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JOEL PEREIRA DE MOURA JÚNIOR
EXPRESSÃO DA HEPARANASE NO EPITÉLIO OVARIANO NORMAL E
NO DE NEOPLASIAS BENIGNA E MALIGNA DO OVÁRIO
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo –Escola Paulista de Medicina– para
obtenção do Título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Mancini Nicolau
Co-orientadores: Profª. Dra. Maria Aparecida Pinhal
Prof. Dr. João Norberto Stávale
Coordenador: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
São Paulo
2007
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Moura Jr., Joel Pereira de
Expressão da heparanase no epitélio ovariano normal e no de neoplasias
benigna e maligna do ovário. / Joel Pereira de Moura Júnior. -- São Paulo, 2007.
xii, 68f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ginecologia.
Título em ingles: Expression of heparanase in normal, benign and malignant ovarian
neoplasms.
1) Câncer de ovário. 2) Neoplasia epitelial benigna de ovário. 3) Ovário normal. 4)
Heparanase-2 5) Endoglicosidases.
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .................................................................................................... 01
PROPOSIÇÃO .................................................................................................... 20
PACIENTES E MÉTODOS ................................................................................. 22
RESULTADOS .................................................................................................... 33
DISCUSSÃO ........................................................................................................ 40
CONCLUSÕES ................................................................................................... 45
ANEXOS
.…………………...................…………………………………………… 47
RESUMO ............................................................................................................ 54
SUMMARY …...................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………....................………………………….. 58
FONTES CONSULTADAS ................................................................................... 67
Introdução
1. Câncer de Ovário
Por ter a imensa capacidade de originar tumores das mais diversas
linhagens histológicas e em qualquer época da vida, e ainda, por estar abrigado
cuidadosamente na pelve, onde em geral não se pode alcançá-lo, as doenças do ovário
continuam sendo para os ginecologistas, um enorme desafio. A soma de novos
conhecimentos, possivelmente permitirá que se tenha melhores condições de enfrentar
a primeira causa de morte por tumores malignos ginecológicos e a quarta causa mais
freqüente de morte por câncer na mulher.
Nos Estados Unidos, o risco de uma mulher desenvolver câncer
ovariano é de 1 para 70. Aproximadamente 23% dos cânceres ginecológicos são de
origem ovariana, entretanto, ele é responsável por 47% de todas as mortes por câncer
ginecológico. Sabe-se que, entre os tumores malignos os mais comuns são os de
origem epitelial. Especificamente, o carcinoma epitelial do ovário constitui 4% de todos
os cânceres diagnosticados nas mulheres e 5% das mortes por todos os cânceres
femininos. Sua incidência aumenta proporcionalmente com a idade, sendo que a
maioria das pacientes é acometida entre 60 e 64 anos (Cannistra, 2004; Heintz et al.,
2003; Runneban & Stickeler, 2001; Olzols et al., 2000).
Estima-se que 25.400 novos casos sejam diagnosticados
anualmente nos Estados Unidos e que, aproximadamente, 14.300 mulheres morrem
desta doença todos os anos. (Jemal et al, 2006) As neoplasias ovarianas tendem a ser
assintomáticas devido ao posicionamento profundo do ovário na pelve, o que impede a
sua identificação clínica precoce. Quando o tumor é palpado durante um exame
rotineiro, a massa ovariana já possui aproximadamente 6 cm de diâmetro e pode ser
bilateral em 35% das vezes (Lima et al., 1999).
Desprovido de qualquer característica clínica particular e com a falta
de procedimentos diagnósticos confiáveis para detectá-lo precocemente, ainda haverá
algum tempo para retirá-lo da liderança das causas de morte por malignidades
ginecológicas. Aproximadamente 75% das pacientes são diagnosticadas com a doença
em estádios avançados, com carcinomatose peritoneal, ascite e metástase à distância.
Conseqüentemente, seu índice de sobrevida em cinco anos é de apenas 35% (Heintz
et al., 2003).
Devido aos escassos recursos diagnósticos, valorizam-se a
identificação dos fatores de risco, entre os quais destacam-se as histórias de câncer
ovariano em parente de primeiro grau e o antecedente pessoal de câncer de mama,
cólon ou endometrial, apesar da identificação do fator genético estar presente em
apenas 5% das mulheres acometidas. Com base na teoria das ovulações ininterruptas,
que pode predispor o epitélio superficial ovariano à transformação maligna, estipularam-
se como fatores predisponentes, a menarca precoce, a menopausa tardia e o uso de
drogas para o tratamento de infertilidade por período prolongado. Ao contrário,
gestações a termo, uso de anticonceptivos hormonais orais por cinco ou mais anos e
amamentação são considerados fatores redutores de risco (Bhoola & Hoskins, 2006).
Os principais indicadores do prognóstico deste carcinoma são o
estadiamento e o volume residual do tumor após a cirurgia primária. O valor
prognóstico quanto ao tipo histológico é relativo. Parece que os mucinosos e
endometrióides têm melhor prognóstico que os serosos. Entretanto, no que se refere à
evolução da doença, a graduação histológica constitui um indicador de mais gravidade
quando comparado ao tipo histológico (FIGO, 2006; Abrão et al., 1997).
A sobrevida das pacientes está intimamente associada ao
estadiamento. No estádio I a sobrevida de cinco anos é de 80-90%; no II de 40 a 60%;
a partir do estádio III o prognóstico piora substancialmente, tendo uma sobrevida de 10
a 15% e, no IV de apenas 5% (Lima et al,1999).
2. Transformação Neoplásica e a matriz extracelular
Compreende-se, atualmente, que uma célula tumoral é aquela na
qual houve perda dos mecanismos reguladores do comportamento normal. A
proliferação, diferenciação e sobrevivência das células individuais em organismos
multicelulares são cuidadosamente reguladas, buscando especificamente cumprir as
necessidades do organismo como um todo. A perda desta regulação permite que elas
se multipliquem descontroladamente e, posteriormente, se disseminem, interferindo nas
funções de tecidos e órgãos normais. A perda do controle de divisão e de sobrevivência
celular estão sendo investigados por meio de pesquisas utilizando recursos da biologia
celular e molecular.
A primeira etapa no processo da formação tumoral é a mutação
celular, quando, principalmente, a célula perde o controle de proliferação. Durante todo
o desenvolvimento neoplásico, continuarão ocorrendo mutações adicionais, conferindo
a estas células maior seletividade proliferativa. Este processo chamado de seleção
clonal, torna estas células, progressivamente, mais capacitadas a sobreviver, multiplicar
e, conseqüentemente, de invadir e metastatizar.
Justamente nesta fase mutagênica é que ocorrem as alterações nos
genes reguladores das funções e propriedades celulares. Estas alterações acontecem
ao longo da vida e são causadas por agentes ambientais ou por erros intrínsecos de
replicação celular. As mutações responsáveis pelo desenvolvimento de câncer
processam-se em dois tipos de genes: os supressores de tumores e os oncogenes. Os
genes supressores de tumores codificam proteínas que, em conjunto, são responsáveis
por evitar o acúmulo de mutações genômicas e impedir a replicação de células
alteradas. Por outro lado, os oncogenes codificam proteínas que controlam diversas
vias da transdução de sinais ou da sinalização celular e, uma vez modificados, são
responsáveis pela multiplicação desordenada das células neoplásicas. Geralmente são
encontradas nos tumores malignos mutações, tanto em genes supressores, quanto em
oncogenes. A iniciação tumoral não está totalmente esclarecida, mas, sem dúvida, esta
etapa é crítica na instalação das propriedades celulares da neoplasia.
Entre as propriedades adquiridas pela célula tumoral, duas são
consideradas fundamentais: a perda da inibição dependente da densidade da
proliferação celular, ou seja, de atingir uma densidade finita, e a necessidade reduzida
de fatores de crescimento ou estímulo autócrino de crescimento. Como conseqüência
direta destes duas alterações haverá menor regulação na interação célula-célula e
célula-matriz extracelular, o que as tornará menos aderentes.
Mais uma importante característica das células malignas, que afeta a
sua inter-relação com outros componentes do tecido, é a sua capacidade de secretar
proteases capazes de degradar estruturas da matriz extracelular, facilitando a expansão
tumoral, a invasão da lâmina basal e, posteriormente, promover angiogênese (Cooper,
2001).
Além disso, as mutações bloqueiam, em um estágio precoce, a
propriedade da célula em se diferenciar. Sabe-se que nas células mais diferenciadas,
as divisões celulares são mais raras. O processo apoptótico integra esta etapa do
programa de diferenciação celular e a perda desta propriedade com a indiferenciação
celular, facilitaria consideravelmente o avanço tumoral.
Os progressos na biologia molecular e celular estão permitindo a
identificação de alterações celulares e teciduais relacionadas com a proliferação
tumoral e, em breve, ajudarão, com novas abordagens no diagnóstico, na prevenção e
no tratamento de tumores malignos.
O conhecimento da teoria celular, que em essência postula que
todos os organismos vivos são compostos por células e produtos celulares, realmente
evoluiu a partir das investigações no século XVII, decorrente do desenvolvimento das
lentes ópticas e sua combinação para construir o microscópio. O termo célula foi
empregado pela primeira vez por Robert Hooke, em 1665, para descrever suas
investigações sobre “a textura da cortiça através das lentes de aumento”. Mas foram o
botânico Schleiden (1838) e o zoólogo Schwann (1839) que definiram-na como sendo
uma massa de protoplasma limitada no espaço por uma membrana celular e que
possuía um núcleo.
Este conceito pouco mudou por mais de um século. Foi com o
ingresso da microscopia eletrônica que se desvendou um mundo de organização
subcelular que alcança o nível molecular, permitindo compreender distúrbios orgânicos
que se instalam em elementos que medem até 1 nanômetro (De Robertis & Hib,
2001). O conhecimento desta organização submicroscópica levou-nos às
transformações funcionais e físico-químicas moleculares, que estudadas em conjunto
com a biologia molecular, têm nos detalhado o funcionamento celular e as alterações
primordiais das doenças.
Quando Koltzoff, em 1929, propôs a existência de um esqueleto
sólido para promover a forma e a sustentação celular, não houve aceitação por parte da
comunidade científica, que considerava os fragmentos intracitoplasmáticos visualizados
na microscopia óptica como artefatos de fixação. No entanto, hoje está comprovado
que a maioria das células eucarióticas possui uma trama citoplasmática formada por
microtúbulos e diversos microfilamentos (Figura 1), organizados de maneira altamente
estruturada, formando um retículo tridimensional dinâmico e que serve de
armazenamento de proteínas solúveis, enzimas e de ribossomos. O citoesqueleto
também é responsável pela movimentação celular e pelo transporte interno de
organelas e outras estruturas, como os cromossomos mitóticos. Ao contrário do que o
nome possa sugerir, o citoesqueleto não é rígido e estático; é, na verdade, uma
estrutura dinâmica, continuamente reorganizada conforme as necessidades da célula
(De Robertis & Hib, 2001).
Figura 1- Microfilamentos protéicos de actina de 7 nm (reproduzido do livro “ A Célula”,
Cooper GM. Cap: Superfície Celular).
Entretanto, os tecidos animais e vegetais não são constituídos
apenas por células. O espaço entre elas, definido como matriz extracelular, é
preenchido por inúmeros tipos de glicoproteínas e polissacarídeos, em proporções
variáveis, que se organizam formando uma rede fibrótica. A quantidade de matriz é
variável conforme o tipo de tecido, sendo em parte responsável pela grande diversidade
morfológica e funcional dos diversos tecidos (Carson, 2004).
Inclui-se, atualmente, a matriz extracelular como um dos mais
importantes fatores na regulação celular e do comportamento tecidual. Já se
demonstraram inúmeras mudanças na composição e na distribuição de seus
componentes durante o desenvolvimento e a diferenciação tecidual e das várias
modificações morfo-estruturais das células decorrentes dos estímulos de hormônios,
fatores de crescimento e citoquinas que ficam armazenados entre diferentes estruturas
da matriz extracelular.
A conexão da matriz extracelular com a membrana celular ocorre
através de vários tipos de receptores, principalmente as integrinas e alguns
proteoglicanos que, por sua vez, interagem com elementos do citoesqueleto, permitindo
considerar a existência de uma relação direta e contínua, dos elementos internos
celulares com o espaço extracelular (Carson, 2004; Cooper, 2001).
