( PDF ) Formação de s-nitrosomiosina sob condições fisiológicas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Instituto de Bioquímica Médica

Laboratório de Química Fisiológica da Contração Muscular

Formação de S-nitrosomiosina sob condições fisiológicas

Cícero Figueiredo Freitas

Rio de Janeiro

2009

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Cícero Figueiredo Freitas

FORMAÇÃO DE S-NITROSOMIOSINA SOB CONDIÇÕES

FISIOLÓGICAS

Dissertação de Mestrado

apresentada ao Programa de Pós-

Graduação de Química Biológica,

Instituto de Bioquímica Médica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em

Ciências (Química Biológica).

Prof

Martha M.Sorenson

Orientadora

Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica/ICB/UFRJ

Rio de Janeiro

2009

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iii

FOLHA DE APROVAÇÃO

Cícero Figueiredo Freitas

FORMAÇÃO DE S-NITROSOMIOSINA SOB CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS

Rio de Janeiro, _____ de_____________ de 2009

Banca Examinadora:

______________________________________

Martha M.Sorenson

Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica/IBqM/UFRJ

Orientadora

______________________________________

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Professora Adjunta do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/IBCCF/UFRJ

______________________________________

Paulo César de Carvalho Alves

Professor Associado do Instituto de Bioquímica Médica/IBqM/UFRJ

______________________________________

Antonio Galina Filho

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/IBqM/UFRJ

______________________________________

Marcus Fernandes de Oliveira

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/IBqM/UFRJ

Revisor e Suplente Interno

______________________________________

Roberto Takashi Sudo

Professor Titular do Instituto de Ciências Biomédicas/ICB/UFRJ

Suplente Externo



FICHA CATALORÁFICA

FIGUEIREDO-FREITAS, Cícero.

FORMAÇÃO DE S-NITROSOMIOSINA SOB CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS. Cícero

Figueiredo Freitas

/ Rio de Janeiro: CCS, UFRJ, 2009

Rio de Janeiro, UFRJ, programa de Pós-Graduação em Química Biológica, 2009

XV fls, 67 fls

Dissertação: Mestrado em Química Biológica

1 – Músculo Esquelético 2- Óxido Nítrico 3 – S-nitrosação



Este trabalho foi realizado no Laboratório de Química Fisiológica da Contração

Muscular no Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro,

sob a orientação da Professora Martha M. Sorenson, na vigência de uma bolsa cedida

pela CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), de auxílios concedidos pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de

Janeiro (FAPERJ) e pelo Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX).



Dedico esta tese a minha

filha Maria Clara, a minha

esposa Paula e a minha

família.



vii

AGRADECIMENTOS

A Deus por permitir-me chegar até aqui e possibilitar que eu consiga concluir

bem mais um projeto em minha vida. E, também, realizar o maior e mais sublime

experimento que a vida pode proporciona a um ser humano: Maria Clara, “Se

soubesse tudo o que sei agora, erraria tudo exatamente igual”.

A Maria Clara, a Adelina, a Paula Maria, a Carolina, a Denazir e a Martha.

Mulheres que me ajudaram a conquistar essa vitória tão importante em minha vida.

A minha esposa Paula e a minha filha Maria Clara por me ajudarem nesse

momento importante e por superarem mais esse momento.

A meus pais Alcyro e Adelina pela educação e caráter que me passaram por

toda minha vida e me fizeram tornaram um homem mais justo e sensato. A minha

irmã Carolina por ser uma companheira incondicional. A minha Tia/irmã Taís por

companheira.

A Adriana, Arthur e Amanda por serem nossos anjos protetores.

A tia Denazir por ser como uma mãe e por me ajudar a construir minha nova

família.

A tia Márcia e tia Liana por serem pessoas especiais e indispensáveis em

minha vida.

A Martha por sua paciência, dedicação e por me permitir crescer

cientificamente. Em nenhum momento em minha vida, imaginei conhecer alguém tão

justa e sensata como ela.

Ao amigo e orientador Leonardo Nogueira por me ensinar como pensar

cientificamente e como prosseguir com os experimentos e por ser um amigo para

todas as horas.

Aos amigos de laboratório Daniel, Renato, Tiago, José Renato, Jamila, José

Henrique, Marcelo Sant’anna, Luciana, Teresa Raquel, Fábio, Verônica, Gustavo,

Gabriel, Dionísio, Helena e Lidiane de laboratório que dividiram todos os dias de

alegria e tristeza no trabalho. Em especial a Raquel por me receber no laboratório e

me ensinar a dar os primeiros passos no laboratório.

Agradeço ao Marcelo Sant’anna e a Débora “Toquinho da Alegria” que me

ensinaram sobre convivência e amizade.

Agradeço aos amigos Elizandro (Piu), Leonardo Domingos, Daniel Reynaldo,

Leonardo Nogueira e Renato de Paula por serem os irmãos que a vida me deu.

Agradeço aos amigos dos lab`s dos professores Sérgio Ferreira (Jordano,

Teresa Raquel, Adriano Sebolela, Ana Paula), Leopoldo de Méis (Luiza Ketzer),

Robson Monteiro, Russolina Zingali e Vivian Rumjanek (André – técnico), Marcus



viii

Oliveira, Antonio Galina e por tantos empréstimos de materiais em todos os

laboratórios do IBqM.

Agradeço aos amigos da comissão da semana de pós-graduação pelas

reuniões e conversas descontraídas.

Agradeço a algumas pessoas que não estão presentes, mas que ainda zelam

por mim: Tios Sérgio e Darcy.

Gostaria de agradecer, especialmente, a minha filha Maria Clara por me trazer

paz, alegria, sensatez, tranquilidade e me fazer crescer como homem e pai.



ABREVIAÇÕES

AA Ácido ascórbico

BSA Albumina de soro bovino

Biotina-HPDP (N-(6-(Biotinamida)hexil)-3'-(2'-piridilditio)-propionamida

DEANO Dietilamina-NONOato

DTNB 5,5'-Ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)

DTT Ditiotreitol

GSH Glutationa

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGTA Ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetilester)-N,N,N’,N’-tetra-acético

FKBP12 Fujimicina (FK506) ligada a proteína de 12 KDa

GSSG Dissulfeto de glutationa

GSNO S-nitrosoglutationa

GSNOR S-nitrosoglutationa redutase

HEN HEPES, EDTA e neocuproína

LC Cadeia leve de miosina

LMM Meromiosina leve

LPS Lipopolissacarídeo

MMTS Metilmetanotiosulfonato

•

Óxido nítrico radical

Cátion nitrosônio

Ânion nitroxil

NOS Óxido nítrico sintase

ONOO

Peroxinitrito

PBS Tampão fosfato

PDZ

Proteina de densidade pós-sináptica (PSD95), Grande disco

supressor tumoral em Drosofila (DlgA), e proteina da zonula de

oclusão-1 (zo-1).

Logarítimo negativo da constante de equilíbrio para

protonação

PMSF Fenilmetanosulfonilfluoreto

ROS Espécies reativas de oxigênio



RNS Espécies reativas de nitrogênio

Radical tiil

RSNO S-nitrosotiol

RyR1 Receptor rianodina muscular esquelético

S1 Subfragmento-1 da miosina

S2 Subfragmento -2 da miosina

SDS-PAGE

Eletroforese em gel de poliacrilamida com duodecil sulfato de

sódio

TBS-T Tampão de amostra Tris-HCl – Tween



LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 A, B e C..........................................................................................................3

Figura 2 A e B...............................................................................................................5

Figura 3......................................................................................................................22

Figura 4......................................................................................................................23

Figura 5......................................................................................................................27

Figura 6......................................................................................................................28

Figura 7......................................................................................................................30

Figura 8......................................................................................................................32

Figura 9......................................................................................................................37

Figura 10....................................................................................................................38

Figura 11 A, B e C......................................................................................................40

Figura 12 A e B...........................................................................................................42

Figura 13 A e B...........................................................................................................44

Figura 14 A e B...........................................................................................................46

Figura 15 A e B...........................................................................................................47

Figura 16....................................................................................................................48

Figura 17....................................................................................................................51

Tabela 1......................................................................................................................38

Esquema 1...................................................................................................................6



xii

Sumário

I. INTRODUÇÃO..........................................................................................................1

I.1 - Miosina.............................................................................................................2

I.2 – Grupamentos tióis (-SH) da miosina...............................................................7

I.3 – Radicais na biologia celular............................................................................9

I.3.1 - Óxido nítrico no tecido muscular esquelético e exercício...................10

I.4 – S-nitrosotióis de baixo e alto peso molecular................................................13

I.5 – Denitrosação.................................................................................................15

I.6 – Fatores regulatórios de nitrosação e denitrosação.......................................17

II. - OBJETIVOS.........................................................................................................21

II.1 – Objetivo geral...............................................................................................21

II.2 – Objetivos específicos...................................................................................21

III. - MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................22

III.1 – Doadores de NO.........................................................................................22

III.1.1 – S-nitrosoglutationa (GSNO).............................................................22

III.1.2 – DietilaminaNONOato (DEANO) ...........................................................22

III.2 – Purificação de miosina................................................................................24

III.3 – Dosagem de proteína..................................................................................24

III.4 – Atividade Mg

ATPásica da miosina...........................................................25

III.5 – Detecção de S-nitrosotióis por Griess-Saville.............................................26

III.6 – Técnica de troca de resíduo S-nitrosados por tiobiotinilados (Biotin Switch

Technique)............................................................................................................28



xiii

III.7 – Fibras descascadas....................................................................................31

III.8 – S-nitrosação e denitrosação in vitro............................................................32

III.9 – Detecção de estresse nitrosativo no exercício............................................33

III.10 – Eletroforese..............................................................................................34

III.11 – Western blot...................................................................................................34

III.12 – Reagentes......................................................................................................35

III.13 – Análise estatística...........................................................................................35

IV. - RESULTADOS...................................................................................................36

IV.1 – Exercício e estresse nitrosativo..................................................................36

IV.2 – S-nitrosação e denitrosação de miosina.....................................................39

IV.3 – Efeito da S-nitrosação na atividade da miosina sob condições

fisiológicas.............................................................................................................46

V. - DISCUSSÃO........................................................................................................49

VI. - CONCLUSÕES...................................................................................................55

VII. - REFERÊNCIAS.................................................................................................56



xiv

RESUMO

Cícero Figueiredo Freitas. Formação de S-nitrosomiosina sob condições fisiológicas.

Rio de Janeiro, 2009. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Instituto de

Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Óxido nítrico (NO

•

) é produzido no músculo esquelético pela enzima NO sintase

neuronal e induz a S-nitrosação (-SNO) de proteínas que alteram a função contrátil,

mas os efeitos em miofibrilas não são conhecidos. Aqui nós investigamos a S-

nitrosação de proteínas sob condições fisiológicas in vitro e in vivo. Ratos Sprague-

Dawley foram submetidos a exercício de natação de baixa e alta intensidade por 30

e 4.7 min, respectivamente, no último caso, com 14% do peso corporal adicionado a

cauda do animal, e o conteúdo de proteína-SNO foi analisado pelo método de

Griess/Saville.em músculo EDL e sóleo. Em ambos os músculos (EDL e sóleo) o

conteúdo de nitrito aumentou e em EDL, a formação de -SNO também aumentou

(P<0.05; n=9) comparada ao controle. As proteínas alvo para formação de –SNO no

músculo em repouso e exercitado foram acessadas usando a técnica do biotin

switch. Miosina foi o principal alvo para formação de –SNO em exercício de alta

intensidade. Para mimetizar nitrosação/denitrosação em miócitos, nós incubamos o

homogenato de músculo sóleo e EDL com S-nitrosoglutationa (GSNO - 40 µM),

seguido ou não por glutationa (GSH – 5 mM). A formação de S-nitrosomiosina

aumentou com GSNO e ocorreu denitrosação parcial com GSH, mostrando que

susceptibilidade a nitrosação/denitrosação varia e que existem populações estáveis

e instáveis de –SNO. Em fibras musculares “descascadas” (sem sarcolema)

incubadas por 30 min com 0-1000 µM GSNO e processadas pela técnica do biotin-

switch, miosina e actina foram os principais alvos para -SNO. Condições favoráveis

para formação de -SNO (baixo pH e baixo Po

) são produzidas com exercício de alta

intensidade e foram testadas in vitro utilizando em miosina purificada. GSNO (5 μM,

1 h) inibiu a atividade MgATPásica de miosina isolada independentemente do pH

(pH 6 – 8). O efeito da dietilaminaNONOato (DEANO – um doador de NO

•

) foi

medido em baixo Po

(1%) para mimetizar as condições celulares. A atividade da

miosina foi inibida por DEANO apenas em Po

fisiológica (1%); em Po

atmosférica

(21%) não foi afetada. Os resultados sugerem que miosina é um importante alvo

para S-nitrosação no músculo esquelético e que formação de –SNO pode inibir a

função contrátil durante estresse nitrosativo.



