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GERLANE DE MEDEIROS COSTA
Estudo histomorfológico e análise dos perfis celulares do rim cefálico, fígado,
baço e timo do Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887, Teleósteo,
Characidae), pacu
São Paulo
2007
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2
GERLANE DE MEDEIROS COSTA
Estudo histomorfológico e análise dos perfis celulares do
rim cefálico, fígado, baço e timo do Piaractus
mesopotamicus (Holmberg, 1887, Teleósteo, Characidae),
Pacu
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres
Orientador:
Prof. Dr. José Roberto Kfoury Junior
SÃO PAULO
2007
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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1921 Cagnoto, Daniela Gomes
FMVZ Estudo do desenvolvimento dos Sistemas Renais em embriões
bovinos (Bos indicus e Bos taurus) durante o período gestacional
compreendido entre 10 e 50 dias / Daniela Gomes Cagnoto. – São Paulo :
D. G. Cagnoto, 2007.
78 f. : il
.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, 2007.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres.
Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres.
Orientador: Profa. Dra. Arani Nanci Bomfim Mariana.
1. Pronefro. 2. Mesonefro. 3. Metanefro. 4. Embrião bovino.
5. Sistemas Renais. I. Título.
4
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: COSTA, Gerlane de Medeiros
Título: Estudo histomorfológico e análise dos perfis celulares do rim cefálico, fígado,
baço e timo do Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887, Teleósteo, Characidae),
pacu
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências
Data: _____/______/_____
Banca examinadora
Prof. Dr.: ________________________ Instituição: _____________________
Assinatura:_______________________ Julgamento: ____________________
Prof. Dr.: ________________________ Instituição: _____________________
Assinatura:_______________________ Julgamento: ____________________
Prof. Dr.: ________________________ Instituição: _____________________
Assinatura:_______________________ Julgamento: ____________________
5
DEDICATÓRIA
Às minhas três filhas Talita, Mariana e Iara, que são meu orgulho, alegria e os
maiores tesouros da minha vida, por sempre me acompanharem e nunca terem, em
nenhum momento, questionado ou cobrado a minha ausência.
Ao meu sogro e sogra, Edézio Barbosa de Lima e Magali Guerreiro de Lima, pela
ajuda e apoio incondicional desde o inicio, para que eu pudesse realizar este
sonho e dar este passo em minha vida.
Aos meus amigos de república Juliana Braz Freire e André Luiz Rezende
Franciolli com os quais pude contar em todos os momentos bons e ruins, alegres e
tristes, frios e quentes com muito bom humor e companheirismo. Eles foram
demais.
A todos os meus amigos, e eles sabem quem são, que estiveram comigo durante
esse tempo de USP me ajudando, acompanhando, apoiando, brigando, dando
risada, ensinando, aprendendo, nunca esquecerei vocês.
6
AGRADECIMENTOS
À FAPESP pelo apoio financeiro.
Ao meu professor, orientador e agora amigo Dr. José Roberto Kfoury Jr., o “meu
Zezinho”, por acreditar e confiar em mim desde o início, me apoiando e ajudando
em todas as horas que precisei dele.
Às minhas colegas de laboratório Renatinha (Renata Stecca Iunes), Ana Maria
Rita (Ana Rita Lima), Jana Maria (Janaína Munuera Monteiro) e Rose Maria
(Rosemary Viola Bosch) que muito me ensinaram e ajudaram em meus
experimentos e em minha vida durante esse tempo. Sem vocês eu não teria
chegado aqui.
Ao meu grande amigo e companheiro de sala de cubas, sala de aula prática, nas
horas que as peças chegavam para preparar, na hora de arranjar peças e
principalmente na hora em que precisei de um amigo Edinaldo Ribas Farias (o
Indio). Esse negão foi muito.
À Piscicultura XV de novembro – São João da Boa Vista-SP, por ter me cedido os
exemplares de excelente qualidade de pacu, sem os quais eu não teria realizado a
minha pesquisa.
Ao Jailton, funcionário responsável pelos tanques da piscicultura, por em nenhum
momento ter deixado de me atender. Estando sempre com um sorriso no rosto e
com extrema boa vontade, mesmo nas manhãs geladas dos finais de semana que o
fiz entrar nos tanques.
7
À professora Dra. Maria Angélica Miglino por ter criado este programa e eu
poder ter estado, assim como muitos outros, em um dos melhores programas de
pós-graduação do país.
Aos professores Dr. Francisco Javier Hernandez-Blazquez, Dr. Pedro Primo
Bombonato, Dra. Tatiana Carlesso e a Dra. Ana Flávia de Carvalho, pela ajuda e
esclarecimentos que me deram neste trabalho.
Aos amigos do departamento Maicon Barbosa da Silva, Jaqueline Martins de
Santana, Diogo Palermo, Ronaldo Agostinho da Silva, Sandra F. Affonso, Maise
Jesus de Oliveira, João do Carmo Freitas, Raimundo Leal de Sousa e Fátima de
Lourdes Minare por ter podido sempre contar com eles.
A todos os meus colegas de pós-graduação que me acompanharam, em especial a
Emerson T. Fioretto, que me ajudaram e apoiaram durante este período e neste
trabalho.
A todos os que, de alguma forma me ajudaram e contribuíram para realização
deste trabalho.
Muito obrigada.
8
RESUMO
COSTA, G. M. Estudo histomorfológico e análise dos perfis celulares do rim
cefálico, fígado, baço e timo do Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887,
Teleósteo, Characidae), pacu. [Histomorphologic study and analysis of the cellular
profiles of the head kidney, liver, spleen and thymus of Piaractus mesopotamicus
(Holmberg, 1887, Teleostei, Characidae), pacu]. 2007. 133f. Dissertação (Mestrado
em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2007.
O pacu, Piaractus mesopotamicus, é um teleósteo da Família Characidae,
intensivamente cultivado no Brasil por causa de sua rusticidade, crescimento rápido
e fácil adaptação, além de seu excelente sabor. Para uma melhor produção de
peixes, informações sobre seu sistema imunológico incluindo a histologia dos órgãos
linfóides se faz necessária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi descrever histo-
morfologicamente os órgãos linfóides: rim cefálico, fígado, baço e timo do Piaractus
mesopotamicus, analisando os perfis celulares de cada órgão. Foram utilizados 30
animais juvenis, com idade que variaram entre 5 meses a um ano, com peso médio
de 588.1 g e comprimento total médio de 27,51 cm. Os órgãos foram pós-fixados em
solução de paraformaldeído 4% e Karnovsky, depois desidratados, diafanizados em
xilol e incluídos em parafina. Os cortes foram obtidos com uma espessura de 4µm e
corados em hematoxilina-eosina. Os esfregaços sanguíneos foram corados em
Giemsa-May Grünwald para microscopia de luz. Para microscopia eletrônica de
transmissão as amostras fixadas em Karnovsky foram lavadas em sacarose e pós-
fixadas em tetróxido de ósmio 1%, desidratadas e emblocadas em resina Spurr. O
resultado da análise macroscópica mostra que a distribuição do rim, rim cefálico,
timo, fígado e baço são as mesmas encontradas na maioria dos teleósteos. Quanto
à forma desses órgãos, o fígado apresentou uma variação anatômica na forma e
números de lobos, sendo constituído por três lobos. O rim apresentou uma forma em
“H”, onde a região central deste se expandia sobre a bexiga natatória. O rim cefálico,
em animais com idade mais avançada, se apresentou como uma dilatação na região
cranial do rim, se mostrando bem visível. O timo e o baço apresentaram localização
e forma similares aos de outros teleósteos. A microscopia mostrou similaridades
entre os órgãos do Piaractus mesopotamicus e outros teleósteos. Na microscopia
9
eletrônica de transmissão foram observadas similaridades ultraestruturais das
células encontradas no rim cefálico, fígado, timo e baço e as já descritas em peixes
teleósteos. Hemácias, trombócitos, linfócitos, eosinófilos e células granulocíticas
especiais encontrados no sangue periférico, tanto de animais jovens quanto dos
animais com idade mais avançada, foram os mesmos tipos celulares descritos na
literatura de teleósteos. Observando nossos resultados concluímos que
histologicamente os órgão linfóides de Piaractus mesopotamicus são similares aos
de outros teleósteos e comparando os resultados de microscopia de transmissão
concluímos que as estruturas encontradas nas nossas análises são as mesmas das
descritas em outras espécies. Os resultados das nossas observações
macroscópicas mostraram que o pacu é uma espécie que apresenta algumas
características morfológicas singulares e que podem estar ligadas ao tipo de
alimentação e a adaptações evolutivas. Esses achados demonstram que a anatomia
dos órgãos de peixes e suas variações precisam ser analisados e correlacionados
com suas funções e forma de vida de cada espécie.
Palavras-chave: Células hematopoiéticas. Piaractus mesopotamicus. Órgãos
linfóides.
10
ABSTRACT
COSTA, G. M. Histomorphologic study and analysis of the cellular profiles of
the head kidney, liver, spleen and thymus of Piaractus mesopotamicus
(Holmberg, 1887, Teleostei, Characidae), pacu. [Estudo histomorfológico e análise
dos perfis celulares do rim cefálico, fígado, baço e timo do Piaractus mesopotamicus
(Holmberg, 1887, Teleósteo, Characidae), pacu.]. 2007. 133 f. Dissertação (Mestrado
em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2007.
Piaractus mesopotamicus (Pacu) is a fish from the Characidae Family, it is
intensively culture in Brazil because of its rusticity, easy raising and adaptation,
besides its excellent flavour. In order to produce a healthy fish, information on its
immunological system, including the histology of the lymphoid organs is needed.
Therefore, the objective of this study is to describe histomorphologicaly the lymphoid
organs: head kidney, liver, spleen and thymus of the Piaractus mesopotamicus,
analyzing the cellular profiles of each organ. Thirty young animals, with age varying
between 5 months to a year, with average weight and total length of 588.1 g and a
27.51 cm, respectively, were used. The organs were fixed in 4% paraformaldehyde
solution, and Karnovsky, afterwards dehydrated, diafanized in xilol and included in
paraffin. Four µm sections were obtained and stained with hematoxilin-eosin. Blood
smears were stained with Giemsa-May Grünwald for light microscopy. Samples for
transmission electric microscopy were fixed in Karnovsky, washed in sacarose and
post-fixed with osmium tetroxide 1%, dehydrated and embedded in resin Spurr. The
macroscopic analysis show that the localization of the kidney, head kidney, thymus,
liver and spleen are very similar to most of the teleosts. Some particularities were
observed in the liver, which presented an anatomical variation in the shape and
number of lobes, being constituted by three lobes. The kidney presented existe "H"
shape, where the central region overlaps the swimming bladder. The head-kidney, in
adult animals, presented an evident dilation in the cranial region of the kidney. The
thymus and spleen presented a similar location and shape to that of the teleosts. The
light microscopy studies showed similarities between the organs of the Piaractus
mesopotamicus and other teleost fishes. The transmission electron microscopy
studies showed ultrastructural similarities, of the cells from the head kidney, liver,
thymus and spleen with the literature. Eritrocytes, trombocytes, lymphocytes,
11
eosinophils and special granulocytic cells were found in peripheral blood of both
juvenile and adult animals and were similar to the cellular profiles described in the
literature to the other teleost fishes. Our studies were successful in describing the
macro, micro and ultrastructure of Piaractus mesopotamicus organs and may be
used as reference for further research aiming the improvement of fish health status in
aquaculture.
Key-words: Hematopoietic cell. Piaractus mesopotamicus. Lymphoid organs.
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografia em vista lateral do Piaractus mesopotamicus,
evidenciando a disposição dos órgãos “in situ”: rim (R), rim
cefálico (circulo pontilhado), baço (B), timo (T) e fígado (F).
Barra: 1 cm. ................................................................................. 56
Figura 2 - Fotografia dos órgãos “in situ” do Piaractus
mesopotamicus. A: Visão lateral da região média do rim
em forma de “H” (seta), dilatação do rim cefálico (círculo
pontilhado). Animal com 8 meses de idade:fixado em
formol 10%,Barra: 1,5 cm B: Posição em decúbito dorsal,
rim (circulo pontilhado) e rim cefálico (seta). Não é
possível observar uma clara distinção entre os dois
órgãos. Animal com 4 meses de idade a fresco. Barra:
3cm............................................................................................... 58
Figura 3 - A: posição em decúbito dorsal nota-se a membrana que
separa a cavidade celomática da cabeça (seta). Barra:
1,5cm. B: visão lateral do lobo dorsolateral direito do
fígado (F), dorsal a este lobo a bexiga natatória (BN),
observamos o lobo ventral evidenciando impressão do
estômago (Est) e a expansão lateral do rim sobre a bexiga
natatória (seta). Barra: 3cm. C: visão lateral esquerda do
fígado evidenciando o lobo dorsolateral direito (LDD) e
esquerdo (LDE) e lobo ventral (LV). Barra: 3cm........................... 60
Figura 4 - Visão lateral direita do timo direito (círculo). Barra: 3cm .............. 62
Figura 5 - Vista lateral direita do baço (circulo pontilhado),
caudalmente ao lobo dorsolateral direito (LDD),
ventralmente a bexiga natatória (BN) e dorsalmente a
porção média da vesícula biliar (seta). Barra: 1,5 cm....................63
13
Figura 6 - Fotomicrografia A: no rim, glomérulos (G) e cápsula de
Bowman (seta), vasos sangüíneos (V) e melano-
macrófagos (círculo pontilhado) dispersos no citoplasma.
Barra: 50µm B: túbulos contorcidos proximais, epitélio
cúbico simples (seta) e túbulos contorcidos distais com
epitélio cúbico baixo com luz central reduzida (*).
Coloração HE. Barra: 40µm...........................................................65
Figura 7- Fotomicrografia A: região medular do rim cefálico (RM) e
Região cortical (RC). Barra: 50µm. B: tecido adiposo
unilocular (TAU) e hemácias (círculo pontilhado).
Coloração HE. Barra: 50µm.......................................................... 69
Figura 8 - Fotomicrografia do rim cefálico. Observar no vaso
sangüíneo (seta vazia) hemácias; túbulos contorcidos
proximais (estrela azul); linfócitos (seta preta); célula
reticular (seta vermelha); trombócitos (seta verde); melano-
macrófagos livres (seta amarela) e melano-macrófagos
centrais (estrela vazia) Observar o parênquima constituído
em sua maioria por células sangüíneas relativamente
frouxas. Coloração HE. Barra: 40µm............................................ 70
Figura 9 - Fotomicrografia do rim cefálico: Parênquima constituído na
sua maioria por hemácias. Observar que a região cortical e
medular são pouco distintas. Coloração HE. Barra: 40µm ........... 71
Figura 10 - Eletromicrografia do túbulo contorcido proximal em área de
transição entre rim e rim cefálico. Na célula endotelial
microvilosidades apicais (seta fina), um núcleo de formato
irregular (estrela preta) com heterocromatina e
eucromatina (seta azul), vacúolos eletro-densos (estrela
branca) e muitas mitocôndrias (m). Desmossomos
interconectavam essas células (seta vermelha) e entre
14
uma célula e outra pôde-se observar uma célula limitante
(CL) Barra: 5µm............................................................................ 72
Figura 11 - Eletromicrografia do parênquima do rim cefálico. Observar
hemácias (seta laranja); trombócitos (seta vermelha);
linfócitos (seta azul) e eosinófilos (seta preta) Barra: de 5µm ...... 73
Figura 12 - Eletromicrogafia de eosinófilo do rim cefálico. Observar a
forma irregular da célula. Núcleo grande eucromático (N) e
um nucléolo evidente (seta branca fina). No citoplasma
presença de grânulos (G), mitocôndria (seta pequena) e
vacúolos (seta vermelha), Barra: 5µm.......................................... 74
Figura 13 - Eletromicrografia de protrombócito encontrado no rim
cefálico. Esta célula apresentava um formato arredondado,
núcleo eucromático grande em forma de ferradura (seta
branca), vacúolos (seta vermelha). Barra: 2µm............................ 75
Figura 14 - Eletromicrografia de mielócito. Observar o núcleo grande,
excêntrico com eucromatina (N). No citoplasma, presença
de vacúolos (V), vesículas (seta azul), retículo
endoplasmático rugoso (rer), mitocôndrias (m) e complexo
de Golgi (seta larga). Barra: 2µm ................................................. 76
Figura 15 - Eletromicrografia de linfócito no rim cefálico. Observar um
núcleo grande (N) com muita eucromatina. No citoplasma
mitocôndrias (m), alguns vacúolos (seta pequena) e
material granular. Barra: 2µm ....................................................... 77
Figura 16 - Eletromicrografia de uma célula tronco no rim cefálico.
Observar a o formato arredondado da célula com
pequenas projeções da membrana. Seu núcleo grande
com reentrâncias (estrela) e um nucléolo central (n). No
citoplasma complexo de Golgi (CG), vesículas (V),
15
vacúolos (seta vermelha), retículo endoplasmático (seta
pequena) mitocôndrias (m) e ribossomos livres (seta
verde). Barra: 2µm........................................................................ 78
Figura 17 - Eletromicrografia de monócito no rim cefálico. Observar a
forma irregular da célula com projeções citoplasmáticas
(seta larga branca), núcleo grande (N) com reentrâncias e
heterocromatina e eucromatina (seta branca). No
citoplasma presença de complexo de Golgi (CG), grânulos
(G), vesículas (seta vermelha), mitocôndrias (m) e
vacúolos (v). Barra: 2µm............................................................... 79
Figura 18 - Eletromicrografia de plasmócito no rim cefálico (seta
larga). Célula caracterizada pela grande quantidade de
reticulo endoplasmático rugoso em seu citoplasma (seta
vermelha). Núcleo grande central com heterocromática na
periferia (N), algumas mitocôndrias (m), vacúolos (V),
vesículas (seta azul) e material eletro-denso (seta verde)
disperso pelo seu citoplasma. Barra: 2µm.................................... 80
Figura 19 - Fotomicrografia A: Parênquima do fígado constituído por
hepatócitos (círculo pontilhado), artéria hepática (A), um
ducto biliar (seta) e um ramo da artéria (V). Barra: 50µm B:
Veia central (V) associada a um ducto. Coloração HE.
Barra: 50µm.................................................................................. 82
Figura 20 – Fotomicrografia do parênquima do fígado. Observar um
parênquima formado por hepatócitos em forma de cordões
e entre eles um pequeno vaso sinusóide (setas finas).
Células dendriticas ou endoteliais (seta larga) aparecem
entrem os hepatócitos. No interior dos hepatócitos observar
a presença de gotículas amarronzadas e espaços vazios.
Aumento Coloração HE. Barra: 20µm .......................................... 83
16
Figura 21 - Eletromicrografia do hepatócito.. Esta célula apresentou um
núcleo grande com cromatina condensada na periferia e
dispersa pelo núcleo (N). No citoplasma grânulos (G),
mitocôndrias (m), complexo de Golgi (cg) e reticulo
endoplasmático rugoso (seta). Barra: 2µm....................................84
Figura 22 - Eletromicrografia de estruturas do hepatócito. Observar a
presença de um complexo de Golgi (seta larga) bem
desenvolvido, mitocôndrias (m) e vacúolos (V) onde poderia
estar contido gordura. Barra: 2µm ................................................ 85
Figura 23 - Fotomicrografia. A: timo constituído pelo Corpúsculo de
Hassall (circulo pontilhado), vasos sangüíneos (seta)
Barra: 50µm B: no tecido conjuntivo presença de vaso
sangüíneo (V) e infiltrado mononuclear (circulo). Coloração
Tricromo de Masson. Barra: 50µm .............................................. 88
Figura 25 - Fotomicrografia de luz de parênquima tímico sem definição
de zona cortical e medular. Parênquima constituído por
hemácias (h), timócito (seta amarela), eosinófilo (seta
branca) e células imaturas (ci). Coloração HE. Barra: 20µm........ 89
Figura 26 - Eletromicrografia de célula tronco do timo. Observar o
formato irregular, com núcleo grande com cromatina
heterogênea (N), nucléolo excêntrico (n) e disperso no
citoplasma mitocôndrias, Complexo de Golgi e vacúolos.