A identificação dos elementos da matriz extracelular vem ocorrendo
rapidamente, graças a diferentes técnicas laboratoriais. Por meio de
imunoprecipitações, tem sido possível isolar e caracterizar bioquimicamente várias
destas estruturas. Com a imunohistoquímica pôde-se identificar a localização intra e
extracelular e, por meio de culturas celulares, já é possível verificar a atuação de muitos
receptores de membrana e de seus fatores ativadores transitando entre os dois
ambientes.
Os componentes da matriz extracelular são secretados,
principalmente, por células do tecido conjuntivo. Dividem em dois tipos: moléculas
protéicas alongadas, que se agregam formando estruturas fibrilares como o colágeno e
a elastina; e as que se juntam sem formar fibras, estas, por sua vez, dividem-se em
dois subgrupos: glicoproteínas alongadas (fibronectina e laminina), cuja função principal
é participar da adesão entre a matriz extracelular e as células, e os glicosaminoglicanos
e proteoglicanos, que formam um gel hidratado no qual estão imersos os outros
componentes da matriz. Estudos têm demonstrado que este último grupo de moléculas
está envolvido no desenvolvimento tumoral. Os glicosaminoglicanos são polímeros
lineares de açúcares formado por unidades repetitivas de dissacarídeos, sendo que um
dos açúcares sempre tem um radical amino e no outro um ácido urônico, com exceção
do queram sulfato. Geralmente, encontram-se associados à proteína, formando
macromoléculas denominadas de proteoglicanos (Carson, 2004; De Robertis & Hib,
2001; Cooper, 2001).
O proteoglicano contém uma ou várias centenas de cadeias de
glicosaminoglicanos ligados ao esqueleto protéico, constituindo uma família complexa
da qual o dermatam sulfato, o condroitim sulfato e o heparam sulfato são os principais
componentes. O radical carboxila constituinte dos resíduos de acido urônico,
juntamente com os grupamentos sulfato, conferem aos glicosaminoglicanos uma
densidade de carga negativa. Cumpre observar que o ácido hialurônico não apresenta
grupamentos sulfato em sua constituição, e o queratam sulfato não possui o ácido
urônico na sua formação. A Figura 2 e a Tabela I esquematizam a constituição dos
glicosaminoglicanos.
CONDROITIM
6 - SULFATO
DERMATAM
SULFATO
OH
NAc
O
COOH
OH
O
O
O
OH
CH
2
OH
OH
O
OH
O
COOH
NAc
OH
O
CH
2
OH
ÁCIDO
HIALURÔNICO
R
1
= AC, SO
3
H
HEPARAM
SULFATO
O
OH
OH
O
OH
O
O
NAc
OH
O
OH
O
OH
O
NAc
CH
2
O-R
CH
2
O-R
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
QUERATAM
SULFATO
R = H, SO
3
H
CONDROITIM
4 - SULFATO
R
2
= H, SO
3
H
COOH
O
OH
OH
O
O
O
OH
OH
NSO
3
H
O
COOH
OH
O
OSO
3
H
O
OH
O
OSO
3
H
O
COOH
OH
O
O
CH
2
OSO
3
H
NSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
NSO
3
H
HEPARINA
n
OH
O
COOH
OH
OH
O
O
OH
O
OH
O
COOH
OH
O
O
N -R
1
CH
2
O-R
2
N -R
1
CH
2
O-R
2
...
...
...
...
...
...
OH
O
COOH
OH
O
NAc
O
O
OH
O
COOH
OH
O
NAc
O
HO
3
SO
CH
2
OH
CH
2
OH
HO
3
SO
...
...
O
COOH
OH
OH
NAc
O
OH
O
O
OH
O
COOH
OH
O
NAc
OH
O
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
...
...
OH NAc
OH
NAc
O
COOH
OH
O
O
O
CH
2
OH
HO
3
SO
O
COOH
OHO
O
HO
3
SO
CH
2
OH
... ...
Figura 2 - Unidade estrutural dos glicosaminoglicanos A Figura ilustra a unidade
estrutural dos glicosaminoglicanos. A D-glucosamina é a hexosamina constituinte da
heparina, heparam sulfato, queratam sulfato e ácido hialurônico e a D-galactosamina
está presente em condroitim 4 e 6-sulfato e dermatam sulfato. O açúcar não
nitrogenado é um ácido urônico (-D-glucurônico ou -L-idurônico), exceto no
queratam sulfato que apresenta D-galactose. A posição dos grupamentos sulfatos
podem estar em C-2 e C-6 na hexosamina e C-2 no ácido urônico. A hexosamina está
unida ao ácido urônico por ligação
α
em heparina e heparam sulfato e
β
nos demais
compostos.
Tabela I. Características Estruturais dos Glicosaminoglicanos
GAG
Açúcar não-
nitrogenado
Ligação
Glicosídica
Hexosamina
(Hx)
Ligação
glicosídica
*Sulfato(s)
Ácido
Hialurônico
Ácido β-D-
glucurônico
β (1-3)
β-D-N-
Acetilglucosamina
β (1-4)
-
Condroitim
Sulfato
Ácido β-D-
glucurônico
β (1-3)
β-D-N-
Acetilgalactosamina
β (1-4)
C4 ou C6
(Hx)
Dermatam
Sulfato
α-L-idurônico
Ácido β-D-
glucurônico
α (1-3)
β (1-3)
β-D-N-
Acetilgalactosamina
β (1-4)
C4
(Hx)
Queratam
Sulfato
β-D-
Galactose
β (1-4)
β-D-N-
Acetilgalactosamina
β (1-3)
C6 (Hx)
C6 (Gal)
Heparam
Sulfato
Ácido β-D-
glucurônico
β (1-4)
α-D-N-
Acetilglucosamina
α-D-Glucosamina
N-Sulfato
α (1-4)
N2 e/ou C6
(Hx)
Heparina
α-L-idurônico
α (1-4)
α-D-Glucosamina
N-Sulfato
α (1-4)
N2 e C6
(Hx)
C2 (AU)
Os proteoglicanos estão presentes na membrana basal, na matriz
extracelular, na superfície de muitas células e em grânulos citoplasmáticos. O heparam
sulfato é um dos mais importantes proteoglicanos. São considerados fundamentais na
membrana e na lâmina basal, por se ligarem ao colágeno do tipo IV e a outras
estruturas protéicas. Além de atuar na composição da matriz extracelular, eles são um
dos elementos básicos na ancoragem das células a esta matriz, onde, também,
interagem com muitos fatores sinalizadores da função celular, tornando-se um
reservatório extracelular destas moléculas funcionais (Lindahl et al., 1998; Bernfield et
al., 1999; Carson, 2004).
As glicoproteínas são longas moléculas flexíveis que possuem
domínios capazes de se ligar com uma variedade de colágenos, proteínas da superfície
celular, polissacarídeos e outras proteínas da matriz extracelular como o heparam
sulfato. Esta habilidade de conectar-se a diferentes estruturas, torna-a uma das mais
importantes estruturas de ligação entre esta matriz e as células. A maioria das
proteínas de superfície está distribuída uniformemente ao longo da membrana celular.
Elas são divididas em cinco classes: caderinas, a superfamília das imunoglobulinas,
selectinas, mucinas e integrinas (Lindahl et al., 1999; Cooper, 2001; Calderwood,
2004; Springer & Wang, 2004).
As integrinas possuem baixa afinidade com seus ligantes. No
entanto, centenas a milhares de fracas interações permitem à célula ficar firmemente
ancorada à matriz extracelular (Figura 3). No processo migratório é necessário que a
célula seja capaz de, inicialmente, desfazer e, posteriormente, na reimplantação, de
refazer os contatos de adesão. Este processo é facilitado, justamente, por estas fracas
ligações. Neste ponto, ressalta-se o papel das enzimas proteolíticas que participam da
desconexão celular e, no momento final da migração, onde após a aderência no
endotélio, estas proteases promoverão a degradação da matriz extracelular local,
permitindo a penetração no tecido alvo (Calderwood, 2004; French-Constant et al.,
2004).
Figura 3: Tecido conjuntivo e esquema de uma membrana basal.
A- Esquema geral da matriz extracelular e seus constituintes, representada
abaixo da camada epitelial. B- Membrana basal e moléculas constituintes: laminina,
colágeno, entactina e o proteoglicano perlecam
(
reproduzido de
Alberts et al., 1999).
Contudo é importante compreender que a matriz extracelular não é
apenas um meio de ligação intercelular ou uma barreira para evitar a invasão tumoral.
Como já se assinalou, nela estão presentes proteínas que atuam na adesão celular,
como também, moléculas relacionadas com os processos sinalizadores da atividade e
sobrevivência celular.
Fibra Elástica
Glicosaminogli
canos e
proteoglicanos
Fibroblastos
Macrófagos
Camada
Epitelial
Membrana
Basal
Colágeno
Capilar
Mastócito
(A)
Fibra Elástica
ccolágeno tipo IV
laminina
perlecan
entactina
(B)
A capacidade ligante das cadeias de heparam sulfato com várias
moléculas cria uma rede que relaciona diferentes estruturas, como o colágeno da matriz
extracelular e as glicoproteínas presentes na membrana celular. Sua intermediação na
integração destas várias moléculas, coloca-o como um dos mais importantes elementos
da propriedade de insolubilidade da matriz extracelular e da membrana basal.
Pesquisas têm mostrado que o heparam sulfato está relacionado
com a migração, diferenciação e proliferação tumoral. Verificaram-se várias moléculas
interagindo com este proteoglicano (Figura 4). Entre as moléculas ligantes do heparam
sulfato podemos citar vários fatores de crescimento (ex: fatores de crescimento celular
e de crescimento derivado da plaqueta), as citoquinas (interleucinas -2 e -8), algumas
proteínas da matriz extracelular (fibronectinas e colágeno), fatores envolvidos na
coagulação sangüínea (cofator II-heparina) e outras proteínas como lipoproteínas, DNA
topoisomerases e proteína β-amilóide (Lindahl et al., 1998) (Bernfield et al., 1999).
Figura 4 - esquema mostrando interação do heparam sulfato com o fator de
crescimento celular (http://www.gak.co.jpFCCAglycowordPG-A01PGA)
A cadeia do heparam sulfato é originalmente sintetizada como um
polissacarídeo a partir de resíduos do ácido glucurônico (GlcUA) e da N-
acetilglucosamina (GlcNAc). No sistema de Golgi ocorre uma série de reações
enzimáticas, entre elas a remoção dos grupos acetil e sua substituição por grupos
sulfato, a epimerização do ácido glucurônico em acido idurônico e a ligação de sulfatos
nos carbonos C-6 e C-3 dos grupos da glucosamina, bem como no C-2 do grupo dos
resíduos ácido urônico (Figura 5) (Bernfield et al., 1999).
Figura 5 - Esquema da biossíntese dos Glicosaminoglicanos
O equilíbrio entre os diversos elementos que se relacionam no
ambiente circundante à membrana celular pode ser alterado pela atividade das
proteases. Nos últimos anos, o envolvimento destas enzimas tem sido intensamente
valorizado. Do conhecimento inicial, que as referenciava apenas como degradadoras da
membrana basal, passou-se, atualmente, a relacioná-las como um importante elemento
para a atividade de inúmeros fatores de crescimento e seus receptores e de citoquinas
(Iozzo et al., 1994; Bernfield et al., 1999).
Além do que, os fragmentos resultantes da proteólise podem
desencadiar estímulos desorganizados nos receptores de membrana, alterando suas
ligações com as integrinas, resultando, além da perda de adesão celular, numa série de
estímulos alterados para a função celular (Friedl et al., 2004; Wang et al., 2004;
Bauvois et al., 2004).
GlcA C5 Epimerase
2-O-Sulfotransferase
6-O-Sulfotransferase
3-O-Sulfotransferase
PAPS
NS NSNS NSNS NSNS
NS NSNS NSNS NSNS
NS NSNS NSNS NSNS2S 2 S2S
2S
NS NSNS NSNS NSNS2S 2 S2S 2S
6S 6S 6S 6S 6S6S
NS NSNS NSNS NSNS2 S 2S2S
6S 6S 6S 6S 6S6S
3S
PAPS
PAPS
PAPS
= GlcNAc
= GlcA
= Gal
= Xyl
= IdoA
GlcNAc-N-deacetylase/
N-sulfotransferase
2S
3. Heparanase
A enzima heparanase quebra pontos de ligação específicos entre
resíduos de glucosamina denominados de S-domains, onde os grupos sulfatos estão
ligados ao ácido idurônico (Toyoshima & Nakagima, 1999; Bame et al., 2001; Reiland
et al., 2004). Recentemente, vários laboratórios, por diferentes métodos, conseguiram
purificar e isolar o cDNA da heparanase humana. Pôde-se, assim, definir sua ação e os
fragmentos obtidos pela clivagem do oligossacarídeo [HexUA(2S)-GlcN (NS,6S)-IdoUA-
GlcNAc(6S)-GlcUA*-GlcN(NS)-Ido-UA(2S)–GlcN (NS,6S)], sendo, o ponto marcado
com asterisco (Figura 6), o local da ação enzimática (Bame, 2001).
