( PDF ) Caracterização morfológica dos pseudocistos de Tritrichomonas foetus

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Dissertação de Mestrado

Caracterização Morfológica dos Pseudocistos de

Tritrichomonas foetus

ANTONIO PEREIRA DAS NEVES NETO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

RIO DE JANEIRO

2009

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Antonio Pereira das Neves Neto

Caracterização morfológica dos pseudocistos de Tritrichomonas foetus.

Tese: Mestrado em ciências morfológicas

Universidade Federal do Rio de Janeiro, IB, CCS, Programa de Pós-Graduação

em Ciências Morfológicas.

Rio de Janeiro, 2009

xv, 142f.: il

Orientador: Marlene Benchimol

1. Tritrichomonas foetus. 2. Pseudocistos. 3. Mitose. 4. Endocitose. 5. Interação

parasito-célula hospedeira.

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CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS PSEUDOCISTOS DE

Tritrichomonas foetus

ANTONIO PEREIRA DAS NEVES NETO

RIO DE JANEIRO

2009

Dissertação apresentada ao Programa

de Ciências Morfológicas – UFRJ

como parte das exigências para a

obtenção do grau de Mestre em

Biologia Celular

Orientador: Dra. Marlene Benchimol

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS PSEUDOCISTOS DE Tritrichomona

foetus

ANTONIO PEREIRA DAS NEVES NETO

Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Morfológicas – PCM, Instituto de Ciências Biomédicas – ICB, Universidade

Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do grau de Mestre.

Aprovada por:

___________________________________________________________________

Prof. Silvana Allodi

Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ

_______________________

____________________________________________

Prof. Marcia Attias

Instituto de Biofísica – UFRJ

___________________________________________________________________

Prof. Maria Cristina Machado Motta

Instituto de Biofísica – UFRJ

___________________________________________________________________

Prof. Helene Santos Barbosa (Revisora)

Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ

_____________________________________________________________________

Prof. Ana Maria Blanco Martinez (Suplente)

Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ

___________________________________________________________________

Prof. Marlene Benchimol (Orientadora)

Programa de Ciências Morfológicas - UFRJ

Rio de Janeiro

2009

Esta dissertação foi desenvolvida no Laboratório de Ultra-estrutura Celular da

Universidade Santa Úrsula, sob a orientação da Dra. Marlene Benchimol, com o apoio

financeiro do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico),

PRONEX (Programa de Núcleo de Excelência), FAPERJ (Fundação Carlos Chagas

Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), CAPES (Coordenação de

perfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e AUSU (Associação Universitária

Santa Úrsula).

Este trabalho é dedicado:

os meus pais Maria Zélia Baptista das Neves

e Antonio Pereira das Neves Filho por terem

me dado a oportunidade de estudar mesmo

com todas as dificuldades enfrentadas.

A Deus, pela benção de viver.

AGRADECIMENTOS

Aos familiares:

Meus agradecimentos a minha família chegam a ser redundantes, já que ela é o pila

em que sustento toda minha vida.

os meus pais Maria Zélia e Antonio Pereira pelo amor, carinho, mimo, dedicação e

paciência dados a mim. No mundo não há melhores pais. Eu não seria ninguém sem

vocês dois. Amo vocês.

s minhas irmãs Teresa e Rosangela. Vocês são muito mais do que irmãs, são mães.

Obrigado por me mimarem, por fazerem as minhas vontades e por terem sempre

incentivado e apoiado os meus estudos.

os meus sobrinhos Gabriel, Caroline e Anna por me lembrarem que dentro de nós há

sempre uma criança.

o meu cunhado Washington por ter me dado apoio num momento em que eu

precisei.

Aos colaboradores:

Ao Professor Renato Cruz (in memoriam) pelos seus valiosos ensinamentos sobre

microscopia eletrônica. A microscopia no Brasil teve uma enorme perda.

Karla Ribeiro (Karlinha), Rívea Cristina, Francisco Gomes (Chico) e Elivaldo Lima

(Eli) pelos preciosos ensinamentos sobre as mais diferentes técnicas e aparelhos.

Obrigado pelo carinho e a amizade. O laboratório nunca mais foi o mesmo sem vocês.

s Professoras Márcia Attias, Cristina Motta, Silvana Allodi e Ana Martinez por terem

aceito o convite para fazer parte da banca examinadora.

Aos Amigos:

Ivone Rosa. Minha irmã, amiguinha e companheira do mestrado. Obrigado pela

amizade, carinho e momentos divertidíssimos. Nossa amizade deixa todo mundo do

laboratório com ciúme, mas você sabe que eu nem ligo (e eu aperto mesmo).

A Gladys Côrrea pela sua doçura, amizade e carinho. Sei que você será muito feliz.

o Victor Midlej. Peraí! Na verdade é você que tem que me agradecer, mas tudo bem.

Obrigado pela amizade, os momentos super divertidos e por me deixar implicar com

você. Saiba que mesmo não querendo você é amiguinho SIM!

A Fernanda Reinol (Fê). Obrigado pela amizade, carinho, momentos divertidos e o

apoio técnico. Gosto muito de você, mesmo com nossas opiniões (às vezes)

divergentes.

o Ricardo Vilela (Hai) por me mostrar como as pessoas melhoram depois que

começamos a gostar delas. Obrigado pelos momentos de descontração, amizade e

pela ajuda com as células MDCK.

Débora Rocha (pequenininha) por ser a irmã mais nova que eu nunca tive (e que

nunca terei, diga-se de passagem!). Obrigado pelo seu jeito meigo e carinhoso.

Às novinhas Lilian (do contra) e Isadora (cabelo) por serem irritadas por mim

facilmente. Gosto muito de vocês.

o Alexandre Fabre. Apesar de todos os problemas, obrigado pela paciência e carinho

que teve comigo.

vii

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Palavras são insuficientes para expressar os meus agradecimentos a minha

orientadora Professora Marlene Benchimol. Sem a senhora este trabalho não existiria.

Obrigado por ter me aceito e confiado em mim quando eu era apenas um pirralho de

16 anos (Nossa! Quanto tempo!). Obrigado por ser a minha mãe científica (espero que

a minha mãe não fique com ciúmes). Sua confiança, orientação e competência

contribuem para o meu crescimento profissional, intelectual e pessoal. Toda minha

admiração por seu brilhantismo acadêmico se torna secundária quando contemplo seu

lado humanista e sua obstinação. Orientadora é uma palavra ideal para defini-la. É sob

sua tutela que guio meus passos. Muito obrigado! Por tudo!

gradeço à professora Adriana Cataldi. Anjo que apareceu na minha vida. Sem você,

dificilmente eu estaria no laboratório da Professora Marlene Benchimol.

gradeço à Professora Helene Barbosa pela atenção e carinho dados a mim durante a

revisão deste trabalho. A atitude e a competência da senhora estão marcadas em mim

para sempre. Muito obrigado!

Agradeço ao Claudio Padua, meu companheiro e amigo. Anjo enviado por Deus para

me mostrar a felicidade. Obrigado por existir e por ser parte essencial da minha vida.

(Fui bailar no meu batel - Além do mar cruel - E o mar bramindo - Diz que eu fui rouba

- A luz sem par - Do teu olhar tão lindo).

viii

“O homem está sempre disposto a

negar aquilo que não compreende.”

(Luigi Pirandello)

ÍNDICE

DEDICATÓRIA iv

AGRADECIMENTOS v

EPÍGRAFO viii

ÍNDICE ix

PUBLICAÇÕES xii

RESUMO xiii

ABSTRACT xiv

ABREVIATURAS xv

1 - INTRODUÇÃO 1

1.1. Classificação 1

1.2. A Biologia de T. foetus 2

1.3. Epidemiologia e Importância Econômica e Veterinária 4

1.4. Interação Parasito-Hospedeiro 6

1.5. Morfologia dos Parasitos Piriformes 8

1.5.1. Superfície Celular 8

1.5.2. Hidrogenossomos 9

1.5.3. Retículo Endoplasmático 10

1.5.4. Complexo de Golgi e Filamentos Parabasais 11

1.5.5. Vesículas e Lisossomos 12

1.5.6. Citoesqueleto 12

1.5.6.1. Flagelos 14

1.5.6.2. Complexo Pelta-Axostilar 15

1.5.6.3. Costa 16

1.5.6.4. Centrossomos e Fuso Mitótico 17

1.5.7. Núcleo e Divisão 17

1.6. Pseudocistos em Tricomonadídeos 20

1.6.1. Histórico 22

1.6.2. Pseudocistos em T. foetus 25

1.7. Objetivos 27

1.7.1. Geral 27

1.7.2. Específicos 27

2 - MATERIAIS E MÉTODOS 28

2.1. Cultivo in vitro de Tritrichomonas foetus 28

2.2. Análise das Culturas Axênicas 28

2.3.Testes de Indução e Reversibilidade de Pseudocistos 29

2.4. Videomicroscopia 30

2.5. Microscopia Óptica de Fluorescência 30

2.5.1. Marcadores Nucleares 30

2.5.1.1. DAPI 30

2.5.1.2. Hoechst 33342 e Iodeto de propídeo 31

2.5.2. Imunofluorescência 31

2.6. Microscopia Eletrônica 32

2.6.1. Microscopia Eletrônica de Varredura 32

2.6.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão 33

2.7. Ensaios de Endocitose

2.7.1. Traçadores Fluorescentes 34

2.7.1.1. Lucifer Yellow e FITC-BSA 34

2.7.1.2. Micro-Esferas de Poliestireno Fluorescentes 34

2.7.2. Traçadores Não-Fluorescentes 35

2.7.2.1. Micro-Esferas de Poliestireno 35

2.7.2.2. Lactobacilos e Escherichia coli 35

2.7.3. Ensaios de Inibição 36

2.7.4. Fosfatase Ácida 36

2.7.5. Quantificação da Endocitose 37

2.7.5.1. Capacidade de Adesão 37

2.7.5.2. Habilidade Endocítica 37

2.7.5.3. Quantificação de Fluorescência 37

2.7.5.4. Análise Morfométrica 38

2.8. Ensaios de Interação Parasita/Célula-Hospedéira e Citotoxicidade 38

3 – RESULTADOS 40

3.1. Análise das Culturas Axênicas 40

3.2. Indução dos Pseudocistos 40

3.3. Reversibilidade dos Pseudocistos 41

3.4. Mitose dos Pseudocistos 47

3.5. Formação dos Pseudocistos Multinucleados 55

3.6. Atividade Endocítica dos Pseudocistos 62

3.7. Interação com Células Epitelias: Pseudocistos são

mais citotóxicos 70

4 - DISCUSSÃO 76

4.1. Formação dos Pseudocistos 76

4.2. Comparação Morfológica entre a Mitose dos Parasitos

Piriformes e dos Pseudocistos 77

4.3. Pseudocistos Multinucleados 79

4.4. Comparação Morfológica entre a Mitose dos Pseudocistos

de T. foetus e de Outros Parabasalídeos 81

4.5. Os Microtúbulos do Fuso de T. foetus são Resistentes ao Frio 84

4.6. Endocitose pelos Pseudocistos 85

4.7. Tricomonadídeos são Capazes de Endocitar Durante a Mitose 87

4.8. Efeitos Citotóxicos Exercidos pelos Pseudocistos 87

4.9. Conclusões 90

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91

6 - ANEXO 104

xii

Parte dos resultados desta dissertação encontra-se no seguinte trabalho

aceito para publicação na revista Protist (vide Anexo):

PEREIRA-NEVES, A., BENCHIMOL, M. Tritrichomonas foetus: budding from

multinucleated pseudocysts.

Outra parte dos resultados desta dissertação encontra-se nos trabalho

abaixo submetido para publicação:

PEREIRA-NEVES, A., BENCHIMOL, M. Endocytic activity and cytopathic effects

exerted by Tritrichomonas foetus pseudocysts.

Durante o desenvolvimento desta dissertação, participei também dos

seguintes trabalhos:

PEREIRA-NEVES, A., BENCHIMOL, M. (2008) Trichomonas vaginalis: in vitro survival

in swimming pool water samples. Exp. Parasitol., 118: 438-441.

VANCINI, R.G., PEREIRA-NEVES, A., BOROJEVIC, R., BENCHIMOL, M. (2008)

Trichomonas vaginalis harboring Mycoplasma hominis increases cytopathogenicity in

vitro. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 27: 259-267.

xiii

RESUMO

Tritrichomonas foetus é um protozoário parasita flagelado causador da tricomonose

bovina, a principal doença sexualmente transmissível em gado. Este parasito possui

um ciclo de vida simples, apresentando somente a forma de trofozoíto, que se

caracteriza pela morfologia piriforme. Sob condições ambientais desfavoráveis, os

trofozoítos de T. foetus assumem uma forma arredondada e internalizam os seus

flagelos formando os pseudocistos. Por muito tempo, os pseudocistos foram

considerados uma forma degenerativa. Atualmente, acredita-se que os pseudocistos

sejam reversíveis e que sua formação represente um mecanismo de defesa frente às

condições ambientais desfavoráveis. Existem inúmeras questões importantes sobre a

biologia dos pseudocistos que ainda precisam ser elucidadas, tais como: (1) eles são

capazes de realizar mitose? (2) os pseudocistos possuem atividade endocítica? (3) os

pseudocistos são capazes de exercer efeitos citotóxicos sobre as células-alvo? No

presente estudo, para analisar e comparar o comportamento dos pseudocistos com os

parasitos piriformes foram utilizadas técnicas de imunofluorescência, videomicroscopia

microscopia eletrônica de varredura e transmissão, ensaios de citotoxicidade pelo

método de coloração com cristal violeta, dentre outras. Ambas as formas de T. foetus

foram submetidas a ensaios de endocitose com diferentes traçadores, tais como,

Lucifer yellow, FITC-BSA e partículas de poliestireno. Adicionalmente, ensaios de

interação foram realizados utilizando ambas as formas de T. foetus e células MDCK

(uma linhagem de célula epitelial de rim de cachorro). Os resultados mostraram que os

pseudocistos realizavam sucessivas divisões mitóticas sem a ocorrência da citocinese,

formando células multinucleadas. Sob condições ambientais favoráveis, os

pseudocistos multinucleados externalizaram os seus flagelos e, em seguida, cada

indivíduo piriforme foi gradualmente se individualizando e se desprendendo po

completo da célula multinucleada. Análises morfológicas e quantitativas quanto a

capacidade endocítica de cada forma revelaram que os pseudocistos ingeriram mais

traçadores endocíticos do que os trofozoítos. Além disso, os pseudocistos provocaram

mais danos à monocamada de células MDCK do que os trofozoítos. Assim, as

conclusões obtidas foram que os pseudocistos: (1) se dividem por um processo

distinto da mitose realizada pelos organismos piriformes; (2) são capazes de endocita

e possuem uma atividade endocítica maior do que os parasitos piriformes; (3)

constituem uma forma mais citotóxica do que os organismos piriformes. O presente

estudo contribui, portanto, para uma melhor compreensão dos pseudocistos no

contexto da biologia dos tricomonadídeos.

xiv

BSTRACT

Tritrichomonas foetus is a flagellated protozoan parasite that causes bovine

trichomoniasis, a major sexually transmitted disease in cattle. This parasite presents a

simple life cycle, exhibiting only the trophozoitic form, which is characterized by a pear-

shaped body. Under unfavorable environmental conditions, the T. foetus trophozoites

can round up and internalize their flagella forming pseudocysts. For many years,

pseudocysts were considered to be a degenerated form. Currently, it is believed tha

this form is reversible and that its formation represents a defense mechanism to

unfavorable environmental conditions. There are still several open questions

concerning pseudocysts´ biology, such as: (1) is this form capable to divide? (2) are

pseudocysts able to endocytose? (3) Does pseudocyst exert cytotoxic effects on host

cells? In the present work, complementary techniques, such as, immunofluorescence,

videomicroscopy, scanning and transmission electron microscopy and cytotoxicity

assays by crystal violet staining method were performed in order to study and compare

the behavior of pseudocysts with the pear-shaped organisms. Both T. foetus forms

were submitted to endocytic assays using several markers, such as, Lucifer yellow,

FITC-BSA and polystyrene microspheres. In addition, interaction trials of both parasite

forms with MDCK (an epithelial kidney canine cell) were carried out. The results

showed that cytokinesis is arrested during pseudocyst mitosis while the nucleus

proceeds with sequential karyokineses forming multinucleated cells. Under favorable

environmental conditions, the multinucleated pseudocysts externalized the flagella and

then pear-shaped organisms were gradually separated from these multinucleated cells.

Morphological and quantitative analyses revealed that pseudocysts were able to ingest

different endocytic tracers in a higher ratio than the pear-shaped parasites. Moreover,

pseudocysts provoked greater injury on MDCK monolayers than the pear-shaped. The

conclusions were that pseudocysts: (1) are capable to divide with characteristics

different from those found in the pear-shaped parasites; (2) are able to endocytose and

demonstrated higher endocytic ability when compared to the pear- shaped organisms;

(3) are more cytotoxic when compared to pear-shaped parasites. Thus, the present

study contributes to a better understanding of the trichomonad pseudocysts’ biology.

ABREVIATURAS

- ATP Trifosfato de adenosina

- BSA Albumina sérica bovina

- CCD Dispositivo de carga acoplado

- CO

Dióxido de carbono

- CP-30 Cisteíno-protease de 30 kDa

- DAPI 4’, 6-diamidino-2-fenilindol

- DIC Contraste interferencial diferencial

- DMEM

Dubelcco’s Modified Eagle Medium

- DNA

- FITC

Ácido desoxirribonucléico

Isotiocianato de fluoresceína

- Hoechst 33342 2’-(4-etoxifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-2, 5’-bi-1H-benzimidazol

- MDCK

Madin-Darby Canine Kidney

- mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

- NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo

- PBS Tampão fosfato de sódio salino

- PCR Reação de polimerase em cadeia

- SDS Dodecil sulfato de sódio

- SB Soro bovino

- TYM

Tryptcase - Yeast extract - Maltose

1. INTRODUÇÃO

1.1 C

LASSIFICAÇÃO

Tritrichomonas foetus (Riedmüller, 1928) é um protozoário parasita

pertencente ao Filo Parabasala e à Família Trichomonadidea. Os tricomonadídeos são

organismos que se caracterizam pela presença de quatro a seis flagelos (um sempre

recorrente), de um aparato parabasal (complexo de Golgi com filamentos parabasais

associados) e do complexo pelta/axóstilo (sistema de microtúbulos). Além disso, estes

protozoários são amitocondriais (parte do metabolismo energético provém de

organelas chamadas hidrogenossomos), não apresentam peroxissomos e possuem

ribossomo 70S (Champney et al., 1992). Dentre os representantes desta família

encontram-se os patógenos Trichomonas vaginalis (Donné, 1836), parasito do trato

urogenital humano, Tetratrichomonas gallinarum (Martin & Robertson, 1911), parasito

da cavidade bucal e do ceco de aves, Tritrichomonas muris (Grassé, 1926), parasito

do trato intestinal de roedores, e o próprio T. foetus, parasito do trato urogenital bovino

e do trato intestinal de felinos.

Apesar de ainda não estar claro o grau de parentesco entre as diversas

espécies de tricomonadídeos, estudos moleculares de filogenia indicam que esses

organismos encontram-se entre os mais primitivos eucariotos (Fig. 1).

A classificação atual deT. foetus foi proposta por Hampl et al. (2006):

Filo Parabasala

Classe Trichomonadea

Ordem Trichomonadida

Família Trichomonadidae

Subfamília Tritrichomonadinae

Gênero Tritrichomonas

Espécie Tritrichomonas foetus

Figura 1. Árvore filogenética universal baseada na comparação das sequências de 16s rRNA.

A barra de escala corresponde a 0.1 modificações por nucleotídeo (fonte: Pace, 1997).

1.2 A BIOLOGIA DE T. foetus

T. foetus é o agente etiológico da tricomonose urogenital bovina, uma

doença sexualmente transmissível de ampla distribuição geográfica. Esta doença se

caracteriza por um processo infeccioso no trato urogenital, acompanhado de

inflamação, por conta da interação deste organismo e o epitélio desta região. Como

conseqüência, pode causar infertilidade e levar ao aborto, acarretando, portanto,

perdas econômicas consideráveis em todo o mundo (Singh et al., 2004).

Recentemente, T. foetus foi também reconhecido como o agente

responsável pela tricomonose felina, doença que afeta o intestino grosso de gatos

domésticos (Stockdale et al., 2008a; 2009). Os sinais clínicos desta doença incluem

diarréia crônica associada com sangue ou muco, flatulência, tenesmo, irritação anal,

anorexia e perda de peso (Gookin et al., 1999; Foster et al., 2004; Stockdale et al.,

2006).

T. foetus foi descrito pela primeira vez em 1900 por Manzzati (revisto em

Kirby, 1951). Quando cultivado em meio axênico, este parasito é caracterizado

morfologicamente por formato oval (piriforme), medindo em torno de 16 µm de

comprimento e 10 µm de largura no eixo maior (Kirby 1951; Mattos et al., 1997).

Apresenta três flagelos anteriores de tamanhos aproximadamente iguais (cerca de 13

µm) e um flagelo recorrente que possui de três a cinco ondulações medindo em torno

de 16 µm de comprimento (Fig. 2) (Benchimol, 2004).

À parte do seu interesse veterinário, T. foetus também é importante sob o

aspecto celular e evolutivo. Neste organismo ocorre a presença de estruturas como o

complexo pelta-axostilar (uma estrutura estável, composta por microtúbulos), a costa,

os hidrogenossomos, além da ausência de mitocôndrias e peroxissomos (Fig. 2)

(Benchimol, 2004). Seu citoesqueleto, formado por uma variedade de estruturas

protéicas, ainda não é muito bem compreendido (Benchimol, 2005).

Além da forma oval (que é a mais comum nos meios de cultura axênicos), o

parasito pode ainda assumir duas outras morfologias distintas: a amebóide (mais

frequente quando o parasito interage com suas células-alvo) e o pseudocisto (que será

descrito posteriormente no item 1.6). Formas císticas não foram encontradas em T.

foetus.

Figura 2. Esquema geral (a) e microscopia eletrônica de transmissão (b) de T. foetus

destacando as principais organelas e estruturas celulares. FA, flagelos anteriores; FR, flagelo

recorrente; MO, membrana ondulante; CB, corpúsculos basais; P, pelta; A, axóstilo; C, costa;

FP, filamentos parabasais; G, complexo de Golgi; RE, retículo endoplasmático; H,

hidrogenossomos; V, vesícula; L, lisossomo; Gl, grânulos de glicogênio. Barra = 1µm (Fonte:

Benchimol, 2004).

1.3 EPIDEMIOLOGIA E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA E VETERINÁRIA

A tricomonose bovina provoca graves prejuízos financeiro e econômico

nos Estados Unidos, Canadá e América do Sul, bem como em outras regiões do

mundo onde o controle sanitário é deficiente ou o sistema de produção é extensivo,

com a prática de procriação natural (Honigberg, 1978; Alstad et al., 1984; BonDurant,

1997). As perdas econômicas com esta doença em gado de corte podem ser

relacionadas com os custos com tratamento, sacrifício e reposição de animais

infectados e o mais importante: queda na produção de terneiros pela demora no

estabelecimento da prenhes (Anderson et al., 1996; BonDurant, 1997; Felleisen,

1999).

A transmissão da tricomonose bovina é direta e se dá através do coito. A

transmissão mecânica durante a inseminação artificial é rara. No macho, T. foetus se

aloja na cavidade do prepúcio, podendo invadir a uretra e porções mais profundas do

trato urogenital. O touro é portador assintomático, não demonstrando claramente a

infecção nem adquirindo naturalmente imunidade contra a mesma (Anderson et al.,

1994), e assim passa a infectar várias vacas. Os touros mais velhos têm maiores

riscos de adquirirem a doença e manterem-se portadores permanentes, uma vez que

com a idade há aumento da profundidade das criptas prepuciais (Honigberg, 1978,

Singh et al., 1999).

Após a transmissão, o parasito encontra o epitélio vaginal ao qual se adere

e inicia seu processo infeccioso. Como decorrência surge a vaginite, e,

subseqüentemente, os parasitos migram para o útero e possivelmente para o oviduto,

ficando confinado às células epiteliais do endométrio e da placenta, quando a vaca

está prenhe. No decorrer da gestação, se a vaca estiver contaminada, o parasito pode

comprometer o desenvolvimento fetal. São descritas várias conseqüências da

tricomonose bovina, como o aborto e esterilidade temporária e às vezes até mesmo

esterilidade permanente, caso ocorra destruição da mucosa uterina (Anderson et al.,

1996; BonDurant, 1997; Felleisen, 1999). A doença pode ser autolimitante a vacas,

que passam a apresentar uma resolução espontânea da infecção (Singh et al., 1999).

Na tricomonose felina, T. foetus coloniza e adere à superfície das células

do íleo, ceco e cólon do intestino grosso dos gatos provocando diarréia crônica

(Yaeger & Gookin, 2005; Stockdale et al., 2009). Esta doença afeta principalmente

filhotes e gatos com menos de dois anos de idade (Stockdale et al., 2008; 2009). O

mecanismo de transmissão da tricomonose felina ainda não foi determinado. Não está

claro se o parasito é transmitido através de fezes contaminadas ou entre a mãe e os

filhotes (Stockdale et al., 2009). Existe apenas um relato na literatura mostrando uma

infecção provocada por T. foetus no útero felino (Dahlgren et al., 2007).

