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DANIARA CRISTINA FERNANDES
Estudo químico e atividade biológica de Garcinia
xanthochymus (Clusiaceae)
Dissertação apresentada ao Instituto de Química,
Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em Química
Orientadora: Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva
Araraquara
2010
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SÚMULA CURRICULAR
DANIARA CRISTINA FERNANDES
DADOS PESSOAIS
Nascimento: 16/11/1981
Nacionalidade: Brasileira
Naturalidade: Jáu/SP
Estado civil: Solteira
Filiação: Wilson Fernandes
Marilda Aparecida Marquesan Fernandes
Profissão: Química
Endereço: Av. Sorocaba n° 2128, Vila Quitandinha, Araraquara-SP
Telefone: (16) 9186 5788
E-mail: daniaraf@gmail.com
FORMAÇÃO ACADÊMICA
Licenciatura em Química
Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”
Período: 2003-2007
Mestrado em Química
Área de Concentração: Química Orgânica
Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”
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ESTÁGIOS REALIZADOS
Iniciação à Pesquisa Científica
Título do projeto: Estudo químico e atividade antioxidante de Pterogyne nitens
(Leguminosae)
Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”
Orientação: Dulce Helena Siqueira Silva
Período: 2006-2007
Bolsa: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP
PARTICIPAÇÕES EM CONGRESSOS E COMISSÕES
Perfil químico e atividade biológica das folhas de Garcinia xanthochymus
(clusiaceae). 2009. 17° Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química,
Araraquara-SP.
Obtenção e estudo do potencial de híbridos orgânico-inorgânicos para aplicações
como filtros em protetores solares. 2009. 17° Encontro Regional da Sociedade Brasileira
de Química, Araraquara-SP.
The leaves chemical profile and biological activity of Garcinia xanthochymus. 2009.
2º Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro-SP.
Perfil químico e atividade biológica das folhas de Garcinia xanthochymus
(Clusiaceae). 2009. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Fortaleza-CE.
Perfil cromatográfico por HPLC-DAD e atividade biológica dos extratos dos frutos
de Eugenia jambolana (Myrtaceae). 2009. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, Fortaleza-CE.
Identificação de triterpenos e esteróides de Pterogyne nitens (Fabaceae-
Caesalpinioideae) utilizando cromatografia gasosa de alta resolução. 2008. XII Congresso
Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas e III Simpósio Brasileiro de
Cromatografia e Técnicas Afins, Florianópolis-SC.
Atividade sequestradora de radicais livres de extratos obtidos de Pterogyne nitens
(Fabaceae). 2007. Simpósio Paulista de Farmacognosia, Araraquara-SP.
Myeloperoxidase inhibitory flavonoids from fruits and leaves of Pterogyne nitens
(Fabaceae). 2007. 48
th
Annual Meeting of the American Society of Pharmacognosy,
Portland-OR, EUA.
Avaliação eletroquímica de flavonóides isolados de Pterogyne nitens (Fabaceae)
empregando voltametria cíclica. 2007. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, Águas de Lindóia-SP.
Interaction of potential antimalarial guanidine alkaloids from Pterogyne nitens
(Leguminosae) with heme using spectrophotometry. 2007. 6
th
International Congress of
Pharmaceutical Sciences, Ribeirão Preto-SP.
Mieloperoxidase inhibitory flavonoids from fruits and leaves of Pterogyne nitens
(Fabaceae). 2007. 1
st
Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro-SP.
Study of interaction of potential antimalarial guanidine alkaloids and flavonoids from
Pterogyne nitens (Leguminosae) with heme using spectrophotometry. 2007. 1
st
Brazilian
Conference on Natural Products, São Pedro-SP.
Alternativas às barreiras encontradas na aplicação de teorias pedagógicas no ensino
de química. 2007. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de
Lindóia-SP.
Pterogyne nitens (FABACEAE) como fonte de produtos naturais bioativos. 2007.
XV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades Grupo
Montevideo, Assunción, Paraguai.
Ação antioxidante e constituintes químicos de Pterogyne nitens (Leguminosae).
2006. XVIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Bauru-SP.
Atividade antiinflamatória e constituintes químicos das folhas de Pterogyne nitens
(Leguminosae). 2006. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de
Lindóia-SP.
Busca de substâncias antioxidantes em Pterogyne nitens (Leguminosae) empregando
cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica. 2006. II Simpósio
Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afins, São Pedro-SP.
O desenvolvimento de uma concepção científica através de metodologias
alternativas. 2006. XIII Encontro Nacional do Ensino de Química, Campinas-SP.
Três diferentes concepções geradas a partir de uma parceria Universidade-Escola
Pública diferenciada. 2006. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas
de Lindóia-SP.
Atividade antiinflamatória e constituintes químicos das folhas de Pterogyne nitens
(Leguminosae). 2006. I Escola de Inverno da USP-RP.
Estudo dos constituintes químicos de baixa polaridade de Pterogyne nitens
(Leguminosae). 2005. XII Congresso de Iniciação científica da UNESP, Araraquara-SP.
Espaços não-formais: motivação para a aprendizagem do ensino de física
promovendo a educação científica. 2005. V Encontro Nacional de Pesquisa em Educação
em Ciências, Bauru-SP.
Centro de Ciências de Araraquara: Plantão de Dúvidas. 2004. II Evento de Educação
em Química, Araraquara-SP.
Educação científica em espaços não-formais promovendo o ensino de química. 2004.
XII Encontro Nacional do Ensino de Química, Goiânia-GO.
Plantão de dúvidas como agente facilitador no processo ensino-aprendizagem em
Química. 2004. XII Encontro Nacional do Ensino de Química, Goiânia-GO.
Comissão organizadora do VI Simpósio e VI Reunião de Avaliação do Programa
Biota-Fapesp, 2008, Araraquara-SP.
Organização do III e IV Workshop do NuBBE, 2008 e 2009, Araraquara-SP.
TRABALHOS CIENTÍFICOS PUBLICADOS
Regasini, L. O.; Vieira-Júnior, G. M.; Fernandes, D. C.; Bolzani, V. S.; Cavalheiro,
A. J.; Silva, D. H. S. Identification of triterpenes and sterols from Pterogyne nitens
(Fabaceae-Caesalpinioideae) using high-resolution gas chromatography. Journal of the
Chilean Chemical Society. v. 54, n. 3, p. 218-221, 2009.
Regasini L. O.; Fernandes D. C.; Silva D. H. S.; Furlan M.; Barreiro E. J.L.; Young
M. C. M.; Bolzani V. Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens
(Caesalpinioideae). Química Nova. v. 31, p. 802-806, 2008.
Fernandes D. C.; Regasini L. O.; Vellosa J.C. R.; Oliveira O. M.; Bolzani V.; Castro-
Gamboa I.; Silva D. H. S. Myeloperoxidase inhibitory and radical scavenging activities of
flavones from Pterogyne Nitens. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 56, n. 5, p.
723-726, 2008.
INFORMAÇÕES ADICIONAIS
Premiações:
- Auxílio-mérito pelo trabalho intitulado “Avaliação eletroquímica de flavonóides isolados
de Pterogyne nitens (Fabaceae) empregando voltametria cíclica” apresentado na 30ª
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química.
- Resumo completo selecionado pela PROEX entre os 40 melhores da UNESP. O trabalho
intitulado como “Pterogyne nitens (FABACEAE) como fonte de produtos naturais
Bioativos” foi selecionado para apresentação oral e premiado como melhor trabalho na
categoria de Produtos naturais bioativos e suas aplicações, Reunião da AUGM, Assunción,
Paraguai, 2007.
- Seleção entre os alunos do Instituto de Química/Araraquara/UNESP para cursar a
disciplina intersemestral “Métodos Modernos de Caracterização Estrutural e Dinâmica de
proteínas” oferecida pelo Instituto de Química da UNICAMP em janeiro de 2007.
Aos meus pais Wilson Fernandes e Marilda Ap. M.
Fernandes que me auxiliaram a continuar com
dedicação esta pesquisa, por toda compreensão, por
terem lutado para eu chegar à universidade e por
estarem sempre comigo...
As minhas irmãs e verdadeiras amigas Daniele G.
Fernandes e Daniane M. Fernandes, por
compartilharem solidariamente a alegria das vitórias e
o dissabor dos insucessos...
Ao meu noivo Marco Aurélio Cebim, minha maior
conquista e credor do meu amor, carinho e respeito...
DEDICO ESTE TRABALHO
AGRADECIMENTOS
Foram longos momentos de desafios e provações, porém momentos de intenso
aprendizado e prazer. Muitas pessoas se notabilizaram por suas relevantes e
despretensiosas cooperações, por isso terão seus nomes merecidamente mencionados,
como forma de perpetuar suas valiosas participações. Meu grato reconhecimento:
À Deus por estar ao meu lado mesmo quando eu estava longe e perdida...
À doce profª Dra. Dulce Helena Siqueira Silva que me proporcionou grandes
oportunidades de aprendizado, me mostrando sempre as opções e me apoiando nas minhas
decisões. Agradeço pela confiança em mim depositada durante a realização deste trabalho
e ainda, pelos ensinamentos, que com sua seriedade, tranquilidade e conhecimento, me
guiaram para caminhos corretos e compensadores. Agradeço por ter despertado em mim o
interesse pelo estudo das plantas. Muito obrigada...
Ao meu mestre Dr. Ian Castro-Gamboa, pesquisador obstinado e perfeccionista, o
qual instigou minha paixão pela Química Orgânica e mesmo que distante, sua ousadia,
motivação, alegria e capacidade intelectual me contagiam...
À profª Dra. Márcia Nasser e à profª Dra. Ângela R. Araújo, por sempre estarem
dispostas a transmitir seus valiosos ensinamentos e por me incentivarem nesta longa
caminhada. Meu estimado apreço pelo exemplo de docente, pesquisador e principalmente
ao exemplo relacionado ao valor da vida...
Aos professores Dra. Vanderlan da Silva Bolzani, Dr. Alberto Cavalheiro, Dr. Lúcia
Xavier, Dr. Maysa Furlan, Dra. Isabele Rodrigues Nascimento e Dra. Lourdes C. dos
Santos, pela convivência e pelo aprendizado durante meus seis anos no laboratório...
Aos professores, membros da banca, que gentilmente aceitaram o convite de ler este
manuscrito...
Ao Dr. Nivaldo Boralle, pela realização dos espectros de RMN, por seus valiosos
conhecimentos e ensinamentos, pelos bons momentos de descontração, pela sua seriedade
e disponibilidade em resolver meus “pepinos” e claro, por cuidar muito bem do Nerinho.
Um cão é a única coisa na terra que nos ama mais do que ama a sí mesmo...
Ao Dr. Alberto C. Alécio, pela amizade, compreensão, por seus ensinamentos, por
estar sempre solícito quando é necessário, e principalmente pela humildade em lidar com
as pessoas. Admiro pessoas como vc...
Aos professores Dr. Norberto Peporine (USP- Ribeirão Preto) e ao especialista em
Laboratório Dr. José Carlos Tomaz, pela realização dos espectros de massas,
imprescindíveis para a elucidação estrutural das substâncias isoladas neste trabalho...
Ao professor Antonio Gilberto Ferreira da Universidade Federal de São Carlos pelas
medidas dinâmicas de RMN...
Ao prof° Dr. Wagner Vilegas e em especial as doutorandas Juliana Severi e Juliana
Rodrigues pela presteza na realização das medidas ópticas...
À profª Dra. Mary Rosa R. de Marchi e seu orientado Flavio Soares Silva pela
disponibilidade do equipamento de CG-EM...
Aos Professores integrantes do Projeto Temático Biota/Bioprospecta-Fapesp e seus
orientados pela realização dos ensaios farmacológicos. Em especial as alunas Tarsia, pelo
ensaio quimiopreventivo; Mariana, pelo ensaio tripanocida e Luciana pelos ensaios
antifúngicos...
Ao meu amigo, irmão e mestre Dr. Luis Octávio Regasini pelo seu esmero e
dedicação na pesquisa e transmissão de conhecimentos científicos agregados a valores
éticos (elementos fundamentais para uma boa qualificação profissional) e pelas
oportunidades concedidas para meu aperfeiçoamento acadêmico, as quais têm me
permitido acessar novos campos de estudo. “Espero corresponder às suas expectativas.”
Aos amigos Amanda, Marcos, Marília, Vanessa, Sheila, Carol, Welington, Aline,
Néia, Mike, Ana, Juliana, Thais, Luciene, Andréinha, João Marcos, Sílvia, Lidiane,
Marcos Marçal, Sara, Otávio, Luciana, Magela, Vânia, Vivi, Cristiano e Fernando, por
terem me ensinado muito sobre suas experiências em Química de Produtos Naturais,
durante o período de Graduação e Pós-Graduação, cujo aprendizado acelerou o
amadurecimento da minha formação científica. “Sou grata pelas informações que
produziram atalhos, e pelo apoio emocional que me fortaleceu durante a caminhada.”
À minha amiga Alessandra Cr. Dametto, minha parceira no estudo fitoquímico, nos
grupos de sala de aula, nas confraternizações, nos congressos e como não se lembrar, das
incansáveis organizações. Muito obrigada por fazer parte da minha história...
As minhas amigas inseparáveis Adriana, Sheila, Patrícia e Rosilene “O quarteto
fantástico”, ou melhor, “As agregadas” e à Thayz, por me ajudarem sempre, me acolherem
e me ouvirem. Por tudo que vivemos juntas desde a graduação até hoje, amigas verdadeiras
que quero sempre em minha vida, mesmo longe...
Aos colegas da gradução Aroldo, Flavia, João Medeiros, Leandro, Mônica, Éderson,
Fabrícia, Renata, Jeane, Paulo, Ademar e Jorge, por fazerem parte da minha vida até hoje...
À FAPESP pela bolsa concedida e apoio financeiro ao projeto.
“Primeiro aprenda a ser um artesão. Isso
não impedirá você de ser um gênio”.
Eugène Delacroix
Resumo
RESUMO
A espécie Garcinia xanthochymus, comumente conhecida como Gamboja, é uma árvore
nativa da Índia com aproximadamente 8-10 metros, utilizada extensamente na medicina
popular como antidiarréica. Este trabalho descreve o estudo químico e biológico das folhas
e frutos de G. xanthochymus. Dentre as substâncias isoladas, podemos destacar 3 triterpenos
obtidos do extrato hexânico das folhas: friedelina (1), lanosta-8,24-dien-3-ol (2) e lanosta-
7,24-dien-3-ol (3), sendo as substâncias 2 e 3 relatadas pela primeira vez na literatura da
espécie. A prospecção química da fase acetato de etila das folhas revelou uma abundante
presença de biflavonóides, sendo as substâncias saharanflavona (4), I3, II8-biapigenina (5),
GB1a (6), (+)-morelloflavona (8), GB2a (11), volkensiflavona (12), GB2 (14),
xantochimusídeo (15) e fukugisídeo (16), caracterizadas pela ligação interflavonoídica do
tipo 38’’, e as substâncias podocarpusflavona (7) e amentoflavona (9), pela ligação do
tipo 3’8’’. Merece destaque a substância 4, isolada pela primeira vez de fontes naturais.
A composição química de G. xanthochymus constituiu-se ainda das substâncias
diidrokaempferol (10), ácido vanílico (13), cinco derivados de ácidos fenilpropanoídicos:
ácido 3-O-cafeoilquínico (17), ácido 5-O-cafeoilquínico (18), ácido 3-p-coumaroilquínico
(21), ácido 4-O-cafeoilquínico (22) e ácido 4-p-coumaroilquínico (23); e ainda a mistura
binária das benzofenonas xantochimol (19) e cicloxantochimol (20). Todas as substâncias
foram relatadas pela primeira vez nas folhas de G. xanthochymus, com exceção da
substância 7 e as substâncias 10, 13, 17, 18, 21, 22 e 23 ainda não haviam sido identificadas
na espécie. Através da técnica CG-DIC foram identificados 15 triterpenos e/ou esteróides
nos extratos de baixa polaridade e através das técnicas hifenadas, como CLAE-UV e
CLAE-EM, foi possível localizar substâncias já isoladas e/ou isoladas em trabalhos
anteriores. Os resultados observados para os ensaios antioxidantes utilizando-se o radical
DPPH evidenciaram a importância dos grupos catecólicos como essenciais para uma
excelente ação antioxidante. Em relação à atividade antifúngica os extratos etanólico e
hexânico dos frutos de G. xanthochymus apresentaram resultados muito atrativos, com CIM
de 1,95
µg/mL, oito vezes menor que o apresentado pelo padrão comercial fluconazol
(CIM=16,0 µg/mL). A (+)-morelloflavona (8) mostrou elevada capacidade de indução da
atividade da enzima quinona redutase, comparável ao da 4’-bromoflavona (padrão
comercial), evidenciando o potencial quimiopreventivo de G. xanthochymus.
Palavras-chave: Garcinia xanthochymus. Biflavonóide. Bioprospecção.
Abstract
ABSTRACT
The species Garcinia xanthochymus, known as Gamboja is a native Indian tree ca. 8-10 m
high, which is extensively used as folk medicine for treating diarrhea and dysentery. This
work describes the study of the chemical profile of G. xanthochymus leaves and fruits.
Among the isolated substances three triterpenes were obtained from the hexane extract of
the leaves: friedelin (1), lanosta-8,24-dien-3-ol (2) e lanosta-7,24-dien-3-ol (3), with
compounds (2) and (3) described for the first time in the literature of this species. The
chemical prospection of the ethyl acetate extract of the leaves revealed an abundant amount
of biflavonoids, with compounds saharanflavone (4), I3,II8-biapigenin (5), GB1a (6), (+)-
morelloflavone (8), GB2a (11), volkensiflavone (12), GB2 (14), xanthochymuside (15) and
fukugiside (16) characterized by the interflavonoid 38” bond, and compounds
podocarpusflavone (7) and amentoflavone (9), by the interflavonoid 3’8’’ bond.
Substance 4 was isolated for the first time from a natural source. The chemical composition
of G. xanthochymus included additionally dihydrokaempferol (10), vanillic acid (13), and
five phenylpropanoid acid derivatives: 3-O-caffeoylquinic acid (17), 5-O-caffeoylquinic
acid (18), 3-p-coumaroylquinic acid (21), 4-O-caffeoylquinic acid (22) and 4-p-
coumaroylquinic acid (23); as well a binary mixture of xanthochymol (19) and cycle-
xanthochymol (20) benzophenones. All the compounds were reported for the first time in
the leaves of G. xanthochymus, with the exception of compound 7, and compounds 10, 13,
17, 18, 21, 22 e 23, which had not yet been identified in this species. By CG-FID technique
fifteen triterpenes and/or steroids were identified in the low polarity extracts. Hyphenated
techniques such as HPLC-UV and HPLC-MS were used to locate previously isolated
compounds from different fractions and/or isolated substances from other works. The
bioactivity evaluation of extracts, semipurified fracions and pure compounds from G.
xanthochymus displayed attractive results. The free radical scavenging assay with DPPH
radical confirmed the importance of the cathecol group as essential for optimum antioxidant
action. The ethanol and hexane extracts from the fruits of G. xanthochymus showed potent
antifungal activity (MIC= 1.95
µg/mL), ca. eight times lower than the commercial standard
fluconazole (MIC=16,0 µg/mL). Additionally, (+)-morelloflavone (8) showed strong
induction of quinone reductase enzyme activity, comparable to the positive control 4’-
bromoflavone, evidencing the chemopreventive potential of G. xanthochymus.
Keywords: Garcinia xanthochymus. Biflavonoid. Bioprospection.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Foto de diferentes partes de Garcinia xanthochymus. 33
Figura 2 - Algumas classes de substâncias isoladas da espécie de Garcinia xanthochymus.
33
Figura 3 - Esquema geral da rota biossintética de flavonóides (ACC-acetil CoA-
carboxilase, CS-chalcona sintetase e CI-chalcona isomerase). 37
Figura 4 - Estrutura de biflavonóides tipo flavona-flavona. 37
Figura 5 - Experimento de RMN
1
H para a (±)-morelloflavona (Li et al., 2002) em
temperaturas variáveis. O sinal 1a representa o confôrmero principal e 1b o
confôrmero minoritário. 40
Figura 6 - Representação do equilíbrio entre as EROs e as defesas antioxidantes do nosso
organismo (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). 42
Figura 7 - Fracionamento cromatográfico dos frutos de Garcinia xanthochymus. 52
Figura 8 - Fracionamento cromatográfico das folhas de Garcinia xanthochymus. 53
Figura 9 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia
xanthochymus em coluna de permeação em gel (LH-20, Sephadex
®
). 53
Figura 10 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia
xanthochymus em coluna de fase normal (sílica-gel 60-230 µ). 54
Figura 11 - Fracionamento cromatográfico da fração BuOH-FOL de Garcinia
xanthochymus. 54
Figura 12 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-FOL-14,
eluída com MeOH:H
2
O: HOAc (57:42,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 57
Figura 13 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-
FOL-15 e (b) AcOEt-FOL-16, eluídas com MeOH:H
2
O: HOAc (75:24,5:0,5) e
detecção em λ=254 nm. 58
Figura 14 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-
SIL-3 e (b) AcOEt-SIL-9, eluídas com MeOH:H
2
O: HOAc (45:54,5:0,5) e
detecção em λ=254 nm. 58
Figura 15 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-
SIL-4, eluída com MeOH:H
2
O: HOAc (60:39,5:0,5) e (b) AcOEt-SIL-5, eluídas
com MeOH:H
2
O: HOAc (50:49,5:0,5). 59
Figura 16 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-SIL-11,
eluída com MeOH:H
2
O: HOAc (35:64,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 60
Lista de Figuras
Figura 17 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração BuOH-FOL-6,
eluída com MeOH:H
2
O: HOAc (20:79,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 61
Figura 18 - Cromatoplaca da subfração AcOEt-FRU-7 com (a) revelação física em =254
nm e (b) revelação química com anisaldeído sulfúrico (c) Cromatograma
analítico da subfração AcOEt-FRU-7, obtido em coluna ODS (Phenomenex,
25,0 cm x 4,6 mm x 5m) eluída com fase móvel de MeOH:H
2
O: HOAc
(75:24,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 61
Figura 19 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV do extrato ETOH (a) e das
frações AcOEt (b), BuOH (c) e HA (d) dos frutos (acima) e das folhas (abaixo)
de Garcinia xanthochymus no modo gradiente em H
2
O: MeOH (95:5) até
MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x
5m). 68
Figura 20 - Espectro no UV de algumas substâncias isoladas da fração AcOEt-FOL de
Garcinia xanthochymus. 68
Figura 21 - Espectro de massas da substância 1 obtido por CG-EM (IE=+70 eV). 70
Figura 22 - Espectro vibracional na região do IV da substância 1. 71
Figura 23 - Proposta de fragmentação da substância 1. 71
Figura 24 - Espectro vibracional na região do IV da substância 2. 73
Figura 25 - Espectro de massas da substância 2 obtido por CG-EM (IE= + 70 eV). 73
Figura 26 - Proposta de fragmentação da substância 2. 73
Figura 27 - Estrutura da substância 4. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 4 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 76
Figura 28 - Espectro vibracional na região do IV da substância 4. 76
Figura 29 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 4 obtido no modo
negativo (ESI). 78
Figura 30 - Estrutura da substância 5. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 5 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m) 79
Figura 31 - Espectro vibracional na região do IV da substância 5. 80
Figura 32 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 5 obtido no modo
negativo (ESI). 80
Lista de Figuras
Figura 33 - Estrutura da substância 8. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 8 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 82
Figura 34 - Espectro vibracional na região do IV da substância 8. 83
Figura 35 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 8,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 5% para EM2 (ESI). 83
Figura 36 - Proposta de fragmentação da substância 8. 83
Figura 37 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 8. 85
Figura 38 - Estruturas do confôrmero principal (8a) e minoritário (8b) da morelloflavona.
85
Figura 39 - Estrutura da substância 9. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 9 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 87
Figura 40 - Espectro vibracional na região do IV da substância 9. 88
Figura 41 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 9 obtido no modo
negativo (ESI). 88
Figura 42 - Estrutura da substância 10. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 10 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 90
Figura 43 - Espectro vibracional na região do IV da substância 10. 91
Figura 44 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 10,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 91
Figura 45 - Proposta de fragmentação da substância 10. 92
Figura 46 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 10. 93
Figura 47 - Estrutura da substância 11. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 11 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 94
Figura 48 - Espectro vibracional na região do IV da substância 11. 94
Figura 49 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 11,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 95
Figura 50 - Proposta de fragmentação da substância 11. 95
Lista de Figuras
Figura 51 - Experimento de RMN
1
H com temperatura variável da substância 11. 98
Figura 52 - Estrutura da substância 12. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 12 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 99
Figura 53 - Espectro vibracional na região do IV da substância 12. 100
Figura 54 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 12,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 101
Figura 55 - Proposta de fragmentação da substância 12. 101
Figura 56 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 12. 101
Figura 57 - Estrutura da substância 13. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 13 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 102
Figura 58 - Espectro vibracional na região do IV da substância 13. 103
Figura 59 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 13,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 105
Figura 60 - Proposta de fragmentação da substância 13. 105
Figura 61 - Estrutura da substância 14. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de
absorção da substância 14 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm
x 5m). 106
Figura 62 - Curva de dicroísmo circular (DC) das substâncias (a) 11 e (b) 14. 108
Figura 63 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 14,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 108
Figura 64 - Proposta de fragmentação da substância 14. 109
Figura 65 - Estruturas das substâncias 17 e 18. (a) Cromatogramas analíticos e (b)
espectros de absorção das substâncias 17 e 18 obtido via CLAE-UV-DAD no
modo isocrático 35:75 (MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS
(Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m). 110
Figura 66 - Espectro vibracional na região do IV da substância 17. 110
Figura 67 - Estrutura do ácido quínico. (a) conformação de maior estabilidade. (b)
conformação de menor estabilidade evidenciando interação 1,3-diaxial entre a
carboxila e a hidroxila em C5. 112
Lista de Figuras
Figura 68 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 17,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 114
Figura 69 - Proposta de fragmentação da substância 17. 114
Figura 70 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 18,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 115
Figura 71 - Proposta de fragmentação da substância 18. 115
Figura 72 - Cromatograma analítico de alguns constituintes majoritários obtido via CLAE-
UV-DAD das subfrações (a) AcOEt-FRU-13 (b) e AcOEt-FRU-17, no modo
gradiente em H
2
O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico:
ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m). 117
Figura 73 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 24,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 117
Figura 74 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 25 obtido no modo
negativo (ESI). 117
Figura 75 - Proposta de fragmentação da substância 24. 118
Figura 76 - Proposta de fragmentação da substância 25. 118
Figura 77 - Estruturas das xantonas padrão utilizadas no processo de desreplicação das
substâncias 24 e 25. 119
Figura 78 - (a) Espectro de absorção da substância 24, da xantona 1 e cromatograma
analítico da xantona 1 (b) Espectro de absorção da substância 25, xantona 2 e
cromatograma analítico da xantona 2. Modo gradiente em H
2
O: MeOH (95:5)
até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6
mm x 5m). 120
Figura 79 - Espectro de absorção no UV comparativo (a) da substância 11 e o pico 2 da
fração AcOEt-FRU-17 e (b) da substância 14 e o pico 1 da fração AcOEt-FRU-
17. 120
Figura 80 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem dos picos 1
(esquerda) e 2 (direita) da subfração AcOEt-FRU-17, obtido em modo
negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 121
Figura 81 - (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 6 obtido
via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m). 121
Figura 82 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 6 (DMSO-d
6
). 122
Figura 83 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 6,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 123
Figura 84 - Proposta de fragmentação da substância 6. 123
Lista de Figuras
Figura 85 – Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 7 (DMSO-d
6
). 124
Figura 86 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 7 obtido no modo
negativo (ESI). 124
Figura 87 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 15 (DMSO-d
6
). 124
Figura 88 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 16 (DMSO-d
6
). 125
Figura 89 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 15,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 125
Figura 90 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 16 obtido no modo
negativo (ESI). 126
Figura 91 - Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da subfração AcOEt-FRU-7
obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático MeOH:H
2
O:HOAc
(75:24,5:0,5), suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x
5m) e detecção em λ=254 nm. 128
Figura 92 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d
6
). 128
Figura 93 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da subfração AcOEt-
FRU-7, obtido em modo negativo com energia de colisão de 30% para EM2
(ESI). 129
Figura 94 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 22,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 130
Figura 95 - Espectro de massas de primeira e segunda-ordem obtido em modo negativo
com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI) da (a) substância 21 e da (b)
substância 23. 130
Figura 96 - Estruturas dos triterpenos e esteróides identificados nos extratos e frações de
baixa polaridade de Garcinia xanthochymus. 131
Figura 97 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-5 (a) do HEX-FRU [38 t
r
=22,05; 39
t
r
=23,38; 35 t
r
=23,82; 27 t
r
=24,43 e 32 t
r
=26,84] (b) da FR. HEX-FOL [39
t
r
=23,38; 35 t
r
=23,75; 27 t
r
=24,33 e 32 t
r
=26,75] (c) e do EXT-FOL [37 t
r
=20,41
e 34 t
r
=24,82], em presença de colesterol (padrão interno). 133
Figura 98 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-50 (a) do HEX-FRU [38 t
r
=17,29; 39
t
r
=19,24; 35 t
r
=22,97; 27 t
r
=24,06 e 32 t
r
=25,46] (b) da FR. HEX-FOL [39
t
r
=19,11; 35 t
r
=22,80; 27 t
r
=23,31 e 32 t
r
=25,35] (c) e do EXT-FOL [37 t
r
=15,86
e 34 t
r
=25,64], em presença de colesterol (padrão interno). 133
Figura 99 - Gráfico da curva de concentração dos extratos e frações (a) das folhas e dos (b)
frutos de G. xanthochymus versus a % de seqüestro de DPPH. 135
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Substâncias isoladas de Garcinia xanthochymus e bioatividades relatadas nas
referências citadas. 34
Tabela 2 - Intervalos de absorção no UV para diferentes tipos de flavonóides. 69
Tabela 3 - Dados de RMN de
13
C (125 MHz) das substâncias 1, 2 e 3 em CDCl
3
. 75
Tabela 4 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 4
(DMSO-d
6
). 78
Tabela 5 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 5
(DMSO-d
6
). 81
Tabela 6 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 8
(DMSO-d
6
). 86
Tabela 7 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 9
(DMSO-d
6
). 89
Tabela 8 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 10
(DMSO-d
6
). 93
Tabela 9 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 11
(DMSO-d
6
). 96
Tabela 10 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 12
(DMSO-d
6
). 102
Tabela 11 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 13
(DMSO-d
6
). 105
Tabela 12 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 14
(DMSO-d
6
). 107
Tabela 13 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 17
(DMSO-d
6
). 110
Tabela 14 - Fragmentos obtidos dos analitos isolados de G. xanthochymus a partir da
análise por EM e EM2 obtido em modo negativo com energia de colisão de
15%. 113
Tabela 15 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d
6
). 127
Tabela 16 - Fragmentos obtidos de benzofenonas isoladas de G. xanthochymus através de
EM e EM2. 129
Tabela 17 - Valores da retenção relativa das amostras com o colesterol. 132
Lista de Tabelas
Tabela 18 - Atividade antioxidante dos extratos e frações de Garcinia xanthochymus frente
ao radical DPPH. 134
Tabela 19 - Atividade inibitória in vitro no ensaio de formação de β-Hematina para os
extratos e frações de Garcinia xanthochymus. 136
Tabela 20 - Atividade antifúngica in vitro dos extratos e frações de G. xanthochymus frente
a fungos patogênicos humanos. 137
Tabela 21 - Atividade biológica dos constituintes isolados das folhas e frutos de Garcinia
xanthochymus. 138
Tabela 22 - Atividade tripanocida dos extratos e frações de G. xanthochymus. 139
Tabela 23 - Avaliação da taxa de indução (IR) da atividade de QR em linhagem Hepa1c1c7
para 8. 140
Lista de Anexos
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Espectro de RMN de
1
H da substância 1. ......................................................... 156
Anexo 2. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1. ................................... 156
Anexo 3. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1. ................................... 157
Anexo 4. Espectro de RMN de
13
C da substância 1. ........................................................ 157
Anexo 5. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 1. .................................. 158
Anexo 6. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 1. .................................. 158
Anexo 7. Espectro de DEPT 135° da substância 1. .......................................................... 159
Anexo 8. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 1. .................................... 159
Anexo 9. Espectro de DEPT 90° da substância 1. ............................................................ 160
Anexo 10. Espectro de RMN de
1
H da substância 2. ........................................................ 160
Anexo 11. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1................................... 161
Anexo 12. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 2................................... 161
Anexo 13. Espectro de RMN de
13
C da substância 2 ....................................................... 162
Anexo 14. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 2. ................................ 162
Anexo 15. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 2. ................................ 163
Anexo 16. Espectro de DEPT 135° da substância 2. ........................................................ 163
Anexo 17. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2. .................................. 164
Anexo 18. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2. .................................. 164
Anexo 19. Espectro de DEPT 90° da substância 2. .......................................................... 165
Anexo 20. Espectro de RMN de
1
H da mistura 2 e 3........................................................ 165
Anexo 21. Espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3. ..................................................... 166
Anexo 22. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3. ............................... 166
Anexo 23. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3. ............................... 167
Anexo 24. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3. ............................... 167
Anexo 25. Espectro de RMN de
1
H da substância 4. ........................................................ 168
Anexo 26. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 4................................... 168
Anexo 27. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 4. ......................................... 169
Anexo 28. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 4. ................... 169
Anexo 29. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 4. ....................................... 170
Anexo 30. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 4 .................. 170
Anexo 31. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4. ....................................... 171
Anexo 32. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4. ................. 171
Lista de Anexos
Anexo 33. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4. ................. 172
Anexo 34. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4. ................. 172
Anexo 35. Espectro de HOMODEC da substância 4 ....................................................... 173
Anexo 36. Espectro de NOESY 1D (irradiação em
H
6,25) da substância 4. ................... 173
Anexo 37. Espectro de RMN de
1
H da substância 5......................................................... 174
Anexo 38. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 5................................... 174
Anexo 39. Espectro de RMN de
13
C da substância 5........................................................ 175
Anexo 40. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 5. ................................ 175
Anexo 41. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 5. ................................ 176
Anexo 42. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 5. ......................................... 176
Anexo 43. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 5. ................... 177
Anexo 44. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5. ....................................... 177
Anexo 45. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5. ................. 178
Anexo 46. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5. ................. 178
Anexo 47. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5. ................. 179
Anexo 48. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ....................................... 179
Anexo 49. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ................. 180
Anexo 50. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ................. 180
Anexo 51. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ................. 181
Anexo 52. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ................. 181
Anexo 53. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5. ................. 182
Anexo 54. Espectro de RMN de
1
H da substância 8. ........................................................ 182
Anexo 55. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 8................................... 183
Anexo 56. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 8. ......................................... 183
Anexo 57. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 8. ................... 184
Anexo 58. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8. ....................................... 184