Figura 6 - Estrutura do glicosaminoglicano hepam sulfato e os locais de quebra
da molécula pela heparanase (28).
Legenda: IdoUA: ácido idurônico
GlcNAc: glucosamina
GlcNAc (6S): glucosamina-6-sulfatada
GlcUA: ácido glucurônico
IdoUA (2S): ácido idurônico 2-sulfatado
GlcN (NS,6S): Glucosamina N e 6-sulfatada
Quando está localizada extracelularmente, a endo-ß-glucuronidase,
como também é chamada a heparanase, faz parte do processo de remodelação da
membrana basal pós-trauma ou agressão inflamatória. Sua atuação está relacionada
com a regulação da proliferação e diferenciação celular, alterando a matriz extracelular
e liberando fatores de crescimento, fatores angiogênicos e citoquinas, que possuem
alta afinidade ligante com o heparam sulfato. Nas condições inflamatórias, esta enzima
pode ser secretada por plaquetas ou leucócitos que estejam dentro do lúmen vascular,
comprometendo a integridade do vaso sangüíneo e permitindo a passagem de células
do lúmen para dentro de interstício (Matzer et al., 1985; Gilat et al., 1995; Edovitsky
et al., 2004).
No endotélio, as moléculas de heparam sulfato estão localizadas
principalmente na membrana subendotelial, onde ajudam a sustentar a parede
vascular. Este posicionamento parece ser muito importante, pois, o estudo de
Goldshmidt et al. (2003) demonstra que a adesão inicial do leucócito no endotélio é
uma fixação rápida e de baixa afinidade, não intermediada pelas integrinas no primeiro
momento. Os autores mostraram que o ácido hialurônico e o heparam sulfato são os
que estão, realmente, envolvidos na aderência inicial. A atuação da heparanase
localizada na superfície celular é fundamental neste momento, pois sua ação permite
que se formem pontes entre os heparam sulfatos da célula circulante com os da parede
vascular. Além disso, ela está relacionada com a ativação de inúmeras reações que
provocarão a reorganização molecular de estruturas, como a actina e a paxilina do
citoesqueleto, para facilitar a fixação celular definitiva.
A relação entre a heparanase e a adesão celular foi claramente
identificada em estudo com células de linfoma não aderente. A introdução da enzima
sem atividade proteolítica no meio de cultura induziu, precocemente, a adesão celular.
Da mesma forma, a introdução de inibidores da heparanase ativada impede mudanças
na adesão e na configuração tecidual, indicando haver diferentes atividades para a
mesma enzima (Goldshmidt et al., 2003).
McKenzie et al. (2000) comparando a composição seqüencial de
aminoácidos da heparanase, identificaram um outro gene que produz uma enzima com
35% de seqüência idêntica à da heparanase original, e a denominaram de heparanase-
2 (HPA-2), cujo tamanho varia de 48 a 60 kDa. Entretanto, pesquisas preliminares
sugerem que estas duas isoformas não possuem a mesma função e os mecanismos de
ação. Estudos já confirmaram a expressão da HPA-2 no cérebro, na glândula mamária,
na próstata, no intestino delgado, nos testículos e no útero, porém nenhum estudo
avaliou a heparanase-2 em patologias especificas ou em um grande número de
amostras.
Quatro outros tipos de moléculas, com atividade semelhante à da
heparanase, também foram identificadas intracelularmente. Foram incluídas na família
heparanase as proteínas C1A, (37-48 kDa), C1B (30 kDA), C2A e C2B (ambas com,
aproximadamente 45 kDA). (Bame et al., 1998) Até o momento, a única destas novas
moléculas a ser estudada com propriedade foi a C1A, e parece não ser uma
glicoproteína, mas sim, seria derivada do grupo das proteínas ERM (ezrin, radixin,
moesin proteína). Considera-se que estas proteínas estão envolvidas na regulação
morfológica e na adesão celular, por fazerem parte do mecanismo dinâmico dos
filamentos de actina intracelular (Chishti et al., 1998; Tsukita et al., 1999). No entanto,
por ser este um conhecimento recente, os autores questionam se a C1A realmente faz
parte da família da heparanase ou se, integrará um novo grupo de proteínas.
Na literatura internacional, os estudos que tiveram finalidade de
investigar a importância da quebra do heparam sulfato e toda alteração estrutural da
sustentação dos tecidos decorrentes da sua degradação, utilizam, quase na sua
totalidade, a primeira heparanase clonada, ou seja, a heparanase-1(HPA-1).
O locus genômico humano que codifica a heparanase-1 é composto
por 12 exons separados por 11 introns e está localizado no cromossomo 4 q21.3. O
cDNA da heparanase codifica um polipeptídeo com 543 aminoácidos com
aproximadamente 65 kDa. A forma proteolítica possui 50 kDa, devido à quebra em dois
pontos, Glu109-Ser110 e Gln157-158, o que resulta na formação de duas formas
heterodimerizadas sem função e em uma ativada, com capacidade proteolítica. Ela está
localizada primariamente nos lisossomos perinucleares e, quando necessário, através
dos endossomos pode alcançar a membrana para ser secretada (Bame, 2001; Okada
et al., 2002; Goldeshmidt et al., 2002; Zetser et al., 2004).
A HPA-1 foi descoberta em 1985, quando Vlodasvsky investigava a
habilidade dos neutrófilos em degradar a matriz extracelular subendotelial de células
vasculares cultivadas laboratorialmente. O autor identificou-a durante o processo de
fragmentação do heparam sulfato. Relatou que sua atuação era fundamental na
primeira etapa do processo leucocitário de extravasamento e diapedese na resposta a
um órgão inflamado (Matzer et al., 1985). Poucos anos mais tarde, o mesmo autor
descreveu a relação desta enzima com a liberação de fatores de crescimento celulares
envolvidos com o processo neoangiogênico (Vlodavsky et al.,1988; Friedl & Wolf,
2003).
A participação enzimática na etapa inicial do processo de adesão da
célula migratória ou durante a reorganização da matriz extracelular induz à ativação,
produção e secreção de heparanase intracitoplasmática. Este fato indica que a
regulação da produção desta enzima depende do aumento da atividade enzimática
junto à membrana celular. Possivelmente, a quebra do heparam sulfato e a perda de
seu domínio na membrana desencadeariam o mecanismo estimulatório, fazendo com
que a célula atinja níveis de saturação em 120 minutos e mantenha a produção
enzimática por até 30 horas (Nadav et al., 2002). O tempo de conversão da enzima de
65 kDa para a forma ativada (50 kDa) leva aproximadamente 30 minutos após o
estímulo (Gingis-Velitski et al., 2004).
Este estímulo não ocorre só nas células migratórias ou nas que
serviram para a ancoragem. Outras células do estroma adjacente também produzem e
secretam a enzima ativada, como pode ser verificado na fotomigrografia da Figura7.
Além do mais, sabe-se que células com maior potencial metastático possuem a
capacidade de armazenar enzimas produzidas por outras células mediante o
mecanismo endocitótico (Marchetti & Shen, 2000). Entretanto, deve haver algum
mecanismo de regulação da secreção enzimática, pois, se existir uma grande
quantidade da forma ativada no meio extracelular, haverá com este excesso o
impedimento das células se agruparem, levando-as a apoptose (Ikeguchi et al., 2003).
Figura 7 - Fotomicrografia de cistoadenoma mucinoso. Observa-se positividade tanto
nas células epiteliais como nas do estroma adjacente. Imuno-histoquímica para
heparanase-2. Aumento de 400 x.
A localização celular das formas enzimáticas somente foi esclarecida
mais recentemente. A heparanase HPA-1 inativa acha-se distribuída difusamente pelo
citoplasma, enquanto a forma proteolítica encontra-se acumulada em vesículas
perinucleares. Esta proximidade nuclear dá indícios de que, provavelmente, exista uma
regulação gênica para a sua produção. A localização da forma ativada junto ao núcleo
contrariou muitas publicações anteriores, que indicavam que a ativação enzimática
ocorreria em organelas próximas à membrana celular (Goldshmidt et al., 2002; Shafat
et al., 2006).
Figura 8 - Representação esquemática da biossíntese e da secreção da heparanase
Gingis-Velitski, S. et al. J. Biol. Chem. 2004.
A atuação da heparanase HPA-1 varia conforme o pH do ambiente
onde ela se encontra. Várias pesquisas confirmaram a ação enzimática em meio
acidificado, com um pico de atuação entre 5,5 e 5,8 (Bame, 2001). No entanto, quando
a enzima está em um meio com um pH acima 7, sua função relaciona-se com a adesão
celular (Gilat et al., 1995; Toyoshima et al., 1999; Zetser et al., 2003). Esta atividade
diferenciada confere a esta enzima importante papel no mecanismo regulatório do
equilíbrio da matriz extracelular. Em condições fisiológicas sua função é de manter a
estabilidade tecidual; em contrapartida, no meio patológico acidificado, exerce uma
ação proteolítica, provocando importante desordem na rede de sustentação tecidual,
facilitando, inclusive, a proliferação tumoral (Zetser et al., 2003).
Além do mais, com a degradação do heparam sulfato, haverá a
liberação de inúmeros fatores associados á atividade celular, que junto a ele, estavam
armazenados. Este evento foi francamente confirmado em vários estudos, que
analisaram o processo de neovascularização tumoral. Neles verificou-se que após a
ação da heparanase, houve aumento na expressão de FGF-2 e VEGF na matriz
extracelular, desencadeando forte atividade angiogênica local (Vlodavsky et al., 1988;
Vlodavsky et al., 2001; Goldshmidt et al., 2002; Cairns et al., 2003).
São muitas as confirmações da expressão desta enzima em diversas
situações fisiopatológicas humanas. A heparanase está envolvida com a implantação e
com o desenvolvimento dos sistemas vascular e nervoso embrionário. Em adultos, sua
função enzimática está relacionada com a reparação e a remodelação tecidual, como
também com a resposta imunológica.
Verificou-se, ainda, sua expressão da HPA-1 em condições não
patológicas. Altos níveis de sua atividade foram detectados na placenta e, mais
recentemente, na pele sã (Dempsey et al., 2000; Nadav et al., 2002; Haimov-
Kochman et al., 2002). Estudos avaliando afecções não tumorais, como diabete e
doenças benignas do fígado (Xiao et al., 2003) e do rim (Levidiotis et al., 2001)
mostraram aumento de expressão da heparanase-1. Detectou-se, inclusive, a presença
desta enzima na urina, sugerindo que futuramente, poderá ser utilizada como marcador
precoce de agravamento do diabete ou do avanço metastático tumoral (Ferro et al.,
2004).
A heparanase homóloga, HPA-2, já foi encontrada em tecido bovino
e de rato, mas a enzima que degrada os proteoglicanos dos insetos Drosophila
melanogaster e Caenorhabditis elegans não são semelhantes à humana (DeClerck et
al., 2004). Em bactérias, as enzimas que possuem a mesma atuação são chamadas de
heparinase e heparitinase (Okada et al., 2002).
4. Heparanase-1 e Câncer
Entretanto, ultimamente, estudos têm enfatizado a importante relação
da expressão da heparanase HPA-1com proliferação de enorme variedade de tumores
primários, inclusive com o aumento da vascularização tumoral e com pobre resultado
de sobrevivência pós-operatória. Pesquisas também têm associado sua presença com
maior potencial metastático de diferentes linhagens de tumor.
A avaliação da heparanase no carcinoma de cólon demonstrou forte
expressão enzimática, tanto no carcinoma primário como nas metástases. Na análise
comparativa com tubulovilosidades de adenomas, observou-se que a presença
enzimática foi evidentemente mais fraca nas amostras benignas, e que ainda, no tecido
colônico normal, não se verificou sua expressão (Friedmann et al., 2000).
