( PDF ) Caracterização de proteínas do complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus

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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Caracterização de Proteínas do Complexo de Golgi de Tritrichomonas

foetus

IVONE ROSA DE ANDRADE

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

RIO DE JANEIRO

2009

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Ivone Rosa de Andrade

Caracterização de proteínas do complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus/

Dissertação: Mestrado em Ciências Morfológicas

Universidade Federal do Rio de Janeiro, IB, CCS, Programa de Pós

Graduação em Ciências Morfológicas

Rio de Janeiro, 2009

xvi, 116.: il

Orientador: Dra. Marlene Benchimol

1. Tritrichomonas foetus. 2. Complexo de Golgi. 3. Ultraestrutura. 4.

Proteômica. 5. Anticorpos

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CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DO COMPLEXO DE GOLGI DE

Tritrichomonas foetus

IVONE ROSA DE ANDRADE

RIO DE JANEIRO

2009

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Ciências Morfológicas

–

UFRJ como parte das exigências para

obtenção do grau de Mestre em Biologia

Celular

Orientador: Dra. Marlene Benchimol

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DO COMPLEXO DE GOLGI DE

Tritrichomonas foetus

IVONE ROSA DE ANDRADE

Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Morfológicas – PCM, Instituto de Ciências Biomédicas – ICB, Universidade Federal do Rio

de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre.

Aprovada por:

______________________________________________________________________

Prof. Claudia Mermelstein

Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Narcisa Leal de Cunha e Silva

Instituto de Biofísica – UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Fernando Costa e Silva Filho

Instituto de Biofísica – UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Tecia Ulisses de Carvalho (Revisora)

Instituto de Biofísica – UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Manoel Luis Pereira da Silva Costa (Suplente)

Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Marlene Benchimol (Orientadora)

Programa de Ciências Morfológicas - UFRJ

Rio de Janeiro

2009

Essa dissertação foi realizada no Laboratório de Ultraestrutura Celular da Universidade

Santa Úrsula e na Unidade de Espectrometria de Massa e Proteômica – UEMP na

Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Profa. Marlene Benchimol, com

o apoio financeiro do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico), PRONEX (Programa de Núcleo de Excelência), FAPERJ (Fundação Carlos

Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), CAPES (Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e AUSU (Associação Universitária Santa

Úrsula).

Este trabalho é dedicado

os meus pais, Alaide Rosa e Manoe

atrocínio, por serem os pilares da

minha vida, por estarem comigo em

minha caminhada, segurando minhas

mãos e me apoiando. Por abrirem meus

olhos e iluminarem meu caminho. Po

tudo que me ensinaram, por todo carinho

que possibilitou que alcançasse meus

ideais.

AGRADECIMENTOS

Aos familiares

Aos meus pais, por me apoiarem e me incentivarem a cada conquista. Pelo carinho e

atenção que dedicaram a mim em todos os momentos.

Aos meus primos Sérgio, Eduardo, Célia, Guilherme, Alexandre e Bruna por torcerem

por mim e principalmente pelas recordações que me fazem valorizar pequenos momentos.

Aos meus tios Jurimar, Gelson, Luzia, Niel (in memórian) por cuidarem de mim nos

momentos difíceis e por vibrarem comigo nos momentos de alegria.

Aos meus afilhados Bruno, Lorena e Breno por serem as luzes da minha vida, por me

permitirem ficar encantada a cada nova descoberta de vocês.

Aos colaboradores

Ao Prof. José Morgado por me ensinar as técnicas de isolamento do complexo de

Golgi, eletroforese e immunoblotting que foram essenciais para o desenvolvimento deste

trabalho.

A Profª. Narcisa, pela atenção que sempre me dá nos momentos que necessito de

alguma ajuda científica, por ter aceitado fazer parte da minha banca de projeto e dissertação

de mestrado e principalmente pelas dicas de imunoprecipitação que aperfeiçoaram e muito os

nossos resultados.

Ao Prof. Peralta, por permitir que eu acompanhasse o processamento de obtenção de

anticorpos monoclonais, para que assim eu tivesse um melhor entendimento deste

procedimento que foi realizado no trabalho, porém não foi desenvolvido por nós.

Ao Dr. Jorge Luiz da Chron Epigen, pela paciência em explicar as etapas do processo

de obtenção dos anticorpos monoclonais e por tirar minhas dúvidas em relação ao

procedimento.

A Diva da Cruz, pela atenção e dedicação que demonstrou nos dias de observação das

etapas do processo de obtenção de anticorpo monoclonais.

A Ana Lúcia e Patrícia, pelas dicas e conselhos de como proceder nas técnicas

proteômicas.

Aos Profs. Cláudia Mermelstein, Manoel Luis Costa e Fernando Costa e Silva por

terem aceitado o convite para fazer parte da banca julgadora da minha dissertação de

mestrado.

A Profª. Tecia pelas dicas e ótima revisão da minha dissertação de mestrado.

vii

A Juliana pela paciência e pelas várias técnicas que me ensinou durante minha

iniciação científica, principalmente a ultramicrotomia.

A todos que me ajudaram a romper 2 L de célula para os experimentos de isolamento

do Golgi e a fazer as inúmeras imunofluorescências durante a seleção dos anticorpos.

Obrigada é pouco para vocês.

Aos Amigos

A minha amiga Marjolly por esses 7 anos de amizade, pelas conversas (às vezes

monólogos nos seus momentos de raiva e que você não deixa ninguém falar, né?) pelas

palavras de incentivo e muitas vezes de consolo (quando você vinha com a frase “Amiga!

Você quer um consolo? O meu material não voa, o seu voou!!!! rsrsrs”) só você para me fazer

rir nos momentos em que tudo estava dando errado. E principalmente muito obrigada pela

atenção e dedicação que você deu a esse trabalho, estando comigo em todos os experimentos

de proteômica.

Ao Antonio, por ser essa pessoa única, que me ensinou a compreender coisas

essenciais para manter um bom relacionamento com as pessoas. Por ser essa pessoa bem

humorada, sempre de bem com a vida que torna nossos dias no laboratório sempre mais

agradáveis. Obrigada pelas discussões científicas e ajuda em experimentos. Pela energia

positiva e pelo carinho que você transmite em seus abraços de todas as manhãs. Deixe que as

pessoas sintam ciúmes da nossa amizade, seremos sempre “amiguinhos” e por isso você vai

poder apertar quando quiser.

A Gladys, pela amizade construída no dia-a-dia que foi tomando força e hoje você se

tornou minha irmãzona. Tantos momentos que passamos juntas, muitos bons, alguns ruins,

mas você sempre cuidando de mim, preocupada comigo. Mesmo distante não me esqueço de

você, obrigada por tudo.

Ao Victor, meu irmãozinho adotivo, por ser esse menino moleque, às vezes ingênuo,

mas isso é porque seu coração é enorme e eu admiro isso em você. Obrigada pela ajuda no

laboratório, pelas conversas, pela força no momento de tristeza e pelos chopps de sexta que

você agitava depois de uma semana exaustiva.

Ao Vilela (Hai!!!), por suas reações e frases inesperadas que sempre quebram o

silêncio do laboratório... Mas tudo bem!!! Ás vezes um momento de descontração faz bem

mesmo. Obrigada pelas ajudas nos experimentos e pelo carinho que tem por mim.

A Fernanda (ou devo dizer as Fernandas), porque às vezes você está fazendo 1001

coisas ao mesmo tempo, mas sempre tem um tempinho para nos ajudar nos experimentos, nas

culturas de células, nas compras de reagentes. Obrigada por tudo, principalmente pela

amizade nos últimos tempos.

A Débora (Deb), você conseguiu tirar meu posto de pequininha do laboratório... É,

realmente esse posto tem muito mais sua cara do que a minha. Mas fico muito feliz por isso,

pois estou tendo a oportunidade de conhecer a cada dia mais essa pessoa meiga e sempre

prestativa que você é.

viii

Ao Eli (papai), por todo carinho e cuidado que teve e continua tendo por mim, mesmo

não trabalhando mais juntos. Obrigada também pelas ajudas no MET.

Ao Rodrigo, que quando estava defendendo sua dissertação de mestrado disse que era

para eu deixar de trabalhar com Giardia e passar a trabalhar com Trichomonas que era muito

mais legal. Acho que isso ficou no meu subconsciente. Pois bem, não foi escolha minha, mas

os caminhos me levaram a trabalhar com Trichomonas e estou muito feliz. Obrigada também

pelo carinho, atenção e pela ajuda que você me deu durante as visualizações no Multifoton,

que apesar de não terem sido para este trabalho, ajudaram a responder perguntas de um

trabalho desenvolvido paralelamente.

Ao Fabio, por me compreender e me dar razão em alguns momentos... Hum!!!! Será

porque somos muito parecidos... Taurinos!!!! Fome sempre!!! rsrsrs Obrigada pelo

companheirismo da época de faculdade e pela amizade fora dela.

A Karine, minha amiga de infância, às vezes cabeça dura demais, mas adoro esse seu

jeito. Finge que é durona nos momentos difíceis e sempre vê o que tem de melhor em cada

situação. Com certeza sem você na minha vida, ela teria muito mesmo graça.

A equipe do Museu Espaço Ciência Viva, principalmente ao Pedro Persechini,

Eleonora Kurtenbach, Robson Coutinho, Dona Lurdes e Gustavo Rubini e Sônia, por me

ensinarem que existe outro jeito de ensinar bem diferente das tradicionais salas de aula.

Aprendi muito com vocês. A motivação de vocês em ver esse museu crescer e dar certo é

contagiante. Obrigado por torcerem por mim.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Prof. Marlene Benchimol, primeiramente pela oportunidade que a senhora me deu

de poder crescer profissionalmente, me aceitando para fazer parte da sua equipe. Pela

confiança que depositou em mim e pelo carinho praticamente de mãe que tem demonstrado

durante esses 5 anos que estamos trabalhando juntas. Por me tranqüilizar no momento difícil

que passei, por todas as conversas e broncas também, que mesmo sendo poucas me fizeram

refletir e contribuíram para o meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada pela senhora

ser este exemplo de seriedade e dedicação.

A Prof. Lina Zingali, por aceitar que desenvolvêssemos parte deste trabalho na UEMP,

pela oportunidade de aprendizado das técnicas bioquímicas e proteômicas. Por vibrar conosco

a cada resultado obtido e pelas ótimas sugestões para a otimização de nossos resultados.

Ao Rafael, meu anjo protetor que tem estado todo tempo ao meu lado me ajudando e

cuidando de mim, literalmente segurando em minhas mãos nos momentos difíceis. Pessoa

especial, dedicada, carinhosa e amiga, você trouxe alegria a minha vida em um momento em

estava precisando. Simplesmente obrigada por você ser quem você é.

Sei que meu trabalho é uma gota no

oceano. Mas sem ele, o oceano seria

menor... (Madre Teresa de Calcutá)

ÍNDICE

Dedicatória v

Agradecimentos vi

Epígrafo x

Indice xi

Publicações xiii

Resumo xiv

Abstract xv

Abreviaturas xvi

1. INTRODUÇÃO

1.1 Tritrichomonas foetus e Tricomonoses 1

1.1.1 Tricomonose felina 1

1.1.2. Tricomonose suína 1

1.1.3 Tricomonose canina 2

1.1.4 Tricomonose bovina 2

1.1.5 Tritrichomonas foetus em humanos 4

1.1.6 Ultraestrutura Celular 5

1.1.6.1 Superfície Celular 5

1.1.6.2 Citoesqueleto 6

1.1.6.2.1 Complexo Pelta-Axóstilo 7

1.1.6.2.2 Filamentos Parabasais 8

1.1.6.2.3 Corpúsculos Basais e Filamentos Associados 9

1.1.6.2.4 Flagelos 10

1.1.6.3 Vacúolos e Lisossomos 10

1.1.6.4 Hidrogenossomos 11

1.1.6.5 Núcleo e Divisão 13

1.1.6.6 Retículo Endoplasmático 14

1.1.6.7 Complexo de Golgi 15

1.1.6.7.1 Organização Estrutural 15

1.1.6.7.2 Funções 16

1.1.6.7.3 Complexo de Golgi em tricomonadídeos 18

1.2. Justificativa 22

xii

1.2.1 Objetivo Geral 22

1.2.2 Objetivos Específicos 22

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Cultivo in vitro 23

2.2 Fracionamento Subcelular 23

2.3 Produção de Anticorpos Monoclonais 25

2.4 C

-NBD-Ceramida 29

2.5 Imunofluorescência 29

2.6 Microscopia Eletrônica de Transmissão 30

2.6.1 Resina Hidrofílica – Unicryl e LR-White 30

2.6.2 Resina Hidrofóbica – Epon 31

2.7 Técnicas Proteômicas 32

2.8 Dosagem de Proteínas – Método de Lowry e Peterson 33

2.9 Imunoprecipitação 34

2.10 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) 34

2.11 Revelação do Gel 35

2.11.1 Coomassie G-250 35

2.11.2 Impregnação pela prata 36

2.12 Immunobloting 36

2.13 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF e MALDI-TOF/TOF) 37

3. RESULTADOS

3.1 Fracionamento Subcelular 39

3.2 Caracterizações morfológicas da fração do complexo de Golgi 39

3.3 Obtenção de anticorpos monoclonais 42

3.4 Imunofluorescência 67

3.5. Imunocitoquímica 79

3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida 89

3.7 Immunoblotting 89

3.8 Imunoprecipitação 89

3.9 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF/TOF) 96

4. DISCUSSÃO

100

5. CONCLUSÕES

105

6. REFERÊNCIAS

106

xiii

! Os resultados desta dissertação encontram-se no seguinte manuscrito em preparação:

DE ANDRADE ROSA, I., CARUSO, M. B., MORGADO-DÍAZ, J. A., ZINGALLI, R. B.,

BENCHIMOL, M. Characterization of 60 kDa and 66 kDa proteins of Golgi complex of

Tritrichomonas foetus.

! Os resultados desta dissertação foram apresentados na forma de pôster no seguinte

congresso:

ROSA, I. A. CARUSO, M. B., MORGADO-DÍAZ, J.A., ZINGALI, R. B., BENCHIMOL.

M. Identification and characterization of a Golgi complex protein of Tritrichomonas foetus.

Simpósio de Microscopia no Cerrado realizado entre os dias 24 a 26 de novembro de 2008 no

Centro de Convenções da Pousada Pirineus em Pirinópolis, GO.

! Durante o desenvolvimento desta dissertação também participei dos seguintes

trabalhos:

BENCHIMOL, M., DE ANDRADE ROSA, I., DA SILVA FONTES, R., BURLA DIAS, A.

J. Trichomonas adhere and phagocytose sperm cells: adhesion seems to be a prominent stage

during interaction. Parasitol Res. 2008.102(4):597-604.

ROSA, I. DE A., EINICKER-LAMAS, M., BERNARDO, R. R., BENCHIMOL, M.

Cardiolipin, a lipid found in mitochondria, hydrogenosomes and bacteria was not detected in

Giardia lamblia. Exp Parasitol. 2008. 120(3):215-20.

xiv

RESUMO

Tritrichomonas foetus é um parasita do trato urogenital de gado bovino causando

inúmeros problemas de saúde como infertilidade, aborto e infecções. Sabe-se atualmente que

também pode infectar outros animais como: gatos, cães e porcos. Como todos os membros da

Família Trichomonadidae, T. foetus apresenta diversas organelas peculiares como a costa,

axóstilo, pelta, hidrogenossomos e filamentos parabasais, entre outros. Possui um aparelho

Parabasal muito desenvolvido formado pelo complexo de Golgi e filamentos parabasais,

indicando um papel significativo, análogo ao já descrito em outras células, embora pouco se

saiba a respeito da composição de proteínas residentes desta organela em T. foetus. Portanto,

procedemos à purificação do complexo de Golgi de T. foetus e a geração de anticorpos

monoclonais anti-Golgi que levaram ao isolamento de proteínas de 60 e 66 kDa. Utilizamos

diversos testes como: imunofluorescência, microscopia eletrônica de transmissão,

imunoprecipitação, eletroforese, entre outros, para a caracterização destas proteínas. Por

imunocitoquímica, verificamos que, em T. foetus, estas proteínas estão presentes no Golgi,

com uma distribuição específica e em algumas vesículas. O anticorpo monoclonal 20.3

quando testado em controles como Leishmania e Trypanosoma cruzi resultou em uma

marcação perinuclear, enquanto que em células da linhagem MDCK, a localização foi

observada no complexo de Golgi, indicando a conservação destas proteínas. Devido à falta de

banco de dados de T. foetus utilizamos banco de dados de T. vaginalis, por se tratar do

organismo mais próximo filogeneticamente. Usando técnicas proteômicas foi possível

identificar seis proteínas ainda não caracterizadas, repetições de anquirina e a reigião N-

terminal da adaptina os quais mostraram homologia com seqüências de aminoácidos da

proteína caracterizada pelo anticorpo anti-Golgi. Entretanto, outras metodologias como: a

derivatização da proteína, o seqüenciamento manual e a análise por Q-TOF ainda são

necessárias para a confirmação dos dados obtidos por espectrometria de massa do tipo

MALDI-TOF/TOF.

