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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Concentração Análises Clínicas
Avaliação da Anexina V e Calceína AM como Marcadores de
Apoptose em Linfócitos
Priscila Rodrigues Palma
Dissertação para obtenção do grau de
MESTRE
Orientador
Prof. Dr. Arício Treitinger
Florianópolis
2005
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Livros Grátis
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Priscila Rodrigues Palma
Avaliação da Anexina V e Calceína AM como Marcadores de Apoptose em Linfócitos
Comissão Julgadora
da
Dissertação para obtenção do grau de Mestre
Prof. Dr. Celso Spada
1° examinador
Profa. Dra. Kioko Takei
2º examinador
Prof. Dr. Edelton Flávio Morato
3º examinador
Florianópolis, 30 de março de 2005
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ii
Aos meus pais, José Américo e
Maria Emília, pelo amor, carinho e
incentivo sempre dispensados, que
sem os quais, esta jornada não seria
possível.
Aos meus irmãos Fabiano,
Eduardo e José Américo pelo apoio à
minha formação.
A Emmanuel Costa, pela
compreensão e carinho dispensados
ao longo desta jornada.
Ao Professor Arício Treitinger,
pela orientação e apoio.
Ao Professor Paulo José
Ogliari, pelo apoio e colaboração.
Aos Mestrandos Juliano
A
nderson Pacheco e Renata da Silva
pela amizade, apoio e colaboração.
Aos amigos Bolivar Soares,
Irma Luiza Christmann, Maria Regina
Cataldo e Carolina Peruzzo Pereira
pelo apoio e carinho.
Aos portadores do HIV, que
colaboraram com este estudo, pelas
lições de esperança.
A vocês, que dedico este
trabalho, meus mais profundos e
sinceros agradecimentos.
iii
EXPRESSO MINHA SINCERA GRATIDÃO E CARINHO
À Universidade Federal de Santa Catarina, em nome do seu Reitor, professor Lucio
José Botelho.
Ao Centro de Ciências da Saúde, em nome do seu diretor, professor Cléo Nunes de
Sousa.
Ao departamento de Análises Clínicas, em nome do professor Arício Treitinger,
chefe do departamento.
Ao Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da UFSC, em nome de
seu chefe, professora Maria de Lourdes Rovaris.
Ao Hemocentro do Estado de Santa Catarina (HEMOSC) de Florianópolis, em nome
de seu diretor, Dr. Guilherme Genovez.
Ao FUNPESQUISA, pelo fornecimento dos conjuntos reagentes.
À equipe de coleta do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da
UFSC, pelo apoio e triagem dos pacientes.
À Médica Silvia I. A. C. de Pires Ferreira e à Farmacêutica Renata da Silva pelo
apoio na realização dos ensaios de viabilidade e apoptose celular.
Às professoras Maria Cláudia dos Santos, Maria Luiza Bazzo e Tânia Beatriz
Creczynski Pasa pela colaboração profissional.
Aos colegas Giovana Baggio e Joel Cunha pelo apoio a este trabalho.
Ao professor Paulo José Olgliari e ao Mestrando Juliano Anderson Pacheco, pelo
apoio na análise estatística dos resultados.
OBRIGADO
iv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
1.1 Considerações gerais........................................................................................ 1
1.2 Principais Mediadores de Apoptose e Alterações Celulares ............................. 5
1.2.1 Indução do processo apoptótico por linfócitos “T” citotóxicos...................... 9
1.2.2 Indução da apoptose por quimioterapia, radiação ultravioleta, radiação
ionizante, hipóxia e falta de estímulos de sobrevivência .................................... 10
1.2.3 Apoptose mediada pela família de proteínas Bcl-2.................................... 10
1.2.4 Moléculas regulatórias anti-apoptóticas..................................................... 11
1.3 Indução da apoptose de linfócitos CD4 e CD8 na infecção pelo HIV .............. 11
1.3.1 Alterações moleculares mediadas pelo HIV .............................................. 12
1.4 Métodos de Detecção da Apoptose................................................................. 13
2. OBJETIVOS......................................................................................................... 19
2.1 Objetivo Geral.................................................................................................. 19
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 19
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 20
3.1 Casuística........................................................................................................ 20
3.2 Coleta de material biológico ............................................................................ 20
3.3 Isolamento das células mononucleares........................................................... 21
3.4 Manutenção das células mononucleares......................................................... 21
3.5 Ensaios para verificação da viabilidade e apoptose dos linfócitos .................. 22
3.5.1 Marcação das células com o conjunto reativo ANNEXIN V-FITC e iodeto
de propídio.......................................................................................................... 23
3.5.2 Marcação das células com o conjunto reativo LIVE/DEAD
contendo
calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1)
................................................... 23
3.5.3 Avaliação da viabilidade e apoptose dos linfócitos por citometria de fluxo 24
3.6 Análise estatística............................................................................................ 32
4. RESULTADOS..................................................................................................... 34
4.1 Análise descritiva............................................................................................. 34
4.2 Análise inferencial ........................................................................................... 35
4.2.1 Avaliação das correlações entre os resultados obtidos para calceína
AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de propídio após 24 horas de
incubação
........................................................................................................... 35
v
4.2.2 Avaliação das correlações entre os resultados obtidos para calceína
AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de propídio após 48 horas de
incubação
........................................................................................................... 35
4.2.3 Quantificação de linfócitos viáveis após 24 horas de incubação ............... 39
4.2.4 Quantificação de linfócitos em apoptose após 24 horas de incubação ..... 40
4.2.5 Quantificação de linfócitos inviáveis após 24 horas de incubação ............ 41
4.2.6 Quantificação de linfócitos viáveis após 48 horas de incubação ............... 42
4.2.7 Quantificação de linfócitos em apoptose após 48 horas de incubação ..... 43
4.2.8 Quantificação de linfócitos inviáveis após 48 horas de incubação ............ 44
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 45
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 54
ANEXO 1.................................................................................................................. 70
APÊNDICE 1............................................................................................................ 73
APÊNDICE 2............................................................................................................ 76
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Principais diferenças entre os processos de morte celular...................... 2
FIGURA 2. Morfogênese e separação dos dedos...................................................... 3
FIGURA 3. Apoptose: formação e remoção de corpos apoptóticos........................... 6
FIGURA 4. Representação da apoptose e seus principais mediadores..................... 8
FIGURA 5. Ligação da anexina V aos resíduos de fosfatidilserina. ......................... 17
FIGURA 6. Conversão da calceína AM por esterases intracelulares....................... 18
FIGURA 7. Citômetro de fluxo, modelo FACSCallibur. ............................................ 24
FIGURA 8. Seleção de células e/ou estruturas marcadas com Anexina V-FITC/PI,
através do programa CELLQuest. ...................................................................... 25
FIGURA 9. Seleção de células e/ou estruturas marcadas com Calceína AM/EthD-1,
através do programa CELLQuest. ...................................................................... 26
FIGURA 10. Distribuição das células selecionadas, através do CELLQuest, de
acordo com a intensidade da marcação pela anexina e/ou iodeto de propídio. . 27
FIGURA 11. Distribuição das células selecionadas, através do CELLQuest, de
acordo com a intensidade da marcação pela calceína AM e/ou Homodímero de
Etídio. ................................................................................................................. 28
FIGURA 12. Células selecionadas e analisadas através do PAINT A GATE,
marcadas pela anexina e/ou iodeto de propídio. ................................................ 28
FIGURA 13. Células selecionadas e analisadas através do PAINT A GATE,
marcadas pela calceína e/ou homodímero de etídio. ......................................... 29
FIGURA 14. Distribuição dos linfócitos, de acordo com a intensidade de sua
marcação pela anexina e/ou iodeto de propídio. ................................................ 29
FIGURA 15. Distribuição dos linfócitos, de acordo com a intensidade de sua
marcação pela calceína e/ou homodímero de etídio. ......................................... 30
FIGURA 16. Resultado final da avaliação da viabilidade e apoptose de linfócitos,
marcados com anexina e/ou iodeto de propídio................................................. 32
FIGURA 17. Resultado final da avaliação da viabilidade e apoptose de linfócitos,
marcados com calceína AM e/ou homodímero de etídio.................................... 32
FIGURA 18. Correlação entre níveis de linfócitos viáveis obtidos após 24 horas.... 36
FIGURA 19. Correlação entre níveis de linfócitos em apoptose obtidos 24 horas. .. 36
FIGURA 20. Correlação entre níveis de linfócitos inviáveis obtidos 24 horas.......... 37
FIGURA 21. Correlação entre níveis de linfócitos viáveis obtidos após 48 horas.... 37
vii
FIGURA 22. Correlação entre níveis de linfócitos em apoptose obtidos após 48
horas................................................................................................................... 38
FIGURA 23. Correlação entre níveis de linfócitos inviáveis obtidos após 48 horas. 38
FIGURA 24. Valor percentual médio de células viáveis obtidas após 24 horas de
incubação. .......................................................................................................... 39
FIGURA 25. Valor percentual médio de células apoptóticas obtidas após 24 horas de
incubação. .......................................................................................................... 40
FIGURA 26. Valor percentual médio de células inviáveis obtidas após 24 horas de
incubação. .......................................................................................................... 41
FIGURA 27. Valor percentual médio de células viáveis obtidas após 48 horas de
incubação. .......................................................................................................... 42
FIGURA 28. Valor percentual médio de células apoptóticas obtidas após 48 horas de
incubação. .......................................................................................................... 43
FIGURA 29. Valor percentual médio de células inviáveis obtidas após 48 horas de
incubação. .......................................................................................................... 44
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Patologias associadas à apoptose anormal............................................ 5
TABELA 2. Categorias de alterações celulares que formam a base dos ensaios de
detecção da apoptose. ....................................................................................... 15
TABELA 3. Estatísticas descritivas, com tempo de incubação de 24 horas. ........... 34
TABELA 4. Estatísticas descritivas, com tempo de incubação de 48 horas.. .......... 34
TABELA 5. Dados e estatísticas descritivas para o tempo de incubação de 24hs.. 74
TABELA 6. Dados e estatísticas descritivas para o tempo de incubação de 48hs.. 75
TABELA 7. Estatísticas descritivas de células viáveis – 24hs ................................. 77
TABELA 8. Estatísticas descritivas de células em apoptose – 24hs ....................... 77
TABELA 9. Estatísticas descritivas de células inviáveis – 24hs .............................. 77
TABELA 10. Estatísticas descritivas de células viáveis – 48hs ............................... 78
TABELA 11. Estatísticas descritivas de células em apoptose –48hs ...................... 78
TABELA 12. Estatísticas descritivas de células inviáveis – 48hs ............................ 78
ix
ABREVIATURAS
AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AO: Acridine orange; alaranjado de acridina
Apaf-1: Fator de ativação de proteases pró-apoptóticas
APO 3L: Ligante APO3 do recetor DR
ATP: Adenosina Trifosfato
CAD: Dnase caspase ativada
Calceína AM: Acetóxi-metil éster de calceína
cFLIP: Proteína inibitória homóloga a FLICE
CPP32: caspase3
CTL: Linfócitos T citotóxicos
dATP: 2’-deoxiadenosina 5’-trifosfato
DED: Domínio efetor de morte
DISC: Complexo sinalizador de indução da morte
DNA: Ácido desoxirribonucléico
DR3: Recepto de morte tipo 3
EB: Brometo de etídio
EthD-1: Homodímeri-1 de Etídio
FAAD: Domínio de morte associado aoFas
FasL: Ligante Fas
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
FLASH: Proteína FLICE associada
FLICE: caspase 8
FLIP: Proteína inibitória a FLICE
FSC: Dispersão dianteira
gp 120: Glicoproteína 120
HIV: Vírus da Imunodeficiência Adquirida
IAP: Proteínas indutoras da apoptose
IL-1: Interleucina 1
IL-2: Interleucina 2
IL-6: Interleucina 6
IL-12: Interleucina 12
x
ISNT: Transferência de marcação in situ
MACH: caspase 8
Mach5: caspase 8
MAP kinase: Proteína cinase ativada por mitógeno
Mort-1: Domínio de morte associado ao Fas
NF-κB: Fator de necrose tumoral κB
PI: Iodeto de propídio
PI-3: Inositol 1,4,5 trifosfato
PS: Fosfatidilserina
RIP: Proteína de interação com o receptor
RNA: Ácido ribonucléico
SSC: Dispersão lateral
tat: Proteína regulatória da transcrição viral
TCD3: Receptor CD3 de superfície de células T
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
TNFR: Receptor 1 do fator de necrose tumoral
TRAAD: Domínio de morte TNFR1
TRAF-2: Fator 2 associado ao TNFR
TRAIL/APO-2L: Ligantes indutores da apoptose relacionado ao TNF dos tipos 1 e 2.
TRAIL R/1: Receptor TRAIL do tipo 1
TRAIL R/2: Receptor TRAIL do tipo 2
TUNEL: Marcação e classificação da porção deoxinucleotidiltransferase termial
mediado por biotina-dUTP
7-AAD: 7-aminoactinomicina D
xi
RESUMO
A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada
por métodos que utilizam anexina V-FITC como marcador vital, que se associa aos
resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A
utilização conjunta do marcador nuclear fluorescente iodeto de propídio (PI), por sua
vez, torna possível verificar as alterações nucleares características dos estágios
tardios da apoptose, como resultado do aumento da permeabilidade de membrana.
