( PDF ) Estudo fitoquímico da madeira nobre Khaya ivorensis (Meliaceae) imune a Hypsipyla grandella e sua adaptação química ao Botryosphaeria rhodina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO FITOQUÍMICO DA MADEIRA NOBRE KHAYA IVORENSIS

(MELIACEAE) IMUNE A HYPSIPYLA GRANDELLA E SUA ADAPTAÇÃO

QUÍMICA AO BOTRYOSPHAERIA RHODINA

KARINE VALADARES GUIMARÃES*

Orientadora: Prof

. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva

* Bolsista Fapesp

SÃO CARLOS – SP

2007

Tese apresentada como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

DOUTOR EM CIÊNCIAS, na área de

concentração QUÍMICA ORGÂNICA.

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária/UFSCar

G963ef

Guimarães, Karine Valadares.

Estudo fitoquímico da madeira nobre Khaya ivorensis

(Meliaceae) imune a Hypsipyla grandella e sua adaptação

química ao Botryosphaeria rhodina / Karine Valadares

Guimarães. -- São Carlos : UFSCar, 2008.

243 f.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,

2007.

1. Produtos naturais. 2. Meliaceae. 3. Limonóides. 4.

Khaya. 5. Hypsipyla grandella. 6. Quantificação. I. Título.

CDD: 547.3 (20

)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia

Departamento de Quimica

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Curso de Doutorado

Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliaram e

aprovaram a defesa de tese de doutorado da candidata Karine Valadares

Guimarães realizado em 20 de novembro de 2007:

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Prof. Dr. Ma~fred Willy MÜIJer/~ .-' '

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Profa. Dra. Reginà'Virícenzi Oliveira

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Profa. Ora. Mitsue Haraguchi

Dedico este trabalho:

A minha filhinha Larissa, a melhor parte de tudo isso.

Ao Tiago, meu grande amor, meu porto-seguro.

As famílias Valadares, Guimarães, Vicente e Reche, meus presentes de Deus.

“Um homem disciplinado é um tesouro.

Quem sabe desincumbir-se dos serviços

monótonos e constantes, pode

compreender grandes realizações com a

certeza do êxito. Agir com ordem e ter

consciência de que a vida é uma ação que

não cessa, significa um avançado passo

no caminho da evolução”.

Joanna de Ângelis

AGRADECIMENTOS

À professora Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva por sua

orientação e amizade.

Ao Dr. Manfred Willy Müller por fornecer o material vegetal com muita

boa vontade e por sua contribuição neste trabalho.

Ao professor Dr. Edson Rodrigues Filho, por ter permitido que eu

utilizasse o LC/MS por horas consecutivas, por sua colaboração e amizade.

Ao professor Dr. Alzir por ter disponibilizado o aparelho de CLAE

indispensável neste trabalho.

Aos professores Dr. João Batista Fernandes e Dr. Paulo Cezar Vieira.

Dr. Antônio Gilberto Ferreira pelos ensinamentos e conselhos.

Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais por toda troca de

experiência e estímulo e por tornarem a execução deste trabalho ainda mais

prazerosa.

Aos amigos dos Laboratórios de Espectrometria de Massas, CLAE e

RMN pela convivência e ensinamentos, principalmente a Bianca e ao Gezimar, que

muito contribuíram e auxiliaram nas análises do perfil químico.

As minhas queridas alunas de iniciação científica Vanessa e Suzana

por suas amizades e dedicação.

Aos técnicos Luciana, Paulo, Thiago e Mariana por terem colaborado

para a realização deste trabalho.

Às secretárias da PPGQ Luciani, Ariane e Cristina pelos trabalhos

prestados.

À FAPESP pela bolsa concedida

A todos aqueles que acreditaram neste trabalho e contribuíram para a

execução do mesmo.

Resumo

ESTUDO FITOQUÍMICO DA MADEIRA NOBRE KHAYA IVORENSIS

(MELIACEAE) IMUNE A HYPSIPYLA GRANDELLA E SUA ADAPTAÇÃO

QUÍMICA AO BOTRYOSPHAERIA RHODINA – As espécies de Khaya

ivorensis correspondem ao mogno africano com madeira de ótima qualidade.

Com isto, tem-se intensificado a introdução de espécies deste gênero em

substituição ao mogno Swietenia macrophylla, já que elas vêem se mostrando

imunes a Hypsipyla grandella. Contudo, recentemente foi observado K.

ivorensis sintomáticas ao fungo Botryosphaeria rhodina em plantações

experimentais, caracterizadas por apresentarem nódulos os quais tornam a

madeira de menor valor comercial. Os objetivos deste trabalho foram: 1)

Estudo fitoquímico de Khaya ivorensis sintomática ao fungo (Botryosphaeria

rhodina), porém permanecendo imune a Hypsipyla grandella. 2) Comparar por

LC-MS se houve interferência do fungo no metabolismo secundário de K.

ivorensis, analisando espécies sintomáticas e não sintomáticas a este fungo e

3) Desenvolvimento e validação do método de quantificação do limonóide

angolensato de metila por LC-MS/MS (SRM). Foram isoladas 18 substâncias,

11 relatadas pela primeira vez em Khaya ivorensis, sendo 4 limonóides do tipo

fragmalina (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-[4.2.110,30.11,4]-triciclo-meliac-7-

oato de metila, 2,14-epoxi-1a,6,8a-tri-hidroxi-3-oxo-[4.2.110,30.11,4]-

triciclomeliac-7-oato de metila, 1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.110,2.11,4]-triciclomeliac-7-oato de metila e Khayanolídeo F), 2 apo-

protolimonóides (24-hidroxigrandifoliolenona e Acetato de sapelina E ), 1

limonóide do grupo gedunina (7-desacetil gedunina) e 1 do tipo mexicanolídeo

(8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal) e 3 triterpenos (odoratona , 23-hidroxi-

20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila e 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-

γ-lactona-angolensato de metila) e mais sete substâncias comuns no gênero

(angolensato de metila, 7-desacetoxi-7-oxogedunina, mexicanolídeo, khivorina,

6-hidroxiangolensato, 3-desacetil-khivorina e grandifoliolenona). Analisando os

cromatogramas de íons totais (TIC) juntamente com os espectros de massas

obtidos destes, observaram diferenças que justificassem uma mudança nos

metabólitos presentes nos tecidos analisados, ou seja, por meio do

experimento de full scan pôde-se inferir que o ataque por fungo ocasionou

modificação nos metabólitos dos tecidos analisados. O método de validação de

acordo com os parâmetros utilizados foi considerado: seletivo, linear, sensível,

preciso, exato e reprodutível.

Abstract

PHYTOCHEMISTRY STUDY OF NOBLE WOOD KHAYA IVORENSIS

(MELIACEAE) IMMUNE TO HYPSIPYLA GRANDELLA, TO UNDERSTAND A

RECENT PROBLEM: ATACK BY BOTRYOSPHAERIA RHODINA - The

species of Khaya ivorensis was introduced in Brazil and has been showing

resistant to Hypsipyla grandella. However, recently was observed K. ivorensis

symptomatic to fungus Botryosphaeria rhodina in experimental plantations,

which is characterized by nodules which make the wood less commercial value.

The objectives of this study were: 1) Phytochemistry study of Khaya ivorensis

symptomatic to Botryosphaeria rhodina, but remained resistant to Hypsipyla

grandella. 2) Analyses by LC-MS to verify if there was interference of the fungus

in the secondary metabolism of K.ivorensis, analyzing species symptomatic and

no symptomatic to this fungus. 3) Development and validation of the method of

quantification of limonoid methyl angolensate by LC-MS/MS (SRM). In

phytochemistry study was isolated 18 substances, 11 reported for the first time

in Khaya ivorensis: 4 fragmaline limonoids: 1α,2β,3α,6,8α,14β–hexahydroxy-

[4.2.1

10,30

1,4

]-methyl-tricyclo-meliac-7-oate, 2,14-epoxy-1α,6,8α – trihydroxy-3-

oxo-[4.2.1

10,30

1,4

]-methyl-tricyclomeliac-7-oato, 1α,6,8α,14β,30β–

pentahydroxy-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

]-methyl-triciclomeliac-7-oate and khayanolide

F; 2 apo-protolimonoids: 24-hydroxygrandifoliolenone and sapelin E acetate; 1

limonoid of gedunin group: 7-deacetyl gedunin; 1 of mexicanolide group:

mexicanolide; and 3 triterpenes: odoratone, 23-hydroxy-20(22)-en-21,23-δ-

lactone-methyl angolensate and 21-hydroxy-20(22)-en-21,23-δ-lactone-methyl

angolensate. Analyzing the chromatograms of the total ions (ICT) together with

the mass spectra was not observed differences that suggested a change in

metabolites present in the examined extracts. The validation method is in

accordance with the parameters used were considered: selective, linear,

sensitive, precise, accurate and reproducible.

Abreviaturas e Símbolos

ACN Acetonitrila

AcOET Acetato de etila

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

CC Cromatografia em Coluna

CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CEPLAC Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

COSY Correlation Spectroscopy

DCM Diclorometano

d Dubleto

dd Duplo Dubleto

ddd Duplo Duplo Dubleto

ddl Duplo Dubleto Largo

ddt Duplo Duplo Tripleto

DEPT Distortion less Enhancement by Polarization Transfer

dl Dubleto Largo

dq Duplo Quarteto

DQ Departamento de Química

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EM/ESI Espectroscopia de Massa modo Eletrospray

ESI Eletrospray

ESOMI Estação Experimental Sosthenes de Miranda

EtOH Etanol

EMF-H Extrato metanólico das folhas fração hexânica

EMF-D Extrato metanólico das folhas fração diclorometano

EMF-Ac Extrato metanólico das folhas fração acetato

EMCc-H Extrato metanólico da casca do caule fração hexânica

EMCc-D Extrato metanólico da casca do caule fração diclorometano

eV Elétron-volt

HMBC Heteronuclear Multiplete Bond Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Hz Hertz

IE Impacto Eletrônico

J Constante de acoplamento

KRaH Extrato hexânico das raízes

KRaD Extrato diclorometano das raízes

KRaM Extrato metanólico das raízes

Lit. Literatura

LC/MS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas

LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas em

seqüências

m Multipleto

Me Metila

MeOH Metanol

mult Multiplicidade

m/z Relação massa/carga

MHz Mega-hertz

nOe nuclear Overhouser effect

q Quarteto

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

s Singleto

sl Singleto Largo

SRM Selected Reaction Monitoring

SPE Extração em fase sólida

t Tripleto

tl Tripleto Largo

TIC Cromatograma de Ìons Totais

UV Ultravioleta

[α]

Rotação específica

Deslocamento químico para hidrogênio

Deslocamento químico para carbono

Lista de Tabelas

Tabela 3.1 – Extratos brutos obtidos da espécie Khaya ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina

Tabela 3.2 – Frações provenientes do fracionamento dos extratos metanólicos

das folhas e casca do caule de K. ivorensis

Tabela 3.3 – Fracionamento dos extratos de K. ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina

Tabela 4.1 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 1 (angolensato de metila) 48

Tabela 4.2 – Valores de RMN

H e

C do limonóide – 2 (7-desacetil gedunina). 56

Tabela 4.3 - Valores de RMN

H e

C do limonóide - 3 (7-desacetoxi-7-

oxogedunina)

Tabela 4.4 - Valores de RMN

H e

C do limonóide - 4 (mexicanolídeo) 68

Tabela 4.5 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 5 (1α,6,8α,14β,30β–

penta-hidroxi-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

Tabela 4.6 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 6 (8β-hidroxicarapina 3,8-

hemiacetal )

Tabela 4.7 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 7 (1α,2β,3α,6,8α,14β–

hexa-hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.)

Tabela 4.8 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 8 (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-

hidroxi-3-oxo-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

Tabela 4.9 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 9 (6-hydroxiangolensato

de metila.)

107

Tabela 4.10 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 10 (khivorina) 114

Tabela 4.11 – Valores de RMN

H e

C do limonóide - 11 (3-desacetil-

khivorina)

121

Tabela 4.12 – Valores de RMN

H e

C do triterpeno - 12 (odoratona) 127

Tabela 4.13 – Valores de RMN

H e

C do protolimonóide - 13 (24-

hidroxigrandifoliolenona)

135

Tabela 4.14 – Valores de RMN

H e

C do Protolimonóide - 14 (Acetato de

sapelina E)

142

Tabela 4.15 – Valores de RMN

C do Protolimonóide - 15 (Grandifoliolenona) e

do Protolimonóide - 16 (Acetato de sapelina E)

150

Tabela 4.16 – Valores de RMN

C do limonóide – 17 (23-hidroxi-20(22)-en-

21,23-γ-lactona-angolensato de metila) e do limonóide - 18 (21-

hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila)

160

Tabela 4.17 – Valores de RMN

C do limonóide – 17 (23-hidroxi-20(22)-en-

21,23-γ-lactona-angolensato de metila) e do limonóide - 18 (21-

hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila)

161

Tabela 5.1 - Extratos aquosos e clorofórmio obtidos dos materiais vegetais

(caule, casca do caule e folhas) de K. ivorensis sintomática e não

sintomática ao B. Rhodina

175

Tabela 5.2 - Extratos etanólico obtidos dos materiais vegetais (caule, casca do

caule e folhas) de K. ivorensis sintomática e não sintomática ao B.

Rhodina

204

Tabela 5.3 – Parâmetros utilizados no LC-MS\MS 224

Tabela 5.4 – Parâmetros de quantificação do angolensato de metila 227

Tabela 5.5 – Sensibilidade e linearidade para as matrizes (caule, casca do cale

e folhas não sintomáticas ao Botryosphaeria rhodina). Para n=3

231

xii

Tabela 5.6 – Exatidão (%) e Precisão (%) Intradia: Triplicata de cada ponto da

curva; Interdias: Triplicata de cada ponto analisado em 4 dias não

consecutivos, com intervalo de 4 dias entre cada seqüência de

injeções.

233

Tabela 5.7 - Recuperação (n =5) de angolensato de metila no CQB, CQM e

CQA.

235

Tabela 5.8 – Concentração de angolensato de metila nas matrizes (caule, casca

do caule e folha) sintomáticas e não sitomaticas ao B. rhodina.

236

Lista de Fluxogramas

Fluxograma 3.1 - Obtenção dos extratos de Khaya ivorensis com sintomas

frente ao Botryosphaeria rhodina

Fluxograma 3.2 - Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico das raízes

de Khaya ivorensis com sintomas frente ao Botryosphaeria

Rhodina

Fluxograma 3.3 - Fracionamento cromatográfico do extrato

diclorometanometano das raízes de Khaya ivorensis com sintomas

frente ao Botryosphaeria Rhodina

Fluxograma 3.4 - Fracionamento cromatográfico do extrato metanólico das

raízes de Khaya ivorensis com sintomas frente ao Botryosphaeria

rhodina

Fluxograma 3.5 – Partição líquido-líquido dos extratos metanólicos das folhas e

da casca do cerne

Fluxograma 3.6 - Fracionamento cromatográfico da fase hexano e

diclorometanometano da casca do cerne de Khaya ivorensis

sintomática ao Botryosphaeria rhodina

Fluxograma 3.7 - Fracionamento cromatográfico da fase Hexano e

diclorometanometano das folhas de Khaya ivorensis sintomática

ao Botryosphaeria rhodina

xiii

Lista de Figuras

Figura 1.1 - Árvore e folhagem do Mogno. 01

Figura 1.2 - Casca e madeira do mogno. 02

Figura 1.3 – Rotas biogenéticas dos limonóides de Meliaceae. 04

Figura 1.4 – Khaya ivorensis sem sintoma (a) e formações de nódulos em K.

ivorensis com sintomas (b).

Figura 3.1 – Cromatogramas das frações KRiD-C3, KCH-C4, KDC-C3, KHG-

C5, KDG-C4, KCH-C3, KCH-C5, KHG-C4 e KDG-C3, obtidos por

eluição do gradiente exploratório.

Figura 3.8 – Cromatograma da fração KCD-C3 obtido por eluição do gradiente

exploratório.

Figura 3.9 – Cromatograma da fração KCH-C3 obtido por eluição do gradiente

exploratório

Figura 4.1 - Espectro de RMN

H do limonóide angolensato de metila (400

MHz, CDCl

)

Figura 4.2 - Espectro de RMN

C do limonóide angolensato de metila (50

MHz, CDCl

)

Figura 4.3 - Espectro de DEPT do limonóide angolensato de metila (50 MHz,

CDCl

)

Figura 4.4 - Espectro de HSQC do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

Figura 4.5 - Espectro de HMBC do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

Figura 4.6 - Espectro de COSY do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

Figura 4.7 - Espectro de massas ESI (+) de angolensato de metila 52

Figura 4.8 – Espectro de RMN

H de 7–desacetilgedunina. (200MHz, CDCl

) 57

Figura 4.9 – Espectro de RMN

C de 7–desacetilgedunina. (50MHz, CDCl

) 57

Figura 4.10 - Espectro de HSQC de 7–desacetilgedunina (400 MHz, CDCl

) 58

Figura 4.11 - Espectro de HMBC de 7–desacetilgedunina (400 MHz, CDCl

) 58

Figura 4.11B - Espectro ampliado de HMBC de 7–desacetilgedunina (400

MHz, CDCl

)

Figura 4.12 – Espectro de COSY de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (400MHZ,

CDCl

)

Figura 4.13 - Espectro de massas ESI (-) de 7–desacetil gedunina 60

Figura 4.14 – Espectro de RMN

H de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (400MHZ,

CDCl3)

Figura 4.15 – Espectro de RMN

C de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (50MHZ,

CDCl

)

Figura 4.16 – Espectro de massas ESI (+) de 7-desacetoxi-7-oxogedunina

Figura 4.17 – Espectro de RMN

H de mexicanolídeo. (400MHz, CDCl

) 69

Figura 4.18 – Espectro de RMN

C de mexicanolídeo. (50MHz, CDCl3)

Figura 4.19 – Espectro de HSQC de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

) 70

Figura 4.20 – Espectro de HMBC de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

) 70

Figura 4.21 - Espectro de COSY de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

) 71

Figura 4.22 – Espectro de massas ESI (-) de mexicanolídeo 71

xiv

Figura 4.23 – Espectro de RMN

H de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD)

Figura 4.24 – Espectro de RMN

C de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (100MHz, CDCl

OD)

Figura 4.25 – Espectro de HSQC de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) ((400MHz, CDCl

OD)

Figura 4.26 – Espectro de HMBC de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD)

Figura 4.27 – Espectro de massas ESI (-) de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-

3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

Figura 4.28 – Espectro de RMN

H de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.29 – Espectro de RMN

C de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.30 – Espectro de HSQC de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.31 – Espectro de HMBC de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.32 - Espectro de COSY de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.33 – Espectro de massas ESI (-) de 8β-hidroxicarapina 3,8-

hemiacetal

Figura 4.34 – Espectro de RMN

H de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) ((400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.35 – Espectro de RMN

C de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) (100MHz, CDCl

e CD

OD).

Figura 4.36 – Espectro de HSQC de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) (400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.37 – Espectro de HMBC de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) (400MHz, CDCl

e CD

OD)

Figura 4.38 – Espectro de massas ESI (-) de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-

hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.)

Figura 4.39 – Espectro de RMN

H de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) ((400MHz, CDCl

OD)

100

Figura 4.40 – Espectro de RMN

C de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (100MHz, CDCl

OD)

100

Figura 4.41 – Espectro de HSQC de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD)

101

Figura 4.42 – Espectro de HMBC de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD)

101

Figura 4.43 – Espectro de COSY de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD)

102

Figura 4.44 – Espectro de massas ESI (-) de (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-

oxo-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

108

Figura 4.45 – Espectro de RMN

H de 6-hydroxiangolensato de metila

(400MHz, CDCl

)

109

Figura 4.46 – Espectro de RMN

C de 6-hydroxiangolensato de metila

(100MHz, CDCl

)

110

Figura 4.47 – Espectro de HSQC de 6-hydroxiangolensato de metila (400MHz,

CDCl

)

115

Figura 4.48 – Espectro de HMBC de 6-hydroxiangolensato de metila

(400MHz, CDCl

)

115

Figura 4.49 – Espectro de massas ESI (-) de 6-hydroxiangolensato de metila 116

Figura 4.50 – Espectro de RMN

H de khivorina (400MHz, CDCl

) 116

Figura 4.51 – Espectro de RMN

C de khivorina (100MHz, CDCl

) 117

Figura 4.52 – Espectro de HSQC de (khivorina) (400MHz, CDCl

) 117

Figura 4.53 – Espectro de HMBC de (khivorina) (400MHz, CDCl

) 122

Figura 4.54 – Espectro de COSY de (khivorina) (400MHz, CDCl

) 122

Figura 4.55 – Espectro de massas ESI (-) de khivorina 123

Figura 4.56 – Espectro de RMN

H de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

) 123

Figura 4.57 – Espectro de RMN

C de3-desacetilkhivorina (100MHz, CDCl

) 124

Figura 4.58 – Espectro de HSQC de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

) 124

Figura 4.59 – Espectro de HMBC de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

128

Figura 4.60 - Espectro de COSY de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

OD)

128

Figura 4.61 – Espectro de massas ESI (+) de 3-desacetilkhivorina 128

Figura 4.62 – Espectro de RMN

H de odoratona (400MHz, CDCl

) 129

Figura 4.63 – Espectro de RMN

C de odoratona (100MHz, CDCl

) 129

Figura 4.64 – Espectro de DEPT 135

de odoratona (100MHz, CDCl

) 130

Figura 4.65 – Espectro de HSQC de odoratona (400MHz, CDCl

) 130

Figura 4.66 – Espectro de HMBC de odoratona (400MHz, CDCl

). 131

Figura 4.67 – Espectro de COSY de odoratona (400MHz, CDCl

) 131

Figura 4.68 – Espectro de massas ESI (-) de (odoratona) 136

Figura 4.69 – Espectro de RMN

H de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz,

CDCl

)

136

Figura 4.70 – Espectro de RMN

C de 24-hidroxigrandifoliolenona (100MHz,

CDCl

136

Figura 4.71 – Espectro de HSQC de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz,

CDCl

)

137

Figura 4.72 – Espectro de HMBC de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz,

CDCl

)

137

Figura 4.73 – Espectro de COSY de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz,

CDCl

)

138

Figura 4.74 – Espectro de massas ESI (-) de 24-hidroxigrandifoliolenona 138

Figura 4.75 – Espectro de RMN

H de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

) 143

xvi

Figura 4.76 – Espectro de RMN

C de Acetato de sapelina E (100MHz, CDCl

143

Figura 4.77 – Espectro de HSQC de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

)

144

Figura 4.78 – Espectro de HMBC de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

)

144

Figura 4.79 – Espectro de COSY de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

)

145

Figura 4.80 – Espectro de massas ESI (+) de Acetato de sapelina E

145

Figura 4.81 – Espectro de RMN

H da mistura de grandifoliolenona (15) e

acetato de sapelina E (16) (400 MHz, CDCl

151

Figura 4.81B – Ampliação do espectro de RMN

H da mistura de

grandifoliolenona (15) e acetato de sapelina E (16) (400 MHz,

CDCl

)

151

Figura 4.82 – Espectro de RMN

C (PENDANT) da mistura de

grandifoliolenona (15) e acetato de sapelina E (16) (50 MHz,

CDCl

152

Figura 4.83 – Mapa de correlações HSQC da mistura de grandifoliolenona

(15) e acetato de sapelina E (16) (400 MHz, CDCl

)

152

Figura 4.83B – Ampliação do mapa de correlações HSQC da mistura de

grandifoliolenona (15) e acetato de sapelina E (16) (400 MHz,

CDCl

153

Figura 4.84 – Mapa de correlações HMBC da mistura de grandifoliolenona

(15) e acetato de sapelina E (16) (400 MHz, CDCl

153

Figura 4.84B – Ampliação do mapa de correlações HMBC da mistura de

grandifoliolenona (15) e acetato de sapelina E (16) (400 MHz,

CDCl

154

Figura 4.85 – Espectro de COSY da mistura de grandifoliolenona (15) e

acetato de sapelina E (16) (400 MHz, CDCl

154

Figura 4.86 – Espectro de massas ESI (+) de Acetato de sapelina E 155

Figura 4.87 – Espectro de RMN

H da mistura de 23-hidroxi-20(22)-em-21,23-

γ-lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-em-21,23-

γ-lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

162

Figura 4.88 – Espectro de RMN

C da mistura de 23-hidroxi-20(22)-em-21,23-

γ-lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-em-21,23-

γ-lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

)

162

Figura 4.89 – Espectro de RMN

C (PENDANT) da mistura de 23-hidroxi-

20(22)-em-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-

20(22)-em-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz,

CDCl

163

Figura 4.90 – Espectro de HSQC da mistura de 23-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

163

Figura 4.91 – Espectro de HMBC da mistura de 23-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

164

Figura 4.92 – Espectro de COSY da mistura de 23-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-em-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

164

xvii

Figura 4.93 – Espectro de massas ESI (+) da mistura de 23-hidroxi-20(22)-

em-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (17) 21-hidroxi-20(22)-

em-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (18) (400 MHz, CDCl

164

Figura 5.1 – Esquema para o pré-tratamento das amostras de Khaya

ivorensis.

169

Figura 5.2 - Cromatograma de eluição gradiente da fração metanólica de

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina após

tratamento por extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN).

170

Figura 5.3 - Cromatograma de eluição gradiente da fração de folhas de K.

ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina, após tratamento por

extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN).

171

Figura 5.4 - Cromatograma de eluição gradiente da fração de folhas de K.

ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina: (a) após tratamento

por extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN)e (b) sem

tratamento.

173

Figura 5.5 – Esquema da extração 3 174

Figura 5.6 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

177

Figura 5.7 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

177

Figura 5.6a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmico das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

178

Figura 5.7a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

178

Figura 5.6b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

179

Figura 5.7b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

179

Figura 5.6c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

180

Figura 5.7c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

180

Figura 5.6d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

181

Figura 5.7d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

181

Figura 5.8 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

182

xviii

Figura 5.9 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao

fungo B. rhodina.18

182

Figura 5.8a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

183

Figura 5.9a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

183

Figura 5.8b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

184

Figura 5.9b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

184

Figura 5.8c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

185

Figura 5.9c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

185

Figura 5.8d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

186

Figura 5.9d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio do cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

186

Figura 5.10 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-

sintomático ao fungo B. rhodina.

187

Figura 5.11 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis

sintomático ao fungo B. rhodina.

187

Figura 5.10a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

188

Figura 5.11a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

188

Figura 5.10b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B.rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

189

Figura 5.11b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

189

Figura 5.10c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

190

xix

Figura 5.11c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

190

Figura 5.10d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

191

Figura 5.11d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

191

Figura 5.12 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

192

Figura 5.13 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

192

Figura 5.12a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

193

Figura 5.13a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

193

Figura 5.12b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 30min.

194

Figura 5.13b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 30min.

194

Figura 5.12c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 30 a 45min.

195

Figura 5.13c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 30 a 45min.

195

Figura 5.14 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina.

196

Figura 5.15 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina.

196

Figura 5.14a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

197

Figura 5.15a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15 min.

197

Figura 5.14b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30min.

198

Figura 5.15b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30 min.

198

Figura 5.14c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 45min.

199

Figura 5.15c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 45min.

199

Figura 5.16 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina.

200

Figura 5.17 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato aquoso do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina.

200

Figura 5.16a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

201

Figura 5.17a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

201

Figura 5.16b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 30min.

202

Figura 5.17b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 30min.

202

Figura 5.16c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 30 a 35min.

203

Figura 5.17c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso

da casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 30 a 35min.

203

Figura 5.18 – Esquema para a extração 4 204

Figura 5.19 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático

ao fungo B. rhodina.

206

Figura 5.20 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

206

Figura 5.19a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

207

Figura 5.20a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

207

Figura 5.19b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

208

xxi

Figura 5.20b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

208

Figura 5.19c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

209

Figura 5.20c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

209

Figura 5.19d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

210

Figura 5.20d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

210

Figura 5.21 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina.

211

Figura 5.22 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina.

211

Figura 5.21a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

212

Figura 5.22a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

212

Figura 5.21b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

213

Figura 5.22b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 25min.

213

Figura 5.21c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

214

Figura 5.22c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 25 a 35min.

214

Figura 5.21d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

215

Figura 5.22d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 35 a 45min.

215

Figura 5.23 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico da casca do cerne de K. ivorensis não-

sintomático ao fungo B. rhodina.

216

xxii

Figura 5.24 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo

do extrato etanólico da casca do cerne de K. ivorensis sintomático

ao fungo B. Rhodina

216

Figura 5.23a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

217

Figura 5.24a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

217

Figura 5.23b – Espectros de massas dos analitos presentes do extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

218

Figura 5.24b – Espectros de massas dos analitos presentes do extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.23c – Espectros de massas dos analitos presentes do extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao

fungo B. rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

218

219

Figura 5.24c – Espectros de massas dos analitos presentes do extrato

etanólico da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

219

Figura 5.23d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

220

Figura 5.24d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato

etanólico Da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo

B. rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

220

Figura 5.25 – Espectros dos íons filhos de m/z 471, variando a energia de

ionização em 12, 15 e 18eV.

225

Figura 5.26 – Proposta de fragmentação de angolensato de metila;( Proposta

1 e 2 - perda de água ,18Da) e (Proposta 3: perda de uma

molécula de MeOH, 32Da)

226

Figura 5.27 – Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→

453 no modo positivo para as concentrações 5 e 1000ng/mL do

angolensato de metila.

229

Figura 5.28 – Cromatograma de SRM da casca do cerne referente à transição

471→ 453 no modo positivo para as concentrações 5 e

1000ng/mL do angolensato de metila.

229

Figura 5.29 – Cromatograma de SRM das folhas referente à transição 471→

453 no modo positivo para as concentrações 5 e 1000ng/mL do

angolensato de metila.

230

Figura 5.30 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 5

a 1000µg/mL, n = 3

230

Figura 5.31 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz casca do cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de

trabalho de 5 a 1000µg/mL, n = 3.

231

Figura 5.32 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz folha não sintomática ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 5

a 1000µg/mL, n = 3.

231

xxiii

Figura 5.33 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 5

a 1000µg/mL, n = 3.

234

Figura 5.34 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz casca do cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de

trabalho de 5 a 1000µg/mL, n = 3.

235

Figura 5.35 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a

matriz folha não sintomática ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 5

a 1000µg/mL, n = 3.

235

Figura 5.36 – Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→

453 e 471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na

matriz cerne sintomático e não sintomático.

237

Figura 5.37 – Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→

453 e 471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na

matriz casca do cerne sintomático e não sintomático.

237

Figura 5.38 – Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→

453 e 471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na

matriz casca do cerne sintomático e não sintomático

238

xxiv

Sumário

1- Introdução 01

1.2 - Investigações sobre a resistência de plantas exóticas 02

1.3 – Perfil químico da família Meliaceae 03

1.4 – O gênero Khaya e a espécie Khaya ivorensis 05

1.5 – Revisão dos metabólitos secundários do gênero Khaya. 07

1.5.1 – Esteróides 07

1.5.2 – Cicloartanos 08

1.5.3 – Apo-protolimonóides derivados do eufol/tirucalol 09

1.5.4 – Grupo Azadirono (Grupo 1) 09

1.5.5 – Grupo gedunina (Grupo 2) 11

1.5.6 – Grupo B-seco (Grupo 4) 12

1.5.7 – Limonóides mexicanolídeo (Grupo 5) 13

1.5.8 – Limonóides fragmalina 17

1.5.9 – Limonóides com modificações nos anéis A e B 19

1.5.10 – Cumarinas 20

1.5.11 – Flavonóides 20

2 – Objetivos 23

3 – Procedimentos Experimentais 25

3.1 – Material Botânico 25

3.2 – Obtenção dos extratos orgânicos de Khaya ivorensis sintomática ao fungo

Botryosphaeria rhodina

3.3 – Fracionamento dos extratos brutos de Khaya ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina.

3.3.1 – Isolamento e purificação do extrato hexânico das raízes 27

3.3.2 – Isolamento e purificação do extrato diclorometano das raízes 28

3.3.3 – Isolamento e purificação das raízes do extrato metanólico 29

3.3.4 – Fracionamentos dos extratos metanólicos das folhas e casca do caule 30

3.3.5 – Fracionamentos das frações EMCc–H e EMCc-D 32

3.3.6 – Fracionamentos das frações EMF–H e EMF-D 32

3.3.7 – Tratamento dos extratos via CLAE - gradiente 33

3.4 – Equipamentos 40

3.4.1 – Evaporadores 40

3.4.2 - Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear 40

xxv

3.4.3 – Espectrômetro de massas 40

3.4.4 – Câmara de análise de fluorescência por luz ultravioleta 40

3.4.5 – Balança analitica 40

3.4.6 – CLAE 40

3.5 – Materiais 41

3.5.1 - Fases Estacionárias 41

3.5.2 – Solventes 41

3.5.3 – Placas Cromatográficas 41

4 - Resultados e discussões do estudo fitoquímico de Khaya ivorensis

sintomática ao fungo Botryosphaeria rhodina

4.1 - Determinação estrutural do limonóide – 1 43

4.2 - Determinação estrutural do limonóide – 2 e 3 52

4.3 - Determinação estrutural do limonóide - 4 63

4.4 - Determinação estrutural do limonóide - 5 72

4.5 - Determinação estrutural do limonóide - 6 79

4.6 - Determinação estrutural do limonóide - 7 87

4.7 - Determinação estrutural do limonóide - 8 94

4.8 - Determinação estrutural do limonóide 9 103

4.9 - Determinação estrutural do limonóide 10 110

4.10 - Determinação estrutural do limonóide 11 118

4.11 - Determinação estrutural do triterno 12 125

4.12 - Determinação estrutural do protolimonóide- 13 131

4.13 - Determinação estrutural do protolimonóide- 14 139

4.14 - Determinação estrutural do protolimonóide- 15 e 16 146

4.15 – Determinação estrutural dos limonóides - 17 e 18 155

5 - Resultados e Discussões do Perfil Químico de Khaya ivorensis

sintomática e não sintomática ao fungo Botryosphaeria rhodina

167

5.1 – Desenvolvimento de método para análise do perfil químico da espécie

Khaya ivorensis sintomática e não sintomática ao fungo Botryosphaeria

rhodina

167

5.2 – Quantificação de Angolensato de Metila nos tecidos vegetais de Khaya

ivorensis sintomática e não sintomática ao fungo

221

5.2.1 – Validação de métodos analíticos 221

5.2.2 – Desenvolvimento do Método e Seletividade 223

5.2.3 – Linearidade e Sensibilidade 227

5.2.4 – Precisão e exatidão 232

xxvi

5.2.5 – Recuperação 234

5.2.6 – Quantificação de angolensato de metila nas matrizes sintomáticas ao

Botryosphaeria rhodina

236

5.2.7 – Considerações Finais 239

6 – Conclusões Gerais

241

7 – Referências Bibliográficas

243

1- Introdução

A família Meliaceae compreende 51 gêneros de plantas lenhosas dos

trópicos e subtrópicos de ambos os hemisférios. O número de espécies é de

aproximadamente 1400 (BANERJI e NIGAM, 1984). No Brasil são encontrados seis

gêneros (PENNINGTON e STYLER, 1975): Cedrela (cedro-branco, cedro-rosa,

cedro-vermelho), Cabralea, Swietenia (mogno), Carapa (andiroba), Guarea, e

Trichilia que apresentam grande interesse econômico por parte das indústrias

madeireiras.

Figura 1.1 - Árvore e folhagem do Mogno:

http://www.clubedasemente.org.br/mogno.html

O mogno (Swietenia macrophylla, Figura 1.1) vulgarmente chamado de

aguana, araputanga e mogno brasileiro em países de língua portuguesa, é muito

conhecido no exterior por caoba (em espanhol), acajou (em francês) e mahogany

(em inglês) (PINHEIRO,A.L. 2000 e MÜLLER, et al, 2002).

A árvore é de grande porte, decídua, heliófita, característica de floresta

de terra firme, e de rápido crescimento em seu habitat natural. Sua madeira é

indicada para o mobiliário de luxo, painéis, lambris, objetos de adorno, esquadrias,

laminados e folhas faqueadas, contraplacados, acabamentos internos como

guarnições, venezianas, rodapés, molduras, assoalhos, etc.

Devido às excepcionais qualidades e vantagens comparativas, o

mogno foi eleito ao longo dos séculos como madeira ideal para nobres, sofisticadas

e duradouras aplicações. Sua durabilidade, textura e manuseio aliados à facilidade

de acabamento, sua densidade média, o rendimento volumétrico da árvore e a

pequena área de alburno, além da cor clássica, elevaram-no à categoria ideal e

preferida (Figura 1.2).

Figura 1.2 - Casca e madeira do mogno:

http://www.clubedasemente.org.br/mogno.html

Porém nos últimos anos as reservas naturais de espécies desses

gêneros vêm diminuindo rapidamente devido à exploração intensiva e ao

desmatamento desordenado das matas, para a agricultura e pecuária. Desta forma,

tem se intensificado o plantio dessas espécies fornecedoras de madeira nobre,

contudo, sem grande sucesso. Isto porque os brotos jovens dessas plantas sofrem

ataques drásticos de larvas de um microlepdóptero do gênero Hypsipyla. Este

ataque chega a provocar a morte dos brotos, estimulando a formação de vários

outros brotos, levando a ramificação na copa do vegetal jovem. Como conseqüência,

tem-se a formação de árvores adultas com muitos ramos, de troncos curtos e não

homogêneo, reduzindo drasticamente o valor e a viabilidade comercial do mogno

OIANO, 2000.

1.2 - Investigações sobre a resistência de plantas exóticas

Vários experimentos foram realizados na tentativa de combater a praga

Hypsipyla grandella, no entanto, a busca e seleção de plantas resistentes ao ataque

deste inseto parecem ser o melhor caminho. Testes realizados em várias regiões

tropicais indicam que as Meliaceae exóticas não são ou são bem menos atacadas

por Hypsipyla da região, quando comparadas com os ataques observados àquelas

nativas. Por exemplo, Cedrela odorata da América Latina, introduzida na Austrália

não é atacada por H. robusta, a qual destrói plantações de Toona ciliata var

australis, nativa desta região. Na África Cedrela odorata não é atrativa para H.

robusta, assim como nas Filipinas Swietenia macrophylla está livre de ataques e tem

sido usada para reflorestamento (GRIJPMA, et al, 1970). Em Honduras o ataque de

H. grandella a Khaya nyasica, K. ivorensis, Toona ciliata e Entandrophragma rederi

era mínimo, enquanto que as nativas Cedrela odorata e Swietenia macrophyla são

fortemente atacadas. Em Porto Rico, as exóticas Toona ciliata e T. sureni também

não são atacadas pelo inseto nativo.

1.3 – Perfil químico da família Meliaceae

É comum encontrar nesta família limonóides, que são conhecidos por

apresentarem vários tipos de atividades biológicas: anticancerígena, antiparasitária,

antimalária, antifúngica, antibacteriana, antiviral e principalmente atividade contra

insetos (CHAMPAGNE, et al.; 1992).

A família Meliaceae é capaz de produzir vários tipos estruturais de

limonóides (Figura 1.3) a partir de um precursor comum (grupo 1), que possui

esqueleto básico de 26 átomos de carbono. Esse precursor sofre abertura oxidativa

dos anéis B, D e B/D para produzir os limonóides dos grupos 2, 6 e 4. Os limonóides

do grupo 4, após sofrerem uma reciclização produzem os limonóides do grupo 5

conhecidos como mexicanolídeos. A partir do mesmo precursor, a abertura oxidativa

dos anéis A/B leva aos limonóides dos grupos 8 e 9. A clivagem oxidativa do anel C

produz os limonóides com anel C-seco típicos do grupo da azadiractina (grupo 7).

Os limonóides presentes nos gêneros pertencentes à subfamília

Swietenioideae no geral seguem a rota que leva ao grupo do mexicanolídeo (grupo

5), enquanto os gêneros da subfamília Melioideae formam principalmente limonóides

ao longo de rotas biogenéticas que levam aos grupos 6, 7, 8 e 9. Várias pesquisas

no grupo de Produtos Naturais da Universidade Federal de São Carlos já foram

desenvolvidas com o objetivo de se certificarem se a preferência ou não ao ataque

de Hypsipyla está correlacionada com os metabólitos secundários presentes em

gêneros dessas subfamílias, que são bem distintos como mencionado

anteriormente. De acordo com essas informações, nota-se uma forte preferência do

inseto a gêneros da subfamília Swieteniodeae e não Melioideae. Neste trabalho

pretende-se dar continuidade ao estudo fitoquímico de plantas exóticas, para isso foi

escolhida uma espécie de mogno africano, a Khaya ivorensis.

