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Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
BIOFERRAMENTA ANALÍTICA:
PRODUÇÃO E DESENVOLVIMENTO
EMPREGANDO ANTICORPO
MONOCLONAL ANTIAFLATOXINA
(HIBRIDOMA AF2 E AF4)
CÁSSIA REIKA TAKABAYASHI
Londrina - PR
2009
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Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
BIOFERRAMENTA ANALÍTICA:
PRODUÇÃO E DESENVOLVIMENTO
EMPREGANDO ANTICORPO
MONOCLONAL ANTIAFLATOXINA
(HIBRIDOMA AF2 E AF4)
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Ciência de Alimentos
Mestranda: Cássia Reika Takabayashi
Orientadora: Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka
Londrina - PR
2009
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BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. Dr. Miguel Machinski Junior
____________________________________________
Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano
____________________________________________
Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka
____________________________________________
Profa. Dra. Elisabete Yurie Sataque Ono
(Suplente)
____________________________________________
Profa. Dra. Emilia Kiyomi Kuroda
(Suplente)
Londrina, 27 de fevereiro de 2009.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia –
Micotoxinas e Ficotoxinas do Departamento de Ciência e
Tecnologia de Alimentos (Centro de Ciências Agrárias) sob
orientação da Profa Dra Elisa Yoko Hirooka, sob auxílio da
Profa Dra Eiko Nakagawa Itano do Laboratório de Imunologia
Aplicada do Departamento de Ciências Patológicas (Centro de
Ciências Biológicas) da Universidade Estadual de Londrina. O
apoio contou com Coodenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior - CAPES, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Projeto n.
47816/2007-0 do Edital MCT/CNPq nº 15/2007 Universal-Faixa
C e Proj. nº 506334/2004-0 do Edital CT-Saúde/MCT/
CNPq/MS n. 030/2004), Fundação Araucária (Proj. nº 04/2006,
Protocolo (FUP) nº 9105), SETI/UGF Unidade Gestora do
Fundo Paraná (CV. 33/04 Prot. nº 88, CP01/2004-
Desenvolvimento Estratégico da Vigilância em Saúde) e
PROPPG/UEL.
Aos meus pais, por sempre acreditar em mim e me
incentivar, mesmo estando longe.
Ao Henrique, por todo amor, compreensão e apoio.
AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Elisa Yoko Hirooka, pela orientação, paciência, incentivo e valiosos
ensinamentos, meus sinceros agradecimentos.
À Universidade Estadual de Londrina e aos professores do Depto.Ciência de Alimentos,
pelos preciosos ensinamentos e colaboração durante o desenvolvimento do Mestrado;
À Chefia e Coordenadoria do Curso de Pós-graduação, pela atenção e colaboração;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela
concessão da bolsa de mestrado e apoio financeiro;
Ao CNPq e SETI-UFG-Fundo Paraná pelo apoio financeiro com os projetos;
Ao Dr. Osamu Kawamura de Kagawa University, Japão, pelo fornecimento de
hibridoma AF2 e AF4, pela orientação e valiosas informações sobre produção de reagentes
imunológicos, sem os quais este trabalho não seria possível;
À Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano, pela valiosa orientação, auxílio no
desenvolvimento técnico, utilização do laboratório de imunologia e empréstimo de materiais
para confecção de coluna de imunoafinidade;
À Profa. Dra. Elisabete Yurie Sataque Ono, pela orientação, apoio e esclarecimentos
de dúvidas no decorrer do trabalho;
À Profa. Dra. Tereza Cristina Rocha Moreira de Oliveira, Elza Youko Ida e Raúl J. H.
Castro-Gómez, pela colaboração e empréstimo de materiais;
Ao prof. Dr. Mario Augusto Ono, pela coloboração tanto em permitir assistir as aulas
de especialização, assim como pelo empréstimo de materiais para realizar eletroforese e a
sua atenção;
Ao prof. Dr. Emerson José Venâncio, por permitir assistir a aula de especialização
sobre assunto relacionado a anticorpo.
Ao prof. Dr. Dilson Ishikawa, pela usa ajuda, principalmente no uso do
espectrofluorímetro;
Às futuras Doutoras e amigas Joice Sifuentes dos Santos e Dani Luce Doro da Silva
pelo apoio, coloboração, os momentos de descontrações e, sobretudo pelas suas amizades;
À Doutora Simone Fujii, pelos preciosos ensinamentos desda época de estágio, apoio,
colaboração, prontidão em esclarecer dúvidas;
À Mestra Luciana Hayashi, que deu início a esse trabalho, pelas preciosas
colaborações, prontidão em esclarecer dúvidas;
À amiga Tatiane Martins de Oliveira pelo auxílio prestado no cultivo de células,
produção de anticorpos e demais experimentos, colaboração, alegria e amizade;
Aos estagiários Jayme de Toledo Piza e Almeida Filho, Waneska Gomes Franco, Ligia
Manoel Martins, Maísa Almeida Leite, Diogo Gimenes Pedrollo e Igor Fernando Escanfelli
da Silva pela colaboração, ajuda, apoio e alegrias;
À amiga Agnes Izumi Nagashima pela alegria, descontrações nos intervalos,
companheirismo e amizade;
Aos colegas Cleiton Ramos, profª Dra. Emilia H. Kuroda e Luciana P. Bernd pelo
precioso apoio, colaboração, dicas, companheirismo e, sobretudo, amizade;
Ao grupo de pesquisa, Angélica Tiemi Ishikawa, Thiago Montagner Souza, Leandro de
Barros Ferrari, Wagner Ezequiel Risso, Carolina Nachi Rossi, Jaqueline Gozzi Bordini,
Tatiana Ávila Miguel, Virgínia Carla de Almeida Falcão;
À Patrícia Sambatti, pela preciosa ajuda no laboratório, com reagentes, pedidos e
favores, carinho e amizade;
A todos os funcionários e técnicos do Depto. Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Nelson, Rubens, Célia, Irene, Alessandra, D. Marília, Sandra Rezende, Berenice e Elza
Youssef, por me prestarem ajuda quando necessário;
Aos pós-graduandos e funcionários do Depto. Ciências Patológicas, em especial a
Luciene Nagashima, Nilson, Mari, Tatiane e Jaqueline pela grande ajudam e colaboração;
Aos amigos e colegas, Luciana Lobato, Franciele Pelissari, Karla B. Guergoletto,
Elisângela A. Ângelo, Andréia C. Santana, Leonardo R. Quintana, Fernanda Darpossolo,
Tatiana Pimentel, Elvis P. Martins, Romilaine M. Nicolau Souza, Gislaine Silveira, Elenir L.
Lobato, Danieli F. Zampieri, Lilian M. Pagamunici, Allan E Wilhelm, Gisele Nobre, Giselle
Onuki, Marciane Magnani, Ana Paula Bilck, Iris L. Ziober, Luiz R. Morioka, Denis F.
Marchi, Luciane Y. Yoshiara, Caroline M. Calliari, Michele Rosset, Cristiane Canan, Kérley
Casari, pelo companheirismo, momentos de descontração e alegria, que suavizaram os dias
árduos de trabalho;
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
AGRADECIMENTO PESSOAL
A Deus, por ter me dado a oportunidade de conviver com pessoas maravilhosas, sendo
fundamental em minha vida e na concretização desta etapa;
Aos meus Pais, Hiromichi e Emilia Emiko Takabayashi, por todo incentivo, apoio,
amor, dedicação e esforços realizados para minha formação profissional, apesar da
distância sempre acreditaram em mim;
Ao André, Alyson e Maitê, meus queridos irmãos e cunhada, pelo apoio, carinho,
compreensão, alegria dedicados a mim;
Ao meu sobrinho Kian, pelas alegrias e saudades que traz a minha vida;
Ao meu querido namorado Henrique Suizu Yamashita, pelo apoio, paciência,
compreensão, força, carinho, amizade, amor e felicidade proporcionados a mim, servindo de
estímulo para a concretização do mestrado, além das correções de português;
Aos meus futuros sogros e sua família, pelo apoio e receptividade a mim e a Alyson;
À Célia de Paulo Proêncio Ribeiro por ser meu apoio na casa, enquanto estava na
universidade;
Ao meu amigo Eder Takeo Sato pelo apoio, principalmente para formatar computador
e amizade nas idas e vindas a Bastos;
Aos meus queridos amigos e parentes, Ângela Cristina K. Loni, Cláudia Larissa S.
Montanher, Natália Cristina S. de Lima, Paula Fernanda F. Artilha, Marco Antônio S. Volso,
Alini B. Cardoso, Aline A. Marchette, Danilo Y. Enoki, Emerson, Eliza S. Utsunomiya,
Francis M. Hayakawa, Letícia S. M de Souza, Natalino Ribeiro e Paula Camila Hayashi que
tanto me deram força, apoio, carinho e amizade, dentro e fora da universidade.
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................................i
ABSTRACT ...............................................................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................................iii
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................iv
1
INTRODUÇÃO...................................................................................................................1
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................3
2.1
A
FLATOXINAS
................................................................................................................3
2.2
M
ETODOLOGIA ANALÍTICA NA DETECÇÃO DE AFLATOXINAS
..........................................7
2.3
I
MUNOENSAIO PARA ANÁLISE DE MICOTOXINAS
...........................................................10
2.4
C
OLUNA DE IMUNOAFINIDADE
.....................................................................................14
2.5
P
RODUÇÃO DE
A
NTICORPO
M
ONOCLONAL
..................................................................16
3
OBJETIVOS......................................................................................................................18
3.2
O
BJETIVOS
E
SPECÍFICOS
...............................................................................................18
4
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................19
4.1
M
ANUTENÇÃO DE HIBRIDOMA LINHAGEM
AF2
E
AF4
PARA PRODUÇÃO DE
I
G
G
ANTI
AFB
1
..............................................................................................................................19
4.2
P
URIFICAÇÃO DE
I
G
G
ANTI
AFB
1
.................................................................................20
4.3
E
XTRAÇÃO DE
AFB
1
PARA ANÁLISE POR IC
-ELISA.....................................................21
4.4
Q
UANTIFICAÇÃO DE
AFB
1
POR IC
-ELISA....................................................................22
4.5
C
ONFECÇÃO DE COLUNA DE IMUNOAFINIDADE
............................................................23
5
CAPÍTULO I .....................................................................................................................25
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFB
1
: PRODUÇÃO IN VITRO VISANDO
DESENVOLVIMENTO DE BIOFERRAMENTAS
MATERIAL
E
MÉTODOS...................................................................................................25
Material..............................................................................................................................25
Linhagem de hibridoma.....................................................................................................26
Cutivo de hibridoma e produção de AcM específico para aflatoxina................................27
Manutenção e recuperação de hibridoma .................................................................................................
27
Contagem e análise de viabilidade celular................................................................................................
28
Produção de AcM IgG em meio sintético Hybridoma-SFM ....................................................................
28
Determinação de proteína (IgG) ........................................................................................29
Determinação de atividade antiAF por i-ELISA ...............................................................29
Purificação parcial de anticorpo monoclonal IgG antiAFB
1
.............................................30
Precipitação com (NH4)
2
SO
4
...................................................................................................................
30
Diálise de proteína....................................................................................................................................
30
Eletroforese em SDS-PAGE..............................................................................................30
ic-ELISA............................................................................................................................31
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO...........................................................................................31
CONCLUSÃO ......................................................................................................................36
6
CAPÍTULO II....................................................................................................................42
IC-ELISA PARA AFLATOXINA UTILIZANDO ANTICORPO MONOCLONAL
ANTIAFB
1
PRODUZIDO POR HIBRIDOMA AF2
MATERIAL
E
MÉTODOS...................................................................................................42
Amostras............................................................................................................................42
Material..............................................................................................................................42
Extração de AF nas matrizes alimentares..........................................................................43
Elisa competitivo indireto..................................................................................................43
Padronização de conjugado AFB
1
-BSA...................................................................................................
43
Padronização de anticorpo........................................................................................................................
43
Preparo de substrato TMB........................................................................................................................
44
Procedimento............................................................................................................................................
44
Limite de quantificação do ic-ELISA.......................................................................................................
45
Análise de interferentes no ic-ELISA.......................................................................................................
45
Recuperação de AFB
1
em matrizes alimentares.......................................................................................
45
CCD para análise de matrizes alimentares para seleção de controle negativo..........................................
45
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO...........................................................................................46
CONCLUSÃO ......................................................................................................................50
7
CAPÍTULO III...................................................................................................................57
COLUNA DE IMUNOAFINIDADE DESENVOLVIDO COM AFFI-GEL 10 E
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFLATOXINA B
1
COMO BIOFERRAMENTA
VISANDO DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE AFLATOXINAS
MATERIAL
E
MÉTODOS...................................................................................................57
Material..............................................................................................................................57
Confecção de CIA para detecção de AFB
1
empregando AcM antiAFB
1
..........................58
Preparação da CIA Affi-Gel 10: acoplamento aquoso .............................................................................
58
Determinação de proteína (IgG) ........................................................................................59
Determinação de proteína pelo método de Bradford.........................................................59
Determinação de atividade antiAFB
1
.................................................................................59
Avaliação da eficiência de imobilização de AcM à CIA Affi-Gel 10...............................60
Determinação da capacidade de retenção de AFB
1
em CIA Affi-Gel 10..........................60
Determinação de AFB
1
por cromatografia de camada delgada.........................................61
Determinação de AFB
1
por espectrofluorimetria ..............................................................61
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO...........................................................................................61
CONCLUSÃO ......................................................................................................................64
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................................71
i
TAKABAYASHI, C. R Bioferramenta analítica: produção e desenvolvimento empregando
anticorpo monoclonal antiaflatoxina (hibridoma AF2 e AF4). 2009. Dissertação (Mestrado em
Ciência de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual de
Londrina, Londrina. Orientadora Profª. Drª. Elisa Yoko Hirooka.
RESUMO
Aflatoxinas (AFs) constituem grupo de metabólitos secundários fúngicos de importância relevante na
segurança de alimentos, com ênfase ao controle de aflatoxina B
1
em commodities da cadeia produtiva
agropecuária. O monitoramento de micotoxinas em alimentos requer método analítico sensível,
específico, exato, preciso e robusto. A análise quantitativa pode ser procedida por métodos químicos
(CLAE, CCD, CG) e imunoquímicos (ELISA). A coluna de imunoafinidade (CIA) emprega anticorpo
específico e, constitui método de escolha para a limpeza e concentração do analito. O estudo propôs
cultivo de hibridoma linhagem AF2 e AF4 para produção de anticorpo monoclonal (AcM) in vitro em
meio RPMI + 15 % de soro fetal bovino (SFB), assim como o mesmo meio com adição gradual de H-
SFM (25, 50, 75 e 100 % H-SFM). A concentração proteica foi avaliada a 280 nm nas etapas de pós-
cultivo, pós-precipitação com (NH
4
)
2
SO
4
e pós-diálise. A produção de AcM por hibridoma AF2
correspondeu à concentração média proteica de 2,94 mg/mL, enquanto que o hibridoma AF4 produziu
2,7 mg/mL. Embora AcM produzido pelo hibridoma AF4 apresente maior especificidade para AFB
1
,
para ensaios posteriores optou-se pelo hibridoma AF2, devido a facilidade no cultivo. Maior produção
de AcM por AF2 ocorreu em cultivo contendo 50, 75 e 100 % H-SFM (eletroforese e i-ELISA em
dialisado pós-precipitado com (NH
4
)
2
SO
4
). Entre estes, o AcM produzido em 100 % de H-SFM (isento
de SFB) e precipitado com saturação de 50 % de (NH
4
)
2
SO
4
apresentou menor teor de interferentes,
sendo portanto, o procedimento indicado para obter Ac de qualidade destinado ao desenvolvimento de
bioferramentas. O AcM produzido foi destinado ao desenvolvimento de ic-ELISA, que apresentou
limite de detecção de 4,95 ng/g. Empregando este ic-ELISA, analisou-se AFB
1
em páprica (03),
paçoca (02), pé de moleque (01) e milho (03), considerando que estas amostras sejam positivas em
análise prévia realizada em Instituto Adolfo Lutz-SP (IAL), Kagawa University-JP (KUJ) e milho
positivo pertencente ao monitoramento realizado no Norte do Paraná-BR. O resultado preliminar em
amostra de milho A5 indicou nível de AFB
1
detectado
por ic-ELISA desenvolvido
(12,8 ng/g)
semelhante ao valor obtido no IAL (19,2 ng/g). O mesmo pode ser inferido perante análise de milho B,
uma amostra altamente contaminado perante ic-ELISA (310,66 ng/g), em relação ao valor detectado
no KUJ empregando CIA-CLAE (333,04 ng/g) e coluna multifuncional-CLAE (296,45 ng/g).
Contudo, principalmente nas amostras de páprica ocorreu reação falso-positivo com superestimação
dos valores devido à intensa interferência de matriz, inviabilizando o uso do ic-ELISA desenvolvido
para este grupo alimentar. Outrossim, para viabilizar a aplicação deste ic-ELISA ainda deve-se
aperfeiçoar a etapa de extração e limpeza de extrato, assim como aumentar a sensibilidade.
Paralelamente, introduziu-se a confecção de CIA empregando AcM produzido, sendo isso também o
primeiro passo para o desafio visando montagem de imunobioferramentas da categoria de biosensores.
A eficiência de acoplamento do AcM antiAFB
1
ao suporte Affi-Gel 10 variou de -8,03 a 80,61 %,
indicando ser altamente promissor para prosseguir introduzindo a montagem de imunobiosensores.
Ainda assim, deve-se prosseguir para a validação de CIA desenvolvida, assim como reutilização,
capeamento e estabilidade visando suporte com alta especificidade, capaz de assegurar a qualidade de
produto desenvolvido. A produção de AcM reduziria a dependência da importação de kits para análise
de micotoxina e consequentemente, o custo da análise no controle de qualidade, constituindo em
técnica alternativa indispensável na triagem de aflatoxinas
em matriz alimentar.
