ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SOLANGE TERESINHA CARPES
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E
BIOLÓGICAS DO PÓLEN APÍCOLA DE Apis mellifera L. DA
REGIÃO SUL DO BRASIL
CURITIBA
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
SOLANGE TERESINHA CARPES
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E
BIOLÓGICAS DO PÓLEN APÍCOLA DE Apis mellifera L. DA
REGIÃO SUL DO BRASIL
Tese apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Tecnologia
de Alimentos, Setor de Tecnologia
da Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à
obtenção do título de Doutor em
Tecnologia de Alimentos.
Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Maria
Lúcia Masson - UFPR
Co-orientador: Prof. Dr. Severino
Matias de Alencar – ESALQ/USP
CURITIBA
2008
ads:
Carpes, Solange Teresinha
Estudo das características físico-químicas e biológicas do
pólen apícola de Apis mellifera L. da região Sul do Brasil / Solange
eresinha Carpes. – Curitiba, 2008.
248 f.: il.; tabs., grafs.
Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Maria Lúcia Masson
Co-orientador: Prof. Dr. Severino Matias de Alencar
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de
Tecnologia, Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos.
Inclui Bibliografia.
1. Abelha – Pólen. 2. Abelha - Produtos. 3. Apis mellifera L.
1. Antioxidantes. 5. Compostos fenólicos. I. Título. II. Masson,
Maria Lúcia. I. Título. III. Universidade Federal do Paraná.
CDD 638.1
Dedico este trabalho a toda
minha família e em especial aos
meus amores Julia (in
memoriam), Ana Luíza e Jailson.
AGRADECIMENTOS
À Prof
a
Dra. Maria Lúcia Masson, pela atenção, confiança, apoio, respeito
e carinho durante todo o trabalho.
Ao Prof. Dr. Severino Matias de Alencar, também pela confiança, amizade
e oportunidade concedida em seus laboratórios de pesquisa na
ESALQ/USP.
À Direção e Coordenação do Curso de Química Industrial da
Universidade Tecnológica Federal do Paraná - Campus Pato Branco, pelo
companheirismo na liberação de minhas atividades acadêmicas para a
execução desta tese.
À Coordenação do CNPq, pela ajuda financeira com bolsa de estudos
PICDT.
Ao Sr. Ballardim, apicultor de Campos Novos, Santa Catarina pelo seu
comprometimento com a pesquisa e envio das amostras de pólen apícola.
Ao Sr. Breyer, apicultor, empresário e cientista de União da Vitória,
Paraná, pelas amostras de pólen apícola e por suas brilhantes sugestões
durante a execução desse trabalho.
A todos os apicultores da região Sul do Brasil contatados na aquisição
das amostras de pólen, pela sua generosidade, simplicidade e
comprometimento nesse projeto.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba, SP, (FOP/UNICAMP), pela confiança e oportunidade
concedida ao ceder as instalações e infra-estrutura de seus laboratórios
de microbiologia para a execução das análises de atividade
antibacteriana.
Ao Prof. Dr. Elliot Kitajima, chefe do Laboratório do Núcleo de Apoio à
Pesquisa em Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária
(NAP/MEPA) da ESALQ-USP, Piracicaba-SP, pela confiança e
oportunidade no uso de seus laboratórios para a realização de todas as
análises de microscopia.
A Dra. Cynthia Fernandes Pinto da Luz, pesquisadora do Instituto de
Botânica da Secretaria do Meio Ambiente de São Paulo, pelo seu
conhecimento e ajuda na identificação dos tipos polínicos.
A Prof.
a
Dra. Lys Mary Bileski Cândido pela confiança e por ceder as
instalações de seus laboratórios no Departamento de Nutrição – UFPR,
para a realização das primeiras análises desta Tese.
Ao Prof. Dr. Gerson Barreto Mourão, do Departamento de Ciências
Exatas da ESALQ/USP pela ajuda nas análises estatísticas.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Bioquímica e Análise
Instrumental da ESALQ/USP; Severino, Tatiane, Ingridy, Adna, Lucimara,
Ivani, Rosângela, Rodrigo, Letícia e Mirella; que compartilharam comigo
toda a dor da perda de minha Julia. Deram-me força e apoio para
continuar esse trabalho e participaram das alegrias da chegada de Ana
Luíza. Obrigada por fazerem parte dessa história.
A Ingridy Ribeiro pela ajuda nas análises de microscopia de luz e
microbiologia e Tatiane Oldoni pela colaboração nas análises de
cromatografia líquida de alta eficiência.
Aos colegas de turma Osmar Dallasanta, pelo incentivo com o
empréstimo dos tubos de ensaio para o preparo dos extratos de pólen. A
Cristiane Schüler pela amizade, companheirismo durante todo o tempo do
curso. À Danielle Dyminski pela amizade desde o tempo de Mestrado.
Ao casal de amigos de todas as horas, Elizabete e Junior, pelo
companheirismo e acolhida inúmeras vezes em sua casa em Curitiba.
Felipe e Derileia, Gustavo e Joana, pela amizade, passeios e
churrascadas aos domingos. Vocês tornaram este trabalho bem mais leve
e agradável.
À todos os professores do programa de Pós-Graduação em Tecnologia
de Alimentos da UFPR, por serem parte fundamental na aquisição de
conhecimentos indispensáveis para a minha formação profissional.
À todos os colegas do programa que foram aparecendo no caminho
deixando sua marca e importância.
De uma maneira especial
a Deus, pela força, ânimo,
coragem e fé.
RESUMO
O pólen apícola possui uma composição química constituída por
carboidratos, proteínas, aminoácidos, vitaminas e minerais, sendo
considerado uma boa fonte nutricional com benefícios para a saúde,
principalmente pela presença de compostos fenólicos com atividade
antioxidante. Neste estudo foi determinada a composição química,
compostos fenólicos totais e flavonóides totais, atividade antioxidante e
antibacteriana e análise palinológica do pólen apícola produzido da
Região Sul do Brasil. Para a determinação da composição química foram
realizadas análises pelas técnicas de cromatografia líquida de alta
eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). A atividade
antioxidante dos extratos etanólicos de pólen apícola (EPE) foi
determinada e comparada à de antioxidantes comerciais (BHT, BHA e α-
tocoferol) pelos métodos de seqüestro do radical livre DPPH (2,2 difenil-1-
picrilhidrazil) e clareamento do sistema β-caroteno/ácido linoléico. Os
teores médios de umidade, proteína e açúcares redutores foram de
4,19%, 20,47% e 48%, respectivamente, e os minerais predominantes
foram fósforo (6923,63 mg/kg), potássio (5116,76 mg/kg), cálcio (1031,98
mg/kg) e magnésio (754,62 mg/kg). Os valores médios obtidos para os
compostos fenólicos e flavonóides totais foram de 30,46 mg EAG/g pólen
(EAG: equivalente em ácido gálico) e 8,92 mg de quercetina/g pólen,
respectivamente. Foram encontradas altas atividades de seqüestro para o
radical livre DPPH, com EC
50
(concentração da substância antioxidante
necessária para reduzir em 50% a concentração inicial do DPPH•) médio
de 1920 µg/mL. A atividade antioxidante média dos EPE foi de 73,44%
pelo método do DPPH e 83,60% pelo sistema de clareamento do β-
caroteno/ácido linoléico. Foi observada alta capacidade de seqüestro de
radical livre para as amostras SC 03, SC 02, RS 07 e RS 09. A atividade
antioxidante do EPE do Estado do Rio Grande do Sul foi superior à dos
antioxidantes sintéticos (BHT, BHA) utilizados na indústria alimentícia,
enquanto a do Estado de Santa Catarina foi maior que a do BHT. Foi
observada correlação estatisticamente significativa (p<0,01) entre
atividade antioxidante pelo método do DPPH e teor de compostos
fenólicos totais e flavonóides totais. A alta atividade antioxidante dos EPE
SC 03 e RS 09 pode ser explicada pela presença dos flavonóides rutina e
miricetina, identificados por CLAE/DAD. Pela técnica de CG-EM foi
detectada a presença de ácidos fenólicos e vários ácidos graxos. Embora
os EPE da Região Sul do Brasil analisados tenham apresentado alto teor
de compostos fenólicos com atividade antioxidante, não demonstraram
atividade antibacteriana pelos métodos utilizados.
STUDY OF PHYSICAL-CHEMICAL AND BIOLOGICAL
CHARACTERISTICS OF BEE POLLEN EXTRACTED BY
Apis mellifera L. IN THE SOUTHERN REGION OF BRAZIL
ABSTRACT – Bee pollen is constituted by carbohydrates, proteins, amino
acids, vitamins, and minerals, and therefore is considered a good
nutritional source that brings benefits to human health, mainly due to the
presence of polyphenols presenting antioxidant activity. In this study,
analyses to determine chemical composition, total phenolics, flavonoids,
antioxidant and antibacterial activity, and palynological characterization
were carried out for pollen produced in the Southern Region of Brazil.
Analyses using high performance liquid chromatography-diode array
detector (HPLC-DAD) and gas-chromatography/mass spectrometer (GC-
MS) were performed to determine the chemical composition. The
antioxidant activity of the ethanolic extracts of bee pollen (EPE) was
determined and compared to commercial antioxidants (BHT, BHA, and α-
tocopherol) using the methods DPPH• (2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazyl)
radical scavenging activity and β-carotene/linoleic acid bleaching. The
mean values of moisture, protein, and sugar were 4.19%, 20.47%, and
48%, respectively, and the main minerals were phosphorus (6923,63
mg/kg), potassium (5116,76 mg/kg), calcium (1031,98 mg/kg) and
magnesium (754,62 mg/kg). The mean values of total phenolics and
flavonoids were 30.46 mg GAE/g pollen (GAE: galic acid equivalent) and
8.92 mg quercetin/g pollen, respectively. High scavenging activity was
found for DPPH•, presenting mean IC
50
(the concentration of antioxidant
substance necessary to reduce 50% of the initial concentration of DPPH•)
of 1920 µg/mL. The mean antioxidant activity of EPE was 73.44% using
DPPH and 83.60% using β-carotene/linoleic acid bleaching system. High
scavenging activity was observed for samples SC 03, SC 02, RS 07, and
RS 09. The antioxidant activity of EPE from the state of Rio Grande do Sul
was higher than the synthetic antioxidants (BHT, BHA) used in the food
industry, whereas the one from the state of Santa Catarina was higher
than BHT. A significant statistical correlation (p<0.01) was observed
between antioxidant activity using DPPH method and total phenolics and
flavonoids. The high antioxidant activity of EPE SC 03 and RS 09 can be
explained by the presence of rutin and myricetin, flavonoids identified by
HPLC-DAD. The presence of phenolic acids and several fatty acids was
detected using GC-MS. Although the analyzed EPE from the Southern
Region of Brazil presented high levels of phenolics with antioxidant
activity, they did not show antibacterial activity through the methods used.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01 - ABELHA Apis mellifera L. SOBRE O FAVO DA COLMÉIA ............
30
FIGURA 02 - ESTAMES COM ANTERAS EVIDENTES, CARREGADAS DE
PÓLEN ........................................................................................
31
FIGURA 03 - ABELHA COLETANDO PÓLEN DAS FLORES .........................
32
FIGURA 04 - GRÃO DE PÓLEN NA CORBÍCULA DA ABELHA .....................
32
FIGURA 05 - COLETORES DE PÓLEN COLOCADO NA FRENTE DO
ALVADO........................................................................................
34
FIGURA 06 - GAVETA DE RECOLHIMENTO DO PÓLEN ................................
35
FIGURA 07 - COLETA DO PÓLEN POR APICULTORES ...................................
36
FIGURA 08 - ESTUFA SECADORA DE PÓLEN APÍCOLA .................................
37
FIGURA 09 - SEPARADOR DE PÓLEN APÍCOLA ..........................................
38
FIGURA 10 - ESTRUTURA QUÍMICA DE UM FENOL SIMPLES ...................
