( PDF ) Estudos da fosforilação por CK2 da proteína HMGB1 de Schistosoma mansoni (SmHMGB1)

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

Estudos da fosforilação por CK2 da proteína HMGB1 de

Schistosoma mansoni (SmHMGB1)

Isabel Caetano de Abreu da Silva

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química

Biológica, Instituto de Bioquímica Médica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Química Biológica.

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

Rio de Janeiro

2008

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DA SILVA, Isabel Caetano de Abreu

Estudos da fosforilação por CK2 da proteína HMGB1 de Schistosoma mansoni

(SmHMGB1)/ Isabel Caetano de Abreu da Silva. – 2008.

111 fl.

Dissertação (Mestrado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, 2008.

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

1.High Mobility Group B1. 2. Fosforilação. 3.

Schistosoma mansoni. 4. Metabolismo

de DNA. – Dissertações.

I. Fantappié, Marcelo Rosado (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica.

III. Título.

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iii

O seguinte trabalho foi realizado no Instituto de Bioquímica Médica, nos laboratórios

de Bioquímica e Biologia Molecular de

Schistosoma mansoni e Bioquímica e Biologia

Molecular de Helmintos e Artrópodes da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, sob

orientação do professor Marcelo Rosado Fantappié e financiado pelo CNPq, FAPERJ,

SONDA-FUJB e OMS/TDR.

Estudos da fosforilação por CK2 da proteína HMGB1 de Schistosoma mansoni (SmHMGB1)

Isabel Caetano de Abreu da Silva

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica,

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Química Biológica.

Aprovada em 29 de Setembro de 2008 por:

Orientador: Dr. Marcelo Rosado Fantappié

Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBqM/UFRJ

Dr. Ronaldo da Silva Mohana-Borges

Prof. Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBiof/UFRJ

. Teca Calcagno Galvão

Pesquisadora Visitante do Instituto Oswaldo Cruz – IOC

Dr. Mário Alberto Cardoso da Silva Neto

Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBqM/UFRJ

Suplente externo: Yraima Moura Lopes Cordeiro

Profa. Adjunta do Depto de Fármacos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio

de Janeiro – UFRJ

Revisor/Suplente interno: Dr

.Gabriela de Oliveira Paiva e Silva

Profa. Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBqM/UFRJ

AGRADECIMENTOS

À Deus, por todas as oportunidades.

Ao meu Orientador, Marcelo Fantappié, por todo o incentivo e orientação cheios de energia e

também por toda confiança em mim depositada.

Ao Doutor Francisco de Oliveira, por seu olhar crítico, ter me ensinado muito do que eu sei e

por toda ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Professor Franklin Rumjanek, por ter me recebido em seu laboratório, logo no início da

minha experiência profissional, durante o meu estágio curricular da Escola Técnica Federal de

Química e pela confiança depositada ao longo dos anos.

A professora Gabriela Oliveira, pela atenção na revisão da tese e por todo incentivo

demonstrado ao longo das discussões durante o acompanhamento do trabalho.

Aos membros e suplentes da banca de defesa da dissertação, pela disponibilidade de

participar deste importante passo em minha vida profissional.

À amiga Vanessa Sandim, que em meio as suas indas e vindas entre praticamente todas as

Universidades e Institutos de Pesquisa destaca-se sempre pela simpatia, boa companhia e

generosidade infinitas. Obrigada!!

Ao amigo de laboratório Vitor Coutinho, pelo bom humor, discussões de resultados e

gentilezas divididas ao longo dos anos de convivência.

À Amanda Vicentino e Fábio Schineider que recentemente entraram para o grupo e vieram

acrescentar muito, tanto com a amizade e carinho quanto cientificamente.

À Doutora Renata Maciel, pelo apoio e amizade, principalmente nos últimos anos.

À Doutoranda Nívea Amoêdo, com o seu jeito sempre tranqüilo de ser, agradeço por todo o

convívio agradável e amizade construída ao longo dos anos.

À Mestranda Paula Pezzuto, pelos momentos de descontração via email e pela amizade

construída durante a convivência.

À professora Ana Lúcia Giannini, por ser a pessoa mais gentil e prestativa que eu conheço.

Obrigada pelas sugestões construtivas durante as discussões do grupo.

À Técnica Marta Freire, pela sua ajuda, amizade e apoio no bom funcionamento do

laboratório.

Aos meus pais e irmãos, por todo amor, carinho e paciência. Obrigada por estarem ao meu

lado e apoiarem a decisão que tomei sobre o rumo da minha vida profissional.

Ao meu companheiro, Marcelo Nunes, por todo apoio, amor e paciência ao longo dos anos

compartilhados.

A todos os colegas de laboratório, atuais e passados, obrigada pelos ensinamentos, discussões

e sugestões construtivas e também pela boa companhia.

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a

concretização deste trabalho.

Às agências de fomento CNPq, FAPERJ, SONDA-FUJB e OMS/CDT.

vii

RESUMO

DA SILVA, Isabel Caetano de Abreu. Estudos da fosforilação por CK2 da proteína HMGB1

Schistosoma mansoni (SmHMGB1). Dissertação (Mestrado em Química Biológica) –

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

2008.

Schistosoma mansoni é um parasita multicelular causador da esquistossomose.

Apesar da existência de programas de controle, cerca de 200 milhões de pessoas no mundo

ainda são afetadas por esta doença. Como o ciclo do parasita é complexo, envolvendo estágios

de vida livre e dois hospedeiros diferentes, a caracterização de proteínas envolvidas na

regulação da expressão gênica ao longo do desenvolvimento é de grande importância. Essa

abordagem pode também revelar potenciais alvos para interferência quimioterápica. As

proteínas do tipo “High Mobility Group” (HMGs) estão entre as mais abundantes e ubíquas

em eucariotos. Essas proteínas estão envolvidas em processos de transcrição, replicação,

recombinação e reparo de DNA, sendo desta forma alvo de nosso interesse. A HMGB contém

dois domínios homólogos de ligação ao DNA, os HMG

boxes A e B, e uma região C-

terminal, rica em resíduos de aminoácidos ácidos. Elas são capazes de reconhecer e ligar-se

preferencialmente a moléculas de DNA distorcidas ou dobradas, e de promover o super-

enovelamento e a dobra de moléculas de DNA, causando mudanças estruturais em seus

padrões. Neste trabalho, a proteína HMGB1 de

Schistosoma mansoni (SmHMGB1), isolada

pelo nosso grupo, teve a sua fosforilação mediada pela proteína cinase CK2 investigada.

Inicialmente, foi realizada uma análise computacional da seqüência primária da

SmHMGB1, o

que nos sugeriu a existência de quatro sítios putativos de fosforilação para ação da proteína

CK2 (S-167, T-169, S-172 e S-174). De fato, foi possível demonstrarmos que a proteína

SmHMGB1 é fosforilada, especificamente, in vitro, pela CK2. Além disso, foram mapeados

os resíduos que estavam sendo fosforilados na

SmHMGB1: dois resíduos de serina nas

posições 172 e 174. Estudos funcionais comparando as formas não fosforiladas e fosforiladas

da proteína demonstraram que a fosforilação mediada pela CK2 não é capaz de regular a

capacidade da

SmHMGB1 de promover o super-enovelamento do DNA, assim como a

promoção de dobras no mesmo. Finalmente, demonstrar através de ensaios de fosforilação

vitro

e utilizando extratos totais do parasita como fonte de proteínas cinases, que o mesmo

possui proteínas cinases endógenas capazes de fosforilar a

SmHMGB1 e, ainda, que a CK2

endógena estava mediando majoritariamente este processo. Juntos, estes resultados nos

permitem sugerir que a fosforilação da

SmHMGB1 por CK2 pode estar ocorrendo

endogenamente e levanta uma discussão a respeito de outros possíveis efeitos desta

fosforilação em outras ações celulares envolvendo a proteína, como por exemplo, a sua

distribuição núcleo-citoplasma. Estudos posteriores envolvendo este exemplo e outros mais,

ainda serão necessários para um melhor esclarecimento dos efeitos da fosforilação mediada

por CK2.

viii

ABSTRACT

DA SILVA, Isabel Caetano de Abreu. CK2 Phosphorylation studies about Schistosoma

mansoni

HMGB1 protein (SmHMGB1). Dissertation (Master in Biological Chemistry).

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

2008.

Schistosoma mansoni is a multicellular parasite with a complex life cycle including

human and snail hosts. About 200 million people in the world are affected by this disease

despite available control programs. Because of its complex life-cycle, characterization of

proteins involved in the regulation of the parasite gene expression is important for a better

understanding of the mechanisms that regulate the parasite life cycle, development and

maturation. In addition these studies may reveal strategies for chemotherapy interference.

High mobility group (HMGs) proteins are among the most abundant and ubiquitous proteins

in eukaryotes. HMGBs are involved in DNA transcription, replication, recombination and

repair. HMGB protein contains two homologous DNA binding domains, the HMG boxes A

and B, and an acidic C-terminal tail. The HMG boxes recognize and preferentially bind to

bent or distorted DNA. They can cause structural changes in the DNA molecule by promoting

DNA supercoiling and bending. The present work characterized the phosphorylation of

Schistosoma mansoni HMGB1 protein (SmHMGB1) by CK2. A preliminary in silico

prediction of SmHMGB1 phosphorylation sites showed four putative sites for protein kinase

CK2 (S-167, T-169, S-172 and S-174). We confirmed that

SmHMGB1 was specifically

phosphorylated

in vitro by CK2. In addition, we mapped the residues that were

phosphorylated by CK2, the serine residues 172 and 174. Functional studies showed that

phosphorylation by CK2 did not regulate the ability of

SmHMGB1 to supercoil or bend DNA.

Using

S. mansoni total extract as a source of protein kinases, as well as specific inhibitors, we

demonstrated that

SmHMGB1 was mainly phosphorylated by an endogenous CK2. This

results suggests that phosphorylation of

SmHMGB1 by CK2 might happen endogenously and

raises a discussion about other possible effects of CK2 phosphorylation, such as

SmHMGB1

nucleocytoplasmic shuttling. Further studies involving this possibility and another ones, will

still be needed for a better explanation of the effects of phosphorylation mediated by CK2

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

– Micrografia eletrônica de varredura de um casal de vermes adultos de S.

mansoni

------------------------------------------------------------------------------------------- 20

Figura 2 – Distribuição geográfica da esquistossomose mansônica --------------------- 21

Figura 3 – Casos confirmados de Esquistossomose. Brasil e Grandes Regiões, 1995-

2006 ----------------------------------------------------------------------------------------------- 22

Figura 4 – Ciclo de vida do S. mansoni ----------------------------------------------------- 24

Figura 5 – Hospedeiro invertebrado do S. mansoni, caramujo da espécie

Biomphalaria glabrata ------------------------------------------------------------------------- 24

Figura 6 Estágios do ciclo de vida do S. mansoni ----------------------------------------- 25

Figura 7 – Patologia da Esquistossomose -------------------------------------------------- 26

Figura 8 – Promotores eucarióticos e proteínas regulatórias interagindo mediante

dobra do DNA pelas HMGs ------------------------------------------------------------------- 37

Figura 9 – Diagrama representativo das HMGAs de mamíferos ------------------------ 38

Figura 10 – Diagrama representando as HMGNs de mamíferos ------------------------ 40

Figura 11 – Diagrama representando as HMGBs de mamíferos ------------------------ 41

Figura 12 – Representações esquemáticas das proteínas HMGB1de mamíferos e de

plantas -------------------------------------------------------------------------------------------- 41

Figura 13 – Estrutura do domínio HMG box da HMGB1 de rato ----------------------- 42

Figura 14 – Mecanismos de controle da expressão gênica por proteínas HMGB ----- 44

Figura 15 – Alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas HMGB ----- 46

Figura 16 – Estrutura e sítios de algumas modificações pós-traducionais da proteína

HMGB1 humana -------------------------------------------------------------------------------- 49

Figura 17 – Diagrama esquemático das construções da proteína recombinante

SmHMGB1 utilizada nos ensaios ------------------------------------------------------------- 53

Figura 18 – Análise da SmHMGB1 no programa NetPhosK 1.0 Server ---------------- 62

Figura 19 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida das construções da

SmHMGB1 --------------------------------------------------------------------------------------- 63

Figura 20 – Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pela enzima CK2 ------ 64

Figura 21 – Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pela enzima CK2 65

Figura 22 – Seqüência dos aminoácidos finais da proteína SmHMGB1 ---------------- 66

Figura 23 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida da SmHMGB1 com

mutações sítio dirigidas ------------------------------------------------------------------------ 67

Figura 24 – Fosforilação das proteínas recombinantes da SmHMGB1 com mutações

sítio dirigidas pela enzima CK2 --------------------------------------------------------------- 68

Figura 25 – Ensaio de super-enovelamento do DNA com a SmHMGB1 fosforilada

pela CK2 ------------------------------------------------------------------------------------------ 70

Figura 26 – Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1

fosforilada pela CK2 ---------------------------------------------------------------------------- 71

Figura 27 – Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes adultos de

S. mansoni ----------------------------------------------------------------- 73

Figura 28 – Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes macho e fêmea maduros e imaturos de

S. mansoni ------------------------------- 74

Figura 29 – Fosforilação da proteína SmHMGB1 com o extrato total de vermes

adultos de

S. mansoni na presença de inibidor de CK2 ------------------------------------ 75

Figura 30 – Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pelo extrato total

de vermes adultos de

S. mansoni na presença de inibidor de CK2 ----------------------- 77

Figura 31 – Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1

fosforilada pelo extrato total de

S. mansoni ------------------------------------------------- 78

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

– Detecção imunológica da CK2 -------------------------------------------------- 35

Tabela 2 – Repertório de proteínas fosforiladas por CK2 --------------------------------- 36

Tabela 3 – Seqüência dos oligonucleotídeos para introdução de mutações sítio

dirigidas ------------------------------------------------------------------------------------------ 56

xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Alanina

aa Aminoácido (s)

α Alfa

ADP Adenosina di-fosfato

ATP Adenosina tri-fosfato

β Beta

Base pairs

C Graus Celsius

CBP

CREB binding protein

cdk7 Cyclin-dependent kinase 7

cDNA Ácido desoxiribonucléico complementar

CK2 Caseína cinase 2

cm Centímetro (s)

cols Colaboradores

C-terminal Carboxi-terminal

D Ácido Aspártico

dCTP Desoxicitidina trifosfato

DMSO Dimetil sulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato

D.O. Densidade ótica

DTT Ditiotreitol

E Ácido Glutâmico

EDTA Ácido Etileno Diamino Tetra-Acético

ESTs

Expressed Sequence Tags

ExoIII Exonuclease III

γ Gama

G Glicina

Glyt1

Glycine Transporter 1

x g Gravidade

hHMGB

Human High Mobility Group Box

xiii

HSFI1 Heat Shock factor 1

IL Interleucina

IRF

Interferon Regulatory Factor

IPTG Isopropil-tio-beta-D-galactosideo

JAK Janus cinase

K Lisina

KAPα1 Karyopherin alpha 1

kDa Quilodálton (s)

L Litro (s)

LB Lauria Bertani

M Molar

MAP

Mitogen Activated protein

mg Miligrama (s)

min Minuto (s)

mL Mililitro (s)

mm Milímetro (s)

mM Milimolar



Microcurie



Micrograma (s)



Micrômetro (s)

ng Nanograma (s)

NFκB Nuclear Factor-kappa B

nm Nanômetro (s)

N-terminal Amino-terminal

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PDB Protein Data Bank

PKA Proteína cinase A

PKC Proteína cinase C

PMSF Fenilmetilsulfonil fluoride

RAGE

Receptor for Advanced Glycation Endproducts

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RNA Ácido ribonucléico

xiv

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

s Segundo (s)

S Serina

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SmHMGB1 HMGB1 de S. mansoni

PKC1 Proteína Cinase C 1 de S. mansoni

T Treonina

TBB 4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazol

TBE Tampão Tris-Ácido Bórico-EDTA

TBP

TATA-binding protein

TDR Tropical Disease Control

TE Tampão Tris-EDTA

TFIIH

General Transcription Factor IIH

TLR Toll Like Receptor

TNFα Tumor Necrosis Factor α

Topo I Topoisomerase I

Tris 2-Amino-2-Hidroximetilpropano-1,3-diol

U Unidade

V Volt (s)

V/cm Volts por centímetro

WHO

World Health Organization

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside

XPB

Xeroderma Pigmentosum B

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ------------------------------------------------------------------------

RESUMO ----------------------------------------------------------------------------------------

vii

ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------

viii

LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------------------

LISTA DE TABELAS ------------------------------------------------------------------------ xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ------------------------------------------------

xii

SUMÁRIO --------------------------------------------------------------------------------------

1 INTRODUÇÃO ------------------------------------------------------------------------------

1.1 Aspectos Gerais da Esquistossomose --------------------------------------------------

1.2 Família Schistosomatidae ----------------------------------------------------------------

1.2.1 O Gênero

Schistosoma e a sua Distribuição Geográfica ---------------------------- 20

1.2.2 Ciclo de Vida do

Schistosoma mansoni ----------------------------------------------- 22

1.2.3 Patologia da Esquistossomose ---------------------------------------------------------- 25

1.3 Fosforilação de proteínas ---------------------------------------------------------------- 27

1.3.1 Breve histórico ---------------------------------------------------------------------------- 27

1.3.2 Fosforilação e Metabolismo do DNA ------------------------------------------------- 30

1.3.3 A proteína cinase CK2 ----------------------------------------------------------------- 33

1.4 As proteínas do tipo High Mobility Group -------------------------------------------

1.4.1 As proteínas do tipo High Mobility Group A (HMGAs) ----------------------------

1.4.2 As proteínas do tipo High Mobility Group N (HMGNs) ----------------------------

1.4.3 As proteínas do tipo High Mobility Group Box (HMGBs) ------------------------- 40

1.5 Modificações pós-traducionais das proteínas do tipo High Mobility Group --

1.5.1 Proteínas HMGB ------------------------------------------------------------------------- 47

xvi

2 OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------

2.1 Objetivos Específicos ---------------------------------------------------------------------- 52

3 MATERIAL E MÉTODOS ---------------------------------------------------------------

3.1 Expressão e purificação das proteínas recombinantes ----------------------------

3.2 Dosagem de proteínas -------------------------------------------------------------------- 54

3.3 Análises computacionais -----------------------------------------------------------------

3.4 Manutenção do Ciclo de Vida do S. mansoni e Obtenção de Vermes Adultos

por Perfusão ------------------------------------------------------------------------------------

3.5 Infecções Unissexuais de S. mansoni ---------------------------------------------------

3.6 Extração de RNA e síntese de cDNA --------------------------------------------------

3.7 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ----------------------------------------------

3.8 Marcação Radioativa de Sondas de DNA --------------------------------------------

3.9 Preparação de extratos totais de vermes adultos de S. mansoni -----------------

3.10 Ensaio de fosforilação in vitro da SmHMGB1 utilizando CK2 -----------------

3.11 Ensaio de fosforilação da SmHMGB1 utilizando extrato total de vermes

adultos de

S. mansoni -------------------------------------------------------------------------

3.12 Ensaio de super-enovelamento do DNA ---------------------------------------------

3.13 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase -----------------------

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------

4.1 Análises Computacionais ----------------------------------------------------------------

4.2 Expressão das construções da proteína SmHMGB1 recombinante -------------

4.3 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pela CK2 ----------------------

4.4 Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pela CK2 ----------------

xvii

4.5 Proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas (S-A) -------------------------

4.6 Expressão da proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas --------------

4.7 Fosforilação da proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas (S-A) ----

4.8 Ensaio de super-enovelamento do DNA com a SmHMGB1 fosforilada pela

CK2 -----------------------------------------------------------------------------------------------

4.9 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1

fosforilada pela CK2 --------------------------------------------------------------------------

4.10 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes adultos de

S. mansoni ---------------------------------------------------------------

4.11 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes macho e fêmea maduros e imaturos de

S. mansoni ---------------------------

4.12 Fosforilação da proteína SmHMGB1 com o extrato total de vermes adultos

de S. mansoni na presença de inibidor de CK2 (TBB) ---------------------------------

4.13 Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes adultos de

S. mansoni na presença de TBB -------------------------------------

4.14 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1

fosforilada pelo extrato total de

S. mansoni ----------------------------------------------

5 DISCUSSÃO ----------------------------------------------------------------------------------

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS --------------------------------------------------

ANEXO – TRABALHO RELACIONADO À TESE PUBLICADO EM

PERIÓDICO DE CIRCULAÇÃO INTERNACIONAL -------------------------------

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos Gerais da Esquistossomose

A esquistossomose é uma doença que atinge a espécie humana desde a antiguidade.

Exames de múmias do Egito revelaram lesões produzidas pela doença. Em 1851, o

pesquisador alemão Theodor Bilharz descobriu o seu verme causador, ao qual mais tarde foi

atribuído o nome de Schistosoma (ROSS e cols., 2002). No Brasil ela é popularmente

conhecida como barriga-d´água.

Segundo a organização mundial de saúde (WHO, Geneva, 2002), nas áreas tropicais e

subtropicais do globo, a esquistossomose só é superada pela malária em termos de

importância sócio-econômica e de saúde pública. É estimado que cerca de 200 milhões de

pessoas, em 74 países, tenham esquistossomose, 85% das quais vivem na áfrica sub-Saariana,

onde o

Schistosoma mansoni é endêmico (CHITSULO e cols., 2000; SAVIOLI e cols., 2004).

O principal fator da patogênese da doença é a resposta imune do hospedeiro contra

antígenos da casca do ovo, formando granulomas ao redor dos ovos que são depositados no

fígado (ROSS e cols., 2002). A contínua deposição de ovos e formação de granulomas leva a

instalação de extensas áreas cicatriciais que, pouco a pouco, vão alterando a arquitetura e o

funcionamento do tecido onde se encontram (REY, 2002).