Figura 1.3 – Rotas biogenéticas dos limonóides de Meliaceae.

Grupo 3

Grupo 4

Grupo 8

810

COOMe

Grupo 9

Grupo 2

Grupo 1

28 29

Grupo 7

OHO

Grupo 5

Apoeufol (20R)

Apotirucalol (20S)

28 29

Grupo 6

COOR

Swietenioideae

Melioideae

1.4 – O gênero Khaya e a espécie Khaya ivorensis

O gênero Khaya A. Juss, é classificado junto à subfamília

Swietenioideae, ocorre na África e Madagascar. Ele é de difícil taxonomia,

devido à grande similaridade entre as espécies. Atualmente apenas seis

espécies são oficialmente reconhecidas: K. anthoteca (Welw.) C. DC., K.

grandifoliola C. DC., K. ivorensis A. Chev., K. madagascariensis Jumelle et

Perrier, K. nyasica Stapf ex BaK.f. e K. senegalensis (Desr.) A. Juss.

O mogno africano (Khaya ivorensis) é uma espécie que vem

despertando o interesse de pequenos produtores na Amazônia, por apresentar

madeira de boa qualidade e crescimento rápido. Suas árvores possuem em

torno de 22m de altura e 2m de perímetro, sendo uma importante fonte de

mogno da África. Ao contrário das Meliaceas nativas da Amazônia, o mogno

africano não é atacado pela broca das ponteiras (Hypsipyla grandella), que

como mencionado anteriormente é o principal problema silvicultural das

meliáceas tradicionais.

O gênero Khaya apresenta uma grande importância para as

indústrias madeireiras, com isto, tem-se intensificado a introdução de suas

espécies no Brasil, em substituição ao nosso mogno Swietenia macrophylla,

Durante o ano de 2001, foram distribuídas 70.000 sementes

dessa espécie, para pequenos produtores de 144 municípios do Estado do

Pará, como forma de promover a espécie e estimular o reflorestamento junto à

agricultura familiar.

A Embrapa Amazônia Oriental (Belém-PA) distribuiu também 38

quilos de sementes de espécies florestais regionais, por meio dos cursos e

treinamentos, beneficiando técnicos de instituições de pesquisa, prefeituras

municipais, estudantes e instituições ambientais.

No entanto, este investimento pode não ter sucesso, isso porque

recentemente o Dr. Manfred Willy Müller da CEPLAC - Superintendência

Regional da Bahia, Salvador -, observou a ocorrência de cancro na Khaya

ivorensis, provavelmente provocado por fungo em áreas experimentais da

CEPLAC, localizado no Recôncavo baiano (MÜLLER et al, 2002).

Estes fungos provocam a formação de nódulos que tornam a

madeira de menor valor comercial, como observa-se na Figura 1.4. Segundo o

pesquisador Müller, estima-se que a área plantada com Khaya, somente no

estado do Pará, seja de aproximadamente 20.000ha visando a exploração de

madeira e que a proliferação da doença poderá inviabilizar a expansão do

mogno africano, haja vista que existem outras plantações no Brasil, visando à

exploração desta madeira, ele acredita que o combate deste fungo vai ser o

problema na introdução do mogno africano.

Figura 1.4 – Khaya ivorensis sem sintoma (a) e formações de nódulos em K.

ivorensis com sintoma (b), (c) e (d).

(a)

(b)

(c)

(d)

Em virtude deste relato, o estudo fitoquímico da espécie Khaya

ivorensis, com cancro, porém permanecendo resistente a H. grandella, busca

entender este ataque por fungo e também contribuir com os estudos sobre a

quimiossistemática deste gênero.

Já foram realizados no laboratório de Produtos naturais da

UFSCar os estudos fitoquímicos de Khaya senegalensis (SALLES, 1995), K.

ivorensis sem cancro (BARBOSA, 2007) e de K. anthotheca (FERREIRA et al,

2005), todas as espécies resistentes ao ataque do microlepdóptero Hypsipylla

grandella, como também foi realizado o estudo fitoquímico de Swietenia

macrophylla (SOARES, 2002, DA SILVA, 2005), a qual sofre ataque deste

inseto.

Podendo assim, questionar se a preferência da H. grandella a

determinadas espécies, está ou não associada à rota biogenética dos

limonóides.

É importante mencionar que o desenvolvimento deste projeto foi

realizado paralelo ao projeto de doutorado de Silva, 2007 que teve por objetivo

pesquisar o isolamento, identificação e desenvolvimento deste fungo.

Com objetivo de conhecer o perfil químico de Khaya, foi feita uma

revisão da ocorrência dos compostos isolados deste gênero, em parceria com

Barbosa, 2007, onde observou-se a predominância da classe dos limonóides,

os quais são caracterizados por apresentarem esqueletos do tipo azadirono

(Grupo 1, Figura 1.3), gedunina (Grupo 2, Figura 1.3) e derivados

mexicanolídeos (Grupo 5, Figura 1.3) (SALLES, 1995).

1.5 – Revisão dos metabólitos secundários do gênero Khaya

1.5.1 – Esteróides

Os fitoesteróides são de ocorrência ampla no reino vegetal. Entre

estes os mais comuns são o sitosterol, estimagmasterol e campesterol.

Normalmente aparecem em misturas, de difícil separação, pois apresentam

propriedades físicas semelhantes. O sitosterol já foi isolado das espécies K.

anthotheca (EKONG, et al., 1975; HALSALL e TROKE, 1975), K. grandifoliola

(FERREIRA, et al., 2005, CONNOLLY, et al., 1968; TCHUENDEM, et al.,

1998), K. ivorensis (ADESOGAN, et al., 1970b; ADESINA, 1983), K. nyasica

(TAYLOR, 1969), K. senegalensis (ADESINA, 1983; OLMO, et al., 1996). O

campesterol e o estigmasterol foram isolados de K. anthotheca (EKONG, et al.,

1975; FERREIRA, et al., 2005), K. ivorensis (ADESINA, 1983), K. senegalensis

(ADESINA, 1983; OLMO, et al., 1996), e O 3β-O-β-D-glucopiranosilsitosterol de

K. anthotheca (TCHIMENE, et al., 2005), K. senegalensis (OLMO, et al., 1996).

1.5.2 – Cicloartanos

Na literatura há apenas relatos da presença do cicloeucalenol e

24-metilenocicloartanol na casca do caule de K. anthotheca (EKONG, et al.,

1975).

Β-sitosterol

cam

esterol

estigmasterol

glu-D-β

3β-O-β-D-glucopiranosil sitosterol

cicloeucalenol

24-metilenocicloartanol

1.5.3 – Apo-protolimonóides derivados do eufol/tirucalol

Os apo-protolimonóides são os precursores biossintéticos dos

limonóides, eles possuem oito átomos de carbono na cadeia lateral e

insaturação no C-14. Foi relatado um apo-protolimonóide (a grandifoliolenona)

com anel de seis membros na cadeia lateral, em K. grandifoliola (CONNOLLY,

et al., 1967a, CONNOLLY, et al., 1971) e K. ivorensis (ADESOGAN, et al.,

1970a).

1.5.4 – Grupo Azadirono (Grupo 1)

São considerados os limonóides com os esqueletos triterpênicos

intactos. Foram relatados 14 limonóides presentes na casca do caule, caule,

sementes, galhos e raízes nas espécies de Khaya:

- K. anthotheca:

(1) azadirona (HALSALL e TROKE, 1975)

(2) 11α-acetoxiazadirona (HALSALL e TROKE, 1975)

(3)1α,11:14β,15β-diepoxi-6-hidroximeliaca-5,9,20,22-tetraen-3,7-

diona (HALSALL e TROKE, 1975)

(4) 11β-acetoxiazadirona (EKONG, et al., 1975)

(5) 3,7-diacetato de desoxihavanensina (ADESOGAN, et al.,

1970b)

(6) havanensina (ADESOGAN, et al., 1970b)

(7) 1,7-diacetato de havanensina (ADESOGAN, et al., 1970b)

(8) triacetato de havanensina (ADESOGAN, et al., 1970b)

(9) cedrelona (ADESOGAN, et al., 1970b, EKONG, et al., 1975)

OAcO

grandifoliolenona

(10) anthothecol (ADESOGAN, et al., 1970b , EKONG, et al.,

1975 HALSALL & TROKE, 1975)

(11) khayanthona, (ADESOGAN & TAYLOR, 1967c e

ADESOGAN, et al., 1970b)

- K. nyasica:

(12) desoxikhayathona (TAYLOR, 1969)

(11) khayanthona (TAYLOR, 1969).

- K. grandifoliola:

(13) 7-hidroxi-7-desacetoxikhivorina (CONNOLLY, et al., 1968).

(14) 7-oxo-7-desacetoxikhivorina (CONNOLLY, et al., 1968)

OOAc

α-AcO

AcO

OAc

AcO

α-OAc

R1 R2 R3

OAc OAc OAc

OH OH OH

OAc OH OAc

OAc O OAc

R1 R2 R3

H H H

Ac Ac H

Ac Ac Ac

1.5.5 – Grupo gedunina (Grupo 2)

Os limonóides deste grupo são caracterizados por um anel D-

lactônico, que são formados por meio de reações de Baeyer-Villiger. Foram

relatados 12 limonóides isolados das sementes, caule, casca do caule e raízes

no gênero Khaya:

(15) gedunina em K. grandifoliola (BICKII, et al., 2000) e K.

senegalensis (ADESOGAN, et al., 1967a)

(16) 7-desacetoxi-7-oxogedunina em K. ivorensis (ADESOGAN &

TAYLOR, 1970a; TAYLOR, 1977) e K. senegalensis (ADESOGAN & TAYLOR,

1968).

(17) grandifoliona em K. grandifoliola (CONNOLLY, et al., 1968).

(18) 3,7-didesacetilkhivorina em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1997; GOVINDACHARI & KUMARI, 1998).

(19) 3-desacetilkhivorina em K. anthotheca (ADESOGAN &

TAYLOR, 1967c; ADESOGAN, et al., 1970b), K. ivorensis (ADESOGAN &

TAYLOR, 1970a; TAYLOR, 1977; TAYLOR, 1970; TAYLOR, 1969), K.

madagascariensis (TAYLOR, 1970), K. nyasica (TAYLOR, 1969) e K.

senegalensis (ADESIDA, et al., 1967; ADESOGAN, et al., 1967a; ADESOGAN

& TAYLOR, 1968; GOVINDACHARI, et al., 1997).

(20) 1-desacetilkhivorina em K. grandifoliola (BICKII, et al., 2000).

(21) 7-desacetilkhivorina em K. grandifoliola (BICKII, et al., 2000),

K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1970a; TAYLOR, 1977; TAYLOR, 1970;

TAYLOR, 1977), K. senegalensis (GOVINDACHARI & KUMARI, 1998). Embora

tenham nomes diferentes, 17 e 21, tratam-se do mesmo limonóide

(22) khivorina em K. anthotheca (ADESOGAN & TAYLOR, 1967c;

ADESOGAN, et al., 1970b), K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1970a;

TAYLOR, 1977), K. nyasica (TAYLOR, 1969), K. senegalensis (TAYLOR, 1967;

ADESIDA, et al., 1967; ADESOGAN, et al., 1967a; ADESOGAN & TAYLOR,

1968).

(23) nyasina em K. nyasica (TAYLOR, 1967, TAYLOR, 1969;

CONNOLLY, et al., 1973).

(24) 11β-acetoxikhivorina em K. madagascariensis (TAYLOR,

1970 e TAYLOR, 1968), K. nyasica (TAYLOR, 1969).

(25) 3-desacetil-7-desacetoxi-7-oxokhivorina em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1997; GOVINDACHARI & KUMARI, 1998;

ABDELGALEIL e IWAGAWA, 2004).

(26) 7-desacetoxi-7-oxokhivorina em K. senegalensis (ADESIDA,

et al., 1967; ADESOGAN, et al., 1967a; ADESOGAN & TAYLOR, 1968)

1.5.6 – Grupo B-seco (Grupo 4)

Os limonóides deste grupo apresentam o anel D-lactônico e o

anel B aberto. Foram relatados cinco limonóides com este tipo estrutural, eles

foram isolados do caule, raízes, casca do caule e sementes. A seguir estão

descritos os nomes, as estruturas e as espécies em que cada um foi

encontrado.

(27) angolensato de metila em K. anthotheca (TCHIMENE, et al.,

2005), K. grandifoliola (CONNOLLY, et al., 1967b; CONNOLLY, et al., 1968;

OAc

OOR

R1 R2 R3

17 Ac H Ac

Ac H H

Ac Ac H

H Ac Ac

21 Ac H Ac

Ac Ac Ac

OAc

AcO OAc

OAc

RO O

CONNOLLY, et al., 1971; TCHUENDEM, et al., 1998; BICKII, et al., 2000), K.

ivorensis (ADESIDA, et al., 1967; ADESOGAN & TAYLOR, 1968;TAYLOR,

1977), K. senegalensis (ADESIDA, et al., 1967; ADESOGAN & TAYLOR, 1968;

ABDELGALEIL, et al., 2001; NAKATANI, et al., 2000a; NAKATANI, et al.,

2000b; NAKATANI, et al., 2001).

(28) 6-hidroxiangolensato de metila em K. anthotheca

(TCHIMENE, et al., 2005), K. grandifoliola (CONNOLLY, et al., 1967b;

CONNOLLY, et al., 1968; CONNOLLY, et al., 1971; TCHUENDEM, et al., 1998;

BICKII, et al., 2000), K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1968; TAYLOR,

1977), K. senegalensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1968; ABDELGALEIL, et al.,

2001; ABDELGALEIL e IWAGAWA, 2004).

(29) 6-acetoxiangolensato de metila em K. grandifoliola

(CONNOLLY, et al., 1967b; CONNOLLY, et al., 1971), K. senegalensis

(ABDELGALEIL, et al., 2001)

(30) khayanosídeo em K. senegalensis (NAKATANI, et al., 2002)

(31) ivorensato de metila em K. ivorensis (ADESOGAN &

TAYLOR, 1969; ADESOGAN & TAYLOR, 1970a, TAYLOR, 1977),

1.5.7 – Limonóides mexicanolídeo (Grupo 5)

Este grupo é caracterizado por possuir o anel B seco com

subseqüente ciclização. Foram descritos 36 limonóides em várias espécies de

Khaya, sendo isolados principalmente das sementes, mas também foram

encontrados nas raízes, galhos, casca do caule e caule. Os limonóides de

Khaya que fazem parte deste grupo foram descritos abaixo:

OAc

glu

gluglu

(32) 6-desoxidestigloilswietenina em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1998).

(33) acetato de 6-desoxidestigloilswietenina em K. senegalensis

(ADESIDA, et al., 1967; ADESOGAN & TAYLOR, 1968).

(34) 3β-isobutiriloxi-1-oxomeliac-8,30-enato de metila em K.

nyasica (TAYLOR, 1969).

(35) swietenina em K. nyasica (TAYLOR, 1969).

(36) diacetato de 6-epidestigloilswietenina em K. senegalensis

(ADESIDA, et al., 1967).

(37) 3β,12β-diacetoxi-1-oxomeliac-8(30)-enato de metila em K.

senegalensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1968).

(38) 6-desoxiswietenolídeo em K. ivorensis (ADESOGAN &

TAYLOR, 1970a), K. senegalensis (GOVINDACHARI, et al., 1997;

GOVINDACHARI, et al., 1999)

(39) fissinolídeo em K. nyasica (TAYLOR, 1969), K. ivorensis

(ADESOGAN & TAYLOR, 1970a; TAYLOR, 1977)., K. grandifoliola

(ADESOGAN & TAYLOR, 1967b), K. madagascariensis (TAYLOR, 1970), K.

senegalensis (KHALID, et al., 1998; GOVINDACHARI, et al., 1999)

(40) khayasina em K. ivorensis (VANUCCI, et al., 1992),

K.senegalensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1968)

(41) mexicanolídeo em K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR,

1970a), K. senegalensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1968; GOVINDACHARI, et

al., 1998; GOVINDACHARI, et al., 1999)

(42) swietenolídeo em K. ivorensis (TAYLOR, 1977),

K.grandifoliola (BICKII, et al., 2000)

(43) 6-acetilswietenolídeo em K.grandifoliola (BICKII, et al., 2000)

(44) 2α,3β-di-hidroxi-3-deoximexicanolídeo em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1997; GOVINDACHARI, et al., 1998)

(45) 2-hidroxifissinolídeo em K. ivorensis (ADESOGAN &

TAYLOR, 1970a), K. senegalensis (TAYLOR, 1977)

(46) 2-acetoxifissinolídeo em K. ivorensis (TAYLOR, 1977)

(47) 2α-hidroximexicanolídeo em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1997; GOVINDACHARI e KUMARI, 1998;

GOVINDACHARI, et al., 1999)

(48) 2,6-di-hidroxifissinolídeo em K. senegalensis (KHALID, et al.,

1998)

(49) 3β-hidroxi-3-deoxicarapina em K. senegalensis

(GOVINDACHARI, et al., 1997; GOVINDACHARI, et al., 1998)

(50) 3β-acetoxi-1-oxo-meliac-14(15)-enato de metila em K.

nyasica (TAYLOR, 1969)

(51) 3β-acetoxi-3-desoxo-6(R)-hidroxicarapina em K.

senegalensis (KHALID, et al., 1998) e K. anthotheca (TCHIMENE, et al., 2005)

(52) 6(R),8α-di-hidroxicarapina em K. anthotheca (TCHIMENE, et

al., 2005)

(53) 3β-isobutiriloxi-1-oxomeliacato de metila em K. anthotheca

(ADESOGAN, 1970b)

(54) 3β-acetoxi-2-hidroxi-1-oxomeliacato de metila em K.

madagascariensis (TAYLOR, 1970)

(55) 3β-isobutiriloxi-30α-acetoxi-1-oxomeliacato de metila em K.

nyasica (TAYLOR, 1970)

(56) khayanona em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,, 2001)

(57) seneganolídeo A em K. senegalensis (ABDELGALEIL, et al.,

2004)

(58) 2-hidroxiseneganolídeo A em K. senegalensis

(ABDELGALEIL, et al., 2004)

(59) 2-acetoxiseneganolídeo A em K. senegalensis

(ABDELGALEIL, et al., 2004)

(60) Anthothecanolídeo em K. anthotheca (TCHIMENE, et al.,

2005)

(61) 3-O-acetilanthothecanolídeo em K. anthotheca (TCHIMENE,

et al., 2005)

(62) 2,3-di-O-acetilanthothecanolídeo em K. anthotheca

(TCHIMENE, et al., 2005)

(63) Seneganolídeo em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,

2000a; ABDELGALEIL, et al., 2001; NAKATANI, et al., 2001; NAKATANI, et al.,

2002)

(64) 2-Hidroxiseneganolídeo em K. senegalensis (NAKATANI, et

al., 2001; NAKATANI, et al., 2002)

MeO

R1 R2 R3 R4

H OH H H

H OAc H

β-H

OH OAc H

β-H

OH O H

α- OH

(65) 1α,8α-óxido-3β-acetoxi-2α-acilperoxi-1α,14α-di-hidroxi-

[3.3.1

10,2

]-biciclomeliac-7,19-olídeo em K. anthotheca (FERREIRA, et al., 2005)

(66) substância C em K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR,

1970a; TAYLOR, 1977)

(67) composto E em K. ivorensis (TAYLOR, 1977)

MeO

R1 R2

H H

H Ac

H COPr

OH H

AcO Ac

OAc

MeO

R1 R2 R3

H OH H

H OAc H

H OCOPr

H O H

OH OH H

AcO OH H

H OH OH

H OAc OH

H OAc OAc

H O OH

OAc

Oac

MeO

R1 R2 R3 R4 R5

H OCOPr

H H

β-H

H OAc OH H

β-H

H OCOPr

H OAc-

β-H

OH OH O H

α-OH

1.5.8 – Limonóides fragmalina

Os limonóides pertencentes a essa classe são derivados dos

mexicanolídeo. A maior parte destes limonóides foi relatada na espécie Khaya

senegalensis, isolados principalmente da casca do caule e folhas. A seguir

serão mostrados 11 limonóides descritos na literatura.

(68) Khayanolídeo D em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,

2002)

(69) Khayanolídeo B em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,

2002; ABDELGALEIL, et al., 2001; NAKATANI, ET AL., 2001)

(70) Khayanolídeo E em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,

2002)

(71)1α-acetoxi-3β,6,8α-triidroxi-2α-metoxi-2β,14β-epoxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila em K. senegalensis (OLMO, et

al.,1997)

MeO

AcO

R1 R2 R3 R4

OH OH OH H

OAc OH OH H

OAc OAc OH H

O OH H OH

MeO

(72) Khayanolídeo A em K. senegalensis (NAKATANI, et al.,

2000b; ABDELGALEIL, et al., 2001; NAKATANI, ET AL., 2001)

(73) 1-O-acetilkhayanolídeo A em K. senegalensis (NAKATANI, et

al., 2001; NAKATANI, et al., 2002)

(74)1α,2β,3α,6,8α,14β-hexa-hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-

7-oato de metila em K. senegalensis (OLMO, et al.,1996) e K. anthotheca

(FERREIRA, et al., 2005)

(75)1α-acetoxi-2β,3α,6,8α,14β-penta-hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

triciclomeliac-7-oato de metila em K. senegalensis (OLMO, et al.,1996)

(76) Khayanolídeo C em K. senegalensis (ABDELGALEIL, et al.,

2001)

(77)1α,6,8α,14β,30β-penta-hidroxi-3-oxo-[3.3.110,2.11,4]-

triciclomeliac-7-oato de metila em K. senegalensis (OLMO, et al.,1997,

NAKATANI, et al., 2002)

(78)1α-acetoxi-6,8α,14β,30β-tetra-hidroxi-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

triciclomeliac-7-oato de metila em K. senegalensis (OLMO, et al.,1997)

MeO

R1 R2 R3 R4

H OH H H

OH OH H H

OH O Ac H

OH OH Ac OMe

MeO

1.5.9 – Limonóides com modificações nos anéis A e B

Apenas dois limonóides foram relatados com modificações nos

anéis A e B. O 3-acetoxi-8,14-dien-8,30-seco-khayalactona (79) isolado dos

galhos de Khaya anthotheca (ABDELGALEIL, et al., 2004) e o khayalactona

(80) isolado da casca do caule de K. anthotheca (TCHIMENE, et al., 2005) e K.

grandifoliola (TCHUENDEM, et al,. 1998).

MeO

MeO O

AcO

MeO O

1.5.10 – Cumarinas

Na literatura também foi relatada a presença de apenas quatro

cumarinas no gênero Khaya:

umbeliferona isolada de K. ivorensis (ADESINA, 1983),

aesculetina isolada de K. senegalenis (ADESINA, 1983),

escopoletina isolada de K. anthotheca (FERREIRA, et al., 2005),

K. ivorensis (ADESINA, 1983) e K. senegalensis (ADESINA, 1983; OLMO, et

al., 1997)

escoparona isolada de K. ivorensis (ADESINA, 1983), K.

senegalensis (ADESINA, 1983; OLMO, et al., 1996)

1.5.11 – Flavonóides

Os flavonóides isolados de Khaya foram relatados principalmente

em Khaya senegalensis, sendo apenas cinco destes compostos descritos na

literatura:

β-quercitrina isolado de K.senegalensis (OLMO, et al., 1997),

rutina isolado de K.senegalensis (OLMO, et al., 1997),

catequina isolado de K. grandifoliola (TCHUENDEM, et al,. 1998;

BICKII, ET AL., 2000),

catequina-(4α,6)-catequina isolado de K.senegalensis (KAYSER,

et al., 2001),

catequina-(4α,8)-catequina isolado de K.senegalensis (KAYSER,

et al., 2001).

OHO O

umbeliferona aesculetina

MeO

OHO O

MeO

escopoletina escoparona

ORha

uercitrina

OGlc-Rha

rutina

catequina

catequina-(4α,8)-catequina

cate

uina-

(

)

-cate

uina

2 – Objetivos

1) Estudo fitoquímico de Khaya ivorensis sintomática ao fungo

Botryosphaeria rhodina, porém permanecendo imune a Hypsipyla grandella.

2) Comparar por LC-MS se houve interferência do fungo no

metabolismo secundário de K. ivorensis, analisando espécies sintomáticas e

não sintomáticas ao Botryosphaeria rhodina.

3) Desenvolvimento de método de quantificação do limonóide

angolensato de metila por LC-MS/MS (SRM)

3 – Procedimentos Experimentais

3.1 – Material Botânico

A espécie Khaya ivorensis foi adquirida no dia 20 de outubro de

2003, na Estação Experimental Sosthenes de Miranda (ESOMI), unidade

experimental de Pesquisas do Cacau (CEPLAC), localizada no município de

São Sebastião do Passe, região do Recôncavo da Bahia, de uma plantação

modelo com sintomas (cancro) frente a fungos. Foram coletadas parte de uma

planta sem cancro (folhas, galhos e cernes) e também parte de uma planta

com cancro (raízes, galhos, folhas e cernes). A coleta foi supervisionada pelo

Dr. Manfred Willy Müller do CEPLAC e pelo doutorando Sebastião da Cruz

Silva. É importante relatar que este aluno faz parte do grupo de pesquisa de

Produtos Naturais da UFSCar e o objetivo do seu projeto foi pesquisar o

isolamento, a identificação e desenvolvimento do fungo isolado da espécie

Khaya ivorensis. Este doutorando caracterizou o fungo patógeno como sendo o

Botryosphaeria rhodina.

3.2 – Obtenção dos extratos orgânicos de Khaya ivorensis sintomática ao

fungo Botryosphaeria rhodina

O material vegetal coletado foi separado por partes, seco em

estufa de circulação de ar a 40

C por mais ou menos 36 horas, pulverizado em

moinho Willey e posteriormente extraído à temperatura ambiente e macerado

com solventes em ordem crescente de polaridade (hexano,

diclorometanometano, metanol e metanol:água 1:1) por três dias, repetindo-se

o processo por 3 vezes (Fluxograma 3.1). As soluções resultantes foram

concentradas sob vácuo em evaporador rotativo obtendo assim os extratos

brutos descritos na Tabela 3.1.

Fluxograma 3.1 - Obtenção dos extratos de Khaya ivorensis com sintomas

frente ao Botryosphaeria rhodina

Tabela 3.1 – Extratos brutos obtidos da espécie Khaya ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina

Q de Ms (g): quantidade em gramas de material seco e moído

Q de E (g): quantidade em gramas de extrato seco

Parte vegetal Q de Ms(g) Solvente Q de E (g) Código

Raiz Hexano 8,69 KRaH

Raiz Diclorometanometano 9,56 KRaD

Raiz Metanol 92,36 KRaM

Raiz

2105,5

Hidrometanólico fungou KRaA

Raízes secundárias Hexano 0,40 KRiH

Raízes secundárias Diclorometano 0,77 KRiD

Raízes secundárias Metanol 4,19 KRiM

Raízes secundárias

77,4

Hidrometanólico 3,20 KRiA

Cerne Hexano 18,83 KCH

Cerne Diclorometano 7,18 KCD

Cerne Metanol 138,85 KCM

Cerne

4400,4

Hidrometanólico fungou KCA

Casca do cerne Hexano 12,85 KCcH

Casca do cerne Diclorometano 19,095 KCcD

Casca do cerne Metanol 18,29 KCcM

Casca do cerne

1144,6

Hidrometanólico 17,61 KCcA

Galhos Hexano 0,95 KGH

Galhos Diclorometano 1,087 KGD

Galhos Metanol 8,56 KGM

Galhos

158,4

Hidrometanólico 12,41 KGA

Folhas Hexano 11,07 KFH

Folhas Diclorometano 36,30 KFD

Folhas Metanol 6,91 KFM

Folhas

335,4

Hidrometanólico 34,6 KFA

Material Vegetal

Extrato Hexânico

Torta

Extrato Diclorometano

Torta

Extrato Metanólico

TortaExtrato Hidrometanólico

Maceração com Hexano

por três dias por três vezes

Maceração com

Diclorometanometano por três

Maceração com Metanol

por três dias por três vezes

Maceração com mistura de

Água/Metanol na proporção de

1:1

or três dias

or duas vezes

3.3 – Fracionamento dos extratos brutos de Khaya ivorensis sintomática

ao Botryosphaeria rhodina

3.3.1 – Isolamento e purificação dos constituintes do extrato hexânico das

raízes

O extrato hexânico das raízes de Khaya ivorensis com sintomas

frente ao Botryosphaeria rhodina foi submetido à cromatografia em coluna de

sílica-gel (230-400µm). Foram obtidas 80 frações analisadas via cromatografia

em camada delgada comparativa onde verificou-se que seus constituintes

eluiam satisfatoriamente a baixa polaridade. As frações foram reunidas de

acordo com as semelhanças de R

produzindo 12 subfrações. Após revelação

em U.V. e em vanilina ácida percebeu-se a presença de uma mancha intensa

cor de vinho nas frações KRaH 1-12 a 18-22, estas foram analisadas através

de RMN

H onde observou-se a presença de misturas de terpenos e esteróides.

As frações KRaH 34-35 a 45-53 apresentaram uma mancha bem

escura após revelação em U.V. e em vanilina ácida. A fração KRaH-44 foi

analisada por meio de RMN

H e verificou-se a presença de sinais

característicos de um limonóide e após determinação estrutural foi

caracterizado por limonóide 1.

As frações KRaH-34-35 e 45-53 foram submetidas a CLAE

utilizando uma coluna de octadecil (C-18) e fase móvel ACN:H

O (3:7), mas

constatou-se, por RMN

H, ser o mesmo limonóide 1.

O Fluxograma 3.2 mostra a visão geral do fracionamento

cromatográfico do extrato KRaH.

Fluxograma 3.2 - Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico das

raízes de Khaya ivorensis com sintomas frente ao

Botryosphaeria Rhodina

3.3.2 – Isolamento e purificação dos constituintes do extrato

diclorometanometano das raízes

O extrato diclorometanometano das raízes de K. ivorensis com

sintomas frente ao Botryosphaeria rhodina foi fracionado por meio de

cromatografia em coluna de sílica-gel (230-400mesh). Obtendo-se 60 frações

que foram agrupadas em 9 subfrações de acordo com R

apresentados na

CCDC. O Fluxograma 3.3 mostra, de forma geral, o fracionamento

cromatográfico do extrato KRaD, onde foram isolados os limonóides 1, 2, 3 e 7.

Limonóide 1

1-12

3,61g

Misturas de

limonóides

Coluna de octadecil (C-18)

(25 x 2cm)

Modo isocrático

Eluentes: ACN:H

O (3:7)

Coluna de sílica (230-400µm)

(47 x 4,6cm)

Modo gradiente

Eluentes: Hex/AcOEt/MeOH

KRaH

8,6862g

36-43

0,03g

16-17

0,62g

0,29g

18-22

0,49g

23-29

0,27g

34-35

0,05g

13-15

0,66g

30-33

0,13g

45-53

0,39g

54-64

0,23g

65-80

0,15g

Limonóide 1

Fitoesteróides

Misturas de

limonóides

Fluxograma 3.3 - Fracionamento cromatográfico do extrato

diclorometanometano das raízes de Khaya ivorensis com

sintomas frente ao Botryosphaeria Rhodina

3.3.3 – Isolamento e purificação dos constituintes das raízes do extrato

metanólico

O extrato metanólico das raízes de K. ivorensis com sintomas

frente ao Botryosphaeria rhodina foi submetido à cromatografia em coluna de

celulose cristalina. Foram obtidas 62 frações agrupadas de acordo com o R

apresentados na CCDC, reunidas em 9 subfrações, sendo possível isolar o

limonóide 4 e 1.

CLAE -Preparativo

Coluna Polimérica-

Asahipak GS-31 2G

(50 x 2,5cm)

Eluentes: MeOH:DCM (95:5)

V=4,5mL/min;

λ =217 e254nm

CLAE- Preparativo

Coluna de octadecil

(C-18)

(25 x 2,12cm)

Eluentes:

MeOH:H

(gradiente)

V=14,5mL/min

λ =217 e 254nm

33-39

1,39g

CLAE-

Preparativo

Coluna de

octadecil (C-18)

(25 x 2,12cm)

Eluentes:

ACN:H

O (3:7)

7mL/min

Coluna de sílica

(230-400µm)

(27 x 2,3cm)

Modo gradiente

Hex/AcOEt/MeOH

CLAE -Preparativo

Coluna Polimérica-

Asahipak GS-31 2G

(50 x 2,1cm)

Eluentes:MeOH:DC

M (95:5)

V=4,5mL/min;

217 e254nm

Coluna de sílica (230-400

(60 x 5,2cm)

Modo gradiente

Eluentes: Hex/AcOEt/MeOH

1-12

0,88g

43-52

1,24g

20-23

0,48g

53-60

0,88g

25-28

1,53g

29-32

2,19g

39-40

0,01g

13-19

0,47g

Limonóide 2

1-15

0,33g

16-24

0,05g

25-29

0,32g

30-32

0,02g

Limonóide 1 e 3

Limonóide 1

Limonóide 7

33-38

0,01g

KRaD

9,5605g

Fluxograma 3.4 - Fracionamento cromatográfico do extrato metanólico das

raízes de Khaya ivorensis com sintomas frente ao

Botryosphaeria rhodina

3.3.4 – Fracionamentos dos extratos metanólicos das folhas e casca do

cerne

Os extratos metanólicos das folhas e casca do cerne de K.

ivorensis com cancro por Botryosphaeira rhodina foram submetidos à partição

líquido-líquido (Fluxograma 3.5) em um funil de separação, com a finalidade de

separar os constituintes altamente polares. A Tabela 3.2 mostra as frações

obtidas deste fracionamento.

Coluna de Sephadex_LH20

(47 x 1,8cm)

Modo isocrático

Eluente: MeOH

Coluna de celulose D-Microcristalina

(30 x 1,8cm)

Modo gradiente

Eluentes: Hex/AcOEt/MeOH

KRaM

8,6862g

1-7

3,61g

47-50

0,57g

11-19

0,62g

51-62

0,29g

20-25

0,12g

26-30

0,08g

38-46

0,06g

8-10

0,66g

31-37

0,13g

Limonóide 1

Limonóide 4

Fluxograma 3.5 – Partição líquido-líquido dos extratos metanólicos das folhas

e da casca do cerne.

Tabela 3.2 – Frações provenientes do fracionamento dos extratos metanólicos

das folhas e casca do cerne de K. ivorensis

Fração Solvente Massa (g)

EMF-H

EMF-D

EMF-Ac

EMCc-H

EMCc-D

EMCc-Ac

Hexano

AcOEt

Hexano

AcOEt

0,44

1,72

1,22

2,60

1,66

1,32

Suspensão em metanol/água 7:3 + hexano

(300 mL por 3 vezes)

Fração

Diclorometanometano

Extrato metanólico Khaya ivorensis com

sintomas frente ao Botryosphaeira rhodina

Extração com

diclorometanometano (300 mL por

3 vezes

)

Parte hidroalcoólica

Fração hexânica

Parte hidroalcoólica

Fração Acetato de etila Parte hidroalcoólica

Extração com Acetato de etila

(300 mL por 3 vezes)

3.3.5 – Fracionamentos das frações EMCc–H e EMCc-D

As frações EMCc-H e EMCc-D foram reunidas e submetidas à

cromatografia em coluna de sílica-gel (Fluxograma 3.6), utilizando como

eluentes: Hexano/diclorometanometano/acetona/metanol, obtendo-se 54

frações, as quais foram agrupadas por CCDC.

Fluxograma 3.6 - Fracionamento cromatográfico da fase hexano e

diclorometanometano da casca do cerne de Khaya

ivorensis sintomática ao Botryosphaeria rhodina

3.3.6 – Fracionamentos das frações EMF–H e EMF-D

As frações EMF-H e EMF-D também foram reunidas e

submetidas à cromatografia em coluna de sílica-gel (Fluxograma 3.7),

utilizando como eluentes: hexano/acetato de etila/metanol, obtendo-se 38

frações, as quais foram agrupadas por CCDC.

1-6

1,2g

EMCc-H/EMCc-D

4,0g

Coluna de sílica (230-400

(22 x 6cm)

Modo gradiente

Eluentes: Hex/DCM/Acetona/MeOH

40-48

0,57g

12-15

0,03g

49-54

0,29g

16-17

0,01g

18-22

0,08g

31-39

0,06g

7-12

0,4g

23-30

0,13g

Limonóide 5

Limonóides

em misturas

Fluxograma 3.7 - Fracionamento cromatográfico da fase Hexano e

diclorometanometano das folhas de Khaya ivorensis

sintomática ao Botryosphaeria rhodina

3.3.7 – Tratamento dos extratos via CLAE - gradiente

Além das frações trabalhadas apresentadas anteriormente, outras

frações foram analisadas, como por exemplo, o extrato hexânico das cascas

dos cernes, onde foram feitas sucessivas cromatografias em coluna sem

grandes sucessos. Isso porque, observaram-se via RMN

H, que a maior parte

destas frações apresentava sinais característicos de limonóides, sendo os

sinais mais intensos peculiares ao composto angolensato de metila. Isso

implica que este limonóide achava-se em maior quantidade nestas frações, o

que tornou mais trabalhoso encontrar os limonóides em menores quantidades,

além disso, as frações que tinham estas substâncias em misturas possuíam

pouquíssima massa o que dificultava purificá-las por cromatografia clássica.

CLAE- Preparativo

Coluna de octadecil (C-18)

(25 x 2,12cm)

Eluentes: MeOH:H

O (gradiente)

V=14,5 mL/min

λ =217 e 254nm

1-4

0,41g

EMF-H/EMF-D

2,0g

Coluna de sílica (230-400

(19 x 4 cm)

Modo gradiente

Eluentes: Hex/AcOEt/MeOH

29-34

0,37g

8-10

0,03g

35-38

0,29g

11-14

0,02g

0,01g

22-28

0,06g

5-8

0,4g

16-21

0,13g

Limonóide 7

Limonóide 8

Diante da dificuldade em se obter novos limonóides optou-se por

fazer um gradiente exploratório via CLAE (Cromatografia Liquida de Alta

Eficiência). Para isso os extratos foram previamente limpos via coluna filtrante

com emprego de vácuo em funil de placa sinterizada, para evitar que as

impurezas ficassem retidas na coluna cromatográfica e conseqüentemente

danificando-a. O tratamento utilizado para a pré-limpeza dos extratos encontra-

se na Tabela 3.3 a seguir:

Tabela 3.3 – Fracionamento dos extratos de K. ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina

KCH

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 15 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KCH-C1 KCH-C1 KCH-C3 KCH-C4 KCH-C5

Massa (g)

0,020 10,224 2,303 0,603 1,149

KGH

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 17 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KGH-C1 KGH-C2 KGH-C3 KGH-C4 KGH-C5

Massa (g)

0,008 0,467 0,096 0,031 0,310

KFH

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 15 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KFH-C1 KFH-C2 KFH-C3 KFH-C4 KFH-C5

Massa (g)

0,721 0,624 0,876 0,394 0,748

KRiD

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 10 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KRiD-C1 KRiD-C2 KRiD-C3 KRiD-C4 KRiD-C5

Massa (g)

0,001 0,081 0,266 0,171 -

KFD

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 17 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KFD-C1 KFD -C2 KFD -C3 KFD -C4 KFD -C5

Massa (g)

0,007 1,402 1,076 2,194 2,817

KCD

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 17 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KCD-C1 KCD-C2 KCD-C3 KCD-C4 KCD -C5

Massa (g)

0,008 2,800 1,424 1,1303 2,2175

KGD

(sílica-gel 230-400 mesh e florisil, 17 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KGD-C1 KGD-C2 KGD-C3 KGD-C4 KGD-C5

Massa (g)

0,003 0,101 0,105 0,2362 0,592

KCcD

(sílica-gel 230-400mesh e florisil, 17 x 9cm, modo gradiente)

Frações

KCcD-C1 KCcD-C2 KCcD C3 KCcD-C4 KCcD-C5

Massa (g)

0,001 13,947 1,931 1,694 2,733

C1- hexano 100%,

C2- acetato de etila:hexano (3:7),

C3– acetato de etila:hexano (1:1),

C4- acetato de etila 100% e

C5- metanol 100%

Para o desenvolvimento do método de análise de limonóides em

extratos, foi realizada uma análise gradiente exploratória via CLAE utilizando

uma coluna analítica C

– Gemini (150 x 4,6mm, 10µm) contendo uma pré-

coluna (4 x 3mm, 5 µm). Gradientes exploratórios em fase reversa são

usualmente feitos com amplas faixas de gradientes, 5% a 100% onde se

emprega uma mistura de H

O (solvente A) e um solvente orgânico (solvente B -

MeOH ou acetonitrila - ACN) como constituintes da fase móvel.

Foi empregado um detector de arranjo de fotodiodos com seleção

da faixa de comprimento de onda entre 250-500nm na região do UV para se

obter a determinação das absorbâncias das substâncias presentes na amostra.