Por outro lado, a utilização de calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1) permite
a verificação da apoptose através da detecção da diminuição de atividade esterásica
intracelular e alterações físico-químicas na membrana celular, através do EthD-1,
que combina-se à cromatina à medida que esta se torna condensada. O objetivo
deste trabalho foi avaliar e comparar a sensibilidade na avaliação precoce da
apoptose dos métodos que utilizam calceína AM e homodímero de etídio aqueles
que utilizam anexina V FITC e iodeto de propídio, tomado como método de
referência, a partir da marcação de células mononucleares periféricas de pacientes
infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV). As análises por citometria
de fluxo foram realizadas após os períodos de incubação de 24 e 48 horas em meio
RPMI 1640. Os resultados demonstraram que a metodologia que utiliza calceína
AM/ homodímero de etídio apresentou-se mais sensível na quantificação das células
apoptóticas em ambos períodos de incubação (Média 46,95% ± 3,56, p<0,0001,
para 24 horas e Média 37,67% ± 2,47, p<0,0014 para 48 horas), além de permitir
definir com clareza as populações de células viáveis, em apoptose e inviáveis.
Tendo em vista que a regulação anormal do processo de morte celular por apoptose
está envolvida na patogênese de diversas desordens, incluindo a progressão da
infecção pelo HIV, o emprego de metodologias sensíveis de avaliação desse
processo, como a calceína AM-EthD-1, pode resultar em importante mecanismo de
acompanhamento da progressão de doenças.
xii
ABSTRACT
“Evaluation of Annexin-V and Calcein-AM as Markers of Lymphocytes Apoptosis”.
The evaluation of apoptosis levels by flow cytometry is generally accomplished by
methods that use annexin V-FITC as vital dye, which binds to negatively charged
phospholipids like phosphatidylserine, exposed on the outer leaflet at the beginning
of apoptotic process. In addition, the concomitant uses of nuclear fluorescent dye
propidium iodide (PI) turns possible verify the nuclear alterations characteristics of
the late apoptosis stages, since the membrane permeability increases. On the other
hand, the use of calcein AM and ethidium homodimer (EthD-1) allows the apoptosis
evaluation through detection of esterase activity decrease and cellular membrane
physical-chemical alterations, through EthD-1, which binds to chromatin as this one
become condensed. The objective of this study was compare the sensibility of the
methods that use calcein AM and ethidium homodimer with those that use annexin
V-FITC and propidium iodide for early apoptosis evaluation, by peripheral blood
mononuclear cells cultures, kept on RPMI1640 half, obtained from HIV-infected
patients. Apoptosis and cellular viability were detected and quantified by flow
cytometry after 24 and 48 hours incubation times. The results showed that calcein
AM/ethidium homodimer methodology was more sensitive for apoptotic cells
quantification in both incubation times than annexin V FITC/propidium iodide (Mean
46.95% ± 3.56, p<0.0001, for 24 hours and Mean 37.67% ± 2.47, p<0.0014 for 48
hours), besides allowing to clearly define the viable, apoptotic and dead cell
populations. Since the abnormal regulation of apoptotic process is involved with
several disorders pathogenesis, including HIV infection progress, the employment of
sensitive apoptosis evaluation methods, as calcein AM-EthD-1, could result on
important mechanism of diseases progress accompaniment.
Key words: apoptosis, HIV, flow cytometry, annexin V-FITC, propidium iodide,
calcein AM, ethidium homodimer.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
Os processos de morte celular conhecidos como apoptose e necrose podem
ser diferenciados a partir da observação de alterações morfológicas e bioquímicas
(WILLINGHAM, 1999). Estas alterações são dependentes da duração e da
intensidade dos estímulos, da velocidade do processo de morte, bem como da
extensão da depleção de adenosina trifosfato (ATP), observados nas células
envolvidas (BUSSOLATI et al., 1995; COTRAN et al., 1999).
A morte celular por necrose é conseqüente a estímulos intensos e de curta
duração (COTRAN et al., 1999). Este processo é caracterizado pelo aumento do
volume intracelular, cariólise e lise da célula. Em virtude do envolvimento de elevado
número de grupos celulares e da perda precoce dos componentes citoplasmáticos
para o espaço extracelular, a necrose geralmente resulta em resposta inflamatória
intensa (VanENGELAND et al., 1997; WYLLIE, 1997; WILLINGHAM, 1999; KANNAN
& JAIN, 2000). Freqüentemente, este processo não requer o consumo dos
suprimentos energéticos celulares (SAIKUMAR et al., 1999).
Algumas patologias associadas à morte celular por necrose incluem:
granulomatose de Wegener (BACON, 2005), adenoma da paratireóide (VASATKO et
al., 2004), infarto pulmonar associado à síndrome de Sjogren (NAKAYAMA et al.,
2004), zigomicose, cirrose hepática e doenças neoplásicas (HENRY, 1999).
A morte celular por apoptose, por sua vez, decorre de estímulos de menor
intensidade, mas de duração prolongada (COTRAN et al., 1999; WILLINGHAM,
1999), como por exemplo: ligante Fas, fator de necrose tumoral α (TNF- α) e ligantes
TRAIL/APO 2-L e APO 3-L (McGEEHAN et al., 1994; MOHLER et al., 1994;
TANAKA et al., 1996). A atuação destes estímulos resulta na ativação regulada de
programas de execução preexistentes, codificados no genoma (KERR et al., 1972).
Durante a apoptose, o material celular é freqüentemente preservado, o que
por sua vez, resulta em resposta inflamatória e dano tecidual local menos intensos
em relação aqueles observados na necrose (SCHWARTZMAN & CIDLOWSKI,
1993). O consumo de ATP, por outro lado, faz-se necessário para promover as
mudanças do compartimento nuclear durante este processo de morte celular
(LAZEBNIK et al., 1993; PATKI & LEDERMAN, 1996). (Figura 1).
2
A apoptose participa de forma complementar, ainda que oposta, ao processo
de divisão celular como um mecanismo homeostático da morfogênese e
reconstrução tecidual normal (VanENEGLAND et al., 1997; MEIER et al., 2000;
KIMURA et al., 2003). Igualmente, esse processo é importante na remoção de
células danificadas, infectadas ou potencialmente neoplásicas (NAGATA, 1996;
SAIKUMAR et al., 1999).
FIGURA 1. Principais diferenças entre os processos de morte celular. (Adaptado de:
www.merian.fr.bw.schule.de/mueller/Schueler/sterben.htm
). Acesso em: 23 julho
2004.
3
Durante o desenvolvimento embrionário humano, a apoptose auxilia a esculpir
partes do corpo, sendo essencial, por exemplo, na formação das cavidades,
eliminação de vestígios de estruturas funcionais durante a embriogênese, bem como
na morfogênese e separação dos dedos (SAIKUMAR et al., 1999; NEWTON et al.,
2000; RATHMELL et al., 2002). (Figura 2).
Embora requisitada essencialmente durante o desenvolvimento animal, a
morte celular por apoptose prossegue ao longo da vida adulta. Em animais adultos,
a apoptose promove o balanço da divisão celular e favorece o equilíbrio celular dos
tecidos (WYLLIE, 1997). Além disso, a remoção de células afetadas por defeitos
genéticos, pelo avanço da idade, por doenças ou por exposição a agentes nocivos,
ocorre possivelmente, devido à apoptose (SALMENA et al., 2003).
FIGURA 2. Morfogênese e separação dos dedos, durante os quais a apoptose é
essencial. (Adaptado de: www.ac-strasbourg.fr/microsites/svt-
01/prodelev/cerveau/images/APOPTOSE.JPG). Acesso em: 11 novembro 2004.
4
Outros processos fisiológicos caracteristicamente regulados por apoptose
incluem: (1) involução da mama após o desaleitamento (STRANGE, et al., 1995), (2)
desprendimento do endométrio durante a menstruação (KOKAWA et al., 1996), (3)
impotência induzida por atrofia prostática (SAIKUMAR et al., 1999), (4) morte das
células epidérmicas que migram da camada germinal basal à superfície do epitélio
escamoso (WEIL et al., 1999), (5) morte de neutrófilos durante a resposta
inflamatória aguda (SENDO et al., 1996) e (6) exclusão de timócitos autoreativos
(KING & ASHWELL, 1994; BUDD, 2001; GERMAIN, 2002; RATHMELL &
THOMPSON, 2002), destinados a marcação por receptores de superfície CD3 de
células T (TCD3), responsáveis pela ligação a auto-antígenos, durante o
desenvolvimento de linfócitos T (BOUILLET et al., 2002).
Em alguns casos, a apoptose pode também formar a base para o tratamento
de patologias. O tratamento de tumores por radiação e quimioterapia, por exemplo,
envolve a ativação seletiva da apoptose nas células neoplásicas (SAIKUMAR et al.,
1999).
Por outro lado, a execução fisiologicamente anormal da apoptose pode estar
associada a processos patológicos (SALMENA et al., 2003). Assim, tanto a
exacerbação quanto a diminuição deste processo de morte celular podem promover
conseqüências biológicas adversas (NAGATA, 1996), como as verificadas nas
doenças neurodegenarativas de Alzheimer e Parkinson, AIDS e isquemia cardíaca,
bem como na artrite reumatóide e nos diferentes tipos de câncer, respectivamente
(THOMPSON, 1995; DUKE et al., 1996). (Tabela 1).
Doenças autoimunes, como a tireoidite de Hashimoto (ARSCOT & BAKER,
1998; STASSI et al., 1999) e lúpus eritematoso sistêmico (TSOKOS & LIOSSIS,
1999) são causados pelo aumento da morte celular por apoptose na glândula
tireóide e outros órgãos alvo (SAIKUMAR et al., 1999). Contudo, a diminuição da
apoptose em células imunes autoreativas, associada a indução e proliferação
dessas células, representam importantes fatores no desenvolvimento da
autoimunidade (FRENCH et al., 1996).
Além disso, malformações congênitas relacionadas a defeitos de
desenvolvimento podem estar relacionadas a apoptose reduzida ou excessiva em
determinadas populações celulares, normalmente alvos de destruição durante a
embriogênese (SAIKUMAR et al., 1999).
5
TABELA 1. Patologias associadas à apoptose anormal (SAIKUMAR et al., 1999).
Apoptose Deficiente Apoptose Excessiva
Síndrome linfoproliferativa autoimune
(Síndrome de Canale-Smith).
Doenças neurodegenerativas
(Alzheimer, Huntington, Parkinson).
Doença de Graves
Anemia aplásica
Síndrome da hipereosinofilia
Síndrome da imunodeficiência
adquirida (HIV)
Lúpus Eritematoso
Tireoidite de Hashimoto
Linfoma Lúpus eritematoso
Leucemia Esclerose múltipla
Tumores sólidos Síndrome mielodisplásica
Diabetes mellitus Tipo I Diabetes mellitus Tipo I
Osteoporose Colite ulcerativa
Doença de Wilson
Neutropenia crônica
1.2 Principais Mediadores de Apoptose e Alterações Celulares
A apoptose consiste, basicamente, de três estágios sucessivos: (1) o
comprometimento à morte provocado por sinais extras e intracelulares; (2) execução
da morte celular por ativação de proteases intracelulares; (3) formação e remoção
dos corpos apoptóticos por fagocitose, seguido da degradação lisossomal pelas
células fagocíticas (VAUX & STRASSER, 1996). (Figura 3).
A indução da apoptose pode ocorrer em decorrência da ligação de moléculas
sinalizadoras a seus receptores cognatos localizados na superfície das células, entre
os quais: (1) ligante Fas (FasL) ao receptor Fas (CD95) (LILES, 1997; NAGATA,
1996; SCAFFIDI et al.,1998), (2) ligante TNF-α ao receptor 1 do fator de necrose
tumoral (TNFR1) (DARNAY & AGGARWAL, 1997; MAGNUSSON & VAUX, 1999),
(3) ligantes TRAIL/APO 2-L (ligantes indutores de apoptose relacionado ao TNF) aos
receptores TRAIL/R dos tipos 1 e 2 (WILEY et al., 1995; BADLEY et al., 2000), (4)
ligante APO 3-L ao receptor DR 3 (SAIKUMAR et al., 1999).
6
FIGURA 3.
Apoptose: formação e remoção de corpos apoptóticos por células
fagocíticas. (Adaptado de: http://spacebio.net/modules/gs_teare.html
). Acesso em:
24 de maio de 2004.
Após a ligação das moléculas protéicas sinalizadoras FasL e TNF- α a seus
respectivos receptores Fas e TNFR1, proteínas associadas à membrana,
conhecidas como “domínios de morte”, são clivadas pela ação de metaloproteases
(McGEEHAN et al., 1994; MOHLER et al., 1994; HSU et al., 1995; TANAKA et al.,
1996). A ativação destes domínios de morte promove o recrutamento das proteínas
adaptadoras FADD /Mort-1(domínio de morte associado ao Fas) (MEMON et al.,
1998; ZHANG et al., 1998; SALMENA et al., 2003) e TRADD (domínio de morte
associado ao receptor TNF) respectivamente, (HSU, et al., 1995, HSU et al., 1996)
para formar complexos sinalizadores de indução da morte (DISC) (LI et al., 1998;
LUO et al., 1998; KRAMMER, 2000).
