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i
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho
Bruno de Souza Gonçalves
DEGENERAÇÃO DE
FOTORRECEPTORES EM MODELO
MURINO DE RETINOSE
PIGMENTAR: PARTICIPAÇÃO DA
VIA DA ERK
Rio de Janeiro
2010
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ii
Bruno de Souza Gonçalves
DEGENERAÇÃO DE FOTORRECEPTORES EM
MODELO MURINO DE RETINOSE PIGMENTAR:
PARTICIPAÇÃO DA VIA DA ERK
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas (Biofísica),
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientador: Luciana Barreto Chiarini
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2010
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iii
Gonçalves, Bruno de Souza
Degeneração de fotorreceptores em modelo murino de retinose pigmentar:
participação da via da ERK / Bruno de Souza Gonçalves. – Rio de Janeiro:
UFRJ / IBCCF, 2010.
Orientadores: Luciana Barreto Chiarini.
Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.
Referências bibliográficas:
1.Retina 2.Retinose pigmentar 3.Fotorreceptores 4.Morte Celular
Programada 5.ERK. I. Chiarini, Luciana. II. Universidade Federal do Rio
de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, Biofísica. III.
iv
FOLHA DE APROVAÇÃO
DEGENERAÇÃO DE FOTORRECEPTORES EM MODELO MURINO DE
RETINOSE PIGMENTAR: PARTICIPAÇÃO DA VIA DA ERK
Bruno de Souza Gonçalves
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Rio de Janeiro, Maio de 2010.
_____________________________________________
Dr. Ricardo Augusto de Melo Reis
_____________________________________________
Dra. Ana Lúcia Marques Ventura
_____________________________________________
Dr. Roberto Paes de Carvalho
_____________________________________________
Dra. Luciana Barreto Chiarini
(ORIENTADORA)
_____________________________________________
Dra. Patrícia Franca Gardino
(REVISORA)
v
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurogênese, Programa
de Neurobiologia, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), sob orientação da professora Luciana Barreto
Chiarini, na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo Conselho de Apóio a
Pesquisa e Ensino Superior (CAPES) e pela Fundação Carlos Chagas Filho de
Apoio a Pesquisa no Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à minha família, por ter me apoiado em todos os
momentos, me permitindo sempre ir atrás de meus sonhos, independentemente
das tendências sociais, econômicas e da mídia. Agradeço por ter tido uma família
de mente e espírito iluminados a ponto de perceber que o mais importante para
seus filhos, além de educá-los para que se tornassem pessoas de bem, é fazer
com que eles sigam o caminho que lhes dá prazer e satisfação. Agradeço minha
família pela educação e liberdade que recebi, pois foi isto que me permitiu, desde
ainda muito jovem, dar um rumo à minha vida e perseguir as coisas cujas tenho
vocação para exercê-las. E aqui estou eu escrevendo uma dissertação de
mestrado, fruto de dois anos de um trabalho árduo, porém extremamente
prazeroso e gratificante.
Devo agradecer também à minha orientadora, Luciana, por ter apostado em
meu potencial como cientista, ao me escolher para ser seu aluno quando eu ainda
estava no terceiro período da graduação. Muito atenta a detalhes, dotada de uma
paciência quase infinita e de uma personalidade que sem dúvida teve efeito
sinérgico em meu desempenho.
Devo agradecer também a todo o grupo de alunos e professores do
Laboratório de Neurogênese. Trata-se de um grupo bastante peculiar de pessoas
muito cultas e inteligentes, que sempre levantam discussões interessantes a todo
momento, e que têm a capacidade de transformar um seminário de apresentação
de um artigo simples em uma mega discussão científica. Como somos fruto do
ambiente em que vivemos, e a epigenética está aí para nos mostrar, crescer como
um cientista em um ambiente como o Laboratório de Neurogênese é um privilégio.
Posso dizer que de todos os genes que me faziam ter vocação para ser um
cientista, este laboratório metilou os que eram ruins e desmetilou os que eram
bons...
São praticamente 5 anos de Laboratório de Neurogênese, portanto muitos
vínculos são formados, o que torna a tarefa de citar nomes aqui um tanto quanto
injusta. Porém, é natural que alguns laços mais fortes se estabeleçam, pelo critério
BBB já tão conhecido, o critério da afinidade. Bom, como já citei o nome da
vii
Luciana, então ela já está imune. Portanto citarei algumas pessoas, que tanto
quanto ela, estiveram presentes e foram de uma forma ou de outra relevantes
para o meu trabalho de mestrado e/ou minha formação como cientista:
Mona Lisa, pelos macetes de bancada e por ter sido a pessoa na qual
primeiramente me espelhei para desenvolver minha expertise metodológica
científica.
Daianne, por ter me dado a chance de transmitir um pouco de conhecimento e me
orgulhar disso depois.
Brian, dono de uma percepção e poder de análise foras do comum; agradeço pela
amizade e conversas descontraídas filosóficas, mas principalmente por me
emprestar suas havaianas.
Vinicius, por transmitir os conhecimentos de microscopia confocal e pelas partidas
de poker que me deixaram “rico”.
Rodrigo, pelas críticas, incentivos, conselhos e pelas críticas.
Mari, pelo alto astral contagioso e comentários sempre muito sagazes.
Tati, a simpatia em pessoa. E apesar de ser uma das quase-doutoras que mais
trabalham no lab. está sempre humilde e acessível a todos. Tati, duvido que exista
alguém no mundo que não goste de ti.
Rachel, que apesar de ser estressada e sem paciência, é impossível não ir com a
cara dela, pois seu senso de humor anula tudo. Ah, e obrigado pelas caronas!
viii
Sebastian, que preferiu fazer seu pós-doc em uma cidadezinha do interior mas
que enquanto esteve no lab. cativou a todos com seu imenso carisma e
inteligência. Um grande cara a se admirar.
Rafael Mariante, pós-doc do lab. pelo qual também nutro profunda admiração, por
sua competência e paixão pela ciência. E agradeço, em nome do lab, por sempre
repassar para a galera e-mails engraçados, com curiosidades científicas (ou não)
e piadas digitais que têm o poder de salvar o dia após um experimento frustrado.
Maithe, apesar de já tanto tempo distante, não esqueci você. Minha admiração por
ti, como cientista e pessoa, é eterna.
E ao sangue novo do lab., Átila, Maurício e cia.; é sempre bom conversar com
vocês e ver que a chama da ciência já brilha forte nos novos. Seria muita
pretensão minha dizer que me vejo na minha época de IC quando olho para
vocês, pois acredito que são alunos muitos melhores do que eu fui naquela época.
E para terminar, queria dizer que além das características que enumerei, as
pessoas citadas merecem meu respeito e admiração principalmente por fazerem
ou tentarem fazer de suas paixões os seus ofícios. Quando talento, dedicação e
paixão se unem, o resultado só pode ser o sucesso.
Dedico então esta dissertação ao time do Laboratório de Neurogênese, um
time de sucesso, que me formou em suas divisões de base.
ix
“Cada proteína funcional em nosso corpo é uma “imagem” complementar
de um sinal do ambiente. Se não houvesse um sinal para complementá-
las, elas não teriam função. Isto significa que cada proteína em nosso
organismo é um complemento físico-eletromagnético de algo no ambiente.
Como somos máquinas de proteína, por definição somos feitos à imagem
do ambiente, seja ele o chamado universo ou, como muitos preferem
chamá-lo, o próprio Deus.”
Bruce Lipton
x
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc: adenosina 5’monofosfato-cíclico
APAF-1: Apoptosis activating factor-1, fator ativador de apoptose-1
BSA: Bovine serum albumin, albumina de soro bovino
CTR: Controle
DAB: diaminobenzidina
ERK: Extracellular signal-regulated kinase, cinase regulada por sinal extracelular
GCL: Ganglion cell layer, camada de células ganglionares
GS: Glutamina Sintetase
INL: Inner nuclear layer, camada nuclear interna
IPL: Inner plexiform layer, camada plexiforme interna
JNK: c-Jun N-terminal kinase, cinase c-Jun N-terminal
MAPK: Mitogen activated protein kinase, proteína cinase ativada por mitógeno
MCP: Morte celular programada
NBL: Neuroblastic layer, camada neuroblástica
ONL: Outer nuclear layer, camada nuclear externa
OPL: Outer plexiform layer, camada plexiforme externa
PBS: Phosphate buffered saline, salina tamponada por fosfato
PM: Peso molecular
RNAm: RNA mensageiro
RPCs: Retina progenitors cells, células progenitoras da retina
TBS: Tris buffered saline, tampão tris-salina
TNF: Tumor necrosis factor, fator de necrose tumoral
TNFα: Tumor necrosis factor
α
, fator de necrose tumoral α
TUNEL:Terminal desoxinucleotídeo dUTP-biotin nick end-labeling
xi
RESUMO
A retinose pigmentar é caracterizada pela morte de fotorreceptores da retina, o
que causa cegueira. Portanto, estudar os mecanismos responsáveis pela morte
dos fotorreceptores retinianos é de extrema importância para o desenvolvimento
de estratégias terapêuticas. Nosso objetivo foi testar o papel da via da ERK na
degeneração de fotorreceptores de retinas de camundongos rd1 C3H-HeJ, um
modelo murino de retinose pigmentar. Trata-se de um animal homozigoto para a
mutação no gene que codifica a subunidade β da fosfodiesterase de GMPc
(Pdebrd1). Esta é uma das mutações mais comuns associadas à retinose
pigmentar autossômica recessiva em humanos. Esta mutação leva ao acúmulo do
segundo mensageiro GMPc no citoplasma que, de forma ainda não totalmente
elucidada, leva à morte dos fotorreceptores, aparentemente por apoptose.