ABSTRACT

Cícero Figueiredo Freitas. S-nitrosomyosin formation under physiological conditions.

Rio de Janeiro, 2009. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Instituto de

Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Nitric oxide (NO

•

) is produced in skeletal muscle by neuronal NO synthase and

induces S-nitrosation (-SNO) in proteins that alter contractile function, but its effect on

myofibrils is not known. Here we investigated protein S-nitrosation in physiological

conditions in vitro and in vivo. Sprague-Dawley rats were subjected to low and high

intensity swimming for 30 min or 4.7 min, respectively in the latter case with 14% of

body weight added to the tail, and protein–SNO content was analyzed by the

Griess/Saville method in EDL and sóleo muscles. In both muscles (EDL and sóleo)

nitrite content increased and in EDL, -SNO formation increased significantly (P<0.05;

n=9) compared to controls. Proteins that were targets of –SNO formation in resting

and exercised muscles were ascertained using the biotin switch. Myosin was the

main target of –SNO formation at high exercise intensity. To mimic

nitrosation/denitrosation in myocytes, we incubated homogenates of EDL and sóleo

muscle with S-nitrosoglutathione (GSNO - 40 µM), followed or not by glutathione

(GSH – 5 mM). S-nitrosomyosin formation increased with GSNO and partial

denitrosation occurred with GSH, showing that susceptibility to

nitrosation/denitrosation varies and that there are stable and unstable populations of

–SNO. In skinned fibers incubated for 30 min with 0-1000 µM GSNO and processed

by the biotin-switch method. Myosin and actin were the main targets for -SNO.

Favorable conditions for -SNO formation, (low pH and low Po

) are both produced

with high intensity exercise and here were tested using purified myosin in vitro.

GSNO (5 μM, 1 h) inhibited MgATPase activity of isolated myosin by 50%, regardless

of pH (pH 6 – 8). The effect of diethylamineNONOate (DEANO - an NO

•

donor) was

measured at low (1%) Po

to mimic intracellular conditions. The activity of myosin

was inhibited by DEANO only at physiological Po

(1%); at atmospheric Po

(21%)

there was no effect. Taken together, these results suggest that myosin is an

important target for S-nitrosation in skeletal muscle and that -SNO formation may

inhibit contractile function during nitrosative stress.



I - Introdução

O corpo humano contém três tipos de músculos, o músculo liso que compõe

artérias, veias e intestino; o esquelético, que nos permite movimentar, gesticular e

exercitar-nos; o cardíaco que tem por função principal manter o fluxo sanguíneo

corporal. A partir desse momento, será abordado apenas o tecido muscular

esquelético. Este tecido é distribuído por todo o corpo; existem mais de 600

músculos que são fixados nos 206 ossos do esqueleto humano (Vianna A.L., 1981).

A base estrutural do mecanismo pelo qual o músculo é capaz de desempenhar sua

função foi proposta por H. E. Huxley em 1954, e a teoria dos filamentos deslizantes é

muito bem aceita até hoje (Huxley, 2004). Através das proteínas contráteis a célula

muscular esquelética é capaz de converter energia química (ATP) em energia

mecânica (contração muscular).

O desempenho muscular é modulado por metabólitos produzidos durante a

atividade contrátil; uma parte desses metabólitos são as espécies reativas de

oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). O aumento na atividade contrátil do músculo

esquelético acarreta em um aumento da produção dessas espécies incluindo uma

variedade de radicais. Radicais são moléculas com um ou mais elétrons

desemparelhados (Halliwell B. & Gutteridge J.M.C., 2007). Nas células, os radicais

sinalizam através de modificações redox reversíveis ou irreversíveis em proteínas,

alterando indiretamente a função celular (Forrester & Stamler, 2007; Hausladen &

Stamler, 1999).

Nas proteínas, um dos principais alvos para modificação redox é o grupamento

sulfidrila. Os radicais são capazes de modular a força, a velocidade de



encurtamento, a eficiência do acoplamento excitação-contração e a capacidade de

hidrólise de ATP (Powers & Jackson, 2008; Reid, 1999).

O óxido nítrico (NO

•

)

é um radical que promove modificação nos grupos

sulfidrila, e uma das modificações provocadas pelo NO

•

é a S-nitrosação (ligação

covalente de NO a um tiol protéico) que vem emergindo nos últimos 15 anos como

uma das principais vias de modulação das funções celulares (Gaston, 1999; Hess et

al., 2005; Hogg, 2002). Esse radical tem papel importantíssimo na regulação da

contração muscular (Stamler & Meissner, 2001), sendo que a produção de óxido

nítrico é dependente da intensidade de estimulação elétrica do músculo (Silveira et

al., 2003). Os alvos para as modificações redox podem ser protegidos por

antioxidantes não enzimáticos e enzimáticos (Meister & Anderson, 1983; Powers &

Jackson, 2008).

A miosina é uma das proteínas do aparato contrátil do músculo (~55% do

conteúdo celular) e apresenta na sua sequência primária muitos grupos sulfidrila

(Lowey et al., 1969). Segundo dados do nosso laboratório, estes sofrem

modificações redox pelo óxido nítrico, assim alterando a função protéica in vitro

(Nogueira, 2008). Entretanto ainda não foi mostrada a formação de S-nitrosomiosina

ou sua denitrosação sob condições fisiológicas.

I.1 - Miosina

As proteínas contráteis compõem os sarcômeros do músculo esquelético.

Estas estruturas são formadas por filamentos finos (Banda I, composta

principalmente por actina) e filamentos grossos (Banda A, composta principalmente

por miosina) e sua extensão vai de uma linha Z a outra (Vianna A.L., 1981), como



mostrado na Figura 1. Será abordada, a partir desse momento, a proteína mais

abundante na célula muscular e que compõe o filamento grosso: a miosina.

BandaI BandaA

DiscoZ LinhaM DiscoZ

Figura 1: Imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão mostrando a

disposição de filamentos no sarcômero. (A) Mostra as bandas I (Isotrópica) e A

(anisotrópica) em um sarcômero estendido e (B) linhas Z (actinina) e M (miomesina)

em um sarcômero encurtado. Em A, a banda I está maior que em B, onde também

há uma aproximação das linhas Z e o tamanho da banda A não foi alterado (é

importante destacar que nenhum filamento tem seu tamanho alterado). Estas

observações forneceram os primeiros indícios que o filamento fino, componente

principal da banda I, deslizava sobre a banda A composta principalmente pelo

filamento grosso (Huxley, 2004). C, Miosina solubilizada em alta força iônica e

visualizada por marcação negativa em microscopia eletrônica. Cada molécula

consiste em duas cabeças, dois pescoços e uma cauda.

O filamento grosso apresenta-se com uma estrutura única ao centro e com

pequenas projeções nas extremidades. Para conhecer melhor o filamento grosso,

Slayter & Lowey (1967) homogeneizaram o músculo de coelho em tampão de alta

força iônica, e após a diluição observaram por microscopia eletrônica de transmissão



que a proteína mais abundante (miosina) se apresentava com uma longa cauda,

porém com duas cabeças (Figura 1C).

Para melhor compreender a função da miosina na célula muscular, a proteína

foi fragmentada por incubação com tripsina para ser estudada a função de cada

parte da miosina. O peso molecular do hexamero é de ~520 KDa e a cadeia pesada

subdivide-se em três tipos de fragmento após quimiotripsinização limitada: cabeça

ou S1 (2 unidades do subfragmento-1, 120 KDa), pescoço ou S2 (2 unidades do

subfragmento-2, 40 KDa) e cauda ou LMM (1 unidade de meromiosina leve, 150

KDa) (Slayter & Lowey, 1967). Mais tarde, com a descoberta de outras isoformas, a

miosina do músculo esquelético foi denominada miosina II (por ter duas cabeças)

(Mermall et al., 1998). Há muitos anos sabia-se que o músculo utiliza ATP como

substrato para diversas reações (Engelhardt W.A. & Ljobimowa M.N., 1939). Ficou

estabelecido que a miosina tem um sítio para ligação e clivagem de ATP e outro

para ligação de actina, em posições opostas (Rayment et al., 1993b), como

mostrado na Figura 2.

O S2 ou pescoço tem por função transmitir a mudança conformacional que

ocorre com hidrólise do ATP no sítio catalítico para a cauda, para que haja o

deslizamento entre os filamentos fino e grosso (Blankenfeldt et al., 2006). A cauda,

por ser insolúvel a baixa força iônica, associa-se com outras moléculas de miosina,

formando o filamento grosso, mantendo estável o dímero que compõem as

moléculas de miosina e o conjunto de caudas o filamento grosso (Lowey et al.,

1969).



Figura 2: A, Subfragmento-1 apresenta um domínio de estrutura globular próximo

ao N-terminal com sítio de ligação para nucleotídeo e outro para actina; e outro

domínio filamentoso, próximo ao C-terminal, ao qual se associam as cadeias leves

(Rayment, 1996). As cores indicam domínios produzidos por tripsinólise (50 KDa

superior e inferior, 25 KDa e 20 KDa). Parte da cauda foi eliminada para resolução

da estrutura tridimensional do S1. B, a ilustração mostra com detalhes as proteínas

que compõem o sarcômero e a disposição do filamento grosso (composto

principalmente por miosina) e do filamento fino (composto principalmente por actina).

As pequenas projeções que emergem do filamento grosso são cabeça e pescoço da

miosina, que interagem com a actina (Sparrow & Schock, 2009).

Domínio de

50 KDa inferio

Domínio Conversor

20 KDa

Sítio de

ligação do

nucleotídeo

Domínio de

50 KDa superior

Sítio de

ligação

de actina

Cadeia leve

regulatória

Cadeia leve

essencial

Braço de

alavanca

Switch 2

25 KDa

Actina LinhaM DiscoZ

ComplexoTroponina‐Tropomiosina

BandaI BandaA BandaI

Sarcômero



Em cada S1 existem duas cadeias leves (LC): LC-1 e 3 são denominadas

“essenciais”, com peso molecular de 25 KDa e 16 KDa respectivamente, e LC-2 é

denominada “regulatória”, com peso molecular de 20 KDa (Rayment, 1996).

A miosina é capaz de hidrolisar ATP apenas na presença de cofatores iônicos

(cátions mono ou divalentes) que também regulam a velocidade de hidrólise. Na

presença de K

ou NH

, a atividade pode aumentar 20 ou 40 vezes,

respectivamente, em relação à atividade na presença de Mg

(Seidel, 1969a;

Seidel, 1969c). A afinidade da miosina por diferentes nucleotídeos (ATP, ITP, UTP,

GTP e CTP) também é diferente dependendo do cátion complexado ao nucleotídeo

(Hasselbach, 1957). Entretanto, o substrato que simula melhor o sistema celular é o

complexo MgATP

AM* → AM.ATP ↔ AM’.ATP ↔ A-M”.ADP.Pi ↔ AM’.ADP.Pi ↔ AM*ADP ↔ AM*

+ATP - A( (+A -Pi -ADP

M'.ATP ↔ M”.ADP.Pi

Esquema 1: Ciclo catalítico da miosina (M) na presença de actina (A). ATP se liga à

actomiosina (AM), diminuindo a afinidade entre as proteínas e dissociando a actina.

A clivagem do ATP em ADP e Pi (M.ADP.Pi) ocorre na miosina. Em seguida, a

actomiosina é novamente formada. O passo limitante no ciclo catalítico é a liberação

de Pi do sítio de hidrólise e, em seguida, ocorre à liberação de ADP.

Outro fator que também interfere na atividade da miosina é o pH, sendo que o

pH ótimo para atividade da miosina na presença de Mg

é pH 9.0 (Singher &

Meister, 1945).