Palavras-chave: aflatoxina, hibridoma, anticorpo monoclonal, ic-ELISA e coluna de imunoafinidade
ii
TAKABAYASHI, C. R Biotechnological tool: production and development using anti-aflatoxin
monoclonal antibody (hybridoma AF2 and AF4). 2009. Master in Food Science - Department of
Food Science and Technology, State University of Londrina, Londrina. Superviser: Prof. Elisa Yoko
Hirooka
ABSTRACT
Aflatoxins (AFs) are a group of secondary fungal metabolites of relevant importance in food safety,
with emphasis on aflatoxin B
1
control in agricultural commodities in the productiveness chain. The
monitoring of mycotoxin in food has to be performed using sensitive, specific, reliable, precise and
robust analytical methods. The quantitative analysis can be carried out using chemical (HPLC, TLC,
GC) and immunochemical methods (ELISA). The immunoaffinity column (CIA) prepared with
specific antibody is the most suitable procedure to clean-up and concentrate the analyte. Purposed
were the cultivation of hybridoma strain AF2 and AF4 aiming in vitro production of monoclonal
antibody (mAb) in RPMI medium + 15 % fetal calf serum (SFB), as well as the same culture medium
gradually added with increasing concentration of H-SFM (25, 50, 75 and 100 % H-SFM). The protein
concentration in post-cultivation, post-precipitation with (NH
4
)
2
SO
4
and post-dialysis steps was
monitored at 280 nm. The mAb produced by hybridoma AF2, which corresponded to the average of
protein level was 2.94 mg/mL, whereas the hybridoma AF4 produced 2.7 mg/mL. Although the
hybridoma AF4 provided highy specific anti-AFB
1
mAb, further assays were performed using
hybridoma AF2, due to easier cultivation. Higher production of mAb by AF2 occurred in culture with
50, 75 and 100 % of H-SFM (demonstrated by i-ELISA and electrophoresis carried out in (NH
4
)
2
SO
4
post-precipitated dialysate). Among these, the mAb produced in 100 % of H-SFM (SFB-free),
followed by precipitation with 50 % saturated (NH
4
)
2
SO
4
showed lower interferent bands. Therefore,
this procedure should be recommended for antibody production aiming development of biotools. The
ic-ELISA with detection limit of 4.95 ng/g was developed using this mAb, and it was applied to
analyse AFB
1
in paprika (03), peanut derived product paçoca (02), pé-de-moleque (01) and corn (03).
They were positive samples previously analysed in Instituto Adolfo Lutz, Sao Paulo (IAL), Kagawa
University, JP (KUJ); the aflatoxin positive corn belonged to the local monitoring sample in northern
Paraná state-BR. The preliminary data of the corn sample A5 by ic-ELISA (12.8 ng/g) detected AFB
1
at similar level obtained in IAL (19.2 ng/g). The same inference could be deduced from highly
contamined maize B analysed by ic-ELISA (310.66 ng/g), when compared with CIA- HPLC (333.04
ng/g) and multicolumn-HPLC data (296.45 ng/g) performed in KUJ. However, mainly the paprika
samples showed false-positive reaction with overestimation due to intense matrix interference,
desabling this ic-ELISA concerning analysis of such food group. Nevertheless, the application of ic-
ELISA in development can be feasible if extraction and clean-up step, as well as the sensitivity were
improved. Additionally, the manufacture of CIA prepared with mAb was challenged, which would be
the first device in assembling immunobiotools of biosensor category. The coupling efficiency of anti-
AFB
1
mAb in Affi-Gel 10 support ranged from -8.03 to 80.61 %, which point out a promising
continuity of research through insertion of CIA as a device of immunobiosensor. Additional
improvement, as well as the validation of prepared CIA, reuse, end-capping and stability aiming
highly specific support, which can assure the quality of developed product is also topic in concern.
The production of mAb enables the reduction of current dependence on importation of kits for
mycotoxins analysis, and then the cost of analysis in food quality control, appointing as an essential
alternative technique in aflatoxin screening in food matrix.
Keyword: aflatoxin, hybridoma, monoclonal antibody, ic-ELISA and immunoaffinity column.
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura de principais aflatoxinas e metabólitos.....................................................4
Figura 2 - Ativação de AFB
1
e conjugação com proteína carreador......................................................12
Figura 3 - Esquema de ic-ELISA............................................................................................................13
Figura 4 - Princípio da coluna de imunoafinidade..................................................................................15
Figura 5 – Reativação, expansão e manutenção dos hibridomas AF2 e AF4 e produção de IgG
antiAFB
1
em meio sintético....................................................................................................................19
Figura 6 – Purificação, armazenamento e diálise de IgG antiAFB
1
.......................................................20
Figura 7 – Extração de AFB
1
em amostra de milho, páprica, paçoca e pé de moleque.........................21
Figura 8 – Quantificação de AFB
1
por ic-ELISA...................................................................................22
Figura 9 – Preparo da coluna de imunoafinidade utilizando suporte Affi-Gel 10 e IgG antiAFB1
produzido................................................................................................................................................23
Figura 10 - Vista microscópica de células de hibridoma após descongelamento e saturação
celular......................................................................................................................................................37
Figura 11 – SDS-PAGE de AcM anti-AFB
1
produzido por hibridoma AF2 e AF4 em diferentes etapas
de cultivo.................................................................................................................................................39
Figura 12- Determinação de atividade antiAFB
1
por i-ELISA dos AcM produzidos por hibridoma AF2
e AF4.......................................................................................................................................................39
Figura 13 – AcM precipitado com (NH
4
)
2
SO
4
para concentração e purificação parcial do AcM..........40
Figura 14 – Curva de ic-ELISA para confirmar o título de AcM (1:2000) comparando com título de
AcM (1:200)...........................................................................................................................................40
Figura 15 – Avaliação da atividade de AcM antiAFB
1
produzidos em meio de 50, 75 e 100 % H-SFM
por ic-ELISA...........................................................................................................................................41
Figura 16 – Determinação da concentração ótima de AFB
1
-BSA empregando i-ELISA......................51
Figura 17 – Determinação do título de AcM antiAFB
1
e concentração de AFB
1
-BSA empregando
ic-ELISA.................................................................................................................................................51
Figura 18 – Curva padrão de ic-ELISA para AFB
1
................................................................................52
Figura 19 – CCD de amostras de páprica, paçoca, pé-de-moleque e milho...........................................52
Figura 20 – Diluição de matriz alimentar visando redução da interferência na determinação de AFB
1
por ic-ELISA..........................................................................................................................................53
Figura 21 – Esquema para confecção de CIA visando análise de AFB
1
, diferenciando a concentração
de AcM, temperatura de acoplamento, temperatura e tempo de bloqueio.............................................65
Figura 22 – CIA confeccionada com antiAFB
1
acoplada a 0,5 ml de Affi-Gel 10................................66
Figura 23 – Esquema da confecção das CIAs ........................................................................................67
Figura 24 – Visualização sob luz UV do CCD das principais fração de metanol eluído.......................69
Figura 25 – Aspecto esbranquiçado e compacto do metanol eluído da CIA confeccionada................70
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Reatividade cruzada de anticorpo monoclonal produzido por hibridoma AF4 e AF2
analisadas por ic-ELISA.........................................................................................................................27
Tabela 2 – Estimação de proteína e atividade antiAFB
1
por hibridoma AF2 e AF4.............................38
Tabela 3 – Recuperação de AFB
1
em matrizes alimentares contaminados artificialmente com solução
de 20 ng AFB
1
/g.....................................................................................................................................53
Tabela 4 – Determinação de AFB
1
em amostras de pápricas, paçocas, pé-de-
moleque e milho por
ic-ELISA...
............................................................................................................................................54
Tabela 5 – Estudo comparativo interlaboratorial de determinação de AFB
1
em amostras de pé-de-
moleque, paçocas, pápricas e milhos e acrescido de concetração de AFB
2
...........................................55
Tabela 6 - Eficiência do acoplamento de IgG antiAFB
1
(%) ao Affi-Gel 10 em CIA
confeccionada.
.......................................................................................................................................68
Tabela 7 - Teste de recuperação de AFB
1
com 10 ng/mL (3 mL) com CIA confeccionadas,
quantificado por espectrofluorimetria (360-420 nm).............................................................................68
1
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui base econômica na agropecuária, sendo grande produtor e
exportador, principalmente de grãos de soja, carne de frango e bovino. O Estado do Paraná se
destaca como produtor de animais, especialmente de frango e será um dos maiores produtores
de cereais, leguminosas e oleaginosas do país na safra de 2009, pelas estimativas do IBGE.
O conhecimento de que micotoxinas podem causar efeitos negativos a humanos e
animais fizeram com que muitos países estabelecessem regulamentações a micotoxinas em
alimentos e rações nas últimas décadas para proteger a saúde humana e os interesses
econômicos dos produtores e comércio.
Dentro do grupo das micotoxinas, destaca-se aflatoxinas que são metabólitos
secundários produzidas por um grupo de fungos, Aspergillus flavus, A
spergillus parasiticus e
Aspergillus nomius; sendo B
1
, B
2
, G
1
e G
2,
os principais análogos estudados. Nos anos 60,
tornou-se evidente que aflatoxinas representam significativa preocupação da saúde pública.
Embora, a contaminação de fungos naturais como Aspergillus, não possa ser eliminada,
exposição a toxinas pode ser minimizadas. Aflatoxina B
1
(AFB
1
) é a toxina mais comum
desse grupo, classificado pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer no Grupo 1,
carcinógeno ao humano.
Para monitorar a presença de micotoxinas em alimentos é necessário métodos de
detecções analíticas que sejam sensíveis, específicos, exatos, precisos e robustos. Um método
desejável além de ter essas características tem que ser de uso fácil, rápido e econômico.
A detecção de micotoxinas envolve a obtenção uma amostra adequada, preparação
de amostra, e procedimentos analíticos. Amostra selecionada deve ser submetida à extração
da toxina e limpeza para retirar interferentes. Posteriormente, o extrato limpo deve ser
submetido a um sistema de detecção para determinar a presença ou quantificar a micotoxina
na amostra. Os procedimentos para quantificação incluem cromatografia de camada delgada
(CCD), cromatografia de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG), fluorimetria,
cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (LC-MS), testes baseados
imunologicamente como imunoensaio enzimático (ELISA), sendo este considerado técnica
alternativa atrativa e promissora para triagem de micotoxinas em alimentos. Os métodos
devem ser validados para garantir que sejam funcionais e precisos.
2
A etapa de limpeza do extrato é crítico na determinação de micotoxinas. A utilização
de anticorpos na coluna de imunoafinodade (CIA) tem se tornado popular devido a sua alta
seletividade, capacidade de extração e remoção de interferentes.
Os anticorpos monoclonais (AcM) produzidos por hibridomas caracterizam-se pela
alta especificidade, uniformidade e afinidade constante a um único epítopo, com produção
contínua e em larga escala.
O desenvolvimento de ic-ELISA e CIA alia a disponibilidade de AcM antiAFB
1
, o
uso reduzido de solventes orgânicos e detecção rápida; visando minimizar o custo da análise
no controle e segurança em alimentos.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aflatoxinas
A contaminação por micotoxinas é um assunto relevante na segurança de alimentos
devido ao efeito tóxico, carcinogênico, teratogênico e imunossupressivo em humanos e
animais (SAHA et al., 2007; TAVČAR-KALCHER, et al., 2007). Uma vez produzidas em
condições específicas, estes metabólitos secundários persistem no armazenamento, assim
como resistem ao processamento, constituindo num perigo natural de maior frequência na
cadeia produtiva de alimento, já que o fungo constitui principal agente de doença em plantas
(ANKLAM et al., 2002; TAVČAR-KALCHER, et al., 2007; MUSCARELLA et al., 2007;
GORYACHEVA et al., 2007).
Dentre as micotoxinas, o grupo de aflatoxinas (AFs) produzido principalmente por
Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius destaca-se, não somente pela maior toxicidade,
mas também pelo perigo de produção desde o estágio de campo, colheita, secagem,
processamento e armazenagem. A contaminação e o acúmulo de AFs são afetados pelas
condições ambientais, com ênfase à temperatura (25-30 ºC) e alta umidade, associada à injúria
causada por inseto e/ou mecânica (CARLSON et al., 2000; JAIMEZ et al., 2000;
CHIAVARO et al., 2001; CHO et al., 2008; DORNER, 2008).
A exposição humana a AFs preocupa a saúde pública, pela ampla possibilidade de
ocorrência numa variedade de alimentos e plantas, envolvendo desde produtos de origem
vegetal como cevada, milho, arroz, feijão, grãos de soja, castanhas, avelã, noz moscada,
pistache, amendoim e derivados, farinha de trigo, figo, tamareira, pimenta, cerveja, sementes
de algodão, copra, batata, sorgo, ervas medicinais, tabaco; a contaminação indireta através dos
produtos de origem animal a exemplo do fígado, carne, leite, ovos e produtos derivados
(JAIMEZ et al.,2000; LEE et al., 2004; EDINBORO & KARNES, 2005; XIULAN et al. ,
2005; IP & CHE, 2006; CAVALIERE et al., 2007; CALLERI et al., 2007; MUSCARELLA
et al., 2007; TANAKA et al., 2007; ARDIC et al., 2008). Além de perigo à saúde, a
contaminação por AFs afeta o valor econômico de culturas agrícolas, bem como reduz a
eficiência na produção animal, aumentando o custo em todos os setores produtivos (SALAY
& MERCADANTE, 2002; LEE et al., 2004).
4
Existem mais de 20 análogos de AFs, sendo os principais B
1
, B
2
, G
1
e G
2
conforme
ocorrência e patogenia. Os metabólitos derivados, resultante da biotransformação hepática de
AFB, a exemplo de AFM
1
e AFM
2
, são detectados em leite e outros fluídos orgânicos (Figura
1) (HUSSEIN & BRASEL, 2001).
Figura 1 - Estrutura de principais aflatoxinas e metabólitos oriundos de
biotransformação hepática (Fonte: LEE, et al., 2004).
AFs são bisfurano cumarinas derivadas de decacetídeo, sintetizada pela via de
policetídeos. A série G difere quimicamente da série B pela presença do anel 3-lactona, ao
invés do anel ciclopentanona. Uma dupla ligação entre carbono 8 e 9 ocorre como vinil éter
no terminal de anel furano em AFB
1
e AFG
1
, mas não em AFB
2
e AFG
2
. Essa pequena
diferença estrutural afeta drasticamente a atividade, aumentando a carcinogenicidade e
5
toxicidade de AFB
1
e AFG
1
em relação aos respectivos análogos AFB
2
e AFG
2
(JAIMEZ et
al., 2000).
A conjugação e rigidez estrutural de aflatoxina conferem característica natural de
fluorescência, sendo que as denominações B e G decorrem de emissão em azul (blue, emissão
cerca de 440 nm) e verde (green, a 460 nm), respectivamente, sob exposição à luz ultravioleta
(360-365 nm). As pequenas variações estruturais têm influência drástica na propriedade
fluorescente, permitindo a distinção visual das AFs, i.e. os análogos AFG
2
e AFB
2
fluorescem
com maior intensidade do que homólogos insaturados AFB
1
e AFG
1
(JAIMEZ et al., 2000;
MARAGOS et al., 2008).
A AFB
1
é a mais tóxica do grupo, classificada pela International Agency for Research
on Cancer (IARC, 2002) no Grupo 1, i.e. carcinógeno ao humano. A toxicidade manifesta-se
pela mutagenicidade, carcinogenicidade e teratogenicidade, dependendo da dose e tempo de
exposição. Efeitos agudos causam danos estruturais e funcionais no fígado devido à necrose
celular, hemorragia, lesões, fibrose e cirrose. Adicionalmente, desencadeiam imunossupressão,
infecção no trato respiratório inferior, hemorragia gastrointestinal, indisposição e febre.
Exposição crônica a AFs pode resultar em câncer hepático, bem como carcinomas em rim,
pulmão, colon e sistema nervoso (COULOMBE, 1993; CARLSON et al., 2000; JAIMEZ et
al., 2000; CHIAVARO et al., 2001; EDINBORO & KARNES, 2005; BINDER et al., 2007).
A susceptibilidade à AFs pode ser atribuída a fatores genéticos: espécie, sexo, raça e
linhagem; fisiológicos: idade, nutrição, outras doenças, presença de outras toxinas e
ambientais: clima, agricultura e tratamento (BRADBURN et al., 1995; CARLSON et al.,
2000). Embora a susceptibilidade humana à AFs não esteja totalmente esclarecida, a alta
incidência de carcinoma hepatocelular no sul da África, sudeste da Ásia, Coreia, Taiwan e
China tem sido relacionado à dieta com elevado teor de AFs, combinada à infecção por vírus
da hepatite B (SYLLA et al, 1999; ANKLAM et al., 2002; LEE et al., 2004;
POLYCHRONAKI, et al., 2008). Entre patogêneses associando ingestão de alimento
contaminado com AFs citam-se a “cirrose infantil indiana”, parcialmente decorrente de
intoxicação por AF e “Síndrome de Reye”, resultando em encefalopatia e degeneração
lipídica de vísceras em criança (JAIMEZ et al., 2000).
A biotransformação de AFB
1
é mediada principalmente pelo citocromo P450
microssomal intra e extra-hepática, embora haja outras conversões. A detoxicação hepática
6
consiste em formação de metabólitos hidroxilados como AFM
1
, AFQ
1
, AFP
1
, AFB
2a
(Figura
1) com potencial mutagênico inferior à AFB
1
; em contraste, a ativação de AFB
1
gera AFB
1
-
8,9-epóxido altamente instável e reativo (COULOMBE, 1993; ORSI et al., 2007).
A ação carcinogênica e mutagênica de AFB
1
decorre de alta afinidade eletrofílica e
reatividade de AFB
1
-8,9-epóxido a nucleófilos celulares como DNA, com ataque nucleofílico
ao átomo N
7
de guanina (GROOPMAN et al., 1984; COULOMBE, 1993). Os indícios
mostram que AFB
1
seja indutora de mutação no códon 249 em gene p53 supressor de tumor e,
ocorre nas maioria das hepatocarcinomas (LEE et al., 2004).
