ads:
SÍLVIA LIGÓRIO FIALHO
DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES
BIODEGRADÁVEIS DESTINADOS À ADMINISTRAÇÃO
INTRA-OCULAR DE CORTICÓIDES
Belo Horizonte
Faculdade de Farmácia da UFMG
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
SÍLVIA LIGÓRIO FIALHO
DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES
BIODEGRADÁVEIS DESTINADOS À ADMINISTRAÇÃO
INTRA-OCULAR DE CORTICÓIDES
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial à obtenção do título de Doutor em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Professor Armando da Silva
Cunha Júnior
Belo Horizonte
Faculdade de Farmácia da UFMG
2006
ads:
3
Fialho, Sílvia Ligório.
F438d
Desenvolvimento de implantes biodegradáveis destinados à
administração intra-ocular de corticóides / Sílvia Ligório Fialho. -
Belo Horizonte, 2006.
148f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Armando da Silva Cunha Júnior.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Minas Gerais.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2006.
1. Implantes biodegradáveis – Teses. 2. Medicamentos –
Aplicação intra-ocular – Teses. 3. Polímeros na medicina – Teses. I.
Cunha Júnior, Armando da Silva. II. Universidade Federal de Minas
Gerais. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
CDD:615.19
4
AGRADECIMENTOS
Ao professor Armando, pela orientação, atenção e confiança durante todo o trabalho.
Aos meus pais e minhas irmãs, pelo grande apoio e ajuda quando necessários.
À CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da
UFMG pela oportunidade de realização do doutorado.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Jorge da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, pela
colaboração.
Ao Dr. Rubens Siqueira, pelo entusiasmo e pela colaboração na realização das cirurgias.
Ao Marcelo Brandão Rêgo da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, pela
realização dos estudos clínicos e histológicos e grande colaboração durante todo o trabalho.
Aos professores, colegas e funcionários dos Laboratórios de Farmacotécnica e Tecnologia
Farmacêutica.
Ao professor Hélio Chiarini Garcia, do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG, pela contribuição nas análises de microscopia eletrônica de varredura.
Ao professor Tasso e aos funcionários do laboratório de Nutrição Experimental da
Faculdade de Farmácia da UFMG, por permitirem a utilização de equipamentos do
laboratório.
À professora Glaura Goulart, pela grande ajuda na interpretação das análises de DSC.
Ao Dr. Luis Guilherme Dias, da Fundação Ezequiel Dias, e ao Álvaro, pela ajuda na
realização do ELISA.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização dessa tese.
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Os segmentos anterior e posterior do bulbo do olho.
14
Figura 2 - Esquema mostrando os principais estratos da retina.
20
Figura 3 -
Esquema das principais estruturas oculares.
23
Figura 4 - Principais doenças causadoras de cegueira no Brasil e no Mundo.
27
Figura 5 - Mecanismo de hidrólise de PLA, PGA ou PLGA.
52
Figura 6 - Curva de calibração do acetato de dexametasona.
68
Figura 7 - Curva de calibração do acetato de dexametasona após dosagem
por ELISA mostrando os padrões e as amostras.
69
Figura 8 - Esquema do estudo de liberação in vitro.
78
Figura 9 - Fotografia dos implantes de PLGA contendo acetato de
dexametasona preparados pelas técnicas de moldagem a quente (A) e
compressão (B) (barra = 1mm).
79
Figura 10 - Termogramas de DSC. (A) curvas do acetato de dexametasona: (I)
antes da liofilização, (II) liofilizado; (B) curvas do PLGA 50:50: (I) antes da
liofilização, (II) liofilizado, (III) + acetato de dexametasona; (C) curvas do PLA:
(I) antes da liofilização, (II) liofilizado, (III) + acetato de dexametasona.
81
Figura 11 - Fotomicrografias dos implantes de PLGA preparados pelos
métodos de compressão em aumento de 300X (A) e de 1000X (C); e
preparados pelo método de moldagem a quente em aumento de 300X (B) e de
1000X (D).
86
Figura 12 - Alteração de massa representada pela porcentagem de massa
restante dos implantes de PLGA 50:50 e de PLA preparados por compressão e
moldagem a quente (Os valores são representados como média ± desvio
padrão, n = 4).
87
Figura 13 - Liberação acumulada do acetato de dexametasona a partir dos
implantes de PLGA 50:50 e de PLA preparados por compressão e moldagem a
quente (Os valores são representados como média ± desvio padrão, n = 4.
P<0,05).
90
6
Figura 14 - Cirurgia de colocação dos implantes. (A) Local de realização da
cirurgia; (B) Início da esclerotomia pela qual o implante foi inserido; (C) Término
da esclerotomia; (D) Limpeza do local para colocação do implante; (E)
Colocação do implante através da esclerotomia; (F) Sutura da esclerotomia
após a colocação do implante.
98
Figura 15 - Concentrações de acetato de dexametasona intravítrea liberada a
partir dos implantes ao longo das 8 semanas do estudo. Os valores são
representados como média ± desvio padrão (n = 4).
105
Figura 16 - Freqüência de distribuição da concentração de acetato de
dexametasona intravítrea de acordo com a média aritmética ( ) e a mediana ( )
por semana.
105
Figura 17 - Intervalos de confiança (95%) para as medias amostrais da
concentração intravítrea de acetato de dexametasona durante o período do
estudo. As médias correspondentes a letras diferentes representam diferença
estatística em α=5%.
106
Figura 18 - Porcentagem de acetato de dexametasona restante nos sistemas
desenvolvidos após implantação intravítrea. Os dados são representados como
a média ± o desvio padrão (n = 3).
108
Figura 19 - Fotomicrografias dos implantes biodegradáveis intravítreos antes da
implantação. (A) aumento de 20X e (B) aumento de 1000X.
109
Figura 20 - Fotomicrografias dos implantes biodegradáveis intravítreos após 2 a
5 semanas de implantação. (A,B) 2 semanas; aumentos de 20X e 1000X; (C,D)
3 semanas; aumentos de 20X e1000X; (E,F) 4 semanas; aumentos de 25X e
1000X; (G,H) 5 semanas; aumentos de 25X e 500X.
110
Figura 21 - Foto mostrando o implante posicionado no local implantado (seta)
ao final da primeira semana.
113
Figura 22 - Médias (A) e medianas (B) dos valores de pressão intra-ocular dos
olhos experimentais, do grupo 1 ( )e do grupo 2 ( ) , antes e após 1, 4 e 8
semanas de implantação dos sistemas.
114
Figura 23 - Média (A) e mediana (B) das amplitudes das ondas A ( ) e B ( )
nos animais do grupo 1 antes e após implantação dos sistemas desenvolvidos.
115
Figura 24 - Corte semifino da retina de coelho do grupo 1 corado com toluidina
azul. (A) Todos os estratos da retina são visualizados neste aumento. Com
exceção de alguns espaços nas porções mais internas da retina, nenhuma
outra alteração morfológica foi observada. O estrato de fotorreceptores com os
7
cones e bastonetes é visualizado na parte inferior da figura. Barra: 50 µm. (B)
Maior aumento do estrato dos fotorreceptores mostrado em A, sem alterações
morfológicas. Bastonetes (asterisco) e cones (seta) são facilmente visualizados.
Barra: 10 µm. (C) Corte semifino da retina de coelho do grupo 2. As mesmas
características morfológicas mostradas em A são observadas. Os espaços na
região interna são indicados pela seta maior enquanto a seta menor indica um
cone. Barra: 20µm.
116
Figura 25 - Fotomicrografia eletrônica de transmissão do estrato de
fotorreceptores de coelho do grupo 1 mostrando bastonetes (B), cone (C) e o
segmento interno de um cone (SI) com mitocôndria, todos mostrando
características morfológicas normais. Contraste com acetato de uranila e citrato
de chumbo. Barra: 1,0µm.
116
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Estimativa global de problemas visuais em 2002 por região.
25
Tabela 2 - Número de cegos em 2002 de acordo com a idade (em anos) por
região.
26
Tabela 3 - Doenças associadas à neovascularização ocular, presentes no
segmento posterior do olho.
29
Tabela 4 - Propriedades dos polímeros e copolímeros derivados dos ácidos
lático e glicólico.
54
Tabela 5 - Alguns corticóides de uso geral comumente empregados.
57
Tabela 6 - Condições cromatográficas do acetato de dexametasona.
63
Tabela 7 - Temperatura de transição vítrea dos polímeros utilizados e das
misturas polímero-fármaco a 27,7% p/p após a primeira e a segunda etapa de
aquecimento.
80
Tabela 8 - Parâmetros determinados por DSC para o acetato de
dexametasona em diferentes condições: antes de liofilização, liofilizado e
misturado com os polímeros na concentração de 27,7% p/p.
82
Tabela 9 - Parâmetros determinados por DSC para os implantes finais
preparados com PLGA 50:50 ou PLA pelos métodos de moldagem a quente e
compressão.
84
Tabela 10 - Constante de primeira ordem da velocidade de degradação, tempo
de início de perda de massa dos implantes e coeficientes de correlação para os
implantes de PLGA 50:50 e PLA preparados pelos métodos de compressão e
moldagem a quente (n = 4).
88
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-FU - 5-fluoruracila
5-FUrd - 5 fluorouridina
AMD - Degeneração macular ligada à idade (Age-related macular degeneration)
ARVO - Association for research in vision and ophthalmology
CEMEL - Centro de microscopia eletrônica
CETEA - Comitê de ética em experimentação animal
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CMVR - Retinite por citomegalovírus
CNV - Neovascularização corioidal
CsA - Ciclosporina A
DITI - Interface digital de transferência de imagens (Digital image transference
interface)
DPR - Desvio padrão relativo
DSC - Calorimetria diferencial exploratória
ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay
ERG - Eletrorretinografia
EUA - Estados Unidos da América
FDA - Food and Drug Administration
FMRP - Faculdade de medicina de Ribeirão Preto
HAART - Highly active antiretroviral therapy
MET - Microscopia eletrônica de transmissão
MEV - Microscopia eletrônica de varredura
MM - Massa molar
10
ND - Não determinado
NF-kappaB - Nuclear factor kappa beta
ns - Não significativamente diferente
OMS - Organização Mundial de Saúde
PBS - Solução tampão fosfato (Phosphate buffered solution)
PGA - Polímero poli-glicólico
PIO - Pressão intra-ocular
PLA - Polímero poli (lático)
PLGA - Polímero poli (D,L-lático-co-glicólico)
PVR - Vitreoretinopatia proliferativa (proliferative vitreoretinopathy)
RD - Retinopatia diabética
SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida
SP - São Paulo
T
f
- Temperatura de fusão
T
g
- Temperatura de transição vítrea
TGF-β - Transforming growth factor
t-PA - Agente trombolítico
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
UK - Reino Unido (United Kingdom)
UNIRP - Universidade de Rio Preto
USP - Universidade de São Paulo
USP 24 - The United States Pharmacopeia 24
UV- Ultravioleta
v.i. - Viscosidade inerente
VEGF - Fator de crescimento endotelial (vascular endothelial growth factor)
11
RESUMO
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, considerando a população
mundial de 2002, o número estimado de pessoas com distúrbios visuais era de 161
milhões, sendo 37 milhões de indivíduos cegos e 124 milhões com baixa visão. No
Brasil, o número de cegos foi estimado em 0,4 a 0,5% da população, ou seja, de 4 a
5 mil pessoas por milhão de habitantes, variando em termos de diferentes níveis
sócio-econômicos. Doenças do segmento posterior do bulbo do olho são
responsáveis pela maioria dos casos de cegueira irreversível no mundo inteiro e, até
o momento, apresentam sucesso terapêutico limitado devido à dificuldade de
penetração dos fármacos neste local. Visando a obtenção de níveis terapêuticos
adequados de fármacos no segmento posterior do olho por período prolongado,
sistemas de liberação poliméricos de implantação intravítrea estão sendo
investigados. Eles são preparados a partir de polímeros que podem ser
biodegradáveis ou não-biodegradáveis e os derivados dos ácidos lático e glicólico
têm se revelado promissores devido, principalmente, às suas características de
biocompatibilidade e biodegradabilidade. Este trabalho objetivou o desenvolvimento
e a avaliação de implantes biodegradáveis à base de polímeros derivados dos
ácidos lático e glicólico, como uma alternativa à administração intra-ocular de
corticóides. Em um primeiro momento, foi avaliada a influência de dois métodos de
preparo, compressão e moldagem a quente, no perfil de degradação in vitro das
matrizes poliméricas e na velocidade de liberação do acetato de dexametasona. Os
resultados mostraram que o método de preparo influencia o processo de
degradação e a velocidade de liberação do fármaco. Os implantes comprimidos
degradaram mais rapidamente e permitiram uma liberação mais rápida do acetato de
dexametasona. Em seguida, os sistemas preparados por moldagem a quente foram
avaliados in vivo, após implantação em olhos de coelhos. O implante desenvolvido
não apresentou reações tóxicas significativas para a retina de coelhos normais e foi
capaz de liberar o fármaco no corpo vítreo por um período de 8 semanas. Este
sistema pode, portanto, apresentar-se como uma nova e promissora opção de
tratamento para doenças do segmento posterior do olho que exigem a manutenção
de níveis terapêuticos de fármacos por longos períodos e que são normalmente
tratadas por meio de injeções repetidas intravítreas.
Palavras-chave: implantes biodegradáveis, dexametasona, aplicação intra-ocular.
12
ABSTRACT
According to the World Health Organization, considering the world population of the
year of 2002, the estimated number of people with visual impairment was of 161
million: 37 million were blind and 124 million had low vision. In Brazil, the number of
blind people was estimated in 0.4 to 0.5 % of the population, in other words, from 4 to
5 thousand people per million of habitants, which varies according to different socio-
economic levels. Diseases of the posterior segment of the eye are responsible for the
major cases of irreversible blindness worldwide and, until this moment, they present
limited therapeutic success due to the difficulty of penetration of the drugs in this
region. In order to obtain adequate therapeutic levels of drugs in the posterior
segment of the eye for long period, polymeric delivery systems for intravitreal
implantation are being studied. They are prepared from polymers that can be
biodegradable or non-biodegradable and the derivatives of the lactide and glycolide
acids have been the most promising because of their biocompatibility and
biodegradability. This work aimed the development and evaluation of biodegradable
implants prepared with the lactide and glycolide acids derivatives copolymers as an
alternative to the intraocular administration of corticosteroids. Firstly, the influence of
the two preparation methods, compression and hot molding, in the in vitro
degradation profile of the polymeric matrices and in the release rate of the
dexamethasone acetate was evaluated. The results showed that the preparation
technique influences degradation and drug release processes. The compressed
implants degraded faster and allowed one higher release of the dexamethasone
acetate. In another moment, the implants prepared by the hot molding technique
were evaluated in vivo after implantation in rabbits’ eyes. The developed implant did
not present significant toxic reactions to the retina of normal rabbits and it was able to
release the drug in the vitreous for 8 weeks. The developed system can, therefore,
present as a new and promising alternative of treatment to diseases of the posterior
segment of the eye that need the maintenance of therapeutic levels of drugs for long
time and that are normally treated by repeated intravitreal injections.
Keywords: biodegradable implants, dexamethasone, intraocular application.
13
SUMÁRIO
1 O OLHO E SEUS SEGMENTOS 14
2 PRINCIPAIS DOENÇAS RELACIONADAS AO SEGMENTO POSTERIOR DO
BULBO DO OLHO 23
3 DIFICULDADES NA ADMINISTRAÇÃO INTRA-OCULAR DE FÁRMACOS 37
4 RECENTES ESTUDOS VISANDO O TRATAMENTO DE DOENÇAS DO
SEGMENTO POSTERIOR DO OLHO
42
5 ESTRUTURA E TIPOS DE POLÍMEROS UTILIZADOS NO PREPARO DE
IMPLANTES
49
6 UTILIZAÇÃO DE CORTICÓIDES NO TRATAMENTO DE INFLAMAÇÕES
OCULARES
55
1 OBJETIVO GERAL 60
!
1
MATERIAIS E MÉTODOS 62
2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
67
"" !#!#$ %
&#'"(
"#
1 INTRODUÇÃO 71
2 MATERIAIS E MÉTODOS 72
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 78
4 CONCLUSÃO 92
"" !#!#$ %
&#'"(
""
1 INTRODUÇÃO 94
14
2 MATERIAIS E MÉTODOS 95
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 104
4 CONCLUSÃO 117
))*
118
+,)*-.+)
120
/
ANEXO 01 Certificado de aprovação do trabalho pelo CETEA 134
ANEXO 02 Publicação no periódico Arquivos Brasileiros de Oftalmologia 135
ANEXO 03 Publicação no periódico Drug Delivery 141
15
16
1 O OLHO E SEUS SEGMENTOS
O bulbo do olho encontra-se situado em uma cavidade óssea, a órbita, que
apresenta a principal função de protegê-lo (SNELL; LEMP, 1998). Ele é dividido,
anatomicamente, em dois segmentos principais, sendo eles o anterior e o posterior.
O segmento anterior é composto pela córnea, pela esclera, pelas câmaras anterior e
posterior, pela íris, pelo corpo ciliar e pela lente; o posterior é formado pelo corpo
vítreo, pela retina, pela coróide, pelo nervo óptico e também pela esclera (Figura 1)
(OGURA, 2001; YASUKAWA et al., 2004).
Figura 1 – Os segmentos anterior e posterior do bulbo do olho.
Fonte - Adaptado de ATLAS DE OFTALMOLOGIA BÁSICA, 1997.
Segmento
Anterior
Segmento
Posterior
Câmara anterior
(humor aquoso)
Córnea
Íris
Câmara posterior
(humor aquoso)
Coróide
Esclera
Retina
Corpo
vítreo
Esclera
17
Os anexos do bulbo do olho são constituídos pelas pálpebras, pela conjuntiva
e pelo aparelho lacrimal (SNELL; LEMP, 1998). No entanto, estas estruturas não
serão consideradas neste trabalho.
1.1 O SEGMENTO ANTERIOR DO BULBO DO OLHO
1.1.1 Córnea
A córnea é uma estrutura transparente que forma a parte anterior do bulbo do
olho. Por apresentar uma curvatura superior à do restante do bulbo, forma-se um
pequeno sulco que a separa da esclera. A córnea e a esclera são estruturalmente
contínuas e, mesmo histologicamente, existe uma dificuldade em prever onde uma
termina e a outra se inicia (WOLFF’S, 1973).
A transparência da córnea é obtida pela disposição de suas camadas, pela
avascularização, pela presença de nervos desmielinizados e por ser uma estrutura
desidratada. A inervação é feita pelo ramo oftálmico do nervo trigêmeo; a nutrição é
obtida através das lágrimas, do humor aquoso e dos vasos perilimbais; o oxigênio é
proveniente diretamente do meio ambiente. Essa estrutura é a principal responsável
pela refração da luz que entra no olho (SNELL; LEMP, 1998).
A córnea se assemelha a uma membrana plasmática, e dois principais
mecanismos estão envolvidos na sua permeabilidade: os passivos (difusão e
solubilização de fases) e os ativos (bomba de sódio e pinocitose) (LIOTET, 1995).
18
1.1.2 Câmaras anterior e posterior
O bulbo do olho é composto por duas câmaras (anterior e posterior), as quais
são divididas pela íris (SNELL; LEMP, 1998; WOLFF’S, 1973).
As duas câmaras do olho são preenchidas por humor aquoso, que é um fluido
biológico límpido cuja função é suprir as necessidades metabólicas da lente e da
córnea. Com a sua pressão, ele sustenta a parede do bulbo do olho e mantém a
forma deste (SNELL; LEMP, 1998).
O humor aquoso apresenta um pH em torno de 7,21 e é composto,
principalmente, por proteínas, enzimas, glicose, sódio, potássio, cálcio, fosfatos,
bicarbonatos, ácido ascórbico, ácido lático e ácido hialurônico (LIOTET, 1995).
A câmara anterior é limitada, na parte frontal, pela córnea e por uma pequena
parte da esclera e, posteriormente, pela face anterior da íris, por uma pequena parte
da face anterior da lente e por parte do corpo ciliar. Contém um volume de
aproximadamente 200 µL. A câmara posterior é limitada anteriormente pela íris; na
região periférica, pelos processos ciliares, e, posteriormente, pela lente e pelos
ligamentos suspensórios. É pequena, apresentando-se como uma fenda, e se
comunica com a câmara anterior através da pupila. Contém um volume de
aproximadamente 60 µL (SNELL; LEMP, 1998).
1.1.3 Íris
A íris é um diafragma formado por um tecido conjuntivo frouxo pigmentado e
muito vascularizado, que divide o compartimento ocular anterior nas câmaras
19
anterior e posterior, as quais se comunicam através de um orifício central, a pupila. A
principal função da pupila é controlar, através de seus reflexos, a entrada de luz que
incide sobre a retina (WOLFF’S, 1973).
1.1.4 Corpo ciliar
O corpo ciliar, posteriormente, é contínuo à coróide; anteriormente, à margem
ciliar da íris. Ele mede cerca de 6 mm de largura. Em corte transversal, apresenta-se
como uma estrutura triangular com a base voltada para a câmara anterior do olho, o
ângulo anterior externo voltado para a esclera e seu ápice se estendendo
posteriormente e lateralmente contínuo à coróide (SNELL; LEMP, 1998).
Essa estrutura apresenta como principais funções o fornecimento de
nutrientes à córnea e à lente, bem como a remoção de seus catabólitos através do
humor aquoso, que é o líquido continuamente produzido pelo corpo ciliar. Além
disso, tendo em vista os ligamentos suspensórios que possui, ele é responsável pela
sustentação da lente e pela acomodação visual.
1.1.5 Lente
A lente, juntamente com a córnea, o humor aquoso e o corpo vítreo, forma o
meio refrativo do olho. Trata-se de uma estrutura transparente, biconvexa, avascular,
de aparência cristalina, que se situa atrás da íris e da pupila e à frente do corpo
vítreo. Está suspensa no centro do olho por meio dos ligamentos suspensórios, cujo
20
estiramento garante a acomodação visual (SNELL; LEMP, 1998). Apresenta um
diâmetro de 9 a 10 mm e uma espessura de 4 a 5 mm, que variam dependendo do
foco do olho para objetos próximos ou distantes (WOLFF’S, 1973).
Quimicamente, a lente é formada quase exclusivamente por proteínas e água.
O oxigênio e os metabólitos necessários à sua manutenção chegam, principalmente,
através do humor aquoso (SNELL; LEMP, 1998).
1.2 SEGMENTO POSTERIOR DO BULBO DO OLHO
1.2.1 Esclera
Também presente no segmento anterior do olho, a esclera forma a parte
maior da camada protetora fibrosa do olho (SNELL; LEMP, 1998; WOLFF’S, 1973).
É destituída de transparência devido à presença de fibras irregularmente
organizadas, à abundante vascularização e ao baixo conteúdo de
mucopolissacarídeos. Sua porção anterior é visível e constitui o “branco” do olho,
estendendo-se por todo o bulbo do olho, a partir do limbo, apresentando, na sua
porção posterior, a lâmina cribriforme, que é o local por onde penetram as fibras do
nervo óptico.
A esclera é mais espessa na parte posterior (cerca de 1mm) e gradualmente
se torna mais fina quando se aproxima da parte anterior (WOLFF’S, 1973).
21
1.2.2 Coróide
A coróide é uma estrutura fina, pigmentada e altamente vascularizada que se
estende do corpo ciliar ao nervo óptico e consiste, principalmente, de vasos
sangüíneos embora, nos dois lados dessa estrutura, seja encontrada uma camada
avascular (WOLFF’S, 1973). Ela é mais espessa na região posterior (cerca de 0,22
mm) e gradualmente se torna mais fina ao se aproximar da região anterior (cerca de
0,1 mm). Encontra-se firmemente ligada à esclera, na região do nervo óptico, onde
as artérias ciliares posteriores e os nervos ciliares penetram no olho. Essa estrutura
tem como principal função a nutrição da retina. Além disso, o grande número de
células pigmentadas na coróide absorve o excesso de luz que penetra na retina
(SNELL; LEMP, 1998).
