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LEONARDO LUIZ CALADO
COLETA E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE RÃ-TOURO,
LITHOBATES CATESBEIANUS (SHAW, 1802)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal,
para obtenção do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS-BRASIL
2009
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LEONARDO LUIZ CALADO
COLETA E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE RÃ-TOURO,
LITHOBATES CATESBEIANUS (SHAW, 1802)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal,
para obtenção do título de Magister Scientiae em
Biologia Animal.
APROVADO:
Prof. Ph. D. Luiz Carlos dos Santos
(Co-Orientador)
Prof. Dr. Luis David Solis Murgas
(Co-Orientador)
Prof. Ph. D. José Cola Zanuncio
Prof. Dr. José Teixeira de Seixas Filho
Prof. Dr. Oswaldo Pinto Ribeiro Filho
(Orientador)
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A Deus, na sua infinita sabedoria e amor, por me permitir esta oportunidade e experiência;
aos meus pais Ana e Wilson por seu amor e seus conselhos, sempre apoiadores em
todas as decisões ao longo da vida.
Dedico!
II
AGRADECIMENTOS
Ao Departamento de Biologia Animal, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
da Universidade Federal de Viçosa (UFV) e a Universidade Federal de Lavras,
Departamento de Medicina Veterinária.
Aos Professores Oswaldo Pinto Ribeiro Filho, Luiz Carlos dos Santos e Luis David
Solis Murgas, pela orientação, a amizade, o incentivo e o apoio na realização deste
trabalho.
Aos Professores, José Cola Zanuncio e José Teixeira de Seixas Filho pela
participação na banca da tese.
Aos Professores Priscila Vieira Rosa Logato e Sérgio da Matta pelo apoio e
sugestões.
A minha família, em especial a "Tia Nem", "Titone" e "Tiniltin", que foram sempre
presentes nos momentos de dificuldades desde o meu começo de caminhada.
A minha “eterna” namorada Anelisa pelo convívio, incentivo, paciência e companhia
nestes anos.
Ao amigo, Professor George Shigueki Yasui pelos ensinamentos e incentivo.
Aos amigos e colegas de Ranário Experimental, Christiano, Marcelo "morcego",
Cláudio "lagartixa", pelo convívio e ajuda na realização do trabalho.
Aos meus amigos e colegas, André "Furazoio", Antunes, Ana Júlia, Cíntia, Cris
Nakazawa, Dibuca, Dvar, Elayna, Elecir, Fábio, Fabrício, Gilmara, "Grupo de Capoeira
Angoleiros do Mar", Guilherme, Jaime, Jana, Leo Vaz, Marcelo, Márcio Zangeronimo,
Marquinho, Rafael, Raquel, Sustanis, Simone, Thais, Thiago, Tia Tone, Uedson "Baiano",
William, Zé Ruberto.
Aos funcionários do Ranário Experimental da UFV, Everaldo, Álvaro, Zé Antônio,
Carlos Roberto e Raimundo pelo convívio e auxílio durante a execução do trabalho.
Aos funcionários da Piscicultura, "Seu" Paulo e João "Pindóia" pela amizade.
A todos que, de alguma forma, colaboraram com este trabalho.
MEUS MAIS SINCEROS AGRADECIMENTOS.
III
“A expansão do conhecimento provém da investigação das coisas
Quando se investiga, o conhecimento sofre expansão.
Quando o conhecimento é expandido tornamo-nos sinceros nos propósitos.
Quando formos sinceros nos propósitos, o coração poderá ser corrigido
Quando este for dotado de correção a vida pessoal poderá ser cultivada.
Quando a vida pessoal for cultivada, a comunidade poderá ser regida
Quando a comunidade for regida poderemos governar com ordem
Quando se puder governar com ordem resultará paz no mundo.”
Confúcio
Iv
BIOGRAFIA
Leonardo Luiz Calado, filho de Wilson Luiz Calado Filho e Ana Lúcia Rosa
Calado, nascido em 18 de outubro de 1975, em Belo Horizonte, Minas Gerais.
Em março de 2003, graduou-se no curso de Zootecnia pela Universidade
Federal de Viçosa, (UFV), onde teve bolsa de extensão, (MEC/UFV), com cultivo de
tilápias.
Em março de 2007, ingressou no Curso de Pós-graduação em Biologia
Animal, nível de mestrado, na Universidade Federal de Viçosa.
Em 26 de fevereiro de 2009, vai submeter-se aos exames finais de defesa
de dissertação.
V
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Desencadeamento da resposta hormonal dos ranídeos em relação
a um estímulo ambiental....................................................................
09
FIGURA 2
Marcação dos exemplares de rã-touro, Lithobates catesbeianus
(Shaw, 1802), com etiquetas plásticas fixadas á base das
palmouras...........................................................................................
20
FIGURA 3
Aplicação hormonal intraperitoneal dos exemplares de rã-touro,
Lithobates catesbeianus (Shaw,1802)...............................................
21
FIGURA 4
Coleta de sêmen do exemplar de rã-touro, Lithobates catesbeianus
(Shaw, 1802), por meio de capilaridade utilizando pipeta
volumétrica.........................................................................................
22
FIGURA 5
Etapas de descongelamento do sêmen de rã-touro Lithobates
catesbeianus, (Shaw, 1802)...............................................................
25
FIGURA 6
Volume seminal de rã-touro (Lithobates catesbeianus (Shaw,
1802)) (n= 30) após indução hormonal e 12 horas de coleta............
32
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Principais soluções diluidoras de sêmen para peixes e
anuros.........................................................................................
12
TABELA 2 Classificação dos crioprotetores quanto a permeabilidade através da
membrana celular.....................................................
16
TABELA 3 Concentração ótima de DMSO para criopreservação de sêmen de
espécies de peixe marinho........................................
17
TABELA 4 Hormônio e respectivas dosagens de aplicação para espermiação de
rã-touro.............................................................
23
TABELA 5 Indutores e respectivas dosagens de aplicação utilizadas na
espermiação de râ-touro, Lithobates catesbeianus (Shaw,
1802)...........................................................................................
24
TABELA 6 Percentual de animais espermiados e parâmetros do sêmen mediante
indução hormonal........................................................
27
TABELA 7
Parâmetros seminais de rãs-touro (Lithobates catesbeianus (Shaw,
1802)) avaliados em diferentes tempos após aplicação de acetato de
gonadorelina........................................................
31
TABELA 8 Peso corporal, comprimento total, comprimento rostro cloacal, volume
seminal, motilidade subjetiva, vigor e osmolaridade do sêmen de rã-
touro (Lithobates catesbeianus) antes da submissão aos tratamentos
com crioprotetores.........................
35
TABELA 9 Motilidade, vigor e duração do tempo de motilidade pré-congelamento
de rã-touro com diferentes concentrações de DMSO e
Metanol........................................................................
36
TABELA 10 Influência das concentrações de DMSO e Metanol associados à BTS
5% (m:v) e Lactose 1%(m:v) sobre a motilidade pré-
congelamento.............................................................................
37
TABELA 11 Influência das concentrações de DMSO e Metanol associados à BTS
5% (m:v) e Lactose 1%(m:v) sobre o vigor pré-
congelamento.............................................................................
37
ix
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE FIGURAS............................................................................... ........viii
LISTA DE TABELAS............................................................................... .........ix
RESUMO .......................................................................................................... x
ABSTRACT...................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 01
2. OBJETIVOS .................................................................................................. 03
2.1. Objetivos gerais ..................................................................................... 03
2.2. Objetivos específicos ............................................................................. 03
3. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 04
3.1. Características da espécie .................................................................... 04
3.2. Morfo-fisiologia reprodutiva dos machos ............................................... 06
3.3. Técnica de indução hormonal ................................................................ 07
3.4. Biologia do sêmen ................................................................................ 10
3.5. Osmolaridade ........................................................................................ 11
3.6. Motilidade espermática dos anuros ....................................................... 14
3.7. Motilidade espermática dos peixes ........................................................ 14
3.8. Soluções crioprotetoras ......................................................................... 15
3.9. Congelamento do sêmen ....................................................................... 18
3.10. Descongelamento do sêmen ............................................................... 19
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 19
4.1. Execução dos experimentos .................................................................. 19
4.2. Manejo geral dos animais ...................................................................... 20
4.2.1. Morfometria e mantença .............................................................. 20
4.2.2. Procedimento de indução hormonal ............................................. 20
4.2.3. Coleta de sêmen e avaliação espermática ................................... 21
4.3. Experimento 1: Eficácia hormonal entre diferentes indutores sobre a
espermiação de rã-touro............................................................................. ..22
vi
4.4. Experimento 2: Influência da hora pós aplicação (HPA) sobre os
parâmetros espermáticos ............................................................................. 23
4.5. Experimento 3: Toxidez dos crioprotetores internos e externos, congelamento e
descongelamento ......................................................................................... 23
4.6. Análise estatística .................................................................................. 26
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 26
5.1. Experimento 1: Eficácia hormonal entre diferentes indutores sobre a
espermiação de rã-touro............................................................................. ..26
5.2. Experimento 2: Influência da hora pós aplicação (HPA) sobre os
parâmetros espermáticos ............................................................................. 30
5.3. Experimento 3: Toxidez dos crioprotetores internos e externos, congelamento e
descongelamento ......................................................................................... 35
5.3.1. Aspectos in natura do sêmen de rã-touro .................................... 35
5.3.2. Toxidez dos crioprotetores ........................................................... 36
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 41
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 42
9. ANEXOS ....................................................................................................... 56
Vii
RESUMO
CALADO, Leonardo Luiz., M.Sc. Universidade Federal de Viçosa. fevereiro de 2009.
Coleta e criopreservação do sêmen de rã-touro (Lithobastes catesbeianus Shaw,
1802). Orientador: Oswaldo Pinto Ribeiro Filho. Coorientadores: Luiz Carlos dos Santos e
Luis David Solis Murgas.
O impacto da introdução de espécies exóticas no Brasil e no mundo, é um grande
problema ao desequilíbrio ambiental. O estudo de métodos para otimizar e melhorar a
permanência das espécies nativas em declínio e utilizar o potencial das espécies exóticas
para o fornecimento de alimentos sem prejuízo ao meio, tem sido um desafio para as
atividades de produção animal e conservação das espécies. O objetivo do presente
estudo foi desenvolver um protocolo de espermiação induzida em rã-touro, seguido de
criopreservação seminal. Três experimentos foram conduzidos na Universidade Federal
de Viçosa e Universidade Federal de Lavras, estado de Minas Gerais. O primeiro
experimento avaliou-se a indução da espermiação com extrato bruto hipofisário (EBH –
5000 µg/kg), acetato de buserelina (AB – 13 µg/kg), acetato de gonadorelina (AG – 83
µg/kg) e gonadotropina coriônica humana (hCG – 830 UI/kg). Trinta machos de rã-touro
foram induzidos com esses hormônios e o sêmen coletado por 12 horas. Parâmetros
espermáticos (motilidade, volume, cor, vigor, odor, concentração) foram observados para
se obter o melhor hormônio indutor. No segundo experimento a influência do período após
indução sobre as características seminais foi avaliada. Outro grupo de machos (n=30) foi
induzido com o melhor hormônio obtido do experimento anterior e amostras foram
coletadas em duas, quatro, seis, oito, dez e dose horas após a primeira aplicação. No
terceiro experimento a toxicidade e a criopreservação com crio-soluções compostas por
DMSO (1,0; 2,5; 5,0; 7,5%) e metanol (1,0; 2,5; 5,0; 7,5%) como crioprotetores internos e
Lactose e BTS a 1 e 5% foram avaliadas respectivamente. O sêmen foi diluído nas crio-
soluções e a motilidade espermática, vigor e duração do tempo (n=11) foram avaliados. O
sêmen foi congelado
X
utilizando-se as mesmas soluções crioprotetoras e os parâmetros seminais pós-
descongelamento, também, foram observados. Os dados foram submetidos ao teste de
Kruskal-Wallis e submetidos à análise de variância e de regressão (P<0.05). Somente o
AG e AB induziram a espermiação, onde 100% e 20% dos machos liberaram sêmen,
respectivamente. O período após indução afetou o volume (y = 0,1084x + 1,1527; R
2
=
0,37) e não afetou os outros parâmetros. A motilidade espemática foi afetada pelo
metanol (92,1 ± 8,0%) ou DMSO (89,0 ± 3,0%), embora o vigor (4,2 ± 0,1 e 3,6 ± 0,5) e a
duração da motilidade (287 ± 10s and 252 ± 23s), mostraram efeito significativo. O
metanol associado ao BTS 5% e lactose 1% influenciou o parâmetro motilidade. A
motilidade pós-descongelamento indicou que nenhuma das soluções mantivera a
motilidade espermática. A extração seminal pode ser realizada com o acetato de
gonadorelina até 10 horas após a primeira aplicação.
xi
ABSTRACT
CALADO, Leonardo Luiz., M.Sc., Universidade Federal de Viçosa. February, 2009.
