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Universidade de Mogi das Cruzes - UMC
Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca – LEC
Maurício Marques de Oliveira
Estudo de Alterações Causadas por Campos Elétricos
de Altas Intensidades sobre Corações Isolados de Ratos
Mogi das Cruzes, SP
Novembro de 2005
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Universidade de Mogi das Cruzes - UMC
Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca – LEC
Maurício Marques de Oliveira
Estudo de Alterações Causadas por Campos Elétricos
de Altas Intensidades sobre Corações Isolados de Ratos
Orientador
Prof. Dr. Paulo Alberto Paes Gomes
Mogi das Cruzes, SP
Novembro de 2005
Monografia apresentada à Comissão de Pós
Graduação da Universidade de Mogi das
Cruzes, para a obtenção do título de Mestre
em Engenharia Biomédica.
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Dedicatória
Dedico este trabalho a Isabel, Julia e Pedro.
Jamais, nem por mil metáforas e geometrias descrevê-los:
cheiro, gosto ou planos ortogonais.
Em vão delinear e colorir seus contornos.
Somente sonhos, no limite do desperto-acordado:
um cochicho,
um cochilo,
um colo.
Mostrarão com alta resolução.
4
Agradecimentos
Ao Prof Dr. Paulo Alberto Paes Gomes... Isso de querer ser exatamente aquilo
que a gente é ainda vai nos levar além (Leminski).
Ao Prof. Dr. Marcelo Gurjão de Godoy pela generosidade e auxílio inestimáveis.
Ao Prof. Dr. Jair Ribeiro Chagas por todo apoio e amizade.
Aos professores do NPT, em particular Fulvio, Arida e Jean, amigos de fé e
irmãos camaradas.
Aos amigos do LEC Diego, Kleber, Birche, Sérgio, Alessandra, José Augusto e
Marcelo... Quem não tem um amigo e um umbigo?
Aos meus Pais Moacyr e Esmeralda (in memorian), pelo que hoje penso e sinto.
À minha família: irmãs, sogros, cunhados, sobrinhos e sobrinho-neto.
A todos os amigos do NPT e UMC, não citarei nomes, pois são muitos.
À Teresinha, minha amiga Charles Brown.
À Fabiane agradecimentos a perder de vista.
Ao Sr Jadir e seu “Staff”... Olho em redor do bar em que escrevo estas linhas.
Aquele homem ali no balcão, caninha após caninha, nem desconfia que se acha conosco
desde o início das eras. Pensa que está somente afogando problemas dele, João Silva...
Ele está é bebendo a milenar inquietação do mundo! (Mario Quintana).
Aos meus companheiros de armas Luís Roberto, Fábio Sá, Maurício, Fábio
Freitas e Davi.
5
Resumo
No presente trabalho, uma montagem experimental foi desenvolvida para permitir o
estudo dos efeitos deletérios da aplicação de choques desfibrilatórios em corações isolados de
ratos Wistar, em preparação de Langendorf, tendo o campo elétrico como grandeza
quantificada. Para avaliar a contratilidade, utilizamos a pressão ventricular (P
v
), como
parâmetro da automaticidade, a freqüência cardíaca (F
c
), como forma de avaliar condução do
estímulo no ventriculo esquerdo, a largura do complexo QRS (L
qrs
) do ECG e para monitorar
a circulação coronariana, a perfusão (Per). Choques de 50 V/cm não foram capazes de causar
alterações nos parâmetros pesquisados. Imediatamente após a aplicação dos choques de 100 e
150 V/cm ocorreu uma contração rápida e uma contração lenta seguidas por um período de
assistolia de até 250 segundos. Estes eventos foram dependentes da intensidade do choque
estando possivelmente relacionados à eletroporação do sarcolema. Choques de 150 V/cm
causaram lesão funcional e/ou estrutural permanente nas células miocardiais de trabalho,
traduzida pela redução da pressão ventricular em até 60% da inicial. Ocorreu redução da
freqüência cardíaca de até 40% da inicial, indicando provável disfunção das células nodais.
Houve um alargamento do complexo QRS (~250%) e diminuição da perfusão (~40%), esta
última provavelmente devida ao aumento da tensão diastólica do miocárdio. Não houve
efeitos deletérios significativos com a repetição dos choques, havendo, sim, um valor de
campo elétrico situado entre 100 e 150 V/cm, a partir do qual os efeitos deletérios tornaram-se
irreversíveis.
6
Abstract
In the present work, an experimental setup was developed to allow the study of the
deleterious effects of defibrillatory shocks applied on isolated hearts of wistar rats on a
Langendorf type apparatus, with the electrical field quantified as the main parameter. To
evaluate the contractility, the ventricular pressure was used (P
v
); the cardiac frequency was
registered as an automaticity parameter, (F
c
); to estimate the left ventricular stimulus
conduction, the ECG QRS complex width was obtained (L
qrs
) and to monitorate the coronary
circulation, the perfusion was measured (Per). Shock intensities of 50 V/cm were not able to
cause changes on the studied parameters. Immediately following the 100 and 150 V/cm shock
application, a rapid and a slow contractions occurred, followed by an assistoly period up to
250 seconds. These events were dependent on shock intensity, probability related with the
sarcolema electroporation. 150 V/cm shocks give rise to permanent functional and/or
structural miocardial cells lesion, expressed by a ventricular pressure reduction over 60%.
Frequency reduction occurred about 40% of the initial F
c
, due to nodal cells dysfunction. A
QRS complex enlargement occurred (∼250%) and perfusion reduction (∼40%) are probably
related to the rise of miocardial diastolic tension. Significant deleterious effects did not occur
with the shocks repetition. With an electrical field value between 100 and 150 V/cm the
deleterious effects became evident.
7
Lista de Tabelas
3.1
Protocolos experimentais
…………………………………………………............
4.1 Condição inicial das amostras (média+EPM)…………………………….............
4.2 Pressão ventricular em ritmo sinusal e sob estimulação externa ...........................
39
44
56
8
Lista de Ilustrações
1.1
Anatomia do coração (Modificado de Medline Plus
, 2005)......
.................
................
1.2 Representação gráfica do potencial de ação rápido, na qual podemos observar:
fase 0 (despolarização rápida), fase 1 (repolarização rápida), fase 2 (platô), fase 3
(repolarização lenta) e fase 4 (potencial de repouso)..................................................
1.3 Representação esquemática do potencial de ação das células marcapasso. A fase 1
(repolarização rápida) não está presente, a fase 2 (platô) constitui-se apenas por
uma menor taxa de repolarização, e podemos notar a despolarização diastólica
lenta na fase 4..............................................................................................................
1.4 Eletrofisiologia do coração. Os diferentes potenciais de ação de cada uma das
células especializadas encontradas no coração são exibidos. As latências
apresentadas são próximas às encontradas no coração saudável, o ECG normal
também é apresentado no canto inferior direito (Modificado de Malmivuo &
Plonsey, 1995).............................................................................................................
1.5 Eletrocardiograma de um paciente que evolui desde um traçado normal, até um
episódio de FV, no qual notamos a total desorganização do traçado (Modificado de
Beers & Berkow, 2004)...............................................................................................
3.1 Câmara experimental. A (vista frontal): 1- coração; 2- câmara experimental; 3-
eletrodo de captação; 4- placas de aço inoxidável; 5- cânula de perfusão; 6– equipo
de perfusão; 7 – tubo do sistema de sucção; 8 - câmara para passagem de água
aquecida. B (corte lateral): podemos observar o posicionamento dos eletrodos
de captação, de modo similar à derivação D2 do ECG...............................................
3.2 Vista superior da câmara experimental com o posicionamento dos eletrodos de
estimulação (verde), eletrodos de medição (azul) e coração (vermelho). Podemos
observar o alinhamento dos eletrodos de medição com relação às linhas do campo
elétrico (verde), assim como em relação ao coração...................................................
3.3 Esquema elétrico do estimulador cardíaco de altos campos (ECAC). Seu
funcionamento é baseado na descarga de um banco de capacitores, cuja duração
é controlada pelo fechamento de uma chave tipo MOSFET, chave esta
controlada por um circuito eletrônico que utiliza um oscilador monoestável (CD
4047) operando como gerador de pulsos quadrados..................................................
3.4 Esquema de ligação dos equipamentos para a aplicação dos pulsos elétricos de
altas intensidades. Em A, temos a situação durante a carga dos capacitores; e em B
estão representadas as conexões no momento da aplicação dos choques...................
3.5 Esquema do posicionamento dos equipamentos na montagem experimental: CARB
- carbogênio, BC – Bomba aquecedora, MULT – multímetro, EAC – Estimulador
de altos campos, EB – Equipo Bureta, CE – Câmara experimental, TP –
Transdutor de pressão, FDC – Fonte DC, SUC – Sistema de sucção, BV – Bomba
de vácuo, OSC – Osciloscópio, AB – Amplificador de Biopotenciais, AQDADOS
– PC com sistema de aquisição de dados....................................................................
16
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26
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30
34
9
3.6 A: Registro da marca de calibração de 100 mmHg; B: Registro da pressão após o
fechamento da torneira de três vias. A amplitude do primeiro pulso é tomada como
uma das referências para se estabelecer a viabilidade da amostra..............................
3.7 Correlação entre pressão com interferência da coluna de perfusão (torneira aberta)
e pressão após o fechamento da torneira de três vias..................................................
3.8 Registro da pressão ventricular durante os experimentos, apresentando os limites
utilizados para a quantificação da amplitude da onda de pressão. 500 mV equivale
a 23 mmHg. Pv representa a diferença entre pressão diastólica e sistólica................
3.9
Traçado de ECG obtido durante os experimentos, exibindo a forma de
mensuração dos parâmetros: complexo QRS e intervalo R-R....................................
3.10
Protocolo experimental do grupo 0, que foi submetido somente a isquemia
................
3.11 Protocolo experimental G1. Durante todo o experimento, a pressão ventricular e o
eletrograma são continuamente registrados, exceto no momento dos pulsos
elétricos, quando uma chave isola o amplificador de biopotenciais da câmara. No
grupo 1 são aplicados os 4 choques; no grupo 2, o choque de 50 V/cm não é
aplicado; no grupo 3 apenas os dois choques de 150 V/cm são aplicados.................
3.12 Registro da pressão ventricular no momento do choque. A intensidade da
contração durante o choque e da última contração precedente estão sinalizadas em
vermelho......................................................................................................................
3.13 Registro da pressão ventricular exibindo os limites para a medida do tempo de
assistolia pós-choque. A elevação da linha de base trata-se de um artefato causado
pela reabertura da perfusão. no caso apresentado acima, o tempo de assistolia foi
de 155 s.......................................................................................................................
3.14 Protocolo experimental com estimulação externa.......................................................
4.1 Comparação do campo obtido experimentalmente com o coração posicionado na
câmara (pontos azuis e reta preta) com o campo elétrico calculado a partir de
L=2,83 cm, h=3,16 cm e do valor médio de σ de 0,0142 (reta vermelha)..................
4.2 Efeito da isquemia. São exibidas as médias ± EPM dos quatro parâmetros
estudados ao final do período de estabilização após cada uma das quatro
isquemias.....................................................................................................................
4.3 Registro da pressão ventricular no momento da aplicação dos choques no grupo 1.
As setas vermelhas indicam o momento da aplicação dos choques............................
4.4 Representação gráfica das médias ± EPM da pressão ventricular ao término do
período de isquemia que precede a aplicação dos choques (preto) e da pressão no
momento do choque (vermelho).................................................................................
4.5 Representação gráfica das medidas da duração da assistolia nos três grupos
experimentais..............................................................................................................
4.6 Registro simultâneo do eletrocardiograma e pressão ventricular ao término do
período de estabilização pós-choque de 20 minutos...................................................