Barra: 2µm.................................................................................... 90
Figura 27 - Eletromicrografia de eosinófilo encontrado no timo de
Piaractus mesopotamicus. Célula com formato irregular,
núcleo excêntrico e grânulos dispersos em seu citoplasma.
Barra: 2µm.................................................................................... 91
17
Figura 28 - Eletromicrografia de trabécula (tr) encontrada no timo.
Constituída por células achatadas com núcleo pequeno no
ápice celular (seta), vaso sangüíneo (V), no parênquima
fibras colágeno (FC), células reticulares (CR), células
limitantes (CL) e grânulos (G). Barra: 10µm................................. 92
Figura 29 - Eletromicrografia de timócito. Célula com núcleo grande de
formato irregular (N), hetrorocromatico (estrela).
Apresentando projeções na membrana citoplasmática (seta
larga), vacúolos (V) e Complexo de Golgi (CG) no
citoplasma. Barra: 2µm................................................................. 93
Figura 30 - Eletromicrografia de célula limitante no timo. Observar a
forma irregular da célula (CL) com extensões
citoplasmáticas (seta larga). Seu núcleo irregular
acompanha a forma da célula (N). Barra: 2µm............................. 94
Figura 31 - Eletromicrografia de “nurse-cells”. Observar vacúolos (V),
vesículas com material flocular (seta larga) e pequeno
complexo de Golgi (seta vermelha) dispersos no citoplasma.
Barra: 2µm.................................................................................... 95
Figura 32 - Fotomicrografia. A: baço constituído por polpa branca (PB)
e polpa vermelha (PV). Barra: 50µm B: trabécula (T)
dividindo o parênquima, constituída por tecido conjuntivo
(seta), artérias (A) e veias (V). Coloração HE. Barra: 50µm......... 98
Figura 33 - Fotomicrografia de luz do parênquima do baço. Foram
observados dispersos pelo parênquima vasos sanguineos
(V), melano-macrófagos livres (seta branca), eosinófilos
(seta amarela) e linfócitos (seta azul). Coloração HE.
Barra: 20µm.................................................................................. 99
18
Figura 34 - Eletromicrografia de célula reticular do baço. Célula de
formato irregular e pequenas projeções citoplasmáticas
(seta azul), com núcleo grande heterocromático (N).
Observar no citoplasma mitocôndrias (m) e material eletro-
denso (seta branca). Barra: 2µm ................................................ 100
Figura 35 - Eletromicrografia de esplenócito. Observar a forma
arredondada da célula, núcleo com cromatina condensada
na membrana (N) e citoplasma granular (G). Observar
extensões celulares de células limitantes (CL) conectando-
as (seta). Barra: 2µm.................................................................. 101
Figura 36 - Eletromicrografia de célula limitante no baço. Célula com
forma irregular (CL) e núcleo heterocromático
acompanhando a forma da célula (seta). Observar que a
célula envolve uma “nurse cells”” (CN). Barra: 2µm ................... 102
Figura 37- Fotomicrografia das células sangüíneas encontradas no
sangue periférico de Piaractus mesopotamicus. A:
eosinófilos (eo), trombócitos (t), hemácia (seta) e linfócito
(l). B: célula granulocítica especial (cge). C: célula imatura
(ci) e neutrófilo (n). D: monócito (m). Coloração de
Panótico rápido. Barra: 20µm..................................................... 105
19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................22
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 24
2.1 ÓRGÃOS LINFÓIDES.................................................................................................... 24
2.1.1 Rim................................................................................................................................. 26
2.1.2 Rim Cefálico................................................................................................................ 27
2.1.3 Fígado........................................................................................................................... 32
2.1.4 Timo............................................................................................................................... 38
2.1.5 Baço .............................................................................................................................. 43
2.2 LEUCÓCITOS ................................................................................................................. 46
2.2.1 Monócitos-Macrófagos ............................................................................................ 47
2.2.2 Melano-Macrófagos Centrais ................................................................................. 47
2.2.3 Granulócitos ............................................................................................................... 48
2.2.4 Linfócitos..................................................................................................................... 49
2.2.5 Células Granulocíticas Especiais ......................................................................... 49
2.2.6 Trombócitos................................................................................................................ 50
2.2.7 Eosinófilos................................................................................................................... 51
20
2.2.8 Neutrófilos................................................................................................................... 51
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 52
3.1 MATERIAL ....................................................................................................................... 52
3.2 MÉTODOS ....................................................................................................................... 53
3.2.1 Microscopia de Luz................................................................................................... 53
3.2.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão............................................................. 54
4 RESULTADOS............................................................................................................... 55
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA......................................................................................... 55
4.1.1 Rim................................................................................................................................. 56
4.1.2 Rim Cefálico................................................................................................................ 56
4.1.4 Timo............................................................................................................................... 60
4.1.5 Baço .............................................................................................................................. 61
4.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA......................................................................................... 63
4.2.1 Rim................................................................................................................................. 63
4.2.2 Rim Cefálico................................................................................................................ 65
4.2.3 Fígado........................................................................................................................... 80
4.2.4 Timo............................................................................................................................... 85
21
4.2.5 Baço .............................................................................................................................. 96
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 105
5.1 RIM .................................................................................................................................. 105
5.2 RIM CEFÁLICO............................................................................................................. 106
5.3 FÍGADO .......................................................................................................................... 110
5.4 TIMO ............................................................................................................................... 112
5.5 BAÇO .............................................................................................................................. 114
5.6 SANGUE......................................................................................................................... 115
6 CONCLUSÕES................................................................................................118
REFERÊNCIAS.......................................................................................................119
22
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui grande potencial hídrico e climático, possibilitando o cultivo de
diversas espécies de peixes. Contudo, a piscicultura ainda apresenta resultados
modestos de desenvolvimento devido aos processos de produção adotados e à falta
de informações sobre as espécies nativas (BEERLI; LOGATO; FREITAS, 2004).
O pacu, Piaractus mesopotamicus (HOLMBERG, 1887), é um teleósteo da
Família Characidae, a qual engloba a maior parte dos peixes de água doce do
Brasil, com cerca de 400 espécies (BRITSKI, 1970; FERRAZ DE LIMA, 1993). É
uma espécie endêmica da bacia dos rios Paraná-Paraguai, de grande importância
econômica, sendo a mais cultivada da região neotropical (SEREVI, 2000).
Entretanto, Petreri Jr. (1989) descreveu sua distribuição como sendo uma espécie
originária do Rio Prata e do Pantanal do Mato Grosso, sendo morador habitual dos
rios Paraná, Mogi-guaçu, Paraíba e baixo Tietê.
O pacu é um peixe de escamas, com corpo rombóide e achatado, possuindo
uma coloração uniforme, variando do castanho ao cinza escura, com o ventre
amarelado. Os dentes são do tipo molariforme (BRITSKI, 1970). Apresenta
respiração branquial obrigatória, sobrevivendo tanto em ambiente natural quanto em
viveiros de criação. Quando submetido à baixa tensão de oxigênio dissolvido,
desenvolve a formação de uma expansão temporária do lábio inferior, vulgarmente
chamada de beiço (FERRAZ DE LIMA et al., 1995).
No ambiente natural sua maturação sexual ocorre por volta dos quatro anos
de idade, com cerca de 34 cm de comprimento total. Para sua comercialização seu
tamanho ideal para captura é de 40 cm de comprimento (ALMEIDA, 2003).
Esta espécie é migratória, onívora, apresenta hábito alimentar
especificamente frugívoro-onívoro, do tipo podador e de caráter oportunista. Tem
como principais características, alta capacidade de aproveitamento de alimentos de
origem vegetal, carne firme e com excelente sabor, resistente, de fácil crescimento,
desova completa e de fácil adaptação para a produção em confinamento
(CESTAROLLI et al., 1984; SILVA, 1985; CASTAGNOLLI; CYNIRO, 1986;
CASTAGNOLLI, 1992).
23
Das espécies nativas mantidas em estabelecimentos de pesca esportiva no
Estado de São Paulo, os peixes “redondos” (pacu, tambaqui e seus híbridos) são os
que ocorrem com maior freqüência (VENTURIERI, 2002). É uma espécie de
importância econômica por ter uma grande aceitação pelo mercado consumidor. O
pacu é uma das espécies brasileiras mais estudadas nas áreas da biologia,
ecologia, nutrição e aqüicultura. Apesar disso, muitas dúvidas ainda persistem sobre
as exigências nutricionais e fisiológicas desta espécie dada a grande diversidade de
sistemas de cultivo, ambientes ocupados, ingredientes e aditivos para rações,
manejo do cultivo e outros fatores que determinam diferentes respostas dos animais
(ALMEIDA, 2003).
Apesar de já haver o aprimoramento das técnicas de reprodução, alimentação
e manejo na piscicultura, muitos problemas ainda precisam ser resolvidos (BEERLI;
LOGATO; FREITAS, 2004), principalmente em relação ao conhecimento do seu
sistema imune para se garantir a qualidade da higidez do animal e, desta forma, ter
uma produção satisfatória e saudável dos peixes nestes sistemas de cultivo.
Considerando a grande diversidade de espécies de peixes teleósteos e a
conseqüente variação morfofisiológica, o sistema linfóide permite uma grande área
de estudos. Apesar de, nas últimas décadas, vários estudos terem sido realizados,
pouco se conhece, havendo pouca informação sobre estruturas e função dos órgãos
linfo-hematopoiéticos de teleósteos (ROCHA et al., 2001).
Conhecendo a importância econômica do pacu (Piaractus mesopotamicus) e
considerando a pouca informação sobre a morfologia dos órgãos do seu sistema
imune, este trabalho objetivou o estudo histomorfológico e a análise de seus
componentes celulares pela microscopia de luz e eletrônica de transmissão do rim
cefálico, fígado, timo e baço, visando o melhor entendimento da funcionabilidade e
produção celular dos mesmos.
24
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Esta revisão procura apresentar sucintamente o estudo da
histomorfologia dos órgãos linfóides de peixes e suas características ultraestruturais.
2.1 ÓRGÃOS LINFÓIDES
Em mamíferos o sistema de defesa é constituído pelo Sistema Linfático e o
Vascular, formando o Sistema hematolinfático, o qual é constituído pelo baço, timo,
linfonodos e nódulos linfáticos (BANKS, 1992).
Tizard (2002) separa os órgãos do Sistema Imune de vertebrados maiores em
dois grupos: órgãos linfóides primários, constituídos pelo timo, pele, placas de Peyer,
glândulas linfoepiteliais, medula óssea e bursa de Fabricius em aves. Têm por
função regular a produção e a diferenciação dos linfócitos, de modo que os linfócitos
maduros, por sua vez, se encaixem em duas populações principais, as células T e B,
dependendo do órgão linfóide primário de sua maturação. Os órgãos linfóides
secundários são constituídos pelos linfonodos, nódulos hemolinfáticos e baço, e são
responsáveis pela resposta e estimulação antigênica produzindo células de defesa e
são ricos em macrófagos, células dendítricas e linfócitos T e B, os quais medeiam as
respostas imunes.
De acordo com Zapata, Chibá e Varas (1996), em peixes modernos, incluindo
condrictes e osteictes, o sistema linfo-hematopoiético compõe-se por timo, baço e
um fígado em desenvolvimento, que apresentam agregados linfóides, além de um
grande número de diferentes órgãos que vão, desde uma meninge primitiva até o
rim, contendo tecido linfo-hematopoiético, condição típica de vertebrados que
possuem pouca medula óssea. Esses três autores relataram também que os peixes
primitivos não possuem medula óssea linfo-hematopoiética, sendo a formação de
células sanguíneas provenientes de órgãos distintos, cujas estruturas e funções são
semelhantes às da medula óssea de vertebrados maiores.
25
Em teleósteos de água doce os órgãos linfóides são constituídos pelo timo,
rim (pro- e mesonefron) e baço. O timo é o primeiro órgão a se desenvolver e o rim
contém progenitores hematopoiéticos não linfóides. Nos teleósteos marinhos ocorre
o inverso, onde o maior órgão linfóide é o rim, depois o baço e finalmente o timo,
ressaltando-se que o baço da larva teria uma função mais eritropoiética do que
linfopoiética (ZAPATA et al., 2006).
Segundo Fishelson (2006) os teleósteos da Família Apogonidae, possuem
timo, baço, rim cefálico e fígado formando o sistema linfo-hematopoiético principal.
Para Stoskopf (1993) os peixes são desprovidos de medula óssea, fonte de
células mielóides de anuros e vertebrados maiores. Não apresentam linfonodos e o
tecido linfóide e mielóide estão associados ao rim em teleósteos e esturjões, e ao
fígado em elasmobrânquios e hagfish.
Segundo Chilmonczyk (1984) e Fange e Pulsford (1985) o timo nos peixes
representa o mais primitivo dos tecidos linfóides. Os linfócitos são a população
celular predominante, entretanto, não estão organizados num córtex distinto, como
ocorre na medula de mamíferos.
Os órgãos linfóides são constituídos principalmente por linfócitos, monócitos,
trombócitos, granulócitos e eritrócitos. A intensidade das atividades hematopoiéticas
dos órgãos linfóides difere entre as diferentes espécies de peixes teleósteos
(TAVARES-DIAS; MORAES, 2004). Além disso, existe ainda uma séria de tipos
celulares descritos de diferentes formas por diferentes autores que também fariam
parte dos órgãos do sistema imune e que se diferenciam entre as varias espécies de
peixes teleósteos (BIELEK, 1981; ZAPATA, 1983; ZUASTI; FERRER, 1988;
MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991; ROCHA et al., 2001).
O tecido hematopoiético está associado ao fígado em lampréias, tubarões e
raias. A válvula espiral dos cartilaginosos é rica em tecido mielóide, que também
está associado ao órgão epigonal e ao órgão de Leydig (STOSKOPF, 1993), sendo
também o baço um importante órgão linfomielóide nestas classes, produtor de
eritrócitos, linfócitos e trombócitos (WALSH; LUER, 1998).
Nos peixes teleósteos o tecido hematopoiético localiza-se no interstício renal,
estroma esplênico, nos espaços periportais hepáticos, submucosas intestinais, no
peritônio e no timo (QUENTEL; OBACH, 1992).
26
O processo de renovação das células do sistema imune é realizado através
da hematopoiese, onde ocorre à diferenciação de células tronco multipotentes em
células progenitoras na medula óssea (BARREDA; NEUMANN; BELOSEVIC, 2000).
Em mamíferos a hematopoiese é desencadeada em resposta a fatores
estimulantes da colônia exógena de macrófagos e outros fatores de crescimento
(STAFFORD et al., 2001), enquanto nos peixes a produção de macrófagos se deve
a fatores de crescimento endógenos, responsáveis por regularem sua diferenciação
e proliferação, eventos pouco conhecidos em vertebrados menores como os
teleósteos (NEUMANN; BARREDA; BELOSEVIC, 1998).
2.1.1 Rim
O rim em vertebrados maiores é uma glândula tubular composta, formada por
túbulos renais, apresentando em algumas espécies apenas um lobo, embora, em
outras, a lobação possa persistir ou fundir-se secundariamente. Este lobo é formado
por componentes medulares e corticais exercendo um papel central na criação e
manutenção de um ambiente interno, no qual as células constituintes são capazes
de prosperar e, em contrapartida, funcionar como um órgão endócrino, secretando
renina, fator eritropoiético renal e metabólitos ativos da vitamina D. O rim e as vias
urinárias filtram o sangue, removendo os produtos residuais, recuperando os
metabólicos úteis, armazenando os resíduos líquidos e transportando os produtos
residuais para o exterior (BANKS, 1992).
Ellis e Souza (1974) e Zapata (1979, 1981) e Hibiya (1982) relataram que o
rim de teleósteos apresenta função excretora e é um importante órgão linfóide
composto de dois segmentos distintos: um anterior cefálico, rim cefálico ou pronefron
e o médio ou posterior, tronco do rim ou protonefron, embora estruturalmente
similares. Essas regiões mostram capacidade hematopoiética, sendo maior no rim
cefálico, cuja função renal desapareceu.
A função excretora do rim de peixes é observada, primeiramente, no rim
caudal. O rim cefálico contém uma variedade de tecidos que não têm função no
sistema urinário (STOSKOPF, 1993).
27
Segundo alguns autores, nos peixes, o rim cefálico ou protonéfron é um órgão
muito complexo, que realiza diversas funções e é formado por uma variedade de
células e tecido epitelial (MESSEGUER et al., 1991; ESTEBAN; MESSEGUER,
1994; FISHELSON, 1996; BECKER; FISHELSON; AMSELGRUBER, 2001).
De acordo com Fergunson (1995) o rim de teleósteos é um órgão fundido que
se encontra localizado retroperitonealmente na região dorsal da cavidade
celomática, ventralmente à coluna vertebral, frequentemente aderido nestes
processos.
Histologicamente, o rim de peixes é extremamente variável. O glomérulo é
estruturalmente similar ao glomérulo de mamíferos, composto por um corpúsculo
renal completo, com cápsula de Bowman, arteríolas aferentes e células
justaglomerulares. O tamanho dos glomérulos é altamente variável entre as
espécies: os peixes de água doce têm glomérulos maiores e mais numerosos que
peixes marinhos, e algumas espécies marinhas apresentam rim aglomerular
(STOSKOPF, 1993). Fergunson (1995) descreveu o rim contendo nefrons com
variadas quantidades de tecido hematopoiético e linfóide no interstício e Hibiya
(1982) observou que este era constituído por muitos nefrons e por tecido linfóide e o
rim cefálico composto por tecido linfóide.
Ainda segundo Stoskopf (1993), os peixes não apresentam alça de Henle e o
túbulo contorcido distal ocorre apenas no rim de peixes de água doce. A diferença
entre o túbulo contorcido distal do túbulo contorcido proximal é a presença de
células epiteliais que são menos eosinofílicas e sem borda em escova.
2.1.2 Rim cefálico
O rim cefálico representa o principal órgão formador de células sangüíneas
em teleósteos (ZUASTI; FERRER, 1988; BIELEK, 1981).
Segundo Powell (2000) o rim cefálico em peixes teleósteos, primariamente é
formado por tecido hematopoiético, contendo células hematopoiéticas e fagocíticas.
Na sua porção posterior contém túbulos e glomérulos do sistema excretor,
parecendo ser um órgão multifuncional, porém não possuindo função excretora e
osmorregulatória.
28
De acordo com Fergunson (1995), este órgão apresenta tecido
hematopoiético e linfóide e elementos endócrinos, células de cromatina e tecido
interrenal podem ser localizados ao redor de vasos sanguíneos maiores, relativo à
medula e córtex na adrenal de mamíferos.
Foi observado por Rocha et al. (2000) que o rim cefálico apresenta um
parênquima composto por uma glândula interrenal formada por grupos, celulares;
tecido cromafin formado por pequenos grupos de células cromafin e melano-
macrófagos centrais adicionados ao tecido linfóide e hematopoiético.
No rim cefálico cada linhagem de células hematopoiéticas parece ser
diferenciada a partir de células progenitoras (AL-ADHAMI; KUNS, 1976) com uma
importante capacidade linfo e plasma-citopoiética (SMITH et al., 1967). A atividade
hematopoiética no rim cefálico de teleósteos varia entre uma espécie e outra,
podendo ser considerado um órgão linfopoiético ou exclusivamente eritropoiético,
entretanto este órgão pode, em algumas espécies, ter uma função exclusivamente
linfo ou eritropoiética, enquanto em outras pode apresentar uma função
hematopoiética plena (ELLIS et al., 1976; ZAPATA, 1980).
Fishelson (1996) descreveu que durante a ontogênese o rim cefálico,
inicialmente funciona como órgão hematopoiético parenquimatoso, função que mais
tarde desaparece e o órgão passa a ter predominantemente funções de excreção e
endócrinas.