Seminal sampling and cryopreservation in the bullfrog (Lithobastes catesbeianus
(Shaw, 1802). Adviser: Oswaldo Pinto Ribeiro Filho. Coadvisers: Luiz Carlos dos Santos
and Luis David Solis Murgas.
The impact caused by alien species in Brazil and over the world presents consequences
for native populations of frogs. The development of methodologies to preserve the native
species and optimize the food production is a challenging task for aquaculture. The aim of
the present study was to develop a protocol of induced spermiation in the bullfrog
Lithobastes catesbeianus followed by sperm cryopreservation. Three experiments were
conducted at Universidade Federal de Lavras and Universidade Federal de Viçosa, Minas
Gerais State. The first experiment aimed to evaluate the induced spermiation using carp
crude pituitary gland (CPE – 5000 – µg/kg), buserelin acetate (BA – 13 µg/kg), gonadorelin
acetate (GA – 83 µg/kg), and human chorionic gonadotropin (hCG – 830 IU/kg). Thirty
males were induced with the mentioned hormones followed by sperm sampling 12 hours
afterwards. Sperm parameters (sperm motility, volume, color, vigor, odor, concentration)
were compared in order to obtain the best hormone inducer. In the experiment 2, we
aimed to evaluate the influence of the period after inducement on sperm traits. Another
group of males (n=30) were induced using the best procedure obtained above and then
the sperm was sampled at 2, 4, 6, 8, 10 and 12 hours afterwards. In the experiment 3, we
have evaluated the toxicity and cryopreservation success using cryo-solutions composed
by DMSO (at 1,0; 2,5; 5,0 and 7,5%) and methanol (at 1,0; 2,5; 5,0 e 7,5%) as the main
cryoprotectants; and BTS at 1 or 5%. Sperm was diluted using the cryo-solutions and then
observed the motility parameters (sperm motility, VIGOR and duration; n=11). The sperm
was also cryopreserved using the same cryo-solutions and cooled in vapour nitrogen
vessel (dry-shipper), and then observed the post-thawed sperm parameters. Data were
xii
compared by Kruskal-Walis test and Anova followed by regression analysis (P<0.05). Our
results indicate that only AG and AB succeed to induce spermiation, where 100% and 20%
of the males released the sperm, respectively. The period after inducement have
influenced the sperm parameters of volume (y = 0,9727 + 01327x; R
2
= 0,50) and
concentration (y = -0,1784x + 2,5878; R
2
= 0,86), although there was not a significant
effect for other parameters. Regarding the toxicity of the cryoprotectants, the sperm
motility did not show a significant effect with methanol (92,1 ± 8,0%) or DMSO (89,0 ±
3,0%), although sperm vigor (4,2 ± 0,1 and 3,6 ± 0,5) and the duration of motility (287 ±
10s and 252 ± 23s, respectively) showed a significant effect. A clear interaction was
observed on motility parameters when methanol at 1% was associated with BTS at 5%
and lactose at 1%. Similar trend was observed when DMSO or methanol was associated
with lactose or BTS. Data regarding the post-thawed motility indicate that none of the cryo-
solutions succeed in maintain the sperm motility. In conclusion, the sperm sampling was
optimized using gonadorelin acetate followed by sperm sampling 10 hour afterwards.
Other investigations are stil necessary in order to improve the cryopreservation success.
xiii
1. INTRODUÇÃO
A produção animal pode potencializar a qualidade e a quantidade de
alimento de origem animal para o consumo humano e as espécies exóticas
podem ser utilizadas para este processo já que possui características
zootécnicas para tal. Espécies invasoras como a rã-touro Lithobates
catesbeianus (SHAW, 1802), são responsáveis por impactos no ambiente, por
competir por alimento e predar espécies nativas, e causar desequilíbrio trófico,
por ser um predador não específico. O estudo de métodos para aperfeiçoar e
melhorar a permanência de espécies nativas e utilizar o potencial das exóticas
para fornecer alimento para o consumo humano sem prejuízo à fauna nativa de
anuros representa um desafio a produção animal e conservação das espécies.
A introdução de espécies no ambiente contribui para o declínio de
populações, principalmente de anfíbios nativos. Outras causas que colaboram
para o declínio da população mundial de anfíbios incluem infecções por fungos,
vírus ou bactérias, aumento da radiação ultravioleta, secas drásticas, habitats
poluídos com herbicidas ou inseticidas, precipitação ácida e desmatamento
(Junca, 2001 e Michael e Jones, 2004).
No Brasil, a rã-touro, Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802), foi
introduzida na região da Baixada Fluminense no Rio de Janeiro na década de
1930 para a ranicultura. Trezentos casais de rã-touro, oriundas dos Estados
Unidos, deram origem ao primeiro ranário brasileiro, o Ranário Aurora. As
características zootécnicas atrativas das rãs foram determinantes nos projetos
de implantação da ranicultura no Brasil, que, por isso, tem apresentado bons
índices de crescimento no manejo e produção animal.. (OLVERA-NOVOA et al.
2007; BRAGA et al. 2005; MARTÍNEZ et al. 2004; LIMA et al. 2003; SOMSUEB
e BOONYARATPALIN, 2001; RIBEIRO FILHO, 1999; RIBEIRO FILHO, 1994;
VIZOTTO, 1979).
Animais como: Rana pipiens, Lithobates catesbeianus e Xenopus sp.
têm sido muito utilizados em pesquisa pela semelhança morfológica e
fisiológica com os vertebrados superiores (CULLEY JR., 1973). Inúmeros
trabalhos de fisiologia, ecologia e aspectos da biologia básica, foram realizados
sem escala proporcional àqueles da biologia aplicada. Por isto a conservação
de espécies de anuros e a ranicultura apresentam carência em aspectos
importantes do sistema conservacionista e produtivo.
Técnicas aplicadas à reprodução, como a indução hormonal, se
apresentam como ferramentas importantes, pois proporcionam vantagens
como a padronização em idade e tamanho dos animais, podendo, inclusive,
reduzir o período inter-reprodutivo, além de tornar factível a aplicação de
biotécnicas importantes como a manipulação cromossômica (WAGGENER e
CARROLL JR, 1998; ARAI, 2000). Contudo, a intensificação da produção de
alimentos, taxas de ocupação do espaço e avanços tecnológicos contribuem
mais para o declínio populacional de anfíbios e de espécies, o que leva a
tendência de se empregar mais recursos tecnológicos para mitigar o impacto
destas atividades. A melhoria da produção animal e a adoção de linhagens de
melhor desempenho levariam à tendência de se empregar a rastreabilidade, o
que justifica a adoção de técnicas como a reprodução artificial e a
criopreservação de gametas.
O conhecimento das características seminais básicas pode aperfeiçoar o
processo produtivo das espécies domésticas e criar bancos de sêmen
daquelas ameaçadas de extinção. Parâmetros da capacidade fecundante dos
espermatozóides e sua estocagem permitem melhorar a utilização das
amostras seminais e reduzir o plantel de reprodutores de diversas espécies, e
comercialmente, interferir no manejo, e nos custos de produção. Apesar dos
avanços da reprodução induzida em rã-touro (ROSEMBLIT et al., 2006;
AGOSTINHO et al., 2000; BROWNE et al., 2001; WAGGENER e CARROLL
JR, 1998), outros aspectos são necessários para a sua otimização, entre eles o
conhecimento de características andrológicas básicas tais como métodos para
a obtenção, avaliação e armazenamento de amostras seminais de qualidade.
Assim com o presente trabalho objetiva-se discutir e elaborar formas de
obtenção de sêmen utilizando métodos de indução hormonal e extração para
posteriormente armazená-lo sob congelamento em nitrogênio líquido com
intuito de poder melhor aproveitá-lo para trabalhos futuros.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
A realização deste trabalho teve como principal objetivo desenvolver
protocolos de indução hormonal com um análogo sintético de GnRH (hormônio
liberador de gonadotropinas) para otimizar a coleta e de congelamento de
sêmen com extração seminal do animal vivo, pois, os demais protocolos
prevêem, em sua maioria, eutanásia dos animais e extração testicular.
2.2. Objetivos específicos
1. Identificar o indutor mais eficaz na obtenção de espermiação;
2. Verificar o tempo mais adequado para a coleta de sêmen após aplicação do
indutor mais eficaz;
3. Determinar qual o grau de toxicidade das soluções crioprotetoras e sua
eficácia pré e pós-congelamento;
4. Criopreservar o sêmen da rã-touro Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802).
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Características da espécie
A espécie Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802) (previamente Rana catesbeiana) pertence à
classe dos anfíbios, ordem Anura e família Ranidae, com distribuição geográfica que se estende do
Canadá, Estados Unidos até o México, embora tenha sido disseminada para outras regiões do globo,
incluindo Europa e América do Sul (FLORES-NAVA, 2000). No Brasil, é a única espécie de rã utilizada
em produção comercial.
A alta exigência protéica de Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802) leva
ao hábito alimentar carnívoro dessa espécie da fase pós-metamórfica à fase
adulta, incluindo insetos, pequenos mamíferos, peixes, répteis e, também,
outros anfíbios (REEDER, 1964). Em cativeiro, essa rã pode receber
treinamento e consumir alimentos artificiais (ração). A grande aceitação pelo
consumidor e os bons preços no mercado atenuam os custos de produção e
justificam a criação comercial da espécie.
A rã-touro é um animal ectotérmico com a temperatura corporal variando
de acordo com a do ambiente. A sua reprodução é um fenômeno cíclico e a
prole, geralmente, é produzida na época do ano mais propícia a sobrevivência.
Os acontecimentos fisiológicos endógenos, que regulam a atividade funcional
gonadal, são sincronizados por fatores ambientais como fotoperíodo,
temperatura e umidade relativa do ar para garantir o sucesso reprodutivo
(LOFTS, 1974).
A rã-touro é um animal prolífico e precoce e está apta a reprodução aos sete meses de idade,
quando têm entre 150 e 200 g e podem gerar de 3.000 a 5.000 ovócitos segundo Lima e Agostinho
(1988). Após dois anos, a produção de ovócitos pode aumentar e atingir valores superiores a 24.000 ovos
(RIBEIRO FILHO, 1994). As rãs-touro atingem a maturidade sexual um ano após completarem a
metamorfose em habitat natural, o que as torna reprodutivamente dependentes do ambiente em que se
encontram (DUELLMAN e TRUEB, 1994). No entanto, rãs em cativeiro atingiram a maturidade sexual
de quatro a seis meses após a metamorfose (AGOSTINHO, 1995). Em trabaho realizado por Ferreira et
al. (2002) observa-se que, em condições tropicai, a postura dessa rã variou de 5.000 a 20.000 ovos, com
valores semelhantes à observada por Lima e Agostinho (1988). O tamanho das fêmeas a primeira
maturação foi de 10,33cm, com peso vivo de 109,78g e para os machos o valor foi de 8,09 cm e 45g,
confirmando a precocidade destes em relação às fêmeas. A maturidade é atingida quando os machos
alcançam 254 g e as fêmeas 209 g (COSTA, 1992).
A rã-touro tem comportamento reprodutivo como à maioria dos anuros: são animais
territorialistas e os machos defendem a área escolhida em corpos permanentes de água. A reprodução, nos
trópicos, acontece frequentemente na primavera e no verão, quando os machos vocalizam para atrair a
fêmea, que tem como característica principal de corte, a natação e movimento lentos ao aproximarem dos
machos. A estação reprodutiva pode durar todo o ano desde que as condições ambientais sejam
manipuladas para isto. Os machos, ao permitirem a chegada da fêmea, realizam o amplexo axilar que
pode durar horas até a liberação total dos ovócitos e do esperma. Referente ao desenvolvimento
ontogênico, os ovos expostos a temperaturas acima de 27,7°C desenvolvem de maneira anormal e com
menor eclodibilidade. Assim, essa espécie concentra as desovas nos períodos mais quentes do ano e as
posturas são realizadas em corpos d’água com temperaturas amenas (TYNING, 1990; POUGH, 2003).