A atividade Mg

-ATPásica da miosina é a que melhor representa a condição

fisiológica, porém é menor que a atividade Ca

ou K

ATPásica. Na presença de

actina, a atividade Mg

-ATPásica é potencializada em cerca de 50-100x (Sellers &

Goodson, 1995). Em seu ciclo catalítico, a miosina tem forte afinidade para actina na

ausência de ATP e, na presença de ATP, essa afinidade é diminuída. Durante o



ciclo catalítico da miosina, a hidrólise de ATP em ADP e Pi tem como passo limitante

a saída de Pi do sítio de hidrólise (Esquema 1). Na presença de actina, esse passo é

acelerado. Após esse passo, a actina volta a ter alta afinidade pela miosina e, para

que haja novamente o ciclo, é necessário que uma nova molécula de ATP se ligue

ao sítio catalítico (Sellers & Goodson, 1995; Vianna A.L., 1981).

O ciclo catalítico da miosina e sua interação com a actina podem ser alterados

por modificações covalentes em cisteínas presentes na miosina. Serão abordados a

seguir alguns efeitos decorrentes dessas modificações.

I.2 - Grupamentos tiol (–SH) da miosina

Muitas proteínas sofrem modificações redox, principalmente, no aminoácido

cisteína, uma vez que este é o único aminoácido que apresenta em sua cadeia

lateral o grupamento tiól ou sulfidrila (-SH), que apresenta um pK

em torno de 8,5.

Embora existam resíduos de cisteína com variados valores de pK

(Sethuraman M et

al., 2006), essa variação está relacionada à região da proteína em que a cisteína se

encontra e ao compartimento (mitocôndria, retículo sarcoplasmático) no qual a

proteína está localizada, podendo alterar a carga do tiol passando a ânion tiolato

(CysS

). Esta forma é mais facilmente oxidada do que um grupo tiol reduzido

(Winterbourn & Metodiewa, 1999). Um grupamento tiol de uma proteína pode sofrer

modificações pós-traducionais como, por exemplo, acilação, S-nitrosação e oxidação

(tiolação ou formação de ácido sulfênico, sulfínico ou sulfônico) (Hess et al., 2005;

Konorev et al., 2000; Roth et al., 2006; Saurin et al., 2004).

A miosina apresenta em sua sequência primária 42 cisteínas (~1% de 3400

aminoácidos). A medida do número de tióis na miosina pode variar dependendo da



maneira que é medido, podendo ser encontrado três pontes dissulfeto no caso de

soluções com pequena contaminação de metais e, em soluções livres de metais,

pode-se encontrar os 42 grupos sulfidrila reduzidos (Lowey et al., 1969).

Algumas modificações redox em tióis da miosina são conhecidas por alterar

sua atividade (Seidel, 1969b; Seidel et al., 1970; Saurin et al., 2004). Modificações

químicas em duas cisteínas da miosina por DTNB e N-etilmaleimida modulam a

capacidade de hidrolisar ATP e a afinidade por actina (Kielley & BRADLEY, 1956).

Essas cisteínas denominadas SH1 (Cys707) e –SH2 (Cys697) da miosina têm sido

alvo de muitos estudos, pois estão localizadas em regiões da proteína que se

aproximam e se afastam durante o ciclo catalítico (Kielley & BRADLEY, 1956; Seidel

et al., 1970; Walser et al., 1981). Além disso, existem duas classes de grupamentos

tiois: o grupo S

, mais reativo a agentes S-tiolantes e alquilantes; e o grupo S

, o

menos reativo. Ambos os grupamentos quando modificados, modulam a atividade

catalítica da miosina.

Os tióis –SH1 e –SH2 têm um importante papel na atividade ATPásica da

miosina. Mudanças conformacionais durante o ciclo de hidrólise de ATP estão

relacionadas aos estados de oxidação desses tióis, devido à sua localização

próxima ao sítio de hidrólise de ATP (Kielley, 1964; Seidel et al., 1970; Seidel, 1972).

Estas cisteínas localizam-se entre o sítio de ligação do ATP e a fenda próxima ao

sítio de ligação com actina (Rayment et al., 1993b). Ainda existem outros

grupamentos sulfidrila em regiões mais acessíveis na superfície. O subfragmento-1

(cabeça) possui 11 cisteínas (Rayment et al., 1993a), que são suscetíveis à

modificação redox como a formação de –SOH (Saurin et al., 2004). Outras espécies

reativas também podem modificar a atividade ATPásica da miosina, como o ONOO



(Tiago et al., 2006). Entretanto, ainda não foi mostrado como o óxido nítrico e seus

produtos de oxidação reagem com a miosina, e nem se eles modificam a atividade

da miosina em condições fisiológicas.

I.3 - Radicais na biologia celular

O radical é um átomo ou molécula que apresentam um ou mais elétrons

desemparelhados. O uso da palavra “livre” depois de “radical” foi introduzida de

forma desnecessária, pois todo radical é livre (Halliwell B. & Gutteridge J.M.C., 2007;

Koppenol & Traynham, 1996; Koppenol, 1997). A primeira molécula radical

(trifenilmetila) foi descrita pelo russo Moses Gomberg, por volta de 1900 (Augusto,

2006). Com o passar dos anos, vários outros radicais foram descritos como, por

exemplo, o anion superóxido (O

•

) e o óxido nítrico (NO

•

), possuindo o

desemparelhamento nos átomos de oxigênio e nitrogênio, respectivamente.

A primeira evidência que os radicais eram encontrados em materiais biológicos

foi detectada por EPR (espectrometria de ressonância eletrônica paramagnética) em

músculo de coelho (Commoner et al., 1954). Neste mesmo ano, foi mostrado que

radiação ionizante e oxigênio geram danos celulares (Gerschman et al., 1954).

Alguns anos mais tarde, McCord & Fridovich (1969) identificaram a enzima

superóxido dismutase capaz de converter superóxido (O

•

) a peróxido de hidrogênio

), detoxificando a célula (McCord & Fridovich, 1969). Anos mais tarde, foram

mostrados outros radicais sendo produzidos em células.

Um radical que ganhou grande importância na área celular foi o óxido nítrico,

que era conhecido apenas por sua toxicidade como um gás, até meados dos anos

80; apesar das evidências benéficas que a nitroglicerina (um potente doador de NO)



era utilizada para tratamento de angina (Ignarro, 2002). Em 1985 foi publicado na

revista Proceedings of the National Academy of Sciences que macrófagos de

camundongos produziam nitrito e nitrato em resposta ao tratamento das células com

lipopolissacarídeo (LPS – agente pró-inflamatório) de E. coli; dois anos mais tarde,

foi visto que células endoteliais produziam óxido nítrico (Stuehr & Marletta, 1985;

Palmer et al., 1987).

Em 1990, foi purificada e caracterizada a enzima que produz NO

•

em células, a

óxido nítrico sintase (Bredt & Snyder, 1990). Hoje é sabido que sua expressão

ocorre em quase todas as células de mamíferos (Alderton et al., 2001), entre elas a

célula muscular esquelética (Kobzik et al., 1994); e que o radical produzido é capaz

de modular a função celular (Eu et al., 2003).

I.3.1 - Óxido nítrico no tecido muscular esquelético e exercício

Os estudos dos efeitos do óxido nítrico no músculo esquelético aumentaram

quando foi detectada a expressão do mRNA da nNOS em células musculares

esqueléticas (Nakane et al., 1993). Mais tarde, foi visto que a enzima óxido nítrico

sintase apresenta três isoformas: neuronal (nNOS) ou tipo 1 (Kobzik et al., 1994),

induzível (iNOS) ou tipo 2 (Liu et al., 1993) e endotelial (eNOS) ou tipo 3 (Bredt,

1999), sendo que as três isoformas são capazes de produzir NO

•

em velocidades

diferentes, e as duas constitutivas (tipo 1 e 3) são reguladas pelo cálcio. A outra

isoforma (induzível, tipo 2) é independente de cálcio, sendo essa última isoforma

expressa em quase todas as células do corpo humano (Alderton et al., 2001; Nathan

& Xie, 1994).



Das três isoformas, a nNOS é localizada no sarcolema, ancorada através do

seu domínio PDZ (Proteina de densidade pós-sináptica (PSD95), Grande disco

supressor tumoral em Drosofila (DlgA), e proteina da zonula de oclusão-1 (zo-1)

(Brenman et al., 1995). Foi observado que no músculo de contração rápida (tipo II) a

isoforma nNOS é mais expressa e capaz de modular a atividade contrátil.

Concomitante ao aumento da atividade contrátil há o aumento da atividade da nNOS

e da eNOS (Balon & Nadler, 1994); sendo assim, a produção de NO

•

no músculo

pode aumentar durante o exercício. Entretanto, ainda não são conhecidos todos os

alvos do óxido nítrico para modificação redox e alteração da função contrátil.

O óxido nítrico produzido pela enzima NOS é liberado na forma de NO

•

(óxido

nítrico radical), pois apresenta um elétron desemparelhado no orbital 2p-π* (Halliwell

B. & Gutteridge J.M.C., 2007). A difusão do NO

•

em condições celulares é pouco

conhecida. Lancaster (1994) fez simulações em um software na tentativa de analisar

o comportamento do NO

•

em condições celulares e concluiu que a molécula é muito

instável na forma original, tendo um t

≤ 25 ms. O NO

•

em soluções aquosas

apresenta uma constante de difusão de 3300 µm

/seg, sendo assim, o NO

•

seria

capaz de se difundir por 10-200 µm a partir do seu ponto de síntese. Entretanto, não

existem dados experimentais que comprovam as simulações de difusão (Lancaster,

Jr., 1994). O que se sabe, experimentalmente, é que o NO

•

em ambientes

hidrofóbicos de membranas celulares é capaz de reagir, rapidamente, com O

•

lipídeos de membrana (Liu et al., 1998; Radi et al., 1991).

Em ambiente celular é pouco provável que o NO

•

se difunda por distâncias

como as descritas acima, devido aos antioxidantes celulares. Assim, sua ação

ocorre em alvos próximos à enzima produtora. Uma das formas para transmissão do



sinal do NO

•

para locais e compartimentos diferentes nas células pode ser através

da formação de S-nitrosotióis de baixo peso molecular como, por exemplo, o GSNO

(Bryan et al., 2004).

A atividade física induz um aumento na captação de O

pelas células e ~1-5%

do O

consumido gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS);

estes podem servir como sinalizadores intracelulares ou levar ao dano celular

(Halliwell B. & Gutteridge J.M.C., 2007). Os mecanismos que causam fadiga são

divididos em central e periférica. A fadiga central está relacionada a fatores de

condução do impulso elétrico para ação muscular, acidose metabólica (H

)

sanguínea e disfunção em bombas de troca de íons (Na-K

-ATPase) na membrana

plasmática. Os fatores relacionados à fadiga periférica incluem diminuição do

conteúdo de glicogênio muscular, acidose metabólica intracelular (lactato e acidose),

alterações no conteúdo muscular de fosfato inorgânico

muscular, disponibilidade de

para o tecido muscular e formação de ROS e RNS (Allen et al., 2008; Powers &

Jackson, 2008). As RNS promovem S-nitrosação em proteínas do músculo

esquelético que são capazes de modular a contratilidade (Stamler & Meissner,

2001).

S-nitrosação (p. 2) é uma modificação que tem sido pouco relacionada com a

fadiga muscular. Recentemente, Bellinger et al. (2008), em modelo in vivo,

propuseram a S-nitrosação do receptor rianodina de músculo esquelético (RyR1)

como moduladora da fadiga através da regulação do complexo macromolecular

RyR1/FKBP12. A dissociação da FKBP12 do RyR1 está relacionada a um aumento

no vazamento de cálcio celular devido à FKBP12 estabilizar o RyR1 em uma

conformação fechada (sem vazamento de cálcio). Entretanto, modificações pós-



traducionais como fosforilação e S-nitrosação são capazes de dissociar FKBP12 do

RyR1, gerando um vazamento de cálcio. Este vazamento de cálcio do retículo

sarcoplasmático para o citossol, ativa proteases (calpaina) que degradam proteínas

contráteis e, consequentemente, levam à fadiga muscular precoce (Bellinger et al.,

2008). Estes dados sugerem que há uma relação entre fadiga e S-nitrosação

interligada pela modificação do RyR1. Contudo, não é apenas o RyR que é alvo para

S-nitrosação nas células musculares. Há modificações em outras proteínas como

creatina quinase, gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase, proteínas da cadeia

respiratória e proteínas contráteis que são conhecidas por sofrerem S-nitrosação

(Cleeter et al., 1994; Mohr et al., 1994; Shi et al., 2008; Wolosker et al., 1996).

Apesar disso, a S-nitrosação dessas proteínas ainda não foi bem relacionada a

modelos de regulação da contratilidade.