Anexo 59. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8. ................. 185
Anexo 60. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8. ................. 185
Anexo 61. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8. ................. 186
Anexo 62. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8 ........................................ 186
Anexo 63. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 187
Anexo 64. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 187
Anexo 65. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 188
Anexo 66. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 188
Lista de Anexos
Anexo 67. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 189
Anexo 68. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 189
Anexo 69. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 190
Anexo 70. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8. ................. 190
Anexo 71. Espectro de RMN de
1
H da substância 9. ........................................................ 191
Anexo 72. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 9................................... 191
Anexo 73. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 9................................... 192
Anexo 74. Espectro de RMN de
13
C da substância 9........................................................ 192
Anexo 75. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 9. ................................ 193
Anexo 76. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 9. ................................ 193
Anexo 77. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 9. ......................................... 194
Anexo 78. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 9. ................... 194
Anexo 79. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9. ....................................... 195
Anexo 80. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9. ................. 195
Anexo 81. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9. ................. 196
Anexo 82. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9. ....................................... 196
Anexo 83. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9. ................. 197
Anexo 84. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9. ................. 197
Anexo 85. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9. ................. 198
Anexo 86. Espectro de RMN de
1
H da substância 10. ...................................................... 198
Anexo 87. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 10. ................................ 199
Anexo 88. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10......................................... 199
Anexo 89. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10. ................. 200
Anexo 90. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10. ................. 200
Anexo 91. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 10. ..................................... 201
Anexo 92. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 10. ............... 201
Anexo 93. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10. ..................................... 202
Anexo 94. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10. ............... 202
Anexo 95. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10. ............... 203
Anexo 96. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10. ............... 203
Anexo 97. Espectro de RMN de
1
H da substância 11. ...................................................... 204
Anexo 98. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 11 ................................. 204
Anexo 99. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 11. ................................ 205
Anexo 100. Espectro de RMN de
13
C da substância 11. ................................................... 205
Lista de Anexos
Anexo 101. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11. ............................. 206
Anexo 102. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11. ............................. 206
Anexo 103. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11. ............................. 207
Anexo 104. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11. ............................. 207
Anexo 105. Espectro de DEPT 135° da substância 11. .................................................... 208
Anexo 106. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11. .............................. 208
Anexo 107. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11. .............................. 209
Anexo 108. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11. ...................................... 209
Anexo 109. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11. ............... 210
Anexo 110. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11. ............... 210
Anexo 111. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11. ............... 211
Anexo 112. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11. ................................... 211
Anexo 113. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11 .............. 212
Anexo 114. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11. ............. 212
Anexo 115. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11. ............. 213
Anexo 116. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ................................... 213
Anexo 117. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 214
Anexo 118. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 214
Anexo 119. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 215
Anexo 120. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 215
Anexo 121. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 216
Anexo 122. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 216
Anexo 123. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 217
Anexo 124. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 217
Anexo 125. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11. ............. 218
Anexo 126. Espectro de RMN de
1
H da substância 12. .................................................... 218
Anexo 127. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 12. .............................. 219
Anexo 128. Espectro de RMN de
13
C da substância 12. ................................................... 219
Anexo 129. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12 .............................. 220
Anexo 130. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12. ............................. 220
Anexo 131. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12. ............................. 221
Anexo 132. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12. ...................................... 221
Anexo 133. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12. ............... 222
Anexo 134. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12. ............... 222
Lista de Anexos
Anexo 135. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ................................... 223
Anexo 136. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ............. 223
Anexo 137. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ............. 224
Anexo 138. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ............. 224
Anexo 139. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ............. 225
Anexo 140. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12. ............. 225
Anexo 141. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ................................... 226
Anexo 142. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ............. 226
Anexo 143. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ............. 227
Anexo 144. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ............. 227
Anexo 145. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ............. 228
Anexo 146. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12. ............. 228
Anexo 147. Espectro de RMN de
1
H da substância 13. .................................................... 229
Anexo 148. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 13. .............................. 229
Anexo 149. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 13. ...................................... 230
Anexo 150. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 13. ............... 230
Anexo 151. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 13. ................................... 231
Anexo 152. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 13. ............. 231
Anexo 153. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 13. ................................... 232
Anexo 154. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 13. ............. 232
Anexo 155. Espectro de RMN de
1
H da substância 14. .................................................... 233
Anexo 156. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 14. .............................. 233
Anexo 157. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 14. .............................. 234
Anexo 158. Espectro de RMN de
13
C da substância 14. ................................................... 234
Anexo 159. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14. ............................. 235
Anexo 160. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14. ............................. 235
Anexo 161. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14. ............................. 236
Anexo 162. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14 ....................................... 236
Anexo 163. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14. ............... 237
Anexo 164. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14. ............... 237
Anexo 165. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14. ................................... 238
Anexo 166. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14. ............. 238
Anexo 167. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14. ............. 239
Anexo 168. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14. ................................... 239
Lista de Anexos
Anexo 169. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14. ............. 240
Anexo 170. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14. ............. 240
Anexo 171. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14 .............. 241
Anexo 172. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14 .............. 241
Anexo 173. Espectro de RMN de
1
H da substância 17. .................................................... 242
Anexo 174. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17. .............................. 242
Anexo 175. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17. .............................. 243
Anexo 176. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17. .............................. 243
Anexo 177. Espectro de RMN de
13
C da substância 17. ................................................... 244
Anexo 178. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17. ...................................... 244
Anexo 179. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17. ............... 245
Anexo 180. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17. ............... 245
Anexo 181. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17. ................................... 246
Anexo 182. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17 .............. 246
Anexo 183. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17. ............. 247
Anexo 184. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17. ............. 247
Anexo 185. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ................................... 248
Anexo 186. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ............. 248
Anexo 187. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ............. 249
Anexo 188. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ............. 249
Anexo 189. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ............. 250
Anexo 190. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17. ............. 250
Anexo 191. Espectro de RMN de
1
H da substância 18. .................................................... 251
Anexo 192. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18. .............................. 251
Anexo 193. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18. .............................. 252
Anexo 194. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18. .............................. 252
Anexo 195. Espectro de RMN de
13
C da substância 18. ................................................... 253
Anexo 196. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18. ...................................... 253
Anexo 197. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18. ............... 254
Anexo 198. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18. ............... 254
Anexo 199. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18. ................................... 255
Anexo 200. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18. ............. 255
Anexo 201. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18. ............. 256
Anexo 202. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18. ............. 256
Lista de Anexos
Anexo 203. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ................................... 257
Anexo 204. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 257
Anexo 205. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 258
Anexo 206. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 258
Anexo 207. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 259
Anexo 208. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 259
Anexo 209. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18. ............. 260
Abreviaturas e símbolos
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
T
D
rotação óptica
comprimento de onda
H
deslocamento químico de hidrogênio
C
deslocamento químico de carbono
ACC enzima acetil CoA-carboxilase
ACQ ácido cafeoilquínico
AcOEt acetato de etila
AcOEt-FOL fração acetato de etila das folhas
AcOEt-FRU fração acetato de etila dos frutos
AcOEt-SIL fração acetato de etila submetida a CC-FN
ApCoQ ácido p- coumaroilquínico
BuOH-FOL fração n-butanólica das folhas
BuOH-FRU fração n-butanólica dos frutos
CC cromatografia em coluna
CCDC cromatografia em camada delgada comparativa
CC-FN cromatografia em coluna de fase normal
CDCl
3
clorofórmio deuterado
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-prep cromatografia líquida de alta eficiência preparativa
CI chalcona isomerase
CI
50
concentração inibitória mínima
CG cromatografia gasosa
CPG cromatografia de permeação em gel
CS chalcona sintetase
d dubleto
dd duplo dubleto
DAD detector com arranjo de diodos
DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
DIC detector de ionização de chama
DMSO-d
6
dimetilsulfóxido deuterado
DPPH radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
Abreviaturas e símbolos
DNA Ácido desoxiribonucleíco
ELL extração líquido-líquido
EM espectrometria de massa
EM2 espectrometria de massa de segunda-ordem
EROs espécies reativas de oxigênio
ESI electrospray
FR. HEX-FOL fração hexânica das folhas
ETOH-FOL extrato etanólico das folhas
ETOH-FRU extrato etanólico dos frutos
gCOSY gradient Correlated Spectroscopy
gHMBC gradient Heteronuclear Multiple Bond Correlation
gHMQC gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
GSH enzima glutationa peroxidase
GSSG enzima glutationa redutase
GST enzima glutationa s-transferase
J constante de acoplamento
HA-FOL fração hidroalcoólica das folhas
HA-FRU fração hidroalcoólica dos frutos
HEX hexano
HEX-FOL extrato hexânico das folhas
HEX-FRU extrato hexânico dos frutos
HOAc ácido acético
HOMODEC homonuclear decoupling
IV infravermelho
IE impacto eletrônico
m multipleto
m massa
m/z relação massa/carga
MeOH metanol
MTT 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio
n-BuOH n-butanol
NaOH hidróxido de sódio
NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy
NuBBE Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais
Abreviaturas e símbolos
RMN de
1
H ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN de
13
C ressonância magnética nuclear de carbono
s singleto
SPB-5 coluna capilar (5% fenil-metil-siloxano)
SPB-50 coluna capilar (50% fenil-metil-siloxano)
SNC Sistema Nervoso Central
SOD enzima superóxido dismutase
RR retenção relativa
ODS octadecilsilano
OMS Organização Mundial da Saúde
QR quinona redutase
t
r
tempo de retenção
t tripleto
TMS tetrametilsilano
UV ultravioleta
UV-vis ultravioleta e visível
v volume
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 30
1.1 O ESTADO DA ARTE 30
1.2 A FAMÍLIA CLUSIACEAE 31
1.3 A ESPÉCIE GARCINIA XANTHOCHYMUS 32
1.4 BIFLAVONÓIDES 36
1.4.1 Atropoisomerismo 38
1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 39
1.6 BIFLAVONÓIDES COMO AGENTES ANTIOXIDANTES 41
1.7 AGENTES QUIMIOPREVENTIVOS 43
2 JUSTIFICATIVA 45
3 OBJETIVOS 47
4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 48
4.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 48
4.1.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) 48
4.1.2 Cromatografia em coluna de fase normal (CC-FN) 48
4.1.3 Extração líquido-líquido (ELL) 49
4.1.4 Cromatografia de permeação em gel (CPG) 49
4.1.5 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-
DAD) 49
4.1.6 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (CLAE-UV) 49
4.1.7 Cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (CLAE-UV-prep) 50
4.1.8 Cromatografia gasosa (CG) 50
4.2 ESPECTROMETRIA 50
4.3 SOLVENTES 51
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 52
5.1 COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES 52
5.2 PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA PARA CLAE-DAD E UV 55
5.3 ESTUDO QUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO DAS FOLHAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS
(HEX-FOL) 55
Sumário
5.4 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DA FRAÇÃO ACOET DAS FOLHAS DE GARCINIA
XANTHOCHYMUS (ACOET-FOL) 56
5.5 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÃO ACOET-FOL-14 56
5.6 ESTUDO QUÍMICO DAS SUBFRAÇÕES ACOET-FOL-15 E 16 57
5.7 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÕES ACOET-SIL-3 E 9 58
5.8 ESTUDO QUÍMICO DAS SUBFRAÇÕES ACOET-SIL-4 E 5 59
5.9 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÃO ACOET-SIL-11 59
5.10 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO E ESTUDO QUÍMICO DA FRAÇÃO BUOH DAS
FOLHAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (BUOH-FOL) 60
5.11 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO E ESTUDO QUÍMICO DA FRAÇÃO ACOET DOS
FRUTOS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (ACOET -FRU) 61
5.12 IDENTIFICAÇÃO POR CLAE-DAD-EM DOS CONSTITUINTES DE FRAÇÕES
SELECIONADAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS-ANÁLISE POR DESREPLICAÇÃO 62
5.13 IDENTIFICAÇÃO DE TRITERPENOS E ESTERÓIDES PRESENTES NOS EXTRATOS DE BAIXA
POLARIDADE DE GARCINIA XANTHOCHYMUS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA GASOSA
(CG) 62
5.14 ENSAIOS ANTIOXIDANTES 63
5.14.1 Descoloração de β-caroteno 63
5.14.2 Atividade seqüestradora de radicais livres: DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila) 63
5.15 ENSAIO IN VITRO DA POLIMERIZAÇÃO DE HEME 63
5.16 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA 64
5.17 ATIVIDADE TRIPANOCIDA 65
5.18 ATIVIDADE QUIMIOPREVENTIVA 66
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 67
6.1 ANÁLISE DOS CROMATOGRAMAS E ESPECTROS DE ABSORÇÃO 67
6.2 ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS 69
6.2.1 Caracterização espectrométrica da substância 1 69
6.2.3 Caracterização espectrométrica da substância 3 74
6.2.4 Caracterização espectrométrica da substância 4 75
6.2.5 Caracterização espectrométrica da substância 5 79
6.2.6 Caracterização espectrométrica da substância 8 81
6.2.7 Caracterização espectrométrica da substância 9 87
6.2.8 Caracterização espectrométrica da substância 10 90
Sumário
6.2.9 Caracterização espectrométrica da substância 11 93
6.2.10 Caracterização espectrométrica da substância 12 98
6.2.11 Caracterização espectrométrica da substância 13 102
6.2.12 Caracterização espectrométrica da substância 14 106
6.2.13 Caracterização espectrométrica das substâncias 17 e 18 109
6.3 A DESREPLICAÇÃO EM ESTUDOS DE BIOPROSPECÇÃO 115
6.3.1 Identificação por CLAE-UV-DAD-EM dos constituintes de Garcinia xanthochymus 116
6.4 IDENTIFICAÇÃO DE TRITERPENOS E ESTERÓIDES PRESENTES NOS EXTRATOS DE BAIXA
POLARIDADE DE GARCINIA XANTHOCHYMUS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA GASOSA
(CG) 131
6.5 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS EXTRATOS, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE
GARCINIA XANTHOCHYMUS 134
6.5.1 Atividade antioxidante 134
6.5.2 Ensaio in vitro da polimerização de heme 135
6.5.3 Atividade antifúngica 137
6.5.4 Atividade tripanocida 138
6.5.5 Atividade quimiopreventiva 139
7 CONCLUSÕES 141
REFERÊNCIAS 144
ANEXOS 155
Introdução 30
1 INTRODUÇÃO
1.1 O estado da arte
A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas
conhecidas. Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o que tem contribuído
de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos destes
de grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos,
alimentos e agroquímicos (PINTO et al., 2002).
Os trabalhos de isolamento das primeiras substâncias puras do reino vegetal tiveram
início entre os séculos XVIII e XIX. Com o aparecimento da química combinatória na
década de 80 e as triagens em alta escala, que são os paradigmas tecnológicos de
desenvolvimento da química medicinal moderna ou atual, os departamentos de produtos
naturais das grandes empresas farmacêuticas foram eliminados ou transferidos para
empresas menores (YOUNES; VARELLA; SUFFREDINI, 2007). No entanto, nestes
últimos 10 anos, mudanças importantes vêm sendo observadas no rumo da pesquisa por
fármacos novos devido aos avanços da biologia molecular, mapeamento genético,
bioensaios automatizados e quimiogenômica. Esses eventos têm levado a indústria
farmacêutica a repensar sua maneira de investimento na busca por fármacos de origem
natural (NEWMAN; CRAGG, 2007).
A descoberta dos alcalóides morfina, cocaína e quinina, entre tantas substâncias
isoladas de plantas e utilizadas como medicamentos até os dias atuais, não deixam dúvidas
quanto à importância das plantas, principalmente, de uso tradicional (PINTO et al., 2002).
Com a descoberta dos antibióticos e anticolesterolêmicos a partir de microrganismos,
dos benefícios divulgados pela Organização Mundial de Saúde na década de 70 sobre a
eficácia da medicina chinesa e da descoberta de quimioterápicos eficazes como
vimblastina (Velban
), vincristina (Oncovin
), podofilotoxina e análogos (VP-16-213;
Vepeside
), Teniposídeo (VM-26; Vulmon
) e taxol (plaxitaxel; taxol
) a procura pelos
produtos naturais como modelos para agentes terapêuticos voltou a ser um tema recorrente
da indústria farmacêutica (KIRBY, 1996).
Um terço dos medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo foi desenvolvido a
partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003). No caso dos agentes antitumorais e
antibióticos, por exemplo, esse percentual atingiu aproximadamente 60% e 75%,
respectivamente (NEWMAN; CRAGG, 2007). As estatinas foram responsáveis por um
Introdução 31
mercado de US$ 19 bilhões em 2002 e a OMS estima que as vendas totais de ervas
medicinais alcançaram um lucro de US$ 400 milhões no Brasil em 2001 (SOYAMA,
2007), mostrando o forte impacto desses medicamentos no mercado mundial.
Diante destes dados, países como o Brasil, que detém grande parte da biodiversidade
mundial, poderão usufruir deste patrimônio se esforços forem dirigidos para a pesquisa
colaborativa na descoberta por fármacos potenciais desta biodiversidade (GREENWOOD;
MUTABINGWA, 2002).
Nos últimos anos, o NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de
Produtos Naturais do IQ-UNESP, Araraquara) vem concentrando esforços na busca por
substâncias com atividades antitumoral, antifúngica, antimalárica e antioxidante,
caracterizando uma pesquisa de bioprospecção multifocal. Várias espécies coletadas nos
biomas do Estado de São Paulo foram selecionadas devido a alguma bioatividade
apresentada na triagem preliminar, agregando valor à extratoteca, já bastante representativa
com mais de 1800 extratos. Dentre as espécies selecionadas, Garcinia xanthochymus
demonstrou especial interesse por conter substâncias fenólicas com potencial antitumoral e
antioxidante. Além disso, ocorrem neste gênero substâncias da classe das xantonas,
conhecidas por sua atividade antimalárica (CHANMAHASATHIEN et al., 2003a).
1.2 A família Clusiaceae
A família Clusiaceae compreende cerca de 50 gêneros e 1200 espécies de ocorrência
exclusiva nas regiões tropicais. A maioria dos representantes desta família são árvores,
arbustos ou ervas sendo raramente epífitas (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002).
Alguns gêneros e espécies são endêmicos de certas áreas, por exemplo, o gênero
Symphonia L. e Pentadesma sabine são encontradas unicamente na África
(SULTANBAWA, 1980). No Brasil, há 21 gêneros e 183 espécies distribuídas na
Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica (CRUZ et al., 1998). Os gêneros são distribuídos em
três subfamílias, destacando-se inúmeros com importância medicinal no Brasil, como
Hypericum e Vismia (Hypericoideae), Clusia, Calophyllum e Garcinia (Calophylloideae) e
Kielmeyera (Bonnetioideae). Destacam-se nesses gêneros importantes espécies econômicas
para a produção de madeiras, gomas, pigmentos, óleos essenciais e resinas (DI STASI;
HIRUMA-LIMA, 2002).
Introdução 32
O estudo da constituição química dos troncos de várias espécies de Clusiaceae
brasileiras mostrou, além dos triterpenóides comuns, xantonas como constituintes
predominantes (GOTTLIEB; RAMAIAH; LAVIE, 1985).
A família Clusiaceae apresenta um número de xantonas comparáveis com as da
família Gentianaceae e se destaca por apresentar mais da metade dessas xantonas
substituídas por isoprenóides (SIMÕES et al., 2002; PANTHONG, et al., 2006; ZHONG;
CHEN; YANG, 2008).
1.3 A espécie Garcinia xanthochymus
O gênero Garcinia pertence à família Clusiaceae, sinonímia de Guttiferae, e contêm
cerca de 200 espécies confinadas nos trópicos como árvores ou arbustos, raramente
epífitas, das quais 21 espécies encontram-se na China (ZHONG; CHEN; YANG, 2008).
No Brasil é nativa a espécie Garcinia brasiliensis conhecida como Bacupari, encontrada na
Mata Atlântica e Amazônia, porém ocorrem outras espécies como Garcinia gardneriana e
Garcinia xanthochymus.
A espécie Garcinia xanthochymus (Figura 1) comumente conhecida como Gamboja,
é uma árvore nativa da Índia com aproximadamente 8-10 metros. As árvores possuem
folhas verdes escuras e sua fruta é amarela com polpa suculenta ácida, possui diâmetro de
6-7 cm, duas sementes e é utilizada extensamente na medicina popular como antidiarréica.
A Gamboja é usada como pigmento para aquarela e como corante amarelo de tecidos. O
fruto acidificado é utilizado em geléias, conservas e vinagres (BAGGETT et al., 2005).
Revisão bibliográfica sobre o estudo fitoquímico das folhas, frutos, cascas e caules de
Garcinia xanthochymus (Tabela 1) revelou a presença principalmente de benzofenonas,
flavonóides, biflavonóides, triterpenos e xantonas (Figura 2), as quais possuem atividade
analgésica, antibacteriana, antioxidante, antiviral e antitumoral.
Introdução 33
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O OH
OCH
3
OCH
3
OH
OH
O
HH H
O
OH
OH
O
O
OH
Figura 1 - Foto de diferentes partes de Garcinia xanthochymus.
O
OH
OH
O
OH
O
Figura 2 - Algumas classes de substâncias isoladas da espécie de Garcinia xanthochymus.
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
Benzofenonas
Derivados do floroglucinol
Triterpenos
Flavonoides
Biflavonoides
Xantonas
Introdução 34
Tabela 1 - Substâncias isoladas de Garcinia xanthochymus e bioatividades relatadas nas referências citadas.
Classe
Substância
bioatividade
órgão
Referência
benzofenona
aristofenona A
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
cicloxantochimol
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
isoxantochimol
-
frutos
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981; BAGGETT et al.,
2005; KARANJGOAKAR,
et al., 1973
gambogenona
antitumoral,
antioxidante
frutos
BAGGETT et al., 2005
gutiferona E
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
gutiferona H
antitumoral,
antioxidante
frutos
BAGGETT et al., 2005
maclurina
-
frutos
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981; TANDON et al.,
1980; BAGGETT et al.,
2005
xantochimol
antimicrobial
frutos
KARANJGOAKAR et al.,
1973; RAMA RAO;
VENKATSWAMY;
YEMUL, 1980
biflavonóide
agatisflavona
-
folhas
PARVEEN et al., 1994
amentoflavona
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
I3,II8-biapigenina
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
(±)-fukugisídeo
-
frutos
KONOSHIMA et al., 1970;
BAGGETT et al., 2005
(±)-fukugetina
-
frutos
KONOSHIMA et al., 1970;
BAGGETT et al., 2005
7-O-metilamentoflavona
-
folhas
PARVEEN et al., 1994
volkensiflavona
-
frutos
KONOSHIMA et al., 1970;
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981; BAGGETT et al.,
2005
xantochimusídeo
-
caules
KONOSHIMA et al., 1970
GB1
-
frutos
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981
GB1a
-
frutos
KONOSHIMA et al., 1970;
BASLAS; KUMAR, 1979
GB2
-
caules
KONOSHIMA et al., 1970
GB2a
-
caules
KONOSHIMA et al., 1970
bis-xantona
bigarcinenona A
antioxidante
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
éster
tereftalato de dimetila
-
folhas
SINGH et al., 1991
flavonóide
6-prenilapigenina
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
vitexina
-
folhas
PARVEEN et al., 1994
Derivado do
floroglucinol
garcinenona F
antioxidante
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
Terpeno
betulina
-
folhas
SINGH et al., 1991
canofilol
-
folhas
SINGH et al., 1991
friedelina
-
folhas
SINGH et al., 1991
-sitosterol
-
folhas
SINGH et al., 1991
Introdução 35
xantona
alloathyriol
-
frutos
BAGGETT et al., 2005
1,3,5,6-tetrahidroxi-4,7,8-
triprenilxantona
Regenerativa
de nervos
caule
CHANMAHASATHIEN et
al., 2003a
garcinexantona A
-
cascas
CHEN et al., 2008
garcinexantona B
-
cascas
CHEN et al., 2008
garcinexantona C
-
cascas
CHEN et al., 2008
garcinexantona D
-
cascas
CHEN et al., 2008
garcinexantona E
-
cascas
CHEN et al., 2008
garciniaxantona E
Regenerativa
de nervos,
antitumoral
caule
CHANMAHASATHIEN et
al., 2003a;
HAN et al., 2007
12b-hidroxi-des-d-garcigerrina
Regenerativa
de nervos
caule
CHANMAHASATHIEN et
al., 2003b
5-hidroxi-1,2-dimetoxixantona
-
cascas
ZHONG et al., 2008
5-hidroxi-1,3-dimetoxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,5-dihidroxixantona
-
frutos
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981
1,4,5,6-tetrahidroxi-7-
prenilxantona
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
1,4,5,6-tetrahidroxi-7,8-
diprenilxantona
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
1,3,5,6-tetrahidroxy-4,7,8-
triprenilxantona
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
1,7-dihidroxixantona
-
frutos
BASLAS; KUMAR, 1979
e 1981
1,5-dihidroxi-3-metoxixantona
antioxidante
cascas
CHENG et al., 2008
1,2-dihidroxi-5,6-
dimetoxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,6-dihidroxi-4,5-
dimetoxixantona
-
cascas
ZHONG et al., 2007
2,5-dihidroxi-1-metoxixantona
antioxidante
cascas
CHENG et al., 2008
1,2,5-trihidroxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,3,7-trihidroxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,4,5-trihidroxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,2,7-trihidroxi-4-(1,1-
dimetilalil)xantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,5,6-trihidroxi-7,8-di(3-metil-
2-butenil)-6’,6’-
dimetilpirano(2`,3`:3,4)xantona
-
cascas
ZHONG et al., 2007
1,4,6-trihidroxi-5-
metoxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,3,7-trihidroxi-5-
metoxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,2,5-trihidroxi-6-
metoxixantona
-
cascas
ZHONG; CHEN;
YANG, 2008
1,2,6-trihidroxi-5-metoxi-7-(3-
metil-2-butenil)xantona
Regenerativa
de nervos
caule
CHANMAHASATHIEN et
al., 2003b
Introdução 36
1,4,6-trihidroxi-5-metoxi-7-
prenilxantona
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
1,2,5,6-tetrahidroxi-7-
geranilxantona
antitumoral
cascas
HAN et al., 2007
1,4,5,6-tetrahidroxi-7,8-di(3-
metil-2-butenil)xantona
Regenerativa
de nervos
caule
CHANMAHASATHIEN et
al., 2003b
1.4 Biflavonóides
Os flavonóides figuram entre as classes de substâncias químicas de maior ocorrência
botânica, sendo contabilizados em números superiores a seis mil exemplares
(HARBORNE e WILLIAMS, 2000). São derivados de benzo--pirona com a maioria de
seus representantes formados por 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental.
A biossíntese dos flavonóides (Figura 3) apresenta a singularidade de seus anéis
aromáticos serem formados por rotas metabólicas distintas. Sua porção fenil-propanoídica
(anel B + C2,C3,C4) é derivada do ácido p-cumárico formado pela via do chiquimato. Por
outro lado, o anel A é formado basicamente pela condensação de unidades de acetato, pela
via dos policetídeos, que se inicia com a formação de malonil CoA a partir de acetil CoA
mediante a enzima acetil CoA-carboxilase (ACC). A biossíntese geral dos flavonóides tem
como intermediário central o tio-éster p-cumaril-CoA, que será alongado pela condensação
de três unidades de malonil-CoA, catalisado pela enzima chalcona sintetase (CS). A
ciclização resulta na formação do anel A e produz a chalcona, que em condições
fisiológicas, tende espontaneamente à flavona racêmica.
É relatado também que a ciclização da chalcona é catalisada pela enzima chalcona
isomerase (CI), que induz o fechamento estereoespecífico do anel (adição syn sobre a
dupla ligação E) formando exclusivamente a 2-(S)-flavanona. Os outros tipos de
flavonóides são formados por subseqüentes etapas de óxi-redução deste intermediário
comum (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000; XIE e DIXON, 2005).
Os biflavonóides se caracterizam pela união covalente das unidades monoméricas
dos flavonóides (Figura 4). Essas unidades podem ser semelhantes ou possuírem
diferentes tipos estruturais e se diferenciam de outros oligômeros como as
proantocianidinas, devido à origem biogenética das unidades constituintes (SUZART et al.,
2007).
As ligações entre as unidades flavonoídicas podem ser C-C ou C-O-C envolvendo os
anéis A, B ou C dos monômeros. Raramente ocorre alteração no padrão de oxigenação dos
precursores, sendo garantida a oxigenação em 5, 7 e 4'. Adicionalmente, podem ocorrer
Introdução 37
oxidações nas posições 6, 8 ou 3' e quando isso acontece é, normalmente proveniente da
outra unidade ligada nessa posição via ligação C-O-C (SUZART et al., 2007).
Rota Chiquimato
Fenilalanina
Ácido cinâmico
Ácido cumárico
Ácido cafeico
Ácido clorogênico
Ácido quínico
p-cumaril-CoA
Malonil CoA
Acetil CoA
lignanas
ACC
chalcona
flavona isoflavonaflavanona
dihidroflavonolflavonol
catequina
antocianidina antocianina
epicatequina
leucoancianidina
Taninos
condensados
Rota acetato
malonato
CS
CI
Rota Chiquimato
Fenilalanina
Ácido cinâmico
Ácido cumárico
Ácido cafeico
Ácido clorogênico
Ácido quínico
p-cumaril-CoA
Malonil CoA
Acetil CoA
lignanas
ACC
chalcona
flavona isoflavonaflavanona
dihidroflavonolflavonol
catequina
antocianidina antocianina
epicatequina
leucoancianidina
Taninos
condensados
Rota acetato
malonato
CS
CI
Figura 3 - Esquema geral da rota biossintética de flavonóides (ACC-acetil CoA-carboxilase, CS-
chalcona sintetase e CI-chalcona isomerase).
Figura 4 - Estrutura de biflavonóides tipo flavona-flavona.
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
6’
9
4
5’
3’
2’
8
4’
10
7
5
6
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
2’’’
10’’
9’’
8’’
7’’
6’’
5’’
4’’
3’’
2’’
3
2
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
6’
9
4
5’
3’
2’
8
4’
10
7
5
6
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
2’’’
10’’
9’’
8’’
7’’
6’’
5’’
4’’
3’’
2’’
3
2
Introdução 38
Estima-se que a quantidade de biflavonóides seja superior a duzentas substâncias,
dispersas principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas, das quais se
destacam as famílias Clusiaceae, Ochnaceae e Anacardiaceae.
Os biflavonóides, quando comparados aos seus monômeros, frequentemente
apresentam maior atividade, como por exemplo, em doenças espamódicas (HARBONE e
WILLIAMS, 2000).
A biflavanona 7,7’’-di-O-metiltetraidroamentoflavona isolada das folhas de Rhus
retinorrhoea apresentou moderada atividade frente às cepas W2 e D6 de P. falciparum
com valores de CI
50
de 0,98 e 2,80 g.mL
-1
, respectivamente (AHMED et al., 2001). O
fracionamento do extrato n-BuOH da raiz de Wikstroemia indica permitiu o isolamento de
sikokianina B e sikokianina C com valores de CI
50
de 0,54 e 0,56 g.mL
-1
,
respectivamente, frente à cepa cloroquina-resistente K1 de P. falciparum (NUNOME et al.,
2004). Alguns biflavonóides apresentaram atividade antifúngica, como a amentoflavona,
6,6’’-bigenquanina e 7,7’’-dimetoxiagastisflavona que inibiu a produção de aflatoxina em
Aspergillus flavus (GONCALEZ; FELICIO; PINTO, 2001). Atividades antivirais foram
determinadas para os compostos amentoflavona, agatisflavona, rhusflavanona e
robustaflavona, em ensaios frente aos vírus Myxovirus influenzae (gripe), Herpes simplex
(LIN et al., 1999) e HIV (LIN et al., 1997). O potencial antineoplásico de alguns
biflavonóides e análogos já foi avaliado com sucesso, em testes de citotoxicidade frente a
linhagens de células tumorais (CHEN; DUH; CHEN, 2005), (LIN; KUO; CHOU, 2000),
(SILVA et al., 1995), (LIN; CHEN; LEE, 1989) e mediante ensaios de inibição da enzima
DNA topoisomerase (GRYNBERG et al., 2002). As biflavonas 6→6′′-begenquanina e
7,7′′-O-dimetilagatisflavona isoladas de Ouratea spectabilis apresentaram atividade
inibitória sobre a enzima aldose redutase de cristalino bovino. O aumento da atividade
dessa enzima está relacionado com a patogênese da maioria das complicações da diabetes,
como cataratas, retinopatia, neuropatia (FELÍCIO et al., 1995).
1.4.1 Atropoisomerismo
O fenômeno conhecido como atropoisomerismo, denominação oriunda da palavra
grega atropos (sem rotação), é atribuído a um tipo de estereoisomerismo característico de
sistemas onde a rotação livre em torno de uma ligação simples é impedida, produzindo
uma barreira energética suficientemente elevada, de modo a permitir o isolamento ou
simplesmente a detecção dos diferentes rotâmeros, chamados atropoisômeros (FRAGA, et
Introdução 39
al., 2007). O atropoisomerismo ocorre quando os isômeros são separáveis com meia-vida
de pelo menos 1000 s (16,7 min), não depende do valor da barreira energética de
interconversão e é variável com a temperatura (CANUTO, 2007).