7
Em conseqüência ao recrutamento dos domínios de morte FADD e TRADD,
têm início a ativação seqüencial da família das cisteíno proteases, também
conhecidas como caspases. As caspases são sintetizadas como zimógenos inativos
que se tornam ativos após a remoção de um pró-domínio terminal (COHEN, 1997;
MILLER, 1997; STROH & SCHULZE-OSTHOFF, 1998). Caspases ativadas
catalisam a clivagem de outras caspases, que por sua vez, ativam diversas
proteases e endonucleases celulares (ROSEN & CASCIOLA-ROSEN, 1997)
promotoras da apoptose (BADLEY et al., 2000). Como exemplos, a caspase 8,
também conhecida como FLICE, MACH e Mach5 (BODMER et al., 2000; PATEL et
al., 2000; ASHKENAZI et al., 2002) e a caspase 3 (CPP32) (FERNANDES-ALNEMRI
et al., 1996; KUMAN, 1997; FUGITA et al., 1998;) estão envolvidas na apoptose
mediada pela ligação ao Fas, TNFR1 e receptores TRAIL/R1, TRAIL/2-R e DR 3
(BADLEY et al., 2000; PATEL et al.,2000).
A formação dos complexos sinalizadores de indução da morte (DISC)
promove a ativação da enzima iniciadora caspase 8 (SALVESEN, 1999; PATEL et
al., 2000), que por sua vez, ativa a enzima efetora, caspase 3 (BUDIHARDJO et al.,
1999). A atividade da caspase 3 tem como conseqüência a degradação de proteínas
nucleares e celulares, assim como a decomposição do DNA cromossômico (LI et al.,
1998; LUO et al., 1998).
A caspase 8 pode, também, ativar a caspase 3 através da clivagem da
proteína Bid, que por sua vez, é translocada à superfície da mitocôndria e interage
seqüencialmente com as proteínas externas da membrana mitocondrial. Como
resultado, tem-se a formação de poros que permitem a liberação do citocromo C e a
ativação da enzima iniciadora caspase 9, devido a ativação do fator de ativação de
proteases pro-apoptóticas (Apaf-1) (LI et al., 1998; LUO et al., 1998; KUWANA et al.,
2002). A caspase 9, por sua vez, ativa a caspase 3, responsável pela degradação
das proteínas celulares e nucleares e pela ativação da proteína CAD (Caspase-
activated DNase) (SAIKUMAR et al., 1999).
Outras proteínas adaptadoras como FLASH (FLICE-associated huge protein),
que associam-se aos domínios efetores de morte (DED) da caspase 8 (IMAI et al.,
1999), proteínas inibidoras como FLIP (FLICE-inhibitory protein) e proteínas
envolvidas em mecanismos de sobrevivência como RIP (Receptor-interection
protein) podem atuar sobre o processo apoptótico, determinando assim, a
sobrevivência ou a morte celular (SAIKUMAR et al., 1999). Conseqüentemente ao
8
desencadeamento deste processo, a célula passa a apresentar alterações
bioquímicas e morfológicas, que são característicos da apoptose (BADLEY et al.,
2000). (Figura 4).
FIGURA 4.
Representação da apoptose e seus principais mediadores (Adaptado de:
www.uni-ulm.de/aktuelles/aktuelles_thema/aktuell0308/
). Acesso em: 15 de janeiro
de 2005.
Nos estágios iniciais da apoptose, os níveis citoplasmáticos de cálcio
bivalente são reduzidos e o volume celular diminui, enquanto o contato com as
células vizinhas e a matriz extracelular é perdido (VanENGELAND et al., 1997). O
efluxo do cálcio intracelular resulta num acentuado declínio do potencial
transmembranar da mitocôndria e conseqüentemente, no estresse oxidativo da
célula (KANNAN & JAIN, 2000).
A membrana plasmática passa, então, a exibir modificações, como a perda de
resíduos de ácido siálico da membrana glicoprotéica e a perda de microvilosidades e
9
junções intercelulares (VanENGELAND et al., 1997). Verifica-se ainda, a
translocação de resíduos de fosfatidilserina à face externa da membrana plasmática,
que fisiologicamente se encontram confinados na face interna da bicamada lípidica
das células (KOOPMAN et al., 1994; MARTIN et al., 1995; MOURDJEVA et al.,
2005). O conseqüente aumento da permeabilidade da membrana plasmática, por
sua vez, promove a diminuição da atividade esterásica intracelular em decorrência à
presença de toxinas no citoplasma (KANNAN & JAIN, 2000; FLANAGAN
PRODUKTE, 2003). Dessa forma, a cromatina é clivada em fragmentos
oligonucleossomais pela ativação de endonucleases cálcio-magnésio dependentes e
condensada em cápsulas granulares periféricas (VanENGELAND et al., 1997;
WILLINGHAM, 1999).
Finalmente, a superfície celular forma vesículas, que resultam na formação
dos corpos apoptóticos. Os corpos apoptóticos, por sua vez, são reconhecidos e
fagocitados pelos macrófagos e células vizinhas (VAUX & STRASSER, 1996;
VanENGELAND et al., 1997).
1.2.1 Indução do processo apoptótico por linfócitos “T” citotóxicos
As células T citotóxicas (CTLs) constituem a principal defesa dos vertebrados
em resposta a processos infecciosos (OFFIT et al., 1991). Uma vez ativadas, essas
células induzem a apoptose das células infectadas e assim, previnem a multiplicação
dos agentes infecciosos e a propagação da infecção (ZAJAC et al., 1996).
A apoptose promovida pelas células T citotóxicas pode ocorrer tanto através
da via FasL/Fas, como descrito anteriormente, quanto pelo fornecimento de
perforinas e granzime B via exocitose cálcio-dependente às células alvo (BARRY et
al., 2000). A ação das perforinas resulta na formação de poros na membrana
plasmática e permitem a entrada de granzime B na célula alvo (BARRY et al., 2000;
WATERHOUSE, 2004).
Uma vez dentro da célula, a granzime B ativa uma ou mais proteases
apoptóticas (caspases -1,-2,-3,-6,-7 e -8) que desencadeiam a cascata de morte
celular (ATKINSON et al., 1998). Assim, as interações Fas/FasL e o sistema
perforina/granzime B são elos da maquinaria apoptótica que mantém a homeostase
das células do sistema imonulógico (SAIKUMAR et al., 1999).
10
1.2.2 Indução da apoptose por quimioterapia, radiação ultravioleta,
radiação ionizante, hipóxia e falta de estímulos de sobrevivência
A ação de quimioterápicos, radiação ultravioleta e radiação ionizante, podem
também induzir mudanças mitocondriais que promovem o aumento da
permeabilidade e a perda do potencial transmembranar (BOSSY-WETZEL &
GREEN, 1999; SALEH et al., 1999; SOENGAS et al., 1999) mediados geralmente
pela formação de radicais livres, com envolvimento do gene supressor de tumores
p53, que inicia o processo apoptótico pelo aumento da transcrição de proteínas
como Bax (SAIKUMAR et al., 1999).
Enquanto a falta de estímulos de sobrevivência atua sobre Bax por
mecanismos que envolvem MAP kinase e PI-3 kinase, a hipóxia e a depleção de
ATP atuam diretamente sobre esta proteína que, ao se translocar para a superfície
da mitocôndria, forma poros que permitem a liberação de citocromo C (SAIKUMAR
et al., 1999). Conseqüentemente, proteínas reguladoras da apotose, incluindo Apaf-
1 e caspase 9, são liberadas e iniciam a ativação das caspases, levando
ultimamente, à apoptose (BOSSY-WETZEL & GREEN, 1999; SALEH et al., 1999;
SOENGAS et al., 1999).
1.2.3 Apoptose mediada pela família de proteínas Bcl-2
A família de genes Bcl-2 inclui tanto membros promotores, como Bax, Bak,
Bok, Diva, Bcl-x
S
, Bik, Bim, Hrk, Nip3, Nix, Bad e Bid, quanto membros inibidores da
apoptose, como Bcl-2, Bcl-x
L
, Bcl-w, Mcl-1, Nr13 e A1/Bfl-1 (ADAMS & CORY, 1998;
REED, 1998).
Todos os membros da família Bcl-2, incluindo Bcl-x
S
, Bcl-x
L
, Bad e Bax
(BADLEY et al., 2000), possuem, pelo menos, um dos quatro domínios conhecidos:
BH1, BH2, BH3 e BH4 (SAIKUMAR et al., 1999). Para que se verifique a atividade
inibitória sobre a morte celular, os membros anti-apoptóticos devem possuir no
mínimo três domínios (BH1, BH2, e BH3), os que são essenciais para a interação
proteína-proteína e supressão da apoptose (KANNAN & JAIN, 2000). Por outro lado,
BH3 atua como domínio de morte mínimo para os membros pró-apoptóticos
(KELEKAR & THOMPSON, 1998).
11
Os grupos pró- e anti-apoptóticos podem formar homodímeros ou
heterodímeros e aparententemente, podem neutralizar as funções uns dos outros,
sugerindo que suas concentrações relativas em uma determinada célula atuam
como reostato do programa apoptótico (KANNAN & JAIN, 2000).
A Bcl-2 está localizada na face citoplasmática da membrana externa da
mitocôndria, retículo endoplasmático e envelope nuclear. Esta localização
estratégica permite o registro e o contrabalanço do dano oxidativo sobre tais
compartimentos (HOCKENBERRY, 1995; YANG & KORSMEYER, 1996;
ANTONSSON et al., 1997). A proteína Bcl-2 permite, ainda, a manutenção da
integridade de membrana da mitocôndria através da prevenção direta ou indireta da
liberação de citocormo C que, juntamente com dATP e Apaf-1, facilitam a ativação
da caspase 9 (YANG & KORSMEYER, 1996; ANTONSSON et al., 1997).
1.2.4 Moléculas regulatórias anti-apoptóticas
Em oposição ao efeito pró-apotótico mediado pela ligação de TNF-α ao
receptor 1 do fator de necrose tumoral, o complexo TNF-α/TNFR1 pode inciar uma
resposta anti-apoptótica. Este efeito controverso é conseqüente ao recrutamento de
TRAF-2 (TNFR-associated factor 2) a partir do aumento da expressão de genes de
sobrevivência mediado pela ativação de NF-κB (SAIKUMAR et al., 1999).
Por outro lado, proteínas inibitórias à FLICE (FLIP) inibem o processo de
morte celular por apoptose por se associarem a FADD e com isso, prevenirem a
ativação da caspase 8 (IRMLER et al., 1997; TSCHOPP et al., 1998).
Além disso, a família de proteínas inibidoras da apoptose (IAP), incluindo
HIAP e XIAP, atuam como moléculas anti-apoptóticas a partir da inibição da caspase
3 e possivelmente outras caspases (DUCKETT et al., 1996; LISTON et al., 1996;
DEVERAUX et al., 1997).
1.3 Indução da apoptose de linfócitos CD4 e CD8 na infecção pelo HIV
Desde que foi proposta como um importante mecanismo da depleção das
células T CD4 durante a infecção pelo vírus HIV (AMEISEN & CAPRON, 1991), a
apoptose passou a ser estudada com maior ênfase (BADLEY et al., 2000).
12
A infecção pelo vírus HIV está associada a disfunções precoces nas células T
CD4 (LEWIS et al., 1994), seguido pela depleção gradual das células T CD4
(CHAVES & KALLAS, 2004) e pelo declínio das células T citotóxicas (CD8)
específicas ao HIV quando da instalação de AIDS (CARMICHEL et al., 1993;
LELIEVRE et al., 2005).
A contínua perda
de linfócitos CD4, por sua vez, resulta em imunodeficiência
e aumento da susceptibilidade a infecções oportunistas, comumente observados
durante esta infecção (BADLEY et al, 2000, LUM et al., 2003).
Embora a produção de células T CD4 esteja prejudicada (HELLERSTEIN et
al, 1999), existem atualmente fortes evidências de que a base primária da depleção
das células T CD4 e CD8 durante a infecção pelo vírus HIV ocorre principalmente,
pelo aumento da apoptose dessas células (BADLEY et al, 2000; ROSHAL et al,
2001; CHAVES & KALLAS, 2004 ).
Os mecanismos que têm sido propostos para explicar o aumento da
susceptibilidade à apoptose das células mononucleares na infecção pelo vírus HIV,
incluem a associação da glicoproteína do envelope viral gp120 aos linfócitos CD4 e
subseqüente ativação e depleção das células T (BANDA et al., 1992; LUM et al.,
2003), disfunção das células apresentadoras de antígeno (MEYAARD et al., 1993)
ou aumento dos níveis de expressão de citocinas, como TNF-α, IL-1 e IL-6
(PANTALEO et al.,1995; FAUCI et al., 1996).
1.3.1 Alterações moleculares mediadas pelo HIV
O par de receptor-ligante mais amplamente estudado como potencial
mediador da apoptose na infecção pelo HIV é o Fas/Fas-ligante (BADLEY et al,
1997; PATEL et al., 2000).
A infecção aguda da linhagem celular pró-monocítica U937 pelo vírus HIV
está associada com a apoptose dependente da replicação viral (BADLEY et al.,
1996). Esta infecção é caracterizada pelo aumento da expressão de Fas e FasL
(BADLEY et al., 1996; LELIEVRE et al., 2005), por regulação retroativa de proteínas
anti-apoptóticas Bcl2 e BclXL e pelo aumento das proteínas pró-apoptóticas BclXS e
Bax (BADLEY et al., 2000).