3.2. Morfo-fisiologia reprodutiva dos machos
O sistema reprodutor masculino da rã-touro é constituído pelas gônadas masculinas, comumente
chamadas testículos, com duas estruturas ovóides amareladas, na superfície ventral anteriormente aos rins
e suportadas por um ligamento denominado mesórquio. Possui. também, ductos eferentes (arquinéfricos
ou de Wolffian) responsáveis pela condução dos espermatozóides aos rins mesonéfros; um par de corpos
gordurosos ou adiposos, que são estruturas digitiformes inseridas na porção anterior dos ligamentos
gonadais culminando com a cloaca, anteriormente situada ao ânus, que recebe o bolo fecal proveniente do
reto, urina, sêmen e ovócitos provenientes do sistema urogenital, sendo assim eliminados para o meio
externo (DUELLMAN e TRUEB 1994).
Os testículos têm túbulos seminíferos contornados por uma cápsula de epitélio germinativo responsável
por seu alinhamento dentro do mesmo, onde a gametogênese ocorre, uniformemente. Tais estruturas estão
inseridas em um tecido intersticial composto basicamente por tecido conjuntivo, capilares, células de
Leydig, esta última responsáveis pela produção de andrógenos (LOFTS, 1974). Outra célula, presente nos
túbulos seminíferos e que atuam na nutrição dos espermatozóides são as de Sertoli. Essas têm citoplasma
hialino, núcleo volumoso medianamente basófilo, sem nucléolos aparentes e são produtoras de inibina,
uma proteína ligadora que transformam andrógenos que são produzidos nas células de Leydig em
estrógenos (COSTA et al., 1998).
A espermatogênese de anuros é composta por oito divisões celulares que culmina na formação de 200
células germinativas (espermatócitos primários) a partir de uma espermatogônia, que nos anamniotas é
denominada cística (LOFTS, 1974).
A Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802) possui dimorfismo sexual, em
alguns machos, a rugosidade nos membros anteriores, a região gular com
tonalidade amarelada e diâmetro da região timpânica são relativamente
maiores que a das fêmeas. As características sexuais podem variar de
intensidade quando se aproxima o período reprodutivo, tornando-se mais
conspícuas, quando a rã está apta para o acasalamento (ALONSO 1997). A
definição sexual nas rãs ocorre em nível cromossômico e hormonal, sendo os
testículos e os ovários definidos como características sexuais primárias e
aqueles fenotípicos as secundárias (AGOSTINHO, 1995). Além das
características sexuais secundárias, os anuros incluem outros parâmetros
como contagem diferenciada das células vermelhas do sangue, tamanho do
pulmão, padrões comportamentais (como o fato de somente o macho emitir
vocalizações de acasalamento) e diferenças fisiológicas e estruturais entre os
sexos (LOFTS, 1974; FERREIRA et al., 2002).
Os estádios testiculares de rã-touro foram definidos em total de cinco:
estádio um, caracterizado pela predominância de espermatogônias G1; dois,
início da maturação, fase em que é marcante o começo da atividade
espermatogênica; três, maturação intermediária, marcada pelo aumento no
número de espermatócitos secundários; quatro, maturação avançada, na
presente fase os testículos atingem seu grau máximo de desenvolvimento e
cinco, esgotado o lume dos túbulos seminíferos, nesta fase se encontra amplo
e esvaziado, apenas com a presença de espermatozóides residuais. Após o
estádio cinco não se observou retorno ao estádio de repouso para os machos,
o que sugere que o processo de espermatogênese ocorra continuamente nos
indivíduos adultos (COSTA et al., 1998).
3.3. Técnica de indução hormonal
A indução hormonal em animais domésticos é utilizada para aperfeiçoar a obtenção de gametas
viáveis para a obtenção de esperma para bancos de sêmen, planejamento e ciclagem do período
reprodutivo e melhoramento genético animal. A indução hormonal em anfíbios foi conseguida a partir da
aplicação de LH mamífero e de gonadotropina coriônica humana (hCG) (LOFTS ,1974). Os anuros por
apresentar fecundação externa o desenvolvimento de técnicas de inseminação artificial podem ser
consideradas mais simples (KOUBA, 2009). Isto é comprovado pelo uso de hormônios exógenos para
induzir a espermiação em uma grande variedade de sapos e rãs (BROWNE et al., 2006; WAGGENER e
CARROLL JR., 1998).
O hormônio exógeno para indução à reprodução age sobre as gônadas ou sobre a glândula
hipófise. Esta se localiza numa depressão da caixa craniana do osso esfenotimóide (RIBEIRO FILHO,
1994), sendo composta por cinco partes, a adeno-hipófise, (pars distalis, ou lobo anterior), neuro-hipófise
(pars nervosa, ou lobo posterior), pars intermédia (lobo intermediário), pars tuberalis e pars distalis. A
adeno-hipófise possui cinco tipos de células secretoras, com destaque para aquelas gonadotrópicas
responsáveis pela síntese e secreção dos hormônios folículo estimulantes (FSH) e luteinizantes (LH) que
tem como principal órgão alvo as gônadas sexuais. O controle da liberação dos hormônios adeno-
hipofisários é regido pelo hipotálamo que, por intermédio da circulação porta hipofisária, secreta o
hormônio liberador de gonadotropinas também conhecido como GnRH (DICKSON, 1996)
A reprodução influenciada pelas condições climáticas tem inicio no hipotálamo, que é
estimulado e secreta os GnRH que agirão sobre a adeno-hipófise liberando gonadotropinas. Esses
compostos atuam sobre as gônadas provocando a síntese de esteróides importantes no comportamento
sexual, maturação das gônadas e reprodução. Estes esteróides são responsáveis pelo mecanismo de retro-
alimentação sinalizando o fim do processo reprodutivo, induzindo, por seu aumento, o hipotálamo e a
hipófise a diminuírem as taxas secretoras de hormônios reprodutivos (AGOSTINHO, 1995). O sistema do
hormônio liberador de gonadotropina é o principal regulador neuroendócrino do eixo hipotalamico-
hipofisário-gonadal na maioria dos vertebrados incluindo os ranídeos (TSAI et al., 2003) (Figura 1).
Estímulo
Ambiental
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
Adenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADAS
Andrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Fonte: modificado de BALDISSEROTTO (2002)
Estímulo
Ambiental
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
Adenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADAS
Andrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Estímulo
Ambiental
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
Adenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADAS
Andrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Estímulo
Ambiental
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
Adenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADAS
Andrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Estímulo
Ambiental
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
Adenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADAS
Andrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Cérebro
Hipotálamo
GnRH
AdenohipófiseAdenohipófise
Gonadotropinas
(LH, FSH)
Gonadotropinas
(LH, FSH)
GÔNADASGÔNADAS
Andrógenos e EstrógenosAndrógenos e Estrógenos
Comportamento
Reprodutivo
Comportamento
Reprodutivo
Caracteres sexuais
secundárias
Caracteres sexuais
secundárias
Produção de
gametas
Produção de
gametas
Fonte: modificado de BALDISSEROTTO (2002)
FIGURA 1. Desencadeamento da resposta hormonal dos ranídeos em relação a um estímulo ambiental
A técnica de indução hormonal para a produção animal inclui a aplicação de extrato bruto
hipofisário de animais doadores (fêmeas de rãs-touro com características secundárias reprodutivas
evidentes e em estágio de maturação gonadal adequado) dissolvidos em solução fisiológica de Ringer,
aplicados intraperitonealmente em um animal receptor que também deve possuir estádio gonadal apto a
receber a dose hormonal (LIMA e AGOSTINHO, 1988). A padronização dessa técnica mostrou que o
melhor protocolo de indução ao acasalamento deveria conter duas doses de 5,5 mg de extrato bruto
hipofisário de rã-touro por quilograma de peso vivo aplicadas no músculo interno da coxa (Gracillis
maior) em um intervalo de seis horas, ou 7,7 mg nas mesmas condições com exceção para o intervalo de
aplicações que foi de dezoito horas. A definição da aplicação para os machos, seria de 50% do total das
fêmeas em aplicação única, ao mesmo tempo em que se aplica a segunda dose nas mesmas (RIBEIRO
FILHO et al., 1998a, b).
O LHRHa (10µg/kg), foi utilizado para a extrusão em Rana catesbiana
(SHAW, 1802) enquanto 300 U.I. de hCG/animal para indução de Bufo baxteri.
O hormônio LHRH na concentração de 0,1mg/kg foi utilizado para induzir
espermiação em três espécies de anuros (Rana lessonae, R. esculenta, R.
ridibunda) (BROWNE et al., 2006; REYER et al., 2003; AGOSTINHO et al.,
2000, 1996).
Amostras de sêmen testicular foram obtidas na maioria dos protocolos, sem indutores (MICHAEL e
JONES, 2004; EDWARDS et al. 2004; BEESLEY et al., 1998; REINHART et al., 1998; HOLLINGER e
CORTON, 1980; RICHARD, 1973; SHIVERS e JUDITH, 1971). Esse método de coleta apresenta
limitações como o percentual de gametas viáveis, o que, geralmente, é atenuado superestimando a dose-
inseminante (SHIMODA, 2007). Contudo, a coleta e a utilização de dosagens ótimas de espermatozóides
evitam o sacrifício dos animais e propicia uma utilização mais racional do sêmen, o que pode refletir nos
custos de produção e na conservação das espécies.
Diversos indutores reprodutivos como macerado de hipófise desidratada
de carpa, gonadotropina coriônica humana e hormônios liberadores de
gonadotropinas podem ser utilizados para a maturação final das gônadas
(ANDRADE e YASUI, 2003). O uso de indutores em peixes é bem difundido
para a maturação gonadal final, principalmente em fêmeas de espécies
reofílicas, visto que a maturação final dos ovócitos não acontece em ambientes
lênticos, e pesquisas com tais indutores ainda possuem aspectos que não
foram completamente elucidados em anuras (WOYNAROVICH e HORVÁTH,
1989). O conhecimento desses processos reprodutivos é relevante para a
reprodução por estar relacionado com a multiplicação de indivíduos para as
fases posteriores do ciclo produtivo.
3.4. Biologia do sêmen
A averiguação da qualidade seminal é realizada por avaliação microscópica em várias espécies, mas esta,
isolada, não é capaz de predizer com precisão a capacidade fecundante do sêmen (SOUZA et al., 2001).
Em Crinia georgiana as características seminais, freqüentemente,
mostram extrema variação inter e intra-específicas, que pode ser devido à
competição, onde o espermatozóide mais capacitado a deixar descendentes
seria aquele onde os parâmetros espermáticos tais como variação numérica
(concentração), volume, motilidade e longevidade fossem melhores e assim
aumentando a capacidade fecundante. A motilidade e a longevidade do
espermatozóide são os mais importantes para determinar a habilidade de
fertilização dos machos (HETTYEY e ROBERTS, 2006). Os espermatozóides
dos anuros são altamente móveis por breves períodos em um meio
hiposmótico e são quiescentes em soluções balanceadas de sais (HARDY e
DENT, 1986).
O sêmen de anuros apresenta semelhanças com o de peixes, e a motilidade espermática é a principal
característica comum entre esses dois grupos. Em ambos sua iniciação depende da interação com o meio
aquático. Nesses grupos os espermatozóides são imóveis no trato reprodutivo, mas em contato com o
meio circundante apresentam alterações da concentração osmótica ou iônica que alteram a polarização do
cálcio da membrana, dando início a motilidade (COSSON, 2004; MORISAWA et al., 1983). O
decréscimo da osmolaridade inicia a motilidade espermática em anuros, o que enfatiza o emprego de
metodologias de coleta de sêmen que evitem a contaminação das amostras seminais com a urina e água.
A contaminação de amostras seminais por urina foi discutida para várias espécies de peixes (PERCHEC-
POUPARD et al, 1998; DREANNO et al, 1998; LINHART et al, 1999; HARVEY, 1983; GLOGOWSKI
et al., 2000) e anuros (HOLLINGER e CORTON, 1980).
3.5. Osmolaridade
O número de partículas presentes em uma solução afeta a motilidade dos espermatozóides que são
imóveis nos órgãos reprodutivos de muitas espécies de peixes marinhos, de água doce e de anfíbios
(INODA e MORISAWA, 1987). Os espermatozóides são imóveis em um meio isotônico ou com uma
osmolaridade pouco hipertônica em relação ao plasma seminal, sendo iniciada a motilidade logo encontre
o meio hipotônico (BERNARDINI et al., 1988). A alta osmolaridade do sêmen em relação ao meio
previne o gasto de energia pelo acionamento precoce da motilidade. O sêmen pode ser diluído em
soluções para manter a osmolaridade do meio constante, a qualidade seminal também pode ser mantida ao
se aumentar a disponibilidade de oxigênio para as células e reduzir a concentração de proteínas do plasma
seminal capazes de degenerar com o passar do tempo. (BILLARD e COSSON, 1992). As soluções
diluidoras na literatura são compostas basicamente por sais e tampões (Tabela 1). Soluções diluidoras são,
também, utilizadas como imobilizadoras para atenuar efeitos de contaminação por urina e sangue, e até
mesmo reimobilizar os espermatozóides natantes devido ao aumento da osmolaridade (LINHART et al,
2005; BILLARD e ZHANG, 2001).