ABSTRACT

Tritrichomonas foetus is a parasite of the urogenital tract of cattle causing numerous

health problems such as infertility, miscarriage and infection. Currently, T. foetus is

recognized as a parasite that can also infect other animals such as cats, dogs and pigs. Like

all members of the Family Trichomonadidae, T. foetus presents several unique organelles

such as the costa, axostyle-pelta complex, hydrogenosomes and parabasal filaments,

among others. The well developed parabasal apparatus formed by Golgi complex and the

parabasal filament, indicates a significant role, similar to that previously described in

other cells, although little is known about the resident-protein composition of this

organelle. Therefore, we proceeded to the purification of the Golgi complex of T. foetus

and the generation of anti-Golgi monoclonal antibody that led to the isolation of proteins

of 60 and 66 kDa. We have used tests such as immunofluorescence, transmission electron

microscopy, immunoprecipitation, SDS-PAGE, among others, to characterize these

proteins. By immunocytochemistry, we found that these proteins are present in the Golgi

of T. foetus, with a specific distribution on it and also in some vesicles. The monoclonal

antibody 20.3 was also used in controls such as Leishmania and Trypanosoma cruzi and

resulted in a perinuclear labeling, whereas in the MDCK cell line, the location was

observed in the Golgi complex, indicating the conservation of these proteins. Due to lack

of database of T. foetus, we have used the database of T. vaginalis, since it is the

phylogenetically closer organism. Using proteomics techniques, it was possible to identify

six uncharacterized proteins, ankyrin repeat protein and adaptin N-terminal region and

which showed homology with amino acids sequences of proteins isolated by the presently

studied antibody anti-Golgi. However, other methodologies such as the derivatization of

the protein, the manual sequencing and analysis by Q-TOF are still needed to confirm the

data obtained by mass spectrometry of type MALDI-TOF/TOF.

xvi

xvii

ABREVIAÇÕES

BSA albumina sérica bovina

cdg Camundongo

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO Dimetilsulfóxido

DTT Ditiotreitol

FG Fração do Golgi

GTP Guanosina trifosfato

HAT Hipoxantina, Aminopterina e Timidina

HGPRT Hypoxantina Guanina Fosforibosil Transferase

HT Hipoxantina e Timidina

IAA Iodoacetamida

IP Imunoprecipitação

MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization

MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells

MS Mass spectrometry

NCBInr National Center for Biotechnology não redundante

PEG Polietilenoglicol

PNS Sobrenadante pós nuclear

Q-TOF Quadrupole time-of-flight

TTP Timidina trifosfato

TCA Ácido tricloroacético

TOF Time-of-flight mass spectrometer

1. INTRODUÇÃO

1.1 TRITRICHOMONAS FOETUS E TRICOMONOSES

Tritrichomonas foetus é um protozoário descrito inicialmente como um parasito do

sistema reprodutor bovino. Atualmente, os microrganismos desta espécie têm sido

encontrados também no sistema digestivo de gatos, cães e porcos.

1.1.1 Tricomonose felina

A tricomonose felina é uma doença caracterizada por afetar o intestino grosso de

gatos, principalmente de gatos jovens e filhotes (FOSTER et al., 2004; GOOKIN et al., 2001;

LEVY et al., 2003). Este tipo de tricomonose pode apresentar como sinais clínicos diarréia

crônica associada com sangue e/ou muco, flatulência e irritação anal (FOSTER et al., 2004;

STOCKDALE et al., 2006). Porém, muitos gatos infectados só apresentam o quadro de

diarréia semanas ou meses após a infecção, conseqüentemente, estes animais apresentam

problemas na eliminação do parasito, não tendo uma cura espontânea (STOCKDALE et al.,

2008).

1.1.2 Tricomonose suína

Em suínos, T. foetus foi descrito inicialmente como outra espécie de Trichomonas,

chamada de Tritrichomonas suis. Embora apresentassem hospedeiros diferentes, estudos têm

descrito T. foetus e T. suis como sendo a mesma espécie, por serem idênticos

morfologicamente. Além disso, evidências de estudos de microscopia eletrônica de

transmissão, cultura in vitro, ensaios bioquímicos e imunológicos têm demonstrado que estes

dois tricomonadídeos podem realmente se tratar da mesma espécie (MATTOS et al., 1997;

LUN et al., 2005; RIVERA et al., 2008). Este protozoário é comumente encontrado na

cavidade nasal, estômago, ceco, cólon e ocasionalmente no intestino delgado de porcos (LUN

et al., 2005). Porém, nestes animais T. foetus é um protozoário comensal e devido a isto não

há relatado de sinais clínicos em porcos infectados (TACHEZY et al., 2002).

1.1.3 Tricomonose canina

A descrição de tricomonadídeos em fezes de caninos com diarréia já foi relatada com

base em caracterizações morfológicas. As infecções causadas por estes organismos eram

classificadas como oportunistas ocasionadas por Pentatrichomonas hominis. No entanto, a

caracterização molecular desses tricomonadídeos só foi descrita recentemente através da

análise gênica das seqüências de rRNA, revelando assim, a identidade dos tricomonadídeos

observados nas fezes de cães com diarréia. Com base nesse estudo, os tricomonadídeos

encontrados apresentaram 100% de identidade com Tritrichomonas foetus ou P. hominis

(GOOKIN, et al., 2005).

1.1.4 Tricomonose bovina

Em bovinos, T. foetus é descrito como o agente causador da tricomonose urogenital,

uma doença sexualmente transmissível (DST) (HONIGBERG, 1978). Trata-se de um parasito

monogenético, capaz de habitar o trato reprodutivo bovino incluindo regiões como o

prepúcio, a região distal do pênis, vagina e útero (HONIGBERG, 1978). A tricomonose

urogenital bovina é transmitida através da monta ou do uso de sêmen contaminado, levando a

um grande prejuízo econômico (HONIGBERG, 1978; ALSTAD et al., 1984; BONDURANT,

1985).

O ciclo celular de T. foetus in vitro foi estimado em seis horas (RIBEIRO, 1997), onde

os trofozoítos se multiplicam por divisão binária longitudinal, através de uma mitose do tipo

fechada com fuso extranuclear (HEATH, 1980; CAVALIER-SMITH & CHAO, 1996;

DACKS & REDFIELDS, 1998; RIBEIRO et al., 2000).

Estudos filogenéticos realizados ao nível molecular utilizando a subunidade menor do

RNA ribossomal, foram utilizados para classificar esse organismo como sendo um dos

eucariotos mais primitivos (LEIPE et al., 1993; VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1993;

VISCOGLIOSI et al., 1999). Desta forma, foi enquadrado com a seguinte classificação

taxonômica:

Filo Parabasalia

Classe Zoomastigophorea

Ordem Trichomonadida

Família Trichomonadidae

Gênero Trichomonas

Espécie Tritrichomonas foetus

A tricomonose urogenital bovina ainda é pouco estudada devido a algumas

dificuldades encontradas, entre elas, o custo de se manter animais experimentais, ausência de

modelos de laboratório confiáveis e a ausência de linhagens celulares que possam reproduzir

características do tecido ou órgão.

Células epiteliais e também não epiteliais tais como:

células epiteliais humanas (WISH) e células de rim de cachorro (MDCK) têm sido

empregadas nos estudos de interação entre tricomonas e células hospedeiras (ALDERETE &

PEARLMAN, 1984; KRIEGER et al., 1985, RASMUESSEN et al., 1986; SILVA FILHO &

DE SOUZA, 1988).

A adesão de tricomonadídeos, assim como em outros processos de interação célula-

célula, é um fenômeno muito complexo precedido pela etapa de reconhecimento celular. A

adesina TF190 (SHAIA et al., 1998) demonstrou ter capacidade de reconhecimento de

moléculas de células hospedeiras, favorecendo assim a citoaderência do parasito. Ainda pouco

se sabe sobre os componentes das células epiteliais envolvidos no processo de

reconhecimento pelos tricomonadídeos. Porém, alguns glicoconjugados de domínios apicais

de MCDK-I são candidatos, principalmente em interações com T. foetus (BONILHA et al.,

1995). Lectinas presentes na superfície dos trichomonadideos também parecem apresentar

uma grande importância no reconhecimento de células epiteliais (BABÁL & RUSSEL, 1999).

O mecanismo pelo qual o parasito provoca alterações às células hospedeiras ainda não

é totalmente compreendido. Entretanto, foi sugerido que citotoxinas solúveis, principalmente

cisteíno-proteases liberadas pelo parasito possam ter um papel importante no efeito citotóxico

nas células hospedeiras e na infecção (ARROYO & ALDERETE, 1995; THOMFORD et al.,

1996; PETRIN et al., 1998; MENDONZA-LOPEZ et al., 2000; QUE & REED, 2000; SAJID

& MCKERROW, 2002). Além disso, essas citotoxinas também podem agir como fatores de

virulência (ARROYO & ALDERETE, 1989; NEALE & ALDERETE, 1990; ARROYO &

ALDERETE, 1995; MALLINSON et al., 1994; MALLINSON et al., 1995; THOMFORD et

al., 1996), como fatores de adesão (CROUCH & ALDERETE, 1999; MENDONZA-LOPEZ

et al., 2000; ALVAREZ-SANCHEZ et al., 2000) e ainda como fatores que contribuem para a

patogenicidade quando liberado na superfície da mucosa hospedeira (TALBOT et al., 1991;

BASTIDA-CORCUERA et al., 2000).

Estudos recentes foram capazes de demonstrar a destruição de células epiteliais

vaginais bovinas quando em interação de T. foetus (SINGH et al., 1999). Este dano causado

às células epiteliais seria provocado pela indução de apoptose que pode ser causada por

cisteíno-protease de 30kDa (SINGH et al., 2004).

1.1.5 Tritrichomonas foetus em humanos

Recentemente, a identificação de algumas espécies de tricomonadídeos feita em

pulmões de humanos foi realizada através de estudos imunológicos e moleculares. Os

resultados apontaram reações positivas para T. vaginalis (DUBOUCHER et al., 2003), P.

hominis (JONGWUTIWES et al., 2000), T. tenax (MALLAT, et al., 2004), T. gallinarum

(KUTISOVA et al., 2005) e T. foetus (DUBOUCHER et al.,2006). A identificação desses

dois últimos protozoários cria dúvidas a respeito do potencial zoonótico dos tricomonadídeos,

embora a possibilidade de cepas adaptadas aos humanos não possa ser excluída. A presença

de tricomonadídeos no trato respiratório de humanos não é incomum e faz com que a real

freqüência destes microrganismos no pulmão seja questionada (DUBOUCHER et al., 2008).

A presença de tricomonadídeos como um agente coinfectante foi relata em 60% dos

pacientes com pneumonia causada por Pneumocystis jiroveci. Em casos em que a doença é

provocada por fungos essa porcentagem pode atingir 100%. Este fato pode ocorrer devido ao

ambiente propício criado pela obstrução dos alvéolos, por fungos ou por debris celulares,

gerando um local de hipóxia. Isso leva a crer que a hipóxia alveolar seja um fator que

favoreça o desenvolvimento de tricomonadídeos mais do que a imunodepressão

(DUBOUCHER et al., 2008).

1.1.6 Ultraestrutura Celular

1.1.6.1 Superfície Celular

A superfície celular compreende a membrana plasmática da célula e o glicocálice, ou

seja, a bicamada lipídica com proteínas integrais, periféricas e/ou ancoradas e os carboidratos,

associados covalentemente a proteínas ou lipídeos do lado externo da membrana, formando

glicoproteínas e glicolipídeos, respectivamente (ALBERTS et al., 2004).

A membrana plasmática de T. foetus apresenta três regiões fisiologicamente distintas:

a membrana que recobre o corpo do parasito, a membrana ondulante e os flagelos. A região

que recobre o corpo do parasito apresenta um glicocálice bastante desenvolvido, apresentando

um aspecto ondulado, quando visto por criofratura (BENCHIMOL, et al., 1992).

Na região flagelar é possível verificar áreas de especialização bem definidas, como a

membrana que reveste os flagelos. Esta possui uma menor densidade de partículas

intramembranosas quando observadas por criofratura, quando comparada com a membrana do

corpo da célula. Estas partículas tratam-se de proteínas integrais, as quais teriam a função de

conectar o citoesqueleto com a organização do axonema (BENCHIMOL et al., 1992). Na

membrana dos flagelos anteriores observam-se arranjos circulares de partículas

intramembranosas, formando rosetas, que poderiam ter funções sensoriais (BENCHIMOL et

al., 1992). Outra região especializada é o colar ciliar ou necklace, observada na região de

onde emergem os flagelos anteriores. Entretanto, sua função ainda é desconhecida

(BENCHIMOL et al., 1992).

A membrana ondulante, que liga o flagelo recorrente ao corpo do parasito, acompanha

o batimento deste flagelo, sugerindo que deva atuar dissipando as vibrações causadas pela

força propulsora. Concentrado nesta membrana encontra-se uma extensa trama de filamentos

estáveis do citoesqueleto deste organismo (GERMOT et al., 1996).

1.1.6.2 Citoesqueleto

Os tricomonadídeos apresentam um citoesqueleto (FIGs. 1 e 2) formado

principalmente pelo complexo pelta-axóstilo, a costa, os filamentos parabasais, os corpúsculos

basais e filamentos associados, os filamentos sigmóides, o corpo infra e supra-cinetosomal.

Entretanto, ainda não se tem descrito a funcionalidade das duas últimas estruturas citadas.

Figura 1. Esquema de Tritrichomonas foetus mostrando as principais estruturas: FA: flagelos

anteriores; A: axóstilo; CB: corpúsculo basal; C: costa; RE retículo endoplasmático; G: Golgi; H:

hidrogenossomos; L: lisossomos; N: núcleo; Nu: nucléolo; P: pelta; FP: filamento parabasal; FR:

flagelo recorrente; MO: membrana ondulante; V: vacúolo; Gl: glicogênio (Retirado de

BENCHIMOL, 2004).

1.1.6.2.1 Complexo Pelta-axóstilo

O complexo pelta-axóstilo é uma estrutura formada por microtúbulos estáveis

(RIBEIRO et al., 2000), embora alguns trabalhos admitam que essas estruturas se

despolimerizem (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994). Além disso, o complexo pelta-

axóstilo possui uma participação importante no processo de divisão celular, promovendo a

constrição do núcleo na etapa de cariocinese (RIBEIRO et al., 2000).

O axóstilo consiste em uma fita disposta longitudinalmente desde a porção anterior

até o final da porção posterior da célula, onde esta estrutura empurra a membrana plasmática

(BENCHIMOL et al., 2000). A pelta (FIG. 1, P), também formada por microtúbulos está

localizada na porção anterior da célula. Esta estrutura parece desempenhar o papel de

sustentação da parede do canal periflagelar, do qual os flagelos emergem.

1.1.6.2.2 Filamentos Parabasais

Os filamentos parabasais (FIGs. 1 e 2, FPs) estão presentes em todos os

tricomonadídeos e são encontrados próximos à face Cis do complexo de Golgi

(HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). São estruturas formadas por polímeros que

possuem uma periodicidade com bandas claras e escuras alternadas, apresentando assim, um

aspecto de fibra estriada (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994). A associação destes

filamentos com o complexo de Golgi forma o aparelho parabasal (HONIGBERG &

BRUGEROLLE, 1990). Além disso, verificou-se uma conexão estrutural entre a primeira

cisterna do complexo de Golgi e esta estrutura periódica, sugerindo um papel funcional desses

filamentos na migração do Golgi, junto com os corpúsculos basais e os flagelos, durante a

mitose (BENCHIMOL et al., 2001).