Monitoramos a progressão da degeneração da camada de fotorreceptores in vitro
e in vivo através de medidas da espessura relativa da camada de fotorreceptores
e da detecção in situ de fotorreceptores com fragmentação de DNA pela técnica
de TUNEL. Para o controle dos experimentos com os animais mutantes rd1
utilizamos os camundongos selvagens C57-Bl6. Testamos in vitro o efeito do
inibidor de MEK, U0126, sobre a degeneração de fotorreceptores em explantes de
retina de camundongos C3H/HeJ e C57-Bl6. Observamos que sob nossas
condições experimentais a degeneração da camada de fotorreceptores dos
camundongos rd1 C3H/HeJ se inicia no décimo quinto dia pós-natal, progredindo
rapidamente durante os dias subseqüentes, de forma que por volta do vigésimo
dia somente uma única fileira de fotorreceptores é observada. Notamos um
aumento nos níveis da MAP cinase ERK fosforilada concomitante com o período
de degeneração da camada de fotorreceptores. Além disso, quando inibimos
farmacologicamente a ativação da ERK, conseguimos diminuir a degeneração de
fotorreceptores. Por imunofluorescência, verificamos a proteína ERK fosforilada
nas células da glia de Müller e microglia, mas não nos fotorreceptores. Notamos
também a presença de microglia ativada, identificada pela morfologia mediante
marcação para CD11b, em locais justapostos aos fotorreceptores positivos para
TUNEL nos primeiros dias de degeneração da ONL. Nossos experimentos
xii
mostraram que a via da ERK tem papel pró-apoptótico neste modelo de
degeneração de fotorreceptores, e que o conteúdo da forma fosforilada da ERK
encontra-se nas células da glia de Muller e microglia, não sendo visível nos
fotorreceptores. Estes resultados indicam que a ativação de ERK que ocorre nas
células de glia de Muller e/ou na microglia nas retinas de camundongos rd1 é
necessária para a degeneração de fotorreceptores. Concluindo, os dados nos
permitem sugerir que a Glia de Muller e/ou microglia induzem a degeneração de
fotorreceptores no camundongo rd1, modelo murino de retinose pigmentar.
xiii
ABSTRACT
Retinitis pigmentosa is characterized by the death of retinal photoreceptors, which
leads to blindness. Therefore, studying the mechanisms involved in this death is
important to the development of treatment strategies. Our goal was to test the role
of ERK pathway in the photoreceptors’ degeneration of the mutant mice rd1 C3H-
HeJ, a model of retinitis pigmentosa. This mouse has a mutation in the beta
subunit of the cGMP (Pdeb
rd1
). This is the most common mutation associated with
retinitis pigmentosa in humans. This mutation leads to the citoplasmic increase of
GMPc which, in a still unknown way, triggers the photoreceptors’ death, most likely
by apoptosis. We monitored the progression of this degeneration in vivo and in
vitro by measuring the relative thickness of the photoreceptors’ layer and by the
TUNEL technique. We used wild types C57-Bl6 mice as our experiment controls.
We tested the in vitro effect of the ERK activation inhibitor, the U0126 drug, over
the C3H-HeJ’s retinal degeneration. Our data shown that the photoreceptors’
degeneration of the mutant mice starts around the 15
th
day of life of these animals,
and progresses rapidly during the following days, in a way that by the 20
th
day, only
a single layer of photoreceptor cells can be saw. We noticed an increase of p-ERK
during this degeneration period. Also, when we inhibited the ERK activation, by
using U0126, we decreased the photoreceptors’ lost during this period. By
immunofluorescence, we saw that p-ERK was localized in the microglia and Müller
glia cells, but not in photoreceptors. Also, we saw the presence of activated
microglia beside the photoreceptors’ degeneration starting zone. Our data sugest
that the activation of ERK pathway, which occurs in the Müller glia cells and
microglia, is necessary for the photoreceptors’ death in the rd1 C3H-HeJ retinas.
Final, our results sugest that Müller glial cells and microglia contribute for the
photoreceptors’ death in this rd1 retinitis pigmentosa mice model.
xiv
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO.....................................................................................................1
1.1- Retina................................................................................................................1
1.2- A retina como modelo de estudo.......................................................................6
1.3 -Retinose pigmentar.......................................................................................... 9
1.4 -Controle da degeneração de fotorreceptores..................................................10
1.5- Camundongos C3H-HeJ: um modelo de estudo da retinose pigmentar.........12
1.6- As MAPKs........................................................................................................13
1.7- Via da ERK......................................................................................................13
2 OBJETIVOS........................................................................................................16
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................17
3.1 - Cultura de tecido............................................................................................17
3.2 - Preparação das lâminas.................................................................................17
3.3 - Imunohistoquímica.........................................................................................18
3.4 - Detecção de Morte Celular Programada........................................................19
3.5 - Reação de TUNEL.........................................................................................20
3.6 - Extração de proteína......................................................................................21
3.7 - Dosagem de proteínas pelo método de Lowry..............................................22
3.8 - Western Blotting.............................................................................................22
4 RESULTADOS....................................................................................................23
4.1 - Degeneração de fotorreceptores no modelo murio de retinose pigmentar rd1
C3H/HeJ.................................................................................................................23
4.2 - Análise da via da ERK in vivo.......................................................................28
4.3 - Análise da degeneração de fotorreceptores de retinas de camundongos rd1
C3H/HeJ in vitro.....................................................................................................32
4.4 - Análise do papel da via da ERK na degeneração de fotorreceptores de
camundongos rd1 C3H/HeJ...................................................................................37
5 DISCUSSÃO.......................................................................................................54
5.1 – Via da ERK e degeneração de fotorreceptores.............................................55
5.2 - Células da glia de Müller e degeneração de fotorreceptores.........................55
5.3 – Microglia e degeneração de fotorreceptores.................................................58
6 CONCLUSÕES...................................................................................................62
7 REFERÊNCIAS...................................................................................................66
1
1- INTRODUÇÃO
1.1- Retina
A retina é um fino tecido receptor de luz e condutor de sinal luminoso que
recobre o fundo do olho (Figura 1). Localiza-se entre a coróide e o vítreo e pode
ser dividida em duas porções: neural e não neural. Na retina neural estão
localizados os neurônios que são sensíveis à luz, os fotorreceptores, bem como
células responsáveis pelo processamento inicial da imagem, o que faz da retina
uma peça chave para o sentido da visão.
O epitélio pigmentado, localizado adjacente aos fotorreceptores, compõe a
porção não neural da retina. É uma estrutura muito importante para a qualidade da
imagem, pois com sua coloração escura (dada pela melanina) absorve toda a luz
não capturada previamente pela retina, prevenindo assim fenômenos de reflexão
luminosa e espalhamento dos raios luminosos que poderiam retornar e serem
capturados sob forma de ruído. O epitélio pigmentado possui outras funções
importantes, como a fagocitose de discos dos segmentos externos dos
fotorreceptores, transporte de pequenas moléculas para a retina neural, bem como
a secreção de fatores importantes ao desenvolvimento e à homeostase do tecido
retiniano (Kandel et al., 2003; Martínez-Morales et al., 2004 para revisão). Alguns
mamíferos noturnos apresentam uma forma variante de epitélio pigmentado que
ao invés de conter melanina é rico em substâncias refletoras e possui uma
superfície perfeitamente lisa. Esta estrutura possui o nome de tapeto lúcido, e
realiza um trabalho oposto ao do epitélio pigmentado. Ao invés de extinguir, no
2
fundo do olho, a luz que atravessa a retina sem ser capturada, o tapeto a reflete
perfeitamente com a mesma direção de incidência, o que dá aos fotorreceptores
retinianos uma segunda chance de capturar a luz. Isso aumenta muito a
capacidade visual destes animais em ambientes com baixa luminosidade e
durante a noite. É pela alta eficiência do tapeto lúcido em refletir a luz, que
podemos notar o intenso brilho nos olhos de felinos, por exemplo, durante a noite.
A retina é uma estrutura derivada do neuroectoderma (diencéfalo),
pertencente ao sistema nervoso central e responsável pela transformação da
energia eletromagnética em potenciais de ação. Estes são conduzidos aos centros
superiores através das fibras que compõem o nervo óptico, formado pelos axônios
pertencentes a um tipo particular de neurônio retiniano, a célula ganglionar
(Dowling et al., 1987).
O tecido retiniano não se restringe à simples sinalização, para o cérebro, da
presença ou ausência de luz. A competência deste tecido na modulação dos
sinais neurais gerados confere uma transmissão com aspecto mais complexo. A
imagem projetada sobre a retina é decomposta em diversas características físicas
que serão analisadas pelos centros cerebrais (Dowling et al., 1987).
3
Figura 1: Anatomia esquemática do olho humano. Adaptado de http://gruporetina.org.br/olho.htm
A retina é composta por diversos tipos de neurônios: fotorreceptores (cones
e bastonetes), células horizontais, células bipolares, células amácrinas e células
ganglionares (Masland et al., 2001). Possui um padrão de organização laminar
dividido em cinco camadas principais: três camadas nucleares, onde estão
localizados os corpos celulares (soma), e duas camadas plexiformes, onde se
localizam os prolongamentos sinápticos (Farah, 2006 para revisão). Em relação ao
centro do globo ocular, a camada mais interna é composta por células
ganglionares e células amácrinas deslocadas. Os axônios das células
4
ganglionares formam um feixe que denominamos de nervo óptico. Este se projeta
para fora do olho, fazendo a conexão entre retina e cérebro. A camada nuclear
seguinte é a nuclear interna, composta por células da glia de Müller, células
bipolares, células amácrinas e células horizontais. Estes três últimos tipos são
interneurônios que transmitem e modulam sinais dos fotorreceptores para as
células ganglionares (Masland et al.,1996).
A camada nuclear externa é composta pelos fotorreceptores. Entre as três
camadas nucleares existem duas camadas plexiformes, uma mais interna e outra
mais externa, onde encontramos os processos celulares (axônios e dendritos), em
outras palavras, sinapses (Gardner et al., 1999; Linden et al., 1999; Donovan &
Dyer, 2005 para revisão). Os fotorreceptores convertem sinais luminosos em
sinais elétricos (Wensel et al., 2008).
Os bastonetes são capazes de detectar claro e escuro e são extremamente
sensíveis à luz, de forma que um único fóton é capaz de desencadear uma
resposta elétrica detectável e, por isso, esse tipo celular é importante para a visão
noturna. Os fotorreceptores do tipo cone são adaptados para funcionar na
presença de luz intensa, ao contrário dos bastonetes, e por isso são importantes
na visão diurna. Estão concentrados na retina central e a eles cabem as funções
de detecção de cor, contraste e acuidade visual (Dacey, 2000; Punzo & Cepko,
2007). Mutações em certos genes dos cones podem acarretar em daltonismo.
Os fotorreceptores, de forma geral, quando excitados pelos fótons de luz,
enviam informação para as células bipolares e horizontais. Antes da informação
visual chegar ao cérebro, sua propagação até as células ganglionares se dá de
maneira complexa e envolve uma circuitaria complicada. (Kandel et al.,2003). No
5
entanto, os fotorreceptores precisam primeiro converter os fótons de luz em sinais
elétricos, o que é chamado de fototransdução ou ciclo visual. Este processo exige
um receptor acoplado à proteína G, chamado opsina, que contém o cromóforo 11-
cis-retinal ligado covalentemente. Este cromóforo é derivado da vitamina A e é o
responsável pela captação de fótons. A ativação do fotopigmento ocorre pela
isomerização do 11-cis-retinal em trans-retinal quando a molécula é atingida por
um fóton. Esta foto-isomerização promove a liberação do cromóforo e,
conseqüentemente, muda a conformação da opsina, o que ativa uma cascata de
transdução de sinal que envolve a redução da concentração do segundo
mensageiro GMPc por ativação de uma fosfodiesterase de GMPc no citoplasma.
