonil glicina exerce atividade antinociceptiva (Burstein et al.,
2000; Huang et al., 2001), apesar de praticamente não se ligar aos
receptores canabinóides CB
1
(Sheskin et al., 1997). Desta maneira,
17
outros efeitos comportamentais normalmente associados aos
canabinóides não ocorrem após a administração de N-araquidonil
glicina (Burstein et al., 2000). Já se sabe também que ela não se liga a
receptores vanilóides TRPV
1
(Huang et al., 2001). O real mecanismo de
ação deste e outros possíveis lipoaminoácidos permanece obscuro.
Figura 6 – Vias enzimáticas de degradação da anandamida (AEA). A principal
via de degradação da AEA é a via da enzima amido hidrolase de ácidos graxos
(FAAH), com geração de ácido araquidônico (AA) e etanolamina (EA).
Alternativas incluem a via da 12 e 15 lipoxigenase (LOX), com geração de
hidroperoxi-eicosatetraenoil-etanolamidas (HPETE-EA); a via da
cicloxigenase (COX) 2 com geração de prostamidas como a etanolamida da
prostaglandina E2 (PGE
2
-EA); a via dos citocromos P450 com geração de
hidróxi-eicosatrienoatos de etanolamidas (HPETE-EAs) e ácidos epóxi-
eicosatrienóicos (EETs) e a via seqüencial da álcool desidrogenase (AD) e
aldeído desidrogenase (AD) gerando lipoaminoácidos como a araquidonil
glicina. (Figura modificada de (Kozak e Marnett, 2002)).
Muito pouco se sabe sobre vias enzimáticas de síntese e/ou
degradação dos outros endocanabinóides listados. Da mesma forma, a
investigação das interações farmacológicas existentes entre as diversas
classes de eicosanóides está apenas começando. Uma perspectiva
interessante que se abre com a consideração das vias oxidativas, é que
talvez existam vias que além de contribuírem para a inativação dos
endocanabinóides, possam catalisar a formação de derivados estruturais
18
com atividade intrínseca, seja em receptores canabinóides ou outros.
Desta maneira, considera-se a via de biotransformação de canabinóides
em uma esfera qualitativa, além da quantitativa, admitindo-se que
determinados tecidos ou tipos celulares possam representar um ambiente
bioquímico onde os efeitos canabinóides sejam “personalizados”.
Inclusive, pode-se pensar em biotransformações que gerem derivados
endocanabinóides ainda mais potentes do que os originais, ou que ajam
em alvos mais interessantes do ponto de vista de potencial terapêutico.
O estudo do metabolismo dos endocanabinóides certamente contribuirá
para uma compreensão mais global de como as vias lipídicas interagem
entre si para a regulação fina da neurotransmissão no SNC.
1.4 - FARMACOLOGIA DOS ENDOCANABINÓIDES
De uma maneira geral, os receptores CB
1
e CB
2
apresentam um sistema
primário de transdução de sinal bastante semelhante. Ambos os
receptores são acoplados a proteínas G
i/o
, e atuam inibindo a adenilato
ciclase (com a conseqüente diminuição dos níveis de AMPc), inibindo
canais de Ca
+2
dependentes de voltagem dos tipos L, N, P, Q e ativando
canais de K
+
do tipo A. Receptores canabinóides também ativam a via
de quinases ativadas por mitógeno (MAP) e da inositol-3-fosfato (PI
3
)
quinase entre outras vias intracelulars (revisado em Howlett et al., 2004;
Pacher et al., 2006). A conseqüência funcional da ativação de receptores
canabinóides é a supressão da excitabilidade neuronal e inibição da
liberação de neurotransmissores induzida por despolarização, incluindo
monoaminas, aminoácidos excitatórios e inibitórios, além de
neuropeptídeos (Howlett et al., 2002). Apesar deste resumo geral dos
efeitos da ativação de receptores canabinóides, já se tem notícia de que
seus efeitos podem variar enormemente dependendo do tecido e tipo
celular onde são expressos. Um experimento in vitro inclusive
demonstrou que receptores CB
1
podem mediar efeitos excitatórios na
célula. Neste experimento, onde o acoplamento a proteínas G inibitórias
foi bloqueado farmacologicamente, a ativação de receptores CB
1
induziu uma estimulação da adenilato ciclase e aumento dos níveis do
segundo mensageiro AMP através do acoplamento a proteínas G
s
excitatórias, contrariando em muito a visão tradicional sobre estes
receptores (Glass e Felder, 1997; Rhee et al., 1998).
É interessante notar que a eficácia de agonistas canabinóides
depende da interação com as proteínas G
i
ou G
o
, de modo que há uma
certa seletividade de sinalização metabotrópica dependendo do
19
endocanabinóide e do tecido observado (Glass e Northup, 1999). A
eficácia de ativação dos receptores CB
1
varia dependendo do
endocanabinóide em questão. A AEA age como um agonista parcial,
induzindo níveis sub-máximos de acoplamento de proteína G e
transdução do sinal, enquanto o 2-AG age como um agonista pleno
nestes receptores, induzindo a maior resposta possível destes receptores
em um dado tecido ou preparação (Sugiura et al., 1995; Hillard et al.,
1999; Gonsiorek et al., 2000; Savinainen et al., 2001). Este fator pode
ter importantes conseqüências para a modulação endógena da
excitabilidade neuronal, dependendo se uma ou outra molécula é
liberada. Esta “sensibilidade” dos receptores CB
1
mediando ação
diferenciada para um ou outro ligante foi chamada de “seletividade
funcional” e pode ser explicada pela indução de diferentes mudanças
conformacionais no receptor e acoplamento a efetores intracelulares
particulares, dependendo do ligante (Howlett, 2005; Mackie, 2008).
Pelo menos parte desta seletividade de agonistas pode estar relacionada
com a existência de diversos pontos de ligação nos receptores
canabinóides, como sugerido por estudos de modelagem molecular
(Reggio, 2003). Por exemplo, um sítio alostérico de modulação nos
receptores CB
1
foi recentemente descrito, mas ainda não se tem
informações sobre a ligação de prováveis ligantes endógenos neste sítio,
sejam eles endocanabinóides ou de outra origem (Price et al., 2005).
Recentemente foi relatado que os receptores GPR55,
anteriormente considerados órfãos, possuem sítios de ligação com alta
afinidade para canabinóides endógenos, sintéticos e para antagonistas
CB
1
, apesar de apresentarem homologia estrutural de apenas 10-15%
com os receptores CB
1
e CB
2
. É importante deixar claro que o agonista
canabinóide WIN55,212-2 não se liga aos receptores GPR55, de modo
que estes receptores não representam o suposto CB
3
, mas possivelmente
uma quarta entidade no sistema endocanabinóide (Brown, 2007).
Sugere-se que os receptores GPR55 sejam os receptores em que o
canabidiol e derivados estruturais se ligam, e que antes eram descritos
simplesmente como sítios não-CB
1
, não-CB
2
, por falta de evidência
estrutural da existência de um novo tipo de receptor canabinóide. Em
ratos, os receptores GPR55 são expressos em diversas regiões,
destacando-se baço (à semelhança dos receptores CB
2
) e cérebro
(hipocampo, tálamo, córtex frontal, cerebelo, estriado, hipotálamo,
tronco cerebral). Uma curiosidade é que estes receptores metabotrópicos
são acoplados à proteína G
13
, agindo indiretamente via proteínas G da
família das Ras e não são acoplados às proteínas G
i
como os outros
20
receptores canabinóides, nem a proteínas G “estimulantes” como a G
s
ou G
q
(Ryberg et al., 2007).
Além dos receptores membranares já mencionados, há evidências
de que os endocanabinóides possam agir em receptores nucleares para
lipídeos (O'Sullivan, 2007). Receptores PPAR pertencem a uma família
de receptores nucleares, com três isoformas: α, δ e γ. Estes receptores se
heterodimerizam com receptores retinóide X e se ligam a elementos
responsivos a PPAR no DNA, levando à transcrição gênica. Entre as
diversas classes de transmissores que atuam nos PPAR estão os ácidos
graxos e seus derivados, de maneira que não surpreende que estes
receptores possam participar da sinalização endocanabinóide.
A última classe de receptores que merecem ser mencionados são
os receptores vanilóides TRPV
1
, que embora não sejam parte do sistema
endocanabinóide propriamente dito, são um dos alvos moleculares da
molécula considerada o endocanabinóide protótipo, a AEA. Por este
motivo, a descrição da farmacologia dos receptores TRPV
1
se faz
necessária para a interpretação de alguns dos efeitos deste lipídeo. Os
receptores TRPV
1
são canais iônicos não-seletivos permeáveis a Ca
+2
e
foram primariamente identificados no terminal pós-sináptico de
neurônios sensoriais primários oriundos do gânglio da raiz dorsal. Mais
recentemente estes receptores foram identificados também em regiões
do cérebro, como o hipocampo e substância cinzenta periaquedutal, e
estima-se que algumas das moléculas consideradas endocanabinóides
tenham maior afinidade para estes receptores do que para os próprios
receptores canabinóides. Por este motivo, alguns endocanabinóides,
inclusive a própria AEA, foram recentemente chamados de
endovanilóides (alguns autores brasileiros preferem o termo
endobaunilhóide) (revisado em Starowicz et al., 2007). Uma
interpretação alternativa poderia ser de que existe uma interação intensa
entre os sistemas endocanabinóide e endovanilóide. Ligantes endógenos
exclusivos (ou preferenciais) para os receptores TRPV
1
ainda não foram
satisfatoriamente caracterizados. Os candidatos atuais para o posto de
endovanilóides são eicosanóides derivados da lipoxigenase como o 12-
HPETE (Shin et al., 2002). Veja resumo na tabela 1 abaixo.
21
Tabela 1 – Receptores-alvo para endocanabinóides
Atividade dos ligantes endocanabinóides em receptores metabotrópicos (CB
1
,
CB
2
e GPR55), canal iônico ativado por ligante (TRPV1) e receptores
nucleares (PPARα e δ). Legenda: O sem atividade, - antagonista, + agonista
parcial fraco, ++ agonista parcial intermediário, +++ agonista total. AEA:
anandamida, 2-AG: 2-araquidonil glicerol, NADA: n-araquidonil dopamina.
(Adaptado de Alexander e Kendall, 2007).
Importante ressaltar que a funcionalidade seletiva e a existência
de múltiplos receptores fazem com que os níveis dos receptores não
sejam o único fator determinante da eficácia da transmissão
endocanabinóide, uma vez que além da densidade relativa de receptores,
as conseqüências da ativação destes receptores dependem
intrinsicamente da eficiência de acoplamento aos sistemas de efetores
moleculares (Breivogel et al., 1997). Contudo, o maior desafio neste
campo da farmacologia molecular é diferenciar as interações molécula-
receptor que são fisiologicamente relevantes daquelas que ocorrem
unicamente devido a interações moleculares no ambiente artificial dos
ensaios in vitro e, portanto, praticamente não existem em condições
fisiológicas de liberação de endocanabinóides.
1.5 - A DINÂMICA DA SINAPSE ENDOCANABINÓIDE
Até pouco tempo atrás, a imagem de uma típica sinapse
endocanabinóide era bastante simplificada. A Figura 7 abaixo ilustra os
elementos básicos de uma sinapse deste tipo, segundo evidências das
primeiras descobertas. Este conceito inicial da sinapse endocanabinóide
foi bastante ampliado e aprofundado, de modo que hoje se cogita
existirem cerca de 8 moléculas endocanabinóides, além de pelo menos 3
receptores onde elas se ligam.
Endocanabinóide
CB
1
CB
2
GPR55
TRPV
1
PPARα
PPARδ
AEA
++
++
++
++
++
++
2-AG
+++
+++
++
O
O
O
Noladin
++
+
++
O
++
O
Virodamina
-
++
+++
O
++
O
NADA
++
O
O
+++
O
O
22
Figura 7 – Elementos básicos de uma sinapse endocanabinóide. Os receptores
canabinóides CB1, presentes em terminais neuronais pré-sinápticos são
ativados pela anandamida e inibem a liberação de neurotransmissor.
Interessante notar que a anandamida é liberada da pós-sinapse para a pré-
sinapse, um fenômeno conhecido como transmissão retrógrada e que possui um
papel fundamental na plasticidade sináptica. A anandamida pode ser liberada
em resposta ao influxo de Ca+2 (por exemplo, pela ativação de receptores
glutamatérgicos do tipo NMDA) ou pela ativação de receptores metabotrópicos
de acetilcolina (M1/M3), de glutamato (MAGLuR5) ou dopamina (D3), este
último não demonstrado na figura. Uma vez terminada sua ação, a anandamida
é recaptada por um sistema transportador ainda não identificado e
metabolizada pela enzima FAAH a ácido araquidônico e etanolamina. (Figura
adaptada de Alger, 2004).
O ciclo de vida de um endocanabinóide começa com sua síntese
sob demanda após ativação neuronal e aumento dos níveis intracelulares
de Ca
+2
na pós-sinapse. A mobilização de precursores fosfolipídeos da
membrana celular dá origem à AEA ou 2-AG, dependendo da rota
sintética estimulada. O 2-AG, além de ser um endocanabinóide, é
também um intermediário do metabolismo de fosfoglicerídeos, e por
esta razão ele está presente em níveis consideráveis mesmo nas células
em repouso. Este processo dinâmico de síntese e liberação sob demanda
favorece que a ação dos endocanabinóides seja bastante pontual e
restrita no plano espaço-temporal. Eles são moléculas sinalizadoras
23
desenhadas para atuar somente onde e quando forem necessárias,
viajando da pós-sinapse para a pré-sinapse, como que sinalizando a
“resposta” do neurônio pós-sináptico ao pré-sináptico, nesta verdadeira
comunicação eletroquímica que são as sinapses neuronais. Por conta
desta ação pouco usual no mundo da farmacologia, os endocanabinóides
são chamados de neurotransmissores retrógrados (Wilson e Nicoll,
2002). Um típico exemplo de uma “rodada” de ação endocanabinóide
está representado na figura 8 abaixo, levando em conta os
endocanabinóides e receptores para os quais já se tem uma boa
quantidade de detalhes sobre seu modo de ação. A ativação da célula
pós-sináptica induz a produção de endocanabinóides, que atravessam a
membrana celular e alcançam a fenda sináptica agindo de maneira
retrógrada. Sítios proteicos de alta afinidade (receptores CB
1
) são
facilmente encontrados nos terminais pré-sinápticos de células
inibitórias ou excitatórias, e quando ativados promovem diversos
eventos celulares que culminam com a inibição da liberação do
neurotransmissor característico da célula pré-sináptica e alteração de
plasticidade sináptica pela ativação de vias de proteínas quinases e
fatores de transcrição nuclear. Simplificando, a conseqüência funcional
da ativação de receptores canabinóides é a supressão da excitabilidade
neuronal e inibição da liberação de neurotransmissores induzida por
despolarização, incluindo monoaminas, aminoácidos excitatórios e
inibitórios, além de neuropeptídeos. Assim que a missão dos
endocanabinóides é cumprida, eles são captados por um sistema
seletivo, saturável e dependente de temperatura, muito provavelmente
guiado por um transportador proteico compartilhado pela AEA e 2-AG.
Assim que os endocanabinóides são captados pelos neurônios ou células
gliais circundantes, as enzimas de degradação (FAAH para AEA e
MAGL para o 2-AG) promovem a rápida metabolização destas
moléculas em araquidonato e etanolamina (AEA) ou glicerol (2-AG).
No entanto, também existem evidências de que os endocanabinóides
possam gerar respostas celulares na própria célula que os sintetizou,
após serem recaptadas. Um exemplo de sítio de ação neste caso são os
receptores vanilóides TRPV
1
, que possuem sítios intracelulares de
interação com a AEA.
24
25
Figura 8 – O processo dinâmico de sinalização retrógrada endocanabinóide.
Para uma explicação detalhada, leia a sessão “A dinâmica da sinapse
endocanabinóide” acima. Abreviaturas utilizadas neste esquema – AEA:
anandamida, 2-AG: 2-araquidonil glicerol, PLD: fosfolipase D, PLC:
fosfolipase C, DAG: diacilglicerol, DGL: diacilglicerol lipase, L-PLC: liso
fosfolipase C, L-PI: liso fosfatidil inositol, AC: adenilato ciclase, PKA: proteína
quinase A, pCREB: fator de transcrição CREB fosforilado, MAPK: proteína
quinase ativada por mitógeno, PI
3
K: proteína quinase do fosfatidilinositol,
FAAH: amido hidrolase de ácido graxo, MAGL: monoacil lglicerol lipase.
Setas inteiras pretas indicam movimento, setas pontilhadas cinzas indicam sítio
de ação, setas pontilhadas vermelhas indicam ativação, setas pontilhadas azuis
indicam inibição. Os círculos vermelhos simbolizam neurotransmissores
excitatórios ou inibitórios, dependendo do tipo celular da pré-sinapse. (Figura
baseada em Chevaleyre et al., 2006).
1.6 - INTERAÇÕES ENTRE OS ENDOCANABINÓIDE E OUTROS
EICOSANÓIDES
Os endocanabinóides são neurotransmissores lipídicos que fazem
parte de uma família de moléculas derivadas do ácido araquidônico, os
eicosanóides. Os eicosanóides clássicos são constituídos dos
prostanóides (prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos) e
leucotrienos; enquanto uma definição mais moderna e abrangente do
termo inclui também os derivados da lipoxigenase e endocanabinóides,
entre outros (Fride, 2002).
Os prostanóides são derivados do ácido araquidônico obtidos
como produto das enzimas cicloxigenases, os leucotrienos e lipoxinas
são derivados das lipoxigenases, enquanto os endocanabinóides
possuem enzimas distintas para sua síntese, ainda não completamente
caracterizadas. Atualmente, sabe-se que muitas destas moléculas
interferem direta ou indiretamente com o sistema endocanabinóide. A
figura 9 acima traz uma visão global esquemática das vias dos
eicosanóides, nomeando as 4 principais classes de ocorrência natural
(leucotrieno, lipoxinas, prostanóides e endocanabinóides). A via de
síntese da 15-epi-LXA
4
, uma lipoxina gerada artificialmente como
efeito da aspirina também é demonstrada na figura.
26
27
Figura 9 - Representação esquemática das vias sintéticas dos eicosanóides,
incluindo seus receptores mais conhecidos. O ácido araquidônico é o precursor
comum de prostaglandinas e outros prostanóides, endocanabinóides,
leucotrienos e lipoxinas. Da esquerda para a direita: os leucotrienos e
lipoxinas compartilham uma mesma via metabólica usando lipoxigenases
(LOX) para geração do precursor 15-HPETE. Então, a leucotrieno hidrolase
gera os leucotrienos, que agem nos receptores de leucotrienos (CysLT, BLT).
Lipoxinas são geradas primariamente por uma via serial de LOXs e agem nos
receptores ALX (especialmente a lipoxina A
4
, LXA
4
), antes chamados de FPRL-
1. Uma via alternativa para a síntese de da 15-epi-lipoxina A
4
(15-epi-LXA
4
)
ocorre via acetilação da ciclooxigenase (COX) 2 pela aspirina. (Por este
motivo a 15-epi-LXA
4
é denominada lipoxina liberada por ação da aspirina).
Prostaglandinas são sintetizadas pelas enzimas COX
1/2
e agem nos receptores
de prostaglandinas (PGD, PGE, PGI, PGF). Endocanabinóides são
sintetizados pela via da fosfolipase D (PLD) para anandamida (AEA) ou via
diacilglicerol lipase (DAGL) para o 2-araquidonil glicerol (2-AG, não
representado) e ativam os receptores CB
1
/CB
2
. Aspirina inibe as enzimas COX
e acetila a COX-2. Linhas pontilhadas representam vias sintéticas. Linhas cheia
representam sítios de ação. (Figura modificada de Pamplona et al., 2010).
1.7 - LIPOXINAS: DA PERIFERIA AO CÉREBRO
As lipoxinas são compostos endógenos que constituem uma
família de eicosanóides amplamente envolvidos em eventos celulares
relacionados ao sistema imunológico. Os representantes mais comuns
desta família são o ácido 5S,6R,15S-tri-hidroxi-7,9,13-trans-11-cis-
eicosatetranóico (lipoxina A
4
; LXA
4
) e o seu isômero estrutural, o ácido
5S,14R,15S-tri-hidroxi-6,10,12-trans-8-cis-eicosatetranóico (lipoxina
B4), além da 15-epi-lipoxina A
4
e da 15-epi-lipoxina B
4
, formadas pela
inibição da ciclooxigenase 2 provocada pela aspirina (Claria e Serhan,
1995; McMahon et al., 2001). A LXA
4
foi descoberta na década de 80
pelo pesquisador americano Carlos Serhan, durante seu período como
pesquisador visitante no Instituto Karolinska, Suécia (Serhan et al.,
1984). Este mesmo pesquisador prestou um grande serviço a este campo
científico tendo descoberto também os receptores e várias importantes
funções fisiológicas das lipoxinas. A lipoxina gerada pela aspirina
também foi descoberta 10 anos depois da endógena pelo mesmo grupo.
Não seria exagero considerar Serhan o “pai” da lipoxina A
4
…
O primeiro experimento funcional, após a caracterização química
da LXA
4
, investigou seus efeitos no ensaio farmacológico do órgão
isolado. A preparação utilizada foi tiras de pulmão de porco, onde os
28
estudos de estrutura-atividade demonstraram que entre os diversos
isômeros possíveis, a orientação 5S, 6R dos grupamentos hidroxilas
próximos à terminação carboxílica caracterizavam a LXA
4
biologicamente ativa. Além disso, a LXA
4
estimula o rápido
remodelamento lipídico e liberação de ácido araquidônico em
polimorfonucleares humanos in vitro de maneira sensível ao tratamento
com toxina pertussis, indicando necessidade de acoplamento à proteína
G
i/o
(Grandordy et al., 1990; Nigam et al., 1990). A estereospecificidade,
juntamente com a evidência de participação de segundos mensageiros
nos efeitos da LXA
4
sugeria a existência de um sítio de reconhecimento
específico, que de fato foi descoberto anos depois pelo grupo de Serhan,
nesta época com laboratório próprio estabelecido nos Estados Unidos
(Brink et al., 2003). Na mesma levada, descobriu-se que a 15-epi-LXA
4
era produzida no fígado e nos rins em resposta à administração de
aspirina, onde suas ações eram muito semelhantes às ações da LXA
4
de
ocorrência natural (Munger et al., 1999).
Desde o seu descobrimento, há cerca de 20 anos atrás, as
lipoxinas têm sido intensamente estudadas como agentes anti-
inflamatórios naturalmente sintetizados pelos organismos, cuja produção
e liberação está relacionada à resolução “programada” de processos
inflamatórios (McMahon et al., 2001). Lipoxinas exercem seus efeitos
anti-inflamatórios por regulação de eventos pró-inflamatórios como a
liberação de citocinas pró-inflamatórias (Hachicha et al., 1999), a
rolagem e aderência de leucócitos na microcirculação (Scalia et al.,
1997), liberação de interleucina 8 (IL-8) induzida por TNFα ou
patógenos externos (Gewirtz et al., 1998; Gronert et al., 1998). O efeito
geral é a regulação do excesso de ativação leucocitária, inibição da
infiltração de polimorfonucleares e diminuição da permeabilidade
vascular (Takano et al., 1998). Evidências mais recentes sugerem que a
inibição da via do fator de transcrição NFκB seja um dos elementos
mecanísticos centrais para os efeitos anti-inflamatórios da LXA
4
(Gewirtz et al., 2002). Apesar do notório sucesso dos grupos envolvidos
nas investigações do papel da LXA
4
na regulação dos fenômenos
inflamatórios enumerados acima, acredita-se que a importância destes
mediadores na fisiologia animal seja ainda maior, como destaca Andrew
Rowley, pesquisador do grupo de Carlos Serhan: “apesar das lipoxinas
serem estruturas moleculares bastante conservadas ao longo da
evolução das espécies, sendo produzida por mamíferos, peixes e até
anfíbios, as suas potenciais funções fisiológicas ainda não foram
amplamente testadas fora do contexto da inflamação e do sistema
29
imune” (Rowley et al., 1994). Hoje, cerca de 15 anos depois da
publicação, esta afirmação continua sendo verdadeira.
As enzimas responsáveis pela síntese de lipoxinas são as
lipoxigenases (5-, 12- ou 15-LOX), que catalisam a formação de
lipoxina a partir do ácido araquidônico, passando por um intermediário
conhecido como 15-HPETE (Serhan et al., 1984) (ver figura 10 abaixo).
As lipoxinas são rapidamente metabolizadas por rotas de
desidrogenação e oxidação (Boarder e Hourani, 1998). Por isso,
considerando o potencial terapêutico das lipoxinas em certas áreas da
medicina, há o investimento na obtenção de análogos estáveis que
sofrem menor metabolização, especialmente nos carbonos 15-16 e 20,
sítios de maior ação dos mecanismos acima mencionados. Os análogos
estáveis disponíveis possuem atividade biológica similar a das lipoxinas
de ocorrência natural, mas com muito maior biodisponibilidade. A
estabilidade aumentada destes análogos sintéticos nos modelos
inflamatórios testados sugerem que eles podem ser de interesse médico-
farmacêutico (Lustig et al., 1993; Barnard et al., 1997).
As lipoxinas possuem receptores próprios, conhecidos como
receptores ALX, nos quais a LXA
4
e seus derivados estruturais (como a
15-epi-LXA
4
) se ligam com alta afinidade e potência, com efeitos
biológicos na faixa de nanomolar (Chiang et al., 2003). Os receptores
ALX foram inicialmente identificados em cultura de células HL-60
(Fiore et al., 1994) e poucos anos depois clonados a partir de material
murino (Takano et al., 1997). A homologia estrutural entre os receptores
de roedores e humanos é em torno de 75-80% (Chiang et al., 2003).
Além do sítio de lipídeos, onde se liga a LXA
4
e derivados, os
receptores ALX também possuem um sítio para interação de peptídeos,
onde se liga o peptídeo derivado da anexina 1 (Perretti et al., 2002). Os
efeitos da lipoxina B
4
, no entanto, estão relacionados à ativação de outro
tipo de receptores ainda não completamente identificados (Brink et al.,
2003). O sistema de transdução de sinal dos receptores ALX ainda é
pouco conhecido e aparentemente varia dependendo do tipo celular. Em
neutrófilos polimorfonucleares, por exemplo, os receptores ALX são
receptores acoplados à proteína G
i
, inibindo a produção do segundo
mensageiro inositol-tri-fosfato (IP
3
) e conseqüentemente a mobilização
de Ca
+2
intracelular (Lee et al., 1989; Grandordy et al., 1990). Já em
monócitos e células THP-1 transfectadas, a ativação dos receptores
ALX pela LXA
4
provoca o acúmulo de Ca
+2
, sugerindo sinalização
intracelular distinta, apesar dos mesmos receptores membranares
(Romano et al., 1996).
30
Figura 10 – Árvore filogenética relacionando os receptores ALX com outros
receptores metabotrópicos para lipídeos, incluindo os de eicosanóides.
Destaca-se a alta homologia entre os receptores ALX e os receptores de formil
peptídeos (os receptores ALX já foram chamados de “receptores tipo
receptores de formil peptídeo) e a baixa homologia com receptores
canabinóides CB
1
e CB
2
. Esta árvore foi construída com o programa “All All
Program” do servidor de bioquímica computacional, disponível em
(http://crbg.inf.ethz.ch/Server/AllAll.html). (Figura modificada de Chiang et al.,
2003).
A expressão dos receptores ALX foi demonstrada em diversos
tecidos onde a LXA
4
exerce importante função na regulação do processo
inflamatório como o endotélio (Serhan, 1997), epitélio (Godson e
Brady, 2000), tecido pulmonar (Brink et al., 2003), coração (Chiang et
al., 2003), fígado (Chiang et al., 2003), baço (Chiang et al., 2003), além
de tipos celulares como os monócitos (Serhan, 1997), neutrófilos
(Serhan, 1997) e fibroblastos (Mcmahon et al., 2001). Ainda não há
evidências conclusivas sobre a expressão dos receptores ALX no SNC,
embora se saiba que a LXA
4
pode ser sintetizada em tecidos cerebrais
durante eventos isquêmicos (Kim, 1988). Atualmente, sabe-se que além
31
das lipoxinas, outros mediadores celulares ativam os receptores ALX,
muitas vezes com efeitos biológicos inversos (Su et al., 1999). Deste
fato surge a curiosidade de saber se a própria LXA
4
também poderia se
ligar a outros alvos celulares.
Figura 11 – Localização tecidual dos receptors ALX demonstrada por técnica
de Western blot. (Figura modificada de Chiang et al., 2003).
Raros estudos têm sido realizados sobre os efeitos dos derivados
da LOX no SNC, embora sua presença no cérebro tenha sido relatada
anteriormente (Kim, 1988; Simmet e Peskar, 1990). Os relatos de efeitos
centrais da LXA
4
se limitam a uns poucos estudos publicados entre o
final da década de 80 e início da década de 90. Sri Kantha et al. (1994)
foram pioneiros em demonstrar efeitos in vivo da LXA
4
no SNC.
Naquele estudo, os autores demonstraram que a LXA
4
infundida no
terceiro ventrículo cerebral (100 mol/min) provoca um aumento de
cerca de 20% na duração do sono de ondas lentas, sem promover
qualquer alteração na duração do sono REM (Sri Kantha et al., 1994).
Além disso, Shearman et al. (1989) também trouxeram contribuições
importantes para o entendimento das ações da LXA
4
no SNC,
demonstrando que esta molécula é capaz de promover a ativação
seletiva do sub-tipo γ da proteína quinase C (γ-PKC), cuja expressão
ocorre majoritariamente no cérebro (Shearman et al., 1988; Shearman et
32
al., 1989), com ativação inexpressiva dos subtipos α e β, que são
expressos amplamente em outros tecidos não-neuronais (Huang et al.,
1986; Shearman et al., 1988). Esta ação da LXA4 no sub-tipo neuronal
de PKC pode estar relacionada aos seus efeitos eletrofisiológicos
envolvidos na plasticidade sináptica e freqüentemente relacionados a
processos de aprendizado e memória (Shearman et al., 1989; Mcgaugh,
2000). Neste contexto, a indução de potenciação de longo-prazo (LTP)
em fatias de hipocampo foi drasticamente reduzida por um inibidor da
5-LOX (Williams e Bliss, 1988). Estes achados sugerem a participação
de derivados da LOX, na indução de LTP em fatias de hipocampo.
Contudo, apesar destas evidências de efeitos da LXA
4
no cérebro, ainda
não se tem relatos de que estes efeitos estejam relacionados à ativação
de seus receptores ALX ou de quaisquer outros receptores. Tendo em
mente que pouco se sabe a respeito da farmacologia das lipoxinas no
SNC, torna-se importante que sejam identificados os mecanismos
responsáveis pelos efeitos biológicos observados para estas moléculas.
Interessante notar que estes efeitos centrais produzidos pela lipoxina A
4
(ativação de γ-PKC, indução de sono de ondas lentas, participação na
indução de LTP e liberação durante eventos isquêmicos) são todos
também produzidos pela ativação de receptores canabinóides CB
1
(De
Petrocellis et al., 1995; Murillo-Rodriguez et al., 1998; Berger et al.,
2004; De Oliveira Alvares et al., 2006); de modo que, além da
similaridade estrutural decorrente da coincidência de precursor lipídico
(ácido araquidônico), há uma semelhança funcional entre os efeitos
centrais da LXA
4
e do endocanabinóide protótipo AEA (vide tabela 2
abaixo).