TABELA 1. Principais soluções diluidoras de sêmen para peixes e anuros
Solução
diluidora
Componentes Espécie utilizada Referência
Peixes
NaCl NaCl 1,2%
Brycon insignis
SHIMODA
(2004)
Trealose Trehalose
Cyprinus carpio
WARNECKE
e PLUTA
(2003)
Solução de
Ringer
modificada
128,3mM NaCl
23,6mM KCl
2,1mM MgCl
2
3,6mM CaCl
2
Misgurnus
anguillicaudatus*
ARAI et al.
(1993)
Solução
imobilizadora
para Silurus
Glanis
200mM NaCl; 30mM
Tris-HCl
Silurus glanis
LINHART et
al. (2005)
Solução
diluidora de
Kurokura
128,4mM NaCl
2,7mM KCl
1,4mM CaCl
2
2,4mM NaHCO
3
Cyprinus carpio
Tinca tinca
Ctenopharyngodon idella
KUROKURA
et al. (1984);
WARNECKE
e PLUTA,
(2003)
Soluções
diluidoras à
base de sais e
açúcares
350mM glicose
30mMTris
Cyprinus carpio
HORVÁTH
et al. (2003)
300mM sacarose
30mMTris
350mM frutose
30mMTris
200mM KCl
30mMTris
Solução
diluidora para
ciprinídeos
75mM NaCl
70mM KCl
2mM CaCl
2
1mM MgSO
4
20mM Tris-base
0,5% glicina
Barbus barbus
Chondrostoma nasus
Ctenopharyngodon idella
Cyprinus carpio
Hypophtalmichtys molitrix
Leuciscus cephalus
Rutilus meidingerii
LAHNSTEIN
ER et al.
(2000)
Vimba vimba
Continuação da tabela 1
Anuros
Solução de
DeBoer
110mM NaCl
0,44mM CaCl
2
1,3mM KCl
NaHCO
3
(pH7,3)
Xenopus laevis
VO e
HEDRICK
(2000);
CHRISTENS
SEN et al.,
(2004) ;
REINHART
et al., (1998)
Solução de
Holtfreter
60 mM NaCI
1 mM KCI
1 mM CaCl
2
1 mM MgCI
2
5 mM Tris-hydroximetil
amino metano
(pH 8,0)
Rana pipiens
Rana lessonae, Rana
esculenta, Rana ridibunda
SHIVERS e
JUDITH
(1971)
REYER et al.
(2003)
Solução de
Ringer para
anfíbios
113 mM NaCl
2 mM KCl
1,35 mM CaCl
2
1,2 mM NaHCO
3
Limnodyanastes
tasmaniensis,
Rana pipiens
EDWARDS
et al. (2004)
BRIGGS
(1952)
Solução de
Ringer para
anfíbios
simplificada
113 mM NaCl
1 mM CaCl
2
2 mM KCl
3,6 mM NaHCO
3
(pH7,2)
Bufo marinus
RUGH
(1962);
BROWNE et
al. (2001)
Solução F1
41.25 mM NaCl
1.75 mM KCl
0.5 mM NaHPO
4
1.9 mM NaOH
2.5 mM HEPES
0.063 mM MgCl
2
0.25 mM CaCl
2
(pH 7.8)
Xenopus laevis
GLAHN e
NUCCITELLI
(2003)
OR2
(82.5 mM NaCl, 2.5 mM
KCl, 1.0 mM CaCl2 1.0
mM MgCl2, 1.0 mM
Na2HPO4, 5.0 mM
Hepes; pH 7.8)
Xenopus laevis
BUGRIM et
al., 2003
Fonte: YASUI (2007)
3.6. Motilidade espermática dos anuros
A espécie Crinia georgiana possui fertilização externa e por isto as
características do sêmen como motilidade e longevidade do espermatozóide e
do meio em que são liberados são decisivas para a determinação da
paternidade (HETTYEY e ROBERTS, 2006). Por outro lado, na maioria dos
Urodelas o meio não tem tanta influência sobre as características do ejaculado,
pois o espermatozóide é depositado em espermatóforos e estão previamente
ativados (HARDY e DENT, 1986). A duração da motilidade do sêmen dos
animais com fertilização externa, como os anuros, é mais curta que daqueles
de fertilização interna pela exposição imediata após a espermiação a um
ambiente adverso (CHRISTENSEN et al., 2004).
As fases da motilidade podem ser classificadas como pouco móvel,
progressivo ou hiperativo, fases estas definidas para Xenopus laevis e que
podem ser distinguíveis ao microscópio. Espermatozóides com baixa
motilidade têm acentuada vibração do corpo celular sem saírem do lugar, o
espermatozóide gira em torno do próprio eixo e se move a frente em
movimentos helicoidais. A hiperativação é caracterizada por alta amplitude do
batimento flagelar em movimentos circulares e aumento da velocidade
(CHRISTENSEN et al., 2004).
3.7. Motilidade espermática dos peixes
A motilidade em peixes é um dos principais parâmetros espermáticos,
por estar relacionado com a capacidade fecundante do sêmen (BILLARD e
ZHANG, 2001). Após a ativação os espermatozóides têm tempo limitado para a
fertilização dos ovócitos e a duração da motilidade sendo espécie-específica.
Na maioria dos casos tem duração de alguns minutos, como para a carpa e a
tilápia (YASUI, 2007), e o dojo (YOSHIKAWA et al., 2007), mas podem durar
de 30-40 segundos, como em Epalzeorhynchus frenatus (VIDAL JR et al.,
2002), Clarias gariepinus (MANSOUR et al., 2004) e salmonídeos
(KOBAYASHI et al., 2004; SCOTT e BAYNES, 1980).
A metodologia de observação da motilidade é importante, pois a técnica
mais utilizada, a diluição em duas etapas, consiste em uma pré-diluição não
ativadora, com solução diluidora e uma diluição ativadora. Essa técnica
possibilita melhor visualização e ativação simultânea dos espermatozóides no
campo óptico, embora seja necessária uma solução diluidora que não
comprometa a qualidade seminal (BILLARD e COSSON, 1992).
O sêmen obtido por extrusão, geralmente apresenta motilidade superior
a 80% para peixes (LINHART et al., 1999 e 2005; RURANGWA et al., 2004). A
motilidade espermática em anuros apresenta valores mais baixos e maior
variabilidade. Além das características intrínsecas destes grupos, isto pode
ocorrer devido à metodologia de coleta, com maceração testicular e, neste
caso, outros tipos celulares da linhagem espermatogênica podem também,
estarem presentes (CHRISTENSEN et al., 2004).
3.8. Soluções crioprotetoras
O glicerol é um crioprotetor eficiente na conservação de células seminais (POLGE et al., 1949) e
representou um grande avanço na criopreservação, embora houvesse pouco aprimoramento sobre as
técnicas na década de 1950. Apesar disso, a implantação dessa nova tecnologia surtiu um grande impacto
na criação animal, especialmente de gado (HOLT, 2000). As soluções crioprotetoras são acrescidas ao
meio diluidor para proteger as células contra crioinjurias durante o congelamento e o descongelamento.
Os crioprotetores protegem as células contra as criolesões, mas em concentrações elevadas se tornam
tóxicas para o espermatozóide e devem ter alta solubilidade em água e toxicidade reduzida (MILIORINI,
2006).
Os crioprotetores são classificados de acordo com a capacidade de permeabilidade através da
membrana celular e são intracelulares (glicerol) e extracelulares que agem basicamente como
estabilizadores de membrana (lactose). As propriedades físico-químicas são o que determinam sua
capacidade de penetração pela membrana, aqueles com baixo peso molecular têm acesso facilitado ao
interior da célula. Diversos crioprotetores foram classificados quanto à permeabilidade através da
membrana (MILIORINI, 2006) (Tabela 2).
TABELA 2. Classificação dos crioprotetores quanto à permeabilidade através da membrana celular
Crioprotetores intracelulares
(solúveis)
Crioprotetores extracelulares (não
solúveis)
Dimetilsulfóxido (DMSO) Glicose
Glicerol Sacarose
Metanol Gema de ovo
Etilenoglicol Leite desnatado
Propilenoglicol Soro
Propanodiol Água de coco
Butanodiol Lactose, HOLT (2000)
Acetamida
Fonte: Modificado de MILIORINI (2006)
A uilização de crioprotetores intracelulares é imprescindível para anular ou reduzir os efeitos
deletérios da formação de microcristais de gelo durante o congelamento, ao removerem osmoticamente a
água intracelular responsável pelo choque osmótico causado pela reidratação celular durante o
descongelamento (ROBLES et al., 2005). Os crioprotetores internos têm maior interação com a
membrana plasmática e podem danificar a mesma por serem tóxicos em temperaturas elevadas. Alguns
protocolos que utilizam o dimetilsulfóxido preconizam sua utilização com tempo de contato entre o
crioprotetor e a membrana e temperatura de 4°C para minimizar ou evitar esses efeitos (WEWETZER e
DILMAGHANI, 2001). O crioprotetor mais efetivo é aquele com rápida difusão através da membrana e
menor grau de toxicidade para a célula (SIMEONE, 1998). A associação entre crioprotetores solúveis e
não solúveis devem ser usadas para a crioproteção das células espermáticas (GODINHO, 2003;
CAROLSFELD e HARVEY, 1999).
O crioprotetor intracelular deve ser eficaz para a proteção das células pela sua capacidade de permear
a membrana plasmática e toxicidade. O metanol é um crioprotetor solúvel e, com o glicerol e o
dimetilsulfóxido, são os mais utilizados na crioproteção de células espermáticas de anfíbios e peixes, no
entanto é considerado o mais tóxico, apesar de todos terem o grau de toxicidade variável entre espécies de
organismos (BROWNE et al., 2002; BEDORE, 1999).
Polímeros, açúcares e componentes anfipáticos são utilizados como crioprotetores, incluindo
compostos e moléculas como a lactose e a rafinose, sendo a primeira utilizada em combinação com o
glicerol para evitar danos às células de mamíferos carnívoros (HOLT, 2000).
As concentrações de crioprotetores variam com a espécie, tipo celular (gametas ou células somáticas)
e protocolo de congelamento (slow-cooling, vitrificação, etc). Soluções de 0,5M de metanol, glicerol,
DMSO e etilenoglicol soluções convertidas em percentuais de 1,6%, 4,6%, 3,9% e 14,6%,
respectivamente, apresentaram proteção semelhante e evitaram a lise celular de espermatozóides
(BEESLEY et al., 1998). Os percentuais de concentrações e os autores de protocolos para nove espécies
de peixes marinhos com a variação entre crioprotetores, e entre crioprotetores (SUQUET et al., 2000)
(Tabela 3).
TABELA 3. Concentrações ótimas de DMSO para criopreservação de sêmen de espécies de peixes
marinhos
Espécies Concentração (%) Referência
Atlantic croaker 15
Gwo et al. (1991)
Barramundi 5 Leung (1987)
Black grouper 20
Gwo et al. (1993)
Grouper 10 Withler e Lim (1982)
Ocean pout 20 Yao et al. (1995)
Pacific herring 15 Pillai et al. (1994)
Seabream 10 Maisse et al. (1998)
Turbot 10 Dreanno et al. (1997)
Yellowtail flounder 10
Richardson et al.
(1995)
Fonte: Modificado de SUQUET et al. (2000)
3.9. Congelamento do sêmen
Soluções de dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol e glicose foram utilizadas a -80°C para testar a tolerância
de células espermáticas de sêmen de Rana sylvatica a baixas temperaturas (BEESLEY et al., 1998). A
criopreservação de células germinativas animais envolve procedimentos de armazenamento de
espermatozóides no nitrogênio líquido a temperatura próxima aos -196°C, mantendo a viabilidade
gamética por tempo indeterminado (MILIORINI, 2006).
A condição de criopreservação de gametas é útil para a manutenção de sêmen viável para a fertilização
sem necessitar manter grande número de reprodutores das espécies escolhidas, o que reduz os custos de
manutenção dos mesmos. Além disso, elimina problemas com assincronia reprodutiva entre machos e
fêmeas, estabelece programas de melhoramento genético que pode preservar a variabilidade genética de
espécies ameaçadas com uma maior segurança quanto à sanidade do plantel de reprodutores machos
(CHEREGUINI et al., 2003; RIBEIRO e GODINHO, 2003); transporte de gametas sem perda da
viabilidade (MILIORINI et al., 2005) e a utilização de todo o sêmen disponível (OHTA e IZAWA, 1996).