Isto promove o fechamento dos canais de sódio e cálcio, hiperpolarizando os
fotorreceptores (Masland et al.,1996; Arshavsky et al., 2002).
6
1.2 - A retina como modelo de estudo
A retina de vertebrados tem sido extensamente usada como modelo
experimental do sistema nervoso central, bem como para o estudo da biologia do
desenvolvimento. A sua localização permite um fácil acesso e isolamento, e sua
estrutura em camadas facilita a identificação dos tipos celulares por sua
localização e morfologia. Além disso, é de fácil manipulação e através da técnica
de obtenção de explantes, a sua estrutura morfofuncional pode ser preservada
para tratamentos in vitro e posteriores análises de microscopia (Figura 2).
O desenvolvimento da retina, como de outros tecidos neurais, ocorre em
uma seqüência de eventos que muitas vezes se sobrepõem temporalmente. Estas
etapas incluem: proliferação, migração, diferenciação celular, determinação da
morfologia final de células, organização tecidual, aquisição de fenótipo
neuroquímico e sinaptogênese (Sharma e Ehinger, 1997).
A retina se desenvolve a partir das vesículas prosencefálicas laterais, das
quais emergem as vesículas ópticas. Em ratos, as vesículas ópticas sofrem uma
invaginação no 12º dia embrionário (E12), formando o cálice óptico, onde as
camadas celulares que formarão o epitélio pigmentado e a retina serão originadas
(Barnstable et al., 1987).
A diferenciação celular na retina de vertebrados é iniciada a partir de uma
população comum de células progenitoras (RPCs), residentes na camada interna
do cálice óptico. Outra característica da retinogênese de vertebrados é a
seqüência cronológica bem estabelecida de surgimento dos diferentes tipos
celulares que compõem este tecido (Marquardt & Gruss, 2002).
7
Figura 2: Organização estrutural da retina adulta de roedores. A retina madura de roedores é
composta por sete tipos celulares: células ganglionares (azul escuro), células amácrinas (amarelo),
células horizontais (vermelho), células bipolares (rosa), cones (verde), bastonetes (cinza) e células
da glia de Müller (azul claro). Estes sete tipos de células se organizam em 3 camadas de corpos
celulares: camada de células ganglionares (Ganglion Cell Layer - GCL), camada nuclear interna
(Inner Nuclear Layer - INL) e camada nuclear externa (Outer Nuclear Layer - ONL); e em 2
camadas compostas por prolongamentos: camada plexiforme interna (Inner Plexiform Layer - IPL)
e camada plexiforme externa (Outer Plexiform Layer - OPL).
Adaptado de Martins e Pearson, 2007.
Como em outros tecidos no sistema nervoso central, na retina fatores
epigenéticos e genéticos conduzem as células progenitoras à geração do número
final de cada tipo celular. A retina neural de vertebrados é um complexo tecido
sensorial cuja função depende da correta e harmônica formação de sua
citoarquitetura laminar (Marquardt & Gruss, 2002).
Bastonetes (80%)
Cones (2%)
Células
Horizontais (0.5%)
Células
Bipolares/Müller (10%)
Células
Amácrinas (7%)
Células
Ganglionares (0.5%)
GCL
IPL
INL
OPL
ONL
8
Todos os tipos celulares retinianos, exceto a microglia, são gerados a partir
das mesmas células precursoras multipotentes, em proporções características. As
células ganglionares e as células horizontais são as primeiras a se diferenciarem,
ainda no período embrionário, seguidas pelos fotorreceptores do tipo cone e pelas
células amácrinas. Uma nova “onda de diferenciação” se inicia nos primeiros dias
pós-natal, onde surgem primeiramente os fotorreceptores do tipo bastonetes,
seguidos das células bipolares e das células da glia de Müller (Levine & Green,
2004; Donavan & Dyer, 2005 para revisão). (Figura 3).
Figura 3: Linha do tempo da neurogênese dos diferentes tipos celulares da retina de
camundongos em desenvolvimento. E: idade embrionária (valores em escala de dias). P: idade
pós-natal (valores em escala de dias). Quanto maior a altura de uma curva, maior a intensidade de
neurogênese do tipo celular correspondente (pela cor) à ela.
Adaptado de Martins e Pearson, 2007.
células
ganglionares
cones
células
horizontais
células
amácrinas
bastonetes
células da glia
de Müller
células
bipolares
9
1.3 - Retinose pigmentar
Doenças neurodegenerativas, hereditárias ou adquiridas, que acometem a
retina são a maior causa de diminuição ou perda total da visão em humanos e têm
sido alvo de inúmeros estudos mundialmente relevantes (The Eye Tech Study
Group, 2001; Mitchell et al., 2005; Leonard et al., 2007). A retinose pigmentar é a
principal causa de cegueira na população de faixa etária economicamente ativa a
nível mundial, atacando uma a cada 4 mil pessoas; possui componentes
hereditários e leva à degeneração da camada de fotorreceptores (ONL) (Leonard
et al., 2007).
A retinose pigmentar pode se apresentar nas formas autossômica
dominante, autossômica recessiva, ligada ao cromossomo X, multigênica ou
sindrômica (Berson, 1996; Sanz et al., 2007). Nesta patologia, em humanos,
inicialmente ocorre a degeneração dos bastonetes localizados na periferia da
retina, o que ocasiona perda de visão noturna e periférica (gerando o efeito de
visão em túnel). Posteriormente, a degeneração avança até o centro da retina,
onde afeta os cones, levando à atrofia secundária da retina e do epitélio
pigmentado (Sanz et al., 2007; Arnhold et al., 2007). Esta degeneração, e
conseqüente perda celular, é de caráter irreversível, até o momento, para a
camada de fotorreceptores e, por isso, muito se tem estudado no sentido de
impedir ou retardar a iminente cegueira (Maclaren et al., 2006; Sanz et al., 2007).
Apesar de várias hipóteses com grau variável de suporte experimental,
diversos estudos mostram que ainda pouco se sabe sobre a patogênese da
retinose pigmentar a partir de defeitos genéticos ou alterações ambientais (Wong,
10
1994; Chader, 2002; Ripps, 2002; Farrar et al, 2002; Doonan et al, 2003; Yu et al,
2004).
1.4 - Controle da Degeneração de Fotorreceptores
A forma mais estudada de morte celular programada (MCP) é apoptose
(Hengartner, 2000) e seus mecanismos de execução mais conhecidos dependem
da ativação de uma família de proteases conhecidas como caspases (Salvesen,
2002). De forma geral, a degeneração dos fotorreceptores na retinose pigmentar é
atribuída à apoptose (van Soest et al, 1999; Carella, 2003; Delyfer et al, 2004),
com base em estudos de diferentes modelos animais (Chang et al, 1993; Wong,
1994; Portera-Cailliau et al, 1994). Todavia, há apenas 2 casos documentados de
apoptose em variantes da doença humana (Li e Milam, 1995) e os mecanismos
moleculares da degeneração dos fotorreceptores são ainda desconhecidos.
Várias vias de execução de apoptose e outras formas de morte celular
programada vêm sendo mapeadas e seus mecanismos investigados em diversos
tipos celulares e circunstâncias distintas (Leist & Jaatela, 2001; Lockshin & Zakeri,
2001; Guimarães & Linden, 2004). Recentemente, por exemplo, nosso grupo
detectou em células retinianas indiferenciadas, precursoras de fotorreceptores em
sua maioria, 4 vias alternativas de morte celular induzidas por inibição de síntese
proteica, envolvendo tanto autofagia quanto apoptose mediada por vias distintas,
porém dependentes de caspases (Guimarães et al., 2003). Foi demonstrado ainda
que a sensibilidade e os mecanismos de morte celular em fotorreceptores variam
11
dependendo do estado de diferenciação celular (Chiarini et al, 2003). Outros
autores demonstraram apoptose de fotorreceptores independente de caspases em
modelos murinos de degeneração retiniana (Doonan et al, 2003). Estudos
recentes indicam uma multiplicidade de mecanismos alternativos de morte celular
programada, dependentes do tipo celular, estágio de diferenciação e contexto
tecidual (Guimarães e Linden, 2004 para revisão).
Foi estabelecido por nosso grupo um modelo de indução in vitro de morte
de fotorreceptores no tecido retiniano através do tratamento com a tapsigargina
(Chiarini et al, 2003) um inibidor da Ca
2+
ATPase do retículo endoplasmático,
descrito como clássico indutor de estresse a esta organela. A indução de morte
celular pelo uso da tapsigargina no tecido retiniano de ratos com 6 dias pós-natal
mostrou ser seletiva à camada de fotorreceptores e dependente da via da MAP
cinase ERK.
Para ampliar o entendimento sobre como funcionam os mecanismos de
morte celular programada nos fotorreceptores, utilizamos neste trabalho o
camundongo C3H-HeJ, um animal aceito na literatura como modelo de retinose
pigmentar.
12
1.5 - Camundongos C3H-HeJ: um modelo de estudo da retinose pigmentar
Muitos modelos animais existem para o estudo de doenças degenerativas
da retina e, no caso da retinose pigmentar, um dos modelos importantes é o
camundongo de degeneração retiniana do tipo 1 (rd1) (Chang et al.,2002; Doonan,
2003). Dentre os rd1 está o camundongo C3H-HeJ (Figura 4), que é um animal
homozigoto para a mutação no gene que codifica a subunidade β da
fosfodiesterase de guanosina monofosfatada cíclica (GMPc) (Pdeb
rd1
). Esta é uma
das mutações mais comuns associadas à retinose pigmentar autossômica
recessiva em humanos, fazendo deste camundongo um importante modelo de
estudo (Chang et al.,2002). A mutação leva ao acúmulo do segundo mensageiro
GMPc no citoplasma que, de forma ainda não totalmente elucidada, leva à morte
dos fotorreceptores, aparentemente por apoptose. Mutações no mesmo gene
foram encontradas em formas autossômicas recessivas de retinose pigmentar em
humanos (Caffé et al.,2001).