1.4

INTERAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO

T. foetus é um parasita extracelular que interage tanto com o trato

urogenital de vacas infectadas (colonizando todas as regiões dos órgãos reprodutores)

quanto com o trato intestinal de gatos. Entretanto, os mecanismos de citotoxicidade

envolvidos na interação tricomonas-célula hospedeira ainda não foram totalmente

esclarecidos. É discutido se esses efeitos são dependentes ou independentes de

contato físico, embora se acredite que ambos os fatores possam estar envolvidos.

Alguns pesquisadores acreditam que os efeitos citotóxicos do parasito se

dêem por um processo dependente do contato com a célula hospedeira, causando-lhe

dessa forma, uma série de danos (Burgess et al; 1990; Singh et al., 2004). O

mecanismo de aderência do T. foetus envolve a interação entre moléculas da sua

superfície com as da superfície das células hospedeiras, tal como adesinas,

glicoconjugados, integrinas, glicosidases, proteínas formadoras de poro e

neuraminidases (Alderete & Garza, 1985; Silva Filho et al., 1989; Alderete et al., 1995;

Bonilha et al., 1995; Shaia et al., 1998; Singh et al., 1999; López et al., 2000).

A adesão do parasito é dependente de tempo, temperatura e pH, além de

perturbações causadas no citoesqueleto (Alderete & Garza, 1985; Silva Filho & de

Souza, 1988). Estudos mostraram que in vitro T. foetus adere predominantemente à

superfície das células epiteliais vaginais bovinas podendo ocorrer a invasão de tecidos

mais profundos (Rhyan et al., 1995). Em alguns trabalhos em nível ultraestrutural, foi

possível visualizar a emissão de projeções celulares – os filopódios, estabelecendo um

contato físico mais intenso com a superfície da célula hospedeira (Silva Filho & De

Souza, 1988; Bonilha et al., 1995).

Algumas moléculas têm sido evidenciadas no estudo da interação de T.

foetus com a célula hospedeira. Acredita-se que estruturas imunogênicas, importantes

na adesão do parasito com as células epiteliais estejam localizadas em um

componente do complexo da adesina Tf190 (Shaia et al., 1998). Observou-se também

a ação mediadora de laminina e fibronectina no processo de interação de T. foetus.

Em experimentos com superfícies de poliestireno e utilizando a linhagem celular

MDCK (Silva Filho & De Souza, 1988) ou HeLa (Petrópolis et al., 2008), foi visto que a

adesão do parasito é intensificada pela laminina. Constatou-se que a endocitose de

partículas de poliestireno por T. foetus aumentou quando revestidas por laminina e

fibronectina (Benchimol et al., 1990). Recentemente, demonstrou-se que T. foetus

possui pelo menos cinco proteínas de superfície capazes de reconhecer laminina-1

(Petrópolis et al., 2008).

Admite-se que durante a interação, as tricomonas interagem com o

ambiente vaginal, utilizando neste processo moléculas envolvidas com a transdução

de sinais, adesão à célula epitelial, interação com a matriz extracelular e com a

citotoxicidade (Silva Filho & De Souza, 1988). No ambiente onde o parasito se

encontra ocorrem intensas mudanças hormonais, o que é de grande importância, pois

há indícios do aumento da adesão de tricomonas em interação com células MDCK,

sob ação do estrogênio (Silva-Filho & Bonilha, 1992). As macromoléculas presentes

no soro também são importantes para o desenvolvimento da tricomonose. O soro

bovino inclui lipídios, lipoproteínas, proteínas carreadoras e adesivas, como albumina,

transferrina e fibronectina. Foi demonstrado que as tricomonas possuem receptores

para lipoproteínas, LDL e fibronectina (Peterson & Alderete, 1984a; 1984b; Alderete et

al., 2002). Vale também destacar os receptores para transferrina e lactoferrina nos

parasitos, pois estes transportadores de ferro mediariam a aquisição desse íon que é

necessário para a formação de enzimas que participam do metabolismo energético da

célula (Sutak et al., 2008).

Recentemente, duas cisteíno-proteases, a CP-30 e CP-8, foram

encontradas mediando o processo citotóxico de T. foetus em células epiteliais bovinas

(Singh et al., 2004; 2005; Lucas et al., 2008). Estas cisteíno-proteases estariam

relacionadas ao processo de apoptose das células vaginais (Singh et al., 2004) e do

endométrio (Singh et al., 2005). Pelo fato de estarem envolvidas na degradação de

proteínas da matriz extracelular, como a laminina e a fibronectina, as cisteíno-

proteases potencializariam o processo de citotoxicidade do protozoário (Silva Filho et

al., 2002). Sendo assim, as tricomonas assumiriam um caráter mais invasivo, pois o

acesso do parasito às camadas epiteliais profundas provocaria a esfoliação das

camadas mais superficiais.

Embora a importância das cisteíno-proteases tenha sido demonstrada in

vitro, seu papel parece ser também relevante in vivo (Felleisen, 1999). Algumas

cisteíno-proteases são capazes de clivar as imunoglobulinas IgG1 e IgG2 bovinas

evitando matar o parasito (Corbeil, 1994; De Azevedo & De Souza, 1992; 1996).

Acredita-se que estas cisteíno-proteases sejam capazes de atuar contra a resposta

imune degradando anticorpos do hospedeiro (Granger & Wardwood, 1996).

1.5

MORFOLOGIA DOS PARASITOS PIRIFORMES

1.5.1 Superfície Celular

A superfície celular de T. foetus possui grande interesse em pesquisa, uma

vez que é o ponto de contato com a célula hospedeira. É aí que se encontram as

moléculas, anteriormente descritas, responsáveis pela adesão do parasito que são de

grande interesse científico para melhor compreensão do parasitismo.

A organização da membrana plasmática dos tricomonadídeos foi

inicialmente descrita com base em estudos de microscopia eletrônica de transmissão

convencional (Simpson & White, 1964; Honigberg et al., 1971). Contudo, somente com

o advento das técnicas de congelamento celular e criofratura é que foi possível obter

detalhamento da ultraestrutura da membrana (Benchimol et al., 1981a; 1982a; 1992).

Diversos carboidratos, incluindo ácido siálico, manose, galactose, N-acetil

glicosamina e N-acetil galactosamina foram identificados na superfície deste parasito,

bem como nas membranas de compartimentos intracelulares (Benchimol et al., 1981b,

1982b; Benchimol & Bernardino, 2002).

1.5.2 Hidrogenossomos

Os tricomonadídeos são desprovidos de mitocôndrias, mas possuem uma

organela incomum e de grande importância: os hidrogenossomos. O termo

hidrogenossomo foi proposto por Lindmark & Müller (1973) devido à atividade

produtora de hidrogênio molecular da organela, que oxida o piruvato ou malato em

ácidos orgânicos, resultando na síntese de ATP, fundamental para o metabolismo

energético (Müller, 1993). Em T. foetus, os hidrogenossomos são organelas esféricas

com dimensões de 0,3 µm a 0,6 µm de diâmetro, que se apresentam dispostos

preferencialmente próximos ao axóstilo e a costa. Possuem uma dupla membrana e

uma vesícula periférica, independente da dupla membrana e da matriz, formando um

compartimento distinto (Benchimol et al., 1996a, 1996b; Benchimol, 2008). Através da

técnica de microanálise por raios-X, identificou-se a presença de íons divalentes no

interior desta vesícula, tais como os de cálcio, magnésio e zinco (Ribeiro et al., 2001),

além de alto nível de fósforo, que provavelmente estaria sob a forma de pirofosfatos

(Chapman et al., 1985). Ribeiro et al. (2001) relataram ainda a presença de cobalto e

alumínio nesta vesícula.

Uma série de similaridades foi observada entre os hidrogenossomos e as

mitocôndrias, tanto em nível bioquímico quanto estrutural, sugerindo um grau de

proximidade evolutiva entre as duas organelas. As principais semelhanças

encontradas foram: (1) a produção de ATP pela degradação do piruvato (Lindmark &

Müller, 1973; Muller, 1993); (2) a dupla membrana (Benchimol & De Souza, 1983); (3)

o mecanismo de biogênese, que ocorre por segmentação e partição (Benchimol et al.,

1996b); (4) o seqüestro de íons cálcio (Ribeiro et al., 2001); (5) as enzimas envolvidas

na formação de centros de ferro-enxofre (Carlton, et al., 2007); (6) a cardiolipina, um

lipídeo marcador de membrana mitocondrial interna e de bactérias (De Andrade Rosa

et al., 2006); (7) a NADH-desidrogenase, uma enzima constituinte da cadeia

transportadora de elétrons mitocondrial (Carlton, et al., 2007). Além disso, verificou-se

que as mitocôndrias e os hidrogenossomos possuem mecanismos de importação de

proteínas muito similares (Dyall et al., 2000; Carlton et al., 2007), uma vez que foram

encontradas em tricomonas várias chaperonas (Hsp70, Hsp60, Hsp10) responsáveis

por esta translocação, com seqüências sinais similares às seqüências de importação

para mitocôndrias (Bui et al., 1996; Carlton et al., 2007).

Varias diferenças, porém, foram constatadas entre ambas as organelas.

Nos hidrogenossomos não foram encontrados citocromos, enzimas do ciclo de Krebs,

atividade de F

ATPase, material genético e ribossomos (Lloyd et al., 1979; Turner &

Müller, 1983; Clemens & Johnson, 2000). Por outro lado, os hidrogenossomos

possuem enzimas que as mitocôndrias não apresentam, como a hidrogenase (Bui e

Johnson, 1996) e a piruvato-ferredoxina óxido-redutase (Hrdy & Müller, 1995).

Diversas hipóteses foram levantadas com o intuito de se estabelecer um

grau de parentesco evolutivo entre mitocôndrias e hidrogenossomos. Atualmente,

alguns grupos acreditam na possibilidade dos hidrogenossomos e mitocôndrias terem

evoluído de um ancestral comum a partir da mesma organela progenitora (Embley,

2006).

1.5.3 Retículo Endoplasmático

Assim como em células de eucariotos superiores, em T. foetus, o retículo

endoplasmático (RE) é normalmente visto ao redor do núcleo, e também formando a

membrana externa do envelope nuclear, porém em menor quantidade (Queiroz et al.,

1991; Benchimol, 2004). O RE também é encontrado em outros locais do citoplasma,

como próximo aos hidrogenossomos, podendo estar relacionado à formação das

vesículas periféricas (Benchimol & De Souza, 1985; Benchimol et al., 1996b;

Benchimol et al., 2000; Benchimol, 2008). Experimentos citoquímicos demonstraram a

presença de cálcio no RE de T. foetus, sugerindo que atue como reservatório deste

íon (Benchimol et al., 1982c; De Souza & Benchimol, 1988).

A vesiculação do RE durante a divisão celular, fenômeno comumente

observado em células de eucarioto superior, não foi constatado nos tricomonadídeos.

Sabe-se, porém, que em T. foetus algumas cisternas do retículo se alinham de modo

paralelo com os microtúbulos do fuso mitótico, o que poderia representar um recurso

de doação ou sequestro de cálcio para a divisão do parasito (Ribeiro et al., 2002a).

1.5.4 Complexo de Golgi e Filamentos Parabasais

Nos tricomonadídeos, o complexo de Golgi corresponde ao aparelho

parabasal, formado pelas cisternas e os filamentos parabasais (Benchimol 2004). Em

T. foetus, o aparelho parabasal fica localizado na região dorsal e à direita do núcleo. T.

foetus possui um único Golgi muito desenvolvido, podendo alcançar cerca de 5 µm de

comprimento, apresentando de 8 a 12 cisternas (Benchimol et al., 2001). Estudos

citoquímicos demonstraram a presença das enzimas tiaminopirofosfatase e fosfatase

ácida no Golgi de T. foetus (Queiroz et al., 1991). Experimentos utilizando a lectina

WGA fluorescente evidenciaram a existência de resíduos de N-acetil-glicosamina

nesta organela (Benchimol & Bernadino, 2002). Ao contrário do que ocorre nas células

de eucariotos superiores, onde há vesiculação do Golgi durante a divisão celular, nos

tricomonadídeos a organela permanece íntegra, apenas aumentando de tamanho por

crescimento lateral e se dividindo em duas, num processo denominado golgicinese

(Benchimol et al., 2001).

Os filamentos parabasais são estruturas cilíndricas e periódicas, formadas

por bandas claras e escuras. São morfologicamente semelhantes à costa, embora

sejam mais delgados que estas. Apresentam-se em número de dois, sendo

denominados filamentos parabasais 1 e 2 (PF1 e PF2). O PF1 tem sua origem entre

os corpúsculos basais do segundo e terceiro flagelos anteriores, e o PF2, entre o

terceiro flagelo anterior e o recorrente (Fig. 3) (Honigberg et al., 1971). Acredita-se que

os filamentos parabasais dêem suporte e mantenham o posicionamento do complexo

de Golgi (Honigberg et al., 1971; Brugerolle & Viscogliosi, 1994). A existência de

conexões filamentosas comunicando a cisterna cis do Golgi com os filamentos

parabasais tem sido sugerida (Benchimol et al., 2001).

Como os filamentos parabasais parecem ser nucleados a partir dos

corpúsculos basais (cinetossomos), existiria, portanto, possibilidade de haver uma

conexão entre o complexo de Golgi e os cinetossomos através de fibrilas (Benchimol

et al., 2001). Esta hipótese explicaria a provável migração do complexo de Golgi que

ocorre simultaneamente com a separação dos cinetossomos e dos flagelos durante a

mitose de T. foetus (Benchimol et al., 2001).

1.5.5 Vesículas e lisossomos

A atividade endocítica dos tricomonadídeos tem sido observada com a

utilização de diversos marcadores, como a peroxidase e várias proteínas conjugadas a

ouro ou revestindo microesferas de poliestireno (albumina, lactoferrina, transferrina,

lectinas) (Benchimol et al., 1986, 1990; Affonso et al., 1994, 1997).

O citoplasma de T. foetus possui várias vesículas de tamanhos distintos,

que compõem o sistema endocítico da célula. T. foetus apresenta uma atividade

endocítica muito intensa, embora esta aparente ser menor que a de T. vaginalis

(Benchimol et al., 1990; Affonso et al., 1994). As vesículas podem ser observadas, em

sua grande parte, constituindo o processo inicial da endocitose e, por este motivo,

localizam-se logo abaixo da superfície celular ou, mais profundamente, no citoplasma

da célula (Affonso et al., 1997).

Sugeriu-se que as principais enzimas constituintes dos lisossomos de

tricomonas seriam as hidrolases ácidas e neutras (Queiroz et al., 1991). Portanto, a

acidificação dos lisossomos sugeriria a presença de uma bomba de prótons nas

membranas desta organela, tal como é observado em outros eucariotos.

1.5.6 Citoesqueleto

Dentre os principais componentes do citoesqueleto dos tricomonadídeos

temos: o complexo pelta-axóstilo, formado por microtúbulos estáveis (Ribeiro et al.,

2000; 2002a; 2002b; Benchimol, 2005); os flagelos, que no caso de T. foetus são três

anteriores e um recorrente – este último percorre todo o corpo celular em contato com

a membrana plasmática, formando a chamada membrana ondulante (Honigberg et al.,

1971); os corpúsculos basais e seus filamentos associados, de onde emergem os

flagelos e as demais estruturas relacionadas ao movimento do parasito (Honigberg et

al., 1971; Ribeiro et al., 2000); a costa, estrutura protéica estriada com função de

suporte de sustentação da membrana ondulante (Honigberg et al., 1971); e os

filamentos parabasais (Brugerolle & Viscogliosi, 1994; Benchimol et al., 2001).

Diversas estruturas, como os filamentos sigmóides e os corpos infra e supra-

cinetossomal, ainda têm suas funções desconhecidas. Em T. foetus, pode-se também

encontrar microtúbulos lábeis como os que formam o fuso mitótico (Ribeiro et al.,

2000; 2002a).

Estudos bioquímicos, moleculares e estruturais também constataram a

presença de microfilamentos de actina no citoesqueleto de várias espécies de

tricomonadídeos (Brugerolle et al., 1996; Bricheux & Brugerolle, 1997; Bricheux et al.,

1998; 2000; Pereira-Neves & Benchimol, 2007). Estes microfilamentos são

preferencialmente encontrados na região cortical e nos pseudópodes das tricomonas,

quando realizam fagocitose ou em adesão ao substrato ou às células-alvo (Brugerolle

et al., 1996; Pereira-Neves & Benchimol, 2007). Em tricomonas, os filamentos

intermediários ainda não foram descritos.

Estudos sobre o citoesqueleto de tricomonas mostraram a modificação da

morfologia do protozoário durante sua atividade fagocítica ou quando aderido à

respectiva célula hospedeira (Brugerolle et al., 1996; Pereira-Neves & Benchimol,

2007). Desse modo, foi possível constatar uma reorganização do citoesqueleto

(principalmente os microfilamentos de actina), já que os parasitos apresentam uma

forma oval em meio axênico, e se transformam em amebóides quando ingerem

alguma partícula ou interagem com as células-alvo (Brugerolle et al., 1996; Pereira-

Neves & Benchimol, 2007). Em T. foetus, observou-se também uma reorganização

das estruturas esqueléticas durante sua transformação em pseudocistos (Granger et

al., 2000; Pereira-Neves et al., 2003).

Figura 3. Diagrama esquemático mostrando as principais estruturas esqueléticas encontradas

na região anterior de T. foetus. BB

, cinetossomo do primeiro flagelo anterior; BB

, cinetossomo

do segundo flagelo anterior; BB

, cinetossomo do terceiro flagelo anterior; RF, flagelo

recorrente; UM, membrana ondulante; Pe, pelta; Ax, axóstilo; FS, filamentos sigmóides; SB,

corpo supra-cinetossomal; C, costa; PF

, primeiro filamento parabasal; PF

, segundo filamento

parabasal; G, complexo de Golgi.

1.5.6.1 Flagelos

Os flagelos, tanto os anteriores quanto o recorrente, têm origem nos

corpúsculos basais, localizados na região anterior de T. foetus (Honigberg et al.,

1971). Cada corpúsculo basal recebeu um número e possui uma posição relativa (Fig.

3). O corpúsculo basal #2 emite de oito a nove fibras estriadas, denominadas de

filamentos sigmóides (Fig. 3) (Honigberg et al., 1971). Estes filamentos sigmóides

encontram-se próximos à região da junção pelta-axóstilo e conectam os corpúsculos

basais ao complexo pelta-axostilar, bem como, à superfície interna da pelta à área da

junção pelta-axóstilo (Honigberg et al., 1971). Entre o corpúsculo basal #2 e conectado

a ele e à pelta, na região anterior, situa-se o corpo supra-cinetossomal (Fig. 3)

(Honigberg et al., 1971). As funções do corpo supra-cinetossomal e dos filamentos

sigmóides são ainda desconhecidas, embora se acredite que estes sejam centros

organizadores dos microtúbulos do complexo pelta-axóstilo (Brugerolle et al., 2000).

Verificou-se que os flagelos anteriores possuem batimentos ciliares,

enquanto o recorrente, batimentos flagelares (Monteiro-Leal et al., 1995). Isto faz com

que o corpo do parasito gire em torno do seu próprio eixo e produza uma rotação.

1.5.6.2 Complexo Pelta-Axostilar

O complexo pelta-axostilar de tricomonadídeos é uma estrutura axial,

formada por microtúbulos, com função de sustentação e participação na cariocinese,

sendo composta pela pelta e pelo axóstilo (Fig. 3). Este se apresenta como uma folha

de microtúbulos, arrumados lado a lado, percorrendo o eixo longitudinal da célula,

desde a sua porção anterior até o extremo posterior da célula, onde termina como uma

forma afilada (Honigberg et al., 1971; Benchimol, 2004). A pelta se encontra numa

posição mais anterior e contígua ao axóstilo, sustentando as paredes do canal

periflagelar formando uma espécie de “colarinho” na região de emergência dos

flagelos (Honigberg et al., 1971; Benchimol, 2004).

Benchimol & De Souza (1987), utilizando microscopia eletrônica de alta

voltagem, mostraram a associação de hidrogenossomos com microtúbulos do sistema

pelta-axostilar de T. foetus. Posteriormente, utilizando técnicas de congelamento ultra-

rápido, Benchimol e colaboradores (2000) sugeriram que esta associação seria

estabelecida por filamentos delgados. Verificou-se também, após o uso de citoquímica

ultraestrutural para a detecção de glicose-6-fosfatase, a presença de perfis de retículo

endoplasmático percorrendo em paralelo aos microtúbulos do axóstilo de T. foetus

(Benchimol et al., 2000).

Alguns autores propuseram que o axóstilo de tricomonas fosse formado por

microtúbulos lábeis, já que estes seriam despolimerizados durante o início da divisão

celular do parasito ou quando submetidos ao tratamento de drogas que afetam os

microtúbulos, como a colchicina (Brugerolle, 1975; Juliano et al., 1986; Viscogliosi &

Brugerolle, 1994; Delgado-Viscogliosi et al., 1996). No entanto, nosso grupo mostrou

que os microtúbulos do axóstilo de T. foetus são estáveis, permanecendo íntegros

durante todo o processo de divisão celular (participando inclusive da cariocinese) ou

mesmo quando submetidos a tratamentos com drogas que afetam o citoesqueleto,

como vimblastina, colchicina, nocodazol e taxol (Silva-Filho & De Souza, 1986; Batista

et al., 1988; Ribeiro et al., 2000; 2002a; Madeiro da Costa & Benchimol, 2004).

1.5.6.3 Costa

A costa é uma estrutura presente em todos os tricomonadídeos. Assim

como as fibras parabasais, a costa é cilíndrica e formada por proteínas que

apresentam uma periodicidade com bandas claras e escuras, contudo esta é maior e

mais larga do que as fibras parabasais (Benchimol, 2004).

A costa percorre o sentido ântero-posterior da região dorsal de T. foetus,

estando sempre associada à membrana ondulante e ao flagelo recorrente, além disso,

possui sua origem entre os corpúsculos basais #2, #3 e R (Fig. 3) (Honigberg et al.,

1971). Benchimol et al. (1993) visualizaram por congelamento rápido seguido de

freeze-etching, filamentos delgados que fazem a conexão da costa à membrana

ondulante. O fato de haver filamentos que se projetam da costa, principalmente na

região voltada para a membrana ondulante, reforça a idéia de que a costa funcione

para esta como uma estrutura de ancoramento (Benchimol et al., 1993).

Existem duas classificações distintas de costa, denominadas tipo A e B.

Esta classificação é dada por diferenças no padrão periódico de sua estrutura e no

formato na região onde ela se origina (Honigberg et al., 1971). O padrão de estriação

da costa do tipo A (presente em T. foetus) é em bandas paralelas, alternando bandas

eletrondensas (com cerca de 37 nm de largura) com bandas mais claras (com largura

de 49 nm). O padrão de costa tipo B (presente em T. vaginalis) apresenta estriações

semelhantes à “espinhas de peixe”, com periodicidade de cerca de 42 nm.

1.5.6.4 Centrossomos e Fuso Mitótico

Os centrossomos dos tricomonadídeos são chamados de atractóforos

(Honigberg & Brugerolle, 1990). Os atractóforos são constituídos por um agregado

denso em forma de pêndulo localizado na base dos corpúsculos basais das

tricomonas e de outros parabasalídeos (Brugerolle, 1975; Ribeiro et al., 2002a). Em T.

foetus, demonstrou-se que estas estruturas estão abaixo do corpúsculo basal #2,

localizadas próximo à base da costa (Ribeiro et al., 2002a).

Durante a divisão celular, os atractóforos se tornam responsáveis pela

nucleação dos microtúbulos que constituirá o fuso mitótico. Os tricomonadídeos

apresentam um tipo de mitose muito peculiar, chamado de pleuromitose fechada com

fuso extranuclear (Brugerolle, 1975; Ribeiro et al., 2000; 2002a). Neste tipo de mitose,

o envoltório nuclear permanece íntegro durante todo o processo de divisão celular e

não há formação da placa metafásica. O fuso mitótico é extranuclear, disposto

lateralmente ao núcleo e formado por dois grupos de microtúbulos: os microtúbulos de

pólo-a-pólo e de pólo-a-núcleo (Brugerolle, 1975; Ribeiro et al., 2000; 2002a).

Os microtúbulos de pólo-a-núcleo interagem diretamente com o envelope

nuclear e não com os cinetócoros dos cromossomos (Brugerolle, 1975; Raikov, 1994;

Ribeiro et al., 2002a). Os microtúbulos de pólo-a-pólo, também chamados de

paradesmose, formam um feixe espesso e coeso entre os atractóforos duplicados

(Brugerolle, 1975; Raikov, 1994; Ribeiro et al., 2002a). À medida que a mitose

transcorre, o paradesmose continua a se alongar e pode se tornar curvo na forma de

“U” ou “V” (Brugerolle, 1975; Viscogliosi & Brugerolle, 1994; Ribeiro et al., 2002a).