Tabela 2 – Efeitos da LXA
4
e AEA no SNC
PKC: proteína quinase C, LTP: potenciação de longo prazo, 5-LOX: 5-
lipoxigenase, LXA
4
: lipoxina A
4
, AEA: anandamida
33
2 - JUSTIFICATIVA
Relatadas algumas similaridades entre as ações da LXA
4
e de
endocanabinóides em funções do SNC e tendo em mente a coincidência
de precursor biosintético (ácido araquidônico), assim como a elevada
similaridade estrutural entre a LXA
4
e a AEA, especula-se que possa
haver uma inter-relação entre as ações destes sistemas de
neurotransmissão. Especificamente, alguns resultados envolvendo os
ligantes principais destes sistemas apresentam evidências contundentes
que justificariam a investigação de uma possível inter-relação entre eles:
1) AEA e LXA
4
possuem atividades no SNC que estão relacionadas
à ativação de proteína G (Pertwee, 1997; Brink et al., 2003) e
dependem da ativação de proteína quinase C (Shearman et al.,
1989; De Petrocellis et al., 1995).
2) AEA e LXA
4
aumentam a duração do sono, com particular
potencialização do sono de ondas lentas (Sri Kantha et al., 1994;
Murillo-Rodriguez et al., 1998).
3) AEA e LXA
4
são liberadas no cérebro em eventos isquêmicos
(Kim, 1988; Berger et al., 2004).
4) O bloqueio de receptores CB
1
ou a inibição da 5-lipoxigenase
prejudicam a indução de LTP em fatias de hipocampo (Williams
e Bliss, 1988; De Oliveira Alvares et al., 2006).
Portanto, considerando que as funções da LXA
4
no cérebro ainda
não foram relacionadas à ativação de receptores farmacológicos
específicos, mas se assemelham à ação dos endocanabinóides; somado
ao fato de que sabidamente a LXA
4
atua em receptores farmacológicos
distintos, além dos dela própria, o presente trabalho se propõe a
investigar uma possível participação do sistema endocanabinóide nas
ações centrais da lipoxina A
4
.
34
3 - OBJETIVO
3.1 - GERAL
Investigar a participação do sistema endocanabinóide nos efeitos
centrais da LXA
4
em camundongos.
3.2 - ESPECÍFICOS
1) Investigar os efeitos da administração i.c.v. da LXA
4
nos
parâmetros de locomoção, temperatura corporal, catalepsia e
sensibilidade à dor; todos eles considerados preditivos para ação
canabinóide.
2) Verificar os efeitos de antagonistas de receptores canabinóides
CB
1
e do receptor da lipoxina ALX sobre os efeitos da LXA
4
nos
parâmetros acima mencionados.
3) Caracterização dos efeitos da LXA
4
em ensaios bioquímicos,
descrevendo a participação de elementos do sistema
endocanabinóide de modo a investigar um possível mecanismo de
ação para os efeitos centrais da LXA
4
.
4) Investigar se os níveis fisiológicos de LXA
4
contribuem para a
atividade endocanabinóide.
5) Investigar se a 15-epi-LXA
4
, gerada por efeito da aspirina,
compartilha dos mesmos efeitos observados para a LXA
4
de
ocorrência natural.
35
4 – MÉTODOS
4.1 – ANIMAIS
Foram utilizados camundongos Swiss albino e ratos Wistar
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa
Catarina (Florianópolis, Brasil). Camundongos C57Bl/6NCrl foram
comprados dos Laboratórios Charles River (Sulzfeld, Alemanha ou
Janvier, França) e utilizados no país de origem. Camundongos knock-
outs para os receptores CB
1
(CB
1
-/-
) e seus respectivos controles (CB
1
+\+
)
foram gerados no Instituto Max Planck de Psiquiatria (Munique,
Alemanha) e utilizados em experimentos nesta instituição. Todos os
animais utilizados eram machos adultos, com cerca de 3 meses na data
de experimentação. Os camundongos foram mantidos em caixas
coletivas (42 x 34 x 17 cm), contendo 15-20 indivíduos (exceto CB
1
+\+
e
CB
1
-\-
, mantidos em gaiolas individuais), com condição controlada de
temperatura (23 ± 2 °C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 h, fase
clara das 7:00 às 19:00). Água e ração especial para roedores foram
providas ad libitum. Todos os procedimentos experimentais utilizados
no presente estudo foram realizados em grupos independentes de
animais e conduzidos cuidadosamente de acordo com as normas do
Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Federal de
Santa Catarina (CEUA/UFSC), que segue normais internacionais de
utilização de animais para pesquisa científica.
4.2 – SUBSTÂNCIAS UTILIZADAS
Para administração por via intracerebroventricular (i.c.v.), lipoxina A
4
(LXA
4
), 15-epi-lipoxina A
4
(15-epi-LXA
4
) e anandamida (AEA) foram
dissolvidas em solução de etanol 0,5% e o 2-Araquidonil glicerol (2-
AG) foi dissolvido em solução de acetonitrila 0,5%, ambos em salina
tamponada com fosfato (PBS 0,1 M). BOC-2 foi dissolvido somente em
PBS. Para administração por via intraperitoneal (i.p.), SR141716A
(Rimonabant), MK-886 e BOC-2 foram dissolvidos em solução
fisiológica (NaCl 0,9%) contendo dimetilsufóxido 10% (DMSO) e
Tween 80 0,1%. Para administração por via oral (p.o.), a aspirina foi
suspensa em solução fisiológica contendo carboximetilcelulose 0,5%
(CMC). Para os ensaios in vitro, SR141716A, WIN-55212,2, URB597,
MAFP, LXA
4
e AEA foram dissolvidos em 0,5% etanol em tampão de
ensaio, enquanto o 2-AG for dissolvido em acetonitrila 0,5%. Os
36
veículos utilizados para dissolução/suspensão das drogas foram
utilizados como soluções controle. O volume de injeção foi de 2 ou 5 l
por animal para via i.c.v e 0,1 ml / 100 g de peso corporal para via i.p. e
p.o. As doses de LXA
4
, 15-epi-LXA
4
, AEA e 2-AG utilizadas foram
definidas em experimentos piloto. As doses das outras drogas foram
selecionadas com base na literatura (Raffa et al., 1999; Da Silva e
Takahashi, 2002; Souza et al., 2003; Von Der Weid et al., 2004;
Takahashi et al., 2005; Bisogno et al., 2006; Menezes-De-Lima et al.,
2006; Pamplona e Takahashi, 2006). A tabela 3 abaixo traz uma lista
das substâncias utilizadas.
Tabela 3 – Mecanismo de ação das substâncias utilizadas no presente
trabalho.
Substância
Abreviação
Mecanismo de ação conhecido
Lipoxina A
4
LXA
4
Agonista dos receptores ALX
15-epi-lipoxina A
4
15-epi-LXA
4
Agonista dos receptores ALX
Boc-2
-
Antagonista dos receptores ALX
Anandamida
AEA
Agonista dos receptores CB
1
/CB
2
2-Araquidonil
glicerol
2-AG
Agonista dos receptores CB
1
/CB
2
WIN55212-2
-
Agonista dos receptores CB
1
/CB
2
SR141716A
-
Antagonista dos receptores CB
1
MK-886
-
Inibidor da enzima 5-LOX
URB597
-
Inibidor da enzima FAAH
MAFP
-
Inibidor da enzima MAGL
Aspirina
-
Inibidor das enzimas COX
37
4.3 – PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
4.3.1 – Administração intracerebroventricular
A administração das drogas por via i.c.v. foi realizada segundo
metodologia de administração freehand descrita por Haley e Mccormick
(1957) e adaptada por Laursen e Belknap (1986). Os camundongos
foram levemente anestesiados com isoflurano em câmara apropriada
para a realização do procedimento. A injeção foi realizada com uma
agulha (13 x 0,4 mm; 26 Gauge), acoplada por meio de um tubo de
polietileno 10 a uma microseringa (Hamilton) com capacidade de 10 L.
O comprimento da agulha foi ajustado com um anteparo de tubo de
polietileno para se obter uma incisão de aproximadamente 2,5 mm de
profundidade. A cabeça do animal foi mantida em posição horizontal
fixa pelo experimentador e o sítio de injeção foi definido guiando-se por
duas linhas imaginárias traçadas a partir da base das orelhas e da linha
medial do crânio, dividindo a cabeça do animal em quatro quadrantes
(figura 12). A injeção foi realizada com a agulha posicionada
perpendicularmente ao osso do crânio a cerca de 2-3 mm (rostral) da
linha base das orelhas, próximo ao limite da pele circundando a
cavidade ocular e aproximadamente na metade da distância entre a base
das orelhas e os olhos. A injeção foi realizada unilateralmente a 1-2 mm
(lateral) da intersecção destas linhas imaginárias e os hemisférios direito
e esquerdo foram intercalados no mesmo grupo experimental. Na figura
12, a intersecção entre as linhas pontilhadas finas demonstram os sítios
aproximados de injeção. O volume total de injeção foi de 2 ou 5 L,
conforme indicação no experimento, e os animais foram avaliados
comportamentalmente 5 min após a administração i.c.v. A solução foi
injetada gradualmente e os animais apresentaram comportamento
aparentemente normal cerca de 1-2 min após a injeção.
38
Figura 12 - Representação da técnica utilizada para injeções i.c.v. freehand
descrita por Haley e McCormick (1957) e adaptada por Laursen e Belknap
(1986). (A) Orientação baseada em pontos específicos da cabeça do
camundongo. Uma linha imaginária coronal na base das orelhas e uma linha
imaginária sobrepondo a linha medial do crânio do animal são traçadas
(linhas pontilhadas grossas). (B) Corte transversal de cérebro de camundongo
indicando as regiões ventriculares onde se deseja realizar a injeção de
substâncias pelo método descrito. (C) Justaposição das orientações anatômicas
externas e do corte transversal de cérebro. As linhas pontilhadas finas são
linhas imaginárias secundárias, a coronal cerca de 2-3 mm rostral da linha
base das orelhas, na altura de uma linha que se aproxima da pele delineando a
cavidade ocular quando a cabeça do animal é mantida em posição horizontal
entre o dedo indicador e polegar do experimentador, e as duas cerca de 1-2 mm
laterais à linha medial. A intersecção das linhas pontilhadas finas demonstra os
sítios aproximados de injeção em cada hemisfério. (D) Fotografia de corte
coronal de cérebro de camundongo injetado por este método com corante Azul
de Evans. O círculo pontilhado demonstra o local de injeção e a cor azul o
estravasamento da solução de corante por todo o sistema ventricular. Figuras
adaptadas do artigo original de descrição da técnica (Haley e Mccormick,
1957), do atlas neuroanatômico de camundongos (Paxinos e Franklin, 2001) e
de um artigo de nosso grupo (Prediger et al., 2008).
39
A porcentagem de injeções realizadas corretamente na região
ventricular foi de cerca de 90%, verificadas a olho nu pelo traço da
agulha injetora, e descontados animais com quaisquer sinais de
hemorragia cerebral, de acordo com descrição prévia de taxa de acerto
dos experimentos realizados em nosso laboratório (Prediger et al.,
2008).
4.3.2 – Procedimentos comportamentais in vivo
Todos os experimentos comportamentais foram idealizados de
modo a minimizar o número de animais utilizados e realizados seguindo
estritamente normas internacionais de cuidado e manuseio de animais
para experimentação científica. Cada bloco de experimentos foi
realizado no mesmo período do dia, durante a fase clara, de modo a
minimizar a influência de flutuações do ritmo circadiano dos animais.
As salas de experimentação foram mantidas com temperatura (23 ± 2
ºC) e luminosidade (aproximadamente 100 lux) controladas no período
de habituação (pelo menos 1 hora antes dos experimentos) e durante o
experimento.
4.3.2.1 – Testes preditivos para atividade canabimimética
Os testes preditivos para atividade canabimimética em
camundongos foram realizados conforme descrição em revisão recente
(Fride et al., 2006), em grupos independentes de animais. Uma
ilustração dos testes pode ser vista na figura 13.
Campo aberto: a locomoção foi avaliada em um campo aberto (30
x 30 x 15 cm) construído em acrílico transparente, com o assoalho
pintado de preto e dividido em 9 quadrantes de 10 x 10 cm. Os animais
foram avaliados por 5 min (movimentação livre) e o número de
cruzamentos nas linhas que demarcam os quadrantes foi utilizado como
parâmetro de atividade locomotora.
Catalepsia: a catalepsia foi avaliada utilizando uma barra de vidro
posicionada horizontalmente a 5 cm do chão. Os animais foram
posicionados individualmente com as patas dianteiras apoiadas na barra
horizontal, de modo a permanecerem numa posição vertical ereta, porém
apoiados com a porção distal do corpo e as patas sobre a bancada.
Foram realizadas três reconduções a esta posição por um período total
máximo de 300 s. O somatório do tempo de imobilidade das três
reconduções foi utilizado como parâmetro de catalepsia.
40
Temperatura retal: a temperatura corporal foi avaliada por um
termômetro digital (Cole-Parmer, modelo 8402-00, Estados Unidos da
América) acoplado a uma sonda retal apropriada para uso em
camundongos. A sonda foi lubrificada com vaselina e introduzida cerca
de 30 mm no reto dos animais. A temperatura foi registrada quando se
manteve estável por pelo menos 10 s. O registro da temperatura foi
realizado 1 h antes e 5 min após a administração i.c.v.
Placa quente: a nocicepção foi avaliada em uma placa quente
(Insight, Brasil), ajustada para uma temperatura de 55 ± 0,5 ºC pelo
menos 1 h antes dos experimentos. Após a estabilização da temperatura,
os animais foram colocados individualmente na placa quente e a latência
(s) para lambida da pata traseira foi utilizada como parâmetro
nociceptivo.
Figura 13 – Fotografias dos testes comportamentais constituintes do teste de
atividade canabimimética, também chamado de teste da tétrade canabinóide,
como realizado em nossas condições experimentais.
41
4.3.3 – Procedimentos funcionais in vitro
4.3.3.1 – Contração de ducto deferente de rato induzida eletricamente
A montagem do sistema de ducto deferente isolado foi realizada
conforme procedimento descrito na literatura (Pertwee et al., 1995;
Christopoulos et al., 2001). Os vasos deferentes foram dissecados e
montados com tensão inicial de 1 g em uma cuba de 5 ml contendo
solução de Krebs livre de Mg
+2
mantida a 37°C e borbulhada
continuamente com carbogênio (95% O
2
, 5% CO
2
). A composição da
solução de Krebs foi (em mM): 118,2 NaCl; 4,75 KCl; 1,19 KH
2
PO
4
; 25
NaHCO
3
; 11 Glicose; 2,54 CaCl
2
. Contrações isométricas foram
induzidas na preparação por estimulação elétrica de campo, com trens
de pulsos de 500 ms e 0,1 Hz de freqüência e duração de pulso de 0,5
ms, aplicados através de eletrodos de platina conectados acima (gancho
conectado por fio de 0,6 mm) e abaixo (anel de 3 mm de diâmetro) da
preparação. Os estímulos foram gerados por 3 estimuladores (HSE,
Alemanha) cujos sinais foram amplificados por um amplificador (HSE,
Alemanha). As contrações foram monitoradas por meio de transdutores
de força, pré-amplificados (1000 Hz) acoplados a um sistema de registro
em papel termosensível utilizando polígrafo (Letica Instrumentos,
Espanha). Cada preparação foi equilibrada por pelo menos 30 min antes
do início da estimulação elétrica e estimulados por curtos períodos
alternados com repouso de 5 min até obtenção de uma linha de base
constante. A partir de então, as preparações foram deixadas em repouso
por cerca de 10 min adicionais antes do início dos experimentos. Uma
série de 6 contrações seqüenciais foi utilizada como parâmetro para cada
ponto experimental, com intervalo de 15 min entre cada série. As drogas
a serem testadas foram adicionadas ao banho 10 min antes de reiniciar
cada série de estimulação para realização de curvas cumulativas de
concentração-efeito das substâncias testadas individualmente ou em
combinação. Cada ponto experimental constituiu na média da amplitude
das contrações de uma série, representadas como porcentagem de
inibição máxima. A média das contrações da série imediatamente
anterior à adição das primeiras substâncias testadas no banho foi
considerada como a contração máxima para quantificação da inibição de
contração. As preparações que não apresentaram contrações estáveis
foram descartadas.
42
4.3.4 – Procedimentos bioquímicos in vitro
4.3.4.1 – Preparação das frações celulares
Os extratos citosólicos contendo frações ricas em membranas ou
conteúdo citosólico para os ensaios de ligação e enzimáticos,
respectivamente, foram preparados a partir de cérebro total de
camundongos. Os camundongos foram sacrificados rapidamente por
decapitação, seguido por remoção do cérebro total e homogeneização
em 5 ml do tampão de preparação (320 mM de sacarose, 50 mM de
Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCl
2
, pH=7,4) em gelo. O
homogenato de cérebro total foi centrifugado a 1.600 g por 10 min e o
precipitado foi descartado. O sobrenadante foi centrifugado novamente a
16.000 x g por 1 hora. O pellet foi ressuspenso em tampão e utilizado
como fração membranar no ensaio da FAAH e no ensaio de ligação, o
sobrenadante constitui a fração citosólica e foi utilizado no ensaio de
determinação da atividade da MAGL. Os extratos citosólicos contendo
fração citosólica e membranar para o ensaio de Western Blot para
receptores ALX de lipoxina foram preparados a partir de cérebro
(hipocampo, cerebelo e córtex) e baço (controle positivo) de
camundongos. Os tecidos foram dissecados a fresco, congelados em
nitrogênio líquido e então homogeneizados em tampão contendo
HEPES 10 mM (pH 7,4), MgCl
2
2 mM, KCl 10 mM, fluoreto de
fenilmetanosulfonila (PMSF) 1 mM, leupeptina 1 mg/ml, pepstatina A 1
mg/ml, aprotinina 1 mg/ml, ortovanodato de sódio 1 mM, b-
glicerofosfato 10 mM, fluoreto de sódio 50 mM, Triton-X 1% e
ditiotreitol 0,5 mM. Após a centrifugação a 14.000 x g por 1 hora, o
sobrenadante contendo a fração citosólica e membranar foi coletado e
acondicionado em freezer -70 ºC para posterior análise. As
concentraçãos de proteínas totais nas frações membranar e citosólica dos
extratos foram determinadas por colorimetria (595 nM) indiretamente
por comparação com solução padrão de albumina de soro bovino (BSA),
seguindo o método de Bradford (1976).
4.3.4.2 – Ensaio de ligação em receptores canabinóides CB
1
O ensaio de ligação foi realizado utilizando fração membranar de
cérebro total de camundongo, conforme metodologia previamente
descrita (Hirst et al., 1996; Abood et al., 1997). As membranas foram
43
homogeneizadas e diluídas em tampão de amostra (50 mM de Tris-HCl,
1 mM de EDTA, 3 mM de MgCl
2
, pH=7,4) resultando em uma
concentração final de 1 mg/ml de proteínas totais. O ensaio de ligação
constituiu na incubação de 50 µg de proteínas a um tubo contendo 0,5
nM do antagonista dos receptores CB
1
radioativo [
3
H]SR141716A (43
Ci/mmol) em quantidade suficiente de tampão de ensaio (50 mM de
Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 3 mM de MgCl
2
, 1 mg/ml de BSA, 100 µM
de PMSF, pH=7,4), totalizando um volume final de 500 µl. A ligação
inespecífica foi estimada pela adição de 10 M do agonista canabinóide
WIN-55212,2 sem marcação radioativa. Após incubação por 1 h a 37
ºC, o ensaio de ligação foi terminado pela adição de 1 ml do tampão de
ensaio resfriado em gelo e filtração a vácuo por filtros de feltro
previamente tratados com polietilenamina (0,1 %) por pelo menos 2 h,
seguidos de 3 lavagens com 3 ml de tampão gelado. Os filtros foram
mergulhados individualmente em 1 ml de líquido de cintilação e
agitados por 1 h antes da determinação da radioatividade. Por questões
práticas, o método de interrupção do ensaio de ligação foi modificado
durante o decorrer deste estudo, sendo substituído pela centrifugação a
10.000 g por 10 min (4 °C), seguido de 2 lavagens de 1 ml com tampão
e centrifugações, sem prejuízo da qualidade dos ensaios. Neste caso, o
líquido de cintilação foi adicionado diretamente ao recipiente do ensaio
logo após o final das lavagens e centrifugações.
4.3.4.3 – Atividade enzimática da FAAH, enzima de degradação da
AEA
O ensaio de atividade enzimática da FAAH, enzima de
degradação da AEA foi realizado conforme descrição prévia (Bisogno et
al., 2006) utilizando a fração membranar do homogenato de cérebro
total de camundongos. A preparação das membranas foi realizada
conforma descrito acima. As membranas (100 µg de proteína total)
foram incubadas com 1,8 µM do endocanabinóide radioativo [
14
C]AEA
(5 mCi/mmol) em tampão de ensaio (50 mM de Tris-HCl, pH=9) por 30
min a 37 °C. O ensaio foi finalizado por centrifugação a 10.000 g por 10
min (4 °C) e o sobrenadante retirado para extração da fase aquosa com 2
volumes de clorofórmio/metanol (1:1). A quantidade de
[
14
C]Etanolamina produzido em decorrência da degradação de
[
14
C]AEA foi quantificada por cintilação líquida, normalizada pela
massa (em mg) de tecido fresco e utilizada para cálculo da atividade
enzimática.
44
4.3.4.4 – Atividade enzimática da MAGL, enzima de degradação do 2-
AG
O ensaio de atividade enzimática da MAGL, enzima de
degradação do 2-AG, foi realizado conforme descrição prévia (Bisogno
et al., 2006) utilizando a fração citosólica do homogenato de cérebro
total de camundongos. A preparação da fração citosólica foi realizada
conforme descrito acima. A fração citosólica (100 µg de proteína total)
foi incubada com 25 µM do substrato radioativo [
3
H]2-AG (1
mCi/mmol) em tampão de ensaio (50 mM de Tris-HCl, pH=7) por 20
min a 37 °C. O sobrenadante do ensaio foi retirado para extração da fase
aquosa com 2 volumes de clorofórmio/metanol (1:1) e os extratos foram
liofilizados a vácuo. A quantidade de [
3
H]Glicerol produzido em
decorrência da degradação de [
3
H]2-AG foi quantificada por cintilação
líquida, normalizada pela massa (em mg) de tecido fresco e utilizada
para cálculo da atividade enzimática.
4.3.4.5 – Determinação da expressão de receptores ALX
As amostras de proteínas (40 µg) foram adicionadas ao tampão
(Tris 200 mM, glicerol 10%, SDS 2%, β-mercaptoetanol 2,75 mM e
azul de bromofenol 0,04%) e, em seguida, foram fervidas durante 5
minutos. Posteriormente, as amostras foram separadas por eletroforese
(SDS-PAGE) em gel de acrilamida 10% e eletrotransferidas para uma
membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após a transferência, a
fim de evitar ligação inespecífica do anticorpo, as membranas foram
incubadas primeiramente com leite desnatado diluído em tampão Tris
(TBS) overnight a 4 ºC e então foram lavadas com TBS e Tween-20 a
5% (TBST), por três vezes durante 5 min cada. Em seguida, a
membrana foi incubada com um dos seguintes anticorpos para as
proteínas de interesse: ALX (1:500) ou β-actina (1:1.000). Após a
incubação com os anticorpos primários, as membranas foram lavadas
com TBST por três vezes por 5 min cada e incubadas com anticorpo
secundário conjugado a fosfatase alcalina 1:80.000 por 1 h. As
membranas foram novamente lavadas com TBST. A visualização das
proteínas foi realizada utilizando solução reveladora para fosfatase
alcalina, segundo recomendações do fabricante.
45
4.3.5. – Procedimentos bioquímicos ex vivo
4.3.5.1 – Dosagem de endocanabinóides no cérebro
A quantificação dos níveis de endocanabinóides AEA e 2-AG em
homogenatos de cérebro de camundongo foi realizada por meio de
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) conforme
modificação de técnica previamente descrita (Di Marzo et al., 2000;
Marsicano et al., 2002). Os tecidos foram homogeneizados em tampão
de amostra contendo 50 mM de Tris-HCl (pH=7,5) e os lipídeos foram
extraídos usando 2 volumes de clorofórmio/metanol (2:1) contendo 5
pmol de d
4
-AEA e d
5
-2-AG como padrões internos. O extrato lipídico
foi pré-purificado em mini-colunas de sílica gel utilizando
concentrações crescentes de metanol em clorofórmio. As frações
contendo AEA e 2-AG foram obtidas por eluição das amostras com
clorofórmio/metanol (1:9), seguida por evaporação sob atmosfera de gás
nitrogênio (N2).
As amostras foram então analisadas por cromatografia líquida de
alta performance (Shimadzu, LC-10ADVP) utilizando coluna de fase
reversa Phenomenex (5 µm, 150 x 4,5 mm), acoplada a um
espectômetro de massa (Shimadzu, LCMS-2010). A eluição de AEA e
2-AG foi realizada com fase móvel de metanol/água/ácido acético
(85:15:0,2) e velocidade de fluxo de 1 ml/min, com temperatura das
colunas e das amostras mantida a 25 °C. A análise foi realizada em
modo de monitoramento de íon específico (identificado pelo valor de
m/z) à temperatura de ionização de 400 °C, sob pressão atmosférica. Os
tempos de retenção utilizados foram 14,5 min para AEA e 17 min para
2-AG e a quantidade dos endocanabinóides (em pmol) quantificada por
método de diluição do isótopo e normalizada pela massa (em mg) dos
extratos lipídicos.
4.3.5.2 – Dosagem de LXA
4
no cérebro
A quantificação dos níveis de LXA
4
no cérebro de camundongo
foi realizada por meio de kit ELISA (Oxford Biomedical Research,
EUA). Os tecidos foram homogeneizados em etanol (5µl/mg de tecido)
e centrifugados por 5 min a 10.000 g. O sobrenadante foi coletado,
diluído em água deionizada (acidificada a pH 3,5) e purificado em uma
coluna reversa Sep-Pak C18 pré-ativada, com fases móveis água,
hexano e formiato de etila, nesta seqüência, com velocidade de eluição
46
de 1 ml/min. A fração formiato de etila contendo a LXA
4
extraída foi
evaporada sob atmosfera de gás nitrogênio (N
2
) e ressuspensa em
tampão de ensaio. As amostras foram incubadas com conjugado HRP-
LXA
4
(peroxidase) por 1 hora à temperatura ambiente (25 °C) em placa
de 96 poços tratada com anticorpos anti-LXA
4
. Após sucessivas
lavagens, a reação foi revelada com uso de substrato TMB, cuja
coloração azul é inversamente proporcional à quantidade de LXA
4
na
amostra (leitura a 650 nm). A quantidade de LXA
4
nas amostras foi
normalizada pela massa (em mg) de tecido fresco.
4.3.6 – Seqüência experimental
Os experimentos listados abaixo foram realizados ao longo dos 4
anos de desenvolvimento deste estudo, idealizados para responder
perguntas de diferentes complexidades e utilizando as metodologias
disponíveis. Neste documento, os experimentos estão organizados em 4
grupos. Primeiramente, dada a raridade de evidências sobre o assunto,
foi preciso investigar se a LXA
4
induziria algum efeito no SNC, em
especial aqueles associados à ativação de receptores canabinóides.
Depois, iniciamos as investigações de um possível mecanismo de ação
para os efeitos da LXA
4
no SNC, seguida pela investigação de possível
relevância fisiológica da interação entre o sistema de derivados da
lipoxigenase e endocanabinóides. Finalmente, investigamos se a 15-epi-
LXA
4
, o isômero da LXA
4
gerada como efeito da aspirina, compartilha
dos efeitos canabimiméticos da LXA
4
de ocorrência natural.
4.3.6.1 – Grupo 1: A LXA
4
induz efeitos similares aos de canabinóides
no sistema nervoso central?
Experimento 1: Investigação de atividade canabimimética da
LXA
4
em camundongos. O teste da tétrade de efeitos canabinóides foi
utilizado a fim de se investigar se a LXA
4
poderia exercer efeitos
similares aos dos canabinóides no SNC. Os animais foram injetados
com LXA
4
(0,01 – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em
PBS) e 5 min depois avaliados nos testes do campo aberto (locomoção),
catalepsia, temperatura retal ou placa quente (nocicepção).
Experimento 2: Investigação da participação de receptores
canabinóides CB
1
ou de receptores de lipoxina ALX nos efeitos centrais
da LXA
4
em camundongos. Este experimento de antagonismo
farmacológico foi realizado para investigar a participação de receptores
47
canabinóides CB
1
ou de receptores de lipoxina ALX nos efeitos centrais
da LXA
4
observados. Os animais foram injetados com o antagonista dos
receptores canabinóides CB
1
SR141716A (1 mg/kg, i.p.), o antagonista
dos receptores ALX BOC-2 (10 g/kg, i.p.) ou solução controle (10%
DMSO e 0,1% Tween80 em salina), seguido 55 min depois pela injeção
de uma dose selecionada de LXA
4
(1 pmol/ 5 µl) ou controle (etanol
0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no teste do campo aberto
(locomoção), catalepsia, temperatura retal ou placa quente (nocicepção).
Experimento 3: Confirmação da ausência de participação dos
receptores ALX na catalepsia induzida pela LXA
4
em camundongos. A
partir dos experimentos iniciais descritos nos itens acima, a catalepsia
foi escolhida como parâmetro comportamental preditivo de atividade
canabimimética para a realização de experimentos adicionais de
farmacologia. Esta abordagem teve o intuito de evitar o uso
desnecessário de animais na geração de dados que seriam, em grande
parte, redundantes. Para confirmar a ausência de participação dos
receptores ALX nos efeitos centrais da LXA
4
investigados, o
experimento com o antagonista BOC-2 foi repetido, desta vez com
injeção central conjunta deste antagonista e LXA
4
. Os animais foram
injetados com uma dose selecionada de LXA
4
(1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou
controle (etanol 0,5% em PBS), co-injetado com BOC-2 (1000 pmol/2
µl, i.c.v.) ou controle (PBS) e 5 min depois avaliados no teste da
catalepsia.
Experimento 4: Confirmação da participação dos receptores CB
1
na catalepsia induzida pela LXA
4
em camundongos. Para confirmar a
participação dos receptores CB
1
nos efeitos centrais da LXA
4
investigados, utilizamos animais com deleção gênica para os receptores
CB
1
(CB
1
-/-
) e seus respectivos controles (CB
1
+\+
) como uma abordagem
complementar à farmacológica. Inicialmente, realizamos uma curva-
dose resposta de LXA
4
(0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) em
camundongos C57Bl/6NCrl, repetindo o experimento 1 nesta linhagem,
que foi utilizada como background para a geração dos camundongos
CB
1
-/-
. No experimento propriamente dito, os camundongos CB
1
+\+
e
CB
1
-/-
foram injetados com uma dose selecionada de LXA
4
(1 pmol/2 µl,
i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no
teste da catalepsia.
48
4.3.6.2 – Grupo 2: Em busca de um mecanismo de ação para os efeitos
centrais da LXA
4
Experimento 5: Ensaio competitivo de ligação contra
[
3
H]SR141716A em membranas de cérebro total de camundongo. Como
a LXA
4
induziu efeitos centrais canabimiméticos, recorremos à técnica
de ensaio competitivo de ligação utilizando um antagonista canabinóide
marcado radioativamente para investigar se a ligação a receptores CB
1
poderia constituir um mecanismo de ação da LXA
4
no sistema nervoso
central. Concentrações crescentes de LXA
4
(1 nM – 10 µM) foram
incubadas com as membranas de cérebro de camundongo a 37 °C por 1
h na presença de 0,5 nM do antagonista canabinóide CB
1
marcado
radioativamente [
3
H]SR141716A. Curvas controle foram realizadas com
adição cumulativa das concentrações de etanol comparáveis às presentes
nas soluções de LXA
4
(máximo de 1%).