O congelamento deve ser lento e gradativo para não danificar a membrana plasmática, mas o do tipo
vitrificação deve ser o mais rápido possível. A inserção do sêmen, mesmo acondicionado em palhetas,
diretamente em nitrogênio líquido, desorganiza a membrana celular e a peça intermediária podendo levá-
las ao desaparecimento. Devido a estes fatores o congelamento em vapor de nitrogênio antes do líquido,
por cerca de vinte e quatro horas, reduz os danos causados a estas microestruturas (BILLARD, 1983).
Os crioprotetores ingressam no citoplasma e o fluido intracelular pode ser super-resfriado a
temperaturas entre -5°C e -15°C sem formação de cristais de gelo, por reduzirem o ponto de
congelamento pela diminuição da interação das moléculas de água. Neste intervalo de temperatura há
formação de cristais de gelo no meio externo e quando há redução da mesma abaixo desta faixa formam-
se cristais no meio interno (ROBLES et al., 2005).
O processo de criopreservação implica em desidratação celular pela remoção da água intracelular por
diferença osmótica e os crioprotetores penetram na célula por difusão pela membrana causando
encolhimento da mesma e um influxo iônico do meio externo para o interno, o que pode ser prejudicial à
célula por aumentar a concentração de sais no seu interior (ROBLES et al., 2005; MAZUR, 1984).
3.10. Descongelamento do sêmen
A etapa de descongelamento do sêmen é importante para a manutenção da viabilidade e utilização
do mesmo e dependendo da taxa de descongelamento poderá haver formação de cristais de gelo
intracelulares e causar crioinjurias. A hidratação celular ocorre por influxo de água pela membrana
durante a criopreservação, ao contrário do congelamento (HOLT, 2000). O descongelamento de sêmen de
Xenopus laevis a 37°C sem mencionar o tempo utilizado foi utilizado por Buchholz et al. (2004) e o
sêmen de salmonídeos foi descongelado a 25°C por 30 segundos e 60°C por 5 segundos por Murgas et al.
(2001a) e Lanhesteiner et al. (1997).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Execução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos nas instalações da Estação de
Piscicultura e no Laboratório de Fisiologia e Farmacologia da Universidade
Federal de Lavras no período de 18 de agosto a 01 de janeiro de 2009, com
animais do Ranário Experimental da Universidade Federal de Viçosa. No
primeiro experimento objetivou-se testar quatro indutores a espermiação para
obtenção de sêmen de Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802). No segundo
experimento a influência da hora pós aplicação (HPA) dos análogos de
hormonios liberadores de gonadotropinas, extrato bruto hipofisário e
gonadotropina coriônica humana, sobre volume de sêmen, concentração
espermática e motilidade foi avaliada. No terceiro experimento avaliou-se a
toxicidade da mistura entre as quatro concentrações de soluções internas
(dimetilsulfóxido (DMSO) e metanol 1,0; 2,5; 5,0 e 7,5%) com uma
concentração de solução externa (lactose 1%) e (Best thawnig solution (BTS)
5%) sobre o sêmen, analisando-se o parâmetro motilidade, congelamento e
posterior descongelamento das amostras submetidas as soluções citadas.
4.2. Manejo geral dos animais
4.2.1 Morfometria e mantença
Os animais foram pesados em balança eletrônica de precisão
(3000g/0,1g; BS3000A
®
). O comprimento total e rostro cloacal foram medidos
com paquímetro digital (0-150mm; King Tools
®
) e marcados com aplicador de
pinos plásticos para linha de tecidos (Tagfix
®
) com etiquetas plásticas
numeradas entre os artelhos na porção basal as palmouras finas (PEREIRA et
al., 2008) (Figura 2) e mantidos em baias de sistema alagado de cultivo de 1,4
m
2
para a mantença dos espécimes semi-submersos em lâmina d’água de,
aproximadamente, 8 cm em sua extensão numa temperatura de 25° ± 3°C. Os
exemplares foram alimentados com ração comercial peletizada (8 mm) com
42% de proteína bruta com fotoperíodo de 13 horas de luz. Os animais
permaneceram nessas condições por dois meses até o início do experimento.
FIGURA 2. Marcação dos exemplares de rã-touro, Lithobates catesbeianus
(SHAW, 1802), com etiquetas plásticas fixadas á base das
palmouras.
4.2.2 Procedimento de indução hormonal
Os reprodutores foram escolhidos, pelo estado de saúde, pelas
características sexuais secundárias evidentes na época do acasalamento:
região gular amarelada, presença de calo nupcial nos artelhos anteriores e
capacidade de amplexo e, quando possível, pela identificação da vocalização.
Os animais foram submetidos a aplicação hormonal com seringa hipodérmica e
agulha de 25 x 0,7 mm introduzida intraperitonealmente no músculo reto do
abdome na região ilíaca esquerda na posição ventral posterior segurando-se o
exemplar com o dorso voltado para a palma da mão com o rostro voltado para
baixo e o ventre exposto. As seringa foi posicionada na posição oblíqua ao
corpo e a agulha introduzida levemente até a metade para não perfurar ou
danificar órgãos internos (Figura 3).
FIGURA 3. Aplicação hormonal intraperitoneal dos exemplares de rã-touro,
Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802).
4.2.3 Coleta de sêmen e avaliação espermática
A coleta seminal foi feita com pipeta volumétrica de 5 mL introduzida na
cloaca do exemplar por suaves massagens na região ventro posterior
celomática (Figura 4). A motilidade, vigor, e volume, medido imediatamente
após a coleta com a própria pipeta volumétrica. A extração foi realizada após a
introdução da pipeta na cloaca do exemplar até esgotamento total do sêmen
com intuito de padronizar a metodologia.
Uma alíquota de 10 µL de sêmen foi colocada em uma lâmina e avaliada
em um microscópio óptico em aumento de 400 vezes para se determinar a
motilidade, e o vigor imediatamente após a coleta. A motilidade subjetiva
consistiu no percentual de espermatozóides móveis em determinado campo de
visualização e o percentual e capacidadede movimentação do corpo celular em
linha reta tiveram escalas definidas de 0 a 100%. O vigor espermático foi
definido de zero a cinco sendo o vigor zero, ausência de turbilhonamento e
motilidade; vigor 1, capacidade de turbilhonamento e motilidade subjetiva de 1
a 20%; vigor 2, turbilhonamento e motilidade subjetiva de 21 a 40% e assim por
diante até completar o vigor 5, com turbilhonamento e motilidade subjetiva
pode variar de 81 a 100%. Alíquotas de 50 µL do sêmen coletado foram
retiradas e colocadas em 250 µL de formol citrato para avaliação de morfologia
e concentração espermática, esta realizada em câmara de Neubauer com
microscópio óptico (400X).
FIGURA 4. Coleta de sêmen do exemplar de rã-touro, Lithobates catesbeianus
(SHAW, 1802), por meio de capilaridade utilizando pipeta
volumétrica
4.3. EXPERIMENTO 1: Comparação da eficácia entre diferentes
indutores sobre a espermiação de rã-touro
Vinte e cinco animais foram separados em blocos de cinco e submetidos
a aplicação hormonal para se avaliar a eficácia de indutores segundo
metodologia citada com os seguintes tratamentos; solução fisiológica (T0), EBH
de carpa (T1) (RIBEIRO FILHO, 1994), acetato de gonadorelina (T2), acetato
de buserelina (T3) (AFONSO, 2004) e hCG (gonadotropina coriônica humana)
(T4) (Tabela 4).
TABELA 4. Hormônio e respectivas dosagens de aplicação para espermiação
de rá-touro
Tratamento Hormônio Dosagem/kg
T0 Solução Fisiológica 0,3ml
T1 Extrato Bruto Hipofisário de carpa 5000 µg
T2 Acetato de gonadorelina 83,0µg
T3 Acetato de Buserelina 13,0µg
T4 Gonadotropina coriônica Humana 830UI
4.4. EXPERIMENTO 2: Influência da hora pós aplicação hormonal (HPA)
sobre os parâmetros espermáticos
Trinta animais aleatóriamente subdivididos em seis blocos de cinco
animais cada, para se ajustar a melhor hora para a coleta seminal com o
hormónio mais eficaz. Uma aplicação única da dose do hormônio foi realizada
na hora zero e a coleta feita em intervalos de duas em duas horas até doze
horas, dose de 0,1 ml de acetato de gonadorelina. Cinco exemplares foram
tomados a cada duas horas, como descrito anteriormente, e o sêmen foi
extraído para análise da qualidade seminal (motilidade, vigor, concentração
subjetiva visual, concentração espemática e volume).
4.5. EXPERIMENTO 3: Teste de toxicidade dos crioprotetores internos e externos,
congelamento e descongelamento
Diluições entre crioprotetores internos e externos foram preparadas
permanecendo cerca de uma hora em incubação para minimizar os efeitos das
reações exotérmicas do álcool, evitar injúrias e manter a conservação celular
(MILIORINI, 2006). Dois crioprotetores internos (DMSO e metanol) foram
utilizados com dois externos (lactose a 1% e BTS a 5%). As concentrações de
crioprotetor interno foram de 1,0%, 2,5%, 5,0% e 7,5% (Tabela 5).
TABELA 5. Soluções crioprotetoras para tratamento do sêmen da rã-
touro, Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802)
Tratamento Lactose (% m:v) Crioprotetor
DL1 1 DMSO a 1,0%
DL2 1 DMSO a 2,5%
DL3 1 DMSO a 5,0%
DL4 1 DMSO a 7,5%
ML1 1 Metanol a 1,0%
ML2 1 Metanol a 2,5%
ML3 1 Metanol a 5,0%
ML4 1 Metanol a 7,5%
Tratamento BTS (% m:v) Crioprotetor
DB1 5 DMSO a 1,0%
DB2 5 DMSO a 2,5%
DB3 5 DMSO a 5,0%
DB4 5 DMSO a 7,5%
MB1 5 Metanol a 1,0%
MB2 5 Metanol a 2,5%
MB3 5 Metanol a 5,0%
MB4 5 Metanol a 7,5%
Alíquotas de 400 µL de sêmen foram diluídas em 1200 µL de solução
crioprotetora (1:3) e as características seminais (motilidade e vigor) foram
avaliadas em microscópio optico em um aumento de 400 vezes com a
presença dos crioprotetores. As soluções sêmen:diluidor foram envazadas em
palhetas de 0,5 ml, três por tratamento vedados por microesferas. A seguir as
palhetas foram inseridas em raques de polietileno, acondicionadas e inseridas
em botijao de vapor de nitrogênio líquido (Taylor-Wharton, modelo CP 300, tipo
dry shipper) para resfriamento gradativo. Após 24 horas, as raques foram
armazenadas em botijão (modelo DS-18 - Cryometal) por, aproximadamente,
sete dias e permaneceram submersas em nitrogênio líquido, para se
comprovar o tempo indeterminado de conservação. Ao final deste período as
palhetas foram retiradas e descongeladas no laboratório do setor de Fisiologia
e Farmacologia da Universidade Federal de Lavras, em Lavras, Estado de
Minas Gerais.
O descongelamento foi individual por imersão e agitação da palheta todo
o tempo em banho-maria durante 10 segundos a 37°C (BUCHHOLZ et al.,
2004) para total liquidez do sêmen. A seguir, as palhetas foram secas em papel
toalha, ambas as extremidades foram cortadas e o conteúdo inserido em um
tupo tipo eppendorf
®
de 600 µL, para posterior análise. O sêmen foi
homogeneizado no tubo, sob leve pipetação, com a própria ponteira da pipeta
de precisão. Uma alíquota de 10 µL de sêmen descongelado foi depositada por
lâmina para avaliação visual das características com aumento de 400 vezes em
microscópio óptico (Figura 5). Após descongelamento, a motilidade subjetiva e
o vigor espermático foram analisados com escores variando de 0 a 100% e
zero a 5, respectivamente.
FIGURA 5. Etapas de descongelamento do sêmen de rã-touro, Lithobates
catesbeianus (SHAW, 1802): (A) abertura do botijão e retirada da
tampa; (B e C) retirada do canister; (D) retirada da raque; (E)
descongelamento da palheta em banho maria; (F) secagem da
palheta; (G) inserção do sêmen em tubo eppendorf
®
; (H) retirada
da alíquota de sêmen; (I) colocação da amostra na lâmina para
avaliação visual.
