( PDF ) Avaliação da atividade fitoestrogênica do extrato hidroalcoólico e da infusão das folhas de Morus nigra L

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FITOESTROGÊNICA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO E DA INFUSÃO DAS FOLHAS DE Morus nigra L.

Ana Paula Nunes Bitencourt Vanoni

Porto Alegre

Novembro de 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FITOESTROGÊNICA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO E DA INFUSÃO DAS FOLHAS DE Morus nigra L.

Ana Paula Nunes Bitencourt Vanoni

Dissertação apresentada como um dos

requisitos para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Veterinárias na área

de Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Augusto Langeloh.

Co-orientadora: Dra. Eliane Dallegrave.

Porto Alegre

Novembro de 2006

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DEDICATÓRIA

A todos aqueles que trabalham pelo desenvolvimento da educação baseada no amor e

compreensão, buscando o sentido primordial de nossa existência.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Augusto Langeloh, pela destreza em transmitir seus ensinamentos

refentes à pesquisa científica, sempre fundamentados na compreensão, amizade e

incentivo.

Á Dra. Eliane Dallegrave, pela generosidade e amor pela educação, princípios

estes essenciais para o suporte técnico e colaboração para o crescimento profissional e

espiritual de seus alunos.

Aos bolsistas de iniciação científica que participaram deste trabalho, colaborando

para a execução dos experimentos, bem como à Dra. Ângela Lopes.

Aos professores, funcionários, mestrandos, doutorandos, bolsistas e estagiários

do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, pela

acolhida e amizade.

Aos meus colegas do Colégio Luterano da Paz, pela crença na educação de

jovens para a pesquisa avançada, especialmente, Marilda, Márcia, Carmen, Ana Silvia,

Paulo e Edílcia, exemplos de dedicação e fé.

Á minha família, alicerce da construção de meus ideais, e à quem dedico todo o

meu esforço, hoje e sempre, especialmente Eduardo e Matheus, por iluminarem meus

caminhos.

Ao meu marido Marco, por ter sido o melhor companheiro, mesmo nos

momentos mais solitários da elaboração deste trabalho.

Aos animais, modelos experimentais, aos quais dediquei o meu mais profundo

respeito.

EPÍGRAFE

“ Todo projeto de vida que não for feito com amor, compreensão e razão,

não deve então ser seguido”

Albert Einstein

RESUMO

Avaliou-se a influência do extrato hidroalcoólico e da infusão das folhas de

Morus nigra L. em diferentes ensaios biológicos (uterotrófico em ratas adultas

ovariectomizadas e em pré-púberes, e pubertal) em ratas Wistar. O objetivo dos ensaios

foi avaliar a atividade estrogênica de Morus nigra observando-se o desenvolvimento

uterino de ratas adultas ovariectomizadas e pré-púberes, e, a manifestação da abertura

do canal vaginal, regularidade do ciclo estral e desenvolvimento uterino de ratas do

desmame à puberdade. Os protocolos realizados foram embasados nos padrões

estabelecidos pela Organization for Economic Co-operation and Development (OECD)

– Programa para a validação de ensaios uterotróficos como rastreamento de possíveis

substâncias com atividades estrogênicas in vitro. O material vegetal foi coletado a

campo, na cidade de Porto Alegre, RS e utilizado ainda fresco para a preparação da

infusão e do extrato hidroalcoólico sendo o primeiro preparado por maceração mecânica

das folhas (20g de folhas frescas) em 200ml de água destilada, e o segundo por

maceração de 100g de folhas em 1000ml de solução hidroalcoólica (1:1), com posterior

concentração em rotavapor à vácuo, ambos conservados sob refrigeração durante o

período dos ensaios biológicos. O cálculo do resíduo seco para estas amostras foi

efetuado com base na evaporação em estufa de volumes conhecidos em frascos de

Becker, resultando em (média ± desvio padrão) 5,4 ± 0,32mg/ml de 7 amostras para a

infusão e 123,1 ± 0,17mg/ml de 9 amostras para o extrato hidroalcoólico. As ratas

foram tratadas diariamente, por via oral com sonda flexível ou rígida, com 0,4mg/kg de

benzoato de estradiol (controle positivo), 10ml/kg de óleo de canola (controle),

615,3mg/kg de extrato hidroalcoólico 50% ou 27,0mg/kg de infusão das folhas de

Morus nigra L.. Os ensaios uterotróficos tiveram uma duração de 7 dias, para fêmeas

ovariectomizadas e de 3 dias, para as pré-púberes, e o ensaio pubertal (subcrônico)

cerca de 35 dias. Os resultados revelaram, no ensaio com ratas adultas

ovariectomizadas, um aumento da massa corporal relativa dos grupos tratados com óleo

de canola (controle) e extrato das folhas de Morus nigra L.em relação aos demais

grupos (estradiol- controle positivo- e infusão das folhas de Morus nigra L.), bem como

o aumento da massa relativa do útero úmido e seco dos grupos tratados com estradiol e

infusão de Morus nigra, acompanhado de retorno ao ciclo estral somente no grupo

estradiol; em relação aos demais órgãos, houve redução significativa da massa de fígado

e rins do grupo infusão de Morus nigra em relação ao demais grupos. No ensaio

uterotrófico em ratas pré-púberes, os resultados demonstraram um aumento da massa

corporal dos animais tratados com infusão de Morus nigra e um aumento na massa

relativa do útero úmido e seco do grupo estradiol em relação aos demais. Nas fêmeas

tratadas subcronicamente no ensaio pubertal, o grupo estradiol apresentou uma

antecipação da abertura do canal vaginal, uma redução significativa da massa dos

ovários e um aumento igualmente significativo na massa relativa do fígado em relação

aos demais grupos e um aumento igualmente significativo na massa relativa do rim

direito em comparação ao grupo controle. Conclui-se que o extrato hidroalcoólico e a

infusão das folhas de Morus nigra não apresentaram atividade estrogênica (nas doses

administradas) nos protocolos avaliados.

ABSTRACT

The influence of Morus nigra leaves was studied by using biological assays of

uterotrofic models in Wistar rats. The present study was undertaken in order to evaluate

a oestrogenic activity of Morus nigra extract or infusion throught: the uterine

development of ovariectomized rats treated with extract or infusion of Morus nigra

leaves; the manifestation of secondary sexual characteristics such as timing of vaginal

opening and uterine development of immature rats treated with extract or infusion of

Morus nigra leaves and the manifestation of secondary sexual characteristics: estral

cycle and uterine development in rats treated with extract or infusion of Morus nigra

leaves, since the weaning until puberty. The biological assays showed in this work were

based on OECD studies (Organization for Economic Co-operation and Development -

Program to validate the uterotrophic bioassay to screen compounds for in vitro

estrogenic responses). Field collected plants (Morus nigra fresh leaves) were used for

the infusion and hydroalcoholic extract by mechanical maceration in water or

hydroalcoholic solution (1:1), respectively. Both samples were conserved in

refrigerator. Residuous material was dryed (at room temperature) and evaporated in

glasses, in order to evaluate their inicial and final weigth resulting in 5,4

0,32mg/ml

of 7 samples of infusion and 123,1

0,17mg/ml of 9 samples of hydroalcoholic extract.

The animals were treated with oestradiol (0,4mg/kg), canola oil (10ml/kg),

hydroalcoholic extract 50% (615,3mg/kg) and infusion (27mg/kg) of Morus nigra fresh

leaves by oral gavage. The rats were treated for 7,3 and approximately 35 days,

respectively, in each experiment. It has been observed in ovariectomized rats that the

body weight was reduced at the oestradiol and infusion groups, comparing to the others

(canola oil, Morus nigra extract). Furthermore, results showed a significant increase of

the body weight for the groups treated with canola oil and Morus nigra extract; results

also showed a significant increase in the uterine weight for the groups treated with

infusion and oestradiol, and an important return of the cycle phase for the animals

treated with oestradiol , at the other organs, it has been observed a significant decrease

of liver and kidneys weight for the group treated with Morus nigra infusion, comparing

to the others. Both experiments with immature rats were compared: results showed a

body weight gain of the rats treated with infusion of Morus nigra leaves, nevertheless,

the oestradiol group had anticipation of vaginal opening, and an important increase of

the uterine weight. The subchronical bioassay with immature rats showed an

anticipation of vaginal oppening, and also, a decrease in ovarian weight and an

increase of the right kidney and liver weigh .The main conclusion highlighs that

hydroalcoholic extract and infusion of Morus nigra leaves did not show an oestrogenic

activity for the protocols and doses considered.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 -

Aspecto da Morus nigra L. em período de frutificação: amoras em

distintos graus de crescimento e maturação............................................

FIGURA 2 -

Manipulação da fêmea para coleta do lavado vaginal e marcação da

cauda para a identificação dos animais experimentais

.................................................................................................................

FIGURA 3 -

Microfotografia do lavado vaginal de ratas demonstrando as fases do

ciclo estral: proestro (a,b), estro (c,d), metaestro (e,f) e diestro (g,h).

Leucócitos (L), células do epitélio (E) e células ceratinizadas (C) estão

caracterizadas nas ilustrações. Ampliação de 10 X (na coluna da

esquerda) ou 40 X (na coluna da direita), sem

coloração..................................................................................................

FIGURA 4 -

Desenvolvimento ponderal em percentual (massa corporal em gramas

do 1º dia = 100%) das ratas ovariectomizadas durante o período de

tratamento. Os marcadores representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=7)..............................................................

FIGURA 5 -

Massa relativa (%) do útero úmido e seco das fêmeas adultas

ovariectomizadas tratadas com óleo de canola (controle), estradiol

(controle positivo), extrato e infusão das folhas de Morus nigra. As

colunas representam as médias e as barras os respectivos erros padrões

(n=7).........................................................................................................

FIGURA 6 -

Massa relativa do fígado (%) das fêmeas tratadas com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão das folhas

de Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=7).............................................................

FIGURA 7 -

Massa relativa (%) dos rins de ratas adultas ovariectomizadas

referentes aos grupos experimentais tratados com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos

erros padrões (n=7).................................................................................

FIGURA 8 -

Massa relativa (%) das adrenais de ratas adultas ovariectomizadas

referentes aos grupos experimentais tratados com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos

erros padrões (n=7).................................................................................

FIGURA 9 -

Desenvolvimento ponderal de ratas pré-púberes durante o período

experimental dos grupos tratados com óleo de canola (controle),

estradiol (controle positivo), infusão e extrato de M. nigra. Os

marcadores representam as médias e as barras os respectivos erros

padrões (n=8)..........................................................................................

FIGURA 10 -

Massa relativa uterina (%) das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo

de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

M. nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos

erros padrões (n=8).................................................................................

FIGURA 11 -

Massa relativa do fígado das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=8)..............................................................

FIGURA 12 -

Massa relativa dos rins das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=8).............................................................

FIGURA 13 -

Massa relativa das adrenais das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo

de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=8)..............................................................

FIGURA 14 -

Desenvolvimento ponderal em percentual (massa corporal em gramas

do 1º dia = 100%) das ratas pré-púberes durante o período de

tratamento. Os marcadores representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).............................................................

