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FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE
PORTO ALEGRE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: FARMACOLOGIA E TERAPÊUTICA
CLÍNICA
ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO CARDIOPULMONAR E DA
RESPOSTA HEMODINÂMICA EM RATOS EXPOSTOS
AGUDAMENTE AO MATERIAL PARTICULADO DURANTE O
EXERCÍCIO
Dissertação de Mestrado
Thiago Gomes Heck
Porto Alegre, 2007
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO CARDIOPULMONAR
E DA RESPOSTA HEMODINÂMICA EM RATOS EXPOSTOS
AGUDAMENTE AO MATERIAL PARTICULADO DURANTE
O EXERCÍCIO
Aluno: Thiago Gomes Heck
Orientadora: Claudia Ramos Rhoden
Co-Orientador: Pedro Dall’Ago
Área de Concentração: Farmacologia e Terapêutica Clínica
Dissertação de Mestrado
Porto Alegre, 2007
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DEDICATÓRIA
Sem sombra de dúvida, o esforço gasto durante esta etapa não poderia ser
dedicado à outra pessoa se não aquela que me apóia em todos os momentos da vida. Os
caminhos do amor e do carinho sempre foram repassados por ela. Portanto, é com esses
sentimentos que dedico à minha mãe esta nossa vitória.
4
AGRADECIMENTOS
Certamente ninguém conquista seu objetivo sozinho neste mundo. Portanto
agradeço todos que, de alguma forma, foram importantes nesta etapa.
À família, pelo apoio inestimável, auxiliando com afeto estes anos de estudo.
Especialmente ao meu irmão Cadete Lion, pelos ensinamentos, correções e distrações
durante este período. Pelas correções e pela companhia na reta final, agradeço minha
namorada Isabele.
Ao professor e grande amigo Alexandre Maslinkiewicz (Baby), que mostrou os
valores do caminho da pesquisa e do ensino. Conquistas e épocas de trabalhos em
conjunto, sempre serão lembradas.
Ao professor Pedro Dall’Ago, por despertar a curiosidade pela fisiologia no início
de minha formação e agora me acompanhar de perto durante os momentos decisivos
desta jornada.
Aos meus colegas de laboratório (especialmente os cabeludos Marcelo Petry,
Roberto Damiani e a Jéssica Lima) pela ajuda e companheirismo do início até o final
deste trabalho.
A Profa. Claudia Ramos Rhoden, por me conceder a oportunidade de realização
deste trabalho, pelos ensinamentos que me foi passado e serão de fundamental
importância em uma futura atividade docente. Acompanhar o nascimento e crescimento
de seu laboratório neste processo de amadurecimento acadêmico, sem dúvida foi uma
experiência inigualável.
5
Aos meus professores, Prof. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr, e Prof. Álvaro
Reischak de Oliveira, que sempre me auxiliaram respondendo a qualquer momento uma
chamada emergencial, deixando as portas abertas para um novo aprendizado.
Ao companheiro e sempre prestativo Mario Serapião por não deixar os
experimentos pararem.
Aos professores desta instituição pelo exemplo e oportunidades durante este
período. Especialmente ao professor Ernani Rhoden pelo auxílio nesta reta final.
Aos funcionários da secretaria de Pós-Graduação, especialmente Ivonice Santos e
Marcelo
Cardoso Fonseca pelo empenho no suporte aos alunos deste curso.
Aos meus colegas de Pós-Graduação que compartilharam desabafos neste trajeto
(Maurício Nin, Viviane Toniazo, Ramiro Nunes, Carolina Boettge, Elisa DeLeon, Paula
Campagnolo, Fernanda Praia, Ana Zanchi, Carlos Eurico e Gisele Bortolini).
Um abraço especial aos amigos e aos tricolores pelas “comemorações”.
6
LISTA DE ABREVIATURAS:
CAT: Catalase
CL: Chemiluminescense
EAO: Espécies ativas de oxigênio
EPA: Environmental Protection Agency (EUA)
FC: Freqüência cardíaca
GPx: Glutationa Peroxidase
LAC: lactate concentration
LPO: Lipoperoxidação
MDA: Malondialdeido
MP: Material Particulado
PAS: Pressão arterial sistólica
PAD: Pressão arterial diastólica
PAM: Pressão arterial média
PM: Particulate Matter
QL: Quimiluminescência
ROFA: Partículas resultantes da queima de óleo diesel
SOD: Superóxido dismutase
TBARS: Teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
7
ABSTRACT
Epidemiological studies have associated particulate matter (PM) exposure with
cardiopulmonary damage, responsible for hospital admission and sudden death. Animal
studies have shown that oxidative stress is one mechanism involved in lung/heart injuries
induced by PM inhalation. Acute physical exercise increases oxygen species production
in these organs. The objective of this study was to investigate the cardiopulmonary
oxidative stress and hemodynamics parameters during exercise in rats exposed to PM.
Methods: the experiments were divided into two steps:
1) The study of the lung oxidative stress in the rats submitted to two models of PM
exposure during exercise: exposure to PM in ambient levels “real world” or ROFA (fine
particles rich in transition metals) intratracheal instillation. Wistar, adult, male rats were
submitted to a moderate intensity physical exercise for 20 or 60 minutes breathing
filtered air (F) or PM (P). In addition, four groups of rats received intratracheal
instillation of Saline (100µL NaCl 0.9%) or ROFA (500µL/100µ NaCl 0.9%) and
maintained in resting condition (R-S and R-RF) or were submitted to the swimming
exercise for 20 minutes (EX-S and EX-RF). Rats were decapitated and lung was excised
to oxidative stress evaluation by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS),
chemiluminescence (CL) and catalase activity (CAT). Results: the exposure to ambient
particles were unable to promote a increase of lipid peroxidation in lung tissue as
compared to the animals that received filtered air [TBARS (nmol MDA/mg protein):
F20=0.078±0.021; P20=0.094±0.04; F60=0.108±0.04 e P60=0.114±0.05; CL (cps/mg
protein): F20=3970±772; P20=3345±465; F60=4727±850 e P60=4881±1062; CAT
8
(µmol H
2
O
2
/sec/mg protein): F20=0.162±0.062 P20=0.189±0.056; F60=0.279±0.134 e
P60=0.219±0.079 p>0.05]. In addition, we detected that exercise for longer time (60
minutes) produced an increase of lung lipid peroxidation as compared with resting
condition groups independently of PM exposure (p<0.05). Regarding the intratracheal
instillation protocol, we observed that exercise increased lung oxidative stress, detected
by TBARS, CL and CAT measurements (p<0.05). ROFA instillation increased the lung
oxidative stress induced by exercise [(TBARS nmol MDA/mg protein): R-
S=0.041±0.008; R-RF=0.066±0.011 e EX-S=0.054±0.01 versus EX-RF=0.076±0.017,
p<0.05].
2) The study of heart oxidative stress and hemodynamic parameters in rats submitted to
Saline (100µL NaCl 0.9%) or ROFA (500µG/100µL NaCl 0.9%) by intratracheal
instillation before performed moderate intensity physical activity for 20 minutes.
Previously of experiment, one catheter filled was implanted into the carotid artery of alls
rats for hemodynamic data acquisition during exercise: heart rate (HR), mean arterial
pressure (MAP), systolic arterial pressure (SAP) and diastolic arterial pressure (DAP). At
the end of 20 minutes of swimming exercise the rats were decapitated and heart was
excised to oxidative stress evaluation by TBARS, CL and CAT activity. Results: ROFA
treatment increased heart tissue oxidative stress [TBARS (nmol MDA/mg): Saline=
0.0289±0.0063 versus ROFA=0.049±0.0164, p=0.03; QL (cps/mg protein):
Saline=3600±531 versus ROFA=5202±951, p=0,015; CAT (µmol H
2
O
2
/sec/mg protein):
Salina=0.031±0.003 vs ROFA=0.027±0.003, p=0.087) but these effects were not
associated with hemodynamic alterations during short-term and moderate intensity
exercise. [HR (beats per minute): Saline=432±15 vs ROFA=416±36; MAP (mmHg):
9
Saline=109.3±9.7 vs ROFA=109±11.4; SAP (mmHg): Saline=127.3±9.7 vs
ROFA=128±11; DAP (mmHg): Saline=87.9±8.3vs ROFA=87.3±11.3)]. In conclusion,
our studies demonstrated that PM exposure increased cardiopulmonary oxidative stress
parameters without hemodynamic alterations.
Keywords: Oxidative stress, Air pollution, particulate matter, exercise, heart and lung.
10
RESUMO
Estudos epidemiológicos têm associado à exposição ao material particulado (MP)
com comprometimento do sistema cardiorrespiratório, sendo este responsável pelo
aumento do número de internações hospitalares e de mortes súbitas. Estudos em modelos
animais apontam o estresse oxidativo como um dos mecanismos responsáveis pelos
danos pulmonares e/ou cardíaco induzidos pela exposição a este poluente. Além disso, a
demanda energética gerada por uma sessão de exercício físico promove aumento da
produção de espécies ativas de oxigênio nos tecidos supra-citados. Nosso estudo teve
como objetivo investigar os parâmetros oxidativos cardiopulmonares e a função
hemodinâmica durante uma sessão de exercício físico em ratos expostos ao MP. Para
tanto dividimos o nosso estudo em duas etapas:
1) Estudo do efeito do MP sobre o estresse oxidativo pulmonar em ratos
submetidos a dois modelos de exposição: - em nível ambiental (“real world”) ou -
instilação intra-traqueal de “residual oil fly ash” (ROFA – partícula fina rica em metais
de transição). Ratos, Wistar, machos, adultos realizaram exercício de natação de
intensidade moderada por 20 ou 60 minutos na presença (P20 e P60) ou não (F20 e
F60) de MP em níveis ambientais. Outro grupo de ratos foi subdivido em 4 grupos:
Grupo 1:R-S: recebeu 100µl de NaCl 0,9% por instilação intra-traqueal e permaneceu
em repouso; Grupo 2:R-RF: recebeu 500µg/100µl de suspensão de ROFA via intra-
traqueal e permaneceu em repouso; Grupo 3: EX-S recebeu 100µl de NaCl 0,9% por
instilação intra-traqueal e foi submetido a natação de intensidade moderada por 20
11
minutos e Grupo 4: EX-RF: recebeu 500µg/100µl de suspensão de ROFA via intra-
traqueal e foi submetido a natação de intensidade moderada por 20 minutos Após os
experimentos, em ambos os modelos, os ratos foram eutanasiados e foi realizada a
retirada do pulmão para avaliação dos parâmetros oxidativos através do teste de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), quimiluminescência (QL) e
atividade da catalase (CAT). Os resultados mostraram que a exposição ao MP em nível
ambiental não resultou em aumento significativo do estresse oxidativo pulmonar em
ratos submetidos a natação de intensidade moderada [TBARS (nmol MDA/mg proteína):
F20=0,078±0,021; P20=0,094±0,04; F60=0,108±0,04 e P60=0,114±0,05; p=0,164; QL
(cps/mg proteína): F20=3970±772; P20=3345±465; F60=4727±850 e P60=4881±1062;
CAT (µmol H
2
O
2
/seg/mg proteína) F20=0,162±0,062 P20=0,189±0,056;
F60=0,279±0,134 e P60=0,219±0,079 p>0,05]. Entretanto, verificamos que os animais
exercitados por 60 minutos apresentaram aumento da lipoperoxidação pulmonar quando
comparados aos animais que realizaram exercício por 20 minutos, independente da
condição ou não de exercício( p<0,05). Em relação ao protocolo de instilação intra-
traqueal de ROFA, observamos, através da determinação do TBARS, QL e CAT que o
exercício aumentou o estresse oxidativo pulmonar de ratos (p<0,05). Além disso,
detectamos que o poluente promoveu um aumento do estresse oxidativo pulmonar,
exacerbando o efeito do exercício (TBARS nmol MDA/mg proteína: R-S=0,041±0,008;
R-RF=0,066±0,011 e EX-S=0,054±0,01 versus EX-RF=0,076±0,017, p<0,05).
2) Estudo do efeito do MP sobre o estresse oxidativo cardíaco e alterações
hemodinâmicas de ratos submetidos a instilação intra-traqueal de “residual oil fly ash”-
ROFA. A artéria carótida de ratos Wistar, machos, adultos foi canulada para registro dos
12
parâmetros hemodinâmicos: freqüência cardíaca (FC), pressão arterial média (PAM),
pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD). Estes animais foram
submetidos à administração via intra-traqueal de solução fisiológica (grupo Salina=
100µl NaCl 0,9%) ou suspensão de ROFA (grupo ROFA= 500µg/100µl NaCl 0,9%) e
imediatamente submetidos ao exercício de natação de intensidade moderada durante 20
minutos com simultâneo registro hemodinâmico. Ao término do experimento os ratos
foram eutanasiados e foi realizada a retirada do coração para avaliação dos parâmetros
oxidativos: TBARS, QL e atividade da CAT. Resultados: o tratamento com ROFA
aumentou o estresse oxidativo do coração durante o exercício. [TBARS (nmol MDA/mg
proteína): Salina= 0,0289±0,0063 vs ROFA=0,049±0,0164, p=0,03; QL (cps/mg
proteína): Salina=3600±531 vs ROFA=5202±951, p=0,015; CAT (µmol H
2
O
2
/seg/mg
proteína): Salina=0,031±0,003 vs ROFA=0,027±0,003, p=0,087). Em relação aos
parâmetros hemodinâmicos não fora encontradas diferenças estatisticamente
significativas [FC (batimentos por minuto): Salina=432±15 vs ROFA=416±36; PAM
(mmHg): Salina=109,3±9.7 vs ROFA=109±11,4; PAS (mmHg): Salina=127,3±9.7 vs
ROFA=128±11; PAD (mmHg): Salina=87,9±8.3 vs ROFA=87,3±11,3, p>0,05].
Em conclusão, nossos resultados demonstraram que a exposição ao MP promoveu
um aumento do estresse oxidativo cardiopulmonar em ratos exercitados sem causar
alterações dos parâmetros hemodinâmicos.
13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Região de deposição das partículas inaladas de acordo com seu diâmetro
aerodinâmico. (A) Alvéolos, (TB) Traquéia e Brônquios e (NFL) Nariz, Faringe e
Laringe. (Adaptado de MARCONI, 2003) .......................................................................23
Figura 2. Mecanismos de formação de EAO no coração em resposta a inalação de
material particulado. (adaptado de GONZALEZ-FLECHA, 2004)..................................26
Figura 3. Mecanismos de formação de espécies ativas de oxigênio (EAO) no pulmão em
resposta a inalação de material particulado. (adaptado de GONZALEZ-FLECHA, 2004)
...........................................................................................................................................26
Figura 4. Distribuição eletrônica nas espécies ativas de oxigênio (EAO) mostrando
apenas os elétrons dos orbitais π externos. .......................................................................32
Figura 5. Representação esquemática das etapas da lipoperoxidação de membranas
celulares. ...........................................................................................................................43
Figura 6. Algumas doenças humanas relacionadas com excessiva produção de espécies
ativas de oxigênio (Adaptado de PINCEMAIL, 1995).....................................................49
Figura 7. Hipótese de produção de espécies ativas de oxigênio (EAO) pelo exercício
realizado com concentrações inadequadas de material particulado e suas implicações...61
Tabela 1: Padrões Nacionais de Qualidade do Ar, através da resolução n.º 03 de
28/06/1990, CONAMA
17
Tabela 2 - Critérios para episódios críticos de poluição do ar ..........................................18
Tabela 3. Espécies ativas de oxigênio...............................................................................35
14
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................15
1.1POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – GENERALIDADES............................................15
1.1.2 MATERIAL PARTICULADO – FORMAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO...........20
1.1.3 MATERIAL PARTICULADO – EFEITOS BIOLÓGICOS............................22
1.1.4 MATERIAL PARTICULADO – MÉTODOS DE EXPOSIÇÃO....................30
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO.......................................................................................31
1.2.1 FORMAÇÃO DAS ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO..............................31
1.2.2 MECANISMOS ANTIOXIDANTES...............................................................36
1.2.3 DANOS CAUSADOS POR ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO ................41
1.2.4 DOENÇAS RELACIONADAS AO ESTRESSE OXIDATIVO......................46
1.3 EXERCÍCIO............................................................................................................50
1.3.1 EXERCÍCIO FÍSICO E ESTRESSE OXIDATIVO.........................................52
1.3.2 TREINAMENTO FÍSICO E ESTRESSE OXIDATIVO .................................56
1.4 EXERCÍCIO FÍSICO E POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA. .......................................59
2. OBJETIVO GERAL .....................................................................................................63
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................63
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..........................................................................64
4. ARTIGO 1.....................................................................................................................76
5. ARTIGO 2...................................................................................................................101
6. CONCLUSÕES ..........................................................................................................127
15
INTRODUÇÃO
1.1 POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – GENERALIDADES
A terminologia poluente diz respeito a substâncias químicas que excedem as
concentrações naturais e causam efeitos adversos nos seres vivos e/ou no ecossistema.