42
FIGURA 11- VIA DO ÁCIDO CHIQUÍMICO PARA BIOSSÍNTESE DE
COMPOSTOS FENÓLICOS .......................................................
46
FIGURA 12 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO BENZÓICO .......................
47
FIGURA 13 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO CINÂMICO ........................
47
FIGURA 14 - ESTRUTURA QUÍMICA DA CUMARINA ...................................
48
FIGURA 15 - ÁCIDOS FENÓLICOS GERALMENTE ENCONTRADOS EM
PRODUTOS APÍCOLAS ...........................................................
51
FIGURA 16 - NUMERAÇÃO DE UM FLAVONÓIDE COM ANEL C ................
52
FIGURA 17 - NUMERAÇÃO DE UM FLAVONÓIDE SEM ANEL C .................
53
FIGURA 18 - PRODUÇÃO DE FLAVONÓIDES A PARTIR DE
FENILPROPANÓIDES (P-CUMARIL CoA) E MALONIL CoA ...
57
FIGURA 19 - ESTRUTURAS QUÏMICAS DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE
FLAVONÓIDES .............................................................................
58
FIGURA 20 - ALGUNS FLAVONÓIDES GERALMENTE ENCONTRADOS EM
PRODUTOS APÍCOLAS ...............................................................
65
FIGURA 21 - POSSÍVEIS ROTAS METABÓLICAS DOS POLIFENÓIS EM
DIETA HUMANA .........................................................................
67
FIGURA 22 - DOENÇAS E DANOS CAUSADOS PELAS ESPÉCIES
REATIVAS AO OXIGÊNIO (ERO
S
) ............................................
74
FIGURA 23 - ESQUEMA DE SEQÜESTRO DE EROS (R) POR
FLAVONÓIDES (FL) ..................................................................
85
FIGURA 24 - SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE METAIS EM FLAVONÓIDES ...........
85
FIGURA 25 - ESTRUTURA DO FLAVONOL QUERCETINA MOSTRANDO
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES NA DEFINIÇÃO DE
POTENCIAL ANTIOXIDANTE CLÁSSICO DOS FLAVONÓIDES.
87
FIGURA 26 - ESTRUTURA QUÍMICA DO BUTILIHIDROXIANISOL (BHA) E
BUTILIHIDROXITOLUENO (BHT) ..............................................
89
FIGURA 27 - ESTRUTURA QUÍMICA DO α – TOCOFEROL ............................
91
FIGURA 28 - DISTRIBUIÇÃO INTERFACIAL DE ANTOXIDANTES
LIPOFÍLICOS E HIDROFÍLICOS EM ÓLEO COMPARADO A
EMULSÕES ÓLEO EM ÁGUA ...................................................
99
FIGURA 29 - REAÇÃO DO RADICAL LIVRE DPPH COM UMA MOLÉCULA
ANTIOXIDANTE ...........................................................................
107
FIGURA 30 - APARÊNCIA DAS AMOSTRAS DE PÓLEN APÍCOLA a)
ESTADO DO PARANÁ, b) ESTADO DE SANTA CATARINA, c)
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL .........................................
137
FIGURA 31 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DO PARANÁ ...............................................................
145
FIGURA 32 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DE SANTA CATARINA ...............................................
145
FIGURA 33 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL .........................................
146
FIGURA 34 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DO PARANÁ ........................................
148
FIGURA 35 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DE SANTA CATARINA ........................
150
FIGURA 36 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL ..................
151
FIGURA 37 - CROMATOPLACAS DE CCDAE-FR VISUALIZADAS SOB LUZ
ULTRAVIOLETA A 366 nm DOS EPE DO ESTADO DO
FIGURA 46 - ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (%) PELO MÉTODO DO β-
CAROTENO- ÁCIDO LINOLEICO ................................................
171
FIGURA 47 - CORRELAÇÃO ENTRE FENÓLICOS TOTAIS E % ATIVIDADE
DE SEQÜESTRO DE RADICAL (A) E ENTRE FLAVONÓIDES
TOTAIS E % ATIVIDADE DE SEQÜESTRO DE RADICAL (B) ....
175
FIGURA 48 - TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR DAS AMOSTRAS DE PÓLEN
APÍCOLA (EPE) (PR 01, PR 02, SC 01, SC 02, RS 02)
CONTRA Streptococcus mutans...................................................
178
FIGURA 49 - TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR DAS AMOSTRAS DE PÓLEN
APÍCOLA (EPE) (RS 01, RS 02, RS 03, SC 09, SC 10)
CONTRA Staphylococcus aureus ................................................
178
FIGURA 50 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DOS EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA PR 03 .
182
FIGURA 51 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DOS EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA SC 03..
183
FIGURA 52 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DOS EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA RS 09..
184
FIGURA 53 - (A) HOMOGENEIZAÇÃO DA RESINA XAD2 COM O EXTRATO
DE PÓLEN, (B) EMPACOTAMENTO EM COLUNA E (C)
EXTRATO METANÓLICO IRRADIADO COM LUZ U.V 366 nm ..
187
FIGURA 54 - PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA (EPE) DA AMOSTRA PR
03 APÓS O USO DA RESINA XAD2 ............................................
190
FIGURA 55 - PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA DA AMOSTRA SC 03
APÓS O USO DA RESINA XAD2..................................................
191
FIGURA 56 - PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA DA AMOSTRA RS 09
APÓS O USO DA RESINA XAD2 .................................................
192
FGURA 57 - PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CG-EM DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA APÓS O USO DA RESINA
XAD2. (A) PR 03; (B) SC 03; (C) RS 09........................................
194
FIGURA 58 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN
DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS POR MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 1. EUPHORBIACEAE; 2.
ASTERACEAE ELEPHANTOPUS; 3. ASTERACEAE
EUPATORIUM; 4. ASTERACEAE GOCHNATIA; 5.
ASTERACEAE BACCHARIS; 6. SAPINDACEAE MATAYBA; 7.
MYRTACEAE EUCALYPTUS; 8. MIMOSACEAE MIMOSA
SCABRELLA .................................................................................
208
FIGURA 59 - TIPOS POLÍNICOS ENCONTRADOS NA AMOSTRA PR 14.
MICROSCOPIA ÓPTICA (400 X) .................................................
209
FIGURA 60 - ESPÉCIES DA FAMÍLIA ASTERACEAE ENCONTRADAS NO
PÓLEN APÍCOLA DA REGIÃO SUL. MICROSCOPIA ÓPTICA,
50 µM, 400 X. A: ASTERACEAE BACCHARIS; B:
ASTERACEAE ELEPHANTOPUS; C: ASTERACEAE
EUPATORIUM; D: ASTERACEAE GOCHNATIA ........................
209
FIGURA 61 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN
DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS POR MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 9 VERBENACEAE
AEGIPHILA; 10. BRASSICACEAE; 11. ARECACEAE TIPO I, NA
SETA PRETA PINUS; 12. ARECACEAE TIPO 2; 13.
ANACARDIACEAE SCHINUS; 14. ANACARDIACEAE TIPO I;
15. ANACARDIACEAE ASTRONIUM; 16. LEGUMINOSAE .....
211
FIGURA 62 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN
DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS POR MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 17. BORAGINACEAE
CORDIA; 18. ARECACEAE; 19. ANACARDIACEAE TIPO 2; 20.
ROSACEAE PRUNUS; 21. ROSACEAE; 22. LORANTHACEAE
STRUTHANTHUS..........................................................................
213
FIGURA 63 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN
DA REGIÃO SUL DO BRASIL. MICROSCOPIA ÓPTICA (50 µ,
400 X). A: MYRTACEAE EUCALYPTUS; B: ROSACEAE; C:
LORANTHACEAE STRUTHANTHUS; D: ANACARDIACEAE
TIPO 1 .........................................................................................
214
FIGURA 64 ANACARDIACEAE ASTRONIUM PRESENTE NO PÓLEN
APÍCOLA DAS AMOSTRAS PR 05 (< 3%) E PR 10 (3 – 15%).
MICROSCOPIA ÓPTICA (400 X)................................................
214
LISTA DE TABELAS
TABELA 01 - CLASSIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS ..................
44
TABELA 02 - COMPRIMENTO DE ONDA DE ABSORÇÃO DAS PRINCIPAIS
CLASSES DE FLAVONÓIDES .....................................................
54
TABELA 03 - DIFERENTES CLASSES DE FLAVONÓIDES, SEUS
SUBSTITUÍNTES E FONTES DIETÉTICAS ...............................
61
TABELA 04 - PRINCIPAIS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E
NITROGÊNIO NAS FORMAS DE RADICAIS E NÃO
RADICAIS....................................................................................
76
TABELA 05 - PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS PARA QUALIDADE DO
PÓLEN APÍCOLA DESIDRATADO ............................................
115
TABELA 06 - PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS DO PÓLEN APÍCOLA
BRASILEIRO ..............................................................................
115
TABELA 07 - LOCALIDADES DE ORIGEM DO PÓLEN APÍCOLA E
DENOMINAÇÕES DAS AMOSTRAS ...........................................
121
TABELA 08 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS AMOSTRAS DE PÓLEN
APÍCOLA ......................................................................................
139
TABELA 09 - CONTEÚDO MINERAL DAS AMOSTRAS DE PÓLEN APÍCOLA
143
TABELA 10 - TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS,
FLAVONÓIDES TOTAIS E ATIVIDADE DE SEQUESTRO DO
RADICAL EC
50
DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA.............
155
TABELA 11 - PORCENTAGEM ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS
EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA (EPE) PELO MÉTODO DO
DPPH ..........................................................................................
169
TABELA 12 - ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS
ETANÓLICOS DE PÓLEN (EPE) PELO MÉTODO DE DIFUSÃO
EM ÁGAR......................................................................................
179
TABELA 13 - ANÁLISE QUÍMICA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA
APÓS O USO DA RESINA HIDROFÓBICA ................................
188
TABELA 14 - COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA
COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO EXTRATO
ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA PR 03)
.....................................................................................................
195
TABELA 15 - COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA
GASOSA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO
EXTRATO ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA SC
03)...............................................................................................
197
TABELA 16 - COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA
GASOSA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO
EXTRATO ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA RS
09) ..............................................................................................
199
TABELA 17 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO
PÓLEN APÍCOLA DO ESTADO DO PARANÁ ..........................
204
TABELA 18 TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO
PÓLEN APÍCOLA DO ESTADO DE SANTA CATARINA ..........
205
TABELA 19 TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO
PÓLEN APÍCOLA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL ....
206
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
BHT Butilihidroxitolueno
BHA Butilihidroxianisol
PG Galato de propila
TBHQ Butilhidroquinona terciária
ATCC American Type Culture Collection
CLAE/DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de
arranjo de diodos
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de
Massas
MO Microscopia Óptica
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
ERO
S
Espécies reativas ao oxigênio
ERN
S
Espécies reativas ao nitrogênio
RL Radicais livres
SOD Superóxido dismutase
CAT Catalase
GP
X
Glutationa peroxidase
•
OH Radical hidroxil
O
2
• -
Radical ânion superóxido
HO
2
•
Radical hidroperoxil
RO
2
•
Radical peroxil
RO
•
Radical alcoxil
β Beta
α Alfa
AH Antioxidante
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
DPPH 2,2 difenil-1-picridrazina
ABTS+ 2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)
EC
50
A concentração mínima da substância antioxidante
necessária para reduzir em 50% a concentração inicial do
DPPH•
EPE Extratos Etanólico de Pólen
%AA Atividade Antioxidante (%)
GAE/g Equivalente em ácido gálico por grama de amostra de pólen
apícola
CIM Concentração mínima inibitória
Abs
a
Absorvância da amostra
Abs
b
Absorvância do branco
Abs
c
Absorvância do controle
DR
c
Taxa de degradação da amostra controle
DR
s
Taxa de degradação da amostra contento a substância
teste
PD Pólen predominante ou dominante
PA Pólen secundário ou acessório
PII Pólen de menor importância ou isolado
PIO Pólen minoritário ou ocasional
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................... 24
1.1 OBJETIVO GERAL .......................................................... 27
1.2 OBJETIVO ESPECÍFICO ................................................ 27
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................. 29
2.1 ABELHA Apis mellifera ....................................................... 29
2.2 PÓLEN APÍCOLA ................................................................ 31
2.2.1 Beneficiamento do Pólen Apícola ....................................... 35
2.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO PÓLEN APÍCOLA .............. 39
2.3.1 Compostos Fenólicos em Plantas ....................................... 41
2.3.2 Síntese e Classificação dos Compostos Fenólicos ............ 43
2.3.2.1 Ácidos fenólicos .................................................................. 47
2.3.3 Compostos Fenólicos em Pólen .......................................... 49
2.3.4 Flavonóides ......................................................................... 52
2.3.5 Síntese e Classificação dos Flavonóides ............................ 55
2.3.6 Flavonóides Presentes no Pólen ......................................... 62
2.4 ABSORÇÃO E METABOLISMO DOS COMPOSTOS
FENÓLICOS ........................................................................