AFB
1
-8,9-epóxido pode ser enzimaticamente inativada por glutationa (GSH), sendo
uma importante via de desintoxicação em várias espécies animais. Vias de conjugação com
sulfato e ácido glicurônico também participam neste processo, sendo excretado através de
urina (COULOMBE, 1993).
Aflatoxina M
1
(AFM
1
) originada pela hidroxilação de AFB
1
em fígado animal
corresponde a aproximadamente 1 a 3 % de AFB
1
ingerida e é conhecida como “toxina do
leite” por ser a principal via de excreção, sendo eliminada dentro de algumas horas após a
ingestão (ARAÚJO, 1990). AFM
1
é menos carcinogênico e mutagênico que AFB
1
, mas com a
toxicidade aguda similar a outras AFs. IARC classifica esta toxina no grupo 2B, i.e. possível
carcinógeno ao humano
(
IARC, 2002). O perigo reside no caráter relativamente estável ao
processo térmico de pasteurização e esterilização, mantendo-se durante o preparo e estocagem
de produtos derivados (MUSCARELLA et al., 2007). Em consideração à importância na dieta
humana, principalmente na nutrição infantil, a AFM
1
em produtos lácteos tem sido motivo de
preocupação à saúde pública perante segurança alimentar (CUCCI et al., 2007; FINK-
GREMMELS, 2008).
Agências governamentais têm estabelecido rigorosos programas para regulamentar
os níveis de AFs permitidos em alimentos e rações, visando evitar exposição humana
(AKIYAMA et al.,2001; XIULAN et al., 2006; VAN EGMOND et al., 2007). O limite de
tolerância para AFs varia conforme país importador ou exportador, blocos comerciais, bem
como matrizes alimentares (ANKLAM et al., 2002).
A Comunidade Europeia estabeleceu limite de 2 µg/kg para AFB
1
e 4 µg/kg para a
soma de aflatoxinas (B
1
+B
2
+G
1
+G
2
) em amendoim, nozes em geral, frutas secas e cereais.
7
Para espécies de pimenta, decretou tolerância de AFB
1
em 5 µg/kg e, 10 µg/kg para AFs
totais; 0,05 ng/L para AFM
1
no leite em geral, exceto leite para bebê e leite de transição
(Regulamento (CE) 1881/2006, 2006).
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA regulamentou o
limite máximo tolerável de AF total (B
1
+B
2
+G
1
+G
2
) em 20 µg/kg para milho, amendoim e
derivados; 0,5 µg/L para AFM
1
em leite fluído; 5,0 µg/L para leite em pó (Resolução RDC
274, 2002).
2.2 Metodologia analítica na detecção de aflatoxinas
Detecção rápida de micotoxinas ou fungos produtores é um fator crucial no controle
de qualidade e monitoramento, tendo em vista à necessidade do cumprimento de acordos
comerciais e prevenção de perigo a saúde populacional (ANKLAM et al., 2002). O
monitoramento de AFB
1
em alimento e ração depende de métodos analíticos precisos e exatos,
fato este confrontante em países em desenvolvimento, responsável pela produção de matéria-
prima alimentar (XIULAN et al., 2006; VAN EGMOND et al., 2007).
A análise de micotoxinas geralmente segue etapas de amostragem, homogeneização,
extração e limpeza-concentração de extrato (BERTHILLER et al., 2007). Amostragem
adequada é um ponto crucial para obter informação sobre níveis de contaminação, devido à
distribuição heterogênea de contaminação. I.e., num lote normalmente ocorre baixa unidade
de sementes contaminadas, porém estas apresentam níveis extremamente elevados de toxinas
(VAN EGMOND et al., 2007; DORNER, 2008; KRSKA et al., 2008).
A separação dos analitos de interesse é comumente alcançada por técnicas
cromatográficas, seguida de detecção por métodos físico-químicos e imunoquímicos. A
cromatografia tem como vantagem separar inúmeros analitos, enquanto que método
imunoquímico utiliza anticorpos altamente específicos (BERTHILLER et al., 2007).
Métodos analíticos tradicionais para a detecção de AFs empregam coluna
cromatográfica, partição líquido-líquido, ou adsorção química para remover componentes
interferentes. A quantificação é geralmente realizada após separação por cromatografia de
8
camada delgada (CCD) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), seguida de
detecção fluorimétrica (BRADBURN et al., 1995, XIULAN et al., 2006).
A CCD frequentemente destina-se à triagem de micotoxinas, devido à simplicidade e
praticidade. O método é realizado em placas de sílica gel, sendo AFs detectadas por
comparação do spot de amostras com padrão de toxinas sob luz UV (análise semiquantitativo),
ou densitometria. No primeiro caso, a precisão e confiança dos resultados dependem da
habilidade e experiência do técnico (STROKA & ANKLAM, 2000, 2002; STROKA et al.,
2000).
CLAE é atualmente o método mais empregado para análise de micotoxinas, estando
acoplado a várias estratégias de detecção (EDINBORO & KARNES, 2005). Na separação de
AFs pode empregar tanto o sistema CLAE de fase normal ou reversa. Todavia, a fase reversa
é mais frequente pela facilidade de manipulação, assim como menor toxicidade de fase móvel
aquosa (JAIMEZ et al., 2000; CALLERI et al., 2007).
A propriedade fluorescente de AFs permite empregar sistema de detecção mais
sensível e seletivo baseado em fluorescência. A principal inconveniência é a fluorescência de
AFs (B
1
,B
2
,G
1
,G
2
) dependente da composição de solvente. Diferentes processos de
derivatização têm sido testados, incluindo a derivatização pré-coluna com ácido
trifluoroacético (TFA), ou derivatização pós-coluna com agentes como cloramina T, iodo e
bromo ativos. Beta-ciclodextrina intensifica a fluorescência de anéis furanos insaturados de
AFB
1
, podendo ser utilizada como agente derivatizante pós-coluna, ou aditivo eluente em
CLAE (JAIMEZ et al., 2000; CALLERI et al., 2007).
Embora a CLAE seja intensamente empregada, denota-se o aumento no uso de CCD
através de alta performance (HPTLC) para análise de AFs. Embora a precisão de CCD seja
inferior a CLAE, os dados obtidos por HPTLC são similares a CLAE e mais consistentes que
ensaio ELISA (JAIMEZ et al., 2000).
Cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (LC/MS) vem
ocupando espaço entre métodos espectrométricos, sem necessidade de manipulação pós-
coluna (EDINBORO & KARNES, 2005), além de aumentar a seletividade e sensibilidade
(outrossim, detecção por fluorescência ainda tem sido mais sensível para AFs) (KRSKA et al.,
9
2008). A última geração de LC-MS/MS com ionização por eletrospray (ESI) permite análise
de extrato bruto de planta sem limpeza prévia (BERTHILLER et al., 2007).
CLAE-MS/MS permite detectar e quantificar os componentes polares sem
derivatização. Outras vantagens incluem baixo limite de detecção, habilidade de gerar
informações estruturais do analito exigindo mínimo tratamento da amostra, aliado a
possibilidade de abranger diversos analitos de diferentes polaridades e exclui tendência de
erro decorrente de derivatização e etapas de limpeza, diminuindo o tempo de análise.
Espectrômetros de massas são detectores que não dependem somente das características
químicas como absorvância em UV ou fluorescência. A desvantagem atual ainda está no
custo elevado de análise (BERTHILLER et al., 2007; KRSKA et al., 2008).
A necessidade da implementação de novos métodos rápidos, compartilhando
simplicidade com sensibilidade e precisão é evidente. No contexto, as bioferramentas tendem
a compartilhar a alta especificidade de sistemas biológicos com a diversidade eletrônica,
química e engenharia (TOMA, 2008).
A introdução de tecnologias emergentes em métodos rápidos para a detecção de
resíduos tóxicos consiste principalmente de sistemas baseados em anticorpo (Ac). Os métodos
imunoquímicos surgiram como alternativa biotecnológica para minimizar o custo de análise,
com destaque atual à coluna de imunoafinidade para limpeza. A advinda de biosensores
destaca o Ac entre sensores que combina a atividade seletiva de elemento biológico sensível
ao analito de interesse. O avanço introduziu novas modalidades de imunosensores
eletroquímicos, imunoensaio de fluorescência polarizada, microarrays, os quais empregam
anticorpo monoclonal-AcM marcado com cromóforo fluorescente e imunoensaios baseados
em membranas como sondas dipstick, flow-through assay e lateral flow test. A química
analítica isenta de solventes tóxicos e equipamentos sofisticados tem sido a meta do
desenvolvimento de biotecnologia aplicada ao controle de resíduos, protegendo os analistas e
evitando a contaminação ambiental. Estas biotecnologias emergentes para resíduos tóxicos
dependem de anticorpos extremamente selecionados, assim como da produção irrestrita de
AcMs (CARLSON et al., 2000; DALY et al., 2000; SCHNERR et al., 2002; DELMULLE et
al., 2005; SAPSFORD et al., 2006; KRSKA et al., 2008).
Xiulan et al. (2005 e 2006) desenvolveram a imunocromatografia capaz de acelerar
o procedimento analítico, além de permitir realização de teste sem manejo de reagentes
10
orgânicos altamente voláteis e tóxicos. Permitindo ensaio em uma etapa, não requendo
separação de anticorpo do complexo antígeno-anticorpo. A estimação semiquantitativa é
obtida através de quantificação por reação enzima-substrato.
Aparelhos promissores baseados em técnicas físicas não-destrutivas constituem
outro sistema atraente, principalmente para o monitoramento em escala portuária e industrial,
já que diferindo de métodos analíticos químicos, permitem disponibilizar ao mercado os
produtos diretamente analisados perante perigo. Em nível de triagem, destaca-se as técnicas
fundamentadas em método espectroscópico no infravermelho próximo ou médio,
espectroscopia fotoacústica associada e infravermelho com transformada de Fourier; estes não
determinam a própria toxina, mas indica probabilidade de contaminação no material analisado.
Outrossim, deve-se salientar que a aplicação desse tipo de técnica é ainda limitada para
triagem, devido à alta interferência dos componentes de matriz alimentar, além da
disponibilidade reduzida de materiais certificados para calibração (ANKLAM et al., 2002;
KOS et al., 2002; MAIER et al., 2004; KRSKA et al., 2008). Recentemente, Fernández-
Ibañez et al. (2009) demonstraram o potencial uso de método espectroscopia no
infravermelho próximo (NIRS) para rápida detecção de AFB
1
em cereais.
2.3 Imunoensaio para análise de micotoxinas
Os imunoensaios constituem ferramentas bioanalíticas de abrangência universal, seja
na área de ciências básicas como aplicada, sendo indispensável no diagnóstico clínico, cuja
utilidade se estendeu para outras áreas como biotecnologia, ciência de alimentos, incluindo
análise, microbiologia, nutrição, controle de qualidade e de processo (FUJII et al., 2004).
Entre os métodos imunoquímicos, o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
se destaca entre os pioneiros na detecção rápida visando análise rotineiro de micotoxinas
(ANKLAM et al., 2002; CALLERI, 2007; XIULAN et al., 2006). Diversos imunoensaios
ELISA têm sido comercialmente disponibilizados para uma variedade de micotoxinas,
incluindo detecção de aflatoxinas, ocratoxinas, fumonisinas, zearalenona, deoxinivalenol,
citrinina e toxina T-2 (PITTET, 2005; KRSKA et al., 2008). Método de ELISA é uma
alternativa simples e econômica a métodos instrumentais químicos em constante avanço,
11
sendo indicado para a triagem rápida na análise de micotoxinas em matrizes alimentares
(KOLOSOVA et al., 2006; PRIETO-SIMÓN et al., 2007).
A imensa variabilidade de reagentes comerciais depende da qualidade de Acs
selecionados para a obtenção do imunorreagente; portanto, especificidade, sensibilidade e
reatividade-afinidade de Ac destinado à produção de kits contra mesma micotoxina varia
conforme grupo técnico-científico responsável pela inovação e desenvolvimento para a
Empresa.
A baixa complexidade e massa molecular de micotoxinas conferem baixa
imunogenicidade, deste modo, são incapazes de estimular o sistema imune isoladamente. Não
obstante, as micotoxinas precisam ser conjugadas covalentemente a uma proteína carreadora
para se tornarem imunógenas. Assim, T-2 toxina, ocratoxina, citrinina e aflatoxinas
apresentando diferentes grupos funcionais resultam em diferentes ligações químicas a
moléculas carreadoras (CHU & UENO, 1977; XIAO et al., 1995).
Por exemplo, a AFB
1
requer introdução de grupo carboxílico para conjugação com
moléculas carreadoras (Figura 2). Esse grupo pode ser ativado e liga-se covalentemente ao
grupo amina de proteína para formar ligação amida estável. Primeiramente, AFB
1
é
convertido a AFB
1
-О-carboximetil-oxime (Afla B
1
-oxime) (CHU & UENO, 1977); a seguir,
diferentes conjugados AFB
1
-proteína podem ser preparados reagindo AFB
1
-oxime com
albumina de soro bovino (BSA), ovalbumina (OVA), keyhole limpet hemocyanin (KLH) e
gama globulina bovino (BGG) (CHU & UENO, 1977; GROOPMAN et al., 1984;
HEUSSNER et al., 2007). Assim como, AFB
1
pode ser conjugada com molécula carreadora,
na posição da dupla ligação entre carbono 8 e 9 da molécula e por fim apresentar produção de
anticorpo de afinidade diferente. A especificidade do anticorpo a ser produzido tem influência
do hapteno usado para se tornar imunógeno e o método para conjugar o hapteno a molécula
carreadora (FRUTOS, 1995).
12
Figura 2 - Ativação de AFB
1
e conjugação com proteína carreadora (Fonte: UENO et al.,
1987) .
Assim, a modalidade de ELISA indicada para proceder à determinação de
micotoxinas seria o competitivo indireto (ic-ELISA), cujo protocolo de ensaio requer somente
um Ac específico (FUJII et al., 2004).
O princípio de ic-ELISA fundamenta-se na competição entre micotoxina presente na
amostra com a toxina imobilizada na microplaca, perante o mesmo sítio específico do Ac. A
concentração de toxina na amostra é indiretamente quantificada pela reação procedente de Ac
específico antimicotoxina absorvido à superfície sensibilizada, que atua como sítio de ligação
ao anti-IgG (Ac secundário) marcado com enzima, responsável pela reação colorimétrica
(Figura 3).
13
Figura 3 - Esquema de ic-ELISA (Fonte: ONO et al., 2004).
As principais vantagens de imunoensaio são a especificidade na detecção - devido à
seletividade de ligação anticorpo-antígeno, rapidez, simplicidade e adaptabilidade; sendo a
reação realizada numa microplaca com capacidade de análise simultânea para dezenas de
amostras (LEE et al., 2004; SAHA et al., 2007; KRSKA et al., 2008). Além disso, a maioria
de protocolos não requer uma limpeza de amostras após diluição do extrato e/ou filtração
antes da análise (PITTET, 2005).
Entretanto, as limitações consistem na manutenção da integridade estrutural de Ac
utilizado, já que se tratando de proteína, a desnaturação pode resultar em baixa
reprodutibilidade, devido a perda de afinidade específica; somam-se ainda a possibilidade de
resultado falso-positivo devido à reação cruzada, i.e. ligação do Ac com constituintes
interferentes e/ou inibição da atividade da enzima dependendo de matrizes alimentares,
implicando na necessidade de procedimentos confirmatórios (ANKLAM et al., 2002; LEE et
al., 2004; PITTET, 2005; CALLERI et al., 2007; PRIETO-SIMÓN et al., 2007; CHO et al.,
2008). A interferência de matriz pode ser minimizada procedendo diluição prévia do extrato,
ou incluir processo de limpeza antes do ensaio (ONO et al., 2000; FUJII, 2002).
14
2.4 Coluna de imunoafinidade
A melhora na eficiência e sensibilidade de métodos tradicionais imunológicos e
instrumentais, seja ELISA, CCD ou CLAE, requer preparo de amostras anteriormente às
respectivas análises, i.e. fornecer extrato suficientemente limpo, capaz de permitir detecção e
quantificação adequada do analito. O processo de extração empregando coluna de fase sólida
preparado com suporte contendo sítios ativos de caráter químico (sílica gel, C-18, florisil,
fenil, aminopropil, material de troca iônica tanto aniônico como catiônico) ou Acs
(imunoafinidade), têm simplificado a etapa de limpeza e/ou concentração de analitos de
interesse a partir de uma mistura complexa. O processo empregando Acs usa volume de
solvente não clorado relativamente pequeno; permite a automação, sendo menos tóxico,
reduzindo tempo de análise e aumentando o rendimento (BRADBURN et al., 1995;
RHEMREV-BOOM et al., 2001; FUJII et al., 2004; XIULAN et al, 2006; NICHOLAS et al.,
2009) .
A atual tendência indica o uso da coluna de imunoafinidade (CIA) na etapa de
limpeza e pré-concentração de amostra para análise de micotoxinas. CIA ideal deve limpar o
extrato alimentar, reduzindo-se os interferentes da matriz em nível mínimo, além de
proporcionar rapidez, facilidade no manuseio e pouco ou nenhum uso de solvente orgânico
(SANCHEZ et al., 2007; CHO et al., 2008; KRSKA et al., 2008).
CIA emprega Ac covalentemente ligado ao suporte (sílica, poli-etilenoimina,
hidrazida e CNBr-Sepharose ativada 4B ou agarose), para fornecer extração seletiva de
analito presente em mistura complexa de um matriz alimentar (RHEMREV-BOOM et al.,
2001; EDINBORO & KARNES, 2005). A afinidade de ligação entre Ag-Ac é determinada
pela interação hidrofóbica, ligação eletrostática, força de Van der Waals e ligação de
hidrogênio, sendo todos afetados pela característica conformacional e eletrônico, seja de Ag
ou Ac (HOLTZAPLLE et al., 1996).
O processo de limpeza ocorre pela retenção seletiva do analito (ex., micotoxina) ao
Ac imobilizado na coluna, seguido de eluição com solvente apropriado (Figura 4). Já é de
conhecimento que a afinidade de ligação na CIA pode ser afetada por fatores como pH,
concentração de sal e ligação competitiva (IP & CHE, 2006).