Durante a infecção pelo HIV, os linfócitos T demonstram tanto um aumento da
expressão de receptores Fas quanto susceptibilidade elevada à morte celular
13
mediada por Fas (GEHRI et al., 1996; SLOAND et al., 1997; McCLOSKEY et al.,
1998). Além disso, a expressão do ligante Fas se encontra elevada nas células
mononucleares periféricas e está correlacionada com a carga de RNA viral
(HOSAKA et al., 1998).
A regulação do fator de necrose tumoral (TNF), de receptores de TNF ou de
ambos, encontra-se fundamentalmente alterada durante a infecção pelo HIV. A
infecção de linfócitos e monócitos resulta em produção de TNF (BADLEY et al.,
2000), ativação de NF-κB e conseqüentemente, ativação da transcrição do vírus HIV
(HAN et al., 1996; BADLEY et al., 2000).
1.4 Métodos de Detecção da Apoptose
A apoptose representa um processo ativo de remoção celular que
freqüentemente requer ativação gênica, síntese protéica e ativação de
endonucleases (COTTON et al., 1997). Morfologicamente, este processo é
caracterizado pela condensação da cromatina, diminuição do citoplasma, formação
de vesículas a partir da membrana e finalmente, formação dos corpos apoptóticos
(BADLEY et al., 2000).
Baseadas na detecção de tais alterações morfológicas, diferentes
metodologias como eletroforese, microscopia eletrônica e citometria de fluxo, são
amplamente empregadas na avaliação da apoptose (SCHMID et al., 1992;
KOOPMAN et al., 1994). (Tabela 2).
A fragmentação do DNA por endonucleases, por exemplo, é classicamente
demonstrada por eletroforese como uma graduação típica de DNA (KOOPMAN et
al., 1994), enquanto o percentual de fragmentação pode ser determinado por
métodos colorimétricos após a separação dos fragmentos por ultracentrifugação
(NICOLETTI et al., 1991).
A principal falha desses métodos, posto que são desenvolvidos com todo o
extrato nuclear, é a inabilidade em determinar diretamente o percentual de
fragmentos nucleares e de reconhecer as células apoptóticas em populações
celulares heterogêneas (NICOLETTI et al., 1991). Além disso, a clivagem
internucleossomal detectada por eletroforese e por coloração histoquímica do núcleo
pelo método de TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin
nick end labeling) (LASSUS & HIBNER, 1998; LOO & RILLEMA, 1998; TONETTI et
14
al., 1998), por exemplo, não permitem distinguir entre a célula necrótica e a
apoptótica (CHARRIAUT-MARLANGUE & BEM-ARI, 1995; McCARTHY & EVAN,
1998). Tal constatação deve-se ao fato de que os meios proteolíticos que operam na
necrose podem também promover a ativação de enzimas que clivam o DNA em
fragmentos internucleossomais indistinguíveis daqueles observados durante a
apoptose (DONG et al., 1997).
Alternativamente, a fragmentação do DNA pode ser visualizada a partir da
quantificação percentual de bases celulares por ensaios de transferência de
marcação in situ (ISNT, in situ nick translation) (FEHSEL et al., 1991; GOLD et al.,
1993; GORCZYCA et al., 1993). Contudo, as evidências morfológicas da apoptose
nem sempre são acompanhadas pela clivagem do DNA, podendo acarretar em
interpretações subestimadas a respeito deste mecanismo de morte celular (COHEN
et al., 1992; FALCIERI et al., 1993).
A utilização de microscopia eletrônica associada a corantes fluorescentes
(SCHMID et al., 1992; TELFORD et al., 1992), embora permita detectar o processo
apoptótico por criteriosa avaliação morfológica (GOUGEON et al., 1991), torna-se
inapropriado na quantificação da apoptose, posto que a marcação das células,
geralmente realizada através de marcadores não vitais, ocorre somente após o dano
da membrana (KOOPMAN et al., 1994).
As metodologias que incluem a avaliação e quantificação das populações
celulares por citometria de fluxo fornecem análises mais precisas e reprodutíveis do
processo de morte celular por apoptose (NICOLETTI et al., 1991, OLIVIER, 1995;
PETIT et al., 1995). Na citometria de fluxo, a redução do volume celular e o aumento
da granulosidade das células apoptóticas podem ser avaliados a partir de
modificações nos padrões FSC (foward scatter) e SSC (side scatter) de dispersão da
luz, respectivamente (BROWN et al., 1993).
Entre os marcadores nucleares e corantes fluorescentes comumente
utilizados nos ensaios de verificação e quantificação da apoptose por citometria de
fluxo, destacam-se: iodeto de propídio, brometo de etídio, homodímero de etídio , 7 -
aminoactinomicina D (7-AAD), acridine orange (LECOEUR & GOUGEON, 1996;
COTTON et al, 1997), anexina-V-FITC e calceína AM (GATTI et al, 1998). (Tabela
2).
15
TABELA 2.
Categorias de alterações celulares que formam a base dos ensaios de
detecção da apoptose. (WILLINGHAM, M. C., 1999, BADLEY et al., 2000).
Evento Ensaio Detecção
Alterações da morfologia nuclear:
• Condensação da cromatina,
segmentação e formação de
corpos apoptóticos;
• Marcadores de DNA (DAPI)
• Microscopia
Alterações na permeabilidade da
membrana:
• Corantes Vitais (PI);
• Marcadores de permeabilidade
do DNA (DAPI Hoechst 33258,
Calceína AM).
• Microscopia;
• Citometria de fluxo com
determinação simultânea de
tamanho.
Alterações na composição da
membrana:
• Externalização da fosfatidilserina
• Associação à Anexina V
• Citometria de fluxo
Clivagem de proteínas nucleares Polimerase poly ADP ribose Western blot
Atividade e integridade
mitocondriais
• Alterações na transição da
permeabilidade (∆Ψm);
• Acessibilidade a antígenos
mitocondriais;
• Liberação de citocromo-c;
• Produção de radicais livres.
• Corantes Vitais (DiOC
6
, JC-1);
• Anticorpos Apo2,7;
• Anticorpos Anti-citocromo-c;
• DPPP/dihidroetídio.
• Citometria de fluxo;
• Citometria de fluxo;
• Citometria de fluxo, Western
blot;
• Citometria de fluxo.
Ativação de caspases:
• Detecção de produtos da
clivagem de caspases;
• Detecção de caspases ativas;
• Detecção da atividade de
caspases.
• Substratos conhecidos de
caspases: PARP, caspase 3,
caspase 8, DNA-PK, PK-C;
• Anticorpos anti-caspase 3
ativada;
• Clivagem de susbtratos
fluorescentes ou coloridos.
• Western blot;
• Western blot;
• Fluorímetro, colorímetro.
Degradação do DNA:
• Fragmentos grandes;
• Fragmentos pequenos;
• Detecção do pico Sub-G1
• Marcadores de DNA Homodímero
de Etídio, SYBR green);
• Marcador de DNA (Homodímero
de Etídio);
• Radioatividade (C
14
);
• Marcador de DNA (Homodímero
de Etídio);
• Radioatividade (C
14
);
• Marcador de DNA (PI).
• Eletroforese em gel de campo
oscilante;
• Comet
• Detecção de DNA radiomarcado
por filtrado marcado;
• Eletroforese em gel de agarose
(escala de DNA);
• Detecção de DNA radiomarcado
por filtrado marcado;
• Citometria de fluxo.
Detecção de finos fragmentos de
DNA
• Corte da porção terminal dUTP e
marcação (TUNEL);
• PCR mediada por ligação.
• Hibridização in situ, Citometria
de fluxo;
• Eletroforese
16
Os métodos citoquímicos, como aqueles que utilizam 7-aminoactinomicina D
(7-AAD) e iodeto de propídio ou acridine orange e brometo de etídio (LECOEUR &
GOUGEON, 1996), são amplamente empregados e podem ser mais ou menos
específicos na análise da apoptose (WILLINGHAM, 1999).
A perda progressiva da integridade da membrana, por exemplo, pode ser
avaliada pela incorporação de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) ao DNA, que permite
distinguir as células apoptóticas precoces das inviáveis (SCHMID et al., 1994).
Assim, células em estágios iniciais de apoptose são fracamente marcadas com 7-
AAD, enquanto as células inviáves permitem a penetração efetiva deste marcador.
Entretanto, os percentuais médios de apoptose em células mononucleares de
pacientes infectados pelo HIV obtidos pelo método 7-AAD/PI podem ser
subestimados devido à interferência de eritrócitos com o corante 7-
aminoactinomicina D (7-AAD) (LECOEUR & GOUGEON, 1996).
Por outro lado, a metodologia que utiliza acridine orange (AO) (OLIVIER,
1995; PETIT et al., 1995) e brometo de etídio (EB) como marcadores da apoptose
permite detectar três populações celulares por citometria de fluxo: (1) células viáveis,
marcadas fracamente com AO, mas não marcadas por EB; (2) células inviáveis,
marcadas fracamente por EB, mas não marcadas por AO; e (3) células apotóticas
com DNA fragmentado, marcadas fracamente com AO, não marcadas por EB, mas
com volume reduzido, indicado pelo padrão de dispersão foward scatter (FSC)
(PETIT et al., 1995; OLIVIER, 1995; LECOEUR & GOUGEON, 1996). Entretanto,
esta distinção dos grupos celulares viáveis, apoptóticos e inviáveis pode se tornar
pouco reprodutível devido ao largo espectro de emissão promovido por acridine
orange e pelo brometo de etídio (NICOLETTI et al., 1991; LECOEUR & GOUGEON,
1996).
A anexina V se mostrou útil na detecção de células apoptóticas em
decorrência de sua ligação preferencial a fosfolipídeos negativamente carregados,
como a fosfatidilserina exposta no início do processo apoptótico (KOOPMAN et al.,
1994; HOMBURG et al., 1995; VERMES et al., 1995; CLARKE et al., 2000; LEE et
al., 2004). A conjugação do corante Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) à anexina-
V (KOOPMAN et al., 1994), permite identificar e quantificar as células apoptóticas
através da citometria de fluxo (vanENGLAND et al., 1998). (Figura 5). A utilização
concomitante do marcador nuclear fluorescente iodeto de propídio (PI), por sua vez,
17
torna possível verificar as alterações nucleares características dos estágios tardios
da apoptose (WILLINGHAM, 1999).
Tal propriedade deve-se ao fato de que marcadores de DNA de elevado peso
molecular, como iodeto de propídio, não são passíveis de penetrar na célula intacta
em decorrência do seu tamanho, bem como não marcam células apoptóticas sem
que estas apresentem alterações na permeabilidade da membrana plasmática, como
ocorre nos estágios finais da apoptose. Desse modo, utilizando citometria de fluxo, o
marcador anexina V-FITC permite detectar os estágios iniciais da apoptose,
enquanto o iodeto de propídio permite avaliar os momentos finais deste processo de
morte celular (vanENGLAND et al., 1998; WILLINGHAM, 1999).
FIGURA 5.
Ligação da anexina V aos resíduos de fosfatidilserina. (Adaptado de:
www.funakoshi.co.jp/h_news/Apoptosis/imgs/AnnexinV01.gif
). Acesso em: 10
dezembro 2004.
O acetóxi-metil-éster de calceína é um diéster fluorogênico que atravessa
passivamente a membrana celular na forma elétrica neutra, quando então é
convertido por esterases intracelulares, ativas somente em célula íntegra, a seu
análogo negativo, impermeável e de fluorescência verde, também conhecido como
calceína (NERI et al., 2001; FLANAGAN PRODUKTE, 2003). Com a perda da
integridade ou aumento da permeabilidade da membrana, a atividade esterásica
18
cessa e o homodímero de etídio (EthD-1) reage com os ácidos nucléicos, produzindo
fluorescência vermelha (GATTI et al., 1998; FLANAGAN PRODUKTE, 2003).
Assim, a calceína permite a verificação da viabilidade celular através da
diminuição da atividade esterásica, enquanto EthD-1 permite constatar as alterações
físicas e químicas na membrana celular verificadas na membrana danificada, com
elevação de 40 vezes em sua fluorescência à medida que associa-se a ácidos
nucléicos (MOLECULAR PROBES INCORPORATION, 1999; TREITINGER, 2002).
(Figura 6).
FIGURA 6.
Conversão da calceína AM por esterases intracelulares na célula viável.
(Adaptado de: www.dojindo.com/newimages/-Cellstain-Calcein-AM-Mech.jpg
).
Acesso em: 10 dezembro 2004.
O método de avaliação e quantificação do processo de morte celular por
apoptose mais utilizado atualmente leva em conta a associação da anexina V-FITC e
iodeto de propídio. Por outro lado, a metodologia que utiliza calceína AM e
homodímero de etídio mostrou-se sensível na quantificação deste processo em
estudo anterior através da marcação de células como PC 12 e NIH3T3 (GATTI et al.,
1998). Considerando que este estudo foi realizado com células aderentes não
incluindo, portanto, células mononucleares do sangue periférico como linfócitos, o
presente estudo baseou-se na avaliação da performance do método que utiliza
calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1) na detecção e quantificação da
viabilidade, apoptose e inviabilidade celular em células mononucleares do sangue
periférico, através da comparação com o método que utiliza anexina V-FITC e iodeto
de propídio.
19
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Comparar o método que utiliza calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1),
cuja sensibilidade na detecção e quantificação de linfócitos viáveis e em apoptose
não se encontra descrita na bibliografia especializada, com o método que utiliza
anexina V e iodeto de propídio, a partir do sangue periférico de pacientes infectados
pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) submetidos à terapia anti-retroviral.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a possibilidade de utilização do método que propõe a calceína
AM/homodímero de etídio como marcador para detecção e quantificação de células
mononucleares viáveis e apoptóticas do sangue periférico, como os linfócitos, a
partir da comparação com o método que utiliza anexina V-FITC/iodeto de propídio
como referência.