FIGURA 15 -

Massa relativa do útero úmido e útero seco das fêmeas pré-púberes

tratadas com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo),

extrato e infusão de Morus nigra. As colunas representam as médias e

as barras os respectivos erros padrões

(n=10)......................................................................................................

FIGURA 16 -

Massa relativa do ovário direito e ovário esquerdo das fêmeas pré-

púberes tratadas com óleo de canola (controle), estradiol (controle

positivo), extrato e infusão de Morus nigra. As colunas representam as

médias e as barras os respectivos erros padrões (n=10)..........................

FIGURA 17 -

Massa relativa do fígado das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).............................................................

FIGURA 18 -

Massa relativa dos rins das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus nigra. .As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).............................................................

FIGURA 19 -

Massa relativa das adrenais das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo

de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).............................................................

FIGURA 20 -

Idade média na abertura do canal vaginal (dias) das ratas tratadas com

óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e

extrato de Morus nigra. As colunas representam a idade média (dias)

e as barras os erros padrões (n=10)........................................................

FIGURA 21 -

Regularidade do ciclo estral (%) das ratas tratadas com óleo de canola

(controle), estradiol, infusão e extrato de Morus nigra. As colunas

representam o percentual de fêmeas com o ciclo regular

(n=10)......................................................................................................

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABEAS -

Associação Brasileira de Educação Agrícola Superior

ANOVA -

Análise de variância

ANVISA -

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

°C -

graus Celsius

COBEA -

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

cm -

centímetro (s)

CREAL -

Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório

epm -

erro padrão da média

g -

grama(s)

h -

hora(s)

ICBS -

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

kg -

quilograma (s)

litro(s)

mg -

miligrama(s)

ml -

mililitro (s)

MR -

medidas repetidas

N -

número de indivíduos da população

n -

número de indivíduos presentes na amostra

NOD -

Non obese diabetic mice (Camundongos diabéticos não obesos)

OECD -

Organization for Economic Co-operation and Development (Organização

para cooperação econômica e desenvolvimento)

P -

nível de significância alcançado

PUCRS -

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

SERMS –

Selective estrogens receptor modulators (Modulador seletivo de receptor de

estrogênio)

UFRGS -

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

WHI-

Women’s Health Iniciative (Iniciativa da saúde da mulher)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................

2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................

2.1 Fitoterapia e formas farmacêuticas.................................................................

2.2 Terapia de reposição hormonal e fitoestrógenos............................................

2.3 Fitoestrógenos da isoflavona: fitoquímica e mecanismo de ação..................

2.4 Utilização das plantas da família Moraceae...................................................

2.5 Morus nigra Linnaeus.......................................................................................

2.6 Avaliação da atividade estrogênica.................................................................

3 OBJETIVO........................................................................................................

3.1 OBJETIVO GERAL.........................................................................................

3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO...............................................................................

4 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................

4.1 Material vegetal.................................................................................................

4.1.1 Coleta das folhas de Morus nigra.....................................................................

4.1.2 Preparo do extrato hidroalcoólico...................................................................

4.1.3 Preparo da infusão............................................................................................

4.2 Resíduo seco.......................................................................................................

4.3 Animais Experimentais.....................................................................................

4.3.1 Ensaio uterotrófico em ratas adultas ovariectomizadas................................

4.3.2 Ensaio uterotrófico em ratas pré-púberes......................................................

4.3.3 Ensaio pubertal em ratas..................................................................................

4.4 Análise estatística..............................................................................................

5 RESULTADOS..................................................................................................

5.1 Ensaio uterotrófico em ratas adultas ovariectomizadas................................

5.2 Ensaio uterotrófico em ratas pré-púberes......................................................

5.3 Ensaio pubertal em ratas..................................................................................

6 DISCUSSÃO......................................................................................................

7 CONCLUSÃO...................................................................................................

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................

1. INTRODUÇÃO

A terapia de reposição hormonal em medicina humana utiliza medicamentos

alopáticos para repor hormônios que deixaram de ser produzidos pelo ovário em

conseqüência da menopausa. No entanto, a segurança deste tipo de tratamento para

mulheres ficou abalada após a publicação parcial e interrupção do estudo americano

multicêntrico, randomizado, duplo-cego, controlado com placebo, realizado por

pesquisadores do Women’s Health Initiative (WHI). Este estudo demonstrou que os

riscos globais excediam os benefícios: houve um aumento significativo do risco de

doença arterial coronariana, de acidente vascular cerebral, de tromboembolismo venoso;

um decréscimo significativo do risco de câncer de cólon e do risco total de fraturas e,

quanto ao câncer de mama, apresentou uma relação de risco em razão do tempo de

duração da tratamento (VIGETA, 2004).

Segundo Koo Han (2002), a utilização de fitoestrogênios poderia ser justificada

por possuírem alguns dos efeitos do estrogênio, porém, não seriam carcinogênicos.

Muitos estudos têm assinalado efeitos benéficos dos fitoestrógenos na prevenção de

várias doenças crônicas como os cânceres de cólon, mama e próstata, e doenças

cardiovasculares. Nas pacientes na pós-menopausa, observou-se que os fitoestrógenos

são capazes de reduzir os sintomas e que estes, poderiam prevenir algumas doenças

crônicas que ocorrem no climatério, como a osteoporose (AGNUSDEI & BUFALINO,

1997). As propriedades estrogênicas e antiestrogênicas dos fitoestrógenos decorrem da

sua interação com receptores de estrogênio (KONDO et al, 1990), visto que os

chamados lignanos e as isoflavonas têm atividade estrogênica fraca e, às vezes,

antiestrogênica (como o tamoxifeno). Sob o aspecto químico, estes fitormônios são

compostos não-esteróides que uma parte das plantas fabrica em células não

especializadas e que apresentam, quase sempre, um anel fenólico em sua estrutura e são

capazes de aderir, em sua maioria, aos receptores estrogênicos (ou proestrogênicos)

humanos. São classificados, então, em moduladores de receptores estrogênicos (SERMS

– selective estrogen receptor modulators) agindo como agonistas ou antagonistas do

estrogênio, a depender do tipo de receptores onde atuam. Os fitormônios são absorvidos

pelo trato gastrintestinal após desconjugação pela flora, resultando em fenóis

heterocíclicos com estrutura semelhante ao estrogênio humano, conferindo-lhes

biodisponibilidade (FRANCO, 2005).

A amoreira negra (Morus nigra L.) e a amoreira branca (Morus alba) são árvores

asiáticas da família Moraceae, que possuem alguns fitoesteróides. Estes, estão sendo

usados (mais comumente o da amoreira branca) com sucesso como a terapia de

reposição hormonal natural, embora sejam conhecidos mundialmente por suas ações

como adstringente e adjuvante para o tratamento das afecções bucais, corrimentos

vaginais e ulcerações da pele (FRANCO, 2005). Acredita-se que o chá das folhas de

amoreira negra, objetivo deste estudo, podem auxiliar na produção de estrona

(hormônio da terceira idade) que tem 40% da ação do estradiol. Hormônio este, ligado

às características sexuais secundárias da mulher, que deixa de ser produzido pelo ovário

no climatério (COSMO ON LINE, 2004). Sabe-se que os fitoestrógenos são substâncias

naturais produzidas por algumas plantas e que apresentam estrutura química diferente

dos estrógenos, mas que atuam de modo similar. Pesquisadores analisaram os fatores

distintivos das populações asiáticas (povos em cuja prática da utilização de plantas

medicinais é um forte aspecto cultural) dos povos ocidentais, visto que os primeiros

possuem baixas taxas de câncer de mama e próstata. Descobriram que a dieta asiática

inclui alto nível de fitoestrógenos (sobretudo proveniente da soja e derivados) o que

poderia influenciar na menor prevalência de doenças e na facilidade com que as

mulheres asiáticas convivem com a menopausa (NAHÁS et al., 2003). Outras

publicações sugerem que, na medicina tradicional indiana, certas plantas são utilizadas

no tratamento dos sintomas indesejáveis da menopausa. Na forma de preparações

herbais, estes fitoterápicos administrados experimentalmente em ratas pré- púberes e em

ratas ovariectomizadas, são responsáveis por um aumento significativo da massa uterina

dos animais em ambos ensaios, o que confere sua atividade uterotrófica associada à

existência de flavonóides na preparação herbal possuindo, portanto, alta atividade

estrogênica (GOPUMADHAVAN et al., 2005). No entanto, a utilização e aceitação de

produtos fitoterápicos é bastante polêmica, devido, principalmente, ao número restrito

de estudos no sentido da garantia de ação biológica (eficácia), bem como da segurança

quanto à isenção de efeitos tóxicos ou indesejáveis dos produtos utilizados pela

população (SONAGLIO, 1987).

Estudos farmacológicos de amoreiras (incluindo a M. nigra L.), publicados até o

presente momento, não referem uma possível atividade fitoestrogênica. Os relatos da

medicina popular e citações na literatura não científica (Folha de São Paulo, 2001)

sugerem que o chá das folhas de Morus nigra L. podem apresentar tal atividade. A

investigação científica de plantas usadas pela população para fins medicinais é

interessante a medida que muitas informações populares podem ser verificadas para

garantir-se a qualidade e inocuidade de tais produtos fitoterápicos. A atribuição popular

leva a crer que a utilização das folhas de M. nigra L. possa amenizar os efeitos da

menopausa nas mulheres que fazem uso da infusão diariamente. Este fato, impulsiona a

curiosidade em testar tais efeitos no tocante à terapia de reposição hormonal. A eventual

comparação do efeito hormonal avaliado em modelo experimental, pode contribuir com

a possibilidade de um tratamento adicional aos já existentes, possivelmente com menos

efeitos adversos e mais acessível à população em geral. Os mecanismos responsáveis

pelos efeitos dos fitoestrógenos não são claramente compreendidos, porém existem

evidências sugestivas de que os mesmos possam agir de acordo com dois mecanismos

receptores de estrógeno: dependente e independente (GINSBURG et al, 2000). Muitos

estudos têm demonstrado que os fitoestrógenos ligados aos receptores de estrogênio

mostram efeitos significativos em animais, em humanos e em cultura de células

(ADLERCREUTZ et al, 1992).

Frente ao exposto, no presente trabalho foi avaliada a possível atividade

fitoestrogênica do extrato hidroalcoólico e da infusão das folhas de Morus nigra L.

sobre o útero de ratas pré púberes e adultas ovariectomizadas, bem como a possível

antecipação da puberdade de ratas pré puberes.

2.REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Fitoterapia e formas farmacêuticas

A utilização de plantas medicinais e/ou seus derivados como agentes terapêuticos

naturais tem por objetivo prevenir, curar ou minimizar os sintomas das doenças, com

um custo mais acessível à população e aos serviços públicos de saúde,

comparativamente àqueles obtidos por síntese química, que são, em geral, mais caros

devido às patentes tecnológicas envolvidas (TOLEDO et al, 2003).

Os produtos naturais utilizados para fins medicinais, contudo, devem visar a

preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância

de sua ação biológica e sua segurança de utilização, além de valorizar o seu potencial

terapêutico. Para garantir estes objetivos, a produção de firoterápicos requer estudos

prévios relativos a aspectos botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos e

toxicológicos, para a obtenção de metodologias analíticas e tecnológicas plausíveis

(MIGUEL & MIGUEL, 1999).

