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II
Estruturas secretoras, parede celular e mecanismos
de secreção
Emilio de Castro Miguel
Tese a ser apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Biociências e
Biotecnologia para a obtenção do título de Doutor
em Biociências e Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Maura Da Cunha
Universidade Estadual do Norte Fluminense-Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes
Fevereiro de 2010
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III
Mecanismos de defesa de plantas: Estruturas
secretoras, parede celular e processos que envolvem
a secreção
Emilio de Castro Miguel
Tese a ser apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Biociências e
Biotecnologia para a obtenção do título de Doutor
em Biociências e Biotecnologia
Aprovada em 4 de fevereiro de 2010.
Comissão Examinadora
___________________________________________________
Dra. Helena Regina Pinto Lima - IB - UFRRJ
___________________________________________________
Dra. Claudia Franca Barros - IPJBRJ
___________________________________________________
Dr. Claudio Andrés Retamal - LBCT-CBB-UENF
___________________________________________________
Dra. Maura Da Cunha - LBCT-CBB-UENF
(orientadora)
IV
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Centro de
Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense-Darcy Ribeiro,
sob orientação da Dra. Maura Da Cunha e com financiamento da CAPES, PETROBRAS,
CNPq e FAPERJ e bolsa de doutorado concedida pela CAPES, durante a vigência do curso.
V
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus por colocar as pessoas certas no meu caminho, me dar
forças e exemplos para seguir sempre em frente sem fraquejar, e sempre cuidar de mim.
Quanto mais o tempo passa, mais tenho a certeza que escolhi o caminho da coletividade.
Se não houvesse escolhido esse, estaria bastante longe de onde estou agora, seria menos feliz que
sou agora. E como é bom conviver com pessoas como essas as quais agradeço. Pessoas que
fizeram parte da minha vida, científica ou não. Muito ou pouco, cada uma teve o seu tempo, cada
uma teve o seu lugar.
Sinto-me impotente em não conseguir agradecer com mais tempo e espaço a cada uma
dessas pessoas. A todos vocês, o meu muito obrigado.
Agradeço...
À Dra. Maura Da Cunha com quem aprendi quase tudo. Mãe científica, bondade e paciência.
Muito obrigado.
Aos membros da banca, Dra. Helena Regina Pinto Lima (IB/UFRRJ), Dra. Claudia Franca Barros
(IPJBRJ), Dr. Claudio Andrés Retamal (LBCT-CBB-UENF), por aceitarem o convite.
A André Oliveira pela criteriosa e valorosa revisão.
Ao Dr. Flávio Miguens, um louco incentivador da pesquisa científica, com quem tive o prazer de
aprender.
Aos amigos do grupo da Profa. Maura Da Cunha: Guilherme Rabelo, Germana Bueno, Isabel
Titoneli, Tarsila Moraes, Camilla Alexandrino, Cristiane Tulli, Marcos Vinicios Almeida, Glaziele
Campbell, Ricardo Alves e Thaisa Capato pelo divertido e paciente convívio dentro de um espaço
tão pequeno, porém agradável.
Aos técnicos do LBCT em especial Giovanna Alves e Beatriz Ferreira.
À chefia do LBCT, na figura do Dr. Flávio Miguens e, posteriomente, Dr. Renato DaMatta, pelo
apoio.
À Dra. Helena Regina Pinto Lima, generosa incentivadora e colaboradora.
À Dra. Elsie Guimarães (JBRJ) pela identificação correta da espécie de Piper.
VI
Dra. Maria Auxiliadora Kaplan, Dr. Leosvaldo Velozo, Ana Paula Tindrade, do NPPN da UFRJ pela
ajuda nas análises dos óleos essenciais.
Aos amigos Germana e Umberto Zottich companheiros e incentivadores dentro e fora do
laboratório.
À minha família, à qual dedico esse trabalho. Sem vocês eu não seria NADA. Obrigado Papai,
Obrigado Mamãe, Obrigado minha linda Thaiz, Obrigado meu querido Lucas.
À Thaiz Rangel, amor da minha vida. Inspiração e compreensão para todos os momentos. Minha
vida, meu amor, meu sonho. Obrigado por fazer parte de tudo isso.
A Saulo Pireda, fiel escudeiro, companheiro de todas as horas. A disposição em pessoa.
Lucas Miguel, meu grande irmão. Presente, da sua forma, em todos os momentos.
Raul Murito, irmão por opção. Longe ou perto sempre com a mesma amizade e compreensão.
Wendel Pompilho, companheiro de todo o tempo. Amigo-irmão.
Aos membros da Pig House, Ronan Tessinari, Leandro Mattos e Steveen Leal, pela convivência na
bagunça mais organizada que conheci.
Aos ex-membros da Pig House, distantes, mas não menos importantes, Pablo, Abraao, Douglas e
Luís Cezar.
Fica aqui também, uma homenagem a todos os que passaram de alguma forma por essa
tese e não foram mencionados. Obrigado aos que eu me esqueci de agradecer.
VIII
ÍNDICE
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ............................................................................... 01
2 INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................................... 03
2.1 A familia Rubiaceae e o gênero
Psychotria (Cham. & Schltdl.) Wawra 04
2.1.1 O gênero
Bathysa C. Presl.. ............................................... 05
2.2 A família Piperaceae e Piper hoffmannseggianum Schult .................. 07
2.3 A família Euphorbiaceae e Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp ......... 07
2.4 Estruturas secretoras em plantas ..................................................... 08
2.4.1 Coléteres ............................................................................... 10
2.4.2 Tricomas secretores ............................................................. 11
2.4.3 O processo secretor e senescência de estruturas secretoras 12
2.5 Parede celular vegetal ...................................................................... 14
2.6 Estruturas secretoras e mecanismos de defesa de plantas .............. 15
3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 17
3.1 Objetivo geral .................................................................................... 17
3.2 Objetivos específicos ......................................................................... 17
4. RESULTADOS ................................................................................................... 18
4.1 Capítulo 1 ........................................................................................... 18
4.2 Capítulo 2 ........................................................................................... 34
4.3 Capítulo 3 ........................................................................................... 59
4.4 Capítulo 4 ........................................................................................... 87
5 DISCUSSÃO GERAL .......................................................................................... 134
6 CONCLUSÕES .................................................................................................. 143
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 146
IX
RESUMO
Estruturas secretoras produzem diferentes substâncias sendo encontradas em diversas formas e
em diferentes locais da planta. Estas estruturas podem se desenvolver a partir de diferentes tipos
de tecidos meristemáticos e sofrem em geral, transformações relativamente rápidas durante sua
diferenciação. Com isso a estrutura, ultraestrutura e conteúdo químico das células podem sofrer
modificações em dias ou até mesmo em horas. A diversidade de tipos, levando-se em
consideração não só a morfologia, como também sua posição e funcionamento, dificultam a
classificação das estruturas secretoras. Muitas podem atuar no processo de defesa das plantas,
especialmente pela ação dos seus exsudatos. Neste sentido o objetivo desse trabalho foi investigar
mecanismos de defesa estruturais de plantas relacionando sua função com a estrutura e os
processos que envolvem a secreção, utilizando para tanto modelos de estruturas secretoras e da
parede periclinal externa. Para tanto, utilizou-se técnicas de microscopia óptica, eletrônica de
varredura e transmissão, além de cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa. Esta
tese foi escrita na forma de capítulos sendo esses organizados na forma de artigos científicos,
destinados especificamente a revistas científicas na área de botânica. Foram descritos os coléteres
estipulares em
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra (Rubiaceae); Bathysa gymnocarpa K.
Schum. e
B. stipulata (Vell.) C. Presl. (Rubiaceae) sendo que nas duas ultimas espécies foi descrito
o processo de senescência. Foram investigados estruturalmente os tricomas secretores de
Piper
hoffmannseggianum
Schult .e composição do seu óleo essencial. As paredes periclinais externas
dos coléteres de
B. nicholsonii K. Schum. e C. thymifolia (L.) Millsp foram investigadas e
comparadas quanto à sua estrutura e função, especialmente quanto à sua funcionalidade,
passagem de moléculas e mecanismos de defesa. O estudo em questão contribui para o
conhecimento de estruturas secretoras em plantas, bem como seu mecanismo de defesa.
X
ABSTRACT
Secretory structures produces different substances, being founded under different forms and at
different plant tissues and organs. These structures can develop from many meristematic tissues e
pass in general, to relative quick transformation during their differentiation. With this the
structure, ultrastructure and cell biochemical contain can be modified in days or even in hours.
The type diversity, considering not only the morphology, but the position and working, turns these
secretory structures classification difficult. Many of them can act at plant defense process,
especially by exsudates action. This way, the aim of this work was investigated structural plant
defense mechanisms relating the function with structure and the processes involving the
secretion, utilizing for this models of secretory structures and outer cell wall. For these, utilized
optical, scanning and transmission electron microscopy techniques, and gas chromatography
coupled to mass spectrometry. The thesis was written in chapters and articles, destinated specific
to scientific journals at botany area. Stipular colleters of
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra
(Rubiaceae);
Bathysa gymnocarpa K. Schum. and B. stipulata (Vell.) C. Presl. (Rubiaceae) were
described. The two last species the senescence process was described.
Piper hoffmannseggianum
Schult . Secretory trichomes were investigated structurally and essential oil composition. B.
nicholsonii
K. Schum. and C. thymifolia Spurge colleters outer cell walls were investigated and
compared in structure and function, especially on functionality, molecules passage and defense
mechanism. This study contributed in secretory structures knowledge, as well as their defense
mechanism.
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
Ab – abaxial
Ad – adaxial
APG II – Angiosperm Phylogenetic Group
BSE – eletrons retroespalhados
Cit – citoplasma
CO
2
– dióxido de carbono
Cut – cutícula
EDS – energia dispersiva de elétrons
eV – elétron volt
kDa – quilo
alton
KeV – quilo elétron volt
MEV – microscopia eletrônica de varredura
MEV/EDS – microscopia eletrônica de
varredura por energia dispersiva de eletrons
Mg – magnésio
P - polissacarídeos
PBS – tampão fosfato salino
PBS/BSA – tampão fosfato salino com
soroalbumina bovina
Pol – polissacarídeos
PP – parede periclinal
PPE – parede periclinal externa
Ret – retículo
S – secreção
S – secreção
SAM – meristema do ápice caulinar
SAS – sítio de acúmulo de secreção
SC – célula secretora
SDS – sodium dodecil sulphate
Si/Li - Silício/lítio
SL – camada subepidérmica
SP – parênquima paliçádico
ST – estípula
T – tricoma
THC – tetrahidrocanabinol
VB – feixe vascular
1
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Esta tese foi escrita na forma de capítulos e artigos, destinados especificamente
a revistas científicas na área de botânica.
O primeiro capítulo intitulado
Coléteres estipulares em Psychotria nuda
(Cham. & Schltdl.) Wawra (Rubiaceae): micromorfologia, anatomia e microanálise
dos cristais gerou um artigo com o mesmo título, de autoria de Emilio de Castro
Miguel, Daniel Gomes de Moraes e Maura Da Cunha. Tal artigo encontra-se publicado
na revista Acta Botanica Brasilica 23(4) 1034-1039.
O segundo capítulo intitulado Ultraestrutura de coléteres senescentes e
secretores de Bathysa gerou um artigo intitulado Ultrastructure of secretory and
senescence phase in colleters of Bathysa gymnocarpa K. Schum. and B. stipulata
(Vell.) C. Presl. (Rubiaceae) de autoria de Emilio de Castro Miguel, Denise Espellet
Klein, Marco Antonio de Oliveira e Maura Da Cunha. Tal artigo encontra-se na segunda
revisão da Revista Brasileira de Botânica.
O terceiro capítulo intitulado
Tricomas de Piper hoffmannseggianum Schult.:
estrutura e composição do óleo essencial
gerou um artigo intitulado Piper
eucaliptophyllum C. DC. (Piperaceae) leaf ontogeny and secretory trichomes
ultrastructure
, de autoria de Emilio de Castro Miguel, Cristiane Ferrante Tullii, Maria
Isabel Titoneli Pacheco, Germana Bueno Dias, Helena Regina Pinto Lima, Leosvaldo
Salazar Marques Velozo, Ana Paula Felix Trindade, Maria Auxiliadora Kaplan e Maura
Da Cunha. Tal artigo foi escrito de acordo com as normas da revista
Annals of Botany.
O quarto capítulo intitulado Parede periclinal externa: uma breve comparação
entre estruturas secretoras e não secretoras gerou dois artigos. O primeiro, intitulado
Chamaesyce thymifolia (Euphorbiaceae) leaf epidermal cell walls under SEM/EDS de
autoria de Emilio de Castro Miguel, Guilherme Rodrigues Rabelo, Flavio Costa Miguens
e Maura Da Cunha foi escrito de acordo com as normas da revista Jounal of
Microscopy. O segundo, intitulado Outer cell wall ultrastructure and secretion
mechanism in Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) colleters, de autoria de
3
2 INTRODUÇÃO GERAL
Estruturas secretoras produzem diferentes substâncias sendo encontradas em
diversas formas e em diferentes órgãos da planta. Estas estruturas se desenvolvem a
partir de diferentes tipos de tecidos meristemáticos e, em geral, sofrem
transformações relativamente rápidas durante sua diferenciação. Com isso, a
estrutura, a ultraestrutura e o conteúdo químico das células secretoras podem ser
modificados em dias ou até em horas. A diversidade de tipos, levando-se em
consideração não só a morfologia, como também sua posição e funcionamento,
dificultam a classificação destas estruturas. Muitas podem atuar no processo de defesa
das plantas, especialmente pela ação dos seus exsudatos (Fahn, 1979; Dicknson, 2000).
A parede celular é um envoltório extracelular presente em todos os vegetais e
algumas bactérias, fungos e protozoários, cuja composição varia conforme o hábito de
cada organismo perante os processos evolutivos e adaptativos. Essa estrutura
impossibilita, até certo ponto, alterações morfológicas dos organismos, devido ao seu
caráter semi-rígido; ou seja, as células não conseguem alterar a forma em
conseqüência do impedimento espacial limitado pela rigidez da parede celular. Nas
plantas, a parede celular é composta principalmente por celulose, hemicelulose,
pectina e cálcio. Tem como principais funções o suporte estrutural e mecânico,
manutenção no tamanho e formato das células, resistência à pressão de turgor,
controle do crescimento celular dentre outros (Machado, 2005).
De modo geral, mecanismos de defesa de plantas contra a estresses bióticos e
abióticos podem ser divididos em duas categorias: constitutivos e induzidos.
Mecanismos constitutivos possuem ação durante o desenvolvimento normal da planta
enquanto os induzidos atuam em alguma resposta específica contra determinado
estímulo. Eles podem ser divididos ainda em estruturais, que atuam como barreiras
físicas que impedem o agressor de penetrar na planta, e químicos, que exercem suas
funções através de substâncias tóxicas que inibem o crescimento do organismo
agressor (Agrios, 1998; Shewry e Lucas, 1997).
4
Nesse sentido, o Laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Centro de
Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense conduz no
Setor de Biologia Vegetal o projeto de pesquisa intitulada Estruturas secretoras em
plantas: anatomia, ultraestrutura e biologia da secreção, sob a coordenação da
Professora Maura Da Cunha. Este projeto já apresenta resultados satisfatórios para
discussão do tema análise anatômica e ultraestrutural de diferentes estruturas
secretoras, caracterização de seus exsudados, bem como mecanismo de defesa e as
estratégias de externalização (Klein et al., 2004; Vieira et. al., 2006; Miguel et al.,
2006). Um exemplo de estudos em espécies de Rubiaceae pelo nosso grupo têm sido
estruturas envolvidas no mecanismo de defesa de plantas, com especial ênfase nos
coléteres, que são estruturas secretoras comum em espécies dessa família. O
ambiente encontrado em regiões de Floresta Atlântica é bastante úmido, sendo
propício para o desenvolvimento de diversos microrganismos, patógenos ou não,
sendo assim faz-se necessária à adaptação das plantas através de mecanismos de
defesa. Aliado a isto, a caracterização da composição da secreção das estruturas
secretoras em questão, bem como o teste de sua atividade biológica, proporcionam o
melhor entendimento do envolvimento da secreção no mecanismo de defesa dessas
espécies. O estudo da composição da secreção pode ainda contribuir para o
apontamento de algum aproveitamento econômico desse exsudado.
Por este motivo, nosso grupo permanece investindo no estudo de estruturas
secretoras relacionando aos mecanismos de defesa estruturais de plantas, sua função
com a estrutura e os processos que envolvem a secreção, utilizando para tanto
modelos de diferentes estruturas secretoras e da parede periclinal externa de espécies
de Floresta Atlântica.
2.1 A família Rubiaceae e o gênero Psychotria (Cham. & Schltdl.) Wawra
A família Rubiaceae encontra-se entre as quatro maiores famílias de
Angiospermas, considerando-se o número de espécies, depois das famílias Asteraceae,
Orchidaceae e Fabaceae (lato sensu = Leguminosae), com cerca de 13.000 espécies e
650 gêneros (Robbrecht, 2004). No Brasil, segundo Delprete (1998), a família
5
compreende aproximadamente 118 gêneros e 1.600 espécies. Nesta família encontra-
se ervas, subarbustos, arbustos ou árvores, e menos frequente, lianas. Possuem folhas
opostas, simples, sempre com estípulas interpeciolares, ocasionalmente
transformadas em espinhos ou semelhantes a galhas. As flores são vistosas ou não,
bissexuais ou menos freqüentemente unissexuadas (Souza e Lorenzi, 2005).
O gênero Psychotria L. é pantropical que pertence à tribo Psychotrieae
(Robbrecht, 1988). É comumente representado por arbustos, pequenas árvores, ervas
e raramente por epífitas. É um gênero pantropical e subtropical, encontrado nos dois
hemisférios. É comum no sub-bosque de matas tropicais (Taylor, 1996; Hamilton,
1990) apresenta aproximadamente 2.000 espécies.
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.)
Wawra é um arbusto com 1 a 5 metros de ampla distribuição e é denominada
vulgarmente de sonhos-de-ouro (EMBRAPA, 1994). Esta espécie é largamente
distribuída na Floresta Atlântica que cobre a costa oriental do Brasil.
2.1.1 O gênero Bathysa C. Presl.
O gênero Bathysa é representado por cerca de 15 espécies, sendo árvores,
arvoretas ou arbustos, distribuídos no Panamá, Guiana Francesa, Venezuela, Colômbia,
Peru, Bolívia e Brasil. No Brasil ocorrem sete espécies, todas exclusivas da Floresta
Atlântica das regiões sudeste e sul: B. mendonçaei, B. gymnocarpa, B. sylvestrae, B.
australis, B. stipulata, B. nicholsonii e B. cuspidata (Germano-Filho, 1999). Dentro
desse gênero foram selecionados para o estudo, as espécies Bathysa gymnocarpa K.
Shum., B. nicholsonii K. Shum. e Bathysa stipulata (Vell.) C. Presl. Grande parte do
ambiente dessas espécies está sendo destruído, devido à ação antrópica, e
conseqüentemente, algumas estão sendo ameaçadas de extinção.
Espécies do gênero Bathysa C. Presl. podem ser encontradas em diversos
remanescentes de Floresta Atlântica no estado do Rio de Janeiro. Algumas espécies
desse gênero são consideradas relevantes pelo índice de valor de importância (IVI)
para remanescentes estudados pelo Programa Mata Atlântica indicando então, uma
grande representatividade dessas espécies na área (Guedes-Bruni, 1998).
6
De acordo com Germano-Filho (1999), Bathysa gymnocarpa K. Shum. apresenta
árvores com até sete metros de altura, casca castanho acinzentada e estípulas
caducas, ocorre em matas primárias ou secundárias nas regiões serranas dos Estados
do Rio de Janeiro e São Paulo, na beira de picadas ou riachos dentro da mata. Pode
ser, segundo os critérios da International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources (IUCN), considerada protegida. É muito freqüente nos Estados do
Rio de Janeiro, onde é conhecida com o nome vulgar de “guamirim” e “guapeba-
branca”, e em São Paulo. Mantém populações significativas em áreas de preservação
tais como o Parque Nacional da Tijuca, Reserva Biológica de Tinguá e Estação Ecológica
do Paraíso.
Bathysa nicholsonii apresenta árvores com até sete metros com a casca
castanha com placas longitudinais; ramos crassos, possui estípulas persistentes. No
estado do Rio de Janeiro ocorre no Parque Nacional da Tijuca e na Reserva Biológica de
Tinguá onde é encontrada na orla da mata associada com indivíduos de B. cuspidata, é
conhecida vulgarmente por “bapebucu” e “quina-do-mato”. Também pode ocorrer no
Estado de Minas Gerais. Segundo os critérios da IUCN a espécie pode ser considerada
rara. Indícios levam a crer que B. nicholsonii tenha populações de tamanho reduzido,
nos Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. (Germano-Filho, 1999).
Bathysa stipulata apresenta árvores com até 12 metros de comprimento.
Ocorre nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo, na Serra do Mar, em vegetação
primária ou secundária. É cultivada na Estação Experimental de Café em Coronel
Pacheco, Minas Gerais. Essa espécie pode ser considerada, segundo os critérios (IUCN),
como vulnerável e poderá entrar na zona de perigo se não forem tomadas medidas
conservacionistas. É conhecida pelos nomes vulgares de “autuparana” e “folha-larga”
em Minas Gerais; “autuparana” em São Paulo; “quina-da-serra” e “pau-de-colher” no
Rio de Janeiro. Essa espécie foi relacionada entre as espécies arbustivo-arbóreas cujas
sementes são passíveis de utilização na recuperação da vegetação na Serra do Mar da
região de Cubatão no Estado de São Paulo (Germano-Filho, 1999).
7
2.2 A família Piperaceae e Piper hoffmannseggianum Schult .
A família Piperaceae, com 10 gêneros e 1.400 a 2.000 espécies no mundo,
ocorre em toda a região tropical, freqüentemente em locais sombreados (Cronquist,
1981). No Brasil está distribuída, de Norte a Sul, sendo notados cinco gêneros (
Ottonia
Spreng., Peperomia Ruiz & Pav., Piper L., Pothomorphe Miq. e Sarcorhachis Trel.),
abrangendo cerca de 500 espécies.
Piper e Peperomia são os maiores gêneros,
respectivamente com 265 e 166 espécies (Yuncker, 1972, 1973, 1974). Desde 1990,
Pothomorphe está incluído no gênero Piper (Tebbs, 1990). São ervas, arbustos ou
pequenas árvores, freqüentemente epífitas ou lianas, folhas alternas, opostas ou
verticiladas, com ou sem estípulas (Souza e Lorenzi, 2005).
Piper hoffmannseggianum
Schult .. Presente na Reserva Biológica de Poço das Antass (Guimarães e Monteiro,
2006) e em outros estados, tem sido difundida como planta medicinal, principalmente
nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais.
2.3 A família Euphorbiaceae e Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp
A família Euphorbiaceae possui distribuição predominantemente pantropical,
incluindo cerca de 300 gêneros e 6000 espécies. No Brasil ocorrem cerca de 70
gêneros e 1000 espécies, representando uma das principais famílias da flora brasileira
e uma das mais complexas do ponto de vista taxonômico (Souza e Lorenzi, 2005). Esta
família também inclui diversas espécies de interesse econômico como Hevea
brasiliensis (seringueira) e a Manihot esculenta (mandioca ou aipim). Ervas ou
subarbustos, eretos a prostrados, monóicos, latescentes, sem tricomas urticantes.