Verificar a sensibilidade do método que utiliza calceína AM/homodímero de
etídio como marcador precoce para detecção e quantificação dos níveis de apoptose
em células mononucleares não aderentes, em relação ao método dos marcadores
anexina V-FITC/iodeto de propídio, utilizado como referência.
Contribuir para a eleição da metodologia mais sensível na realização de
estudos posteriores de avaliação dos níveis de apoptose e viabilidade de células
mononucleares, como os linfócitos.
20
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Casuística
A viabilidade, apoptose e inviabilidade de células mononucleares foram
avaliados em amostras de sangue de 50 pacientes, comprovadamente soropositivos
para o HIV, diagnosticados por dois métodos com princípios metodológicos distintos
e confirmados por imunofluorescência indireta, conforme recomendado pelo
Ministério da Saúde e aceito pela Organização Mundial da Saúde (BRASIL,
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).
Os pacientes, atendidos rotineiramente no Laboratório de Análises Clínicas do
Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina e que aceitaram
participar deste estudo, foram devidamente esclarecidos sobre a natureza e
objetivos do presente trabalho. Após assinarem o termo de consentimento, estes
pacientes foram submetidos à coleta adicional de 10 mL de sangue periférico. Para
evitar possíveis interferências causadas por elevados níveis de carga viral ou
contagens excessivamente alteradas de células T CD4 e CD8, a seleção dos
pacientes levou em conta a utilização de terapia anti-retroviral e a ausência de
infecções oportunistas no momento da coleta.
Das 50 amostras de sangue obtidas, 25 foram destinadas ao ensaio de
verificação da viabilidade e apoptose de células mononucleares após 24 horas de
incubação em meio RPMI 1640, simultaneamente com os métodos que utilizam
calceína AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de propídio,
respectivamente. As outras 25 amostras foram destinadas à realização dos mesmos
ensaios, sendo o período de incubação modificado para 48 horas.
A realização deste estudo foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa
com Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina, conforme consta
do processo n° 163/2003, cujo parecer encontra-se em anexo (Anexo1).
3.2 Coleta de material biológico
As amostras de sangue venoso dos pacientes foram obtidas por punção
anterocubital, pela manhã, utilizando-se sistema a vácuo. Foram colhidos 10 mL de
sangue em tubo contendo heparina.
21
3.3 Isolamento das células mononucleares
Após centrifugação do sangue a 1500 rpm (378 g) por 15 minutos, a camada
de glóbulos brancos formada entre o plasma e as hemácias foi removida com pipeta
de Pasteur e ressuspendida com 8 mL de solução salina tamponada com fosfato
0,01M (PBS), pH 7,4.
A suspensão de células, contendo leucócitos e hemácias, foi lentamente
transferida para outro tubo contendo 2,5 mL de Ficoll-Paque, densidade 1,077 g/mL
(Sigma Chemical Company, Sant Louis, U.S.A.) e centrifugada a 1500 rpm (378 g)
durante 20 minutos para separação das células mononucleares, em centrífuga
clínica Celm, modelo LS-II. A camada de células localizada entre o tampão e o
Ficoll-Paque foi retirada com pipeta Pasteur, lavada duas vezes em PBS pH 7,4 e
sedimentada por centrifugação a 1000 rpm (168 g) por 10 minutos.
Em seguida, as células mononucleares foram ressuspendidas em 1 mL de
meio RPMI 1640 com 25 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina (Sigma Chemical
Company, Sant Louis, U.S.A.), suplementado com 1000 µL de soro bovino fetal
inativado pelo calor (Sigma Chemical Company, Sant Louis, U.S.A.), 10 UI/mL de
penicilina, 10 µg/mL de estreptomicina e 5 µL de anfotericina B.
Finalmente, as células mononucleares foram contadas em câmara de
Neubauer e a suspensão celular foi ajustada para 5 X 10
5
células por mililitro de
meio RPMI 1640, suplementado com 1000 µL de soro bovino fetal inativado pelo
calor (Sigma Chemical Company, Sant Louis, U.S.A.), 10 UI/mL de penicilina, 10
µg/mL de estreptomicina e 5 µL de anfotericina B.
3.4 Manutenção das células mononucleares
Para cada amostra, foram mantidos 2 meios de cultura com volume final de 2
mL cada, contendo 5 X 10
5
células mononucleares por mililitro de meio RPMI 1640
(contendo 25 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina (Sigma Chemical Company,
Sant Louis, U.S.A.), suplementado com 1000 µL de soro bovino fetal inativado pelo
calor (Sigma Chemical Company, Sant Louis, U.S.A.), 10 UI/mL de penicilina, 10
µg/mL de estreptomicina e 5 µL de anfotericina B.
22
Das 50 amostras, 25 foram mantidas por 24 horas, enquanto as 25 restantes
foram mantidas por 48 horas, ambas a 37° Celsius, em estufa com 5% de CO
2
.
(Fluxograma 1).
50 amostras
iniciais
25 amostras com
incubação de 48
horas
25 amostras com
incubação de 24
horas
25 amostras
marcadas
com
Calceína AM
e
homodímero
de etídio
25 amostras
marcadas
com Anexina
V-FITC e
iodeto de
propídio
25 amostras
marcadas
com
Calceína AM
e
homodímero
de etídio
25 amostras
marcadas
com Anexina
V-FITC e
iodeto de
propídio
FLUXOGRAMA 1.
Separação das amostras de acordo com o tempo de incubação e
tipo de ensaio de verificação da viabilidade e apoptose de células mononucleares.
3.5 Ensaios para verificação da viabilidade e apoptose dos linfócitos
Após o período de incubação de 24 ou 48 horas, as suspensões de células
foram centrifugadas a 1000 rpm (168 g) por 10 minutos e ressuspendidas com
solução de PBS pH 7,4. Em seguida, as células foram novamente centrifugadas a
1000 rpm (168 g) por 10 minutos.
Posteriormente, os linfócitos viáveis, em apoptose e inviáveis foram
determinados utilizando-se o conjunto reativo para detecção de apoptose ANNEXIN
23
V-FITC
contendo anexina V-FITC, iodeto de propídio e tampão (SIGMA Chemical
Co. Saint Louis, MO, EUA) e o conjunto reativo para detecção de viabilidade e
citotoxicidade LIVE/DEAD
(L-3224), contendo calceína AM e homodímero-1 de
etídio (EthD-1) (Molecular Probes Incorporation, Eugene, Oregon, EUA) (Fluxograma
1).
3.5.1 Marcação das células com o conjunto reativo ANNEXIN V-FITC e
iodeto de propídio
Após a segunda centrifugação, as células foram ressuspendidas no tampão
de ligação, previamente diluído em água deionizada na proporção 1:10. Em seguida,
500 µL da suspensão de células foram marcados com 5 µL de anexina V-FITC e 10
µL de iodeto de propídio.
Após 10 minutos de repouso ao abrigo da luz, a fluorescência das células foi
imediatamente determinada em citômetro de fluxo. As células que se encontravam
nos estágios inicias da apoptose foram marcadas intensamente por anexina V-FITC,
que emite fluorescência verde como resultado de sua ligação preferencial aos
resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo. Já as células
necróticas ou inviáveis foram marcadas intensamente por iodeto de propídio, que
emite fluorescência vermelha, e menos intensamente por anexina V-FITC. As células
viáveis, por sua vez, não foram marcadas nem por anexina V-FITC, nem por iodeto
de propídio.
3.5.2 Marcação das células com o conjunto reativo LIVE/DEAD
contendo calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1)
Após a segunda centrifugação, as células foram marcadas com 200 µL da
solução de uso de calceína AM 1 µM e homodímero de etídio 8 µM em solução de
PBS pH 7,4.
Após 10 minutos de repouso em temperatura ambiente, a fluorescência das
células foi imediatamente determinada em citômetro de fluxo. As células viáveis
foram marcadas por calceína AM, como resultado da ação das esterases
intracelulares, ativas somente na célula íntegra. Conseqüentemente à diminuição da
24
atividade esterásica e ao aumento das alterações físicas e/ou bioquímicas da
membrana celular, as células em apoptose apresentaram fraca marcação por
calceína AM e progressiva marcação por EthD-1, que apresenta fluorescência
vermelha. As células inviáveis, por sua vez, não foram marcadas por calceína AM,
mas foram intensamente marcadas por EthD-1
.
3.5.3 Avaliação da viabilidade e apoptose dos linfócitos por citometria de
fluxo
Os ensaios de viabilidade das células mononucleares foram realizados no
Hemocentro do Estado de Santa Catarina (HEMOSC) em citômetro de fluxo modelo
FACSCallibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA,U.S.A.),
através de dois programas, o CELLQuest e o PAINT-A-GATE (Figura 7).
FIGURA 7.
Citômetro de fluxo, modelo FACSCallibur (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.).
Posteriormente à aquisição das células em citômetro de fluxo FACSCallibur
(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.) através do
programa CELLQuest, células e/ou estruturas foram selecionadas de acordo com
seu volume e granulosidade (Figuras 8 e 9). Assim, as células e/ou estruturas
25
maiores, como os monócitos, foram excluídas, posto que a análise de sua
viabilidade não foi objetivo deste estudo.
FIGURA 8. Seleção de células e/ou estruturas marcadas com Anexina V-FITC/PI, de
acordo com seu volume e sua granulosidade, através do programa CELLQuest.
A seleção das células marcadas com Anexina V-FITC/PI permitiu a distinção
de três grupos celulares, que podem ser classificados como: a) células viáveis, que
constituem o grupo de células localizado no quadrante inferior esquerdo e que não
foram marcadas por anexina ou iodeto de propídio; b) células em apoptose, que
constituem o grupo de células localizado no quadrante inferior direito, marcadas
intensamente por anexina V-FITC e c) células inviáveis, que se encontram no
quadrante superior direito, marcadas por iodeto de propídio e por anexina V-FITC
(Figura 10).
Por outro lado, a seleção das células marcadas com Calceína AM/EthD-1
permitiu a distinção de três grupos celulares, que podem ser classificados como: a)
células viáveis, que constituem o grupo de células localizado no quadrante inferior
direito e que foram marcadas intensamente pela calceína; b) células em apoptose,
que constituem o grupo de células localizado no quadrante inferior esquerdo e que
foram marcadas pela calceína e pelo EthD-1, de acordo com o estágio de apoptose
em que se encontram e c) células inviáveis, que se encontram no quadrante superior
26
esquerdo, as quais foram intensamente marcadas pelo homodímero de etídio
(Figura 11).
FIGURA 9. Seleção de células e/ou estruturas marcadas com Calceína AM/EthD-1,
de acordo com seu volume e sua granulosidade, através do programa CELLQuest.
Assim, as imagens das células e/ou estruturas selecionadas foram salvas em
arquivo específico, para que fosse possível sua análise através do programa PAINT-
A-GATE.
No PAINT-A-GATE, realizou-se novamente a seleção das células e/ou
estruturas de acordo com seu volume e granulosidade. Desse modo, células
maiores, como os monócitos e as células que apresentam granulações, como os
segmentados, que não foram separados durante o isolamento das células
mononucleares pelo Ficoll-Paque, foram excluídas. (Figuras 12 e 13).
As distribuições das células obtidas pelo PAINT-A-GATE são semelhantes
àquelas verificadas no CELLQuest. Entretanto, o programa PAINT-A-GATE permite
que os linfócitos pertencentes aos três grupos distindos sejam selecionados e
coloridos.
27
É importante ressaltar que as células que se encontravam muito próximas do
eixo y foram excluídas, posto que correspondiam, provavelmente, a fragmentos
celulares restantes.
FIGURA 10. Distribuição das células selecionadas, através do CELLQuest, de
acordo com a intensidade da marcação pela anexina e/ou iodeto de propídio.
28
FIGURA 11.
Distribuição das células selecionadas, através do CELLQuest, de
acordo com a intensidade da marcação pela calceína AM e/ou Homodímero de
Etídio.
FIGURA 12. Células selecionadas e analisadas através do PAINT A GATE, de
acordo com o seu volume e sua granulosidade, marcadas pela anexina e/ou iodeto
de propídio.
29
FIGURA 13.
Células selecionadas e analisadas através do PAINT A GATE, de
acordo com o seu volume e sua granulosidade, marcadas pela calceína e/ou
homodímero de etídio.
Durante a avaliação da viabilidade celular com o conjunto reativo ANNEXIN
V-FITC
, os linfócitos marcados mais intensamente com anexina, que constituem o
grupo localizado na porção intermediária e à direita, foram coloridos de azul claro.
Os linfócitos marcados mais intensamente com iodeto de propídio e localizados na
parte superior à direita, por sua vez, foram coloridos de vermelho. Finalmente, os
linfócitos localizados na porção inferior à esquerda, que não apresentam marcação
por anexina ou iodeto de propídio, foram coloridos de azul escuro. A escolha das
cores utilizadas levou em conta a proximidade destas com a fluorescência emitida
pelos corantes quando da marcação das células. (Figura 14).
FIGURA 14. Distribuição dos linfócitos, obtida através do PAINT A GATE, de acordo
com a intensidade de sua marcação pela anexina e/ou iodeto de propídio.