A pesquisa efetiva em fitoterapia inicia-se pelo levantamento em literatura

científica e catálogos internacionais nas áreas específicas do referido conhecimento, e

possui caráter interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional, uma vez que abrange

diversas áreas do conhecimento, como a botânica, a química, ecologia, farmacologia,

toxicologia, entre outras. O conhecimento da etnobotânica, o qual trata da observação

do uso popular de plantas nas diferentes culturas, também se faz relevante na coleta de

informações para o estudo da fitoterapia (CAMARGO, 1998).

A administração de fármacos, tanto em medicina humana quanto em medicina

veterinária, requer a incorporação em uma forma farmacêutica caracterizada

normalmente pelo estado físico de apresentação, constituída de componentes

farmacologicamente ativos e de adjuvantes farmacêuticos. Algumas formas

farmacêuticas de relevância para o presente estudo serão mencionadas: quanto as

formulções líquidas utilizadas experimentalmente na atualidade, destacam-se as resinas,

óleos e, principalmente, o sumo das partes frescas do vegetal, os quais são utilizados

para uma ampla variedade de preparações fitoterápicas aquosas obtidas por diversos

métodos (TOLEDO et al, 2003). As chamadas alcoolaturas são preparados que utilizam

plantas frescas (excepcionalmente plantas secas) por maceração em tempertaura

ambiente com etanol. Os alcoolatos são obtidos por destilação da matéria-prima fresca

em etanol. Certos estudos que avaliam a atividade estrogênica para o tratamento dos

sintomas da menopausa relatam a utilização destes preparados alcoolatos de diversas

espécies botânicas (potencialmente fitoestrogênicas), sugerindo sua utilização na

suplementação da dieta de mulheres afetadas pela sintomatologia do climatério (LIU et

al., 2001). Os extratos podem apresentar-se líquidos, moles, espessos ou secos. Destaca-

se a importância de extratos aquosos serem preparados para o uso imediato, em virtude

de sua suscetibilidade à degradação e à contaminação microbiana inerente à presença de

água como solvente (TOLEDO et al, 2003). O mesmo cuidado é sugerido para as

preparações herbais em forma de infusão, preconizando-se, ainda, a refrigeração das

amostras por um curto período de tempo para retardar o desenvolvimento de

microorganismos. Conforme normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA, 2004) entende-se por infusão o método de preparação no qual a água, em

temperatura acima de 90ºC, é vertida sobre o produto que deve permanecer em repouso,

diferente do chá, que é o produto constituído de uma ou mais partes de espécies vegetais

fragmentadas ou moídas, com ou sem fermentação. A mesma resolução da ANVISA

define os métodos de decocção (método de preparação no qual o produto é fervido em

água) e esgotamento (processo tecnológico utilizado para retirar parcial ou totalmente

a(s) substância(s) sápida(s) ou aromática(s) de uma espécie vegetal). Já as cápsulas, as

quais representam 60% das formulações comercializadas nas farmácias de manipulação,

são uma das formas farmacêuticas de maior aceitação em medicina humana. Segundo

Miguel & Miguel. (2002), estas formas são destinadas à administração oral, vaginal ou

retal. Estudos em medicina veterinária incentivam a utilização de pellets contendo

preparações herbais provenientes das folhas de Mangifera indica L e Morus nigra L.

como forrageira para coelhos de criação, por possuírem um grande valor nutritivo,

importante para o bom funcionamento do aparato digestório destes animais

(DEMETEROVÁ, 1998).

2.2. Terapia de reposição hormonal e fitoestrógenos

O déficit estrogênico decorrente do fim da função reprodutiva do ovário facilita a

apresentação de sintomas indesejáveis nas mulheres acometidas pela menopausa. Entre

alguns dos efeitos mais brandos, pode-se citar aqueles responsáveis pela denominação

muito utilizada em medicina humana para a caracterização da fase: síndrome do

climatério, cuja principal característica é a ruborização da face e o “abafamento” ou

“calorão”. Outros efeitos são descritos, tais como: distúrbios psíquicos, atrofia do

aparato genitourinário, osteoporose e enfermidades cardiovasculares, este último,

constitui a principal causa de morte em mulheres pós-menopáusicas que vivem nos

países desenvolvidos (DESPAIGNE, 2001).

A terapia de reposição hormonal é capaz de reverter quase todas as

conseqüências do hipoestrogenismo pós-menopáusico, porém apenas 35% a 40% das

mulheres o utilizam, e muitas que iniciam o tratamento não dão continuidade. Um dos

principais motivos da relutância em iniciar a terapia de reposição hormonal é a

percepção da prescrição médica de estrógenos como um método “não-natural”, por isso,

estudos atuais procuram investigar a ação de fitoestrógenos, fitoterápicos nos quais se

detecta hormônio estrogênico (GLAZIER et al; 2001).

Nos anos 70, a terapia de reposição hormonal foi severamente condenada pelo

sugerido aumento de riscos de câncer de mama e endométrio em mulheres expostas,

portanto, o tratamento deve ser empregado preferencialmente por curto prazo e sua

indicação limita-se ao controle dos sintomas climatéricos, mesmo assim quando o

benefício (alívio dos sintomas vasomotores e melhoria do trofismo e lubrificação da

mucosa vaginal) suplantar o risco (WANNMACHER & LUBIANCA, 2004). A terapia

de reposição hormonal era vista como um método de redução dos riscos de infarto do

miocárdio em mulheres na pós-menopausa, mas, evidências recentes parecem

contradizer os estudos observacionais (MORELLI et al; 2002).

Os estrógenos provenientes de plantas foram detectados no ano de 1926 por

Dohrn et al., e em 1930 simultaneamente por Butenandt and Jacobi e Skarzynsky. Tais

resultados, no entanto, não obtiveram um método efetivo de detecção do hormônio e,

para a época, apenas tiveram um caráter de pioneirismo nas pesquisas em fitoterapia

(JANECZKO e SKOCZOWSKI, 2005). Estudos mais elaborados foram realizados para

a detecção de hormônios esteróides em plantas (128 espécies de 50 famílias) com

técnicas de radioimunofluorescência em 1989 (SIMONS e GRINWICH, 1989). Por

meio dos avanços tecnológicos na área da farmacologia, atualmente sabe-se que os

fitoestrogênios com maior ação estrogênica são as isoflavonas presentes no gérmen de

soja, estes se apresentam quimicamente como compostos não-esteróides, que se ligam

fracamente aos receptores estrogênicos (menos de 1% da afinidade de ligação do

estradiol). Os referidos compostos apresentam ação seletiva, isto é, exibem atividade

estrogênica em alguns tecidos e antiestrogênica em outros (BAKER et al, 2000). Há

evidências de que a isoflavona diminui a intensidade e frequência dos sintomas

vasomotores em mulheres na menopausa (HAN et al, 2002). A maioria dessas

observações sobre o uso dos fitoestrogênios são epidemiológicas, muitas delas baseadas

em estudos realizados em regiões de alto consumo de soja (LISSIN & COOKE, 2000).

Alguns autores sugerem diferentes terapias que poderiam substituir a reposição

hormonal clássica, evitando desta forma o risco de câncer de mama que a terapia de

reposição hormonal pode causar. Uma destas terapias sugere a utilização dos chamados

moduladores seletivos do receptor estrogênico (SERMs), podendo ser naturais (como os

mencionados fitoestrógenos) ou sintéticos (COMINO, 1999), como os derivados do

trifeniletileno (tamoxifeno, idoxifeno, droloxifeno, toremifeno e clomifeno), entre

outros compostos.

Um levantamento da literatura científica inglesa citado por Glazier et al. (2001),

identificou mais de 1000 artigos publicados nos últimos 30 anos sobre fitoestrógenos.

No total, 74 foram selecionados para a inclusão em um artigo de revisão baseados na

relevância dos assuntos. Os estudos escolhidos incluíam pesquisas com fitoestrógenos

na inibição do crescimento de células cancerígenas em linhagens celulares in vitro e em

animais, o papel dos fitoestrógenos na redução dos níveis de colesterol e a utilização de

um derivado (ipriflavona) na prevenção da osteoporose.

Na medicina veterinária, a reposição estrogênica também se constitui em um

importante objeto de pesquisa para a preservação do perfil lipoprotéico em cadelas

ovariectomizadas (SCHMIDT et al, 2004), apresentando resultados compatíveis com

aqueles citados na literatura humana, em que mulheres, após a menopausa, apresentam

elevação nos níveis de colesterol total. É comprovado cientificamente que, após o início

da reposição estrogênica, os valores tendem a diminuir, permanecendo dentro da

normalidade (WOLFE & HUFF, 1995; SPEROFF et al., 1996; SULLIVAN, 1996;

GIANINI, 2001). Dalsenter (1991), abordando outro aspecto, refere a importância de se

estudar plantas produtoras de substâncias com atividade sobre o sistema reprodutor e

que possam ser responsabilizadas pela redução da performance reprodutiva dos

rebanhos bovinos e ovinos. Para Hughes (1996) a exposição a dieta fitoestrogênica,

principalmente através de leguminosas, pode conduzir a inúmeros distúrbios

reprodutivos. A composição química destes fitoestrógenos inclui flavonóides:

isoflavonas como a genisteína e a daidzeína, e os cumestanos, como o cumesterol. O

mecanismo de ação destes não está completamente estabelecido. Os efeitos dos

fitoestrógenos são mais variados com relação à espécie animal e principalmente, quanto

as fases da vida; durante a idade reprodutiva, reduzem a fertilidade de bovinos e ovinos,

são agentes antifertilizantes com possíveis sítios de ação nos ovários, hipófise e no

sistema nervoso central feminino (DALLEGRAVE, 1999).

No entanto, poucos estudos realizados examinaram a importância dos

fitoestrógenos na prevenção dos sintomas da menopausa na espécie humana. Por este

motivo, as evidências do uso destes fitoterápicos na substituição da terapia de reposição

hormonal tradicional são insuficientes para uma recomendação na medicina humana e

necessitam de um maior aprofundamento científico.

2.3 Fitoestrógenos da isoflavona: fitoquímica e mecanismo de ação

Uma das principais classes de fitoestrógenos são as isoflavonas

encontradas nas sementes de leguminosas e em grande quantidade nos derivados de soja

(THAN et al, 1998). A partir de estudos fitoquímicos realizados com os gêneros

alimentícios mencionados, pôde-se identificar dois tipos de compostos que poderiam

exercer efeitos benéficos em mulheres pós-menopáusicas, reduzindo a sintomatologia

do climatério e, até mesmo, protegendo o organismo contra certas doenças, como a

osteoporose , o câncer, e as doenças cardiovasculares: a genisteína e a daidzeína (YIN et

al, 2000). As ações em nível celular e molecular destes compostos fitoestrogênicos

podem ser influenciadas por muitos fatores, dentre os quais pode-se citar as condições

do receptor e do tipo de órgão-alvo, bem como, o nível de estrogênios endógenos. Desta

forma, quando há um nível elevado de estrogênios, as isoflavonas podem agir como

antagonistas estrogênicos, em contrapartida, em níveis mais baixos (como nas mulheres

pós-menopáusicas), as isoflavonas comportariam-se como agonistas estrogênicos

(SETCHELL, 1998).