Dessa forma, a poluição atmosférica envolve qualquer alteração qualitativa ou
quantitativa da constituição normal da atmosfera suficiente para produzir um efeito
mensurável sobre o homem, outros animais, vegetais e minerais (OGA, 1996). Produtos
emitidos diretamente pelas fontes poluidoras são chamados de poluentes primários
enquanto os que resultam de sua transformação são poluentes secundários. Segundo a
Environmental Protection Agency (EPA, 1996), os principais poluentes da atmosfera são
os óxidos de enxofre, monóxido de carbono, óxidos de nitrogênio, hidrocarbonetos,
ozônio e o material particulado (MP).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) e o Programa Ambiental Norte
Americano têm afirmado que a poluição atmosférica por MP representa o mais grave
problema global de poluição do ar nos dias de hoje. Entre as 20 maiores megacidades
(aquelas com população acima de 10 milhões de habitantes), 12 delas apresentam sérios
problemas de poluição por MP, o qual se encontra persistentemente acima dos índices
preconizados pela OMS (GOMES, 2002).
16
Acidentes que comprometeram a qualidade do ar, como o do Vale do Meuse
(França) em 1930, o de Donora (EUA) em 1948 e o de Londres em 1952, permitiram a
associação entre elevação da poluição atmosférica e ações deletérias à saúde,
principalmente sobre o aparelho respiratório, inclusive com aumento na mortalidade
(WILLIAMS, 2004). Esses fatos levaram os governos de vários países a estabelecerem
programas de controle da poluição atmosférica, como o britânico Air Pollution Control
Act of London de 1956, o norte-americano Clean Air Act Amendments de 1970 o qual
serviu como base para o National Ambient Air Quality Standards (AAQS), e o Europeu
Air Quality Guidelines for Europe (EPA, 1996; HAUCK et al, 1998; WHO, 2000). Dessa
forma, programas de monitoramento da qualidade do ar já fazem parte da realidade de
algumas das principais cidades industrializadas do mundo (GODLESKI & CLARKE,
1998).
O padrão americano de qualidade do ar para concentrações de MP
10
, ficou mais
rigoroso no ano de 2005, passando o limite permitido de 150µg/m
3
em média durante 24
horas para 50µg/m
3
, e de 50µg/m
3
em média durante o período de um ano para 20µg/m
3
.
Quando consideramos o MP
2,5
, o padrão estabelecido para concentrações deste passou de
65µg/m
3
para média do período de 24 horas e 15µg/m
3
durante o período e de um ano,
para 25 e 10µg/m
3
, respectivamente (WHO, 2005). O Brasil segue os mesmos valores
estabelecidos para MP
10,
durante 24 horas e para o período de um ano, sendo adicionado
um padrão de qualidade do ar de 240µg/m
3
para 24 horas e 80µg/m
3
para um ano de
medida das concentrações de partículas totais. Não há padrão estabelecido para PM
2,5.
17
Em Porto Alegre, o índice de qualidade do ar é avaliado e divulgado pela
Fundação Estadual de Proteção Ambiental Henrique Luis Roessler - RS (FEPAM),
seguindo os parâmetros estabelecidos pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
(CONAMA), demonstrado na Tabela 1. Os padrões primários referem-se a concentrações
de poluentes que, ultrapassadas, poderão afetar a saúde da população. Podem ser
entendidos como níveis máximos toleráveis de concentração de poluentes atmosféricos,
constituindo-se em metas de curto e médio prazo. Os secundários são as concentrações
de poluentes atmosféricos abaixo das quais se prevê o mínimo efeito adverso sobre o
bem-estar da população, assim como o mínimo dano à fauna e à flora, aos materiais e ao
meio ambiente em geral. Podem ser entendidos como níveis desejados de concentração
de poluentes, constituindo-se em meta de longo prazo.
Tabela 1. Padrões Nacionais de Qualidade do Ar (Resolução n.º 03 de 28/06/1990,
CONAMA)
Poluente
Tempo de
Amostragem
Padrão Primário
(µg/m³)
Padrão
Secundário
(µg/m³)
24 horas* 240 150 Partículas
Totais em
Suspensão
(PTS)
MGA** 80 60
24 horas* 150 150 Partículas
Inaláveis (PI)
MAA*** 50 50
* Não deve ser excedido mais que uma vez ao ano. ** Média geométrica anual.
*** Média aritmética anual.
18
Essa resolução do CONAMA também estabelece critérios para episódios críticos
de poluição do ar, nos quais temos a presença de altas concentrações de poluentes na
atmosfera em curto período de tempo, como resultante da ocorrência de condições
meteorológicas desfavoráveis à dispersão dos mesmos. Ficam estabelecidos os níveis de
atenção, alerta e emergência (Tabela 2).
Tabela 2. Critérios para episódios críticos de poluição do ar
Poluente
Atenção Alerta Emergência
Partículas Totais em Suspensão (PTS)
µg/m
3
– 24 horas
375 625 875
Partículas Inaláveis (PI)
µg/m
3
– 24 horas
250 420 500
O estabelecimento de padrões de qualidade de ar em grandes cidades tem
contribuído para realização de estimativas que auxiliam na administração das mesmas no
que diz respeito às questões ambientais. Bell et al. (2006), ao avaliar as cidades Santiago
(Chile), São Paulo (Brasil) e Cidade do México (México), estimam que uma política de
redução de emissão de poluentes pode evitar 156.000 mortes, 4 milhões de ataques de
asma, 300.000 atendimentos a crianças e 48.000 casos de bronquite crônica em um
período de 20 anos (2000-2020). Na Cidade do México, entre os anos de 1997 e 2003, a
média das concentrações de MP
10
foi de 60,2 µg/m
3
, já em São Paulo foi de 49,02µg/m
3
.
Na cidade do México, os níveis de MP
10
excederam os padrões em 112 dias em 1995 e
19
apenas 5 dias em 2002. Em Santiago, os níveis de MP
10
diminuíram de 108µg/m
3
(1990)
para 82µg/m
3
(1998), enquanto o MP
2,5
diminui de 65 µg/m
3
para 39 µg/m
3
no mesmo
período (CIFUENTES et al., 2005).
A economia também é afetada pela poluição atmosférica, pois se estimam 8
milhões de ausências no trabalho devido a problemas de saúde referentes à exposição a
poluentes em grandes centros urbanos da América Latina (BELL et al., 2006). Medidas
efetivas para remoção de poluentes estão sendo implantadas nas principais cidades e
incluem áreas de reflorestamento e parques. Embora eficientes, áreas arborizadas geram
gastos em torno de US$ 10.000 por tonelada de MP
10
removida, enquanto controles
relacionados aos combustíveis veiculares custam entre US$ 25.000 e US$ 50.000
(ESCOBEDO et al., 2007).
20
1.1.2 MATERIAL PARTICULADO – FORMAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
O MP consiste em qualquer tipo de partícula sólida ou líquida muito pequena
invisível a olho nu. Sua composição e propriedades químicas são extremamente
variáveis. Segundo Kelly & Sandström (2004), 40% das partículas existentes no ar,
menores que 10µm, são provenientes da exaustão de partículas de diesel, da poeira
carregada pelos ventos, da queima de madeira, das estradas não pavimentadas e também
dos resíduos industriais. No entanto, há uma variabilidade nas fontes emissoras em
diferentes cidades. Na Cidade do México (México), 40% da emissão de partículas
menores que 10µm são oriundos do setor de transporte, enquanto que em Santiago
(Chile) os valores atribuídos são de 86%. (O’RYAN & LARRAGUIBEL, 2000 apud
BELL et al., 2006). A poluição pelos meios de transporte é exacerbada pelo aumento
constante da frota de veículos, longo período de utilização destes, manutenção
inadequada e tráfego congestionado (BELL et al., 2006).
Além de ser proveniente de fontes diretas, o MP também pode ser formado
indiretamente quando gases provenientes da combustão reagem com a luz solar e vapor
de água. Em grandes quantidades, o MP pode formar pequenas nuvens de poluição que
diminuem a visibilidade em diversas cidades, principalmente durante períodos de
inversão térmica (ZIELINSKA, 2005) Nos primeiros 10 quilômetros da atmosfera,
normalmente o ar vai se resfriando à medida que nos distanciamos da superfície da terra.
Assim, o ar mais próximo à superfície, que é mais quente, portanto mais leve, pode
ascender, favorecendo a dispersão dos poluentes emitidos pelas fontes. A inversão
térmica é uma condição meteorológica que ocorre quando uma camada de ar quente
21
sobrepõe-se a uma camada de ar frio, impedindo o movimento ascendente do ar, uma vez
que o ar abaixo dessa camada fica mais frio, portanto mais pesado, fazendo com que os
poluentes se mantenham próximos da superfície. As inversões térmicas são fenômenos
meteorológicos que ocorrem durante todo o ano, sendo que no inverno elas são mais
baixas e mais freqüentes, principalmente no período noturno. Em ambientes com grande
número de indústrias e de circulação de veículos, como o das cidades, a inversão térmica
pode levar a alta concentração de poluentes, podendo ocasionar problemas de saúde
(OGA, 1996).
O deslocamento das partículas na atmosfera pode ocorrer de modo horizontal e
vertical simultaneamente (ZIELINSKA, 2005). As concentrações de metais, adsorvidos a
MP podem diminuir de 4 a 22 vezes à medida que se afasta de um centro onde transitam
diariamente 20 a 25mil veículos (ZIEMACKI et al., 2003).
Classificam-se partículas de acordo com seu diâmetro aerodinâmico: em
ultrafinas (MP
0,1
) que têm diâmetro menor que 0,1µm, partículas finas com diâmetro
entre 0,1 e 2,5µm (MP
2,5
) e partículas com diâmetro entre 2,5 e 10µm são chamadas de
partículas grosseiras (MP
10
). Embora partículas menores que 30µm possam ser inaladas e
absorvidas, e partículas maiores possam causar contaminação do solo ou da água (OGA,
1996), partículas com diâmetro menor que 10µm têm maior relevância em relação à
influência no sistema respiratório. (SMITH & THIER, 1981).
22
1.1.3 MATERIAL PARTICULADO – EFEITOS BIOLÓGICOS
O destino das partículas inaladas depende do seu comportamento aerodinâmico,
além dos fatores anatômicos e fisiológicos. As propriedades dinâmicas das partículas
aéreas, por sua vez, dependem da sua dimensão, forma, densidade, inércia, difusão e
composição química, sendo que a deposição do MP é devido à impactação inercial, à
sedimentação gravitacional e aos movimentos brownianos (ZIELINSKA, 2005). Quanto
à inércia, partículas inaladas movem-se rapidamente pelo interior das vias aéreas. A
tendência da partícula se mover na mesma direção é considerada inércia, que pode
aumentar conforme a velocidade da entrada do ar (CARLISLE & SHARP, 2001). Essa
característica resulta em maior deposição nas vias aéreas superiores, podendo ser
incrementada com o aumento da freqüência respiratória. A sedimentação das partículas
depende da densidade das mesmas, e quanto mais lenta e profunda for a respiração,
maior a sedimentação. A difusão das partículas através dos movimentos brownianos é
uma característica considerada apenas nas unidades respiratórias terminais, onde a massa
de ar em movimento é baixa. A difusão dos gases é muito mais rápida do que das
partículas, no entanto considera-se relevante a difusão de partículas menores que 0,5µm.
Assim, a deposição de partículas ao longo das vias aéreas depende de seu
diâmetro aerodinâmico (MARCONI, 2003) (Figura 1). Enquanto partículas maiores que
10µm raramente ultrapassam a cavidade nasal, partículas de 1µm dificilmente são retidas
nessa região. Já partículas com 2µm apresentam pico de deposição na região alveolar. No
entanto, estas características são idealizadas desconsiderando a composição das
23
partículas, pois materiais mais solúveis rapidamente entram na corrente sangüínea,
podendo atingir outros órgãos, enquanto as menos solúveis se depositam e podem causar
lesões epiteliais e atuar sobre vários receptores (HAUCK, 1998; GOMES, 2002). Desse
modo, a inalação, deposição e absorção de MP podem afetar o aparelho respiratório e
atingir a circulação sistêmica distribuindo-se para outros órgãos, como o coração
(GOMES, 2002).
Figura 1. Região de deposição das partículas inaladas de acordo com seu diâmetro aerodinâmico. (A)
Alvéolos, (TB) Traquéia e Brônquios e (NFL) Nariz, Faringe e Laringe. (Adaptado de MARCONI,
2003)
Associação entre exposição a diferentes concentrações de MP e alteração da
função respiratória e cardiovascular, vem sendo demonstrada em estudos
epidemiológicos. Essa associação torna-se mais evidente em indivíduos particularmente
suscetíveis como crianças (NASCIMENTO et al, 2006; DELFINO et al, 2004;
TIMONEN et al, 2002; FREITAS et al., 2004, SALDIVA et al., 1994; CANÇADO, et
al., 2006; NASCIMENTO et al., 2006; FARHAT et al., 2005), idosos (CANÇADO, et
24
al., 2006; FREITAS et al., 2004; DEVLIN et al., 2003; SALDIVA et al., 1995),
gestantes (GOUVEIA et al., 2004), ou indivíduos com doenças cardíacas (IBALD-
MULLI et al., 2004; KLOT et al., 2005; ZANOBETTI et al., 2004; LAGORIO et al.,
2003; PEKKANEN et al., 2002) e/ou pulmonares (ZEKA et al., 2006; LAGORIO et al.,
2006; LAGORIO et al., 2003).
A análise da função expiratória pulmonar é capaz de avaliar a influência dos
níveis de MP sobre o trato respiratório. Os indivíduos expostos a esse poluente
apresentam diminuição do volume expiratório forçado em um segundo, diminuição da
capacidade vital forçada e do pico de fluxo expiratório, afetando principalmente
indivíduos asmáticos (TURNOVSKA et al., 2007; DELFINO et al., 2004; LAGORIO et
al., 2003; PENTTINEN et al., 2001; TIMONEN et al., 2002; GRIEVINK et al., 1998).
Dentre os mecanismos relacionados à disfunção cardiovascular (TURNOVSKA et al.,
2007) está o aumento da freqüência cardíaca (LAGORIO et al., 2003), a diminuição da
variabilidade da freqüência cardíaca (SANTOS et al., 2005; DEVLIN et al., 2003;
GOLD et al. 2000; IBALD-MULLI et al., 2004; LAGORIO et al., 2003) a alteração na
pressão arterial (SANTOS et al., 2005; ZANOBETTI et al., 2004; IBALD-MULLI et al.,
2004; VOLPINO et al., 2004) e a indução de eventos arrítmicos e isquêmicos cardíacos
(VOLPINO et al., 2004; PEKKANEN et al., 2002; ZAREBA et al., 2001). A ação do
MP sobre o sistema cardiopulmonar pode ser também demonstrada pelo aumento da
resposta inflamatória pulmonar (SOUKUP & BECKER, 2001) e circulatória
(SULLIVAN et al., 2007; SALVI et al., 1999). A inalação de MP resulta em alterações
na relação entre o sistema pulmonar e circulatório, demonstrada pela queda na saturação
da hemoglobina pelo oxigênio (VOLPINO et al., 2004; DeMEO et al., 2004). Devido a
25
tantas evidências, a American Heart Association emitiu um posicionamento oficial sobre
a associação entre poluição atmosférica e doenças cardiovasculares (BROOK et al.,
2004).
