( PDF ) Investigação molecular e perfil bioquímico de pacientes com mucopolissacaridoses

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GUSTAVO MONTEIRO VIANA

INVESTIGAÇÃO MOLECULAR E PERFIL BIOQUÍMICO DE

PACIENTES COM MUCOPOLISSACARIDOSES

BELÉM/PA

2010

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GUSTAVO MONTEIRO VIANA

INVESTIGAÇÃO MOLECULAR E PERFIL BIOQUÍMICO DE

PACIENTES COM MUCOPOLISSACARIDOSES

Dissertação de Mestrado submetida ao

Programa de Pós-graduação em Neurociências

e Biologia Celular da Universidade Federal do

Pará como requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre em Neurociências e Biologia

Celular.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da

Silva, ICB – UFPA.

BELÉM/PA

2010

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GUSTAVO MONTEIRO VIANA

INVESTIGAÇÃO MOLECULAR E PERFIL BIOQUÍMICO DE

PACIENTES COM MUCOPOLISSACARIDOSES

Dissertação de mestrado submetida ao

Programa de Pós-graduação em Neurociências

e Biologia Celular da Universidade Federal do

Pará como requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre em Neurociências e Biologia

Celular.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da

Silva, ICB – UFPA.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva (ICB – UFPA)

Banca examinadora

Avaliador

: Prof. Dr. João Farias Guerreiro (ICB / UFPA)

Avaliador

: Prof. Dr. José Ricardo dos Santos Vieira (ICB/UFPA)

Avaliador

: Profa. Dra. Rita Mousinho Ribeiro (ICB/UFPA)

Avaliador

(suplente): Prof. Dr. André Salim Khayat (ICB / UFPA)

Avaliador

(suplente): Prof. Dr. José Eduardo Melo dos Santos (ICB/UFPA)

BELÉM/PA

2010

Dedico esse trabalho aos meus pais,

verdadeiros alicerces da minha vida.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me proporcionar serenidade e paciência durante a realização

deste trabalho.

Aos meus pais, que sempre estiveram ao meu lado, me apoiaram em todas as

minhas decisões e me incentivaram em todos os momentos;

Ao meu orientador Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva, pela orientação, por

todo empenho, sabedoria, exigência e, acima de tudo, pelo companheirismo e

amizade que demonstrou ao longo da realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Anderson Manoel Herculano de Oliveira pelo apoio e envolvimento

dados no momento da minha qualificação.

Aos meus colegas do LEIM, pelo companheirismo e amizade.

Aos meus amigos Erik Alves e Cléber Cruz, por terem sido essenciais na

elaboração deste trabalho e pelo apoio fornecido nos momentos mais difíceis.

À Dra. Isabel Cristina Neves de Souza e à Dra. Raimunda Helena Feio, pela

importante participação no projeto ao fornecer os dados clínicos dos pacientes.

Ao grupo do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto

Alegre, pela hospitalidade e pelos ensinamentos a mim dedicados.

Aos pacientes com MPS e seus familiares, pela paciência e compreensão

durante a realização do estudo.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

E a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a

realização deste trabalho.

“A verdadeira ignorância não reside na falta de

conhecimentos, mas na falta de vontade de aceitá-los”

Karl Popper

RESUMO

As Mucopolissacaridoses (MPS) consistem em um raro grupo de doenças

metabólicas hereditárias e são causadas pela deficiência de enzimas

lisossomais específicas responsáveis pela degradação de glicosaminoglicanos

(GAG). Uma vez não degradados, os GAG acumulam-se em vários tecidos e

órgãos, levando ao desenvolvimento de uma doença crônica de caráter

progressivo e multisistêmico. A Terapia de Reposição Enzimática (TRE) tem

demonstrado eficácia na redução da acumulação tecidual e excreção urinária

de GAG. Além disso, a TRE também permitiu uma melhora dos sintomas

clínicos apresentados pelos pacientes com MPS. O presente estudo investigou

as características bioquímicas e moleculares de 10 pacientes com MPS

provenientes da região Norte do Brasil (2 com MPS I, 4 com MPS II, 1 com

MPS IIB e 3 com MPS VI), sendo alguns submetidos à TRE. Para avaliar a

eficácia da TRE durante o tratamento, a excreção urinária de GAG foi

mensurada através do ensaio colorimétrico utilizando o reagente Azul de

Dimetileno (DMB). A análise molecular revelou a presença da mutação P533R

nos pacientes com MPS I. Nos pacientes com MPS II, foi detectada a mutação

R468W. Em pacientes com MPS VI, dois polimorfismos anteriormente descritos

(V358M e V376M) também foram identificados. Após 48 semanas de

tratamento, observou-se uma redução significativa da excreção urinária de

GAG (p<0,01) em todos os pacientes com MPS submetidos à TRE. Os

resultados obtidos no presente estudo estão de acordo com a literatura,

confirmando a eficácia da TRE na redução da excreção urinária de GAG em

pacientes com MPS e a elevada heterogeneidade molecular da doença. Este é

o primeiro estudo bioquímico e molecular realizado em pacientes com MPS no

Estado do Pará.

ABSTRACT

Mucopolysaccharidoses (MPS) are rare lysosomal disorders caused by the

deficiency of specific lysosomal enzymes responsible for glycosaminoglycan

(GAG) degradation. When not degraded, GAG accumulates in various tissues

and organs, leading to a chronic, progressive and multisystem disease. Enzyme

Replacement Therapy (ERT) has been shown to reduce accumulation and

urinary excretion of GAG. It has also been demonstrated that ERT is able to

improve some clinical signs of MPS patients. We studied biochemical and

molecular characteristics of 10 MPS patients (2 MPS I, 4 MPS II, 1 MPS IIB and

3 MPS VI) undergoing ERT in Northern Brazil. To evaluate the efficacy of the

ERT during the treatment, urinary GAG excretion was measured by colorimetric

assay using Dimethylene Blue (DMB). Patients were screened for 8 known

MPS related mutations using PCR, RFLP, SSCP and direct sequencing.

Molecular analysis of two MPS I patients revealed the previously reported

mutation P533R. In MPS II patients, mutation analysis identified one previously

reported mutation (R468W) and in MPS VI patients, two previously detected

polymorphisms (V358M and V376M) were also found. In the biochemical

analysis, total urinary GAG excretion significantly decreased in patients with

MPS I (p<0,01) and MPS VI (p<0,01) after 48 weeks of ERT. Our findings are in

agreement with literature, confirming the efficacy of ERT on the reduction of

urinary GAG excretion in MPS patients and the high molecular heterogeneity of

this disease. This is the first biochemical and molecular study of MPS patients

in the State of Pará.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 Mucopolissacaridoses (MPS) 01

1.1.1 Generalidades 01

1.1.2 Classificação 02

1.1.3 Diagnóstico clínico 05

1.1.4 Diagnóstico laboratorial 08

1.1.5 Tratamento 09

1.1.6 Aspectos epidemiológicos 12

1.1.7 Bases Celulares das MPS 13

1.1.8 Bases Moleculares das MPS 15

a) Mucopolissacaridose I (MPS I) 15

b) Mucopolissacaridose II (MPS II) 18

c) Mucopolissacaridose IIIB (MPS IIIB) 20

d) Mucopolissacaridose VI (MPS VI) 21

2. OBJETIVOS 23

2.1 Objetivo Geral 23

2.2 Objetivos Específicos 23

3. MATERIAL E MÉTODOS 24

3.1 MATERIAL 24

3.1.1 Caracterização da amostra 24

3.2 Critérios de inclusão 24

3.3 Aspectos éticos 27

3.4 Coleta e armazenamento das amostras 27

3.2 MÉTODOS 27

3.2.1. Análise bioquímica 27

a) TRE 27

b) Dosagem de cratinina urinária 28

c) Dosagem dos GAG urinários 28

3.2.2 Análise molecular 29

a) Extração do DNA 29

b) Reação em cadeia da polimerase (PCR) 29

c) Análise por digestão com endonucleases de restrição 32

d) Análise de Polimorfismos Conformacionais de Cadeia Simples (SSCP) 34

e) Seqüenciamento direto 34

f) Análise estatística 35

4. RESULTADOS 36

4.1 MPS I 36

4.1.1 Perfil bioquímico 36

4.1.2 Perfil molecular (gene IDUA) 37

4.2 MPS II 40

4.2.1 Perfil molecular (gene IDS) 40

4.3 MPS IIIB 43

4.3.1 Perfil molecular (gene NAGLU) 43

4.4 MPS VI 43

4.4.1 Perfil bioquímico 43

4.4.2 Perfil molecular (gene ARSB) 44

5. DISCUSSÃO 48

5.1 Investigação molecular 48

5.2 Perfil bioquímico 54

5.3 Considerações finais 58

6. CONCLUSÕES 60

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61

8. ANEXOS 74

8.1 Carta de aceite do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos 74

8.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 75

LISTA DE QUADROS E FIGURAS

QUADRO 01: Classificação das mucopolissacaridoses 04

QUADRO 02: Perfil bioquímico inicial dos pacientes com MPS antes da

TRE.

QUADRO 03: Resumo das características clínicas dos pacientes com

MPS

QUADRO 04: Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para a

amplificação de fragmentos específicos dos genes IDUA (MPS I), IDS

(MPS II), NAGLU (MPS IIIB) e ARSB (MPS VI).

QUADRO 05: Protocolo básico para as reações de amplificação por

PCR.

QUADRO 06:

Condições usadas nas reações de PCR. 31

QUADRO 07:

Protocolo empregado nas reações com enzimas de

restrição.

QUADRO 08: Protocolo básico de digestão com endonucleases de

restrição

QUADRO 09:

Protocolo básico utilizado nas reações de

seqüenciamento

FIGURA 01: Rota metabólica da degradação do dermatan sulfato. Nac

(N-acetil-galactosamina)

FIGURA 02: Esquema celular das Mucopolissacaridoses 14

LISTA DE TABELAS

TABELA 01: Mutações e polimorfismos encontrados nos pacientes com

MPS e seus parentes.

TABELA 02: Características moleculares, bioquímicas e clínicas dos

pacientes com MPS.

LISTA DE ABREVIA

TURAS E SIGLAS

ARSB: Arilsulfatase B

BCTMA: Brometo de cetil-trimetil-amônio

DLD: Doença de depósito lisossômico

DNA: Ácido desoxirribonucléico

EIM: Erros inatos do metabolismo

GAG: glicosaminoglicanos

IDS: iduronato-sulfatase

IDUA: α-L-iduronidase

MPS: mucopolissacaridoses

NAGLU: α-N-acetil-glicosaminidase

PCR: polimerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)

RFLP: restriction fragment lenght polymorphism (digestão por

endonucleases de restrição)

SSCP: single stranded conformational polymorphism (polimorfismo

conformacional de cadeia simples)

1. INTRODUÇÃO

1.1. Mucopolissacaridoses

1.1.1. Generalidades

As mucopolissacaridoses (MPS) correspondem a um grupo de doenças

lisossômicas de depósito (DLD), causadas pela deficiência de enzimas lisossomais

(Figura 01) essenciais para o metabolismo de componentes da matriz extracelular

como os glicosaminoglicanos (GAG). Uma vez não degradados, os GAG são

estocados nos compartimentos lisossômicos celulares, promovendo uma série de

complicações patológicas que iniciam desde o período fetal, até a intensa

progressão dos sintomas na fase infantil (Nelson & Cox, 2000; Scriver et al., 2001).

Figura 01. Rota metabólica da degradação do dermatan sulfato. Nac (N-acetil-galactosamina). Fonte:

Scriver, 2001.

1.1.2. Classificação

A Mucopolissacaridose do tipo I corresponde a um tipo de DLD

caracterizada pela deficiência da enzima alfa-L-iduronidase (IDUA; E.C.: 3.2.1.76),

responsável pela quebra dos GAG dermatan sulfato e heparan sulfato. A MPS I é

dividida em três subformas, de acordo com a apresentação clínica dos pacientes:

Síndrome de Hurler (forma grave, OMIM: 607014), Síndrome de Hurler-Scheie

(forma intermediária, OMIM: 607015) e Síndrome de Scheie (forma atenuada, OMIM:

607016). Os sintomas apresentados estão inseridos em um amplo espectro clínico,

de caráter progressivo, que geralmente resultam na morte do indivíduo ainda na fase

infantil, em função de diagnósticos tardios e/ou da ausência de um tratamento

específico (Neufeld & Muenzer, 2001).

A Síndrome de Hunter ou MPS II (OMIM: +309900), corresponde a um

tipo de DLD caracterizada pela deficiência da enzima iduronato-sulfatase (IDS; E.C.:

3.1.6.13), responsável pela quebra dos GAG dermatan sulfato e heparan sulfato.

Sua herança, diferentemente dos outros tipos de MPS, é ligada ao cromossomo X.

Pacientes com essa doença apresentam praticamente os mesmos quadros clínicos

característicos da MPS I, com exceção do opacificação de córnea e do

comprometimento progressivo do sistema nervoso central (Neufeld & Muenzer,

2001).

As MPS do tipo III (Síndrome de Sanfilippo) correspondem, também, a um

grupo de doenças autossômicas recessivas que afetam o metabolismo dos GAG em

função da deficiência ou ausência de hidrolases lisossomais específicas. De acordo

com a deficiência enzimática, as MPS III podem ser dividas em 4 diferentes subtipos,

de acordo com a enzima deficiente: MPS IIIA (heparan-N-sulfatase, EC.: 3.10.1.1;

OMIM:252900); MPS IIIB (α-N-acetilglicosaminidase, E.C.: 3.2.1.50 OMIM: 252920);

MPS IIIC (acetil-CoA:alfa-glicosaminídeo acetiltransferase, E.C.: 2.3.13; OMIM:

252930) e MPS IIID (N-acetilglicosamina-6-sulfatase, E.C.: 3.1.6.14 OMIM: 252930).

A MPS IIIA parece ser a forma mais grave, com rápida progressão dos sintomas e

baixa expectativa de vida (van de Kamp et al., 1981; Yogalingam et al., 2000).

A Mucopolissacaridose do tipo IV (Síndrome de Morquio) é classificada em

dos subtipos (conforme a deficiência da enzima lisossomal específica): MPS IVA (N-

acetilgalactosamina-6-sulfatase, OMIM: 253000) e MPS IVB (β-D-galactosidase,

OMIM: 253010). A doença é causada por uma alteração no gene GALNS,

responsável pela expressão da enzima lisossomal inativa, o que leva a uma falha na

degradação do GAG keratan sulfato (Oshima et al., 1991; Neufeld & Muenzer,

2001).