A eluição dos compostos presentes em Khaya ivorensis

sintomática ao Botryosphaeria rhodina foi avaliada utilizando-se uma variação

de acetonitrila (solvente B) - em água (5-100%), por 60 minutos, com uma

vazão de 2,0 mL/min, no entanto, foi necessário melhorar a interação e

distribuição cromatográfica dos compostos presentes nas amostras analisadas

com a fase estacionária, desta forma, a condição cromatográfica gradiente

utilizada foi de 5 a 100% de MeOH, usado como solvente orgânico em

substituição a acetonitrila, por 60 minutos e com uma vazão de 1,0 mL/min.

Os cromatogramas apresentados na Figura 3.1 mostram o

gradiente exploratório obtidos para se avaliar as características dos

constituintes químicos dos extratos de khaya ivorensis sintomática ao

Botryosphaeria rhodina, onde notou-se que as frações analisadas

apresentaram substâncias de média e baixa polaridade.

Figura 3.1 – Cromatogramas das frações KRiD-C3, KCH-C3, KCH-C4, KCH-

C5, KCD-C3, KGH-C4, KHC-C5, KGH-C5 e KGD-C3 e KGD-C4

obtidos por eluição do gradiente exploratório, 5 a 100% de

MeOH, usado como solvente orgânico por 60 minutos e com

uma vazão de 1,0 mL/min.

KRiD-C3

KCH-C3

KCH-C4

KCH-C5

KCD-C3

KGH-C4

KGH-C5

KGD-C3

KGD-C4

Conhecendo o perfil cromatográfico das frações estudadas,

variações no percentual do modificador orgânico (alteração na inclinação do

gradiente) foram testadas com o intuito de melhorar a retenção dos compostos

e a seletividade das bandas.

As condições avaliadas não foram adequadas para se obter

melhor retenção dos compostos presentes nas amostras, assim como, uma

melhor separação destes. A elevada absorção na região do UV do angolensato

de metila interferiu na observação das bandas dos demais compostos.

Desta forma optou-se por fazer as análises no modo gradiente,

utilizando coluna preparativa C

– Gemini (250 x 21,2mm, 10µm). O gradiente

exploratório foi realizado com uma fase móvel em H

O e MeOH, alterando a

força da fase móvel, variando a porcentagem de MeOH de 5% a 100% por 60

mim, com uma vazão de 1 mL/min.,acompanhado a corrida gradiente com um

detector de UV (λ = 217, 254 e 365nm).

Todas as frações KRiD-C3, KCH-C4, KCH-C5, KGH-C4, KHC-C5,

KGH-C5 e KGD-C3 e KGD-C4 foram trabalhadas, mas as frações KCD-C3 e

KCH-C3, tiveram uma melhor separação cromatográfica. O cromatograma

apresentado na Figura 3.8 refere-se à eluição do gradiente exploratório, via

CLAE, da fração KCD-C3 onde observaram-se vários picos de absorção sendo

possível isolar oito substâncias: dois triterpenos e seis limonóides.

A Figura 3.9 refere-se ao cromatograma da fração KCH-C3, onde

também apresentou vários picos de absorção, mas só foi possível identificar

quatro limonóides.

Figura 3.8 – Cromatograma da fração KCD-C3 obtido por eluição do gradiente

exploratório MeOH de 5% a 100% por 60 mim, com uma vazão

de 1 mL/min.,acompanhado a corrida gradiente com um

detector de UV (λ = 217, 254 e 365nm).

Figura 3.9 – Cromatograma da fração KCH-C3 obtido por eluição do gradiente

exploratório, MeOH de 5% a 100% por 60 mim, com uma vazão

de 1 mL/min.,acompanhado a corrida gradiente com um

detector de UV (λ = 217, 254 e 365nm).

L13 e14

L12

L11

T 15 e 16

L13 e 14

L10

3.4 – Equipamentos

3.4.1 - Evaporadores

−BÜCHI, rotavapor R-114, equipado com banho BÜCHI B-480 e recirculador

refrigerado NESLAB, modelo CFT-25 mantido a 5°C.

− BÜCHI, rotavapor R-200, equipado com banho BÜCHI 490 e recirculador

refrigerado NESLAB, modelo CFT-25 mantido a 5°C.

3.4.2 - Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear

−BRUKER modelo DRX 400

−BRUKER modelo ARX 200

3.4.3 – Espectrômetro de massas

−MICROMASS QUATTRO LC – Ionização por Eletrospray

−CG-EM: Shimadzu QP 5000 Ionização por impacto eletrônico

3.4.4 – Câmara de análise de fluorescência por luz ultravioleta

−Cabine tipo SPECTROLINE modelo CM-10 com luz tipo SPECTROLINE

modelo ENF-260C. (λ = 254 e 365nm)

3.4.5 – Balança analítica

−SARTORIUS modelo BP210S

−AND modelo HR200

3.4.6 – CLAE

−Cromatógrafo: Shimadzu SCL-10Avp, equipado com: válvula de reciclo,

válvula de injeção Rheodyne 7725i, alça de amostragem de 200, 500 e 2000µL,

bombas Shimadzu LC-6AD e detector de UV-Vis Shimadzu SPD-10vvp.

−Cromatógrafo: ÄKTA, equipado com: válvula de injeção inv-907, alça de

amostragem de 200, 500 e 2000µL, bombas P-900 (P-901/903) e detector de

UV-900.

−Cromatógrafo: Shimadzu SCL-10Avp, equipado com: degaseificador de

membrana Shimadzu DGU-14A, duas bombas Shimadzu LC-10ADvp e

detectores de Foto-diodo Shimadzu SPD-M10Avp.

3.5 – Materiais

3.5.1 - Fases Estacionárias

−Sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM), MERCK

−Sílica gel (230-400 mesh ASTM), MERCK

−Celulose microcristalina, VETEC

3.5.2 - Solventes

−MERCK, SINTH, VETEC, LABSYNTH e outros destilados na sala de

destilação do Departamento de Química da UFSCar para obtenção de extratos

e fracionamento dos mesmos.

−Solventes deuterados da MERCK e ALDRICH para obtenção de espectros de

RMN.

3.5.3 - Placas Cromatográficas

−Cromatoplaca de sílica gel 60 GF

254

em alumínio, MERCK

4 - Resultados e Discussões do Estudo fitoquímico de Khaya ivorensis

sintomática ao Botryosphaeria Rhodina

4.1 - Determinação estrutural do limonóide 1:

Para a determinação estrutural do limonóide 1 foram feitos os

espectros de RMN

H, RMN

C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS

representados respectivamente por FIGURAS 4.1, 4,2, 4,3, 4.4, 4.5, 4,6 e 4.7. Os

valores dos deslocamentos químicos foram comparados com os valores

encontrados na literatura (TABELA 4.1).

A identificação deste limonóide foi iniciada pelos sinais de

deslocamentos químicos do anel furano. Analisando o espectro de hidrogênio,

notou-se um sinal em δ

6,39 d (J = 1,7Hz) que via HSQC acoplou com um sinal em

109,7 e correlacionou-se via HMBC com os sinais em δ

120,6, 140,5 e 142,5. O

sinal em δ

7,39 t (J = 1,7Hz) acoplou com o sinal do carbono em δ

142,5 e

correlacionou-se com os sinais de carbono em δ

120,6 e 140,5. Já o sinal δ

140,5

acoplou com o sinal de hidrogênio em δ

7,44 sl e correlacionou-se em δ

109,7,

120,6 e 142,5. Observou-se via DEPT que o sinal em δ

120,6, refere-se a um

carbono quaternário e como foi mostrado anteriormente ele correlacionou-se com os

hidrogênios em δ

6,39 e 7,44.

Desta forma, as correlações citadas sugeriram as subestruturas A e B

para o anel furano, e pôde-se atribuir os sinais δ

120,6, 109,7, 142,5 e δ

140,5

respectivamente aos carbonos 20, 22, 23 e 21 ou 20, 22, 21 e 23, isso porque

observaram correlações a

J ou a

J como mostrado nas subestruturas A e B abaixo:

7,39

142,5

7,44

140,5

120,6

109,5

6,39

Subestrutura A

7,39

142,5

7,44

140,5

120,6

109,5

6,39

Subestrutura B

HMBC

H→C

Além das correlações apresentadas para os sinais em δ

109,7,

120,6 e

140,5 estes também correlacionaram-se com o sinal δ

5,67 que acoplou com o sinal

em δ

79,3 (via DEPT indica ser um CH). Estas correlações sugeriram o sinal em δ

5,67 para o H-17 e confirmaram o sinal em δ

140,5 para o C-21. Assim sendo, a

subestrutura A representou adequadamente o anel furano, pois, o sinal em H-17

correlacionou com o sinal δ

140,5 (

J), mas para se correlacionar com o sinal em δ

142,5 (C-23) seria necessário um

Estas correlações discutidas acima sugeriram que o anel D foi oxidado

para C-16 lactona e que o sinal δ

5,67 mostrou correlações com os sinais de

carbono do anel furano e também correlacionou-se com o sinal de um carbono

quaternário em δ

41,1 que indicou o C-13 e com os sinais em δ

29,0 e 13,5 que

apontaram ser respectivamente os C-12 e Me-18.

Analisando os dois pares de dubletos em δ

2,91 d (J = 18Hz) e δ

2,58 d (J = 18Hz) verificou-se que estes acoplaram em δ

33,5 e correlacionaram-se

com os sinais em δ

80,0 e 169,9, sendo que somente aquele em δ

2,58

correlacionou-se com o sinal δ

41,1 (C–13). Estas correlações permitiram atribuir

os dois sinais de hidrogênio (CH

) ao 2H-15, δ

33,5 (C-15), assim como, o sinal em

169,9

ao C-16.

O sinal em δ

0,87 da Me-18 correlacionou com os sinais em δ

41,1

(C-13), 29,0 (C-12), 79,3 (C-17) e 80,0. Estas correlações confirmaram as

atribuições feitas acima, como mostradas abaixo e sugeriram a presença de uma

hidroxila ou éter (OR) em C-14 (δ

80,0).

HMBC

H→C

Notaram-se no espectro de RMN

H dois sinais de hidrogênio

característicos de dupla terminal em δ

4,90 s e δ

5,16 s, os quais acoplaram em δ

111,4 (C-30) e correlacionaram-se com os sinais de C-14 e em δ

49,6. O sinal em

4,90 também correlacionou com o sinal de carbono sp

totalmente substituído em

145,4. A correlação do sinal de C-14 permitiu posicionar esta dupla ligação entre

C-8 e C-30. As demais correlações levaram a atribuir em δ

49,6 o C-9 e em δ

145,4 o C-8.

O sinal em δ

2,18 d (J= 2,4Hz) (H-9) mostrou correlações via HMBC

com os seguintes sinais de carbonos: δ

145,4 (C-8), 111,4 (C-30), 80,0 (C-14),

77,0, 29,0 (C-12) e 23,5. Por meio destas correlações foi assinalado o sinal em δ

23,5 para o C-11 e em δ

77,0 – sinal de deslocamento químico característico de

carbono oxidado - para o C-1. Ainda verificou um sinal em δ

0,95 que acoplou via

HSQC em δ

21,2 e correlacionou-se em δ

77,0 (C-1), 42,6 (C-5), 43,7 (um

quaternário, C–10) e δ

49,6 (CH, C–9). Estas correlações permitiram atribuir o sinal

em δ

0,95 a Me-19.

Observou-se também um sinal em δ

3,72 s característico de uma

metoxila de um grupo carbometoxi que acoplou via HSQC em δ

51,8 e

correlacionou via HMBC em δ

173,6 – sinal de deslocamento químico que indica

um carbometoxi para o C-7, este correlacionou com os sinais em δ

2,62 dd (J=10,4

e 16,4Hz) e δ

2,26 d (J=16,4Hz) correspondentes aos 2H-6, os quais acoplaram

em δ

32,4 (C-6). Estas correlações conferem à abertura do anel B.

Os dois dubletos em δ

2,52 dd (J=4,0 e 14,3Hz) e δ

2,91dd (J=6,6 e

14,3Hz), acoplaram via HSQC em δ

39,1 (C-2) e correlacionaram-se em δ

21,2

HMBC

H→C

(Me-19) e 25,4 (Me-28) e também com o sinal de uma carbonila em δ

212,7, esta

só poderia estar em C-3 considerando o esqueleto básico de um limonóide.

Os sinais de duas metilas em δ

1,19 e δ

1,04 por meio do HSQC

acoplaram em δ

25,4 e 21,2 respectivamente, e correlacionaram via HMBC com os

sinais em δ

42,6 (C-5), 47,8 (C-4) e com C-3. Assim sendo, as duas metilas

corresponderam àquelas ligadas ao C–4, ou seJa Me-28 e Me-29.

Logo, os sinais em δ

2,91 e 2,52 referem-se aos 2H-2. As constantes

de acoplamento do sinal em δ

2,52 (dd, J=4,0 e 14,3Hz) sugerem atribuí-lo ao H-

2eq e do sinal em δ

2,91 (dd, J=6,2 e 14,3) ao H-2ax. Uma vez que as constantes

de acoplamento entre dois hidrogênios axiais são grandes e varia de 9-13Hz,

enquanto entre dois hidrogênios axial-equatorial ou equatorial-equatorial elas são

pequenas, variando de 2-5Hz. Esta informação permitiu inferir que a hidroxila ou OR

em C-1 deve estar em axial (face α), pois, as constantes encontradas em δ

3,53

foram: dd, J=4,0 e 6,2Hz, H-1equatorial.

Com todos os dados em mãos faltou verificar se em C-14 e C-1

estariam hidroxilas ou éter. Considerando que todos os sinais de carbono foram

atribuídos e supondo as hidroxilas ausentes, a ligação éter só poderia ser entre C-1

e C-14.

Por meio do espectro de massas ESΙ (+) (FIGURA 4,7) foi possível

verificar um pico em m/z 471 [M+H]

, correspondente ao íon pseudo-molecular,

confirmado pelos picos em m/z 493 e m/z 509, respectivamente, dos íons do aduto

de sódio e potássio. Assim, foi possível confirmar a fórmula molecular C

para

o limonóide 1, que é denominado de angolensato de metila.

HMBC

H→C

29 28

OOMe

Como visto nas discussões anteriores, só não foi possível atribuir

corretamente os sinais de 2H-11 e 2H-12. Comparando com os sinais descritos na

literatura (KADOTA et al, 1990) (TABELA 4,1), confirmaram-se os sinais em δ

1,59

m para o H-11a e 2,18 sl para os H-11b, 1,90 ddd (18,7,14,0 e 5,0Hz) para H-12a e

1,12 m para H12b.

O limonóide angolensato de metila apresentou rotação ótica específica

de [α]

= -40,0

(c 0,0014; CHCl

COOMe

Limonóide 1

(angolensato de metila)

TABELA 4.1 – Valores de RMN

H e

C do limonóide 1 (angolensato de metila)

LITERATURA

(KADOTA et al, 1990)

LIMONÓIDE 1

(Hz) δ

1 3,52 dd (6,5 e 4,0) 77,2 3,53 dd (6,6 e 4,0) 77,0

2a 2,51 dd (14,5 e 4,0) 39,4 2,52 dd (14,3 e 4,0)

2b 2,90 dd (14,5 e 6,0) 2,91 dd (14,3 e 6,6)

39,1

3 212,6 212,7

4 48,0 47,8

5 2,88 d (10,5) 42,9 2,88 d (10,3) 42,6

6a 2,25 d (16,5) 32,5 2,26 d (16,4)

6b 2,61 dd (15,6 e 10,5) 2,62 dd (16,4 e 10,3)

32,4

7 173,8 173,6

8 145,9 145,4

9 2,17 dd (5,0e 1,5) 50,0 2,17 sl 49,6

10 44,1 43,7

11a 1,57 tl (14,5 e 5,0) 23,8 1,59 m 23,5

11b 2,20 m 2,18 sl

12a 1,90 dt (14,0 e 5,0) 29,3 1,90 ddd (18,7,14,0 e 5,0)

12b 1,14 ddd (14,0; 6,0 e 1,5) 1,12 m

29,0

13 41,5 41,1

14 80,2 80,0

15a 2,58 d (18,0) 33,8 2,58 d (18,0)

15b 2,91 d (18,0) 2,91 d (18,0)

33,5

16 169,9 169,9

17 5,67 s 79,6 5,67 s 79,3

18 0,84 s 13,8 0,87 s 13,5

19 0,95 s 21,7 0,95 s 21,2

20 120,2 120,6

21 7,44 dd (1,5 e 0,8) 141,0 7,44 sl 142,5

22 6,39 dd (1,5 e 0,8) 109,8 6,39 d (1,7) 109,7

23 7,38 t (1,5) 143,1 7,39 t (1,7) 142,5

28 1,05 26,0 1,04 25,4

29 1,19 21,5 1,19 21,2

30a 4,90 s 111,5 4,90 s

30b 5,15 s 5,15 s

111,4

OMe 3,72 s 52,1 3,72 s 51,8

1 =.CDCl

, 400MHz

2 = CDCl

, 100MHz

3=CDCl

, 400MHz

FIGURA 4.1 - Espectro de RMN

H do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

FIGURA 4.2 - Espectro de RMN

C do limonóide angolensato de metila (50 MHz,

CDCl

)

FIGURA 4.3 - Espectro de DEPT do limonóide angolensato de metila (50 MHz,

CDCl

FIGURA 4.4 - Espectro de HSQC do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

FIGURA 4.5 - Espectro de HMBC do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

FIGURA 4.6 - Espectro de COSY do limonóide angolensato de metila (400 MHz,

CDCl

)

m/z

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740

100

Padrao_3 1019 (26.154) Sm (Md, 1.00); Cm (909:1060) 1: Scan ES+

1.23e7

x2 493

491

471

183

150

172

509

533

551

593

565

FIGURA 4.7 - Espectro de massas ESI (+) de angolensato de metila

4.2 - Determinação estrutural dos limonóides 2 e 3:

A determinação estrutural do limonóide 2 foi feita por interpretação dos

espectros de RMN

C, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS (FIGURAS 4.8, 4.9, 4.10,

4.11, 4.12 e 4,13) e também por comparação dos valores de deslocamentos

químicos obtidos com os valores descritos na literatura (TABELA 4.2) (KADOTA et

al., 1990a).

O espectro de RMN

H apresentou sinais característicos do anel furano

em δ

7,41 m, 7,41 m e 6,36 dd (J = 1,6 e 0,8Hz) e relativos aos hidrogênios H-21,

H-23 e H-20. No espectro de RMN

C o anel furano caracterizou-se pelos sinais em

141,2 (C-21), 143,0 (C-23), 120,7 (C-20) e 110,0 (C-22). Estas atribuições foram

observadas no mapa de correlações HSQC. Cinco sinais de singletos relativos às

metilas terciárias em δ

1,09, 1,10, 1,15, 1,20 e 1,24, juntamente com os sinais

característicos do anel furano, evidenciaram que esta substância trata-se de um

limonóide.

No espectro de RMN

H, dois singletos em δ

3,90 (H-15) e 5,60 (H-17)

acoplam via HSQC em δ

57,9 e 78,5, respectivamente. As correlações destes

sinais, baseadas no HMBC, permitiram inferir a presença do anel D δ-lactônico com

um epóxido entre C-14 e C-15. Notou-se também que estes singletos

correlacionaram com o sinal de carbono em δ

69,8, o que sugeriu que este sinal de

deslocamento químico fosse atribuído ao carbono tetrassubstituído do epóxido (C-

14), haja visto, que nessa posição atribuiu-se um

J. Estas correlações juntamente

com as observadas para a Me-18 levaram ao fechamento do anel D, como mostrado

nas figuras a seguir:

A presença de dois dubletos em δ

5,85 e 7,11 (J= 10,2Hz),

característicos de uma ligação dupla conjugada a uma carbonila no anel A, foi

observada no espectro de RMN

H, os quais foram atribuídos aos hidrogênios

olefínicos H-1 e H-2. O acoplamento destes dubletos foi evidenciado no espectro de

COSY. Esta ligação dupla foi caracterizada no espectro de RMN

C, pelos sinais em

157,7 e 125,8 e via HSQC estes sinais foram atribuídos aos C-1 e C-2

respectivamente. De acordo com esqueleto básico de um limonóide a carbonila

conjugada só poderia estar em C-3 (δ

204,5).

O sinal do singleto de metila em δ

1,20 acoplou em δ

20,0 e foi

atribuído a Me-19 de acordo com as correlações mostradas abaixo, bem como, as

demais correlações para o anel A.

H→C

HMBC

H→C

HMBC

No espectro de RMN

H também foi observado um singleto largo em δ

3,58, característico de um hidrogênio oximetínico, que foi atribuído ao H-7, que via

HSQC acoplou em δ

70,0 (C-7), este sinal correlacionou via HMBC com o sinal em

18,7. Como o sinal em δ

1,09, via HSQC (Figura 4.11B), acoplou em δ

18,7,

este foi atribuído como sendo a Me-30, que seria a única ainda não determinada. As

demais correlações para o anel B e para a Me-30 foram apresentadas a seguir:

O espectro de massas ESΙ (-) para este limonóide 2 (FIGURA 4.12)

apresentou um pico em m/z 439 [M-1]

daltons, correspondente ao íon pseudo-

molecular de acordo com a fórmula molecular C

e apresentou rotação ótica

específica de [α]

= +27,7

(c 0,0019; CHCl

Em virtude da determinação mostrada, concluiu-se que o limonóide 2

refere-se ao 7-desacetilgedunina. Este limonóide já foi isolado de outras espécies

de Meliaceae - Swietenia mahagoni, (KADOTA et al., 1990), enxerto de Cedrela

odorata sobre Toona ciliata (PAULA, 1996), Pseudocedrela kotschyii (BANERJI e

NIGAM, et al.,1984), e também de Cedrela fissilis (LEITE et al., 2006), sendo a

primeira vez relatado no gênero Khaya.

Os valores de deslocamentos químicos encontrados para o limonóide

2 comparados com aqueles descritos na literatura para o 7-desacetilgedunina

(PAULA, 1996) foram concordantes (TABELA 4.2).

Como o limonóide – 3 difere do 7-desacetil gedunina (2) pela presença

de uma carbonila em C-7, que caracterizou o 7-desacetoxi-7-oxogedunina. Foram

necessários apenas os espectros RMN

C e ESI/MS (FIGURAS 4.14, 4.15 e

4.16), haja visto, que os espectros destes limonóides são bem semelhantes.

O limonóide 7-desacetoxi-7-oxogedunina foi isolado de várias espécies

pertencentes à família Meliaceae, por exemplo, Cedrela odorata, Guarea guidona,

H→C

HMBC

Khaya senegalensis, Pseudocedrela kotschyii, Carapa guianensis (BANERJI e

NIGAM, 1984) e também de Cedrela fissilis (LEITE, 2006).

O espectro de RMN

H apresentou sinais característicos do anel furano

em δ

7,42 sl, 7,40 t (J = 1,7Hz) e 6,36 sl relativos aos hidrogênios H-21, H-23 e H-

20. No espectro de RMN

C o anel furano caracterizou-se pelos sinais em δ

141,0

(C-21), 143,1 (C-23), 120,1 (C-20) e 109,8 (C-22).

Observaram-se cinco sinais de singletos relativos às metilas terciárias

em δ

1,13, 1,14, 1,16, 1,22 e 1,35 atribuídos a Me-18, Me-29, Me-28, Me-30 e Me-

19, respectivamente; e um anel D δ-lactônico com sinais de epóxido em δ

65,5 (C-

14) e δ

56,6 (C-15), e em δ

3,87(sl) e δ

5,47(sl). Dois duplos dubletos (J = 10, 0 e

4,2Hz) em δ

7,10 e 5,93 relativos à H-1 e H-2 indicaram a natureza do anel A 1-en-

3-ona, que foi definido por meio dos sinais em δ

156,0 e δ

126,5, relativos aos

carbonos da ligação dupla e do sinal de carbonila em δ

203,3 (C-3). O anel B

apresentou sinais bem distintos em δ

2,41 (H-6α), 2,18 (H-5) e 2,93 (H-6β), devido

ao acoplamento geminal do H-6β, t (J = 14,4Hz) com H-6α dd (J = 14,0 e 3,1Hz) e

diaxial com H-5, dd (J = 14,0 e 3,1Hz). Por fim, também observou-se um sinal de

carbonila não conjugada em δ

208,2 que confirma o C-7.

As demais atribuições foram realizadas através da comparação com

os dados descritos na literatura (KADOTA et al., 1990) para o limonóide 7-

desacetoxi-7-oxogedunina (3) (TABELA 4.3). O espectro de massas (ESI) modo

positivo deste limonóide (FIGURA 4.16) apresentou um pico m/z 438 daltons,

correspondentes ao íon molecular, condizente com a fórmula molecular C

Este limonóide também apresentou rotação ótica específica de [α]

= +16,5

0,0005; CHCl

Limonóide 2

(7-desacetilgedunina)

Limonóide 3

(7-desacetoxi-7-oxogedunina)

TABELA 4.2 – Valores de RMN

H e

C do limonóide 2 (7-desacetilgedunina)

LITERATURA

(PAULA, 1996)

LIMONÓIDE 2

(Hz) δ

1 7,12 d (12,0) 158,0 7,11 d (10,2) 157,7

2 5,85d (12,0) 125,7 5,85 d (10,2) 125,8

3 204,9 204,5

4 44,2 44,3

5 2,49 dd (13,2 e 2,2) 44,5 2,49 dd (13,2 e 2,2) 44,7

6a 1,95 m ou 1,87 m 27,2 1,90 m ou 1,70 m

6b 1,87 m ou 1,95 m 1,70 m ou 1,90 m

27,4

7 3,57 sl 69,6 3,58 sl 70,0

8 43,7 43,7

9 2,52 dd (12,8 e 6,0) 37,9 2,52 dd (12,4 e 6,2) 38,4

10 40,2 40,3

11a 1,92 m 1,98 m

11b 1,81m

15,1

1,83 sl

15,1

12a 1,59 m 26,4 1,58 m

12b 1,70 m 1,70 m

26,5

13 38,4 38,4

14 70,1 69,8

15 3,94 s 57,9 3,90 s 57,9

16 168,6 168,2

17 5,61 s 78,6 5,60 s 78,5

18 1,24 s 17,8 1,24 s 120,7

19 1,20 s 19,9 1,20s 143,0

20 120,6 110,0

21 7,45 m 141,2 7,41 m 141,2

22 6,32 m 110,0 6,36 dd (J = 1,6 e 0,8Hz) 17,8

23 7,45 m 143,0 7,41 m 20,0

28 1,10 s 27,3 1,10 s 27,4

29 1,11 s 21,5 1,15 s 21,5

30 1,14 s 18,7 1,09 s 18,7

1= CDCl

, 400MHz

2=CDCl

, 100MHz

3=CDCl

, 200MHz

4=CDCl

, 50MHz

FIGURA 4.8 – Espectro de RMN

H de 7–desacetilgedunina. (200MHz, CDCl

FIGURA 4.9 – Espectro de RMN

C de 7–desacetilgedunina. (50MHz, CDCl3).

FIGURA 4.10 - Espectro de HSQC de 7–desacetilgedunina (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.11 - Espectro de HMBC de 7–desacetilgedunina (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.11B - Espectro ampliado de HMBC de 7–desacetilgedunina (400 MHz,

CDCl

FIGURA 4.12 – Espectro de COSY de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (400MHZ,

CDCl

FIGURA 4.13 - Espectro de massas ESI (-) de 7–desacetilgedunina.

m/z

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740

100

Padrao_2_LCMS 1079 (27.685) Cm (1076:1080) 1: Scan ES-

1.41e7

396

243

177

323

259

316

285

271

343

341

378

368

439

422

412

455

TABELA 4.3 - Valores de RMN

H e

C do limonóide 3 (7-desacetoxi-7-

oxogedunina)

LITERATURA

(KADOTA et al, 1990)

LIMONÓIDE 3

(Hz) δ

1 7,10 d (10,0) 155,9 7,11 d (10,2) 157,7

2 5,93d (10,0) 126,5 5,93 d (10,2) 125,7

3 203,2 204,6

4 42,5 44,2

5 2,18 dd (14,0 e 3,5) 54,6 2,18 dd (14,0 e 3,1) 44,6

6ª 2,41 dd (14,0 e 3,5) 36,7 2,41 dd (14,0 e 3,1)

6b 2,93 t (14,0) 2,93 t (14,0)

27,3

7 208,2 70,1

8 53,4 43,7

9 2,22 dd (11,0 e 1,5) 47,6 2,22 dd (10,8 e 1,5) 38,0

10 39,6 40,2

11ª 2,0 m 2,0 m

11b 1,79m

17,2

1,82 m

14,1

12ª 1,48 m 32,2 1,50 m

12b 1,99 m 1,87 m

26,4

13 37,7 38,4

14 65,6 69,7

15 3,87 s 53,6 3,87 s 57,8

16 166,8 168,3

17 5,47 s 78,0 5,47 s 78,6

18 1,14 s 20,9 1,13s 120,6

19 1,36 s 19,9 1,35s 142,9

20 120,2 109,9

21 7,42 dd (1,8 e 1,0) 141,4 7,42 sl 141,2

22 6,37 dd (1,8 e 1,0) 109,8 6,36 sl 17,8

23 7,40 t (1,8) 143,1 7,40 t (1,7) 19,9

28 1,16 s 27,0 1,16 s 27,1

29 1,14 s 20,7 1,14 s 21,5

30 1,22 s 17,4 1,22 s 18,7

1= CDCl

, 400MHz

2=CDCl

, 100MHz

3= CDCl

, 50MHz

FIGURA 4.14 – Espectro de RMN

H de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (400MHZ,

CDCl3)

FIGURA 4.15 – Espectro de RMN

C de 7-desacetoxi-7-oxogedunina (50MHZ,

CDCl

)

FIGURA 4.16 – Espectro de massas ESI (+) de 7-desacetoxi-7-oxogedunina

4.3 - Determinação estrutural do limonóide 4:

A determinação estrutural para o limonóide 4 foi realizada através dos

espectros de RMN

H (FIGURA 4.17), RMN

C (FIGURA 4.18), HSQC (FIGURA

4.19), HMBC (FIGURA 4.20), COSY (FIGURA 4.21) e ESI/MS (FIGURA 4.22) e

também por comparação com os dados descritos na literatura (GOVINDACHARI e

KUMARI, 1998).

O espectro de RMN

H apresentou sinais característicos do anel furano

em δ

7,58 q (J = 0,8Hz), 7,40 t (J = 1,6Hz) e 6,49 dd (J = 1,6 e 0,8Hz) e um singleto

em 5,27, estes sinais acoplam via HSQC com os sinais em δ

141,6 (C-21), 142,8

(C-23), 110,0 (C-22) e 120,4 (C-20) e 80,7 (C-17), respectivamente. Foram

observados no espectro de RMN

H quatro singletos de metilas δ

0,88, 0,99, 1,01 e

1,25 e também um singleto característico de um grupo carbometoxi em δ

3,73.

O singleto em δ

5,27 (H-17), por meio da análise do mapa de

correlações HSQC, correlacionou-se com os sinais em δ

110,0 (

J, C-22), 120,4 (

C-20), 141,6 (

J, C-21), 38,0 (

J, C-13), 17,4 (

J) e também em δ

133,9 (

J). Como o

sinal em δ

17,4 (Me-18) acoplou via HSQC em δ

1,01 e correlacionou-se via HMBC

em δ

133,9 (

J), 80,7 (C-17), 38,0 (C-13) e 28,8 (C-12), este sinal foi atribuído a Me-

18.

m/z

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740

100

Padrao_1_a 920 (23.632) Sm (Mn, 3x2.00); Cm (920-(921:934+910:919)) 1: Scan ES+

3.36e5

438

183

179

151

154

299

263

209

199

252

224

228

289281

347

305

317

337

355

380

362

416

395

409

429

470

453

510

477

485

495

576

526

571

549

532

720

650

613

605

587

641

633

717

684

663

696

744

747

Os sinais em δ

3,50 dd (J = 2,5 e 1,7Hz) e 3,47 t (J = 2,5Hz),

acoplaram em δ

33,0 (C-15) e correlacionaram com os sinais em δ

169,8 e δ

133,9, desta forma, pode-se atribuir os sinais em δ

133,9 ao C-8 e em δ

169,8 ao

C-16 (carbonílico). As outras correlações para o anel D lactônico podem ser

observadas a seguir:

No espectro de RMN

H também foram notados um duplo dubleto em

3,21 dd (J = 13,8 e 3,1Hz) e um multipleto em δ

2,31, estes sinais acoplaram

entre si no espectro de COSY e em δ

36,5 no mapa de correlações HSQC. O sinal

3,21 correlacionou-se via HMBC com os sinais δ

50,5, 58,0, 125,4, 133,9 e com

os sinais característicos de carbonila em δ

211,1 e 213,0, no entanto, o sinal δ

2,31

apresentou correlações somente com os sinais δ

211,1 e 125,4. Pode-se então

atribuir os sinais em δ

2,31 e 3,21 aos 2H-30.

H→C

HMBC

H→C

HMBC

O sinal em δ

58,0 acoplou via HSQC com o sinal em δ

3,25 dd (J =

5,0 e 3,1Hz) e correlacionou-se com os sinais em δ

213,0, 211,0 e 133,9 e também

J com o sinal em δ

50,5. Este sinal em δ

58,0, foi atribuído ao C-2 e o sinal em

50,5 ao C-9, como o dubleto em δ

2,10 (H-9) correlacionou-se com o sinal em δ

125,4, foi possível atribuí-lo ao C-14.

O espectro de RMN

H também apresentou dois duplos dubletos em δ

2,49 (J

= 8,1 e 4,8Hz, H-5) e δ

2,76 (J = 8,1 e 4,8Hz, H-6). O sinal de H-5 acoplou-se em δ

40,2 (C-5) e correlacionou-se através do mapa de correlações HMBC com os sinais

em δ

173,6 (C-7), 54,3 (C-10), e 50,5 (C-9), 32,3 (C-6), 22,0 (Me-29) e 18,0/17,9

(Me-19 ou 28 / Me-28 ou 19). O outro sinal δ

2,48 acoplou em δ

32,2 (C-6) e

correlacionou-se com os sinais em δ

173,6 (C-7), 54,3 (C-10) , 49,4 (C-4) e 40,2. As

correlações dos dois duplos dubletos podem ser visualizadas a seguir:

→C

HMBC

H→C

HMBC

Os singletos de metila em δ

0,88 e 0,99 acoplaram via HSQC em δ

17,9/18,0 e δ

22,0, respectivamente. Estes sinais apresentaram correlações entre si

e também com os sinais em δ

211,0 (C-3), 49,4 (C-4), 40,2 (C-5), os quais foram

então atribuídos as metilas Me-28 (δ

0,88) e Me-29 ((0,99). O singleto δ

1,25, foi

atribuído a Me-19 e este via HSQC acoplou com o sinal em δ

17,9/18,0 e

correlacionou-se com os sinais δ

213,0 (C-1), 54,3 (C-10), 50,5 (C-9), 40,2 (C-5).

Não foi possível atribuir os sinais de deslocamentos químicos de carbono (δ

17,9 ou

18,0) para as Me-28 e Me-19, haja visto, que os sinais são muito próximos.

O espectro de massas ESΙ (-) para este limonóide 4 (FIGURA 4.22)

apresentou um pico em m/z 467 [M-1]

daltons, correspondente ao íon pseudo-

molecular de acordo com a fórmula molecular C

; e este apresentou rotação

ótica específica de [α]

= -74,7

(c 0,0024; CHCl

Em virtude da determinação mostrada, e comparando os dados de

RMN

C com os dados apresentados na literatura (TABELA 4.3), concluiu-se que o

limonóide – 4 refere-se ao mexicanolídeo.

Este limonóide já foi isolado de outras espécies de Meliaceae –

Cedrela glaziovii, Cedrela mexicana, Cedrela odorata e Khaya grandifoliola, Khaya

H→C

HMBC

MeO O

→C

HMBC

senegalensis, Khaya ivorensis (BANERJI E NIGAM, 1984) e Cedrela fissilis (LEITE

et al., 2006).

MeO O

Limonóide 4

(mexicanolídeo)

TABELA 4.4 - Valores de RMN

H e

C do limonóide 4 (mexicanolídeo)

LITERATURA (LEITE, 2005) LIMONÓIDE 4

(Hz) δ

1 212,9 213,0

2 3,24dd (5,0 e 3,0) 125,7 3,25dd (5,0 e 3,1) 58,0

3 204,2 211,1

4 49,4 49,4

5 2,76 dd (8,1 e 4,8) 40,2 2,76 dd (8,1 e 4,8) 40,2

6a 2,50 m 32,4 2,49 dd (8,1 e 4,8)

32,3

7 173,6 173,6

8 133,9 133,9

9 2,10 m 50,6 2,10 dl (6,4) 50,5

10 54,3, 54,3

11a 1,80 m 1,83 m

11b

18,6

1,80 m

18,6

12a 1,15 m 28,9 1,15 m

12b 1,83 m

28,8

13 38,0 38,0

14 125,4 125,4

15a 3,50 m 3,50 dd (2,5 e 1,7)

15b

33,0

3,47 t (2,5)

33,0

16 169,8 169,8

17 5,27 s 80,7 5,27 s 80,7

18 0,87 s 17,4 1,01 s 17,4

19 1,01 s 17,9 1,25 s 18,0

20 120,4 120,4

21 7,58 m 142,8 7,58 q (0,8) 141,6

22 6,49 dd (1,7 e 0,6) 110,0 6,49 dd (1,6 e 0,8) 110,0

23 7,41 t (1,7) 141,6 7,40 t (1,6) 142,8

28 1,25s 18,0

0,88 s

17,9

29 0,99 s 21,9 0,99 s 22,0

30a 3,25 dd (13,8 e 3,1) 3,21 dd (13,7 e 3,0)

30b 2,32 m

36,5

2,31 m

36,5

OMe 3,73 s 52,2 3,73 s 52,2

1= CDCl

, 400MHz

2=CDCl

, 100MHz

FIGURA 4.17 – Espectro de RMN

H de mexicanolídeo (400MHz, CDCl

FIGURA 4.18 – Espectro de RMN

C de mexicanolídeo (50MHz, CDCl3).

FIGURA 4.19 – Espectro de HSQC de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.20 – Espectro de HMBC de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.21 - Espectro de COSY de mexicanolídeo (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.22 – Espectro de massas ESI (-) de mexicanolídeo.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

Padrao_4_LCMS 1018 (26.120) Cm (1016:1023-(1024:1046+969:1012)) 1: Scan ES-

7.22e6

394

467

4.4 - Determinação estrutural do limonóide 5:

A determinação estrutural para o limonóide – 5 foi realizada através

dos espectros de RMN

H (Figura 4.23), RMN

C (Figura 4.24), HSQC (Figura 4.25),

HMBC (Figura 4.26) e ESI/MS (Figura 4.27) e por comparação com os dados

descritos na literatura (OLMO et al.,1997).

No espectro de RMN

H observou-se a presença de três sinais

referentes às metilas em δ

1,11, 1,18 e 1,33. Um singleto em δ

3,72, característico

de um grupo metoxila, três sinais desblindados em δ

7,42, 7,41 e 6,39 típicos de

hidrogênios do anel furano e três sinais que devem corresponder à prótons

carbinólicos em δ

5,53, 4,34 e 4,29. Essas informações sugerem que o limonóide 5

referia-se a um derivado do mexicanolídeo, pois, apresenta três metilas e carboxila

no C-7. Como a espécie estudada é classificada na subfamília Swietenioideae, é

comum encontrar limonóides do grupo mexicanólideo.

Essa proposta é reforçada em função de se observar dois pares de

sinais típicos de sistema AB, um deles em δ

2,68 d (J = 18,9 Hz) e δ

3,21 dd (J =

18,9 e 8,0Hz) e outro em δ

1,83 d (J = 12,7 Hz) e 2,17 dd (J = 12,7 e 3,1Hz),

sugerindo a presença de dois grupos metilênicos isolados, onde seus prótons

acoplam apenas entre si, com constantes grandes, geminais.

O espectro de RMN

H apresentou sinais em δ

7,42 m (H-21), 7,41 d

(J = 1,8Hz, H-23) e 6,39 sl (H-22), os quais através do mapa de correlações HSQC

acoplaram com os sinais em δ

141,3 (C-21), 143,1 (C-23), 110,2 (C-22),

respectivamente. Estes sinais H-21, H-22 e H-23 correlacionaram via HMBC com o

sinal em δ

120,7, que foi atribuído ao C-20.