Rocha et al. (2001) descreveu o rim cefálico de Brycon cephalus composto
por lobos bilaterais fundidos, localizados anteriormente a bexiga natatória e
ventrolateralmente a coluna espinhal. Apresenta a superfície ventral recoberta por
peritônio parietal e o lobo direito ligeiramente maior que o lobo esquerdo.
Conforme Hibiya (1982), no rim cefálico o tecido linfóide e o intertubular,
tecidos hematopoiéticos de teleósteos, são compostos de tecido reticular, células
reticulares e muitos capilares, podendo ser encontrados no interior destes tecidos,
mastócitos e células maduras do sangue, observando-se ainda mitoses que
indicariam o processo de formação de células sanguíneas.
Já para Stoskopf (1993) o tecido linfóide é completamente proeminente no rim
cefálico, que é altamente vascularizado, contendo células maduras do sangue no
interior de seus capilares como as células hematopoiéticas. A atividade mitótica
deste tecido apresenta-se normalmente elevada.
29
Histologicamente o rim cefálico é recoberto por uma cápsula de tecido
conjuntivo fibroso denso (ROCHA et al., 2001), constituído por uma rede reticular de
células estromais, macrófagos livres e elementos linfóides, além de células
granulopoiéticas, trombopoiéticas e eritropoiéticas (MESEGUER; ESTEBAN;
AGULLEIRO, 1991).
Tecido linfóide e hematopoiético formados por uma variedade de tipos
celulares, glândula interrenal, tecido cromafin, grupos de melano macrófagos
centrais e livres, células vermelhas em diferentes estágios de maturação
adicionados ao tecido hematopoiético e linfóide foram observados constituindo o
parênquima do rim cefálico de Sea bass (MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO,
1991), Clarias gariepinus (VERMEULEN et al., 1995), Sparus auratus (ZUASTI;
FERRER, 1988, 1989) e Hoplias malabaricus, (MELA et al., 2006). Entretanto, foi
relatado por Vermeulen et al. (1995) em Clarias gariepinus, que o tecido interrenal
desta espécie está localizado em outros órgãos e em Hoplias malabaricus, a maior
parte das células que constituem o rim cefálico são de leucócitos e células
vermelhas em diferentes estágios de maturação (MELA et al., 2006).
Para Zuasti e Ferrer (1988) o rim consiste de ambos os tecidos, excretor e
hematopoiético, sendo que o tecido hematopoiético é encontrado principalmente na
porção anterior do rim (rim cefálico) e todos os tipos celulares encontrados no rim
cefálico são originadas de uma única célula tronco.
Ultraestruturalmente as células encontradas no rim cefálico de algumas
espécies de peixes teleósteos estudados como Brycon cephalus (ROCHA et al,
2001), Dicentrarchus labrax (ESTEBAN et al., 1989; MESEGUER et al., 1990),
Sparus auratus (ZUASTI; FERRER, 1988,1989) entre outras, as mais comumente
encontradas e descritas foram macrófagos, melano-macrófagos, células estromais,
células reticulares, linfócitos e células granulopoiéticas. Entre estas descrições,
diferentes autores relataram diferenças estruturais relativas ao tamanho do núcleo,
granulação e forma e os colocaram em séries dentro de grupos.
Os melano-macrófagos podem ser encontrados livres ou agrupados como
melano-macrófagos centrais. Estas células continham grânulos ou hemossiderina e
estavam frequentemente associadas aos lisossomos (MESEGUER; ESTEBAN;
AGULLEIRO, 1991). São células pigmentadas com material heterogêneo ou
granular, com coloração que vai do amarelo ao marrom escuro. Quando há o
aumento no número destas células no rim cefálico, indica o aumento da atividade
30
fagocítica no órgão (RABITTO et al., 2005; MELA et al., 2006). O tamanho, número e
conteúdo são altamente variáveis, estando este fato relacionado à espécie, idade e
status de saúde (AGIUS, 1980).
Os macrófagos são células grandes de formato irregular, com um núcleo
excêntrico de margem irregular, ocasionalmente apresentam nucléolos. Em seu
citoplasma encontram-se dispersos lisossomos de variados tamanhos, mitocôndrias
com cristas escassas, vesículas, um complexo de Golgi pequeno, ribossomos e
reticulo endoplasmático rugoso e pode haver a presença de debris (ELLIS, 1976;
FERGUNSON, 1976; BIELEK, 1980; HAWKINS et al., 1981).
Entre as células estromais estão inclusas as células sinusóides, que formam
uma parede entre o tecido hematopoiético e o sangue. Apresentam um formato
achatado, estando conectadas por interdigitações celulares e junções intercelulares.
O seu citoplasma apresenta pequenas vesículas, microfilamentos, microtúbulos, um
pequeno complexo de Golgi, ribossomos livres, lisossomos, peroxissomos e
glicogênio (ZAPATA, 1983; FÄNGE; NILSSON, 1985; CROCKER; MORRIS;
GORDON, 1988; MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991).
Células reticulares formam uma rede de tecido hematopoiético. São células
grandes com processos de filamentos citoplasmáticos e se ligam por desmossomos.
Apresentam um núcleo redondo heterocromático, algumas mitocôndrias, ribossomos
livres, complexo de Golgi e numerosas vesículas arredondadas de variados
tamanhos, algumas contendo material moderadamente denso, homogêneo ou
granular. Estas células também foram classificadas como células reticulares tipo
macrófagos. Seus processos celulares circundavam eritroblastos ou outro tipo de
célula hematopoiética. Apresentavam um núcleo lobado heterocromático e
numerosas vesículas com material heterogêneo (ZAPATA, 1983; CROCKER;
MORRIS; GORDON, 1988; MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991).
Linfócitos foram observados em todas as espécies estudadas, livres ou em
pequenos agrupamentos, apresentando tamanho grande e pequeno. Sua
constituição era similar em ambos os tamanhos e mostraram uma forma
arredondada com margem irregular, um núcleo grande oval ou arredondado e
central com cromatina condensada e um nucléolo excêntrico. Disperso no seu
citoplasma mitocôndrias, ocasionalmente cisternas de reticulo endoplasmático
rugoso, complexo de Golgi e ribossomos livres. A superfície da célula em alguns
31
casos apresentava microvilos curtos (CHILMONCZYK, 1978; MILLER et al., 1985;
ZUASTI; FERRER, 1989).
Células granulopoiéticas segundo Zuasti (1988) consistem de séries de
promielócitos, mielócitos, metamielócitos e granulócitos maduros. Os promielócitos
são células arredondadas edentadas, apresentam um núcleo pequeno
heterocromático. No seu citoplasma há presença de grânulos, ribossomos, cisternas
de reticulo endoplasmático granular e algumas mitocôndrias. Os mielócitos são
células que apresentam um núcleo excêntrico heterocromático, no seu citoplasma
pequenas vesículas, cisternas de reticulo endoplasmático e citoplasmático e
grânulos eletro-densos. Em Dicentrarchus labrax apresentavam um núcleo
pregueado com heterocromatina abundante e no citoplasma, cisternas de reticulo
endoplasmático rugoso e algumas mitocôndrias estavam presentes (MESEGUER;
ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991). Os metamielócitos são células irregulares com
núcleo excêntrico e pouca heterocromatina densa no núcleo, podendo se apresentar
profundamente pregueado. O citoplasma mostra numerosos grânulos,
homogeneamente eletro-densos circundado por uma membrana, algumas cisternas
de reticulo endoplasmático liso, ribossomos livres e complexo de Golgi justanuclear
(ZAPATA, 1979; ZUASTI, 1988; MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991). Os
granulócitos maduros são similares aos metamielócitos, exceto por possuir um
grande número de grânulos no citoplasma (ZUASTI, 1988). Esta célula mostrou um
delineado irregular, com núcleo lobado excêntrico com heterocromatina na periferia.
Em seu citoplasma estavam presentes ribossomos livres, pequenas mitocôndrias
arredondadas, um complexo de Golgi bem desenvolvido e alguns grânulos
pequenos de glicogênio (ELLIS, 1977; BIELEK, 1981; MESEGUER; ESTEBAN;
AGULLEIRO, 1991).
Plasmócitos também formam observados e descritos como células
arredondadas ou ovais, com núcleo grande central ou excêntrico com blocos de
heterocromatina periféricos. A característica citoplasmática mais aparente desta
célula são as numerosas cisternas de retículo endoplasmático rugoso. Ribossomos,
mitocôndrias e numerosos grânulos de tamanhos e densidades diferentes estavam
relacionados a um complexo de Golgi bem desenvolvido. Estas células também
foram classificadas como plasmócitos maduros e sua principal característica foi a
presença de numerosas cisternas de reticulo endoplasmático rugoso dilatados
32
preenchidos por um material granular (PULSFORD; FANGE; MORROW, 1982;
SAVAGE, 1983; ZUASTI; FERRER, 1989; ROCHA et al., 2001)
Há muita discussão e controvérsias a respeito de classificação e descrição
das células do rim cefálico. Diferenças estruturais e ultraestruturais descritas para
diferentes células em diferentes espécies de peixes podem ter relação apenas com a
sazonalidade, maturidade sexual, idade, status de saúde ou mesmo adaptabilidade
ambiental como sugerido por vários autores. Não tendo essas células uma função ou
origem diferenciada.
2.1.3 Fígado
O fígado de mamíferos é a maior glândula isolada do corpo desempenhando
diversas funções metabólicas. Essas funções são realizadas por dois tipos celulares:
os hepatócitos e as células de von Kupffer (BANKS, 1992).
Os hepatócitos têm alto potencial mitótico e suas funções são de síntese,
secreção, armazenamento, biotransformação e metabolismo. As células de von
Kupffer são células do sistema macrofágico, revestem as regiões dos sinusoídes
hepáticos, estando a atividade fagocitária do fígado ligada a função destas células
(BANKS, 1992).
Segundo Takashi (1982) o fígado é uma das glândulas digestivas que se
desenvolve de um brotamento do saco embrionário invaginando-se do arquêntero. É
composto por células parênquimais hepáticas e arranjos de fibras cuja função é
suportar a estrutura do órgão.
Em peixes, o fígado é um órgão compacto localizado ventralmente na
cavidade celomática. Seu tamanho, forma e volume estão adaptados ao espaço
utilizado pelos outros órgãos viscerais e varia muito entre as espécies. Apresenta
uma coloração vermelho-pardo amarronzado (BRUSLÉ; ANADON, 1996), ou
avermelhado (OSTRANDER, 2000), ocasionado pela densa vascularização,
tendendo para o amarelo, quando o estoque de gordura é alto. Em muitas espécies
de teleósteos o fígado é dividido em três lobos, entretanto, em alguns casos
nenhuma lobação é reconhecida (BRUSLÉ; ANADON, 1996). Apresenta uma
33
superfície lisa recoberta por membrana serosa e alguns tecidos conjuntivos desta
cápsula se estendem pelo parênquima (OSTRANDER, 2000; FISHELSON, 2006).
Segundo Fergunson (1995) o fígado, em algumas espécies de peixes, é um
órgão separado na porção anterior da cavidade celomática, enquanto em outras é
dividido em lobos que se interligam com o intestino, podendo ter o comprimento da
cavidade abdominal.
De acordo com Vincentine et al. (2005) o fígado de tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus) é um órgão largo com apenas dois lobos. O lobo esquerdo é
maior e se estende através de quase toda cavidade corpórea. Na face visceral
observa-se a impressão do intestino. A vesícula biliar é bem desenvolvida e tem um
formato arredondado.
Estruturas e função do fígado em teleósteos não apresentam grandes
diferenças em comparação ao fígado de vertebrados maiores, estando as maiores
funções do fígado relacionadas ao controle da homeostasia da glicose realizado
pelas brânquias e ramos dos nervos simpáticos e parassimpáticos, assim como na
detoxificação de substâncias estranhas e produção de glucagon e insulina
(FISHELSON, 2006). Alguns estudos relataram alterações no fígado causadas por
organoclorados e outros xenobióticos, existindo a possibilidade de usar estas
alterações como bioindicadores de poluição ambiental (HINTON; LAUREN, 1980;
FREDELLO et al., 2001).
De acordo com Fergunson (1995) o fígado também realiza funções
metabólicas similares à dos mamíferos e, apesar de contradições nas informações
relatadas, teleósteos possuem drogas metabolizando enzimas nas fases de
ativação, inativação de grupos reativos e conjugação. Considerando o crescente
número de xenobióticos ambientais, é de grande importância o rápido e eficiente
caminho destas combinações pelo intestino, brânquias e pele destes animais para a
adaptabilidade e sucesso do grupo.
Células fagocíticas mononucleares encontradas nos sinusoídes do fígado são
conhecidas como células de Kupffer. Essas células fagocíticas, atacam bactérias e
vírus no sangue (KENDALL; HAWKINS, 1975). Se a função das células Kupffer em
peixes for similar a dos fígados de mamíferos, então essas células são capazes de
apresentar antígenos para o linfócito T (ROITT; ROSTOFF; MALE, 1993).
34
Segundo Powell (2000) o fígado em peixes também é responsável pela
produção de proteínas serosas e de linfócitos adjacentes durante uma infecção,
atuando como sistema de defesa.
A histologia é essencialmente similar à dos mamíferos, embora sua lobação
seja menos distinta e menos organizada. A típica tríade da veia porta é bem óbvia
como em mamíferos (FERGUNSON, 1995).
Em certas espécies de peixes o tecido pancreático exócrino pode ser
observado circundando a veia porta.
Segundo Akiyoshi e Inoue (2004) um grande número de estudos morfológicos
de células hepáticas, hepatócitos, células endoteliais, células de Kupffer, células de
ductos biliares no nódulo hepático e no sistema biliar têm revelado detalhes de sua
relação e estabelecido estruturas e funções do fígado. Eles estudaram o fígado de
200 espécies de peixes teleósteos, estas espécies pertenciam a três ordens e doze
famílias e relataram que em quase todos os peixes as unidades estruturais
conhecidas como lóbulos hepáticos estavam ausentes. Na maioria das espécies o
fígado era composto principalmente de um campo compacto contínuo de
hepatócitos, com ilhas de tecido conjuntivo próximo a ductos biliares e vasos
arteriais. Em algumas poucas espécies, os lóbulos hepáticos foram demarcados por
tecido conjuntivo contendo ductos biliares, veia porta e artérias, similares ao trato
portal em mamíferos.
As estruturas hepáticas dos peixes foram classificadas por Akiyoshi e Inoue
(2004) em três tipos diferentes: em forma de cordões; em forma tubular e forma
sólida. No tipo cordão a maioria dos hepatócitos estavam alinhados em camadas
simples. Os sinusóides hepáticos eram dilatados e estavam diretamente ligados por
vasos perilobulares. Os hepatócitos tinham formato poliédrico com núcleo
arredondado. Na forma tubular a maioria dos hepatócitos alinhavam-se em dupla
camada e os capilares sinusóides tinham formato irregular e estreito, surgindo entre
o interstício e as camadas hepáticas. Três a quatro hepatócitos circundavam um
capilar sinusoidal. Os hepatócitos eram poliédricos ou arredondados com núcleo
redondo. Na forma sólida a maior parte dos hepatócitos se alinhavam em camadas
múltiplas. Os sinusóides hepáticos eram estreitos e os capilares pequenos e
tortuosos. Neste caso os hepatócitos eram redondos com núcleos pequenos e
arredondados. Em todos os casos o citoplasma dos hepatócitos estava preenchido
com gotículas de gordura.
35
Para Hinton, Snipes e Kendall (1972) e Hinton e Pool (1976) o parênquima
hepático de teleósteos é constituído por duas linhas celulares circundadas por
sinusoídes. Entre os sinusoídes os hepatócitos são arranjados em cordões que se
estendem entre a zona portal e centrais.
Bruslé e Anadon (1996) descreveram o parênquima hepático do teleósteo
Micropogon undulatus como sendo muito homogêneo constituído por hepatócitos
poligonais, muitas vezes fracamente basofílicos se comparados aos de mamíferos.
Apresenta núcleo esférico com um único nucléolo central. Ao redor dos sinusóides
os hepatócitos estavam arranjados como cordas, usualmente com duas células
grandes, mas bifurcações e anastomoses destas cordas podiam resultar em quatro
ou mais camadas de células, circundados por sinusóides. As tríades eram
constituídas por uma ramificação da veia portal, uma artéria hepática e um ducto
biliar bem distintos. Este mesmo arranjo foi observado em Oreochromis niloticus
(VINCENTINE et al., 2005), estando o ducto biliar localizado próximo a veia porta e
era constituído por um epitélio cúbico simples. Uma camada concentrada de
colágeno e fibras musculares foi observada sob o epitélio.
Mela et al. (2006), estudando o efeito da contaminação por mercúrio em
Hoplias malabaricus, descreveu o fígado de indivíduos do grupo controle constituído
por hepatócitos organizados em cordões, geralmente apresentando duas células
grandes entre dois sinusóides contínuos.
Elementos vasculares, veias, artérias e ducto biliar foram observados
espalhados dentro do parênquima do fígado de Salmo trutta por Rocha, Monteiro e
Pereira (1994) tendo sido descrita a presença de alguns vasos sanguíneos que não
estavam associados a nenhum outro vaso e outros estavam associados a uma ou
duas arteríolas. Observou-se também uma associação de três elementos, uma veia,
uma ou duas arteríolas e o ducto biliar. Os ductos biliares estavam tanto isolados
como em grupos de duas ou três unidades. Frequentemente, uma arteríola estava
associada aos ductos, arteríolas isoladas foram raramente observadas. Células Ito
foram ocasionalmente observadas no espaço Disse (ROCHA; MONTEIRO;
PEREIRA, 1994). Estas células foram encontradas em conexão com vasos venosos
de pequeno calibre por Rocha, Monteiro e Pereira (1997) e veias centrais foram
observadas dispersas no parênquima (ROCHA; MONTEIRO; PEREIRA, 1994).
Para Hacking, Budd e Hodson (1977) o sistema sinusoidal do fígado de truta
arco-iris era morfologicamente similar a de outros animais, exceto pela ausência
36
evidente de células de Kupffer. As células associadas com os sinusóides eram
células de armazenamento de gordura e células endoteliais. Estas células tinham
algumas extensões citoplasmáticas curtas no lúmen sinusoidal.
Fujita, Tamaru e Miygawa (1980) observaram a ocorrência de numerosos
desmossomos entre as células Ito de alguns teleósteos, sugerindo que essas células
têm a função de suporte nestes animais, juntamente com a vitamina A,
armazenando gordura.
No fígado de bacalhau uma característica do sistema de suporte de células de
Ito e seus processos citoplasmáticos, constituem redes tridimensionais que formam
o órgão (FUJITA, 1985), sendo estas células o principal componente celular no
espaço perisinoidal deste órgão (FUJITA et al., 1986),
Arellano, Storch e Sarasquete (1999) relataram que em fígado de Solea
senegalenses o sistema porta, ducto biliar e arteríolas hepáticas não estão
agrupados juntos na tríade hepática e não apresentavam lóbulos hepáticos.
Rocha, Monteiro e Pereira (1994, 1997) descreveram em truta marrom (Salmo
trutta) o fígado composto, principalmente por um campo compacto de hepatócitos
com sinusóides e ilhas de tecido conjuntivo que envolvem ductos biliares, vasos
arteriais e venosos. Os hepatócitos estão organizados radialmente em túbulos
sinuosos e ramificados, aparecendo como placas com dois ou mais hepatócitos. Em
algumas áreas do tecido conjuntivo foi observada a presença de células fortemente
pigmentadas coradas em grupos, os melano-macrófagos centrais.
Bruslé e Anadon (1996) relataram que veias hepáticas classicamente
localizadas no centro dos lóbulos hepáticos, também chamadas veias centro lobular,
são encontrados dispersas em todas as partes do parênquima hepático, estando
ausente os lóbulos hepáticos. Eles também relataram a ocorrência de melano-
macrófago centrais no parênquima hepático de Lutjanus bohar e Plectropomus
leopardus. O tamanho, número e conteúdo destas células são altamente variáveis,
dependendo da espécie, idade e estado de saúde do animal. Estão normalmente
localizados próximos as arteríolas hepáticas, veias portais ou ductos biliares.