O tratamento medicamentoso da esquistossomose sempre foi limitado devido à

dificuldade de serem encontrados quimioterápicos que exibissem alta eficácia e grande

tolerância (ANDREWS e cols., 1983; SEUBERT e cols

., 1977). Atualmente, utiliza-se no

tratamento o fármaco praziquantel. No entanto, estudos epidemiológicos recentes chamam a

atenção para o surgimento de focos de parasitas resistentes ao praziquantel no Senegal e no

Egito (CIOLI e cols., 1993; FALLON & DOENHOFF, 1994; HAGAN e cols

., 2004;

BOTROS e cols., 2005). Estes relatos de resistência a drogas geram uma discussão a respeito

da eficácia desse tipo de tratamento quando utilizado de forma generalizada. No entanto, não

descarta a possibilidade de se tratar do resultado da intensa reinfecção e transmissão

observada nestas regiões (GRYSSELS e cols., 2001). O estudo de vacinas é outra abordagem

para a tentativa de erradicação da doença, no entanto, ainda é inconclusivo e incerto.

Com o avanço das chamadas tecnologias do DNA recombinante e ainda a publicação

do transcriptoma de

S. mansoni, por Verjovski-Almeida e colaboradores (Verjovski-Almeida

e cols., 2003) e mais recentemente do genoma completo do parasita

(<http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/

>), uma série de “estratégias genômicas”

alternativas passaram a interessar vários grupos de pesquisa. Estas estratégias seriam, de uma

forma geral, tentativas de se compreender melhor a biologia do parasita através da

disponibilidade das seqüências genômicas e com isso estabelecer possíveis alvos para o

desenvolvimento de fármacos e até mesmo de vacinas.

1.2 Família Schistosomatidae

Os esquistossomos são parasitas acelomados multicelulares cujo ciclo de vida inclui

hospedeiros humanos e caramujos. Os esquistossomos pertencem ao filo Platyhelminthes,

classe Trematoda, subclasse Digenea e família Schistosomatidae. Membros desta família

parasitam o sistema vascular de vertebrados. Uma característica comum desta família é que as

fêmeas maduras são menores e mais alongadas que os machos, e normalmente se alojam em

um sulco ventral do macho, o canal ginecóforo (ROLLINSON e SOUTHGATE, 1987)

(Figura 1).

Figura 1. Micrografia eletrônica de varredura de um casal de vermes adultos de S. mansoni.

Casal em cópula com a fêmea alojada no canal ginecóforo do macho. Adaptado de:

<http://www.weichtiere.at/Mollusks/Schnecken/parasitismus/schistosoma.html

>. Acesso em: Junho

2008.

1.2.1 O Gênero Schistosoma e a sua Distribuição Geográfica

Vermes adultos do gênero Schistosoma são brancos ou acinzentados, apresentando um

corpo cilíndrico de aproximadamente 7-20 mm de comprimento com duas ventosas terminais,

tegumento, trato digestivo cego e órgãos reprodutores. Contrariamente à generalidade dos

trematódeos, o gênero é dióico, exibindo sexos separados (GRYSEELS e cols., 2006).

Dentre os parasitas que habitam a corrente sanguínea de mamíferos, o gênero

Schistosoma possui a maior distribuição geográfica e diversificação em termos de número de

espécies. As principais espécies de

Schistosoma capazes de infectar o homem são: S. mansoni,

que é transmitido por caramujos do gênero

Biomphalaria e causa esquistossomose intestinal e

hepática na África, Península Arábica e América do Sul

(Figura 2); S. hematobium,

transmitido pelo caramujo do gênero

Bulinus e causador da esquistossomose urinária na

África e na Penínssula Arábica; e o

S. japonicum, transmitido pelo caramujo anfíbio

Oncomelania e causador da esquistossomose hepatoesplênica na China, Filipinas e Indonésia.

S. intercalatum e o S. mekongi são apenas de importância local (GRYSEELS e col., 2006).

Figura 2. Distribuição geográfica da esquistossomose mansônica. Retirado de:

<http://www.path.cam. ac.uk/~schisto/Background/Distribution.html

>. Acesso em: Junho 2008.

No Brasil, as áreas de maior concentração da esquistossomose mansônica estão nas

regiões Nordeste e Sudeste

(Figura 3). Três espécies de moluscos do gênero Biomphalaria,

glabrata, tenagophila e straminea são hospedeiros intermediários do S. mansoni no Brasil

(PESSOA & MARTINS, 1982).

Figura 3. Casos confirmados de Esquistossomose. Brasil e Grandes Regiões, 1995-2006.

Adaptado de: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/gif/casos_esquistossomose.gif

>. Acesso em:

Setembro 2008.

1.2.2 Ciclo de Vida do Schistosoma mansoni

O Schistosoma mansoni possui dois hospedeiros para completar seu ciclo de vida

(Figura 4). No hospedeiro intermediário, o caramujo do gênero Biomphalaria (Figura 5), o

S. mansoni se desenvolve de miracídio a cercária. O hospedeiro definitivo, o homem, é

infectado pela cercária, e esta se desenvolve até o estágio de verme adulto.

As fêmeas adultas

(Figura 6d) do S. mansoni produzem centenas de ovos (Figura 6a)

por dia. Cada ovo contém uma larva ciliada denominada de miracídio (Figura 6b), capaz de

secretar enzimas proteolíticas que auxiliam os ovos durante a sua migração para o lúmen do

intestino. Atingindo este órgão, os ovos são excretados nas fezes do hospedeiro definitivo e

podem permanecer viáveis por até sete dias. Em contato com a água, os ovos eclodem e

liberam o miracídio, que representa um dos estágios larvais no ciclo de vida do

S. mansoni.

Os miracídios, em função de estímulos químicos e luminosos, deslocam-se através de

batimentos ciliares a procura de seus hospedeiros intermediários, os caramujos do gênero

Biomphalaria (Figura 5). Após penetrar no caramujo, o miracídio se multiplica

assexuadamente em esporocistos multicelulares e mais tarde em cercárias

(Figuras 4 e 6c),

que são as formas infectantes para o hospedeiro humano. As cercárias começam a ser

liberadas pelo caramujo de quatro a seis semanas após a infecção e são capazes de nadar

ativamente por até 72 horas a procura do hospedeiro definitivo. A liberação das cercárias é

estimulada pela luz , ocorrendo majoritariamente durante o dia. Um caramujo, infectado por

um miracídio, pode liberar milhares de cercárias todos os dias por meses. Encontrando o

hospedeiro, as cercárias penetram ativamente a sua pele e após cerca de três horas atravessam

o epitélio e transformam-se em esquistossômulos, após perder a cauda e seu revestimento de

células ciliadas. Os esquistossômulos penetram nos vasos sanguíneos e atingem os pulmões

via artéria pulmonar. Pela veia pulmonar eles chegam ao sistema porta-hepático. Durante a

migração até o fígado os esquistossômulos se desenvolvem em vermes adultos. Do fígado, a

maioria dos vermes migra para as veias do intestino onde residem se alimentando de

hemácias, e se reproduzem com a ovoposição da fêmea. O tempo total de maturação vai de

quatro a seis semanas. (JOURDANE & THERON, 1987; WILSON, 1987; GRYSEELS e

cols., 2006).

Figura 4. Ciclo de vida do S. mansoni. Retirado de:

<http://rgmg.cpqrr.fiocruz.br/modules/edito/edito.php?idedito=26

>. Acesso em: Junho 2008.

Figura 5. Hospedeiro invertebrado do S. mansoni, caramujo da espécie Biomphalaria glabrata.

Retirado de: <http://www.weichtiere.at/Mollusks/Schnecken/parasitismus/ schistosoma.html

>. Acesso

em: Junho 2008.

a. b. c.

Figura 6. Estágios do ciclo de vida do S. mansoni. a. Microscopia de um ovo. A seta indica a

espícula lateral característica da espécie. Retirado de: <http://www.path.cam.ac.uk/%7

Eschisto/SchistoLife/S.mansoni.egg.html>. Acesso em: Junho 2008. b. Microscopia eletrônica de

varredura de um miracídio (seta vermelha) recém eclodido do ovo (seta azul). Adaptado de:

<http://www.path.cam.ac.uk/~schisto/SchistoLife/Miracidium.html>. Acesso em: Junho 2008. c.

Microscopia de uma cercaria. Adaptado de: <http://www.weichtiere.at/Mollusks/Schnecken

/parasitismus/schistosoma.html>. Acesso em: Junho 2008. d. Vermes adultos. Adaptado de:

<http://cienciahoje.uol.com.br/controlPanel/materia/view/2938>. Acesso em: Setembro 2008.

1.2.3 Patologia da Esquistossomose

As principais lesões que levam ao estabelecimento da infecção crônica não ocorrem

devido à presença dos vermes adultos, mas sim, como dito anteriormente, de seus ovos. Isto

se dá porque nem todos os ovos produzidos pelos vermes adultos ficam retidos na mucosa

intestinal e capilares do sistema porta-hepático do hospedeiro vertebrado, sendo alvo de

reações imunológicas em outros órgãos como baço, pulmão ou sistema nervoso central

(GRYSEELS e cols., 2006). O ovo secreta enzimas proteolíticas capazes de provocar reações

inflamatórias granulomatosas e tipicamente de natureza eosinofílica que são progressivamente

substituídas por depósitos fibróticos

(Figura 7) (CHEEVER e cols., 2000).

a. b.

Figura 7. Patologia da Esquistossomose. a. Granuloma agudo formado ao redor do ovo de S.

mansoni

no fígado de um camundongo infectado experimentalmente e contendo inúmeros linfócitos e

eosinófilos, assim como alguns macrófagos. As células maiores avermelhadas são hepatócitos intactos.

b. Granuloma crônico ao redor dos restos de ovo de S. mansoni em um fígado de camundongo com

um tecido fibroso dominante (cor azulada). Adaptado de: GRYSEELS e cols., 2006.

A severidade dos sintomas está diretamente relacionada à intensidade da infecção e a

resposta imune individual (GRYSEELS e cols., 2006). Os doentes crônicos, onde se observa

uma obstrução por fibrose do sistema porta-hepático, podem desenvolver

hepatoesplenomegalia, lesões vasculares, hipertensão do sistema porta e ascite, ou seja,

acúmulo de líquido no abdômen, razão pela qual a doença também é conhecida como barriga

d’água. Em casos mais graves, a hipertensão chega a matar o hospedeiro devido ao

sangramento de varizes gastroesofágicas formadas na tentativa de compensar o

comprometimento da circulação intra-hepática (CHEEVER e cols., 2000).

A média de vida de um verme adulto é de aproximadamente três a cinco anos, mas em

alguns casos, podem alcançar até 30 anos, sendo que a capacidade reprodutiva teórica de um

par de vermes adultos ao longo de sua vida pode chegar a mais de 600 bilhões de novos

parasitas (GRYSEELS, 2006).

1.3 Fosforilação de proteínas

Todas as células em um ambiente fisiológico recebem um grande número de estímulos

que devem ser processados e integrados para determinar alterações no comportamento celular,

tais quais, migração, proliferação, apoptose e diferenciação. As modificações protéicas

reversíveis são um dos mecanismos que governam este tipo de processamento de informações

pela célula. Em particular, a fosforilação de proteínas tem se mostrado ser uma das forças

diretórias primárias na propagação de sinais celulares. Através da sua habilidade de controlar

interações proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-fosfolipídeos, reorganização estrutural

alostérica, degradação e translocação, a fosforilação de proteínas tem impacto em todo

aspecto da biologia celular (JORGENSEN & LINDING, 2008). Atualmente, o número de

citações bibliográficas envolvendo a fosforilação de proteínas e os seus efeitos é tão grande,

que verificamos que praticamente todo evento fisiológico passa por algum tipo de modulação

dos seus componentes através da fosforilação dos mesmos.

1.3.1 Breve histórico

Entre os primeiros relatos da atividade de proteínas cinases, está o trabalho publicado

em 1954 por Kennedy e Burnett. Os autores descreveram uma enzima do fígado capaz de

catalisar a fosforilação da caseína. Mais tarde, Fischer e Krebs (FISCHER & KREBS, 1955;

KREBS & FISCHER e 1956) e Sutherland e Wosilait (1955) demonstraram que a

interconversão da proteína fosforilase

b a fosforilase a envolvia um processo de fosforilação/

defosforilação. Em particular, Fischer e Krebs mostraram que a conversão da forma

b para a

forma

a ocorria na presença de Mg

-ATP, e de uma proteína denominada por eles de

fosforilase cinase. Posteriormente foi mostrado que esta cinase catalisava a transferência do

grupamento fosfato gama da molécula de ATP para um resíduo de serina específico na

fosforilase

b (FISCHER e cols., 1959). Em 1968, Walsh e colaboradores, descreveram uma

proteína cinase dependente de AMP cíclico, a proteína cinase A (PKA) e ainda mostraram que

a mesma era capaz de ativar a proteína fosforilase cinase. Este foi um dos primeiros exemplos

de uma cascata, na qual uma proteína cinase ativava a outra. Nesta mesma época, também se

verificou que a PKA inibia a enzima glicogênio sintase, um dos primeiros exemplos de

inibição de atividade protéica através da fosforilação (BISHOP & LARNER, 1969;

SODERLING e cols., 1970). Com o decorrer das décadas, a fosforilação foi ganhando

importância com a descoberta de que reações extremamente importantes estavam sob intensa

regulação através da fosforilação de suas proteínas constituintes. Como exemplo, podemos

citar o trabalho onde foi demonstrado que o complexo da piruvato desidrogenase mitocondrial

era inativada pela fosforilação (LINN e cols., 1969) e outro, onde descreveu-se que a proteína

piruvato cinase era inibida pela ação da PKA (LJUNGSTROM e cols., 1974). Além disso, a

demonstração de que as proteínas cinases estavam distribuídas em diversos tecidos e

organismos sugeriam uma função cada vez mais abrangente para esta classe de proteínas

(KUO & GREENGARD, 1969). Em 1980, Kishimoto e colaboradores publicaram um

trabalho envolvendo a proteína cinase C e a sua ativação pelo segundo mensageiro

diacilglicerol, trazendo à tona o conceito de proteínas cinases dependentes de segundos

mensageiros.

Concomitante ao surgimento de trabalhos envolvendo as proteínas cinases, algumas

das principais fosfatases específicas para resíduos de serina e treonina foram classificadas

durante o final da década de 70 e início da década de 80 (INGEBRITSEN & COHEN, 1983),

e os mecanismos pelos quais estas proteínas eram reguladas começaram a ser identificados

(COHEN, 2002).

Em 1975, foi descrito que a PKA era capaz de fosforilar alguns peptídeos obtidos da

digestão de mielina (DAILE e cols., 1975) e isto levou a conclusão de que PKA e

possivelmente outras cinases fosforilavam os seus substratos em resíduos específicos em uma

seqüência também específica. Estes estudos fundamentaram as técnicas modernas que

utilizam peptídeos sintéticos e foram de extrema importância para o estudo da fosforilação de

proteínas (COHEN, 2002).

Estando entre as primeiras proteínas cinases descritas na literatura, a PKA foi também

a primeira proteína cinase a ter a sua sequência de aminoácidos determinada, no início dos

anos 80 (SHOJI, 1981). Ainda nesta década, ficou demonstrado que as proteínas cinases e

fosfatases não encontravam seus substratos simplesmente por difusão, mas que com bastante

freqüência elas eram direcionadas para regiões específicas da célula por proteínas alvo, com

as quais elas interagiam (COHEN, 2002). As proteínas que interagem com a subunidade

regulatória RII

β da PKA (BREGMAN e cols., 1989) e a subunidade da proteína fosfatase-1

alvo de glicogênio (STRALFORS e cols., 1985) são alguns dos primeiros exemplos deste

fenômeno importante.

Em 1980, Hunter e Sefton descreveram a primeira tirosina cinase, a proteína v-Src, de

um sarcoma vírus. Logo em seguida o receptor de crescimento epidermal também foi descrito

como uma tirosina cinase (USHIRO & COHEN, 1980). Na mesma década, as tirosinas

fosfatases começavam a ser citadas na literatura (TONKS e cols., 1988), o que gerou um

enorme interesse nesta nova família de enzimas e cerca de 100 membros foram identificados

posteriormente, incluindo uma série de receptores tirosina fosfatase (COHEN, 2002). No final

da década de 80 e começo de 90 foi realizada a clonagem das JAK cinases (WILKS e cols.,

1991), intensamente estudadas atualmente e envolvidas em um grande número de vias de

sinalização celular.

A ação de proteínas cinases em cascata, primeiramente mencionada por Walsh e

colaboradores, em 1968, aguardou mais de 20 anos até que exemplos posteriores deste

fenômeno fossem identificados (COHEN, 2002). Uma proteína cinase estimulada por

insulina, que atuava sobre outra proteína, denominada na época de proteína 2 associada aos

microtúbulos (atualmente denominada de proteína ativada por mitógeno) (MAP2) foi

identificada no final dos anos 80 e denominada de MAP cinase (RAY & STURGILL, 1987).

Esta enzima foi descrita como sendo ativada pela fosforilação de uma treonina e uma tirosina

(ANDERSON e cols., 1990) catalisadas por uma MAP cinase cinase (AHN e cols., 1991;

GOMEZ & COHEN, 1991). Estes trabalhos foram seguidos por vários outros que envolviam

outras cascatas de MAP cinase importantes para a preservação da célula contra estresse,

agentes danosos e infecções por organismos patogênicos (COHEN, 2002). Destes trabalhos

até os dias atuais, a nossa compreensão a respeito de fosforilação protéica atingiu o estágio

onde a sua importância em praticamente todo evento fisiológico está claramente reconhecida.

Dentro do contexto da regulação transcricional e levando-se em conta a função nuclear

desempenhada pelas proteínas HMGB, será dada ao longo da próxima seção uma maior

atenção aos eventos de fosforilação relacionados ao metabolismo de DNA, tais como

replicação, transcrição e reparo de DNA.

1.3.2 Fosforilação e metabolismo do DNA

O genoma eucariótico encontra-se organizado na forma de uma estrutura compacta,

denominada cromatina. Esta, por sua vez, é constituída de unidades repetitivas nomeadas de

nucleossomos, formados por uma associação entre o DNA e proteínas histonas (H2A, H2B,

H3 e H4) (MARMORSTEIN, 2001). É nessa estrutura onde ocorrem os processos nucleares

fundamentais de transcrição, replicação e reparo de DNA. Uma das maneiras de se afetar o

nível de compactação do material genético, e conseqüentemente a exposição de regiões alvo

para a ligação de proteínas é modificando as proteínas histona (HANS & DIMITROV, 2001).

Embora a acetilação seja a principal modificação envolvida nesse processo, as histonas

constituintes dos nucleossomos já foram descritas como sendo alvos de fosforilações

(IIKUKA & SMITH, 2003; NOWAK & CORCES, 2004; PETERSON & COTE, 2004).

Como conseqüência dessas modificações pode-se observar, no exemplo da fosforilação da

serina 10 da histona H3, uma maior condensação dos cromossomos e subsequente segregação

durante a mitose/ meiose (NOWAK & CORCES, 2004).

Além das histonas, os fatores de transcrição e as proteínas que irão compor os

chamados complexos remodeladores da cromatina também podem ter as suas atividades de

ligação ao DNA e interações com outras proteínas reguladas por fosforilação. Como exemplo

de um fator transcricional regulado por fosforilação podemos citar a proteína p53. Esta

proteína atua como uma molécula anti-apoptótica ao ser mobilizada em situações de estresse

na célula tais como hipoxia e dano no DNA. Neste último caso, a expressão da proteína

aumenta e a mesma é fosforilada e acetilada (DOHONEY e cols., 2004). Logo após o dano no

DNA ter ocorrido, a proteína é fosforilada nos resíduos de serina 15, 20, 33 e 37, localizados

no domínio N-terminal. Acredita-se que estas fosforilações tenham um papel importante na

estabilidade e atividade da molécula (LAMBERT e cols., 1998; ASHCROFT & VOUSDEN,

1999). Um outro exemplo de fator de transcrição regulado por fosforilação a se mencionar é o

fator de choque térmico 1 (

heat shock factor 1 – HSF1). Sob condições normais de

crescimento esta proteína existe na célula como um monômero fosforilado no qual a atividade

de ligação ao DNA está reprimida. Em resposta a situações envolvendo um choque térmico,

assim como outras situações de estresse como os ambientais ou fisiológicos, a proteína HSF1

forma um trímero, ligando-se a regiões promotoras específicas e ativando genes relacionados

à resposta associadas ao estímulo evocado no início do processo (HOLMBERG e cols., 2001).

Mais uma vez, a fosforilação de proteínas envolvidas nas vias de sinalização desses processos

irá atuar como um mecanismo regulatório importante. A proteína p300, um co-regulador

transcricional com atividade de histona acetil transferase, e conseqüentemente sendo capaz de

acetilar as histonas e atuar sobre a acessibilidade da cromatina, tem a sua atividade regulada

pela fosforilação do seu domínio C-terminal (SCHWARTZ e cols., 2003). Proteínas

envolvidas no reparo de DNA, como é o caso do fator de transcrição e reparo TFIIH também

são alvos de fosforilação. Esta proteína compõe-se de várias subunidades com diferentes

atividades enzimáticas, incluindo helicases XPB e proteína cinase cdk7 (ZURITA &

MERINO, 2003). A fosforilação irá atuar deslocando uma atividade em relação à outra.

(HOLMBERG e cols., 2001). Durante a mitose, a atividade transcricional da TFIIH é inibida

através da fosforilação das suas subunidades cdk7 e p62 (AKOULITCHEV & REINBERG,

1998; LONG ecols., 1998). De forma oposta, a fosforilação da subunidade XPB, envolvida no

processo de reparo do DNA, quando ocorrida na serina 751, inibe a atividade de reparo de

DNA da proteína TFIIH, mas não atua sobre a sua função transcricional (COIN e cols., 2004).