A complexidade dos espectros de um biflavonóide, em que se observa duplicação e
pareamento de sinais, é explicada pela atropoisomeria e ocorre frequentemente em
estruturas cujas unidades estão interligadas através dos carbonos C-3→C-8’’.
Li et al. (2002) mostrou que um experimento de RMN
1
H com os biflavonóides (±)-
morelloflavona, (±)-morelloflavona-7-sulfato e (±)-volkensiflavona-7-sulfato, isolados de
Rheedia acuminata, realizado sob aquecimento de 80°C simplifica o espectro devido a alta
energia da rotação, resultando assim, no desaparecimento das linhas espectrais duplicadas.
À temperatura ambiente (25°C) foram observados sinais pareados referente à mistura de
rotâmeros (1a e 1b) em razão da lenta interconversão causada pela elevada barreira
energética. Entretanto, em temperaturas superiores (80 °C) observa-se que os sinais duplos
tendem a aproximar-se (alargamento dos picos), coalescem (pico único alargado) e por
último obtem-se um sinal simples cuja absorção corresponde a uma freqüência central às
duas existentes anteriormente. Isto acontece porque o aquecimento acelera a velocidade de
interconversão, fazendo com que seja superada mais facilmente a barreira energética,
favorecendo a formação exclusiva de um dos confôrmeros (Figura 5).
1.5 Atividade antioxidante
Doenças degenerativas do Sistema Nervoso Central (SNC) como Mal de Alzheimer e
Mal de Parkinson estão associadas em parte com os efeitos deletérios que o desequilíbrio
entre fatores pró e antioxidantes, decorrente da produção descontrolada de radicais livres,
pode provocar nos sistemas biológicos.
A geração de radicais livres ocorre normalmente durante o metabolismo. Em
condições fisiológicas, de todo o oxigênio molecular captado nas mitocôndrias e
processado na cadeia respiratória, só 1 a 5% escapam e formam oxirradicais. Porém, esta
mínima porcentagem é suficiente para dar origem a diversas espécies reativas, seja por
absorção de energia ou por transferência de elétrons. Vale notar que nem todas as espécies
reativas de oxigênio (EROs) são radicais, o peróxido de hidrogênio e o oxigênio singlete
não possuem elétrons desemparelhados, e sua reatividade é atribuída ao fato de seus
elétrons de valência estarem situados em órbitais mais distantes do núcleo, o que leva o
Introdução 40
átomo a um estado químico altamente reativo, com características diradicalares (CAO;
SOFIC; PRIOR, 1997).
Figura 5 - Experimento de RMN
1
H para a (±)-morelloflavona (Li et al., 2002) em temperaturas
variáveis. O sinal 1a representa o confôrmero principal e 1b o confôrmero minoritário.
A produção dessas espécies de maneira desordenada provoca danos oxidativos em
macromoléculas biológicas como lipídeos, proteínas, DNA, alterando suas propriedades,
estruturas e as funções das membranas celulares e do material genético (POTTERAT,
1997).
O
2
O
2
-.
H
2
O
2
HO
-.
H
2
O
Na tentativa de minimizar os efeitos danosos dos radicais livres, organismos
aeróbicos desenvolveram mecanismos de proteção antioxidante (Figura 6) que envolvem
sistemas enzimáticos como a superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa
peroxidase (GSH) e sistemas antioxidantes compostos por micromoléculas como o ácido
Introdução 41
ascórbico (vitamina C), tocoferóis (vitamina E), carotenóides e flavonóides, entre outros
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Embora o organismo tenha capacidade de prevenir reações indesejáveis e reparar
moléculas e tecidos danificados, estes mecanismos de defesa não são suficientemente
abrangentes para reparar todos os danos causados por tais reações, ocorrendo o acúmulo de
substâncias prejudiciais ao nosso corpo. Esta situação de desequilíbrio entre a formação de
espécie com poder oxidante e a sua destruição denomina-se estresse oxidativo e pode
conduzir a um metabolismo anormal, disfunção celular, à perda de funções fisiológicas, a
doenças e à morte.
Trabalhos sobre medicina preventiva mostram que as substâncias fenólicas são os
antioxidantes naturais mais eficientes e enfatizam a importância da descoberta de novas
substâncias que possam ser incluídas na dieta alimentar, visando à manutenção do
equilíbrio pró-oxidante/antioxidante corporal, evitando assim o estresse oxidativo (RICE-
EVANS; MILEER; PAGANGA, 1996).
1.6 Biflavonóides como agentes antioxidantes
Os flavonóides/biflavonóides têm sido objeto de considerável interesse científico
principalmente pela sua potencial ação antioxidante. De um modo geral, estes possuem
estrutura ideal para o seqüestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos que as
vitaminas C e E em determinadas situações. A atividade antioxidante dos flavonóides
depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: estabilidade do radical
flavonoil formado, reatividade como agente doador de H
.
e elétrons, capacidade de quelar
metais de transição e solubilidade e interação com as membranas (BARREIROS; DAVID;
DAVID, 2006).
A atividade de seqüestro está diretamente ligada ao potencial de oxidação dos
flavonóides e das espécies a serem seqüestradas. Quanto menor o potencial de oxidação do
flavonóide, maior é a sua atividade como seqüestrador de radicais livres.
Introdução 42
O
2
Mitocôndria
NADPH
oxidase
O
2
-
H
2
O
2
OH
-
H
2
O
Fe
2+
Fe
3+
Reação de
Fenton
H
2
O
O
2
catalase
Peroxidação lipídica
Lesão protéica
Lesão do DNA
Glutationa-
peroxidase
Glutationa-
redutase
2GSH
GSSG
Defesas
antioxidantes
ERO
H
2
O
2
O
2
-
OH
-
catalase
GSH
SOD
SOD
vitamina C
tocoferóis
HOO
O
2
Mitocôndria
NADPH
oxidase
O
2
-
H
2
O
2
OH
-
H
2
O
Fe
2+
Fe
3+
Reação de
Fenton
H
2
O
O
2
catalase
Peroxidação lipídica
Lesão protéica
Lesão do DNA
Glutationa-
peroxidase
Glutationa-
redutase
2GSH
GSSG
Defesas
antioxidantes
ERO
H
2
O
2
O
2
-
O
2
-
OH
-
OH
-
catalase
GSH
SOD
SOD
vitamina C
tocoferóis
HOOHOO
Figura 6 - Representação do equilíbrio entre as EROs e as defesas antioxidantes do nosso
organismo (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Quanto maior o número de hidroxilas, maior atividade como agente doador de H
radicalar e de elétrons (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997; YANG et al., 2001). Flavonóides
monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por exemplo, a 5-hidroxi-flavona tem
atividade abaixo dos limites de detecção. Entre os flavonóides diidroxilados, destacam-se
aqueles que possuem o grupo catecol (3’, 4’ -diidroxi) no anel B. Os flavonóides com
múltiplas hidroxilas como a miricetina, quercetina, luteolina, e taxifolina possuem forte
atividade antioxidante quando comparados ao α-tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno,
glutationa, ácido úrico e bilirrubina (YANGet al., 2001).
A estabilidade do radical livre flavonoil formado depende da habilidade em
deslocalizar o elétron desemparelhado. A presença de hidroxilas em orto e a insaturação
em C2-C3 são os principais fatores que auxiliam nessa deslocalização. Os flavonóides,
devido ao seu caráter fracamente ácido e à extensa conjugação, encontram-se, em geral,
parcialmente ionizados, o que aumenta a estabilidade do radical formado na posição C-4 e
favorece a deslocalização do elétron desemparelhado do radical formado entre os anéis A,
B e C.
A remoção de metais de transição livres no meio biológico é fundamental para a
proteção antioxidante do organismo, visto que esses catalisam as reações de Fenton (1) e
de Haber-Weiss (2), produtoras de EROs. Para a atividade de quelação de metais é
fundamental a presença de grupos orto-dioxigenados, onde o mais comum é o sistema 3’,
4’-diidroxi, unidade catecol em B e/ou estruturas cetol com 4-ceto-3-hidroxi e 4-ceto-5-
Introdução 43
hidroxi. A substituição de qualquer uma das hidroxilas envolvidas na quelação de metais
reduz essa atividade devida ao impedimento estérico provocado.
Outro fator importante que influencia a atividade antioxidante é a sua interação com
as biomembranas. A lipofilicidade do flavonóide indica a incorporação deste pela
membrana, que é alvo da grande parte dos radicais livres. Assim deve haver uma
concentração mínima do flavonóide por ácido graxo, de modo a assegurar a presença de
suas moléculas próximas aos sítios preferências de ataque do radical (VAN ACKEL et al.,
1996). Flavonóides que possuem uma cadeia de açucares ligada em sua estrutura são muito
polares, não sendo assimilados pela membrana, porém nesta forma eles podem ser
armazenados em vesículas, possuindo um tempo maior de permanência no organismo. Os
flavonóides que são assimilados pelas membranas exercem a função de moduladores de
fluidez. Restringindo essa fluidez os flavonóides geram um impedimento físico pra a
difusão dos radicais livres, de modo que decresce a cinética das reações responsáveis pelo
estresse oxidativo.
Os biflavonóides apresentam significativa atividade antioxidante como a
amentoflavona que é capaz de proteger membranas lipossômicas contra a degradação
peroxidativa causada pelos raios UV (YAMAGUCHI et al., 2005). Recentemente, o
biflavonóide morelloflavona mostrou-se ativo frente à inibição da oxidação de
lipoproteínas de baixa densidade (HUTADILOCK-TOWATANA; KONGKACHUAY;
MAHABUSARAKAM, 2007) e alguns biflavonóides como amentoflavona e
hinokiflavona mostraram efeitos de proteção em estudos de morte celular induzida por
estresse oxidativo com H
2
O
2
(KANG et al., 2005).
1.7 Agentes quimiopreventivos
A quimioprevenção pode ser entendida como o uso de substâncias químicas a fim de
prevenir, retardar ou reverter o processo de carcinogênese (WATTENBERG, 1985).
Muitas substâncias quimiopreventivas potenciais estão presentes na dieta como polifenóis,
isoflavonas, curcumina, fenetil isoiocianato, sulforafano, licopeno, ácidos salicílicos,
cafeína entre outras. Tais substâncias tem-se mostrado grande aliadas no tratamento dos
H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
Fe
O
2
.-
+ H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
+ O
2
Fe
(1)
(2)
H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
Fe
O
2
.-
+ H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
+ O
2
Fe
H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
Fe
O
2
.-
+ H
2
O
2
HO
.
+ HO
-
+ O
2
Fe
(1)
(2)
Introdução 44
linfomas, dos tumores da infância e das neoplasias de células germinativas (KELLOFF et
al., 2000; CHUANG et al., 2000).
Os elementos quimiopreventivos podem ser classificados em dois grupos de acordo
com a etapa da carcinogênese química sobre a qual são eficazes. O primeiro grupo é
composto por agentes bloqueadores, representados por compostos capazes de modular os
processos de absorção intestinal, biotransformação e bioativação microssomal, excreção
renal e interação com o material genético de substâncias cancerígenas. O segundo grupo de
quimiopreventivos é composto por agentes supressores que interferem em alguns eventos
celulares críticos à promoção e progressão da carcinogênese, prevenindo a evolução da
malignização celular (WATTENBERG, 1985).
Algumas das estratégias para a proteção de células dos eventos iniciais da formação
de tumores incluem a inibição de enzimas metabólicas responsáveis pela geração de
espécies reativas (enzimas de fase I), ao passo que enzimas da fase II são estimuladas,
promovendo a desativação de radicais e eletrófilos envolvidos nos processos celulares
normais. Os agentes responsáveis por este acontecimento são denominados “indutores
bifuncionais”, onde os carcinógenos poderiam induzir a uma proteção contra seu próprio
efeito tóxico. Além destes, existem os “indutores monofuncionais”, que somente induzem
enzimas de fase II seletivamente e ativam elementos de resposta antioxidante (CUENDET
et al., 2006).
A redução de quinonas eletrofílicas pela quinona redutase se constitui numa via
importante de detoxificação e o seu grau de atividade pode ser inferido através da indução
em células da linhagem de hepatocarcinoma murino-Hepa 1c1c7. A indução de enzimas da
fase II pode proteger os sistemas biológicos contra espécies químicas tóxicas e reativas, e
estudos recentes demonstram que a elevação dessas enzimas, como a NADPH: quinona-
redutase e GST (Glutationa s-transferase) estão correlacionadas com a proteção celular nos
estágios iniciais e intermediários contra a carcinogênese induzida por agentes químicos em
modelos animais (WATTENBERG, 1985; SONG et al., 1999; CUENDET et al., 2006).
Justificativa 45
2 JUSTIFICATIVA
A obtenção de substâncias bioativas a partir de fontes naturais sofreu interesse
renovado nos últimos anos, apesar do avanço acentuado de tecnologias competitivas como
a química combinatória, análise de proteoma e metaboloma e a engenharia molecular
(ROUHI, 2003; NEWMAN; CRAGG, 2007). A obtenção de moléculas de esqueleto
inédito ou com atividades biológicas marcantes e/ou novos mecanismos de ação age como
força matriz para esforços intensos e contínuos em atividades de bioprospecção e
justificam os grandes investimentos realizados em escala mundial na busca por protótipos
moleculares para o desenvolvimento de fármacos (CORDELL, 2000; YOUNES;
VARELLA; SUFFREDINI, 2007).
O Brasil, com sua enorme biodiversidade apresenta motivos adicionais para
intensificar essas atividades já que o conhecimento científico dos remanescentes da nossa
flora podem despertar a consciência sobre as consequências da degradação dos nossos
ecossistemas, com a perda de espécies desconhecidas ou não investigadas e
consequentemente, de substâncias potencialmente úteis. Os projetos em andamento no
NuBBE visando à conservação e uso sustentável da diversidade vegetal no Estado de São
Paulo através de estudos sobre diversidade química e busca de drogas potenciais, incluem
as atividades de bioprospecção e fazem parte da estratégia de exploração racional de nossa
biodiversidade.
As substâncias presentes nos extratos vegetais pertencem a variadas classes de
produtos naturais e podem apresentar atividades biológicas marcantes. A vasta gama de
patologias decorrentes do estresse oxidativo permite uma abordagem que usa a detecção e
avaliação das propriedades antioxidantes de extratos vegetais como etapa preliminar e
indicativa de outros tipos de bioatividades. Assim, a detecção de atividade citotóxica
seletiva para determinadas linhagens de células tumorais, por exemplo, através de
mecanismos de apoptose e, no caso de plantas usadas por suas propriedades
antiinflamatórias, os antioxidantes podem agir como redutores de estresse oxidativo que
ocorre nas células sob ação dos mediadores químicos pró-inflamatórios.
Outras patologias associadas ao estresse oxidativo, como o câncer, podem ser
evitados com o uso de agentes quiomiopreventivos, ou seja, extratos vegetais, frações
semipurificadas ou substâncias isoladas que associam as propriedades antioxidantes com
efeitos biológicos de indução sobre enzimas destoxificantes do organismo, por exemplo, a
Justificativa 46
quinona redutase. Fica evidente, portanto, a complementariedade das informações obtidas
na busca por substâncias naturais com atividade antioxidante, citotóxica e indutora de
quinona redutase, justificando esta abordagem.
Objetivos 47
3 OBJETIVOS
(A) Isolamento e determinação estrutural de substâncias dos frutos e folhas de Garcinia
xanthochymus;
(B) Avaliação do potencial de bioatividade dos extratos brutos, frações semipurificadas e
substâncias isoladas empregando ensaios para atividade antioxidante, indutora de quinona
redutase, antifúngica, antimalárica e tripanocida.
Materiais e Equipamentos 48
4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
4.1 Métodos cromatográficos
4.1.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
As cromatoplacas foram preparadas aplicando-se uma suspensão de sílica gel 60
PF254, com indicador de fluorescência em água destilada, na proporção de 1:2 (m:v) sobre
placas de vidro, obtendo-se 25 mm de espessura de adsorvente através da utilização de
espalhador Quickfitt
®
. Após a preparação das cromatoplacas, estas foram ativadas em
estufa por 30 minutos.
Revelação das cromatoplacas: cada cromatoplaca foi revelada por meio de um ou mais dos
métodos físicos e químicos descritos abaixo:
(A) Inspeção em luz ultravioleta: as cromatoplacas foram expostas a luz ultravioleta, nos
comprimentos de onda de 254 e 365 nm.
(B) Solução de anisaldeído: aproximadamente 5,0 ml de solução de anisaldeído (0,5 ml de
anisaldeído + 10,0 mL de ácido sulfúrico concentrado + 85,0 ml de MeOH) foi preparada
com a adição dos reagentes em banho de gelo. Tal solução foi acondicionada em vidro
âmbar e armazenada a 8°C. Para a revelação de cromatoplacas, borrifaram-se pequenas
alíquotas e então, estas foram colocadas em estufas a 120°C.
(C) Solução de β-caroteno: Preparou-se uma solução de 0,02% de β-caroteno (Aldrich
®
)
em metanol. Após a nebulização das cromatoplacas, essas foram expostas ao ar e luz
natural, por cerca de 6 horas, a fim de catalisar a oxidação do β-caroteno.
4.1.2 Cromatografia em coluna de fase normal (CC-FN)
Para cromatografia em coluna de fase normal foi utilizado como fase estacionária
sílica-gel 60-230 µ (Merck). O empacotamento da coluna se deu 24 horas antes do início
da eluição.
Materiais e Equipamentos 49
4.1.3 Extração líquido-líquido (ELL)
As amostras submetidas à ELL foram seletivamente separadas entre dois solventes
imiscíveis. Para obter a mistura binária, empregaram-se os seguintes solventes: AcOEt, n-
BuOH e solução hidroalcoólica de MeOH:H
2
O otimizadas na proporção 6:4.
4.1.4 Cromatografia de permeação em gel (CPG)
Buscou-se por meio dessa técnica a separação de substâncias através dos seus
diferentes tamanhos moleculares, empregando LH-20 (Sephadex
®
) como suporte
cromatográfico. Tal suporte foi mantido na fase eluente cerca de 48 horas antes do início
da coluna para que o gel adquirisse porosidade homogênea.
4.1.5 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de
diodos (CLAE-DAD)
Para o delineamento do perfil cromatográfico dos extratos, frações e sufrações
empregou-se um cromatógrafo líquido Varian, Pro star 240
®
, detector de arranjo de diodos
UV-VIS modelo Pro star 330, injetor automático modelo 410, e aquisição de dados via
computador tipo Pentium III 550 MHz, utilizando software Star Chromatography
Workstation, versão 5.31, e PV 2000 (tratamento de dados espectrais de ultravioleta).
4.1.6 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (CLAE-UV)
Utilizou-se um Cromatógrafo líquido Varian, modelo Pro star 230, injetor manual
Rheodyne 7725, com detector UV-VIS modelo 310 e aquisição de dados via computador
tipo Pentium II 300 MHz utilizando software Varian Star Chromatography Workstation,
versão 5.31.
Materiais e Equipamentos 50
4.1.7 Cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (CLAE-UV-prep)
Utilizou-se um Cromatógrafo líquido Varian, modelo Pro star SD1, injetor manual
Rheodyne 7725, com detector UV-VIS modelo 320 e aquisição de dados via computador
tipo Pentium III 550 MHz utilizando software Varian Star Chromatography Workstation,
versão 5.31.
4.1.8 Cromatografia gasosa (CG)
Utilizou-se um cromatógrafo a gás Varian, modelo CP-3800, com injetor ajustado a
temperatura de 260°C e detector de ionização em chama a 310°C para SPB-5 (5% fenil-
metil-silicone, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) e 290°C para SPB-50 (50% fenil-metil-
silicone, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). O volume injetado foi 2 μL, a temperatura da coluna
SPB-50 foi de 280°C (isoterma) e a temperatura da coluna SPB-5 foi inicialmente de
250°C, mantida por 12 min, seguido por um aumento de temperatura de 6°C.min
-1
até
280°C. As retenções relativas (RR) de triterpenos e esteróis foram comparados com as RR
de padrões (CREVELIN et al., 2006) utilizando colesterol como padrão interno.
4.2 Espectrometria
Para a identificação e elucidação estrutural das substâncias isoladas foram
empregadas técnicas de ressonância magnética nuclear mono e bidimensionais. Os
espectros de RMN foram obtidos nos espectrômetros Bruker AC 200
®
, operando a 200
MHz na frequência do hidrogênio e a 50 MHz na frequência do carbono e/ou em
espectrômetro Varian Inova 500
®
, operando a 500 MHz na frequência do hidrogênio e em
125 MHz na frequência do carbono. Os espectros dinâmicos de RMN foram feitos no
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear (UFSCar), sob orientação do profº Antonio
Gilberto Ferreira.
Os espectros de Infravermelho (IV) foram obtidos no Laboratório de Fitoquímica
(UNESP- Araraquara), sob supervisão do Profº Vagner Wilegas. Utilizou-se um
espectrofotômetro Shimadzu FT–IR 8300.
As análises em CLAE-EM e CLAE-EM/EM foram realizadas na USP-RP em um
cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Shimadzu, modelo Class Vp 20 equipado
com duas bombas de solvente (LC-20AD), detector por arranjo de diodos (SPD-M20A) e
Materiais e Equipamentos 51
sistema controlador (CBM-20A). Este cromatógrafo foi acoplado a um espectrômetro de
massas da marca Bruker Daltonics (Billerica, MA), modelo UltroTOF-Q, equipado com
uma fonte de ionização por electrospray (ESI) e analisador por tempo de vôo, operando
nos modos negativo e positivo. As amostras foram injetadas utilizando-se um injetor
Rheodyne, modelo 7125 equipado com um loop de 20 μL. Como calibração interna foi
usada uma solução de NA-TFA a 10 mg.mL
-1
.
Para os espectros de CG-EM utilizou-se um cromatógrafo da marca Shimadzu CG 17
A, EM DP5050A, IE: + 70 eV (fixo), coluna DB-1 (30m x 0,25 mm), filme 0,1 mm,
injeção 1 mL (split 1:20), temperatura do injetor: 280°C, temperatura interface: 300°C, gás
de arraste He e temperaturas programadas: 50ºC (3 min), aquece a 2°C.min
-1
até chegar a
290°C, onde permanece por 20 min.
A rotação óptica ([α]
D
) foi obtida em um polarímetro Polamat A Carl Zeiss Jena na
temperatura de 26°C.
As medidas de dicroísmo circular foram realizadas em um cromatógrafo da marca
Jasco, bomba modelo PU-2089, acoplado a um detector de dicroísmo circular (CD-2095) e
injetor automático AS-2055. A coluna utilizada foi ODS da marca Phenomenex (25,0 cm x
4,6 mm x 5m) com fase móvel de MeOH:H
2
O:HOAc (55:44,5:0,5) e vazão de 1,0
mL/min.
Ambas as medidas ([α]
D
e dicroísmo circular) foram realizadas no Laboratório de
Fitoquímica da UNESP de Araraquara.
4.3 Solventes
Como solvente para o preparo de amostras (análises de RMN) foi utilizado DMSO-
d
6
e CDCl
3
e, como referência interna TMS, para os experimentos de RMN de
13
C e
1
H. Os
solventes utilizados na extração foram destilados no laboratório e no processo final de
isolamento os solventes foram da marca JT Baker
®
.
Procedimento Experimental 52
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.1 Coleta do material botânico e preparação dos extratos e frações
Os frutos e folhas de Garcinia xanthochymus foram coletados no Campus da
Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho (UNESP)-Jaboticabal em maio de 2008,
sendo identificados pelo Profº Antonio Baldo G. Martins. As folhas foram secas em estufa a
40ºC e em seguida pulverizadas em moinho de facas. Já os frutos foram triturados com
etanol a temperatura ambiente. Os produtos obtidos foram submetidos ao processo de
extração por maceração em n-hexano (3x), com posterior remaceração em etanol (3x),
fornecendo as soluções hexânica e etanólica. Essas soluções foram evaporadas a pressão
reduzida e forneceram os extratos hexânicos (HEX) e etanólico (ETOH), respectivamente.
O extrato etanólico foi solubilizado em uma mistura de água:metanol (6:4) e então
submetido à extração líquido-líquido (ELL), empregando n-hexano, AcOEt e n-BuOH
como contra-fase (Figura 7 e Figura 8).
Todos os extratos e/ou frações oriundas da ELL foram analisados por ensaios em
cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), nebulizadas com solução de β-
caroteno e anisaldeído. Estes também foram analisados via CLAE-UV-DAD, para obtenção
do perfil cromatográfico de cada amostra.
Figura 7 - Fracionamento cromatográfico dos frutos de Garcinia xanthochymus.
MeOH:H
2
O;
AcOEt e n-BuOH
ELL
Frutos de Garcinia
xanthochymus
(m=2,2 kg)
HEX-FRU
(m=4,0g)
Torta
ETOH-FRU
(m=50,0 g)
AcOEt-FRU
(m=4,0 g)
BuOH-FRU
(m=8,2 g)
HA-FRU
(m=14,3 g)
Maceração em etanol
e evaporação
CPG
CCDC
CLAE-UV
18 subfrações
Xantochimol (Subst. 19)
+ Cicloxantochimol (Subst. 20)
(m=100 mg)
Maceração em n-hexano
e evaporação
Procedimento Experimental 53
Figura 8 - Fracionamento cromatográfico das folhas de Garcinia xanthochymus.
Figura 9 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia xanthochymus em
coluna de permeação em gel (LH-20, Sephadex
®
).
Torta
Maceração em n-hexano
e evaporação
Maceração em etanol
e evaporação
ETOH-FOL
(m=90,0 g)
MeOH:H
2
O; n-hexano,
AcOEt e n-BuOH
ELL
CC-FN
(gradiente n-Hex-AcOet)
CCDC
RMN
1
H
CC-FN
(gradiente Hex-AcOet)
HEX-FOL
(m= 8,0 g)
45 frações
HEX- FOL-3-31
HEX-FOL-3
HEX- FOL-3-59
HEX- FOL-3-65
Friedelina
m=4 mg
(Subst. 1)
Lanosterol
m=9 mg
(Subst. 2)
AcOEt-FOL
(m=24,6 g)
HA-FOL
(m=31,9 g)
Folhas de Garcinia
xanthochymus
(m=1,2 kg)
BuOH-FOL
(m=15,1 g)
CPG
AcOEt-FOL
(m=3 g)
CLAE-UV
CLAE-DAD
I3,II8-
Biapigenina
m=2mg
(Subst. 5)
16 subfrações
CLAE-UV-prep
AcOEt-FOL-14
(m=30,3 mg)
CLAE-UV-prep
CCDC
AcOEt-FOL-15
(m=269,3 mg)
Morelloflavona
m=80mg
(Subst. 8)
Amentoflavona
m=8mg
(Subst. 9)
GB1a
m=1mg
(Subst. 6)
CLAE-UV-
prep
AcOEt-FOL-16
(m=87,4 mg)
Lanosta-7,24-
dien-3-ol
m= 7 mg
(Subst. 3)
Saharanflavona
m=1mg
(Subst. 4)
Podocarpusflavona
m=1mg
(Subst. 7)
FR. HEX-FOL
(m=10,6 g)
Procedimento Experimental 54
Figura 10 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia xanthochymus em
coluna de fase normal (sílica-gel 60-230 µ).
Figura 11 - Fracionamento cromatográfico da fração BuOH-FOL de Garcinia xanthochymus.
CC-FN
(gradiente Hex-AcOet-MeOH)
AcOEt-FOL
(m=3 g)
CLAE-UV
CLAE-DAD
11 subfrações
CLAE-UV-prep
AcOEt-SIL-3
(m=30,3 mg)
AcOEt-SIL-9
(m=243,1 mg)
Diidrokaempferol
m= 2mg
(Subst. 10)
CLAE-UV-prep
CCDC
AcOEt-SIL-4
(m=269,3 mg)
AcOEt-SIL-5
(m=87,4 mg)
AcOEt-SIL-11
(m=325,9 mg)
Volkensiflavona
m=6mg
(Subst. 12)
CLAE-UV-prep
CLAE-UV-prep
Ácido vanílico
m=2mg
(Subst. 13)
GB2
m=20mg
(Subst. 14)
Xantochimusídeo
m=40mg
(Subst. 15)
Fukugisídeo
m=20mg
(Subst. 16)
Ácido 4-O
cafeoilquínico
m=1 mg
(Subst. 22)
CLAE-UV-
prep
CLAE-UV-
prep
CPG
BuOH-FOL
(m=3 g)
CLAE-UV
CLAE-DAD
9 subfrações
BuOH-FOL-6
(m=375,7 mg)
CLAE-UV-prep
CCD
C
Ácido 5-O-
cafeoilquínico
m=7 mg
(Subst. 18)
GB2a
m=30mg
(Subst. 11)
Ácido 4-p-
coumaroilquínico
m=1 mg
(Subst. 23)
Ácido 3-p-
coumaroilquínico
m=1 mg
(Subst. 21)
Ácido 3-O-
cafeoilquínico
m=9 mg
(Subst. 17)
Procedimento Experimental 55
5.2 Pré-tratamento da amostra para CLAE-DAD e UV
Antes de serem injetados no cromatógrafo, os extratos e frações de Garcinia
xanthochymus foram submetidos a um tratamento preliminar, etapa que envolve a
eliminação de grande parte dos pigmentos e constituintes de baixa polaridade. A extração
em fase sólida de fase reversa foi utilizada por ser a técnica de escolha em pré-tratamentos
de amostras para análises em CLAE fase reversa. Dessa maneira, seguiu-se o seguinte
procedimento:
1. Pesagem de 1,5g de ODS (40-63m) e preparação de um cartucho com uma coluna de
vidro (0,9 cm di).
2. Condicionamento do cartucho com 3,0 mL do eluente MeOH:H
2
O (95:05).
3. Solubilização do extrato ou fração em 1,0 mL do eluente.
4. Aplicação do extrato na coluna e eluição da amostra com 5,0 mL do eluente.
5. Filtração da amostra em membrana Millipore
®
(0,2 m) e acondicionamento em frasco
para injeção.
5.3 Estudo químico do extrato hexânico das folhas de Garcinia
xanthochymus (HEX-FOL)
O extrato hexânico (HEX-FOL) foi submetido à cromatografia em coluna de fase
normal (CC-FN), eluída no modo gradiente, utilizando misturas de HEX e AcOEt (Figura
8). Foram obtidas 45 frações, as quais foram analisadas por cromatografia em camada
delgada comparativa (CCDC) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio um (RMN de
1
H). Assim, conseguiu-se um perfil cromatográfico e espectrométrico das frações obtidas, o
qual revelou a presença de ácidos graxos, triterpenos e esteróides. Diante da simplicidade
(menor número de substâncias reveladas em anisaldeído sulfúrico) e da presença de poucas
substâncias adsorvidas fortemente nas cromatoplacas (alta polaridade), optou-se
primeiramente pela fração HEX-FOL-3 para prosseguir o fracionamento cromatográfico. A
fração HEX-FOL-3 foi submetida à CC-FN (gradiente HEX e AcOEt), culminando no
isolamento da substância 1 (friedelina) e da substância 2 (lanosterol), inédita na literatura
para essaa espécie. A subfração HEX-FOL-3-65 apresentou-se como uma mistura de dois
esteróides: lanosterol e a substancia 3 (lanosta-7,24-dien-3-ol), também não identificada na
espécie em estudo.
Procedimento Experimental 56
5.4 Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt das folhas de
Garcinia xanthochymus (AcOEt-FOL)
Diante dos resultados preliminares da ação antioxidante e antimalárica dos extratos e
frações obtidos das folhas de Garcinia xanthochymus (Tabela 18 e Tabela 19) optou-se
inicialmente pelo estudo químico da fração AcOEt-FOL.
A fração AcOEt-FOL foi submetida à cromatografia de permeação em gel (CPG),
empregando-se LH-20/Sephadex
®
e eluição isocrática com MeOH. Foram coletadas 45
subfrações, as quais foram analisadas por meio de CCDC, em placas de sílica gel eluídas
com AcOEt:H
2
O (100:27) acidificadas com 11% de ácido acético e 11% de ácido fórmico
(BLADT, 1996) e revelação com solução de anisaldeído, possibilitando reuní-las em 16
subfrações (Figura 9).
Em virtude da grande quantidade da massa (24,6 g) e baseando-se em referências da
literatura na busca de xantonas preniladas (ZHONG; CHEN; YANG, 2008;
CHANMAHASATHIEN et al., 2003; CHEN et al., 2008) a fração AcOEt-FOL também foi
submetida à CC-FN (sílica-gel 60-230 µm), utilizando misturas de HEX, AcOEt e MeOH
no modo gradiente. Após análise comparativa por CCDC em placas de sílica gel e fase
móvel 9:1 (AcOEt: MeOH) foi possível reunir as frações coletadas em 11 subfrações
(Figura 10).
Todas as subfrações (AcOEt-FOL-1 a 16 e AcOEt-SIL-1 a 11) tiveram seu perfil
químico analisado por CLAE-DAD (ODS, Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m) e
eluição gradiente em H
2
O: MeOH (95:5) até MeOH (100).
Com isso, foi possível caracterizar o número de substâncias presentes em cada
subfração, bem como selecionar as subfrações AcOEt-FOL-14-16, AcOEt-SIL-3-5, AcOEt-
SIL-9, AcOEt-SIL-11 para isolamento de seus constituintes químicos, baseando-se nas
massas e perfil cromatográfico de cada matriz.
5.5 Estudo químico da subfração AcOEt-FOL-14
A otimização em CLAE para a subfração AcOEt-FOL-14 foi obtida com a fase móvel
na composição de 57% metanol e 43% de água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna
Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20
L (Figura 12). Quando submetida à CLAE-prep, com fluxo de 10 mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-
1
e detecção em λ=254 nm , a subfração AcOEt-FOL-14 (483,9 mg), apresentou cinco
Procedimento Experimental 57
picos; o pico em t
r
=11,5 min (Substância 4), o pico em t
r
=19,0 min (Substância 5) e o pico
em t
r
=27,0 min (Substância 6) apresentaram-se puros e com sinais característicos de
flavonóides, evidenciados pelos dados de UV e RMN de
1
H.