Correlacionando a expressão da heparanase com o prognóstico do
câncer colorretal, Sato et al. (2004) registraram que, dos 104 pacientes, cujas cirurgias
foram classificadas como de ressecção curativa, 84% das com expressão negativa da
heparanase tiveram sobrevida de cinco anos, contra 47% daquelas que possuíam
positividade enzimática. Resultados de pior sobrevida pós-operatória, também foram
notados em pacientes acometidos pelo adenocarcinoma ductal pancreático. A média de
sobrevida foi de 34 contra 17 meses nos pacientes com heparanase negativa e positiva,
respectivamente (Rohloff et al., 2002).
No carcinoma gástrico, a presença desta enzima foi
significativamente maior nas neoplasias quando comparadas com amostras de tecido
adjacente normal. Detectou-se ainda que, nos tumores mais volumosos e nos que havia
confirmação de invasão linfática, a expressão enzimática estava claramente aumentada
e que, decorrente a isto, estavam associados a pior prognóstico (Endo et al., 2001;
Takaoka et al., 2003; Chen et al.,2004).
Na amostra celular obtida do lavado peritoneal de pacientes com
carcinoma gástrico avançado, a detecção de heparanase foi de 100% nos que
apresentavam evidentes metástases peritoneais e de 59% nos que possuíam invasão
da serosa. Os autores deste estudo concluíram que a confirmação enzimática em
células do líquido peritoneal pode representar doença micrometastática do peritônio,
justificando, talvez, uma postura terapêutica mais agressiva (Wang et al., 2005).
Diversos estudos relacionaram a heparanase-1 com o câncer
mamário. Verificou-se que os tumores que apresentavam linfonodo sentinela positivo
possuíam expressão desta heparanase em 53% dos carcinomas primários, entretanto;
23% dos tumores com representação enzimática positiva não tinham sentinela positivo.
Notou-se que, nos tumores com um a cinco cm, havia aumento significativo da
expressão enzimática quando comparados com os menores de 1 cm (Maxhimer et al.,
2002). Confirmou-se, também, que os com maior indiferenciação histológica possuíam
maior expressão enzimática (Gotte & Yip, 2006). Quanto a metastatização à distância,
relacionaram o envolvimento precoce da enzima com a promoção da osteólise
metastática, até antes da confirmação do exame de imagem diagnóstica, sugerindo que
terapias anti-enzimáticas poderiam interromper a expansão deste tumor para os ossos
(Elkin et al., 2003; Kelly et al., 2005).
Observou-se, também, que amostras de câncer mamário com
receptor de estrogênio positivo mostraram forte expressão da heparanase-1,
contrariamente das com receptores negativos onde a representação enzimática era
mínima, ou até mesmo ausente. Especificamente sobre a relação do estrogênio com
esta neoplasia, o estudo realizado por Elkin et al. (2003) demonstrou importante
envolvimento desse hormônio na promoção gênica da heparanase-1. Utilizando cultura
de células de carcinoma mamário, os autores demonstraram que a presença
estrogênica induzia fortemente à produção enzimática, fato que não se mantinha após a
introdução no meio de cultura de medicação antiestrogênica. Os autores concluíram
que, de alguma forma os receptores extrínicos estariam envolvidos no mecanismo
ativador da transcrição da heparanase.
Esta enzima também foi avaliada em outros tumores ginecológicos.
Análise comparativa de amostras de colo normal, de tumores cervicais microinvasivos e
invasivos, mostrou maior expressão nos tumores mais avançados. Correlacionou-se
que, nas amostras onde havia importante presença enzimática, o tumor tinha mais
vascularização e maior poder metastático (Kodama et al., 2005), além do que as
pacientem tinham, notadamente, menor sobrevida e o tempo livre da doença. No
entanto, não houve diferença significativa quanto à idade da paciente e ao grau
histológico tumoral (Shinyo et al., 2003).
No câncer endometrial, Watanabe et al. (2003) detectaram a
heparanase-1 em 50% de suas amostras, mas havia forte expressão a partir do estádio
III C (FIGO), nos tumores mais indiferenciados e nos que possuíam envolvimento do
espaço linfovascular. Os autores também associaram a positividade enzimática à maior
densidade vascular tumoral. Resultados semelhantes foram obtidos em 2006 por
Hasengaowa et al., que ainda confirmaram a presença da HPA-1 no endométrio
normal, principalmente na fase proliferativa tardia.
Entretanto, apesar do ovário ser o mais letal dos tumores malignos
ginecológicos, pouco são os estudos que analisaram a expressão da heparanase-1.
Ginath et al. (2001) compararam a atividade enzimática em 10 tumores malignos
epiteliais de vários tipos, dois tumores benignos e quatro amostras de tecido ovariano
normal. Notaram baixa atividade enzimática nos tumores benignos e no tecido normal,
sendo que nestas amostras a pouca expressão desta enzima estava localizada
predominantemente em células endoteliais. Exclusivamente com relação aos tumores
malignos, observaram que a expressão da heparanase-1 foi maior nos mucinosos do
que nos serosos e nos endometrióides.
Comparando amostras de 50 carcinomas ovarianos, 33 metástases
linfonodais deste câncer e 10 cistoadenomas serosos, verificou-se claramente maior
expressão da heparanase-1 nas amostras malignas, e ainda que ela era maior nos
tumores primários do que nos linfonodos comprometidos (Liu et al., 2003).
Kodama et al. (2003) verificaram haver forte produção desta enzima
em 16 de 31 amostras de tumores epiteliais ovarianos malignos, sendo as que
possuíam mais expressão enzimática eram aquelas com alto grau de diferenciação e
de pacientes que apresentavam ascite importante.
5. Perpespectivas Futuras e Interesses de Pesquisa
Inibidores da angiogênese e de metástases tumorais têm emergido
como as mais novas candidatas para o sucesso na terapia oncológica. Drogas com o
intuito de inibir a ação enzimática da heparanase-1 sobre a matriz extracelular estão
sendo pesquisadas. Dois oligossacarídeos sulfatados, sulfato de fosfomanopentose (PI-
88) e sulfato de maltohexose, têm mostrado importantes propriedades, atuando
simultaneamente como potentes inibidores in vitro da angiogênese e da heparanase-1.
Outra medicação, o sulfato de laminarina, também demonstrou ter atividade anti-
heparanase-1, bem como a capacidade de inibir a ligação do FGF-2 com seu receptor,
resultando na inibição da proliferação de células endoteliais e, conseqüentemente, da
angiogênese (Hoffmann et al., 1995; Miao et al., 1999; Miao et al., 2006).
Entretanto, como já foi referido, a investigação de Mackenzie et al,
em 2000, confirmou haver outras enzimas da família da heparanase. Esses autores
identificaram a heparanase-2 (HPA-2) em vários tecidos humanos normais e em
algumas células tumorais. O locus gênico desta enzima está no cromossomo 10q23-24,
entre os marcadores WI-5915 e WI-4209. E da mesma forma que sua isorforma HPA-1,
é encontrada tanto no citoplasma como na membrana celular. Para estes autores a
heparanase-2 apresentou-se muito mais expressa tumores mamários do que em tecido
glandular normal. Da mesma forma, em amostras de adenocarcinoma pancreático,
havia expressão muito maior desta enzima quando comparadas ao tecido pancreático
normal (Mackenzie et al., 2000).
Assim, nossa proposta de avaliar a expressão de heparanase HPA-2
nas neoplasias epiteliais do ovário e compará-las com a de amostras de tecido ovariano
normal, deve-se ao interesse de identificar ou não sua presença nestes tumores, visto
que até o momento os dados da literatura internacional a esse respeito são parcos.
Proposição
Propõe-se, no presente estudo, avaliar comparativamente por meio
de análise qualitativa e quantitativa pela técnica de imuno-histoquímica, a expressão da
heparanase-2 (HPA-2) em amostras de epitélio de ovário normal e de neoplasias
ovarianas epiteliais benigna e maligna.
Pacientes e Métodos
1. PACIENTES
Fizeram parte deste estudo 75 pacientes que foram atendidas na
Disciplina Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM), com o
diagnóstico de neoplasia do ovário, ou que por apresentarem alguma outra neoplasia,
necessitaram ser submetidas a ooforectomia. Excluímos todas as que receberam
previamente químio ou radioterapia.
Em 58 dessas pacientes, a indicação cirúrgica foi o diagnóstico pré-
operatório de tumor anexial; em 14 por apresentarem tumor uterino e, por fim em três, o
material foi obtido por biópsia de ovário que se apresentava com aspecto duvidoso no
momento cirúrgico, em pacientes que haviam sido submetida à cirurgia com diagnóstico
de doença abdmino-pélvica não ovariana.
Com o propósito de estabelecer cuidadoso critério de
homogeneidade entre os grupos, realizamos detalhada anamnese, exames físico geral
e ginecológico, colheita de citologia oncológica cérvico-vaginal e estudo histopatológico
ovariano. Entre os exames subsidiários de imagem, efetuaram-se ultra-sonografia
pélvica transvaginal e RX simples de tórax. Quanto aos exames laboratoriais,
avaliaram-se hemograma e coagulograma, além das dosagens de glicemia de jejum,
creatinina, sódio, potássio, uréia, transaminases glutâmico oxalacética e pirúvica.
Na anamnese, foram anotados os seguintes dados: idade; raça;
número de gestações, de partos e de abortamento, e também a época da incidência da
menarca e o início e o tempo de pós- menopausa.
Esses dados permitiram verificar que a idade variou de 13 a 87 anos,
com idade média de 53,88. Especificamente, no grupo das pacientes com câncer
ovariano a idade média foi de 64,7 anos.
Quanto à raça, houve um predomínio da branca (70,67%). A idade
média da menarca foi de 12,94 anos e 54,67% das pacientes encontravam-se na pós-
menopausa. A média de gestações foi de 3,53 e, a de partos, de 2,81 (Anexo/Tabelas
IX, X, XI).
Entre os dados do exame físico geral anotaram-se o peso, a altura e
o índice de massa corpórea. O índice de massa corpórea foi calculado pela relação
entre o peso (em quilogramas) divido pela altura (em metros) ao quadrado (KEYS,
1972). Também se verificou a pressão arterial, caracterizando-se como estado
hipertensivo quando, em dois atendimentos consecutivos, os níveis observados nos
membros superiores ultrapassavam 140 mmHg para a pressão sistólica ou de 90
mmHg para a diastólica. Verificou-se que 37,33% apresentavam hipertensão arterial
sistêmica e o índice de massa corpórea médio foi de 24,85.
De acordo com o material ovariano obtido, as pacientes foram
divididas em três grupos: o primeiro com 23 espécimes cujo diagnóstico histopatológico
foi de neoplasia epitelial maligna; o segundo com 35 amostras com diagnóstico de
neoplasia epitelial benigna e, por último, 17 fragmentos de ovário diagnosticado como
normal, obtido de laparotomias realizadas para tratamento de afecções benignas do
útero. Convém ressaltar, ainda, que foram excluídas pacientes com neoplasia ovariana
de origem não epitelial ou aquelas que, para o estudo comparativo de ovário normal,
tivessem em seus antecedentes pessoais algum tipo de neoplasia maligna.
As pacientes com neoplasia maligna do ovário foram estadiadas de
acordo com os critérios adotados pela FIGO – Federação Internacional de Ginecologia
e Obstetrícia em 2003
.
No primeiro grupo, onde estão as pacientes com neoplasia
epitelial ovariana maligna, 5 (21,74%) tinham tumor restrito aos ovários (estádios I A e I
B) e 18 (78,26%) possuíam neoplasias com estádio acima de I C.
As pacientes com tumores bem diferenciados nos estádios IA e IB
tiveram, como tratamento cirúrgico, histerectomia com salpingooforectomia bilateral,
omentectomia e linfonodectomia seletiva.
Nos estadiamentos II, III e IV, foram realizadas cirurgias
citorredutoras para remoção do máximo possível de tumor e dos eventuais implantes
metastáticos. Posteriormente, as pacientes foram encaminhadas para complementação
quimioterapêutica.
2. MÉTODOS
2.1 MÉTODO ANATOMOPATOLÓGICO
O material estudado foi obtido a partir de peças operatórias de
cirurgias realizadas no Hospital São Paulo (UNIFESP-EPM) e processadas pelo
Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo.
Os espécimes a serem estudados seguiram a rotina desse
Departamento. Assim, o material foi colocado em um frasco contendo formol
tamponado a 10%. Posteriormente, as peças foram desidratadas em concentrações
crescentes de etanol, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina.
Os blocos parafinados foram cortados em espessura aproximada de
três micras e, as lâminas, coradas pela técnica de hematoxilina-eosina. Dessa forma,
determinou-se o tipo histológico e o grau de diferenciação nos casos de neoplasia
maligna.