1.5.7 Núcleo e Divisão

Os tricomonadídeos, quando não estão em divisão, apresentam um único

núcleo localizado preferencialmente na região anterior da célula. O envoltório nuclear

de T. foetus se apresenta como em eucariotos superiores. A porção mais externa está

em continuação com o retículo enquanto que a membrana interna se encontra voltada

para a matriz nuclear. Inúmeros complexos de poros típicos estão distribuídos ao

longo de todo o envoltório. (Benchimol et al., 1982a; Benchimol, 2004). Contudo, a

presença de laminas nucleares ainda não foi detectada. Estudos de cariótipo

revelaram que T. foetus é um organismo haplóide que possui cinco cromossomos

lineares e um único nucléolo, arredondado e que não se desfaz durante a mitose

(Ribeiro et al., 2002b).

Existe uma grande dificuldade para analisar o comportamento da divisão

celular dos tricomonadídeos pelo fato destes organismos apresentarem uma mitose

fechada com fuso extranuclear. Entretanto, pesquisas recentes apontam, além da

interfase (períodos G

, S e G

), quatro etapas distintas na mitose de T. foetus (Ribeiro

et al., 2000; 2002a; 2002b). No início da interfase (G1), o parasito apresenta a típica

forma oval e suas estruturas ainda não foram duplicadas (Fig. 4a). Posteriormente,

nos períodos S/G2, ocorre a duplicação dos flagelos (anteriores e recorrente), do

complexo pelta-axóstilo, da costa e do material genético (Figs. 4b-c).

Na fase 1 da divisão celular, o protozoário se mantém na forma oval,

contudo apresenta mais volume (Figs. 4d-e). Gradualmente, devido ao impulso

proporcionado pelos flagelos, os cinetossomos duplicados começam a migrar para

lados opostos do parasito (Fig. 4f). Como conseqüência, os axóstilos duplicados

também se movimentam (acompanhando os cinetossomos) (Fig. 4f). Esta migração

faz com que as tricomonas alterem gradativamente sua morfologia, assumindo uma

forma triangular (fase 2 da mitose) (Figs. 4f-h).

Na fase 2, o núcleo das tricomonas se encontra mais alongado e entre os

dois axóstilos que agora estão curvados na região anterior da célula (Figs. 4f-h). Ao se

cruzarem os axóstilos começam a estrangular o núcleo (que irá posteriormente

culminar na cariocinese) (Figs. 4f-h). Outra característica desta fase é a elevação do

flagelo recorrente a uma posição perpendicular ao eixo axial do corpo celular do

parasito. Este último evento redireciona a força de propulsão do flagelo recorrente.

Neste momento, as extremidades posteriores dos axóstilos estão completamente

separadas e voltadas para direções opostas (Fig. 4i). A migração dos axóstilos em

direções contrárias faz com que o parasito altere o seu formato triangular e assuma

uma morfologia alongada (fase 3) (Figs. 4j-l). A transição da fase 2 para fase 3 é

caracterizada pela cariocinese, que no caso de T. foetus é uma conseqüência do

deslocamento dos axóstilos (Fig. 4i). Por último, a fase 4 se caracteriza pela

separação das duas células-filhas (Fig. 4m). Os movimentos dos flagelos (juntamente

com a localização deles em direções opostas no corpo celular do parasito durante a

divisão celular) parecem auxiliar o processo de citocinese (Ribeiro et al., 2000; 2002a;

2002b). O mecanismo de segregação dos cromossomos das tricomonas ainda

permanece um mistério.

Algumas controvérsias marcaram os relatos referentes ao comportamento

das estruturas do citoesqueleto durante a divisão celular em tricomonas. Trabalhos

antigos sugerem o desaparecimento do axóstilo no início do processo da mitose,

indicando sua possível despolimerização (Samuels, 1957; 1959; Brugerolle, 1975;

Viscogliosi & Brugerolle, 1994; Delgado-Viscogliosi et al., 1996). Segundo esses

autores, os microtúbulos do fuso de pólo-a-núcleo seriam os únicos responsáveis pela

cariocinese e os de pólo-a-pólo seriam essenciais para a separação das células-filhas.

Há também discordâncias a respeito do comportamento dos flagelos. Enquanto

Viscogliosi & Brugerolle (1994) propuseram que tais estruturas se duplicariam durante

a mitose, Ribeiro et al. (2000) afirmaram que esta duplicação aconteceria na interfase.

Figura 4. Imagens de T. foetus durante o processo mitótico obtidas por microscopia óptica de

campo claro após coloração pelo método do Panótico. a: Parasito em interfase (período G1). b-

c: Períodos S/G2 da interfase. d-e: fase 1 da mitose. f-h: fase 2 da mitose. i-l: fase 3 da

mitose. m: fase 4. A, Axóstilo; N, núcleo. Barras: figs. a-h = 3µm; figs. i-m = 2µm. (Fonte:

Ribeiro et al., 2000).

1.6 PSEUDOCISTOS EM TRICOMONADÍDEOS

A grande maioria dos tricomonadídeos tem um ciclo de vida simples

apresentando somente a forma do trofozoíto. Formas císticas foram descritas somente

em duas espécies de tricomonas comensais do intestino de anfíbios e lagartos:

Trichomitus batachorum e Trichomitus sanguisugae (Brugerolle, 1973). Embora sejam

as suas únicas formas, os trofozoítos dos tricomonadídeos, como mencionado

anteriormente, apresentam uma grande plasticidade morfológica: quando cultivadas

em meio axênico ou estão se locomovendo livremente, as tricomonas apresentam o

típico formato oval; ao interagirem com suas células-alvo ou algum outro tipo de

substrato, estes organismos assumem uma morfologia amebóide, dependendo da

espécie. Além disso, as tricomonas podem apresentar uma terceira forma distinta: o

pseudocisto (Pereira & Almeida, 1940; Stachan et al., 1984; Abonyi, 1995; Pereira-

Neves et al., 2003; Benchimol, 2004).

A formação dos pseudocistos se refere à mudança morfológica dos

tricomonadídeos piriformes em formas arredondadas (ou amebóides), imóveis, com os

flagelos internalizados, muito semelhantes a cistos, porém sem apresentar uma parede

cística (Fig. 5) (Pereira-Neves et al., 2003). Os pseudocistos são encontrados nas mais

diversas espécies de tricomonadídeos e parabasalídeos (Pereira & Almeida, 1940;

Pereira-Neves et al., 2003; Hampl et al., 2007). Eles são frequentemente observados em

culturas axênicas submetidas a condições de estresse, tais como deprivação de

nutrientes, choque térmico, aumento da tensão de oxigênio e tratamento com drogas

como colchicina, taxol e nocodazol (Mattern, et al., 1973; Granger et al., 2000; Pereira-

Neves et al., 2003; Madeiro da Costa & Benchimol, 2004). Contudo, estas formas

também são encontradas sob condições in vivo tanto em lesões teciduais associadas

à presença de tricomonas como em amostras de corrimentos vaginais, urina e fezes

diarréicas (Pereira & Almeida, 1940; Mattern & Daniel, 1980; Malyszko & Januszko,

1991; Lipman et al., 1999).

Durante a formação dos pseudocistos, as tricomonas piriformes, que

apresentam polaridade e flagelos externalizados, tornam-se arredondadas (ou

amebóides) e internalizam todos os seus flagelos (Fig. 5). Resultados obtidos através de

imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão revelaram que todas as

estruturas e organelas presentes nos parasitos piriformes são mantidas nos

pseudocistos, porém com algumas diferenças, dentre elas os flagelos, que ficam

localizados dentro de sulcos citoplasmáticos circundados por uma membrana; e o

axóstilo e a costa, que assumem uma forma curva ao invés de axial (Lipman et al., 1999;

Granger et al., 2000; Pereira-Neves et al., 2003). Contudo, a cadeia completa de eventos

e sinalizações que dispara todas estas alterações morfológicas ainda não foi

completamente elucidada.

Figura 5. Visão geral de T. foetus em pseudocisto observado por microscopia eletrônica de

varredura (a) e de transmissão (b). Note que os flagelos estão internalizados (F) e o parasito não

possui parede cística. N, núcleo; H, hidrogenossomo; Ax, axóstilo; G, complexo de Golgi; C, costa.

Barras fig. a = 3µm; fig. b = 1µm.

1.6.1 Histórico

Segundo Wenrich (1939), Donné (1837) já havia assinalado a existência de

formas amebóides e sem flagelos em T. vaginalis. Embora tenham sido notados por

muitos pesquisadores desde 1837, os pseudocistos nem sempre foram reconhecidos

como tricomonadídeos, pois eram frequentemente associados a fases do processo de

encistamento de outros protozoários, ou então considerados como meros achados ou

artefatos em esfregaços (Pereira & Almeida, 1940). Os pseudocistos só foram descritos

como uma forma de tricomonas em 1903 por Shaudinn, que estudava o parasito do

intestino humano Pentatrichomonas hominis (Pereira & Almeida, 1940). Posteriormente,

estas formas foram sendo observadas em outros tricomonadídeos. Contudo, a partir do

momento em que os pseudocistos foram claramente identificados como tricomonas,

surgiu a questão sobre qual seria o papel exercido por estas formas no ciclo de vida dos

tricomonadídeos.

Durante as três primeiras décadas do século XX, a grande maioria dos

trabalhos morfológicos referentes aos pseudocistos relacionou esta forma “aflagelada”

como precursora para a formação de cistos em tricomonas (Wenyon, 1907; Fanthan,

1910; Barlow, 1916; Boyd, 1919; Fonseca, 1920; Wenrich, 1921; Grassé, 1926; Tanabe,

1926; Galli-Valerio, 1927; Penso, 1932). Sabe-se hoje que os tricomonadídeos (com

raríssimas exceções) não apresentam cistos, entretanto, para tentar compreender como

os hospedeiros se tornavam infestados, inúmeros pesquisadores especularam (mesmo

nunca tendo encontrado) a existência de cistos em tricomonas. As formas císticas de

tricomonadídeos mostradas em alguns poucos trabalhos deste período eram na

realidade cistos de outros flagelados como giárdia, proteromonas, Chilomastix, dentre

outros (Pereira & Almeida, 1940).

Em contrapartida, alguns autores já negavam a possibilidade de existirem

cistos nos tricomonadídeos, e consideravam que as tricomonas “aflageladas”

representariam organismos em degeneração ao invés de formas pré-císticas (Martin &

Robertson, 1911; Goodey, 1917; Dobell & O´Connor, 1921; Bishop, 1931; Wenrich,

1931; 1939; Powell, 1936; Samuels, 1941; 1959). Partindo deste ponto de vista,

Wenrich (1931) passou a denominar estas formas “aflageladas” de pseudocistos

(“falsos cistos”) em referência ao aspecto esferóide assumido pelas tricomonas e pela

ausência da parede cística.

A partir da década de 40, a idéia de que os tricomonadídeos não

apresentavam formas císticas já estava praticamente aceita. Os pseudocistos

começaram a ser, então, ignorados pela maioria dos parasitologistas que

consideraram estas formas como degenerativas. Entretanto, ainda nos anos 40,

Pereira & Almeida (1940) ao estudarem diversas espécies de tricomonas, afirmaram

que os pseudocistos não estavam relacionados com o encistamento e nem com

degeneração. Estes autores verificaram, tanto em culturas quanto em hospedeiros,

que os pseudocistos eram formas reversíveis, patogênicas, com intensa capacidade

de multiplicação e com um elevado grau de vitalidade. Posteriormente, as

observações de Pereira & Almeida (1940) foram confirmadas por Houge (1943).

Por razões pouco claras os dois artigos citados acima não tiveram muita

repercussão, e o conceito de que os pseudocistos eram formas degenerativas de

tricomonas prevaleceu praticamente irrefutável até o final da década de 70. Para

reforçar ainda mais esta hipótese, Mattern e colaboradores (1973) publicaram um

estudo ultraestrutural em pseudocistos de T. batrachorum onde eles afirmaram que a

transformação das tricomonas em pseudocistos era irreversível e que estaria

relacionada com uma série de alterações morfológicas degenerativas, como o

desarranjo dos microtúbulos do flagelo recorrente e a degradação da membrana

ondulante.

Contudo, a partir dos anos 80, estudos reabriram as discussões sobre o

papel dos pseudocistos dentro do ciclo de vida das tricomonas. Conforme Pereira &

Almeida (1940) já haviam demonstrado, muitos pesquisadores começaram a sugerir

que os pseudocistos pudessem, de fato, ser metabolicamente ativos ao invés de

meras formas degenerativas. Foi verificado (tanto in vitro quanto in vivo) que os

pseudocistos de T. muris, embora apresentem uma capacidade de sobrevivência

limitada quando estão fora de seu hospedeiro, não seriam formas degenerativas, mas

pelo contrário, seriam reversíveis e infectantes (Mattern & Daniel, 1980; Stachan et al.,

1984; Koyama et al., 1987; Lipman et al., 1999). Friedhoff e colaboradores (1991)

também confirmaram estas mesmas observações para os pseudocistos de diversas

espécies de tricomonas parasitas de aves. Estudos experimentais realizados com

pseudocistos de T. foetus mostraram que estes são também formas reversíveis e

capazes de aderir às células hospedeiras (Granger et al., 2000; Mariante et al., 2004)

Atualmente, acredita-se que estas formas sejam reversíveis e que

representem uma resposta às condições ambientais desfavoráveis, tais como

mudanças bruscas de temperatura, aumento da tensão de oxigênio e dessecamento.

Uma vez as condições ambientais se normalizando, o parasito retornaria à forma oval,

com os flagelos exteriorizados. Entretanto, se o estresse for prolongado, os

pseudocistos se tornam irreversíveis e acabam degenerando (Stachan et al., 1984.

Mariante et al., 2003).

1.6.2 Pseudocistos em T. foetus

Embora T. foetus seja o tricomonadídeo de maior importância veterinária e

econômica, sua biologia ainda é pouco explorada e conhecida. Diferentemente do que

foi descrito para outras espécies de tricomonas, não há na literatura nenhum relato

sobre a existência in vivo de pseudocistos em T. foetus. Por muito tempo, inclusive,

acreditou-se que estes tricomonadídeos não formavam pseudocistos. Contudo,

estudos in vitro publicados recentemente mostraram que T. foetus pode ser facilmente

induzido a se transformar em pseudocisto (Granger et al., 2000; Pereira-Neves et al.,

2003; Mariante et al., 2004). Assim como verificado em outros tricomonadídeos, os

pseudocistos de T. foetus também são induzidos sob condições de estresse (como

baixas temperaturas e uso de drogas no meio de cultura) e reversíveis (Granger et al.,

2000; Pereira-Neves et al., 2003; Mariante et al., 2004). Entretanto, existem

pouquíssimos trabalhos dedicados à caracterização destas formas em T. foetus.

Embora a estrutura da superfície celular dos pseudocistos quando

observada por microscopia eletrônica convencional seja muito similar à superfície das

tricomonas piriformes (Stachan et al., 1984; Granger et al., 2000), não existem estudos

comparando a presença, quantidade e a distribuição de lipídios, glicoconjugados e

proteínas de membrana (como as adesinas e outros receptores) entre essas duas

formas de tricomonadídeos. Morfologicamente, os hidrogenossomos, o retículo

endoplasmático, o complexo de Golgi e o núcleo parecem não sofrer alterações

durante a formação dos pseudocistos (Granger et al., 2000; Pereira-Neves et al.,

2003). Contudo, nenhum estudo comparativo quanto a funcionalidade e o metabolismo

destas organelas entre as tricomonas piriformes e os pseudocistos tem sido explorado.

Não se sabe também se os pseudocistos teriam suas expressões gênicas alteradas.

Existem pouquíssimas informações no que diz respeito à reorganização das moléculas

do citoesqueleto durante a formação dos pseudocistos.

Imagens de pseudocistos observados por microscopia eletrônica de

transmissão revelam que estes, assim como nas tricomonas piriformes, apresentam

uma grande quantidade de vacúolos endocíticos (Pereira-Neves et al., 2003; Mariante

et al., 2004). Entretanto, não foram feitas comparações quantitativas entre as

atividades endocíticas dos pseudocistos em relação aos trofozoítos.

Alguns artigos na literatura apontam a possibilidade dos pseudocistos se

multiplicarem (Kofoid & Swezy; 1915; Pereira & Almeida, 1940; Stabler, 1941;

Pignatari de Martinez et al., 1976; Abonyi, 1995; Pereira-Neves et al., 2003). Estudos

ultraestruturais mostraram a presença do fuso mitótico em pseudocistos de T. foetus,

indicando que estas formas sejam capazes de se dividir de modo diferente dos

organismos piriformes (Pereira-Neves et al., 2003). Contudo, os eventos

morfogenéticos durante a mitose dos pseudocistos ainda não foram totalmente

esclarecidos.

Experimentos in vitro demonstraram que os pseudocistos de T. foetus

conseguem aderir às células-hospedeiras com muito mais intensidade do que os

parasitos piriformes (Mariante et al., 2004). Entretanto, são necessários estudos para

verificar se estas formas são realmente capazes de exercer efeitos citotóxicos nas

células-alvo e, posteriormente, comparar com a citotoxicidade exercida pelas

tricomonas piriformes.

Em face à escassez de conhecimentos a respeito dos pseudocistos de T.

foetus, o presente trabalho se propõe a esclarecer algumas dessas questões em

aberto, objetivando contribuir para uma melhor compreensão dos pseudocistos no

contexto da biologia dos tricomonadídeos.

1.7 OBJETIVOS

1.7.1 Geral

• Caracterizar funcional e morfologicamente os pseudocistos de T.

foetus procurando estabelecer critérios comparativos com o

trofozoíto.

1.7.2 Específicos

• Avaliar a viabilidade dos pseudocistos.

• Caracterizar o processo de adesão e citotoxicidade de pseudocistos

com células epiteliais e comparar com tricomonas piriformes.

• Verificar a atividade endocítica em pseudocistos comparando com

tricomonas piriformes.

• Verificar a capacidade mitótica dos pseudocistos e comparar com a

divisão celular dos parasitos piriformes.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 C

ULTIVO IN VITRO DE TRITRICHOMONAS FOETUS

A cepa k de T. foetus foi isolada na década de 70 pelo Dr. Hélio Guida

(Embrapa, Rio de Janeiro, Brasil) da cavidade prepucial de um touro naturalmente

infectado do estado do Rio de Janeiro, Brasil.

O meio TYM (Diamond, 1957) foi utilizado no presente trabalho com a

seguinte composição: 22 mg/ml de triptose (BBL), 11 mg/ml de extrato de levedura

(BBL), 5,6 mg/ml de maltose (Sigma Chemical Co.), 1 mg/ml de L-cisteína (Sigma

Chemical Co.), 0,2 mg/ml de ácido ascórbico (Sigma Chemical Co.), 0,9 mg/ml de

fosfato de potássio monobásico (Vetec) e 0,9 mg/ml de fosfato de potássio dibásico

(Vetec). Após adicionar os componentes acima, o pH foi ajustado para 6,2 e o meio foi

autoclavado a 120ºC por 20 minutos.

Assim, os trofozoítos foram cultivados axenicamente em tubos de vidro de

8 mL contendo 7 mL de meio TYM , acrescido de 10% de soro fetal bovino (Laborclin)

inativado por calor (60ºC por 1 hora). As culturas foram mantidas em estufa

(Thermolyne – 19200) à 37ºC por 24 horas e o meio foi trocado após este período, que

corresponde à fase logarítmica de crescimento.

2.2 A

NÁLISE DAS CULTURAS AXÊNICAS

Com o objetivo de verificar a freqüência dos pseudocistos nas culturas

axênicas crescidas sem qualquer tipo de alteração física ou química do meio, três

amostras independentes de T. foetus cultivadas por 36 horas a 37ºC foram fixadas em

4% de formaldeído em 0.1M de tampão fosfato de sódio por 1 hora a temperatura

ambiente. Após a fixação, as células foram lavadas 2 vezes por centrifugação em PBS

(pH 7.2) e colocadas para aderir por 15 minutos em lamínulas previamente recobertas

com poli-L-lisina (0.1% em PBS pH 7.2) (Sigma Chemical Co.). Posteriormente, as

lamínulas foram lavadas em PBS para retirar as células que não aderiram e montadas

em lâminas. As amostras foram, então, observadas e contadas em microscopia de

contraste interferencial diferencial (DIC) no microscópio Zeiss Axioplan II utilizando

uma objetiva de 63X com número de abertura de 1.4. As porcentagens do número de

pseudocistos dentro da população foram calculadas a partir de 1.000 células

analisadas aleatoriamente em cada amostra. Consideramos pseudocistos somente os

parasitos que possuam formas arredondadas ou amebóides e nenhum flagelo

externalizado.

2.3 T

ESTES DE INDUÇÃO E REVERSIBILIDADE DE PSEUDOCISTOS

Para induzir a formação de pseudocistos em T. foetus, tubos de cultura

com parasitos cultivados por 36 horas a 37ºC foram completamente imersos num

recipiente a 4ºC contendo uma mistura de gelo picado com água por um período de

até 4 horas. O meio de cultivo não foi trocado ou modificado e a temperatura do

sistema permaneceu praticamente constante no decorrer de todo o experimento. Os

pseudocistos estudados neste trabalho foram obtidos desta forma. Para verificar a

porcentagem de pseudocistos obtida durante a indução, a cada 30 minutos uma

alíquota foi retirada, fixada com 4% de formaldeído em 0,1M de tampão fosfato,

processada e analisada conforme descrito no item 2.2.

Para os testes de reversibilidade dos pseudocistos, algumas culturas de T.

foetus, depois de terem sido mantidas por 4 horas a 4ºC conforme descrito acima

foram recolocadas na estufa a 37ºC por mais 4 horas. A cada 30 minutos uma alíquota

foi retirada, fixada e analisada como descrito no item 2.2 e a porcentagem de

pseudocistos foi então registrada.

A cada 30 minutos dos testes de indução e reversibilidade dos

pseudocistos, uma alíquota também foi retirada para quantificar o número de parasitos

por mL. Esta análise quantitativa foi feita com parasitos não fixados em um

hemocitômetro (câmara de Neubauer). T. foetus cultivadas por 36 horas sob

condições física e química padrão foram usadas como controle para ambos os testes.

2.4 VIDEOMICROSCOPIA

Para melhor estudar o comportamento dos pseudocistos, uma alíquota foi

retirada a cada 30 minutos durante os ensaios de indução e reversibilidade dos

pseudocistos, e os parasitos foram, então, filmados ao microscópio óptico Zeiss

Axioplan II por microscopia de DIC, utilizando-se uma objetiva de 63X, N.A. 1.4. As

sequências de imagens foram obtidas com uma câmera CCD de alta resolução

(Hamamatsu C5985) acoplada ao microscópio e gravadas em tempo real em um vídeo

S-VHS (JVC). Posteriormente, as imagens do vídeo foram analisadas, selecionadas e

digitalizadas no programa KS300 versão 3.0 (Zeiss).

2.5

MICROSCOPIA ÓPTICA DE FLUORESCÊNCIA

2.5.1 Marcadores Nucleares

2.5.1.1 DAPI

A fim de verificar possíveis alterações numéricas ou morfológicas nos

núcleos de T. foetus, os parasitos incubados a 4ºC por 4 horas foram centrifugados

por cerca de 5 minutos a 300g. Após descartar o sobrenadante, as células foram

fixadas, lavadas e aderidas em lamínulas conforme descrito no item 2.2.

Posteriormente, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 (0.01% em PBS,

pH 7.2) (Sigma Chemical Co.) por 10 minutos, lavadas com PBS (pH 7.2) e, em

seguida, incubadas com DAPI (5 µg/ml) (Invitrogen) por 15 minutos no escuro. As

lamínulas foram, então, lavadas em água destilada e montadas em lâminas com o

líquido anti-decaimento Slowfade (Invitrogen). As lâminas foram observadas ao

microscópio óptico de fluorescência Zeiss Axiophot II (filtro λ=350-400 nm). As

imagens foram adquiridas com uma câmera CCD Hamamatsu e posteriormente

processadas no programa Adobe Photoshop 7.0 (Adobe). Os parasitos piriformes

cultivados por 36 horas sob condições normais e aqueles obtidos ao final do teste de

reversibilidade foram usados como controles do experimento.

2.5.1.2 Hoechst 33342 e Iodeto de Propídeo

Com o objetivo de verificar a viabilidade dos pseudocistos de T. foetus ao

final do teste de indução, os parasitos foram incubados ainda vivos, no próprio meio de

cultura, com o marcador Hoechst 33342 (10 µg/ml) (Sigma Chemical Co.) por 20

minutos, a 4ºC no escuro. Após este período, as células foram lavadas 3X com PBS

(pH 7.2) a 4ºC, incubadas com iodeto de propídeo (10 µg/ml) (Sigma Chemical Co.) e

imediatamente observadas ao microscópio óptico de fluorescência Zeiss Axiophot II

(Hoechst 33342 – filtro λ=350-400 nm; iodeto de propídeo – filtro λ=523 nm). As

imagens foram adquiridas e processadas conforme descrito anteriormente. Os

controles foram realizados com os parasitos piriformes cultivados sob condições

normais por 36 horas e os obtidos ao final do teste de reversibilidade. Para o controle

positivo, as células foram tratadas com DNAse I (10µg/mL) (Sigma Chemical Co.) por

10 minutos à temperatura ambiente.