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Volts
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Figura 12 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-FOL-14, eluída
com MeOH:H
2
O: HOAc (57:42,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
5.6 Estudo químico das subfrações AcOEt-FOL-15 e 16
As subfrações AcOEt-FOL-15 e 16 também foram submetidas a experimentos de
otimização em CLAE-UV para posterior utilização e separação por CLAE-prep. A melhor
condição para tal separação foi obtida com a fase móvel na composição de 75% metanol e
25% de água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna Fenil-Hexil (Phenomenex Luna 25,0
cm x 4,6) com detecção em λ=254 nm, fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20 L
(Figura 13a e Figura 13b).
A subfração AcOEt-FOL-15 (61,2 mg) foi submetida à CLAE-prep, com fluxo de 10
mL.min
-1
, c= 10 mg.mL
-1
e detecção em λ=254 nm, sendo que quatro picos foram
separados. O segundo pico (t
r
em 4,0 min, Substância 7) e o quarto pico de interesse (t
r
em
7,7 min, Substância 8) apresentaram-se puros e com sinais característicos de flavonóides,
evidenciados pelos dados de UV e RMN de
1
H.
Nestas mesmas condições, a subfração AcOEt-FOL-16 (129,8 mg) apresentou dois
picos, porém apenas o 2º caracterizava-se como uma substância pura (Substância 9).
Subst. 5
Subst. 6
Subst. 4
Procedimento Experimental 58
Figura 13 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-FOL-15 e
(b) AcOEt-FOL-16, eluídas com MeOH:H
2
O: HOAc (75:24,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
5.7 Estudo químico da subfrações AcOEt-SIL-3 e 9
As condições de separação das subfrações AcOEt-SIL-3 (m=30,3 mg) e AcOEt-SIL-9
(m=243,1 mg) foram otimizadas por CLAE-UV na condição de 45% metanol e 55% de
água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x
4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20 L. Quando submetida ao fracionamento
em escala preparativa em coluna Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 21), fluxo de 10
mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-1
e detecção em λ=254 nm, a subfração AcOEt-SIL-3 (Figura 14a)
permitiu o isolamento da substância 10 (t
r
=17,5 min). A subfração AcOEt-SIL-9 (Figura
14b) apresentou dois picos, porém apenas o 2º caracterizava-se como uma substância pura
(Substância 15).
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
Volts
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Volts
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
mAU
254nm,4nm (1.00)
Figura 14 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-SIL-3 e (b)
AcOEt-SIL-9, eluídas com MeOH:H
2
O: HOAc (45:54,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
Subst.7
Subst. 8
Subst. 9
Subst. 10
Subst. 15
Procedimento Experimental 59
5.8 Estudo químico das subfrações AcOEt-SIL-4 e 5
A subfração AcOEt-SIL-4 (m=269,3 mg) apresentou dois picos de interesse na
condição cromatográfica de 60% metanol e 40% de água dopada com 0,5% de HOAc, em
coluna Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume
injetado de 20 L (Figura 15a). A posterior separação em CLAE-prep com fluxo de 10
mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-1
e detecção em λ=254 nm permitiu o isolamento da substância 11
(pico em t
r
=11,2 min) e da substância 12 (pico em t
r
=14,5 min).
Já subfração AcOEt-SIL-5 (m= 87,4) (Figura 15b) quando submetida à CLAE-UV-
prep com a fase móvel de 50% metanol e 50% de água dopada com 0,5% de HOAc, em
coluna Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 21), fluxo de 10 mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-1
e detecção em λ=254 nm, permitiu o isolamento do ácido vanílico (pico em t
r
=5,1 min,
Substância 13), do biflavonóide GB2 (pico em t
r
=15,1 min, substância 14) e da substância
8, já isolada anteriormente da subfração AcOEt-FOL-15.
Figura 15 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt-SIL-4,
eluída com MeOH:H
2
O: HOAc (60:39,5:0,5) e (b) AcOEt-SIL-5, eluídas com MeOH:H
2
O: HOAc
(50:49,5:0,5).
5.9 Estudo químico da subfração AcOEt-SIL-11
A otimização em CLAE para a subfração AcOEt-SIL-11 foi obtida com a fase móvel
na composição de 35% metanol e 65% de água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna
Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20
L (Figura 16). Quando submetida à CLAE-prep, com fluxo de 10 mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-
1
e detecção em λ=254 nm , a subfração AcOEt-SIL-11 (325,9 mg), apresentou cinco picos;
o segundo pico em t
r
=5,5 min (Substância 16) apresentou-se com sinais característicos de
Subst. 11
Subst. 12
Subst. 14
Subst. 8
Subst. 13
Procedimento Experimental 60
flavonóides glicosilados, evidenciados pelos dados de UV e RMN de
1
H. Já as substâncias
22 e 23 foram identificadas como derivadas de ácidos fenilpropanoídicos.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
mAU
254nm,4nm (1.00)
Figura 16 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-SIL-11, eluída com
MeOH:H
2
O: HOAc (35:64,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
5.10 Fracionamento cromatográfico e estudo químico da fração BuOH
das folhas de Garcinia xanthochymus (BuOH-FOL)
A fase butanólica das folhas (BuOH-FOL) foi submetida à CPG (LH-20, Sephadex
®
),
eluída isocraticamente em MeOH. Foram coletadas 26 frações, as quais foram analisadas e
reunidas em 9 subfrações por meio de CCDC (Figura 11), em placas de sílica gel eluídas
com H
2
O:BuOH:HOAc (50:40:10) e revelação com solução de anisaldeído.
A análise das cromatoplacas, dos cromatogramas obtidos via CLAE-DAD e dos
espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio um (RMN de
1
H) possibilitou a
escolha da subfração BuOH-FOL-6 para posterior estudo fitoquímico. A melhor condição
cromatográfica foi de 20% metanol e 80% de água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna
Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20
L (Figura 17). Quando submetida à CLAE-prep, com fluxo de 10 mL.min
-1
, c=10 mg.mL
-
1
e detecção em λ=254 nm a subfração BuOH-FOL-6 (375,7 mg) apresentou três picos,
sendo que o 1º pico (t
r
=5,5 min) foi identificado como substância 17, o 2º pico (t
r
=7,0 min)
como substância 18 e o 3º pico (t
r
=7,6 min) como substância 21.
Subst. 16
Subst. 23
Subst. 22
Procedimento Experimental 61
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
mAU
254nm,4nm (1.00)
Figura 17 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração BuOH-FOL-6, eluída com
MeOH:H
2
O: HOAc (20:79,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
5.11 Fracionamento cromatográfico e estudo químico da fração AcOEt
dos frutos de Garcinia xanthochymus (AcOEt -FRU)
Após análise das cromatoplacas em diversos tipos de eluentes e reveladores, a fração
AcOEt-FRU foi selecionada para estudo fitoquímico por apresentar melhor resolução, um
menor número de substâncias e maior massa.
Uma alíquota da fração AcOEt-FRU (4,0 g) foi dissolvida em 4 mL de MeOH e
submetida a CC em LH-20/Sephadex
®
. Utilizando metanol como eluente, foram coletadas
37 frações de 25 mL, analisadas por CCDC, o que permitiu sua reunião em 18 subfrações.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU
254nm,4nm (1.00)
Figura 18 - Cromatoplaca da subfração AcOEt-FRU-7 com (a) revelação física em =254 nm e (b)
revelação química com anisaldeído sulfúrico (c) Cromatograma analítico da subfração AcOEt-FRU-
7, obtido em coluna ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m) eluída com fase móvel de
MeOH:H
2
O: HOAc (75:24,5:0,5) e detecção em λ=254 nm.
A cromatoplaca da subfração AcOEt-FRU-7 (100 mg) revelou a presença de apenas
uma mancha amarela em revelação com anisaldeído sulfúrico, pureza também exibida em
(a)
(b)
(c)
Subst. 18
Subst. 21
Subst. 17
Procedimento Experimental 62
análise por CLAE-DAD (Figura 18). Porém quando submetida às análises espectroscópicas
evidenciou-se a presença de uma mistura isomérica (Substâncias 19 e 20).
5.12 Identificação por CLAE-DAD-EM dos constituintes de frações
selecionadas de Garcinia xanthochymus-análise por desreplicação
Após o pré-tratamento de amostras para CLAE, conforme descrito no item 5.2,
algumas subfrações (provenientes da fração AcOEt dos frutos) e/ou substâncias puras foram
analisadas e identificadas por CLAE-DAD-EM. As condições cromatográficas foram:
AcOEt-FRU-13, 30% metanol e 70% de água dopada com 0,5% de HOAc, em coluna
Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e volume injetado de 20
L e para a subfração AcOEt-FRU-17, 40% metanol e 60% de água dopada com 0,5% de
HOAc, em coluna Fenil-hexil (Phenomenex Luna 25,0 cm x 4,6), fluxo de 1 mL.min
-1
e
volume injetado de 20 L.
Por apresentar pequena quantidade de massa e/ou impurezas, algumas amostras
(Substâncias 6, 7, 15, 16, 21, 22, 23 e a subfração AcOEt-FRU-7) foram analisadas por EM,
injeção direta (sistema off), a fim de aumentar a concentração para um mesmo volume
injetado. Estas também foram comparadas e identificadas através dos tempos de retenção,
bandas de absorção e dados de RMN obtidos da literatura.
5.13 Identificação de triterpenos e esteróides presentes nos extratos de
baixa polaridade de Garcinia xanthochymus utilizando cromatografia
gasosa (CG)
Em virtude do extrato hexânico das folhas (HEX-FOL), a fração hexânica das folhas
(FR. HEX-FOL) e o extrato hexânico dos frutos (HEX-FRU) apresentarem um perfil em
CCDC bastante complexo e de difícil separação, essas matrizes foram analisadas por CG,
conforme metodologia e equipamentos descritos no item 4.1.8. O pré-tratamento consistiu
em solubilizar 10 mg de cada amostra em clorofórmio (3 mL) e eluir as mesmas por uma
coluna cromatográfica contendo celite:carvão ativo (1:1, 100 mg) + sílica gel (200 mg) e
fase móvel 10 mL de clorofórmio. Após a evaporação à temperatura ambiente, o eluído foi
então, solubilizado em n-hexano: AcOEt (7:3).
Procedimento Experimental 63
5.14 Ensaios antioxidantes
5.14.1 Descoloração de β-caroteno
Preparou-se uma solução de 0,02% de β-caroteno (Aldrich
®
) em metanol e após a
nebulização das cromatoplacas, essas foram expostas ao ar e luz natural, por cerca de 6
horas, a fim de catalisar a oxidação do β-caroteno (SILVA et al., 2001).
5.14.2 Atividade seqüestradora de radicais livres: DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazila)
O radical DPPH apresenta absorção máxima em 531 nm. Neste comprimento de onda
avalia-se a absorbância na ausência e na presença das amostras-teste, sendo que na presença
de agentes antioxidantes ocorre aumento da transmitância. A solução de DPPH (200 μM)
foi preparada em MeOH. Na placa de 96 poços foram adicionados: Amostra: 200 μL de
DPPH e 100 μL de amostra em diversas diluições. Controle positivo: 200 μL de DPPH e
100 μL de antioxidante padrão. Controle negativo: 200 μL de DPPH e 100 μL de solvente.
A placa foi mantida por 30 minutos no escuro. A avaliação da forma reduzida do DPPH
gerado foi determinada através da diminuição da absorbância a 517 nm. (SON e LEWIS,
2002; PAULETTI et al., 2003).
Processamento dos dados:
Fórmula: % de sequestro do radical livre DPPH
% = (absorbância do CONTROLE DPPH- absorbância da AMOSTRA ou PADRÃO)*100
Absorbância do CONTROLE-DPPH
5.15 Ensaio in vitro da polimerização de heme
O ensaio foi baseado na metodologia de Baelmans e colaboradores, com algumas
modificações. Este teste consistiu na incubação em microtubos de 1,5 mL por 24 horas a
37°C das seguintes soluções: 50 µL de extratos dissolvidos em DMSO (à concentração final
Procedimento Experimental 64
de 2,5 mg/mL), DMSO (50 µL) para os controles com 100 µL de heme (6,4 mM de heme
dissolvida em 0,2 N NaOH, 4,16 mg em 1000 L, que foi preparada 60 minutos antes da
execução do ensaio, incubada a 37
o
C e protegida da luz), 200 µL de acetato de sódio 0,5 M
e 50 µL de ácido acético. Após a incubação, os microtubos foram centrifugados por 10 min
e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado duas vezes, com 400 µL de
DMSO e 400 µL de metanol, e dissolvido em 1000 µL de NaOH 0,1 M. Aliquotas de 20 µL
da β-hematina dissolvida foram transferidas para uma placa de 96 poços com 180 µL de
NaOH 0,1 M, e as amostras foram lidas a 405 nm no leitor de microplacas. Quinina e
cloroquina foram utilizadas como controle positivo. Os dados foram expressos como
porcentagem de inibição da polimerização do heme e foram calculados pelo programa KC4
pelo emprego da fórmula a seguir. As análises foram feitas sempre em triplicata para o
cálculo do desvio padrão.
5.16 Atividade antifúngica
O teste incluiu os organismos Candida albicans ATCC 90028, Candida krusei ATCC
6258, Candida parapsilosis ATCC 22019 e Cryptococcus neoformans ATCC 90012. Os
testes foram realizados no Departamento de Análises Clínicas/Laboratório de Micologia
Clínica, Araraquara-UNESP, sob supervisão da Dra. Maria José M. Giannini.
A atividade antifúngica foi realizada seguindo a metodologia de microdiluição e
verificação de turbidez em leitor de microplacas descrita no documento M27-A2 do CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute) com algumas modificações. As análises foram
feitas em triplicatas e o meio utilizado foi RPMI 1640 com L-glutamina e ácido
morfolinopropanosulfônico 0,165 M (pH: 7,0) acrescido com 2% glicose.
As amostras foram preparadas em DMSO numa concentração de 250 μg/ml. A
suspensão das células foram preparadas em uma solução 0,85% salina e inoculada numa
placa de microtubos previamente preparada com as amostras diluídas numa concentração
entre 250 μg/mL para 0,48 μg/mL. As placas foram incubadas sob agitação a 37°C por 24 h
para a espécie Candida e 48 h para Crytococcus neoformans.
% inibição da formação de -hematina= (A
controle +
- A
amostra
) *100/ A
controle +
Procedimento Experimental 65
O controle positivo utilizado foi o fluconazol dissolvido em DMSO. Pelo método
espectrofotométrico, a CIM foi definida como a concentração mais baixa em que a
densidade ótica (OD) foi reduzida a 90% do OD do poço controle do crescimento.
5.17 Atividade tripanocida
O teste colorimétrico do MTT foi realizado no Laboratório de Imunologia e Biologia
Molecular de Parasitos sob supervisão da Profª Regina M. B. Cicarelli no Departamento de
Ciências Biológicas, Araraquara-UNESP. A forma epimastigota de Trypanosoma cruzi foi
escolhida por ser uma forma não infectante e de fácil manutenção em cultura.
Os testes foram realizados em triplicata em placas de poliestireno com 96 poços
estéreis e com tampa em fluxo laminar.
Após diluições em DMSO, 3 μL de cada substância testada (concentrações finais de
100, 50, 25, 10, 5, 2,5 e 1 μg/mL, respectivamente), foram adicionados a 95 μL de meio
LIT (Liver Infusion Tryptose) contendo 1,0 x 10
7
parasitos/ml na forma epimastigota de T.
cruzi (fase log). Para os extratos e frações, as concentrações das substâncias foram
extrapoladas até valores de 200, 300, 400 e 500 μg/mL. A placa foi incubada em câmara
úmida por 72 horas. Então, adicionou-se 10 μL de solução MTT/PMS em todos os poços e
a placa novamente foi incubada, ao abrigo de luz por 75 minutos a 28ºC. Neste momento,
ocorre a redução do sal tetrazolium MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólio em
um produto colorido, formazan, pela ação da enzima succinato desidrogenase das
mitocôndrias. Após solubilização dos cristais de formazan e incubação a temperatura
ambiente por 30 minutos, foi feita a leitura num espectrofotômetro a 595 nm
(COTINGUIBA et al., 2009).
A porcentagem de citotoxicidade (%C) foi calculada segundo a equação abaixo:
%C = [(Gc – Gp)/Gc]*100 Gc = Ac – Am, Gp = Ap – Apm
Sendo que, Gc representa o número de parasitos/mL nos poços controle e Gp, o
número de parasitos/mL detectados em diferentes concentrações da substância. Ac
corresponde ao valor de absorbância nos poços controle (na ausência da substância) sem
parasito; Ap, o valor da absorbância nos testes e Apm, o valor da absorbância das diferentes
concentrações da substância na ausência do parasito.
Procedimento Experimental 66
Foram realizados dois controles, um na ausência do parasito para cada poço teste, mas
na presença da substância e outro na ausência desta, mas contendo parasitos.
5.18 Atividade quimiopreventiva
O ensaio da quinona redutase (QR) constitui um método simples para detecção e
avaliação da indução da enzima quinona redutase (enzima de fase II), que destoxifica
carcinógenos por produtos naturais, baseado na medida direta da atividade da QR em
células de hepatocarcinoma celular (KINGHORN et al., 2004). A quinona redutase catalisa
a redução da menadiona (2-metil-1,4-naftoquinona), a menadiol mediada por NADPH
como doador de elétrons. O MTT é então reduzido não-enzimaticamente pelo menadiol,
resultando na formação do sal azul de formazan (FAHEY et al., 2004). A linhagem
derivada de hepatocarcinoma celular murino-Hepa 1c1c7 contém quantidades de QR
induzíveis facilmente mensuráveis que fornece um sistema confiável para detecção de
indutores de enzimas de fase II (CUENDET et al., 2006).
A atividade de QR foi determinada em placas de 96 poços com células (1,5x 10
4
células/cavidade) da linhagem de hepatocarcinoma murino-Hepa 1c1c7. A atividade
específica foi definida como a concentração nanomolar de MTT formado por mg de
proteína por minuto, monitorada em leitor de placas a 595 nm. A indução da QR foi
calculada pela comparação da atividade específica de células tratadas com aquelas expostas
apenas ao solvente, sendo gerado um gráfico dessas razões.
IQ= CI
50
/CD
CD representa a concentração necessária para duplicar a indução de QR e o Índice de
Quimioprevenção (IQ) é um valor gerado pela comparação de CD e CI
50
(concentração para
50% de inibição da viabilidade celular).
Resultados e Discussão 67
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Análise dos cromatogramas e espectros de absorção
Nas condições empregadas, os cromatogramas dos extratos e frações das folhas e
frutos de Garcinia xanthochymus mostraram que nos frutos os metabólitos secundários são
minoritários e/ou se encontram em menores concentrações, com exceção do pico em t
r
=45
min (Substs. 19 e 20, isoladas da fração AcOEt-FRU-7, Figura 18), que é majoritário no
extrato ETOH e fração AcOEt dos frutos (Figura 19a e Figura 19b-acima). Similaridades
nos tempos de retenção e nos espectros de UV foram encontradas para substâncias com t
r
=
12,5 e 28,0 min que estão presentes na fração BuOH das folhas e frutos. A substância com
t
r
= 12,5 min também está presente na fração HA de ambos órgãos (Figura 19c e Figura
19d-acima e abaixo).
Nota-se também semelhanças entre o extrato ETOH e a fração AcOEt das folhas no
que diz respeito à composição (bandas de absorção no UV) e tempos de retenção. Assim
também para as frações BuOH e HA, que apresentam similaridades na região de menores
tempos de retenção dos picos nos cromatogramas (relativo à composição da fase móvel
com maior teor de água no gradiente exploratório), o que sugere um caráter mais polar das
substâncias presentes nesta região do cromatograma.
Os picos majoritários da fração AcOEt-FOL (Figura 19b-abaixo) apresentam
espectros de absorção no UV característicos de flavonóides (Figura 20). O espectro
consiste de dois máximos de absorção, nos intervalos de comprimento de onda de 230-295
nm (banda II) e entre 300-560 nm (banda I). A posição precisa e as intensidades relativas
desses máximos fornecem informações valiosas da natureza do flavonóide e de seu padrão
de oxigenação (Tabela 2). Sendo assim, mudanças na substituição do anel A normalmente
são evidenciadas por alteração na posição e/ou intensidade na banda II, enquanto
alterações nos anéis B e C resultam em alterações na banda I (MABRY; MARKHAM;
THOMAS, 1970; MERKEN; BEECHER, 2000).
As substâncias 11 e 15 isoladas da fração AcOEt-SIL-4 e 9, respectivamente (Figura
15a e Figura 14b), apresentaram uma banda em 293 nm e outra banda pouco intensa em
332 nm, sugerindo a subclasse das flavanonas. A adição de uma unidade de açúcar, em C-
3, C-5, C-7 ou C-4’, causa um deslocamento hipsocrômico na banda II das flavanonas.
Assim, pode-se sugerir a presença de uma unidade de açúcar na substância 15. A
Resultados e Discussão 68
substância 9 apresentou duas bandas (banda II em 268 nm e a banda I em 337 nm)
evidenciando a subclasse das flavonas. Já as substâncias 8 e 16 apresentaram bandas
características de flavanonas para o anel A (banda II em 290 nm) e, para o anel B e C,
apresentaram bandas características da subclasse das flavonas (banda I entre 310-350 nm),
sugerindo a presença de duas subclasses distintas no esqueleto flavonoídico.
Figura 19 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV do extrato ETOH (a) e das frações
AcOEt (b), BuOH (c) e HA (d) dos frutos (acima) e das folhas (abaixo) de Garcinia
xanthochymus no modo gradiente em H
2
O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
Figura 20 - Espectro no UV de algumas substâncias isoladas da fração AcOEt-FOL de Garcinia
xanthochymus.
(a)
(b)
(c)
(d)
16
8
11
15
9
Resultados e Discussão 69
Tabela 2 - Intervalos de absorção no UV para diferentes tipos de flavonóides.
Banda II (nm)
Banda I (nm)
Tipo de flavonóide
250-280
310-350
Flavona
250-280
330-360
Flavonol (3-OH substituído)
250-280
350-385
Flavonol (3-OH livre)
245-275
310-330 (pouca intensa)
Isoflavona
275-295
300-330 (pouca intensa)
Flavanona e Diidroflavonol
230-270 (pouco intensa)
340-390
Chalcona
230-270 (pouco intensa)
380-430
Aurona
230-270
465-560
Antocianidina e Antocianina
6.2 Estudo químico das folhas
As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas através da análise de dados
espectrométricos, especialmente RMN uni e bi dimensional (gHMBC, gHMQC, COSY,
DEPT, NOESY e HOMODEC), além dos dados de UV, IV e EM e comparação com dados
encontrados na literatura.
6.2.1 Caracterização espectrométrica da substância 1
A substância 1 foi isolada do extrato HEX-FOL, conforme procedimento
experimental em 5.3.
A análise dos espectros de RMN de
1
H e
13
C, IV e EM, permitiu caracterizar a
substância 1 como um triterpeno pentacíclico pertencente à classe dos friedelanos.
O espectro de IV (Figura 22) apresentou sinal de estiramento de carbonila em 1698
cm
-1
(
C=O
), uma banda em 2925 cm
-1
correspondente a deformação axial da ligação C-H
O
HH H
1
22
29
30
5
23
4
3
2
10
25
6
7
8
9
11
14
13
12
20
19
18
17
28
21
27
15
16
24
26
A
C
B
D
E
Resultados e Discussão 70
de grupos metílicos e metilênicos (
C-H
) e bandas entre 1450 e 1550 cm
-1
correspondentes a
vibrações de deformação angular de C-H (
C-H
) (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE,
1994).
O espectro de massas obtido por CG-EM (IE=+70 eV) apresentou o íon molecular
em m/z 426 e um fragmento em m/z 273, típicos de friedelanos saturados quando
substituídos apenas nos anéis A ou E (Figura 21). Os fragmentos em m/z 55 e 69 podem
ser resultantes da clivagem inicial, respectivamente, das ligações C2-C3 ou C4-C3, com
posterior migração de um átomo de hidrogênio, conforme ilustrado na Figura 23,
concomitante à clivagem das ligações C1-C10 ou C5-C10.
O espectro de RMN
13
C apresentou sinal de carbono carbonílico em δ
C
213,2 e um
sinal de um grupo metila em δ
C
6,8 protegido pelo efeito do oxigênio da carbonila
(Anexos 4 a 6). Através da análise dos espectros de RMN de
13
C e DEPT foi possível
contabilizar 30 carbonos, dos quais 8 são carbonos metílicos, 11 são carbonos metilênicos,
4 metínicos e 7 quaternários (Anexos 7 a 9, Tabela 3).
O espectro de RMN de
1
H mostrou sinais de absorção entre
H
1,36 a 2,43 referentes
aos grupos metilênicos e metínicos; e na região entre
H
0,74 a 1,20, mostrou 8 sinais
associados às 8 metilas da estrutura desta substância (Anexos 1 a 3).
A comparação dos dados espectrométricos de 1 com valores registrados na literatura
permitiu identificar este triterpeno como 3-oxo-friedelano (friedelina) (GOTTIEB et al.,
1985).
A friedelina foi isolada das folhas de Garcinia xanthochymus por Singh et al. em
1991. Este composto mostrou-se muito eficaz como agente antibacteriano. Há relatos que
atribuem à friedelina atividade antiúlcera estomacal e contra gastrite (CORDEIRO;
VILEGAS; LANCAS, 1999; RAMESH et al., 2002). A friedelina possui ainda efeito
antiinflamatório quando administrada por via tópica, inclusive para inflamações oculares
(DI STASI; GOMES; VILEGAS, 1999).
Figura 21 - Espectro de massas da substância 1 obtido por CG-EM (IE=+70 eV).
(Text File) 17.266 min, Scans: 1991-1997
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540 570 600
0
50
100
41
55
67
81
95
109
149
163
205
231
257
273
287
321
341
351 369 385
426
435 451 475 492 507 524 539 565 581
69
Resultados e Discussão 71
Figura 22 - Espectro vibracional na região do IV da substância 1.
Figura 23 - Proposta de fragmentação da substância 1.
O
HH H
H
2
C
+
H
CH
O
+
H
CH
2
O
+
H
O
HH H
O
+
O
+
m/z 426
m/z 273
153
(a)
(b)
(a)
(b)
.
+
.
+
.
+
O
+
.CH
H
.
+
O
+
.
+
m/z 55
.
+
m/z 69
O
+
.
+
CH
2
.
O
+
H
.
+
O
HH H
H
2
C
+
H
CH
O
+
H
CH
2
O
+
H
O
HH H
O
+
O
+
m/z 426
m/z 273
153
(a)
(b)
(a)
(b)
.
+
.
+
.
+
.
+
.
+
.
+
O
+
.CH
H
.
+
.
+
O
+
.
+
.
+
m/z 55
.
+
.
+
m/z 69
O
+
.
+
.
+
CH
2
.
O
+
H
.
+
.
+
Resultados e Discussão 72
6.2.2 Caracterização espectrométrica da substância 2
OH
29
19
23
22
24
20
30
8
7
6
5
4
3
1
2
9
10
26
27
28
21
25
13
12
11
14
15
16
18
17
OH
29
19
23
22
24
20
30
8
7
6
5
4
3
1
2
9
10
26
27
28
21
25
13
12
11
14
15
16
18
17
A substância 2 foi isolada do extrato HEX-FOL, conforme procedimento
experimental em 5.3.
A análise dos espectros de RMN de
1
H e
13
C, IV e EM, permitiu identificar a
substância 2 como um esteróide.
O espectro na região do IV (Figura 24) apresentou uma banda larga de absorção em
3336 cm
-1
característica do estiramento da ligação O-H (
O-H
), bandas em 2935 e 2868 cm
-
1
atribuídas aos estiramentos da ligação C-H dos grupos metilênicos e metínicos (
C-H
),
uma banda em 1722 cm
-1
referente à deformação axial de C=C (
C=C
), absorções em 1455
cm
-1
correspondentes a deformação angular da ligação C-H (
C-H
). O espectro apresentou
ainda uma banda em 1377 cm
-1
referente à deformação angular da ligação O-H (
O-H
) e
uma banda em 1091 cm
-1
, atribuída ao estiramento C-O (
C-O
) (SILVERSTEIN;
WEBSTER; KIEMLE, 1994).
O espectro de massas obtido por CG-EM (IE=+70 ev) (Figura 25) mostrou o íon
molecular em m/z 426, o íon base em m/z 393, referente à perda de uma metila, e um
fragmento intenso em m/z 411, referente à perda de uma molécula de água (Figura 26). É
interessante notar que esqueletos de triterpenos com insaturação na posição C-12 (série
ursano e oleano) e não substituídos, apresentam fragmentação típica denominada Retro-
Diels-Alder, que ocorre no anel C, provocando a formação de um íon em m/z 218. O íon
m/ 218 não foi detectado no espectro da substância 2, sugerindo que a mesma não possui
insaturação em C-12.
Resultados e Discussão 73
Figura 24 - Espectro vibracional na região do IV da substância 2.
Figura 25 - Espectro de massas da substância 2 obtido por CG-EM (IE= + 70 eV).
Figura 26 - Proposta de fragmentação da substância 2.
OH
CH
3
C
OH
C
H
2
O
(Text File) 18.652 min, Scans: 2167-2173
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540 570 600
0
50
100
30
41
55
69
81
95
109
121
147
187
241
259
283
311
341
377
393
411
426
475 503 549 600
m/z 426
m/z 393
m/z 411
+
+
++
++
++
Resultados e Discussão 74
O espectro de RMN de
1
H apresentou sinais de prótons olefínicos (δ
H
5,02; m) e de
prótons carbinólicos (δ
H
3,17; dd; J=12,0 e J=4,5 Hz). A região de δ
H
0,69 a 1,19 mostrou
8 sinais referentes às metilas da molécula, e entre δ
H
1,30 a 2,10, os sinais correspondentes
aos grupos metilênicos e metínicos (Anexos 10 a 12).
Através da análise dos espectros de RMN de
13
C e DEPT, foi possível identificar 30
carbonos dos quais 8 são carbonos metílicos, 10 são carbonos metilênicos, 5 metínicos e 7
quaternários (Anexos 16 a 19, Tabela 3). Os sinais dos carbonos olefínicos no espectro de
13
C (Anexos 13 a 15) em δ
C
125,2 (C-24), δ
C
130,8 (C-25), δ
C
134,1 (C-8) e δ
C
133,6 (C-
9), além do sinal de carbono carbinólico em δ
C
79,0 (C-3) e as observações citadas acima
permitiram identificar a substância 2 como lanosta-8,24-dien-3-ol, conhecida como
lanosterol (KNIGHT, 1973).
6.2.3 Caracterização espectrométrica da substância 3
26
OH
29
19
23
22 24
20
30
8
7
6
5
4
3
1
2
9
10
27
28
21
25
13
12
11
14
15
16
18
17
26
OH
29
19
23
22 24
20
30
8
7
6
5
4
3
1
2
9
10
27
28
21
25
13
12
11
14
15
16
18
17
A estrutura da substância 3 foi determinada em mistura, conforme procedimento
experimental em 5.3.
Nos espectros de RMN de
13
C e DEPT desta fração foi possível identificar 58
carbonos dos quais 30 foram atribuídos ao lanosterol, cuja elucidação foi discutida acima
(Anexos 21 a 24). Os sinais restantes foram atribuídos ao esteróide lanosta-7,24-dien-3-ol
(Tabela 3), que co-ocorre com a substância 2 em grande parte dos vegetais. Os espectros
de IV e massas apresentaram características análogas às da substância 2, confirmando a
presença dos isômeros de posição 2 e 3 na amostra.
Os sinais em δ
C
117,8 (C-7), δ
C
145,8 (C-8), δ
C
125,1 (C-24) e δ
C
130,9 (C-25) foram
atribuídos aos carbonos olefínicos e o sinal em δ 79,3 foi atribuído ao carbono
Resultados e Discussão 75
hidroximetínico C-3. Estes dados, aliados à análise de RMN
1
H da mistura (Anexo 20) e
comparação com dados da literatura, permitiram identificar 3 como lanosta-7,24-dien-3-ol
(OLEA; ROQUE, 1990).
Tabela 3 - Dados de RMN de
13
C (125 MHz) das substâncias 1, 2 e 3 em CDCl
3
.
Posição
δ
c
(ppm)
1
δ
c
(ppm)
2
δ
c
(ppm)
3
1
22,3 t
35,3 t
37,2 t
2
41,5 t
27,7 t
27,6 t
3
213,2 s
79,0 d
79,3 d
4
58,3 d
38,9 s
38,9 s
5
42,2 s
50,9 d
50,7 d
6
41,3 t
18,9 t
23,9 t
7
18,3 t
27,9 t
117,8 d
8
53,1 d
134,1 s
145,9 d
9
37,5 s
133,6 s
48,9 s
10
59,5 d
37,3 s
35,1 s
11
35,7 t
21,5 t
22,1 t
12
30,5 t
28,1 t
34,9 t
13
39,7 s
44,1 s
43,6 s
14
38,3 s
50,0 s
51,3 s
15
32,5 t
30,9 t
33,8 t
16
36,0 t
29,8 t
28,4 t
17
30,0 s
49,7 d
53,2 d
18
42,9 d
15,6 q
13,1 q
19
35,4 t
20,1 q
18,1 q
20
28,2 s
35,4 d
35,8 d
21
32,8 t
18,9 q
18,6 q
22
39,3 t
35,9 t
36,1 t
23
6,8 q
24,8 t
25,4 t
24
14,6 q
125,2 d
125,1 d
25
17,9 q
130,8 s
130,9 s
26
20,3 q
17,7 q
26,6 q
27
18,6 q
25,7 q
*
28
32,1 q
24,5 q
*
29
31,8 q
28,1 q
27,7 q
30
35,0 q
15,5 q
14,7 q
*valores não observados
6.2.4 Caracterização espectrométrica da substância 4
A substância 4 foi isolada da subfração AcOEt-FOL-14, conforme procedimento
experimental em 5.5.