Todas as lâminas do material em estudo foram revisadas por um
segundo patologista, não apenas para a confirmação diagnóstica, como também, para
a seleção das áreas mais representativas do tumor. Assim, após a revisão e seleção
das lâminas, fez-se novo corte nos blocos, colocando–se esse material em lâminas
previamente silanizadas a 4% para a execução do estudo imuno-histoquímico.
Após o estudo imuno-histoquímico, as lâminas foram novamente
revisadas pelo segundo patologista, ou seja, efetuou-se uma terceira revisão dos casos,
para que, realmente, a área de neoplasia a ser estudada fosse a mais representativa
para nossa avaliação.
2.2 MÉTODO IMUNOHISTOQUÍMICO
As reações imuno-histoquímicas foram efetuadas no Laboratório de
Biologia Molecular da UNIFESP-EPM. Após os blocos terem sido cortados com a
utilização de um micrótomo, as lâminas, que inicialmente foram silanizadas, foi
submetidas à técnica de imunohistoquímica que seguiu o seguinte protocolo:
primeiramente elas foram desparafinadas permanecendo 20 minutos em xilol aquecido
a 95ºC, seguido de três banhos de xilol à temperatura ambiente.
Em seguida, o tecido foi hidratado, submergindo-se as lâminas em
álcool absoluto, álcool 95% e álcool 70%, respectivamente, seguido de lavagem em
água corrente e depois em água destilada e deionizada. O próximo passo foi à
recuperação antigênica realizada em “banho maria”, sendo as lâminas colocadas em
solução de citrato 10 mM, pH 6,0 a 95-100ºC. Após 35 minutos, as lâminas foram
retiradas seguindo-se à lavagem em tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2-7,4 (PBS)
três vezes por três minutos.
Na seqüência, procedeu-se o bloqueio das peroxidases endógenas
lavando-se as lâminas em água oxigenada 10V (3%), sete vezes por cinco minutos,
seguido de lavagem em água corrente, em água destilada e em PBS três vezes por três
minutos. Seguiu-se então, o bloqueio de sítios inespecíficos colocando-se as lâminas
em leite Molico® 2%. O anticorpo primário HPA-2 C-17 ,produto sc-14900 (Santa Cruz
Biotechnology Inc, Califórnia – EUA), é um anticorpo policlonal purificado a partir de
soro de cabra que tem afinidade contra um peptídeo localizado próximo à porção
carboxiterminal da heparanase de origem humana. O anticorpo foi diluído na proporção
de 1:50 em Soro Albumina Bovina (BSA), Sigma. Todas as lâminas foram cobertas com
100 µL dessa solução e permaneceram incubadas em câmara úmida em geladeira
durante 18 horas.
Após este período de incubação, as lâminas foram lavadas em PBS
três vezes por três minutos e em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo
secundário biotinilado e depois com o complexo estreptoavidina peroxidase por 15
minutos a temperatura ambiente.
No final das incubações, as lâminas foram lavadas em PBS três
vezes por três minutos. Procedeu-se, então, a revelação, processo em que as lâminas
são colocadas no cromógeno (3-3’-diaminobenzamidina – DAB 100mg em 70 mL de
PBS + 3 mL de água oxigenada) por um minuto e em seguida, lavadas em água
corrente por cinco minutos, contracoradas em hematoxilina de Harris por 30 segundos e
de novo lavadas em água corrente por cinco minutos para serem desidratadas,
submergindo-as em álcool 70%, álcool 95%, álcool absoluto e em solução de xilol três
vezes, respectivamente. Finalmente, as lâminas foram finalmente montadas com
lamínula e Etelan, rotuladas e mantidas em posição horizontal por 24 horas.
2.3 MÉTODO DE INTERPRETAÇÃO QUALITATIVA PARA
AVALIAR A EXPRESSÃO DA HEPARANASE-2.
Analisou-se a imunoexpressão da heparanase no Laboratório de
Biologia Molecular e Ginecologia Experimental do Departamento de Ginecologia
(UNIFESP- EPM).
Para leitura, colocou-se cada lâmina sob a luz do microscópio óptico com aumento de
400 vezes. Por padronização, escolheram-se os campos com maior concentração de
células apresentando imunoexpressão enzimática. O padrão de positividade foi
determinado pela intensidade da coloração acastanhada do citoplasma corado da
célula estudada.
Critérios utilizados para avaliar a imunoexpressão qualitativa da
heparanase-2:
(-) negativo: ausência de positividade em todas as células estudadas no material ou
células isoladas positivas, não excedendo 5% da amostra (até 5% de células com
positividade citoplasmática foi considerada desprezível).
(+) fraca: presença de células isoladas ou não, com positividade leve, entre 5 a 25% da
amostra de células verificadas.
(++) moderada: presença de positividade em até 50% das células da amostra.
(+++) intensa: presença de positividade acima de 50% das células avaliadas.
Consideramos, para a análise estatística, os valores acima de 25%
de coloração, moderada ou intensa, como positivos para heparanase. (Taylor et al.,
2006)
2.4 MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DIGITAL DA
IMUNOEXPRESSÃO CITOPLASMÁTICA PARA HEPARANASE (80)
Inicialmente, as lâminas foram analisadas em microscópio óptico
Nikon Eclipse
®
TS100 sob a mesma intensidade de luz e altura do condensador. A área
que melhor representava a marcação estudada (hot spots) foi escolhida em aumento
microscópico de 40 e 100x. Para análise digital da imunoexpressão, em aumento de
400x, foram realizadas fotomicrografias de 640x480 pixels, em campos consecutivos e
não coincidentes com câmera digital Nikon Coolpix
®
4300 em zoom óptico máximo,
abertura de condensador F13.4 e tempo de exposição de 1/250, com flash desligado.
As imagens obtidas foram transferidas para um computador Pentium 4
®
com sistema
operacional Windows XP
®
e analisadas por meio do Sistema de Processamento e
Análise de Imagem ImageLab
®
(Softium Informática
®
, São Paulo, Brasil), calibrado para
utilizar a escala em micrômetro (µm).
Foram determinados, pelo método de quantificação digital o Índice de
Positividade (IP
DIG
), Intensidade de Expressão (ItE
DIG
) e Índice de Expressão (IE
DIG
)
Imuno-histoquímico caso a caso.
2. 4. 1 CÁLCULO DO ÍNDICE DE POSITIVIDADE (IP
DIG
)
As células positivas e negativas foram individualmente selecionadas
(Figura 9) em cada fotomicrografia digital. Sua contagem foi feita simultaneamente pelo
programa ImageLab
®
, até o mínimo de 1000 células tumorais de origem epitelial. Caso
no último campo analisado não fossem atingidas 1000 células, realizava-se a análise
total do próximo campo. Assim, determinou-se o total de imagens a serem analisadas
em cada caso e o Índice de Positividade (IP
DIG
), expresso em porcentagem (%),
segundo a equação:
IP
DIG
= número de células positivas x 100 → [%]
número total de células contadas
Figura 9 – Demonstração do uso do ImageLab
®
na identificação manual de células
positivas (pontos brancos) e negativas (pontos pretos) e sua concomitante contagem
automática (seta) para o cálculo do IP
DIG
.
2. 4. 2 CÁLCULO DA INTENSIDADE DE EXPRESSÃO (ItE
DIG
):
A intensidade da coloração castanha expressa foi objetivamente
determinada com o emprego do programa de análise de imagem. Para tanto,
selecionou-se manualmente uma região da área do citoplasma de 12 células positivas
distribuídas homogeneamente nas mesmas fotomicrografias utilizadas no cálculo do
IP
DIG
.
A densidade óptica de imunoexpressão (DOi) dessas áreas foi
calculada automaticamente e representou a média de composição das cores vermelha,
verde e azul (RGB) pela área total selecionada (Figura 10), expressa em unidades
ópticas por micrômetro quadrado (u.o./µm
2
).
(A) (B)
Figura 10 – Demonstração do uso do ImageLab
®
. (A) Determinação manual das 12
áreas de citoplasma marcadas com peroxidase (quadrados em vermelho); (B) planilha
de resultados onde a seta indica a densidade óptica pela área total selecionada.
O mesmo procedimento foi aplicado para obtenção da densidade
óptica do fundo (DOf) em uma área com ausência de tecido ou espaço vascular, com
intuito de equalizar as cores das imagens capturadas (Figura 11). A delimitação de
apenas uma área é suficiente, uma vez que o fundo é homogêneo em cada
fotomicrografia.
Figura 11 – Demonstração do uso do ImageLab
®
na delimitação manual da área de
ausência de tecido (quadrado em vermelho) e o cálculo de sua densidade (seta).
É importante ressaltar que os valores de densidade óptica calculados
pelo programa compõem uma escala decrescente na qual altos valores correspondem
a cores visualmente claras. Isso se deve ao fato de que a cor branca absoluta, que
corresponde ao máximo da densidade óptica (320,7 u.o./µm
2
), é composta pela
totalidade de vermelho, verde e azul; e o preto, a ausência delas.
A equação abaixo foi aplicada para o cálculo do Índice de
Intensidade de Expressão (ItE
DIG
), cujos valores compõem uma escala crescente,
equalizados pela DOf, proporcional à densidade óptica do branco absoluto.
ItE
DIG
= 320,7 – 320,7 x Σ DOi → [u.o./µm
2
] Σ DOf
Nesta equação, “Σ DOi” representa a somatória da Densidade Óptica
da imunomarcação, “Σ DOf” a somatória da densidade óptica do fundo e “ItE
DIG
” a
Intensidade de Expressão em unidades ópticas por micrômetro quadrado.
2. 4. 3 CÁLCULO DO ÍNDICE DE EXPRESSÃO (IE
DIG
):
O Índice de Expressão Imuno-histoquímico (IE
DIG
) é proporcional à
fração de células positivas e à intensidade de expressão, segundo a equação abaixo:
IE
DIG
= IPDIG x ItE
DIG
→ [u.o./µm
2
]
100
Nela, “IP
DIG
” representa o Índice de Positividade, “ItE
DIG
” a
Intensidade de Expressão e “IE
DIG
“ o Índice de Expressão em unidades ópticas por
micrômetro quadrado (Anexo -Tabela II, III, IV).
2.5 MÉTODO ESTATÍSTICO
Devido à sua capacidade de analisar diferentes grupos de
distribuição, optou-se pelo teste de Kolmogorov-Smirnov para a avaliação estatística
comparativa dos diferentes tipos de amostras com valores dispersos. Para todas as
análises utilizou-se o programa SPSS versão 13.0 (SPSS Inc; Ilinois, USA).
Os valores obtidos pelo estudo de cada variável contínua foram
organizados e descritos pela média e desvio padrão. Para as categorizadas utilizaram-
se freqüências absolutas e relativas.
Para as comparações da freqüência de um fenômeno entre grupos
de variáveis categorizadas foram aplicados os testes exato de Fisher e qui-quadrado de
Pearson. Na comparação entre as médias de duas populações amostrais utilizou-se o
teste “U” de Mann-Whitney ou “t” de Student, e entre as médias de três ou mais
populações aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis ou ANOVA, segundo a parametricidade
da amostra.
Resultados
1. Fotomicrografias com representação da imunomarcação da Heparanase-2
Figura 12 -Fotomicrografias de cistoadenocarcinomas serosos de ovário com forte
expressão imunohistoquímica de heparanase-2, aumento de 400 x.
Figura 13 - Fotomicrografias de cistoadenomas mucinosos de ovário com forte
expressão imunohistoquímica de heparanase-2, aumento de 400 x.
A. B.
C. D.
Figura 14 - Fotomicrografias de neoplasias epiteliais malignas (A e B) e benignas (C e
D) do ovário com fraca ou nenhuma expressão imunohistoquímica de heparanase-2,
aumento de 400 x
.
2. Dados descritivos e resultados da expressão de heparanase-2
Os dados descritivos encontrados nas neoplasias de natureza benigna
e maligna quanto à morfologia e índices imuno-histoquímicos de expressão da
heparanase HPA-2, encontram-se enumerados na Tabela V.