66
2.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS COMPOSTOS
FENÓLICOS .......................................................................
69
2.6 ANTIOXIDANTES .............................................................. 73
2.6.1 Radicais Livres .................................................................... 75
2.6.2 Sistema de Defesa Antioxidante ......................................... 77
2.6.2.1 Sistema Antioxidante Enzimático ........................................ 78
2.6.2.2 Sistema Antioxidante Não Enzimático ................................ 81
2.6.3 Peroxidação Lipídica ........................................................... 82
2.6.4 Mecanismo de Ação dos Antioxidantes Fenólicos .............. 83
2.6.5 Antioxidantes Fenólicos Sintéticos ...................................... 88
2.6.6 Antioxidantes Fenólicos Naturais ........................................ 90
2.7 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE IN VITRO ...............................................
93
2.7.1 Método Direto - Habilidade em Inibir a Oxidação de
Lipídeos em Sistemas Modelo ............................................
96
2.7.1.1 Paradoxo Polar ................................................................... 96
2.7.1.2 Método da lipoperoxidação pelo TBARS ............................ 100
2.7.1.3 Método do β-caroteno-ácido linoleico ................................. 101
2.7.2 Método Indireto - Seqüestro de Radical .............................. 104
2.7.2.1 Método do ABTS
+
(2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-
ácido sulfônico) ...................................................................
105
2.7.2.2 Método do radical DPPH• (2,2 difenil-1-picrilhidrazina) ...... 106
2.8 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO PÓLEN APÍCOLA ........... 110
2.9 LEGISLAÇÃO BRASILEIRA DO PÓLEN APÍCOLA ........... 114
2.10 ATIVIDADE E MERCADO DE PÓLEN APICOLA NO
BRASIL ...............................................................................
116
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................... 120
3.1 MATERIAL........................................................................... 120
3.1.1 Amostras de Pólen ............................................................. 120
3.1.2 Preparo dos Extratos Etanólicos do Pólen (EPE) ............... 121
3.1.2.1 Purificação dos extratos etanólicos de pólen em resina
hidrofóbica .........................................................................
122
3.2 MÉTODOS .......................................................................... 123
3.2.1 Proteína Total ...................................................................... 123
3.2.2 Atividade de Água (A
w
) ........................................................ 123
3.2.3 Umidade .............................................................................. 123
3.2.4 Fibras .................................................................................. 124
3.2.5 Lipídeos ............................................................................... 124
3.2.6 Cinzas ................................................................................. 124
3.2.7 Açúcares ............................................................................ 125
3.2.8 Minerais .............................................................................. 125
3.2.9 Compostos Fenólicos Totais .............................................. 125
3.2.10 Flavonóides Totais .............................................................. 126
3.2.11 Espectrofotometria na Região Ultravioleta-Visível .............. 127
3.2.12 Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência em
Fase Reversa (CCDAE-FR) dos EPE..................................
127
3.2.13 Análises Biológicas dos Extratos Etanólicos do Pólen
Apícola ................................................................................
128
3.2.13.1 Atividade Antibacteriana dos Extratos de Pólen pelo
Método de Difusão em Ágar ................................................
128
3.2.13.2 Concentração Inibitória Mínima (C.I.M.) em Meio Líquido .. 128
3.2.13.3 Atividade Antioxidante dos Extratos de Pólen ..................... 129
3.2.13.3.1 Atividade de Seqüestro do Radical DPPH• ......................... 129
3.2.13.3.2 Atividade Antioxidante pela Oxidação Acoplada do β-
caroteno e Ácido Linoléico ..................................................
131
3.2.14 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa
(CLAE-FR) ...........................................................................
132
3.2.15 Cromatografia Gasosa com Espectrometria de Massas
(CG-MS) ............................................................................. 133
3.2.16 Microscopia Óptica (MO) .................................................... 134
3.2.17 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)................ .......
135
3.2.18 Análise Estatística .............................................................. 136
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................ 137
4.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO PÓLEN APÍCOLA ............... 138
4.2 EXTRATOS ETANÓLICOS DE PÓLEN (EPE) ................... 144
4.2.1 Espectrofotometria na Região Ultravioleta-Visível dos EPE
146
4.2.2 Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência em
Fase Reversa (CCDAE-FR) dos EPE .................................
152
4.2.3 Compostos Fenólicos Totais e Flavonóides Totais dos
EPE .....................................................................................
154
4.2.4 Atividade Antioxidante dos Extratos de Pólen Apícola ........ 158
4.2.4.1 Cinética de reação do DPPH: determinação do tempo de
reação .................................. ..............................................
158
4.2.4.2 Atividade de Seqüestro do Radical Livre DPPH ................. 164
4.2.4.3
Atividade Antioxidante pelo Método do β-caroteno .............
170
4.2.5 Correlação entre Atividade Antioxidante e Compostos
Fenólicos ............................................................................
174
4.2.6 Atividade Antibacteriana dos Extratos de Pólen Apícola
(EPE) ...................................................................................
176
4.2.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de
Arranjo de Diodos (CLAE-DAD) .......................................... 181
4.2.8 Purificação dos Extratos Etanólicos de Pólen Apícola ........ 186
4.2.8.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência dos Extratos
Etanólicos de Pólen Apícola após o uso da resina
AMBERELITE XAD2 ........................................................... 189
4.2.8.2 Cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de
massas (CG-EM) dos extratos etanólicos de pólen apícola
após o uso da resina XAD2 .................................................
193
4.2.9 Caracterização Palinológica ................................................ 203
5 CONCLUSÕES ...................................................... 215
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 219
REFERÊNCIAS .....................................................
1 INTRODUÇÃO
Os produtos apícolas tais como o mel, geléia real, própolis e pólen
têm sido utilizados há muitos anos na medicina tradicional, assim como
nas dietas e nutrição suplementar, devido a suas propriedades
nutricionais e fisiológicas benéficas à saúde humana (PARK et al., 1998;
KROYER e HEGEDUS, 2001).
A demanda criada pelo consumidor consciente tem dado grande
impulso ao mercado dos alimentos funcionais. Além de uma vida mais
plena, o consumidor espera amenizar o sofrimento causado por uma série
de doenças que impingem na população, de forma aparentemente
descontrolada, assim como reduzir despesas com saúde.
Entre os produtos naturais, o pólen vem se destacando tanto pelas
suas propriedades terapêuticas como atividade antioxidante
(SOMERVILLE, 2005; ALMARAZ-ABARCA et al., 2007), quanto pela
possibilidade de aplicação na indústria alimentícia, na forma de alimentos
funcionais (SERRA BONVEHÍ e ESCOLÁ JORDÁ, 1997; MARCHINI et
al., 2006). Os efeitos terapêuticos têm sido atribuídos aos diversos
compostos fenólicos presentes nesses produtos (KROYER e HEGEDUS,
2001; LEJA et al., 2007).
Os compostos sintéticos BHT e BHA são antioxidantes efetivos e
muito utilizados na indústria de alimentos, porém podem apresentar
atividades mutagênicas (NAMIKI, 1990). Neste sentido, a procura de
24
agentes antioxidantes naturais tem recebido atenção especial por parte
dos pesquisadores de todo mundo e da indústria alimentícia.
O pólen coletado por abelhas, geralmente composto de pólen de
várias espécies de plantas, pode ser considerado como uma fonte de
energia e de nutrientes para o consumo humano. O pólen de abelhas
contém substâncias nutricionais como carboidratos, proteínas,
aminoácidos, lipídeos, vitaminas, minerais e traços de micronutrientes.
Além destas, também possui quantidades significativas de substâncias
polifenólicas, principalmente flavonóides.
Os flavonóides e ácidos fenólicos são considerados como os
principais ingredientes do pólen apícola, podendo ser usado para
padronizá-lo em relação às suas propriedades nutricionais fisiológicas e
para controlar a qualidade das preparações de pólen apícola distribuídas
no comércio (KROYER e HEGEDUS, 2001).
As propriedades bioativas como a atividade de seqüestro dos
radicais livres (atividade antioxidante), podem ser aumentadas utilizando
um solvente adequado para sua extração. Desta forma, extratos
adequados de pólen apícola podem ser utilizados como alimento
funcional ou suplemento alimentar, devido a quantidade de compostos
fenólicos e de sua capacidade de sequestrar os radicais livres
responsáveis pelo estresse oxidativo e a carcinogênese (KROYER e
HEGEDUS, 2001).
Entretanto, vários autores relatam a necessidade de maiores
estudos para avaliar a composição relativa das substâncias polifenólicas
25
no pólen apícola brasileiro e nos extratos de pólen, assim como as
diferenças em suas especificidades, visando avaliar sua função e
contribuição no que diz respeito a atividade antioxidante (BARRETO et
al., 2006; MARCHINI et al., 2006; ALMARAZ-ABARCA et al., 2007).
Dessa forma, a caracterização físico-química e biológica do pólen se
faz importante em um controle de qualidade e, até mesmo, em uma
padronização do pólen brasileiro, para uma efetiva aplicação terapêutica.
26
1.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste projeto foi avaliar as características físico-
químicas, biológicas e tipos polínicos do pólen apícola de Apis mellifera
produzido na região sul do Brasil.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Determinar a composição centesimal do pólen apícola (umidade,
proteínas, lipídeos, minerais, fibras e carboidratos);
2) Determinar a concentração ótima dos extratos etanólicos de pólen
para a máxima extração de compostos bioativos;
3) Determinar os teores de compostos fenólicos e flavonóides totais nas
amostras de pólen;
4) Avaliar a composição química dos compostos bioativos do EPE por
meio das técnicas cromatográficas de CLAE/DAD e CG-EM;
5) Avaliar as propriedades antioxidantes dos extratos de pólen apícola
pelo método de seqüestro do radical DPPH e pelo método de clareamento
do β-caroteno/ácido linoléico;
6) Avaliar atividade antibacteriana do EEP contra cinco microrganismos
patogênicos (Bacillus subillis ATCC 21.332, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15.442, Streptococcus mutans Ingbritt 1600, Staphylococcus
aureus ATCC 25.923 e Klebsiella pneumoniae) e quatro bactérias
27
fitopatogênicas (Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas vesicatoria pv
vesicatoria, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, Pseudomonas
syringae pv. tomato).
7) Determinar os tipos polínicos presente nas amostras de pólen apícola
por Microscopia Óptica (MO) e Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV).
28
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 ABELHA Apis mellifera L.
As abelhas são descendentes das vespas que deixaram de se
alimentar de pequenos insetos e aranhas para consumirem o pólen das
flores. Durante esse processo evolutivo surgiram várias espécies de
abelhas. Hoje se conhecem mais de 20 mil espécies, mas acredita-se que
existam mais de 40 mil espécies ainda não descobertas (PEREIRA et al.,
2002).
As abelhas da espécie A. mellifera foram introduzidas no Brasil em
1839, oriundas do Porto, Portugal (CAMARGO,1972). Em 1956, W. E.