2.5.2 Imunofluorescência

As análises do número e disposição dos axóstilos foram feitas através de

ensaios de imunofluorescência com a utilização do anticorpo monoclonal anti -β-tubulina

#357 (Amershan). Parasitos incubados à 4ºC por 4 horas foram fixados, lavados e

aderidos em lamínulas conforme descrito no item 2.2. Em seguida, as células foram

permeabilizadas com Triton X-100 (0.01% em PBS pH 8.0) por 10 minutos, lavadas

com PBS (pH 8.0) e bloqueadas com 50mM de cloreto de amônio por 30 minutos e,

depois, com 3% de PBS/BSA por 15 minutos. Após os bloqueios, os parasitos foram

incubados com o anticorpo anti-tubulina, diluído 1:20 em 3% de PBS/BSA, por 12

horas a 4ºC. Posteriormente, as lamínulas foram lavadas com PBS (pH 8.0) e

bloqueadas novamente com 3% de PBS/BSA por 15 minutos. Logo em seguida, as

células foram incubadas com o anticorpo secundário (anti-camundongo) conjugado

com Alexa 488 (Invitrogen), diluído 1:100 em 3% de PBS/BSA, por 40 minutos a

temperatura ambiente e no escuro. Finalmente, as lamínulas foram lavadas em PBS e

água destilada, e montadas em lâminas com o líquido anti-decaimento Slowfade. Em

alguns experimentos, as células foram incubadas com DAPI (5 µg/ml) por 15 minutos,

no escuro, antes de montar as lâminas e observá-las ao microscópio óptico de

fluorescência. As imagens foram adquiridas e processadas conforme descrito no item

2.5.1.1. Os controles usados foram os parasitos piriformes cultivados sob condições

normais por 36 horas e os que foram obtidos ao final do teste de reversibilidade.

2.6

MICROSCOPIA ELETRÔNICA

As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão foram usadas para

analisar a ultraestrutura dos pseudocistos e estabelecer comparações morfológicas

com as tricomonas piriformes. Os pseudocistos foram obtidos como descrito no item

2.3, e os parasitos piriformes, conforme o item 2.2.

2.6.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

Os parasitos foram coletados por centrifugação (conforme especificado no

item 2.5.1.1) e fixados com 2.5% de glutaraldeído em 0.1M de tampão fosfato de sódio

(pH 7.2) por cerca de 1 hora, a temperatura ambiente. Depois de fixadas, as células

foram lavadas 2 vezes em PBS (pH 7.2) e, então, colocadas para aderir por cerca de

15 minutos em lamínulas previamente recobertas com poli-L-lisina. Após este período,

as lamínulas foram lavadas novamente em PBS para retirar as células que não

aderiram. Em seguida, os parasitos foram pós-fixados por 15 minutos no escuro com

uma solução de tetróxido de ósmio a 1% em 0.1M de tampão fosfato de sódio (pH

7.2). Posteriormente, as lamínulas foram lavadas (3X) em PBS e, logo em seguida, as

células foram desidratadas em uma bateria de concentrações crescentes de etanol:

7.5%, 15%, 30%, 50%, 70%, 90% e 100% (2X). As lamínulas ficaram imersas por

cerca de 15 minutos em cada uma destas concentrações de etanol. Finalmente, as

lamínulas foram secas pelo método do ponto crítico do CO

, utilizando o aparelho Bal-

Tec CPD 030 e posteriormente levadas ao metalizador (Bal-Tec SCD 005) onde foram

revestidas por uma fina camada (25nm) de ouro. As amostras foram, então, montadas

em suportes metálicos apropriados, e observadas ao microscópio eletrônico de

varredura Jeol 5800.

2.6.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão

As células foram coletadas por centrifugação e fixadas por cerca de 1 hora

a temperatura ambiente com 2.5% de glutaraldeído em 0.1M de tampão cacodilato de

sódio (pH 7.2). Depois deste período, as células foram lavadas (3X) em PBS (pH 7.2)

e pós-fixadas por 30 minutos no escuro em uma solução de tetróxido de ósmio a 1%,

com 0.8% de ferricianeto de potássio e 5mM de cloreto de cálcio em 0.1M de tampão

cacodilato. Em seguida, as células foram lavadas (3x) em água destilada e colocadas

por 2 horas no escuro em uma solução de acetato de uranila a 2% em água destilada.

As células foram então, novamente lavadas (3X) em água destilada e, em seguida,

centrifugadas por 10 minutos a 15.000g para que se obtivesse um sedimento

compacto. Este sedimento foi então, transferido para uma placa de Petri contendo

acetona 70% e cortado em pequenos fragmentos. A desidratação das células foi feita

em concentrações crescentes de acetona: 70%, 90% e 100% (2X) (15 minutos em

cada concentração). As células foram infiltradas por cerca de 48 horas em resina

epoxy Poly Bed 812 (Epon) (Polysciences, Inc) e polimerizadas em estufa a 60ºC por

72 horas. Após a polimerização, os blocos de Epon foram trimados e fatiados com

faca de diamante (Diatome) no ultramicrótomo (Leica – Ultracut UCT). Os cortes

ultrafinos de cor prateada (que medem aproximadamente 70nm) foram coletados em

grades de cobre, de 300 mesh e, posteriormente, contrastados no escuro com 5% de

acetato de uranila por 30 minutos e citrato de chumbo por 10 minutos. Finalmente, as

grades foram observadas ao microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1210.

2.7

ENSAIOS DE ENDOCITOSE

Os seguintes traçadores foram utilizados para avaliar a atividade endocítica

em pseudocistos e comparar com tricomonas piriformes: (1) o corante fluorescente

Lucifer Yellow (Sigma Chemical Co.); (2) FITC-BSA (Invitrogen); (3) microesferas de

poliestireno; (4) lactobacilos; (5) Escherichia coli. Os pseudocistos foram obtidos

conforme mencionado no item 2.3, e os parasitos piriformes, como especificado no

item 2.2.

2.7.1 Traçadores fluorescentes

2.7.1.1 Lucifer Yellow e FITC-BSA

Os parasitos foram lavados (3X) em PBS (pH 7.2) morno (37ºC), coletados

por centrifugação e incubados por 1 hora a 37ºC em PBS (pH 7.2) contendo 1mg/mL

de Lucifer Yellow ou 500 µg/mL de FITC-BSA. Após a incubação, as células foram

lavadas novamente em PBS (pH 7.2) e aderidas em lamínulas conforme descrito no

item 2.2. Depois, as lamínulas foram montadas em lâminas com o líquido anti-

decaimento Slowfade e observadas ao microscópio óptico de fluorescência. As

imagens foram adquiridas e processadas conforme descrito no item 2.5.1.1.

2.7.1.2 Microesferas de Poliestireno Fluorescentes

Partículas de poliestireno medindo 1µm de diâmetro (Invitrogen) e

conjugadas com fluorocromos foram, primeiramente, suspensas em PBS na

concentração de 10

partículas/mL. Em algumas amostras, as microesferas foram

opsonizadas com soro bovino (SB) (Laborclin). A opsonização foi feita misturando-se

0.5mL de SB com 0.5 mL da suspensão de microesferas por 30 minutos a 37ºC em

agitação constante. Posteriormente, as microesferas foram colocadas para interagir

com as tricomonas em meio TYM sem soro por 1 hora a 37ºC. A relação entre

partículas e tricomonas utilizada durante as interações foi de 10:1. Depois da

interação, os parasitos foram coletados por centrifugação, lavados (3X) em PBS (pH

7.2) morno (37ºC) e fixados por 1 hora à temperatura ambiente com 4% de

formaldeído em 0.1M de tampão fosfato de sódio (pH 7.2). Após a fixação, as células

foram lavadas novamente (3x) em PBS (pH 7.2) e aderidas em lamínulas conforme

descrito no item 2.2. Por fim, as lamínulas foram montadas em lâminas e observadas

ao microscópio óptico de fluorescência (filtro λ=350-400nm). As imagens foram

adquiridas da mesma forma especificada no item 2.5.1.1 e, em seguida, processadas

com o programa Adobe Photoshop 7.0.

2.7.2 Traçadores Não-Fluorescentes

2.7.2.1 Microesferas de Poliestireno Não-Fluorescentes

Partículas de poliestireno medindo 0,96 µm de diâmetro (Polysciences, Inc)

foram suspensas em PBS na concentração de 10

partículas/mL. Em algumas

amostras, as microesferas foram opsonizadas com SB conforme descrito no item

2.7.1.2. Posteriormente, as microesferas foram colocadas para interagir com as

tricomonas em meio TYM sem soro por 1 hora a 37ºC. A relação entre partículas e

tricomonas utilizada durante as interações foi de 10:1. Após a interação, os parasitos

foram coletados por centrifugação, lavados (3X) em PBS (pH 7.2) morno (37ºC) e

fixados por 1 hora à temperatura ambiente com 2.5% de glutaraldeído em 0.1M de

tampão cacodilato de sódio (pH 7.2). Depois da fixação, as células foram processadas

para microscopia eletrônica de transmissão conforme mencionado no item 2.6.2.

2.7.2.2 Lactobacilos e Escherichia coli

Lactobacilos (medindo cerca de 1 µm de comprimento) obtidos a partir de

bebidas lácteas fermentadas (Yakult, SP, Brasil) e E. coli (ATCC 25922) foram lavados

em PBS (pH 7.2) e, em seguida, suspensos nas concentração de 10

bactérias/mL em

PBS. Em algumas amostras, a suspensão de bactérias foi misturada com SB na

proporção de 1:1 por 30 minutos a 37ºC em agitação constante. Posteriormente, as

bactérias foram incubadas por 1 hora à 37ºC junto com os parasitos em meio TYM

sem soro. A relação entre bactérias e tricomonas durante as interações foi de 10:1.

Em seguida, os parasitos foram coletados por centrifugação, lavados (3X) em PBS (pH

7.2) morno (37ºC) e fixados por 1 hora a temperatura ambiente com 2.5% de

glutaraldeído em 0.1M de tampão cacodilato de sódio (pH 7.2). Após a fixação, as

células foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão conforme

mencionado no item 2.6.2.

2.7.3 Ensaio de Inibição

T. foetus foram previamente incubadas com SB por 10 minutos a 37ºC em

agitação constante. Em seguida, os parasitos foram co-incubados conforme descrito

no item 2.7.1.2 com as microesferas de poliestireno (fluorescentes e não

fluorescentes) revestidas com soro. Após a interação as amostras foram fixadas e

processadas para microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de

transmissão.

2.7.4 Fosfatase Ácida

Para verificar se os materiais endocitados pelos pseudocistos de T. foetus

foram direcionados para lisossomos, foram feitas análises citoquímicas pelo método

modificado de Robinson e Karnovsky (1983) para detectar a presença da enzima

fosfatase ácida. Após a interação com partículas de poliestireno conforme descrito no

item 2.7.2.1, os parasitos foram coletados por centrifugação, lavados (3X) em PBS (pH

7.2) a 37ºC e fixados por 1 hora à temperatura ambiente com 2.5% de glutaraldeído

em 0.1M de tampão cacodilato de sódio (pH 7.2). Depois de fixadas, as tricomonas

foram lavadas (2X) com 0.1M de tampão cacodilato de sódio (pH 7.2) e, em seguida

lavadas (2X) com 0.1M de tampão TRIS-maleato (pH 5.0). Após as lavagens, as

células foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente em uma solução contendo

10mM de β-glicerofosfato de sódio e 2.4mM de nitrato de chumbo em 0.1M de tampão

TRIS-maleato (pH 5.0). Em seguida, as células foram novamente lavadas (2X) em

0.1M de tampão TRIS-maleato (pH 5.0) seguido de mais duas lavagens em 0.1M de

tampão cacodilato de sódio (pH 7.2). Depois, os parasitos foram submetidos ao

processamento de microscopia eletrônica de transmissão como especificado no item

2.6.2.

2.7.5 Quantificação da Endocitose

2.7.5.1 Capacidade de Adesão

A capacidade de adesão foi definida como o número médio de partículas

de poliestireno fluorescentes aderidas por parasito. Os parasitos foram inicialmente

incubados a 4ºC por 45 minutos. Posteriormente, as células foram incubadas com as

microesferas de poliestireno fluorescentes (revestidas e não revestidas com SB) por

30 minutos a 4ºC. Após a incubação, as células foram lavadas (3X) em PBS (pH 7.2) e

aderidas em lamínulas revestidas com poli-L-lisina. Em seguida, as lamínulas foram

lavadas em PBS (pH 7.2) e montadas em lâminas com o líquido anti-decaimento

Slowfade. Três experimentos independentes foram realizados em duplicatas e

analisados por microscopia de fluorescência. Os campos microscópicos foram

selecionados aleatoriamente e todos os parasitos presentes em cada campo foram

examinados. A capacidade de adesão foi determinada pela média do número de

partículas aderidas por parasito em 1.000 células por amostra.

2.7.5.2 Habilidade Endocítica

A habilidade endocítica foi definida como a porcentagem de parasitos

dentro da população que continham uma ou mais partículas de poliestireno

fluorescentes (revestidas e não revestidas com SB). Três ensaios independentes de

endocitose com microesferas de poliestireno fluorescentes foram realizados em

duplicatas e analisados por microscopia de fluorescência. Os campos microscópicos

foram selecionados conforme descrito no item 2.7.5.1. A habilidade endocítica foi

determinada pela média das contagens de 1000 células por amostra.

2.7.5.3 Quantificação de Fluorescência

As imagens adquiridas após os ensaios de endocitose com os traçadores

Lucifer Yellow e FITC-BSA foram analisadas com o programa ImageJ v. 1.4. Todas as

imagens foram adquiridas com o mesmo tempo de exposição, brilho, contraste e

saturação. A partir das imagens, o programa gerou um espectro de cores e um gráfico

tridimensional. Com base no espectro de cores, cada pico no gráfico representa uma

intensidade de pixel em unidades arbitrárias (UA) que está diretamente associado com

a intensidade de fluorescência registrada na imagem original. Os valores dos picos

foram, então, “plotados” em imagens bidimensionais.

2.7.5.4 Análise Morfométrica

A análise morfométrica da endocitose foi realizada por microscopia

eletrônica de transmissão de acordo com o método de Weibel (1969). Para estimar o

volume relativo dos vacúolos contendo materiais endocitados em relação ao volume

total da célula, cerca de 50 cortes de parasitos provenientes dos materiais

processados no item 2.7.2.1 foram analisados. Para garantir que não houvesse erro

de amostragem, os cortes analisados foram obtidos de diferentes blocos do mesmo

material, sendo que, de cada bloco foi obtida apenas uma única grade, e de cada

grade apenas um único corte foi analisado. As amostras foram fotografadas e, em

seguida, os negativos foram digitalizados no Scanner HP G4050 (Hewlett Packard). As

imagens digitalizadas foram medidas com auxílio do programa Adobe Photoshop 7.0.

As medidas obtidas foram analisadas segundo o princípio de Dellesse, que postula

que a área relativa ocupada por uma estrutura dentro de cortes aleatórios de um sólido

tridimensional corresponde ao seu volume relativo. Desta forma, o volume relativo (Vr)

dos vacúolos contendo os materiais endocitados é igual ao resultado da divisão da

área dos vacúolos nos cortes (Av) pela área de todo o corte (At). Assim: Vr = Av/At

2.8

ENSAIOS DE INTERAÇÃO PARASITO/CÉLULA-HOSPEDEIRA E CITOTOXICIDADE

Foram realizados testes de interação entre pseudocistos de T. foetus e

células MDCK com o intuito de comparar os processos de adesão e citotoxicidade

exercidos pelas tricomonas piriformes e pelos pseudocistos nas células epiteliais. Os

pseudocistos foram obtidos conforme descrito no item 2.3, e os parasitos piriformes,

como mencionado no item 2.2. Após o ensaio de indução, os pseudocistos foram

imediatamente transferidos para tubos de vidro de 8 mL contendo 7 mL de meio

DMEM e mantidos a 37ºC. Ensaios prévios revelaram que taxa de reversibilidade dos

pseudocistos foi bem pequena (cerca de 10%) quando eles foram mantidos somente

em meio DMEM. Entretanto, a incubação dos parasitos pirifomes em meio DMEM não

foi suficiente para induzir a formação dos pseudocistos.

As células MDCK (Madin-Darby canine kidney) foram cultivadas em placas

de 24 poços contendo meio DMEM (Sigma Chemical Co.) suplementado com 10% de

SFB até atingirem confluência e formarem uma monocamada. Posteriormente, os

parasitas foram adicionados às monocamadas, obedecendo a uma proporção de

parasita-célula hospedeira de 10:1, e, em seguida, foram incubados por diferentes

tempos a 37ºC em meio DMEM sem soro. Como controle, os parasitos não foram

adicionados às monocamadas. Depois dos períodos de interação, as células foram

fixadas e processadas para microscopia eletrônica de varredura e transmissão

conforme mencionado, respectivamente, nos itens 2.6.1 e 2.6.2.

Os testes de citotoxicidade foram realizados conforme descrito por Alderete

& Pearlman (1984). As interações entre tricomonas e células epiteliais, incluindo o

controle, foram feitas da mesma forma como descrito acima. Entretanto, ao final dos

tempos de incubação, as células foram lavadas (3X) com PBS morno (pH 7.2) e

fixadas por 20 minutos a temperatura ambiente com 2% de formaldeído em PBS (pH

7.2). Após a fixação, a células remanescentes foram novamente lavadas (3X) com

PBS e coradas com uma solução contendo 0.13% de cristal violeta, 5% de etanol e

2% de formaldeído em água destilada. Subsequentemente, as células coradas foram

lavadas (3X) em água destilada e, então, secas ao ar. Depois de seco, o corante

remanescente nas placas foi solubilizado com uma mistura contendo 1% de SDS e

50% de etanol em água destilada. Por fim, a solução corada foi levada a um

espectrofotômetro (Micronal B580, SP, Brasil) para a leitura da absorbância em 570nm

de comprimento de onda. A citotoxicidade foi expressa como a porcentagem de

corante remanescente nos poços onde a interação ocorreu em relação à quantidade

de corante presente nas monocamadas controle (sem parasito).

3. RESULTADOS

3.1 A

NÁLISES DAS CULTURAS AXÊNICAS

As análises morfológicas realizadas em culturas de T. foetus cultivadas por

36 horas sob condições padrão mostraram que a maioria das tricomonas (em torno de

92% da população) apresenta o típico formato piriforme com os flagelos externalizados

(Fig. 6a, c). Contudo, mesmo sob estas condições de cultivo, aproximadamente 8% da

população encontravam-se sob a forma de pseudocisto (Fig. 6b, c).

3.2 I

NDUÇÃO DOS PSEUDOCISTOS

Devido à baixa frequência de pseudocistos nas culturas de T. foetus

mantidas sob condições padrão, é indispensável, para os estudos in vitro destas

formas, métodos eficientes para induzir a transformação dos parasitos piriformes em

pseudocistos. Sabe-se que T. foetus pode formar pseudocisto quando incubada por

um determinado período de tempo em temperaturas inferiores a 18ºC (Granger et al.,

2000). Portanto, neste estudo, com o objetivo de se obter uma quantidade apreciável

de pseudocistos, culturas de T. foetus foram mantidas a 4ºC por 4 horas após terem

sido cultivadas por 36 horas a 37ºC. Ao final do teste de indução, aproximadamente

95% dos parasitos havia se transformado em pseudocistos (Fig. 7). O número de

células por mL permaneceu inalterado durante todo ensaio de indução (Fig. 8),

indicando que os parasitos não sofreram lise e que provavelmente ocorreu um

bloqueio na divisão celular.

O uso combinado dos marcadores fluorescentes Hoechst 33342 e iodeto de

propídeo constitui uma ferramenta valiosa para traçar o perfil de viabilidade celular. O

Hoechst tem a propriedade de corar diferencialmente o núcleo de células viáveis (azul

escuro) e apoptóticas (azul claro brilhante), enquanto o iodeto de propídeo penetra

somente nas células que perderam a permeabilidade seletiva da membrana

plasmática corando, assim, o núcleo de vermelho. Portanto, com o objetivo de verificar

a viabilidade dos pseudocistos, os parasitos foram incubados ao final do teste de

indução com estes marcadores (Figs. 9-10). O controle positivo foi feito com células

tratadas com DNAse I (Fig. 9a-b). Parasitos piriformes cultivados sob condições

padrão foram utilizados como controle negativo (Figs. 9c-d; 10). Após incubação com

Hoechst, o núcleo dos parasitos piriformes tratados com DNAse I apresentou

coloração azul brilhante e intensa fragmentação (Fig. 9a-b). Resultados similares

foram obtidos com os pseudocistos tratados com DNAse (dados não mostrado).

Entretanto, após a marcação com o Hoechst, a fragmentação nuclear não foi

observada nos parasitos do controle negativo (Fig. 9c-d) e nos pseudocistos (Fig. 9e-f)

indicando a preservação da integridade do núcleo. A maioria das células cultivadas

sob condições padrão ou submetidas ao teste de indução de pseudocistos apresentou

marcação negativa para o corante iodeto de propídeo (resultados não mostrados).

Análises quantitativas dos ensaios de viabilidade mostraram que, assim como no

controle negativo, cerca de 96% das tricomonas estavam viáveis ao final do teste de

indução de pseudocistos (Fig. 10). Quando os parasitos foram mantidos à 4ºC por 24

horas o número de células por mL continuou praticamente inalterado e os

pseudocistos permaneceram viáveis (resultados não mostrados).

3.3 R

EVERSIBILIDADE DOS PSEUDOCISTOS

Após os testes de indução de pseudocistos, algumas amostras foram re-

incubadas na estufa a 37ºC por mais 4 horas. No decorrer deste período, os

pseudocistos foram reassumindo a morfologia piriforme (Fig. 7) e o número de células

por mL voltou a crescer (Fig. 8). Ao final do ensaio de reversibilidade, os pseudocistos

voltaram a representar apenas 8% da população, ou seja, a mesma freqüência

encontrada em culturas mantidas sob condições padrão (Fig. 7). A quantidade de

parasitos por mL nos testes de reversibilidade aumentou mais rapidamente do que nas

culturas crescidas sob condições padrão (Fig. 8). Ensaios qualitativos e quantitativos

de viabilidade mostraram que as células permaneceram viáveis ao final do teste de

reversibilidade (Figs. 9g-h; 10).

Figura 6. Análise morfológica de T. foetus cultivadas sob condições

adrão por 36

horas à 37ºC. a-b, visão geral de T. foetus piriforme (a) e em pseudocisto (b

)

observadas por microscopia de DIC. Observa-se que os parasitos piriforme

apresentam os flagelos anteriores (FA) e o recorrente (FR) exteriorizados, bem

como, uma projeção na sua extremidade posterior (seta) formada pela região

terminal do axóstilo (Ax). Nota-se que nos pseudocistos os flagelos não são

visíveis já que estão localizados no interior do parasito. N, núleo; H,

hidrogenossomos. Barras, 4µm; c, porcentagem dos pseudocistos nas culturas

axênicas padrão. Os dados equivalem à média das duplicatas de três amostra

independentes ± Desvio Padrão. Foram analisadas 1.000 células aleatoriamente

em cada material. Observa-se que aproximadamente 8% da polulação

encontravam-se sob a forma de pseudocisto.

Figura 7. Análise morfológica de T. foetus durante os ensaios de indução

(

■) e

reversibilidade (▲) dos pseudocistos. T. foetus cultivadas por 36 horas a 37ºC (♦) foram

usadas como controle para ambos os testes. Os dados representam a média da

proporção de pseudocistos nas du

licatas de três amostras independentes ± Desvio

Padrão. Foram analisadas 1.000 células aleatoriamente de cada condição experimental.

Observa-se que

ao final do teste de indução, aproximadamente 95% dos parasitos havia

se transformado em pseudocistos. Após os ensaios de reversibilidade, os pseudocistos

voltaram a representar apenas 8% da população, ou seja, a mesma freqüência

encontrada em culturas mantidas sob condições padrão.

Figura 8. Análise do número de T. foetus por mL durante os ensaios de indução

(

■) e

reversibilidade (▲) dos pseudocistos. T. foetus cultivadas por 36 horas a 37ºC (♦) foram

utilizadas como controle para ambos os testes. Os dados representam a média da

duplicatas de três amostras independentes ± Desvio Padrão. Observa-se que o número

de células por mL permaneceu inalterado durante todo ensaio de indução, enquanto

durante os testes de reversibilidade, a quantidade de parasitos por mL aumentou mai

rapidamente do que nas culturas crescidas sob condições padrão.

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

0 30 60 90 120 150 180 210 240

Número de parasitos X 10

/mL

Tempo (minutos)

Parasitos à 37ºC

Parasitos à 4ºC após serem cultivados por 36 h à 37ºC

Parasitos à 37ºC após serem mantidos por 4 h à 4ºC

após 36 h de cultivo

Figura 9. T. foetus incubadas com o marcador nuclear Hoechst 33342. Os parasitos podem ser observados

por DIC (a, c, e, g) seguido pelas respectivas imagens de microscopia de fluorescência (b, d, f, h). Estas

células apresentaram marcação negativa para o corante fluorescente iodeto de propídeo; a-b, controle

positivo: parasito piriforme tratado com DNAse I. Observa-se a fragmentação nuclear (cabeça de seta

branca); c-d, T. foetus piriforme cultivada sob condições padrão: a fragmentação nuclear não foi observada.