O composto de fórmula C
30
H
18
O
11
foi obtido como cristais amarelos e apresentou
espectro de UV típico da subclasse das flavonas, com a banda II em 267 nm e a banda I em
Resultados e Discussão 76
343 nm (Figura 27). A fórmula molecular proposta foi obtida pela espectrometria de
massas de alta resolução no modo negativo (ESI) (Figura 29), em que foi observado o pico
referente ao íon molecular em m/z 553,0872 [M - H]
-
.
O espectro de absorção na região do IV (Figura 28) mostrou uma banda vibracional
larga em 3421 cm
-1
correspondente à deformação axial da ligação O-H (
O-H
) e uma banda
em 2952 cm
-1
referente à deformação axial C-H de aromáticos (
C-H
). Também mostrou
uma banda em 1639 cm
-1
referente à carbonila conjugada da molécula (
C-O
), bandas entre
1500 e 1602 cm
-1
atribuídas à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático, absorção
em 1258 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
), bandas referentes à deformação
angular no plano de C-H (
C-H
) entre 1072 e 1167 cm
-1
e uma banda em 814 cm
-1
relacionadas a deformações angulares fora do plano das ligações C-H (
C-H
) do anel
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
Figura 27 - Estrutura da substância 4. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 4 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
Figura 28 - Espectro vibracional na região do IV da substância 4.
250 500 nm
0
50
100
150
200
mAU
9.22/ 1.00
244
313
663
647
267
343
651
O
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OOH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.932
3.235
3.517
3.854
4.312
4.860
5.651
6.218
6.635
6.784
7.531
8.485
9.589
11.014
12.759
15.717
20.654
21.531
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
4’’’
250 500 nm
0
50
100
150
200
mAU
9.22/ 1.00
244
313
663
647
267
343
651
O
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OOH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.932
3.235
3.517
3.854
4.312
4.860
5.651
6.218
6.635
6.784
7.531
8.485
9.589
11.014
12.759
15.717
20.654
21.531
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
4’’’
(a)
(b)
Resultados e Discussão 77
O espectro de RMN de
1
H (Anexos 25 e 26) mostrou a presença de dois singletos em
δ
H
12,82 (unidade I) e δ
H
13,04 (unidade II), correspondentes a hidroxilas quelatadas que
estabelecem ligação de hidrogênio intramolecular com os oxigênios carbonílicos situados
em C-4 e C-4’’, respectivamente. Destaca-se a presença de dois dubletos em δ
H
7,34 (2H,
H-2’/6’, J=8,5 Hz) e δ
H
6,68 (2H, H-3’/5’, J=8,5 Hz) caracterizando a presença de um
padrão de substituição para-hidroxilado no anel B da unidade I. Sinais de um anel
aromático trissubstituído contendo dois carbonos oxigenados foram observados em δ
H
7,06
(d, H-2’’’, J=2,0 Hz), δ
H
6,75 (d, H-5’’’, J=8,5 Hz) e δ
H
7,10 (dd, H-6’’’, J=2,0 e 8,5 Hz)
caracterizando o anel B da unidade II, fato também confirmado pelo espectro de gCOSY
que mostrou a interação de H-2’’’ com H-6’’’, de H-5’’’ com H-6’’’ e de H-6’’’ com H-
2’’’ e H-5’’’ (Anexos 27 e 28). Os dubletos em
H
6,26 e 6,51 (J=2,0 Hz) correspondentes
a H-6 e H-8, respectivamente, demonstram a presença de apenas um par de hidrogênios em
acoplamento meta, o que sugere a ligação interflavonoídica entre C3 da unidade I e C8’’ da
unidade II. Esse espectro exibiu ainda um singleto em δ
H
6,26 (sobreposto ao dubleto em
δ
H
6,26 correspondente à H-6), atribuído ao hidrogênio H-6’’, e um singleto em δ
H
6,63
correspondente a H-3’’, ambos atribuídos à unidade II do esqueleto flavonoídico.
O experimento de gHMBC (Anexos 31 a 34) mostrou a interação a longa distância
de
H
6,26 (H-6’’) com
c
99,4 (C-8’’) e 104,5 (C-10’’) confirmando que a ligação
interflavonoídica ocorre em C-8’’. Também mostrou a interação de
H
6,63 (H-3’’) com
c
163,8; de
H
6,68 (H-3’/5’) com
c
122,9; de
H
6,75 (H-5’’’) com
c
122,0 e 146,0; de
H
7,06 (H-2’’’) com
c
149,8 e de
H
7,34 (H-2’/6’) com
c
129,2 e 159,9. Mostrou ainda
interações J2 e J3 entre
H
12,82 e 13,04 com C-5, C-6 e C-10 de ambas as unidades,
corroborando a proposta acima delineada (Tabela 4).
O experimento NOESY-1D (Anexo 36), com irradiação do singleto em
H
6,26, não
mostrou efeito NOE com os hidrogênios presentes na molécula, confirmando a atribuição
do respectivo sinal para H-6 e H-6’’. Pela análise do espectro de HOMODEC (Anexo 35)
não houve alteração na multiplicidade e/ou presença dos sinais de hidrogênios quando
ocorreu a eliminação do sinal em
H
6,63, confirmando a atribuição deste singleto a H-6’’.
A partir desses dados, a substância 4 foi caracterizada como saharanflavona, uma
biflavona ainda não encontrada como produto natural, sintetizada anteriormente a partir da
oxidação da morelloflavona (PELTER et al., 1971).
Resultados e Discussão 78
553.0872
-MS, 0.6min #13
0
100
200
300
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 29 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 4 obtido no modo negativo (ESI).
Tabela 4 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 4 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
-
*
-
-
3
-
*
-
-
4
-
*
-
-
5
-
161,4
-
-
6
6,26 (d; 2,0)
98,4
*
*
7
-
*
-
-
8
6,51 (d; 2,0)
93,9
*
*
9
-
*
-
-
10
-
103,1
-
-
1’
-
122,9
-
-
2’ 6’
7,34 (d; 8,5)
129,2
129,2; 159,9
H-3’
3’ 5’
6,68 (d; 8,5)
114,7
122,9
H-2’
4’
-
159,9
-
-
5-OH
12,82 (s)
-
98,4; 103,1; 161,4
-
2’’
-
163,8
-
-
3’’
6,63 (s)
102,3
163,8
-
4’’
-
*
-
-
5’’
-
161,0
-
-
6’’
6,26 (s)
98,4
99,4; 104,5
-
7’’
-
*
-
-
8’’
-
99,4
-
-
9’’
-
*
-
-
10’’
-
104,5
-
-
1’’’
-
122,0
-
-
2’’’
7,06 (d; 2,0)
112,8
149,8
H-6’’’
3’’’
-
149,8
-
-
4’’’
-
146,0
-
-
5’’’
6,75 (d; 8,5)
114,8
122,0; 146,0
H-6’’’
6’’’
7,10 (dd; 2,0 e 8,5)
118,3
*
H-2’’’; H-5’’’
5’’-OH
13,04 (s)
-
98,4; 161,0
-
*valores não observados
Os valores de RMN de
13
C foram atribuídos através das interações observadas nos experimentos gHMQC e gHMBC.
Resultados e Discussão 79
6.2.5 Caracterização espectrométrica da substância 5
A substância 5 foi isolada da subfração AcOEt-FOL-14, conforme procedimento
experimental em 5.5.
A substância 5 foi obtida como um sólido amarelo pálido amorfo com fórmula
molecular C
30
H
18
O
10
. O espectro no UV sugeriu a subclasse das flavonas, fato evidenciado
pelas bandas em 268 nm (banda II, anel A) e 333 nm (banda I, anéis B e C). A análise por
CLAE mostrou t
r
= 14,1 min para 5, sugerindo um esqueleto com menor polaridade que 4,
que apresentou t
r
= 9,6 min (Figura 31).
A análise do espectro de IV (Figura 31) mostrou uma banda vibracional larga
atribuída à hidroxila (
O-H
) em 3445 cm
-1
, bandas em 2920 e 2854 cm
-1
, referentes à
deformação axial C-H de aromáticos (
C-H
) e uma banda em 1690 cm
-1
referente à
carbonila conjugada da molécula (
C-O
). Apresentou ainda, uma banda em 1458 cm
-1
atribuída à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático e bandas referentes à
deformação angular no plano de C-H (
C-H
) entre 1062 e 1377 cm
-1
(SILVERSTEIN;
WEBSTER; KIEMLE, 1994).
No espectro de massas no modo negativo (ESI) obtido para essa substância (Figura
33) foi observado o íon m/z 537 [M-H]
-
que confirma a estrutura proposta.
Figura 30 - Estrutura da substância 5. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 5 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m)
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
6’
9
4
5’
3’
2’
8
4’
10
7
5
6
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
2’’’
10’’
9’’
8’’
7’’
6’’
5’’
4’’
3’’
2’’
3
2
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
6’
9
4
5’
3’
2’
8
4’
10
7
5
6
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
2’’’
10’’
9’’
8’’
7’’
6’’
5’’
4’’
3’’
2’’
3
2
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.655
2.942
3.223
3.869
4.340
4.924
5.051
5.287
5.878
6.278
7.269
8.021
10.514
11.631
14.122
18.743
21.255
23.186
24.436
37.224
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
mAU
14.11/ 1.00
295
245
514
198
268
333
(a)
(b)
Resultados e Discussão 80
O espectro de RMN
13
C mostrou sinais para dois carbonos com deslocamento
químico característico de carbonilas de flavonas (
c
181,7 e 180,4), sugerindo a presença
de um núcleo flavonoídico na forma dimérica (Anexos 39 a 41).
Figura 31 - Espectro vibracional na região do IV da substância 5.
537.1
-MS, 0.4min #9
0
2000
4000
6000
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 32 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 5 obtido no modo negativo (ESI).
Os quatro dubletos (J=9,0 Hz) no espectro de
1
H em
H
7,34; 6,66 e
H
7,54; 6,76,
cada um correspondendo a 2H, sugeriu a presença de um padrão de substituição para-
hidroxilado em ambos os anéis B. A análise dos dados de gCOSY e gHMBC permitiu sua
atribuição aos H-2’/H-6’; H-3’/H-5’ e H-2’’’/H-6’’’; H-3’’’/H-5’’’, das unidades I e II
respectivamente. O s dubletos em
H
6,23 e 6,49 (J=2,0 Hz) atribuídos a H-6 e H-8,
respectivamente, demonstraram a presença de apenas um par de hidrogênios em
acoplamento meta, sugerindo a ligação interflavonoídica entre C3 da unidade I e C8’’ da
unidade II (Anexos 37 e 38).
Os espectros de gHMQC permitiram estabelecer a correlação direta entre os
hidrogênios e seus respectivos carbonos (Anexos 44 a 47). O experimento de gHMBC
(Tabela 5) mostrou a interação a longa distância entre
H
7,34 (H-2’) e
c
163,3 (C-2)
mostrando e confirmando a atribuição dos sinais para o anel B; e ainda a interação de
H
6,21 (H-6’’) e
c
98,9 (C-8’’), confirmando a ligação interflavonoídica na posição C-8’’.
Resultados e Discussão 81
Mostrou também interações J2 e J3 entre
H
12,81 e 13,12 com as posições C-5, C-6 e C-
10 de ambas as unidades, corroborando a proposta apresentada (Anexos 48 a 53).
A partir dos resultados obtidos das análises espectroscópicas, concluiu-se que a
substância 5 é o biflavonóide I3, II8-biapigenina, cujos dados espectroscópicos estão de
acordo com os relatados na literatura (BERGHÖFER; HÖLZL, 1987). Esse biflavonóide
foi isolado dos frutos de Garcinia xanthochymus por Baggett et al. (2005).
Tabela 5 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 5 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
-
163,3
-
-
3
-
110,5
-
-
4
-
181,7
-
-
5
-
161,5
-
-
6
6,23 (d; 2,0)
99,2
93,7; 102,8
-
7
-
164,5
-
-
8
6,49 (d; 2,0)
93,7
99,2; 102,8; 157,3; 164,5
-
9
-
157,3
-
-
10
-
102,8
-
-
1’
-
122,9
-
-
2’ 6’
7,34 (d; 9,0)
129,6
129,6; 161,0; 163,3
H-3’
3’ 5’
6,66 (d; 9,0)
115,1
115,1; 122,9; 161,0
H-2’
4’
-
161,0
-
-
5-OH
12,81 (s)
-
99,2; 102,8; 161,5
-
2’’
-
163,4
-
-
3’’
6,70 (s)
102,7
103,8; 163,4
-
4’’
-
180,4
-
-
5’’
-
161,0
-
-
6’’
6,21 (s)
98,9
98,9
-
7’’
-
164,5
-
-
8’’
-
98,9
-
-
9’’
-
154,8
-
-
10’’
-
103,8
-
-
1’’’
-
121,1
-
-
2’’’ 6’’’
7,54 (d; 9,0)
127,9
127,9; 159,8; 163,4
H-3’’’
3’’’ 5’’’
6,76 (d; 9,0)
115,8
115,8; 121,1; 159,8
H-2’’’
4’’’
-
159,8
-
-
5’’-OH
13,12 (s)
-
98,9; 103,8; 161,0
-
6.2.6 Caracterização espectrométrica da substância 8
A substância 8 foi isolada da subfração AcOEt-FOL-15, conforme procedimento
experimental em 5.6.
Resultados e Discussão 82
A substância de fórmula C
30
H
20
O
11
foi obtida como cristais amarelos e apresentou
espectro de UV típico de flavona/flavanona, com a banda II em 289 nm e a banda I em 348
nm (Figura 33). A fórmula molecular de 8 foi obtida pelo espectro de massas no modo
negativo (ESI) que apresentou íon molecular em m/z 555 [M-H]
-
e um único fragmento em
m/z 429 [M-H]
-
, justificado pela perda do floroglucinol (126 u) como mostrado na Figura
35 e Figura 36.
O espectro de absorção na região do IV (Figura 34) apresentou bandas em 3733 e
3621 cm
-1
correspondentes à deformação axial da ligação O-H (
O-H
). O espectro também
exibiu uma banda em 2956 cm
-1
referente à deformação axial C-H de aromáticos (
C-H
),
uma banda em 1641 cm
-1
referente à carbonila conjugada da molécula (
C-O
), bandas em
1509 e 1364 cm
-1
atribuídas à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático, absorção
em 1263 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
) e ainda, uma banda em 821 cm
-1
relacionadas a deformações angulares fora do plano das ligações C-H (
C-H
) do anel
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
Figura 33 - Estrutura da substância 8. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 8 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
4000
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.261
2.491
2.823
3.058
3.221
3.857
4.401
4.927
5.153
5.965
6.436
7.519
8.201
9.091
10.139
11.531
14.637
16.409
17.462
20.576
21.553
25.011
30.520
40.327
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
11.54/ 1.00
245
319
644
211
289
346
656
O
OH
OOH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
4’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
4000
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.261
2.491
2.823
3.058
3.221
3.857
4.401
4.927
5.153
5.965
6.436
7.519
8.201
9.091
10.139
11.531
14.637
16.409
17.462
20.576
21.553
25.011
30.520
40.327
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
11.54/ 1.00
245
319
644
211
289
346
656
O
OH
OOH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
4’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
O
OH
OOH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
4’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
(a)
(b)
Resultados e Discussão 83
Figura 34 - Espectro vibracional na região do IV da substância 8.
555.1
-MS, 2.0min #39
429.1
-MS2(555.1), 5eV, 1.2min #24
0
200
400
600
800
Intens.
0
50
100
150
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 35 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 8, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 5% para EM2 (ESI).
Figura 36 - Proposta de fragmentação da substância 8.
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
-H
-H
m/z 429
m/z 555
(a)
(b)
Resultados e Discussão 84
O espectro de RMN de
1
H (Anexos 54 e 55) mostrou dois singletos largos em
H
13,05 e 12,24, provavelmente relacionados a hidrogênios de hidroxilas quelatadas, capaz
de estabelecer uma ligação de hidrogênio intramolecular com o oxigênio carbonílico em C-
4. Destacam-se os dubletos em
H
5,71 e 4,88 (J=12,0), atribuídos a H-2 e H-3,
respectivamente, evidenciando a subclasse das flavanonas.
O espectro de RMN de
1
H apresentou ainda, dois dubletos em
H
7,13 (J=8,5 Hz;
2H) e δ
H
6,38 (J=8,5 Hz; 2H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-2’/H-6’ e H-
3’/H-5’, respectivamente, para a unidade I. O multipleto em δ
H
7,41 foi atribuído aos
hidrogênios H-6’’’ e H-2’’’ e o dubleto δ
H
6,90 (J=8,5 Hz, 1H) foi atribuído ao hidrogênio
H-5’’’, para a unidade II. Este sistema foi confirmado por gHMBC através das correlações
entre o sinal
H
7,41 e
C
113,4 (C-2’’’), 119,6 (C-6’’’), 146,2 (C-3’’’), 150,0 (C-4’’’) e
164,0 (C-2’’). A correlação a longa distância também foi útil para designar a união inter-
flavonoídica tipo 38’’, através da correlação do sinal em
H
4,88 (H-3) com
C
161,8 (C-
7’’) e 155,8 (C-9’’). Também confirmou a posição dos anéis B pela correlação do sinal em
H
7,13 (H-2’) com
C
81,0 (C-2) e
H
7,41 (H-6’’’) com
C
164,0 (C-2’’) (Anexos 62 a
70).
Observou-se um singleto intenso em δ
H
5,97 atribuído a H-6 e H-8, um singleto em
δ
H
6,23 correspondente ao H-6’’ e um singleto em δ
H
6,56 associado ao H-3’’. Através de
todos os dados espectroscópicos e comparação com dados da literatura (LI, 2002), pode-se
definir a substância 8 como morelloflavona.
Este composto foi isolado de várias espécies de Garcinia (KONOSHIMA et al.,
1969, 1970; MBWAMBO et al., 2006; VERDI et al., 2004) e a caracterização estrutural e
análise conformacional proposta por Li et al. (2002) evidencia o efeito atropisomérico da
morelloflavona, como discutido no item 1.4.1. No espectro de RMN
1
H da morelloflavona
os sinais principais são acompanhados por sinais de menor intensidade, fato explicado pela
restrição na rotação C-3C-8’’, confirmando a interligação das unidades flavonoídicas
através desses carbonos. As estruturas mais estáveis são definidas a partir da correlação
espacial (NOESY-1D) entre H-3 e H-6’’’ do confôrmero principal, e entre H-2 e H-6’’’ do
confôrmero minoritário, e mostra claramente que o confôrmero majoritário (8a) possui a
unidade da flavona AIICIIBII estendida sob o plano dos anéis AICI da unidade da
flavanona. O confôrmero minoritário (8b) apresenta os anéis AIICIIBII abaixo do plano
dos anéis AICI da unidade da flavanona (Figura 38).
Resultados e Discussão 85
Os dados de RMN
1
H do confôrmero principal e minoritário estão apresentados na
Tabela 6. Para o confôrmero minoritário foram listados apenas os dados de RMN
1
H, pois
os sinais de carbonos foram de baixa intensidade.
A substância 8 apresentou
T
D
= +170,8 (c=1,0 mg.mL
-1
) em MeOH. A análise da
curva de dicroísmo circular indicou efeito Cotton positivo para as transições n* e
* em 345 e 285, respectivamente (Figura 37). Um efeito Cotton positivo sobre 285
nm para compostos semelhantes a 8, indica uma configuração absoluta 2R (LI et al., 2002).
Assim, fazendo uso da estereoquímica relativa inferida a partir do experimento de RMN,
no qual os hidrogênios H-2 e H-3 apresentaram configuração trans (J
2,3
= 12,0 Hz), pode-se
concluir que a substância 8 apresenta configuração absoluta de 2R, 3S.
-4
0
5
CD [mdeg]
250 300 350 400
Wavelength [nm]
-4
0
5
CD [mdeg]
250 300 350 400
Wavelength [nm]
Figura 37 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 8.
Figura 38 - Estruturas do confôrmero principal (8a) e minoritário (8b) da morelloflavona.
AI
CI
BI
AII
BII
CII
AI
CI
BI
AII
BII
CII
2,6 A°
2,5 A°
Resultados e Discussão 86
Tabela 6 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 8 (DMSO-d
6
).
Posição
δ
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
(8a) (8b)
δ
c
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
5,71 (d; 12,0) 5,58 (d; 12,0)
81,0
128,7
H-3
3
4,88 (d; 12,0) 4,98 (d; 12,0)
48,8
81,0; 101,1; 128,7;
155,8; 161,8; 196,0
H-2
4
- -
196,0
-
-
5
- -
164,0
-
-
6
5,97 (s) 5,97 (s)
96,0
101,1; 163,5
*
7
- -
163,5
-
-
8
5,97 (s) 5,97 (s)
96,2
101,1; 163,5; 166,6
*
9
- -
166,6
-
-
10
- -
101,1
-
-
1’
- -
128,7
-
-
2’ 6’
7,13 (d; 8,5) 7,08 (d; 8,5)
128,8
81,0; 128,8; 158,0
H-3’
3’ 5’
6,38 (d; 8,5) 6,60 (d; 8,5)
114,6
114,6; 128,7; 158,0
H-2’
4’
- -
158,0
-
-
5-OH
12,24 (s) 12,19 (s)
-
96,0; 101,1; 164,0
-
2’’
- -
164,0
-
-
3’’
6,56 (s) 6,61 (s)
102,2
103,6; 121,8; 164,0;
182,0
-
4’’
- -
182,0
-
-
5’’
- -
161,0
-
-
6’’
6,23 (s) 6,06 (s)
99,0
100,7; 103,6; 161,8
-
7’’
- -
161,8
-
-
8’’
- -
100,7
-
-
9’’
- -
155,8
-
-
10’’
- -
103,6
-
-
1’’’
- -
121,8
-
-
2’’’
7,41 (m) 7,24 (m)
113,4
119,6; 146,2; 150,0
H-6’’’
3’’’
- -
146,2
-
-
4’’’
- -
150,0
-
-
5’’’
6,90 (d; 8,5) 6,50 (d; 8,5)
116,2
121,8; 146,2
H-6’’’
6’’’
7,41 (m) 6,96 (m)
119,6
113,4; 150,0; 164,0
H-2’’’; H-5’’’
5’’-OH
13,05 (s) 12,89 (s)
-
99,0; 103,6; 161,0
-
(8a) representa o confôrmero principal e a série (8b) o confôrmero minoritário.
*valores não observados
Os valores de RMN de
13
C foram atribuídos através das interações observadas nos experimentos gHMQC e gHMBC.
Resultados e Discussão 87
6.2.7 Caracterização espectrométrica da substância 9
Figura 39 - Estrutura da substância 9. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 9 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
A substância 9 foi isolada da subfração AcOEt-FOL-16, conforme procedimento
experimental em 5.6.
Os resultados observados no espectro de RMN de
13
C e
1
H, UV, IV e massas
permitiram caracterizar 9 como sendo uma substância pertencente à classe dos
biflavonóides tipo flavona-flavona.
O composto de estrutura C
30
H
18
0
10
apresentou-se como um sólido amarelo amorfo e
apresentou bandas de absorção no UV características de flavonas (268 e 337 nm). A
fórmula molecular foi obtida pelo espectro de massas no modo negativo (ESI) que
apresentou o pico íon molecular em m/z 537 [M-H]
-
(Figura 41). O tempo de retenção da
substância 9 foi de t
r
=33,4 min (Figura 39) mostrando que, sob mesmas condições de
análise, uma mudança de posição da ligação inter-flavonoídica, faz com que a molécula
apresente propriedades como polaridade bastante diferenciadas. A união entre as unidades
I e II do flavonóide em 9 é do tipo 3’8’’ e para 5, ocorre tipo 38’’. Essa diferença na
posição das ligações de união das unidades (isomeria de posição) faz com que 9 apresente
uma polaridade significativamente menor que 5 (t
r
=14,1 min).
O espectro de absorção na região do IV (Figura 40) mostrou uma banda larga em
3490 cm
-1
correspondente à deformação axial da ligação O-H (
O-H
), evidenciando a
presença de hidroxila, uma banda em 2970 cm
-1
referente à deformação axial C-H de
aromáticos (
C-H
), uma banda em 1648 cm
-1
referente à carbonila conjugada da molécula
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.880
3.233
3.876
4.370
4.657
4.902
5.099
6.301
7.268
9.866
33.455
250 500 nm
0
100
200
300
400
500
600
700
mAU
33.40/ 1.00
248
289
485
655
337
268
582
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
2’’’
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
3’’
4’’
2’’
10’’
5
,,
6’’
7’’
8’’
8
7
6
5
4
10
3
2
6’
2’
3’
4’
5’
9’’
9
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.880
3.233
3.876
4.370
4.657
4.902
5.099
6.301
7.268
9.866
33.455
250 500 nm
0
100
200
300
400
500
600
700
mAU
33.40/ 1.00
248
289
485
655
337
268
582
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
2’’’
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
3’’
4’’
2’’
10’’
5
,,
6’’
7’’
8’’
8
7
6
5
4
10
3
2
6’
2’
3’
4’
5’
9’’
9
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
2’’’
6’’’
5’’’
4’’’
3’’’
3’’
4’’
2’’
10’’
5
,,
6’’
7’’
8’’
8
7
6
5
4
10
3
2
6’
2’
3’
4’
5’
9’’
9
(a)
(b)
Resultados e Discussão 88
(
C-O
), bandas em 1485 cm
-1
atribuída à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático
e ainda, bandas referentes à deformação angular no plano de C-H (
C-H
) em 1062 cm
-1
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
Figura 40 - Espectro vibracional na região do IV da substância 9.
537.1
-MS, 3.0min #58
0
1000
2000
3000
4000
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 41 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 9 obtido no modo negativo (ESI).
No espectro de RMN de
13
C (Anexos 74 a 76) destacaram-se os sinais em δ
C
163,9 e
δ
C
102,4 atribuídos a C-2 e C-3, respectivamente, evidenciando a subclasse das flavonas e
os sinais em δ
C
181,9 e δ
C
181,6 correspondentes aos carbonos carbonílicos C-4 e C-4’’
das unidades I e II (Tabela 7).
O espectro de RMN de
1
H (Anexos 71 a 73) mostrou a presença de dois singletos em
δ
H
12,98 (unidade II) e δ
H
13,10 (unidade I), correspondentes a hidroxilas quelatadas com
ligação de hidrogênio intramolecular com o oxigênio carbonílico situado em C-4 e C-4’’.
Destaca-se a presença de dois dubletos em δ
H
7,58 (2H, H-2’’’/6’’’, J=9,0 Hz) e δ
H
6,66
(2H, H-3’’’/5’’’, J=9,0 Hz) correspondentes à unidade II. Sinais de um anel aromático
trissubstituído contendo um carbono carbinólico foram observados em δ
H
8,05 (d, H-2’,
J=2,0 Hz), δ
H
7,06 (d, H-5’, J=9,0 Hz) e δ
H
7,96 (dd, H-6’, J=2,0; 9,0 Hz), juntamente com
Resultados e Discussão 89
os dubletos de um anel aromático tetrassubstituído em δ
H
6,16 (d, H-6, J=2,0 Hz) e δ
H
6,40
(d, H-8, J=2,0 Hz).
Tabela 7 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 9 (DMSO-d
6
).
Posição
δ
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
δ
c
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
-
163,9
-
-
3
6,74 (s)
102,4
103,6; 163,9
-
4
-
181,9
-
-
5
-
161,3
-
-
6
6,16 (d; 2,0)
98,7
93,9; 103,6; 161,3; 165,2
-
7
-
165,2
-
-
8
6,40 (d; 2,0)
93,9
98,7; 103,6; 157,3; 165,2
-
9
-
157,3
-
-
10
-
103,6
-
-
1’
-
121,4
-
-
2’
8,05 (d; 2,0)
131,3
104,1; 127,4; 161,8
H-6’
3’
-
120,1
-
-
4’
-
161,8
-
-
5’
7,06 (d; 9,0)
116,9
120,1
H-6’
6’
7,96 (dd; 2,0 e 9,0)
127,4
131,3; 161,8; 163,9
H-2’; H-5’;
5-OH
13,10 (s)
-
98,7; 103,6; 161,3
-
2’’
-
163,4
-
-
3’’
6,79 (s)
102,6
102,4; 121,4; 163,4
-
4’’
-
181,6
-
-
5’’
-
160,4
-
-
6’’
6,28 (s)
99,4
104,1
-
7’’
-
*
-
-
8’’
-
104,1
-
-
9’’
-
*
-
-
10’’
-
102,4
-
-
1’’’
-
121,4
-
-
2’’’ 6’’’
7,58 (d; 9,0)
128,1
128,1; 160,8; 163,4
H-3’’’
3’’’ 5’’’
6,66 (d; 9,0)
115,6
121,4; 160,8
H-2’’’
4’’’
-
160,8
-
-
5’’-OH
12,98 (s)
-
99,4; 102,4; 160,4
-
*valores não observados
A correlação a longa distância (Anexos 82 a 85) foi útil para designar a união inter-
flavonoídica, tipo 3’8’’, através da correlação de
H
8,05 (H-2’) com
C
104,1 (C-8’’),
assim como o experimento de gCOSY (Anexos 77 e 78) que mostrou interação entre
H
8,05 (H-2’) e com
H
7,96 (H-6’); de
H
7,06 (H-5’) e
H
7,96 (H-6’) e de
H
7,96 (H-6’)
com
H
8,05 (H-2’) e
H
7,06 (H-5’).
Resultados e Discussão 90
A análise destas informações em conjunto com os dados da literatura (CARBONEZI
et al., 2007), permitiu identificar a substância 9 como amentoflavona, um biflavonóide já
isolado dos frutos de Garcinia xanthochymus por Baggett et al. (2005).
6.2.8 Caracterização espectrométrica da substância 10
Figura 42 - Estrutura da substância 10. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 10 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
A substância 10 foi isolada da subfração AcOEt-SIL-3, conforme procedimento
experimental em 5.7.
A substância 10 obtida como pó amorfo de coloração amarelada apresentou fórmula
molecular de C
15
H
12
O
6
correspondendo ao íon m/z 287 [M-H]
-
. Além do pico íon
molecular m/z 287 [M-H]
-
, a substância 10 apresentou pico íon base de m/z 259,
correspondendo à perda de CO [M-H-28]
-
e m/z 243, correspondendo à perda de CO
2
[M-
H-44]
-
(Figura 44 e Figura 45).
O espectro de UV apresentou uma única banda em 290 nm, podendo ser atribuída a
uma flavanona ou diidroflavonol (Figura 42).
O espectro de absorção na região do IV de 10 apresentou bandas em 3733 e 3616 cm
-
1
referentes à deformação axial da ligação O-H (
O-H
), uma banda em 2995 cm
-1
referente à
deformação axial C-H de aromáticos (
C-H
), uma banda em 1678 cm
-1
referente à carbonila
da molécula (
C-O
) e bandas em 1631, 1509 e 1456 cm
-1
atribuídas à deformação axial de
C-C (
C-C
) do anel aromático (Figura 43). Exibiu ainda, bandas com absorção em 1160 e
1083 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
) e uma banda em 821 cm
-1
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.446
6.150
7.314
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
5.99/ 1.00
207
249
409
510
657
200
212
290
411
649
O
O
OH
OH
OH
OH
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.446
6.150
7.314
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
5.99/ 1.00
207
249
409
510
657
200
212
290
411
649
O
O
OH
OH
OH
OH
(a)
(b)
Resultados e Discussão 91
relacionada à deformação angular fora do plano das ligações C-H (
C-H
) do anel
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
Figura 43 - Espectro vibracional na região do IV da substância 10.
287.1
-MS, 4.4min #85
259.1
243.1
-MS2(287.1), 10eV, 5.2min #99
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intens.
0
200
400
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 44 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 10, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI).
Os espectros de RMN de
1
H e
13
C, juntamente com os dados acima, permitiram
inferir que a substância 10 pertence à subclasse dos diidroflavonol ou flavanonol.
O espectro de RMN
1
H (Anexos 86 e 87) apresentou um par de dubletos em
H
5,84 e
5,90, sugerindo um anel A 5, 7, 9, 10-tetrassubstituído e 5, 7, 9-trioxigenado. Os sinais
integrando para 2H em
H
7,30 e 6,77 podem ser atribuídos aos hidrogênios H-2’/6’ e H-
3’/5’, sugerindo padrão de substituição 1,4-dissubstituído para o anel B. O espectro ainda
(a)
(b)
Resultados e Discussão 92
mostrou dois dubletos em
H
5,03 (H-2, J=11,5 Hz) e 4,51 (H-3, J=11,5 Hz), sugerindo um
acoplamento do tipo axial-axial e a proposta de que o anel B e o grupo hidroxila em C-3
mantêm uma relação anti.
Entre outras feições, o espectro de gHMQC (Anexos 91 e 92) mostrou a correlação
entre o sinal em
H
5,03 e
C
82,0; e entre o sinal
H
4,51 e
C
71,0, associados aos C e H
nas posições 2 e 3, respectivamente, confirmando a proposta estrutural de um
diidroflavonol.
O espectro de gHMBC (Anexos 93 a 96) corrobora a proposição estrutural à medida
que revela importantes acoplamentos a longa distância, entre eles, o acoplamento existente
entre o hidrogênio H-2 (
H
5,03) e os carbonos C-3, C-1’, C-2’/6’ e C-4; entre H-3 (
H
4,51) e C-2; entre H-2’/6’ (
H
7,30) e C-2 e C-4’ e entre H-3’/5’ (
H
6,77) e os carbonos C-
1’ e C-4’ (Tabela 8).
A substância 10 apresentou
T
D
= +70,5 (c=1,0 mg.mL
-1
) em MeOH. A análise da
curva de dicroísmo circular indicou efeito Cotton negativo para as transições * em
aproximadamente 290 nm e efeito Cotton positivo para as transições n* em 330 nm.
(Figura 46). Assim, a partir de dados de DC da literatura para os estereoisômeros do
diidrokaempferol (LI et al., 2002) foi possível identificar a substância 10 como (2R,3R)-
diidrokaempferol, um diidroflavonol ainda não identificado na espécie G. xanthochymus.
Figura 45 - Proposta de fragmentação da substância 10.