Um singleto em δ

5,55 (H-17), característico de um limonóide com

anel D-lactônico, acoplou via HSQC em δ

81,1 (C-17) e mostrou, via HMBC,

correlações com os sinais em δ

14,5, 33,0, 110,2 (C-22), 120,7 (C-20), 141,3 (C-

21). O sinal em δ

1,11 acoplou em δ

14,5 e foi atribuído a Me-18. Os sinais dos

hidrogênios da Me-18 mostraram correlações em δ

26,2 (C-12), 37,8 (C-13), 81,1

(C-17) e 87,4. Estas correlações sugeriram uma hidroxila em C-14 e atribuíram o

sinal δ

87,4 a C-14. Os sinais em δ

2,68 d (J = 18,9 Hz) e δ

3,21 dd (J = 18,9 e

8,0 Hz) - referem-se a um dos grupos metilênicos citados inicialmente – acoplaram

em δ

33,0 e correlacionaram-se em δ

171,9, este sinal é característico de carboxila

de lactona, assinalado ao C-16. Este grupo metilênico foi atribuído ao CH

-15.

O espectro de RMN

H mostrou um dubleto em δ

3,12 (J = 6,0Hz, H-5),

via HSQC este acoplou em δ

43,3 (C-5) e correlacionou-se por meio do mapa de

correlações HMBC em δ

19,0 (C-19), 44,2 (C-29), 50,6 (C-4), 56,3 (C-9), 60,1 (C-

10) e 71,3 (C-6). Um outro sinal em δ

4,29 d (J = 6,0 Hz, H-6) acoplou em δ

71,3

(indicativo de um carbono metínico carbinólico) e correlacionou-se com os sinais em

43,3 (C-5), 50,6 (C-4), 60,1 (C-10), 174,9 (C-7) e 207,1 (C-3). Em δ

2,22

observou-se um outro dubleto (J = 6,0Hz, H-9) que acoplou, via HSQC, em δ

56,3

(C-9) e correlacionou-se, via HMBC, com os sinais em δ

43,3 (C-5), 60,1 (C-10), e

87,4 (C-8 - carbono quaternário e carbinólico). Também foram notados os sinais dos

prótons do grupo metila em δ

1,33 (Me-19) acoplando em δ

19,0 e

correlacionando-se com os sinais em δ

43,3 (C-5), 56,3 (C-9), 60,1 (C-10). Estas

correlações podem ser observadas a seguir:

O espectro de RMN

H apresentou ainda um sinal em δ

2,77 d

(10,4Hz, H-2), via HSQC acoplou em δ

63,6 (C-2) e correlacionou-se em δ

207,1

(C-3), 56,3 (C-9), 60,1 (C-10) e com dois carbonos quaternários e carbinólicos em δ

H→C

HMBC

MeO O

H→C

HMBC

84,6 (C-1) e 87,4 (C-14). Sinais dos hidrogênios da metila em δ

1,18 acoplaram em

15,6 e correlacionaram-se, via HMBC, com os sinais em δ

43,3 (C-5), 50,6 (C-4)

e 207,1 (C-3). Este sinal (δ

15,6) foi atribuído a Me-28. Também foi observado um

duplo dubleto em δ

4,33 dd (11,7 e 5,5Hz, H-30) que acoplou em δ

74,7 (C-30) e

correlacionou-se com os sinais em δ

50,6 (C-29), 84,6 (C-8), e 207,1 (C-3).

A estereoquímica deste limonóide 5 foi baseada na biossíntese dos

limonóides do tipo estrutural fragmalina (OLMO et al., 1996). A atribuição para H-30

em α e, portanto a hidroxila presente neste carbono estar em β, foi baseada em

dados da literatura (BOKEL e TAYLOR, 1989), onde constata-se que quando se tem

em C-30 um substituinte OR em α e, portanto H-30β, este acopla com H-2 com uma

constante pequena de 3Hz. Ao passo que se as posições estão trocadas, H-30α e

H-2 acoplam com uma constante próxima de 10Hz, que é o caso em questão.

Em virtude da determinação mostrada, e comparando os dados de

RMN

C com os dados apresentados na literatura (TABELA 4.5), concluiu que o

limonóide 5 refere-se ao 1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

triciclomeliac-7-oato de metila

Este limonóide já foi relatado anteriormente em Khaya senegalenis

(OLMO et al., 1996) e K. anthoteca (Ferreira, 2005), mas é a primeira vez que este é

citado em Khaya ivorensis.

O espectro de massas ESΙ (-) para este limonóide 5 (Figura 4,27) não

apresentou o pico do íon molecular, condizente com a formula C

, mas o

-H

a m/z 516 (100%). Este apresentou rotação ótica específica de [α]

+17,1

(c 0,0023; MeOH).

H→C

HMBC

MeO O

LIMONÓIDE 5

(1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

triciclomeliac-7-oato de metila)

TABELA 4.5 – Valores de RMN

H e

C do limonóide 5 (1α,6,8α,14β,30β–penta-

hidroxi-3-oxo-[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

1= DMSO-d

, 200MHz, 3=CDCl

e CD

OD, 400MHz

2= DMSO-d

, 50MHz, 4=CDCl

e CD

OD, 100MHz

LITERATURA ( OLMO et al., 1996 ) LIMONÓIDE 5

(Hz) δ

−

83,6

−

84,6

2 2,88 d (10,3) 62,7 2,77 d (10,4) 63,6

−

206,5

−

207,1

−

49,3

−

50,6

5 3,25 d (8,0) 41,9 3,12 d (6,0) 43,3

6 4,22 dd (8,0 e 5,0) 70,0 4,29 d (6,0) 71,3

−

173,6

−

174,9

−

86,80

−

87,4

9 2,28 dl (10,0) 54,6 2,22 d (6,0) 56,3

−

59,3

−

60,1

11β

1,90 m 1,90 m

11α

1,77 – 1,83 m

16,2

1,75 m

15,5

12β

1,77 – 1,83 m 26,3 1,65 m

12α

0,85 dl (9,0) 0,95 m

26,5

−

36,9

−

37,8

−

83,0 87,4

15β

2,69 (ABd =18,6) 2,68 (ABd =18,9)

15α

3,10

33,1

3,21dd (18,9 e 8,0)

33,0

−

169,9

−

171,9

17 5,40 s 80,2 5,55 s 81,1

18 1,11 s 14,6 1,11 s 14,5

19 1,33 s 18,3 1,33 s 19,0

−

120,7

−

120,7

21 7,59 m 141,5 7,42 m 141,3

22 6,47 m 110,4 6,39 sl 110,2

23 7,56 m 143,3 7,41 d (1,8) 143,1

28 0,99 s 15,3 1,18 s 15,6

29a 1,78 (ABd =12,6) 1,83 (ABd =12,7)

29b 2,11

44,3

2,17 dd (12,7)

44,2

30 4,37 d (10,3) 74,5 4,33 dd (11,7 e 5,5) 74,7

OMe 3,66 s 51,6 3,72 s 52,2

OH 5,44 d (5,0) 5,53 s

OH 4,97 sl 4,39 d

OH 4,60 sl 4,29 s

FIGURA 4.23 – Espectro de RMN

H de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.24 – Espectro de RMN

C de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (100MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.25 – Espectro de HSQC de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) ((400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.26 – Espectro de HMBC de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-oxo-

[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.27 – Espectro de massas ESI (-) de (1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-

oxo-[3.3.1

10,2

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila).

4.5 - Determinação estrutural do limonóide 6:

O espectro de RMN

H (Figura 4.28) do limonóide 6 confirmou a

presença de um anel furano β-substituído, devido aos sinais observados em δ

7,51(m) (H-23), 7,44 (td;1,7Hz) (H-21) e 6,47 (dd; 0,8 e 1,7Hz) (H-22), os quais

acoplaram via HSQC (Figura 4.30) com os sinais em δ

143,2 (C-23), 141,4 (C-21) e

110,0 (C-22), respectivamente (Figura 4.29). Por meio do mapa de correlações

HMBC (Figura 4.31) as correlações observadas entre estes sinais e o sinal em δ

119,9 permitiram atribuir este ao C-20.

Um singleto em δ

5,19 acoplou via HSQC em δ

81,0 e mostrou

correlações via HMBC com os sinais em δ

165,5, 141,4, 119,9, 110,0, 31,8, 36,9,

(carbono quaternário) e 21,6 (grupamento metila). O sinal δ

1,08 acoplou, via

HSQC, em δ

21,6 e mostrou correlações em δ

164,9, 81,0, 36,9, 31,8. Estas

correlações permitiram atribuir o sinal em δ

81,0 ao C-17, aferir o sinal em δ

21,6 a

Me-18, como também admitir uma ligação dupla no C-14 (δ

164,9) e confirmar os

sinais em δ

36,9 ao C-13 e em δ

31,8 ao C-12.

m/z

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740

100

Padrao_5_LCMS 755 (19.379) Sm (Mn, 3x2.00); Cm (751:756-(757:804+675:749)) 1: Scan ES-

5.82e6

516

455

484

562

(7,44;143,2)

(7,51;141,4)

(6,47; 110,0)

(5,19; 81,0)

(119,9)

(21,6)

(36,9)

(6,46; 118,5)

(164,9)

(165,5)

O sinal δ

6,46 (s), característico de hidrogênio olefínico, acoplou, via

HSQC, em δ

118,5 e apresentou correlações via HMBC em δ

164,9, 165,5, 36,9 e

82,2, permitindo atribuir o δ

118,5 ao C-15. O sinal em δ

82,2 foi conferido ao C-8

já que esta foi a única posição a

J possível de ser atribuída e garantindo ainda

haver uma ligação com oxigênio (OR).

O sinal δ

3,70 (s) acoplou via HSQC em δ

52,4 (grupo metoxila) e

correlacionou-se via HMBC em δ

174,3 e o sinal δ

2,22 acoplou via HSQC em δ

32,4 e correlacionou-se em δ

41,3, 52,4 e 174,3. Estas correlações sugeriram

atibuir ao C-7 o deslocamento δ

174,3 (grupo carbometoxi) e ao C-6 δ

32,4. O

sinal δ

2,76 (dd; 9,4 e 3,1Hz) acoplou via HSQC em δ

41,3 e correlacionou-se com

174,3, 212,2, 41,9, 47,0, 82,2 e 18,8, permitindo atribuir o deslocamento em δ

41,3 ao C-5.

Os sinais característicos de metila em δ

1,14 (s) e 0,80 (s) acoplaram

em δ

22,2 e 18,8, respectivamente, correlacionaram-se com os sinais em δ

41,3 e

108,5. Estas correlações permitiram atribuir estes sinais as Me-29 (δ

22,2) e Me-

28.(δ

18,8). Desta forma, pôde-se assinalar o C-4 em δ

41,9 e o C-3 em δ

108,5.

Mas, é importante inferir que este valor de deslocamento para o C-3 sugere ligações

com oxigênio (OR).

Observou-se ainda que o sinal em δ

3,04 acoplou, via HSQC, em δ

57,8 e correlacionou-se em δ

212,2, 82,2, 47,0 e 52,4. E os sinais δ

2,10 e δ

2,78

acoplaram, via HSQC, em δ

47,0 e correlacionaram-se via HMBC com os δ

212,2,

82,2, 52,4 e 165,5. Estas correlações sugeriram o sinal em δ

57,8 para o C-2 e o

em δ

47,0 para o C-30.

O singleto em δ

0,97 acoplou, via HSQC, em δ

16,8 e correlacionou-

se, via HMBC, em δ

212,2, 52,0, 53,2 e 41,3. Estas correlações levaram a atribuir

16,8 a Me-19 e δ

53,2 (carbono quaternário) o C-10.

As demais atribuições para o limonóide 6 foram confirmadas por meio

das técnicas de RMN descritas e por comparação com os dados da literatura para o

limonóide Cedrodorina (VEITCH et al., 1999), juntamente como o limonóide 8β-

hidroxicarapina 3,8-hemiacetal (CONNOLLY et al., 1993) (Tabela 4.6). Assim, foi

possível verificar sinais de deslocamentos químicos entre os carbonos C-14 e C-15

mais desblindados, o que sugeriram a presença de uma insaturação, como ocorre

no 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal e não uma hidroxila no C-14 como ocorre na

Cedrodorina. Outra diferença importante entre estes limonóides, é o valor do sinal

em δ

108,5 (C-3) muito mais desblindado no limonóide 6, que sugeriu além da

ponte etérica entre C-3 e C-8, um outro grupo OH em C-3. Dessa forma, concluiu-se

que o limonóide 6 trata-se do limonóide 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal. Este

limonóide foi relatado por CONNOLLY et al., 1993 como produto da oxidação de

carapina, mas é a primeira vez que o mesmo é descrito em planta.

O espectro de massas ESΙ (-) (Figura 4.33) para o limonóide 6

apresentou o pico do íon molecular em m/z 484 daltons [M-1]

, condizente com a

formula C

. Este apresentou rotação ótica específica de [α]

= +48,5

0,001; CHCl

MeO

174,3

2,22; 32,4

2,76; 41,3

1,14; 22,2

0,80; 18,8

108,5

41,9

3,04; 57,8

2,10 e 2,75; 47,0

53,2

0,97; 16,8

MeO

Limonóide 6

(8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal)

OOC

Cedrodorina

TABELA 4.6 – Valores de RMN

H e

C do limonóide 6 (8β-hidroxicarapina 3,8-

hemiacetal )

1= CDCl

, 67,8MHz, 2= CDCl

, 67,8MHz, 3=CDCl

e CD

OD, 400MHz

LITERATURA

(VEITCH et al., 1999)

(CONNOLLY et

al., 1993)

LIMONÓIDE 6

(Hz) δ

−

214,1 212,9

−

212,2

2 3,03 m 48,9 53,5 3,04 d (6,0) 57,8

3 4,00 d (5,8) 93,0 108,6

−

108,5

−

38,0

−

41,9

5 2,83 d (2,8) 48,5 2,76 dd (9,4 e 3,1) 41,3

6 4,36 sl, 71,0 2,22 dd ( 9,4 e 3,1) 32,4

−

175,7

−

174,3

−

85,2 81,7

−

82,2

9 2,04 dd (12,2 e

4,6)

52,6 1,64 dd (10,2 e

4,3)

52,0

10 51,0

−

53,2

11α

1,56 m 18,2 1,69 m

11β

1,90 m

1,87 m

19,5

12α

1,74 m 28,8 1,90 m

12β

1,52 m 1,38 m

31,8

13 40,1

−

36,9

14 74,4 166,5

−

164,9

15α

2,52 d (17,7) 37,2

15β

3,16 d (17,7)

118,6 6,46 s

118,5

16 170,1 165,0

−

165,5

17 6,22 s 76,4 81,1 5,19 s 81,0

18 1,00 s 16,1 1,08 s 21,6

19 1,32 s 18,4 0,97 s 16,8

20 120,9

−

119,9

21 7,48 m 140,7 7,51 m 141,4

6,45 m

109,9 6,47 dd (1,8 e 0,8) 110,0

23 7,46 t (1,5) 143,1 7,44 td (1,8) 143,2

28 0,95 s 21,4 1,18 s 18,8

29ª 1,05 s 29,9 1,14 s 22,2

30α

2,07 d (12,5) 42,9 2,10td (12,1)

30β

2,54 dd (12,5 e

6,7)

2,78 d (12,1)

47,0

OMe 3,83 s 52,6 3,70 s 52,4

OH-6 2,59 sl 5,53 s

OH-14 4,39 d

FIGURA 4.28 – Espectro de RMN

H de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal (400MHz,

CDCl

e CD

OD).

FIGURA 4.29 – Espectro de RMN

C de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal

(400MHz, CDCl

e CD

OD).

FIGURA 4.30 – Espectro de HSQC de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal (400MHz,

CDCl

e CD

OD)

Figura 4.31 – Espectro de HMBC de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal (400MHz,

CDCl

e CD

OD).

FIGURA 4.32 - Espectro de COSY de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal (400MHz,

CDCl

e CD

OD).

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

Padrao_6_LCMS 959 (24.610) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (955:959) 1: Scan ES-

1.35e7

484

410

255

311

638

FIGURA 4.33 – Espectro de massas ESI (-) de 8β-hidroxicarapina 3,8-hemiacetal.

4.6 - Determinação estrutural do limonoíde 7:

A determinação estrutural para o limonóide 7 foi realizada através dos

espectros de RMN

H (Figura 4.34), RMN

C (Figura 4.35), HSQC (Figura 4.36),

HMBC (Figura 4.37), ESI/MS (Figura 4.38) e por comparação com os dados

descritos na literatura (OLMO et al.,1997).

O espectro de RMN

H apresentou-se semelhante ao espectro do

limonóide 5, onde observou-se a presença de três sinais referentes às metilas em δ

1,02, 1,10 e 1,22, um singleto em δ

3,71, característico de um grupo metoxila, três

sinais desblindados em δ

7,51, 7,39 e 6,46 típicos de hidrogênios do anel furano e

três sinais que devem corresponder à prótons carbinólicos em δ

4,18, 4,50 e 5,78.

Desta forma, essas informações sugerem que o limonóide 7, também trata-se de um

derivado do mexicanólideo, pois, apresenta três metilas e carboxila no C-7, além de

se observar dois pares de sinais de grupos metilênicos isolados, típicos de sistema

AB, um deles em δ

2,83 e δ

3,12 d (J = 18,8 Hz) e outro em δ

1,32 e 1,91 dd (J =

11,8 Hz).

O espectro de RMN

H apresentou sinais em δ

7,39 m (H-21), 7,51 sl

(H-23) e 6,46 sl (H-22), os quais através do mapa de correlações HSQC acoplaram

com os sinais em δ

140,7 (C-21), 142,3 (C-23), 109,7 (C-22), respectivamente.

Estes sinais H-21, H-22 e H-23 correlacionaram via HMBC com o sinal em δ

120,4,

que foi atribuído ao C-20. Estas correlações podem ser observadas na pág. 82.

Um singleto em δ

5,78 (H-17), característico de um limonóide com

anel D-lactônico, acoplou via HSQC em δ

81,0 (C-17) e mostrou, via HMBC,

correlações com os sinais em δ

14,1, 25,9, 37,4, 109,7 (C-22), 120,4 (C-20), 140,7

(C-21). O sinal em δ

1,02 acoplou em δ

14,1 e foi atribuído a Me-18. Os sinais dos

hidrogênios da Me-18 mostraram correlações em δ

25,9 (C-12), 37,4 (C-13), 81,0

(C-17) e 83,8. Estas correlações sugerem uma hidroxila em no C-14 com

deslocamento δ

83,8.

Os sinais em δ

2,83 e δ

3,12 d (J = 18,8 Hz) - referem-se a um dos

grupos metilênicos citados inicialmente – acoplaram em δ

31,8 e correlacionaram-

se em δ

171,9, este sinal é característico de carboxila de lactona, assinalado ao C-

16. Este grupo metilênico foi atribuído ao CH

─15.

O espectro de RMN

H mostrou um dubleto em δ

3,21 (J = 3,5Hz, H-5),

o qual via HSQC, acoplou em δ

40,2 (C-5) e correlacionou-se por meio do mapa de

correlações HMBC em δ

18,9 (Me-28), 44,5 (C-29), 42,0 (C-4), 55,5 (C-9), 58,9 (C-

10) e 70,7 (C-6). Um outro sinal em δ

4,18 d (J = 9,0 Hz, H-6) acoplou em δ

70,7

(indicativo de um carbono metínico carbinólico) e correlacionou-se com os sinais em

40,2 (C-5), 42,0 (C-4), 58,9 (C-10), 175,2 (C-7). Em δ

2,10 observou-se um outro

dubleto (J = 8,3Hz, H-9) que acoplou, via HSQC, em δ

55,5 (C-9) e correlacionou-

se, via HMBC, com os sinais em δ

40,2 (C-5), 58,6 (C-10), 25,9 (C-12) e 86,6 (C-8)

- carbono quaternário e carbinólico. Também notaram-se os sinais dos prótons do

grupo metila em δ

1,22 (Me-19), estes acoplaram-se em δ

19,0 e mostraram

correlações com os sinais em δ

40,2 (C-5), 55,5 (C-9), 58,9 (C-10) e 86,6 (C-8).

Estas correlações podem ser observadas a seguir:

O espectro de RMN

H apresentou ainda um sinal em δ

4,50 dd (9,4 e

6,6Hz, H-2), o qual via HSQC, acoplou em δ

72,2 (C-2) e correlacionou-se em δ

42,0 (C-4) e com dois carbonos quaternários e carbinólicos em δ

81,1 (C-1) e 86,6

(C-8). Sinais dos hidrogênios da metila em δ

1,10 acoplaram em

18,6 e

correlacionaram-se, via HMBC, com os sinais em δ

40,2 (C-5), 42,0 (C-4), 44,5 (C-

H→C

HMBC

MeO

→C

HMBC

29), sendo possível atribuir o sinal em δ

18,6 a Me-28. Também foi observado um

duplo dubleto em δ

2,66 d (9,4Hz, H-30) que acoplou em δ

63,0 (C-30) e

correlacionou-se com os sinais em δ

55,5 (C-9), 58,9 (C-10), 72,2 (C-2), 81,1 (C-1),

83,8 (C-14) e 86,6 (C-8). As demais correlações podem ser observadas a seguir:

Comparando os valores de sinais de deslocamentos químicos dos

limonóides 5 e 7, notou-se que estes são semelhantes, permanecendo os anéis C e

D bastante similares. A diferença entre eles está na ausência do sinal da carbonila e

na existência de mais um sinal referente a um carbono metínico carbinólico. No

entanto, consultando a literatura observou-se que Olmo et al, 1996 mostraram que a

diferença estava no sistema tricíclico, e que é comum o rearranjo pinacol no

esqueleto [3.3.1

10,2

]-biciclo-meliac, levando ao sistema [4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac.

Os dados obtidos de RMN

H e de RMN

C para o limonóide 7 foram

comparados com os descritos na literatura (OLMO et al., 1996) (Tabela 4.7) e pôde-

se identificá-lo como 1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-

7-oato de metila. Este limonóide já foi citado anteriormente em Khaya senegalenis

(OLMO et al., 1996) e anthoteca (Ferreira, 2005), sendo que é a primeira vez que

este composto está sendo relatado em Khaya ivorensis.

O espectro de massas ESΙ (-) para este limonoíde 7 (Figura 4.38) não

apresentou a molécula desprotonada condizente com a formula C

, mas o

[M-H

a m/z 518 (100%). Este apresentou rotação ótica específica de [α]

+52,1

(c= 0,0014; MeOH), correspondendo ao mesmo tipo de deslocamento da luz

polarizada citada na literatura (OLMO et al., 1996).

MeO

H→C

HMBC

MeO

Limonóide 7

(1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

triciclo-meliac-7-oato de metila)

TABELA 4.7 – Valores de RMN

H e

C do limonoíde 7 (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-

hidroxi-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.)

1= DMSO-d

, 200MHz, 2= DMSO-d

, 50MHz, 3= CDCl

e CD

OD, 400MHz 4= CDCl

e CD

OD, 100MHz

LITERATURA (OLMO et al., 1996 )

LIMONOÍDE 7

(Hz) δ

−

83,6

−

81,1

2 4,28 dd (9,2 e 7,2) 72,3 4,50 dd (9,4 e 6,6) 72,2

3 3,21 dd (9,0 e 7,2) 78,2

3,40 d (6,6)−

78,5

−

42,4

−

42,0

5 2,88 d (6,8) 40,4 3,21 d (3,5) 40,2

6 4,03 dd (6,8 e 3,6) 71,4 4,18 d (9,0) 70,7

−

175,1

−

175,2

−

86,6

−

86,6

9 2,03 dl (9,0) 55,8 2,10 d (8,3) 55,5

−

59,2

−

58,9

11α

1,74 m 2,04 m

11β

1,60 m

16,4

1,67 m

16,0

12α

1,78 m 26,0 1,77 m

12β

0,62 m 0,86 m

25,9

−

37,1

−

37,4

−

80,7 83,8

15α

2,63 (ABd =18,5) 3,12 (ABd =18,8)

15β

2,86

32,1

2,83

31,8

−

170,5

−

171,9

17 5,61 s 80,7 5,78 s 81,0

18 0,96 s 14,5 1,02 s 14,1

19 1,07 s 18,7 1,22 s 16,9

−

121,3

−

120,4

21 7,58 m 141,8 7,39 m 140,7

22 6,45 m 110,5 6,46 sl 109,7

23 7,62 m 143,2 7,51 sl 142,3

28 0,95 s 19,7 1,10 s 18,6

29α

1,16 (ABd =12,2) 1,32 (ABd =11,8)

29β

1,68

45,3

1,91

44,5

30 2,48 63,1 2,66 d (9,4) 63,0

OMe 3,57 s 51,4 3,71 s 51,7

1-OH 4,50 sl

3-OH 3,70 d (9,0) 4,35 d (10,3)

8-OH 4,95 sl

6-OH 5,41 d (3,6) 5,50 d (6,0)

Figura 4.34 – Espectro de RMN

H de 1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila (400MHz, CDCl

OD).

Figura 4.35 – Espectro de RMN

C de 1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila (100MHz, CDCl

OD).

Figura 4.36 – Espectro de HSQC de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) (400MHz, CDCl

e CD

OD).

Figura 4.37 – Espectro de HMBC de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila.) (400MHz,

CDCl

e CD

OD).

Figura 4.38 – Espectro de massas ESI (-) de (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclo-meliac-7-oato de metila).

4.7 - Determinação estrutural do limonoíde 8:

A determinação estrutural para o limonóide 8, como nas anteriores, foi

realizada através dos espectros de RMN

H (Figura 4.39), RMN

C (Figura 4.40),

HSQC (Figura 4.41), HMBC (Figura 4.42), COSY (Figura 4.43) e ESI/MS (Figura

4.44) e por comparação com os dados descritos na literatura (FERREIRA et al.,

2003).

O espectro de RMN

H confirmou a presença de três sinais referentes

às metilas em δ

1,04, 1,13, 1,34, um singleto em δ

3,71, característico de um

grupo metoxila, três sinais desblindados em δ

7,48, 7,45 e 6,42 típicos de

hidrogênios do anel furano e dois sinais que devem corresponder à hidrogênios

carbinólicos em δ

4,34 e 4,24. Desta forma, essas informações sugerem que o

limonóide 8, também trata-se de um derivado do mexicanólideo, pois, apresenta três

metilas e carboxila no C-7, além de se observar os dois pares de sinais de grupos

metilênicos isolados, típicos de sistema AB, um deles em δ

2,72 d (J = 19,2 Hz) e δ

3,20 dd (J = 19,2 e 7,2 Hz) e outro em δ

1,83 d (J = 12,6 Hz) e 2,14 dd (J = 12,6 e

7,6 Hz).

O espectro de RMN

H apresentou sinais em δ

7,48 s (H-21), 7,45 s

(H-23) e 6,42 s (H-22), os quais através do mapa de correlações HSQC acoplaram

com os sinais em δ

142,7 (C-21), 144,3 (C-23), 111,3 (C-22), respectivamente.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P26 736 (18.876) Sm (Mn, 2x2.00); Sm (Mn, 2x2.00); Cm (734:740) 1: Scan ES-

6.35e6

518

458

564

550

532

586

572

Estes sinais H-21, H-22 e H-23 correlacionaram via HMBC com o sinal em δ

121,9

que foi atribuído ao C-20.

Um singleto em δ

5,50 (H-17), característico de um limonóide com

anel D-lactônico, acoplou via HSQC em δ

82,7 (C-17) e mostrou, via HMBC,

correlações com os sinais em δ

15,3, 27,9, 38,9, 84,7, 111,3 (C-22), 121,9 (C-20),

142,7 (C-21). O sinal em δ

1,11 acoplou em δ

15,3 e foi atribuído a Me-18. Os

sinais dos hidrogênios da Me-18 mostraram correlações em δ

27,9 (C-12), 38,9 (C-

13), 82,7 (C-17) e 84,7. Estas correlações sugerem um grupo OR no C-14, com

deslocamento químico δ

84,7.

Os sinais em δ

2,83 e δ

3,12 d (J = 18,8 Hz) - referem-se a um dos

grupos metilênicos citados inicialmente – acoplaram em δ

34,5 e correlacionaram-

se em δ

38,9 (C-13)

84,7 (C-14) e 173,3, este sinal é característico de carboxila de

lactona, assinalado ao C-16. Este grupo metilênico foi atribuído ao CH

-15. Essas

correlações permitiram concluir os anéis C e D.

O espectro de RMN

H mostrou um dubleto em δ

3,28 (J = 8,0Hz, H-5),

o qual via HSQC, acoplou em δ

43,7 (C-5) e correlacionou-se por meio do mapa de

correlações HMBC em δ

18,7 (Me-19), 45,5 (C-29), 50,8 (C-4), 56,8 (C-9), 61,0 (C-

10), 71,6 (C-6), 175,9 (C-7) e 208,1 (C-3). Um outro sinal em δ

4,24 d (J = 8,0 Hz,

H-6), acoplou em δ

71,6 (indicativo de um carbono metínico carbinólico) e

correlacionou-se com os sinais em δ

43,7 (C-5), 50,8 (C-4), 61,0 (C-10), 175,9 (C-

7). Em δ

2,27 observou-se um outro dubleto (J =8,0Hz, H-9) que acoplou, via

HSQC, em δ

56,8 (C-9) e correlacionou-se, via HMBC, com os sinais em δ

17,4

(C11), 43,7 (C-5), 61,0 (C-10), 27,9 (C-12) e 88,3 (C-1) - carbono quaternário e

carbinólico. Também notaram-se o sinal dos hidrogênios do grupo metila em δ

1,34

(Me-19), o qual no HSQC correspondeu ao δ

18,7 e mostraram correlações com os

→C

HMBC

sinais em δ

43,7 (C-5), 56,7(C-9), 61,0 (C-10) e 85,3 (C-8) no HMBC. Estas

correlações podem ser observadas a seguir:

O espectro de RMN

H apresentou ainda um sinal em δ

4,34 dd (J =

10,4 e 4,8Hz, H-2), o qual via HSQC acoplou em δ

72,7 (este sinal de deslocamento

químico sugere um grupo OR no C-2) e correlacionou-se em δ

50,8

(C-4) e com

dois carbonos quaternários e carbinólicos em δ

88,3 (C-1) e 85,3 (C-8).

Sinais dos hidrogênios da metila em δ

1,04 acoplaram em

15,9 e

correlacionaram-se, via HMBC, com os sinais em δ

43,7 (C-5), 50,8 (C-4), 45,5 (C-

29), sendo possível atribuir o sinal em δ

15,9 a Me-28. Um duplo dubleto em δ

2,83

(d J = 12,4Hz, H-30) acoplou em δ

64,8 (C-30) e correlacionou-se com os sinais em

56,8 (C-9), 61,0 (C-10), 72,7 (C-2), 88,3 (C-1) e 85,3 (C-8) e com o sinal da

carbonila em δ

208,1(C-3).

Para concluir a discussão do sistema AB, observaram-se sinais em δ

1,83 d (J = 12,6Hz) e 2,14 d (J= 12,6 Hz), referentes aos outros hidrogênios

metilênicos de H-29, que acoplaram em δ

45,5 e correlacionaram com os sinais em,

208,1(C-3), 50,8 (C-4), 43,7 (C-5), 61,0 (C-10), 15,9 (Me-28), 64,8 (C-30) e

88,1(C-1). Estas correlações podem ser observadas a seguir:

MeO O

H→C

HMBC

MeO O

Comparando os valores de sinais de deslocamentos químicos do

limonóide 8 com do limonóide khayanolídeo E (NAKATANI et al., 2002), notou-se

que estes são semelhantes, que a diferença está na ausência de um sinal do grupo

acetato em torno de δ

2,07. De acordo com NAKATANI, a esteroquímica do

khayanolídeo E foi definida por NOE e a presença da ligação éter entre o 2β e 14β

foi confirmada por espectrometria de massas. Desta forma, foi proposto que o

limonóide 8 fosse o 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-

7-oato de metila. Este limonóide também foi isolado da espécie Khaya ivorensis por

BARBOSA, 2007 e foi denominado de Khayanolídeo F, dando seqüência à série de

khayanolídeos isolados de Khaya senegalensis (ABDELGALEIL et al., 2001;

NATAKANI et al., 2000 e 2002)

O espectro de massas ESΙ (-) para este limonoíde 8 (Figura 4.44)

apresentou a molécula desprotonada condizente com a formula C

, [M-H]

m/z 516 (100%). Este apresentou rotação ótica específica de [α]

= -23,1

(0,0021;

MeOH), correspondendo ao mesmo tipo de deslocamento da luz polarizada citada

na literatura (FERREIRA et al., 2003).

→C

HMBC

MeO O

OOC

Limonóide 8

(2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-[4.2.1

10,30

1,4

triciclomeliac-7-oato de metila).

OOC

OAc

Khayanolídeo E

TABELA 4.8 – Valores de RMN

H e

C do limonoíde 8 (2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-

hidroxi-3-oxo-[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila)

1= DMSO-d

, 200MHz

2= DMSO-d

, 50MHz

3= CDCl

e CD

OD, 400MHz

4= CDCl

e CD

OD, 400MHz

LITERATURA (FERREIRA et al., 2003) LIMONOÍDE 8

(Hz) δ

−

91,4

−

88,3

2α

4,38 d (10,5) 74,0 4,34 dd (10,4 e 4,8) 72,7

−

204,8

−

208,1

−

52,3

−

50,8

5 3,02 d (4,9) 42,1 3,28 d (8,0) 43,7

6β

4,34 d (4,9) 71,7 4,24 d (8,0) 71,0

−

174,9

−

175,9

−

87,7

−

85,3

9α

2,36 dl (9,5) 57,6 2,27 d (8,0) 56,8

−

62,1

−

61,0

11α

1,92 ddt (13,5; 9,3; 5,5) 1,98 m

11β

1,54 ddd (13,5; 4,4; 2,0)

16,7

1,79 m

17,9

12α

0,94 ddd (14,4; 5,5; 2,0) 32,9 0,94 d (10,4)

12β

1,71 ddd (14,4; 13,5; 4,4) 1,71 m

27,9

−

37,5

−

38,9

−

83,3

−

84,7

15α

3,08 d (18,8) 3,20 d (19,2)

15β

2,64 d (18,8)

32,5

2,72 d (19,2)

34,2

−

170,0

−

173,3

17 5,52 s 79,9 5,50 s 82,7

18 1,10 s 14,2 1,11 s 15,3

19 1,41 s 20,1 1,34 s 18,7

−

120,6

−

121,9

21 7,40 sl 141,1 7,48 m 142,7

22 6,36 dl (1,5) 110,1 6,42 s 111,3

23 7,39 t (1,7) 142,9 7,45 s 144,3

28 1,26 s 15,9 1,04 s 15,9

29α

2,12 d (12,7) 1,83 d (12,6)

29β

2,78 d (12,7)

40,7

2,14 d (12,6 )

45,5

30 3,37 d (10,5) 59,7 2,83 d (12,4) 64,8

OMe 3,75 s 52,5 3,73 s 51,9

OAc 4,50 sl 21,8

− −

100

FIGURA 4.39 – Espectro de RMN

H de 2,14-epoxi-1α,6,8α-triidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.40 – Espectro de RMN

C de 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila) (100MHz,

CDCl

e CD

OD)

101

FIGURA 4.41 – Espectro de HSQC de 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.42 – Espectro de HMBC de 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila (400MHz, CDCl

OD).

102

FIGURA 4.43 – Espectro de COSY de 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.44 – Espectro de massas ESI (-) de 2,14-epoxi-1α,6,8α-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.1

10,30

1,4

]-triciclomeliac-7-oato de metila.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P26 793 (20.338) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (790:796) 1: Scan ES-

3.81e6

516

481

191

177

455

562

537

103

4.8 - Determinação estrutural do limonóide 9:

A determinação do limonóide 9 foi semelhante à do limonóide 1 onde

observaram-se no RMN

H (Figura 4.45) sinais característicos do anel furano em δ

6,36 dd (J = 0,8 e 1,7Hz), o qual via HSQC (Figura 4.47) acoplou-se com um sinal

em δ

109,9 e correlacionou, via HMBC (Figura 4.48) com outros sinais de carbono

(Figura 4.46) em δ

140,8 e 140,5. Já o sinal emc δ

7,39 tl (J = 1,6Hz) acoplou via

HSQC com o sinal em δ

142,7 e correlacionou-se, via HMBC, com o sinal em δ

140,8. Este sinal δ

140,8 acoplou com o sinal em δ

7,43 m (J = 0,7Hz) e

correlacionou-se com os sinais em δ

120,7 e 142,7. O sinal δ

120,7 refere-se a um

carbono quaternário.

Além das correlações apresentadas para os sinais δ

109,9,

120,7 e

140,8, estes também se correlacionaram com o sinal δ

5,63 (s) que acoplou com o

sinal em δ

78,3. Estas correlações sugeriram o sinal em δ

5,63 para o H-17 e

confirmou o sinal em δ

140,8 para o C-21, pois, o sinal em H-17 correlacionou-se

com o sinal em δ

140,8 (

J), mas para se correlacionar com o sinal em δ

142,7 (C-

23) seria necessário um

J. Estas correlações permitiram assinalar os sinais em δ

120,7, 109,9, 140,8 e δ

142,7 respectivamente aos carbonos 20, 22, 21 e 23,

levando a concluir o do anel furano e sugerindo uma lactona para o anel D do

limonóide.

Além das correlações do sinal δ

5,63 com os sinais de carbono do

anel furano, verificou-se que este também correlacionou-se com o sinal de um

carbono quaternário em δ

41,3 (C-13) e em δ

13,8. O sinal em δ

0,88 (Me-18)

2122

HMBC

H→ C

104

acoplou, via HSQC, em δ

13,8 e correlacionou-se, via HMBC, com os sinais em δ

41,3 (C-13), 28,6 (C-12), 78,3 (C-17) e 80,4. Analisando os sinais de δ

2,91 d (J =

18,2 Hz) e δ

2,59 d (J = 18,2 Hz) verificou-se que estes correlacionaram com os

sinais em δ

80,4 e 170,1, sendo que somente aquele em δ

2,59 correlacionou-se

com o sinal δ

41,3 (C–13). Estas correlações permitiram atribuir os dois sinais de

hidrogênio (CH

) ao 2H-15, assim como δ

170,1 ao C-16. Estas correlações

confirmaram as atribuições feitas acima e sugeriram a presença de uma hidroxila

ou éter (OR) em C-14 (δ

80,4).

Pôde-se notar, via HSQC, dois singletos característicos de dupla

terminal em δ

4,91 e 5,20, os quais acoplaram em δ

111,6 (C-30) e

correlacionaram, via HMBC, em δ

50,8 (C-9) e 80,4 (C-14), sendo que o sinal em δ

4,91 também se correlacionou em δ

145,9 - carbono sp

totalmente substituído.

Estas correlações permitiram posicionar a dupla ligação terminal entre C-8 e C-30.

As demais correlações levaram a concluir o do anel C e permitiram atribuir o sinal

em δ

145,9 ao C-8.

HMBC

H→ C

HMBC

H→ C

105

Observou-se também no espectro de hidrogênio um sinal em δ

3,84 sl

característico de uma metoxila de um grupo carbometoxi. Este sinal, via HSQC,

acoplou em δ

53,4 e correlacionou, via HMBC, em δ

176,6, indicando um grupo

carbometoxi para C-7 que confirmou a abertura do anel B e permitiu atribuir os

deslocamentos em δ

53,4 para a –OMe e 176,6 para C-7. O sinal em δ

4,42 sl,

HSQC, acoplou em δ

72,3 (C-6) (sinal de carbono carbinólico) e correlacionou-se

com os sinais δ

176,6 (C-7), 44,7 (C-10) e 48,7 (C-4) no HMBC. Os sinais de

hidrogênios da Me-19 em δ

1,39 acoplaram em δ

23,4 e correlacionaram em δ

44,7 (C-10), 47,5 (C-5), 50,8 (C-9) e 77,2 (C-1). Estas correlações permitiram

posicionar uma hidroxila ou éter (OR) em C-1 (δ

77,2).

Os dois dubletos em δ

2,34 e 3,12 (J = 14,1 e 2,5 Hz) acoplaram em

39,1(C-2) e correlacionaram-se com os sinais em δ

48,7 (C-4) e δ

212,2 -

característico de um sinal de carbonila, o qual só poderia ser atribuído ao C-3,

considerando o esqueleto básico de um limonóide. As demais correlações

mostradas a seguir levaram a concluir o anel A.

Com todos os dados em mãos faltaria verificar se em C-14 e C-1

estariam hidroxilas ou éter. Considerando o espectro de massas (ESI) modo

negativo deste limonóide (Figura 4.49) que apresentou um pico m/z 485 daltons,

correspondentes ao íon molecular condizente com a fórmula molecular C

ou seja, um oxigênio e dois hidrogênios a menos que a estrutura acima, conclui-se

haver uma ligação éter entre C-1 e C-14. Comparando os dados de RMN de

H e

C (Tabela 4.9) encontrados com aqueles do 6-hidroxiangolensato de metila

29 28

OOMe

HMBC

→ C

106

verifica-se uma linearidade muito grande, permitindo identificar o limonóide 9 como

o 6-hidroxiangolensato de metila.