A Síndrome de Maroteaux-Lamy, ou MPS VI (OMIM: 253200), corresponde

a uma DLD cuja principal característica é a ausência total ou parcial da enzima

arilsulfatase B (ARSB; EC. 3.1.6.12), responsável pelo catabolismo do GAG

dermatan sufato. Inicialmente, descrita em 1963 como uma síndrome semelhante à

Síndrome de Hurler (MPS I), a MPS VI é, também caracterizada, pelo baixo índice

de alterações do desenvolvimento intelectual (Scriver et al., 2001, Siddharth et al.,

2004).

A Síndrome de Sly (MPS VI, OMIM: 253220) é ocasionada pela deficiência

da enzima β-glicuronidase (gene GUSB), responsável pela degradação dos GAG

dermatan sulfato, heparan sulfato e condroitin sulfato (Neufeld & Muenzer, 2001).

A Mucopolissacaridose do tipo IX (Deficiência da enzima hialuronidase,

OMIM: 610492), é a MPS descoberta mais recentemente. Apesar da existência de

apenas 1 caso na literatura, os sintomas apresentados são semelhantes àqueles

evidentes em pacientes com MPS (baixa estatura, acúmulo intracelular de

substratos em função da degradação ineficaz do ácido hialurônico (Triggs-Raine et

al., 1999; Neufeld & Muenzer, 2001).

Todos os tipos de MPS, com exceção da MPS II (herança ligada ao

cromossomo X) são doenças de herança autossômica recessiva. O resumo da

classificação das MPS quanto à deficiência enzimática, excreção urinária de GAG e

o tipo de herança está descrito no quadro 01:

QUADRO 01: Classificação das mucopolissacaridoses

Tipo de MPS Sinonímia Herança

GAGs na

urina

Deficiência

enzimática

MPS I H/HS/S

Hurler/ Hurler-

Scheie/

Scheie

HAR DS + HS

α-L-

Iduronidase

MPS II

(grave/leve)

Hunter HLX DS + HS

Iduronato

sulfatase

MPS III A Sanfilippo A HAR HS

Heparan-N-

sulfatase

MPS III B Sanfilippo B HAR HS

α-N-Acetil-

glicosaminidas

MPS III C Sanfilippo C HAR HS

Acetil-CoA:α-

glicosamina

acetiltransfera

MPS III D Sanfilippo D HAR HS

N-

acetilglicosami

na 6-sulfatase

MPS IV A Morquio A HAR QS

Galactose-6-

sulfatase

MPS IV B Morquio B HAR QS

β-

galactosidase

MPS VI

Maroteaux-

Lamy

HAR DS Arilsulfatase B

MPS VII Sly HAR DS + HS

β-

glicuronidase

MPS IX ------ HAR CS Hialuronidase

DS: dermatan sulfato; HS: heparan sulfato; QS: queratan sulfato; CS: condroitin sulfato; HAR:

herança autossômica recessiva; HLX: Herança ligada ao X; H: Hurler; S: Sheie; HS: Hurler-

Sheie. Adaptada de Neufeld & Muenzer, 2001.

1.1.3. Diagnóstico clínico

Apesar de apresentarem, em comum, características crônicas e

progressivas, os sintomas apresentados por pacientes com MPS variam de acordo

com o tipo. Dentre os sintomas descritos estão organomegalia, disostose múltipla,

hepatoesplenomegalia, mão em garra e fácies grosseiras, todos relacionados ao

acúmulo de GAG nos tecidos (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

Os pacientes com MPS I classificados como portadores da Síndrome de

Hurler apresentam uma evolução clínica progressiva, sistêmica (envolvimento

múltiplo de órgãos e tecidos) e com baixa expectativa de vida, levando à morte ainda

na infância. O diagnóstico dessa síndrome é realizado entre o 4º e o 18º mês de

vida, período no qual os sintomas se tornam mais evidentes. Deformidades ósseas,

infecções nasais e auriculares recorrentes, hérnias umbilicais e inguinais,

descaracterização facial, opacificação, córnea, hepatoesplenomegalia e

macroglossia são identificados nos estágios iniciais. Além disso, alguns pacientes

morrem em função de uma cardiomiopatia fatal antes de completarem 1 ano de

idade, sem receber o diagnóstico clínico de MPS. A desaceleração no crescimento

também ocorre precocemente (entre o 6º e o 18º mês), alcançando uma estatura

máxima de 110 cm em média. (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

A Síndrome de Hurler-Scheie (MPS I HS) corresponde a uma forma clínica

intermediária na qual os sintomas mais evidentes, resultantes do envolvimento

somático progressivo (disostose múltipla, opacificação córnea, comprometimento

articular e cardíaco) ocorrem entre a infância e a juventude. Esses pacientes

geralmente apresentam micrognastia, que causa uma descaraterização facial

característica dessa síndrome. Apesar do envolvimento cardíaco e da obstrução de

vias áreas serem responsáveis pela maior parte dos eventos que causam a

mortalidade clínica desses pacientes, o aparecimento dos sintomas geralmente

ocorre entre o 3º e o 8° ano de vida e a sobrevivên cia até a vida adulta é comum

(Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

Os pacientes com a forma atenuada da MPS I (Síndrome de Scheie, MPS I

S) apresentam, em geral, comprometimento articular, doença aórtica valvar,

opacificação da córnea e algumas outras alterações somáticas. A inteligência e a

estatura são normais, entretanto a má formação facial ainda é presente. Mãos em

garra, síndrome do túnel do carpo e deformidades nos pés são sintomas que podem

levar os pacientes a limitações funcionais. Alguns pacientes podem necessitar,

eventualmente, de traqueostomia para reverter a apnéia do sono causada pela

doença obstrutiva das vias aéreas. A surdez também foi descrita em pacientes com

MPS I S, porém a etiologia dessa alteração é desconhecida. O aparecimento dos

sintomas geralmente começa após os 5 anos de idade, e o diagnóstico, realizado

entre o 10º e o 20º ano de vida (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

A Síndrome de Hunter (MPS II), apesar de apresentar duas classificações

específicas (moderada e grave), possui um amplo espectro de apresentação clínica.

A forma grave da síndrome apresenta características semelhantes à MPS I H, com

exceção da opacificação córnea e da lenta progressão do comprometimento

somático e do sistema nervoso central. Descaracterização facial, baixa estatura,

deformidades ósseas, comprometimento articular e retardo mental são

características dessa forma, assim como degeneração retiniana grave, convulsões,

obstrução das vias aéreas e comprometimento cardiopulmonar, que constituem as

principais causas de mortes entre 10 e 15 anos de idade. A forma moderada da

Síndrome de Hurler é análoga à MPS I HS ou MPS I S, possuindo expectativa de

vida prolongada e lenta progressão da deteriorização somática, com preservação

intelectual (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

A Síndrome de Sanfilippo (MPS III), apesar de ter 4 subtipos

bioquimicamente distintos conforme a enzima lisossomal deficiente (MPS IIIA, IIIB,

IIIC e IIIB), possui um espectro clínico semelhante em todas as suas formas. A

síndrome é caracterizada pela grave degeneração do sistema nervoso central e pelo

moderado comprometimento somático. Hiperatividade com comportamento

agressivo, atraso no desenvolvimento, hipertricose, hirsutismo, desordens do sono,

e hepatoesplenomegalia também são evidentes nesses pacientes. Apesar do

relativo comprometimento ósseo, pacientes com MPS III apresentam grave

degeneração neurológica entre os 6 e os 10 anos de idade, acompanhado com

rápida deteriorização das interações sociais e capacidades adaptativas (van de

Kamp et al., 1981; Yogalingam et al., 2000; Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer,

2004).

A Mucopolissacaridose do tipo IV ou Síndrome de Morquio (MPS IV)

apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, das quais as

predominantes são as alterações ósseas e comprometimento do sistema nervoso

central. Como na maioria das MPS, pacientes com MPS IV são aparentemente

normais após o nascimento. Os sintomas iniciais, que ocorrem entre o 1º e o 4º ano

de idade, são cifose, retardo no crescimento com tronco e pescoço curtos e o “andar

de galope” com tendência à queda. As alterações ósseas típicas em pacientes com

MPS IV são o nanismo (com tronco curto), platispondilia, hipoplasia odontóide,

hiperlordose, escoliose e osteoporose. Outras manifestações como

comprometimento da audição, opacificação córnea moderada, hepatomegalia,

obstrução das vias aéreas superiores, lesões em válvulas cardíacas e

descaracterização facial (ex.: prognatismo) também já foram descritas em pacientes

com essa síndrome (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

O desenvolvimento neurológico em pacientes com Síndrome de Maroteuax-

Lamy (MPS VI) é geralmente normal, apesar do comprometimento físico e visual

impedir o desempenho psicomotor. Alterações somáticas também são evidentes na

forma grave da doença, tais como hérnias umbilicais e/ou inguinais, atraso no

crescimento e hepatoesplenomegalia após o 6º ano de vida, opacificação córnea,

comprometimento articular, mãos em forma de garra e síndrome do túnel do carpo.

As alterações ósseas encontradas em pacientes com MPS VI são semelhantes

àquelas descritas na MPS I H, todas relacionadas a uma disostose múltipla.

Disfunção valvar (aórtica e mitral) são as mais comuns alterações cardíacas

encontradas em pacientes com a forma intermediária. Entretanto, a maioria dos

pacientes com a forma grava da doença morreram entre a segunda e a terceira

década de vida em função da falência das funções cardíacas (Neufeld & Muenzer,

2001; Muenzer, 2004).

A Mucopolissacaridose do tipo VII ou Síndrome de Sly é caracterizada pela

presença de sintomatologias semelhantes às MPS I H ou II. Dentre as

apresentações clínicas mais proeminentes, estão a descaracterização facial,

hepatoesplenomegalia, hérnia umbilical, deformidades vertebrais e deficiência

mental moderada. A opacificação córnea aparece, geralmente, após os 8 anos de

idade.Já a deficiência mental é evidente a partir dos 3 anos de idade, porém,

aparentemente, de caráter não-progressivo. Disostose múltipla, baixa estatura e

episódio de pneumonia também podem ser apresentados por esses pacientes

(Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

A Mucopolissacaridose IX, causada pela deficiência da enzima

hialuronidase, possui apenas 1 caso relatado na literatura. Dentre os sintomas

apresentados, todos estão relacionados ao acúmulo de massas periarticulares e

intra-articulares,, causados pela incapacidade da enzima em degradar o ácido

hialurônico que é normalmente encontrado em altas concentrações em cartilagens e

no líquido sinovial (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

1.1.4. Diagnóstico laboratorial

A investigação bioquímica em pacientes com suspeita de MPS começa a

partir de testes de triagem urinária, com teste do Brometo de Cetil-Trimetil-Amônio

(BCTMA), Azul de Toluidina, dosagem de GAG na urina (quantitativo) e

cromatografia de GAG em camada delgada (qualitativo).

O BCTMA corresponde a um teste preliminar, no qual pode-se verificar a

presença de GAG na urina através da reação destes metabólitos com o reagente

(BCTMA), resultando na formação de um líquido turvo e com precipitado. O teste do

azul de toluidina permite avaliar qualitativamente uma possível excreção de GAG na

urina, através da impregnação de pequenas quantidades urina em papel filtro. Caso

os testes de BCTMA e Azul de Toluidina forem positivos, parte-se para a dosagem

de GAG urinários e para a cromatografia em camada delgada, na qual pode-se

avaliar os tipos de GAG excretados e, assim, verificar qual a MPS possivelmente

relacionada.

O diagnóstico definitivo das MPS é realizado através da mensuração da

atividade das enzimas lisossomais deficientes em cada subtipo de MPS (Wajner et

al., 2001).

1.1.5. Tratamento

A partir da década de 70, ocorreram tentativas para correção do

metabolismo dos GAG em culturas de células de pacientes com MPS, entretanto, as

primeiras tentativas de reposição enzimática in vivo falharam, provavelmente, devido

à administração da enzima inadequada. Até 1980, apenas terapias paliativas e não

específicas foram aplicadas para pacientes com MPS. Estas condutas terapêuticas

falharam em virtude de não produzir nenhuma mudança no quadro clínico,

provavelmente, devido esses procedimentos produzirem somente uma quantidade

insignificante de enzima (Neufeld & Muenzer, 2001; Muenzer, 2004).

Hobbs et al. (1981) relataram que um transplante alogênico de medula

óssea em um menino de 9 anos de idade portador da síndrome de Hurler (MPS I)

proporcionou uma considerável mudança no aspecto da doença. Desde então, o

entendimento dos benefícios e das limitações do transplante de medula óssea vêm

caminhando junto com as extensivas experiências clínicas com pacientes portadores

de MPS e com numerosos estudos experimentais em modelos animais. O advento

do transplante de medula óssea beneficiou alguns casos, principalmente, as formas

graves da MPS I e MPS VI (Muenzer, 2004).

Outra alternativa terapêutica ainda em período de testes é a terapia

gênica, que consiste, basicamente, na utilização de vetores para inserção de células

modificadas que expressam a enzima deficiente em um tecido deficiente. Apesar de

ter demonstrado diversos resultados positivos na melhoria da sintomatologia da

MPS em modelos animais, sua implantação em estudos clínicos com humanos

ainda é improvável. Entretanto, a terapia gência ainda é considerada promissora

para o tratamento de pacientes com MPS durante os estágios inicias do

desenvolvimento infantil (Ponder et al., 2007; Tolar et al., 2008).

A Terapia de Reposição Enzimática (TRE), uma outra alternativa recente

de tratamento, repõe a enzima ausente através de infusões intravenosas. Com o

advento das técnicas de engenharia genética, a enzima humana recombinante pôde

ser gerada, eliminando a necessidade de purificação da enzima de humanos ou de

tecidos animais. A maior vantagem da TRE está no fato que ela pode distribuir mais

enzimas do que as produzidas pelo transplante de células tronco hematopoiéticas. A

TRE está associada a um significante baixo risco e é apropriada para um número

maior de pacientes (Muenzer, 2004).

Os protocolos clínicos utilizando a TRE têm mostrado resultados

promissores no tratamento de pacientes com MPS I, II e VI. Recentemente, a TRE

para MPS I e VI tornou-se comercialmente disponível (Rohrbach & Clarke, 2007;

Harmatz et al., 2005; Wraith et al., 2008).