Durante a avaliação da viabilidade celular com o conjunto reativo
LIVE/DEAD
, os linfócitos marcados mais intensamente com calceína, que
constituem o grupo localizado na porção inferior e à direita, foram coloridos de azul
30
claro. Os linfócitos marcados com mais intensidade pelo homodímero de etídio e
localizados na parte superior, por sua vez, foram coloridos de vermelho. Finalmente,
os linfócitos localizados na porção intermediária à esquerda, marcados
gradativamente com menos intensidade pela calceína e com mais intensidade pelo
homodímero de etídio, foram
coloridos de azul escuro. A escolha das cores
utilizadas levou em conta a proximidade destas com a fluorescência emitida pelos
corantes quando da marcação das células. (Figura 15).
FIGURA 15. Distribuição dos linfócitos, obtida através do PAINT A GATE, de acordo
com a intensidade de sua marcação pela calceína e/ou homodímero de etídio.
Após a seleção das células e/ou estruturas através do CELLQuest e do
PAINT-A-GATE, de acordo com seu volume e granulosidade, realizou-se a exclusão
das estruturas que se encontravam muito próximas do eixo y, ou seja, que foram
marcadas praticamente apenas por homodímero de etídio ou iodeto de etídio, posto
que correspondiam, possivelmente, a fragmentos celulares restantes.
31
Posteriormente à avaliação da viabilidade e apoptose dos linfócitos, realizada
como descrito, determinou-se a proporção (%) dos grupos celulares, em apoptose e
inviáveis (Figuras 16 e 17).
32
FIGURA 16.
Resultado final da avaliação da viabilidade e apoptose de linfócitos,
marcados com anexina e/ou iodeto de propídio.
FIGURA 17.
Resultado final da avaliação da viabilidade e apoptose de linfócitos,
marcados com calceína AM e/ou homodímero de etídio.
3.6 Análise estatística
A análise estatística consistiu de uma parte descritiva (BUSSAB & MORETIN,
2002), com a determinação das estatísticas descritivas básicas, e de uma parte
inferencial, baseada em testes de comparação de médias para dados pareados
(BUSSAB & MORETIN, 2002), que estudou o efeito do tipo de marcador na
classificação dos linfócitos viáveis, em apoptose e inviáveis para os tempos de 24 e
48 horas. Esta comparação foi realizada através do teste t para dados pareados ao
nível de significância (α) de 5% (MONTGOMERY, 2001).
A avaliação das correlações entre os níveis de linfócitos viáveis, em apoptose
e inviáveis, obtidos através da marcação pela calceína AM/homodímero de etídio, e
os níveis dos mesmos grupos celulares obtidos pela anexina V-FITC/PI, foi realizada
através da determinação dos coeficientes correlação de Pearson, ao nível de
significância (α) de 5%
33
Para a realização das análises dos dados obtidos, foram utilizados os
softwares SAS
®
System e Statistica
®
6.0.
34
4. RESULTADOS
4.1 Análise descritiva
A partir da análise estatística descritiva, foram determinados os valores de
mínimo, máximo, mediana, média e erro padrão dos valores obtidos para os grupos
de células viáveis, apoptóticas e inviáveis, a partir dos marcadores anexina V-
FITC/iodeto de propídio e calceína AM/homodímero de etídio, em função dos
tempos de incubação de 24 e 48 horas (Tabelas 3 e 4, Apêndice 1).
TABELA 3.
Estatísticas descritivas para as 50 amostras analisadas, com tempo de
incubação de 24 horas, com resultados expressos em valores percentuais.
Tipo de
Célula (%)
Marcador Mínimo Máximo Mediana Média Erro Padrão
Anexina 5,89 34,78 17,16 16,71 1,34
Inviáveis
Calceína 2,49 33,19 11,85 13,02 1,44
Anexina 15,88 73,22 39,22 42,31 3,24
Apoptose
Calceína 14,92 83,61 46,19 46,95 3,56
Anexina 9,56 78,18 41,47 40,51 3,95
Viáveis
Calceína 6,55 82,59 38,76 39,87 4,22
TABELA 4.
Estatísticas descritivas para as 50 amostras analisadas, com tempo de
incubação de 48 horas, com resultados expressos em valores percentuais
Tipo de
Célula (%)
Marcador Mínimo Máximo Mediana Média Erro Padrão
Anexina 8,26 41,54 25,50 25,60 2,01
Inviáveis
Calceína 5,17 44,83 21,33 20,99 2,00
Anexina 8,06 67,73 32,21 33,83 2,65
Apoptose
Calceína 16,29 64,79 38,19 37,67 2,47
Anexina 3,70 76,77 32,85 40,24 4,06
Viáveis
Calceína 6,77 76,68 38,33 41,22 4,10
A análise estatística descritiva prévia demonstrou que os níveis de viabilidade,
apoptose e inviabilidade celular apresentaram distribuição aproximadamente normal
de valores. Esta distribuição permite validar a análise estatística inferencial utilizada,
baseada em testes de comparação de médias para dados pareados.
35
4.2 Análise inferencial
A partir da análise estatística inferencial, foram determinados os resultados da
comparação dos valores percentuais médios, obtidos para os grupos de células
viáveis, apoptóticas e inviáveis, para cada tempo de incubação, tomando o tipo de
marcador como fator para análise. A comparação foi realizada através do teste t
para dados pareados, com nível de significância (α) de 5%. (Apêndice 2).
4.2.1 Avaliação das correlações entre os resultados obtidos para
calceína AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de
propídio após 24 horas de incubação
A determinação dos coeficientes de correlação de Pearson demonstrou que
os níveis de viabilidade, apoptose e inviabilidade celular, obtidos pela marcação com
calceína AM/homodímero de etídio após 24 horas de incubação, apresentaram
significativas correlações entre os níveis de linfócitos viáveis (r=0,9517, p<0,001),
em apoptose (r=0,9681, p<0,001) e inviáveis (r=0,8170, p<0,001) obtidos pela
marcação com anexina V-FITC/iodeto de propídio após 24 horas de incubação.
(Figuras 18 a 20).
4.2.2 Avaliação das correlações entre os resultados obtidos para
calceína AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de
propídio após 48 horas de incubação
A determinação dos coeficientes de correlação de Pearson demonstrou que
os níveis de linfócitos viáveis, em apoptose e inviáveis, obtidos pela marcação com
calceína AM/homodímero de etídio após 48 horas de incubação, apresentaram
significativas correlações entre os níveis viabilidade (r=0,9557 p<0,001), apoptose
(r=0,9160, p<0,001) e inviabilidade (r=0,8968, p<0,001) celulares obtidos pela
marcação com anexina V-FITC/iodeto de propídio após 48 horas. (Figuras 21 a 23).
36
FIGURA 18. Correlação entre níveis de linfócitos viáveis obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos viáveis obtidos pela anexina V-
FITC/iodeto de propídio após 24 horas.
FIGURA 19. Correlação entre níveis de linfócitos em apoptose obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos em apoptose obtidos pela anexina
V-FITC/iodeto de propídio após 24 horas.
37
FIGURA 20.
Correlação entre níveis de linfócitos inviáveis obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos inviáveis obtidos pela anexina V-
FITC/iodeto de propídio após 24 horas.
FIGURA 21. Correlação entre níveis de linfócitos viáveis obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos viáveis obtidos pela anexina V-
FITC/iodeto de propídio após 48 horas.
38
FIGURA 22. Correlação entre níveis de linfócitos em apoptose obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos em apoptose obtidos pela anexina
V-FITC/iodeto de propídio após 48 horas.
FIGURA 23.
Correlação entre níveis de linfócitos inviáveis obtidos pela calceína
AM/homodímero de etídio e os níveis de linfócitos inviáveis obtidos pela anexina V-
FITC/iodeto de propídio após 48 horas.
39
4.2.3 Quantificação de linfócitos viáveis após 24 horas de incubação
A determinação dos níveis de viabilidade celular após 24 horas de incubação
não demonstrou diferença estatisticamente significante (p=0,6284) entre os valores
percentuais médios de linfócitos viáveis, obtidos pelos marcadores anexina V-
FITC/PI (40,51% ± 3,95) e calceína AM/EthD-1 (39,87% ± 4,22). (Figura 24).
40,51
±
3,95
39,87
±
4,22
0
10
20
30
40
50
Anexina 24hs Calceína 24hs
Células viáveis (%)
FIGURA 24. Valor percentual médio de células viáveis obtidas com anexina V-FITC/
iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 24 horas de
incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Não houve diferença significativa entre os marcadores (p= 0,6284).
40
4.2.4 Quantificação de linfócitos em apoptose após 24 horas de
incubação
A determinação dos níveis de apoptose após 24 horas de incubação
demonstrou que os valores percentuais médios de linfócitos em apoptose obtidos
pelo marcador calceína AM/EthD-1 (46,95% ± 3,65) foram estatisticamente
superiores (p<0,0001) quando comparados aos valores obtidos pelo marcador
anexina V-FITC/PI (42,31% ± 3,24). (Figura 25).
46,95
±
3,56*
42,31
±
3,24
0
10
20
30
40
50
60
Anexina 24hs Calceína 24hs
Células apoptóticas (%)
FIGURA 25. Valor percentual médio de células apoptóticas obtidas com anexina V-
FITC/ iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 24 horas
de incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Valores assinalados com (*) indicam diferença significativa (p<0,05) entre os valores
percentuais médios.
Houve diferença significativa entre os marcadores (p<0,0001).
41
4.2.5 Quantificação de linfócitos inviáveis após 24 horas de incubação
A determinação dos níveis de inviabilidade após 24 horas de incubação
demonstrou que os valores percentuais médios de linfócitos inviáveis obtidos pelo
marcador anexina V-FITC/PI (16,71% ±
1,34) foram estatisticamente superiores
(p=0,0002) quando comparados aos valores obtidos pelo marcador calceína
AM/EthD-1 (13,02% ± 1,44). (Figura 26).
13,02
±
1,44
16,71
±
1,34 *
0
5
10
15
20
25
Anexina 24hs Calceína 24hs
Células inviáveis (%)
FIGURA 26.
Valor percentual médio de células inviáveis obtidas com anexina V-
FITC/ iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 24 horas
de incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Valores assinalados com (*) indicam diferença significativa (p<0,05) entre os valores
percentuais médios.
Houve diferença significativa entre os marcadores (p=0,0002).
42
4.2.6 Quantificação de linfócitos viáveis após 48 horas de incubação
A determinação dos níveis de viabilidade celular após 48 horas de incubação
não demonstrou diferença estatisticamente significante (p=0,4290) entre os valores
percentuais médios de linfócitos viáveis, obtidos pelos marcadores anexina V-
FITC/PI (40,24% ± 4,06) e calceína AM/EthD-1 (41,22% ± 4,10). (Figura 27).
41,22
±
4,10
40,24
±
4,06
0
10
20
30
40
50
Anexina 48hs Calceína 48hs
Células viáveis (%)
FIGURA 27. Valor percentual médio de células viáveis obtidas com anexina V-FITC/
iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 48 horas de
incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Não houve diferença significativa entre os marcadores (p=0,4290).
43
4.2.7 Quantificação de linfócitos em apoptose após 48 horas de
incubação
A determinação dos níveis de apoptose após 48 horas de incubação
demonstrou que os valores percentuais médios de linfócitos em apoptose obtidos
pelo marcador calceína AM/EthD-1 (37,67% ± 2,47) foram estatisticamente
superiores (p=0,0014) quando comparados aos valores obtidos pelo marcador
anexina V-FITC/PI (33,83% ± 2,65). (Figura 28).
37,67
±
2,47*
33,83
±
2,65
0
10
20
30
40
50
Anexina 48hs Calceína 48hs
Células apoptóticas (%)
FIGURA 28.
Valor percentual médio de células apoptóticas obtidas com anexina V-
FITC/ iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 48 horas
de incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Valores assinalados com (*) indicam diferença significativa (p<0,05) entre os valores
percentuais médios.
Houve diferença significativa entre os marcadores (p=0,0014).
44
4.2.8 Quantificação de linfócitos inviáveis após 48 horas de incubação
A determinação dos níveis de inviabilidade celular após 48 horas de
incubação demonstrou que os valores percentuais médios de linfócitos inviáveis
obtidos pelo marcador anexina V-FITC/PI (25,60% ± 2,01) foram estatisticamente
superiores (p<0,0001) quando comparados aos valores obtidos pelo marcador
calceína AM/EthD-1 (20,99% ± 2,00). (Figura 29).
20,99
±
2,00
25,60
±
2,01 *
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Anexina 48hs Calceína 48hs
Células inviáveis (%)
FIGURA 29. Valor percentual médio de células inviáveis obtidas com anexina V-
FITC/ iodeto de propídio e calceína AM/ homodímero de etídio (n=25) após 48 horas
de incubação.
Resultados estão expressos como média
±
erro padrão.
Valores assinalados com (*) indicam diferença significativa (p<0,05) entre os valores
percentuais médios.
Houve diferença significativa entre os marcadores (p<0,0001).
45
5. DISCUSSÃO
A morte programada da célula ou apoptose, uma via suicida resultante da
ativação de endonucleases e subseqüente redução do DNA a fragmentos
nucloessomais (ROSEN & CASCIOLA-ROSEN, 1997; SALGAME et al., 1997),
representa processos fisiológicos importantes, como os observados na
metamorfose, embriogênese e atrofia tecidual, onde a restrição do número de
células envolvidas é essencial (MEIER et al., 2000; EVANS & VOUSDEN; 2001;
HUANG, 2002; RATHMELL et al., 2002).