A fosforilação também já foi descrita como sendo capaz de regular a atividade de proteínas

envolvidas no

splicing de RNA (STAMM, 2002). Neste caso, a fosforilação altera a interação

entre proteínas regulatórias individuais envolvidas no processo e também entre algumas

destas proteínas e o RNA alvo. Uma das conseqüências da fosforilação é a modificação na

composição celular das proteínas reguladoras do

splicing, o que altera a seleção de sítios de

splicing. A outra conseqüência é que as proteínas regulatórias modificam a sua localização

celular e alteram as suas concentrações em regiões onde o

splicing esteja ocorrendo, o que

novamente resulta em uma modificação na seleção dos sítios de

splicing (STAMM, 2008).

1.3.3 A proteína cinase CK2

A fosforilação de proteínas, como discutido nas seções anteriores, é um ponto crítico

no controle de eventos celulares fundamentais, incluindo a proliferação celular e a

sobrevivência da célula de uma maneira geral. A fosforilação reversível de proteínas,

envolvida nesse processo, está sobre o controle de vias regulatórias envolvendo cinases e

fosfatases. A proteína CK2 é um componente vital deste processo (OLSTEN e cols., 2005).

Apesar de ter sido descrita há mais de 50 anos (BURNETT & KENNEDY, 1954), esta

serina/treonina proteína cinase extremamente conservada ainda permanece como uma

molécula surpreendente no que se refere às suas características funcionais (BIBBY &

LITCHFIELD, 2005) e continua sendo alvo de intensos estudos.

A proteína CK2 é expressa de forma ubíqua em células eucarióticas e é extremamente

conservada ao longo das espécies. Diferentemente das subunidades catalíticas de outras

proteínas cinases, que permanecem quiescentes até que a sua atividade seja ativada em

resposta a um estímulo e efetores específicos, a CK2 é constitutivamente ativa e independente

de segundos mensageiros e eventos de fosforilação (MEGGIO & PINNA, 2003).

Em vários organismos, a proteína cinase CK2 aparece como um heterotetrâmero

composto de duas subunidades α e duas subunidades regulatórias β (FAUST &

MONTENARH, 2000). Primeiramente, duas formas diferentes de subunidades catalíticas

(designadas CK2α ou CK2α´), foram caracterizadas em humanos (LOZEMAN e cols., 1990).

Estas são codificadas por genes distintos e são bastante similares entre si, com cerca de 90%

de identidade. Mais recentemente uma terceira isoforma (designada CK2α´´) foi identificada

(SHI e cols., 2001). Esta difere da isoform

a CK2α, principalmente em seu domínio C-terminal

(BIBBY & LITCHFIELD, 2005).

Uma série de trabalhos tem demonstrado que as diferentes isoformas são

extremamente relacionadas e exibem uma sobreposição considerável de suas funções. No

entanto, evidências sugerindo uma especialização funcional para as isoformas individuais em

modelos de leveduras, camundongos e mamíferos têm sido descritas (LITCHFIELD, 2003).

Em contraste às três isoformas catalíticas descritas para a CK2, apenas uma

subunidade regulatória (designada CK2

β) foi identificada em mamíferos (ALLENDE &

ALLENDE, 1995). A sua homologia também é bastante elevada entre as espécies, assim

como observado na subunidade catalítica (ALLENDE & ALLENDE, 1995; LITCHFIELD &

LUSCHER, 1993).

Em geral, o tetrâmero da enzima apresenta-se constitutivamente ativo, atividade esta

podendo ser facilmente detectável na grande maioria das células ou extratos de tecidos na

ausência de qualquer estímulo. Embora as subunidades catalíticas da CK2 estejam ativas na

ausência de CK2

β, a subunidade regulatória tem um papel relevante na regulação de uma

variedade de ações distintas. Assim, já se demonstrou

que CK2β é capaz de estimular a

atividade de CK2 sobre determinados substratos tais quais topoisomerase II e p53, e inibir a

sua atividade sobre outros como, por exemplo, a calmodulina (BIBBY & LITCHFIELD,

2005; MARIN e cols., 1999).

Faust e Montenarh, em 2002, em uma revisão sobre a localização subcelular de CK2,

documentaram que a proteína cinase CK2 está presente em praticamente todos os

compartimentos da célula

(Tabela 1). Foram reunidos trabalhos anteriores, onde a presença

de CK2 foi verificada através da sua atividade de proteína cinase, e trabalhos mais recentes,

que analisaram as subunidades, individualmente. Os estudos envolveram ensaios

imunológicos e bioquímicos, utilizando-se de anticorpos específicos para cada subunidade.

Com isto foi possível combinar os dois tipos de análise e verificar-se que uma atividade

elevada de proteína cinase da CK2 esteve sempre acompanhada de um nível elevado de CK2,

e vice-versa, corroborando ambos os resultados (FAUST & MONTENARH, 2000).

Tabela 1. Detecção imunológica da CK2. Adaptado de: FAUST & MONTENARH, 2000.

Em relação aos seus substratos, a CK2 já teve mais de 300 deles descritos na literatura.

Estes incluem principalmente fatores de transcrição, proteínas que afetam a estrutura de

DNA/RNA, e proteínas envolvidas em sinalização. Esta extensiva lista reflete o envolvimento

da proteína CK2 em uma gama de processos globais, tais como expressão gênica,

sobrevivência, apoptose e transformação celular (ALLENDE-VEGA e cols., 2005).

Entre os substratos descritos para a proteína CK2 estão as proteínas do tipo HMG

(Tabela 2) (MEGGIO & PINNA, 2003), descritas nas seções seguintes.

Tabela 2. Repertório de proteínas fosforiladas por CK2. Destacadas em vermelho as proteínas do

tipo HMG. Adaptado de: MEGGIO & PINNA, 2003.

1.4 As proteínas do tipo High Mobility Group

As proteínas do tipo High Mobility Group (HMGs) foram descritas há cerca de 30

anos como componentes da cromatina capazes de serem extraídos com ácidos e apresentando

uma alta mobilidade eletroforética em géis de uréia (GOODWIN e cols., 1973), o que lhes

rendeu a sua denominação. Elas são proteínas ubíquas em eucariotos e praticamente ausentes

em eubactéria e archaea (ZIMMERMANN e cols., 2004).

As HMGs pertencem a três famílias (HMGA, HMGB e HMGN), estruturalmente

diferentes, mas funcionalmente similares. Elas atuam com freqüência no estabelecimento de

domínios ativos ou inativos da cromatina e aparentemente em um número limitado de genes

específicos (BIANCHI e AGRESTI, 2005). Na literatura, as HMGs são comumente

denominadas de proteínas de “arquitetura”, pois são capazes de distorcer, dobrar ou modificar

a estrutura do DNA complexado com fatores de transcrição ou histonas (AGRESTI e

BIANCHI, 2003)

(Figura 8).

Figura 8. Promotores eucarióticos e proteínas regulatórias interagindo mediante dobra do DNA

pelas HMGs

. Adaptado de: Principles of Biochemistry, Lehninger, 4ª Edição, p.1105, 2004.

1.4.1 As proteínas do tipo High Mobility Group A (HMGAs)

As HMGAs são as menores proteínas da família das HMGs, tendo por volta de 10

kDa. Elas foram assim denominadas por conterem em sua estrutura os chamados domínios

AT-

hooks (Figura 9), segmentos constituídos por nove aminoácidos, que se ligam a regiões

do DNA ricas em repetições A/T

in vitro e in vivo (ZHANG e cols., 2007). A família se

subdivide em duas proteínas, a HMGA1 e HMGA2, codificadas por dois genes distintos

(REEVES e cols., 2001). Assim como as outras HMGs, estas proteínas exercem a sua função

geral, na regulação da cromatina, e ainda estão diretamente envolvidas no controle

transcricional de genes específicos. Nesse último caso, participam dos chamados

enhanceosomes, complexos multiprotéicos compostos por fatores transcricionais e co-fatores.

Em um dos

enhanceosomes mais bem caracterizados na literatura, localizado na região

omotora do gene interferon β, a HMGA1 atua distorcendo o DNA levemente, desta forma

aumentando a afinidade de outras proteínas por seus sítios de ligação e, ainda estabelecendo

interações com os fatores de transcrição NF-

ĸB e IRF (fator de resposta a interferon) (YIE e

cols., 1999).

Figura 9. Diagrama representando as HMGAs de mamíferos. O número de aminoácidos em cada

proteína está indicado. As caixas azuis representam os domínios de ligação ao DNA A-T

hook.

Adaptado de: BIANCHI e AGRESTI, 2005.

A concentração celular da proteína HMGA varia bastante durante o desenvolvimento.

No início da embriogênese, ela é abundante, e, na grande maioria das células, é expressa

apenas de modo basal (SGARRA e cols

., 2004). Isso poderia ser explicado pelo fato das

HMGAs participarem da regulação gênica de modo diferencial, dependendo do contexto

celular. Assim, o seu papel irá sofrer uma série de mudanças durante os estágios embrionários

e na fase adulta (MARTINEZ-HOYOS e cols., 2004). Esta família de proteínas também está

freqüentemente envolvida no desenvolvimento de tumores (TAKAHA e cols., 2004; FEDELE

e cols., 2002, 2005), estando comumente super expressas nos mesmos, particularmente em

aqueles de origem mesenquimal (REEVES e cols., 2001).

1.4.2 As proteínas do tipo High Mobility Group N (HMGNs)

As HMGNs são as proteínas que possuem peso molecular intermediário dentro da

família das HMGs, entre 10 e 20 kDa. Elas foram nomeadas de acordo com os seus domínios

e o seu modo de ação. Em sua estrutura estão presentes um domínio de ligação a

nucleossomos e um domínio C-terminal ácido denominado

chromatin-unfolding domain

(Figura 10) (BIANCHI e AGRESTI, 2005). Elas são capazes de ligar-se no interior dos

nucleossomos, mais especificamente entre as espirais de DNA e o octâmero de histonas

(AGRESTI e BIANCHI, 2003). Através dessa ligação elas afetam a habilidade da histona H1

ligar-se aos nucleossomos, causando uma redução no tempo de residência da histona H1 no

DNA, o que acaba facilitando o acesso à cromatina e com isso permitindo que fatores

regulatórios atinjam seus alvos no DNA (CATEZ e cols., 2002). São descritos quatro

membros desta subfamília, HMGN1 e HMGN2, que já foram intensamente estudadas por

mais de 30 anos e HMGN3 e HMGN4, descritas mais recentemente (BIRGER e cols., 2001;

WEST e cols., 2001).

Figura 10. Diagrama representando as HMGNs de mamíferos. O número de aminoácidos em cada

proteína está indicado. As caixas vermelhas representam os domínios de ligação aos nucleossomos e

em laranja o

chromatin-unfolding domain. Adaptado de: BIANCHI e AGRESTI, 2005.

Assim como as outras HMGs, as HMGNs interagem com o DNA de forma bem

dinâmica: mais de 99% das moléculas desta proteína estão ligadas a cromatina quase que a

todo momento, porém o tempo que elas permanecem ligadas varia de 4 a 25 segundos

(PHAIR e cols

., 2004). Atualmente, já foram descritos alguns genes específicos regulados

positivamente pelas HMGNs, como o Glyt 1, que codifica uma proteína transportadora

transmembranar que regula a concentração de glicina nas junções sinápticas (WEST e cols.,

2004).

1.4.3 As proteínas do tipo High Mobility Group Box (HMGBs)

A família das HMGBs de vertebrados compreende três proteínas: HMGB1, HMGB2 e

HMGB3

(Figura 11). Elas possuem alta conservação na sua seqüência de aminoácidos (80%)

e propriedades bioquímicas indistinguíveis (BUSTIN, 2001b). Em vertebrados existem dois

domínios homólogos de ligação ao DNA na estrutura das HMGBs, sendo estes denominados

HMG

boxes A e B. Além deles, uma porção C-terminal carregada negativamente é bastante

característica (BUSTIN, 1999)

(Figura 12a). Em plantas as HMGBs são compostas por

apenas um domínio HMG box, flanqueado por um domínio C-terminal ácido e um N-terminal

básico (Figura 12b) (THOMSEN e cols., 2004).

Figura 11. Diagrama representando as HMGBs de mamíferos. O número de aminoácidos em cada

proteína está indicado. As caixas verdes representam os domínios de ligação ao DNA (boxes A e B).

As barras cinzas representam a região que conecta os domínios de ligação ao DNA e a porção C-

terminal rica em resíduos de aminoácidos ácidos, respectivamente. Adaptado de: BIANCHI e

AGRESTI, 2005.

Figura 12. Representações esquemáticas das proteínas HMGB1 de mamíferos e de plantas. a.

HMGB1 humana. As duas caixas brancas representam os domínios de ligação ao DNA e a caixa preta

destaca a cauda ácida, composta de uma sequência de 30 resíduos de ácido glutâmico e ácido

aspártico. Adaptado de: YANG e TRACEY, 2005. b. HMGB1 de milho. O domínio central de ligação

ao DNA está indicado como uma caixa branca, enquanto o domínio C-terminal está indicado como

uma caixa preta. As posições dos aminoácidos delimitando o início e o fim dos domínios estão

indicadas. Adaptado de: THOMSEN e cols., 2004.

Os domínios HMG box não são exclusivos das HMGBs, eles estão presentes em uma

série de proteínas, incluindo inúmeros fatores de transcrição, assim como fatores envolvidos

no controle do desenvolvimento e diferenciação celular (JANTSEN e cols., 1990; AGRESTI

e BIANCHI, 2003; HOCK e cols., 2007). A estrutura dos domínios

Box A e B em solução já

foi determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) (WEIR e cols.,

1993; READ e cols., 1993; HARDMAN e cols., 1995). Esta, constitui-se de três

α-hélices em

formato de L (THOMAS e TRAVERS., 2001), exemplificada na figura 13.

Figura 13. Estrutura do segundo domínio HMG box da HMGB1 de rato. A estrutura (Protein

Data Bank, PDB: 1HME) foi resolvida por ressonância magnética nuclear. As três

α-hélices que

compreendem o domínio estão indicadas (

α1–α3). Adaptado de WEIR e cols., 1993.

Os domínios HMG boxes das HMGBs se ligam ao DNA sem especificidade à

seqüência de nucleotídeos e tem alta afinidade por estruturas distorcidas de DNA, como, por

exemplo, DNA super-enovelado e cruciforme (STROS & MUSELÍKOVA, 2000; AGRESTI

& BIANCHI, 2003)

. A função mais característica destes HMG boxes é a sua capacidade de

promover a dobra do DNA, uma estrutura transitória capaz de facilitar a ligação de outras

proteínas (BIANCHI & AGRESTI, 2005), possivelmente envolvidas na regulação da

transcrição gênica. Acredita-se que a energia necessária para esse processo seja proveniente

do intenso contato dos HMG boxes com o sulco menor do DNA (AGRESTI & BIANCHI,

2003).

Dentro da estrutura das HMGBs, a porção C-terminal, rica em resíduos ácidos é

considerada uma região reguladora na interação DNA-proteína, pois quando retirada em

experimentos

in vitro observa-se um favorecimento na ligação ao DNA (YAMAMOTO e

cols., 1997; YOSHIOKA e cols., 1999; LEE & THOMAS, 2000; SHEFLIN e cols., 1993;

STROS e cols., 1994). É também nesta porção da proteína onde geralmente estão localizadas

as maiores diferenças entre as HMGBs dos diversos organismos.

Já foram desvendados alguns mecanismos pelos quais as HMGBs de mamíferos

podem promover a transcrição de uma série de genes. Entre eles a interação direta da proteína

com nucleossomos

(Figura 14a), facilitando o acesso de complexos remodeladores de

cromatina; interagindo ou ainda facilitando a ligação de fatores de transcrição, como o TATA

box binding protein (TBP) (Figura 14b) e expondo regiões do DNA para que outras proteínas

regulatórias possam se ligar

(Figura 14c) (BIANCHI & AGRESTI, 2005).

Figura 14. Mecanismos de controle da expressão gênica por proteínas HMGB. a. HMGB1

interage com nucleossomas: o DNA é um sítio de ligação para HMGB1 e histona H1. A ligação das

duas exerce efeitos opostos: H1 bloqueia o deslizamento do nucleossoma e induz a compactação da

cromatina. Já a HMGB1 torna a cromatina mais fluida, facilitando o remodelamento do nucleossoma.

b. HMGB1 promove a dobra do DNA promotor aumentando a afinidade do fator de transcrição TBP

pelo seu motivo de ligação TATA box. O recrutamento de outros fatores de transcrição e da RNA

polimerase II se segue com uma maior eficiência. c. HMGB1 pode dobrar o DNA e com isso tornar

acessíveis seqüências do mesmo, permitindo a ligação de fatores de transcrição, estabilizando a

ligação deste fator no seu alvo, promovendo o recrutamento de outras proteínas ou uma combinação

destas ações. GR: receptor de glicocorticóide. TAFs: fatores associados a TBP. Adaptado de:

AGRESTI & BIANCHI, 2005.

As HMGBs também estão envolvidas no reconhecimento de estruturas danificadas de

DNA, na manutenção da integridade do genoma, no reparo do DNA, transposição (BIANCHI

& AGRESTI, 2005) e recombinação V(D)J (YOSHIDA e cols., 2000).

As HMGBs de mamíferos são expressas de maneira diferencial. Em adultos a HMGB1

é expressa em todas as células, com exceção de neurônios cerebrais enquanto a HMGB2 e

HMGB3 são apenas expressas nos testículos e órgãos linfóides. Embriões expressam altos

níveis das três proteínas (AGRESTI & BIANCHI, 2003).

Dentre as HMGBs, a HMGB1 destaca-se pela sua abundância, pois a grande maioria

das células de mamíferos contém aproximadamente um milhão de moléculas desta proteína, e

importância no desenvolvimento, já que camundongos knockout para o gene hmgb1 morrem

24 horas após o nascimento (AGRESTI & BIANCHI, 2003; CALOGERO e cols., 1999).

Além do seu papel clássico de ligação ao DNA, a HMGB1 foi descrita recentemente

como apresentando um papel importante como mediador da inflamação. Uma série de grupos

de pesquisadores demonstraram que a HMGB1 pode ser liberada, de forma ativa, a partir de

uma grande variedade de células, incluindo macrófagos (WANG e cols., 1999) e células

mononucleares de sangue periférico (ANDERSSON e cols., 2000). Além disso, sua liberação

pode ocorrer de forma passiva, por células danificadas ou sofrendo o processo de necrose

(SCAFFIDI e cols

., 2002). Uma vez liberada, a HMGB1 pode ligar-se a receptores de

superfície celular como o TLR2 e 4 e RAGE e mediar várias respostas celulares tais quais

movimentos celulares quimiotáticos e liberação de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o

fator de necrose tumoral-alfa (TNF-

α) e a interleucina 1 (IL-1) (ANDERSSON e cols., 2000;

STERN e cols., 2002; YU e cols., 2006; PARK e cols., 2004; DEGRYSE e cols., 2001;

RAUVALA & ROUHIAINEN, 2007).

A HMGB1 de

Schistosoma mansoni (SmHMGB1), recentemente caracterizada em

nosso laboratório (DE OLIVEIRA e cols., 2006), destaca-se entre as HMGBs de outros

organismos por apresentar uma região C-terminal ácida curta, com apenas 5 resíduos de

aminoácidos ácidos. Em mamíferos, esta região é constituída de 30 resíduos de aminoácidos

ácidos (glutamato e aspartato). Apesar desta diferença, foi demonstrado em nosso laboratório

que a proteína SmHMGB1 é capaz de reconhecer e ligar-se preferencialmente ao DNA no

estado superenovelado e que a mesma promove o super-enovelamento de DNA tratado com

Topoisomerase I e a dobra de fragmentos de DNA dupla fita de 123 e 66 pares de bases. O

gene da SmHMGB1 é organizado na forma de 3 éxons e 2 íntrons, enquanto o gene humano

apresenta 4 éxons e 3 íntrons. Além disso, o alinhamento da SmHMGB1 com suas ortólogas,

demonstrou um alto grau de similaridade na porção que compreende os dois domínios HMG

box. (Figura 15)

Também foi demonstrada a presença de uma única cópia do gene hmgb1 no

genoma do S. mansoni, através da técnica de Southern blot, e que a SmHMGB1 é

constitutivamente expressa em vermes adultos de ambos os sexos, através da técnica de

Northern blot.

Figura 15. Alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas HMGB. hHMGB1:

HMGB1 de Homo sapiens (n

de acesso no GenBank NP_002119); SmHMGB1 e SmHMGB2:

HMGB1 e HMGB2 de S. mansoni (n

de acesso no GenBank: DQ005529 e BN000821,

respectivamente) e SmHMGB3 (não publicado). A caixa vermelha, azul e verde representa,

respectivamente, os boxes A e B e a cauda ácida. As porcentagens de similaridade entre as seqüências

alinhadas estão realçadas em preto (100%), cinza escuro (80%) e cinza claro (60%). Alinhamento

realizado no programa Omiga 2.0.

1.5 Modificações pós-traducionais das proteínas do tipo High Mobility Group (HMGs)

As modificações pós-traducionais de uma proteína determinam e/ou modulam a sua

estabilidade, conformação tridimensional, distribuição, localização, meia-vida e interação

com o DNA e outras proteínas. Assim como as histonas, as HMGs tem as suas atividades

reguladas através de modificações pós-traducionais, incluindo a acetilação (BONALDI e

cols., 2003), metilação (ITO e cols., 2007), fosforilação (EINCK & BUSTIN, 1985; VAN

HOLDE, 1989; WISNIEWSKI e cols., 1994; YOUN & SHIN., 2006; SAKAMOTO e cols.,

2001) e ADP-ribosilação (DITSWORTH e cols., 2007). Estes tipos de modificações são

dinâmicas e rapidamente responsivas a eventos de sinalização intra e extracelulares (ZHANG

& WANG, 2008).