De forma geral, as enzimas recombinantes utilizadas nas TRE mimetizam

os efeitos biológicos da enzima nativa por serem molecularmente desenhadas para

que possam ser facilmente captadas pelas células dos pacientes. Resíduos de

manose-6-fosfato são inseridos nas cadeias glicoprotéicas da enzima recombinante,

o que permite que a mesma se ligue em receptores específicos de manose-6-fosfato

da superfície celular, seja captada pela célula e direcionada para organelas

específicas (lisossomos), onde irão atuar no catabolismo dos GAG acumulados

(Wraith et al., 2007).

Estudos recentes mostram uma diminuição da excreção de GAG urniários

em pacientes que encontram-se em TRE. Em relação aos pacientes com MPS I, os

quais recebiam a enzima recombinante (laronidase®), Miebach et al., (2005),

Thomas et al. (2006), Arora et al. (2007) e El Dib et al. (2007) descreveram uma

redução significativa da quantidade de GAG excretados na urina, assim como uma

redução da organomegalia, apesar de outros aspectos clínicos (comprometimento

músculo-esquelético, respiratório e medular) não apresentarem melhora significativa.

Em pacientes com MPS VI, que recebiam a enzima recombinante (rhASB),

foram verificadas melhorias em alguns aspectos clínicos, tais como capacidade

respiratória e articular, além de uma redução dose-dependente de GAG urinários,

principalmente naqueles pacientes que apresentavam formas mais graves da

doença e que receberam maiores doses da enzima (Harmatz et al., 2004; Harmatz

et al., 2005; Harmatz et al., 2008; Feio et al., 2008).

Karageorgeos et al. (2007) descreveram os padrões genotípicos e

fenotípicos de pacientes com o mesmo subtipo de MPS que já encontravam-se em

TRE, indicando que, juntamente à anáise de GAG urinários, outros parâmetros

bioquímicos (mensuração das atividades enzimáticas residuais em fibroblastos dos

pacientes) são necessários para a determinação do espectro clínico em cada

paciente.

A maior desvantagem é que a administração intravenosa da enzima não

ultrapassa a barreira hemato-encefálica. Dessa forma, nos casos de MPS onde há

sintomas neurológicos, a TRE não poderá reverter esse aspecto clínico (Muenzer,

2004).

A TRE não interfere significativamente na progressão óssea e neurológica

da doença, devido ao elevado peso molecular das enzimas recombinantes. Porém,

estudos com diferentes formas de administração como a aplicação intratecal e intra-

articular da enzima vêm sendo realizados com o objetivo de superar este obstáculo

(Munoz-Rojas, 2008).

Além disso, o uso da enzima recombinante demonstrou, em modelos

felinos e em humanos, que quanto mais precoce o início da terapia menor o

comprometimento das articulações, ossos, válvulas cardíacas e cartilagem traqueal

(Harmatz et al., 2008; Clarke 2008).

1.1.6. Aspectos epidemiológicos:

As MPS estão entre as DLD mais freqüentes, com uma incidência estimada

em 1:10000 e 1:25000 recém-nascidos. As MPS I e II são consideradas as mais

freqüentes, enquanto a MPS VII parece ser o tipo mais raro. Todas as MPS, com

exceção da MPS II são herdadas de forma autossômica recessiva. A MPS II possui

herança ligada ao X (Solyon, 1996; Meikle et al., 1999).

Em função da escassez de centros de referência para a investigação de

EIM e à falta de informação dos médicos, as MPS ainda são pouco diagnosticadas.

Entretanto, a partir de 1990, com a implantação de novos centros de referência,

esse retrospecto vem mudando gradativamente. Atualmente, ainda não existem

trabalhos que descrevam a epidemiologia das MPS no Brasil, porém, Coelho et al.

(1997) verificaram que dentre as MPS estão entre os EIM mais freqüentemente

diagnosticados em pacientes de alto risco no Brasil.

O Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da Universidade Federal do

Pará (LEIM/UFPa) e o Hospital Universitário Bettina Ferro de Souza (HUBFS) são,

atualmente, os principais centros de referência regional no diagnóstico bioquímico e

molecular, assim como no tratamento de pacientes com MPS, respectivamente. Em

colaboração com esses centros regionais, está o Laboratório de Referência de Erros

Inatos do Metabolismo do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de

Porto Alegre (LREIM/SGM/HCPA), o qual oferece suporte auxiliar na identificação de

várias doenças hereditárias metabólicas.

A rede MPS Brasil foi uma iniciativa criada em 2004 para aprimorar o

diagnóstico e o manejo de pacientes com MPS por todo o Brasil (Vieira et al., 2008).

Entre 249 pacientes diagnosticados com MPS, 60 apresentaram MPS I, 82 MPS II,

31 MPS III (7 MPS IIIA, 14 MPS IIIB e 10 MPS IIIC), 15 MPS IV (11 MPS IVA e 4

MPS IVB), 57 MPS VI e 4 com MPS VII (Vieira et al., 2008).

Embora não consista um estudo epidemiológico (devido ao número

pequeno de casos identificados), Castro et al. (2007) descreveram a freqüência de

MPS no Estado do Pará. Dentre as MPS mais freqüentemente diagnosticadas estão

a MPS II e VI (1:960.005 por nascidos vivos), seguida da MPS I (1:1.140.000 por

nascidos vivos). A freqüência de 1:411.430 encontrada para nascidos vivos com

MPS não classificada reflete a necessidade da implantação de protocolos de

investigação dessa doença no Estado do Pará.

1.1.7. Bases celulares das MPS

Os GAG são moléculas não-ramificadas de heteropolissacarídeos formadas

por unidades repetitivas de dissacarídeos. A natureza do monossacarídeo que

compõe os dissacarídeos define, especificamente, o subtipo de GAG: o heparan

sulfato é formado por glicosamina e iduronatos de ácidos hexurônicos ou

glicuronatos; o dermatan sulfato é composto por galactosamina e iduronato de ácido

hexurônico; o condroitin sulfato é formado por galactosamina e glicuronato de ácido

hexurônico; o queratan sulfato, por galactose e glicosamina e o ácido hialurônico por

glicuronato e glicosamina (Clarke, 2008).

Uma vez produzidos, os proteoglicanos serão encaminhados tanto para a

superfície quanto para matriz celular, onde sofrerão mudanças na composição de

seus açúcares. Na superfície celular (ex.: proteoglicanos do heparan sulfato), as

cadeias laterias de heparan sulfato podem ser clivadas e liberadas para o meio

extracelular através da enzima heparanase (Prydz & Dalen, 2000).

A degradação dos GAG ocorre a partir da clivagem de moléculas de

proteoglicanos por proteases e pela remoção de suas porções endoglicosídicas. A

catálise desses compostos pode, portanto, ocorrer tanto na matriz extracelular

quanto nos compartimentos lisossomais celulares. Uma vez no meio extracelular, os

GAG podem, também, seqüestrar fatores humorais (figura 02), modulando seus

efeitos biológicos (Clarke, 2008).

Figura 02: Esquema celular das Mucopolissacaridoses. A figura ilustra os diversos processos

fisiológicos que podem ser afetados pela deficiência na degradação de GAG, com conseqüente

aumento do depósito desses compostos na matrix extracelular. (a) Macrófago disfuncional em função

do acúmulo de GAG nos lisossomos; (b) padrão alterado de receptores da membrana plasmática; (c)

Alteração na captação de citocinas e fatores de crescimento; (d) alteração no recrutamento de

citocinas circulantes; (e) Alteração na apresentação de citocinas aos receptores; (f) interferência no

tráfico celular; (g) Depósito lisossômico adicional pela interferência de hidrolases lisossomais; (h)

interações anormais da matriz extracelular; (i) adesão celular alterada. Adaptado de Clarke, 2008.

A ausência ou deficiência de uma ou mais enzimas relacionadas a esse

processo de regulação da catálise de GAG ocasiona a deposição destes compostos

em diversos tecidos orgânicos. Modelos animais têm demonstrado um excessivo

acúmulo de GAG em tecidos hepáticos, renais, pulmonares, cardíacos e esplênicos,

com leve comprometimento de tecidos nervosos (Li et al., 1999; Vogler et al., 2001;

Vogler et al., 2005).

Além disso, outras implicações sistêmicas estão relacionadas com a

deficiência enzimática característica das MPS, tais como alteração na atividade de

outras enzimas lisossomais (ex.: β-hexoaminidase, α-glicosidase, β-galactosidase e

β-glicuronidase), alterações no metabolismo de gangliosídeos (GM2 e GM3), o que

ocasionalmente representa um dos principais fatores para o comprometimento

neural progressivo, evidente em alguns pacientes com MPS (Canstantopoulos &

Dekaban, 1978; Jones et al., 1997; Walkley, 2004).

Como conseqüência da catálise deficiente, os GAG não degradados são,

portanto, excretados na urina, o que consiste em um importante parâmetro para a

investigação de MPS. Dependendo do tipo de MPS, o catabolismo de diferentes

GAG (ex.: heparan sulfato, dermatan sulfato, keratan sulfato) pode ser bloqueado

isoladamente ou em conjunto (Clarke, 2008).

1.1.8. Bases moleculares das MPS

Após a clonagem dos genes que codificam a maioria das enzimas

relacionadas à catálise de GAG na década de 90, vários estudos têm sido realizados

com o objetivo de elucidar quais as principais mutações relacionadas às deficiências

enzimáticas presentes em cada tipo de MPS. Apesar da grande variabilidade

apresentada pelos pacientes de diferentes tipos de MPS, algumas mutações

relatadas em pacientes com essa patologia são bastante freqüentes, embora

algumas possuam um predomínio em determinadas regiões geográficas e/ou em

populações específicas (Isogai et al., 1998; Venturi et al., 2002; Lin et al, 2008).

a) Mucopolissacaridose I (MPS I)

A partir de critérios clínicos, é possível distinguir diferentes padrões

fenotípicos relacionados a MPS I, os quais são didaticamente divididos em três

subtipos: Hurler (forma leve), Hurler-Scheie (forma moderada) e Scheie (grave).

Cada subtipo possui um padrão fenotípico distinto, com variações, por exemplo, na

taxa de excreção urinária de GAG, no nível de comprometimento ósseo e mental e

na funcionalidade de alguns órgãos (Hopwood & Morris, 1990).

O gene que expressa a enzima IDUA está localizado na região p16.3 do

cromossomo 4, possui 19 kb, incluindo 14 éxons, os quais codificam um proteína

com 627 resíduos de aminoácidos. A enzima IDUA apresenta peso molecular de

70.029 kDa (Scott et al., 1990).

Em relação às mutações patogênicas descritas no gene IDUA, Scott et al.,

(1992) mostraram a existência de algumas mutações freqüentes em populações

caucasianas como, por exemplo, W402X e Q70X e outra menos freqüente como

P533R. Essas mutações são responsáveis pela ausência da produção da enzima

funcional e, consequentemente, pelo aparecimento de formas graves e/ou

intermediárias. Outras mutações também foram descritas em pacientes com MPS I

(mutações sem sentido, destruição do sítio de splicing e mudança na matriz de

leitura), correlacionadas a diferentes quadros clínicos.

Yamagishi et al. (1996) verificaram que a maioria dos pacientes japoneses

com MPS I apresentava a mutação R89Q, a qual também está presente em

caucasianos e está relacionada a um fenótipo intermediário.

Matte et al. (2003) descreveram 13 novas mutações em pacientes

brasileiros, além das anteriormente descritas (W402X e Q70X). As mutações mais

comuns encontradas em pacientes brasileiros foram a W402X (fenótipo grave) e a

P533R (fenótipo intermediário), sendo que a primeira foi encontrada com a mesma

freqüência em populações ibero-americanas (60%) (Gort et al., 1998), e a segunda

foi, também, encontrada com a mesma freqüência (10%) em populações italianas

(Gatti et al., 1997).

Estudos in vitro têm sido amplamente utilizados como ferramenta na tentativa

de estabelecer padrões entre uma determinada alteração genética e suas

conseqüências nos processos de expressão, transcrição, tradução e tráfego

intracelular, além das alterações estruturais na molécula protéica que podem levar a

depleção da atividade enzimática. Ainda segundo esses estudos, uma vez

conhecidas as mutações e suas implicações intracelulares, pode-se estimar o grau

de comprometimento clínico do paciente e, assim, identificar o fenótipo apresentado.

Sugawara et al. (2008) descreveram as alterações estruturais causadas na

enzima α-L-iduronidase por diversas mutações previamente descritas. Com base na

correlação genótipo/fenótipo feita por estudos anteriores, foram utilizados modelos

estruturais dessa enzima, cada um resultante de 33 alterações de aminoácidos

(apenas mutações missense). Tais alterações eram responsáveis pelo aparecimento

de diversas formas clínicas de MPS I (17 graves, 8 intermediárias e 8 atenuadas).

Segundo o estudo, as mutações descritas como responsáveis pelo

aparecimento de fenótipos graves (ex.: A75T, L218P, I270S e A327P) causam

alterações em um número maior de átomos da molécula do que as que são

responsáveis por fenótipos atenuados. Em pacientes com fenótipo grave, as

mutações encontravam-se, em sua maioria, na parte interna da proteína, o que

poderia acarretar em sérias alterações conformacionais da proteína, gerando uma

falha no processo de empacotamento e/ou tráfego intracelular e, posteriormente, a

degradação da enzima pelo sistema de controle de qualidade do retículo

endoplasmático antes da sua chegada ao lisossomo.

Já as mutações apresentadas por pacientes com fenótipos atenuados (ex.:

R89Q) ocorriam mais frequentemente na superfície da estrutura protéica

tridimensional. Isso sugere que essas alterações permitem que uma pequena parte

da enzima mutante possa ser processada pelo retículo endoplasmático e

transportada para o lisossomo sem perder, necessariamente, sua atividade

enzimática total. Assim, a atividade enzimática, ainda que residual, permite certa

degradação dos substratos uma vez acumulados, levando ao desenvolvimento

tardio da doença e, dessa forma, ao desenvolvimento de um fenótipo atenuado.