15
Coluna de
imunoafinidade
com AcM
específico
imobilizado.
Extrato de amostra
com micotoxina é
eluído através da
coluna.
AcM retém a
micotoxina na
coluna. Os
interferentes são
eliminados.
O eluente rompe a
ligação Ag-Ac e
libera a
micotoxina.
micotoxina interferentes
Figura 4 - Princípio da coluna de imunoafinidade (Fonte: R-BIOPHARM RHÔNE
Ltd., USA).
A limitação da coluna comercial é falha na regeneração e reutilização, sendo que os
fabricantes recomendam o uso descartável, com aplicação de apenas uma amostra por coluna.
Com o intuito de minimizar o custo de análise, determinados autores sugeriram a regeneração
da CIA utilizando tampão fosfato salina (PBS) pH 7,4, seguida de manutenção da coluna
úmida por pelo menos 24 horas a 4 ºC antes de reutilização (KONDO et al., 2000;
RHEMREV-BOOM et al., 2001; CALLERI et al., 2007; FUJII, 2007).
Rhemrev-Boom et al. (2001) testaram a estabilidade de CIA perante análise de
estradiol (solução padrão e amostras) procedendo determinação semanal por 6 meses; a
coluna armazenada a 4-8 ºC manteve ativa, com mínima degradação do Ac. Sanchez et al.
(2007) desenvolveram CIA para detectar herbicida triclopyr capaz de manter a taxa de
recuperação na faixa de 80 % após 30 usos.
Nakajima et al. (1990) reportou o reuso de CIA antiocratoxina A por mais de 30
vezes sem perder a atividade de ligação do anticorpo acoplado, sendo após o uso a coluna
lavada com tampão Tris-HCl 1 M (pH 8,5) com NaCl 0,5 M e tampão acetato de sódio 0,1 M
(pH 4,5) com NaCl 0,5 M e armazenado a 4 ºC.
16
Miyamoto (2007) desenvolveu CIA para analisar AF, em que conseguiu reutilizar 8
vezes a coluna sem alterar a taxa de recuperação (abaixo de 90 % de recuperação da toxina),
executando a regeneração da coluna com metanol e PBS.
2.5 Produção de Anticorpo Monoclonal
A técnica de hibridoma desenvolvida por Köhler & Milstein (1975) permitiu a
produção ilimitada de anticorpo monoclonal (AcM) caracterizada pela alta especificidade,
uniformidade e afinidade constante a um único epítopo. O hibridoma é gerado pela fusão de
esplenócitos secretores de Ac com célula de mieloma (TIZARD, 1995; ROITT et al.,1997).
Kawamura et al. (1988) utilizaram camundongo BALB/c imunizadas com conjugado AFB
1
-
BSA, para obter células esplênicas secretora de IgG. A fusão destes linfócitos sensibilizados
com células de mieloma linhagem SP2/0-AG14 permitiu obtenção de hibridomas, que foram
selecionados em meio HAT (meio Dulbecco´s modified Eagle´s, contendo 100 µM de
hipoxantina, 0,4 µM de aminopterina e 16 µM de timidina) e triados por ELISA não-
competitivo indireto perante presença de AcM antiAFB
1
.
Anteriormente, a produção em massa de AcMs era obtida inoculando hibridomas
selecionados em cavidade ascítica de rato ou camundongo. A prática de tecnologia in vitro
ocorreu pela preocupação ética, assim como reduz a necessidade de pessoas com experiência
em manejar animais (ILAR, 1999; HEILMANN et al.,2005). Métodos in vivo para produção
de AcMs causam dor e sofrimento aos animais, além de conter proteínas animais e outros
contaminantes, requerendo etapas de purificação (ILAR, 1999).
O potencial de produção em larga escala de AcM destinado a aplicação visando
diagnóstico, terapia e outros interesses tecnológicos estimulou a melhoraria do processo
baseado no cultivo de hibridoma em meio artificial (TINTÓ et al., 2002.; BIRCH &
RACHER, 2006). Sendo uma opção economicamente viável e segura a produção em grande
escala (mais de 100 mg de AcM) no sistema de produção in vitro (ILAR, 1999).
Atualmente, o soro animal ainda é adicionado no meio de cultura para dar suporte a
multiplicação de diversos tipos celulares visando produção de AcM. O soro bovino fetal
(FBS) confere fatores hormonais de estimulação e proteínas para transporte de hormônios,
17
minerais, lipídios, entre outros (AYBAY& IMIR, 2000; LEGAZPI et al., 2005; EVEN et al.,
2006).
A técnica de cultivo celular pode ser aperfeiçoada pela remoção completa de soro
animal do meio de cultura, a exemplo de Hybridoma-serum free médium (H-SFM) (LEGAZPI
et al., 2005; EVEN et al.,2006). O meio de cultura livre de soro fornece benefícios técnicos e
segurança, já que reduz a probabilidade do perigo de contaminação oriundo de material
biológico como príon, vírus e micoplasma. Sendo meio de composição definida, permite
controle de multiplicação celular, facilita purificação de AcM por conter menor teor de
componentes interferentes, diminuindo o custo de imunorreagente produzido (LEGAZPI et al.,
2005; EVEN et al., 2006).
A produção de AcM tem permitido o desenvolvimento de métodos imunoquímicos,
como ELISA, que é uma alternativa para análise de triagem de micotoxinas em amostras;
assim como, de CIA, utilizada na etapa de limpeza e concentração do analito. Ambos visam
minimizar o custo e tempo de análise no controle e segurança em alimentos.
18
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Produzir anticorpo monoclonal antiaflatoxina utilizando hibridoma AF4 e/ou AF2,
fornecido pelo intercâmbio com o grupo de Kagawa University, Japão. Assim como, usá-lo
como bioferramenta para análise de AFB
1
em matriz alimentar, desenvolvendo ic-ELISA e
CIA.
3.2 Objetivos Específicos
♦ Cultivar e manter hibridoma secretor de AcM IgG específico para aflatoxina;
♦ Produzir IgG antiAFB
1
procedendo cultivo de hibridoma em meio sintético,
seguido de concentração e purificação;
♦ Padronizar imunoensaio ic-ELISA para análise de AFB
1
em matriz alimentar;
♦ Avaliar a eficiência de ic-ELISA em amostras de matriz positivas para AFB
1
;
♦ Confeccionar CIA empregando IgG antiAFB
1
e Affi-Gel 10.
19
4 MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia executada no transcurso da pesquisa foi esquematizada sob forma de
fluxogramas, conforme apresentado abaixo. O procedimento técnico, redigido em detalhes,
foi inserido em cada capítulo descrito posteriormente.
4.1 Manutenção de hibridoma linhagem AF2 e AF4 para produção de IgG antiAFB
1
Figura 5 – Reativação, expansão e manutenção dos hibridomas AF2 e AF4 e produção de IgG
antiAFB
1
em meio sintético.
Reativação celular
(Meio RPMI 1640 + 30% SFB + 2mM Glutamina + 23 mM
NaHCO
3
+ 10 mM HEPES + 40 µg/mL Gentamicina
37 ºC, 5% CO
2
)
• Descongelamento rápido (37 ºC)
• Lavagem (meio RPMI 1640)
• 200 x g – 5 min
Hibridoma linhagem AF4 e AF2
(
-
185
ºC, SFB:DMSO (9:1))
Viabilidade celular
(microscopia)
Determinação proteica
(Absorvância 280 nm )
Produção de IgG antiAF
Sobrenadante do cultivo (IgG)
Armazenado(4º C)
Avaliação da presença de AcM
antiAFB
1
(i-ELISA)
Expansão celular
(Meio RPMI 1640 + 15% SFB + 2mM Glutamina + 23 mM
NaHCO3 10 mM HEPES + 40 µg/mL Gentamicina – 37 ºC,
5% CO
2
)
Adaptação celular - gradual
(Meio Hybridoma-SFM +Meio RPMI 1640 + 15% SFB +
2mM glutamina +100U/mL penicilina +100µg/mL
streptomicina – 37 ºC, 5% CO2)
Expansão celular
(Meio Hybridoma-SFM + 2mM glutamina +100U/mL
penicilina +100µg/mL streptomicina – 37 ºC, 5% CO2)
Manutenção celular
(congelamento
-
185 ºC)
20
4.2 Purificação de IgG antiAFB
1
Figura 6 – Purificação, armazenamento e diálise de IgG antiAFB
1
produzido em meio
sintético.
•
Agitação lenta / 18 h / 4 ºC
Armazenagem (4 ºC)
Solução de AcM
40, 50 ou 60 % de saturação
de (NH
4
)
2
SO
4
Diálise:
• PBS pH 7,3
• H
2
O ultra-pura
Descongelamento
PBS (± 3mL)
Avaliação da presença de AcM
antiAFB
1
(i-ELISA)
Determinação proteica
(Método a 280 nm )
Precipitação e purificação parcial de IgG
8000x g / 30 min / 4 ºC
Avaliação da presença de AcM
antiAFB
1
(i-ELISA)
Determinação proteica
(Absorvância 280 nm )
Congelamento (-85 ºC)
21
4.3 Extração de AFB
1
para análise por ic-ELISA
Figura 7 – Extração de AFB
1
em amostra de milho, páprica, paçoca e pé de moleque
(RIDASCREEN® Aflatoxin Total)
•
Secagem N
2
/ 50 ºC
•
Agitação 150 rpm
•
10
min
2 g amostra
10 mL metanol:H
2
O
(70:30, v/v)
Ressuspensão
PBST:metanol 2,5%
100 µL da solução
Filtragem
(papel tipo Whatman n º1)
ic-ELISA
22
4.4 Quantificação de AFB
1
por ic-ELISA
Figura 8 – Quantificação de AFB
1
por ic-ELISA (KAWAMURA et al., 1988 adaptado).
•
Incubação: 1 h / 25 ºC
•
Incubação: 1 h / 25 ºC
• Lavagem: 6 x PBST
•
Incubação: 18 h / 4 ºC
• Lavagem: 4 x PBST
•
Incubação: 1 h / 25 ºC
• Lavagem: 5 x PBST
•
Incubação: 1 h /37 ºC
• Lavagem: 4 x PBST
Sensibilização: 100 µL AFB
1
-BSA
(100 ng/mL)
Bloqueio: 200 µL PBS-OVA 0,1%
Substrato cromógeno:
100 µL TMB
100 µL IgG anti-mouse-HRP (1:1000)
Competição:
50 µL amostra ou padrão AFB
1
+ 50 µL IgG antiAF (1:200)
Solução de Parada: H
2
SO
4
1M
Leitura 450 nm
ELISA COMPETITIVO INDIRETO
(KAWAMURA et al., 1988,
adaptado)
23
4.5 Confecção de coluna de imunoafinidade
Figura 9 – Preparo da coluna de imunoafinidade utilizando suporte Affi-Gel 10 e IgG
antiAFB
1
produzido.
• i-ELISA
•
Bradford
•
Lavagem: 3 x H
2
O ultra-pura a 4
ºC
(350x g, 1 min, 4
ºC)
(cent
•
Agitação orbital / 1 h /25 ºC
• 350x g, 1 min, 4 ºC
•
Agitação orbital / 18 h / 4 ºC
• 350x g, 1 min, 4
ºC
•
AFFI-GEL 10
4 mg de IgG/ mL de gel
Armazenagem
PBS com 0,1% NaN
3
(4º C)
Lavagem (350x g, 1 min, 4 ºC) :
10 x com PBS
Bloqueio:
Etanolamina-HCl 1 M pH 8,0
(1:1 de gel)
24
Os material e métodos detalhados, assim como os resultados foram redigidos sob
forma de capítulos para publicação, listados abaixo:
CAPÍTULO I
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFB
1
: PRODUÇÃO IN VITRO VISANDO
DESENVOLVIMENTO DE BIOFERRAMENTAS
CAPÍTULO II
IC-ELISA PARA AFLATOXINA UTILIZANDO ANTICORPO MONOCLONAL
ANTIAFB
1
PRODUZIDO POR HIBRIDOMA AF2
CAPÍTULO III
COLUNA DE IMUNOAFINIDADE DESENVOLVIDO COM AFFI-GEL 10 E
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFLATOXINA B
1
COMO BIOFERRAMENTA
VISANDO DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE AFLATOXINAS
25
5 CAPÍTULO I
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFB
1
: PRODUÇÃO IN VITRO VISANDO
DESENVOLVIMENTO DE BIOFERRAMENTAS
MATERIAL E MÉTODOS
Material
AcM antiAFB
1
(linhagem AF2 com 133 % de reatividade cruzada com AFB
2
e
linhagem AF4 com 122 % de reatividade cruzada com aflatoxicol) previamente preparado por
Kawamura et al. (1988); AFB
1
padrão (cat. no. A6636), AFB
1
-BSA (cat. no. A6655),
anticorpo IgG anti-mouse-HPR (cat. no. A4416), etanolamina-HCl (cat. no. 18674-0),
glicina-etil-éster (cat. no. G650-3), ovalbumina (cat. no. A5378), TMB líquido (3,3',5,5'-
tetramethyl-benzidina) (cat. no. T0440), coomassie brilliant blue R (cat. no. B0630), corante
vital Azul de Trypan (cat. no. T6146), saco para diálise (membrana de celulose)
(cat. no.
D9777), reagente de Bradford (cat. no. B6916), DMSO estéril (cat. no. D260) (Sigma
Chemical Co., USA); microplaca de 24 orifícios, criotubo (Corning, USA); filtro de
microfibra de vidro (GF/C 2,5 cm i.d) (Whatman International Ltd., UK); meio RPMI 1640
(cat. no. 31800-04), meio Hybridoma-SFM (serum free medium)
(cat. no. 12300-067) soro
fetal bovino (SFB) (cat. no. 312657-029), penicilina-estreptomicina líquido (5000 U/mL de
penicilina G e 5000 µg/mL de estreptomicina) (cat. no. 15070-063), L-glutamina (cat. no.
21051-024) (Gibco Co., USA); sulfato de amônio (Sigma-Aldrich, Inc.,, USA, cat. no. A5132
e Synth, Brasil, cat. no. S1051.01.AG); frascos para cultivo de células de 25, 75 e 150 cm
2
(TPP, Suiça); tubo de centrífuga 50 mL (Labcon, Petaluma, USA); membrana GS em éster de
celulose (0,22 µm de poro, 2,5 mm i.d.) (Millipore Corp., USA); HEPES (ácido N-(2-
hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfónico) (Acros Organics, USA, cat. no. 7365-45-9);
sulfato de gentamicina (80 mg/mL) (Schering Corporation, USA); metanol grau HPLC (J.T.
Baker, USA); marcador molecular BenchMarkTM Protein Ladder (Invitrogen, USA, cat. no.
10747-012); ácido acético glacial (Synth, Brasil); água ultrapura (Purelab® Classic UF, Elga
Labwater Global Operation, UK); recipiente para congelamento de criotubos (Bio Freezing
Vessel, Bicell, Nihon Freezer Co., Japão) agitador magnético (Fisatom,Brasil); banho a 37 ºC;
26
banho ultrassônico (Ultrasonic cleaner Unique); câmara de Neubauer (Inlab, Brasil);
centrífuga (EV:250-M, Evlab, Brasil); centrífuga refrigerada (Centrifuge 5804 R, Eppendorf,
3805 03551, Alemanha); cuba para eletroforese (Mighty Small II SE 250/SE260, Hoefer
Pharmacia Biotech, Inc., USA); espectrofotômetro UV-VIS Cintra 20 (GMB, Brasil); freezer
(-85 ºC) (CFC FREE, Sanyo, USA); fluxo laminar (Clean Plus CL FV-09, Veco, Brasil);
homogeneizador (BHS-30, Benfer, Brasil); homogeneizador de tubo (Lab Dancer S25, IKA®
Work, Inc., Alemanha); incubadora sob 5 % CO
2
(modelo 3110, Forma Scientific, USA); N
2
gasoso; leitora de ELISA (Bio-Tek Instruments ELX800, USA); microscópio invertido
(Lamba LGD2, ATTO Instruments Co., China); peagâmetro (Digimed DM-22, Digicrom
Analítica Ltda, Brasil); recipiente de nitrogênio líquido a -185 ºC (Cryo Diffusion, França).
Linhagem de hibridoma
O hibridoma linhagem AF4 e AF2 secretor de AcM específico para AFB
1
(isotipo
IgG
1
lambda), derivada de mieloma linhagem SP2/0-AG14 e célula esplênica de camundongo
BALB/c, foram produzidas por Kawamura et al. (1988) em Faculty of Pharmaceutical
Sciences, Science University of Tokyo e, mantidas em Department of Biochemistry and Food
Science, Faculty of Agriculture, Kagawa University, Japão.
O hibridoma AF4, secretor de AcM IgG
1
antiAFB
1
, foi selecionado para uso,
baseado no melhor perfil perante especificidade a AFB
1
e menor reatividade cruzada com as
demais aflatoxinas. O hibridoma AF2 foi selecionado pela maior viabilidade celular durante o
cultivo e manutenção a -85 ºC. A tabela 1 apresenta o perfil da reatividade cruzada de AcM
produzido pelo hibridoma AF2 e AF4 perante análogos de AFB
1
.
27
Tabela 1 - Reatividade cruzada de anticorpo monoclonal produzido por hibridoma linhagem
AF4 e AF2 com análogos de AFB
1
, analisadas por ic-ELISA.
Aflatoxina % reatividade cruzada
AF4
AF2
B
1
100 100
B
2
2,3 133
G
1
3,4 13,4
G
2
2,4 14,7
AFL I
a
14,1 2
AFL II
b
122 5,5
M
1
4,5 0,9
Q
1
10,8 >0,5
P
1
>1,3 0,9
B
2a
>1,3 >0,5
a
AFL I, isômero natural de [1S]-aflatoxicol
b
AFL II, isômero natural de [1R]-aflatoxicol
ic-ELISA: Ensaio imunoenzimático indireto competitivo
Fonte: KAWAMURA et al., 1988.