1.2.3 Retina
A retina, camada mais interna do bulbo do olho, é uma membrana fina e
transparente de coloração avermelhada. Posteriormente contínua ao nervo óptico,
ela se estende, anteriormente, em direção ao epitélio do corpo ciliar e à íris. A sua
superfície externa se encontra em contato com a lâmina basilar da coróide; a
superfície interna está em contato com o corpo vítreo.
Trata-se de uma estrutura ocular responsável pela captação dos estímulos
luminosos, para a qual utiliza os fotorreceptores presentes, que são os cones e os
bastonetes. Essas células são altamente especializadas, complexas e contêm
fotopigmentos que produzem energia química, quando expostas à luz, que é
22
transformada em impulsos elétricos. Os bastonetes são responsáveis pela captação
de estímulos luminosos de baixa intensidade na visão noturna, e os cones só
conseguem captar estímulos de alta intensidade sob condições de iluminação
abundante, sendo responsáveis pela visão diurna colorida (SNELL; LEMP, 1998).
A retina é formada por dez estratos na direção da órbita para o corpo vítreo,
os quais são dificilmente diferenciados microscopicamente (WOLFF’S, 1973) (Figura
2).
Figura 2 - Esquema mostrando os principais estratos da retina.
Fonte - Adaptado de LANG; LANG, 2002.
Luz incidente
Camada
ganglionar
Estrato
plexiforme
interno
Estrato
nuclear
externo
Estrato
nuclear
interno
Estrato
plexiforme
externo
Células
ganglionares
Células
amácrinas
Células
bipolares
Células
horizontais
Bastonete Cone Cromatóforo Estrato pigmentoso
Célula de
Müller
Luz incidente
Camada
ganglionar
Estrato
plexiforme
interno
Estrato
nuclear
externo
Estrato
nuclear
interno
Estrato
plexiforme
externo
Células
ganglionares
Células
amácrinas
Células
bipolares
Células
horizontais
Bastonete Cone Cromatóforo Estrato pigmentoso
Célula de
Müller
Luz incidente
Camada
ganglionar
Estrato
plexiforme
interno
Estrato
nuclear
externo
Estrato
nuclear
interno
Estrato
plexiforme
externo
Células
ganglionares
Células
amácrinas
Células
bipolares
Células
horizontais
Bastonete Cone Cromatóforo Estrato pigmentoso
Célula de
Müller
Luz incidente
Camada
ganglionar
Estrato
plexiforme
interno
Estrato
nuclear
externo
Estrato
nuclear
interno
Estrato
plexiforme
externo
Células
ganglionares
Células
amácrinas
Células
bipolares
Células
horizontais
Bastonete Cone Cromatóforo Estrato pigmentoso
Célula de
Müller
Estrato
ganglionar
23
O estrato pigmentoso é formado por células pavimentosas poligonais que,
além de desempenhar um papel fundamental no metabolismo da retina, produz
grânulos de melanina que absorvem a luz e excitam os fotorreceptores.
O estrato dos segmentos externo e interno se compõe dos segmentos
externos dos cones e dos bastonetes.
O terceiro estrato da retina, o estrato limitante externo, é uma estrutura
crivada por onde passam as partes externas dos fotorreceptores, que estão fixadas
nessa membrana. Nela se encontra um tipo de célula glial (célula de Müller), que se
estende entre os dois estratos limitantes, formando o esqueleto estrutural da retina.
O estrato nuclear externo é formado pelo núcleo dos fotorreceptores.
O quinto estrato da retina, o estrato plexiforme externo, compõe-se de
sinapses entre os axônios dos cones e dos bastonetes com os dendritos das células
bipolares.
O estrato nuclear interno contém, principalmente, células bipolares sensoriais
e, também, células horizontais, denominadas neurônios de associação e
caracterizadas por células planas cujos processos se espalham horizontalmente;
células amácrinas; núcleo das células de Müller e capilares dos vasos centrais da
retina.
A segunda e última região sináptica da retina, o estrato plexiforme interno, é
formado principalmente pelos axônios das células bipolares e pelos dendritos das
células ganglionares.
O estrato ganglionar contém as células ganglionares, que representam o
terceiro neurônio das vias ópticas.
O penúltimo dos estratos da retina, o estrato das neurofibras, constitui-se dos
axônios das células ganglionares. Elas formam fibras amielínicas distribuídas em
24
feixes que se estendem paralelamente à superfície da retina e convergem ao nível
do disco óptico, formando o nervo óptico.
Situado entre a retina e o corpo vítreo, o estrato limitante interno, forma tanto
o limite interno da retina quanto a camada externa do corpo vítreo.
1.2.4 Corpo vítreo
O corpo vítreo é uma estrutura gelatinosa, transparente e incolor. Ele se
localiza na câmara vítrea, ocupando cerca de 60 a 80% do bulbo do olho na região
posterior à lente. Ele sustenta, lateralmente, o corpo ciliar e a retina e é atravessado,
na sua região central, pelo canal hialóideo (WOLFF’S, 1973).
Quimicamente, o vítreo é constituído por 98% de água, ácido hialurônico,
aminoácidos, proteínas solúveis, sais e ácido ascórbico. Ele possui, também, uma
rede de fibrilas de colágeno, que estão presentes em maior quantidade no córtex
que na região central. Por esse motivo, a região central do vítreo é mais líquida que
a cortical (SNELL; LEMP, 1998).
Do ponto de vista de distribuição de fármacos, o corpo vítreo pode ser visto
como um líquido estático, onde pequenas substâncias ou solutos são transportados
principalmente por difusão (RITTENHOUSE; POLLACK, 2000).
25
A Figura 3 apresenta as principais estruturas do bulbo do olho.
Figura 3 - Esquema das principais estruturas oculares.
Fonte - Adaptado de ALL ABOUT VISION, 2005.
2 PRINCIPAIS DOENÇAS RELACIONADAS AO SEGMENTO POSTERIOR DO
BULBO DO OLHO
2.1 DEFINIÇÕES
Para que se possa compreender os dados apresentados a seguir, é
necessário, inicialmente, a definição de alguns termos relacionados a problemas
visuais (THYLEFORS et al., 1995; RESNIKOFF et al., 2004).
Câmara posterior
Câmara anterior
Lente
Córnea
Pupila
Humor aquoso
Íris
Conjuntiva
Ligamentos suspensórios
Corpo ciliar
Músculo reto lateral
Músculo reto medial
Corpo vítreo
Nervo óptico
Esclera
Corióide
Retina
Mácula lútea
Fóvea central
Câmara posterior
Câmara anterior
Lente
Córnea
Pupila
Humor aquoso
Íris
Conjuntiva
Ligamentos suspensórios
Corpo ciliar
Músculo reto lateral
Músculo reto medial
Corpo vítreo
Nervo óptico
Esclera
Corióide
Retina
Mácula lútea
Fóvea central
26
O termo deficiência visual refere-se a uma situação de diminuição da
resposta visual, com perda das funções da visão como acuidade visual e campo
visual, em virtude de causas congênitas ou hereditárias, mesmo após tratamento
clínico e/ou cirúrgico e uso de óculos convencionais. A diminuição da resposta visual
pode ser leve, moderada, severa, profunda (visão subnormal ou baixa visão) e total
(cegueira).
O indivíduo portador de baixa visão ou visão subnormal é aquele que
apresenta, freqüentemente, graus variáveis de comprometimento das várias funções
visuais, mesmo após tratamento e/ou correção óptica convencional, mas que usa ou
é potencialmente capaz de usar a visão para o planejamento e/ou execução de uma
tarefa.
A cegueira é, por definição, a perda total da visão (ausência de percepção de
luz). De acordo com a Organização Mundial de Saúde o indivíduo cego é aquele que
apresenta acuidade visual menor do que 20/400 no melhor olho, com a menor
correção óptica.
2.2 PREVALÊNCIA DE PROBLEMAS VISUAIS
De acordo com estimativas da prevalência de deficiências visuais e suas
causas, divulgadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e considerando a
população mundial de 2002, o número estimado de pessoas com deficiências
visuais era de 161 milhões, sendo 37 milhões de indivíduos cegos e 124 milhões
com baixa visão (RESNIKOFF et al., 2004). A tabela 1 representa a estimativa global
de problemas visuais por regiões.
27
Tabela 1 - Estimativa global de problemas visuais em 2002 por região.
Região
Número de
pessoas cegas
(milhões)
Número de
pessoas com
baixa visão
(milhões)
Número de
pessoas com
deficiência
visual
(milhões)
África (Centro e Sul) 7,288 21,288 28,576
África (Norte) 2,482 7,696 10,178
Estados Unidos da América 2,418 13,117 15,535
Europa 2,732 12,79 15,521
Sudeste Asiático
†
12,558 38,108 50,665
Oeste do Pacífico
‡
9,378 31,268 40,646
Brasil 1,392 7,6 8,992
Mundo 36,857 124,264 161,121
†
Indonésia, Malásia, Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Índia, Nepal e Paquistão.
‡
Austrália, China, Mongólia, Camboja, Myanmar, Vietnam.
Fonte - Adaptado de RESNIKOFF et al., 2004.
Embora a cegueira infantil seja um grande problema, sendo estimadas 1,4
milhões de crianças cegas com idade inferior a 15 anos, a magnitude deste
problema é relativamente pequena quando comparada à extensão da cegueira em
adultos maiores de 50 anos: mais de 82% de pessoas cegas apresentam 50 anos ou
mais (Tabela 2).
Os dados evidenciam o aumento progressivo da cegueira e da deficiência
visual no mundo, o qual pode ser atribuído, em especial, ao crescimento
populacional, ao aumento da expectativa de vida, à escassez de serviços
especializados, às dificuldades de acesso da população à assistência oftalmológica,
às dificuldades econômicas e à ausência/insuficiência de esforços educativos que
promovam a adoção de comportamentos preventivos (TEMPORINI; KARA-JOSÉ,
2004).
28
Tabela 2 - Número de cegos em 2002 de acordo com a idade (em anos) por região.
Número de pessoas cegas (milhões)
Região
< 15 15 - 49 50
África (Centro e Sul) 0,387 0,668 6,234
África (Norte) 0,082 0,263 2,137
Estados Unidos da América
0,123 0,558 1,738
Europa 0,071 0,575 2,087
Sudeste Asiático
†
0,492 1,755 10,309
Oeste do Pacífico
‡
0,212 1,362 7,805
Brasil 0,085 0,369 0,937
Mundo 1,368 5,181 30,308
†
Indonésia, Malásia, Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Índia, Nepal e Paquistão.
‡
Austrália, China, Mongólia, Camboja, Vietnam.
Fonte - Adaptado de RESNIKOFF et al., 2004.
No Brasil, o número de cegos foi estimado em 0,4 a 0,5% da população, ou
seja, de 4 a 5 mil pessoas por milhão de habitantes. Considerando-se a população
brasileira de 160 milhões de habitantes no ano 2000, estima-se existirem 640.000
cegos no país. A estimativa da prevalência de cegueira no Brasil sofre variações em
termos de diferentes níveis sócio-econômicos existentes em áreas mais, ou menos
desenvolvidas. Pode-se, assim, estimar a prevalência de 0,25% em locais
semelhantes a países desenvolvidos e de 0,75% em áreas mais pobres
economicamente (TEMPORINI; KARA-JOSÉ, 2004).
A Figura 4 representa as principais doenças causadoras de cegueira no Brasil
e no Mundo.
29
Figura 4 - Principais doenças causadoras de cegueira no Brasil e no Mundo.
Fonte - Adaptada de RESNIKOFF et al., 2004.
2.3 ALGUMAS DAS PRINCIPAIS DOENÇAS DO SEGMENTO POSTERIOR DO
BULBO DO OLHO
As doenças do segmento posterior do bulbo do olho são responsáveis pela
maioria dos casos de cegueira irreversível no mundo inteiro (GEROSKI;
EDELHAUSER, 2001). Este cenário, portanto, estimula o desenvolvimento de novas
modalidades de tratamento para degenerações retinianas e doenças do segmento
posterior do bulbo do olho. O sucesso no tratamento destas doenças visa,
essencialmente, o transporte de doses efetivas de fármacos para os tecidos mais
internos do olho.
40
15
5 5
7
6,4
0,8
0
20,8
47,8
8,7
5,1 4,8
3,9
3,6
0,8
13
12,3
0
10
20
30
40
50
60
Catarata
Glaucoma
AMD
Opacidade
corneana
Retinopatia
diabética
Cegueira
infantil
Tracoma
Oncocerquiase
Outras
Brasil Mundo
30
2.3.1 Neovascularização ocular
O processo de neovascularização ocular se refere ao aparecimento e/ou à
divisão anormal de células endoteliais, causando e contribuindo para estados
patológicos (LEE et al., 1998a).
A neovascularização, na maioria dos casos, provoca uma redução na visão e,
caso não controlada corretamente pode levar à cegueira. Os novos vasos podem
crescer próximo aos tecidos oculares e afetar a córnea, a íris, a retina e o nervo
óptico.
Embora nenhum fator explique todas as causas de ocorrência de
neovascularização ocular, muitos fatores contribuintes têm sido relatados, tais como
a inflamação e seus mediadores moleculares, os fatores angiogênicos do tumor e
um fator de hipóxia retiniano (LEE et al., 1998a). O principal mecanismo relatado de
formação de novos vasos pode ser resumido da seguinte forma: um estímulo inicial
causador de hipóxia dos tecidos (como por exemplo, o diabetes), induz um efeito
compensatório de produção de fatores de crescimento endoteliais pelos tecidos
envolvidos, como o VEGF (fator de crescimento endotelial, do termo em inglês
vascular endothelial growth factor), levando ao surgimento de vasos anormais
(WITMER et al., 2003). Os novos vasos formados são estruturalmente fracos,
apresentam vazamento de fluidos e ausência de integridade estrutural, e resultam
em hemorragia, exsudatos e fibrose, causando, geralmente, a cegueira.
As principais doenças associadas à neovascularização ocular no segmento
posterior do olho estão descritas na Tabela 3.
31
Tabela 3 - Doenças associadas à neovascularização ocular, presentes no
segmento posterior do olho.
Tecido (região) Doença
Retina
1
• Retinopatia diabética
• Retinopatia da prematuridade
• Degeneração macular ligada à idade (AMD)*
• Descolamento de retina
Coróide
2
• Degeneração macular ligada à idade*
• Uveíte crônica
1
A neovascularização da retina envolve o crescimento de novos capilares a
partir dos vasos que partem da região do nervo óptico ou da retina interna. Os
novos capilares podem se extender para o corpo vítreo e romper, resultando
em hemorragia local, a qual leva à perda da visão.
2
A neovascularização corioidal (CNV) é definida pela formação de novos vasos
localizados entre o estrato pigmentoso da retina e a lâmina basilar da coróide e
são contínuos aos vasos normais da coróide. A perda da visão ligada à CNV é
significativa devido ao fraco prognóstico, embora em alguns casos a CNV
possa ser controlada com laser.
* A AMD também pode estar associada à neovascularização retiniana,
entretanto, a neovascularização primária, nesta doença, origina-se na coróide.
Fonte – Adaptado de LEE et al., 1998a.
2.3.1.1 Retinopatia diabética
A retinopatia diabética (RD), definida como uma microangiopatia ocular,
desde 1968 se tornou a principal causa de cegueira, principalmente nos países
desenvolvidos. Cerca de 90% de todos os diabéticos apresentam algum tipo de
retinopatia após os 20 anos da ocorrência da doença (LANG, G. E.; LANG, G. K,
2002).
32
A RD é classificada em não-proliferativa e proliferativa. A não-proliferativa é
caracterizada principalmente por dilatação venosa, hemorragia retiniana,
microaneurisma e exsudatos lipídicos intrarretinianos. A RD proliferativa é
caracterizada pela proliferação de novos vasos anormais e/ou de tecido fibroso na
superfície da retina, a qual pode se extender para a região do vítreo. A hemorragia
vítrea é a maior causa de perda de visão, pois os novos vasos são frágeis e podem
causar vazamentos. Em casos mais graves, a proliferação de tecido fibrovascular
leva a um completo descolamento da retina (LEE et al., 1998a).
De acordo com o National Eye Institut, nos Estados Unidos, 16 milhões de
diabéticos são alvos potenciais para a perda de visão; 7 milhões de diabéticos
apresentam retinopatia diabética; 700.000 diabéticos encontram-se, atualmente, em
risco de cegueira; 65.000 diabéticos por ano desenvolvem RD proliferativa
(NATIONAL EYE INSTITUTE, 2005).
O principal tratamento da RD têm sido a ablação retiniana por meio de
fotocoagulação à laser ou crioterapia (LEE et al., 1998a). Um outro processo, ainda
sem muito sucesso terapêutico, é a terapia fotodinâmica, que consiste na oclusão
vascular dos novos vasos por meio de uma reação fotoquímica. Do ponto de vista
molecular, estudos experimentais mostram que o VEGF é o principal mediador no
crescimento de novos vasos e pode existir como diferentes glicoproteínas. O
ranibizumab (Lucentis
®
, Genentech, EUA), um fragmento de anticorpo monoclonal
que bloqueia o VEGF; o pegaptanib sódico (Macugen
®
, Eyetech Pharmaceuticals
Inc., EUA), um agente anti-VEGF seletivo; e o octreotide, um análogo da
somatostatina, são substâncias que se encontram atualmente em estudos clínicos
para o tratamento da RD.
33
Recentemente, a utilização de corticóides também está sendo pesquisada e
tem se mostrado eficaz no controle da RD.
2.3.1.2 Degeneração macular ligada à idade
A degeneração macular ligada à idade (AMD, do termo em inglês Age-related
macular degeneration) é uma degeneração crônica e progressiva dos fotoreceptores,
do estrato pigmentoso da retina, da lâmina basilar da coróide e possivelmente dos
coriocapilares na mácula. Alterações decorrentes da doença podem resultar em
perda da acuidade visual central (TUO et al., 2004).
A AMD pode ser definida como a degeneração progressiva da mácula em
idosos e que não pode ser atribuída a causas inflamatórias ou infecciosas. Ela
constitui a principal causa de cegueira em indivíduos com idade superior a 65 anos
nos Estados Unidos, oeste da Europa, Austrália e Japão (LANG, G. E.; LANG, G. K,
2002).
De acordo com o National Eye Institut, nos Estados Unidos, 13 milhões de
pessoas apresentam sinais de degeneração macular; 6,3 milhões de pessoas
desenvolveram a AMD em 2003; 1.200.000 de pessoas encontram-se em fase
avançada da doença; e 230.000 pessoas são cegas devido à degeneração macular
(NATIONAL EYE INSTITUTE, 2005).
Nos casos de degeneração macular neovascular ligada à idade, novos vasos
são formados abaixo da retina, levando à destruição de seu estrato pigmentoso.
Caso os vasos rompam, a hemorragia resultante leva à perda da visão (EVANS,
2001).
34
Embora exista uma intensa pesquisa, a etiologia precisa dos eventos moleculares
ligados à AMD ainda é pouco compreendida (AMBATI et al., 2003). Estudos
recentes revelam alguns dos processos bioquímicos envolvidos, mas a sua
complexidade ainda torna difícil a compreensão da doença.
Recentemente, não é encontrado tratamento seguro e eficaz contra a AMD que
seja capaz de recuperar a visão. Embora a fotocoagulação à laser visando os vasos
corioidais, a terapia fotodinâmica, a translocação cirúrgica da mácula e os agentes
angiogênicos pareçam reduzir os riscos de perda de visão moderada a severa em
alguns pacientes que apresentam a forma neovascular da doença, ainda não existe
um tratamento eficaz para a AMD avançada (TUO et al., 2004). A terapia
fotodinâmica representa uma opção, mas com um benefício restrito e custo elevado
(EVANS, 2001). Os estudos visando melhores terapias para a AMD são os mesmos
descritos para a retinopatia diabética. Por apresentarem efeitos antiproliferativos, os
corticóides também têm sido pesquisados para o tratamento da AMD.
2.3.1.3 Vitreoretinopatia proliferativa
A vitreoretinopatia proliferativa (PVR, do termo em inglês Proliferative
vitreoretinopathy), processo que pode se desenvolver após descolamento de retina,
é a causa mais comum de falha na cirurgia corretiva do descolamento de retina e
envolve a formação de membranas fibrosas compostas de células do estrato
pigmentoso da retina, células gliais, macrófagos e fibroblastos na retina ou próximo à
ela (YASUKAWA et al., 2004). A PVR pode também ser definida como o crescimento
e a contração de membranas celulares dentro do corpo vítreo e em ambas as
35
superfícies da retina e, em muitos casos, pode ser tratada como um processo
fibrótico da própria retina (PASTOR, 1998; PASTOR et al., 2002). Esta doença
representa entre 5 e 10% de todos os descolamentos de retina (PASTOR, 1998). O
fator mais importante é provavelmente o excesso de reação inflamatória que ocorre
em algumas situações clínicas que predispõem a PVR.
A cirurgia ainda continua sendo o tratamento padrão. Casos leves e
moderados de PVR podem ser tratados por meio de cirurgia convencional para
descolamento de retina, mas a vitrectomia é indicada em muitos casos (PASTOR et
al., 2002). Diferentes fármacos, tais como antimetabólitos e corticóides, têm sido
testados como potenciais agentes terapêuticos na inibição da proliferação celular e
na formação e contração da membrana (YASUKAWA et al., 2001). No entanto,
muitos destes fármacos antiproliferativos apresentam potenciais efeitos adversos e
apenas alguns estão sendo avaliados em estudos clínicos.
Estudos têm sido realizados visando avaliar os possíveis benefícios a partir
da utilização de substâncias que inibem diferentes aspectos da PVR. Estas
substâncias, entre outras, incluem o NF-kappaB (nuclear factor kappa beta) do
estrato pigmentoso da retina, os agonistas do receptor-β do ácido retinóico, os
antagonistas de cálcio para a elevação do AMPcíclico e de citocinas como o TGF-
β (transforming growth factor) e o VEGF (PASTOR et al., 2002).
2.3.2 Retinite por citomegalovírus (CMVR)
A retinite por citomegalovírus (CMVR) é a infecção ocular mais comum e a
maior causa de perda de visão em pacientes que apresentam a síndrome da
36
imunodeficiência adquirida (SIDA) (YASUKAWA et al., 2004). Ela ocorre em cerca
de 20 a 25% dos pacientes com SIDA durante o período da doença (KUNOU et al.,
2000a).
O diagnóstico precoce e o controle efetivo são indispensáveis para a
preservação da função visual. Uma terapia antiretroviral (highly active antiretroviral
therapy - HAART) composta de uma combinação de inibidores da replicação viral foi
administrada para promover a regressão da CMRV e demonstrou-se que a
prevalência da doença reduziu significativamente e o controle tem se tornado mais
fácil devido à recuperação imune (KUNOU et al., 2000a). Em alguns pacientes, no
entanto, a CMVR ainda é problemática já que aqueles que não respondem à terapia
antiretroviral desenvolvem uma CMVR nova ou reativada. Novas modalidades de
tratamento, portanto, ainda são necessárias para estes pacientes.
Recentemente, são encontrados seis tratamentos aprovados pelo Food and
Drug Administration (FDA) para CMVR: ganciclovir (intravenoso, oral e implante
intravítreo), foscarnet (intravenoso), cidofovir (intravenoso), fornivirsen (intravítreo)
(KUNOU et al., 2000a). A administração sistêmica de ganciclovir ou foscarnet
mostrou-se, inicialmente, efetiva na redução da progressão da doença. No entanto,
estes fármacos estão freqüentemente associados a sérios efeitos adversos, os quais
podem levar a uma discontinuidade da terapia. No caso da administração intravítrea,
esta requer aplicações freqüentes e está associada com riscos de catarata,
endoftalmite e descolamento de retina (YASUKAWA et al., 2004).