Segundo estes autores eles concentram materiais heterogêneos como lipofucsina,
melanina e hemosiderina, que podem ter um papel na neutralização de radicais
livres potencialmente tóxicos e produção de cátions durante peroxidação de lipídeos
insaturados.
37
Segundo Mela et al. (2006) os melano-macrófagos são células pigmentadas
com material heterogêneo ou granular de cor amarelo ao marrom escuro e podem
aparecer isoladas ou arranjadas em grupos formando os melano-macrófagos
centrais.
Entre os hepatócitos adjacentes ao espaço de Disse foram observados em
Salmo trutta, macrófagos com citoplasma rico em pequenas vesículas e
fagolisossomos, porém pobres em organelas. Células alongadas e pleomorfas no
espaço perisinusoidal emitiam projeções citoplasmáticas finas, apresentavam
poucos microtúbulos, alguns retículos endoplasmáticos rugosos e gotas de lipídios.
Estas células foram consideradas como células de Ito ou células estreladas
(ROCHA; MONTEIRO; PEREIRA, 1997). Em Solea senegalenses foi observado que
os hepatócitos apresentavam muitas gotas lipídicas durante a época de reprodução
(ARELLANO; STORCH; SARASQUETE, 1999).
Ultraestruturalmente os hepatócitos de peixes apresentam um núcleo
arredondado, localizado centralmente. A cromatina é granular com heterocromatina
condensada localizada na periferia do núcleo. O nucléolo é mais homogêneo e se
apresenta muito eletro-denso. O retículo endoplasmático rugoso muitas vezes está
disposto paralelamente ao núcleo. As mitocôndrias são arredondas ou alongadas e
estão associadas ao reticulo endoplasmático rugoso. Vacúolos citoplasmáticos de
diferentes tamanhos estão distribuídos no citoplasma (VINCENTINE et al., 2005).
Rocha, Monteiro e Pereira (1997) descreveram hepatócitos com um núcleo
simples e um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso e glicogênio, sendo
o reticulo endoplasmático liso escasso (ROCHA; MONTEIRO; PEREIRA, 1994). O
revestimento dos sinusóides possuíam projeções ramificadas em formato de dedos,
estendendo-se através do espaço de Disse. Células do endotélio sinusoidal
apresentavam um típico aspecto alongado achatado freqüentemente fenestrado
(ROCHA; MONTEIRO; PEREIRA, 1997).
Hinton e Pool (1976) observaram que hepatócitos de Ictalurus punctatus
apresentavam acima da zona lateral microvilos que se estendiam para dentro das
passagens biliares. Estas células apresentavam organelas múltiplas, incluindo
mitocôndrias e retículo endoplasmático rugoso organizados ao redor do núcleo,
assim como ao longo e próximo a membrana citoplasmática, formando uma fina
camada eletro-densa limitante entre os hepatócitos. Corpos lipídicos também eram
esporadicamente visíveis no citoplasma dos hepatócitos. Seus núcleos
38
apresentavam uma abundante eucromatina e pouca heterocromatina condensada
na periferia e um nucléolo evidente e central.
Hepatócitos de Solea senegalenses apresentavam um núcleo arredondado
eucromático com nucléolo proeminente. Ao redor do núcleo havia duas ou três
cisternas de retículo endoplasmático rugoso, não tendo sido observado um
complexo de Golgi evidente. O reticulo endoplasmático liso era pouco desenvolvido
se localizando na periferia da célula. Um grande número de mitocôndrias e poucos
lisossomos estavam dispersos no citoplasma. Lisossomos apresentavam dois tipos
morfológicos: arredondados com matriz homogênea muito escura e pleomorfos com
conteúdo heterogêneo (ARELLANO; STORCH; SARASQUETE, 1999). Hacking,
Budd e Hodson (1977) também observou em teleósteos, um citoplasma rico em
lisossomos, que se apresentavam como estruturas arredondadas com uma matriz
homogênea escura.
Em peixes, grandes agregados de macrófagos ou melano-macrófagos
centrais, normalmente encontrados no sistema linfático e outros órgãos, estão
envolvidos em vários processos de fagocitose, armazenamento e detoxificação de
bactérias e corpos estranhos (TSUJI; SENO, 1990; FREDELLO et al., 2001).
Micale e Perdichizzi (1990) demonstraram que o crescente número de
melano-macrófagos centrais no fígado e baço de peixes é induzido por fatores
ambientais. Seguindo observações em Ciclídeos, Fishelson (1996) concluiu que um
aumento anormal no número de melano-macrógafos centrais identifica um estresse
ambiental.
2.1.4 Timo
Segundo Fishelson (2006) o timo em peixes é um órgão linfático primário e o
fornecedor central de linfócitos ao sangue, de células T do sistema imune, como
também fonte de timina. Em teleósteos, exerce um importante papel no
desenvolvimento do sistema imune totalmente funcional, como demonstrado pela
timectomia (NAKANISHI, 1986; TREDE, 1998).
Em várias espécies de peixes, essa glândula produz timosina, uma
linfoproteína que estimula a produção de linfócitos em todos os centros linfáticos. O
39
tipo de célula dominante no timo é a célula T imunoativa, que é produzida pelo
mesmo e amadurece no baço (FISHELSON, 2006).
O timo desenvolve-se a partir de grupos de células endoteliais e
mesenquimais, separadas pelas terceira e quarta bolsa de brânquias embrionárias
(FISHELSON, 2006).
De acordo com Fergunson (1995) o timo pode ser detectado em algumas
espécies de peixes alguns dias antes da eclosão do ovo e, em outros, apenas após
a metamorfose da larva. Entretanto, na maioria dos peixes esta glândula se forma e
se torna completa e funcional ainda no estágio de embriogênese (FISHELSON,
2006).
Geralmente, se desenvolve na lâmina própria do trato gastrointestinal, em
bolsas localizadas na base dos arcos branquiais, que então migram para o
mesênquima durante a ontogênese (BOWDEN; COOK; ROMBOUT, 2005). Na
maioria dos teleósteos está localizado perto da cavidade da brânquia e está
intimamente associado ao epitélio faringeano (CHILMONCZYK, 1992).
Em carpa doméstica o timo surge primeiramente na forma de corpos
redondos alongados presos a ambos os lados da base do opérculo e se
desenvolvem acima dos arcos branquiais (FISHELSON, 1995). São compostos por
massas relativamente soltas de células semelhantes a timócitos jovens, que
apresentam um núcleo proeminente (BECKER; FISHELSON; AMSELGRUBER,
2001).
Hibiya (1982) descreveu o timo como um órgão branquiogênico, estando
localizado na parede dorsolateral da faringe, a partir do quarto arco branquial. Sua
superfície ventral é recoberta por uma mucosa epitelial, onde há uma camada de
tecido conjuntivo adjacente. A face dorsal possui uma linha subseqüente de
músculos e o parênquima consiste de tecido linfóide, o qual é quase inteiramente
composto de linfócitos.
Esta glândula existe em todas as classes de peixes, exceto nos Agnatas,
representados pelas lampreias. Infiltrações de linfóides foram observadas no
músculo faringeano e acúmulos de linfócitos foram descritos no epitélio faringeaano
em larvas de lampreias. O tecido linfóide é localizado no sangue dos sinusoídes, os
quais ocorrem na lamina própria faringeana, sendo considerado como um
equivalente do timo (CHILMONCZYK, 1992). Entretanto tem sido sugerido que a
prega existente no meio de intestino, encontrado em invertebrados e agnatas, pode
40
ter atividade tímica em lampreias, tendo sido também sugerido que linhagens de
células se diferenciaram e colonizaram diferentes áreas e proliferaram para formar
tecidos linfóides sob influencia de fatores ambientais (BOWDEN; COOK;
ROMBOUT, 2005).
Em estudos com Apogon annularis, A. cyanosoma, A. cookii, o timo está
situado atrás da cápsula ótica, dorsocranialmente à cabeça do rim, e à dissecação é
freqüentemente visto como uma marca externa de melanossomas pretos, dispersos
na cobertura epitelial (FISHELSON, 2006).
Em peixes, assim como em vertebrados maiores, a involução tímica ocorre
devido a variações fisiológicas ou estímulos externos. Está associada principalmente
ao envelhecimento, maturidade sexual, induzido por estresse, períodos do ano e
hormônios. A involução do timo não é uma regra geral para peixes e pode variar.
Depois da incubação, o timo do peixe normalmente aumenta em tamanho e
extensão e atinge seu máximo crescimento nas semanas e meses seguintes. A
morfologia geral pode parecer a mesma durante toda a vida ou pode sofrer
mudanças significativas. Em carpas e tubarões primitivos o timo parece não involuir,
enquanto que o timo de grandes raias e tubarões regride (CHILMONCZYK, 1992).
De acordo com Fishelson (1995) e Becker, Fishelson e Amselgruber (2001)
essa glândula se diferencia do timo de vertebrados mais desenvolvidos, por
permanecer ativa e continuar a aumentar durante o curso de vida dos peixes.
Porém, segundo Liu et al. (2004) em Paralichthys olivaceus, ele interrompe o seu
desenvolvimento e diminui sua atividade em períodos de reprodução, determinadas
épocas do ano e idade, podendo apresentar quadros de involução.
A estrutura característica do timo de peixe é uma cápsula envolvendo um
córtex de tecido linfóide. Em zebrafish granulomas foram descritos como agregados
de macrófagos dentro da cápsula, formados sem o envolvimento de células T
(DAVIS et al., 2002; BOWDEN; COOK; ROMBOUT, 2005).
O parênquima tímico consiste de linfócitos, macrófagos, células dendríticas
interdigitantes e células mielóides, havendo no estroma linfócitos com morfologia de
células epiteliais. Trabéculas são bem distintas em algumas espécies de peixes
(ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996; BOWDEN; COOK; ROMBOUT, 2005).
O timo é composto de células linfóides diferenciadas (timócitos) dentro de
uma rede de células epiteliais e geralmente está organizado em zona cortical e
medular (MANNING, 1994). Esta demarcação foi baseada na histologia de diferentes
41
espécies de peixes (ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996), incluindo a carpa (ROMBOUT
et al., 1997). Entretanto, a presença de um córtex e uma medula não é uma
constante (TREDE; ZON, 1998) e seus papéis ainda não foram bem definidos
(CHILMONCZYK, 1992). Segundo Gorgolon (1983) e De e Pal (1998),
diferenciações nas estruturas do timo são muito variáveis entre os teleósteos. Em
muitas espécies de peixes não é clara a diferenciação cortico-medular, assim como
parece ser em vertebrados maiores (LUER, 1995; DE; PAL, 1998; LIU et al., 2004).
Em algumas espécies eles podem estar arranjados para formar um córtex e medula
aparentes, com Corpúsculos de Hassall podendo ser observados (FERGUNSON,
1995).
Segundo Bowden, Cook e Rombout (2005) o timo pode ser considerado um
agregado de macrófagos encapsulados que funciona como um sistema de
proliferação de células T.
A presença de uma rede epitelial tímica foi observada em diversas espécies
de peixes (ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996), mas uma classificação uniforme de
elementos epiteliais e seus possíveis papéis funcionais não foram identificados
(ROMANO et al., 1999).
Estruturas linfóides estão situadas na superfície dorsal da cavidade branquial.
São cobertas por um epitélio muito fino e possuem um estroma de tecido conjuntivo.
O maior número de componentes celulares é de timócitos, porém células epitelióides
ou macrófagos e células eosinófilicas granulares também podem estar presentes
(FERGUNSON, 1995).
Além dessas células, outros três tipos com extensões citoplasmáticas
ramificadas são encontradas no timo: reticulócitos, macrófagos e retículo-
epiteliócitos (FISHELSON, 2006).
As extensões do retículo-epiteliócito criam uma malha envolvendo grupos de
timócitos. As células tronco pluripotentes que formam os reticulócitos também são a
fonte dos macrófagos e ambos os tipos de células são muito ativas, especialmente
em endocitoses (CHILMONCZYK, 1984; FISHELSON, 1995; BECKER;
FISHELSON; AMSELGRUBER, 2001).
Ultraestruturalmente os timócitos são pequenas células com núcleo redondo,
com um cariossoma proeminente, cercado por um citoplasma relativamente estreito
com pequenas mitocôndrias (FISHELSON, 2006).
42
Corpúsculos de Hassall constituem as organelas mais específicas do timo,
assim como em vertebrados maiores (FISHELSON, 1995). Em algumas espécies de
peixes estudados, eles são corpos redondos de até 30µm de diâmetro, formados por
agregados de fagócitos, cercados por um envelope constituído por extensões de
reticulócitos, interconectados por numerosos desmossomos. Os Corpúsculos de
Hassall juvenis são menores, compreendendo apenas algumas células e uma única
camada de células reticulares que as circundam. Com a idade e o crescimento dos
corpúsculos, o número de reticulócitos ao redor aumenta (FISHELSON, 2006).
O microambiente tímico, onde ocorre a interação de células do estroma e
timócitos, é composto por células epiteliais tímicas e várias outras células do
estroma. Estas células foram caracterizadas como células epiteliais tímicas
limitantes e as “nurse cells” (XIE et al., 2006) de acordo com a sua distribuição e
características citológicas nas áreas internas e externas do timo (ROMANO et al.,
1999; XIE et al., 2006).
Células epiteliais tímicas limitantes são observadas na zona subcapsular,
subseptal e perivascular, em paralelo com a superfície do timo, delineando a zona
apical e a zona exterior. Essas células são eletro-luzentes com projeções alongadas
de tonofilamentos. Também são observadas células mucosas nesta zona
(CASTILLO et al., 1991; ROMANO et al., 1999; XIE et al., 2006).
As células epiteliais tímicas “nurse cells” são bifurcadas, formando uma rede
epitelial tridimensional e apresentam linfócitos viáveis intactos nos vacúolos das
suas invaginações. Estas células estão conectadas por desmossomos à sua célula
epitelial adjacente formando uma cobertura continua que cobre a zona apical e a
divide em outras zonas (PULSFORD et al., 1991; FLAÑO et al., 1996; XIE et al.,
2006). Células epiteliais ”nurse cell” possivelmente desempenham o papel de
formação de um microambiente necessário para a maturação dos timócitos
(ROMANO et al., 1999). Estas células foram diferenciadas de outros tipos celulares
pela densidade de eletrons no citoplasma pouco eletro-luzentes e vacúolos com
conteúdo flocular e por algumas apresentarem inclusões eletro-densas e organelas,
como reticulo endoplasmático e mitocôndrias (XIE et al., 2006).
No timo também foram observados linfócitos formando uma rede, conectados
por processos citoplasmáticos de diferentes tipos de células epiteliais (ZAPATA;
CHIBA; VARAS, 1996; XIE et al., 2006).
43
2.1.5 Baço
O baço é segundo Banks (1992), a maior massa de tecido linfático do corpo
de mamíferos. Exercendo múltiplas funções como formação de células sanguíneas,
metabolismo de hemoglobina e ferro, distribuição de hemácias, filtração e
armazenamento de sangue. O baço é uma mistura de seios fagocitários, estroma de
fibras reticulares e parênquima celular, não havendo a diferenciação de córtex e
medula. O parênquima é formado por polpa vermelha e polpa branca.
Em peixes, o baço se apresenta como um corpo plano, elipsóide, com uma
coloração vermelha escuro e justaposta ao fígado. Este órgão linfático apresenta
uma citologia muito mais heterogênea do que o timo. Ele é constituído internamente
por células do retículo endotelial dos quais seus processos formam lóbulos contendo
grupos de células brancas e vermelhas (FISHELSON, 2006).
A superfície do baço é revestida por uma membrana serosa que é constituída
principalmente por tecido conjuntivo. Uma parte desta cápsula estende-se
internamente, formando uma rede trabecular. A artéria que entra gradualmente
dentro do baço se ramifica em pequenos vasos e forma uma rede de capilares. O
baço é constituído por essas duas redes e por células que preenchem os espaços
dentro das redes. Essas células são compostos por eritrócitos, linfócitos e
macrófagos (HIBIYA, 1982; ZAPATA, 1982).
Citologicamente, o baço em peixes teleósteos é muito similar aquele de
vertebrados maiores (QUESADA; VILLEVA; ANGULLEIRO, 1990). Apresenta uma
separação pronunciada muito menor na polpa vermelha, contendo uma rede de
cordões e polpa branca com tecido linfático (IWAMA; NAKANISHI, 1996).
No baço de Osteictes, não há distinção entre polpa vermelha e polpa branca
como ocorre em baço de mamíferos. As regiões ricas em eritrócitos e linfócitos são
misturadas (HIBIYA, 1982).
Para Zatapa (1982) essas regiões são bem distintas em Rutilus rutilus e
Gobio gobio e estão frequentemente associadas ao tecido pancreático. Para ele a
polpa branca desta espécie é constituída por células linfóides dispostas em densos
grupos dentro de redes de células reticulares.
44
Sailendri e Muthukkaruppan (1975) descreveram o baço de Tilapia
mossambica como sendo constituído por polpa vermelha e branca, sendo que a
polpa vermelha é totalmente eritróide, com muito poucos linfócitos. A polpa branca é
constituída por redes reticulares ao redor de vasos sanguíneos, sendo bem pequena
e pobremente desenvolvida e estas áreas apresentaram vários tipos celulares como
granulócitos, monócitos e eritrócitos.
Trabéculas são frequentemente encontradas no baço de teleósteos e se
apresentam como invaginações de tecido conjuntivo no parênquima do baço com
vasos e artérias no seu interior (SAILENDRI; MUTHUKKARUPPAN,1975; HIBIYA,
1982; ZATAPA,1982).
Segundo Liu et al. (2004), o baço foi observado em Paralichthys olivaseus no
oitavo dia de encubação, porém ficou mais visível no décimo primeiro dia. Está
localizado dorsalmente ao mesogástrio e perto do tecido pancreático. Mostrou-se
como uma massa sólida de células, com formato esférico, não havendo distinção
entre polpa vermelha e polpa branca, tanto em jovens como em animais adultos.
No baço dos teleósteos, recipientes sanguíneos elipsoidais são menos
desenvolvidos do que no baço de elasmobrânquios, mas são organizados de acordo
com o mesmo padrão, com capilares terminais que mostram uma fina camada de
células endoteliais, cercada por uma fina bainha de fibras reticulares e macrófagos
(YOFFEY, 1929).
Junto à proliferação de células vermelhas do sangue, o baço de teleósteos é
muito rico em macrófagos, que podem funcionar não apenas como sistema de
defesa, mas também produzindo hidrolases lisossomais, proteínas do sistema
complemento e parcialmente interferon, superóxido e radicais hidróxidos. O baço
contém numerosos neutrófilos e eosinófilos, tornando essa glândula um grande local
de fagocitose de matéria particulada e células sanguíneas, bem como de atividade
hematopoiética (FISHELSON, 2006).
Alguns autores também analisaram o padrão histoenzimático de macrófagos
elipsoidais do baço do teleósteo, observando suas similaridades a zona marginal de
macrófagos do baço de mamíferos (YOFFEY, 1929; PRESS; DANNEVIG;
LANDSVERK, 1994). Uma zona marginal limitando a polpa branca e vermelha não
está presente no baço de teleósteo e, de acordo com estudos de microscopia de
varredura em moldes de corrosão vascular, a circulação esplênica está aberta aos
45
capilares arteriais que terminam na rede reticular da polpa vermelha (KITA;
ITAZAWA, 1990).
A ligação antígena, resposta e produção de anticorpos foram observadas em
trutas e esplenócitos podem ser estimulados indiretamente, sugerindo a presença de
células T e B no baço de teleósteos (IWAMA; NAKANISHI, 1996).
Funções do tecido linfóide esplênico de teleósteos permanecem controversas,
embora seu papel no processamento antigênico pareça certo. A esplenectomia não
tem efeito em respostas humorais em alguns teleósteos, apesar de, em outras
espécies, o baço aparentemente represente um importante órgão linfóide (YU et al.,
1976).
Tatner (1985) observou uma migração preferencial de timócitos dentro do
baço de trutas, havendo um maior envolvimento do baço em respostas imunes
secundárias.