Figura 4: Camundongo C3H-HeJ. Adaptado de: http://www.jax.org
13
1.6 - As MAPKs
A família de proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) regulam
uma enorme variedade de funções em praticamente todos os tipos celulares. Em
vertebrados, cinco famílias de MAPKs codificadas por 11 genes incluem ERK 1/2,
a cinase N-terminal c-Jun JNK 1/2/3, p-38 α/β/δ/γ, ERK5 e ERK7. Existem ainda
diversas formas variantes oriundas de splicing alternativo. As MAP cinases
fosforilam proteínas-alvo específicas que controlam proliferação celular,
sobrevivência, motilidade, metabolismo, transcrição e tradução. As MAP cinases
contribuem para respostas celulares a diversos estímulos, incluindo fatores de
crescimento, citocinas, respostas a estresse por toxinas, drogas, mudanças de
osmolaridade, aderência ao substrato, radicais livres, luz ultravioleta e temperatura
(Pearson et al., 2001). Não é de surpreender, portanto, que a desregulação da
atividade das MAPKs esteja associada a inúmeros distúrbios patológicos, como
morte celular prematura e câncer (Johnson and Lapadat, 2002; Hollenbach et al.,
2004; Gollob et al., 2006).
1.7 - A via da ERK
A ERK (MAP cinase) é ativada por fosforilação promovida por MEK (MAP
cinase cinase), que por sua vez se torna ativa quando fosforilada por Raf (MAP
cinase cisase cinase). As proteínas Raf são ativadas pelas proteínas GTPases
14
Ras. Após ativação mediada por ligante-receptor, a GTPase Ras, pode recrutar
Raf cinases para a membrana plasmática, promovendo uma subseqüente ativação
da via.
O estudo da via da ERK tem sido muito relevante na área de biologia
tumoral. A via pela qual fatores de crescimento e mitógenos ativam ERK é bem
descrita em estudos de câncer. A maioria das mutações associadas ao câncer e
que levam à uma sinalização via ERK constitutiva e aumentada, apresentam os
passos iniciais de ativação da via por superexpressão do receptor tirosina-cinase.
(Kolch et al., 2005). O papel da ERK em tumores tem sido relacionado a
proliferação celular e manutenção da sobrevivência celular.
Já no sistema nervoso, o papel da ERK ainda é bastante controverso no
que diz respeito às possíveis atividades anti e pró-apoptóticas que esta via pode
ter. Foi mostrado, em um modelo de indução de retinopatia diabética, que a
injeção intravítrea de eritropoietina possui um efeito neuroprotetor mediado pela
via da ERK (Zhang et al., 2008). Rhee e colaboradores observaram, em um
modelo rd1 murino de degeneração lenta, um efeito protetor do CNTF sobre a
degeneração da ONL. Porém, em concentrações mais elevadas, o CNTF, além de
não mais proteger, acelerava a morte dos fotorreceptores. Ambos os efeitos eram
mediados pela via da ERK. (Rhee et al., 2007).
Apesar da literatura possuir um vasto número de trabalhos que apontam um
papel neuroprotetor para ERK em diversos tipos de danos, como hipóxia e
isquemia (Brann et al., 2009), alguns estudos sugerem que esta MAP cinase pode
também possuir um papel pró-apoptótico em alguns tecidos e sob certas
condições fisiológicas.
15
Foi mostrado por Aguirre e colaboradores, em 2007, que, em um modelo
canino de mutação para rodopsina, a degeneração de fotorreceptores induzida por
exposição à luz era acompanhada de um aumento da ativação da via da ERK.
Apesar de não o terem comprovado de fato, baseando-se nas evidências obtidas,
o grupo sugere um possível papel pró-apoptótico da via no modelo em questão
(Aguirre et al., 2007).
Estudos anteriores do nosso grupo apontaram um papel pró-apoptótico
para ERK em diferentes modelos de indução in vitro de morte celular programada
na retina de ratos (Chiarini et al., 2003; Leal-Ferreira et al., 2006; Gonçalves et al.,
2007 – monografia de conclusão de graduação). Dois destes modelos possuem
relevância especial para este trabalho por se tratarem de modelos de indução de
morte de fotorreceptores: o modelo de indução de morte pela ação do ácido
ocadáico e o modelo de indução morte pela ação da tapsigargina, em explantes
de retina de ratos com seis dias pós-natais (Chiarini et al., 2003). Em ambos, a
utilização de inibidores da ativação da via da ERK atenuou a morte celular de
fotorreceptores induzida in vitro.
Portanto, não está totalmente esclarecido o papel da via da ERK na
modulação da degeneração de fotorreceptores.
16
HIPÓTESE:
Descrevemos previamente que a degeneração de fotorreceptores induzida
pelo tratamento de explantes de retina com tapsigargina dependia da ativação da
via da ERK (Leal-Ferreira, M.L. et al 2005). Sendo assim, nos propomos a
investigar se a degeneração dos fotorreceptores que ocorre nas retinas de
camundongos rd1 C3H/HeJ, modelo murino de retinose pigmentar, dependeria
também desta via. Formulamos a hipótese de que a degeneração de
fotorreceptores da retina de camundongos rd C3H/HeJ pode ser bloqueada pela
inibição de ERK.
Objetivos específicos:
1- Avaliar a cinética de degeneração de fotorreceptores na retina de camundongos
rd1 in vivo.
2- Analisar se há correlação entre a ocorrência de ativação da via da ERK e a
degeneração de fotorreceptores em retinas de camundongos rd1 C3H-HeJ e C57-
Bl6 (camundongo controle).
3- Avaliar a cinética de degeneração de fotorreceptores na retina de camundongos
rd C3H-HeJ in vitro.
4- Testar se a inibição da via da ERK bloqueia a degeneração de fotorreceptores
em retinas rd C3H-HeJ e Bl6.
5- Analisar quais as células apresentam p-ERK na retina in vivo.
17
3 – METODOLOGIA
3.1 - Cultura de explantes de retina:
Camundongos, nas diferentes idades utilizadas (de 12 a 20 dias pós-natal),
foram sacrificados por inalação de clorofórmio ou câmara de CO
2
. Em seguida,
seus olhos foram retirados e as retinas dissecadas em meio de cultura DMEM -
Sigma-Hepes 20mM, pH 7,4 com 5% de soro fetal bovino (Invitrogen), glutamina
2mM (Sigma) e gentamicina 0,1mg/mL (Invitrogen). As retinas foram então
cortadas em explantes de aproximadamente 1mm
2
, imediatamente fixadas ou
mantidas em meio de cultura com agitação orbital a 37
o
C por diferentes tempos e
tratamentos. O tecido foi fixado por imersão em solução de paraformaldeído 4%
em tampão fosfato pH 7,4 por uma hora e posteriormente transferido para solução
de sacarose 20%, no mesmo tampão (para fins de crioproteção). Os explantes
foram orientados, congelados em meio OCT (polietileno glicol 4,26%, polivinil
álcool 10,24%) e cortadas seções de 10µm de espessura no criostato. Os
protocolos experimentais de obtenção de retinas foram aprovados pela Comissão
de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa (CAUAP) do IBCCF.
3.2 - Preparação das lâminas:
Para quantificação da espessura da ONL, os cortes de tecido retiniano
foram corados com cresil violeta ou vermelho neutro, anilinas básicas. A coloração
com vermelho neutro foi obtida mergulhando-se as lâminas em solução 5% de
tampão acetato 0,1M, pH 3,3, por dois minutos, em seguida na solução de
vermelho neutro 1% por 1 minuto e novamente na solução 5% de tampão acetato
18
0,1M, pH 3,3, por um minuto (para remover o excesso do corante). Após secagem,
as lâminas foram desidratadas em etanol absoluto por 5 segundos e
imediatamente em xilol por 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram recobertas
com meio de montagem Entellan (Merck) e lamínulas.
A solução 1% de vermelho neutro foi obtida dissolvendo-se 1g de vermelho
neutro em 100mL de H
2
O destilada. Esta mistura depois de filtrada, recebe 4mL
de Tampão Acetato pH 4,8 (para fins de ajuste de pH).
3.3 - Imunohistoquímica:
As lâminas contendo os explantes foram submetidas ao detergente não
iônico Triton X-100, na concentração de 0,5% em tampão PBS por 15 minutos. Em
seguida, foi feita uma lavagem em PBS por 10 minutos, e então foi feita a
incubação com BSA 1% (em PBS pH7,4) por meia hora. Em seguida, foi feita a
incubação overnight a 4
o
C com um dos anticorpos citados nas tabelas a seguir:
Anticorpos primários utilizados no western blot
Antígeno Fabricante Diluição
Espécie em que foi
produzido
Fosfo-ERK Cell Signaling 1:1000 coelho
ERK 2 Santa Cruz Biotechnology 1:5000 coelho
α- tubulina
Sigma 1:20000 camundongo
19
Após a incubação com o anticorpo primário, as lâminas foram lavadas em
PBS por 10 minutos, em seguida foi feita a incubação com o anticorpo secundário
(1:200) por 30 minutos em temperatura ambiente.
3.4 - Detecção de Morte Celular Programada:
A quantificação de morte celular programada foi feita através da análise
pela reação de TUNEL. Em cada experimento, foram contados três campos em
cada explante de retina analisado, de três explantes no total.
Anticorpos secundários conjugados à peroxidade utilizados no western
blot
Antígeno Fabricante Diluição
Espécie em que
foi produzido
IgG camundongo Cell Signaling 1:2000 cavalo
IgG coelho Cell Signaling 1:2000 Cabra
Anticorpos utilizados em imunohistoquímica
Antígeno Fabricante Diluição
Espécie em que foi
produzido
Fosfo-ERK Cell Signaling 1:200 coelho
GS Cell Signaling 1:200 camundongo
CD11b Pharmigen 1:400 camundongo
20
3.5 - Reação de TUNEL
A técnica de TUNEL permite a identificação de morte celular programada
por possibilitar a visualização de eventos de fragmentação internucleossomal do
DNA. Quando uma célula está em processo apoptótico, o seu DNA é fragmentado
em intervalos regulares correspondentes aos segmentos inter-histonas que ficam
vulneráveis à clivagem de endonucleases ativadas na apoptose.
A reação de TUNEL se dá pela afinidade que a enzima TdT possui por
extremidades 3’OH do DNA, onde a mesma sintetiza um oligonucleotídeo
contendo digoxigenina. Quando utilizamos um anticorpo anti-digoxigenina
conjugado à fluoresceína, podemos observar marcação fluorescente nas regiões
onde a digoxigenina está presente, em outras palavras, podemos observar,
fluorescentes, todas as extremidades 3’OH livres do DNA de células individuais
em um tecido. O número de células positivas para TUNEL na camada nuclear
externa foi quantificado ao microscópio óptico de fluorescência. As quantificações
foram feitas em triplicata para cada experimento: 3 regiões diferentes de cada
explante foram quantificadas, chegando-se à uma média, num total de 3 explantes
quantificados por grupo experimental.