37
2.3.3 Endoftalmite
A endoftalmite é uma reação inflamatória dos fluidos ou tecidos intra-oculares,
podendo ser de origem infecciosa ou imunológica. Esta doença é classificada como
infecciosa ou não infecciosa, sendo que a primeira pode ser de origem pós-
operatória, pós-traumática e/ou endógena e a segunda apresenta como principais
causas as uveítes, a facoanafilaxia (Inflamação grave secundária à exposição no
mesmo olho ou no olho contralateral a material cristaliniano em um individuo
previamente sensibilizado às proteínas do cristalino) e a oftalmia simpática (Reação
inflamatória gravíssima que ocorre no olho contralateral após a realização de cirurgia
intra-ocular ou após trauma perfurante no outro olho) (KRESLOFF et al., 1998).
O tratamento da endoftalmite de origem infecciosa é baseado na
antibióticoterapia intra-ocular (amicacina, vancomicina, ceftazidima), tópica
(vancomicina, ceftazidima) e/ou sistêmica (ceftazidima, amicacina), se possível
adaptada ao agente causador (SPRAUL; LANG, 2002; KRESLOFF et al., 1998).
A incidência de endoftalmite endógena fúngica tem aumentado como
resultado do crescimento da prevalência de imunossupressão associada ao
transplante de órgãos, aos tumores, à uma recuperação prolongada de
procedimentos cirúrgicos complexos e ao crescimento intenso da utilização de
antibióticos, agentes imunossupressores e hiper-alimentação intravenosa
(YASUKAWA et al., 2001). Neste tipo da doença, o fluconazol e a anfotericina B têm
sido os fármacos de escolha no tratamento.
38
2.3.4 Uveítes
A uveíte é uma inflamação no trato uveal, o qual é composto pela íris, pelo
corpo ciliar e pela coróide. Entretanto, esse termo tem sido empregado para
designar inflamações que acometem estruturas adjacentes como a retina, o nervo
óptico e o corpo vítreo (ORÉFICE, 2000).
Diferentes distúrbios sistêmicos (como por exemplo, a toxoplasmose, a SIDA,
o herpes, a síndrome de Behçet, entre outras), algumas vezes, associam-se a
inflamações oculares e são bastante úteis no diagnóstico diferencial de algumas
uveítes (ORÉFICE, 2000; RIORDAN-EVA; VAUGHAN, 2001). A toxoplasmose
constitui uma das maiores causas de uveíte no Brasil e pode ser decorrente do
contato com fezes de felinos contaminados com Toxoplasma gondii e pela ingestão
de carne crua ou mal cozida (ORÉFICE, 2000).
Como principais objetivos do tratamento das uveítes podem ser mencionadas
a prevenção das complicações da visão, a redução do desconforto e, se possível, a
remoção da causa primária (KANSKI, 1994). Os grupos de fármacos mais utilizados
no tratamento das uveítes são, principalmente, os corticóides (por exemplo, a
dexametasona, a triancinolona, a prednisolona e a betametasona), os midriáticos e
cicloplégicos (por exemplo, a atropina, a escopolamina, a homatropina, o
ciclopentolato, a tropicamida e a fenilefrina), os antiinflamatórios não-esteróides (por
exemplo, o flurbiprofeno, o diclofenaco, e a indometacina), os imunossupressores
citotóxicos (por exemplo, o clorambucil, a azatioprina, e a ciclofosfamida) e não-
citotóxicos (por exemplo, a ciclosporina) os antivirais (por exemplo, o aciclovir, o
fanciclovir, o ganciclovir, o foscarnet, o cidofovir e o fomivirsen) e os antifúngicos
(KANSKI, 1994; ORÉFICE, 2000; RIORDAN-EVA; VAUGHAN, 2001).
39
Os corticóides têm sido os fármacos de escolha para o tratamento da maioria
das inflamações oculares (RIORDAN-EVA; VAUGHAN, 2001). A maior parte das
células do organismo possui receptores específicos para esses antiinflamatórios,
incluindo as células da íris, do corpo ciliar e dos tecidos perioculares. A dose inicial e
a duração do tratamento irão depender da gravidade e da natureza da doença, além
da resposta do paciente ao tratamento. Eles apresentam ação antiinflamatória e
imunossupressora inespecífica, protegendo os tecidos contra inflamações,
independente da causa.
3 DIFICULDADES NA ADMINISTRAÇÃO INTRA-OCULAR DE FÁRMACOS
A baixa penetração dos fármacos no interior do olho limita o número de
medicações indicadas para uso em oftalmologia e exige cuidado com aquelas
disponíveis devido a possíveis ocorrências de efeitos adversos (OGURA, 2001). A
administração de fármacos para o tratamento de doenças oculares deve ser feita,
preferencialmente, por meio de vias que atinjam o tecido local, visando reduzir a
ocorrência de efeitos indesejáveis e a absorção sistêmica. A seguir, estão descritas
as principais características das vias mais empregadas para administração ocular de
fármacos.
40
3.1 VIA TÓPICA
A administração de uma preparação pela via tópica, por meio de colírios, é a mais
utilizada em oftalmologia, principalmente quando a doença acomete o segmento
anterior do olho. Esta via apresenta maior facilidade de aplicação e comodidade
para o paciente (URTTI; SALMINEN, 1993).
Entretanto, as preparações tópicas são, algumas vezes, ineficazes em razão
de sua baixa biodisponibilidade, devido a fatores biológicos que protegem o olho e,
conseqüentemente, limitam a entrada dos fármacos (DAVIES, 2000). Tais fatores
incluem a impermeabilidade relativa do epitélio corneano, a dinâmica lacrimal, a
drenagem nasolacrimal e a eficiente barreira hemato-ocular (DING, 1998).
Estima-se que menos de 5% da dose administrada pela via tópica é absorvida e
atinge os tecidos intra-oculares. Grande parte dessa dose é absorvida
sistemicamente pela conjuntiva ocular e pela mucosa nasal (JÄRVINEN et al., 1995).
A conjuntiva, uma membrana fina e bastante vascularizada, apresenta uma área de
superfície superior à da córnea, além de ser muito mais permeável. Portanto, a partir
da administração tópica na região pré-corneal, a conjuntiva se torna uma importante
estrutura que contribui para a perda do fármaco pela circulação sistêmica e para a
competição pela absorção corneal (DAVIES, 2000).
3.2 VIA PERIOCULAR
A via periocular é utilizada no tratamento de doenças do segmento posterior do
olho por meio das injeções subconjuntival e, principalmente, subtenoniana.
41
A esclera constitui o tecido de acesso a esta via e algumas de suas
características, tais como elevada área de superfície e fácil acesso, alto grau de
hidratação, e permeabilidade que não mostra declínio apreciável com a idade,
facilitam a administração de fármacos por meio de injeções perioculares (FOSTER et
al., 1994; OLSEN et al., 1995, 1998; AMBATI et al., 2000).
Os principais riscos relacionados à via periocular incluem a perfuração do bulbo
do olho, a fibrose dos músculos extra-oculares e a possível ocorrência de
endoftalmite (HIDA et al., 1986; SMITH et al., 2002; GUPTA et al., 2003).
3.3 VIA SISTÊMICA
Os fármacos administrados pela via sistêmica atingem o segmento posterior do
olho através da circulação sanguínea e encontram um obstáculo anatômico
importante para o tratamento de doenças oculares que é a barreira hemato-ocular,
compreendida pelas barreiras hemato-aquosa e hematorretiniana (FOULDS et al.,
1980; CUNHA-VAZ, 1997, 2004).
A utilização desta via na terapêutica ocular requer, geralmente, a administração
de doses elevadas visando a manutenção de níveis terapêuticos intravítreos
adequados por períodos prolongados, o que pode levar a sérios efeitos adversos já
que esses fármacos administrados não são ocular-específicos, ou seja, seus
receptores não se situam unicamente no olho (URTTI; SALMINEN, 1993).
42
3.4 VIA INTRA-OCULAR
Visando a tentativa de manutenção de níveis terapêuticos adequados no
segmento posterior do olho, em particular, no corpo vítreo, na retina e na coróide, a
via intra-ocular tem sido a de escolha para o tratamento de diferentes doenças intra-
oculares. Utilizando esta via, pode ser evitada a ocorrência de efeitos adversos
sistêmicos proporcionados por vias que não liberam o fármaco no local de ação.
(PEYMAN; GANIBAN, 1995).
Devido a uma rápida eliminação dos fármacos, para que se obtenha uma
terapia eficaz, são necessárias múltiplas injeções intra-oculares de forma a manter a
concentração do princípio ativo dentro da faixa terapêutica, no local preciso onde se
desenvolve a doença, e durante um período suficiente. As injeções intra-oculares
repetidas, no entanto, podem causar sérias complicações, tais como hemorragia
intra-ocular, descolamento de retina, endoftalmite e catarata (PEYMAN; GANIBAN,
1995; VELEZ; WHITCUP, 1999; YASUKAWA et al., 2004).
No caso de ser feita uma injeção contínua (bolus), são observados efeitos de
picos e vales, principalmente para fármacos com faixa terapêutica estreita: o pico
inicial pode provocar uma toxicidade para os tecidos oculares, enquanto a queda
drástica da concentração intra-ocular do fármaco pode resultar em uma ineficácia do
tratamento (BEHAR-COHEN, 2002).
A injeção intra-ocular de triancinolona para o tratamento de várias doenças
intra-oculares proliferativas e edematosas tornou-se freqüente e tem se expandido
no mundo inteiro. É realizada, geralmente, a administração de 4 mg do fármaco e
seu efeito dura, em média, 21 dias (PEYMAN; MOSHFEGHI, 2004; JONAS et al.,
2005).
43
Um outro fármaco, também injetado por esta via, e que se encontra em fase
de estudos clínicos é o acetato de anecortave. Esta substância está sendo testada
para a inibição da neovascularização principalmente em casos de degeneração
macular ligada à idade. Foi observado que a administração de uma suspensão
contendo 15 mg deste fármaco se apresentou segura e eficaz no tratamento da
AMD, sendo capaz de prevenir a perda da visão severa durante o período de 1 ano
(D’AMICO et al., 2003).
O pegaptanib sódico (Macugen
®
, Eyetech Pharmaceuticals Inc. e Pfizer Inc.,
EUA), um outro fármaco também injetado pela via intra-ocular, foi recentemente
aprovado pelo FDA como uma nova terapia visando o controle da evolução da AMD.
Esta substância é um antagonista seletivo do VEGF e mostrou-se eficaz na redução
da perda da visão nos estudos clínicos realizados (U.S. FOOD AND DRUG
ADMINISTRATION, 2005a).
Devido a todas as dificuldades encontradas, pesquisas têm sido realizadas no
sentido de desenvolver sistemas de administração intra-oculares que permitam
liberar concentrações terapêuticas dos fármacos por um período prolongado e
adequado. Tais sistemas podem proporcionar inúmeras vantagens, como aumentar
a biodisponibilidade do fármaco, no sentido de obter uma liberação constante e
prolongada; aumentar as concentrações locais, sem a ocorrência de efeitos
adversos sistêmicos; atingir mais especificamente um tipo de tecido ou célula;
reduzir a freqüência de injeções intra-oculares. Tais vantagens podem aumentar o
conforto do paciente e reduzir as complicações observadas das injeções intra-
oculares (BEHAR-COHEN, 2002).
44
4 RECENTES ESTUDOS VISANDO O TRATAMENTO DE DOENÇAS DO
SEGMENTO POSTERIOR DO OLHO
Recentemente, novos sistemas de transporte de fármacos têm sido
desenvolvidos para o tratamento de doenças vitreorretinianas no sentido de
aumentar a baixa penetração das vias oculares convencionais.
Sistemas de liberação controlada, como as microesferas e os lipossomas,
estão em estudo com o objetivo de melhorar o tratamento por meio da manutenção
da concentração e do aumento da liberação do fármaco no local de aplicação e da
redução da toxicidade intra-ocular (MEISNER; MEZEI, 1995; ZIMMER; KREUTER,
1995; LAW et al., 2000; CLELAND et al., 2001; GAVINI et al., 2004; KAWAKAMI et
al., 2004).
Um exemplo de formulação lipossomal encontrada no mercado para
tratamento de algumas doenças intra-oculares, e que é bastante utilizada
atualmente, é o Visudyne
®
(Novartis Pharmaceuticals Corporation, EUA) que
apresenta como princípio ativo a verteporfina (NOVARTIS Pharmaceuticals Corp,
2005; ICHIKAWA et al., 2004). Esta formulação, aplicada pela via intravenosa, é
indicada, principalmente, para o tratamento de neovascularização em pacientes com
degeneração macular (NOVARTIS Pharmaceuticals Corp, 2005). No entanto, apesar
do sucesso comercial do produto, os resultados observados na clínica ainda são
bastante questionáveis no tratamento da neovascularizaçao.
A utilização das microesferas e dos lipossomas é, no entanto, limitada pois
existem alguns obstáculos relacionados à complexidade dos métodos de preparação
e à dificuldade de esterilização. Além disso, ao serem administradas, as partículas
presentes nessas formulações se encontram suspensas na cavidade vítrea,
45
causando embaçamento da visão do paciente e dificultando o exame de fundo de
olho pelo oftalmologista (WADA et al., 1990; PEYMAN; GANIBAN, 1995; OGURA,
2001).
A iontoforese é uma técnica de interesse particular no transporte de fármacos
para diferentes tecidos do olho, incluindo o segmento posterior e, principalmente,
para o espaço subretiniano visando atingir a retina e a coróide (FIALHO; SILVA-
CUNHA, 2004). Diferentes aplicações da iontoforese em oftalmologia clínica e
experimental têm sido descritas principalmente no tratamento de infecções
bacterianas e virais, inflamações, glaucoma, entre outras doenças que afetam
milhões de pessoas a cada ano em todo o mundo (SARRAF; LEE, 1994, BEHAR-
COHEN et al., 1997, 1998, 2001, BEHAR-COHEN, 2002, MONTI et al., 2003,
FRUCHT-PERY et al., 2004). Esta técnica pode ser considerada como um método
não-invasivo e não traumático designado para promover uma ampla penetração e
transporte intra-ocular de fármacos (FIALHO; SILVA-CUNHA, 2004). Baseada na
aplicação de uma corrente elétrica contínua de baixa intensidade, ela abre novas
possibilidades de tratamento de doenças do segmento posterior do olho e pode
minimizar as complicações indesejáveis dos métodos de tratamento atualmente
disponíveis. No entanto, para doenças que necessitam de tratamento prolongado, a
iontoforese ainda não apresenta sucessos, já que o paciente necessita de
aplicações freqüentes, o que torna um desconforto e reduz a adesão ao tratamento
(BEHAR-COHEN et al., 2001; FIALHO; SILVA-CUNHA, 2004).
Recentemente, implantes intra-oculares capazes de promover a liberação
prolongada de fármacos para o interior do olho estão sendo estudados.
46
4.1 IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS INTRA-OCULARES (INTRAVÍTREOS E
INTRA-ESCLERAIS)
Implantes preparados à partir de sistemas poliméricos podem ser aplicados
em diferentes regiões do olho. Ordenando-se as regiões da mais superficial a mais
profunda, temos: região subconjuntival, região subtenoniana, esclera e o interior do
bulbo do olho (câmara anterior e corpo vítreo). Em geral quanto mais profunda a
região, mais delicado o procedimento e mais eficaz a concentração no vítreo e na
retina (KIMURA; OGURA, 2001; FIALHO et al., 2003).
Os implantes intravítreos evitam o problema de redução da transparência do
meio ocular e têm sido investigados para o tratamento de diferentes doenças intra-
oculares e também para aplicação em cirurgias de catarata (SANBORN et al., 1992;
HASHIZOE et al., 1994; RUBSAMEN et al., 1994; CHENG et al., 1995; KUNOU et
al., 1995; YANG et al., 1998; ZHOU et al., 1998; VÉLEZ; WHITCUP, 1999; JAFFE et
al., 2000; TAN et al., 2001).
Implantes não-biodegradáveis de liberação lenta foram aprovados para uso
clínico nos Estados Unidos da América (EUA): o Ocusert
®
(Alza, EUA), um
dispositivo conjuntival que libera pilocarpina, o Vitrasert
®
(Bausch & Lomb, EUA),
um implante intravítreo contendo ganciclovir que tem sido usado em pacientes com
SIDA para o tratamento de CMVR e o Retisert
®
(Bausch & Lomb, EUA), um
implante intravítreo contendo fluocinolona indicado para o tratamento de uveíte não
infecciosa crônica (U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2005b). O problema
destes implantes é que, como os polímeros não são biodegradáveis, é necessária a
remoção do sistema após completa liberação do fármaco ou, caso não sejam
47
removidos, eles permanecem no local, até que sejam retirados por meio de
processos cirúrgicos.
Implantes intra-oculares preparados com polímeros biodegradáveis não
precisam ser posteriormente removidos, pois são completamente metabolizados e
eliminados pelo organismo. O desenvolvimento destes sistemas pode se tornar um
grande avanço já que eles poderão ser capazes de manter concentrações do
fármaco no local, dentro da faixa terapêutica e por longo período (HASHIZOE et al.,
1994; KIMURA et al., 1994; ZHOU et al., 1998; TAN et al., 2001; SAKURAI et al.,
2003).
A seguir, estão descritos os principais estudos realizados com implantes
biodegradáveis para aplicação intra-ocular.
Hashizoe e colaboradores desenvolveram um implante biodegradável
contendo doxorrubicina para o tratamento de vitreorretinopatia proliferativa
experimental em coelhos e a taxa de liberação do fármaco no corpo vítreo foi
avaliada (HASHIZOE et al., 1994). Esse sistema, composto pelo polímero poli(D,L-
lático-co-glicólico) (PLGA) e contendo 1% de doxorrubicina, foi implantado na pars
plana, sendo capaz de promover a liberação diretamente no corpo vítreo e não
alterando a transparência do meio ocular. Os estudos in vitro realizados mostraram
que 26% do fármaco foram liberados durante quatro semanas, e os in vivo
mostraram uma manutenção da concentração da doxorrubicina no corpo vítreo
dentro da faixa terapêutica por um período superior a quatro semanas. Não foi
observada nenhuma reação tóxica significativa avaliada por eletrorretinografia e
histopatologia do local.
Foi estudada igualmente, a eficácia de um implante à base de PLGA,
contendo 5-fluoruracila (5-FU), para o tratamento de PVR (RUBSAMEN et al., 1994).
48
As concentrações intravítreas do fármaco foram mantidas entre 1,0 e 13,0 µg/mL
por, no mínimo, 14 dias, e permaneceram acima de 0,3 µg/mL por cerca de 21 dias.
A implantação do sistema se mostrou eficaz na inibição de PVR, sem sinais de
efeitos tóxicos na retina.
Um implante intra-ocular capaz de liberar o ganciclovir no corpo vítreo foi
preparado com polímero poli-lático (PLA) e PLGA, utilizando diferentes
concentrações do fármaco e foram testados em coelhos para o tratamento de CMVR
(KUNOU et al., 1995). Os estudos de liberação in vitro mostraram que a degradação
do polímero era influenciada pela composição dos ácidos lático e glicólico. Embora
os implantes de PLA tenham liberado o fármaco por seis meses, esses não
apresentaram aplicação terapêutica já que obtiveram um longo período de latência.
Para os estudos de liberação in vivo e de biodegradação, foram utilizados, portanto,
os dispositivos de PLGA 75:25. Os resultados observados mostraram que a
concentração do fármaco foi mantida dentro da faixa terapêutica para humanos, no
corpo vítreo, por mais de três meses e na retina/coróide por mais de cinco meses.
No estudo de biodegradação, todos os sistemas desapareceram do corpo vítreo e
do espaço subconjuntival cinco meses após terem sido implantados.
No sentido de melhorar o perfil de liberação dos implantes acima estudados,
foram desenvolvidos, pelo mesmo grupo, novos sistemas à base de misturas de PLA
de peso molecular alto e baixo (KUNOU et al., 2000a). Os resultados in vitro
mostraram que o implante composto de PLA-70000 Daltons e PLA-5000 Daltons na
proporção de 80/20 foi o mais adequado, sendo, então, utilizado nos estudos in vivo.
A concentração de ganciclovir no corpo vítreo foi mantida dentro da faixa terapêutica
por 6 meses a partir desse implante.
49
Zhou e colaboradores desenvolveram um implante para o tratamento de PVR,
composto de PLGA 50:50, contendo três segmentos cilíndricos, cada um contendo
um dos seguintes fármacos: 5-fluorouridina (5-FUrd), triancinolona e um agente
trombolítico (t-PA) (ZHOU et al., 1998). No segmento de t-PA, o implante foi
revestido com PLGA, no sentido de promover um período de latência para liberação
do fármaco no momento adequado e, também, para reduzir o risco de sangramento
pós-operatório. Conseguiu-se combinar todos os três segmentos, e o processo de
revestimento foi bem sucedido. Os resultados mostraram que o 5-FUrd e a
triancinolona foram liberados na taxa de 1,0 µg/dia por mais de quatro semanas e de
10,0-190,0 µg/dia por mais de duas semanas, respectivamente. Após um período de
latência de cerca de dois dias, o t-PA foi liberado ativo na taxa de 0,2-0,5 mg/dia
durante duas semanas.
Um sistema de liberação de dexametasona para o tratamento de inflamação
após cirurgia de catarata, o Surodex
®
(Oculex Pharmaceuticals, Inc, EUA) foi
avaliado clinicamente (TAN et al., 1999, 2001). Este implante foi preparado com
PLGA e continha 60 µg do fármaco. O sistema foi capaz de promover liberação do
fármaco por um período de, aproximadamente, 7 a 10 dias. Os estudos clínicos
revelaram, ainda, que o implante foi bem tolerado e efetivo contra a inflamação.
Segundo dados de 2000, este sistema já foi aprovado para utilização clínica na
Singapura e no México, e completou os estudos clínicos de fase III, mas ainda
aguarda a aprovação do FDA para utilização nos EUA (THE WALL STREET
TRANSCRIPT, 2000).
A biocompatibilidade e a biodegradação in vivo de implantes intravítreos
preparados com diferentes ésteres de ácido hialurônico foi avaliada em olhos de
coelhos (AVITABILE et al., 2001). Os sistemas preparados com os derivados etil
50
éster e benzil éster do ácido hialurônico na concentração de 100% foram
degradados em 60 e 150 dias, respectivamente. O implante à base de benzil éster a
75% foi completamente reabsorvido após 15 dias. Estudos de microscopia,
oftalmoscopia e eletrorretinografia realizados mostraram que os implantes
preparados com ácido hialurônico são biocompátiveis e não foram observados sinais
de inflamação ocular.
A segurança e a eficácia de um sistema biodegradável composto de PLGA e
contendo 0,5 mg de ciclosporina (CsA) foram avaliadas após sua implantação na
câmara anterior de olhos de coelhos (THENG et al., 2003). Foram encontradas
concentrações elevadas do fármaco nas camadas da córnea (epitélio anterior,
substância própria e epitélio posterior) durante os 3 meses do estudo. Baixas
concentrações de CsA foram detectadas no humor aquoso e não foi detectado o
fármaco no sangue. Não foram observadas reações adversas durante o estudo.
Um sistema biodegradável à base de PLA e contendo fosfato de
betametasona foi implantado na esclera de olhos de coelhos (OKABE et al., 2003). A
toxicidade e a biocompatibilidade do implante foram avaliadas por oftalmoscopia,
eletrorretinografia e microscopia óptica. Os resultados in vitro mostraram que o
fármaco foi liberado por 8 semanas. A concentração de betametasona foi mantida
dentro da faixa terapêutica no vitreo e na retina-coróide por mais de 8 semanas. Não
foi observada reação tóxica na retina durante o estudo e o implante apresentou-se
biocompatível com o olho.
A eficácia de um implante polimérico biodegradável contendo tacrolimus foi
avaliada em um modelo animal de uveíte experimental (SAKURAI et al., 2003). Os
sistemas desenvolvidos foram implantados no corpo vítreo dos olhos de coelhos e o
grau de inflamação na câmara anterior e no corpo vítreo assim como a função
51
retiniana e análises histológicas foram avaliados. Os resultados mostraram que os
olhos tratados apresentaram menores sinais de inflamação que os não tratados.