4.7 Representação gráfica das medidas da pressão ventricular nos três grupos
experimentais..............................................................................................................
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36
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4.8 Representação gráfica das medidas da freqüência cardíaca nos três grupos
experimentais..............................................................................................................
4.9 Representação gráfica das medidas da duração do complexo QRS nos três grupos
experimentais..............................................................................................................
4.10 Representação gráfica das medidas do fluxo de perfusão nos três grupos
experimentais
....................................................................................................................................
4.11
Registro da pressão ventricular sob estimulação externa. Os traços azuis indicam
o período de ritmo sinusal e os traços vermelhos, o período de estimulação
externa.........................................................................................................................
5.1 Níveis de lesão celular cardíaca com choques de 50, 100 e 150 V/cm......................
53
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57
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11
Lista de Abreviaturas
ATP Adenosina-trifosfato
AC Corrente alternada
Ca
2+
Íon Cálcio
E Campo elétrico
E
c
Campo elétrico no interior da câmara experimental
ECAC Estimulador cardíaco de altos campos
ECG Eletrocardiograma
E
med
Campo elétrico medido
EPM Erro padrão da média
E
cal
Campo elétrico calculado
F
c
Freqüência cardíaca
FV Fibrilação ventricular
I
p
Corrente do pulso
j Densidade de corrente
K-H Solução de Krebs-Henseleit
LIB Laboratório de Instrumentação Biomédica
L
qrs
Largura do complexo QRS
NAV Nodo Atrioventricular
NSA Nodo Sinoatrial
P
v
Pressão ventricular
PA Potencial de ação
P
c
Pressão ventricular no momento do choque
P
er
Perfusão coronariana
12
RS Retículo sarcoplasmático
T
a
Tempo de assistolia pós-choque
V
c
Tensão no banco de capacitores
V
m
Potencial de repouso
σ
σσ
σ Condutividade
13
Lista de Unidades
A Ampere
ºC Graus Celsius
cm centímetro
Hz Hertz
MHz Megahertz
J Joule
mM Milimolar
mm Milímetro
µ
µµ
µM Micromolar
µF Microfaraday
ms Milisegundos
mmHg Milímetro de mercúrio
η
ηη
ηM Nanomolar
Ω
ΩΩ
Ω Ohm
s Segundos
V Volts
V/cm Volts por centímetro
W Watt
14
Sumário
1. Introdução
..........................................................................................................................
2. Objetivos .............................................................................................................................
3. Metodologia ........................................................................................................................
3.1 Animais e preparação da amostra ..........................................................................
3.2 Solução ...................................................................................................................
3.3 Montagem experimental ........................................................................................
3.3.1 Câmara experimental ...............................................................................
3.3.2 Estimulador cardíaco de altos campos ....................................................
3.3.3 Outros equipamentos ...............................................................................
3.3.4 Montagem experimental completa ..........................................................
3.4 Protocolos experimentais .......................................................................................
3.4.1 Estabilização e medidas iniciais: viabilidade da amostra.........................
3.4.2 Controle do efeito da isquemia …………………....................................
3.4.3 Efeito da aplicação de pulsos elétricos de altas intensidades.. ...............
3.4.4 Influência da freqüência sobre a pressão ventric
ular ........................
3.5 Apresentação e análise dos dados …………………………………......................
4. Resultados ……………………….......................................................................................
4.1 Campo elétrico calculado (E
cal
) versus campo elétrico medido (E
med
) no
interior da câmara ........................................................................................................
4.2 Condições iniciais …………………………………………………......................
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24
25
25
25
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35
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38
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15
4.3
Efeito da isquemia....................................................................................................
4.4 Efeitos imediatos da aplicação de campos elétricos de altas intensidades sobre
corações isolados de ratos ......................................................................................
4.5 Efeitos persistentes da aplicação de campos elétricos de altas intensidades sobre
corações isolados de ratos.......................................................................................
4.6
Análise da influência da freqüência cardíaca sobre a pressão ventricular e
perfusão...................................................................................................................
5. Discussão ..............................................................................................................................
5.1 Montagem experimental e medidas iniciais............................................................
5.2 Efeito da isquemia sobre corações isolados............................................................
5.3 Efeitos imediatos da aplicação dos choques...........................................................
5.4 Efeitos permanentes da aplicação dos choques......................................................
5.5 Conclusões..............................................................................................................
6. Referências Bibliográficas ..................................................................................................
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16
1.
Introdução
O coração dos mamíferos possui uma estrutura fibromuscular, sendo constituído por
quatro câmaras, dois átrios e dois ventrículos, separados no plano longitudinal pelo septo e no
plano transversal por válvulas (figura 1.1). O ciclo rítmico de relaxamento e contração
permite ao coração o preenchimento e esvaziamento coordenado das câmaras cardíacas e o
conseqüente bombeamento de sangue, transportando e distribuindo substâncias essenciais
para os tecidos, removendo os produtos do metabolismo e participando da homeostase do
organismo através da termorregulação (BERNE & LEVY, 1996; AIRES, 1999).
Figura 1.1 - Anatomia do coração (Modificado de Medline Plus, 2005).
A célula muscular cardíaca apresenta grande quantidade de mitocôndrias em seu
citoplasma e retículo endoplasmático como uma única rede, envolvidos por uma membrana
celular. No interior dos miócitos, encontramos miofilamentos compostos basicamente pelas
proteínas actina e miosina, responsáveis pela contratilidade, organizados em unidades
funcionais denominadas sarcômeros.
17
O sarcolema é composto por uma bicamada lipídica de grande resistência dielétrica,
contendo proteínas extrínsecas, mergulhadas parcialmente nas superfícies interna e externa da
membrana e proteínas intrínsecas, que permitem a comunicação entre o interior e exterior do
miócito. Estas últimas formam canais iônicos hidrofílicos e outros sistemas de transporte de
íons e substâncias.
A permeabilidade seletiva do sarcolema aos diversos íons e a bomba de Na/K, geram
uma distribuição assimétrica dos íons entre os meios interno e externo durante a fase de
repouso dos miócitos, polarizando a membrana celular em valores próximos aos -90mV.
A membrana celular dos miócitos, quando despolarizada até valores próximos a -
60mV por impulsos elétricos, apresenta uma resposta característica chamada potencial de
ação (PA). Nas células de trabalho do miocárdio, o potencial de ação rápido caracteriza-se por
possuir cinco fases: despolarização (fase 0), repolarização rápida (fase 1), platô (fase 2) e
repolarização (fase 3), retornando, ao período de diástole elétrica (fase 4). Cada uma destas
fases resulta de diferentes correntes transmembrana de íons, causadas pela abertura e
fechamento de canais iônicos (figura 1.2).
Células especializadas na gênese de potenciais de ação, denominadas células
marcapasso, exibem um tipo de potencial, denominado potencial de ação lento. Este apresenta
uma despolarização diastólica espontânea, gerada por correntes iônicas tipo If e, em sua fase
final, pelo influxo de Ca
2+
causado pela abertura dos canais de cálcio do tipo L (large
conductance). Assim, o potencial transmembrana é elevado até valores nos quais será
deflagrada uma despolarização rápida (potencial limiar), constituindo o início da atividade
elétrica excitatória cardíaca (GARCIA, 2002), (figura 1.3).
Figura 1.2 - Representação gráfica do potencial de ação rápido, na qual podemos observar: fase 0
(despolarização rápida), fase 1 (repolarização rápida), fase 2 (platô), fase 3 (repolarização lenta) e fase 4
(potencial de repouso).
18
Figura 1.3 - Representação esquemática do potencial de ação das células marcapasso. A fase 1 (repolarização
rápida) não está presente, a fase 2 Constitui-se apenas por uma menor taxa de repolarização, e podemos notar a
despolarização diastólica lenta na fase 4. (modificado de Aires,1999)
No Nodo Sino Atrial (NSA), sob modulação do sistema nervoso central, são gerados
espontaneamente os impulsos elétricos que se propagam pelos átrios. Ao chegar ao Nodo
Átrio Ventricular (NAV), o único ponto de contato elétrico da junção entre átrios e
ventrículos, o sinal elétrico sofre um pequeno atraso, percorrendo, então, o feixe de His e as
fibras de Purkinje, terminando por estimular coordenadamente toda a massa ventricular. O
registro da atividade elétrica global do coração efetuado sobre a superfície do corpo,
organizado sob a forma de um sistema padronizado de derivações é chamado
eletrocardiograma (ECG), (AIRES, 1999). (figura 1.4).
Figura 1.4 - Eletrofisiologia do coração. Os diferentes potenciais de ação de cada uma das células especializadas
encontradas no coração são exibidos. As latências apresentadas são próximas às encontradas no coração
saudável, o ECG normal também é apresentado no canto inferior direito (Modificado de Malmivuo & Plonsey,
1995).
19
A estimulação elétrica, fisiológica ou exógena, e a conseqüente despolarização do
sarcolema provocam a entrada de Ca
2+
no citosol, disparando o mecanismo de liberação
adicional de Ca
2+
pelo RS. Este aumento na concentração citosólica de Ca
2+
de ∼ 100ηM para
∼ 1 µM, determina a suspensão da inibição da interação entre Actina e Miosina, o que permite
o desenvolvimento da função contrátil dos miofilamentos na presença de ATP e magnésio. A
redução do nível citosólico de Ca
2+
, recaptado pela ATPase de Ca
2+
do RS e expulsão para o
meio extracelular pela trocador Na/Ca e ATPase de Ca
2+
, levam à terminação do transiente de
Ca
2+
, provocando o relaxamento muscular. A todo este processo, denominamos “acoplamento
excitação-contração” (BERS, 2001).
Apesar do coração possuir diversos mecanismos compensatórios para adaptar-se às
mais adversas condições fisiológicas e fisiopatológicas, as doenças cardiovasculares aparecem
como uma das principais causas de óbitos em todo o mundo.
Mortes por doenças cardiovasculares perfazem 39,4% da mortalidade total nos EUA.
Apesar de não serem precisos os dados sobre a ocorrência de paradas cardíacas súbitas, cerca
de 250.000 pessoas morrem ao ano nos EUA de doença cardíaca coronariana sem
hospitalização. Acredita-se que a grande maioria seja causada por episódios de uma grave
arritmia, a fibrilação ventricular FV (AHA, 2004).
Quanto à base biofísica, a FV caracteriza-se por distúrbios na gênese do potencial de
ação, como, por exemplo, a diminuição do potencial de repouso dos miócitos (V
m
)
(BOYDEN, 1996), ou alterações na condução da onda de despolarização, formando circuitos
reentrantes: ondas de excitação que normalmente apresentam-se planas, podem ser quebradas
gerando ondas espirais (2D), helicoidais (3D), ou múltiplas ondas (SANGUINETTI &
BENNETT, 2003).
A fibrilação atrial é a arritmia mais freqüente, exibindo, porém, baixo êxito letal
(MAISEL & STEVESON, 2003). Já a fibrilação ventricular (FV) é a principal causa de morte
súbita em adultos (FLINDERS & ROBERTS, 2000).
Na FV, a desorganização elétrica leva a uma desorganização mecânica, com um
padrão irregular de bombeamento, causando interrupção do fluxo sanguíneo e da
suplementação de oxigênio (BOSSAERT, 1997). Toda a seqüência coordenada de ativação
dos ventrículos é substituída pela atividade caótica de pequenas ondas de despolarização
fragmentadas (figura 1.4) (MALMIVUO & PLONSEY, 1995).
20
Figura 1.5 – Eletrocardiograma de um paciente que evolui desde um traçado normal, até um episódio de FV, no
qual notamos a total desorganização do traçado (Modificado de Beers & Berkow, 2004).