Experimento 6: Ensaio de inibição de contrações induzidas
eletricamente em ducto deferente isolado de rato. Este experimento teve
como objetivo investigar se a LXA
4
poderia exercer efeito
canabimimético em uma preparação in vitro funcional e sensível à ação
de canabinóides. Concentrações cumulativas crescentes de LXA
4
(1 nM
– 1 µM) foram adicionadas ao banho do ducto deferente isolado de rato.
As contrações induzidas eletricamente após a adição de cada
concentração de LXA
4
foram comparadas à contração máxima, induzida
na ausência de droga. Curvas controle foram realizadas com adição
cumulativa das concentrações de etanol comparáveis às presentes nas
soluções de LXA
4
(máximo de 1%).
Experimento 7: Interação da LXA
4
com os endocanabinóides
AEA e 2-AG no teste da catalepsia em camundongos. Como a LXA
4
aparentemente não age diretamente como um agonista dos receptores
canabinóides CB
1
, procedemos à caracterização de seu mecanismo de
ação investigando se há interação entre seus efeitos e o de doses sub-
efetivas dos endocanabinóides mais estudados, a AEA e o 2-AG.
Inicialmente realizamos curvas dose-resposta de ambos os
endocanabinóides no teste da catalepsia. Os animais foram injetados
com AEA (10 – 200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em
PBS), com 2-AG (1 – 100 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (acetonitrila
0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.
Definidas as curvas dose-resposta para cada um dos endocanabinóides,
os animais foram co-injetados com uma dose sub-efetiva de LXA
4
(0,01
pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS) e uma dose sub-
49
efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou 2-AG (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou
o respectivo controle e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.
Experimento 8: Ensaio de atividade das enzimas de degradação
de endocanabinóides. Com o objetivo de determinar se os efeitos
canabimiméticos da LXA
4
poderiam ocorrer por interferência no
metabolismo de endocanabinóides, investigamos os efeitos da LXA
4
na
atividade das enzimas de degradação de endocanabinóides mais
conhecidas. A FAAH é considerada a principal enzima de degradação
da AEA e a MAGL a principal enzima de degradação do 2-AG. A LXA
4
(até 10 µM) foi incubada com amostras de fração citosólica ou
membranar de cérebro total de camundongos para avaliação da
capacidade de degradação de AEA ou 2-AG marcados radioativamente.
A atividade enzimática da FAAH e da MAGL foi determinada
respectivamente pela geração de metabólitos radioativos da AEA e do 2-
AG no sobrenadante.
Experimento 9: Quantificação dos níveis de endocanabinóides no
cérebro de camundongos após administração de LXA
4
. A fim de
determinar se os efeitos canabimiméticos da LXA
4
poderiam ocorrer por
interferência nos sistemas de regulação dos níveis de endocanabinóides,
investigamos os efeitos da LXA
4
nos níveis dos endocanabinóides AEA
e 2-AG no cérebro de camundongos. Os animais foram injetados com
uma dose efetiva de LXA
4
(1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5%
em PBS) e 5 min depois sacrificados para coleta do cérebro e dissecação
a fresco do hipocampo, córtex e cerebelo para quantificação dos
endocanabinóides nestas estruturas cerebrais por HPLC.
Experimento 10: Investigação dos efeitos combinados de LXA
4
e
AEA no ensaio competitivo de ligação contra [
3
H]SR141716A em
membranas de cérebro total de camundongo. Apesar dos evidentes
efeitos comportamentais da LXA
4
nos animais, quando administradas
isoladamente ou em combinação com a AEA, não conseguimos
identificar seu mecanismo de ação utilizando o ensaio de ligação
competitivo, avaliando a atividade das enzimas de degradação ou os
níveis de endocanabinóides no cérebro após a injeção i.c.v. de LXA
4
nos
camundongos. Então decidimos investigar se a LXA
4
poderia cooperar
com a AEA de modo a facilitar a sua ligação nos receptores
canabinóides CB
1
. O ensaio de ligação competitivo foi então realizado
novamente, testando a capacidade da LXA
4
em alterar a curva
concentração-resposta da inibição da ligação do [
3
H]SR141716A pela
AEA. A AEA (1 nM – 10 µM) foi incubada com 0,5 nM de
50
[
3
H]SR141716A em membranas de cérebro de camundongos na
presença e na ausência de LXA
4
(100 nM).
Experimento 11: Investigação dos efeitos combinados de LXA
4
e
AEA no ensaio de inibição de contrações induzidas eletricamente em
ducto deferente isolado de rato. Para confirmar in vitro se a LXA
4
poderia cooperar funcionalmente com a AEA em um ensaio sensível à
ativação de receptores canabinóides CB
1
, o ensaio de inibição de
contrações neurogênicas do ducto deferente foi então realizado
novamente, testando a capacidade da LXA
4
em alterar a curva
concentração-resposta da inibição de contração induzida pela AEA.
Concentrações cumulativas crescentes de AEA (1 nM – 10 µM) na
presença e na ausência de LXA
4
(100 nM) foram adicionadas ao banho
do ducto deferente isolado de rato. Uma curva similar foi realizada com
o agonista canabinóide WIN55212-2 (10 nM – 1 µM) na presença e na
ausência de LXA
4
(100 nM). As contrações induzidas eletricamente
após a adição de cada concentração das drogas foram comparadas à
contração máxima, induzida na ausência de droga. Curvas controle
foram realizadas com adição cumulativa das concentrações de etanol
comparáveis às presentes nas soluções testadas (máximo de 1%).
4.3.6.3 – Grupo 3: Possível relevância fisiológica da interação entre
derivados da lipoxigenase e endocanabinóides no sistema nervoso
central.
Experimento 12: Quantificação dos níveis de LXA
4
no cérebro de
camundongos. Em função das limitadas informações a respeito da LXA
4
no SNC o primeiro passo para definirmos se os efeitos centrais da LXA
4
têm alguma relevância fisiológica foi determinar se a mesma é
encontrada no cérebro em condições basais. Cérebros de camundongos
foram coletados a fresco para dissecação do hipocampo, córtex e
cerebelo e determinação dos níveis de LXA
4
nestas estruturas cerebrais
por meio de ensaio de ELISA.
Experimento 13: Quantificação dos níveis de receptores ALX no
cérebro de camundongos. Com o objetivo de identificar se os receptores
ALX são expressos no cérebro, realizamos a imunodetecção de
proteínas por Western blot em três regiões cerebrais onde quantificamos
os endocanabinóides e a LXA
4
. Cérebros de camundongos foram
coletados a fresco para dissecação do hipocampo, córtex e cerebelo e
determinação dos níveis de receptores ALX. O baço dos mesmos
camundongos também foi dissecado a fresco e submetido aos mesmos
51
procedimentos e considerado como grupo controle, já que a expressão
de receptores ALX neste órgão é amplamente descrita.
Experimento 14: Investigação dos efeitos da inibição da enzima
de síntese de LXA
4
na transmissão endocanabinóide. Com o objetivo de
investigar se a presença de LXA
4
no cérebro é importante para a
transmissão endocanabinóide, realizamos um experimento de inibição
da enzima de síntese da LXA
4
, a 5-LOX. Os animais foram injetados
com o inibidor da 5-LOX MK-886 (0,3 – 3 mg/kg, i.p.) e 55 min depois
injetados com uma dose efetiva de AEA (200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) e 5 min
depois testados no teste da catalepsia. Para investigar se a
suplementação de LXA
4
exógena poderia reverter os efeitos da inibição
endógena de sua síntese, o experimento de inibição da 5-LOX foi
repetido utilizando-se uma dose selecionada de MK-886 (3 mg/kg, i.p.),
seguido 50 min depois pela co-injeção de AEA (200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) e
LXA
4
(0,01 – 1 pmol / 2 µl, i.c.v.).
4.3.6.4 – Grupo 4: A 15-epi-LXA
4
gerada pela aspirina compartilha dos
efeitos canabimiméticos observados para a LXA
4
de ocorrência natural?
Experimento 15: Interação da aspirina com o endocanabinóide
AEA no teste da catalepsia em camundongos. Para verificar se a
aspirina potencializa os efeitos do endocanabinóide AEA, os animais
receberam aspirina (30-300 mg/kg, p.o.) ou controle 25 min antes de
receberem a injeção de uma dose sub-efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl,
i.c.v.) e serem avaliados no teste da catalepsia 5 min após. Em um
experimento similar subseqüente, a aspirina (300 mg/kg, p.o.) foi
administrada 15, 30, 60 ou 90 minutos antes do teste da catalepsia para
se determinar o decurso temporal de seus efeitos.
Experimento 16: Investigação da participação da enzima 5-LOX
na potencialização dos efeitos da AEA induzida pela aspirina no teste da
catalepsia em camundongos. Para investigar se possíveis derivados da 5-
LOX estavam envolvidos na potencialização dos efeitos da AEA
induzida pela aspirina no teste da catalepsia, os animais foram injetados
com o inibidor da 5-LOX MK-886 (1 mg/kg, i.p.) 10 min antes da
administração de aspirina (300 mg/kg, p.o.). AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.)
ou controle (etanol 0,5% em PBS) foram injetados 25 min depois da
administração de aspirina e o teste da catalepsia foi realizado 5 min
depois da injeção de AEA.
Experimento 17: Interação da 15-epi-LXA
4
com o
endocanabinóide AEA no teste da catalepsia em camundongos. Como
52
derivados da 5-LOX parecem estar envolvidos na potencialização dos
efeitos da AEA induzida pela aspirina no teste da catalepsia, decidimos
investigar se a 15-epi-LXA
4
, um isômero óptico da LXA
4
que é
produzido como conseqüência da acetilação da COX-2 pela aspirina,
também poderia interagir com a AEA, exercendo efeitos centrais
similares aos da LXA
4
, que ocorre naturalmente no cérebro. Os animais
foram co-injetados com uma dose sub-efetiva de 15-epi-LXA
4
(0,01
pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS) e uma dose sub-
efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS)
e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.
Experimento 18: Investigação da participação de receptores
canabinóides CB
1
ou de receptores de lipoxina ALX na potencialização
dos efeitos da AEA induzida pela 15-epi-LXA
4
no teste da catalepsia em
camundongos. O experimento de antagonismo farmacológico foi
realizado para investigar a participação de receptores canabinóides CB
1
ou de receptores de lipoxina ALX nos efeitos centrais da 15-epi-LXA
4
observados. Os animais foram injetados com o antagonista dos
receptores canabinóides CB
1
SR141716A (1 mg/kg, i.p.), o antagonista
dos receptores ALX BOC-2 (10 g/kg, i.p.) ou solução controle (10%
DMSO e 0,1% Tween80 em salina), seguido 55 min depois pela co-
injeção de uma dose selecionada de 15-epi-LXA
4
(0,01 pmol/ 2 µl) ou
controle (etanol 0,5% em PBS) e uma dose sub-efetiva de AEA (10
pmol/ 2 µl, i.c.v.). O teste da catalepsia foi realizado 5 min depois.
4.4 – Análise Estatística
Os dados estão expressos como média ± erro padrão da média
(e.p.m.), com o número amostral (n) expresso na legenda de cada figura.
Os experimentos foram avaliados por análise de variância (ANOVA) de
1 via (tratamento) ou 2 vias (pré-tratamento, tratamento, linhagem,
tempo) dependendo do desenho experimental. O teste post hoc de
Duncan foi utilizado para comparações ponto a ponto após análise
global por ANOVA. O teste t bicaudal para amostras independentes foi
utilizado para análise de experimentos com somente 2 grupos
experimentais ou para validação de metodologia por controles positivos.
Os ensaios competitivos de ligação foram analisados por ajuste de curva
com equação não linear modelo para 1 ou 2 sítios de interação. Estas
mesmas equações foram utilizadas para definição da concentração
inibitória 50 (CI
50
). Os experimentos de órgão isolado foram analisados
por equação não linear modelo de log concentração-resposta. Doses
53
efetivas 50 (DE
50
) nos experimentos comportamentais e concentrações
efetivas 50 (CE
50
) nos experimentos in vitro foram estimadas por
equação não linear. O nível mínimo de significância considerado para
todos os testes foi p<0,05. As análises estatísticas foram realizadas com
o programa Statistica 7 (StatSoft Inc, E.U.A.) e GraphPad 5 (GraphPad
Soft Inc, E.U.A.).
54
5 – RESULTADOS
5.1 - GRUPO 1: A LXA
4
INDUZ EFEITOS SIMILARES AOS DE
CANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL?
Experimento 1: Investigação de atividade canabimimética da
LXA
4
em camundongos. A figura 14 abaixo ilustra os efeitos da injeção
de LXA
4
(0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) no teste da tétrade de efeitos
canabinóides.
Figura 14 – Efeito da LXA
4
no teste da tétrade de efeitos canabinóides. A LXA
4
(0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) ou controle (C) foram injetados nos
camundongos 5 min antes do teste do campo aberto, catalepsia, temperatura
corporal e placa quente. * p<0,05 vs. Controle (post-hoc de Duncan). (n=9-14
no campo aberto, n=7 na catalepsia, n=11-12 na temperatura retal, n=11-12
na placa quente).
Os resultados foram analisados por ANOVA de 1 via
(tratamento). A injeção de LXA
4
reduziu o número de cruzamentos no
teste do campo aberto [F(3,43)=4,56; p<0,01], aumentou o tempo de
55
imobilidade no teste de catalepsia [F(3,24)=9,07; p<0,001], reduziu a
temperatura corporal [F(3,43)=3,49; p<0,05] e aumentou a latência para
resposta nociceptiva no teste da placa quente [F(3,43)=3,18; p<0,05].
Todos os efeitos citados acima ocorreram nas doses de 0,1 e 1 pmol de
LXA
4
(p<0,05).
Experimento 2: Investigação da participação de receptores
canabinóides CB
1
ou de receptores ALX de lipoxina nos efeitos centrais
da LXA
4
em camundongos. A figura 15 abaixo ilustra os efeitos do pré-
tratamento com antagonistas CB
1
e ALX na atividade canabimimética
induzida pela LXA
4
(0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) no teste da tétrade
de efeitos canabinóides. Os resultados foram analisados por ANOVA de
1 via (tratamento). Houve diferenças entre os grupos no número de
cruzamentos no teste do campo aberto [F(5,84)=1,60; p<0,05], no tempo
de imobilidade no teste de catalepsia [F(5,42)=9,82; p<0,0001], na
temperatura corporal [F(5,53)=3,10; p<0,05] e na latência nociceptiva
no teste da placa quente [F(5,77)=5,85; p<0,0001]. Adicionalmente,
uma observação mais criteriosa dos resultados obtidos nos testes de
catalepsia e temperatura retal identificou interação entre os fatores pré-
tratamento e tratamento, quando analisados por ANOVA de 2 vias
([F(2,42)=10,07; p<0,001] e [F(2,53)=4,79; p<0,01], respectivamente).
Replicando os resultados anteriores, a injeção de LXA
4
induziu
hipolocomoção (p<0,05), catalepsia (p<0,05), hipotermia (p<0,05) e
analgesia (p<0,05). O bloqueio dos receptores CB
1
reduziu o efeito da
LXA
4
em todos os testes (p<0,05), só não foi significativo na
nocicepção. O bloqueio dos receptores ALX não reduziu o efeito da
LXA
4
em nenhum dos testes utilizados, confirmando
farmacologicamente seu perfil de atividade canabimimética central.
Como a quase totalidade dos testes comportamentais utilizados nos
experimentos 1 e 2 indicaram resultados na mesma direção, e com o
objetivo de simplificar a execução dos experimentos, priorizando o
aprofundamento da investigação do mecanismo farmacológico,
decidimos eleger somente um teste comportamental para a continuação
dos experimentos. Dos quatro testes da tétrade canabinóide, a catalepsia
e a temperatura retal geraram resultados bastante claros e contundentes.
Contudo, considerando a praticidade de execução do teste da catalepsia
e a necessidade de um número relativamente reduzido de animais para
obtenção de resultados altamente significantes (p<0,0001) comparados
aos outros testes, elegemos o teste da catalepsia para a realização dos
experimentos subseqüentes.
56
Figura 15 – Participação de receptores canabinóides CB1 nos efeitos centrais
da LXA4. O antagonista de receptores CB1 SR141716A (SR; 1 mg/kg, i.p.), o
antagonista dos receptores ALX BOC-2 (BOC; 10 µg/kg, i.p.) ou controle (C)
foram injetados 50 min antes da LXA4 (1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) ou controle. Os
animais foram testados 5 min após no teste do campo aberto, catalepsia,
temperatura corporal e placa quente. * p<0,05 vs Controle; # p<0,05 vs LXA4
(post-hoc de Duncan). (n=10-20 no campo aberto, n=8 na catalepsia, n=8-11
na temperatura retal, n=12-15 na placa quente).
Experimento 3: Confirmação da ausência de participação dos
receptores ALX na catalepsia induzida pela LXA
4
em camundongos.
Como o antagonista BOC-2 utilizado é de origem peptídica, poder-se-ia
especular que a ausência de prevenção dos efeitos da LXA
4
fosse devido
ao fato deste antagonista apresentar pouca distribuição no sistema
nervoso central após administração sistêmica. Desta maneira, repetimos
o experimento de bloqueio farmacológico dos receptores ALX,
administrando o BOC-2 (1000 pmol/ 2 µl) por via i.c.v. Os resultados
deste experimento foram analisados por ANOVA de 2 vias (pré-
tratamento, tratamento) e estão representados na figura 16 abaixo. A
análise dos resultados identificou efeito geral do tratamento com LXA
4
57
[F(1,20)=24,06; p<0,0001], sem efeito do pré-tratamento com
antagonista [F(1,20)=0,25; p=0,62] ou interação entre os fatores
[F(1,20)=0,14; p=0,71], confirmando a ausência de participação dos
receptores ALX na catalepsia induzida pela LXA
4
.
Figura 16 – Confirmação da ausência de participação de receptores ALX nos
efeitos centrais da LXA
4
. O antagonista de receptores ALX BOC-2 (BOC; 1000
pmol/2 µl, i.c.v.) ou controle (C) foram co-injetados com LXA
4
(1 pmol/ 2 µl,
i.c.v.) ou controle 5 min antes do teste de catalepsia. * p<0,05 vs Controle
(post-hoc de Duncan). (n=6).
Experimento 4: Confirmação da participação dos receptores CB
1
na catalepsia induzida pela LXA
4
em camundongos. Inicialmente
repetimos a curva dose-resposta de LXA
4
(0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl,
i.c.v.) na linhagem de camundongos C57Bl/6NCrl, utilizada como
background para a geração dos camundongos CB
1
-/-
, a fim de confirmar
se há correspondência de dose entre esta linhagem e a de camundongos
Swiss albino utilizada para os experimentos anteriores. Os resultados
foram analisados por ANOVA de 1 via (tratamento) e estão
representados na figura 17 abaixo. A LXA
4
induziu catalepsia nos
camundongos da linhagem C57Bl/6NCrl [F(3,29)=3,55; p<0,05], na
mesma faixa de doses (0,1 – 1 pmol) que induziu catalepsia nos
camundongos Swiss albino (p<0,05). Portanto, a dose de 1 pmol de
LXA
4
foi selecionada para os experimentos utilizando os camundongos
modificados geneticamente.
Os resultados deste experimento foram analisados por ANOVA
de 2 vias (linhagem, tratamento) e estão representados na figura 17
abaixo. A análise revelou efeito da linhagem [F(1,21)=8,59; p<0,01], do
tratamento [F(1,21)=10,78; p<0,01] e da interação entre estes fatores
[F(1,21)=4,75; p<0,05]. A LXA
4
induziu catalepsia nos camundongos
CB
1
+/+
(p<0,05), mas não nos camundongos CB
1
-/-
, confirmando a
58
participação dos receptores canabinóides CB
1
na catalepsia induzida
pela injeção central de LXA
4
.
Figura 17 – Confirmação da participação de receptores canabinóides CB
1
nos
efeitos centrais da LXA
4
. LXA
4
(0,01 - 1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (C) foram
injetados 5 min antes do teste de catalepsia em camundongos C57Bl/6NCrl
(painel da esquerda) e em camundongos com deleção gênica dos receptores
CB
1
(CB
1
-/-
) e seus controles (CB
1
+/+
). * p<0,05 vs Controle; # p<0,05 vs LXA
4
nos camundongos CB
1
+/+
(post-hoc de Duncan). (n=8-9 e n=6-7).
5.2 - GRUPO 2: EM BUSCA DE UM MECANISMO DE AÇÃO
PARA OS EFEITOS CENTRAIS DA LXA
4
.
Experimento 5: Ensaio competitivo de ligação contra
[
3
H]SR141716A em membranas de cérebro total de camundongo. Já que
os experimentos comportamentais sugeriram a participação de
receptores canabinóides CB
1
nos efeitos centrais da LXA
4
, a primeira
tentativa de elucidar o possível mecanismo de ação consistiu em
investigar se a LXA
4
se liga nestes receptores. Primeiramente
realizamos um ensaio cinético para determinar a constante de
dissociação (Kd) do ligante radioativo [
3
H]SR141716A. A condição de
equilíbrio foi alcançada em torno de 10 min de incubação, período no
qual definimos o Kd=0,54 nM. Por esta razão, selecionamos a
concentração de 0,5 nM de [
3
H]SR141716A para os ensaios
competitivos subseqüentes. A figura 18 abaixo ilustra os resultados do
ensaio competitivo da LXA
4
(1 nM – 10 µM) contra o [
3
H]SR141716A
em membranas de cérebro total de camundongos. A ligação do
[
3
H]SR141716A foi somente deslocada parcialmente pela LXA
4
, com
inibição de aproximadamente 50% a 10 µM. A equação não linear
modelo para dois sítios de interação foi a que melhor se ajustou aos
dados experimentais (r
2
=0,97), indicando um sítio de alta afinidade e um
59
de baixa afinidade para a LXA
4
nos receptores CB
1
, com CI
50
estimados
de 3,0 ± 0,26 nM e 100 ± 1,0 nM, respectivamente. Se o ajuste da curva
for forçado para simular o efeito de uma substância que deslocasse
totalmente a ligação do [
3
H]SR141716A, o CI
50
estimado para o sítio de
baixa afinidade seria de cerca de 26 µM. O veículo (etanol) não
interferiu na ligação do [
3
H]SR141716A até a concentração máxima
utilizada de 1%.
Tabela 4 - Parâmetros do ensaio competitivo de ligação da
lipoxina A
4
contra [
3
H]SR141716A (0,5 nM) em membranas de
cérebro total de camundongos.
Análise
r
2
Sítio (Fração)
CI50 (nM)
(IC
95%
)
Competitivo
1 sítio
0,83
Único (100%)
5,3
(0,08 - 340)
Competitivo
2 sítios
0,97
Alta afinidade
(35%)
3,0
(0,78 - 12)
Baixa afinidade
(65%)
26370
(4000 - 195000)
Curva de ensaio competitivo de ligação da LXA
4
(1 nM - 10µM)
contra [
3
H]SR141716A (0,5 nM) em membranas de cérebro total
de camundongos. (n=4) LXA
4
: lipoxina A
4
Experimento 6: Ensaio de inibição de contrações induzidas
eletricamente em ducto deferente isolado de rato. O segundo passo na
caracterização in vitro da LXA
4
foi a investigação de seus efeitos em
uma preparação funcional sensível a agonistas de receptores
canabinóides CB
1
.
60
Figura 18 – LXA
4
possui baixa afinidade para os receptores CB
1
e baixa
eficácia canabimimética in vitro. No ensaio competitivo de ligação, a LXA
4
(1
nM – 10 µM) foi incubada com as membranas de cérebro total de camundongos
na presença de [
3
H]SR141716A (0,5 nM) por 60 min a 37°C (painel da
esquerda). No ensaio de órgão isolado, investigamos os efeitos da LXA
4
(1 nM
– 1 µM) nas contrações induzidas eletricamente em vasos deferentes isolados
de ratos (painel da direita). AEA (1 µM) foi utilizada como controle positivo em
ambos os ensaios. (n=4 e n=3-6).
Como demonstrado na figura 18 acima, a LXA
4
inibiu fracamente
as contrações induzidas eletricamente em ducto deferente isolado de
ratos. A porcentagem de inibição máxima foi de aproximadamente 25%
a 1 µM com CE
50
estimada de 7,2 ± 1,0 nM. O veículo (etanol) não
interferiu na ligação do [
3
H]SR141716A até a concentração máxima
utilizada de 1%.
Experimento 7: Interação da LXA
4
com os endocanabinóides
AEA e 2-AG no teste da catalepsia em camundongos. Como os
experimentos in vitro descritos acima não forneceram evidências
suficientes para definirmos um mecanismo farmacológico que
explicasse os efeitos canabimiméticos da LXA
4
no sistema nervoso
central, passamos a uma segunda etapa de caracterização dos efeitos in
vivo da LXA
4
, a fim de obter informações adicionais que pudessem nos
sugerir uma nova perspectiva experimental. Até o momento, apesar da
LXA
4
exercer efeitos centrais dependentes da ativação de receptores
CB
1
, as evidências levantadas não nos permitem afirmar que ela seja um
agonista destes receptores. Então decidimos investigar se além de
exercer efeito canabimimético quando administrada sozinha, a LXA
4
poderia interferir no efeito de ligantes endógenos dos receptores CB
1
, os
endocanabinóides. A abordagem experimental escolhida foi investigar
se a co-administração de uma dose sub-efetiva de LXA
4
com uma dose
sub-efetiva de cada um dos dois endocanabinóides protótipos, a AEA e
61
o 2-AG, poderia resultar em efeitos cumulativos no teste da catalepsia.
Inicialmente foi preciso realizar curvas dose-resposta para AEA (10-200
pmol/ 2 µl, i.c.v.) e 2-AG (1-100 pmol/ 2 µl, i.c.v.) em nossas condições
experimentais. A figura 19 abaixo representa os resultados deste
experimento, analisado por ANOVA 1 via (tratamento). A análise dos
resultados revelou efeito para a AEA [F(3,21)=8,89; p<0,001] e 2-AG
[F(3,23)=12,23; p<0,0001] com doses de 200 e 100 pmol apresentando
diferença significativa comparado ao grupo controle, respectivamente.
Os experimentos subseqüentes de co-injeção da AEA (10 pmol/ 2 µl,
i.c.v.) ou do 2-AG (1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) com a LXA
4
(0,01 pmol/ 2 µl,
i.c.v.) no teste da catalepsia estão representados na figura 19 abaixo e
foram analisados por ANOVA de 1 via (tratamento).
Figura 19 - Interação da LXA4 com os endocanabinóides AEA e 2-AG. Sub-
doses destes endocanabinóides foram definidas em experimentos de dose-
resposta, onde AEA (10 – 200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) e 2-AG (1 – 100 pmol/ 2 µl,
i.c.v.) ou controle (C) foram injetados 5 min antes do teste de catalepsia. LXA4
(0,01 pmol/ 2 µl, i.c.v.) foi co-injetada com AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou 2-AG
(1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) 5 min antes do teste de catalepsia. * p<0,05 vs Controle
62
(post-hoc de Duncan). (n=5-7, n=6-7, n=8-9 e n=7-9 da esquerda para direita
em sentido horário).
A análise dos resultados do experimento com AEA revelou
diferença entre os grupos [F(3,29)=4,98; p<0,01], confirmando que as
doses de AEA e LXA
4
não foram efetivas per se, mas que a co-
administração destas duas substâncias induziu catalepsia, com diferença
significativa do grupo controle (p<0,05). A análise dos resultados do
experimento com 2-AG não revelou diferença significativa entre os
grupos [F(3,27)=2,37; p=0,09]. A dose efetiva 50% (DE
50
) para os
ligantes acima, foi estimada por relação log concentração x resposta,
considerando o tempo máximo de teste (300 s) como resposta máxima
possível (E
máx
) para cada um dos ligantes. O resultado das estimativas
pode ser observado na tabela 5 abaixo. A LXA
4
possui uma eficácia
aparente de cerca de 500x a da AEA. Deve-se, no entanto, interpretar
estes resultados com cautela e reconhecer a limitação da estimativa
realizada somente com 4 pontos da curva dose-resposta dos referidos
ligantes.
Experimento 8: Ensaio de atividade das enzimas de degradação
de endocanabinóides. Seguindo a evidência funcional de que a LXA
4
potencializa os efeitos da AEA, o próximo passo foi investigar a
Tabela 5 – Potência estimada dos ligantes no teste da catalepsia
Ligante
DE50
(IC
95%
)
1
Potência relativa
2
AEA
1174
(862 - 1597)
1x
2-AG
219
(126 - 381)
5x
LXA
4
2
(1 - 5)
500x
1
Em pmol / 2µl, i.c.v. conforme descrito nos experimentos.
2
Estimativa
aproximada da potência relativa, calculado pela razão da DE
50
comparada à da anandamida. AEA: anandamida, 2-AG: 2-araquidonil
glicerol, LXA
4
: lipoxina A
4
.
63
possibilidade de interação metabólica entre a LXA
4
e os
endocanabinóides. Desta maneira, realizamos experimentos in vitro com
o objetivo de investigar se a LXA
4
altera a atividade das duas enzimas
mais importantes para a degradação da AEA e do 2-AG,
respectivamente a FAAH e a MAGL. Os resultados estão representados
na figura 20 abaixo e foram analisados por ANOVA de 1 via ou teste t
para amostras independentes, dependendo do número de grupos. A
comparação entre o grupo controle e os respectivos controles positivos
para cada ensaio foi realizada por teste t para amostras independentes.
Figura 20 – LXA
4
não altera o metabolismo dos endocanabinóides AEA e 2-
AG. LXA
4
(0,1-10 µM) foi incubada com membranas ou conteúdo
citoplasmático, respectivamente para investigação de sua influência na
atividade das enzimas de degradação de endocanabinóide FAAH e MAGL. O
inibidor seletivo URB597 (50 nM) foi utilizado como controle positivo no
ensaio da FAAH e o inibidor MAFP (0,5 µM) foi utilizado comocontrole
positivo no ensaio da MAGL. * p<0,05 vs Controle (teste T). (n=3 e n=2).
A LXA
4
não interferiu na atividade da FAAH, enzima de
degradação da AEA [F(3,7)=0,73; p=0,58], enquanto o controle positivo
URB597 (50 nM) inibiu cerca de 90% da atividade da FAAH (t=4,70;
p<0,05). Da mesma forma, a LXA
4
não interferiu na atividade da
MAGL, enzima de degradação do 2-AG (t=2,26; p=0,15), com inibição
de aproximadamente 96% da atividade pelo controle positivo MAFP
(t=14,96; p<0,01).
Experimento 9: Quantificação dos níveis de endocanabinóides no
cérebro de camundongos após administração de LXA
4
. Seguindo a
mesma linha de raciocínio, decidimos investigar se a LXA
4
poderia
influenciar os níveis de endocanabinóides in vivo, em decorrência de
alteração na síntese, captação e/ou degradação destas moléculas.
Portanto, a LXA
4
foi injetada i.c.v. em uma dose que induz efeito
64
comportamental per se (1 pmol) e 5 min depois o cérebro dos
camundongos foi dissecado para avaliação dos níveis de AEA e 2-AG
no córtex, hipocampo e cerebelo. A figura 21 abaixo ilustra estes
resultados, analisados por teste t para amostras independentes. Não
houve diferença entre os grupos LXA
4
e controle para as áreas cerebrais
avaliadas.