TABELA V:
Dados anatomopatológicos e imuno-histoquímicos da expressão de heparanase nas
neoplasias ovarianas
Variáveis Anátomo-Patológicas e Imunohistoquímicas Valores
NATUREZA DA AMOSTRA
Benigna
32 (61,5%)
Maligna
20 (38,5%)
Não Neoplásico
16( 23,5%)
NEOPLASIAS BENIGNAS
Morfologia:
Seroso
21 (65,6%)
Seromucinoso
1 (3,1%)
Mucinoso
10 (31,3%)
Expressão de Heparanase-2:
Índice de Positividade (IP: %)
72,24
± 38,79
Intensidade de Expressão (ItE: u.o/
µ
m2 - média ± desvio-padrão)
147,24 ± 58,99
Índice de Expressão (IE: u.o/µm2 - média ± desvio-padrão)
121,29 ± 74,96
NEOPLASIAS MALIGNAS
Morfologia:
Seroso
15 (7 5%)
Mucinoso
5 (25%)
Expressão de Heparanase-2:
Índice de Positividade (IP: %)
87,34
± 19,49
Intensidade de Expressão (ItE: u.o/
µ
m2 - média ± desvio-padrão)
134,15 ± 22,88
Índice de Expressão (IE: u.o/µm2 - média ± desvio-padrão)
118,01 ± 37,37
A comparação entre os índices imuno-histoquímicos das neoplasias
benignas e malignas, analisados de uma maneira generalizada, não revelou diferença
estatisticamente significante quanto aos índices de positividade e de expressão da
HPA-2, porém a intensidade de expressão, isoladamente, demonstrou ser mais intensa
nas amostras neoplasias benignas, quando comparadas com o grupo de malignas
(p=0,016; teste “U” de Mann-Whitney). Os valores obtidos nesta comparação
encontram-se na Tabela VI.
TABELA VI : Expressão de heparanase nas células neoplásicas em neoplasias ovarianas de
acordo com a média do Índice de Positividade (IP), Intensidade de Expressão (ItE) e Índice de
Expressão(IE).
Média da Expressão de Heparanase nas Células Neoplásicas
IP(%) ItE(u.o./µm
2
) IE (u.o./µm
2
)
Não Neoplásico (16) - - -
Benigno (32) 72,24 147,24 121,29
Maligno (20) 87,34 134,15 118,01
p** 0,516 0,016* 0,43
* teste “U” de Mann-Whitney
Este resultado, de forma isolada, tem pouca importância, pois o
índice que realmente avalia quantitativamente a expressão de heparanase é o Índice de
Expressão (IE) que agrupa o índice de positividade e a intensidade de expressão.
Como pode ser observado, embora a intensidade de expressão seja significativa,
percebe-se que há menos células positivas, não refletindo, portanto, nos valores finais
do Índice de Expressão. A Figura 15 ilustra a dificuldade de se avaliar a amostra
tecidual como um todo.
Figura 15 - Microscopia óptica em aumento de 400x demonstrando expressão positiva
de heparanase (presença de citoplasma acastanhado) em células epiteliais neoplásicas
tanto benignas (A) quanto malignas (B) em neoplasias ovarianas de padrão sero-
papilífera.
Também foram comparados os índices imuno-histoquímicos da
heparanase-2 de acordo como a morfologia da neoplasia. Não houve diferença
estatisticamente significante entre a expressão de heparanase (pelo do cálculo dos três
índices: IP, ItE e IE) e a natureza da neoplasia, categorizada pela morfologia da
neoplasia. Os resultados encontrados encontram-se sintetizados na Tabela VII.
TABELA VII: Expressão de heparanase em células neoplásicas ovarianas, categorizadas pelo tipo
neoplásico e de acordo com a média do Índice de Positividade (IP), Intensidade de Expressão (ItE)
e Índice de Expressão(IE)
Média da Expressão de Heparanase nas Células Neoplásicas
IP(%) ItE(u.o./µm
2
) IE (u.o./µm
2
)
Morfologia Serosa (*)
Benigno (17) 89,22 176,34 161,82
Maligno (1) 87,40 114,10 99,30
p*** 0,940 0,075 0,296
Morfologia Sero-papilífera (**)
Benigno (4) 100,00 156,02 156,02
Maligno (5) 85,52 148,08 132,00
p*** 0,407 0,628 0,407
Morfologia Mucinosa (*)
Benigno (10) 31,39 93,70 38,47
Maligno (1) 100,00 123,50 123,50
p*** 0,124 0,698 0,112
* valores estatísticos comprometidos pela enorme disparidade das amostras
** sub-tipo histológico
*** teste “t” de Student
Com os resultados encontrados, concluiu-se que não se pode
estabelecer, pela metodologia quantitativa, uma relação entre a heparanase e as
neoplasias ovarianas, visto que houve expressão enzimática semelhante nas
neoplasias de natureza benigna e maligna. Inclusive, entre as duas formas neoplásicas
com área papilífera em seu interior.
Entretanto, na avaliação qualitativa (Tabela VIII) pode-se observar
diferença estatística entre as amostras de neoplasia benigna e maligna. Verificou-se
que o resultado negativo foi muito menos freqüente no grupo dos tumores malignos.
Tabela VIII - Expressão de Heparanase Qualitativa no Tecido
Porcentagem de amostras
Benigno (34) 7 (+++) [20,6%] 8 (++) [23,6%] 6 (+) [17,6%] 13 (-
) [38,2%]
Maligno (23) 3 (+++) [13,0%] 15 (++) [65,2%] 4 (+) [17,4%] 1 (-
) [ 4,3%]*
. não neoplásico (17) 1(+) [ 5,9%] 16 (-
) [94,1%]
p = 0,014 (quiquadrado)
Discussão
Nosso estudo procurou estabelecer uma relação entre a expressão
da heparanase-2 e o desenvolvimento das neoplasias ovariana do tipo epitelial.
Concluímos que, realmente, esta enzima está envolvida com a proliferação tumoral,
entretanto, não a associamos, exclusivamente, ao processo neoplásico maligno.
Em estudo anterior, Moura Jr (2003) utilizou esta mesma amostra de
material ovariano para analisar a expressão da metaloproteinase-2 (MMP-2), outra
enzima que atua na matriz extracelular, cuja função é degradar o colágeno tipo IV, um
dos mais importantes componentes da sustentação desta matriz. O estudo verificou
que a MMP-2 foi mais expressa nas neoplasias malignas comparadas às benignas e às
amostras não neoplásicas diferentemente do que ocorreu no caso da heparanase, em
que não se observou diferença significante entre sua expressão nas neoplasias maligna
e benigna.
Estas duas situações nos fazem concordar que o processo de
expansão tumoral é desenvolvido por meio de uma série de eventos relacionados à
remodelação da matriz extracelular fundamentais nos processos de multiplicação,
migração e de diferenciação celular. A estabilidade estrutural dos tecidos depende
diretamente da integridade dos elementos que se interligam através de pontos de
contato da matriz extracelular com a superfície da célula, onde entre outros
componentes está o proteoglicano heparam sulfato, assim como da sustentação
proporcionada pelo colágeno IV para a manutenção do equilíbrio da matriz extracelular
Entre as propriedades adquiridas pela célula tumoral durante o
processo de malignização está a habilidade de invadir o tecido adjacente normal e ter a
capacidade de formar novos focos, distantes do sítio primário. Este processo, ainda não
compreendido completamente, desenvolve-se a partir de alterações no mecanismo
molecular que envolve a adesão célula-célula, célula-matriz e a degradação da matriz
extracelular (Cairns et al., 2003).
Considerando que as células neoplásicas possuem características
próprias de invasão e expansão, esperávamos que as neoplasias malignas pudessem
apresentar maior expressão enzimática do que as benignas. Baseamo-nos no conceito
da seleção clonal, no qual durante o desenvolvimento tumoral, gradualmente, inúmeras
mudanças comportamentais acumulam-se às características já alteradas destas
células. Essas mutações adicionais vão conferindo a elas importante vantagem
seletiva, isto é, as que possuírem melhor adaptação a condições desfavoráveis e as
que possuírem a habilidade de se multiplicar mais rapidamente, tornar-se-ão
dominantes dentro da população tumoral. Esta seleção clonal contínua aumentará,
conseqüentemente, a agressividade tumoral (Cooper, 2001).
Além do mais, neste processo de aquisição de novas características
desenvolve-se, também, a capacidade de produzir e secretar maior quantidade de
enzimas degradadoras da matriz extracelular. Especificamente na matriz extracelular,
durante a expansão tumoral, ocorrem modificações tanto na degradação da estrutura
preestabelecida, como no processo de remodelação do tecido neoplásico. As células
tumorais aumentam a produção dos componentes da matriz extracelular e por meio de
fatores sinalizadores fazem com que, as células do hospedeiro ajudem a produzir mais
elementos para participar de todo esse processo de proliferativo.
Liu et al. (2003) avaliaram a expressão da heparanase HPA-1 nas
neoplasias ovarianas e em linfonodos acometidos pelo tumor maligno. Os autores
encontraram uma significativa expressão da heparanase-1 nos fragmentos de tecido
malignos e metastáticos. Comparativamente, verificaram menor ação da heparanase-1
nas dez amostras de cistoadenoma ovariano, e destacaram a importância da HPA-1 no
crescimento, na invasão e metastatização do carcinoma ovariano. Resultados
semelhantes foram encontrados por Ginath et al. comparando dez amostras malignas
com dois cistoadenomas e quatro ovários normais. (Ginath et al., 2001)
Outro estudo que associa esta enzima com a progressão do tumor
ovariano foi realizado por Kodama et al. (2003). Estes pesquisadores, além de
confirmar a maior atuação da heparanase-1 no tecido neoplásico maligno em
comparação com algumas amostras de tumores limítrofes, descreveram, também,
haver maior expressão enzimática nos tumores de maior indiferenciação celular.
Na literatura internacional, apenas estes estudos analisaram
comparativamente a presença da heparanase-1 nas neoplasias ovarianas. Suas
conclusões vão de encontro à teoria clássica da proliferação tumoral. Entendendo que a
invasão tumoral iniciasse a partir do momento que ocorre a degradação da membrana
basal, que sustenta a camada celular epitelial e endotelial, e que esta membrana é
formada por uma estrutura de proteínas e polissacarídeos, e que por sua vez, possui
como principal polissacarídeo o heparam sulfato, é de se esperar que nos tumores com
maior potencial proliferativo possam expressar mais heparanase (Timpl, 1996; Kalluri,
2003). No entanto, será que extensos tumores benignos, onde o rearranjo tecidual é
enorme, não haveria, também, importante expressão desta enzima ou ainda, que a
isoforma heparanase- 2 possa apresentar uma função complementar à da heparanase-
1?
Nosso estudo demonstrou não haver diferença de expressão da
HPA-2 entre as neoplasias epiteliais ovarianas. Além disso, observamos amostras com
forte expressão em diferentes graus de diferenciação, havendo, inclusive, amostras
indiferenciadas classificadas qualitativamente como negativas.
Partindo do princípio, que a indiferenciação possa ser o ápice da
transformação maligna, possivelmente, haverá nestes tumores maior expressão
enzimática. Entretanto, este fato não foi confirmado no nosso estudo sobrea a
expressão da heparanase-2. Isto pode ser explicado pela observação reportada por
Sanderson em 2001, que descreveu haver durante as contínuas mudanças fenotípicas
da célula tumoral, uma perda da adesividade celular, com redução no número de
cadeias de heparam sulfato, ocasionando, possivelmente, menor necessidade da ação
da heparanase.
Indiscutivelmente, não há dúvidas a respeito da importância da
enzima heparanase no processo de desenvolvimento tumoral, neovascularização e da
disseminação metastática, inclusive no processo de adesão das células migratórias,
inflamatórias e neoplásicas no tecido-alvo. Sabe-se que tanto na disseminação via
hematogênica, onde a partir da intravasamento a célula tumoral assume uma atitude
independente circulando pelos vasos sangüíneos até extravasar em um órgão distante,
como também, nos casos de tumores abdominais, onde a disseminação pelo líquido
peritoneal, as células tumorais atuam da mesma forma que as células inflamatórias
ativadas, precisando inicialmente aderirem-se ao local para, posteriormente, romperem
enzimaticamente a membrana basal subendotelial e a própria estrutura organizada do
órgão alvo a ser invadido, como ocorre nos tumores abdominais.
O envolvimento da heparanase neste processo vem sendo
pesquisado desde o final dos anos 70, quando a HPA-1 foi identificada em fibroblastos,
mastócitos e em plaquetas. Em 1983, Kramer et al. descreveram sua atividade em
células metastáticas. Os autores investigavam o mecanismo molecular do órgão-
especifico metastático e ressaltaram a importância da degradação do heparam sulfato
no processo da proliferação tumoral à distância. A atuação desta enzima na
disseminação intra-abdominal tem sido largamente confirmada, inclusive com uma forte
presença no líquido ascítico de pacientes com neoplasias abdominais malignas
avançadas.