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
-CO
OH
OH
OH
OH
-CO
2
-H
-H
-H
m/z 287
m/z 243
m/z 259
Resultados e Discussão 93
-6
10
0
5
CD [mdeg]
-6
250 300 350 400
Wavelength [nm]
-6
10
0
5
CD [mdeg]
-6
250 300 350 400
Wavelength [nm]
Figura 46 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 10.
Tabela 8 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 10 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
5,03 (d; 11,5)
82,0
71,0; 127,4; 129,0; 197,0
H-3
3
4,51 (d; 11,5)
71,0
82,0
H-2
4
-
197,0
-
-
5
-
162,0
-
-
6
5,84 (d; 2,0)
94,0
96,3; 100,2; 162,0; 167,0
-
7
-
167,0
-
-
8
5,90 (d; 2,0)
96,3
94,0; 100,2; 163,0; 167,0
-
9
-
163,0
-
-
10
-
100,2
-
-
1’
-
127,4
-
-
2’ 6’
7,30 (d; 8,0)
129,0
82,0; 129,0; 158,1
H-3’
3’ 5’
6,77 (d; 8,0)
115,0
115,0; 127,4; 158,1
H-2’
4’
-
158,1
-
-
5-OH
11,96 (s)
-
*
-
* valores não observados
Os valores de RMN de
13
C foram atribuídos através das interações observadas nos experimentos gHMQC e gHMBC.
6.2.9 Caracterização espectrométrica da substância 11
A substância 11 foi isolada da subfração AcOEt-SIL-4, conforme procedimento
experimental em 5.8.
A substância 11 obtida como cristais amarelos apresentou espectro de UV típico de
flavanonas, com uma única banda em 291 nm (Figura 47).
O espectro de absorção na região do IV de 11 (Figura 48) foi bastante similar ao
espectro de 8, com bandas correspondentes à deformação axial da ligação O-H (
O-H
) em
3733 e 3621 cm
-1
. Também exibiu uma banda em 2954 cm
-1
referente à deformação axial
C-H de aromáticos (
C-H
), uma banda em 1626 cm
-1
referente à carbonila da molécula (
C-
Resultados e Discussão 94
O
), uma banda em 1515 cm
-1
atribuída à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático,
bandas com absorção em 1160 e 1078 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
) e
ainda, uma banda em 811 cm
-1
relacionada à deformação angular fora do plano das
ligações C-H (
C-H
) do anel (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994; JACKSON et
al., 1966).
A fórmula molecular de C
30
H
22
0
11
foi obtida a partir do íon molecular m/z 557 [M-
H]
-
, através do espectro de massa obtido no modo negativo e ionização por ESI. O padrão
de fragmentação de 11 (Figura 49 e Figura 50) sugeriu sua natureza dimérica, através do
íon em m/z 431 [M-H]
-
, referente à perda de floroglucinol (126 u) e o íon em m/z 295 [M-
H]
-
, referente à perda de 136 u por um mecanismo via Retro-Diels-Alder (RDA).
Figura 47 - Estrutura da substância 11. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 11 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
Figura 48 - Espectro vibracional na região do IV da substância 11.
O
OH
OOH
OH
O
OOH
OH
OH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
7.292
7.859
9.612
11.005
12.801
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
mAU
9.46/ 1.00
250
453
582
198
291
480
655
4’’
5’’
6’’
8’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
4’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
7’’
O
OH
OOH
OH
O
OOH
OH
OH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
7.292
7.859
9.612
11.005
12.801
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
mAU
9.46/ 1.00
250
453
582
198
291
480
655
O
OH
OOH
OH
O
OOH
OH
OH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
7.292
7.859
9.612
11.005
12.801
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
mAU
9.46/ 1.00
250
453
582
198
291
480
655
4’’
5’’
6’’
8’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
4’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
7’’
(a)
(b)
Resultados e Discussão 95
431.1
557.1
-MS, 1.4min #28
295.0
431.1
-MS2(557.1), 15eV, 1.3min #26
0
200
400
600
800
Intens.
0
25
50
75
100
125
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 49 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 11, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
Figura 50 - Proposta de fragmentação da substância 11.
A substância 11 também apresentou duplicação dos sinais no espectro de RMN à
temperatura ambiente, devido ao efeito de atropoisomerismo, evidenciando uma ligação
tipo C3C8’’ para o biflavonóide proposto (Anexos 97 a 99).
(a)
(b)
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
m/z 557
m/z 431
m/z 295
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
m/z 557
m/z 431
m/z 295
Resultados e Discussão 96
Devido à complexidade dos espectros, principalmente nas regiões de atribuições
aromáticas entre
H
5,30 a 7,12, realizou-se um experimento dinâmico de RMN de
1
H a
25°C, 45°C, 65°C e 90°C. Observou-se, que em 45°C os sinais duplos coalesceram (pico
único alargado), a 65°C começaram a desaparecer os sinais do confôrmero minoritário e
por último a 90°C, houve a predominância do confôrmero principal. O aquecimento
acelerou a velocidade de interconversão, fazendo com que a barreira energética fosse
superada mais facilmente e assim, favorecesse a formação exclusiva do confôrmero mais
estável (Figura 51).
Tabela 9 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 11 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
11a (25°C) 11b (25°C) 11a (90°C)
C
(ppm)
(25°C)
gHMBC
(25°C)
2
5,71 (d; 12,0)
5,44 (m)
5,70 (d; 12,0)
81,4
129,0
3
4,55 (d; 12,0)
4,68 (d; 12,0)
4,58 (d; 12,0)
47,3
81,4; 101,3; 160,7; 164,4; 196,6
4
-
-
-
196,6
-
5
-
-
-
163,8
-
6
5,90 (s)
5,90 (s)
5,90 (s)
96,1
95,0; 101,2; 162,8
7
-
-
-
162,8
-
8
5,90 (s)
5,90 (s)
5,90 (s)
95,0
96,1; 101,2; 166,4
9
-
-
-
166,4
-
10
-
-
-
101,2
-
1’
-
-
-
129,8
-
2’ 6’
7,12 (m)
7,12 (m)
7,09 (d; 8,8)
129,0
81,4; 129,0; 157,7
3’ 5’
6,59-6,87 (m)
6,59-6,87 (m)
6,63 (d; 8,8)
114,8
*
4’
-
-
-
157,7
-
5-OH
12,16 (s)
12,18 (s)
12,17 (s)
-
96,1; 101,2; 163,8
2’’
5,44 (m)
5,30 (d; 12,0)
5,35 (dd; 2,8 e 12,8)
78,5
129,0
3’’
2,67 (m)
2,67 (m)
2,64 (dd; 2,8 e 17,2)
43,2
78,5; 196,1
2,93 (m)
2,93 (m)
3,01 (dd; 12,8 e 17,2)
78,5; 196,1
4’’
-
-
-
196,1
-
5’’
-
-
-
162,0
-
6’’
5,86 (s)
5,86 (s)
95,0
101,1; 101,3; 162,0
7’’
-
-
-
164,4
-
8’’
-
-
-
101,3
-
9’’
-
-
-
160,7
-
10’’
-
-
-
101,1
-
1’’’
-
-
-
129,0
-
2’’’
6,59-6,87 (m)
6,59-6,87 (m)
6,84 (d; 1,6)
113,5
*
3’’’
-
-
-
145,3
-
4’’’
-
-
-
145,7
-
5’’’
6,59-6,87 (m)
6,59-6,87 (m)
6,72 (d; 8,8)
115,3
*
6’’’
7,12 (m)
7,12 (m)
7,11 (dd; 1,6 e 8,8)
117,5
129,0
5’’-OH
12,13 (s)
12,05 (s)
12,09 (s)
-
95,0; 101,1; 162,0
(11a) representa o confôrmero principal e a série (11b) o confôrmero minoritário.
* sinais sobrepostos
Com o desaparecimento das linhas espectrais duplicadas, os sinais espectrais foram
atribuídos inequivocamente para a substância 11, de maneira consistente com esqueleto
Resultados e Discussão 97
carbônico descrito acima. Os sinais de RMN
1
H do confôrmero principal foram listados na
Tabela 9, assim como dados do experimento de RMN
13
C (Anexos 100 a 104) e gHMBC
(Anexos 116 a 125). Para o confôrmero minoritário, só foram descritos os sinais de RMN
1
H, pois os sinais de RMN
13
C foram de baixa intensidade.
O espectro de RMN
1
H a 90°C mostrou dois singletos referentes a hidrogênios de
hidroxilas quelatadas bastante desprotegidos em
H
12,09 e 12,17, capaz de estabelecer
uma ligação intramolecular com o oxigênio carbonílico em C-4. O espectro mostrou ainda
um sinal em
H
7,09 (2H, d, J=8,8 Hz, H-2’/6’) e um sinal em
H
6,63 (2H, d, J=8,8 Hz, H-
sinal 3’/5’), correspondendo à unidade I e
H
7,11 (1H, dd, J=8,8 Hz, H-6’’’),
H
6,72 (1H,
d, J=8,8 Hz, H-5’’’) e
H
6,84 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2’’’), correspondendo à unidade II.
Baseando-se nos espectros de gCOSY (Anexos 108 a 111), gHMQC (Anexos 112 a
115) e DEPT (Anexos 105 a 107), dois dubletos em
H
5,70 e 4,58 com constante igual a
J=12,0 Hz foram atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-3, respectivamente. Os sinais em
H
2,64 (dd, J=17,2 e 2,8) e 3,01 (dd, J=17,2 e 12,8) foram atribuídos ao carbono metilênico
em
C
43,2 (C-3’’), evidenciando a presença de hidrogênios geminais no anel B da unidade
II da flavanona.
A correlação a longa distância foi útil para designar a união inter-flavonoídica, tipo
38’’, através da correlação do sinal em
H
4,58 (H-3) e
C
101,3 (C-8’’); 160,7 (C-9’’) e
164,4 (C-7’’). Também mostrou importantes correlações entre o sinal em
H
4,58 (H-3)
com
C
81,4 (C-2) e 196,6 (C-4) e entre
H
2,64 e 3,01 e
C
78,5 (C-2’’) e 196,1 (C-4’’),
confirmando a proposta do esqueleto flavanoídico.
A substância 11 apresentou
T
D
= +7,8 (c=1,0 mg.mL
-1
) em MeOH.
A partir dos experimentos espectrométricos, analisados em conjunto com os dados da
literatura (COMPAGNONE, et al., 2008; KONOSHIMA et al., 1970), pode-se inferir que
a substância 11 é o biflavonóide GB2a, uma biflavanona isolada dos frutos de G.
xanthochymus por Konoshima et al. em 1970.
Resultados e Discussão 98
Figura 51 - Experimento de RMN
1
H com temperatura variável da substância 11.
6.2.10 Caracterização espectrométrica da substância 12
A substância 12 foi isolada da subfração AcOEt-SIL-4, conforme procedimento
experimental em 5.8.
A substância 12 obtida como cristais amarelos apresentou fórmula molecular de
C
30
H
20
O
10
, obtida pelo espectro de massas no modo negativo (ESI), no qual apresentou íon
molecular em m/z 539 [M-H]
-
e um único fragmento em m/z 413 [M-H]
-
, justificado pela
perda do floroglucinol (126 u), como mostrado nas Figura 54 e Figura 55.
O espectro de absorção no UV apresentou bandas em 289 nm e 330 nm,
características da subclasse flavona/flavanona. Pode-se notar também, um deslocamento
hipsocrômico da banda I de 12 (330 nm) em relação à banda I de 8 (348 nm), sugerindo
menor grau de oxigenação em 12 nos anéis B ou C (Figura 52).
O espectro de absorção na região do IV (Figura 53) mostrou bandas correspondentes
à deformação axial da ligação O-H (
O-H
) em 3733, 3592 e 3621 cm
-1
. O espectro também
exibiu uma banda em 2927 cm
-1
referente à deformação axial C-H de aromáticos (
C-H
),
uma banda em 1645 cm
-1
referente à carbonila conjugada da molécula (
C-O
), bandas em
25°C
90°C
65°C
45°C
Resultados e Discussão 99
1509 e 1452 cm
-1
atribuídas à deformação axial de C-C (
C-C
) do anel aromático, absorção
em 1170 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
) e ainda, uma banda em 816 cm
-1
relacionadas a deformações angulares fora do plano das ligações C-H (
C-H
) do anel
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
O espectro de RMN
1
H de 12 (Anexos 126 e 127) apresentou igual complexidade de
8 e 11, fenômeno caracterizado pela união interflavonoídica tipo C3C-8’’
(atropoisomerismo). No entanto, a substância 12 apresentou padrão de substituição para-
hidroxilado em ambos os anéis B, com um sinal em
H
7,11 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2’/6’) e
um sinal em
H
6,36 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3’/5’), correspondendo à unidade I e sinais em
H
7,92 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2’’’/6’’’) e
H
6,94 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3’’’/5’’’), associados à
unidade II. Mostrou ainda, dois dubletos em
H
5,67 e 4,97 com constante de acoplamento
de J=12,0 Hz, atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-3, evidenciando a subclasse das
flavanonas.
O espectro de RMN
13
C (Anexos 128 a 131) mostrou sinais para dois carbonos com
deslocamento químico característico de carbonilas de flavona (
c
181,6) e flavanona (
c
196,3), como também apresentou sinais em
c
47,3 e 80,8, confirmando o esqueleto
flavanoídico proposto para a unidade I.
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
4’’’
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.271
16.960
250 500 nm
0
25
50
75
mAU
17.08/ 1.00
209
247
460
487
198
212
289
655
464
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
4’’’
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
4’’
5’’
6’’
8’’
7’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
4’’’
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.271
16.960
250 500 nm
0
25
50
75
mAU
17.08/ 1.00
209
247
460
487
198
212
289
655
464
Figura 52 - Estrutura da substância 12. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 12 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
(a)
(b)
Resultados e Discussão 100
Figura 53 - Espectro vibracional na região do IV da substância 12.
O experimento de gHMBC (Anexos 141 a 146) foi útil para estabelecer a posição da
ligação dimérica, através da correlação entre H-3 (
H
4,97) com C-8’’(
c
100,7)
comprovando que a união das unidades ocorre tipo 38’’. Também mostrou interação
entre
H
13,01 com
c
95,1; 101,5 e 163,6 e
H
12,32 com
c
98,6; 103,0 e 160,5, sugerindo
a presença de um núcleo flavonoídico na forma dimérica, oxigenado nas posições C-5 e C-
5’’ em ambas as unidades (Tabela 10).
A substância 12 apresentou
T
D
= +157,2 (c=1,0 mg.mL
-1
) em MeOH. A análise da
curva de dicroísmo circular (Figura 56) mostrou semelhante efeito Cotton que 8 (positivo
para as transições n* e * em 345 e 285 nm, respectivamente), chegando a
conclusão de uma configuração absoluta de 2R, 3S para 12.
Diante de todos esses dados e comparação com os existentes na literatura (HERBIN
et al., 2007) pode-se identificar a substância 12 como (2R, 3S)-volkensiflavona, isolada de
várias espécies de Garcinia (HERBIN et al., 1970; Konoshima et al., 1970; PELTER et al.,
1971; VERDI et al., 2004).
Resultados e Discussão 101
539.1
-MS, 5.0min #95
413.1
-MS2(539.1), 20eV, 6.1min #116
0
100
200
300
400
Intens.
0
20
40
60
80
100
120
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 54 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 12, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI).
Figura 55 - Proposta de fragmentação da substância 12.
-2
1
-1
0
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
-2
1
-1
0
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
Figura 56 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 12.
(a)
(b)
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
m/z 539
m/z 413
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
m/z 539
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
m/z 539
m/z 413
Resultados e Discussão 102
Tabela 10 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 12 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
(12a) (12b)
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
2
5,67 (d; 12,0)
5,55 (d; 12,0)
80,8
128,4
H-3
3
4,97 (d; 12,0)
4,99 (d; 12,0)
47,3
80,8; 100,7; 196,3
H-2
4
-
-
196,3
-
-
5
-
-
163,6
-
-
6
5,96 (s)
5,96 (s)
95,1
101,5; 166,4
-
7
-
-
166,4
-
-
8
5,96 (s)
5,96 (s)
96,0
163,7
-
9
-
-
163,7
-
-
10
-
-
101,5
-
-
1’
-
-
128,4
-
-
2’ 6’
7,11 (d; 8,5)
7,10 (d; 8,5)
128,7
80,8; 128,7; 157,2
H-3’
3’ 5’
6,36 (d; 8,5)
6,60 (d; 8,5)
114,3
114,3; 128,4
H-2’
4’
-
-
157,2
-
-
5-OH
13,01 (s)
12,97 (s)
-
95,1; 101,5; 163,6
-
2’’
-
-
163,9
-
-
3’’
6,64 (s)
6,77 (s)
102,2
103,0; 121,1; 163,9
-
4’’
-
-
181,6
-
-
5’’
-
-
160,5
-
-
6’’
6,22 (s)
6,05 (s)
98,6
100,7; 103,0; 160,9
-
7’’
-
-
160,9
-
-
8’’
-
-
100,7
-
-
9’’
-
-
157,5
-
-
10’’
-
-
103,0
-
-
1’’’
-
-
121,1
-
-
2’’’ 6’’’
7,92 (d; 8,5)
7,61 (d; 8,5)
128,8
128,8; 161,1; 163,9
H-3’’’
3’’’ 5’’’
6,94 (d; 8,5)
6,61 (d; 8,5)
115,9
121,1
H-2’’’
4’’’
-
-
161,1
-
-
5’’-OH
12,32 (s)
12,28 (s)
-
98,6; 103,0; 160,5
-
(12a) representa o confôrmero principal e a série (12b) o confôrmero minoritário.
6.2.11 Caracterização espectrométrica da substância 13
Figura 57 - Estrutura da substância 13. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 13 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
(a)
(b)
O
OH
O
OH
8
7
5
4
3
1
2
6
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.490
3.267
3.827
4.055
4.332
4.530
5.227
6.125
13.396
200 300 400 500 600 700 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
mAU
4.55/ 1.00
198
211
280
235
420
204
218
260
291
618
O
OH
O
OH
8
7
5
4
3
1
2
6
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.490
3.267
3.827
4.055
4.332
4.530
5.227
6.125
13.396
200 300 400 500 600 700 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
mAU
4.55/ 1.00
198
211
280
235
420
204
218
260
291
618
Resultados e Discussão 103
A substância 13 foi isolada da subfração AcOEt-SIL-5, conforme procedimento
experimental em 5.8.
A substância 13 apresentou bandas em 260 e 291 nm (Figura 57), evidenciando a
presença de derivados do ácido protocatecuico (AO et al., 2009).
Os grupos funcionais presentes na estrutura da substância 13 foram caracterizados
pelas freqüências das bandas observadas no espectro de absorção na região do IV (Figura
58). O espectro mostrou uma banda em 3476 cm
-1
, característica da deformação axial da
ligação O-H (
O-H
), uma banda em 1666 cm
-1
referente à carbonila conjugada da molécula
anel (
C-O
), bandas em 1589 e 1501 cm
-1
atribuídas à deformação axial de C-C (
C-C
) do
anel aromático, absorção em 1277 e 1202 cm
-1
associada a deformações axiais C-O (
C-O
)
e ainda uma banda em 821 cm
-1
relacionadas a deformações angulares fora do plano das
ligações C-H (
C-H
) do anel (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
Figura 58 - Espectro vibracional na região do IV da substância 13.
O espectro de massas de 13 (Figura 59 e Figura 60) obtido no modo negativo (ESI)
exibiu fragmentos de m/z 167 [M-H, pico íon molecular]
-
, m/z 152 [M-H-15,
desmetilação]
-
, 123 [M-H-44, descarboxilação]
-
e m/z 108 [M-H-15-44]
-
. A partir da
composição elementar C
8
H
8
O
4
, fornecida pelo pico íon molecular, foram sugeridos três
análogos metilados do ácido protocatecuico: um éster (a) e dois éteres metílicos, sendo um
alquilado na posição 3 (b) e outro na posição 4 (c).
Resultados e Discussão 104
(a) (b) (c)
Para definir a estrutura correta da molécula foram analisados, juntamente com os
espectros de RMN de
1
H e
13
C, dados de interação à longa distância.
O espectro de
1
H (Anexos 147 e 148) forneceu um dubleto de J=8,5 Hz em δ
H
6,81
correspondente a H-5 (1H), um multipleto em δ
H
7,42 (2H), correspondente a H-2 e H-6 e
um singleto em δ
H
3,79 (3H) relacionados a hidrogênios metoxílicos. Já o espectro de
gHMQC (Anexos 151 e 152) mostrou a presença de um sinal em δ
C
168,0 (típico de
carbonila), dois sinais em δ
C
147,2 e 151,0, característicos de carbonos aromáticos
oxigenados e um sinal em δ
C
55,6, confirmando a presença da metoxila no esqueleto da
molécula.
O espectro de gHMBC (Anexos 153 e 154) exibiu uma correlação entre o sinal em δ
H
7,42 e o sinal em δ
C
168,0, confirmando a posição da carbonila em C-1. Também mostrou
a correlação de H-2 com os sinais em δ
C
123,4; 147,2; 151,0 e 168,0, de H-6 com os sinais
δ
C
112,8; 151,0; 168,0 e de H-5 com os sinais δ
C
123,4; 147,2; 151,0 (Tabela 11).
O espectro de gHMBC mostrou ainda, o acoplamento entre os hidrogênios metílicos
(δ
H
3,79) com o carbono aromático C-3 (δ
C
147,2), evidenciando a presença de um
grupamento éter alquil-aril e justificando a proposta (b). Além disso, no espectro de
massas não foram observados picos em m/z 149 e m/z 135, característicos de moléculas
que possuem grupos contendo hidrogênio na posição orto em relação ao grupo carboxílico.
Este “efeito orto” ocorre, pois tais substituintes podem formar um estado de transição de
seis átomos que facilita a eliminação de moléculas neutras como H
2
O (18 u) ou CH
3
OH
(32 u).
Baseando-se nas informações espectrais e comparando-as com os dados da literatura
(SCOTT, 1972; SOUZA FILHO et al., 2006) concluiu-se que a substância 13 é descrita
pela proposta (b) e identificada como ácido vanílico.
OCH
3
O
OH
OH
OH
O
OCH
3
OH
OH
O
OH
OCH
3
3
4
Resultados e Discussão 105
167.0
-MS, 7.9min #151
108.0
152.0
-MS2(167.0), 10eV, 9.1min #173
0
1000
2000
3000
Intens.
0
100
200
300
400
500
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 59 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 13, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI).
Figura 60 - Proposta de fragmentação da substância 13.
Tabela 11 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 13 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm) (multiplicidade;
J (Hz))
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
1
-
*
-
-
2
7,42 (m)
112,8
123,4; 147,2; 151,0; 168,0
*
3
-
147,2
-
-
4
-
151,0
-
-
5
6,81 (d; 8,5)
115,0
123,4; 147,2; 151,0
H-6
6
7,42 (m)
123,4
112,8; 151,0; 168,0
H-5
7
-
168,0
-
-
8
3,79 (s)
55,6
147,2
-
*valores não observados
Os valores de RMN de
13
C foram atribuídos através das interações observadas nos experimentos gHMQC e gHMBC.
(a)
(b)
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
CH
3
CO
2
O
OH
O
OH
CO
2
-H
-H
-H
-H
m/z 167 m/z 152
m/z 123
m/z 108
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
CH
3
CO
2
O
OH
O
OH
CO
2
-H
-H
-H
-H
m/z 167 m/z 152
m/z 123
m/z 108
Resultados e Discussão 106
6.2.12 Caracterização espectrométrica da substância 14
A substância 14 foi isolada da subfração AcOEt-SIL-5, conforme procedimento
experimental em 5.8.
A substância 14 foi isolada como cristais amarelos e apresentou fórmula molecular
C
30
H
22
O
12
, confirmada pela espectro de massas obtido no modo negativo (ESI), através do
íon molecular m/z 573 [M-H]
-
e pelos fragmentos em m/z 447 [M-H-126]
-
, m/z 429 [M-H-
126-H
2
O]
-
e m/z 419 [M-H-126-CO]
-
(Figura 63 e Figura 64). Apresentou perfil espectral
similar ao de 11 na região do IV e, em relação às bandas no UV apresentou características
da subclasse das flavanonas (Figura 61). Salienta-se, o deslocamento batocrômico da
banda II em relação a 11, sugerindo hidroxila adicional em 14, consistente também com a
redução no tempo de retenção observado: t
r
=6,1 min para 14 e t
r
=9,8 min para 11.
Figura 61 - Estrutura da substância 14. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da
substância 14 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte
cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
De uma maneira geral, os espectros de RMN das substâncias 11 e 14 apresentaram-se
muito semelhantes. Basicamente, a diferença refere-se aos sinais em
H
4,13 (J=12,0 Hz) e
4,92 (J=12,0 Hz), atribuídos aos hidrogênios H-3’’ e H-2’’, respectivamente (Anexos 155
a 157), o que elimina a possibilidade de hidrogênios geminais no anel C, como ocorre em
11. Este fato também foi confirmado pelo espectro de RMN de
13
C (Anexos 158 a 161),
que exibiu sinais em
C
82,7 (C-2’’) e 71,9 (C-3’’), típicos da subclasse dos diidroflavonois
(Tabela 12).
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.446
6.150
7.314
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
mAU
6.14/ 1.00
251
460
194
292
476
4’’
5’’
6’’
8’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
7’’
4’’’
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
OH
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.446
6.150
7.314
250 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
mAU
6.14/ 1.00
251
460
194
292
476
4’’
5’’
6’’
8’’
10’’
2’’
2’’’
3’’’
6’’’
5’’’
2’
3’
4’
5’
6’
4
3
2
10
5
6
7
9
8
9’’
3’’
7’’
4’’’
(a)
(b)
Resultados e Discussão 107
A substância 14 apresentou
T
D
= +187,6 (c=1,0 mg.mL
-1
) em MeOH.
A partir dos dados espectrométricos, incluindo a análise das correlações nos mapas
gHMQC (Anexos 165 a 167) e gHMBC (Anexos 168 a 172), associados à comparação
com dados da literatura pode-se identificar 14 como o biflavonóide GB2, já isolado dos
caules de Garcinia xanthochymus (KONOSHIMA et al., 1970).
GB2 apresentou efeito Cotton positivo para as transições n* em 345 nm e efeito
Cotton negativo para as transições * em 285 nm (Figura 62). Há poucos relatos sobre
a estereoquímica de biflavonóides do tipo GB, ora porque a magnitude do sinal da curva de
Tabela 12 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 14 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
16a (25°C) 16b (25°C) 16a (90°C)
C
(ppm)
(25°C)
gHMBC
2
5,66 (m)
5,35 (d; 12,0)
5,62 (d; 12,0)
81,2
129,4
3
4,45 (d; 12)
4,65 (d; 12,0)
4,53 (d; 12,0)
47,2
81,2; 101,0; 160,1; 164,4;
196,5
4
-
-
-
196,5
-
5
-
-
-
164,4
-
6
5,88 (s)
5,88 (s)
5,90 (d; 2,0)
96,0
95,3; 101,0; 166,3
7
-
-
-
166,3
-
8
5,88 (s)
5,88 (s)
5,90 (d; 2,0)
95,3
101,0; 163,3
9
-
-
-
163,3
-
10
-
-
-
101,0
-
1’
-
-
-
129,4
-
2’ 6’
7,10 (m)
7,10 (m)
7,10 (d; 8,5)
128,8
81,2; 128,8; 157,7
3’ 5’
6,60-6,84 (m)
6,60-6,84 (m)
6,74 (d; 8,5)
115,3
*
4’
-
-
-
157,7
-
5-OH
12,17 (s)
12,19 (s)
12,09 (s)
-
96,0; 101,0; 164,4
2’’
4,87 (d; 12,0)
4,99 (d; 12,0)
4,92 (d; 12,0)
82,7
118,9; 128,0; 197,5
3’’
3,95 (m)
4,19 (m)
4,13 (d; 12,0)
71,9
82,7
4’’
-
-
-
197,5
-
5’’
-
-
-
162,7
-
6’’
5,88 (s)
5,88 (s)
5,88 (s)
95,7
100,2
7’’
-
-
-
164,4
-
8’’
-
-
-
100,2
-
9’’
-
-
-
160,1
-
10’’
-
-
-
99,7
-
1’’’
-
-
-
128,0
-
2’’’
6,60-6,84 (m)
6,60-6,84 (m)
6,82 (d; 1,6)
114,8
*
3’’’
-
-
-
144,5
-
4’’’
-
-
-
145,8
-
5’’’
6,60-6,84 (m)
6,60-6,84 (m)
6,75 (m)
115,3
*
6’’’
6,60-6,84 (m)
6,60-6,84 (m)
6,64 (dd; 1,6 e
8,8)
118,9
*
5’’-OH
11,82 (s)
12,79 (s)
11,62 (s)
-
95,7; 99,7; 162,7
(16a) representa o confôrmero principal e a série (16b) o confôrmero minoritário.
* sinais sobrepostos
Resultados e Discussão 108
dicroísmo é muito baixa, ora pelo efeito atropisomérico da ligação 38’’. Ferrrari e seus
colaboradores (2003) fizeram uma revisão sobre a configuração absoluta dos biflavonóides
GB1, GB2, GB4 e GB4a e propuseram os sinais dos efeitos Cottons de cada
estereoisômero. Para GB2, a configuração absoluta de 2R, 3S, 2’’R, 3’’R é caracterizada
pelo efeito Cotton positivo em 345 nm e efeito Cotton negativo em 285 nm, semelhante à
curva de DC mostrada por 14. Conclui-se afinal, que a substância 14 é o biflavonóide
(2R,3S,2’’R, 3’’R)-5,7,4’,5’’,7’’,3’’, 3’’’,4’’’-octaidroxi-(3,8’’)-biflavanona.
Em relação às biflavanonas (livres na posição C-3’’) GB1a e GB2a, isoladas da
fração AcOEt-FOL, a curva de DC foi similar a da substância 14 (Figura 62), porém, para
uma atribuição completa e inequívoca dos sinais do efeito Cotton, serão necessários
experimentos adicionais, visto que ainda não há relato sobre a configuração absoluta dos
possíveis estereoisômeros.
-9
14
0
10
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
-9
14
0
10
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
30
-10
0
10
20
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
30
-10
0
10
20
CD [mdeg]
220 250 300 350 400
Wavelength [nm]
Figura 62 - Curva de dicroísmo circular (DC) das substâncias (a) 11 e (b) 14.
.
447.1
573.1
-MS, 4.9min #93
447.1
429.1
419.1
-MS2(573.1), 15eV, 5.7min #107
0
500
1000
1500
2000
2500
Intens.
0
50
100
150
200
250
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 63 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 14, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
(a)
(b)
(a)
(b)
Resultados e Discussão 109
Figura 64 - Proposta de fragmentação da substância 14.
6.2.13 Caracterização espectrométrica das substâncias 17 e 18
As substâncias 17 e 18 foram isoladas da subfração BuOH-FOL-6, conforme
procedimento experimental em 5.10.
A substância 17 isolada como um sólido amarelo claro amorfo apresentou fórmula
molecular de C
16
H
18
O
9
correspondendo à massa molecular de 354 g.mol
-1
. Em análise por
CLAE-UV-DAD a substância mostrou um caráter bastante polar, eluindo com t
r
= 4,4 min
com fase móvel de 75% de água. No espectro na região do UV (Figura 65) apresentou
bandas com comprimentos de onda de absorção máxima em 329 nm e um ombro em 290
nm, típico de moléculas com unidades cafeoíla em sua estrutura (MAISUTHISAKUL et
al., 2007).
A análise do espectro de absorção na região do IV (Figura 66) conduziu à
identificação de alguns grupos funcionais como: hidroxila, devido a uma banda larga em
3374 cm
-1
característica da deformação axial da ligação O-H (
O-H
); carbonila conjugada,
evidenciada por uma banda em 1698 cm
-1
(
C-O
); anel aromático, devido a bandas em 1500
e 1597 cm
-1
atribuídas à deformação axial de C-C (
C-C
) e as bandas em 814 e 976 cm
-1
relacionadas a deformações angulares fora do plano das ligações C-H (
C-H
), e ainda,
carbonos oxigenados, reconhecidos através das absorções em 1263 e 1158 cm
-1
associadas
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
OH
-H
-H
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH O
OH
OH
OH
-H
2
O
-CO
-H
-H
m/z 573
m/z 429
m/z 419
m/z 447
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
OH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
OH
-H
-H
OH
O
OH
OOH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH O
OH
OH
OH
-H
2
O
-CO
-H
-H
m/z 573
m/z 429
m/z 419
m/z 447
Resultados e Discussão 110
Figura 65 - Estruturas das substâncias 17 e 18. (a) Cromatogramas analíticos e (b) espectros de
absorção das substâncias 17 e 18 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 35:75
(MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
Figura 66 - Espectro vibracional na região do IV da substância 17.
Tabela 13 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e RMN de
13
C (125 MHz) da substância 17 (DMSO-d
6
).