Considerada como o tipo de isoflavona mais estudada na atualidade, a

genisteína tem sido citada em estudos científicos como um potente agente profilático e

terapêutico para o tratamento do câncer e de outras doenças crônicas, além de apresentar

resultados promissores no tratamento da menopausa em medicina humana

(POLKOVSKI & MAZUREK, 2000). Quanto ao mecanismo de ação, tanto a genisteína

quanto a daidzeína ligam-se aos receptores estrogênicos para gerar respostas

estrogênicas, porém, estes compostos apresentam uma afinidade menor do que aquela

apresentada pelo estradiol (POTTER et al, 1998). De forma interessante, a afinidade

específica aos receptores α e β (onde sabe-se que as isoflavonas agem como potentes

agonistas em receptores β e fracos agonistas em receptores α), poderia explicar as ações

específicas dos fitoestrogênios, considerando-se ainda, também como fator

preponderante, a distribuição desses receptores nos tecidos e órgãos-alvo (VINCENT &

FITZPATRICK, 2000).

Comparados à terapia de reposição hormonal clássica, os fitoestrógenos

revelam ser menos eficazes na redução de sintomas da menopausa, enquanto que, na

prevenção de doenças cardiovasculares e aterosclerose, os compostos que conferem

ação estrogênica às isoflavonas têm demonstrado ser tão eficientes quanto os

estrogênios exógenos, ou até mesmo superiores em alguns casos (CLARKSON et al,

2001).

2.4 Utilização das plantas da família Moraceae

As plantas pertencentes ao gênero Morus (Moraceae) apresentam muitas

propriedades medicinais relatadas na literatura científica. Utilizadas em larga escala na

medicina popular chinesa, as partes aéreas e radiculares da planta possuem compostos

bioativos de atividade antiinflamatória, diurética e expectorante. Estudos recentes

mostraram que estas plantas apresentariam atividades antiespasmódicas e hipotensoras

relacionadas à presença de compostos previamente isolados, do tipo diels-alder, como o

kuwanon G. chalcomoracin e kuwanon E, segundo Santos et al. (1996).

As folhas da amoreira (Moraceae), ricas em proteínas, fibras, minerais e

vitamina C, também apresentam um tipo de glicoproteína chamada moran A a qual se

atribui um efeito antidiabético (ANDALU et al., 2001). No tocante ao efeito anti-

hiperglicêmico, outros estudos referem a atividade da Morus nigra L. em preparações

herbais com outras plantas, indicando uma diminuição significativa dos níveis de

glicose e frutosamina em ratos obesos não-diabéticos (NOD) induzidos pelo aloxano e

tratados com os extratos (PETLEVSKY et a.l, 2001).

Os frutos da amoreira negra são conhecidos não apenas por suas qualidades

nutricionais e sabor característico, mas também pela sua utilização como fitoterápico.

Alguns estudos já relataram que o diabete melito do tipo II pode ser controlado através

da ingestão de uma mistura caseira dos frutos com água, na forma de xarope ou suco.

Além disso, o fruto também é utilizado popularmente para o tratamento das inflamações

da garganta, língua e boca (MARTIN et al, 2003).

Os efeitos dos compostos provenientes do córtex das raízes das plantas da

família Moraceae foram elucidados através de experimentos realizados e as aplicações

clínicas encontradas na literatura ou medicina chinesa. Estudos preliminares com

diferentes modelos experimentais (ratos, camundongos, porquinho-da-Índia e cães)

confirmaram as atividades catárticas, analgésicas, diuréticas, antitussígenas,

antiedematosas, sedativas, anticonvulsivantes e hipotensivas relatadas na medicina

chinesa. Tais efeitos resultam do tratamento dos animais com as frações hidrossolúvel e

n-butanol adicionados às partes radiculares do vegetal. Outros efeitos dos extratos das

folhas de espécimes da família Moraceae (M. alba) foram verificados através de ensaios

crônicos: em coelhos tratados por administração parenteral e subcutânea, foi

diagnosticado degranulação das células beta das ilhotas de Langerhans em variados

graus, quando o pâncreas dos animais experimentais foram analisados através de

microscopia eletrônica (GULUBOVA e BOIADZHIOV, 1975).

Um composto chamado morusina, do grupo dos prenilflavonóides, foi isolado a

partir das raízes de Morus nigra L. Quando administrados aos modelos experimentais

clássicos de dor (camundongos), os compostos apresentaram ação analgésica,

demonstrando uma potência similar àquela dos fármacos geralmente usados como

referência para o tratamento antinociceptivo (SOUZA et al., 2000). A ação antioxidante

de extratos dos frutos de Morus nigra L. foi verificada obtendo-se como resultado a

inibição da glicosilação da hemoglobina induzida pela glicose em diferentes graus. A

hemólise de eritrócitos humanos induzida por peróxido de hidrogênio também foi

inibida, comprovando a utilização farmacológica de diferentes partes vegetais de

exemplares da família Moraceae. Tais resultados sugerem que os frutos de M. nigra L.

apresentam uma ação protetora contra os danos oxidativos às membranas e

biomoléculas (NADERI et a.l, 2004). A atividade antioxidante não fica restrita aos

frutos: as folhas de M. nigra L. também já foram investigadas sugerindo-se uma

modificação sazonal dos compostos com tal atividade, onde verificou-se que os picos de

substâncias antioxidantes ocorreriam no mês de outubro, caindo no mês de fevereiro, no

hemisfério norte.

A litertura não-científica, refere que as folhas de Morus nigra apresentam

estrona, entre outros compostos. Este composto pode conferir atividade estrogênica

relativa a preparações fitoterápicas de suas folhas (COSMO ON LINE 2004;

EMBRAFARMA, 2006).

2.5. Morus nigra Linnaeus

Morus nigra L. (Figura 1), conhecida popularmente como amoreira-negra,

pertence a família Moraceae, e é composta de cerca de 61 gêneros com mais de 1000

espécies e se encontra bem representada no Brasil tanto por espécies indígenas como

por cultivadas. É freqüente de um modo geral nas regiões tropicais de todo o mundo.

Destacam-se dentre os gêneros com representantes exclusivamente cultivados a Morus,

cujas folhas servem de alimento à lagarta do bicho da seda (Bombix mori) e cujas

infrutescências, as amoras, são comestíveis e utilizadas na confecção de geléias (JOLY,

1985).

FIGURA 1 – Aspecto da Morus nigra L. em período de frutificação: amoras em

distintos graus de crescimento e maturação.

Dentre as espécies lenhosas distribuídas nos países de climas quentes, a maior

parte corresponde ao gênero Ficus, gênero ao qual pertencem as figueiras. Morus nigra,

por sua vez, é uma espécie nativa da China, e apresenta-se como árvore ornamental,

principalmente pelo efeito outonal de sua folhagem em regiões de clima ameno como

no sul e sudeste do Brasil. É empregada no paisagismo e na arborização urbana (JOLY,

1985).

Quanto à sua descrição morfofisiológica, a árvore é caducifolia e apresenta uma

altura que varia entre 7 e 12 metros, com tronco revestido por uma casca fina, quase

lisa, de cor acinzentada. É provida de ramos mais ou menos horizontais com as

extremidades pendentes, formando uma copa achatada, morfologicamente. As folhas

são simples, cartáceas, obovadas, variáveis e profundamente lobadas em amostras

jovens e de margens serreadas em plantas adultas, com nervação saliente e superfície

superior brilhante, que varia entre 6 e 12cm de comprimento, com pecíolo de 1 a 2cm.

Sua inflorescência é formada entre os meses de julho e agosto, com flores pequenas,

quase sempre de um só sexo, agrupadas em inflorescências. Cada flor está constituída

de 4 a 6 folhas pequenas. Os frutos são diminutos e secos ou carnosos com apenas uma

semente, porém o receptáculo que o contém apresenta aspecto carnoso e suculento

quando maduro assim como outras partes florais. Apresentam-se, portanto, como drupas

compostas de formato cilíndrico e de superfície tuberculada, inicialmente vermelhos e

pretos quando maduros, de 1 a 2cm de comprimento, de polpa carnosa e agridoce. As

moráceas produzem o látex, suco leitoso que apresenta ceras ou resinas, produzindo, por

vezes, alcalóides e glucosídeos, assim como certas essências (LORENZI et al., 2003).

Quanto à sua composição, quando maduros os frutos (amoras) contém cerca de 9% de

açúcares (glicose e frutose), ácido málico (em estado livre 1,86%), materiais

albuminóides e pectinas, gomas e materiais colorantes, com 85% de água. Na casca do

tronco e nas raízes encontra-se malato cálcico. Quanto ao uso popular das partes

vegetais, sabe-se que o xarope dos frutos se utiliza nas inflamações da garganta e da

boca. A cortiça da raiz apresenta-se como purgante nas preparações por cozimento da

mesma em água, sendo administradas no desjejum. Historicamente, certas bibliografias

apontam as amoreiras como uma árvore conhecida mundialmente pela propriedade de

relaxamento da musculatura uterina através da ingestão de seus frutos. Suas folhas

apresentam-se eficientes no combate às dores de dente quando utilizadas em bochechos

em forma de suco. (QUER,1980)

2.6 Avaliação da atividade estrogênica

Jun Kanno, et al (2001), referem a padronização dos protocolos de ensaios para

detecção de atividade estrogênica ou anti-estrogênica conforme estabelecido pela

OECD (Organization for Economic Co-operation and Development). Este órgão tem

como objetivo produzir um conjunto de normas e estratégias reconhecidas

internacionalmente para o rastreamento de compostos com atividade estrogênica, entre

outras, realizados em animais experimentais e/ou in vitro. Estes incluem os ensaios

uterotróficos e pubertal. Na chamada Fase 1 de planejamento, são realizados ensaios in

vivo de curta duração, onde os protocolos tem por objetivo avaliar em ratas adultas

ovariectomizadas e pré-púberes a relação dose-efeito entre a massa uterina e o estrógeno

de referência (estradiol), comparativamente com as substâncias testadas, utilizando a via

oral ou subcutânea. Na seqüência, são realizados ensaios in vivo de maior duração,

como o pubertal, de forma a rastrear a possibilidade de efeitos estrogênicos decorrentes

da ação de doses repetidas por períodos mais prolongados de estrógeno referência em

comparação com as substâncias em teste.

O primeiro protocolo, utiliza ratas pré-púberes (21 dias de vida) com

administração por via oral durante 3 dias, seguido de eutanasia, 24 horas após a última

administração; o segundo protocolo, utiliza ratas adultas ovariectomizadas tratadas por

7 dias com eutanasia 24 horas após a última administração. Em ambos a variável

utilizada como marcadora de atividade estrogênica é a massa relativa do útero úmido e

seco. Reconhecido como referência segura, o estudo da OECD teve como líder o

laboratório do Instituto Nacional de Ciências da Saúde do Japão (National Institute of

Health Sciencies of Japan), e os protocolos descritos anteriormente foram previamente

testados por 9 laboratórios de 3 países, previamente a padronização. Todos os

protocolos referidos pela OECD foram fundamentados em amostras de 6 animais por

grupo, e o volume oral administrado não excedeu a 5ml/kg. Segundo os protocolos

padronizados, a massa corporal dos animais deve ser mensurada diariamente. A massa

corporal inicial das ratas pré-púberes utilizadas para os ensaios da OECD variou entre

26 e 57g entre os diversos laboratórios e para as adultas ovariectomizadas, 142 a 327g.