O risco à saúde associado à inalação de MP, também é devido ao seu potencial de
adsorção de metais, gases tóxicos como óxidos de nitrogênio ou de enxofre, ou até
mesmo microorganismos, conferindo as partículas características toxicológicas
diferentes, de acordo com sua fonte. Após a inalação, esses componentes podem ser
carreados até os alvéolos juntamente com o MP, causando danos significativos. Segundo
Kelly & Sandström (2004), partículas do ar carregam metais redox ativos, que através de
reações químicas colaboram para formação de processos oxidativos no pulmão.
Efeitos tóxicos podem ocorrer não só em nível local como sistêmico. Gonzalez-
Flecha (2004) sugere a existência de dois mecanismos responsáveis pela toxicidade ao
sistema cardiopulmonar proveniente da inalação de MP: 1) mecanismo direto, causado
pelas próprias partículas e seus componentes adsorvidos; 2) mecanismos indiretos,
relacionados com a indução de mediadores pró-inflamatórios e/ou desbalanço do sistema
nervoso autônomo. Uma característica comum a ambos é a capacidade de induzir a
produção de espécies ativas de oxigênio (EAO). Nas figuras 2 e 3, são demonstrados os
mecanismos de formação de EAO no coração e no pulmão, respectivamente.
26
Figura 2. Mecanismos de formação de espécies ativas de oxigênio no coração em resposta a inalação
de material particulado. (adaptado de GONZALEZ-FLECHA, 2004)
Figura 3. Mecanismos de formação de espécies ativas de oxigênio no pulmão em resposta a inalação
de material particulado. (adaptado de GONZALEZ-FLECHA, 2004).
27
As respostas inflamatórias são mais dependentes do tipo de metal inalado do que
da concentração total de poluentes no ar. A composição e, conseqüentemente, os efeitos
biológicos da inalação de partículas se diferem de acordo com sua fonte emissora e
estação climática em que foi produzida (SEAGRAVE et al., 2006). Diferentes metais
podem ter diferentes efeitos no organismo, variando no tempo de resposta inflamatória
(imediatos ou tardios) e/ou na duração da mesma (rápida ou prolongada) (RICE et al.,
2001). Nesse sentido, foi verificada uma correlação positiva entre a exposição ao
manganês, ferro, cobre e zinco e o aumento de estresse oxidativo no pulmão. Resultado
similar foi encontrado entre a exposição ao alumínio, silício, titânio ou ferro, e a resposta
oxidativa do coração (GURGUEIRA et al., 2002).
Mais detalhadamente, deve-se ressaltar que macrófagos pulmonares constituem a
primeira linha de defesa em resposta à inalação de poluentes. Esses macrófagos
produzem uma variedade de mediadores pró-inflamatórios e antiinflamatórios quando
estimulados por um agente externo. Entre estes mediadores estão citocinas, fatores de
crescimento (principalmente o fator de necrose tumoral alfa, TNF-α) e derivados do
ácido araquidônico (IMRICH et al., 2007). Embora a formação de EAO, por esses
mediadores, seja necessária para a defesa do organismo, as EAO podem causar danos
secundários ao tecido. Alguns estudos (GONZALEZ-FLECHA, 2004; GHIO et al.,
2002) sugerem que o estresse oxidativo é capaz de aumentar a expressão de neutrófilos
quimiotáxicos contribuindo para inflamação pulmonar aguda ou crônica. Estudos in vivo,
mostram que MP aumenta a produção de citocinas e quimiocinas, injúria pulmonar e
migração de neutrófilos. In vitro, MP afeta os macrófagos alveolares, as células epiteliais
28
(MAZZARELLA et al., 2007; AUGER et al., 2006; DYE et al., 1999) e os neutrófilos
(AAM & FONUNNUM, 2007), demonstrando relação com os estudos de estresse
oxidativo causado por MP in vivo (PINHO et al., 2005; PINHO et al. 2004; MUDWAY
et al., 2004; TAO et al., 2003; GHIO et al., 2001).
A relação entre o aumento da lipoperoxidação (LPO) e exposição a MP foi
também demonstrada por Sánchez-Rodríguez et al. (2005). Esses autores demonstraram
que indivíduos que vivem na Cidade do México, sabidamente com níveis de qualidade
do ar inadequados, apresentaram 50% mais LPO plasmática quando comparados aos
indivíduos de cidades vizinhas.
A inalação de MP gera reflexos vasoconstritores nas vias aéreas, iniciados por
terminações nervosas livres na narina e nos brônquios, conduzidos por fibras aferentes e
eferentes do nervo vago. Esse reflexo é passível de bloqueio por atropina, evidenciando
uma resposta do sistema parassimpático. Esta resposta é demonstrada por uma típica
curva dose resposta de efeito constritor devido à inalação de partículas (WHIPP &
WASSERMAN 1991). Os mecanismos oxidativos propostos por Gonzalez-Flecha (2004)
são baseados em trabalhos experimentais de seu grupo. Rhoden et al. (2005)
demonstraram a participação dos sistemas simpático e parassimpático na formação de
danos oxidativos gerados pela inalação de MP. Nesse sentido, Gurgueira et al. (2002)
demonstraram que houve aumento na quimiluminescência do pulmão e coração de ratos
expostos ao concentrador de partículas. Também foram demonstradas respostas
diferentes, conforme o órgão considerado, de forma que no pulmão houve aumento de
oxidação após três horas de exposição, enquanto no coração este efeito apareceu apenas
após cinco horas de exposição. Em trabalho subseqüente, foi demonstrado por Rhoden et
29
al. (2004) que o tratamento com N-acetilcisteína pode prevenir a inflamação pulmonar
induzida pela exposição por cinco horas ao concentrado de partículas à poluição,
indicando a participação direta de mecanismos oxidativos em danos pulmonares
induzidos por MP.
O perfil de enzimas antioxidantes também é modificado pela inalação de
concentrado de partículas. Gurgueira, et al. (2002) demonstraram aumento da atividade
de enzimas importantes no aparato antioxidante, superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT), no pulmão e coração, sendo que essa adaptação é tecido específica: no pulmão
foi encontrado um aumento na indução (70%) para Mn-SOD (a isoforma mitocondrial de
SOD). A CuZnSOD (isoforma citosólica) não apresentou alterações enquanto a CAT
aumentou em 30%. No coração, Cu/ZNSOD aumentou em 100%, Mn-SOD, 40% e CAT,
20%,
Considerando a hipótese da participação de oxidantes na toxicidade de MP,
PEREIRA (2006) demonstrou que ratos expostos à inalação de MP por vinte horas na
cidade de Porto Alegre apresentaram aumento de LPO pulmonar e aumento da resposta
inflamatória bronco alveolar.
Em resumo, a inalação de MP resulta em eventos complexos de toxicidade:
estimulação de receptores pulmonares e células do sistema imune; produção de EAO e
indução de mediadores pró-inflamatórios que podem transformar efeitos locais
(inflamação pulmonar, obstrução da vias aéreas) em efeitos sistêmicos (disfunção
cardíaca, alterações no SNA, alteração na coagulação sangüínea).
30
1.1.4 MATERIAL PARTICULADO – MÉTODOS DE EXPOSIÇÃO
O método mais fidedigno para testar as hipóteses relacionadas aos mecanismos
pelos quais o MP causa seus efeitos biológicos seria a exposição controlada de
indivíduos. No entanto, esses estudos normalmente envolvem um pequeno número de
pessoas e são limitados por razões éticas óbvias. Do mesmo modo, biópsias pulmonares
são raramente possíveis para uma melhor avaliação. O uso de experimentos com animais
possibilita um estudo mais minucioso sobre os mecanismos de toxicidade do MP
(GERDE, 2005). O modelo de inalação de partículas, através de aerosol ou de fluxo
contínuo de ar, é o modelo que melhor mimetiza a exposição ao MP em níveis urbanos.
O modelo de instilação via nasal ou intratraqueal torna-se uma alternativa mais prática e
permite estabelecer relações entre a dose-efeito, a quantidade de MP instilado e os efeitos
biológicos mensurados. Estudos com exposição in vitro são alternativas interessantes sob
o ponto de vista de avaliar uma resposta específica a um dado tipo celular. É importante
salientar que cada método possui vantagens e desvantagens. O método mais realista
normalmente demonstra efeitos biológicos menos pronunciados, mas explora as
condições de exposição em que a população se encontra, sujeita a alterações
diárias/horárias conforme a temperatura, ventos, umidade e tráfego de veículos. Métodos
alternativos com dose estabelecida de partículas permitem uma avaliação mais completa
da toxicocinética e da toxicodinâmica envolvida (SEAGRAVE et al., 2005).
31
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO
1.2.1 FORMAÇÃO DAS ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO
No processo respiratório tem-se, sempre, seja em maior ou menor escala, a
formação de espécies intermediárias de oxigênio, com potencial citotóxico, chamados de
EAO. O metabolismo dos seres aeróbios está então de posse de um paradoxo vital: a
imprescindibilidade do O
2
para manutenção da vida e, por outro lado, seu potencial de
toxicidade diante de vias oxidativas no processo respiratório mitocondrial. Em órgãos
onde a atividade metabólica é mais intensa, verifica-se uma maior população
mitocondrial. Em geral, cerca de 20% do volume citoplasmático é ocupado pelas
mitocôndrias.
Através da cadeia de elétrons mitocondrial, o oxigênio deve sofrer uma redução
tetraeletrônica (estável), catalisada pela citocromo-oxidase. É essa enzima que
condiciona a reação a ocorrer em uma única etapa, sem formação de intermediários,
devido ao seu potencial redutor (POWERS & HOWLEY, 2000). No entanto, isso ocorre
com 95% do oxigênio molecular, e os 5% restantes são reduzidos formando, então, as
chamadas EAO ou radicais livres.
O escape de O
2
desta rota origina as EAO, pois fora
dela dão-se comumente as reduções monoeletrônicas, ou seja, reduções incompletas do
oxigênio.
O termo radical livre designa um átomo ou grupo de átomos com um elétron
desemparelhado, isto é, um elétron ímpar em sua órbita mais externa (Figura 4), o que
32
lhe confere um caráter altamente reativo e com um tempo de vida incrivelmente fugaz,
da ordem de milésimos de segundo.
Figura 4. Distribuição eletrônica nas espécies ativas de oxigênio (EAO) mostrando apenas os elétrons
dos orbitais π externos.
A formação desses compostos é estabelecida pela perda ou ganho de um elétron,
como, por exemplo, na fissão homolítica de uma ligação covalente, em que cada um dos
átomos fica com um elétron desemparelhado. Cabe ressaltar que, embora o oxigênio
molecular no estado fundamental seja um bi-radical, sua reatividade é baixa, por que seus
dois elétrons desemparelhados têm spins paralelos (FERREIRA & MATSUBARA,
1997).
Em razão de sua configuração eletrônica, o oxigênio tem uma forte tendência a
receber um elétron de cada vez. A conversão univalente do oxigênio a água processa-se
da seguinte maneira:
Reação 1: O
2
+ 4e
-
+ 4H
+
→ 2 H
2
O + energia
33
A adição de um elétron a uma molécula de oxigênio no estado fundamental gera a
formação do radical superóxido (O
2
.-
).
Reação 2: O
2
+ e
-
→ O
2
.-
O superóxido, ao receber mais um elétron e dois íons hidrogênio, forma o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) através do processo chamado dismutação. Esta reação é
catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD) encontrada em quantidades elevadas
nas células dos mamíferos e que acelera a velocidade da reação em 10.000 vezes quando
comparada com a dismutação espontânea em um pH fisiológico.
Reação 3: 2O
2
.-
+ 2H
+
SOD H
2
O
2
+ O
2
Quando o peróxido de hidrogênio recebe mais um elétron e um íon hidrogênio, é
formado o radical hidroxil (OH
.
), o mais reativo dos intermediários, pois reage e altera
qualquer estrutura celular que esteja próxima e, assim, influencia enzimas, membranas ou
ácidos nucléicos. O radical hidroxil pode ser formado, também, quando o peróxido de
hidrogênio reage com íons ferro ou cobre (reação de Fenton).
Reação 4: Fé
+2
/Cu + H
2
O
2
→ OH
.
+ OH
-
+ Fé
+3
/ Cu
-2
34
Os íons de metais de transição podem, também, catalisar a reação entre o
peróxido de hidrogênio e o superóxido, o que resulta na produção do radical hidroxil
(reação de Haber-Weiss).
Reação 5: H
2
O
2
+ O
2
.-
Fe/Cu OH
.
+ OH
-
+ O
2
Os radicais superóxido (O
2
.-
) e hidroxil (OH
.
) apresentam elétrons
desemparelhados na sua órbita mais externa e são, portanto, chamados radicais livres. O
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) não é um radical livre, pois representa um metabólito do
oxigênio parcialmente reduzido. Outras espécies de interesse são os oxigênios singlet,
que são formas de oxigênio spin alterada. Estes metabólitos derivados do oxigênio são
denominados EAO em função de sua grande reatividade para biomoléculas e, em geral,
alternam o tamanho e a forma dos compostos com os quais os mesmos interagem.
Além disso, o radical superóxido pode reagir diretamente com o óxido nítrico
(NO), um radical livre centrado no nitrogênio, gerando peroxinitrito. Este pode levar à
formação de um oxidante com características do radical hidroxil.
Reação 6: O
2
.-
+ NO → ONOO
-
→ ONOO
-
+ H
+
→ OH
.
Em resumo, o metabolismo do oxigênio é capaz de formar EAO, sendo ou não
espécies radicalares (Tabela 3).
35
Tabela 3. Espécies ativas de oxigênio
Radicais livres Não radicais
Superóxido O
2
.
-
Peróxido de hidrogênio H
2
O
2
Hidroxil OH
.
Ácido hipocloroso HOCl
Peroxil RO
2
.
Ozônio O
3
Alcoxil RO
.
Peroxinitrito ONOO
-
Hidroxil HO
2
.
36
1.2.2 MECANISMOS ANTIOXIDANTES
Desde que a vida aeróbia se tornou possível, os organismos necessitaram de
dispositivos biológicos que lhes permitissem lidar com a toxicidade do O
2
. As
providências adotadas deram-se pela elaboração de sistemas enzimáticos e não
enzimáticos que podem agir como scavenger (varredores), formando a partir de EAO
produtos menos tóxicos, ou como quencher (absorvendo a energia de excitação destes
radicais, neutralizando-os).
Os antioxidantes biológicos podem exibir dois modos de ação distintos contra as
EAO, atuando como inibidores da síntese de EAO ou como inativadores das espécies já
formadas.
A inativação das espécies já formadas é o processo antioxidante mais usual, seja
através da catálise enzimática ou por combinação desta com scavengers, compostos
altamente hábeis em liberar de sua molécula elétrons ou átomos completos de
hidrogênio, estabilizando, prontamente, as EAO.
O aumento da capacidade enzimática para metabolizar O
2
é, invariavelmente,
acompanhado do aumento das enzimas especializadas que desativam as EAO. O aparato
enzimático antioxidante celular é constituído basicamente por três enzimas: superóxido-
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) (JI, 1999).
A SOD é o maior sistema de defesa em células aeróbias, combatendo os efeitos
tóxicos do oxigênio. Ela pode ter localização intra e extracelular. A enzima localizada no
citosol das células eucarióticas contém o cobre e o zinco em seu sítio ativo (CuZn-SOD)
37
e a localizada na matriz mitocondrial contém manganês (Mn-SOD). A SOD extracelular
também possui o cobre e o zinco no seu sítio ativo, porém seu peso molecular é maior
em relação ao da citosólica. Esse complexo enzimático catalisa a dismutação do radical
O
2
.
-
para formar H
2
O
2
e oxigênio (reação 3).
A CAT é uma hemoproteína com atividade peroxidase específica para H
2
O
2
localizada, principalmente, em organelas intracelulares como os peroxissomos, cuja
função é a remoção do H
2
O
2
no meio (reação 7). Encontra-se, amplamente, distribuída
em órgãos como o fígado, os rins e em baixas concentrações no cérebro.