O parasito apresentou marcação negativa; e-f, parasitos após o teste de indução de pseudocistos. As

células foram incubadas a 4ºC por 4 h e não apresentaram fragmentação nuclear. Nota-se que alguns

pseudocistos apresentam mais de dois núcleos (setas pretas). g-h, parasitos incubados por 2 h a 37ºC após

o ensaio de indução dos pseudocistos. A fragmentação nuclear não foi observada. Nota-se que alguns

parasitos apresentam novamente a morfologia piriforme (setas brancas). Observe que um parasito piriforme

estava se desprendendo de um organismo multinucleado (cabeça de seta preta). Barras, 2µm.

Figura 10. Viabilidade de T. foetus durante os ensaios de indução e reversibilidade

dos pseudocistos. T. foetus cultivadas por 36 horas a 37ºC foram usadas com

controle para ambos os testes. Os parasitos vivos foram incubados com o

marcadores fluorescentes Hoechst 33342 e iodeto de propídeo e, posteriormente,

observados ao microscópio óptico de fluorescência. Os dados estão expressos como

média das duplicatas de três amostras independentes ± Desvio Padrão. Fora

analisadas 1.000 células aleatoriamente em cada material. Nota-se que os ensaios de

indução e reversibilidades dos pseudocistos não afetaram a viabilidade dos parasitos.

3.4 MITOSE DOS PSEUDOCISTOS

Estudos prévios mostraram que os pseudocistos são capazes de se dividir

de um modo distinto da mitose realizada pelos organismos piriformes (Ribeiro et al.,

2002a; Pereira-Neves et al., 2003). Entretanto, há várias questões em aberto

referentes à morfogênese da mitose dos pseudocistos, tais como: (1) a participação do

axóstilo e dos flagelos durante o processo mitótico e (2) avaliar se os pseudocistos

realizam a citocinese. Portanto, para tentar elucidar estas questões e comparar a

mitose dos pseudocistos com os nossos conhecimentos prévios sobre o processo

mitótico no parasito piriforme (Ribeiro et al., 2000; 2002a; 2002b), empregamos

técnicas complementares, como imunofluorescência (Fig. 11), videomicroscopia (Fig.

12) e microscopia eletrônica de transmissão (Figs. 13-15).

Durante a interfase, os pseudocistos apresentam um único núcleo e apenas

um conjunto de estruturas esqueléticas, como o complexo pelta-axóstilo (Fig. 11c-d).

Entretanto, diferentemente dos parasitos piriformes (Fig. 11a-b), o axóstilo dos

pseudocistos apresenta uma forma curva ao invés de axial (Fig. 11c-d). No início da

mitose, os flagelos, o axóstilo e a costa são duplicados e o núcleo aumenta de volume

(Pereira-Neves et al., 2003). Em seguida, os corpúsculos basais duplicados, que

estavam inicialmente localizados lado-a-lado, migram para lados opostos (Figs.

11e-f;

12a-h; 13a). Enquanto os corpúsculos basais se deslocam, os microtúbulos, nucleados

a partir dos atractóforos, interagem diretamente com o envelope nuclear, ou com os

microtúbulos provenientes do pólo oposto, formando os fusos de pólo-a-núcleo e de

pólo-a-pólo, respectivamente (Figs. 11e-h; 12a-h; 13-15). Durante a migração dos

corpúsculos basais, o fuso de pólo-a-pólo é polimerizado lateralmente ao núcleo e

forma um feixe coeso de microtúbulos que liga um pólo ao outro (Figs. 11e-h; 12a-h;

13a). Ao se alongar, este feixe pressiona o núcleo de modo a formar uma invaginação

na superfície desta organela semelhante a um canal (Fig. 13b).

Os microtúbulos de pólo-a-núcleo formam pequenos feixes que se ancoram

em regiões especializadas do envelope nuclear (Figs. 14-15). Como previamente

descrito por Brugerolle (1975), estas regiões de ancoragem são compostas por placas

que apresentam uma camada fibrilar citoplasmática (onde os microtúbulos irão se

conectar) e por um material eletrondenso que recobre as duas membranas nucleares.

Ocasionalmente, massas de cromossomos são observadas próximas destas regiões

(Fig. 14). No transcorrer da mitose, os microtúbulos de pólo-a-núcleo são encurtados.

Como consequência, o envelope nuclear é puxado em direção aos cinetossomos

formando projeções digitiformes (Fig. 14). É interessante observar que os microtúbulos

do fuso são polimerizados mesmo com os parasitos mantidos a uma temperatura de

4ºC.

Nos experimentos de imunofluorescência utilizando anticorpos anti-tubulina,

o axóstilo não foi detectado nas fases iniciais da mitose dos pseudocistos (Fig. 11e-f).

Entretanto, por microscopia eletrônica de transmissão, esta estrutura foi facilmente

observada em todas as fases de divisão celular dos pseudocistos (Figs. 13b; 14-15).

Ao contrário do que ocorre nos parasitos piriformes, a participação dos axóstilos no

processo de cariocinese não foi observada durante a mitose dos pseudocistos.

Portanto, é possível que o fuso de pólo-a-núcleo seja o responsável pela cariocinese

(Fig. 15).

Após a cariocinese, os microtúbulos de pólo-a-pólo continuam a crescer

(Fig. 11i-l) e, aparentemente, auxiliam a direcionar as duas células-filhas para os pólos

opostos (Fig. 11i-l). Posteriormente, estes microtúbulos são despolimerizados. A

citocinese não ocorre e o pseudocisto se torna binucleado (Figs. 11m-n; 12i; 16a). Os

dois núcleos com suas respectivas estruturas mastigontes compartilham a mesma

membrana plasmática e citoplasma (Figs. 11m-n; 12i; 16a).

Figura 11. T. foetus observadas por DIC (a, c, e, g, i, k, m) seguido pelas respectivas imagens de

imunofluorescência (b, d, f, h, j, l, n) com o anticorpo monoclonal anti-

-tubulina (verde). O núcleo das

células (azul) foi marcado com DAPI. a-b, parasito piriforme em interfase cultivado sob condições padrão.

Nota-se que o complexo pelta-axóstilo (Pe-Ax) apresenta uma forma axial; c-n, T. foetus durante o teste de

indução de pseudocistos.Os parasitos foram incubados a 4ºC por 2 horas; c-d, pseudocisto em interfase.

Observa-se que os flagelos (F) estão internalizados e que o axóstilo (Ax) assumiu uma forma curva; e-l,

pseudocistos durante a mitose; o fuso de pólo-a-pólo (S) pode ser visto com um estreito feixe localizado

entre os cinetossomos e acima do núcleo (f, h). Em f, o axóstilo não foi marcado. Em h, somente um

axóstilo (Ax) é claramente visível; i-l, pseudocistos após a cariocinese. Os dois núcleos e as estruturas

esqueléticas duplicadas, como os axóstilos (Ax

e Ax

), estão direcionados para lados opostos. O fuso de

pólo-a-pólo (S) ainda pode ser observado; m-n, pseudocistos binucleados (setas) formados após a mitose.

Barras, 2µm.

Figura 12. Videomicroscopia de pseudocisto de T. foetus em processo

mitótico. O parasito foi incubado a 4ºC por 2 horas. As imagens são de

microscopia de DIC e foram captadas sequencialmente por uma câmera CCD

acoplada a um vídeo-cassete Super-VHS. Os intervalos de tempo entre um

quadro e outro estão indicados no canto superior direito. a-h, os cinetossomos

duplicados (cabeça de seta) se encontram em lados opostos do núcleo. O fuso

de pólo-a-pólo (seta) pode ser visto com um estreito feixe localizado entre os

cinetossomos e acima do núcleo; i, a cariocinese foi completada cerca de 5

minutos após a imagem registrada no quadro a. Nota-se a presença de dois

núcleos (N1 e N2). Barra, 4µm.

Figura 13. Microscopia eletrônica de transmissão dos pseudocistos de T. foetus

durante a mitose. Os parasitos foram incubados a 4ºC por 4 horas; a, corte

longitudinal do parasito. Os corpúsculos basais (CB) foram duplicados e se

encontram direcionados para pólos opostos. Os atractóforos (asterisco),

localizados abaixo dos corpúsculos basais, são os responsáveis pela nucleação

dos microtúbulos do fuso de pólo-a-pólo (seta). Observa-se que o fuso de pólo-a-

pólo forma um feixe coeso localizado lateralmente ao núcleo (N); b, corte

transversal do pseudocisto. Nota-se que o fuso de pólo-a-

ólo (seta) forma uma

invaginação na superfície do núcleo (N). G, complexo de Golgi; Ax, axóstilo.

Barras, 500nm.

foetus em mitos

i incubado a 4º

. Nota-se a

ulos do fuso são

ulos de pólo-a-

nadas áreas da

rvadas próximas

nvelope nuclea

exo de Golgi; V,

Figura 15. Microscopia eletrônica de transmissão de um pseudocisto de T. foetu

após a cariocinese. O parasito foi incubado a 4ºC por 4 horas. a, visão geral:

observa-se que os flagelos (F) estão internalizados. A célula apresenta estruturas

duplicadas, como o núcleo (N

e N

), o complexo de Golgi (G) e os corpúsculos

basais (CB). Observa-se que os corpúsculos basais duplicados (CB) se encontram

direcionados para lados opostos da célula. Nota-se a presença da pelta (Pe) e do

axóstilo (Ax); b, c, detalhes da região dos corpúsculos basais. Os atractóforo

(asterisco) estão localizados abaixo dos corpúsculos basais. Observa-se que os

microtúbulos do fuso de pólo-a-núcleo (seta) originam-se do atractóforo. V,

vesículas; H, hidrogenossomos. Barras, 500nm.

Figura 16. Microscopia eletrônica de transmissão de pseudocistos de T. foetus após a mitose. Os parasito

foram incubados a 4ºC por 4 horas. Observa-se que os flagelos (F) estão internalizados; a,

seudocisto

binucleado. Nota-se que os dois núcleos (N

e N

) e suas respectivas estruturas mastigontes, como pelta

(Pe

e Pe

), axóstilo (Ax

e Ax

) e complexo de Golgi (G

e G

), encontram-se lado-a-lado; b,

seudocist

multinucleado. Observa-se a presença de pelo menos três núcleos. CB, corpúsculos basais; V, vesículas; H,

hidrogenossomos; C, costa. Barras, 1µm.

3.5 FORMAÇÃO DOS PSEUDOCISTOS MULTINUCLEADOS

Observamos que enquanto as condições dos testes de indução foram

mantidas, os pseudocistos binucleados continuaram a realizar sucessivas divisões

nucleares sem a ocorrência da citocinese, formando células policariomastigontes ou

multinucleadas (Fig. 17a-d). Estes organismos são constituídos por uma grande

massa citoplasmática com vários núcleos e seus respectivos complexos mastigontes

(Figs. 9g-h; 16b; 17e-f; 18a-h). Análises feitas por microscopia de fluorescência

revelaram que as sucessivas divisões celulares nos pseudocistos binucleados podem

ocorrer de duas formas: (1) não sincronizada, onde um dos cariomastigontes se

duplica enquanto o outro permanece em interfase (Fig. 17a-b); ou (2) sincronizada, em

que os dois núcleos se dividem ao mesmo tempo (Fig. 17c-d). Observações feitas por

videomicroscopia mostraram que, nestas células, cada núcleo com suas respectivas

estruturas mastigontes se movimenta de forma independente dos outros (Fig. 18a-h).

Os flagelos internalizados continuam a bater provocando intensas ondulações na

membrana plasmática dos pseudocistos multinucleados (Fig. 18a-h). Análises

quantitativas obtidas através do marcador nuclear DAPI revelaram que, ao contrário

dos parasitos cultivados sob condições padrão, a maior parte da população de

pseudocistos (cerca de 88%) ao final dos ensaios de indução era formada por células

contendo de 2 a 4 núcleos (Fig. 19). Aproximadamente 4% dos pseudocistos

continham de 5 a 6 núcleos (Fig. 19). Quando os parasitos foram mantidos a 4ºC por

mais de 24 h, notou-se que cerca de 6% dos pseudocitos continham de 7 a 8 núcleos,

mas a maioria das células (aproximadamente 60%) apresentou de 4 a 6 núcleos

(resultados não mostrados). A presença de células com um número ímpar de núcleos

confirma que o processo mitótico entre os cariomastigontes não é necessariamente

sincronizado. É importante ressaltar que a grande maioria dos pseudocistos

multinucleados estava viável (Figs. 9e-f; 10).

Um fenômeno interessante foi observado quando os pseudocistos

multinucleados foram reaquecidos a 37ºC após serem mantidos por 4 horas a 4ºC. Os

organismos multinucleados externalizaram os seus flagelos (Figs. 18i-p; 20a-b) e,

então, cada indivíduo piriforme foi gradualmente se individualizando e se

desprendendo por completo da célula multinucleada. Estas observações foram feitas

por microscopia de fluorescência (Figs. 9g-h; 17g-h), videomicroscopia (Fig. 18i-x) e

microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 20). Estes resultados poderiam, portanto,

explicar o fato do número de células por mL ter aumentado mais rapidamente durante

os testes de reversibilidade do que quando as culturas foram mantidas estritamente

sob condições-padrão (Fig. 8). Análises realizadas por videomicroscopia revelaram

que durante os ensaios de reversibilidade os pseudocistos multinucleados

externalizaram primeiramente os flagelos anteriores e, em seguida, os recorrentes

(Fig. 18i-p). Os batimentos dos flagelos externalizados pareciam gerar força motora

para que os organismos piriformes se destacassem completamente da célula

multinucleada (Fig.18q-x). O axóstilo dos parasitos piriformes foi a ultima estrutura a

se desprender da massa citoplasmática dos organismos multinucleados (Figs. 17g’’-

h’’; 18v). Imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão mostraram a

presença de estruturas filamentosas entre a célula multinucleada e os parasitos

piriformes que se desprendiam. (Fig. 20c-d).

Após 4 horas a 37ºC, os pseudocistos multinucleados voltaram a ser raros

nas culturas de T. foetus e a maioria da população (cerca de 80%) tornou a ser

constituída por parasitos mononucleares (Fig. 17). Resultados similares foram obtidos

quando os parasitos foram mantidos a 4ºC por mais de 24 h (dados não mostrados).

Figura 17. Pseudocistos multinucleados observados por DIC (a, c, e, g’, g’’) seguido

elas respectivas

imagens de imunofluorescência (b, d, f, h’, h’’) com o anticorpo monoclonal anti-

-tubulina (verde). O núcleo

das células (azul) foi marcado com DAPI. a-d, os parasitos foram incubados a 4º por 4 h. Em a-b, observa-

se um pseudocisto com três núcleos. Nota-se que o processo mitótico entre os cariomastigontes não é

sincronizado: dois núcleos estão conectados pelo fuso de pólo-a-pólo (s) enquanto o terceiro não está em

mitose. Em b, embora os axóstilos estejam triplicados, somente um deles é visível; os outros dois estão nu

plano focal diferente; c-d, célula multinucleada contendo quatro núcleos conectados pelos seus respectivo

fuso de pólo-a-pólo (s

e s

); e-f, pseudocistos incubados a 4ºC por 4 horas. Após este período muito

parasitos possuíam mais de dois núcleos e axóstilos (setas brancas); g’-h’, g’’-h’’, dois diferentes planos

focais de um parasito incubado por 30 min a 37ºC após o teste de indução. Note que um organismo

piriforme estava se desprendendo do pseudocisto multinucleado (seta preta). Barras, 2µm.

Figura 18. Videomicroscopia de um pseudocisto multinucleado contendo cinco núcleos (N). O

parasito foi incubado por 1 h a 37ºC após o teste de indução. Os intervalos de tempo entre um

quadro e outro estão indicados no canto superior direito. Observe que cada cariomastigonte se

movimenta de forma independente dos outros. a-h, nota-se que os batimentos dos flagelos

internalizados provocam intensas ondulações na membrana plasmática da célula; i-l os flagelos

anteriores (AF) foram externalizados. C, costa. Barra, 4µm.

Figura 18 (continuação). Videomicroscopia de um pseudocisto multinucleado contendo cinco

núcleos. O parasito foi incubado por 1 h a 37ºC após o teste de indução. Os intervalos de tempo

entre um quadro e outro estão indicados no canto superior direito. m-x, o flagelo recorrente (RF)

foi externalizado. Os batimentos dos flagelos parecem gerar força suficiente para que um dos

cariomastigontes (N1) consiga se individualizar e se desprender completamente dos outros. Em

v, nota-se que antes de se destacar, o axóstilo (cabeça de seta) do cariomastigonte N1 ainda

permanecia ligado à massa citoplasmática da célula multinucleada. Ax, axóstilo. Barras, 4µm.

Figura 19. Análise do número de núcleos por célula durante os ensaios de indução e

reversibilidade dos pseudocistos. Parasitos cultivados por 36 horas a 37ºC foram usados com

controle. As células foram incubadas com o composto fluorescente DAPI e, posteriorment

observadas no microscópio óptico de fluorescência. Os dados re

resentam a média das

duplicatas de três amostras independentes ± Desvio Padrão. Foram analisadas 1.000 células

aleatoriamente em cada material.

Ao final dos ensaios de indução, a maior parte da população

de T. foetus era formada por parasitos multinucleados. Nota-se que após os ensaios de

reversibilidade, as células multinucleadas voltaram a ser raras e a maioria da população tornou

a ser constituída por parasitos mononucleados.

Figura 20. T. foetus multinucleadas observadas por microscopia eletrônica de transmissão. Os parasito

foram incubados a 37ºC por 1 hora após o teste de indução. Os flagelos recorrentes (FR) fora

externalizados. a, a partir do número de núcleos (N) e de axóstilos (Ax), nota-se a presença de

elo meno

três cariomastigontes; b, é possível observar que a célula apresenta pelo menos quatro complexos pelta-

axostilares (Pe-Ax). Repare na célula da fig. c a presença de uma projeção (seta) que pode sugerir o

desprendimento de um cariomastigonte. Em d, podemos observar esta projeção em detalhe. Estrutura

filamentosas conectam a célula multinucleada com a projeção (asterisco). G, complexo de Golgi; H,

hidrogenossomo; C, costa; V, vesículas. Barras, 1µm.

3.6 ATIVIDADE ENDOCÍTICA DOS PSEUDOCISTOS

Técnicas complementares de microscopia óptica e eletrônica foram usadas

com o objetivo de acompanhar o processo endocítico em pseudocistos de T. foetus e

comparar com as tricomonas piriformes. Os parasitos foram submetidos a ensaios de

endocitose utilizando diferentes traçadores, tais como: Lucifer yellow, FITC-BSA e

partículas de poliestireno. Foram feitos também ensaios endocíticos utilizando

lactobacilos e Escherichia coli como traçadores. Contudo, nenhuma das duas formas

de T. foetus foi capaz de ingerir estas bactérias, mesmo quando foram opsonizadas

com soro bovino.

Os traçadores fluorescentes FITC-BSA (Fig. 21a-d) e Lucifer yellow (Fig.

21e-h) foram usados para localizar os compartimentos endocíticos em ambas as

formas de T. foetus. As duas formas do parasito foram capazes de ingerir estes

marcadores. Inúmeras vesículas foram observadas distribuídas aleatoriamente por

todo o citoplasma dos parasitos piriformes e pseudocistos (Fig. 21a-h). Entretanto, os

pseudocistos apresentaram uma quantidade de vesículas muito maior do que as T.

foetus piriformes (Fig. 21a-h). De acordo com as análises quantitativas de

fluorescência, quando os corantes FITC-BSA e Lucifer yellow foram utilizados, a

intensidade de marcação dos compartimentos endossomais dos pseudocitos foi,

respectivamente, 1,72 e 1,79 vezes maior do que nos parasitos piriformes (Fig. 21i).

Para examinar os aspectos morfológicos da atividade endocítica em ambas

as formas de T. foetus, foram feitos ensaios de endocitose utilizando microesferas de

poliestireno revestidas e não-revestidas com soro bovino. As amostras destes ensaios

foram analisadas por microscopia óptica de DIC e microscopia eletrônica de

transmissão. Análises morfométricas foram realizadas com o objetivo de verificar e

comparar as diferenças no comportamento endocítico dos pseudocistos e dos

parasitos piriformes (Fig. 21). Os seguintes aspectos foram analisados e quantificados:

(1) a média do número de microesferas aderidas por parasito (Fig. 21a); (2) a

porcentagem de parasitos contendo as partículas de poliestireno (Fig. 21b); (3) a

porcentagem do volume citoplasmático relativo ocupado pelos vacúolos contendo as

microesferas (Fig. 21c).

As análises morfológicas mostraram que somente algumas microesferas

não revestidas com soro aderem à superfície de ambas as formas de T. foetus

(resultados não mostrados). Entretanto, durante as interações com as microesferas

opsonizadas com soro, a capacidade de adesão dos parasitos piriformes e dos

pseudocistos aumentou 2,8 e 4,2 vezes, respectivamente (Fig. 22a). Quando

microesferas não-revestidas e revestidas com soro foram utilizadas, a capacidade de

adesão dos pseudocistos foi, respectivamente, 1,53 e 2,30 vezes maior do que nos

parasitos piriformes (Fig. 22a). Durante os ensaios de inibição, a capacidade de

adesão dos parasitos piriformes e dos pseudocistos teve um decréscimo de 1,75 e

2,38 vezes, respectivamente (Fig. 22a). A porcentagem de inibição da capacidade de

adesão dos pseudocistos durante o pré-tratamento com soro foi aproximadamente

1,36 vezes maior do que nos parasitos piriformes (Fig. 22a).

Quando as microesferas aderiram sobre a superfície do pseudocistos (Fig.

23a), pequenas projeções de membrana foram formadas em direção as partículas

(Fig. 23b). Subsequentemente, as microesferas foram internalizadas e observadas

dentro de vacúolos citoplasmáticos (Fig. 23b). Resultados similares foram obtidos

durante a atividade endocítica dos parasitos piriformes (dado não mostrado) Em

nenhuma das duas formas de T. foetus foi observado uma região da célula

preferencial de adesão das microesferas (resultado não mostrado).

Quando os pseudocistos e os parasitos piriformes interagiram com as

partículas revestidas com soro, houve um aumento significativo na atividade endocítica

destas duas formas (Fig. 22b). Entretanto, quando microesferas revestidas e não-

revestidas com soro foram utilizadas, a porcentagem de pseudocistos contendo

partículas ingeridas foi, respectivamente, 2,52 e 2,25 vezes maior do que nos

parasitos piriformes (Fig. 22b). Quando T. foetus foram previamente incubadas com

soro bovino, a porcentagem de parasitos piriformes e de pseudocistos contendo as

microesferas ingeridas teve um decréscimo de 4,52 e 1,9 vezes, respectivamente (Fig.

22b). A porcentagem de inibição da habilidade endocítica dos parasitos piriformes

durante o pré-tratamento com soro foi aproximadamente 1,65 vezes maior do que nos

pseudocistos (Fig. 22b).

A porcentagem do volume citoplasmático relativo de vacúolos nos parasitos

piriformes e nos pseudocistos aumentou 2,17 e 2,23 vezes, respectivamente, durante

as interações com as microesferas opsonizadas com soro (Fig. 22c). Ensaios

qualitativos realizados por microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o

citoplasma dos pseudocistos apresentou uma quantidade de partículas ingeridas muito

maior do que nos parasitos piriformes (Fig. 24a-b). Análises morfométricas revelaram

que quando microesferas não-revestidas e revestidas com soro foram utilizadas, a

porcentagem do volume relativo dos vacúolos nos pseudocistos foi, respectivamente,

2,77 e 2,85 vezes maior do que nos parasitos piriformes (Fig. 22c). Durante os ensaios

de inibição, o volume citoplasmático relativo dos parasitos piriformes e dos

pseudocistos teve um decréscimo de 4,08 e 1,46 vezes, respectivamente (Fig. 22c). A

porcentagem desta inibição nos parasitos piriformes foi aproximadamente 2,40 vezes

maior do que nos pseudocistos (Fig. 22c).

Para confirmar se as microesferas ingeridas por ambas as formas de T.

foetus estavam sendo direcionadas para os lisossomos, foram feitos experimentos

citoquímicos para detectar a presença da enzima fosfatase ácida. Nas duas formas do

parasito, reações positivas foram identificadas dentro de vesículas contendo as

partículas (Fig. 24c-d) Os parasitos piriformes e os pseudocistos foram capazes de

ingerir as partículas de poliestireno mesmo durante a mitose (Fig. 25a-b).