Este limonóide é comum no gênero Khaya (BANERJI e NIGAM, 1983)

e já foi relatado nas espécies: Khaya grandifoliola, Khaya senegalensis e Khaya

ivorensis. Este limonóide também apresentou rotação ótica específica de [α]

= -

56,1

(0,0017; CHCl

), correspondendo ao mesmo tipo de deslocamento da luz

polarizada citada na literatura.

Limonóide 9

(6-hidroxiangolensato de metila)

107

TABELA 4.9 – Valores de RMN

H e

C do limonoíde 9 (6-hidroxiangolensato de

metila)

LITERATURA

(ABDELGALEIL et al., 2001)

LIMONOÍDE 9

(Hz) δ

1 3,57 dd (5,6 e 2,7) 78,3 3,58 (dd J= 5,5 e 2,5Hz) 77,2

2α

2,34 dd (14,2 e 2,7) 39,1 2,34 (dd J= 14,1 e 2,5Hz)

2β

3,10 dd (14,2 e 2,7) 3,12 (dd J= 14,2 e 5,5Hz)

39,1

3 212,0 212,2

4 48,8 48,7

5 2,75 s 47,6 2,73 (s) 47,5

6α

4,42 d (2,0) 72,4 4,42 (sl) 72,3

7 176,6 176,6

8 146,0 145,9

9 2,34 dd (14,2 e 2,7) 50,8 2,34 (dd J= 14,2 e 2,7Hz) 50,8

10 44,7 44,7

11α

1,57 tt (14,7 e 5,3) 24,1 1,57(m) 24,0

12α

1,03 m 28,7 1,72(d J= 5,0Hz)

12β

1,73 dt (13,8 e 4,6) 1,05 (s)

28,6

13 41,4 41,3

14 80,4 80,4

15α

2,90 d (18,1) 33,7 2,59 (d J= 18,2Hz)

15β

2,58 d (18,1) 2,91 (d J= 18,2Hz)

33,7

16 170,0 170,1

17 5,63 s 79,4 5,63 (s) 78,3

18 0,88 s 13,8 0,88 (s) 13,8

19 1,39 s 23,7 1,39 (s) 23,4

20 120,8 120,7

21 7,42 sl 140,8 7,43 (m) 140,8

22 6,36 dd (1,7 e 0,8) 110,0 6,36 (dd J= 1,7 e 0,7Hz) 109,9

23 7,38 t (1,7) 142,8 7,39 (td J= 1,7Hz) 142,7

28 1,06 s 24,8 1,05 (s) 24,7

29 1,46 s 23,4 1,46(s) 23,7

30a 4,91 s 111,6 4,91 (s)

30b 5,19 s 5,20 (s)

111,6

OH 3,09 d (2,0) 3,13 (s)

OMe 3,84 s 53,4 3,84 (sl) 53,4

1 =.CDCl

, 400MHz

2 = CDCl

, 100MHz

108

FIGURA 4.45 – Espectro de RMN

H de 6-hidroxiangolensato de metila (400MHz,

CDCl

FIGURA 4.46 – Espectro de RMN

C de 6-hidroxiangolensato de metila (100MHz,

CDCl

109

FIGURA 4.47 – Espectro de HSQC de 6-hidroxiangolensato de metila (400MHz,

CDCl

FIGURA 4.48 – Espectro de HMBC de 6-hidroxiangolensato de metila (400MHz,

CDCl

110

FIGURA 4.49 – Espectro de massas ESI (-) de 6-hidroxiangolensato de metila.

4.9 - Determinação estrutural do limonóide 10

A determinação do limonóide 10 foi semelhante à dos limonóides 2 e 3

onde observaram-se no RMN

H (Figura 4.50) os sinais característicos dos

hidrogênios do anel furano em δ

7,42 t (J = 1,7Hz, H-21), 6,32 sl (H-22) e 7,40 sl

(H-23). Estes sinais via HSQC (Figura 4.52) acoplam em δ

143,1, 109,8 e 141,1

(RMN

C, Figura 4.51), respectivamente.

No espectro de RMN

H observaram-se também cinco sinais de metilas

como singletos em δ

0,81, 0,92, 1,02, 1,09 e 1,25. Dois singletos integrando para

um hidrogênio cada em δ

3,53 e 5,61, os quais foram atribuídos aos H-15 e H-17,

respectivamente. As atribuições dos deslocamentos químicos em δ

53,4 (C-15) e

78,4 (C17) foram realizadas utilizando o mapa de correlações HSQC. Estes sinais

em δ

3,53 (H-15) e δ

5,61 (H-17) correlacionaram via HMBC (Figura 4.53) com o

sinal de δ

69,7, atribuído ao carbono tetrassubstituído do epóxido (C-14) e também

com um sinal em δ

167,6 assinalado ao C-16.

As atribuições dos sinais de H-15 e H-17 e a presença de um anel D-δ-

lactônico com um epóxido entre C-14 e C-15 foram confirmadas por meio das

seguintes correlações observadas no mapa de correlações HMBC:

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

Padrao_8_LCMS 918 (23.538) 1: Scan ES-

9.38e6

483

423

181

179

229

191

313

380

351

408

393

451

424

449

484

485

111

O singleto em δ

1,25 (Me-18) foi verificado no espectro de RMN

H e

acoplou via HSQC em δ

17,2 e correlacionou via HMBC em δ

26,0 (C-12), 38,8 (C-

13), 69,7 (C-14), e 78,4 (C-17). Estas correlações podem ser observadas a seguir:

Um duplo dubleto em δ

2,87 (J = 12,3 e 6,2 Hz, H-9) acoplou-se via

HSQC em δ

36,3 (C-9) e por meio do mapa de correlações HMBC correlacionou-se

com os sinais em δ

14,4 (C-11), 16,5 (Me-19) e 17,2 (Me-18), 40,6 (C-10) e 42,2 (C-

8). O singleto em δ

1,09 (Me-30) acoplou em δ

18,2 e correlacionou-se com os

sinais em δ

36,3 (C-9), 42,2 (C-8), 69,7 (C-14) e 73,8, (C-7, sugere um grupo OR).

Estas correlações levaram a concluir o anel C.

HMBC

→ C

HMBC

→ C

112

Os sinais em δ

0,81 (Me-29) e 0,92 (Me-38) acoplaram com os sinais

em δ

27,4 e 21,6, respectivamente e via HMBC, correlacionaram entre si e com os

sinais δ

37,0 (C-4) 35,9 (C-5) e 75,8 (C-3, sugere um grupo OR). Um outro singleto

em δ

1,02 (Me-19) acoplou em δ

16,5 e correlacionou-se com os sinais em δ

36,3

(C-9), 37,0 (C-4), 40,6 (C-10) e 72,2 (C-1), sugerindo um grupo OR em C-1. Estas

correlações permitiram concluir o anel A:

No espectro de RMN

H a presença de grupos acetatos foram

evidenciados através de três singletos em δ

2,15, 2,03 e 2,02 referentes aos

hidrogênios das metilas dos acetatos. Os hidrogênios H-3, H-1 e H-7 foram

caracterizados pelos sinais em δ

4,72 t (J=2,8 Hz), δ

4,63 t e δ

4,52 sl

respectivamente. No espectro de RMN

C, a presença dos grupos acetatos foi

assinalada por três sinais em δ

72,2, 75,8 e 73,8, atribuídos aos carbonos C-1, C-3

e C-7 e também por três sinais de carboxila de éster em δ

169,9, 169,8 e 169,7.

Como os valores para as constantes de acoplamentos para estes hidrogênios

carbinólicos foram pequenas, sugerem que estes devem estar em fase α (axial).

Os demais valores de deslocamentos químicos de RMN

H e

C foram

atribuídos por comparação com os valores relatados por TAYLOR et al., 1974 e

HMBC

→ C

OR OR

HMBC

→ C

113

BANERGI e NIGAM 1983 e pôde-se concluir que se trata do limonóde khivorina, o

qual é comum no gênero Khaya (BANERJI e NIGAM, 1983) e já foi relatado nas

espécies: Khaya grandifoliola, K senegalensis, K. anthotheca, K. nyasica e K.

ivorensis. O espectro de massas (ESI) modo positivo deste limonóide (Figura 4.55)

apresentou um pico de m/z 610 daltons, correspondentes ao aduto de sódio

[M+Na]

, condizente com a fórmula molecular C

. Este apresentou rotação

ótica específica de [α]

= -34,9

(0,0006; CHCl

), correspondendo ao mesmo tipo de

deslocamento da luz polarizada citada na literatura (BANERJI e NIGAM, 1983).

OAc

AcO OAc

Limonóide – 10

(khivorina

)

114

TABELA 4.10 – Valores de RMN

H e

C do limonoíde 10 (khivorina)

LITERATURA

(BANERJI e NIGAM,

1983)

limonóide 10

(Hz) δ

1 72,0 4,63 m 72,2

2α

1,67 m

2β

25,2

1,46 m

25,6

3 75,6 4,72 t (2,8 Hz) 75,8

4 36,0 37,0

5 36,6 2,23 d (2,8 Hz) 35,9

6α

2,23 m

6β

22,0

1,97 m

22,4

7 73,5 4,52 s 73,8

8 42,0 42,2

9 35,7 2,87dd (12,3 e 6,2 Hz) 36,3

10 40,4 40,6

11α

1,61 m

11β

14,1

1,35 m

14,4

12α

2,19 m

12β

25,8

2,01 m

26,0

13 39,5 38,8

14 69,4 69,7

15 56,0 3,53 s 53,4

16 167,1 167,6

17 78,1 5,61 s 78,4

18 17,0 1,25 s 17,2

19 16,0 1,02 s 16,5

20 120,4 120,5

21 142,7 7,42 t (1,7 Hz) 143,1

22 109,7 6,32 sl 109,8

23 140,8 7,40 sl 141,1

28 21,3 0,92 s 21,6

29 27,0 0,81 s 27,4

30 17,8 1,09 s 18,2

CO 20,9 2,03 22,3

CO 20,6 2,02 21,3

CO 20,6 2,15 21,1

CO 169,5 169,9

CO 169,2 169,8

CO 169,2 169,7

1 =.CDCl

, 100MHz, 2 = CDCl

, 400MHz

115

FIGURA 4.50 –

Espectro de RMN

H de khivorina (400MHz, CDCl

FIGURA 4.51 –

Espectro de RMN

C de khivorina (100MHz, CDCl

116

FIGURA 4.52 – Espectro de HSQC de khivorina (400MHz, CDCl

FIGURA 4.53 – Espectro de HMBC de khivorina (400MHz, CDCl

117

FIGURA 4.54 – Espectro de COSY de (khivorina) (400MHz, CDCl

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P10_pos 1090 (28.014) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1090) 1: Scan ES+

1.51e7

610

183

172

151

566

642

FIGURA 4.55 – Espectro de massas ESI (-) de khivorina.

118

4.10 - Determinação estrutural do limonóide 11

Para a determinação estrutural do limonóide 11 foram feitos os

espectros de RMN

H, RMN

C, HSQC, HMBC e COSY, representados

respectivamente nas FIGURAS 4.56, 4.57, 4.58, 4.59 e 4.60, os quais foram

comparados com os valores dos sinais de deslocamento químico encontrados na

literatura (Tabela 4.11).

Iniciou-se a identificação deste limonóide pelos sinais bem conhecidos

do anel furano, verificou-se por meio do espectro de hidrogênio os sinais em δ

7,48

(s) e δ

6,40(s) os quais acoplaram via HSQC, respectivamente, com os sinais em δ

142,5 e 111,1 e via HMBC correlacionam entre si e com os sinais em δ

122,5 e

144,2. Este sinal em δ

144,2 acoplou via HSQC com o sinal em δ

7,49 (sl) e via

HMBC correlacionou-se em δ

111,1, 142,5 e 122,2, já o sinal em δ

122,5 refere-se

a um carbono quaternário e como mostrado anteriormente ele correlacionou-se com

os sinais de hidrogênios em δ

7,48 e 7,49, estas correlações podem ser observadas

na estrutura do anel furano mostrada a seguir:

O singleto em δ

5,60 acoplou via HSQC em δ

80,2 e correlacionou-se

via HMBC com os sinais em δ

111,1, 122,2 e 142,5, sugerindo atribuir o sinal δ

5,60 para o H-17 e confirmando δ

142,5 para o C-21, pois o sinal em H-17

correlacionou-se com este último a

Além das correlações do sinal δ

5,60 com os sinais de carbono do

anel furano, verificou-se que este também correlacionou-se com um sinal de

carbono quaternário δ

39,5 que indica ser o C-13 e com os sinais δ

18,4 e 80,2

que apontam ser, respectivamente, Me-18 e C-17.

7,49

6,40

7,48

144,2

122,1

5,60

80,2

142,5

111,1

119

O sinal δ

1,27 da Me-18 correlaciona-se via HMBC com os sinais δ

39,5 (C-13), 27,7 (C-12), 80,2 (C-17) e 71,3. Estas correlações confirmam as

atribuições feitas acima e sugerem a presença de uma hidroxila ou éter (OR) em C-

14 (δ

71,3).

Analisando o sinal em δ

3,89 sl verificou-se que este acoplou via

HSQC em δ

58,3 e correlacionou-se com os sinais em δ

71,3 (C-14) e 170,8. Estas

correlações permitiram atribuir o sinal em δ

3,89, um CH, ao H-15, assim como δ

170,8 ao C-16. Estas atribuições dos sinais de H-15 e H-17 e sugerem a presença

de um anel D-δ-lactônico com um epóxido entre C-14 e C-15 e foram confirmadas

por meio das seguintes correlações observadas via HMBC:

O sinal em δ

2,58 (dd) acoplou via HSQC em δ

36,9 e correlacionou-

se via HMBC com os sinais δ

17,2, 42,0 e 27,7(C-12). O sinal δ

1,05 acoplou via

HSQC em δ

17,2 e correlacionou-se com os sinais δ

44,6 (C-10), 42,0, 70,7 (C-7)

e 71,3 (C-14). Estas correlações permitiram atribuir o sinal δ

36,9 o C-9, δ

42,0 o

C-8 e δ

17,2 a Me-30. O outro sinal em δ

1,05 acoplou via HSQC em δ

19,4 e

correlacionou-se via HMBC em δ

36,3 (C-5), 36,9, 42,0, 44,6 e 74,1, estas

correlações sugeriram atribuir o sinal δ

19,4 a Me-19 e δ

74,1 ao C-1 característico

de uma ligação OR.

HMBC

→ C

OR OR

HMBC

→ C

120

O sinal em δ

3,44 acoplou via HSQC em δ

70,7 e correlacionou-se

via HMBC com o sinal em δ

37,2 (C-4), sugerindo uma hidroxila a C-3. Os sinais

mais desblindados δ

4,58 (t, J=2,8Hz) e 4,68 (t, J=2,8Hz) indicam a presença de

grupos acetoxilas a C-1 e C-7. Suas constantes de acoplamento pequenas sugerem

configurações α (axial).

Me-19

OR H

Me-19

As demais atribuições para o limonóide 11 foram confirmadas por

comparação com os dados da literatura (BANERJI e NIGAM, 1983). Desta forma

concluiu-se que se trata do limonóide 3-desacetilkhivorina, muito comum no gênero

Khaya, tendo sido relatado nas espécies: K. anthotheca (ADESOGAN & TAYLOR,

1967c; ADESOGAN, et al., 1970b), K. ivorensis (ADESOGAN & TAYLOR, 1970a;

TAYLOR, 1977; TAYLOR, 1970; TAYLOR, 1969), K. madagascariensis (TAYLOR,

1970), K. nyasica (TAYLOR, 1969) e K. senegalensis (ADESIDA, et al., 1967;

ADESOGAN, et al., 1967a; ADESOGAN & TAYLOR, 1968; GOVINDACHARI, et al.,

1997).

O espectro de massas (ESI) modo positivo deste limonóide (Figura

4.61) apresentou um pico correspondente ao aduto de sódio m/z 568 [M+Na]

condizente com a fórmula C

OAc

Limonóide 11

3-desacetilkhivorina

121

TABELA 4.11 – Valores de RMN

H e

C do limonóide 11 (3-desacetil-khivorina)

LITERATURA

(BANERJI e

NIGAM, 1983)

LIMONÓIDE – 11

(Hz) δ

1 73,8

4,58 t (2,7)

74,1

2α

2,29 m

2β

27,9

2,01 m

26,6

3 75,4 3,44 sl 70,7

4 37,1 - 37,2

5 36,0 2,89 m 36,3

6α

2,06 m

6β

22,5

2,04 m

21,5

7 74,1 4,68 t (2,7 Hz) 78,1

8 42,3 - 42,0

9 36,5 2,60 m 36,9

10 40,8 - 44,6

11α

1,68 m

11β

14,3

15,6

12α

1,73 m

12β

26,2

27,7

13 38,6 39,5

14 69,5 71,3

15 56,1 3,53 s 58,3

16 167,4 170,8

17 78,3 5,60 s 80,2

18 17,4 1,27 s 18,4

19 18,1 1,05 s 19,4

20 120,5 122,1

21 142,9 7,48 s 142,5

22 109,8 6,40 sl 111,9

23 141,1 7,49 s 144,2

28 21,7 0,97 s 22,6

29 27,9 0,92 s 28,0

30 16,2 1,05 s 17,2

CO 21,2 2,05 21,7

CO 20,9 2,04 21,5

CO 169,3 172,5

CO 172,1

1 =.CDCl

, 100MHz, 2 = CDCl

, 400MHz

122

FIGURA 4.56–

Espectro de RMN

H de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

FIGURA 4.57 –

Espectro de RMN

C de3-desacetilkhivorina (100MHz, CDCl

123

FIGURA 4.58 – Espectro de HSQC de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

FIGURA 4.59 – Espectro de HMBC de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

124

FIGURA 4.60 - Espectro de COSY de 3-desacetilkhivorina (400MHz, CDCl

OD).

FIGURA 4.61 – Espectro de massas ESI (+) de 3-desacetilkhivorina.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P23_pos 1107 (28.440) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1107) 1: Scan ES+

8.10e7

568

608

600

125

4.11 - Determinação estrutural do triterpeno 12

A determinação do triterpeno 12 foi realizada utilizando os espectros

de RMN em uma e duas dimensões, ESI/MS e por comparação com os dados da

literatura (PAULA, 1996).

O Espectro de RMN

H (Figuras 4.62) deste triterpeno apresentou sete

singletos de metilas em δ

0,82, 1,00, 1,05, 1,12 e 1,22; um dubleto em δ

0,85

(J=6,4 Hz) e um singleto na região de hidrogênios olefínicos em δ

5,31. O espectro

de RMN

C (Figuras 4.63) apresentou 30 sinais de carbono, sendo dois sinais

característicos de carbonos olefínicos em δ

117,9 e 146,0 e quatro sinais de

carbonos carbinólicos em δ

72,9, 77,5, 81,0 e 83,7.

Os sinais referentes à H-22 em δ

3,83 d (J=8,0 Hz), H-23 em δ

3,66 t

(J=5,2 Hz) e H-24 em δ

3,97 t (J=7,6 Hz) apresentaram correlações, via HSQC

(Figura 4.65), com os sinais em δ

83,7, 77,5 e 72,9 atribuídos aos C-22, C-23 e C-

24, respectivamente. A ausência do sinal em δ

81,0 no espectro de DEPT 135

(Figura 4.64) possibilitou a atribuição do mesmo ao carbono quaternário C-25.

O espectro de RMN

H também mostrou um triplo-dubleto em δ

2,77

(J=22,4, 14,4 e 8,0Hz), característico de H-2β (axial) de triterpenos com carbonila

em C-3 (δ

217,1).

O sinal em δ

117,8 foi atribuído via HSQC, ao sinal de H-7, onde foi

confirmada a posição da ligação dupla em C-7. utilizando o mapa de correlações

HMBC (Figura 4.66), que mostrou em δ

5,31 (H-7) correlações com os sinais em δ

52,4 (C-5), 49,3 (C-9) e 51,2 (C-14). No espectro de COSY (Figura 4.67) foi

observada a correlação do sinal de H-7 com o multipleto em δ

2,05, atribuído a H-6

(2H).

Os sinais das metilas em δ

0,82, 1,00, 0,87, 1,05, 21,6 e 1,05

acoplaram respectivamente, via HSQC em δ

21,9, 12,8, 12,3, 24,6, 21,6 e 27,8 e

foram atribuídos respectivamente aos sinais da metilas Me-18, Me-19, Me-21, Me-

28, Me-29 e Me-30. Estas atribuições foram realizadas por meio das seguintes

correlações observadas no mapa de correlações HMBC.

126

De acordo com essas atribuições pôde-se concluir que a triterpeno12

trata-se do odoratona. Este triterpeno foi relatado nas espécies Cedrela odorata

(CHAN e TAYLOR, 1967; CHAN et al., 1968), C. glaziovii (CONNOLLY et al., 1968),

C. fissilis (LEITE, 2005) e do enxerto de C. odorata sobre Toona ciliata (PAULA,

1996). foram concordantes com aqueles descritos na literatura para odoratona

(LEITE, 2005) e estão apresentados na Tabela 4.12.

O espectro de massas ESΙ (+) para este triterpeno 12 (Figura 4.68)

apresentou um pico em m/z 473 [M+H]

, correspondente ao íon pseudo-molecular,

confirmado pelo íon do aduto de sódio m/z 495, condizente com a fórmula C

É importante salientar que é a primeira vez que o triterpeno odoratona

está sendo citado no gênero Khaya.

HMBC

→ C

Triterpeno 12

(odoratona)

127

TABELA 4.12 – Valores de RMN

H e

C do Triterpeno 12 (odoratona)

1 =.Acetona –d

, 100MHz

2 = CDCl

, 400MHz

3 = CDCl

, 100MHz

LITERATURA ( LEITE, 2005 ) Triterpeno 12

(Hz) δ

1 1,50; 2,10 m 39,1 1,45; 2,03 m 38,5

2β

2,77 td (14,6 e 5,4) 34,8 2,77 td (14,4 e 5,5) 34,9

2α

2,17 m 215,5 2,23 t 217,1

−

48,3

−

47,9

−

53,1

−

52,3

5 1,75 m 25,1 1,73 t (8,0) 24,3

6 2,15 m 118,8 2,09 t (8,0) 117,8

7 5,35 m 146,9 5,31 sl 146,0

−

49,3

−

49,3

9 2,40 m 35,8 1,89 m 35,0

−

19,1

−

18,4

11 1,65 m 34,6 1,32 m 34,0

12 1,50 – 1,90m 44,2 1,50 d (9,2) 43,5

−

52,0

−

51,2

−

35,4

−

33,5

15 1,50 – 1,90m 28,4 1,85 m 29,6

16 1,40 m 50,4 1,25 sl 48,5

17 1,92 m 22,1 2,32 t 21,9

18 0,86 s 13,1 0,82 s 12,8

19 1,04 s 38,2 1,00 s 37,6

20 1,65 m 12,9 1,61 m 12,3

21 0,85 d (6,4) 84,5 0,83 d (6,4) 83,7

22 3,84 t (6,0) 78,0 3,82 d (8,0) 77,5

23 7,59 dl(6,0) 73,2 3,66 dl (5,2) 72,9

24 3,96 m 81,6 3,97 t 81,0

26 1,17 s 28,3 1,22 s 29,6

27 1,15 s 22,2 1,22 s 21,3

28 1,00 s 25,1 1,05 s 24,6

29 1,11 s 21,8 1,12 s 21,6

30 1,06 s 28,4 1,05 s 27,8

128

FIGURA 4.62 – Espectro de RMN

H de odoratona (400MHz, CDCl

FIGURA 4.63 – Espectro de RMN

C de odoratona (100MHz, CDCl

129

FIGURA 4.64 – Espectro de DEPT 135

de odoratona (100MHz, CDCl

FIGURA 4.65 – Espectro de HSQC de odoratona (400MHz, CDCl

130

FIGURA 4.66 –

Espectro de HMBC de odoratona (400MHz, CDCl

FIGURA 4.67 – Espectro de COSY de odoratona (400MHz, CDCl

131

FIGURA 4.68 –

Espectro de massas ESI (-) de (odoratona)

4.12 -

Determinação estrutural do protolimonóide 13

Para a determinação estrutural deste triterpeno foram feitos os

espectros de RMN

H, RMN

C, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS representados

respectivamente por FIGURAS 4.69, 4,70, 4,71, 4.72, 4.73 e 4.74. Os valores dos

deslocamentos químicos foram comparados com os valores encontrados na

literatura (TABELA 4.13).

A presença de dois dubletos em δ

7,34 e 5,83 (J= 10,2Hz),

característicos de uma ligação dupla conjugada a uma carbonila no anel A, foi

observada no espectro de RMN

H, os quais foram atribuídos aos hidrogênios

olefínicos H-1 e H-2. O acoplamento destes dubletos foi evidenciado no espectro de

COSY. Esta ligação dupla foi caracterizada no espectro de RMN

C, pelos sinais em

161,1 e δ

125,9 atribuídos via HSQC aos C-1 e C-2 respectivamente. De acordo

com a biossíntese de triterpenos a carbonila conjugada só poderia estar em C-3 (δ

207,0).

O sinal do singleto de metila em δ

1,20 acoplou em δ

19,5 e foi

atribuído a Me-19 de acordo com as correlações mostradas abaixo, bem como, as

demais correlações para o anel A.

m/z

100

SEB_14_LC_FSPa 174 (9.662) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (174-175:194) 1: Scan ES+

3.97e5

495

146

241

146

200

175

159

187

218

233

261

251

317

292

270

282

309

377

352

336

473

412

384

390

430

460

486

504

132

No espectro de RMN

H também foi observado um singleto largo em δ

1,94, característico de metila de acetato, via HSQC acoplou em δ

21,2 e foi

atribuído à metila do grupo acetato em C-7α. A acetilação do C-7 foi confirmada pelo

sinal de hidrogênio desblindado em δ

5,21, o qual via HSQC acoplou-se em δ

76,4

e correlacionou-se com os sinais em δ

40,0 (C-9), 47,7 (C-5). O sinal em δ

1,22

(Me-30) acoplou via HSQC com δ

24,7 e correlacionou-se por meio do mapa HMBC

com os sinais de deslocamentos em δ

44,0 (C-8) e 76,4 (C-7). As demais

correlações do anel B foram apresentadas a seguir:

Além dos sinais atribuídos a C-1 (δ

161,1) e C-2 (δ

125,9), o espectro

de RMN

C apresentou ainda outros dois sinais de carbonos olefínicos em δ

160,7

e δ

120,1, característicos da ligação dupla entre C-14 e C-15 de um derivado apo-

tirucalol/eufol.

Novamente observando o espectro de RMN

H notou-se outro sinal de

metila em δ

1,10, este via HSQC acoplou-se com δ

20,4 e foi atribuído a Me-18;

este também mostrou correlações em δ

35,9 (C-20), 58,8 (C-17) e com o sinal do

carbono olefínico em δ

160,7 (C-14).

H→C

HMBC

133

Os singletos de metila em δ

1,22 e 1,29 acoplaram via HSQC com os

sinais em δ

27,7 e 25,2 e foram atribuídos respectivamente às Me-27 e Me-26.

Estes singletos correlacionaram-se em δ

77,4 e 96,5 os quais foram assinalados

aos C-25 e C-24 respectivamente.

Ainda observando o espectro de RMN

H notou-se um tripleto em δ

3,87 (t, J=2,8Hz), o qual acoplou-se via HSQC em δ

69,1 e correlacionou-se

através do mapa de correlações HMBC em δ

31,0 (C-22). Um duplo dubleto em δ

3,83 (dd, J=11,3 e 3,9Hz), via HSQC, acoplou-se em δ

66,3 e correlacionou -se via

HMBC em δ

34,3 (C-16) e 96,5 (C-24). Estas correlações permitiram assinalar em

69,1 - sinal característico de carbono oximetilênico - o C-23 e em δ

66,3 o C-21.

O sinal em δ

3,59 (t, J=11,3Hz) também foi atribuído ao outro hidrogênio de C-21.

Logo, os sinais em δ

3,83 e 3,59 referem-se aos 2H-21. As constantes de

acoplamentos entre dois hidrogênios axiais são grandes e varia de 9-13Hz,

enquanto entre dois hidrogênios axial-equatorial ou equatorial-equatorial são

pequenas, variando de 2-5Hz. Esta informação permitiu inferir que a hidroxila em C-

23 deve estar em axial, pois, as constantes encontradas para estes sinais foram a

seguintes:

As demais atribuições foram feitas por comparação com os sinais de

deslocamentos de carbono da substância grandifoliolenona (1) (MARINHO et al.,

2007), onde observou-se um sinal de deslocamento químico do C-24 mais

desblindado em 96,5 para o Protolimonóide 13 em relação ao grandifoliolenona em

86,6, sugerindo assim uma hidroxila no C-24 deste protolimonóide.

CONNOLLY et al., 1981 relataram este protolimonóide em

Entandrophragma spicatum, no entanto não foi possível comparar os sinais de

deslocamentos químicos desta substância com o protolimonoide -13 pois o artigo

apresentou erro de impressão mostrando no lugar dos deslocamentos químicos de

carbono os mesmos valores de deslocamentos químicos de hidrogênio os quais já

tinham sido mencionados por eles.

H21a e H20a (11,3Hz)

H23e e H22e H22a

(

8Hz

)

134

Desta forma o protolimonóide 13, foi identificado como sendo o 24-

hidroxigrandifoliolenona, sendo a primeira vez citado no gênero Khaya.

Por meio do espectro de massas ESΙ (-) (FIGURA 4.74) foi possível

verificar um pico em m/z 543 [M-H]

, correspondente à molécula deprotonada,

condizente com a fórmula molecular C

OAcO

grandifoliolenona

Protolimonóide 13

24-hidroxigrandifoliolenona

135

TABELA 4.13 – Valores de RMN

H e

C do protolimonóide 13 (24-

hidroxigrandifoliolenona)

LITERATURA

(MARINHO, 2007)

Protolimonóide 13

(Hz) δ

1 158,4 7,34 d (10,2) 161,1

2 125,5 5,83 d (10,2) 125,9

3 204,7

207,0

4 44,2

45,3

5 46,2

3,34 s

47,7

6 23,9

2,06 m / 1,80 m

23,5

7 74,9

5,21 sl

76,4

8 42,8

44,0

9 38,7

2,27 d (6,0 Hz)

40,0

10 39,8 - 41,2

11 16,9

2,01 m / 1,73 m

17,7

12 34,9

2,20 m / 1,97 m

34,9

13 46,4 - 50,3

14 159,0 - 160,7

15 119,6 5,28 sl 120,1

16 34,1

1,70 d (3,0 Hz)

34,3

17 52,4

1,24 d (3,0 Hz)

58,8

18 20,4 1,10 s 20,4

19 19,1 1,20 s 19,5

20 35,9 1,55 m 35,9

21 70,1 3,83 dd (11,3 e 3,9)

/ 3,59 t (11,3)

66,3

22 36,3 2,24 dd (11,3 e 3,9) 31,0

23 64,4 3,87 t (2,8) 69,0

24 86,6 - 96,5

25 74,2 - 77,4

26 24,1 1,29 25,2

27 28,6 1,22 27,7

28 27,1 1,06 27,5

29 21,3 1,08 21,7

30 27,3 1,22 24,7

MeCOO 170,1 171,8

MeCOO 21,2 1,94 21,1

1 =.CDCl

, 100MHz, 2 = CDCl

, 400MHz

136

FIGURA 4.69 – Espectro de RMN

H de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz,

CDCl

FIGURA 4.70 –

Espectro de RMN

C de 24-hidroxigrandifoliolenona (100MHz,

CDCl

137

FIGURA 4.71 – Espectro de HSQC de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz, CDCl

FIGURA 4.72

– Espectro de HMBC de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz, CDCl

138

FIGURA 4.73 – Espectro de COSY de 24-hidroxigrandifoliolenona (400MHz, CDCl

FIGURA 4.74 –

Espectro de massas ESI (-) de 24-hidroxigrandifoliolenona.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P20 1203 (30.840) Cm (1196:1219) 1: Scan ES-

1.59e6

329

321

191

167

181

283

247

205

245

221

275

261

301

330

499

330

346

455

395

381

361

439

419

411

491

473

543

500

533

544

566

556

611

599

585

628

636

139

4.13 - Determinação estrutural do protolimonóide 14

Para a determinação estrutural deste protolimonóide foram feitos os

espectros de RMN

H, RMN

C, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS representados

respectivamente por FIGURAS 4.75, 4.76, 4.77, 4.78, 4.79 e 4.80. Os valores dos

deslocamentos químicos foram comparados com aqueles encontrados na literatura

(TABELA 4.14).

A presença de dois dubletos em δ

7,34 e 5,83 (J= 10,2Hz),

característicos de uma ligação dupla conjugada a uma carbonila no anel A, foi

observada no espectro de RMN

H, os quais foram atribuídos aos hidrogênios

olefínicos H-1 e H-2. O acoplamento destes dubletos foi evidenciado no espectro de

COSY. Esta ligação dupla foi caracterizada no espectro de PENDANT, pelos sinais

em δ

161,2 e δ

125,8 atribuídos via HSQC aos C-1 e C-2 respectivamente. De

acordo com a biossíntese dos triterpenos, a carboníla conjugada só poderia estar

em C-3 (δ

207,1).

O sinal do singleto de metila em δ

1,21 acoplou em δ

19,5 e foi

atribuído a Me-19 de acordo com as correlações mostradas abaixo, bem como, as

demais correlações para o anel A.

No espectro de RMN

H também foi observado um singleto largo em δ

1,95, característico de metila de acetato, o qual via HSQC acoplou em δ

21,7 e foi

atribuído à metila do grupo acetato em C-7α. A acetoxilação do C-7 foi confirmada

pelo sinal de hidrogênio desblindado em δ

5,22, o qual via HSQC acoplou-se em δ

76,4 e correlacionou-se com os sinais em δ

40,0 (C-9), 47,5 (C-5). O sinal em δ

1,23 (Me-30) acoplou via HSQC com δ

27,7 e correlacionou por meio do mapa

HMBC com os sinais de deslocamentos em δ

44,0 (C-8) e 76,4 (C-7). As demais

correlações do anel B foram apresentadas a seguir:

140

Além dos sinais atribuídos a C-1 (δ

161,1) e C-2 (δ

125,9), o espectro

de RMN

C apresentou ainda outros dois sinais de carbonos olefínicos em δ

160,9

e δ

120,1, característicos da ligação dupla entre C-14 e C-15 de um derivado apo-

tirucalol/eufol.

Novamente observando o espectro de RMN

H notou-se outro sinal de

metila em δ

1,02, este via HSQC acoplou-se com δ

20,6 e foi atribuído a Me-18,

este mostrou correlações em δ

37,6 (C-20), 58,8 (C-17) e com o sinal do carbono

olefínico em δ

160,7 (C-14).

Os singletos de metila em δ

1,06 e 1,12 acoplaram via HSQC com os

sinais em δ

26,4 e 27,5 e foram atribuídos respectivamente as Me-27 e Me-26.

Estes singletos correlacionaram-se em δ

77,7 e 81,2 os quais foram assinalados

aos C-25 e C-24 respectivamente.

No espectro de RMN

H também se observou sinais de hidrogênios

oximetínicos em δ

3,79, 3,69 e 3,37, estes sinais acoplaram via HSQC em δ

69,0

(C-23), 65,2 (C-21) e 81,2 (C-24).

As demais atribuições foram feitas por comparação com os sinais de

deslocamentos de carbono da substância Acetato de sapelina E, a qual foi relatada

por MARINHO 2007 pela primeira vez em K. ivorensis.

Desta forma o protolimonóide 14 foi identificado como sendo o Acetato

de sapelina E. No espectro de massas ESΙ (-) (FIGURA 4.80) foi possível verificar

um pico em m/z 528 [M-H]

, correspondente a molécula deprotonada condizente com

a fórmula molecular C

H→C

HMBC

141

OAcO

Protolimonóide – 14

(Acetato de sapelina E)

142

TABELA 4.14 – Valores de RMN

H e

C do protolimonóide 14 (Acetato de

sapelina E)

LITERATURA

(MARINHO,2007)

Protolimonóide 14

(Hz) δ

1 158,4 7,34 d (10,2) 161,2

2 125,5 5,83 d (10,2) 125,8

3 204,7

207,1

4 44,2

47,7

5 46,2

3,35 s

47,5

6 23,9

2,06 m / 1,80 m

24,7

7 74,9

5,21 sl

76,4

8 42,8

44,0

9 38,7

2,27 d (6,0 Hz)

40,0

10 39,8 - 41,2

11 16,9

2,01 m / 1,73 m

17,7

12 34,9

2,20 m / 1,97 m

35,5

13 46,4 - 45,3

14 159,0 - 160,9

15 119,6 5,28 sl 120,1

16 34,1

1,59 m /1,94 m

38,9

17 52,4

1,92 m

56,0

18 20,4 1,02 s 20,6

19 19,1 1,21 s 19,5

20 35,9 1,97 m 37,6

21 70,1 3,68 dd (12,4 e 2,0) /

3,53 m

65,2

22 36,3 2,10 d (2,0) / 2,25 m 35,9

23 64,4 3,74 dd (8,7 e 2,1) 69,0

24 86,6 - 81,2

25 74,2 - 77,7

26 24,1 1,12 23,4

27 28,6 1,06 27,5

28 27,1 1,08 26,4

29 21,3 1,27 21,1

30 27,3 1,23 27,7

MeCOO 170,1 171,8

MeCOO 21,2 1,99 21,1

1 =.CDCl

, 100MHz, 2 = CDCl

, 400MHz

143

FIGURA 4.75 –

Espectro de RMN

H de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

FIGURA 4.76 – Espectro de RMN

C de Acetato de sapelina E (100MHz, CDCl

144

FIGURA 4.77 –

Espectro de HSQC de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

FIGURA 4.78 –

Espectro de HMBC de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

145

FIGURA 4.79 –

Espectro de COSY de Acetato de sapelina E (400MHz, CDCl

FIGURA 4.80 – Espectro de massas ESI (+) de Acetato de sapelina E.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P24 1150 (29.481) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1145:1155) 1: Scan ES-

6.04e6

528

486

329

518

561

574

146

4.14 - Determinação estrutural do protolimonóide- 15

Para a determinação estrutural deste protolimonóide foram feitos os

espectros de RMN

H, RMN

C, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS representados

respectivamente por FIGURAS 4.81, 4.82, 4.83, 4.84, 4.85 e 4.86. Os valores dos

deslocamentos químicos foram comparados com aqueles encontrados na literatura

(TABELA 4.15).

Verificou-se por meio do espectro de hidrogênio alguns sinais

duplicados característicos de mistura de isômeros dos protolimonóides 14 e 15,

onde observaram-se quatro dubletos olefínicos em δ

7,16 (H-1, J= 10,2 Hz) e δ

5,85 (H-2, J= 10,2 Hz) para 15 e δ

7,15 (H-1, J= 10,3 Hz) e δ

5,84 (H-2, J= 10,3

Hz) para 14, característicos de um sistema com ligação dupla conjugada a uma

carbonila no anel A. O acoplamento destes dubletos foi evidenciado no espectro de

COSY. Esta ligação dupla foi caracterizada no espectro de PENDANT, pelos sinais

em δ

158,4 e δ

125,5, atribuídos via HSQC aos C-1 e C-2 respectivamente, para

ambos os compostos. De acordo com a biossíntese de triterpenos a carbonila

conjugada só poderia estar em δ

207,1 (C-3).

No espectro de RMN

H a presença de grupo acetato foi evidenciada

através do singleto em δ

1,93 referente ao hidrogênio da metila do acetato que via

HSQC acoplou em δ

21,2. O hidrogênio H-7 foi caracterizado pelo sinal em δ

5,22

sl. No espectro de RMN

C, a presença dos grupos acetatos foram assinaladas em

74,9 (14) e 74,7 (15), atribuídos aos carbonos C-7 de ambas as substâncias e

também pelo sinal de carboxila de éster em δ

170,1, relativos às carboxilas dos

acetatos.

Além dos sinais atribuídos a C-1 (δ

158,4) e C-2 (δ

125,5), o espectro

de RMN

C apresentou outros quatro sinais de carbonos olefínicos em δ

159,0 e δ

119,6 para 15 e δ

159,2 e δ

119,1 para 14, característicos da ligação dupla entre

C-14 e C-15 de um derivado apo-tirucalol/eufol.

Ainda no espectro de RMN

H foram observados cinco singletos de

metila para a substância 15 em:

- δ

0,95 (Me-18) que acoplou via HSQC em δ

20,4 e correlacionou

com os sinais em 34,9 (C-12), 46,4 (C-13), 159,0 (C-14) e 119,6 (C-15).