Foram alvos de interesse a massa uterina úmida e seca, visto que o aumento da

massa uterina é a resposta fundamental da fêmea submetida à exposição suficiente à um

agonista estrogênico (estradiol – controle positivo). A resposta inicial com a interação

essencial do estrógeno com um receptor de alta afinidade no tecido uterino inicia uma

série de eventos culminando com o aumento da massa uterina, este aumento é uma

associação de embebição de água no tecido e lúmen uterinos com uma resposta

hipertrófica destes tecidos. Portanto, acredita-se que os agonistas estrogênicos podem

ser identificados por um aumento estatisticamente significativo da massa uterina nos

animais tratados em comparação com os controles.

Historicamente, a maioria dos resultados uterotróficos publicados descreveram

massas uterinas após a cuidadosa secagem do útero depois que sua parede fora

perfurada ou cortada para permitir a drenagem do conteúdo luminal. A justificativa para

mensurar a massa uterina seca (técnica também incorporada ao protocolo OECD) é,

usualmente, que as massas úmidas são mais variáveis e a variabilidade aumenta com a

possível perda de líquido do lúmen durante a dissecção e manipulação do tecido.

De acordo com os protocolos da OECD, tomaram-se precauções para especificar

a idade dos animais incluídos nos experimentos de forma que o tratamento pode iniciar

entre os 19-21 dias de idade (pré-púberes), limitando desta forma a massa corporal,

evitando a inclusão inadvertida de animais mais velhos ao estudo, pois os mesmos

poderiam alcançar a puberdade levando a um aumento na massa uterina controle,

aumentando a variabilidade dos resultados (JUN KANO et al, 2001). Um ponto

igualmente importante para o estudo da atividade estrogênica através do ensaio pubertal

é a determinação das fases do ciclo estral das ratas, pois sabe-se que, em razão da curta

duração de seu ciclo, estas espécies constituem um bom modelo para o estudo das

alterações que ocorrem durante o ciclo reprodutivo (MARCONDES et al, 2001). O

ciclo estral de ratas tem duração média de 4 ou 5 dias e é caracterizado por 4 fases, as

quais podem ser determinadas pelos tipos celulares observados a fresco no lavado

vaginal (CHAHOUD & KWASIGROCH, 1977):

a) Proestro (12h) – com grande número de células nucleadas e algumas células

proliferativas do epitélio vaginal;

b) Estro (14h) – com células cornificadas e anucleadas; a ovulação ocorre

espontaneamente na metade do ciclo escuro durante esta fase;

c) Metaestro (21h) – com inúmeros leucócitos e filamentos de muco;

d) Diestro (57h) – período de repouso onde a mucosa vaginal é fina, com poucas células

nucleadas, leucócitos e muco.

Consideradas fêmeas poliéstricas anuais, as ratas manifestam vários ciclos

estrais, de quatro a cinco dias, ao longo do ano (COBEA, 1996).

A Figura 2 mostra a forma correta de manipulação das ratas para o exame de

esfregaço vaginal e a marcação na cauda para a diferenciação entre os animais

utilizados experimentalmente. A Figura 3 ilustra as fases do ciclo estral detectadas por

meio do exame a fresco do lavado vaginal em microscópio óptico com aumento de 100

vezes.

FIGURA 2 - Manipulação da fêmea para coleta do

lavado vaginal e marcação da cauda para

a identificação dos animais

experimentais (MARCONDES, 2002).

FIGURA 3- Microfotografia do lavado vaginal de ratas demonstrando as

fases do ciclo estral: proestro (a,b), estro (c,d), metaestro

(e,f) e diestro (g,h). Leucócitos (L), células do epitélio (E) e

células ceratinizadas (C) estão caracterizadas nas

ilustrações. Ampliação de 10 X (na coluna da esquerda) ou

40 X (na coluna da direita), sem coloração.

(MARCONDES, 2002).

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade fitoestrogênica do extrato hidroalcoólico e da infusão das

folhas de Morus nigra L. em ratas Wistar.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o desenvolvimento uterino de ratas Wistar adultas ovariectomizadas

tratadas com extrato hidroalcoólico ou infusão das folhas de Morus nigra L.

• Avaliar a manifestação das características sexuais secundárias: abertura do canal

vaginal e desenvolvimento uterino de ratas Wistar pré-púberes tratadas com

extrato hidroalcoólico ou infusão das folhas de Morus nigra L.

• Avaliar a manifestação das características sexuais secundárias: abertura do canal

vaginal, ciclo estral e desenvolvimento uterino de ratas Wistar tratadas com

extrato hidroalcoólico ou infusão das folhas de Morus nigra L. do desmame à

puberdade.

4.MATERIAS E MÉTODOS

4.1. Material vegetal

4.1.1 Coleta das folhas de Morus nigra

Foram utilizadas folhas de Morus nigra (herborizadas no Departamento de

Botânica da UFRGS – excicata nº 144411) coletadas em junho de 2005 em Porto

Alegre, RS. O material coletado foi utilizado ainda fresco para a preparação da infusão e

do extrato hidroalcoólico.

4.1.2 Preparo do extrato hidroalcoólico

Foi obtido o extrato hidroalcoólico (1:1) por maceração de 100g de folhas em

1000ml de solução. O sobrenadante foi colhido durante 48 a 72 horas, período durante o

qual o material resultante sofria agitações ocasionais. O processo de maceração e

filtração do sobrenadante foi repetido por 3 vezes até que o filtrado de tornasse límpido.

O extrato foi então concentrado à temperatura inferior à 50ºC em rotavapor até o

volume final de 100ml. O extrato foi conservado sob refrigeração, desde o preparo até o

término do período de realização dos ensaios biológicos.

4.1.3 Preparo da infusão

A infusão foi obtida por maceração mecânica de 20g de folhas frescas em 200ml

de água destilada a 90ºC. A infusão foi preparada semanalmente, e conservada sob

refrigeração durante os dias de tratamento dos animais.

4.2 Resíduo seco

O cálculo para a determinação do resíduo seco das soluções extrativas e da

infusão foi efetuado com base na evaporação em estufa, de volumes conhecidos em

frascos previamente tarados. Um mililitro de cada uma das amostras foi transferido para

cada um dos três copos de Becker (5ml), com massa (g) previamente determinada. Estes

foram levados à estufa (temperatura média de 100ºC) até que a parte líquida da solução

extrativa (infusão) e do extrato hidroalcoólico tivesse evaporado totalmente. Foram

calculadas as médias das três medidas resultantes da diferença entre a massa inicial e

final de cada um dos copos de Becker (referentes a cada uma das amostras), resultando

em (média ± desvio padrão de “N” repetições) 5,4 ± 0,32mg/ml de 7 amostras para a

infusão e 123,1 ± 0,17mg/ml de 9 amostras para o extrato hidroalcoólico.

4.3 Animais experimentais

Foram utilizadas ratas fêmeas da linhagem Wistar (N=100), obtidas do CREAL

(Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório) e mantidas no

biotério do Departamento de Farmacologia do ICBS/UFRGS, em condições constantes

de umidade e temperatura (21ºC ± 2) e ciclo de claro e escuro de 12 horas, recebendo

ração comercial Nuvilab CR1 (Nuvital, Colombo/PR) e água ad libitum durante os

ensaios biológicos.

4.3.1 Ensaio uterotrófico em ratas adultas ovariectomizadas

Foram ovariectomizadas ratas de 60 dias (N=28). O procedimento foi realizado

mediante anestesia dissociativa com a associação de tiletamina e zolazepam (Zoletil®)

na dose de 20mg/kg, por via intramuscular. Na região dorsal, bilateralmente, foram

retirados por arrancamento os pêlos e posteriormente, foi procedida a anti-sepsia com

álcool iodado. Foram efetuadas duas incisões para-vertebrais ( látero-dorsais ) de

aproximadamente 1cm de extensão, pelas quais exteriorizou-se os cornos uterinos e os

ovários, as veias e artérias ovarianas foram ligadas com categute 4-0 com posterior

remoção dos ovários. Por fim, suturou-se a parede muscular com categute 4-0 e a pele

com mononylon 4-0. Ao final da cirurgia foi administrada benzilpenicilina benzatina

40.000UI/kg, por via intramuscular. O período de recuperação cirúrgica foi de 10 dias.

Após este período, foram constituídos aleatoriamente quatro grupos experimentais

(n=7/grupo). As ratas foram tratadas, diariamente, por via oral, com sonda flexível, por

um período de 7 dias, sendo que o grupo controle recebeu óleo de canola (veículo do

estradiol) na dosagem de 5ml/kg, o grupo estradiol (controle positivo) 0,4mg/kg de

benzoato de estradiol, os grupos extrato e infusão receberam, respectivamente,

615,3mg/kg do extrato hidroalcoólico ou 27,0mg/kg da infusão das folhas de Morus

nigra.

Durante o período de tratamento, verificou-se diariamente a massa corporal e a

citologia vaginal. No 8º dia, foi verificada a massa corporal das ratas e efetuada

anestesia com tiletamina e zolazepam (Zoletil®) na dose de 20mg/kg, por via

intramuscular, com posterior abertura da cavidade abdominal e eutanasia por ruptura do

diafragma. Foram retirados útero, fígado, rins e adrenais. A massa de cada órgão foi

mensurada e comparada à massa corporal de cada fêmea para cálculo da massa relativa.

O útero teve sua massa avaliada úmido (com líquido/secreções no interior) e

posteriormente, seco (perfurado /drenado e comprimido entre duas folhas de papel

filtro).

4.3.2 Ensaio uterotrófico em ratas pré-púberes

Foram constituídos aleatoriamente quatro grupos experimentais (N=32) de ratas

com 21 dias de vida (n=8/ grupo). As ratas foram tratadas, diariamente, por via oral,

com sonda rígida, por um período de 3 dias (desde o 21º dia até o 24º dia de vida),

sendo que o grupo controle recebeu óleo de canola (veículo do estradiol) na dosagem de

5ml/kg, o estradiol (controle positivo) 0,4mg/kg de benzoato de estradiol, os grupos

extrato e infusão receberam, respectivamente, 615,3mg/kg do extrato hidroalcoólico ou

27,0mg/kg da infusão das folhas de Morus nigra.

Durante o período de tratamento, verificou-se diariamente a massa corporal e, no 4º

e último dia de experimento, foi efetuada anestesia com tiletamina e zolazepam

(Zoletil®) na dose de 20mg/kg, por via intramuscular, com posterior abertura da

cavidade abdominal e eutanasia por ruptura do diafragma. Posteriormente, foram

retirados útero, fígado, rins e adrenais. A massa de cada órgão dos animais utilizados foi

mensurada e relacionada com a massa corporal correspondente ao 4º dia de

experimento. O útero teve sua massa avaliada úmida e posteriormente, seca entre duas

folhas de papel filtro.