1.5.1 Proteínas HMGB

Embora as proteínas HMGBs não tenham as suas modificações pós-traducionais tão

bem estudadas como as outras proteínas da família das HMGs, elas já foram descritas como

substrato para uma série de modificações pós-traducionais como acetilação (BONALDI e

cols., 2003), metilação (ITO e cols., 2007), ADP-ribosilação (DITSWORTH e cols., 2007),

glicosilação e fosforilação (EINCK & BUSTIN, 1985; VAN HOLDE, 1989; WISNIEWSKI e

cols., 1994; YOUN e SHIN., 2006; SAKAMOTO e cols., 2001)

(Figura 16). Algumas destas

modificações já foram relacionadas a alterações nas propriedades funcionais (ALAMI-

OUAHABI e cols., 1996; WISNIEWSKI e cols., 1994, 1999) e distribuição núcleo-

citoplasma (BONALDI e cols

., 2003; WISNIEWSKI e cols., 1994; YOUN & SHIN, 2006) da

proteína, mas muitas delas ainda carecem de investigação mais detalhada. Entre as enzimas

envolvidas nestas modificações estão a proteína cinase C, a histona acetil transferase CBP

(PASHEVA e cols

., 2004) e, com bastante freqüência, a CK2 (WISNIEWSKI e cols. 1994;

WISNIEWSKI e cols

., 1999; STEMMER e cols., 2002). Entre os trabalhos mais recentes,

podemos destacar o artigo de Youn e Shin, 2006, onde foi verificado que a HMGB1 é

fosforilada em macrófagos murinos e monócitos humanos após o tratamento das células com

TNF-

α ou ácido okadáico (um inibidor de fosfatase). Essa fosforilação resultava na saída da

proteína do núcleo para o citoplasma e eventualmente na sua liberação. Proteínas de

importação do tipo KAP

α1 foram descritas como participantes do processo, de forma que a

fosforilação da HMGB1 parece enfraquecer a sua ligação com KAP

α1. Embora os sítios de

fosforilação não tenham sido localizados neste estudo, os possíveis sítios foram propostos

como sendo as serinas 34, 38, 41, 45, 52 e 180, localizadas proximamente nas duas regiões

sinais para localização nuclear (YOUN & SHIN, 2006). Somente quando os sítios exatos de

fosforilação, assim como as cinases envolvidas forem identificados será possível uma melhor

compreensão do controle exercido pela fosforilação na distribuição núcleo-citoplasma da

proteína.

Figura 16. Estrutura e sítios de algumas modificações pós-traducionais da proteína HMGB1

humana a.

Diagrama ilustrando a estrutura dos domínios da HMGB1 humana. Os dois domínio de

ligação ao DNA estão representados por caixas pretas (Box A e Box B) e a região C-terminal ácida

está representada como uma caixa pontilhada.

b. Seqüência da HMGB1 humana evidenciando os

resíduos modificados pós-traducionalmente (em negrito). A fosforilação, metilação e acetilação estão

representadas como círculos sombreados, retângulos e círculos não sombreados, respectivamente. A

primeira metionina é removida pós-traducionalmente e desta forma não foi incluída na seqüência.

Adaptado de: ZHANG & WANG, 2008.

A fosforilação mediada pela CK2 na HMGB1 de outros organismos mostrou-se capaz

de regular as propriedades de ligação ao DNA das proteínas. Entre as poucas descritas na

literatura está o efeito da fosforilação por CK2 na HMGB de milho (STEMMER e cols.,

2003). Neste artigo, foi demonstrado que HMGB1, 2 e 3 eram fosforiladas

in vivo e in vitro

pela CK2 na região C-terminal ácida e que esta fosforilação aumentava a estabilidade das

proteínas frente a alterações de temperatura. Foi verificado também, por dicroísmo circular,

que as proteínas fosforiladas apresentavam uma elevação em suas temperaturas de

desnaturação, em especial a HMGB1. Ainda no mesmo artigo e comparando as formas não

fosforiladas e fosforiladas

in vitro pela CK2, o autor descreve uma redução na afinidade de

ligação a um fragmento linear de DNA de 98 bp, mas não de minicírculos de DNA da

HMGB1 fosforilada.

Em outro trabalho, desta vez utilizando como modelo a HMGB1 do inseto

Chironomus (WISNIEWSKI e cols., 1999), verificou-se mais uma vez que a proteína era um

substrato para a ação de CK2 e que esta fosforilação estabilizava a proteína na presença de

algumas proteases. Também foi verificado que a proteína nativa, quando submetida a um

tratamento com fosfatase, aumenta a sua afinidade de ligação a DNA do tipo

four way

junction

. No entanto, embora existam indicativos de que a CK2 esteja fosforilando a proteína

do inseto endogenamente, não se pode afirmar que os grupamentos fosfatos que foram

retirados no tratamento com fosfatase eram exclusivamente provenientes da ação da proteína

CK2, e conseqüentemente que o efeito observado relaciona-se diretamente com a fosforilação

por CK2. Ainda utilizando o inseto

Chironomus como modelo, WISNIEWSKI e

colaboradores, em 1994, demonstraram que proteínas HMGB do inseto eram intensamente

fosforiladas

in vivo, e que a presença de inibidores específicos da proteína cinase C (PKC)

reduzia este fenômeno. Isto sugeriu para os autores que as proteínas estariam sendo

fosforiladas pela própria PKC ou por uma cinase ativada pela mesma. Estudos anteriores já

haviam sugerido que a proteína HMGB2 seria um substrato para ação da PKC

(RAMACHANDRAN e cols., 1984), mas apenas no trabalho de WISNIEWSKI e

colaboradores foram mapeados os sítios de fosforilação pela PKC, as serinas 81 e 98 da

HMB1 e serina 96 na HMGB2. Também foi demonstrado que essa fosforilação reduzia a

ligação ao DNA das proteínas e a sua translocação para o núcleo.

Ito e colaboradores, 2007, em uma das poucas menções a metilação de HMGBs,

descreveram a metilação de HMGB1 em neutrófilos. O sítio de metilação foi determinado

como sendo a lisina 42, e esta modificação levou a alterações conformacionais na proteína.

Outras análises, ainda no mesmo trabalho, demonstraram que a grande parte da proteína

metilada residia no citoplasma destes neutrófilos, enquanto a forma não metilada permanecia

no núcleo. O que os autores discutem é que a metilação poderia estar enfraquecendo a

capacidade de ligação ao DNA da proteína, facilitando a sua saída do núcleo. Um mecanismo

parecido com este é proposto para a saída da HMGB1 do núcleo para o citoplasma de células

tratadas com inibidores de histonas desacetilases (BONALDI e cols., 2003).

Tendo em vista a série de eventos de diferenciação ocorridos no curso do complexo

ciclo de vida do

S. mansoni e o envolvimento da HMGB1, já descrito em uma série de

processos regulatórios da transcrição gênica, nos interessamos por investigar a fosforilação da

proteína HMGB1 do parasita e as possíveis implicações na atividade da mesma.

2 OBJETIVOS

Considerando o papel importante da proteína HMGB1 na modulação da conformação

do DNA e conseqüentemente na regulação da expressão gênica, o presente trabalho tem por

objetivo geral caracterizar a fosforilação da HMGB1 de

S. mansoni pela CK2 e as suas

possíveis implicações na atividade da proteína.

2.1 Objetivos Específicos

 Testar a capacidade de uma CK2 heteróloga de fosforilar a proteína SmHMGB1 in

vitro

;

 Mapear o(s) sítio(s) de fosforilação da CK2 na proteína SmHMGB1 recombinante;

 Através de ensaios de super-enovelamento de DNA e de circularização de DNA

mediado por T4 DNA ligase, verificar se a fosforilação da proteína

SmHMGB1 é

capaz de modular sua atividade;

 Investigar a atividade de proteínas cinases presentes no extrato total de vermes adultos

S. mansoni, utilizando como substrato a SmHMGB1 recombinante.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Expressão e purificação das proteínas recombinantes

As células transformadas (BL21-DE3 – Novagen) com o plasmídio pQE80L

(QIAGEN) contendo o cDNA que codifica as construções da proteína

SmHMGB1 (Figura

17)

foram inoculadas e crescidas em meio LB contendo ampicilina 100 µg/mL a 37

C até que

atingissem a D.O.

600nm

de 0,6. Em seguida, adicionou-se IPTG 0,5 mM e manteve-se a

cultura a 20

C por 5 horas. A suspensão de células foi centrifugada a 7700 x g por 10 minutos

a 4

C. O precipitado de células resultante foi ressuspenso em tampão de lise (50 mM

NaH

, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) e sonicado (5 vezes, 20s cada, com

intervalos de 20s em gelo). Seguiu-se uma nova centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos a

4ºC. O sobrenadante foi coletado, filtrado através de uma membrana de 0.45 µm (MFS) e

purificado em uma coluna de Níquel (Pro Bond – Invitrogen) pré-equilibrada com tampão de

lavagem (50 mM NaH

, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0). As proteínas foram

eluídas em tampão de eluição (50 mM NaH

, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0),

dialisadas em tampão de diálise (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA e 0,5

mM DTT), dosadas e armazenadas a -70

Figura 17. Diagrama esquemático das construções da proteína recombinante SmHMGB1

utilizada nos ensaios

. Os números indicam a posição dos aminoácidos. Full length (FL): SmHMGB1

íntegra;

ΔC: SmHMGB1 sem os 7 aminoácidos da porção C-terminal; Box A: Domínio de ligação ao

DNA A e Box B: Domínio de ligação ao DNA B.

SmHMGB1

Box A (1-83aa)

Box B (84-169aa)

161

170

176

ΔC (1-169aa)

Full length (1-176aa)

3.2 Dosagem de proteínas

A concentração das proteínas recombinantes foi determinada segundo método de

Bradford (BRADFORD, 1976), com reagente comercial (Bio-Rad Protein Assay). A curva

padrão foi construída utilizando-se lisozima 0,1 mg/mL.

3.3 Análises computacionais

Para fazer as predições dos resíduos de aminoácidos que poderiam ser fosforilados foi

utilizado o programa NetPhos 2.0 server (Disponível em:

<http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

>). Este programa prediz sítios de fosforilação nos

resíduos de serina, treonina e tirosina de proteínas eucarióticas. Em seguida foi utilizado o

programa NetPhosK 1.0 Server (Disponível em:

<http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/

>), que além do resíduo de aminoácido, sugere

proteínas cinases possivelmente envolvidas na modificação indicada. O programa fornece um

score entre 0 e 1, indicando uma maior ou menor probabilidade da modificação ocorrer

devido a uma maior ou menor semelhança ao sítio consenso de reconhecimento da enzima.

3.4 Manutenção do Ciclo de Vida do S. mansoni e Obtenção de Vermes Adultos por

perfusão

O ciclo de vida do parasita é mantido em nosso laboratório através de infecção dos

hospedeiros intermediários, o gastrópode

Biomphalaria glabrata, e dos hospedeiros

definitivos, camundongos da estirpe BALB/c. As cercárias liberadas, transformadas em

esquistossômulos através de estímulos mecânicos, são injetadas subcutaneamente nos

roedores. Após 45 dias, os vermes adultos são recuperados pela perfusão do sistema porta

hepático das cobaias. Os ovos são extraídos das fezes e do fígado dos roedores e expostos a

condições ideais de luminosidade e osmolaridade para a liberação dos miracídios,

possibilitando, dessa forma, a infecção dos caramujos e o conseqüente re-início do ciclo.

3.5 Infecções Unissexuais de S. mansoni

Infecções unissexuais são aquelas em que o hospedeiro definitivo possui uma

população de parasitas do mesmo sexo. Como o sexo do

S. mansoni é determinado de forma

heterogamética, os parasitas, ao eclodirem dos ovos como miracídios, já possuem sexo

definido. Desta forma, os caramujos são infectados com um único miracídio e este, ao

reproduzir-se assexuadamente, gera uma população clonal de cercárias. Estas cercárias, todas

do mesmo sexo, são utilizadas na infecção dos hamsters ou camundongos. Após o período de

desenvolvimento dos parasitas, os mesmos são recuperados através da perfusão do sistema

porta-hepático dos roedores para a determinação do sexo.

3.6 Extração de RNA e síntese de cDNA

O RNA total de machos e fêmeas de S. mansoni foi preparado de acordo com o

protocolo descrito pelo sistema de purificação de RNA por Trizol (Invitrogen). A

concentração de RNA obtida foi determinada através de leitura em espectrofotômetro

(Ultrospec 300, Pharmacia Biotech). O cDNA foi sintetizado a partir de 1µg de RNA total

obtido, segundo protocolo do fabricante do kit SuperScript

First-Strand Synthesis for RT-

PCR (Invitrogen).

3.7 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Com o objetivo de mapear o resíduo de aminoácido modificado pela CK2 e baseando-

se na análise computacional citada na seção 3.3, foram desenhados oligonucleotídeos

específicos com mutações que geravam uma proteína com uma substituição, do aminoácido

serina para alanina. Esta alteração ocorria nos resíduos de serina 172 ou 174 ou ainda nestes

dois resíduos

(Tabela 3).

Tabela 3. Seqüência dos oligonucleotídeos com mutações sítio dirigidas. Em negrito estão

indicadas as mutações e sublinhadas as seqüências de clivagem das enzimas de restrição BamHI e

HindIII, respectivamente. FL S172A:

SmHMGB1 com uma substituição da serina 172 por uma

alanina; FL S174A:

SmHMGB1 com uma substituição da serina 174 por uma alanina e FL

S174/S172A:

SmHMGB1 com duas substituições nas serina 172 e 174 por duas alaninas.

Oligonucleotídeos

mutados

Seqüência de nucleotídeos

Proteína

gerada

SmHMGB1 Nterm 5´ 5´ GGATCCATGGCTGAAGACAAGGGTAAG 3´

FL S172A

SmHMGB1S172A 5´AAGCTTCTAATCGTCAGACTCTGCATCTTC3´

SmHMGB1 Nterm 5´ 5´ GGATCCATGGCTGAAGACAAGGGTAAG 3´

FL S174A

SmHMGB1S174A 5´AAGCTTCTAATCGTCTGCCTCTGAATCTTC3´

SmHMGB1 Nterm 5´ 5´ GGATCCATGGCTGAAGACAAGGGTAAG 3´

S172A/S174A

SmHMGB1S172A/S174A 3´ 5´AAGCTTCTAATCGTCTGCCTCTGCATCTTC3´

Um microlitro da reação de síntese de cDNA foi utilizado como molde para a PCR.

Cada reação continha também: tampão da Taq Polimerase 1X (Phoneutria), deoxi-

ribonucleosídeos trifosfato (dNTPs), 200 µM (Invitrogen), oligonucleotídeos 0,25 µM cada e

Taq Polimerase 1U (Phoneutria) em 20 µL de reação. O programa de ciclagem da PCR desta

reação foi de 5 minutos a 94

C; 35 ciclos de: 1 minuto a 94

C, hibridização por 1 minuto a

C, extensão por 1 minuto a 72

C e extensão final de 15 minutos a 72

C. Após o término do

programa, as reações foram mantidas a 4

C até serem analisadas em gel de agarose 1%.

Para que fossem gerados os fragmentos de 66 e 123 bp posteriormente marcados

radioativamente e utilizados no ensaio de circularização de DNA mediado por T4 ligase

realizou-se uma reação de PCR de forma a gerar os seguintes fragmentos (fita sense): 66 bp -

5´ GATCCGAAGAAAAAGCTGAAGATGATGTAAAGGAAAATACGAATGGGAAT

TCATCGGTCGCATCGGGATC 3´ e 123 bp – 5´ GATCCTCCAGTCAAAAGGTAACC

AACGGAACGTCTGAGAATGGAAACAGTTCCGACCAACCAGAAGAAAAAGCTGAA

GATGATGTAAAGGAAAATACGAATGGGAATTCATCGGTCGCATCGGGATC 3´. Os

oligonucleotídeos utilizados foram: (1) Sense 66 bp – 5´ CGCGGATCCGAAGAAAA

AGCTGAAGATG 3´, (2) Sense 123 bp – 5´ CGCGGATCCTCCAGTCAAAAGGTAACCA

AC 3´ e (3) Antisense 66 bp e 123 bp – 5´ CGCGGATCCCGATGCGACCGATGAATTC 3´.

As condições de reação foram as mesmas descritas acima, com as seguintes modificações: O

programa de ciclagem da PCR desta reação foi de 5 minutos a 94

C; 35 ciclos de: 20

segundos a 94

C, hibridização por 20 segundos a 55

C, extensão por 20 segundos a 72

C e

extensão final de 5 minutos a 72

3.8 Marcação Radioativa de Sondas de DNA

Os fragmentos de 123 e 66 pb foram gerados a partir de reações de PCR descritas na

seção 3.7, digeridos com BamHI (Promega) e tratados com fosfatase alcalina (New England

Biolabs) segundo manuais dos fabricantes. A marcação radioativa dos fragmentos de DNA de

66 e 123 pb foi realizada utilizando-se a enzima T4 polinucleotídeo cinase (Promega) e 30

μCi de [γ-

P]-dATP (Applied Biosystems), segundo instruções do manual do fabricante.

3.9 Preparação de extratos totais de vermes adultos de S. mansoni

50 machos e 50 fêmeas de vermes adultos recém perfundidos e lavados em NaCl 0.88

% foram macerados em um

potter na presença do seguinte tampão (PBS 1X, 0,5 mM

Benzamidina, 1 mM PMSF, 3 mM NaF, 0,1 mM Vanadato de sódio e 1 µM Ácido Okadáico).

O macerado resultante foi centifugado a 16.000 x g a 4º C por 20 minutos. O sobrenadante foi

coletado, dosado como descrito na seção 3.2 e armazenado a -70º C.

3.10 Ensaio de fosforilação in vitro da SmHMGB1 utilizando CK2

A reação de fosforilação da proteína SmHMGB1 recombinante, assim como de suas

formas truncadas, foi realizada em tampão de reação contendo 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 200

mM NaCl, 10 mM MgCl

, 1 µCi [γ

P]ATP (Applied Biosystems) e 0,1 mM ATP em um

volume final de 10 µL. Foram utilizados no experimento 1 µg de proteína recombinante. As

reações foram iniciadas com a adição de 1 U de CK2 (Promega) seguida por uma incubação a

C. As reações foram encerradas com a adição de tampão de amostra de SDS-PAGE (50

mM Tris-

HCl pH 6,8, 2% SDS, 0,1% azul de bromofenol, 10 % glicerol e 100 mM de β-

mercaptoetanol ou DTT). As reações foram então fervidas por 5 minutos e resolvidas por

eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12-15%. Após o término da

corrida, as proteínas foram coradas com Coomassie Blue R-250 (0,25% em 45% Álcool

Metílico e 10% ácido Acético), descorado em solução descorante (50% Álcool Metílico, 10%

ácido Acético), desidratado e exposto em uma tela do tipo storage phosphor screen

(Molecular Dynamics) ou filmes de Raios-x (Kodak). A imagem foi obtida utilizando o

“Storm 860 Gel and Blot Image System” (GE Healthcare) ou através de sistema de revelação

fotográfica (GBX – Kodak). A Heparina foi utilizada como um controle de especificidade na

concentração de 30 µg/mL.

3.11 Ensaio de fosforilação da SmHMGB1 utilizando extrato total de vermes adultos de

S. mansoni

A reação de fosforilação da proteína SmHMGB1 recombinante, assim como de suas

formas truncadas, foi realizada utilizando-se 4 µg de extrato total e segundo as mesmas

condições descritas na seção 3.10. O inibidor específico de CK2, TBB, foi utilizado na

concentração final de 2Ki/µL.

3.12 Ensaio de super-enovelamento do DNA

As proteínas utilizadas neste experimento foram previamente submetidas a uma reação

de fosforilação como descrito nas seções 3.10 e 3.11 e expostas em filmes de raios-x como

controle de fosforilação. Em seguida as proteínas foram purificadas em colunas Microcon 10

(Amicon), segundo o manual do fabricante. As amostras foram então dosadas pelo método de

Bradford e 1µg da proteína

SmHMGB1 foi utilizado no ensaio de super-enovelamento.

Primeiramente incubou-se um plasmídio super-enovelado (pTZ19R - Fermentas)

purificado na presença de Topoisomerase I (Topo I) (Promega). Cada reação continha:

tampão de reação (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH7,5, 20% glicerol, 1 mM DTT e 1 mM

EDTA), plasmídio pTZ19R (0,6µg) e Topo I (1U). A mistura foi deixada a 37ºC por 90

minutos. Ao DNA relaxado foi então adicionado uma nova alíquota de Topo I (1U), tampão

de reação, 20 mM DTT, 20% glicerol, assim como a proteína

SmHMGB1 (0,5 -1 g). A

mistura foi então incubada a 37ºC por 60 minutos. As reações foram terminadas com a adição

de 460µL de uma solução contendo 1% SDS e 1 M NaCl, 700 µL de clorofórmio/álcool

isoamílico (24:1) e 0,02% poliacrilamida linear, seguida de uma centrifugação a 16.000 x g,

C por 10 minutos. Ao DNA obtido da fase aquosa adicionou-se 2,5 volumes de Etanol

100% gelado. As amostras foram então colocadas em nitrogênio líquido por 1 minuto e

centrifugadas por 30 minutos a 16.000 x g, 4ºC. Ao precipitado obtido foi adicionado 1 mL de

etanol 70%, centrifugado como acima, seco à temperatura ambiente e ressuspendido em 25

L TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA). As reações foram então analisadas por

eletroforese em gel de agarose 1% em TBE 1X (para 1L:10,8 g de Tris, 11 g de Ácido Bórico

e 4mL EDTA 0,5 M pH 8) por 17 h a 3V/cm. O gel foi então corado com Brometo de Etídio

0,5 mg/mL (Merck), descorado com água e fotografado através de um filtro vermelho em um

transiluminador com luz ultravioleta (254nm) no sistema ImaGo (L&B Systems).

3.13 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase

O ensaio de circularização foi baseado em protocolos prévios de Štros, 1998 e 2001.