Figura 21. Imagens de T. foetus piriforme

(

a, b;

, f

)

e sob a forma d

pseudocisto (c, d; g, h) após incubação com FITC-BSA (a-d

)

e Lucife

yellow (e-h). Os parasitos são observados por microscopia de DIC (a, c, e,

g) seguido pelas respectivas imagens de fluorescência (b, d, f, h); O

seudocistos apresentaram uma quantidade de vesículas muito maior do

que os parasitos piriformes; i, análise quantitativa da intensidade de

fluorescência dos compartimentos endocíticos dos pseudocistos e do

parasitos piriformes após incubação com os traçadores FITC-BSA e Lucife

yellow. Os valores são expressos como a média de unidades arbitrárias de

dois experimentos independentes ± Desvio Padrão. Foram analisadas 50

imagens em cada material. Os pseudocistos apresentaram uma

intensidade de marcação maior do que os parasitos piriformes. Barra, 4µm

Figura 22. Análises quantitativas da endocitose de microesferas de poliestireno por T.

foetus piriforme e sob a forma de pseudocisto. Colunas brancas e cinza representam,

respectivamente, microesferas não-revestidas e revestidas com soro bovino; Coluna

preta: T. foetus foram incubadas com soro antes da interação com as microesfera

revestidas com soro. Os dados representam a média das duplicatas de três amostra

independentes. a, habilidade endocítica de T. foetus. Os valores são expressos como

porcentagem de parasitos contendo as partículas de poliestireno ± Desvio Padrão; b,

capacidade de adesão de T. foetus. Os valores são expressos como a média do número

de microesferas aderidas por parasito ± Desvio Padrão; c, análise morfométrica d

ingestão de microesferas por T. foetus. Os resultados são expressos como a

orcentagem do volume citoplasmático relativo ocupado pelos vacúolos contendo a

microesferas ± Desvio Padrão. Os

seudocistos possuem uma atividade endocítica

maior do que os parasitos piriformes.

Figura 23. Microscopia eletrônica de transmissão de pseudocistos de T. foetus coincubados por 6

min com as microesferas de poliestireno revestidas com soro. Nota-se que os flagelos (F) estão

internalizados; a, visão detalhada mostrando três microesferas (asteriscos) aderidas à superfície do

parasito; b, projeções da membrana plasmática (setas) podem ser observadas envolvendo uma

partícula de poliestireno. Nota-se que algumas microesferas foram internalizadas e encontram-s

dentro de vesículas citoplasmáticas. H, hidrogenossomos. Barras, 1µm.

Figura 24. Microscopia eletrônica de transmissão de T. foetus piriformes (a,c

)

e sob a forma de pseudocisto

(b, d) coincubados por 60 min com as microesferas de poliestireno revestidas com soro. Nota-se que e

contraste com o parasito piriforme (a), muitas microesferas (asteriscos) foram ingeridas pelo pseudocisto (b

);

c, d, a reação positiva para a fosfatase ácida confirmou que as microesferas (asterisco) foram direcionada

ara o lisossomo (L). N, núcleo; F, flagelo; RF, flagelo recorrente; H, hidrogenossomos; C, costa; G, complex

de Golgi. Barras, 500nm.

Figura 25. Microscopia eletrônica de transmissão de T. foetus co-incubados por 60 min com as microesferas

de poliestireno revestidas com soro. a, parasito piriforme em mitose logo após a cariocinese. A célula

apresenta estruturas duplicadas, como dois núcleos (N) e dois axóstilos (Ax). Os axóstilos podem se

observados entre os núcleos; b, pseudocisto em mitose. Observam-se os microtúbulos do fuso de pólo-a-

núcleo (seta). Nota-se que mesmo durante a mitose, ambas as formas de T. foetus foram capazes de ingeri

as partículas de poliestireno (asteriscos). AF, flagelos anteriores; RF, flagelo recorrente; H, hidrogenossomos;

C, costa; G, complexo de Golgi: CB, complexo de Golgi. Barras, 750nm.

3.7 INTERAÇÃO COM CÉLULAS EPITELIAIS: PSEUDOCISTOS SÃO MAIS CITOTÓXICOS

Para investigar os efeitos citotóxicos in vitro dos pseudocistos sobre as

células epiteliais e comparar com tricomonas piriformes, foram feitos ensaios de

interação entre ambas as formas de T. foetus e células MDCK (uma linhagem de

célula epitelial de rim de cachorro). Os aspectos ultraestruturais dos efeitos citotóxicos

exercidos pelos parasitos foram observados por microscopia eletrônica de varredura e

transmissão (Figs. 26-28). Os resultados revelaram que os pseudocistos foram capazes

de provocar um dano muito maior ás células epiteliais do que os parasitos piriformes.

Observações feitas por microscopia eletrônica de varredura mostraram que, antes da

interação com os parasitos, as células MDCK formavam uma monocamada coesa com

uma grande quantidade de microvilosidades na porção apical (Figs. 26a; 27a-b). As

células MDCK não sofreram nenhum dano aparente após 18 h de interação com os

parasitos piriformes: a monocamada permaneceu preservada e a quantidade de

microvilosidades não foi alterada (Fig. 26b-c). Após 18 h de incubação com os

pseudocistos, a monocamada de células epiteliais se manteve inalterada, entretanto,

nas regiões em contato com o parasito, as células MDCK apresentaram pequenos

sinais de injúria, como “blebbing” de membrana e retração das microvilosidades (Fig.

26d-f). Ap

ós aderirem às células epiteliais, os parasitos piriformes mantiveram a sua

morfologia (Figs. 26b-c), contudo, os pseudocistos emitiram pseudopódos e filopódios

sobre a superfície das células MDCK, tornando-se amebóides (Fig. 26e-f).

Após 24 h de co-incubação com os parasitos piriformes, a integridade da

monocamada de células MDCK já apresentava sinais proeminentes de danos, como

retração das células vizinhas e algumas áreas de separação intercelular (Fig. 27c).

Quando tricomonas piriformes foram co-incubadas por 48 h com células MDCK, uma

destruição mais extensa da monocamada de células epiteliais pôde ser observada e

as células MDCK remanescentes possuíam sinais de danos, como: retração dos

filopódios e das células vizinhas (Fig. 27d). Após 24 h de interação com os

pseudocistos, a monocamada de células epiteliais apresentou sinais de danos

similares aos observados em 48 horas de co-incubação com os parasitos piriformes:

extensas áreas de rompimento intercelular e as poucas células MDCK que

permaneceram apresentavam retração dos filopódios e diminuição do volume celular

(Fig. 27e). A monocamada de MDCK co-incubada com os pseudocistos foi

completamente destruída após 48 h e as raras células remanescentes foram

severamente danificadas, apresentando, inclusive, ruptura da membrana plasmática

(Fig. 27f).

Análises feitas por microscopia eletrônica de transmissão confirmaram as

diferenças observadas entre os efeitos citotóxicos exercidos pelos pseudocistos e

parasitos piriformes (Fig. 28). Os sinais morfológicos de injúria sobre as células epiteliais

foram muito mais intensos durante a interação com os pseudocistos.

Antes da interação

com os parasitos,

as células MDCK apresentaram características ultraestruturais

inalteradas (Fig. 28a). Sinais de danos nas células MDCK, como intensa vacuolização e

mitocôndrias dilatadas com a matriz elétron-lúcida foram observados somente após 48 h

de co-incubação com os parasitos piriformes (Fig. 28b). Em contrapartida,

quando

pseudocistos foram co-incubados com as células epiteliais, os efeitos descritos acima

foram verificados após 24 h de interação (Fig. 28c). As células MDCK co-incubadas

com os pseudocistos apresentaram sinais evidentes de morte celular após 48 h, como

ruptura de membrana e intensa extração citoplasmática (Fig. 28d). Mesmo durante a

mitose, os pseudocistos de T. foetus foram capazes de aderir à superfície da célula

hospedeira (Fig. 28c).

Análises quantitativas dos efeitos citotóxicos provocados por ambas as

formas de T. foetus foram feitas por espectrofotometria através do método de

coloração pelo cristal violeta (Fig. 29).

Os resultados mostraram que para cada período

de tempo de interação os pseudocistos foram aproximadamente duas vezes mais

citotóxicos do que os parasitos piriformes (Fig. 29). Após 48 h de co-incubação, os

pseudocistos destruíram mais de 80% da monocamada de células MDCK, enquanto

os organismos pirifomes destruíram apenas 40% (Fig. 29).

Figura 26. Microscopia eletrônica de varredura após 18 h de interação entre T. foetus e a cultura de

células epiteliais MDCK. a, células MDCK controle sem interação com os parasitos; b-c, visão geral e

detalhe, respectivamente, da interação dos parasitos piriformes com a monocamada de células

MDCK. Nenhum dano é observado nas células hospedeiras. Nota-se que os parasitos mantêm a

morfologia piriforme durante a adesão; c, visão geral da interação dos pseudocistos com as células

epiteliais; e-f, detalhes da interação dos pseudocistos com MDCK. Observa-se que os pseudocistos

assumiram uma morfologia amebóide apresentando extensas projeções de membrana (asterisco).

Nota-se que após a interação com os pseudocistos, as células epiteliais apresentaram sinais de

injúria, como “blebbing” de membrana (cabeça de seta) e retração das microvilosidades. Barras, a-b,

d 10µm; c, e-f 5 µm.

Figura 27. Microscopia eletrônica de varredura mostrando o aspecto geral das culturas de células

MDCK na ausência dos parasitos (a-b) e após 24 h (painéis da esquerda) e 48 h (painéis da direita)

de interação com T. foetus piriformes (c-d) e pseudocistos (e-f). Nota-se que os pseudocistos foram

capazes de provocar mais danos às células hospedeiras do que os parasitos piriformes. d, após 48 h

de interação com os parasitos piriformes, é possível observar uma destruição extensa da

monocamada e sinais de injúrias nas células epiteliais, como a retração das células vizinhas.

Resultados similares a estes foram obtidos após 24h de interação com os pseudocistos (e). Após 48

h de interação com os pseudocistos as células hospedeiras foram completamente destruídas (f).

Barras, 10µm.

Figura 28. Microscopia eletrônica de transmissão mostrando os efeitos provocados nas células epiteliais

MCDK após a interação com T. foetus. a, células MDCK controle sem interação com os parasitos; b,

interação do parasito piriforme com MDCK após 48 h. A célula epitelial mostra sinais de injúria, como

intensa vacuolização (asteriscos) e mitocôndrias dilatadas com a matriz elétron-lúcida (M); c, co-incubação

dos pseudocistos com MDCK após 24 h. As alterações morfológicas observadas na célula hospedeira são

similares ao resultado mostrado na figura b. Observa-se que o pseudocisto possui pelo menos quatro

núcleos (N); d, interação dos pseudocistos com MDCK após 48 h. A célula epitelial (Ep) apresenta

evidentes sinais de morte celular, como ruptura de membrana e intensa extração citoplasmática. H,

hidrogenossomos; V, vacúolos; ER, retículo endoplasmático; GL, glicogênio; F, flagelo. Barras, 750nm.

Figura 29. Ensaio de espectrofotometria mostrando os níveis de citotoxicidade exercida por T.

foetus piriformes e pseudocistos durante a interação com células epiteliais MDCK. a-c, placas

de 24 poços coradas com cristal violeta após, respectivamente, 18 h, 24 h e 48 h de interação

dos parasitos piriformes (coluna 2) e pseudocistos (coluna 3) com as células MDCK. Nos

experimentos controle, os parasitos não foram adicionados à monocamada (coluna 1). A

intensidade de cor revela a quantidade de células epiteliais que permaneceu em cada poço.

Nota-se que os pseudocistos provocaram um dano muito maior à monocamada (coluna 3); d,

análise quantitativa dos efeitos citotóxicos provocados pelos parasitos piriformes e

pseudocistos. Os valores são expressos como a média das triplicatas de dois experimentos

independentes ± Desvio Padrão. Observe que os pseudocistos são aproximadamente 2 vezes

mais citotóxicos do que os parasitos piriformes.

4. DISCUSSÃO

A grande maioria dos estudos referentes à biologia de T. foetus foi feita

somente com os parasitos piriformes sendo os pseudocistos muito pouco explorados.

A transformação dos tricomonadídeos piriformes em pseudocistos tem levado a

inúmeras questões importantes, tais como: (1) O pseudocisto é uma forma viável e

metabolicamente ativa? (2) Existem diferenças do ponto de vista funcional e

metabólico entre os pseudocistos e os parasitos piriformes? (3) qual o papel

desempenhado pelos pseudocistos no ciclo de vida dos tricomonadídeos?

Por muitos anos, os pseudocistos foram considerados uma forma

irreversível e degenerativa (Samuels, 1959; Mattern et al., 1973; Honigberg &

Brugerolle, 1990). Entretanto, atualmente, acredita-se que os pseudocistos sejam

reversíveis e que sua formação represente um mecanismo de sobrevivência do

parasito quando as condições ambientais estão desfavoráveis (Mattern & Daniel,

1980; Stachan et al., 1984; Lipman et al., 1999; Granger et al., 2000; Pereira-Neves et

al., 2003). Portanto, os estudos dedicados a compreender o papel dos pseudocistos

no ciclo de vida de T. foetus, bem como a sua relação com a tricomonose, estão

recebendo cada vez mais atenção de diferentes grupos de investigadores.

4.1 F

ORMAÇÃO DOS PSEUDOCISTOS

No presente trabalho, para induzir a formação de pseudocistos em T.

foetus, os parasitos foram resfriados a 4ºC por um período de até 24 h. Este método

de indução se mostrou mais eficiente do que o uso de drogas no meio de cultura. A

indução de pseudocistos pelo uso de drogas, como nocodazol e griseofulvina, pode

ser irreversível, desencadeando um processo de morte celular programada nos

parasitos (Madeiro da Costa & Benchimol, 2004; Mariante et al., 2006). Entretanto, as

condições de indução de pseudocistos utilizadas no presente estudo não foram

suficientes para desencadear a morte celular desses parasitos. Nossos resultados

mostraram que os pseudocistos permaneceram viáveis e reversíveis mesmo quando

foram mantidos a 4ºC por 24 h, constituindo assim, um dos objetivos desta

dissertação.

4.2 C

OMPARAÇÃO MORFOLÓGICA ENTRE A MITOSE DOS PARASITOS PIRIFORMES E DOS

PSEUDOCISTOS

As principais fases do processo de divisão celular das tricomonas

piriformes já foram descritas e caracterizadas em estudos prévios realizados pelo

nosso grupo (Ribeiro et al., 2000; 2002a; 2002b). Estes trabalhos mostraram que

estruturas microtubulares, como axóstilo e flagelos, participam ativamente do processo

mitótico de T. foetus piriforme. Observou-se que os axóstilos duplicados auxiliam na

cariocinese, enquanto a força de propulsão gerada pelos batimentos dos flagelos

contribui para o afastamento das células-filhas facilitando a citocinese.

Nossos resultados indicam que os pseudocistos também são capazes de

se dividir. Entretanto, verificamos que as características da mitose realizada pelos

pseudocistos de T. foetus são bem distintas das etapas descritas para a divisão dos

parasitos piriformes. Os seguintes aspectos foram vistos apenas nos pseudocistos: (1)

ausência do envolvimento do axóstilo durante o processo de cariocinese; (2)

participação dos microtúbulos do fuso de pólo-a-pólo e de pólo-a-núcleo; (3) o fuso de

pólo-a-pólo forma uma invaginação na superfície nuclear; (4) o fuso de pólo-a-núcleo

seria o responsável pela cariocinese ao invés do axóstilo; (5) antes da cariocinese, o

envelope nuclear apresenta projeções digitiformes em direção aos cinetossomos; (6)

os microtúbulos de pólo-a-pólo auxiliam a direcionar as duas células-filhas para os

pólos opostos; (7) como os flagelos estão internalizados, não há força propulsora

suficiente para auxiliar a citocinese, o que acarretaria a formação de organismos

policariomastigontes. Portanto, as evidências mostram que T. foetus tem dois modos

distintos de divisão celular: um associado com a morfologia piriforme e outro

relacionado com os pseudocistos.

Como mencionado anteriormente (seção 1.5.7), existem informações

controversas na literatura referentes ao comportamento das estruturas do

citoesqueleto durante a divisão celular das tricomonas piriformes.

Alguns autores

afirmaram que o crescimento dos microtúbulos do fuso de pólo-a-pólo seria a principal

força motora responsável pela separação das duas células-filhas, enquanto a

cariocinese poderia ser explicada por uma ação combinada envolvendo o

encurtamento dos microtúbulos do fuso de pólo-a-núcleo e o alongamento do fuso de

pólo-a-pólo. (Samuels, 1957; 1959; Brugerolle 1975; Juliano et al., 1986; Viscogliosi &

Brugerolle, 1994; Noel et al., 2003). Além disso, Viscogliosi & Brugerolle (1994)

afirmaram que um dos primeiros sinais morfológicos da mitose em T. foetus seria a

alteração da forma dos parasitos que se tornaram arredondados. Nós não

concordamos com os eventos morfogenéticos apresentados por estes autores durante

a mitose das tricomonas piriformes. Presumimos que parte das controvérsias

existentes sobre a divisão celular em tricomonas possa ser explicada devido a uma

descrição combinada da mitose dos parasitos piriformes e dos pseudocistos como um

processo único.

Estudos feitos por imunofluorescência utilizando anticorpos anti-tubulina,

relataram que o axóstilo apresentava ciclos de polimerização e despolimerização

durante a mitose em tricomonas (Juliano et al., 1986; Viscogliosi & Brugerolle, 1994;

Noel et al., 2003). No presente trabalho, esta estrutura foi facilmente observada por

microscopia eletrônica de transmissão em todas as fases de divisão celular.

Entretanto, durante os experimentos de imunofluorescência, nós não fomos capazes

de detectar a presença do axóstilo nas fases iniciais da mitose dos pseudocistos. Esta

observação pode explicar o motivo de alguns autores terem afirmado que o axóstilo

despolimeriza no começo da mitose. Boggild et al. (2002) realizaram um estudo

comparando a distribuição de tubulina acetilada entre os trofozoítos e os pseudocistos

de T. muris. Estes autores demonstraram por imunofluorescência que a marcação no

axóstilo das tricomonas piriformes é descontínua, enquanto em pseudocistos, o

axóstilo se apresenta inteiramente marcado. Nós especulamos que durante a mitose

dos pseudocistos deve ocorrer alguma alteração pós-translacional nos microtúbulos do

axóstilo, dificultando, assim, a acessibilidade dos anticorpos anti-tubulina aos epítopos.

4.3 P

SEUDOCISTOS MULTINUCLEADOS

Os parabasalídeos da Família Calonymphidae são formados por

organismos permanentemente multinucleados, i.e. Calonympha grassi (Gerbord et al.,

2002) (Fig. 30). Contudo, organismos multinucleados também foram observados com

certa frequência em diversas espécies de tricomonadídeos (Kofoid & Swezy, 1915;

Pereira & Almeida, 1940; Stabler, 1941; Kirby, 1946; Samuels 1959; Cleveland, 1966),

incluindo T. foetus (Kirby, 1951; Mariante et al., 2003) e T. vaginalis (Pignatari de

Martinez et al., 1976; Buckener & Mikel, 1983; Abonyi, 1995). Há na literatura

informações controversas referentes ao comportamento dos tricomonadídeos

multinucleados. Foi proposto que estes organismos representariam uma forma

degenerativa (Samuels, 1959; Honigberg & Brugerolle, 1990). Entretanto, há

evidências sugerindo que os organismos multinucleados possam representar uma

forma naturalmente presente no ciclo de vida dos tricomonadídeos. Diversos autores

afirmaram que estes organismos multinucleados seriam estágios de desenvolvimento

que precederiam à formação de flagelados mononucleados (Kofoid & Swezy, 1915;

Cleveland, 1928; 1966; Chatterjee et al., 1933; Kirby, 1946; Ovcinnikov et al., 1974;

1975; Pignatari de Martinez et al., 1976; Abonyi, 1995). Estes trabalhos mostraram

uma série de observações em que organismos mononucleados se individualizavam e

se desprendiam por completo de uma massa de células multinucleadas. Alguns

autores adotaram o termo esquizogonia para descrever este fenômeno e

consideraram que o ciclo de vida de alguns tricomonadídeos seria constituído por

períodos alternados de divisão binária e fissão múltipla (Kofoid & Swezy, 1915;

Cleveland, 1966; Pignatari de Martinez et al., 1976). Entretanto, este fenômeno ainda

não havia sido descrito em T. foetus.

Figura 30. Representação esquemática de Calonympha grassi. Observe que o organismo é

formado por diversos núcleos (N) com suas respectivas estruturas mastigontes, tais como,

flagelos (F) e axóstilos (Ax) (Fonte: Guy Brugerolle; retirado de

http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&imageid=3599).

Os resultados do presente trabalho mostraram que enquanto as condições

ambientais permaneciam desfavoráveis, os pseudocistos realizavam sucessivas

divisões mitóticas sem a ocorrência da citocinese, formando células multinucleadas.

Quando estas células foram colocadas em condições favoráveis seus flagelos foram

externalizados e, conforme descrito para outros tricomonadídeos, cada indivíduo

piriforme tinha força propulsora suficiente para se individualizar e se desprender por

completo do organismo multinucleado. Como mencionado anteriormente, este

processo de divisão foi chamado de esquizogonia por lembrar alguns aspectos do

mecanismo de divisão observado nos protozoários do Filo Apicomplexa, como o

Plasmodium falciparum. Durante a esquizogonia, o esquizonte (célula multinucleada

formada por sucessivas divisões nucleares de um trofozoíto) passa por um processo

de maturação. Cada célula-filha individualiza o seu citoplasma e apresenta sua própria

membrana plasmática bem antes de se desprender do esquizonte (Sunila et al., 2001;

Heussler & Stanway, 2008). Estas características, entretanto, não foram observadas

durante a mitose dos pseudocistos de T. foetus. As análises feitas por microscopia

eletrônica de transmissão mostraram que nas tricomonas multinucleadas todos os

cariomastigontes antes de se desprenderem continuam compartilhando a membrana

plasmática e o citoplasma. Portanto, nós consideramos inapropriado chamar a mitose

dos pseudocistos de esquizogonia.

4.4 C

OMPARAÇÃO MORFOLÓGICA ENTRE A MITOSE DOS PSEUDOCISTOS DE T. FOETUS E

OUTROS PARABASALÍDEOS

O comportamento observado durante a divisão celular dos pseudocistos de

T. foetus é muito semelhante aos processos mitóticos descritos em alguns

parabasalídeos, tais como, os monocercomonadídeos Dientamoeba fragilis e

Histomonas meleagridis; e o devescovinídeo Gigantomonas herculea (Kirby, 1946;

Cleveland, 1966; Honigberg & Bennett, 1971; Camp et al., 1974; Brugerolle, 2005;

Munsch et al., 2009). D. fragilis é um parabasalídeo aflagelado e estritamente

amebóide que infecta o intestino humano. Os trofozoítos de D. fragilis são

normalmente binucleados e apresentam um fuso extranuclear conectando os dois

núcleos (Fig. 31a) (Camp et al., 1974; Johnson et al., 2004). H. meleagridis é um

parasita do trato gastro-intestinal de aves galináceas (Mazet et al., 2008; Munsch et

al., 2009). Duas formas podem ser encontradas em H. meleagridis: (1) uma flagelada

com um único flagelo anterior (Fig. 31b) e (2) uma amebóide com o flagelo

internalizado (Fig. 31c). Esta forma amebóide se divide por um processo muito similar

ao que ocorre em D. fragilis e nos pseudocistos de T. foetus (Fig. 31c) (Honigberg &

Bennett, 1971; Munsch et al., 2009). O devescovinídeo G. herculea é um comensal

encontrado no intestino de térmitas e que também apresenta uma forma flagelada com

três flagelos anteriores e um recorrente (Fig. 31d) e uma forma amebóide com os

flagelos internalizados (Fig. 31e) (Kirby, 1946; Cleveland, 1966; Brugerolle, 2005). Os

organismos amebóides de G. herculea também se dividem e geram organismos

multinucleados de uma forma muito semelhante ao observado nos pseudocistos de T.

foetus (Fig. 31e) (Kirby, 1946; Cleveland, 1966; Brugerolle, 2005).

Figura 31. Representações esquemáticas de D. fragilis (a), H. meleagridis (b-c) e G. herculea

(d-e). a, trofozoíto binucleado de D. fragilis durante a mitose. Observe a presença do fuso de

pólo-a-pólo (S) conectando os dois núcleos (N); b, forma flagelada de H. meleagridis durante a

interfase. O parasito apresenta um único flagelo anterior (FA); c, forma amebóide de H.

meleagridis durante a mitose. O fuso de pólo-a-pólo (S) pode ser observado entre os dois

núcleos (N); d, forma flagelada de G. herculea durante a interfase. O organismo apresenta três

flagelos anteriores (FA), um flagelo recorrente (FR), um núcleo (N) e um axóstilo (Ax); e, forma

amebóide e multinucleada de G. herculea. Note a presença de diversos núcleos (N) dentro da

mesma massa citoplasmática. (Imagens a, d-e: autor: Guy Brugerolle; retiradas de

http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&imageid=3617;

Imagens b-c: retiradas de Munsch et al., 2009).

Figura 32. Árvore filogenética dos parabasalídeos baseada na comparação das sequências de

16s rRNA. A barra de escala corresponde a cinco modificações por cada 100 nucleotídeos.

Observe que T. foetus (seta) forma um grupo-irmão com D. fragilis e H. meleagridis e que estes

três organismos estão posicionados na base do grupo Devescovinidae/Calonymphidae (Fonte:

Gerbod et al., 2002).