4.3.3 Ensaio pubertal em ratas

Os grupos experimentais (N=40) foram constituídos por ratas de 21 dias de idade

(n=10/grupo). O grupo controle foi tratado com óleo de canola na dosagem de 5ml/kg, o

controle positivo com benzoato de estradiol na dosagem de 0,4mg/kg e 615,3mg/kg de

extrato hidroalcoólico ou 27,0mg/kg da infusão de Morus nigra .

Os tratamentos foram administrados por via oral através de sonda rígida (dos 21 aos

39 dias) e flexível (a partir dos 40 dias) até a abertura do canal vaginal. A ocorrência ou

não do evento foi observada diariamente bem como a massa corporal dos animais e, a

partir do dia de abertura do canal vaginal, a fase do ciclo estral das fêmeas foi verificada

diariamente através da citologia vaginal. O material vaginal coletado foi observado a

fresco em microscópio óptico com aumento de 100 vezes. A partir do terceiro estro, foi

efetuada anestesia com tiletamina e zolazepam (Zoletil®) na dose de 20mg/kg, por via

intramuscular, com posterior abertura da cavidade abdominal e eutanasia por ruptura do

diafragma. Posteriormente, foram retirados útero, fígado, rins e adrenais. A massa de

cada órgão dos animais utilizados foi verificada e comparada à massa corporal

correspondente ao último dia de experimento. O útero teve sua massa avaliada úmida e

posteriormente, seca entre duas folhas de papel filtro.

4.4 Análise estatística

Os dados obtidos foram expressos como frequência absoluta ou relativa

(porcentagem), média e erro padrão da média, conforme a variável proposta.

A análise estatística foi efetuada por meio de testes de análise de variância de

medidas repetidas (ANOVA de MR), análise de variância por uma via (ANOVA) e teste

qui-quadrado (ZAR, 1999).

As variáveis quantitativas (que apresentaram uma distribuição normal) referentes

à influência do extrato e da infusão das folhas de Morus nigra no desenvolvimento

ponderal das ratas foram comparadas por meio da análise de variância de medidas

repetidas, seguida do teste de Bonferroni quando indicado. A massa relativa dos órgãos

foi comparada por meio da análise de variância de uma via, seguida do teste de

Bonferroni quando indicado.

As variáveis qualitativas (que apresentaram uma distribuição normal) referentes

à influência do extrato e da infusão das folhas de Morus nigra no ciclo estral.foram

avaliadas mediante o teste qui-quadrado.

Todas as análises foram feitas prevendo um nível α de significância de 0,05. No

texto, foram citados os níveis de significância (P) alcançados em cada teste estatístico

realizado.

Os programas utilizados para efetuar a análise estatística foram o SPSS for

Windows 8.0 e o EXCEL 4.0 (LAPPONI, 1995).

5. Resultados

5.1 Ensaio uterotrófico em ratas adultas ovariectomizadas A Figura 4 mostra o

desenvolvimento ponderal (%) das ratas adultas ovariectomizadas tratadas durante sete

dias com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato ou infusão de

Morus nigra.

FIGURA 4. Desenvolvimento ponderal em percentual (massa corporal em

gramas do 1º dia = 100%) das ratas ovariectomizadas durante o

período de tratamento. Os marcadores representam as médias e as

barras os respectivos erros padrões (n=7).

Verificou-se que durante o período de tratamento, houve um aumento

significativo na massa corporal relativa dos grupos controle e extrato de Morus nigra

em relação aos demais grupos (P < 0,05: ANOVA de Medidas Repetidas, Bonferroni)

estradiol (controle positivo) e infusão de Morus nigra, nos últimos dias do período

experimental (dias 7 e 8).

A Figura 5 mostra a massa relativa do útero úmido e seco das fêmeas adultas

ovariectomizadas dos grupos óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo),

* P < 0,05 ANOVA de Medidas Repetidas, Bonferroni

100

105

110

115

12345678

Período de tratamento (dias)

Massa corporal relativ

ao 1º dia (%)

Controle Estradiol

Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

extrato ou infusão de Morus nigra. Verificou-se uma diferença significativa (P < 0,005:

ANOVA, Bonferroni) na massa relativa do útero úmido e seco dos grupos estradiol e

infusão de Morus nigra em relação aos grupos controle (óleo de canola) e extrato de

Morus nigra.

Foi verificada ainda, diferença significativa (P < 0,005: qui-quadrado) no

percentual de dias estrogênicos, na qual o grupo estradiol apresentou retorno a atividade

estrogênica em 65,6% dos dias avaliados em relação aos grupos controle (óleo de

canola), infusão e extrato das folhas de Morus nigra, que não exibiram atividade

estrogênica no período avaliado.

FIGURA 5. Massa relativa (%) do útero úmido e seco das fêmeas adultas

ovariectomizadas tratadas com óleo de canola (controle), estradiol

(controle positivo), extrato e infusão das folhas de Morus nigra. As

colunas representam as médias e as barras os respectivos erros padrões

(n=7).

0,05

0,1

0,15

0,2

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

Massa relativa do útero (%)

Útero úmido Útero seco

* P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença do controle e do extrato)

A Figura 6 mostra a massa relativa do fígado dos animais tratados com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato ou infusão de Morus nigra.

Conforme os dados, verifica-se que houve redução estatisticamente significativa (P <

0,05: ANOVA, Bonferroni) na massa relativa do fígado do grupo infusão de Morus

nigra em relação aos demais grupos experimentais (controle e extrato de Morus nigra).

FIGURA 6. Massa relativa do fígado (%) das fêmeas tratadas com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão das folhas de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=7).

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

< 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

< 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

A Figura 7 mostra a massa relativa dos rins das ratas adultas ovariectomizadas

tratadas com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato ou infusão

de Morus nigra. Conforme os dados, verifica-se que houve redução estatisticamente

significativa (P < 0,05: ANOVA, Bonferroni) na massa relativa dos rins do grupo

infusão de Morus nigra em relação aos demais grupos experimentais (controle e extrato

de Morus nigra).

FIGURA 7. Massa relativa (%) dos rins de ratas adultas ovariectomizadas

referentes aos grupos experimentais tratados com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos

erros padrões (n=7).

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativa dos rins (%)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

* P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativa dos rins (%)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

* P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

Adrenal direita Adrenal esquerda

Massa relativa das adrenais (%)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

A Figura 8 mostra a massa relativa das adrenais das ratas adultas

ovariectomizadas tratadas com óleo de canola, estradiol, extrato e infusão de Morus

nigra. Quanto à massa relativa das adrenais, não houve diferença estatisticamente

significativa entre os grupos (P > 0,05: ANOVA).

FIGURA 8. Massa relativa (%) das adrenais de ratas adultas ovariectomizadas

referentes aos grupos experimentais tratados com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos

erros padrões (n=7).

5.2 Ensaio uterotrófico em ratas pré-púberes

Na Figura 9 são apresentadas as massas corporais relativas ao longo do período

de tratamento, onde pode-se verificar que houve diferença significativa (P < 0,001:

ANOVA de Medidas Repetidas, Bonferroni), na qual o grupo infusão de Morus nigra

apresentou maior ganho em relação ao grupo tratado com óleo de canola (controle) e

estradiol (controle positivo), evidenciado no terceiro dia de tratamento, mas não se

diferenciou do grupo tratado com o extrato de Morus nigra.

FIGURA 9. Desenvolvimento ponderal de ratas pré-púberes durante o período

experimental dos grupos tratados com óleo de canola (controle), estradiol

(controle positivo), infusão e extrato de M. nigra. Os marcadores

representam as médias e as barras os respectivos erros padrões (n=8).

* P < 0,001 ANOVA de Medidas Repetidas, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

100

110

120

130

140

1234

Período de tratamento (dias)

Massa corporal relativa ao 1º dia (%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

100

110

120

130

140

1234

Período de tratamento (dias)

Massa corporal relativa ao 1º dia (%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

Conforme os dados apresentados na Figura 10, pode-se verificar que houve

diferença significativa (P < 0,001: ANOVA, Bonferroni) na massa relativa do útero

úmido e seco, do grupo estradiol (controle positivo) em relação aos demais (óleo de

canola, infusão e extrato de Morus nigra).

FIGURA 10. Massa relativa uterina (%) das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de M.

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos erros

padrões (n=8).

* P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

Massa relativa do útero (%)

Útero úmido Útero seco

* P < 0,001 ANOVA, Bonderroni (diferença dos demais grupos)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

Massa relativa do útero (%)

Útero úmido Útero seco

* P < 0,001 ANOVA, Bonderroni (diferença dos demais grupos)

A massa relativa do fígado dos animais em estudo está representada na Figura

11. Verifica-se que não houve variação estatisticamente significativa na massa relativa

deste órgão (P > 0,05: ANOVA) para os grupos avaliados (óleo de canola, estradiol,

infusão e extrato de Morus nigra).

FIGURA 11. Massa relativa do fígado das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de Morus

nigra. As colunas representam as médias e as barras os respectivos erros

padrões (n=8).

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

P > 0,05 ANOVA

A Figura 12 mostra a massa relativa dos rins das ratas pré-púberes tratadas com

óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de Morus

nigra. Verifica-se que os órgãos mencionados não sofreram variações significativas

entre os grupos (P > 0,05: ANOVA).

FIGURA 12. Massa relativa dos rins das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=8).

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativadosrins(%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativadosrins(%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

A Figura 13 mostra a massa relativa das adrenais das ratas pré-púberes tratadas

com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de Morus

nigra. Verifica-se que estes órgãos não sofreram variações significativas entre os grupos

(P > 0,05: ANOVA).

FIGURA 13. Massa relativa das adrenais das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo

de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=8).

0,01

0,02

0,03

0,04

Adrenal direita Adrenal esquerda

Massa relativa das adrenais (%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

0,01

0,02

0,03

0,04

Adrenal direita Adrenal esquerda

Massa relativa das adrenais (%)

Controle Estradiol Infusão Morus nigra Extrato Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

5.3 Ensaio pubertal em ratas

A Figura 14 mostra a massa corporal relativa das ratas tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus nigra ao

longo dos dias de tratamento. Verifica-se que não houve diferença significativa entre os

grupos.

FIGURA 14. Desenvolvimento ponderal em percentual (massa corporal em gramas do

1º dia = 100%) das ratas pré-púberes durante o período de tratamento. Os

marcadores representam as médias e as barras os respectivos erros padrões

(n=10).

100

150

200

250

300

350

400

450

500

21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

Idade (dias)

Massa corporal relativa

(1º dia = 100%)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

100

150

200

250

300

350

400

450

500

21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

Idade (dias)

Massa corporal relativa

(1º dia = 100%)

Controle Estradiol Extrato Morus nigra Infusão Morus nigra

P > 0,05 ANOVA

Na Figura 15, verifica-se que não houve diferença significativa na massa

relativa do útero úmido e seco das ratas pré-púberes tratadas com óleo de canola

(controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus nigra ao longo dos

dias de tratamento.