Cutivo de hibridoma e produção de AcM específico para aflatoxina
Manutenção e recuperação de hibridoma
Os hibridomas estocados a -185 ºC em nitrogênio líquido foram recuperados por
descongelamento rápido do criotubo em banho a 37 ºC, lavados com 10 mL de meio RPMI a
37 ºC e centrifugados (200x g, 5 min). Descartado o sobrenadante, as células foram avaliadas
microscopicamente com corante vital Azul de Trypan e a viabilidade celular pós-
congelamento foi calculada e expressa em porcentagem:
Viabilidade (%) = células viáveis pós-congelamento x 100
células viáveis pré-congelamento
Em seguida, as células foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 (RPMI) com
30 % SFB, 2 mM de L-glutamina, 23 mM de bicarbonato de sódio, 10 mM de HEPES e
40 µg/mL de gentamicina, para estimular a recuperação do hibridoma congelado. O cultivo
28
procedeu-se em microplaca de 24 orifícios e frasco de 25 cm
2
a 37 ºC com 5 % CO
2
.
Posteriormente, procedeu a expansão celular para frascos de cultivo de 25, 75 e 150 cm
2
,
assim como diminuição gradativa de SFB até 15 % no meio RPMI.
Uma parte do cultivo reativada e expandida (RPMI com 15 % de SFB) foi
preservada em SFB contendo agente crioprotetor dimetil sulfóxido (DMSO) na proporção 9:1
(v/v) em N
2
líquido a -185 ºC (HARLOW & LANE, 1988a; KAWAMURA, informação
pessoal, Kagawa University). Assim, as células foram centrifugadas (200x g, 5 min) e
ressuspensas em solução de SFB:DMSO (9:1) resfriada a 4 ºC. Alíquotas de 0,5 mL desta
suspensão contendo 2,5 x 10
6
a 2,5 x 10
7
células/mL foram introduzidas em criotubos e
mantidas a -85 ºC por 24 h em recipiente para congelamento lento (Bio Freezing Vessel,
Bicell, Nihon Freezer Co., Japão), sendo posteriormente transferidas para um recipiente
contendo N
2
líquido (-185 ºC).
Contagem e análise de viabilidade celular
Uma alíquota de 100 µL da suspensão celular foi combinada a 100 µL da solução de
corante vital Azul de Trypan (0,25 % em meio RPMI, p/v) e as células viáveis (refringentes,
com citoplasma homogêneo e membrana íntegra) contadas em câmara de Neubauer (x100).
Células viáveis/mL = Total de células viáveis x 2 x 10
4
Número de quadrantes
Produção de AcM IgG em meio sintético Hybridoma-SFM
Os hibridomas cultivados em meio RPMI com 15 % de SFB (37 ºC, 5 % de CO
2
)
foram adaptados em meio Hybridoma-SFM (serum free médium, H-SFM, Gibco Co., USA),
adicionando gradualmente 25, 50 e 75 % de H-SFM suplementado com 2 mM de L-
glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina (HEUSSNER et al., 2007;
KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University).
A produção de AcM foi realizada em cultivo estático por aproximadamente 15 dias
sem reposição de meio, até morte celular. O sobrenadante de cultivo contendo os AcM IgG
29
antiAFB
1
foi centrifugado (2400x g, 10 min, 4 ºC) para remover material celular. O volume
total do sobrenadante foi avaliado quanto à concentração proteica a 280 nm e atividade
antiAFB
1
.
Determinação de proteína (IgG)
A concentração proteica (IgG) foi determinada a 280 nm, adotando coeficiente de
absorção (E
280
) de 1,35 para IgG (HARLOW & LANE, 1988b):
IgG (mg/mL) = absorvância a 280 nm
coeficiente de absorção
Atividade antiAF por i-ELISA
Presença de IgG antiAF
produzido nos sobrenadantes de meio sintético RPMI e
Hybridoma-SFM foi determinado por i-ELISA (Ensaio imunoenzimático indireto), sendo o
protocolo similar ao descrito por Kawamura et al. (1988). As microplacas foram
sensibilizadas com 100 µL de AFB
1
-BSA (2,5µg/mL, tampão Carbonato-Bicarbonato 0,1M
pH 9,6) e incubadas a 4 ºC por 18 h. Após 3 lavagens com PBST (PBS + 0,05 % Tween 20),
as placas foram bloqueadas com 200 µL solução ovalbumina 0,1 % em PBS e incubadas por 1
h a 37 ºC. Após 3 lavagens com PBST, adicionou-se 100 µL de sobrenadante do cultivo ou
dialisado e incubadas a 25 ºC por 1 h. Após 4 lavagens com PBST, adicionou-se 100 µL de
conjugado anti-IgG de camundongo marcado com horseradish peroxidase diluído a 1:10
3
em
PBST e incubadas a 25 ºC por 1 h. Após 5 lavagens com PBST, adicionou-se 100 µL da
solução de substrato cromógeno TMB por 30 min a 25 ºC e, a reação enzimática
interrompida com 50 µL de H
2
SO
4
1M e absorvância lida a 450 nm.
30
Purificação parcial de anticorpo monoclonal IgG antiAFB
1
Precipitação com (NH
4
)
2
SO
4
O sobrenadante de cultivo com Ac antiAF foi adicionado de (NH
4
)
2
SO
4
sob agitação
lenta até concentração final de 40, 50 ou 60 % de saturação para precipitação e purificação
parcial de IgG. O precipitado proteico obtido foi mantido a 4 ºC por 16 h sob agitação,
centrifugado (8000x g, 30 min, 4 ºC), transferido para tubo limpo e mantido a -85 ºC
(KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University).
Diálise de proteína
Para uso, o concentrado proteico precipitado com (NH
4
)
2
SO
4
foi descongelado e
dissolvido em menor quantidade possível de PBS (adicionar 1-2mL de PBS para o precipitado
oriundo de 500 mL de sobrenadante, para obter concentração aproximada de 4,0 mg/mL de
AcM). A diálise (cut-off de 12000-16000 MM, tamanho 25 mm x 16 mm) foi realizada
empregando-se PBS (4 x 1 L) a 4 ºC por 16 h. A solução de AcM parcialmente purificada foi
dialisada em água ultrapura (4 x 1 L) para remoção de (NH
4
)
2
SO
4
. A concentração proteica
(IgG) foi determinada no sobrenadante pós-precipitação com (NH
4
)
2
SO
4
e pós-diálise e
atividade do AcM averiguado por i-ELISA.
Eletroforese em SDS-PAGE
Para avaliar a pureza e quantidade de AcM produzido por hibridoma AF4 e AF2 no
meio RPMI e H-SFM foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE),
descrita por Laemmli (1970). O AcM (1 mg/mL) foi diluído em tampão de amostra 3 vezes
concentrado e, alíquota de 3,75 µL, correspondente a 2,5 µg de proteína, foi aplicada no gel
paralelamente com 5 µL do padrão de marcador molecular (BenchMark
TM
Protein Ladder,
Invitrogen, USA). O gel de concentração (stacking) foi de 5 % de acrilamida, enquanto que de
corrida (running) foi 10 %. Após corrida por 1h sob 20 mA, o gel foi corado com solução de
31
Coomassie blue (Coomassie Brilliant Blue R, Sigma, USA) e descorado com ácido
acético:metanol:H
2
0 (1:4:5), para a visualização e distinção de bandas proteicas.
ic-ELISA
A capacidade da ligação de AcM antiAFB
1
ao antígeno específico (AFB
1
) foi
analisada por ELISA competitivo indireto (KAWAMURA et al., 1988). As microplacas
foram sensibilizadas, bloqueadas e lavadas conforme descrito para i-ELISA. Após a etapa de
bloqueio e lavagem, adicionou-se 50 µL de AFB
1
padrão nas concentrações de 0 a 200 ng/mL
seguida 50 µL de AcM antiAFB
1
(1:2000 em PBST), e agitou-se levemente a placa. Após
incubação a 25 ºC por 1h, as placas foram submetidas a 5 lavagens com PBST. As etapas
posteriores foram executadas conforme anteriormente descrito para i-ELISA.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A viabilidade celular pós-descongelamento rápido de hibridoma AF2 (mantida a
-185 ºC desde 06/04/2004) e AF4 (desde 11/08/2006) foi de 4,27 % e 3,97 %,
respectivamente. Os fatores prejudiciais relevantes à viabilidade celular consistem da
exaustão de nutrientes, acúmulo de compostos indesejáveis provenientes do metabolismo,
restrição de oxigênio e CO
2
devido ao longo período congelado (LEGAZPI et al., 2005).
Soma-se ainda, o uso de DMSO como agente crioprotetor, capaz de injuriar células devido à
interação com membrana celular. A toxicidade de DMSO aumenta em temperatura alta,
portanto recomenda-se adicionar DMSO em soro (1:9) mantido a 4 ºC e imediatamente iniciar
o processo de congelamento (WEWETZER & DILMAGHANI, 2001). Recomenda-se o
congelamento lento mantendo os criotubos em recipiente para congelamento (freezer -85 ºC
por um dia, antes de armazenar a -185 ºC), mas o descongelamento em banho a 37 ºC e
centrifugação devem ser rápidos, devido à toxicidade de DMSO.
No contexto hibridoma AF4 cultivado na Universidade de Kawaga, Japão,
apresentou viabilidade de 80 % (KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University).
32
Portanto, a baixa porcentagem de viabilidade celular observada neste estudo provavelmente
decorreu de fatores inerentes de condições do nosso Laboratório, ainda em processo de
adaptação. Embora os resultados apresentassem baixo valor de viabilidade pós-
criopreservação (Figura 10), a contagem de 4,2 x 10
5
células viáveis/mL para AF2 e
5,45 x 10
5
células viáveis/mL para AF4, permitiu o prosseguimento para a etapa de expansão
celular.
A produção de AcM iniciou-se com o cultivo de hibridoma AF4 (recuperação e
expansão), pela capacidade de produzir Ac com maior especificidade para AFB
1
(KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University). Todavia, o cultivo não pode ser
prosseguido à etapa de adaptação no meio H-SFM, devido à dificuldade na multiplicação
celular, além de não sobreviver no meio com SFB reduzido para 10 %, embora fosse possível
nos estudos anteriores (HAYASHI, 2007; FUJII, 2007).
Assim sendo, optou-se pelo cultivo da linhagem AF2 para prosseguir com os ensaios,
pela maior estabilidade e facilidade na multiplicação in vitro (meio RPMI ou H-SFM). Não
obstante, justifica-se a vantagem de meio H-SFM na produção de AcM, já que permite
multiplicação celular mesmo em cultivo sem SFB (LEGAZPI et al., 2005; EVEN et al.,2006),
i.e. eliminaria presença de diversos componentes oriundos de próprio soro, facilitando a
purificação e garantindo a qualidade do reagente produzido.
Outrossim, o desenvolvimento de meio ideal destinado a finalidades específicas
visando obtenção de produto celular tem sido processo empírico em contínuo avanço (CHU &
UENO, 1977; GROOPMAN et al., 1984; KAWAMURA et al., 1988.; CANDLISH et al.,
1989; HOLTZAPPLE et al.,1996; KONDO et al., 2000; FUJII, 2007; HAYASHI, 2007;
HEILMANN et al., 2007; HEUSSNER et al., 2007). A exemplo, o cultivo em RPMI iniciou-
se simplesmente tamponando o meio com bicarbonato de sódio; a adição de HEPES auxiliou
o tamponamento do meio RPMI, garantindo maior tempo de estabilidade por manter pH
fisiológico, mesmo sob mudança na concentração de CO
2
devido a respiração celular (BAICU
& TAYLOR, 2002).
No nosso ensaio introduziu-se 40 µg/mL de gentamicina no meio RPMI, para inibir a
contaminação bacteriana durante o cultivo. Apresentando vida-média de 15 dias no meio de
cultura a 37 °C, o uso recomendando de até 50 µg/mL de gentamicina tem favorecido a
expansão celular (HARLOW & LANE, 1988a).
33
Salienta-se a importância da suplementação de meio RPMI com SFB na recuperação
e expansão do hibridoma, por conferir fatores hormonais de estimulação e proteínas para
transporte de hormônios, minerais, lipídios e outros fatores naturais essenciais na
multiplicação celular (AYBAY & IMIR, 2000; LEGAZPI et al., 2005; EVEN et al., 2006). A
L-glutamina destaca-se como substrato fundamental no cultivo de hibridoma, constituindo-se
em fonte primária de nitrogênio (LEGAZPI et al., 2005; OKESON & RILEY, 2001). A
exaustão de glutamina no meio de cultura pode cessar a multiplicação de hibridoma
(OZTURK & PALSSON, 1991).
Paralelamente, o desenvolvimento de meio H-SFM visou eliminar problemas
inerentes ao uso de SFB, i.e. diminuir o custo do reagente e perigo de contaminação perante
determinados patógenos microbianos como príon, vírus e micoplasma (LEGAZPI et al., 2005;
EVEN et al., 2006). Em adição a benefícios técnicos e de segurança, sua composição de
caráter definida permite controle no desenvolvimento de cultivo celular, principalmente
perante facilidade na purificação de AcM (LEGAZPI et al., 2005; EVEN et al.,2006).
Assim, o crescimento inicial de hibridoma em 100 % de meio RPMI foi adaptado
através de adição gradual de meio H-SFM suplementado com L-glutamina, penicilina e
estreptomicina na sequência de 25, 50, 75 e 100 %. Para confirmar a capacidade produtora de
IgG antiAFB
1
em hibridoma recuperado, assim como a produtividade de AcM em 100 % de
meio RPMI antes de prosseguir adaptação e, melhoramento do cultivo adicionando H-SFM,
procedeu-se i-ELISA (Tabela 2).
A produção estimada de proteína (Tabela 2), pureza (Figura 11) e avaliação da
atividade antiAFB
1
de AcM produzido (Figura 12) foram analisadas no sobrenadante de
cultivo da linhagem AF2 e AF4.
AcM de alta pureza pode ser obtido por cromatografia de troca iônica, ou separação
por afinidade empregando proteína A ou G (ZOLA & BROOKS, 1982). Não obstante, Fujii
(2007) obteve baixa recuperação de antiOTA produzida pelo hibridoma OTA 1 utilizando
coluna de proteína G (27,96 %), em relação a recuperação de 83,78 % obtida por precipitação
com (NH
4
)
2
SO
4.
Além disso, ocorreu maior redução na atividade antiOTA pós-purificação
através da coluna de proteína G (atividade de 62,42 %), em relação à precipitação com
(NH
4
)
2
SO
4
(80,82 %). Portanto, procedeu-se a concentração e purificação parcial do AcM
precipitando somente com (NH
4
)
2
SO
4
(Figura 13). O (NH
4
)
2
SO
4
remove a molécula de água
34
de proteína, diminuindo a solubilidade e causando precipitação, aliado ao processo simples de
baixo custo (HARLOW & LANE,1988c).
Conforme Tabela 2, adicionando 40 % de (NH
4
)
2
SO
4
em sobrenadantes de cultivo do
hibridoma AF2 em 100 % de RPMI, assim como adicionado de 25, 50 e 75 % de H-SFM,
obteve precipitação satisfatória. Entretanto, a mesma saturação de (NH
4
)
2
SO
4
não permitiu
precipitação adequada de sobrenadante em cultivo com 100 % de H-SFM (precipitado
delgado e frágil sem aderência ao tubo). Aumentando a saturação de (NH
4
)
2
SO
4
para 50 %
ocorreu formação de precipitado consistente, onde se concentrou maior atividade antiAFB
1
,
embora o sobrenandante ainda mantivesse turvo (1ª precipitação, Tabela 2). Assim, neste
sobrenadante turvo adicionou-se (NH
4
)
2
SO
4
até 60 % de saturação, obtendo-se precipitação
parcial (2ª precipitação, Tabela 2). Segundo Harlow & Lane (1988c), a maioria de outros
componentes séricos não precipitam na faixa de 40 a 50 % de saturação, tornando
inexpressiva a distinção destas concentrações. Miyamoto (2007) testando precipitação de
AcM antiAFG produzido no meio H-SFM com 40, 50 e 60 % de (NH
4
)
2
SO
4
, obteve melhor
resultado com 60 % de saturação. Outrossim, os nossos resultados apontaram melhor
rendimento empregando 50 % de saturação.
Os precipitados foram estocados a -85 ºC, sendo descongelados a 4 ºC somente no
momento de diálise para evitar a desnaturação proteica, devendo-se evitar congelamento pós-
diálise, já que ocorre perda drástica de atividade (HAYASHI, 2007).
A Tabela 2 também analisa o teor proteico estimado a 280 nm, obtido no decorrer
das etapas de pós-cultivo, pós-precipitação com (NH
4
)
2
SO
4
e pós-diálise. O hibridoma AF2
produziu em média, 2,94 mg/mL de proteína e AF4, de 2,7 mg/mL. Maior teor estimado de
proteínas (9,88 mg/mL em 100 % RPMI e 10,88 mg/mL em 25 % H-SFM) ocorreu em
cultivo contendo maior proporção de RPMI, indicando interferência de SFB na leitura a
280 nm. Em contraste, cultivos em meio contendo maior proporção de H-SFM apresentou
menor teor proteico (2,29 e 1,80 mg/mL em 100 % H-SFM 1ª e 2ª precipitação,
respectivamente), e pode-se inferir que este corresponda ao valor equivalente mais próximo à
concentração real de anticorpo produzido. Em suma, o processo de produção de AcM
empregando hibridoma AF2 atingiu valor estimado de 385 mg de proteína total, sendo que
maior atividade antiAFB
1
ocorreu no cultivo empregando maior proporção do meio H-SFM.
35
Eletroforese em SDS-PAGE foi realizada para analisar a pureza de AcM produzido
em cada etapa do cultivo utilizando meio RPMI e H-SFM (Figura 11). O uso de
mercaptoetanol (agente redutor) no preparo das amostras (IgG) rompe as pontes dissulfeto,
separando em cadeias pesadas (50 kDa) e cadeias leves (25 kDa) (BOENISCH, 2001). O
resultado confirma presença das bandas de ± 55kDa e ± 25kDa, principalmente em 100 % 1ª
precipitação, 75 % e 50 % de H-SFM. Nas outras amostras (RPMI, 25 % e 100 % 2ª
precipitação H-SFM) as bandas das cadeias do IgG não são evidentes, uma hipótese dessa
ocorrência seria devido o IgG produzidos estar em menor concentração em relação as outras
proteínas presentes ou não houve a quebra do anticorpo, já que pode se visualizar bandas em
± 150 Da.