Procedimento
Os cortes transversais de 10µm dos explantes aderidos em lâmina foram
incubados com o detergente não iônico Triton X-100 por 15 minutos. Em seguida,
foi feita uma lavagem de 10 minutos em PBS pH 7,4 seguida de incubação com o
tampão de equilíbrio por 10 minutos à temperatura ambiente. A seguir, foi feita a
21
incubação com a enzima TdT diluída em tampão de reação por 1 hora e meia a
37
o
C. A reação foi então parada com a solução stop / wash em duas lavagens de
5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi feita uma lavagem de 10
minutos em PBS pH 7,4. Finalmente foi feita a incubação com o anti-digoxigenina
conjugado à fluoresceína, por 1 hora, na ausência de luz, à temperatura ambiente,
seguida de uma lavagem de 10 minutos em PBS pH 7,4.
As lâminas foram montadas em meio de montagem PPD para posterior
análise em microscopia de fluorescência.
3.6 - Extração de proteína:
Após o tratamento em cultura, os explantes foram lavados duas vezes em
PBS gelado e centrifugados para remoção de resíduos de meio de cultura. Para
cada retina ou 8 explantes foram utilizados 75µL de tampão de lise RIPA (Triton X-
100 1%, 10mM de Tris HCl pH 7,6, NP-40 1%, desoxicolato de sódio 1%, 5mM de
EDTA, SDS 0,1% e 150mM de NaCl), acrescido, na hora do uso, de inibidores de
proteases e de fosfatases (PMSF 1mM, 10µg/mL de aprotinina, 10µg/mL de
leupeptina, 10µg/mL de pepstatina, 50mM de NaF e 1mM de ortovanadato de
sódio). Os microtubos contendo as retinas com tampão de lise foram mantidos por
30 minutos no gelo e submetidos à agitação a cada 10 minutos. Após esse tempo,
foi feita centrifugação a 14000 rpm ou aproximadamente 16000g (em uma
centrífuga com um rotor de raio 7,5cm) por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
recolhido e o pellet descartado. Os extratos obtidos foram mantidos a -70ºC até o
uso.
22
3.7 - Dosagem de proteínas pelo método de Lowry:
Foi preparada uma curva padrão com diferentes concentrações de BSA e
duplicatas das amostras. Cada tubo foi incubado com 2mL de RCA (sulfato de
cobre 0,01%; tartarato de NaK 0,02%; carbonato de sódio 0,02% em hidróxido de
sódio 0,1N) por 10 minutos seguido de adição de 100µL de Folin por 30 minutos
antes da leitura das amostras no espectrofotômetro. A leitura foi feita usando o
filtro de 750nm e a densidade óptica obtida para cada amostra comparada com a
curva padrão para aferir a concentração de proteína correspondente.
3.8 - Western Blotting:
Extratos protéicos obtidos de explantes de retina mantidos sob diferentes
tratamentos, contendo 30µg de proteína, dosados pelo método de Lowry, foram
adicionados ao tampão de amostra (Tris 250mM pH 6,8, glicerol 40%, β-
mercaptoetanol 4%, SDS 12% e azul de bromofenol 0,1%). A separação das
proteínas foi feita através de eletroforese em gel SDS-PAGE a 12,5% a 120V por
tempos variados. Em seguida, foi feita transferência das proteínas para uma
membrana de nitrocelulose (Amersham), a 200mA, por 2 horas. Ao final da
transferência, a membrana de nitrocelulose foi corada com vermelho de Ponceau
(Sigma) para avaliar a eficiência da transferência das proteínas. Para visualização
das bandas de proteína, o excesso de corante foi removido com lavagem em água
destilada. Todo o corante residual foi retirado lavando-se a membrana com
TBS/Tween 0,1%.
23
4 - RESULTADOS
4.1 - Degeneração de fotorreceptores no modelo murio de retinose pigmentar
rd1 C3H/HeJ:
Nosso objetivo inicial foi primeiramente detectar a janela de tempo onde a
degeneração de fotorreceptores da retina de camundongos C3H-HeJ estaria
ocorrendo dentro de nossas condições experimentais. Observamos inicialmente,
através de técnicas básicas de coloração histológica, que a retina destes animais,
até o décimo quarto dia pós natal, apresentava-se com aspecto normal no que diz
respeito à espessura relativa de suas camadas (Figura 5A). Contudo, no décimo
oitavo dia, a retina destes animais apresenta uma expressiva redução da camada
de fotorreceptores (Figura 5B), chegando posteriormente a um estágio em que
apenas uma única fileira de células (possivelmente cones, devido o aspecto da
cromatina observada mediante marcação com o intercalante de DNA DAPI) pode
ser observada (Figura 5C).
24
Figura 5: Cortes transversais (10µm) de explantes retinianos de camundongos C3H-HeJ corados
por cresil violeta. A: retina de 14 dias pós-natal (p14). B: retina de 18 dias pós-natal (p18). C: retina
de 20 dias pós-natal (p20). GCL: Ganglion Cell Layer - camada de células ganglionares. IPL: Inner
Plexiform Layer - camada plexiforme interna. INL: Inner Nuclear Layer - camada nuclear interna.
OPL: Outer Plexiform Layer - camada plexiforme externa. ONL: Outer Nuclear Layer - camada
nuclear externa. Note que, enquanto a camada nuclear externa (que contém os fotorreceptores) e
a camada plexiforme externa (que contém os prolongamentos sinápticos dos mesmos)
desaparecem, as demais camadas se mantém dentro das devidas proporções.
Com o objetivo de quantificar a velocidade de degeneração da camada de
fotorreceptores (ONL) da retina de camundongos C3H-HeJ, lançamos mão de
duas ferramentas: a medida da espessura relativa da ONL (ONL / INL) e a
execução da técnica de TUNEL, que detecta eventos de fragmentação da
cromatina, característica típica de morte celular por apoptose.
Em cortes de explantes de retinas de camundongos rd1 C3H-HeJ e C57-
Bl6, corados com vermelho neutro realizamos a medida da espessura relativa da
camada nuclear externa (ONL / INL). Detectamos que na idade de 14 dias pós-
natal (P14), a espessura da ONL nos camundongos C3H-HeJ ainda é
A B C
P14
P18
P20
GCL
IPL
INL
ONL
OPL
50
µ
P14
P18
P20
25
correspondente à da retina do camundongo controle (C57-Bl6). Porém, a partir do
décima quinto dia, a camada de fotorreceptores dos camundongos C3H-HeJ
começa a progressivamente perder espessura (Figura 6). Verificamos que de 14 a
16 dias de idade ocorre diminuição progressiva da espessura relativa da camada
nuclear externa em retinas de camundongos rd1 C3H-HeJ (Figura 6C, 6D, 6E)
mas não de C57-Bl6 (Figura 6B).
Para analisar fotorreceptores em apoptose fizemos a técnica de TUNEL,
que nos permite marcar no tecido retiniano as células que apresentam
fragmentação de DNA, caracterísitca da apoptose.
Observamos marcação de TUNEL em cortes de retina de camundongos
C3H-HeJ na camada nuclear externa, marcação esta que começa a ser detectada
com clareza a partir do 15
o
dia pós-natal e se intensifica no 16
o
. Todavia, não há
marcação, durante o mesmo intervalo de tempo, nas retinas dos camundongos
controle C57-Bl6 como ilustrado nas fotomicrografias da figura 7. Verificamos que
o aparecimento de células com fragmentação de DNA ocorre predominantemente
na porção mais interna da camada nuclear externa (Figura 7), próxima a camada
plexiforme externa em formação.
Pela análise quantitativa da incidência de células TUNEL positivas na
camada nuclear externa nas idades P14, P15 e P16, verificamos uma grande
aumento no número de células TUNEL positivas em retinas de C3H-HeJ P15 e
P16 (Figura 8).
26
Portanto, concomitante com o aparecimento de perfis marcados para a
técnica de TUNEL, observa-se uma progressiva redução de espessura da camada
nuclear externa da retina dos camundongos C3H-HeJ.
Figura 6: Medida da espessura relativa da camada de fotorreceptores (ONL) em retinas de
camundongo C3H-HeJ(A) e C57-Bl6(B) nas idades de 14 (C), 15(D) e 16(E) dias pós-natal. As
fotos ilustrativas mostram cortes transversais (10µm) corados com vermelho neutro (neutral red).
N = 5 em triplicata.
C D E
A B
27
Figura 7
: Análise de morte celular programada pela técnica de TUNEL (verde), em retinas de
camundongos C3H-HeJ nas idades de 14, 15 e 16 dias pós-natal. N = 3 em triplicata. Setas: exemplos
de células TUNEL positivas. Note células TUNEL na porção interna da camada nuclear externa (ONL).
GCL: camada de células ganglionares; INL: camada nuclear interna. Azul: marcação pelo intercalante
de DNA DAPI.
50
µ
m
P14
P15
P16
GCL
INL
ONL
GCL
INL
ONL
28
Figura 8: Quantificação de morte celular programada, pela técnica de TUNEL, em retinas de
camundongo C3H-HeJ(A) e C57-Bl6(B) nas idades de 14, 15 e 16 dias pós-natal. N = 3 em
triplicata.
4.2 - Análise da via da ERK in vivo:
Por termos constatado anteriormente uma participação importante da via da
ERK no modelo de indução de morte de fotorreceptores em explantes de retinas
de ratos tratadas com tapsigargina in vitro (Chiarini, 2003), resolvemos investigar a
importância desta via no camundongo, modelo de retinose pigmentar, C3H-HeJ.
Com o objetivo de se identificar se haveria alguma anomalia nos níveis de
ativação da ERK durante os períodos anteriores e concomitantes à degeneração
dos fotorreceptores dos camundongos C3H-HeJ, foram feitos Western blots,
oriundos de extratos de retina total, para a forma fosforilada desta proteína. A
fosforilação de ERK indica que ocorreu ativação desta proteína cinase. As bandas
A B
29
de ERK fosforilada que aparecem na revelação apresentam 44 e 42 KDa e
correspondem às isoformas 1 e 2 da ERK respectivamente.
Durante a janela de tempo que compreende a explosão inicial de morte dos
fotorreceptores no nosso modelo de estudo e que se mostrou ser entre os dias 14
e 16, nota-se um aumento nos níveis de ERK fosforilada, enquanto os níveis de
ERK total e tubulina encontra-se similar em todas as idades analisadas (Figura
9).
30
Figura 9: Western blot para a forma fosforilada (ativada) da MAP cinase ERK em extrato de retina
de camundongos rd1 nas idades de 14, 15 e 16 dias pós-natal (A). Para a quantificação de
densidade óptica relativa(B) foram utilizados, como controles de carregamento a α-tubulina (n = 3)
e ERK-2 (n = 2).