FIGURA 15. Massa relativa do útero úmido e útero seco das fêmeas pré-púberes

tratadas com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo),

extrato e infusão de Morus nigra. As colunas representam as médias

e as barras os respectivos erros padrões (n=10).

P > ,0,05: ANOVA

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

Útero úmido Útero seco

Massa relativa do útero (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

A Figura 16 mostra a massa relativa dos ovários das ratas pré-púberes tratadas

com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra .Quanto à massa dos ovários, os resultados demonstram uma redução significativa

(P < 0,05: ANOVA, Bonferroni) na massa relativa (média ± erro padrão) do grupo

Estradiol (0,038 ± 0,001%) em relação aos demais: Controle (0,047 ± 0,002%), Extrato

de Morus nigra (0,056 ± 0,001%) e Infusão de Morus nigra (0,060 ± 0,002%).

FIGURA 16. Massa relativa do ovário direito e ovário esquerdo das fêmeas pré-

púberes tratadas com óleo de canola (controle), estradiol (controle

positivo), extrato e infusão de Morus nigra. As colunas representam as

médias e as barras os respectivos erros padrões (n=10).

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Ovário direito Ovário esquerdo

Massa relativa dos ovários (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Ovário direito Ovário esquerdo

Massa relativa dos ovários (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Ovário direito Ovário esquerdo

Massa relativa dos ovários (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

A Figura 17 mostra a massa relativa do fígado dos animais tratados com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus nigra. A

análise estatística confirma que houve aumento significativo (P < 0,05: ANOVA,

Bonferroni) na massa do órgão em fêmeas tratadas com estradiol.

FIGURA 17. Massa relativa do fígado das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

Massa relativa do fígado (%)

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

A Figura 18 mostra a massa relativa dos rins das ratas pré-púberes tratadas com

óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de Morus

nigra. Verifica-se que o grupo estradiol (controle positivo) apresentou um aumento

significativo na massa relativa do rim direito (P > 0,05: ANOVA, Bonferroni) em

relação ao grupo controle.

FIGURA 18. Massa relativa dos rins das fêmeas pré-púberes tratadas com óleo de

canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus nigra. .As colunas representam as médias e as barras os

respectivos erros padrões (n=10).

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

0,300

0,400

0,500

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativa dos rins (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

* P < ,0,05: ANOVA, Bonferroni

0,300

0,400

0,500

Rim direito Rim esquerdo

Massa relativa dos rins (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

A Figura 19 mostra a massa relativa das adrenais das ratas pré-púberes tratadas

com óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e infusão de

Morus

nigra. Observou-se que não houve diferença estatisticamente significativa com relação à

estes órgãos.

FIGURA 19. Massa relativa das adrenais das fêmeas pré-púberes tratadas com

óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), extrato e

infusão de

Morus nigra. As colunas representam as médias e as

barras os respectivos erros padrões (n=10).

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Adrenal direita Adrenal esquerda

Massa relativa das adrenais (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

P > 0,05: ANOVA, Bonferroni

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Adrenal direita Adrenal esquerda

Massa relativa das adrenais (%)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

P > 0,05: ANOVA, Bonferroni

A Figura 20 mostra a idade média na abertura do canal vaginal (em dias) das

ratas pré-púberes tratadas diariamente do 21º dia até o 3º estro após a ocorrência do

evento. A abertura do canal vaginal foi antecipada no grupo estradiol (25,1 ± 0,1 dias)

em relação aos demais grupos e, apesar do atraso manifestado pelo grupo infusão de

Morus nigra (35,7 ± 0,8 dias) em relação aos grupos: controle (33,6 ± 0,5 dias) e extrato

Morus nigra (32,9 ± 0,5 dias), este período é semelhante ao observado em controles

históricos do mesmo laboratório (DALLEGRAVE, 2003).

FIGURA 20. Idade média na abertura do canal vaginal (dias) das ratas tratadas com

óleo de canola (controle), estradiol (controle positivo), infusão e extrato

de Morus nigra. As colunas representam a idade média (dias) e as

barras os erros padrões (n=10).

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

Idade na abertura do canal vaginal (dias

)

* e ** P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

Controle Estradiol Extrato de Morus nigra Infusão de Morus nigra

Idade na abertura do canal vaginal (dias

)

* e ** P < 0,05 ANOVA, Bonferroni (diferença dos demais grupos)

Através da análise da Figura 21, verifica-se que não houve diferença significativa

entre os grupos analisados quanto à regularidade do ciclo estral no período avaliado.

FIGURA 21. Regularidade do ciclo estral (%) das ratas tratadas com óleo de canola

(controle), estradiol, infusão e extrato de

Morus nigra. As colunas

representam o percentual de fêmeas com o ciclo regular (n=10).

100

Controle Estradiol Infusão de Morus

nigra

Extrato de Morus

nigra

Regularidade do ciclo estral (%)

P > 0,05 ANOVA

100

Controle Estradiol Infusão de Morus

nigra

Extrato de Morus

nigra

Regularidade do ciclo estral (%)

P > 0,05 ANOVA

6. DISCUSSÃO

O conjunto de resultados obtidos no presente trabalho sugere a ausência de

atividade fitoestrogênica do extrato hidroalcoólico e da infusão das folhas de

Morus

nigra

(quando administrados diariamente nas doses de 615,3mg/kg e 27,0mg/kg,

respectivamente) em ratas pré púberes e ratas adultas ovariectomizadas.

No ensaio referente às ratas ovariectomizadas, o aumento de massa corporal dos

grupos tratados com óleo de canola (controle) e extrato de

Morus nigra é padrão

esperado para ratas nesta fase de vida (70 dias) e também como resposta à ovariectomia.

Já o grupo tratado com estradiol, não manteve o aumento de massa corporal esperado

para a fase de vida (70 dias), provavelmente em decorrência da suplementação

hormonal pelo mesmo. Considerando que a ovariectomia é um procedimento que induz

aumento de massa corporal devido à remoção abrupta e permanente

dos hormônios

femininos, tal efeito pode ter sido alterado pela reposição do estradiol, que retoma os

níveis estrogênicos e seus efeitos. Os efeitos estrogênicos foram confirmados pelo

aumento na massa relativa do útero úmido e seco e pelos sinais de estro. As fêmeas

tratadas com a infusão de

Morus nigra, de forma semelhante ao grupo estradiol, não

tiveram um aumento de massa corporal esperado para a fase de vida e também em

resposta à ovariectomia. Entretanto o aumento da massa relativa do útero úmido e seco

igualmente evidenciado neste grupo, não foi acompanhado de sinais de estro, revelando

assim, uma resposta estrogênica parcial. Considerando a possível existência de estrona

nas folhas de

Morus nigra (COSMO ON LINE, 2004), e que esta, possui 40% da ação

do estradiol, a resposta parcial evidenciada pode ser decorrente da ação deste tipo de

fitoestrógeno. De forma similar, efeitos estrogênicos são relatados para isoflavonas,

onde afinidades específicas em relação aos receptores estrogênicos alfa e beta justificam

respostas parciais em órgãos alvo (BAKER

et al., 2000; VINCENT & FITZPATRICK,

2000; DUNCAN

et al, 1999).

Considerando que o tratamento com a infusão das folhas de

Morus nigra

manifestou também, uma redução na massa relativa de fígado e rins, pode-se sugerir

que um possível efeito diurético tenha contribuído para a redução destes órgãos, que são

altamente irrigados, e conseqüentemente, mais suscetíveis a alterações hemodinâmicas.

Relatos de uso tradicional apontam certas plantas da família Moraceae como diuréticas,

o que não descarta a mesma atividade para

Morus nigra (NOELLI, 1996).

O ensaio uterotrófico em fêmeas pré-púberes, revelou um aumento na massa

relativa do útero úmido e seco somente para o grupo tratado com o estradiol. Portanto,

os grupos tratados com a infusão ou com o extrato hidroalcoólico de

Morus nigra, não

manifestaram atividade estrogênica por este modelo. Houve apenas um leve aumento de

massa corporal no grupo tratado com a infusão de

Morus nigra, porém este não é

diferente daquele observado em controles históricos do mesmo laboratório

(DALLEGRAVE, 2003).

No ensaio pubertal, de maior duração que os demais, os grupos tratados com a

infusão ou com o extrato hidroalcoólico das folhas de

Morus nigra, não revelaram

alterações significativas na massa corporal e massa relativa dos órgãos, em relação ao

grupo controle. O grupo estradiol manifestou uma antecipação da abertura do canal

vaginal em relação aos demais grupos, conforme esperado para resposta estrogênica em

fêmeas pré-púberes submetidas a terapia com estradiol. Entretanto, as fêmeas tratadas

com a infusão das folhas de

Morus nigra revelaram um atraso na idade da abertura do

canal vaginal em relação aos demais grupos, porém este, não pode ser considerado

efeito anti-estrogênico, já que o período de ocorrência desta característica é semelhante

ao evidenciado em outros ensaios realizados no mesmo laboratório (DALLEGRAVE,

2003). Já a redução significativa dos ovários manifestada pelo grupo tratado com o

estradiol, reflete a retroalimentação negativa esperada pela suplementação hormonal

prolongada (GUYTON, 2002).

O aumento da massa relativa de fígado e rins, no grupo tratado com estradiol,

pode ser justificado pela ação edematogênica deste hormônio, além do aumento da

atividade metabólica dos mesmos com finalidades de eliminação (GUYTON, 2002;

SILVA,2002).

Os diferentes protocolos escolhidos para avaliar a possível atividade estrogênica

das folhas de

Morus nigra em ratas são internacionalmente aceitos. As principais

variáveis preconizadas pela OECD (JUN KANNO, 2001) para estes ensaios são: o

aumento da massa uterina, a antecipação da abertura do canal vaginal, a indução de

estro em ratas pré-púberes e adultas ovariectomizadas. Sendo assim, não foram

observadas alterações significativas relacionadas às variáveis mencionadas para animais

tratados com a infusão e o extrato das folhas de

Morus nigra, em comparação ao

ocorrido com os animais tratados com estradiol. Apenas as fêmeas tratadas com a

infusão das folhas de Morus nigra apresentaram um aumento na massa relativa uterina

no ensaio uterotrófico de fêmeas adultas ovariectomizadas, mas esta atividade não foi

sustentada pelo retorno a atividade cíclica, considerando que nenhuma das fêmeas

apresentou células queratinizadas em nenhum dos dias de tratamento, observados

mediante avaliação do lavado vaginal. Já para o grupo estradiol (controle positivo),

conforme o esperado para avaliação estrogênica, observou-se o aumento da massa

uterina de fêmeas pré-púberes e ovariectomizadas, a indução da presença de células

queratinizadas nos esfregaços vaginais de fêmeas ovariectomizadas (caracterizando o

retorno a atividade cíclica) e a antecipação da abertura do canal vaginal em fêmeas pré-

púberes.