Análises histopatológicas mostraram uma inflamação marcante e uma
desorganização tecidual nos olhos não tratados. A liberação controlada de
tacrolimus a partir destes implantes foi efetiva na supressão da inflamação de uveíte
experimental por 6 semanas.
5 ESTRUTURA E TIPOS DE POLÍMEROS UTILIZADOS NO PREPARO DE
IMPLANTES
Como o sistema de liberação de fármacos na forma de implante deve ser
biocompatível com o organismo, os componentes nele presentes devem ser não-
carcinogênicos, hipoalergênicos, mecanicamente estáveis e não-causadores de
resposta inflamatória no local de aplicação. Acrescenta-se, ainda, que as
características químicas e físicas do material não devem ser modificadas pelo tecido
local (ATHANASIOU et al., 1996).
Os implantes são preparados a partir de diferentes polímeros, sendo eles
biodegradáveis ou não-biodegradáveis. Estes sistemas podem, ainda, ser de dois
tipos: matriciais (ou monolíticos) e reservatórios (DASH; CUDWORTH II, 1998;
KIMURA; OGURA, 2001).
No sistema matricial, a substância se encontra dispersa na matriz polimérica.
A liberação do fármaco, caso se trate de um sistema biodegradável, ocorre por
difusão pelos poros da matriz, por degradação do polímero ou por uma combinação
52
dos dois mecanismos. Quando se utilizam polímeros não-biodegradáveis, a
liberação ocorre apenas por um processo de difusão lenta pela matriz. No sistema
do tipo reservatório, preparados com polímeros biodegradáveis ou não-
biodegradáveis, a substância se encontra em uma cavidade central envolta por uma
membrana polimérica, a qual controla sua taxa de liberação. (DASH; CUDWORTH II,
1998; KIMURA; OGURA, 2001).
Sistemas compostos por polímeros não-biodegradáveis, principalmente, os
derivados de celulose, silicones, polímeros acrílicos, polivinilpirrolidona e
copolímeros dos óxidos de etileno e propileno, embora apresentem uma taxa de
liberação relativamente constante, precisam, geralmente, ser removidos
posteriormente, o que requer processos cirúrgicos. Já os biodegradáveis podem
apresentar vantagens sobre os anteriores, pois são totalmente absorvidos pelo
organismo, não necessitando remoção subseqüente (KIMURA; OGURA, 2001). A
preparação de sistemas biodegradáveis, no entanto, requer o controle de um maior
número de variáveis já que a cinética de degradação do polímero in vivo deve
permanecer constante para que seja obtida uma liberação controlada do fármaco
(DASH; CUDWORTH, 1998).
Polímeros biodegradáveis naturais e sintéticos estão sendo estudados como
componentes em sistemas de liberação de fármacos, mas apenas alguns têm
demonstrado verdadeira biocompatibilidade. Os naturais, à base de proteínas, como
as albuminas bovina e humana, o colágeno e a gelatina, apresentam uso restrito por
conterem pureza questionável e, em alguns casos, atividade antigênica marcante. Já
os sintéticos, representados por poliamidas, poliaminoácidos, polialquilcianacrilatos,
poliésteres, poliortoésteres, poliuretanos e poliacrilamidas, têm apresentado
crescente interesse na aplicação como sistemas de liberação de fármacos. Os
53
polímeros biodegradáveis mais utilizados atualmente são os poliésteres, tais como a
poli(ε-caprolactona), o PLA e os diferentes tipos de PLGA, sendo que os dois últimos
tipos têm sido amplamente empregados (JAIN et al., 1998).
5.1 POLÍMEROS E CO-POLÍMEROS DERIVADOS DOS ÁCIDOS LÁTICO E
GLICÓLICO
Durante o final da década de 60 e início da década de 70, foram realizados
diversos estudos relacionados à utilização dos polímeros derivados dos ácidos lático
e glicólico para a fabricação de fios de sutura. Os resultados mostraram que eles
proporcionaram boas propriedades mecânicas, baixa capacidade alergênica, baixa
toxicidade, excelente biocompatibilidade e uma cinética previsível de biodegradação,
despertando a atenção de vários pesquisadores quanto a suas possíveis aplicações
em tecnologia farmacêutica. Essas substâncias obtiveram aprovação pelo Food and
Drug Administration (FDA) para a utilização como sistemas de liberação de
fármacos, existindo diversos estudos demonstrando sua baixa toxicidade (JAIN et
al., 1998).
Os polímeros e copolímeros derivados dos ácidos lático e glicólico são
sintetizados por uma reação de condensação, através da abertura do anel dos
dímeros cíclicos (ácido lático e/ou ácido glicólico). A polimerização geralmente
ocorre por um período de duas a seis horas, sob temperatura em torno de 175º C,
utilizando, como catalisador, principalmente, o cloreto estanhoso (JAIN et al., 1998).
O ácido lático possui um carbono beta assimétrico que permite a obtenção
das formas levógiras (L-PLA), dextrógiras (D-PLA) ou racêmicas (D,L-PLA), sendo
54
que as formas levógiras e dextrógiras são semicristalinas, graças à elevada
regularidade da cadeia polimérica, e as formas racêmicas são amorfas por
apresentarem irregularidades na estrutura da cadeia do polímero. Logo, prefere-se a
utilização de D,L-PLA já que esta forma permite uma dispersão mais homogênea do
fármaco na matriz polimérica (MERKLI et al., 1998).
A biodegradação desses polímeros ocorre por erosão, por meio de clivagem
da cadeia polimérica por hidrólise, liberando os ácidos lático e glicólico (Figura 5).
Esses ácidos, por serem metabólitos naturais do organismo, são eliminados pelo
ciclo de Krebs na forma de gás carbônico e água (ATHANASIOU et al., 1996). O
papel de atuação das enzimas na biodegradação do PLGA e PLA ainda não se
encontra bem definido, embora dados descritos na literatura afirmem que esse
processo não implica qualquer atividade enzimática, sendo a hidrólise o único
mecanismo envolvido (JAIN, 2000).
O CH
R
C
O
H
2
O
n
HO CH
R
COOH
Ciclo de Krebs
CO
2
+ H
2
O
R = H (ácido glicólico)
R = CH
3
(ácido lático)
n = número de monômeros de ácido lático (PLA), glicólico (PGA) ou ambos (PLGA)
* Os produtos de degradação podem ser: ácido lático (caso o polímero de origem seja PLA), ácido
glicólico (polímero de origem PGA) ou ambos (polímero de origem PLGA).
*
Figura 5 - Mecanismo de hidrólise de PLA, PGA ou PLGA.
Fonte - Adaptada de MERKLI et al., 1998.
55
A presença do grupo metila (CH
3
) no polímero derivado do ácido lático confere
a este uma maior hidrofobicidade quando comparado ao derivado do ácido glicólico
(PGA). O PGA, portanto, por ser bastante sensível à hidrólise, não é adequado para
a utilização em sistemas de liberação de fármacos. Com relação ao PLGA, quanto
maior a proporção de ácido lático, maior a hidrofobicidade do copolímero, já que
absorve menos água, e conseqüentemente, menor será a velocidade de
degradação. Além disso, a massa molar e o grau de cristalinidade podem influenciar
as propriedades mecânicas, a capacidade de hidrólise e a velocidade de
degradação desses polímeros (LEWIS, 1990; BLANCO-PRIETO et al., 1998).
A temperatura de transição vítrea (T
g
) dos diferentes PLA e PLGA encontra-
se acima da fisiológica (37°C) e, nessa condição, eles se apresentam na forma
cristalina. Desse modo, a cadeia se apresenta como uma estrutura relativamente
rígida, proporcionando uma força mecânica significativa e permitindo que sejam
formulados como sistemas de liberação de fármacos. Essa característica é, também,
um fator determinante da velocidade de degradação dos polímeros já que está
relacionada ao grau de cristalinidade e à organização das cadeias poliméricas.
Portanto, o polímero que apresenta maior T
g
geralmente se degrada mais
lentamente. O PGA apresenta temperatura de transição vítrea inferior (ou até
mesmo próxima) à corporal, sendo este um outro fator que o torna inadequado com
relação à sua utilização em sistemas de liberação de fármacos (JAIN et al., 1998).
As propriedades desses polímeros podem ser observadas na tabela 4.
56
Tabela 4 - Propriedades dos polímeros e copolímeros derivados dos ácidos lático e
glicólico.
Polímero ou
copolímero
Temperatura de
transição vítrea (°
°°
°C)
Temperatura
de fusão (°
°°
°C)
Tempo de
degradação
aproximado (meses)*
PLGA 50:50 45-50 amorfo 2
PLGA 75:25 60 amorfo 2-4
PLGA 85:15 45 amorfo 5
D,L-PLA 57-59 amorfo 12-16
L-PLA 60-67 172-174 18-24
PGA 36 230 2-4
* O tempo de degradação pode variar de acordo com a área superficial, porosidade
e massa molecular do sistema.
Fonte - Adaptada de LEWIS, 1990.
Os polímeros descritos podem ser utilizados na preparação de implantes, os
quais se apresentam, geralmente, na forma de bastão, discos ou membranas. Os
métodos de obtenção desses sistemas incluem: a moldagem, a extrusão e a
preparação de filmes. Por meio da moldagem, a mistura de pós (contendo o
polímero e o fármaco) é colocada em um molde desenvolvido na forma do implante
e podem ser utilizados, durante o preparo, aquecimento e pressão. Na extrusão, a
mistura de pós é propulsionada continuamente pelo equipamento, passando por
regiões de alta temperatura e pressão, onde ela é fundida e compactada na forma
final do implante. A preparação de filmes pode ser realizada por meio de fusão e
pressão da mistura de pós ou por adição da solução. O método de adição da
solução é o mais utilizado, e, nele, os componentes são dissolvidos em um solvente
apropriado formando uma solução que é, então, lançada sobre uma superfície lisa e
57
não-adesiva. O solvente se evapora, e o filme formado é retirado da superfície
(KIMURA; OGURA, 2001).
A esterilização de implantes contendo polímeros derivados dos ácidos lático
e glicólico tem sido um grande objeto de estudo. A esterilização terminal e a
preparação em ambientes assépticos são os métodos mais descritos na literatura e
têm se tornado, a cada dia, os mais seguros e eficazes. Os polímeros são facilmente
solúveis em diferentes solventes orgânicos, de modo que a solução resultante pode
ser submetida a uma filtração esterilizante sob fluxo laminar (ATHANASIOU et al.,
1996; JAIN et al., 1998).
6 UTILIZAÇÃO DE CORTICÓIDES NO TRATAMENTO DE INFLAMAÇÕES
OCULARES
A introdução dos corticóides como método terapêutico em doenças oculares
ocorreu há cerca de 50 anos (GORDON et al., 1951) e desde então, esses fármacos
têm sido amplamente empregados tanto no tratamento de doenças do segmento
anterior quanto do segmento posterior do olho (DUKE-ELDER; ASHTON, 1951;
LEIBOWITZ; KUPFERMAN, 1980; MCGHEE et al., 2002; SHERIF; PLEYER, 2002).
Os corticóides, utilizados com prudência, apresentam-se como os fármacos mais
potentes e eficazes no tratamento de inflamação ocular disponíveis até o momento
(MCGHEE et al., 2002).
O córtex da supra-renal sintetiza duas classes de esteróides: os corticóides
(glicocorticóides e mineralocorticóides) e os androgênios. Em seres humanos, a
58
hidrocortisona (cortisol) é o principal glicocorticóide, e a androsterona, o principal
mineralocorticóide. Os corticóides da supra-renal diferem em suas atividades
glicocorticóides e mineralocorticóides relativas (SCHIMMER; PARKER, 1996).
Os mineralocorticóides estão envolvidos na manutenção do equilíbrio
hidroeletrolítico, enquanto os glicocorticóides têm a capacidade de reduzir
acentuadamente as manifestações da inflamação, devido aos efeitos profundos que
exercem sobre a concentração, distribuição e função dos leucócitos periféricos, e de
inibir a atividade da fosfolipase A
2
. Eles inibem as funções dos leucócitos e dos
macrófagos teciduais, reduzindo a capacidade dessas células de responderem a
antígenos e mitógenos, e limitam a capacidade dos macrófagos de fagocitar e
destruir microorganismos e produzir interleucina-1, colagenase, elastase, fator de
necrose tumoral e ativador do plasminogênio. Além de terem efeito
imunossupressor, eles influenciam a resposta inflamatória, ao reduzir a síntese de
prostaglandinas e leucotrienos decorrente da ativação da fosfolipase A
2
, aumentam
a concentração de certos fosfolipídios, que parecem inibir a síntese de
prostaglandinas e leucotrienos, e podem reduzir a expressão da ciclooxigenase, com
conseqüente diminuição da quantidade de enzima disponível para formação de
prostaglandinas (SCHIMMER; PARKER, 1996; GOLDFIEN, 1998).
As modificações químicas na molécula do cortisol geraram derivados com
maiores diferenciações das atividades glicocorticóide e mineralocorticóide, podendo
provocar alterações como: especificidade e/ou potência, decorrente de mudanças na
afinidade e na atividade intrínseca nos receptores de corticóides; absorção; ligação a
proteínas; taxa de transformação metabólica; taxa de excreção e permeabilidade da
membrana (SCHIMMER; PARKER, 1996). No entanto, a eficácia intra-ocular de um
corticóide não só depende da potência antiinflamatória de seus derivados mas
59
também das propriedades da formulação e das características individuais de
metabolização e eliminação (SHERIF; PLEYER, 2002). A tabela 5 mostra os
corticóides comumente empregados e suas respectivas potências antiinflamatórias.
Tabela 5 - Alguns corticóides de uso geral comumente empregados.
Agente
Atividade
antiinflamatória *
hidrocortisona 1
cortisona 0,8
prednisona 4
prednisolona 5
Glicocorticóides de
ação rápida a
intermediária
metilprednisolona 5
triancinolona 5
Glicocorticóides de
ação intermediária
fluprednisolona 15
betametasona 25-40
Glicocorticóides de
ação prolongada
dexametasona 30
*Potência relativa à hidrocortisona.
Fonte - GOLDFIEN, 1998. p. 453.
Assim como em outros tecidos, os corticóides parecem não apresentar
efeitos específicos no olho, mas exercem um amplo espectro de atividade
antiinflamatória. (SHERIF; PLEYER, 2002). Os principais efeitos dos corticóides nos
tecidos oculares, sejam eles positivos ou negativos, incluem: a redução da resposta
imune celular; a redução da permeabilidade vascular inflamatória; a estabilização da
barreira hemato-aquosa; a inibição da proliferação epitelial; a inibição da
neovascularização corneal inflamatória; a redução do tempo de cicatrização; a
elevação da pressão intra-ocular; e a indução de catarata.
60
Foi demonstrado que não existe uma relação entre a potência antiinflamatória
de um corticóide e o seu risco de elevação da pressão intra-ocular, mas o
mecanismo pelo qual ocorre indução da elevação da PIO ainda não foi
completamente elucidado (SHERIF; PLEYER, 2002).
A dexametasona e seus derivados, utilizados em oftalmologia desde a década
de 60, são os fármacos mais empregados no tratamento de inflamações oculares,
devido à sua segurança e à sua potência antiinflamatória (LEOPOLD, 1958;
BAEYENS et al., 1998).
A dexametasona apresenta potência relativa cerca de seis vezes superior à da
triancinolona, um fármaco cujo uso em oftalmologia expandiu-se na atualidade
(SCHIMMER; PARKER, 1996).
O desenvolvimento de um sistema para a liberação lenta e prolongada de
dexametasona intravítrea permitirá que a atividade antiinflamatória do fármaco seja
associada a um efeito terapêutico mais prolongado, com maior tempo de
permanência no interior do olho, aumentando as possibilidades de indicações para o
tratamento de diferentes doenças inflamatórias que acometem o corpo vítreo e a
retina.
A relevância do trabalho se deve ao fato de que este estudo é pioneiro no
Brasil no que se refere à aplicação de implantes biodegradáveis de liberação
prolongada de corticóides para aplicação intra-ocular. Ele representa, ainda, o
primeiro passo para a realização de testes clínicos do sistema em pacientes
brasileiros com doenças crônicas do segmento posterior do olho que apresentam
tratamento limitado até o momento.
61
62
1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho objetivou o desenvolvimento e a avaliação de implantes
biodegradáveis como uma alternativa à administração intra-ocular de corticóides, em
específico, o acetato de dexametasona.
1.1 Objetivos específicos
• Validação das metodologias analíticas de cromatografia líquida de alta eficiência
e ELISA;
• Desenvolvimento de implantes à base de polímeros e copolímeros derivados dos
ácidos lático e glicólico contendo acetato de dexametasona por dois métodos
diferentes;
• Caracterização dos implantes desenvolvidos por meio de análises de calorimetria
diferencial de varredura e de microscopia eletrônica de varredura;
• Avaliação do perfil de liberação e de degradação in vitro dos implantes
desenvolvidos;
• Avaliação do perfil de liberação e de biodegradação in vivo dos implantes
desenvolvidos;
• Avaliação da toxicidade dos sistemas desenvolvidos após implantação intravítrea
por meio de exame clínico, eletrorretinografia e histopatologia.
63
64
1 MATERIAIS E MÉTODOS
1.1 MATERIAIS
Acetato de dexametasona (MM= 434,5; solubilidade em água a 37°C = 0,1
mg/ml, Sigma-Aldrich Co., EUA), água ultrafiltrada (Milli Q plus, Millipore, EUA),
acetonitrila e metanol grau cromatografia líquida de alta eficiência (EM Science,
Merck KgaA, Alemanha). Os outros reagentes utilizados foram de grau analítico.
1.2 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA DE CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) PARA ANÁLISE DE ACETATO DE
DEXAMETASONA
Foi utilizado, nesta etapa, o cromatógrafo líquido Waters
(Waters, EUA),
equipado com bomba modelo 515 (Waters, EUA), injetor automático modelo 717
plus (Waters, EUA), detector de ultravioleta modelo 2487 (Waters, EUA), programa
Millenium
versão 2.15.01 (Waters, EUA). Foi usada uma coluna do tipo C-18 de
fase reversa de 3,9 mm de diâmetro e 150 mm de comprimento, com partículas de
tamanho de 5 µm (Nova-Pak
, Waters, EUA).
O método analítico de CLAE foi empregado para determinação da
concentração do acetato de dexametasona na solução tampão fosfato (phosphate-
buffered solution - PBS) 0,1M, pH 7,4, meio de liberação empregado no estudo de
liberação in vitro dos implantes biodegradáveis e para análise da quantidade de
65
acetato de dexametasona restante nos implantes retirados dos olhos dos animais no
estudo in vivo.
Primeiramente, foram definidas as condições experimentais como:
composição da fase móvel, fluxo, tipo de fase estacionária (coluna), comprimento de
onda de detecção e tempo de retenção, de acordo com a monografia do fármaco
descrita na Farmacopéia Americana (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA 24,
2000 - USP 24, 2000) (Tabela 6).
Tabela 6 - Condições cromatográficas do acetato de dexametasona.
Condições
Acetato de
dexametasona
Fase móvel água:acetonitrila (55:45)
Fluxo da fase móvel (mL/minuto) 2,0
Modo do fluxo isocrático
Comprimento de onda de detecção no
UV (nm)
254
Temperatura da coluna ambiente
Fonte - USP 24, 2000.
Em seguida, foram realizados experimentos para validação do método
considerando os seguintes parâmetros preconizados pela Resolução n
o
899, de 29
de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária: seletividade,
especificidade, linearidade, precisão e exatidão (BRASIL, 2003).
Foi realizada, também, uma análise da presença de interferentes do meio, no
caso a solução tampão fosfato (estudo de liberação in vitro) e o polímero (estudo da
66
quantidade de acetato de dexametasona restante nos implantes), com o tempo de
retenção do fármaco.
A precisão foi estabelecida por meio de nove determinações, ou seja, três
concentrações (baixa, média e alta), com três réplicas para cada determinação. Foi
estimada em termos de desvio padrão relativo (DPR) em um mesmo dia (precisão
intra-dia) e em dias diferentes (precisão inter-dias). As amostras submetidas a esse
teste foram preparadas diluindo-se o fármaco em solvente específico descrito na sua
monografia da USP 24. O DPR deve ser menor que 1,0 para qualquer faixa de
concentração, intra-dia e inter-dias.
A exatidão foi estabelecida pela relação entre a concentração média
analisada experimentalmente e a concentração teórica correspondente,
determinando a porcentagem de recuperação do analito, adicionado ao placebo ou
matriz biológica. Os resultados devem ser de 98,0 a 102,0 % e foram verificados,
também, por meio de nove determinações, ou seja, três concentrações (baixa, média
e alta) com três réplicas para cada determinação. Os ensaios foram realizados em
um mesmo dia (exatidão intra-dia) e em dias diferentes (exatidão inter-dias). Para a
determinação do acetato de dexametasona este foi, primeiramente, diluído no
solvente específico descrito na USP 24 e, posteriormente, foi realizada uma nova
diluição com PBS.
A linearidade foi estabelecida pela injeção de amostras extraídas da matriz
apropriada do fármaco. A equação da reta e o coeficiente de regressão linear (R
2
)
foram obtidos a partir dos valores de absorvância medidos pela área do pico (mV)
versus a concentração do fármaco, empregando-se o cálculo de regressão linear
pelo método dos mínimos quadrados. O coeficiente de correlação linear deve ser de,
no mínimo, 0,999. A determinação da curva de calibração foi realizada por meio da
67
análise de seis concentrações diferentes do acetato de dexametasona nos intervalos
de 0,5 a 120 µg/mL.
O limite de detecção foi estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível detectável, em
triplicata. O limite de quantificação foi estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável
com precisão e exatidão aceitáveis, ou seja, com valor de DPR inferior a 2,0.
1.3 VALIDAÇÃO DO KIT DE ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT
ASSAY) PARA DOSAGEM DE CORTICÓIDES
A metodologia de ELISA foi utilizada para determinar a concentração de
acetato de dexametasona liberada no corpo vítreo a partir dos implantes
biodegradáveis desenvolvidos.
Esta técnica é baseada na utilização de uma enzima para catalisar uma
reação e que gera um produto detectável por métodos calorimétricos. A enzima é
conjugada a um anticorpo, o qual se encontra ligado em uma superfície sólida (no
caso, a placa de ELISA) e que é específico para a substância a ser detectada. A
presença da substância a ser medida é observada por uma reação de mudança de
cor.
Para esta finalidade foi utilizado um kit comercial para dosagem específica
de corticóides (Corticosteroid Elisa Kit, DM 2156, Randox Laboratories Ltd., London,
UK), o qual foi mantido embalado, protegido da luz e sob refrigeração até a
68
execução dos ensaios, observando o prazo de validade. O fotômetro Multiskan
®
MS
(Titertek, EUA) foi usado para a leitura das placas.
Foi feita uma curva de calibração, aplicando-se cada um dos seis padrões
fornecidos com o kit (0; 0,1; 0,2; 0,98; 4,98 e 9,0 ng/ml) em oito diferentes
microcavidades. A curva de calibração foi determinada por análise de regressão,
relacionando o logaritmo (Ln) da concentração com os valores de absorbância,
utilizando o programa WindowChem Software™ – Standard Curves, (versão 4.3,
Hypnovista software, EUA)
Foram analisadas soluções padrões de acetato de dexametasona em
concentrações dentro do intervalo da curva fornecida pelo fabricante do kit (8,0; 4,0;
2,0; 1,0; 0,5 e 0,25 ng/ml). Estas soluções foram preparadas em PBS 0,1M, pH 7,4
já que a quantidade de amostra de corpo vítreo necessária para esta finalidade seria
muito grande e, portanto, inviável. Em paralelo, foram analisados brancos do corpo
vítreo e do PBS, em duplicata, para verificação da ausência de interferentes.
Para avaliar a sensibilidade e a eficiência do kit, soluções de concentrações
decrescentes foram preparadas e aplicadas, em duplicata, nas microcavidades.