No sistema imune, a apoptose congrega um processo crítico do
desenvolvimento de linfócitos (LEONARDO et al., 1999; NAGATA et al., 1999;
RATHMELL & THOMPSON, 2002). A eliminação de células T autoreativas e células
B por apoptose, por exemplo, é essencialmente requisitada para o estabelecimento
e manutenção da tolerância própria (GERMAIN, 2002; RATHMELL & THOMPSON,
2002). Além disso, a apoptose representa papel importante na regulação retroativa
das respostas imunes por eliminação de células T ativadas após sua expansão
inicial (BUDD, 2001).
A regulação anormal e desordenada da morte celular por apoptose pode estar
envolvida na patogênese de diversas desordens, como isquemias cerebral e
cardíaca, doenças autoimunes e neurodegenerativas, rejeições aos transplantes de
órgãos e de medula óssea, ou ainda infecções virais, incluindo a infecção pelo HIV
(BLANKBERG et al., 1998; SALMENA et al., 2003; AHR et al., 2004).
A apoptose pode ser diferenciada da necrose através da observação de
determinadas alterações morfológicas, que são distintas e peculiares a cada
processo de morte celular (WILLINGHAM, 1999). Enquanto a diminuição do volume
celular, a condensação da cromatina e a formação de corpos apoptóticos
caracterizam a apoptose, o aumento do volume celular e cariólise são característicos
da necrose (KANNAN & JAIN, 2000). Além disso, os transtornos metabólicos que
ocorrem durante a necrose promovem lesões osmóticas na membrana plasmática, o
que, por outro lado, é substancialmente preservado durante a apoptose
(BUSSOLATI et al., 1995).
Nos estágios iniciais de apoptose, os resíduos de fosfatidilserina são
redistribuídos da face interna da bicamada lipídica à face externa da membrana
plasmática (MOURDJEVA et al., 2005). Tal redistribuição reserva importantes
46
implicações fisiológicas, uma vez que promove o reconhecimento celular específico,
bem como sua remoção pelos macrófagos (FADOK et al., 1992). A imediata
fagocitose das células apoptóticas, por sua vez, previne o dano tissular potencial
resultante da lise dessas células in situ (KOOPMAN et al., 1994).
A exposição de fosfatidilserina na superfície das células apoptóticas antecede
a fragmentação do DNA e a formação de vesículas na membrana plasmática
(MARTIN et al., 1995; BLANKENBERG et al., 1998) e tem sido amplamente
empregada na avaliação e determinação da apoptose por microscopia e citometria
de fluxo (KOOPMAN et al., 1994; GATTI et al., 1998).
O aumento progressivo da permeabilidade da membrana plasmática, por
outro lado, apresenta-se como alteração morfológica típica das células apoptóticas
tardias ou inviáveis (LECOEUR & GOUGEON, 1996). Este aumento de
permeabilidade permite a entrada e permanência de toxinas no citoplasma o que,
por sua vez, promovem a diminuição da atividade esterásica intracelular. Desse
modo, o nível de atividade das esterases intracelulares pode ser utilizado tanto como
sinalizador da viabilidade e manutenção da integridade da membrana, quanto da
inviabilidade celular (BUSSOLATI te al., 1995; FLANAGAN PRODUKTE, 2003).
Embora o papel exato da apoptose durante a infecção pelo HIV não esteja
completamente definido, crescentes evidências sugerem que este mecanismo de
morte celular apresenta-se como o principal contribuidor da depleção dos linfócitos
CD4 in vivo (BADLEY et al., 1997; PATEL et al., 2000; ROSHAL et al., 2001; LUM et
al, 2003; CHAVES & CALLAS,2004.).
Inicialmente, diversos estudos demonstram que linfócitos CD4 de pacientes
contaminados com o vírus HIV apresentavam aumento da sensibilidade à apoptose
espontânea in vitro (GOUGEON et al., 1993; LEWIS et al., 1994; MEYAARD et al.,
1994). Mais tarde, outros autores demonstraram que este aumento da
susceptibilidade à morte por apoptose é controlado, em parte, pela expressão de
Bcl-2 e Fas (BOUDET et al., 1996, BADLEY et al., 1997). Recentemente, esta
propensão dos linfócitos à apoptose passou a ser relacionada à ativação crônica do
sistema imune, bem como à progressão da doença (BADLEY et al., 2000; PATEL et
al., 2000; LUM et al, 2003; LELIEVRE et al., 2005).
Gougeon et. al. (1996) demonstraram que linfócitos T de pacientes infectados
pelo vírus HIV apresentavam expressão ex vivo de Bcl-2 reduzida, o que promoveu
aumento da susceptibilidade à morte espontânea destas células por apoptose. O
47
estudo demonstrou ainda que houve relação direta entre Bcl-2 e Fas, sendo o
aumento da propensão à apoptose das células possivelmente acompanhado pela
ligação ao receptor Fas (PATEL et al., 2000; LELIEVRE et al., 2005).
Katsikis et. al. (1995), por sua vez, demonstraram que linfócitos CD4 e CD8
apresentam expressão elevada de moléculas Fas durante a infecção pelo HIV, os
quais são sensíveis à apoptose induzida por anticorpos monoclonais anti-Fas.
A morte celular por apoptose durante a infecção pelo HIV, resultante da
ligação de Fas-L aos receptores Fas (PATEL et al.,2000; LELIEVRE et al., 2005),
pode ocorrer tanto através da associação células T Fas sensíveis às células vizinhas
que expressam Fas-L, quanto através da associação deste ligante à superfície da
própria célula (BRUNNER et al., 1995; DHEIN et al., 1995). Conseqüentemente,
moléculas Fas-L são co-expressadas e a apoptose em células T CD4 pode ser
induzida de forma autócrina e/ou parácrina (VIGNAUX et al., 1995; BADLEY et al,
1997).
A interação de células T CD4 Fas sensíveis às células acessórias infectadas
ou não pelo HIV, como os macrófagos, e que expressam Fas-L associado à
membrana ou solúvel, ocorre tanto pelo contexto da apresentação de antígenos
como ao acaso, promovendo a elevação da expressão de Fas-L e a conseqüente
indução da apoptose das células T CD4 (BADLEY et al., 1997).
Entre os diversos mecanismos podem estar envolvidos na apoptose como
conseqüência da infecção pelo HIV, destacam-se: (1) proteínas virais, como gp 120
e Tat, aceleram o processo de morte celular por apoptose mediada por Fas tanto em
linfócitos infectados (BADLEY et al., 2000; LUM et al., 2003), quanto nos não
infectados (WESTENDORP et al., 1995; BADLEY et al., 2000; AHR et al., 2004), (2)
a rápida reposição de células T CD4 em pacientes infectados pelo HIV (GOUGEON
et al., 1996) como conseqüência processo ativo de regeneração de linfócitos, pode
contribuir substancialmente nos níveis de apoptose desses pacientes, (3) a
produção prejudicada de interleucinas, como IL-2 e IL-12, pode contribuir para o
excesso deste processo de morte celular, posto que estas citocinas podem bloquear
a apoptose em linfócitos CD4 e CD8 (GOUGEON et al., 1993; CLERICI et al., 1994;
LEWIS et al., 1994).
O recente reconhecimento da contribuição da apoptose na depleção das
células T CD4 durante a infecção pelo HIV, estimula a verificação da viabilidade dos
48
ensaios amplamente empregados na quantificação deste processo de morte nas
células mononucleares (SAIKUMAR et al., 1999).
Empregando a análise por citometria de fluxo, o presente trabalho comparou
as performances dos conjuntos de marcadores anexina V-FITC/iodeto de propidio e
calceína AM/homodímero de etídio na avaliação da viabilidade, apoptose e
inviabilidade de células mononucleares, mantidas em meio RPMI 1640 por 24 e 48
horas, a partir de amostras de sangue periférico de voluntários infectados pelo vírus
da imunodeficiência adquirida (HIV).
A análise dos processos de morte celular por citometria de fluxo tornou
possível a determinação reprodutível das populações celulares viáveis, em apoptose
e inviáveis. Desse modo, as células mononucleares correspondentes aos linfócitos
foram diferenciadas e adquiridas de acordo com seu tamanho (forward scatter –
FSC) e granulosidade (side scatter – SSC), através dos programas CELLQuest e
PAINT-A-GATE.
Como esperado, os percentuais médios de apoptose para os tempos de 24 e
48 horas foram significativamente superiores quando as células foram marcadas por
calceína-AM e homodímero de etídio. Por outro lado, os percentuais médios de
células consideradas inviáveis foram significativamente superiores durante a
marcação pela anexina V-FITC/iodeto de propídio, para ambos os períodos de
incubação. Durante a avaliação da viabilidade celular, no entanto, os marcadores
calceína-AM/homodímero de etídio e anexina V-FITC/iodeto de propídio
apresentaram percentuais celulares médios estatisticamente semelhantes após 24 e
48 horas de incubação.
O marcador vital anexina V-FITC tem sido amplamente empregado na
avaliação e quantificação das células em apoptose por citometria de fluxo devido a
sua ligação específica aos resíduos de fosfatidilserina (BLANKENBERG et al., 1998;
LASSUS & HIBNER, 1998; CLARKE et al., 2000; LEE et al., 2004). Assim, células
viáveis são classificadas como anexina negativas, enquanto as apoptóticas, como
anexina positivas (KOOPMAN et al., 1994).
Para avaliar as populações de células inviáveis, o corante fluorescente iodeto
de propídio foi empregado concomitantemente ao marcador anexina V-FITC. Como
a membrana plasmática das células inviáveis apresenta-se comprometida,
marcadores de elevado peso molecular, como iodeto de propídio, tornam-se
49
passíveis de penetrar nestas células e de se incorporar aos fragmentos de DNA
celular (WILLINGHAM, 1999).
Como pode ser observado pelos níveis de apoptose demonstrados pela
anexina V-FITC (42,31% ± 3,24 após 24 horas de incubação; 33,83% ± 2,65 após 48
horas de incubação), as células mononucleares, assim como outras linhagens de
células previamente determinadas por este marcador (KOOPMAN et al., 1994;
VanENGELAND et al., 1997), igualmente exibem os resíduos de fosfatidilserina na
face externa da membrana plasmática.
Os resultados, no entanto, demonstraram que a metodologia que emprega
calceína-AM e homodímero de etídio mostrou-se mais sensível na avaliação e
quantificação de linfócitos em apoptose, durante a infecção pelo HIV, em relação
aos marcadores anexina V-FITC e iodeto de propídio.
Estudos anteriores determinaram que células de uma mesma linhagem celular
podem sofrer o processo de morte celular por apoptose sem demonstrarem
concomitantemente, a translocação da fosfatidilserina (FREY, 1997; GATTI et al.,
1998). Não parece provável que a perda da assimetria fosfolipídica, que ocorre nos
estágios iniciais da apoptose, possa ser restaurada ao longo do processo devido à
depleção dos recursos energéticos nos estágios finais (BEVERS et al., 1996). Assim,
é possível que entre as células mononucleares apoptóticas estudadas, algumas
delas não tenham apresentado a translocação de fosfatidilserina e
conseqüentemente, não tenham sido marcadas pela anexina V-FITC.
A reduzida sensibilidade deste marcador frente à calceína AM pode ainda,
estar relacionada ao fato de que a translocação da fosfatidilserina, que forma a base
da detecção da apoptose nas células mononucleares pela anexina V-FITC, pode
ocorrer também durante a necrose (VERMES et al., 1995; BLANKENBERG et al.,
1998; LASSUS & HIBNER, 1998). Por outro lado, a perda de integridade da
membrana plasmática, que caracteriza a inviabilidade celular, permite o acesso do
marcador à face interna da membrana, resultando em marcação falsamente positiva
pela anexina V-FITC (SAIKUMAR et al., 1999).
Além disso, Lecoeur & Gouegon (1996) demonstraram que os percentuais
médios de apoptose em linfócitos de pacientes infectados pelo vírus HIV
quantificados por iodeto de propídio através da citometria de fluxo, foram
subestimados devido à interferência de granulócitos com este marcador. Esta
interferência deve-se ao enriquecimento de granulócitos associado à infecção pelo
50
HIV, observado na composição das células obtidas após o isolamento com Ficoll-
Paque.
De fato, a interferência positiva ou negativa de granulócitos sobre a
quantificação da apoptose em linfócitos a partir do iodeto de propídio depende da
propensão destas células à apoptose espontânea após curto período de incubação
(STERN et al, 1992, LECOEUR & GOUGEON, 1996). Durante a infecção pelo HIV,
tanto eosinófilos quanto neutrófilos podem estar envolvidos no processo apoptótico,
promovendo assim, a redução dos percentuais médios dos linfócitos que se
encontram em apoptose (LECOEUR & GOUGEON, 1996).
Portanto, a utilização dos marcadores anexina V-FITC e iodeto de propídio
apresentam limitações e podem fornecer informações parciais quanto à
determinação e quantificação das células em apoptose, que devem ser consideradas
quando da escolha de metodologias sensíveis na avaliação deste processo de morte
celular.
O acetóxi-metil-éster de calceína é um composto não fluorescente e
permeável à membrana plasmática, o qual é convertido à sua forma aniônica,
impermeável e fluorescente através de esterases intracelulares, ativas somente em
células íntegras (GATTI et al., 2004). Desse modo, a calceína permite determinar as
células viáveis e em apoptose à medida que avalia o metabolismo celular, posto que
as esterases citosólicas responsáveis por sua conversão à calceína, congregam os
principais componentes do metabolismo energético mitocondrial (KATO et al. 2002).