Figura 21 – LXA
4
não altera os níveis de endocanabinóides no cérebro. LXA
4
(1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (C) foram injetados e 5 min depois o cérebro
dos camundongos foi dissecado para avaliação dos níveis de endocanabinóide
no hipocampo, córtex e cerebelo. (n=6)
Experimento 10: Investigação dos efeitos combinados de LXA
4
e
AEA no ensaio competitivo de ligação contra [
3
H]SR141716A em
membranas de cérebro total de camundongo. Com as evidências
reunidas nos experimentos anteriores, conseguimos eliminar algumas
hipóteses de possíveis mecanismos de ação para a atividade
canabimimética da LXA
4
, mas ainda não foi possível evidenciar um
mecanismo de ação plausível, principalmente se considerarmos que os
efeitos in vivo ocorrem em uma faixa de dose baixíssima (pmol), sendo
provavelmente decorrente da interação com um alvo farmacológico em
65
sítio de alta afinidade. Até este ponto, sabemos que a LXA
4
interage
fracamente com receptores canabinóides CB
1
e não altera o
metabolismo dos endocanabinóides, nem seus níveis endógenos
cerebrais. A próxima hipótese explorada foi a de que a LXA
4
poderia
facilitar a ligação da AEA nos receptores canabinóides CB
1
. Esta é uma
hipótese intrigante, visto que sítios alostéricos de interação foram
descobertos nos receptores CB
1
(Price et al., 2005). Embora se
conheçam substâncias sintéticas que interagem com este alvo
farmacológico, facilitando os efeitos de endocanabinóides, a existência
de uma substância endógena que se ligue a estes sítios é ainda um
assunto incerto e controverso. A nossa abordagem experimental foi
selecionar uma concentração de LXA
4
que praticamente não desloca a
ligação do [
3
H]SR141716A dos receptores CB
1
para investigar se a
LXA
4
influencia a ligação da AEA nestes receptores. A figura 22 abaixo
ilustra os resultados do ensaio combinado da LXA
4
(100 nM) e AEA (1
nM – 10 µM) contra o [
3
H]SR141716A em membranas de cérebro total
de camundongos. A ligação do [
3
H]SR141716A foi totalmente
deslocada pela AEA, confirmando seu papel de agonista dos receptores
CB
1
. A equação não linear modelo para dois sítios de interação foi a que
melhor se ajustou aos dados experimentais da curva de AEA (r
2
=0,97)
indicando um sítio de alta afinidade e um de baixa afinidade, com CI
50
estimados de 22 ± 3 nM e 1.338 ± 2 nM, respectivamente. Na presença
de LXA
4
numa concentração que per se não interfere na ligação do
[
3
H]SR141716A, a curva de AEA sofreu um deslocamento
considerável, com CI
50
estimados de 2 ± 2 nM e 685 ± 2 nM para os
sítios de alta e baixa afinidade, respectivamente, e mantendo um ajuste
de curva similar para 2 sítios de interação (r
2
=0,96). A comparação
entre os CI
50
das curvas de AEA na presença e na ausência de LXA
4
identificou diferença para ambos os sítios de interação (t=5,0; p<0,001
para alta afinidade e t=249,0; p<0,0001 para o de baixa afinidade).
66
Tabela 6 - Parâmetros do ensaio competitivo de ligação da AEA contra
[
3
H]SR141716A (0,5 nM) na ausência e na presença de LXA
4
(100
nM) em membranas de cérebro total de camundongos.
Análise
Curva
1
r
2
Sítio (Fração)
CI
50
(nM)
(IC95%)
Competitivo
1 sítio
AEA
0.89
Único (100%)
454
(231 - 892)
AEA +
LXA4
0.68
Único (100%)
92
(23 - 361)
Competitivo
2 sítios
AEA
0.97
Alta afinidade
(33%)
17
(0,9 - 294)
Baixa afinidade
(67%)
1409
(347 - 1938)
AEA +
LXA4
0.96
Alta afinidade
(49%)
2
(0,2 - 25)
Baixa afinidade
(51%)
692
(136 - 2314)
1
Curva de ensaio competitivo de ligação da anandamida (1nM a
10µM) contra [
3
H]SR141716A (0,5 nM) na ausência ou presença de
lipoxina A
4
(100nM) em membranas de cérebro total de camundongos.
2
Estimativa aproximada da potência relativa, calculado pela razão da
CI
50
comparada à da anandamida sozinha. CI
50
(nM) ± e.p.m. obtidas
em condição de equilíbrio cinético, com ajuste de curva não linear.
AEA: anandamida, LXA
4
: lipoxina A
4
Experimento 11: Investigação dos efeitos combinados de LXA
4
e
AEA no ensaio de inibição de contrações induzidas eletricamente em
ducto deferente isolado de rato. Ao contrário do esperado considerando
os dados do ensaio de ligação, a LXA
4
bloqueou o efeito inibitório da
AEA sobre as contrações neurogênicas do ducto deferente isolado de
ratos. A porcentagem de inibição máxima para a AEA foi de
67
aproximadamente 50% a 1 µM com CE
50
estimada de 123 ± 2,9 nM. A
adição de LXA
4
inverteu a curva da AEA, gerando um aumento da
contração em cerca de 20%. Como o experimento de interação entre
AEA e LXA
4
gerou um resultado inesperado, levando em consideração
as evidências anteriores do ensaio de ligação, decidimos investigar se a
LXA
4
poderia interagir com outro agonista canabinóide, o WIN55212-2.
Desta vez, ao contrário do observado para a AEA, a LXA
4
potencializou
o efeito do agonista canabinóide WIN55212-2 de inibir de contrações
induzidas eletricamente. Na presença da LXA
4
, a inibição máxima
gerada praticamente dobrou, chegando a 60%, e a CE
50
diminuiu em 4
vezes (aproximadamente 400 nM e 100 nM respectivamente na ausência
e presença de LXA
4
).
Figura 22 – LXA
4
aumenta a afinidade da AEA pelos receptores canabinóides
CB
1
, mas bloqueia seu efeito in vitro. Ensaio competitivo de ligação combinado
entre AEA (1 nM – 10 µM) e LXA
4
(100 nM) contra [
3
H]SR141716A (0,5 nM)
em membranas de cérebro total de camundongos (painel da esquerda). Efeito
combinado da AEA (1 nM – 10 µM) ou do WIN5521-2 (10 nM – 1 µM) e LXA
4
(100 nM) no ensaio de contração eletricamente induzida em ducto deferente de
rato (n=9-10, n=3-4, n=2).
5.3 - GRUPO 3: POSSÍVEL RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA DA
INTERAÇÃO ENTRE DERIVADOS DA LIPOXIGENASE E
ENDOCANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL.
Experimento 12: Quantificação dos níveis de LXA
4
no cérebro de
camundongos. Uma vez definido que o provável mecanismo de ação da
LXA
4
no cérebro constitui modulação alostérica dos receptores
canabinóides CB
1
, realizamos experimentos visando investigar se a
LXA
4
possui alguma relevância fisiológica para o sistema
endocanabinóide. A primeira abordagem foi quantificar seus níveis em
68
algumas regiões cerebrais onde os endocanabinóides desempenham um
papel fisiológico importante. Nos experimentos efetuados,
quantificamos os níveis dos endocanabinóides AEA e 2-AG no
hipocampo, córtex e cerebelo. Portanto, estas foram as mesmas regiões
escolhidas para quantificação dos níveis de LXA
4
. Como ilustrado na
figura 23 abaixo, todas as regiões analisadas expressam níveis basais de
LXA
4
em menor ou maior grau. Curioso notar que de certa forma os
níveis endógenos de LXA
4
seguem os níveis de AEA (maior presença
no hipocampo), mas não os de 2-AG (maior presença no córtex), pelo
menos entre as áreas analisadas.
Figura 23 – Quantificação dos níveis endógenos de LXA
4
no cérebro. LXA
4
foi
quantifica por ELISA no córtex (Ctx), hipocampo (Hpc) e cerebelo (Cer) de
camundongos. (n=5)
Experimento 13: Quantificação dos níveis de receptores ALX no
cérebro de camundongos. O experimento de avaliação dos possíveis
níveis de receptores ALX no cérebro de camundongos foi parcialmente
bem sucedido. Dificuldades técnicas relacionadas à revelação das
bandas com anticorpo secundário ligado à fosfatase alcalina nos
impediram de realizar uma quantificação precisa dos níveis destes
receptores, até o presente momento. Uma avaliação qualitativa
preliminar utilizando corante sensível a proteínas revelou a existência
maciça de receptores ALX no baço, utilizado como controle positivo, de
acordo com descrição presente na literatura (Chiang et al., 2003). A
mesma análise preliminar sugere a ausência ou presença em baixíssimas
concentrações de receptores ALX no cérebro (hipocampo, cerebelo e
córtex), pelo menos comparado aos níves encontrados no baço.
Experimento 14: Investigação dos efeitos da inibição da enzima
de síntese de LXA
4
na transmissão endocanabinóide. Com a
69
confirmação de que a LXA
4
se encontra no cérebro, a segunda
abordagem utilizada para investigar seu papel fisiológico foi investigar
se a inibição da síntese de LXA
4
pelo MK-886 (0,3 – 3 mg/kg, i.p.)
influencia a ação farmacológica da AEA (200 pmol/ 2 µl, i.c.v.). A
figura 24 abaixo ilustra estes resultados, analisados por ANOVA de 1
via (tratamento). A inibição da enzima 5-LOX pelo MK-886 reduziu a
catalepsia induzida pela AEA [F(3,24)=3,38; p<0,05]. A dose de 3
mg/kg de MK-886 reduziu em cerca de 60% o efeito da AEA (p<0,05).
Para confirmar se foi mesmo a redução dos níveis de LXA
4
o
responsável pelos efeitos comportamentais do MK-886, decidimos
repetir o experimento tentando reverter os efeitos do MK-886 (3 mg/kg,
i.p.) injetando LXA
4
exógena (0,01 – 1 pmol/ 2 µl, i.c.v.). Replicando o
experimento anterior, a injeção de MK-886 reduziu a catalepsia
induzida pela AEA (t=-4,76; p<0,01). A injeção de LXA
4
exógena re-
estabeleceu os efeitos da AEA, mesmo com a inibição da 5-LOX
[F(3,19)=3,27; p<0,05]. A dose de 1 pmol de LXA
4
foi diferente do
grupo controle (MK-886 + AEA), re-estabeleceu completamente o
efeito da AEA (p<0,05).
Figura 24 - LXA
4
endógena participa dos efeitos centrais do endocanabinóide
AEA. O inibidor da enzima de síntese da LXA
4
MK-886 (0,3 – 3 mg/kg, i.p.) ou
controle (C) foram injetados 55 min antes da injeçao de uma dose efetiva de
AEA (200 pmol/ 2 µl, i.c.v.). LXA
4
(0,01 – 1 pmol / 2 µl, i.c.v.) foi co-injetada
com AEA (200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) na tentativa de reverter o efeito de inibição da
5-LOX pelo MK-886 (3 mg/kg, i.p.) na catalepsia induzida pela AEA. Em ambos
os casos, os animais foram submetidos ao teste da catalepsia 5 min depois da
injeção de AEA. * p<0,05 vs Controle (post-hoc de Duncan). A barra
hachurada no painel da direita representa o intervalo ± e.p.m. de um grupo
tratado com AEA 200 pmol. (n=6-8 e n=5-6).
70
5.4 - GRUPO 4: A 15-EPI-LXA
4
GERADA PELA ASPIRINA
COMPARTILHA DOS EFEITOS CANABIMIMÉTICOS
OBSERVADOS PARA A LXA
4
DE OCORRÊNCIA NATURAL?
Experimento 15: Interação da aspirina com o endocanabinóide
AEA no teste da catalepsia em camundongos. Inicialmente realizamos
um experimento de dose-resposta para definir se a aspirina (30 – 300
mg/kg, p.o.) poderia potencializar o efeito de uma dose sub-efetiva de
AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.). A figura 25 abaixo ilustra estes resultados.
A análise dos resultados por ANOVA de 1 via (tratamento) revelou que
a aspirina potencializa a catalepsia induzida por uma sub-dose de AEA
[F(3,24)=11,83; p<0,0001], com efeito maior na dose de 300 mg/kg
comparado ao grupo controle e às outras doses (p<0,05). Além do mais,
analisando o decurso temporal por ANOVA de 2 vias (tratamento,
tempo), identificamos que houve interação entre tratamento e tempo de
administração [F(3,21)=8,89; p<0,0001]. A potencialização dos efeitos
da AEA pela aspirina foi máxima quando o inibidor da COX foi
administrado 30 min antes (p<0,05).
Figura 25 – Aspirina potencializa os efeitos centrais do endocanabinóide AEA.
Aspirina (30 - 300 mg/kg, p.o.) ou controle (C) foram administrados antes de
uma dose sub-efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (C) e os animais
foram submetidos ao teste da catalepsia 5 min depois. * p<0,05 vs Controle
(post-hoc de Duncan). (n=7 e n=6).
Experimento 16: Investigação da participação da enzima 5-LOX
na potencialização dos efeitos da AEA induzida pela aspirina no teste da
catalepsia em camundongos. Com o objetivo de investigar a
participação de derivados da 5-LOX na potencialização dos efeitos da
AEA pela aspirina, os animais foram tratados com o inibidor MK-886 (1
71
mg/kg, i.p.) antes da administração de aspirina (300 mg/kg, p.o.) e AEA
(10 pmol/ 2 µl, i.c.v.). A figura 26 abaixo ilustra os resultados deste
experimento. A análise dos resultados por ANOVA de 2 vias (pré-
tratamento, tratamento) identificou interação entre os fatores
[F(1,26)=21,74; p<0,0001)]. A aspirina potencializou o efeito da AEA
comparado ao grupo controle (p<0,05), confirmando o experimento
anterior. A inibição da 5-LOX aboliu a catalepsia induzida pela
associação entre aspirina e AEA (p<0,05).
Figura 26 – Derivado da 5-LOX gerado pela aspirina participa da
potencialização dos efeitos centrais da AEA. Aspirina (300 mg/kg, p.o.) foi
administrada antes de uma dose sub-efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) na
presença do inibidor da 5-LOX MK-886 (1 mg/kg, i.p.) ou controle. Os animais
foram submetidos ao teste da catalepsia 5 min depois da injeção de AEA.
*
p<0,05 vs C-Controle
#
p<0,05 vs AEA-Controle (post-hoc de Duncan)(n=7-8).
Experimento 17: Interação da 15-epi-LXA
4
com o
endocanabinóide AEA no teste da catalepsia em camundongos. Como o
experimento anterior sugeriu a participação de um derivado da 5-LOX
na potencialização dos efeitos da AEA pela aspirina, o próximo passo
foi testar diretamente se a co-injeção de 15-epi-LXA
4
potencializa os
efeitos da AEA. Os resultados deste experimento estão ilustrados na
figura 27 abaixo.
72
Figura 27 – A lipoxina gerada pela aspirina potencializa os efeitos centrais da
AEA. 15-epi-LXA
4
0,01 pmol/ 2 µl, i.c.v.) foi administrada antes de uma sub-
dose de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (C). Os animais foram
submetidos ao teste da catalepsia 5 min depois da injeção de AEA. * p<0,05 vs
Controle (post-hoc de Duncan)(n=8-10).
A análise dos dados por ANOVA de 1 via (tratamento)
identificou diferença entre os grupos [F(3, 32)=7,69; p<0,001].
Enquanto ambas as doses de AEA e 15-epi-LXA
4
foram sub-efetivas
per se, a combinação de ambas induziu catalepsia comparada ao grupo
controle (p<0,05).
Experimento 18: Investigação da participação de receptores
canabinóides CB
1
ou de receptores de lipoxina ALX na potencialização
dos efeitos da AEA induzida pela 15-epi-LXA
4
no teste da catalepsia em
camundongos. Por último, com o objetivo de investigar se a lipoxina
derivada da aspirina 15-epi-LXA4 compartilha o mecanismo de ação da
LXA
4
de ocorrência natural, injetamos os animais com o antagonista de
receptores canabinóides CB
1
SR141716A (1 mg/kg, i.p.) ou o
antagonista dos receptores ALX BOC-2 (10 µg/kg, i.p.) antes da
repetição do experimento de interação da 15-epi-LXA
4
com a AEA. Os
resultados deste experimento estão ilustrados na figura 28 abaixo. A
análise do experimento com SR141716A por ANOVA de 2 vias (pré-
tratamento, tratamento) identificou interação entre pré-tratamento e
tratamento [F(1,20)=7,08; p<0,01]. A combinação de doses sub-efetivas
de 15-epi-LXA
4
e AEA induziu catalepsia comparada ao grupo controle
(p<0,05), que foi prevenida pelo tratamento com o antagonista
SR141716A (p<0,05). Pelo contrário, a mesma análise aplicada ao
experimento com BOC-2 identificou apenas efeito do tratamento
[F(1,25)=16,95; p<0,001], sem efeito do antagonista [F(1,25)=0,08;
p=0,77] ou da interação entre os fatores[F(1,25)=0,00; p=0,97].
73
Figura 28 – Receptores canabinóides CB
1
participam dos efeitos centrais da
15-epi-LXA
4
. O tratamento com SR141716A (1 mg/kg, i.p.) preveniu a
potencialização de uma sub-dose de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) pela 15-epi-
LXA
4
(0,01 pmol/ 2 µl, i.c.v.). Não houve efeito de tratamento semelhante
realizado com o antagonista dos receptores ALX BOC-2. * p<0,05 vs AEA-
Controle # p<0,05 vs AEA-LXA
4
(post-hoc de Duncan)(n=6 e n=6-8).
74
6 – DISCUSSÃO
A imensa maioria dos estudos científicos sobre a LXA
4
disponíveis abordam a sua atividade modulatória sobre o excesso de
tráfego leucocitário, que parece ser a base celular do seu amplamente
estudado efeito de promover a resolução da inflamação (McMahon et
al., 2001) As lipoxinas são reconhecidos agentes anti-inflamatórios
endógenos que efetuam a resolução programada de processos
inflamatórios por regulação de eventos pró-inflamatórios, como a
liberação de citocinas pró-inflamatórias (Hachicha et al., 1999), a
rolagem e aderência de leucócitos na microcirculação (Scalia et al.,
1997), liberação de IL-8 induzida por TNFα ou patógenos externos
(Gewirtz et al., 1998; Gronert et al., 1998) e inibição da via do fator de
transcrição NFκB (Gewirtz et al., 2002). O efeito geral seria a regulação
do excesso de ativação leucocitária, inibição da infiltração de
polimorfonucleares e diminuição da permeabilidade vascular (Takano et
al., 1998). Desta maneira, o potencial terapêutico das lipoxinas como
substâncias anti-inflamatórias vêm sendo atualmente explorado,
inclusive com o desenvolvimento de análogos sintéticos da LXA
4
e 15-
epi-LXA
4
que são metabolicamente estáveis e comercialmente viáveis.
Estes análogos causam efeitos muito similares aos da LXA
4
e 15-epi-
LXA
4
originais promovendo a regulação de diversos mediadores pró-
inflamatórios com propriedades terapêuticas potenciais em doenças
inflamatórias e auto-imunes (Schottelius et al., 2002).
Como diversos anos de pesquisa científica já estabaleceram a
LXA
4
como um anti-inflamatório natural, a proposta de nosso estudo foi
justamente investigar outras possíveis atividades da LXA
4
, tendo como
foco o SNC. Até a realização da investigação farmacológica apresentada
nesta tese de doutorado, pouquíssimos estudos haviam investigado a
atividade central da LXA
4
. No nosso conhecimento, apenas 4 artigos
estão atualmente disponíveis em língua inglesa nas bases de dados
acessadas (PubMed, ScienceDirect, Google Scholar), cujos resultados
essenciais foram apresentados na tabela 2 da Introdução. Nenhum destes
estudos realizados no final da década de 80 e início da década de 90
associou os efeitos da LXA
4
a algum receptor ou alvo farmacológico
conhecido no SNC, mas curiosamente, todos os resultados descritos na
literatura sugerem efeitos da LXA
4
que são muito similares aos efeitos
causados pela ativação de receptores CB
1
pelos endocanabinóides,
principalmente pela AEA. Resumidamente, os estudos anteriores
sugeriram que a LXA
4
pode ser liberada no cérebro durante eventos
75
isquêmicos (Kim, 1988), ativa o subtipo neuronal da PKC (Shearman et
al., 1988), aumenta a duração do sono de ondas lentas (Sri Kantha et al.,
1994) e participa do processo de LTP no hipocampo (Williams e Bliss,
1988). Estas evidências da literatura, somadas à grande similaridade
estrutural da LXA
4
com os endocanabinóides foram a principal
inspiração para a idealização deste projeto. A possível identificação de
um ponto de interação entre 2 vias conhecidas de eicosanóides já seria
motivação suficiente para a realização deste trabalho. Contudo, se os
endocanabinóides exercem tantas funções importantes no organismo,
como a comunidade científica internacional vem demonstrando, a
possibilidade de caracterizar a LXA
4
como um novo canabinóide de
origem natural nos pareceu extraordinariamente tentadora.
De fato, a caracterização psicofarmacológica da LXA
4
identificou
atividade canabimimética no teste da tétrade de efeitos canabinóides,
envolvendo avaliação de atividade locomotora, temperatura corporal,
sensibilidade à dor e catalepsia. A hipolocomoção, hipotermia, analgesia
e catalepsia induzidas pela LXA
4
nos camundongos envolveu
participação de receptores canabinóides CB
1
, em maior ou menor grau,
e não envolveu a participação de receptores ALX de lipoxina. O teste
comportamental da catalepsia foi utilizado como ferramenta para uma
abordagem mais aprofundada visando à caracterização da participação
do sistema endocanabinóide nos efeitos centrais da LXA
4
. Como
próximo passo, excluímos novamente a participação de receptores ALX
na catalepsia induzida pela LXA
4
utilizando co-injeção cerebral de
LXA
4
e o antagonista dos receptores ALX BOC-2 e confirmamos a
participação de receptores canabinóides CB
1
com o uso de
camundongos knock-out para estes receptores. Estes experimentos nos
permitiram caracterizar que a LXA
4
exerce efeito canabinóide no SNC,
mas de maneira nenhuma nos permitem excluir que ela exerça outros
efeitos comportamentais via receptores ALX, uma vez que a triagem
inicial de atividade central envolveu parâmetros comportamentais e
fisiológicos que são caracteristicamente afetados pelos canabinóides.
Além do mais, nossa abordagem experimental da participação dos
receptores ALX foi um tanto quanto limitada pela utilização
exclusivamente de abordagem farmacológica usando apenas uma classe
de antagonista. Visando identificar se há possibilidade de envolvimento
dos receptores ALX em alguma função cerebral, realizamos um
experimento de Western blot tentando identificar os receptores ALX no
cérebro, já que nem mesmo a União Internacional de Farmacologia
(IUPHAR) possui uma posição inequívoca sobre a existência de
76
receptores ALX no SNC (Brink et al., 2003). O padrão de expressão dos
receptores ALX nas áreas cerebrais estudadas (hipocampo, córtex e
cerebelo) foi pouco expressivo, apesar da evidente expressão de
receptores ALX no baço, utilizado como experimento controle na
validação da metodologia utilizada. Nosso experimento confirmou
experimentos anteriores, demonstrando a expressão dos receptores ALX
em órgãos imunológicos (Chiang et al., 2003), e sugere a ausência
destes receptores no cérebro. Contudo o padrão de expressão dos
receptores ALX em células imunológicas e seu importante papel nos
processos inflamatórios sugere que os ALX possam ser expressos na
glia (Verdier e Penke, 2004).
Considerando a hipótese canabinóide confirmada pelos
experimentos comportamentais iniciais, passamos à investigação in vitro
com o objetivo de identificar um mecanismo de ação concreto para a
LXA
4
no cérebro. Surpreendentemente, esta busca nos levou à
identificação de um provável ligante endógeno para um sítio ainda
pouco estudado dos receptores canabinóides CB
1
. O primeiro passo foi a
realização de um ensaio de ligação contra o antagonista seletivo para os
receptores canabinóides CB
1
[
3
H]SR141716A em membranas de
cérebro de camundongos. O resultado indicou dois sítios de interação
para a LXA
4
neste sistema, um de baixa e outro de alta afinidade. A
ligação da LXA
4
no sítio de alta afinidade, provavelmente o mais
relevante em níveis fisiológicos, inibiu cerca de 25% da ligação do
antagonista CB
1
. De toda maneira, a LXA
4
não inibiu nem 50% da
ligação deste antagonista até a concentração relativamente alta de 10
µM. A AEA inibiu praticamente toda a ligação do antagonista CB
1
na
concentração de 1 µM no mesmo ensaio, também com dois sítios de
interação identificados. A conclusão geral deste experimento é que
aparentemente a LXA
4
não é um ligante dos receptores canabinóides
CB
1
com afinidade comparável a dos ligantes endógenos conhecidos. A
fim de confirmar esta hipótese, realizamos um experimento de órgão
isolado na preparação de ducto deferente, que é sabidamente sensível à
ação de canabinóides e foi utilizada para a caracterização de muitos dos
ligantes canabinóides conhecidos hoje em dia (Pertwee et al., 1995). A
LXA
4
demonstrou baixa eficácia em inibir as contrações induzidas
eletricamente no ducto deferente, corroborando os resultados do ensaio
de ligação. A inibição máxima alcançada foi de apenas 25% a 1 µM,
com evidente formação de platô no efeito máximo. Como comparação, a
AEA provocou o dobro da inibição de contração na mesma
concentração que a LXA
4
. Os dois sítios de interação para a LXA
4
e
77
AEA no experimento de binding provavelmente se devem à existência
de diferentes populações de receptores CB
1
no cérebro, os receptores
CB
1
propriamente dito e a variante estrutural CB
1a
(Ryberg et al., 2005).
Até o momento, 3 subtipos de receptores CB
1
gerados por
splicing de mRNA foram identificados por PCR (CB
1
, CB
1a
e CB
1b
). O
subtipo originalmente descrito de receptores CB
1
é expresso
prioritariamente no cérebro e intestino delgado (jejuno), o subtipo CB
1b
é expresso prioritariamente em tecidos periféricos como nos intestinos
delgado (jejuno) e grosso (cólon), útero e em cérebro fetal, enquanto o
subtipo CB
1a
é expresso em uma ampla variedade de tecidos, incluindo
adipócitos, testículo, pele, pulmões, coração, intestinos (jejuno, duodeno
e cólon), útero, musculatura esquelética e cérebro (adulto e fetal)
(Ryberg et al., 2005). Neste mesmo estudo não foi detectada a presença
de mRNA para nenhum dos subtipos de receptores CB
1
no fígado, baço
e rins (Ryberg et al., 2005). Uma explicação alternativa para a existência
de dois sítios de interação para a AEA e LXA
4
em nosso ensaio de
ligação com membranas de tecido cerebral seria a ligação destes
lipídeos (assim como do [
3
H]SR141716A) em outros receptores, por
exemplo o GPR55 (Ryberg et al., 2007). O mRNA para os receptores
GPR55 foi encontrado em diversos tecidos como glândulas adrenais,
baço, intestinos (jejuno e íleo), medula espinhal e cérebro (hipocampo,
córtex, cerebelo, estriado, hipotálamo, tronco cerebral) (Ryberg et al.,
2007). Até onde se sabe, os receptores GPR55 também possuem
afinidade para algumas das moléculas consideradas endocanabinóides,
como AEA, 2-AG, noladin, virodamina, além do próprio Δ
9
-THC.
Curiosamente algumas moléculas sintéticas como o WIN55,212-2 e o
AM281 não se ligam nestes receptores (Ryberg et al., 2007).
Estes experimentos nos desencorajaram a procurar por um
mecanismo de ação puramente CB
1
“clássico” para a LXA
4
no cérebro.
Consideramos que a baixa afinidade e potência da LXA
4
nos ensaios in
vitro preditivos para atividade canabimimética não são suficientes para
explicar o potente efeito canabinóide observado nos experimentos
comportamentais. Retornando à abordagem comportamental,
resolvemos investigar se o mecanismo de ação da LXA
4
poderia
envolver cooperação farmacológica com os endocanabinóides. Em
baixíssima faixa de doses, a LXA
4
claramente potencializou o efeito de
uma dose sub-efetiva de AEA, sem qualquer alteração no efeito do 2-
AG. Este experimento foi repetido e o mesmo padrão de resposta se
manteve. Enquanto nos sugeria que o mecanismo de ação da LXA
4
envolvia interação com os endocanabinóides, este experimento também
78
nos mostrava que havia diferenças importantes entre a AEA e o 2-AG
no que tange à interação com a LXA
4
que deveriam ser levadas em
consideração. Este foi certamente o primeiro indício sugerindo
claramente que a LXA
4
poderia exercer seu efeito tipo canabinóide em
outro alvo molecular ou em um sítio dos receptores CB
1
alternativo ao
sítio ortostérico “clássico” onde supostamente se ligam tanto a AEA
quanto o 2-AG.
A primeira tentativa de identificar um mecanismo com essa
característica foi investigar se a LXA
4
poderia exercer algum efeito
sobre a atividade das enzimas de degradação de endocanabinóides. Faria
sentido imaginar que a diferença nos resultados dos experimentos de
interação da LXA
4
com a AEA e o 2-AG fosse resultante de uma
inibição da enzima de degradação da AEA e ausência de efeito da LXA
4
sobre a degradação de 2-AG. No entanto, os resultados dos ensaios in
vitro desenhados para testar esta hipótese demonstraram que a LXA
4
não altera a atividade da FAAH, enzima de degradação da AEA, nem da
MAGL, enzima de degradação do 2-AG. Estes resultados foram
confirmados em um experimento mais elaborado, em que investigamos
o impacto da administração de uma dose cataleptogênica de LXA
4
nos
níveis de AEA e 2-AG em 3 estruturas cerebrais. Não houve qualquer
diferença relacionada ao tratamento com LXA
4
nos níveis de
endocanabinóides no hipocampo, córtex ou cerebelo, confirmando que a
LXA
4
não altera a degradação dos mesmos in vivo. Além do mais, este
experimento refutou de antemão qualquer hipótese de mecanismo
relacionado à alteração na síntese ou recaptação, bem como o possível
envolvimento de vias secundárias de metabolismo dos endocanabinóides
avaliados.