Os dados obtidos da curva de calibração foram analisados por regressão linear
utilizando o programa GraphPad Prism
versão 3.00. (GraphPad Software
Incorporated, EUA).
69
2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA DE CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) PARA ANÁLISE DE ACETATO DE
DEXAMETASONA
Conforme descrito anteriormente, para validação da metodologia foram
utilizadas as condições cromatográficas descritas na USP 24 e determinados os
parâmetros de precisão, exatidão, linearidade, sensibilidade e seletividade de acordo
com as exigências do Ministério da Saúde e da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (BRASIL, 2003).
Os resultados obtidos nos testes de precisão para o acetato de
dexametasona se mostraram adequados às análises, já que os valores de DPR
encontrados foram inferiores a 1,0 para qualquer faixa de concentração, intra-dia e
inter-dias.
No teste de exatidão, as porcentagens de recuperação do acetato de
dexametasona, intra-dia e inter-dias, encontraram-se dentro do limite estabelecido
de 98,0 a 102,0 %.
A linearidade, para a faixa de trabalho especificada, apresentou um
coeficiente de correlação linear de 0,9998 para o acetato de dexametasona (Figura
6).
Os valores dos limites de detecção e de quantificação foram equivalentes a
0,05 µg/mL e 0,1 µg/mL, respectivamente. Esses resultados demonstram uma
detectabilidade adequada para as análises em questão.
70
Figura 6 - Curva de calibração do acetato de
dexametasona.
Após avaliação da presença de interferentes do PBS e do polímero na
análise cromatográfica do acetato de dexametasona, foi observada ausência de
absorção, no mesmo tempo de retenção do padrão do fármaco, de picos nos
cromatogramas provenientes do PBS e do polímero.
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que a metodologia analítica
de CLAE está otimizada e validada para as análises a serem desenvolvidas.
2.2 VALIDAÇÃO DO KIT DE ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT
ASSAY) PARA DOSAGEM DE CORTICÓIDES
A curva de calibração para o acetato de dexametasona apresentou
linearidade para a faixa de trabalho especificada, pois foi obtido um coeficiente de
correlação linear de 0,9831. Foi observado, também, que as amostras testadas, no
y = 13957x + 8556,7
R
2
= 0,9998
0
300000
600000
900000
1200000
1500000
1800000
0 20 40 60 80 100 120 140
Concentração (
µ
g/mL)
Área (mV)
71
caso, as soluções preparadas em PBS, encontraram-se dentro dos limites da curva
de calibração (Figura 7).
Figura 7 - Curva de calibração do acetato de dexametasona após
dosagem por ELISA mostrando os padrões e as amostras.
Na determinação da sensibilidade e eficiência do kit, observou-se que todas
as amostras testadas apresentaram resultados positivos, mesmo aquelas com níveis
correspondentes a 0,075 ng/ml. Estes resultados estão de acordo com os dados
fornecidos pelo fabricante que se referem a um limite de detecção inferior a 0,25
ng/ml.
O kit de ELISA para análise de acetato de dexametasona demonstrou
eficiência, sensibilidade e especificidade aceitáveis. A linearidade da resposta do kit
foi observada pela avaliação do coeficiente de correlação linear obtido da curva de
calibração.
A partir dos resultados obtidos, pode-se dizer que o kit de ELISA a ser
empregado é adequado para a análise a ser desenvolvida.
y = -0,3597Ln(x) + 0,8229
R
2
= 0,9831
0,0000
0,3000
0,6000
0,9000
1,2000
1,5000
1,8000
0,100 1,000 10,000
LnConcentração (ng/ml)
Absorvância 450 nm
Padrão Amostra
72
73
1 INTRODUÇÃO
Os derivados dos ácidos lático e glicólico são polímeros biodegradáveis e
biocompatíveis com ampla utilização no desenvolvimento de sistemas de liberação
de fármacos (KIMURA; OGURA, 2001). A degradação destes sistemas, como
descrito na introdução deste trabalho, pode ser influenciada por diferentes fatores,
como por exemplo, o pH, a temperatura, a presença de fármacos e mesmo a própria
natureza do polímero (JAIN, 2000). Com relação à aplicação intra-ocular, sistemas
poliméricos de liberação de fármacos estão sendo estudados para o tratamento de
doenças vitreorretinianas. Estes sistemas podem aumentar a biodisponibilidade do
fármaco e reduzir seus efeitos adversos (KIMURA; OGURA, 2001).
O transporte de fármacos a partir de sistemas poliméricos preparados com
poliésteres é bastante complexo. As propriedades de degradação dos polímeros, as
técnicas de preparo, assim como a quantidade de fármaco presente podem
determinar o comportamento do sistema. Tem sido mostrado que implantes
poliméricos preparados por diferentes técnicas provavelmente não apresentam a
mesma estrutura microporosa e, conseqüentemente, degradam em diferentes
velocidades e possuem comportamento in vitro e in vivo diferentes. Polímeros
termoplásticos como o PLA e o PLGA podem ser preparados na forma de implantes
utilizando técnicas como, por exemplo, moldagem a quente, compressão e extrusão
(ROTHEN-WEINHOLD et al., 1999).
Esta etapa do trabalho consistiu no desenvolvimento de implantes
biodegradáveis intravítreos contendo acetato de dexametasona por dois métodos
diferentes, compressão e moldagem a quente. A comparação da influência destes
74
dois métodos na degradação in vitro das matrizes poliméricas e na liberação do
fármaco foi avaliada. A calorimetria diferencial exploratória (DSC) foi empregada
para avaliação da presença de solvente residual, da estabilidade do fármaco e dos
polímeros, da possibilidade de interação entre o fármaco e os polímeros nas
misturas de pós e, também, para análise dos implantes finais. A morfologia de
superfície dos implantes foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura
(MEV); a degradação in vitro dos implantes foi acompanhada pela medida da
porcentagem de perda de massa; e o perfil de liberação in vitro do acetato de
dexametasona foi analisado (FIALHO; SILVA-CUNHA, 2005).
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS
Acetato de dexametasona (MM = 434,5; solubilidade em água a 37°C = 0,1
mg/ml; Sigma-Aldrich Co, EUA), polímero poli (D,L-lático-co-glicólico) 50:50 [PLGA
50:50; viscosidade inerente (v.i.) = 0,45-0,60 dl/g] (Resomer
RG 504, Boehringer
Ingelheim, Alemanha), polímero poli (D,L-lático) (PLA; v.i. = 0,25-0,35 dl/g)
(Resomer
R 203 H, Boehringer Ingelheim, Alemanha), acetonitrila e metanol grau
CLAE (EM Science, Merck KgaA, Alemanha), água ultrafiltrada (Milli Q plus,
Millipore, EUA). Os outros reagentes utilizados foram de grau analítico.
75
2.2 PREPARO DOS IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS INTRAVÍTREOS
Nesta etapa, o PLGA 50:50 ou o PLA foram utilizados como matrizes
poliméricas e o acetato de dexametasona como fármaco. Todos os sistemas
desenvolvidos apresentavam 27,7 % p/p de acetato de dexametasona, equivalente a
25% p/p de dexametasona, e 72,3 % p/p de polímero.
Primeiramente, o polímero e o fármaco foram dissolvidos em uma mistura de
acetonitrila e água destilada. A solução resultante foi liofilizada (Liofilizador E-C
MODULYO, E-C Apparatus Inc., EUA) para a obtenção de uma mistura homogênea.
Esta mistura foi então utilizada para o preparo dos implantes pelos métodos de
compressão e moldagem a quente.
No método de compressão, os implantes foram preparados empregando
uma prensa hidráulica na pressão de 1 ton/m
2
, utilizando um sistema à base de aço
inoxidável, especialmente desenvolvido para esta finalidade, composto por pinos
cilíndricos de 1mm de diâmetro.
Na técnica de moldagem a quente, a mistura de pós previamente obtida foi
moldada em bastões utilizando uma placa de Teflon
aquecida na temperatura de
100 a 120°C.
Visando avaliar a uniformidade, os implantes desenvolvidos foram pesados e
medidos após o preparo e, em seguida, selecionados.
76
2.3 ANÁLISES DE CALORIMETRIA DIFERENCIAL EXPLORATÓRIA (DSC)
A DSC (calorímetro TA Instruments, model 2910 Modulated DSC, EUA) foi
empregada com a finalidade, inicialmente, de se obter informações da mistura de
pós preparada com relação: à presença de solvente residual após o processo de
liofilização, à estabilidade dos polímeros e do acetato de dexametasona na
temperatura de 100 a 120°C utilizada no preparo dos implantes pelo método de
moldagem a quente, e à possibilidade de interações entre o fármaco e os polímeros
empregados.
Para a análise das misturas de pós, utilizaram-se cadinhos de alumínio semi-
herméticos, os quais foram selados após a pesagem de uma quantidade de 3 a 5
mg das amostras. A calibração do sistema foi realizada utilizando padrão de índio
(In). O seguinte procedimento de análise foi realizado para todas as amostras, sob
atmosfera de nitrogênio:
1) aquecimento inicial em uma razão de 10°C/minuto de 30°C até 100°C
(primeira etapa de aquecimento);
2) isoterma a 100°C por 5 minutos;
3) resfriamento rápido até 20°C;
4) novo aquecimento em uma razão de 10°C/minuto de 20°C até 250°C
(segunda etapa de aquecimento).
A avaliação da presença de solvente residual foi realizada de acordo com as
curvas de DSC obtidas na primeira etapa de aquecimento. As curvas de DSC
obtidas na segunda etapa de aquecimento (temperatura de 20 a 250°C) foram
registradas para estudo da estabilidade dos polímeros e do acetato de
dexametasona e da interação entre o fármaco e o polímero.
77
Finalmente, os implantes desenvolvidos também foram analisados por meio
de DSC. Para esta análise, os sistemas foram selados em cadinhos de alumínio e
aquecidos de 20 a 250°C, sob atmosfera de nitrogênio, na razão de 10°C/minuto.
2.4 ESTUDO DA MORFOLOGIA DE SUPERFÍCIE DOS IMPLANTES
BIODEGRADÁVEIS INTRAVÍTREOS
A morfologia de superfície dos implantes preparados pelos métodos de
compressão e de moldagem a quente foi analisada por meio de microscopia
eletrônica de varredura (MEV).
Imediatamente após serem preparados, os implantes foram selecionados,
aleatoriamente, por meio de iluminação própria e colocados em dessecador
contendo sílica gel com indicador azul por 48 horas. Em seguida, eles foram
montados em suportes porta-amostras (stubs) de alumínio, já que este material
confere condutividade e assim possibilita a obtenção de melhores imagens. Os
sistemas foram montados por inteiro, sem necessidade de cortes, na posição
horizontal, para melhor avaliar o tamanho e também as características da superfície.
Eles foram aderidos aos suportes utilizando fita dupla-face e, imediatamente após,
foram colocados novamente em dessecador por, no mínimo 24 horas antes do
processo de metalização.
Visando conferir condutividade à superfície dos implantes a serem analisados
e a obtenção de melhores imagens, procedeu-se a uma metalização com ouro, sob
atmosfera de argônio, durante 1 minuto. Foi utilizado, nesta etapa, o acessório DSV
78
203 do equipamento BAF 300 da Balzers (EUA). Não foi possível estimar, por meio
do equipamento disponível, a espessura da camada de ouro formada.
As amostras foram observadas no microscópio Zeiss DSM 950 (Carl Zeiss
NTS GmbH, Alemanha) do Centro de Microscopia Eletrônica (CEMEL) do Instituto
de Ciências Biológicas da UFMG. Para o estudo dos implantes biodegradáveis foi
utilizada, inicialmente, uma voltagem de 20 kV. Entretanto, observou-se que eles não
suportaram este valor de voltagem devido, provavelmente, à sensibilidade térmica
do polímero constituinte. Foi empregado neste estudo, portanto, a voltagem de 15
kV.
A superfície dos implantes foi visualizada nos aumentos de 300X e 1000X e
as imagens foram transferidas para o computador por meio de uma interface digital
de transferência de imagens (Digital Image Transference Interface - DITI). As
imagens obtidas foram ajustadas utilizando os programas Adobe Photoshop versão
6.0 e Adobe Illustrator versão 9.01 (Adobe Systems Incorporated, 2000, EUA).
2.5 ESTUDO DE DEGRADAÇÃO IN VITRO
A degradação in vitro dos implantes preparados por compressão e
moldagem, utilizando tanto PLGA 50:50 e PLA como matrizes poliméricas, foi
monitorada por meio da medida da porcentagem de perda de massa.
Os implantes de PLGA 50:50 e PLA preparados por compressão e
moldagem a quente (n=4), previamente pesados, foram colocados em recipientes
individuais e imersos em 200 ml de PBS 0,1M; pH 7,4. Este estudo foi realizado no
banho-maria BD R02020 (Lauda, Alemanha) sob temperatura constante de 37°C.
79
Em intervalos de tempo pré-determinados, o meio contendo os implantes foi
centrifugado e o líquido removido. As amostras restantes foram secadas por 48
horas em um dessecador à vácuo sob temperatura ambiente. Em seguida, o peso
seco final foi registrado e a porcentagem de perda de massa foi calculada pela
equação: % perda de massa = (peso inicial – peso seco final) / peso inicial.
2.6 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VITRO
O estudo de liberação in vitro foi realizado em 200 ml de PBS 0,1M; pH 7,4, sob
condições sink. Este estudo foi realizado no banho-maria BD R02020 (Lauda,
Alemanha) equipado com placa agitadora, sob temperatura constante de 37°C.
Quatro implantes de cada um dos implantes previamente pesados de PLGA 50:50
e PLA preparados por compressão e moldagem a quente foram colocados em
pequenos frascos de polipropileno abertos de modo que permitisse a entrada do
meio e que não causasse grandes movimentos dos implantes no meio de liberação.
Os pequenos frascos foram colocados em recipientes âmbar individuais e fechados
(Figura 8). Este procedimento foi feito visando aproximar o estudo das condições
encontradas in vivo, em que os implantes não se movimentam no meio ocular.
Em intervalos de tempo pré-determinados, 2,0 ml do meio de liberação foram
coletados e 2,0 ml de um novo meio, com a mesma constituição anterior, foi
adicionado a cada recipiente.
80
Figura 8 - Esquema do estudo de liberação in vitro.
A quantidade de acetato de dexametasona liberada no meio foi medida por
meio de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) utilizando o método descrito
na PARTE I (item 1.2, p. 62).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 PREPARO DOS IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS INTRAVÍTREOS
Imediatamente após terem sido desenvolvidos, os implantes compostos por
PLGA 50:50 e PLA, preparados pelas técnicas de compressão e moldagem a quente
foram comparados. O peso médio dos implantes comprimidos foi de 4,3 ± 0,2 mg e
dos implantes moldados foi de 4,7 ± 0,3 mg, o diâmetro médio foi de 1,0 ± 0,1 mm e
o comprimento médio de 4,0 ± 0,1 mm para os implantes preparados pelas duas
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
"
"
Recipiente âmbar
Solução tampão fosfato 0,1 M; pH 7,4.
Banho-maria a 37°C
Frasco de propileno
Implante
Agitação magnética
81
técnicas diferentes (Figura 9). O baixo coeficiente de variação entre os implantes,
equivalente a 2,79%, foi indicativo da reprodutibilidade das técnicas.
Figura 9 - Fotografia dos implantes de PLGA
contendo acetato de dexametasona
preparados pelas técnicas de moldagem a
quente (A) e compressão (B) (barra = 1mm).
Macroscopicamente, todos os implantes se apresentaram lisos, com
aparência similar, e como sistemas monolíticos, nos quais o fármaco se encontrava
disperso na matriz polimérica.
A mesma quantidade de pós foi utilizada no preparo dos implantes pelos
métodos de compressão e moldagem a quente para que fosse possível a
comparação entre os dois métodos.
3.2 ANÁLISES DE CALORIMETRIA DIFERENCIAL EXPLORATÓRIA (DSC)
A presença de resíduos de solventes orgânicos em amostras promove uma
redução na temperatura de transição vítrea (T
g
) para temperaturas mais baixas
(HATAKEYAMA; QUINN, 1994). Os resultados de DSC da primeira etapa de
aquecimento, realizado nas misturas de pós polímero-fármaco não mostraram
alterações significativas nos valores de T
g
, o que pode ser observado na Tabela 7.
82
Isto sugere a ausência de resíduos de solventes nas amostras após o processo de
liofilização.
Tabela 7 - Temperatura de transição vítrea dos polímeros utilizados e das misturas
polímero-fármaco a 27,7% p/p após a primeira e a segunda etapa de aquecimento.
Polímero
T
g1
(°
°°
°C)* T
g2
(°
°°
°C)*
antes de liofilização 45 46
liofilizado 46 46
PLGA 50:50
+ fármaco 48 48
antes de liofilização 50 51
liofilizado 50 51
PLA
+ fármaco 54 55
* Precisão de T
g
é de ± 1
o
C.
T
g1
- Temperatura de transição vítrea após a primeira etapa de aquecimento.
T
g 2
- Temperatura de transição vítrea após a segunda etapa de aquecimento.
Fármacos cristalinos, como o acetato de dexametasona, podem se converter
para forma amorfa durante o processo de liofilização (CLAS et al., 1999). O
aquecimento durante a análise de DSC pode promover a recristalização do fármaco,
o que é observado como uma transição exotérmica. As curvas de DSC do acetato de
dexametasona (Figura 10) mostram que essa substância, quando liofilizada,
cristaliza com maior dificuldade durante a varredura de resfriamento, o que provoca
o aparecimento de um pico de recristalização, exotérmico, durante o aquecimento,
na temperatura de 147°C. Esse fato ocorre, provavelmente, devido a presença de
uma estrutura mais desorganizada, que não permite que o fármaco se cristalize
totalmente durante a queda de temperatura (CLAS et al., 1999). Foi observada,
ainda, uma transição vítrea para o acetato de dexametasona liofilizado na
83
temperatura de 110°C devido ao fenômeno de cristalização durante a análise, já que
parte do fármaco se encontrava na fase amorfa. A T
g
é observada por DSC como
um aumento no fluxo de calor, ou capacidade calorífica, da amostra durante o
aquecimento, o qual é visto como uma modificação na linha de base. A T
g
pode ser
importante para definir a possibilidade de compostos amorfos de cristalizarem em
determinadas temperaturas (HATAKEYAMA; QUINN, 1994). Como estas amostras
se recristalizam e apresentam uma T
g
durante o aquecimento, elas provavelmente
apresentam algum conteúdo amorfo. Um pico de fusão na temperatura de 223°C
também foi observado para o acetato de dexametasona. Já para o fármaco não-
liofilizado não se observou uma T
g
, pois este, provavelmente, cristaliza-se
fortemente durante a etapa de resfriamento.
Figura 10 - Termogramas de DSC. (A) curvas do acetato de dexametasona: (I)
antes da liofilização, (II) liofilizado; (B) curvas do PLGA 50:50: (I), (II) liofilizado, (III) +
acetato de dexametasona; (C) curvas do PLA: (I) antes da liofilização, (II) liofilizado,
(III) + acetato de dexametasona.
84
Os valores de entalpia de fusão encontrados para o fármaco antes da
liofilização são um pouco superiores que o do fármaco liofilizado (Tabela 8).
As curvas do polímero e do fármaco mostram que, dentro da faixa de
temperatura de 100-120°C, não existe nenhum sinal de degradação do fármaco ou
do polímero (Figura 10). Esse resultado é muito importante, pois a faixa de
temperatura usada para o preparo dos implantes pelo método de moldagem a
quente não altera a estabilidade do fármaco e/ou do polímero.
Tabela 8 - Parâmetros determinados por DSC para o acetato de dexametasona em
diferentes condições: antes de liofilização, liofilizado e misturado com os polímeros
na concentração de 27,7% p/p.
Condições do acetato
de dexametasona
∆
∆∆
∆H
f
(J/g)
Cristalinidade
relativa (%)*
T
f
(°
°°
°C)
Antes de liofilização 94,7 ND 227
Liofilizado 84,3 100 223
+ PLGA 50:50 21,2 91 203
+ PLA 13,5 58 209
∆H
f
: entalpia de fusão.
* A cristalinidade relativa do acetato de dexametasona nas misturas foi calculada
fixando o ∆H
f
do fármaco liofilizado como correspondente a 100% de cristalização, e
considerando que todas as misturas contêm 27,7% p/p de acetato de
dexametasona.
T
f
(°C): temperatura de fusão (precisão de ± 1
o
C).
ND: não determinado.
Nas curvas de DSC do PLGA 50:50 (Figura 10B) e do PLA (Figura 10C) em
diferentes condições: antes de liofilização, liofilizado e misturado com 27,7% p/p de
acetato de dexametasona, observou-se que os polímeros são amorfos antes e após
o processo de liofilização, nos quais a T
g
foi determinada.
85
A Tabela 7 apresenta a T
g
dos polímeros utilizados neste trabalho após a
segunda etapa de aquecimento em diferentes condições: antes de liofilização,
liofilizado e misturado com 27,7% p/p de acetato de dexametasona. Os valores de T
g
encontrados para os polímeros (antes de liofilização e liofilizados) foram os mesmos,
não sendo observada alteração da fase amorfa desses polímeros quando
submetidos ao processo de liofilização, do ponto de vista de sua transição de fase.
Na Tabela 8, pode ser observada a temperatura de fusão e a cristalinidade
relativa do acetato de dexametasona após a segunda etapa de aquecimento, nas
diferentes condições: antes de liofilização, liofilizado, misturado com 72,3% p/p de
PLGA 50:50 e misturado com 72,3% p/p de PLA.
Quando o PLGA 50:50 foi misturado com 27,7% p/p de acetato de
dexametasona, observou-se que, como houve uma pequena redução na
cristalinidade relativa do fármaco, a temperatura de fusão do fármaco diminui, já que
o fenômeno de fusão está relacionado à cristalinidade da substância. Considerando-
se ainda que a T
g
não apresentou alteração significativa para essa mistura, ao se
observar a Tabela 7, pode-se sugerir que não há evidência de interação físico-
química relevante entre o fármaco e o polímero nessa mistura.
Os resultados de DSC obtidos para a mistura de PLA e do acetato de
dexametasona permitem propor a existência de interação físico-química entre essas
duas substâncias. Foi observado um desdobramento do pico de fusão, observado
como um “ombro” e que aparece em temperatura inferior à do pico de fusão (Figura
10). Uma redução no valor da cristalinidade relativa para apenas 58% em relação ao
acetato de dexametasona liofilizado foi encontrado e, conseqüentemente, a T
f
também diminuiu (Tabela 8), e apresentou um deslocamento do ponto de fusão. Os
resultados apresentados na Tabela 7 mostram que também ocorreu uma alteração
86
na T
g
do PLA na mistura. Esta provável interação não necessariamente influencia a
liberação do fármaco a partir dos implantes desenvolvidos com este polímero.
Finalmente, as análises realizadas nos implantes finais mostraram que os
métodos de preparo, principalmente o método de moldagem a quente, não
promoveram efeitos negativos na formulação ao se considerar a estabilidade do
fármaco e dos polímeros. A T
g
dos polímeros, a T
f
do acetato de dexametasona e o
∆H
f
do acetato de dexametasona não apresentaram alterações significativas após o
processo de preparo (Tabela 9). Os termogramas dos implantes finais foram
similares aos das misturas de pós antes do preparo.
Tabela 9 - Parâmetros determinados por DSC para os implantes finais preparados
com PLGA 50:50 ou PLA pelos métodos de moldagem a quente e compressão.
Implantes
∆
∆∆
∆H
f
(J/g) T
g
(°
°°
°C) T
f
(°
°°
°C)
PLGA 50:50 (moldado) 25,7 47 205
PLGA 50:50 (comprimido)
20,9 48 202
PLA (moldado) 16,1 56 212
PLA (comprimido) 13,7 54 208
∆H
f
: entalpia de fusão do acetato de dexametasona.
T
g
: temperatura de transição vítrea dos polímeros (precisão de ± 1
o
C).