Folhas simples, opostas a verticiladas, membranáceas a coriáceas, concolores a
discolores; lâmina foliar oblonga a elíptica, ápice mucronado a arredondada, margem
inteira a serreada, base oblíqua, assimétrica, glabrescente a glabra, curto-peciolada a
subséssil. O gênero Chamaesyce é cosmopolita e possui cerca de 250 espécies,
localizadas em sua maioria nos trópicos e subtrópicos americanos e na África (Burger e
Huft, 1995). São plantas quase sempre associadas a solos arenosos e habitat
perturbados.
8
Chamaesyce thymifolia ocorre em quase todo o território brasileiro.
Caracteriza-se por seu hábito prostrado, apêndices petalóides desiguais entre si,
ciátios turbinados, internamente glabros, e pelo pequeno número de flores
estaminadas (Sátiro e Roque, 2008).
2.4 Estruturas secretoras em plantas
Estruturas ou tecidos secretores estão presentes em diferentes órgãos das
plantas e são caracterizadas por suas distintas formas (Dickinson, 2000). Estas por sua
vez, encontram-se associadas às diferenças observadas entre os exsudatos produzidos.
Atualmente, a classificação das estruturas secretoras se baseia na morfologia
ou no conteúdo do exsudado por elas liberado. Entretanto, tal classificação é discutível
uma vez que os tecidos secretores, em geral, sofrem transformações relativamente
rápidas (Machado, 2005). Dessa forma, a estrutura, a ultraestrutura e o conteúdo
bioquímico das células podem ser modificados rapidamente dificultando assim a sua
classificação, já que tecidos iguais podem ser considerados diferentes por se
encontrarem em distintas etapas da maturação (Fahn, 1979). A esse respeito, deve-se
citar o estudo realizado por Fahn (1988), no qual foi organizada uma listagem dos
diferentes tipos de estruturas secretoras de plantas. Neste estudo, o autor classifica as
estruturas secretoras principalmente quanto à sua morfologia e à composição química
da secreção, sendo estas características complementares. Além disso, as estruturas
secretoras formam um grupo polifilético, o que significa dizer que os processos
evolutivos levam as diferentes estratégias de síntese e externalização de exsudatos
(Fahn, 1979; Laurence et al., 2000).
Cumpre mencionar que questões relacionadas às estruturas secretoras de
diferentes espécies de plantas vêm sendo revisadas e investigadas através de diversos
estudos morfofisiológicos de grande relevância científica. Dentre tais estudos, se
destacam as investigações que se seguem: da estrutura do nectário floral de Digitalis
purpurea (Gaffal e Heimler, 1998); da ultraestrutura das células secretoras de duas
espécies de Fagonia (Zygophyllaceae) (Fahn e Shimony, 1998); dos tricomas secretores
9
em folhas de Piper regnellii (Piperaceae) (Silva e Machado, 1999 a,b); da estrutura e
função das células secretoras (Fahn, 2000); da estrutura e função de tricomas
glandulares do cálice de Rosmarinus officinalis (Labiatae) (Bottega e Corsi, 2000); da
avaliação das glândulas de óleo do fruto de Citrus sinensis (Knight et al., 2001); da
estrutura e desenvolvimento de canais secretores em frutos de
Schinus terebinthifolius
(Anacardiaceae) (Machado e Carmello-Guerreiro, 2001); do estudo do nectário de
Digitalis purpurea (Scrophulariaceae) (Gaffal et al., 2007) e dos nectários florais de
Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae, Caesalpinioideae) (Paiva e Machado, 2008); do
estudos de coléteres de Simira (Rubiaceae) (Klein et al., 2004), de Bathysa nicholsonii
(Rubiaceae) (Miguel et al., 2006), dentre outros.
Com relação à ultraestrutura, já se observou que as células de tecidos
secretores são caracterizadas por conterem numerosas mitocôndrias, pequenos
vacúolos e citoplasma denso (Fahn, 1988). Segundo Fahn e Shimony (1998), as células
secretoras de
Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem núcleo relativamente grande e
numerosas mitocôndrias modificadas. Nas células secretoras dos ductos de goma de
Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma é rico em ribossomos, retículo
endoplasmático rugoso, em mitocôndrias, vacúolos e gotas lipídicas e em algumas
etapas de sua diferenciação foram encontrados complexo de Golgi em abundância
(Venkaiah, 1992). Weker e Kislev (1978) argumentam que a produção de secreção, em
tricomas secretores da raiz de Sorghum, está relacionada com o complexo de Golgi.
Formam selecionadas para este estudo os coléteres de Bathysa gymnocarpa, B.
stipulata e B. nicholsonii (Rubiaceae) e os tricomas secretores de Piper
hoffmannseggianum. Para comparação entre parede periclinal externa destas
estruturas e da folha foi utilizada, ainda, a lâmina foliar de Chamaesyce thymifolia
(Euphorbiaceae). Espera-se, com a escolha desses modelos, uma melhor visão e
comparação das estruturas secretoras.
10
2.4.1 Coléteres
Por definição coléteres são estruturas secretoras constituídas por um eixo
central alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato
epidérmico em paliçada (Da Cunha e Vieira, 1997), sendo as células epidérmicas
responsáveis pela secreção (Thomas, 1991). A função dos coléteres ainda é discutida,
porém tem sido atribuída a essa estrutura a função de defesa do meristema apical,
seja física ou química. Essa estrutura foi descrita sob vários nomes. Os mais usados
foram: squamallae (Ramayya e Bahadur, 1968); glândulas estipulares (Van Hove e
Kagoyre, 1974); nectário extrafloral (Dave e Patel, 1975); e glândula de resina (Curtis e
Lersten, 1980). Essas estruturas foram inicialmente, descritas em 1848, por Hanstein
(apud Thomas, 1991). Curiosamente, estes não constam na classificação de estruturas
secretoras, proposta por Fahn (1988); embora sejam reconhecidos como estruturas
secretoras por outros autores (Esau, 1974).
De acordo com Thomas (1991), esse tipo de estrutura secretora é encontrado
na face adaxial de diferentes órgãos de membros de 60 famílias de angiospermas. O
mesmo autor aponta, ainda, que os coléteres podem ocorrer em estipulas e em outros
órgãos, como em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras
famílias.
González (1998) mostra que os coléteres de diferentes espécies da família
Turneraceae estão distribuídos também em outras partes da planta como, por
exemplo, nos primórdios foliares. Para a distinção de famílias, as variações dos
coléteres apresentam-se pouco úteis, mas em termos de gêneros e subgêneros em
Rubiaceae, essa característica se torna bastante consistente (Robbrecht, 1988). O
número de coléteres e seus modos de inserção podem ser variáveis: eles podendo
estar presentes em maior ou menor número; cobrir mais ou menos o interior da
estípula e/ou do cálice; podem estar localizados na borda ou inseridos em uma, ou
mais, fileiras na base. Klein
et al. (2004) mostrou que os coléteres de Simira pikia K.
Schum. se encontram distribuídos em uma linha na base da estípula enquanto o
conjunto dos coléteres de S. glaziovii K. Schum. forma dois triângulos na base da
estípula. Miguel (2004) mostrou que os coléteres em três espécies de Bathysa são
11
distribuídos na base das estípulas. Estudos elucidaram, também, aspectos anatômicos
e ultraestruturais dos coléteres presentes em
Bathysa nicholsonii bem como a ação
antifúngica da secreção (Miguel
et al., 2006).
Recentes estudos têm sido realizados em coléteres de diferentes espécies, em
diferentes abordagens. Paiva e Machado (2008) estudaram a ultraestrutura e
ontogênese dos coléteres de Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae: Caesalpinioideae).
Simões et al. (2006) caracterizaram coléteres de sete espécies de Apocynaceae
(Apocynoideae). De-Paula e Oliveira (2007) relataram a ocorrência de coléteres em
embriões de três espécies de Chamaecrista moench (Fabaceae: Caesalpinioideae).
Gonzalez e Tarragó (2007) descreveram a estrutura e composição da secreção de nove
espécies de Ilex. Leitão e Cortelazzo (2008) investigaram a anatomia e histoquímica
dos coléteres de Rodriguezia venusta (Orchidaceae). Apesar de todos os estudos a
cerca dessa estruturas secretora existem, ainda, algumas incógnitas como, por
exemplo, a passagem da secreção pela parede periclinal externa.
2.4.2 Tricomas secretores
O termo tricoma é utilizado para designar um apêndice epidérmico, seja este
uni ou multicelular (Fahn, 1990). Os tricomas, geralmente, são estruturas simples, que
têm uma ampla variação quanto à forma, ao tamanho, ao conteúdo e, principalmente,
à função (Mauseth, 1988). Tricomas secretores possuem estrutura muito variada e
podem ocorrer em diferentes órgãos das plantas. Tricomas capitados completamente
desenvolvidos constituem em um pedicelo, formado por uma célula não secretora, e
uma cabeça formada por quatro células secretoras (Ascensão e Pais, 1998). De acordo
com esses mesmos autores os tricomas peltados possuem cor laranja característica e
tem formato de balão. Essa estrutura consiste em uma célula basal muito curta com
paredes laterais cutinizadas e uma cabeça arredondada, formada por oito células
arranjadas em disco.
De acordo com Metcalfe e Chalk (1950), os tricomas secretores de Piperaceae
são de dois tipos: pequenas glândulas constituídas de uma célula esférica ampla de
12
aspecto reluzente e tricomas constituídos de pedicelo e célula apical esférica, hemi-
esferica ou saculiforme.
Os tricomas capitados têm o tamanho do pedicelo variado e são formados,
geralmente, por uma ou duas células ovóides na cabeça. Tricomas digitiformes
consistem em três a quatro células, em linha, com diâmetro similar e tamanho
aproximadamente igual. Tricomas secretores podem produzir diferentes substâncias
como proteínas, óleos essenciais, lipídios, polissacarídeos, mono e sesquiterpenos
(Ascensão e Pais, 1998; Sachhetti et al., 1999; Silva e Machado, 1999a; Gershenson et
al., 2004; Urzúa et al., 2004) e muitas outras. Muitas são os estudos que investigam a
composição do óleo essencial secretado por tricomas. Na literatura são notados
trabalhos recentes como o que investiga os tricomas de Stachys germanica (Giuliani et
al., 2009), ou ainda os tricomas de Lamioideae (Giuliani e Bini, 2008).
Células secretoras de tricomas possuem citoplasma denso e núcleo central e
evidente, com contorno irregular. Possuem, ainda, dictiossomos, reticulo
endoplasmático liso e rugoso evidentes, mitocôndria e plastídeos com material
eletrondenso (Fahn, 1988; Silva e Machado, 1999a).
A presença de polissacarídeos, proteínas e lipídios na secreção de tricomas foi
reportada por Werker e Fahn (1981) em Ihula viscose e por Machado et al. (1995) em
tricomas secretores do nectários de Zeyheria digitalis.
Apesar de vários estudos para a caracterização da estrutura e da composição
de sua secreção, a relação entre o processo secretor e a senescência de tricomas
secretores ainda é pouco estudada.
2.4.3 O processo secretor e senescência de estruturas secretoras
A secreção é um processo comum nos vegetais. Trata-se de um complexo
fenômeno de separação ou isolamento de certas substâncias do protoplasto, podendo
incluir processo de síntese, acúmulo em determinados compartimentos intracelulares
assim como liberação ou eliminação extracelular para dentro de espaços internos
13
próximos ou, então, para fora da superfície da planta (Machado, 2000). Considerando,
também, que a secreção é um processo que envolve mudanças importantes em nível
subcelular, o estudo detalhado das células secretoras permite avaliar tanto a dinâmica
do processo secretor, como fazer correlações entre a estrutura e o funcionamento de
determinadas organelas envolvidas na secreção. Machado (2005) alerta para
mudanças das células secretoras durante a secreção. Entre as organelas que mostram
mudanças consideráveis, ao longo do processo secretor, estão os plastídios dos
tricomas glandulares no gineceu de Zeyheria digitalis (Bignoniaceae) (Machado et al.,
1995) e os cloroplastos no parênquima secretor dos nectários de Citharexylum
mirianthum
(Verbenaceae) (Machado, 1999).
Modificações estruturais, inclusive na parede celular, ocorridas durante o
processo secretor podem culminar na morte da célula secretora. Essa morte se dá por
um processo altamente organizado chamado de morte celular programada
(Gunawardena
et al., 2007). A morte celular programada é um processo normal no
desenvolvimento das plantas e controlado geneticamente e pode levar a estrutura à
senescência. Existem muitos tipos de senescência em plantas, desde a senescência de
órgãos a de células especializadas. No caso de estruturas secretoras, o curto ciclo de
vida faz com que as mudanças estruturais e bioquímicas também ocorram muito
rápidas (Dickinson, 2000) dificultando o estudo e compreensão do processo. Após o
processo de secreção ser completo, as células epidérmicas se desorganizam
ultraestruturalmente. A integridade da membrana celular e dos compartimentos é
mantida até a senescência, sugerindo que existe pouca ou nenhuma ligação entre os
processos (Pennel e Lamb, 1997).
No caso específico de coléteres Thomas e Dave (1989) mostraram que a
senescência em Allamanda cathartica (Apocynaceae) é um processo organizado que
envolve primeiro a lignificação da epiderme secretora, levando a uma perda da
identidade do tecido. Subsequentemente, o eixo central adquire as mesmas
características.
14
Independente do estágio que a célula secretora se encontra após a produção
da secreção, essas moléculas devem ainda passar por uma barreira para ganhar o meio
extracelular: a parede periclinal externa.
2.5 Parede celular vegetal
A parede celular vegetal é formada por macromoléculas e constitui uma
barreira ao fluxo bidirecional em grande parte dos tecidos de revestimento nas
plantas. Proteção contra radiação, danos mecânicos, patógenos e pragas também têm
sido relacionadas à parede periclinal externa. Sua variedade de funções dessa
estrutura tem sido associada à sua estrutura, complexidade e diversidade. A
distribuição de seus componentes, usualmente, é heterogênea. A nomenclatura de
seus estratos tem sido baseada nesta peculiaridade. Tenberge (1992) propõe que a
parede celular é dividida em cera epicuticular e três camadas distintas: a cutícula
propriamente dita, as camadas cuticulares, divididas em camada reticulada e camada
arborescente, e camada rica em polissacarídeos. Outros autores também utilizam essa
nomenclatura (Barros e Miguens, 1998; Klein et al., 2004 e Miguel, 2004). A
composição e estrutura das paredes periclinais externas podem variar durante o
crescimento e a diferenciação da célula e em resposta a fatores ambientais (Barros e
Miguens, 1998; Marques, 1998). A morfologia e fisiologia, e os mecanismos passagem
de moléculas pela parede periclinal externa têm sido consideradas espécie específicas.
Nesse sentido, pouco se sabe sobre a parede periclinal externa de estruturas
secretoras.
A parede periclinal externa é a fronteira entre e a planta e o ambiente. O
transporte de moléculas por esta estrutura ainda não foi bem elucidado. A maioria dos
trabalhos que se referem de alguma forma a esta região e utilizaram microscopia
eletrônica de transmissão, apenas citam a presença ou ausência de cutícula.
Ascensão e Pais (1998) relatam o acúmulo da secreção no espaço
periplasmático. A secreção passa pela parede celular e se deposita em um espaço
15
subcuticular, formado pelo deslocamento da cutícula. Esse espaço recebe o nome
também de espaço subcuticular (Possobom e Machado, 2005).
Kim e Mahlberg (1997), utilizando técnicas de imunolocalização, marcaram o
tetrahidrocanabinol (THC) na parede periclinal externa de tricomas criofixados,
reafirmando a função dessa cavidade na passagem de substâncias pela parede. Os
mesmos autores descreveram a formação de vesículas secretoras em tricomas de
Cannabis (Kim e Mahlberg, 2003). Mesmo assim ainda ficam duvidas com relação à
essa passagem. Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que,
em tricomas glandulares de Cannabis, a passagem da secreção através da parede
periclinal externa é feita através de “cavidades secretoras” na parede que servem para
a saída do exsudado após toda a passagem pelo tráfego de vesículas, sendo a parede
celular o meio de exteriorização da secreção. Alguns aspectos dessa passagem ainda
permanecem obscuros, pois nenhum estudo mostrou de maneira convincente todo
esse processo em células de estruturas secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes
a essas “cavidades secretoras” forma descritas na parede periclinal externa dos
coléteres de B. nicholsonii (Miguel, 2004). Essas estruturas tiveram a sua formação
descrita (Miguel et al., 2006) e também parecem estar envolvidas no processo de
passagem da secreção pela parede periclinal externa, no entanto Jefree (1996) aponta
outros mecanismos para essa passagem como, por exemplo, microcanais
perpendiculares ao maior eixo da parede periclinal e acúmulo da secreção nas
camadas cuticulares da parede celular. Esse acúmulo acaba por levar a ruptura física
nessa camada.
Mesmo com os estudos, acima mencionados, muitos aspectos do transporte de
substâncias pela parede periclinal externa permanecem sem esclarecimento,
especialmente em estruturas secretoras. Os mecanismos da síntese, transporte e saída
da secreção das células secretoras dos coléteres também são pouco estudados e
conhecidos.
16
2.6 Estruturas secretoras e mecanismos de defesa de plantas
A exposição das plantas a fatores do ambiente, como variações em
temperatura, umidade e radiação, e a agentes biológicos, como fungos, vírus,
bactérias, nematóides, insetos e herbívoros, faz com que elas necessitem reagir contra
esses estresses. Dentre as formas de defesa constitutiva das plantas, destacamos as
estruturas secretoras e tomamos como exemplos tricomas e coléteres.
Tricomas foliares exercem um papel fundamental na defesa de plantas,
principalmente em relação a insetos fitófagos. Em várias espécies há uma correlação
negativa entre a densidade de tricomas e as respostas de alimentação, oviposição de
insetos adultos e nutrição de larvas (Theobald et al., 1979). Os tricomas não
glandulares podem atuar diretamente sobre os insetos, afetando sua oviposição,
alimentação, locomoção, ou seu comportamento em relação ao abrigo, através de sua
densidade e tamanho. Os tricomas glandulares podem, também, ser complementos na
defesa química devido à secreção de terpenos, alcalóides, substâncias fenólicas e
outras que podem ser repelentes olfatórios ou gustatórios.
Os coléteres atuam na proteção do meristema apical caulinar, prevenindo o
ataque de patógenos e o acesso ao ápice caulinar (Thomas, 1991). Vieira
et al. (2006)
descreveram um β 1,3 glucanase na secreção dos coléteres de Simira (Rubiaceae)
demonstrando a participação dessa estrutura também na defesa química.
Pelo exposto torna-se pertinente a investigação das estruturas secretoras e a
sua relação com os mecanismos de defesa das plantas.
17
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Caracterizar estruturas secretoras e suas paredes periclinais externas,
utilizando os modelos coléteres, tricomas secretores e epiderme foliar.
3.2 Objetivos específicos
Descrever a anatomia e ultraestrutura dos coléteres estipulares em suas fases
secretora e senescente;
Descrever a anatomia e ultraestrutura foliar de Piper hoffmannseggianum
Schult. (Piperaceae), sua senescência e a composição do óleo essêncial;
Descrever a estrutura da parede periclinal externa de Chamaesyce thymifolia
(Euphorbiaceae) em diferentes estágios em microscopia eletrônica de
varredura e microanálise de raio-X;
Descrever a parede periclinal externa dos coléteres bem como o mecanismo de
passagem de moléculas;
Comparar as etapas de desenvolvimento dos coléteres e tricomas;
Comparar a parede periclinal externa da epiderme foliar com a das estruturas
secretoras.