Em fibras “descascadas” (sem sarcolema), foi mostrado que altas doses de S-

nitrosoglutationa (GSNO) são capazes de diminuir a sensibilidade ao cálcio, sendo

essas modificações revertidas por ditiotreitol (DTT) (Spencer & Posterino, 2009).

Entretanto, DTT é capaz de reverter S-glutatiolação (modificação induzida também

por GSNO) e não apenas S-nitrosação, portanto não ficou claro se o efeito era

promovido por formação de S-nitrosotióis. Ainda não foram identificadas às proteínas

contráteis alvos para S-nitrosação ou S-glutatiolação em fibras musculares

descascadas; assim, não sabemos quais são os alvos para S-nitrosação que alteram

a sensibilidade ao cálcio, neste modelo.

I.4 – S-nitrosotióis de baixo e alto peso molecular

Óxido nítrico produzido na célula pode, rapidamente, assumir outras formas

químicas como NO

, NO

, N

e outras, com reatividades diferentes (Stamler et al.,



1992). Também, pode formar S-nitrosotióis de baixo peso (GSNO ou CysNO) ou alto

peso molecular (proteína-SNO) (Bryan et al., 2004; Hogg, 2002). O mecanismo

genérico para formação do S-nitrosotiol celular a partir de NO

•

é mostrado na

equação 1.

2NO

•

+ ½O

+ RSH RSNO + 2NO

+ 2H

Eq. 1

A concentração de NO

•

no músculo cardíaco pode variar de 1-3000 nM (Pinsky

et al., 1997) e o GSNO (principal S-nitrosotiol celular de baixo peso molecular) é

encontrado em concentrações de ~2 µM no cerebelo, 50 µM na aorta e 200 µM na

mitocôndria, dependendo da compartimentalização (Gaston et al., 1993; Kluge et

al., 1997; Ng et al., 2007; Steffen et al., 2001). Sendo assim, o NO

•

e o GSNO

podem ser encontrados em uma faixa µM em diferentes tecidos e compartimentos

celulares (Bryan et al., 2004), porém não se sabe a concentração de NO

•

ou GSNO

no tecido muscular esquelético.

A glutationa (GSH) é um onipresente tiol de baixo peso molecular celular capaz

de proteger as proteínas contra modificações redox através da captura dos agentes

oxidantes e nitrosantes ou sendo doador de elétrons de enzimas antioxidantes (por

exemplo: glutaredoxina). Os tióis de baixo peso molecular podem agir como agentes

trans-nitrosantes, doando NO para tióis de alto peso molecular como as proteínas

(Hogg, 2002; Hess et al., 2005; Stamler et al., 1992).

Recentemente, utilizando doadores de NO

•

, GSNO e soluções saturadas com

NO gás em Po

fisiológica intracelular (1% ou 10 µM O

ou 10 mmHg), Sun et al.

(2008), mostraram que apenas o GSNO é capaz de modular a atividade do RyR2 in

vitro, conferindo a esse doador um papel fundamental na regulação da função

contrátil do músculo cardíaco (Sun et al., 2008). O metabolismo do GSNO é



regulado pela enzima GSNO redutase (GSNOR), que facilita o equilíbrio entre

GSNO e proteína-SNO. Em um camundongo knockout para GSNOR, foi mostrado

que os S-nitrosotióis endógenos são de extrema importância para o funcionamento

do músculo cardíaco (Lima et al., 2009). As evidências experimentais têm indicado

que um potente agente trans-nitrosante é o GSNO.

I.5 - Denitrosação

O antioxidante celular mais abundante é a glutationa, um tripeptídeo (Glu-Cys-

Gly) que é capaz de doar um equivalente redutor (H

+ e

) para outras moléculas

instáveis. A concentração intracelular de GSH pode variar de 0,5-10 mM (Meister &

Anderson, 1983). Este onipresente anti-oxidante celular é capaz de proteger as

proteínas de modificações redox induzidas por estresse oxidativo (Powers &

Jackson, 2008) e/ou nitrosativo (Foster et al., 2003).

No músculo esquelético os níveis de glutationa podem variar de acordo com o

tipo de fibra muscular. Fibras do tipo I de ratos apresentam de quatro a seis vezes

mais GSH (2–3 mM) comparado com fibras do tipo II (0.5 mM) (Leeuwenburgh et al.,

1997). A manutenção do conteúdo de GSH celular é extremamente importante para

a sobrevivência celular, já que pode participar na redução de proteínas oxidadas ou

S-nitrosadas, como em situações fisiopatológicas de alta produção de NO

•

(Durham

et al., 2008; Paige et al., 2008).

O mecanismo de denitrosação de tióis de alto peso molecular ainda é pouco

conhecido, comparado com a denitrosação de tióis de baixo peso molecular,

principalmente, o GSNO (Jensen et al., 1998; Liu et al., 2001). Uma vez que o

GSNO é um conhecido RSNO de baixo peso, dados sugerem que essa molécula



esteja em equilíbrio com os S-nitrosotióis proteicos: a denitrosação do GSNO é

catalisado pela enzima GSNO redutase (GSNOR) (Liu et al., 2001).

Esta enzima é conservada de bactérias a humanos e está se configurando

como uma das principais vias para denitrosação celular (Foster et al., 2009). Em

casos de desequilíbrio do sistema GSNO/GSH há um aumento na formação de

RSNO de alto peso molecular, acarretando um funcionamento celular prejudicado

(Liu et al. 2004). O mecanismo de denitrosação por GSNOR é mostrado na equação

GSNO + NADH + H

GSNHOH + NAD

GSNHOH + NADH + H

GSNH

+ NAD

+ H

GSNH

+ GSH GSSG + NH

Eq.: 2

Em camundongos, a enzima GSNOR é expressa em vários tecidos como

fígado, rim, baço, timo (Liu et al., 2004), pulmão (Que et al., 2005) e músculo

cardíaco (Lima et al., 2009). Em situações como sepse, asma e isquemia cardíaca, o

GSNO se mostrou extremamente importante na homeostase de S-nitrosotióis de alto

peso molecular e muito importante para recuperação do funcionamento celular

destes tecidos.

A atividade física acarreta um aumento na produção de espécies reativas que

promovem modificações redox em tióis protéicos, contribuindo para a fadiga

muscular (Ferreira & Reid, 2008). Com o intuito de achar uma maneira de retardar o

processo de fadiga muscular, foi administrado N-acetilcisteína (precursor da síntese

de GSH) em humanos e medida a capacidade de execução de movimentos no

músculo tibial anterior. Os indivíduos que fizeram uso de N-acetilcisteína tiveram um



menor índice de fadiga. Esse trabalho mostra indícios que o GSH estaria envolvido

na proteção contra modificações redox que possam levar à fadiga (Reid et al., 1994).

Deste modo, o GSH está modulando o mecanismo de regulação de

modificação redox como nitrosação/denitrosação, retardando a fadiga. A partir

desses dados e os de outros trabalhos, há um forte indício da necessidade do

equilíbrio GSH/GSNO intracelular no músculo esquelético.

Existem vias mais específicas para denitrosação como, por exemplo, para

denitrosação de caspase 3, que é mediada pelo receptor FAS, pela tioredoxina e

pela tioredoxina redutase (Benhar et al., 2008; Mannick et al., 1999). Este

mecanismo tem grande importância, pois quando há um aumento da S-nitrosação de

caspase 3, sua atividade é inibida. A tioredoxina promove a denitrosação de

caspase 3, e a tioredoxina redutase reduz a tioredoxina para que esta se mantenha

em um estado ativo, sendo capaz de regular, desta maneira, as vias de apoptose

celular (Holmgren, 2008).

O processo de nitrosação/denitrosação está emergindo como algo semelhante

ao processo de fosforilação/defosforilação (Lane et al., 2001), regulando a função e

a interação das proteínas (Ozawa et al., 2008; Wang et al., 2006) e o tráfico de

proteínas entre compartimentos celulares (Iwakiri et al., 2006). Contudo, pouco se

sabe desse processo no tecido muscular.

I.6 - Fatores regulatórios de nitrosação e denitrosação

Existem diversos fatores que interferem na formação e decomposição de

proteína-SNO, como a produção de NO

•

, cálcio, GSH/GSSG, Po

e pH (Hess et al.,

2005). Nesta parte da tese, serão abordadas apenas as modificações induzidas pelo



pH e pela Po

, ambas sujeitas a alteração em situações especiais como o exercício

(Allen et al., 2008; Richardson et al., 2006). Ambos são considerados limitantes para

manutenção da atividade contrátil (Allen et al., 2008; Eu et al., 2003; Stary & Hogan,

2000), assim contribuindo para o complexo processo da fadiga muscular.

A Po

nas células musculares em repouso pode variar de 23 – 34 mmHg (2 –

5% O

ou ~30 µM O

). Durante a atividade física, a pressão diminui para 3 – 5

mmHg (Gorczynski & Duling, 1978; Honig & Gayeski, 1993; Richardson et al., 1995;

Richardson et al., 2006). A variação de Po

se mostrou importante para formação de

RSNO do ponto de vista celular quando foi visto que a saturação da hemoglobina

com oxigênio está diretamente relacionada a S-nitrosação da hemoglobina, e que

esta modificação poderia modular o estado de relaxamento dos vasos (Jia et al.,

1996; Stamler et al., 1997a). A partir desse momento, cresceram os estudos dos

efeitos da variação da Po

como modulador da formação de RSNO e

consequentemente do comportamento celular. Foi visto que a S-nitrosação do

receptor rianodina (RyR1), do receptor NMDA (Eu et al., 2000; Takahashi et al.,

2007) e das proteínas relacionadas ao metabolismo celular (Foster & Stamler, 2004;

Rodriguez-Juarez et al., 2007) é modulada por variações na Po

, sendo maior a

baixa Po

Utilizando músculo intacto, Eu et al. (2003) mostraram que a variação da Po

modula a produção de força por um músculo intacto isolado estimulado

eletricamente. O bloqueio desse efeito por inibidores de nNOS (L-NAME), mostrou

que o óxido nítrico em Po

fisiológica pode ser um ativador da produção de força e

em Po

atmosférica, é um inibidor. Desta maneira, estes experimentos delinearam

um novo campo para regulação do mecanismo contrátil por óxido nítrico em



situações fisiológicas. Por outro lado, não podemos atribuir apenas ao RyR1 em Po

fisiológica a regulação da contração muscular sem descartar outros alvos que

modulam através do óxido nítrico o mecanismo de contração como, por exemplo, as

proteínas contráteis.

O pH é outro fator muito importante para regulação das modificações redox em

tióis, uma vez que este fator está relacionado com o pK

dos tióis (Sethuraman M et

al., 2006; Winterbourn & Metodiewa, 1999; Ziegler, 1985). Durante a atividade física,

há um aumento na liberação de H

(produzido, principalmente, pela via glicolítica e

hidrólise de ATP), que acidifica o meio intracelular. Em humanos, o pH intracelular

em repouso é de ~7,05, sendo que, no inicio de uma atividade física, o pH pode

aumentar ~0,1 unidade de pH, mas após exercício intenso pode diminuir para ~6,5 e

o nível de lactato intracelular chegar a 30 mM (Bangsbo et al., 1996; Sahlin et al.,

1976). Em outros casos, o pH pode diminuir para ~6,8 ou 6,9 (Hogan et al., 1999),

mostrando que a fadiga muscular esquelética em humanos não, necessariamente,

está relacionada a grandes diminuições em valores de pH.

A formação de S-nitrosotióis varia com pH (Arnelle & Stamler, 1995) e tem sido

relacionada à fadiga muscular como, por exemplo, em animais submetidos a um

período de treinamento intenso. Estes apresentam aumento na S-nitrosação do

RyR1 (que pode estar relacionado a variações no pH) seguido de um vazamento de

cálcio pelo RyR1 e, consequentemente, de disfunções e danos celulares (Bellinger

et al., 2008).

Ambos os fatores apresentados acima (pH e Po

) exercem um importante

papel na modificação pós-transducional de tióis e, principalmente, na formação de



RSNO. Deste modo, modificações nesses dois fatores podem promover a S-

nitrosação de proteínas contráteis que, possivelmente, modula a fadiga muscular.



II - Objetivos

II.1 - Objetivo Geral

Investigar como parâmetros associados com o exercício influenciam a S-

nitrosação e denitrosação das proteínas contráteis in vitro e in vivo.