T
f
(°C): temperatura de fusão do acetato de dexametasona (precisão de ± 1
o
C).
Deve-se observar, no entanto, que a DSC não é uma técnica conclusiva no
que se refere à avaliação da interação entre polímero e fármaco. Para confirmar os
resultados obtidos outras técnicas devem ser associadas.
87
3.3 ESTUDO DA MORFOLOGIA DE SUPERFÍCIE DOS IMPLANTES
BIODEGRADÁVEIS INTRAVÍTREOS
A morfologia da superfície de sistemas poliméricos tem um papel importante
no processo de degradação e de liberação de fármacos. A presença de poros ou
canais na matriz pode permitir uma difusão do fármaco possivelmente não
controlada pela velocidade de degradação do polímero (DASH; CUDWORTH II,
1998).
As fotomicrografias dos implantes de PLGA preparados pelos métodos de
compressão e moldagem a quente estão apresentadas na Figura 11. Como as
fotomicrografias dos implantes de PLA foram similares às dos implantes de PLGA
estas não foram apresentadas.
As fotomicrografias ilustram que diferenças significativas foram observadas na
morfologia de superfície dos implantes preparados pelos dois métodos diferentes.
A superfície dos implantes preparados por compressão se apresentou
irregular, com presença de poros e canais, os quais podem ser observados nas
Figuras 11A e 11C. Os sistemas preparados por moldagem a quente apresentaram
uma superfície mais lisa com pouca evidência de poros e com aparência mais
homogênea que a dos preparados por compressão (Figuras 11B e 11D).
88
Figura 11 - Fotomicrografias dos implantes de PLGA
preparados pelos métodos de compressão em aumento de
300X (A) e de 1000X (C); e preparados pelo método de
moldagem a quente em aumento de 300X (B) e de 1000X (D).
Durante o método de moldagem, o calor empregado leva a uma orientação da
cadeia polimérica, aumentando o grau de cristalinidade e então reduzindo a
porosidade na superfície dos implantes (DASH; CUDWORTH II, 1998). Por outro
lado, a compressão no estado sólido do polímero pode levar a uma redução das
propriedades mecânicas finais do implante já que, neste caso, a orientação da
cadeia não ocorre.
Os poros e canais na matriz polimérica promoveriam um aumento da entrada
de água nos implantes preparados pelo método de compressão, o que pode,
conseqüentemente, acelerar o processo de degradação.
89
3.4 ESTUDO DE DEGRADAÇÃO IN VITRO
A entrada de água tem sido proposta como uma ferrramenta na regulação da
degradação de sistemas poliméricos. Sugere-se que a absorção de água é
acompanhada por clivagem das ligações éster e pela perda de massa (ROTHEN-
WEINHOLD et al., 1999). Neste estudo, o perfil de degradação foi medido pela
porcentagem de perda de massa dos sistemas.
A Figura 12 mostra o perfil de perda de massa dos implantes compostos de
PLGA 50:50 e PLA, preparados pelos métodos de moldagem a quente e
compressão.
PLGA 50:50 comprimido
PLGA 50:50 moldado
PLA comprimido
PLA moldado
% massa restante
Tempo (semanas)
PLGA 50:50 comprimido
PLGA 50:50 moldado
PLA comprimido
PLA moldado
% massa restante
Tempo (semanas)
Figura 12 – Alteração de massa representada pela porcentagem de massa restante
dos implantes de PLGA 50:50 e de PLA preparados por compressão e moldagem a
quente (Os valores são representados como média ± desvio padrão, n = 4).
Os perfis obtidos são típicos destes polímeros em que há um período inicial
no qual não ocorre perda de massa, seguido por uma fase de queda da massa. As
análises estatísticas utilizando o teste t não-pareado, empregando o programa
90
GraphPad Prism
, versão 3.00 (GraphPad Software Incorporated, 1994-1999)
mostraram que a degradação in vitro dos implantes preparados com o mesmo
polímero e por diferentes técnicas não foi significativamente diferente para P<0,05.
A Tabela 10 mostra o tempo de início de perda de massa, a constante de
velocidade de degradação de primeira ordem associada, e os coeficientes de
correlação para os implantes de PLGA 50:50 e PLA preparados por compressão e
moldagem a quente. Estes valores foram calculados utilizando o programa
GraphPad Prism
, versão 3.00 (GraphPad Software Incorporated, 1994-1999).
Tabela 10 - Constante de primeira ordem da velocidade de degradação, tempo de
início de perda de massa dos implantes e coeficientes de correlação para os
implantes de PLGA 50:50 e PLA preparados pelos métodos de compressão e
moldagem a quente (n = 4).
Implantes k
†
(semana
-1
) t
início
‡
(semanas) r
2§
PLGA 50:50 (moldados) 0,1772
ns
4-6 0,9703
PLGA 50:50 (comprimidos) 0,2303
ns
2-4 0,9871
PLA (moldados) 0,0032
ns
20-22 0,9078
PLA (comprimidos) 0,0184
ns
18-20 0,9199
†
Constante de primeira ordem da velocidade de perda de massa.
‡
Tempo de início de perda de massa.
§
Coeficiente de correlação.
ns: não significativamente diferente (P<0,05)
O período de latência anterior ao início da perda de massa foi de 2 e 18
semanas observado para os implantes comprimidos de PLGA 50:50 e de PLA,
respectivamente, comparado ao período de 4 e 20 semanas para os implantes
moldados de PLGA 50:50 e PLA, respectivamente. Os sistemas comprimidos, por se
91
apresentarem como matrizes mais porosas, facilitam a entrada de água e, portanto,
este fato contribui para sua degradação mais rápida quando comparado aos
sistemas moldados.
O tempo de início de perda de massa foi de 4 semanas para os implantes de
PLGA 50:50 e de 20 semanas para os implantes de PLA, ambos preparados pelo
método de compressão, comparado com 6 semanas para os implantes de PLGA
50:50 e de 22 semanas para os implantes de PLA, ambos preparados pelo método
de moldagem a quente.
Como os polímeros PLGA e PLA degradam por erosão, ambos implantes
preparados com estes polímeros apresentaram uma fase de latência independente
da técnica de preparo utilizada. A fase de latência inicial, típica da degradação de
implantes à base de poliésteres, tem sido freqüentemente explicada pela lenta
penetração de água nas matrizes hidrofóbicas. A segunda fase pode ser atribuída à
hidrólise da cadeia polimérica, a qual ocorre por quebra aleatória (WITT et al., 2000).
3.5 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VITRO
O perfil de liberação acumulada do acetato de dexametasona a partir dos
implantes preparados com PLGA 50:50 e PLA, pelos métodos de compressão e
moldagem a quente está representado na Figura 13.
92
! " ! " !
#
#
##
##
$%%&'()
PLGA 50:50 comprimido*
PLGA 50:50 moldado*
PLA comprimido**
PLA moldado**
Liberação acumulada do
acetato de dexametasona, %
Tempo (semanas)
! " ! " !
#
#
##
##
$%%&'()
PLGA 50:50 comprimido*
PLGA 50:50 moldado*
PLA comprimido**
PLA moldado**
Liberação acumulada do
acetato de dexametasona, %
Tempo (semanas)
Figura 13 - Liberação acumulada do acetato de dexametasona a partir dos
implantes de PLGA 50:50 e de PLA preparados por compressão e moldagem a
quente (Os valores são representados como média ± desvio padrão, n = 4. P<0,05).
Em sistemas matriciais o fármaco se encontra disperso no interior do material
polimérico e sua difusão lenta através do sistema promove uma liberação
prolongada (DASH; CUDWORTH II, 1998). A liberação do fármaco a partir de
sistemas monolíticos pode ocorrer por difusão, por degradação do polímero, ou por
uma combinação dos dois mecanismos (JAIN, 2000). Tem sido descrito que o
método de preparo de um sistema pode influenciar a velocidade de liberação do
fármaco (RAMCHANDANI et al., 1997).
Os perfis de liberação in vitro obtidos para os implantes preparados com os
dois diferentes polímeros mostram que o acetato de dexametasona foi liberado
lentamente. No início, provavelmente, o fármaco depositado na superfície e nos
canais aquosos da matriz foi liberado. Em seguida, um estágio de liberação lenta do
fármaco foi observado, e atribui-se à difusão pelos poros iniciais já presentes nas
matrizes e pelos novos canais formados durante o processo de degradação de
polímero.
93
Após 4 semanas, os sistemas preparados com PLGA 50:50 apresentaram
modificações na estrutura inicial e redução de força. Neste momento, os sistemas
desenvolvidos com este polímero mostraram um pico de liberação devido à difusão
do fármaco através do crescente número de poros e canais formados na matriz
durante sua degradação para o meio de liberação. Os sistemas à base de PLA não
apresentaram um pico de liberação já que este polímero apresenta uma menor
velocidade de degradação, o que permite que o fármaco seja liberado mais
lentamente.
A comparação entre os implantes preparados com o mesmo tipo de polímero
mas utilizando métodos diferentes mostrou que os implantes comprimidos
promoveram uma liberação mais rápida do acetato de dexametasona que os
implantes moldados. Isto pode ser atribuído à maior entrada de água nos sistemas
preparados por compressão, devido ao maior número de poros e canais observados
nas fotomicrografias obtidas (Figura 11). Este fato resulta no aumento da liberação
do fármaco, já que o acetato de dexametasona sai da matriz polimérica através dos
canais e poros para o meio de liberação. A presença de poros parece influenciar,
também, a velocidade de degradação dos sistemas. É importante notar que os
canais na matriz dos implantes se tornam, portanto, um pré-requisito para a
liberação do fármaco.
Análises estatísticas utilizando o teste t não-pareado, empregando o
programa GraphPad Prism
, versão 3.00 (GraphPad Software Incorporated, 1994-
1999) mostraram que a liberação in vitro do acetato de dexametasona a partir dos
implantes preparados com o mesmo polímero e por métodos diferentes foi
significativamente diferente para P<0,05.
94
Os implantes comprimidos e moldados apresentaram, respectivamente, uma
porcentagem de liberação máxima de 93% e 76% em 25 semanas.
4 CONCLUSÃO
Os perfis de liberação in vitro obtidos mostraram que os implantes
biodegradáveis são adequados para a liberação prolongada do acetato de
dexametasona. Conforme observado, o método de preparo influencia o processo de
degradação e a velocidade de liberação do fármaco. Um pico de liberação inicial
significativo, que poderia causar um efeito adverso ocular não foi observado em
nenhum dos implantes desenvolvidos.
95
96
1 INTRODUÇÃO
O tratamento de doenças do segmento posterior do olho é bastante limitado
pela dificuldade no transporte de doses efetivas dos fármacos para o corpo vítreo,
para a retina e para a coróide. Algumas doenças oculares crônicas necessitam de
tratamento prolongado e, considerando os tecidos posteriores do olho, a dificuldade
encontra-se no transporte do fármaco ativo para esta região. A via tópica não é
efetiva devido à limitada penetração intra-ocular. As injeções intravítreas e
subcapsulares precisam ser repetidas para manutenção do nível terapêutico do
fármaco e envolvem potenciais riscos de paralisia do músculo extra-ocular,
glaucoma, catarata, descolamento de retina e endoftalmite. A administração
sistêmica pode ser eficaz, mas apresenta muitos efeitos adversos, principalmente na
corticoterapia (HIDA et al., 1986; PEYMAN; GANIBAN, 1995; YASUKAWA et al.,
2004).
O desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos para atingir o
segmento posterior do olho é necessário e pode oferecer diferentes vantagens, as
quais incluem, o aumento da biodisponibilidade; a liberação constante e prolongada
do fármaco; a obtenção de concentrações locais elevadas sem a ocorrência de
efeitos adversos sistêmicos; a atuação específica em um tipo de tecido ou célula,
reduzindo a freqüência das injeções intra-oculares e, portanto, aumentando o
conforto do paciente e contornando os riscos das complicações relacionadas às
injeções intravítreas (BEHAR-COHEN, 2002).
Os implantes intravítreos não prejudicam a claridade do meio ocular e têm
sido estudados para o tratamento de várias doenças e também para aplicação após
97
cirurgia de catarata (SANBORN et al., 1992; YANG et al., 1998; TAN et al., 1999;
VELEZ; WHITCUP, 1999; JAFFE et al., 2000). Implantes intra-oculares preparados
com polímeros biodegradáveis podem liberar o fármaco diretamente no corpo vítreo
e seu desenvolvimento representa um avanço significativo pois estes sistemas são
capazes de manter concentrações adequadas do fármaco no local por longos
períodos (HASHIZOE et al., 1994; KIMURA et al., 1994; ZHOU et al., 1998; TAN et
al., 2001).
Nesta etapa do trabalho, os implantes biodegradáveis intravítreos moldados
de PLGA 50:50, contendo acetato de dexametasona e desenvolvidos na etapa
anterior (Parte II), foram avaliados in vivo. A segurança e a eficácia na liberação
prolongada do fármaco a partir destes implantes foram estudadas, visando sua
aplicação local na prevenção ou tratamento de doenças vitreorretinianas.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS
Acetato de dexametasona (MM = 434,5; solubilidade em água a 37°C = 0,1
mg/ml; Sigma-Aldrich Co, EUA), PLGA 50:50; v.i. = 0,45-0,60 dl/g (Resomer
RG
504, Boehringer Ingelheim, Alemanha). Os outros reagentes utilizados foram de grau
analítico.
98
2.2 PREPARO DOS IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS INTRAVÍTREOS
Os implantes foram preparados pelo método de moldagem a quente, utilizando
o polímero PLGA 50:50, de acordo com a técnica descrita na PARTE II, item 2.2 (p.
73).
2.3 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VIVO
2.3.1 Animais
Foram utilizados, nesta etapa do trabalho, sessenta coelhos machos, da raça
New Zealand, com idade média de 4 meses e pesando entre 2,0 e 2,5 Kg. Durante o
período do estudo, os animais foram mantidos no biotério da Faculdade de Medicina
Veterinária da Universidade de Rio Preto (São José do Rio Preto, SP). Os animais
foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura média de
25ºC, com ar condicionado e exaustor de ar, e luminosidade variando de acordo com
a luz solar. Não houve restrição de água e a alimentação utilizada foi ração animal
própria para a espécie.
Os animais foram divididos em dois grupos. No grupo 1, os sistemas contendo
acetato de dexametasona foram implantados cirurgicamente no corpo vítreo do olho
direito de 38 coelhos. E no grupo 2, o qual serviu como controle, 22 coelhos
receberam os implantes intravítreos sem o fármaco.
99
Os experimentos foram realizados de acordo com as normas da Association for
Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisa
em oftalmologia. Este estudo foi, ainda, aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (Belo Horizonte,
MG) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP, Ribeirão
Preto, SP).
2.3.2 Procedimentos Cirúrgicos
Esta etapa foi realizada com a colaboração dos Doutores Marcelo G. B. Rêgo
(Doutor em Oftalmologia pela Escola de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo), Rodrigo Jorge (Professor do Departamento de Oftalmologia da
FMRP da USP) e Rubens Camargo Siqueira (Centro Especializado de Retina e
Vítreo do Hospital de Olhos de Rio Preto, São José do Rio Preto, SP), colaboradores
deste trabalho, no Hospital Veterinário Dr. Halim Atique da Faculdade de Medicina
Veterinária da Universidade de Rio Preto (UNIRP), em São José do Rio Preto (SP),
onde os animais foram mantidos durante todo o período de estudo (Figura 14A).
Os coelhos foram anestesiados com injeção intramuscular de uma mistura de
cloridrato de cetamina (30 mg/kg, Ketamin
®
50 mg/ml, Cristália, Brasil) e cloridrato
de xilasina (4,0 mg/kg, Coopazine
2,0 g/100ml, Schering-Plough Coopers, Brasil),
com doses adicionais de cetamina caso necessário. No procedimento cirúrgico, uma
peritomia de 5 mm no quadrante temporal superior e uma esclerotomia a 2 mm do
limbo foram realizadas no olho direito, pela qual o implante foi inserido e posicionado
100
sem suturas (Figura 14). A esclera e a conjuntiva foram suturadas com fio absorvível
(Vicryl
®
7.0, Johnson & Johnson, Brazil) (Figura 14F).
Figura 14 - Cirurgia de colocação dos implantes. (A) Local de realização da cirurgia;
(B) Início da esclerotomia pela qual o implante foi inserido; (C) Término da
esclerotomia; (D) Limpeza do local para colocação do implante; (E) Colocação do
implante através da esclerotomia; (F) Sutura da esclerotomia após a colocação do
implante.
Quatro animais do grupo 1 e dois do grupo 2 foram sacrificados, por semana,
com dose letal de pentobarbital 100 mg/kg após 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 semanas de
implantação dos sistemas desenvolvidos. O olho direito dos animais foi
imediatamente enucleado; o corpo vítreo dos 32 animais do grupo 1 e dos 16
animais do grupo 2 foi completamente removido e imediatamente colocado em
freezer a -80°C até ser feita a análise da concentração do fármaco. Os sistemas
implantados também foram removidos dos olhos dos animais e utilizados em etapas
posteriores deste trabalho.
101
2.3.3 Análise da concentração de acetato de dexametasona no corpo vítreo
A quantidade de acetato de dexametasona liberada no corpo vítreo dos
animais que receberam os implantes desenvolvidos foi realizada pelo método de
ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay), utilizando um kit
comercial específico para dosagem de corticóides (Corticosteroid Elisa Kit, DM 2156,
Randox Laboratories Ltd., Inglaterra). O fotômetro Multiskan MS (Titertek, EUA) foi
empregado para leitura das placas. O corpo vítreo dos animais do grupo 2, retirado
semanalmente, também foi analisado e serviu como controle negativo.
Para a realização da análise, as amostras foram descongeladas a
temperatura ambiente e submetidas a análise sem tratamento prévio, de acordo com
as instruções do fabricante do kit. As amostras do corpo vítreo foram utilizadas em
duplicata após homogeneização e diluídas para se encontrarem dentro do intervalo
da curva de calibração (observar PARTE I, item 1.3, p. 65). A quantidade de acetato
de dexametasona liberada foi expressa como concentração equivalente, em ng/ml
de corpo vítreo.
Os dados obtidos da curva de calibração foram analisados por regressão
linear (GraphPad Prism
3.00. GraphPad Software Incorporated, EUA); o fator de
diluição foi multiplicado em todas as amostras para que se obtivesse as
concentrações reais do fármaco.
102
2.4 PORCENTAGEM DE ACETATO DE DEXAMETASONA RESTANTE NOS
IMPLANTES INTRAVÍTREOS
A quantidade de acetato de dexametasona restante nos implantes foi obtida
pela porcentagem do fármaco presente nos implantes versus a sua concentração
inicial.
Para esta análise, três implantes retirados dos olhos dos animais, por
semana, foram delicadamente lavados com água destilada e, em seguida,
dissolvidos em um volume fixo de acetonitrila. A concentração de acetato de
dexametasona foi medida por meio de cromatografia liquida de alta eficiência,
utilizando o método descrito na PARTE I (item 1.2, p. 62).
2.5 ESTUDO DE BIODEGRADAÇÃO IN VIVO
As modificações morfológicas na superfície dos implantes desenvolvidos
contendo acetato de dexametasona retirados dos olhos dos coelhos foram
analisadas por meio de microscopia eletrônica de varredura.
Os implantes retirados, selecionados aleatoriamente, antes de serem
visualizados ao microscópio, foram delicadamente lavados com água destilada,
secados com lenço de papel absorvente para retirar o excesso de água e mantidos
por 72 horas em dessecador a vácuo contendo sílica gel com indicador azul a
temperatura ambiente. Em seguida, eles foram montados em suportes porta-
amostras (stubs) de alumínio, inteiros, sem necessidade de cortes, na posição
horizontal, para melhor analisar o tamanho e também as características da
103
superfície. Os implantes foram aderidos aos suportes utilizando cola branca e,
imediatamente após, foram colocados novamente em dessecador por, no mínimo 24
horas antes do processo de metalização. Visando conferir condutividade à superfície
dos implantes a serem analisados, procedeu-se a uma metalização com ouro, sob
atmosfera de argônio, durante 1 minuto. Foi utilizado, nesta etapa, o acessório DSV
203 do equipamento BAF 300 da Balzers (EUA). Não foi possível estimar, por meio
do equipamento disponível, a espessura da camada de ouro formada.
As amostras foram observados no microscópio Zeiss DSM 950 (Carl Zeiss NTS
GmbH, Alemanha) do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG, na voltagem de 15 kV. A superfície dos implantes foi
visualizada nos aumentos de 20X e 1000X e as imagens foram transferidas para o
computador por meio de uma interface digital de transferência de imagens (DITI). As
imagens obtidas foram ajustadas utilizando os programas Adobe Photoshop versão
6.0 e Adobe Illustrator versão 9.01 (Adobe Systems Incorporated, 2000, EUA). Os
sistemas não implantados no olho dos animais também foram analisados para
comparação, utilizando o mesmo protocolo descrito anteriormente.
2.6 ESTUDO DA TOXICIDADE DOS IMPLANTES DESENVOLVIDOS
Esta etapa foi realizada em colaboração com os Doutores Marcelo G. B. Rego,
Rodrigo Jorge e Rubens Camargo Siqueira.
104
2.6.1 Exame clínico
Seis animais de cada grupo foram avaliados por dois examinadores externos.
A avaliação clínica incluiu exames de inspeção ocular e oftalmoscopia
binocular indireta (Topcon
®
, Japão) antes da cirurgia e semanalmente após a
implantação dos sistemas até a oitava semana. Os seguintes dados clínicos foram
pesquisados: quemose, hiperemia ou secreção conjuntival, edema de córnea,
hipópio, catarata, opacidade vítrea e descolamento de retina.
A pressão intra-ocular (PIO) de ambos os olhos de cada coelho foi medida
(TonoPen
®
, Mentor Corporation, EUA) antes da cirurgia e nas semanas 1, 4 e 8
subseqüentes. Antes das medidas de PIO, foi aplicada a solução tópica de cloridrato
de proximetacaína 0,5%p/v nos olhos dos animais.
2.6.2 Estudo eletrorretinográfico
A função retiniana foi avaliada em ambos os olhos dos mesmos 6 animais dos
grupos 1 e 2 utilizados no exame clínico (item 1.6.1) por meio de eletrorretinografia
(ERG) (LKC, modelo EPIC 2000, EUA). Os eletrorretinogramas foram registrados
antes da implantação e 8 semanas após a cirurgia para colocação dos implantes.
105
2.6.3 Estudo histopatológico
Seis coelhos de cada grupo (1 e 2), utilizados no estudo eletrorretinográfico
(item 1.6.2), foram sacrificados com dose letal de pentobarbital 100 mg/kg, 8
semanas após implantação dos sistemas para análise histopatológica. Os olhos
experimentais foram imediatamente enucleados e preparados para as microscopias
de luz e eletrônica.
Os segmentos posteriores dos olhos enucleados foram fixados por 5 horas a
4°C, em solução tampão fosfato de Sorensen (0,1M; pH 7,2) contendo formaldeído
4%. Após lavagem com o tampão, pequenos pedaços das amostras foram refixados
em glutaraldeído 2,5% no mesmo tampão acima, por 3 horas a 4°C. Em seguida, as
amostras foram fixadas com tetróxido de ósmio a 1% por 2 horas a 4°C. Estas
amostras foram, então, desidratadas por imersão em soluções de etanol de
concentrações crescentes, tratadas com óxido de propileno e incluídas em resina LX
112 (Ladd Research Ind., Burlington, VT, EUA). As seções semifinas (0,5µm) foram
coradas com azul de toluidina para análise por microscopia de luz, enquanto os
cortes ultrafinos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
após contraste com acetato de uranila e citrato de chumbo.
2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada em colaboração com o Dr. Antônio Luis
Rodrigues Junior do Departamento de Medicina Social da FMRP da USP.