Posição
H
(ppm) (multiplicidade;
J (Hz))
C
(ppm)
gHMBC
gCOSY
1’
-
125,7
-
-
2’
7,00 (d; 2,0)
114,5
121,0; 144,3; 148,9
H-6’
3’
-
145,5
-
-
4’
-
148,9
-
-
5’
6,75 (d; 8,0)
115,7
145,5; 148,9
H-6’
6’
6,95 (dd; 8,0 e 2,0)
121,0
114,5; 144,3; 148,9
H-2’; H-5’
7’
7,44 (d; 16,0)
144,3
114,5; 125,7; 166,0
H-8’
8’
6,19 (d; 16,0)
115,0
125,7; 166,0
H-7’
9’
-
166,0
-
-
1
-
72,9
-
-
2
1,97-2,01 (m)
35,1
39,0; 70,9
H-3
3
5,17 (m)
70,9
166,0
H-2; H-4
4
3,53 (d; 4,0)
71,2
*
H-5; H-3
5
3,85 (m)
67,2
70,9; 72,9
H-6; H-4
6
1,83-1,91 (m)
39,0
67,2; 72,9
H-5
7
-
176,1
-
-
* sinal não observado
OH O
HOOC
OH
OH
O
OH
OH
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.251
3.989
4.411
5.461
5.621
6.303
6.853
7.024
200 300 400 500 600 700 nm
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
4000
mAU
4.34/ 1.00
207
230
265
581
215
202
331
233
656
5
3
6’
5’
4’
3’
2’
1’
1
9’
7’
OH
OH
HOOC
OH
O
O
OH
OH
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.240
4.784
5.457
6.643
8.283
250 500 nm
0
250
500
750
mAU
5.53/ 1.00
205
228
268
502
711
326
218
244
675
773
1
3
5
9’
7’
1’
2’
3’
4’
5’
6’
OH O
HOOC
OH
OH
O
OH
OH
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.251
3.989
4.411
5.461
5.621
6.303
6.853
7.024
200 300 400 500 600 700 nm
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
4000
mAU
4.34/ 1.00
207
230
265
581
215
202
331
233
656
5
3
6’
5’
4’
3’
2’
1’
1
9’
7’
OH
OH
HOOC
OH
O
O
OH
OH
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mAU
254nm,4nm (1.00)
3.240
4.784
5.457
6.643
8.283
250 500 nm
0
250
500
750
mAU
5.53/ 1.00
205
228
268
502
711
326
218
244
675
773
1
3
5
9’
7’
1’
2’
3’
4’
5’
6’
17
18
(a)
(b)
(a)
(b)
Resultados e Discussão 111
a deformações axiais C-O (
C-O
) (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 1994).
O espectro de RMN de
1
H (Anexos 173 a 176) da substância 17 apresentou sinais
característicos de substância aromática. Os sinais em
H
7,00 (d, 1H, 2,0 Hz), 6,95 (dd, 1H,
8,0 e 2,0 Hz) e 6,75 (d, 1H, 8,0 Hz) indicaram a presença de anel aromático 1,3,4-
trissubstituído (Tabela 13). Foram observados ainda sinais em
H
7,44 (d, 1H, 16,0 Hz) e
6,19 (d, 1H, 16,0 Hz) que indicaram a presença de ligação dupla trans-dissubstituída. A
análise do conjunto destes sinais evidenciou a presença da porção do ácido cafeico. O
espectro de RMN de
1
H exibiu ainda os sinais em
H
5,17 e 3,85, característicos de
hidrogênios oximetínicos.
A análise do espectro de RMN de
13
C (Anexo 177, Tabela 13) confirmou a presença
da unidade do ácido cafeico pelos sinais em δ
C
166,0; 148,9; 145,5; 144,3; 125,7; 121,0;
115,7 e 114,5. Foram observados sinais de carbonos carbinólicos em δ
C
72,9; 71,2; 70,9 e
67,2 e sinais de carbonos metilênicos em δ
C
35,1 e 39,0. O espectro mostrou ainda, sinal
para carbono de carboxila em δ
C
176,1, sugerindo a estrutura do ácido quínico.
Os acoplamentos observados no mapa de correlação gHMBC (Anexos 185 a 190)
entre os hidrogênios em
H
7,44 (H-7’) e
H
6,19 (H-8’) com o carbono em δ
C
166,0
(atribuída a carbonila de éster em C-9’), confirmaram o sistema carbonílico α, β-insaturado
conjugado ao anel. A localização do ácido quínico na estrutura foi determinada pela
existência de acoplamento a longa distância entre o sinal do hidrogênio em
H
5,17 (H-3)
do ácido quínico e o sinal do carbono carboxílico do ácido cafeico em δ
C
166,0, indicando
a esterificação do ácido cafeico pelo ácido quínico.
Essas observações, associadas aos dados da literatura, permitiram identificar a
substância 17 como ácido 3-O-cafeoilquínico ou ácido clorogênico (3-ACQ).
A substância 18 apresentou um mesmo perfil espectral (Anexos 191 a 209), porém
em análise por CLAE-UV-DAD (Figura 65) o tempo de retenção foi de 5,1 min, diferente
de 17, que mostrou tempo de retenção igual a 4,4 min, nas mesmas condições. Essa
diferença nos levou a investigar a ocorrência de um possível isômero do ácido clorogênico.
Os derivados do ácido clorogênico são resultantes de esterificações de um ou mais
tipos de ácidos trans-cinâmicos (cinâmico, cumárico, cafeico, ferúlico e dimetoxicinâmico)
com as hidroxilas do ácido quínico, gerando uma série de isômeros de posição. Os
derivados com esterificações nas posições 3, 4 e 5 são de ocorrência comum, ao contrário
dos derivados com esterificação na posição 1, de ocorrência rara.
Resultados e Discussão 112
Pela análise dos espectros de RMN
1
H, nota-se uma grande similaridade estrutural
entre 17 e 18, com pequenas variações nos deslocamentos químicos e nas constantes de
acoplamento. A diferenciação se dá principalmente, pela estereoquímica dos substituintes,
observadas a partir dos núcleos de H do ácido quínico. As hidroxilas do ácido quínico nas
posições 1, 3 e 4 devem estar em posição relativas ao plano do anel, enquanto a
carboxila e hidroxila em C-5, devem estar em posição β (DEWICK, 2002). Assim, a
conformação cadeira mais estável é aquela em que o grupo carboxílico ocupa a posição
equatorial (Figura 67a), minimizando a interação do tipo 1,3-diaxial entre carboxila e
hidroxila que ocorreria conforme ilustrado na Figura 67b (CORSE et al., 1966).
1
2
3
4
5
6
7
OH
COOHHO
OH
HO
HOOC
OH OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
HO
))) (((
1
2
3
4
5
6
7
7
a) b) c)
Figura 67 - Estrutura do ácido quínico. (a) conformação de maior estabilidade. (b) conformação de
menor estabilidade evidenciando interação 1,3-diaxial entre a carboxila e a hidroxila em C5.
A atribuição dos hidrogênios H-2, H-3, H-4, H-5 e H6 é dificultada pelo fato dos
sinais estarem sobrepostos em uma estreita região espectral e por possuírem constantes de
acoplamento múltiplas (PAULI.; POETSCH; NAHRSTEDT, 1998). Porém, é possível
contornar este problema levando em consideração a largura total dos multipletos e
comparando-se os deslocamentos, com o ácido quínico não substituído. Desta forma, a
largura total encontrada para o hidrogênio H-3 é de no máximo 15,0 Hz, enquanto que para
o H-5 esta constante é de no máximo 25,0 Hz (GE et al., 2007).
Diante desta sistemática, a substância 17 apresentou um multipleto em
H
3,85
atribuído a H-5 (largura da constante de acoplamento de J=17,5 Hz) e um multipleto em
H
5,17 atribuído a H-3 (largura da constante de acoplamento de J=14,5 Hz) (Anexo 174).
Como o sinal em
H
5,17 deslocou-se para região paramagnética do espectro em relação ao
padrão ácido quínico não substituído (deslocamento em
H
4,00 para H-5 e
H
4,10 para H-
3) e o sinal em
H
3,85 permaneceu inalterado, conclui-se que a esterificação ocorre pela
hidroxila em C-3 do ácido quínico. Essas observações confirmaram a estrutura proposta
para 17, conforme discutido acima.
(a)
(b)
Resultados e Discussão 113
Já para a substância 18, a largura da constante de acoplamento para o sinal em
H
3,85 foi de J=7,0 Hz (H-3) e o deslocamento permaneceu inalterado (Anexo 192). O sinal
em
H
5,17 mostrou uma largura de J=18,5 Hz (H-5) e deslocou-se para região
desprotegida do espectro, indicando que a esterificação do ácido cafeico ocorre pela
hidroxila em C-5 do ácido quínico. Conclui-se que 18 é o ácido 5-O-cafeoilquínico ou
ácido isoclorogênico (5-ACQ).
Tabela 14 - Fragmentos obtidos dos analitos isolados de G. xanthochymus a partir da análise por
EM e EM2 obtido em modo negativo com energia de colisão de 15%.
Compostos
EM1
(íon molecular)
EM2
Pico base
Fragmentos secundários
m/z
m/z
m/z
intensidade*
m/z
intensidade*
3-ACQ
353,1
191,7
179,7
45
135,6
22
4-ACQ
353,1
173,0
191,0
49
179,0
38
5-ACQ
353,1
191,1
-
-
-
-
3-ApCoQ
337,1
163,0
191,1
32
-
-
4- ApCoQ
337,1
173,0
163,0
82
119,0
25
* abundância relativa do fragmento
Pela análise do espectro de massas obtido no modo negativo (ESI), observa-se que o
padrão de fragmentação dos isômeros 3-ACQ e 5-ACQ é bastante similar (Tabela 14,
Figura 68-Figura 71). A diferenciação foi possível a partir da fragmentação EM2, onde os
fragmentos secundários em m/z 179,7 [M-H]
-
e m/z 135,6 [M-H]
-
foram identificados
exclusivamente no espectro de massas do 3-ACQ (substância 17), como relatado para tal
composto por CLIFFORD et al. (2003) e GOBBO-NETO; LOPES (2008).
A facilidade da perda de uma unidade de um ácido trans-cinâmico (como o ácido
cafeico) esterificada em uma posição específica do ácido quínico é influenciada
principalmente pela sua proximidade espacial com carboxila ou hidroxila no C-1 do ácido
quínico, fator que influencia o mecanismo e consequente perfil de fragmentação destes
derivados. No caso do isômero 3-ACQ, um hidrogênio é abstraído da OH em C-1 e no caso
do 5-ACQ, um hidrogênio da carboxila do ácido quínico é abstraído para a eliminação da
porção cafeica. Estas diferenças na fragmentação ocasionam consideráveis diferenças na
intensidade, e às vezes na natureza dos íons produtos nos espectros de segunda geração
Resultados e Discussão 114
EM2, o que possibilita a diferenciação entre os isômeros de posição (CLIFFORD et al.,
2003, 2006).
353.1
707.2
-MS, 4.5min #85
191.7
179.7
135.6
-MS2(353.1), 15eV, 6.4min #119
0
500
1000
1500
Intens.
0
50
100
150
200
250
300
100 200 300 400 500 600 700 800 m/z
Figura 68 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 17, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
Figura 69 - Proposta de fragmentação da substância 17.
(a)
(b)
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
- cafeoil
-ácido quínico
-CO
2
-H
-H
-H
-H
m/z 353,1
m/z 191,7
m/z 135,6m/z 179,7
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
- cafeoil
-ácido quínico
-CO
2
-H
-H
-H
-H
m/z 353,1
m/z 191,7
m/z 135,6m/z 179,7
Resultados e Discussão 115
191.1
353.1
-MS, 7.2min #136
191.1
-MS2(353.1), 15eV, 5.1min #95
0
200
400
600
800
Intens.
0
50
100
150
200
250
100 200 300 400 500 600 700 800 m/z
Figura 70 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 18, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
Figura 71 - Proposta de fragmentação da substância 18.
6.3 A desreplicação em estudos de bioprospecção
Desreplicação é uma estratégia de análise na procura de novos medicamentos, onde o
foco é a identificação rápida de novas substâncias, frequentemente em mistura, ativas
biologicamente, a partir de fontes naturais. O desenvolvimento da técnica começou com a
necessidade de se priorizar a obtenção de substâncias inéditas com ou sem atividade
biológica, uma vez que o trabalho fitoquímico pode ser muitas vezes dispendioso e levar
geralmente a compostos já conhecidos. Estima-se um gasto de $ 50.000 e um trabalho de 3
meses para isolar e identificar um composto como bioativo (CORDELL e SHIN, 1999).
(b)
(a)
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
- cafeoil
OH
OH
OH
OH
O
OH
-H
-H
m/z 353,1
m/z 191,1
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
- cafeoil
OH
OH
OH
OH
O
OH
-H
-H
m/z 353,1
m/z 191,1
Resultados e Discussão 116
A desreplicação utiliza várias técnicas de análise tais como a CLAE-UV-DAD, CG,
CG-EM, CLAE-RMN e CLAE-EM ou uma combinação dessas. O equipamento de CLAE-
EM consiste de um sistema eletrospray e um espectrômetro contendo um detector
quadrupolar e consiste de duas fases distintas. A primeira etapa consiste na coleta e
separação de dados (parâmetros cromatográficos, manipulação da amostra, testes
biológicos) e a segunda consiste na análise de dados (RODRIGUES et al., 2006).
O uso da desreplicação nos mostra uma linha de pesquisa muito promissora, bastando
lembrar a riqueza de nossa flora, para se ter uma idéia da abrangência que pode ser
alcançada nos estudos de extratos de plantas e em curto espaço de tempo (CORDELL e
SHIN, 1999).
6.3.1 Identificação por CLAE-UV-DAD-EM dos constituintes de Garcinia
xanthochymus
A fração AcOEt-FRU de Garcinia xanthochymus apresentou um perfil químico
bastante diversificado (um maior número de picos com diferentes bandas de absorção no
UV), por isso a escolha de tal matriz para análise e identificação de seus metabólitos por
CLAE-DAD-EM.
A análise conjunta de algumas subfrações (selecionadas com base em seus perfis
cromatográficos, Figura 72) originárias da fração AcOEt-FRU por CPG, de substâncias
purificadas durante esse trabalho e comparação com dados da literatura, permitiu a
localização de substâncias já isoladas e/ou isoladas em trabalhos anteriores, assim como foi
possível identificar classes diferentes daquelas já isoladas, tais como as xantonas.
Os fragmentogramas dos metabólitos presentes na subfração AcOEt-FRU-13 (Figura
73 e Figura 74) mostrou padrão de fragmentação semelhante aos encontrados para
algumas xantonas, isoladas em trabalhos anteriores de diversas espécies do gênero
Garcinia (PANTHONG, et al., 2006; HARRISON, et al., 2005; IINUMA, et al., 1996;
ZHOU, et al., 2008; MOREAU, et al., 2002; SCHIEBER; BERARDINI; CARLE, 2003).
O íon m/z 303 [M-H]
-
, verificado no espectro de massas obtido no modo negativo
(ESI) de 24, pode ser atribuído a fórmula molecular C
15
H
12
O
7
. A fragmentação de
xantonas metoxiladas é caracterizada pela presença do fragmento [M-H-15]
-
, referente à
perda de uma metila, tal como é observado no EM de 24. Os íons m/z 288 e m/z 273
correspondentes a [M-H-15]
-
e [M-H-30]
-
, respectivamente, evidenciam a presença de um
Resultados e Discussão 117
Figura 72 - Cromatograma analítico de alguns constituintes majoritários obtido via CLAE-UV-
DAD das subfrações (a) AcOEt-FRU-13 (b) e AcOEt-FRU-17, no modo gradiente em H
2
O: MeOH
(95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
303.1
-MS, 48.4min #918
288.0
273.0
217.0
245.0
-MS2(303.1), 15eV, 48.9min #926
0
500
1000
1500
2000
Intens.
0
50
100
150
200
250
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 73 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 24, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
273.0
258.0
-MS, 37.1min #703
0
100
200
300
400
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 74 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 25 obtido no modo negativo (ESI).
.
(24)
(25)
(14)
(11)
(a)
(b)
(a)
(b)
Resultados e Discussão 118
esqueleto xantônico triidroxilado e dimetoxilado, como relatado para xantonas isoladas em
trabalhos anteriores (BASHIR et al., 1992; FUJITA et al., 1992; IKEYA et al., 1991). A
unidade fundamental de uma xantona também poder ser caracterizada pela presença dos
íons m/z 245 [M-H-30-28]
-
e m/z 217 [M-H-30-56]
-
, referentes à perda de duas metilas
com subseqüente perda de CO (Figura 73 e Figura 75).
Figura 75 - Proposta de fragmentação da substância 24.
Figura 76 - Proposta de fragmentação da substância 25.
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
O
-H
-H
CH
3
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
O
OH
O
OH
OH
O
+
CO
O
O
OH
OH
OH
O
CO
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
-H
-H
+
+
m/z 303
m/z 245
m/z 273
m/z 288
m/z 217
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
O
-H
-H
CH
3
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
O
OH
O
OH
OH
O
+
CO
O
O
OH
OH
OH
O
CO
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
-H
-H
+
+
m/z 303
m/z 245
m/z 273
m/z 288
m/z 217
m/z 273 m/z 258
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
m/z 273 m/z 258
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
m/z 273 m/z 258
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
m/z 273 m/z 258
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
CH
3
O
O
OH
OH
OH
O
-H
-H
Resultados e Discussão 119
O íon molecular m/z 273 [M-H]
-
apresentado pela substância 25 sugere a fórmula
C
14
H
10
O
6
e pode ser atribuído a esqueletos xantônicos triidroxilados e metoxilados. Esse
fato também é confirmado pela presença do íon m/z 258 referente à perda de uma metila
[M-H-15]
-
(Figura 74 e Figura 76). Este tipo de xantona é muito comum e vários isômeros
já foram isolados da espécie G. xanthochymus (BAGGETT et al., 2005; ZHONG; CHEN;
YANG, 2008). É importante salientar que a identificação sugere apenas o esqueleto básico
do metabólito secundário e que a posição dos substituintes só é realmente comprovada com
o auxílio de técnicas de RMN mono e bidimensionais e/ou cuidadosa análise do perfil de
fragmentação por EM1 e EM2 para as amostras e padrões.
A análise através de CLAE fase reversa confirmou essas informações através da
comparação de espectros de UV e dos tempos de retenção obtidos para essas duas
subfrações e amostra padrão (Figura 77). As substâncias 24 e 25 apresentaram t
r
=24,1 min
e t
r
=25,9 min, respectivamente (Figura 72) semelhante aos tempos de retenção de
amostras autênticas de xantonas [1,5,7-triidroxi-2,3-dimetoxixantona (xantona 1), t
r
=24,0
min; 1,3,7-triidroxi-5-metoxixantona (xantona 2), t
r
=25,8 min] analisadas nas mesmas
condições por CLAE (Figura 78).
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
OCH
3
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
Xantona 1
Xantona 2
O
O
OH
OH
OH
OCH
3
OCH
3
O
O
OH
OCH
3
OH
OH
Xantona 1
Xantona 2
Figura 77 - Estruturas das xantonas padrão utilizadas no processo de desreplicação das substâncias
24 e 25.
A subfração AcOEt-FRU-17 apresentou dois picos com tempos de retenção e bandas
no UV semelhantes aos das substâncias 11 e 14 (Figura 79). No espectro de massas obtido
no modo negativo observou-se sinais em m/z 573 [M-H]
-
e m/z 557 [M-H]
-
, que foram
atribuídos aos íons moleculares de GB2 (subst. 14) e GB2a (subst. 11), respectivamente.
Os íons de segunda-ordem (EM2) m/z 431 [M-H-126]
-
e m/z 295 [M-H-126-136]
-
encontrados para o segundo pico e m/z 447 [M-H-126]
-
, m/z 429 [M-H-126-H
2
O]
-
e m/z
419 [M-H-126-CO]
-
, para o primeiro pico, corroboram a proposta apresentada para essas
duas substâncias (Figura 80).
xantona 1
xantona 2
Resultados e Discussão 120
Figura 78 - (a) Espectro de absorção da substância 24, da xantona 1 e cromatograma analítico da
xantona 1 (b) Espectro de absorção da substância 25, xantona 2 e cromatograma analítico da
xantona 2. Modo gradiente em H
2
O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS
(Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
Figura 79 - Espectro de absorção no UV comparativo (a) da substância 11 e o pico 2 da fração
AcOEt-FRU-17 e (b) da substância 14 e o pico 1 da fração AcOEt-FRU-17.
As substâncias 6, 7, 15 e 16 apresentaram espectro de absorção no UV, sinais de
RMN
1
H e padrão de fragmentação característicos de biflavonóides e a subfração AcOEt-
FRU-7 mostrou-se como uma mistura de benzofenonas (Substs. 19 e 20). As substâncias
21, 22 e 23 mostraram-se semelhantes, quando comparados com dados de UV e massas,
aos derivados de ácidos fenilpropanoídicos já isolados e identificados na fração BUOH-
FOL.
A substância 6, isolada da subfração AcOEt-FOL-14 (procedimento experimental
5.5), apresentou banda de absorção no UV em =293 nm atribuída à banda II de uma
flavanona (Figura 81). O espetro de RMN
1
H apresentou sinais entre
H
2,65 e 5,70,
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
mAU
254nm,4nm (1.00)
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
mAU
1/ 24.70/ 1.00
220
293
266
601
658
199
243
315
283
635
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
1/ 26.12/ 1.00
250
316
285
485
458
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
mAU
1/ 34.22/ 1.00
198
244
235
297
356
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
mAU
1/ 34.18/ 1.00
197
249
233
285
360
Subst. 24
Subst. 25
xantona padrão 1
5 10 15 20 25
Minutes
-0.3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
AU
xantona padrão 2
xantona padrão 1
xantona padrão 2
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
mAU
254nm,4nm (1.00)
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
mAU
1/ 24.70/ 1.00
220
293
266
601
658
199
243
315
283
635
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
1/ 26.12/ 1.00
250
316
285
485
458
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
mAU
1/ 34.22/ 1.00
198
244
235
297
356
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
mAU
1/ 34.18/ 1.00
197
249
233
285
360
Subst. 24
Subst. 25
xantona padrão 1
5 10 15 20 25
Minutes
-0.3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
AU
xantona padrão 2
xantona padrão 1
xantona padrão 2
Subst. 24
Subst. 25
Xantona 2
Xantona 1
Xantona 2
Xantona 1
(a)
(b)
Resultados e Discussão 121
447.1
573.1
-MS, 4.7min #88
447.1
419.1429.1
-MS2(573.1), 15eV, 5.6min #105
0
1000
2000
3000
Intens.
0
100
200
300
400
500
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
431.1
557.1
-MS, 5.9min #113
295.0
431.1
-MS2(557.1), 15eV, 5.7min #109
0
200
400
600
800
Intens.
0
200
400
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 80 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem dos picos 1 (esquerda) e 2
(direita) da subfração AcOEt-FRU-17, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15%
para EM2 (ESI).
atribuídos aos hidrogênios H-2, H-3, H-2’’ e H-3’’, sinais entre
H
5,82 e 5,94, atribuídos a
hidrogênios do anel A e sinais entre
H
6,23 e 7,25 atribuídos a hidrogênios do anel B
(Figura 82). Todavia, em virtude da pequena quantidade de massa e complexidade do
espectro em função da existência de atropoisomerismo, não foi possível atribuir
satisfatoriamente os sinais, assim como também não foi possível adquirir os espectros de
13
C e bidimensionais. Assim, a identificação foi realizada a partir da comparação dos íons
precursores de 6 e de seus produtos de fragmentação com dados da literatura, pelo uso da
EM. No modo de ionização negativa (ESI), o espectro exibiu íon molecular m/z 541 [M-
H]
-
e fragmentos em m/z 415 [M-H-126]
-
e 295 [M-H-126-120]
-
, correspondendo à perda
de floroglucinol (126 u) e subseqüente perda de 120 u por um mecanismo Retro-Diels-
Alder (Figuras 83 e 84). Nota-se por fim, que a substância 6 é muito semelhante a 11,
diferindo apenas no padrão de substituição do anel B (livre de hidroxila na posição C-3’’’)
podendo ser identificada com GB1a, um biflavonóide isolado dos frutos de G.
xanthochymus (KONOSHIMA et al., 1970; BASLAS; KUMAR, 1979).
Figura 81 - (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 6 obtido via
CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H
2
O) e suporte cromatográfico: ODS
(Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m).
250 500 nm
0
50
100
150
200
250
300
mAU
14.61/ 1.00
207
250
436
487
198
214
293
439
655
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.655
2.942
3.223
3.869
4.340
4.924
5.051
5.287
5.878
6.278
7.269
8.021
10.514
11.631
14.122
18.743
21.255
23.186
24.436
37.224
250 500 nm
0
50
100
150
200
250
300
mAU
14.61/ 1.00
207
250
436
487
198
214
293
439
655
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mAU
254nm,4nm (1.00)
2.655
2.942
3.223
3.869
4.340
4.924
5.051
5.287
5.878
6.278
7.269
8.021
10.514
11.631
14.122
18.743
21.255
23.186
24.436
37.224
(a)
(a)
(b)
(b)
(b)
(a)
Resultados e Discussão 122
Figura 82 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 6 (DMSO-d
6
).
Do mesmo modo a substância 7, isolada da subfração AcOEt-FOL-15 (procedimento
experimental 5.6) foi identificada através dos dados de EM pelo íon em m/z 551 [M-H]
-
(Figura 86), além da análise do espectro de RMN de
1
H, em que se nota uma grande
semelhança dos deslocamentos químicos e constantes de acoplamento entre 7 e 9,
diferindo apenas no singleto em
H
3,67 integrando para três hidrogênios, que pode ser
atribuído a presença de uma metila na estrutura de 7 (Figura 85). A partir dos dados da
literatura para substâncias já isoladas de G. xanthochymus, pode-se identificar a substância
7 como 7-O-metilamentoflavona, um derivado metoxilado da amentoflavona isolado das
folhas de G. xanthochymus (PARVEEN et al., 1994).
A substância 15, isolada da subfração AcOEt-SIL-9 (procedimento experimental
5.7), apresentou uma única banda de absorção no UV (=293 nm), sugerindo a subclasse
das flavanonas. Já a substância 16, isolada da subfração AcOEt-SIL-11 (procedimento
experimental 5.9), apresentou bandas de absorção características de flavanonas/flavonas,
com a banda I em =348 nm e a banda II em =289 nm (Figura 20).
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
Resultados e Discussão 123
541.1
-MS, 3.5min #67
415.1
295.0
-MS2(541.1), 15eV, 1.3min #26
0
1000
2000
3000
4000
Intens.
0
200
400
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 83 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 6, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
Figura 84 - Proposta de fragmentação da substância 6.
(a)
(b)
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
O
m/z 541
m/z 415
m/z 295
OH
OH
O
C
O
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
O
m/z 541
m/z 415
m/z 295
O
OOH
OH
OH
O
OH
OOH
OH
M-126
OH
O
OH
OOH
OH
O
-H
-H
OH
O
OOH
OH
O
RDA
-H
O
m/z 541
m/z 415
m/z 295
OH
OH
O
C
O
OH
OH
C
O
O
OH
O
Resultados e Discussão 124
O
OOH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OOH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
Figura 85 – Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 7 (DMSO-d
6
).
551.1
-MS, 2.1min #41
0
200
400
600
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 86 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 7 obtido no modo negativo (ESI).
Figura 87 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 15 (DMSO-d
6
).
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
GluO
Resultados e Discussão 125
A complexidade dos espectros de RMN de
1
H e duplicação de sinais pode ser
explicada pelo efeito atropisomérico de ambas as substâncias, indicando a presença de
biflavonóides do tipo C3C8’’. Observa-se a presença de sinais em
H
12,03, relacionados
a hidrogênios de hidroxilas quelatadas, capaz de estabelecer uma ligação intramolecular
com o oxigênio carbonílico em C-4. O espectro também apresentou sinais entre
H
2,54 e
5,12, sugerindo a presença de uma unidade de açúcar ligada à aglicona (Figura 87 e Figura
88). Esses dados permitiram a identificação das substâncias 15 e 16, associados à análise
por EM, que apresentou íon molecular de m/z 719 [M-H]
-
para a substância 15 (Figura 89)
e m/z 717 [M-H]
-
para a substância 16 (Figura 90).
Figura 88 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) da substância 16 (DMSO-d
6
).
719.2
-MS, 5.9min #113
431.1
557.1
719.2
-MS2(719.2), 10eV, 4.2min #80
0
200
400
600
800
Intens.
0
100
200
300
400
500
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 89 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 15,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI).
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
GluO
(b)
(a)
Resultados e Discussão 126
Através do espectro de segunda ordem obtido no modo negativo (ESI) de 15 (EM2)
pode-se sugerir a presença de uma unidade de hexose no esqueleto flavonoídico,
representada pelo íon m/z 557 [M-H-162]
-
e m/z 431 [M-H-162-126]
-
. Aliados a esses
dados e comparando o padrão de fragmentação com o apresentado pela substância 11,
pode-se inferir que a substância 15 é o biflavonóide xantochimusídeo, um derivado
glicosilado do GB2a já isolado dos caules de G. xanthochymus (KONOSHIMA et al., 1970). Já
a substância 16 não apresentou fragmentos secundários que caracterizassem a presença de
uma unidade de açúcar, sugerindo a necessidade de energia de colisão maior que 15%.
Todavia, o espectro de gHMBC mostrou a interação entre o hidrogênio anomérico em
H
5,12 (J=7,5 Hz) com o sinal em
C
160,8, sugerindo a presença da glicose em C-7’’.
Comparando esses dados com a literatura, pode-se identificar a substância 16 como
fukugisídeo, um derivado glicosilado da morelloflavona isolado dos frutos de G.
xanthochymus (KONOSHIMA et al., 1970; BAGGETT et al., 2005).
717.2717.2717.2717.2717.2
-MS, 4.6min #89
0
200
400
600
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 90 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 16 obtido no modo negativo (ESI).
A subfração AcOEt-FRU-7, obtida do fracionamento cromatográfico da fração
AcOEt-FRU (procedimento experimental 5.11), apresentou duas bandas no UV em =251
e 356 nm, características de benzofenonas (Figura 91). O espectro de RMN de
1
H (Figura
92) mostrou sinais entre
H
0,75 e 2,90 característicos de grupos metílicos, metilênicos e
metínicos, e entre
H
4,47 e 4,91 característicos de hidrogênios olefínicos. Exibiu também
sinais em
H
6,65 (d, J=8,5 Hz),
H
6,91 (m) e 7,18 (d, J=2,5 Hz) sugerindo a presença de
um grupo aromático trissubstituído (Tabela 15). Esses dados são consistentes com os
relatados para a classe das benzofenonas, porém a integração dos sinais de RMN de
hidrogênio sugeriu que se tratava de uma mistura composta por dois isômeros, fato
confirmado pela EM que apresentou um único sinal referente ao íon molecular em m/z 601
Resultados e Discussão 127
Tabela 15 - Dados de RMN de
1
H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d
6
).
xantochimol (19)
cicloxantochimol (20)
Posição
δ
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
δ
H
(ppm)
(multiplicidade; J (Hz))
1
-
-
2
-
-
3
-
-
4
-
-
5
-
-
6
1,49 (m)
1,50 (m)
7
2,05 (m)
1,97 (m)
2,25 (d; 14,2)
2,13 (d; 14,6)
8
-
-
9
-
-
10
-
-
11
-
-
12
7,18 (d; 2,0)
7,16 (d; 2,0)
13
-
-
14
-
-
15
6,65 (d; 8,5)
6,64 (d; 6,8)
16
6,91 (m)
6,91 (m)
17
2,58 (m)
2,33 (m)
2,70 (dd; 13,9 e 8,8)
2,49 (m)
18
4,90 (m)
4,88 (m)
19
-
-
20
1,73 (s)
1,60 (s)
21
1,69 (s)
1,52 (s)
22
1,16 (s)
1,05 (s)
23
1,00 (s)
0,91 (s)
24
2,03 (m)
2,04 (m)
2,11 (m)
2,56 (m)
25
4,86 (m)
4,91 (m)
26
-
-
27
1,65 (s)
1,65 (s)
28
1,50 (s)
1,60 (s)
29
1,92 (dd; 13,9 e 5,6)
1,01 (d; 13,1)
2,02 (m)
2,90 (dd; 14,2 e 3,4)
30
2,55 (m)
1,24 (m)
31
-
-
32
4,47 (m)
0,75 (s)
33
1,61 (s)
1,17 (s)
34
1,46 (m)
1,47 (m)
35
1,85 (m)
4,91 (m)
36
-
-
37
4,63 (d; 6,4)
1,64 (s)
38
1,58 (s)
1,61 (s)
[M-1] (Figura 93). Das benzofenonas isoladas de G. xanthochymus apenas cinco
apresentaram massa molecular de 602 g.mol
-1
(BAGGETT et al., 2005; BASLAS; KUMAR,
1979 e 1981; KARANJGOAKAR, et al., 1973; RAMA RAO; VENKATSWAMY; YEMUL,
1980) como mostra a Tabela 16. De acordo com os dados de RMN
1
H, padrão de
Resultados e Discussão 128
fragmentação de cada substância e sinais apresentados através da EM2 pela subfração
AcOEt-FRU-7 (m/z 465, 409 e 273) pode-se inferir que a mesma constitui-se do
xantochimol e cicloxantochimol, identificados como substâncias 19 e 20, respectivamente.
Figura 91 - Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da subfração AcOEt-FRU-7 obtido
via CLAE-UV-DAD no modo isocrático MeOH:H
2
O:HOAc (75:24,5:0,5), suporte cromatográfico:
ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5m) e detecção em λ=254 nm.
Figura 92 - Espectro de RMN de
1
H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d
6
).
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
30.96/ 1.00
229
314
566
201
251
356
672
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU
254nm,4nm (1.00)
(a)
(b)
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mAU
30.96/ 1.00
229
314
566
201
251
356
672
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU
254nm,4nm (1.00)
(a)
(b)
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
Xanthochymol (19)
Cicloxanthochymol (20)
20
21
12
5
23
24
22
8
34
2
10
1
29
17
32
33
9
37
38
32
33
29
34
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
Xanthochymol (19)
Cicloxanthochymol (20)
20
21
12
5
23
24
22
8
34
2
10
1
29
17
32
33
9
37
38
32
33
29
34
Resultados e Discussão 129
Tabela 16 - Fragmentos obtidos de benzofenonas isoladas de G. xanthochymus através de EM e EM2.
Compostos
EM
(íon molecular)
EM2
(principais fragmentos)
m/z
m/z
m/z
cicloxantochimol
601,4
465
-
isoxantochimol
601,4
433
203
Gutiferona E
601,4
449
177
Gutiferona H
601,4
*
*
xantochimol
601,4
409
273
* dados não encontrados na literatura
601.4
-MS, 3.2min #61
465.3
409.2
273.2
-MS2(601.4), 30eV, 5.0min #95
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intens.
0
50
100
150
200
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z
Figura 93 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da subfração AcOEt-FRU-7,
obtido em modo negativo com energia de colisão de 30% para EM2 (ESI).