O estudo realizado por Vazna et al. (2009) também verificou que mutações do

tipo missense, quando presentes na parte interior da proteína, são responsáveis

pelo aparecimento de fenótipos graves, assim como mutações na superfície

molecular acarretam fenótipos atenuados. Além disso, os autores também sugeriram

que outras mutações, que ocorrem na porção C-terminal da proteína, também levam

a manifestações clínicas da doença, indicando a importância dessa região proteica

na investigação molecular de pacientes com MPS I.

b) Mucopolissacaridose II (MPS II)

O gene IDS que codifica a enzima iduronato-sulfatase, deficiente na MPS II,

está localizado na região q28 do cromossomo X, sendo composto por

aproximadamente 24 kb distribuídos por 9 éxons. O gene também possui um

pseudogene que compreende cópias dos éxons 2 e 3 e do íntron 7, localizado 20kb

distante da região codificante do gene (Timms et al., 1995; Froissart et al., 2007

apud Wilson et al., 1993).

A molécula de cDNA produzida pelo gene IDS contém, aproximadamente,

2,3 kb. Ela codifica um polipeptídeo de 550 aminoácidos, incluindo um peptídeo sinal

de 25 aminoácidos. Os precursores de 76 kDa e 90 kDa da enzima IDS, após vários

processos pós-transcricionais como glicosilação, fosforilação e proteólise são

convertidos a várias formas intermediárias que são, por fim, transformados em

formas maduras de 55 kDa e 45 kDa (Froissart et al., 1995).

Mais de 300 mutações já foram identificadas no gene IDS (Lin et al., 2006).

Dentre as mutações apresentadas no gene IDS de pacientes com MPS II, estão as

alterações estruturais, tais como deleções parciais e totais, inserções e mutações no

sítio de splicing, representando aproximadamente 20% do total de alterações

encontradas.

Essas alterações, geralmente associadas ao aparecimento de fenótipos

graves (com elevada freqüência de comprometimento neural), estão relacionadas a

processos de falha no emparelhamento cromossômico, o que leva a recombinações

homólogas entre seqüências do gene IDS e de seu pseudogene (IDS-2) (Lagerstedt

et al., 1997; Karsten et al., 1997). As alterações mais freqüentes são as mutações do

tipo missense, nonsense e pequenas inserções e deleções (Li et al., 1999;

Sukegawa-Hayasaka et al., 2006; Froissart et al., 2007; Martin et al., 2008).

Outros estudos, no entanto, relatam que mutações que afetam o processo de

splicing representaram cerca de 50% das mutações apresentadas em pacientes com

MPS II (Alves et al., 2006). Outras alterações como mutações pontuais e pequenas

alterações estruturais do gene aparecem em, aproximadamente, 80% dos pacientes

(Hopwood et al., 1993).

Apesar da ampla heterogeneidade molecular relacionada ao gene IDS

algumas mutações foram descritas como mais freqüentes em algumas populações.

Isogai et al. (1998) verificaram em pacientes japoneses uma elevada prevalência de

algumas mutações, concentradas nos éxons 5 e 9, além de mutações no sítio de

splicing do éxon 3 e mutações intrônicas, as quais estão relacionadas a um fenótipo

grave da doença.

Alves et al. (2006) estudaram a freqüência de mutações do gene IDS em

pacientes portugueses e verificaram que a maioria das mutações corresponde a

mutações no sítio de splicing, ocasionadas tanto por substituições intrônicas quanto

exônicas, principalmente aquelas que ocorrem no éxon 3.

A análise do perfil mutacional em populações italianas foi realizada por

Filocamo et al. (2001), que descreveram uma elevada freqüência de mutações do

tipo missense (55,2%), nonsense (20,7%), e pequenas deleções ou mutações em

sítios de splicing em pacientes italianos. A maioria das pequenas deleções

encontradas (c.472delTCC, c.533delTT e c.1131-1142del) ocorreu em regiões do

gene muito susceptível à ocorrência de alterações gênicas (éxons 3, 8 e 9). O

estabelecimento de uma correlação do genótipo com o fenótipo em pacientes com

MPS II é muito difícil, haja vista a ampla heterogeneidade de mutações no gene IDS

e a falta de uma classificação clínica dos pacientes em relação às diferentes

apresentações clínicas.

c) Mucopolissacaridose IIIB (MPS IIIB)

O gene NAGLU que codifica a enzima N-acetil-galactosaminidase,

deficiente na MPS IIB, está localizado na região q21 do cromossomo 17, contendo,

aproximadamente, 8,5 kb, dividido em 6 éxons. A molécula de cDNA do gene

contém 2575 pb, a qual codifica uma proteína de 743 resíduos de aminoácidos, que

contem um peptídeo sinal de 20 a 23 aminoácidos imediatamente antes da porção

aminoterminal e seis possíveis pontos de glicosilação. Mais de 100 diferentes

mutações foram associadas ao gene NAGLU, as quais podem estar relacionadas

com a ampla heterogeneidade do fenótipo clínico apresentado pelos pacientes

(Weber et al., 1996; Zhao et al., 1996).

Beesley et al. (1998) amplificaram as 10 regiões codificantes do gene

NAGLU com o objetivo de encontrar alterações genéticas em pacientes europeus

com MPS III. Para isso, foram feitos testes de triagem molecular (SSCP) e análise

de sequenciamento para investigação de possíveis mutações. Das 16 mutações

encontradas, 3 estavam presentes em mais de um paciente (Y140C, R297X e

R626X) e, juntas, corresponderam a 25% dos alelos mutantes analisados.

Tessitore et al. (2000) demonstraram uma ampla heterogeneidade de

mutações entre 20 pacientes italianos. Das 28 mutações identificadas (todas

relacionadas a um fenótipo grave, com exceção da S534Y), 14 eram novas (L35F,

204delC, 221insGCGCG, G82D, W156C, 507delC, IVS3+1G→A, E336X, V501G,

R520W, S534Y, W649C, 1953insGCCA, 2185delAGA), além das descritas

anteriormente (Y140C, R234C, G292R, e901delAA). Algumas mutações, tais como a

L35F, G292R e Y140C foram descritas como alterações comuns em populações

italianas.

Tanaka et al. (2002) realizaram uma triagem molecular em pacientes

japoneses para investigar mutações no gene NAGLU. De acordo com o estudo,

foram encontradas duas novas mutações (F314L e V241M), as quais foram

relacionadas a fenótipos moderados da doença, enquanto que a mutação R565P

correspondia a um fenótipo grave, como comprovado também por Chinen et al.

(2005).

Mais recentemente, Mangas et al. (2008) realizaram um levantamento

acerca do padrão de mutações do gene NAGLU em pacientes ibero-americanos. A

partir da análise de 11 pacientes com MPS IIIB, 9 mutações foram encontradas,

sendo 5 novas (M1K, W147X, G304V, S522P e R533X) e 4 anteriormente descritas

(W168X, R234C, R565W e R643C), sendo que a mutação R234C, relacionada a um

fenótipo grave da doença, foi encontrada com relativa freqüência (32% dos alelos)

nessa população.

d) Mucopolissacaridose VI (MPS VI)

O gene ARSB, codificador da enzima arilsulfatase B (deficiente na MPS VI)

está localizado na região q13-q14 do cromossomo 5 e possui 8 exons. Mutações em

homozigose desse gene promovem as formas mais graves da doença. As mutações

mais freqüentes costumam ocorrer nas regiões correspondentes aos éxons 4 e 5

(Karageorgos et al., 2007).

Em relação ao padrão de mutações desse gene, Litjens et al. (1996)

encontraram alterações freqüentes em pacientes australianos (R95Q, Y210C e

H393), as quais estavam relacionadas a padrões fenotípicos distintos.

Villani et al. (1998) descreveram uma ampla heterogeneidade de mutações

em pacientes italianos, sendo que as alterações genéticas encontradas nesses

pacientes (S65F, P116H, R315Q, Q503X, P531R) eram responsáveis por falhas no

rearranjo tridimensional da enzima ARSB e, conseqüentemente, pelo

desenvolvimento de diferentes formas da doença (leve, moderada e grave).

Petry et al. (2005) também descreveram a variabilidade de mutações nesse

gene (a maioria no éxon 1), através da análise de 12 pacientes sul-americanos (11

brasileiros e 1 chileno). A mutação 1533del23 (éxon 8), uma mutação comum entre

pacientes brasileiros e que está associada com fenótipo grave e intermediários, foi

encontrada em 23,1% dos alelos analisados neste estudo.

Em relação à correlação genótipo/fenótipo, Wicker et al. (1991) analisaram o

perfil molecular de um paciente com a forma leve de MPS VI. Foi possível detectar a

presença de 3 alterações, sendo duas polimorfismos e uma mutação (G137V). De

acordo com os autores, essa mutação não afetaria a síntese da enzima, entretanto

reduziria significativamente a estabilidade do precursor enzimático, o que levaria a

uma degradação prematura desse precursor em estágios iniciais no tráfego

intracelular e, portanto, apenas uma pequena parte desse conteúdo seria

encaminhada para os lisossomos. A apresentação do fenótipo leve seria relacionada

à atividade residual dessa pequena porção de enzima restante no lisossomo.

Outro estudo, realizado por Bradford et al. (2002) também verificou as

implicações intracelulares da mutação Y210C (fenótipo atenuado) através da

expressão de células de ovário de hamster (CHO-K1) contendo essa mutação.

Segundo o estudo, a mutação Y210C não influencia a expressão da enzima, porém

causa falhas no processamento, tráfego e estabilidade da molécula. Apesar disso, a

enzima ainda consegue ser direcionada para o lisossomo, portando uma atividade

enzimática residual, o que permite uma degradação parcial dos substratos e, dessa

forma, características clínicas atenuadas.

A heterogeneidade do padrão de mutações do gene ARSB foi, também,

comprovada por outros trabalhos como o de Garrido et al. (2007), o qual descreveu

19 diferentes mutações em 16 pacientes hispânicos (espanhóis e argentinos).

Dentre as mutações, apenas duas (c.1143-1G>C e c.1143-8T>G) estavam

presentes em 30% dos pacientes analisados. A análise de haplótipos identificou uma

origem comum das mutações mais freqüentes encontradas nessas populações.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

• Analisar o perfil molecular e bioquímico de pacientes e familiares com

Mucopolissacaridoses no Estado do Pará.

2.2. Objetivos Específicos

• Investigar mutações no gene IDUA (éxons 2, 9 e 11) de pacientes com MPS I;

• Investigar mutações no gene IDS (éxons 3 e 9) de pacientes com MPS II;

• Investigar mutações no gene NAGLU (éxons 2, 4 e 6) de paciente com MPS

IIIB;

• Investigar mutações no gene ARSB (éxons 5 e 8) de pacientes com MPS VI.

• Avaliar o padrão de excreção de GAG dos pacientes submetidos à TRE antes

e durante a terapia (MPS I e VI);

• Avaliar a eficácia da TRE nos pacientes submetidos à terapia por meio da

dosagem urinária de GAG (monitoramento bioquímico);

• Descrever possíveis correlações entre os perfis clínicos, bioquímicos e

moleculares apresentados pelos pacientes com MPS I e VI;

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL

3.1.1. Caracterização da Amostra:

O estudo contou com 10 pacientes com MPS (02 com MPS I, 04 com MPS

II, 01 com MPS IIIB e 03 com MPS VI) e 9 familiares desse pacientes, resultando em

um total de 19 indivíduos. Os pacientes foram encaminhados pelo o Hospital

Universitário Bettina Ferro de Souza.

A pré-caracterização da amostra consistiu na determinação do perfil clínico

e na realização de testes bioquímicos iniciais (testes de triagem) para cada paciente,

ambos realizados no Hospital Universitário Bettina Ferro de Souza da Universidade

Federal do Pará – HUBFS/UFPA, no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará – LEIM/ICB/UFPa.

Já o diagnóstico bioquímico (dosagem inicial de GAG urinários e a mensuração de

cada atividade enzimática específica) foram realizados no Laboratório de Referência

em Erros Inatos do Metabolismo do Serviço de Genética Médica do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre – LREIM/SGM/HCPA.

3.2 Critérios de inclusão

Os critérios de inclusão do estudo adotados pelo presente estudo foram o

diagnóstico bioquímico confirmado para MPS (pacientes com níveis urinários de

GAG elevados e atividade enzimática abaixo dos valores normais) e o diagnóstico

clínico previamente realizado pelo corpo médico responsável (HUBFS/UFPa) a partir

da avaliação de determinados parâmetros clínicos, que possibilitaram a

determinação fenotípica para cada paciente (Quadro 03).

Apenas os pacientes com MPS do tipo I e VI foram submetidos à terapia de

reposição enzimática. Dos 4 pacientes com MPS II, apenas 1 estava sob TRE, o que

levou a exclusão da análise bioquímica em MPS II. Em relação aos pacientes com

MPS IIIB, como ainda não há tratamento baseado na reposição enzimática, só foi

realizada, portanto, a investigação molecular.

Quadro 02: Perfil bioquímico inicial dos pacientes com MPS antes da TRE.

Pacientes

GAG urinários

(mg/mmol

CREA)

Valores de

referência

(mg/mmol

CREA)*

Atividade

enzimática em

leucócitos

(nmoles/h/mg prot)

Valores de

referência

(nmoles/h/mg prot)

(MPS I)

76,4

1,5 – 7,0

(18-20 anos)

0,03**

6,8-13,7

(IDUA)

(MPS I)

18,2

3,4 – 11,0

(< 14 anos)

0,25

32-52

(IDUA)

(MPS II)

50,0

5,2 – 12,0

(< 9 anos)

8,9

31-110

(IDS)

(MPS II)

79,0

5,2 – 12,0

(< 9 anos)

ND**

122-463

(IDS)

(MPS II)

12,4

5,2 – 12,0

(< 9 anos)

31-110

(IDS)

(MPS II)

4,7

1,5 – 7,0

(18-20 anos)

31-110

(IDS)

(MPSIIIB)

43,5

3,4 – 11,0

(< 14 anos)

0,13**

11-37

(NAGLU)

(MPS VI)

31,9

3,4 – 11,0

(< 14 anos)

8,0

72-176

(ARSB)

(MPS VI)

27,0

3,4 – 11,0

(< 14 anos)

10,0

72-176

(ARSB)

P10

(MPS VI)

19,0

3,4 – 11,0

(< 14 anos)

11,0

72-176

(ARSB)

CREA: Creatinina; GAG: glicosaminoglicanos; prot: proteína; ARSB: arilsulfatase b; NAGLU: N-acetil-

glicosaminidase; IDUA: α-L-iduronidase; ND: não detectável. *Os valores de referência de GAG

urinários correspondem à faixa etária de cada paciente no momento da realização da primeira

dosagem. **Valor de atividade enzimática dosada em plasma (nmoles/h/mL).