Supostos efeitos das folhas de

Morus nigra provém dos relatos da terapêutica

popular em humanos, que apontam a sua eficácia para o tratamento dos sinais e

sintomas da menopausa, e inclusive utilizam-se do comércio das mesmas como

medicamento, ou mesmo preconizam sua utilização em forma de infusão

(EMBRAFARMA, FARMATTIVA 2006). O eventual sucesso de tal terapêutica deve-

se possivelmente aos fatores relacionados a seguir:

Efeito placebo: Em medicina humana, sugere-se a prescrição médica de um

"placebo" em caso de pacientes com doenças imaginárias crônicas ou porque não há

tratamento apropriado para o tipo de doença diagnosticada. O "placebo" são pílulas de

açúcar ou outras preparações sem medicamento. Em muitos casos o placebo demonstra

ser eficaz na redução ou eliminação de sintomas físicos, incluindo doenças para as quais

não existe cura conhecida. Os únicos ingredientes ativos do tratamento parecem ser as

expectativas positivas que os pacientes têm: (a) de acreditar no médico, (b) e, em

conseqüência, de receber um tratamento adequado (MINAYO, 2006). A partir destes

conhecimentos, a “crença” na melhora dos sintomas físicos da menopausa a partir de

tratamentos diários com a infusão das folhas de

Morus nigra é um aspecto que deve ser

considerado. Analisando-se outros aspectos referentes ao efeito placebo, sabe-se que,

qualquer tratamento novo será considerado eficaz se seus resultados suplantarem os do

placebo (que mede a evolução natural do processo que se quer tratar) ou igualarem-se

aos do tratamento já existente (WANNAMACHER & FUCHS, 2000). Sendo os

“fogachos” uma das principais razões da procura das mulheres por terapia de reposição

hormonal, os estrogênios são a maior arma contra eles. Como podem se resolver com o

tempo e, também, sofrerem grande influência psicológica, placebos podem melhorá-los

(CLAPAUCH et al, 2002);

Uso complementar a outros fármacos, estes sim eficazes: O tratamento dos

sintomas da menopausa utilizando-se reposição hormonal clássica com certos

compostos como o estradiol, é eficiente. Porém, a associação desta terapia à ingestão

diária de infusos de plantas popularmente conhecidas como estrogênicas, para

complementação no tratamento dos sinais e sintomas da menopausa, ainda não se

constituem como uma fonte segura de tratamento, podendo seus efeitos serem

confundidos aos do medicamento. Os benefícios clínicos da terapia de reposição

hormonal são inegáveis, enquanto que as evidências para recomendar fitormônios como

substituto desta são insuficientes (GLAZIER, 2001).

Porém, dentre os componentes ou constituintes isolados nas folhas de

Morus

nigra , mencionam-se alguns de estrutura química semelhante com os fitoestrógenos ou

estrógenos animais. Em trabalho publicado recentemente, por meio de análises

qualitativas do extrato bruto e de infusos destas folhas, utilizando-se como substrato

padrão o estradiol, detectaram-se substâncias semelhantes ao hormônio sexual feminino

nos infusos, preparações similares aos chás preconizados popularmente. Entretanto, esta

substância de interesse encontra-se ligada a alguma outra estrutura e somente após

hidrólise ela é detectada (COUTO et al; 2006). De forma semelhante, acredita-se que a

infusão das folhas de

Morus nigra possa auxiliar na produção de estrona que apresenta

40% da ação do estradiol, hormônio ligado às características sexuais secundárias na

mulher, e que deixa de ser produzido pelo ovário no climatério (COSMO ON LINE,

2004). A estrona, como hormônio estrogênico natural, é administrado combinado

geralmente com outros estrógenos naturais, como o estriol e estradiol

(EMBRAFARMA, 2006). Sabe-se que, com a menopausa, o organismo feminino

suspende a função ovariana, com declínio da secreção estrogênica. Do ponto de vista

bioquímico, a menopausa caracteriza-se por um declínio do estradiol, estrona e estriol,

hormônios mencionados anteriormente, sendo estes dois últimos, considerados

estrógenos fracos (YEUNG, 2001, CASTELLI, 1998). Por estes motivos, a ação da

estrona presente nas folhas de

Morus nigra pode ser insuficiente para a detecção da ação

fitoestrogênica nestas plantas. Dentre outros compostos, a infusão das folhas de

Morus

nigra apresentam flavonóides e alta quantidade de taninos, sendo estes últimos,

substâncias contra-indicadas por promoverem irritação das mucosas digestivas,

principalmente em indivíduos que apresentem gastrite e úlcera gastrointestinal

(EMBRAFARMA, 2006).

A atividade estrogênica de plantas foi primeiramente demonstrada em 1926, e

em meados da década de 70 já se tinha demonstrado que centenas de plantas exibiam

atividade estrogênica. Os fitoestrógenos assumiriam importância biológica e econômica

nos anos 40, com a diminuição da fertilidade induzida em ovelhas pela ingestão de

trevos de pastagens, na Austrália, na chamada "Doença do Trevo" (KNIGHT, 1996).

Outros trabalhos realizados com plantas que efetivamente apresentam atividade

estrogênica em ruminantes (como o

Trifolium subterraneum), determinando

interferências na gestação e fertilidade, revelaram evidentes efeitos estrogênicos em

ratas tratadas com extratos hidroalcoólicos (DALSENTER, 1991) semelhantes aos

extratos de

Morus nigra. Portanto, o método de extração utilizado neste trabalho pode

ser considerado adequado para avaliação fitoestrogênica.

Nos ensaios realizados não houve manifestação de efeito anabolizante, fator este,

provavelmente decorrente do curto tempo de tratamento, uma vez que este tipo de efeito

demoraria duas ou mais semanas para se revelar. Entre os efeitos observados, ao

contrário, houve redução da massa corpórea (o que tb está contra o efeito estrogênico

pois este, pela retenção de líquidos, determina edema e aumento agudo da massa

corpórea). Outros efeitos das folhas de

Morus nigra em animais são descritos, indicando

a utilização de extratos aquosos como eficientes para o acúmulo de glicogênio muscular

em ratos Wistar, podendo sugerir que apresentem mecanismo de ação semelhante à

insulina ou que atuem sensibilizando receptores de membrana para a glicose (SOUZA

al.

, 2004). O efeito diurético das folhas de Morus nigra apresenta-se descrito em

publicações não-científicas, preconizando-se sua utilização em propagandas veiculadas

on line, por farmácias de manipulação (FARMATTIVA, 2006). Os resultados deste

trabalho sugerem uma possível ação diurética da infusão das folhas de

M. Nigra, uma

vez observada a redução da massa relativa de fígado e rins das ratas adultas

ovariectomizadas. Relatos do uso tradicional referem a utilização de certas espécies

vegetais por populações indígenas e caboclas do Brasil e países vizinhos,

fundamentados nos preceitos da etnobotânica e etnofarmacologia. Estes,

apontam a

utilização das plantas da família

Moraceae (Cecropia catharinensis e Chlorophora

tinctoria) como potencialmente diuréticas e largamente utilizadas para fins medicinais

na farmacologia Guarani (NOELLI, 1996). Desta forma, futuros estudos utilizando

animais experimentais poderão investigar e talvez comprovar a sugerida atividade

diurética também das folhas de

Morus nigra.

Sabe-se que, através de certas “crendices populares” (como no caso a utilização

das folhas de

Morus nigra para o preparo de infusões que amenizam os efeitos da

menopausa ou mesmo, que façam a reposição hormonal), algumas evidências positivas

podem ser elucidadas para justificar a utilização da fitoterapia em diversas patologias.

Segundo, Elisabetsky (2003), como estratégia na investigação de plantas medicinais, a

abordagem etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto a

usuários da flora medicinal (comunidades e especialistas tradicionais), com estudos

químicos e farmacológicos. O método etnofarmacológico permite a formulação de

hipóteses quanto à(s) substância(s) ativa(s) responsáveis pelas ações terapêuticas

relatadas. Sabe-se que, de cada dez compostos descobertos, quatro seguem para a fase

de desenvolvimento, enquanto existe uma taxa de 50% de desistência devido a

toxicidade/efeitos adversos, antes mesmo que uma fase clínica I completa seja

deslanchada (HARVEY, A.L.,2002). Esses números indicam o valor de relatos de uso

tradicional em relação a biodisponibilidade e segurança relativa.

Cabe notar que a etnofarmacologia, por se basear em alegações de utilidade

terapêutica e não em determinado perfil químico das espécies (o que, em tese, indicaria

a possibilidade de interação com um determinado alvo biológico), é particularmente útil

no caso de categorias de doenças cuja patofisiologia não é bem conhecida. A mesma

linha de raciocínio pode ser aplicada com relação à descoberta de produtos protótipo

(com mecanismos de ação inovadores): a abordagem mecanicista baseia-se na interação

dos compostos com alvos farmacodinâmicos predeterminados, enquanto que a

etnofarmacologia por partir de relatos de efeitos, pode levar a identificação de produtos

com mecanismos de ação sequer conhecidos. Por isso, modelos

in vivo tem papel

importante nos estudos etnofarmacológicos (ELISABETSKY, 2002).

Outros efeitos relatados para

Morus nigra ou Morus alba, como por exemplo,

efeito anti-hiperglicêmico (HOSSEINZADEH & SADEGUI, 1999)

, atividade

antinociceptiva

(DE SOUZA M.M,2000), catártica, analgésica, antitussígenas, entre

outras

, (YAMATAKE Y, 1976) não referem a atividade estrogênica em ratas. Sendo

assim, este trabalho mostra que não há, até as dosagens referidas por via oral durante o

período dos modelos propostos pela OECD, atividade hormonal característica no extrato

hidroalcoólico ou infusão das folhas de

Morus nigra.

7. CONCLUSÃO

O extrato hidroalcoólico 50% e a infusão de Morus nigra, administrados via oral

diariamente, nas doses referidas durante os ensaios com ratas Wistar ovariectomizadas e

pré-púberes, não interferiram significativamente no desenvolvimento ponderal e massa

relativa dos órgãos avaliados, bem como nas variáveis referentes ao ciclo estral das

fêmeas, descartando, desta forma, a atividade fitoestrogênica das folhas. Os tratamentos

não afetaram o desenvolvimento uterino das ratas adultas ovariectomizadas, e também

não influenciaram nas manifestações das características sexuais secundárias tais como:

abertura do canal vaginal e desenvolvimento uterino das ratas pré-púberes, bem como

na abertura do canal vaginal e no ciclo estral das ratas pré-púberes tratadas do desmame

à puberdade em ensaios subcrônicos. Sendo assim, sugere-se que o extrato

hidroalcoólico e a infusão das folhas de

Morus nigra não interferem diretamente no

desenvolvimento uterino de ratas Wistar ovariectomizadas e pré-púberes, variável

utilizada como refêrencia para a comprovação de atividade fitoestrogênica dos

tratamentos, não interferindo, também, nas demais variáveis observadas ao longo dos

três ensaios biológicos considerados. Dentro deste contexto torna-se evidente a

necessidade de mais estudos que busquem o perfil fitoquímico de diferentes extratos das

folhas de

Morus nigra, como também, ensaios biológicos em modelos animais visando

elucidar possíveis ações terapêuticas e/ou confirmar a ausência de potencial estrogênico

referido pela cultura popular.

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