Examinados os alvos farmacológicos tradicionais, tentamos
elaborar uma hipótese de trabalho que fosse plausível o suficiente para
ser testada. Então decidimos tentar esclarecer esta situação repetindo o
experimento de interação entre a LXA
4
e AEA, mas desta vez utilizando
os ensaios in vitro que havíamos padronizado. Estes interessantes
resultados nos demonstraram que a LXA
4
contribui para a ligação da
AEA pelos receptores CB
1
nas membranas de cérebro, aumentando a
afinidade da AEA por estes receptores em cerca de 11 vezes no sítio de
alta afinidade e em 2 vezes no sítio de baixa afinidade. Este aumento de
afinidade da AEA ocorreu numa faixa de concentração de LXA
4
baixa o
bastante para se supor que ele constitua um efeito fisiologicamente
relevante. Mais uma vez, a existência de múltiplos sítios de interação no
ensaio de ligação sugere que haja interação em sítios diferentes dos
79
receptores CB
1
, subtipos diferentes de receptores CB
1
ou ainda outros
alvos moleculares envolvidos. No experimento de órgão isolado, o
efeito da interação entre LXA
4
e AEA não foi exatamente o mesmo
observado no ensaio de ligação. Enquanto a LXA
4
e a AEA induzem,
respectivamente, baixa e média inibição da contração da preparação de
ducto deferente, a combinação destes dois eicosanóides
surpreendentemente induziu um leve aumento na contração da
preparação. Este resultado é um tanto quanto intrigante, mas foi
observado contundentemente em nosso experimento. Por isso, testamos
os efeitos da interação entre a LXA
4
e o agonista canabinóide
WIN55,212-2 nas contrações do ducto deferente isolado e desta vez a
LXA
4
potencializou a inibição das contrações por este canabinóide
sintético. Se por um lado, estes resultados confirmam a suspeita de que a
LXA
4
contribui para a transmissão dos receptores CB
1
in vivo
interagindo com a AEA, ela também relembra o fato de que cada
molécula canabinóide possui efeitos diferenciados nos tecidos em que a
neuromodulação endocanabinóide atua, relembrando o conceito de
“seletividade funcional” do sistema endocanabinóide apresentado na
introdução desta tese. Diferenças na organização dos ensaios de ligação
e órgão isolado, assim como na constituição de membrana das
preparações de cérebro e ducto deferente devem explicar os diferentes
resultados alcançados. Enquanto o ensaio de ligação realizado nos
permite observar efeitos relacionados aos receptores CB
1
, pois a
“resposta” final que se observa é a inibição da ligação de um antagonista
específico destes receptores, o ensaio de inibição das contrações de
ducto deferente não permite inferências sobre a natureza dos receptores
envolvidos, a não ser que uma abordagem de antagonismo
farmacológico seja realizada, uma vez que diversos receptores diferentes
podem modular as contrações induzidas eletricamente nesta preparação.
Já que a AEA e a LXA
4
inibiram a ligação do [
3
H]SR141716A
em membranas de cérebro de camundongos, a interpretação natural
deste resultado seria que ambas as moléculas se ligam a receptores
canabinóides CB
1
com diferentes afinidades. Seguindo esta linha de
raciocínio, a AEA induziria resposta máxima na concentração de 10
µM, inibindo praticamente toda a ligação do [
3
H]SR141716A (0,5 nM),
enquanto que na mesma concentração de 10 µM a LXA
4
induziu
somente metade do efeito inibitório máximo. O teste de concentrações
mais altas de LXA
4
foi prejudicado pela baixa concentração dos
estoques disponíveis comercialmente para esta molécula, que dificultam
tecnicamente o experimento pela necessidade de evaporação de solvente
80
e aumento de concentração de estoque e inviabilizam financeiramente os
experimentos devido ao alto custo destes estoques, principalmente se
considerarmos a expressiva carga de impostos incluída nos preços dos
produtos científicos importados. Do ponto de vista de importância
fisiológica, a interpretação acima sugere que a AEA seria um ligante de
relativa baixa afinidade para os receptores CB
1
e a LXA
4
possui uma
afinidade praticamente desprezível para estes receptores. No entanto, se
considerarmos a altíssima potência da LXA
4
i.c.v. no ensaio da
catalepsia in vivo, cerca de 500 vezes a da AEA, aliado ao substancial
aumento de afinidade da AEA pelos receptores CB
1
provocado pela
LXA
4
em uma concentração que per se não altera a ligação do
[
3
H]SR141716A nas membranas cerebrais, pode-se pensar em uma
interpretação alternativa destes resultados. Considerando o conjunto de
resultados deste estudo, a hipótese mais provável de mecanismo de ação
para explicar os efeitos da LXA
4
no sistema endocanabinóide é a de que
a LXA
4
é um ligante de baixa afinidade no sítio ortostérico dos
receptores CB
1
, mas cumulativamente se liga a outro sítio onde favorece
a afinidade da AEA pelos receptores CB
1
. Este tipo de cooperação
funcional entre moléculas diferentes, em sítios diferentes de um mesmo
receptor ou oligômero proteico é chamada de alosterismo
(Christopoulos e Kenakin, 2002) e seus possíveis mecanismos e
implicações para a modulação endocanabinóide serão discutidos a
seguir.
A visão clássica da teoria de receptores farmacológicos foi
baseada nos estudos de enzimologia cinética que adotam a lei de ação
das massas como o mecanismo básico de interação entre ligantes e
receptores, assumindo na grande maioria das vezes o tipo de interação
mais simples possível, reversível, saturável e na proporção de 1 receptor
para 1 ligante, como o primeiro mecanismo de ação considerado. É uma
tendência geral na análise de estudos de interação ligante-receptor
considerar que a interação do ligante ocorre somente em um sítio de
ligação primário, normalmente reconhecido pelos agonistas (endógenos
e sintéticos) e pelos antagonistas competitivos (Christopoulos e
Kenakin, 2002). O sítio de ligação primário de um receptor protéico é
conceitualmente equivalente ao sítio de interação de uma enzima com
seu substrato, regido pelas leis fundamentais da termodinâmica, segundo
a teoria da ação das massas. Este sítio primário de interação ligante-
receptor é denominado sítio ortostérico (Proska e Tucek, 1994;
Christopoulos e Kenakin, 2002). Qualquer outro sítio deste receptor que
seja capaz de alterar as propriedades de ligação de substâncias ao sítio
81
ortostérico por uma mudança na conformação do receptor é classificado
como sítio alostérico (Christopoulos e Kenakin, 2002).
O marco inicial no desenvolvimento de uma teoria alostérica (que
no entanto ainda não tinha esse nome) veio de evidência experimental
sugerindo que mais de uma molécula de um ligante poderia se ligar a
certas enzimas ou canais iônicos, gerando uma mudança perceptível na
sua atividade e cinética, um fenômeno que na época foi chamado de
“cooperatividade” (Hill, 1910). O termo alostérico (do grego “outro
lugar”) foi usado pela primeira vez há meros 50 anos atrás na área de
enzimologia (Monod e Jacob, 1961) e mais claramente definido em um
artigo descrevendo a habilidade de certas enzimas de terem sua
atividade biológica modificada positivamente ou negativamente pela
ligação de substratos em sítios de ligação topograficamente distintos dos
sítios de ligação ortostéricos descritos (Monod et al., 1963). As
interações alostéricas acontecem quando a ligação de um ligante ao sítio
alostérico induz mudanças conformacionais na proteína que modulam a
ligação do substrato ao seu sítio ortostérico e vice-versa (Christopoulos
e Kenakin, 2002). De fato, muitos dos mediadores alostéricos não
exercem efeitos biológicos por si só, pois dependem da ligação de uma
substância ao sítio ortostérico para que o efeito biológico sinalizado pelo
receptor seja observado, ou seja, o efeito dos moduladores alostéricos é
modular a afinidade de um ligante pelo seu sítio ortostérico, mas em
geral não possuem ou possuem baixa eficácia, do ponto de vista
farmacológico. As características principais de uma ligação alostérica
em relação à ligação ortostérica são as seguintes:
1) Os sítios ortostéricos e alostéricos não se sobrepõem
estruturalmente e as ligações nesses sítios não são mutuamente
exclusivas, ou seja, a ligação a um sítio pode ocorrer
simultaneamente à ligação no outro.
2) A ligação de uma substância a um sítio afeta a ligação de um
segundo ligante ao outro sítio e vice-versa, ou seja, as ligações
alostéricas e ortostéricas são recíprocas.
3) O efeito de um ligante alostérico pode ser positivo ou negativo
em relação à ligação (afinidade) ou função (eficácia) de uma
substância no sítio ortostérico.
Uma evolução na teoria de interações alostéricas foi o
reconhecimento de que os receptores existem e se comportam como
populações e não como entidades únicas, além do que a estrutura
82
terciária dos receptores possui mais de um estado conformacional. As
flutuações estruturais (conformacionais) que alteram as propriedades de
ligação de uma população de receptores foram a partir de então
denominadas transições alostéricas (Monod et al., 1965). Depois da
adoção deste conceito de múltiplos estados conformacionais para os
receptores farmacológicos, definiu-se um conjunto de características
para proteínas (enzimas, receptores) que podem ser modulados
alostericamente:
1) Proteínas alostéricas possuem natureza oligomérica, ou seja, são
formadas por mais de uma subunidade.
2) Subunidades diferentes podem possuir sítios de ligação, gerando
interações estruturais cooperativas (positiva ou negativamente).
3) As subunidades podem se organizar como uma mistura de
estados conformacionais diferentes, permanecendo em equilíbrio
na ausência de ligantes. Essas transições entre conformações são
denominadas transições alostéricas.
4) A transição entre estados conformacionais envolve a conservação
de simetria molecular, de maneira que as subunidades movem-se
coordenadamente de um estado para outro.
5) Ligantes que possuem maior afinidade por um determinado
estado conformacional “selecionam” este estado conformacional,
deslocando o equilíbrio dinâmico de maneira a aumentar a
proporção de proteínas naquele estado. Como conseqüência, a
afinidade observada para um determinado ligante varia
dependendo do tipo e da proporção de estados conformacionais
disponíveis.
Esta mudança de conceito estrutural do receptor farmacológico
trouxe duas mudanças fundamentais de paradigma. Primeiro, os
cientistas passaram a considerar os receptores como uma população de
estados conformacionais possíveis e em equilíbrio dinâmico ao invés de
uma estrutura rígida cujo estado ativado era induzido pela presença de
um ligante (Kenakin, 1995). Segundo, passou-se a admitir que o(s)
estado(s) ativado(s) de um receptor possa(m) ocorrer em um
determinado tecido na ausência de ativação induzido por ligante,
introduzindo o conceito de atividade intrínseca (Leff, 1995). A
possibilidade mais simples considerando este modelo seria a existência
de dois estados conformacionais dos receptores, um estado “inativo” e
um “ativado”. Este modelo de dois estados, assim como sua elaboração,
83
o modelo de múltiplos estados, envolve um mecanismo de seleção
conformacional por ligante, pelo qual uma molécula se liga
seletivamente a uma conformação pré-existente do receptor, criando um
viés que aumenta proporcionalmente a quantidade desta conformação
por deslocamento de equilíbrio dinâmico. O modelo de múltiplos
estados conformacionais é termodinamicamente preferível em relação
ao modelo antigo de indução conformacional, onde o ligante era o
principal responsável na geração da nova conformação do receptor
(Burgen, 1981; Kenakin, 1995). A figura 29 abaixo ilustra o modelo
teórico mais simples de eqüilíbrio dinâmico de múltiplos (2) estados
conformacionais.
84
Figura 29 – Ilustração do modelo teórico de múltiplos estados conformacionais
de receptores farmacológicos. Duas (ou mais) conformações de receptores co-
existem em equilíbrio dinâmico. As porcentagens sugerem proporções da
população de receptores em estado de equilíbrio dinâmico, na presença de
ligantes agonistas ou antagonistas. Segundo este modelo teórico, a ativação de
um receptor por um agonista ocorre quando o agonista estabiliza a
conformação ativada do receptor, que possui afinidade para a proteína G
respectiva. R: receptor inativo, R*:receptor ativado; L+:ligante agonista;
L0:ligante antagonista.(Figura baseada em Christopoulos e Kenakin (2002).
O modelo de múltiplos estados simplifica a compreensão do
alosterismo, permitindo que a modulação alostérica exista simplesmente
como uma conseqüência natural da preferência de um ligante por um
estado conformacional ou outro, sem necessariamente implicar na
existência de um segundo sítio físico de interação alostérica em cada
conformação, como se inferiria a partir do modelo estático
monoconformacional. No entanto, o modelo de interação alostérica
entre dois sítios também não exclui a existência de múltiplos estados
conformacionais, de maneira que ambas as explicações são
complementares e podem se aplicar a situações diferentes. O conceito de
múltiplos estados conformacionais será importante para a compreensão
da visão farmacológica moderna de alosterismo nos receptores
acoplados a proteínas G, assim como do conceito de seletividade
funcional em receptores canabinóides CB
1
, abordado mais a frente.
Os receptores acoplados a proteínas G (metabotrópicos)
constituem a maior família de receptores farmacológicos e são
responsáveis pela maioria dos eventos de transdução de sinal que
ocorrem na célula. Estes receptores respondem a uma grande variedade
de moléculas relativamente pequenas e de classes químicas bastante
diversas, como aminas, peptídeos, hormônios e lipídeos promovendo
mudanças conformacionais e interações proteína-proteína que resultam
na passagem da informação química do meio extracelular (interação
molécula-receptor) para o meio intracelular (interação receptor-proteína
G) com as respostas características dependendo do tipo celular em
questão. A proteína G possui sub-unidades α e βγ que interagem com
intermediários proteicos intracelularmente. A sub-unidade α possui
atividade catalítica para guanosina-tri-fosfato (GTP), que é o princípio
da ativação de cascatas intracelulares de fosforilação e amplificação de
sinal intracelular (Christopoulos e Kenakin, 2002). Como já discutido
anteriormente, os receptores ligados a proteínas G possuem afinidade
para moléculas em seu sítio ortostérico (convencionalmente definido
85
como o sítio de ligação do agonista endógeno), mas também pode ser
alvo de ligação de moduladores alostéricos que facilitam ou dificultam a
ligação da molécula “principal” ao seu sítio ortostérico. A informação
alostérica pode ser transmitida através do citosol da célula, afetando a
interação entre o receptor farmacológico e seus efetores intracelulares
como a proteína G e sistemas de transdução de sinal subseqüentes.
Figura 30 – Ilustração do modelo teórico de alosterismo conforma a teoria de
múltiplos estados conformacionais de receptores farmacológicos. Duas (ou
mais) conformações de receptores co-existem em equilíbrio dinâmico. As
porcentagens sugerem proporções da população de receptores em estado de
equilíbrio dinâmico, na presença de ligantes alostéricos e agonista. Segundo
este modelo teórico, a ativação de um receptor por um agonista ocorre quando
o agonista estabiliza a conformação ativada do receptor, que possui afinidade
para a proteína G respectiva. O ligante alostérico se liga a uma conformação
pré-ativada do receptor, aumentando a afinidade deste pelo ligante agonista e
86
possivelmente causando uma maior resposta biológica. R: receptor inativo,
R*:receptor ativado; RA:receptor inativo com ligante alostérico; RA*: receptor
ativado com ligante alostérico; L+:ligante agonista; LA:ligante alostérico.
(Figura baseada em Christopoulos e Kenakin (2002).
Diferentes ligantes podem ativar vias de sinalização diferentes,
dependendo da sua afinidade para os diversos sítios e estados
conformacionais do receptor, esta propriedade foi denominada
seletividade funcional (Kenakin, 2007). A natureza dos moduladores
alostéricos é bastante permissiva, de modo que a função do modulador
alostérico pode mudar ligeiramente dependendo do ligante ortostérico e
dos mediadores intracelulares, como vimos acima. Essa possibilidade de
“mudança” de atividade torna os moduladores alostéricos substâncias
muito mais versáteis do que moduladores ortostéricos convencionais do
ponto de vista farmacológico. Três características marcantes da ligação
alostérica nos receptores ligados a proteínas G é que esta ligação é
saturável, é mutuamente dependente do ligante ortostérico e pode causar
efeitos diferenciados na afinidade e eficácia aparentes do ligante
principal (Kenakin, 2009). Como os efeitos do alosterismo dependem
em grande parte da alteração conformacional do receptor, não há regras
muito bem definidas quanto ao que pode acontecer como resultado da
interação com as diferentes moléculas que se ligam ao mesmo receptor.
A modulação do sinal intracelular pode ser inclusive qualitativamente
diferente da resposta causada pelo agonista endógeno, sintonizando as
respostas funcionais de acordo com a necessidade celular momentânea
(Jakubik et al., 1997). A figura 31 abaixo nos dá uma idéia da gama de
possibilidades de modulação do efeito de um agonista total em uma
determinada preparação por supostos moduladores alostéricos.
Algumas das interações entre proteínas são passageiras, como
aqueles entre a porção intracelular de receptores metabotrópicos e as
proteínas G ou uma cascata de transdução de sinal; outras vezes, as
interações proteína-proteína são mais estáveis envolvendo a formação
de complexos multiméricos estáveis e de longa duração. De toda forma,
a interação entre proteínas envolve a formação de ligações entre elas e
alterações estruturais que podem determinar as conseqüências
funcionais desta interação. A figura clássica dos receptores
metabotrópicos como entidades únicas (monômeros) está sendo revista
desde a descoberta de que os receptores metabotrópicos podem formar
complexos protéicos estáveis com outras proteínas além das proteínas
G. Atualmente, inúmeras evidências apontam para o fato de que
monômeros de receptores metabotrópicos podem interagir combinando-
87
se entre si (homodímeros) ou com monômeros de outros receptores
metabotrópicos (heterodímeros) ou mesmo heterômeros de maior
ordem, com 3 ou mais monômeros agrupados (Christopoulos e Kenakin,
2002). Um tipo característico de alosterismo pode surgir desta interação
entre monômeros de receptores. Por exemplo, se o complexo
multimérico possui propriedades farmacológicas diferentes das
proteínas originais no que diz respeito à ligação de substâncias em seu
sítio ortostérico, este tipo de interação é denominada alosterismo por
multimerização e moduladores alostéricos podem agir em uma ou outra
destas proteínas para alterar a resposta funcional final. A formação de
complexos multiméricos é mais recente no campo de estudo dos
receptores metabotrópicos, mas já é amplamente conhecido para outras
famílias de receptores. Os receptores para fatores de crescimento como
o EGF e FGF e para interferons foram identificados como homodímeros
estruturais (Hebert e Bouvier, 1998). Da mesma forma, receptores
ligados a canais iônicos também são conhecidos por ocorreram em
heterooligômeros, ou seja são compostos por múltiplas sub-unidades de
diferentes tipos protéicos, cuja combinação pode levar a uma grande
variedade de sub-tipos de receptores possíveis e funcionalmente viáveis
(Galzi e Changeux, 1994).
88
Figura 31 – Efeitos da modulação alostérica sobre a afinidade e eficácia de um
agonista total. O painel central é o efeito do agonista total sem nenhuma
interferência (linhas azuis). Todos os outros são possibilidades de modulação
alostérica (linhas vermelhas). (Figura modificada de Kenakin (2009)).
Em suma, moduladores alostéricos podem influenciar os efeitos
de agonistas no sítio ortostérico de um receptor por alteração de sua
afinidade por este receptor, por influência da interação deste receptor
com outros receptores (dímeros), com suas respectivas proteínas G ou
via interação com outras proteínas integrantes da sinalização
intracelular. Os moduladores alostéricos podem até mesmo modular a
resposta celular a um dado agonista (sua eficácia) sem alterar sua
ligação ao receptor (sua afinidade) (Kenakin, 2009). Importante lembrar,
a modulação alostérica pode ocorrer com moléculas endógenas ou
exógenas (sintéticas ou naturais). Enquanto as endógenas fazem parte do
processo de regulação fina da transmissão celular, os moduladores
alostéricos exógenos tem sido um grande alvo de busca por potencial
terapêutico, com a promessa de promoverem menos efeitos colaterais do
89
que moduladores atuando diretamente nos sítios principais de ligação
dos neurotransmissores. Uma das possíveis vantagens reais dos
moduladores alostéricos seria a capacidade destas moléculas exercerem
efeito seletivo em determinados tipos celulares ou tecidos que
expressem o dímero de receptores para os quais o modulador alostérico
possui alta afinidade (Milligan e Smith, 2007). Outro potencial efeito
interessante dos moduladores alostéricos que pode ser terapeuticamente
útil é a possibilidade de obtenção de um modulador negativo que reduza
a eficácia ao mesmo tempo em que aumente a afinidade de um receptor
pelo seu agonista. Como o alosterismo é recíproco, desta maneira
teríamos um antagonista alostérico cuja afinidade aumentaria com o
aumento da concentração do agonista. O resultado seria uma espécie de
antagonista “inteligente” capaz de sentir as alterações de concentração
do ambiente próximo ao receptor e ajustar a sua potência de acordo com
estas variações (Kenakin, 2009). É exatamente isso que acontece com o
modulador alostérico negativo dos receptores NMDA ifenprodil, para o
qual foi demonstrado um aumento de potência com concentrações
crescentes do agonista ortostérico NMDA (Kew et al., 1996). Além de
fármacos e substâncias sintéticas, substâncias endógenas,
neurotransmissoras também podem agir como moduladores alostéricos.
Alguns exemplos de receptores que sofrem modulação alostérica
endógena são os receptores nicotínicos de acetilcolina (Galzi et al.,
1991) ou os receptores GABA
A
de GABA (Sigel e Buhr, 1997), que
ligam duas moléculas de seus agonistas endógenos, sendo que a ligação
da primeira facilita cooperativamente a ligação da segunda molécula.
No grupo dos receptores metabotrópicos, podemos citar como exemplo
os receptores muscarínicos de acetilcolina que possui interações
alostéricas entre 5 sub-unidades diferentes dependendo da composição
do receptor muscarínico (Holzgrabe et al., 1996; Christopoulos et al.,
1998). Esta diferença na composição de receptores multiméricos é uma
das explicações para a diferença de afinidade observada para a mesma
substância em tecidos/tipos celulares diversos.
Está cada vez mais evidente que os receptores metabotrópicos
possuem sítios de ligação alostérica para ligantes endógenos e sintéticos
e que a ligação do modulador alostérico provoca uma mudança no
equilíbrio entre as diversas conformações do receptor, afetando a
afinidade e/ou eficácia dos ligantes endógenos (Christopoulos e
Kenakin, 2002). Considerando o objetivo desta tese, qual a importância
da modulação alostérica para a sinalização celular via receptores
canabinóides? Até há pouco tempo atrás, não se tinha o menor
90
conhecimento sobre a existência de sítios de modulação alostérica nos
receptores canabinóides. Foi somente há 5 anos atrás que compostos
sintéticos que atuam como moduladores alostéricos nos receptores
canabinóides CB
1
foram desenvolvidos pela companhia farmacêutica
inglesa Organon (Price et al., 2005). Estes compostos, batizados de
Org27596 e Org29647 possuem características interessantes como
moduladores alostéricos: eles aumentam a ligação e diminuem a
constante cinética de dissociação do agonista canabinóide [
3
H]CP55940
a membranas do cérebro de camundongos, reduzem a eficácia de
agonistas canabinóides do sítio ortostérico de maneira não competitiva e
de maneira ligante-dependente, com efeitos diferentes para agonistas e
antagonistas (Price et al., 2005). Ambos os compostos Org aumentam a
afinidade do agonista [
3
H]CP55940 e reduzem a afinidade do
antagonista [
3
H]SR141716A favorecendo a sinalização canabinóide
(Price et al., 2005). Mais recentemente uma nova molécula PSNCBAM-
1 foi sintetizada e caracterizada farmacologicamente, ampliando a
dimensão da modulação alostérica canabinóide. Esta molécula possui
um perfil farmacológico bastante diferenciado, pois aumenta a afinidade
do agonista [
3
H]CP55940, mas diminui sua eficácia de recrutamento de
proteínas G de forma não competitiva. Da mesma maneira que para as
moléculas Org, o efeito do PSNCBAM-1 é ligante dependente, pois ele
diminui a afinidade do antagonista [
3
H]SR141716A (Horswill et al.,
2007). Estes dados invocam o princípio da seletividade funcional para
os receptores canabinóides CB
1
, sugerindo que os receptores se
comportam diferentemente dependendo do tipo de ligante.
Apesar da contundente modulação alostérica positiva observada
no ensaio de ligação, aumentando a ligação de moléculas no sítio do
agonista, mas diminuindo a ligação no sítio do antagonista nos
receptores canabinóides CB
1
, o efeito mais intrigante do estudo
comentado acima é provavelmente a diferença observada entre os
efeitos dos compostos Org no ensaio de ligação e nos ensaios funcionais
(Price et al., 2005). Ao contrário do observado no ensaio de ligação
onde os compostos Org influenciaram a afinidade por modulação
alostérica, os compostos Org se comportaram como antagonistas não-
competitivos nos ensaios de acoplamento à proteína G com [
35
S]GTPγS
e no ensaio de inibição de contração neurogênica do ducto deferente
isolado, diminuindo a eficácia e efeito máximo dos agonistas
WIN55,212-2, CP55940 e AEA. Este efeito foi observado somente na
presença dos ligantes ortostéricos, não houve evidência de agonismo ou
91
agonismo inverso pelos compostos Org per se sobre a contração do
ducto deferente.
A proposta dos autores para explicar estes efeitos foi de que,
segundo a teoria multiconformacional, os receptores CB
1
existem em
pelo menos dois estados conformacionais, o antagonista SR141716A
estabiliza uma conformação do receptor CB
1
em estado inativado, talvez
acoplado à proteína G em estado de alta afinidade ao GDP, enquanto o
agonista CP55940 estabilizaria o receptores CB
1
em uma conformação
ativada, acoplado à proteína G ligada a GTP. Neste contexto, a função
dos moduladores alostéricos seria manter os receptores CB
1
em um
estado “pré-ativado”, de alta afinidade, já acoplado à proteína G, mas
sem de fato implicar em sinalização intracelular (Ross, 2007). Assim, os
compostos Org não seriam agonistas, antagonistas ou agonistas inversos
dos receptores CB
1
, mas uma classe à parte de moduladores químicos,
pois eles praticamente não exercem nenhum efeito observável nas
preparações in vitro na ausência de agonista. O PSNCBAM-1 também
não alterou a sinalização de receptores CB
1
expressos heterologamente
em células de leveduras por si só, mas antagonizou a inibição de sinal
induzida pelo agonista CP55940 e interferiu com a sinalização
canabinóide endógena diminuindo o consumo de alimento quase tão
eficientemente quanto o antagonista SR141716A (Horswill et al., 2007).
Mudanças de estados conformacionais dos receptores CB
1
dependendo
do ligante interagindo com o receptor foram demonstradas por
modelagem molecular (Shim e Howlett, 2006).
Em suma, os moduladores alostéricos de receptores CB
1
sintéticos estudados até o momento possuem efeitos marcantemente
divergentes quanto à afinidade e eficácia dos ligantes ortostéricos. Estas
moléculas aumentam a afinidade, ao mesmo tempo em que diminuem a
eficácia dos agonistas canabinóides, gerando uma espécie de paradoxo
farmacológico complexo (Ross, 2007). O maior legado desta descoberta
pode contudo não ter sido a obtenção dos compostos Org e PSNCBAM-
1 em si, mas o reconhecimento da existência e a caracterização dos
sítios alostéricos nos receptores CB
1
e sua possível influência no sistema
endocanabinóide. A exemplo do que aconteceu com o Δ
9
-THC e a AEA,
a descoberta dos moduladores alostéricos sintéticos pode ser somente o
primeiro passo na descoberta de mediadores endógenos que façam parte
do sistema endocanabinóide ou mesmo que permitam um intercâmbio
de informações entre sistemas de neurotransmissão paralelos.
Além do alosterismo via modulação por substâncias sintéticas
agindo diretamente em sítios alostéricos do receptor, há também
92
evidências da modulação alostérica por dimerização dos receptores CB
1
com outros receptores metabotrópicos. Até o momento, sabe-se que os
receptores CB
1
formam homodímeros com até 4 monômeros
(tetrâmeros) de receptores CB
1
e heterodímeros com receptores D
2
de
dopamina, receptores µ opióides, receptores A
2A
de adenosina,
receptores β
2
de noradrenalina e receptores OX
1
de orexina (Wager-
Miller et al., 2002; Kearn et al., 2005; Ellis et al., 2006; Rios et al.,
2006; Carriba et al., 2007). Essas interações multiméricas interferem em
vários aspectos funcionais dos receptores CB
1
, incluindo as vias de
sinalização intercelular recrutadas pela ligação de agonistas
canabinóides. A dimerização entre receptores CB
1
e D
2
foi
inequivocamente demonstrada por imunoprecipitação e ocorre mesma
na ausência de agonistas. No entanto, agonistas CB
1
tendem a aumentar
a taxa de dimerização, enquanto agonistas inversos tendem a diminuir a
associação entre os dois receptores (Kearn et al., 2005). Por meio da
atuação nos dímeros CB
1
-D
2
, os agonistas CB
1
podem reverter a
inibição da adenilato ciclase e da fosforilação de MAP produzida por
agonistas D
2
, causando um efeito contrário ao produzido pelo agonismo
de receptores CB
1
expressos isoladamente (Glass e Felder, 1997; Kearn
et al., 2005). A explicação provável para esse mecanismo cooperativo é
que a dimerização com receptores D
2
faz com que os receptores CB
1
promovam uma troca diametralmente oposta de efetor intracelular e
ativem proteínas G
s
estimulatórias, ao invés das usuais proteínas G
i/o
inibitórias (Jarrahian et al., 2004). Um fenômeno similar ocorre quando
receptores CB
1
se dimerizam com receptores µ opióides, com
conseqüente alteração da eficácia de ativação das vias de MAP quinase
por agonistas canabinóides e opióides. Neste caso, a ativação de cada
um dos receptores do dímero por seus agonistas gera ativação de
sinalização via proteínas G
i
inibitórias, enquanto a co-ativação dos
receptores no dímero gera ativação de proteínas G
s
estimulatórias (Rios
et al., 2006). Por outro lado, a dimerização de receptores CB
1
e β
2
adrenérgicos resulta em um efeito contrário, promovendo a afinidade
por proteínas G
i
e praticamente impedindo o acoplamento a proteínas
G
s
. Este efeito é decorrente exclusivamente da interação física entre os
receptores, uma vez que a administração de agonistas ou antagonistas β
2
adrenérgicos não altera a funcionalidade do dímero (Hudson et al.,
2010). A co-ativação de receptores CB
1
e A
2A
dimerizados também leva
à ativação de proteína G
i
inibitórias e inibição da produção de AMPc
induzida por forskolin, muito embora os receptores CB
1
tenham
capacidade de ativar proteínas G
i
inibitórias por si só (Carriba et al.,
93
2007). Estes resultados indicam que a dimerização CB
1
-A
2A
gera uma
estrutura física que não permite o acoplamento a proteínas G
i
na
ausência de agonistas A
2A
, funcionando como um detector de
coincidência de sinal entre estes dois sistemas de neurotransmissão.
Receptores CB
1
também formam dímeros funcionalmente ativos com
receptores de orexina OX
1
. Esses receptores são co-expressos em
algumas áreas cerebrais, particularmente no hipotálamo lateral onde
modulam a atividade de ingesta de alimento, o que pode explicar os
efeitos do modulador alostérico PSNCBAM-1 apresentados
anteriormente. A potência da orexina A, o agonista endógeno dos
receptores OX
1
, em ativar cascatas de fosforilação via MAP e ERK
quinases foi aumentada em cerca de 100 vezes quando os receptores
OX
1
foram co-expressos com receptores CB
1
em células ovarianas de
hamsters, em comparação aos efeitos observados em células
expressando somente os receptores OX
1
(Hilairet et al., 2003). O
tratamento de células co-expressando os dois receptores com o
antagonista CB
1
SR141716A provocou uma redução na capacidade da
orexina A e o tratamento destas células com o antagonista OX
1
SB-
674042 diminuiu a potência do agonista canabinóide WIN55,212-2 de
ativar a via de fosforilação da MAP quinase, de acordo com o processo
de reversibilidade mútua da modulação alostérica (Hilairet et al., 2003).
Curiosamente, os receptores CB
1
também formam homodímeros, ou
seja, dímeros de receptores iguais, com até quatro monômeros de CB
1
.
Não se sabe ao certo qual a vantagem fisiológica desta forma
cooperativa de alteração estrutural (Mackie, 2005). Uma possibilidade
seria a cooperação entre diferentes variantes estruturais, receptores CB
1a
e CB
1b
como abordado anteriormente.