Reação 7: 2 H
2
O
2
CAT 2 H
2
O + O
2
A GPx tem ação peroxidásica inespecífica para H
2
O
2
, podendo ou não utilizar
selênio como co-fator. Apresenta intensa atividade no fígado e nos eritrócitos, moderada
no coração, rins e pulmões e baixa nos músculos. Esta enzima é a principal envolvida na
remoção de H
2
O
2
do cérebro, a qual oxida a glutationa reduzida (GSH). Esta é um tiol de
baixo peso molecular, encontrado no citoplasma e corresponde à maior reserva de
cisteína. A GPx mais o NADPH pode reduzir peróxidos lipídicos, radicais livres e H
2
O
2
.
A GSH é convertida em dissulfeto de glutationa (GSSG) que é reconvertida a GSH pela
glutationa redutase.
A exposição de animais a concentrações aumentadas de O
2
freqüentemente
aumenta a atividade da SOD, CAT e GPX em muitos tecidos, o que significa que a
quantidade presente normalmente é suficiente somente para equilibrar as taxas normais
38
de produção das EAO e, assim, preservar a integridade celular (RAHMAN, 2005;
GIANNERINI et al., 2001; BEJMA et al., 2000)
Os sistemas não enzimáticos podem ser divididos em hidrofóbicos, hidrofílicos e
estruturais. Os ácidos graxos poliinsaturados das membranas lipídicas compõem a região
hidrofóbica das células. O α-tocoferol (vitamina E) e os β-carotenos (vitamina A),
presentes nas membranas celulares fornecem átomos de hidrogênio e podem prevenir as
reações de peroxidação propagadas em cadeia nas mesmas, evitando a desestruturação da
arquitetura celular (SEN & PACKER, 2000; JI, 1999). Podem atuar, também, como
quencher de espécies excitadas, agindo na etapa de terminação da LPO. Os carotenóides
são compostos isoprenóides amplamente distribuídos na natureza, onde desempenham
um importante papel protetor das células e dos organismos (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1999).
Por outro lado, os sistemas hidrofílicos são representados por substâncias
químicas que agem impedindo as reações dos radicais livres nos meios iônicos e aquosos
dos compartimentos celulares. O ácido ascórbico, a cisteína e a glutationa reduzida, a
ceruloplasmina, a transferrina, o triptofano e a histidina são os principais representantes,
agindo, principalmente, no controle da produção do radical OH
.
(DEL MAESTRO,
1980).
O colesterol, intercalado no interior das membranas, pelo seu tamanho e estrutura
é o principal representante dos sistemas estruturais, podendo proteger os ácidos graxos da
lesão peroxidativa. O α-tocoferol também é considerado um antioxidante estrutural, por
39
se intercalar nas membranas celulares. A localização de certos peroxissomos e
mitocôndrias, com seus mecanismos especializados de scavengers, parecem ter papel
importante no controle de reações causadas pelos radicais livres (DEL MAESTRO,
1980).
A vitamina A tem ação de quencher de oxigênio singlet. A vitamina C, a
albumina e a n-acetilcisteína são scavengers de EAO. A vitamina E tem ação
antioxidante bloqueando canais para as substâncias lipossolúveis, tendo participação,
também, na regeneração de GSH e do ácido ascórbico, substâncias também com caráter
antioxidante (PINCEMAIL, 1995).
Pode-se dizer que um organismo encontra-se sob estresse oxidativo, quando
ocorre um desequilíbrio entre os sistemas pró-oxidantes e antioxidantes, de maneira que
os primeiros sejam predominantes (SIES, 1997). Tendo em vista que as células do corpo
humano vivem em constante atividade devido à predominância do metabolismo
oxidativo, pode-se considerar que durante atividades amenas ou mesmo durante o
metabolismo basal, o corpo humano trabalha sob uma normalidade oxidativa. Este estado
basal consiste em formação de EAO em torno de 5% do volume de O
2
admitidos à
intimidade celular que são reduzidos de forma incompleta por outros sistemas
enzimáticos, que não o da citocromo-oxidase. Dentro desses parâmetros, identificam-se
dois tipos de estresse oxidativo: o basal e o estimulado. Quando é imposta à célula uma
sobrecarga de solicitação, instala-se o estimulado, ou seja, aumenta o nível de estresse já
constante nesse sistema. Portanto, ao referir-se ao estresse oxidativo, descrevem-se níveis
40
acima do metabolismo basal (respostas metabólicas ao esforço, por exemplo), porém, não
necessariamente, em níveis patológicos imediatos.
41
1.2.3 DANOS CAUSADOS POR ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO
A LPO é uma reação em cadeia que ocorre na membrana celular e pode ser
dividida em três etapas:
Iniciação: provavelmente o radical hidroxil ou oxigênio singlet – espécies com
spins antiparalelos – reagem abstraindo um átomo de hidrogênio de um grupo metileno (-
CH2-) da cadeia lateral de um ácido graxo poliinsaturado (AGPI) formando um radical
centrado no carbono. Os hidrogênios ligados aos carbonos metilenos são univalentes,
portanto mais reativos.
L-CH + OH
.
→ L-C
.
+ H
2
O
Onde L representa a continuação da cadeia do ácido graxo.
Propagação: este radical centrado no carbono (L-C), por sua vez, reage com o
oxigênio produzindo radicais peroxil, os quais propagam a reação.
L-C
.
+ O
2
→ L-C-O-O
.
Terminação: ocorre quando dois radicais reagem entre si
L-C
.
+ L-C
.
→ L-C-C-L
A LPO pode alterar a permeabilidade das membranas, induzindo a formação de
poros hidrofílicos. Os produtos da degradação podem se difundir do local das reações e
dar origem ao edema celular, às alterações da permeabilidade vascular, à inflamação e à
42
quimiotaxia, bem como causar a polimerização das proteínas de membrana. (FERREIRA
& MATSUBARA, 1997).
A fim de mensurar o dano oxidativo lipídico, pode-se quantificar os produtos da
LPO, como o malondialdeido (MDA), os hidrocarbonetos voláteis (gases etano e
pentano), os aldeídos saturados, insaturados e as cetonas. Alguns produtos podem, ainda,
reagir entre si, formando um tetróxido instável que, decomposto, dá origem a dois
oxigênios singlet e uma carbonila excitada. Estas espécies excitadas retornam ao seu
estado fundamental emitindo luz visível. Esse processo é conhecido por
quimiluminescência (IWAOKA et al., 1987; BOVERIS et al., 1981) e constitui-se num
importante método indireto de quantificação de LPO (Figura 5).
43
Figura 5. Representação esquemática das etapas da lipoperoxidação de membranas celulares.
1
O
2
= oxigênio singlete e CO* = carbonila excitada (Adaptado de DEL MAESTRO, 1980). Além da
QL muitas técnicas estão disponíveis para medir a taxa de peroxidação dos lipídios, dentre elas o
TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) para medir aldeídos (entre eles o MDA), a
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). É importante salientar que cada técnica é capaz de
quantificar produtos diferentes, sendo que um método isolado não deve ser usado como medida
global de estresse oxidativo.
44
Além dos danos lipídicos, as EAO podem causar danos diretamente às proteínas,
levando às diversas disfunções celulares. As enzimas, formadas a partir de aminoácidos
essenciais, podem perder a atividade. Além disso, podem ocorrer danos aos receptores
celulares, a interferência na sinalização intracelular mediada por proteínas e a alteração
de proteínas de membrana com a função de transporte de íons.
Danos secundários podem ocorrer após o estresse oxidativo protéico: proteínas
oxidadas podem ser reconhecidas por células do sistema imune, alterando a formação de
anticorpos e gerando doenças auto-imunes. Enzimas responsáveis por reparações ao
DNA (endonucleases, ligases, etc) também podem sofrer oxidação e aumentar a
incidência de mutações (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).
A oxidação de DNA pode gerar mutações, carcinogênese, envelhecimento celular
ou induzir apoptose. O mecanismo para este fenômeno é a oxidação de adenina, guanina
e pirimidinas (citosina e timina). Estas reagem, respectivamente, com o peróxido de
hidrogênio, oxigênio singlet e radicais hidroxil. As diferentes EAO têm locais específicos
de interação com DNA e diferentes mecanismos de ação, de modo que podem interferir
na sua replicação e alterar os pares de bases de aminoácidos transcritos. As alterações
mais comuns são as transcrições trocadas de citosina para timina e de guanina para
citosina. A transcrição de aminoácidos errôneos pode gerar super ou subexpressão de
proteínas ou, ainda, expressando-as de maneira defeituosa, interferindo no bom
funcionamento celular.
45
As bases de DNA e os nucleotídeos oxidados têm sido usados como
biomarcadores de estresse oxidativo em cultura de células e tecidos. Pode-se, também,
avaliar fluidos biológicos, como, por exemplo, a urina (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1999; CADET et al., 1995).
46
1.2.4 DOENÇAS RELACIONADAS AO ESTRESSE OXIDATIVO
O envolvimento das EAO na patogenia de um grande número de moléstias é,
hoje, fato irrefutável. Existem evidências de que mais de 50 doenças podem estar
relacionadas com o metabolismo oxidativo. Da mesma forma, o envelhecimento do
organismo, ou seja, a perda da vitalidade celular com o avançar da idade é resultado dos
danos acumulados pela ação das EAO na intimidade dos tecidos. (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997).
O cotidiano dos seres humanos está repleto de fatores que podem colaborar para a
deterioração do organismo. Entre estes fatores podemos destacar o estresse psicológico,
os maus hábitos alimentares, o consumo de álcool, o tabagismo, a exposição aos raios
ultravioleta, a poluição do ar e o sedentarismo (MOLLER et al., 1996).
Quanto ao estresse psicológico, tem sido relacionado por Moller et al., (1996) que
indivíduos com personalidades hostis são mais propensos à aterosclerose. Como a
formação da aterosclerose está relacionada com os eventos de oxidação de lipoproteínas
no endotélio, considera-se o estresse psicológico um fator importante para a formação de
EAO e a conseqüente desordem vascular.
No que diz respeito aos hábitos alimentares, há, na literatura, um vasto índice de
trabalhos que demonstraram, em combate ao câncer e às doenças cardiovasculares, os
benefícios de uma dieta rica em antioxidantes e vitaminas (PAPAS, 1999). A restrição
47
calórica pode melhorar a habilidade do organismo de remover substâncias reativas,
moléculas danificadas e reparar os danos causados ao DNA.
Existe uma grande correlação entre o consumo de álcool, as EAO e as desordens
hepáticas. O alcoolismo eleva a LPO hepática promovendo severas doenças hepáticas
como a cirrose. O consumo de bebidas alcóolicas causa o aumento na concentração de
HDL e diminui a habilidade de agregação plaquetária. As EAO são mediadoras de
agregação plaquetária no endotélio lesionado, sendo fatores determinantes para o
surgimento das doenças vasculares. Os radicais livres estão diretamente relacionados
com estresse oxidativo em eventos de isquemia e reperfusão tecidual (HAMILTON et
al., 2003).
A condição de sedentarismo favorece distúrbios metabólicos podendo gerar
obesidade. Fenster et al. (2002) descreveram a participação de adipócitos na formação
das EAO, induzindo disfunções vasculares. Nesse sentido, Vincent et al. (2004)
demonstraram aumento no dano oxidativo lipídico após o exercício físico acentuado em
indivíduos obesos.
As EAO podem desencadear processos degenerativos, tais como a oclusão
vascular por aterosclerose, a osteoartrite, o câncer brônquico, o pulmonar e o cutâneo,
alterações no sistema digestivo e sistema nervoso central, o embranquecimento do
cabelo, o aparecimento de rugas e de manchas cutâneas, entre outros. Numa falha
genética que gera uma menor produção de enzimas antioxidantes (CAT, SOD, GPX),
ocorrem extensas implicações metabólicas.
48
Muitas doenças respiratórias têm sido associadas ao aumento de produção de
EAO, dentre estas a asma, a doença pulmonar obstrutiva crônica, a apnéia obstrutiva do
sono, a síndrome do desconforto respiratório agudo, a fibrose idiopática, a
pneumoconiose (RAHMAN, 2005; ANDRADE JUNIOR et al., 2005). Enfim, muitas
células do parênquima pulmonar são capazes de gerar EAO como as células endoteliais,
as células alveolares tipo II, as células Clara, as células ciliadas da via aérea e os
macrófagos pulmonares.
O sistema antioxidante pulmonar dispõe de diversos mecanismos protetores
contra a oxidação. Dentre estes se destaca em nível alveolar a enzima catalase, uma
proteína homotetramérica de 240kDa, responsável pela decomposição de peróxido de
hidrogênio. Considerada a enzima mais importante no consumo de H
2
O
2
de origem
exógena, esta enzima está localizada, fundamentalmente, em pneumócitos alveolares tipo
II, que são as células pulmonares mais resistentes, mas, também, expressas em
macrófagos (RAHMAN, 2005).
49
Figura 6. Algumas doenças humanas relacionadas com excessiva produção de espécies ativas de
oxigênio (Adaptado de PINCEMAIL, 1995).
50
1.3 EXERCÍCIO
Atualmente é amplamente divulgado na literatura cientifica e, conseqüentemente,
nos meios de comunicação em geral, os benefícios gerados por um estilo de vida
saudável, tendo como fator de destaque para sua obtenção a prática de exercícios físicos
regularmente.
Atividade física é considerada qualquer forma de atividade muscular e resulta no
gasto energético proporcional ao trabalho muscular realizado. O exercício físico
representa um subgrupo da atividade física planejado com o objetivo de melhorar ou
manter o condicionamento (POWERS & HOWLEY, 2000).
Para uma análise de respostas metabólicas do exercício, devem ser levados em
consideração alguns pontos fundamentais: primeiramente, deve estar claro se o fenômeno
metabólico analisado é a resposta para aquela sessão de exercício (resposta aguda), ou se
é uma resposta em uma sessão após um período de treinamento (resposta crônica);
secundariamente, deve-se analisar a intensidade e a duração do exercício.
Uma sessão de exercício resulta em adaptações metabólicas tanto durante como
depois do esforço. Durante a atividade muscular, a demanda energética pode superar a de
repouso em até 35 vezes (ASTRAND et al., 2003), enquanto o consumo de oxigênio
pode aumentar de dez a quinze vezes (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Portanto,
a quantidade de sangue bombeada pelo coração deve ser alterada de acordo com a
demanda elevada de oxigênio consumido na musculatura esquelética. Deste modo, os
51
fatores mais proeminentes no controle da freqüência cardíaca durante o exercício são o
sistema nervoso simpático e parassimpático. O aumento inicial da freqüência cardíaca
deve-se a remoção do tônus parassimpático e, posteriormente, de acordo com a
intensidade, aumento na estimulação nervosa simpática sobre o nodo sinoatrial. Se a taxa
de trabalho for constante e abaixo do limiar de lactato, um platô de estabilidade da FC,
do volume sistólico e do débito cardíaco é atingido em dois ou três minutos. Além disso,
os estímulos gerados pelo exercício em mecanorreceptores cardíacos e musculares,
quimiorreceptores e barorreceptores auxiliam no controle cardiovascular através de um
sistema de retroalimentação para o comando central localizado no cérebro.
Assim como o sistema cardiovascular, o sistema respiratório sofre adaptações
rápidas ao iniciar uma sessão de exercício. Rapidamente ocorre um aumento na
ventilação até encontrar um nível de estabilidade em cargas de trabalho constante.
Alterações no pH sanguíneo estimulam receptores carotídeos com íons H
+
aumentando a
ventilação. Esta relação entre o pH e a ventilação resulta na mensuração do lactato
sanguíneo como forma não invasiva para a verificação do limiar ventilatório.
Catecolaminas circulantes e o aumento da temperatura corporal durante o exercício
também contribuem para o aumento da ventilação (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1999).