Perspectivas promissoras de tratamento para a FV começam a ser estudadas, como o
remodelamento de canais iônicos por terapia genética (SANGUINETTI & BENNETT, 2003).
Porém, no estágio atual, a terapêutica medicamentosa não é eficaz no controle da FV. Hoje,
somente a desfibrilação elétrica permanece como tratamento aceito pela comunidade médica
mundial para a reversão desta grave arritmia.
Em um episódio de FV, caso não haja a pronta intervenção desfibrilatória, a morte
cerebral pode advir em 4 a 6 minutos e a cada minuto de retardo na ressuscitação da vítima a
chance de sobrevivência cairá de 7 a 10 %, sendo de apenas 2% a 5% em 12 minutos.
Segundo dados da Americam Heart Association, 80% das paradas cardíacas súbitas ocorrem
em casa, 60% sem expectadores e cerca de 95% das pessoas acometidas morrem antes da
admissão hospitalar (AHA, 2004). Dada a dramaticidade deste cenário, estão sendo
implantados em diversos países sistemas de desfibrilação pública com o uso de
desfibriladores externos automatizados, visando reduzir o tempo entre o evento de FV e a
aplicação da terapia desfibrilatória (WOOLARD, 2001).
A desfibrilação é um evento de natureza probabilística, não havendo um limiar claro,
acima do qual o sucesso ocorra (BARROS JR, 2003). Logo, a terapêutica desfibrilatória visa
reverter a FV, expondo a massa cardíaca ao menor nível necessário de gradiente de potencial.
Contudo, o grande paradoxo do choque desfibrilatório consiste no fato de que choques de
baixa intensidade não desfibrilam, ao passo que um choque muito intenso pode causar lesões
no coração (TUNG et al., 1994).
Na prática médica, são utilizados choques elétricos com energia entre 200 J e 360 J
para a desfibrilação transtorácica (TUNG, 1996).
Apesar da aplicação dos choques desfibrilatórios ser quantificada em termos da
energia aplicada (em J), uma forma prática para os operadores dos equipamentos, os
500 ms
2 mV
21
mecanismos de desfibrilação e lesão dos pulsos desfibrilatórios estão mais fortemente
relacionados com outra grandeza física, o campo elétrico aplicado sobre o coração.
Campos elétricos mínimos de 6V/cm para ondas monofásicas, e de 4V/cm para ondas
bifásicas devem ser alcançados nas regiões do coração mais distantes dos eletrodos para uma
desfibrilação efetiva, podendo chegar, em algumas condições, até 10V/cm. Isto significa a
seleção de energias que variam de 100J a 360J para uma desfibrilação transtorácica e de 5 a
30J para um desfibrilador-cardioversor interno (WALCOTT et al., 2003).
Grande parte da corrente elétrica aplicada é desviada para os músculos da parede do
tórax, sendo de apenas 4% a fração da corrente que alcança o coração. Assim, para que o
campo elétrico atinja a intensidade desejada nas regiões mais distantes dos eletrodos,
poderemos obter valores de até 200V/cm nas regiões próximas à interface eletrodo/tecidos
(FOTUHI et al., 1999). Este fato torna-se mais grave na desfibrilação interna do que na
transtorácica, pela grande variação da intensidade dos campos elétricos experimentada pelo
coração.
Fatores físicos, como as formas de onda do pulso desfibrilatório; técnicos, como o
posicionamento dos eletrodos; fisiológicos, como a perfusão miocardial e o estágio de
desenvolvimento pós-natal dos miócitos (GOMES et al., 2001) e patológicos, como a
etiologia da arritmia e gravidade de lesões estruturais, também podem interferir no sucesso da
desfibrilação.
Apesar de toda a padronização de procedimentos nas diversas modalidades de
aplicação da desfibrilação, visando aumentar sua segurança (CROCKETT et al., 1997;
KASANUKI & TAKEICHI, 2001; MONSIEUR et al., 2001; SAMSOM et al., 2003), o
choque desfibrilatório pode causar lesões na musculatura esquelética (VOGEL et al., 1998) e
no miocárdio, sendo alterações freqüentes a diminuição do inotropismo, arritmias e dilatação
cardíaca (SYLVESTER et al., 2003). Formas de proteger o miocárdio constituem um campo
de investigação em expansão, através de novas morfologias de onda de estimulação (LENG et
al., 2000; WHITE, 2002), aplicação de pulsos bidirecionais (FREITAS et al., 2004) e
utilização de fármacos (SUN et al., 1999; GAZMURI et al., 2001).
Além do potencial deletério de choques desfibrilatórios únicos, devemos levar em
conta os riscos da sua repetição, fato extremamente comum na prática da medicina de
emergência (GAZMURI et al., 2000).
Choques desfibrilatórios de mesma intensidade afetam de forma diferente as diversas
estruturas constituintes do coração, pois estas possuem sensibilidades variáveis quando
expostas a campos elétricos intensos (TUNG, 1996). A estimulação do miocárdio e a gênese
22
de arritmias podem ser influenciadas pela morfologia do tecido cardíaco, tanto
macroscopicamente quanto na sua microestrutura (GILLIS et al., 2000; HOOKS et al., 2002)
A má perfusão miocardial em um episódio de FV pode desencadear alterações
fisiológicas nos miócitos, causando variações nos limiares de estimulação (YAMAGUCHI et
al., 2002), além de aumentar a vulnerabilidade do miocárdio aos efeitos deletérios do choque
desfibrilatório (KLONER & JENNINGS, 2001). A deterioração eletrofisiológica progressiva
pode explicar a baixa probabilidade de sucesso na ressuscitação após longos períodos de
fibrilação (TOVAR & JONES, 2000).
Existem evidências experimentais indicando que as alterações observadas no coração
após a exposição ao choque elétrico de alta intensidade, podem ser atribuídas a fenômenos de
eletroporação (formação de poros aquosos na membrana celular), e que o tamanho e duração
destes poros varia proporcionalmente
à intensidade e duração dos campos elétricos aplicados
(TOVAR & TUNG, 1991; AL-KADRA et al., 2000; TROIANO et al., 1999;). Após a
aplicação de choques com intensidade de campo entre 100 V/cm e 200 V/cm, ocorre quebra
da resistência dielétrica do sarcolema, o que leva o miocárdio a disfunções pós-choque por
desequilíbrio iônico (JONES et al., 1987). Outros mecanismos de lesão como a formação de
radicais livres e alterações na bomba de Na/K não parecem ser a causa das alterações
deletérias pós-desfibrilatórias, pois somente ocorrem em intensidades maiores de campo
elétrico.
Durante a eletroporação, ocorre um grande influxo de Ca
2+
no miócito, acompanhado
por uma sobrecarga de Na
+
e depleção do conteúdo intracelular de K
+
. Isoladamente ou em
conjunto, estes processos podem levar as células cardíacas à morte (HO & MITTAL, 1996
OLIVEIRA et al.,2005). A sobrecarga de Ca
2+
também
está relacionada com a gênese,
manutenção e terminação da FV (ZAUGG, 2004).
Choques com densidades de corrente similares a desfibrilação parecem causar
depressão da bomba de Ca
2+
do RS, podendo ser a causa das disfunções contráteis pós-
desfibrilatórias (JONES & NARAYANAN, 1998).
Dada a sua importância médica, o estudo dos efeitos deletérios de choques
desfibrilatórios vem crescendo nos últimos anos, estando, porém, distante do esgotamento,
visto que diversas perguntas ainda permanecem sem resposta definitiva.
São escassos os trabalhos científicos mostrando os efeitos nocivos dos choques
desfibrilatórios (SOARES, 2003), assim como experimentos que abordam estimulação tendo
o campo elétrico como grandeza medida (GOMES et al., 2002; GODOY et al, 2002).
23
A realização de um estudo controlado com o coração integral isolado exposto a
campos elétricos uniformes, técnica que permite uma padronização do procedimento de
estimulação, pode contribuir para o estabelecimento de limites de estimulação nocivos ao
tecido cardíaco.
Neste trabalho estudaremos alterações causadas por campos elétricos de altas
intensidades sobre corações de rato em preparação de Langendorf. Serão avaliadas alterações
elétricas, mecânicas e perfusionais após a aplicação de campos elétricos de intensidades
crescentes.
24
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Estudar os efeitos deletérios da aplicação de campos elétricos de altas intensidades
sobre corações isolados de ratos.
2.1. Objetivos específicos
• Avaliar as alterações mecânicas, elétricas e perfusionais em corações isolados de ratos
após choques com intensidade de campo elétrico de 50, 100 e 150 V/cm e duração de
10 ms;
• Estudar o efeito de choques seqüenciais;
• Determinar a intensidade de campo elétrico capaz de lesar permanentemente o tecido
cardíaco.
25
3. Metodologia
3.1. Animais e preparação da amostra
Para realização dos experimentos, utilizamos ratos Wistar, machos, com idade
aproximada de 120 dias, criados em condição de temperatura controlada a 22°C ± 2°C, ciclo
de luz invertido e alimentação ad libitum. Depois de retirados do biotério, os animais são
submetidos à eutanásia por concussão cerebral, sendo, então, decapitados e seus corações
removidos por rápida abertura da caixa torácica e dissecção. O coração é posicionado por
meio de ligadura a uma cânula inserida na artéria aorta (preparação de Langendorf), sendo,
então, perfundido retrogradamente com solução de Krebs-Henseleit a 34ºC.
Todo o protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Manipulação e
Experimentação Animal da Universidade de Mogi das Cruzes (CEMEA/UMC), estando de
acordo com os princípios bioéticos que regem a utilização de animais em experimentação.
3.2. Solução
A solução de perfusão utilizada é a de Krebs-Henseleit modificada (K-H), com a
seguinte composição (em mM): NaCl 122,3; KCl 4,6; KH
2
PO
4
1,2; MgSO
4
1,2; NaHCO
3
17,4; CaCl
2
1,5; Glicose 11,11. O pH da solução é ajustado (com bicarbonato) a 7,4 a 34°C,
sendo saturado com carbogênio (95% de O
2
e 5% de CO
2
).
3.3. Montagem Experimental
Para realização dos procedimentos experimentais, a montagem experimental devia
apresentar os seguintes requisitos:
• Manter o coração isolado vivo e fisiologicamente estável durante um período
mínimo de 4 horas, necessário para a realização do experimento;
• Manter a pressão de perfusão constante;
• Permitir o registro do eletrocardiograma e pressão ventricular;
• Permitir a aplicação de choques de altas intensidades com valores conhecidos de
campos elétricos.
26
3.3.1 Câmara Experimental
A câmara experimental é o centro de toda a montagem. Em seu interior, o coração é
posicionado para a realização dos experimentos. Para que se entenda melhor esta câmara
apresentamos a figura 3.1. A câmara interna (1) é o local onde o coração (2) permanece
durante o experimento, mergulhado em solução de K-H. Dentro desta câmara estão
localizados os eletrodos de captação de Ag/AgCl (3). Estes são fios de prata cloretados a cada
experimento e posicionados de maneira que o sinal captado seja similar à derivação D2 do
eletrocardiograma. Os eletrodos de estimulação são placas de aço inoxidável com de 28,3
mm
de largura, submersos 31,6 mm na solução (4).
O coração está preso pela aorta a uma cânula de aço (5), ligado por uma mangueira ao
equipo (6) que por sua vez é conectado a uma bureta, onde fica a solução de K-H. O nível da
solução fica a uma altura de 85 ± 5 cm, de forma que a pressão de perfusão se mantenha
próxima ao valor fisiológico. Como a perfusão é contínua e em regime aberto, há um tubo (7)
ligado a um sistema de sucção que mantém o nível da solução constante dentro da câmara
durante os experimentos. Para mantermos a temperatura da solução a 34°C, fazemos com que
água aquecida circule pela câmara externa (8).