Figura 2. Esquema da região anterior de T. foetus mostrando a proximidade do complexo de Golgi

(G) com os filamentos parabasais (FP

e FP

), além de estruturas de citoesqueleto como: Costa (C);

Corpúsculos Basais (CB

,CB

e CB

); Corpo supra-cinetosomal (CS); Flagelo recorrente (FR);

Membrana Ondulante (MO). (MARLENE BENCHIMOL, não publicado)

1.1.6.2.3 Corpúsculos Basais e Filamentos Associados

Os corpúsculos basais (FIGs. 1 e 2, CBs) são estruturas das quais se originam os

flagelos e estão localizados na região anterior da célula (HONIGBERG et al., 1971). Estas

estruturas encontram-se associadas a filamentos que podem ser contráteis, como as fibras de

centrina ou não contrátil como é o caso da costa (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994;

BRUGEROLLE et al., 2000). Muitos outros filamentos associados aos corpúsculos basais

estão dispostos em lamelas em forma de ganchos.

A costa é uma estrutura protéica estriada, que se estende da região do corpúsculo basal

do flagelo recorrente até a região posterior do parasito (BENCHIMOL et al., 1993). Está

presente somente nos tricomonadídeos que possuem membrana ondulante. Devido a isto,

acredita-se que sua função esteja relacionada com o suporte do estresse mecânico e a

sustentação da mesma (HONIGBERG et al., 1971).

1.1.6.2.4 Flagelos

Os flagelos dos tricomonadídeos apresentam variações quanto ao número dentre as

diferentes espécies desse grupo. T. foetus possui três flagelos anteriores (FIG. 1, FA) e um

recorrente (FIGs. 1 e 2, FR). Os flagelos anteriores emergem da célula pelo canal flagelar,

enquanto o flagelo recorrente surge da abertura latero-dorsal deste canal (WARTON &

HONIGBERG, 1979; BENCHIMOL, 2004).

1.1.6.3 Vacúolos e Lisossomos

A capacidade endocítica de T. foetus vem sendo investigada com o uso de diversos

marcadores como Lucifer yellow, peroxidase e proteínas conjugadas com partículas de ouro

(albumina, lactoferrina, transferrina, lectinas) (BENCHIMOL et al., 1986, 1990; AFFONSO

et al., 1994, 1997).

Duas vias endocíticas, uma mediada por receptores e outra de fase fluida, foram

caracterizadas em T. foetus através da ligação específica e da internalização da lactoferrina

(BRUGEROLLE, 1971; PETERSON & ALDERETE, 1984; AFFONSO, et al., 1997). Por

outro lado, a fagocitose em T. foetus tem sido estudada através da interação deste parasito

com outras células como hemácias (DE CARLI et al., 2004) e espermatozóides

(BENCHIMOL et al., 2007). Nestes trabalhos, T. foetus mostrou ser capaz de estabelecer a

adesão com estas células e posteriormente internalizá-las.

Os lisossomos (FIG. 1, L) em tricomonadídeos estão presentes como grandes

compartimentos citoplasmáticos, os quais participam da atividade endocítica, e demonstram

reação positiva em ensaios citoquímicos para fosfatase ácida (BENCHIMOL, 1999). Apesar

de não existir uma região preferencial para a ocorrência da endocitose, os lisossomos e

fagolisossomos encontram-se localizados predominantemente na região posterior dos

tricomonadídeos (AFFONSO et al., 1994, 1997; BENCHIMOL & DE SOUZA, 1995).

1.1.6.4 Hidrogenossomos

Os tricomonadídeos são organismos que não apresentam mitocôndrias, porém

apresentam organelas chamadas hidrogenossomos (FIGs.1, 3a, H), responsáveis pelo

metabolismo energético destes organismos. Esta organela foi descrita em T. foetus como um

compartimento subcelular capaz de produzir hidrogênio molecular e ATP (LINDMARK &

MÜLLER, 1973).

Os hidrogenossomos encontram-se geralmente associados a grânulos de glicogênio e a

estruturas do citoesqueleto, como o axóstilo e a costa (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1983;

BENCHIMOL et al., 1996; BENCHIMOL et al., 2000). A associação dos hidrogenossomos

com o retículo endoplasmático também já foi reportada, o que poderia ser um indício de

fornecimento de lipídios para o crescimento dos hidrogenossomos (BENCHIMOL et al.,

1996; BENCHIMOL et al., 2000). A proximidade dos hidrogenossomos com outras estruturas

celulares poderia estar relacionada ao fornecimento de ATP, tal como ocorrem com a

associação já descrita entre mitocôndrias e microtúbulos em células de eucariotos superiores

(HEGGENESS et al., 1978).

Alguns autores consideram esta organela como uma variação das mitocôndrias que se

adaptaram a vida anaeróbica (BIAGINI et al., 1997; EMBLEY et al., 2003).

Entre as semelhanças já apresentadas pode-se destacar a participação na produção de

ATP pela degradação do piruvato (LINDMARK & MÜLLER, 1973; MÜLLER, 1993, BUI et

al., 1996), assumindo o papel energético tanto nas mitocôndrias quanto nos hidrogenossomos

e a presença da dupla membrana (BENCHIMOL et al., 1982b), aproximando estas duas

organelas em relação à mesma origem evolutiva. Além disso, a divisão dos hidrogenossomos

pode ocorrer por partição ou por segmentação, assim como nas mitocôndrias. Na partição, a

divisão se inicia com uma invaginação da membrana interna do hidrogenossomo, formando

um septo transversal que separa a matriz da organela em dois compartimentos. Já no processo

de segmentação ocorre primeiro o alongamento da organela e a formação de uma constrição

na sua porção central (BENCHIMOL et al., 1996). Recentemente, outras semelhanças foram

identificadas, tais como: a presença de translocases na membrana interna dos

hidrogenossomos de tricomonadídeos (SUTAK et al., 2004), a presença de centros de Fe-S

(Centros de ferro e enxofre, DOLEZAL et al., 2005) semelhantes aos mitocondriais e a

presença de cardiolipina (DE ANDRADE ROSA et al., 2006), fosfolipídio típico de

membranas bacterianas e da membrana mitocondrial interna.

Entretanto, os hidrogenossomos e as mitocôndrias diferem em alguns aspectos. Ainda

não foram descritas em hidrogenossomos a presença de citocromos e nem a atividade de F

-F

ATPase (LLOYD et al., 1979). A presença de um material genético apesar de ter sido

sugerida inicialmente (CERKASOVOVÁ et al., 1976), não foi identificada por técnicas de

fluorescência (TURNER & MULLER, 1983) ou de nick-translation (CLEMENS &

JOHNSON, 2000), sugerindo que, possivelmente, tenha ocorrido uma evasão total para o

compartimento nuclear (JOHNSON et al., 1993).

Porém, a origem dos hidrogenossomos ainda é um assunto de grande debate, sendo

que no momento os autores apresentam duas vertentes. A primeira defende que os

hidrogenossomos teriam surgido a partir de um ancestral mitocondrial de metabolismo

aeróbico, o qual utilizava o oxigênio como aceptor final enquanto a outra sugere que essa

organela funcionava em condições anaeróbicas e, consequentemente produziam hidrogênio,

como ocorre com os hidrogenossomos (TJADEN et al., 2004). Com isso, inúmeros estudos

têm sido desenvolvidos com o intuito de procurar semelhanças entre os hidrogenossomos e as

mitocôndrias, tanto ao nível bioquímico, molecular, quanto ao nível ultraestrutural.

1.1.6.5 Núcleo e Divisão

Os tricomonadídeos quando não estão em processo de divisão apresentam um único

núcleo (FIGs. 1, 3a, N) localizado preferencialmente na região anterior da célula. O envoltório

nuclear é formado por duas membranas, as quais apresentam complexos dos poros

característicos (BENCHIMOL et al., 1982a). A matriz nuclear possui filamentos organizados

diferentes dos filamentos presentes em outros organismos, onde a região abaixo do envoltório

nuclear apresenta uma malha mais frouxa que a região central (RIBEIRO, 1997).

Estes protozoários apresentam um tipo diferente de divisão, chamada de mitose

fechada. A mitose dos tricomonadídeos é caracterizada por não apresentar fragmentação do

envoltório nuclear e pela presença de um fuso extranuclear, o qual, aparentemente, não

estabelece contato direto com os cromossomos (BRUGEROLLE et al., 1974). Segundo

Ribeiro e colaborados (2000), T. foetus possui seis fases distintas da mitose. (1) A intérfase

(G1), onde o parasito apresenta aspecto pirifome e estruturas ainda não duplicadas; (2) a pré-

mitose (S/G2) que compreende a etapa em que todas as estruturas de citoesqueleto e o

material genético são duplicados. O complexo pelta-axóstilo não desaparece durante a mitose,

pois tem um papel fundamental na mudança de forma da célula e na cariocinese; (3) na

prófase, ocorre um aumento de volume da célula; (4) a metáfase é caracterizada pela migração

dos corpúsculos basais para pólos opostos na célula, fazendo com que ocorra a migração dos

flagelos e dos complexos pelta-axóstilo. Devido à migração destas estruturas, o protozoário

assume uma forma triangular. A formação da placa metafásica não foi observada até o

momento, permanecendo uma incógnita sobre o que acarretaria a segregação dos

cromossomos; (5) na transição metáfase-anáfase o batimento dos flagelos auxilia no

deslocamento dos axóstilos para sentidos opostos, posicionados de forma cruzada no interior

da célula. Desta forma, seria possível promover a torção da mesma e o estrangulamento do

núcleo, acarretando a citocinese; (6) a transição anáfase-telófase: é a etapa em que ocorre o

afastamento dos núcleos e a separação das duas células-filhas.

1.1.6.6 Retículo Endoplasmático

O retículo endoplasmático de tricomonadídeos é normalmente visualizado ao redor do

núcleo formando a membrana externa do envoltório nuclear (QUEIROZ et al., 1991). Esta

organela pode ser encontrada também próxima aos hidrogenossomos (HONIGBERG, 1978;

BENCHIMOL et al., 1996, 2000), e ao axóstilo (BENCHIMOL et al., 2000). Os ribossomos

podem ser visualizados aderidos à membrana do retículo endoplasmático, formando o retículo

endoplasmático rugoso, ou livres no citoplasma (BENCHIMOL et al., 2001) (FIG. 3b).

Evidências têm demonstrado a sua participação também em processos de autofagia e

seqüestro de cálcio (BENCHIMOL et al., 1996; BENCHIMOL, 1999; DE SOUZA &

BENCHIMOL, 1988).

Durante a mitose dos tricomonadídeos, o retículo endoplasmático se alinha de modo

paralelo com os microtúbulos do fuso mitótico, sugerindo um recurso de fornecimento de

cálcio para a divisão celular do parasito (RIBEIRO et al., 2002).

1.1.6.7 Complexo de Golgi

1.1.6.7.1 Organização Estrutural

O complexo de Golgi é dotado de uma polaridade por possuir em cada pilha duas

faces distintas: uma face cis, também conhecida como face de entrada e uma face trans ou

face de saída. Ambas as faces apresentam-se intimamente associadas a compartimentos

especiais, compostos por uma rede interconectada de estruturas tubulares e de cisternas. Por

sua vez, as cisternas são agrupadas de acordo com a localização, morfologia e composição

química. Assim, as cisternas mais próximas do retículo endoplasmático (RE) e de

conformação convexa são denominadas cisternas cis, as posicionadas na região central do

Golgi são as cisternas médias e as mais côncavas e próximas do sítio de saída da célula, são

chamadas de cisternas trans (FIG. 3).

Além disso, existem compartimentos formados por estruturas membranosas tubulares

conectadas ou por vesículas, denominados rede Golgi cis (CGN) e rede Golgi trans (TGN). A

rede Golgi cis, também chamada de compartimento intermediário entre RE e Golgi (ERGIC)

está localizado entre o retículo endoplasmático (RE) e o sítio de entrada do Golgi. É a face de

entrada do Golgi, que recebe as proteínas recém sintetizadas do RE e as transporta para a

cisterna cis (DEAN & PELHAM, 1990; SEMENZA et al., 1990). Por outro lado, o TGN

segue as cisternas TRANS sendo o sítio de saída de sustâncias para outros compartimentos da

célula ou do meio extracelular (BERTACHINI-LOMBELLO et al., 2001).

As membranas dos diferentes compartimentos do complexo de Golgi diferem quanto a

sua composição lipídica e proteica. Entre as proteínas presentes no Golgi são encontradas

principalmente enzimas, proteínas estruturais e proteínas envolvidas na formação e

direcionamento de vesículas. Devido a esta diferença de conteúdo enzimático é possível

destacar algumas enzimas que são tidas como marcadoras por serem específicas de um

determinado compartimento (TEASDALE & JACKSON, 1996).

Figura 3. Esquema tridimensional do Complexo de Golgi mostrando os sub- compartimentos desta

organela. A face cis corresponde a região mais próxima do retículo endoplasmático e a face trans a

mais próxima da membrana plasmática (Adaptado de ALBETS et al. 2004).

1.1.6.7.2 Funções

O Complexo de Golgi é responsável por desenvolver importantes funções celulares,

tais como: (1) é um dos principais sítios de síntese de carboidratos, produzindo a maioria dos

polissacarídeos celulares. Além disso, sua posição na saída da rota do RE facilita a adição de

oligossacarídeos são adicionados como cadeias laterais em proteínas e lipídeos enviados pelo

RE; (2) é uma estação de classificação e endereçamento dos produtos sintetizados no retículo

endoplasmático, direcionando para a membrana plasmática ou para outras organelas; (3)

biogênese dos lisossomos; (4) acúmulo de cálcio (ALBERTS et al., 2004).

A adição de açúcares a proteínas e lipídeos durante o processo de glicosilação é de

extrema importância, pois é sabido que a presença de açúcares confere uma menor

flexibilidade e carga negativa, fundamental para a estrutura quartenária das proteínas. Além

disso, este processo é fundamental para dificultar a ação de enzimas proteolíticas (JENTOFT,

1990). A glicosilação do tipo N é iniciada no RE com a adição de uma cadeia de 14

oligossacarídeos que são transferidos em bloco único a um resíduo de asparagina. Esse

processo tem continuidade no Golgi com o objetivo de diferenciar as porções glicídicas das

diferentes glicoproteínas (ALBERTS et al., 2004). A glicosilação de oligossacarídeos O-

ligados também ocorre nesta organela, porém neste caso, os açúcares são adicionados um a

um a um radical OH lateral de um aminoácido serina ou treonina (JENTOFT, 1990).

As modificações protéicas ocorrem nos diferentes compartimentos do Golgi através do

transporte vesicular. Para isso, existem proteínas que auxiliam no direcionamento deste

transporte. O complexo de proteínas de revestimento do tipo II (COPII) gera vesículas que

realizam o movimento progressivo, ou seja, carreaiam vesículas oriundas do RE para o Golgi.

Por outro lado, o complexo de proteínas de revestimento do tipo I (COPI) permite o fluxo de

membranas através de um transporte retrógrado de vesículas que brotam do complexo de

Golgi e do ERGIC em direção ao retículo endoplasmático (HAURI & SCHWEIZER, 1992).

Normalmente, o estudo desse compartimento é realizado através da localização de

uma proteína residente, a proteína E53 (SCHWEIZER et al., 1988). Essa proteína cicla

rapidamente do RE para o ERGIC, atuando como um receptor para o transporte de

glicoproteínas realizando entre o RE e ERGIC (HAURI et al., 2000). Além disso, a fosfatase

ácida é usada como enzima marcadora deste compartimento (JENTOFT, 1990; TEASDALE

& JACKSON, 1996).

As vesículas que brotam do ERGIC se fundem com a primeira cisterna do Golgi, a

cisterna cis. Esta é caracterizada por ser o local das reações de fosforilação (ALBERTS et al.,

2004). Uma importante função desse processo está relacionada com a doação de fosfato a um

ou mais resíduos de manose das enzimas lisossomais para a formação de resíduos de manose-

6-fosfato. A presença de manose-6-fosfato em enzimas funciona como sinal, que ao ser

reconhecido por receptores são encaminhadas para os lisossomos. Nessa cisterna, duas

enzimas são consideradas marcadoras, as manosidases I e II (KORNFELD, 1987).

Nas cisternas da região medial a localização da manosidase III e da N-

acetilglicosamina transferase nestas cistenas permitem afirmar que a remoção de resíduos de

manose e a adição de N-acetilglicosamina são modificações restritas deste compartimento do

Golgi.

A reação de sulfatação ocorre a partir do doador de sulfato PAPS (3-fosfoadenosina-

5´-fosfosulfato) presente no lúmem das cisternas da região trans. O sulfato é adicionado aos

proteoglicanos, proteínas secretadas e a domínios extracelulares de proteínas e lipídeos da

membrana plasmática, conferindo a estes carga negativa (DICK et al.,, 2008). Assim como

nas outras cisternas, a participação da cisterna trans no processo de glicosilação foi

comprovada através da localização da galactositransferase e da sialiltransferase, enzimas que

adicionam galactose e ácido siálico, respectivamente as proteínas em processamento

(WEINSTEIN et al., 1982). Sugere-se que o lúmen da cisterna trans seja contínuo à rede trans

do Golgi, onde as proteínas são secretadas para dentro de pacotes de transporte e endereçadas

para seus destinos finais (GRIFFITHS & SIMONS,1986).