Para Zapata (1981) em Gobio gobio e Rutilus rutilus, ultraestruturalmente as
células que constituíam a rede reticular eram grandes e de forma irregular com
muitos filamentos citoplasmáticos que se ligavam entre si por desmossomos. Os
linfócitos se caracterizaram por seu citoplasma escasso e núcleo altamente eletro-
denso. Os linfoblastos se mostraram como células grandes com núcleos pouco
eletro-densos e citoplasma abundante com muitos polissomos. Plasmócitos
continham retículo endosplamático rugoso e mitocôndrias eletro-densas dispersas
em seu citoplasma.
Melano-macrófagos foram observados no tecido hematopoiético de baço de
Trichogaster leeri e Xiphophorus maculatus e eram compostos de grupos de células
normalmente encapsulados por uma camada celular fina, também se apresentando
como células dispersas Essas células contêm grandes quantidades de pigmentos de
ferro livre, provavelmente lipofucsina, podendo ter um significante papel como
depósito e desnaturação de lipoproteínas, não parecendo desempenhar nenhum
papel significante no manejo de ferro (LEKNES, 2004, 2007).
Descrições ultraestruturais das células que compõem o parênquima do baço
foram raramente encontradas.
46
2.2 LEUCÓCITOS
Peixes, da mesma forma que mamíferos, possuem leucócitos que são
produzidos por diferentes órgãos, com diferentes funções. Estas células, em
teleósteos, são produzidas pelo rim cefálico, fígado, baço e timo e a maioria realiza
funções de defesa imune. São classificados conforme a sua morfologia,
ultraestrutura e marcação histoquímica em monócitos, macrófagos, melano-
macrófagos, linfócitos, granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e células
citotóxicas não-específicas (CAMPBELL, 1988; ROWLEY et al., 1988; FÄNGE,
1994; IWAMA, 2004). Porém, diferentemente de mamíferos, não há marcadores de
superfície celular conhecidos em número suficientes para estas células, os quais
seriam usados no reconhecimento e no estudo de sub-populações funcionais de
leucócitos. (CAMPBELL, 1988; FÄNGE, 1994; PASTORET et al., 1998).
Os peixes estão desprovidos de medula óssea e de linfonodos, desta forma
os tecidos mielóide e linfóide estão associados ao mesmo órgão, sendo o tecido
linfóide de maior ou menor complexidade dependendo da posição do peixe na
escala filogenética (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004).
O volume do sangue de peixes varia entre 2 - 6% do volume do corpo e em
conjunto com a linfa, controla homeostaticamente o ambiente interno. As células
vermelhas (eritrócitos) usualmente constituem 98-99% das células do sangue
(FÄNGE, 1994).
Ellsaesser et al. (1985) identificaram no sangue periférico de Ictalurus
punctatus pelo menos quatro tipos de células: os linfócitos, trombócitos, monócitos e
neutrófilos e classificou a ausência ou presença de eosinófilos e basófilos devido a
classificação e designação destes tipos celulares na literatura. Kfoury et al. (1999)
descreveram populações celulares no sangue periférico de truta arco Iris. Estas
populações eram constituídas pelas mesmas células encontradas em outras
espécies, excerto pela diferenciação entre linfócitos grandes e pequenos.
Esteban et al. (2000) descreveu duas populações celulares no sangue de
Dicentrarchus labrax, uma constituída de pequenas e outra de células grandes.
Essas populações eram formadas por eritrócitos imaturos e maduros, trombócitos,
47
granulócitos heterofílicos e acidofílicos, linfócitos, plasmócitos e monócitos-
macrófagos.
2.2.1 Monócitos-Macrófagos
Segundo Fänge (1994) os monócitos constituem a menor população de
células brancas do sangue. Seu núcleo é grande e oval, apresentando um
citoplasma sem granulação. São células fagocíticas e pertencem à mesma linhagem
celular de macrófago dos tecidos. Podendo existir um tipo celular intermediário entre
macrófagos e granulócitos
Kfoury et al. (1999) observaram que os monócitos de truta arco-iris
apresentaram um núcleo bilobado em formato de rim e uma grande quantidade de
reticulo endoplasmático rugoso, muitos grânulos, vesículas e vacúolos dispersos em
seu citoplasma. Estas células tinham em média 8 -20µm.
Os monócitos dão origem aos macrófagos quando estes migram para os
tecidos (TIZARD, 2002).
Segundo Lorenzi (1999) os macrófagos possuem morfologia variável e são
mais ativos que os monócitos dos quais se derivam. Em mamíferos os macrófagos
estimulados adquirem um aspecto de células gigantes policariontes. Este fato
também foi descrito em Paulicea lutkeni, Oncorhyncus mykiss, Oreochromis niloticus
e Piaractus mesopotamicus (TAVARES-DIAS, 2004).
2.2.2 Melano- Macrófagos Centrais
Melano-macrófagos centrais são aglomerados de melano-macrófagos que
contém inclusões heterogêneas, sendo as mais freqüentes a melanina,
hemossiderina e lipofucsina (AGIUS; AGBEDE, 1984).
Estes agregados de células contêm pigmentos que estão presentes nos
tecidos hematopoiéticos do baço e rim e nas áreas periportais do fígado, mas seu
grau de organização varia entre as espécies. Em algumas espécies os centros são
48
limitados por uma fina cápsula argirofílica, rodeada por polpa branca e associado a
vasos estreitos (AGIUS, 1980; ELLIS; ROBERTS; TYTLER, 1989). Entretanto, em
salmonídeos, acúmulos de melano-macrófagos são pouco definidos e com ausência
de uma cápsula, porém a associação com vasos sangüíneos e linfócitos está
presente (PRESS; DANNEVIG; LANDSVERK, 1994).
Os melano-macrófagos centrais podem ser considerados depósitos
metabólicos, mas a sua capacidade de reter antígenos por longos períodos,
possivelmente na forma de complexos imunes, compara-se aos centros germinativos
dos vertebrados superiores (FERGUSON, 1976; AGIUS, 1980).
2.2.3 Granulócitos
Granulócitos podem ser sub-divididos em neutrófilos, eosinófilos e basófilos.
Neutrófilos e eosinófilos são os tipos mais comuns, com basófilo ausente na maioria
das espécies. Assim como macrófagos, os granulócitos podem ser isolados do
sangue, tecidos linfóides e cavidade peritonial (MAINWARING; ROWLEY, 1985;
ROWLEY et al., 1988).
Neutrófilos são granulócitos altamente móveis, fagocíticos e produzem
oxigênio reativo, mas sua atividade bactericida é relativamente pequena se
comparada aos macrófagos. Assim como os macrófagos, eles parecem possuir
região efetora e receptores para complemento, como evidenciado em estudos de
opsonização. Células granulares encontradas no extrato granuloso do intestino,
brânquias, pele, meninges e rodeando vasos sanguíneos maiores não são
considerados eosinófilos (VALLEJO; ELLIS; ROBERTS; TYTLER, 1989).
Os granulócitos também são divididos em granulócitos heterofílicos e
granulócitos acidofílicos. Os granulócitos heterofílicos são células arredondadas a
ovais irregulares com processos celulares curtos. Apresenta núcleo grande bilobado
ou trilobado excêntrico e citoplasma granular. Os granulócitos acidofílicos são
células redondas com núcleo excêntrico bilobado e um citoplasma translúcido
(ESTEBAN et al., 2000; VÁZQUEZ; GUERRERO, 2007).
49
2.2.4 Linfócitos
Os linfócitos constituem aproximadamente metade das células brancas do
sangue e são caracterizadas por um núcleo redondo e um citoplasma basófilo
agranular, sendo responsáveis por respostas imunes (FÄNGE, 1994).
Segundo Kfoury et al. (1998), existem duas populações de linfócitos
morfologicamente distintas em Oncorhynchus mykiss, as quais diferem basicamente
em seus tamanhos e presença de grânulos, com tamanhos médios entre 3-6µm.
Alguns leucócitos, com características ultra-estruturais de linfócitos foram
observados contendo ácido-fosfatase positivo citoplasmático granular, não
estimulados na cavidade peritonial de truta arco-íris (AFONSO; ELLIS; SILVA, 1997).
Foi observado que essas células podem corresponder a células citotóxicas não
específicas, ou às células natural killer, devido as suas similaridades com essas
células de mamíferos. Sobre esta questão também há controvérsias, visto que
Greenle et al. (1991) relatou que em trutas, células citotóxicas não específicas não
são granulares.
Segundo Vázquez e Guerrero (2007) os linfócitos são células pequenas e
redondas. Possui um núcleo grande, esférico que ocupa quase toda célula.
Ultraestruturalmente os linfócitos apresentam processos celulares semelhantes a
dedos, apresentando dimensões em Cichlasoma dimerus entre 3.4 – 4.7 µm. São os
leucócitos mais comuns no sangue de algumas espécies de peixes, apresentando
uma grande diversidade no aspecto morfológico e tem sido descrito com diferentes
nomes por diferentes autores.
2.2.5 Células Granulocíticas Especiais
Células granulocíticas especiais ou leucócitos granular PAS-positivo são
geralmente grandes e muito semelhantes aos neutrófilos, seu núcleo é pequeno e
excêntrico com cromatina densa sem presença de nucléolos (TAVARES-DIAS,
2004).
50
Ribeiro (1978) estudou esta célula no sangue de Pimelodus maculatus e
observou grânulos no seu citoplasma de tamanho, forma e opacidade variados.
Sua freqüência no sangue de peixes das famílias Characidae, Ciprinidae,
Erythrinidae, Prochilodontidae é relativamente baixo e não foi observado em
espécies das famílias Salmonidae, Ictaluridae, Mugilidae e Cichlidae (TAVARES-
DIAS, 2004), ocorrendo freqüentemente apenas em alguns grupos taxonômicos
(BARBER; WESTERMANN, 1978).
Granulócitos semelhantes a essas células em Cyprinus carpio, foram
caracterizados como célula reticular fina e como granulócito tipo 2 por alguns
autores (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004).
2.2.6 Trombócitos
Trombócitos são as células mais abundantes do sangue, depois dos
eritrócitos (UEDA et al., 1997), entretanto alguns autores não incluem trombócitos
dentro de leucócitos (VÁZQUEZ; GUERRERO, 2007).
Para Campbell (1988) trombócitos apresentam forma arredondada, alongado
ou em formato de haste, podendo variar devido ao estágio de maturidade ou no
estágio de reatividade. Segundo ele os trombócitos que apresentam as formas
redondas são os imaturos em algumas espécies de peixes, o formato de haste são
as formas reativas, não se referindo a forma alongada. Os núcleos seguem o
formato da célula apresentando cromatina densa.
Segundo Tavares-Dias e Moraes (2004) os trombócitos são células
predominantemente elípticas com núcleo fusiforme.
De acordo com Fange (1994) os trombócitos são ovais ou apresentam
formato de haste com um núcleo compacto central.
No teleósteo Ictalurus punctatus Cannon et al. (1980) descreveu trombócitos
com forma ovóide alongada.
Em Cichlasoma dimerus trombócitos apresentaram diferentes morfologias,
com eixo fusiforme ou formas ovais com núcleo oval localizado centralmente. O
tamanho dessas células variou entre 8 - 8.9 µm de comprimento e 2.1 - 2.7 µm de
largura e apresentaram citoplasma translúcido (VÁZQUEZ;GUERRERO, 2007).
51
Kfoury Jr. (1999) descreveu trombócitos sendo caracterizados por seu
formato irregular, variando de arredondado a alongado apresentando um citoplasma
com um extenso sistema de canículos e bandas proeminentes de microtúbulos. Seu
tamanho foi de 7 – 20 µm de comprimento e 3 - 5 µm de largura.
2.2.7 Eosinófilos
Os eosinófilos são células arredondas e relativamente pequenas. O
citoplasma é escasso e ocupado por grânulos. O núcleo é geralmente excêntrico e
ocupa grande parte da célula (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004). Podendo também
apresentar um citoplasma escasso de superfície irregular com projeções que levam
a formação de pseudopodes como observado em Salminus maxilosus (VEIGA et al.,
2000). Apresentou tamanhos entre 4.8 – 9.5 µm (VEIGA et al., 2000; VÁSQUEZ;
GUERREIRO, 2007))
2.2.8 Neutrófilos
Segundo Tavares-Dias et al. (2002) neutrófilos apresentam o núcleo na forma
de bastonete ou ocasionalmente segmentado. Se apresentando oval, excêntrico e
formando lóbulos incompletos em algumas espécies de peixes teleósteos (VEIGA et
al., 2000). Se mostrando muito semelhante aos neutrófilos de mamíferos.
52
2. MATERIAL E MÉTODOS
Os animais e a metodologia utilizados neste trabalho estão descritos a seguir.
3.1 MATERIAL
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Técnicas Imunológicas
Aplicado à Morfologia (LTIAM), no Departamento de Cirurgia da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – Universidade de
São Paulo. Os animais mantidos no criatório XV de Novembro Piscicultura,
localizado no município de São João da Boa Vista – SP, Rodovia São João-Aguaí –
Km 221,5, foram retirados dos tanques de manutenção e colocados em piscinas de
aclimatação com capacidade de 1000 l, abastecido com água corrente declorificada
por 5 dias antes do início do experimento.
Foram utilizados 30 espécimes de pacu, Piaractus mesopotamicus, juvenis
com idades que variaram entre 5 meses a um ano, com peso médio de 588.1g
(mínimo de 160g e máxima de 1340g) e comprimento total médio de 27.51cm
(mínimo de 19cm e máximo de 37cm).
Para retirada dos órgãos linfóides e coleta do sangue, os animais foram
anestesiados e eutanasiados em solução de benzocaína a 50 ppm em solução
aquosa (1g de benzocaína em 20L de água), segundo parecer e autorização do
Comitê de Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP- SP.
O sangue foi coletado pela artéria caudal, tendo sido obtido em média 8ml de
sangue em peixes com peso médio de 1075g e comprimento médio de 33.71cm e
2ml de sangue em exemplares com peso médio de 417.5g e comprimento médio de
25.35cm. Após completa cessação dos movimentos operculares, foi feita a abertura
da cavidade abdominal através de incisão ventral. Obteve-se uma janela onde os
órgãos foram fotografados in situ antes de serem retirados.
53
Depois dos órgãos retirados, pequenos fragmentos foram obtidos e estes
fixados em Paraformaldeído 4% PBS para microscopia de luz e em Karnovsky para
microscopia eletrônica de transmissão.
Para o estudo anatômico, os órgãos foram fotografados in situ com o uso de
máquina digital.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Microscopia de Luz
Os órgãos do sistema linfóide foram removidos e obtidos fragmentos que
foram fixados em solução de paraformaldeído 4 % em PBS (Dulbecco’s phosfate
buffer saline-DPBS, Gibco Co, USA). As amostras foram processadas segundo a
técnica de Behmer, Tolosa e Freitas-Neto (1976), em séries crescentes de álcoois,
até o álcool absoluto e em seguida incluído em paraplast. Posteriormente, os
fragmentos foram cortados com espessura de 4µm e corados pelas técnicas de
Hematoxilina-Eosina.
Foram retirados cortes com espessura de 4µm do material embebido em
Histosec com o uso de micrótomo.
O material fixado com Mc Dowell e parte do material fixado com Karnovsky
foram incluídos em Historresina, para tanto passou por duas séries de álcoois (70%
e 90%), álcool-resina, resina e foi emblocado em Historresina. Posteriormente, as
amostras foram cortadas em micrótomo em espessura de 1µm e coradas pelas
técnicas de Hematoxilina-Eosina.
Para análise dos leucócitos foram feitos esfregaços de uma gota de sangue
sobre a lamina, seco em temperatura ambiente e mergulhadas em solução Giemsa-
May Grünwald (BEHMER; TOLOSA; FREITAS-NETO, 1976) e Panótico Rápido.
As colorações de Panótico Rapido e Giemsa-May Grünwald foram feitas para
observação dos leucócitos, seus núcleos e granulações basófilas e acidófilas.
54
3.2.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Os fragmentos obtidos dos órgão linfóides rim cefálico, fígado, timo e baço
foram fixados em Karnovsky. Após um período de fixação não inferior a 24h as
amostras foram lavadas em sacarose e pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%
(osmium tetroxide 4% solution in water, Polyscience, Inc. USA). Desidratadas em
concentrações crescentes de etanol e submetido a dois banhos em solução de
Óxido de propileno (Propylene oxide EM Grade – Polysciences
®
, Inc. USA) puro.
Incluído em uma solução de óxido de propileno e Spurr’s (Spurr’s kit – Electron
Microscopy Sciences, Co. USA), na proporção 3:1 por 1 hora sob agitação.
Decorrido este período o material foi colocado em óxido de propileno e resina
Spurr’s (1:1) por 1 hora sob agitação constante, em seguida foi realizada a troca de
concentração de óxido propileno e Spurr’s na proporção (1:3) mantendo o material
sob mesma condição por 2 horas e posteriormente colocado em Araldite pura por 8
horas. Os fragmentos foram colocados em moldes de silicone contendo resina pura
e permaneceram em estufa 60° C por 72 horas para polimerização da resina.
Após a embebição, procedeu-se a trimagem do bloco e à seguir o material foi
cortado em ultramicrótomo da marca RMC modelo MT- RL efetuando-se cortes ultra-
finos com 70nm - 90 nm de espessura que foram colocados em grids de cobre de
200 mesh, corados com acetato de uranila 3% e citrato de chumbo e observados e
fotografados no Microscópio Eletrônico de Transmissão Philips Morgagni 268 D, na
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo,
Departamento de Cirurgia e Setor de Anatomia (FMVZ-USP).
55
3. RESULTADOS
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA
Os órgãos linfóides de Piaractus mesopotamicus, rim cefálico, baço e fígado
se localizam na cavidade celomática, enquanto o timo está localizado na cabeça
(Figura 1).
Figura 1 - Fotografia em vista lateral do Piaractus mesopotamicus, evidenciando
a disposição dos órgãos “in situ”: rim (R), rim cefálico (circulo
pontilhado), baço (B), timo (T) e fígado (F). Barra: 1 cm
56
4.1.1 Rim
O rim está localizado retroperitonealmente na região dorsal da cavidade
celomática. Encontra-se separado desta por uma membrana, localizando-se
dorsalmente à bexiga natatória e ventralmente à coluna vertebral, estando inserido
entre as costelas o que dificulta a sua remoção. Tem um formato em “H”, sendo que
a região média se expande lateralmente sobre a bexiga natatória, região essa de
encontro entre as porções cranial direita e esquerda e caudal direita e esquerda do
rim (Figura 2A).
Possui uma consistência gelatinosa de coloração vermelha viva (Figura 2A e
2B).
4.1.2 Rim Cefálico
O rim cefálico localiza-se na porção cranial do rim, caudalmente ao crânio e
dorsalmente a porção cranial da bexiga natatória. Lateralmente à região cervical da
coluna vertebral, ele apresenta uma porção direita e uma esquerda e consistência
gelatinosa e de coloração vermelho vivo (Figura 2A). O rim cefálico, em animais com
idade mais avançada, apresentou-se como uma dilatação na porção cranial do rim
(Figura 2A). O que não foi observado em animais jovens.
57
Figura 2- Fotografia dos órgãos “in situ” do Piaractus mesopotamicus.
A: Visão lateral da região média do rim em forma de “H”
(seta), dilatação do rim cefálico (círculo pontilhado).Animal
com 8 meses de idade:fixado em formol 10%,Barra: 1,5 cm
B: Posição em decúbito dorsal, rim (circulo pontilhado) e
rim cefálico (seta). Não é possível observar uma clara
distinção entre os dois órgãos. Animal com 4 meses de
idade a fresco. Barra: 3cm
58
4.1.3 Fígado
Entre o fígado e a cabeça existe uma membrana que separa a cavidade
celomática da cabeça (Figura 3A). O fígado está localizado caudalmente a esta
membrana, na porção cranial da cavidade celomática (Figura 3B). É cranial ao
estômago, ventral a porção cranial da bexiga natatória e dorsal ao intestino (Figura
3B).