Figura 3.1 – Câmara experimental. A (vista frontal): 1- coração; 2 - câmara experimental; 3 - eletrodo de
captação; 4- placas de aço inoxidável; 5 - cânula/equipo de perfusão; 6 – tubo do sistema de sucção; 7 - câmara
para passagem de água aquecida. B (corte lateral): podemos observar o posicionamento dos eletrodos de
captação, de modo similar à derivação D2 do ECG.
A
B
27
Como a câmara experimental é preenchida pela solução de K-H, que é condutora, o
campo elétrico no seu interior é dado pela expressão:
E = j / σ eq 3.1
Onde E é o vetor campo elétrico, j é o vetor densidade de corrente e σ
é a
condutividade do meio.
Pela condição de paralelismo entre os eletrodos de estimulação, podemos inferir que j
é constante e com módulo igual à I
p
/A, onde I
p
é a corrente produzida pelo pulso de
estimulação e A é a área efetiva das placas de estimulação. Desta forma, para determinarmos
o campo elétrico no interior da câmara experimental, seria suficiente a determinação de I
p
e de
σ da solução.
A corrente (I
p
) é calculada a partir da medida da tensão sobre uma resistência de valor
conhecido, posicionada no circuito entre o banco de capacitores e a câmara experimental.
E = j / σ = I
p
/ A . σ = I
p
/ L . h . σ eq 3.2
Onde:
E é o módulo do campo elétrico;
j é o módulo da densidade de corrente;
I
p
é a corrente durante o pulso desfibrilatório;
σ
é a condutividade da solução de K-H;
A é a área submersa dos eletrodos de estimulação;
L
é a largura dos eletrodos e
h é a altura submersa dos eletrodos
Para confirmar se o E na câmara pode ser descrito pela equação 3.2, realizamos
medidas diretamente no interior da câmara. Utilizamos dois eletrodos de Ag/AgCl, fios de
prata cloretada com 3 mm de comprimento, alinhados a uma distância de 1cm, para que a
diferença de potencial medida entre ambos fosse numericamente igual à projeção do campo,
em V/cm. O posicionamento na câmara foi efetuado de modo que a linha imaginária que une
os dois eletrodos fosse paralela ao campo elétrico. Para realização do ensaio com o coração
posicionado, fixamos os eletrodos ao lado da amostra, como demonstra a
(figura 3.2). Foram
levantados seis pares I
p
, E.
28
Figura 3.2 - Vista superior da câmara experimental com o posicionamento dos eletrodos de estimulação (verde),
eletrodos de medição (azul) e coração (vermelho). Podemos observar o alinhamento dos eletrodos de medição
com relação às linhas do campo elétrico (verde), assim como em relação ao coração.
3.3.2. Estimulador cardíaco de altos campos (ECAC)
Este equipamento foi projetado para gerar pulsos monopolares exponenciais
truncados, com durações e intensidades controladas, permitindo submeter os corações a
campos elétricos de até 200 V/cm, valor comparável aos maiores campos elétricos alcançados
durante a aplicação dos pulsos desfibrilatórios. Seu funcionamento é baseado na descarga de
um banco de capacitores cuja duração é controlada pelo fechamento de uma chave tipo
MOSFET, chave esta controlada por um circuito eletrônico que utiliza um oscilador
monoestável (CD 4047) operando como gerador de pulsos retangulares. A intensidade do
pulso do ECAC é determinada pela tensão do banco de capacitores, havendo uma queda de
apenas 3% entre o início e o fim do período truncado. A duração do pulso é escolhida através
de uma chave seletora entre quatro valores (1, 3,2, 10 ou 20 ms) e o disparo é feito
manualmente, através de um botão do tipo push botton. (Figura 3.3).
29
Figura 3.3 - Esquema elétrico do estimulador de altos campos (EAC). Seu funcionamento é baseado na descarga
de um banco de capacitores, cuja duração é controlada pelo fechamento de uma chave tipo MOSFET, chave esta
controlada por um circuito eletrônico que utiliza um oscilador monoestável (CD 4047) operando como gerador
de pulsos quadrados.
O banco é formado por 3 capacitores de 10 000µF (250V) conectados em série, o que
nos permite aplicar pulsos exponenciais truncados de até 30A, gerando no interior da câmara
experimental campos elétricos de até 200V/cm. Ao levantarmos a curva descrita no item 3.3.1
pudemos determinar que, para campos de 50, 100 e 150 V/cm necessitávamos de correntes de
6,3, 12,6 e 18,9 A, que correspondiam à tensões de 220, 448 e 640 V no banco de capacitores,
respectivamente. O monitoramento desta tensão foi efetuado por um multímetro, ligado em
paralelo aos três capacitores.
Para a carga dos capacitores é utilizado um dispositivo para retificação de meia-onda,
constituído por um resistor de 20 Ω (50W) e um diodo, alimentados por 2 Variacs conectados
em série. Os Variacs foram ligados desta forma para garantir que a tensão de carga dos
capacitores nunca ultrapassasse 250 Volts, valor especificado pelo fabricante como tensão
máxima sobre cada capacitor. A carga é efetuada para cada capacitor individualmente, sendo
feita de forma progressiva e lenta. Para evitar disparos forçados, provocados por uma taxa
elevada de aumento da tensão entre os terminais Dreno e Source do MOSFET e também
evitar a passagem de corrente pela câmara experimental durante a carga, foi utilizado o
seguinte esquema para a pré-polarização do MOSFET (figura 3.4):
30
• Antes de iniciarmos a carga dos capacitores, os cabos de alimentação dos eletrodos de
estimulação estão desconectados, evitando desta forma qualquer possibilidade de
passagem de corrente pela câmara;
• Um curto-circuito entre os cabos de alimentação dos eletrodos de estimulação garante
que a tensão de carga dos capacitores esteja entre os terminais Dreno e Source do
MOSFET. Assim, a tensão de polarização do MOSFET, que é igual à tensão do banco
de capacitores, tem aumento lento e progressivo, de forma a evitar disparos forçados;
• Após a carga dos capacitores até o valor necessário, os cabos de alimentação são
ligados aos eletrodos;
• O curto circuito é então aberto, utilizando-se uma chave tipo pushbotton, e o pulso
estimulatório é disparado sobre a câmara;
• Após o pulso, o curto circuito é restabelecido, protegendo a câmara e o usuário de
disparos espúrios.
Figura 3.4 – Esquema de ligação dos equipamentos para a aplicação dos pulsos elétricos de altas intensidades.
Em A, temos a situação durante a carga dos capacitores; e em B estão representadas as conexões no momento da
aplicação dos choques.
Medidas de segurança
- C
omo durante o protocolo experimental chegamos a carregar o
banco de capacitores até 640 V, foi necessário adotar um procedimento de segurança para a
carga e descarga dos capacitores, evitando acidentes:
• Os valores de tensão obtidos pelos Variacs de alimentação são limitados, de maneira
que não haja possibilidade de sobrecarga dos capacitores.
• Toda a fiação e conectores têm a sua polaridade padronizada para evitar problemas na
carga dos capacitores.
• A manipulação dos plugues e jacarés de conexão é feita com apenas uma das mãos,
A
B
31
evitando o risco de acidentes graves com corrente passando pelo tórax
(KINDERMANN, 1995).
• Uma ligação tipo curto-circuito é posicionada entre as duas fases da fiação que
conecta o EAC à câmara experimental, aumentando a segurança durante a conexão
dos jacarés aos eletrodos de estimulação, somente sendo interrompida no momento da
aplicação dos choques.
• Como ocorre a utilização de solução condutora durante o protocolo, foram delimitadas
áreas “secas” e “molhadas” na bancada de trabalho, evitando acidentes por
extravasamento de solução de perfusão.
• Durante o isolamento e canulação do coração, os equipamentos de estimulação e
captação são mantidos cobertos por capas plásticas para evitar que se molhem.
• Após arealização dos experimentos, é realizada a descarga dos capacitores do ECAC
através de um fio conectado em série com um resistor de 100Ω (100W).
3.3.3. Outros equipamentos e componentes
Amplificador de biopotenciais - Este equipamento foi desenvolvido no Laboratório de
Instrumentação Biomédica (LIB), pelo aluno de iniciação científica Marcelo Birche Ferri para
amplificar os potenciais elétricos gerados pelo coração, com filtros passa-baixa (3Hz), passa-
alta (100Hz) e Notch (60Hz).
Na entrada do amplificador foi montado um circuito de proteção com dois diodos
retificadores ligados em paralelo com a entrada dos sinais, com polarização oposta. Estes
diodos funcionam como um curto circuito para sinais maiores que 0,7 V, evitando que pulsos
de altas intensidades venham a danificar seus componentes eletrônicos. O esquema elétrico é
apresentado no Anexo 1.
Transdutor de pressão - Utilizamos um transdutor (gentilmente cedido pelo Prof. JWM
Bassani, DEB/FEEC/UNICAMP) da marca Narco Bio-systems, modelo P100B, acoplado a
uma derivação do equipo de perfusão por uma torneira de três vias e posicionado no mesmo
nível que o coração. A correspondência da tensão de saída gerada pelos botões de calibração
quando comparada com uma fonte de pressão calibrada foi testada anteriormente em nosso
laboratório (SILVA & GOMES, 2004; COLUGNATI, 2004).
32
Amplificador utilizado com o transdutor de pressão - Utilizado para amplificar o sinal
gerado pelo transdutor de pressão (~10 mv), é um amplificador diferencial com ganho
ajustável em 10X ou 100X, dotado de filtro passa-baixa ativo tipo Butterworth, com
freqüência de corte de 22,5 Hz. O esquema elétrico é apresentado no anexo 2.
Fonte de alimentação do transdutor de pressão - Utilizamos uma fonte DC da marca
Dawer, modelo FSCC-3002 D, para alimentação do transdutor com +
15V.
Osciloscópio - Permite a monitoração dos sinais elétrico e mecânico do coração. Marca
Tektronix (modelo TDS 210
)
.
Fontes para carga do banco de capacitores - Para carregar os capacitores do estimulador,
utilizamos dois Variacs ligados em série. Um diodo foi utilizado para permitir uma retificação
de meia-onda, alimentando adequadamente os capacitores, assim como um resistor de 100 Ω
e 20W foi posicionado para limitar a corrente durante a carga dos capacitores.
Multímetro - Utilizado para medir a tensão nos capacitores durante a carga
e após o choque
desfibrilatório (Tektronix modelo DMM 916).
Sistema de aquisição de dados - Constituiu-se de um PC Pentiun II 350 MHz, com sistema
operacional Windows, tendo instalada uma placa de conversão A/D (Lynx CAD 1236) e o
software AqDados for Windows (Lynx).
Estimulador - Para a estimulação cardíaca a baixas intensidades de campos elétricos (pacing)
foi utilizado um estimulador da marca Grass, modelo S48 Stimulator, com unidade de
isolameno SIU5. Utilizamos estímulos monopolares com duração de 10 ms e freqüência de
4,5 Hz.
Bomba de sucção (vácuo) - Aparelho com a finalidade de manter, através de sucção, o nível
de solução constante dentro da câmara (31,6 mm). A solução, quando atinge o nível definido
por um tubo de plástico, é sugada através deste sistema para uma garrafa onde fica
armazenada. Este equipamento é uma modificação de um compressor da marca MULT-
33
HOBBY (modelo P600 Plus).
Torneira de três vias - Posicionada na saída da derivação para o transdutor de pressão do
equipo de perfusão, permite a interrupção do fluxo de perfusão, desviando toda a pressão
exercida pelo ventrículo esquerdo exclusivamente para a derivação do transdutor de pressão,
permitindo o registro da pressão sem a interferência da coluna de líquido do equipo de
perfusão.