KERR introduziu no Brasil a abelha Apis mellifera scutellata, originária do
continente africano. A disseminação dessa abelha foi rápida pelos
apiários e pastagens apícolas do Brasil, com predominância sobre as
raças de abelhas existentes. Em função do rápido processo de
africanização das abelhas presentes no Brasil e da ampla substituição
das abelhas européias pelas africanizadas não existe mais linhagens
puras dessa raça no País (KOO e PARK, 1997; FUNARI et al., 2003;
BARRETO et al., 2006). As várias subespécies de A. mellifera foram
adaptadas às diversas condições ambientais e, atualmente, tem uma
enorme população fora de controle. A Figura 1 mostra abelhas da espécie
A. mellifera em sua colméia.
29
FIGURA 1 - ABELHA Apis mellifera L. SOBRE O FAVO DA COLMÉIA
FONTE: BREYER (2007)
A colônia de abelhas é constituída por uma grande sociedade que
é variável de acordo com a disponibilidade de alimento, época do ano e
com a região. Em cada colônia existe cerca de 80.000 abelhas, a grande
totalidade sendo operárias, uma rainha e de 0 a 400 zangões. A abelha
rainha tem por função a postura dos ovos e a manutenção da ordem
social na colméia, as operárias realizam todo o trabalho para a
manutenção da colméia, executam atividades distintas de acordo com a
idade por conta do desenvolvimento glandular e das necessidades
diferenciadas da colônia e os zangões são os indivíduos machos da
colônia cuja única função é fecundar a rainha durante o vôo nupcial
(WIESE, 1995).
A produção de mel, assim como também a produção de geléia real,
cera, pólen e própolis aumentaram consideravelmente com as abelhas
africanizadas. Além disso, as abelhas do gênero Apis são as que mais se
prestam para a polinização, ajudando enormemente a agricultura
(PEREIRA et al., 2002). Recentemente, colônias de abelhas africanizadas
têm sido alugadas por produtores brasileiros e de outros países para a
30
polinização de uma grande variedade de culturas: café, maçãs, pêras,
frutas cítricas, melões e kiwis, além de outras frutas e vegetais. Abelhas
melíferas, auxiliadas por técnicas de criação bem desenvolvidas, são
também usadas como o principal agente de polinização agrícola no
Hemisfério Norte (MC GREGOR, 2006).
2.2 PÓLEN APÍCOLA
Pólen é o elemento fecundante masculino da flor, que atraído pelo
ovário da mesma fertiliza para formar as sementes, garantindo a
reprodução da planta. Polens são pequenos grânulos de dimensões
microscópicas, em média 50 µm. É o elemento reprodutivo das plantas,
produzido pelas anteras nos estames, órgão masculino da flor (Figura 2).
É formado por minúsculos grãos, localizados nas anteras dos estames da
flor de onde é coletado pelas abelhas e levados para a colônia para
utilização no preparo do alimento das larvas jovens em decorrência do
alto valor nutritivo, rico em proteínas, minerais e vitaminas (WIESE,1995).
.
FIGURA 2 - ESTAMES COM ANTERAS EVIDENTES, CARREGADAS DE
PÓLEN.
FONTE: TIOSAM (2007)
31
As abelhas (A. mellifera) coletam o pólen das flores que adere aos
pelos do seu corpo quando em contato com os estames. Em seguida eles
são escovados com os pentes tibiais, e os grãos aglutinados em bolotas
ou grânulos (BREYER, 2007) (Figura 3).
FIGURA 3 - ABELHA COLETANDO PÓLEN DAS FLORES
FONTE: BREYER (2007)
Depois de pousar em várias flores a abelha começa a recolher os
grãos de sua cabeça, tórax e abdômen, transferindo-os com ajuda das
patas dianteiras e intermediárias e colocando-os na corbículas (Figura 4).
FIGURA 4 - GRÃO DE PÓLEN NA CORBÍCULA DA ABELHA
FONTE: BREYER (2007)
32
A abelha transporta o pólen até a colméia, onde é depositado nos
alvéolos dos favos, comprimido com a cabeça das operárias para obter
uma massa compacta que sofre transformações sob ação da
temperatura, umidade e enzimas salivares, sendo misturado com o néctar
para formar o pão das abelhas.
O pólen é a utilizado no preparo do alimento das larvas jovens em
decorrência do alto valor nutritivo, rico em proteínas, minerais e vitaminas
(WIESE,1995). As abelhas só produzem geléia real a partir da matéria
liberada pela digestão do pólen, que é metabolizado pelas células das
glândulas hipofarígeanas das abelhas nutrizes.
As pesquisas mostram que uma colméia populosa chega a
consumir 35 kg de pólen para alimentação das crias. Para coletar 250g de
pólen as abelhas necessitam de 17 mil vôos. A necessidade diária de
pólen de uma abelha operária é da ordem de 145 mg e é necessária a
visita a 84 flores para uma abelha completar uma carga de pólen, que
pesa até 15mg (BREYER, 2007).
Cada pólen tem suas características específicas ligadas às
espécies florais e cultivares visitadas pelas abelhas. O pólen pode ser
monofloral, quando há uma única origem botânica mantendo as
propriedades organolépticas e bioquímicas da planta original. Quando a
oferta de plantas poliníferas na área em volta do apiário não é suficiente,
as abelhas visitam outras flores ou misturam pellets de pólen de várias
flores. Esse pólen passa a ser chamado de heterofloral ou polifloral e
possui propriedades bioquímicas variadas (BARRETO et al., 2006).
33
O pólen é necessário às abelhas como alimento protéico e desta
forma ele é consumido pelas operárias para a produção de cera e geléia
real. É ainda fornecido às larvas que possuem um desenvolvimento
rápido, pois em apenas seis dias as larvas que eclodiram dos ovos
multiplicam muitas vezes seu peso e tamanho. Desta forma elas
necessitam de um alimento rico para que possam conseguir este grande
desenvolvimento num período de tempo tão curto (BREYER, 2007).
Ao retornar à colméia as abelhas atravessam armadilhas, deixando
cair o pólen nos coletores colocados pelos apicultores que é recolhido
diariamente para ser processado. Os coletores de pólen são constituídos
essencialmente por trampas com perfurações de aproximadamente 4,5
mm de diâmetro para permitir que as abelhas ao atravessarem deixem
cair as bolotas de pólen presas em suas patas traseiras (MAGALHÃES,
2005) (Figura 5).
FIGURA 5 - COLETORES DE PÓLEN COLOCADO NA FRENTE DO ALVADO
FONTE: MAGALHÃES (2005)
Essas bolotas de pólen são recolhidas em uma bandeja (caixa ou
gaveta) que é recoberta por uma tela de arame, de forma que
34
permaneçam isoladas da colméia e as abelhas não possam recolhê-las
novamente (Figura 6).
FIGURA 6 - GAVETA DE RECOLHIMENTO DO PÓLEN
FONTE: MORETI (1995)
2.2.1 Beneficiamento do Pólen Apícola
A coleta do pólen apícola é feita diariamente e ao final da tarde. O
pólen, depois de retirado das gavetas coletoras, é transferido para baldes
de polietileno com tampas de pressão e colocados em freezer, onde
permanecerá até o prazo máximo de 15 dias (Figura 7) (MAGALHÃES,
2005). Segundo Barreto et al. (2006) o pólen apícola dever permanecer
congelado por no mínimo 48 horas, para destruição de possíveis ácaros,
ovos ou larvas de traças de cera (Galleria sp.) e de outros insetos. O
congelamento imediato controla o desenvolvimento de microrganismos
relacionados à microflora normal contida no pólen.
35
FIGURA 7 - COLETA DO PÓLEN POR APICULTORES
FONTE: MAGALHÃES, 2005
Cada pólen tem suas características específicas ligadas à origem
floral, mas a qualidade do produto final também depende do processo de
limpeza, secagem, embalagem e armazenagem. O processamento do
pólen consiste de várias etapas e tem a função de transformar o pólen
apícola em pólen apícola desidratado, como forma de aumentar a vida-
de-prateleira e manter as suas propriedades (BARRETO et al., 2006).
Após o descongelamento gradativo e em geladeira (4 a 8 horas) o
pólen é seco em estufa de circulação forçada com temperatura entre 40 a
42ºC. O pólen chega do campo com umidade variável entre 12 a 30% e
deve ficar no mínimo com 2% e no máximo com 4% de umidade. O tempo
de secagem depende da umidade inicial e varia de 12 a 70 horas. O pólen
é distribuído uniformemente em bandejas com espessura de 1,5cm
(Figura 8).
36
FIGURA 8 - ESTUFA SECADORA DE PÓLEN APÍCOLA
FONTE: MAGALHÃES, 2005.
De acordo com Marques (2000), após a desidratação os grãos de
pólen são classificados por tamanho em uma seqüência de peneiras
granulométricas. É também aplicado um jato de ar seco para a remoção
de sujeiras. Os grumos maiores de pólen são desfeitos e o pó de pólen é
retirado pela parte inferior do equipamento. Após a limpeza mecânica é
feita uma limpeza manual para a retirada de eventuais materiais
estranhos e sujidades como asas e pernas de abelhas, larvas secas,
bolotas de própolis que possuem a mesma densidade do pólen e que não
são retiradas pela caixa de aeração (Figura 9).
Após a limpeza manual o pólen é envasado em potes de vidros ou
plásticos para a comercialização. O armazenamento deve ser em
ambiente seco com temperatura amena e ao abrigo da luz (BARRETO et
al., 2006).
37
FIGURA 9 - SEPARADOR DE PÓLEN APÍCOLA
FONTE: MAGALHÃES (2005)
A produção de pólen apícola no Brasil representa uma atividade
recente que teve início no final da década de 80. Segundo vários autores,
o País tem potencial para ser um grande produtor de pólen, devido
principalmente a riqueza e a diversidade da flora aliada ao clima tropical e
a eficiência das abelhas africanizadas (SALOMÉ e SALOMÉ, 1998;
BARRETO et al., 2006).
38
Limpeza
Caixa de aeração
2.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO PÓLEN APÍCOLA
A composição química do pólen varia com a origem floral,
condições ambientais, climáticas, geográficas, idade e estado nutricional
da planta e estações do ano. O pólen apícola contém substâncias
nutricionais como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídeos,
vitaminas, macro e microelementos minerais. Além disto, o pólen também
contém quantidades significativas de substâncias polifenólicas,
principalmente da classe dos flavonóides (ANDRADE et al., 1999).
Em geral, o pólen apícola possui 15 a 30% de proteínas, sendo que
grande parte da composição protéica do pólen se apresenta na forma de
aminoácidos livres (10 a 13%). Além de proteínas o pólen possui 20 a
40% de açúcar total, 20 a 26% de açúcar redutor e baixo teor de lipídeos,
entre 1,0 a 5%. O pólen possui 3 a 5% de fibras e 2,5 a 3,5% de sais
minerais (DONADIEU, 1979).
O pólen também contém vitaminas como tiamina, riboflavina,
nicotinamida, ácido pantotênico, piridoxina, meso-inositol, biotina e ácido
fólico, além de aminoácidos como alanina, arginina, cisteina, glicina,
histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina
entre outros. No entanto, Almeida-Muradian et al. (2005) analisaram dez
amostras de pólen apícola da Região Sul do Brasil e não encontraram
vitamina C e β-caroteno.
Analisando 20 amostras de pólen apícola de várias regiões da
Espanha, Serra Bonvehí e Escolà Jordà (1997) encontraram altos índices
39
de prolina, 63,1% dos aminoácidos livres totais, 15,3% de proteínas,
32,9g/100g de açúcares redutores e baixos teores de ácidos graxos
saturados, que faz do pólen um complemento alimentar de excelente
qualidade nutricional. Os mesmos autores também encontraram uma
grande variedade de minerais, onde o potássio foi predominante (59% do
total), seguido pelo fósforo, cálcio, sódio e magnésio (39,9%). Os
elementos ferro e zinco encontrados no pólen perfazem 15% da dose
diária recomendada (RDA), sendo que o teor de zinco chega a se
apresentar em maior proporção do que em outros produtos apícolas.