Estudos morfológicos e análises moleculares baseadas na comparação das

sequências de 16s do rRNA indicam que T. foetus, D. fragilis, H. meleagridis, os

devescovinídeos e os organismos multinucleados da Família Calonymphidae integram

um subgrupo monofilético dentro do Filo Parabasala (Fig. 32) (Gerbod et al., 2002;

Hampl et al., 2004; 2006). Além disso, estes trabalhos indicam que D. fragilis e H.

meleagridis constituem um grupo irmão com T. foetus e que estes três organismos

estão localizados primitivamente na base do grupo formado pelos

devescovinídeos/calonimphídeos (Fig. 32). Estes estudos propõem também que os

organismos do grupo Devescovinidae/Calonymphidae descendem diretamente de T.

foetus ou de um parente próximo a este. Portanto, nós levantamos a hipótese de que a

formação dos pseudocistos multinucleados de T. foetus possa ser um comportamento

reminiscente do organismo ancestral que originou os membros do subgrupo T. foetus -

D. fragilis - H. meleagridis – Devescovinidae – Calonymphidae. Nós acreditamos

também que os estudos referentes às formas multinucleadas de T. foetus poderão

auxiliar nas investigações sobre a origem dos organismos multinucleados da Família

Calonymphidae.

4.5 O

S MICROTÚBULOS DO FUSO DE T. FOETUS SÃO RESISTENTES AO FRIO

No presente trabalho, nós observamos que os microtúbulos do fuso nos

pseudocistos de T. foetus foram polimerizados mesmo com os parasitos mantidos a

uma temperatura de 4ºC. Microtúbulos citoplasmáticos resistentes ao frio foram

encontrados em diversos tipos celulares, incluindo neurônios e células da glia (Bosc et

al., 1999; 2003; Slaughter & Black, 2003); células epiteliais e fibroblastos (Brown &

Warn 1993; Lieuvin et al. 1994; Bosc et al., 1999; 2003); fuso mitótico de algumas

células de mamíferos (Brinkley & Cartwright 1975; Bosc et al., 1999) e alguns

protozoários, como Trypanosoma brucei (Vedrenne et al., 2002) e o ciliado Euplotes

focardi (Pucciarelli & Miceli, 2002). Alguns estudos indicam que alterações na

sequência de aminoácidos das subunidades de tubulina e/ou modificações pós-

translacionais são os principais responsáveis pela resistência dos microtúbulos ao frio

(Bane et al., 2002; Pucciarelli & Miceli, 2002; Nyporkpo et al., 2003). Alternativamente,

proteínas de diferentes famílias, como as MAPs (Microtubule-Associated Proteins) e

as STOP (Stable Tubule Only Polypeptide) podem interagir com os microtúbulos,

conferindo a estas estruturas uma resistência ao frio (Bosc et al., 1999; 2003;

Vedrenne et al., 2002; Slaughter & Black, 2003)

T. foetus habita um ambiente morno (em torno de 37ºC) quando está em

seu hospedeiro. Uma vez que temperaturas inferiores à 18ºC induzem à formação de

pseudocistos (Granger et al., 2000), a capacidade desta forma de realizar mitose sob

baixas temperaturas pode ser considerada muito vantajosa para a sobrevivência e

transmissão do parasito caso ele se encontre fora de seu hospedeiro. Entretanto, são

necessários estudos para elucidar quais são os fatores responsáveis pela resistência

dos microtúbulos de T. foetus ao frio.

4.6 E

NDOCITOSE PELOS PSEUDOCISTOS

T. foetus, assim como outros tricomonadídeos, apresenta uma intensa

atividade endocítica. Estudos mostraram que este parasito é capaz de ingerir

macromoléculas, como BSA e o corante fluorescente Lucifer yellow (Benchimol et al.,

1986; 1990; Affonso et al., 1994; 1997), partículas de poliestireno (Benchimol et al.,

1990), bactérias (Benchimol & De Souza, 1995) e fragmentos de espermatozóides

(Benchimol et al., 2008). Entretanto, todos estes estudos referentes ao processo

endocítico de T. foetus foram feitos utilizando somente os parasitos piriformes.

No presente trabalho, com o objetivo de verificar a atividade endocítica em

pseudocistos e comparar com as tricomonas piriformes, ambas as formas de T. foetus

foram submetidas a ensaios de endocitose utilizando diferentes traçadores, como

BSA, Lucifer yellow e microesferas de poliestireno. Nossos resultados mostraram que

os pseudocistos de T. foetus possuem uma maior atividade endocítica quando

comparados com os parasitos piriformes. Koyama et al. (1987) também observaram

que os pseudocistos de T. muris constituem uma forma mais endocítica do que os

organismos piriformes. A deprivação de nutrientes também induz a formação de

pseudocistos, portanto, o fato desta forma ser mais endocítica pode ser considerado

vantajoso para a sobrevivência do parasito sob condições de escassez de nutrientes.

No presente estudo, a opsonização das partículas de poliestireno com soro

bovino provocou um aumento significativo na habilidade endocítica e na capacidade

de adesão de ambas as formas de T. foetus. Além disso, quando os organismos

piriformes e os pseudocistos foram pré-incubados com soro por 15 minutos, a

atividade endocítica exercida por destas duas formas sofreu um decréscimo

significativo. Estes resultados indicam, portanto, que a ingestão das microesferas

revestidas com soro por ambas as formas de T. foetus ocorreu via endocitose mediada

por receptor.

As macromoléculas presentes no soro representam um importante fator

para o desenvolvimento da tricomonose. O soro bovino contém lipídeos, lipoproteínas,

proteínas adesivas, como a fibronectina e proteínas carreadoras, como a albumina,

transferrina e lactoferrina. Benchimol et al. (1990) mostraram que o revestimento com

fibronectina aumentava significativamente a ingestão de partículas de poliestireno por

T. foetus. Adicionalmente, demonstrou-se que este parasito, assim como T. vaginalis,

é capaz de se ligar à fibronectina por um mecanismo mediado por receptores

(Peterson & Alderete, 1984a; López, 2001; Alderete et al., 2002). Estudos revelaram

também que T. foetus é capaz de ingerir lactoferrina e LDL via endocitose mediada por

receptor (Peterson & Alderete, 1984b; Affonso et al., 1994; 1997). Entretanto, no

presente estudo, nós não nos concentramos na identificação das moléculas do soro

que foram reconhecidas pelos parasitos durante a ingestão das microesferas

opsonizadas.

Nós verificamos que durante os testes de inibição, a atividade endocítica

dos parasitos piriformes sofreu um decréscimo maior do que nos pseudocistos,

sugerindo que existem diferenças na expressão de receptores presentes na superfície

de ambas as formas. Os pseudocistos poderiam estar expressando uma quantidade

maior de receptores específicos para uma determinada molécula do soro.

Alternativamente, os pseudocistos poderiam expressar diferentes receptores que

reconheçam diferentes moléculas do soro bovino. Portanto, estudos são necessários

para esclarecer quais são os receptores envolvidos no reconhecimento das partículas

revestidas com soro durante a atividade endocítica dos organismos piriformes e dos

pseudocistos. Além disso, seria interessante comparar a concentração desses

receptores nas duas formas do parasito.

4.7 T

RICOMONADÍDEOS SÃO CAPAZES DE ENDOCITAR DURANTE A MITOSE

Nas células de eucariotos superiores, o tráfego de vesículas cessa durante

a mitose e estruturas como retículo endoplasmático, complexo de Golgi e o envelope

nuclear são fragmentados (Darnell et al., 1995). Em contraste, T. foetus mantém todas

estas organelas intactas durante a divisão celular (Ribeiro et al. 1999; Benchimol et al.,

2001). Além disso, o presente estudo mostrou que ambas as formas deste parasito

foram capazes de endocitar durante o processo mitótico. Resultados similares foram

encontrados durante a ingestão de leveduras por T. vaginalis (Pereira-Neves &

Benchimol, 2007). São necessários estudos para determinar os mecanismos de

sinalização celular responsáveis por este comportamento nos tricomonadídeos.

4.8 E

FEITOS CITOTÓXICOS EXERCIDOS PELOS PSEUDOCISTOS

Diversos estudos têm mostrado que existe uma correlação direta entre a

endocitose e a citotoxicidade exercida pelos tricomonadídeos, ou seja, cepas de

tricomonas com maior atividade endocítica provocam mais danos às células

hospedeiras (Juliano et al., 1991; Rendón-Maldonado et al., 1998; Pereira-Neves &

Benchimol, 2007; Vancini et al., 2008). A demonstração de que os pseudocistos de T.

foetus apresentam maior atividade endocítica do que os parasitos piriformes

possibilitou a realização de ensaios de interação entre ambas as formas de T. foetus e

células MDCK com o objetivo de verificar se os pseudocistos também eram mais

citotóxicos do que os organismos piriformes.

As células MDCK são muito usadas como modelo de células epiteliais para

os estudos de interação tricomonas-hospedeiro (Silva-Filho & de Souza 1988; Silva-

Filho & Bonilha 1992; Jesus et al., 2004; Vancini et al., 2008). Embora o uso deste

modelo forneça resultados significativos referentes à citotoxicidade de tricomonas

sobre células hospedeiras, é importante ressaltar que as células MDCK não

representam o tipo de células epiteliais encontrado pelas T. foetus durante a infecção

in vivo.

Os resultados obtidos mostraram que os pseudocistos de T. foetus são

mais citotóxicos e causaram mais danos às células epiteliais do que os parasitos

piriformes. A transformação amebóide das tricomonas tem sido diretamente

correlacionada com sua citotoxicidade, ou seja, os parasitos amebóides aderem com

muito mais avidez sobre as células-alvo provocando, assim, mais danos ás células

hopedeira (Arroyo et al., 1993; González-Robles et al., 1995; Rendón-Maldonado et

al., 1998; Jesus et al., 2004; Vancini et al., 2008). Assim, nossos dados mostraram que

durante a interação com as células MDCK os organismos piriformes não sofreram

mudanças na sua morfologia, enquanto os pseudocistos se tornaram amebóides

corroborando a sugestão de sua maior citotoxicidade.

Os pseudocistos dos tricomonadídeos podem ser encontrados in vivo em

diferentes secreções dos hospedeiros, tais como, sêmen, urina, fezes e secreções

vaginais (Verges, 1979; Mattern & Daniel, 1980; Buckner & Mikel, 1983; Szarmach et

al., 1983; Soszka et al., 1990; Malyszko & Januszko, 1991; Lipman et al., 1999).

Malyszko & Januszko (1991) mostraram que o pseudocisto de T. vaginalis é a forma

mais comum encontrada em homens infectados. Estudos realizados in vivo revelaram

que os pseudocistos constituem a forma infectiva das espécies de tricomonas que

parasitam aves e roedores (Stachan et al., 1984; Friedhoff et al., 1991; Lipman et al.,

1999). Pereira & Almeida (1940) relataram que os pseudocistos das tricomonas de

anfíbios eram muito agressivos e patogênicos, capazes de provocar sérios danos aos

tecidos do hospedeiro. Adicionalmente, Kondova et al. (2005) observaram que os

pseudocistos de Tritrichomonas sp. foram a forma predominante encontrada em

lesões estomacais provocadas pela tricomonose em macaco Rhesus.

Embora não haja na literatura nenhum relato sobre a existência in vivo de

pseudocistos em T. foetus, nós levantamos a hipótese que esta forma possa ser

infectiva e responsável pelas lesões mais graves observadas na tricomonose bovina e

felina. Nossos resultados mostraram que os pseudocistos de T. foetus constituem uma

forma com maior atividade endocítica, mais citotóxica e capaz de gerar células

multinucleadas liberando organismos piriformes mononucleados. Assim, nós

especulamos que T. foetus possa ser, preferencialmente, transferida para um novo

hospedeiro na forma de pseudocisto, contribuindo assim para uma infecção mais

eficiente. A formação dos pseudocistos de T. foetus poderia ser também muito

vantajosa para o parasito permanecer no hospedeiro durante alguma alteração

ambiental local. Por exemplo, Soszka et al. (1990) mostraram que os pseudocistos de

T. vaginalis são mais comuns em mulheres de resguardo ou idosas do que nas

mulheres excluídas destes dois casos.

T. foetus gera um enorme prejuízo econômico no setor agropecuário do

mundo inteiro. Por isto, a descoberta de uma forma mais virulenta do parasito poderá

abrir novos rumos para as pesquisas focadas no tratamento e combate da doença.

Estudos para caracterizar as diferenças moleculares entre os pseudocistos e os

parasitos piriformes estão sendo realizados pelo nosso grupo e constituirão o

desdobramento do presente trabalho.

4.9 CONCLUSÕES

• Os pseudocistos de T. foetus são formas viáveis e reversíveis.

• Os pseudocistos se dividem por um processo distinto da mitose

realizada pelos organismos piriformes.

• O processo de divisão dos pseudocistos de T. foetus é semelhante

à mitose das formas amebóides de outros parabasalídeos.

• Os microtúbulos do fuso de T. foetus são resistentes ao frio.

• Os pseudocistos são capazes de endocitar e possuem uma

atividade endocítica maior do que os parasitos piriformes.

• Ambas as formas de T. foetus são capazes de endocitar mesmo

durante a mitose.

• Os pseudocistos constituem uma forma mais citotóxica do que os

organismos piriformes.

5. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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104

6.ANEXO

---------- Forwarded message ----------

From: Michael Melkonian <michael.melkonian@uni-koeln.de>

Date: 2009/5/16

Subject: Protist Ms 10-2009

To: marleneben <marleneben@uol.com.br>

Cc: Linda Sperling <linda.sperling@cgm.cnrs-gif.fr>

Dear Dr. Benchimol,

your revised manuscript entitled "Tritrichomonas foetus: budding from multinucleated

pseudocysts" (with A Pereira-Neves), which you submitted to PROTIST has been

received with recommendation from Monitoring Editor Linda Sperling and has been

accepted for publication. To process your manuscript for publication, please send me a

CD containing separate files of the text (in Word format) and each illustration (as TIFF

or EPS files, prepared exactly according to PROTIST "Instructions for Authors"

(attached), i.e. with sufficient resolution at final size). Please include a statement in the

"Methods" section that your strain will be available upon request (see "Instructions for

Authors").

I look forward to receive your CD in due time.

Thank you for submitting this interesting manuscript to PROTIST.

Sincerely Yours,

Michael Melkonian

Editor-in-Chief PROTIST

Prof. Dr. M. Melkonian

Botanisches Institut

Universität zu Köln

Gyrhofstraße 15

50931 Köln

Germany

phone +49 (0) 221 470 2475

fax +49 (0) 221 470 5181

e-mail michael.melkonian@uni-koeln.de

web http://www.melkonian.uni-koeln.de

Profa. Marlene Benchimol

105

Tritrichomonas foetus: budding from multinucleated pseudocysts

Antonio Pereira-Neves

1, 2, 3

and Marlene Benchimol

1, *

Universidade Santa Úrsula. Rua Jornalista Orlando Dantas, 59. Botafogo. CEP

22231-010. Rio de Janeiro. Brazil.

Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas da Universidade Federal

do Rio de Janeiro CCS, bloco F, Cidade Universitária, Rio de Janeiro, 21949-900,

Brazil

Bolsista nota 10 - FAPERJ

Running title: Mitosis of T. foetus pseudocysts

M. Benchimol (corresponding author)

Laboratório de Ultraestrutura Celular, Universidade Santa Úrsula, Rua Jornalista

Orlando Dantas 59, 22231-010, Botafogo, Rio de Janeiro, Brazil.

E-mail: marlenebenchimol@gmail.com

Fax:55-21-2237-0440

106

ABSTRACT

Tritrichomonas foetus is a flagellated protozoan parasite that causes

trichomoniasis, a major sexually transmitted disease in cattle. T. foetus presents a

simple life cycle, exhibiting only the trophozoitic form. However, under unfavorable

growth conditions, the trophozoites, which are polar and flagellated, can round up

and internalize their flagella forming pseudocysts. In this form no cyst wall

surrounds the cell and it also displays a distinct mitosis when compared with the

trophozoite form. In pseudocyst mitosis, the cell proceeds with duplication of

cytoskeletal and mastigont structures; nucleus division occurs but without the

corresponding cytoplasm division. Thus, giant multinucleated cells which present

many mastigont structures are formed (approximately 62% of the population).

These polymastigont/multinucleated cells are maintained when the cells are under

stress conditions. When environmental conditions become favorable, the flagella

are externalized and new flagellated trophozoites one by one, gradually bud from

the multinucleated cell. Thus, in order to better understand the pseudocyst mitosis,

the polymastigont formation and the generation of new cells by this budding

process, videomicroscopy and other complementary techniques, such as

immunofluorescence and transmission electron microscopy were used.

Key words: electron microscopy, mitosis, multinucleate cells, parabasalids,

pseudocyst, Tritrichomonas foetus.

107

Introduction

Trichomonadea, commonly called trichomonads, comprise a class of

amitochondriate protists belonging to the phylum Parabasala (Hampl et al. 2004).

Among these microorganisms, Tritrichomonas foetus is the causative agent of bovine

trichomoniasis, one of the most widespread sexually transmitted diseases in cattle.

Bovine trichomoniasis is a major cause of infertility and abortion leading to

considerable economic losses in beef-producing areas of the world (Rae and Crews

2006). Nowadays T. foetus is recognized as being able to infect other animals. In

domestic cats, T. foetus colonizes the colon, resulting in chronic, large-bowel diarrhea

(Stockdale et al. 2008). The organism has also been described as an inhabitant of the

porcine gastrointestinal and nasal mucosa. Related to this point T. foetus and

Tritrichomonas suis (a gastrointestinal commensal of pigs) are now considered to be

strains of the same species on the basis of structural and molecular data (Lun et al.

2005; Tachezy et al. 2002). Additionally, studies have also recognized that canine

trichomoniasis (an intestinal disease) may be caused by infection with T. foetus

(Gookin et al. 2005).

A non-dividing T. foetus is characterized by a pear-shaped body, one anterior

nucleus, a ribbon of microtubules forming the pelta-axostyle complex, which runs from

the basal bodies to the cell tip and hydrogenosomes lining the axostyle. T. foetus

presents three anterior flagella and a recurrent one that runs toward the posterior

region of the cell adhered to the cell body, forming an undulating membrane

(Honigberg and Brugerolle 1990). The mastigont system also comprises several

skeletal structures including the costa that underlies the recurrent flagella and two

parabasal filaments that support a single Golgi complex (Benchimol et al. 2001).

Like other trichomonads, T. foetus presents only the trophozoite form. However,

under unfavorable environmental conditions, such as a decrease in nutrients, drugs or

abrupt changes in temperature, this organism rounds up forming pseudocysts. In this

108

form, the flagella are internalized, but no cyst wall surrounds the cell (Pereira-Neves et

al. 2003). Although pseudocysts can be observed in several species of trichomonads,

including T. foetus and the related human pathogen Trichomonas vaginalis, their

biological aspects is under-appreciated by most protozoologists. In addition, little is

known about the behavior and role of pseudocysts in the trichomonad cell cycle.

Transformation of such polarized pear-shaped cells into rounded cells with

internalized flagella led to several questions concerning pseudocyst behavior and

metabolic activities. For several years, pseudocysts were considered to be an

irreversible and degenerative form (Honigberg and Brugerolle 1990; Mattern et al.

1973; Samuels 1959). However, currently, it is believed that this form is reversible and

that its formation represents a defense mechanism to unfavorable environmental

conditions (Lipman et al. 1999; Mattern and Daniel 1980; Pereira-Neves et al. 2003).

The infectivity of fecal pseudocysts has been described for amphibians (Pereira and

Almeida 1940), rodents (Lipman et al. 1999; Mattern and Daniel 1980) and birds´

trichomonads (Pereira and Almeida, 1940; Friedhoff et al., 1991). Studies performed by

our group demonstrated that T. foetus pseudocysts are able to adhere to host cells and

that the pseudocyst adhesion rate is even higher than for the pear-shaped parasites

(Mariante et al. 2004).Thus, studies to elucidate the role of pseudocysts in the life cycle

of T. foetus, as well as their relationship with trichomoniasis, are gaining more

importance.

All trichomonad genera studied to date, including T. foetus, exhibit a special

type of mitosis called cryptopleuromitosis (Brugerolle 1975) where the nuclear envelop

persists and the mitotic spindle is totally outside to the nucleus. The microtubules of the

mitotic spindle are polarized by two rod-shaped structures named atractophores that

are appended to the base of the basal bodies and play the role of centrosomes.

Previously, we have characterized the main phases of cell division in pear-shaped

trichomonads (Ribeiro et al. 2000; 2002a; 2002b) and we have shown that it is

109

markedly distinct from pseudocyst mitosis (Pereira-Neves et al. 2003). However, there

are several open questions concerning pseudocyst mitosis, such as the involvement of

the axostyle and flagella during the mitotic process and to clarify whether cytokinesis

occurs. Thus, the present study intends to gain a better understanding of these aspects

of T. foetus pseudocyst behavior. To carry out this study we used videomicroscopy,

fluorescence and electron microscopy. Here we show that cytokinesis is arrested

during pseudocyst mitosis while the nucleus proceeds with sequential karyokineses.

Thus, this parasite form becomes multinucleated originating a polymastigont form.

Interestingly, new individuals, as pear-shaped cells, separate from these

multinucleated cells by a budding process, when under specific conditions.

Results and Discussion.

Pseudocysts induction

Standard cultures of T. foetus present a low frequency of pseudocysts (Pereira-

Neves et al. 2003), thus efficient methods to induce the transformation of the pear-

shaped parasites into pseudocysts are essential for the in vitro studies of these forms.

We have shown that T. foetus pseudocyst formation can be successfully induced if the

parasites are kept at temperatures below 16ºC (Granger et al. 2000). In addition,

pseudocyst formation and reversibility can be obtained by rapid cooling and warming

schemes (Granger et al. 2000). Thus, in order to obtain a large number of pseudocysts,

cultures of T. foetus grown for 36 h at 37º were then cooled to 4ºC for 4 h. Using this

process, approximately 95% of the parasites were transformed into pseudocysts at the

end of the induction test (Fig. 1a). The number of cells per ml remained unaltered

during the pseudocyst formation assay (Fig. 1b), indicating that the parasites were not

damaged and that, probably, the mitotic process was arrested. When the parasites

were kept at 4ºC for more than 24 h, the number of cell per mL remained almost

unaltered (not shown).

The viability of T. foetus at the end of pseudocyst induction assays was

checked using Hoechst 33342 (HO) and propidium iodide (PI) (Figs. 1c, 2). DNAse I-

110

treated parasites were used as positive control (Figs. 2a-b). Pear-shaped parasites

grown under standard conditions were used as negative control (Figs. 2c-d). The HO +

PI dye combination is commonly used to analyze cell culture viability. In vivo, HO has

access into slightly damaged as well as dramatically altered apoptotic nuclei (Weber et

al. 1997). Thus, by using HO it is possible to label cells ranging from early to late

apoptotic stage. PI can enter only in late apoptotic and necrotic cultured cells,

intercalating nucleic acids every 4–5 bp without sequence preference (Lizard et al.

1995). After HO staining, fragmented chromatin masses were observed in the nuclei of

DNAse I-treated pear-shaped parasites (Figs. 2a-b). Condensed chromatin was also

found in DNAse-treated pseudocysts (not shown). However, fragmented nuclei were

not seen in both negative control (Figs. 2c-d) and parasites under pseudocyst induction

assay (Figs. 2e-f). The majority of the parasites (approximately 96%) grown under

standard conditions or submitted to pseudocyst induction assay showed PI negative

staining (not shown).

The induction of pseudocysts by drugs, such as griseofulvin, can lead to an

irreversible process that ends with cell death, depending on the exposure time and/or

the concentration of the drug employed (Mariante et al. 2003). However, in the present

study, the double staining with the fluorescent dyes HO and PI showed that

approximately 96% of the parasites were viable at the end of induction assay (Fig. 1c).

Pseudocysts remained viable even after being kept for more than 24 h at 4º C (not

shown), indicating that the methodology used here to induce pseudocyst formation did

not trigger any type of cell death.

Pseudocysts reversibility

After the pseudocyst induction assay, one group of samples was re-incubated

at 37ºC for 4 h. During this period, the pseudocysts externalized their flagella and were

seen re-transformed into pear-shaped morphology; the number of cells per ml

increased (Fig. 1b). At the end of the reversibility assay, the percentage of pseudocysts

was the same as found in cultures kept under standard conditions (Fig. 1a).

111

Surprisingly, during the reversibility test, the culture presented a faster multiplication

when compared with the controls (Fig. 1b). Similar results were obtained when the

parasites were kept to 4ºC for more than 24 h (not shown). Qualitative and quantitative

analysis of viability tests showed that the cells were viable at the end of reversibility

assays (Figs. 1c, 2d).

Pseudocysts mitosis

In order to better understand the pseudocyst mitosis and compare it with our

previous knowledge of the division process in motile T. foetus (Ribeiro et al. 2000;

2002a; 2002b), we used complementary techniques, such as, immunofluorescence

(Fig. 3), videomicroscopy (Supplementary Fig. S1) and transmission electron

microscopy (Supplementary Figs. S2-S4).

During the interphase, both pear-shaped parasites (Figs. 3a-b) and

pseudocysts (Figs. 3c-d) present a single nucleus and only one set of skeletal

structures, such as pelta-axostylar complex. However, unlike pear-shaped organisms

(Figs. 3a-b), in pseudocysts the axostyle change its shape from an axial structure to a

curved one (Figs. 3c-d). In the early mitosis, the pelta-axostyle, costa and flagella were

already duplicated and the nucleus had increased in size (Pereira-Neves et al. 2003).