A
B
31
Diferente do que acontece com o C3H-HeJ, as retinas de camundongos
C57-Bl6 (camundongos controle, que não apresentam nenhum tipo de
degeneração retiniana) não apresentam aumento tão expressivo dos níveis de
ERK fosforilada durante o mesmo intervalo de tempo (Figura 10).
Figura 10: Western blot representativo, em duplicata, para a forma fosforilada (ativada) da MAP
cinase ERK em extratos de retina de camundongos C57-Bl6 nas idades de 14, 15 e 16 dias pós-
natal (A). ERK-2 foi utilizada como controle de carregamento para a quantificação da densidade
óptica relativa (B) (n = 3).
A
B
32
4.3 - Análise da degeneração de fotorreceptores de retinas de camundongos
rd1 C3H/HeJ in vitro:
Com o objetivo de se estabelecer um protocolo de cultivo in vitro de
explantes de retina de camundongos C3H-HeJ, extraímos retinas de diferentes
idades e as mantivemos in vitro por variados tempos. Estabelecer um
procedimento in vitro neste caso seria de grande utilidade uma vez que além do
interesse em analisar o papel da via da ERK na degeneração de fotorreceptores
de C3H/HeJ com a utilização de inibidores farmacológicos da MEK, desejamos
analisar futuramente, diferentes vias de sinalização que possam regular a
degeneração destes fotorreceptores. Desta forma, uma vez estabelecido um
protocolo de cultivo e análise da degeneração de fotorreceptores de C3H/HeJ in
vitro, haverá uma considerável economia de fármacos, tempo e animais.
Os experimentos de manutenção in vitro de explantes de retina de
camundongos C3H-HeJ em diferentes idades mostraram que a degeneração da
camada nuclear externa continua mesmo fora do olho do animal. Animais, com
idades entre 14 a 16 dias pós-natal, foram sacrificados e suas retinas dissecadas
em explantes que foram imediatamente fixados ou mantidos in vitro por 24 ou 48
horas. A progressão da degeneração da camada de fotorreceptores foi avaliada
tanto pela medida da espessura relativa da ONL (Figura 11) quanto pela técnica
de TUNEL (Figura 13). Quando mantivemos in vitro, explantes retinianos de
camundongos C3H-HeJ, observamos que a degeneração da camada ONL que se
iniciara no organismo do animal, prosseguiu in vitro. Observamos a continuidade
do processo de redução de espessura da ONL nas três idades de animais
analisadas quando as retinas mantidas in vitro (Figura 11). A Figura 12
33
exemplifica o fenômeno na idade de 16 dias. Todavia, a redução de espessura da
ONL em explantes de retina de C3H-HeJ mantidos in vitro parece ocorrer com
uma cinética mais branda quando fazemos uma comparação por tempo total de
vida das retinas, agrupando retinas que passaram ou não algum tempo in vitro
(Figura 11). Uma menor intensidade de marcação para TUNEL em explantes
mantidos in vitro ficou evidente quanto os dados foram agrupados por tempo total
de vida da retina, confrontando diretamente os valores obtidos in vitro e in vivo
(Figura 14).
Figura 11
: Medida da espessura relativa da camada de fotorreceptores de retinas de camundongos C3H-HeJ
in vitro e in vivo. Retinas oriundas de animais com 14, 15 ou 16 dias pós-natal foram recém fixadas(losango)
após o abate ou mantidas in vitro por 24(quadrado) ou 48(triângulo) horas antes de sofrerem a fixação.
Posteriormente as retinas foram processadas e a espessura relativa da ONL foi medida. N = 3 em triplicata.
34
Figura 12: Cortes transversais (10µm) de retina de camundongos C3H-HeJ de 16 dias pós-natal
marcados com DAPI, um intercalante de DNA. A: tecido retiniano recém extraído de um animal de
16 dias e imediatamente fixado. B: tecido retiniano de 16 dias cultivado por mais 24h in vitro. C:
tecido retiniano de 16 dias cultivado por mais 48h in vitro. Observa-se a redução da espessura da
camada de fotorreceptores, de A para C. Também é possível notar a redução da densidade de
células na camada de células ganglionares, de A para C, devido à morte por axotomia das células
em questão.
A B C
35
Figura 13
: Quantificação de morte celular programada pela técnica de TUNEL em retinas de camundongos
C3H-HeJ in vitro e in vivo. Retinas oriundas de animais com 14, 15 ou 16 dias pós-natal foram recém fixadas
após o abate ou mantidas in vitro por 24 ou 48 horas antes de sofrerem a fixação. Posteriormente as retinas
foram processadas e o ensaio de TUNEL foi realizado. N = 3 em triplicata.
36
Os experimentos realizados nos permitiram concluir que a idade de 14 dias
seria o melhor momento para realizar os experimentos de inibição in vitro da via
da ERK, pois nesta idade ainda não detectamos marcação para TUNEL e nem
redução da espessura de ONL. Todavia estes fenômenos começam a ser
observados já nos dois dias subsequentes, tornando esta janela de tempo
bastante interessante para uma avaliação de efeitos farmacológicos sobre a
cinética de degeneração da ONL.
Figura 14
: Incidência de marcação para TUNEL em retinas de camundongos C3H-HeJ é menor in vitro. Retinas
oriundas de animais com 14, 15 ou 16 dias pós-natal foram recém fixadas após o abate (azul) ou mantidas in
vitro por 24 (verde) ou 48 (amarelo) horas antes de sofrerem a fixação. Posteriormente as retinas foram
processadas e o ensaio de TUNEL foi realizado. N = 3 em triplicata.
37
4.4 - Análise do papel da via da ERK na degeneração de fotoreceptores de
camundongos rd1 C3H/HeJ:
Com o sucesso do protocolo de cultivo de explantes retinianos de C3H-HeJ
in vitro, nossa meta seguinte foi testar o efeito que uma inibição farmacológica da
via da ERK provocaria na cinética de degeneração, previamente observada, dos
explantes retinianos mantidos in vitro.
Vimos que o inibidor da fosforilação da MAP cinase ERK, U0126, mostrou
ter um papel protetor diante da degeneração dos fotorreceptores de retinas de
C3H-HeJ mantidas in vitro. Retinas de C3H-HeJ tratadas com U0126 10µM
mostraram redução significativa na incidência de marcação para TUNEL na ONL,
tanto em 24 quanto em 48 horas de tratamento in vitro (Figura 15).
Retinas de C3H-HeJ tratadas com U0126 apresentaram diminuição
significativa da perda de espessura da ONL após 48 horas de tratamento in vitro
(Figura 19). Imagens representativas dos ensaios para TUNEL após tratamentos
de 24 e 48 horas estão apresentadas nas figuras 16 e 17, respectivamente.
Figura 15
: Quantificação de morte celular programada pela técnica de TUNEL em retinas de camundongos C3H-
HeJ e C57-Bl6 mantidas in vitro na presença ou na ausência do inibidor da via da ERK U0126. * = Diferença
significativa Vs. Para One-way ANOVA / Tukey, com p < 0,05. N = 3 em triplicata.
38
Figura 16: Reação de TUNEL em explantes de retina de camundongos C3H-HeJ com 14 dias pós-
natal mantidos por 24 horas in vitro na presença ou ausência do inibidor da via da ERK U0126.
50
µ
39
Figura 17: Reação de TUNEL em explantes de retina de camundongos C3H-HeJ com 14 dias pós-
natal mantidos por 48 horas in vitro na presença ou ausência do inibidor da via da ERK U0126.
50
µ
40
Foi interessante notar, nos grupos controle de retinas de C3H-HeJ (sem o
U0126) a intensa marcação para TUNEL das silhuetas de células de glia de
Muller. A técnica provavelmente está detectando a cromatina fragmentada de
fotorreceptores que a glia de Müller fagocitou (Figura 18).
Figura 18
: Muller fagocita fotorreceptores em degeneração: presença de marcação para TUNEL no interior
das células da glia de Muller. Retina de um animal C3H-HeJ de 14 dias de idade mantida por 48 horas in
vitro. Setas destacando a marcação citoplasmática de céululas da glia de Müller.
C3H
-
HeJ
P16 +48h
TUNEL
41
Com o objetivo de se identificar que células estariam com os níveis de ERK
fosforilada aumentados, foi feita uma imunohistoquímica para p-ERK. Em
imunohistoquímica conjunta e com os mesmos parâmetros de obtenção de
imagem que foram adotados para o C3H-HeJ, a intensidade de marcação para p-
ERK (em verde) pareceu menor nos camundongs C57-Bl6 de mesma idade
(Figura 20). De imediato houve suspeita de que se tratava de marcação de
células da glia de Müller, tanto nas retinas de C3H-HeJ quanto nas de C57-Bl6. Na
microscopia confocal, pudemos obter imagens com melhor nitidez e resolução da
marcação para p-ERK observada e verificamos uma marcação típica de células da
glia de Muller(Figura 21). A confirmação ocorreu após dupla imunohistoquímica
para p-ERK e glutamina sintetase (GS), enzima característica de células da glia de
Muller. Tanto nos camundongos controle (C57-Bl6) (Figura 22) quanto nos
Figura 19
: Medida da espessura relativa da ONL em retinas de camundongos C3H-HeJ e C57-Bl6 mantidas in
vitro na presença ou na ausência do inibidor da via da ERK U0126. * = Diferença significativa Vs. Para One-way
ANOVA / Tukey, com p < 0,05. N = 3 em triplicata.
42
rd1(C3H-HeJ) (Figura 23 e 24) observamos fiel colocalização entre a marcação
para -p-ERK e a marcação para glutamina sintetase.
As imunohistoquímicas para GS também ajudaram a evidenciar um outro
ponto interessante: durante o período de morte dos fotorreceptores nas retinas
dos camundongos C3H-HeJ, os prolongamentos de Muller contidos dentro na
ONL sofrem evidente desorganização (Figura 25).
Figura 20
: Marcação para p-ERK em retinas de camundongo C3H-HeJ e C57-Bl6 nas idades de 15 e 16
dias pós-natal.
43
Figura 21
: Marcação para p-ERK em retinas de camundongo C3H-HeJ e C57-Bl6 nas idades de 15
dias pós-natal. Imagem obtida por microscopia confocal em um corte óptico de 1µm.
44
Figura 22: Marcação para p-ERK em retinas de camundongo C57-Bl6. Em verde,
imunohistoquímica para a forma fosforilada de ERK. Em vermelho, imunohistoquímica para a
enzima glutamina sintetase (GS), exclusiva das células da glia de Müller na retina. Em azul,
marcação nuclear com DAPI, um intercalante de DNA. No campo inferior direito, a sobreposição
das duas marcações imunohistoquímicas. A retina utilizada foi de um camundongo C57-Bl6 com
15 dias pós-natal (p15).