34
3.3.4. Montagem experimental completa
Na figura 3.5 podemos observar toda a montagem experimental, como foi utilizada
para a realização dos experimentos.
Figura 3.5 - Esquema do posicionamento dos equipamentos na montagem experimental: CARB - carbogênio,
BC – Bomba aquecedora, MULT – multímetro, EAC – Estimulador de altos campos, EB – Equipo Bureta, CE –
Câmara experimental, TP – Transdutor de pressão, FDC – Fonte DC, SUC – Sistema de sucção, BV – Bomba de
vácuo, OSC – Osciloscópio, AB – Amplificador de Biopotenciais, AQDADOS – PC com sistema de aquisição
de dados.
35
3.4. Protocolos experimentais
3.4.1. Estabilização e medidas iniciais: viabilidade da amostra
Após o posicionamento e estabilização da amostra, iniciamos o monitoramento e
aquisição do eletrograma e da pressão ventricular. A partir destes registros, obtivemos
medidas quantitativas da pressão ventricular, freqüência cardíaca e largura do complexo QRS.
Observando o gotejamento da solução de perfusão no cata-bolhas do equipo, a perfusão
coronariana foi estimada como o volume perfundido durante o intervalo cronometrado de um
minuto.
Assim, ao final da estabilização inicial e de cada estabilização pós-choque, medimos
estes parâmetros, da seguinte forma:
Pressão ventricular (P
v
) – Trata-se da variação da pressão ventricular durante o ciclo
cardíaco. Utilizamos a diferença entre a pressão sistólica e diastólica, pois esta última é
definida pela altura da coluna de perfusão.Calibrações realizadas em nosso laboratório
confirmaram a coincidência dos valores de pressão gerada pelos botões de calibração do
transdutor de pressão (3.3.3), com valores conhecidos de pressão aplicada no sistema de
perfusão, através de um manômetro.
Pressionando os botões de calibração do transdutor, marcas de 100 mm/Hg e 10
mm/Hg foram geradas no registro da pressão ventricular (figura 3.6 A). A torneira de três vias
foi fechada momentaneamente, desviando o fluxo da perfusão exclusivamente para a
mangueira do transdutor de pressão, evitando a interferência da coluna de líquido da
derivação proveniente da bureta de depósito da solução de K-H. Procedemos, então, à medida
da primeira onda de pressão após o desvio do fluxo de perfusão para o transdutor de pressão.
Depois de transformada em valores absolutos, a amplitude deste pulso é comparada com
dados de experimentos prévios realizados no LEC, para determinação da viabilidade do
coração (SILVA & GOMES, 2004; COLUGNATI, 2004). Na figura 3.6 B, podemos observar
o registro da pressão ventricular com os limites utilizados para a medida da pressão
ventricular com a torneira de três vias fechada.
36
y = 1,4263x + 0,2077
R
2
= 0,9093
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,5 1 1,5 2
pressão com torneira aberta (V)
pressão com torneira
fechada (V)
Figura 3.6 – A: Registro da marca de calibração de 100 mmHg; B: Registro da pressão após o fechamento da
torneira de três vias. A amplitude do primeiro pulso é tomada como uma das referências para se estabelecer a
viabilidade da amostra.
Realizamos, então, uma comparação das pressões com a torneira de três vias aberta e
fechada, para verificação da existência de relação linear entre os dois parâmetros. Isto nos
permitiu evitar a repetição de todo o protocolo de fechamento da torneira de três vias a cada
medida subseqüente da pressão (figura 3.7).
Figura 3.7 – Correlação entre pressão com interferência da coluna de perfusão (torneira aberta) e pressão após o
fechamento da torneira de três vias.
Sob uma análise qualitativa, a medida da pressão sem o fechamento da torneira
apresenta forte correlação positiva com a medida tomada com a torneira de três vias fechada.
Isto nos permitiu tomar a pressão sem o fechamento da torneira no período inicial, em mV e
compará-la, posteriormente, às pressões após o período de estabilização pós-choque.
A
B
37
A figura 3.8 representa a forma de medição da pressão ventricular com a torneira de
três vias aberta.
Figura 3.8 – Registro da pressão ventricular durante os experimentos, apresentando os limites utilizados para a
quantificação da amplitude da onda de pressão. 500 mV equivale a 23 mmHg. Pv representa a diferença entre
pressão diastólica e sistólica.
Freqüência cardíaca (F
c
) -
Trata-se da medida da freqüência cardíaca tomada após a
estabilização do coração na preparação de Langendorf, em Hz. Na figura 3.9 podemos
observar como foi efetuada a medição do intervalo R-R, o que permitiu o cálculo da
freqüência pela seguinte fórmula: F
(Hz) =1/intervalo R-R (em segundos).
Largura do complexo QRS (L
qrs
)
-
É o intervalo de tempo entre a primeira deflexão do
complexo QRS e o retorno à linha de base, tomado após a estabilização da amostra, em
milisegundos (ms), medido a partir do traçado de ECG registrado pelo programa AQdados
(figura 3.9)
Figura 3.9 – Traçado de ECG obtido durante os experimentos, exibindo a forma de mensuração dos parâmetros:
complexo QRS e intervalo R-R.
38
Perfusão (P
er
) - É a medida do gotejamento do equipo de perfusão, convertido em mililitros
por minuto, tomada ao término do período de estabilização da amostra.
3.4.2. Estudo do efeito da isquemia
Durante um episódio de FV seguido de desfibrilação, ocorre um período inicial de
isquemia miocardial, a aplicação do choque e, em caso de sucesso, o restabelecimento do
ritmo sinusal e a reperfusão. No protocolo experimental adotado, procuramos simular esta
seqüência de eventos. Uma questão relevante é a influência da isquemia como fator isolado
sobre os parâmetros que desejávamos medir. Para isto, incluímos um grupo de animais que foi
submetido apenas aos períodos de isquemia (grupo 0, n=5), como exemplificado na figura
3.10.
Figura 3.10 – Protocolo experimental do grupo 0, que foi submetido somente a isquemia.
Ao término de cada período de estabilização, foram levantados os 4 parâmetros:
pressão, freqüência cardíaca, largura do complexo QRS e perfusão.
3.4.3. Efeito da aplicação de pulsos elétricos de altas intensidades
O fluxo de perfusão é interrompido por 3 min, ao término dos quais é aplicado o pulso
elétrico exponencial truncado com 10 ms de duração. Após o choque é restabelecida a
perfusão. Como medida de segurança, realizamos a desconexão física da captação do
eletrograma, sendo esta restabelecida imediatamente após a aplicação dos pulsos elétricos. O
banco de capacitores do ECAC é carregado de modo a gerar campos aproximadamente
uniformes de 50V/cm, 100V/cm ou 150V/cm. No início do experimento, o protocolo a ser
aplicado foi sorteado, de acordo com a tabela 1.
39
Grupos
G1 (N=5)
50V/cm 100V/cm 150V/cm 150V/cm
G2 (N=5)
não 100V/cm 150V/cm 150V/cm
G3 (N=5)
não não 150V/cm 150V/cm
Choques Aplicados
Tabela 3.1
– Protocolos experimentais
O protocolo do grupo G1 está esquematizado na figura 3.11
Figura 3.11 - Protocolo experimental G1. Durante todo o experimento, a pressão ventricular e o eletrograma
são continuamente registrados, exceto no momento dos pulsos elétricos, quando uma chave isola o amplificador
de biopotenciais da câmara. No grupo 1 são aplicados os 4 choques; no grupo 2, o choque de 50 V/cm não é
aplicado; no grupo 3 apenas os dois choques de 150 V/cm são aplicados.
Imediatamente após a aplicação dos choques, observamos uma forte contração,
seguida, em alguns casos, por um período de assistolia. Quantificamos estes fenômenos da
seguinte forma:
Pressão ventricular no momento do choque
(P
c
)
- Choques com intensidade igual ou
superior a 100 V/cm provocaram uma deflexão característica no registro da pressão
ventricular imediatamente após a sua aplicação. Podemos observar na figura 3.12 um registro
da pressão ventricular no momento do choque, assim como a últimas contrações espontâneas.
40
Figura 3.12 – Registro da pressão ventricular no momento do choque (seta). A intensidade da contração durante
o choque e da última contração precedente estão sinalizadas em vermelho.
Tempo de assistolia pós-choque (T
a
) -
É o período no qual ocorre ausência de atividade
elétrica e mecânica detectáveis após a aplicação do pulso elétrico, em segundos, como
mostrado na figura 3.13. Ao término do período de estabilização de 20 minutos pós-choque,
os parâmetros: pressão, freqüência, largura do complexo QRS e perfusão foram medidos
como o descrito em 3.4.1.
Durante os períodos de assistolia também realizamos estimulação externa (1,5X a 5X
limiar, 4,5 Hz, 10 ms), no sentido de estudar a responsividade das células miocardiais de
trabalho.
Figura 3.13 – Registro da pressão ventricular exibindo os limites para a medida do tempo de assistolia pós-
choque. A elevação da linha de base trata-se de um artefato causado pela reabertura da perfusão. No caso
apresentado acima, o tempo de assistolia foi de 155 s.
41
3.4.4. Influência da freqüência sobre a pressão ventricular e perfusão
Para nos certificarmos se as alterações da freqüência cardíaca afetavam
significativamente as medidas de pressão e perfusão, realizamos uma padronização da
freqüência cardíaca em 4,5Hz através de estimulação externa ao término dos períodos de
estabilização, utilizando o estimulador descrito em 3.3.3. Para 2 unidades experimentais do
grupo G1, após estabilização inicial, foi determinado o limiar de estimulação pela diminuição
gradativa da tensão dos pulsos, até que fosse atingido um valor de tensão insuficiente para o
controle externo do passo cardíaco. O valor de 1,5X o limiar de estimulação foi utilizado na
estimulação.
O procedimento foi realizado conforme a figura 3.14
Figura 3.14 – Protocolo experimental com estimulação externa.
3.5. Apresentação e análise dos dados
Para a comparação da pressão ventricular com a perfusão aberta X perfusão fechada
(figura 3.7), assim como para comparar o campo elétrico calculado X campo elétrico medido,
no interior da câmara experimental (figura 4.1), os dados foram plotados em um diagrama de
dispersão, sendo, então, obtidas retas de regressão de mínimos quadrados e o coeficiente de
correlação de Pearson (ZARR,1999),
Os dados obtidos nos experimentos foram apresentados nos gráficos e tabelas como
média +
erro padrão da média (EPM). Os diversos parâmetros foram comparados dentro de
cada um dos grupos através da análise de variância para medidas repetidas, utilizando-se o
42
teste de Tukey, visando identificar quais médias, tomadas duas a duas, diferem
significativamente entre si (CALLEGARI-JACQUES, 2003). A comparação intergrupos foi
efetuada através da aplicação de ANOVA monofatorial (MOORE, 2000).
Valores de P<
0,05 são considerados indicativos de significância estatística.
43
4 Resultados
4.1. Campo elétrico calculado (E
cal
) versus campo elétrico medido (E
med
) no
interior da câmara experimental
Como citado do item 3.3.1, foi realizado um ensaio de bancada para comparar o E
teo
e
o
E
exp
no interior da câmara experimental, contendo um coração isolado. Na figura 4.1
podemos observar que a equação 3.2 representa satisfatoriamente o campo no interior da
câmara em função da corrente aplicada na faixa de utilização de nossos experimentos, de 6 a
20 A.
Para determinar Os valores de corrente utilizados para a obtenção dos campos elétricos
desejados (50, 100 e 150 V/cm), foram obtidos a partir da equação experimental (reta preta).
y = 7,345x + 4,9756
R
2
= 0,9982
y = 7,9026x
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25
Corrente do Pulso (A)
Campo Elétrico (V/cm)
Figura 4.1 - Comparação do campo obtido experimentalmente com o coração posicionado na câmara (pontos
azuis e reta preta) com o campo elétrico calculado a partir de L=2,83 cm, h=3,16 cm e do valor médio de σ de
0,0142 (reta vermelha).