II.2 - Objetivos específicos

Analisar a influência do exercício sobre o estresse nitrosativo e na formação de

RSNO em proteínas do músculo esquelético.

Detectar S-nitrosação e denitrosação de proteínas contráteis em homogenato

de músculo de contração rápida (EDL) e em fibras musculares descascadas

incubadas com GSNO in vitro.

Identificar quais as proteínas contráteis são S-nitrosadas no músculo

esquelético com exercício.

Desenvolver um modelo para estudos da influência da Po

em S-nitrosação e

denitrosação in vitro.

Detectar efeitos de doadores de NO (GSNO e DEANO) sobre a atividade

ATPásica da miosina em diferentes condições de pH e de Po



III - Materiais e Métodos

III.1 - Doadores de NO

III.1.1 - S-nitrosoglutationa (GSNO)

O GSNO (Figura 3) foi sintetizado a partir da combinação de concentrações

equimolares de GSH e NaNO

em solução acidificada com 0,1 M de HCl, seguido de

1 min de reação a temperatura ambiente e adição de 50 mM de imidazol pH 7,0 para

tamponar a solução (Feelisch & Stamler, 1996). O GSNO apresenta uma meia vida

de ~170 min a 24 ºC em soluções aquosas (Sun et al., 2003).

GSNO

Figura 3: Composição química e estrutura química do GSNO.

III.1.2 – DietilaminaNONOato (DEANO)

Os NONOatos ou 1-substituído diazen-1-io-1,2-diolatos são compostos

contendo o grupo funcional [N(O)NO]

que são capazes de doar NO

•

in vitro e in vivo

por simples protonação dos grupamentos NONO e liberação de NO

•

. A meia vida

dos compostos pode ser de 1 min a 1 dia em solução com pH 7,0 a 37 ºC (Keefer et

al., 1996). Um dos compostos utilizados como doador de NO

•

foi o DEANO (Figura

4), um composto com t

de 2-4 min a 37 ºC e 16 min a 22-25 ºC em pH 7,4. Estes

nonoatos são solúveis em água e estáveis em soluções alcalinas até pH 10,0. O

composto foi solubilizado imediatamente antes do experimento com NaOH 10 mM

(Feelisch & Stamler, 1996).



DEANO

)

Figura 4: Composição química e estrutura química do DEANO.

III.2 - Purificação de miosina

A miosina foi purificada de músculo longissimus dorsi de coelho conforme

(Bremel & Weber, 1975), com algumas modificações. O animal foi sacrificado por

deslocamento cervical e hipovolemia sanguínea (Comissão de Avaliação da

Utilização de Animais em Pesquisa do Centro de Ciência da Saúde– CAUAP/UFRJ –

IBQM024). Em seguida, foi feita uma incisão na pele da região dorsal do animal para

expor o músculo e a carcaça do animal foi mantida por 30 min sobre o gelo para

resfriamento do músculo. O músculo foi retirado e após a limpeza manual para

retirar tecido conectivo, o músculo foi passado por duas vezes em um moedor de

carne. As etapas seguintes foram feitas a 4 ºC. Para cada 100 g de músculo foi

adicionado 300 mL de solução com alta força iônica (300 mM KCl, 150 mM KH

50 mM K

HPO

, pH 6,5) e o homogenato foi agitado lentamente na geladeira por 10

min. Em seguida, foi adicionado 1200 mL de H

O (Mili-Q) gelada para cada 100 g de

músculo e a mistura foi agitada, vagarosamente, por 15 min para que a miosina

precipite em baixa força iônica. O homogenato foi filtrado em duas camadas de gaze

e a parte retida foi descartada. A seguir, foi adicionado vagarosamente 1800 mL de

O (Mili-Q) gelada para melhor precipitação da miosina. A solução foi centrifugada

a 30.000 x g por 30 min e o sedimento ressuspenso em alta força iônica (600 mM

KCl), usando 300 mL para cada 100 g de músculo; o sedimento de proteína foi

colocado em um potter e homogeneizado. No momento seguinte, foi adicionado H



(Mili-Q) gelada e novamente centrifugado a 30.000 x g durante 30 min e o

sobrenadante foi filtrado em gaze e ao filtrado foi adicionado 1400 mL H

O (Mili-Q)

gelada para cada 100 g de músculo, seguido de centrifugação a 30.000 g x 30 min.

O precipitado foi ressuspenso em alta força iônica. O processo foi repetido três

vezes para eliminar contaminantes, principalmente, actina. Após a precipitação, a

miosina foi ressuspendida em tampão de alta força iônica (600 mM KCl, 50 mM

HEPES, pH 7,0, preparado em 50% de glicerol) e estocada a -20 ºC. Para utilização

da proteína nos ensaios de ATPase verificar item 3.4.

III.3 - Dosagem de proteína

A concentração de proteína das amostras foi dosada por dois métodos distintos

contra uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA), um deles foi o método

de biureto (Gornall et al., 1949), que detecta ligações peptídicas. Para eliminar o

glicerol em que a miosina purificada estava estocada, foi adicionado 13 volumes de

O a 0.5 mL de miosina e a mistura foi centrifugada a 9000 x g por 25 min. O

sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspenso em 0,6 M KCl, 50 mM

de imidazol pH 7,0 e após foi feita dosagem. A concentração no estoque de miosina

foi normalmente na faixa de 10-15 mg/mL.

Para dosagem de proteína nos experimentos em fibra muscular descascada,

utilizamos o método de Lowry et al (1951), que é um método mais sensível e serve

para concentrações de proteína na faixa de 0,05-2 mg/mL. Foi usada também uma

curva padrão com BSA.



III.4 - Atividade Mg

ATPásica da miosina

Para a análise da atividade da miosina purificada, foi utilizado o meio de reação

que melhor simula o fisiológico, com MgATP

como substrato para miosina. Foi

medida a atividade em diferentes valores de pH (6, 7, 8) e Po

fisiológica e

atmosférica (1 - 5% ou ~10 – 50 µM de O

e 21% ou ~220 µM de O

respectivamente), variando a concentração de doadores de NO (GSNO e DEANO),

com intuito de simular fatores que podem variar a nível celular durante o exercício.

A proteína foi pré-incubada a 1 mg/mL (2 µM) na presença de diferentes

valores de pH (6, 7, 8) e 50 mM KCl, 50 mM imidazol, 5 mM MgCl

, e diferentes

concentrações de GSNO 0-100 µM (volume final 300 µL) a 30 ºC para induzir a

formação de proteína-SNO. A hidrólise foi iniciada com adição de ATP (3 mM) em

pH 7,0 em um volume de solução 10x, volume em que a proteína foi pré-incubada

(diluindo todos os compostos 10X). Desta maneira, a formação de proteína–SNO

ocorreu em diferentes valores de pH e a atividade foi medida a pH 7,0. Quatro

alíquotas (5, 10, 15, 20 min de hidrólise) de 0,5 mL foram retiradas e misturadas com

um volume equivalente de carvão (25 g/100 mL de ácido perclórico 0,1 N). Os tubos

foram centrifugados a 13.000 x g por 25 min e, em seguida, o sobrenadante foi

retirado e incubado com molibdato ferroso, sendo feita à leitura colorimêtrica a 700

nm para dosagem do Pi (Taussky & Shorr, 1953). Ao final da reação, foi medido o

pH da solução, que se manteve 7,0.

Para o ensaio variando Po

, todas as soluções foram equilibradas previamente

para Po

fisiológica com uma mistura de gases de 95% N

, 4% CO

e 1% de O

Esse procedimento foi feito em um tubo vacutainer com volume final de 4 mL. Foi

adicionado ao tubo, 3 mL com 50 mM KCl, 50 mM imidazol e 5 mM MgCl

pH 7,0 e,



para equilibrar com O

, os tubos foram fechados. Uma cânula de 14 gauge (G) de

aço inox e ao lado uma agulha de insulina de 28 G foram inseridos pela superfície

de borracha (superior). Através da cânula de aço inox foi injetado, durante 25 min, a

mistura gasosa na solução. Para confirmar a concentração de O

, foi medida a

concentração de O

(óxigrafo 2k) (Oroboros Instruments, Innsbruch Austria) e a

solução se apresentava em uma faixa de 35 - 45 µM de O

. O pH se manteve em

7,0. Para que não houvesse alteração da Po

, as soluções de DEANO, ATP e

miosina foram preparadas a uma concentração onde seriam adicionados de cada

um 30 µL no máximo. A miosina foi incubada por 1 h com DEANO (doador de NO

•

) e

a reação de hidrólise foi iniciada por adição de ATP. Os ensaios em Po

atmosférica

foram feitos no mesmo sistema utilizado para os ensaios de Po

fisiológica. Foram

retiradas alíquotas de 0,5 mL através da cânula de 14 G e o procedimento para

dosagem de Pi foi como descrito acima.

III.5 - Detecção de S-nitrosotióis por Griess-Saville

Este método é o mais comumente usado para detecção de NO

, sendo um

ensaio colorimétrico. O NO

•

em soluções aquosas é rapidamente auto-oxidado a

nitrito e nitrato em diferentes taxas dependendo das condições do ambiente; a

sensibilidade da técnica é de ~200 nM. A reação pela qual é detectado o NO

mostrada na Figura 5.

Para detecção de RSNO é adicionado mercúrio (Hg

– 145 mM) às amostras.

Sendo que o Hg

tem alta afinidade por grupamentos tióis, ele é capaz de

decompor RSNO (Saville, 1958). Soluções contaminadas por metais têm

interferência na medida de NO



Sulfanilamida

NED

Diazo composto

Figura 5: A reação descrita para detecção de NO

pelo método de Griess. O nitrito

(NO

) reage com a sulfanilamida, promovendo diazotização do composto; em

seguida, o N-1-nafitiletilenodiamina (NED) é acoplado ao composto diazo e medido

colorimetricamente a 540 nm.

Uma alíquota de amostra (40 µL) é adicionada a 200 µL de H

O com e sem 10

µL de 145 mM HgCl

. Após 15 min é adicionada 250 µL de reagente de Griess em

meio ácido (125 µL de 0,1 % [p/v] de N-1-naftiletilenodiamina (NED) em H

O e 125

µL de 1,0 % de sulfanilamida em 10% H

[v/v]). Após 15 min é feita a leitura do

por absorção da luz a 540 nm contra uma curva de nitrito de sódio de 1 a 8 µM.



Figura 6: Decomposição de RSNO por a adição de Hg

como descrito por Saville

(1958). O RSNO é decomposto por adição de HgCl

; em seguida o Hg

se liga a S

liberando NO

•

. Rapidamente, o NO

•

é auto-oxidado a NO

que é medido por Griess

como descrito acima.

As amostras de tecido foram homogeneizadas e, em seguida, adicionadas a

um volume de 1 mL do reagente de Griess com e sem HgCl

(145 mM). Após 15

min, foi realizada a medida colorimetrica em 540 nm.

A leitura do nitrito formado por decomposição por Hg

é considerada

específica para ligações de NO nas cisteínas protéicas, já que Cys é o único

aminoácido a apresentar grupamento sulfidrila e a afinidade por grupamentos tióis é

muito alta.

III.6 - Técnica de troca de resíduos S-nitrosados por tiobiotinilados (Biotin

Switch Technique)

A técnica mais utilizada para identificação de proteínas S-nitrosadas é o biotin

switch, descrita por Jaffrey et al. (2001). É constituída por três passos: (i) “bloqueio”

ou tiometilação de tióis livres nas proteínas, (ii) redução de S-nitrosotióis com ácido

ascórbico (AA) e (iii) tiobiotinilação dos resíduos reduzidos por biotina-HPDP



(Forrester et al., 2007; Forrester et al., 2009a; Jaffrey & Snyder, 2001; Reinartz et al.,

2008).

A técnica foi reproduzida em nosso laboratório com algumas modificações. A

concentração de proteína nas amostras processadas foi ajustada para 1 mg/mL

(tecido ou proteína purificada). Após incubação por 60 min a 50 ºC em tampão HEN

(250 mM Hepes pH 7,7, 1 mM EDTA e 0,1 mM neocuproína) contendo 2,5% de SDS

e 40 mM de metilmetanotiosulfonato (MMTS), em seguida, todas as amostras foram

precipitadas com acetona 70% (v/v) e permaneceram a -20 ºC por 15 min seguida

de centrifugação a 2000 x g por 10 min a 4 ºC. O processo de lavagem foi repetida

por 3 vezes. Após as lavagens, as proteínas foram ressuspensas em tampão HEN

com 1% de SDS e 1 ou 30 mM de AA para proteína purificada e homogenato de

tecido, respectivamente, e 1 mM de (N-(6-(biotinamido)hexil)-3'-(2'-piridilditio)-

propionamida (biotina-HPDP) ou em ausência de AA (controle negativo), reagindo

por 60 min a 37 ºC. Em seguida, as amostras foram lavadas como descrito,

anteriormente, e após o último ciclo de lavagens, as amostras foram ressuspensas

com 1% SDS em tampão HEN diluído 10x. As amostras foram congeladas, para

posterior análise via eletroforese e Western blot com antibiotina (Forrester et al.,

2007), com uma diluição de 1:3.000 para proteína purificada e 1:20.000 para

homogenato de tecido. Todos os passos foram executados na ausência de luz.