19
Coléteres Estipulares em Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra (Rubiaceae): micromorfologia, anatomia e 1
microanálise dos cristais2
3
Emílio de Castro Miguel
1
, Daniel Gomes de Moraes
1
, Maura Da Cunha
1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1-Setor de Citologia Vegetal, Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociência e Biotecnologia –16
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Av. Alberto Lamego 2000, Parque Califórnia – Campos 17
dos Goytacazes/Rio de Janeiro. 18
E-mail para correspondência: [email protected]19
20
20
Coléteres Estipulares em Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra (Rubiaceae): micromorfologia, anatomia e 1
microanálise dos cristais2
3
Resumo4
Coléteres são estruturas secretoras, com função protetora, que podem ocorrer em diferentes órgãos e em 5
diversas famílias de Angiospermae. Esse trabalho teve como objetivo descrever a anatomia e micromorfologia 6
dos coléteres estipulares presentes em
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra bem como analisar a estrutura 7
e composição dos cristais do eixo central da estrutura em questão. O material foi coletado na Reserva Biológica 8
de Tinguá e processado de acordo com técnicas básicas de microscopia óptica e eletrônica de varredura. Os 9
coléteres de
P. nuda são do tipo lacrimiforme, constituídos por um eixo central alongado, formado por 10
parênquima fundamental, circundado por um estrato epidérmico em paliçada responsável pela secreção 11
mucilaginosa. Cristais do tipo ráfide foram observados no eixo central dos coléteres. Através de microanálise de 12
raio-X foi possível mostrar a presença predominante de cálcio nessas estruturas.13
14
Palavras-chave: cristais de oxalato de cálcio, coléteres, estrutura secretora, Rubiaceae.15
16
17
Stipular colleters in Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra (Rubiaceae): micromorphology, 18
anatomy and crystal microanalysis 19
20
Abstract21
Colleters are secretory structures, with protection function, that can occur in different organs and in many 22
Angiospermae families. The aim of this work was describe the anatomy and micromorphology of stipular colleters 23
present in
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra. As well as analyze the structure and composition of crystals 24
from central axis of the structure in study. The material was collected at Reserva Biológica de Tinguá and 25
processed a according to usual techniques for light and scanning electron microscopy. The colleters are from 26
lachrymiform type, constituted by an elongated central axis, formed by fundamental parenchyma, sheathed by a 27
palisade layer, responsible to the secretion. Raphids crystals were observed in colleters central axis. By X-ray 28
microanalysis were possible to show calcium predominance in these structures.29
30
Key-words: Calcium oxalate crystals, colleters; secretory structure, Rubiaceae.31
32
21
Introdução1
Psychotria L. é um gênero pantropical que pertence à tribo Psychotrieae (Robbrecht 1988). Psychotria 2
nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra é um arbusto com 1 a 5 metros de ampla distribuição e é denominada 3
vulgarmente de sonhos-de-ouro (EMBRAPA 1994). Esta espécie é largamente distribuída na Floresta Atlântica que 4
cobre a costa oriental do Brasil. Apesar de existirem registros de coléteres em indivíduos do gênero
Psychotria L. 5
(Whitmoyer & Horner 1970; Da Cunha & Vieira 1993/97), essas estruturas secretoras não foram descritas 6
anatomicamente, até o momento, para a espécie em questão.7
Coléteres em Rubiaceae são, por definição, estruturas secretoras constituídas por um eixo central 8
alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato epidérmico em paliçada (Da Cunha 9
& Vieira 1993/97), sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção (Thomas 1991). A função dos 10
coléteres ainda é discutida, porém tem sido atribuída a essa estrutura a função de defesa do meristema apical e 11
gemas laterais, seja física ou química (Miguel et al. 2006). 12
De acordo com Thomas (1991), os coléteres podem ocorrer em diferentes órgãos como estípulas e partes 13
florais de membros de 60 famílias de Angiospermae incluindo Rubiaceae, Loganiaceae e Apocynaceae. González 14
(1998), em revisão da família Turneraceae, mostra que os coléteres de diferentes espécies estão distribuídos em 15
outras partes da planta. Os coléteres da família Rubiaceae são estruturas intimamente associadas às estipulas, 16
contudo, podem ocorrer na superfície adaxial ou na margem de folhas, podendo ser encontrados ainda no cálice, 17
geralmente junto com tricomas (Thomas 1991).18
O número de coléteres e seus modos de inserção podem ser variáveis: podem estar presentes em maior 19
ou menor número; cobrindo mais ou menos o interior da estípula e/ou do cálice; podem estar localizados na 20
borda ou inseridos em uma, ou mais, fileiras na base. Klein et al. (2004) mostraram que os coléteres de
Simira 21
pikia (K. Schum.) Steyerm se encontram distribuídos em uma linha na base da estípula enquanto o conjunto dos 22
coléteres de
S. glaziovii (K. Schum.) Steyerm forma dois triângulos na base da estípula. Miguel et al. (2006) 23
mostraram que os coléteres em três espécies de
Bathysa são distribuídos na base das estípulas.24
Diferentes classificações foram utilizadas para denominar os tipos morfológicos de coléteres. Lersten 25
(1974b) classificou os coléteres em “stardand” e “brushlike”. Esta estrutura foi designada, ainda, como 26
“Squamallae” por Ramayya e Bahadur (1968), "glândulas estipulares" por Van Hove e Kagoyre (1974), nectário 27
extrafloral por Dave e Patel (1975) ou glândulas de resina por Curtis e Lersten (1974). González (1998) reconhece 28
a variação de formas nos coléteres de Turneraceae e adiciona o termo lacrimiforme na classificação dos coléteres 29
observados em gêneros de
Turnera L. e Piriqueta Aubl.. Simões et al. (2006) definiram coléteres de Apocynaceae 30
como laminar, padrão e séssil. Paiva & Machado (2006a) mostram que os coléteres de
Hymenea são alongados, 31
em forma de clava, exibindo uma camada de células de revestimento. Miguel et al. (2006) mostram que os 32
coléteres de
Bathysa nicholsonii K. Schum. são do tipo cilindrifome. Os trabalhos de Dexheimer & Guenin (1981) e 33
22
Horner & Lersten (1968) em
Psychotria bacteriophila Val. (Rubiaceae) e Miller et al. (1983) em Psychotria kirkii1
Hiern (Rubiaceae) mostram que coléteres dessas espécies secretam substâncias mucilaginosas e possuem 2
morfologia variada. Tal secreção pode estar envolvida na formação de nódulos de bactérias (Horner e Lersten, 3
1968). Em
P. velloziana, Da Cunha & Vieira (1993/97) reportam o coléteres do tipo padrão, encontrados na base 4
das estípulas, secretando substâncias mucilaginosas.5
Os cristais de cálcio se acumulam em plantas aquáticas e terrestres, sendo que a forma mais comum de 6
deposição é o oxalato de cálcio na forma de feixes de ráfides (Franceschi & Nakata 2005). Esses cristais podem 7
proteger a casca do ataque de insetos (Hudgins et al. 2003), atuar como defesa contra a herbivoria de 8
invertebrados (Korth et al. 2006) e vertebrados (Ward et al. 1997), além de indisponibilizar o oxalato. A presença 9
de cristais em plantas pode estar relacionada a fatores genéticos ou abióticos (Franceschi & Nakata 2005). Cristais 10
do tipo ráfide são referidos para Rubiaceae (Metcalfe & Chalk, 1950) e citados para o gênero em questão (p. ex.,11
Vieira & Gomes 1995; Gomes et al. 1995). Porém, não existem registros de cristais em coléteres. 12
Levando em consideração a escassez de dados com relação aos coléteres estipulares do gênero
Psychotria13
L., esse trabalho teve como objetivo caracterizar a anatomia e micromorfologia dos coléteres estipulares 14
presentes em
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra, bem como analisar a estrutura e composição dos cristais 15
do eixo central da estrutura em questão.16
17
Material e Métodos18
Material botânico19
Ápices caulinares de indivíduos adultos, incluindo as estípulas e o meristema apical caulinar, de
Psychotria 20
nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra foram coletados na Reserva Biológica de Tinguá, com licença concedida pelo 21
SISBIO (13575-1). Esta reserva localiza-se na porção central da cadeia da Serra do Mar, no trecho compreendido 22
pelas serras do Tinguá, de São Pedro e do Macuco (22º28’ e 22º39’ S, 22°35' e 43º34’ W), municípios de Nova 23
Iguaçu e Duque de Caxias. Amostras foram depositadas no Herbário da UENF e no Herbário do Jardim Botânico do 24
Rio de Janeiro ainda sem registro.25
26
Microscopia Óptica (MO)27
Fragmentos da base da estípula, contendo coléteres, foram fixados, na área de estudo, em solução 28
aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4,0 % diluídos em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 29
7,2, sob temperatura ambiente, durante 2 horas. Após serem lavados por 45 minutos no mesmo tampão, os 30
fragmentos foram pós-fixados em solução aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % diluído em tampão 31
23
cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na ausência de luz. Após três 1
lavagens de 45 minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram submetidos à série cetônica ascendente (50 %, 2
70 %, 90 %, 100 % (3X)), durante 1 hora em cada etapa, para desidratação. Então, os fragmentos foram infiltrados 3
com resina epóxi (Epon Polibed). A polimerização da resina foi realizada a 60 ºC. Cortes semifinos, 4
aproximadamente 1
m de espessura, foram obtidos com navalhas de vidro em ultramicrótomo (REICHERT 5
ULTRACUT-S
®
). A coloração foi realizada com solução aquosa de azul de toluidina 1,0 %. Lâminas permanentes 6
foram montadas com Entellan
®
. A documentação foi realizada em microscópio óptico Axioplan ZEISS (Oberkohen, 7
Germany), utilizando-se câmera digitalizadora Hamamatsu C3077 e software Analysis
®
- LINK/ISIS/ZEISS (Oxford, 8
UK).9
Os testes histoquímicos foram realizados em cortes obtidos de material recém coletado, que foram 10
submetidos a reagentes específicos. Mucilagem foi identificada pelo vermelho de Rutênio, cutina pelo Sudan IV e 11
lignina pela Floroglucina (Johansen, 1940). Para observação da cutícula, coléteres foram dispostos em lâminas e 12
expostos, no escuro, a uma solução aquosa contendo Auramina O 0,01%. Depois de 15 minutos de exposição, as 13
amostras foram cobertas com lamínula e levadas ao microscópio óptico. Os cortes corados foram observados sob 14
microscopia de fluorescência (filtro de excitação 470 a 490 nm e emissão, 515 a 565nm). Como controle, foram 15
observados coléteres não expostos à Auramina O (Barros & Miguens 1998).16
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)17
Para a microscopia eletrônica de varredura foram utilizados os mesmos procedimentos descritos para 18
microscopia óptica, até a desidratação. Após a desidratação, as amostras foram secas pelo método do ponto 19
crítico de CO
2
utilizando o aparelho CPD-030 BAL-TEC (Liechtenstein). Fragmentos de estípula e ápices foram 20
aderidos com fita adesiva de carbono dupla-face (3M) e cola de carbono em suportes adequados. As amostras 21
foram cobertas por “
sputtering” com uma camada de aproximadamente 20 nm de ouro (SCD-050 BAL-TEC-22
Liechtenstein). A observação e documentação digital (512X480 TIFF) foram realizadas em microscópio eletrônico 23
de varredura (DSM 962 – ZEISS), a uma aceleração de voltagem de 25 kV.24
A análise qualitativa dos elementos químicos constituintes presentes nos cristais foi realizada pela 25
detecção da energia dispersiva de raios-X em microscopia eletrônica de varredura. Estípulas, de ápices 26
caulinares recém coletados, foram congeladas em nitrogênio líquido, por aproximadamente 20 minutos e, 27
em seguida, fraturados. Pequenos fragmentos de estípula foram aderidos em suportes em fita adesiva de 28
carbono dupla-face e com adesivo líquido a base de carbono e cobertos com carbono (XCD-010 BAL-29
TEC-Liechtenstien). 30
A análise qualitativa e o mapa de distribuição dos elementos foram realizados no mesmo microscópio, 31
acoplado a detector de raios-X de Si/Li OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK) com resolução nominal de 138 32
eV (1024 canais), operando nas condições padrão (aceleração de voltagem de 25 KeV (SE); distância de trabalho 33
24
de 25 mm; tempo de captação da microanálise de 300 segundos em janela de Be. Os resultados foram analisados 1
em software LINK-ISIS, OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK).2
3
Resultados e Discussão4
Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra apresenta estípulas de aproximadamente um centímetro no 5
seu ápice caulinar (fig. 1). Na área de estudo, não foram observados ápices caulinares com sinal de herbivoria. 6
Quando observadas em detalhes é possível notar que as estípulas são unidas pela secreção proveniente dos 7
coléteres (fig. 2). Tais estruturas apresentam capacidade fotossintética, mas sua principal função é a de proteção 8
das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn 1990). Os resultados mostrados acima corroboram esta afirmativa. 9
A morfologia e tamanho das estípulas aparentemente não influenciam na função protetora (Miguel et al. 2006). 10
Nesta espécie, a secreção é viscosa tornando-se vítrea após seca, não sendo degradada após o processamento 11
químico para microscopia. Essa característica sugere ser indicativo de proteção física por dificultar o acesso ao 12
meristema apical caulinar. Miguel et al. (2006) mostram que a secreção de
B. nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) 13
possui propriedade antifúngica. Os testes histoquímicos revelam que a secreção é mucilaginosa como reportado 14
em coléteres de Rubiaceae (p. ex. Da Cunha & Vieira 1993/97; Klein et al. 2004). 15
Na superfície adaxial das estípulas foram observados os coléteres, formados por eixo central 16
parenquimático circundado por um estrato epidérmico em paliçada (fig. 3 e 4). Na região de ocorrência dos 17
coléteres na estípula, foram identificados tricomas tectores unicelulares próximos a estas estruturas (fig. 4).18
Em vista frontal, os coléteres se apresentam como estruturas lacrimiformes, cilíndricas de base estreita 19
(fig. 5), às vezes de ápice agudo, ancoradas pela base ao primórdio foliar (fig. 6 e 7) próximo a tricomas. Foi 20
possível observar coléteres parcialmente imersos na secreção (fig. 7), presente entre o primórdio foliar e a 21
estípula. Em detalhe, parede periclinal externa das células epidérmicas é lisa (fig. 8). A morfologia dos coléteres 22
gerou diversas classificações, dentre elas, se destaca a de Lersten (1974a) por ser a primeira. Baseado na 23
morfologia externa dos coléteres o termo mais adequado é o lacrimiforme, seguindo a classificação de González 24
(1998). 25
Em microscopia óptica cortes transversais do ápice caulinar revelaram a presença dos coléteres entre os 26
primórdios foliares e fora deles (fig. 9). Até o momento, em nenhum estudo sobre coléteres de Rubiaceae, essas 27
estruturas foram notadas fora do arcabouço formado pelos primórdios foliares. Cortes transversais dos coléteres 28
revelaram que essas estruturas possuem eixo central, formado por parênquima fundamental, circundado por um 29
estrato epidérmico em paliçada (fig. 10). Em detalhe, a epiderme unisseriada dispostas em paliçada apresenta 30
citoplasma denso (fig. 11) e com uma fina camada de cutícula, revelado pela Auramina O (fig. 12). 31
25
Características morfológicas dos coléteres, como a constrição da base, e anatômicas, como a 1
vascularização no eixo central, são compartilhadas com espécies da mesma família, como
Bathysa (Miguel et al.2
2006),
Pavetta, Neorosea e Tricalysia (Lersten 1974a) e Simira (Klein et al. 2004), e de também de outras famílias 3
como Apocynaceae, no gênero
Mandevilla Vell. (Appezzato-da-Gloria & Estelita, 2000). Estas características 4
parecem não serem importantes para diagnóstico à família Rubiaceae, mas podem auxiliar a classificação no nível 5
genérico; uma vez que, pequenas variações presentes em poucos casos, devem ser consideradas como caracteres 6
taxonômicos (Lersten 1975, Da Cunha 2005). 7
De acordo com Paiva & Machado (2006b), os coléteres de
Caryocar brasiliense Camb. apresentam 8
citoplasma denso e espaço subcuticular, formado pelo deslocamento da cutícula da parede celular. 9
Posteriormente essa cutícula se rompe e expõe a secreção. Miguel et al. (2006) e Klein et al. (2004) observaram a 10
continuidade da cutícula e não formação de espaço subcuticular, bem como notado para
P. nuda, sendo tais 11
características aparentemente conservadas em Rubiaceae.12
Foram notados abundantes cristais do tipo feixes de ráfide e estilóides desde uma região muito próxima 13
ao meristema apical caulinar (fig. 13), até a estípula (fig. 14). No eixo central parenquimático foram notados 14
apenas feixes de ráfides (fig. 15). A análise qualitativa dos elementos químicos constituintes dos cristais revelou a 15
presença predominante de cálcio (fig. 16). O mapa de distribuição do cálcio, em Speed Map®, (fig. 17) coincide 16
com o cristal (fig. 18).17
Na literatura, a presença e função dos cristais de cálcio nos coléteres ainda é discutida (Thomas 1991). 18
Contudo, essa é a primeira descrição de um feixe de ráfides no eixo central de um coléter do tipo lacrimiforme. 19
Baseado na diversidade de formas e distribuição espacial dos cristais existem numerosas hipóteses para suas 20
funções podendo incluir regulação de cálcio, proteção para planta e detoxificação (Franceschi & Nakata 2005).21
Hanley et al. (2007) argumentam que os cristais fazem parte da defesa estrutural das plantas. Ruiz 22
et al. (2002) mostram a distribuição de cristais de oxalato de cálcio no mesofilo de folhas de Pancratium 23
sickenbergeri L. O mesmo trabalho revelou que larvas evitam partes da folha que contêm cristais de 24
oxalato de cálcio.25
Tendo em vista os resultados obtidos, sugere-se uma nova classificação em relação à forma dos 26
coléteres para as espécies de Rubiaceae. Para esta estrutura foi indicado o primeiro registro de cristais do 27
tipo ráfide, apesar de sugerir que esta característica esteja relacionada com a genética na planta. Mais 28
estudos são necessários para evidenciar a real função dos coléteres em plantas e dos cristais de cálcio na 29
espécie em questão.30
31
32
26
Agradecimentos1
Os autores gostariam de agradecer aos técnicos do Laboratório de Biologia Celular e 2
Tecidual/UENF, B.F. Ribeiro e G.A. Moraes; ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 3
Tecnológico (CNPq); à Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ); à PETROBRAS 4
pelo auxílio financeiro; à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela 5
bolsa do primeiro autor. À Sebastião José da Silva Neto pela identificação da espécie. Este estudo faz 6
parte da Tese de Doutorado de ECM, Programa de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do 7
Norte Fluminense (UENF). 8
9
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26
29
Legendas das figuras1
2
Figuras 1-4: Ápice caulinar de Psychotria nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra. em MEV. 1 – Vista geral das estípulas3
(E); 2 – Detalhe da figura 1 (quadrado) evidenciando a secreção (S) unindo o par de estípulas; 3 – Secção 4
longitudinal da estípula mostrando os coléteres (C); 4 – Detalhe dos coléteres em corte transversal e tricomas (T). 5
Barras: 1-
500 μm; 2, 3 e 4 - 200 μm.6
7
30
1
2
3
4
Figura 5-8: Ápice caulinar de P. nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra. em MEV. 5 – Vista geral de um coléter; 6 e 7 –5
Secção longitudinal da estípula (E) mostrando os coléteres (C) embebidos pela secreção (S), inseridos no 6
primórdio foliar (PF) próximos a tricomas (T); 8 – Detalhe da superfície do coléter. Barras: 5, 6 e 7 -
200 μm; 8 - 20 7
μm.8
9
10
31
1
2
3
Figuras 9-12: Ápice caulinar e coléteres de P. nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra.em microscopia óptica. Figuras 9-11 4
- Amostras coradas com azul de toluidina; Figura 12 – Secção a mão livre corado com Auramina O. 9 - Secção 5
transversal do ápice caulinar, evidenciando a presença de coléteres entre o primórdio foliar (seta), próximo a 6
estipula (cabeça de seta); 10 – Secção transversal de um coléter mostrando o eixo central (EC) e a epiderme 7
secretora em paliçada (EP); 11 – Detalhe da epiderme secretora; 12 - Marcação pela Auramina O evidenciando a 8
presença de uma fina cutícula indicada pela fluorescência. (PF), primórdio foliar; (E), estípula; (S) secreção. Barras: 9
9-
500 μm; 10 e 12- 50 μm. 11- 100 μm.10
11
12
32
1
2
Figura 13-15: Ápice caulinar e coléteres de P. nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra. em MEV. 13 – Meristema apical 3
caulinar (MAC) e regiões próximas. Note abundância de cristais do tipo feixes de ráfides e estilóides; 14 – Detalhe 4
dos cristais estilóides e em feixe de ráfides, presentes na estípula. 15 – Coléter em corte transversal mostrando o 5
feixe de ráfides no eixo central (seta). Barras: 13 -
500 μm; 14 - 50 μm; 15 – 100 μm.6
7
33
1
Figura 16-18: P. nuda (Cham. & Schltdl.) Wawra. Microanálise de Raio-X dos cristais de P. nuda. 16 – Análise 2
qualitativa dos elementos químicos constituintes dos cristais; 17 – Cristal em feixe de ráfides presente na estípula 3
(elétrons retroespalhados - BSE). 18 – Speed Map® mostrando apenas a localização do elemento cálcio, na 4
imagem anterior. Barras: 17 e 18 -
50 μm.5
35
Ultrastructure of secretory and senescence phase in colleters of Bathysa gymnocarpa K. Schum.
and
B. stipulata (Vell.) C. Presl. (Rubiaceae)
1
EMILIO DE CASTRO MIGUEL
2
, DENISE ESPELLET KLEIN
2,3
, MARCO ANTONIO DE
OLIVEIRA
4
and MAURA DA CUNHA
2,5
Running title: Ultrastructure and senescence of Bathysa colleters
_______________________
1
Part of the Ph D degree thesis of the first author, Programa de Biociências e Biotecnologia,
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ.
2
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Centro de Biociências e Biotecnologia, Laboratório de
Biologia Celular e Tecidual, Av. Alberto Lamego, 2000, Parque Califórnia, 28013-602 Campos dos
Goytacazes, RJ.
3
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biociências, Depto. de Botânica, Av.
Pasteur, 458, Urca, , 22290-240 Rio de Janeiro, RJ.
4
Universidade do Vale do Paraíba, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Av. Shishima Hifume,
1129, Bairro Urbanova, 12244-000 São José dos Campos, SP, Brasil.
5
Corresponding author: [email protected]
36
ABSTRACT – (Ultrastructure of secretory and senescence phase in colleters of Bathysa gymnocarpa
K. Schum. and B. stipulata (Vell.) C. Presl. (Rubiaceae)). Colleters are secretory structures formed by a
parenchymatic axis with vascular bundles, bounded by a layer of secretory palisade-like epidermis.
Several studies regarding the structure of colleters have focused on secretory cells structure, but not
distinguished the secretory phases. Generally, in mucilage-secreting cells such as colleters, the
endoplasmic reticulum and Golgi apparatus are involved in secretion production and transport. In these
study, colleters structure of
Bathysa gymnocarpa K. Schum. and B. stipulata (Vell.) C. Presl.
(Rubiaceae) were determined two phases: a secretory phase and a senescence one. Samples were
collected and processed by usual light and electron microscopy techniques. Studied colleters are
constituted by an epidermal palisade layer and a central axis formed by parenchymatic cells with rare
vascular traces. During the secretory phase, epidermal cells presented a dense cytoplasm, small
vacuoles, enhanced rough and smooth endoplasmic reticulum, and a Golgi apparatus close to large
vesicles. During the senescence phase epidermal cells presented a disorganized membrane system. No
intact organelles or vesicles were observed. The outer cell wall exhibited similar layers to that observed
during the secretory phase. The senescent phase is easily defined by the morphology of the colleters,
but not well defined at subcellular level. Our research suggests that programmed cell death starts on
secretory phase. However, more evidences are needed to evaluate the phenomena.
Key words – Light and electron microscopy, plant cell ultrastructure, programmed cell dead, secretory
structure, senescence
37
RESUMO – (Ultraestrutura da fase secretora e da senescente dos coléteres de Bathysa gymnocarpa K.
Schum. and
B. stipulata (Vell.) C. Presl. (Rubiaceae)). Coléteres são estruturas secretoras formadas
por um eixo parenquimático que inclui feixes vasculares, circundado por uma camada de células
epidérmicas secretoras em paliçada. Em alguns estudos sobre a estrutura dos coléteres tem sido
observado a ultraestrutura das células secretoras, não discriminam fases baseados nesses dados.
Geralmente, em células secretores de mucilagem como os coléteres, o retículo endoplasmático e o
complexo de Golgi estão envolvidos na produção e no transporte da secreção. Neste estudo, foram
determinadas duas fases baseados na estrutura dos coléteres de Bathysa gymnocarpa K. Schum. and B.
stipulata
(Vell.) C. Presl. (Rubiaceae): a fase secretora e a fase senescente. Amostras foram coletadas e
processadas utilizando técnicas usuais de microscopia de óptica e eletrônica. Os coléteres estudados são
constituídos por uma camada epidérmica em paliçada e um eixo central parenquimático com traços
vasculares raros. Durante a fase secretora, as células epidérmicas se apresentam com o citoplasma
denso, pequenos vacúolos, retículo endoplasmático liso e rugoso evidente e complexo de Golgi
próximo a grandes vesículas. Durante a fase senescente, as células epidérmicas apresentaram o sistema
endomembranar desorganizado. Nenhuma organela intacta ou vesícula foi observada. A fase
senescente é facilmente definida pela morfologia do coléter, mas não é bem definida em nível
subcelular nas células secretoras. Nossa investigação sugere que a morte celular programada se inicia
na fase secretora. Contudo, mais evidências são necessárias para avaliar esse fenômeno.
Palavras-chave - estrutura secretora, microscopia óptica e eletrônica, morte celular programada,
senescência, ultraestrutura celular de planta
38
Introduction
Secretory structures can be present in different plant regions and vary in morphology. They
form a polyphyletic group; divergence in the evolution can have originated distinguished mechanism of
synthesis and externalization of exudates (Dickinson 2000). These variations can be identified by
anatomy and ultrastructure of secretory colleter cells. This secretory structure can be present at stipules,
calyx, leaves, and stem apex.
Rubiaceae colleters are secretory structures associated to the stipule. They can occur at adaxial
surface or at margins; and it is possible to notice at calyx, close to trichomes (Majumdar & Pal 1958,
Horner & Lersten 1968, Lersten 1974a, b, Miller et al. 1983, Robbrecht 1988, Thomas 1991, Da Cunha
& Vieira 1997, Klein et al. 2004, Miguel et al. 2006). Rubiaceae colleters show little morphological
variation comparing to literature, however, there is a great diversity of the length, forms and
development of a basal constriction, and at the central axis diameter (Robbrecht 1988). The presence or
absence of central axis vascularization was discussed by Thomas (1991).