Segundo Wesh e Marston (1983), a presença de zinco, cobre, ferro e uma
alta taxa de potássio/sódio tornam o pólen apícola um alimento
interessante para dietas com um balanço eletrolítico definido.
Os compostos fenólicos, principalmente flavonóides, são
considerados como os principais ingredientes do pólen. Kroyer e Hegedus
(2001) avaliaram as propriedades bioativas dos compostos fenólicos
como seqüestradores de radicais livres em pólen apícola e em extratos
(aquoso, etanólico e metanólico). O pólen apícola apresentou 8,2 mg/g de
compostos fenólicos totais que foi sensivelmente melhorada com a
utilização do etanol como solvente (24,6mg/g). Embora o pólen apícola
tenha apresentado considerável atividade antiradical (PI=35%, poder de
inibição), essa propriedade passou para 53% com no extrato etanólico.
Uma quantidade mínima de 2g/100g de aminoácidos livre foi
sugerida para padronização do pólen no mercado europeu. A
determinação de flavonóides são um indicador de qualidade do produto
40
assim como o índice de aminoácidos livres. O estabelecimento dos
parâmetros e o desenvolvimento de um marcador da qualidade podem
facilitar a inclusão do pólen apícola no mercado europeu (SERRA
BONVEHÍ et al., 2001).
Alencar (2002) avaliando a composição química do mel de
diferentes regiões do Brasil verificou que os flavonóides presentes eram
exclusivamente agliconas que podem ser parcialmente oriundos dos
flavonóides contidos no pólen, resultantes da hidrólise pelas enzimas
presentes na saliva das abelhas. O autor relata a importância de mais
estudos para se verificar a existência de flavonóides, principalmente a
quercetina, no néctar do alecrim do campo. Este parâmetro poderá
funcionar como um marcador químico da origem botânica dos produtos
apícolas.
2.3.1 Compostos Fenólicos em Plantas
Em termos de ação biológica, a principal classe de constituintes do
pólen é a dos compostos fenólicos. Essas substâncias caracterizam-se
pela presença de pelo menos um grupo hidroxila ligada diretamente a um
anel aromático. O composto mais simples é o fenol (Figura 10) e está
amplamente distribuído no reino vegetal e em microrganismos, fazendo
parte também do metabolismo animal (BRAVO, 1998).
41
FIGURA 10 – ESTRUTURA QUÍMICA DE UM FENOL SIMPLES
FONTE: BRAVO (1998).
No entanto, os animais são incapazes de sintetizar o anel
aromático e, neste caso, a síntese dos compostos fenólicos em pequena
quantidade é feita utilizando o anel benzênico de substâncias ingeridas na
dieta. Por outro lado, os vegetais e a maioria dos microrganismos têm a
capacidade de sintetizar o anel benzênico e, a partir dele, produzir
diferentes tipos de compostos fenólicos (SIMÕES, 2001).
A maior parte dos compostos fenólicos não é encontrada na
natureza no estado livre, mas sob a forma de ésteres ou de heterosídeos,
sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos polares.
Esses compostos são muito reativos quimicamente, possuem em geral
características ácidas e podem ser isolados por meio da sua solubilidade
em soluções fracamente básicas (por exemplo, solução de carbonato de
sódio).
Os compostos fenólicos podem formar pontes de hidrogênio, e
estas podem ser tanto intramoleculares quanto intermoleculares. Os
compostos fenólicos apresentam intensa absorção na região do
ultravioleta e uma característica importante é a complexação com metais,
42
sendo que muitos desses quelatos metálicos são importantes em diversos
sistemas biológicos. Os compostos fenólicos são facilmente oxidáveis,
tanto por meio de enzimas vegetais específicas quanto por influência de
metais, luz, calor ou em meio alcalino, ocasionando o escurecimento de
soluções ou composto isolados (SIMÕES, 2001).
2.3.2. Síntese e Classificação dos Compostos Fenólicos
Bravo (1998) classificou os compostos fenólicos presente nos
alimentos em 13 categorias distintas, enquanto que Harborne (1989)
classificou-os de acordo com o número de carbonos conforme
apresentado na Tabela 1.
43
TABELA 1. CLASSIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS
Classe de compostos fenólicos Estrutura básica
Fenóis simples, benzoquinonas C
6
Ácidos fenólicos C
6
-C
1
Acetofenonas e ácidos fenilacéticos C
6
-C
2
Fenilpropanóides: ácidos cinâmicos e
compostos análogos, fenilpropenos,
cumarinas, isocumarinas e cromonas
C
6
-C
3
Naftoquinonas C
6
-C
4
Xantonas, benzofenonas C
6
-C
1
-C
6
Estilbenos, antraquinonas C
6
-C
2
-C
6
Flavonóides, isoflavonóides e chalconas C
6
-C
3
-C
6
Lignanas (C
6
-C
3
)
2
Diflavonóides (C
6
-C
3
-C
6
)
2
Melaninas vegetais (C
6
)n
Ligninas (C
6
-C
3
)n
Taninos hidrolisáveis (C
6
-C
1
)n
Taninos condensados (C
6
-C
3
-C
6
)n
FONTE: HARBORNE (1989)
Segundo Harborne (1989), os compostos fenólicos podem ser
formados por meio de duas rotas biogenéticas: a via do ácido chiquímico
a partir de carboidratos ou a via do acetato-polimalato que se inicia com
acetil-coenzima A e malonil-coenzima A. A origem biogenética determina
o padrão de substituição do composto fenólico resultante. Dessa maneira,
pela via do ácido chiquímico obtêm-se compostos com grupos hidroxilas
em posição orto, que se formam a partir do ácido cinâmico. Por outro
lado, a via do acetato-polimalato origina compostos com grupos hidroxilas
dispostos em meta (DEWICK, 1998). Tirosina e ácidos cinâmicos são
formados a partir da fenilalanina amônio liase (PAL) pela via do ácido
chiquímico (Figura 11).
44
45
Ácido
chiquímico
FIGURA 11 - VIA DO ÁCIDO CHIQUÍMICO PARA BIOSSÍNTESE DE
COMPOSTOS FENÓLICOS.
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004)
2.3.2.1 Ácidos Fenólicos
Os ácidos fenólicos são divididos em três grupos principais: ácidos
benzóicos, ácidos cinâmicos e cumarinas. O primeiro possui sete átomos
46
Fenilalanina
PAL (fenilalanina amônia liase)
Ácido p-cumárico
Ácido trans-cinâmico
Flavonóides
Ácido benzóico
Lignanas
de carbono (C6-C1) e, são os ácidos fenólicos mais simples encontrados
na natureza (Figura 12). O segundo é formado pelos ácidos
hidroxicinâmicos e possuem nove átomos de carbono (C6-C3) (Figura
13). As cumarinas são derivadas do ácido cinâmico por ciclização da
cadeia lateral do ácido o-cumárico (Figura 14) (SOARES, 2002).
FIGURA 12 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO BENZÓICO
FONTE: SOARES (2001).
FIGURA 13 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO CINÂMICO
FONTE: SOARES (2001).
47
FIGURA 14 - ESTRUTURA QUÍMICA DA CUMARINA
FONTE: SOARES (2001).
Os ácidos derivados do ácido benzóico sofrem substituições nas
posições meta e para dando origem, por exemplo, ao ácido gálico
(MAMEDE e PASTORE, 2004). O ácido hidroxicinâmico e seus derivados
como p-cumárico, caféico, ferrúlico e sinápico são originados do
metabolismo da fenilalanina ou tirosina.
Os ácidos p-cumárico, ferrúlico, caféico e sinápico são os ácidos
cinâmicos mais comuns na natureza. Estes ácidos são encontrados nas
plantas, usualmente na forma Ðva/Àge’si
Esses dois grupos de ácidos fenólicos possuem atividade antioxidante
(HARBORNE, 1973). Embora outras características também contribuam
para a atividade antioxidante dos ácidos fenólicos e seus ésteres, esta é,
geralmente, determinada pelo número de hidroxilas presentes na
molécula e também com a proximidade do grupo -CO
2
H com o grupo fenil.
Quanto mais próximo esse grupo estiver do grupo fenil maior será a
capacidade antioxidante do grupo hidroxila na posição meta (BRAVO,
1998).
Em geral, a atividade antioxidante dos derivados dos ácidos
hidroxicinâmicos é maior do que a dos ácidos hidroxibenzóicos. A
presença do grupo –CH=CH-COOH na estrutura do ácido cinâmico
aumenta sua capacidade de estabilizar radicais livres. Provavelmente, há
conjugação da dupla ligação do grupo –CH=CH-COOH com as duplas do
anel. Deve-se destacar que o ácido gálico apresenta atividade
antioxidante maior do que a catequina (flavonóide), que conta com cinco
grupos hidroxilas em sua estrutura (RICE-EVANS et al., 1996).
2.3.3 Compostos Fenólicos de Pólen
Serra Bonvehì et al. (2001) identificaram treze compostos fenólicos
no pólen apícola da Espanha, entre eles sete foram ácidos fenólicos
como: ácido 3,4-dihidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido p-
cumárico, ácido o-cumárico, éster etílico do ácido 4-hidroxibenzóico, ácido
trans-cinâmico e os flavonóides rutina, quercetina, miricetina, kanferol e
isoramnetina.
49
Atualmente, o interesse nos compostos fenólicos tem aumentado
devido às habilidades antioxidantes e de seqüestrar os radicais livres,
prejudiciais à saúde humana (GARCÍA et al., 2001). O pólen apícola
contém nutrientes essenciais e são indicados para serem usadas pela
considerável quantidade de substâncias polifenólicas com possível
atividade antioxidante. Os principais ácidos fenólicos encontrados em
pólens apícolas estão apresentados na Figura 15.
50
FIGURA 15: ÁCIDOS FENÓLICOS GERALMENTE ENCONTRADOS EM
PRODUTOS APÍCOLAS.
FONTE: SERRA BONVEHÍ et al. (2001).
2.3.4 Flavonóides
a) Ácido gálico
= ácido 3,4,5-
trihidroxibenzoico
b) Ácido cafeico
= ácido 3,4-dihidroxicinâmico
c) Ácido ferulico
= ácido 4-hidroxi-3-
metoxicinâmico
d) Ácido trans-cinâmico
= ácido 3- fenil-2-propenóico
e) Ácido o-cumarico
= ácido 2-cumarico
= ácido trans-2-
hidroxicinâmico
f) Ácido protocatecuico
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico
g) Ácido vanilíco
= ácido 4-hidroxi-3-
metoxibenzoico
h) Ácido siringico
= ácido 4-hidroxi-3,5-
dimetoxibenzoico
i) Ácido p-cumarico
= ácido 4-cumarico
=ácido trans-4-hidroxicinâmico
j) Ácido 4-hidroxibenzoico etil
éster
= etil-4-hidroxibenzoato
k) CAPE
Ácido cafeico fenetil ester
51
Os flavonóides são os mais importantes grupos de compostos
fenólicos em alimentos. Sua estrutura comum é o difenil propano (C
6
-C
3
-
C
6
), e consistem de dois anéis aromáticos interligados por três carbonos
que geralmente forma uma estrutura heterocíclica oxigenada (BRAVO,
1998).
O sistema de numeração usado para diferenciar as posições dos
carbonos ao redor da molécula dos flavonóides, por conveniência, utiliza
numeral ordinário para os anéis A e C, sendo seguidos de apóstrofo para
o anel B (Figura 16).
FIGURA 16 – NUMERAÇÃO DE UM FLAVONÓIDE COM ANEL C
FONTE: COOK e SAMMAN (1996).
Para os flavonóides em que o anel C não é formado, a numeração
seguida de apóstrofo é utilizada para o anel A, e os carbonos que unem
os anéis A e B são designados α e β, em relação à carbonila (Figura 17).
Os flavonóides ocorrem na forma de agliconas, embora mais comumente
se encontre como derivados de glicosídeos (BRAVO,1998). As atividades
bioquímicas dos flavonóides e de seus metabólitos dependem de suas
52
estruturas químicas e da orientação das várias posições na molécula
(COOK e SAMMAN, 1996).