Figura 7: Método de troca de RSNO por biotina-HPDP descrito por Jaffrey e Snyder

(2001). As amostras em diferentes condições de estresse nitrosativo (A, baixo; B,

médio; C, alto) passam por três etapas na técnica: (i) Tioalquilação (bloqueio de tióis

livres), (ii) redução de RSNO com AA e (iii) biotinilação dos tióis reduzidos por AA e

análise por Western blot (Forrester et al., 2009a).



III.7 - Fibras descascadas

Os feixes de fibras do músculo psoas de coelho foram extraídos e

permeabilizados como descrito por (Eastwood et al., 1979), e estocados a –20°C em

50% glicerol (v/v) contendo 152 mM propionato de potássio, 20 mM propionato de

imidazol pH 7,0, 2,5 mM acetato de magnésio, 5 mM EGTA, 2,5 mM ATP e um

coquetel de inibidores de protease (Pinto et al., 2008). O glicerol foi removido antes

do uso.

Feixes de cinquenta miligramas (semiseca) foram incubados por 30 min a 30°C

com 0-1 mM de GSNO em solução de relaxamento (152 mM propionato de potássio,

20 mM propionato de imidazol pH 7,0, 6,4 mM acetato de magnésio, 5 mM EGTA,

4,4 mM ATP). Em seguida, as fibras foram lavadas 3x com solução de relaxamento

para remoção do GSNO excedente e homogeneizadas com potter em 1 mL de

tampão contendo 25 mM HEPES pH 7,7, 4 mM EGTA, 4 mM MgCl

, 2 mM ATP, 0,1

mM neocuproína e 0,3 M KCl, na ausência de luz. A detecção de RSNO foi realizada

pela técnica de Griess/Saville e as proteínas foram identificadas por biotin switch

como descrito acima. A Figura 8 mostra o extrato de fibras musculares descascadas

tratadas com diferentes concentração de GSNO.



Figura 8: Incubação de fibras descascadas com GSNO (0 – 1 mM) não altera a

extração de proteínas de fibra musculares descascadas mostradas no SDS-PAGE

10%, corado com Coomassie blue. Padrão de peso molecular: Cadeia pesada de

miosina (MHC), α-actinina, actina, Troponina T (TnT), Tropomiosina (TM), Cadeia

leve de miosina 2 (MLC-2), Troponina C (TnC),Cadeia leve de miosina 3 (MLC-3).

III.8 - S-nitrosação e denitrosação in vitro.

Reações de formação dos S-nitrosotióis protéicos in vivo estão em equilíbrio

com a denitrosação, e a manutenção desse equilíbrio é mediada pelo conteúdo de

GSH celular. Para analisar o perfil de denitrosação das proteínas contráteis, o

músculo extensor digitorum longus (EDL) foi homogeneizado em um potter com 10

volumes do tampão HEN, 600 mM KCl, 10 mM ATP, 5 mM MgCl

e 2% Triton-X100.

O homogenato total foi centrifugado a 500 x g (10 min) e, em seguida, a

concentração de proteína foi ajustada para 1 mg/mL, após incubação com 40 µM

GSNO por 40 min ou veículo (H

O), as proteínas foram precipitadas com 7,5

volumes de tampão HEN e centrifugadas por 2000 x g (10 min), ressuspensas em

tampão HEN e 5 mM de GSH ou veículo por 20 min e precipitadas com tampão

HEN. Após a centrifugação a 2000 x g (10min), as amostras passaram pelo

0 10 100 500 1000

µM GSNO



procedimento do biotin switch como descrito acima, sendo todos os passos feitos na

ausência de luz (Forrester et al., 2007; Paige et al., 2008).

III.9 - Detecção de estresse nitrosativo no exercício

Foram utilizados ratos Sprague-Dawley machos (300-350 g) para realização de

exercício de alta e baixa intensidade. Os animais foram introduzidos em uma piscina

para exercício de natação na presença e ausência de uma carga. O exercício de alta

intensidade consistiu de 4,7 min de duração com 14% do peso do animal adicionado

à própria cauda (14 séries de 20 s alternando com 10 s de repouso) totalizando 7

min até o final da atividade. Esse protocolo foi escolhido por ser conhecido como

exercício que produz concentrações de lactato no plasma em torno de 11 mM

(Terada et al., 2001). No exercício de baixa intensidade, o animal foi colocado na

piscina sem adição de carga e permanecia por 30 min em exercício, não

apresentando exaustão. Ambos os tipos de atividade caracterizam-se como

atividade física aguda, sendo o primeiro, anaeróbio, e o segundo, aeróbio. Em

seguida, os animais foram sacrificados usando Na-pentobarbital (50 mg/Kg) e os

músculos sóleo e EDL foram homogeneizados em tampão (1 % Triton-X100, 20 mM

Tris-HCl pH7,7, 2,5 mM pirofosfato, 1 mM NaVO

, 0,1 mM neocuproína, 1 mM

EDTA, 1 mM EGTA e 1 mM fenilmetanosulfonilfluoreto (PMSF). Os homogenatos

foram analisados para NO

e RSNO pelo método de Griess-Saville como descrito

acima.

O protocolo de exercício descrito acima foi repetido com ratos Wistar (na

ausência de ratos Sprague-Dawley) para observação das proteínas alvo para

formação de RSNO no músculo EDL, detectados pela biotin switch. Neste protocolo,

o músculo EDL foi homogeneizado com solução contendo tampão HEN, 600 mM



KCl, 10 mM ATP, 5 mM MgCl

e 2% Triton-X100 para enriquecer o homogenato com

proteínas contráteis (Barany & Close, 1971).

III.10 - Eletroforese

Para análise do conteúdo de proteínas foi feito SDS-PAGE (eletroforese em gel

de poliacrilamida-duodecil sulfato de sódio), em 8% acrilamida, comparando as

proteínas com o padrão de peso molecular comercializado como Sigma Marker™

Wide Range (M

= 6.500 – 205.000). As amostras foram solubilizadas em tampão de

amostra para eletroforese (Laemmli, 1970).

III.11 - Western blot

A técnica de Western blot foi aplicada após separação das proteínas em um gel

de poliacrilamida 8%. O gel foi colocado em contato com uma membrana de

nitrocelulose para transferência, com uma corrente constante de 200 mA, na

geladeira. Em seguida, a membrana foi incubada para 12-18 h com TBS-T (50 mM

Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl e 0,1% Tween 20) com 3% de BSA. A membrana foi

lavada 4 x durante 15 min cada vez com TBS-T e incubada com estreptavidina

conjugada a peroxidase de rabanete (estreptavidina-HRP) com diluições de 1:3.000

para miosina isolada e 1:20.000 para homogenato de tecido, por 1 h seguido de 6

lavagens de 15 min com TBS-T. A membrana foi incubada com ECL plus (GE

Helthcare, Brasil) (substrato para peroxidase) e um filme (Kodak T-MAT G/RA 18x24

cm) foi exposto à luminescência da membrana e revelado para identificar proteínas

biotiniladas (nitrosadas) (Forrester et al., 2007; Jaffrey & Snyder, 2001).



As intensidades de coloração das proteínas com Coomassie blue R e da

quimioluminescência nos filmes de raios-x foram analisadas usando o software

ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, EUA).

III.12 – Reagentes

Ácido ascórbico, GSH, HgCl

, ATP (Grade I), EDTA, EGTA, imidazol, HEPES,

Tris, DTT, MgCl

, e albumina de soro bovino (BSA) foram comprados da Sigma-

Aldrich (St. Louis, MO), biotina-HPDP foi da Pierce (Rockford, IL), diethylamine nitric

oxide, sodium salt (DEANO) foi da Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan), tubo

vacutainer foi da (Vacuette); mistura do gás foi da (White Martins) e streptavidin-HRP

foi da MP Biomedicals (Irvine, CA). Outros sais foram comprados de empresas

brasileiras.

III.13 – Análise estatística

Foi utilizado o teste-t de Student, pareado ou não, para a análise das

diferenças entre as médias dos valores obtidos em pelo menos três experimentos

distintos, com um nível de significância ≥ 0,05. As diferenças significativas estão

indicadas nas legendas ou no texto. As análises foram feitas com o programa

Sigmaplot 10.0.



IV - Resultados

IV.1 - Exercício e estresse nitrosativo

Em algumas situações fisiológicas ou fisiopatológicas, como o exercício ou

infecções, ocorre um aumento na produção de óxido nítrico, consequentemente

gerando um estresse nitrosativo (Bellinger et al., 2008; Bellinger et al., 2009; Durham

et al., 2008). Deste modo, nos primeiros experimentos foram testadas condições que

possam aumentar a produção de NO

, levando a S-nitrosação das proteínas

contráteis e, consequentemente a uma modificação da sua atividade.

Ratos Sprague-Dawley foram submetidos a exercício de natação de alta e

baixa intensidade como descrito nos Materiais e Métodos (§ 3.8), seguido de análise

do conteúdo de nitrito (NO

) no homogenato dos músculos EDL (contração rápida) e

sóleo (contração lenta) pela técnica de Griess/Saville (§ 3.5). As Figuras 9 e 10

mostram que ambos os exercícios aumentam o conteúdo de nitrito nos músculos

sóleo e EDL comparado ao controle.

Nas amostras contendo HgCl

, composto utilizado para detectar aumento de

nitrito proveniente da decomposição de RSNO, não foi detectado nenhum aumento

na formação de RSNO no músculo sóleo, baseado na relação (NO

com HgCl

)/NO

(Tabela 1). Entretanto, no músculo EDL, o exercício de alta intensidade

promoveu um aumento significativo no conteúdo de RSNO comparado com os

animais controle e com o exercício de baixa intensidade (Tabela 1).



+ HgCl

nmol NO

/mg ptn

Sed. High Low

Cont Alta Baixa

Figura 9: Exercícios de alta e baixa intensidade aumentam o conteúdo de nitrito no

músculo sóleo (contração lenta). Dosagem de nitrito (NO

) no homogenato do

músculo sóleo na ausência (preto) e presença (cinza) de HgCl

(para decomposição

de RSNO), no homogenato do músculo dos animais controle (Cont), exercício de

alta intensidade (Alta) ou de baixa intensidade (Baixa). * diferente dos respectivos

controles (Cont), P ≤ 0,05. (média ± e.m.) (n = 9).



0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

+ HgCl

nmol NO

/mg ptn

Figura 10: Exercício de alta intensidade aumenta a formação de nitrito e de RSNO

no músculo EDL (contração rápida). Dosagem de nitrito (NO

) no homogenato do

músculo EDL sem (preto) e com (cinza) a adição de HgCl

(para decomposição de

RSNO), no controle (Cont) e após exercício de alta intensidade (Alta) ou de baixa

intensidade (Baixa). * diferente em relação ao controle (Cont), P ≤ 0,05. (média ±

e.m.) (n = 8 - 9).

Músculos

Controle

(Cont)

Exercício

anaeróbio

intenso (alta)

Exercício

aeróbio

leve (baixa)

(nmol NO

c/ Hg

/ nmol NO

)/mg ptn

Sóleo

1,01 ± 0,05 0,99 ± 0,03 1,03 ± 0,02

(nmol NO

c/ Hg

/ nmol NO

)/mg ptn

EDL

1,04 ± 0,04 1,68 ± 0,28# 0,97 ± 0,08

Tabela 1: Dosagem de nitrito (NO

) e RSNO (NO

+ Hg

) no homogenato do

músculo sóleo e EDL no controle e após exercício de alta ou de baixa intensidade. #,

diferente em relação ao controle e exercício de baixa intensidade (baixo), P ≤ 0,05.

(média ± e.m.) (n = 9).