Apresenta coloração vermelha viva a amarronzada. Constituído por três
lobos que foram descritos como lobo dorsolateral direito e esquerdo e lobo ventral. O
lobo dorsolateral direito e esquerdo estão localizados dorsalmente ao estômago e
intestinos, apresentando em sua superfície ventral, a impressão do intestino e, na
superfície dorsal a impressão da bexiga natatória. O lobo ventral está localizado
cranialmente ao estômago e dorsalmente ao esôfago e apresenta a impressão dos
mesmos (Figura 3C).
A vesícula biliar se estende desde o lobo ventral do fígado por toda cavidade
celomática. Está dividida em três porções: uma porção cranial, localizada no lobo
ventral do fígado; uma porção média que apresentou um estreitamento na sua
estrutura e está localizada dorsalmente ao estômago e uma porção caudal que se
localiza caudalmente ao estômago e ventralmente à bexiga natatória. (Figura 5A).
59
60
Figura 3- A: posição em decúbito dorsal, nota-se a membrana que
separa a cavidade celomática da cabeça (seta). Barra:
1,5cm. B: visão lateral do lobo dorsolateral direito do
fígado (F), dorsal a este lobo a bexiga natatória (BN),
observamos o lobo ventral evidenciando impressão do
estômago (Est) e a expansão lateral do rim sobre a bexiga
natatória (seta). Barra: 3cm. C: visão lateral esquerda do
fígado evidenciando o lobo dorsolateral direito (LDD) e
esquerdo (LDE) e lobo ventral (LV). Barra: 3cm
4.1.4 Timo
O timo é um órgão par bilateral, localizado na porção caudal da cabeça,
dorsalmente às brânquias na cavidade do opérculo e encontra-se protegido por uma
cápsula membranosa. Em animais jovens sua localização e acesso foram mais
difíceis que em animais com mais de cinco meses de idade, em decorrência do
pequeno tamanho do animal. Apresenta uma forma difusa de consistência
gelatinosa, com coloração variando de vermelha viva à vermelha escura (Figura 4).
61
Figura 4- Visão lateral direita do timo direito (circulo). Barra: 3cm
4.1.5 Baço
O baço se localiza caudo-dorsalmente aos lobos dorsolaterais do fígado,
ventralmente à bexiga natatória e dorsalmente à porção média caudal da vesícula
biliar. Apresenta um formato piramidal, achatado dorsoventralmente, com uma
superfície lisa em animais jovens e lobada em adultos, estando protegido por uma
membrana. Apresenta coloração vermelho escura e consistência firme, compacta
(Figura 5).
62
Figura 5- Vista lateral direita do baço (circulo pontilhado), caudalmente ao lobo
dorsolateral direito (LDD), ventralmente a bexiga natatória (BN) e
dorsalmente a porção média da vesícula biliar (seta). Barra: 1,5 cm
63
4.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA
4.2.1 Rim
No parênquima do rim são encontrados glomérulos que são formados por
capilares. Apresentam cápsula de Bowman onde é observada a presença de dois
folhetos: a camada visceral e a camada parietal da cápsula de Bowman. Nela
observam-se células pavimentosas com núcleo achatado constituindo a parede
parietal e uma membrana muito fina, quase imperceptível, constituindo a camada
visceral. Esta membrana limita a área das células que se encontram no interior do
glomérulo. Estas células são na sua maioria hemácias, linfócitos, trombócitos e
células imaturas (Figura 6A).
O seu estroma é constituído por células hematopoiéticas e linfocíticas, sendo
que foi observado melano-macrófagos e infiltrados mononucleares dispersos pelo
tecido conjuntivo (Figura 6A).
Os túbulos contorcidos proximais são constituídos por um epitélio cúbico
simples, com núcleo redondo basal (Figura 6B) e as células do seu epitélio
apresentam borda em escova e a luz do túbulo era central reduzida. Os túbulos
contorcidos distais são formados por um epitélio cúbico baixo, com núcleos
redondos basais e também apresentam uma luz central reduzida. Também formam
observados glomérulos constituindo o parênquima (Figura 6B).
Veias de grande calibre contendo hemácias e leucócitos estão presentes no
tecido conjuntivo do órgão. Pequenos capilares e arteríolas também são observados
no tecido conjuntivo (Figura 6B).
64
Figura 6- Fotomicrografia A: no rim, glomérulos (G) e cápsula de Bowman (seta),
vasos sangüíneos (V) e melano-macrófagos (circulo pontilhado)
dispersos no citoplasma. Barra: 50µm B: túbulos contorcidos
proximais, epitélio cúbico simples (seta) e túbulos contorcidos distais
com epitélio cúbico baixo com luz central reduzida (*). Coloração HE.
Barra: 40µm
65
4.2.2 Rim Cefálico
No rim cefálico o epitélio de revestimento é formado por uma camada de
células pavimentosas com núcleo achatado, seguido por uma camada de tecido
conjunto frouxo e uma camada de tecido adiposo unilocular. Vasos sanguíneos são
observados no tecido conjuntivo e, em algumas regiões, grandes vasos estão
associados ou ao lado de uma arteríola. Células de gordura envolvidas por tecido
conjuntivo foram observadas constituindo o rim cefálico de animas com mais de seis
meses de idade, o que não foi observado em animais mais jovens (Figura 7A).
A região cortical é formada por infiltrados mononucleares, principalmente
linfocíticos. Nestas regiões também são observados alguns eosinófilos, hemácias e
basófilos (Figura 7B).
Células sanguíneas maduras e imaturas formavam um parênquima
relativamente frouxo. Melano-macrófagos livres, melano-macrófagos centrais, vasos
sanguíneos que continham em seu interior hemácias, células reticulares, pequenos
linfócitos, trombócitos e sinusoídes estavam presentes dispersos pelo parênquima. A
presença de túbulos contorcidos distais e proximais em uma determinada região do
órgão foi observada e este fato pode ter sido ocasionado por se tratar da zona de
transição entre o rim e o rim cefálico, não se confirmando a presença de tais
estruturas no restante das áreas analisadas (Figura 8). Porém, a grande maioria do
órgão era constituído por hemácias (Figura 9).
Ultraestruturalmente os túbulos contorcidos proximais encontrados na região
que seria de transição do rim e do rim cefálico eram constituídos por células
arredondadas alongadas com prolongamentos da membrana no ápice da célula.
Apresentavam um núcleo de formato irregular com heterocromatina condensada
periférica e um nucléolo excêntrico. No seu citoplasma numerosos grânulos,
mitocôndrias arredondadas e alongadas e vacúolos foram observadas. Estas células
estavam conectadas entre si por desmossomos e entre uma e outra célula havia a
presença de uma célula limitante (Figura10).
As células que foram encontradas para análise ultraestrutural foram
eosinófilos, protombócito, trombócitos, mielócitos, linfócitos, células tronco,
neutrófilo, monócitos-macrofagos e linfócitos. (Figura 11).
66
Eosinófilos nesta espécie se mostraram como células grandes de formato
arredondado com núcleo grande de margem irregular, apresentando cromatina
heterogênea condensada próxima a membrana com um nucléolo pequeno
excêntrico. Disperso no seu citoplasma muitos grânulos de formato arredondado ,
alguns vacúolos e mitocôndrias foram observados (Figura 12).
Protrombócitos imaturos e protrombócitos são células com núcleo grande em
forma de ferradura com cromatina heterogênea condensada próxima a parede da
membrana. Seu citoplasma mostrava numerosos vacúolos, reticulo endoplasmático
e grânulos (Figura 13).
Os mielócitos apresentaram um formato arredondado com núcleo grande
periférico, com cromatina condensada na periferia e dispersas pelo núcleo. No seu
citoplasma muitos vacúolos, mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso, vesículas
com material no seu interior e um complexo de Golgi foram observados dispersos no
citoplasma. Estas células, na sua maioria, estavam próximas às células eosinófilas
(Figura 14).
Os linfócitos são pequenos, com pouco citoplasma onde se observou a
presença de algumas mitocôndrias, raros vacúolos e material granular disperso
homogeneamente. Continha um núcleo grande e arredondado. Este núcleo ocupava
quase toda área da célula e continha muita cromática condensada que se distribuía
irregularmente por todo núcleo. (Figura 15).
As células tronco apresentaram um formato arredondado irregular com
pequenas projeções na sua membrana. Esta célula mostrava um núcleo grande com
reentrâncias formando um “H”, tinha pouca cromatina e um nucléolo central.
Dispersos em seu citoplasma foram encontrados retículos endoplasmáticos,
mitocôndrias arredondadas, vesículas contendo material em seu interior, vacúolos,
ribossomos livres e alguns grânulos (Figura 16).
Monócitos não tinham uma forma definida e foram vistos em formato
arredondado alongado ou de formato irregular, com pequenas projeções na
membrana citoplasmática. Seu núcleo era grande e mostrava uma reentrância bem
visível com material granular condensado heterogeneamente na periferia e disperso
por ele. No citoplasma foi encontrado complexo de Golgi bem desenvolvido,
grânulos, vesículas com material em seu interior, mitocôndrias arredondadas e
alongadas e vacúolos (Figura 17).
67
Foram observadas plasmócitos no parênquima entre eosinófilos e linfócitos.
Estas células tinham um formato arredondado ovóide, núcleo grande central com
heterocromatina condensada na periferia. No seu citoplasma uma quantidade muito
alta de retículo endiplasmático rugoso caracterizava este tipo celular, Algumas
mitocôndrias, vesículas contendo material no seu interior, grânulos e material eletron
denso estavam presentes no seu citoplasma (Figura 18).
68
Figura 7- Fotomicrografia A: região medular do rim cefálico (RM) e
Região cortical (RC). Barra: 50µm. B: tecido adiposo
unilocular (TAU) e hemácias (circulo pontilhado).
Coloração HE. Barra: 50µm
69
Figura 8 - Fotomicrografia do rim cefálico. Observar no vaso sangüíneo (seta
vazia) hemácias; túbulos contorcidos proximais (estrela azul);
linfócitos (seta preta); célula reticular (seta vermelha); trombócitos
(seta verde); melano-macrófagos livres (seta amarela) e melano-
macrófagos centrais (estrela vazia) Observar o parênquima
constituído em sua maioria por células sangüíneas relativamente
frouxas. Coloração HE. Barra: 40µm
70
Figura 9 - Fotomicrografia do rim cefálico: Parênquima constituído na sua
maioria por hemácias. Observar que a região cortical e medular são
pouco distintas. Coloração HE. Barra: 40µm
71
Figura 10 - Eletromicrografia do túbulo contorcido proximal em área de
transição entre rim e rim cefálico. Na célula endotelial
microvilosidades apicais (seta fina), um núcleo de formato irregular
(estrela preta) com heterocromatina e eucromatina (seta azul),
vacúolos eletro-densos (estrela branca) e muitas mitocôndrias (m).
Desmossomos interconectavam essas células (seta vermelha) e
entre uma célula e outra pôde-se observar uma célula limitante (CL)
Barra: 5µm
72
Figura 11 - Eletromicrografia do parênquima do rim cefálico. Observar hemácias
(seta laranja); trombócitos (seta vermelha); linfócitos (seta azul) e
eosinófilos (seta preta) Barra de 5µm
73
Figura 12 - Eletromicrogafia de eosinófilo do rim cefálico. Observar a forma
irregular da célula. Núcleo grande eucromático (N) e um nucléolo
evidente (seta branca fina). No citoplasma presença de grânulos
(G), mitocôndria (seta pequena) e vacúolos (seta vermelha), Barra
5µm
74
Figura 13 - Eletromicrografia de protrombócito encontrado no rim cefálico. Esta
célula apresentava um formato arredondado, núcleo eucromático
grande em forma de ferradura (seta branca), vacúolos (seta
vermelha). Barra: 2µm
75
Figura 14- Eletromicrografia de mielócito. Observar o núcleo grande, excêntrico
com eucromatina (N). No citoplasma, presença de vacúolos (V),
vesículas (seta azul), retículo endoplasmático rugoso (rer),
mitocôndrias (m) e complexo de Golgi (seta larga). Barra de 2µm
76
Figura 15 - Eletromicrografia de linfócito no rim cefálico. Observar um núcleo
grande (N) com muita eucromatina. No citoplasma mitocôndrias (m),
alguns vacúolos (seta pequena) e material granular. Barra de 2µm.
77
Figura 16 - Eletromicrografia de uma célula tronco no rim cefálico. Observar a o
formato arredondado da célula com pequenas projeções da
membrana. Seu núcleo grande com reentrâncias (estrela) e um
nucléolo central (n). No citoplasma complexo de Golgi (CG),
vesículas (V), vacúolos (seta vermelha), retículo endoplasmático
(seta pequena) mitocôndrias (m) e ribossomos livres (seta verde).
Barra de 2µm
78
Figura 17 - Eletromicrografia de monócito no rim cefálico. Observar a forma
irregular da célula com projeções citoplasmáticas (seta larga
branca), núcleo grande (N) com reentrâncias e heterocromatina e
eucromatina (seta branca). No citoplasma presença de complexo
de Golgi (CG), grânulos (G), vesículas (seta vermelha),
mitocôndrias (m) e vacúolos (v). Barra de 2µm
79
Figura 18 – Eletromicrografia de plasmócito no rim cefálico (seta larga). Célula
caracterizada pela grande quantidade de reticulo endoplasmático
rugoso em seu citoplasma (seta vermelha). Núcleo grande central
com heterocromática na periferia (N), algumas mitocôndrias (m),
vacúolos (V), vesículas (seta azul) e material eletron denso (seta
verde) disperso pelo seu citoplasma. Barra 2µm
80
4.2.3 Fígado
O fígado é formado por hepatócitos de formato poliédrico constituindo a maior
parte do parênquima. Apresentam um núcleo grande redondo central (Figura 19A).
O parênquima não é dividido em lóbulos e há formação do espaço porta,
constituído por um ducto biliar, uma artéria e uma veia, envoltos por tecido
conjuntivo (Figura 19A). Veias centrais associadas a ductos ou a outras veias e/ou
pequenas artérias mostram-se dispersas aleatoriamente por todo o parênquima
hepático (Figura 19B).
Este se apresenta como um campo contínuo de hepatócitos em forma de
cordões. Esses cordões são constituídos por dois hepatócitos e entre cada dois se
encontra um sinusoíde que se conecta a um vaso. A presença de várias veias
centrais, vasos e sinusóides dispersos por todo o parênquima são observados.
Células dendítricas ou células endoteliais são observadas no interstício,
interconectando os hepatócitos. Pôde-se observar nos hepatócitos vacúolos onde
possivelmente estaria armazenado gordura e gotas de coloração marrom claro que
poderiam ser de ferritina (Figura 20).
Ultraestruturalmente os hepatócitos apresentaram um núcleo central grande
arredondado com cromatina condensada na periferia e dispersa pelo núcleo (Figura
21). No seu citoplasma foi observado réticulo endoplasmático rugoso, grânulos,
complexo de Golgi, mitocôndrias e vacúolos (Figura 22).
81
Figura 19 - Fotomicrografia A: Parênquima do fígado constituído por
hepatócitos (círculo pontilhado), artéria hepática (A), um
ducto biliar (seta) e um ramo da artéria (V). Barra: 50µm B:
Veia central (V) associada a um ducto. Coloração HE.
Barra: 50µm
82
Figura 20 – Fotomicrografia do parênquima do fígado. Observar um parênquima
formado por hepatócitos em forma de cordões e entre eles um
pequeno vaso sinusóide (setas finas). Células dendriticas ou
endoteliais (seta larga) aparecem entrem os hepatócitos. No interior
dos hepatócitos observar a presença de gotículas amarronzadas e
espaços vazios. Aumento Coloração HE. Barra 20µm
83
Figura 21 - Eletromicrografia do hepatócito. Esta célula apresentou um núcleo
grande com cromatina condensada na periferia e dispersa pelo
núcleo (N). No citoplasma grânulos (G), mitocôndrias (m), complexo
de Golgi (cg) e reticulo endoplasmático rugoso (seta). Barra 2µm
84
Figura 22 – Eletromicrografia de estruturas do hepatócito. Observar a presença
de um complexo de Golgi (seta larga) bem desenvolvido,
mitocôndrias (m) e vacúolos (V) onde poderia estar contido gordura.
Barra 2µm
85
4.2.4 Timo
O timo apresenta uma região de concentrados de timócitos formando os
corpúsculos de Hassall (Figura 23A) sendo observadas no centro de alguns desses
corpúsculos, células imaturas sofrendo divisão e nestes mesmos espaços, a
presença de eosinófilos. Circundando os corpúsculos de Hassall, infiltrados
mononucleares, provavelmente timócitos, são observados (Figura 23B).
Este órgão se mostrou bem vascularizado e próximo aos vasos infiltrados
mononucleares, sendo também observado a presença de melano-macrófagos livres
no parênquima (Figura 24).
O parênquima não apresentava uma zona medular e cortical distintas e
constituindo o mesmo, foram observadas muitas hemácias, timócitos, alguns
eosinofilos e células imaturas (Figura 25).
Nas análises ultraestruturais observamos no timo células tronco que
apresentaram um formato irregular, núcleo grande com cromatina heterogênea, um
nucléolo excêntrico e disperso no citoplasma mitocôndrias, complexo de Golgi e
vacúolos (Figura 26).
Os eosinófilos apresentaram um formato irregular, núcleo excêntrico e
grânulos dispersos em seu citoplasma (Figura 27).
Foram observadas trabéculas no interior do parênquima, constituídas por
células epiteliais achadas que apresentavam um núcleo bem pequeno no ápice da
célula. No seu interior pôde-se observar a presença de vaso sangüíneo. Disperso
pelo parênquima fibras colágenas, células reticulares, grânulos e células limitantes
se encontravam próximas a estas trabéculas (Figura 28).
Os timócitos se apresentaram como células pequenas de formas variadas.
Seu núcleo era grande com heterocromatina condensada e seu citoplasma era curto
e granulado. Em alguns casos mostrava extensões citoplasmáticas. Foram
observados ribossomos livres, vacúolos e um pequeno complexo de Golgi no seu
citoplasma (Figura 29). Foi encontrado geralmente conectado a uma célula limitante
ou a uma célula “nurse cells”.
86
As células limitantes se caracterizaram por apresentar um núcleo grande,
alongado e irregular que acompanhavam o formato da célula. Seu citoplasma emitia
projeções que as interconectavam entre si e a outras células (Figura 30).
As “nurse-cells” apresentaram um núcleo grande, com reentrâncias,
vacúolos, vesículas contendo material flocular e um pequeno complexo de Golgi
(Figura 31).
87
Figura 23 - Fotomicrografia. A: timo constituído pelo Corpúsculo de
Hassall (circulo pontilhado), vasos sangüíneos (seta)
Barra: 50µm B: no tecido conjuntivo presença de vaso
sangüíneo (V) e infiltrado mononuclear (circulo).
Coloração Tricromo de Masson. Barra: 50µm
88
Figura 24 – Fotomigrafia de luz de parênquima tímico. Presença de muitos
vasos sangüíneos contendo células sangüíneas maduras e
imaturas (V), infiltrados mononucleares (circulo) e melano-
macrófagos livres (seta). Coloração HE. Barra. 20µm
89
Figura 25 - Fotomicrografia de luz de parênquima tímico sem definição de zona
cortical e medular. Parênquima constituído por hemácias (h),
timócito (seta amarela), eosinófilo (seta branca) e células imaturas
(ci). Coloração HE. Barra 20µm
90
Figura 26 – Eletromicrografia de célula tronco do timo. Observar o formato
irregular, com núcleo grande com cromatina heterogênea (N),
nucléolo excêntrico (n) e disperso no citoplasma mitocôndrias,
Complexo de Golgi e vacúolos. Barra de 2µm
91
Figura 27 – Eletromicrografia de eosinófilo encontrado no timo de Piaractus
mesopotamicus. Célula com formato irregular, núcleo excêntrico e
grânulos dispersos em seu citoplasma. Barra de 2µm
92
Figura 28 - Eletromicrografia de trabécula (tr) encontrada no timo. Constituída
por células achatadas com núcleo pequeno no ápice celular (seta),
vaso sangüíneo (V), no parênquima fibras colágenos (FC), células
reticulares (CR), células limitantes (CL) e grânulos (G). Barra de
10µm
93
Figura 29 – Eletromicrografia de timócito. Célula com núcleo grande de formato
irregular (N), hetrorocromatico (estrela). Apresentando projeções na
membrana citoplasmátiva (seta larga), vacúolos (V) e complexo de
Golgi (CG) no citoplasma. Barra de 2µm
94
Figura 30 - Eletromicrografia de célula limitante no timo. Observar a forma
irregular da célula (CL) com extensões citoplasmáticas (seta larga).