O perfil eletroforético mostrou várias bandas inespecíficas precipitadas pelo
(NH
4
)
2
SO
4
, mas não correspondente ao anticorpo. Segundo Harlow & Lane (1988c), este sal
também precipita outras proteínas de alta massa molecular, bem como proteínas podem aderir
ao precipitado floculante, aumentando impurezas adicionais. Além disso, essas bandas
inespecíficas podem ser originarias de resto celulares, devido o cultivo do hibridoma até
morte visando obter maior quantidade de anticorpo.
Após a realização de eletroforese em SDS-PAGE foram escolhidos AcM produzidos
em meio 100 % H-SFM (1ª precipitação), 75 % e 50 % H-SFM para proceder ic-ELISA e
confirmar capacidade de ligação os AcM antiAFB
1
ao antígeno específico (AFB
1
).
Antes de ic-ELISA, procedeu-se i-ELISA com as soluções dialisadas (diluição de
1:20 a 1:10
6
de Ac) (Figura 12). Assim, pôde estimar 50 % da máxima ligação dos anticorpos
produzidos e ser o título empregado no ic-ELISA (em torno de 1:2000). A diluição 1:2000
inferida (corresponde a 1,145 µg/mL da solução 100 % 1ª precipitação H-SFM), foi testada
com uma menor diluição (1:200, correspondente a 11,45 µg/mL) a fim de verificar a sua
veracidade e proceder a realização de ic-ELISA (Figura 14), tendo resultado positivo desse
título (1:2000) para reação do imunoensaio. As soluções 50 e 75 % também foram diluídas
1:2000 e no i-ELISA os perfis das curvas foram semelhantes.
O ic-ELISA mostrou que 100 % 1ª precipitação, 50 e 75 % H-SFM apresentam um
adequado perfil de atividade antiAFB
1
(Figura 15), sendo apropriados para aplicá-los como
bioferramentas para desenvolvimento de métodos para detecção de AF empregando anticorpo.
36
CONCLUSÃO
O domínio de princípios biológicos básicos é fundamental para a inovação
tecnológica envolvendo bioferramentas. O sucesso depende de cuidados e detalhes críticos,
que viabilizam o cultivo de hibridoma produtor de AcM tendo como meta a produção
ilimitada de Ac destinado à primeira etapa do desenvolvimento de técnicas imunoquímicas. A
introdução de meio sintético como H-SFM isento de SFB permite obtenção de reagente com
maior pureza, baixo custo e menor perigo; a produção em condição nacional possibilitaria
autossuficiência perante reagentes essenciais no diagnóstico rápido dependente de kits
importados, contribuindo na qualidade e segurança de alimentos.
37
Figura 10 - Vista microscópica (microscópio de fase invertida, aumento de 400x) de células
de hibridoma em meio RPMI, (a) após descongelamento rápido em banho a 37 °C, com
contagem inicial (em torno de 4,2 x 10
5
) (b) Saturação celular, após 3-4 dias de cultivo (5 x
10
5
a 1 x 10
6
células/mL).
(b)
(a)
38
Tabela 2 - Produção estimada de proteína - IgG produzido e atividade antiAFB
1
por hibridoma AF2 e AF4 em diferentes fases de cultivo.
Hibridoma Absorção a 280 nm (mg/mL)
i-ELISA
Volume total coletado ou
ressuspendido (mL)
Estimação de Quantidade de
Proteína (mg) *
Quantidade
de tubo
Linhagem Meio de cultura (%)
Pós-
cultivo
Pós-
(NH
4
)
2
SO
4
Pós-
diálise
(Pós-
diálise)
Pós-
cultivo
Pós-
(NH
4
)
2
SO
4
Pós-
diálise
Pós-
cultivo
Pós-
(NH
4
)
2
SO
4
Pós-
diálise
(pós- (NH4)
2
SO
4
)
- 85°C
AF2 RPMI (100)
a
3,68 22,38 9,88 +
750 5 11
682,50 111,90 108,68 4
H-SFM (25)
a
3,67 21,60 10,88
+
600 5 9
734,00 108,00 97,92 3
H-SFM (50)
a
2,92 12,65 5,70 +
580 3 6
426,67 37,95 34,20 3
H-SFM (75)
a
2,56 7,73 3,32 +
500 3 6
320,00 23,19 19,92 6
H-SFM (100)
b
1,86 5,70 2,29 +
860 3 6
266,60 17,10 13,74 6
H-SFM (100)
c
5,34 1,80 +
3 7
16,02 12,60 6
AF4 RPMI (100)
b
2,70 21,21 8,95 +
1120 5 11
504,00 106,05 98,45 6
a
precipitação - 40 % de (NH
4
)
2
SO
4
b
precipitação - 50 % de (NH
4
)
2
SO
4
c
2ª precipitação – 60 % de (NH
4
)
2
SO
4
adicionado ao sobrenadante da 1ª precipitação
* estimação de 1 tubo - restante está congelado; precipitado em sulfato
39
Figura 11 – SDS-PAGE de AcM antiAFB
1
produzido por hibridoma AF2 e AF4 em
diferentes etapas de cultivo empregando meio H-SFM e RPMI (100 % RPMI, 25, 50, 75
e 100 % H-SFM). P: marcador de proteína (BenchMarkTM Protein Ladder, Invitrogen,
USA).
Figura 12- Determinação de atividade antiAFB
1
por i-ELISA dos AcM produzidos por
hibridoma AF2 e AF4 em meio 100 % RPMI, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % H-SFM.
AF2
kDa
40
(a) (b)
Figura 13 – AcM precipitado com (NH
4
)
2
SO
4
para concentração e purificação parcial do
AcM em meio RPMI e H-SFM, sendo que (a) o precipitado com maior teor de RPMI
apresenta-se esbranquiçado e (b) onde predomina H-SFM o precipitado tem coloração
alaranjada.
Figura 14 – Curva de ic-ELISA para confirmar o título de AcM (1:2000) que foi
estimado através de 50 % da máxima ligação dos anticorpos produzidos pelo hibridoma
AF2 em meio 100 % H-SFM, sendo testado título de 1:2000 (50 % da máxima ligação)
e diluição menor (1:200).
41
Figura 15 – Avaliação da atividade de AcM antiAFB
1
produzidos em meio de 50, 75 e
100 % H-SFM por ic-ELISA.
42
6 CAPÍTULO II
IC-ELISA PARA AFLATOXINA UTILIZANDO ANTICORPO MONOCLONAL
ANTIAFB
1
PRODUZIDO POR HIBRIDOMA AF2
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
As amostras consistiram de páprica (3 amostras), paçoca (2), pé-de-moleque
(1) e milho (1) cedidos gentilmente pelo Instituto Adolf Lutz, São Paulo-SP e milho (2)
de Empresas da região do Norte do Paraná, estando as amostras mantidas a -20 ºC.
Material
AcM antiAFB
1
produzido por hibridoma linhagem AF2 (133 % de reatividade
cruzada com AFB
2
), gentilmente fornecido por Dr. Osamu Kawamura (Faculty of
Agriculture, Kagawa University, Japão), em 50 % de meio H-SFM; AFB
1
padrão (cat.
no. A6636), AFB
1
-BSA (5 mg liofilizado, cat no. A6655), anticorpo IgG anti-mouse-
HPR (cat. no. A4416), ovalbumina (cat. no. A538), reagente de Bradford (cat. no.
B6916), 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidina (TMB) (cat. no. T2885), peróxido de hidrogênio
30 % (cat. no. H1009), dimetilsulfóxido (DMSO) (cat. no. D260) (Sigma Chemical Co.,
USA); microplaca de 96 orifícios (Corning, USA); placa de sílica para CCD – sílica gel
60 (Alugram® SilG, Macherey-Nagel, Alemanha); metanol grau HPLC (J.T. Baker,
USA); água ultrapura (Purelab® Classic UF, Elga Labwater Global Operation, UK);
Papel de filtro (Whatman nº1, Whatman International Ltd., England); tolueno, acetato
de etila, ácido fórmico, clorofórmio grau P.A. (Synth, Brasil); acetato de sódio
(NaC
2
H
3
O
2
.H
2
0) (Mallinckrodt Inc., USA); agitador magnético (Fisatom, Brasil); banho
a 50 ºC; banho ultrassônico (Ultrasonic cleaner Unique, Brasil); centrífuga refrigerada
43
(Centrifuge 5804 R, Eppendorf, 3805 03551, Alemanha); espectrofotômetro UV-VIS
Cintra 20 (GMB, Brasil); freezer (-85 ºC) (CFC FREE, Sanyo, USA); homogeneizador
de tubo (Lab Dancer S25, IKA® Work, Inc., Alemanha); peagâmetro (Digimed DM-22,
Digicrom Analítica Ltda, Brasil); espectrofluorímetro (Varian, Cary-Eclipse, Australia);
leitora de ELISA (Bio-Tek Instruments ELX800, USA); lâmpada de UV (modelo
UVGL-15, Miralight Lamp, USA); Incubadora refrigerada com agitação (MA830/A,
Marconi Equipamentos para Laboratório, Brasil).
Extração de AF nas matrizes alimentares
A extração foi realizada conforme procedimento descrito no kit comercial
RIDASCREEN
®
Aflatoxin Total para análise de aflatoxinas por ELISA (R-Biopharm
GmbH, Darmstadt, Alemanha). Alíquota de 2 g de amostra, adicionada com 10 mL de
solução metanol grau HPLC:H
2
O (70:30, v/v), foi agitada a 150 rpm por 10 min,
filtrada (Whatman nº1) e 100 µL do filtrado seco sob fluxo de N
2
a 50 ºC. O resíduo foi
dissolvido em PBST:metanol 2,5 %.
Elisa competitivo indireto
Padronização de conjugado AFB
1
-BSA
A diluição de conjugado AFB
1
-BSA a ser utilizado na sensibilização do
imunoensaio foi avaliada por i-ELISA (Ac diluído, 1:20 a 1:10
6
), testando as
concentrações de 100, 250, 500, 1000 e 2500 ng/mL em tampão Carbonato-Bicarbonato
0,1 M pH 9,6, sendo o ensaio realizado em duplicata.
Padronização de anticorpo
A diluição ótima de AcM para imunoensaio foi determinada, empregando
antiAFB
1
diluído a 1:1000, 1:2000, 1:5000 em PBST e, procedendo ic-ELISA com o
conjugado AFB
1
-BSA (100 e 250 ng/mL), fixando-se as demais condições de ensaio.
44
Preparo de substrato TMB
Uma alíquota de 100 µL da solução de 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidina - TMB
(10 mg de TMB em 1 mL de dimetilsulfóxido - DMSO) foi adicionada em 10 mL de
tampão acetato de sódio 0,1 M a pH 5,0 e, no momento de uso, acrescentada com 100
µL de H
2
O
2
0,5 %, procedendo homogeneização manual lenta. Foi realizada a análise
de tempo de reação do TMB (10, 20 e 30 min) no ic-ELISA, visando obter leitura
ótima.
Procedimento
ELISA competitivo indireto foi realizado seguindo o protocolo descrito por
Kawamura et al. (1988) adaptado conforme nossa condição laboratorial. As microplacas
foram sensibilizadas com 100 µL de AFB
1
-BSA (100 ng/mL, Tampão Carbonato-
Bicarbonato 0,1M pH 9,6) e incubadas a 4 ºC por 18 h. Após 4 lavagens com PBST
(PBS + 0,05 % Tween 20), as placas foram bloqueadas com 200 µL solução
ovalbumina 0,1 % em PBS e incubadas por 1 h a 37 ºC. Após 4 lavagens com PBST,
adicionou-se 50 µL de padrões AFB
1
ou amostra diluída, seguida de 50 µL AcM
antiAFB
1
produzido em cultivo com 50 % H-SFM (1:2000 em PBST), procedendo
reação em duplicata para curva padrão e triplicata para amostras, agitou-se levemente a
placa, foi incubado a 25 ºC por 1 h. A placa foi lavada 5 vezes com PBST, adicionada
de 100 µL de conjugado anti-IgG de camundongo marcado com horseradish peroxidase
(1:10
3
em PBST) e incubada a 25 ºC por 1 h. Após 6 lavagens com PBST, 100 µL da
solução de substrato cromógeno TMB foi adicionado. Após 30 min a 25 ºC, a reação
enzimática foi paralisada com 50 µL de H
2
SO
4
1M e a absorbância lida a 450nm.
A média de absorvâncias foi calculada a partir de valores individuais obtidos e
os resultados expressos em porcentagem de ligação:
% ligação = (A
+
/A
-
)x100
Onde A
+
corresponde à média de absorvância na presença de amostra ou
padrão, enquanto que A
-
, a média da absorvância na ausência de toxina (controle
negativo). A concentração de AFB
1
foi determinada pela curva padrão (1 a 100 ng/mL
de AFB
1
), plotando a porcentagem de ligação contra log da concentração de AFB
1
.
45
Limite de detecção do ic-ELISA
O limite de quantificação foi determinado, calculando a média e 3 x desvio
padrão dos valores de absorvância do controle negativo (0 ng/mL de AFB
1
, 100 %
ligação), obtidos em duplicata, sendo o cálculo realizado em diferentes dias.
Análise de interferentes no ic-ELISA
Dois gramas de amostra (páprica, paçoca e pé-de-moleque adquiridos no
mercado local; milho negativo para AFB
1
total analisado por dc-ELISA (Veratox
Aflatoxin Neogen Corporation, USA)) foi adicionado de 10 mL de metanol:H
2
O (70:30,
v/v) e agitado a 150 rpm por 10 min. Após filtração (Whatman nº1), 100 µL foi seco
sob fluxo de N
2
a 50 ºC e o resíduo suspenso em PBST:metanol 2,5 %, para obter
diluição no fator de 1:2 a 1:10.
Recuperação de AFB
1
em matrizes alimentares
As amostras de páprica, paçoca, pé-de-moleque e milho foram contaminadas
artificialmente com solução padrão de AFB
1
(100 ng/mL) na concentração final de 20
ng AFB
1
/g alimento e mantido a temperatura ambiente por 18 h. A seguir, a AFB
1
foi
extraída e quantificada por ic-ELISA conforme descrito acima, sendo o teste de
recuperação realizado em duas repetições em triplicata .
CCD para análise de matrizes alimentares para seleção de controle
negativo
As amostras de páprica, paçoca, pé-de-moleque e milho a serem destinadas ao
controle negativo do ensaio foram selecionadas, analisando amostras procedentes de
mercados locais por cromatografia de camada delgada - CCD (SOARES &
RODRIGUEZ-AMAYA, 1996). Cinquenta gramas da amostra foi adicionada de 270
46
mL de metanol e 30 mL de KCl 4 % e agitada a 150 rpm por 5 min. Um volume de 150
mL do filtrado (Whatman nº1) foi acrescido de 150 mL da solução de sulfato cúprico a
10 % e 50 g de celite. Após agitação, 150 mL do filtrado foi recolhido e transferido para
um funil de separação contendo 150 mL de H
2
O destilada. O extrato clorofórmico foi
obtido adicionando 10 mL de clorofórmio ao funil de separação e agitado suavemente
por 3 min (duas repetições). A fase clorofórmica recolhida foi juntada e 10 mL seca em
banho a 50 °C sob fluxo de N
2
.
Para análise, o resíduo foi dissolvido com 500 µL de clorofórmio sob
sonicação por 30 s. Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi aplicada em placa
cromatográfica de sílica gel (sílica gel 60, 2 mm de espessura) juntamente com 10 µL
solução padrão de AFB
1
a 1 µg/mL, a 2 cm da base. O cromatograma foi desenvolvido
em cuba saturada com fase móvel contendo tolueno:acetato de etila:ácido fórmico
(60:40:0,1, v/v/v) para corrida de 10 cm e, observado sob UV longa.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O desenvolvimento de ic-ELISA iniciou-se com a determinação das
concentrações de reagentes a serem utilizados, i.e., conjugado AFB
1
-BSA cedido pela
Kagawa University-Japão e AcM antiAFB
1
produzido por hibridoma AF2 in vitro, no
meio de cultura com 50 % de meio H-SFM e 50 % de meio RPMI.
Imunoensaio i-ELISA foi realizado para avaliar a influência da
concentração de AFB
1
-BSA na leitura de absorção a 450 nm ao diluir a concentração de
anticorpo (Figura 16). Assim como, a curva foi plotada para obter 50 % da ligação
máxima, sendo o título de anticorpo correspondente a esta porcentagem de ligação
utilizada para proceder ic-ELISA (KAWAMURA et al., 1988).
A Figura 16 mostra a similaridade na inclinação de curvas obtidas com
conjugado AFB
1
-BSA na faixa de 100 a 2500 ng/mL, sendo que em 100 ng/mL pôde-se
distinguir a absorção entre as diluições de AcM primeiramente, indicando que
sensibilização da placa pode aplicar essa concentração e assim também, economizar o
reagente. Baseado neste resultado, escolheu-se AFB
1
-BSA na concentração de
47
100 ng/mL para proceder ic-ELISA; além deste valor, também incluiu-se no teste
250 ng/mL de AFB
1
-BSA, já que Kawamura et al. (1988) realizou com essa
concentração a sensibilização do ensaio ic-ELISA para análise de AFB
1
em derivados
de amendoim, assim como Devi et al. (1999) sensibilizou poços com 225 ng/mL de
AFB
1
-BSA.
Teoricamente, o título de Ac correspondente a 50 % de ligação seria a
diluição ideal para desenvolver ic-ELISA (KAWAMURA et al., 1988). Todavia, a
Figura 16 mostra 100 % de ligação equivalente a absorvância de aproximadamente 0,5,
portanto infere-se absorvância de 0,25 para 50 % de ligação; este corresponde ao título
de AcM >1:10
5
(0,018 µg/mL de proteína), sendo isto improvável na condição de
ensaio (obteve-se reação negativa procedendo ic-ELISA empregando AcM diluído a
10
-5
). O fato pode indicar deterioração de substrato utilizado (TMB em pó ou H
2
0
2
),
obtendo-se absorvância máxima em torno de apenas 0,5. Kits comerciais informam que
leitura < 0,6 indica degradação do reagente (RIDASCREEN, R-Biopharm GmbH,
Alemanha).