44
4.2 Condições iniciais
Como podemos observar na tabela 4.1, os diversos grupos experimentais apresentaram
características morfológicas e fisiológicas semelhantes em sua condição inicial.
Todos as medidas efetuadas nos diversos grupos apresentaram EPM% <
10%, com
exceção de F
c
do G0 e P
v
do G2.
peso animal (g) peso coração (g) P
v
(mmHg) F
c
(Hz) L
qrs
(ms) P
er
(ml/min)
G0 360 ± 5 1,6 ± 0,1 50 ± 2 3,0 ± 0,4 31 ± 1 7,9 ± 0,5
G1 368 ±
12 1,6 ± 0,1 58 ± 3 2,7 ± 0,1 29 ± 2 9,0 ± 0,8
G2 350 ±
3 1,5 ± 0,1 59 ± 7 2,9 ± 0,1 27 ± 3 8,6 ± 0,4
G3
344 ±
4 1,5 ± 0,1 55 ± 2 2,6 ± 0,2 30 ± 2 10,7± 0,6
Tabela 4.1 - Condição inicial das amostras (média+
EPM)
45
1º 2º 3º 4º
0
20
40
60
80
100
120
PRESSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
ISQUEMIA
1ª 2ª 3ª 4ª
0
20
40
60
80
100
120
QRS (% CONDIÇÃO INICIAL)
ISQUEMIA
4.3 Efeito da isquemia
Na figura 4.2, podemos observar o efeito da isquemia sobre os parâmetros estudados:
1ª 2ª 3ª 4ª
0
20
40
60
80
100
120
FREQUÊNCIA (% CONDIÇÃO INICIAL)
ISQUEMIA
1ª 2ª 3ª 4ª
0
20
40
60
80
100
120
PERFUSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
ISQUEMIA
Figura 4.2 – Efeito da isquemia. São exibidas as
médias ± EPM dos quatro parâmetros estudados ao
final do período de estabilização após cada uma das
quatro isquemias.
a) Pressão - Como podemos observar ao lado, houve
uma tendência de queda da pressão ventricular, não
havendo, porém, diferença significativa entre os
diversos choques, p = 0,63.
b) Freqüência cardíaca - a seqüência de isquemias
não foi capaz de provocar nenhum efeito significativo
sobre a freqüência cardíaca, p = 0,99.
c) Complexo QRS - não houve nenhuma alteração
significativa da duração do complexo QRS, p = 0,90.
d) Perfusão - apesar de tendência de diminuição da
perfusão com as isquemias seriadas, não houve
diferenças significativas em relação à condição inicial,
p = 0,28.
46
100mV
100mV
100mV
ms
ms
ms
ms
ms
ms
4.4. Efeitos imediatos da aplicação de campos elétricos de altas intensidades
sobre corações isolados de ratos
Ao final do período de isquemia, a pressão ventricular em isquemia apresentava
amplitude média de 70 mV e duração de 170 ms. Choques de 50 V/cm não provocaram
nenhuma alteração detectável no registro de pressão. Na figura 4.3 podemos observar o efeito
da aplicação dos choques de 100 e 150 V/cm em uma unidade experimental do grupo 1
Figura 4.3
– Registro da pressão ventricular no
momento da aplicação dos choques no grupo 1.
As setas vermelhas indicam o momento da
aplicação dos choques.
a) Com a aplicação do choque de 50 V/cm
ocorreu uma contração com amplitude
semelhante às precedentes.
c
)
Choque de 150 V/cm: podemos observar após o
choque Pc com amplitude de 380 mV e 398 ms.
Também podemos notar a elevação da linha de
base do registro da pressão ventricular.
c)
2º choque de 150 V/cm: A amplitude do
registro da Pc foi de 170 mV, com duração de 343
ms. Houve, também, uma discreta elevação da
linha de base do registro.
100mV
b
)
Choque de 100 V/cm: Imediatamente após o
choque, observamos uma contração com a
amplitude da Pc de 100 mV e duração de 490 ms.
47
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
400
PRESSÃO (mV)
CHOQUES
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
400
PRESSÃO (mV)
CHOQUES
Pressão ventricular durante o choque
Como descrito na figura 4.3, a amplitude do registro da pressão ventricular no
momento do choque apresenta um aumento significativo. A figura 4.4, apresenta as médias ±
EPM da pressão no momento da aplicação dos choques, assim como da amplitude da onda de
pressão que precede a sua aplicação.
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
400
PRESSÃO (mV)
CHOQUES
Figura 4.4
– Representação gráfica das médias ±
EPM da pressão ventricular ao término do período de
isquemia que precede a aplicação dos choques (preto)
e da pressão no momento do choque (vermelho)
a) Grupo 1 – As contraturas aumentaram com o
incremento da intensidade do choque até o primeiro
choque de 150V/cm, que pareceu causar lesão
permanente, pois a pressão no choque subseqüente
apresentou menor amplitude. Também podemos
observar o efeito de precondicionamento das
isquemias seqüenciais.
b) Grupo 2
–
A
mbas as
press
ões apresentaram
comportamento semelhante ao grupo 1. Sendo que o
primeiro choque de 150 V/cm fez com que o coração
desenvolvesse uma pressão aproximadamente 50%
maior.
c) Grupo 3
-
A aplicação do choque de 150 V/cm
causou dano permanente, pois a pressão desenvolvida
após a aplicação do 2º choque foi menor. Também é
evidente o fenômeno de precondicionamento.
48
A amplitude do registro de pressão foi significativamente maior, seguindo o aumento
de intensidade dos choques (p = 0,0003), até a aplicação do primeiro choque de 150 V/cm. A
partir de então, ocorreu dano permanente, traduzido pelo diminuição da amplitude do registro
da pressão no segundo choque de 150 V/cm. Choques de 100 e 150 V/cm, quando aplicados
como primeiros choques, causaram aumento significativo da pressão (p < 0,0001). Não houve
diferença significativa na comparação entre pressões desenvolvidas sob o efeito dos choques
de 150 V/cm.
49
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
(ASSISTOLIA (segundos)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
(ASSISTOLIA (segundos)
CHOQUE (V/Cm)
Figura 4.5
- Representação gráfica das medidas da
duração da assistolia nos três grupos experimentais.
a) Grupo 1 – Choques de 50 e 100 V/cm não
causaram assistolia significativa. as médias dos
choques de 150 V/cm, diferiram significativamente
dos choques de 50 e 100 V/cm (p = 0,0002).
Assistolia
Imediatamente após os choques de 100 e 150 V/cm, ocorreram períodos de assistolia
variáveis. A figura 4.5 apresenta as durações dos períodos de assistolia pós-choque dos grupos
experimentais, em valores absolutos. Para determinar a responsividade das células de
trabalho do miocárdio à estimulação externa, foi realizada a estimulação (10 ms, 1,5X limiar)
nos períodos de assistolia. Não ocorreu nenhuma resposta, mesmo com a elevação do pulso de
estimulação para 5X o limiar.
Ao compararmos o efeito do primeiro choque em cada um dos 3 grupos, podemos
notar a ocorrência de assistolia significativa (p = 0,001), com o choque de 150 V/cm. A
comparação entre os choques de 150 V/cm revelou assistolia significativamente maior com
choque de 150 V/cm não precedido por choques de 50 e 100 V/cm (p = 0,0087). Comparando
o 2º choque de 150 V/cm não encontramos diferenças (P = 0,247).
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
ASSISTOLIA (segundos)
CHOQUE (V/Cm)
b) Grupo
2
-
O mesmo efeito descrito no grupo 1
repetiu-se com o grupo 2. A duração das assistolias
apresentou uma tendência de aumento, não sendo
significativamente diferente do grupo 1.
c) Grupo 3
– O primeiro choque de 150V/cm
provocou uma assistolia com duração
significativamente maior que o mesmo choque nos
grupos precedentes. Já o segundo choque não
apresentou diferenças quando comparado ao efeito
observado nos grupos anteriores.
50
4.5. Efeitos persistentes da aplicação de campos elétricos de altas
intensidades sobre corações isolados de ratos
Na figura 4.6 podemos observar o comportamento inicial do eletrocardiograma e
registro da pressão ventricular de uma unidade experimental do G1, assim o comportamento
destes parâmetros ao término do período de estabilização pós-choque.
Figura 4.6
–
Registro simultâneo do
eletrocardiograma e pressão ventricular ao término do
período de estabilização pós-choque de 20 minutos.
a) Registro do eletrograma e pressão ventricular após
o período inicial de estabilização. Os corações
apresentavam-se rítmicos, com freqüência média de
2,8 Hz, desenvolvendo pressão de aproximadamente
56 mmHg. Os complexos QRS exibiam duração
média de 29 ms. A perfusão média era de 9 ml/min.
b)
Após a aplicação do choque de 50V/cm, ocorreu
diminuição da freqüência e pressão ventricular pós-
choque, retornando aos valores iniciais ao término do
período de estabilização. Também pudemos observar
tendência de alargamento do complexo QRS e
aumento da perfusão (não significativos).
c)
Após o choque de 100V/cm ocorreu alargamento do
complexo QRS (44,6ms), diminuição da freqüência
para a média de 2,1Hz, tendência de queda da pressão
ventricular (não significativa) e queda da perfusão
para 7,7 ml/min.
51
A seguir, passaremos a apresentar a quantificação dos parâmetros pesquisados. Como
citado em 3.4.2, pressão ventricular, freqüência cardíaca, largura do complexo QRS e
perfusão, serão apresentados como porcentagem da condição inicial.
d)
Com o choque de 150V/cm observamos diminuição
da freqüência para 1,9Hz e redução da pressão
ventricular média para 31,9mmHg. O complexo QRS
apresentou duração de 50ms. A perfusão caiu para
cerca de 5,8 ml/min. Não ocorreu a recuperação destes
parâmetros.
e)
Com o 2º choque de 150V/cm observamos
diminuição da freqüência para 1,5Hz e redução da
pressão ventricular média para 15,6 mmHg. O
complexo QRS apresentou duração de 60ms, e
perfusão caiu para cerca de 3,9 ml/min. Estas
alterações foram duradouras, havendo cessação das
atividades elétrica e mecânica em uma das amostras.
52
Pressão
A figura 4.7 apresenta gráficos de coluna onde podem ser comparados os efeitos sobre a
pressão ventricular de choques repetidos de intensidades crescentes, choques da mesma
intensidade precedidos por outros choques e primeiros choques de 50, 100 e 150V/cm.
Comparando-se as médias das pressões do grupo 1, apenas choques de 50 e 100 V/cm
não apresentaram diferenças significativas. Houve redução significativa da pressão (p < 10
-4
),
comparando-se os choques de 150V/cm com os demais choques. Comparando-se os primeiros
choques de cada um dos grupos, somente o choque de 150 V/cm foi capaz de provocar
alteração significativa da pressão (p = 0,0477). Ambos os choques de 150 V/cm causaram
lesão, não sendo afetados pela aplicação dos choques de menor intensidade (p = 0,356 e
0,144, respectivamente).
Figura 4.7
–
Representação gráfica das medidas da
pressão ventricular nos três grupos experimentais.
a) Grupo 1 - As médias das pressões apresentaram
redução progressiva com a aplicação de choques de
intensidades crescentes, mais evidente após os
choques de 150V/cm.
b
) Grupo 2
-
H
ouve
uma
diminuição significativa da
pressão ventricular a partir do choque de 150V/cm.
c
) Grupo
3
-
O
primeiro choque de 150 V/cm foi
capaz de causar diminuição da pressão, efeito este
acentuado com a aplicação do segundo choque.