Seu núcleo irregular acompanha a forma da célula (N). Barra 2µm
95
Figura 31 – Eletromicrografia de “nurse-cells”. Observar vacúolos (V), vesículas
com material flocular (seta larga) e pequeno complexo de Golgi
(seta vermelha) dispersos no citoplasma . Barra de 2µm
96
4.2.5 Baço
No baço são observadas uma polpa branca e uma polpa vermelha (Figura
32A). A polpa branca é formada por nódulos linfáticos constituídos por células
imaturas, linfócitos e eosinófilos. A membrana deste nódulo é muito delgada, porém
limita o espaço ocupado por eles no tecido conjuntivo.
A polpa vermelha constituiu-se num campo de células de hemácias e a polpa
branca por nódulos linfáticos constituídos por infiltrados mononucleares.
Trabéculas, veias e artérias são observadas no parênquima envolvidas por
tecido conjuntivo frouxo (Figura 32B).
São observados, dispersos no tecido conjuntivo da polpa vermelha vasos
sangüíneos, melano-macrófagos livres, eosinófilos e linfócitos (Figura 33).
Ultraestruturalmente foram observadas vários tipos celulares. As células
reticulares apresentaram um formato irregular com pequenas projeções
citoplasmáticas, núcleo heterocromático e no seu citoplasma vesículas eletro-densas
e mitocôndrias (Figura 34).
Esplenócitos se mostraram como células pequena com núcleo grande
arredondado com heterocromatina condensada na membrana. Seu citoplasma era
granular e não foi observada presença de organelas. Pode-se observar extensões
celulares conectado a essas células a outras no parênquima (Figura 35).
Células limitantes foram observadas constituindo o parênquima envolvendo o
que poderia ser uma “nurse cells”. As células limitantes apresentavam um núcleo
grande irregular heterocromático e sua forma parecia acompanhar a forma da célula
(Figura 36).
97
Figura 32 - Fotomicrografia. A: baço constituído por polpa branca
(PB) e polpa vermelha (PV). Barra: 50µm B: trabécula
(T) dividindo o parênquima, constituída por tecido
conjuntivo (seta), artérias (A) e veias (V). Coloração HE.
Barra: 50µm
98
Figura 33 – Fotomicrografia de luz do parênquima do baço. Foram observados
dispersos pelo parênquima vasos sanguineos (V), melano-
macrófagos livres (seta branca), eosinófilos (seta amarela) e
linfócitos (seta azul). Coloração HE. Barra de 20µm
99
Figura 34 - Eletromicrografia de célula reticular do baço. Célula de formato
irregular e pequenas projeções citoplasmáticas (seta azul), com
núcleo grande heterocromático (N). Observar no citoplasma
mitocôndrias (m) e material eletro-denso (seta branca). Barra de
2µm
100
Figura 35 - Eletromicrografia de esplenócito. Observar a forma arredondada da
célula, núcleo com cromatina condenada na membrana (N) e
citoplasma granular (G). Observar extensões celulares de células
limitantes (CL) conectando-as (seta). Barra 2µm
101
Figura 36 - Eletromicrografia de célula limitante no baço. Célula com forma
irregular (CL) e núcleo heterocromático acompanhando a forma da
célula (seta). Observar que a célula envolve uma “nurse cells”
(CN). Barra de 2µm
102
4.2.6 Sangue
Foi observado no sangue periférico de Piaractus mesopotamicus hemácias,
trombócitos, células granulocíticas especiais, linfócitos, neutrófilos, monócitos,
eosinófilos e células imaturas.
Pela microscopia de luz, as hemácias apresentam um formato ovalado, com
núcleo central. Seu citoplasma se apresentou hialino e seu núcleo não apresentam
granulação (Figura 37A). O tamanho das hemácias variou entre 12.21 -14.16 µm x
7.15 – 8.72 µm (comprimento e largura), tendo o seu núcleo variado entre 5.07 –
7.23 µm x 2.81 – 3.56 µm (comprimento e largura).
Os trombócitos apresentam-se na forma elíptica, com núcleo grande e
fusiforme. Seu citoplasma era hialino sem granulações (Figura 37A). O tamanho
destas células nesta espécie variou entre 9.91 – 11.20 µm x 3.46 – 5.72 µm e o
núcleo em 6.55 – 8.35 µm x 2.58 – 3.38 µm.
Os linfócitos são células pequenas arredondas, com núcleo grande que ocupa
quase todo espaço citoplástico, visualizado como uma fina luz na extremidade da
célula, não tendo sido observado granulações no núcleo e citoplasma (Figura 37A).
Seus tamanhos variaram entre 4.33 -6.11 µm x 4.32 – 6.57 µm
Eosinófilos são células grandes arredondas e com núcleo pequeno
excêntrico. Observam-se granulações no seu citoplasma e núcleo. Seu citoplasma é
basófilo, corando-se de azul ou violeta (Figura 37A). Apresentaram tamanho entre
11.11 – 13.93 µm x 11.60 – 13.26 µm e o núcleo em 4.31 – 7.17 µm x 4.31 – 5.58
µm.
As células granulocíticas especiais são células grandes redondas, que no
sangue periférico desta espécie foi observado disperso entre as hemácias.
Apresentam um núcleo redondo, localizado no ápice da célula sem grânulos. Seu
citoplasma é hialino sem grânulos (Figura 37B), com tamanhos que variaram entre
13.18 – 14.23 µm x 12.75 – 14.05 µm, com o núcleo variando entre 3.36 – 7.00 µm x
3.83 – 6.92 µm.
Neutrófilos são células grandes de formato arredondado, contendo grânulos
no citoplasma. O núcleo em forma de ferradura está localizado no ápice
103
citoplasmático (Figura 37C) Apresentaram tamanhos entre 12.39 – 12.73 µm x 12.20
– 12.89 µm.
Células imaturas não apresentam uma forma definida. Seu núcleo é grande e
central sem grânulos, seu citoplasma hialino se cora levemente (Figura 37C). Essas
células demonstraram variados tamanhos que ficaram entre 12.75 – 16.98 µm x 9.81
– 15.18 µm, tendo o seus núcleos variando entre 5.15 – 7.98 µm x 3.72 – 8.26 µm.
Monócitos são células grandes que não apresentam uma forma definida, seu
citoplasma é hialino e seu núcleo é grande e apresenta grânulação. Projeções
citoplasmáticas com aparência de braços são visualizadas na membrana (Figura
37D). A medida destas células se mostrou entre 11.28 – 12.58 µm x 7.37 – 10.38 e o
núcleo com tamanhos de 6.42 – 7.27 µm x 4.35 – 5.44 µm.
104
Figura 37- Fotomicrografia das células sangüíneas encontradas no sangue
periférico de Piaractus mesopotamicus. A: eosinófilos (eo),
trombócitos (t), hemácia (seta) e linfócito (l). B: célula granulocítica
especial (cge). C: célula imatura (ci) e neutrófilo (n). D: monócito (m).
Coloração de Panótico rápido. Barra: 20µm
105
4. DISCUSSÃO
As observações macroscópicas realizadas em nosso trabalho tiveram por
objetivo demonstrar a localização e anatomia do rim, rim cefálico, fígado, timo e
baço de Piaractus mesopotamicus. As nossas análises nos mostraram muitas
semelhanças destas estruturas com as de outras espécies de teleósteos e algumas
diferenças encontradas no rim e o fígado desta espécie, que apresentam uma
anatomia singular, a qual, até o momento, não foi descrita em outras espécies.
Diferenças anatômicas entre os órgãos de diferentes espécies de peixes podem
estar relacionadas à forma corpórea, hábitos alimentares, idade, stress e condições
ambientais, variando entre espécies (BRUSLÉ e ANADON, 1996; ROCHA et al.
2001).
5.1 RIM
A localização do rim de Piaractus mesopotamicus na cavidade celomática é a
mesma encontrada em outras espécies de teleósteos (FERGUNSON, 1995). A
forma em “H” apresentada pelo rim de pacu demonstra uma região central que se
expande lateralmente sobre a bexiga natatória e dela partem a porção cranial direita
e esquerda do rim e caudalmente a porção caudal direita e esquerda. Estas
características anatômicas não foram relatadas em outras espécies, assim como
foram escassos relatos sobre anatomia e consistência do rim de peixes na literatura.
Hibiya (1982) relatou que a forma do rim de peixes varia de acordo com a espécie e
divide o rim de teleósteos em duas porções: rim cefálico e um corpo ou rim, assim
como Ellis e Souza (1974) e Zapata (1979, 1981).
Macroscopicamente, não se notou uma separação clara entre o rim e o rim
cefálico em animais jovens e uma descrição semelhante foi feita por Becker;
Fishelson e Amselgruber (2001) em Cyprinus carpio. Em animais mais velhos a
distinção entre os dois órgãos ficou evidente pelo fato do rim cefálico apresentar-se
106
como uma dilatação do órgão, porém esta característica não foi observada em
outros teleósteos.
As análises histológicas do rim de Piaractus mesopotamicus revelaram
similaridades com o rim de outras espécies de teleósteos, apresentando em sua
constituição glomérulos, túbulos contorcidos proximais e distais e vasos sanguíneos
como descritos por Ellis e Souza (1974); Zapata (1979, 1981); Hibyia (1982) e
Stoskopf (1993). Não foi observada presença de alça de Henle. Esta é um segmento
delgado que liga o túbulo contorcido proximal ao túbulo contorcido distal
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Tal observação corroborou com Stoskopf (1993)
que relata a ausência da alça de Henle no rim de peixes.
5.2 RIM CEFÁLICO
Em nossas análises macroscópicas o rim cefálico de Piaractus
mesopotamicus localizou-se na extremidade da porção cranial do rim, o que foi
confirmado através da microscopia de luz. Esta localização do rim cefálico também
foi observada em outras espécies de teleósteos (ELLIS et al., 1976; ZAPATA, 1980;
ROCHA et al., 2001; BECKER; FISHELSON; AMSELGRUBER, 2001).
Não foi possível observar uma clara distinção entre o rim cefálico e o rim em
animais jovens. Macroscopicamente, os dois órgãos se mostraram como uma única
estrutura que compunha a porção cranial do rim. Entretanto, em animais com idade
mais avançada, o rim cefálico apresentou-se como uma dilatação na extremidade da
porção cranial do rim, se tornando bem evidente a região do rim cefálico e a porção
cranial do rim. Este achado não foi descrito por outros autores em outros teleósteos.
O rim cefálico é considerado o principal órgão formador de células do sangue
de teleósteos (BIELEK, 1981), composto por uma variedade de células
hematopoiéticas em diferentes estágios de maturação ocupando o espaço
extravascular, assim como macrófagos, melano-macrófagos centrais, células
reticulares, fibras reticulares e células sangüíneas imaturas (ESTEBAN et al., 1989).
Em nossas analises histológicas o rim cefálico se mostrou como uma massa
celular dividida em uma região medular e uma região cortical e apresentou, na
região de transição entre o rim e o rim cefálico, a presença de túbulos contorcidos
107
proximais e alguns túbulos distais, o que também foi observado por Zuasti e Ferrer
(1988), Fergunson (1995) e Powell (2000) em peixes teleósteos. Este órgão se
caracterizou por ser constituído de vários tipos celulares como linfócitos,
macrófagos, eosinófilos, alguns melano-macrófagos livres e melano-macrófagos
centrais, células sangüíneas em vários estágios de maturação e vasos sanguíneos.
A camada de revestimento e os tipos celulares que o constitui são similares às
descritas para outras espécies de peixes (CHILMONCZYK, 1978; MILLER et al.,
1985; ZUASTI; FERRER, 1989; MESSEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991;
ROCHA et al., 2000; ROCHA et al., 2001; MELA et al., 2006).
Uma camada de tecido adiposo unilocular foi observada no parênquima do
órgão, não havendo nenhum relato a respeito desta arquitetura na literatura
consultada. Camadas de gordura foram frequentemente observadas recobrindo os
órgãos de animais com idade mais avançada próximo ao período reprodutivo,
provavelmente este fato pode estar relacionado a acúmulo de energia para este
período.
Zapata (1979); Quesada; Villeva e Angulleiro (1990), Messeguer et al. (1991);
Power (2000) e Rocha et al. (2000) descreveram o rim cefálico de várias espécies de
peixes e suas características histológicas são similares às encontradas em Piaractus
mesopotamicus. O rim cefálico seria um centro de processamento e formação de
células sanguíneas, apresentando a capacidade de alojar e diferenciar células
precursoras (AL-ADHAMI; KUNS, 1976), contendo um alto número de células
hematopoiéticas e fagocíticas (POWER, 2000).
Os melano-macrófagos centrais observados pela microscopia de luz se
apresentaram como um aglomerado de células de coloração marrom dispersos no
parênquima próximos de vasos sangüíneos no rim cefálico. Estas características
morfológicas dos melano macrófagos são as mesmas descritas para outras espécies
de peixes teleósteos (MESSEGER et al., 1991; RABITTO et al., 2005; MELA et al.,
2006).
As células encontradas e analisadas pela microscopia eletrônica de
transmissão incluem células tronco, protombócito, trombócitos, mielócitos,
eosinófilos, linfócitos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos as quais foram observadas
no rim cefálico em diferentes espécies de peixes teleósteos e descritas por diversos
autores. Nossa identificação foi realizada comparando as diversas descrições da
literatura consultada. Existem muitas divergências entre os autores quanto à
108
nomenclatura e classificação destas células pela análise morfológica, seja essa
microscópica ou ultraestrutural.
Os eosinófilos encontrados são células grandes de formato arredondado
irregular, apresentavam em seu citoplasma muitos grânulos, alguns vacúolos e
mitocôndrias. Essa característica dos eosinófilos é muito similar às encontradas em
mamíferos (ROITT, 1991; TIZARD, 2002). Suas organelas como mitocôndrias,
vacúolos e grânulos de variados tamanhos observados em nossos achados eram
semelhantes às descritas em peixes teleósteos, os quais foram relatados como
semelhantes aos de mamíferos (ZUASTI, 1988; ESTEBAN et al., 1989, 1990;
RABITTO et al., 2005; MELA et al., 2006).
Os monócitos-macrófagos foram descritos com esta nomenclatura por se
tratar de um tipo celular que se encaixava nos dois tipos descritos na literatura.
Segundo Tizard (2002), monócitos são células que se encontram no sangue
circulante e macrófagos são células que se localizam nos tecidos, podendo ser
observados na corrente sangüínea. O fato de alguns autores terem descrito estes
tipos celulares no rim cefálico está ligado ao fato de o rim cefálico ser um centro de
processamento e formação de células sanguíneas (AL-ADHAMI; KUNS, 1976;
BIELEK, 1981). Estas células em Piaractus mesopotamicus se apresentaram em
formato arredondado alongado ou sem uma forma definida, com pequenas
projeções na membrana citoplasmática. As características apresentadas pelo seu
núcleo como reentrâncias e material granular condensado heterogeneamente na
periferia e pelas organelas observadas em seu citoplasma como complexo de Golgi,
grânulos, vesículas, mitocôndrias e vacúolos, são características similares deste tipo
celular descritas em todas as espécies de peixes (ELLIS, 1976; FERGUNSON,
1976; BIELEK, 1980; HIGHTOWER et al., 1984; PETERS; SCHWARZER, 1985;
TATNER, 1985; MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991). Em nossos estudos
não foi possível analisar em que estágio de maturação se encontravam estas
células.
Os protombócito imaturos e protrombócitos maduros observados em nosso
trabalho apresentavam núcleo grande edentados ou em forma de ferradura com
cromatina heterogênea condensada, numerosos vacúolos, reticulo endoplasmático e
grânulos no seu citoplasma. Os protrombocitos imaturos e maduros foram
classificados quanto a forma do núcleo, tipo de cromatina e organelas dispersas em
seu citoplasma e nossas observações ultraestruturais eram similares aos destes
109
tipos celulares descritos para Salmo gairdneri (TATNER, 1985), Sparus auratus
(ZUASTI, 1988, 1989) Dicentrarchus labrax (ESTEBAN et al., 1989; MESEGUER;
ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991). Contudo os protrombócitos maduros de
Dicentrarchus labrax apresentaram também alguns processos na membrana celular
(ESTEBAN et al., 1989), o que não foi encontrado em nossas análises .
Os mielócitos encontrados no rim cefálico de Piaractus mesopotamicus eram
células grandes com núcleo grande periférico, apresentando em seu citoplasma
mitocôndrias arredondadas ou alongadas, retículo endoplasmático rugoso, vesículas
e complexo de Golgi. A escassez de grânulos no citoplasma de algumas destas
células poderiam caracterizá-las como um mielócito da série de promielócito
heterofílco (MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991). Estas células são
descritas na literatura dentro de séries granulopoiéticas, onde são classificadas de
acordo com o seu estágio de desenvolvimento (ZUASTI, 1988). Em nossas análises
consideramos a morfologia celular e organelas encontradas no citoplasma,
mitocôndrias, grânulos, complexo de Golgi e vesículas e a maioria delas
apresentava-se similar aos mielócitos descritos em peixes teleósteos (ZUASTI,
1988; MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991).
Em Piaractus mesopotamicus os linfócitos se apresentaram como pequenas
células com pouco citoplasma granular onde foram observadas algumas
mitocôndrias e raros vacúolos. Exibiam um núcleo grande, arredondado que
ocupava quase toda célula, com cromátina condensada distribuída irregularmente
por ele. Essas características encontradas no linfócito de Piaractus mesopotamicus
são semelhantes às características descritas em todas as espécies de peixes
(ELLIS, 1976; FERGUNSON, 1976; CHILMONCZYK, 1978; BIELEK, 1980; MILLER
et al., 1985; ZUASTI; FERRER, 1989) e aos de mamíferos (ROITT, 1991).
Plasmócitos encontrados entre linfócitos e eosinófilos no rim cefálico se
caracterizaram por serem arredondadas ou ovóides, com núcleo grande central e
heterocromatina condensada na periferia. Apresentavam em seu citoplasma uma
quantidade muito alta de retículo endoplasmático rugoso mitocôndrias, vesículas,
grânulos e material eletro-denso. Estas característica ultraestruturais dos
plasmócitos eram semelhantes às Salmo gairdneri (CHILLER et al., 1969), Cyprinus
carpio (SMITH et al., 1970) Esox lucius (SAVAGE, 1983) e Dicentrarchus labrax
(MESEGUER; ESTEBAN; AGULLEIRO, 1991).
110
5.3 FIGADO
O fígado, em algumas espécies, pode se encontrar separado dos outros
órgãos na cavidade celomática e em outras, ligado ao intestino, podendo ter o
comprimento da cavidade celomática (FERGUNSON, 1995). Pode ser composto por
dois a três lobos ou não apresentar lobação, variando de acordo com a espécie. A
forma, tamanho e volume deste órgão variam entre espécies e estão adaptados ao
espaço utilizado pelos outros órgãos viscerais (BRUSLÉ; ANADON, 1996;
OSTRANDER, 2000; VINCENTINE et al., 2005; FISHELSON, 2006).