Considerando o insucesso na determinação de título de AcM através da
inferência de 50 % da ligação máxima, utilizou dados anteriores (Capítulo 1) em que foi
correlacionado título de Ac a 50 % ligação da máxima ligação, sendo de 1:2000. Em
vista disso, títulos próximos a esse valor foram avaliados no ic-ELISA.
Visando melhorar a leitura, testou-se tempo de reação do substrato
cromógeno entre 10 a 30 min. A reação em 30 min apresentou melhor coeficiente de
determinação com R
2
= 0,84, seguida de 20 min com R
2
= 0,58 e 10 min com R
2
= 0,65
(p<0,05). Portanto, os ensaios posteriores foram executados fixando o tempo de reação
com substrato em 30 min. Miyamoto (2007) realizou ic-ELISA para análise de AFB
1
reagindo com substrato TMB com tempo de duração de 10 min.
Após reduzir as possíveis concentrações de trabalho dos reagentes, foi
realizado ic-ELISA avaliando na sensibilização dos poços 100 e 250 ng/mL AFB
1
-BSA
e diluição do AcM em 1:1000, 1:2000 e 1:5000 (Figura 17). Os resultados indicaram
que experimento empregando 100 ng/mL AFB
1
-BSA e 1:2000 (0,92 µg/mL) para Ac
48
antiAFB
1
como sendo adequado para prosseguir com a padronização, já que as diluições
maiores resultaram em valores próximos, podendo economizar reagentes.
Determinadas as condições para ic-ELISA, a curva padrão foi
confeccionada, utilizando concentração de AFB
1
a 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 e 100 ng/mL em
PBST:metanol 2,5 %. A curva apresentou coeficiente de determinação de 0,97 e limite
de detecção de 0,99 ng AFB
1
/mL (4,95 ng/g) (Figura 18), constituindo uma técnica que
atende a legislação brasileira (20 ng/g de AF total para milho, amendoim e derivados).
Entretanto, ainda não apresenta sensibilidade desejável para detecção de AFB
1
em
algumas matrizes alimentares regulamentados quanto à presença de AFB
1
pela
Comunidade Europeia (máximo de AFB
1
permitido é de 2ng/g para amendoim, nozes
em geral, frutas secas e cereais).
As amostras aplicadas no estudo da intereferência de matriz foram
demonstradas negativos perante a análise de CCD (Figura 19). Os extratos de amostras
controle negativas para AFB
1
foram submetidos a 4 diluições (1:2, 1:5, 1:7 e 1:10) para
estudar o efeito da matriz na análise por ic-ELISA (Figura 20). A Figura evidenciou o
efeito das diferentes diluições de extrato no imunoensaio, com interferência
significativa em baixas diluições (1:2 e 1:5) (p<0,05 no teste de Tukey) na amostra de
páprica. Nessas diluições, possivelmente a alta concentração de componentes
alimentares constituídos de proteínas, lipídios e pigmentos causaram interações
inespecíficas e bloqueio estérico na reação imunológica, resultando em falso-positivo
(HEFLE, 1995; FUJII, 2002). Entretanto para amostra de paçoca o teste de Tukey não
demonstrou diferença significativa entre as diluições, e para amostra de pé-de-moleque
na diluição entre 1:5 a 1:10 evidenciou similaridade, porém houve diferença
significativa para diluição 1:2, indicando que esta seja inadequada para imunoensaio
dessa amostra (p<0,05). A diluição 1:5 a 1:10 nas amostras de milho são
estatisticamente iguais (p>0,05) e diluições 1:2 e 1:5 idem.
Diluição superior a 1:10 não foi avaliado, já que ic-ELISA desenvolvido
apresentou limite de detecção de 4,95 ng/g, portanto a diluição do extrato acarretaria em
resultado falso-negativo (ANKLAM et al., 2002; CALLERI et al., 2007; PRIETO-
SIMÓN et al., 2007). Sendo assim, a diluição de 1:7 a 1:10, exceto para amostras de
49
páprica que definiu diluição de 1:10, proporcionaria menos interferência das matrizes
alimentares, permitindo detecção do analito.
A aplicabilidade de ic-ELISA para análise de AFB
1
foi avaliada perante a
taxa de recuperação de amostras de páprica, paçoca, pé-de-moleque e milho
contaminados artificialmente (20 ng/g). Assim como, foi realizado comparação dos
resultados obtidos por ic-ELISA desenvolvido com resultados positivos obtidos por
outros autores e metodologias.
A recuperação das amostras contaminadas, considerando o efeito de
interferência da matriz, variou de 186; 90,55; 82,25 e 81,15 % para páprica, paçoca, pé-
de-moleque e milho, respectivamente (Tabela 3), sendo o valor recomendado de
recuperação para AF de 80 a 110 % para amostras com contaminação > 10 µg/kg de AF
(Regulamento (CE) 401/2006, 2006). As amostras de páprica apresentaram alta
recuperação (186,69 %) e isso se deve à composição da matriz colorida, sendo que a
diluição usada não foi suficiente para diminuir a interferência, devendo aumentar a
diluição e/ou adicionar etapa de limpeza do extrato antes do ensaio.
A análise de AFB
1
por ic-ELISA desenvolvida em amostras de páprica,
paçoca, pé-de-moleque e milho indica contaminação acima do permitido pela legislação
brasileira (20 ng/g de aflatoxinas total) (Tabela 4), devendo confirmar por outra
metodologia. Devido o conhecimento da análise de recuperação em amostra de páprica
contaminada artificialmente, o resultado provavelmente foi superestimado.
Comparada à literatura (MIYAMOTO, 2007; IAL, 2007 e SILVA, 2007),
o resultado do ic-ELISA para as amostras de páprica A6, A7 e A8, paçoca A3, pé-de-
moleque A1 e milho A5 e K 1373 confirmou a superestimação de valores (Tabela 5a),
demonstrando que esse imunoensaio ainda não é adequado para detectar baixa
concentração de AFB
1
e também ser aplicado a matrizes alimentares, como páprica e
derivados de amendoim.
ic-ELISA apresentou resultados próximos obtidos esses autores quando
nas amostras foram quantificadas elevada concentração de AFB
1
, como nas amostras de
milho B e paçoca A2. Todavia, essas amostras exibiram concentrações bem superiores
tolerados pela legislação brasileira, sendo facilmente detectados em outros métodos.
50
Kawamura et al. (1988) reportaram que o hibridoma da linhagem AF2
produtor de AcM antiAFB
1
possui reatividade cruzada com AFB
2
(133 %). Devido a
esse fato, as amostras analisadas por Miyamoto (2007) e IAL (2007) que foram
positivas para AFB
2
(paçoca A3 e A2, pé-de-moleque A1, milho A5 e K 1373) foram
acrescentados os valores dessa micotoxina e comparados novamente com ic-ELISA
(Tabela 5b).
A adição de AFB
2
nas amostras não aproximou os resultados de ic-
ELISA para contaminação abaixo de 20 ng/g, evidenciando que o ic-ELISA
desenvolvido é ainda inadequado para determinação de AFB
1
em amostras que podem
estar no limiar do aceitável ou não ao consumo, devendo-se estudar melhor o efeito da
matriz e estabelecer etapa de limpeza principalmente para amostras de pápricas.
CONCLUSÃO
O ic-ELISA desenvolvido para determinação de AFB
1
apresentou limite
de detecção de 4,95 ng/g, não sendo ainda um método adequado de análise em amostras
de páprica e derivados de amendoim. Contudo, devido possibilidade de produção de
AcM antiAFB
1
e sendo ic-ELISA, um método rápido, exato e simples ao comparar com
métodos analíticos, intenciona-se aperfeiçoar o desenvolvimento desse imunoensaio
visando introdução de técnica alternativa para detecção de AFB
1
em matrizes
alimentares.
51
Figura 16 – Determinação da concentração ótima de AFB
1
-BSA empregando i-ELISA.
Análise de conjugado AFB
1
-BSA (100 a 2500 ng/mL) em tampão Carbonato-Bicarbonato 0,1 M pH 9,6
empregando AcM antiAFB
1
.
Figura 17 – Determinação do título de AcM antiAFB
1
e concentração de AFB
1
-BSA
para sensibilização de microplaca empregando ic-ELISA.
52
Figura 18 – Curva padrão de ic-ELISA para AFB
1
. Eixo X representa o log da
concentração de AFB
1
e o eixo Y a % de ligação.
LD = Limite de determinação, calculada através da média e 3 x desvio padrão dos valores de
absorvância do controle negativo (0 ng/mL de AFB1, 100 % ligação).
Figura 19 – CCD de amostras de páprica, paçoca, pé-de-moleque e milho, verificando
negatividade perante AFB
1
o e uma co-cromatografia da amostra de pé-de-moleque
como AFB
1
.
R
2
=0,97
LD = 4,95 ng/g
Paçoca Milho
Pé-de-
moleque
PADRÃO
AFB
1
Pé-de-moleque
+ AFB
1
Páprica
53
Figura 20 – Diluição de matriz alimentar visando redução da interferência na
determinação de AFB
1
por ic-ELISA
.
Calculada pela fórmula 100 - (A+/A-)*100, em que cada dado consistiu de valores de duas repetições em duplicata.
Tabela 3 – Recuperação de AFB
1
em matrizes alimentares contaminados artificialmente
com solução de 20 ng AFB
1
/g.
Recuperação (%)
Recuperação
a
AFB
1
(ng/g)
Média
(ng/g)
Total
Sem interferência
da matriz
Páprica 43,035
83,296
63,165 315,83
186,69
Pé-de-moleque 19,873
18,738
19,306 96,53 82,25
Milho 26,922
13,896
20,409 102,04
90,55
Paçoca 24,046
19,165
21,606 108,03
81,15
a
médias de valores de duas repetições em triplicata
a
a
ab
b
b
b
b
b
a
b
c
c
54
Tabela 4 – Determinação de AFB
1
em amostras de páprica, paçoca A3, paçoca A2, pé-
de-moleque e milho por ic-ELISA.
Amostras AFB
1
(ng/g)
a
Sem Interferência
da matriz (ng/g)
Páprica A6 64,154 39,070
Páprica A7 43,764 26,382
Páprica A8 72,261 44,038
Paçoca A3 41,428 25,924
Paçoca A2 118,776 74,266
Pé-de-moleque A1 53,272 45,753
Milho A5 69,413 12,803
Milho K1373 19,794 12,803
Milho B 479,262 310,661
55
Tabela 5 – Estudo comparativo interlaboratorial de (a) determinação de AFB
1
em amostras de pé-de-moleque, paçocas, pápricas e milhos e (b)
acrescido de concetração de AFB
2
quantificado Miyamoto (2007) e IAL (2007).
Comparação interlaboratorial de resultados obtidos de AFB1
MIYAMOTO, 2007 IAL, 2007 SILVA, 2007* TAKABAYASHI, 2009
CIA - HPLC MFC - HPLC HPLC TLC
dc-ELISA (Neogem)
ic-ELISA
(ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)
Pé-de-moleque A1 20,64 5,17 16 nr nr 45,753
Paçoca A2 110,24 20,01 16 nr nr 74,266
Paçoca A3 1,73 0,43 2,4 nr nr 26,503
Páprica A6 0,72 nr 2,4 nr nr 39,070
Páprica A7 8,72 nr 9,6 nr nr 26,382
Páprica A8 9,55 nr 8 nr nr 44,038
Milho A5 5,46 6,51 19,2 nr nr 12,803
Milho K 1373 0,55 0,65 nr 3 3,78 12,803
Milho B 333,04 296,45 nr nr nr 310,661
* Determinação de Aflatoxinas totais.
CIA – HPLC: análise realizada empregando coluna de imunoafinidade seguida de detecção por HPLC.
MFC – HPLC: análise realizada empregando coluna multifuncional seguida de detecção por HPLC.
CCD: cromatografia de camada delgada.
dc-ELISA: ELISA competitivo direto (kit comercial)
nr: ensaio não realizado.
(a)
56
Comparação interlaboratorial de resultados obtidos de AFB1 + AFB2
MIYAMOTO, 2007 IAL, 2007 SILVA, 2007*
TAKABAYASHI, 2009
CIA - HPLC MFC - HPLC HPLC TLC
dc-ELISA (Neogem)
ic-ELISA
(ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)
Pé-de-moleque A1 27,71 5,27
22
nr nr 45,753
Paçoca A2 134,79 24,5
19,45
nr nr 74,266
Paçoca A3 2,08 1,43 2,4 nr nr 26,503
Páprica A6 0,72
nr
2,4
nr nr 39,070
Páprica A7 8,72 nr 9,6 nr nr 26,382
Páprica A8 9,55 nr 8 nr nr 44,038
Milho A5 5,92 7,09 19,2 nr nr 12,803
Milho K 1373 0,6 0,65 nr 3 3,78 12,803
Milho B 333,04 296,45 nr nr nr 310,661
* Determinação de Aflatoxinas totais.
CIA – HPLC: análise realizada empregando coluna de imunoafinidade seguida de detecção por HPLC.
MFC – HPLC: análise realizada empregando coluna multifuncional seguida de detecção por HPLC.
CCD: cromatografia de camada delgada.
dc-ELISA: ELISA competitivo direto (kit comercial)
nr: ensaio não realizado.
(b)
57
7 CAPÍTULO III
COLUNA DE IMUNOAFINIDADE DESENVOLVIDO COM AFFI-GEL 10 E
ANTICORPO MONOCLONAL ANTIAFLATOXINA B
1
COMO
BIOFERRAMENTA VISANDO DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE AFLATOXINAS
MATERIAL E MÉTODOS
Material
AcM antiAFB
1
– produzido em 100 % de H-SFM e 75 % de H-SFM adicionado
ao RPMI+15 % de SFB foi combinado – empregando hibridoma linhagem AF2 (133 %
de reatividade cruzada com AFB
2
, gentilmente fornecido por Dr. Osamu Kawamura,
Faculty of Agriculture, Kagawa University, Japão); AFB
1
padrão (cat. no. A6636),
AFB
1
-BSA (cat. no. A6655), albumina (Initial fractionation by cold alcohol
precipitation ≥ 97 % albumin, cat. no. A4378), anticorpo IgG anti-mouse-HPR (cat. no.
A4416), etanolamina-HCl (cat. no. 18674-0), ovalbumina (cat. no. A5378), glicina-etil-
éster (cat. no. G650-3), reagente de Bradford (cat. no. B6916), 3,3',5,5'-tetramethyl-
benzidina (TMB)
(cat. no. T2885), peróxido de hidrogênio 30 % (cat. no. H1009),
dimetilsulfóxido (DMSO) (cat. no, D260) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA);
microplaca de 96 orifícios (Corning, USA); Activated Immunoaffinity Supports Affi-Gel
10 (Bio-Rad, USA, cat. no.153-6046); coluna de prolipropileno (Muromac Columns,
Muromachi Technos Co., Japão); placa de sílica para TLC – sílica gel 60 (Alugram®
SilG, Macherey-Nagel, Alemanha); tubo de centrífuga de 15 mL (BD Falcon™, USA ),
metanol grau HPLC (J.T. Baker, USA); água ultrapura (Purelab® Classic UF, Elga
Labwater Global Operation, UK); tolueno, acetato de etila, ácido fórmico, clorofórmio
graus P.A. (Synth, Brasil); ); acetato de sódio (NaC
2
H
3
O
2
.H
2
0) (Mallinckrodt Inc.,
USA); agitador magnético (Fisatom, Brasil); banho a 50 ºC; banho ultrassônico
(Ultrasonic cleaner Unique, Brasil); centrífuga refrigerada (Centrifuge 5804 R,
Eppendorf, 3805 03551, Alemanha); espectrofotômetro UV-VIS Cintra 20 (GMB,
Brasil); freezer (-85 ºC) (CFC FREE, Sanyo, USA); homogeneizador de tubo (Lab
Dancer S25, IKA® Work, Inc., Alemanha); peagâmetro (Digimed DM-22, Digicrom
58
Analítica Ltda, Brasil); espectrofluorímetro (Varian, Cary-Eclipse, Australia); leitora de
ELISA (Bio-Tek Instruments ELX800, USA); Lâmpada de UV longo (modelo UVGL-
15, Miralight Lamp, USA).
Confecção de CIA para detecção de AFB
1
empregando AcM antiAFB
1
Affi-Gel 10 (Activated Immunoaffinity Supports, Bio-Rad) é um suporte de
afinidade constituída de éster N-hidroxisuccinamida derivatizado ao gel de agarose,
capaz de acoplar espontaneamente ao grupamento amina livre de anticorpo em solução
aquosa ou não aquosa.
Preparação da CIA Affi-Gel 10: acoplamento aquoso
AcM antiAFB
1
parcialmente purificado, utilizado no preparo de CIA foi
proveniente do cultivo de hibridoma AF2 (pool do dializado pós-(NH
4
)
2
SO
4
do
sobrenadante de cultivo em 100 % de H-SFM e 75 % de H-SFM adicionado ao
RPMI+15 % de SFB). Affi-Gel 10 lavada três vezes com água ultrapura a 4 ºC foi
adicionada de AcM antiAFB
1
na proporção aproximada de 4 mg proteína/mL de gel
(informação pessoal, Dr. Kawamura, Kagawa University). A confecção de CIA
constituiu no total de 11 ensaios, agrupados em 3 experimentos (Exp.A, B e C, Figura
21), procedendo incubação por 18 h sob agitação lenta a 4 ºC, ou 25 ºC. Para o preparo
de CIA 1, a mistura de Ac e suporte foi preparada diretamente na coluna. Para o preparo
de CIA 2 a 9, a mistura de Ac e suporte foi preparada em tubo tipo Falcon de 15 mL e
centrifugada (350 x g por 1 min a 4 ºC). Os sítios ativos não acoplados, correspondentes
a reação inespecífica, foram bloqueados com etanolamina-HCl 1,0 M pH 8,0 na
proporção 1:1 de gel utilizado durante 1h a 25 ºC, ou 2 h a 4 ºC sob agitação lenta e o
gel lavado 10 vezes com PBS. O gel acoplado foi suspendido em PBS contendo 0,02 %
de azida sódica (NaN
3
) e armazenada a 4ºC. Para o ensaio, um volume de 0,5 mL de
Ac-gel foi transferido para uma coluna de prolipropileno (Muromac Columns,
Muromachi Technos Co., Japão) com o objetivo de testar a eficiência de ligação com
AFB
1
.