1.1.6.7.3 Complexo de Golgi em Tricomanadídeos

Sabe-se que o complexo de Golgi desempenha importantes funções celulares, como a

glicosilação do tipo N e O de proteínas e lipídios, endereçamento e biossíntese dos

lisossomos. Ainda existem poucos estudos relacionados a esta organela em tricomonadídeos

no que diz respeito à sua estrutura e função (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1985; QUEIROZ

et al., 1991; DÍAZ & DE SOUZA, 1998; BENCHIMOL et al., 2001).

Nos tricomonadídeos, o complexo de Golgi é único e bastante proeminente (FIG. 4a),

ao contrário do que ocorre com outros protozoários parasitos como Toxoplasma e

Trypanosoma (HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). Em tricomonas, esta organela pode

medir de 4,7-6µm de comprimento e 1-1,2µm de largura, apresentando 8 a 12 cisternas

alongadas e localiza-se na porção dorsal da célula e a direita do núcleo (FIGs. 4a - 4b).

Pequenas vesículas sem revestimento com 40 nm de diâmetro e outras com revestimento

medindo 75 nm de diâmetro foram descritas como associadas à porção lateral das cisternas do

Complexo de Golgi (BENCHIMOL et al., 2001).

Em tricomonas, os filamentos parabasais (FIGs. 2, 4a) encontram-se associados à esta

organela formando o aparelho Parabasal (HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). Conexões

filamentosas foram observadas interligando a cisterna cis com os filamentos parabasais

(BENCHIMOL et al., 2001), sugerindo que este sistema possa proporcionar uma sustentação

às cisternas do Golgi (HONINGBERG & BRUGEROLLE, 1990).

Os filamentos parabasais são estruturas caracterizadas por apresentar uma

periodicidade semelhante à encontrada na costa. Entretanto, os filamentos parabasais diferem

por serem mais delgados e apresentam-se em número de dois, sendo assim denominados

filamentos parabasais 1 e 2 (FP1 e FP2) (HONINGBERG & BRUGEROLLE, 1990).

Estudos citoquímicos mostraram a presença das enzimas tiaminopirofosfatase e

fosfatase ácida nas cisternas cis e trans do Golgi de tricomonadídeos, repectivamente

(QUEIROZ et al., 1991; BENCHIMOL et al., 2001). Além disso, a técnica de Thiéry foi

capaz de demonstrar a presença de açúcares na membrana desta organela (BENCHIMOL &

DE SOUZA, 1985; BENCHIMOL et al., 2001). Posteriormente, com o uso de lectinas como

WGA (Wheat germ agglutinin) fluorescentes e conjugadas ao ouro coloidal foi possível

comprovar a presença de resíduos de N-acetil-glicosamina (BENCHIMOL et al., 2001;

BENCHIMOL & BERNARDINO, 2002). O emprego da técnica de iodeto de zinco-tetróxido

de ósmio (ZIO) proporcionou a visualização de fenestras nos sáculos do Golgi e

interconexões entre as cisternas do mesmo (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1985;

BENCHIMOL et al., 2001). Por freeze-etching foi possível descrever estruturas filamentosas

conectando uma face à outra das cisternas do Golgi (BENCHIMOL et al., 1993).

Além disso, métodos bioquímicos foram capazes de revelar que o Golgi de tricomonas

desempenha um papel importante no acúmulo de cálcio, sendo o principal sítio com esta

função nestes organismos (ALMEIDA, 2000).

Ao longo do ciclo celular dos tricomonadídeos, foi observado o alongamento das

cisternas do Golgi embora o número de cisternas se mantenha constante. Antes da mitose, o

Golgi atinge um comprimento que pode variar de 4,7 a 6,0 µm e sofre uma fissão, dividindo

esta organela. A célula passa a ter duas pequenas pilhas de cisternas medindo entre 1,0 a 1,2

µm. Durante a mitose de tricomonas, o Golgi permanece íntegro e migra junto com a porção

anterior de cada axótilo, posicionando-se entre os corpúsculos basais e o núcleo. Durante esse

processo esta organela sofre um novo alongamento atingindo 3,7 µm, no final da telófase.

Além disso, proteínas, como as adesinas, foram detectadas ao longo da via secretora durante

todo o ciclo celular (BENCHIMOL et al., 2001).

Figura 4. a. Micrografia eletrônica de Tritrichomonas foetus em vista longitudinal. Célula em

interfase, (P) Pelta, (Ax) axóstilo, (FA) flagelos anteriores, (H) hidrogessomos, (G) complexo de

Golgi, Filamento Parabasal (seta), (Gl) glicogênio e (N) núcleo. Barra, 500nm. b. Proximidade do

complexo de Golgi com retículo endoplasmático (RE), núcleo (N) e filamento parabasal (FP). Barra,

2µm.

1.2 JUSTIFICATIVAS

O complexo de Golgi em Tritrichomonas foetus se destaca por ser bastante

desenvolvido, o que indica que deva exercer funções importantes para o parasito e na

parasitemia. Contudo, o assunto ainda é pouco estudado. Por isso, existe a necessidade de se

realizar estudos que ajudem a elucidar a funcionalidade, as proteínas aí presentes, e

comportamento desta organela e de seus componentes durante o ciclo de vida deste parasito.

1.2.1 Objetivo Geral

• Identificar pelo menos uma proteína do complexo de Golgi de T. foetus que possa servir

como proteína marcadora e assim, ser rastreada.

1.2.2 Objetivos Específicos

• Isolar o Complexo de Golgi de T. foetus

• Produzir anticorpos monoclonais contra proteínas do C. Golgi de T. foetus

• Rastrear por imunocitoquímica e imunofluorescência a sensibilidade e especificidade dos

anticorpos monoclonais gerados

• Identificar proteínas reconhecidas pelos anticorpos

• Identificar proteínas específicas de Golgi em Tricomonadídeos

• Verificar se as proteínas reconhecidas pelos anticorpos são conservadas, e, portanto, são

reconhecidas em outros organismos.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Cultivo in vitro

Os protozoários da cepa K de Tritrichomonas foetus, utilizada neste trabalho, foi

isolada pelo Dr. Hélio Guida (Embrapa, Rio de Janeiro, Brasil) da cavidade prepucial de um

touro do estado do Rio de Janeiro, Brasil. A cepa JT de Trichomonas vaginalis foi isolada de

uma paciente atendida no Hospital Universitário Federal do Rio de Janeiro, Brasil.

Os trofozoítos foram cultivados axenicamente em meio de cultura TYM modificado

(Diamond, 1957), acrescido de 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas foram

mantidas a 37ºC por 24 horas. Para o fracionamento subcelular foram cultivados 2 litros de T.

foetus, na densidade de 10

células/ml.

O meio TYM utilizado é composto por 22mg/ml de triptona, 11 mg/ml de extrato de

levedura, 5,6 mg/ml de maltose, 1mg/ml de L-cisteína, 0,2 mg/ml de ácido ascóbico, 0,9

mg/ml de fosfato de potássio monobásico e 0,9 mg/ml de fosfato de potássio dibásico. O pH é

ajustado para 6,2 com HCl 0,1M e o meio é posteriormente esterilizado por autoclação por 20

min.

As células epiteliais de rim de cachorro MDCKII foram doadas pelo Dr. José Andrés

Morgado Diaz (Departamento de Biologia Celular – INCA) e cultivadas em meio DMEM

(Sigma, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino. As culturas foram mantidas em

condições de 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO

2.2 Fracionamento Subcelular

O isolamento do complexo de Golgi de T. foetus foi realizado de acordo com o

protocolo descrito por Díaz e De Souza (1998) (FIG. 5). Para isso foram cultivados dois litros

do parasito e todo o procedimento foi realizado a 4ºC. Os trofozoítos de T. foetus foram

centrifugados à 1.000x g por 10 minutos (ultracentrífuga Sorvall RCB com rotor GSA). As

células foram lavadas três vezes com tampão G (10mM tampão Tris-HCl, pH 7,4, contendo

0,25M sacarose e 2mM MgCl

)

utilizando a mesma velocidade. As células foram ressuspensas

em solução hipotônica (tampão G sem sacarose) e, em seguida, foram rompidas

mecanicamente em homogenizador Potter. O monitoramento da ruptura das células foi

realizado com a observação do material ao microscópio de contraste de fase. O

homogeneizado foi centrifugado à 2.500x g por 10 minutos e o pellet contendo células não

rompidas, núcleo e hidrogenossomos foram descartados. O sobrenadante pós-nuclear (PNS)

resultante foi misturado em proporção de 1:1 a uma solução concentrada de sacarose a 2,3M

em tampão G. Essa suspensão foi colocada no fundo dos tubos da ultracentrífuga (Beckman

SW28). Soluções com concentrações decrescentes de sacarose foram adicionadas

sucessivamente ao tubo (1,2M, 1,0M e 0,8M em tampão Tris-HCl 10mM, pH 7,4). O

gradiente foi centrifugado a 95.000x g por 1 hora e 30 minutos na ultracentrífuga L8M usando

o rotor Beckman SW28 (Palo Alto, CA, USA). O pellet e as bandas formadas foram

cuidadosamente coletados com pipetas Pasteur e diluídos 10 vezes em tampão G sem

sacarose. O pellet, rico em complexos de Golgi, resultante da centrifugação a 80.000x g por

45 minutos, utilizando o rotor Beckman SW28, foi coletado para análise.

Figura 5. Esquema do fracionamento subcelular, mostrando as etapas para a obtenção das frações

do complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus. Sobrenadante pós-nuclear (PNS).

2.3 Produção de anticorpos monoclonais

Uma vez isolada a organela, a mesma foi observada por MET para verificação de sua

pureza. Em seguida, foi liofilizada para envio à FK Biotec, Rio Grande do Sul, Brasil, para

produção de anticorpos monoclonais. O processo seguiu as seguintes etapas: imunização,

fusão (FIG. 6e), seleção dos hibridomas positivos (triagem), clonagem, reclonagem e

criopreservação, produção em larga escala dos anticorpos e purificação.

Na etapa de imunização, a primeira inoculação foi feita com 100µg/cdg do isolado do

complexo de Golgi diluído em 0,5 ml de adjuvante completo de Freund, na cavidade

peritonial de quatro camundongos BALB/c. As demais inoculações seguiram dias e diluições

de acordo com a tabela I, respeitando um interregno de 30 dias.

Tabela 1. Dia, concentração e forma de diluição dos inóculos durante a etapa de imunização.

Uma nova inoculação endovenosa foi feita 72 horas antes da fusão com 50µg/cdg do

antígeno. Para a etapa de fusão o baço do camundongo imunizado foi retirado (FIGs. 6b-c).

Em seguida, o baço foi colocado em uma placa de Petri contendo meio DMEM (Cultilab,

Campinas, Brasil) e o órgão foi perfurado com o auxílio de agulhas de seringas de 1ml para a

obtenção das células (FIG. 6d). O meio contendo as células do baço (2 x10

células/ml) foi

transferido para um tubo de 50ml. Estas células foram lavadas 1x com meio DMEM.

Paralelamente, as células de mieloma SP2/O (1 x 10

células/ml) cultivadas em meio DMEM

suplementado com 20% de soro fetal bovino foram centrifugadas a 2.000x g. A obtenção de

células híbridas foi feita através da fusão das células de mieloma SP2/O com as células do

baço do animal imunizado na proporção de 1:2. Para isso foi utilizado uma solução de

polietilenoglicol (PEG) 41% (Sigma, USA) e dimetilsulfóxido (DMSO) 15% em DMEM a

46ºC, aplicado gota a gota por 1 minuto (FIG. 6e) (KÖHLER & MILSTEIN, 1975).

Para a seleção das células híbridas, após a fusão as células foram lavadas 1 x em meio

DMEM e ressuspensas em meio HAT (Hipoxantina, Aminopterina e Timidina) (FIG. 6f),

onde foram mantidas durante 7 dias a 37ºC. Esse meio favorece o crescimento das células

Dia Antígeno Veículo

0 100µg/cdg Adjuvante completo de

Freund

7 100µg/cdg Adjuvante incompleto de

Freund

14 50µg/cdg PBS

21 50µg/cdg PBS

30 50µg/cdg PBS

híbridas, devido à ação da aminopterina, uma droga que age inibindo a síntese de DNA, pois

impede a produção de guanosina trifosfato (GTP) e timidina trifosfato (TTP). A produção de

TTP pode ser realizada através da adição de timidina no meio. Por outro lado, a síntese de

GTP só ocorre a partir da hipoxantina metabolizada pelos linfócitos B, através da atividade da

enzima hypoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT). Apesar dos linfócitos

conseguirem sintetizar o DNA, estes morrem no período de 7 a 10 dias de cultura. Os

mielomas que não possuem esta enzima não conseguem produzir uma nova fita de DNA e não

sobrevivem. Desta forma, somente as células híbridas sobrevivem por herdarem a enzima

hypoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT) dos linfócitos e a durabilidade dos

mielomas. Após o período de seleção das células híbridas, o meio HAT é substituído por meio

HT (Hipoxantina e Timidina) por mais 3 dias. As culturas seguintes foram realizadas em meio

DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino.

O teste de triagem foi realizado somente depois que as colônias de hibridomas

atingiram mais de 50% de crescimento em cada cavidade. Nesta etapa, os sobrenadantes das

culturas foram testados através do ensaio imunoenzimático direto (ELISA), para determinar

se as células estavam secretando imunoglobulinas de interesse. Os sobrenadantes que

apresentaram resultados positivos foram testados por imunofluorescência para verificar a

localização do reconhecimento do anticorpo e a intensidade desta fluorescência. Os

hibridomas secretores de anticorpos com especificidade para o complexo de Golgi foram

selecionados para a etapa de clonagem.

A clonagem consiste na realização de diluições seqüenciais de modo a permitir que,

matematicamente, uma única célula permanecesse em cada cavidade. Assim, os hibridomas

oriundos tratavam-se de clones de uma única célula e, conseqüentemente, os anticorpos

secretados reconheciam o mesmo epítopo, sendo, portanto monoclonais. Os melhores clones

foram selecionados após imunofluorescência e em seguida foram reclonados, repetindo as

diluições feitas para a obtenção dos clones. Posteriormente os mesmos foram expandidos,

congelados e armazenados. A etapa da produção de anticorpos em larga escala foi realizada in

vitro, através da coleta do sobrenadante do meio onde os hibridomas foram cultivados. Para a

etapa de purificação de anticorpos, foi necessária a utilização da técnica de cromatografia de

bioafinidade.

Figura 6. Etapas da produção de anticorpos monoclonais. a. Preparo do camundongo para a

retirada do baço; b. Retirada do baço do camundongo imunizado; c. Baço do camundongo d.

Extração das células do baço; e. Fusão de mielomas com células do baço; f. Plaqueamento das

células híbridas.

2.4 C

-NBD-Ceramida

NBD-ceramida é um análogo fluorescente da ceramida, biologicamente ativo e

permeável as membranas (ROSENWALD & PAGANO, 1993). Depois de expostos a célula

estes lipídeos são acumulados no complexo de Golgi, onde são convertidos em

glicosilcerebrosídeos e esfingomielinas fluorescentes (LIPSKY & PAGANO,1985).

Neste estudo, utilizamos a C

NBD-ceramida (Molecular Probes Co, USA) para

demonstrar a localização do complexo de Golgi de T. foetus e de células MDCK e verificar se

os anticorpos monoclonais apresentam marcação na mesma região. Para isso, incubamos os

trofozoítos com 5µM de C

NBD-ceramida por 5 minutos à 37ºC. Em seguida, as células

foram centrifugadas a 1.000x g por 5 minutos. O pellet foi fixado com formaldeído 1% em

tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, por 1 hora. Depois, os núcleos das células foram corados com

DAPI (5µg/ml). As amostras foram observadas ao microscópio óptico de fluorescência Zeiss

Axophot II.