Em estudo prévio realizado em diferentes células aderentes, como PC 12 e
NIH3T3, demonstrou-se que as metodologias que utilizam como marcadores de
integridade celular o acetóxi-metil-éster calceína (calceína-AM) e homodímero de
etídio (EthD-1), apresentaram-se mais sensíveis na detecção precoce da apoptose
em relação aos marcadores anexina V-FITC/iodeto de propídio (GATTI et al, 1998).
De fato, o presente estudo demonstrou que o marcador calceína AM/
homodímero de etídio foi igualmente útil e mais sensível na quantificação da
apoptose em células mononucleares, como os linfócitos, quando comparado ao
marcador anexina V-FITC/iodeto de propídio, além de permitir definir com clareza as
populações de linfócitos viáveis, em apoptose e inviáveis.
Tais constatações devem-se ao fato de que as características inerentes à
calceína AM, como a retenção de sua fluorescência associada à manutenção da
atividade esterásica, fornecem evidências morfológicas da condensação da
51
cromatina e da segregação das células em vesículas (FLANAGAN PRODUKTE,
2003). Contudo, este marcador é liberado rapidamente do citoplasma celular à
medida que a membrana plasmática torna-se comprometida, mesmo na presença de
atividade esterásica residual (BUSSOLATI et al., 1995).
Assim, a calceína permite quantificar não apenas as células que se
encontram nos estágios inicias da apoptose, mas também os corpos apoptóticos,
que igualmente mantém a integridade da membrana plasmática e portanto, retém a
fluorescência citoplasmática da calceína, mesmo nos estágios tardios deste
processo (BUSSOLATI et al., 1995), embora os mesmos sejam excluídos durante a
seleção por citometria de fluxo, como conseqüência do seu tamanho reduzido.
Por outro lado, informações funcionais a respeito da competência da
membrana plasmática e inviabilidade celular podem ser obtidas através do marcador
homodímero de etídio, que se acumula nos fragmentos de DNA das células cuja
membrana plasmática encontra-se comprometida, mas que não é passível de
penetrar na membrana íntegra (CHEN et al., 2002; FLANAGAN PRODUKTE, 2003).
No presente estudo, os níveis de viabilidade, apoptose e inviabilidade de
linfócitos obtidos pelos marcadores calceína AM/homodímero de etídio
demonstraram correlações significativas entre os níveis dos mesmos grupos
celulares obtidos pelos marcadores anexina V-FITC/iodeto de propídio, após 24 e 48
horas de incubação (Figuras 18-23). Esta constatação permite validar a hipótese de
que ambos marcadores determinam a viabilidade, a apoptose e a inviabilidade de
linfócitos T de modo semelhante, ainda que suas sensibilidades sejam
estatisticamente distintas em relação à quantificação das células que se encontram
em apoptose.
O crescente reconhecimento da morte celular por apoptose como importante
característica da patogênese de doenças, incluindo a progressão da infecção pelo
HIV, tem suscitado o interesse elucidativo nas pesquisas sobre apoptose.
Embora seja claro que tanto a exacerbação como a diminuição deste
processo podem estar envolvidos na expressão dos sintomas de diversas
patologias, muitos temas relacionados à morte celular por apoptose permanecem
por ser esclarecidos. Assim, técnicas que permitam a detecção quantitativa acurada
da apoptose necessitam de constantes avaliações e aperfeiçoamento.
Tendo em vista que a depleção acentuada das células T CD4 durante a
infecção pelo HIV resulta do aumento da apoptose, o que por sua vez, contribui para
52
o aumento da susceptibilidade a infecções oportunistas, o emprego de metodologias
sensíveis de avaliação desse processo, como a calceína AM-EthD-1, pode resultar
em importante mecanismo de acompanhamento da doença.
53
6. CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo permitem concluir que:
1. A utilização dos marcadores calceína AM e homodímero de etídio mostrou-se
eficaz na detecção e quantificação da viabilidade e morte celular por apoptose
em células mononucleares, como os linfócitos, quando comparada à anexina
V-FITC/iodeto de propídio.
2. A metodologia que utiliza calceína AM/homodímero de etídio apresentou-se
mais sensível na determinação e quantificação dos linfócitos em apoptose
associados ao vírus HIV, quando comparada à metodologia que utiliza
anexina V-FITC/iodeto de propídio.
3. As vantagens metodológicas inerentes aos marcadores calceína
AM/homodímero de etídio, como a significativa sensibilidade na quantificação
de linfócitos em apoptose e a clara definição da populações celulares viáveis,
em apoptose e inviáveis, permite elegê-los como metodologia preferencial em
relação aos marcadores anexina V-FITC/iodeto de propídio.
4. Estudos sobre a morte celular por apoptose através dos marcadores calceína
AM/homodímero de etídio devem ser realizados futuramente para que seja
possível avaliar sua reprodutibilidade em populações sadias, bem como
determinar sua utilidade como mecanismo de acompanhamento da infecção
pelo HIV, a partir de correlações com os níveis de linfócitos CD4, CD8 e carga
viral, antes e após o tratamento com terapia anti-retroviral.
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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WATERHOUSE, N.J., SEDELIS, K.A., CLARKE, C.J.P. Granzyme B: the chalk-mark
of a cytotoxic lymphocyte. J. Transl. Med., London, v.2, n.36, p.1-3, 2004.
WEIL, M., RAFF, M.C., BRAGA, V.M. Caspase activation in the terminal
differentiation of human epidermal keratinocytes. Curr. Biol., London, v.9, p.361-367,
1999.
WESTENDORP, M.O., et al. Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by
HIV-1 Tat and gp120. Nature, London, v.375, n.6531, p.497-500, 1995.
WILEY, S. R., et al. Identification and characterization of a new member of the TNF
family that induces apoptosis. Immunity, Massachusetts, v.3, p.673-682, 1995.
WILLINGHAM, M.C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis. J.
Histochem. Cytochem., Baltimore, v.47, n.9, p.1101-1109, 1999.
WYLLIE, A. H. Apoptosis: an overview. Br. Med. Bull, London, v.53, p.451-465, 1997.
70
ANEXO 1
COMPROVANTES DA APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA NO COMITÊ
DE ÉTICA EM PESQUISA COM SERES HUMANOS
71
72
73
APÊNDICE 1
TABELAS COM DADOS E ESTATÍSTICAS DESCRITIVAS PARA OS
MARCADORES ESTUDADOS, APÓS 24 E 48 HORAS DE INCUBAÇÃO
74
TABELA 5. Dados e estatísticas descritivas para os pacientes com tempo de
incubação de 24hs
Amostra Células Inviáveis
(%)
Células Apoptose (%) Células Viáveis (%)
Anexina Calceína Anexina Calceína Anexina Calceína
S1 20,79 15,63 37,85 51,60 39,15 31,79
S2 25,84 14,69 42,76 46,19 29,12 38,70
S3 12,71 7,81 34,64 37,08 51,14 54,10
S4 24,70 33,19 53,49 54,97 18,80 11,19
S5 34,78 25,87 47,08 55,88 18,14 18,25
S6 18,83 19,57 19,77 31,22 61,40 49,21
S7 26,35 20,02 56,00 61,98 15,58 17,34
S8 19,30 14,71 61,47 59,00 19,23 26,29
S9 5,89 5,24 48,21 58,01 45,90 36,75
S10 17,34 13,40 68,83 72,63 13,83 13,97
S11 16,10 10,60 49,70 50,64 34,27 38,76
S12 21,51 22,33 57,32 70,80 20,44 6,55
S13 14,76 8,86 55,26 58,86 29,98 32,28
S14 10,65 7,63 65,02 70,87 24,33 21,50
S15 17,22 8,51 73,22 83,61 9,56 7,88
S16 9,94 4,89 28,49 30,27 61,57 64,84
S17 10,62 14,31 35,75 41,67 53,63 44,02
S18 5,94 2,49 15,88 14,92 78,18 82,59
S19 14,01 7,65 33,56 32,65 52,43 59,70
S20 19,31 12,08 39,22 41,74 41,47 46,18
S21 17,16 11,85 32,82 38,14 50,02 50,01
S22 13,93 10,21 34,12 37,28 51,95 52,51
S23 12,24 7,29 21,36 19,07 66,40 73,64
S24 18,15 19,13 22,78 28,48 59,07 52,39
S25 9,76 7,50 23,09 26,12 67,15 66,38
Mínimo 5,89 2,49 15,88 14,92 9,56 6,55
Máximo 34,78 33,19 73,22 83,61 78,18 82,59
Mediana 17,16 11,85 39,22 46,19 41,47 38,76
Média 16,71 13,02 42,31 46,95 40,51 39,87
Erro Padrão 1,34 1,44 3,24 3,56 3,95 4,22
75
TABELA 6. Dados e estatísticas descritivas para os pacientes com tempo de
incubação de 48hs
Amostra Células Inviáveis
(%)
Células Apoptose
(%)
Células Viáveis
(%)
Anexina Calceína Anexina Calceína Anexina Calceína
P1 33,46 21,67 39,99 41,05 26,55 37,28
P2 21,16 16,19 17,29 19,74 61,53 63,93
P3 14,54 12,65 8,06 16,29 76,77 70,80
P4 20,81 11,22 21,34 19,57 56,55 69,19
P5 34,35 26,43 25,43 32,28 40,22 41,29
P6 36,44 22,32 30,11 43,49 32,53 33,88
P7 34,76 31,00 32,39 40,77 32,85 28,23
P8 36,46 31,69 34,07 35,74 29,47 32,57
P9 41,54 26,82 29,91 38,87 27,20 33,59
P10 40,21 44,83 47,70 48,40 12,09 6,77
P11 29,45 24,50 44,57 40,04 25,98 35,46
P12 33,42 33,75 47,01 47,48 15,62 17,40
P13 31,33 28,18 44,21 43,92 24,46 27,90
P14 25,50 21,33 44,39 40,34 30,01 38,33
P15 28,57 27,71 67,73 64,79 3,70 7,50
P16 38,11 34,20 49,19 58,90 12,70 6,90
P17 16,53 14,24 26,55 33,98 56,92 51,78
P18 17,98 15,45 26,68 36,44 55,34 48,11
P19 19,84 12,08 32,21 38,19 47,95 49,73
P20 19,62 21,18 49,50 56,30 30,88 22,52
P21 19,89 18,08 29,62 37,97 50,49 43,95
P22 14,91 7,22 15,69 26,28 69,40 66,50
P23 8,26 5,17 23,11 18,15 68,63 76,68
P24 9,35 7,22 25,60 26,38 65,05 66,40
P25 13,51 9,69 33,35 36,51 53,14 53,80
Mínimo 8,26 5,17 8,06 16,29 3,70 6,77
Máximo 41,54 44,83 67,73 64,79 76,77 76,68
Mediana 25,50 21,33 32,21 38,19 32,85 38,33
Média 25,60 20,99 33,83 37,67 40,24 41,22
Erro Padrão 2,01 2,00 2,65 2,47 4,06 4,10
76
APÊNDICE 2
TABELAS COM OS RESULTADOS ESTATÍSTICOS DOS MARCADORES
ESTUDADOS
77
TABELA 7. Estatísticas descritivas para o percentual de células viáveis – 24hs
Marcador n Média Erro Padrão Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 39,87 4,22 0,64 0,49 0,6284
Anexina V-FITC/PI 25 40,51 3,95
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Não existe diferença entre os marcadores estudados: p=0,6284
n= Número de amostras estudadas.
TABELA 8.
Estatísticas descritivas para o percentual de células em apoptose – 24hs
Marcador n Média Erro Padrão Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 46,95 3,56 -4,64 -5,08 <0,0001
Anexina V-FITC/PI 25 42,31 3,24
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Existe diferença entre os marcadores estudados: p<0,0001
n= Número de amostras estudadas.
TABELA 9.
Estatísticas descritivas para o percentual de células inviáveis – 24hs
Marcador n Média Erro Padrão Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 13,02 1,44 3,69 4,37 0,0002
Anexina V-FITC/PI 25 16,71 1,34
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Existe diferença entre os marcadores estudados: p=0,0002
n= Número de amostras estudadas.
78
TABELA 10. Estatísticas descritivas para o percentual de células viáveis – 48hs
Marcador n Média Erro Padrão Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 41,22 4,10 -0,98 -0,80 0,4290
Anexina V-FITC/PI 25 40,24 4,06
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Não existe diferença entre os marcadores estudados: p=0,4290
n= Número de amostras estudadas.
TABELA 11.
Estatísticas descritivas para o percentual de células em apoptose –
48hs
Marcador n Média Erro Padrão Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 37,67 2,47 -3,85 -3,62 0,0014
Anexina V-FITC/PI 25 33,83 2,65
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Existe diferença entre os marcadores estudados: p=0,0014
n= Número de amostras estudadas.
TABELA 12.
Estatísticas descritivas para o percentual de células inviáveis – 48hs
Marcador n Média
Erro
Padrão
Diferença t
Valor
p
Calceína AM/EthD-1 25 20,99 2,00 4,61 5,05 <0,0001
Anexina V-FITC/PI 25 25,60 2,01
Teste t para dados pareados, com
α
de 5%:
Existe diferença entre os marcadores estudados: p<0,0001
n= Número de amostras estudadas.
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