50
µ
45
Figura 23: ERK fosforilada é encontrada majoritariamente na glia de Müller. Em verde,
imunohistoquímica para a forma fosforilada de ERK. Em vermelho, imunohistoquímica para a
enzima glutamina sintetase (GS), exclusiva das células da glia de Müller na retina. Em azul,
marcação nuclear com DAPI, um intercalante de DNA. No campo inferior direito, a sobreposição
das duas marcações imunohistoquímicas. A retina utilizada foi de um camundongo C3H-HeJ com
15 dias pós-natal (p15).
50
µ
46
Figura 24
: ERK fosforilada é encontrada majoritariamente na glia de Müller. Em verde,
imunohistoquímica para a forma fosforilada de ERK. Em vermelho, imunohistoquímica para a enzima
glutamina sintetase (GS), exclusiva das células da glia de Müller na retina. Em azul, marcação nuclear
com DAPI, um intercalante de DNA. No campo inferior direito, a sobreposição das duas marcações
imunohistoquímicas. A retina utilizada foi de um camundongo C3H
-
HeJ com 16 dias pós
-
natal (p16).
47
Figur
a 25
: Desorganização dos prolongamentos das células da glia de Muller na ONL durante o período de
degeneração retiniana dos camundongos C3H-HeJ. As setas destacam a porção dos prolongamentos de Müller
que se encontram na camada de fotorreceptores. Note que, enquanto a porção de prolongamentos mais interna à
retina (parte superior das imagens) permanece bem orientada, a porção contida na ONL perde sua organização
durante o período de degeneração dos fotorreceptores nos camundongos rd1.
48
Conhecendo-se o fato de que inúmeros tipos de dano e processos
degenerativos que afetam o sistema nervoso central podem disparar uma resposta
inflamatória, partimos para investigar possíveis indícios de ativação de
mecanismos inflamatórios, bem como a presença e disposição de células do
sistema imune no tecido, que no caso da retina, trata-se da microglia.
Uma imunohistoquímica para CD11b (proteína de superfície presente, na
retina, exclusivamente em microglia) nos revelou a presença de quantidade
expressiva de infiltrado de microglia nas camadas retinianas do C3H-HeJ. A
microglia revelada pôde ser identificada como latente (que apresenta um fenótipo
alongado e ramificado) e como ativada (que apresenta um contorno mais
compacto e amebóide). Verificamos grande densidade das formas amebóides
compactas (microglia ativada) acumuladas nas proximidades da camada nuclear
externa. O mesmo não acontece no C57-Bl6 (Figura 26). A microglia, que pode
ser também observada em imunohistoquímicas para GS, apresenta sua marcação
para CD11b colocalizando com p-ERK (Figura 27).
49
Figura 26: Imunohistoquímica para a proteína de superfície CD11-b, exclusiva de microglia, em
cortes de retina de camundongos C3H-HeJ e C57-Bl6. Em azul, marcação com o intercalante de
DNA DAPI.
É importante ressaltar que, nas retinas de C3H-HeJ, é justamente a faixa de
região da ONL que está mais próxima da microglia que começa a apresentar
primeiramente a marcação para a técnica de TUNEL (Figura 28).
50
µ
50
Figura 27
: Colocalização de marcação para p-ERK e CD11b em retina de camundongos C3H-HeJ.
Foto representativa de retina de um animal de 15 dias pós-natal.
51
Figura 28
: A marcação para TUNEL se dá preferencialmente na porção mais interna da ONL durante os
primeiros dias do período de degeneração retiniana dos camundongos C3H-HeJ com 15,5 dias pós-natal.
Os segmentos amarelos marcam os limites da camada de fotorreceptores.
52
Além da forte evidência de localização da microglia no tecido e a
localização do início de marcação para TUNEL nas retinas de C3H-HeJ (Figura
29), uma outra evidência que remete a dados iniciais deixa esta questão ainda
mais interessante: a microglia deixa de ser detectada após permanência das
retinas no ambiente in vitro (Figura 30). Este fato somado aos dados de retardo
da cinética de degeneração da ONL na condição in vitro, sugerem novamente uma
Figura 29
: Proximidade entre primeiras células a apresentar marcação para TUNEL e microglia em
retinas de camundongos C3H-HeJ.
53
relação entre a microglia e a cinética de degeneração dos fotorreceptores destes
animais.
Figura 30
: Após tratamento in vitro microglia deixa de ser visualizada mediante marcação para CD11b
em retinas de camundongos C3H-HeJ. T0: retinas recém fixadas após o sacrifício dos animais.
54
5 - DISCUSSÃO
Para o estudo da retinose pigmentar utilizamos o modelo murino C3H-HeJ e
monitoramos a progressão da degeneração da camada de fotorreceptores in vitro
e in vivo. O camundongo C3H-HeJ é um modelo de retinose pigmentar aceito na
literatura e é conhecido por apresentar uma severa degeneração da camada ONL
da retina (a camada que contém os fotorreceptores) em um curto intervalo de
tempo alguns dias após o seu nascimento.
Com a finalidade de detectar a janela de tempo em que os fotorreceptores
do camundongo C3H-HeJ estavam degenerando em nossas condições de
laboratório, fizemos uma curva onde medimos a espessura relativa da camada
ONL bem como quantificamos a presença de marcação para a técnica de TUNEL
na camada em questão.
Observamos que sob nossas condições experimentais a degeneração da
ONL nestes animais se inicia em média por volta do décimo quinto dia pós-natal,
progredindo rapidamente durante os dias subseqüentes, de forma que por volta do
vigésimo dia somente uma camada de células é observada. Nossos experimentos
mostraram que a via da ERK possui papel pró-apoptótico neste modelo e que o
conteúdo desta MAP cinase em sua forma fosforilada se encontra nas células da
glia de Muller e microglia, não sendo visível nos fotorreceptores. Notamos também
uma sugestiva correlação entre a posição de microglia ativada, identificada pela
morfologia mediante marcação para CD11b, e a localização da marcação para
TUNEL nos primeiros dias de degeneração da ONL.
55
5.1 - Via da ERK e Degeneração de Fotorreceptores
Notamos que a degeneração da camada de fotorreceptores começa a
ocorrer a partir do décimo quinto dia pós-natal (p15), com um aumento
concomitante dos níveis de fosforilação da MAP cinase ERK. O papel da via da
ERK na morte celular programada na retina ainda é pouco conhecido.
Observamos que o conteúdo majoritário de ERK em sua forma fosforilada
encontra-se presente nas células da glia de Muller, tanto em retinas de
camundongo C3H-HeJ, quanto em retinas de camundongos controle (C57-Bl6).
Todavia, diferente do que observamos no camundongo mutante, as retinas do
C57-Bl6 não apresentaram aumento similar nos níveis de fosforilação de ERK
durante o mesmo intervalo de tempo em que ocorre a degeneração dos
fotorreceptores nos camundongos C3H-HeJ.
Somando-se à estas evidências sobre a importância da via da ERK na
degeneração dos fotorreceptores do C3H-HeJ, experimentos de manutenção de
explantes retinianos in vitro nos revelou que com a presença de um inibidor da
MEK (U0126) a degeneração dos fotorreceptores da retina de camundongos C3H-
HeJ foi retardada. Estes dados reforçam a tese de que a via da ERK possui papel
pró-apoptótico nos fotorreceptores destes animais.
5.2 - Células de Müller e Degeneração de Fotorreceptores
Virtualmente todas as formas de dano ou doença na retina, incluindo
trauma mecânico (Caicedo et al., 2005), descolamento retiniano (Lewis et al.,
1995; Sethi et al., 2005), glaucoma (Wang et al., 2002) e diabetes (Mizutani et al.,
1998), disparam a gliose. Na retina, a gliose é definida como um conjunto de
56
mudanças nas características fisio-morfológicas dos astrócitos e das células da
glia de Müller, e por um aumento na produção de proteínas de filamentos
intermediários, como GFAP e vimentina (Lewis et al., 2003).
Evidências acumuladas na literatura sugerem que a astroglia pode produzir
e liberar fatores que favorecem a sobrevivência celular (Srebro et al., 2001;
Takuma et al., 2004) bem como produzir moléculas que inibem a regeneração
axonal e que provocam neurotoxicidade e dano secundário aos neurônios
próximos (Sandvig et al., 2004; Silver et al., 2004). Ou seja, a astroglia pode ser
benéfica ou maléfica a neurônios lesados, dependendo do contexto do tecido
(Pekny et al., 2005). Portanto, entender melhor as reações gliais retinianas à
doenças e danos é de suma importância para o desenvolvimento de novas
estratégias terapêuticas.
A resposta reativa astroglial envolve uma gama de eventos extra e
intracelulares. Incluem-se nestes eventos o aumento de GFAP e vimentina, já
mencionado anteriormente, a ativação das vias sinalizadoras ERK (Neary et al.,
2004) e c-fos (Butler et al., 2004), um aumento na produção de citocinas e
quimiocinas (Little et al., 2002) como o TNF-α, e um aumento da proteína
quimioatratora de monócitos (MCP-1), o que resulta em um recrutamento de
microglia e monócitos para a região do insulto (Izikson et al., 2002).
Na retina, as células de glia de Müller, especialmente os seus “pés” são
menos resistentes a estresse (Lundkvist et al., 2004).
As células de Müller são o tipo glial predominante na retina de vertebrados
e ocupam toda a extensão da espessura retiniana (Sarthy et al., 2001). Com seus
57
longos prolongamentos orientados no eixo paralelo ao caminho percorrido pela
luz, fazem contato com todos os tipos celulares da retina. Seus prolongamentos
vão desde a camada nuclear externa, onde se encontram os fotorreceptores, até a
camada de células ganglionares (Robinson et al., 1990).
A glia de Müller é a principal glia de suporte para os neurônios da retina
adulta de vertebrados e realiza diversas funções importantes relacionadas com
oligodendrócitos, astrócitos e células ependimais em outras regiões do sistema
nervoso central (Newman et al., 1996). A glia de Müller é o último tipo celular a se
diferenciar na janela de tempo do desenvolvimento de retina de vertebrados
(Prada et al., 1991).
Apesar do papel da glia de Müller no processamento visual ser ainda muito
pouco compreendido, é sabido que estas células sintetizam e secretam
importantes moléculas sinalizadores na retina em desenvolvimento e na retina
adulta (Reis et al., 2008).
O fato das imunohistoquímicas terem nos revelado que o conteúdo
majoritário de ERK fosforilada está nas células da glia de Muller, nos faz refletir
sobre as possíveis maneiras pelas quais a ativação desta MAP cinase estaria
levando os fotorreceptores à morte.