FIGURA 17 – NUMERAÇÃO DE UM FLAVONÓIDE SEM ANEL C.
FONTE: COOK e SAMMAN (1996).
A estrutura química dos flavonóides favorece sua ação
antioxidante. Os hidrogênios dos grupos hidroxilas adjacentes (orto-
difenóis), localizados em várias posições dos anéis A, B e C, as duplas
ligações dos anéis benzênicos e a dupla ligação da função oxo (-C=O) de
algumas moléculas de flavonóides fornecem a estes compostos alta
atividade antioxidante (RICE-EVANS et al. 1996).
Os flavonóides absorvem radiação eletromagnética na faixa do
ultravioleta (UV) visível e dessa maneira apresentam um papel de defesa
das plantas frente à radiação UV da luz solar. Uma idéia da riqueza
espectral dos compostos fenólicos e flavonóides foram sumarizadas por
Adelmann (2005) e apresentados na Tabela 2.
TABELA 2 - COMPRIMENTO DE ONDA DE ABSORÇÃO DAS PRINCIPAIS
CLASSES DE FLAVONÓIDES
53
Classe dos
Flavonóides
Exemplos Solvente Faixa
espectral da
absorção
(nm)
λ
máx
(nm)
principal e
(secundário)
Antocianinas Cianidina-3-
rutinosídeio
0,01% HCl
em metanol
269-289
310-333
495-538
523
(290)
Flavonas Leteolina Etanol 248-286
332-356
350
(255;268)
Flavonóis Quercetina;
Canferol;
Miricetina
Etanol 252-268
345-379
368
(268)
Flavononas Naringenina Etanol 215-233
278-290
312-335
325
(290;224)
Isoflavonas Genistina Etanol 241-275
296-302
320-335
262
(330)
Chalconas Neoplatimenina 95% etanol 235-266
320-385
393
(268;320)
Auronas Hispidol 95% etanol 234-272
254-355
388-413
388
(234;254)
Xantonas Mangiferina 95% etanol 230-245
250-265
305-330
340-400
258
(242;316;364)
Fonte: ADELMANN (2005).
Os flavonóides possuem espectros de absorção característicos no
ultravioleta, determinados pelo núcleo comum benzopirona, com dois
máximos de absorção: um ocorrendo entre 240-285 nm (banda II) e outro
entre 300-400 nm (banda I). Em geral, a banda II pode ser considerada
como devido à existência do anel A e a banda I devido ao anel B. O
aumento do grau de hidroxilação do núcleo leva ao aumento do efeito
batocrômico e, conseqüentemente, os espectros deslocam-se no sentido
dos maiores comprimentos de onda (MARCUCCI, 1998). Então, de um
modo geral, apresentam uma maior absorção na faixa entre 250 e 350 nm
(PARK et al., 1995).
54
2.3.5 Síntese e Classificação dos Flavonóides
Alguns compostos fenólicos de massa molecular intermediários,
tais como, os flavonóides (C
6
-C
3
-C
6
), são produzidos pela combinação dos
dois mecanismos (pela via do ácido chiquímico e via do acetato-
polimalato). Segundo O’connel e Fox (2001), o anel aromático A dos
flavonóides é derivado do acetato (resorcinol ou fluoroglucinol), enquanto
o anel B é produzido pela via metabólica do ácido chiquímico (Figura 11).
Com mais de 8000 compostos individuais conhecidos, os
flavonóides são biosintetizados a partir de um derivado do ácido cinâmico
(trans-4-coumarato), sintetizado a partir do metabolismo dos aminoácidos,
fenilalanina ou tirosina, que age como precursor na síntese de um
intermediário ao qual são adicionados três resíduos de malonato
(malonato coenzima A), a qual leva a formação de chalconas que
posteriormente ciclizam-se sob condições ácidas (SAHIDI e NACZK,
2004) (Figura 18). Desta forma os flavonóides têm o esqueleto básico de
difenilpropano (C
6
-C
3
-C
6
) com diferentes níveis de oxidações do anel
pirano central (BRAVO, 1998).
As atividades bioquímicas dos flavonóides e seus metabólitos
dependem da estrutura química e da orientação relativa das várias
posições das moléculas. De acordo com as características químicas e
biossintéticas, os flavonóides são separados em diversas classes. As
classes dos flavonóides variam em sua estrutura característica ao redor
55
do anel C, e são quimicamente classificados de acordo com a presença
ou não do anel central, de uma dupla ligação no anel e de um grupo
hidroxila a ele ligado (MARCUCCI, 1998).
56
Resveratrol
(estibeno)
p-cumárico CoA + 3 malonyl CoA
Tetrahidrochalcona
Flavanol
(Catequina)
Flavonona
Flavononol
Flavonol
Isoflavona Flavona
Antocianidina
Chalcona isomerase
Síntese do Estilbeno Síntese da Chalcona
FIGURA 18 – PRODUÇÃO DE FLAVONÓIDES A PARTIR DE
FENILPROPANÓIDES (P-CUMARIL CoA) E MALONIL CoA.
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004).
Cook e Samman (1996) classificaram os flavonóides em 8 grandes
grupos, conforme mostrado na Figura 19. Com exceção das chalconas,
57
todos os flavonóides possuem um anel pirânico (com heteroátomo de
oxigênio).
FIGURA 19 – ESTRUTURAS QUÏMICAS DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE
FLAVONÓIDES.
FONTE: COOK e SAMMAN (1996).
Segundo Shaidi e Naczk (2004), no caso dos flavonóides e
isoflavonóides, dependendo dos pontos de substituições e de
insaturações podem-se formar as flavonas, flavononas, flavonóis,
flavononóis, flavanóis (flavan-3-óis) e compostos a estes relacionados. As
a) Flavona
b) Flavonol
c) Flavonona
d) Flavononol
e) Isoflavona
f) Flavanol (Catequina) g) Antocianinas
h) Chalcona
58
flavonas e flavonóis ocorrem como agliconas em alimentos;
aproximadamente 200 flavonóis e um pouco mais de 100 foram
identificadas em plantas. Estes compostos possuem uma dupla ligação
entre o C-2 e C-3. Os flavonóis são diferenciados das flavonas por
possuírem uma hidroxila na terceira posição.
Dentro de cada classe, flavonóides individuais podem variar em
função do número e da distribuição das hidroxilas, assim como do grau de
alquilação ou de glicosilação. As flavononas e flavononóis são
caracterizados pela presença de uma ligação saturada entre os C-2 e C-3
e de um grupo carbonila na posição 4. Os flavononóis diferem das
flavononas por possuírem uma hidroxila no posição 3 e são muitas vezes
referenciadas como 3-hidroxiflavononas ou dihidroflavonóis (COOK e
SAMMAN, 1996) (Figura 19).
O termo flavonóide é derivado do latim flavus, que significa
amarelo, porém observa-se que o grupo flavonona (ex. pinocembrina) é
incolor e que a classe das antocianinas possui substâncias que variam no
seu espectro de coloração do verde ao azul (LOPES et al., 2000). As
antocianinas são antocianidinas que possuem grupos glicosídicos e estão
presentes em muitas flores e frutos. As chalconas e flavonas possuem
coloração amarela e as antocianinas são pigmentos solúveis em água
responsáveis pela cor vermelha, azul e violeta das frutas e de outros
alimentos (MAZZA e MINIATI, 1993; MAZZA, 1998). A Tabela 3 fornece
alguns exemplos de flavonóides que ocorrem naturalmente em alimentos
e seus substituintes na estrutura molecular do flavonóide.
59
TABELA 3 - DIFERENTES CLASSES DE FLAVONÓIDES, SEUS
SUBSTITUÍNTES E FONTES DIETÉTICAS.
60
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004).
2.3.6 Flavonóides Presentes no Pólen
A maioria dos flavonóides existente no pólen está na forma
glicosilada, ou seja, um açúcar é ligado em uma ligação semiacetal em
Classes
Nomes Substituintes Fonte dietética
Chalcona
(sem ligação 1-2)
Buteína
Ocanina
2,4,3’, 4’ –OH
2, 3, 4,3’, 4’ –OH
Vegetais variados
Vegetais variados
Flavona Crisina
Apigenina
Rutina
5,7 – OH
5,7,4’ –OH
5,7,3’,4’ –OH;
3 – rutinose
Peles das frutas
parsley, celery
Trigo mourisco, frutas
cítricas, pimenta
vermelha, vinho tinto,
pele de tomate
Flavonona Naringin
Naringeninia
Taxifolin
Hesperidina
Isosacuranetina
5,4’-OH;
7-ramnoglucose
5,7,4’- OH
3,5,7,3’,4’-OH
3,5,3’-OH, 4’-OMe;
7-rutinose
5,7-OH; 4’-OMe
Frutas cítricas, uva
Frutas cítricas
Frutas cítricas
Laranjas
Frutas cítricas
Flavonol Canferol
Quercetina
3,5,7,4’-OH
3,5,7,3’4’-OH
Leek, brócolis, endives,
uva, chá preto
Cebola, berries, alface,
brócolis, tomate,chá,
macã, azeite de oliva
Flavononol Engeletin
Genistin
3,5,7,4’-OH;
3-O-ramnose
5,4’-OH; 7- glucose
Pele de uva branca
Soja
Isoflavona Genisteína
Daidzina
5,7,4’-OH
4’-OH, 7-glucose
Soja
Soja
Flavanol Catequina
Galocatequina
3,5,7,3’,4’-OH
3,5,7,3’,4’,5’-OH
Chá
Chá
Antocianidina Epigenidina
Cianidina
5,7,4’-OH
3,5,7,4’-OH;3,5-OMe
Frutas estocadas
Cereja, raspberry,
morango
61
um ou mais grupos hidroxílicos da molécula. Os compostos fenólicos
livres são chamados de agliconas e aparecem in vivo pela ação das
enzimas glicosidases. A D-glicose, D-galactose e L-ramnose são os
açúcares mais freqüentemente encontrados nos flavonóides. Alguns
dissacarídeos e trissacarídeos são ocasionalmente ligados aos
flavonóides, como é o caso da rutina (SERRA BONVEHI et al. 2001).
Na colméia, as bolotas de pólen são misturadas com mel e
secreções glandulares hipofarigeanas das abelhas com a presença de
enzimas hidrolíticas do tipo α- e β-glicosidase. Desta forma, agliconas são
encontradas no estado livre e o acúmulo de quercetina no pólen
desidratado é evidentemente devido à atividade da glicosidase. Várias
teorias sugerem que os flavonóides estão envolvidos no metabolismo e
crescimento, outros têm focado a proteção passiva e como um atrativo
para algum vetor de polinização. A determinação quantitativa dos
flavonóides glicosilados é difícil porque a maioria dos padrões não estão
comercialmente disponíveis. A hidrólise de todos os glicosídeos a
agliconas oferece um procedimento prático para a determinação
quantitativa dos flavonóides. No pólen apícola este procedimento não é
necessário porque as secreções glandulares hipofaringeanas das abelhas
hidrolizam os flavonóides heterosídeos a agliconas livres, aumentando
assim a possível atividade biológica do produto.
Os flavonóides, por serem pigmentos presentes em todas as
células fotosintetizadoras, são encontrados em ervas, legumes, frutas,
mel e por conseqüência dentre outros produtos de consumo cotidiano
62
(LOPES et al. 2000; HAVSTEEN, 2002). As flavononas ocorrem
predominantemente em frutas cítricas, as flavonas em plantas utilizadas
para condimentos, os isoflavonóides em legumes, as antocianinas e
catequinas em frutas e flavonóis em todas as frutas e vegetais
(PETERSON e DWYER, 1998). Os nutricionistas estimam que a ingestão
média de flavonóides em uma dieta normal é de 1–2g por dia
(HAVSTEEN, 2002), e por serem consumidos em grandes proporções
dentro de uma dieta humana regular, esses compostos desempenham um
importante papel na saúde humana.