The term colleter originates from the Greek “colla”, meaning glue, and refers to the production
of a glue-like secretion (Thomas 1991). This structure has been described under different names that
include trichomes (Horner & Lersten 1968), squamellae (Ramayya & Bahadur 1968) and stipular
glands (Van Hove & Kagoyre 1974). The most used term for this structure is colleter. Lersten (1974a,
b) characterized some types of colleters in Rubiaceae species, and denominated the commonest as
standard type. One significant feature of the colleters is the protodermal and fundamental origin
(Thomas 1991). Klein et al. (2004) reported that the colleters of some
Simira (Rubiaceae) species are
formed as emergentia from the stipule, originating from protodermis and fundamental meristem.
Miguel et al. (2006) visualized the same structure to
Bathysa nicholsonii K. Schum. colleters.
39
The anatomical structure of colleters can be described as a parenchymatic cells axis surrounded
by one layer of secretory palisade-like epidermis (Thomas 1991, Da Cunha & Vieira 1997).
Occasionally, the middle axis present vascular bundles (Thomas 1991, Appezzato-da-Gloria & Estelita
2000, Klein et al. 2004).In various Rubiaceae genera, the colleters ultrastructure was described recently
(Klein
et al. 2004, Miguel et al. 2006, Miguel et al. 2009, Barreiro & Machado 2007). Several studies
reported on colleter structure with emphasis on secretory cells, especially in secretion production
phase. Epidermal cell of the colleters present a dense cytoplasm, enhanced endoplasmic reticulum,
Golgi apparatus, mitochondria and nuclei. Endoplasmic reticulum presence close to the plasma
membrane is remarkable in Rubiaceae (Horner & Lersten 1968, Dexheimer & Guenin 1981, Miller
et
al.
1983, Klein et al. 2004, Miguel et al. 2006). Generally, in mucilage-secreting cells, such as those
found in Rubiaceae colleters, the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus are involved in secretion
production and transport (Fahn 1988), this latter being mediated by vesicle traffic (Fahn 1988).
The outer cell walls of the colleters represent the limit between the environment and the plant
(Brett & Waldron 1990) and, as such represents the last barrier to prevent secretion to the environment.
In
Simira and Bathysa species, the outer cell wall presented three layers; a polysaccharide portion, a
cuticular membrane and a cuticle proper. The secretion, in these species, could be externalized without
cuticle rupture, passing through all cell wall layers (Klein
et al. 2004, Miguel et al. 2006).
In general, characteristics are changed rapidly in secretory structures, such as ultrastructure
making their understanding more difficult (Dickinson 2000). Some of these changes can be related to
senescence controlled by programmed cell death (Doorn & Woltering 2004), a process that is an
integral part of plant development and defense (Doorn & Woltering 2005). In
Allamanda cathartica L.,
senescent colleters were found to begin with epidermal cell walls lignification, followed by the central
axis (Thomas & Dave 1989). However, this anatomical study is the only available about senescence of
40
colleters and a gap in our knowledge remains with regard to cell conditions under the senescence phase
in colleters.
The Atlantic Rain Forest has feature high moisture, facilitating the development of many
microorganisms present in various plant interactions, including pathogeny. So, the study of colleters
and their secretion can to provide a better understand of secretion role at defense mechanisms of
studied species. The studied species are representative at Atlantic Rain Forest and according with
International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN),
Bathysa stipulata
(Vell.) J. Presl., (quina-da-serra) and B. gymnocarpa K. Schum. (guapeba-branca), are vulnerable and
protected, respectively (Germano-Filho 1999). The aim of this study was to characterize the anatomy
and ultrastructure of colleters from
Bathysa gymnocarpa and B. stipulata, in order to distinguish
secretory and senescence phases.
Material and methods
Plant material – Bathysa gymnocarpa and B. stipulata shoot apices, with completely expanded stipules,
were collected from many specimens at Reserva Biológica de Tinguá (22
º
28’ 22º39’ S, 22º35’ 43º34’
W), in the cities of Duque de Caxias and Nova Iguaçu, in Rio de Janeiro State, Brazil. These cities are
located between 220 and 1.600 m above sea level, the annual average temperature is approximately
21.6 ºC and pluviosity level is 2.268 mm (SOS Mata Atlântica 2002). The plants were found in
vegetation recognized as Atlantic Rain Forest. To visualization under different microscopy technique
was necessary separate stipule and apex, using tweezers and blades. By convention, the nodes found at
shoot apex were numerated according to separated stipule pairs: the pair closest to apical meristem was
considered the first node, the next, second node and following. Colleters were named senescent on the
third or old node.
41
Scanning electron microscopy – Samples, at different stages, were fixed for two hours in a solution of
2.5 % glutaraldehyde and 4.0 % formaldehyde in 0.05 M cacodylate buffer, pH 7.2 (Klein
et al. 2004).
Subsequently, the samples were rinsed in the same buffer and post-fixed for one hour at room
temperature with 1.0 % osmium tetroxide in 0.05 M cacodylate buffer, pH 7.2 (Klein
et al. 2004). The
post-fixed samples were dehydrated in an ascending acetone series (1 hour each step). Afterwards, the
samples were submitted to the critical-point-drying method using CO
2
. Dried samples were placed in
stubs, sputtered with 20 nm gold, and then observed with a digital scanning electron microscope
(DSEM 962 Zeiss).
Light microscopy – Stipule fragments were fixed, post-fixed and dehydrated as described for
scanning electron microscopy. Subsequently, the material was embedded in epoxi resin (Polybed).
Thin sections (1.0 µm) were stained with 1 % toluidine blue (Klein
et al. 2004). The glass slides
were sealed with Entellan
®
(Merck) and examined with an Axioplan Zeiss microscope.
Transmission electron microscopy – The stipule fragments were fixed, post-fixed, dehydrated, and
embedded as described above. Ultrathin sections (80 nm) were collected in copper grids (300 mesh)
and stained with 1.0 % alcoholic uranyl acetate followed by 5.0 % aqueous lead citrate. Three another
methods were used to elucidate the cytochemical aspects of colleter cells: (1) the preservation and
contrast of lipids was enhanced using imidazole-buffered osmium tetroxide (Angermüller & Fahimi
1982). (2) 1% ruthenium red was used to detect pectins and acid polysaccharides (Luft 1971) of the
colleter palisade cells. (3) Periodic acid-thiocarbohydrazide (THC)-silver proteinate (PATAg) was used
to detect polysaccharides containing 1,2-glycol groups (Thiéry 1967). Ultrathin sections exposed to all
42
the related techniques were observed at 80 kV using a transmission electron microscope (EM 900
Zeiss).
Results
Bathysa stipulata and B. gymnocarpa have persistent stipules (figures 1 and 2) in the shoot
apex. The colleters are located on stipule adaxial surface and are about 1 mm in height. These secretory
structures are distributed in lines (figures 3 and 4).
Bathysa gymnocarpa has a greater amount of
colleters than
B. stipulata. The secretion of the colleters is translucent and covers the interior of the
shoot apex. Even after the exposure of samples to all the procedures described, it was possible to
observe secretion over the stipule adaxial surface (figure 5).
During this study, in order to a better understand of the colleters structure, two phases were
distinguished: a secretory phase and a senescence one. In the secretory phase (figure 5), standard
colleters denominated in this study like lachrymiform type presented yellow color in fresh material
(data not shown). In the senescence phase (figure 6), the colleters present brown color in fresh material
(data not shown), and had be noted a rough surface (figure 6, 7, 8). Colleters from both species, during
the last phase, fall easily.
Both colleters from the studied species are constituted by an epidermal palisade layer and a
central axis formed by non secretory parenchyma cells (figures 9-11) with rare vascular traces (figure
9). A constriction at the colleter base was seen (figure 10). This structure is no-secretory and easily
distinguished at the secretory phase.
During the secretory phase, the palisade epidermal cells presented a dense cytoplasm in
transversal section (figure 12). All epidermal secretory cells presented undefined contours, which
provided a difficult visualization of the secretory tissues (figure 12). Secretory cells of both
B.
43
gymnocarpa and B. stipulata presented dense cytoplasm, vacuoles, enhanced rough and smooth
endoplasmic reticulum (data not show) distributed along the cytoplasm, hypertrophy Golgi apparatus
(figures 13) secreting small vesicles that fuse with large vesicles (figures 13, 14), mitochondria and
evident nuclei. In
B. stipulata, lipid vesicles were observed in the cytoplasm close to the cell wall
(figure 14). These vesicles appeared to be fusing with the membrane (figure 14). In
B. gymnocarpa,
electrondense vesicles were observed all over the cytoplasm, including the region close to the plasma
membrane. These vesicles seem to dock, fuse and unload their content in a space between the cell wall
and the plasma membrane (figures 15-18).
The outer cell wall of the
Bathysa colleters during the secretory phase exhibited a
polysaccharide portion, a cuticular membrane and a cuticle proper (figures 19 and 20). The cuticular
membrane presented arborescent and reticulated strata (figures 19 and 20). No cuticle rupture was
observed. Both the polysaccharide portion and the cuticular layer reacted with PATAg (figure 21), for
acid polysaccharides, and with ruthenium red, for pectin (data not shown). The lipid portion of the
cuticular membrane, which includes the cuticle proper and the matrix of the cuticular layer, reacted with
osmium/imidazole (figure 22).
The epidermal secretory cells of studied species observed in the senescence phase were
anatomically disorganized (figures 23 and 24) and presenting irregular outlines. These cells presented a
collapsed aspect, making their individualization difficult (figures 23 and 24). The cellular
disorganization started in the epidermal cells of the colleter tip (Figure 24) and progressively reached
colleter base. The epidermal cells presented a dramatic change between secretory (figure 9) and
senescence phases, when compared to vascular and parenchymatic cells. In these tissues were
demonstrated only slight changes between the secretory and senescence phases (figure 23). Most of the
parenchymatic cells did not exhibit a collapsed aspect, although cell walls outline were not as regular
44
as during the secretory phase. In addition, in some parenchyma cells were accumulated of a highly-
stained material (figure 23).
During the senescence phase, epidermal secretory cells of the
B. stipulata and B. gymnocarpa
colleters presented a disorganized membrane system. No intact organelles or vesicles were observed
(figure 25). The outer cell wall exhibited a cuticular membrane that seems to disrupt network (figures
19 and 20).
Discussion
Based on morphological data, we were able to describe stipular colleters from Bathysa
stipulata
and B. gymnocarpa and observe secretory and senescence phases. The colleters of Bathysa are
standard and because its form classified lachrymiform, similar type described by González (1998). The
main features that characterize this type of colleter and distinguish them from other types, are their
palisade-like epidermal cells that are linked to each other (Lersten 1974b) and the base diameter that is
larger than the tip diameter, forming a tear-shaped structure (González 1998). Since the term standard
does not depict colleter morphology, the classification of this structure is still confused and requires
additional studies.
Our results showed that general aspects of anatomy in colleters do not vary much considerably
in Rubiaceae genera, as seen for a few species of
Pavetta, Neorosea, Tricalysia (Lersten 1974b),
Simira (Klein et al. 2004), and previously studied Bathysa nicholsonii (Miguel et al. 2006). Most
anatomical features are also similar to colleters from other families, i.e., Apocynaceae (Appezzato-da-
Gloria & Estelita 2000) and Turneraceae (González 1998).
Bathysa gymnocarpa and B. stipulata
presented rare vascular bundle in the middle axis, as seen in most species (Thomas 1991, Appezzato-
45
da-Gloria & Estelita 2000, Klein et al. 2004). But the vascular traces seem not to be involved with
secretion production, as observed by (Appezzato-da-Gloria & Estelita 2000).
Ramayya & Bahadur (1968) suggested a protection role for colleter, which was mainly
attributed to the secretion produced. According to Ramayya & Bahadur (1968), Williams
et al. (1982),
and Mueller (1985), the exudates can protect the apical meristem preserving it from several damages,
such as desiccation and pathogens.
Bathysa nicholsonii secretion has been tested in vitro for anti-fungi
activity and presented inhibiting properties against fungi growth (Miguel
et al. 2006). The secretion of
the
Bathysa colleters is translucent and covers the interior of the shoot apex, suggesting the physical
mechanism for the protection of meristematic tissues.
Mucilage secretory cells are characterized by the presence of a dense cytoplasm, nuclei,
mitochondria, enhanced endoplasmic reticulum and Golgi apparatus (Rachmilevitz & Fahn 1972, Fahn
1979). Besides these general features, secretory colleters cells from
Bathysa nicholsonii presents an
enhanced endoplasmic reticulum that is particularly close to the cell membrane (Miguel
et al. 2006).
The ultrastructure of
B. stipulata and B. gymnocarpa colleters secretory cells presented general features
of mucilage secretory cells. These cells were also similar to
B. nicholsonii secretory cells (Miguel et al.
2006), presented dense cytoplasm, vacuoles, enhanced rough and smooth endoplasmic reticulum,
hypertrophy Golgi apparatus, mitochondria and evident nuclei. Furthermore,
B. gymnocarpa also
presented a peculiar feature; the presence of electrondense vesicles all over the cytoplasm, in contrast
to
B. stipulata, where lipid vesicles were noted mainly close to the cell wall, and to B. nicholsonii in
which none of those aspects were seen (Miguel
et al. 2006), suggesting different secretory routs at
these species.
Dexheimer & Guenin (1981) reported that the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum have
a role in mucilage production of
Psychotria bacteriophyla colleters. Meanwhile, in root hairs,
46
Werker & Kislev (1978) suggested that mitochondria can have a role in mucilage production in
species of
Sorghum (Poaceae). The secretion in B. gymnocarpa was probably produced in the Golgi
apparatus, since a great amount of these organelles were found close to large vesicles, in contrast to
B. stipulata that exhibited apparently less Golgi stacks. Our results indicated that Bathysa stipulata
and B. gymnocarpa colleters secretory cells transport the secretion mainly by vesicles. This has been
previously observed in secretory structures, such as nectaries, secretory trichomes and mucilage
secretory cells (Fahn & Shimony 1997).
The paths taken by vesicular traffic have been intensively researched in animal cells but are less
well characterized in plant cells (Hawes
et al. 1999); however, Fahn (1988) proposed general
models for the passage of secretion to the cell membrane; one of these models is similar to the
complete vesicle fusion process, observed in
B. gymnocarpa. Another model proposed by Fahn
(1988) is the fusion of the that endoplasmic reticulum to the cell membrane for secretion unloading,
as also observed in
B. nicholsonii colleters (Miguel et al. 2006). Fricke et al. (2000) reported that the
unloading of the vesicle, in plant cells, is achieved by a pore formation, composed by the partial
fusion of the vesicle and the cell membrane. After the unloading, the vesicle becomes flat and
recycles back to the endoplasmic reticulum. Modifications in the secretory pathway may be related
to secretion composition (Machado 2005).
The senescence is a normal process development controlled by plant genetic program. There are
several senescence types in plants, from organs to specialized cells. The colleters performing their
secretion function and then enter into senescence. Secretory structures, possibly due to their short life,
rapidly change aspects such as anatomy and ultrastructure, making their understanding more difficult
(Dickinson 2000). Epidermal cells are disorganized, making individualization difficult.
Ultrastructurally, the membrane system is disorganized. Membrane integrity and cellular
47
compartmentalization are maintained until the senescence process, suggesting that there is little or no
leakage of cellular contents (Pennel & Lamb 1997).
Thomas & Dave (1989) showed that senescence in colleters of
Allamanda cathartica was an
organized process that involves, first, the epidermal secretory cell lignification, completely loosing
tissue identity. Subsequently, the central axis cells were involved in part of this process acquiring the
same features. Our study described the ultrastructural aspects of senescent colleters for both
Bathysa
gymnocarpa
and B. stipulata. In the senescence phase, the epidermal secretory cells of the species
studies were anatomically disorganized, presenting a collapsed aspect, making their difficult
individualization. The cellular disorganization began at the epidermal cells of the colleter tip and
progressively reached colleter base. The epidermal cells presented a dramatic change between secretory
and senescence phases. During secretion production and externalization colleters secretory cell
ultrastructure is modified according to its life cycle and/or product. These alterations can take the cell
to programmed cell death (PCD) (Gaffal et al. 2007). Some studies about structural variation have been
done and the results shows that some organelles and cell wall, are considerable changed during this
process (Machado
et al. 1995, Klein et al. 2004, Miguel et al. 2006, Gunawardena et al. 2007).
Thomas & Dave (1989) observed colleters lignification during senescence, however, cell wall
structure was not lignification, as in the studied species. In secretory structure studies, there is still little
knowledge relating cell wall structure and function, especially for secretion passage through outer cell
wall. In this way, the knownledge of cell wall structure can be useful to infer its function and
physiological aspects. This study showed that the outer cell wall of the secretory phase of the colleter
developed a reticulated network of polysaccharides in its cuticular layer. In contrast, the senescence
phase the cell wall seems to disrupt this network. Although many studies report that secretions are
released via cuticular rupture (Horner & Lersten, 1968; Thomas & Dave, 1989), the cuticle was not
observed to rupture in colleters of
Bathysa species studies. This observation suggests an involvement of
48
the outer cell wall in the secretion process already discussed in Klein et al. (2004) and Miguel et al.
(2006).
Programmed cell death (PCD) is defined as event sequence that can provide controlled and
organized cell destruction (Lockshin & Zakeri 2004). This process is important at plant development,
pathogen response (McCabe & Leaver 2000) and senescence (Doorn & Woltering 2005).
Ultrastructural aspects of senescence secretory cells was similar to classic programmed cell death
signals and Doorn (2005), suggesting that senescence may be motivated by PCD. However, there is no
literature available relating PCD to ultrastructural changes and senescence in secretory structures. More
studies are needed to elucidate colleters senescence and PCD.
Colleters of both Bathysa species, at secretory phase, present cells with hypertrophic
endoplasmic reticulum and Golgi apparatus suggesting synthesis activity. However, some organelles
present membrane disorganization. Senescent colleters present shriveled with secretion at surface. The
epidermis cells shows disorganized, with collapsed aspect and difficult internal structures
individualization, including ultrastructure. The studied colleters can be divided in two phases: secretory
and senescent. The senescent phase is easily defined by cell structure, but not well defined at secretory
cells level. Our investigation suggests that programmed cell death starts on secretory phase. However,
more evidences are needed to evaluate the phenomena.
Acknowledgements - The authors are indebted to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), the Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação
de Aperfeiçoando de Pessoal de Nível Superior (CAPES), and PETROBRAS for their financial
support. We thank B.F. Ribeiro, and G.A. Moraes of the LBCT/CBB/UENF technicians. G.B. Dias for
critical reading of manuscript and S.J.Silva-Neto for species determination.
49
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54
Figure legends
Figures 1-4. Leaves and shoot apex. 1. Bathysa stipulata leaves and shoot apex. 2. Bathysa stipulata
colleters distributed in lines at stipule adaxial surface base. 3. Bathysa gymnocaropa stipule base
adaxial surface showing colleters organization. 4.
Bathysa gymnocarpa base adaxial surface showing
colleters organization. Bar = 2,5 cm (1,2), 0,15 cm (3), 0,3 cm (4).
55
87
8
Figures 5-8. Scanning electron microscopy of Bathysa colleters. 5, 8. Bathysa stipulata. 6, 7. Bathysa
gymnocarpa
. 5. Secretory colleters (asterisk) covered by secretion (triangle). 6. Colleter inserted in the
stipule base, close to trichomes (t). 7. Senescent colleter transverse section showing the rough surface
(arrow), disorganized epidermal cells (star) and central axis (square). 8. Colleter smooth surface detail.
Bar = 200 µm (5, 7), 2 µm (6), 100 µm (8).
56
Figures 9-12. Light microscopy of Bathysa colleters. 9, 10. Bathysa stipulata. 11, 12. B. gymnocarpa.
9, 10, 11. Colleter longitudinal section showing the base constriction (arrows), the secretory epidermis
(star) and central axis (square). Stipule (st), trichome (T), vascular trace (vt), xylem (X). 12. Detail of
the palisade secretory tissue in longitudinal section. Note secretion (S) outside the cells. Bar = 50 µm
(9), 25 µm (10, 11, 12).
57
13
14
15
16
17
18
Figures 13-18. Transmission electron microscopy of Bathysa colleters secretory cells. 13, 15-18.
Bathysa stipulata. 14. B. gymnocarpa. 13. Dense cytoplasm with enhanced Golgi apparatus (arrow);
14. Cell wall and lipid vesicles (V) appeared to be fusing to membrane. 15-18. Vesicle fusion with
plasma membrane sequence. Vesicles (large arrows), cell wall (asterisk), plasma membrane (small
arrows). Bar = 0.5 µm (13, 14), 0.3 µm (15, 17, 19), 0.8 µm (16).
58
Figure 19-22. Transmission electron microscopy of Bathysa colleters outer cell wall. 19, 20, 21.
Bathysa stipulata. 20. B. gymnocarpa. 19, 20. Outer cell wall (OCW) layers, basal polysaccharides rich
(P), cuticular membrane divided in aborescent layer (A) and reticulated layer (R) and cuticle proper
(Cut). 21. Outer cell wall treated according to Thiéry method, note polysaccharide portion (P). 22.
Outer cell wall treated with osmium/imidazole. Note lipid portion (L). Bar = 0.1 µm (19, 21), 0.4 µm
(20, 22).
59
Figure 23-25. Senescent colleters of Bathysa. 23. Transverse section of senescent colleters of B.
gymnocarpa
under light microscopy showing disorganized epidermis (star) and central axis (square).
Vascular trace (Vt). 24. Longitudinal section of senescent colleters of
B. stipulata under light
microscopy showing disorganized epidermis and central axis. 25. General observation of disorganized
cytoplasm (triangle) in
B. stipulata colleters secretory cells. Outer cell wall (OCW). Bar = 50 µm (23,
24), 0.12 µm (25).