Fragmentos de DNA de 123 pb e 66 pb (~1 nM) com extremidades coesivas foram pré-

incubados em gelo por 20 minutos com 20 ng da proteína recombinante em tampão de T4

ligase 1 X (30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl

2, 10 mM DTT e 0,5 mM ATP; Promega)

em um volume final de 20 μl. O DNA foi incubado na presença de 0.6 U de T4 ligase

(Promega) a 30° C por 20 minutos e a reação, encerrada, através da incubação das amostras a

65° C por 15 minutos. Como controle, algumas das reações foram incubadas na presença de

50 U de exonuclease III (Promega) a 37° C por 30 minutos. As reações foram terminadas com

a adição de 460µL de uma solução contendo 1% SDS e 1 M NaCl, 700 µL de

clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e 0,02% poliacrilamida linear seguida de uma

centrifugação a 16.000 x g, 4

C por 10 minutos. Ao DNA obtido da fase aquosa adicionou-se

2,5 volumes de Etanol 100% gelado. As amostras foram então deixadas a -20ºC por 2 horas e

centrifugadas por 30 minutos a 16.000 x g, 4ºC. Ao precipitado obtido foi adicionado 1 mL de

etanol 70%, centrifugado como acima, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 15

L TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA). A amostra foi fracionada em gel de

poliacrilamida não desnaturante a 6% (DNA 123 pb) e a 8% (DNA 66 pb) em 0.5 X TBE a

200 V por 2–3 h a 4° C. Depois de fracionado, o gel foi desidratado e visualizado através do

“Storm 860 Gel and Blot Image System” (GE Healthcare) ou filmes de raios-x (Kodak).

4 RESULTADOS

4.1 Análises Computacionais

Como uma abordagem inicial do estudo da fosforilação da SmHMGB1, realizamos

uma análise computacional da seqüência primária da proteína nos programas NetPhos 2.0

server (Disponível em: <http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

>) e NetPhosK 1.0 Server

(Disponível em: <http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/

>). O que se pôde verificar foi

que a CK2 e a proteína cinase C (PKC) apresentavam o maior número de sítios putativos, e os

mais altos

scores, o que nos indicava uma maior similaridades dos sítios de ação já descritos

na literatura dessas enzimas e dos sítios detectados na

SmHMGB1.

Todos os ensaios posteriores foram feitos com enfoque na CK2, comumente citada na

literatura como envolvida na fosforilação das proteínas HMG.

Method: NetPhosK without ESS filtering:

Query: SmHMGB1

Site Kinase Score

---------------------

S-21

PKC 0.84

T-34

PKC 0.69

S-52

PKC 0.83

S-86

PKC 0.84

S-101 PKA 0.57

S-145 PKA 0.64

Y-154 EGFR 0.61

Y-154 INSR 0.54

S-167

CKII 0.58

S-167 PKA 0.59

S-167 PKG 0.60

T-169

CKII 0.59

S-172

CKII 0.60

S-174

CKII 0.71

---------------------

Figura 18. Análise da SmHMGB1 no programa NetPhosK 1.0 Server. Em negrito estão destacadas

a proteína cinase CK2 e a proteína cinase C.

4.2 Expressão das construções da proteína SmHMGB1 recombinante

As proteínas recombinantes expressas em um sistema heterólogo foram dosadas pelo

método de Bradford (BRADFORD, 1976) e resolvidas por eletroforese em gel desnaturante

de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE), de acordo com a descrição na seção Material e

Métodos, para que pudéssemos visualizar o seu grau de pureza.

Como pode ser observado na figura 19, as proteínas apresentaram um alto grau de

pureza, sem o aparecimento de bandas inespecíficas. O tamanho teórico é de 20,6 kDa para a

proteína inteira (FL), 19,8 kDa para a proteína sem a cauda ácida (ΔC), 9,7 kDa para o

domínio A (Box A) da proteína e 10,1 kDa para o domínio B (Box B) da proteína

(<http://www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html>).

Figura 19. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida das construções da SmHMGB1. 1

µg das proteínas recombinantes expressas resolvidas por eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) e coradas com Coomassie Blue. P: padrão de baixa massa

molecular; SmHMGB1: proteína inteira, SmHMGB1ΔC: SmHMGB1 sem a cauda ácida, Box A:

Domínio A e Box B: Domínio B.

4.3 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pela CK2

Com o objetivo de verificar se a SmHMGB1 seria um substrato para ação da enzima

CK2, foram realizados ensaios de fosforilação in vitro utilizando fosfato radioativo

(γ

P[ATP]). O primeiro ensaio realizado tratou-se de uma cinética de fosforilação com a

proteína inteira variando-se o tempo de incubação de 0 a 120 minutos.

Como pode ser visualizado na figura 20, através da incorporação do fosfato radioativo,

somos capazes de afirmar que a SmHMGB1 é fosforilada in vitro pela CK2. Este experimento

também nos permitiu definir o tempo de reação ideal, correspondente a 60 minutos. Isto

porque em tempos superiores de incubação não foi possível observar-se um acréscimo

significativo na intensidade da banda radioativa. Desta forma, todos os experimentos

posteriores, com exceção aos experimentos de atividade (incubação de 180 min), foram

realizados com um tempo de incubação igual a 60 minutos.

A heparina, um inibidor específico da CK2, foi utilizada como um controle da

especificidade da reação. Como pode ser observado na canaleta 6 da figura 24, quando

adicionamos heparina na reação de fosforilação, a enzima perde a capacidade de fosforilar a

proteína, e conseqüentemente não ocorre incorporação de fosfato radioativo, não aparecendo a

banda radioativa. Com isto podemos afirmar que a fosforilação da SmHMGB1 está sendo

mediada especificamente por ação da CK2.

Figura 20. Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pela enzima CK2. As canaletas 1 a 6

representam 1µg da proteína SmHMGB1 fracionada por eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) e corada por Coomassie Blue (painel superior), assim como a sua

autoradiografia correspondente (painel inferior).

4.4 Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pela CK2

Após verificarmos que a SmHMGB1 era de fato um substrato para ação da CK2 in

vitro, realizamos um ensaio de fosforilação com as construções contendo deleções da

proteína. O objetivo era mapear qual domínio continha os resíduos que estavam sendo

modificados.

Como pode ser observado na figura 21, através da ausência de sinal radioativo,

nenhuma das construções atuou como substrato para a CK2 in vitro. Isto nos sugeriu que os

resíduos que estariam sendo modificados por ação da CK2 deveriam estar presentes na porção

C-terminal da proteína (resíduos 170-176), ausente nas construções onde não foi constatada a

fosforilação; (FL sem cauda ácida (1-169aa), Domínio A (1-83aa) e Domínio B (84-169aa)).

Esta suposição está de acordo com a análise computacional realizada, onde dois dos quatro

resíduos propostos se localizavam nesta porção C-terminal da proteína (S172 e S174) (Figura

21). Sendo assim, estes dois resíduos foram alvo de mutações sítio dirigidas.

Figura 21. Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pela enzima CK2. As canaletas 1

a 4 representam respectivamente 1µg das proteínas, inteira (1-176aa), sem a cauda ácida (1-169aa),

Domínio A (1-83aa) e Domínio B (84-169aa) resolvidas por eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) corado por Coomassie Blue (painel superior) e a sua autoradiografia

correspondente (painel inferior).

4.5 Proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas (S-A)

Após verificarmos que apenas a proteína SmHMGB1 inteira era um substrato para a

ação da CK2

in vitro, foram geradas proteínas com mutações sítio dirigidas em dois dos

quatro sítios propostos para ação da CK2 surgidos durante a análise computacional (S172 e

S174). Estes resíduos estão localizados na região C-terminal da proteína (aa 170-176) e foram

substituídos por resíduos de alanina, de maneira isolada, FL S172A e FL S174A ou em

conjunto, FL S174A/S172A

(Figura 22). De posse destas proteínas mutantes fomos capazes

de mapear que resíduos estavam de fato sendo modificados.

FL (162) KAGKKSKTEDSESDD (176)

FL S172A

(162) KAGKKSKTEDAESDD (176)

FL S174A

(162) KAGKKSKTEDSEADD (176)

FL S172A/S174A

(162) KAGKKSKTEDAEADD (176)

Figura 22. Seqüência dos aminoácidos finais da proteína SmHMGB1. Os asteriscos vermelhos

indicam o aminoácido que foi substituído. FL:

SmHMGB1 inteira; FL S172A: SmHMGB1 com

substituição da serina 172 por uma alanina; FL S174A:

SmHMGB1 com substituição da serina 174 por

uma alanina e FL S172A/S174A:

SmHMGB1 com substituições das serinas 172 e 174 por duas

alaninas.

4.6 Expressão da proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas

As proteínas com mutações sítio-dirigidas expressas em um sistema heterólogo foram

dosadas pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976) e resolvidas por eletroforese em gel

desnaturante de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) de acordo com a descrição em métodos

para que pudéssemos visualizar o seu grau de pureza.

Como pode ser visualizado na figura 23, as proteínas apresentaram um bom grau de

pureza, sem o aparecimento de bandas inespecíficas.

Figura 23. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida da SmHMGB1 com mutações

sítio dirigidas. 1µg das proteínas recombinantes expressas foram resolvidas em eletroforese em gel

desnaturante de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) e coradas com Coomassie Blue. P: padrão de massa

molecular. 1. FL S172A: SmHMGB1 com substituição da serina 172 por uma alanina; 2. FL S174A:

SmHMGB1 com substituição da serina 174 por uma alanina e 3. FL S172A/S174A: SmHMGB1 com

substituições nas serinas 172 e 174 por duas alaninas.

4.7 Fosforilação da proteína SmHMGB1 com mutações sítio dirigidas (S-A)

Com o objetivo de determinar qual ou quais aminoácidos estariam sendo modificados

por ação da CK2, realizou-se o ensaio de fosforilação utilizando as proteínas com mutações

sítio dirigidas nos sítios propostos para ação da CK2. A figura 24 demonstra, mais uma vez,

que a SmHMGB1 é um substrato para ação da CK2 e que a SmHMGB1 sem a cauda ácida

não é capaz de ser fosforilada. E ainda, que os resíduos de serina nas posições 172 e 174 eram

os resíduos que, de fato, estavam sendo modificados, pela adição de um grupamento fosfato,

por ação da CK2. Isto porque quando os resíduos eram mutados isoladamente pela

substituição do resíduo de serina por alanina na posição 172 ou 174 da proteína, ainda

observava-se a fosforilação, sendo esta inviabilizada quando as mutações ocorriam em

conjunto nas duas posições citadas. Esses resultados permitem afirmar que a proteína

SmHMGB1 é di-fosforilada pela CK2 in vitro. Além disso, também observamos uma menor

intensidade na banda radioativa correspondente ao mutante S172A em dois experimentos

independentes. O que podemos especular é que a troca da serina 172 por uma alanina reduziu

a afinidade da CK2 pelo sítio de fosforilação localizado na serina 174.

Figura 24. Fosforilação das proteínas recombinantes da SmHMGB1 com mutações sítio

dirigidas pela enzima CK2. As canaletas 1 a 5 representam respectivamente 1µg das proteínas. FL:

SmHMGB1 inteira (1-176aa); ∆C: SmHMGB1 sem a cauda ácida (1-169aa);. FL S174A: SmHMGB1

com substituição da serina 174 por uma alanina; FL S172A: SmHMGB1 com substituição da serina

172 por uma alanina e FL S174A/S172A: SmHMGB1 com substituições nas serinas 174 e 172 por

duas alaninas. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE) corado por

Coomassie Blue (painel superior) e a sua autoradiografia correspondente (painel inferior).

4.8 Ensaio de super-enovelamento do DNA com a SmHMGB1 fosforilada pela CK2

Neste ensaio analisamos a capacidade da SmHMGB1 de induzir o super-enovelamento

do DNA. O ensaio constitui-se basicamente de duas etapas. Na primeira etapa, um plasmídio

super-enovelado purificado é colocado na presença de Topoisomerase I (Topo I), uma

proteína capaz de desfazer as torções do plasmídio, tornando o mesmo relaxado. Na segunda

etapa do experimento, o plasmídio relaxado é colocado na presença da SmHMGB1, ainda na

presença de Topo I, de forma que a SmHMGB1 e a Topo I irão atuar sobre o DNA, a primeira

super-enovelando e a segunda relaxando. Ao final do ensaio o que se obtém são formas

intermediárias de super-enovelamento do DNA, que quando separadas em um gel de agarose

corado com brometo de etídio, apresentam um padrão de bandeamento seqüencial,

caracterizando a promoção do super-enovelamento pela proteína estudada. Já havia sido

descrito em nosso trabalho (DE OLIVEIRA e cols., 2006) que a SmHMGB1 apresenta esta

propriedade. Decidiu-se então verificar se a fosforilação da

SmHMGB1 seria capaz de

modular esta atividade. A figura 25a representa a reação de fosforilação das proteínas

utilizadas no experimento de super-enovelamento (controle positivo de fosforilação). A figura

25 b representa um desenho esquemático do que foi descrito acima. Na figura 25c observamos

o resultado do experimento de super-enovelamento (gel representativo de três experimentos

independentes). Na canaleta 1 verifica-se o plasmídio super-enovelado purificado e na

canaleta 2 o plasmídio após a primeira etapa do experimento, na forma relaxada. As canaletas

seguintes correspondem as diferentes situações estudadas: 3-5:

SmHMGB1 não fosforilada; 6-

SmHMGB1 fosforilada e 9-11: SmHMGB1 S174A/S172A. O padrão de bandeamento

seqüencial apresentou-se muito semelhante em todas as condições avaliadas, de forma que

concluímos que a di-fosforilação nos resíduos de serina nas posições 174 e 172 não é capaz de

alterar a capacidade da

SmHMGB1 de promover o super-enovelamento do DNA in vitro.

a. b.

Figura 25. Ensaio de super-enovelamento do DNA com a SmHMGB1 fosforilada pela CK2. a.

letroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE)

com 1 µg das proteínas

utilizadas no ensaio visualizado na letra c (3h de incubação na reação de fosforilação). P: padrão de

massa molecular; 1. SmHMGB1 proveniente da reação de fosforilação com CK2; 2: SmHMGB1

proveniente da reação de fosforilação com CK2 na ausência da mesma 3. SmHMGB1S174A/S172A

proveniente da reação de fosforilação com CK2. b. Desenho esquemático ilustrando o ensaio de super-

enovelamento. c. Ensaio de super-enovelamento do DNA pela proteína SmHMGB1. Gel de Agarose

1% corado com Brometo de Etídio e fotografado com o sistema de registro de imagem ImaGo (B&L

Systems). 1. 0,6µg Plasmídio pTZ19R super-enovelado; 2. 0,6µg Plasmídio pTZ19R na forma

relaxada; 3-5: SmHMGB1 fosforilada ; 6-8: SmHMGB1 não fosforilada e 9-11: SmHMGB1

S174A/S172A. As letras I e II referem-se ao desenho esquemático na letra b.

4.9 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1 fosforilada

pela CK2

Este ensaio baseia-se na capacidade da SmHMGB1 em promover a dobra de

fragmentos lineares de DNA, favorecendo a ligação intramolecular de suas extremidades

coesivas mediante a ação de T4 DNA ligase. A formação de mini-círculos de DNA

decorrentes de ligações intramoleculares pode ser comprovada através da sua resistência à

enzima exonuclease III, capaz de digerir, apenas moléculas de DNA lineares.

Os ensaios de circularização com fragmentos de DNA de 66 pb e 123 pb utilizando a

SmHMGB1 fosforilada e não fosforilada demonstraram capacidade muito semelhante em

promover a circularização do DNA linear (Figura 26b e c). Isto nos permite dizer que a

fosforilação por CK2 não é capaz de regular a capacidade da proteína promover a dobra de

fragmentos de DNA de 66 bp e 123 bp.

Figura 26. Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1 fosforilada

pela CK2. a. E

letroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE)

com 1 µg

das proteínas utilizadas nos ensaios visualizados nas letras b e c. P: padrão de massa molecular; 1:

SmHMGB1 proveniente da reação de fosforilação com CK2; 2: SmHMGB1 proveniente da reação de

fosforilação na ausência de CK2; 3: SmHMGB1 proveniente da reação de fosforilação com CK2 na

ausência de ATP e 4: SmHMGB1 proveniente da reação de fosforilação com CK2 na ausência de

tampão de reação. As sondas radioativas de DNA linear de e 123 pb (b) e 66 pb (c) foram incubadas

com 20 ng da proteína recombinante e em seguida, submetidas à T4 ligase. C: SmHMGB1 controle; 1-

4: SmHMGB1 como descrito em a. A canaleta 3 corresponde ao controle positivo dos mini-círculos

obtidos através da incubação na presença de 20 ng da SmHMGB1 submetidos, posteriormente, à

exonuclease III (ExoII).

4.10 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de vermes

adultos de S. mansoni

Com o objetivo de verificar se a SmHMGB1 seria um substrato para a ação de

proteínas cinases presentes no extrato total dos parasitas, realizamos uma cinética de

fosforilação utilizando com única fonte de proteínas cinases, 4 g de um extrato total de

vermes adultos machos e fêmeas.

O que pudemos observar (Figura 27) foi uma intensa atividade do extrato, com o

surgimento de um forte sinal de incorporação já nos 5 primeiros minutos de incubação com a

proteína recombinante. Esses dados nos sugerem que a SmHMGB1 é substrato para proteínas

cinases endógenas do S. mansoni in vitro.

Figura 27.

Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de

vermes

adultos de

S. mansoni

. As canaletas 1 a 4 representam 1µg da proteína SmHMGB1 resultante da

fosforilação com 4 g de extrato total a 37ºC e fracionadas em eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) coradas por Coomassie Blue (painel superior) e a sua

autoradiografia correspondente (painel inferior). P: padrão de massa molecular.

4.11 Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de vermes macho

e fêmea maduros e imaturos de S. mansoni

Após observarmos uma intensa atividade de proteínas cinases no extrato total de

vermes adultos maduros tendo como substrato a SmHMGB1 recombinante, verificamos se

extratos totais de vermes adultos provenientes de infecções unisexuais apresentariam um

perfil cinético semelhante. Como pode ser visualizado na figura 28, não fomos capazes de

observar nenhuma diferença clara entre os perfis de fosforilação. Isto se manteve tanto para

uma comparação entre os sexos quanto dentro do mesmo sexo.

Figura 28.

Cinética de fosforilação da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de vermes

macho e fêmea maduros e imaturos de S. mansoni

. Canaletas 1-5 SmHMGB1 fosforilada com

extrato total de fêmeas unisexuais; canaletas 6-10: SmHMGB1 fosforilada com extrato total de fêmeas

bissexuais; canaletas 11-15: SmHMGB1 fosforilada com extrato total de machos unisexuais e

canaletas 16-20: SmHMGB1 fosforilada com extrato total de machos bissexuais. Todas as reações

foram realizadas com 1 µg de SmHMGB1, 4 g de extrato total e incubação a 37ºC por 0, 5, 15, 30 e

60 min. As reações foram fracionadas por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12%

(SDS-PAGE), coradas por Coomassie Blue (painel superior) e a sua autoradiografia correspondente

(painel inferior). P: padrão de massa molecular.

4.12 Fosforilação da proteína SmHMGB1 com o extrato total de vermes adultos de S.

mansoni na presença de inibidor de CK2 (TBB)

Tendo verificado a intensa atividade de proteínas cinases fosforilando SmHMGB1 in

vitro, nos interessamos em averiguar se a CK2 endógena estaria participando desta

fosforilação. Foi realizada então uma reação de fosforilação com o extrato total na presença

de um inibidor específico de CK2, o TBB. O que observamos na figura 29 (canaleta 1

comparada com as canaletas 2-3) foi que, na presença do inibidor, o sinal de fosforilação teve

uma significativa redução, o que nos sugere uma grande participação da CK2 na fosforilação

observada com o extrato total e também está de acordo com os resultados obtidos com a CK2

purificada. O controle com o diluente do inibidor (Figura 29, canaleta 4) não apresentou

nenhum efeito na atividade enzimática do extrato, validando a redução do sinal como

proveniente apenas da inibição da atividade de CK2.

Figura 29.

Fosforilação da proteína SmHMGB1 com o extrato total de vermes adultos de

S. mansoni na presença de inibidor de CK2.

As canaletas 1 a 4 representam 1µg da proteína

SmHMGB1 resultante da reação de fosforilação com 4 g de extrato total a 37ºC por 1 hora e

fracionada por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) corado por

Coomassie Blue (painel inferior) e a sua autoradiografia correspondente (painel superior). TBB:

inibidor específico da atividade de CK2 nas concentrações de 2Ki/µL e 4Ki/µL. DMSO: solvente do

TBB.

4.13 Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pelo extrato total de vermes

adultos de

S. mansoni na presença de TBB

Após verificarmos que o extrato total de vermes adultos apresentava intensa atividade

de proteínas cinases tendo como substrato a

SmHMGB1 in vitro, realizamos os mesmos

ensaios, só que desta vez com as construções da proteína (Figura 30, canaletas 1, 4, 6 e 8). O

que verificamos foi que assim como a

SmHMGB1 inteira é um substrato para as enzimas

presentes no extrato, as construções também o são, com destaque para o domínio B, com uma

marcação bastante intensa (Figura 30, canaleta 8). Neste mesmo ensaio também testamos a

influência do inibidor específico de CK2 na fosforilação das construções. O que constatamos

foi que o inibidor não teve efeito evidente na fosforilação das construções mediada pelas

enzimas do extrato total. Estes resultados corroboram os resultados dos ensaios

in vitro com a

CK2 purificada, que tem como substrato apenas a proteína inteira. O controle do diluente do

inibidor (Figura 30, canaleta 3) mais uma vez não teve efeito na fosforilação mediada pelo

extrato, validando os resultados de inibição como específicos para a atividade de CK2.

Figura 30.

Fosforilação das construções da proteína SmHMGB1 pelo extrato total

vermes adultos de

S. mansoni

na presença de inibidor de CK2. 1 g das construções da

SmHMGB1 resultantes da reação de fosforilação com 4 g de extrato total a 37ºC por 1hora e

fracionada por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) corado por

Coomassie Blue (painel superior) e a sua autoradiografia correspondente (painel inferior). ∆C:

SmHMGB1 sem a cauda ácida (1-169aa); Box A: Domínio A (1-83aa) e Box B: domínio B (84-

169aa). TBB: inibidor específico da atividade de CK2 na concentração de 2Ki/µL. DMSO: solvente do

TBB.