106
No estudo de liberação in vivo, foi realizada uma análise estatística descritiva
e exploratória, observando as médias aritméticas, os desvios-padrão e as medianas
dos valores encontrados em cada semana, considerando a liberação do fármaco ao
longo das 8 semanas. Os intervalos de confiança para as médias amostrais em cada
semana também foram calculados. O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis foi
utilizado para comparar as concentrações intravítreas do acetato de dexametasona
no corpo vítreo dos animais do grupo 1 em todas as semanas do estudo.
O mesmo teste anterior foi empregado para avaliar a PIO antes e após 1, 4 e
8 semanas de implantação em cada grupo e também para comparar a diferença de
pressão entre os grupos 1 e 2.
Para a comparação das amplitudes das onda A e B no ERG antes e 8 semanas
após implantação dos sistemas nos animais do grupo 1, foi usado o teste não-
paramétrico de Wilcoxon.
Para todos os testes, o nível de significância foi estabelecido como α=0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VIVO
A concentração de acetato de dexametasona no corpo vítreo dos coelhos do
grupo 1 durante o período de 8 semanas do estudo está representada na Figura 15.
107
Figura 15 - Concentrações de acetato de dexametasona intravítrea
liberada a partir dos implantes ao longo das 8 semanas do estudo.
Os valores são representados como média ± desvio padrão (n = 4).
A Figura 16 apresenta os valores correspondentes às médias aritméticas e
medianas, das concentrações intravítreas de dexametasona observadas, em cada
uma das semanas de avaliação.
Figura 16 - Freqüência de distribuição da concentração de
acetato de dexametasona intravítrea, de acordo com a média
aritmética ( ) e a mediana ( ), por semana (n=4).
Tempo (semanas)
Concentração de
acetato de dexametasona (ng/ml)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 3 4 5 6 7 8
Semanas
Concentração de acetato de
dexametasona, ng/ml
108
A Figura 17 representa o intervalo de confiança (=5%), para as médias
amostrais, revelando a variabilidade experimental.
Figura 17 - Intervalos de confiança (95%) para as medias
amostrais da concentração intravítrea de acetato de
dexametasona durante o período do estudo. As médias
correspondentes a letras diferentes representam diferença
estatística em α=5% (n=4).
Os valores encontrados são consistentes com o perfil de liberação trifásico:
um pequeno pico, um segundo estágio provocado pela difusão do fármaco antes do
início da erosão polimérica, e um pico final causado pela desintegração da matriz
polimérica (FIALHO; SILVA-CUNHA, 2005). Os níveis do acetato de dexametasona
começaram a reduzir a partir da sétima semana. Nos animais do grupo 2, nos quais
foi colocado o implante sem o fármaco, não foi detectada a presença de acetato de
dexametasona no corpo vítreo.
O perfil de liberação in vitro obtido a partir destes implantes, previamente
descrito na parte II deste trabalho, foi similar ao encontrado no estudo in vivo.
Inicialmente, um estágio de liberação lenta do fármaco foi observado, e pode ser
atribuído à sua difusão através dos poros inicais presentes nas matrizes poliméricas
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 3 4 5 6 7 8
Semanas
Concentração de acetato de
dexametasona, ng/ml
a
b
b
c
d
e
e
e
109
e dos novos canais formados durante o processo de degradação. Um pico de
liberação observado após 4 semanas em ambos os estudos, in vitro e in vivo, deve-
se, provavelmente, à difusão do fármaco pelo crescente número de poros e canais
formados na matriz durante a degradação do polímero, os quais permitem uma
saída mais rápida do fármaco para o meio. O implante biodegradável desenvolvido
apresentou uma liberação do acetato de dexametasona, in vitro, por 25 semanas. É
possível prever que a liberação do fármaco, in vivo, ocorreria em um intervalo de
tempo mais reduzido quando comparado aos resultados observados in vitro e este
fato pode ser atribuído ao meio em que se encontravam os implantes no corpo
vítreo, que não representa exatamente o mesmo meio onde eles se localizavam no
estudo in vitro. As condições do meio que circunda o implante influenciam
fortemente no perfil de liberação. O transporte do fármaco no corpo vítreo e o seu
perfil de eliminação no olho, não encontrados no meio in vitro mas que aparecem no
meio in vivo, contribuem para uma liberação mais rápida do fármaco. A natureza do
meio e dos tecidos adjacentes presentes criam gradientes de concentração dentro
do corpo vítreo que devem ser considerados ao se desenvolver sistemas de
liberação (FRIEDRICH et al., 1997; TOJO; ISOWAKI, 2001).
Concentrações efetivas de dexametasona para a supressão de processos
inflamatórios encontram-se na faixa de 150 a 4000 ng/mL (CULPEPPER; LEE, 1985;
LEWIS et al., 1986; GRABSTEIN et al., 1986; KNUDSEN et al., 1987; LEE et al.,
1988). Concentrações equivalentes e mesmo superiores, que não causariam
reações tóxicas, foram encontradas durante todo o período do estudo.
Para doenças dos segmento posterior do olho, principalmente para as uveítis,
implantes não-biodegradáveis desenvolvidos por Jaffe e colaboradores
apresentaram uma liberação prolongada de corticóides por vários anos (JAFFE et
110
al., 2000). Este sistema, no entanto, precisa ser removido após completa liberação
do fármaco, ou, caso não seja, permanece no local até que seja realizada uma
cirurgia para sua retirada. A vantagem do sistema biodegradável desenvolvido é que
ele não necessita remoção subseqüente.
3.2 PORCENTAGEM DE ACETATO DE DEXAMETASONA RESTANTE NOS
IMPLANTES INTRAVÍTREOS
A porcentagem de acetato de dexametasona ainda presente nos sistemas
implantados no corpo vítreo dos coelhos, na sexta semana, foi de aproximadamente
40%, ou melhor, os implantes liberaram, in vivo, aproximadamente 60% do fármaco
em 6 semanas (Figura 18).
Figura 18 - Porcentagem de acetato de dexametasona
restante nos sistemas desenvolvidos após implantação
intravítrea. Os dados são representados como a média ± o
desvio padrão (n = 3).
Acetato de dexametasona
restante (%)
Tempo (semanas)
111
Após seis semanas não foi possível avaliar a quantidade de fármaco restante
nos implantes pois os sistemas se apresentavam bastante degradados e, portanto,
nao era possível removê-los dos olhos enucleados.
3.3 ESTUDO DE BIODEGRADAÇÃO IN VIVO
As Figuras 19 e 20 representam, respectivamente, fotomicrografias dos
implantes biodegradáveis intravítreos contendo acetato de dexametasona antes e
após implantação nos olhos dos coelhos.
Figura 19 - Fotomicrografias dos implantes
biodegradáveis intravítreos antes da implantação. (A)
aumento de 20X e (B) aumento de 1000X.
112
Figura 20 - Fotomicrografias dos implantes biodegradáveis
intravítreos após 2 a 5 semanas de implantação. (A,B) 2
semanas; aumentos de 20X e 1000X; (C,D) 3 semanas;
aumentos de 20X e1000X; (E,F) 4 semanas; aumentos de
25X e 1000X; (G,H) 5 semanas; aumentos de 25X e 500X.
113
Nas fotomicrografias obtidas podem ser observadas modificações na superfície
e na forma dos sistemas desenvolvidos durante a biodegradação no olho. Após 5
semanas, não foi possível estudar a superfície dos implantes pois eles se
encontravam muito frágeis e não foram capazes de suportar o feixe de elétrons
utilizado no procedimento de visualização das imagens.
A morfologia de superfície de sistemas poliméricos apresenta um papel
importante na degradação do sistema e na liberação do fármaco (DASH;
CUDWORTH, 1998). Os poros e canais nas matrizes permitem a difusão do fármaco
possivelmente não dependente da degradação polimérica. As matrizes de PLGA
degradam por hidrólise das ligações éster formando seus monômeros constituintes,
os ácidos lático e glicólico (PARK, 1995). Alguns estudos mostraram que a
degradação destes polímeros ocorre mais rapidamente no centro do sistema que na
sua superfície (KUNOU et al., 1995, 2000b). Desta forma, canais aquosos são
formados durante o processo de degradação, conectando a superfície ao interior do
implante e permitindo a difusão do fármaco através dos canais da matriz polimérica
(KUNOU et al., 2000a). Os poros e canais nas matrizes podem promover um
aumento da entrada de água nos implantes e este fato pode, conseqüentemente,
acelerar o processo de degradação. A superfície dos implantes contendo acetato de
dexametasona se apresentou inicialmente lisa, sem evidência de poros ou canais.
Uma semana após implantação os poros começaram a surgir e foram aumentando
ao longo do estudo. Os poros observados podem ser atribuídos à liberação do
fármaco ou à absorção de água pelo sistema.
O perfil de liberação observado (Figuras 13 e 15) pode ser relacionado a uma
liberação inicial do acetato de dexametasona depositado na superfície, seguido de
um estágio de liberação promovido pela dissolução do fármaco dentro do meio e/ou
114
pela sua difusão através dos canais e poros formados durante a degradação das
matrizes.
3.4 ESTUDO DA TOXICIDADE DOS IMPLANTES DESENVOLVIDOS
3.4.1 Exame clínico
Por meio de inspeção ocular e oftalmoscopia binocular indireta não se
observaram evidências de toxicidade do fármaco ou opacidade dos meios oculares
nos animais de ambos os grupos durante o período de 8 semanas do estudo.
Algumas complicações cirúrgicas foram encontradas nos olhos de dois animais do
grupo 1: um deles apresentou inflamação grave quatro dias após implantação do
sistema, sugerindo um diagnóstico de endoftalmite, e o outro animal apresentou
descolamento de retina após 3 semanas de implantação no local da esclerotomia.
Estes dois animais foram excluídos do estudo.
O implante permaneceu junto à parede ocular, no local correspondente à
esclerotomia, em todas as semanas do estudo (Figura 21), mostrando sinais de
degradação evidentes a partir da quinta semana.
115
Figura 21 - Foto mostrando o implante posicionado no
local implantado (seta) ao final da primeira semana.
Com relação à pressão intra-ocular, um animal do grupo 1 apresentou um
valor médio de pressão de 25,33 mmHg, representando um aumento de 10 mmHg
em relação ao valor medido antes da implantação. Nos outros animais de ambos os
grupos, nos quais a PIO foi medida, não houve aumento da pressão, a qual se
encontrou abaixo de 20 mmHg na oitava semana. Não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa na PIO quando os valores basais (medidos antes da
implantação) foram comparados aos obtidos na primeira, quarta e oitava semanas
após colocação dos implantes, no grupo 1 (P=0,0544) e no grupo 2 (P=0,2500)
(Figura 22). As análises estatísticas da PIO entre os dois grupos também não
mostraram diferenças significativas antes (P=0,4705) ou após 1 semana (P=0,8852),
4 semanas (P=0,3123) e 8 semanas (P=0,5637) da implantação.
116
Figura 22 - Médias (A) e medianas (B) dos valores de pressão intra-ocular dos
olhos experimentais, do grupo 1 ( )e do grupo 2 ( ) , antes e após 1, 4 e 8
semanas de implantação dos sistemas.
3.4.2 Estudo eletrorretinográfico
O eletrorretinograma realizado não mostrou sinais de toxicidade retiniana em
nenhum dos 6 animais do grupo 1 que pudessem ter sido causados pelo fármaco ou
pela presença do sistema polimérico no corpo vítreo.
Na oitava semana, as amplitudes de onda A (P=1,000) e B (P=0,5637) não
apresentaram diferenças significativas dos valores medidos antes da implantação
dos sistemas biodegradáveis (Figura 23).
0
5
10
15
20
pré 1 4 8
Semanas
PIO, mmHg
0
5
10
15
20
pré 1 4 8
Semanas
PIO, mmHg
A B
117
Figura 23 – Média (A) e mediana (B) das amplitudes das ondas A ( ) e B ( )
nos animais do grupo 1 antes e após implantação dos sistemas desenvolvidos.
3.4.3 Estudo histopatológico
O estudo histopatológico dos olhos analisados não mostrou sinais de toxicidade
retiniana ou infiltração de células inflamatórias (Figuras 24 e 25).
Não foram observadas anormalidades estruturais na oitava semana seguinte à
implantação dos sistemas após análise por microscopia de luz e por microscopia
eletrônica de transmissão. A anatomia normal da retina foi preservada nos olhos dos
animais.
0
50
100
150
200
0 8
Tempo (semanas)
Amplitude,
µ
V
0
0
50
100
150
200
8
Tempo (sem
anas)
Amplitude,
µ
µ
µ
µ
V
(B)
(A)
118
Figura 24 - Corte semifino da retina de coelho do grupo 1 corado com toluidina-
azul. (A) Todos os estratos da retina são visualizados neste aumento. Com exceção
de alguns espaços nas porções mais internas da retina, nenhuma outra alteração
morfológica foi observada. O estrato de fotorreceptores com os cones e bastonetes
é visualizado na parte inferior da figura. Barra: 50 µm. (B) Maior aumento do estrato
dos fotorreceptores mostrado em A, sem alterações morfológicas. Bastonetes
(asterisco) e cones (seta) são facilmente visualizados. Barra: 10 µm. (C) Corte
semifino da retina de coelho do grupo 2. As mesmas características morfológicas
mostradas em A são observadas. Os espaços na região interna são indicados pela
seta maior enquanto a seta menor indica um cone. Barra: 20µm.
Figura 25 - Fotomicrografia eletrônica de transmissão
do estrato de fotorreceptores de coelho do grupo 1
mostrando bastonetes (B), cone (C) e o segmento
interno de um cone (SI) com mitocôndria, todos
mostrando características morfológicas normais.
Contraste com acetato de uranila e citrato de
chumbo. Barra: 1,0µm.
*
A
B
C
B
SI
C
119
O implante desenvolvido se mostrou biocompatível com o olho pois não foram
observadas reações tóxicas significativas na retina pelas análise de ERG e
histopatologia. No entanto, é importante considerar que, por se tratarem de espécies
diferentes, não é possível a extrapolação de nossos dados a partir de coelhos para
seres humanos. O período de realização do estudo limita as conclusões
relacionadas à indução de catarata e glaucoma pelo acetato de dexametasona.
Também é importante dizer que efeitos tóxicos potenciais podem diferir em olhos
normais e doentes, sendo que estes últimos podem responder com uma maior taxa
de inflamação e de elevação da pressão intra-ocular.
4 CONCLUSÃO
O implante biodegradável contendo acetato de dexametasona desenvolvido não
apresentou reações tóxicas significativas para a retina de coelhos normais e foi
capaz de liberar o fármaco no corpo vítreo por um período de 8 semanas,
mostrando-se, portanto, adequado para a aplicação intravítrea.
A desvantagem do emprego de procedimentos cirúrgicos para a implantação
dos sistemas pode ser compensada pela obtenção da liberação prolongada do
fármaco. Assim, o implante desenvolvido pode se tornar uma alternativa para o
tratamento de doenças retinianas que são normalmente tratadas por meio de
injeções repetidas intravítreas. Mais estudos, no entanto, ainda são necessários para
assegurar sua aplicação clínica.
120
))*
121
Este trabalho mostrou, em um primeiro momento, que os implantes
biodegradáveis são adequados para a liberação prolongada do acetato de
dexametasona in vitro. Observou-se, ainda, que o método de preparo dos implantes
biodegradáveis tem um papel importante na velocidade de degradação do sistema e
no perfil de liberação dos fármacos neles incorporados. Finalmente, utilizando a
técnica de DSC, mostrou-se que o método de preparo não altera as características
das substâncias utilizadas.
Em uma segunda etapa, implantes de PLGA 50:50 contendo acetato de
dexametasona e desenvolvidos pelo método de moldagem a quente foram avaliados
in vivo. Os resultados obtidos mostraram que o sistema desenvolvido foi capaz de
promover a liberação do fármaco para o interior do corpo vítreo de olhos de coelhos
durante um período de 8 semanas. Não foram evidenciados sinais de toxicidade
retiniana que pudesse ter sido causada pela presença do fármaco ou do PLGA no
corpo vítreo, após a realização de ERG e histopatologia. A eficácia terapêutica, in
vivo, do implante desenvolvido só pode ser confirmada após a realização de
pesquisas empregando-se modelos experimentais de inflamação ocular.
O implante desenvolvido pode, portanto, apresentar-se como uma nova e
promissora opção de tratamento para doenças do segmento posterior do olho que
exigem a manutenção de níveis terapêuticos de fármacos por longos períodos. A
alteração da composição do sistema pode ser realizada de acordo com cada caso a
ser tratado, no sentido de otimizar o perfil de liberação do fármaco a ser empregado
e o tratamento a ser realizado.
122
+,)*-.+)
123
ALL ABOUT VISION. In: Resources – Reference Materials. Anatomy of the eye.
Disponível em: <http://www.allaboutvision.com/resources/anatomy.htm>. Acesso em:
04 jul 2005.
AMBATI, J.; CANAKIS, C. S.; MILLER, J. W.; GRAGOUDAS, E. S.; EDWARDS, A.;
WEISSGOLD, D. J.; KIM, I.; DELORI, F. C.; ADAMIS, A. P. Diffusion of high
molecular weight compounds through sclera. Investigative ophthalmology and
visual science, Rockville, v. 41, n. 5, p. 1181-1185, apr. 2000.
AMBATI, J.; AMBATI, B. K.; YOO, S. H.; IANCHULEV, S.; ADAMIS, A. P. Age-
related macular degeneration: etiology, pathogenesis, and therapeutic strategies.
Survey of ophthalmology, Baltimore, v. 48, n. 3, p. 257–293, may./jun. 2003.
ATHANASIOU, K. A.; NIEDERAUER, G. G.; AGRAWAL, C. M. Sterilization, toxicity,
biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid
copolymers. Biomaterials, Guilford, v. 17, n.2, p. 93-102, jan. 1996.
ATLAS DE OFTALMOLOGIA BÁSICA vol. 1, 1997. CD-ROM. Alcon Laboratórios do
Brasil LTDA.
AVITABILE, T.; MARANO, F.; CASTIGLIONE, F.; BUCOLO, C.; CRO, M.;
AMBROSIO, L.; FERRAUTO, C.; REIBALDI, A. Biocompatibility and biodegradation
of intravitreal hyaluronan implants in rabbits. Biomaterials, Guilford, v. 22, n. 3, p.
195-200, feb. 2001.
BAEYENS, V.; KALTSATOS, V.; BOISRAMÉ, B.; VARESIO, E.; VEUTHEY, J. L.;
FATHI, M.; BALANT, L. P.; GEX-FABRY, M.; GURNY, R. Optimized release of
dexamethasone and gentamicin from a soluble ocular insert for the treatment of
external ophthalmic infections. Journal of controlled release, Amsterdam, v. 52, n.
1-2, p. 215-220, mar.1998.
BEHAR-COHEN, F.; PAREL, J. M.; POULIQUEN, Y.; THILLAYE-GOLDENBERG, B.;
GOUREAU, O.; HEYDOLPH, S.; COURTOIS, Y.; DE KOZAK, Y. Iontophoresis of
dexamethasone in the treatment of endotoxin-induced-uveitis in rats. Experimental
eye research, London, v. 65, n. 4, p. 533-545, oct. 1997.
BEHAR-COHEN, F.; SAVOLDELLI, M.; PAREL, J. M.; GOUREAU, O.; THILLAYE-
GOLDENBERG, B.; COURTOIS, Y.; POULIQUEN, Y.; DE KOZAK, Y. Reduction of
corneal edema in endotoxin-induced-uveitis after application of L-NAME as nitric
oxide synthase inhibitor in rats by iontophoresis. Investigative ophthalmology and
visual science, Rockville, v. 39, n. 6, p. 897-904, may. 1998.
124
BEHAR-COHEN, F.; EL AOUNI, A.; LE ROUIC, J. F.; PAREL, J. M.; RENARD, G.;
CHAUVAUD, D. Iontophorèse : revue de littérature et perspectives. Journal français
d'ophtalmologie, Paris, v. 24, n. 3, p. 319-327, mar. 2001.
BEHAR-COHEN, F. Systèmes de délivrance des médicaments pour le segment
antérieur : bases fondamentales et applications cliniques. Journal français
d'ophtalmologie, Paris, v. 25, n. 5, p. 537-544, mai. 2002.
BLANCO-PRIETO, M. J.; FATTAL, E.; PUISIEUX, F.; COUVREUR, P. The multiple
emulsion as a common step for the design of polymeric microparticles. In:
GROSSIORD, J. L.; SEILLER, M. Multiple emulsions: structure, properties and
applications. Paris: Éditions de Santé; 1998. p. 397-435.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE n
o
899, de 29 de
maio de 2003. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 02 jun.
2003.
CHENG, C. K.; BERGER, A. S.; PEARSON, P. A.; ASHTON, P.; JAFFE, G. J.
Intravitreal sustained-release dexamethasone device in the treatment of experimental
uveitis. Investigative ophthalmology and visual science, Rockville, v. 36, n.2, p.
442-453, feb. 1995.
CLAS, S. D.; DALTON, C. R.; HANCOCK, B. Differential scanning calorimetry:
applications in drug development. Pharmaceutical science and technology today,
New York, v. 2, n. 8, p. 311-320, aug. 1999.
CLELAND, J. L.; DUENAS, E. T.; PARK, A.; DAUGHERTY, A.; KAHN, J.;
KOWALSKI, J.; CUTHBERTSON, A. Development of poly-(D,L-lactide-co-glycolide)
microsphere formulations containing recombinant human vascular endothelial growth
factor to promote local angiogenesis. Journal of controlled release, Amsterdam, v.
72, n. 1-3, p. 13-24, may. 2001.
CULPEPPER, J. A.; LEE, F. Regulation of IL 3 expression by glucocorticoids in
cloned murine T lymphocytes. Journal of immunology, Baltimore, v. 135, n. 5, p.
3191-3197, nov. 1985.
CUNHA-VAZ, J. G. The blood-ocular barriers: past, present, and future. Documenta
ophthalmologica. Advances in ophthalmology, Dordrech, v. 93, n. 1-2, p. 149-
157, 1997.
125
CUNHA-VAZ, J. G. The blood-retinal barriers system. Basic concepts and clinical
evaluation. Experimental eye research, London, v. 78, n. 3, p. 715-721, mar. 2004.
D'AMICO, D. J.; GOLDBERG, M. F.; HUDSON, H.; JERDAN, J. A.; KRUEGER, D.
S.; LUNA, S. P.; ROBERTSON, S. M.; RUSSELL, S.; SINGERMAN, L.; SLAKTER, J.
S.; YANNUZZI, L.; ZILLIOX, P.; ANECORTAVE ACETATE CLINICAL STUDY
GROUP. Anecortave-acetate as monotherapy for treatment of subfoveal
neovascularization in age-related macular degeneration. Ophthalmology,
Rochester, v. 110, n. 12, p. 2372-2385, dec. 2003.
DASH, A. K.; CUDWORTH II, G. C. Therapeutic applications of implantable drug
delivery systems. Journal of pharmacological and toxicological methods, New
York, v. 40, n. 1, p. 1-12, jul. 1998.
DAVIES, N. M. Biopharmaceutical considerations in topical ocular drug delivery.
Clinical and experimental pharmacology and physiology, Melbourne, v. 27, n. 7,
p. 558-562, jul. 2000.
DING, S. Recent developments in ophthalmic drug delivery. Pharmaceutical
science and technology today, Oxford, v.1, n. 8, p. 328-335, nov. 1998.
DUKE-ELDER, S.; ASHTON, N. Action of cortisone on tissue reactions in
inflammation and repair with special reference to the eye. British journal of
ophthalmology, London, v. 35, n.11, p. 695-707, nov. 1951.
EVANS, J. R. Risk factors for age-related macular degeneration. Progress in retinal
and eye research, Oxford/New York, v. 20, n. 2, p. 227- 253, mar. 2001.
FIALHO, S. L.; REGO, M. G. B.; CARDILLO, J. A.; SIQUEIRA, R. C.; JORGE, R.;
SILVA-CUNHA, A. Implantes biodegradáveis destinados à administração intra-
ocular. Arquivos brasileiros de oftalmologia, São Paulo, v. 66, n.6, p.891-896,
dez. 2003.