A
B
C
D
G
E
F
H
I
4.6. Análises estatísticas
Os resultados foram submetidos à análise de variância, e quando
necessário ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para comparação entre
as médias a uma probabilidade de 5%. Os dados de volume foram submetidos
a análise de regressão linear e a concentração espermática à análise de
variância. Os dados da variável concentração espermática, foram
transformados (Log
10
X) para se obter a normalidade. As análises foram
realizadas utilizando-se com o software SISVAR versão 5.0 (FERREIRA,
2004).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O parâmetro morfologia espermática não foi avaliado devido a presença
de aglutinações o que impossibilitou uma análise acurada do sêmen, pois
subestimaria a mesma.
5.1. EXPERIMENTO 1: Eficácia de diferentes indutores para a
espermiação de rã-touro.
Um total de 28% dos animais induzidos apresentaram resultado positivo
aos indutores; sendo 20% com acetato de gonadorelina e 8% com acetato de
buserelina. Os demais 72%; 12% restantes do tratamento com acetato de
buserelina, 20% do tratamento com gonadotropina coriônica humana, 20% com
extrato bruto hipofisário e 20% com solução fisiológica tiveram resultado
negativo para a indução. O resultado se repetiu em todos os intervalos de
tempo (Tabela 6).
TABELA 6. Percentual de animais espermiados e parâmetros espermáticos mediante
indução hormonal
Indutores
Hor
a
Animais
espermiados
Volume
(ml)
Vigor
(0-5)
Motilidade
(%)
Concentração
espermatozóide/ml
Acetato de Gonadorelina
2
5 4,56 ± 2,35 2,6 ± 1,1 67 ± 16 1,28x10
5
Acetato de buserelina 2 3,25 ± 3,89 1,5 ± 0,7 57 ± 28 3,03x10
5
Acetato de Gonadorelina
4
5 2,54 ± 2,09 2,2 ± 1,3 54 ± 25 1,82x10
5
Acetato de buserelina 2 3,17 ± 1,61 3,5± 2,0 28 ± 28 2,83x10
5
Acetato de Gonadorelina
6
5 1,40 ± 0,89 1,4 ± 1,5 22 ± 38 5,86x10
5
Acetato de buserelina 2 2,75 ± 3,18 1,5 ± 0,7 27 ± 32 1,00x10
4
Os resultados encontrados no que diz respeito a eficácia hormonal e
tempo de resposta ao indutor foram superiores aos encontrados por outros
autores confirmando a melhor atuação do análogo de GnRH, acetato de
gonadorelina, provavelmente devido a ação prolongada, descrita na posologia
da solução injetável. Easley et al., 1979, induzindo exemplares Rana
catesbeiana afirmaram que 80% dos animais induzidos com LH/FSH-RH
sintético obtiveram resultado positivo ao mesmo, enquanto 60% dos animais
responderam ao extrato bruto hipofisário, 50% ao LH de mamíferos, 40% ao
hCG e 20% com FSH tiveram resposta positiva a indução. Ao passo que o
tempo de resposta ao LH foi menor que o do LH/FSH-RH sintético. O primeiro
responde de uma a três horas após aplicação e o segundo em,
aproximadamente, 30 minutos a partir da hora inicial de aplicação.
Os resultados mostraram uma maior eficiencia do acetato de
gonadorelina em relação ao percentual de animais espermiados, 100% dos
animais induzidos em todas as HPAs isso, possivelmente, também, pela ação
prolongada em relação aos outros hormônios. Kobayashi et al. (1993)
trabalhando com Rana nigromaculata, induzida com 10UI/ml de hCG e 5 µg/ml
de glicoproteína pituitária, obteve espermiação em 60,3±8,4% e 55,4±7,8%
respectivamente. Adicionalmente, com LH purificado de rãs-touro, mostraram
resultados satisfatórios com uma dosagem de 0,1 µg/ml, 30,0 ± 4,6% de
sucesso e, também, em concentração dez vezes maior (1µg/ml), onde 50,0 ±
5,2% espermiaram.
Com a utilização de acetato de buserelina obteve-se resultado inferior
ao encontrado por Alonso (1997), provavelmente, pela baixa concentração
aplicada nos exemplares (13µg), que se comparados ao acetato de
gonadorelina (83µg) foi, aproximadamente, seis vezes menor. O mesmo autor
utilizou 2 µg/Kg de três análogos de GnRH, (buserelina, GnRH para mamíferos
e GnRH para salmões) obteve 100% de espermiação com buserelina contrário
ao encontrado neste trabalho (8%). O análogo utilizado para salmões (73%
espermiados) e para mamíferos (60% espermiados) tiveram, também, sua
eficácia comprovada. A espermiação de oito espécies de anuros
(Lepidobatrachus laevis, Xenopus laevis, Rana pipiens, Lepidobatrachus
llanensis, Ceratophrys ornata, Ceratophrys cranwelli, Ceratophrys cornuta,
Pysicephalus adspersus) foi feita por Waggener e Carroll Jr (1998) com doses
hormonais variáveis de 100 a 575 µg/Kg de GnRH, eles obtiveram espermiação
que variaram de 30 minutos a 4 horas pós indução.
Não houve resposta dos animais ao extrato bruto hipofisário, no
entanto, Ribeiro Filho (1998a) mencionou que machos induzidos com o mesmo
hormônio apresentaram boa resposta a indução, com alta taxa de fecundação
dos ovócitos.
A abundância de esperma e a hora de liberação variam com o
hormônio e a dosagem do mesmo, mas uma injeção de 5 µg de LH-FSH-RH
estimulou a liberação rápida e eficaz de níveis concentrados de esperma
(EASLEY et al., 1979).
Em relação a HPA houve semelhança nos resultados a aqueles
encontrados por Pozzi e Ceballos (2000), diferindo no hormônio (GnRHa), na
dosagem (83,0µg) e na espécie (Lithobates catesbeianus, (SHAW, 1802)). Os
autores afirmaram que estudos realizados em Bufo arenarum mostraram que o
tempo e a concentração hormonal ótima para produzir alta taxa de
espermiação são respectivamente duas horas após aplicação de 10 UI de
hCG. A gonadotropina coriônica humana mostrou uma alta taxa de
espermiação produzida, quando se utilizou a mesma dose que os autores
supracitados, após duas HPA em Rana catesbiana e Leptodactilus ocellatus
(ROSEMBLIT et al., 2006).
Com menores valores aos deste experimento Limori et al. (2005)
obtiveram resultados onde a indução hormonal teve sucesso em 79% das
tentativas após administração de 5 µg de GnRH, 1000 µg de FSH e 1000 e
2000 UI de hCG a cada três, seis e doze horas após aplicação, provavelmente,
devido a dosagem de hormônio utilizada. No caso do GnRH a dosagem pode
ter sido subestimada enquanto as outras superestimadas causando uma
resposta menos eficaz a espermiação. O tratamento com 1000 e 2000 UI de
hCG foi mais efetivo que o com GnRH.
Houve declínio da espermiação a partir da décima hora de coleta,
possivelmente pelo porte da espécie trabalhada, pela queda do efeito do
hormônio sobre a liberação de gonadotropinas e esvaziamento testicular,
Browne et al. (2006) administraram intraperitonealmente 300 UI de hCG, em
Bufo baxteri e obtiveram espermiação por vinte e cinco horas seguidas e
declínio do volume a partir da quinta hora de coleta. Quarenta por cento dos
machos espermiaram as duas HPA, valores inferiores aos encontrados,
provavelmente devido a dosagem aplicada, já que outros autores obtiveram
melhores resultados ministrando doses de hCG dez vezes maiores para
animais pertencentes ao mesmo gênero. A administração de 300 UI de hCG
por 50g de peso em muitos Bufonídeos, produz uma alta na liberação seminal
de três a seis horas pós aplicação hormonal, mas em Rana pipiens esta dose
hormonal chega a ser alta 500 UI em combinação com LHRH, 10 µg, mesmo
assim extraindo um esperma de baixa qualidade (KOUBA et al., 2009).
A obtenção de espermiação duas horas após aplicação hormonal pode
ser devido ao porte dos espécimes trabalhados e a dosagem hormonal,
provavelmente, a administração de maior dose de acordo com o peso dos
animais poderia reduzir o tempo de coleta aumentando a intensidade de
liberação. Em Dendrobates auratus utilizou-se 100 UI de hCG e realizou-se a
coleta em quatro machos após o intervalo de 1 hora obtendo 100% de
espermiação, possivelmente devido ao menor porte dos animais e melhor ação
do hormônio (LIPKE et al., 2008).
Hormônios liberadores de gonadotropinas possuem estruturas
moleculares semelhantes e por isto se obtem sucesso na indução de
mamíferos e peixes e resposta semelhante às de anfíbios (ZANIBONI-FILHO e
NUÑER ,2004). Portanto, o análogo do GnRH, acetato de gonadorelina, para
indução e posterior extração seminal, pode ser considerado um hormônio
eficiente para a espermiação.
5.2. EXPERIMENTO 2: Influência da hora pós aplicação (HPA) nos
parâmetros espermáticos de Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802).
O uso do indutores mais eficaz com seis coletas em doze horas a
intervalos de duas, não mostrou efeito (P>0,05) entre a HPA e o volume, o
vigor e a concentração, que permaneceram inalterados estatisticamente. A
motilidade foi de 91,9 ± 7,67% até a 10ª HPA com efeito (P<0,05) entre o
mesmo parâmetro e a hora pós-aplicação (Tabela 7).
TABELA 7. Parâmetros seminais de rãs-touro Lithobates catesbeianus (SHAW,
1802) avaliados em diferentes tempos após aplicação de acetato de
gonadorelina
Características
seminais
Horas após aplicação hormonal
P= CV(%) 2 4 6 8 10 12
Volume
1
1,56 1,76 0,94 2,66 1,91 2,65 0,0192 41,92
Motilidade 82,5 85,0 96,0 96,0 100,0 32,0 0,0095 -
Vigor 3,4 3,8 4,2 3,4 4,4 2 0,2188 -
Concentração
2
2,49 x 10
5
1,60 x 10
5
1,23 x 10
5
1,36 x 10
5
1,05 x 10
5
3,0 x 10
4
0,2325 10,32
1
Médias seguidas por diferentes letras diferem pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05)
2
espermatozóide/ml - Opção de transformação: Log
10
X
Os resultados do volume mostraram, em uma regressão linear simples
(Figura 6), que a ação hormonal acontece a medida que há tendência de maior
liberação de sêmen até um patamar de estabilização da liberação do ejaculado.
y = 0,1084x + 1,1527
R
2
= 0,3747
0,00
1,00
2,00
3,00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tempo (HPA)
Volume (ml)
FIGURA 6. Volume seminal de rã-touro Lithobates catesbeianus (SHAW, 1802)
(n= 30) após indução hormonal e 12 horas de coleta.
Os resultados encontrados com o indutor buserelina foram inferiores aos
encontrados por Alonso (1997), possivelmente devido as condições do
ambiente, pois apesar dos animais passarem por um período de adaptação a
temperatura, umidade relativa do ar e a intensidade de luz estes, por serem
controlados artificialmente, podem ter influenciados na acão hormonal. O autor
afirmou que machos tratados com buserelina liberaram, em média, maior
concentração de espermatozóides por indivíduo durante um maior tempo.
Aqueles tratados com análogos de GnRH de mamíferos e salmão,
praticamente, não alteraram a liberação de sêmen e a densidade espermática.
A faixa de variação de volume e concentração espermática deste
trabalho foram respectivamente 0,94 a 2,66 ml e 3,0 x 10
4
a 2,49 x 10
5
espermatozóides/ml provavelmente devido a variação entre os animais durante
o experimento. Waggener e Carroll Jr (1998) trabalhando com oito espécies
distintas (Lepidobatrachus laevis, Xenopus laevis, Rana pipiens,
Lepidobatrachus llanensis, Ceratophrys ornata, Ceratophrys cranwelli,
Ceratophrys cornuta, Pysicephalus adspersus) obtiveram uma ampla variação
da densidade espermática aproximadamente 1,0 x 10
4
espermatozóide/ml a
13,8 x 10
6
espermatozóide/ml e volume variável de 8 a 8400 µL de sêmen.
Agostinho et al. (2000) e Pozzi e Ceballos (2000) encontraram médias
de 1,63 x 10
6
espermatozóide/ml e 8,15 x 10
6
± 0,83 x 10
6
espermatozóides/ml, em animais induzidos com análogos de GnRH e hCG,
respectivamente maiores que no presente trabalho que foi de 1,34 x 10
5
espermatozóides/ml.