2.5 Imunofluorescência

Para os testes de imunofluorescência as células foram primeiramente fixadas com

formaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2, e aderidas a lamínulas recobertas com poli-

L-lisina 0,1% (Sigma, USA). A permeabilização das células foi feita com 0,1% de Triton X-

100 em PBS/BSA a 1%, por 10 minutos. Em seguida, as células passaram por uma etapa de

bloqueio com cloreto de amônio (NH

Cl) 50mM por 15min e depois com albumina bovina

(BSA) 3% por 15 minutos. Posteriormente, as células foram incubadas por 3 horas ou

overnight com os sobrenadantes dos hibridomas 20, 93, 110 e com o anticorpo primário

purificado anti-Golgi 20.3 aqui desenvolvidos, diluído 1:10 em PBS/BSA 1%. A revelação

dos anticorpos foi feita com a incubação da amostra com o anticorpo secundário anti-

camundongo conjugado com AlexaFluor 488, diluído 1:100, por 1 hora. Os núcleos das

células foram corados com DAPI (5µg/ml). As amostras foram observadas ao microscópio

óptico de fluorescência Zeiss Axophot II.

Para verificar se as proteínas reconhecidas pelo anticorpo purificado eram

conservadas, foram feitas imunofluorescências com T. vaginalis, formas epimatigota do

Trypanosoma cruzi e promastigota de Leishmania amazonensis, além de células MDCKII. Os

protozoários Trypanosoma cruzi e Leishmania amazonensis foram doados fixados com 4% de

formaldeído em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2 pela Dra. Narcisa Leal da Cunha-e-Silva

(UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil).

O controle foi realizado incubando as células somente com o anticorpo secundário.

2.6 Microscopia Eletrônica de Transmissão

2.6.1 Resinas hidrofílicas - Unicryl e LR-White

As células foram fixadas em uma mistura de 4% de formaldeído e 0,1% de glutaraldeído

grau I em tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,2, overnight. As amostras foram lavadas

3x em PBS, pH 7,2 e 3x em H

O destilada. Para a obtenção de um melhor contraste do

material, foi feita a coloração em bloco em uma solução de acetato de uranila a 5% em água

destilada por 2 horas, protegido da luz. Após esse período, o material foi lavado em água

destilada e centrifugado a 1.500x g por 5 minutos com o objetivo de se obter um pellet

compacto. A amostra foi transferida para uma placa de Petri com etanol 70% e cortado em

pequenos fragmentos. A desidratação do material foi feita em concentrações crescentes de

etanol 70%, 90%, 100%, super-seco, por 15 minutos em cada etapa. A infiltração foi realizada

com concentrações crescentes de resina LR-White diluída em etanol super-seco, nas

proporções de 1:2, 1:1, 2:1 e puro, depois o material foi polimerizado em resina pura à -18ºC

sob luz UV.

Para imunocitoquímica de materiais polimerizados em resina LR-White, foram obtidos

cortes ultrafinos de 70nm de espessura que foram coletados em grades de níquel de 300 mesh.

As etapas de bloqueio foram realizadas com cloreto de amônio 50mM, pH 8,0, por 40

minutos, PBS/BSA 1%, PBS/BSA3% e Tween 0,2%, por 10 minutos em cada solução. As

células foram incubadas com os sobrenadantes dos hibridomas 20, 93, 110 e com o anticorpo

purificado anti-Golgi 20.3 diluído 1:10 em PBS/PBS 1%, overnight. O material foi lavado

com PBS/BSA 3%, 1%, 3% e incubado com o anticorpo secundário anti-camundongo IgG

conjugado com partículas de ouro coloidal de 10nm, diluído 1:100 em PBS/BSA 1%, por 50

minutos. O controle foi feito com a amostra que teve a etapa de incubação com o anticorpo

primário ocultada. Em seguida, o material foi novamente lavado em soluções de PBS/BSA

3%, 1%, PBS puro e H

O destilada. O material foi contrastado com acetato de uranila 5% e

citrato de chumbo e, posteriormente, observado ao microscópio eletrônico de transmissão

JEOL 1210.

2.6.2 Resina Hidrofóbica – EPON

Os trofozoítos de T. foetus K foram coletados por centrifugação e fixados em

glutaraldeído a 2,5% em tampão Cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,2, por 2 horas ou overnight à

temperatura ambiente. Depois desse período, as células foram lavadas por três vezes em PBS,

pH 7,2 e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio a 1% e tampão Cacodilato de sódio

contendo ferricianeto de potássio a 0,8% acrescido de CaCl

5mM. Posteriormente, as células

foram desidratadas utilizando concentrações crescentes de acetona 70%, 90%, 100% por 15

minutos em cada concentração. O material foi, então, infiltrado em solução de resina Epoxy

Poly Bed 812 (Epon): acetona, nas proporções de 1:2, 1:1, 2:1 e Epon puro, por 3h ou

overnight em cada mistura. Finalmente, foi feita a polimerização do material na estufa a 60ºC

por 72 horas.

Depois dos blocos polimerizados, foram realizados cortes ultrafinos de 70 a 100nm,

utilizando o ultramicrótomo Leica Ultracut UCT. Os cortes foram coletados em grades de

cobre de 300 mesh ou em grades de níquel de 300 mesh quando o objetivo era fazer

imunocitoquímica. As amostras coletadas em grades de cobre foram contrastadas em acetato

de uranila 5% por 30 minutos e em citrato de chumbo por 10 minutos.

Para as imunocitoquímicas realizadas em materiais incluídos em resina epon foram feitas

algumas modificações no protocolo acima descrito. Cortes ultrafinos foram obtidos com

100nm de espessura e coletados em grades de níquel de 300 mesh. Foi necessário realizar uma

etapa de etching consistindo em uma retirada parcial da resina epon e uma “desosmificação”

com H

1% por 10 minutos, antes da etapa de bloqueio (revisto por SKEPPER, 2000). O

material foi lavado exaustivamente em H

O destilada, seguida da etapa de bloqueio, como já

descrita anteriormente. Os tempos de incubação com os anticorpos primário e secundário

foram de 48 h e 2 h, respectivamente.

2.7 Técnicas Proteômicas (SOLOVIEV & FINCH, 2005)

Neste trabalho, utilizamos uma estratégia para identificação das proteínas do Golgi de

T. foetus, que foi feita através da seleção da proteína usando a técnica de imunoprecipitação

(IP). Para isso, utilizou-se o anticorpo específico para uma das proteínas do Golgi e proteína-

A conjugada à resina Sepharose. Em seguida, as proteínas capturadas foram separadas por

peso molecular através de um gel de poliacrilamida 12% SDS-PAGE. As bandas

correspondentes às proteínas do complexo de Golgi imunoprecipitadas foram extraídas e

tratadas com Ditiotreitol (DTT - agente redutor de pontes dissulfeto), iodoacetamida (IAA -

responsável pela alquilação das cisteínas) e digeridas pela ação da tripsina que cliva para a

conversão das proteínas em peptídeos. Posteriormente, as amostras foram analisadas pelo

espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF/TOF (FIG. 7).

Figura. 7. Estratégia para identificação das proteínas do complexo de Golgi. As proteínas do Golgi

foram imunoprecipitadas(IP) e avaliadas por SDS-PAGE. As bandas correspondentes às proteínas do

Golgi foram extraídas e digeridas com tripsina para obtenção de peptídeos, que foram analisados por

MALDI-TOF/TOF. As informações obtidas a partir dos espectros de massas foram comparadas com

seqüências depositadas em bancos de dados do MASCOT®.

2.8 Dosagens de Proteínas - Método Lowry-Peterson (PETERSON, 1983)

Para os experimentos bioquímicos, as frações isoladas do Golgi de T. foetus foram

tratadas com tampão de lise (20mM de Tris-HCl, 2mM de EDTA, 0,1% de SDS, 0,5% de

deoxicolato, 1% de Triton X-100, 137mM NaCl, 10% de glicerol, pH 7,2) e coquetel de

inubidores de protease 1x (Sigma, USA). Porém, alguns destes componentes são considerados

interferentes para a dosagem de proteína pelo método de Lowry, devido a isso, foi necessário

fazer, primeiramente, uma precipitação das proteínas.

Em eppendorfs de 1,5ml foram aplicados o 10µl do tampão de lise (branco), 10, 20,

30, 40 e 50µl de solução de albumina 1mg/ml (padrão) e 20µl da amostra. Em seguida, foram

adicionados 50µl da solução de deoxicolato 1,5%. A mistura foi mantida por 10 minutos à

temperatura ambiente. Após esse período, foram adicionados 50µl de ácido tricloroacético

72% (TCA) que ficou reagindo por 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram

centrifugadas a 4.000x g por 25 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso

em 400µl no reagente de formação do complexo (250µl de CuSO

0,4%, 250µl de Tartarato

de potássio 0,8%, 500 µl de Na

20%, 1ml de SDS 10%, 1ml de NaOH 0,8M e 5ml de

água destilada) por 10 minutos. Em seguida, as amostras foram incubadas com 100µl do

reagente de Folin (1:6) por 60 minutos. A leitura foi feita a 650nm no leitor de ELISA

TermoMax microplate reader.

2.9 Imunoprecipitação

Para a reação de imunoprecipitação, a fração total do complexo de Golgi (1mg/ml) foi

incubada com 20µl de anticorpo 20.3 (1mg/ml), overnight à 4ºC (Pré-ligação).

Simultaneamente, em outro eppendorf foi feita a reação de pré-lavagem, incubando (1mg/ml)

com 50µl de proteína A-Sepharose (Sigma, USA) durante o mesmo tempo. Após esse

período, as amostras foram centrifugadas a 1.000x g por 10 minutos à 4ºC. Em seguida, foi

feita a incubação do sobrenadante da Pré-ligação e o pellet da pré-lavagem, overnight à 4ºC,

sob leve agitação. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 1.000x g por 10 min. O

pellet foi ressuspenso em 90µl de tampão de amostra (300 µl de tampão de amostra Laemmli

- Bio-Rad Laboratories, USA, 15 µl de β-mercaptoetanol e coquetel de inibidores de protease

1x concentrado - Sigma, USA), e fervido por 5 minutos para dissociação do complexo

proteico. A amostra foi centrifugada a 1.000x g por 5 minutos, para separar a Sepharose, e o

sobrenadante, contendo o anticorpo e o antígeno separados, que foi aplicado no gel de

Poliacrilamida a 12% como descrito abaixo.

2.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e

Eletrotransferência

A eletroforese foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Laemmli (1970).

O homogeinizado total de T. foetus e as frações do complexo de Golgi foram diluídos em

tampão de amostra (300 µl de tampão de amostra Laemmli - Bio-Rad Laboratories, USA, 15

µl de β-mercaptoetanol e coquetel de inibidores de protease 1x concentrado - Sigma, USA)

para uma concentração final de 5 ou 30µg/µl, dependendo da finalidade. Para as proteínas

imunoprecipitadas, foram aplicados 30µl da preparação descrita acima por poço do gel.

As proteínas foram separadas de acordo com o peso molecular em géis de Poliacrilamida

10% ou 12%, seguindo os seguintes parâmetros: 120V e 120 minutos. O peso molecular das

proteínas das amostras foram comparadas com o padrão kaleidoscope (Bio-Rad Laboratories,

USA). Algumas das preparações com 30µg/µl foram eletrotransferidas para membrana de

nitrocelulose ou PVDF utilizando o aparelho de transferência semi-seco a 10V por 60 minutos

como descrito por Towbin e colaboradores (1979). Após a transferência, as membranas de

nitrocelulose ou de PVDF foram coradas em uma solução de 0,2% Ponceau red e 3% de

ácido tricloroacético e em seguida, guardada à 4ºC.

2.11 Revelação do Gel

O mapa protéico resultante da eletroforese pode ser visualizado através de métodos de

coloração de proteínas. As proteínas no gel corado aparecem como bandas reveladas pelo azul

de Coomassie G-250 ou através da impregnação por prata.

2.11.1 Coomassie G-250 (NEUHOFF et al., 1988)

Os géis com 30 µg/µl de proteína foram colocados em solução fixadora contendo

etanol 30%, ácido fosfórico 2% (v/v) em água por 30 minutos. Esse procedimento foi repetido

três vezes. Em seguida, os géis foram lavados 2x por 20 minutos em ácido fosfórico 2% (v/v)

em água. Essa solução foi substituída por uma solução de ácido fosfórico 2% (v/v), etanol (ou

metanol) 18%, sulfato de amônio 15% (p/v) em água durante 30 minutos. A coloração do gel

foi realizada com adição de 5 ml (1% do volume) de uma solução contendo 20g de azul de

Comassie G-250 por litro de água. Os géis foram mantidos nesta solução por 72 horas sob

agitação moderada. O excesso de corante foi removido com lavagens de água deionizada.

2.11.2 Impregnação pela Prata

O gel para visualização do perfil proteico de 5µg/µl de proteínas do homogeinizado

total de T. foetus e da fração do complexo de Golgi, obtida após isolamento, foi fixado em

uma solução contendo 50% de metanol, 10% de ácido acético, 10% de Fixative enhancer

(Bio-Rad Laboratories, USA) e 30% de H

O deionizada. Em seguida, o gel foi lavado duas

vezes por 10 minutos em H

O deionizada e corado pela prata com a mistura de 10 ml da

solução A (Bio-Rad Laboratories, USA) (1ml de Silver complex solution, 1ml de Reduction

moderation solution, 1ml de Image develoment reagent e 7ml de H

O deionizada) e 10ml da

solução B (5g de Development acelerator em 100ml de H

O deionizada). Quando a coloração

do gel se tornou satisfatória a reação foi interrompida com uma solução de ácido acético 5%.

2.12 Immunoblotting

A membrana de nitrocelulose com as proteínas eletrotransferidas foi lavada 2x com

tampão TBS-T (20mM de Tris-HCl, 137 mM de cloreto de sódio e 0,1% de Tween-20) para a

retirada do corante vermelho de Ponceau. Em seguida, foi bloqueada com leite desnatado

(Molico) a 5% diluído em tampão TBS-T, por 1 hora. A membrana de nitrocelulose foi

incubada com os anticorpos primários diluídos 1:1000 em TBS-T contendo 5% de leite

desnatado, overnight. Depois, foi feito um novo bloqueio e a membrana foi incubada com o

anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)

diluído 1:2000 em TBS-T contendo 5% de leite desnatado. A revelação foi feita com o kit de

quimioluminescência ECL (Amersham Biosciences, Sweden), por 3 minutos e com exposição

a um filme de Raio-X (KODAK, USA) por 60 segundos.

2.13 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF e MALDI-TOF/TOF)

As bandas presentes no gel de imunoprecipitação correspondente às proteínas de

interesse foram extraídas do gel e passaram primeiramente por uma etapa de descoloração.

Nesta etapa, os fragmentos do gel foram colocados em uma solução contendo 50% de

acetonitrila e 25mM de bicarbonato de amônio por 24 hora, sob agitação. Depois, os

fragmentos do gel foram transferidos para tubos eppendorfs previamente tratados com

metanol para evitar a contaminação da amostra com polímeros. Foi adicionado 25µl da

solução A (10mM de DTT e 25mM de sulfato de amônio) por 1 hora à 56ºC, para ocorrer a

redução das pontes de disulfeto. Em seguida, a solução anterior foi removida e adicionou-se

25µl da solução B (55mM de iodoacetamida, 25mM de bicarbonato de amônio, 10mg/ml de

DTT) por 45 minutos protegido da luz, para bloquear as cisteínas livres.

Após essas etapas, os fragmentos do gel foram desidratados com 50µl de acetonitrila

100% por 10 minutos. Posteriormente, essa solução foi retirada e foi adicionado 10µl da

solução C (0,01µg/ml de tripsina diluída em 25mM de bicarbonato de amônio) por 20 horas à

37ºC. Após esse período, acrescentou-se 50µl da solução D (50% de acetonitrila e 5% de

ácido tricloroacético) por 15 minutos, no sonicador. As soluções obtidas foram reservadas em

outros tubos eppendorfs e esta etapa foi repetida mais duas vezes para que fosse evitada a

perda de qualquer material. A solução final contendo aproximadamente 110µl foi liofilizada

no SpeedVac, até que o material estivesse totalmente seco. Em seguida, as amostras foram

ressuspensas em 15 µl de água deionizada. Para concentrar a amostra e eliminar resíduos dos

solventes usados na extração de peptídeos do gel, as amostras foram passadas no Zip-Tip C18

(Millipore Corporation, USA).