52
1.3.1 EXERCÍCIO FÍSICO E ESTRESSE OXIDATIVO
As adaptações cardiopulmorares dependentes da intensidade e duração do
exercício podem modular a resposta oxidante e antioxidante do organismo
(SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004). Segundo Moller et al. (1996), o exercício físico
está relacionado ao estresse oxidativo de duas maneiras: por um lado o exercício acelera
o metabolismo oxidativo gerando uma maior formação de radicais livres e, por outro, um
efeito protetor antioxidante que pode ser gerado através de sessões regulares. A redução
completa do O
2
no sistema de transporte de elétrons mitocondrial ocorre com
aproximadamente 95% do O
2,
enquanto que o restante é reduzido pelo metabolismo
celular formando EAO tanto em repouso como durante o exercício. Portanto, o que se
altera durante o exercício é o consumo de O
2
por minuto e não a taxa de formação de
EAO (SIGNORINI & SIGNORINI, 1993).
Desta forma, é possível relacionar o estresse oxidativo com a intensidade do
exercício, uma vez que intensidades moderadas não parecem induzir danos oxidativos ao
organismo, diferente do que ocorre com exercício de alta intensidade (SOUZA et al.,
2005; ALESSIO, 1993). O dano oxidativo lipídico que ocorre na resposta aguda é
proporcional à intensidade do exercício (ALESSIO, 1993; ALESSIO et al., 1988),
enquanto que os danos ao DNA, um indicativo de que mutações genéticas podem ser
causadas por estresse oxidativo, não estão relacionados com a mesma (SEN, 1994). A
correlação existente entre a concentração de lactato [LA], um marcador de intensidade, e
53
LPO, ambas diminuídas em exercício de baixa intensidade, sugere menor dano oxidativo
gerado em exercícios submáximos.
Em intensidades baixas ou moderadas, pequenos incrementos na intensidade
resultam em um significativo aumento no consumo de oxigênio (VO
2
) até que o estado
de equilíbrio seja alcançado, fenômeno que leva aproximadamente 3 minutos,
dependendo da magnitude do incremento e do estado de condicionamento do indivíduo.
Em um exercício prolongado no estado de equilíbrio, com intensidade submáxima, há
um leve aumento do consumo de oxigênio. O nível de catecolaminas circulantes
contribui para este (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).
Já em um exercício intenso, quando o organismo não é capaz de manter a
condição de equilíbrio, há a instalação de acidose metabólica e um rápido aumento na
respiração mitocondrial. Quanto maior for a intensidade, mais rápido o aumento no
consumo de oxigênio. Além disso, ocorre a degradação de ATP, indicada pela liberação
de xantina e hipoxantina do músculo esquelético. A enzima xantina oxidase presente no
músculo esquelético pode gerar radicais de hipoxantina e oxigênio. Então, quando os
produtos da degradação do ATP se acumulam, a xantina oxidase pode gerar os radicais
livres. Ao inibir esta enzima com alopurinol, há redução do estresse oxidativo e do dano
muscular associado ao exercício exaustivo em humanos (VIÑA et al., 2000).
O dano oxidativo pode depender, ainda, do grau de exaustão e não diretamente da
intensidade (VIÑA et al., 2000). Em 1982, Davies et al, já haviam demonstrado o
aumento de radicais livres no músculo e no fígado de ratos exercitados até a exaustão.
54
Diversas lesões musculares subcelulares, devido ao estresse oxidativo, têm sido relatadas
diante de uma única carga de trabalho exaustivo demonstrando a correlação entre a LPO
e os marcadores de lesões musculares (CHILD et al., 1998) e entre as concentrações de
lactato e LPO no plasma (LOVLIN et al., 1987).
O redirecionamento do fluxo sangüíneo para os músculos em atividade também
pode formar EAO. Ao encerrar a atividade física, órgãos como o fígado e o rim, ou
mesmo os músculos não exercitados sofrem um efeito semelhante ao já conhecido
isquemia-reperfusão, sabidamente responsável pelo aumento de produção de EAO em
vários tecidos (DI MEO & VENDITTI, 2001). Deste modo, as mitocôndrias do tecido
reperfundido seriam o primeiro alvo do estresse oxidativo após o exercício.
O sistema enzimático antioxidante também sofre adaptações resultantes do
exercício físico. Enzimas antioxidantes podem ser ativadas seletivamente durante uma
sessão de exercício, dependendo da intensidade e do tecido. O músculo esquelético e o
cardíaco estão diretamente envolvidos na produção das EAO necessitando de imediata
proteção contra as mesmas. As enzimas SOD, CAT e GPx são as defesas primárias
contra o dano oxidativo, tanto em animais quanto em humanos (DEL MAESTRO, 1980;
HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). No entanto, as informações encontradas na
literatura relacionadas às adaptações dessas enzimas não são conclusivas, provavelmente
por uma grande diversificação de protocolos de treinamento em modelos experimentais
diferentes (natação ou esteira), variando em intensidade e duração (SCHENEIDER &
OLIVEIRA, 2004; JI, 1993). De uma maneira geral, após uma sessão de exercício,
ocorre o aumento na atividade das enzimas antioxidantes em diversos órgãos.
55
Especificamente no coração, a demanda metabólica resultante do exercício físico
causa um aumento na produção de EAO (BEJMA et al., 2000) a partir do aumento nos
níveis de LPO e de atividade das enzimas antioxidantes como SOD (NAVARRO-
AREVALO et al., 1999), CAT e GPX (BEJMA et al., 2000). Embora o pulmão
apresente resposta semelhante ao exercício quanto à resposta oxidativa (HATAO et al.,
2006; CAILLAUD et al., 1999), Giannerini et al. (2001) demonstram que cada tecido
responde de forma diferente a um evento oxidativo, com respostas enzimáticas
independentes de outros tecidos.
56
1.3.2 TREINAMENTO FÍSICO E ESTRESSE OXIDATIVO
Em organismos treinados ou não treinados, a percentagem representativa da
quantidade de oxigênio que não é reduzido pela citocromo-oxidase aumenta na mesma
proporção do aumento do volume global de O
2
que é admitido por uma demanda maior
da célula. Neste aspecto se poderia até esperar um estresse oxidativo maior no organismo
treinado. No entanto, o que se vê é que a demanda de antioxidantes no organismo
treinado também é maior, evitando, assim, as conseqüências de um estresse oxidativo
patológico (KIRAN et al., 2004).
Pela compreensão destes eventos, pode-se deduzir que o fator chave do
condicionamento ideal num organismo está centrado na adequação bioquímica deste ao
estado metabólico imposto pelas condições de esforço. Neste aspecto, foi encontrada
uma maior atividade eritrocitária da enzima GPx em triatletas comparados aos
indivíduos não treinados e uma capacidade antioxidante total (TRAP) aumentada após o
exercício em esteira rolante a ambos os grupos (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004).
Além disso, o treinamento parece modular a expressão de proteínas de choque térmico e
de membrana tendo, desta forma, uma participação direta no sistema de defesa
antioxidante e sendo responsáveis pelo reparo aos danos oxidativos (KRAUSE et al.,
2007).
Atletas de resistência aeróbia possuem predominância de fibras lentas, nas quais
se encontra um grande número de mitocôndrias, sendo a maior parte delas localizadas
próximas à periferia da fibra e aos capilares sangüíneos, os quais fornecem um amplo
57
suprimento de oxigênio. Estas fibras possuem uma alta capacidade para o metabolismo
oxidativo, resistem a fadiga e são especializadas no desempenho de ações intensas e
repetidas por períodos prolongados. Sobre estas fibras estão relacionados os efeitos do
treinamento no que diz respeito a liberação, a captação e a utilização do oxigênio. Estas
adaptações metabólicas periféricas resultam em maior produção de energia e mais
eficiente remoção de “lixo” metabólico, desta forma reduzindo fatores considerados
responsáveis pela fadiga.
Sabe-se, também, que um maior condicionamento aeróbio gera níveis menores de
liberação de cortisol e de catecolaminas (POWERS & HOWLEY, 2000), implicando em
menor estresse global e menor freqüência cardíaca. Assim, como uma terapia
cardiovascular, o exercício combate através de adaptações do sistema antioxidante
doenças como as dislipidemias, a hipertensão, o diabetes mellitus, a obesidade, a
trombose e a disfunção endotelial (SHEPHARD & BALADY, 1999), todas relacionadas
ao estresse oxidativo (PINCEMAIL, 1995).
O organismo treinado, de acordo com Nies et al. (1996), pode obter a redução dos
efeitos das EAO quanto aos danos no DNA de leucócitos circulantes, após exercício
exaustivo em esteira comparado aos indivíduos não treinados. Em animais, a adaptação
resultante do treinamento também diminui estes efeitos (HUSAIN, 2003; HUSAIN &
HAZELRIG, 2002; RADAK et al., 2000).
JI (1993) demonstrou que em músculo esquelético uma carga isolada de trabalho
exaustivo produzia um aumento de LPO e que a atividade das enzimas GPx, GR, SOD e
58
CAT estavam significativamente aumentadas. Alessio (1993) cita um aumento de LPO
em fibras musculares lentas e rápidas de ratos submetidos a cargas de exercício,
indicando um aumento do estresse oxidativo induzido pela atividade. Este estresse era
mais bem tolerado por ratos treinados, sugerindo uma adaptação dos sistemas oxidantes.
No entanto, as adaptações ao treinamento parecem ser dependentes da intensidade, do
volume do treinamento e tecido específico (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004).
59
1.4 EXERCÍCIO FÍSICO E POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA.
Sabendo-se que tanto a inalação de poluentes quanto o exercício físico tem como
resposta aguda a produção de EAO, torna-se pertinente a seguinte questão: Como
responde o organismo ao realizar uma sessão de exercício físico em um ambiente com
níveis indesejáveis de poluição?
Poucas referências foram encontradas na literatura relacionando a prática de
exercícios físicos, a inalação de poluentes e ao estresse oxidativo.
As respostas fisiológicas do organismo frente aos poluentes estão relacionadas à
quantidade ou à “dose” recebida. Os principais fatores que determinam a dose são a
concentração de poluente, a duração da exposição e o volume de ar inalado. Este último
fator aumenta a deposição de partículas ultrafinas (<10µm) nas vias aéreas em até 4,5
vezes durante o exercício físico comparado ao repouso. O aumento da ventilação e o uso
da respiração bucal e não a nasal durante o exercício (DAIGLE et al., 2003) são fatores
responsáveis pela maior deposição de partículas, além de ser uma razão pela qual a
atividade física é abreviada durante os momentos de níveis de pico de poluição
(FOLINSBEE, 1990). Nesse sentido, Turnovska et al. (2007) demonstraram aumento da
ventilação durante o exercício em crianças residentes em uma região intensamente
poluída, quando comparadas às crianças de uma região com menores concentrações de
MP. A emissão de gases como o monóxido de carbono reduz a capacidade de transporte
de hemoglobina para conversão em carboxi-hemoglobina gerando um efeito
compensatório do aumento da freqüência ventilatória. (WHIPP &WASSERMAN, 1991).
60
Alguns estudos utilizaram o exercício físico como modo de exacerbar as respostas
mecânicas ventilatórias após a exposição aos poluentes, encontrando como resposta a
diminuição da Capacidade Vital Forçada (CVF) e, no Volume Expiratório Forçado em 1
segundo (VEF
1
) e três segundos (VEF
3
) (TURNOVSKA et al., 2007; VOLPINO et al.,
2004; TIMONEN et al., 2002; SALVI et al., 1999; DRECHSLER-PARKS et al., 1987).
Um estudo realizado na cidade do México (VILLAREAL-CALDERON et al.,
2002) questiona o horário da educação física escolar, justamente por ser praticada em
horários e locais de grandes concentrações de poluentes, correlacionado com o aumento
da incidência de admissões hospitalares por doenças respiratórias. A preocupação com os
locais para prática de exercícios durante o horário escolar também foi relatada em outros
estudos (GILLILAND et al., 1999; TURNOVSKA et al., 2007).
Indivíduos com doenças coronarianas apresentam maiores riscos de sofrer
arritmias cardíacas quando praticam exercícios expostos aos poluentes, devido às
alterações no sistema nervoso simpático e parassimpático, diagnosticadas através das
alterações no segmento S-T do eletrocardiograma (ECG) (PEKKANEN et al., 2002).
Zareba et al. (2001) também analisando o segmento S-T identificaram mudanças súbitas
no funcionamento do miocárdio.
A redução da variabilidade da freqüência cardíaca é um indicador de alterações
no controle simpático e parassimpático cardíaco, além de ser um sintoma associado ao
aumento da morbidade e da mortalidade (TSUJI et al., 1996). O estudo de Gold et al.
(2000) sugeriu que houve um decréscimo na função parassimpática após inalação de MP
61
2,5
, o que se reflete no aumento da frequência cardíaca (FC). Ele, também, sugeriu que a
resposta aguda pode ser diferente da crônica (diminuição da FC e da VFC) e dependente
da constituição dos poluentes inalados, que variam de região para região.
A inalação de MP pode agir sobre o sistema cardiorrespiratório por mecanismos
diretos e indiretos como representado na figura 7.
Figura 7. Hipótese de produção de espécies ativas de oxigênio (EAO) pelo exercício realizado com
concentrações inadequadas de material particulado e suas implicações
62
Além dos estudos epidemiológicos que correlacionam altas concentrações com as
doenças respiratórias, estudos recentes têm procurado detalhar o nível de exposição
individual ao MP de acordo com os fatores sóciodemográficos e com as atividades
diárias. Os riscos associados à poluição passam a depender não somente da cidade em
que a pessoa vive, mas onde especificamente na cidade na qual o indivíduo desempenha
as suas atividades diárias (DOCKERY & STONE, 2007). Deste modo, surge o dado de
que os indivíduos que praticam exercício em rodovias e nos grandes centros urbanos são
mais expostos à poluição por MP (SHARMAN et al., 2004).
A prática de exercício físico regular é comum com o objetivo de melhorar o
condicionamento físico do o organismo tornando-o menos propenso a doenças
cardiovasculares. Freqüentemente, as pessoas realizam este tipo de atividade em locais
(parques) próximos a autovias de fluxo intenso e nos horários dos picos de tráfego,
conseqüentemente expostos a elevadas concentrações de MP. Assim, a questão é
investigar se ao exercitar-se nestes locais o indivíduo não estará sujeito à condição
adversa e, portanto, provocando malefícios à saúde. Até o momento, não existem dados
na literatura respondendo a tais questões, o que justifica a realização deste estudo.
63
2. OBJETIVO GERAL
Estudar o estresse oxidativo pulmonar e cardíaco, bem como parâmetros
hemodinâmicos de ratos expostos agudamente ao MP durante uma sessão de exercício
físico.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Avaliar o estresse oxidativo pulmonar de ratos expostos ao MP de uma amostra
do ar de Porto Alegre durante 20 ou 60 minutos de exercício físico, através da
determinação do TBARS, QL e CAT.
2- Avaliar o estresse oxidativo pulmonar de ratos tratados com instilação intra-
traqueal de ROFA e submetidos a 20 minutos de exercício, através da determinação do
TBARS, QL e CAT.
3- Avaliar o estresse oxidativo cardíaco de ratos tratados com instilação intra-
traqueal de ROFA e submetidos a 20 minutos de exercício, através da determinação do
TBARS, QL e CAT.
4- Avaliar a função hemodinâmica de ratos tratados com instilação intra-traqueal
de ROFA durante 20 minutos de exercício físico, através da análise da FC, PAS, PAD e
PAM.
64
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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76
4. ARTIGO 1
LUNG OXIDATIVE STRESS INDUCED BY PARTICULATE MATTER
DURING EXERCISE: “REAL WORLD EXPOSURE VERSUS RESIDUAL OIL
FLY ASH INSTILLATION
Thiago Gomes Heck, Marcelo Rafael Petry, Alexandre Maslinkiewicz, Pedro Dall’Ago,
Claudia Ramos Rhoden
Post-Graduation Course in Medical Sciences and Laboratory of Oxidative Stress and
Atmospheric Pollution. Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre (FFFCMPA). Porto Alegre, RS, Brazil.
Correspondence:
Cláudia Ramos Rhoden
Rua: Jaraguá, 370/302 – Bairro Bela Vista – Porto Alegre – RS.
CEP: 90450-140. Brazil
Phone: 55-51-33038801
e-mail: crhoden@fffcmpa.edu.br
Page proofs should be sent to Cláudia Ramos Rhoden
77
ABSTRACT
Particulate matter inhalation is associated with increase of hospital admissions, morbidity
and mortality in polluted cities. Oxidative stress is described as one mechanism that
induces particle lung damage. Physical exercise is usually prescribed in order to promote
physical health. However, one exercise session increases lung free radical production.