59
Original article1
2
Piper eucalyptophyllum C. DC. (Piperaceae) leaf development and glandular3
trichomes ultrastructure and essential oil composition4
5
EMILIO DE CASTRO MIGUEL
1
, CRISTIANE FERRANTE TULLII
1
, CAMILLA 6
RIBEIRO ALEXANDRINO
1
, MARIA ISABEL TITONELI PACHECO
1
, GERMANA 7
BUENO DIAS
1
, HELENA REGINA PINTO LIMA
2
, LEOSVALDO SALAZAR 8
MARQUES VELOZO
3
, ANA PAULA FELIX TRINDADE
3
, MARIA 9
AUXILIADORA KAPLAN
3
and MAURA DA CUNHA
1*
10
11
1
Centro de Biociências e Biotecnologia, Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, 12
Universidade Estadual do Norte Fluminense, CEP 28015-620, Campos dos Goytacazes, 13
RJ, Brazil;
2
Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Universidade Federal 14
Rural do Rio de Janeiro, CEP 23890-000, Seropedica, RJ, Brazil;
3
Núcleo de Pesquisas 15
de Produtos Naturais, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de 16
Janeiro, CEP 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil17
18
Running title: Piper eucalyptophyllum leaf development and glandular trichomes 20
60
Background and Aims - The Piperaceae family is pantropical with species distributed in 1
the New World from Mexico to southeastern Argentina. One remarkable feature of this 2
family is the presence of secretory trichomes. These structures are outgrows from the 3
epidermis and vary in size and complexity, including hairs, scales, and other structures. 4
Their main functions are associated with defense what justify the usual higher density at 5
young leaves, a vulnerable and fragile tissue. The aim of this work was study Piper 6
hoffmannseggianum leaf development anatomy and trichome structure.7
Methods - Leaf samples at different development stages were collected at Paraty, RJ, 8
and processed according to usual techniques for light and electron microscopy. 9
Trichomes counts were made at 25 images. Four development stages were analyzed: 10
leaf primordial smaller than 1cm; approximately 2 cm and approximately 3 cm; and 11
young leaves with 12 cm.12
Key Results - Secretory trichomes are present at both surfaces but in a large number at 13
abaxial. These secretory structures are classified as saculiform, formed by one basal cell 14
and one secretory cell. Trichomes density decreases during leaf blade expansion, being 15
scarce in completed expanded leaf. Trichomes originate from the protoderm of the leaf 16
primordia and reach the maturity at very young leaves(1 cm), persisting at young leaves, 17
and rare in fully leaf. Hypostomatic leaf blade present unisseriated epidermis covered 18
with a thin cuticle, dorsiventral mesophyll with 1-2 palisade layers and 4-5 spongy 19
layers. Leaf essential oil was characterized by a high content of germacrene D and B; Z-20
β-farnesene; 4-octilresorcinol, α-cadinol and bisabolene.21
Conclusions - Piper hoffmannseggianum leaves were studied under microscopy. 22
Different development stages were described, as outer cell wall ontogenesis and 23
secretory trichomes structure. Essential oil composition indicates a possible role in 24
defense mechanisms.25
26
27
Key words: Piper hoffmannseggianum, Piperaceae, trichomes, stomata, secretory28
structure, leaf anatomy, leaf development, outer cell wall ontogeny, essential oil.29
30
61
INTRODUCTION1
The Piperaceae family is pantropical with species distributed in the New World 2
from Mexico to southeastern Argentina (Cronquist, 1981, Judd et al., 2002). In Brazil 3
these plants are found from North to South, represented by 5 genera and 500 species 4
(Souza and Lorenzi, 2005). The family may be recognized vegetative by their 5
herbaceous habit and/or their separate vascular bundles in the stem, by their swollen 6
nodes, and by their soft and/or fleshy leaves that are often cordate at the base (Stevens, 7
2007). 8
The genus Piper L. includes more than 1000 species making it one of the largest 9
genera of basal angiosperms (Soltis et al., 1999) consisting in small trees, shrubs, sub 10
shrubs, or rarely herbs erect or reclining, glabrous or pubescent. A new review 11
established an infrageneric classification for Piper dividing it in 6 sections Ottonia, 12
Enkea, Macrostachys, Callianira, Churumaya and Radula (Tebbs, 1989). Brazilian 13
forests shelters 283 species of Piper L (Yuncker, 1972; 1973). Among these species we 14
can locate Piper hoffmannseggianum Schult., as a medicinal plant, utilized at Rio de15
Janeiro, São Paulo and Minas Gerais states.16
17
Leaf development18
Leaves are produced only through the activity of a shoot apical meristem. The 19
leaf morphogenesis involves three main stages: initiation (through cell division), 20
morphology acquisition and tissues differentiation. At the base of the meristem, cells 21
just interior to the protoderm grow outward, forming a protrusion know as leaf 22
primordial. During this stage the primordial consists of a leaf protoderm and leaf ground 23
meristem, and all cells are meristematic, with dense cytoplasm and small vacuoles 24
62
(Mauseth, 1995). In early stages leaf epidermis can develop specialized cells as stomata 1
and trichomes. Trichomes vary widely in structure with species, and more than one 2
structural type can be present on a given plant (Dickinson, 2000). Stomata originate 3
through a series of divisions that generate the stomatal spacing pattern, control stomatal 4
frequency, and produce the two guard cells of the valve (Bergmann and Sack, 2007).5
Many anatomical characteristic of completely expanded leaves as vascular 6
bundles, epidermal aspects, secretory structures and petiole are useful for taxonomy 7
(Metcalfe and Chalk, 1979; Dickinson, 2000). The understanding of these processes can 8
generate benefits for future structural plant studies.9
10
Outer cell wall 11
The outer cell wall is a frontier zone, where the cell encounters the outside 12
world. This attribute provides peculiar characteristics to cell wall. Primary cell walls are 13
composed of polysaccharides, smaller proportions of glycoproteins and, in some 14
specialized cell types various noncarbohydrate substances such as lignin, suberin, cutin, 15
cutan or silica (Fry, 2004). In the protoderm it is evident the presence of amorphous 16
procuticle. Development of the cutinized layers proceeds by sequential impregnation as 17
successive cell wall layers with cutin, by growth and lateral fusion of globular cutin 18
cystoliths. The later stages of development of the cell wall may involve deposition of 19
inorganic material (Tenberge, 1992). 20
The current opinion is that the ultrastructure of diffusion pathways trough the 21
cuticular membrane must be at intermolecular level. The outer cell wall presents various22
features at different development stages and environmental conditions. This variation 23
can be noted in many organs in the same species (Klein et al., 2007). In a general way, 24
63
impermeable cuticles presents ultrastructure with one external lamellate layer, followed 1
by a reticulated internal and continuous layers (type II cuticle). The impermeable 2
cuticles present only the reticulated layer (type IV) (Holloway, 1982). Further studies 3
would be needed to elucidate the outer cell wall architecture and its biological function.4
5
Secretory trichomes ultrastructure6
Secretory trichomes are outgrows from the epidermis and vary in size and 7
complexity, including hairs, scales, and other structures (Dickinson, 2000). According 8
to Solereder (1908) and Metcalfe and Chalk (1950), Piperaceae secretory trichomes are 9
from two types: pearl glands, constituted by a spherical luminous cell and sac-like 10
trichomes, constituted by a basal cell and secretory cells, spherical or saculiform. These 11
structures can secret lipids, proteins and polysaccharides, as observed in Piper regnellii12
var. regnellii (Silva and Machado, 1999). 13
Ultrastructurally, secretory trichomes during secretory phase are characterized 14
by plastid hypertrophy and the extensive proliferation of endoplasmic reticulum, 15
concurrently with the development of a large subcuticular space to accommodate the 16
oleoresin (Ascensão et al., 1997; Giuliani and Bini, 2008). Leaf capitate trichomes of 17
Leonotis leonurus (Lamiaceae) presented smooth and rough endoplasmic reticulum 18
proliferation and increase in the number of Golgi stacks (Ascensão and Pais, 1999). 19
Further studies are needed to enable relationship between the materials secreted with 20
ultrastructural features.21
22
23
64
Essential oil1
The genus Piper L. includes a large number of species that are characterized by 2
the production of oils essential of great interest as pharmaceutical and insecticides 3
(Machado et al., 1994). Many Piper species are aromatic and as a consequence, the 4
chemical composition of the essential oils of several of them has been the subject of 5
incessant studies, revealing a diverse range of volatile components, including 6
monoterpenes, sesquiterpenes, and other compounds (Cysne et al., 2005; Morais et al., 7
2007; Guerrini et al., 2009) 8
Considering that little is known about the studied specie, the aim of this work 9
was describe the leaf development, secretory trichomes ultrastructure and leaf essential 10
oil composition of Piper hoffmannseggianum Schult..11
12
65
MATERIALS AND METHODS1
Plant material2
Leaves of Piper hoffmannseggianum Schult. were collect from Atlantic rain forest 3
natural populations at Paraty, Rio de Janeiro State, Brazil. Voucher specimens were 4
deposited in the Jardim Botânico do Rio de Janeiro Herbarium, under the RB 494467.5
Samples were classified under different stages: leaf development (1 cm), leaf 6
development (2 cm) and young leaf (12 cm), separated under base, medial and apex 7
region.8
Anatomical studies9
Fresh samples were clarified for 24 h in sodium hypochlorite 5%, washed in distilled 10
water and mounted to observation in light microscopy. The number of trichomes and 11
stomata were taken by measuring 25 images (1650 μm
2
) with Analysis
®
Program. 12
Graphics were constructed with Excel
®
.13
Fragments were fixed for 2 h in a solution of 2.5% glutaraldehyde and 4.0% 14
formaldehyde, in 0.05 M cacodylate buffer to pH 7.2 at room temperature. After being 15
rinsed with the same buffer, the samples were post-fixed with 1.0% osmium tetroxide in 16
0.05 M cacodylate buffer pH 7.2 for 2 h. Subsequently, the samples were dehydrated in 17
a graded series of acetone solutions. The material was infiltrated and embedded in the 18
epoxy resin (Polybed). Sections of 1 μm were obtained and stained with toluidine blue 19
(1% aqueous solution). The slides were sealed with Entellan
®
(Merk) and observed in an 20
Axioplan Zeiss microscope coupled to a Cannon PowerShot A640 digital camera.21
66
Fresh material free hand cuts were obtained and processed to histochemical 1
methods ruthenium red, Shiff reagent and astra blue/fucsine according to Jensen (1962). 2
Cuts were staind with a solution of 1 % Auramine O during 10 minutes and observed at 3
fluorescence microscopy.4
Ultrastructurural studies 5
Leaf fragments were fixed, post-fixed, dehydrated, and embedded, as described 6
previously. Ultrathin sections were collected on 300-mesh grids, stained with 1.0% 7
uranil acetate followed by 5.0% lead citrate (Reynolds, 1963). Sections were observed 8
at 80 kV using a Zeiss EM 900 transmission electron microscope.9
Micromorphology studies10
The material were fixed, post-fixed, and dehydrated as described above. Samples were 11
subsequently critical-point dried in CO
2
, sputter coated with 20 nm gold, and observed 12
with a digital scanning electron microscope (Zeiss DSEM 962).13
14
Isolation of essential oils15
Fresh leaf samples (500 g) were subjected to hydro distillation for 2 h in a Clevenger-16
type apparatus. The isolated essential oils were extracted with dichloromethane and 17
analysed by gas-chromatography mass-spectrometry (GC-MS).18
19
GC-MS conditions20
GC-MS analysis was carried out on a Hewlett-Packard Model HP6890 using a ZB-5MS 21
capillary column (30 mm x 0.25 mm x 0.25), helium as the carrier gas, flow rate of 1 22
67
mL.min
-1
and with split ratio. The injector temperature and detector temperature was 1
260 ºC and 200 ºC, respectively. The column temperature was programmed from 60 °C 2
to 240 ºC. 3
4
Compound identification5
The volatile components were identified by comparison of their 70 eV mass spectra 6
with those of the spectrometer data base using the Wiley L-built library and other two 7
computer libraries MS searches using retention indices as a preselecting routine. 8
9
68
RESULTS1
Leaf development2
Young leaves with 1 cm, in transverse sections show saculiform secretory trichomes 3
and undifferentiated cells (Fig. 1A). Secretory cells starts differentiation at mesophyll. 4
In transversal section of 2 cm leaf, the epidermis seems to be constituted by a single 5
layer of the isodiametrical cells covered by a thin cuticle (Fig. 2A). The mesophyll 6
consisting of 5 to 7 strata of undifferentiated isodiametrical cells, except for palisade 7
parenchyma that starts its differentiation and the secretory cells are also at this tissue 8
level (Fig. 1B). Vascular bundles are evidenced by the presence of the xylem and 9
phloem cells, not fully differentiated. Trichomes are common at epidermis (Fig. 1B) and 10
with secretory cells cytoplasm composed by protein and lipids (data not shown). These 11
structures remain in the 3 cm leaves when the tissues are not yet fully differentiated 12
(Fig. 1C). 12 cm leaves present unisseriated epidermis, with a sub epidermis strata at 13
abaxial surface. The mesophyll is dorsiventral and consists of 1-2 palisade layers and 2-14
3 spongy parenchyma layers (Fig. 1D). At 12cm leaves transverse section epidermis are 15
unistratificated, isodiamentric and covered by cuticle. A sub epidermal layer is present 16
only at abaxial epidermis. 17
Epidermis description 18
Piper hoffmannseggianum leaf blade was investigated at different development stages19
under light and electron microscopy. At frontal view, all analyzed stages presented the 20
straight anticlinal cell wall in adaxial surface (Fig. 2A) and sinuous in abaxial surface 21
(Fig. 2B). Leaves are hypostomatic presenting tetracytic stomata (Fig. 2C). Trichomes 22
are present at both epidermis and had high density at young leaves with 1 or 2cm (Fig. 23
2D), at 12 cm leaves they are more disperse (Fig. 2E) and rare and detach at completed 24
69
expanded leaves (fig. 2F). Glandular trichomes originate from the leaf protoderm and 1
reach their maturity in the young leaves with 1cm on the stem apex. In a closer view, it 2
is possible to observe that unisseriated trichomes are composed of a basal cell (BC) and 3
an apical secretory cell (SC), turgid at young leaves (fig. 2G), at 12cm leaves trichomes 4
secretory cells turns wilt (Fig. 2H) and, later, they detach. Only basal cells persist after 5
this process (fig. 2I). Under scanning electron microcopy, the trichome secretory cells 6
presents sac shaped and smooth surface and the same stages was observed. Young 7
leaves with many trichomes (fig. 3A, 3B and 3C), and turgid secretory cells (fig. 3D), 8
followed by wilting (fig. 3E) and senescence (fig. 3F). 9
Trichomes counting revealed 87,9±9 for the adaxial surface of 1cm adaxial 10
surface; 75,4±9,3 for 2 cm leaves abaxial surface; 67,13±9,8 for 3 cm adaxial surface 11
and 1,9±1,3 for young leaves with 12cm medium region adaxial surface (fig. 4A). Leaf 12
primordia trichomes with 1, 2 and 3 cm were not counted because of the great trichomes 13
amount. No significant differences were found at described values. Stomata number was 14
2,44±2 for young leaves with 12 cm basal region, 1,4±0,7 for medium region and 15
2,48±1,0 for apical region (fig. 4B). 16
Outer cell wall17
The calcofluor technique showed marking distinct in the basal layer of the outer 18
periclinal cell wall, extending up to the anticlinal revealed polysaccharides. This 19
technique demarcated polysaccharides of the outer cell wall in 2 cm leaves development 20
(Fig. 5A), 12cm (Fig. 5B) and fully extended leaves (Fig. 5C). Shiff's reagent (Fig. 5D) 21
and Ruthenium red techniques (Fig. 5E) exhibited similar marking while Auramine 22
(Fig. 5G) revealed the cuticular membrane on the reticulated side. Note a site in the 23
cuticular membrane not stained by any of the reagents used. These locations in the 24
70
external periclinal appear above the position of epidermis anticlinal cells walls in 1
cuticular membrane.2
Trichomes ultrastructure3
Trichome precursor cell (Fig. 6A) is elongated the form papillose with a 4
thickened and electron-dense cuticle; the anticlinal walls are thin with plasmodesmata; 5
the cytoplasm is denser with many mitochondria and ribosomes; the plastids have 6
globular inclusions of variable sizes; the nucleus is spherical, centrally located with a 7
conspicuous nucleolus; the vacuoles are small and contains electron-dense globular 8
inclusions. 9
In secretory trichomes the basal cell has thin anticlinal walls and thickened 10
tangential walls impregnated with moderately electron-dense lipophilic substance the 11
transverse wall shows plasmodesmata connecting to secretory cell. Secretory cells 12
cytoplasm presents spherical conspicuous nucleus, mitochondria, dictyosomes, plastids 13
varying in size. The cell wall was thickened, covered with a thick cuticle (Fig. 6B).14
Epidermal outer periclinal cell walls of leaves are similar to secretory trichome 15
cell (Fig. 6C). Ultrastructuraly, the outer cell wall starts with a thin procuticule at 1 cm 16
leaves (Fig. 6D) followed by extension of this layer and differentiation to cuticular 17
membrane (Fig. 6E). The cuticular membrane expands at 3 cm leaves (fig. 6F) and more 18
at 12 cm leaves (Fig. 6G) were starts the separation of arborescent and reticulated 19
layers.20
Essential oil composition21
72
DISCUSSION1
Leaf development2
Developmental landmarks can be used to divide the leaf morphogenesis process 3
into three stages (Sussex, 1955). At the organogenesis stage (stage 1), cells on the flank 4
of the shoot apical meristem are set aside as the founder cells of the initiating leaf. 5
Increased cell division rates characterize the region that will give rise to the leaf 6
primordia. Stage 2 delimits the basic morphological domains for the growth and 7
development of leaf parts. Cell and tissue differentiation occurs during the final stage 8
(stage 3) of leaf development by coordinated processes of cell division, expansion, and 9
differentiation (Sylvester et al., 1996). The latter two stages occur in the leaf primordia 10
proper. Leaves can initiate at the shoot apex meristem (SAM) in one of several patterns. 11
Numerous experimental studies indicate that preexisting primordia and the SAM itself 12
can influence the placement of initiating primordia and that biophysical constraints may 13
also play a role in primordia placement (Fleming et al., 1997; Green, 1987; Snow and 14
Snow, 1931, Sussex, 1955). Our work described leaf development showing that this 15
process is similar to the observed at other works.16
The occurrence of trichomes constituted by an apical cell saculiform is a 17
characteristic mentioned by Solereder (1908) and confirmed in the species in P. 18
regnellii var. regnellii (Silva e Machado, 1999). In this species, saculiform trichomes 19
recover the entire extension of young leaves (1 and 2 cm), forming a dense cover on 20
both surfaces of the leaf blade. As the leaf blade expands, the density decreases and the 21
trichomes show signs of senescence. 22
The senescence is a normal development process controlled by plant genetic 23
program. There are several senescence types in plants, from organs to specialized cells 24
73
(Dickinson 2000). The high trichome density at young leaves is reflect of protection 1
function and described by other Piper species.2
Outer cell wall3
The outer cell wall is involved in processes of defense, directly or indirectly. 4
Cuticles of leaves need to be both permeable and impermeable. They protect internal 5
leaf tissues by providing a physical barrier against pathogens, herbivores, and the 6
conductance of ultraviolet light and water (Riederer and Muller, 2006). Our results 7
suggested that Piper hoffmannseggianum secretory trichomes outer cell wall seems to 8
be related to secretion passage more than defense. However epidermal outer cell wall 9
must be related to defense more than secretion.10
The cutinization, process many times is not restrict to external portion of outer 11
cell wall, taking part at anticlinal walls, and alsointernal cell walls and even at sub 12
epidermal cell, as demonstrated at Vanilla planifolia (Gouret et al., 1993). This fact 13
made the term cuticle confuse. Holloway (1982) use the term cuticular membrane 14
substituting the generic designation of cuticle, defining then chemically related to cutin 15
presence. This work makes remarkable historical of cuticular membrane nomenclature, 16
as well as the different interpretation by the presence of cellulose constitution. 17
Carpenter et al. (2007) described giant cuticular pores in Eidothea zoexylocarya18
(Proteaceae) leaves. These structures are not similar to the described at Piper 19
hoffmannseggianum leaves supposing other mechanism of secretion passage through 20
cell wall.21
22
23
74
Trichomes ultrastructure1
Secretory cells ultrastructural characteristics observed in the trichome apical cell 2
suggest a secretion composed by a mixture of polysaccharides, proteins, and lipids, 3
whose presences were confirmed by histochemical and cytochemical tests in same 4
gerera species (Silva and Machado 1999). The presence of polysaccharides, proteins, 5
and lipids in secretion was previously reported by Werker and Fahn (1981) in the 6
glandular trichomes of Hula viscosa, and by Machado et al. (1995) in the secretory 7
trichomes present in the nectaries of Zeyheria digitalis.8
The plastids have been regarded as important organelles in several secretory 9
systems and their presence could be associated with the synthesis and storage of 10
different substances, such as proteins, polysaccharides and lipids. The aspects of the 11
plastids vary from typical to highly modified, depending on the secreted material and/or 12
the secretory stage (Fahn, 1979; Silva and Machado, 1999). Trichomes ultrastructure 13
suggests a mix secretion. This information was confirmed by histochemical tests.14
15
Essential oil composition16
Piper hoffmannseggianum essential oil composition confirmed the Piper medicine17
potencial. Several plants of Piper genus are largely used in folk medicine in several 18
parts of the world and have been reported to produce compounds with diverse biological 19
and pharmacological properties (Danelutte et al., 2005; Stöhr et al., 2001). Other 20
bioactivities of Piper are studied by Guerrini et al. (2009). Larvicidal activity of 21
essential oils from Piper species were studied by Morais et al., (2009).22
75
Compounds as β-farnesene and germacrene D are present at essential oils from 1
Piper lanceaefolium (Piperaceae) (Mundina et al., 2001). Germacrene D and α-cadinol 2
are found at other Piper species (Cysne et al., 2005). These compounds can be related to 3
leaf protection against pathogens and predators.4
5
6
CONCLUSIONS7
Piper hoffmannseggianum Schult (Piperaceae) leaves were studied under light 8
and electron microscopy. Different development stages were described, as outer cell 9
wall ontogenesis and secretory trichomes structure. Essential oil composition indicates a 10
possible role in defense mechanisms; however, more studies must be carried to 11
elucidate this proposition.12
13
ACKNOWLEDGEMENTS 14
We thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); 15
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and 16
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), for financial support; 17
B.F. Ribeiro, and G.A. Moraes of the LBCT/CBB/UENF technicians. This study was 18
part of the PhD thesis of the first author, presented to the Programa de Pós-Graduação 19
em Biociências e Biotecnologia/UENF.20
21
22
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9
80
FIGURE CAPTIONS1
2
3
4
5
Figure 1. Light microscopy of Piper hoffmannseggianum leaves at different 6
development stages. A - leaf primordia 1 cm, note undifferentiated tissues; B - leaf 7
primordia 2cm; C - leaf primordia 3cm; D - leaf primordia 12 cm. St – stipule; sc –8
secretory cell; LP – leaf primordia; Arrows – secretory trichome; Ad – adaxial 9
epidermis; PP – palisade parenchyma; VB – vascular bundle; SP – spongy parenchyma; 10
Ab – abaxial epidermis; SL – subepidermal layer. Bars: 50 μm.11
12
81
1
Figure 2. Light microscopy of Piper hoffmannseggianum leaves frontal view at 2
different stages. A-D and G – 2cm leaf; E and H – 12 cm leaf; I and F – Completely 3
expanded leaf. A – Adaxial epidermis; B-D – Abaxial epidermis; BC – basal cell, SC –4
secretory cell, T – trichome, S – stomata. Bars: A-C/G-I – 50 μm; D-F – 25 μm.5
6
82
1
Figure 3. Scanning electron microscopy of Piper hoffmannseggianum leaves at 2
different stages. A - leaf primordia 1 cm, note trichomes abundance; B - leaf primordia 3
2cm, note abundant trichomes; C - Trichome detail; D - turgid trichome; E - trichome 4
with wilt secretory cell; F - trichome scar.T – trichomes; SC – secretory cells; BC –5
basal cell. Bars: A and B – 200 μm; C-D – 20 μm; E-F – 10 μm.6
7
83
1
Figure 4. Piper hoffmannseggianum trichomes (A) and stomata (B) number at different 2
leaf stages. A – Number of trichomes at 1650 μm
2
in abaxial and adaxial surface. B –3
Number of stomata at 1650 μm
2
in abaxial and adaxial surface. LP 1 cm - leaf primordia 4
(1cm); LP 2 cm - leaf primordia (2cm); YL 12 cm B - young leaf (12 cm) basal region; 5
YL 12 cm M - young leaf (12cm) medial region; YL 12 cm A - young leaf (12 cm) 6
apex region.7
8
84
1
2
Figure 5. Fluorescence microscopy of Piper hoffmannseggianum leaves at different 3
stages. A - leaf primordia 2 cm; B – young leaf 12cm; C – complet expanded leafs 4
(calcofluor); D - leaf primordia 12 cm, shiff reagent; E - Leaf 12 cm, Ruthenium red; F -5
leaf primordia 2 cm (Astra blue and fucsine); G - young leaf 12 cm (auramina O). Bars: 6
50 μm.7
8
85
A B
C
D
E F G
1
Figure 6. Transmission electron microcopy of Piper hoffmannseggianum leaves at 2
different stages. A – leaf primordia 1 cm, note secretory cell; B – tricome secretory cell; 3
C – Trichome (T) and epidermal cell (EP); D - leaf primordia 1cm; E - leaf primordia 4
2cm outer cell wall; F - leaf primordia 3 cm outer cell wall; G - young leaf 12 cm outer 5
cell wall. Bars: 200 nm.6
7
88
Chamaesyce thymifolia (Euphorbiaceae) leaf epidermal cell walls under SEM/EDS
EMILIO DE CASTRO MIGUEL, GUILHERME RODRIGUES RABELO, FLÁVIO
COSTA MIGUENS and MAURA DA CUNHA*
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Centro de Biociências e Biotecnologia,
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Av. Alberto Lamego, 2000, Parque
Califórnia, Campos dos Goytacazes, RJ, Brazil – CEP 28013-602. [email protected]
* Corresponding author: Tel: +55 22 27397263
e-mail address: [email protected]
89
Abstract
The outer cell wall is a frontier zone, where the cell encounters the outside world. This
attribute provides peculiar characteristics to cell wall. During the development of cell
wall occurs an anisotropic expansion, responsible to shaping the cell. The aim of this
work was evaluated leaf epidermis of
Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp
(Euphorbiaceae) under four stages, with and without Ruthenium red treatment and
investigated silicon accumulation during the leaf maturation using SEM/EDS.