As amostras foram misturadas com uma matriz sólida (alpha-cyano) nas proporções de

1:1 e somente 1µl dessas misturas foi aplicado nos spots das placas do MALDI-TOF/TOF a

fim de correlacionar os dados presentes nos espectros de MS/MS com uma possível

identificação protéica utilizamos o programa MASCOT® baseando as buscas no banco de

dados NCBInr (National Center for Biotechnology não redundante). Para tal, foram

estabelecidos os seguintes parâmetros: leitura dos peptídeos trípticos, permitindo uma única

falha de clivagem e sem restrições taxonômicas. A carboaminometilação em resíduos de

cisteína foi adotada como modificação fixa e a oxidação da metila como modificação

variável. A precisão das massas foi realizada dentro de 100ppm em MS/MS, estes parâmetros

foram baseados em outros trabalhos da área (DE JESUS et al., 2007; CUERVO et al., 2008).

3. RESULTADOS

3.1 Fracionamento Subcelular

O rompimento de T. foetus foi realizado no Potter e acompanhado por microscopia de

contraste de fase. O homogenizado foi considerado satisfatório para o fracionamento quando a

maioria das células (aproximadamente 90%) estava rompida. O sobrenadante pós nuclear

(PNS) e as frações das interfaces de 0,8-1,0M e 1,0-1,2M, correspondentes às frações

enriquecidas do complexo de Golgi foram obtidas por flotação no gradiente de sacarose.

Conseqüentemente, essas amostras foram processadas para microscopia eletrônica de

transmissão para averiguar a pureza de cada fração.

3.2 Caracterizações morfológicas da fração do complexo de Golgi

As frações referentes ao complexo de Golgi de T. foetus avaliadas por microscopia

eletrônica de transmissão apresentaram-se na sua maioria formada por membranas. Na análise

do sobrenadante pós nuclear (PNS), fração correspondente ao extrato celular antes de ser

submetido ao gradiente de sacarose, foi possível observar algumas cisternas ainda intactas

(FIG. 8). Por outro lado, nas frações obtidas das interfaces 0,8/1,0M (FIG. 9a e c) e 1,0/1,2M

(FIG. 9b e d) do gradiente de sacarose foram observadas amostras ricas em membranas, as

quais foram resseladas. Em maior aumento, foi possível observar detalhes destas membranas

e verificar que não apresentam uma forma definida (FIG. 9c e d, cabeças de seta). Nestas

frações enriquecidas no complexo de Golgi não foram observadas contaminações por

organelas como núcleo ou hidrogenossomos.

Figura 8. Micrografia eletrônica do sobrenadante pós-nuclear (PNS) mostrando as cisternas do

Complexo de Golgi a. Cisternas alongadas, Barra, 10nm. b. Cisternas empilhadas, Barra, 50nm.

3.3 Obtenção de anticorpos monoclonais

A primeira etapa (triagem) de seleção para a obtenção dos anticorpos monoclonais foi

realizada através do teste de ELISA, pela empresa responsável pela produção destes. Nesta

etapa, o mesmo isolado do Golgi utilizado para imunizar os camundongos foi adsorvido as

microplacas. Esta análise resultou em 395 amostras positivas que foram avaliadas por

imunofluorescência para determinar a localização e a intensidade da fluorescência (Tabela 2).

Estas informações foram adicionadas a tabelas contendo o número de cada célula secretora.

Além disso, as amostras foram classificadas quanto à intensidade de fluorescência em uma

escala de um a seis (+). As amostras que não tiveram marcação foram representadas pelo

símbolo (-) e o símbolo (°) foi determinado para as marcações visualizadas em toda a célula.

Das 395 amostras positivas 94 apresentaram marcação para o complexo de Golgi com

intensidade igual ou maior que +++ que foram selecionados para a etapa de clonagem (Tabela

2, azul). Amostras (total = 5) que apresentaram marcação para o complexo de Golgi, porém

com baixa intensidade (++) também foram selecionadas devido a sua especificidade por esta

organela (Tabela 2, rosa). Amostras que apresentaram especificidade para o retículo

endoplasmático (total =12) foram escolhidas para a produção de anticorpos monoclonais

visando trabalhos futuros (Tabela 2, amarelo). O resultado desta seleção deu origem a 111

clones que passaram pelo mesmo processo de avaliação (Tabela 3). Assim, 17 sobrenadantes

que apresentaram marcação para complexo de Golgi com alta intensidade de fluorescência (>

+++) (Tabela 3, azul), 1 sobrenadante com marcação para o complexo de Golgi com baixa

intensidade fluorescência (Tabela 3, rosa) e 3 sobrenadantes com marcação para outras

estruturas celulares (membrana plasmática e retículo endoplasmático) (Tabela 3, amarelo)

foram selecionados. Como as marcações obtidas foram visualizadas em mais de uma

estrutura, foi necessário fazer uma reclonagem, com o objetivo de se obter uma única

organela marcada.

A etapa de reclonagem gerou 18 hibridomas reclonados, avaliados da forma

mencionada nas outras etapas (Tabela 4). Nesta etapa obtivemos 4 hibridomas com marcação

exclusivamente para o complexo de Golgi (amostras 20, 41, 78 e 93) e com a intensidade de

fluorescência alta (Tabela 4, azul). Além disso, duas outras amostras foram de nosso interesse.

A amostra (22) que apresentou marcação no retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

vesículas (Tabela 4, rosa) e outra (69) com marcação para retículo endoplasmático e

envoltório nuclear (Tabela 4, amarelo). As células secretoras dos sobrenadantes responsáveis

por tais marcações foram selecionadas para a produção de anticorpos em larga escala. Três

hibridomas (99, 103 e 110) foram perdidos uma vez que estas células morreram ou pararam

de secretar imunoglobulinas.

Após a obtenção de 100 ml dos sobrenadantes dos hibridomas selecionados, estes

foram novamente testados para verificar se as células continuavam secretando

imunoglobulinas antes de passar para a etapa de purificação dos anticorpos (Tabela 5). Nesta

etapa selecionamos 2 sobrenadantes (20 e 69) para serem purificados. O sobrenadante 20

apresentou melhor intensidade de fluorescência com marcação para o complexo de Golgi.

Após a purificação originou o anticorpo monoclonal IgG anti-Golgi 20.3. Por outro lado, o

sobrenadante 69 deu origem aos anticorpos monoclonais IgG 69.1 e 69.2 que não foram

utilizados neste trabalho pois marcavam retículo, o que no momento não era do nosso

interesse.

Tabela 2. Triagem dos sobrenadantes das culturas das células híbridas avaliadas por

imunofluorescência.

Número

dos

anticorpos

Intensidade de

fluorescência

Local da marcação

P1.1 +++++ Vesículas e membrana plasmática

P1.2 +++++ Vesículas e membrana plasmática

P1.3 ++++ Vesículas e membrana plasmática

P1.4 +++ Vesículas e membrana plasmática

P1.5 ++++ Membrana plasmática

P1.6 ++++ Membrana plasmática

P1.7 ++++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.8 +++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.9 ++ Vesículas

P1.10 +++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.11 +++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.12 - -

P1.13 - -

P1.14 ++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.15 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.16 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.17 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.18 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.19 +++++ Membrana plasmática e marcações pontuais

citoplasmáticas

P1.20 +++++ Membrana plasmática e marcações pontuais

citoplasmáticas

P1.21 +++++ Complexo de Golgi

P1.22 ++++ Membrana plasmática e marcações pontuais

citoplasmáticas

P1.23 ++++ Membrana plasmática, marcações pontuais

citoplasmáticas e complexo de Golgi

P1.24 ++ marcações pontuais citoplasmáticase complexo

de Golgi

P1.25 ++++ Vesículas e membrana plasmática

P1.26 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P1.27 ++++ Vesículas, membrana plasmática e complexo de

Golgi

P1.28 ++ Vesículas, membrana plasmática e complexo de

Golgi

P1.29 ++ Vesículas, membrana plasmática e complexo de

Golgi

P1.30 + Vesículas, membrana plasmática e complexo de

Golgi

P1.31 +++ Membrana plasmática

P1.32 +++ Membrana plasmática

P1.33 ++++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.34 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.35 - -

P1.36 + Membrana plasmática

P1.37 + Membrana plasmática

P1.38 +++ Complexo Golgi e vesículas

P1.39 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P1.40 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P1.41 ++ Vesículas

P1.42 + Vesículas

P1.43 + Vesículas

P1.44 - -

P1.45 + Vesículas

P1.46 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e membrana

plasmática

P1.47 - -

P1.48 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas e complexo

de Golgi

P1.49 - -

P1.50 +++ Membrana plasmática e vesículas

P1.51 - -

P1.52 - -

P1.53 - -

P1.54 + Membrana plasmática e vesículas

P1.55 ++++ Membrana plasmática e vesículas

P1.56 +++ Vesículas e Membrana plasmática

P1.57 ++++ Complexo de Golgi e vesículas

P1.58 + Complexo de Golgi e vesículas

P1.59 ++++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P1.60 - -

P1.61 - -

P1.62 ++ -

P1.63 + Marcações pontuais citoplasmáticas e membrana

plasmática

P1.64 -

P1.65 ++++ Complexo de Golgi e membrana plasmática

P1.66 ++++ Complexo de Golgi e membrana plasmática

P1.67 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e complexo

de Golgi

P1.68 - -

P1.69 - -

P1.70 ++++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P1.71 ++++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P1.72 ++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P1.73 +++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P1.74 - -

P1.75 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma

e membrana plasmática

P1.76 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma

e membrana plasmática

P1.77 - -

P1.78 + Membrana plasmática

P1.79 +++ Membrana plasmática e vesículas

P1.80 ++ Membrana plasmática e vesículas

P1.81 ++ Complexo de Golgi

P1.82 ++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P1.83 ++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P1.84 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P1.85 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P1.86 - -

P1.87 ++++ Membrana plasmática e vesículas

P1.88 -

P1.89 -

P1.90 ++++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P1.92 ++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P1.93 +++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P1.94 ++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P1. 95 +++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P1.96 +++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P2.1 ++++ Membrana plasmática

P2.2 +++ Membrana plasmática e vesículas

P2.3 - -

P2.4 +++ Membrana plasmática

P2.5 ++++ º

P2.6 - -

P2.7 +++ º

P2.8 +++ Vesículas e retículo endoplasmático

P2.9 ++++ º

P2.10 ++++ º

P2.11 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P2.12 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P2.13 +++ Membrana plasmática

P2.14 ++++ º

P2.15 - -

P2.16 ++++ º

P2.17 +++++ Complexo de Golgi, membrana plasmática,

retículo endoplasmático e vesículas

P2.18 - -

P2.19 +++++ º

P2.20 +++++ º

P2.21 +++++ º

P2.22 ++ Complexo de Golgi, vesículas e retículo

endoplasmático

P2.23 + Complexo de Golgi, vesículas e retículo

endoplasmático

P2.24 +++ Complexo de Golgi, vesículas e retículo

endoplasmático

P2.25 - -

P2.26 ++++ º

P2.27 ++ º

P2.28 +++++ Membrana plasmática, vesícula, retículo

endoplasmático e complexo de Golgi

P2.29 - -

P2.30 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.31 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.32 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.33 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.34 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.35 +++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P2.36 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.37 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.38 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.39 - -

P2.40 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma,

membrana plasmática

P2.41 ++++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P2.42 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.43 ++++ Complexo de Golgi, vesícula, retículo

endoplasmático, membrana plasmática

P2.44 - -

P2.45 - -

P2.46 - -

P2.47 +++ Membrana plasmática

P2.48 - -

P2.49 - -

P2.50 ++++ º

P2.51 ++ º

P2.52 ++++ º

P2.53 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.54 - -

P2.55 +++++ º

P2.56 +++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.57 +++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.58 ++++ º

P2.59 - -

P2.60 ++++ º

P2.61 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P2.62 - -

P2.63 +++++ º

P2.64 +++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.65 ++++ º

P2.66 +++ Vesículas e membrana plasmática

P2.67 ++++ º

P2.68 +++ Retículo endoplasmático e vesículas

P2.69 - -

P2.70 ++++ º

P2.71 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas, membrana

plasmática, citoplasma

P2.72 +++++ º

P2.73 +++ Membrana plasmática

P2.74 +++ Retículo endoplasmático, vesículas complexo de

Golgi

P2.75 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.76 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.77 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P2.78 ++++ Complexo de Golgi

P2.79 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.80 +++ Membrana plasmática e vesículas

P2.81 ++ Vesículas

P2.82 + Membrana plasmática

P2.83 ++ º

P2.84 ++++ º

P2.85 - -

P2.86 - -

P2.87 ++++ Complexo de Golgi, vesículas, retículo

endoplasmático e membrana plasmática

P2.88 - -

P2.89 - -

P2.90 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P2.91 + Membrana plasmática

P2.92 +++++ º

P2.93 - -

P2.94 +++ º

P2.95 ++++ º

P2.96 - -

P3.1 ++++ º

P3.2 +++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.3 ++ Membrana plasmática

P3.4 +++ º

P3.5 + º

P3.6 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P3.7 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.8 - -

P3.9 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.10 - -

P3.11 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.12 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.13 ++ Membrana plasmática

P3.14 - -

P3.15 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.16 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.17 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas e membrana

plasmática

P3.18 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.19 +++ Membrana plasmática

P3.20 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.21 ++ Membrana plasmática

P3.22 - -

P3.23 +++ Retículo endoplasmático, vesículas e membrana

plasmática

P3.24 ++ Vesículas

P3.25 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.26 +++ Retículo endoplasmático e vesículas

P3.27 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P3.28 - -

P3.29 - -

P3.30 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma

e membrana plasmática

P3.31 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas e complexo

de Golgi

P3.32 +++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.33 ++++ Membrana plasmática e vesículas

P3.34 +++ Membrana plasmática

P3.35 - -

P3.36 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.37 ++ Complexo de Golgi e vesículas

P3.38 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.39 - -

P3.40 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática e no citoplasma

P3.41 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática e no citoplasma

P3.42 - -

P3.43 - -

P3.44 +++ Membrana plasmática e retículo endoplasmático

P3.45 - -

P3.46 ++++ Vesículas, retículo endoplasmático, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.47 +++++ Retículo endoplasmático, membrana plasmática,

vesículas e complexo de Golgi

P3.48 - -

P3.49 ++ Retículo endoplasmático e vesículas

P3.50 +++++ º

P3.51 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática e complexo de Golgi

P3.52 +++++ Membrana plasmática, retículo endoplasmático,

complexo de Golgi e vesículas

P3.53 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.54 ++++ º

P3.55 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.56 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.57 ++++ º

P3.58 - -

P3.59 +++ º

P3.60 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas e membrana

plasmática

P3.61 ++++ Retículo endoplasmático e membrana plasmática

P3.62 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.63 +++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.64 ++++ Membrana plasmática e retículo

P3.65 +++ Retículo endoplasmático e membrana plasmática

P3.66 + Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma

e membrana plasmática

P3.67 ++++ Vesículas

P3.68 +++ Membrana plasmática e retículo encoplasmático

P3.69 +++ Vesículas, retículo endoplasmático e membrana

plasmática

P3.70 - -

P3.71 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P3.72 ++++ º

P3.73 +++ Vesículas

P3.74 +++ Vesículas

P3.75 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.76 ++++ Membrana plasmática e vesículas

P3.77 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.78 ++++ º

P3.79 ++++ º

P3.80 ++++ º

P3.81 ++++ º

P3.82 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.83 - -

P3.84 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.85 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.86 +++++ Membrana plasmática e marcações pontuais

citoplasmáticas

P3.87 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas e membrana

plasmática

P3.88 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P3.89 +++ Membrana plasmática e marcações pontuais

citoplasmáticas

P3.90 ++++ º

P3.91 ++++ º

P3.92 ++++ º

P3.93 +++++ Vesículas e membrana plasmática

P3.94 ++++ Vesículas e retículo endoplasmático

P3.95 ++++ Vesículas e retículo endoplasmático

P3.96 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.1 ++ Retículo endoplasmático e vesículas

P4.2 - -

P4.3 - -

P4.4 +++ Vesículas

P4.5 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.6 +++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.7 +++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.8 ++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.9 ++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.10 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.11 ++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.12 +++ Retículo endoplasmático e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.13 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.14 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.15 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.16 +++ Retículo endoplasmático e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.17 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.18 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.19 - -

P4.20 - -

P4.21 - -

P4.22 - -

P4.23 - -

P4.24 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.25 ++++ Retículo endoplasmático e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.26 ++++ Membrana plasmática, complexo de Golgi e

marcações pontuais citoplasmáticas

P4.27 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e membrana

plasmática

P4.28 ++++ Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

marcações pontuais citoplasmáticas

P4.29 ++++ Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

marcações pontuais citoplasmáticas

P4.30 ++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.31 ++++ Complexo de Golgi e retículo endoplasmático