The proposal of this study was to verify the lung oxidative stress caused by particles
during exercise and to compare it to a resting condition. Methods: Wistar, adult rats were
exposed to two experimental conditions: “real world” exposure and ROFA instillation. In
the “real world” condition, rats swam during 20 or 60 minutes (P20 and P60 groups n=12
and n=8 respectively) with simultaneous exposure to air of Porto Alegre, Brazil. Control
group exercised in the same condition while breathing filtrated air (F20 and F60 groups
n=12 and n=8 respectively). In ROFA instillation protocol rats received 500µg/100µL of
ROFA or 100µL saline intratracheally and exercised (swimming) for 20 minutes (Ex-S
and Ex-RF groups, respectively) or were maintained in rest during the same time (R-S
and R-F). In both protocols, after the exercise, blood lactate concentrations (LAC) were
measured and rats were decapitated to remove the lung. Homogenates of lungs were
processed and oxidative stress was evaluated by Thiobarbituric Acid Reactive Substances
(TBARS: mmol MDA/mg protein), Chemiluminescence (CL: cps/mg protein) and
Catalase activity (µmol H
2
O
2
/sec/mg protein). Results: PM exposure and ROFA did not
interfere in LAC. In “real world” protocol PM exposure did not promote lung oxidative
stress, while ROFA protocol showed that instillation of particles induced an increase of
oxidative stress (TBARS: R-S=0.041±0.008; R-RF=0.066±0.011, Ex-S=0.054±0.01 and
78
Ex-RF=0.076±0.017, p<0.05) (CL: R-S=3728±711; R-RF=5131±470, Ex-S=5610±1872
and Ex-RF=6276±525, p<0.05) and these effects were more pronounced in exercise
group. Our data suggests that PM can increase lung oxidative stress induced by physical
exercise dependently of particles concentration.
Key words: Oxidative stress, exercise, lung, particulate matter, pollution
79
INTRODUCTION
Particulate matter air pollution consists of solid and liquid particles derived from
vehicle emissions, forest fire, domestic, agriculture and industrial pollutants
(ZIELINSKA, 2005). They are classified depending on their size into coarse particles
(PM
10
, diameter 2.5-10µm), fine particles (PM
2.5.,
diameter < 2.5µm) and ultrafine
particles (PM
0.1,
diameter < 0.1 µm). Comparing to coarse particles, fine and ultrafine
particles deposit into deeper regions of lung and have a high potential of impact on
health. (BELL et al., 2006; ZEKA et al., 2006).
In the last years, many studies have shown that air pollution is related to hospital
admissions, illness and death related to pulmonary function alterations, especially of
paediatric and elderly people (FARHAT et al., 2005). Daily variation of PM
2.5
and PM
0.1
may lead to an increase in the epithelial barrier permeability of lungs (TIMONEN et al.,
2004), affect respiratory function (DELFINO et al., 2004; VOLPINO et al., 2004;
TIMONEN et al., 2002; PETTINEN et al., 2001) producing proinflammatory responses
(MAZZARELLA et al., 2007; SALVI et al., 1999) and alveolar damage (GHIO et al.,
2001).
Numerous reports link oxidative stress to PM-induced adverse effects on the
respiratory system (RHODEN et al., 2004; HATZIS et al., 2006; GURGUEIRA et al.,
2002; PINHO et al., 2005; AAM et al., 2007; GONZALEZ-FLECHA, 2004). PM has the
intrinsic ability to induce oxidative stress and it is largely mediated by transition metal
adsorbed at its surface. These metals generate hydroxyl radicals that are able to induce
cellular damage. In addition, PM can also stimulate oxidative stress mediated by
80
transcription factors which act on genes regulating proinflammatory cytokines and
adhesion molecules to enhanced the generation of inflammatory mediators and the
recruitment of inflammatory cells (AAM et al., 2007; SULLIVAN et al., 2007; IMRICH
et al., 2007). In this sense, Gurgueira et al. (2002) showed an increase of oxidative stress
in lung of rats exposed to concentrated air pollution (CAPs) for 3 hours. A similar effect
was found after exposure to 30 minutes of residual oil fly ash (ROFA –ultrafine particles
rich in transition metals) instillation.
Exercise is a common practice for health life style, and represents a non
pharmacological therapy for prevention of cardiorespiratory diseases. However, there are
three reasons why exercise is a special condition to be considered a risk to inhaling
pollutants: proportional increase in amount of pollutants inhaled with increase in minute
ventilation during exercise; a larger fraction of air inhaled through the mouth that not
pass by normal nasal mechanisms of filtration; and the increase of velocity flow can
carrier pollutants deeper into respiratory tract (CARLISLE & SHARP, 2001). Many
athletic fields and school playgrounds are adjacent to high traffic roadways and may
present long-term health risks for exercising children and young adults (VILLARREAL-
CALDERON et al., 2002).
The aim of this study was to verify the effect of acute exercise session and
simultaneously exposure to ambient particulate matter or intratracheal ROFA instillation
in oxidative stress parameters of the lung.
81
MATERIAL AND METHODS
Animals
Wistar male, adult rats, from the Animal Facility of the Fundação Faculdade
Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre were used. The animals were kept in plastic
cages (47 cm x 34 cm x 18 cm) under controlled humity (75-85%), temperature (22
0
+
2
0
C), dark-light cycle of 12 hours (lights on from 7 a.m. to 7 p.m.) and were fed with a
conventional laboratory diet (Supra-lab, Alisul Alimentos S.A, Brazil) and water ad
libitum.
Animal care
The authors assure that the study was conducted in accordance with National and
Institutional Guidelines for Animal Welfare. All animals used in the research were
treated humanely, with due consideration to the alleviation of distress and discomfort.
This protocol was approved by the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas
Ethical Committee for Research (CPA 017/05).
ROFA Characterization
ROFA consisted of particles retained in the electrostatic precipitator installed in
one of the chimneys of a large steel plant localized in São Paulo city, Brazil. The element
composition of ROFA suspension particles was determined by neutron activation
analysis. Basically the procedure involved short irradiations of 5 min for the
determination of Cl meaning chlorine; K, potassium; Mn, manganese; Na, sodium and
82
Sr, strontium using a pneumatic transfer system facility under a thermal neutron of
1.4x10
12
ncm
-2
s
-1
. Longer irradiations of 16 h under a thermal neutron flux of about 10
12
ncm
-2
s
-1
were performed for determinations of As meaning arsenic; Ba, barium; Ca,
calcium; Ce, cerium; Cr, chromium; Co, cobalt; K, potassium; La, lanthanum; Mn,
manganese; Na, sodium; Rb, rubidium; Sb, antimony; Sc, scandium; Th, thorium; V,
vanadium and Zn, zinc. After adequate decay times, the irradiated samples and standards
were measured using a hyperpure detector Model GX2020 coupled to Model 1510
(Perkin Elmer Ortec, Oak Ridge TN, USA) integrated signal processor, both from
Canberra Corporate Headquarters (Meriden CT, USA). Counting times from 200 to
50,000 s were used, depending on the half-lives or activities of radioisotopes considered.
The radioisotopes measured were identified according to their half-lives and γ-ray
energies. The concentrations of the elements were calculated using a comparative
method. Measurements of the diameters of the particles (largest diameter) were made
using an integrating eyepiece with polarized light microscopy. Each line in the eyepiece
represented a 10 µm length at a magnification of 1000 x. About 230 events for each
particle were measured (MEDEIROS et al., 2004).
Particles of ROFA presented 44.6+0.1% of iron; bromine, 1.482+19 µg g
-1
;
cesium, 16.3+0.3 µg g
-1
; cobalt, 9.90+0.25 µg g
-1
; chromium, 107.7+1.4 µg g
-1
;
lanthanum, 10.3+0.1 µg g
-1
; manganese, 3,884+24µg g
-1
; rubidium, 719.7+1.0µg g
-1
;
antimony, 2.27+0.9 µg g
-1
; arsenic, 154.4+0.8µg g
-1
; vanadium, 35+4µg g
-1
; zinc,
491.9+3.1µg g
-1
. Almost all particles had a diameter of less than 10 µm; the means and
standard deviations were 1.7+2.56 µm for carbon; 1.2+2.24 µm for transition metals
83
particles. About 78% of carbon particles and 98% of transition metals particles had a
diameter less than 2.5 µm (MEDEIROS et al., 2004).
Adaptation to the water
All rats were adapted to the water before the beginning of experiments. The adaptation
consisted of keeping the animals during ten minutes in shallow water at 30°C, for three
consecutive days. This procedure had the objective to reduce the rat behavior stress
related to its contact with water. Physical training was not allowed with this intervention.
The experiments started 24 hours after the adaptation period.
Site of “Real World” Exposure
Inhalation chambers were located on the second floor of the Fundação Faculdade Federal
de Ciências Médicas de Porto Alegre Building, located in Porto Alegre (30°03’45”S,
51°11’15”W), downtown, at a crossroad with heavy traffic, facing an automated air
pollution monitoring station of the State Environmental Agency, that provides
continuous PM
10
measurements (beta monitor). Porto Alegre has a population of
approximately 1.5 million inhabitants; it is the central city of a metropolitan
industrialized area of 3.2 million inhabitants. The vehicle fleet was of 522.555 vehicles in
March 2004 (BNDES, 2003), approaching 1 vehicle for every 2.7 individuals, and there
is a significant increased of 4.5% vehicles by year. The vehicular traffic is the mainly
source of air pollution in the bigger cities of Brazil, being responsible by approximately
90% of CO and PM
10
emissions, with the air pollution representing a serious problem in
84
many regions (SALDIVA, 1998). Porto Alegre has a 496.827 Km
2
of total area, with
40% of the urban area occupied by the transportation structure (BNDES, 2003). This city
presents thermal inversions frequently and defined climate seasons. In average the
temperature varies from 18 and 25ºC, and the average of rain days varying from 3 to 6
days/month (based on 8 years of historical weather readings) (climate zone
http://www.climate-zone.com/climate/brazil/fahrenheit/porto-alegre.htm).
Chamber of exercise and “Real World” exposure
The protocol of swimming exercise simultaneously to air pollution exposure was carried
through with the animals inside of acrylic chambers (30cm x 100cm x 30cm), filled
45cm with water at 30°C, hermetically closed, with the exception of one entrance
(connected to the outdoor environment) and one exit. A vacuum pump was connected to
the exit and pumped outdoor air through the exposure chambers at a flow rate of 10 liters
per minute. One of the chambers (designated as filtered groups) received a 37mm Teflon
filter (Millipore, Ireland) in the inlet, thus avoiding the admission of ambient particles
major than 2.5µm, whereas the other received atmospheric air without the filter system
(designed as polluted groups).
Protocols
“Real world”
Forty rats were divided into four groups: F20 (n=12)= exercise in filtered air for
20min; F60 (n=8) = exercise in filtered air for 60min; P20 (n=12)= exercise in polluted
air for 20min and P60 (n=8) = exercise in polluted air for 60min. At the end of the
85
exercise session caudal venous lactate concentration was measured and immediately after
the rats were decapitated and the lungs were quickly removed and stored at -80°C for
TBARS, CL and CAT activity evaluation.
Intratracheal ROFA instillation
Twenty -four rats (8 per group) were intratracheally instilled with 100µL saline or 500µG
/100µL ROFA suspension and divided into four groups : Rest Saline (R-S); Rest ROFA
(R-RF); Exercise Saline (EX-S) and Exercise ROFA (EX-RF). All of administrations
were performed under light anesthesia with ether. Swimming exercise was performed for
20 minutes into chamber filled 45cm with water at 30°C. Rats in resting condition were
maintained for 20 minutes into chamber filled 5cm with water at the same temperature.
Immediately after the experiment, caudal venous lactate concentration was measured and
the animals were decapitated and the lungs were quickly removed and stored at -80°C for
TBARS, CL and CAT activity evaluation.
Blood lactate concentration
Blood samples (~25µL) were collected from caudal vein. The lactate concentrations were
determined in Lactate Analyzer (Accutrend
®
Lactate, Roche) and expressed as mmol of
lactate/ liter.
Tissue preparation
The lung from each rat was excised, washed in saline solution and quickly frozen in
liquid nitrogen. For determination of oxidative stress parameters, tissue samples were
86
homogenized in 5 volumes of 120mmol KCl, 30mmol sodium phosphate buffer (pH=7.4)
added with protease inhibitor 0.5mmol PMSF (Phenylmethanesulfonyl Fluoride) at 0-
4°C. The suspensions were centrifuged at 600g for 10 min at 0-4°C to remove nuclei and
cell debris. The pellets discarded and the supernatants were used as homogenates.
Chemiluminescence
Chemiluminescence was measured in a liquid scintillation counter in the out-of-
coincidence mode (LKB Rack Beta Liquid Scintillation Spectrometer 1215, LKB -
Produkter AB, Sweden). Lung homogenates were placed in low-potassium vials at a
protein concentration of 0.5–1.0mg of protein/mL in a reaction medium consisting of
120mmolL KCl, 30mmol/L sodium phosphate buffer (pH=7.4). Measurements were
started by the addition of 3mmol/L tert-butyl hydroperoxide and the data expressed as
counts per second per milligram of protein.
Thiobarbituric acid reactive substances method (TBARS) - Lipid peroxidation
Homogenates were precipitated with 10 % TCA, centrifuged, and incubated with
thiobarbituric acid (Sigma, Chem. Co.) for 60 minutes at 100
0
C. TBARS were extracted
using butanol (1:1 V/V). After centrifugation, the absorbance of the butanol layer was
measured at 535nm (BUEGE & AUST, 1978). The amount of TBARS formed was
expressed in nanomoles of malondialdehyde per milligram of protein. Malondialdehyde
standards were prepared from 1,1,3,3,-tetramethoxypropane.
87
Catalase enzyme activity
Catalase activity was determined by following the decrease at 240 nm-absorbance in a
reaction medium containing 50mmol/L sodium phosphate buffer (pH=7.2), and
10mmol/L hydrogen peroxide (H
2
O
2
) (AEBI, 1984). It was expressed as picomole of
H
2
O
2
reduced per second per milligram of protein.
Protein measurement
Protein was measured by the method of Bradford (BRADFORD, 1976), using bovine
serum albumin (1mg/mL) as standard. The results were expressed in mg of protein/mL.
Statistical analysis
One Way-ANOVA test was used for the statistical analysis of data of blood lactate
concentration and all oxidative stress parameters evaluation (TBARS, CL, CAT). Post
hoc Multiple comparison between groups were done with the Student Newman Keuls
Test. The results were presented as the mean ± standard deviation and the level of
significance was set at 5%. All statistical analyses were performed using the Sigma-Stat
2.0 Software (Jandel Corporation, 1992-1995).
88
RESULTS
“Real World” exposure
Rats submitted to swimming exercise for 20 minutes presented higher blood
lactate levels as compared with rats exercised for 60 minutes (p<0.05). The exposure to
ambient air particles did not change this measure (Figure 1).
As indicated in the Figure 2 (A and B), rats who performed exercise session for
longer time (60 minutes) showed an increase of lipid peroxidation detected by CL,
independently of ROFA treatment (p<0.05). However, malodialdehyde levels were
similar in all of treatment groups (p>0.05). Acute exercise increased CAT activity only in
the group submitted to filtered air for 60 minutes (p<0.05) (Figure 2 C).
Intratracheal instillation
Swimming exercise for 20 minutes promoted an increase of LAC (mmol/L) in
Saline (R-S=1.82±0.41 at rest and Ex-S=4.01±0.83 after exercise) when compared to
ROFA (R-RF=1.78±0.63 at rest and Ex-RF=4.08±0.76 after exercise) groups (p<0.05).
ROFA instillation did not change these findings (Figure 3).
As demonstrated in Figure 4(A), in terms of lipid peroxidation parameters rats
treated with ROFA presented an increase of malondialdehyde levels as compared to
saline groups independently of exercise condition. However, chemiluminescence
measurement detected an increase of lipid peroxidation in both groups of rats submitted
to exercise as well as in group treated with ROFA in resting condition (Figure 4B).