Valores de referência

em plasma humano (nmoles/h/mL). Fonte: LEIM/ICB/UFPa e LREIM/SGM/HCPA.

Quadro 03: Resumo das características clínicas dos pacientes com MPS

CS: consangüinidade; OC: opacificação córnea; DC: dano cardíaco; IIS: Idade do início dos sintomas; IUA: Idade da última avaliação; ND: Não disponível. G/I: fenótipo grave a

intermediário; I: fenótipo intermediário; A: fenótipo atenuado. # Paciente faleceu durante a realização do estudo.

Pacientes Origem Gênero

Idade

(anos)

CS IIS (meses)

IUA

(anos)

Altura (cm) OC DC FC

(MPS I)

Belém (PA) M 20 Sim < 6 20 138 ++++ Insuf. Mitral/ Aórtica

G/I

(MPS I)

Belém (PA) M 15 Não 60 15 152 ++ Insuf. Mitral

(MPS II)

Belém (PA) M 10 Não 12 10 133 - -

G/I

(MPS II)

Anajás

(PA)

M # Não 48 08 100 - Insuf. mitral

(MPS II)

Portel (PA) M 08 Não 36 08 104 - Insuf. aórtica

G/I

(MPS II)

Breu

Branco

(PA)

M 10 Não 24 09 110 - -

G/I

(MPS IIIB)

Abaetetuba

(PA)

F 10 Não ND ND ND ND ND

(MPS VI)

Cametá

(PA)

F 16 Não 14 16 121,5 +++ Insuf. Mitral/ aórtica

G/I

(MPS VI)

Cametá

(PA)

F 14 Não 24 14 121,5 ++

Insuf. Mitral /

Aórtica

G/I

P10

(MPS VI)

Colares

(PA)

M # Não 24 10 97 ++ -

G/I

3.3 Aspectos éticos

O presente estudo levou em consideração os princípios éticos básicos das

diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos. As

famílias dos pacientes que aceitaram participar deste estudo receberam um termo

de consentimento livre e esclarecido, além de informações sobre os objetivos da

pesquisa conforme protocolo de pesquisa (número 172/08) aprovado no Comitê de

Ética em Pesquisa do Instituto de Ciências da Saúde, na reunião do dia 11 de

novembro de 2008 (anexo 01).

Embora alguns pacientes apresentarem idade superior a 18 anos, eles não

foram considerados seus próprios responsáveis legais, em função das limitações

impostas pela doença, cabendo aos familiares tal responsabilidade.

3.4 Coleta e armazenamento das amostras

As amostras de sangue total (5 a 10 mL) foram obtidas através de punção

venosa e colhidas em frascos de vidro de 5 mL (tipo vacutainer), contendo

anticoagulante EDTA. Em seguida, as mesmas foram adequadamente identificadas

com o nome do paciente e a data da coleta e armazenadas a -20ºC até o momento

da extração de DNA. As amostras de urina (30mL) dos pacientes com MPS I e MPS

VI foram coletadas semanalmente, antes de cada infusão de reposição enzimática.

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Análise bioquímica

a) TRE

As enzimas recombinantes Laronidase (Aldurazyme®, Biomarin

Pharmaceutical Inc., Novato, CA, USA; Genzyme Corporation , Cambridge, MA,

USA) e Galsulfase (Naglazyme®, BioMarin Pharmaceutical Inc., Novato, CA, USA)

foram administradas por via endovenosa, semanalmente, durante 48 semanas, nas

doses de 1 mg/kg e 0,58 mg/kg nos pacientes com MPS I e VI, respectivamente. As

infusões foram realizadas no Hospital Universitário Bettina Ferro de Souza da

Universidade Federal do Pará.

b) Dosagem de creatinina urinária:

A dosagem de creatinina, descrita por Dick (1970), na urina é um

procedimento inicial prévio à separação e à quantificação de GAG’s que visa estimar

a quantidade de soluto da amostra em função da excreção do metabólito creatinina.

A creatinina, determinada pela mensuração espectofotométrica da coloração obtida

a partir da reação da amostra da urina com os reagentes da técnica (ácido pícrico e

hidróxido de sódio), serviu como parâmetro para a correção do valor de excreção

urinária de GAG.

c) Dosagem dos GAG urinários:

A dosagem dos GAG urinários consiste em um método simples e de fácil

emprego, comumente utilizado por laboratórios que realizam a triagem urinária para

investigação de MPS. Esse método produz resultados mais confiáveis em relação a

falsos-negativos e indica a quantidade de GAG excretados na urina do paciente

através do método espectrofotométrico descrito por De Jong et al. (1989), o qual

mede a absorbância da reação obtida entre uma solução tamponada de azul de

dimetileno (DMB) e os GAG presentes na urina. Os resultados obtidos foram

expressos em mg de GAG / mmol de creatinina ou ug de GAG / mg de creatinina.

3.2.2. Análise molecular

a) Extração do DNA:

As amostras de sangue de cada pacientes com MPS e seus familiares (pais

e/ou irmãos) foram coletadas para a extração de DNA, segundo o método do Fenol-

Clorofórmio (Sambrook et al., 2001).

b) Reação em cadeia da polimerase (PCR):

Para a amplificação dos fragmentos de interesse (Quadro 04), foi utilizada

a técnica de PCR. Os oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados neste estudo,

com exceção dos utilizados na amplificação do éxon 6 do gene NAGLU (Yogalingam

et al., 2000) foram desenhados com o auxílio do programa Primer3

(

http://www.genome.wi.mit.edi/cgi-bin/primer3_www.cgi):

Quadro 04: Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para a amplificação de

fragmentos específicos dos genes IDUA (MPS I), IDS (MPS II), NAGLU (MPS IIIB) e

ARSB (MPS VI):

Tipo de MPS Éxon Primer (5’







3’)

Tamanho do

fragmento

(pb)

MPS I

GGCTTGAACGTGTGTGTCAG(F)

TCCCATCTGTGCCTCTGTAA(R)

274

CTGGGGACTCCTTCACCAAG(F)

CAGAGACCTCCCTGGAACC (R)

354

11*

GTGTGGGTGGGAGGTGGA (F)

TTAGGGGACTGCCACTTGC (R)

250

MPS II

AAGCATCTGCTGGTTTCAGG(F)

CAGACTCTGGACATGGAGCA(R)

423

9I*

CATATGGAGCCCAGACAGGT(F)

ATGCTGCGTATGGAATAGCC(R)

399

9II*

CCCGTGAACTGATTGCCTAT (F)

ACTAGCCCTCAGGCTGCTTC(R)

400

MPS IIIB

GATGGGGGATTTGTTCCAG(F)

GTGGGGAAGGGACAGTGG(R)

246

6a**

GGCCCTCTGTTTCATCACTC(F)

AAATCTGGCACTGGGTCCTT(R)

444

6b**

GCATCAGCCAGAACGAAGTG(F)

CCAGCTCCTTGCTCAGGTAG(R)

426

6c**

CAACCGATCTGATGTGTTTG(F)

TTGGCATAGTCCAGGATGTT(R)

386

6d**

GCTGGCTAGTGACAGCCGCTT(F)

CTGGTGCTGTTGGAAAGGGAT(R)

261

6e**

GCCGAGGCCGATTTCTAC(F)

GCGAATCTATCACCAAGAGC(R)

345

6f**

CGTTCTCAGCAAGCAGAGGTA(F)

CAAGCGTGGCAGCAGTGACC(R)

373

CTGCGTGTATCCTGGGAGAT(F)

AGCTAAGTGGAGGGGGTGAG(R)

197

MPS VI

TCATCCTCATGCCAAGACCT (F)

GAAAAAGGGCAGGGTGTAGG(R)

300

CCTCTGTGCTTCTCCCTCAG (F)

CTTCCAATTGAAAGGTTTTC (R)

347

(F) forward; (R) reverse; (pb) pares de bases *LEIM/ICB/UFPA **Yogalingam et al., 2000

Os primers foram diluídos com água Mili-Q até uma concentração de 1000

pmoles/µL (solução estoque). A solução de uso foi preparada para uma

concentração de 10 pmoles/µL. O protocolo de preparo e as condições das reações

encontram-se resumidos nos quadros 05 e 06, respectivamente.

Quadro 05: Protocolo básico para as reações de amplificação por PCR.

Soluções 1X

DNTPs (2 mM) 2,5 µL

Tampão de PCR 10x (sem MgCl

) 2,5 µL

Primer

1,5 ou 2,0 µL

Primer

1,5 ou 2,0 µL

MgCl

(50 mM) 2,0 ou 1,5 µL

Taq polimerase

1,0; 0,5 ou 0,25 µL

DNA (100 ng/µL) 2,0 µL

Água Mili-Q estéril q.s.p 25 µL

Quadro 06: Condições usadas nas reações de PCR.

Estágios Número de ciclos Temperatura Tempo (minutos)

Desnaturação inicial 1 94ºC 5

Desnaturação

94ºC 1

Anelamento 55ºC a 66ºC* 1

Extensão 72ºC 1

Extensão final 1 72ºC 5

* Intervalo que compreende as temperaturas de anelamento de todos os éxons investigados.

Após as reações de amplificação, os produtos de PCR (5,0 µL) serão

submetidos à análise por eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5%, 2,0% ou

3,0% (p/v) (com brometo de etídio), de acordo com o fragmento analisado. Após a

eletroforese, o gel de agarose será transferido para um transiluminador com luz

ultravioleta, para visualização dos fragmentos de DNA. O tamanho do fragmento

amplificado será comparado ao marcador de peso molecular (50 pb ou 100pb), com

o objetivo de confirmar a amplificação desejada.

c) Análise por digestão com endonucleases de restrição:

Com base em alguns estudos moleculares realizados em pacientes com

MPS (Beesley et al., 1998; Beesley et al., 2001; Garrido et al., 2008), algumas

mutações específicas e comuns nos genes correspondentes a cada tipo da doença

foram analisadas por digestão com enzimas de restrição (Quadros 07 e -08). As

mutações estudadas foram: Q70X, W402X e P533R (MPS I); Y140C e R234C (MPS

IIIB); e R315Q (MPS VI). A mutação P533R

O protocolo empregado nesta metodologia está representado no Quadro 07.

Após as reações, os produtos da digestão enzimática (10,0 µL) foram submetidos à

análise por eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5%, 2,0% ou 3,0% (p/v) (com

brometo de etídio), de acordo com o tamanho do fragmento analisado. Após a

eletroforese, o gel de agarose foi transferido para um transiluminador com luz

ultravioleta, para visualização dos fragmentos digeridos. O tamanho do fragmento

digerido foi comparado ao marcador de peso molecular (50 pb ou 100 pb), com o

objetivo de verificar o tamanho dos fragmentos clivados e/ou não clivados.

Quadro 07: Protocolo empregado nas reações com enzimas de restrição.

Tipo

MPS

Éxon

Mutação

Enzima

restrição

Produto

de PCR

(pb)

Fragmentos esperados

Normal (pb)

Mutante

(pb)

MPS

2 Q70X –Sau96I 274 122+95+57 179+95

MPS

9 W402X +BfaI 354 354 127 + 227

MPS

9I R468W -MspI 399 316 + 83 399

MPS

9I R468Q -TaqI 399 241 + 158 399

MPS

9I P467L -NciI 399 316 + 83 399

MPS

IIIB

2 Y140C -Fnu4HI 246 196 + 31 + 19 76 + 170

MPS

IIIB

4 R234C -HhaI 197 103 + 94 197

MPS

5 R315Q -TaqI 300 77 + 179 + 44 256 + 44

(-) perda do sítio de restrição; (+) criação de novo sítio de restrição; (pb) pares de bases

Quadro 08: Protocolo básico de digestão com endonucleases de restrição

Soluções 1X

Tampão da enzima de restrição (10X) 2,0 µL

Enzima de restrição (500, 1000 ou

5000 U/µL)

1,0 µL

Produto da PCR 10,0 ou 20,0 µL

Água Mili-Q estéril q.s.p

d) Análise de Polimorfismos Conformacionais de Cadeia Simples (SSCP):

A análise por SSCP (Labrune et al., 1991) é um método de triagem

molecular, baseado na desnaturação do DNA em alta temperatura (acima de 90ºC),

originando 2 fitas simples. Possíveis alterações na seqüência gênica dos produtos

da desnaturação podem ser visualizadas em gel de poliacrilamida não-desnaturante,

corado com nitrato de prata. A presença de uma alteração na seqüência normal

provoca um padrão de migração eletroforético alterado e diferente do indivíduo

controle (normal), o qual pode ser visualizado ao final da análise.

Os produtos de PCR das seqüências gênicas que não apresentaram

mutações ou não foram submetidos à análise por digestão com endonucleases de

restrição foram submetidos à análise por SSCP, a fim de identificar regiões dos

genes com alterações na seqüência gênica.

e) Seqüenciamento direto:

Todos os fragmentos gênicos analisados foram, posteriormente, submetidos

à análise por seqüenciamento direto automatizado, com o intuito de identificar

alterações na seqüência gênica.

A análise por seqüenciamento direto foi realizada em um Seqüenciador

Automático ABI-PRISM 377 (Applied Biosystems), com o auxílio do kit ABI PRISM

BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, USA). Este

procedimento foi realizado no Laboratório de Genética Humana e Médica da

Universidade Federal do Pará (LGHM/UFPa). O Quadro 09 mostra o protocolo

básico utilizado nas reações de seqüenciamento.

QUADRO 09: Protocolo básico utilizado nas reações de seqüenciamento

Soluções 1X

BigDye 1 µL

Tampão Save Money 2 µL

Primer (5 pmol/µL)

1 µL

DNA 2 µL

Água mili-Q estéril 4 µL

f) Análise estatística:

Para a análise dos resultados dos testes bioquímicos (variáveis

quantitativas) será utilizado o teste t de Student (p = 0,05) através do software

Biostat 5.0.