Portanto, a importância desta enzima na expansão dos tumores é
inquestionável, fato confirmado no nosso estudo, onde observamos, na avaliação
quantitativa, a presença da heparanase em todas as amostras de tecido neoplásico
maligno.
Para melhor sustentar nossa análise, utilizamos e comparamos dois
métodos diferentes de avaliação da expressão enzimática. Um qualitativo, no qual as
amostras foram revistas por patologistas experientes, com a finalidade de diminuir a
possibilidade de falha interpretativa, onde o resultado foi classificado em número de
cruzes (+). E outro, no qual nossos resultados qualitativos foram reanalisados por uma
nova técnica quantitativa, que está sendo desenvolvido e aplicado pelo Laboratório de
Biologia Molecular da Unifesp.
Este último é um método rápido e menos subjetivo, assistido por um
computador, que permite quantificar digitalmente a imunoexpressão de diferentes
marcadores biológicos; e seu resultado está baseado na porcentagem de células
imunomarcadas em relação ao total de células estudadas e da intensidade da
coloração da expressão em relação ao branco absoluto de cada amostra.
Avaliando comparativamente as duas metodologias, notamos que a
técnica quantitativa discordou da análise qualitativa principalmente nas amostras com
menor expressão. A diferença principal foi nas amostras classificadas qualitativamente
com menos 25% de células expressas. Algumas destas amostras foram classificadas
como negativas para a análise qualitativa, entretanto sob ponto de vista quantitativo,
encontramos índice de positividade de até 100%.
Esta diferença talvez possa ser justificada, porque na metodologia
quantitativa, analisamos apenas campos previamente selecionados. Estas áreas eram
patológica e imunohistoquimicamente, as regiões mais representativas da neoplasia
avaliada, diferentemente do que ocorreu na leitura da análise qualitativa, onde a
varredura completa da lâmina possa ter dado à avaliação, uma interpretação mais
global do tecido analisado.
Ainda a respeito desta divergência de resultados entre as duas
metodologias podemos indagar, se não há dentro do tumor diferentes momentos de
proliferação celular, permitindo, desta forma, questionar qual dos métodos poderia
melhor representar a expressão enzimática.
Finalmente, é relevante ressaltar que, de fato, a heparanase-2 está
envolvida com a expansão tumoral, provavelmente relacionada com a perda do controle
celular ocorrido durante o processo mitótico da tranformação e proliferação tumoral,
alterando principalmente a adesão celular. Portanto, da mesma forma que estudos
laboratoriais, já em estágios avançados, utilizando inibidores da função proteolítica da
heparanase-1, demonstraram haver inibição de até 80% da proliferação neoplásica
(Hoffman et al.,1995; Miao et al., 1999; Miao et al., 2006), acreditamos que,
futuramente, poder-se-á dispor de mais uma opção terapêutica no tratamento adjuvante
do câncer utilizando-se inibidores da heparanase – 2, impedindo a quebra da estrutura
tecidual.
Conclusões
Do exposto pode-se concluir que:
1- Houve importante expressão da heparanase-2 na análise quantitativa nas
amostras de neoplasia maligna ovariana.
2- Não se verificou variação da imunoexpressão no material de neoplasia ovariana
maligna conforme seu grau de diferenciação.
3- A imunoexpressão da heparanase-2 nas neoplasias epiteliais malignas não foi
significativamente maior que nas neoplasias epiteliais benignas, mas sim nos
ovários normais.
4- A avaliação quantitativa mostrou-se mais especifica, quando comparada com o
critério qualitativo
Anexos
Tabela II- Grupos das amostras ovarianas normais
paciente Rg-EPM Nº. Lâmina idade raça DIAGNÖSTICO
heparanase
quantificação
EMP 914949 B95-12667 25 B Corpo Lúteo
JRS 568055 B97-03761 66 N Cistos Foliculares - N N
AMG 551086 B98-10911 51 B Corpos Albicans - N N
VNG 945343 B98-10541 80 N Corpos Albicans + N N
MFGG 808626 B00-25760 45 B CistosTeca-luteínicos - N N
MEF 46240 B00-35391 56 N Corpos Albicans - N N
CRLP 989113 B00-37279 53 B Corpos Albicans - N N
LSS 1069567 B00-38016 73 B Corpos Albicans - N N
VMS 16904 B01-01086 50 N Corpos Albicans - N N
ECS 27217 B01-01087 50 N C. Lút. Hemorrágico - N N
RFA 17896 B01-01817 52 B Corpos Albicans - N N
CPF 1067152 B01-01845 50 B Corpos Albicans - N N
RSS 26674 B01-02921 36 N Corpos Albicans - N N
MAS 27847 B01-2922 52 B Corpo Lúteo - N N
CPS 1101078 B01-03733 41 N Corpos Albicans - N N
EJB 1126483 B01-06629 51 B Corpos Albicans - N N
LAS 766391 B01-9165 64 N Corpos Albicans - N N
Tabela III - Grupo das amostras de patologias ovarianas benignas
paciente
Rg-EPM nº. Lâmina
id
Raça
DIAGNÓSTICO
heparanase
IP(%)
itE(µ.o/µm²)
IE(µ.o/µm)
ANSM 912483 B95-18176 55 N Cistoadenoma MUCINOSO +
N
0 0 0
BGS 201562 B96-3592 72 B Cistoadenoma SEROSO -
N
12,1 129,5 15,7
FSM 931687 B96-1522 76 B Cistoadenoma Seroso Papilífero ++
P
100 159,4 159,4
LAGD 559887 B96-3307 58 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
6,1 115,4 7,1
LT 966374 B97-13085 53 N Cistoadenoma Sero-mucinoso ++
P
79,4 152,9 121,5
ALGA 956922 B97-1328 21 N Cistoadenoma MUCINOSO +
N
80,3 147,2 119,2
LCB 966694 B97-10442 26 B Cistoadenoma MUCINOSO +
N
51,5 153,5 79
FLSS 997942 B98-17680 32 B Cistoadenoma Seroso Papilífero +++
P
100 110,2 110,2
MJS 643090 B98-21081 42 B Cistoadenoma SEROSO Simples
+++
P
100 186,2 186,2
AS 668835 B98-21687 28 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
0 0 0
NFM 346912 B99-01951 72 B Cistoadenoma SEROSO +++
P
100 165,3 165,3
CN 716339 B99-26849 58 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
JDM 989496 B00-1513 60 N Cistoadenoma SEROSO +++
P
100 150,1 150,1
RCS 1031866 B00-3636 45 B CistoadenomSeroso multiloculad +
N
55 122,1 67,1
JMLV 525693 B00-14297 62 B Cistoadenoma Seroso Papilífero ++
P
100 185,2 185,2
ECSC 1061708 B00-18438 13 N Cistoadenoma MUCINOSO -
N
8,6 154,3 13,3
JAS 1058121 B00-19971 46 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
100 59,5 59,5
AOCS 1052165 B00-20904 48 N Cistoadenoma Seroso Papilífero +++
P
100 169,3 169,3
MGO 1032480 B00-21554 26 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
63,3 155 98
VRS 1057331 B00-24657 60 B Cistoadenoma SEROSO -
N
84 126.8 106
MAAL 480749 B00-26505 72 B Cistoadenoma SEROSO -
N
91 153,6 139,9
MCS 1039453 B00-27042 39 N Cistoadenoma SEROSO ++
P
100 169,2 169,2
MP 1063051 B00-33008 27 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
5,6 152,1 8,6
JGS 1057702 B00-33009 44 N Cistoadenoma SEROSO -
N
74,8 172,7 129,1
CPP 16584 B00-35004 40 B Cistoadenoma SEROSO +++
P
100 212,5 212,5
MLC 646178 B01-01418 69 B Cistoadenoma SEROSO +
N
100 184,5 184,5
RAS 1075890 B01-02359 26 B Cistoadenoma SEROSO +++
P
100 203,7 203,7
MJA 1074161 B01-02813 35 B Cistoadenoma SEROSO -
N
100 193,5 193,5
OAG 17625 B01-03538 44 B Cistoadenoma MUCINOSO -
N
0 0 0
MGSS 1078930 B01-04522 41 N Cistoadenoma SEROSO ++
P
100 212,6 221,6
NN 481365 B01-5597 58 B Cistoadenoma SEROSO ++
P
100 216,6 216,6
AAA 1073066 B01-05716 46 B Cistoadenoma SEROSO ++
P
100 216,5 216,5
APM 1102863 B01-08180 77 B Cistoadenoma SEROSO Simples
+
N
ASJ 1005272 B01-12878 73 B Cistoadenoma SEROSO ++
P
100 182,4 182,4
Tabela IV - Grupo das amostras de patologias malignas ovarianas
rg-EPM Nº. Lâmina idad
raça
DIAGNÓSTICO
hpa2
qual IP(%)
itE(µ.o/µm²)
IE(µ.o/µm²)
875083 B94-9205 65 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IV G2
P
++ 94,5 100,7 95,2
891438 B95-1400 54 N AdenoCA.Ser.Papíl+AdenoCA.Céls.Claras
Ic G2
P
++
903587 B95-9069 73 N AdenoCA. Seroso Papilífero IIIb G2
P
++
914571 B95-12557
31 B Cistoadenocarcinoma Mucinoso Ia G1
P
+++ 100 123,5 123,5
824272 B95-12902
38 B Adenocarcinoma Papilífero IIIc G2
P
++ 100 134,5 134,5
884776 B96-2883 76 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IIIc G1
P
++ 100 141,2 141,2
774468 B96-3285 70 B Adenocarcinoma Papilífero IV G2
P
++ 63,3 116,7 73,6
956211 B97-1222 72 B Adenocarcinoma Papilífero IIIc G3
P
++ 76 115,7 87,9
971763 B97-12370
74 B Adenocarcinoma Papilífero IV G2
P
++ 94,8 110,1 104,4
930483 B97-12488
41 B Cistoadenocarcinoma Mucinoso Ia G1
P
++ 87,4 114,1 99,3
767940 B97-13241
87 B Cistoadenocarcinoma Papilífero IIb G2
P
+++ 100 162,1 162,1
980442 B97-20383
82 B Cistoadenocarcinoma Papilífero IIIc G2
P
++ 100 163 163
889962 B98-11359
50 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IIIc G2
P
++ 100 152,5 152,5
473098 B99-1432 66 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IIb G3
N
+ 100 108 108
1029202
B99-23449
73 N Adenocarcinoma Seroso Papilífero Ic G1
P
++ 100 145,8 145,8
1039715
B99-30810
43 B Adenocarcinoma Seroso Papilífero Ia G1
P
++ 100 167,9 167,9
1041371
B99-30841
59 N Adenocarcinoma produtor de muco Ib G1
N
+ 51,8 137,2 71
1031104
B00-9092 67 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IIIc G3
P
++ 42,6 133 56,6
1068286
B00-30537
26 B CistoadenomaCA. Mucinoso Papilífero Ia G1
P
++ 96,1 139,9 139,9
1073808
B00-36363
70 B Adenocarcinoma Papilífero IV
G2
P
+++ 100 179,5 179,5
1077092
B00-38248
48 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IV G2
N
+ 91 102.1 93
1163638
B01-12743
72 N Adenocarcinoma Mucoprotetor IIIc G1
N
+ 49,4 135,8 67,1
1079725
B01-12388
63 B Cistoadenocarcinoma Seroso Papilífero IIIc G1
N
N
Tabela IX - NEOPLASIA MALIGNA - HIPERTENSÃ0 – ÍNDICE DE MASSA
CORPÓREA – GLICEMIA – MENARCA -
CONTRACEPTIVO ORAL - MENOPAUSA –
TEMPO DE PÓS- MENOPAUSA - NÚMERO
DE GESTAÇÕES, PARTO E ABORTOS.