C.
thymifolia
leaves were collected from plants grown in the UENF campus, Rio de
Janeiro, Brazil. Four different leaf stages were analyzed from the first to third node and
fully expanded leaves. Samples were prepared according usual methods for light and
electron microscopy. In addition, samples were treated with chloroform and Ruthenium
red. C. thymifolia showed surface, covered by platelets of epicuticular wax. Uniseriate
epidermis presented a single layer; with anticlinal cell walls slightly sinuous in the both
surface. Leaves also showed Anomocytic, paracytic and anisocytic stomata. In cross-
section, stomata were observed at the lower level of the remaining typical epidermic
cells. Chloroform treatment removed the epicuticular wax in both surfaces making
ruthenium red penetration easily in both surface. The most part of ruthenium signal
under EDS was noted in anticlinal walls. No anatomical differences were noted in the
evaluated stages of C. thymifolia leaves; however we noted a silicon accumulation in
the old stage. More studies are need to evaluate the penetrability the Ruthenium red and
silicon accumulation biological function.
Keywords: Chamaesyce thymifolia, epidermis, cell walls; SEM/EDS; microanalysis.
90
1. Introduction
Primary cell walls are composed of polysaccharides, smaller proportions of
glycoproteins and, in some specialized cell types, various combination of
noncarbohydrate substances such as lignin, suberin, cutin, cutan and silica (Fry, 2004).
Under transmission electron microscopy, Tenberge (1992) described that cell
wall is divided in three distinct layers: the cuticle proper, the cuticular layers, divided in
reticulated and arborescent, and a basal polysaccharide rich. Others authors follow this
classification as Barros and Miguens (1998); Klein et al. (2004), Miguel et al. (2006).
However, this view is not enough to study cell wall architecture.
Spatial regulation of cell wall secretion by the cytoskeleton is crucial for
determining patterns of wall extensibility and thus patterns of growth (Smith and
Oppenheimer, 2005). During the cell wall development occurs an anisotropic
expansion, responsible to shaping the cell (Baskin, 2005). During this process the cell
wall architecture can be modified by enzymes like peroxidases (Passardi
et al., 2004)
and little is known about the enzymes that catalyze synthesis of cell wall
polysaccharides (Somerville et al., 2004).
The word microfibril applies to any group of glucose chains, whether it is the
“elementary” microfibril whose number of chains is a matter of debate or to higher-
order assemblies of already crystalline domains. Neighboring microfibrils tend to be
roughly parallel, giving the cell wall a mat-like appearance and a distinct structural
anisotropy (Baskin, 2005). When observed under electron microscopy, cell walls appear
to be a network of extended polysaccharides with high molecular weights (Somerville et
al., 2004). Great extent information can be extract from a carefull view of cell walls,
especially in outer cell walls.
91
The outer cell wall is a frontier zone, where the cell encounters the outside world
(Brett and Waldron, 1990). This attribute provides peculiar characteristics to the cell
wall. Among the peculiar characteristics are the incorporation of minerals such as
silicon functions include mechanical stability of tissues, protection against fungi, insects
and herbivores, resistance to drought, facilitation of light interception, and alleviation of
problems caused by nutrient deficiency and excess (Motomura, et al., 2006). The
quantity levels of mineral elements found in plant tissues ranges to 0.1–10% on a dry
weight basis (Epstein, 1999). Analyses of many plants led Jones and Handreck (1967)
to propose a rough division of plants into three groups: wetland Poaceae have the
highest values, on the order of 10–15% on a dry weight basis; dryland grasses, which
have levels about 1–3%; with less than 1% for most of dicots.
In leaf epidermis silicon can combine with cellulose (Jones and Handreck, 1967;
Cheong et al., 1973), can be present in guard cells, trichomes, papilous and bulliform
cells (Campos and Labouriau, 1969; Silva and Laubouriau, 1970; Ball et. al., 1999).
Silicon deposition in cell wall makes this structure resistant to fungi and insect and
prevents water loss (Dayanandam et. al., 1983; Cheong et al., 1973; Postek, 1981).
Euphorbiaceae represents one of most important Brazilian dicotyledonous
family, comprising about 70 genera and 1000 species.
Chamaesyce thymifolia (L.)
Millsp., a synonym of Euphorbia thymifolia L, has inumerous ethnobotanical uses. This
plant reputed to be efficacious medicinally as diuretic, anthelmentic, possesses
antibiotic properties, antioxidant and antiviral activities and it has also shown beneficial
effects when used in the treatment of diarrhea and dysentery (Gupta et al., 2007).
The aim of this work was evaluated leaf epidermis of Chamaesyce thymifolia
under four stages, with and without Ruthenium Red treatment and investigated silicon
accumulation during the leaf maturation using SEM/EDS.
92
2. Material and methods
2.1. Plant material
Morphology – Chamaesyce thymifolia is a small annual prostrate forming dense
mats up to 20 cm. in diameter, grayish green and usually reddish purple tinged on all
parts, herb, hispid, branches with opposite obliquely oblong obtuse crenulate; leaves
opposite, very small, glabrous or puberulent, coppery; stipules elongate fimbriate;
inflorescences minute axillary compound pubescent; cyathial gland small or none;
capsule shortly stalked, seeds 4-angled, blunt, with 5 or 6 shallow transverse furrows
(Stone, 1970; Souza and Lorenzi, 2005).
Chamaesyce thymifolia (Euphorbiaceae) leaves were collected from plants
grown in the Universidade Estadual do Norte Fluminense-Darcy Ribeiro campus, Rio
de Janeiro, Brazil. Four different leaf stages were analyzed from the first to third node
and fully expanded leaves.
2.2. Scanning electron microscopy
For scanning electron microscopy, the samples were fixed for two hours in a
solution of 2.5 % glutaraldehyde and 4.0 % formaldehyde in 0.05 M cacodylate buffer,
pH 7.2. Subsequently, the samples were rinsed in the same buffer, dehydrated in an
ascendant acetone series and treated in chloroform for 30 minutes at 60ºC. After this
procedure, rinsed in water. Part of the samples was exposed to Ruthenium red for 36
hours, in aqueous solution. A dehydratation was performed again (Johansen, 1940).
Afterwards, the samples were critical-point-dried using CO
2
(CPD 030 –
Baltec). Dried samples were adhered on stubs with carbon adhesive tape (3M) and
93
covered with carbon in a CED 030 (Baltec). As routine technique after the first
dehydrated samples were critical-point-dried, mounted and observed. Data were carried
out in a Zeiss DSM962 operating at 25 kV. X-ray microanalysis data were obtained in a
Link Oxford System (1024 channels) attached to Zeiss DSM962 using Si(Li) detector
with berilium window. In adition completed expanded leaves were air dried and
observed at the same microscope.
94
3. Results
3.1. Leaf microstructure
Chamaesyce thymifolia showed leaf surface covered by platelets of epicuticular
wax. The leaf blade has uniseriate epidermis, presented a single layer; with anticlinal
cell walls slightly sinuous in the adaxial (fig. 1) and abaxial (fig. 2) epidermis. The
presence of anomocitic stomata at adaxial and abaxial surfaces characterize an
anfistomatic leaf. In addition, the leaves also showed paracytic and anisocytic stomata.
In cross-section, stomata were observed at the lower level of the remaining typical
epidermis cells (data not shown).
The chloroform treatment removed the epicuticular wax in both adaxial (fig. 3)
and abaxial (fig. 4) surfaces that appear smooth and revealed a sinuous anticlinal wall.
Additional Ruthenium red treatment does not result in any changes under back scattered
electrons (BSE) images (figs. 5 and 8). However, by EDS, the ruthenium was detected
in both epidermis (fig. 6 and 9) and accumulated in anticlinal walls in abaxial (fig. 7)
and adaxial (fig.10) surfaces, but not in stomata as demonstrated by Ruthenium map.
3.2. Silicon accumulation
Little modifications were noted in BSE images to the four studied stages. The
sinuous anticlinal walls were evident in all node (fig. 11, 14, 17 and 20). EDS spectra
reveled the predominance of calcium signal in the epidermis (fig. 12, 15, 18 and 21),
however, in fully expanded leaves a silicon peak was noted (fig. 21) and it was located
in guard cells as demonstrated by (fig. 22) in the three first stages, the silicon signal was
detected dispersed in the epidermis (figs. 13, 16 and 19).
95
4. Discussion
Plant wax is the collective term used to describe cuticle lipid components which
covers the outer surface of aerial plant tissues (Kunst and Samuels, 2003). The
chloroform treatment dissolved the wax, allowing a best penetration of Ruthenium red
in the epidermis. This strategy was used before by Johansen (1940), however this
technique is not used commonly.
Comparing samples treated with chloroform and with chloroform and
Ruthenium red, no differences were observed into micromorphology. Some authors
suggest that Ruthenium red penetration do not changed the cell walls ultrastructure
(Klein et al., 2004; Miguel et al., 2006).
Pectins are one of the structural polysaccharide components of the primary cell
walls of plants and are useful as gel-forming, thickening, and stabilizing agents in the
food industry where the main fields of application include jams and jellies and
confectionery and dairy products (Christensen, 1986). Ruthenium red is a dye which
selectively binds to the intramolecular spaces of carboxyl groups of pectin and shows
little binding to alginic acid carboxyl groups (Hou et al., 1999). Our study show, by
MEV/EDS, ruthenium accumulation in both epidermis, predominantly in anticlinal
walls but not in stomata suggesting the chemical composition of these structures.
Silicon is the most abundant element in the earth’s crust (Motomura et al.,
2006). The accumulation of silicon in guard cell wall makes this structure resistant to
fungi and insects and also prevents the water loss (Dayanandam et al., 1983; Cheong et
al., 1973; Postek, 1981). Attention is drawn to the fact that even relatively low values in
silicon contents tissue, such as 0.1%, are still comparable with the low values found for
such macronutrient elements as S, P, and Mg (Epstein, 1994). However, in view of the
96
large variability, all categorizations should be viewed with caution (Epstein, 1999). A
tabulation of the ranges of the tissue levels of mineral elements found in plants gives the
range for silicon as 0.1–10% on a dry weight basis, it being understood that both lower
and higher values may be encountered (Epstein, 1994).
Silicon deposition in epidermis was detected in many monocots as
Pleioblastus
chino (Motomura et al., 2006) and Dactylis Glomerata (Laue et al., 2007). However
there are just a fell registration for silicon accumulation in dicots, been the
Cucurbitaceae and Rosales intermediated accumulators (Epstein, 1999).
The Euphorbiaceae family belongs to Malphighiales, the bigger Rosids order
whereas Curcubitaceae and Urticaceae, respectively, Curcubitales and Rosales order,
compose of the nitrogen-fixing clade. All these taxa were assembled in Eurosids I (APG
II, 2003). In despite of silica contents in the stomata cells, the phylogenetic relationship
suggests this event occurs independently in these families. This is the first report for
silicon accumulation in dicots guard-cell.
97
5. Conclusions
Chloroform treatment removed the epicuticular wax in both surfaces making
ruthenium red penetration easily in both epidermis. The most part of ruthenium signal
under EDS was noted in anticlinal walls. No anatomical differences were noted in the
evaluated stages of
C. thymifolia leaves however we noted a silicon accumulation in the
old stage. More studies will be needed to evaluate the penetrability the Ruthenium red
and also the silicon accumulation biological function.
Acknowledgments
We thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), for financial support.
B.F. Ribeiro, and G.A. Moraes of the LBCT/CBB/UENF technicians. This study was
part of the PhD thesis of the first author, presented to the Programa de Pós-Graduação
em Biociências e Biotecnologia/UENF.
98
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101
Figures legends
76
9 10
3 4
5 8
1 2
Figure 1-10: Epidermal fully expanded leaf surface of Chamaesyce thymifolia. Adaxial
(1) and abaxial (2) leave surface under routine technique, secondary electrons; adaxial
(3) and abaxial (4) leave surface treated in chloroform only, BSE; adaxial (5) leave
surface treated in chloroform and Ruthenium red (BSE), relative spectrum (6) and
Ruthenium map (7) at corresponding area; abaxial (8) leave surface treated in
chloroform and Ruthenium red (BSE), relative spectrum (9) and Ruthenium map (10) at
corresponding area.
102
11
17
20
12
15
18
21
14
13
22
16
19
Figure 11-22: Epidermal abaxial leaf surface of Chamaesyce thymifolia. 11-13 – First
node leaves. BSE image (11), respective X-ray spectrum (12) and silicon map at
corresponding area (13); 14-16 – Second node leaves. BSE image (14), respective X-
ray spectrum (15) and silicon map at corresponding area (16); 17-19 – Third node
leaves. BSE image (17), respective X-ray spectrum (18) and silicon map at
corresponding area (19); 20-22 – Fully expanded leaves. BSE image (20), respective X-
ray spectrum (21) and silicon map at corresponding area (22). Note silicon disperse in
the samples, except in the complete expanded leaves (22) where silicon accumulated in
guard cells.
103
CAPÍTULO 4
Parede periclinal externa: uma breve comparação entre estruturas secretoras e não
secretoras
Parte II: Artigo 5
Outer cell wall ultrastructure and secretion mechanism in Bathysa nicholsonii K.
Schum. (Rubiaceae) colleters
Artigo será traduzido de acordo com as normas da revista American Jounal of Botany
104
Estrutura da parede periclinal externa e mecanismos de secreção dos coléteres de
Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae)
Outer cell wall ultrastructure and secretion mechanism in
Bathysa nicholsonii K.
Schum. (Rubiaceae) colleters
Emilio de Castro Miguel, Flavio Costa Miguens, Claudia Franca Barros, Umberto Zottich
Pereira, Valdirene Moreira Gomes e Maura Da Cunha
Artigo a ser traduzido de acordo com as normas da revista American Jounal of Botany
105
INTRODUÇÃO
Estruturas ou tecidos secretores estão presentes em diferentes órgãos das
plantas e são caracterizadas por suas distintas formas (Dickinson, 2000). Atualmente, a
classificação das estruturas secretoras se baseia na morfologia ou no conteúdo do
exsudato por elas liberado. Entretanto, tal classificação é discutível uma vez que os
tecidos secretores, em geral, sofrem transformações relativamente rápidas (Machado,
2005). Dessa forma, a estrutura, a ultraestrutura e o conteúdo bioquímico das células
podem ser modificados rapidamente dificultando assim a sua classificação, já que
tecidos iguais podem ser considerados diferentes por se encontrarem em distintas
etapas da maturação (Fahn, 1979).
Partindo do principio que a parede celular vegetal tem composição estrutural
diferenciada nos vários órgãos e estruturas dependendo de sua função, a parede
periclinal externa das estruturas secretoras são diferenciadas.
Por definição, coléteres são estruturas secretoras constituídas por um eixo
central alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato
epidérmico em paliçada (Da Cunha e Vieira, 1997), sendo as células epidérmicas
responsáveis pela secreção (Thomas, 1991). A função dos coléteres ainda é discutida,
porém tem sido atribuída a essa estrutura a função de defesa do meristema apical,
seja física ou química. Essa estrutura foi descrita sob vários nomes (Ramayya e
Bahadur, 1968; Van Hove e Kagoyre, 1974; Dave e Patel, 1975; Curtis e Lersten, 1980).
De acordo com Thomas (1991), esse tipo de estrutura secretora é encontrado
na face adaxial de diferentes órgãos de membros de 60 famílias de Angiospermae. O
mesmo autor aponta, ainda, que os coléteres podem ocorrer em estipulas e em outros
106
órgãos, como em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras
famílias. Para a distinção de famílias, as variações dos coléteres apresentam-se pouco
úteis, mas em termos de gêneros e subgêneros em Rubiaceae, essa característica se
torna bastante consistente (Robbrecht, 1988).
Estudos recentes demonstram a presença de coléteres em diferentes famílias e
em regiões não descritas anteriormente. Paiva e Machado (2006) elucidaram a
ontogênese e ultraestrutura dos coléteres de Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae:
Caesalpinioideae). Simões et al. (2006) descreveram os coléteres calicinais de sete
espécies de Apocynaceae (Apocynoideae). De Paula e Oliveira (2007) notificaram a
ocorrência de coléteres em embriões de três espécies de Chamaecrista Moench
(Fabaceae: Caesalpinioideae). Leitão e Paiva (2008) caracterizaram os coléteres das
brácteas de Rodriguezia venusta (Orchidaceae). González e Tarragó (2009)
descreveram a estrutura e a secreção dos coletes foliares de Ilex (Aquifoliaceae). Com
esses recentes estudos estas estruturas secretoras, incluindo sua definição e função
retornou a discussão na literatura.
A parede celular vegetal é formada principalmente por celulose, hemicelulose e
pectina. O domínio péctico determina o grau de porosidade e fornece moléculas
sinalizadoras para disparar mecanismos de defesa em plantas. O domínio de celulose e
de hemicelulose influencia na forma celular, pois as hemiceluloses interagem
especificamente com a celulose, orientando as microfibrilas durante o processo de
biossíntese e determinando também a orientação do crescimento. Acredita-se que a
orientação dessas fibrilas tenha um papel importante no crescimento celular por
107
alongamento e também na forma celular. Outras moléculas, como as proteínas,
também desempenham papel estrutural na parede celular vegetal (Raven, 1999).
De acordo com o órgão, e estágio de desenvolvimento, dois tipos básicos de
paredes podem ser encontrados em vegetais superiores: paredes primárias e paredes
secundárias. As primárias são produzidas por células em crescimento, portando podem
se alongar, enquanto as paredes secundárias não possuem essa capacidade (Hayashi,
1989). Ainda nesse contexto de variação, as paredes celulares podem exercer
diferentes funções. Ou seja, a parede celular reforça a célula, mas também permite a
troca metabólica de alguns constituintes especialmente durante a germinação,
amadurecimento de frutos e abscisão. Tem ainda como função proteger de forma
eficiente contra ataque de patógenos. Além disso, o depósito de material
complementar como lignina e calose em resposta ao ataque de patógenos, danos a
tecidos e estresse ambiental (Christiernin, 2006).
A PPE é a fronteira entre a planta e o ambiente. Esta estrutura é formada por
macromoléculas e constitui uma barreira ao fluxo bidirecional em grande parte dos
tecidos de revestimento nas plantas. A parede periclinal externa tem sido relacionada
também à proteção contra radiação, danos mecânicos, patógenos e pragas. A
variedade de funções dessa estrutura tem sido associada à sua estrutura,
complexidade e diversidade. A distribuição de seus componentes, usualmente, é
heterogênea. A nomenclatura de seus estratos tem sido baseada nesta peculiaridade.
Tenberge (1992) propõe que a parede celular é dividida em cera epicuticular e três
camadas distintas: a cutícula propriamente dita, as camadas cuticulares, divididas em
camada reticulada e camada arborescente, e camada rica em polissacarídeos. Outros
108
autores também utilizam esta nomenclatura (Barros e Miguens, 1998; Klein et al.,
2004 e Miguel, 2004). A composição e estrutura das paredes celulares vegetais podem
variar durante o crescimento e a diferenciação da célula e em resposta a fatores
ambientais (Barros e Miguens, 1998; Marques, 1998). No entanto, a morfologia e
fisiologia, sobretudo os mecanismos de secreção, da parede periclinal externa têm sido
considerados espécies-específicas.
Além disso, sabe-se também que o sucesso do processo de secreção se
encontra intimamente relacionado à modificação e preparação de toda a maquinaria
celular, o que conseqüentemente desencadeia a produção e a externalização do
exsudato (Fahn, 2000). A etapa final do processo secretor é caracterizada pela
passagem de moléculas de secreção pela parede celular, cujas principais funções são:
evitar a ruptura da membrana plasmática; determinar o tamanho e a forma da célula,
a textura do tecido e a forma final do órgão vegetal; promover a junção de células,
evitando que se deslizem e se separem; conferir resistência mecânica às estruturas
vegetais, permitindo-lhes alcançar grandes alturas e exercer papel ativo na defesa
contra bactérias e fungos patogênicos recebendo e processando informação da
superfície e transmitindo a informação à membrana plasmática (Raven, 1999). A
variedade de funções dessa estrutura tem sido associada à sua composição estrutural
que se apresenta complexa e diversa, sendo a distribuição de seus componentes,
usualmente, heterogênea.
O transporte de moléculas pela parede periclinal externa de estruturas
secretoras ainda não foi completamente elucidado. A maioria dos trabalhos, que se
referem de alguma forma a passagem de moléculas pela parede periclinal externa,
utilizou microscopia eletrônica de transmissão, e apenas citam a presença ou ausência
109
de cutícula. Quanto ao mecanismo de secreção, Ascensão e Pais (1998) relatam o
acúmulo da secreção no espaço periplasmático. A secreção passa pela parede celular e
se deposita em um espaço subcuticular, formado pelo deslocamento da cutícula. Esse
espaço recebe o nome também de espaço subcuticular (Possobom e Machado, 2005).
Kim e Mahlberg (1997), utilizando técnicas de imunolocalização, marcaram o
Tetra-hidro-canabinol na parede periclinal externa de tricomas criofixados,
reafirmando a função dessa cavidade na passagem de substâncias pela parede. Os
mesmos autores descreveram a formação de vesículas secretoras em tricomas de
espécies da família Cannabaceae (Kim e Mahlberg, 2003a). Mesmo assim ainda ficam
duvidas com relação ao mecanismo de passagem.
Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em
tricomas glandulares de Cannabis, a passagem da secreção através da parede periclinal
externa é feita através de “cavidades secretoras” na parede que servem para a saída
do exsudado após toda a passagem pelo tráfego de vesículas, sendo a parede celular o
meio de exteriorização da secreção. Alguns aspectos dessa passagem ainda
permanecem obscuros, pois nenhum estudo mostrou de maneira convincente todo
esse processo em células de estruturas secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes
a essas cavidades secretoras forma descritas na parede periclinal externa dos coléteres
de B. nicholsonii (Miguel, 2004) e aparentemente estão envolvidas no processo de
tráfego da secreção pela parede periclinal externa. No entanto, Jefree (1996) aponta
outros mecanismos para este tráfego, dentre os quais, microcanais perpendiculares ao
maior eixo da parede periclinal e acúmulo da secreção nas camadas cuticulares da
parede celular. Esse acúmulo acaba por levar a ruptura física dessa camada.