59
A eficiência de acoplamento de AcM foi analisado, procedendo leitura a
280 nm ou método de Bradford, assim como i-ELISA no sobrenadante pós-
acoplamento, pós-bloqueio e pós-lavagem de coluna.
Determinação de proteína (IgG)
A concentração proteica (IgG) foi determinada pela leitura de absorvância a
280 nm, adotando coeficiente de absorção (E
280
) de 1,35 para IgG (HARLOW &
LANE, 1988b):
Concentração IgG (mg/mL) = absorvância a 280 nm
coeficiente de absorção
Determinação de proteína pelo método de Bradford
A concentração proteica foi determinada por método de Bradford (1976) sob
forma de microensaio (microplaca com 96 orifícios). A curva padrão de proteína foi
confeccionada empregando 10 µL de soro albumina bovina (BSA, Initial fractionation
by cold alcohol precipitation ≥ 97 % albumin, Sigma, USA) nas concentrações de 31;
25; 62,5; 125; 175; 200; 250 µg/mL (suspendida em PBS 0,015M pH7,3), tendo PBS
como branco da reação. Um volume de 100 µL do reativo de Bradford foi adicionado à
reação e após 15 min lida a 650 nm.
Determinação de atividade antiAFB
1
IgG antiAFB
1
remanescente no sobrenadante pós-acoplamento, pós-bloqueio e
pós-lavagem de coluna foi determinado por i-ELISA (Ensaio imunoenzimático
indireto), seguindo essencialmente o protocolo descrito por Kawamura et al. (1988). As
microplacas foram sensibilizadas com 100 µL de AFB
1
-BSA (100 ng/mL, tampão
Carbonato-Bicarbonato 0,1M pH 9,6) e incubadas a 4 ºC por 18 h. Após 3 lavagens com
60
PBST (PBS + 0,05 % Tween 20), as placas foram bloqueadas com 200 µL de solução
ovalbumina a 0,1 % em PBS e incubadas por 1 h a 37 ºC. Após 3 lavagens com PBST,
adicionou-se 100 µL de sobrenadante pós-acoplamento, pós-bloqueio e pós-lavagem a
25 ºC por 1 h. Após 4 lavagens com PBST, adicionou-se 100 µL de conjugado anti-IgG
de camundongo marcado com horseradish peroxidase diluído a 1:10
3
em PBST e
incubadas a 25 ºC por 1 h. Após 5 lavagens com PBST, adicionou-se 100 µL da solução
de substrato cromógeno TMB (3,3',5,5'-tetramethyl-benzidina) por 30 min a 25 ºC . A
reação foi interrompida com 50 µL de H
2
SO
4
1M e a absorvância lida a 450nm.
Avaliação da eficiência de imobilização de AcM à CIA Affi-Gel 10
A eficiência de acoplamento do AcM antiAFB
1
ao suporte Affi-Gel 10 foi
estimado empregando equação abaixo (GAO et al., 1998):
Onde:
A
0
, A
E
, A
E0
são valores de absorvância correspondente à proteína total antes do
acoplamento, sobrenadantes pós-acoplamento somado ao do pós-bloqueio, e tampão de
acoplamento (PBS), respectivamente, obtido pela leitura direta a 280 nm, ou a 650 nm
pelo Método de Bradford.
V
0
e V
E
representam os volumes correspondentes à solução inicial de proteína e
efluente de proteína não-ligada.
Determinação da capacidade de retenção de AFB
1
em CIA Affi-Gel 10
A capacidade da retenção de AFB
1
na coluna foi testada, pipetando 5 mL
de solução de AFB
1
(10 ng/mL, 2,5 % de metanol em PBS) em CIA previamente
acondicionada com PBS (10 mL). Em seguida, a coluna foi lavada com 15 mL de PBS e
61
AFB
1
eluída em 5 frações sequenciais de metanol grau CLAE (2 mL por fração), sob
fluxo de 1-2 gotas/s a 25° C. O eluato correspondente a cada fração foi seco sob fluxo
de N
2
gasoso e presença de AFB
1
visualizada por cromatografia de camada delgada
(SOARES & RODRIGUEZ-AMAYA, 1996).
Determinação de AFB
1
por cromatografia de camada delgada
O resíduo seco, correspondente a cada fração oriundo de CIA, foi
ressuspendido em 200 µL de metanol. Uma alíquota de 40 µL foi aplicada em placa de
sílica gel juntamente com 10 µL solução padrão de AFB
1
(1 µg/mL). O cromatograma
foi desenvolvido com a fase móvel tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (60:40:0,1,
v/v/v) e analisado sob UV longa.
Determinação de AFB
1
por espectrofluorimetria
O resíduo foi ressuspendido em 300 µL de metanol. Uma alíquota de 125 µL
de amostra foi adicionado de 125 µL de revelador (solução aquosa de bromo 0,003 %,
v/v) e após 60 s, procedeu-se leitura em 360 nm de excitação e 420 nm de emissão
(espectrofluorímetro Cary-Eclipse, Varian, Australia), conforme padronizado por
HAYASHI (2007).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conforme recomendação geral, o acoplamento aquoso de proteína ao suporte
ativo Affi-Gel 10 deve proceder em tampão MÊS, MOPS, HEPES, POPSO, acetato ou
bicarbonato sob agitação a 4 ºC por 4 h de preferência, ou a 25 ºC por 1h. Para
acoplamento emprega-se acima de 25 mg de proteína por mL de suporte ativo. Aliado a
isso, o volume da solução proteica deve ser mantido entre 1,5 a 4,5 mL / mL de gel
(manual do fabricante, BIO-RAD LABORATORIES, 2000).
62
Para o nosso experimento empregou-se o AcM produzido pelo hibridoma AF2
no meio de 75 e 100 % H-SFM, precipitado com (NH
4
)
2
SO
4
e dialisado em PBS 0,1 M
pH 7,3 e H
2
O ultrapura. A quantidade de proteína foi reduzido para 4 mg por mL de gel
(KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University; MIYAMOTO, 2007).
No total foram confeccionadas 11 CIAs (Figura 22 e 23), obtendo resultados de
eficiência de acoplamento diferentes (Tabela 6), assim como devido a resultados
negativos foram testados alterações no processo de acoplamento.
A CIA 1 foi confeccionada realizando processo de acoplamento, bloqueio e
lavagem na coluna. Em estudo anterior relatou-se baixa eficiência da coluna devido a
ligações inespecíficas do suporte com interferentes de matrizes alimentares (FUJII,
2007). Portanto, para o bloqueio de sítios inespecíficos testou-se etanolamina-HCl 1,0M
(pH 8,0), glicina-etil-éster 1,0M (pH 8,0) (BIO-RAD LABORATORIES, 2000) e BSA
a 5 % em 0,01M PBS (XIULAN et al., 2006). Assim, a CIA 1 foi divida em CIA 1A
(etanolamina-HCl), CIA 1B (glicina-etil-éster) e CIA 1C (BSA) e cada coluna foi eluída
3 vezes com metanol grau HPLC (10 mL cada fração) e quantificada por
espectrofluorimetria (Tabela 7). Os resultados superestimaram a quantidade de toxina
adicionada (3935 % a 8014,6 % de recuperação), indicando ineficiência das CIAs
confeccionadas, repetindo o insucesso anterior (HAYASHI, 2007).
Tendo em vista a dificuldade em proceder todo processo dentro da coluna
(Figura 21, Exp.1), principalmente devido ao rompimento do filtro e consequente perda
de recheio Ac-Gel, as CIAs 2 a 9 foram confeccionadas com a mistura de Ac-Gel
previamente preparado em tubo tipo Falcon de 15 mL.
A concentração proteica em sobrenadante obtido de CIA 1, 2, 3 e 4 foi
determinada a 280 nm, conforme manual do fabricante. Porém, a baixa eficiência de
acoplamento em CIA 2 e 3 (-8,03 e 10,1 %, respectivamente), indicada pela leitura em
280 nm, demonstrou Affi-Gel 10 em dissolução nos sobrenadantes, causando absorção
neste comprimento de onda e superestimando a leitura de proteína não acoplada. Para
contornar o problema, a determinação de proteína em sobrenadante oriunda de CIA 5 a
9 foi realizada pelo método de Bradford.
63
CIA 4 e 5 apresentaram negatividade na eluição de AFB
1
passada pela coluna,
não sendo visualizada na placa cromatográfica (CCD) banda azul sob luz UV. Uma das
possíveis explicações é o armazenamento inadequado do Affi-Gel 10. O fabricante
informa que pode armazená-lo a -20 ºC por 1 ano ou -70 ºC por 1,5 ano mantendo pelo
menos 80 % da atividade sendo que, ao ser adquirido, foi estocado no laboratório a
-20 ºC em torno de 1 ano, sem considerar o período anterior ao tempo de transporte até
o laboratório. Assim, o gel utilizado provavelmente perdeu a atividade de acoplamento a
proteína.
CIA posteriores foram confeccionadas com Affi-Gel 10 recém adquiridos e
armazenados a -85 ºC. CIA 6 apresentou porcentagem de eficiência de acoplamento
relativamente baixo (52,5 %). Ao verificar por CCD, a toxina foi eluida no metanol,
obtendo-se resultado negativo, não sendo visualizada a banda azul. O motivo de não
lograr êxito está na hipótese que a coluna foi acondicionada em metanol, H
2
O ultrapura
e PBS, e a solução em que continha AFB
1
ter sido feita com metanol: PBS (1:9, v/v).
Kondo et al. (2000) acondicionou CIA confeccionada com Affi-Gel 10 e AcM
antimicrocistina com PBS, metanol e água destilada. No ensaio, contudo, o solvente
pode ter afetado a ligação do Ac ao suporte ativo, desfazendo o acoplamento (KONDO
et al., 2002). Desse modo, foi retirada a etapa de acondicionamento com metanol e o
padrão de AFB
1
foi diluído em 2,5 % de metanol em PBS.
Pelos resultados obtidos anteriormente, foram testadas outras condições de
acoplamento (Figura 21, Exp. 2 e 3) na tentativa de melhorar a porcentagem de
eficiência de acoplamento e na retenção da toxina pelos anticorpos imobilizados ao
suporte.
CIA 7 foi preparada de forma similar aos anteriores alterando a concentração
de metanol da solução de AFB
1
(2,5 % metanol). Na CIA 8, alterou-se a temperatura de
acoplamento (25 ºC), apesar do manual recomendar a reação a 4 ºC. Miyamoto (2007)
desenvolveu a CIA na temperatura a 25 ºC, alcançando 94 a 105 % de taxa de
recuperação de aflatoxinas em amostras de milhos, utilizando CIA como etapa de
limpeza e concentração, sendo determinado por CLAE. Na CIA 9 foi modificada a
temperatura de bloqueio (4 ºC) e também o AcM foi liofilizado e resuspendido em PBS
0,1 M pH 7,3.
64
As CIA 7, 8 e 9 apresentaram retenção da toxina por CCD (Figura 24), sendo a
eluição da toxina obtida na primeira fração do metanol (nos primeiros 2 mL). Não se
consegue distinguir qual das 3 colunas reteve mais toxina, sendo necessário outro
método analítico para obter quantificação e assim saber qual preparo é mais eficiente,
tanto no acoplamento quanto na retenção de toxina.
As 2 primeiras frações de metanol apresentaram-se esbranquiçadas e
compactas após a secagem, sendo mais evidente na primeira fração (Figura 25).
Provavelmente, o suporte ativo não compactado passou pelo filtro que a coluna possui,
sugerindo-se uma pré-filtragem para quantificação de AFB
1
.
No i-ELISA para todos os sobrenadantes das etapas do preparo da coluna (pós-
acoplamento, pós-bloqueio e pós-lavagem) apresentaram resultados positivos, indicando
que nessas soluções ainda havia anticorpo. Miyamoto (2007) obteve na solução pós-
bloqueio resultado negativo de atividade de anticorpo por i-ELISA. Nas próximas
tentativas de confecção de CIA deve-se aperfeiçoar o processo de acoplamento,
tentando acoplar mais anticorpo ao suporte.
CONCLUSÃO
A confecção de CIA visando limpeza e concentração de extratos de amostras
para análise de AFB
1
foi laborioso, exigindo-se atenção em todas as etapas. Os
resultados obtidos indicam que CIA com melhor resultado de acoplamento pode ser
alcançado concentrando o IgG produzido e preparando a 4 ºC. Devem-se prosseguir os
estudos para desenvolvimento de CIA, analisando: melhor método de preparo da
coluna, solução de bloqueio, redução do uso de metanol para eluição da toxina,
estabelecimento de uma filtragem do eluato ressuspendido ou otimização do filtro da
coluna e ensaios de validação. Assim como, deve-se padronizar o espectrofluorímetro a
fim de aumentar a sensibilidade de detecção, facilitar e agilizar a análise.
65
Figura 21 – Esquema para confecção de CIA visando análise de AFB1, diferenciando a concentração de AcM, temperatura de acoplamento, temperatura
e tempo de bloqueio com etanolamina-HCl 1 M pH 8,0. * CIA 1: acoplamentode Ac-Gel na coluna; CIA 2 a 7: acoplamento de Ac-Gel em tubo tipo
Falcon de 15 mL.
Bloqueio
Agitação orbital
Lenta – 1 h, 25º C
Acoplamento
Agitação orbital
Lenta - 18 h, 4º C
+
Affi-Gel 10
AcM
(± 4 mg/mL de gel)
AcM Pós-diálise
CIA 1 a 7*
Exp. A
Bloqueio
Agitação orbital
Lenta – 1 h, 25º C
Acoplamento
Agitação orbital
Lenta - 18 h, 25º C
+
Affi-Gel 10
AcM
(± 4 mg/mL de gel)
AcM Pós-diálise
CIA 8
Exp. B
Bloqueio
Agitação orbital
Lenta – 2 h, 4º C
Acoplamento
Agitação orbital
Lenta - 18 h, 4º C
+
Affi-Gel 10
AcM
(± 4 mg/mL de gel)
AcM Pós-liofilização
CIA 9
Exp. C
66
Figura 22 – CIA confeccionada com antiAFB
1
acoplada a 0,5 ml de Affi-Gel 10.
67
Figura 23 – Esquema da confecção das CIAs (11 colunas) visando limpeza e concentração de AFB
1
.
CIA confeccionadas
Affi-Gel 10 +AcM (± 4 mg/mL de gel)
1 mL gel 1 mL gel 1 mL gel 1 mL gel 1 mL gel 1 mL gel 1 mL gel 1,5 mL gel 1 mL gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
CIA 1 CIA 4 CIA 5 CIA 6 CIA 7 CIA 8 CIA 9 CIA 2 CIA 3
CIA 1A
etanolamina
-
HCl
CIA 1B
glicina
-
etil
-
éster
CIA 1C
BSA
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
0,5 mL
gel
68
Tabela 6 - Eficiência do acoplamento de IgG antiAFB
1
(%) ao Affi-Gel 10 em CIA confeccionada.
CIA 1
a*
CIA 2
a
CIA 3
a
CIA 4
b
CIA 5
b
CIA 6
b
CIA 7
b
CIA 8
b
CIA 9
b
Eficiência 74,68 -8,03 10,1 63,04 54,51 52,5 60,13 62,95 80,61
de acoplamento (%)
a
Determinação de proteína pela absorvância a 280 nm
a*
Determinação proteína pela absorvância a 280 nm de gel acoplado que foi divida em 3 coluna com diferentes soluções de bloqueios
b
Determinação de proteína pelo Método de Bradford
Tabela 7 - Teste de recuperação de AFB
1
com 10 ng/mL (3 mL) com CIA confeccionadas com suporte Affi-Gel 10
e AcM antiAFB
1
, bloqueada com etanolamina-HCl 1,0 M (pH 8,0), glicina-etil-éster 1,0 M (pH 8,0) ou BSA a
5 % em 0,01M PBS e quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).
CIA 1 AFB
1
recuperada Recuperação (%) Recuperação total (%)
(ng) (soma das frações)
CIA 1A - fração 1 592,68 1975,60
CIA 1A - fração 2 290,00 966,67 3935,00
CIA 1A - fração 3 297,82 992,73
CIA 1B - fração 1 1264,82 4216,07
CIA 1B - fração 2 631,42 2104,73 7467,97
CIA 1B - fração 3 344,15 1147,17
CIA 1C - fração 1 1287,43 4291,43
CIA 1C - fração 2 799,92 2666,40 8014,60
CIA 1C - fração 3 317,03 1056,77
CIA 1A : solução bloqueio etanolamina-HCl 1,0 M (pH 8,0)
CIA 1B : solução bloqueio glicina-etil-éster 1,0 M (pH 8,0)
CIA 1C: solução bloqueio BSA a 5 % em 0,01M PBS
fração 1, 2 e 3 são as frações de metanol coletadas na eluição da CIA (10 mL de metanol cada)
69
Figura 24 – Visualização sob luz UV do CCD das principais fração de metanol eluído das
CIA 7, 8 e 9, e do padrão de AFB
1
para comparação.
CIA 7
1ª fração
CIA 7
2ª fração
CIA 7
3ª fração
CIA 7
4ª fração
PADRÃO
AFB
1
CIA 8
1ª fração
CIA 8
1ª fração
CIA 8
2ª fração
PADRÃO
AFB
1
CIA 8
3ª fração
CIA 8
4ª fração
CIA 9
1ª fração
CIA 9
2ª fração
70
Figura 25 – Aspecto esbranquiçado e compacto da 1ª e 2ª fração de eluição com metanol da
CIA confeccionada.
71
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