4. RESULTADOS

4.1 MPS I

4.1.1 Perfil Bioquímico

A análise da concentração de GAG urinários revelou uma diminuição

significativa da excreção de GAG em todos os pacientes com MPS I submetidos à

TRE em relação aos níveis anteriores a terapia. A concentração inicial de GAG

inicial de 76,38 mg/mmol CREA diminuiu, significativamente, para 12,34±9,35

mg/mmol CREA, correspondendo a uma redução de aproximadamente 79%

(p<0,001) na taxa de excreção do paciente P1 durante as 6 primeiras semanas de

TRE. Essa redução se tornou mais evidente nas semanas posteriores, chegando a

10,20±6,89 mg/mmol CREA (redução de 91%) a partir da 12

semana e se manteve

em níveis relativamente constantes até o final do período analisado (Figura 03).

Já em relação ao paciente P2, a concentração inicial de GAG de 17,27

mg/mmol CREA reduziu para 9,17±4,1 mg/mmol CREA, uma diminuição de

aproximadamente 47% (p<0,05). Entretanto, esses valores oscilaram

acentuadamente, chegando a valores bem próximos ao valor inicial durante a 12

semana (16,4±7,6 mg/mmol CREA; p>0,05) e retornando a valores menores durante

a 18

e 24

(semana (11,1±7,2 mg/mmol CREA e 4,3±0,53 mg/mmol CREA,

respectivamente). Não foi possível realizar as dosagens de GAG urinários deste

paciente após a 24ª semana em função da interrupção do tratamento do mesmo

durante tal período (Figura 03).

Figura 03: Concentração de GAG urinários de pacientes com MPS I antes e durante a TRE. Os

valores representam as médias das concentrações de GAG urinários encontradas em um período de

seis semanas, ao longo de 48 semanas. As barras de erros representam o desvio padrão de cada

amostra

4.1.2 Perfil Molecular (gene IDUA)

Em relação ao SSCP, os dois pacientes com MPS I apresentaram alterações

no padrão de migração de bandas quando comparados a um controle negativo. A

Figura 04 ilustra um exemplo de padrões de migração (linhas 2 e 3) diferentes dos

padrão apresentado pelo indivíduo saudável (linha 1). Para confirmar se essas

alterações correspondiam necessariamente a mutações, os mesmos fragmentos

foram, posteriormente, submetidos ao seqüenciamento direto.

Figura 04: Análise de SSCP do éxon 11 do gene IDUA (MPS I). Indivíduo controle (linha 1),

pacientes com padrões de migração alterados (linhas 2 e 3).

A técnica de seqüenciamento direto das amostras amplificadas permitiu

confirmar que os padrões de migração alterados no SSCP correspondiam a uma

mutação patogênica (P533R). Essa mutação é resultante da troca de um resíduo de

aminoácido prolina por um de arginina na posição 533 da cadeia polipeptídica e é

responsável pela alteração estrutural da conformação tridimensional da enzima, o

que leva a uma perda significativa de sua função enzimática e, consequentemente, à

falha na degradação do substrato (GAG).

Além disso, por meio da técnica de seqüenciamento, foi possível identificar o

paciente homozigoto e o heterozigoto para a mutação. A Figura 05 ilustra a

seqüência de DNA do indivíduo saudável (Fig. 05A), seguida da seqüência do

paciente homozigoto (Fig. 05B) e do heterozigoto (Fig. 05C).

1 2 3

Figura 05: Sequenciamento do éxon 11 do gene IDUA (MPS I). 01: Alelo selvagem; 02: Homozigoto

para P533R (paciente P1); 03: Heterozigoto para P533R (paciente P2).

C>G

(P533R)

homozigoto

C>G

(P533R)

heterozigoto

4.2 MPS II

4.2.1 Perfil Molecular (gene IDS)

A investigação molecular dos pacientes com MPS II começou a partir da

amplificação por PCR e análise do padrão de migração dos fragmentos amplificados

pelo SSCP. Dentre todos os pacientes analisados, apenas o paciente P5

demonstrou alteração no éxon 9, através de um padrão de migração diferente do

padrão de um indivíduo normal, o que demonstra uma possível alteração no

fragmento analisado (Figura 06).

Figura 06: Análise de SSCP do éxon 9 do gene IDS (MPS II). Indivíduos controles (linhas 1, 2, 3, 4,

5, 7 e 8) e padrão de migração alterado (linha 6).

A análise da digestão por endonucleases de restrição revelou que a

alteração encontrada no éxon 9 do paciente P5 consistia na mutação R468W

(enzima MspI) como mostra a Figura 07. A mutação R468W promove a destruição

do sítio de restrição da enzima em função de uma troca C>T (Arg

 Trp) no éxon 9

4 5 6 7

do gene IDS, causando a não clivagem do produto de PCR de 399 pb. Em

indivíduos normais, esse fragmento é clivado em dois subprodutos: um com 316 pb

e outro 83 pb.

Figura 07: Digestão enzimática do exon 9 do gene IDS para a detecção da mutação R468W (MPS II).

M: Marcador de 100 pb; ND: Produto não-digerido; 01: Paciente apresentando padrão de digestão

correspondente à mutação R468W; 02: Indivíduo controle.

O seqüenciamento direto (Figura 08) confirmou a presença da mutação

R468W (em homozigose) no paciente P5. A alteração, como dito anteriormente,

corresponde a uma troca C>T no nucleotídeo 1526 do gene IDS, a qual resulta na

mudança de um resíduo de aminoácido Arginina (R) para um de Triptofano (W) no

precursor polipeptídico da enzima. Embora não existam estudos in vitro que avaliam

o efeito dessa mutação na proteína, acredita-se que essa alteração cause uma

desestruturação da conformação tridimensional da enzima iduronato-sulfatase,

levando a um déficit na atividade enzimática.

M100 ND 01 02

Figura 08: Sequenciamento do éxon 9 do gene IDS (MPS II). A: Alelo selvagem; B: Paciente com a

mutação R468W (paciente P3).

C>T

(R468W)

4.3 MPS IIIB

4.3.1 Perfil Molecular (gene NAGLU)

A paciente com MPS IIIB não apresentou alterações em nenhum éxons

investigado por meio das técnicas moleculares utilizadas (PCR, digestão por

endonucleases de restrição, SSCP e sequenciamento direto). Entretanto, é

necessária a investigação de mutações em outros éxons do gene para a efetiva

identificação de mutações e/ou polimorfismos.

4.4 MPS VI

4.4.1 Perfil Bioquímico

A concentração de GAG nas urinas das pacientes com MPS VI também foi

significativamente reduzida após o início da TRE. Em relação à paciente P8, a

dosagem inicial de 31,9 mg/mmol CREA reduziu para 6,17 mg/mmol CREA durante

as 6 semanas inicias, representando uma redução de, aproximadamente, 80%

(p<0,01). Esses valores permaneceram relativamente constantes até a 36ª semana,

quando se verificou um discreto aumento na concentração, porém não-significativo

em relação à dosagem inicial. Já em relação à paciente P9, verificou-se, também,

uma redução significativa de, aproximadamente, 94% nas 6 semanas iniciais (6,1

mg/mmol CREA) em relação à dosagem inicial (31,90mg/mmol CREA) anterior ao

início da TRE (Figura 09). O paciente P10 não foi submetido à TRE em função da

indisponibilidade da mesma durante o período em que o paciente estava vivo.

Figura 09: Concentração de GAG urinários de pacientes com MPS I antes e durante a TRE. Os

valores representam as médias das concentrações de GAG urinários encontradas durante um

período de 6 semanas, ao longo de 48 semanas.. As barras de erros representam o desvio padrão de

cada amostra,

4.4.2 Perfil Molecular (gene ARSB)

Após amplificação, os fragmentos obtidos foram submetidos à digestão por

endonucleases de restrição, análise de SSCP e seqüenciamento direto. Embora a

análise por digestão enzimática não tenha indicado a presença de mutação, a

análise de SSCP demonstrou uma alteração no padrão de migração de bandas

entre os pacientes e o controle negativo no éxon 5 (Figura 10). Além disso, o padrão

de migração apresentado pelas pacientes P8 e P9 (linhas 3 e 4, respectivamente) foi

diferente daquele observado pelo paciente P10 (linha 2) no mesmo éxon, o que

indica a presença de diferentes alterações entre esses pacientes.

Figura 10: Análise de SSCP do éxon 5 do gene ARSB (MPS VI). Indivíduo controle (linha 1),

pacientes com padrões de migrações alterados (linhas 2, 3 e 4).

Após o seqüenciamento direto das amostras (Figura 11), os polimorfismos

V358M e V376M (éxon 5), descritos pela literatura como freqüentes em pacientes

com MPS VI, foram detectados. O polimorfismo V358M foi identificado em

homozigose nas pacientes P8 e P9. Já o polimorfismo V376M foi identificado em

homozigose no paciente P10.

Figura 11: Sequenciamento do éxon 5 do gene ARSB (MPS VI). A e C: Alelos selvagens; B:

Homozigoto para polimorfismo V358M; D: Homozigoto para polimorfismo V376M.

G>A

(V376M)

A>G

(V358M)

Dos 10 éxons investigados em pacientes com diferentes tipos de MPS,

apenas 3 apresentaram alterações: MPS I (éxon 11), MPS II (éxon 9) e MPS VI

(éxon 5). A Tabela 01 mostra as mutações e polimorfismos encontrados nos

pacientes e familiares (mães) de acordo com o protocolo de investigação molecular

adotado pelo presente estudo.

TABELA 01: Mutações e polimorfismos encontrados nos pacientes com MPS e seus parentes.

Paciente Mutação Polimorfismo Mãe

MPS I

P1 P533R/P533R - P533R

P2 P533R/? - P533R

MPS II

P3 - - -

P4 - - -

P5 R468W - R468W

P6 - - -

MPS IIIB

P7 - - -

MPS VI

P8 - V358M/V358M V358M

P9 - V358M/V358M V358M

P10 - V376M/V376M V358M/V376M

5. DISCUSSÃO

A região Norte do Brasil, mais especificamente o Estado do Pará é

caracterizado pela longa extensão territorial e pela dispersão habitacional. A

população residente em regiões distantes dos grandes centros urbanos, por não

possuir um adequado sistema de apoio de saúde local, busca na capital uma

alternativa para um atendimento adequado.

Em função disso, vários pacientes com MPS residentes nessa região têm o

seu diagnóstico realizado tardiamente. Em alguns casos, o paciente passa por

diversas avaliações clínicas até que haja, por fim, a suspeita de MPS. Quando isso

ocorre, o paciente, geralmente, já possui uma idade elevada e as intervenções

terapêuticas podem surtir pouco ou nenhum efeito significativo.

Outro fator que implica no manejo desses pacientes é o fato de que a maioria

das análises bioquímicas e moleculares (essenciais para a adoção de medidas

terapêuticas adequadas) seja realizada fora do Estado. O período compreendido

entre o envio da amostra e o recebimento do exame pode durar alguns meses e,

durante esse período, os sintomas das MPS continuam a progredir.

5.1 Investigação molecular

A investigação molecular em pacientes com MPS no Norte do Brasil consistiu

na busca por mutações freqüentes em pacientes brasileiros com MPS, por meio da

amplificação de fragmentos gênicos específicos descritos como regiões propensas à

ocorrência dessas mutações. Dos 10 pacientes analisados, apenas 3 apresentaram

mutações (2 com MPS I e 1 com MPS II) e 3 apresentaram apenas polimorfismos (3

com MPS VI). O restante dos pacientes não apresentou alterações em nenhum dos

éxons investigados.

O presente estudo demonstrou uma heterogeneidade da mutação P533R em

relação ao desenvolvimento de fenótipos clínicos em pacientes com MPS I. O

paciente P1, homozigoto para a mutação P533R, apresentou características clínicas

e bioquímicas condizentes com um fenótipo clínico grave a intermediário, enquanto

o heterozigoto (P2) apresentou características clínicas e bioquímicas relacionadas a

um fenótipo atenuado.

A ampla heterogeneidade da doença também é evidenciada por outros

estudos que tentaram correlacionar a presença de uma determinada mutação com

um fenótipo clínico específico. Gatti et al. (1997) avaliou em um grupo de 27

pacientes italianos com MPS I, a presença de mutações no gene IDUA. As

mutações mais frequentemente encontradas foram a W402X e a Q70X,

correspondendo a 11% e 13% dos alelos, respectivamente. A mutação P533R,

também encontrada em uma freqüência elevada (11%), foi encontrada em

homozigose em 2 pacientes com diferentes fenótipos clínicos (intermediário e leve).

Venturi et al. (2002) identificou 23 mutações diferentes, sendo 10 novas e 13

já conhecidas. Dentre as mutações encontradas, apenas a P533R, Q70X e G51D

foram encontradas em mais de 1 paciente, indicando uma elevada freqüência nessa

população. Os pacientes portadores da mutação P533R (tanto em homozigose

quanto em heterozigose) também possuíam fenótipo clínico variado.

Em relação à população brasileira, Matte et al. (2003) descreveu como

freqüente a mutação P533R (11,6% dos alelos). Os pacientes homozigotos para a

mutação apresentavam um fenótipo classificado como intermediário enquanto os

heterozigotos, como grave a intermediário. O fenótipo intermediário apresentado

pelos homozigotos corresponde à atividade residual da enzima mutante. Uma

segunda alteração paralela a essa pode trazer intensas modificações na estrutura

tridimensional da proteína, levando a uma menor capacidade catalítica da enzima e,

assim, ocasionar fenótipos mais graves.

Ainda não há estudos que avaliem a interferência da mutação P533R na

estrutura tridimensional da enzima α-L-iduronidase. Entretanto, é provável que essa

mutação, quando em homozigose, seja responsável por uma alteração significativa

na conformação tridimensional protéica, conforme fenótipo apresentado pelo

paciente P1 (grave a intermediário). A variação fenotípica apresentada por pacientes

com essa mesma mutação, tal como em pacientes heterozigotos (ex.: paciente P2)

pode estar relacionada a diversos fatores, dentre eles, a interação da mutação com

polimorfismos e/ou haplótipos, background genético e fatores ambientais e sociais.

Para a identificação da mutação presente no outro alelo do paciente P2

(heterozigoto composto), uma análise molecular mais detalhada do gene deve ser

realizada, através da amplificação de outros fragmentos gênicos e de estudos de

expressão in vitro, a fim de verificar o impacto das mutações na formação da

proteína e, assim, determinar quais implicações as alterações na enzima terão na

caracterização clínica do paciente.