O volume médio obtido através da indução hormonal foi três vezes
menor (1,9 ± 0,7 ml) do que aquele encontrado por Limori et al. (2005) que
trabalhando com Bufo marinus foi de 5,6 ± 0,4 ml, já concetração obtida pelo
mesmo autor, após administração de FSH foi relativamente baixa (< 0,1 x 10
6
espermatozóide/ml) e ao ministrarem hCG (1000 UI e 2000 UI) durante
intervalos de 6 e 12 horas, obtiveram o resultado médio de concentração de
13,6 ± 6,4 e 5,9 ± 2,4 e 3,24 ± 3,0 e 24,9 ± 14,1 (x 10
6
espermatozóide/ ml;
média ± desvio padrão) respectivamente. Estes valores foram em média mais
elevados que os encontrados, se comparados à média das 6 e 12 HPA, isto
supostamente devido ao nível de estresse que a metodologia utilizada pode
trazer durante a coleta . O percentual de motilidade média nas mesmas
circunstâncias supracitadas foram respectivamente, 66,2 ± 16,1 e 30,7 ± 25,3 e
64,7 ± 22,5 e 39,5 ± 32,3 (%; média ± desvio padrão), para as dosagens
ministradas, menores que no presente trabalho que foi de 87,8 ± 7,9 e 76,0 ±
38,1 respectivamente, para os tempos de 6 e 12 HPA.
Os resultados obtidos demonstram que a motilidade se manteve
constante da segunda até a décima HPA e a concentração também
permaneceu sem alteração significativa, porém até a décima segunda HPA. O
volume teve comportamento linear com uma queda significativa na sexta HPA,
provavelmente, pela grande variabilidade entre os animais e problemas para
extração seminal. Browne et al. (2006) encontraram após duas e três horas de
coleta motilidades de 95 e 22%, respectivamente, e o alcance máximo da
mesma se deu em torno de cinco horas pós administração e permaneceu
constante até as vinte horas. A concentração atingiu sua maior densidade
espermática após sete horas pós indução (12,5 x 10
6
espermatozóide/ml) e
permaneceu constante até as 12 horas pós administração, seguido por seu
declínio. O maior volume de sêmen obtido foi com cinco horas pós indução (0,8
ml) e declinou até as 14 horas (0,2 ml) e permanecendo constante durante o
restante do período. Rosemblit et al. (2006) obtiveram em média 2,5 x 10
5
±
0,76 x 10
5
espermatozóide/ml e 4,1 x 10
5
± 2,8 x 10
5
espermatozóide/ml
(resultados expressados em média ± desvio padrão) para R. catesbeiana e L.
ocellatus, induzidas com dosagens variadas de hCG (0, 1, 2, 10, 20, 40 e 100
UI/ml).
Em peixes, devido a semelhanças reprodutivas com os anuros, Miranda
et al. (2005) verificaram incremento no volume seminal em Odontesthes
bonariensis, ao comparar diversos indutores reprodutivos. O incremento em
volume foi de 16,7 vezes com hCG em relação ao controle, resultado superior
aos demais indutores utilizados, como a hipófise desidratada de carpa (13,5x);
hipófise de salmão (12,8x); GnRHa de salmão (16,7x) e GnRHa de mamíferos
(10,8x).
Em espécies como o bagre africano (Clarias gariepinus), a indução de
machos não provocou diferença significativa no volume seminal (YASUI et al.,
2007), possivelmente em função do indutor utilizado (hipófise de carpa), pois
outros são mais eficientes para essa espécie (VIVEIROS et al., 2003),
demonstrando tendência espécie-específica dos hormônios.
O uso de implantes de GnRHa aumentou o volume seminal em
linguados (Rhombosolea tapirina) (LIM et al., 2004) e técnicas semelhantes de
implantes mostraram incremento na produção espermática em peixes do
gênero Morone com máximo de 15 mL/kg após dois dias, ao passo que no
controle os valores oscilaram entre 2 a 3 mL/kg (MYLONAS e ZOHAR, 2001).
A aplicação de hCG (2000 UI/kg) em Pangasius bocourti 12 horas após
a aplicação, observou-se um incremento de treze vezes o volume seminal
(CACOT et al., 2003). Esses autores observaram que o uso de GnRH
associado a domperidona, implicou em menor produção espermática.
O salmão do Atlântico e a truta arco-íris tiveram produção seminal em
intervalos semanais e volume final de 136,7 ± 59,2mL para o salmão do
Atlântico e 22,9 ± 14,5mL para trutas. Em ambos os casos, a produção
decrésceu na produção com tempo (GJERD, 1984).
Com refêrencia ao período de coleta, Christ et al. (1996) observaram
que Parâmetros seminais como a concentração e volume de sêmen mostraram
variação sazonal, mas a osmolaridade do plasma seminal e a qualidade dos
movimentos espermáticos e a linearidade foi pouco afetada. Em geral, a
qualidade de espermática é aumenta nas estações reprodutivas, com o
desenvolvimento gonadal.
5.3. EXPERIMENTO 3: Toxicidade dos crioprotetores internos,
congelamento e descongelamento
5.3.1. Aspectos
in natura
do sêmen de rã-touro
O peso total e comprimento total, comprimento rostro cloacal, volume,
motilidade subjetiva vigor e osmolaridade seminal de onze machos de rã-touro
obtidos estão descritos na tabela 8. A motilidade do sêmen in natura em Crinia
georgiana foi de 80%, com tempo de motilidade total de 120 min (HETTYEY e
ROBERTS, 2007).
TABELA 8. Peso corporal, comprimento total, comprimento rostro cloacal,
volume seminal, motilidade subjetiva, vigor e osmolaridade do
sêmen de rã-touro (Lithobates catesbeianus) antes da submissão
aos tratamentos com crioprotetores
Animais
Peso
Total
(g)
Comp.
Total
(cm)
Comp.
Rostro
Cloacal
(cm)
Volume
(ml)
Motilidade
Subjetiva
(%)
Vigor
(0-5)
Osmolarid
ade
mOsmol/k
g
01 303,3
30,5 13,0 1,7 86,7 3,7 116,7
02 330,5
31,5 13,1 1,3 80,0 4,0 97,0
03 334,6
32,0 13,4 3,8 95,0 4,0 61,0
04 375,7
32,0 17,5 1,3 95,0 4,2 92,0
05 390,7
32,0 15,0 1,7 85,0 3,5 71,7
06 402,1
32,0 14,2 1,7 100,0 5,0 101,7
07 407,2
32,0 13,8 2,9 95,0 4,0 72,3
08 409,4
32,5 14,1 0,9 95,0 4,0 52,7
09 424,9
34,0 15,4 1,4 90,0 4,1 77,7
10 433,0
33,0 14,3 2,0 85,0 4,3 63,3
11 470,9
35,0 14,0 1,4 90,0 4,0 79,0
Média
389,3
32,4 14,4 1,8 90,6 4,1 80,5
DP*
49,8 1,2 1,3 0,8 6,0 0,4 19,4
*Desvio Padrão da média
5.3.2. Toxicicidade dos crioprotetores
A toxicidade dos crioprotetores internos DMSO e metanol, isoladamente,
não apresentaram interação entre os parâmetros observados e a concentração
dos mesmos. No entanto, entre os crioprotetores, a motilidade teve variação de
89,0 ± 3,0% para o DMSO e 92,1 ± 8,0% para o metanol sem diferença ao
nível de (P>0,05), enquanto o vigor, com de 3,6 ± 0,5 e 4,2 ± 0,1, para o DMSO
e o metanol, diferiu ao nivel de (P<0,05) de acordo com o tipo de crioprotetor.
O tempo de motilidade de esperma de rã-touro variou de 252 ± 23s para o
DMSO e 287 ± 10s para o metanol, com diferença entre os crioprotetores
(Tabela 9).
TABELA 9. Motilidade, vigor e duração do tempo de motilidade pré-
congelamento de rã-touro com diferentes concentrações de
DMSO e Metanol
Crioprotetor
Parâmetro
Avaliado
Dose
Média
P
CV
(%)
1,0 2,5 5,0 7,5
DMSO
Motilidade¹
92,5
90,0
85,0
88,3
89,0 > 0,2092
10,61
Vigor² 4,2 3,3 3,2 3,5 3,6 A
= 0,0387
-
Tempo³ 280 257 226 244 252 a
= 0,0009
6,59
Metanol
Motilidade¹
97,5
92,5
80,8
97,5
92,1 > 0,2092
10,61
Vigor² 4,3 4,3 4,2 4,0 4,2 B
= 0,0387
-
Tempo³ 300 285 277 287 287 b
= 0,0009
6,59
1
Não significativo ao teste F (P>0,05)
2
Médias seguidas por diferentes letras diferem pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05)
3
Médias seguidas de letras diferentes diferem pelo teste F (P<0,05)
Os crioprotetores associados aos diluidores mostraram efeito (P<0,05)
na motilidade e nas concentrações de lactose a 1% e BTS a 5% combinados
com metanol a 1%. Também houve efeito (P<0,05) das concentrações de
DMSO e metanol a 2,5% também mostraram efeito com os diluidores externos
(Tabela 10).
TABELA 10. Influência das concentrações de DMSO e metanol associados à
BTS 5% (m:v) e lactose 1%(m:v) sobre a motilidade pré-
congelamento
1
Crioproteto
r interno
Crioprotetor
externo
Dose de crioprotetor interno
1
Média
1,0 2,5 5,0 7,5
DMSO
BTS 5% 48,6 45,7
b
50,0 42,9 46,8
Lactose 1%
50,0 75,0
a
50,0 40,0 53,8
Média 49,3 60,4 50,0 41,4
Metanol
BTS 5% 48,3
b
48,3
b
43,3 43,3 45,8
Lactose 1%
65,0
a
65,0
a
45,0 45,0 55
Média 56,7 56,7 44,2 44,2
CV (%) 22,8
1
Médias seguidas de letras diferentes por coluna diferem pelo teste F (P<0,05)
Não houve efeito das concentrações de crioprotetores associados ao
BTS e a lactose sobre o vigor espermático como demonstrados na tabela 11
(P>0,05).
TABELA 11. Influência das concentrações de DMSO e metanol associados à
BTS 5% (m:v) e lactose 1%(m:v) sobre o vigor pré-
congelamento
1
Crioprotetor
externo
Crioprotetor
interno
Dose de crioprotetor interno
Média
1,0 2,5 5,0 7,5
DMSO
BTS 5%
2,43 1,86 2,29 2,00
2,14
Lactose 1%
2,22 2,67 1,89 1,89
2,17
Média
2,33 2,26 2,09 1,94
Metanol
BTS 5%
1,86 1,86 1,71 2,29
1,93
Lactose 1%
2,44 2,44 2,22 2,00
2,28
Média
2,15 2,15 1,97 2,14
P = 0,6963
1
Não significativo ao teste de qui-quadrado (P>0,05)
A motilidade espermática pós congelamento não recuperou,
possivelmente, pela concentração das soluções ou o tipo de compostos
utilizados. Estes podem ter danificado as células espermáticas ou pelo nível de
concentração alta do crioprotetor, no tratamento de maior percentual, pela
maior presença de água nos níveis de concentrações inferiores ou pela pouca
afinidade entre os crioprotetores externos com as células espermáticas, o que
causaria a formação de cristais de gelo durante o congelamento e
desestabilização da membrana plasmática. Browne et al. (1998) utilizando
diluidores, afirmam que não houve recuperação da motilidade após
congelamento no sêmen submetido a 10%(w:v) de sucrose embora sem danos
morfológicos às células espermáticas. O mesmo autor, utilizando Bufo marinus,
mostrou haver recuperação da motilidade no sêmen submetido aos
tratamentos com glicerol (20%) e dimetilsulfóxido (20%) onde as taxas de
motilidade pós-descongelamento foram relativamente altas (68,9 ± 3,8 e 58 ±
5,9%). A molitlidade pré-congelamento atingiu valores acima dos 70% para
tratamentos de dimetilsulfóxido e glicerol (10, 15 e 20%).
Nos anuros como Rana sylvatica, Rana pipiens e Bufo americanus a
associação do dimetilsulfóxido e metanol com o diluidor e o crioprotetor
externo, no tocante ao congelamento e descongelamento não foram eficazes,
isto possivelmente devido à concentração, que pode ter sido subestimada,
causando boa taxa de motilidade pré-congelamento e lise celular pós-
descongelamento. As causas de motilidade zero pós-descongelamento pode
ser devido às crioinjúrias, formação de cristais de gelo pela quatidade maior de
água no meio. Quatro crioprotetores (soluções de 0,5M de dimetilsulfóxido,
metanol, glicerol e etilenoglicol) e dois diluidores suplementares (soro bovino
fetal e glutationa), mostraram que o dimetilsulfóxido promove maior proteção às
células espermáticas e resultados semelhantes aos demais crioprotetores. A
associação de crioprotetores e diluidores é mais eficaz para a concentração
espermática, viabilidade celular e recuperação da motilidade dos
espermatozóides pós-descongelamento. A associação do dimetilsulfóxido e do
soro bovino fetal é recomendada para a criopreservação e seria eficaz quando
comparada ao metanol, etilenoglicol e glicerol, suplementados com o soro
bovino sérico ou glutationa (BEESLEY et al., 1998).