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PRESSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PRESSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PRESSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
53
Freqüência cardíaca
Na figura 4.8 podemos observar o comportamento da freqüência cardíaca dos três
grupos experimentais ao término do período de estabilização pós-choque.
Comparando-se as médias das F
c
após o primeiro choque aplicado em cada grupo,
obtivemos p = 0,0028, indicando que o efeito do choque é fortemente dependente de sua
intensidade. Os choques de 150 V/cm são igualmente lesivos, independentemente da
aplicação dos choques de 50 e 100 V/cm. Ao compararmos as médias dos 3 grupos após o
primeiro choque de 150 V/cm e após o segundo choque de 150 V/cm, obtivemos p = 0,675 e
0,655, respectivamente.
Figura 4.8
- Representação gráfica das medidas da
freqüência cardíaca nos três grupos experimentais.
a) Grupo 1 - Houve uma tendência de
bradicardização A média da freqüência foi
significativamente menor a cada choque aplicado
(p < 10
-4
).
b
) Grupo 2
-
O
choque inical de 100V/cm não causou
diminuição de freqüência, fato que só ocorreu a partir
do primeiro choque de 150V/cm.
c
) Grupo 3
-
Choques iniciais de 150 V/cm foram
capazes de provocar diminuição significativa da
freqüência, da mesma monta que os grupos anteriores
que receberam maior número de choques.
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
FREQUÊNCIA (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
CHOQUE (V/Cm)
FREQUÊNCIA (% CONDIÇÃO iNICIAL)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
FEQUÊNCIA (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
54
Largura do complexo QRS
A figura 4.9 apresenta as medidas de duração do complexo QRS ao fim do período de
estabilização pós-choque.
A comparação dos primeiros choques aplicados em cada grupo não revelou diferenças
significantes (p =0,409). Choques de 150 V/cm causaram alteração do complexo QRS, sem
sofrer influência da aplicação prévia dos choques de 50 e 100 V/cm (p = 0,313 e 0,91,
respectivamente).
b
)
Grupo 2
- Foi observado uma tendência do
aumento progressivo da duração do complexo QRS
com a aplicação dos choques de intensidades
crescentes.
c
) Grupo 3
- Observamos a mesma tendência dos
grupos 1 e 2.
Figura 4.9
- Representação gráfica das medidas da
duração do complexo QRS nos três grupos
experimentais.
a) Grupo 1 - Apenas choques de 150V/cm causaram
aumento significativo da duração do complexo QRS
(p = 0,0038).
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
QRS (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
QRS (% CONDIÇAÕ INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
50
100
150
200
250
300
350
QRS (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
55
Perfusão
Os gráficos apresentados na figura 4.10 nos permitem comparar os fluxos de perfusão ao final
do período de estabilização pós-choque.
Comparando-se os primeiros choques de cada um dos três grupos, não encontramos
diferença significativa (p = 0,736), indicando não haver efeito deletério relacionado com a
intensidade do primeiro choque aplicado. Apesar da tendência de redução da perfusão com a
aplicação de choques de 50 e 100 V/cm, os choques de 150 V/cm não foram
significativamente diferentes entre os 3 grupos, indicando não haver influência da aplicação
prévia de choques de 50 e 100 V/cm (p = 0,0574 e 0,914, respectivamente).
Figura 4.10
-
Representação gr
áfica das medidas do
fluxo de perfusão nos três grupos experimentais.
a) Grupo 1 - Choques de 50 e 100V/cm não alteraram
a perfusão. Choques de 150V/cm causaram redução
significativa da perfusão (p < 10
-4
).
b
) Grupo 2
– Somente após a aplicação dos choques
de 150 V/cm ocorreu redução da perfusão.
c
) Grupo 3
-
Somente o segundo choque de 150 V/cm
causou redução da perfusão.
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PERFUSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PERFUSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
50 100 150 2º 150
0
20
40
60
80
100
120
PERFUSÃO (% CONDIÇÃO INICIAL)
CHOQUE (V/Cm)
56
P
v
sinusal (V) P
v
estim (V) F
c
sinusal (Hz) F
c
estim (Hz)
inicial
1,15 0,96 (90%) 3 4,5
pós-choque 50 V/cm
1,26 1,3 (103%) 2,8 4,5
pós-choque 100 V/cm
1,25 1,28 (100,2%) 2,2 4,5
pós-choque 150 V/cm
0,94 0,86 (91%) 1,6 4,5
Tabela 4.2
- Pressão ventricular em ritmo sinusal e sob estimulação externa.
4.6. Análise da influência da freqüência cardíaca sobre a pressão
ventricular e perfusão
Realizamos um experimento exploratório para a determinação da influência da
freqüência cardíaca sobre a pressão ventricular, conforme o descrito em 3.4.4. Na figura 4.6
podemos observar os registros de pressão ventricular em ritmo sinusal e sob estimulação
externa (4,5 Hz, 10 ms e 1,5X limiar).
O monitoramento da perfusão durante períodos de estimulação externa pós-choque de
150 V/cm (4,5 Hz, 10 ms e 1,5X limiar), não revelou nenhuma relação entre diminuição do
fluxo de perfusão e freqüência cardíaca.
Na tabela 4.2 podemos observar as medidas de F
c
e P
v
em ritmo sinusal e sob
estimulação externa nos períodos inicial e pós-choque.
57
Figur
a 4.11
–
Registro da pressão ventricular sob
estimulação externa. Os traços azuis indicam o
período de ritmo sinusal e os traços vermelhos, o
período de estimulação externa.
a) Na condição inicial, a amplitude do sinal de
pressão em ritmo sinusal era de 1,15 V a 3 Hz, com
estimulação externa (1,5X, 4,5Hz, 10ms), passou a ser
de 0,96 V (90%)
b)
Ao término do período de estabilização pós-choque
de 50 V/Cm, a amplitude da pressão com ritmo sinusal
era de 1,26 V a 2,8 Hz. Com estimulação (1,5X,
4,5Hz,10 ms), este valor passou a ser de 1,3 V
(103%).
d)
Após o período de estabilização pós-choques de
150V/cm, a pressão desenvolvida a 1,6 Hz era de
0,94 V. Com estimulação externa (1,5X, 4,5Hz,
10ms), este valor passou a ser de 0,86V (91 %).
c)
Após estabilização pós-choque de 100V/cm, a
amplitude do sinal de pressão era de 1,26 V a 2,2 Hz.
Sob estimulação externa (1,5X, 4,5Hz, 10ms), este
valor passou a ser de 1,28V (100,2 %).
58
5. Discussão
Nossa proposta de trabalho se iniciou através de uma revisão bibliográfica que nos
proporcionou uma visão geral sobre as bases da lesão miocardial pela aplicação de pulsos
desfibrilatórios e o estado da arte nesta área do conhecimento científico. Desde os primeiros
estudos, tornou-se patente a dificuldade de padronização dos procedimentos e,
conseqüentemente, a comparação dos resultados obtidos pelos diversos grupos de pesquisa
(JONES & NARAYANAN, 1998, AL-KHADRA et al., 2000, QIN et al., 2002).
5.1. Montagem experimental e medidas iniciais
A preparação de corações isolados de Langendorf e a estimulação por campo elétrico,
metodologias já utilizadas em nosso laboratório, foram a opção encontrada para o estudo dos
efeitos deletérios dos choques de altas intensidades sobre o coração. Nossa amostra foi
posicionada em um volume condutor com características físico-químicas estáveis, no interior
de uma câmara de dimensões conhecidas. Isto, somado a um estimulador especialmente
projetado para esta finalidade, permitiu-nos a padronização da estimulação com a utilização
de campos elétricos de intensidades controladas, numa condição experimental altamente
reprodutível.
Montagens experimentais anteriormente utilizadas em nosso laboratório (SILVA &
GOMES, 2004; COLUGNATI et al., 2004; FREITAS et al., 2004 e BARROS JR, 2003),
serviram como base para a construção da câmara experimental e para a adaptação da
preparação de Langendorf. Como necessitávamos de um estimulador capaz de gerar campos
elétricos de até 150V/cm, foi desenvolvido um equipamento que se mostrou confiável, sendo
capaz de produzir pulsos de até 650 V, com durações de 1, 3,2, 10 e 20 ms. No ensaio de
bancada (item 4.1), obtivemos valores de campos elétricos experimentais muito próximos
àqueles calculados a partir da equação 3.2.
Gazmuri et al. (2000) e Matsuda et al. (1992) obtiveram os valores de pressão
ventricular em suas montagens experimentais de ∼ 100 mm Hg, bastante próximos dos
obtidos em nossa montagem, de ∼ 105 mm Hg (58 mm Hg de pressão da coluna de perfusão e
45 mmHg do ∆ da pressão ventricular medida). Na montagem experimental apresentada,
desenvolvemos uma forma de mensuração da pressão ventricular de fácil execução, uma vez
59
que não foram utilizados microbalões posicionados no ventrículo esquerdo (GAZMURI et al.,
2000).
O valor médio de F
c,
de 2,8 ± 1 Hz a 34 ± 0,5 ºC, foi menor que o citado por Gazmuri
(2000), que obteve a média de 3,6 ± 0,75 Hz a 36 ºC, por trabalharmos em temperaturas mais
baixas.
A forma de captação da atividade elétrica do coração isolado, com eletrodos
posicionados ao lado da amostra, similarmente à derivação D2, permitiu a aquisição do
traçado de ECG com qualidade superior àquela de trabalhos onde os eletrodos de captação
foram posicionados sobre o epicárdio de corações isolados (ABERRA et al., 2001). Isto
possibilitou a medida da duração do complexo QRS com EPM% máximo de 10% ao término
do período inicial de estabilização das amostras. Além disto, um registro mais claro pode
possibilitar a análise de diversos outros parâmetros eletrocardiográficos, tais como: onda P,
intervalo PR, intervalo QT, etc.
O sistema de perfusão por gravidade mostrou-se confiável, de fácil operação e baixo
custo. O fluxo da solução, em ml/min, apresentou valores muito próximos à perfusão
coronariana medida por He & Downey, 1998 (8,9 ± 0,4 ml/min) e Watters et al., 1989 (∼10
ml/min), utilizando sistemas muito mais sofisticados. Assim, consideramos que o fluxo de
solução de perfusão pode ser um estimador confiável da perfusão coronariana.
Finalmente, a montagem experimental utilizada correspondeu de forma satisfatória aos
requisitos citados no item 3.3 e os valores basais obtidos com as amostras foram semelhantes
aos encontrados na literatura.
5.2. Efeito da isquemia sobre corações isolados
Em corações hipoperfundidos, choques desfibrilatórios com energias e intensidade de
campo elétrico menores
podem causar danos ao miocárdio, quando comparados a corações
em condições de normoperfusão (YAMAGUCHI et al., 2002). Para mimetizar a seqüência de
eventos que ocorre na FV seguida de desfibrilação, optamos por incluir períodos de isquemia
precedendo a aplicação dos pulsos elétricos.
60
Para que fossem descartados os efeitos da isquemia per se (YAMAGUCHI et al.,
2002; HE & DOWNEY, 1998), como por exemplo, o precondicionamento (KLONER &
JENNINGS, 2001; TANG et al., 2000), fenômeno no qual breves períodos de isquemia
prévios minimizam os efeitos deletérios causados por um período isquêmico subseqüente de
maior duração, realizamos experimentos em um grupo que foi submetido somente à isquemia,
sem a aplicação de choques.