Tomas-Barberan et al. (1989) mostraram que o pólen apícola de
jara contém principalmente quercetina e isoramnetina-3-glicosídeo e
traços de miricetina e canferol-3-glicosídeo. Estes flavonóides são iguais
aos encontrados no pólen de jara, sugerindo que estes flavonóides
podem ser usados como marcadores químicos. Similarmente o composto
8-metoxicanferol-3-glicosídeo pode ser considerado um marcador químico
de pólen, desde que esteja presente somente no pólen de amêndoas.
Assim, os padrões de flavonóides característicos dos pólens apícolas
podem ser usados como marcadores bioquímicos da planta que deu
origem (CAMPOS et al., 1997; TOMÁS-BARBERÁN et al., 1989).
Na Figura 20 são mostradas as estruturas de flavonóides
comumente encontrados em produtos apícolas: o canferol, a miricetina, a
quercetina, isoramnetina e a galangina que são flavonóis; a rutina,
canferide, a apigenina, a acacetina e crisina são exemplos de flavonas; a
63
naringenina, naringina, pinocebrina e sakuranetina são flavononas
(SERRA BONVEHI et al., 2001).
64
a) Acacetina
= 5,7-dihidroxi-4'-metoxiflavona
b) Apigenina
= 4',5,7-trihidroxiflavona
c) Chalcona
= 2-Benzilidenoacetofenona
d) Crisina
5,7-dihidroxiflavona
e) Galangina
= 3,5,7-trihidroxiflavona
f) Canferide
= 3,5,7-trihidroxi-
4'-metoxiflavone
g) Canferol
= 3,4',5,7-tetrahidroxiflavona
h) Miricetina
= 3,3',4',5,5',7-
hexahidroxiflavona
i) Naringenina
= 4',5,7-trihidroxiflavanona
j) Naringina
= naringenin-7-O-
neohesperidoside
l) Quercetina
= 3,3',4',5,7-
pentahidroxiflavona
m) Rutina
Quercetin-3-O-rutinosideo
n) Sacuranetina
= naringenina-7-metileter
= 4',5-
dihidroxi-7-metoxiflavanona
m) Isoramnetina
= 3,4',5,7-tetrahidroxi-3'-metoxi
flavona
n) Pinocembrina
=5,7-Dihidroxiflavanona
FIGURA 20 - ALGUNS FLAVONÓIDES GERALMENTE ENCONTRADOS EM
PRODUTOS APÍCOLAS.
FONTE: SERRA BONVEHÍ et al. (2001).
65
2.4 ABSORÇÃO E METABOLISMO DOS COMPOSTOS
FENÓLICOS
A ingestão de compostos fenólicos na dieta é afetada pelos hábitos
alimentares e preferências individuais. A média diária de ingestão de
polifenóis na dieta é de 1g por pessoa; as principais fontes são bebidas,
frutas e em menor quantidade, os vegetais e legumes. Entretanto fatores
como, diversidade estrutural, a falta de padronização e de métodos
disponíveis para a quantificação, a variação no teor e a distribuição
desigual dos fenólicos em cada planta, além do processamento
tecnológico torna difícil a avaliação exata das quantidades de polifenóis
ingeridas (SCALBERT e WILLIAMSON, 2000).
Hertog et al. (1993) relataram que o chá preto, uma das maiores
fontes de flavonóides, contribui com 61% da dieta, enquanto que cebolas
e maçãs fornecem 13 e 10% da ingestão total de flavonóides na dieta,
respectivamente.
As informações a respeito da biodisponibilidade e absorção dos
fenólicos são diversas, fragmentadas e muitas vezes contraditórias. A
Figura 21 mostra possíveis rotas para o metabolismo dos polifenólicos
ingeridos na dieta humana. Nessas rotas metabólicas estão envolvidas
enzimas, fenolsulfotransferase, catecol-O-transferases,
β
-glucosidases,
lactase-floridizina oxidasesglucoronosil transferase entre outras. A
absorção e a biodisponibilidade dos polifenóis no organismo dependem
do seu metabolismo no intestino delgado e são influenciados por diversos
fatores tais como, masa molecular, lipofilicidade, solubilidade e pKa,
66
assim como o tempo de trânsito no intestino e estômago, a
permeabilidade da membrana, lúmem e pH. Somente os polifenóis não
absorvidos no estômago e no intestino delgado e os metabólicos
excretados são degradados pela microflora intestinal (SHAHIDI e NACZK,
2004).
FIGURA 21 – POSSÍVEIS ROTAS METABÓLICAS DOS POLIFENÓIS EM
DIETA HUMANA.
FONTE: SHAHIDI e NACZK ( 2004).
Os polifenóis glicosilados podem ser absorvidos assim como estão
ou após hidrólise por enzimas intestinais. Crespy et al. (1999), usando
modelo de perfusão in situ, mostraram que a quercetina é absorvida,
metabolizada e parcialmente reexcretada pelo intestino delgado. Denovan
et al. (2001) relataram que após a absorção nas paredes intestinais as
catequinas são extensivamente metabolizadas. Metabolismo adicional de
polifenóis envolve sua conjugação por glucoronidação, O-metilação,
67
Polifenóis da dieta
Intestino delgado
Intestino grosso
Fezes
Fígado
Bile
Tecidos
Rim
Urina
sulfatação ou uma combinação que pode ocorrer no fígado. Os
metabólicos conjugados são depois transferidos aos tecidos ou
excretados na urina ou bile.
Pouco é conhecido sobre os metabólitos de antocianinas,
entretanto alguns autores sugerem que elas são pouco absorvidas
(MORAZZONI et al., 1991). Entretanto, vários autores relatam que as
catequinas e epicatequinas são extensivamente metabolizadas e
conjugadas durante a transferência do lúmen até a superfície serosal.
Kuhnle et al. (2000) e Donavan et al. (2001) verificaram que os
metabólicos de catequina são encontrados no plasma após o consumo de
vinho tinto.
Segundo Miyake et al. (1997), o eriodictiol-7-rutinosidase presente
em limões foi metabolizado por 18 bactérias intestinais cultivadas a partir
das fezes humanas. Os metabólitos primários da eriocitrina foram
identificados como eriodictiol, o qual foi depois metabolizado em ácido
3,4-dihidroxicinâmico e floroglucinol pelo Clostridium butyricum. Não foi
detectada a presença de eriodictiol após 15 horas de cultura, porém a
presença de eriodictiol e ácido 3,4-dihidroxicinâmico após 6 e 9 horas de
incubação, respectivamente.
A quercetina-3-glucosidase e a quercetina-4’-glucosidase são
rapidamente absorvidas pelo corpo humano, sendo alcançada uma
concentração máxima desses compostos no sangue após 37 ± 12 e 27± 5
minutos de ingestão, respectivamente (OLTHOF et al. 2000). Vries et al.
(2001) estudaram a absorção de quercetina em humanos após o
68
consumo de quantidades similares de vinho tinto, cebolas amarelas ou
chás. A absorção da quercetina foi estimada baseada em suas
concentrações no plasma e na urina, sendo que os resultados sugeriram
que a biodisponibilidade da quercetina do vinho é menor do que das
cebolas, mas maior do que dos chás.
2.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS COMPOSTOS
FENÓLICOS
Muitos compostos fenólicos são adicionados aos alimentos como
agentes antioxidantes e/ou antimicrobianos (ATROSHI et al., 2003),
entretanto, a natureza lipofílica dos fenóis pode reduzir suas propriedades
antimicrobianas (BARANOWSKI e NAGEL, 1984).
A ação antimicrobiana dos compostos fenólicos está relacionada
com a inativação das enzimas celulares, além de mudanças na
permeabilidade das membranas celulares.
Ensaios com polifenóis de chás demonstraram inibição do
crescimento de bactérias cariogênicas, como Streptococcus mutans e
Streptococcus sobrinus (HAMILTON-MILLER, 2001). A quercetina
encontrada em um grande número de frutas como maçã, apricot, figo,
ameixa, morango e tomate demonstrou atividades antivirais contra herpes
simples tipo 1, parainfluenza tipo 3 e polio tipo 1 em estudos in vivo e in
vitro (MIDDLETON, 1986).
69
Pierson e Reddy (1982) avaliaram a atividade de alguns
antioxidantes contra o crescimento e a produção de toxinas de
Clostridium tipos A e B em carnes enlatadas, inoculadas com 8000
esporos/g de carne e adicionadas de ésteres de ácido gálico e ácido p-
hidroxibenzóico. Neste estudo foi verificado que o estufamento tóxico foi
retardado por três dias de armazenamento quando comparado ao
controle.
Durante os últimos anos tem sido relatada in vitro a atividade
antimicrobiana da própolis que se deve aos flavonóides, ácidos
aromáticos e ésteres presentes na resina natural (GEBARA et al., 2002).
A galangina, pinocembrina e pinostrombina são tidos como os flavonóides
mais efetivos contra bactérias (KORU et al., 2007). Os ácidos ferrúlico e
caféico também contribuem para a ação bactericida da própolis. O
mecanismo de atividade antimicrobiana é complexo e provavelmente
baseado na inibição da RNA-polimerase bacteriana (BOSIO, 2000),
podendo decorrer de um efeito sinergístico entre flavonóides,
hidroxiácidos e sesquiterpenos (MARCUCCI, 1995).
A atividade antibacteriana das chalconas e seus derivados contra
microrganismos Gram positivos são freqüentemente maiores do que
contra bactérias Gram negativas, no entanto, alguns análogos também
podem inibir o crescimento de microrganismos Gram negativos
(OPLETALOVA, 2000). Já foram relatadas inibições para as bactérias:
Micrococcus luteus (INAMORI et al., 1991), Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus (ALCARÁZ et al., 2000), Escherichia coli
70
(ALCARÁZ et al., 2000; ALVAREZ et al., 2004) e Staphylococcus
epidermidis (DIMMOCK et al., 1999).
Proestos et al. (2005) encontraram os ácidos p-hidroxibenzóico,
gálico, caféico, p-cumárico, vanílico, ferrúlico e siríngico, além dos
flavonóides quercetina, apigenina, luteolina, naringenina, eriodictiol,
rutina, catequinas e epicatequinas, em vinte e sete extratos de plantas da
Grécia que foram testadas contra as bactérias Escherichia coli,
Staphylococcus enteridis, Staphylococcus aureus, Listeria monocitogena
e Bacillus cereus. Os extratos de plantas mais efetivos na inibição contra
essas bactérias foram a Asperoulla odorata e Vinca rosea. Neste estudo
as bactérias Gram-positivas foram mais sensíveis aos extratos de plantas
do que as bactérias Gram-negativas (E. coli e S. enteridis).
Asolini et al. (2006) avaliaram as propriedades antibacterianas e
antioxidantes de compostos fenólicos encontrados em fitoterápicos
comumente consumidos na região sudoeste do Paraná, como: arruda
(Ruta graveolens), camomila (Matricaria chamomilla), macela
(Achyrocline satureioides), alcachofra (Cynara scolymus), erva-mate (Ilex
paraguariensis), tanchagem (Plantago major), malva (Malva silvestris),
sálvia (Salvia officinalis), capim-limão (Cymbopogon citratus) e alecrim
(Rosmarinus officinalis). Os resultados obtidos indicaram que existe uma
grande variação na concentração dos compostos fenólicos nos diversos
tipos de chás analisados, tanto nos extratos etanólicos quanto nos
aquosos. Somente o extrato aquoso de alcachofra demonstrou atividade
71
antibacteriana, diferentemente dos extratos etanólicos em que todos
apresentaram alguma atividade contra a bactéria Staphylococcus aureus.
Özcan et al. (2004) examinaram o efeito da ação inibitória de
extratos de pólen apícola de cinco regiões diferentes da Turquia contra as
bactérias Alternaria alternata e Fusarium oxysporium. Neste estudo os
extratos de pólen de Taskent não apresentaram inibição contra a
Alternaria alternata entre o terceiro e o quarto dia de incubação, porém
após esse período o efeito inibitório foi sensivelmente melhorado.