A pesquisa envolvendo alosterismo por dimerização pode
indubitavelmente resultar na geração de drogas com alvos
farmacológicos inovadores e com o potencial de agir diferentemente em
determinados tipos celulares, rompendo com o dogma da procura por
drogas que ajam isoladamente em um único receptor. Vale a pena
comentar a opinião dos pesquisadores Miligan e Smith, para os quais:
94
“a identificação de moduladores alostéricos
requer uma mudança na abordagem de
triagem farmacológica utilizada na indústria
farmacêutica, porque se um receptor é
estudado isoladamente em uma linhagem de
células heterólogas, a dimerização de
receptores nunca será observada. Novas
abordagens de triagem ou o retorno para o
uso de tecidos íntegros na identificação de
novos ligantes são necessários” (Milligan e
Smith, 2007).
Tendo em vista as considerações acima e à luz dos resultados
reunidos no presente estudo seria plausível sugerir a LXA
4
como um
modulador alostérico endógeno dos receptores canabinóides CB
1
. A
interpretação dos efeitos da LXA
4
sobre a neurotransmissão
endocanabinóide seria que ela aumenta a afinidade de ligantes como a
AEA e o WIN55212-2 (e provavelmente não do 2-AG) para o sítio
ortostérico de agonistas, exercendo uma pequena redução de afinidade
no sítio de antagonista, como observado pelo ensaio com o SR141716A.
O aumento de afinidade da AEA pelos receptores CB
1
é acompanhado
de um contundente aumento de potência nos seus efeitos centrais, e por
uma curiosa mudança qualitativa no efeito observado na
neurotransmissão no ducto deferente. Uma possibilidade é que a LXA
4
estabilize uma forma pré-ativada do receptor CB
1
cerebral, mas não
exerça acoplamento à proteína G e transdução de sinal intracelular
(efeito funcional), até que ocorra a ligação de um agonista ortostérico.
No ducto deferente, talvez pela diferença de constituição molecular no
sítio onde os receptores CB
1
se encontram, ou por proporção diferente
de isoformas dos receptores CB
1
, ou ainda pela presença de receptores
distintos, a ligação simultânea de LXA
4
e AEA provoca o acoplamento
a proteínas G estimulatórias, ao invés das proteínas G inibitórias
ativadas pela LXA
4
e AEA individualmente. O alosterismo por
dimerização poderia explicar este efeito colaborativo, assim como foi
demonstrado para a dimerização entre receptores CB
1
e D
2
ou CB1 e µ
opióides (Jarrahian et al., 2004; Kearn et al., 2005). Uma possibilidade
seria a dimerização dos receptores CB
1
com os próprios receptores ALX
de lipoxinas, isto considerando que os receptores ALX sejam expressos
no ducto deferente (informação ainda indisponível). Outro candidato
para mediador da inibição de contração causada pela AEA no ducto
95
deferente poderiam ser os receptores vanilóides TRPV
1
, onde agem
tanto a capsaicina quanto a AEA (Ross et al., 2001; Pertwee et al.,
2005). A possibilidade de dimerização entre receptores CB
1
e TRPV
1
no
ducto deferente é reforçada pelo fato de que tanto o antagonista CB
1
SR141716A quanto o antagonista TRPV
1
capsazepina bloqueiam
indiscriminadamente os efeitos de agonistas canabinóides (AEA, m-
AEA, WIN55,212-2) e vanilóides (capsaicina, resiniferatoxina) nesta
preparação (Ross et al., 2001). Interessante notar que ao contrário do
que ocorreu com a AEA, a inibição de contração do ducto deferente
causada pelo agonista WIN55,212-2 foi potencializada pela LXA
4
demonstrando a seletividade funcional da modulação alostérica dos
receptores CB
1
pela LXA
4
.
Além disso, o perfil farmacológico apresentado pela LXA
4
na
contração do ducto deferente (sensível ao SR141716A e na mesma
direção do WIN55,212-2) é similar ao perfil observado para moléculas
que se ligam ao suposto receptor “CB
3
”, ainda não caracterizado
molecularmente (Pertwee et al., 2005). A participação de receptores
GPR55 está aparentemente descartada, pois até onde se sabe o
WIN55,212-2 não se liga nestes receptores (Ryberg et al., 2007). Para a
confirmação inequívoca do perfil farmacológico da LXA
4
na preparação
de ducto deferente seria necessário testar a sensibilidade a ambos
antagonistas SR141716A e AM251, ao qual agonistas CB
3
seriam
insensíveis, e repetir os ensaios in vitro em tecido de animal knock-out.
Por si só, o fato de que a LXA
4
inibe a ligação do antagonista CB
1
em
dois sítios de interação é evidência suficiente para se suspeitar de pelo
menos dois alvos moleculares distintos. Sem desconsiderar o que foi
discutido anteriormente, pode-se pensar que um dos alvos seria o sítio
ortostérico dos receptores CB
1
, onde a LXA
4
se ligaria exercendo os
efeitos CB
1
“diretos” (ex: 25% de inibição no órgão isolado) e o outro
sítio, um sítio alostérico, “silencioso” no que tange à função principal
deste receptor, mas capaz de influenciar a ligação de outros ligantes ao
sítio principal. Esta é, até prova contrária, a explicação mais concreta
possível para os efeitos centrais da LXA
4
observados no presente
estudo, convergindo os resultados obtidos nos testes comportamentais e
nos ensaios utilizando tecido nervoso central.
Identificado um mecanismo de ação plausível para os efeitos da
LXA
4
, nos dedicamos a investigar uma possível relevância fisiológica
da LXA
4
para a transmissão endocanabinóide. Primeiramente,
decidimos quantificar os níveis endógenos de LXA
4
nas três estruturas
cerebrais onde já havíamos identificado a presença dos
96
endocanabinóides. A LXA
4
se mostrou presente no córtex, cerebelo e
hipocampo, com maiores níveis nesta última estrutura. Curiosamente, os
níveis endógenos de LXA
4
seguem o padrão dos níveis de AEA (maior
presença no hipocampo), mas não os de 2-AG (maior presença no
córtex), pelo menos entre as áreas analisadas. Confirmada a presença de
LXA
4
nas mesmas áreas em que os endocanabinóides também estão
presentes, decidimos testar a importância da LXA
4
para os efeitos da
AEA in vivo. Desta vez realizamos uma abordagem inversa ao do
experimento de potencialização realizado anteriormente, inibindo a
enzima 5-LOX para inibir a síntese de LXA
4
e conseqüentemente
reduzir seus níveis endógenos. Surpreendentemente, a inibição da 5-
LOX exerceu um grande impacto na transmissão endocanabinóide,
reduzindo o efeito de uma dose cataleptogênica de AEA praticamente
pela metade. O experimento subseqüente comprovou que a presença de
LXA
4
aplicada exogenamente é suficiente para re-estabelecer a potência
da AEA, mesmo com os níveis endógenos reduzidos pela inibição da 5-
LOX. Interessante notar que os efeitos da inibição da 5-LOX sobre o
comportamento de roedores têm sido recentemente investigados.
Camundongos knock-out para a enzima 5-LOX exibem distúrbios de
emocionalidade, com redução de comportamento ansiogênico no teste
do labirinto em cruz elevado (Uz et al., 2002) e redução de
comportamento tipo depressivo no teste do nado forçado (Uz et al.,
2008). Nossos dados sugerem que estes efeitos podem ser decorrentes
da diminuição da potência de agonistas canabinóides nos receptores
canabinóides CB
1
. Além disso, já se sabe que o efeito anti-inflamatório
do canabinóide sintético ácido ajulêmico envolve a ativação de
receptores canabinóides CB
1
e a formação de LXA
4
in vivo (Zurier et
al., 2009). Este estudo utilizou propositalmente o ácido ajulêmico pela
sua ausência de efeitos centrais, enquanto que no presente estudo nós
demonstramos que esta interação entre o sistema da LOX e
endocanabinóides também acontece no SNC.
A imagem que se apresenta é a de que a LXA
4
endógena de fato
possui uma função fisiologicamente relevante na transmissão
endocanabinóide, podendo supostamente agir mesmo como um co-
agonista da AEA nos receptores canabinóides CB
1
. Poder-se-ia imaginar
uma regulação interna do sistema endocanabinóide, com transmissores
diferentes liberados em diferentes freqüências de estímulo neuronal, ou
mesmo a liberação de um endocanabinóide isolado ou em combinação
com outros dependendo do tipo celular do neurônio em questão. Embora
estas hipóteses sejam atraentes, não possuímos dados concretos que nos
97
permitam refutá-las ou confirmá-las até o momento. No entanto, estas
especulações são úteis como exercício na formulação de novas hipóteses
e abordagens experimentais.
Por fim, investigamos se a 15-epi-LXA
4
, gerada como efeito da
aspirina, compartilha in vivo dos mesmos efeitos canabimiméticos
observados para a LXA
4
. Comprovando a expectativa, a administração
de aspirina por via oral potencializa os efeitos da AEA injetada por via
i.c.v. de forma dependente de dose e tempo de administração. Além
disso, demonstramos que este efeito da aspirina é indireto, pois depende
essencialmente de derivados da via das LOX. Pode-se criticar que este
efeito é artificial, pois só ocorreu em uma dose consideravelmente alta
de aspirina; no entanto, é importante que se considere que o teste
comportamental utilizado (catalepsia) geralmente só pode ser induzido
em altas doses, mesmo para os canabinóides clássicos como o Δ
9
-THC.
De toda maneira, este experimento serve como identificação de um
possível mecanismo de ação canabinóide indireto para a aspirina, que
pode ser relevante em estados de desequilíbrio do organismo, como a
inflamação, além de constituir uma interessante abordagem
experimental para o estudo da relação entre as vias de COX, LOX e
endocanabinóides. Recentemente foi identificado um mecanismo
canabinóide indireto para o paracetamol, por exemplo (Dani et al., 2007;
Umathe et al., 2009). O metabolismo da molécula do paracetamol com
posterior conjugação com ácido araquidônico gera um derivado
estrutural (AM404) que inibe a recaptação de endocanabinóides,
aumentando os níveis endógenos destas moléculas (Hogestatt et al.,
2005). O aumento dos níveis de endocanabinóides certamente contribui
para o efeito analgésico do paracetamol (Dani et al., 2007; Mallet et al.,
2008), além de ter inspirado a investigação de um surpreendente
potencial terapêutico do paracetamol como ansiolítico (Umathe et al.,
2009).
Como abordagem complementar, demonstramos que a 15-epi-
LXA
4
co-administrada por via i.c.v. potencializa o efeito
cataleptogênico da AEA de uma maneira independente de receptores
ALX, mas sensível ao antagonista canabinóide CB
1
SR141716A. Estes
experimentos confirmaram os resultados anteriormente observados para
a LXA
4
de ocorrência natural e resultaram na publicação de um artigo
em periódico científico internacional (em anexo).
O substrato teórico fundamental para estes experimentos foi que
as enzimas COX participam do metabolismo dos endocanabinóides,
sendo que inibidores da COX-2 potencializam o efeito de
98
endocanabinóides, sugerindo uma relação funcional entre estas vias
eicosanóides (Slanina e Schweitzer, 2005). A mesma interação entre as
enzimas COX e os endocanabinóides foi observada in vivo. O efeito
analgésico do inibidor não seletivo de COX indometacina é bloqueado
pelo antagonista canabinóide AM251 e ausente em camundongos CB
1
-/-
(Guhring et al., 2002), além do mais, inibidores seletivos de COX-2
prejudicam a aquisição de memórias espaciais via ativação de receptores
CB
1
(Teather et al., 2002; Rall et al., 2003), sugerindo a participação de
endocanabinóides nestes efeitos. Além de inibir a COX não
seletivamente, um efeito particular da aspirina é a acetilação da COX-2
com a conseqüente geração de mediadores lipídicos intermediários que
são substratos da LOX. O final desta reação é a geração da 15-epi-
LXA
4
, como já explicado na introdução. Sabe-se que derivados da via
das LOX participam dos efeitos anti-inflamatórios periféricos da
aspirina, mas praticamente não se tem idéia de seus efeitos no SNC. Até
o momento não há evidência experimental sugerindo a participação da
via da LOX na potencialização dos efeitos de endocanabinóides pela
aspirina. Esta possibilidade de que uma lipoxina gerada por ação da
aspirina potencializaria os efeitos centrais de um endocanabinóide
pareceu bastante desafiadora. Essa seria uma descoberta bastante
promissora, incentivando a investigação da relação entre as vias de LOX
e os endocanabinóides, além da sua já conhecida relação com a via das
COX no SNC, com potencial terapêutico na neuroproteção (Chen e
Bazan, 2005).
As diversas vias eicosanóides podem influenciar umas às outras,
formando vias de sinalização interativas que regulam a fisiologia do
sistema endocanabinóide. A descrição da lista completa de moléculas
que influenciam a atividade dos receptores canabinóides será
imprescindível na compreensão deste sistema como um todo (Placzek et
al., 2008). Mesmo a presença de lipídeos que não se ligam diretamente a
receptores canabinóides pode interferir na sua função. A influência da
composição de membrana lipídica na produção de endocanabinóides
tem sido documentada. Por exemplo, as cavéolas, microdomínios
lipídicos ricos em colesterol, esfingolipídeos e ácido araquidônico
organizados por proteínas estruturais conhecidas como caveolinas,
alteram a ligação de endocanabinóides aos receptores CB
1
(Bari et al.,
2005). O tratamento de células com metil-β-ciclodextrina, um agente
que desorganiza as cavéolas, resulta em um aumento de afinidade do
agonista CP55940 pelos receptores CB
1
e aumento da sinalização via
AMPc e MAP quinase dependente de proteína G (Bari et al., 2005). A
99
composição das cavéolas também facilita a captação de AEA da região
perisináptica (McFarland et al., 2004; McFarland et al., 2006) e há
indícios que os produtos da degradação de endocanabinóides passam a
integrar as cavéolas depois da hidrólise de AEA ou 2-AG, de maneira
que as cavéolas funcionam como uma espécie de “tampão”, regulando
os níveis extracelulares e atividade dos endocanabinóides (McFarland et
al., 2006). Considerando as moléculas que atuam diretamente em
receptores canabinóides e correlatos, o que se sabe até o momento é que
a COX-2 catalisa a oxidação e a formação das prostamidas com
atividade biológica a partir da AEA e do 2-AG, mas ainda sem
receptores associados (Woodward et al., 2008). Já o metabolismo dos
endocanabinóides pela via das LOX gera derivados estruturais que
mantém atividade biológica considerável tanto nos próprios receptores
CB
1
, quanto em PPARα e TRPV
1
(Edgemond et al., 1998; Craib et al.,
2001; Kozak e Marnett, 2002). A AEA metabolizada pela 12-LOX
mantém afinidade pelos receptores CB
1
, enquanto o derivado resultante
da metabolização pela 15-LOX não se liga a receptores CB, mas inibe a
FAAH (Edgemond et al., 1998; Van Der Stelt et al., 2002). Outros
derivados hidroxilados da AEA ainda não completamente identificados
agem via receptores TRPV
1
(Craib et al., 2001). Além disso, os
hidroperóxidos do ácido eicosatetraenóico derivados da vias das LOX,
assim como o leucotrieno B
4
são potentes agonistas dos receptores
vanilóides TRPV
1
(Hwang et al., 2000).
Outros mediadores lipídicos, apesar de demonstrarem baixa ou
nenhuma afinidade pelos receptores canabinóides, ainda assim
apresentam atividade canabimimética periférica e central. Por exemplo,
a oleiletanolamida (OEA) e a palmitoiletanolamida (PEA), dois lipídeos
de ocorrência natural de classe química similares à AEA induzem
analgesia e aumento de consumo de alimento, apesar de não se ligarem
aos receptores canabinóides (Lambert e Di Marzo, 1999; Lambert et al.,
1999; Rodriguez De Fonseca et al., 2001). Esforços recentes têm tentado
identificar novos receptores canabinóides que possam ser responsáveis
por estes efeitos. Há evidências de que a OEA possa se ligar a um
receptor órfão GPR119 e a PEA ao GPR55, dois receptores que vem
sendo gradativamente considerados como candidatos a receptores
canabinóides (Fu et al., 2005; Loverme et al., 2005; Mackie e Stella,
2006; Overton et al., 2006). Mais recentemente tem se dado atenção a
uma classe relativamente nova de mediadores endógenos com atividade
canabimimética, os lipoaminoácidos, cuja estrutura se assemelha a dos
endocanabinóides. O lipoaminoácido mais parecido estruturalmente com
100
a AEA é a N-araquidonilglicina, que ocorre naturalmente no cérebro e
outros tecidos (Huang et al., 2001), apesar da sua origem sintética não
ser totalmente conhecida. Os estudos até o momento indicam que a N-
araquidonilglicina provoca efeito que lembra o perfil farmacológico da
AEA, mas é inativa no restante dos testes da tétrade de efeitos
psicotrópicos típicos de canabinóides analgésicos (Huang et al., 2001).
A N-araquidonilglicina não possui afinidade para os receptores
canabinóides CB
1
(Sheskin et al., 1997), não altera a atividade do
transportador de AEA (Huang et al., 2001), nem se liga a receptores
vanilóides TRPV
1
(Huang et al., 2001), mas inibe a enzima de
metabolização da AEA FAAH (Huang et al., 2001), elevando os níveis
endógenos de AEA (Burstein et al., 2002). Supõe-se que a N-
araquidonilglicina seja um possível agonista dos receptores órfãos
GPR18 (Samuelson et al., 1996; Kohno et al., 2006). Outros
lipoaminoácidos como a N-araquidonilserina também foram
encontrados no cérebro e outros tecidos (Bradshaw e Walker, 2005).
Um estudo particularmente importante foi deixado para o final da
discussão porque as informações sobre novos mecanismos de ação no
sistema endocanabinóide, juntamente com os resultados desta tese,
permitem reinterpretá-lo. Há cerca de 12 anos atrás um estudo de
colaboração entre os laboratórios de Raphael Mechoulam e Vincenzo
DiMarzo entre outros, descreveu um série de ésteres derivados do
endocanabinóide 2-AG que não se ligam aos receptores canabinóides
CB
1
/ CB
2
nem inibem as enzimas de degradação de endocanabinóides,
mas aumentam a eficácia do 2-AG em inibir a produção de AMPc via
adenilato ciclase, potencializam seus efeitos canabimiméticos in vivo e
aumentam afinidade do 2-AG para os receptores CB
1
(Ben-Shabat et al.,
1998). À luz do conhecimento da época, os autores cunharam um termo
novo para descrever o efeito destes ésteres de 2-AG e o chamaram de
“efeito da companhia” (entourage), o que praticamente atesta que apesar
do pioneirismo, eles não faziam a mínima idéia do mecanismo
farmacológico envolvido no efeito que estavam observando. Um dos
ésteres inibiu parcialmente a hidrólise do [
3
H]2-AG, mas somente numa
concentração em que o próprio 2-AG “frio” também inibia, sugerindo
que o éster é um substrato competitivo para a MAGL em altas
concentrações (Ben-Shabat et al., 1998). Apesar de concordar com a
idéia dos autores de que testando moléculas que co-existem na fenda
sináptica aproximamos o teste de um ambiente mais próximo da
realidade (Ben-Shabat et al., 1998), uma possível interpretação
alternativa daqueles dados seria de que os autores se depararam com um
101
modulador alostérico endógeno para o endocanabinóide 2-AG. Um
estudo recente, ainda publicado somente na forma de resumo de evento
científico, identificou compostos sintéticos que potencializam a
atividade da AEA em receptores CB
1
expressos heterologamente em
cultura de células. Estes compostos provocaram um modesto aumento
de no máximo 5 vezes na afinidade e 2 vezes na eficácia da AEA (Ross,
2007). Nesta tese de doutorado, propomos que a LXA
4
seja um
modulador alostérico endógeno positivo para o endocanabinóide AEA,
provavelmente o primeiro descrito na literatura científica e mais potente
do que os moduladores positivos sintéticos recentemente descritos.
Esta descoberta tem o potencial de causar impacto no campo de
estudo dos endocanabinóides, pois aumenta ainda mais a complexidade
deste sistema, sugerindo um ligante endógeno que participa
seletivamente dos efeitos do endocanabinóide AEA nos receptores CB
1
.
A exemplo do que acontece em outros sistemas de neurotransmissão,
estudos adicionais podem vir a caracterizar a LXA
4
como um verdadeiro
co-agonista dos receptores CB
1
, cuja presença é fisiologicamente
importante para diversas funções endocanabinóides estudadas até o
momento. O amplo potencial terapêutico indicado para a manipulação
do sistema endocanabinóide (Pertwee, 2005) pode muito bem vir a ser
compartilhado pela LXA
4
, ainda mais considerando a existência de seus
derivados estruturais metabolicamente estáveis, com maior
biodisponibilidade comparado à molécula endógena. A geração da 15-
epi-LXA
4
pela aspirina também pode vir a ser uma alternativa
interessante do ponto de vista terapêutico. Existem diversas evidências
que endocanabinóides participam em diversas situações fisiológicas e
patológicas, nos quais estes sistemas parecem exercer uma função
fundamentalmente protetora, sendo requerido em momentos para
modular uma “superativação” de sistemas excitatórios no cérebro
(Pertwee, 2005). Hipoteticamente, moduladores alostéricos da atividade
endocanabinóide podem potencializar este sistema de autoproteção, sem
nenhum efeito em áreas cerebrais onde os endocanabinóides não estejam
ligados aos receptores CB
1
, evitando efeitos adversos globais no SNC.
Os moduladores alostéricos prometem ser a nova geração de
ferramentas terapêuticas endocanabinóides viáveis, a exemplo da grande
esperança depositada nos inibidores seletivos da degradação de AEA e
2-AG. Se por um lado os inibidores da degradação podem agir
aumentando os níveis de endocanabinóides onde eles estão abaixo dos
níveis desejados, os moduladores alostéricos podem aumentar ou reduzir
os efeitos endocanabinóides de maneira eficiente e localizada. A
102
potencialização alostérica do sistema endocanabinóide deve ser
preferível em relação ao simples aumento dos níveis de
endocanabinóides, pois a modulação alostérica implica em uma
regulação da eficácia e afinidade destas moléculas somente em seus
alvos “preferenciais”, evitando os efeitos que podem ocorrer pela ação
de endocanabinóides em alvos secundários (como receptores TRPV
1
) e
o aumento de outras moléculas degradadas pelas mesmas enzimas
metabólicas. Como mencionado anteriormente, uma das características
da modulação alostérica nos receptores CB
1
é ser funcionalmente
seletiva para ligantes. Apesar de sabermos que a AEA, o 2-AG e
provavelmente os outros endocanabinóides possuem alta afinidade para
os receptores CB
1
, eles podem muito bem ter papéis fisiológicos e
patológicos ainda não explorados, assim como serem liberados em
tecidos diferentes, iniciando reações celulares típicas, dependendo do
ambiente e composição sináptica. É particularmente estimulante pensar
que a modulação alostérica possa proporcionar uma regulação fina deste
sistema de múltiplos ligantes endógenos, afetando-os seletivamente, e
respeitando a dinâmica da sinalização específica do tecido onde atuam.
A pesquisa em moduladores alostéricos dos receptores canabinóides
ainda se encontra em estágio verdadeiramente embrionário. Os efeitos
destes moduladores no tráfego de receptores, expressão e taquifilaxia,
tolerância e sensibilização ainda estão por serem estudados. Quando
mais grupos de pesquisa despertarem para esta faceta da modulação
farmacológica, o campo irá provavelmente se transformar na vanguarda
da pesquisa científica em endocanabinóides, assim como na busca pelo
próximo medicamento canabinóide terapeuticamente viável.
103
CONCLUSÕES
O lipídeo endógeno LXA
4
está presente no cérebro e provoca efeitos
canabimiméticos centrais (hipolocomoção, hipotermia, catalepsia e
analgesia), além de potencializar os efeitos do endocanabinóide AEA.
Estes efeitos centrais da LXA
4
dependem da ativação de receptores
canabinóides CB
1
, mas não da ativação de receptores ALX para
lipoxinas.
A extensa investigação de um possível mecanismo farmacológico
sugere que a LXA
4
é um modulador alostérico positivo dos receptores
canabinóides CB
1
, aumentando a afinidade destes para o
endocanabinóide AEA.
A LXA
4
contribui para os efeitos in vivo da AEA, com possível
relevância para as funções fisiológicas do sistema endocanabinóide.
O análogo estrutural 15-epi-LXA
4
, gerado artificialmente como
conseqüência da acetilação da COX-2 pela aspirina, também exerce
efeitos canabimiméticos ao potencializar os efeitos da AEA de maneira
dependente dos receptores CB
1
.
Este estudo é o primeiro a descrever uma substância endógena que
modula alostericamente os receptores canabinóides CB
1
, possivelmente
constituindo parte do sistema endocanabinóide cerebral.
104
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abood, M. E., Ditto, K. E., Noel, M. A., Showalter, V. M. e Tao, Q.
Isolation and expression of a mouse CB1 cannabinoid receptor gene.
Comparison of binding properties with those of native CB1 receptors in
mouse brain and N18TG2 neuroblastoma cells. Biochem Pharmacol,
v.53, n.2, Jan 24, p.207-14. 1997.
Abumrad, N., Coburn, C. e Ibrahimi, A. Membrane proteins implicated
in long-chain fatty acid uptake by mammalian cells: CD36, FATP and
FABPm. Biochim Biophys Acta, v.1441, n.1, Oct 18, p.4-13. 1999.
Alexander, S. P. e Kendall, D. A. The complications of promiscuity:
endocannabinoid action and metabolism. Br J Pharmacol, v.152, n.5,
Nov, p.602-23. 2007.
Alger, B. E. Endocannabinoids and their implications for epilepsy.
Epilepsy Curr, v.4, n.5, Sep-Oct, p.169-73. 2004.
Bari, M., Battista, N., Fezza, F., Finazzi-Agro, A. e Maccarrone, M.
Lipid rafts control signaling of type-1 cannabinoid receptors in neuronal
cells. Implications for anandamide-induced apoptosis. J Biol Chem,
v.280, n.13, Apr 1, p.12212-20. 2005.
Barnard, E. A., Simon, J. e Webb, T. E. Nucleotide receptors in the
nervous system. An abundant component using diverse transduction
mechanisms. Mol Neurobiol, v.15, n.2, Oct, p.103-29. 1997.
Begg, M., Pacher, P., Batkai, S., Osei-Hyiaman, D., Offertaler, L., Mo,
F. M., Liu, J. e Kunos, G. Evidence for novel cannabinoid receptors.
Pharmacol Ther, v.106, n.2, May, p.133-45. 2005.
Beltramo, M. e Piomelli, D. Carrier-mediated transport and enzymatic
hydrolysis of the endogenous cannabinoid 2-arachidonylglycerol.
Neuroreport, v.11, n.6, Apr 27, p.1231-5. 2000.
Beltramo, M., Stella, N., Calignano, A., Lin, S. Y., Makriyannis, A. e
Piomelli, D. Functional role of high-affinity anandamide transport, as
revealed by selective inhibition. Science, v.277, n.5329, Aug 22, p.1094-
7. 1997.
105
Ben-Shabat, S., Fride, E., Sheskin, T., Tamiri, T., Rhee, M. H., Vogel,
Z., Bisogno, T., De Petrocellis, L., Di Marzo, V. e Mechoulam, R. An
entourage effect: inactive endogenous fatty acid glycerol esters enhance
2-arachidonoyl-glycerol cannabinoid activity. Eur J Pharmacol, v.353,
n.1, Jul 17, p.23-31. 1998.
Berger, C., Schmid, P. C., Schabitz, W. R., Wolf, M., Schwab, S. e
Schmid, H. H. Massive accumulation of N-acylethanolamines after
stroke. Cell signalling in acute cerebral ischemia? J Neurochem, v.88,
n.5, Mar, p.1159-67. 2004.
Bisogno, T., Cascio, M. G., Saha, B., Mahadevan, A., Urbani, P.,
Minassi, A., Appendino, G., Saturnino, C., Martin, B., Razdan, R. e Di
Marzo, V. Development of the first potent and specific inhibitors of
endocannabinoid biosynthesis. Biochim Biophys Acta, v.1761, n.2, Feb,
p.205-12. 2006.
Bisogno, T., Ligresti, A. e Di Marzo, V. The endocannabinoid signalling
system: biochemical aspects. Pharmacol Biochem Behav, v.81, n.2, Jun,
p.224-38. 2005.
Bisogno, T., Maccarrone, M., De Petrocellis, L., Jarrahian, A., Finazzi-
Agro, A., Hillard, C. e Di Marzo, V. The uptake by cells of 2-
arachidonoylglycerol, an endogenous agonist of cannabinoid receptors.
Eur J Biochem, v.268, n.7, Apr, p.1982-9. 2001.
Boarder, M. R. e Hourani, S. M. The regulation of vascular function by
P2 receptors: multiple sites and multiple receptors. Trends Pharmacol
Sci, v.19, n.3, Mar, p.99-107. 1998.
Bodor, A. L., Katona, I., Nyiri, G., Mackie, K., Ledent, C., Hajos, N. e
Freund, T. F. Endocannabinoid signaling in rat somatosensory cortex:
laminar differences and involvement of specific interneuron types. J
Neurosci, v.25, n.29, Jul 20, p.6845-56. 2005.
Bornheim, L. M., Kim, K. Y., Chen, B. e Correia, M. A. The effect of
cannabidiol on mouse hepatic microsomal cytochrome P450-dependent
anandamide metabolism. Biochem Biophys Res Commun, v.197, n.2,
Dec 15, p.740-6. 1993.
106
Bornheim, L. M., Kim, K. Y., Chen, B. e Correia, M. A. Microsomal
cytochrome P450-mediated liver and brain anandamide metabolism.
Biochem Pharmacol, v.50, n.5, Aug 25, p.677-86. 1995.
Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem, v.72, May 7, p.248-54. 1976.
Bradshaw, H. B. e Walker, J. M. The expanding field of cannabimimetic
and related lipid mediators. Br J Pharmacol, v.144, n.4, Feb, p.459-65.
2005.
Breivogel, C. S., Sim, L. J. e Childers, S. R. Regional differences in
cannabinoid receptor/G-protein coupling in rat brain. J Pharmacol Exp
Ther, v.282, n.3, Sep, p.1632-42. 1997.
Brink, C., Dahlen, S. E., Drazen, J., Evans, J. F., Hay, D. W., Nicosia,
S., Serhan, C. N., Shimizu, T. e Yokomizo, T. International Union of
Pharmacology XXXVII. Nomenclature for leukotriene and lipoxin
receptors. Pharmacol Rev, v.55, n.1, Mar, p.195-227. 2003.
Brown, A. J. Novel cannabinoid receptors. Br J Pharmacol, v.152, n.5,
Nov, p.567-75. 2007.
Brown, D. A. e London, E. Structure and function of sphingolipid- and
cholesterol-rich membrane rafts. J Biol Chem, v.275, n.23, Jun 9,
p.17221-4. 2000.
Buckley, N. E., Hansson, S., Harta, G. e Mezey, E. Expression of the
CB1 and CB2 receptor messenger RNAs during embryonic
development in the rat. Neuroscience, v.82, n.4, Feb, p.1131-49. 1998.
Burgen, A. S. Conformational changes and drug action. Fed Proc, v.40,
n.13, Nov, p.2723-8. 1981.
Burstein, S. H., Huang, S. M., Petros, T. J., Rossetti, R. G., Walker, J.
M. e Zurier, R. B. Regulation of anandamide tissue levels by N-
arachidonylglycine. Biochem Pharmacol, v.64, n.7, Oct 1, p.1147-50.
2002.
107
Burstein, S. H., Rossetti, R. G., Yagen, B. e Zurier, R. B. Oxidative
metabolism of anandamide. Prostaglandins Other Lipid Mediat, v.61,
n.1-2, Apr, p.29-41. 2000.