FIALHO, S. L.; SILVA-CUNHA, A. Iontoforese no transporte ocular de drogas.
Arquivos brasileiros de oftalmologia, São Paulo, v. 67, n. 5, p. 839-845, out. 2004.
FIALHO, S. L.; SILVA-CUNHA, A. Manufacturing techniques of biodegradable
implants intended for intraocular application. Drug delivery, Orlando, v. 12, n. 2, p.
109-116, mar/apr. 2005.
126
FOSTER, C. S.; SAINS DE LA MAZA, M. The Sclera. New York: Springer-Verlag;
1994.
FOULDS, W. S.; MOSELEY, H.; EADIE, A.; MCNAUGHT, E. Vitreal, retinal, and
pigment epithelial contribution to the posterior blood-ocular barrier. Transactions of
the ophthalmological societies of the United Kingdom, London, v. 100, n. 3, p.
341-342, sep. 1980.
FRIEDRICH, S.; SAVILLE, B.; CHENG, Y. L. Drug distribution in the vitreous humor
of the human eye: the effects of aphakia and changes in retinal permeability and
vitreous diffusivity. Journal of ocular pharmacology and therapeutics, New York,
v. 13, n. 5, p. 445-459, oct. 1997.
FRUCHT-PERY, J.; MECHOULAM, H.; SIGANOS, C. S.; EVER-HADANI, P.;
SHAPIRO, M.; DOMB, A. Iontophoresis - gentamicin delivery into the rabbit cornea,
using a hydrogel delivery probe. Experimental eye research, London, v. 78, n. 3, p.
745-749, mar. 2004.
GAVINI, E.; CHETONI, P.; COSSU, M.; ALVAREZ, M. G.; SAETTONE, M. F.;
GIUNCHEDI, P. PLGA microspheres for the ocular delivery of a peptide drug,
vancomycin, using emulsification/spray-drying as the preparation method: in vitro/in
vivo studies. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics,
Stuttgart, v. 57, n. 2, p. 207-212, mar 2004.
GEROSKI, D. H.; EDELHAUSER, H. F. Transscleral drug delivery for posterior
segment disease. Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v. 52, n. 1, p. 37-
48, oct. 2001.
GOLDFIEN, A. Adrenocorticosteróides e antagonistas cortico-supra-renais. In:
KATZUNG, B.G. Farmacologia básica e clínica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1998. Cap. 38, p.450-461.
GORDON, D. M.; McLEAN, J. M.; KOTEEN, H.; BOUSQUET, F. P.; McCUSKER, W.
D.; BARAS, I.; WETZIG, P.; NORTON, E. W. The use of ACTH and cortisone in
ophthalmology. American journal of ophthalmology, Chicago, v. 34, n. 12, p.
1675-1686, dec. 1951.
GRABSTEIN, K.; DOWER, S.; GILLS, S.; URDAL, D.; LARSEN, A. Expression of
interleukin 2, interferon-, and the IL 2 receptor by human peripheral blood
lymphocytes. Journal of immunology, Baltimore, v. 136, n. 12, p. 4503–4508, jun.
1986.
127
GUPTA, O. P.; BOYNTON, J. R.; SABINI, P.; MARKOWITCH, W.; QUATELA, V. C.
Proptosis after retrobulbar corticosteroid injections. Ophthalmology, Rochester, v.
110, n. 2, p. 443-447, feb. 2003.
HASHIZOE, M.; OGURA, Y.; KIMURA, H.; MORITERA, T.; HONDA, Y.; KYO, M.;
HYON, S-H.; IKADA, Y. Scleral plug of biodegradable polymers for controlled drug
release in the vitreous. Archives of Ophthalmology, Chicago, v. 112, n. 10, p.
1380-1384, oct. 1994.
HATAKEYAMA, T.; QUINN, F. X. Applications of thermal analysis. In:
HATAKEYAMA, T.; QUINN, F. X. Thermal analysis – fundamentals and
applications to polymer science, London: John Willey & Sons Ltd, 1994. p. 65-105.
HIDA, T.; CHANDLER, D.; ARENA, J. E.; MACHEMER, R. Experimental and clinical
observations of the intraocular toxicity of commercial corticosteroid preparations.
American journal of ophthalmology, Chicago, v. 101, n. 2, p. 190-195, feb. 1986.
ICHIKAWA, K.; TAKEUCHI, Y.; YONEZAWA, S.; HIKITA, T.; KUROHANE, K.;
NAMBA, Y.; OKU, N. Antiangiogenic photodynamic therapy (PDT) using Visudyne
causes effective suppression of tumor growth. Cancer letters, Amsterdam, v. 205, n.
1, p. 39-48, mar. 2004.
JAFFE, G. J.; BEN-NUN, J.; GUO, H.; DUNN, J. P.; ASHTON, P. Fluocinolone
acetonide sustained drug delivery device to treat severe uveitis. Ophthalmology.
Rochester, v. 107, n. 11, p. 2024-2033, nov. 2000.
JAIN, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly
(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials, Guilford, v. 21, n. 23, p. 2475-
2490, dec. 2000.
JAIN, R.; SHAH, N. H.; MALICK, A. W.; RHODES, C. T. Controlled drug delivery by
biodegradable poly (ester) devices: different preparative approaches. Drug
development and industrial pharmacy, New York, v. 24, n. 8, p. 703-727, aug.
1998.
JÄRVINEN, K.; JÄRVINEN, T.; URTTI A. Ocular absorption following topical delivery.
Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v.16, n. 1, p. 3-19, aug. 1995.
JONAS, J. B.; KREISSIG, I.; DEGENRING, R. Intravitreal triamcinolone acetonide for
treatment of intraocular proliferative, exudative, and neovascular diseases. Progress
in retinal and eye research, Oxford/ New York, v. 24, n. 5, p. 587-611, sep. 2005.
128
KANSKI, J. J. Uveitis. In: KANSKI, J. J. Clinical ophthalmology: a systematic
approach. 3. ed. Oxford: Butterworth-Heinemann international editions, 1994. Cap.
6, p. 151-200.
KAWAKAMI, S.; HARADA, A.; SAKANAKA, K.; NISHIDA, K.; NAKAMURA, J.;
SAKAEDA, T.; ICHIKAWA, N.; NAKASHIMA, M.; SASAKI, H. In vivo gene
transfection via intravitreal injection of cationic liposome/plasmid DNA complexes in
rabbits. International journal of pharmaceutics, Amsterdam, v. 278, n. 2, p. 255-
262, jul. 2004.
KIMURA, H.; OGURA, Y. Biodegradable polymers for ocular drug delivery.
Ophthalmologica, Basel, v. 215, n. 3, p. 143-155, may./jun. 2001.
KIMURA, H.; OGURA, Y.; HASHIZOE, M.; NISHIWAKI, H.; HONDA, Y.; IKADA, Y. A
new vitreal drug delivery system using an implantable biodegradable polymeric
device. Investigative ophthalmology and visual science, Rockville, v. 35, n. 6, p.
2815-2819, may. 1994.
KNUDSEN, P. J.; DINARELLO, C. A.; STROM, T. B. Glucocorticoids inhibit
transcriptional and post-transcriptional expression of interleukin 1 in U937 cells.
Journal of immunology, Baltimore, v. 139, n. 12, p. 4129–4134, dec. 1987.
KRESLOFF, M. S.; CASTELLARIN, A. A.; ZARBIN, M. A. Endophthalmitis. Survey
of ophthalmology, Baltimore, v. 43, n. 3, p. 193-224, nov./dec. 1998.
KUNOU, N.; OGURA, Y.; HASHIZOE, M.; HONDA, Y.; HYON, S. H.; IKADA, Y.
Controlled intraocular delivery of ganciclovir with use of biodegradable scleral implant
in rabbits. Journal of controlled release, Amsterdam, v. 37, n. 1-2, p. 143-150, nov.
1995.
KUNOU, N.; OGURA, Y.; YASUKAWA, T.; KIMURA, H.; MIYAMOTO, H.; HONDA,
Y.; IKADA, Y. Long-term sustained release of ganciclovir from biodegradable scleral
implant for the treatment of cytomegalovirus retinitis. Journal of controlled release,
Amsterdam, v. 68, n. 2, p. 263–271, aug. 2000a.
KUNOU, N.; OGURA, Y.; HONDA, Y.; HYON, S. H.; IKADA, Y. Biodegradable scleral
implant for controlled intraocular delivery of betamethasone phosphate. Journal of
biomedical materials research, Hoboken, v. 51, n. 4, p. 635-641, sep. 2000b.
LANG, G. E.; LANG, G. K. Rétine. In: LANG, G. K. Atlas de poche en couleurs:
Ophtalmologie. Paris: Éditions Maloine, 2002. Cap. 12, p. 299-357.
129
LAW, L.; HUANG, K. J.; CHIANG, C. H. Acyclovir-containing liposomes for potential
ocular delivery: Corneal penetration and absorption. Journal of controlled release,
Amsterdam, v. 63, n. 1-2, p. 135-140S, jan. 2000.
LEE, P.; WANG, C. C.; ADAMIS, A. P. Ocular neovascularization. An epidemiological
review. Survey of ophthalmology, Baltimore, v. 43, n. 3, p. 245-269, nov./dec.
1998a.
LEE, S. W.; TSOU, A. P.; CHAN, H.; THOMAS, J.; PETRIE, K.; EUGUI, E. M.;
ALLISON, A. C. Glucocorticoids selectively inhibit the transcription of the interleukin 1
gene and decrease the stability of interleukin 1 mRNA. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.
85, n. 4, p. 1204-1208, feb. 1988b.
LEIBOWITZ, H. M.; KUPFERMAN, A. Anti-inflammatory medications. International
ophthalmology clinics, Boston, v. 20, n. 3, p. 117-134.1980.
LEOPOLD, I. H. Nonsteroidal and steroidal anti-inflamatory agents. In: SEARS, M. L.;
TARKKANEN, A. Surgical pharmacology of the eye. New York: Raven Press,
1958. p.83-133.
LEWIS, D. H. Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymers.
In: CHASIN, M.; LANGER, R. Biodegradable polymers as drug delivery systems.
New York: Marcel Dekker, 1990. p. 01-41.
LEWIS, G. D.; CAMPBELL, W. B.; JOHNSON, A. R. Inhibition of prostaglandin
synthesis by glucocorticoids in human endothelial cells. Endocrinology, Springfield,
v. 119, n. 1, p. 62–69, jul. 1986.
LIOTET, S. Anatomie et physiologie de l’oeil et de ses annexes. In: OOTEGHEM, M.
V. Préparations ophtalmiques. Paris: Technique & Documentation – Lavoisier,
1995, Cap. 2, p. 7-57.
MCGHEE, C. N. J.; DEAN, S.; DANESH-MEYER, H. Locally administered ocular
corticosteroids: benefits and risks. Drug safety: an international journal of medical
toxicology and drug experience, Auckland, v. 25, n. 1, p. 33-55, 2002.
MEISNER, D.; MEZEI, M. Liposome ocular delivery systems. Advanced drug
delivery reviews, Amsterdam, v. 16, n. 1, p. 75-93, aug. 1995.
130
MERKLI, A.; TABATABAY, C.; GURNY, R.; HELLER, J. Biodegradable polymers for
the controlled release of ocular drugs. Progress in polymer science, Darmstadt, v.
23, n. 3, p. 563-580, 1998.
MONTI, D.; SACCOMANI, L.; CHETONI, P.; BURGALASSI, S.; SAETTONE, M.F.
Effect of iontophoresis on transcorneal permeation ‘in vitro’ of two b-blocking agents,
and on corneal hydration. International journal of pharmaceutics, Amsterdam, v.
250, n. 2, p. 423-429, jan. 2003.
NATIONAL EYE INSTITUTE. Statistics and data. Disponível em:
<http://www.nei.nih.gov/eyedata/>. Acesso em: 04 jul 2005.
NOVARTIS Pharmaceuticals Corp. Full prescribing Information for Visudyne.
Disponível em: <http://www.pharma.us.novartis.com/product/pi/pdf/visudyne.pdf>.
Acesso em: 04 jul 2005.
OGURA, Y. Drug delivery to the posterior segments of the eye. Advanced drug
delivery reviews, Amsterdam, v. 52, n. 1, p. 1-3, oct. 2001.
OKABE, J.; KIMURA H.; KUNOU N.; OKABE K.; KATO A.; OGURA Y.
Biodegradable intrascleral implant for sustained intraocular delivery of
betamethasone phosphate. Investigative ophthalmology and visual science,
Rockville, v. 44, n. 2, p. 740-744, feb. 2003.
OLSEN, T. W.; EDELHAUSER, H. F.; LIM, J. I.; GEROSKI, D. H. Human scleral
permeability. Effects of age, cryotherapy, transescleral diode laser, and surgical
thinning. Investigative ophthalmology and visual science, Rockville, v. 36, n. 9, p.
1893-1903, aug. 1995.
OLSEN, T. W.; AABERG, S. Y.; GEROSKI, D. H.; EDELHAUSER, H. F. Human
sclera: thickness and surface area. American journal of ophthalmology, Chicago,
v. 125, n. 2, p. 237-241, feb. 1998.
ORÉFICE, F. Uveíte clínica e cirúrgica. Rio de Janeiro: Cultura Médica, 2000, v. 1,
593 p.
PARK, T. G. Degradation of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres: effect of
copolymer composition. Biomaterials, Guilford, v. 16, n. 15, p. 1123-1130, oct. 1995.
131
PASTOR, J. C. Proliferative vitreoretinopathy: an overview. Survey of
ophthalmology, Baltimore, v. 43, n. 1, p. 3-18, jul./aug. 1998.
PASTOR, J. C.; RÚA, E. R.; MARTÍN, F. Proliferative vitreoretinopathy: risk factors
and pathobiology. Progress in retinal and eye research, Oxford/ New York, v. 21,
n. 1, p. 127-144, jan. 2002.
PEYMAN, G. A.; GANIBAN, G. J. Delivery systems for intraocular routes. Advanced
drug delivery reviews, Amsterdam, v. 16, n. 1, p. 107-123, aug. 1995.
PEYMAN, G. A.; MOSHFEGHI, D. M. Intravitreal triamcinolone acetonide. Retina,
Philadelphia, v. 24, n. 3, p. 488-490, jun. 2004.
RAMCHANDANI, M.; PANKASKIE, M.; ROBINSON, D. The influence of the
manufacturing procedure on the degradation of poly(lactide-co-glycolide) 85:15 and
50:50 implants. Journal of controlled release, Amsterdam, v. 43, n. 2-3, p. 161-
173, jan. 1997.
RESNIKOFF, S.; PASCOLINI, D.; ETYA’ALE, D.; KOCUR, I.;
PARARAJASEGARAM, R.; POKHAREL, G.; MARIOTI, S. P. Global data on visual
impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization, Geneva,
v. 82, n. 11, p. 844-851, nov. 2004.
RIORDAN-EVA, P.; VAUGHAN, D. G. Eye. In: TIERNEY, L. M.; McPHEE, S. J.;
PAPADAKIS, M. A. Current – medical diagnosis & treatment. 40. ed. New York:
Lange Medical Books / Mc Graw-Hill, 2001. Cap. 7, p.185-216.
RITTENHOUSE, K. D.; POLLACK, G. M. Microdialysis and drug delivery to the eye.
Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v. 45, n. 2-3, p. 229-241, dec. 2000.
ROTHEN-WEINHOLD, A.; BESSEGHIR, K.; VUARIDEL, E.; SUBLET, E.; OUDRY,
N.; KUBEL, F.; GURNY, R. Injection-molding versus extrusion as manufacturing
technique for the preparation of biodegradable implants. European journal of
pharmaceutics and biopharmaceutics, Stuttgart, v. 48, n. 2, p. 113-121, sep. 1999.
RUBSAMEN, P. E.; DAVIS, P. A.; HERNANDEZ, E.; O’GRADY, G. E.; COUSINS, S.
W. Prevention of experimental proliferative vitreoretinopathy with a biodegradable
intravitreal implant for the sustained release of fluorouracil. Archives of
ophthalmology, Chicago, v. 112, n. 3, p. 407-413, mar. 1994.
132
SAKURAI, E.; NOZAKI, M.; OKABE, K.; KUNOU, N.; KIMURA, H.; OGURA Y.
Scleral plug of biodegradable polymers containing tacrolimus (FK506) for
experimental uveitis. Investigative ophthalmology and visual science, Rockville,
v. 44, n. 11, p. 4845-4852, nov. 2003.
SANBORN, G. E.; ANAND, R.; TORTI, R. E. Sustained-release ganciclovir therapy
for treatment of cytomegalovirus retinitis. Use of an intravitreal device. Archives of
ophthalmology, Chicago, v. 110, n. 2, p. 188-195, feb. 1992.
SARRAF, D.; LEE, D. A. The role of iontophoresis in ocular drug delivery. Journal of
ocular pharmacology, New York, v. 10, n. 1, p. 69-81, jan. 1994.
SCHIMMER, B. P.; PARKER, K. L. Hormônio adrenocorticotrófico, esteróides
adrenocorticais e seus análogos sintéticos, inibidores da síntese e das ações dos
hormônios adrenocorticorticais. In: HARDMAN, J. E.; LIMBIRD, L. E. Goodman &
Gilman as bases farmacológicas da terapêutica. 9. ed. São Paulo: McGraw Hill,
1996. Cap. 59, p.1082-1102.
SHERIF, Z.; PLEYER, U. Corticosteroids in ophthalmology: past-present-future.
Ophthalmologica, Basel, v. 216, n. 5, p. 305-315, oct. 2002.
SMITH, J. R.; GEORGE, R. K.; ROSENBAUM, J. T. Lower eyelid herniation of orbital
fat may complicate periocular corticosteroid injection. American journal of
ophthalmology, Chicago, v. 133, n. 6, p. 845-847, jun. 2002.
SNELL, R. S.; LEMP, M. A. The eyeball. In: SNELL, R. S.; LEMP, M. A. Clinical
anatomy of the eye. 2. ed. Oxford: Blackwell Science, 1998. Cap. 6, p. 132-213.
SPRAUL, C. W.; LANG, G. K. Corps vitré. In: LANG, G. K. Atlas de poche en
couleurs: Ophtalmologie. Paris: Éditions Maloine, 2002. Cap. 11, p. 279-298.
TAN, D. T. H.; CHEE, S.; LIM, L.; LIM, A. S. Randomized clinical trial of a new
dexamethasone delivery system (surodex) for treatment of postcataract surgery
inflammation. Ophthalmology, Rochester, v. 106, n. 2, p. 223-231, feb. 1999.
TAN, D. T.; CHEE, S. P.; LIM, L.; THENG, J.; VAN EDE, M. Randomized clinical trial
of Surodex steroid drug delivery system for cataract surgery: anterior versus posterior
placement of two Surodex in the eye. Ophthalmology, Amsterdam, v. 108, n. 12, p.
2172-2181, dec. 2001.
133
TEMPORINI,
E. R.; KARA-JOSÉ, N. A perda da visão - estratégias de prevenção.
Arquivos brasileiros de oftalmologia, São Paulo, v. 67, n. 4, p. 597-601, ago.
2004.
THENG, J. T.; SENG-EI, T.; ZHOU, L.; LAM, K. W.; CHEE, S. P.; TAN, D.
Pharmacokinetic and toxicity study of an intraocular cyclosporine dds in the anterior
segment of rabbit eyes. Investigative ophthalmology and visual science,
Rockville, v. 44, n. 11, p. 4895–4899, nov. 2003.
THE UNITED STATES PHARMACOPEIA 24 ed. – NF 19. (USP 24) Rockville: United
States Pharmacopeial Convention Inc., 2000. CD-ROM (Insight Publishing
Productivity).
THE WALL STREET TRANSCRIPT. In: Dain rauscher wessels healthcare & life
sciences special. CEO/COMPANY Interview - DONALD J. EATON - Oculex
Pharmaceuticals, Inc. Dec. 2000. Disponível em: <
http://www.twst.com/pdf/oculex.pdf#search='surodex%20approval'> Acesso em: 08
ago 2005.
TOJO, K.; ISOWAKI, A. Pharmacokinetic model for in vivo/in vitro correlation of
intravitreal drug delivery. Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v. 52, n. 1,
p. 17-24, oct. 2001.
TUO, J.; BOJANOWSKI, C. M.; CHAN, C. Genetic factors of age-related macular
degeneration. Progress in retinal and eye research, Oxford/ New York, v. 23, n. 2,
p. 229-249, mar. 2004.
URTTI, A.; SALMINEN, L. Minimizing systemic absorption of topically administered
ophthalmic drugs. Survey of ophthalmology, Baltimore, v. 37, n. 6, p. 435-456,
may./jun. 1993.
U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. In: FDA news. FDA approves new
drug treatment for age-related macular degeneration. Rockville, 20 dez. 2004.
Disponível em: <http://www.fda.gov/bbs/topics/news/2004/new01146.html>. Acesso
em: 04 jul 2005a.
U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. In: FDA news. Product approvals.
Disponível em: < http://www.fda.gov/opacom/7approvl.html>. Acesso em: 08 ago
2005b.
134
VELEZ, G.; WHITCUP, S. M. New developments in sustained release drug delivery
for the treatment of intraocular disease. British journal of ophthalmology, London,
v. 83, n. 11, p. 1225–1229, nov. 1999.
WADA, R.; HYON, S. H.; IKADA, Y. Lactic acid oligomer microspheres containing
hydrophilic drugs. Journal of pharmaceutical sciences, Washington, v. 79, n. 10, p.
919-924, oct. 1990.
WITMER, A. N.; VRENSEN, G. F.; VAN NOORDEN, C. J.; SCHLINGEMANN, R. O.
Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in
retinal and eye research, Oxford/ New York, v. 22, n. 1, p. 1-29, jan. 2003.
WITT, C.; MÄDER, K.; KISSEL, T. The degradation, swelling and erosion properties
of biodegradable implants prepared by extrusion or compression molding of
poly(lactide-co-glycolide) and ABA triblock copolymers. Biomaterials, Guilford, v. 21,
n. 9, p. 931-938, mai. 2000.
WOLFF’S, E. The eyeball. In: WOLFF’S, E. Anatomy of the eye and orbit. 6. ed.
London: H. K. Lewis & Co. Ltda, 1973. Cap. 2, p. 30-181.
YANG, C. S.; KHAWLY, J. A.; HAINSWORTH, D. P.; CHEN, S. N.; ASHTON, P.;
GUO, H.; JAFFE, G. J. An intravitreal sustained-release triamcinolone and 5-
fluorouracil codrug in the treatment of experimental proliferative vitreoretinopathy.
Archives of ophthalmology, Chicago, v. 116, n. 1, p. 69-77, jan. 1998.
YASUKAWA, T.; KIMURA, H.; TABATA, Y.; OGURA, Y. Biodegradable scleral plugs
for vitreoretinal drug delivery. Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v. 52,
n. 1, p. 25-36, oct. 2001.
YASUKAWA, T.; OGURA, Y.; TABATA, Y.; KIMURA, H.; WIEDEMANN, P.; HONDA
Y. Drug delivery systems for vitreoretinal diseases. Progress in retinal and eye
research, Oxford/ New York, v. 23, n. 3, p. 253-281, may. 2004.
ZHOU, T.; LEWIS, H.; FOSTER, R. E.; SCHWENDEMAN, S. P. Development of a
multiple-drug delivery implant for intraocular management of proliferative
vitreoretinopathy. Journal of controlled release, Amsterdam, v. 55, n. 2-3, p. 281-
295, nov. 1998.
ZIMMER, A.; KREUTER J. Microspheres and nanoparticles used in ocular delivery
systems. Advanced drug delivery reviews, Amsterdam, v. 16, n. 1, p. 61-73, aug.
1995.
135
/
136
ANEXO 01
Certificado de aprovação do trabalho pelo CETEA
137
ANEXO 02
Publicação no periódico Arquivos Brasileiros de Oftalmologia
138
139
140
141
142
143
144
ANEXO 03
Publicação no periódico Drug Delivery
145
146
147
148
149
150
151
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