Catalase activity was increased in rats treated with ROFA in resting condition or
exercised without ROFA treatment (p<0.05) (Fig 4C).
89
DISCUSSION
Some studies have shown that exercising people are more susceptible to adverse
effects of PM than sedentary people (VOLPINO et al., 2004; SHARMAN et al., 2004;
CARLISLE & SHARP, 2001; GRIEVINK et al., 1998). The exercise metabolism, with
ventilatory rate and oxygen consumption higher than rest values, could be associated
with PM airway deposition. Ultrafine inhaled particles accumulated in the lungs are able
to translocate from the airways into the bloodstream causing systemic inflammation via
oxidative stress (NEMMAR et al., 2007). In addition, the interaction between pollutants
and lung cells may increase the levels of proinflammatory cytokines resulting in
oxidative stress and/or changes in autonomic nervous system (RHODEN et al., 2005;
GURGUEIRA et al., 2002, GONZALEZ-FLECHA, 2004).
The majority of experimental studies regarding adverse effects of PM are
conducted with rats in resting condition. In the current study we used rats in exercise
condition, being imperative to determine the intensity of exercise performed by our
animal groups. As suggested by the literature, the blood lactate concentration was used to
mark the intensity of exercise (GOBBATO et al., 2001). Kramer et al. (1993) and
Gobbato et al. (2001) determined that values of blood lactate concentration around
2mmol/L are indicative of rest condition and values at 5.5mmol/L indicate high intensity
exercise. In this study, we found higher blood lactate levels in the group of rats submitted
to 20 minutes swimming exercise as compared with the 60 minutes exercise group in the
“real world” exposure protocol. Probably, during the 20 minutes exercise, the rats
exercised in more intensity conditions, because it was possible to observe they were more
90
active when they exercised for 60minutes.These results could be explained due some
adaptation of rats to this adverse condition, resulting in slowly movements,
independently of pollutant exposure. When we analyzed data of ROFA instillation
protocol, we found 2-fold increase in lactate concentration after exercise, indicating that
rats reached moderate intensity lactate levels independently of treatment groups
(GOBBATO et al., 2001). However, the rats of rest groups presented lactate levels
higher than recommended by the literature (KRAMER et al., 1993; GOBBATO et al,
2001). One hypothesis to explain this result could be the influence of ether anesthesia,
which increases the blood lactate levels until 60 minutes after its administration
(FREGOSI & DEMPSEY, 1986).
The oxidative stress imposed by PM exposure is associated with the lung
inflammation and toxicity. Pre-treatment with N-acetylcysteine (NAC) prevented these
biological effects (RHODEN et al., 2004). Increased lung oxidative stress in animals
exposure to PM (in resting condition) is well documented in the literature
(GURGUEIRA et al., 2002; RHODEN et al., 2004). Recent findings of our laboratory
demonstrated higher levels of the lung lipid peroxidation in rats exposure to PM for 24
hours (average= 130± 10.0 µg/m
3
) in “real world” model (PEREIRA, 2006). In this study
we did not detect changes of this variable, probably due short-term PM exposure (20 or
60 minutes) and lower PM concentration during experiment (average= 51.8±34.0 µg/m
3,
Table1.). In terms of physical exercise, we showed that longer duration of exercise
produced an increase of lipid peroxidation in the lung independently of PM exposure.
Regarding antioxidant enzyme, catalase activity presented increased in according with
exercise demand only in rats that were submitted to filtered air. This result is in
91
agreement with Somani et al., (1995) that demonstrated that exercise per se increases
mitochondrial CAT activity by 358%. The absence of this finding in the pollutant group
could be indicate in some consumption of this enzymatic defense by PM.
ROFA produces a significant increase of cell membrane lipid peroxidation of
lung of rats maintained in resting condition. Other studies that used similar doses of
ROFA showed that this pollutant promotes acute inflammatory response mediated by
oxidants (RHODEN et al., 2004; PINHO et al, 2005). In addition, we detected similar
effects of ROFA in rats submitted to physical exercise. The aggregation of exercise and
pollutant promoted an increase in accumulation of TBARS, suggesting that the
association of these two conditions could lead to stronger lung oxidative damage. In
agreement with other authors ROFA instillation promoted an increase of CAT activity in
resting condition rats (GURGUEIRA et al., 2002). In addition, our results corroborate
the literature findings which demonstrate that exercise also increases the activity of this
enzyme (SOMANI et al., 1995). However, ROFA treatment abolished this effect in
exercising group. Our findings could reinforce the idea that PM inhalation promotes a
consumption of antioxidant enzyme, as described in “real world” protocol.
In conclusion, our data demonstrate that PM can promote lung oxidative stress
during exercise. More studies including exercise intensity variations, longer or
exhaustive protocols with simultaneous PM exposure may elucidate the health risk of
this association.
92
Table 1. Particulate Matter Concentration - Day by Day of “Real World” Exposure
Date Time of exposure [PM]µg/m
3
June/24/2005
20 minutes
70.03
July /9/2005
20 minutes
38.15
July/14/2005
20 minutes
102.38
August/11/2005
60 minutes
28.42
September/2/2005
60 minutes
19.99
93
0
1
2
3
4
5
6
F20 P20 F60 P60
lactate mmlo/L
Figure 1. Venous lactate concentration of rats after exercise for 20 or 60 minutes and exposed to
particulate matter in “real world”. Values represent the mean ± standard deviation of 12 rats in F20
and P20groups and 8 rats in F60 and P60 groups. * Statistical significance as compared to F60 and
P60 groups (F
(3,36)
= 8.08, p<0.05) One way-ANOVA, followed by the Student Newman Keuls Test.
(F20= 20 minutes exercise + filtered air; P20=20 minutes exercise + pollutant; F60= 60 minutes
exercise + filtered air; P60=60 minutes exercise + pollutant)
*
94
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
F20 P20 F60 P60
mmol MDA/mg prot
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
F20 P20 F60 P60
cps/mg prot
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
F20 P20 F60 P60
µmol H2O2/sec/mg prot
Figure 2. Malondialdehyde concentration (A), chemiluminescence (B) and catalase activity (C) of
lung of rats after exercise for 20 or 60 minutes and exposed to particulate matter in “real world”.
Values represent the mean ± standard deviation of 12 rats in F20 and P20 groups and 8 in F60 and
P60 groups. * Statistical significance as compared to F20 and P20 groups (F
(3,36)
= 8.26, p<0.05); **
statistical significance as compared to F20 group (F
(3,36)
=3.44 p=0.027). One way-ANOVA, followed
by the Student Newman Keuls Test. (F20= 20 minutes exercise + filtered air; P20=20 minutes
exercise + pollutant; F60= 60 minutes exercise + filtered air; P60=60 minutes exercise + pollutant)
*
**
95
0
1
2
3
4
5
6
R-S R-RF EX-S EX-RF
mmol/L
Figure 3. Venous lactate concentration of rats after 20 minutes of exercise or rest condition followed
by ROFA instillation Values represent the mean ± standard deviation of 8 rats per group. *
Statistical significance as compared to R-S and R-RF groups (F
(3,28)
=41.23, p<0.05) One way-
ANOVA, followed by the Student Newman Keuls Test. (R-S = rest + saline; R-RF= rest + ROFA;
EX-S= exercise + saline and EX-RF= exercise + ROFA)
*
96
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.1
R-S R-RF EX-S EX-RF
nmol MDA/ mg prot
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
R-S R-RF EX-S EX-RF
cps/ mg prot
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
R-S R-RF EX-S EX-RF
µmol H2O2/ sec/ mg prot
Figure 4. Malondialdehyde concentration (A), chemiluminescence (B) and catalase activity (C) of lung of rats
submitted to 20 minutes of swimming exercise and instillate with ROFA. Values represent the mean ± standard
deviation of 8 rats per group. * Statistical significance as compared to R-S group** as compared to EX-S group; *** as
compared to all other groups. One way-ANOVA, followed by the Student Newman Keuls Test, [(A)F
(3,28)
=12.76; (B)
F
(3,28)
=8.28 (C) F
(3,28)
=18.92) p<0.05)]. R-S = rest + saline; R-RF= rest + ROFA; EX-S= exercise + saline and EX-
RF= exercise + ROFA
*/**
*
* *
*
***
*
A
B
C
97
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101
5. ARTIGO 2
RESIDUAL OIL FLY ASH INDUCES HEART OXIDATIVE STRESS WITHOUT
HEMODYNAMIC ALTERARIONS DURING EXERCISE: AN EXPERIMENTAL
STUDY IN RATS.
Thiago Gomes Heck, Marcelo Rafael Petry, Alexandre Maslinkiewicz, Ramiro Barcos
Nunes, Pedro Dall’Ago, Claudia Ramos Rhoden
Post-Graduation Course in Medical Sciences and Laboratory of Oxidative Stress and
Atmospheric Pollution. Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre (FFFCMPA). Porto Alegre, RS, Brazil.
Correspondence:
Cláudia Ramos Rhoden
Rua: Jaraguá, 370/302 – Bairro Bela Vista – Porto Alegre – RS.
CEP: 90450-140. Brazil
Phone: 55-51-33038801
e-mail: crhoden@fffcmpa.edu.br
Page proofs should be sent to Cláudia Ramos Rhoden
102
ABSTRACT
Background: Epidemiological studies have linked ambient particulate matter (PM)
exposure to an increased cardiovascular diseases risk. The role of oxidative stress in this
process is well documented in the literature. During exercise physiological
cardiovascular changes occur, such as an increasing of free radical production. The aim
of this study was to verify the PM effect in heart oxidative stress and hemodynamic
parameters in rats submitted to acute exercise session. Methods: twelve Wistar, adult rats
were divided into two treatment groups: Saline (100µL NaCl 0.9%) or ROFA
(500µgROFA/100µL saline), which were administrated by intratracheal instillation. After
treatment, rats were submitted to exercise session (20 minutes swimming) and heart rate
(HR), systolic (SAP), diastolic (DAP) and mean arterial pressure (MAP) were recorded.
Arterial lactate concentration (LAC) was measured before and after the exercise session.
Homogenate of the heart tissue were processed for lipid peroxidation of the cell
membranes (Thiobarbituric Acid Reactive Substances Test-TBARS and
Chemiluminescence-CL) and catalase (CAT) activity evaluation. Results: In both groups
blood LAC was increased 2-folds (p<0.05) by the exercise session. Lipid peroxidation in
ROFA group was significantly higher when compared to the control group (TBARS
mmol MDA/mg protein: Saline= 0.028±0.006 x ROFA=0.049±0.016, p=0.03); (CL
cps/mg protein: Saline =3600±531 x ROFA=5202±951, p=0.015) and CAT activity was
similar in both groups (CAT activity µmol H
2
O
2
/sec/mg protein : Saline= 0.031±0.003 vs
ROFA= 0.027±0.003, p=0.087). Conclusion: The current study in rats demonstrated that
103
ROFA instillation increased heart tissue oxidative stress but this effect was no associated
with hemodynamic alterations during short-term and moderate intensity exercise.
Key words: Oxidative stress, exercise, heart, particulate matter, pollution, blood
pressure, hemodynamic parameters
104
INTRODUCTION
Epidemiological studies have linked ambient particulate matter (PM) exposure to
an increase of cardiovascular complications (BROOK et al., 2004). These studies report
that exposures to PM could be associated with a first cardiovascular event (MILLER et
al., 2007), hospital readmissions (KLOT et al., 2005) and increase of blood pressure in
preexisting cardiac disease patients (ZANOBETTI et al., 2004), and also an increase of
risk of death for cerebrovascular and coronary heart diseases (MILLER et al., 2007).
Experimental studies have demonstrated that the mechanisms by which PM
inhalation promotes cardiovascular injuries may be related to direct and/or indirect
actions. Ultrafine inhaled particles accumulated in the lungs are able to translocate from
the airways into the bloodstream (NEMMAR et al., 2007) causing systemic
inflammation via oxidative stress, which mediates endothelial dysfunction and
atherosclerosis (YAMAWAKI & IWAI, 2006), increase blood coagulability by
activating platelets and coagulation factors such as fibrinogen. In addition, the interaction
between pollutants and lung cells may signalize to heart by activation of pulmonary
neural reflexes initiating changes in autonomic nervous system and/or increasing the
levels of pro-inflammatory cytokines which result in increases of lipid peroxidation and
antioxidants enzymes activity in the heart of rats (RHODEN, et al., 2005; GURGUEIRA,
et al., 2002), as well as dysfunction of autonomic nervous system activity (GONZALEZ-
FLECHA, 2004).
Chronic health effects of exercise activity sessions are reached by regular training
and promote acute cardiovascular adaptation when the rest homeostasis is broked. During
105
exercise cardiovascular function may be changed according to type, intensity, duration of
the exercise activity as well as the physical conditioning. Increase of heart rate is
described in human and animal models during physical activity and it is considered an
important variable associated with the intensity of exercise. The rate of reactive oxygen
species generation in biological tissues is closely related to oxygen metabolism. During
physical exercise occurs an increase of mitochondrial metabolism which is associated
with enhanced oxygen consumption by the heart. Several studies showed increase of free
radical production and antioxidants enzymes adaptations in the heart after acute exercise
activity (KRAUSE et al., 2007; GUL et al., 2006; SOMANI et al., 1995).
Even the impact of PM on athletic performance has not been well documented,
systemic oxidative stress and inflammation induced by the pollutants particles may have
a negative impact on cardiovascular function and can in some extension be related to
physical performance (FLORIDA-JAMES et al., 2004). Based in these hypothetical
phenomenon, supplementation of antioxidants vitamins may have a protective effect
against ozone air pollution on lung and heart function of individuals on physical
activities (GRIEVINK et al., 1998). Chronic exposure to outdoor traffic pollution has
been suggested to be associated with decreases in physical efforts and maybe increases
the risk of abnormal cardiovascular functionality during exercise (VOLPINO et al.,
2004).
Despite extensive literature on exercise, oxidative stress and oxidative stress
induced by PM, few studies have investigated the heart effects of PM inhalation during
exercise. Based in these aspects above discussed the aim of this study was to verify the
106
effect of PM on heart tissue oxidative stress and hemodynamic parameters of rats
submitted to moderate and short-term exercise session.
107
METHODS
Animal:
Adult, Wistar male rats from Animal Facility of the Fundação Faculdade Federal de
Ciências Médicas de Porto Alegre were used. Animals were fed with a conventional
laboratory diet (Supra-lab, Alisul Alimentos S/A, Brazil) and water ad libitum. They
were kept under controlled condition of temperature (21±2°C) and 12 hours light/dark
cicle.
Animal care:
The authors assure that the study was conducted in accordance with National and
Institutional Guidelines for Animal Welfare. All animals used in the research were
treated humanely, with due consideration to the alleviation of distress and discomfort.
This protocol was approved by the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas
Ethical Committee for Research (CPA 017/05).
Drugs
Dopalen
®
(Ketamin 1.16g/10mL, Agribrands Ltda, Brazil) and Anasedan
®
(Xylazin
2,3g/100mL, Agribrands Ltda, Brazil), ROFA suspension (500µg/100µL NaCl 0.9%) or
NaCl 0.9% were used.
108
Characterization of particles
ROFA consisted of particles retained in the electrostatic precipitator installed in
one of the chimneys of a large steel plant localized in São Paulo city, Brazil. The element
composition of ROFA suspension particles was determined by neutron activation
analysis. Basically the procedure involved short irradiations of 5 min for the
determination of Cl meaning chlorine; K, potassium; Mn, manganese; Na, sodium and
Sr, strontium using a pneumatic transfer system facility under a thermal neutron of
1.4x10
12
ncm
-2
s
-1
. Longer irradiations of 16 h under a thermal neutron flux of about 10
12
ncm
-2
s
-1
were performed for determinations of As meaning arsenic; Ba, barium; Ca,
calcium; Ce, cerium; Cr, chromium; Co, cobalt; K, potassium; La, lanthanum; Mn,
manganese; Na, sodium; Rb, rubidium; Sb, antimony; Sc, scandium; Th, thorium; V,
vanadium and Zn, zinc. After adequate decay times, the irradiated samples and standards
were measured using a hyperpure detector Model GX2020 coupled to Model 1510
(Perkin Elmer Ortec, Oak Ridge TN, USA) integrated signal processor, both from
Canberra Corporate Headquarters (Meriden CT, USA). Counting times from 200 to
50,000 s were used, depending on the half-lives or activities of radioisotopes considered.