Cadas, H., Gaillet, S., Beltramo, M., Venance, L. e Piomelli, D.
Biosynthesis of an endogenous cannabinoid precursor in neurons and its
control by calcium and cAMP. J Neurosci, v.16, n.12, Jun 15, p.3934-
42. 1996.
Capdevila, J. H. e Falck, J. R. The CYP P450 arachidonic acid
monooxygenases: from cell signaling to blood pressure regulation.
Biochem Biophys Res Commun, v.285, n.3, Jul 20, p.571-6. 2001.
Carriba, P., Ortiz, O., Patkar, K., Justinova, Z., Stroik, J., Themann, A.,
Muller, C., Woods, A. S., Hope, B. T., Ciruela, F., Casado, V., Canela,
E. I., Lluis, C., Goldberg, S. R., Moratalla, R., Franco, R. e Ferre, S.
Striatal adenosine A2A and cannabinoid CB1 receptors form functional
heteromeric complexes that mediate the motor effects of cannabinoids.
Neuropsychopharmacology, v.32, n.11, Nov, p.2249-59. 2007.
Chen, C. e Bazan, N. G. Lipid signaling: sleep, synaptic plasticity, and
neuroprotection. Prostaglandins Other Lipid Mediat, v.77, n.1-4, Sep,
p.65-76. 2005.
Chevaleyre, V., Takahashi, K. A. e Castillo, P. E. Endocannabinoid-
mediated synaptic plasticity in the CNS. Annu Rev Neurosci, v.29, p.37-
76. 2006.
Chiang, N., Takano, T., Arita, M., Watanabe, S. e Serhan, C. N. A novel
rat lipoxin A4 receptor that is conserved in structure and function. Br J
Pharmacol, v.139, n.1, May, p.89-98. 2003.
Christopoulos, A., Coles, P., Lay, L., Lew, M. J. e Angus, J. A.
Pharmacological analysis of cannabinoid receptor activity in the rat vas
deferens. Br J Pharmacol, v.132, n.6, Mar, p.1281-91. 2001.
Christopoulos, A. e Kenakin, T. G protein-coupled receptor allosterism
and complexing. Pharmacol Rev, v.54, n.2, Jun, p.323-74. 2002.
108
Christopoulos, A., Lanzafame, A. e Mitchelson, F. Allosteric
interactions at muscarinic cholinoceptors. Clin Exp Pharmacol Physiol,
v.25, n.3-4, Mar-Apr, p.185-94. 1998.
Claria, J. e Serhan, C. N. Aspirin triggers previously undescribed
bioactive eicosanoids by human endothelial cell-leukocyte interactions.
Proc Natl Acad Sci U S A, v.92, n.21, Oct 10, p.9475-9. 1995.
Craib, S. J., Ellington, H. C., Pertwee, R. G. e Ross, R. A. A possible
role of lipoxygenase in the activation of vanilloid receptors by
anandamide in the guinea-pig bronchus. Br J Pharmacol, v.134, n.1,
Sep, p.30-7. 2001.
Cravatt, B. F., Demarest, K., Patricelli, M. P., Bracey, M. H., Giang, D.
K., Martin, B. R. e Lichtman, A. H. Supersensitivity to anandamide and
enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid
amide hydrolase. Proc Natl Acad Sci U S A, v.98, n.16, Jul 31, p.9371-6.
2001.
Cravatt, B. F., Giang, D. K., Mayfield, S. P., Boger, D. L., Lerner, R. A.
e Gilula, N. B. Molecular characterization of an enzyme that degrades
neuromodulatory fatty-acid amides. Nature, v.384, n.6604, Nov 7, p.83-
7. 1996.
Cristino, L., De Petrocellis, L., Pryce, G., Baker, D., Guglielmotti, V. e
Di Marzo, V. Immunohistochemical localization of cannabinoid type 1
and vanilloid transient receptor potential vanilloid type 1 receptors in
the mouse brain. Neuroscience, v.139, n.4, p.1405-15. 2006.
Cristino, L., Starowicz, K., De Petrocellis, L., Morishita, J., Ueda, N.,
Guglielmotti, V. e Di Marzo, V. Immunohistochemical localization of
anabolic and catabolic enzymes for anandamide and other putative
endovanilloids in the hippocampus and cerebellar cortex of the mouse
brain. Neuroscience, v.151, n.4, Feb 19, p.955-68. 2008.
Da Silva, G. E. e Takahashi, R. N. SR 141716A prevents delta 9-
tetrahydrocannabinol-induced spatial learning deficit in a Morris-type
water maze in mice. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, v.26,
n.2, Feb, p.321-5. 2002.
109
Dani, M., Guindon, J., Lambert, C. e Beaulieu, P. The local
antinociceptive effects of paracetamol in neuropathic pain are mediated
by cannabinoid receptors. Eur J Pharmacol, v.573, n.1-3, Nov 14,
p.214-5. 2007.
De Oliveira Alvares, L., Genro, B. P., Vaz Breda, R., Pedroso, M. F., Da
Costa, J. C. e Quillfeldt, J. A. AM251, a selective antagonist of the CB1
receptor, inhibits the induction of long-term potentiation and induces
retrograde amnesia in rats. Brain Res, v.1075, n.1, Feb 23, p.60-7. 2006.
De Petrocellis, L., Orlando, P. e Di Marzo, V. Anandamide, an
endogenous cannabinomimetic substance, modulates rat brain protein
kinase C in vitro. Biochem Mol Biol Int, v.36, n.6, Aug, p.1127-33.
1995.
Devane, W. A., Dysarz, F. A., 3rd, Johnson, M. R., Melvin, L. S. e
Howlett, A. C. Determination and characterization of a cannabinoid
receptor in rat brain. Mol Pharmacol, v.34, n.5, Nov, p.605-13. 1988.
Devane, W. A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R. G., Stevenson, L. A.,
Griffin, G., Gibson, D., Mandelbaum, A., Etinger, A. e Mechoulam, R.
Isolation and structure of a brain constituent that binds to the
cannabinoid receptor. Science, v.258, n.5090, Dec 18, p.1946-9. 1992.
Di Marzo, V. Biosynthesis and inactivation of endocannabinoids:
relevance to their proposed role as neuromodulators. Life Sci, v.65, n.6-
7, p.645-55. 1999.
Di Marzo, V. A brief history of cannabinoid and endocannabinoid
pharmacology as inspired by the work of British scientists. Trends
Pharmacol Sci, v.27, n.3, Mar, p.134-40. 2006.
Di Marzo, V., Breivogel, C. S., Tao, Q., Bridgen, D. T., Razdan, R. K.,
Zimmer, A. M., Zimmer, A. e Martin, B. R. Levels, metabolism, and
pharmacological activity of anandamide in CB(1) cannabinoid receptor
knockout mice: evidence for non-CB(1), non-CB(2) receptor-mediated
actions of anandamide in mouse brain. J Neurochem, v.75, n.6, Dec,
p.2434-44. 2000.
110
Di Marzo, V. e Deutsch, D. G. Biochemistry of the endogenous ligands
of cannabinoid receptors. Neurobiol Dis, v.5, n.6 Pt B, Dec, p.386-404.
1998.
Di Marzo, V., Fontana, A., Cadas, H., Schinelli, S., Cimino, G.,
Schwartz, J. C. e Piomelli, D. Formation and inactivation of endogenous
cannabinoid anandamide in central neurons. Nature, v.372, n.6507, Dec
15, p.686-91. 1994.
Dinh, T. P., Carpenter, D., Leslie, F. M., Freund, T. F., Katona, I., Sensi,
S. L., Kathuria, S. e Piomelli, D. Brain monoglyceride lipase
participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci U S
A, v.99, n.16, Aug 6, p.10819-24. 2002.
Domenici, M. R., Azad, S. C., Marsicano, G., Schierloh, A., Wotjak, C.
T., Dodt, H. U., Zieglgansberger, W., Lutz, B. e Rammes, G.
Cannabinoid receptor type 1 located on presynaptic terminals of
principal neurons in the forebrain controls glutamatergic synaptic
transmission. J Neurosci, v.26, n.21, May 24, p.5794-9. 2006.
Edgemond, W. S., Hillard, C. J., Falck, J. R., Kearn, C. S. e Campbell,
W. B. Human platelets and polymorphonuclear leukocytes synthesize
oxygenated derivatives of arachidonylethanolamide (anandamide): their
affinities for cannabinoid receptors and pathways of inactivation. Mol
Pharmacol, v.54, n.1, Jul, p.180-8. 1998.
Ellis, J., Pediani, J. D., Canals, M., Milasta, S. e Milligan, G. Orexin-1
receptor-cannabinoid CB1 receptor heterodimerization results in both
ligand-dependent and -independent coordinated alterations of receptor
localization and function. J Biol Chem, v.281, n.50, Dec 15, p.38812-24.
2006.
Fankhauser, M. History of Cannabisin Western Medicine. In:
Grotenhermen, F. e Russo, E. B. (Ed.). Cannabis and Cannabinois. New
York: The Haworth Integrative Healing Press, 2002. History of
Cannabis in Western Medicine, p.37-51
Farooqui, A. A., Rammohan, K. W. e Horrocks, L. A. Isolation,
characterization, and regulation of diacylglycerol lipases from the
bovine brain. Ann N Y Acad Sci, v.559, p.25-36. 1989.
111
Fiore, S., Maddox, J. F., Perez, H. D. e Serhan, C. N. Identification of a
human cDNA encoding a functional high affinity lipoxin A4 receptor. J
Exp Med, v.180, n.1, Jul 1, p.253-60. 1994.
Fride, E. Endocannabinoids in the central nervous system--an overview.
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, v.66, n.2-3, Feb-Mar, p.221-
33. 2002.
Fride, E., Perchuk, A., Hall, F. S., Uhl, G. R. e Onaivi, E. S. Behavioral
methods in cannabinoid research. Methods Mol Med, v.123, p.269-90.
2006.
Fu, J., Oveisi, F., Gaetani, S., Lin, E. e Piomelli, D.
Oleoylethanolamide, an endogenous PPAR-alpha agonist, lowers body
weight and hyperlipidemia in obese rats. Neuropharmacology, v.48, n.8,
Jun, p.1147-53. 2005.
Galiegue, S., Mary, S., Marchand, J., Dussossoy, D., Carriere, D.,
Carayon, P., Bouaboula, M., Shire, D., Le Fur, G. e Casellas, P.
Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human
immune tissues and leukocyte subpopulations. Eur J Biochem, v.232,
n.1, Aug 15, p.54-61. 1995.
Galzi, J. L. e Changeux, J. P. Neurotransmitter-gated ion channels as
unconventional allosteric proteins. Curr Opin Struct Biol, v.4, p.554-
565. 1994.
Galzi, J. L., Revah, F., Bessis, A. e Changeux, J. P. Functional
architecture of the nicotinic acetylcholine receptor: from electric organ
to brain. Annu Rev Pharmacol Toxicol, v.31, p.37-72. 1991.
Gaoni, Y. e Mechoulam, R. Isolation, structure and partial synthesis of
an active constituent of hashish. J. Am. Chem. Soc., v.86, p.1646. 1964.
Gewirtz, A. T., Collier-Hyams, L. S., Young, A. N., Kucharzik, T.,
Guilford, W. J., Parkinson, J. F., Williams, I. R., Neish, A. S. e Madara,
J. L. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial
proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran
112
sodium sulfate-induced colitis. J Immunol, v.168, n.10, May 15, p.5260-
7. 2002.
Gewirtz, A. T., Mccormick, B., Neish, A. S., Petasis, N. A., Gronert, K.,
Serhan, C. N. e Madara, J. L. Pathogen-induced chemokine secretion
from model intestinal epithelium is inhibited by lipoxin A4 analogs. J
Clin Invest, v.101, n.9, May 1, p.1860-9. 1998.
Giuffrida, A., Parsons, L. H., Kerr, T. M., Rodriguez De Fonseca, F.,
Navarro, M. e Piomelli, D. Dopamine activation of endogenous
cannabinoid signaling in dorsal striatum. Nat Neurosci, v.2, n.4, Apr,
p.358-63. 1999.
Glass, M. e Felder, C. C. Concurrent stimulation of cannabinoid CB1
and dopamine D2 receptors augments cAMP accumulation in striatal
neurons: evidence for a Gs linkage to the CB1 receptor. J Neurosci,
v.17, n.14, Jul 15, p.5327-33. 1997.
Glass, M. e Northup, J. K. Agonist selective regulation of G proteins by
cannabinoid CB(1) and CB(2) receptors. Mol Pharmacol, v.56, n.6,
Dec, p.1362-9. 1999.
Godson, C. e Brady, H. R. Lipoxins: novel anti-inflammatory
therapeutics? Curr Opin Investig Drugs, v.1, n.3, Nov, p.380-5. 2000.
Gonsiorek, W., Lunn, C., Fan, X., Narula, S., Lundell, D. e Hipkin, R.
W. Endocannabinoid 2-arachidonyl glycerol is a full agonist through
human type 2 cannabinoid receptor: antagonism by anandamide. Mol
Pharmacol, v.57, n.5, May, p.1045-50. 2000.
Grandordy, B. M., Lacroix, H., Mavoungou, E., Krilis, S., Crea, A. E.,
Spur, B. W. e Lee, T. H. Lipoxin A4 inhibits phosphoinositide
hydrolysis in human neutrophils. Biochem Biophys Res Commun, v.167,
n.3, Mar 30, p.1022-9. 1990.
Gronert, K., Gewirtz, A., Madara, J. L. e Serhan, C. N. Identification of
a human enterocyte lipoxin A4 receptor that is regulated by interleukin
(IL)-13 and interferon gamma and inhibits tumor necrosis factor alpha-
induced IL-8 release. J Exp Med, v.187, n.8, Apr 20, p.1285-94. 1998.
113
Guhring, H., Hamza, M., Sergejeva, M., Ates, M., Kotalla, C. E.,
Ledent, C. e Brune, K. A role for endocannabinoids in indomethacin-
induced spinal antinociception. Eur J Pharmacol, v.454, n.2-3, Nov 15,
p.153-63. 2002.
Hachicha, M., Pouliot, M., Petasis, N. A. e Serhan, C. N. Lipoxin
(LX)A4 and aspirin-triggered 15-epi-LXA4 inhibit tumor necrosis factor
1alpha-initiated neutrophil responses and trafficking: regulators of a
cytokine-chemokine axis. J Exp Med, v.189, n.12, Jun 21, p.1923-30.
1999.
Hajos, N., Katona, I., Naiem, S. S., Mackie, K., Ledent, C., Mody, I. e
Freund, T. F. Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic
transmission and network oscillations. Eur J Neurosci, v.12, n.9, Sep,
p.3239-49. 2000.
Haley, T. J. e Mccormick, W. G. Pharmacological effects produced by
intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. Br J Pharmacol
Chemother, v.12, n.1, Mar, p.12-5. 1957.
Hanus, L., Abu-Lafi, S., Fride, E., Breuer, A., Vogel, Z., Shalev, D. E.,
Kustanovich, I. e Mechoulam, R. 2-arachidonyl glyceryl ether, an
endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor. Proc Natl Acad
Sci U S A, v.98, n.7, Mar 27, p.3662-5. 2001.
Hebert, T. E. e Bouvier, M. Structural and functional aspects of G
protein-coupled receptor oligomerization. Biochem Cell Biol, v.76, n.1,
p.1-11. 1998.
Herkenham, M., Lynn, A. B., Little, M. D., Johnson, M. R., Melvin, L.
S., De Costa, B. R. e Rice, K. C. Cannabinoid receptor localization in
brain. Proc Natl Acad Sci U S A, v.87, n.5, Mar, p.1932-6. 1990.
Hilairet, S., Bouaboula, M., Carriere, D., Le Fur, G. e Casellas, P.
Hypersensitization of the Orexin 1 receptor by the CB1 receptor:
evidence for cross-talk blocked by the specific CB1 antagonist,
SR141716. J Biol Chem, v.278, n.26, Jun 27, p.23731-7. 2003.
Hill, A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of
haemoglobin on its dissociation curves. J Physiol, v.40, p.4-7. 1910.
114
Hillard, C. J., Edgemond, W. S., Jarrahian, A. e Campbell, W. B.
Accumulation of N-arachidonoylethanolamine (anandamide) into
cerebellar granule cells occurs via facilitated diffusion. J Neurochem,
v.69, n.2, Aug, p.631-8. 1997.
Hillard, C. J., Manna, S., Greenberg, M. J., Dicamelli, R., Ross, R. A.,
Stevenson, L. A., Murphy, V., Pertwee, R. G. e Campbell, W. B.
Synthesis and characterization of potent and selective agonists of the
neuronal cannabinoid receptor (CB1). J Pharmacol Exp Ther, v.289,
n.3, Jun, p.1427-33. 1999.
Hirsch, D., Stahl, A. e Lodish, H. F. A family of fatty acid transporters
conserved from mycobacterium to man. Proc Natl Acad Sci U S A, v.95,
n.15, Jul 21, p.8625-9. 1998.
Hirst, R. A., Almond, S. L. e Lambert, D. G. Characterisation of the rat
cerebella CB1 receptor using SR141716A, a central cannabinoid
receptor antagonist. Neurosci Lett, v.220, n.2, Dec 13, p.101-4. 1996.
Hogestatt, E. D., Jonsson, B. A., Ermund, A., Andersson, D. A., Bjork,
H., Alexander, J. P., Cravatt, B. F., Basbaum, A. I. e Zygmunt, P. M.
Conversion of acetaminophen to the bioactive N-acylphenolamine
AM404 via fatty acid amide hydrolase-dependent arachidonic acid
conjugation in the nervous system. J Biol Chem, v.280, n.36, Sep 9,
p.31405-12. 2005.
Holzgrabe, U., Wagener, M. e Gasteiger, J. Comparison of structurally
different allosteric modulators of muscarinic receptors by self-
organizing neural networks. J Mol Graph, v.14, n.4, Aug, p.185-93,
217-21. 1996.
Horswill, J. G., Bali, U., Shaaban, S., Keily, J. F., Jeevaratnam, P.,
Babbs, A. J., Reynet, C. e Wong Kai in, P. PSNCBAM-1, a novel
allosteric antagonist at cannabinoid CB1 receptors with hypophagic
effects in rats. Br J Pharmacol, v.152, n.5, Nov, p.805-14. 2007.
Howlett, A. C. Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase: relative
activity of constituents and metabolites of marihuana.
Neuropharmacology, v.26, n.5, May, p.507-12. 1987.
115
Howlett, A. C. Cannabinoid receptor signaling. Handb Exp Pharmacol,
n.168, p.53-79. 2005.
Howlett, A. C., Barth, F., Bonner, T. I., Cabral, G., Casellas, P., Devane,
W. A., Felder, C. C., Herkenham, M., Mackie, K., Martin, B. R.,
Mechoulam, R. e Pertwee, R. G. International Union of Pharmacology.
XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev, v.54,
n.2, Jun, p.161-202. 2002.
Howlett, A. C., Breivogel, C. S., Childers, S. R., Deadwyler, S. A.,
Hampson, R. E. e Porrino, L. J. Cannabinoid physiology and
pharmacology: 30 years of progress. Neuropharmacology, v.47 Suppl 1,
p.345-58. 2004.
Huang, K. P., Nakabayashi, H. e Huang, F. L. Isozymic forms of rat
brain Ca2+-activated and phospholipid-dependent protein kinase. Proc
Natl Acad Sci U S A, v.83, n.22, Nov, p.8535-9. 1986.
Huang, S. M., Bisogno, T., Petros, T. J., Chang, S. Y., Zavitsanos, P. A.,
Zipkin, R. E., Sivakumar, R., Coop, A., Maeda, D. Y., De Petrocellis,
L., Burstein, S., Di Marzo, V. e Walker, J. M. Identification of a new
class of molecules, the arachidonyl amino acids, and characterization of
one member that inhibits pain. J Biol Chem, v.276, n.46, Nov 16,
p.42639-44. 2001.
Hudson, B. D., Hebert, T. E. e Kelly, M. E. Ligand- and heterodimer-
directed signaling of the CB(1) cannabinoid receptor. Mol Pharmacol,
v.77, n.1, Jan, p.1-9. 2009.
Hwang, S. W., Cho, H., Kwak, J., Lee, S. Y., Kang, C. J., Jung, J., Cho,
S., Min, K. H., Suh, Y. G., Kim, D. e Oh, U. Direct activation of
capsaicin receptors by products of lipoxygenases: endogenous
capsaicin-like substances. Proc Natl Acad Sci U S A, v.97, n.11, May
23, p.6155-60. 2000.
International-Association-for-Cannabis-Based-Medicine. IACM
Bulletin. 2010.
116
Jakubik, J., Bacakova, L., El-Fakahany, E. E. e Tucek, S. Positive
cooperativity of acetylcholine and other agonists with allosteric ligands
on muscarinic acetylcholine receptors. Mol Pharmacol, v.52, n.1, Jul,
p.172-9. 1997.
Jarrahian, A., Watts, V. J. e Barker, E. L. D2 dopamine receptors
modulate Galpha-subunit coupling of the CB1 cannabinoid receptor. J
Pharmacol Exp Ther, v.308, n.3, Mar, p.880-6. 2004.
Kano, M., Ohno-Shosaku, T., Hashimotodani, Y., Uchigashima, M. e
Watanabe, M. Endocannabinoid-mediated control of synaptic
transmission. Physiol Rev, v.89, n.1, Jan, p.309-80. 2009.
Katona, I., Sperlagh, B., Sik, A., Kafalvi, A., Vizi, E. S., Mackie, K. e
Freund, T. F. Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors
regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal
interneurons. J Neurosci, v.19, n.11, Jun 1, p.4544-58. 1999.
Kawamura, Y., Fukaya, M., Maejima, T., Yoshida, T., Miura, E.,
Watanabe, M., Ohno-Shosaku, T. e Kano, M. The CB1 cannabinoid
receptor is the major cannabinoid receptor at excitatory presynaptic sites
in the hippocampus and cerebellum. J Neurosci, v.26, n.11, Mar 15,
p.2991-3001. 2006.
Kearn, C. S., Blake-Palmer, K., Daniel, E., Mackie, K. e Glass, M.
Concurrent stimulation of cannabinoid CB1 and dopamine D2 receptors
enhances heterodimer formation: a mechanism for receptor cross-talk?
Mol Pharmacol, v.67, n.5, May, p.1697-704. 2005.
Kenakin, T. Agonist-receptor efficacy. I: Mechanisms of efficacy and
receptor promiscuity. Trends Pharmacol Sci, v.16, n.6, Jun, p.188-92.
1995.
Kenakin, T. Functional selectivity through protean and biased agonism:
who steers the ship? Mol Pharmacol, v.72, n.6, Dec, p.1393-401. 2007.
Kenakin, T. P. '7TM receptor allostery: putting numbers to shapeshifting
proteins. Trends Pharmacol Sci, v.30, n.9, Sep, p.460-9. 2009.
117
Kew, J. N., Trube, G. e Kemp, J. A. A novel mechanism of activity-
dependent NMDA receptor antagonism describes the effect of ifenprodil
in rat cultured cortical neurones. J Physiol, v.497 ( Pt 3), Dec 15, p.761-
72. 1996.
Kim, J., Isokawa, M., Ledent, C. e Alger, B. E. Activation of muscarinic
acetylcholine receptors enhances the release of endogenous
cannabinoids in the hippocampus. J Neurosci, v.22, n.23, Dec 1,
p.10182-91. 2002.
Kim, S. J. Formation of lipoxins by alveolar macrophages. Biochem
Biophys Res Commun, v.150, n.2, Jan 29, p.870-6. 1988.
Kohno, M., Hasegawa, H., Inoue, A., Muraoka, M., Miyazaki, T., Oka,
K. e Yasukawa, M. Identification of N-arachidonylglycine as the
endogenous ligand for orphan G-protein-coupled receptor GPR18.
Biochem Biophys Res Commun, v.347, n.3, Sep 1, p.827-32. 2006.
Kozak, K. R. e Marnett, L. J. Oxidative metabolism of
endocannabinoids. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, v.66, n.2-
3, Feb-Mar, p.211-20. 2002.
Kozak, K. R., Prusakiewicz, J. J., Rowlinson, S. W., Schneider, C. e
Marnett, L. J. Amino acid determinants in cyclooxygenase-2
oxygenation of the endocannabinoid 2-arachidonylglycerol. J Biol
Chem, v.276, n.32, Aug 10, p.30072-7. 2001.
Kozak, K. R., Rowlinson, S. W. e Marnett, L. J. Oxygenation of the
endocannabinoid, 2-arachidonylglycerol, to glyceryl prostaglandins by
cyclooxygenase-2. J Biol Chem, v.275, n.43, Oct 27, p.33744-9. 2000.
Lambert, D. M. e Di Marzo, V. The palmitoylethanolamide and
oleamide enigmas : are these two fatty acid amides cannabimimetic?
Curr Med Chem, v.6, n.8, Aug, p.757-73. 1999.
Lambert, D. M., Dipaolo, F. G., Sonveaux, P., Kanyonyo, M., Govaerts,
S. J., Hermans, E., Bueb, J., Delzenne, N. M. e Tschirhart, E. J.
Analogues and homologues of N-palmitoylethanolamide, a putative
endogenous CB(2) cannabinoid, as potential ligands for the cannabinoid
receptors. Biochim Biophys Acta, v.1440, n.2-3, Sep 22, p.266-74. 1999.
118
Laursen, S. E. e Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in
mice. Some methodological refinements. J Pharmacol Methods, v.16,
n.4, Dec, p.355-7. 1986.
Lee, T. H., Horton, C. E., Kyan-Aung, U., Haskard, D., Crea, A. E. e
Spur, B. W. Lipoxin A4 and lipoxin B4 inhibit chemotactic responses of
human neutrophils stimulated by leukotriene B4 and N-formyl-L-
methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine. Clin Sci (Lond), v.77, n.2, Aug,
p.195-203. 1989.
Leff, P. The two-state model of receptor activation. Trends Pharmacol
Sci, v.16, n.3, Mar, p.89-97. 1995.
Leggett, J. D., Aspley, S., Beckett, S. R., D'antona, A. M. e Kendall, D.
A. Oleamide is a selective endogenous agonist of rat and human CB1
cannabinoid receptors. Br J Pharmacol, v.141, n.2, Jan, p.253-62. 2004.
Leterrier, C., Laine, J., Darmon, M., Boudin, H., Rossier, J. e Lenkei, Z.
Constitutive activation drives compartment-selective endocytosis and
axonal targeting of type 1 cannabinoid receptors. J Neurosci, v.26, n.12,
Mar 22, p.3141-53. 2006.
Li, H. L. An archaeological and historical account of cannabis in China.
Economic Botany, v.28, n.4, p.437-448. 1973.
Li, H. L. Hallucinogenic plants in Chinese herbals. J Psychodelic Drugs,
v.10, n.1, p.17-26. 1978.
Loverme, J., La Rana, G., Russo, R., Calignano, A. e Piomelli, D. The
search for the palmitoylethanolamide receptor. Life Sci, v.77, n.14, Aug
19, p.1685-98. 2005.
Lustig, K. D., Shiau, A. K., Brake, A. J. e Julius, D. Expression cloning
of an ATP receptor from mouse neuroblastoma cells. Proc Natl Acad
Sci U S A, v.90, n.11, Jun 1, p.5113-7. 1993.
Maccarrone, M., Rossi, S., Bari, M., De Chiara, V., Fezza, F., Musella,
A., Gasperi, V., Prosperetti, C., Bernardi, G., Finazzi-Agro, A., Cravatt,
B. F. e Centonze, D. Anandamide inhibits metabolism and physiological
119
actions of 2-arachidonoylglycerol in the striatum. Nat Neurosci, v.11,
n.2, Feb, p.152-9. 2008.
Mackie, K. Cannabinoid receptor homo- and heterodimerization. Life
Sci, v.77, n.14, Aug 19, p.1667-73. 2005.
Mackie, K. Cannabinoid receptors: where they are and what they do. J
Neuroendocrinol, v.20 Suppl 1, May, p.10-4. 2008.
Mackie, K. e Stella, N. Cannabinoid receptors and endocannabinoids:
evidence for new players. AAPS J, v.8, n.2, p.E298-306. 2006.
Mallet, C., Daulhac, L., Bonnefont, J., Ledent, C., Etienne, M., Chapuy,
E., Libert, F. e Eschalier, A. Endocannabinoid and serotonergic systems
are needed for acetaminophen-induced analgesia. Pain, v.139, n.1, Sep
30, p.190-200. 2008.
Marsicano, G. e Lutz, B. Expression of the cannabinoid receptor CB1 in
distinct neuronal subpopulations in the adult mouse forebrain. Eur J
Neurosci, v.11, n.12, Dec, p.4213-25. 1999.
Marsicano, G., Wotjak, C. T., Azad, S. C., Bisogno, T., Rammes, G.,
Cascio, M. G., Hermann, H., Tang, J., Hofmann, C., Zieglgansberger,
W., Di Marzo, V. e Lutz, B. The endogenous cannabinoid system
controls extinction of aversive memories. Nature, v.418, n.6897, Aug 1,
p.530-4. 2002.
Martin, B. R. Characterization of the antinociceptive activity of delta-9
tetrahydrocannabinol in mice. In: Harvey, D. J. (Ed.). Marihuana.
Oxford: IRL Press, 1985. Characterization of the antinociceptive
activity of delta-9 tetrahydrocannabinol in mice, p.685-692
Matsuda, L. A., Lolait, S. J., Brownstein, M. J., Young, A. C. e Bonner,
T. I. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the
cloned cDNA. Nature, v.346, n.6284, Aug 9, p.561-4. 1990.
McFarland, M. J. e Barker, E. L. Anandamide transport. Pharmacol
Ther, v.104, n.2, Nov, p.117-35. 2004.
120
McFarland, M. J., Porter, A. C., Rakhshan, F. R., Rawat, D. S., Gibbs,
R. A. e Barker, E. L. A role for caveolae/lipid rafts in the uptake and
recycling of the endogenous cannabinoid anandamide. J Biol Chem,
v.279, n.40, Oct 1, p.41991-7. 2004.
McFarland, M. J., Terebova, E. A. e Barker, E. L. Detergent-resistant
membrane microdomains in the disposition of the lipid signaling
molecule anandamide. AAPS J, v.8, n.1, p.E95-100. 2006.
McGaugh, J. L. Memory--a century of consolidation. Science, v.287,
n.5451, Jan 14, p.248-51. 2000.
McMahon, B., Mitchell, S., Brady, H. R. e Godson, C. Lipoxins:
revelations on resolution. Trends Pharmacol Sci, v.22, n.8, Aug, p.391-
5. 2001.
Mechoulam, R., Ben-Shabat, S., Hanus, L., Ligumsky, M., Kaminski, N.
E., Schatz, A. R., Gopher, A., Almog, S., Martin, B. R., Compton, D. R.
e Et Al. Identification of an endogenous 2-monoglyceride, present in
canine gut, that binds to cannabinoid receptors. Biochem Pharmacol,
v.50, n.1, Jun 29, p.83-90. 1995.
Mechoulam, R. e Hanus, L. A historical overview of chemical research
on cannabinoids. Chem Phys Lipids, v.108, n.1-2, Nov, p.1-13. 2000.
Menezes-De-Lima, O., Jr., Kassuya, C. A., Nascimento, A. F.,
Henriques, M. G. e Calixto, J. B. Lipoxin A4 inhibits acute edema in
mice: implications for the anti-edematogenic mechanism induced by
aspirin. Prostaglandins Other Lipid Mediat, v.80, n.3-4, Sep, p.123-35.
2006.