Sabendo-se do fato de que inúmeros danos no sistema nervoso central
podem levar à uma reação de gliose, e que, no caso da retina, a glia de Müller tem
papel importante, voltamos nossa atenção para a glia da retina destes animais.
Um estudo recente abordando a degeneração de fotorreceptores induzida
por descolamento de retina em camundongos mostrou que na ausência de GFAP
e vimentina há uma expressiva atenuação da reação glial retiniana, com redução
58
da ativação de ERK e c-fos. Além disso, foi observada uma redução na produção
de MCP-1 nas retinas de camundongos nulos para vimentina e GFAP que foram
dissociadas do epitélio pigmentado. O dado mais relevante deste estudo, segundo
o autor, é o de que os camundongos nulos para GFAP e vimentina apresentam
uma enorme redução na morte de fotorreceptores em conseqüência ao
descolamento de retina após 3 dias, que é o tempo de pico de morte de
fotorreceptores nos camundongos controle (Miller et al., 2007).
5.3 - Microglia e Degeneração de Fotorreceptores
As células microgliais possuem papel crucial na resposta imune do sistema
nervoso central e são ativadas durante condições neuropatológicas, com a
finalidade de restaurar a homeostase do sistema (Glezer et al., 2007). A microglia
ativada pode também promover danos neuronais através da liberação de fatores
citotóxicos e pró-inflamatórios, incluindo o TNF-α, IL-1β, IL-6, óxido nítrico (NO) e
espécies reativas de oxigênio (ROS) (Dheen et al.; 2007). A ativação microglial
crônica tem sido implicada na destruição neuronal associada à várias doenças
neurodegenerativas (Wilms et al., 2007). Estudos mostram que mecanismos
contrabalanceadores da ativação microglial são essenciais para o controle dos
possíveis danos ao sistema nervoso central que a eventual atividade exacerbada
da microglia pode causar (McCarty et al., 2006).
Macrófagos tecido-residentes estão presentes em todos os tecidos do
corpo, e o sistema nervoso central não é exceção. Extensiva literatura tem
debatido a origem da grande parte dos macrófagos que se encontram residentes
59
no cérebro e a origem da microglia, especialmente se elas são de origem mielóide
ou neuroectodermal. O fato é que a demora em se conseguir identificar a linhagem
mielóide da microglia, mostra que essas células têm um fenótipo que é distinto de
outros macrófagos teciduais. Muitas evidências têm convergido para estabelecer
que a microglia se origina de uma linhagem mielóide, o que foi reforçado pela sua
ausência no sistema nervoso central de camundongos nulos para PU.1.
(McKercher et al., 1996). Estes mesmos camundongos apresentaram vasta
população microglial habitando o sistema nervoso central após receberem
transplante de medula de camundongos selvagens (Beers et al., 2006).
É importante mencionar que células equivalentes à microglia são
observadas no sistema nervosos central de invertebrados. Estudos com
sanguessugas revelaram uma população de células neuroectodermais
denominadas “pequena glia” (small glia) ou mesmo microglia, e elas fagocitam
debris. Sanguessugas apresentam regeneração axonal e preciso restabelecimento
de contatos sinápticos após lesão de nervo. Curiosamente, o bloqueio do acúmulo
de microglia na região da lesão impossibilita a regeneração axonal (Morgese et al.,
1983; Ngu et al., 2007).
A microglia, no sistema nervoso central de mamíferos adultos, possui corpo
celular (soma) pequeno, um reduzido citoplasma perinuclear e numerosos, finos e
ramificados processos. Estudos de imagens in vivo demonstraram que os finos
processos da microglia continuamente tateiam e monitoram o ambiente ao redor
(Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005).
A literatura defende a premissa de que a microglia ativada provém de um
estado não ativado que apresenta um fenótipo celular ramificado. Uma vez
60
ativada, a microglia assume primeiramente um fenótipo mais robusto, assumindo
em seguida uma forma mais compactada, amebóide, fagocítica (Figura 31).
Todavia, estudos mais recentes questionam o conceito “microglia ativada” uma
vez que mesmo em seu estado ramificado e “inativo” (resting state), a microglia
está constantemente "sentindo e interagindo com o ambiente" ao seu redor e,
portanto, chamá-la de microglia não-ativada seria um equívoco (Hanisch et al.,
2007).
O desenvolvimento do sistema nervoso central é caracterizado por um
excesso na produção de células e de conexões sinápticas. Durante a “lapidação”
do sistema, as células em excesso sofrem apoptose e são fagocitadas pela
microglia sem que haja processo inflamatório (Hume et al., 1983; Perry et al.,
1985; Strei et al., 2001). Foi muito especulado se a microglia poderia induzir ou
facilitar a apoptose de células do sistema nervoso central em desenvolvimento.
Estudos mais recentes têm dado suporte à esta idéia. Cultura de fatias
cerebelares de camundongos neonatos revelaram apoptose de neurônios de
Purkinjie, os quais estavam envoltos em processos microgliais. Além disso, a
eliminação da microglia, com o uso de lipossomos de clodronato, reduziu a taxa
de apoptose dos neurônios de Purkinjie nos mesmos experimentos com cultura de
fatias cerebelares de camundongos neonatos (Marin-Teva et al., 2004).
O tema principal dos estudos que abordam o papel da microglia em
neuropatologias é a dicotomia entre sua contribuição para a neurodegeneração
versus o seu possível papel na neuroproteção. O papel dos macrófagos no reparo
de lesões é bem documentado (Martin et al., 2005). Segundo vários
pesquisadores, o racional por trás de se estudar esta dicotomização é que se
61
pudermos entender os dois componentes, podemos minimizar o nocivo e
maximizar o benéfico (Crutcher et al., 2006; Popovich, 2008). Este é um objetivo
bastante ambicioso quando reconhecemos que ainda nem o foi atingido a ponto
de vantagens clínicas poderem ser obtidas em quaisquer outros órgãos, quem
dirá para o sistema nervoso central imerso em sua grande complexidade. Além
disso, o sistema nervoso central é um órgão imuno-privilegiado no qual as
pressões evolutivas garantiram que as respostas imunes inatas e adquiridas
estejam firmemente controladas.
Figura 31: Esquema da relação fisiologia/fenótipo da microglia. Adaptado de Streit et al., 1999.
Ao compararmos a retina dos camundongos C3H-HeJ com a retina dos
camundongos C57-Bl6 diante de uma imunohistoquímica para a proteína de
superfície CD11b, exclusiva de microglia, observamos uma evidente diferença de
marcação. Nas retinas dos camundongos que apresentam degeneração dos
62
fotorreceptores (C3H-HeJ), a quantidade de microglia na região da camada
plexiforme externa é muito maior. Além disso, o fenótipo da microglia presente
nesta região é compacto e amebóide, fenótipo típico de microglia ativada. As
imunohistoquímicas para CD11b se tornam ainda mais interessantes quando
confrontadas com as marcações de TUNEL em retinas p15 em início de
degeneração. Observamos que nas retinas de C3H-HeJ os fotorreceptores que
começam a sofrer apoptose primeiro são justamente aqueles que estão
adjacentes à microglia.
Existem alguns trabalhos na literatura que mostram que a microglia no
sistema nervoso central pode agir de forma análoga a uma célula natural killer,
podendo liberar íons superóxidos, matando neurônios próximos a ela. Yang e
colaboradores mostraram que o meio condicionado de retina de camundongos
C3B, que apresentam degeneração de cones, era capaz de induzir ativação de
microglia, quando adicionado em cultura de células microgliais (Yang et al., 2006).
Sendo assim, para o nosso grupo, seria interessante testar a relevância da
microglia na degeneração dos fotorreceptores dos camundongos C3H-HeJ em
experimentos futuros.
6 - CONCLUSÃO
Analisando os dados obtidos, pudemos formular um modelo que levanta
algumas hipóteses para explicar os possíveis mecanismos de morte dos
fotorreceptores dos camundongos C3H-HeJ que poderiam ser influenciados pela
via da ERK, células microgliais e pela glia da Müller. Esta proposta está
esquematizada na Figura 32.
63
Uma vez que a microglia é observada ocupando posição adjacente à
camada de fotorreceptores ainda em P14 (Figura 26 e Figura 30), ou seja, antes
de começarmos a detectar marcação para TUNEL, redução da espessura da
camada de fotorreceptores e aumento dos níveis de ERK, torna-se necessária
uma hipótese de sinalização de fotorreceptores para microglia, de forma direta ou
indireta precoce; sinalização esta que recrutaria a microglia para a região-
problema antes mesmo que a degeneração de fato se inicie. Após as células
microgliais chegarem às proximidades dos fotorreceptores, uma sinalização uni ou
multi-direcional pode acontecer entre elas, os fotorreceptores e glia de Müller, com
liberação de substâncias que podem acelerar o processo de degeneração, como
certas quimiocinas e espécies reativas de oxigênio. Por fim, após se dar o
aumento dos níveis de ERK fosforilada na glia da Müller, haveria a possibilidade
de uma liberação de ATP pela glia, que acionaria mecanismos pró-apoptóticos nos
fotorreceptores via receptores da família P2X. Foi mostrado que o aumento dos
níveis de ERK fosforilada é importante para a liberação de ATP por parte de
macrófagos, e que camundongos mutantes, nulos para o receptor de ATP P2X-7,
possuem fotorreceptores mais resistente à morte (Puthussery et al., 2009; Monick
et al., 2008).
64
Durante a janela temporal de degeneração da ONL ocorre aumento de ERK
fosforilada em retinas de camundongos rd1 C3H/HeJ. Vimos que esta
degeneração depende da via da ERK. Todavia, p-ERK não é detectada nos
fotorreceptores, mas sim nas células da glia de Müller e microglia. Além disso, a
presença, fenótipo e localização de células microgliais em retinas de C3H-HeJ,
somados à constatação de uma cinética de degeneração da ONL mais branda in
vitro, sugerem uma correlação entre a microlia e a degeneração retiniana destes
animais.
Concluindo, os dados nos permitem sugerir que o aumento dos níveis de
ERK fosforilada nas células da glia de Müller e possivelmente microglia teria um
papel crucial no mecanismo de morte celular dos fotorreceptores no camundongo
rd1 C3H-HeJ, modelo murino de retinose pigmentar.
65
Figura 32
: Proposta levantada pelo trabalho após evidências obtidas. Números indicam a proposta
ordem cronológica dos eventos.
1
2
3
3
4
66
REFERÊNCIAS
Aguirre, G., Acland G., Li Z., Beltran W., Gu D. Clinical Light Exposure,
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