4.14 Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1 fosforilada

pelo extrato total de S. mansoni

Após verificar que a SmHMGB1 era um substrato para ação das proteínas cinases

endógenas in vitro, decidimos verificar se essa fosforilação seria capaz de regular a

capacidade da proteína promover a dobra de fragmentos lineares de DNA. A figura 31a

demonstra a integridade das proteínas que foram utilizadas no ensaio de atividade, assim

como as suas respectivas fosforilações. Como pode ser visualizado pela figura 31b tanto a

proteína inteira quanto a proteína sem a cauda ácida não apresentaram alterações em sua

atividade quando fosforiladas.

a. b.

Figura 31. Ensaio de circularização do DNA mediado por T4 ligase da SmHMGB1 fosforilada

pelo extrato total de S. mansoni. a. Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante 12% (SDS-

PAGE) com 1 μg das proteínas utilizadas no ensaio visualizado em b. Canaletas 1-2: SmHMGB1 não

fosforilada e fosforilada, respectivamente; canaletas 3-4: SmHMG B1 sem a cauda ácida não

fosforilada e fosforilada, respectivamente. Painel superior: coloração com Coomassie Blue. Painel

inferior: autoradiografia correspondente. b. Ensaio de circularização do DNA comparando as

atividades das proteínas fosforiladas e não fosforiladas. A sonda radioativa de DNA linear de 123 pb

foi incubada com 20 ng da proteína recombinante e em seguida, submetidas à T4 ligase. Canaletas 1-2:

controle de auto-circularização mostrando apenas a sonda linear. Canaleta 3: controle positivo dos

mini-círculos obtidos através da incubação na presença de 20 ng da SmHMGB1 submetidos,

posteriormente, à exonuclease III (Exo III). FL: SmHMGB1 inteira; pFL: SmHMGB1 inteira

fosforilada; ΔC: SmHMGB1 sem a cauda ácida e pΔC: SmHMGB1 sem a cauda ácida fosforilada.

5 DISCUSSÃO

A caracterização de proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica é essencial

para uma melhor compreensão do complexo ciclo de vida do

Schistosoma mansoni, bem

como de seu desenvolvimento. A proteína HMGB1, envolvida na modulação da conformação

do DNA através de uma série de eventos é parte integrante desse processo. Na literatura são

descritas várias modificações pós-traducionais sofridas pela HMGB1, tanto em mamíferos

quanto em plantas e insetos. Entre elas estão a fosforilação, acetilação e ADP-ribosilação.

Algumas destas modificações já foram relacionadas a alterações na atividade da proteína.

Desta forma nos interessamos por investigar se a HMGB1 de

S. mansoni (SmHMGB1),

recentemente caracterizada pelo nosso grupo, também poderia sofrer modificações pós-

traducionais. Dentre as modificações citadas acima, optamos por investigar a fosforilação

sofrida pela proteína. A fosforilação, ou seja, a adição de um ou mais grupamentos fosfato,

com conseqüente adição de cargas negativas à proteína é um mecanismo regulatório pós-

traducional muito comum em sistemas biológicos. Sendo assim, foram feitos ensaios

in vitro

utilizando a enzima CK2, sugerida em uma análise computacional utilizando os programas

NetPhosK 1.0 e NetPhos server 2.0 feita em nosso laboratório.

A CK2 é uma proteína ubíqua em eucariotos, altamente conservada em sua seqüência

de aminoácidos e composta por duas subunidades catalíticas (CK2

 e/ou CK2´) e duas

subunidades regulatórias (CK2

). Ela está envolvida na regulação de uma série de eventos

celulares importantes como a replicação e transcrição do DNA ou ainda a sinalização celular

para a apoptose (DAVID e cols., 2005). Durante estes eventos esta enzima fosforila resíduos

de serina e treonina em uma grande variedade de substratos. Estes incluem fatores

transcricionais, proteínas capazes de afetar a estrutura do DNA e RNA e também aquelas

envolvidas na síntese e tradução de RNA. Toda essa gama de substratos e uma outra

infinidade deles (MEGGIO & PINNA, 2003) fazem desta proteína um elemento importante

na regulação da expressão gênica. Assim, nos interessamos em investigar o seu papel na

fosforilação da

SmHMGB1. Como a CK2 ainda não foi caracterizada em S. mansoni,

utilizamos uma CK2 comercial, obtida a partir de fígado de rato.

Em nossos experimentos constatamos que, de fato, a

SmHMGB1 era um substrato para

ação da CK2

in vitro, e mapeamos quais resíduos estavam recebendo o grupamento fosfato,

duas serinas na posição 172 e 174 da proteína. Estes resíduos se localizavam na porção C-

terminal rica em resíduos de aminoácidos ácidos da proteína, a região que mais sofre variação

entre as espécies e que em

S. mansoni constitui-se de apenas 7 aminoácidos. A natureza ácida

dos aminoácidos presentes nesta região da proteína (

KTEDS

172

174

DD) também foi

observada na HMGB1 de milho (

DEEGS

149

EEDEDDDE). De fato, a CK2 parece ter uma

maior afinidade por resíduos de serina e treonina cercados por aminoácidos ácidos (MEGGIO

e PINNA, 2003).

Através de ensaios de super-enovelamento do DNA verificamos que a di-fosforilação

SmHMGB1 não foi capaz de influenciar na capacidade de a proteína promover o super-

enovelamento do DNA em relação a proteína não modificada. O mesmo foi constatado

quando investigamos uma outra atividade da proteína, a promoção da dobra em fragmentos de

DNA (66 bp e 123 bp) e circularização dos mesmos na presença de T4 ligase.

Apesar de termos utilizado uma enzima heteróloga ao

S. mansoni, alguns dados na

literatura nos sugerem a presença de uma enzima semelhante no parasita em questão. Entre

elas está a recente caracterização da subunidade regulatória

β da CK2 em S. japonicum

(PENG e cols., 2004), um parasita do mesmo gênero e desta forma com grande possibilidade

de apresentar as mesmas proteínas em seu organismo em se tratando de uma enzima tão

conservada entre as espécies. Um outro dado também reforça a possibilidade do

S. mansoni

possuir uma CK2, o fato de no banco de dados do Projeto Genoma funcional do S. mansoni

(<http://verjo18.iq.usp.br/schisto/

>) aparecerem ESTs (SmAE número 605597.1)

apresentando similaridade com a CK2 de outros organismos. Além disso, esta enzima e outras

cinases já foram caracterizadas em uma série de organismos mais ou tão primitivos quanto o

S. mansoni. Como exemplo podemos citar as subunidades catalíticas α e α´ da CK2 de

Leishmania chagasi (BHATIA e cols., 1998) e Trypanosoma brucei (PARK e cols., 2002) e a

subunidade α da CK2 do protozoário Theileria parva (OLE-MOIYOI e cols., 1992).

Finalmente, o próprio

S. mansoni teve recentemente caracterizada uma proteína cinase C

(

SmPKC1) (BAHIA e cols., 2006). Além disso, fomos capazes de verificar intensa atividade

de proteínas cinases endógenas tendo como substrato

in vitro a SmHMGB1 recombinante, e

posteriormente que parte desta atividade era proveniente da ação de CK2 do parasita, já que

na presença de um inibidor específico da CK2, o TBB, a fosforilação mediante atividade das

proteínas cinases foi claramente reduzida. Juntos, estes dados nos sugerem de que a regulação

transcricional via fosforilação da

SmHMGB1 pela CK2 é um processo que pode estar

ocorrendo em

S. mansoni.

A fosforilação mediada pela CK2 na HMGB1 de outros organismos mostrou-se capaz

de regular as propriedades de ligação ao DNA das proteínas. Entre as mais semelhantes ao

nosso trabalho descritas na literatura está o efeito da fosforilação por CK2 na HMGB de

milho (STEMMER e cols., 2003). Neste artigo, foi demonstrado que HMGB1, 2 e 3 eram

fosforiladas

in vivo e in vitro pela CK2 na região C-terminal ácida e que esta fosforilação

aumentava a estabilidade das proteínas frente a alterações de temperatura. Foi verificado

também, por dicroísmo circular, que as proteínas fosforiladas apresentavam uma elevação em

suas temperaturas de desnaturação, em especial a HMGB1. Ainda no mesmo artigo e

comparando as formas não fosforiladas e fosforiladas

in vitro pela CK2 o autor descreve uma

redução na afinidade de ligação a um fragmento linear de DNA de 98 bp, mas não de

minicírculos de DNA da HMGB1 fosforilada. Apesar destes resultados não estarem em total

concordância com os resultados observados nesta dissertação, onde não fomos capazes de

verificar efeito regulatório da fosforilação por CK2 da

SmHMGB1, vale ressaltar que a

HMGB1 de plantas apresenta em sua estrutura apenas um domínio de ligação ao DNA, e que

os ensaios de ligação ao DNA

in vitro adotados não eram próximos o bastante dos ensaios de

atividade realizados na dissertação para que pudéssemos realizar uma comparação mais

precisa. Além disso, o ensaio de atividade onde se empregou minicírculos de DNA, uma

estrutura pela qual a HMGB1 tem alta afinidade (BUSTIN, 1999; BUSTIN, 2001a; THOMAS

& TRAVERS, 2001), não demonstrou nenhuma diferença na ligação ao DNA entre as formas

não fosforiladas e fosforiladas.

Em outro trabalho, desta vez utilizando como modelo a HMGB1 do inseto

Chironomus (WISNIEWSKI e cols., 1999), verificou-se mais uma vez que a proteína era um

substrato para a ação de CK2 e que esta fosforilação estabilizava a proteína na presença de

determinadas proteases. Também foi verificado que a proteína nativa, quando submetida a um

tratamento com fosfatase, aumenta a sua afinidade de ligação a DNA do tipo

four way

junction

. No entanto, embora existam indicativos de que a CK2 esteja fosforilando a proteína

do inseto endogenamente, não se pode afirmar que os grupamentos fosfatos que foram

retirados no tratamento com fosfatase eram exclusivamente provenientes da ação da proteína

CK2, e conseqüentemente que o efeito observado relaciona-se diretamente com a fosforilação

por CK2.

Verificando as publicações que vem sendo produzidas desde a descrição das HMGs,

há mais de trinta anos (GOODWIN e cols., 1973), a CK2 parece ser, se não a principal, uma

das principais proteínas cinases capazes de fosforilar a proteína HMGB1 de diversos

organismos, quer estes possuam apenas um ou dois domínios de ligação ao DNA. Esta

fosforilação pode estar atuando na regulação da proteína HMGB1 no que se refere as suas

propriedades de ligação ao DNA e em uma gama de outros efeitos, como por exemplo, a

interação com outras proteínas (KROHN e cols., 2002) e conformação tridimensional

(WISNIEWSKI e cols., 1999). Em segundo lugar poderíamos citar a PKC, com bastante

freqüência descrita como sendo capaz de fosforilar a HMGB1 (WISNIEWSKI e cols., 1994) e

outras HMGs (XIAO e cols., 2000; STEMMER e cols.,2003).

Ao ser realizada uma busca de trabalhos relacionados a fosforilação de proteínas

HMGB1 verifica-se um volume pequeno de trabalhos mais detalhados. Isto chama a atenção

para a necessidade de se investigar mais criteriosamente as HMGBs e os efeitos regulatórios

da fosforilação em suas atividades como um regulador geral da transcrição e uma citocina

pró-inflamatória. Embora cada vez mais surjam trabalhos relacionando a fosforilação da

HMGB1 de mamíferos, e não mais apenas a acetilação da mesma, e o seu papel como citocina

pró-inflamatória, ainda não se sabe exatamente qual ou quais proteínas cinases estão

majoritariamente envolvidas neste processo.

Toda esta gama de possibilidades é alvo de interesse do nosso grupo, sendo nossa

pretensão dar continuidade aos trabalhos de modificações pós traducionais da HMGB1, mais

especificamente em

S. mansoni, parasita modelo de nosso estudo.

Futuramente pretendemos complementar o trabalho com ensaios de transfecção de

células de mamíferos com o objetivo de verificar se a fosforilação da

SmHMGB1 pode estar

modulando outras atividades dentro da célula, como a distribuição núcleo-citoplasma, assim

como já foi descrito para a fosforilação da HMGB1 de mamíferos (YOUN & SHIN, 2006).

Experimentos in vivo com o objetivo de demonstrar a presença da proteína nativa fosforilada

também estão incluídos em nossos planos. Além disso, a interação com outras proteínas

também pode estar sofrendo alguma influência mediante fosforilação nos resíduos descritos,

assim como a sua estabilidade frente a proteases, já descrita em trabalhos anteriores

(WISNIEWSKI e cols., 1999).

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ANEXO – TRABALHO RELACIONADO À TESE PUBLICADO EM PERIÓDICO DE

CIRCULAÇÃO INTERNACIONAL

DE OLIVEIRA, F. M. B.; DA SILVA, I. C. A.; RUMJANEK, F. D.; DIAS-NETO, E.;

GUIMARÃES; P. E. M.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; ŠTROS, M.; FANTAPPIÉ, M. R.

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Francisco Meirelles Bastos de Oliveira

, Isabel Caetano de Abreu da Silva

Franklin David Rumjanek

, Emmanuel Dias-Neto

, Pedro Edson Moreira Guimarães

Sergio Verjovski-Almeida

, Michal Štros

⁎

, Marcelo Rosado Fantappié

⁎

Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil

Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 05403-010, São Paulo, Brazil

Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo, SP, Brazil

Laboratory of Analysis of Chromosomal Proteins, Academy of Sciences of the Czech Republic, Institute of Biophysics,

Královopolská 135, 61265 Brno, Czech Republic

Received 19 September 2005; received in revised form 2 March 2006; accepted 3 March 2006

Availble online 27 April 2006

Received by F. Salvatore

Abstract

The parasitic helminth Schistosoma mansoni contains three HMGB proteins, HMGB1, HMGB2 and HMGB3, of primary amino acid

sequences highly similar to vertebrate proteins. In this report we describe the characterization of the HMGB1 proteins and their genes from S.

mansoni and Schistosoma japonicum. The deduced amino acid sequences of HMGB1 proteins from both schistosome species are identical, and

comprise 176 residues. The proteins contain the two evolutionarily highly conserved HMG-box domains, A and B, exhibiting 60% similarity to

mammalian HMGB1. Unlike the human HMGB1 which contains an unbroken run of 30 glutamic or aspartic residues, the SmHMGB1 or

SjHMGB1 proteins possess unusually short acidic C-terminal tails (5 acidic residues interrupted by 2 serines). Southern hybridization and DNA

sequencing revealed a single copy HMGB1 gene, composed of 3 exons and two introns, in S. mansoni. The exon/intron boundaries are identical to

those of the human HMGB1 gene, with the exception that the second exon of the SmHMGB1 gene which is not split into two exons as in the

human HMGB1 gene. RNA blot analysis revealed that the SmHMGB1 gene is constitutively expressed in similar levels both in male and female

worms. The single-sized mRNA for SmHMGB1 is consistent with the size derived from the cDNA. Although DNA binding properties of

SmHMGB1 (or SjHMGB1) protein seem to be similar to those previously reported with human HMGB1, i.e., preferential binding to supercoiled

DNA over linear DNA, specific recognition of DNA four-way junctions, DNA-induced supercoiling in the presence of topoisomerase I, and DNA

bending, we have observed two important differences relative to those observed with the human HMGB1: (i) the inability of the isolated

SmHMGB1 domain A to bend DNA (as revealed by T4 ligase-mediated circularization assay), and (ii) higher DNA supercoiling and bending

potential of the SmHMGB1 protein as compared to its human counterpart. The latter finding may indicate that the long acidic C-tail of human

HMGB1 has much stronger repressive role on DNA bending or DNA supercoiling by topoisomerase I at physiological ionic strength than the

short C-tail of the SmHMGB1 protein. Considering the important role of HMGB1 in DNA replication, transcription, recombination, and in

Gene 377 (2006) 33 – 45

www.elsevier.com/locate/gene

Abbreviations: SmHMGB1, S. mansoni high mobility group B1; SjHMGB1, S. japonicum high mobility group B1, EST, expressed sequence tag; SmGAPDH, S.

mansoni glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PMSF, phenylmethylsulphonylfluoride; GST, glutathione S-transferase; RT-PCR, reverse transcriptase

polymerase chain reaction; DTT, dithiothreitol.

⁎

Corresponding authors. Fantappié is to be contacted at Instituto de Bioquímica Médica, CCS, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, Rio de

Janeiro, 21941-590, Brazil. Tel.: +55 21 2562 6759; fax: +55 21 2270 8647. Štros, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic,

Královopolská, 135, 61265 Brno, Czech Republic. Tel.: +420 5 41517183; fax: +420 5 41211293.

E-mail addresses: [email protected] (M. Š tros), [email protected] (M.R. Fantappié).

doi:10.1016/j.gene.2006.03.001

particularly, the mediation of inflammation responses in mammalian cells, further studies on schistosome HMGB proteins may provide valuable

information related to schistosomiasis, where inflammation plays a critical role in this disease.

Keywords: S. japonicum HMGB1 protein; S. mansoni HMGB1 protein; DNA binding; DNA bending; DNA supercoiling; Genomic structure

1. Introduction

Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum are the

causative agents of schistosomiasis in Brazil and Africa, and in

Asia, respectively. There is a continued transmission of

schistosomiasis in these countries despite effective control

programs that focus on the application of the drug praziquantel

(PZQ). Although there is not yet clear-cut evidence for the

existence of PZQ-resistant schistoso me strains , decreas ed

susceptibility to the drug has been observed in several countries

(McManus and Bartley, 2004). In addition, efforts on vaccine

development against either S. mansoni or S . japonicum have

proved to be frustrating until now (McManus et al., 2004). In

this regard, the knowledge of the molecular biology of S.

mansoni and S. japonicum, by manipulating gene expression

and understanding gene function, should point to alternative

strategies for the control of schistosomiasis.

Studies conducted with many eukaryotic organisms have

shown that regulation of DNA metabolism such as transcrip-

tion, replication, recombination and DNA repair involves the

interplay of a number of nuclear proteins interacting with DNA

and/or other proteins.

The high mobility group (HMG) B1 protein is a highly

abundant protein in the nuclei of mammalian cells. It is estimated

that there is about one molecule per 10–20 nucleosomes (Thomas

and Travers, 2001). The protein contains two copies of

homologous DNA binding motifs known as the HMG-boxes, A

and B, which are found in a large number of proteins collectively

referred to as the HMG-box family of proteins (Thomas and

Travers, 2001). The HMG-box family includes many transcrip-

tion factors and factors involved in the control of development or

differentiation (Agresti and Bianchi, 2003). HMGB1 can facili-

tate the assembly of complexes involved in recombination and

transcription, as well as nucleosome remodeling (Bustin, 1999;

Bonaldi et al., 2002; Travers, 2003). HMGB1 were shown to

interact with a number of biologically important proteins, in-

cluding transcription factors and the B-form DNA, albeit with low

affinity. Interestingly, HMGB1 exhibits a remarkably high affinity

for distorted DNA conformations such as supercoiled DNA, four-

way DNA junction, DNA minicircles, cisplatin-modified DNA

and DNA bulges (reviewed by Travers, 2000; Thomas and

Travers, 2001; Grasser, 2003), but it can also actively distort DNA

by bending or looping and changing of DNA-topology (Paull et

al., 1993; Pil et al., 1993; Štros et al., 1994; Teo et al., 1995; Štros,

1998; Sheflin and Spaulding, 1989; Murphy et al., 1999). In

addition to the intracellular role of HMGB1 in association with

chromatin structure, the protein seems to have an important ex-

tracellular role as a mediator of inflammatory mechanisms (Wang

et al., 1999; Taguchi et al., 2000; Lotze and Tracey, 2005). In this

context the participation of schistosome HMGB1 during infection

might also provide valuable information related to the disease,

where inflammation plays a critical role in the pathology of

schistosomiasis and in particular to granuloma. While this paper

was submitted, a report has appeared (Gnanasekar et al., 2006)

describing cloning of the SmHMGB1 gene and characterization of

SmHMGB1 protein with emphasis on its putative role in granu-

loma mediated inflammation.

Although HMGB1 from several organisms (including plants,

yeast, protozoans, invertebrates, and vertebrates; see (Baxevanis

and Landsman, 1995) for classification and comparison of 121

primary amino acid sequenc es) have been identified, only few of

them have been characterized (reviewed by Grasser, 2003).

Preliminary studies have determined the occurrence of HMGB1

proteins in schistosomes (Rabelo et al., 1992; Fantappié and

Rumjanek, 1994), but data corres ponding to cDNA and genes

have been lacking so far. Here we describe the cloning, genomic

structure and DNA binding properties of HMGB1 proteins in the

parasitic helminths S. mansoni and S. japonicum, and discuss the

putative biological roles of these proteins.

2. Materials and methods

2.1. Cloning of SmHMGB1 and SjHMGB1 cDNAs and genes

The available genomic sequences of S. mansoni and S.

japonicum

and that of putative HMG sequences (SmAE number

701186.1 for S. mansoni putative HMGB and GenBank accession

no. AY914896 for S. japonicum putative HMGB) allowed us to

isolate both genes and cDNAs. Total cDNA from S. japonicum

was kindly provided by Dr. Karl Hoffmann (University of

Cambridge) and the genomic DNA from S. japonicum was a

generous gift of Dr. Matty Knight (Biomedical Research Institute,

Maryland). In order to isolate the entire coding region of

SmHMGB1, the

P-labeled EST clone was used as a probe to

screen the S. mansoni adult worm cDNA library (DeMarco et al.,

2005; Verjovski-Almeida et al., 2003).The bacteriophage harbor-

ing the full-length SmHMGB1 was excised with helper

phage ExAssist™ (Stratagene) into recombinant phagemid

pSmHMGB1-BlueScript®-SK (Stratagene).