Em Bufo marinus o percentual de motilidade relativa do sêmen com os
diluidores sucrose (10%, w:v), solução de Ringer e solução de Ringer mais
10% de gema de ovo e com os crioprotetores metanol, glicerol e
dimetilsulfóxido em concentrações de 10, 15 e 20%, mostraram altas taxas
relativas de recuperação da motilidade no tratamento com sucrose (10% w:v)
(40,3 ± 2,3%), seguidas de solução de Ringer e 10% de gema de ovo (32,0 ±
1,9%) e solução de Ringer (13,7 ± 1,2%). Os tratamentos com os crioprotetores
solúveis mostraram alta taxa de recuperação da motilidade em dimetilsulfóxido
(37,2 ± 2,0%), seguidos do glicerol (29,8 ± 1,9%) e do metanol (19,7 ± 2,1%).
Comparações entre crioprotetores mostraram declínio da recuperação da
motilidade com a redução da mesma, com taxas de 35,2 ± 2,3%, 31,3 ± 2,0% e
19,5 ± 1,6% para 20, 15 e 10%, respectivamente (BROWNE et al., 2002).
A associação de diluidores aos crioprotetores mostrou bons resultados
na recuperação de motilidade espermática em alguns tratamentos com Bufo
marinus. A sucrose com 15% de dimetilsulfóxido e 20% de glicerol forneceu
maior taxa de motilidade, enquanto aqueles com 15% de metanol e 10% de
glicerol foram mais baixos. O tratamento de 15% de dimetilsulfóxido teve
resultados mais satisfatórios que os demais na mesma concentração. A
solução de Ringer e 10% de gema de ovo e a composta por 20% (v:v) de
metanol teve maior taxa de recuperação da motilidade pós-descongelamento
(BROWNE et al., 2002). A taxa de recuperação da motilidade foi menor com
solução de Ringer e mais alta com a diluição de 15% (v:v) de dimetilsulfóxido e
menores com o metanol em todas as concentrações (< 5%).
O soro bovino fetal ou associado ao dimetilsulfóxido, glicerol e sucrose
mostrou maiores percentuais de motilidade próximos a 20% após o
congelamento, embora o número de células vivas tenham sido superiores a
50% em Eleutherodactylus coqui segundo Michael e Jones (2004). A motilidade
espermática de Xenopus laevis observados por Hollinger e Corton (1980) foram
inferiores a 40%, resultado semelhante ao observado em mamíferos e aves
por Christensen et al. (2004).
O comportamento pré-congelamento do sêmen de Salvelinus alpinus em
concentrações diferentes de diluentes e crioprotetores, não mostrou diferença
na variação da motilidade entre tratamentos com glicose e um diluente
adaptado composto por 0,137M de NaCl; 0,011M de KCl; 0,004M de
Na
2
HPO
4
.7H
2
O e 7,5 g/L de L-α-lecitina. Os crioprotetores analisados a
dimetilacetamida mostraram maior taxa de motilidade após ativação e não
diferiu do dimetilsulfóxido. O glicerol teve baixa taxa de motilidade após a
ativação (RICHARDSON et al., 2000).
A motilidade do espermatozóide do sêmen de Pseudopleuronectes
americanus foi obtida em todos os tratamentos com interação entre os
crioprotetores e os diluentes. A sucrose e o propilenoglicol forneceram maior
taxa de motilidade com resultados inferiores que esse crioprotetor adicionado a
solução salina e o dimetilsulfóxido associado à sucrose. Os crioprotetores
mostraram diferenças sobre a motilidade, sendo que o propilenoglicol mais
efetivo, seguido do dimetilsulfóxido e do glicerol, resultados semelhantes para
os diluentes foram encontrados (RIDEOUT et al., 2003).
A motilidade e a taxa de sobrevivência dos espermatozóides de Urechis
uinicintctus foram maiores com 15% (v:v) de dimetilsulfóxido, seguido pelo
glicerol a 10% (v:v) segundo Ho Kang et al. (2004). O sêmen de Tor khudree
submetidos a quatro soluções diluidoras com 10% de dimetilsulfóxido, metanol
e propilenoglicol, mostrou variação na motilidade espermática pré-
congelamento de 41,67 ± 1,67% (metanol + solução 4) a 96,67 ± 1,67
(propilenoglicol + solução 3) e de 0 (metanol + solução 2, 3 e 4; dimetilsulfóxido
+ solução 1 e 3) a 53,33 ± 3,33% (dimetilsulfóxido + solução 2) (BASAVARAJA
e HEDGE, 2004).
Cinco crioprotetores com solução de Cortland em concentrações de 6%
a 20% mostraram taxa de motilidade de Pagrus major após o congelamento de
36,5 ± 4,7% para soluções contendo 6% de dimetilacetamida e de 88,6 ± 8,0%
para aqueles com 15% de dimetilsulfóxido (LIU et al., 2006).
A motilidade espermática do sêmen de curimba foi de 72 ± 19,41% a 89
± 13,07% antes, e de 50 ± 25,30% a 74 ± 16,59% após o congelamento, com
concentrações fixas de 10% de dimetilsulfóxido e metanol e 4,5% de BTS,
variando somente concentrações de KCl (MURGAS et al., 2007).
No pós-descongelamento a motilidade foi de 0% em todos os
tratamentos e o vigor também foi 0 isso pode ser devido a fatores intrínsecos a
metodologia de extração de um sêmen com menor nível de contaminação com
urina ou problemas durante o congelamento como já foi citado acima. Os
crioprotetores, segundo Bedore (1999), são espécie-específicos, e a seleção
de qual solução utilizar inicialmente para uma espécie deve ser realizada por
tentativa e erro variando a solução interna e externa, em concentração e tipo
de crioprotetor (HOLT, 2000). Para exemplificar a diferença interespecífica
Carosfeld et al. (2003b) utilizaram DMSO sob as concentrações de 10% e 5% e
constataram que ao descongelarem sêmen de várias espécies tais diluições
eram adequadas, já para o surubim (Pseudoplatystoma corruscans) tiveram um
resultado não efetivo. Muitos compostos têm eficácia testada como,
crioprotetores do sêmen, porém o glicerol pode ser utilizado como meio
crioprotetor, e o dimetilsulfóxido (DMSO) é ainda, mais eficaz para muitas
espécies (HOLT, 2000).
Os protocolos de congelamento são responsáveis por um número em
potencial de danos às células espermáticas por estresse. Além disso, a
mudança brusca de temperatura e o estresse tóxico apresentado pela
exposição a concentrações molares de crioprotetores são os principais
causadores de injúrias, seguidos da formação de cristais de gelo no ambiente
extracelular (WATSON, 2000).
O espermatozóide quando envolvido em mudanças de temperatura,
principal foco da criopreservação, apresenta modificação do conteúdo lipídico
da membrana celular para adaptar-se às condições do ambiente em que se
encontram (HOLT, 2000).
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dentre os indutores testados o análogo de GnRHa (acetato de
gonadorelina) é o mais recomendado para a obtenção de sêmen de rãs-touro
até a décima hora após aplicação. Quanto ao grau de toxicidade dos
crioprotetores pré-congelamento, todos podem ser utilizado para diluição,
porém não são eficazes pós-descongelamento.
Faz-se necessário a realização de mais pesquisas para a extração,
diluição e crioproteção de sêmen extraído in vivo. As pesquisas realizadas com
reprodução artificial de anuros devem focar na extração de sêmen sem a
presença de urina ou em protocolos de purificação do mesmo após extração.
Testes de toxicidade sobre os gametas de crioprotetores internos,
externos e diluidores, antes da criopreservação são necessários para melhorar
a aplicabilidade destes procedimentos sobre o sêmen de espécies de anuros
em extinção e a produção de alimentos.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9.ANEXOS
ANEXO 1 Análise de regressão do efeito de diferentes tempos
(horas) no volume de
sêmen..................................................................................
59
ANEXO 2 Análise de regressão do efeito de diferentes tempos
(horas) na concentração espermática (variável
transformada em
log
10
x).................................................................................. 59
ANEXO 3 Análise de variância do efeito da dose de crioprotetor
sobre a motilidade subjetiva (%) observada nos
espermatozóides................................................................. 59
ANEXO 4 Análise de variância para o efeito da dose de crioprotetor
sobre vigor espermático (0-5) observado nos
espermatozóides................................................................. 59
ANEXO 5 Análise de variância do efeito da adição de diferentes
concentrações de soluções crioprotetoras internas em
associação com soluções diluidoras externas sobre a
motilidade (%)
espermática.........................................................................
60
ANEXO 1
Análise de regressão do efeito de diferentes tempos (horas) sobre o volume de
sêmen obtido em rã-touro
FV GL SQ QM Fc P>F
Tempo 5 11,513617
2,302723 3,364 0,0192
Linear 1 5,413888 5,413888 7,909 0,0100
Quadrática 1 0,407972 0,407972 0,596 0,4480
Cúbica 1 0,698339 0,698339 1,020 0,3230
Erro 24 16,427880
0,684495
ANEXO 2
Análise de regressão do efeito de diferentes tempos (horas) sobre a
concentração espermática do sêmen de rã-touro (variável transformada em
log
10
x)
FV GL SQ QM Fc P>F
Tempo 5 1,878570 0,375714 1,482000 0,2325
Erro 24 6,084049 0,253502
ANEXO 3
Análise de variância e teste F para o efeito da dose de crioprotetor sobre a
motilidade subjetiva (%) observada nos espermatozóides
FV GL SQ QM Fc P>F
Crioprotetor 1 0,069263 0,069263 0,069000 0,7947
Dose 3 4,782894 1,594298 1,580000 0,2092
Crio X Dose 3 1,829974 0,609991 0,605000 0,6158
Erro 40 40,356723
1,008918
ANEXO 4
Análise de variância e teste F para o efeito da dose de crioprotetor sobre o
vigor espermático (0-5) observado nos espermatozóides
FV GL SQ QM Fc P>F
Crioprotetor 1 14,992299
14,992299 12,875000
0,0009
Dose 3 9,419652 3,139884 2,696000 0,0587
Crio X Dose 3 1,841421 0,613807 0,527000 0,6662
Erro 40 46,578439
1,164461
ANEXO 5
Análise de variância do efeito da adição de diferentes concentrações de
soluções crioprotetoras internas em associação com soluções diluidoras
externas sobre a motilidade (%) espermática
FV GL SQ QM Fc P>F
Crioext 1
25,178967
25,178967
10,0140
0,0020
Crioint 1
0,049423
0,049423
0,0200
0,8888
Conc 3
15,060733
3,368953
1,9970
0,1187
Crioext*Crioint 1
3,368953
3,368953
1,3400
0,2496
Crioext D/
1
Crioint 1 /1 1
5,063816
5,063816
2,0140
0,1587
Crioext D/
1
Crioint 2 /2 1
23,484105
23,484105
9,3400
0,0028
Crioext D/
1
Crioint 1 /1 1
1,488085
1,488085
0,5920
0,4434
Crioext D/
1
Crioint 2 /2 1
1,930291
1,930291
0,7680
0,3828
Crioext*Conc 3
2,706892
0,902297
0,3590
0,7827
Crioext /1 1
5,566793
5,566793
2,2140
0,1396
Crioext /2 1
16,103870
16,103870
6,4050
0,0128
Crioext /3 1
3,786589
3,786589
1,5060
0,2224
Crioext /4 1
2,428607
2,428607
0,9660
0,3279
Crioint*Conc 3
5,221376
1,740459
0,6920
0,5586
Conc /1 3
1,570389
0,523463
0,2080
0,8905
Conc /2 3
16,197237
5,399079
2,1470
0,0976
Crioint /1 1
0,334202
0,334202
0,1330
0,7161
Crioint /2 1
0,038965
0,038965
0,0150
0,9012
Crioint /3 1
0,618310
0,618310
0,2460
0,6210
Crioint /4 1
4,279321
4,279321
1,7020
0,1948
Crioext*Crioint*Conc 3
6,620985
2,206995
0,8780
0,4550
erro 110
276,581274
2,514375
1
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