Não houve variação significativa em nenhum dos parâmetros registrados neste grupo
(G0, n=5). Consideramos então que as alterações observadas nos grupos G1, G2 e G3 não
devem ser atribuídas aos períodos de isquemia mas, sim, aos choques de altas intensidades.
5.3. Efeitos imediatos da aplicação dos choques
Pressão ventricular no momento dos choques
Dois eventos distintos ocorreram no momento da aplicação dos choques: uma
contração rápida, seguida do aumento relativamente lento da pressão de base.
O registro de pressão no momento do choque apresentou uma morfologia semelhante
às contrações espontâneas precedentes, com uma amplitude até 10X maior. Este aumento
momentâneo da pressão ventricular foi proporcional à intensidade dos campos elétricos, até o
primeiro choque de 150 V/cm, quando, então, pareceu haver lesão, pois a amplitude da
pressão do segundo choque de 150V/cm foi menor que a do choque precedente. A elevação
da linha de base da pressão inicia-se no instante do choque, e perdura por vários segundos.
Disfunções miocardiais pós-desfibrilatórias parecem estar relacionadas com aumento
da concentração intracelular de cálcio [Ca
2+
]
i
, como demonstrou Gazmuri et al. (2000),
quando choques aplicados no epicárdio de corações isolados de ratos causaram disfunções
diastólicas antes de provocar disfunções sistólicas. Jones & Narayanan (1998), demonstraram
a existência de correlação negativa entre a intensidade de choques desfibrilatórios aplicados
sobre o tórax de ratos e a recaptação de Ca
2+
pelo RS.
Consideramos que ambos os fenômenos observados após a aplicação do choque se
devem, de alguma forma, à eletroporação da membrana celular. Durante a contração rápida,
há uma forte liberação de cálcio pelo RS induzida pela entrada maciça de cálcio pelos poros.
Esta contração diminui à medida que o RS consegue recaptar o cálcio citosólico. A posterior
elevação da linha de base indica contratura das células, o que pode estar relacionado ao
aumento gradativo da [Ca
2+
]
i,
devido ao influxo contínuo deste íon pelos poros formados e
61
também à diminuição da recaptação de Ca
2+
pelo RS (JONES & NARAYANAN, 1998). O
seu curso temporal parece estar relacionado também a um terceiro evento, a assistolia que se
seguiu à aplicação dos pulsos elétricos de altas intensidades.
Assistolia
Os períodos de assistolia (elétrica e mecânica), iniciaram-se a partir dos choques de
100 V/cm, apresentando correlação positiva com a intensidade dos choques. Parece haver um
efeito de precondicionamento, pois choques de 150V/cm apresentaram menores períodos de
assistolia quando precedidos por choques de 50 e 100 V/cm. Com o retorno da atividade,
bradicardia diretamente relacionada à intensidade do choque foi observada. Trabalhos
produzidos nos últimos 30 anos relatam a existência de períodos de assistolia seguidos de
bradicardia (CORABOEUF, 1963 apud TUNG, 1996) e de taquicardia (PELESKA, 1963
apud TUNG, 1996), efeitos atribuídos a distúrbios na condução do impulso elétrico.
Uma questão foi suscitada neste ponto: a assistolia estaria relacionada com uma parada
sinusal ou as células miocardiais de trabalho não seriam responsivas à estimulação. Foi, então,
realizada estimulação externa de até 5X o limiar, não havendo resposta contrátil. Não nos foi
possível avaliar a atividade de marcapasso das células nodais neste período pelas
características de captação da montagem experimental, mas pudemos comprovar a
inexcitabilidade dos miócitos ventriculares de trabalho. Assim, consideramos que, se ocorrem
distúrbios na gênese e condução do impulso elétrico, não se trata de um fenômeno isolado,
havendo também comprometimento da excitabilidade das células musculares de trabalho.
A estimulação de miócitos ventriculares isolados com campos elétricos de altas
intensidades, realizada por Oliveira et al. (2005), levou à ocorrência de eletroporação e
acumulação citosólica de Ca
2+
, com poros permanecendo ativos por diversos minutos. Assim,
acreditamos que a contração rápida, a lenta e a assistolia pós-choque estão relacionadas ao
fenômeno da eletroporação.
5.4. Efeitos permanentes da aplicação dos choques
Pressão ventricular
Existem diversos relatos na literatura científica de disfunções miocardiais anatômicas
62
e contráteis pós-desfibrilatórias. Jongh et al. (2002) e Sylvester et al. (2003) relatam a
ocorrência de dilatação cardíaca em estudos clínicos e experimentais, respectivamente. Xie et
al. (1997) e Gazmuri et al. (1996, 2000) descrevem alterações na contratilidade e no
relaxamento do miocárdio de ratos, diretamente relacionadas à intensidade dos choques
aplicados. Clinicamente, o conjunto destas disfunções, é denominado stunned myocardium
(KLONER & JENNINGS 2001), sendo freqüentemente observado no período subseqüente a
desfibrilação.
Nos experimentos, choques de 50 e 100 V/cm não afetaram a pressão de forma
significativa. Já choques de 150V/cm causaram redução permanente da pressão ventricular.
Estes achados são compatíveis com resultados de Soares (2003), que relata redução da
contratilidade após a aplicação de campos elétricos de altas intensidades sobre tecido atrial
isolado de ratos.
A estimulação externa, como demonstrado no item 4.11, não afetou de forma
significativa as pressões pós-choque, fato que, indica ser a disfunção um problema primário
das células de trabalho. Consideramos que a partir dos choques de 150 V/cm, uma população
significativa de miócitos ventriculares encontra-se funcional ou estruturalmente lesada, não
permitindo o desenvolvimento da pressão ventricular normal.
Freqüência cardíaca
Choques de 50V/cm não alteraram significativamente as F
c
iniciais; choques de
100V/cm só causaram uma pequena diminuição quando precedidos pelo choque de 50V/cm e
choques de 150V/cm causaram uma redução de cerca de 40% na F
c
.
Como as terminações do sistema nervoso periférico permanecem intactas no coração
integral isolado, sua estimulação poderia estar envolvida na modulação das freqüências
sinusais, através da diminuição do tono simpático (BODE, 1998), principalmente nos
períodos de iniciais de bradicardia após a assistolia. Já a bradicardia persistente ao término do
período de estabilização das amostras, deve estar relacionada com fenômenos de
eletroporação e desbalanceamento iônico das células nodais, pois só ocorre após choques de
150 V/cm.
Complexo QRS
O alargamento do complexo QRS está relacionado com alterações na geometria dos
ventrículos (principalmente a dilatação), bloqueios na condução do impulso elétrico nos
ramos direito e esquerdo do feixe de Hiss, distúrbios eletrolíticos, isquemias regionais e
63
infarto do miocárdio (TILLEY, 1992; CARNEIRO, 1992). Tung (1996) relata a existência de
alterações no complexo QRS após a aplicação de choques desfibrilatórios. Com a aplicação
dos choques acima de 100V/cm houve um aumento na duração do complexo QRS, sendo
maior quando foram aplicados choques precedentes, chegando próximo dos 240% após o
segundo choque de 150V/cm.
Como citado por Jongh et al. (2002) e Sylvester et al. (2003), ocorre dilatação cardíaca
imediatamente após a aplicação de choques desfibrilatórios, podendo constituir uma das
causas transitórias do alargamento do complexo QRS, que se apresentou mais pronunciada no
terço inicial do período de estabilização pós-choque.
Apesar de algumas estruturas serem mais sensíveis a choques que outras (GILLIS et
al., 2000), não nos foi possível determinar com precisão o sítio de lesão que gerou o
alargamento permanente do complexo QRS. Este pode ser devido a lesões em células de
trabalho, em estruturas do sistema especializado de condução ou em ambos.
Perfusão
Ocorreu um queda significativa na perfusão coronariana a partir da aplicação do
choque de 150 V/cm, principalmente nos grupos que receberam choque prévios de 50 e 100
V/cm.
Em nossa montagem, coração é mantido sob um regime de perfusão com pressão
constante, através da canulação retrógrada da artéria aorta. Presumindo-se a integridade da
válvula bicúspide, qualquer alteração do fluxo de perfusão se deve a alterações no fluxo
coronariano.
Por analogia à lei de Ohm: Fluxo coronariano
=
pressão de perfusão ÷ resistência ao
fluxo de perfusão. Como a pressão de perfusão é constante, qualquer diminuição da perfusão
se deve ao aumento da resistência ao fluxo de perfusão. Toda a resistência ao fluxo
coronariano está concentrada, tanto na sístole quanto na diástole, nos ramos intramurais das
artérias coronárias, pelo seu calibre e pela compressão exercida pelas tensões diastólica e
sistólica do miocárdio (AIRES, 1999).
Como Walcott et al. (2003) relata a existência de alterações ventriculares diastólicas
pós-choque, acreditamos que a queda do fluxo de perfusão coronariana se deve
principalmente ao aumento da tensão diastólica. Esta hipótese é corroborada pelo
supradesnivelamento pós-choque da linha de base do registro de pressão e pela ausência de
correlação entre freqüência cardíaca e perfusão, fato verificado por estimulação externa com
freqüência fixa no período de estabilização pós-choque de 150 V/cm.
64
Não houve aumento do fluxo de perfusão mesmo nos períodos de assistolia, condição
na qual, normalmente, é observado um alívio compressivo sobre os vasos intramiocárdicos.
Isto provavelmente ocorreu devido ao aumento na tensão diastólica do miocárdio, registrada
durante este período.
5.5. Conclusões
Em nossa proposta inicial, desejávamos estudar o efeito de campos elétricos de altas
intensidades sobre corações isolados de ratos. Para isto, construímos uma montagem
experimental que permitiu a realização de experimentos confiáveis e reprodutíveis, levando-
nos às seguintes conclusões:
1)
Choques de 50 e 100 V/cm não foram capazes de provocar alterações permanentes nos
parâmetros estudados.
2)
Choques de 150 V/cm provocaram danos permanentes ao miocárdio. O limite de lesão
deve situar-se entre 100 e 150 V/cm (resultado concordante com a literatura).
3)
O efeito imediato da aplicação de choques > 100 V/cm sobre a pressão ventricular é
uma sobreposição de dois fenômenos: uma contração rápida, provavelmente causada
por liberação de Ca
2+
do RS induzida por Ca
2+
, e uma contração lenta que parece estar
relacionada à eletroporação e sobrecarga citosólica de Ca
2+
. Ambos os fenômenos
dependem da intensidade do choque.
4)
Ocorre assistolia após choques > 100 V/cm. As células ventriculares de trabalho não
respondem à estimulação externa durante o período de assistolia.
5)
Ocorre disfunção permanente das células nodais, traduzida pela bradicardia
persistente, após choques de 150 V/cm. O limiar de lesão nodal deve situar-se entre
100 e 150 V/cm.
6)
A diminuição da perfusão coronariana após choques de 150 V/cm parece ter sido
causada pelo aumento da tensão miocárdica passiva.
7)
Não houve efeitos deletérios significativos com a repetição dos choques, havendo,
sim, um valor de campo elétrico situado entre 100 e 150 V/cm, a partir do qual os
efeitos nocivos são evidentes.
Os níveis de lesão causados pelos choques de 50, 100 e 150 V/cm podem ser
resumidos da seguinte forma (figura 5.1)
65
Figura 5.1 – Níveis de lesão celular cardíaca com choques de 50, 100 e 150 V/cm.
Baseados no que foi exposto acima, consideramos que os objetivos deste trabalho
foram alcançados. A montagem e as técnicas desenvolvidas podem contribuir para um maior
entendimento dos fenômenos lesionais pós-desfibrilatórios, pois permitem o controle dos
experimentos e a quantificação dos parâmetros relevantes ao problema.
66
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