P4.32 - -

P4.33 ++ Retículo endoplasmático

P4.34 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.35 +++ Complexo de Golgi, membrana plasmática e

vesículas

P4.36 ++++ Complexo de Golgi, membrana plasmática,

retículo endoplasmático e vesículas

P4.37 - -

P4.38 + Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.39 +++++ Complexo de Golgi, membrana plasmática,

retículo endoplasmático e vesículas

P4.40 +++++ Marcações pontuais citoplasmáticas e membrana

plasmática

P4.41 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e complexo

de Golgi

P4.42 +++ Retículo endoplasmático e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.43 +++ Retículo endoplasmático

P4.44 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.45 +++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.46 ++++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.47 ++ Retículo endoplasmático e complexo de Golgi

P4.48 +++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.49 +++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P4.50 +++ Complexo de Golgi e retículo endoplasmático

P4.51 ++++ Complexo de Golgi e vesículas e membrana

plasmática

P4.52 +++ Complexo de Golgi e marcações pontuais

citoplasmáticas

P4.53 +++++ Complexo de Golgi, vesículas e membrana

plasmática

P4.54 +++ Vesículas

P4.55 +++ Vesículas

P4.56 +++ º

P4.57 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.58 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.59 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.60 ++++ º

P4.61 ++++ º

P4.62 ++++ º

P4.63 - -

P4.64 ++++ Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

membrana plasmática

P4.65 ++++ Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

membrana plasmática

P4.66 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.67 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.68 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P4.69 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P4.70 +++ Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

P4.71 ++++ Vesículas

P4.72 ++++ º

P4.73 ++++ º

P4.74 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.75 - -

P4.76 ++++ º

P4.77 ++++ º

P4.78 ++++ Complexo de Golgi e retículo endoplasmático

P4.79 +++ º

P4.80 ++++ º

P4.81 ++++ º

P4.82 ++++ Complexo de Golgi e vesículas

P4.83 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

membrana plasmática e vesícula

P4.84 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

membrana plasmática

P4.85 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

membrana plasmática

P4.86 +++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

membrana plasmática

P4.87 +++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

membrana plasmática

P4.88 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.89 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P4.90 + Vesículas

P4.91 ++++ Complexo de Golgi, membrana plasmática,

vesículas e retículo endoplasmático

P4.92 ++++ Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

vesículas

P4.93 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático,

vesículas e membrana plasmática

P4.94 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas, membrana

plasmática, retículo endoplasmático e vesículas

P4.95 ++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

vesículas

P4.96 ++++ º

P5.1 ++++ º

P5.2 ++++ º

P5.3 ++++ º

P5.4 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

P5.5 ++++ º

P5.6 ++ Vesículas

P5.7 +++ Vesículas

P5.8 ++++ º

P5.9 +++++ º

P5.10 +++ º

P5.11 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

Tabela 3. Mapeamentos dos sobrenadantes das culturas dos clones avaliados por imunofluorescência

Número

dos

anticorpos

Intensidade de

fluorescência

Local da marcação

1 +++

Retículo endoplasmático, vesículas e complexo

de Golgi

2 ++

Retículo endoplasmático, vesículas e complexo

de Golgi

3 +++++

Retículo endoplasmático, vesículas e complexo

de Golgi

4 + Vesículas, marcações pontuais citoplasmáticas

na membrana plasmática

5 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas

6 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana

7 +++++ Complexo de Golgi, retículo endoplasmático e

vesículas

8 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

9 + Marcações pontuais citoplasmáticas

10 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas

11 +++

Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

12 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e flagelos

13 ++++ Flagelos, marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática, vesículas, retículo

endoplasmático

14 ++++

Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

15 +++++

Membrana plasmática, retículo endoplasmático e

muitas vesículas

16 +++

Membrana plasmática e vesículas

17 +++

Retículo endoplasmático, vesículas e complexos

de Golgi

18 +++

Retículo endoplasmático, alguns complexos de

Golgi e vesículas

19 +++ Membrana plasmática

20 +++++ Membrana plasmática, retículo endoplasmático e

complexo de Golgi

21 +++++ Membrana plasmática e vesículas

22 ++++ Membrana plasmática, vesículas e complexo de

Golgi

23 ++++ Membrana plasmática e vesículas

24 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

25 +++++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática e vesículas

26 +++ Vesículas

27 -

28 -

29 -

30 + Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

31 -

32 ++++ Membrana plasmática e citoplasma

33 - -

34 +++ Marcações pontuais no citoplasma e complexo

de Golgi

35 +++ Vesículas e complexo de Golgi

36 ++ Marcações pontuais na membrana plasmática

37 + Vesículas

38 -

39 ++ Vesículas

40 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas e complexo

de Golgi

41 ++++ Vesículas e complexo de Golgi

42 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

43 + Citoplasma

44 ++

Marcações pontuais citoplasmáticas

45 + Complexo de Golgi

46 + Citoplasma

47 + Citoplasma

48 + Citoplasma

49 + Complexo de Golgi

50 + Marcações pontuais citoplasmáticas

51 + + Marcações pontuais citoplasmáticas

52 +++ Complexo de Golgi

53 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas e vesículas

54 +++ Marcações pontuais citoplasmáticas e vesículas

55 + Citoplasma

56 + Citoplasma

57 + Marcações pontuais citoplasmáticas

58 ++++ Membrana plasmática, flagelos e vesículas

59 ++ Vesículas e Retículo endoplasmático

60 ++++ Membrana plasmática e vesículas

61 +++ Vesículas

62 +++ Vesículas

63 ++++ Vesículas, membrana plasmática e flagelos

64 -

65 -

66 + Vesículas, membrana plasmática e flagelos

67 + Marcações pontuais citoplasmáticas e flagelos

68 ++++ Vesículas e membrana plasmática

69 ++++ Retículo endoplasmático, envoltório nuclear e

complexo de Golgi

70 -

71 +++ Vesículas, membrana plasmática, flagelos,

retículo endoplasmático

72 ++++ Vesículas, membrana plasmática e flagelos

73 +++ Vesículas e membrana plasmática

74 ++++ Vesículas e membrana plasmática

75 ++++ Vesículas e membrana plasmática

76 ++++++ Vesículas e membrana plasmática

77 ++++ Vesículas, membrana plasmática e flagelos

78 ++++ Vesículas, membrana plasmática e complexo de

Golgi

79 ++++ Vesículas, membrana plasmática e flagelos

80 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas, membrana

plasmática e flagelos

81 ++++ Flagelos

82 ++++ Vesículas e membrana plasmática

83 -

84 -

85 -

86 + Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

87 -

88 -

89 -

90 ++ Vesículas

91 ++++ Vesículas, membrana plasmática, flagelos e

retículo endoplasmático

92 -

93 ++++++ Complexo de Golgi e vesículas

94 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas na

membrana plasmática

95 ++++ Vesículas, membrana plasmática e flagelos

++++

Vesículas, membrana plasmática e flagelos

97 + Inespecífica

98 ++++ Vesículas

99 ++++ Complexo de Golgi

100 ++++ Vesículas e retículo endoplasmático

101 +++ Vesículas, marcações pontuais citoplasmáticas,

membrana plasmática e retículo endoplasmático

102 +++++ Vesículas, retículo endoplasmático e membrana

plasmática

103 ++++ Complexo de Golgi e vesículas

104 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas, citoplasma

e membrana plasmáica

105 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

106 + Inespecífico

107 ++ Marcações pontuais citoplasmáticas

108 ++++ Marcações pontuais citoplasmáticas e vesículas

109 ++++ Vesículas e retículo endoplasmático

110 +++++ Complexo de Golgi e vesículas

111 +++++ Vesículas e marcações pontuais citoplasmáticas

Tabela 4. Mapeamentos dos sobrenadantes das culturas de hibridomas reclonados avaliados por

imunofluorescências.

Número

dos

anticorpos

Intensidade de

fluorescência

Local da marcação

Retículo endoplasmático e vesículas

++++

Marcações pontuais citoplasmáticas e Complexo

de Golgi

++++

Marcações pontuais citoplasmáticas

++++

Vesículas e retículo endoplasmático

++++

Vesículos e retículo endoplasmático

++++++

Complexo de Golgi

+++++

Retículo endoplasmático, complexo de Golgi e

vesículas

+++++

Retículo endoplasmático, vesículas, membrana

plasmática

+++

Complexo de Golgi e vesículas

++++

Marcações pontuais citoplasmáticas

++++

Complexo de Golgi

+++

Retículo endoplasmático e complexo de Golgi

++++

Vesículas e retículo endoplasmático

+++++

Retículo endoplasmático, vesículas e envoltório

nuclear

++++

Complexo de Golgi

++++

Marcações pontuais citoplasmáticas e vesículas

+++

Complexo de Golgi

Tabela 5. Mapeamentos dos sobrenadantes da produção de anticorpos em larga escala analisados

por imunofluorescência

Número

dos

anticorpos

Intensidade

fluorescência

Local da marcação

20 ++++++ Complexo de Golgi

22 ++++ Retículo endoplasmático, vesículas e complexo de

Golgi

41 - -

69 ++++++ Retículo endoplasmático, envoltório nuclear e vesículas

78 +++ Complexo de Golgi

93 +++ Complexo de Golgi

3.4 Imunofluorescência

Durante as etapas de seleção dos hibridomas foram feitas análises de

imunofluorescência para determinar a localização e intensidade de fluorescência. Na etapa de

clonagem o anticorpo 110 (Tabela 3) mostrou uma ótima marcação para complexo de Golgi.

(FIG. 10). Entretanto este clone perdeu a capacidade de secretar imunoglobulinas.

Na etapa de reclonagem, o anticorpo 93 (Tabela 4) marcou o complexo de Golgi de T.

foetus (FIG. 11), assim como o 20 (Tabela 4), entretanto este último demonstrou marcação

mais intensa (FIG. 12). A marcação e a intensidade de fluorescência deste anticorpo se

mantiveram na etapa de produção de anticorpo em larga escala. Desta forma, o anticorpo 20

foi purificado, dando origem ao anticorpo 20.3 que em trofozoítos de T. foetus observamos

uma marcação restrita ao complexo de Golgi (FIG. 13). Para confirmar que a localização a

qual nos referimos tratava-se realmente do complexo de Golgi, tratamos trofozoítos de T.

foetus com C

-NBD-Ceramida, um marcador específico para esta organela (FIG. 14). A

marcação obtida com este marcador foi semelhante ao descrito nas imunofluorescências com

os anticorpos anti-Golgi aqui produzidos.

Apesar dos anticorpos terem sido produzidos contra T. foetus, nos despertou a

curiosidade de saber se a proteína reconhecida pelo anticorpo anti-Golgi 20.3 poderia ser

conservada e assim reagir com proteínas de outros organismos. Desta forma, realizamos testes

de imunofluorescência em protozoários como T. vaginalis, também membro da Família

Trichomonadidae e nas formas promatigota Leishmania amazonensis e epimastigota de T.

cruzi. Células de mamíferos, representadas aqui pela linhagem de células MDCK também

foram usadas nestes testes.

Em Trichomonas vaginalis (FIG. 15), a marcação obtida no complexo de Golgi foi

semelhante à descrita em T. foetus. Por outro lado, em promastigotas de Leishmania

amazonensis, foi possível verificar que muitos destes parasitos apresentaram marcações

pontuais no citoplasma na região posterior da célula e no envoltório nuclear (FIG.16). Quando

testado em Trypanosoma cruzi (FIG.17), encontramos uma marcação de forma difusa em

apenas algumas células, restrita à região posterior (FIG.17b e f) e ao redor do núcleo

(FIG.17d), sugerindo uma marcação de retículo endoplasmático.

As células MDCKII foram eleitas como representantes de células de mamíferos. Em

células em interfase, observamos uma intensa marcação na região perinuclear e em algumas

vesículas no citoplasma (FIG. 18a). Por outro lado, células em mitose apresentaram uma

marcação disposta em pontos em toda célula, o que é natural em células em mitose (FIG.

18b). Ambas as marcações encontradas são características de complexo de Golgi de

mamíferos, o que nos leva a crer que o anticorpo anti-Golgi 20.3 possa estar reconhecendo

também uma proteína desta organela. As células MDCK também foram tratadas com C

NBD-Ceramida para verificar se a marcação obtida com o anticorpo anti-Golgi 20.3 era

coerente com a localização do complexo de Golgi desta célula (FIG. 19).

Os controles realizados somente com o anticorpo secundário anti-camudongo não

apresentaram marcações para nenhum dos tipos celulares utilizados nas imunofluorescências.

3.5. Imunocitoquímica

Durante a seleção dos anticorpos, foram realizadas imunocitoquímicas (em

microscopia eletrônica de transmissão) utilizando-se alguns anticorpos que apresentaram boa

marcação por imunofluorescência. Na FIG. 20, observamos uma nítida marcação bem

distribuída entre as cisternas do complexo de Golgi de T. foetus utilizando o anticorpo 93

(Tabela 3).

O anticorpo 110 (Tabela 4) apresentou uma marcação intensa na membrana plasmática

e nas cisternas das regiões medial e Trans do complexo de Golgi (FIG. 21). A rede Trans do

Golgi, vesículas e perfis de membrana distribuídos na célula também foram identificados por

este anticorpo. Este tipo de marcação nos leva a crer que a proteína tenha sido marcada ao

longo de seu tráfego pelo Golgi até o seu destino final, na membrana plasmática (FIG. 21). O

fato das primeiras cisternas não apresentarem marcação, pode ser devido a modificações pós-

translacionais sofridas pelas proteínas nas cisternas da região medial. Estas modificações

seriam essenciais para o reconhecimento pelo anticorpo.

Com o anticorpo 20, a marcação em T. foetus se apresentou de forma intensa no

complexo de Golgi, principalmente nas cisternas da região medial, onde se concentrou a

maioria das partículas de ouro (FIGs. 22 e 23). Uma leve marcação nas redes Cis, Trans e em

algumas vesículas também pode ser observada (FIGs. 22 e 23). Na figura 24, observam-se

ainda três Golgi marcados de forma homogênea, sem uma localização preferencial das

partículas de ouro.

Com o anticorpo 20.3 em trofozoítos de T. foetus, a marcação obtida manteve-se

restrita ao complexo de Golgi. (FIGs. 25 e 26).

A imunocitoquímica realizada com as frações do Golgi, utilizando-se os anticorpos

20.3 apresentou a marcação na membrana desta organela. (FIG. 27).

As imunocitoquímicas feitas como controle, sem a presença do anticorpo primário não

tiveram marcação.

3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida

O perfil protéico da fração do complexo de Golgi de T. foetus (FIG. 28), observou-se

24 andas de polipeptídeos com peso molecular entre 14 e 97 kDa. Além disso, foi possível

verificar 5 bandas mais evidentes, as quais apresentam pesos moleculares de 16, 28, 38 74 e

79 kDa (#).

3.7 Immunoblotting

As proteínas do homogeneizado total foram corridas em gel, transferidas para

membranas de nitrocelulose e incubadas com o anticorpo 20.3. O anticorpo 20.3 reconheceu

duas bandas de peso molecular de 60 e 66kDa (FIG. 29).

3.8 Imunoprecipitação

O complexo proteína-anticorpo-proteína A Sepharose foi preparado misturando-se ao

tampão de amostra e aquecido a 95ºC por cinco minutos para desfazer este complexo. Depois,

as amostras foram centrifugadas por 13.000x g, por 2 minutos, para separar as proteínas da

resina, para que pudessem ser aplicadas no gel de poliacrilamida a 12%.

O gel corado com Comassie blue G-250 (FIG. 30) revelou as proteínas resultantes do

processo de imunoprecipitação (IP). As IPs realizadas com o anticorpo 20.3 nas frações PNS,

FG1 (interface 0.8/1.0M) e FG2 (interface 1.0/1.2M), revelaram 5 bandas em cada amostra

(FIG. 30). As proteínas de 60 e 66 kDa, reconhecidas no immunoblotting do homogeneizado

de T. foetus, também foram detectadas nas IPs. Além destas, foram identificadas outras três

proteínas de pesos moleculares de 25, 50 e 73 kDa. No entanto, quando as amostras das IPs

foram submetidas ao immnoblotting, somente quatro bandas puderam ser localizadas nas

amostras PNS e FG2 (25, 50, 60 e 66 kDa) e três na fração FG1 (onde a banda de 66 kDa não

foi revelada) (FIG. 31). Em nenhuma das frações, a banda de 73 kDa foi identificada.