Sed High Low

RestHighLow

Cont Alta Baixa



IV.2 – S-nitrosação e denitrosação de miosina

A técnica do biotin switch descrita por Jaffrey et al. (2001) (ver Materiais e

Metodos desta dissertação) tem sido utilizada para detecção de proteínas S-

nitrosadas específicas em homogenato de células e de tecido (Whalen et al., 2007).

No passo de troca dos residuos S-nitrosados por tiobiotinilados, é adicionado ácido

ascórbico (AA) para reduzir especificamente RSNO a RS

e promover biotinilação do

tiol nascente. Foi mostrado que o aumento na concentração de AA nesse passo

pode aumentar a sensibilidade da técnica (Forrester et al., 2007). Homogenato de

músculo EDL de ratos Wistar em repouso (controle) foi submetido à técnica do biotin

switch na presença de variadas concentrações de AA. Na presença de 30 mM de

AA, ocorreu um aumento na S-nitrosação da banda de 200 kDa (cadeia pesada da

miosina) (Figura 11A). A quantificação do efeito de AA é mostrada na Figura 11B,

levando à conclusão de que há formação de S-nitrosomiosina em condições basais

(músculo em repouso). A técnica foi repetida em músculo sóleo e não foi encontrada

marcação em nenhuma proteína, o que reforça a ausência de um possível falso-

positivo da técnica (Figura 11C). Foi utilizado 30 mM de AA para todos os

experimentos subsequentes em homogenato de tecido.



Ascorbato [mM]

011030

Anti-biotina/CB da

banda de 200 KDa

200 KDa (MHC)

Figura 11: Formação de S-nitrosomiosina em músculo EDL em ratos Wistar em

repouso, detectada pela técnica do biotin switch. A concentração de AA foi variada

(0-30 mM) para otimizar a sensibilidade para detecção de proteínas contráteis S-

nitrosadas. A, O painel da esquerda mostra um exemplo de um SDS-PAGE (8%

EDL

Sóleo

PM011030[AA],mM

200 KDa

116 KDa

97 KDa

84 KDa

66 KDa

55 KDa

45 KDa

[AA], mM - 0 1 10 30 100 - 0 1 10 30 100

Coomassie Blue

200 KDa



Antibiotina



acrilamida) corado com Coomassie blue R e à direita um Western blot antibiotina das

amostras tratadas com diferentes concentrações de AA. Em B, a quantificação de 4

experimentos mostrando a cadeia pesada de miosina (MHC, 200 KDa) da Figura

11A em todas as concentrações de ascorbato (AA). * diferente das outras amostras

(P ≤ 0,05); (média ± e.m.) (n = 4). Em C, painel superior mostra um SDS-PAGE (8%

acrilamida) corado com Coomassie blue e no painel inferior um Western blot

antibiotina das amostras de músculo EDL (contração rápida) e sóleo (contração

lenta), O músculo sóleo não apresentou proteína S-nitrosada. Peso molecular (PM -

KDa), cadeia pesada da miosina (200), β-galactosidase, fosforilase B (97), frutose-6-

fosfato quinase (84), albumina (66), desidrogenase glutamica (55) e ovalbumina (45).

O próximo experimento visou determinar quais proteínas contráteis seriam

alvos para formação de RSNO a nível celular após exercício agudo. Ratos Wistar

foram submetidos a exercício agudo de alta e baixa intensidade e, em seguida,

sacrificados. O músculo EDL foi extraído, homogeneizado para enriquecimento de

proteínas contráteis e processado com o biotin switch. Novamente, os animais

controle apresentaram marcação apenas na banda da cadeia pesada da miosina,

sendo a marcação igual à marcação observada após exercício de baixa intensidade.

Entretanto, o exercício de alta intensidade induziu um aumento na formação de S-

nitrosomiosina comparado ao controle (Figura 12A). Para confirmar a diferença entre

as marcações da Figura 12A, foi feita quantificação da S-nitrosação da banda de

200 KDa (Figura 12B) e foi encontrada uma diferença significativa na marcação do

grupo alta intensidade comparado ao grupo controle (P < 0,05).



Figura 12: S-nitrosação de miosina in vivo após exercício de alta e baixa

intensidade. Detecção de S-nitrosomiosina em músculo EDL por biotin switch em

controle (controle, em repouso), exercício de alta (Alta) e baixa (Baixa) intensidade.

A, o painel da esquerda mostra um exemplo de SDS-PAGE 8% com amostras de

dois animais para cada grupo (Controle, Alta, Baixa), corado com Coomassie blue.

Cada amostra foi processada pelo biotin switch na ausência (-) e presença (+) de

ácido ascórbico para controle de falso positivo. No painel da direita, Western blot

correspondente do painel da esquerda. B, Quantificação da relação antibiotina/CB

da banda de 200 KDa, * diferente do controle, P ≤ 0,05, (média ± e.m.) (n = 4).

Recentemente, foi mostrado que proteínas alvo para S-nitrosação podem

apresentar tióis estáveis e instáveis, sendo que uma das principais rotas celulares

para denitrosação é mediada por GSH (Forrester et al., 2009b; Liu et al., 2001; Paige

Controle ighLowH

xer

exer

g i

Anti-biotina/CB da

banda de 200 KDa

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Control Alta Baixa

Control AltaBaixa

Anti-Biotin

Coomassie blue

ControlAlta Baixa

PM‐‐++‐‐++‐ ‐ ++

‐ ‐ ++‐ ‐++‐‐++

200 KDa

116 KDa

97 KDa

84 KDa

66 KDa

55 KDa

45 KDa



et al., 2008). No experimento da Figura 13, foi investigado se a miosina-SNO é

suscetível à denitrosação por GSH in vitro. O homogenato do músculo EDL do rato

em repouso, foi incubado com veículo (H

O) ou 40 µM de GSNO por 40 min para

promover S-nitrosação das proteínas contráteis. As proteínas contráteis foram

precipitadas com tampão HEN para remover excesso de GSNO não reagido,

seguido de incubação com 5 mM GSH por 20 min e o protocolo do biotin switch para

verificar proteínas S-nitrosadas (Figura 13). A formação de S-nitrosomiosina

aumentou quando o homogenato foi incubado com GSNO e diminuiu quando a

amostra foi incubada, em seguida, com GSH. Isso mostra a suscetibilidade à

denitrosação não-enzimática mediada por GSH, e indica que existem S-nitrosotióis

mais estáveis e menos estáveis a essa intervenção (Forrester et al., 2009b; Paige et

al., 2008).



CoomassieBlue

Anti-biotina/CB da

banda de 200 KDa

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Figura 13: Denitrosação de miosina in vitro é mediada por GSH. A, mostra um

exemplo de SDS-PAGE (8% de acrilamida) (painel da esquerda) e Western blot com

antibiotina para detecção de S-nitrosomiosina em homogenato de músculo EDL por

biotin switch, após tratamento com GSNO (40 µM) ou GSNO seguido de GSH (5

mM) (painel da direita); B, quantificação da Figura 13A da banda de 200 KDa

(cadeia pesada de miosina) por densitometria (média ± e.m.) (n = 3). AA, ácido

ascórbico, 0 ou 30 mM.

‐ ‐ ‐ ++

‐‐+‐+

030303030

GSNO‐‐ ‐ ++

GSH‐‐+‐+

AA030303030

200 KDa

116 KDa

97 KDa

84 KDa

66 KDa

55 KDa

45 KDa

PM AntiBiotina

GSNO

‐‐‐++

GSH

‐‐+‐+

AA030303030



Com o objetivo de detectar quais proteínas contráteis são suscetíveis à

modificação nitrosativa, foi realizado um experimento de S-nitrosação in vitro em

fibras musculares descascadas. Neste modelo, as fibras possuem o aparato contrátil

intacto e servem para estudar o mecanismo de contração muscular pela tensão

isométrica desenvolvida. A S-nitrosação de fibras musculares descascadas foi

induzida com GSNO. Deste modo, feixes de fibras musculares foram incubados com

GSNO durante 30 min, homogeneizadas e processadas para os protocolos

Griess/Saville e biotin switch. Após a incubação das fibras com GSNO, foi observado

um aumento em S-nitrosação em proteínas contráteis (Figura 14A). A Figura 14B

mostra que miosina e actina são alvos preferenciais para S-nitrosação em fibras

musculares descascadas.

Modificações redox por RNS em fibras musculares acarretam a diminuição da

sensibilidade ao cálcio (Andrade et al., 1998; Spencer & Posterino, 2009), porém

não são conhecidos os alvos para as modificações redox. Dados preliminares

obtidos em colaboração com Veltri T. em nosso laboratório indicam que o tratamento

com uma dose fisiológica (10 µM) de GSNO em fibras musculares descascadas é

capaz de diminuir a sensibilidade ao cálcio (Figueiredo-Freitas. e Veltri, dados não

mostrados). Nossa intenção é investigar, no futuro próximo, como as modificações

redox são capazes de modular a contratilidade através das proteínas contráteis.



Figura 14: Detecção de S-nitrosação de proteínas contráteis em fibras musculares

“descascadas”. A, mostra formação de proteína-SNO em fibras musculares

“descascadas” tratadas com GSNO e processadas pelo método de Griess/Saville, *

diferente do controle, P ≤ 0,05. (média ± e.m.) (n = 4). B, Miosina e actina são alvos

para S-nitrosação em fibras musculares “descascadas”. As fibras foram (i) incubadas

com GSNO, (ii) homogeneizadas e (iii) S-nitrosação foi detectada pelo biotin switch.

Coomassie Blue (CB), controle positivo (CP) e controle negativo (CN).

IV.3 – Efeitos da S-nitrosação na atividade da miosina sob condições

fisiológicas

Nos experimentos a seguir, serão observadas que condições afetam a

atividade Mg

-ATPásica e, consequentemente, a S-nitrosação da miosina. As

condições escolhidas são alteradas durante o exercício e podem contribuir para a

fadiga muscular.

Uma das condições que é alterada durante o exercício é o pH. No experimento

da Figura 15, a miosina purificada foi incubada com variadas concentrações de

GSNO por 1 h a pH 6, 7 e 8. Após o período de incubação, foi adicionado tampão

CB CP CN 0 10 100 500 1000

GSNO, µM



pH 7,0 seguido de adição de 3 mM ATP para hidrólise por até 20 min a 30ºC.

Verificamos que o efeito do GSNO na atividade Mg

-ATPásica é dose-dependente e

não pH-dependente (Figura 15A). A miosina é S-nitrosada a pH 7.0 com as doses de

GSNO que inibem a atividade (Figura 15B).

Figura 15: S-nitrosação de miosina purificada diminuiu a atividade Mg

ATPásica,

independentemente do pH. A, Mostra o efeito da pré-incubação de miosina com

GSNO em diferentes valores de pH (6, 7 e 8) seguido de dosagem da atividade

-ATPásica em pH 7,0. (média ± e.m.) (n = 5); B, mostra um exemplo de SDS-

PAGE (8% de acrilamida) e um Western blot antibiotina da S-nitrosação da cadeia

pesada da miosina (200 KDa) após o tratamento com GSNO a pH 7,0.

Outra condição que é alterada durante a transição repouso-exercício é a

redução da Po

intracelular. Foi mostrado, anteriormente, que a variação na Po

capaz de modular a S-nitrosação de proteínas de membrana (Eu et al., 2000; Sun et

al., 2003; Takahashi et al., 2007). No experimento da Figura 16, a miosina foi

incubada em baixa Po

(1%) e Po

atmosférica (21%) e tratada com doador de NO

200 KDa

Anti Biotina

Coomassie

Blue

5 0 1 5 10 100 µM GSNO

0 1 1 1 1 1 mM AA

[GSNO], µM

0 10 20 3060 80 100

Atividade Mg

100

120

ATPásica

(% controle)

[GSNO], µM

0 1020306080100

[GSNO], µM

pH 6.0

pH 7.0

pH 8.0

0 1020306080100



radical (DEANO) e o efeito na atividade Mg

ATPásica da miosina foi verificado. Na

atmosférica, a atividade da miosina não sofre efeito após incubação com

DEANO; entretanto, a baixa Po

(semelhante aos valores fisiológicos), a miosina tem

sua atividade inibida em torno de 60% por 50 µM DEANO, o que representa em

torno de 75 µM NO

•

liberado (Figura 16). Esse dado sugere que o radical NO pode

regular a atividade da miosina em condições de Po

semelhantes ao exercício físico.

Obviamente, em um futuro próximo, será importante avaliar a S-nitrosação da

miosina em Po

fisiológica.