Afterwards, the duplicated basal bodies, now placed side-by-side, migrated in opposite

directions (Figs. 3e-f; supplementary Figs. S1a-h, S2a). At the same time, the

microtubules nucleated from the duplicated atractophores interacted with the

microtubules emanating from the opposite cell pole, or directly with the nuclear

envelope, producing pole-to-pole or pole-to-nucleus spindles, respectively (Figs. 3e-h;

supplementary Figs. S1a-h, S2-S4). During migration of the basal bodies, a tight

microtubular bundle is formed connecting one pole to the other and it is positioned

laterally to the nucleus (Figs. 3e-h; supplementary Figs. S1a-h, S2a). In the course of

spindle elongation this microtubule bundle presses the nucleus forming an invagination

on its surface similar to a canal (supplementary Fig. S2b).

The pole-to-nucleus microtubules form small bundles and are anchored on

112

specialized regions of the nuclear envelope (supplementary Figs. S3-S4). As

previously described by Brugerolle (1975), these regions are seen as dense plates with

a fibrillar coat where the spindle microtubules are attached. An electrondense material

coats the inner and the outer membranes of the nuclear envelope. Occasionally,

chromatin masses are seen close to these regions (supplementary Fig. S3). During the

mitosis course, the pole-to-nucleus microtubules are shortened and, as a

consequence, the nuclear envelope is pulled to the poles, assuming finger-like

projections (Pereira-Neves et al. 2003) (supplementary Fig. S3). Although the axostyle

was easily observed by electron microscopy (supplementary Figs. S2b, S3-S4), it was

not always seen during pseudocyst mitosis when anti-tubulin antibodies were

employed in immunofluorescence (Figs 3e-f). The participation of the axostyle in

karyokinesis as previously described in tear-drop forms, was not observed in

pseudocysts. Thus, it is possible that the pole-to-nucleus spindle participates in or even

could be responsible for the pseudocyst karyokinesis (supplementary Fig. S4).

After the karyokinesis, the pole-to-pole microtubules keep growing and they

apparently help the basal bodies and the nucleus to move to cell poles (Figs. 3i-l).

Afterwards, the spindle microtubules are depolymerized, but the mitosis is not

completed since cytokinesis does not occur. Thus, the pseudocyst cell becomes

binucleated (Figs. 3m-n, 4a; supplementary Fig. S1i). We observed that both nuclei

present independent movement and together with all duplicated cell structures, share

the same plasma membrane (Figs. 3m-n, 4a; supplementary Fig. S1i).

Polymastigont forms

We observed that while the conditions of induction assays were maintained, the

binucleated pseudocysts kept on dividing, but without cytokinesis (Figs. 5a-d). As a

consequence, polymastigont forms, which are composed of a large cytosolic mass,

containing several nuclei and their respective mastigont structures appeared (Figs. 2e-

f, 4b, 5e-f, 6a-h). At the end of the induction assay, approximately 67% of binucleated

cells were converted to multinucleated parasites (Fig. 1d). Fluorescence microscopy

113

showed that nuclear division in binucleated pseudocysts could occur by synchronized

(Figs. 5a-b) or non-synchronous (Figs. 5c-d) ways. During the 4 h of pseudocyst

induction assay, the nuclei number varied from two to six (Fig. 1d), although the

majority of the parasites (approximately 88%) presented two to four nuclei (Fig. 1d).

When the parasites were kept at 4ºC for more than 24 h, some pseudocysts containing

seven or eight nuclei were observed (approximately 6%), but the majority of cells

(approximately 60%) presented four to six nuclei (not shown). Parasites containing

more than eight nuclei were not observed. The presence of odd nuclei numbers

corroborates that the nuclei division was not necessarily synchronized.

Videomicroscopy showed that each nucleus, with its respective mastigont structures,

presented independent movement (Figs. 6a-h). The majority of the multinucleated

pseudocysts were viable as seen by the viability tests with the fluorescent dyes HO and

PI (Figs. 1c, 2e-f).

Polymastigont organisms have been recorded in several trichomonad species

(Kofoid and Swezy 1915; Samuels 1959; Stabler 1941), including T. foetus (Kirby

1951; Mariante et al. 2003) and T. vaginalis (Abonyi 1995; Ovcinnikov et al. 1974;

1975), as well as other parabasalids, such as the devescovinid Gigantomonas herculea

(Cleveland 1966; Kirby 1946). In addition, the calonymphid parabasalids comprises

multinucleated flagellates with a permanent polymonad organization, i.e. Calonympha

grassi (Gerbord et al. 2002). There are several controversial observations concerning

the polymastigont trichomonads. Some authors have suggested that these forms

represent degenerative organisms (Honigberg and Brugerolle 1990; Samuels 1959).

However, there are evidences suggesting that these polymastigont trichomonads could

represent a normal part of the life cycle. Several authors claimed that polymastigont

organisms of several trichomonads species, such as T. vaginalis, Pentatrichomonas

hominis, Trichomitus fecalis, Tritrichomonas augusta and G. herculea, are

developmental stages preceding the appearance of mononuclear flagellates (Abonyi

1995; Chatterjee et al. 1933; Cleveland 1928; 1966; Kirby 1946; Kofoid and Swezy

114

1915; Ovcinnikov et al. 1974; 1975). They recorded interesting observations by light or

electron microscopy in which single organisms drew out and detached themselves from

the polymastigont body until all of them were completely separated. Some of these

researchers adopted the terminology schizogony to describe this phenomenon and

considered that the life cycle of some trichomonads includes alternate periods of binary

and multiple fission (Cleveland 1966; Kofoid and Swezy 1915). However, to our

knowledge, the separation of single organisms from the large multinucleated cell has

not been previously shown for T. foetus.

In the present work, an important observation was made when the

polymastigont pseudocyst population was warmed to 37ºC, after four h at 4ºC. As

mentioned above for other trichomonads, the polymastigont organism began to

externalize the flagella and then each group comprising one nucleus with its respective

mastigont structures was gradually individualized still inside the polymastigont form

(Figs 6i-p). Afterwards, every single piriform organism is seen in a budding process

which culminates with its complete separation. These observations were made not only

by videomicroscopy (Figs. 6i-x) but also by fluorescence microscopy (Figs. 2g-h, 5g-h)

and transmission electron microscopy (Fig. 7). These observations could explain the

increase in cell numbers during the reversibility experiments when compared with the

standard growth culture (Fig. 1b). After four h at 37ºC, the polymastigont forms were

rare in the cultures and most of the population was formed by mononuclear pear-

shaped and flagellated organisms (Fig. 1d). Similar results were obtained when the

parasites were kept at 4ºC for more than 24 h (not shown).

Thus, our results show that T. foetus pseudocyst mitosis can be characterized

by two events: (1) the pole-to-nucleus spindle may be responsible for the karyokinesis

and not the axostyle as occurs in the pear-form; (2) since the flagella are internalized,

the propulsion force is not enough to promote the daughter-cell separation and

posterior cytokinesis, as occurs in the pear-form cells, resulting in multinucleated cells.

115

As mentioned above, this division process was called schizogony because it presents

similarities with the schizont stage of Apicomplexa organisms, such as Plasmodium

falciparum. However, during true schizogony, the schizont is subject to a maturation

process and before the budding of single organisms from the schizont mass, each

daughter cell displays its own plasma membrane within a common schizont cell

envelope (Heussler and Stanway 2008). These characteristics are not observed during

T. foetus pseudocyst mitosis. Electron microscopy shows that in polymastigont cells all

karyomastigonts are included in a common cytoplasmic mass (Fig. 8). Thus, we

consider it is more appropriate to call T. foetus pseudocyst mitosis a ‘schizogony-like’

division.

Cold-stable spindle microtubules

Interestingly, the spindle microtubules in T. foetus pseudocysts were

polymerized even at 4ºC. When T. foetus is in a host the environment is warm. Since

low temperatures lead T. foetus to undergo pseudocyst formation, the finding that the

pseudocyst is able to proceed with mitosis at 4ºC may be considered very

advantageous for parasite survival and transmission when it is not in a host. The

presence of abundant subsets of cold-stable microtubules in the cytoplasm of different

cell types has been an intriguing property of these polymers. Cold-stable microtubules

are found in many model systems used to study the cytoskeleton, including neurons,

glial cells epithelial cells, fibroblasts and mitotic spindles of mammalian cells (Bosc et

al. 1999; 2003; Brinkley and Cartwright 1975) and some protozoa, such as

Trypanosoma brucei (Vedrenne et al. 2002). Studies have provided evidence that cold-

stable microtubules are mostly formed by amino acid changes in the tubulin subunits

and/or occur posttranslationally (Bane et al. 2002; Nyporko et al. 2003). Many non-

tubulin proteins can also interact with microtubules and influence their sensitivity to cold

(Vedrenne et al. 2002). Studies are needed in order to determine the factors

responsible for microtubular adaptation to low temperatures in T. foetus microtubules

116

Morphological comparison between the behavior of mitosis in T. foetus

pseudocyst and other close parabasalids

T. foetus pseudocyst schizogony-like division is very similar to some dividing

parabasalids, such as, amoeboid monocercomonadids Dientamoeba fragilis (Camp et

al. 1974) and Histomonas meleagridis (Honigberg and Bennett 1971; Munsch et al.

2008), as well as, devescovinid G. herculea (Cleveland 1966; Kirby 1946). D. fragilis is

an aflagellated parasite of the human intestine and is strictly amoeboid. The

binucleated form of D. fragilis is the typical stage observed and in this cell, an

extranuclear spindle is commonly found between the nuclei (Camp et al. 1974). H.

meleagridis is a parasite of the liver and gut of gallinaceous birds (Munsch et al. 2008),

which presents two different forms: (1) a flagellated form with one anterior flagellum

and (2) an amoeboid form with an internalized flagellum. The amoeboid form of this

parasite is predominant and it is able to carry out mitosis by a process similar to T.

foetus pseudocysts and D. fragilis (Honigberg and Bennett 1971; Munsch et al. 2008).

The devescovinid G. herculea is a commensal of the termite midgut and it also

presents a motile flagellate form and an amoeboid form with a complete internal

flagellar apparatus (Cleveland 1966; Kirby 1946). The amoeboid G. herculea is the

common form and it generally displays a mitotic process that is similar to the

schizogony-like division in T. foetus pseudocysts, including the formation of the

polymastigont organism (Cleveland 1966; Kirby 1946).

Morphological date and comparative analysis of small subunit rRNAs indicate

that T. foetus, amoeboid monocercomonadids, devescovinids and the multinucleated

calonymphids integrate a monophyletic sub-group within the Phylum Parabasalia

(Gerbod et al. 2002; Hampl et al. 2004). In addition, these studies indicated that the

amoeboid monocercomonadids D. fragilis and H. meleagridis could be a sister branch

to T. foetus suggesting their potentially primitive position at the base of the

Devescovinidae/Calonymphidae group. These authors claimed that Devescovinidae

and some Calonymphidae have evolved from T. foetus or are closely related. Thus, the

117

formation of polymastigont organisms in T. foetus might help to understand the origin of

the Calonymphidae. We raised the hypothesis that the polymastigont forms of T. foetus

might be a reminiscent characteristic of an ancestral organism from which radiated the

members of T. foetus/amoeboid monocercomonadids/devescovinids/calonymphids

group.

Conclusions

This study contributes to a better understanding of the trichomonad

pseudocysts. Our results showed that T. foetus pseudocysts were able to generate

polymastigont organisms that released single organisms. This finding might be

considered very advantageous for parasite survival and transmission during stress

conditions. However, further studies are needed to clarify the exact role of pseudocysts

in vivo

Methods

Tritrichomonas foetus

The T. foetus K strain was isolated by Dr. H. Guida (Embrapa, Rio de Janeiro,

Brazil) from the urogenital tract of a bull and has been maintained in culture since the

1970’s. The parasites were cultivated in Trypticase - yeast extract - maltose (TYM)

medium (Diamond 1957) supplemented with 10% bovine serum. T. foetus was grown

in 7 mL of TYM medium for 30 h at 37ºC, which corresponds to the logarithmic growth

phase. The initial inoculum was 1x10

parasites/mL.

Pseudocysts induction and reversibility assays

In order to induce pseudocyst formation, samples of parasites grown for 36h at

37ºC were cooled to 4ºC for 4h without changing the culture medium during this period.

Pseudocyst formation was checked by light microscopy inspection and the percentage

of pseudocysts was determined from counts of at least 1,000 parasites per sample at

30 minute intervals. In order to induce reversibility, after being kept for 4h at 4ºC, some

samples were warmed to 37ºC for 4h. Again at 30 minute intervals an aliquot was

taken and the pseudocyst percentage was estimated as described above.

118

T. foetus cultures grown for 36h under standard conditions were used as controls

for both assays. During pseudocyst induction and reversibility assays, the number of

parasites per mL was calculated using a Neubauer hemocytometer.

Videomicroscopy

Living cells were recorded by differential interference contrast microscopy,

using a 63X, N.A. 1.4 objective lens. The sequences of images were obtained with a

chilled C5985-10 CCD camera (Hamamatsu, Japan) attached to a Zeiss Axiophot II

light microscope (Zeiss, Germany). The sequences were optimized by an analogue

process and recorded on an S-VHS video recorder. The video images were analyzed

and the best images were selected and digitized using KS-300 software (Kontronics,

Germany).

Fluorescence microscopy

DAPI

Cells were harvested by centrifugation and fixed with 4% paraformaldehyde in

0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.2). Afterwards, cells were rinsed with PBS and

allowed to adhere to poly-L-lysine-coated glass coverslips. In order to investigate the

number of nuclei per parasite during both pseudocyst induction and reversibility

assays, cells were stained with 5 µg/ml DAPI (Molecular Probes, USA) for 15 min and

examined in an Axiophot II Zeiss microscope equipped with UV epifluorescence.

Images were acquired with a Hamamatsu chilled CCD camera C5985 and processed

using Adobe Photoshop (Adobe, USA). The number of nuclei per parasite was

determined from counts of at least 1,000 parasites per sample. T. foetus grown for 36h

at 37ºC was used as control.

Hoechst 33342 and propidium iodade

The viability of T. foetus during pseudocyst induction and reversibility assays

was checked using Hoechst 33342 (HO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) and

propidium iodide (PI) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Living cells were incubated

with HO (10 µg/mL) for 20 minutes at 4ºC. Afterwards, cells were washed with PBS at

119

4ºC and then they were incubate with PI (10 µg/mL) for 5 minutes at room temperature.

Positive control slides were treated with DNAse I (Sigma, St. Louis, MO) for 10min at

room temperature. The parasites were examined in an Axiophot II Zeiss microscope

(HO – 350-400 nm; PI – 523 nm) and the images were acquired with a Hamamatsu

chilled CCD camera C5985 and processed using Adobe Photoshop (Adobe, USA). T.

foetus grown for 36h at 37ºC was used as control.

Immunofluorescence

Cells were fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS and allowed to adhere

to poly-L-lysine-coated glass coverslips. Parasites were then permeabilized with 3%

Nonidet P-40 for 40 min and, next, in acetone at 20ºC for 15 min. Fixed cells were

quenched using 50 mM ammonium chloride solution and 3% bovine serum albumin in

PBS (BSA/PBS). Next, they were incubated overnight, at 4ºC, with the monoclonal anti

-β-tubulin #357antibody (Amershan - Aylesbury, UK), followed by 1 hour incubation

with a fluorescein-conjugated anti-mouse antibody diluted (1:100) in BSA/PBS.

Parasites were also stained with 5µg/ml DAPI to visualize the nucleus. Finally, cells

were washed and examined in an Axiophot II Zeiss microscope and the images were

acquired with a Hamamatsu chilled CCD camera C5985 and processed using Adobe

Photoshop (Adobe, USA).

Transmission electron microscopy (TEM)

Cells were fixed overnight at room temperature in 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M

cacodylate buffer. Afterwards, the cells were washed in PBS and post-fixed for 15 min

in 1% OsO4 in 0.1 M cacodylate buffer containing 5 mM CaCl

and 0.8% potassium

ferricyanide. The cells were dehydrated in acetone and embedded in Epon. Ultra-thin

sections were harvested on 300 mesh copper grids, stained in 5% uranyl acetate and

1% lead citrate and then observed in a JEOL 1210 transmission electron microscope.

120

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do

Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES), Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX), and

Associação Universitária Santa Úrsula (AUSU).

121

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Legends

Fig. 1. Quantitative analyses of T. foetus cultures during pseudocyst induction and

reversibility assays. Parasites grown for 36 h at 37ºC were used as control. The values

are expressed as the means ±S.D. of six independent experiments, each performed in

duplicate. 1,000 parasites per sample were counted. In (a), analyses of pseudocyst

percentages; (b) effects on T. foetus growth during pseudocyst induction and

reversibility assays; (c) viability of parasites by fluorescence microscopy analysis

determined by HO and PI; (d) analyzes of number of nuclei per cell after DAPI staining.

Note that during pseudocyst induction assay multinucleated cells were commonly

observed. After reversibility assay, almost all the population was formed by

mononuclear organisms and multinucleated organisms were uncommon in the

cultures.

Fig. 2. T. foetus DNA stained by HO. Parasites are revealed by DIC microscopy (a, c,

e, g) followed by HO staining (b, d, f, h). These cells were PI-negative; (a-b) positive

control: DNAse I- treated pear-shaped parasite. Fragmented chromatin mass can be

seen (arrowheads); (c-d) Interphasic pear-shaped parasite grown under standard

conditions. Fragmented chromatin is not observed; (e-f) Parasites under pseudocyst

induction assay. They were incubated at 4ºC for 3h. Fragmented chromatin mass is not

seen. Note that some cells display more than two nuclei (black arrows); (g-h) Parasites

incubated for 2 h at 37ºC after pseudocyst induction. Fragmented chromatin is not

observed. Note that some cells already display tear-drop form (white arrows). A pear-

shaped parasite (black head-arrow) was caught in the process of budding from a

multinucleated cell Bars, 2µm.

Fig. 3. T. foetus are seen by DIC (a, c

, e, g, i, k, m) followed by immunofluorescence

(b, d, f, h, j, l, n)

using monoclonal anti beta-tubulin antibody (green) and DAPI staining

(blue); (a-b) Interphasic pear-shaped parasite grown under standard conditions. Note

127

that the pelta-axostyle complex (Pe-Ax) is straight; (c-n) T. foetus under pseudocyst

induction assay. The parasites were incubated at 4ºC for 2h; (c-d) interphasic

pseudocyst. Notice that the flagella are internalized and the axostyle is curved; (e-l)

Pseudocysts in division process. Pole-to-pole spindle microtubules (S) are observed as

tight bundle positioned laterally to the nucleus (f, h). In (f), the axostyles do not

fluoresce. In (h), the basal bodies are further apart. Note that only one axostyle (Ax) is

clearly visible; (i-l) Pseudocysts after karyokinesis. The cells reveal duplicated

structures, such as two nuclei and two axostyles (Ax

and Ax

), which are at opposite

sides. The spindle (S) is still seen; (g) Binucleated pseudocysts (arrow) formed after

mitosis. Bars, 2 µm.

Fig. 4. Transmission electron microcopy of T. foetus pseudocyst after karyokinesis.

The parasites were incubated at 4ºC for 4h. Notice that flagella (F) are internalized; (a)

Binucleated pseudocyst. Note that the two nuclei (N

and N

) with their respective

structures, such as the pelta (Pe

and Pe

), axostyle (Ax

and Ax

), and Golgi complex

and G

) are located side-by-side; (b) Polymastigont pseudocyst. Notice the

presence of three nuclei, at least. BB, basal bodies; H, hydrogenosome; V, vesicles.

Bar, 1µm.

Fig. 5. Multinucleated pseudocysts are observed by DIC (a, c, e, g’, g’’) followed by

immunofluorescence (b, d, f, h’, h’’) using monoclonal anti beta-tubulin antibody

(green) and DAPI staining (blue); (a-d) The parasites were incubated at 4ºC for 3 h. In

(a-b), a pseudocyst with three nuclei is seen, suggesting that the nuclei division is not

synchronized; two nuclei are connected by a pole-to-pole spindle (s) while the third is

not in mitosis. In (b), although the axostyles have already triplicated, in this micrograph

only one axostyle (Ax) is visible because the others are on a different focal plane; (c-d)

Multinucleated pseudocyst with four nuclei and two pole-to-pole spindles (S

and S

)

are observed; (e-f) Pseudocysts incubated for 4 h at 4ºC. Observe that the parasites

128

present several nuclei and axostyles (white arrows); (g’-h’, g’’-h’’) Two distinct focal

planes of a parasite incubated for 30 minutes at 37ºC after pseudocyst induction. A

pear-shaped parasite (black arrow) can be seen in the process of budding from a

multinucleated cell. Bars, 2µm.

Fig. 6. Videomicroscopy frames of T. foetus during a reversibility assay. The parasite

was incubated at 37 °C for 30 minutes after pseudocyst induction. The time interval

between a frame and another is shown at the top right. This cell presents five nuclei.

Each nucleus and its respective mastigont structures presented independent

movement. In Figs. a-h, flagella beating inside the cell, which provoked undulations on

the plasma membrane, were seen. Afterwards, the anterior flagella (AF) and recurrent

flagellum (RF) were externalized and each karyomastigont intensified their movements

(i-p). The flagella beating generated enough motor strength to individualize one

karyomastigont (N1). Next, this individualized cell is seen in the process of detachment

from the main body. Note that before the detachment the axostyle (arrowhead) of this

individualized karyomastigont was still linked to the main body (g-x). C, costa. Bar,

4µm.

Fig. 7. Transmission electron microscopy of a multinucleated T. foetus. Parasites were

incubated at 37°C for 1 hour after the pseudocyst induction assay. Observe that the

recurrent flagella (RF) are externalized. By counting the nuclei and axostyles it was

possible to visualize, at least, three individuals in Figs. a, c. In Fig. b there are four

pelta-axostylar systems (Pe-Ax). Notice in Fig. c that the cell exhibits a projection

(arrow), suggesting the detachment of a new karyomastigont. In d, this projection is

seen in detail. Notice that filamentous structures seem to connect the multinucleated

cell with this projection (asterisk). G, Golgi complex; H, hydrogenosome; C, costa; V,

vacuoles. Bar, 1 µm.

129

Supplementary content

Figure S1. Videomicroscopy frozen frames of T. foetus pseudocyst observed by DIC

during mitosis. The parasite was incubated at 4ºC for 2h. The time interval between

one frame and the next is shown in seconds at the top right. (a-h) The duplicated

kinetosomes (arrowheads) are located at opposite sides of the nucleus (N). Pole-to-

pole spindle (arrow) is observed as a thin bundle located among the kinetosomes and

above the nucleus. In frame i, karyokinesis occurred. It is possible to observe the

presence of two nuclei (N1 and N2). Bar, 4µm.

Figure S2. Transmission electron microcopy of T. foetus pseudocyst during mitosis.

The parasites were incubated at 4ºC for 4h. (a) Longitudinal section of a pseudocyst.

Observe that the atractophores (asterisk), located below the basal bodies (BB),

nucleate pole-to-pole spindle (arrow). Note that the pole-to-pole spindle forms a tight

bundle connecting one pole to the other and it is positioned laterally to the nucleus (N).

(b) Cross-section of a pseudocyst from a top view. Notice that the pole-to-pole spindle

(arrow) forms an invagination on nuclear surface. G, Golgi complex; Ax, axostyle. Bars,

500nm.

Figure S3. General (a) and detail (b) views of a T. foetus pseudocyst during mitosis by

transmission electron microcopy. The parasite was incubated at 4ºC for 4h. Notice that

flagella (F) are internalized; Notice the presence of axostyles (Ax) at each cell pole.

The microtubules of the mitotic spindle are polarized by atractophores (asterisk). Note

the attachment sites (arrows) of the pole-to-nucleus microtubules on the nuclear

envelope. Chromosome masses are observed in the nuclear matrix (stars). The

nucleus (N) displays a “finger like-projection” (arrowheads) towards the atractophores.

G, Golgi complex; V, vesicles; H, hydrogenosome; C, costa. Bars, 500 nm.

130

Figure S4. Transmission electron microcopy of a T. foetus pseudocyst after

karyokinesis. The parasites was incubated at 4ºC for 4h. (a) general view. It is

possible to observe the internalized flagella (F) and duplicated cell structures, such as

the nucleus (N

and N

), Golgi complex (G) and basal bodies (BB). The duplicated

basal bodies (bb) are seen at opposite poles of the cell. Notice the pelta (Pe) and

axostyle (Ax); (b-c) Details of the basal bodies region. Observe that the atractophores

(asterisk), located below the basal bodies (BB), nucleate pole-to-nucleus spindle

(arrows). V, vesicles; H, hydrogenosomes. Bars, 500 nm.

131

Figure 1

132

Figure 2

133

Figure 3

134

Figure 4

135

Figure 5

136

Figure 6 a-l

137

Figure 6m-x

138

Figure 7

139

Supplementary figure S1

140

Supplementary figure S2

141

Supplementary figure S3

142

Supplementary figure S4

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