A ampla heterogeneidade clínica e molecular da MPS II também pôde ser

comprovada pelos achados do presente estudo. O paciente P3, portador da mutação

R468W, foi diagnosticado clinicamente como portador de um fenótipo grave a

intermediário, resultado que difere da maioria dos estudos que tentaram traçar tal

correlação. Essa dificuldade em determinar correlações genótipo-fenótipo pode ser

considerada resultado de alguns fatores, como a raridade da doença e o fato de que

a maioria das mutações apresentadas pelos pacientes corresponde a mutações

privadas, ou seja, mutações que ocorrem apenas em uma determinada população.

Alguns estudos sugerem que certas mutações que envolvam transições CT

ou GA em dinucleotideos CpG do gene IDS são causados por processos de

metilação-deaminação in situ e que, por isso, essas regiões são consideradas como

“hot spots” ou “pontos-chave” para a identificação de mutações. A mutação R468W

ocorre devido a uma troca de CT em regiões CpG e, portanto, é considerada como

uma “mutação-chave”. Entretanto, sua caracterização enquanto ao seu papel no

desenvolvimento do fenótipo do paciente ainda não é totalmente definida devido à

elevada heterogeneidade molecular do gene (Rathmann et al., 1996; Tomatsu et al.,

2004)

A mutação R468W corresponde a uma troca de um resíduo de arginina por

um de triptofano na posição 468 do polipetídeo precursor da enzima iduronato-

sulfatase. Apesar da ausência de estudos in vitro que possam avaliar o impacto

dessa mutação na estrutura protéica, é provável que essa alteração promova uma

diminuição significativa da atividade enzimática. Entretanto, essa depleção da

atividade enzimática aparentemente é variável, pois diferentes fenótipos clínicos são

associados a mesma alteração genética, como mostram alguns estudos.

Segundo Froissart et al. (1998), dos 8 pacientes com fenótipo atenuado, 7

carreavam uma mutação do tipo missense, incluindo a R468W. Além disso, Jonsson

et al. (1995) também descreveram 3 pacientes com essa mutação, todos

apresentando um fenótipo leve. Em contraste, Isogai et al. (1998), Lin et al. (2006) e

Froissart et al., (2007) relataram fenótipos graves associados a essa mesma

mutação em pacientes diferentes. Já Li et al. (1999) não relatou a classificação

fenotípica em função da falta de dados clínicos do paciente.

A posterior investigação de outras mutações que possam estar presentes em

outros éxons do gene IDS nos pacientes com MPS II pertencentes a este estudo é

imprescindível, pois com a recente implantação da TRE para esse tipo de MPS no

Estado no Pará, o diagnóstico molecular, juntamente com o bioquímico e clínico

servirá como base para a elaboração de abordagens terapêuticas mais eficazes

para esses pacientes.

A única paciente com MPS IIIB participante deste estudo (P8) não apresentou

alterações nos éxons investigados (éxons 2, 4 e 6). Além disso, em função da

ausência de dados clínicos e bioquímicos, não foi possível determinar o seu fenótipo

e, assim, correlacionar o perfil mutacional com o perfil bioquímico e clínico. Para a

identificação da mutação e/ou polimorfismos causadores da doença, uma análise

molecular completa deve ser realizada, por meio da amplificação dos fragmentos

que ainda não foram amplificados. Além disso, a análise bioquímica (mensuração da

atividade enzimática e da concentração de GAG urinários) também deve ser

realizada para que, junto com o diagnóstico molecular, o caracterização clínica

completa seja realizada.

Os polimorfismos encontrados nos pacientes com MPS VI no presente estudo

(V358M e V376M) não podem ser estritamente relacionados a um padrão fenotípico

específico, pois podem estar associados a diversas mutações causadoras de várias

apresentações clínicas. Entretanto, esses polimorfismos podem servir como base

para uma investigação molecular mais específica, uma vez que a presença desses

polimorfismos, em muitos casos, está ligada, também, a presença de determinadas

mutações.

Assim como nos outros demais tipos de MPS, a heterogeneidade molecular

também é evidenciada na MPS VI. Vários estudos demonstram que o padrão

genotípico apresentado não está, na maioria dos casos, diretamente relacionada

com o perfil bioquímico e clínico dos pacientes.

O estudo realizado por Villani et al. (1999) identificaram, em pacientes com

MPS VI, algumas mutações (

65F

, P116H, R315Q, Q503X, P531R) e polimorfismos

(I114I, L124L, G324G e V358M) e, também,

avaliaram o impacto das mesmas

através da análise da estrutura tridimensional da proteína mutante. De acordo com

os autores, a mutação R315Q, presente em um dos pacientes e responsável pelo

aparecimento do fenótipo intermediário, consiste em uma torça de G>A no

nucleotídeo 944 do éxon 5 do gene ARSB, o que resulta em uma troca de Arg para

Gln no resíduo 315. Essa alteração promove sérias mudanças na estrutura da

proteína, levando a falhas no processo de empacotamento e, consequentemente, de

estabilidade da forma madura da proteína.

Karageorgeos et al. (2007) descreveram um raro caso no qual um paciente

com MPS VI apresentava, ao mesmo tempo, 3 mutações no gene ARSB (L72R,

R315Q e S384N) além do polimorfismo V358M. A mutação R315Q foi descrita

anteriormente como causadora de um fenótipo intermediário, enquanto a S384N era

responsável por um fenótipo de rápida progressão dos sintomas. A outra mutação

(L72R) é possivelmente relacionada com uma significante alteração na estrutura

tridimensional da proteína e também é responsável pelo aparecimento rápido de

sintomas (fenótipo grave). Além disso, através da clonagem de produtos de RT-PCR

e posterior seqüenciamento, foi possível detectar que as mutações R315Q e S384N

estão ligadas no mesmo alelo, enquanto a mutação L72R e o polimorfismo V358M

estão localizados em outro.

Outro trabalho realizado por Petry et al. (2005) também relatou a presença

das mutações R315Q e 1533del23 e dos polimorfismos V358M, V376M e P397P.

Segundo os autores, a mutação R315Q, relacionada anteriormente fenótipos

intermediários, foi identificada em 2 pacientes gêmeos com fenótipos diferentes (um

grave e o outro grave a intermediário). Além disso, outros pacientes, que possuiam

classificação clínica tipicamente grave, também apresentaram essa mutação. Em

relação a mutação 1533del23, encontrada tanto em homozigose quanto em

heterozigose, foi relacionada a um fenótipo grave.

Segundo Karageorgeos et al. (2004), os polimorfismos V358M, V376M e

P397P, causados por transições em dinucleotideos CpG, quando ligados a

determinadas mutações causadoras de MPS VI, podem contribuir para diminuir a

atividade residual da enzima e, assim, influenciar no desenvolvimento clínico do

paciente.

Todas as mutações e/ou polimorfismos encontrados nos pacientes com MPS

e em seus familiares já foram descritas anteriormente, entretanto a correlação entre

essas alterações genéticas e o fenótipo clínico apresentado pelos pacientes difere

significativamente entre os estudos publicados. Assim, o presente estudo buscou

verificar correlações entre os fenótipos bioquímicos e clínicos apresentado por cada

paciente e comparar os resultados com aqueles obtidos na literatura.

Embora estudos sofisticados como a análise de expressão in vitro e a

cristalografia de proteínas permitam verificar o impacto de mutações na estrutura e

atividade das enzimas, as implicações celulares que essas mutações causam

diferem de paciente para paciente, conforme outras variáveis como fatores

ambientais, sociais e genéticos e, dessa forma, caracterísiticas clínicas diferentes

são apresentadas por pacientes com a mesma mutação, impedindo, portanto,

possívies correlações genótipo/fenótipo.

6.2 Perfil bioquímico

O tratamento das MPS era, antigamente, realizado através do controle dos

sintomas apresentados pelos pacientes. Entretanto, com o advento de novas

tecnologias terapêuticas, esse tratamento foi tornando-se mais específico e eficaz.

Dentre as terapias atualmente disponíveis, a TRE ainda constitui a mais eficaz para

pacientes com MPS (Arora et al., 2007; Harmatz et al., 2008; Muenzer et al., 2009).

Embora estudos recentes tenham demonstrado que outras formas de tratamento

como a terapia gênica (em modelos animais) (Fu et al., 2007; Wang et al, 2008;

McIntyre et al., 2008), injeção enzimática intratecal para casos com

comprometimento neurológico (Kakkis et al., 2004; Dickson et al., 2007) e

transplante de medula óssea (Zheng et al., 2004; Ellinwood et al., 2007; Sprangers

et al., 2009) apresentam resultados positivos na melhora dos quadros clínicos, a

TRE ainda é a abordagem que possui menor proporção entre efeitos adversos e a

melhora clínica dos paciente.

Com isso, alguns grupos de pesquisa vêm desenvolvendo uma série de

ensaios clínicos a fim de determinar qual a melhor forma intervenção em pacientes

submetidos à TRE (dosagem, intervalo entre as infusões e tempo total de

tratamento). Alguns parâmetros bioquímicos, como a dosagem de GAG urinários,

são utilizados como ferramentas para determinação da eficácia do tratamento, uma

vez que esse teste permite avaliar a variação da degradação desses compostos

após a infusão da enzima recombinante.

O estudo realizado por Harmatz et al. (2004) verificou que a dosagem da

excreção total de GAG na urina fornece forte evidência bioquímica de um efeito

estável, dependendo da dose de TRE administrada nesses pacientes. A dose mais

elevada de 1.0 mg/kg, como esperado, é mais eficaz do que doses mais baixas na

diminuição da excreção urinária de GAG em pacientes com MPS.

Posteriormente, para confirmar a eficácia e a segurança da TRE em pacientes

com MPS, Harmatz et al. (2006) avaliaram, por meio de um estudo duplo-cego,

randomizado, controlado por placebo, multicêntrico e multinacional em um período

de 24 semanas, 39 pacientes com MPS. Os pacientes foram divididos em 2 grupos

distintos (intervenção e placebo) e monitorados de acordo com parâmetros clínicos

(mobilidade articular e capacidade cardiopulmonar) e bioquímicos (excreção urinária

de GAG).apresentados ao longo da terapia. Ao final do período, foi possível verificar

que além de melhorias significativas nos aspectos clínicos, houve, também, uma

redução drástica da excreção de GAG urinários no grupo intervenção quando

comparado ao placebo.

Em relação ao presente estudo, é importante ressaltar que apesar de

todos os pacientes terem mais de 5 anos e apresentarem a doença em estágio

avançado, a TRE foi capaz de trazer benefícios à qualidade de vida dos mesmos.

Embora alguns dados sobre melhoras clínicas pós-TRE não tenham sido incluídos

nos resultados do presente estudo, foi possível observar uma diminuição

significativa da concentração de GAG urinários em todos os pacientes submetidos à

TRE. E de acordo com a literatura, a redução de GAG está intimamente ligada ao

aperfeiçoamento da condição clínica dos pacientes.

Os resultados obtidos com a TRE em pacientes com MPS em estágio

avançado indicam a capacidade de estabilização dos sintomas já desenvolvidos,

entretanto a administração precoce da enzima recombinante parece evitar a

progressão da doença e, conseqüentemente, de sintomas mais graves. Estudos

utilizando modelos animais (ex.: modelo felino) demonstram que quanto mais cedo

for o iniciado o tratamento, maiores serão as melhorias nos quadros esqueléticos

(Crawley et al., 1997), uma vez que a implantação do tratamento prévio antes do

aparecimento dos sintomas irreversíveis da doença pode maximizar os benefícios da

terapia.

A terapia precoce depende da triagem eficiente em recém–nascidos e

identificação de pacientes com risco de ter a doença. Programas para triagem de

recém-nascidos tem sido propostos (Whitley et al., 1989; Meikle et al., 1999; Whitley

et al., 2002), mas ainda estão em desenvolvimento e não estão disponíveis para

uso.

Em relação aos pacientes com MPS I, a redução de GAGs encontrada em

P1 foi de 79% na 6ª semana e de 91% nas semanas posteriores. O paciente P2

apresentou uma redução de 47% na 6ª semana e, após um período de oscilação

decorrente da interrupção do tratamento, a redução observada foi de 75% após a

25ª semana. Esta redução é superior à descrita na literatura, a qual varia entre

54,1% e 59,7% em 26 semanas, mantêm-se 59,1% em 52 semanas e alcança

patamares entre 69,1% e 88,4% em um estudo que durou seis anos (Wraith et al.,

2004; Sifuentes et al., 2007; Wraith et al., 2007).

Em tais estudos, por outro lado, a quantidade de enzima por kg corpóreo

aplicada por infusão foi menor – 0,58mg/kg, enquanto neste estudo aplicou-se

1mg/kg. Em pacientes que receberam 1,06mg/kg corpóreo, Wraith et al. (2007)

relataram em 52 semanas uma redução média de 67,7% - valor ainda inferior ao

encontrado no presente estudo, mas superior ao encontrados no mesmo estudo com

uma dosagem inferior da enzima.

Por outro lado, diferentemente do relatado na literatura (et al., 2004;

Sifuentes et al., 2006; Wraith et al., 2007), a quantidade de GAG excretada na urina

dos pacientes continuou acima do patamar normal por um período maior do que o

esperado. Para a faixa etária de P1 (19 anos), os valores de referência são entre 3,5

e 7 mg / mmol de creatinina; já para P2, entre 3,4 e 11 mg / mmol de creatinina (13

anos) (Fonte: Hospital de Clínicas de Porto Alegre).

Houve uma interrupção da TRE para P1 (MPS I) durante dois meses.

Neste período foi observada uma pequena elevação dos níveis de GAG na 12ª

semana após o início da TRE. No entanto, este incremento não foi significativo

(p>0,01) quando comparado com a última dosagem realizada na 4º semana de

tratamento. Foi também observada uma interrupção da TRE para P2 (MPS I)

durante 10 meses, porém, também os valores encontrados de GAG não diferiram

estatisticamente da última infusão (p>0,01).

Tais resultados sugerem que a enzima recombinante apresenta atividade

residual por um tempo ainda não conhecido. Na literatura há poucos artigos

relatando efeitos da descontinuidade do tratamento. Anbu et al. (2006) relataram

uma grande regressão clínica em uma paciente que teve a TRE suspensa após 80

semanas de tratamento. Neste caso, a interrupção foi por um período muito mais

longo – 2 anos.