2.2. Plasmids

The S. mansoni cDNAs encoding recombinant SmHMGB1

full-length (aa residues 1–176), SmHMGB1 box A (aa residues

1–83), SmHMGB1 box B (residues 84–169) and SmHMGB1

lacking the acidic tail (residues 1–169) were amplified by RT-

PCR using sense primer F1 (5′-GGATCC

ATGGCTGAAGA-

CAAGGGTAAG-3′)(BamHI restriction site is in bold and

initiation codon is underlined) and anti-sense primers F2 (5′-

AAGCTT

CTAATCGTCAGACTCTGAAATC-3′)forthe

34 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

SmHMGB1 full-length, A1 (5′-AAGCTTCTATTCGTCGG-

CAGGGGGTTC-3′) for the SmHMGB1 box A and C1 (5′-

AAGCTT

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′)forthe

SmHMGB1 lacking the acidic tail (HindIII restriction site is in

bold, and the termination codon is underlined). The SmHMGB1

Box B was amplifi ed by using sense primer B1 (5′-

GGATCCGGCCGCAGCAAGAAAAGGAAA-3 ′) and anti-

sense primer C1 (BamHI restriction site is in bold). The S.

japonicum cDNAs corresponding to the SjHMGB1 full-length

(residues 1–176), SjHMGB1 box A (aa residues 1–83),

SjHMGB1 box B (aa residues 84–169) and SjHMGB1 lacking

the acidic tail (residues 1–169) were amplified by RT-PCR using

sense primer F3 (5′ -GGATCC

ATGGCTGAAGAGAAAGG-

TAAG-3′)(BamHI restriction site is in bold and initiation

codon is underlined) and anti-sense primers F4 (5′-AAGCTT

C-

TAATCGTCGGATTCTGAGTC-3′) for the SjHMGB1 full-

length, A2 (5 ′ -AAGCTT

CTATTCATCTGCAGGCTC-3′)

for the SjHMGB1 boxAandC2(5′ -AAGCTT-

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′) for the SjHMGB1 lacking

the acidic tail (HindIII restriction site is in bold, and the ter-

mination codon is underlined). The SjHMGB1 Box B was

amplified by using sense primer B2 (5′-GGATCCGGCCG-

CAGCAAGAAAAG GAAA-3 ′) and anti-sense primer C2

(BamHI restriction site is in bold). RT-PCR was performed on

S. mansoni and S. japonicum adult worm cDNAs, sub-cloned

into pCR2.1 TOPO plasmid (Invitrogen), and dideoxy-se-

quenced on both strands (Macrogen Inc., Korea). In order to

generate recombinant his-tag proteins, plasmids were digested

with the appropriate enzymes (Promega) and cloned into the

pQE-80L expression vector (Qiagen), according to the manu-

facturer's instructions.

2.3. Southern hybridization s

DNA from S. mansoni was digested with several restriction

enzymes (described in Fig. 2D) to completion, and resolved on

a 0.8% agarose gels in 0.5× TBE buffer. DNA was denaturated

by soaking the gel in the denatu ration buffer containing 0.4 M

NaOH and 1 M NaCl for 30 min, transferred to a Nylon

membrane (Hybond-N+, Amersham Biosciences) by capillary

action, and hybridized with

P-labeled probe derived from the

SmHMGB1 cDNA. The membrane was washed twice in 1×

SSC/0.1 SDS at room temperature for 15 min, followed by a

final wash in 0.1× SSC/0.1 SDS at 68 °C for 30 min (high

stringency). The DNA was visualized in a Storm 860

PhosphorImager (Molecular Dynamics). DNA marker con-

sisted of

P-labeled λ DNA digested with HindIII.

2.4. Northern blot analysis of SmHMGB1 transcripts

Total RNAs from sexually immature male, sexually immature

female, adult mature male and adult mature female worms were

extracted using the TRIzol® Reagent (Invitrogen). The

SmHMGB1 531 bp cDNA was used as a probe for the Northern

blots, essentially as previously described (Fantappié et al., 1999).

The SmGAPDH 795 bp fragment was used as a constitutive

control and was obtained by RT-PCR using gene-specific primers

5′-GGCTTGTGCCATCAGCGAAGTC-3 (GAPDH_

Frw

) and

5′-TGGTTGTTGGGACGCGGAAAG-3′ (GAPDH1_

Rev

2.5. Expression and purification of recombinant proteins

HMGB1 proteins and domains used throughout the paper

were expressed as fusion prote ins with (His)

-tag at their N-

termini. BL21(DE3) cells (Novagen) harboring the pQE-80L

constructs (Qiagen) encoding SmHMGB1, SjHMGB1, or rat

(human) HMGB1 were grown in the presence of ampicillin

(100 μg/ml) to OD

600

values of ∼ 0.6 at 37 °C. Cell cultures were

then cooled to 25 °C, then isopropyl-1-thio-β-

D-galactopyrano-

side (IPTG) was added to final 1 mM, and the cells were grown

for 5 h. After centrifugation at 7700 ×g for 20 min, the cell pellets

were re-suspended in ice-cold lysis buffer (50 mM NaH

pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole and 1 mM PMSF),

briefly sonicated and centrifuged at 20.000 ×g for 30 min. The

supernatants were then filtered through 0.45 μm filters, and

loaded onto Ni

–agarose columns (Pro-Bond™, Invitrogen).

Unbound proteins were eluted with lysis buffer containing

20 mM imidazol, and His-tagged HMGB1 proteins or peptides

were eluted in the same buffer but containing 250 mM

imidazole. The isolated proteins or peptides were finally

dialysed against buffer D (10 mM Tris–HCl, pH 7.6, 50 mM

KCl, 0.1 mM EDTA and 0.5 mM dithiothreitol), and the

concentration of proteins was determined by the Bio-Rad

Protein Assay (Bio-Rad). The purity and amounts of the

HMGB1 proteins were also checked by resolution of the

samples on 15% SDS-PAGE, followed by Coomassie Blue R-

250 staining. Some of the DNA binding experiments were

carried out with both His-tagged SmHMGB1 and Sm HMGB1

fused with GST (cloning and protein expression were as in Štros,

1998) with similar results, indicating that the GST moiety had

very little, if any, effect on the DNA binding properties of the

SmHMGB1 protein. The full-length rat HMGB1 (aa residues 1–

215), HMGB1-ΔC (aa residues 1–162), domain A (aa residues

1–88) and domain B (aa residues 85–180) were expressed with

(His)

-tag at their N-termini as previously described (Štros et al.,

2004). As the primary amino acid sequences of rat and human

HMGB1 are absolutely identical, and as the genomic structure of

schistosome HMGB1 gene was compared with the human

counterpart (notice that genomic structure of the rat HMGB1

gene is so far not available), all figures showing DNA binding

experiments with recombinant rat HMGB1 are indicated in the

paper as human HMGB1 for better clarity.

2.6. Gel retardation assay with supercoiled DNA

Gel retardation experiments were carried out as using an

equimolar mixture of highly-purified negatively superc oiled

plasmid pTZ19R and the HindIII-linearized pl asmid, as

previously described (Štros and Reich, 1998). Briefly, 0.5 μg

of plasmid DNAs was mixed with increasing amounts of

SmHMGB1 in buffer A (0.14 M NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.5,

0.2 mM EDTA, 5 mM DTT) in a final volume of 20 μ l and pre-

incubated on ice for 30 min. The DNA–protein complexes were

resolved by electrophoresis on 1% agarose gels in 0.5× TBE

35F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

buffer at 3 V/cm for 15–18 h at 4 °C. The gels were stained with

0.5 μg/ml ethidium bromide, distained in water and photo-

graphed through a red filter in an UV-transilluminator (254 nm)

using 100 T-MAX black and white negative film (Kodak).

2.7. DNA supercoiling assay

DNA supercoiling assays were carried out as previously

described (Štros and Muselíková, 2000). Briefly, CsCl-purified

negatively supercoiled plasmid pTZ19R was relaxed at a DNA

concentration ∼ 170 μg/ml in Topo I relaxation buffer (50 mM

NaCl, 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 20% glycerol

and 1 mM dithiothreitol) with wheat germ topoisomerase I

(2 units/μg DNA; Promega) at 37 °C for 90 min. The relaxed

DNA (0.5 μg DNA) was then diluted to final 40 or 140 mM

NaCl, then the same amount of the topoisomerase I was added,

followed by the addition of recombinant HMGB1 proteins or

peptides (as indicated in the Legends to Figures). The 20 μl

reactions were allowed to proceed at 37 °C for 60 min after

which they were terminated by addition of SDS and NaCl to

final 1% and 1 M, respectively. DNA was deproteinized by

chloroform/isoamyl alcohol (24:1) extraction in the presence of

0.02% linear acrylamide instead of carrier DN A. Deproteinized

DNA was then precipitated with 2.5 volume of ethanol, washed

with 70% ethanol, air-dried and finally dissolved in 0.1× TE

buffer. Distribution of DNA topoisomers was analyzed by

electrophoresis in 1% agarose gels in 1× TBE buffer at 3 V/cm

for 17 h. The gels were stained with 0.5 μg/ml ethidium

bromide, distained in water and photographed through a red

filter in an UV-transilluminator (254 nm) using 100 T-MAX

black and white negative film (Kodak).

2.8. Determination of sign of DNA supercoiling

To determine the sign of DNA supercoiling, the gels were

soaked after the first dimension electrophoresis (see Analysis of

DNA supercoiling) in chloroquine (2.5 μg/ml) for 1 h, turned

horizontally by 90° and resolved in the second dimension in

0.5× TBE buffer containing chloroquine at 5 V/cm for 10 h as

previously described (Štros and Muselíková, 2000). DNA was

then visualized by staining with 0.5 μg/ml ethidium bromide,

and the destained gels were photographed through a red filter in

an UV-transilluminator (254 nm) using 100 T-MAX black and

white negative film (Kodak).

2.9. T4 DNA ligase-mediated circularization assay

The circularization assay used was based on previous pro-

tocols (Štros, 1998, 2001; Štros et al., 2004). Briefly, the

P-

labeled 123-bp or 66-bp DNA fragments (∼ 1 nM) with

cohesive ends were pre-incubated on ice for 20 min with ap-

propriate amounts of recombinant proteins (typically 0.02–

5 μM) in 1× T4 DNA ligase buffer (30 mM Tris–HCl, pH 7.8,

10 mM MgCl

, 10 mM dithiothreitol, and 0.5 mM ATP;

Promega) in a final volume of 20 μl. The DNA was then ligated

with T4 DNA ligase (0.05 unit/reaction; Promega) at 30 °C for

20 min, and the ligation reactions were terminated by incubation

of samples at 65 °C for 20 min. Some of the ligation mixtures

were digested after termination of ligations with ∼ 20 units of

exonuclease III (Promega) at 37 °C for 30 min. Before elec-

trophoresis, all DNA samples were deproteinized as described

in the DNA supercoiling assay. The protein-free DNAs were

loaded on pre-run 6% (123-bp DNA) or 8% (66-bp DNA)

polyacrylamide slab gels in 0.5× TBE buffer, and finally

resolved at 250 V for 2–3 h at 4 °C. After electrophoresis, the

gels were vacuum-dried and visualized by autoradiography or

PhosphorImager STORM 860 (Molecular Dynamics) using

Image Quant 5.2 software.

2.10. Gel retardation with synthetic four-way junctions or

plasmid DNA

Synthetic DNA four-way junctions (4WJs) were constructed

as indicated earlier (Štros and Muselíková, 2000). Briefly, the

DNA binding experiments were carried out in t he Mg

-free

DNA binding buffer (25 mM NaCl, 5 mM KC l, 10 mM Hepes-

KOH, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM spermidine, 1 mM DTT

and 3.5% Ficoll) with ∼ 1.5 nM

P-labeled 4WJs and

increasing amounts of GST–SmHMGB1 or GST alone (as in-

dicated in the legends to figures) in the absence or presence of

competitor linear DNA (of the length and sequences identical

to those of the 4WJs). The complexes were resolved on 5.8%

non-denaturing polyacryla mide gels in 0.5× TBE at 10 V/cm

for 4–5 h and visualized by PhosphorIma ging (Štros and

Muselíková, 2000).

3. Results and discussion

3.1. Isolation of cDNAs and genomic organization of

schistosome HMGB1 genes

We cloned two 531-bp open reading frames of S. mansoni

HMGB1 (SmHMGB1)andS. japo ni cum HMGB1 (SjHMGB1)

cDNAs. In both cases the lengths of the HMGB1 sequences

consisted of 531-b p which are transl ated into p rote in s of

176 amino acids with esti mated masses of about 18 kDa.

Like th e verteb rate HMGB1 prot ein s, the SmHMGB1 and

SjHMGB1 proteins contained two HMG-box domains, A and

B, and the acidic C-tail (Fig. 1A). Comparison o f th e de du ced

amino acid seq uenc e of SmHMGB1 with the S. manson i tran-

scriptome database (Verjovski-Almeida et al., 2004) revea led

thatacontighadbeenassembledwith76ESTsderivedfrom

all developmental stages (eggs, miracidia, cercariae, germ-

balls, schist osomula and male/fem ale adults) and was an-

notated as coding for an unnamed protein (SmAE 607928.1). It

has 100% identity and full-len gth cove rag e of SmHMGB1.

Further analy se s rev eale d that two other isoforms of Sm-

HMGB1 a re expressed in S. mansoni. Thus, we identi fied

contig SmAE 604202.1, assembled from 15 EST reads again

derived from all stages except cercaria, which codes for a

226 amino acids protein that has 56% identity and 74% s im-

ilarity with SmHMGB1 over 164 amino acids. Thus, we named

it SmHMGB2 (GenBank accession no. BN000821). Also,

contig SmAE 60 898 2.1 was identified (derived from 12 EST

36 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

from all stages except cercaria and miracidium) which codes

for a 246 amino acids protein that has 48% identity and 68%

similarity w ith SmHMGB1 ove r 178 am in o acids. We named it

SmHMGB3 (GenBank ac cessio n no . BN0 00822 ). I n addi tion,

this two other variant genes of the HMGB-box family, Sm -

HMGB2 and SmHMGB3 have no significant similarity with

SmHMGB1 at the DNA level. In this paper, we analyzed in

details only the HMGB1 cDNAs and the corresponding pro-

teins from S. mansoni and S. japonicum.

Comparison of the deduced amino acid sequences of the

SmHMGB1 and SjHMGB1 proteins with HMGB1 proteins from

tick, trout, frog, chicken and human revealed ∼ 60% similarity to

Fig. 1. (A) Alignment of deduced amino acid sequences of HMGB1, HMGB2 and HMGB3 from Schistosoma mansoni (GenBank accession nos. DQ005529,

BN000821 and BN000822, respectively) and HMGB1 from Schistosoma japonicum (GenBank accession no. DQ005528) with HMGB1 proteins from Homo sapiens

(human), GenBank accession no. NP_002119; Gallus gallus (chicken), GenBank accession no. CAA76978; Xenopus tropicalis (frog), GenBank accession no.

AAH61601; Salmo specie (trout), GenBank accession no. S48708; and Dermacentor variabilis (tick), GenBank accession no. AA092280. Please notice that primary

amino acid sequences of human and rat HMGB1 proteins are identical. Sequences in boxes represent, respectively, the HMGB1 A domain (1–84), B domain (93–161)

and the acidic C-terminus (170–176). Percentages of similarities among all aligned sequences are shaded as black (100%), dark grey (80%) and light grey (60%).

(B) Comparison of amino acid sequences of the acidic C-tails from S. mansoni and S. japonicum with those from different species: Danio rerio (zebrafish), GenBank

accession no. AAQ97791; Naegleria fowleri (amoeba), GenBank accession no. AAL13284. Other aligned sequences are indicated in panel A. The accurate

positioning and lengths of the acidic C-tails within each of the compared sequences are indicated by numbers. Asterisk depicts a number of acidic residues (shaded as

grey) within each of the aligned C-tails (notice that the indicated numbers do not necessarily correspond to the size of the full-length acidic C-tail).

37F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

the A + B di-domain (designated as HMGB1-ΔC) of human

HMGB1, mainly displaying conservative substitutions among

schistosome and human HMGB1 domains A and B (Fig. 1A).

On the other hand, the most striking differences between schis-

tosome and rat HMGB1 prote ins occurred within their C-

terminal flanking regions of domains B and the acidic C-tails

(only ∼ 17% similarity). The most obvious difference between

the human HMGB1 and the SmHMGB1 and SjHMGB1 proteins

is the presence of an unusually short acidic C-terminal tail (5

acidic residues interrupted by 2 serines) within the schistosome

HMGB1 proteins, as compared to an unbroken run of 30 glu-

tamic or aspartic residues found in rat HMGB1 (Fig. 1). From

Fig. 1B, it is suggestive that the length of the acidic C-tail within

the HMGB1 decreases with the complexity of the organism. In

other words, the acquisition of the acidic C-tail in HMGB1

proteins seems to have been a relatively recent evolutionarily

event.

Consistently, RNA blot analysis revealed that the

SmHMGB1 gene is constitutively expressed in similar levels

both in mal e and female worms Fig. 2C), and a single-sized

SmHMGB1 mRNA was consistent with the size derived from its

cDNA (Fig. 2A).

Digestion of genomic S. mansoni DNA with restriction

enzymes not cleaving within the SmHMGB1 cDNA (BamHI,

EcoRI or EcoRV) revealed one band in each lane when probed

with

P-labeled full-length SmHMGB1 cDNA at high strin-

gency. This result indicated the existence of only one copy of the

HMGB1 gene in the S. mansoni genome (Fig. 2D).

PCR amplification of genomic sch istosome DNA with

primers annealing to 5′- and 3′-ends of the SmHMGB1 and

SjHMGB1 cDNAs (513-bp) revealed DNA duplexes of 603-bp

(SmHMGB1) and 602-bp (SjHMGB1), suggesting the existence

of intron(s) within the SmHMGB1 and SjHMGB1 ge nes.

Sequencing of the 603/602-bp PCR products indicated that

both SmHMGB1 and SjHMGB1 genes are organized into 3

exons two introns (Fig. 3).

The splice donor and acceptor sites of all SmHMGB 1 and

SjHMGB1 exons conformed to the established consensus GT at

5′-end of the intron and AG at the 3′-end (Table 1). The exon/

intron boundaries of the schistosome HMGB1 genes were

Fig. 2. (A) Northern blot analysis of SmHMGB1 mRNA. Total RNA from mature and immature male and female worms was probed with a random primed

P-labeled

SmHMGB1 (top panel) and SmGAPDH (bottom panel) cDNA probes. (B) Quantitative analysis by phosphorimaging. The intensity indicates divided relative volumes

of SmHMGB1 and SmGAPDH bands. (C) Amplification of the open reading frames using the HMGB1 cDNA or genomic DNA from S. mansoni and S. japonicum by

RT-PCR and PCR, respectively. Lane 1, λ DNA digested with PstI DNA; lanes 2–3, genomic sequences of SmHMGB1 and SjHMGB1; lanes 4–5, cDNA sequences of

SmHMGB1 SjHMGB1 (open reading frame). (D) Southern blot analysis. S. mansoni DNA was digested with restriction endonucleases not cutting (BamHI, EcoRI and

EcoRV) or having one cutting site within the SmHMGB1 cDNA (TaqI), transferred by capillary blotting to the Hybond-N+ membrane and hybridized with

P-labeled

full-length SmHMGB1 cDNA. The membrane was then washed at high stringency and subjected to PhosphorImaging. The arrow indicates one of the two bands

obtained upon digestion with TaqI.

38 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

identical to those of the human HMGB1 gene, with the exception

that the exon E2 of the SmHMGB1 (or SjHMGB1) gene is not

split into two exons (EII and EIII) as in the human HMGB1 gene

(Fig. 3).

3.2. Structure and purification of recombinant SmHMGB1 and

SjHMGB1 proteins

For the purpose of DNA binding studies, S. mansoni and S.

japonicum HMGB1 proteins and domains were expressed in E.

coli with His-tag (or in some cases also with GST-tag) at their

N-termini and purified by affinity chromatography. The purity

of the HMGB1 proteins was checked by electrophoresis on a

SDS/15%-polyacrylamide gel (Fig. 4).

3.3. Preferential binding of SmHMGB1 to DNA four-way

junctions and supercoiled DNA

Reports of Bianchi et al. (1989, 1992) indicated that HMGB1

could bind strongly and selectively to cruciform structures and

synthetic four-way junctions (4WJs). A clear preference in

HMGB1 binding to 4WJs was observed for the open, planar

conformation of 4WJs with maximal separation of the strands

which occurs in the absence of divalent cations (Pöhler et al.,

1998). Here we confirmed that schistosome HMGB1 binds to

the 4WJs (Fig. 5A), resulting in up to three retarded bands (I–

III). Competition experiments with line ar DNA derived from

the 4WJs arms indicated that SmHMGB1, like human HMGB1,

preferentially and specifically binds to the DNA cross-over of

the 4WJs (band I).