Milligan, G. e Smith, N. J. Allosteric modulation of heterodimeric G-
protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci, v.28, n.12, Dec,
p.615-20. 2007.
Monod, J., Changeux, J. P. e Jacob, F. Allosteric proteins and cellular
control systems. J Mol Biol, v.6, Apr, p.306-29. 1963.
121
Monod, J. e Jacob, F. General conclusions: teleonomic mechanisms in
cellular metabolism, growth and differentiation. Cold Spring Harbor
Symp Quant Biol, v.26, p.389-401. 1961.
Monod, J., Wyman, J. e Changeux, J. P. On the Nature of Allosteric
Transitions: A Plausible Model. J Mol Biol, v.12, May, p.88-118. 1965.
Monory, K., Massa, F., Egertova, M., Eder, M., Blaudzun, H.,
Westenbroek, R., Kelsch, W., Jacob, W., Marsch, R., Ekker, M., Long,
J., Rubenstein, J. L., Goebbels, S., Nave, K. A., During, M., Klugmann,
M., Wolfel, B., Dodt, H. U., Zieglgansberger, W., Wotjak, C. T.,
Mackie, K., Elphick, M. R., Marsicano, G. e Lutz, B. The
endocannabinoid system controls key epileptogenic circuits in the
hippocampus. Neuron, v.51, n.4, Aug 17, p.455-66. 2006.
Munger, K. A., Montero, A., Fukunaga, M., Uda, S., Yura, T., Imai, E.,
Kaneda, Y., Valdivielso, J. M. e Badr, K. F. Transfection of rat kidney
with human 15-lipoxygenase suppresses inflammation and preserves
function in experimental glomerulonephritis. Proc Natl Acad Sci U S A,
v.96, n.23, Nov 9, p.13375-80. 1999.
Munro, S., Thomas, K. L. e Abu-Shaar, M. Molecular characterization
of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature, v.365, n.6441, Sep 2,
p.61-5. 1993.
Murillo-Rodriguez, E., Sanchez-Alavez, M., Navarro, L., Martinez-
Gonzalez, D., Drucker-Colin, R. e Prospero-Garcia, O. Anandamide
modulates sleep and memory in rats. Brain Res, v.812, n.1-2, Nov 23,
p.270-4. 1998.
Nigam, S., Fiore, S., Luscinskas, F. W. e Serhan, C. N. Lipoxin A4 and
lipoxin B4 stimulate the release but not the oxygenation of arachidonic
acid in human neutrophils: dissociation between lipid remodeling and
adhesion. J Cell Physiol, v.143, n.3, Jun, p.512-23. 1990.
Nyiri, G., Cserep, C., Szabadits, E., Mackie, K. e Freund, T. F. CB1
cannabinoid receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on
preterminal segments of hippocampal GABAergic axons. Neuroscience,
v.136, n.3, p.811-22. 2005.
122
O'Sullivan, S. E. Cannabinoids go nuclear: evidence for activation of
peroxisome proliferator-activated receptors. Br J Pharmacol, v.152, n.5,
Nov, p.576-82. 2007.
O'Sullivan, S. E., Kendall, D. A. e Randall, M. D. Characterisation of
the vasorelaxant properties of the novel endocannabinoid N-
arachidonoyl-dopamine (NADA). Br J Pharmacol, v.141, n.5, Mar,
p.803-12. 2004.
Ohno-Shosaku, T., Matsui, M., Fukudome, Y., Shosaku, J., Tsubokawa,
H., Taketo, M. M., Manabe, T. e Kano, M. Postsynaptic M1 and M3
receptors are responsible for the muscarinic enhancement of retrograde
endocannabinoid signalling in the hippocampus. Eur J Neurosci, v.18,
n.1, Jul, p.109-16. 2003.
Onaivi, E. S., Ishiguro, H., Gong, J. P., Patel, S., Perchuk, A., Meozzi,
P. A., Myers, L., Mora, Z., Tagliaferro, P., Gardner, E., Brusco, A.,
Akinshola, B. E., Liu, Q. R., Hope, B., Iwasaki, S., Arinami, T.,
Teasenfitz, L. e Uhl, G. R. Discovery of the presence and functional
expression of cannabinoid CB2 receptors in brain. Ann N Y Acad Sci,
v.1074, Aug, p.514-36. 2006.
Organização-Das-Nações-Unidas. Convenção de Substâncias
Psicotrópicas. 1971.
Overton, H. A., Babbs, A. J., Doel, S. M., Fyfe, M. C., Gardner, L. S.,
Griffin, G., Jackson, H. C., Procter, M. J., Rasamison, C. M., Tang-
Christensen, M., Widdowson, P. S., Williams, G. M. e Reynet, C.
Deorphanization of a G protein-coupled receptor for oleoylethanolamide
and its use in the discovery of small-molecule hypophagic agents. Cell
Metab, v.3, n.3, Mar, p.167-75. 2006.
Pacher, P., Batkai, S. e Kunos, G. The endocannabinoid system as an
emerging target of pharmacotherapy. Pharmacol Rev, v.58, n.3, Sep,
p.389-462. 2006.
Pamplona, F. A., Menezes-De-Lima, O., Jr. e Takahashi, R. N. Aspirin-
triggered lipoxin induces CB1-dependent catalepsy in mice. Neurosci
Lett, v.470, n.1, Feb 5, p.33-7.
123
Pamplona, F. A. e Takahashi, R. N. WIN 55212-2 impairs contextual
fear conditioning through the activation of CB1 cannabinoid receptors.
Neurosci Lett, v.397, n.1-2, Apr 10-17, p.88-92. 2006.
Paxinos, G. e Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic
coordinates. New York: Academic Press. 2001
Perretti, M., Chiang, N., La, M., Fierro, I. M., Marullo, S., Getting, S. J.,
Solito, E. e Serhan, C. N. Endogenous lipid- and peptide-derived anti-
inflammatory pathways generated with glucocorticoid and aspirin
treatment activate the lipoxin A4 receptor. Nat Med, v.8, n.11, Nov,
p.1296-302. 2002.
Pertwee, R. G. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors.
Pharmacol Ther, v.74, n.2, p.129-80. 1997.
Pertwee, R. G. The therapeutic potential of drugs that target cannabinoid
receptors or modulate the tissue levels or actions of endocannabinoids.
AAPS J, v.7, n.3, p.E625-54. 2005.
Pertwee, R. G., Griffin, G., Lainton, J. A. e Huffman, J. W.
Pharmacological characterization of three novel cannabinoid receptor
agonists in the mouse isolated vas deferens. Eur J Pharmacol, v.284,
n.3, Sep 25, p.241-7. 1995.
Pertwee, R. G., Thomas, A., Stevenson, L. A., Maor, Y. e Mechoulam,
R. Evidence that (-)-7-hydroxy-4'-dimethylheptyl-cannabidiol activates
a non-CB(1), non-CB(2), non-TRPV1 target in the mouse vas deferens.
Neuropharmacology, v.48, n.8, Jun, p.1139-46. 2005.
Pike, L. J., Han, X., Chung, K. N. e Gross, R. W. Lipid rafts are
enriched in arachidonic acid and plasmenylethanolamine and their
composition is independent of caveolin-1 expression: a quantitative
electrospray ionization/mass spectrometric analysis. Biochemistry, v.41,
n.6, Feb 12, p.2075-88. 2002.
Pinto, J. C., Potie, F., Rice, K. C., Boring, D., Johnson, M. R., Evans, D.
M., Wilken, G. H., Cantrell, C. H. e Howlett, A. C. Cannabinoid
receptor binding and agonist activity of amides and esters of arachidonic
acid. Mol Pharmacol, v.46, n.3, Sep, p.516-22. 1994.
124
Piomelli, D. The molecular logic of endocannabinoid signalling. Nat
Rev Neurosci, v.4, n.11, Nov, p.873-84. 2003.
Placzek, E. A., Okamoto, Y., Ueda, N. e Barker, E. L. Membrane
microdomains and metabolic pathways that define anandamide and 2-
arachidonyl glycerol biosynthesis and breakdown. Neuropharmacology,
v.55, n.7, Dec, p.1095-104. 2008.
Porter, A. C., Sauer, J. M., Knierman, M. D., Becker, G. W., Berna, M.
J., Bao, J., Nomikos, G. G., Carter, P., Bymaster, F. P., Leese, A. B. e
Felder, C. C. Characterization of a novel endocannabinoid, virodhamine,
with antagonist activity at the CB1 receptor. J Pharmacol Exp Ther,
v.301, n.3, Jun, p.1020-4. 2002.
Prediger, R. D., Medeiros, R., Pandolfo, P., Duarte, F. S., Passos, G. F.,
Pesquero, J. B., Campos, M. M., Calixto, J. B. e Takahashi, R. N.
Genetic deletion or antagonism of kinin B(1) and B(2) receptors
improves cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease.
Neuroscience, v.151, n.3, Feb 6, p.631-43. 2008.
Price, M. R., Baillie, G. L., Thomas, A., Stevenson, L. A., Easson, M.,
Goodwin, R., Mclean, A., Mcintosh, L., Goodwin, G., Walker, G.,
Westwood, P., Marrs, J., Thomson, F., Cowley, P., Christopoulos, A.,
Pertwee, R. G. e Ross, R. A. Allosteric modulation of the cannabinoid
CB1 receptor. Mol Pharmacol, v.68, n.5, Nov, p.1484-95. 2005.
Proska, J. e Tucek, S. Mechanisms of steric and cooperative actions of
alcuronium on cardiac muscarinic acetylcholine receptors. Mol
Pharmacol, v.45, n.4, Apr, p.709-17. 1994.
Raffa, R. B., Stone, D. J., Jr. e Hipp, S. J. Differential cholera-toxin
sensitivity of supraspinal antinociception induced by the cannabinoid
agonists delta9-THC, WIN 55,212-2 and anandamide in mice. Neurosci
Lett, v.263, n.1, Mar 19, p.29-32. 1999.
Rall, J. M., Mach, S. A. e Dash, P. K. Intrahippocampal infusion of a
cyclooxygenase-2 inhibitor attenuates memory acquisition in rats. Brain
Res, v.968, n.2, Apr 11, p.273-6. 2003.
125
Razani, B., Woodman, S. E. e Lisanti, M. P. Caveolae: from cell biology
to animal physiology. Pharmacol Rev, v.54, n.3, Sep, p.431-67. 2002.
Reggio, P. H. Pharmacophores for ligand recognition and
activation/inactivation of the cannabinoid receptors. Curr Pharm Des,
v.9, n.20, p.1607-33. 2003.
Rhee, M. H., Bayewitch, M., Avidor-Reiss, T., Levy, R. e Vogel, Z.
Cannabinoid receptor activation differentially regulates the various
adenylyl cyclase isozymes. J Neurochem, v.71, n.4, Oct, p.1525-34.
1998.
Rios, C., Gomes, I. e Devi, L. A. mu opioid and CB1 cannabinoid
receptor interactions: reciprocal inhibition of receptor signaling and
neuritogenesis. Br J Pharmacol, v.148, n.4, Jun, p.387-95. 2006.
Rodriguez De Fonseca, F., Navarro, M., Gomez, R., Escuredo, L., Nava,
F., Fu, J., Murillo-Rodriguez, E., Giuffrida, A., Loverme, J., Gaetani, S.,
Kathuria, S., Gall, C. e Piomelli, D. An anorexic lipid mediator
regulated by feeding. Nature, v.414, n.6860, Nov 8, p.209-12. 2001.
Romano, M., Maddox, J. F. e Serhan, C. N. Activation of human
monocytes and the acute monocytic leukemia cell line (THP-1) by
lipoxins involves unique signaling pathways for lipoxin A4 versus
lipoxin B4: evidence for differential Ca2+ mobilization. J Immunol,
v.157, n.5, Sep 1, p.2149-54. 1996.
Ross, R. A. Allosterism and cannabinoid CB(1) receptors: the shape of
things to come. Trends Pharmacol Sci, v.28, n.11, Nov, p.567-72. 2007.
Ross, R. A., Gibson, T. M., Brockie, H. C., Leslie, M., Pashmi, G.,
Craib, S. J., Di Marzo, V. e Pertwee, R. G. Structure-activity
relationship for the endogenous cannabinoid, anandamide, and certain of
its analogues at vanilloid receptors in transfected cells and vas deferens.
Br J Pharmacol, v.132, n.3, Feb, p.631-40. 2001.
Roth, S. H. e Williams, P. J. The non-specific membrane binding
properties of delta9-tetrahydrocannabinol and the effects of various
solubilizers. J Pharm Pharmacol, v.31, n.4, Apr, p.224-30. 1979.
126
Rowley, A. F., Lloyd-Evans, P., Barrow, S. E. e Serhan, C. N. Lipoxin
biosynthesis by trout macrophages involves the formation of epoxide
intermediates. Biochemistry, v.33, n.4, Feb 1, p.856-63. 1994.
Russo, E. B., Jiang, H. E., Li, X., Sutton, A., Carboni, A., Del Bianco,
F., Mandolino, G., Potter, D. J., Zhao, Y. X., Bera, S., Zhang, Y. B., Lu,
E. G., Ferguson, D. K., Hueber, F., Zhao, L. C., Liu, C. J., Wang, Y. F. e
Li, C. S. Phytochemical and genetic analyses of ancient cannabis from
Central Asia. J Exp Bot, v.59, n.15, p.4171-82. 2008.
Ryberg, E., Larsson, N., Sjogren, S., Hjorth, S., Hermansson, N. O.,
Leonova, J., Elebring, T., Nilsson, K., Drmota, T. e Greasley, P. J. The
orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid receptor. Br J
Pharmacol, v.152, n.7, Dec, p.1092-101. 2007.
Ryberg, E., Vu, H. K., Larsson, N., Groblewski, T., Hjorth, S., Elebring,
T., Sjogren, S. e Greasley, P. J. Identification and characterisation of a
novel splice variant of the human CB1 receptor. FEBS Lett, v.579, n.1,
Jan 3, p.259-64. 2005.
Samuelson, L. C., Swanberg, L. J. e Gantz, I. Mapping of the novel G
protein-coupled receptor Gpr18 to distal mouse chromosome 14. Mamm
Genome, v.7, n.12, Dec, p.920-1. 1996.
Savinainen, J. R., Jarvinen, T., Laine, K. e Laitinen, J. T. Despite
substantial degradation, 2-arachidonoylglycerol is a potent full efficacy
agonist mediating CB(1) receptor-dependent G-protein activation in rat
cerebellar membranes. Br J Pharmacol, v.134, n.3, Oct, p.664-72. 2001.
Scalia, R., Gefen, J., Petasis, N. A., Serhan, C. N. e Lefer, A. M.
Lipoxin A4 stable analogs inhibit leukocyte rolling and adherence in the
rat mesenteric microvasculature: role of P-selectin. Proc Natl Acad Sci
U S A, v.94, n.18, Sep 2, p.9967-72. 1997.
Schaffer, J. E. e Lodish, H. F. Expression cloning and characterization
of a novel adipocyte long chain fatty acid transport protein. Cell, v.79,
n.3, Nov 4, p.427-36. 1994.
Schottelius, A. J., Giesen, C., Asadullah, K., Fierro, I. M., Colgan, S. P.,
Bauman, J., Guilford, W., Perez, H. D. e Parkinson, J. F. An aspirin-
127
triggered lipoxin A4 stable analog displays a unique topical anti-
inflammatory profile. J Immunol, v.169, n.12, Dec 15, p.7063-70. 2002.
Serhan, C. N. Lipoxins and novel aspirin-triggered 15-epi-lipoxins
(ATL): a jungle of cell-cell interactions or a therapeutic opportunity?
Prostaglandins, v.53, n.2, Feb, p.107-37. 1997.
Serhan, C. N., Hamberg, M. e Samuelsson, B. Lipoxins: novel series of
biologically active compounds formed from arachidonic acid in human
leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, v.81, n.17, Sep, p.5335-9. 1984.
Shearman, M. S., Berry, N., Oda, T., Ase, K., Kikkawa, U. e Nishizuka,
Y. Isolation of protein kinase C subspecies from a preparation of human
T lymphocytes. FEBS Lett, v.234, n.2, Jul 18, p.387-91. 1988.
Shearman, M. S., Naor, Z., Sekiguchi, K., Kishimoto, A. e Nishizuka,
Y. Selective activation of the gamma-subspecies of protein kinase C
from bovine cerebellum by arachidonic acid and its lipoxygenase
metabolites. FEBS Lett, v.243, n.2, Jan 30, p.177-82. 1989.
Sheskin, T., Hanus, L., Slager, J., Vogel, Z. e Mechoulam, R. Structural
requirements for binding of anandamide-type compounds to the brain
cannabinoid receptor. J Med Chem, v.40, n.5, Feb 28, p.659-67. 1997.
Shim, J. Y. e Howlett, A. C. WIN55212-2 docking to the CB1
cannabinoid receptor and multiple pathways for conformational
induction. J Chem Inf Model, v.46, n.3, May-Jun, p.1286-300. 2006.
Shin, J., Cho, H., Hwang, S. W., Jung, J., Shin, C. Y., Lee, S. Y., Kim,
S. H., Lee, M. G., Choi, Y. H., Kim, J., Haber, N. A., Reichling, D. B.,
Khasar, S., Levine, J. D. e Oh, U. Bradykinin-12-lipoxygenase-VR1
signaling pathway for inflammatory hyperalgesia. Proc Natl Acad Sci U
S A, v.99, n.15, Jul 23, p.10150-5. 2002.
Sigel, E. e Buhr, A. The benzodiazepine binding site of GABAA
receptors. Trends Pharmacol Sci, v.18, n.11, Nov, p.425-9. 1997.
Simmet, T. e Peskar, B. A. Lipoxygenase products of polyunsaturated
fatty acid metabolism in the central nervous system: biosynthesis and
putative functions. Pharmacol Res, v.22, n.6, Nov-Dec, p.667-82. 1990.
128
Slanina, K. A. e Schweitzer, P. Inhibition of cyclooxygenase-2 elicits a
CB1-mediated decrease of excitatory transmission in rat CA1
hippocampus. Neuropharmacology, v.49, n.5, Oct, p.653-9. 2005.
Souza, M. H., De Lima, O. M., Jr., Zamuner, S. R., Fiorucci, S. e
Wallace, J. L. Gastritis increases resistance to aspirin-induced mucosal
injury via COX-2-mediated lipoxin synthesis. Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol, v.285, n.1, Jul, p.G54-61. 2003.
Sri Kantha, S., Matsumura, H., Kubo, E., Kawase, K., Takahata, R.,
Serhan, C. N. e Hayaishi, O. Effects of prostaglandin D2, lipoxins and
leukotrienes on sleep and brain temperature of rats. Prostaglandins
Leukot Essent Fatty Acids, v.51, n.2, Aug, p.87-93. 1994.
Starowicz, K., Nigam, S. e Di Marzo, V. Biochemistry and
pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther, v.114, n.1, Apr,
p.13-33. 2007.
Stella, N., Schweitzer, P. e Piomelli, D. A second endogenous
cannabinoid that modulates long-term potentiation. Nature, v.388,
n.6644, Aug 21, p.773-8. 1997.
Su, S. B., Gong, W., Gao, J. L., Shen, W., Murphy, P. M., Oppenheim,
J. J. e Wang, J. M. A seven-transmembrane, G protein-coupled receptor,
FPRL1, mediates the chemotactic activity of serum amyloid A for
human phagocytic cells. J Exp Med, v.189, n.2, Jan 18, p.395-402. 1999.
Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Nakane, S., Shinoda, A., Itoh, K.,
Yamashita, A. e Waku, K. 2-Arachidonoylglycerol: a possible
endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochem Biophys Res
Commun, v.215, n.1, Oct 4, p.89-97. 1995.
Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Tonegawa, T., Nakane, S.,
Yamashita, A., Ishima, Y. e Waku, K. Transacylase-mediated and
phosphodiesterase-mediated synthesis of N-arachidonoylethanolamine,
an endogenous cannabinoid-receptor ligand, in rat brain microsomes.
Comparison with synthesis from free arachidonic acid and
ethanolamine. Eur J Biochem, v.240, n.1, Aug 15, p.53-62. 1996.
129
Takahashi, R. N., Pamplona, F. A. e Fernandes, M. S. The cannabinoid
antagonist SR141716A facilitates memory acquisition and consolidation
in the mouse elevated T-maze. Neurosci Lett, v.380, n.3, Jun 3, p.270-5.
2005.
Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. e Serhan, C. N.
Neutrophil-mediated changes in vascular permeability are inhibited by
topical application of aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 and novel
lipoxin B4 stable analogues. J Clin Invest, v.101, n.4, Feb 15, p.819-26.
1998.
Takano, T., Fiore, S., Maddox, J. F., Brady, H. R., Petasis, N. A. e
Serhan, C. N. Aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 (LXA4) and LXA4
stable analogues are potent inhibitors of acute inflammation: evidence
for anti-inflammatory receptors. J Exp Med, v.185, n.9, May 5, p.1693-
704. 1997.
Teather, L. A., Packard, M. G. e Bazan, N. G. Post-training
cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibition impairs memory consolidation.
Learn Mem, v.9, n.1, Jan-Feb, p.41-7. 2002.
Touwn, M. The religious and medicinal uses of Cannabis in China,
India and Tibet. J Psychoactive Drugs, v.13, p.23-34. 1981.
Ueda, N., Yamamoto, K., Yamamoto, S., Tokunaga, T., Shirakawa, E.,
Shinkai, H., Ogawa, M., Sato, T., Kudo, I., Inoue, K. e Et Al.
Lipoxygenase-catalyzed oxygenation of arachidonylethanolamide, a
cannabinoid receptor agonist. Biochim Biophys Acta, v.1254, n.2, Jan
20, p.127-34. 1995.
Umathe, S. N., Manna, S. S., Utturwar, K. S. e Jain, N. S.
Endocannabinoids mediate anxiolytic-like effect of acetaminophen via
CB1 receptors. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, v.33, n.7,
Oct 1, p.1191-9. 2009.
Uz, T., Dimitrijevic, N., Imbesi, M., Manev, H. e Manev, R. Effects of
MK-886, a 5-lipoxygenase activating protein (FLAP) inhibitor, and 5-
lipoxygenase deficiency on the forced swimming behavior of mice.
Neurosci Lett, v.436, n.2, May 9, p.269-72. 2008.
130
Uz, T., Dimitrijevic, N., Tueting, P. e Manev, H. 5-lipoxygenase
(5LOX)-deficient mice express reduced anxiety-like behavior. Restor
Neurol Neurosci, v.20, n.1-2, p.15-20. 2002.
Van Der Stelt, M., Van Kuik, J. A., Bari, M., Van Zadelhoff, G.,
Leeflang, B. R., Veldink, G. A., Finazzi-Agro, A., Vliegenthart, J. F. e
Maccarrone, M. Oxygenated metabolites of anandamide and 2-
arachidonoylglycerol: conformational analysis and interaction with
cannabinoid receptors, membrane transporter, and fatty acid amide
hydrolase. J Med Chem, v.45, n.17, Aug 15, p.3709-20. 2002.
Van Sickle, M. D., Duncan, M., Kingsley, P. J., Mouihate, A., Urbani,
P., Mackie, K., Stella, N., Makriyannis, A., Piomelli, D., Davison, J. S.,
Marnett, L. J., Di Marzo, V., Pittman, Q. J., Patel, K. D. e Sharkey, K.
A. Identification and functional characterization of brainstem
cannabinoid CB2 receptors. Science, v.310, n.5746, Oct 14, p.329-32.
2005.
Varma, N., Carlson, G. C., Ledent, C. e Alger, B. E. Metabotropic
glutamate receptors drive the endocannabinoid system in hippocampus.
J Neurosci, v.21, n.24, Dec 15, p.RC188. 2001.
Verdier, Y. e Penke, B. Binding sites of amyloid beta-peptide in cell
plasma membrane and implications for Alzheimer's disease. Curr
Protein Pept Sci, v.5, n.1, Feb, p.19-31. 2004.
Von Der Weid, P. Y., Hollenberg, M. D., Fiorucci, S. e Wallace, J. L.
Aspirin-triggered, cyclooxygenase-2-dependent lipoxin synthesis
modulates vascular tone. Circulation, v.110, n.10, Sep 7, p.1320-5.
2004.
Wager-Miller, J., Westenbroek, R. e Mackie, K. Dimerization of G
protein-coupled receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example.
Chem Phys Lipids, v.121, n.1-2, Dec 31, p.83-9. 2002.
Williams, J. H. e Bliss, T. V. Induction but not maintenance of calcium-
induced long-term potentiation in dentate gyrus and area CA1 of the
hippocampal slice is blocked by nordihydroguaiaretic acid. Neurosci
Lett, v.88, n.1, May 16, p.81-5. 1988.
131
Wilson, R. I. e Nicoll, R. A. Endocannabinoid signaling in the brain.
Science, v.296, n.5568, Apr 26, p.678-82. 2002.
Woodward, D. F., Liang, Y. e Krauss, A. H. Prostamides
(prostaglandin-ethanolamides) and their pharmacology. Br J Pharmacol,
v.153, n.3, Feb, p.410-9. 2008.
Yu, M., Ives, D. e Ramesha, C. S. Synthesis of prostaglandin E2
ethanolamide from anandamide by cyclooxygenase-2. J Biol Chem,
v.272, n.34, Aug 22, p.21181-6. 1997.
Zurier, R. B., Sun, Y. P., George, K. L., Stebulis, J. A., Rossetti, R. G.,
Skulas, A., Judge, E. e Serhan, C. N. Ajulemic acid, a synthetic
cannabinoid, increases formation of the endogenous proresolving and
anti-inflammatory eicosanoid, lipoxin A4. FASEB J, v.23, n.5, May,
p.1503-9. 2009.
132
ANEXO 1 – PUBLICAÇÃO DE PARTE DOS RESULTADOS EM
PERIÓDICO CIENTÍFICO INTERNACIONAL
133
134
135
136
137
138
ANEXO 2 – OUTRAS PUBLICAÇÕES E PREMIAÇÕES
RESULTANTES DESTA TESE DE DOUTORADO
139
Prêmios – Menções Honrosas
Pamplona, F.A.; Ferreira, J.; Menezes-de-Lima Jr, O.; Calixto, J.B.;
Takahashi, R.N.
Lipoxin A4: a new player on endocannabinoid
neurotransmission suggests endogenous allosteric modulation of CB1
receptors. 41º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica
Experimental – SBFTE, Brasil, 2009.
Pamplona, F.A.; Ferreira, J.; Duarte, F.S.; Menezes-de-Lina Jr., O.;
Calixto, J.B.; Takahashi, R.N. Lipoxina A
4
: um novo ligante
endocanabinóide com ações centrais? 38º Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapêutica Experimental – SBFTE, Brasil, 2006.
Resumos apresentados em congressos contendo resultados da tese:
Takahashi, R.N.; Pamplona, F.A. Lipoxin A
4
exerts neuroprotective
effects mediated by the endocannabinoid system in mice. 22º European
College of Neuropsychopharmacology – ECNP, Turquia, 2009.
Pamplona, F.A.; Ferreira, J.; Menezes-de-Lima Jr, O.; Calixto, J.B.;
Takahashi, R.N.
Lipoxin A
4
: a new player on endocannabinoid
neurotransmission suggests endogenous allosteric modulation of CB1
receptors. 41º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica
Experimental – SBFTE, Brasil, 2009.
Pamplona, F.A.; Prediger, R.D.S.; Menezes-de-Lima Jr, O.; Takahashi,
R.N. Lipoxin A
4
: a new player in endocannabinoid-mediated
neuroprotection? 2º Simpósio do Instituto Internacional de
Neurociências de Natal – IINN, Brasil, 2007.
Pamplona, F.A.; Ferreira, J. Duarte, F.S.; Menezes-de-Lima Jr, O.;
Calixto, J.B.; Takahashi, R.N. Lipoxina A
4
: um novo ligante
endocanabinóide com ações centrais? 38º Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapêutica Experimental – SBFTE, Brasil, 2006.
Pamplona, F.A.; Prediger, R.D.S.; Menezes-de-Lima Jr, O.; Takahashi,
R.N. Administração i.c.v. de lipoxina A
4
previne prejuízos cognitivos
em um modelo animal da doença de Alzheimer. 38º Congresso
Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental – SBFTE,
Brasil, 2006.
140
ANEXO 3 – OUTRAS PUBLICAÇÕES DURANTE
O PERÍODO DO DOUTORADO
141
Capítulo de Livro (1)
Pamplona, F.A.; Takahashi, R.N. Cannabis e Estresse Pós-Traumático
em Zuardi, A.W.; Crippa, J.A.S.; Guimarães, F.S. et al. Cannabis e
Saúde Mental. São Paulo: FUNPEC-Editora, 2008.
Artigos Completos (11)
Pamplona, F.A.; Henes, K.; Micale, V.; Mauch, C.P.; Takahashi, R.N.;
Wotjak, C.T. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance
behavior in mice. Journal of Psychiatric Research (submetido).
Pamplona, F.A.; Pandolfo, P.; Duarte, F.S.; Takahashi, R.N. Altered
emotionality leads to increase pain tolerance in amyloid β (1-40)
peptide-treated mice. Behavioural Brain Research (in press).
de Carvalho, C.R.; Pandolfo, P.; Pamplona, F.A.; Takahashi, R.N.
Environmental enrichment reduces the impact of novelty and
motivational properties of ethanol in spontaneously hypertensive rats.
Behavioral Brain Research 208 (2010) 231-6.
Pamplona, F.A.; Menezes-de-Lima, O. Jr.; Takahashi, R.N. Aspirin-
triggered lipoxin induces CB(1)-dependent catalepsy in mice.
Neuroscience Letters 470 (2010) 33-37.
Pamplona, F.A.; Pandolfo, P.; Savoldi, R.; Prediger, R.D.; Takahashi,
R.N. Environmental enrichment improves cognitive deficits in
Spontaneously Hypertensive Rats (SHR): relevance for Attention
Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD). Progress in
Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 33 (2009) 1153-60.
Pires, V.A.; Prediger, R.D.S.; Pamplona, F.A.; Pandolfo, P.; Fernandes,
D.; Takahashi, R.N. Adenosine receptor antagonists improve short-term
object recognition ability of Spontaneously Hypertensive Rats (SHR):
an animal model of Attention / Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD).
Behavioral Pharmacology 20 (2009) 134-45.
Bitencourt, R.M.; Pamplona, F.A.; Takahashi, R.N. Facilitation of
contextual fear memory extinction and anti-anxiogenic effects of
142
AM404 and cannabidiol in conditioned rats. European
Neuropsychopharmacology 18 (2008) 849-859.
Pamplona, F.A.; Bitencourt, R.M.; Takahashi, R.N. Short- and long-
term of cannabinoids on the extinction of contextual fear memory in
rats. Neurobiology of Learning and Memory 90 (2008) 290-293.
Takahashi, R.N.; Pamplona, F.A.; Prediger, R.D.S. Adenosine receptor
antagonists for cognitive dysfunction: A review of animal studies.
Frontiers in Biosciences 13 (2008) 2614-2632. Review.
Pamplona, F.A.; Vendruscolo, L.F.; Takahashi, R.N. Increased
sensitivity to cocaine-induced analgesia in Spontaneously Hypertensive
Rats (SHR). Behavioral and Brain Functions 3 (2007) 9-13.
Pandolfo, P.; Pamplona, F.A.; Prediger, R.D.S.; Takahashi, R.N.
Increased sensitivity of adolescent spontaneously hypertensive rats, an
animal model of attention deficit hyperactivity disorder, to the
locomotor stimulation induced by the cannabinoid receptor agonist
WIN55,212-2. European Journal of Pharmacology 563 (2007) 141-148.
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