As pacientes com MPS VI (P8 e P9) fizeram parte do estudo realizado por

Harmatz et al. (2004) no início do tratamento, onde foi relatada uma diminuição

progressiva na excreção de GAGs (71% na 24º semana e 76% na 48º) em relação

ao valores encontrados antes do início da terapia. Nossos resultados demonstram

que esses valores reduzidos mantiveram-se relativamente constantes como uma

média de 73% em P8 e 77% em P9 até a 48º semana. A ausência de estudos dos

efeitos da galsulfase na excreção de GAG em longo prazo torna os resultados aqui

encontrados particularmente relevantes.

Byers et al. (1998) relataram em estudos preliminares que a injeção de

rhASB nas junções ósseas de gatos auxilia na preservação da cartilagem. O dado

mais relevante desse estudo foi o achado de que essas injeções poderiam ser

administradas em um curto intervalo de tempo, dando a esta terapia potencial de

uso em humanos. Simonaro et al. (2001) descreveram a diminuição da liberação de

óxido nítrico e de fatores de necrose tumoral em cultura de condrócitos das

articulações de humanos com MPS VI, sugerindo que a TRE deve atuar reduzindo a

inflamação ao redor das junções. No estudo de Harmartz et al. (2008) foi observada

regressão nos sintomas referentes às junções com diminuição da dor e melhora na

capacidade de movimento.

A Tabela 02 ilustra os dados obtidos pela caracterização molecular,

bioquímica e clínica dos pacientes com MPS analisados pelo presente estudo. Foi

possível observar uma heterogeneidade entre subtipo da doença, uma vez que em

alguns casos, a elevada excreção inicial de GAG correspondia a uma dosagem

enzimática baixa, juntamente com uma apresentação clínica de grave a

intermediária (ex.: P1). Em outros casos, porém, a mesma apresentação clínica foi

identificada em pacientes que apresentavam uma excreção urinária inicial de GAG

bem menor e níveis maiores de atividade enzimática (ex.: P8, P9 e P10). Esses

resultados, assim como demonstrado pela literatura, indicam a ampla

heterogeneidade das MPS e a dificuldade em estabelecer correlações entre o

genótipo e o fenótipo apresentado pelos pacientes.

TABELA 02: Características moleculares, bioquímicas e clínicas dos pacientes com MPS.

Paciente Mutação

Polimorfismo

[ ]

inicial

GAG

redução

GAG*

A.E.

Fenótipo

clínico

MPS I

P533R/P533R -

76,4 94% 0,03**

G/I

P533R/? -

18,2 41% 0,25

MPS II

- -

50,0 - 8,9

G/I

- -

79,0 - ND

R468W -

12,4 - ND

G/I

- -

4,7 - ND

G/I

MPS

IIIB

- -

43,5 - 0,13**

MPS VI

- V358M/V358M

31,9 77% 8,0

G/I

- V358M/V358M

27,0 73% 10,0

G/I

P10

- V376M/V376M

19,0 - 11,0

G/I

A.E.: Atividade enzimática; ND: não detectável; G/I: Grave a intermediário; I: Intermediário; A:

Atenuado. (*) A redução da excreção de GAG (%) corresponde à diferença entre a dosagem inicial e

a média de redução durante o período analisado apenas em pacientes submetidos à TRE (MPS I e

VI). (**) Atividade enzimática dosada em plasma.

5.3 Considerações finais

A identificação de mutações causadoras de MPS é uma importante

ferramenta para o desenvolvimento de uma intervenção terapêutica mais eficaz, pois

permite a elucidação de possíveis alterações em mecanismos intracelulares e de

seus efeitos na sintomatologia que os pacientes possam apresentar no futuro. Além

disso, a identificação de mutações e/ou polimorfismos em familiares dos pacientes

permite um maior esclarecimento sobre os riscos inerentes a uma nova gestação

(aconselhamento genético).

A estratégia de investigação molecular adotada pelo presente estudo, embora

tenha permitido a identificação das mutações e polimorfismos em alguns pacientes,

não foi suficiente para a detecção das alterações presentes nos demais pacientes.

Novos protocolos de investigação molecular, tais como o seqüenciamento completo

de cada gene responsável pelos subtipos da doença, devem ser utilizados, a fim de

determinar o padrão genotípico de todos os indivíduos.

Paralela ao diagnóstico molecular, a dosagem de GAG urinários consiste em

uma importante ferramenta tanto para o diagnóstico de MPS quanto para o

acompanhamento da TRE, uma vez que esse monitoramento permite avaliar

possíveis flutuações desses metabólitos urinários em eventuais interrupções do

tratamento e, dessa forma, auxiliar no melhor entendimento sobre a

farmacodinâmica dessas substâncias no organismo dos pacientes.

6. CONCLUSÕES

• Dentre as 8 mutações investigadas, foi possível identificar apenas 2:

P533R (MPS I) e R468W (MPS II). Além disso, 2 polimorfismos foram

encontrados em 3 pacientes com MPS VI (2 com V358M e 1 com V376M);

• Houve uma redução significativa da taxa de excreção urinária de GAG

dos pacientes com MPS I e VI após o início da TER, indicando a eficácia

da terapia.

• As correlações entre os fenótipos clínico, bioquímico e molecular

diferiram da maioria dos estudos encontrados na literatura, o que

comprova a elevada heterogeneidade das MPS e a necessidade de mais

estudos envolvendo análises mutacionais in vitro paralelamente a

determinação fenotípica.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXOS

8.1 Carta de aceite do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos

8.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

INFORMAÇÕES PARA OS PAIS OU RESPONSÁVEIS LEGAIS

TÍTULO DO ESTUDO: “CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE

PACIENTES COM MUCOPOLISSACARIDOSES”

O QUE SÃO MUCOPOLISSACARIDOSES: Mucopolissacaridoses são doenças genéticas

raras, causadas pela ausência ou insuficiência de enzimas responsáveis pela quebra dos

mucopolissacarídeos. Também são conhecidas por: MPS, Síndrome de Hurler (MPS-IH),

Síndrome de Scheie (MPS-IS), Síndrome de Hurler-Scheie (MPS-IHS), Síndrome de Hunter

(MPS-II), Síndrome de Sanfilippo (MPS-III), Síndrome de Morquio (MPS-IV), Síndrome de

Maroteaux-Lamy (MPS-VI) e Síndrome de Sly (MPS-VII). Os mucopolissacarídeos -

atualmente denominados GAGs ou glicosaminoglicanos - não são corretamente processados

nem eliminados pelo organismo. O acúmulo dessas substâncias causa distúrbios, incluindo o

progressivo mau funcionamento físico e/ou mental. Os sintomas podem aparecer nos

primeiros meses de vida ou demorar alguns anos, a medida em que mais e mais células são

danificadas.

QUAIS AS CONSEQUÊNCIAS DESSA DOENÇA?: Uma das características de muitas

dessas síndromes pode ser observada nas mãos que ficam com dedos "encurvados" para

dentro e "grossos". São freqüentes algumas alterações no rosto, enrijecimento das

articulações, dificuldades respiratórias e cardíacas, alterações no crescimento, deformações

ósseas, aumento do fígado e baço e das mucosas em geral. Deficiência visual, auditiva e

retardamento mental também podem ocorrer.

COMO O MÉDICO FAZ O DIAGNÓSTICO?: O diagnóstico para MPS é realizado

através de uma triagem inicial na urina do paciente. Caso a triagem detecte alterações

indicativas de uma excreção excessiva de GAG (característico em pacientes com MPS), testes

mais específicos (ex.: dosagem enzimática em leucócitos do sangue periférico) são realizados

para confirmação do diagnóstico.

COMO SE TRATA?: A Terapia de Reposição Enzimática (TER) consiste no principal

tratamento para pacientes com MPS. O tratamento, entretanto, só está disponível atualmente

apenas para alguns tipos de MPS (MPS I, II e VI). O procedimento terapêutico consiste na

administração semanal de uma enzima recombinante intravenosamente. Esta enzima irá atuar

de forma semelhante à enzima deficiente, causando um melhora significativa do quadro

clínico geral do paciente, apesar da enzima recombinante não possuir efeito na reversão de

quadros com comprometimento ósseo e/ou neurológico. O controle do tratamento consiste na

medida semanal dos níveis de GAG na urina do paciente em tratamento.

POR QUE ESTE ESTUDO ESTÁ SENDO REALIZADO?: O objetivo desse estudo é

identificar a causa genética (mutações – alterações no DNA) e sua possível correlação com os

sintomas clínicos apresentados pelos pacientes com MPS.

COMO E ONDE ESTE ESTUDO SERÁ REALIZADO?: Deverão participar deste estudo

pacientes do Estado do Pará. Os pacientes selecionados serão solicitados a fornecer

informações sobre sua história médica. Se você permitir, estas informações poderão ser

obtidas através do seu médico ou de registros médicos hospitalares. O seguinte procedimento

será realizado: Coleta de sangue (5 a 10mL) e Coleta de urinas (30 mL): O material

coletado será processado e analisado no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da

UFPA.

QUAIS OS RISCOS DESTE ESTUDO? A coleta de sangue poderá causar um desconforto

temporário por causa da picada de agulha, hematoma e raramente, infecção. Às vezes, uma

pessoa pode ficar tonta ou desmaiar quando o sangue for coletado.

QUAIS SÃO OS BENEFÍCIOS DESTE ESTUDO?: Como esse diagnóstico, poderá ser

possível estabelecer correlação com a gravidade da doença. Além disso, para as famílias

interessadas, este estudo pode ser oferecido para encontrar pessoas portadoras da mutação, ou

seja, identificar pessoas da mesma família que têm o risco de ter um filho com MPS.

POSSO RECUSAR A PARTICIPAÇÃO? Seu filho não é obrigado a participar deste

estudo. A sua participação neste estudo é voluntária. A recusa em participar não terá

conseqüências para os seus cuidados presentes e futuros. Seu filho poderá se retirar do estudo

a qualquer momento.

TENHO QUE PAGAR PARA PARTICIPAR? Não há nenhum custo para participar dessa

pesquisa. Seu filho não será pago para participar deste estudo.

E SE EU / MEU FILHO FOR PREJUDICADO?: O Dr. Luiz Carlos Santana da Silva

deverá ser notificado se você suspeitar que seu filho foi prejudicado por estar no estudo.

AS INFORMAÇÕES SOBRE MEU FILHO SE TORNARÃO PÚBLICAS? A identidade

de seu filho e outras informações pessoais obtidas neste estudo serão confidenciais.

Informações científicas e médicas obtidas neste estudo, das quais a identidade de seu filho não

poderá ser revelada, deverão ser apresentadas em encontros e publicadas a fim de tornar as

informações obtidas neste estudo de benefício para os outros.

COM QUEM POSSO TIRAR DÚVIDAS?: Você está livre para fazer perguntas sobre este

estudo. Quando você tiver dúvidas relacionadas a este estudo, poderá falar com: Dr. Luiz

Carlos Santana da Silva e/ou Mestrando Gustavo Monteiro Viana.

Lab. Erros Inatos do Metabolismo, Instituto de Ciências Biológicas. UFPA. Av. Augusto

Correa, S/N, Guamá, CEP. 666075900 Belém-Pa. Fone: 32018030; e-mail: [email protected]

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (PACIENTE)

Eu manifesto meu

consentimento com envolvimento do meu(minha) filho(a) no projeto de pesquisa intitulado:

“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE PACIENTES COM

MUCOPOLISSACARIDOSES”.

1. A natureza e objetivo do projeto de pesquisa, descritos na folha de informação em anexo,

foram explicadas a mim. Eu compreendo e concordo em participar.

2. Eu compreendo que meu (minha) filho (a) poderá não ter benefício direto por participar

do estudo

3. Eu entendo que os possíveis riscos e/ou efeitos adversos, desconforto e inconveniências,

como foi destacado na folha de informações, foram explicadas a mim.

4. Eu compreendo que, apesar das informações obtidas no estudo poderem ser publicadas,

elas serão confidenciais e meu (minha) filho(a) não será identificado(a) a partir delas.

5. Eu compreendo que posso retirar meu (minha) filho(a) do estudo em qualquer etapa e que

isto não irá afetar os cuidados médicos ou quaisquer outros aspectos da relação recebidos

a ele(a).

6. Eu compreendo que não haverá pagamento para meu(minha) filho(a) por participar deste

estudo.

7. Eu tive a oportunidade de discutir a participação de meu(minha) filho(a) neste projeto de

pesquisa com um membro da família ou amigo e/ou tive a oportunidade de ter um

membro da família ou amigo presente enquanto o projeto de pesquisa estava sendo

explicado pelo pesquisador.

8. Eu estou ciente de que devo guardar uma cópia do Termo de Consentimento, quando

completo, e da folha de Informações.

9. Eu concordo que o material (sangue e urina) coletado de meu(minha) filho(a) seja

utilizado no projeto acima.

Assinatura do Responsável:

Relação de parentesco com o paciente:

Nome completo do paciente:

Data: __ / __ / __

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

(FAMILIAR DO PACIENTE)

Eu manifesto meu

consentimento em participar do projeto de pesquisa intitulado: “CARACTERIZAÇÃO

MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE PACIENTES COM MUCOPOLISSACARIDOSES”.

1. A natureza e objetivo do projeto de pesquisa, descritos na folha de informação em anexo,

foram explicadas a mim. Eu compreendo e concordo em participar.

2. Eu compreendo que poderei não ter benefício direto por participar do estudo.

3. Eu entendo que os possíveis riscos e/ou efeitos adversos, desconforto e inconveniências,

como foi destacado na folha de informações, foram explicadas a mim.

4. Eu compreendo que, apesar das informações obtidas no estudo poderem ser publicadas,

elas serão confidenciais e eu não serei identificado(a) a partir delas.

5. Eu compreendo que posso me retirar do estudo em qualquer etapa e que isto não irá afetar

os cuidados médicos ou quaisquer outros aspectos da relação recebidos.

6. Eu compreendo que não haverá pagamento em nenhuma espécie por participar deste

estudo.

7. Eu tive a oportunidade de discutir a minha participação neste projeto de pesquisa com um

membro da família ou amigo e/ou tive a oportunidade de ter um membro da família ou amigo

presente enquanto o projeto de pesquisa estava sendo explicado pelo pesquisador.

8. Eu estou ciente de que devo guardar uma cópia do Termo de Consentimento, quando

completo, e da folha de Informações.

9. Eu concordo com a utilização do meu material biológico (sangue) como amostra do projeto

acima citado.

Assinatura do Participante:

Nome do paciente do qual possui parentesco:

Grau de parentesco:

Data: __ / __ / __

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