110
Partindo deste princípio, nosso trabalho tem por objetivo investigar a parede
periclinal externa da parede periclinal externa dos coléteres de
Bathysa nicholsonii K.
Schum, propondo um mecanismo de passagem de moléculas por essa, caracterizando
esta parede com técnicas de histoquímica, citoquímicas e imunocitoquimicas .
111
MATERIAL E MÉTODOS
Área de coleta e material botânico -
O material foi coletado na Reserva Biológica de
Tinguá, com licença concedida pelo SISBIO nº 13575-2. Esta reserva localiza-se na
porção central da cadeia da Serra do Mar, no trecho compreendido pelas serras do
Tinguá, de São Pedro e do Macuco (22º28’ e 22º39’ S, 22°35' e 43º34’ W), municípios
de Nova Iguaçu e Duque de Caxias. Os desníveis altimétricos da reserva variam entre
220 e 1.600 metros, destacando-se o maciço do Tinguá como a maior elevação. Ápices
caulinares de indivíduos adultos, incluindo as estípulas e o meristema apical caulinar,
de
Bathysa nicholsonii foram coletados com o auxílio de podão. Amostras testemunhas
foram depositadas no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro. As estípulas
foram dissecadas dos ápices caulinares com o emprego de bisturis e pinças.
Preparo de amostras para microscopia - O material foi fixado quimicamente no local
de coleta e, para extração da secreção as estípulas foram levadas ao laboratório,
acondicionadas de maneira a preservar as estruturas a temperatura ambiente; No
laboratório as estípulas foram destacadas e observadas em esteriomicroscópio. Cortes
a mão livre foram realizados no material fresco e submetidos a testes histoquímicos
para a detecção de: a) Carboidratos (hidroxilas vicinais): Cortes a mão livre de ápices
caulinares foram lavados em água destilada e imersos em solução aquosa de ácido
periódico de Schiff 1,0%, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem
em água destilada, estes foram imersos em reagente de Schiff durante 15 minutos, a
temperatura ambiente, sendo então, lavada em água destilada, durante 5 minutos a
temperatura ambiente (Hotchkiss, 1948). b) Proteínas totais foram evidenciadas em
cortes expostos a solução aquosa de Azul Brilhante de Coomassie G 0,25 % contendo 5
112
% de ácido acético, durante trinta minutos. Este procedimento foi seguido de lavagem
em solução aquosa de ácido acético 5 % por três vezes, durante 5 minutos em cada
etapa. Lâminas permanentes foram obtidas com glicerina 50%.
Alternativamente, fragmentos da base da estípula, contendo coléteres, foram
fixados em solução aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4,0 % diluídos
em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, sob temperatura ambiente, durante
2 horas. Após serem lavados por 45 minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram
pós-fixados em solução aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % diluído em tampão
cacodilato de sódio 0,05 M, pH 7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na
ausência de luz. Após três lavagens de 45 min no mesmo tampão, os fragmentos foram
submetidos à série cetônica ascendente [50 %, 70 %, 90 %, 100 % (3X)], durante 1 hora
em cada etapa, para desidratação. Então, os fragmentos foram infiltrados com
historesina Leica. Cortes semifinos foram obtidos em micrótomo rotativo e corados
com azul de toluidina 0,1% por 30 segundos e azul de Astra fucsina, por 30 segundos.
Para microscopia eletrônica de transmissão foram utilizados os mesmos
procedimentos que para microscopia óptica, exceto a ultramicrotomia e a
contrastação. Cortes ultrafinos, com aproximadamente 70 nm de espessura, foram
obtidos, utilizando-se navalha de diamante (Diatome
®
) em ultramicrótomo (REICHERT
ULTRACUT-S
®
); os cortes foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. A
contrastação foi realizada em solução aquosa saturada de acetato de uranila, durante
40 minutos, seguida de lavagem em água destilada e de 5 minutos em citrato de
chumbo 1% (Reynolds, 1963). A documentação analógica foi realizada em microscópio
113
eletrônico de transmissão (ZEISS EM 900), operando a uma aceleração de voltagem de
80 kV, em chapas fotográficas, 6” x 9”, Kodak 4489.
Testes citoquímicos foram realizados para evidenciar características
ultraestruturais e foram documentadas como descrito no tópico anterior, relativo a
microscopia eletrônica de transmissão. Os testes foram: a) Detecção de moléculas
orgânicas insaturadas: Fragmentos, após a fixação descrita anteriormente, foram
tratados com solução aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % e iodeto de potássio
1,0 % diluídos em água destilada, durante 48 h no escuro, a temperatura ambiente.
Em seguida, as amostras foram lavadas, por duas vezes, em solução aquosa de iodeto
de potássio 1,0% diluído em água destilada, durante 1 h no escuro, a temperatura
ambiente (Locke e Huie, 1983). Seguiram-se, então, os procedimentos para
microscopia eletrônica de transmissão, descrita anteriormente. O controle foi
realizado pela exclusão do iodeto de potássio.
Imunolocalização - A localização sub-celular da proteína majoritária de 29 Kda da
secreção de Bathysa nicholsonii, descrita por Miguel et al. (2006), foi feita através do
método de imunocitoquímica.
Produção de anticorpos contra proteínas majoritárias presentes nos exsudatos
Para a obtenção do soro pré-imune coelhos com três meses de idade foram
inicialmente submetidos a sangria, através de um corte na extremidade da orelha, com
uma lâmina. Após a coleta de 20 mL em um Becker, o sangue foi deixado por 30 mim a
37 ºC para coagular. Após a formação do coágulo o soro foi recolhido e submetido a
114
centrifugação a 16000 x g por 6 mim em uma microcentrifuga refrigerada a 4 ºC. Após
este procedimento o soro clarificado e livre de hemácias será armazenado a temperatura
de –20 ºC.
Amostras da proteína majoritária, que serviram de antígenos, foram preparadas
de acordo com o método descrito por Retamal et al. (1988).
Inicialmente, as bandas protéicas de interesse foram identificadas, com a ajuda
de um padrão de peso molecular corado, e recortadas do gel. Em seguida, essas bandas
foram transferidas pra um tubo falcon de 15 mL onde foram submetidas a três lavagens
de 5 mim cada uma com 2 mL de tampão Tris-HCl 250 mM e EDTA 250 mM pH7,4.
Na etapa seguinte, as amostras foram lavadas três vezes em água destilada. Em seguida,
o gel foi fragmentado com um espátula na presença de 1 mL de tampão Tris-HCl 20
mM contendo SDS 0,1 %, pH 7,4. Após esse procedimento foram feitas 15 sonicações
de 50 segundos cada. Todos os passos descritos foram realizados em banho de gelo.
Após a sonicação, as amostras foram submetidas à centrifugação a 16000 x g. O
sobrenadante foi recolhido e o precipitado descartado. O sobrenadante, contendo a
proteína majoritária de interesse, foi emulsificado em adjuvante completo de Freud na
proporção de 2:1 (proteína:adjuvante).
O protocolo de imunização do coelho para a obtenção dos anticorpos policlonais
se processou por 28 dias da seguinte forma; Dia 01 – Imunização intramuscular do
antígeno + adjuvante (1,0 mL); Dia 14 – Imunização subcutânea do antígeno +
adjuvante (1,0 mL); Dia 21 – Imunização subcutânea do antígeno (1,0 mL) + primeira
sangria; Dia 28 – Imunização subcutânea do antígeno (1,0 mL) + segunda sangria. A
obtenção e estocagem do soro após a imunização seguiu o mesmo procedimento do soro
pré-imune. A confirmação da especificidade do anticorpo policlonal foi feita através de
“Western Blotting” (Towbin et al., 1979).
115
Cortes de aproximadamente 70 nm de espessura das amostras foram coletados
em grades de níquel cobertas com um filme de Formvar e processadas da seguinte
forma. Primeiramente, as grades serão incubadas por 2 h em uma solução de cloreto
de amônio 50 mM. Em seguida serão incubadas por 2h com PBS-BSA 1% para bloqueio
dos sítios não específicos. Então, as amostras serão expostas em uma solução de PBS-
BSA com o anticorpo primário, anti-proteína majoritária (1:50), por 2 h. Em seguida, as
grades serão lavadas com PBS-BSA por duas vezes, 10 mim cada lavagem.
Subseqüentemente, as amostras são incubadas, por 2 h, com o anticorpo secundário
anti-IgG de coelho (1:300) conjugado com ouro coloidal de 10 nm. Em seguida o
material será lavado com PBS e depois com água deionizada por 20 mim cada lavagem.
Após o período de incubação o material será contrastado com acetato de uranila 5 % e
citrato de chumbo 1%. As amostras serão observadas ao microscópio eletrônico de
transmissão (ZEISS 900). O controle desse experimento será feito utilizando o soro pré-
imune de coelho e o anticorpo secundário conjugado a partículas de ouro coloidal de
10 nm e sem o anticorpo primário.
116
RESULTADOS
A observação de estipulas destacadas dos ápices caulinares de B. nicholsonii em
estereomicroscópio, revelou que os coléteres caracterizavam-se por possuir formato
cilíndrico, superfície lisa e coloração uniformemente amarela brilhante (fig. 1A). Alguns
coléteres apresentavam ápice com coloração amarronzada, sugerindo a sua
senescência.
Em cortes transversais à mão livre de material fresco, foram observados o eixo central
parenquimático e a epiderme em forma de paliçada (fig. 1B). O método histoquímico de
Schiff revelou a presença de açúcares, predominantemente no ápice das células
epidérmicas e na secreção (fig. 1C e 1D); enquanto que a coloração com Azul Brilhante de
Coomassie revelou proteínas com localização similar a dos polissacarídeos revelados pelo
método de Schiff (fig. 1E).
Cortes de material processado e incluído em historesina revelaram o mesmo aspecto
quando corados com azul de toluidina (fig. 1F). Detalhes da composição diferenciada da
parede celular podem ser notados quando a amostra foi corada com azul de astra/fucsina
(fig. 1G).
A observação da parede periclinal externa dos coléteres de B. nicholsonii
permitiu identificar diferentes fases de diferenciação da parede periclinal externa das
células das epidermes secretoras. Assim, na primeira fase, a parede periclinal externa
de B. nicholsonii apresentou três camadas morfologicamente distintas. Uma camada
basal rica em polissacarídeos, uma membrana cuticular, rica em lipídios, subdividida
em arborescente e reticulada, e uma fina camada de cutícula propriamente dita (fig.
2A).
117
Sítios de acúmulo de secreção (SAS), presentes exclusivamente na camada
basal e caracterizados por serem regiões da parede celular pobres em material fibrilar,
foram identificados na segunda fase, durante o processo de diferenciação da parede
periclinal externa (fig. 2B). Estes sítios apresentaram-se fortemente marcados pelo
método tetróxido de ósmio/imidazol (fig. 2C) e pelo método de iodeto de potássio (fig.
2D). O método do tetróxido de ósmio/imidazol revelou, ainda, intensa marcação na
membrana cuticular e nos sítios de acúmulo de secreção (fig. 2E); a camada basal e a
cutícula propriamente dita foram fracamente marcadas. A marcação pelo método de
iodeto de potássio revelou-se heterogênea na membrana cuticular, sendo intensa nas
regiões próximas à camada basal (fig. 2D), em contraste com a fraca marcação
observada na camada basal e na cutícula propriamente dita.
Os sítios de acúmulo de secreção aumentam gradativa e relativamente de tamanho em
relação à camada basal, sendo que, em determinadas regiões atingem a membrana
cuticular (fig. 3A). Os métodos citoquímicos apresentaram resultados similares aos
descritos anteriormente; ressaltando-se a intensa marcação da membrana cuticular
próxima à camada basal pelo método do iodeto de potássio, a continuidade de marcação
pelo do tetróxido de ósmio/imidazol na membrana cuticular (fig. 3B), e a marcação dos
sítios de acúmulo de secreção por estes dois métodos.
A partir de determinado momento, os sítios de acúmulo de secreção não eram mais
individualmente identificáveis; e, as imagens fortemente sugerem a dispersão do material
acumulado pela parede periclinal externa (fig. 3C). Cortes transversais aparentemente
revelaram um aumento relativo da membrana cuticular em comparação com a camada
basal, as quais se projetam regiões pontuais da membrana cuticular (fig. 3C). Os métodos
citoquímicos revelaram o mesmo padrão de marcação, anteriormente descrito, diferindo
no aumento de intensidade de marcação (fig. 3D e 3E).
118
Subseqüentemente, evidenciou-se desestruturação da parede periclinal
externa (fig. 4A - 4D). A camada basal apresentou-se menos condensada que
anteriormente (fig. 4A) e os sítios de acúmulo de secreção não foram identificáveis (fig.
4A e 4B). As projeções da camada polissacarídica, nos estratos cuticulares, tornam-se
menos evidentes. A marcação com iodeto de potássio revelou-se heterogênea na
membrana cuticular enquanto que, o emprego de tetróxido de ósmio/imidazol foi
homogêneo nesta região. Finalmente, evidenciou-se a desestruturação da camada
arborescente da membrana cuticular (fig. 4C), que praticamente desapareceu ao
termino da diferenciação (fig. 4D). A diferenciação da parede periclinal externa das
células da epiderme secretora dos coléteres foi observada.
A imunolocalização revelou marcação da proteína majoritária da secreção nos
sítios de acúmulo de secreção das paredes celulares e no exterior da célula (fig. 5A-D).
A partir dos resultados mostrados pela microscopia eletrônica de transmissão e
a técnica de imunolocalização foi possível criar um modelo dinâmico da estrutura da
parede periclinal externa dos coléteres de B. nicholsonii relacionado à passagem de
moléculas de secreção (fig. 6).
119
DISCUSSÃO
Este trabalho descreve a estrutura as mudanças da PPE dos coléteres de
Bathysa nicholsonii, durante diferentes fases de desenvolvimento. Tais mudanças
estruturais estão relacionadas diretamente ao mecanismo de passagem de moléculas
por esta estrutura. Em coléteres, a microscopia eletrônica de transmissão tem sido
utilizada para enfocar a presença ou ausência de cutícula (Klein, 2004). Os resultados
permitiram distinguir três camadas na PPE das células secretoras da epiderme dos
coléteres de
B. nicholsonii, similares aos presentes em tricomas secretores de Cannabis
sativa
(Mahlberg e Kim, 1992), coléteres de Simira glaziovii e S. pikia (Klein et al.,
2004). Este resultado adicionado da técnica de imunocitoquimica não só confirmou
esta caracterização na espécie em estudo como sugere um mecanismo de passagem
de moléculas através da PPE dos coléteres. O fluxo apoplástico pela PPE é motivo de
debate nos estudos de biologia celular vegetal. No entanto, tem sido considerado que
a parede periclinal externa da epiderme constitui uma barreira física na fronteira entre
a planta e o ambiente (Tenberge, 1992). A construção tridimensional das
macromoléculas é marcante e heterogênea, formando camadas características. Tal
estrutura deve ser, ao mesmo tempo permeável e impermeável.
Benzing e Pridgeon (1983) sugerem a absorção de água através de tricomas
secretores de mucilagens em Orquidáceas, ainda que por um curto espaço de tempo,
durante fases precoces do desenvolvimento e expansão foliares. Por outro lado,
estudos demonstram que a cutícula é mais impermeável do que qualquer filme
polimérico artificial de mesma espessura já inventado pelo homem (Riederer e
Schreiber, 2001), tornando-a uma barreira muito eficiente contra a perda de água após
120
o fechamento dos estômatos, especialmente nos epífitos vasculares, incluindo-se as
orquídeas (Helbsing
et al., 2000). Miller (1986), utilizando microscopia óptica, descreve
poros com cerca de 1
m de diâmetro, alinhados a canais anticlinalmente orientados
em mais de 50 espécies, sugerindo, assim, que a presença de poros e canais seja muito
mais amplas entre as plantas vasculares superiores. Apesar dessa proposição, poucos
estudos abordam o tema e mostram um modelo estático de parede celular que seja
permeável pela sua constituição estrutural. A maior parte dos autores acredita como
Jeffree (1996) que vias de difusão através da cutícula propriamente dita devam ser em
nível intermolecular
Várias imagens de microscopia eletrônica de transmissão das células secretoras
da epiderme dos coléteres de B. nicholsonii sugerem fortemente alterações estruturais da
PPE, durante o processo de secreção. Assim, inicialmente surge um sítio de acúmulo de
secreção na camada basal. Posteriormente, este sítio expande-se em direção ao meio
externo. Neste momento, há aparentemente uma inversão em espessura relativa entre a
camada basal e a membrana cuticular, sugerindo o fluxo da secreção. A literatura revela
processos semelhantes. Já que a secreção é lipídica e protéica, a tendência é que essa
atravesse com mais facilidade as camadas lipídicas, nesse momento maior. Mahlberg e
Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas glandulares de
Cannabis sativa, a passagem da secreção pela parede periclinal externa se da através de
estruturas semelhantes, denominadas cavidades secretoras. Kim e Mahlberg (1997)
localizaram o tetra-hidro-canabinol (THC) nas cavidades secretoras, fortalecendo esta
idéia. Utilizando criofixação e criosubstituição, os mesmos autores, observaram a
formação de vesículas secretoras que se encaminham para as cavidades secretoras (Kim
e Mahlberg, 2003). Possobon e Machado (2005) denominaram estruturas semelhantes
121
às cavidades secretoras de sítios de acúmulo de secreção. Veys et al. (2002) mostram
que a externalização de moléculas em cavidades secretoras de folhas de
Azolla se dá por
projeções na parede periclinal externa. Sugerimos, então, que as paredes periclinais
externas de estruturas secretoras assumam uma dinâmica diferente. Nosso trabalho
elucidou através da imunocitoquimica uma proteína majoritária descrita para secreção
de coléteres de
Simira glaziovii nos sítios de acúmulo de secreção da parede periclinal
externas das células secretoras do coléteres sugerindo que esta proteína é sintetizada e
transportada pelas vias secretoras e atravessa a parede celular.
Jefree (1996) aponta mecanismo diverso do citado anteriormente para o fluxo
de secreção, sugerindo a presença de microcanais, perpendiculares a membrana
plasmática, e acúmulo da secreção nas camadas cuticulares da parede celular. Este
acúmulo acaba por levar a ruptura física da parede periclinal externa. Outros autores
argumentam que não existem microcanais ou estruturas equivalentes, e que a
secreção flui através da parede periclinal externa por difusão (Veys et al., 2002).
Nenhuma estrutura semelhante às vesículas secretoras foi observada, provavelmente
pela técnica utilizada. Mais estudos utilizando técnicas de criofixação, criosubstituição
e marcadores imunológicos devem ser conduzidos para melhor elucidar a passagem da
secreção pela membrana plasmática, até a parede celular, bem como sua passagem
por essa.
O método citoquímico de iodeto de potássio (Locke e Huie, 1983) evidenciou os
compostos lipídicos da membrana cuticular, marcando-a heterogeneamente; enquanto
que, método do tetróxido de ósmio/imidazol (Angermuller e Fahimi, 1972) revelou
marcação homogênea dos mesmos compostos nesta mesma camada. A diferença entre
os dois métodos indica a necessidade de refinamento metodológico que permita
122
esclarecer tal questão. O primeiro teste aponta para que a heterogeneidade desses
extratos possa estar relacionada com o processo de passagem de moléculas pela PPE.
Nenhum estudo relacionou, ainda, a composição das camadas lipídicas da
parede celular com o mecanismo de passagem de moléculas por essa. Nesse sentido, a
elaboração de um modelo dinâmico de mudança estrutural da parede celular de
acordo com a passagem da secreção torna-se pertinente.
CONCLUSÃO
A PPE dos coléteres de Bathysa nicholsonii possui estrutura dividida em
camadas estruturalmente distintas. Foram identificadas várias fases do
desenvolvimento desta parede e, de acordo com essas mudanças foi possível elaborar
um modelo dinâmico de passagem de moléculas de secreção.
123
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128
Legendas das figuras
Figura 1: Microscopia estereoscópica e óptica dos coléteres de Bathysa nicholsonii. A –
Base da face adaxial da estípula vista ao microscópio estereoscópico. Note detalhe dos
coléteres vistos em microscópio estereoscópico; B-E – Cortes à mão livre dos coléteres
submetidos a testes citoquímicos; B – Controle; C e D - Amostras submetidas ao
reagente de Shiff; E – Amostra submetida ao teste com Azul Brilhante de Comassie.
Note, em ambos os casos, marcação na secreção, predominantemente. F – Amostra
coradas com Azul de toluidina. G – Amosta submetida ao teste de Azul de
Astra/Fucsina. Epiderme em paliçada (EP); eixo central parenquimático (quadrado);
secreção (S). Barras: A - 0,5 mm; B, C, D e F - 50 µm; G - 10 µm.
129
Figura 2: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das
células secretoras dos coléteres e da estípula de Bathysa nicholsonii. A – Parede
periclinal externa no primeiro estágio de desenvolvimento contrastada com acetato de
uranila/citrato de chumbo (rotina); B, C e D - Segundo estágio de desenvolvimento da
parede periclinal externa. B – Marcação de rotina. Note o inicio da formação dos sítios
de acúmulo de secreção (SAS) na camada polissacarídica; C – Marcação com iodeto de
potássio. Note marcação heterogênea das camadas lipidicas e fraca marcação na
camada polissacarídica. D – Marcação com Ósmio/imidazol. Note marcação
homogênea nos sítios de acúmulo de secreção e camadas lipidicas. Pol – camada
polissacarídica da parede periclinal externa; Ext cut – Extratos cuticulares, subdivididos
em camada reticulada (Ret) e arborescente (Arb); Cut – Cutícula propriamente dita.
Barras: A, B - 0,15 µm; C e D - 0,4 µm.
130
Figura 3: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das
células secretoras dos coléteres e da estípula de Bathysa nicholsonii. A e B – Terceiro
estágio de diferenciação da parede periclinal externa, marcação de rotina (A). Note os
sítios de acumulo de secreção (SAS) ocupando a maior parte da camada
polissacarídica, invadindo as camadas lipidicas; B – Marcação com Ósmio/imidazol; C e
D – Quarto estágio de diferenciação da parede periclinal externa; C - Marcação de
rotina. Observe as projeções das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas; D –
Marcação com iodeto de potássio; E – Marcação com ósmio/imidazol. Os padrões de
marcação são os mesmos descritos anteriormente. Ext – Espaço extracelular; Cit –
Citoplasma; Pol – camada polissacarídica da parede periclinal externa; Seta – Projeções
das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas. Barras: A – 0,12 µm; B-E – 0,4 µm.
131
Figura 4: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das
células secretoras dos coléteres de
Bathysa nicholsonii. A e B – Quinto estágio de
maturação da parede periclinal externa; A – Marcação de rotina. Observe
desorganização dos estratos cuticulares, especialmente na suas camadas
arborescentes; B – Marcação com iodeto de potássio, revelando marcação
heterogênea nos extratos cuticulares; C e D – Sexto estágio de maturação da parede
periclinal externa, marcação de rotina. Desorganização, seguida de provável
degradação, da camada arborescente dos estratos cuticulares Barras: A – 0,25 µm. B,
C, D – 0,4 µm.
132
A B
C
D
Figura 5: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das
células secretoras dos coléteres de Bathysa nicholsonii. Imunolocalização da proteína
majoritária da secreção dos coléteres. A – Quarto etágio de desenvolvimento da
parede periclinal externa. Note marcação nos locais onde se formavam os sítios de
acúmulo de secreção. C e D - Sexto estágio de desenvolvimento. Note marcação nos
locais onde se formavam os sítios de acúmulo de secreção. Barras: 100 µm.