The radioisotopes measured were identified according to their half-lives and γ-ray
energies. The concentrations of the elements were calculated using a comparative
method. Measurements of the diameters of the particles (largest diameter) were made
using an integrating eyepiece with polarized light microscopy. Each line in the eyepiece
represented a 10 µm length at a magnification of 1000 x. About 230 events for each
particle were measured (MEDEIROS et al, 2004).
109
Particles of ROFA presented 44.6+0.1% of iron; bromine, 1.482+19 µg g
-1
; cesium,
16.3+0.3 µg g
-1
; cobalt, 9.90+0.25 µg g
-1
; chromium, 107.7+1.4 µg g
-1
; lanthanum,
10.3+0.1 µg g
-1
; manganese, 3,884+24µg g
-1
; rubidium, 719.7+1.0µg g
-1
; antimony,
2.27+0.9 µg g
-1
; arsenic, 154.4+0.8µg g
-1
; vanadium, 35+4µg g
-1
; zinc, 491.9+3.1µg g
-1
.
Almost all particles had a diameter of less than 10 µm; the means and standard deviations
were 1.7+2.56 µm for carbon; 1.2+2.24 µm for transition metals particles. About 78% of
carbon particles and 98% of transition metals particles had a diameter less than 2.5 µm.
Tissue preparation
The heart from each animal was excised, washed in saline solution and quickly frozen in
liquid nitrogen. For determination of oxidative stress parameters, tissue samples were
homogenized in 7 volumes of 120mM KCl, 30mM sodium phosphate buffer (pH=7.4)
added with protease inhibitor 0.5mM PMSF (Phenylmethanesulfonyl Fluoride) at 0-4°C.
The suspensions were centrifuged at 600g for 10 min at 0-4°C to remove nuclei and cell
debris. The pellets discarded and the supernatants were used as homogenates.
Chemiluminescence
Chemiluminescence was measured in a liquid scintillation counter in the out-of-
coincidence mode (LKB Rack Beta Liquid Scintillation Spectrometer 1215, LKB -
Produkter AB, Sweden). Heart homogenates were placed in low-potassium vials at a
protein concentration of 0.5–1.0 mg of protein/mL in a reaction medium consisting of
120 mM/L KCl, 30mM/L sodium phosphate buffer (pH=7.4). Measurements were started
110
by the addition of 3mM/L tert-butyl hydroperoxide and the data expressed as counts per
second per milligram of protein.
Thiobarbituric acid reactive substances method (TBARS)
Homogenates were precipitated with 10 % TCA, centrifuged, and incubated with
thiobarbituric acid (Sigma, Chem. Co.) for 60 minutes at 100
0
C. TBARS were extracted
using butanol (1:1 V/V). After centrifugation, the absorbance of the butanol layer was
measured at 535nm (BUEGE & AUST, 1978). The amount of TBARS formed was
expressed in nanomoles of malondialdehyde per milligram of protein. Malondialdehyde
standards were prepared from 1,1,3,3,-tetramethoxypropane.
Catalase enzyme activity
Catalase (CAT) activity was determined by following the decrease at 240nm-absorbance
in a reaction medium containing 50mM/L sodium phosphate buffer (pH=7.2), and
10mM/L hydrogen peroxide (H
2
O
2
) (AEBI, 1984). It was expressed as picomole of H
2
O
2
reduced per second per milligram of protein.
Protein measurement
Protein was measured by the method of Bradford (BRADFORD, 1976), using bovine
serum albumin (1mg/mL) as standard. The results were expressed in mg of protein/mL.
111
Arterial lactate concentration
Arterial blood samples (~25µL) were collected from blood flow into catheter implanted
in carotid arteria. The lactate concentrations were determined in lactate analyzer
(Accutrend
®
Lactate, Roche) and expressed as mmol of lactate/ liter.
Hemodynamic data acquisition and analysis
One catheter filled with 0.06
mL saline was implanted in anesthetized rats (85 mg/kg
ketamin
and 15 mg/kg xylazin) into the carotid artery (PE-10) for direct arterial pressure
measurements. After the surgery rats were separated in individual cages and received
food and water ad libitum. At the day of experiment the arterial
cannula was connected to
a strain-gauge transducer (P23Db, Gould-Statham),
and blood pressure signals were
recorded over 20 minutes at rest and for 20 minutes during exercise period
by a
microcomputer equipped with an analog-to-digital converter
board (CODAS, 2-kHz
sampling frequency; Dataq Instruments, Inc).
The recorded data were analyzed on a beat-
to-beat basis to quantify
changes in systolic arterial pressure (SAP), diastolic arterial
pressure (DAP), mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR).
Adaptation to the water
All rats were adapted to the water before the beginning of experiments. The adaptation
consisted of keeping the animals during ten minutes in shallow water at 30°C, in three
consecutive days. This procedure had the objective to reduce the rat behavior stress
related to its contact with water. Physical training was not allowed with this intervention.
112
Experimental design and procedures
One day after the adaptation period, the carotid was cannulated as described above.
Twenty-four hours later, rest hemodynamic data were recorded and blood samples were
obtained for arterial lactate concentration measurement. After, the rats were quickly and
lightly anesthetized with ether for intratracheal instillation and divided into two groups:
Saline (n=8) 100µL saline and ROFA (n=7) 500µG/100µL ROFA suspension. After ten
minutes of instillation the rats from both groups were submitted to 20 minutes swimming
exercise into a chamber filled 45cm with water at 30°C. Simultaneously to exercise, the
register of hemodynamic parameters were recorded, as described. At the end of the
exercise session, blood samples were obtained for arterial lactate concentration
determinations, and immediately after the rats were decapitated and the heart was quickly
removed and stored at -80°C for TBARS, CL and CAT activity evaluation.
Statistical analysis
The results were expressed as the mean± standard deviation for all variables.
Unpaired Student T test was used to compare MDA concentration, chemiluminescence,
catalase activity, and hemodynamic data between groups of treatment. Paired Student T
test was used for arterial lactate concentration evaluation and hemodynamic parameters
when compared rest and exercise conditions.
All statistical analyses were performed using the Sigma-Stat 2.0 Software (Jandel
Corporation, 1992-1995). The level of significance was set in 5%.
113
RESULTS
Arterial lactate concentration and heart tissue oxidative stress status
Swimming exercise test for 20 minutes promoted an increase of arterial lactate levels
(mM/L) in Saline (1.82±0.41 at rest vs 4.01±0.83 after exercise) and ROFA (1.78±0.63
at rest vs 4.08±0.76 after exercise) groups (p<0.05). ROFA instillation did not change
this measure, demonstrated by similar increases in lactate levels after exercise compared
with rest condition in ROFA and Saline groups.
As indicated in the Figures 1 and 2, rats treated with ROFA presented an increase
of MDA levels (p=0.03) and CL evaluation (p=0.015) on heart tissue. However, catalase
activity (Figure 3) was similar into the two groups (p=0.087).
Hemodynamic results
Cardiovascular data are demonstrated in Table 1. The HR and DAP, SAP and MAP
values were similar between the groups during rest condition. During exercise, there
were no differences on hemodynamic data between the treatment groups. When
compared rest and exercise condition, the HR values increased in exercise condition,
while diastolic, systolic and mean arterial pressure decrease, independently of treatment.
The magnitude of the increase of HR and the decrease of the arterial pressure were
similar for the Saline and ROFA groups during the exercise.
114
DISCUSSION
Although there are few studies in the literature (GRIENVICK et al., 1998,
FLORIDA-JAMES et al., 2004; VOLPINO et al., 2004) associating air pollution adverse
effects with exercise, Sharman et al. (2004) published a recommendation to avoid
exercise practice in parks or in recreational areas close to busy roadways or industrial
sites. These authors also suggest useful to limit exercise session in terms of hours per day
when air pollution is critical.
Increase of oxygen consumption, significant rise in pulmonary ventilation and
diffusion capacity can be three important reasons for augmented risk to particles
inhalation damage to cardiovascular system during exercise (SHARMAN et al., 2004). It
is demonstrated in the literature, that the total amount of ultrafine particles deposited in
respiratory tract of humans during moderate exercise is approximately five times higher
than in rest (DAIGLE et al., 2003). Human studies demonstrated alterations in HR and
HR variability, blood pressure and arrhythmic events, in patients with preexisting
cardiovascular disease when exposed to PM in resting condition.
In this study an increased heart oxidative stress induced by PM inhalation was
verified. More specifically, we observed that ROFA (fine ambient particles rich in metal
transitions) instillation promoted an increase of lipid peroxidation in heart tissues of rats
submitted to exercise activity. The fact that PM induces lipid peroxidation is not novel.
Several authors, such as Gurgueira et al., (2002); Rhoden et al., (2004); and Rhoden et
al., (2005) demonstrated that pulmonary and cardiac adverse effects of PM might be
mediated by mechanism dependent on oxidants. Although, in current study CAT activity
115
were similar in the treatment groups. This result is in disagreement with some authors
who demonstrated protective effect of catalase in cardiac miocytes damage induced by
diesel exhaust (OKAYAMA et al., 2006) and an increase of 21% in catalase activity in
heart tissue of rats exposed to concentrated ambient particles (CAPs) for 5 hours
(GURGUEIRA et al., 2002) The absence of increased CAT activity in our study maybe
in some extension could be explained by the fact that acute exercise per se increases
mitochondrial CAT activity by 358% as compared with rest condition (SOMANI et al.,
1995).
It is important to notice that all papers regarding oxidative stress and PM
exposure were conducted with rats in resting condition. Our proposal is novel because we
used rats in exercise condition, being imperative to determine the intensity of exercise
performed by our animal groups. The literature suggests that the blood lactate
concentration is a good marker of intensity of exercise (GOBBATO et al., 2001). In the
present study we found the rest lactate concentration was close to 2mmol/L, which is in
agreement with other authors (KRAMER et al., 1993; GOBBATO et al., 2001). After
exercise session we detected 2-fold increase in lactate concentration. Gobbato et al.
(2001) demonstrated that maximal lactate steady state for sedentary rats submitted to
acute swimming exercise occurs at 5.5mmol/L blood lactate concentration, which is an
indicative that our rats reached moderate intensity exercise, independently of treatment
group.
The idea that oxidants alter cardiac function is well documented by several
authors in different studies (BERNIER et al., 1986; FERREIRA et al., 1989;
MENASCHE et al., 1986). Recently, it was demonstrated by Rhoden et al. (2005) that
116
sympathetic and parasympathetic blockers prevented CAPs-mediated cardiac adverse
effects, showing the critical role for autonomic nervous system signaling in this damage.
In the current study, unlikely that is described in the literature (RIVERO et al., 2005;
WELLENIUS et al., 2002) ROFA instillation did not result in significant changes in
heart rate, in systolic, diastolic and mean blood pressure. One reason for this
disagreement may be related to the exercise condition. There are some controversial data
in the literature regarding hemodynamic parameters in animal models of exercise. For
example, Kramer et al. (1995) demonstrated an increase of HR in rats submitted to a
swimming test. Yeung et al. (2006) found an increase in HR and SAP without alteration
on DAP using a treadmill for 7 minutes. Evaluating cardiovascular responses during
human exercise in water, Park et al. (1999) and Cider et al. (2006) found increases of HR
and blood pressure when compared to resting condition. During water immersion at 30°
of temperature, Park et al. (1999) showed 50% increase in cardiac output, although HR
decreased in 15%. The water immersion modified other hemodynamic parameters such
as an increase of 8% in SAP, 15% in DAP and decrease of 32% in total peripheral
resistance. Other studies found decrease in blood pressure (CRAIG & DVORAK, 1966)
or no significant alterations in these parameters (CIDER et al., 2006; GABRIELSEN, et
al., 1993).
In the present study we observed that rats submitted to short-term moderate
exercise activity increased HR in both groups independently if the rats were treated or
not with ROFA when submitted to swimming exercise model. However, interestingly all
of the measurements regarding blood pressure reduced with exercise and no differences
between exposure groups were found. Sturek et al., (1984) showed similar changes in
117
HR and PAM analysis in rats during swimming exercise and suggest that these effects
occur in response to gradually parasympathetic influence that could be evoked by the
frequent submerges of the animal.
In conclusion, our data suggest that PM inhalation during exercise may
exacerbate the free radicals production in the heart tissue without producing
physiological alterations on hemodynamic control.
118
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre, Brazil. T.G. Heck was supported by a fellowship from Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES; M.R. Petry was supported by
FAPERGS; Dr C.R. Rhoden and Dr. P. Dall´Ago are supported by - Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq. The authors declare they have no
conflict of interest.
Special thanks for technical assistance to the students of Laboratory of Atmospheric
Pollution and Oxidative Stress – FFFCMPA, to Laboratory of Experimental Air
Pollution –University of São Paulo and to Porto Alegre Ambient Protection State
Foundation (FEPAM).
119
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
Saline ROFA
nmol MDA/mg prot
Figure 1. Malondialdehyde (MDA) concentration in heart of rats treated or not with ROFA and
submitted to 20 minutes of swimming exercise session. Values represent the mean of 6 independent
determinations per group ± standard deviation. Unpaired Student T test, * t=-2.568, p=0.03.
*
120
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Saline ROFA
cps/mg prot
Figure 2. Chemiluminescence in heart of rats treated or not with ROFA and submitted to 20 minutes
of swimming exercise session. Values represent the mean of 6 independent determinations per group
± standard deviation. Unpaired Student T test, * t=-3.224, p=0.015.
*
121
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
Saline ROFA
µmol H
2
O
2
/sec/mg prot
Figure 3. Catalase activity in heart of rats treated or not with ROFA and submitted to 20 minutes of
swimming exercise session. Values represent the mean of 6 independent determinations per group ±
standard deviation. Unpaired Student T test, t=-2.568, p=0.087.
122
Table 1. Diastolic arterial pressure (DAP), systolic arterial pressure (SAP), mean arterial pressure
(MAP), heart rate (HR) at rest and during exercise. Results are expressed as mean ± standard
deviation. Values in parentheses indicate the number of rats per group. Paired Student T test, *
significant differences (p<0.05) between exercise and rest values in the same treatment group.
Hemodynamic
Parameters
Saline Group (n=8) ROFA Group (n=7)
DAP (mmHg)
Rest 101.1±6.2 103.5±7.8
Exercise 87.9±8.3* 87.3±11.3*
delta -13.2±8.2 -16.2±7.5
SAP (mmHg)
Rest 136.3±10.4 136.7±9.8
Exercise 127.3±9.7* 128±11*
delta -9.0±9.2 -8.7±3.9
MAP (mmHg)
Rest 120.7±6.4 121.7±6.8
Exercise 109.3±9.7* 109±11.4*
delta -11.4±8.7 -12.7±5.8
HR (bpm)
Rest 370±38 348±14
Exercise 432±15* 416±36*
delta 61±43 68±24
123
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127
6. CONCLUSÕES
1- A exposição ao MP de uma amostra do ar de Porto Alegre não promoveu alteração do
estresse oxidativo pulmonar dos animais; a realização de exercício físico por 60 minutos
causou aumento do mesmo independentemente da exposição ao poluente;
2- A instilação intra-traqueal de ROFA, na dose utilizada, promoveu um aumento do
estresse pulmonar de ratos. A condição de exercício exacerbou este efeito;
3- A instilação intra-traqueal de ROFA, na dose utilizada, promoveu um aumento do
estresse oxidativo cardíaco dos ratos submetidos ao exercício físico;
4- A instilação intra-traqueal de ROFA não promoveu alteração dos parâmetros
hemodinâmicos avaliados; o exercício físico causou alteração dos mesmos
independentemente da exposição prévia a este poluente.
Em conclusão, nossos resultados demonstram que a exposição ao MP promoveu
um aumento do estresse oxidativo cardiopulmonar em ratos exercitados sem causar
alterações dos parâmetros hemodinâmicos.
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