147

- δ

1,15 (Me-19) via HSQC acoplou-se em δ

19,1 e correlacionou-se

via HMBC em δ

158,4 (C-1), 46,2 (C-5) e 39,8 (C-10).

- δ

1,06 (Me-28 e 29) via HSQC acoplaram-se em δ

27,1 e 21,3,

respectivamente e correlacionaram via HMBC em δ

204,7 (C-3), 44,2 (C-4) e 46,2

(C-5).

- δ

1,19 (Me-30) via HSQC acoplou-se em δ

27,3 e correlacionou via

HMBC em δ

38,7 (C-9), 42,8 (C-8) e 74,9 (C-7).

No espectro de RMN

H foram também observados cinco singletos de

metilas para a substância 14 em:

- δ

0,96 (Me-18) que acoplou-se via HSQC em δ

20,0 e correlacionou

com os sinais em 35,0 (C-12), 46,3 (C-13), 159,2 (C-14) e 119,1 (C-15).

- δ

1,15 (Me-19) via HSQC acoplou-se em δ

19,1 e correlacionou-se

via HMBC em δ

158,4 (C-1), 46,2 (C-5) e 39,9 (C-10).

- δ

1,06 (Me-28 e 29) via HSQC acoplaram-se em δ

27,1 e 21,3,

respectivamente e correlacionaram via HMBC em δ

204,7 (C-3), 44,2 (C-4) e 46,2

(C-5).

- δ

1,18 (Me-30) via HSQC acoplou-se em δ

27,3 e correlacionou via

HMBC em δ

38,7 (C-9), 42,8 (C-8) e 74,7 (C-7).

No espectro RMN

H também foram verificados dubletos referentes a

hidrogênios oximetilênicos em δ

3,96 (J= 11,5 Hz) e δ

3,43 (J= 11,5 Hz) para 15,

estes dubletos mostraram correlação com o sinal de carbono em δ

70,1 (C-21) via

HSQC e apresentaram correlações via HMBC com os sinais de carbonos em δ

36,3

(C-22); δ

52,4 (C-17) e δ

86,6 (C-24). Também foram observados multipletos

referentes a hidrogênios oximetilênicos em δ

3,86 e δ

3,59 para 14, estes

acoplaram em δ

64,3 (C-21) por meio do mapa de correlações HSQC.

Outros sinais de hidrogênios oximetínicos foram observados em δ

3,87; δ

3,80; δ

3,42 e δ

2,89. Para a substância 15 foram atribuídos os sinais em

3,87 que via HSQC acoplou em δ

64,4 (C-23) e o sinal δ

2,89 (d, J= 9,1 Hz)

acoplou com o sinal de carbono em δ

86,6 (C-24) e via HMBC correlacionou com os

sinais em δ

24,1 (C-26); δ

28,6 (C-27); δ

64,4 (C-23) e δ

74,2 (C-25). Para a

substância 14 foram atribuídos os sinais em δ

3,80 e δ

3,42 (d, J= 8,8 Hz). O sinal

em δ

3,80 apresentou correlação com o sinal em δ

68,1 (C-23) via HSQC e o

dubleto mostrou correlação com o sinal δ

80,7 (C-24) através do mapa de

148

correlações HSQC e via HMBC apresentou correlação com os sinais em δ

22,4 (C-

26) e δ

26,3 (C-27).

As demais atribuições foram feitas por comparação com os sinais de

deslocamentos de carbono das substâncias Bourjotinolona (I), Hispidona (II) (JOLAD

et al,. 1980) e 20,21,22,23-tetraidro-23-oxoazadirona (III) (PAULA et al., 1977). Isso

porque não foram encontrados dados de RMN

C para estas substâncias.

A substância 15 denominada de Grandifoliolenona por CONNOLLY

(1967) foi o primeiro derivado natural apo-tirucalol/eufol (CANNOLLY et al, 1971),

este já foi isolada anteriormente de em K. grandifoliola (CONNOLLY, et al., 1967a,

CONNOLLY, et al., 1971), K. ivorensis (ADESOGAN, et al., 1970 e MARINHO 2007)

entre outras espécies de Meliaceae.

A substância 14 trata-se do mesmo protolimónoide isolado no item

4.14, o Acetato de sapelina E, já discutida.

Desta forma a mistura dos isômeros protolimonóides 14 e 15 foi

também identificada por meio do espectro de massas ESΙ (+) (FIGURA 4.86) onde

foi possível verificar um pico em m/z 528 [M+H]

, correspondente a molécula

protonada condizente com a fórmula molecular C

destes isômeros.

149

OAcO

III

OAcO

Protolimonóide – 15

(Grandifoliolenona)

OAcO

Protolimonóide – 14

(Acetato de sapelina E)

150

TABELA 4.15 – Valores de RMN

C do protolimonóide - 14 (Acetato de sapelina

E) e protolimonóide 15 (Grandifoliolenona).

14 15 Literatura I

(ITOKAWA et al.,

1992)

Literatura II

(ITOKAWA et al.,

1992)

Literatura IIII

(PAULA et al,

1997)

1 158,4 158,4 38,6 38,6 38,5

2 125,5 125,5 35,0 34,9 34,9

3 204,7 204,7 216,8 217,1 217,0

4 44,2 44,2 47,9 47,9 47,9

5 46,2 46,2 52,4 52,4 52,4

6 23,9 23,9 24,6 24,4 24,4

7 74,7 74,9 118,1 118,1 118,0

8 42,8 42,8 145,7 145,8 145,7

9 38,7 38,7 48,5 48,4 48,4

10 39,9 39,8 35,1 34,9 35,0

11 16,8 16,9 18,2 18,1 18,1

12 35,0 34,9 33,0 32,6 32,6

13 46,3 46,4 43,3 43,4 43,3

14 159,2 159,0 51,3 51,3 51,3

15 119,1 119,6 34,0 33,9 34,0

16 34,1 34,1 27,4 28,2 28,1

17 54,3 52,4 44,8 47,5 47,5

18 20,0 20,4 21,6 12,8 21,6

19 19,1 19,1 12,8 21,6 12,8

20 38,5 35,9 37,5 38,6 38,5

21 64,3 70,1 70,1 64,4 64,4

22 37,9 36,3 36,5 37,5 34,4

23 68,1 64,4 64,6 68,7 68,5

24 80,7 86,6 86,5 80,8 80,7

25 76,2 74,2 74,2 76,2 76,2

26 22,4 24,1 24,0 22,4 22,3

27 26,3 28,6 28,5 26,3 26,3

28 27,1 27,1 24,6 27,4 24,5

29 21,3 21,3 22,3 24,6 22,2

30 27,3 27,3 27,5 22,4 27,4

MeCOO 170,1 170,1 - - -

MeCOO 21,2 21,2 - - -

CDCl

, 400MHz

CDCl

, 22,63 MHz

151

FIGURA 4.81 – Espectro de RMN

H da mistura de acetato de sapelina E (14) e

grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.81B – Ampliação do espectro de RMN

H da mistura de acetato de

sapelina E (14) e grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

152

FIGURA 4.82 –

Espectro de RMN

C (PENDANT) da mistura de acetato de

sapelina E (14) e grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.83 – Mapa de correlações HSQC da mistura de grandifoliolenona (15) e

acetato de sapelina E (14) (400 MHz, CDCl

153

FIGURA 4.83B – Ampliação do mapa de correlações HSQC da mistura de acetato

de sapelina E (14) e grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.84 – Mapa de correlações HMBC da mistura de acetato de sapelina E

(14) e grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

154

FIGURA 4.84B – Ampliação do mapa de correlações HMBC da mistura de acetato

de sapelina E (14) e grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.85 –

Espectro de COSY da mistura de acetato de sapelina E (14) e

grandifoliolenona (15) (400 MHz, CDCl

155

FIGURA 4.86 – Espectro de massas ESI (+) de Acetato de sapelina E em mistura

com

a grandifoliolenona

4.15 – Determinação estrutural dos triterpenos 16 e 17

A determinação estrutural destes triterpenos é semelhante a do

limonóide 1, no entanto, não se observaram no espectro de RMN

H os sinais

característicos do anel furano. Para a determinação estrutural destes foram obtidos

os espectros de RMN

H, RMN

C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY e ESI/MS,

representados, respectivamente, por FIGURAS 4.87, 4.88, 4.89, 4.90, 4.91, 4.92 e

4.93. Os valores dos deslocamentos químicos foram comparados com os valores

encontrados na literatura (TABELA 4.17).

Como estes triterpenos estão em mistura, primeiro será apresentada a

determinação estrutural para a substância 16 e posteriormente a determinação para

a substância 17.

Notaram-se no espectro de RMN

H dois sinais de hidrogênio

característicos de dupla terminal em δ

4,90 (s) e δ

5,15 (s) os quais acoplaram em

112,4 (C-30) e correlacionaram-se com os sinais em δ

80,0 (C-14) e δ

50,0. O

sinal em δ

4,90 também correlacionou com o sinal de carbono sp

totalmente

substituído em δ

144,9. A correlação com o sinal do C-14 permitiu posicionar esta

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P24_pos 1147 (29.469) Cm (1140:1151) 1: Scan ES+

8.34e7

552

301

339

552

574

156

ligação dupla terminal entre C-8 e C-30. As demais correlações levaram a atribuir

em δ

50,0 o C-9 e em δ

144,9 o C-8.

O sinal em δ

2,22 sl (H-9) mostrou correlações via HMBC com os

seguintes sinais de carbonos: δ

144,9 (C-8), 112,4 (C-30), 80,0 (C-14), 77,3, 28,8

(C-12) e 23,6. Por meio destas correlações foi assinalado o sinal em δ

23,6 para o

C-11 e em δ

77,3 – sinal de deslocamento químico característico de carbono

oxidado - para o C-1. Ainda verificou um sinal em δ

0,94 que acoplou via HSQC em

21,4 e se correlacionou via HMBC em δ

77,3 (C–1), 42,9 (C-5), δ

43,9 (um

quaternário, C–10) e δ

50,0 (CH, C–9), estas correlações sugerem a Me-19 em δ

21,4.

Observou-se também um sinal em δ

3,72 s característico de uma

metoxila de um grupo carbometoxi que acoplou via HSQC em δ

52,2 e

correlacionou-se via HMBC em δ

173,6 – sinal de deslocamento químico que indica

um carbometoxi para o C-7, este correlacionou em δ

2,60 d (J=11,5Hz) e δ

2,27 sl

correspondentes aos 2H-6, os quais acoplaram via HSQC em δ

32,9 (C-6). Estas

correlações conferem à abertura do anel B.

Os sinais em δ

2,52 d (J=4,2Hz) e δ

2,93 m acoplaram via HSQC em

39,6 (C-2) e correlacionaram-se em δ

21,4 (Me-19), 26,4 (Me-28) e também com

o sinal de uma carbonila em δ

213,0, esta só poderia estar em C-3 considerando o

esqueleto básico de um limonóide.

Os sinais de duas metilas em δ

1,07 e δ

1,19 por meio do HSQC

acoplaram em δ

26,4 e 21,3 respectivamente, e correlacionaram via HMBC com os

sinais em δ

42,9 (C-5), 48,0 (C-4) e com C-3. Assim sendo, as duas metilas

corresponderam àquelas ligadas ao C–4, ou seja Me-28 e Me-29.

HMBC

→C

157

Analisando os dois pares de dubletos em δ

2,88 d (J = 18Hz) e δ

2,57 d (J = 18Hz) verificou-se que estes acoplaram em δ

33,7 e correlacionaram-se

com os sinais em δ

80,0 e 168,9, sendo que somente aquele em δ

2,58

correlacionou-se com o sinal em δ

41,9 (C–13). Estas correlações permitiram

atribuir os dois sinais de hidrogênio (CH

) ao 2H-15 e em δ

33,7 o C-15, assim

como, o sinal em δ

168,9

ao C-16.

O sinal em δ

0,91 da Me-18 correlacionou com os sinais em δ

41,9

(C-13), 28,8 (C-12), 78,0 (C-17) e 80,0. Estas correlações confirmaram as

atribuições feitas acima, como mostradas a seguir e sugeriram a presença de uma

hidroxila ou éter (OR) em C-14 (δ

80,0).

No espectro de RMN

H ao invés dos sinais de um anel furano,

observaram-se dois singletos largos em δ

7,30 e 6,15, atribuídos a H-22 e H-23,

respectivamente, sugerindo a presença de uma γ-hidroxibutirolactona. No espectro

de RMN

C a presença do substituinte em C-17 foi definida pelos sinais em δ

134,0

(C-20), 1168,7 (C-21), 149,7 (C-22) e 97,2 (C-23). Estas atribuições foram

confirmadas por comparação com os dados de RMN

H e RMN

C descritos para

Domesticulídeo D (SAEWAN et al., 2006), podendo desta forma, denominar a

substância – 16 de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila.

Ao analisar os experimentos em uma e duas dimensões da substância

17 observou-se um sinal em δ

6,19 (sl), o qual via HSQC acoplou-se com o sinal

em δ

98,0, estes foram atribuídos ao H-23 e C-23 respectivamente.

HMBC

→C

158

Já o sinal em δ

6,24 (s) acoplou via HSQC com o sinal em δ

122,0 o

qual foi atribuído ao C-22. No experimento de HMBC observou-se a correlação deste

sinal em δ

6,24 com o sinal em δ

169,7, assinalado ao C-16.

Ao analisar o sinal do H-17 em δ

5,60 foi possível determinar os

valores de deslocamentos químicos de C-20 e C-21 através do experimento de

HMBC, onde observou-se a correlação do H-17 com os sinais em δ

98,0, 122,0 e

163,6, sendo esses sinais atribuídos aos C-21, C-22 e C-20, respectivamente.

No experimento de COSY foi possível confirmar as correlações entre

os hidrogênios 21 e H-22 para essa substância.

Estas atribuições foram confirmadas por comparação com os dados de

RMN

H e RMN

C descritos para Domesticulídeo C (SAEWAN et al., 2006),

podendo desta forma denominar a substância 17 de 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila.

Estas substâncias estão sendo citadas pela primeira vez no gênero

Khaya, mas foram relatadas recentemente por SANTOS 2006 na espécie Cabralea

canjerana.

Os espectros de massas ESI (+) (Figura 4.93) destes limonóides

mostraram um pico em m/z = 525 [M + Na]

, correspondente aos isômeros 16 e 17,

condizente com a fórmula molecular C

159

(XII)

COOMe

(XI)

COOMe

21 21

Triterpeno 16

(23-hidroxi-20(22)-en-21,23-

γ-

lactona-angolensato de metila)

Triterpeno 17

(21-hidroxi-20(22)-en-21,23-

γ-

lactona-angolensato de metila)

OAc

Domesticulídeo D

OAc

Domesticulídeo C

160

TABELA 4.16 – Valores de RMN

C do triterpeno 16 (23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila) e do triterpeno 17 (21-hidroxi-

20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila)

Literatura

(Domesticulide C)

SAEWAN et

al.,2006

Literatura

(Domesticulide D)

SAEWAN et

al.,2006

Triterpeno 16 Triterpeno 17

1 3,53 m 3,55 dd (5,0 e 2,5) 3,50 t (5,7) 3,53 dd (6,2; 4,2)

2 2,33 dd (15,0 e 5,5) 3,06 dd (14,0 e 5,0) 2, 52 d (4,2) 2,47 d (4,2)

2 3,01 dd (14,5e 6,0) 2,37 dd (14,0e 2,5) 2,93 m 2,93 m

5 3,02 s 2,93 s 2,98 d (11,4) 2,98 d (11,4)

6 4,94 s 5,46 s 2,27 sl 2,31 sl

6 2,60 d (11,5) 2,60 d (11,5)

9 2,34 m 2,36 m 2,22 sl 2,23 m

11α 1,61 m 1,67 m 1,64 m 1,59 m

11β 2,35 m 2,41 m 2,20 m 2,20 m

12α 1,05 dt (12,5 e 4,0) 1,25 m

12β 2,05 m 1,89 dt (13,5 e 5,0)

15β 2,91 d (18,0) 2,88 d (18,0) 2,57 d (18,0) 2,59 d (20,0)

15α 2,55 d (18,0) 2,60 d (18,0) 2,88 d (18,0) 2,87 d ( 20,0)

17 5,55 s 5,58 s 5,63 s 5,60 s

18 0,93 s 0,93 s 0,91 s 0,90 s

19 1,09 s 1,06 s 0,94 s 0,92 s

21 6,14 sl 6,19 sl

22 7,29 t (1,0) 6,28 dd(1,5 e 0,5) 6,15 sl

23 6,18 s 7,30 s 6,24 s

28 1,13 s 1,09 s 1,07 s 0,96 s

29 1,44 s 1,46 s 1,19 s 1,01 s

30 5,19 s 5,24 s 4,90 s 4,92 s

30 4,94 s 4,93 s 5,15 s 5,21 s

OAc

2,21 s 2,22 s

OMe 3,77 s 3,78 s 3,72 s 3,71 s

161

TABELA 4.17 – Valores de RMN

C do triterpeno 16 (23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila) e do triterpeno 17 (21-hidroxi-

20(22)-en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila)

Literatura

(Domesticulide

SAEWAN et

al.,2006

Literatura

(Domesticulide D)

SAEWAN et

al.,2006

Triterpeno 16 Triterpeno 17

1 77,8 78,2 77,2 77,3

2 39,1 38,9 39,3 39,6

3 211,6 211,6 212,6 213,0

4 48,8 48,7 47,9 48,0

5 46,3 46,6 42,9 42,9

6 72,4 72,2 32,6 32,9

7 170,7 170,8 173,9 173,6

8 145,2 144,7 145,4 144,9

9 50,5 50,4 49,5 50,0

10 44,2 44,4 44,0 43,9

11 24,1 24,0 23,8 23,6

12 28,4 28,7 29,3 28,8

13 41,8 41,8 41,8 41,9

14 80,2 80,3 79,9 80,0

15 33,7 33,4 33,5 33,7

16 170,1 169,0 169,7 168,9

17 78,2 79,9 77,8 78,0

18 13,6 14,2 14,3 13,6

19 22,8 22,6 21,6 21,4

20 133,9 163,5 163,6 134,0

21 170,7 98,2 98,0 168,7

22 150,1 121,6 122,0 149,7

23 97,6 169,4 173,6 97,2

28 23,6 23,8 25,8 26,4

29 24,7 24,7 21,6 21,3

30 112,0 112,5 111,9 112,4

6-OAc 170,0 170,5 - -

21,1 21,1 - -

OMe 53,0 170,5 52,3 52,2

162

FIGURA 4.87 – Espectro de RMN

H da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.88 –

Espectro de RMN

C da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

163

FIGURA 4.89 –

Espectro de RMN

C (PENDANT) da mistura de 23-hidroxi-20(22)-

en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-

en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.90 –

Espectro de HSQC da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

164

FIGURA 4.91 –

Espectro de HMBC da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

FIGURA 4.92 – Espectro de COSY da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-

lactona-angolensato de metila (17) (400 MHz, CDCl

165

FIGURA 4.93 –

Espectro de massas ESI (+) da mistura de 23-hidroxi-20(22)-en-

21,23-γ-lactona-angolensato de metila (16) 21-hidroxi-20(22)-

en-21,23-γ-lactona-angolensato de metila (17)

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

P11_pos 1095 (28.141) Cm (1089:1114) 1: Scan ES+

1.04e8

525

547

557

167

5 - Resultados e Discussões do Perfil Químico de Khaya Ivorensis Sintomática

e Não Sintomática ao Fungo

Botryosphaeria Rhodina

5.1 - Desenvolvimento de método para análise do perfil químico da espécie

Khaya ivorensis sintomática e não sintomática ao fungo Botryosphaeria

rhodina

Para o desenvolvimento de métodos de análise de substâncias em

matrizes complexas através de Cromatografia Líquida de alta eficiência, faz-se

necessário a investigação e ajuste de diversos parâmetros. Muitos métodos

cromatográficos são descritos na literatura para a quantificação de extratos,

empregando as mais diversificadas técnicas de pré-purificação e preparo das

amostras, além de diversas configurações de equipamentos possíveis entre CLAE e

CL-EM. Buscando analisar o perfil químico da espécie Khaya ivorensis, tanto a

planta não sintomática como a planta sintomática ao fungo Botryosphaeria rhodina,

foi proposto o desenvolvimento de um método, que fosse seletivo, reprodutivo e de

fácil aplicação.

Desta forma, para o desenvolvimento inicial de um método analítico

de quantificação do cerne, casca do cerne e folha de K. ivorensis, escolheu-se a

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

A abertura de uma amostra vegetal é tradicionalmente realizada pela

técnica de extração em fase sólida, cujo objetivo é a retirada dos interferentes com

retenção seletiva das substâncias de interesse do tecido vegetal. A eficiência da

extração depende das interações químicas entre a substância e o solvente

utilizados, a migração diferencial entre duas fases imiscíveis, uma móvel e uma

estacionária chega-se a separação efetiva dos analitos de interesse. (SNYDER et al,

1997).

Portanto, iniciou-se o desenvolvimento do método, usando os

tecidos vegetais secos, triturados e uniformizando o tamanho dos grânulos, por meio

de uma peneira granulométrica. Foram testados inicialmente dois métodos de

extração:

168

Extração 1:

a) pesou-se separadamente 100 mg dos materiais vegetais [cerne (C),

casca do cerne (Cc) e folhas (F)] de K. ivorensis não sintomática ao B. rhodina

b) estes foram extraídos com 2mL de metanol, sob agitação utilizando

um agitador de tubos AP56 (PHOENIX) por 5 minutos, seguidos de filtração em um

funil analítico com o auxílio de papel filtro (INLAB tipo 10, porosidade 3,0µm).

c) repetiu-se a etapa b por mais duas vezes, obtendo-se no final 6 mL

de cada filtrado etanólico.

e) as amostras foram secas no evaporador de solventes a vácuo

(SPEEDVAC) (43

C/2 horas) obtendo-se 3,6, 10,6 e 16,0mg de extratos secos

respectivamente do cerne, casca do cerne e folhas não sintomáticas.

Após essa etapa foi feito um pré-tratamento das amostras,

procedimento comum e necessário antes da medida do analito de interesse. O pré-

tratamento deve promover uma melhor seletividade ao método pela eliminação de

interferentes que podem co-eluir com o analito, além de evitar danos às colunas

analíticas. O procedimento de limpeza investigado para o extrato etanólico foi à

extração em fase sólida (SPE).

A SPE é realizada pela retenção seletiva dos compostos de

interesse em uma fase estacionaria. No tratamento do extrato etanólico foi testado

cartucho de SPE empacotados com 100 mg cianopropil (CN). Assim, os extratos

etanólicos foram dissolvidos 200 µL de hexano, em seguida agitados e aplicados

nos cartuchos de SPE, já previamente condicionados com 5 mL de hexano. O tubo

de ensaio foi novamente lavado com mais 100 µL de hexano e posteriormente

aplicado lentamente ao cartucho. Em seguida a amostra é lavada com 4 mL de

hexano permitindo que o cartucho seque no final. Mais uma vez o tubo é lavado,

porém, agora com 200 µL de MeOH e aplicado ao cartucho, onde se adiciona mais

1,0 mL de MeOH para a eluições das substâncias. Foi utilizada uma câmara à vácuo

acoplada a uma bomba de vácuo, trabalhando a uma pressão próxima a 70 mmHg

onde os cartuchos eram embutidos e o fluxo de lavagem e eluição mantido

constante. Esta fração metanólica foi coletada, seca sob ar comprimido e

reconstituída em 500 µL de MeOH estando pronta para a análise. A Figura 5.1

(FORIM, 2006), mostra como foi feito o pré-tratamento das amostras.

169

Figura 5.1 –

Esquema para o pré-tratamento das amostras de Khaya ivorensis.

Extração 2:

Todo o procedimento citado anteriormente foi repetido alterando

apenas a forma de extração na etapa (c), onde a suspensão foi submetida à

extração por 15 minutos com ultra-som.

As amostras foram secas no evaporador de solventes à vacuo

(SPEEDVAC) (43

C/2 horas) obtendo-se: 3,2, 11,7 e 14,4mg de extratos secos

respectivamente do cerne, casca do cerne e folhas não sintomáticas ao fungo.

Assim foram realizados análises exploratórias dos extratos obtidos por

cromatografia líquida acoplada a detector de ultravioleta (CLAE-UV/DAD) usando

uma coluna C

Phenomenex® luna (10µm) de 150 x 4,6mm, com uma pré-coluna

Phenomenex® (4 x 3mm, 10µma) acoplada. A fase móvel foi constituída de

água (H

O) e ACN:MeOH (1:1), variando a porcentagem da fase orgânica de 5 à 100

% em 60 minutos, numa vazão de 1,0 mL/min.

1 mL

agitador

Hexano

MeOH

300

5 m

(a)

(b)

4 m

Condicionamento Lavagem

200

Seca com ar

comprimido

Reconstituir em

500

L de MeOH

Análise por

CLAE

Extrato

vegetal

agitador

HexanoHexano

MeOH MeOH

5 m

(a)

(b)

(c)

4 m

Condicionamento Lavagem

Catucho

Ciano

100 m

(d)

(e)

Seca com ar

comprimido

170

A Figura 5.2 mostra os cromatogramas obtidos para os extratos

etanólicos das folhas utilizando o método de extração 1 e 2, após tratamento com

SPE.

FIGURA 5.2 -

Cromatograma de eluição gradiente da fração etanólica de folhas de

K. ivorensis não sintomáticas ao fungo B. rhodina após tratamento por

extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN).

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

mAU

100

150

200

250

300

350

400

mAU

100

150

200

250

300

350

400

216 nm

Fdvm

Método 1

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

mAU

-50

100

150

200

250

300

350

400

mAU

-50

100

150

200

250

300

350

400

216 nm

FDSMb

Método 2

171

O objetivo inicial destas análises era verificar qual o método de

extração seria o mais eficiente, o envolvendo ultra-som para a extração das

amostras ou empregando a agitação mecânica. Foi observado que ambos tiveram

o mesmo rendimento e também apresentaram o mesmo perfil cromatográfico. Assim

por praticidade, optou-se por trabalhar com o método de Extração 2, fazendo uso da

extração por ultra-som.

Definido o método de extração, passou-se a analisar o melhor solvente

para a mesma. Foram testados diferentes solventes: acetato de etila,

metanol/acetonitrila (1:1), metanol e etanol. Também foi realizada uma análise

exploratória dos extratos das folhas (Figura 5.3). Os cromatogramas foram obtidos

por cromatografia líquida, nas mesmas condições citadas anteriormente. O gradiente

exploratório foi realizado com uma fase móvel constituída de água (H

O) e

ACN:MeOH (1:1), variando a porcentagem da fase orgânica de 20 à 100 % em 60

minutos, numa vazão de 1,0 mL/min. Analisando estes cromatogramas, pode-se

observar que o etanol teve uma melhor interação com os componentes presentes no

extrato vegetal de folhas. Devido à melhor eficiência de extração do etanol e

também por este ser considerado um solvente menos tóxico ao meio ambiente,

optou-se por utilizá-lo como solvente nas extrações.

FIGURA 5.3 -

Cromatograma de eluição gradiente da fração de folhas de K.

ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina, após tratamento por

extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN).

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

mAU

100

200

300

400

500

600

mAU

100

200

300

400

500

600

217 nm

K2E-1met20

Etanol

172

FIGURA 5.3

– Continuação do cromatograma de eluição gradiente da fração de

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina, após

tratamento por extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN).

Escolhido o método de extração, passou-se a analisar o método de

pré-tratamento das amostras. Primeiramente foi analisado por CLAE se a

utilização dos cartuchos de extração em fase sólida (CN) era eficiente nas

análises, ou seja, se estes estavam retendo satisfatoriamente os interferentes das

amostras. A condição cromatográfica utilizada foi a mesma citada anteriormente.

Notou-se, por meio dos cromatogramas representados na Figura 5.4 que a

remoção dos interferentes não foi significativa a ponto de se fazer necessário a

utilização destes cartuchos no pré-tratamento das amostras. Além disso, como o

Minut es

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

mAU

-100

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mAU

-100

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

216 nm

FDAct

Acetato de etila

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

mAU

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mAU

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

217 nm

K1M_3M

Metanol

173

objetivo era analisar o perfil químico da planta sintomática e não sintomática ao

fungo, seria melhor garantir que nenhum analito de interesse fosse perdido ao

longo deste procedimento.

FIGURA 5.4 -

Cromatograma de eluição gradiente da fração de folhas de K.

ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina: (a) após tratamento por

extração em fase sólida (Varian



- Bond-eluit –CN) e (b) sem

tratamento.

Outros métodos de pré-tratamento também foram testados, como a

filtração, centrifugação, extração líquido-líquido, mas estes não forneceram

seletividade às análises. Assim, novos testes foram feitos, investigando-se o pré-

tratamento e outras possíveis combinações entre solventes orgânicos e água para

constituir a fase móvel de análise no sistema cromatográfico. Mas novamente a

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

mAU

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mAU

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

217 nm

FDMH-met20

(a) Com SPE

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

mAU

100

200

300

400

500

600

mAU

100

200

300

400

500

600

217 nm

K2E-1met20

(b) Sem SPE

174

seletividade não foi alcançada. Outra informação obtida dos cromatogramas dos

tecidos sintomáticos e não sintomáticos (folhas, cerne e casca do cerne), foi que

eles não apresentaram nenhuma diferença que indicassem uma transformação

química nos metabólitos destes tecidos.

Optou-se assim, por fazer o estudo do perfil químico empregando a

técnica CL-EM/EM. Esta técnica utiliza a eficiência das colunas cromatográficas na

separação de substâncias complexas com a elevada capacidade de identificação

destas pelo espectrômetro de massas. O uso desta técnica foi uma alternativa para

obtenção de informações estruturais sobre os compostos presentes nos

cromatogramas fingerprinting obtidos das espécies de Khaya ivorensis não

sintomática e sintomática ao Botryosphaeria rhodina. Foi necessário ajustar as

condições cromatográficas para a obtenção dos cromatogramas com melhor

seletividade.

Segundo WOLFENDER et al., 1998 uma rápida detecção e

caracterização de produtos naturais constituem uma importante tarefa quando se

trabalha com compostos vegetais. Isto se deve ao fato que os extratos vegetais

podem apresentar muitos compostos químicos. Além do mais, a obtenção de

informações estruturais sobre estes compostos em estágios iniciais do processo de

isolamento é uma estratégia que permite guiar este procedimento de modo seletivo

e eficiente. Entretanto, segundo estes pesquisadores, devido à numerosa

diversidade e variabilidade química presente nestes extratos, podem surgir diversos

problemas de detecção e consequentemente caracterização destes constituintes.

Embora existam inúmeros detectores disponíveis no mercado

(infravermelho, ultravioleta, espalhamento de luz, fluorescência, espectrômetro de

massas), a maioria destes não permite uma detecção de todos os metabólitos

secundários presentes nos extratos vegetais.

Desta maneira, o espectrômetro de massas surge como uma excelente

ferramenta analítica, uma vez que ele permite a detecção da massa molecular da

grande maioria dos compostos químicos presentes no extrato vegetal. Além disso,

importantes informações estruturais podem ser obtidas quando estas análises são

realizadas por espectrometria de massas tandem (EM/EM)

Essas análises foram iniciadas testando os métodos extração 3 e 4,

mostrados a seguir, com objetivo de certificar-se da eficiência da extração para a

análise por CL-EM/EM.

175

Extração 3:

a) pesou-se separadamente 50 mg dos materiais vegetais (cerne,

casca do cerne e folhas) de K. ivorensis sintomática e não sintomática ao B. rhodina

b) estes foram extraídos com 2mL de H

O:ACN por 10 minutos em

ultra-som, seguidos de filtração em um funil analítico com o auxílio de papel filtro

(INLAB tipo 10, porosidade 3,0µm).

c) repetiu-se a etapa b, mais uma vez, obtendo-se no final 4 mL de

cada filtrado aquoso.

d) adicionou-se 2mL de clorofórmio ao filtrado e centrifugou-se por 10

minutos.

e) a parte aquosa foi separada da fase orgânica e ambas foram secas

no evaporador de solventes a vácuo (SPEEDVAC) (43

C/2 horas), o esquema da

extração pode ser observado na Figura 5.5 e a quantidade de extrato obtido foi

relatado na Tabela 5.1.

Figura 5.5 –

Esquema da extração 3

Tabela 5.1 -

Extratos aquoso e clorofórmico obtidos dos materiais vegetais (cerne,

casca do cerne e folhas) de K. ivorensis sintomática e não sintomática

ao B. rhodina

Sintomáticas Não-sintomáticas

Extratos aquoso

Parte Vegetal

Cerne Casca

do cerne

Folhas Cerne Casca

do cerne

Folhas

Massa (mg)

4,8 12,0 12,8 2,6 11,7 13,4

Extratos clorofórmico

Parte Vegetal

Cerne Casca

do cerne

Folhas Cerne Casca

do cerne

Folhas

Massa (mg)

1,3 2,2 2,6 1,2 2,1 2,9

Extrato vegetal

50mg

O:ACN

(2mL)

Ultra-som 10min

Clorofórmio

(4mL)

aquoso clorofórmio

Extrato vegetal

50mg

O:ACN

(2mL)

Ultra-som 10min

Clorofórmio

(4mL)

aquoso clorofórmio

176

f) posteriormente estes foram reconstituídos em MeOH e analisados

por CL/UV/EM. Os cromatogramas dos íons totais (TIC) juntamente com os

espectros de massas foram obtidos no modo positivo, como pode-se observar nas

Figuras 5.6 a 5.7.

As separações cromatográficas por CL/UV/EM foram realizadas em

coluna C

Phenomenex® luna (10µm) de 150 x 4,6mm, com uma pré-coluna C

Phenomenex® (4 x 3mm, 10µm) acoplada, método gradiente, fase móvel

água:metanol (10-100%) com pressão do sistema mantida entre 50- 70bar. A coluna

foi mantida à temperatura de 40

C, e uma válvula de desvio de fluxo da coluna foi

empregada para desviar o eluente a fim que entrasse somente uma vazão de

0,3mL/min da amostra no aparelho, com um tempo total de corrida 30 minutos. A

temperatura do auto-injetor foi mantida em 10

C com volume de injeção de 40µL.

Outras condições de análises CL/MS foram: probe de electrospray

positivo, potencial do capilar = 3,60 kvolts, potencial do cone = 36 volts, potencial do

cone extrator = 5 volts, lentes RF = 0,70 volts, temperatura de dessolvatação =

300

C, temperatura do bloco da fonte= 70

C, fluxo do gás de nebulização = 58

litros/hora e fluxo do gás de dessolvatação = 822 litros/hora.

177

Extração 3: fase orgânica de clorofórmio:

Folhas não-sintomática

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FSA_A1_pos 1: Scan ES+

TIC

3.41e9

30.84

28.88

26.72

34.53

33.45

38.45

40.57

Figura 5.6 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmico das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao

fungo B. rhodina.

Folhas sintomática

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FDA_A2_pos 1: Scan ES+

TIC

3.80e9

30.82

28.86

34.52

33.28

35.89

42.19

40.31

38.76

Figura 5.7 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina.

178

Figura 5.6a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmico

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.7a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FSA_A1_pos 574 (14.744) Cm (390:590) 1: Scan ES+

6.61e5

150

153

224

172

165

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

329

421

381

395

527

461

455

487

501

567

561

593

607

633

FSA_A1_pos 370 (9.512) Cm (189:384) 1: Scan ES+

5.76e5

150

153

224

156

178

181

203

275

269

235

309

277

315

415

349

375

381

521

487

455

421

587

527

547

FSA_A1_pos 120 (3.102) Cm (6:201) 1: Scan ES+

5.10e5

150

224

153

166

181

203

217 269

229

243

365

309

277

343

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDA_A2_pos 583 (14.976) Cm (387:583) 1: Scan ES+

6.64e5

150

151

153

224

172

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

323

421

381

415

527

461

455

501

495

561

555

567

587

607

FDA_A2_pos 383 (9.846) Cm (193:389) 1: Scan ES+

6.03e5

150

151

153

224

178

165

203

217

275

269

235

309

277

315

415

349

375

381

455

421

521

487

481

494

527

547

587

FDA_A2_pos 120 (3.102) Cm (4:197) 1: Scan ES+

5.46e5

150

151

224

153

167

203

181

365

269

229

243

277

309

343

321

:1 - 5 min

: 5 - 10 min

: 10 - 15min

179

Figura 5.6b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.7b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FSA_A1_pos 967 (24.838) Cm (871:968) 1: Scan ES+

1.34e6

183

150

172

153

183

241

201

223

299

281

249

259

279

289

321

317

357

329

379

565

535

437

387

415

477

472

485

495

543

582

598

686

642

626

623

684

658

700

728

731

FSA_A1_pos 793 (20.367) Cm (775:875) 1: Scan ES+

9.74e5

183

150

172

153

183

249

241

209

201

223

289

279

259

471

299

309

329

379

355

387

437

427

445

539

535

485

493

543

633

561

583

601

618

641

747

739

699

689

707

FSA_A1_pos 752 (19.314) Cm (584:779) 1: Scan ES+

6.90e5

150

183

172

153

167

249

209

201

224

241

289

267

275

355

315

299

329

347

395

387

379

539

501

461

453

435421

475

535

541

555

575

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDA_A2_pos 970 (24.917) Cm (871:970) 1: Scan ES+

1.40e6

183

150

151

172

153

183

241

201

223

281

249

259

299

289

357

321

307

329

379

598

581

535

477

437

387

415

445

485

495

543

566

641

626

686

681

699

727

739

FDA_A2_pos 792 (20.342) Cm (780:872) 1: Scan ES+

9.68e5

183

150

151

172

153

183

249

241

209

201

223

233

471

289

279

259

299

321

325

379

347

437

387

427

445

539

535

477

485

517 633

543

561

583

591

601

641

739

699

681

673

731

747

FDA_A2_pos 752 (19.315) Cm (577:783) 1: Scan ES+

6.78e5

150

151

183

172

153

167

183

249

209

201

224

241

289

275

267

315

299

355

329

347

395

387

365

539

527

475

461

453

501

541

581555

633

587

641

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

180

Figura 5.6c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.7c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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2.09e7

534

518

183

150

299

534

576

534

556

618

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3.87e6

566

550

183

150

172

301

299

241

197

201

229

281

259

534

357

321

339

359

437

379

415

532

495

477

517

594

566

592

590

636

608

634

650

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1.72e6

183

150

172

157

183

566

299

241

201

223

259

281

357

321

307

347

415

379

387

407

550

437

427

535

477

445

495

517

626

582

610

608

668

654

652

696

692

732

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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2.40e7

534

518

183

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534

556

618

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4.67e6

566

550

534

183

150

172

301

241

197

201

299

281

259

357

321

339

532

437

379

415

495

477

517

548

594

566

592

588

636

608

634

650

FDA_A2_pos 1070 (27.494) Cm (973:1070) 1: Scan ES+

1.81e6

183

150

172

157

183

566

241

201

223

299

259

281

357

317

321

347

415

379

369

387

413

550

437

427

535

477

445

495 505

582 626

610

598

668

654

652

696

691

731

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

181

Figura 5.6d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.7d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FSA_A1_pos 1688 (43.431) Cm (1550:1751) 1: Scan ES+

2.74e6

185

172

171

157

185

239

225

217

199

239

413

283

269

261

327

284

293

371

337

357

382

391

479

415

435

449

465

523

489

503

533

577

547

676

621

587

601

666

631

719

690

729

744

FSA_A1_pos 1495 (38.454) Cm (1461:1554) 1: Scan ES+

2.89e6

185

172

171

150

157

185

413

239

225

217

199

239

283

269

261

327

293

307

371

337

351

382

391

415

479

435

449

465

523

493

503

533

577

547

666

631

621

591

645

676

719

690

743

FSA_A1_pos 1378 (35.436) Cm (1357:1458) 1: Scan ES+

3.60e6

413

185

172

171

157

185

239

199

217

225

284

269

243

327

287

301

381

371

337 394

415

486

442

435

470

449

533

523

493

666

547

577

551

591

631

621

646

680

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDA_A2_pos 1686 (43.406) Cm (1551:1743) 1: Scan ES+

2.95e6

185

172

150

157

185

239

185

225

217

199

239

413

283

269

261

327

284

293

317

371

337

357

381

391

479

415

435

449

465

523

489

503

533

577

547

675

631

621

587

666

645

719

680

730

744

FDA_A2_pos 1468 (37.779) Cm (1461:1555) 1: Scan ES+

3.13e6

185

172

150

157

185

413

239

225

217

199

213

239

283

261

269

284

327

293

307

371

337

351

381

391

415

479

435

449

465

523

493

503

533

577

547

666

622

600

631

645

675

719

690

729

744

FDA_A2_pos 1342 (34.523) Cm (1268:1362) 1: Scan ES+

1.22e7

413

394

185

171

150

382

239

217

199

284

269

353

301

327

415

500

446

444

482

516

534

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

182

Cerne não-sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CSA_A3_pos 1: Scan ES+

TIC

4.04e9

34.50

30.81

29.60

33.44

39.20

Figura 5.8 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio do cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina.

Cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CDA_A4_pos 1: Scan ES+

TIC

3.82e9

34.52

30.81

29.42

18.85

37.93

39.43

42.19

Figura 5.9 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio do cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina.

183

Figura 5.8a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.9a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CSA_A3_pos 566 (14.541) Cm (389:579) 1: Scan ES+

6.80e5

150

151

153

224

172

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

421

381

415

527

461

455

495

487

501

567

561

593

601

633

CSA_A3_pos 380 (9.769) Cm (195:388) 1: Scan ES+

6.11e5

150

151

153

224

178

165

203

217

275

269

235

309

277

315

415

349

375

381

487

455

421

481

521

515

587

547

CSA_A3_pos 119 (3.077) Cm (1:192) 1: Scan ES+

5.80e5

150

151

224

153

166

203

178

215

365

269

229

243

309

277

343

:1 - 5 min

: 5 - 10 min

: 10 - 15min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDA_A4_pos 575 (14.771) Cm (393:585) 1: Scan ES+

6.77e5

150

151

153

224

172

165

209

183

249

235

315

275

269

289

355

349

329

421

381

415

461

455

527

487

501

567

561

593

601

633

CDA_A4_pos 390 (10.026) Cm (193:390) 1: Scan ES+

6.02e5

150

151

224

153

165

178

181

203

275

269

235

309

277

315

415

349

381

375

521487

455

421

481

494

587

547

CDA_A4_pos 119 (3.076) Cm (2:195) 1: Scan ES+

5.26e5

150

151

224

153

203

167

181

215

366

269

229

243

309

277

343

:1 - 5 min

: 5 - 10 min

: 10 - 15min

184

Figura 5.8b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.9b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CSA_A3_pos 969 (24.892) Cm (877:972) 1: Scan ES+

1.44e6

183

150

172

153

183

241

201

223

299

249

259

289

281

277

357

321

307

329

379

437

387

415

477

445

535

485

495

543

559

575

583

641

CSA_A3_pos 844 (21.680) Cm (779:876) 1: Scan ES+

9.78e5

183

150

151

172

153

183

249

241

209

201

223

289

281

259

299

605

329

307

583

379

355

539

535

387

485

477

445

437

503

543

575

643

607

668

739

683

699

712

743

CSA_A3_pos 736 (18.904) Cm (584:778) 1: Scan ES+

6.74e5

150

151

183

172

153

167

183

249

209

201

224

241

289

275

267

315

299

355

329

339

608

541

395

387

501

461

453

445

485

535

543

581

567

637

623

667

641

739

699

684

715

747

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDA_A4_pos 971 (24.944) Cm (878:973) 1: Scan ES+

1.43e6

183

150

151

172

161

183

241

201

223

299

249

259

289

281

357

321

307

329

565

379

437

415

387

477

445

543

535

485

495

567

583

643

641

609

665

691 731

CDA_A4_pos 842 (21.629) Cm (775:877) 1: Scan ES+

8.91e5

183

150

151

172

153

183

249

241

209

201

223

539

249

289

281

259

299

329

307

355

485

379

477

387

437

517

495

643

611

583

543

561

605

633

682

667

747

707

739

CDA_A4_pos 734 (18.853) Cm (584:777) 1: Scan ES+

6.58e5

150

151

183

172

153

183

249

209

201

224

241

541

539

289

275

259

315

299

355

329

347

501

395

387

461

453

493

519

581

579

551

607

601

637

609

639

667

699

689

715 739

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

185

Figura 5.8c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.9c –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CSA_A3_pos 1199 (30.809) Cm (1167:1264) 1: Scan ES+

6.19e6

534

183

150

518

299

241

197

211

225

259

284

357

315

317

413

369

384

516

415

495

476

437

465

534

576

556

CSA_A3_pos 1152 (29.599) Cm (1071:1170) 1: Scan ES+

1.89e6

183

150

172

171

183

301

241

197

201

217

299

281

259

261

289

534

357

317

321

339

495

437

415

379

359

393

477

465

505

531

550

535

594

552

566

575

636

633

611

691

651

673

731

749

CSA_A3_pos 1070 (27.488) Cm (975:1070) 1: Scan ES+

1.90e6

183

150

172

157

183

241

201

223

209

299

259

281

357

317

321

339

415

379

369

387

408

437

419

526

477

445

462

495

517

535

570

567

593

633

611

686

641

681

691

731

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDA_A4_pos 1343 (34.524) Cm (1261:1359) 1: Scan ES+

1.34e7

413

394

172

150

185

382

353

239

199

225

284

301

415

445

444

CDA_A4_pos 1199 (30.809) Cm (1165:1265) 1: Scan ES+

3.73e6

534

150

183

518

299

241

197

211

225

259

269

413

357

315

317

369

384

516

495

465

437

435

458

476

534

576

556

593

CDA_A4_pos 1036 (26.615) Cm (973:1071) 1: Scan ES+

1.80e6

183

150

172

171

183

526

241

201

223

209

299

259

281

357

317

307

321

339

415

379

369

387

437

427

477

445

467

495

517

526

570

535

593

633

612

691

641

673

731

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

186

Figura 5.8d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.9d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio do

cerne de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo de

retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CSA_A3_pos 1686 (43.383) Cm (1554:1750) 1: Scan ES+

2.99e6

185

172

150

157

185

239

225

217

199

239

413

283

269

261

327

284

293

371

337

351

382

391

415

479

435

449

465

523

489

503

533

577

547

676

666

631

621

587

645

719

680

729

743

CSA_A3_pos 1524 (39.200) Cm (1458:1550) 1: Scan ES+

3.00e6

185

172

171

157

185

413

185

239

225

217

199

239

283

261

269

327

293

307

371

337

351

381

391

415

479

435

449

465

523

493

503

533

577

547

666

600

616

622

645

680

686

719

744

CSA_A3_pos 1342 (34.500) Cm (1267:1361) 1: Scan ES+

1.39e7

413

394

185

172

353

239

217

199

284

301

382

415

445

500

516

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDA_A4_pos 1688 (43.430) Cm (1559:1748) 1: Scan ES+

2.89e6

185

172

171

157

185

239

185

225

199

217

239

413

283

269

243

327

284

293

371

337

357

381

391

415

479

435

449

465

533

523

489

577

547

567

675

666

631

621

587

645

719

680

729

744

CDA_A4_pos 1475 (37.933) Cm (1456:1553) 1: Scan ES+

2.92e6

185

172

150

157

413

185

239

199

225

239

283

243

253

327

284

293

301

371

337

351

381

391

415

479

435

449

463

523

493

503

666

533

600

547

577

615

621

645

680

743

729

690

719

CDA_A4_pos 1364 (35.067) Cm (1364:1460) 1: Scan ES+

4.17e6

413

185

172

150

157

239

199

225

283

243

273

327

287

307

371

361

382

394

415

442

435

666

479

449

523

493

516

533

547

577

616

586

645632

737

680

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

187

Casca do cerne não-sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CcSA_A5_pos 1: Scan ES+

TIC

4.22e9

34.49

30.82

28.90

27.98

25.21

22.61

19.29

20.81

33.19

35.89

40.51

38.70

Figura 5.10 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático

ao fungo B. rhodina.

Casca do cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CcDA_A6_pos 1: Scan ES+

TIC

3.81e9

34.51

33.42

30.82

29.58

27.93

19.27

39.00

Figura 5.11 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato clorofórmio da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina.

188

Figura 5.10a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.11a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSA_A5_pos 568 (14.592) Cm (393:586) 1: Scan ES+

6.70e5

150

151

153

224

172

165

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

329

555

421

381

375

415

461

455

527

487

501

535

587

557

589

635

603

679

CcSA_A5_pos 385 (9.897) Cm (196:389) 1: Scan ES+

5.85e5

150

151

224

153

165

178

203

275

269

235

309

277

415

315

349

381

375

455

447

487

481

521

494

587

547

553

CcSA_A5_pos 120 (3.103) Cm (2:197) 1: Scan ES+

5.15e5

150

151

224

166

203

181

365

269

229

243

309

277

343

:1 - 5 min

: 5 - 10 min

: 10 - 15min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDA_A6_pos 566 (14.541) Cm (390:582) 1: Scan ES+

6.84e5

150

151

153

224

172

165

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

557

421

381

415

527

461

455

487

495

555

587

567

589

607

633

CcDA_A6_pos 377 (9.693) Cm (193:386) 1: Scan ES+

6.10e5

150

151

224

153

165

178

181

203

275

269

235

309

277

415

315

375

349

381

487

455

421

481

521

515

587

547

553

593

CcDA_A6_pos 119 (3.076) Cm (2:197) 1: Scan ES+

5.26e5

150

151

224

166

203

181

365

269

229

243

277

309

343

:1 - 5 min

: 5 - 10 min

: 10 - 15min

189

Figura 5.10b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo

B.rhodina com tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.11b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSA_A5_pos 880 (22.613) Cm (875:973) 1: Scan ES+

1.38e6

183

150

172

161

565

183

565

281

241

201

223

249

259

267

299

289

357

321

307

347

543

379

477

437

387

409

445

525

485

524

564

567

644

581

583

641

626

686

665

734

701

707

739

CcSA_A5_pos 842 (21.635) Cm (781:874) 1: Scan ES+

1.38e6

644

611

183

150

172

153

583

183

539

249

241

209

201

525

289

279

259

299

329

517

379

355

485

437

387

477

445

540

551

561

585

601

612

627

644

683

659

676

733

691

720

739

CcSA_A5_pos 751 (19.293) Cm (587:780) 1: Scan ES+

6.56e5

539

150

539

151

183

172

153

167

183

249

209

201

224

241

289

275

267

355

315

299

329

347

501

395

387

357

461

453

421

485

519

541

561 581

571

691

659

613

588

633

678

707

731

739

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDA_A6_pos 969 (24.896) Cm (877:974) 1: Scan ES+

1.44e6

183

150

151

161

183

241

201

223

299

249

281

259

267

565

357

321

307

329

379

437

387

415

477

445

543

535

495

525

563

567

644

583

641

625

665

685

731

699

739

CcDA_A6_pos 841 (21.605) Cm (780:876) 1: Scan ES+

9.40e5

183

150

151

172

153

183

611

249

241

209

201

223

539

289

281

259

299

329

307

379

355

485

437

387

427

477

445

535

525

583

551

561

601

644

633

683

659

692

739

719

747

CcDA_A6_pos 750 (19.267) Cm (581:781) 1: Scan ES+

6.72e5

150

151

183

172

153

167

183

539

249

209

201

224

241

289

275

267

315

299

355

329

501

395

387

357

461

453

421

485

519

541

581

555

659

601

614

633

691

681

707

731

739

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

190

Figura 5.10c –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.11c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

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100

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496

299

241

197

211

414

357

534

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534

556

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550

183

150

172

534

301

241

197

201

299

281

259

357

317

321

532

495

437

359

379

415

393

477

455

510

550

552

566

594

592

590

608

636

610

615

652

717

692

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1.66e6

183

150

172

157

183

566

241

201

223

299

259

281

416

357

321

307

347

379

387

413

550

526

437

427

493

477

461

445

495

686

570

625

612

582

608

628

668

652

717

707

725

739

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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197

211

217

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281

414

357

315

317

349

370

384

400

532

518

415

496

444

465

475

534

576

534

556

618

603

593

676

644

661

692

719

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171

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299

241

197

201

229

259

281

269

289

550

357

317

321

339

548

534

415

379

360

397

437

495

477

465

505

552

566

593

591

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636

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691

651

673

731

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1.83e6

183

150

151

157

183

241

201

223

209

299

259

281

277

357

321

307

339

416

379

369

387

437

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566

477

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455

535

495

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563

568

593

612

626

633

686

691

:25 – 27,5 min

:27,5 - 30 min

:32,5 - 35min

191

Figura 5.10d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina com tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.11d –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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171

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239

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337

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459

533

523

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547

567

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631

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587

646

719

680

729

743

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4.36e6

413

185

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371

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523

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577

598

632

645

680

730

737

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1.47e7

413

394

172

150

185

239

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353

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516

500

446

444

482

480

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDA_A6_pos 1688 (43.439) Cm (1558:1748) 1: Scan ES+

2.99e6

185

172

150

157

185

239

185

225

199

239

413

283

269

253

327

285

293

317

371

337

347

381

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

666

632

622

587

645

720

680

729

744

CcDA_A6_pos 1362 (35.024) Cm (1362:1456) 1: Scan ES+

4.60e6

413

185

172

150

157

239

225

199

283

243

269

327

301

371

361

382

394

415

479

442

435

449

666

533

523

493

547 577

631

591

621

645

732

680

737

CcDA_A6_pos 1342 (34.507) Cm (1265:1361) 1: Scan ES+

1.41e7

414

394

172

150

185

239

225

199

382353

301

283

415

446

444

:35 – 37,5 min

:37,5 - 40 min

:40 - 45min

192

Extração 3: fase aquosa

Folhas não-sintomáticas

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FSAA_A8_pos 1: Scan ES+

TIC

3.76e9

34.52

29.62

39.19

Figura 5.12 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso das folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo

B. rhodina.

Folhas sintomáticas

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FDAA_A7_pos 1: Scan ES+

TIC

3.83e9

34.54

29.64

Figura 5.13 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina.

193

Figura 5.12a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso das

folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.13a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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6.50e5

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153

224

172

165

209

183

217

249

235

315

275

269

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355

349

323

421

381

415

527

455

447

461

487

495

567

561

593

607

633

FSAA_A8_pos 383 (9.847) Cm (197:388) 1: Scan ES+

5.71e5

150

224

153

165

181

203

217

275

269

235

309

277

415

315

375

349

381

455

447

521

487

481

494

587

547

553

FSAA_A8_pos 118 (3.052) Cm (3:194) 1: Scan ES+

5.19e5

150

151

224

166

203

181

217

365

269

229

243

309

277

343

315

415

375

449

487 547

515

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDAA_A7_pos 584 (15.003) Cm (385:585) 1: Scan ES+

7.02e5

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151

153

224

172

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183

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275

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355

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323

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381

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415

527

461

455

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521

567

561

593

633

601

673

FDAA_A7_pos 389 (10.000) Cm (196:391) 1: Scan ES+

6.32e5

150

151

224

153

166

181

203

275

269

235

309

277

315

415

349

381

375

455

421

521

487

481

515

547

587

FDAA_A7_pos 117 (3.025) Cm (2:199) 1: Scan ES+

6.14e5

150

151

224

166

203

181

217

269

229

243

365

309

277

343

515

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

194

Figura 5.12b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso das

folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30min.

Figura 5.13b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FSAA_A8_pos 1153 (29.621) Cm (969:1165) 1: Scan ES+

1.86e6

183

150

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171

183

241

201

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259

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359

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535

505

593

575

553

633

603

691

641

673

731

FSAA_A8_pos 970 (24.915) Cm (779:972) 1: Scan ES+

1.24e6

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150

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209

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379

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477

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485

535

495

543

633

583

575

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641

731

699

691

739

FSAA_A8_pos 776 (19.931) Cm (586:777) 1: Scan ES+

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150

151

183

172

153

165

249

209

201

224

217

241

289

275

259

355

315

299

329

347

395

387

369

461

453

445

421

501

485

535

527

543

567

581

601

:15-20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDAA_A7_pos 1154 (29.644) Cm (969:1170) 1: Scan ES+

1.83e6

183

150

172

171

183

241

201

223

299

259

281

289

301

357

317

321

339

437

415

379

360

397

535

477

445

465

495

505

593

575

553

633

603

691

641

673

731

FDAA_A7_pos 972 (24.966) Cm (779:972) 1: Scan ES+

1.17e6

183

150

151

172

153

183

241

201

209

223

249

299

289

259

357

321

307

329

379

437

387

415

477

445

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485

495

543

633

583

575

593

641

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150

151

183

172

153

249

209

201

224

217

241

289

275

259

355315

299

329

347

395

387

357

501

461

453

435

421

485 527

535

551

567

581

:15-20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

195

Figura 5.12c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso das

folhas de K. ivorensis não-sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 45min.

Figura 5.13c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato clorofórmio

das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 45min.

amostra_Ka

m/z

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100

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2.89e6

185

172

171

157

185

239

225

199

217

239

414

283

269

253

327

285

293

307

371

337

347

382

392

479

415

435

425

449

465

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523

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547

567

675

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621

587

666

645

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680

729

744

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3.68e6

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185

239

225

199

283

269

243

327

284

293

307

371

337

368

382

392

415

479

435

449

463

533

523

489

666

577

547

561

631

622

591

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283

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382

357

301

327

354

444

446

533

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDAA_A7_pos 1688 (43.413) Cm (1559:1754) 1: Scan ES+

2.89e6

185

172

171

157

185

239

225

199

217

239

414

283

269

253

327

285

293

307

371

337

347

382

392

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

680

729

744

FDAA_A7_pos 1361 (34.978) Cm (1360:1556) 1: Scan ES+

3.68e6

414

185

172

150

157

185

239

225

199

283

269

243

327

284

293

307

371

337

368

382

392

415

479

435

449

463

533

523

489

666

577

547

561

631

622

591

646

680

729

719

690

744

FDAA_A7_pos 1344 (34.539) Cm (1169:1359) 1: Scan ES+

7.44e6

414

150

172

394

185

239

225

211

299

241

283

269

382

357

301

327

354

444

446

533

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

196

Cerne não-sintomático

Time

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100

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TIC

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33.40

29.59

3.05

Figura 5.14 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B.

rhodina.

Cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

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TIC

3.78e9

34.51

29.64

3.05

37.33

40.92

Figura 5.15 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B.

rhodina.

197

Figura 5.14a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.15a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 1 a 15 min.

amostra_Ka

m/z

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100

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6.60e5

150

151

153

224

172

156

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

329

421

381

415

527

461

455

487

501

567

561

593

607

CSAA_A12_pos 378 (9.716) Cm (196:386) 1: Scan ES+

5.93e5

150

151

224

153

166 178

203

217

269

235

261

275

309

415

315

349

355

375

455

421

487

481

521

494

587

547

553

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5.18e5

150

151

365

224

203

153

166

181

217 269

229

251

309

277

343

381

527

515

415

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

amostra_Ka

m/z

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100

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150

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209

183

315

249

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275

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289

355

349

329

527

421

381

415

461

455

487

501

567

561

593

607

633

CDAA_A9_pos 385 (9.898) Cm (198:390) 1: Scan ES+

5.83e5

150

151

224

153

165

178

181

203

275

269

235

309

277

315

415

349 375

381

487455

447

481

521

515

547 587

553

CDAA_A9_pos 118 (3.051) Cm (2:197) 1: Scan ES+

5.23e5

150

151

365

203

153

166

175

224

217

269

249

229

281

309

343

527

381

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

198

Figura 5.14b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30min.

Figura 5.15b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 15 a 30 min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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183

150

172

171

183

299

241

201

223

259

281

301

357

317

321

339 437

415

379

360

397

535

477

465

445

495

505

525

593

575

553

633

603

691

651

661

731

CDAA_A9_pos 966 (24.812) Cm (781:975) 1: Scan ES+

1.28e6

183

150

151

172

153

183

241

201

223

249

299

289

259

357

321

307

329

379

437

387

415

477

445

485

535

495

543

575

583

633

593

641

CDAA_A9_pos 756 (19.418) Cm (583:780) 1: Scan ES+

6.82e5

150

151

183

172

153

167

183

249

209

201

224

223

241

289

275

259

355315

299

329

347

395

387

357

541

461

453

421

501

493

535

543

581

633

609

601

641

:15-20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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1.86e6

183

150

172

171

183

241

201

223

299

259

281

301

357

317

321

339

437

415

379

359

397

427

535

477

445

465

495

505

593

575

553

633

603

691

651

673

731

CSAA_A12_pos 973 (24.989) Cm (784:973) 1: Scan ES+

1.32e6

183

150

172

153

183

241

201

223

249

299

289

259

357

321

307

329

379

437

387

415

477

445

543

535

485

495

575

551

583

641

633

601

739

681

649

CSAA_A12_pos 779 (20.006) Cm (582:781) 1: Scan ES+

6.66e5

150

151

183

172

153

156

183

249

209

201

224

223

241

289

275

259

315

299

355

329

347

395

387

357

501

461

453

421

493

535

527

543

559

567

609

:15 - 20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

199

Figura 5.14c –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 45min.

Figura 5.15c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 30 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDAA_A9_pos 1687 (43.393) Cm (1557:1751) 1: Scan ES+

3.13e6

185

172

171

157

185

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225

199

217

239

413

283

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327

284

293

307

371

337

347

381

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

680

729

743

CDAA_A9_pos 1373 (35.288) Cm (1364:1552) 1: Scan ES+

3.72e6

413

185

172

171

157

185

239

225

199

239

283

269

243

327

284

293

307

371

337

351

382

391

415

479

435

449

463

533

523

489

666

577

547

561

621

591

601

632

645

680

719

689

743

CDAA_A9_pos 1343 (34.514) Cm (1177:1363) 1: Scan ES+

8.05e6

413

172

150

394

185

239

217

199

299

241

287

259

382

370

301

327

415

446

444

458

534

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CSAA_A12_pos 1688 (43.408) Cm (1559:1751) 1: Scan ES+

2.97e6

185

172

171

157

185

239

185

225

199

217

239

413

283

269

253

327

293

307

371

337

347

381

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

689

729

743

CSAA_A12_pos 1384 (35.568) Cm (1366:1550) 1: Scan ES+

3.61e6

413

185

172

171

157

185

239

225

199

283

269

243

327

284

293

307

371

337

351

381

391

415

479

435

449

459

533

523

489

666

577

547

561

621

591

601

631

645

675

743

719

689

CSAA_A12_pos 1343 (34.510) Cm (1174:1360) 1: Scan ES+

7.95e6

413

172

150

353

185

239

225

217

299

241

287

301

327

394

382

415

446

444

534

:30-35 min

:35 – 40 min

:40 – 45 min

200

Casca do cerne não-sintomático

Time

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TIC

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34.53

33.47

30.84

29.65

19.27

3.08

21.60

36.87

Figura 5.16 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao

fungo B. rhodina.

Casca do cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CcDM_A15_pos 1: Scan ES+

TIC

3.56e9

34.55

33.44

30.81

29.63

19.29

3.05

21.63

41.60

38.73

36.95

Figura 5.17 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato aquoso da casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao

fungo B. rhodina.

201

Figura 5.16a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.17a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

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172

156

209

183

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235

275

269

289

445

355

349

329

421

381

375

415

461

487

527

521

601

567

561

593

633

607

667

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156

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203

275

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415

315

349 381375

601455

421

521487

481

494

547 587

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224

166

203

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215

269

229

243

277

309

343 527382

515

415

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

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m/z

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156

209

183

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315

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235

275

269

289

355

349

421

381

415

435

461

601

527

487

501

567

561

593

733

605

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150

151

224153

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178

203

217

275

269

235

309

277

602

415

315

349

375

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455

421

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219

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248

269

362

309

343

367

527

381

441

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

202

Figura 5.16b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 30min.

Figura 5.17b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 30min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

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183

241

201

223

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281

301

357

317

321

339

437

379

359

415

397

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535

477

445

455

495

505

593

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633

612

686

651

673

691

731

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183

150

172

153

183

241

209

201

223

249

299

289

259

644

357

321

307

329

565

379

437

387

415

477

445

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485

535

495

583

611

641

665 683

691

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150

183

172

153

156

183

249

209

201

224

217

241

539

249

289

275

259

355

315

299

329

347

395

387

357

501

461

453

445

485

535

503

541

561

581

601

641

633

707

699

649

739

715

:15-20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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183

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201

223

299

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281

289

301

357

317

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437

415

379

359

397

491

477

465

445

535

495

550

593

566

633

612

691

651

673

731

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183

150

172

153

183

241

209

201

223

249

299

289

259

644

565

357

321

307

329

379

369

437

387

415

485

477

445

543

535

495

612

583

601

633

666

682

700

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150

539

183

172

153

183

249

209

201

224

241

249

289

275

259

315

299

355

329

339

455

395

387

357

445

421

501

485

461

519

541

581

561

617

601

639

641

707

699

657

739

731

747

:15-20 min

:20 - 25 min

:25 - 30min

203

Figura 5.16c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomática ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 30 a 35min.

Figura 5.17c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato aquoso da

casca do cerne de K. ivorensis sintomática ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 30 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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3.07e6

185

172

150

157

185

239

225

199

217

239

413

283

271269

327

284

293

371

337

347

382

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

685

699

729

743

CcSM_A16_pos 1383 (35.559) Cm (1362:1550) 1: Scan ES+

3.34e6

413

185

172

171

157

185

239

225

199

283

243

269

327

284

293

307

371

337

351

382

391

415

479

435

449

463

533

523

493

644

577

547

561

618

591

666

675

719

689

729

744

CcSM_A16_pos 1343 (34.526) Cm (1167:1363) 1: Scan ES+

7.41e6

413

172

150

185

299

239

225

211

241

259

283

382

353

301

327

357

384

415

534

445

444

642

576

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDM_A15_pos 1689 (43.458) Cm (1556:1751) 1: Scan ES+

3.00e6

185

172

150

157

185

239

225

199

217

239

413

283

269

253

327

284

293

317

371

337

347

381

391

640

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

631

621

587

675

666

730

720

690

743

CcDM_A15_pos 1366 (35.122) Cm (1366:1552) 1: Scan ES+

3.33e6

413

185

172

150

157

185

239

199

225

283

243

269

327

284

293

307

371

337

351

382

391

415

479

435

449

463

533

523

493

666

577

547

561

632

621

601

645

680

743729

719

689

CcDM_A15_pos 1344 (34.554) Cm (1169:1361) 1: Scan ES+

7.59e6

413

172

150

185

299

259

237

217

197

281

353

301

327

382

357

384

415

534

446

444

576

:30 - 35 min

:35 - 40 min

:40 - 45min

204

Extração 4:

a) pesou-se separadamente 50 mg dos materiais vegetais (cerne,

casca do cerne e folhas) de K. ivorensis sintomática e não sintomática ao B. rhodina

b) estes foram sonicados com 2mL de etanol por 10 minutos em ultra-

som e seguidos de filtração em um funil analítico com o auxílio de papel filtro.

d) repetiu-se a etapa b por mais duas vezes, obtendo-se no final 6 mL

de cada filtrado etanólico

e) os filtrados foram secos no evaporador de solventes à vacuo

(SPEEDVAC) (43

C/2 horas), de acordo com o esquema apresentado na figura 5.18

e a quantidade de extrato obtido foi relatada na tabela 5.2.

Figura 5.18 – Esquema para a extração 4.

Tabela 5.2 - Extratos etanólico obtidos dos materiais vegetais (cerne, casca do

cerne e folhas) de K. ivorensis sintomática e não sintomática ao B.

rhodina

Sintomáticas Não-sintomáticas

Parte Vegetal

Cerne Casca do

cerne

Folhas Cerne Casca do

cerne

Folhas

Massa (mg)

1,7 5,3 9,4 1,5 5,4 9,3

Estes extratos etanólicos foram tratados dissolvendo-os em 200 µL de

hexano, em seguida sendo agitados e aplicados num cartucho de extração em fase

sólida de 100 mg de ciano como fase estacionária, já previamente condicionado com

5 mL de hexano. O mesmo extrato é novamente lavado com mais 100 µL de hexano

e aplicado lentamente ao cartucho. Em seguida a amostra é lavada com 4 mL de

hexano permitindo que o cartucho seque no final. Mais uma vez o tubo é lavado,

porém, agora com 200 µL de MeOH e aplicado ao cartucho, onde se adiciona mais

1,0 mL de MeOH para as eluições das substâncias. Foi utilizada uma câmara à

vácuo acoplada a uma bomba de vácuo, trabalhando a uma pressão próxima a 70

mmHg onde os cartuchos eram introduzidos e o fluxo de lavagem e eluição mantido

Extrato vegetal

50mg

Etanol

(2mL)

Ultra-som 10min

3 vezes

Extrato vegetal

50mg

Etanol

(2mL)

Ultra-som 10min

3 vezes

205

constante. Estas frações metanólicas foram secas sob ar comprimido e reconstituída

em 500 µL de MeOH e analisadas por CL/EM, como mostram as Figura 5.19 a 5.24.

As separações cromatográficas por CL/UV/EM foram realizadas em

coluna C

Phenomenex® luna (10µm) de 150 x 4,6mm, com uma pré-coluna C

Phenomenex® (4 x 3mm, 10µm) acoplada, método gradiente, fase móvel

água:metanol (10-100%) com pressão do sistema mantida entre 50- 70bar. A coluna

foi mantida à temperatura de 40

C, e uma válvula de desvio de fluxo da coluna foi

empregada para desviar o eluente a fim que entrasse somente uma vazão de

0,3mL/min da amostra no EM, com um tempo total de corrida 30 minutos. A

temperatura do auto-injetor foi mantida em 10

C com volume de injeção de 40µL.

Outras condições de análises do CL/MS, como já mostradas

anteriormente, foram: probe de electrospray positivo, potencial do capilar = 3,60

kvolts, potencial do cone = 36 volts, potencial do cone extrator = 5 volts, lentes RF =

0,70 volts, temperatura de dessolvatação = 300

C, temperatura do bloco da fonte=

C, fluxo do gás de nebulização = 58 litros/hora e fluxo do gás de dessolvatação =

822 litros/hora.

206

Extração 4: extrato etanólico

Folhas não-sintomáticas

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FSN_A13_pos 1: Scan ES+

TIC

3.61e9

34.50

30.84

29.63

3.08

33.41

37.23

40.25

Figura 5.19 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico das folhas de K. ivorensis não - sintomático ao

fungo B. rhodina.

Folhas sintomáticas

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

FDN_A14_pos 1: Scan ES+

TIC

3.54e9

34.55

30.81

29.58

3.08

33.42

37.26

Figura 5.20 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico das folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B.

rhodina.

207

Figura 5.19a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.20a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FSN_A13_pos 583 (14.977) Cm (390:584) 1: Scan ES+

6.57e5

150

151

153

224

172

156

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

329

421

381

410

527

461

455

487

501

561

535

567

593

601

633

FSN_A13_pos 387 (9.949) Cm (193:389) 1: Scan ES+

5.97e5

150

151

224

153

166

178

203

217

275

269

235

309

277

315

415

349

375

381

487

455

421

481

521

515

587

547

553

FSN_A13_pos 119 (3.076) Cm (2:198) 1: Scan ES+

5.09e5

150

151

224

166

203

181

195

215

365

269

237

243

321

277

309

343

515

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

amostra_Ka

m/z

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153

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183

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487

495

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541

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593

601

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341

349 381

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455

421

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481

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587

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229

261

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291

343

515

415

527

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

208

Figura 5.19b – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.20b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

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249

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277

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307

329

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477

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535

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495

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583

575

593

625

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691

681

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739

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249

241

209

201

223

289

281

259

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329

307

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379

387

437

419

445

634

487

543

493

535

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601

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699

731

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315

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347

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387

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453

411

501

475

527

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541

561

649

707

699

681

739

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

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249

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307

329

379

369

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477

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485

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583

575

593

601

641

739

731

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249

241

209

201

223

471

289

281

259

299

329

307

379

355

437

387

395

445

633

487

543

493

535

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575

584

617

641

649

739

689

681

699

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6.47e5

150

151

183

172

153

183

249

209

201

224

223

241

289

275

267

355

315

299

329

347

539

395

387

369

411

453

445

501

461

475

511

633

541

561

620

581

641

699

681

679

739

707

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

209

Figura 5.19c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.20c –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

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357

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437

415

379

360

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505

531

535

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608

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691

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1.88e6

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150

172

171

183

241

201

223

209

299

259

281

357

321

307

339

437

415

379

369

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566

477

445

455

535

495

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654

593

633

626

668

691

731

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

amostra_Ka

m/z

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211

225

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556

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183

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301

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197

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223

299

259

281

289

550

357

317

321

339

534

437

415

379

360

397

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477

465

505

531

566

592

636

595

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673

731

FDN_A14_pos 1072 (27.540) Cm (973:1072) 1: Scan ES+

1.92e6

183

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183

241

201

223

209

299

259

281

357

321

307

339

566

415

379

370

397

437

427

477

445

465

535

495

517

550

593

575

626

609

633

654

668

691

732

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

210

Figura 5.19d –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis não - sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.20d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico das

folhas de K. ivorensis sintomáticas ao fungo B. rhodina com tempo

de retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

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337

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523

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577

547

567

675

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621

587

666

645

719

680

729

743

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185

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225

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327

284

307

371

337

351

382

391

415

479

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442

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533

523

486

547

577

621

591

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631

645

680

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1.44e7

413

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172

150

239

225

199

382

353

283

301

313

415

446

444

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

FDN_A14_pos 1687 (43.403) Cm (1552:1749) 1: Scan ES+

2.97e6

185

172

171

157

185

239

225

199

217

239

413

283

269

253

327

284

293

307

371

337

347

381

391

479

415

435

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533

523

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577

547

567

676

632

621

587

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719

689

700

729

744

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4.35e6

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243

269

327

285

307

371

337

351

381

392

415

486

479

435

442

534

523

493

666

547

577

561

621

591

601

631 645

680

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1.41e7

413

353

185

172

239

225

199

283

301

382

415

445

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

211

Cerne não-sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CSM_A18_pos 1: Scan ES+

TIC

3.72e9

34.57

30.83

29.65

3.08

Figura 5.21 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo

B. rhodina.

Cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CDM_A17_pos 1: Scan ES+

TIC

3.58e9

34.56

29.64

3.03

40.53

Figura 5.22 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B.

rhodina.

212

Figura 5.21a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.22a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo de

retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

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100

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6.08e5

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224

172

156

209

183

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249

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275

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289

355

349

329

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381

375

415

527

461

455

487

501

567

561

593

601

633

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5.29e5

150

224

153

165

178

203

275

269

235

309

277

415

315

349

355

375

409

455

447

487

481

521

494

587

547

553

593

621

CSM_A18_pos 119 (3.076) Cm (2:196) 1: Scan ES+

4.61e5

150

365

224

203

153

166

181

195

222

269

229

255

277

309

343

527

515

415

409

375

449

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

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m/z

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150

153

224

172

156

209

183

315

249

235

275

269

289

355

349

329

527

461

421

381

415

455

487

501

567

561

601

593

633

607

699

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5.09e5

150

224

153

165

181

203

275

269

235

309

277

315

415

375

349

381

455

447

487

481

521

515

547

587

555

593

621

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4.48e5

150

365

224

203

166

181

195

215

269

248

277

309

343

321

527

381

515

415

449

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

213

Figura 5.21b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.22b –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo de

retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

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100

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1.45e6

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150

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157

183

241

201

223

299

249

281

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321

307

329

379

369

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415

387

445

467

535

485

495

543

583

575

641

593

633

691

681

739

699

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1.00e6

183

150

151

172

153

183

249

241

209

201

223

289

281

259

299

329

321

379

355

543

485

387

437

435

419

477

445

535

503

583

551

641

601

633

649

739

699

689

681

731

CSM_A18_pos 753 (19.340) Cm (587:780) 1: Scan ES+

6.04e5

150

183

172

153

156

183

249

209

201

224

241

249

289

275

259

315

299

355

329

347

395

387

357

461

453

421

535

501

485

527

541

581

567

607

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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1.46e6

183

150

172

157

183

241

201

223

299

249

259

289

263

357

321

307

329

379

369

437

415

387

477

445

535

485

495

543

583

565

641

633

593

691

681

649

731

739

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9.82e5

183

150

172

153

183

249

241

209

201

223

249

289

281

259

299

329

307

379

357

355

437

387

427

419

485

477

445

543

535

503

583

551

612

641

633

644

CDM_A17_pos 750 (19.264) Cm (587:780) 1: Scan ES+

5.95e5

150

183

172

153

167

183

249

209

201

224

241

289

275

259

539

315

299

355

329

347

395

387

369

501

461

453

421

493

535

503

541

581

543

561

609

601

633

649

707

699

687

739

731

747

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

214

Figura 5.21c –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.22c – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo de

retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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1.73e6

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183

150

172

157

299

241

197

211

225

259

281

357

329

315

339

413

369

384

407

415

518

495

437

435

465

534

535

576

563

553

660

593

603

633

691

675

731

729

745

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1.93e6

183

150

172

171

183

301

241

197

201

229

299

259

281

289

357

321

339

437

415

379

359

397

550

535

495

477

465

505

594

552

633

603

617

691

651

673

731

CSM_A18_pos 1027 (26.379) Cm (976:1071) 1: Scan ES+

1.89e6

183

150

172

157

183

241

201

223

209

299

259

281

357

317

321

339

491

379

369

437

415

397

427

477

445

465

535

495

593

543

575

633

691

641

673

731

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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1.20e6

183

150

172

171

157

183

299

241

197

211

225

259

281

413

357

315

317

339

369

384

407

534

415

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437

435

445

505

519

535

563

549

593

660

603

633

691

676

719

730

749

CDM_A17_pos 1154 (29.644) Cm (1074:1169) 1: Scan ES+

1.93e6

183

151

172

171

183

301

241

197

201

229

299

259

281

269

289

357

317

321

339

437

415

379

360

397

495

477

465

535

505

549

593

553

633

603

691

651

673

731

701

CDM_A17_pos 1070 (27.484) Cm (974:1071) 1: Scan ES+

1.84e6

183

150

172

171

183

241

201

223

209

299

259

281

357

321

307

339

437

379

369

415

397

427

526

477

445

455

495 517

535

593

575

553

633

691

642

673

731

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

215

Figura 5.21d – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.22d –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com tempo de

retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

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3.11e6

185

172

150

157

185

239

225

199

217

239

413

283

271

269

327

284

293

307

371

337

351

381

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

632

621

587

666

645

719

689

699

729

743

CSM_A18_pos 1357 (34.877) Cm (1357:1458) 1: Scan ES+

5.39e6

413

185

172

171

157

185

239

199 225

283

243

269

327

287

307 371

337

382

391

415

479

435

442

533

523

493

666

577

547

591

621

631

680

CSM_A18_pos 1345 (34.566) Cm (1265:1362) 1: Scan ES+

1.49e7

413

185

172

150

239

225

199

382

353

283

301

415

445

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CDM_A17_pos 1687 (43.390) Cm (1548:1749) 1: Scan ES+

3.18e6

185

172

150

157

185

239

225

199

217

239

413

283

269

253

327

293

307

371

337

347

381

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

689

729

743

CDM_A17_pos 1364 (35.056) Cm (1364:1459) 1: Scan ES+

4.63e6

413

185

172

171

157

185

239

199

225

283

243

269

327

284

307

371

337

382

391

415

479

435

442

533

523

493

666

577547

621591

631

645

680

CDM_A17_pos 1345 (34.565) Cm (1263:1362) 1: Scan ES+

1.48e7

413

185

172

150

382

239

225

199

353

301283

394

415

445

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

216

Casca do cerne não-sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CcSM_A16_pos 1: Scan ES+

TIC

3.53e9

34.53

33.47

30.84

29.65

19.27

3.08

21.60

36.87

Figura 5.23 – Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico da casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático

ao fungo B. rhodina.

Casca do cerne sintomático

Time

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

100

CcDM_A15_pos 1: Scan ES+

TIC

3.56e9

34.55

33.44

30.81

29.63

19.29

3.05

21.63

41.60

38.73

36.95

Figura 5.24 –

Cromatograma de íons totais electrospray (TIC) modo positivo do

extrato etanólico da casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao

fungo B. rhodina.

217

Figura 5.23a –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 1 a 15min.

Figura 5.24a – Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 1 a 15min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSM_A16_pos 576 (14.797) Cm (387:587) 1: Scan ES+

6.27e5

150

153

224

172

156

209

183

217

315

249

235

275

269

289

445

355

349

329

421

381

375

415

461

487

527

501

601

567

561

593

633

607

667

CcSM_A16_pos 389 (10.000) Cm (194:393) 1: Scan ES+

5.61e5

150

224

153

156

178

203

275

269

235

309

277

415

315

349 375

381

601

455

421

521

487

481

494

547 587

553

CcSM_A16_pos 119 (3.077) Cm (3:193) 1: Scan ES+

4.61e5

150

366

224

166

203

181

195

215

269

229

243

277

309

343 527

382

515

415

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDM_A15_pos 583 (14.977) Cm (391:585) 1: Scan ES+

6.46e5

150

151

153

224

172

156

209

183

445

315

249

235

275

269

289

355

349

421

381

415

435

461

601

527

501

487

567

561

593

733

605

CcDM_A15_pos 381 (9.796) Cm (194:388) 1: Scan ES+

5.74e5

150

151

224

153

165

178

203

217

275

269

235

309

277

602

415

315

349

375

381

521

487455

421

481

515 547

587

CcDM_A15_pos 118 (3.052) Cm (11:189) 1: Scan ES+

4.70e5

150

365

151

224

203

153

166

177

195

219

281

248

269

362

309

343

367

527

381

441

:1 - 5 min

:5 - 10 min

:10 - 15min

218

Figura 5.23b –

Espectros de massas dos analitos presentes do extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 15 a 25min.