134
5 DISCUSSÃO GERAL
O conhecimento das características morfológicas das plantas é de grande
importância para o sucesso de estudos acerca das interações entre plantas, herbívoros
e inimigos naturais (Price, 1997). Espécies de um mesmo gênero de planta podem
variar consideravelmente quanto às características das folhas, flores e frutos. Essas
variações muitas vezes são determinantes da ocorrência, abundância e diversidade de
organismos que as habitam, assim como os seus mecanismos de defesa (Petters,
2002). Nesse sentido, torna-se pertinente a investigação cuidadosa de estruturas que
possam estar envolvidas nesse processo. Dentre as possibilidades de investigação
destacamos as estruturas secretoras e a parede celular e o mecanismo de secreção
como parte fundamental do processo de defesa das plantas estudadas.
Partindo deste consenso, o estudo em coléteres estipulares encontradas nos
ápices caulinares vegetativos de Psychotria nuda, Bathysa gymnocarpa, B. stipulata, B.
nicholsonii
, o estudo da parede e tricoma glandular de Piper eucalyptophyllum e a
parede periclinal de Chamaesyce thymifolia apresentam sua importância e foram
caracterizados estruturalmente.
Coléteres são estruturas secretoras particularmente bem representadas nas
Gentianales, onde ocorrem em 228 gêneros (Thomas, 1991). Essas estruturas
secretoras destacam-se não só pela função, como pela importância taxonômica
(Woodson e Moore, 1938; Thomas, 1991) a posição, o número e o aspecto dos
coléteres foram considerados de valor taxonômico para Apocynaceae por Woodson e
Moore (1938) e sua presença foi utilizada como caráter distintivo em chaves de
identificação em nível de gênero e espécies (Barroso, 1986; Rio, 2001). Esta
caracteristicas tambem vêm sendo utilizada para taxonomia da familia Rubiaceae
(Thomas, 1991; Robbrecht, 1998; klein et al., 2004; Miguens et al. 2006).
A morfologia dos coléteres gerou diversas classificações. Lersten (1974a;
1974b) identificou tipos distintos de coléteres e os classificou em: dendróides, tipo
escova (“brush-like”) e padrão. Thomas (1991) enriquece a classificação e acrescenta
os tipos: reduzido, alado e filiforme. Da Cunha (2005) sugere os termos cilindriforme e
claviforme, para classificação de coléteres de Rubiaceae, subdividindo o tipo padrão
135
em duas categorias. De acordo com (Da Cunha et al., 2006) essa, os coléteres das
espécies estudadas são denominados cilindriformes. No entanto, as características
morfológicas, como a constrição da base, e anatômicas, como a vascularização no eixo
central, dos coléteres desta espécie são compartilhadas com espécies do mesmo
gênero, de outros gêneros da família Rubiaceae, como por exemplo,
Pavetta,
Neorosea
e Tricalysia (Lersten, 1974a) e Simira (Klein et al., 2004), e de outras famílias,
Mandevilla illustris e M. velutina, Apocynaceae (Appezzato-da-Gloria e Estelita, 2000).
Tais característica parece não ser importante para diagnóstico à família Rubiaceae,
mas podem auxiliar a classificação no nível genérico; uma vez que, pequenas variações
presentes em poucos casos, devem ser consideradas como caracteres taxonômicos
(Lersten, 1975; Da Cunha, 2005).
A definição de coléteres, como a de muitas estruturas secretoras, é
controversa; principalmente, em nossa opinião, por ser baseada exclusivamente na
estrutura, desconsiderando outros parâmetros e às vezes sendo baseada apenas em
sua função e localização. Com isso deverá entrar em discussão a clara definição de
coléteres que para o nosso grupo se baseia na morfologia e origem da estruturas.
Objetivando aumentar o grau de precisão do tema, preconizamos uma
definição que abranja anatomia, ultraestrutura e composição da secreção para
coléteres. Neste contexto, coléteres são estruturas secretoras, de origem epidérmica e
de camadas subepidérmicas, constituídas por eixo central alongado, formado por
parênquima fundamental, podendo apresentar traço vascular, limitado por um extrato
epidérmico em paliçada, sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção,
sendo esta é uma estrutura de defesa constitutiva da planta. Mesmo sem a
confirmação da ontogênese, estruturas secretoras são denominadas coléteres
exclusivamente por sua forma, como no estudo de De Paula e Oliveira (2007) onde
estruturas são descritas como coléteres em embriões de três espécies de
Chamaecrista Moench (Fabaceae: Caesalpinioideae).
Outro fenômeno que deve ser considerado é a senescência destas estruturas.
Thomas e Dave (1989) mostraram a senescência em coléteres de Allamanda cathartica
como um processo que envolve primeiro a lignificação das células secretoras,
136
perdendo completamente sua identidade. Subseqüentemente, as células do eixo
central são envolvidas como parte deste processo, adquirindo as mesmas
características. Nosso estudo descreveu os aspectos estruturais dos coléteres
senescentes de Bathysa gymnocarpa e B. stipulata. Na sua fase senescente, as células
secretoras da epiderme das espécies estudadas foram anatomicamente
desorganizadas, apresentando aspecto colapsado, fazendo sua individualização difícil.
A desorganização celular inicia-se com as células do ápice dos coléteres e
alcança a base. As células epidérmicas apresentam uma mudança drástica entre as
células secretoras e senescentes. Durante a produção e a externalização da secreção
dos coléteres, sua estrutura é modificada de acordo com o ciclo de vida e/ou a fase
produtiva da secreção. Tais alterações podem levar a célula a um processo de morte
celular programada (Gaffal et al. 2007). Alguns estudos que abordam variação
estrutural das células secretoras têm sido realizados e os resultados mostram que as
organelas, e a parede celular, são consideravelmente variáveis durante tal processo
(Machado et al. 1995, Klein et al. 2004, Miguel et al. 2006, Gunawardena et al. 2007).
Thomas e Dave (1989) observaram a lignificação das células secretoras de
coléteres durante o processo de senescência, contudo, a estrutura da parede celular
não sofreu lignificação nas espécies estudadas. Neste trabalho, as estruturas
secretoras estudadas ainda existe muito pouco conhecimento relacionado à estrutura
e função da parede celular, especialmente com relação ao mecanismo de passagem de
moléculas pela parede periclinal externa. Dessa forma, o conhecimento sobre a parede
periclinal externa pode ser bastante útil nos estudos funcionais e fisiológicos.
Outra estrutura secretora ligada ao mecanismo de defesa estrutural das plantas
são os tricomas. Estas estruturas são projeções da epiderme e podem variar em
complexidade, incluindo várias estruturas inclusive glandular. Tricomas secretores
podem ser uni ou multicelular e de tipos variados dependendo o grupo taxonômico
que ocupam (Dickinson, 2000). Membros da família Piperaceae possuem
caracteristicamente células secretoras com conteúdos de natureza oleosa, os quais
podem ser translúcidos ou não. As folhas, sempre hipoestomáticas, normalmente
apresentam tricomas secretores unisseriados ou glândulas peroladas unicelulares
137
decíduas, estando estas glândulas presentes somente no gênero Piper (Solereder,
1908; Metcalfe e Chalk; 1950).
Existem alguns estudos relacionados com estrutura dos tricomas secretores de
Piperaceae. Tricomas secretores Pothomorphe umbellata ocorrem nas folhas e são
caracterizados por apresentar uma célula basal inserida na epiderme, um pedicelo
curto unicelular e uma célula apical saculiforme paralela à epiderme (Solereder, 1908;
Metcalfe e Chalk, 1950; Marinho, 2008). Os tricomas saculiformes de Piper regnellii
recobrem toda a extensão das folhas jovens, formando uma cobertura densa em
ambas as faces do limbo (Silva e Machado, 1999). Estas mesmas estruturas são
encontradas em
Piper eucalyptophyllum, e assim como P. ragnellii, à medida que o
limbo se expande, a densidade diminui e os tricomas apresentam sinais de
senescência. A diferença é que em
P ragnellii os tricomas não sofrem abscisão, na
espécie estudada, os tricomas sofrem abscisão, deixando apenas a marca nas folhas
mais expandidas.
Mesmo sendo sabido o fato que alguns tricomas secretores sofrem abscisão
após o termino da sua fase secretora poucos são os estudos que quantificam esse
processo. Alguns estudos mostram diferentes fases do processo de secreção,
geralmente com especial atenção à ultraestrutura das células secretoras nas fases pré
secretoras e na fase secretora. Shanker et al. (1999) mostraram que o número total de
tricomas secretores na superfície de Mentha arvensis (Labiateae) aumenta com a
expansão da folha, contudo, sua densidade (por centímetro quadrado) diminui ao
longo do aumento do limbo foliar. Ascensão e Pais (1987), estudando os tricomas
secretores de Artemisia campestris (Asteraceae) mostram o processo de uma forma
bem parecida, o que nos leva a crer que o processo desenvolvimento é bem
conservativo em tricomas secretores. Outro fato que chama a atenção, e condiz com
todos nossos resultados, é o fato de tricomas secretores serem encontrados maduros
ainda em folhas bem jovens (Shanker et al., 1999; Silva e Machado, 1999a e b). É
razoável pensar nesse ponto já que tais estruturas secretoras podem desempenhar
função de defesa contra herbívoros e patógenos (Svoboda et al. 1998/1999).
138
A ultraestrutura das células secretoras de tricomas e coléteres estudados
condiz com as informações disponíveis na literatura. A ultraestrutura de células
secretoras de tricomas secretores maduros de Labiatae mostram leucoplastos e
retículo endoplasmático liso, típicos de células produtoras de terpenóides, e também
retículo endoplasmático rugoso e Complexo de Golgi, indicando a presença de
compostos hidrofílicos e lipofílicos que aparecem em microscopia eletrônica de
transmissão como inclusões eletrondensas imersos em uma matriz granular (Giuliani e
Bini, 2008). Retículo endoplasmático e complexo de Golgi hipertróficos são descritos
em células secretoras de coléteres (Horner e Lersten, 1968; Miguel et al., 2006; Rocha,
2004) e em tricomas secretores de
Piper regnelii (Silva e Machado, 1999a) sugerindo
forte síntese para formação da secreção de ambas as estruturas. Os tricomas
estudados apresentaram, em suas células secretoras, numerosas mitocôndrias, Golgi e
ribossomos hipertróficos, plastídios com inclusões globulares e de tamanhos variáveis,
o núcleo é esférico e central. As células secretoras dos coléteres apresentam, além das
estruturas citadas acima, vesículas eletrondensas no citoplasma próximas à parede
periclinal externa. Todas as características acima sugerem que as células secretoras
apresentam síntese e secreção dos de componentes da secreção sendo de óleos
essenciais e proteínas para os tricomas glandulares de
P. eucalyphyllum quanto de
mucilagem, proteínas e lipídios para os coletéres das espécies estudas.
Se por um lado existem poucos estudos com relação anatomia, principalmente
a senescência de tricomas de Piper, muitos são os estudos relacionados à produção de
óleos essenciais nessas espécies, especialmente com relação ao seu potencial
medicinal e utilização popular dos mesmos. Em linhas gerais, princípios
farmacologicamente ativos encontrados em plantas medicinais ocorrem em estruturas
secretoras especializadas (Fahn, 1979; Svoboda et al., 1998/1999). Estas são de grande
importância na farmacognosia, podendo servir como caráter diagnóstico, para
confirmar ou não a autenticidade do material vegetal (Oliveira et al. 1998). Além disso,
as estruturas secretoras constituem os sítios de produção e, ou acúmulo de princípios
ativos (Fahn, 1979; Mauseth, 1988; Evert, 2006), largamente utilizados na indústria
farmacêutica, cosmética e de perfumaria.
139
O tipo de estrutura secretora e a sua freqüência também podem estar
relacionados com a quantidade e a qualidade de substâncias produzidas por
determinada espécie. Assim, vários autores, mediante estudos com microscopia
óptica, eletrônica de varredura e de transmissão, aliados a testes histoquímicos,
puderam associar a composição química de metabólitos produzidos a diferentes
estruturas secretoras em diversas famílias de plantas (Zobel, 1986; Platt e Thomson,
1992; Ferreira e Janick, 1995; Fahn e Shimony, 1996; Ascensão et al., 1997; Ascensão
et al., 1999; Kolbi e Müller, 2004; Machado et al., 2006). Da mesma maneira, a
ontogenia de estruturas secretoras pode fornecer dados para esclarecer o processo de
desenvolvimento dessas estruturas, bem como evidenciar o processo de síntese e
secreção dos compostos produzidos (Ascensão e Pais, 1987; Mariani et al. 1989; Silva e
Machado, 1999; Monteiro et al., 2001; Ciccarelli et al., 2001; Kalachanis e Psaras, 2005;
Moura
et al., 2005, Liang et al., 2006). As células secretoras estudadas possuem
ultraestrutura condizente com o conteúdo do exsudato, seja detectado na secreção ou
na comparação com outras espécies disponíveis na literatura.
Muitos estudos farmacológicos confirmaram propriedades medicinais em
espécies de Piperaceae. Ensaios
in vitro confirmam que suas folhas de Pothomorphe
umbellata (L.) MIQ. apresentam atividade antimalárica tanto sobre o Plasmodium
berghei (Amorim et al., 1988; Ferreira-da-Cruz et al., 2000) como sobre o P. falciparum
(Adami et al., 1998; Atindehou et al., 2004). Também foi comprovado, na mesma
espécie, potencial no tratamento contra a doença do sono, a qual é desencadeada
pelo parasita Trypanossoma brucei rhodesiense (Atindehou et al., 2004). Outros
estudos demonstraram que as folhas dessa espécie apresentam atividade contra a
Leishmania amazonensis, além de possuírem atividades antifúngicas (Braga et al.,
2007). As propriedades antiinflamatórias e analgésicas das folhas da P. umbellata
também já foram comprovadas, reforçando seu uso popular no tratamento de
desordens inflamatórias (Perazzo et al., 2005). Compostos isolados do óleo essencial
de Piper eucalyptophyllum confirmam o potencial medicinal das plantas da família
Piperaceae (Danelutte et al., 2005; Stohr et al., 2001; Guerrini et al., 2009). A
propriedade larvicida do óleo essencial de espécies de Piperaceae foi comprovada por
Morais et al. (2009). Compostos como β-farneseno e germacreno D, presente no óleo
140
essencial da espécie estudada, também estão presentes no óleo essencial de Piper
lanceaefolium
(Piperaceae) (Mundina et al., 2001) e em outras espécies (Cysne et al.,
2005). Tais compostos estão relacionados com proteção contra predadores e
patógenos.
Nosso trabalho mostrou diferentes tipos de paredes celulares de estruturas
secretoras. Enquanto os coléteres possuem a parede periclinal externa organizada em
três camadas morfologicamente distintas, os tricomas não apresentaram variação
significativa durante as fases de desenvolvimento. Este fato sugere que as paredes
periclinais diferenciadas destas duas estruturas apresentam forma diferente de
externalização da secreção. A parede periclinal externa dos coléteres de Bathysa
nicholsonii
mostrou reorganização durante o processo secretor, sugerindo mudança
estrutural durante a passagem de secreção pelos sítios de acúmulo de secreção. Já na
parede periclinal externa de folhas de
Chamaesyce thymifolia foi feito tratamento com
clorofórmio para remover a cera epicuticular em ambas às superfícies tornando fácil
penetração vermelho de Rutênio na epiderme e utilizada a microscoipia eletrônica de
varredura e microanálise. A maior parte do sinal de Rutênio foi observada em paredes
anticlinais. Não foram constatadas diferenças anatômicas nas fases avaliadas. No
entanto, observamos um acúmulo de silício. Novos estudos utilizando esta técnica são
necessários para desvendar a passagem da secreção pela parede nas estruturas
secretoras.
Em biologia celular vegetal o fluxo apoplástico, em células secretoras ainda é
motivo de debate. No entanto, a parede periclinal externa constitui uma barreira física
na fronteira entre o vegetal e o ambiente (Tenberge, 1992). Sendo assim, constituindo
também uma barreira à externalização de secreção em celulas secretoras. Mahlberg e
Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas glandulares de
Cannabis sativa, a passagem da secreção pela parede periclinal externa se da através
de estruturas semelhantes às descritas nas paredes de B. nicholsonii, denominadas
cavidades secretoras. Kim e Mahlberg (1997) localizaram o tetra-hidro-canabinol (THC)
nas cavidades secretoras, fortalecendo esta idéia. Utilizando criofixação e
criosubstituição, os mesmos autores, observaram a formação de vesículas secretoras
que se encaminham para as cavidades secretoras (Kim e Mahlberg, 2003). Possobon e
141
Machado (2005) denominaram estruturas semelhantes às cavidades secretoras de
sítios de acúmulo de secreção. Veys
et al. (2002) mostra que a externalização de
moléculas em cavidades secretoras de folhas de
Azolla se dá por projeções na parede
periclinal externa. Não foi observada nenhuma estrutura que pudesse estar
relacionada com a passagem da secreção pela parede celular dos tricomas de
Piper
eucalyptophyllum
, sugerindo que a passagem da secreção provoca mudanças no nível
inframolecular. Também não foi visto ruptura na cutícula comprovado pelo
muchamento das células secretoras sem o seu rompimento. Jefree (1996) mostra a
presença de microcanais, perpendiculares a membrana plasmática, e acúmulo da
secreção nas camadas cuticulares da parede celular. Este acúmulo acaba por levar a
ruptura física da parede periclinal externa. Outros autores argumentam que não
existem microcanais ou estruturas equivalentes, e que a secreção flui através da
parede periclinal externa por difusão (Veys
et al., 2002).
A parede periclinal externa dos coléteres de
Bathysa nicholsonii mostrou
reorganização durante o processo secretor, sugerindo mudança estrutural durante a
passagem de secreção pelos sítios de acúmulo de secreção. Enquanto isso, apenas
uma estrutura foi notada na parede celular dos tricomas de Piper eucalyptophyllum,
sugerindo que tais estruturas possuem diferentes estratégias de externalização de
exsudatos.
Mucilagens constituem uma secreção de natureza mista constituída
principalmente por heteropolissacarídeos ácidos e/ou neutros, proteínas e fenóis.
Apresentam ampla distribuição nos vegetais, formando soluções coloidais que, em
contato com a água, torna-se viscosa (Priolo de Lufrano e Caffini, 1981; Gregory e
Baas, 1989; Roschinia e Roschinia, 1993; Martini et al., 2003). Esse produto secretado
pode exercer uma grande quantidade de funções como retenção de água, reserva de
carboidratos, redução da transpiração, proteção contra radiação, dispersando ou
refletindo a luz, proteção de estruturas ou órgãos em desenvolvimento e proteção
contra a herbivoria (Gregory e Baas, 1989; Fahn, 1979; Roschinia e Roschinia, 1993;
Clinfford et al., 2002; Martini et al., 2003). A secreção dos coléteres das espécies
estudadas apresenta características semelhantes às expostas, sendo possível o seu
papel na função de defesa da planta. Outra possibilidade de função de proteção das
142
mucilagens é a participação direta na defesa contra patógenos. Vieira et al. (2006)
mostraram a presença de uma
β-1,3 glucanase na secreção de Simira glaziovii
(Rubiaceae). A detecção de uma proteína na secreção desta espécie sugere que o
exsudato possui papel na defesa. Esta papel de defesa já foi mostrado pela Robbrecht
(1988), que descreveu o importância biológica da secreção do coléter em aumentar a
proteção estrutural química oferecida pelas estípulas e cálices para os tecidos
meristematicos. A presença de proteínas na secreção de Bathysa nicholsonii
(Rubiaceae) bem como a atividade antifúngica do extrato protéico total foi descrita por
Miguel et al., (2006). Tal fato sugere a proteção do meristema apical caulinar pela
secreção produzida pelos coléteres de
Bathysa nicholsonii. Além disso, observações de
ápices caulinares dessa espécie no campo evidenciaram que poucos apresentaram
sinais de herbivoria ou ataque de patógenos.
Com base no exposto, é possível argumentar que as características das células
secretoras de coléteres e tricomas são diretamente proporcionais aos exsudatos
produzidos, estando em acordo com a literatura disponível. Guardadas as devidas
proporções, os tecidos secretores possuem características semelhantes, como a
presença de citoplasma denso e especializações na parede periclinal externa e que
estas estruturas fazem parte do mecanismo de defesa constitutivo das plantas.
143
6 CONCLUSÕES
Tendo em vista os resultados obtidos, sugere-se uma nova classificação em
relação à forma dos coléteres para as espécies de Rubiaceae. Nas espécies
estudadas,
Bathysa stipulata, B. gymnocarpa e Psychotria nuda os coléteres são
do tipo lacrimiforme enquanto em
B. nicholsonii são de formato cilíndrico.
Possuem base estreita e eixo central parenquimático contornado por uma
epiderme secretora em paliçada. Em Psychotria nuda foi observado idioblastos
com feixes de ráfides no eixo central, e representam a primeira citação de
cristais em coléteres;
O estudo dos coléteres de Bathysa stipulata e B. gymnocarpa definiu os coléteres
em dois estágios: secretor e senescente. A fase senescente é facilmente definida
pela estrutura dos coléteres, mas não é bem definida em estágios subcelulares. A
passagem de um estágio para outro, bem como o processo final das células
secretoras, é dirigido provavelmente por um processo de morte celular
programada;
As folhas de Chamaesyce thymifolia tiveram sua cera epicuticular removida
quando tratadas com clorofórmio. Esse tratamento também facilitou a penetração
do vermelho de Rutênio em ambas epidermes o que pode proporcionar uma
metodologia diferenciada para o estudo de parede celular vegetal. Durante a
expansão foliar não foram notadas diferenças anatômicas nas epidermes
analisadas exceto pelo acúmulo de sílica nos estômatos de folhas mais velhas,
sugerindo o papel de defesa dessa estrutura;
144
Foram estudados diferentes estágios de desenvolvimento das folhas de Piper
eucalyptophyllum
onde foi possível notar o desenvolvimento da parede periclinal
externa das folhas e a senescência dos tricomas. Desde os estágios mais jovens os
tricomas foram notados em estágio secretor. O óleo essencial de
Piper
eucalyptophyllum
é composto principalmente por germacreno D, germacreno B, Z-
β-farneseno, 4-octilresorcinol, α-cadinol e bisaboleno, confirmando o potencial
medicinal da espécie em questão;
A parede periclinal externa dos coléteres de Bathysa nicholsonii possui estrutura
dividida em camadas estruturalmente distintas. Foram identificadas várias fases
do desenvolvimento desta parede e, de acordo com essas mudanças foi possível
elaborar um modelo dinâmico de passagem de moléculas de secreção;
Após todo o processo de secreção os coléteres e tricomas senescem. No caso dos
coléteres, o processo começa pelo ápice da estrutura, alcançando sua base.
Contudo, não foi detectado nenhum sinal de que a estrutura se destaca. No caso
dos tricomas, as células secretoras murcham e, em seguida, se destacam da célula
basal.
A parede periclinal externa das estruturas estudadas varia, não só de acordo com
sua função, mas também com o mecanismo de secreção. A estrutura da parede
periclinal externa dos coléteres de Bathysa nicholsonii se reorganiza, de acordo
com a passagem da secreção. Enquanto isso, nos tricomas secretores de Piper
eucalyptophyllum, a parede periclinal externa das células secretoras se mantém
estável com a passagem da secreção, indicando que essa passa sem o rompimento
da cutícula propriamente dita;
146
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