DEANO,µM

Figura 16: NO

•

modula a atividade Mg

ATPase da miosina quando a pressão

parcial de oxigênio (Po

) é baixa, próxima dos níveis fisiológicos alcançados durante

o exercício. As soluções foram pré-equilibradas com a Po

de interesse e, em

seguida, foram acrescentadas miosina e DEANO. Após 30 min a 30 ºC, a reação de

hidrólise foi iniciada pela adição de ATP (média ± e.m.) (n = 3).



V - Discussão

Modificações químicas em proteínas após o estágio de tradução do mRNA são

capazes de alterar sua função. Um dos principais alvos para essas modificações são

os tióis, que podem sofrer a S-nitrosação (Hess et al., 2005). Situações nas quais há

um aumento da função contrátil, acarretam o aumento da produção de NO

•

(Silveira

et al., 2003) e esta molécula é capaz de promover S-nitrosação em proteínas do

tecido muscular esquelético e cardíaco (Bellinger et al., 2008; Shi et al., 2008). As

Figuras 10 e 11 mostram que há um aumento de RSNO em músculo EDL (fibras do

tipo II - contração rápida) e não há aumento de RSNO em músculo sóleo (fibras do

tipo I - contração lenta). Este aumento na formação de RSNO pode estar associado

ao fato deste tipo de fibra muscular (tipo II) apresentar maior expressão de nNOS

(Kobzik et al., 1994) ou a uma menor capacidade antioxidante.

Recentemente, foi mostrado em animais e humanos que a S-nitrosação do

RyR1 está relacionada à diminuição da capacidade de fazer exercício (Bellinger et

al., 2008), porém, até agora, não foi excluída a possibilidade de efeitos de S-

nitrosação em outras proteínas. Em condições de repouso, mostramos que dentre as

proteínas contráteis, a miosina é o principal alvo para S-nitrosação endógena (Figura

11), provavelmente, devido sua meia vida (~30 dias) (Kay, 1978) e o grande número

de tióis em sua estrutura primária (Lowey et al., 1969), sugerindo um possível papel

na modulação da contratilidade através da formação de S-nitrosomiosina.

A atividade da nNOS está relacionada a um aumento da atividade contrátil que

é correlacionado com um aumento da produção de NO

•

(Reiser et al., 1997). Em

animais Knockout para nNOS, a atividade contrátil dependente de NO

•

não aumenta

(Eu et al., 2003). Em nossos experimentos, observamos um aumento na formação



de nitrito após exercício de alta e baixa intensidade. Verificamos que a intensa

atividade contrátil (exercício de alta intensidade) promove um aumento significativo

na formação especificamente de S-nitrosomiosina (Figura 12), dando suporte a idéia

que esta modificação esteja associada à regulação da contratilidade. Nossos dados

não indicam o mecanismo para S-nitrosação da miosina, mas acreditamos que esse

mecanismo esteja relacionado a uma alteração na relação GSH/GSNO. O GSNO é

capaz de promover S-trans-nitrosação, numa reação que é reversível e que ocorre

com uma cinética de segunda ordem (Hogg, 1999).

O mecanismo de S-trans-nitrosação é indicado como proeminente na formação

de S-nitrosoproteínas em condições de estresse nitrosativo (Hogg, 2002). As

proteínas que são alvos para trans-nitrosação apresentam um motif consenso para

tal modificação (Stamler et al., 1997b) que contém aminoácidos vizinhos a cisteína

com cargas positiva (ácidos) e negativa (básicos). A sequência, mais

frequentemente, encontrada em torno de Cys nitrosada

(Lys/Arg/His/Asp/Glu)Cys(Asp/Glu) apresenta carga negativa e positiva próximo a

Cys (Ascenzi et al., 2000). Existem cisteínas na cabeça da miosina (Cys 402, 522 e

540) com esse perfil (Nogueira, 2008). Essas três cisteínas estão localizadas

próximas ao sítio de hidrólise de ATP. A reação de trans-nitrosação é proposta para

nitrosação e denitrosação, catalisada por aminoácidos vizinhos a cisteínas, que

apresentam um motif ácido/Cys/Base, como mostrado na Figura 17 (Stamler et al.,

1997b).

Este mecanismo foi comprovado, experimentalmente, por mutações sítio

dirigidas na enzima metionina adenosiltransferase. Os aminoácidos adjacentes a

cisteína alvo foram modificados, alterando a carga dos aminoácidos que catalisam a



reação de transferência do NO do tiol de baixo peso molecular para o tiol de alto

peso molecular (Perez-Mato et al., 1999). A trans-nitrosação não ocorria na

presença das mutações.

Figura 17: Representação esquemática da reação de trans-nitrosação da Cys via

um nitrosotiol (R-S-NO), catalisada por aminoácidos vizinhos His e Asp (atuando

como base e ácido, respectivamente), em um ambiente protéico. Diferentes resíduos

(Glu, Tyr, Lys, Arg) podem atuar como ácido/base na reação (Stamler et al., 1997b).

A denitrosação das proteínas em situações fisiológicas e fisiopatológicas está

relacionada ao equilíbrio de GSNO/GSH mediada pela enzima GSNOR (Durham et

al., 2008; Stamler et al., 2008). Deste modo, observamos que a miosina in vitro é

nitrosada por GSNO e denitrosada por GSH (Figura 13). A miosina apresenta duas

populações distintas de nitrosotióis, uma população estável e outra população

instável; várias proteínas apresentam essas populações de nitrosotióis (Forrester et



al., 2009b; Paige et al., 2008). Ainda não é conhecida a função dos nitrosotióis

estáveis, porém na sua tese Nogueira (2008) propôs uma função para os nitrosotióis

protéicos instáveis. A miosina tratada com GSNO foi nitrosada em treze cisteínas,

tendo sua atividade inibida em 25%. Uma extensa lavagem (5x) eliminou a S-

nitrosação de dez cisteínas, junto com a inibição. Deste modo foi proposto que

alguns dos S-nitrosotióis instáveis contribuem para inibição da atividade.

Recentemente, foi mostrado que doses suprafisiológicas de GSNO são

capazes de diminuir a sensibilidade ao cálcio das proteínas contráteis em fibras

descascadas (Spencer & Posterino, 2009). A contraprova (reversão) deste

experimento foi feita com DTT, que é um antioxidante capaz de desfazer não só a

nitrosação mas também a S-tiolação (modificação induzida por concentrações

suprafisiológicas de GSNO ou GSSG), e, portanto, não serve para comprovar a S-

nitrosação. Ao tratar fibras descascadas com GSNO, identificamos miosina e actina

como alvos para S-nitrosação (Figura 14), e observamos, também, que o tratamento

de fibras descascadas com concentrações fisiológicas de GSNO (10 µM) promove

uma diminuição na sensibilidade ao cálcio, sendo este efeito revertido por ascorbato

(decompositor específico de RSNO - Kashiba-Iwatsuki et al., 1997) (dados não

mostrados).

Deste modo, temos um modelo para estudos da alteração de sensibilidade ao

cálcio em fibras musculares esqueléticas e cardíacas, sendo que, em situações que

mimetizam insuficiência cardíaca e outras patologias musculares, podemos estudar

como as proteínas contráteis se comportam e qual o papel da S-nitrosação.

Durante o exercício, ocorrem alterações em dois parâmetros que são capazes

de modular a S-nitrosação de proteínas: o pH e a Po

. Foi mostrado que estes dois



fatores são capazes de regular a S-nitrosação de algumas proteínas específicas sob

condições fisiológicas (Arnelle & Stamler, 1995; Eu et al., 2000; Takahashi et al.,

2007). O efeito do pH está relacionado ao pK

dos tióis, que é de extrema

importância para determinar sua sensibilidade à S-nitrosação. Para compreender

quais condições que favorecem a S-nitrosação da miosina in vitro, incubamos a

miosina com GSNO em diferentes valores de pH e medimos sua atividade em pH

7.0. Entretanto, a sua inibição pelo GSNO não era pH-dependente.

A outra condição que modula a S-nitrosação é a Po

(Stamler et al., 1992).

Desenvolvemos um modelo para estudo de S-nitrosação e atividade enzimática em

diferentes pressões parciais de O

(Po

). A técnica permite manter a Po

no decorrer

do experimento e evitar alteração no pH. Realizamos experimentos para medir a

atividade Mg

-ATPásica em Po

fisiológica, usando um doador de NO

•

(DEANO)

para simular a produção de NO

•

pela nNOS na célula. Alguns tióis protéicos são

reativos ao NO

•

em soluções aquosas apenas quando o O

é excluído da solução

(Stamler et al., 1992). Verificamos que a atividade da miosina é inibida fortemente

pelo NO

•

em Po

fisiológicas e o provável mecanismo de S-nitrosação de tióis

protéicos por NO

•

é mostrado na equação 1.

Em conjunto, os dados sugerem que a miosina é S-nitrosada in vivo e que o

exercício pode modular a S-nitrosação da miosina, possívelmente, associada com a

variação na Po

intracelular. Este mecanismo também se estende para células

cardíacas em situações de isquemia (Bryan et al., 2004; Hare & Stamler, 2005) e

ambientes que têm variações frequentes de Po

, por exemplo, a mitocôndria

(Rodriguez-Juarez et al., 2007). O processo para denitrosação é favorecido pelo

GSH, como observado para outras proteínas (Paige et al., 2008). Em fibras



descascadas, os alvos para S-nitrosação são: miosina e actina, acarretando na

diminuição da sensibilidade ao cálcio, diminuição da produção de força e, assim,

capaz de modular a contratilidade muscular (Galler et al., 1997; Spencer &

Posterino, 2009) e contribuir para o processo de fadiga muscular (Ferreira & Reid,

2008). A formação de S-nitrosomiosina é uma nova proposta para modulação da

contratilidade muscular.



VI - Conclusões

1) No exercício de alta intensidade não houve aumento de RSNO no músculo

sóleo. Entretanto, há aumento de S-nitrosoproteína no músculo EDL (de contração

rápida), consistente com a maior expressão de nNOS.

2) Miosina é S-nitrosada endógenamente em músculo EDL e o nível aumenta com

exercício de alta intensidade.

3) Miosina é suscetível a denitrosação mediada por GSH in vitro, apresentando S-

nitrosotióis estáveis e instáveis.

4) Em fibras musculares permeabilizadas, tanto miosina quanto actina são alvos

preferenciais para a S-nitrosação por GSNO in vitro.

5) O efeito do GSNO na atividade Mg

-ATPásica é dose-dependente e não pH-

dependente.

6) O radical NO só é capaz de promover inibição da atividade da miosina quando

a pressão parcial de oxigênio é baixa, próxima ao valor alcançado durante o

exercício.



VII - Referências

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Sci. U. S. A. 103, 1295-1300.

140. Whalen, E.J., Foster, M.W., Matsumoto, A., Ozawa, K., Violin, J.D., Que, L.G.,

Nelson, C.D., Benhar, M., Keys, J.R., Rockman, H.A., Koch, W.J., Daaka, Y.,

Lefkowitz, R.J., & Stamler, J.S. (2007). Regulation of beta-adrenergic receptor

signaling by S-nitrosylation of G-protein-coupled receptor kinase 2. Cell. 129,

511-522.

141. Winterbourn, C.C. & Metodiewa, D. (1999). Reactivity of biologically important

thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide. Free Radic. Biol.

Med. 27, 322-328.

142. Wolosker, H., Panizzutti, R., & Engelender, S. (1996). Inhibition of creatine

kinase by S-nitrosoglutathione. FEBS Lett. 392, 274-276.

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143. Ziegler, D.M. (1985). Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiols-

disulfides in metabolic regulation. Annu. Rev. Biochem. 54, 305-329.

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Nome: Cícero Figueiredo Freitas

Nascimento: 18/04/1984

Naturalidade: Rio de Janeiro

¾ Formação Acadêmica

• Faculdade de Fisioterapia – Universidade Estácio de Sá, janeiro de 2002 a dezembro de

2005.

• Faculdade de Educação Física (Licenciatura Plena) – Universidade Estácio de Sá,

janeiro de 2004 a dezembro de 2005.

¾ Comunicação em Congresso

• 7 comunicações em congressos nacionais

• 2 comunicação em congressos internacionais

¾ Publicações

Nogueira L., Figueiredo-Freitas C., Magdesian M.H., Assreuy J. & Sorenson M.M. (2009)

Myosin is reversibly inhibited by S-nitrosylation. Biochem. Journal. 424: 221-231.

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