Em nossos estudos em Piaractus mesopotamicus o fígado está localizado
cranialmente na cavidade celomática. Esta localização é a mesma descrita por
Stoskopf (1993) para os teleósteos marinhos. Entre o fígado e a cabeça, existe uma
membrana que o separa desta na cavidade celomática. Não foi encontrado relatos
na literatura sobre esta membrana ou qualquer estrutura que separe a cavidade
celomática da cabeça. O fígado mostrou-se constituído por três lobos. Segundo
Bruslé e Anadon (1996), muitas espécies de teleósteos apresentam um fígado
constituído por três lobos, entretanto o fígado de tilápia do Nilo é formado apenas
por dois lobos (VINCENTINE et al., 2005).
No pacu, a vesícula biliar encontra-se dividida em três porções: uma porção
cranial, localizada no lobo ventral do fígado; uma porção média, que apresentou um
estreitamento na sua estrutura e está localizada dorsalmente ao estômago, e uma
porção caudal que se localiza caudalmente ao estômago e ventralmente à bexiga
natatória.
A microscopia de luz demonstrou que o fígado de Piaractus mesopotamicus
apresenta um parênquima formado por um campo de hepatócitos poliédricos,
arranjados na forma de cordões, não apresentando lobação e mostrando bem
evidente uma tríade portal com um ducto, uma veia e uma artéria. Entretanto, a
tríade se mostrou em alguns momentos formada por um ducto e duas veias. Este
tipo de arranjo do parênquima e a forma dos hepatócitos foi observado em várias
espécies de teleósteos (BRUSLÉ; ANADON; 1996; AKIYOSHI; INOUE, 2004).
Sinusóides, veias centrais, melano-macrófagos centrais e livres e células dendítricas
no interstício foram observadas constituindo o parênquima hepático. As veias
centrais encontravam-se distribuídas por todo parênquima e algumas se mostraram
111
associadas a um ducto. A forma e constituição apresentada pelo fígado de Piaractus
mesopotamicus foi a mesma descrita para as várias espécies de teleósteos já
estudadas (HINTON; NIPES; KENDALL, 1972; HINTON; POOL, 1976; ROCHA;
MONTEIRO; PEREIRA,1994; BRUSLÉ; ANADON, 1996; ROCHA; MONTEIRO;
PEREIRA, 1997; VINCENTINE et al., 2005), não havendo nenhum tipo de
característica particular no fígado desta espécie. Alguns autores relataram que
diferenças na forma do parênquima hepático estariam relacionadas com tipo de
alimentação, estresse ou alterações no meio ambiente, como temperatura e poluição
ambiental (HINTON; LAUREN, 1980; FREDELLO et al., 2001).
As tríades hepáticas normalmente constituídas, em mamíferos por um ducto,
uma veia e uma artéria, no fígado do pacu eram formadas por um ducto e duas
veias, característica que não foi descrito em outros teleósteos. (ARELLANO;
STORCH; SARASQUETE, 1999) relatou em Solea senegalenses que sistema porta,
ducto biliar e arteríolas hepáticas não estão agrupados juntos na tríade hepática.
Esta forma de arranjo da tríade encontrada em nossas análises pode ter ocorrido
também devido a direção em que foi realizado o corte histológico.
Os melano-macrófagos centrais e livres observados pela microscopia de luz
são similares aos encontrados em outros órgãos e se mostraram semelhantes aos
encontrados em outras espécies (FERGUNSON, 1995; MELA et al., 2006).
Células dendítricas ou células endoteliais (HACKING; BUDD; HODSON,
1977) interconectando os hepatócitos no espaço perisinusoidal, apresentaram um
formato irregular, núcleo central com projeções citoplasmáticas. Células
estruturalmente similares e localizadas nestes mesmos espaços foram classificadas
como células Ito ou estreladas que têm a função de suporte e arranjo de parênquima
(ROCHA; MONTEIRO; PEREIRA, 1997; ARELLANO et al., 1999).
Ultraestruturalmente os hepatócitos de Piaractus mesopotamicusse
apresentaram um núcleo central arredondado com cromatina condensada na
periferia. Retículo endoplasmático rugoso, grânulos, complexo de Golgi,
mitocôndrias e vacúolos estavam dispersos em seu citoplasma. Estas características
ultraestruturais são similares as encontradas em espécies como Solea senegalenses
(ARELLANO; STORCH; SARASQUETE, 1999), Hoplias malabaricus (RABITTO et
al., 2005; MELA et al., 2006) e bacalhau (FUJITA, 1985). Estes autores relataram em
seus trabalhos que seus achados eram similares aos descritos em outras espécies,
112
demonstrando desta forma que os hepatócitos de peixes pouco variam entre as
várias espécies.
5.4 TIMO
O timo de peixes é um órgão par, localizado acima dos arcos branquiais, atrás
da cápsula ótica (HIBIYA, 1982; CHILMONCZYK, 1992; BECKER; FISHELSON;
AMSELGRUBER, 2001; FISHELSON, 2006). Este órgão parece não involuir na
maioria dos peixes (CHILMONCZYK, 1992; FISHELSON, 1995; BECKER;
FISHELSON; AMSELGRUBER, 2001), entretanto há relatos de sua involução
(CHILMONCZYK, 1992; LIU et al., 2004).
Em nossos estudos macroscópicos o timo de Piaractus mesopotamicus se
apresentou com um órgão par, localizando-se acima dos arcos branquiais,
caudalmente no crânio e cranial ao rim cefálico, parecendo ser uma continuação
deste órgão. Apresentou uma consistência gelatinosa e coloração vermelho escura.
A localização do timo, consistência e cor se mostraram semelhantes às descritas por
Yatsutake e Wales (1983) em peixes, por Stoskopf (1993) para a maioria dos peixes
teleósteos e por Fishelson (2005) em Apogon annularis, Apogon cyanosoma e
Apogon cookii. A localização descrita para o timo não deixa claro se ele, nas
espécies estudadas, se encontrava no interior do crânio ou fixado acima dos arcos
branquiais.
O timo de Piaractus mesopotamicus mostrou-se constituído histologicamente
por concentrados mononucleares, Corpúsculos de Hassall, timócitos, vasos e células
epiteliais.
Os concentrados mononucleares eram formados por timócitos e junto às
células epiteliais e sangüíneas constituíam o parênquima, que se mostrava
relativamente frouxo. Células linfóides diferenciadas ou timócitos foram observados
por Manning (1994) dentro de uma rede de células epiteliais e um parênquima
relativamente frouxo foi observado em carpa doméstica por Becker, Fishelson e
Amselgruber, (2001), como o encontrado em nossas análises.
Os Corpúsculos de Hassall se apresentam constituídos por um epitélio
simples de células achatadas, sendo observadas, no seu interior, células imaturas
113
sofrendo divisão e eosinófilos. Os Corpúsculos de Hassall juvenis são constituídos
por algumas células e uma única camada de células reticulares que as circundam.
Com a idade e o crescimento dos corpúsculos, o número de reticulócitos ao redor
aumenta (FISHELSON, 2006).
Não houve uma clara distinção entre região medular e cortical na maior parte
do parênquima, porém, nas áreas onde se encontravam os Corpúsculos de Hassall
e os infiltrados mononucleares, o parênquima se dividia e se formava uma região
medular. Nestas áreas a região cortical se tornava evidente e era constituída por
células sangüíneas e células epiteliais. Para Manning (1994) a região cortical é
formada por células epiteliais, enquanto que a região medular é constituída por
células linfóides diferenciadas. Entretanto, observações realizadas em várias
espécies de peixes por Chilmonczyk (1992); Trede e Zon (1998); De e Pal (1998);
Luer (1995) e Liu et al. (2004) mostraram que o timo dessas espécies não
apresentavam uma zona córtico-medular distinta. Fergunson (1995); Fishelson
(1995, 2006) e Bowden; Cook e Rombout (2005) relataram uma região medular em
peixes teleósteos constituída por Corpúsculos de Hassall e infiltrados
mononucleares como observado em Piaractus mesopotamicus. Gorgolon (1983) e
De e Pal (1998) relataram que estas regiões cortico-medulares e estruturas do timo
de peixes variam muito entre as espécies.
Trabéculas constituídas por tecido conjuntivo e vasos sangüíneos também
estavam presentes no parênquima tímico. No timo de mamíferos trabéculas não
fazem parte da constituição do órgão (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004), entretanto
Zapata; Chiba e Varas, (1996) observou esta estrutura em elasmobrânquios e
Bowden; Cook e Rombout (2005) em teleósteos, confirmando nossos achados.
Uma intensa vascularização caracterizou este órgão em Piaractus
mesopotamicus, o que também foi observado em várias espécies de peixes
teleósteos (NAKANISHI, 1986; CHILMONCZYK, 1992; MANNING, 1994; ZAPATA;
CHIBA; VARAS, 1996; TREDE; ZON, 1998; LIU et al., 2004; BOWDEN; COOK;
ROMBOUT, 2005).
Ultraestruturalmente os timócitos, célula mais abundante do timo, como
também relata Chilmonczyk (1992) em teleósteos, demonstraram extensões
citoplasmáticas e organelas como ribossomos, vacúolos e um complexo de Golgi,
similares às descritas para timócitos por Press e Evensen (1999); Becker rt al.
(2001) e Fishelson (2006). Células estruturalmente similares aos timócitos
114
encontrados em nossas análises foram classificadas também como células
mielóides (CHILMONCZYK, 1992), linfócitos (ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996; XIE et
al., 2006) ou células T imunoativas (FISHELSON, 2006), embora todas tenham a
mesma função e desenvolvimento. Nós classificamos esta pequena célula como
timócito, por se tratar de uma nomenclatura mais clássica e usual para as mesmas.
Células limitantes apresentaram um núcleo grande, alongado e irregular que
acompanhavam o formato da célula. Seu citoplasma emitia projeções que as
interconectavam entre si e as “nurse cells” do timo apresentavam grânulos eletro
densos, vacúolos, vesículas e um pequeno complexo de Golgi. Estes tipos celulares
eram ultraestruturalmente similares aos descritos para Stcyases sanguineus
(GORGOLON, 1983), Salmo gairneri (CASTILLO et al., 1990), Solea solea
(PULSFORD et al., 1991), Oncorhynchus mykiss (FLAÑO et al., 1996), Diplopus
puntazzo (ROMANO et al., 1999) e Siniperca chuatsi (XIE et al., 2006). Estas células
têm função imune, de arranjo de parênquima e de suporte.
5.5 BAÇO
O baço de Piaractus mesopotamicus localiza-se centralmente na cavidade
celomática, entre o fígado, bexiga natatória e a porção média da vesícula biliar.
Apresenta sua superfície lisa em animais jovens e lobada em adultos, com uma
coloração vermelho escura e consistência firme. Caracteristicas similares a estas
foram descritas por Liu et al. (2004) em Paralichthys olivaseus e Fishelson (2006)
em Cardinal fish. Descrições detalhadas quanto a localização e forma do órgão
foram escassas na literatura.
Histologicamente o baço de Piaractus mesopotamicus apresentou uma
distinção bem óbvia da polpa branca e polpa vermelha, porém desorganizados. A
polpa vermelha era constituída por um campo de hemácias, vasos sangüíneos,
melano-macrófagos livres, eosinófilos e linfócitos e a branca por nódulos linfáticos
formados por infiltrados mononucleares. Segundo Fishelson (2006) o baço de peixes
teleósteos é similar ao de vertebrados maiores, com uma bem pronunciada
separação entre uma polpa branca, constituída de tecido linfático, e uma polpa
vermelha que contém uma rede de cordões celulares enrolados, rico em
115
macrófagos, neutrófilos e eosinófilos. Esta característica de formação de parênquima
foi também observada em nossos achados. No baço de Paralichthys olivaseus não
há distinção entre polpa vermelha e polpa branca em animais jovens e adultos (LIU
et al., 2004).
Trabéculas bem evidentes constituídas por tecido conjuntivo, veias e artérias
foram observadas invaginando-se do epitélio de revestimento para o interior do
órgão. Trabéculas são estruturas que fazem parte do parênquima esplênico de todos
os mamíferos (BANKS, 1992; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004) e são
frequentemente encontradas no baço de teleósteos com constituição similar às
observadas em Piaractus mesopotamicus (SAILENDRI; MUTHUKKARUPPAN,
1975; HIBIYA, 1982; ZATAPA;1982).
Melano-macrófagos livres foram observados presentes no parênquima da
polpa vermelha. Em Trichogaster leeri e Xiphophorus maculatus os melano
macrófagos foram observados em sua maioria envolvidos em uma cápsula celular
fina (LEKNES, 2004, 2007). Em muitos teleósteos o baço contém numerosos
elipsóides e grandes áreas de células brancas e melano-macrófagos centrais (ELLIS
et al., 1976; MESEGUER et al., 1994; ROMANO et al., 2000). Em nossos achados
só foi confirmada presença de melano-macrófagos livres, a presença de muitos
vasos e leucócitos, o que mostra que o baço de Piaractus mesopotamicus é similar a
de outras espécies de teleósteos estudadas até o momento.
Ultraestruturalmente células reticulares, células interdigitantes, linfócitos,
melano-macrófagos e plasmócitos apresentaram forma e composição semelhantes
às encontradas em outros órgãos. Esta classificação ultraestrutural foi baseada nas
similaridades destas células com as mesmas observadas em outros órgãos devido a
escassez de informação e descrição específica de células no baço de peixes.
5.6 SANGUE
Os tipos celulares observados no sangue periférico de Piaractus
mesopotamicus foram hemácias, trombócitos, células granulocíticas especiais,
linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos e células imaturas.
116
As hemácias ou células vermelhas constituíam a maior parte das células no
sangue periférico. Apresentaram forma oval a alongada, com núcleo central sem
granulação e citoplasma hialino. Segundo Fänge (1994) normalmente 98-99% das
células do sangue em peixes são de hemácias. O que se confirmou em nossas
análises.
Os trombócitos foi o tipo celular, depois das hemácias, mais observado no
sangue de Piaractus mesopotamicus e de acordo com Ueda et al., (1997), estas
células representam 50% dos leucócitos circulantes no sangue dos peixes. A forma
elíptica apresentada por eles em nossas análises, também foi relatada em Rhamdia
quelen (jundiá) e Cichlasoma dimerus (TAVARES-DIAS et al., 2002). Entretanto
diferentes formas são relatadas para trombócitos, que podem se apresentar
fusiformes, em formas ovais, irregulares e que podem variar de arredondado a
alongado (CANNON et al., 1980; CAMPBELL; 1988; FÄNGE, 1994; KFOURY JR.,
1999; VÁSQUEZ; GUERREIRO, 2007). Para Tavares-Dias e Moraes (2004) os
trombócitos são células predominantemente elípticas em teleósteos.
O tamanho dos trombócitos nesta espécie variou entre 11.20 – 9.91 µm x 5.72
– 3.46 µm e o núcleo em 8.35 – 6.55 µm x 3.38 – 2.58 µm. Em Cichlasoma dimerus
essas células demonstração tamanhos entre 8.9 –8µm x 2.1 – 2.7 µm (VÁSQUEZ;
GUERREIRO, 2007), os trombócitos de formato fusiforme em DIcentrarchus labrax
apresentaram tamanhos médios de 7.72 ± 2.19 µm (ESTEBAN, 2000). Esta variação
demonstra que o tamanho dos trombócitos varia entre espécies.
Os linfócitos são células pequenas arredondas, com núcleo grande que ocupa
quase todo espaço citoplasmático. A morfologia destes linfócitos se mostrou similar
a descrita em Dicentrarchus labrax (ESTEBAN et al., 2000), em Rhamdia quelen
(TAVARES-DIAS et al., 2002) e Cichlasoma dimerus (VÁSQUEZ; GUERREIRO,
2007), sendo semelhantes também aos que compõem as populações celulares de
pequenos linfócitos observados em truta arco-iris (KFOURY JR., 1999). O tamanho
dos linfócitos desta espécie não apresentou diferenças significantes quando
comparadas as de outros teleósteos descritos na literatura (KFOURY JR., 1999;
ESTEBAN, 2000; VÁSQUEZ; GUERREIRO, 2007).
As células granulocíticas especiais foram observadas dispersas entre as
hemácias e se caracterizaram por ter um citoplasma hialino sem grânulos. Estas
células apresentam similaridades morfológicas de forma e tamanho as descritas em
Prochilodus scrofa (curimbatá) (RANZANI-PAIVA; GODINHO, 1983), Brycon sp.
117
(pirapitinga do sul) (RANZANI-PAIVA, 1991), Brycon cephalus (TAVARES-DIAS,
2004), o hibrido tambacu (TAVARES-DIAS, 2004) e Rhamdia quelen (jundiá)
(TAVARES-DIAS et al., 2004).
Os eosinófilos encontrados em Piaractus mesopotamicus apresentaram
morfologia semelhante as de Aristichthys nobilis e Astronotus ocellatus (TAVARES-
DIAS; MORAES, 2004) e Cichlasoma dimerus (VÁSQUEZ; GUERREIRO, 2007).
Estas células também se mostraram muito parecidas as de Salminus maxilosus
(VEIGA et al., 2000), entretanto não apresentavam projeções citoplasmáticas. A
forma descrita para eosinófilos de Piaractus mesopotamicus foi semelhante a
descrita na literatura, contudo apresentou um tamanho celular maior do que
eosinófilos de outras espécies (VÁSQUEZ; GUERREIRO, 2007).
A morfologia observada nos neutrófilos de Piaractus mesopotâmicos é muito
semelhante a encontrada em neutrófilos de mamíferos (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2004), apesar de se assemelharem em alguns aspectos aos descritos para espécies
como Rhamdia quelen (jundiá) (TAVARES-DIAS et al., 2002) e Salminus maxilosus
(VEIGA et al., 2000) os nossos achados mostraram uma semelhança muito maior
com neutrófilos de mamíferos.
A mesma morfologia descrita para células imaturas de Rhamdia quelen
(TAVARES-DIAS et al., 2002) foi observada em Piaractus mesopotamicus.
A morfologia encontrada nos monócitos é semelhante a observada por
Campbell (1988) os quais se apresentam como células grandes, mostrando
ocasionalmente vacúolos no citoplasma com projeções na sua membrana. Seu
núcleo ocupa menos de 50% da célula e tem formatos variados, frequentemente
redondo e ocasionalmente oval. Para Tavares-Dias et al. (2002) os monócitos de
Rhamdia quelen, são células predominantemente grandes, de forma arredondada
com citoplasma basofílico, núcleo freqüentemente excêntrico, geralmente alongado,
ocasionalmente esférico. Em Pimelodus maculatus, uma célula arredondada, com
citoplasma basofílico, vacuolizado, núcleo excêntrico alongado a esférico foi
denominado como célula monocitóide por Ribeiro (1978).
118
5. CONCLUSÕES
As análises macroscópicas do timo e baço de Piaractus mesopotamicus
revelaram que estes apresentam semelhantes com outros peixes.
O rim demonstrou forma em “H” que se expandia sobre a bexiga natatória,
não descrito em outros teleósteos.
O rim cefálico se apresentou como uma dilatação na porção anterior do rim
em animais com idade mais avançada, o que não foi observado em animais jovens.
A vesícula biliar apresentou uma morfologia particular, sendo muito extensa e
dividida em três porções que se estendiam por toda cavidade celomática, não tendo
sido encontrado relato similar na literatura a observada em Piaractus
mesopotamicus.
O fígado era constituído por três lobos que formavam uma estrutura
semelhante a uma asa.
Histologicamente todos os órgãos se mostraram similares aos de outras
espécies.
O fígado apresentou o arranjo do parênquima em forma de cordões,
semelhante ao de outras espécies de teleósteos.
Ultraestruturalmente, os tipos celulares encontrados foram semelhantes aos
descritos na literatura para outras espécies de peixes, demonstrando não haver
diferenças significativas na composição das organelas destas células.
Ficou evidenciada em nossos estudos uma grande divergência na
nomenclatura e uma falta de consenso na classificação de tipos celulares.
Evidenciando em alguns casos, a nítida impressão de que vários autores estavam
descrevendo um mesmo tipo celular, com mesma função, localização, tamanho e
forma com nomes diferentes.
O sangue do Piaractus mesopotamicus é compostos pelos mesmos tipos
celulares encontrados em outras espécies de peixes teleósteos, segundo
classificação e descrição usada para teleósteos neotropicais.
119
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