O anticorpo 20.3 foi aplicado no gel de poliacrilamida sem passar pela etapa de

imunoprecipitação, e em seguida, as proteínas foram coradas pela prata, para que servissem

de padrão de peso molecular de IgG (FIG. 32). Assim, as bandas de aproximadamente 25 e 50

kDa presentes em todas as amostras de IP foram classificadas como sendo referentes à cadeia

leve e pesada do anticorpo. Outra banda visível no perfil do anticorpo (FIG. 32) também

apareceu na reação de imunoprecipitação do anticorpo anti-Golgi 20.3 (FIG. 30), que mostrou

uma proteína de peso molecular de 73 kDa.

3.9 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF/TOF)

As proteínas imunoprecipitadas pelo anticorpo anti-Golgi 20.3 foram corridas em gel

de poliacrilamida 12% e coradas com Commasie Blue G-250. As bandas obtidas foram

cortadas e os peptídeos foram extraídos do gel de acordo como descrito no material e

métodos.

As bandas referentes ao peso molecular 25 e 73 kDa, foram identificadas por

espectrometria de massa como sendo as cadeias leve (Tabela 6) e pesada (Tabela 7) da

imunoglobulina.

As massas dos peptídeos da proteína de 66 kDa foram analisadas na forma de espectro

(FIG. 33). Algumas dessas massas foram capazes de gerar seqüências de aminoácidos (Tabela

5), as quais foram analisadas no MASCOT® usando o banco de dados do NCBInt. A

comparação dessas sequências de aminoácidos com os dados do NCBInt, mostrou

similaridade com oito proteínas de T. vaginalis (Tabela 8). Além disso, estas seqüências de

aminoácidos também apresentaram similaridade com de proteínas de outros protozoários

como Leishmania, T. cruzi, T. brucei e Entamoeba dispar (Tabela 9).

igura 33. Espectro das massas dos peptídeos obtidos por de proteínas imunoprecipitadas com o anticorpo anti-Golgi 20.3. Algumas dessas massas foram capazes

de gerar uma seqüência de aminoácido (massas destacadas em amarelo). O pico destacado com a seta corresponde à massa de 1949.7313 que também gerou uma

seqüência de aminoácidos.

899.0 1421.8 1944.6 2467.4 2990.2 3513.0

Mass

(

m/z

)

1858.8

100

% In ten sity

4700 Reflector Spec #1 MC=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)[BP = 1707.7, 1859]

1707.7408

1603.7982

1320.5494

1765.7220

2501.2124

1330.7184

2383.9111

1638.8253

1804.8734

1704.8638

1838.8926

2399.9841

1045.5533

2207.9929

2342.9705

2705.1516

2287.1211

2511.3188

1002.5219

Tabela 5. Massas e seqüências de aminoácidos dos peptídeos das proteínas imunoprecipitadas pelo

anticorpo anti-Golgi 20.3 obtidas através da espectrometria de massa.

Massas Seqüência de aminoácidos

2287.1211 R.VAAYLSSALYYFLFQFQKK.S

1002.5232 R.NQAEAAENR.I

1949.7313 R.YEPGNRYSAEYICSIK.Q

2511.3188 K.LMSPLQAIDGPVKPDWNGASTASR.V

1603.7964 K.RLANLEGGMVDSIGR.T

1330.7277 K.AVSILAKWEGEK.Q

Tabela 6. Proteínas identificadas por espectrometria de massa referente aos peptídeos

extraídos da banda de 25kDa.

Tabela 7. Proteínas identificadas por espectrometria de massa referente aos peptídeos

extraídos da banda de 73kDa.

Nº de acesso

do NCBI

Massa Score Proteína

gi|3114311 23822 91 Chain A, Structure Of Immunoglobulin

gi|4324002

52 Immunoglobulin kappa light chain variable region [Homo

sapiens]

Nº de acesso

do NCBI

Massa Score Proteína

gi|2995714 62074 111 immunoglobulin heavy chain [Mus musculus]

gi|577587 50880 111 mu-immunoglobulin [Mus musculus]

gi|2995712 62162 111 immunoglobulin heavy chain [Mus musculus]

gi|12055400 50697 111

immunoglobulin heavy chain constant region mu [Mus musculus]

Tabela 8. Proteínas de T. vaginalis identificadas no Mascot® database usando o programa

Data Explore

Nº de acesso

do NCBI

Massa Score Proteína

gi|123480482

23620 48

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|154412839 53459 36

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|123454216 70954

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|123437029 82033

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|123482423 79610 32

ankyrin repeat protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|154422277 17989 32

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

gi|154419301 92968 31

Adaptin N terminal region family protein [Trichomonas

vaginalis G3]

gi|123977042 58759 31

hypothetical protein [Trichomonas vaginalis G3]

Tabela 9. Proteínas de diferentes protozoários identificadas no Mascot® database usando o

programa Data Explore

Nº de acesso

do NCBI

Massa Score Proteína

gi|167384862 24045 46 poly [ADP-ribose] polymerase [Entamoeba dispar

SAW760]

gi|71649841 47570 39 hypothetical protein [Trypanosoma cruzi strain CL

Brener]

gi|71423287 146599 38 hypothetical protein [Trypanosoma cruzi strain CL

Brener]

gi|29468373 50556 36 unknown [Trypanosoma cruzi]

gi|154331854 172792 35 hypothetical protein [Leishmania braziliensis

MHOM/BR/75/M2904]

gi|157867484 61990

hypothetical protein [Leishmania major strain Friedlin]

gi|71651138 141181 34 hypothetical protein [Trypanosoma cruzi strain CL

Brener]

gi|71663030 69685 34 hypothetical protein [Trypanosoma cruzi strain CL

Brener]

gi|73537015 78178 32 hypothetical protein [Leishmania major strain Friedlin]

gi|71748890 90169 32 methyltransferase [Trypanosoma brucei TREU927]

gi|72393683 75681 31 hypothetical protein [Trypanosoma brucei TREU927]

100

4. DISCUSSÃO

O complexo de Golgi bastante desenvolvido em tricomonadídeos é um provável

indicador de funções importantes análogas às descritas em outras células (Müller, 1990).

Porém, ainda são poucos os estudos de isolamento e/ou análises bioquímicas voltados para

esta organela. Em 1996, Díaz e colaboradores descreveram uma técnica de isolamento do

complexo de Golgi de T. foetus. Os autores apontaram o fracionamento celular como sendo

uma técnica essencial para a obtenção de dados bioquímicos e para um melhor entendimento

da organização e função das estruturas intracelulares. Foi a partir desta técnica que também se

obtiveram os primeiros resultados da caracterização bioquímica do perfil protéico da fração

do Golgi (DÍAZ & DE SOUZA, 1998). Posteriormente, Almeida e colaboradores (2003)

sugeriram a presença de uma Ca

ATPase no Golgi de T. foetus, após estudos utilizando o

fracionamento celular e inibidores para esta enzima. Estes resultados serviram para confirmar

a presença desta proteína no complexo de Golgi, já demonstrada anteriormente através de

estudos citoquímicos (BENCHIMOL et al., 2001). Isso corroborou para demonstrar o

envolvimento desta organela na regulação de Ca

na célula junto com os hidrogenossomos e

o retículo endoplasmático (BENCHIMOL et al., 2001).

Em estudos do Golgi em células de mamífero, o uso da técnica de fracionamento

celular utilizando gradiente de sacarose para obtenção de uma fração purificada, demonstrou a

capacidade de isolar a maioria das proteínas identificadas do complexo de Golgi

(WEINSTEIN et al., 1982; MOREMAN et al., 1991; DUDEN et al., 1991). Entre estas

proteínas destacam-se enzimas envolvidas no processamento de oligossacarídeos, proteínas de

transporte vesicular e proteínas integrais e associadas à membrana, como: a

galactosiltransferase (GERBER et al., 1979), sialiltransferases (WEINSTEIN et al., 1982), α-

manosidade II (MOREMAN et al., 1991) e a βCOP, uma proteína periférica da membrana do

Golgi (DUDEN et al., 1991).

101

Em T. cruzi, protozoário parasito que apresenta um complexo de Golgi pouco

desenvolvido, o gradiente de sacarose se mostrou eficiente para o isolamento desta organela.

Isto tornou possível a identificação de uma proteína de 58 kDa, a qual os autores sugerem que

a sua função in vivo esteja relacionada ao ancoramento do complexo de Golgi a microtúbulos

do citoesqueleto (MORGADO-DÍAZ et al., 2001), como já descrito em células de mamífero

(BLOOM & BRASHEAR, 1989).

O uso de anticorpos monoclonais tem sido empregado como uma ferramenta

importante para a caracterização de diversas estruturas celulares em protozoários. Em T.foetus

anticorpos monoclonais foram usados para purificar e caracterizar proteínas de superfície

envolvidas na adesão do parasito a célula hospedeira (HODGSON et al.,1990; SHAIA et al.,

1998). Uma nova proteína de atractóforo (estrutura semelhante ao centrossomo), a P477,

também foi descrita após a seleção de anticorpos monoclonais produzidos a partir de um

isolado do citoesqueleto de T. vaginalis (BRIECHEUX et al., 2007). Com o anticorpo

específico os autores conseguiram caracterizar a estrutura da proteína e estabelecer sua

funcionalidade.

Para estudos relacionados com o complexo de Golgi de tricomonadídeos, até o

momento só foram utilizados anticorpos produzidos contra outros organismos ou proteínas

não específicas do Golgi, mas que apresentassem reação cruzada com esta organela. Desta

forma, foi possível determinar através de imunocitoquímica utilizando um anticorpo

policlonal para DNaK de Eschirichia coli, a localização de Hsp70 e Hsp60 no complexo de

Golgi, retículo endoplasmático e nos hidrogenossomos (BOZNER, 1997). Além disso, o

comportamento do Golgi durante a divisão celular de T. vaginalis foi acompanhado por

imunofluorescência utilizando os anticorpos anti-adesina AP51 e AP65 (BENCHIMOL et al.,

2001). Assim, anticorpos produzidos contra o complexo de Golgi de tricomonadídeos são

necessários para se obter informações mais específicas sobre esta organela, como sua

102

composição protéica e funcionalidade. Em 1999, Lingnau e colaboradores realizaram a

técnica de fracionamento celular para obter vesículas endossomais e lisossomais de T. brucei.

Esta fração foi utilizada para produzir anticorpos monoclonais com a finalidade de

caracterizar uma proteína de 85kDa, chamada proteína 1 do Golgi/Lisossomo. Por estudos

imunocitoquímicos foi verificada a localização desta proteína no complexo de Golgi e

lisossoma de T. brucei. Além disso, o anticorpo produzido apresentou reatividade com

Leishmania amazonensis e Toxoplasma gondii, demonstrando que esta proteína possa ter a

função conservada. Neste trabalho seguimos metodologias semelhantes às descritas por

Lingnau e colaboradores (1999), com o objetivo de caracterizar uma proteína do complexo de

Golgi de T. foetus. Assim, obtivemos anticorpos produzidos a partir do isolado do Golgi, que

por sua vez teve sua eficiência comprovada nos ensaios de imunofluorescência e

imunocitoquímica, onde observamos marcações restritas ao complexo de Golgi de

tricomonas, semelhante à marcação observada por Benchimol e colaboradores (2001). Além

disso, o anticorpo anti-Golgi 20.3 reconheceu proteínas de T. vaginalis, L. amazonensis,

T.cruzi e MDCK. Entretanto, a marcação encontrada nos tripanosomatídeos foi bastante

distinta, localizada na região posterior da célula e ao redor do núcleo. Comparado nossos

resultados com aqueles obtidos em estudos utilizando marcadores de retículo endoplasmático

em Leishmania major (KNUEPFER et al.,2001), sugerimos que o anticorpo produzido esteja

reconhecendo uma proteína desta organela. A marcação no retículo endoplasmático destes

protozoários pode ser devido à íntima relação desta organela com o complexo de Golgi. Esta

mistura entre os componentes do RE-Golgi inclusive com o envelope nuclear também foi

observada em Giardia lamblia (SOLTYS et al., 1996), leveduras (VORISEK, 1998) e

Toxoplasma gondii (LINGNAU et al., 1999).

A afinidade dos anticorpos por proteínas do Golgi foi satisfatória para os estudos

bioquímicos, uma vez que estas moléculas foram capazes de reconhecer proteínas na fração

103

purificada desta organela. O fato de o anticorpo mostrar reação em duas bandas no gel de

eletroforese (60 e 66kDa), pode indicar duas proteínas distintas ou uma mesma proteína com

diferentes modificações co- e pós-translacionais, as quais conferem diferentes pesos

moleculares. Estas modificações podem acarretar mudanças na localização, nas interações

moleculares ou ainda nas atividades das proteínas (LARSEN & ROEPSTORFF, 2000). A

presença de cinco bandas nos géis de imunoprecipitação tornou necessária a distinção das

bandas referentes as proteínas do complexo de Golgi e das bandas do anticorpo. Por isso,

realizamos o SDS-PAGE do anticorpo 20.3, onde foi possível verificar que além das bandas

de 25 e 50kDa, a banda de 73kDa também estava presente nesta amostra. Esses dados foram

então confirmados por espectrometria de massa, que identificou as bandas de 25 e 50kDa

como sendo as cadeias leve e pesada da imunoglobulina de camundongo, respectivamente.

Entretanto, a análise da banda de 73kDa também foi identidicada como sendo a cadeia pesada

da imunoglobulina de camundongo. Assim, acreditamos que esta banda possa ser de

imunoglobulinas que não foram totalmente dissociadas ou que estejam conjugadas a alguma

proteína usada na solução onde os anticorpos foram ressuspensos após a etapa de purificação

no processo de obtenção de anticorpos monoclonais.

Para a identificação da proteína reconhecida pelo anticorpo foi necessário combinar a

técnica de fracionamento celular com a espectrometria de massa, obtendo assim, uma

poderosa abordagem para este fim. Normalmente, a proteômica de organelas faz uso de géis

uni- e bidimensionais acompanhados da identificação da proteína por espectrometria de massa

(WU et al., 2004). Entretanto, neste trabalho utilizamos o anticorpo produzido como

ferramenta para isolar a proteína do Golgi por meio da imunoprecipitação, por isso, não foi

necessária a realização do gel bidimensional. Por se tratar de um trabalho novo em T. foetus,

encontramos dificuldades para estabelecer protocolos de purificação e identificação através de

técnicas proteômicas. Uma das maiores dificuldades durante a identificação das proteínas

104

reconhecidas pelo anticorpo do Golgi foi o fato de não existir um banco genômico de T. foetus

disponível. Assim, nossas análises tiveram que ser realizadas com base no genoma de T.

vaginalis, por se tratar do organismo mais próximo filogeneticamente, e que apresenta o

genoma já seqüenciado. Além disso, verificamos neste trabalho que o anticorpo produzido

reconhece também o complexo de Golgi deste protozoário. Desta forma, utilizando os

parâmetros descritos em estudos proteômicos de T. vaginalis (DE JESUS et al., 2007;

CUERVO et al., 2008), conseguimos identificar oito proteínas de T. vaginalis que

apresentaram similaridade com as seqüência de aminoácidos gerados durante a análise por

espectrometria de massa. As proteínas hipotéticas, as quais apresentam funções

desconhecidas, representam grandes candidatas para a exploração de novas funções ou até

mesmo para integrar informações a esta organela. Além disso, a identificação por

espectrometria de massa apontou similaridade com a região N-terminal da adaptina e com

repetições de anquirina. Estas regiões são tidas como domínios conservados de proteínas

presente em todos os organismos, incluindo procariontes, alguns vírus e principalmente em

eucariotos (MOSAVI et al., 2004). As repetições de anquirina agem como suporte para a

interações moelulares, que são extremamente importantes, pois medeiam a interação proteína-

proteína, além de interagir com muitas ouras proteínas como: canais iônicos, moléculas de

adesão celular, tubulina, clatrina e outras (BENNET & CHEN, 2001). Proteínas com

repetições de anquirina localizadas no retículo endoplasmático, sugerem que sua função esteja

relacionada com mudanças morfológicas desta organela ou esteja envolvida na síntese e

transporte de proteínas para o complexo de Golgi (KURIYAMA et al., 1999). Entretanto,

outras abordagens são necessárias para que possamos confirmar estes dados. A derivatização

da proteína, o seqüenciamento manual e a utilização do Q-TOF são metodologias que serão

adotadas para este fim.

105

5. CONCLUSÕES

No presente estudo obtivemos um anticorpo monoclonal que reconhece o complexo de

Golgi de T. foetus, que pode ser usado em trabalhos futuros como uma ferramenta que ajude a

elucidar questões sobre esta organela. Além disso, estabelecemos protocolos de métodos

bioquímicos e proteômicos que podem ser usados não somente no estudo do complexo de

Golgi, mas também de outras estruturas celulares de T. foetus.

106

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