Although 4WJs are unlikely to represent the binding targets

of HM GB1 in the cell, structures similar to 4WJs such as DNA

cross-overs generated in plasmid DNA by supercoiling may be

one of the natural, albeit not yet identified, DNA binding sites

of this protein in the chromatin. In this context mammalian

HMGB1 proteins were previously shown to exhibit a pre-

ferential affinity to supercoiled DNA over nicked-circular or

linear double-stranded DNA (Sheflin and Spaulding, 1989;

Štros and Reich, 1998; Štros, 2001). In order to determine

whether schistosome HMGB1 proteins also bind preferentially

to supercoiled DNA, we have performed gel retardation assays

with complexes prepared by pre-incubation of SmHMGB1 with

a mixture of negatively supercoiled (∼ 45%), linearized

(∼ 45%) and relaxed closed-circular (∼ 10%) plasmid

pTZ19R. As shown in Fig. 5B, SmHMGB1 protein exhibited

a clear preference for binding to supercoiled DNA over linear or

Table 1

Intron and exon boundaries, splice acceptor and splice donor sites in the gene encoding S. mansoni and S. japonicum HMGB1

Organism Exon Exon length (bp) Donor Intron Intron size (bp) Acceptor

Exon Intron Intron Exon

S. mansoni 1 147 TGGAGG gtatgttgt 1 37 atttctcag AATCTA

Trp Lys Asn Leu

S. mansoni 2 321 GAGAAA gtaggtttg 2 35 actttctag GCGATG

Glu Lys Ala Met

S. mansoni 360

S. japonicum 1 147 TGGAAG gtaagttat 1 31 atttttcag AATCTT

Trp Lys Asn Leu

S. japonicum 2 321 GAAAAA gtaagttcc 2 40 cttgtctag GCGATG

Glu Lys Ala Met

S. japonicum 360

Fig. 3. Genomic structure of S. mansoni HMGB1 gene as determined by PCR of genomic DNA from S. mansoni, and its comparison with published genomic

organization of human HMGB1 gene (Ferrari et al., 1996; GenBank accession no. U51677). A schematic of positions and relative sizes of the 3 exons (E1–E3) and 2

introns (arrowed) of the S. mansoni HMGB1 gene is indicated, and compared with positions and relative sizes of the 4 exons and 3 introns of the human HMGB1 gene

(the human exons EII and EIII correspond to the schistosome exon E2). Alignment of HMGB1-boxes and the acidic C-tail with exon/intron boundaries of the S.

mansoni and human HMGB1 genes is presented. Genomic structure and exon/intron boundaries of S. japonicum HMGB1 gene were identical (not shown).

39F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

relaxed closed-circular DNAs (similar results were obtained

with SjHMGB1, not shown).

3.4. DNA supercoiling by schistosome HMGB1 proteins

Vertebrate HMGB1 and its isolated HMG-box domains can

unwind and distort DNA by insertion of negative supercoils (in

the presence of topoisomerase I) in topologically closed domains

of DNA (Sheflin and Spaulding, 1989; Štros et al., 1994). Here we

have analyzed the ability of the full-length SmHMGB1 and its

truncated forms to induce DNA supercoiling, and compared the

results with those obtained under the same conditions with rat

HMGB1 which has the amino acid sequence identical to the

human HMGB1. The supercoiling results are presented mainly

with SmHMGB. However, indistinguishable results were also

obtained with the SjHMGB1 protein.

As DNA supercoiling of rat HMGB1 strongly depends on

ionic strength (Štros et al., 1994), all supercoiling experiments

were therefore carried out at low (50 mM) or high (150 mM)

ionic strengths (I.S). At ∼ 50 mM I.S., SmHMGB1 (Fig. 6A),

like human HMGB1 (Fig. 6C), can supercoil DNA in the

presence of topoisomerase I. While removal of the acidic C-tail

from human HMGB1 had at ∼ 50 mM I.S. no effect on the ability

of the trunc ated HMGB1 protein (designated as HMGB1-ΔCor

ΔC) to supercoil DNA (Fig. 6C), DNA supercoiling was

significantly decreased at higher amounts of SmHMGB1-ΔC

(Fig. 6A and C). Simi larly, DNA supercoiling by SmHMGB1

domain B was signifi cantly decreased at higher amounts of the

peptide but not by human HMGB1 domain B (Fig. 6A and C). In

contrast, HMGB1 domains A from both human and S. mansoni

could supercoil DNA to a similar extent at ∼ 50 mM I.S.

To determine the sign of DNA supercoiling by schistosome

HMGB1 proteins, the first dimension electrophoresis gels were

turned by 90° and further resolved in the secon d dimension in the

presence of the intercalative drug chloroquine. Chloroquine inter-

calation into DNA results in decreased mobility of negative super-

coils and inc reased mobility of positive supercoils. The results in

Fig. 7, show clearly that the sign of DNA supercoiling induced by

both SmHMGB1 an d SjHMGB1 protei ns was negative.

The impact of the acidic C-tail on the ability of HMGB1 to

supercoil DNA, as well as the differences between the full-length

proteins, was far more apparent when the DNA supercoiling by

schistosome HMGB1 and human HMGB1 were a ssessed at

∼150 mM I.S. (Fig. 6B and D). Whereas SmHMGB1 could fully

supercoil DNA, DNA supercoiling by the full-length human

HMGB1 was suppressed (Fig. 6D). On the other hand, the extent of

DNA supercoiling by both human and SmHMGB1 lacking the

Fig. 5. Preferential binding of schistosome HMGB1 protein to DNA four-way

junctions and supercoiled DNA. (A) Gel retardation experiments were carried

with ∼ 1.5 nM

P-labeled 4WJs and increasing amounts of GST-fused HMGB1

from S. japonicum (0.5, 1, 1.5 and 2 μM, left to right) in the absence or presence

of 5, 25 and 100-fold mass excess of competitor linear DNA (corresponding to

the size and sequences of the 4WJs arms) over 4WJs. The concentration of GST

was 1 μM. The DNA–protein complexes were resolved on 5.8% non-denaturing

polyacrylamid e gels and v isua lize d b y a utor adiog raphy. The proposed

compositions of each of the retarded bands are depicted on the right site of

the panel. (B) An equimolar mixture of supercoiled and linearized plasmid

pTZ19R (∼ 10 nM) was pre-incubated with increasing amounts of HMGB1

from S. mansoni (0.5–5 μM, from left to right) and the DNA–protein complexes

were resolved on an 1% agarose gel, followed by staining of the gel with

ethidium bromide. Form I, supercoiled DNA; L, linear DNA; form II, relaxed

open circular DNA.

Fig. 4. (A) Schematic structure of S. mansoni and S. japonicum HMGB1

proteins and the truncated HMGB1 proteins. (B) Purity of recombinant His-

tagged HMGB1 proteins and truncated HMGB1 proteins. The HMGB1 proteins

and peptides were expressed in E. coli, purified by affinity chromatography, and

resolved by electrophoresis on a SDS/15%-polyacrylamide gel. Proteins were

visualized by staining with Coomassie Blue R-250. Lanes 1 and 2: (wt), wild-

type HMGB; lanes 3 and 4: (ΔC), HMGB1 lacking the acidic C-tail; lanes 5 and

6: (A), domain A; lanes 7 and 8: (B), domain B. Sm and Sj stand for Schistosoma

mansoni and Schistosoma japonicum, respectively.

40 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

acidic C-tail (Fig. 6B and D) was very similar. Collectively these

results indicate that while the long acidic C-tail of human HMGB1

has a strong repressive role on the DNA supercoiling (possibly by

masking or destabilizing of the two DNA binding HMG-box

domains, as also reported earlier by Štros et al., 1994), the short C-

tail of SmHMGB1, on the other hand, exhibited very little, if any,

inhibitory effect on DNA supercoiling by this protein.

The acidic C-tails could clearly “fine-tune” the DNA binding

properties of two HMG-box domains of different HMGB1

proteins as a function of their length and perhaps also the in-

dividual sequences. It is not known whether in vivo the DNA

binding properties of HMGB1 are modulated by proteolytic

removal of the acidic C-tail, despite the frequently reported

cleavage of the acidic C-tail from HMGB1 in the course of the

Fig. 6. DNA supercoiling by schistosome and human HMGB1 proteins. Circular relaxed plasmid pTZ19R DNA (∼ 10 nM) was incubated in the presence of

topoisomerase I with HMGB1 (17 and 35 μM, left to right) and truncated forms at ∼ 50 or ∼ 150 mM ionic strength (I.S.). Deproteinized DNA topoisomers were

resolved on 1% agarose gels, followed by staining of the gels with ethidium bromide. Form I, supercoiled DNA; form II, relaxed circular DNA. FL, full-length

HMGB1; ΔC, HMGB1 lacking the acidic C-tail; A, domain A; B, domain B.

Fig. 7. Determination of sign of DNA supercoiling. Circular relaxed plasmid pTZ19R DNA (∼ 10 nM) was incubated in the presence of topoisomerase I with 35 μMof

human HMGB1, SmHMGB1 and SjHMGB1 at ∼ 50 mM I.S. After separation of the deproteinized DNA in the first dimension on a 1% agarose gel (1× TBE buffer),

the gel was soak in chloroquine, turned by 90°, and the DNA topoisomers resolved in the second dimension to determine the sign of DNA supercoiling. The presence

of chloroquine during electrophoresis in the second dimension will increase the mobility of positive DNA topoisomers, whereas the mobility of the negative DNA

topoisomers will be decreased as depicted in the right part of the panel. Upon completion of the electrophoresis in the second dimension, the gels were stained with

ethidium bromide.

41F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

protein isolation from tissues (Goodwin and Johns, 1977)or

recombinant E. coli cultures (M.Š., unpublished). However,

interaction of the acidic C-tail of HMGB1 with a host of cellular

factors such as divalent cations (Štros et al., 1990) and other

nuclear proteins including histones H1 (Carballo et al., 1983;

Štros and Vorlíčková, 1990; Kohlstaedt and Cole, 1994; Hill et

al., 1999; Sheflin et al., 1993; Štros et al., 1994; Knapp et al.,

2004) may result in changes of the DNA binding properties of

HMGB1 similar to those observed in vitro upon remo val of the

C-tail (Figs. 6 and 8).

Fig. 8. Comparison of DNA bending by schistosome and human HMGB1 proteins and truncated forms. The

P-labeled 66-bp (panels A and B) or 123-bp (panels C, D

and E) DNA fragments (∼ 1 nM) were pre-incubated with increasing amounts of recombinant proteins (as indicated), followed by ligation with T4 DNA ligase as

detailed in the Materials and methods. Exonuclease III was used to verify the identity of DNA minicircles. The deproteinized DNA ligation products were subjected to

electrophoresis on 5.8% non-denaturing polyacrylamide gels and visualized by autoradiography and/or PhosphorImaging. FL, full-length HMGB1; ΔC, HMGB1

lacking the acidic C-tail; A, isolated domain A; B, isolated domain B. L1, linear monomers; L2, linear dimers. Exo III, exonuclease III.

42 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

3.5. DNA bending by schistosome HMGB1

An intriguing property of proteins containing the HMG-box

domain, including HMGB1, is that these proteins not only bind

with high-affinity to non-B type DNA conformat ions (such as

supercoiled DNA, four-way DNA junction and DNA mini-

circles), but they also actively distort DNA by bending/lo oping

and unwinding but it can also actively distort DNA by bending

or looping and changing of DNA-topology (Travers, 2000;

Thomas and Travers, 2001; Grasser, 2003; Paull et al., 1993; Pil

et al., 1993; Štros et al., 1994; Teo et al., 1995; Štros, 1998;

Sheflin and Spaulding, 1989; Murphy et al., 1999).

HMGB1 from several species, including rat and human, has

previously been shown to bend DNA using the ligase-mediated

circularization assay (the DNA ring closure assay) (Paull et al.,

1993; Pil et al., 1993; Teo et al., 1995; Štros, 1998). This assay

measures the efficiency with which T4 DNA ligase forms circles

from DNA fragments shorter than the persistency length (∼ 150-

bp). In the absence of internal curvature, the stiffness of a short

DNA fragment prevents intramolecular alignments so that

minicircles are detected only by a protein that bends DNA.

Using the above assay it was previously shown that the efficien-

cy to form mini-circles is decreasing in the order: HMGB1-

ΔC≥ HMGB1N domain B≫ domain A (Štros, 1998).

The T4 ligase-mediated cyclization assay was performed with

increasing amounts of schistosome or human HMGB1 and 66-bp

or 123-bp DNA fragments bearing sticky ends at low DNA

concentrations (∼1 nM) to promote intramolecular alignments at

the expense of intermolecular associations. The identity of DNA

minicircles was verified by their resistance to exonuclease III,

which digests only linear DNA molecules. Initial circularization

assays were carried out with a 66-bp DNA fragment. As shown in

Fig. 8A (FL), ligation of the 66-bp DNA by T4 DNA ligase in the

presence of SmHMGB1 (designated as FL) resulted in the

formation of DNA minicircles, the proportion of which 2–3-folds

were decreased when the cyclization experiments were carried out

with SmHMGB1 lacking the acidic C-tail, SmHMGB1-ΔC(Fig.

8A, ΔC). These results indicate that even the very short acidic C-

tail (5 acidic residues interrupted by 2 serines) could modulate the

ability of the DNA binding HMG-box domains of the

schistosome HMGB1 protein to promote DNA flexure of the

66-bp DNA duplex.

The formation of 66-bp minicircles obviously requires a

greater amount of DNA bending per bound HMGB1 than the

closure of larger DNA duplexes into minicircles (see also Yen et

al., 1998). In agreement with this assumption, the importance of

the short acidic C-tail of SmHMGB1 was diminished when the

size of the DNA duplex to be circularized had been ∼2-fold

increased, as evidenced by formation of similar percentage of

minicircles from 123-bp DNA duplexes by both SmHMGB1 and

SmHMGB1-ΔC(Fig. 8C). This contrasted to earlier observations

(Štros, 1998; Grasser et al., 1998) demonstrating that removal of

the long acidic C-tail (an unbroken run of 30 glutamic or aspartic

residues) from rat (human) HMGB1 protein resulted in a

significant decrease of the amount of DNA circularized (87-bp

or 123-bp DNA duplexes) as a function of protein input. The latter

observation was a possible consequence of excessive binding of

the A + B di-domain (SmHMGB1-ΔC) to DNA resulting in more

compact, higher-order, structures (Štros et al., 1994, 2000)with

reduced flexibility which had prevented alignment of the two

DNA ends and/or reduced accessibility of the ligase.

While DNA bending (and partially also supercoiling)

properties of isolated domains B from human or schistosome

HMGB1 were very similar, significant differences were obtained

between the isolated A domains. As shown in Fig. 8B, the human

HMGB1 domain A could bend 66-bp DNA only at ∼10-fold

higher protein/DNA input relative to the domain B. The efficiency

of the human domain A to form minicircles was higher when a

longer DNA duplex was used for the circularization assay, 123-bp

(Fig. 8D). On the other hand, no DNA bending was observed with

schistosome HMGB1 domain A, irrespective of the length of

DNAduplexused(Fig. 8B and D). The inability of the schis-

tosome domain A to bend DNA (Fig. 8A–D) parallels to certain

extent with its inability to supercoil DNA (Fig. 6B) at ∼ 150 mM I.

S. similar to that used for DNA bending. The observed differences

in DNA bending properties between human and schistosome

HMGB1 domains A may be partially related to small changes

within their N-termini, in particularly due to two more basic

residues in human (and slightly longer sequence) and the presence

of phenylalanine at position 18 in human domain A relative to the

alanine in the schistosome domain A (Fig. 1A). However, the

most likely explanation is that while the recombinant human

HMGB1 domain A contained the C-terminal flanking sequence

TKKK

, the recombinant schistosome HMGB1 domain A used

for DNA binding studies did not possess the corresponding

natural C-terminal flanking sequence

RSKKR

.The

TKKK

sequence seems to be also a prerequisite for efficient DNA flexure

by this domain (M.Š., unpublished; see also Štros, 1998, 2001).

Similarly, lower DNA supercoiling by human HMGB1-ΔCat

∼ 150 mM I.S. (Fig. 6D) than that previously reported at similar

conditions (Štros et al., 1994) is also very likely related to the

absence of the C-terminal flanking sequence in the truncated

HMGB1 protein used in the present paper.

Direct comparisons of DNA bending properties of the human

and S. mansoni HMGB1 proteins revealed that the schistosome

HMGB1 was more efficient in circularization of the 123-bp

DNA than its human counterpart (Fig. 8E) . These data might

suggest that the shorter acidic C-tail of the schistosome HMGB1

exhibited much weaker repressive effect on DNA bending than

the longer C-tail of the human HMGB1. However, definitive

conclusions are to be reached from the DNA circularization

experiments using schistosome A + B di-domain with attached

human or schistosome C-tails (the “switch-tail”) or vice versa.

Results presented in this report show for the first time that

parasitic helminths S. mansoni and S. japonicum contain HMGB1

proteins with primary amino acid sequences and DNA binding

properties related to the homologous vertebrate proteins. Our

study indicated higher DNA supercoiling and bending potentials

of these proteins as compared to their human counterpart.

Considering the high conservation of the HMGB-box domains

between human and schistosome HMGB1 proteins, the latter

differences are most likely to be explained by the presence of a

very short acidic C-tail in the schistosome HMGB1 proteins. This

is consistent with previous work of Lee and Thomas (2000) using

43F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

chimeric rat (human) HMGB1 and HMGB2 with switched acidic

C-tails. These authors have demonstrated that HMGB1 with the

longest acidic tail was less effective than HMGB2a and 2b with

shorter C-tails (at a given molar input ratio) in DNA supercoiling

and in inducing T4 ligase-mediated circularization of an 88-bp

DNA fragment. While removal of the acidic tails increased the

affinity of the HMG-boxes for DNA, it completely abolished the

differences between the three HMGB species (Lee and Thomas,

2000). Thus, the length and very likely also the sequence (Fig. 1B,

see also Payet and Travers, 1997; Ueda et al., 2004) of the acidic

tail appears to be the dominant factor in mediating the differences

in DNA binding properties among evolutionarily distinct

HMGB1 proteins to fulfill their different cellular roles. The

ability of HMGB1 protein to bend (and untwist) DNA, and to

physically interact with plethora of transcription factors and other

sequence-specific proteins, is the most plausible explanation of

functioning of HMGB1 in facilitation of DNA recombination and

transcription by promoting binding of these factors to their

cognate sites, and enabling communications of distant regulatory

elements by DNA looping (reviewed by Thomas and Travers,

2001; Agresti and Bianchi, 2003).

After this paper was submitted for publication, a report on

cloning and characterization of HMGB1 from S. mansoni and S.

haematobium was published (Gnanasekar et al., 2006). The

authors concluded that SmHMGB1 is a stage-specific protein,

being abundantly expressed in eggs and adult female stages, and

at moderate levels in skin-stage schistosomula. Whereas the main

focus of our paper is DNA binding properties of the SmHMGB1

protein, the paper of Gnanasekar et al. (2006) describes possible

pro-inflammatory functions of the parasite derived HMGB1

protein. SmHMGB1 was shown to be a potent inducer of a

number of pro-inflammatory cytokines such as TNFα,IL-1Rα,

IL-13 and MIP-1α from mouse peritoneal macrophages. Release

of pro-inflammatory cytokines by SmHMGB1 seemed to be

associated with the domain B of the protein, and anti-SmHMGB1

antibodies blocked the SmHMGB1-induced TNFα secretion from

mouse macrophages. As both TNFα and IL-13 represent critical

molecules in the development of egg-induced pathology of

schistosomias (e.g. Haseeb et al., 2001), it is likely that egg-

derived SmHMGB1 may have an important immunomodulatory

role in the development of egg-induced pathology and granuloma

responses in schistosomias.

The (nuc lear and extracellular) role of SmHMGB1 or

SjHMGB1 proteins (as well as other, not yet identified, proteins

of the HMGB-box family) remains to be established in the

complex cellular processes of the helminths S. mansoni and S.

japonicum. Knowledge about these processes would signifi-

cantly strengthen the ongoing efforts associated to functional

genomics with data derived from whole genome projects of S.

mansoni and S. japonicum which are near completion (El-Sayed

et al., 2004; Lukeš et al., 2005).

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Jennifer Fitzpatrick (University of

Cambridge) for preparing S. japonicum cDNA. The technical

assistance of Maria Marta Freire is also acknowledged. M.R.F. is a

recipient of CNPq fellowship. This research received financial

support from UNDP/World bank/World Health Organization/

TDR, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tec-

nológico, CNPq-PROFIX No. 540002/01-1 (CAPES — Coor-

denação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), by

the international collaboration program between Brazilian

Academy of Sciences and the Academy of Sciences of the

Czech Republic, and by grants to M.Š. from the Academy of

Sciences of the Czech Republic (AVOZ50040507: Biophysics of

dynamic structures of biological systems) and the Grant Agency

of the Czech Republic (204/05/2031). Finally, we would like to

thank an anonymous reviewer for his critical comments which

helped improve the quality of the final version of the manuscript.

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45F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

CURRICULUM VITAE

Nome: Isabel Caetano de Abreu da Silva

Nascimento: 13/02/1983

Naturalidade : Rio de Janeiro

 Formação Acadêmica

 Universidade Federal Fluminense – Bacharelado em Biologia do Desenvolvimento, agosto

de 2002 a julho 2006.

 Mestrado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica – Universidade

Federal do Rio de Janeiro.

 Orientação de Estudante

1. Maria Luiza Medaglia – iniciação científica de julho/2007 a novembro/2007.

 Comunicação em Congresso

 10 comunicações em congressos nacionais

 2 comunicações em congressos internacionais

 Publicações

Fantappié, M. R.; Oliveira, F. M. B.; Maciel, R. M., Mansure, J. J.; Furtado, D. R., Silva I. C.

e Rumjanek, F. D. Control of transcription in Schistosoma mansoni: Chromatin remodeling

and other regulatory elements.

Acta Tropica, 2008, in press.

Oliveira, F. M. B.;

Silva, I. C. A.; Rumjanek, F. D.; Dias-Neto, E., Guimarães, P.

E., Verjovski-Almeida, S., Štros, M., Fantappié, M. R. Cloning the genes and DNA binding

properties of High Mobility Group B1 (HMGB1) proteins from the human blood flukes

Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum. Gene, Estados Unidos, v.377, p. 33-45,

2006.

Oliveira, F. M. B.;

Silva, I. C. A.; Rumjanek, F. D.; Valadão, A. F.; Franco, G. R.; Mesquita

R. D.; Silva-Neto, M. A. C. e Fantappié, M. R. functional properties of Schistosoma mansoni

single-stranded DNA binding protein SmPUR-alpha. Description of the interaction between

SmPUR-alpha and SmYB1.

Molecular and Biochemical Parasitology, Estados Unidos, v.

135, p. 21-30, 2004.

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