Paciente
rg-EPM HAS IMC
glicJ
ACO
Menarc
menopausa
PósMen
G P A
ZBA
875083
SIM 32,8
116
NÃO
10 42 23 2 2 0
MJMB 891438
SIM 34,14
98 NÃO
12 50 2 2 2 0
ASC 903587
SIM 20,4
106
NÃO
16 45 28 1 0 1
MJFS 914571
NÃO 26,22
90 SIM 15 NÃO NÃO 2 2 0
VPR 824272
NÃO 29,55
88 SIM 15 NÃO NÃO 6 1 5
MA 884776
SIM 21,89
130
NÃO
11 55 21 0 0 0
ILC 774468
SIM 29,58
103
NÃO
14 52 18 1 1 0
NLF 956211
SIM 27,87
10 NÃO
11 50 22 3 3 0
APS 971763
NÃO 16,6
89 NÃO
15 54 20 0 0 0
MMS 930483
NÃO 22,79
85 SIM 11 NÃO NÃO 0 0 0
LFM 767940
SIM 25,51
77 NÃO
18 52 35 2 2 0
RFS 980442
NÃO 32,42
149
NÃO
12 50 32 12
10
2
MGT 889962
NÃO 28,99
88 NÃO
13 NÃO NÃO 3 2 1
UPR 473098
SIM 21,1
105
NÃO
11 40 26 14
14
0
JPS 1029202
NÃO 18,7
90 NÃO
12 45 28 6 5 1
QPL 1039715
NÃO 25 90 SIM 15 NÃO NÃO 2 2 0
LJSB 1041371
SIM 20,7
91 NÃO
12 45 14 5 4 1
EAA 1031104
NÃO 24,97
84 NÃO
14 50 17 3 2 1
NCP 1068286
NÃO 25 103
SIM 12 NÃO NÃO 1 1 0
AMC 1073808
NÃO 24,6
90 NÃO
11 48 22 3 3 0
FOS 1077092
NÃO 25,4
88 SIM 12 NÃO NÃO 2 2 0
MIP 1163638
SIM 24,4
118
NÃO
13 50 22 3 2 1
MAS 1079725
NÃO 21 82 NÃO
13 52 11 1 1 0
Tabela X - NEOPLASIA BENIGNA - HIPERTENSÃ0 – ÍNDICE DE MASSA
CORPÓREA – GLICEMIA – MENARCA -
CONTRACEPTIVO ORAL - MENOPAUSA –
TEMPO DE PÓS- MENOPAUSA - NÚMERO
DE GESTAÇÕES, PARTO E ABORTOS.
paciente
rg-EPM HAS IMC
glicJ
ACO
menarc
menopausa
PósMen
G P A
ANSM
912483
NÃO 17,06
86 NÃO
12 48 7 18
15
3
BGS 201562
SIM 31,99
90 NÃO
14 52 20 4 4 0
FSM 931687
SIM 28,57
150
NÃO
14 50 26 7 7 0
LAGD 559887
SIM 23,37
96 NÃO
12 50 18 8 4 4
LT 966374
SIM 23,43
103
NÃO
11 51 2 4 3 1
ALGA 956922
NÃO 21,7
94 NÃO
16 NÃO NÃO 1 1 0
LCB 966694
NÃO 20,43
80 NÃO
14 NÃO NÃO 0 0 0
FLSS 997942
NÃO 19,53
88 NÃO
16 NÃO NÃO 3 3 0
MJS 643090
SIM 22,89
92 NÃO
14 NÃO NÃO 12
10
2
AS 668835
NÃO 21,22
77 SIM 9 NÃO NÃO 0 0 0
NFM 346912
NÃO 23,4
86 NÃO
12 50 23 3 3 0
APM 1037034
NÃO 22,5
107
SIM 16 NÃO NÃO 2 2 0
CN 716339
NÃO 22,94
65 NÃO
13 55 3 7 6 1
JDM 989496
NÃO 23,43
90 NÃO
12 40 20 3 3 0
RCS 1031866
NÃO 31,18
94 SIM 14 NÃO NÃO 6 5 1
JMLV 525693
NÃO 25,63
103
NÃO
11 50 12 3 2 1
ECSC 1061708
NÃO 24,1
92 NÃO
10 NÃO NÃO 0 0 0
JAS 1058121
NÃO 23,8
78 SIM 11 45 1 2 1 0
AOCS 1052165
NÃO 28 69 SIM 16 NÃO NÃO 3 3 0
MGO 1032480
NÃO 21,6
84 SIM 14 NÃO NÃO 4 3 1
VRS 1057331
NÃO 23,4
82 NÃO
13 50 10 2 2 0
MAAL 480749
SIM 31 266
NÃO
12 52 20 1 1 0
MCS 1039453
NÃO 31,6
83 NÃO
11 NÃO NÃO 5 5 0
MP 1063051
NÃO 26 99 SIM 13 NÃO NÃO 1 1 0
JGS 1057702
NÃO 26,1
101
NÃO
16 40 4 6 4 2
CPP 16584 NÃO 28,2
74 SIM 13 NÃO NÃO 2 2 0
MLC 646178
SIM 23 116
NÃO
11 51 18 3 3 0
RAS 1075890
NÃO 22,4
86 SIM 14 NÃO NÃO 2 1 1
MJA 1074161
NÃO 28,2
79 SIM 18 NÃO NÃO 4 3 1
OAG 17625 NÃO 23,5
111
NÃO
13 43 1 4 3 1
MGSS 1078930
NÃO 25 76 SIM 13 NÃO NÃO 4 4 0
NN 481365
SIM 27,8
84 SIM 13 48 10 2 1 1
AAA 1073066
NÃO 26,7
82 SIM 17 NÃO NÃO 1 1 0
APM 1102863
SIM 29,2
110
NÃO
15 45 32 0 0 0
ASJ 1005272
SIM 25,4
95 NÃO
12 50 23 1 1 0
Tabela XI- OVÁRIO NORMAL - HIPERTENSÃ0 – ÍNDICE DE MASSA
CORPÓREA – GLICEMIA – MENARCA -
CONTRACEPTIVO ORAL - MENOPAUSA –
TEMPO DE PÓS- MENOPAUSA - NÚMERO
DE GESTAÇÕES, PARTO E ABORTOS.
paciente
rg-EPM HAS IMC
glicJ
ACO menarc
menopausa
pósMenop
G P A
EMP
914949
NÃO 22,1
80 SIM 15 NÃO NÃO 2 2 0
JRS 568055
SIM 26,1
108
NÃO 15 51 15 6 4 2
AMG 551086
NÃO 23 89 NÃO 15 43 8 4 4 0
VNG 945343
NÃO 19,8
91 NÃO 14 52 28 6 4 2
MFGG 808626
SIM 22,6
94 SIM 13 NÃO NÃO 1 1 0
MEF 46240 SIM 20,3
89 NÃO 11 54 2 2 2 0
CRLP 989113
NÃO 25,7
94 NÃO 13 50 3 0 0 0
LSS 1069567
NÃO 20,7
101
SIM 11 57 16 5 2 3
VMS 16904 SIM 27,3
76 SIM 13 NÃO NÃO 8 6 2
ECS 27217 SIM 26,2
81 SIM 12 NÃO NÃO 2 2 0
RFA 17896 SIM 24 102
SIM 13 NÃO NÃO 3 3 0
CPF 1067152
SIM 21,5
113
NÃO 11 NÃO NÃO 4 4 0
RSS 26674 NÃO 25,7
80 SIM 11 NÃO NÃO 3 2 1
MAS 27847 NÃO 31,25
82 NÃO 11 NÃO NÃO 3 2 1
CPS 1101078
NÃO 21,4
85 SIM 12 NÃO NÃO 4 3 1
EJB 1126483
NÃO 26,5
92 SIM 12 NÃO NÃO 5 2 3
LAS 766391
SIM 30,4
114
NÃO 12 50 14 5 3 2
Resumo
Introdução: Durante a progressão da neoplasia maligna, as células tumorais
desenvolvem a habilidade de invadir o tecido normal adjacente e de formar novos focos
à distância. Recentemente, pesquisas têm destacado as alterações que ocorrem no
ambiente entre a célula e a matriz extracelular durante o processo de expansão
neoplásica.
A enzima heparanase-1 possui a capacidade de degradar o heparam sulfato, um
importante polissacarídeo que participa da estrutura da matriz extracelular e da
membrana basal. Diversos artigos associam o aumento de sua expressão ao potencial
invasor, angiogênico e metastático de diversos tumores malignos. A heparanase-2,
provavelmente, está relacionada com a perda da adesividade celular.
Objetivo: Associar novos conhecimentos a respeito desta isoforma poderá ser útil para
esclarecer as inúmeras mudanças que ocorrem nas neoplasias.
Métodos: Analisamos 75 espécimes de ovários de pacientes atendidas no
Departamento de Ginecologia da Unifesp-EPM. Selecionamos 23 (30,66%) pacientes
com neoplasia ovariana epitelial maligna; destas, cinco tinham neoplasia restrita aos
ovários - estádios IA e IB (FIGO) e 17 tinham neoplasia nos estádios IC ou superior.
Outras 35 mulheres (46,66%) apresentavam neoplasia ovariana epitelial benigna e as
17 (22,66%) restantes, tinham o diagnóstico histológico de ovário não neoplásico.
Utilizamos duas técnicas metodológicas para avaliar a imunoexpressão da heparanase-
2. A primeira, obedecendo ao critério qualitativo de positivo ou negativo em relação à
expressão da enzima e, a segunda, realizando, nas mesmas lâminas, quantificação
computadorizada desta expressão.
Resultados: Na análise quantitativa, encontramos índice de positividade (IP) de
expressão de heparanase-2 de 72,24% e 87,34% nas amostras de neoplasias benigna
e maligna, respectivamente. Nelas, a intensidade de expressão e o índice de expressão
foram de, respectivamente,
147,24 e 121,29 para as neoplasias benignas e de 134,15 e
118,01 para as neoplasias malignas. Qualitativamente, a expressão da heparanase-2 foi de
intensidade forte ou moderada em 44,2% dos tumores benignos e 78,2% dos malignos. Todas
as amostras não neoplásicas foram negativas para a expressão da enzima, com exceção de
uma amostra em que a análise qualitativa foi fracamente positiva.
Conclusões: Pudemos observar a importância desta enzima na expansão tumoral,
devido à evidente diferença entre os grupos de neoplasias comparados com o grupo de
amostras de tecido ovariano não neoplásico. Entretanto, não verificamos variação
significativa entre as neoplasias quanto à presença e intensidade de reação
imunohistoquímica entre a neoplasia benigna e maligna, nas duas técnicas de análise.
Summary
Introduction: During the progression of malignant neoplasia, the tumor cells develop the
ability to invade the adjacent normal tissue and form new foci at a distance. Recently,
studies have highlighted the changes that take place in the environment between the
cell and the extracellular matrix during the process of neoplastic expansion.
The enzyme heparanase-1 has the capacity to degrade heparan sulfate, which is an
important polysaccharide that participates in the structure of the extracellular matrix and
the basal membrane. Several papers have made an association between increased
expression of this enzyme and the invasive, angiogenic and metastatic potential of
various malignant tumors. Heparanase-2 is probably related to loss of cell adhesion.
Objective: Making associations with new knowledge on this isoform may be useful for
explaining the large number of changes that occur in neoplasia.
Methods: We analyzed 75 ovary specimens from patients attended at the Department of
Gynecology of Unifesp-EPM. We selected 23 patients (30.66%) with malignant epithelial
ovarian neoplasia. Of these, five had neoplasia that was restricted to the ovaries, in
FIGO stages IA and IB, and 17 had neoplasia in stages IC or higher. Another 35 women
(46.66%) presented benign epithelial ovarian neoplasia and the histological diagnosis
for the remaining 17 (22.66%) was that their ovaries were not neoplastic.
We used two methodological techniques for evaluating the immunoexpression of
heparanase-2. The first followed the qualitative criterion of positive or negative in
relation to expression of the enzyme, and the second involved computerized
quantification of this expression, performed on the same slides.
Results: In the quantitative analysis, we found positivity indices for heparanase-2
expression of 72.24% and 87.34% in the samples of benign and malignant neoplasias,
respectively. In these, the intensity of expression and the express index were,
respectively,
147.24 and 121.29 for the benign neoplasias and 134.15 and 118.01 for the
malignant neoplasias. Qualitatively, the expression of heparanase-2 was strong or moderate in
intensity in 44.2% of the benign tumors and 78.2% of the malignant tumors. All the non-
neoplastic samples were negative for the expression of this enzyme, with the exception of one
sample in which the qualitative analysis was weakly positive.
Conclusions: We were able to observe the importance of this enzyme in tumor
expansion because of the evident difference between the neoplastic groups and the
non-neoplastic group of ovarian tissue samples. However, we did not find any significant
variation among the neoplasias with regard to the presence and intensity of the
immunohistochemical reaction, between benign and malignant neoplasia, for either of
the analysis techniques.
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