Figura 5.24b – Espectros de massas dos analitos presentes do extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 15 a 25min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSM_A16_pos 969 (24.893) Cm (872:973) 1: Scan ES+

1.48e6

183

150

172

157

183

241

201

223

299

249

281

259

565

357

321

307

329

379

369

437

387

415

477

445

543

535

485

495

551

568

644

583

641

601

665

686 739691

731

CcSM_A16_pos 841 (21.602) Cm (780:875) 1: Scan ES+

1.01e6

183

150

172

153

183

249

241

209

201

223

644

289

281

259

611

583

299

321

307

329

543

379

355

437

387

427

485

477

445

525

503

551

567

585

634

645

683

659

699

707

739

747

CcSM_A16_pos 750 (19.265) Cm (586:779) 1: Scan ES+

6.02e5

150

183

172

153

156

183

249

209

201

224

217

241

539

249

289

275

259

355

315

299

329

347

395

387

357

501

461

453

445

485

535

503

541

561

581

601

641

633

707

699

649

739

715

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDM_A15_pos 959 (24.638) Cm (872:970) 1: Scan ES+

1.46e6

183

150

172

157

183

241

201

223

249

299

281

259

565

357

321

307

329

379

369

437

415

387

477

445

543

485

535

525

545

567

644

583

641

626

666

685

731

691

739

CcDM_A15_pos 842 (21.630) Cm (778:876) 1: Scan ES+

9.66e5

183

150

172

153

183

249

241

209

201

223

612

289

281

259

583

299

329

307

551

379

355

539

485

437

387

395

427

445

471

525

495

567

585

644

633

644

683

659

699

748

727

708

CcDM_A15_pos 751 (19.291) Cm (583:779) 1: Scan ES+

5.98e5

150

539

183

172

153

183

249

209

201

224

241

249

289

275

259

315

307

355

329

339

455

395

387

357

445

421

501

485

477

519

541

581

561

617

601

639

641

707

699

657

739

715

747

:15 – 20 min

:20 – 22,5 min

:22,5 - 25min

219

Figura 5.23c –

Espectros de massas dos analitos presentes do extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina

com tempo de retenção de 25 a 35min.

Figura 5.24c –

Espectros de massas dos analitos presentes do extrato etanólico da

casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 25 a 35min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSM_A16_pos 1200 (30.838) Cm (1167:1264) 1: Scan ES+

1.46e6

534

183

150

172

171

157

299

241

197

211

225

259

281

413

357

315

317

339

369

384

385

415

495

437

435

465

532

505

534

535

576

563

549

642

593

617

633

643

660

691

701

749

719

CcSM_A16_pos 1154 (29.653) Cm (1075:1165) 1: Scan ES+

1.93e6

183

150

172

171

183

301

241

197

201

229

299

259

281

289

357

317 321

339

550

437

415

379

359

413

535

495

477

465

505

593

552

566

608 633

691

636

652

731

CcSM_A16_pos 982 (25.228) Cm (972:1071) 1: Scan ES+

1.96e6

183

150

172

157

183

241

201

223

209

299

259

281

357

317

321

339

379

369

437

415

387

477

445

686

535

495 525

566

543

570

593

633

626

641

651

691

731

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

:25 – 27,5 min

:27,5 – 32,5 min

:32,5 – 35min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDM_A15_pos 1199 (30.813) Cm (1168:1266) 1: Scan ES+

1.40e6

534

150

183

151

171

157

183

299

241

197

211

237

259

255

281

413

357

315

317

339

370

384

397

415

495

437

435

465

445

531

517

534

576

535

563

553

660

593

603

618

633

691

675

699

719

749

729

CcDM_A15_pos 1153 (29.630) Cm (1072:1167) 1: Scan ES+

1.91e6

183

150

172

171

183

301

241

197

201

229

299

259

281

289

357

317

321

339

550

495437415

379

359

397

477

465

535

505

594

552

566

633

608

691

636

651

731

CcDM_A15_pos 1025 (26.336) Cm (977:1068) 1: Scan ES+

1.81e6

183

150

172

157

183

241

201

223

209

299

259

281

357

321

307

339

491

437

379

369

415

397

427

477

445

465

535

495

567

566

633

570

593

611

686

651

681

691

731

220

Figura 5.23d –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico do

cerne de K. ivorensis não-sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

Figura 5.24d –

Espectros de massas dos analitos presentes no extrato etanólico Da

casca do cerne de K. ivorensis sintomático ao fungo B. rhodina com

tempo de retenção de 35 a 45min.

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcSM_A16_pos 1685 (43.353) Cm (1553:1745) 1: Scan ES+

3.21e6

185

172

150

157

185

239

225

199

217

239

413

283

271

269

327

284

293

371

337

347

382

391

479

415

435

425

449

465

533

523

489

577

547

567

675

631

621

587

666

645

719

685

699

729

743

CcSM_A16_pos 1383 (35.559) Cm (1361:1459) 1: Scan ES+

4.21e6

413

185

172

171

157

185

239

199

225

283

243

269

327

284

307

371

337

382

391

415

644

479

435

442

533

523

493

618

547

577

592

666

680

732

CcSM_A16_pos 1343 (34.526) Cm (1267:1361) 1: Scan ES+

1.46e7

413

172

150

185

382

353

239

225

199

301

283

311

415

445

444

642

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

amostra_Ka

m/z

150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750

100

CcDM_A15_pos 1689 (43.458) Cm (1459:1749) 1: Scan ES+

3.09e6

185

172

150

157

185

239

225

199

239

413

283

269

253

327

284

293

371

337

351

381

391

415

479

435

425

449

465

533

523

489

640

577

547

567

631

621

587

675

666

719

680

729

743

CcDM_A15_pos 1362 (35.019) Cm (1360:1458) 1: Scan ES+

4.44e6

413

185

172

150

157

185

239

199

225

283

243

257 327

287

371

337

351

382

391

415

442

435

479

445

666

493

523

503

533

547

577

680

737

CcDM_A15_pos 1344 (34.554) Cm (1267:1359) 1: Scan ES+

1.49e7

413

172

151

185

353

239

217

199

311

301

382

394

415

446

444

:35 – 37,5 min

:37,5 – 40 min

:40-45min

221

Analisando os cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos durante a

análise de CL/UV/EM das folhas, cerne e casca do cerne de K. ivorensis sintomática

e não sintomática ao fungo B. rhodina, os quais foram mostrados anteriormente,

notou-se que estes apresentaram pequenas diferenças que indicam uma leve

alteração nos metabólitos presentes nos tecidos analisados, ou seja, por meio do

experimento de full scan pôde-se inferir que a presença do fungo ocasionou ligeiras

modificações nos metabólitos dos tecidos analisados.

Desta forma, preferiu-se desenvolver um método de quantificação do

limonóide angolensato de metila nas folhas, casca do cerne e cerne de K. ivorensis

sintomática e não sintomática ao fungo. Isso porque, a presença deste limonóide na

espécie sintomática foi uma das dificuldades encontradas no estudo fitoquímico

clássico, pois em quase todas as frações trabalhadas eram detectados, por RMN

os sinais característicos do angolensato de metila. O mesmo não ocorreu no estudo

fitoquímico de Khaya ivorensis não sintomática realizado no laboratório de produtos

naturais da UFSCar por BARBOSA, 2007.

O objetivo em se desenvolver este método de quantificação foi buscar

uma resposta ao comportamento químico da espécie K. ivorensis frente à presença

do fungo (B. rhodina), a qual nessas condições demonstrou acumular grande

quantidade de angolensato de metila.

5.2 – Quantificação de Angolensato de Metila nos tecidos vegetais de Khaya

ivorensis sintomática e não sintomática ao fungo

5.2.1 – Validação de métodos analíticos

A validação de um método segundo RIBANI et al., 2004 engloba todos

os procedimentos necessários para demonstrar se o método empregado para a

quantificação da concentração de uma amostra em uma matriz é eficaz e especifico

para a aplicação desejada.

Os parâmetros necessários para medir a aceitabilidade do

desempenho de um método analítico de acordo com a FDA (Food and Drug

Administration) e ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) são: precisão,

exatidão, sensibilidade, seletividade, linearidade e recuperação. Estes parâmetros

são conceituados abaixo.

222

I) Precisão: este parâmetro avalia a repetitividade, a precisão intermediária e

reprodutibilidade (RIBANI et al., 2004).

• .I-1) A repetitividade é o grau de concordância entre resultados de análises

individuais quando o procedimento é aplicado repetidamente à múltiplas

análises de uma mesma amostra homogênea, em idênticas condições de

teste. Os coeficientes de variação (CV) obtidos no mínimo de três matrizes

para o controle de qualidade (CQ), CQB - baixo, CQM – médio e CQA - alto

devem ser menores ou iguais a 15%, e menores ou iguais a 20% para o limite

de detecção (RIBANI et al., 2004).

• I-2) A precisão intermediária expressa as variações dentro de um laboratório,

como: dias diferentes, analistas diferentes, métodos diferentes, ou

equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou padrão, definindo

exatamente quais as condições a variar (uma ou mais). Os resultados dos

dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um

mesmo equipamento, mesmas concentrações e mesma metodologia, deverão

ser o mesmo (RIBANI et al., 2004).

• I-3) A reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das

medições de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas de

medição (mudança de operador, local, equipamentos, etc.), ou seja,

colaboração interlaboratorial (RIBANI et al., 2004 e Inmetro 2002).

II) Exatidão: deve apresentar valores compreendidos entre mais ou menos 15% do

valor nominal CQB, CQM e CQA e de mais ou menos 20% para LQ, calculados a

partir de no mínimo três matrizes diferentes (RIBANI et al., 2004).

III) Sensibilidade: descreve quanto a resposta varia com a variação da concentração

do analito, a menor concentração da curva pode ser aceita como o LQ do método

quando o CV para o controle de qualidade for inferior a 20% (RIBANI et al.,

2004).

IV) Seletividade: é a habilidade de um método separar, do composto de interesse,

componentes da amostra que serão visíveis no detector. A resposta de

interferentes no tempo de retenção da substância investigada deve ser inferior a

20% da resposta do LQ (RIBANI et al., 2004).

V) Linearidade: É a habilidade das respostas analíticas serem diretamente

proporcionais às concentrações das substâncias em estudo. Deve ser construída

uma curva com a matriz que irá ser utilizada em triplicata com seis ou mais

223

concentrações diferentes. O desvio do LQ deve ser menor ou igual a 20% e para

os demais pontos da curva devem ser menores ou igual a 15%. O coeficiente de

correlação deve ser igual ou superior a 0,95% (RIBANI et al., 2004).

VI) Recuperação: É a relação entre o resultado experimental obtido depois da

análise de uma amostra, fortificada com uma quantidade conhecida do analito, e

o valor teórico desta quantidade fortificada (RIBANI et al., 2004).

5.2.2 – Desenvolvimento do Método e Seletividade

A espécie Khaya ivorensis destinada à quantificação foi adquirida no

dia 15 de outubro de 2006, na Estação Experimental Sosthenes de Miranda

(ESOMI), unidade experimental de Pesquisas do Cacau (CEPLAC), localizada no

município de São Sebastião do Passe, região do Recôncavo da Bahia, de uma

plantação experimental sintomática a um fungo. Foi coletada parte de uma planta

não sintomática ao fungo (folhas e cerne) e também parte de uma planta sintomática

ao fungo (folhas e cerne). A coleta foi supervisionada pelo Dr. Manfred Willy Müller

do CEPLAC. O material vegetal coletado foi separado por partes (folhas, cerne e

casca do cerne), seco em estufa de circulação de ar a 40

C por mais ou menos 36

horas, pulverizado em moinho Willey. Os tamanhos dos grânulos foram

homogeneizados com uma peneira granulométrica.

A Extração-4 descrita anteriormente foi utilizada para obtenção dos

extratos a serem analisados, mas ao invés de se utilizar cartucho de SPE para o

pré-tratamento da amostra, utilizou-se o processo de filtração como pré-tratamento,

ou seja, antes de secar as amostras no evaporador de solventes a vácuo

(SPEEDVAC) essas eram filtradas utilizando-se filtros millipore



30 mm de diâmetro

e poros de 0,45µm, sendo posteriormente secas. Este método de extração foi

escolhido por ser um método simples, eficiente e fácil de ser reproduzido.

As primeiras análises de quantificação foram feitas utilizando APCI

(Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Essa mudança foi necessária pois o

difusor de fluxo estava oscilando muito e como no processo de ionização por

electrospray não é viável o emprego de uma vazão acima de 0,5mL/min, optou-se

por utilizar o probe de APCI que permite uma vazão mais alta. O maior problema

enfretado foi que após todas as condições ajustadas o probe quebrou e novamente

a ionização por electrospray teve que ser utilizada. Entretanto como já mencionado,

224

precisou-se mudar as condições de análises, haja vista, que trabalhar com o difusor

de fluxo implicaria em resultados não confiáveis.

A primeira modificação foi alterar o tamanho da coluna para

conseqüentemente diminuir a vazão para 0,4mL/min e trabalhar com adição de um

aditivo químico, no caso, ácido trifluoracético, buscando conservar as características

cromatográficas mas tentando diminuir o tempo de retenção do analito de interesse.

Os extratos foram analisados por CL-EM/EM e os parâmetros de

separação cromatografica foram ajustados. Foi utilizada uma coluna de octadecil C-

18 Phenomenex® (150 x 4,6mm, 5µm) com uma vazão de 0,4mL/min, modo

gradiente (conforme tabela abaixo). A ionização por electrospray no modo positivo

ESI(+),e os demais parâmetros do espectrômetro de massas”Micromass Quattro LC”

podem ser observados na Tabela 5.3 abaixo:

Tabela 5.3 – Parâmetros utilizados no LC-MS\MS

Parâmetros CL/EM/MS

Eluição gradiente Potencial do capilar 3,65kV

T (min)

O 1%

TFA

(%)

MeOH 1%

TFA (%)

Potencial do cone 18V

0,00 70 30 Potencial cone extrator 7V

25,0 10 90 Potencial lentes RF 0,7V

30,0 0 100 Temperatura do probe 400

Temperatura do bloco da

fonte

110

Pressão do gás de colisão 1,4.10

-3

mbar

Pressão do vácuo 1,4.10

-3

mbar

Fluxo do gás de

dessolvatação (N

)

820L/h

Energia de colisão 15,0eV

Temperatura da coluna 20

A análise quantitativa do limonóide angolensato de metila utilizando

CL/EM-MS foi realizada no modo de SRM (Selected Reaction Monitoring). Este

modo envolve o monitoramento de uma ou mais transição (fragmentação) específica

em uma dada condição (MAGNANI et al 2007). As transições definidas para o

experimento de SRM foram baseadas nos espectros dos íons fragmentos (Figura

5.25) do composto angolensato de metila e as transições selecionadas foram: m/z

471 → 453 (dwell time = 0,30s) e 471→ 439 (dwell time = 0,30s). O tempo de

monitoramento para cada análise foi 30 minutos sendo a média do tempo de

retenção do angolensato de metila de 12,79 minutos com um desvio padrão relativo

de 3,5%. As propostas de fragmentações para as transições 471 → 453 (Proposta 1

e 2) e 471→ 439 (Proposta 3) podem ser observadas na Figura 5.26.

225

Figura 5.25 –

Espectros dos íons filhos de m/z 471, variando a energia de ionização

em 12, 15 e 18eV.

Padrao de an

olesato

m/z

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

100

Test_Gezimar_1307_16 8 (0.436) Sm (Mn, 4x0.75); Cm (8:10-(3:5+16:21)) 3: Daughters of 471ES+

1.11e5

439.6

411.6

393.6

337.2

193.0

161.1

300.0

225.7

267.6

361.4

453.4

471.6

Test_Gezimar_1307_16 8 (0.419) Sm (Mn, 4x0.75); Cm (8:10-(3:4+19:29)) 2: Daughters of 471ES+

1.67e5

439.6

411.7

379.1

315.5

425.2

453.8

471.7

Test_Gezimar_1307_16 9 (0.453) Sm (Mn, 4x0.75); Cm (8:11-(2:5+20:37)) 1: Daughters of 471ES+

1.31e5

471.4

439.3

411.4

376.9

395.3

424.8

453.7

12,0eV

15,0eV

18,0eV

226

Proposta 1 - Proposta 1 de fragmentação para a transição 471 → 453, via carbonila

protonada.

Proposta 2 - Proposta 2 de fragmentação para a transição 471 → 453, via hidroxila

protonada.

Proposta 3 -

Proposta de fragmentação para a transição 471 → 439

Figura 5.26 –

Proposta de fragmentação de angolensato de metila; ( Proposta 1 e 2

- perda de água ,18Da) e (Proposta 3: perda de uma molécula de

MeOH, 32Da)

COOMe

-H

COOMe

m/z 471 m/z 453

COOMe

OH O

COOMe

m/z 471 m/z 453

OOCH

m/z 471 m/z 439

227

A Tabela 5.4 mostra os parâmetros utilizados para a seletividade deste

limonóide, como já discutido anteriormente. Os canais selecionados foram os que

demonstraram uma melhor resposta em relação à presença de interferentes no

tempo de retenção deste composto, podendo assim assegurar a seletividade do

método.

Tabela 5.4 –

Parâmetros de quantificação do angolensato de metila

Parâmetros

Tempo de retenção 12,79 ± 0,45 (média ± DP)

Molécula protonada ([M+H]

) 471

Canal de SRM usado para

quantificação

471 → 453

Canal de SRM usado para

comprovação

471 → 439

5.2.3 – Linearidade e Sensibilidade

Para a obtenção da linearidade e da sensibilidade adequada para a

quantificação do composto de interesse, foram preparadas várias concentrações de

angolensato de metila, na faixa linear de trabalho de 1000 a 5 ng/mL. Estas

concentrações foram adicionadas separadamente as matrizes a serem analisadas,

ou seja, cerne, casca do cerne e folhas não sintomáticas ao fungo Botryosphaeria

rhodina. Os parâmetros utilizados nas análises por CL-EM/EM (SRM) foram as

mesmas apresentadas na Tabela 5.3.

Os cromatogramas das figuras 5.27, 5.28 e 5.29 das matrizes de

cerne, casca do cerne e folhas, respectivamente, mostram o ponto mais diluído

(5ng/mL) e mais concentrado (1000ng/mL) da curva de calibração. As relações

sinal/ruído indicadas nestas figuras foram utilizadas para se calcular a média desta

relação, como mostradas na Tabela 5.5. Nesta tabela também estão apresentados

os valores dos limites de quantificação (LQ) para as matrizes, que nada mais é do

que a menor concentração do composto que pode ser medida com uma precisão

especificada (SN ≅ 10). Para as três matrizes foram obtidos valores para o LQ muito

próximos aos desejados. O limite de detecção (LD) destas matrizes também foi

228

encontrado por meio desses cromatrogramas, sendo que o limite de detecção (LD)

produz uma resposta três vezes maior a do sinal ruído, como foram observados nos

cromatogramas dessas figuras.

Os gráficos apresentados nas Figuras 5.30, 5.31 e 5.32 mostram as

curvas de calibração para as matrizes cerne, casca do cerne e folhas

respectivamente. A curva de calibração foi construída por adição de padrão, onde

quantidades conhecidas do analito de interesse foram adicionadas a uma amostra

desconhecida antes do seu preparo. A escolha por adição de padrão foi feita por

existirem nos brancos das matrizes o analito de interesse. As soluções padrões

utilizadas para o desenvolvimento do método foram preparadas a partir de 1µg/mL

de angolensato de metila solubilizado em MeOH, obtendo seis concentrações

diferentes desta substância (5, 10, 50, 100, 500 e 1000ng/mL) usadas na construção

da curva, sendo que cada ponto da curva analítica foi preparado em triplicata. Por

meio da Tabela 5.5, notou-se que o coeficiente de correlação das matrizes foi maior

do que 0,99%, o que demonstra uma excelente linearidade do método condizente

com o valor do coeficiente de variação (CV) que deve ser igual ou superior a 95%.

229

Figura 5.27 –

Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→ 453 no

modo positivo para as concentrações 1000 e 5ng/mL do angolensato

de metila, respectivamente.

Figura 5.28 –

Cromatograma de SRM da casca do cerne referente à transição 471→

453 no modo positivo para as concentrações 1000 e 5ng/mL do

angolensato de metila, respectivamente.

Angolesato 1000 ng/ml

20:25:49

26-Jul-2007

Time

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Linearidade_cs_1_Angolesato_8 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

8.65e4

12.84

Linearidade_cs_1_Angolesato_3 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

2.32e3

11.63

S/N:RMS=14.63

13.13

28.12

Angolesato 1000 ng/ml

11:02:48

26-Jul-2007

Time

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Linearidade_ccs_1_Angolesato_8 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

1.23e5

13.02

Linearidade_ccs_1_Angolesato_3 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

2.22e3

S/N:RMS=11.86

1.11

29.26

26.81

23.71

230

Figura 5.29 –

Cromatograma de SRM das folhas referente à transição 471→ 453 no

modo positivo para as concentrações 1000 e 5ng/mL, do angolensato

de metila, respectivamente.

Figura 5.30 –

Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 1000 a

5µg/mL, repectivamente, n = 3.

0 200 400 600 800 1000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 163.00101 169.20653

B 51.20149 0.36885

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.9999 330.03496 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

Concentração (ng/mL)

Angolesato 1000 ng/ml

04:32:25

27-Jul-2007

Time

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Linearidade_fs_1_Angolesato_8 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

1.19e5

12.86

Linearidade_fs_1_Angolesato_3 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

2.20e3

S/N:RMS=15.30

12.74

29.52

13.05

231

Figura 5.31 –

Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

casca do cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de

1000 a 5µg/mL, repectivamente, n = 3.

Figura 5.32 –

Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

folha não sintomática ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 1000 a

5µg/mL, repectivamente, n = 3.

Tabela 5.5–

Sensibilidade e linearidade para as matrizes (cerne, casca do cale e

folhas não sintomáticas ao Botryosphaeria rhodina). Para n=3

Matriz

Media Relação

sinal / ruído

(S/N)

Limite de

quantificação

(ng/mL)

Limite de

detecção

(ng/mL)

Coeficiente de

correlação (r)

Cerne 12,96 ± 0,14 3,86 ± 0,04 1,16 ± 0,01

0,9991 ± 0,0003

Casca do cerne 11,36 ± 0,45 4,41 ± 0,17 1,32 ± 0,05

0,9982 ± 0,0006

Folhas 14,87 ± 0,53 3,37 ± 0,12 1,01 ± 0,04

0,9980 ± 0,0005

Calculado com base no valor médio da relação S/N

200

400

600

800

1000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 212.81613 757.248

B 54.4937 1.65073

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.99817 1477.00161 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

0 200 400 600 800 1000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 421.35924 865.93747

B 53.33531 1.88767

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.9975 1688.99891 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

Concentração (ng/mL)

232

5.2.4 – Precisão e exatidão

Para as análises das precisões e exatidões foram utilizadas as

mesmas faixas de trabalho empregadas na determinação da linearidade e

sensibilidade. Por meio da Tabela 5.6 observa-se que para a matriz cerne sem

cancro as porcentagens de desvio padrão relativo (RSD) intradia (n=3) foram

adequadas para toda a faixa de trabalho, o mesmo ocorrendo para o erro relativo

que teve apenas na concentração de 50 ng/mL um valor fora do ideal (>15%). Nessa

mesma matriz, notou-se que para as análises interdias (n=12) as porcentagens do

RSD mantiveram-se perto do ideal, mas as porcentagens do erro relativo foram

muito grandes. A matriz casca do cerne sem cancro apresentou porcentagens do

erro relativo e do RSD intradia (n=3) e interdias (n=12) satisfatórias, menos para a

concentração de 50ng/mL que apresentou um valor acima do aceitável (>15%).

De acordo com CASS, Q. B. e DEGANI, A.L.G. 2001 a precisão de

um método é dado por intermédio do desvio-padrão e/ou do coeficiente de variação

das medidas obtidas, sendo que para um método de análise em matrizes

complicadas ser considerado preciso, os coeficientes de variação não devem

ultrapassar 15%, com exceção do limite de quantificação que pode chegar a 20%. A

exatidão é a relação entre o valor encontrado pelo método e o valor aceito como

verdadeiro.

Diante deste relato constatou-se que o método de análise intradia

para essas matrizes poderia ser considerado preciso e exato. Entretanto, as análises

interdias apresentaram uma grande variação da porcentagem do RSD. Tais

variações talvez pudessem ter sido melhoradas se as análises fossem feitas em

quintuplicata e em cinco dias não consecutivos, ao invés de apenas 4, mas o fator

mais importante seria o uso de padrão interno que daria uma maior confiabilidade

nas análises.

233

Tabela 5.6 – Exatidão (%) e Precisão (%) Intradia: Triplicata de cada ponto da curva;

Interdias: Triplicata de cada ponto analisado em 4 dias não

consecutivos, com intervalo de 4 dias entre cada seqüência de

injeções

Intradia (n = 3) Interdias (n = 12)

Matriz

Concentração

esperada

(ng/mL)

Concentração

medida

(média ± SD)

(ng/mL)

RSD

(%)

Erro

relativo

(%)

Concentração

medida

(média ± SD)

(ng/mL)

RSD

(%)

Erro

relativo

(%)

5,9 ± 0,8

14,4

18 6,8 ± 1,3 19,0 36,0

11,7 ± 1,1

9,0

17,5 12,1 ± 0,7 6,0 20,7

89,3 ± 11,3

12,7

78,6 64,7 ± 11,2 17,3 29,5

100

87,8 ± 3,9

4,4

-12,2 96,8 ± 18,3 18,9 -3,2

500

460,1 ± 50,0

10,9

-8,0 495,9 ± 82,4 16,6 -0,8

Cerne

1000

934,7 ± 80,3

8,59

-6,5 993,4 ± 134,4 13,5 -0,7

6,0 ± 0,3 5,0 20,0 5,2 ± 1,0

20,0 4,0

11,3 ± 1,0 8,4 13,0 10,5 ± 1,0

10,3 4,5

54,1 ± 21,0 38,8 8,2 58,9 ± 19,6

33,2 17,8

100

106,0 ± 11,3 10,7 6,0 110,6 ± 15,9

14,4 10,6

500

512,3 ± 67,6 13,2 2,4 500,1 ± 59,3

11,7 0,1

Casca

do cerne

1000

985,7 ± 169,3 17,2 -1,4 1100,2 ± 64,3

5,8 10,0

5,7 ± 0,9 14,8 14,7 5,5 ± 0,9 15,8 9,5

11,8 ± 2 1,3 18,3 11,7 ± 0,3 2,9 16,8

52,5 ± 3,8 7,2 5,1 64,4 ± 23,8 37,0 28,7

100

100,3 ± 5,7 5,7 0,3 103,8 ± 8,3 8,0 3,8

500

451,3 ± 19,4 4,3 -9,7 485,9 ± 37,1 7,6 -2,8

Folhas

1000

946,4 ± 20,6 2,2 -5,4 982,3 ± 74,2 7,6 -1.7

Matriz

Exatidão (%) Precisão (%) Exatidão (%) Precisão (%)

5 84,7 14,4 73,5 19,0

10 84,9 9,0 82,6 6,0

50 56 12,7 77,2 17,3

100 113,9 4,4 103,3 18,9

500 108,7 10,9 100,8 16,6

Cerne

1000 107,1 8,59 100,7 13,5

5 88,4 5,0 96,1 20,0

10 92,4 8,4 95,2 10,3

50 92,4 38,8 84,9 33,2

100 94,3 10,7 90,4 14,4

500 97,6 13,2 99,9 11,7

Casca

do cerne

1000 101,4 17,2 90,8 5,8

5 87,7 14,8 90,9 15,8

10 118,0 1,3 85,4 2,9

50 95,2 7,2 77,6 37,0

100 99,7 5,7 96,3 8,0

500 110,8 4,3 102,9 7,6

Folhas

1000 105,7 2,2 101,8 7,6

234

5.2.5 – Recuperação

Para se avaliar a eficiência do método de extração foi construída

uma nova curva de calibração com um novo fator de diluição para se certificar da

quantidade de angolensato de metila presente no branco das matrizes. Foi utilizado

a mesma faixa de trabalho (5 a 1000ng/mL) obtendo-se os gráficos apresentados

nas figuras 5.33, 5.34 e 5.35 respectivamente para as matrizes cerne, casca do

cerne e folhas. A Tabela 5.7 mostra os valores (%) de recuperação obtidos para o

CQB (controle de qualidade baixo), CQM (controle de qualidade médio) e CQA

(controle de qualidade alto) referentes às concentrações 8, 600 e 900 ng/mL,

respectivamente. Essas concentrações foram adicionadas às matrizes de análise em

quintuplicatas, secando-se as mesmas e seguindo-se o método de extração 4. O

branco também foi preparado em quintuplicatas. Nesta tabela pode-se notar que

houve uma recuperação de 80,7% para o caule. Para a casca do cerne , o valor de

recuperação foi um pouco maior (89,8%), Embora o desvio padrão relativo no CQB

tenha sido alto (28,4%), o valor do RSD global manteve-se abaixo dos 10% (9,3%).

Isso provavelmente ocorreu devido a prováveis erros de dopagem ou mesmo na

extração. Já nas folhas, a recuperação obtida foi de 32,1% para o método

trabalhado.

Figura 5.33 –

Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 1000 a 5

µg/mL, n = 3.

0 200 400 600 800 1000

20000

40000

60000

80000

100000

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 10128.29558 667.86632

B 85.92787 1.45589

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.99943 1302.6639 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

Concentração (ng/mL)

235

Figura 5.34 – Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

casca do cerne não sintomático ao B. rhodina. Faixa de trabalho de

1000 a 5 µg/mL, n = 3.

Figura 5.35 –

Curva de calibração externa de angolensato de metila para a matriz

folha não sintomática ao B. rhodina. Faixa de trabalho de 5 a

1000µg/mL, n = 3.

Tabela 5.7 - Recuperação (n =5) de angolensato de metila no CQB, CQM e CQA

Recuperação (% da media ± RSD); n = 5

Concentração

esperada

(ng/mL)

Cerne Casca do Cerne Folhas

8 80,5 ± 10,7 80,4 ± 28,4 30,0 ± 14,6

600 81,8 ± 4,3 96,5 ± 8,3 26,4 ± 6,2

900 79,8 ± 4,1 92,6 ± 7,2 39,8 ± 23,8

Media geral 80,7 ± 1,3 89,8 ± 9,3 32,1 ± 21,6

-200 0 200 400 600 800 1000 1200

-10000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

------------------------------------------------------------

A 52.65262 368.45412

B 55.42053 0.8032

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.99958 718.66459 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

Concentração (ng/mL)

0 200 400 600 800 1000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

140000

150000

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 76129.5171 381.43989

B 69.69989 0.8315

------------------------------------------------------------

RSDNP

------------------------------------------------------------

0.99972 743.99316 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Área SRM

Concentração (ng/mL)

236

5.2.6 – Quantificação de angolensato de metila nas matrizes sintomáticas ao

Botryosphaeria rhodina

Após o desenvolvimento dos parâmetros analíticos necessários para a

validação do método (seletividade, sensibilidade, linearidade, precisão, exatidão e

recuperação), o próximo passo foi verificar qual a quantidade de angolensato de

metila estava presente nas matrizes sintomáticas ao Botryosphaeria rhodina. As

matrizes foram preparadas em quintuplicatas e a quantidade de angolensato nas

matrizes sintomáticas foi comparada com a encontrada nas matrizes não

sintomáticas com base nas curvas feitas com extrato mais concentrado subtraindo-

se a área dos brancos de todos os pontos da curva de calibração. Além disso, os

valores destas áreas foram também comparados com as curvas feitas no extrato

com fator de diluição maior (curvas utilizadas na linearidade). Os resultados obtidos

foram muito semelhantes, diferindo em torno de ± 5%. Por meio do cromatograma

apresentado na Figura 5.36 nota-se que houve um aumento de três vezes na área

do angolensato de metila na matriz sintomática do cerne por comparação com a

matriz não sintomática, já nas figuras 5.37 e 5.38 não foi observado um aumento

significativo na área destes cromatogramas das matrizes casca do cerne e folhas

sintomática por comparação às matrizes não sintomáticas.

A tabela 5.8 mostra as médias das concentrações das amostras

sintomáticas e não sintomáticas das matrizes cerne, casca do cerne e folhas,

juntamente com o desvio padrão relativo com base nas curvas feitas com o extrato

mais diluído, onde verificou-se por comparação das matrizes que houve grande

aumento na quantidade de angolensato de metila no cerne e menos pronunciado

nas folhas.

Tabela 5.8 – Concentração de angolensato de metila nas matrizes (cerne, casca do

cerne e folha) sintomáticas e não sitomaticas ao B. rhodina.

Matriz

Quantidade na amostra

sadia (branco) em

ng/mL (media

± RSD)

Quantidade na amostra

doente em ng/mL

(media ± RSD)

Cerne

17,2 ± 10,4 61,3 ± 8,0

Casca do cerne

93,1 ± 5,5 80,3 ± 16,7

Folhas

164,2 ± 8,9 201,7 ± 10,9

237

Figura 5.36 –

Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→ 453 e

471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na matriz

cerne sintomático e não sintomático.

Figura 5.37 – Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→ 453 e

471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na matriz

casca do cerne sintomático e não sintomático.

Caule doente

23:26:14

09-Oct-2007

Time

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Amostra_caule_doente_03 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

7.42e3

Area

12.59

3280

Amostra_caule_doente_03 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

1.42e4

Area

12.60

6325

Recuperacao_caule_2_Angolesato_3 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

3.08e3

Area

12.70

1086

Recuperacao_caule_2_Angolesato_3 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

5.60e3

Area

12.72

2306

Cerne sintomático (471→ 439)

Cerne sintomático

(

471→ 453

)

Cerne não sintomático

(

471→ 453

)

Cerne não sintomático

(

471→ 439

)

Cascacaule doente

01:14:16

10-Oct-2007

Time

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Amostra_cascacaule_doente_02 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

2.11e4

Area

12.69

10101

Amostra_cascacaule_doente_02 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

1.12e4

Area

12.68

5083

Recuperacao_cascacaule_2_Angolesato_2 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

2.07e4

Area

12.60

9652

Recuperacao_cascacaule_2_Angolesato_2 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

1.09e4

Area

12.60

4785

Casca do cerne sintomático

(

471→ 439

)

Casca do cerne sintomático

(

471→ 453

)

Casca do cerne não sintomático

(

471→ 439

)

Casca do cerne não sintomático

(

471→ 453

)

238

Figura 5.38 –

Cromatograma de SRM do cerne referente à transição 471→ 453 e

471→ 439 no modo positivo do angolensato de metila na matriz casca

do cerne sintomático e não sintomático

Folha doente

03:56:15

10-Oct-2007

Time

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00

100

Amostra_folhas_doente_02 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

4.18e4

Area

12.73

20614

Amostra_folhas_doente_02 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

2.16e4

Area

12.74

10628

Recuperacao_fs_2_Angolesato_22 2: MRM of 1 Channel ES+

471 > 439

3.60e4

Area

12.71

16702

Recuperacao_fs_2_Angolesato_22 1: MRM of 1 Channel ES+

471 > 453

1.91e4

Area

12.71

8612

Folhas sintomáticas

(

471→ 439

)

Folhas sintomáticas

(

471→ 453

)

Folhas não-sintomáticas

(

471→ 439

)

Folhas não-sintomáticas

(

471→ 453

)

239

5.2.7 – Considerações finais

Através das análises realizadas usando o método proposto, constatou-

se que o aumento do angolensato de metila foi mais significativo na matriz de cerne

sintomático ao B. rhodina, haja vista que nas outras matrizes este aumento foi

desprezível. Mas o que estaria levando a uma produção tão significativa desta

substância nos cernes da planta sintomática?

Algumas hipóteses foram levantadas, como por exemplo:

i) O angolensato de metila poderia estar atuando como um sinalizador químico para

esta patogenia – Resposta Sistêmica Adquirida – ou seja, a planta usaria este

método para “avisar” as outras partes dela que há uma infecção. Isto explicaria o

aumento de angolensato nos demais órgãos da planta, pois embora não tenha sido

quantificado foi isolada uma grande quantidade de angolensado de metila nas raízes

da planta sintomática. Essa hipótese poderia ser confirmada se houvesse um

aumento da produção de ácidos jasmônico e salicílico por toda a planta que são

sinalizadores naturais das plantas (MITHÖFER, A.; et al., 2005 e SANTOS et al.,

2003).

ii) Como foi observada a formação do cancro somente na casca do cerne acredita-se

que não foi avaliado um aumento na produção de angolensato nesta matriz, pois

microorganismos oportunistas poderiam estar biotransformando esta substância e

utilizado-a como fonte de carbono para sua própria sobrevivência (SANTOS et al.,

2003).

iii) Teoria do screening que sugere que a planta esteja apenas “testando” possíveis

inibidores do fungo, já que a doença é relativamente nova na espécie Khaya

ivorensis, assim seria necessário verificar no futuro se o aumento de angolensato no

cerne se mantém (FIRN, R.D. e JONES, C.J. 2003).

iv) Angolensato de metila pode está se comportando como uma fitoalexina

(SANTOS et al., 2003)

241

6 - Conclusões Gerais

Diante dos objetivos propostos concluiu-se:

1) Estudo fitoquímico de Khaya ivorensis sintomática ao fungo

(Botryosphaeria rhodina), porém permanecendo imune a Hypsipyla grandella.

Com o estudo fitoquímico de Khaya ivorensis sintomática ao B. rhodina, foram

isoladas 18 substâncias, 11 relatadas pela primeira vez em Khaya ivorensis, sendo 4

limonóides do tipo fragmalina (1α,2β,3α,6,8α,14β–hexa-hidroxi-[4.2.110,30.11,4]-

triciclo-meliac-7-oato de metila, 2,14-epoxi-1a,6,8a-tri-hidroxi-3-oxo-

[4.2.110,30.11,4]-triciclomeliac-7-oato de metila, 1α,6,8α,14β,30β–penta-hidroxi-3-

oxo-[3.3.110,2.11,4]-triciclomeliac-7-oato de metila e Khayanolídeo F), 2 apo-

protolimonóides (24-hidroxigrandifoliolenona e Acetato de sapelina E ), 1 limonóide

do grupo gedunina (7-desacetil gedunina) e 1 do tipo mexicanolídeo (8β-

hidroxicarapina 3,8-hemiacetal) e 3 triterpenos (odoratona , 23-hidroxi-20(22)-en-

21,23-γ-lactona-angolensato de metila e 21-hidroxi-20(22)-en-21,23-γ-lactona-

angolensato de metila) e mais sete substâncias comuns no gênero (angolensato de

metila, 7-desacetoxi-7-oxogedunina, mexicanolídeo, khivorina, 6-hidroxiangolensato,

3-desacetil-khivorina e grandifoliolenona).

2) Comparar por LC-MS se houve interferência do fungo no

metabolismo secundário de K. ivorensis, analisando espécies sintomáticas e não

sintomáticas ao Botryosphaeria rhodina. Analisando os cromatogramas de íons

totais (TIC) juntamente com os espectros de massas obtidos destes, não se

observaram diferenças que justificassem uma mudança nos metabólitos presentes

nos tecidos analisados, ou seja, por meio do experimento de full scan pôde-se

sugerir que a patogenia não ocasionou modificação nos metabólitos dos tecidos

analisados.

3) Desenvolvimento e validação do método de quantificação do

limonóide angolensato de metila por LC-MS/MS(SRM). Foi constatado um aumento

significativo na quantidade de angolesanto de metila presente nos caules da planta

sintomática ao fungo, mas o aumento de mesma magnitude deste limonóide, não foi

constatado nas folhas e na casca do caule. Algumas suposições foram levantadas

diante dos resultados da validação: a) o angolensato de metila estaria sendo um

sinalizador para a patogenia, b) microorganismos oportunistas estariam

242

biotransformando esta substância c) teoria de screening e d) fitoalexina

(fitoantecipina). Estas suposições precisam de estudos que possam certificar o

porquê do aumento do angolensato de metila no caule da planta sintomática ao B.

rhodina.

243

7 – Referências bibliográficas

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