As substâncias 21, 22 e 23 (derivados de ácidos fenilpropanoídicos), isoladas da
subfração BuOH-FOL-6 (procedimento experimental 5.10) e da subfração AcOEt-SIL-11
(procedimento experimental 5.9), apresentou pequena quantidade de massa, o que
inviabilizou o processo de elucidação estrutural por técnicas convencionais de RMN mono
e bidimensionais. Assim, a identificação foi realizada a partir da comparação dos íons
precursores e de seus produtos de fragmentação (razão m/z e intensidade dos fragmentos
em relação ao pico base, em porcentagem), de acordo com dados da literatura (CLIFFORD
et al., 2003 e 2006). Como apresentado na tabela 14, o ácido 4-cafeoilquínico (4-ACQ)
apresenta pico base em m/z 173 [M-H]
-
, diferentemente dos isômeros 3-ACQ e 5-ACQ,
que apresentam pico base em m/z 191 [M-1]. Comparando-se o espectro de primeira e
segunda-ordem da substância 22 (Figura 94) com o padrão de fragmentação apresentado
pelo 4-ACQ, pode-se identificar 22 como ácido 4-cafeoilquínico. De maneira análoga, as
substâncias 21 e 23 foram identificadas como ácidos 3-p-coumaroilquínico (3-ApCoQ) e
4-p-coumaroilquínico (4-ApCoQ), respectivamente (Figura 95).
(a)
(b)
Resultados e Discussão 130
353.1
-MS, 8.2min #157
173.0
353.1
179.0
191.0
-MS2(353.1), 15eV, 4.0min #76
0
200
400
600
800
Intens.
0
100
200
300
400
500
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 94 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 22, obtido em
modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI).
163.0
337.1
-MS, 3.9min #75
163.0
191.1
-MS2(337.1), 15eV, 5.4min #104
0
500
1000
1500
2000
2500
Intens.
0
100
200
300
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
163.0
337.1
-MS, 5.6min #107
119.0
173.0
163.0
-MS2(337.1), 15eV, 2.3min #45
0.0
0.5
1.0
1.5
4
x10
Intens.
0
200
400
600
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Figura 95 - Espectro de massas de primeira e segunda-ordem obtido em modo negativo com
energia de colisão de 15% para EM2 (ESI) da (a) substância 21 e da (b) substância 23.
(a)
(b)
(a)
(b)
OH
O
HOOC
OH
OH
O
OH
OH
HOOC
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
HOOC
OH
O
OH
O
OH
(21)
(23)
(22)
Resultados e Discussão 131
6.4 Identificação de triterpenos e esteróides presentes nos extratos de
baixa polaridade de Garcinia xanthochymus utilizando cromatografia
gasosa (CG)
A bioatividade de extratos de baixa polaridade tem sido frequentemente associada a
misturas complexas de triterpenóides e/ou esteróides, sem no entanto, uma análise mais
aprofundada de identificação dos componentes da mistura. Isso acontece, em primeiro
lugar, porque os procedimentos de fitoquímica tradicional, que incluem isolamento dos
componentes de misturas de diversos componentes, icluindo isômeros, podem ser afanosos
e relativamente caros. Em segundo lugar, devido à sua complexidade estrutural, a análise
Figura 96 - Estruturas dos triterpenos e esteróides identificados nos extratos e frações de baixa
polaridade de Garcinia xanthochymus.
de triterpenos e esteróides por técnicas espectroscópicas, tem se mostrado difícil em muitos
casos. A Cromatografia gasosa (CG) surgiu como uma das melhores técnicas analíticas
OH
H
H
H
OH
H
H
H
OH
H
H
H
OH
AcO
H
H
H
AcO
H
H
H
AcO
O
HH H
O
H
H
H
O
H
H
H
O
H
H
H
O
H
H
OH
OH
OH
(26)
(28)
(29)
(30)
(31)
(32)
(35)
(1)
(34)
(33)
(27)
(36)
(37)
(38)
(39)
Resultados e Discussão 132
para caracterização rápida, simples e relativamente barata de compostos apolares de
extratos de plantas (REGASINI et al., 2009).
Tabela 17 - Valores da retenção relativa das amostras com o colesterol.
Compostos
HEX-FOL
FR. HEX-
FOL
HEX-FRU
SPB-5
SPB-50
a b
a b
a b
(26)
-Amirina
1,36
-
1,37
-
-
-
1,38
2,02
(27)
-Amirina
-
-
1,31
1,78
1,31
1,82
1,32
1,80
(28) Lupeol
-
-
1,39
-
1,39
-
1,39
2,16
(29) Taraxerol
-
-
-
1,74
-
-
1,29
1,75
(30) Acetato de
-amirina
1,55
-
-
-
-
-
1,57
2,25
(31) Acetato de
-amirina
-
-
-
1,93
-
1,92
1,49
1,93
Acetato de lupeol
-
-
-
-
-
-
1,58
2,27
Acetato de bauerenila
-
-
-
-
-
-
-
2,54
(32) Acetato de taraxerol
1,46
-
1,44
1,93
1,44
1,92
1,46
1,93
Acetato de friedelanoíla
-
-
-
-
-
-
1,82
2,95
(1) Friedelina
-
2,76
-
-
-
-
1,58
2,78
(33) Lupenona
1,36
-
-
-
-
-
1,34
2,01
(34)
-Amirenona
1,36
1,95
-
-
-
-
1,34
1,94
(35)
-Amirenona
1,28
-
1,28
1,74
1,28
1,73
1,28
1,73
(36) Germanicona
-
-
1,26
-
1,26
-
1,26
1,66
(37) Campesterol
1,12
1,21
-
-
1,13
-
1,13
1,23
(38) Estigmasterol
1,18
-
1,19
-
1,19
1,30
1,18
1,30
(39)
-Sitosterol
-
-
1,26
1,48
1,26
1,45
1,26
1,48
Estigmas-4en-3-ona
-
-
-
-
-
-
-
-
Colesterol
1
1
1
1
1
1
1,00
1,00
“a” significa que a análise foi realizada em SBP-5 e “b” realizada em SPB-50.
Diante deste contexto, o extrato hexânico das folhas (HEX-FOL), a fração hexânica
das folhas (FR. HEX-FOL) e o extrato hexânico dos frutos (HEX-FRU) foram analisados
por cromatografia gasosa (CG) em comparação às retenções relativas (RR) de triterpenos e
esteróis padrões relatadas por Crevelin (2006). A Tabela 17 e as Figura 96Figura 98
apresentam a composição química de cada amostra, realizadas nas duas colunas capilares
especificadas no item 4.1.8.
A exatidão do método é maior quando ocorre reprodutibilidade entre as colunas
capilares e, para maior confiabilidade do método, define-se que o erro não pode ultrapassar
duas casas decimais. Assim, pode-se inferir que a
-amirina, acetato de taraxerol,
-
amirenona e
-sitosterol estão presentes na FR. HEX-FOL e HEX-FRU com maior
Resultados e Discussão 133
confiabilidade. Também para
-amirenona e campesterol, presentes no HEX-FOL, e
estigmasterol, detectado somente no HEX-FRU, os dados apresentam alta confiabilidade.
Com menor reprodutibilidade, pode-se dizer que estão presentes no HEX-FOL a
-
amirina, acetato de
-amirina, acetato de taraxerol, friedelina, lupenona,
-amirenona e
estigmasterol. Adicionalmente, foram também detectados na FR. HEX-FOL, a
-amirina,
lupeol, germanicona e estigmasterol, e no HEX-FRU, o lupeol, acetato de
-amirina,
germanicona e campesterol.
Estes resultados mostram claramente que os extratos e frações de baixa polaridade de
dois diferentes órgãos de Garcinia xanthochymus apresentam grande similaridade em seus
perfis químicos, corroborando ainda mais a importância da desreplicação, etapa crucial,
que imprime maior agilidade a estudos de bioprospecção.
Figura 97 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-5 (a) do HEX-FRU [38 t
r
=22,05; 39
t
r
=23,38; 35 t
r
=23,82; 27 t
r
=24,43 e 32 t
r
=26,84] (b) da FR. HEX-FOL [39 t
r
=23,38; 35 t
r
=23,75;
27 t
r
=24,33 e 32 t
r
=26,75] (c) e do EXT-FOL [37 t
r
=20,41 e 34 t
r
=24,82], em presença de colesterol
(padrão interno).
Figura 98 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-50 (a) do HEX-FRU [38 t
r
=17,29; 39
t
r
=19,24; 35 t
r
=22,97; 27 t
r
=24,06 e 32 t
r
=25,46] (b) da FR. HEX-FOL [39 t
r
=19,11; 35 t
r
=22,80;
27 t
r
=23,31 e 32 t
r
=25,35] (c) e do EXT-FOL [37 t
r
=15,86 e 34 t
r
=25,64], em presença de colesterol
(padrão interno).
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)
(a)
Resultados e Discussão 134
6.5 Atividade biológica dos extratos, frações e substâncias isoladas de
Garcinia xanthochymus
6.5.1 Atividade antioxidante
As folhas de G. xanthochymus apresentaram melhores resultados de CI
50
quando
comparadas com os frutos da mesma espécie. Segundo a tabela abaixo, o Extrato Bruto
Etanólico das folhas (ETOH-FOL) mostrou-se bastante ativo com valor de CI
50
=12
µg/mL). Após o fracionamento por ELL, destacaram-se as frações AcOEt-FOL e BuOH-
FOL, com CI
50
de 11 µg/mL e 18 µg/mL, respectivamente, próximos ou menores aos
apresentados pelos controles positivos Trolox
®
(CI
50
=10 µg/mL) e quercetina (CI
50
=17
µg/mL).
Os resultados observados no gráfico (Figura 99) a na Tabela 18 corroboram a
importância de substâncias com unidades fenólicas e/ou núcleos catecólicos (presentes em
sua maioria em extratos polares) em antioxidantes em potencial.
Tabela 18 - Atividade antioxidante dos extratos e frações de Garcinia xanthochymus frente ao
radical DPPH.
Extratos e frações de Garcinia xanthochymus
CI
50
(µg/mL)
Folhas
ETOH-FOL
12
HEX-FOL
n*
FR. HEX-FOL
n*
AcOEt-FOL
11
BuOH-FOL
18
HA-FOL
19
Frutos
ETOH-FRU
n*
HEX-FRU
n*
AcOEt-FRU
n*
BuOH-FRU
n*
HA-FRU
n*
Trolox
10
Quercetina
17
n*: não apresentaram atividade significativa.
As substâncias 5, 8, 10-20 foram avaliadas a fim de verificar se alguma delas seria a
responsável pela forte atividade antioxidante apresentada nos extratos e/ou frações de G.
xanthochymus (Tabela 21).
As substâncias 8 e 16 apresentaram os melhores resultados com valores de CI
50
iguais
Resultados e Discussão 135
a 8 µg/mL e 6 µg/mL, respectivamente.
Figura 99 - Gráfico da curva de concentração dos extratos e frações (a) das folhas e dos (b) frutos
de G. xanthochymus versus a % de seqüestro de DPPH.
As substâncias 11, 14, 15, 17-20 apresentaram valores igualmente promissores, com
valores de CI
50
entre 9 e 12 µg/mL. As menores atividades foram observadas para as
substâncias 5, 10, 12 e 13, com valores de CI
50
maior que 100 µg/mL, consideradas
inativas por comparação com as outras substâncias citadas acima.
Como discutido no item 1.6 a combinação de substituição 3’,4’-diidroxi no anel B,
com insaturação em C-2-C-3 e uma função carbonila em C-4, são requisitos estruturais que
contribuem de maneira destacada para estabilização do radical flavonoídico, formado após
a doação de hidrogênio radicalar pelas substâncias antioxidantes em potencial (FURUNO;
AKASAKO; SUGIHARA, 2002). Os resultados encontrados estão de acordo com tais
observações, pois: 5, 10 e 12 são biflavonas monoidroxildas no anel B; 13 é um
monoaromático (menor número de estruturas mesoméricas); 11, 14 e 15 são biflavonóides
com grupos catecólicos em B, porém saturadas em C-2 e C-3; e 8 e 16 são biflavonas (com
insaturação em C-2-C-3) com um núcleo catecólico no anel B, corroborando as diferenças
de potencial sequestrador de radicais livres observados para as substâncias fenólicas de G.
xanthochymus.
6.5.2 Ensaio in vitro da polimerização de heme
A malária é considerada uma doença infecto-parasitária grave, transmitida por
protozoários do gênero Plasmodium, aflige mais de 500 milhões de pessoas causando, pelo
menos, 1 milhão de óbitos anuais, tendo como agravantes a resistência crescente do
Resultados e Discussão 136
parasita à quimioterapia e a falta de uma vacina eficaz. No Brasil, a região amazônica
concentra mais de 99% da transmissão da malária, representando um dos maiores
problemas de saúde pública, vindo figurar entre as grandes epidemias que assolam o país.
(KRETTLI et al., 2001; ALECRIM, 2000; ALSHAWSH et al., 2007)
Uma das mais importantes estratégias na busca de novos fármacos é a identificação
de novos alvos e a subseqüente descoberta de substâncias que sejam capazes de agir nestes
alvos. No caso da malária um destes alvos é a polimerização de heme (ROSENTHAL,
2003). No vacúolo digestivo ácido, o Plasmodium degrada 75% da hemoglobina do
hospedeiro e utiliza os seus aminoácidos para a síntese de proteínas. Nesse processo, heme
tóxica é liberada, armazenando-se na forma de um polímero inerte chamado hemozoína ou
pigmento malárico, onde o grupo propionato do heme liga-se ao Fe
3+
do outro heme.
Sendo assim, substâncias capazes de inibir a síntese de hemozoína podem servir de
modelos para a terapia da malária.
Ensaios empregando os extratos e frações das folhas de Garcinia xanthochymus
evidenciaram uma forte interação com o grupo heme, com valores de inibição da
polimerização do heme de 91 ± 1,5 % a 2.5 mg/mL. Após a partição do extrato bruto, a
fração AcOEt-FOL mostrou a maior atividade, com inibição de 84 ± 0,7 % a 2.5 mg/mL,
sugerindo a presença de substâncias com potencial atividade antimalárica nesta fração. Os
frutos apresentaram valores moderados de inibição da formação do polímero hemozoína,
com valores de 62 ± 2,5 % a 2.5 mg/mL para o ETOH-FRU, e 71 ± 3,5 % a 2.5 mg/mL
para a AcOEt-FRU (Tabela 19).
Tabela 19 - Atividade inibitória in vitro no ensaio de formação de β-Hematina para os extratos e
frações de Garcinia xanthochymus.
Extratos e frações de Garcinia xanthochymus
% inibição
(2,5 mg/mL)
Folhas
ETOH-FOL
91
HEX-FOL
53
FR. HEX-FOL
47
AcOEt-FOL
84
BuOH-FOL
n*
HA-FOL
n*
Frutos
ETOH-FRU
62
HEX-FRU
23
AcOEt-FRU
71
BuOH-FRU
5
HA-FRU
10
Quinina
88
Cloroquina
82
n*: não apresentaram atividade significativa.
Resultados e Discussão 137
6.5.3 Atividade antifúngica
Os resultados dos ensaios antifúngicos das amostras provenientes de folhas de G.
xanthochymus evidenciaram uma moderada atividade do HEX-FOL frente aos fungos
patogênicos humanos Candida krusei, Candida parapsilosis e Cryptococcus neoformans
usando o método de microdiluição e verificação da inibição em leitor automático de
microplacas (HOLETZ, 2002). Já as FR. HEX-FOL e AcOEt-FOL apresentaram uma
maior atividade frente aos fungos Candida parapsilosis e Candida krusei, respectivamente,
com valor de CIM igual a 31,3 µg/mL, valor próximo ao padrão comercial fluconazol
(CIM=16 µg/mL). Em relação aos frutos de Garcinia xanthochymus, os resultados foram
bastante promissores. Frente ao fungo Candida krusei os ETOH-FRU e HEX-FRU
apresentaram CIM de 1,95
µg/mL, resultado 8 vezes menor que o apresentado pelo padrão
comercial fluconazol (CIM=16 µg/mL). O HEX-FRU também foi bastante ativo frente ao
fungo Candida parapsilosis e Candida albicans, com CIM de 3,9 e 31,3 µg/mL,
respectivamente (Tabela 20).
Tabela 20 - Atividade antifúngica in vitro dos extratos e frações de G. xanthochymus frente a
fungos patogênicos humanos.
CIM (µg/mL)
Extratos e frações de
Garcinia xanthochymus
Candida
krusei
Candida
parapsilosis
Candida
albicans
Cryptococcus
neoformans
Folhas
ETOH-FOL
62,5
125
250,0
62,5
HEX-FOL
62,5
62,5
250,0
62,5
FR. HEX-FOL
125
31,3
250,0
125,0
AcOEt-FOL
31,3
250
250,0
62,5
BuOH-FOL
125
125
250,0
125,0
HA-FOL
250
250
250,0
250,0
Frutos
ETOH-FRU
1,95
>250,0
62,5
>250,0
HEX-FRU
1,95
3,9
31,3
>250,0
AcOEt-FRU
7,8
>250,0
125,0
>250,0
BuOH-FRU
>250,0
>250,0
>250,0
>250,0
HA-FRU
>250,0
>250,0
>250,0
250,0
Fluconazol
16,0
As substâncias isoladas da fração AcOEt-FOL de G. xanthochymus (Substs. 5, 8, 10,
11, 14-16) apresentaram atividade antifúngica fraca (CIM de 62,5 µg/mL), resultados
coerentes com o apresentado pela fração AcOEt-FOL, que apresentou fraca atividade
frente ao fungo Cryptococcus neoformans (CIM de 62,5 µg/mL) e moderada atividade
Resultados e Discussão 138
frente ao fungo Candida krusei (CIM de 31,3 µg/mL). As substâncias 17 e 18 não
apresentaram atividade fungitóxica, também concordante com a fração de origem BuOH-
FOL. A mistura de substâncias majoritárias nos frutos de G. xanthochymus (Substs. 19 e
20) parece não ser a responsável pela forte atividade antifúngica apresentada pelo ETOH-
FRU (CIM de 1,95 µg/mL), pois apresentou valor de CIM maior que 250 µg/mL (Tabela
21), sugerindo a presença de outros metabólitos minoritários mais ativos.
Tabela 21 - Atividade biológica dos constituintes isolados das folhas e frutos de Garcinia
xanthochymus.
Substâncias
antioxidante
antifúngica
tripanocida
CI
50
(µg/mL)
Candida
krusei
CIM
(µg/mL)
Candida
parapsilosis
CIM
(µg/mL)
Candida
albicans
CIM
(µg/mL)
Cryptococcus
neoformans
CIM
(µg/mL)
CI
50
(µg/mL)
1
-
-
-
-
-
n*
2
-
>250
>250
>250
>250
n*
3
-
>250
>250
>250
>250
n*
4
-
-
-
-
-
n*
5
n*
-
-
125
62,5
n*
6
-
-
-
-
-
n*
7
-
-
-
-
-
n*
8
8
62,5
250
125
62,5
n*
9
-
-
-
>250
250
n*
10
n*
-
-
62,5
62,5
n*
11
11
62,5
125
125
62,5
n*
12
n*
> 250
-
-
250
n*
13
n*
-
-
125
250
75,6
14
9
250
62,5
125
62,5
n*
15
11
62,5
125
125
250
n*
16
6
-
-
62,5
250
n*
17
12
125
250
125
62,5
n*
18
12
125
250
125
62,5
n*
19 e 20
9
>250
>250
>250
>250
36,9
Benzonidazol
Fluconazol
17
16
9,7
Quercetina
n*: não apresentaram atividade significativa.
6.5.4 Atividade tripanocida
A atividade tripanocida foi mais pronunciada nas amostras provenientes dos frutos do
que as folhas de G. xanthochymus com CI
50
de 21,2 µg/mL para o HEX-FRU. Este
resultado, quando comparado com a droga usada atualmente contra a Doença de Chagas, o
Resultados e Discussão 139
benzonidazol (CI
50
de 9,7 µg/mL), incentiva o estudo na busca de micromoléculas
antiparasitárias nesta matriz para servirem de modelos no desenvolvimento de novos
agentes terapêuticos para o tratamento da Doença de Chagas (Tabela 22).
Conforme dados da tabela 20, somente a substância 13 e a mistura de 19 e 20
exibiram dados de CI
50
, com valores de 75,6 µg/mL e 36,9 µg/mL, respectivamente. A
baixa atividade antiparasitária dos biflavonóides em questão está de acordo com as
publicações anteriores (MBWAMBO, et al., 2006; WENIGER, et al., 2006). Diversos tipos
estruturais de biflavonóides já foram testados frente aos parasitas Trypanosoma brucei
brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum e Plasmodium falciparum e em quase
todos os casos, biflavonóides do tipo 38’’ apresentaram-se inativos.
Tabela 22 - Atividade tripanocida dos extratos e frações de G. xanthochymus.
Extratos e frações de Garcinia xanthochymus
CI
50
(µg/mL)
Folhas
ETOH-FOL
> 100
HEX-FOL
> 100
FR. HEX-FOL
> 100
AcOEt-FOL
> 100
BuOH-FOL
50,2
HA-FOL
> 100
Frutos
ETOH-FRU
90,2
HEX-FRU
21,2
AcOEt-FRU
160,2
BuOH-FRU
n*
HA-FRU
n*
Benzonidazol
9,7
n*: não apresentaram atividade significativa.
6.5.5 Atividade quimiopreventiva
O experimento para avaliação do potencial de quimioprevenção(item 5.18), através
da indução da enzima quinonaredutase (QR) empregando-se a linhagem celular hepa-
1c1c7 em teste espectrofotométrico realizado com os extratos e frações de G.
xanthochymus, indicaram potencial quimiopreventivo moderado. Porém, a (+)-
morelloflavona (Subs. 8) mostrou-se com uma elevada capacidade de indução da atividade
da enzima QR, como é observado na Tabela 23. Há uma duplicação da atividade indutora,
sugerindo que substâncias com estruturas semelhantes a da 4’-bromoflavona (4’-BF,
padrão comercial) podem ser protótipos para agentes quimiopreventivos, contribuindo para
inibir a instalação de eventos iniciais associados à etiologia do câncer.
Resultados e Discussão 140
Tabela 23 - Avaliação da taxa de indução (IR) da atividade de QR em linhagem Hepa1c1c7 para 8.
IR
CI
50
(µM)
CD (µM)
IQ
Morelloflavone
2,15 ± 0,5
84,2 ± 4,5
28,7 ± 1,4
2,93 ± 2,1
4'-BF
3,0 ± 0,6
> 166
0,01*
>17,000*
Conclusões 141
7 CONCLUSÕES
O estudo químico e biológico das folhas e frutos da espécie Garcinia xanthochymus,
através do isolamento e/ou identificação de 25 substâncias, demonstrou coerência com
relatos encontrados na literatura no que concerne a química da família Clusiaceae.
Dentre as substâncias isoladas, podemos destacar 3 triterpenos obtidos do extrato
hexânico das folhas: friedelina (1), lanosta-8,24-dien-3-ol (2) e lanosta-7,24-dien-3-ol (3),
sendo que as substâncias 2 e 3 foram relatadas pela primeira vez na literatura da espécie.
A prospecção química da fase acetato de etila das folhas revelou uma abundante presença
de biflavonóides, sendo as substâncias saharanflavona (4), I3,II8-biapigenina (5), GB1a
(6), (+) morelloflavona (8), GB2a (11), volkensiflavona (12), GB2 (14), xantochimusídeo
(15) e fukugisídeo (16), caracterizadas pela ligação interflavonoídica do tipo 38’’, e as
substâncias podocarpusflavona (7) e amentoflavona (9), pela ligação do tipo 3’8’’.
Merece destaque a substância 4, isolada pela primeira vez de fontes naturais. Este
biflavonóide foi sintetizado por Pelter et al. em 1970 e depois só obtido novamente de
forma sintética. A composição química de G. xanthochymus constituiu-se ainda das
substâncias diidrokaempferol (10), ácido vanílico (13), cinco derivados de ácidos
fenilpropanoídicos: ácido 3-O-cafeoilquínico (17), ácido 5-O-cafeoilquínico (18), ácido 3-
p-coumaroilquínico (21), ácido 4-O-cafeoilquínico (22) e ácido 4-p-coumaroilquínico (23);
e ainda a mistura binária das benzofenonas xantochimol (19) e cicloxantochimol (20).
Todas as substâncias foram relatadas pela primeira vez nas folhas de G. xanthochymus,
com exceção da substância 7, isolada anteriormente por PARVEEN et al. (1994) e as
substâncias 10, 13, 17, 18, 21, 22 e 23, ainda não identificadas na espécie.
No estudo biológico realizado com os extratos, frações e substâncias puras isoladas
dos frutos e folhas de G. xanthochymus, foram avaliados o potencial antioxidante,
antimalárico, antifúngico, tripanocida e quimiopreventivo em testes in vitro
espectrofotométricos e/ou enzimáticos. Os resultados observados para o ensaio de
sequestro de radicais livres utilizando o radical DPPH evidenciaram a importância dos
grupos catecólicos como essenciais para uma ação antioxidante potencializada. Os
biflavonóides comportaram-se como potentes seqüestradores de radical livre com CI
50
compreendidos entre 6 e 12 µg/mL, configurando-se como promissores modelos para
aplicação no desenvolvimento de novos protótipos antioxidantes. A fração AcOEt-FOL
evidenciou uma forte interação com o grupo heme, com inibição de 84 ± 1% a 2.5 mg/mL,
Conclusões 142
sugerindo a presença de substâncias com potencial atividade antimalárica nesta fração. Em
relação à atividade antifúngica, a fração HEX-FOL e a fração AcOEt-FOL mostraram-se
moderadamente ativas frente aos fungos patogênicos humanos Candida parapsilosis e C.
krusei, enquanto os extratos ETOH-FRU e HEX-FRU dos frutos de Garcinia
xanthochymus apresentaram resultados muito atrativos, com CIM de 1,95
µg/mL, cerca de
oito vezes menor que o apresentado pelo padrão comercial fluconazol (CIM=16,0 µg/mL).
Também a atividade tripanocida foi mais pronunciada nas amostras provenientes dos frutos
do que das folhas de G. xanthochymus com CI
50
de 21,2 µg/mL para o HEX-FRU, o que
incentiva seu estudo na busca de micromoléculas antiparasitárias ou de protótipos para o
desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento da Doença de Chagas. A (+)-
morelloflavona (8) mostrou elevada capacidade de indução da atividade da enzima
quinona-redutase, confirmando o potencial quimiopreventivo atrativo de flavonóides, em
especial de flavonas e seus derivados, incluindo biflavonóides com pelo menos uma
unidade de flavona, como apresentado na estrutura da substância 8. Esses resultados
indicam G. xanthochymus como uma fonte rica de substâncias quimiopreventivas que
sejam potencialmente úteis para inibir a instalação dos eventos iniciais associados à
etiologia do câncer.
De maneira global, os resultados de bioatividade dos extratos, frações
semipurificadas e substâncias isoladas de G. xanthochymus confirmaram a importância de
estudos de bioprospecção planejados e conduzidos de maneira adequada, mostrando-se
indispensáveis para as etapas desenvolvidas neste trabalho. Dessa forma, foi possível a
obtenção de um conjunto de dados de alto valor agregado, a partir do qual podem ser
selecionadas frações ou substâncias puras para estudos mais aprofundados, incluindo o
preparo de derivados, visando a potencialização de bioatividade ou ajuste de propriedades
farmacocinéticas e/ou toxicológicas durante o processo de desenvolvimento de potenciais
agentes terapêuticos.
A técnica CG-DIC mostrou-se eficiente e rápida na detecção de esteróides e
triterpenos em misturas complexas. Foram identificados 15 compostos lipofílicos sem a
necessidade de etapas demoradas e caras que são características do processo em escala
preparativa. A utilização das técnicas hifenadas CLAE-UV e CLAE-EM foi imprescindível
não somente para obter dados espectrométricos das substâncias isoladas, mas também para
localizar substâncias já isoladas neste estudo e/ou isoladas em trabalhos anteriores,
evitando-se a replicação de resultados. Fica evidente o grande potencial dessas técnicas na
localização e identificação de substâncias de interesse em matrizes complexas, como
Conclusões 143
extratos vegetais, que são fundamentais para atender à crescente demanda, decorrente da
intensificação das atividades de bioprospecção, que se configuram como um dos principais
focos das pesquisas realizadas pelo NuBBE.
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Anexos 155
Anexos
Anexos 156
Anexo 1. Espectro de RMN de
1
H da substância 1.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexo 2. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexos 157
Anexo 3. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexo 4. Espectro de RMN de
13
C da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 158
Anexo 5. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 6. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 159
Anexo 7. Espectro de DEPT 135° da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 8. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 160
Anexo 9. Espectro de DEPT 90° da substância 1.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 10. Espectro de RMN de
1
H da substância 2.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexos 161
Anexo 11. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 1.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexo 12. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 2.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexos 162
Anexo 13. Espectro de RMN de
13
C da substância 2
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 14. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 163
Anexo 15. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 16. Espectro de DEPT 135° da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 164
Anexo 17. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 18. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 165
Anexo 19. Espectro de DEPT 90° da substância 2.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 20. Espectro de RMN de
1
H da mistura 2 e 3.
(500 MHz – CDCl
3
)
Anexos 166
Anexo 21. Espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 22. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 167
Anexo 23. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexo 24. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da mistura 2 e 3.
(125 MHz – CDCl
3
)
Anexos 168
Anexo 25. Espectro de RMN de
1
H da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 26. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 169
Anexo 27. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 28. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 170
Anexo 29. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 30. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 4
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 171
Anexo 31. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 32. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 172
Anexo 33. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 34. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 173
Anexo 35. Espectro de HOMODEC da substância 4
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 36. Espectro de NOESY 1D (irradiação em
H
6,25) da substância 4.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 174
Anexo 37. Espectro de RMN de
1
H da substância 5
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 38. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 175
Anexo 39. Espectro de RMN de
13
C da substância 5.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 40. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 5.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 176
Anexo 41. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 5.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 42. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 177
Anexo 43. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 44. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 178
Anexo 45. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 46. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 179
Anexo 47. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 48. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 180
Anexo 49. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 50. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 181
Anexo 51. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 52. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 182
Anexo 53. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 5.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 54. Espectro de RMN de
1
H da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 183
Anexo 55. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 56. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 184
Anexo 57. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 58. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 185
Anexo 59. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 60. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 186
Anexo 61. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 62. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 187
Anexo 63. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 64. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 188
Anexo 65. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 66. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 189
Anexo 67. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 68. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 190
Anexo 69. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 70. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 8.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 191
Anexo 71. Espectro de RMN de
1
H da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 72. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 192
Anexo 73. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 74. Espectro de RMN de
13
C da substância 9.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 193
Anexo 75. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 9.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 76. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 9.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 194
Anexo 77. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 78. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 195
Anexo 79. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 80. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 196
Anexo 81. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 82. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 197
Anexo 83. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 84. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 198
Anexo 85. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 9.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 86. Espectro de RMN de
1
H da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 199
Anexo 87. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 88. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 200
Anexo 89. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 90. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 201
Anexo 91. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 92. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 202
Anexo 93. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 94. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 203
Anexo 95. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 96. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 10.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 204
Anexo 97. Espectro de RMN de
1
H da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 98. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 11
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 205
Anexo 99. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 100. Espectro de RMN de
13
C da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 206
Anexo 101. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 102. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 207
Anexo 103. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 104. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 208
Anexo 105. Espectro de DEPT 135° da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 106. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 209
Anexo 107. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 108. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 210
Anexo 109. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 110. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 211
Anexo 111. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 112. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 212
Anexo 113. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 114. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 213
Anexo 115. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 116. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 214
Anexo 117. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 118. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 215
Anexo 119. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 120. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 216
Anexo 121. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 122. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 217
Anexo 123. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 124. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 218
Anexo 125. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 11.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 126. Espectro de RMN de
1
H da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 219
Anexo 127. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 128. Espectro de RMN de
13
C da substância 12.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 220
Anexo 129. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 130. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 221
Anexo 131. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 12.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 132. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 222
Anexo 133. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 134. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 223
Anexo 135. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 136. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 224
Anexo 137. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 138. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 225
Anexo 139. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 140. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 226
Anexo 141. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 142. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 227
Anexo 143. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 144. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 228
Anexo 145. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 146. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 12.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 229
Anexo 147. Espectro de RMN de
1
H da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 148. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 230
Anexo 149. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 150. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 231
Anexo 151. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 152. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 232
Anexo 153. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 154. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 13.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 233
Anexo 155. Espectro de RMN de
1
H da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 156. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 234
Anexo 157. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 158. Espectro de RMN de
13
C da substância 14.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 235
Anexo 159. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 160. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 236
Anexo 161. Ampliação do espectro de RMN de
13
C da substância 14.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 162. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 237
Anexo 163. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 164. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 238
Anexo 165. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 166. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 239
Anexo 167. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 168. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 240
Anexo 169. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 170. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 241
Anexo 171. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 172. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 14
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 242
Anexo 173. Espectro de RMN de
1
H da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 174. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 243
Anexo 175. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 176. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 244
Anexo 177. Espectro de RMN de
13
C da substância 17.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 178. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 245
Anexo 179. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 180. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 246
Anexo 181. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 182. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 247
Anexo 183. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 184. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 248
Anexo 185. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 186. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 249
Anexo 187. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 188. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 250
Anexo 189. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 190. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 17.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 251
Anexo 191. Espectro de RMN de
1
H da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 192. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 252
Anexo 193. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 194. Ampliação do espectro de RMN de
1
H da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 253
Anexo 195. Espectro de RMN de
13
C da substância 18.
(125 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 196. Mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 254
Anexo 197. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 198. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
1
H gCOSY da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 255
Anexo 199. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 200. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 256
Anexo 201. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 202. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMQC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 257
Anexo 203. Mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 204. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 258
Anexo 205. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 206. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 259
Anexo 207. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexo 208. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
Anexos 260
Anexo 209. Ampliação do mapa de contorno
1
H-
13
C gHMBC da substância 18.
(500 MHz – DMSO-d
6
)
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