Entretanto, esse mesmo pólen só apresentou alguma atividade contra o
Fusarium oxysporium após cinco dias de incubação. Por outro lado, o
pólen de Alanya teve um efeito máximo no terceiro dia de incubação,
decrescendo após esse período com ambos os microrganismos. A grande
variabilidade no efeito inibitório desses pólens pode ser em parte
explicada pelas diferenças químicas, principalmente compostos fenólicos
e flavonóides da flora das diferentes regiões.
2.6 ANTIOXIDANTES
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias capazes
de diminuir ou previnir significativamente a oxidação de outra substância,
sempre que presente em menor concentração quando comparado a
substância oxidável de interesse (HALLIWELL e GUTERIDGE (1990).
Outra definição é o de antioxidantes em alimentos, como uma substância
que em pequena quantidade é capaz de prevenir ou retardar
72
grandemente a oxidação de materiais facilmente oxidáveis, como as
gorduras (BECKER et al., 2004).
Estas definições gerais não limitam a atividade antioxidante a um
grupo específico de compostos químicos e nem se referem a um
mecanismo particular de ação. Para a situação in vivo, o conceito de
antioxidante é amplo, incluindo enzimas antioxidantes, ligações de ferro e
proteínas transportadoras e outros compostos que afetam o sinal de
expressão gênica.
Para alimentos e bebidas, antioxidantes podem ser relacionados a
proteção da oxidação de substratos específicos ou a formação de
produtos de oxidação específicos, e valores podem ser definidos para
diferentes produtos. De um ponto de vista termodinâmico, a ação
antioxidante depende de parâmetros bem definidos, como a energia de
ligação e potenciais de redução padrão, e, desta forma é possível deduzir
se um dado radical pode ser seqüestrado por um antioxidante específico
ou não (BECKER et al., 2004).
O mecanismo pelos quais estes antioxidantes exercem seus efeitos
pode variar dependendo das características de cada alimento, inclusive
da presença dos compostos minoritários. Além disso, os efeitos benéficos
do consumo de vegetais a saúde tem sido atribuído, em parte, a presença
de compostos fenólicos, os quais estão associados com a neutralização
dos riscos de doenças cardiovasculares, câncer, catarata e outras
doenças degenerativas. Isto é conseguido pela prevenção da oxidação
lipídica, mutação do DNA, modificação na estrutura das proteínas (protein
73
cross linking) e danos aos tecidos. Nas últimas décadas, os antioxidantes
têm sido de grande interesse pelos profissionais da saúde, porque eles
ajudam o corpo humano a se proteger contra os danos causados pelas
espécies reativas ao oxigênio e ao nitrogênio, associadas com doenças
degenerativas (Figura 22).
FIGURA 22 – DOENÇAS E DANOS CAUSADOS PELAS ESPÉCIES REATIVAS
AO OXIGÊNIO (ERO
S
).
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004).
Os danos causados por radicais livres podem ter um papel
importante na formação da aterosclerose mediante à oxidação de
lipoproteínas de baixa densidade. As LDL oxidadas são facilmente
adsorvidas por macrófagos e formam células espumosas que, ao
crescerem dão lugar às placas ateroscleróticas que obstruem os vasos,
74
Espécies Reativas ao Oxigênio (ERO
S
)
Trombose
Envelhecimento
Artrite
Aterosclerose
Câncer
Diabetes
Parkisonismo
Isquemia
(coração e
cérebro)
Inflamação
Infecção
Malária,
AIDS
Frostbite
impedindo o fluxo sanguíneo ou sofrendo uma ruptura, o que desencadeia
em uma trombose (SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
02.6.1 Radicais Livres
Radicais livres é um átomo ou grupo de átomos que apresentam um
ou mais elétrons desemparelhados. Um elétron desemparelhado é aquele
que ocupa um orbital atômico ou molecular mais externo. Nos átomos, os
elétrons ocupam uma região no espaço conhecida como orbitais. Cada
orbital “s” pode ter no máximo dois elétrons com spins em direções
opostas. Para que uma molécula permaneça estável é necessária a
presença de elétrons pareados na sua órbita externa. Entretanto, esta
falta de paridade forma moléculas altamente instáveis, de vida média
muito curta, os radicais livres (OLSZEWER, 1995).
Os radicais livres (RL) são átomos ou moléculas que possuem um
ou mais elétrons não pareados na sua órbita externa, geralmente formado
pela perda ou ganho de elétrons (oxirredução) (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 2000). Em meio biológico a maioria das moléculas não se
encontram na forma de radicais, permanecendo com elétrons pareados,
entretanto em determinadas situações os RL, também denominados de
espécies reativas são formados e podem causar efeito fisiológico e
patológico (OLSZEWER, 1995; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000).
As espécies reativas é um termo coletivo que inclui as espécies
reativas de oxigênio (ERO
S
), bem como outras espécies reativas, como,
75
por exemplo, de nitrogênio (ERN
S
) (Tabela 4). Reativo não é sempre um
termo apropriado uma vez que H
2
O
2
, O
2
•-
e óxido nítrico (NO
•
) reagem
diretamente com poucas moléculas no corpo humano, enquanto
•
OH pode
reagir com qualquer molécula (HALLIWELL, 2001).
TABELA 4. PRINCIPAIS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E NITROGÊNIO
NAS FORMAS DE RADICAIS E NÃO RADICAIS.
FONTE: HALLIWELL (2001).
O oxigênio molecular (O
2
) em seu estado fundamental é um bi-
radical, contendo dois elétrons desemparelhados em seu orbital mais
externo (estado este também conhecido como triplete). Entretanto, estes
dois elétrons desemparelhados apresentam spins de mesma orientação,
tornando o O
2
uma molécula pouco reativa, podendo reagir com apenas
um elétron por vez. Por outro lado, se um dos dois elétrons
desemparelhados for excitado e mudar sua orientação de spin, o
Espécies reativas de oxigênio (ERO
S
)
Radicais Não Radicais
Superóxido (O
2
• -
)
Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
Hidroxil (
•
OH) Ácido hipocloroso (HClO)
Peroxil (RO
2
•
) Ácido hipobromoso (HOBr)
Alcoxil (RO
•
) Ozônio (O
3
)
Hidroperoxil (HO
2
•
) Oxigênio Singleto (
1
O
g
)
Espécies reativas de nitrogênio (ERN
S
)
Radicais Não Radicais
Óxido nítrico (NO
•
) Peroxinitrito (ONOO
-
)
Dióxido de nitrogênio (NO
2
•
) Alquil peroxinitrito (ROONO)
76
resultado será uma espécie altamente oxidante conhecida como oxigênio
singlete, capaz de reagir com outros pares de elétrons, especialmente
duplas ligações. Os radicais estão sempre procurando por um outro
elétron com o qual eles possam formar pares. Alguns radicais, como o
radical hidroxila, reagem com a maioria das moléculas próximas ao seu
sítio de formação, reagindo quase que a cada colisão (10
10
M
-1
s-1).
Entretanto, outras espécies são menos reativas ou ainda, muito pouco
capazes de reagir devido a sua alta estabilidade, como o radical
trifenilmetila, capaz até de se manter num tubo de ensaio.
2.6.2 Sistema de Defesa Antioxidante
As células são capazes de se defender contra os efeitos deletérios
das EROs por mecanismos de defesa antioxidante. Em organismos
aeróbios saudáveis, os níveis de EROs estão em equilíbrio com o sistema
de defesa antioxidante. Entretanto, o desbalanço metabólico entre a
produção de EROs e o sistema de defesa antioxidante caracteriza o
estresse oxidativo celular. Esse desequilíbrio pode ser causado pelos
seguintes fatores: (i) diminuição da defesa antioxidante causada por
mutações nas enzimas de defesa; (ii) diminuição da ingestão de vitaminas
e outros constituintes na dieta; (ii) aumento da produção de EROs
causada por fatores ambientais como, por exemplo, fumo, radiação
(ultravioleta, raios X etc.); (iii) excesso de atividade física; (iv) ingestão de
gorduras; (v) consumo de álcool; (vi) estresse físico e mental; (vii)
inflamações e infecções, entre outros. O sistema antioxidante de um
77
organismo pode ser didaticamente dividido em enzimático e não
enzimático (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000).
2.6.2.1 Sistema Antioxidante Enzimático
Como parte do sistema de defesa antioxidante enzimático, pode-se
citar as enzimas: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa
peroxidase (GPx).
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas por meio
da redução parcial do oxigênio até a água através de sucessivas reações.
A transferência de um elétron para o O
2
produz o primeiro intermediário
reativo, o ânion superóxido (O
2
•-
) (Equação 01), catalisada pela enzima
superóxido dismutase (SOD), o qual sofre dismutação espontânea a
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), que não é um RL (Equação 02). O H
2
O
2
sofre uma reação de quebra das ligações entre os átomos de O
2
formando
o radical hidroxil (
•
OH), catalisada por metais de transição (reação de
Fenton) (Equação 03), ou pela combinação do O
2
•-
com o H
2
O
2
(Haber-
Weiss) (Equação 04), (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000).
H
2
O
2
+ O
2
•
-
OH• + OH- + O
2
(04)
78
SOD
O
2
+ e
-
O
2•
-
(0 1)
Fe
2+
/Cu
+
+ H
2
O
2
OH• + OH
-
+ Fe
3+
/Cu
2+
(03)
Fe/Cu
SOD
2 O
2•
-
+ 2H+ H
2
O
2
(02)
A catalase (CAT) é uma hemoproteína, presente na maior parte
dos tecidos e age removendo tanto o H
2
O
2
gerado pela redução de dois
elétrons do O
2
, quanto indiretamente pela dismutação do O
2
•-
(via SOD).
Essa enzima apresenta-se ligada em organelas denominadas
peroxissomos e é específica para H
2
O
2
, não apresentando atividade para
hidroperóxidos orgânicos, como descrito na Equação 05 (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 2000).
(05)
Segundo Raggi (1998), a glutationa peroxidase (GPx) pode ser
considerada fundamental no metabolismo do peróxido de hidrogênio,
peróxidos orgânicos, bem como EROs, pois age como doadora de
elétrons nas reações catalisadas e dessa forma, ela protege as células
dos danos causados pelas espécies reativas de oxigênio. Essa enzima
está presente tanto em células animais, quanto de plantas e bactérias,
sintetizando intracelularmente a partir do ácido glutâmico, cisteína e
glicina. Desempenha um papel importante em muitos processos
biológicos, entre eles, a síntese de proteínas e de DNA, como cofator de
várias enzimas, na proteção celular contra agentes ionizantes e
compostos exógenos e, principalmente, contra as EROs.
Segundo Nepomuceno et al. (1999) o organismo está sujeito a
reações de desequilíbrio que levam a formação de radicais livres, que por
sua vez podem provocar vários danos celulares como a degeneração de
79
CAT
H
2
O
2
+ H
2
O
2
2 H
2
O + O
2
membranas lipídicas. Para impedir ou equilibrar esse tipo de dano celular,
o organismo tem a proteção de enzimas endógenas já citadas
anteriormente (como superóxido dismutase, glutationa peroxidase e
catalase) capazes de catalisar reações para inativação de radicais livres.
Muitas vezes, ocorre grande desequilíbrio entre a produção e a inativação
de radicais livres, seja pela queda na capacidade do sistema enzimático
ou pelo excesso de produção de espécies reativas ao oxigênio (ERO
S
).
Nesses casos, o organismo encontra-se em situação de estresse
oxidativo (HALLIWELL, 2001). Segundo Aruoma (1994), o estresse
oxidativo está envolvido na incidência de doenças degenerativas como
Parkinson e Ahlzeimer que surgem com a idade.
Os radicais livres podem provocar também modificações nas
proteínas celulares, resultando em sua fragmentação, cross linking,
agregação e, em certos casos, ativação ou inativação de certas enzimas
devido à reação dos radicais livres com aminoácidos constituintes da
cadeia polipeptídica. A reação de radicais livres com ácidos nucléicos
também foi observada, gerando mudança em moléculas de DNA e
acarretando certas aberrações cromossômicas. Além destes efeitos
indiretos, há a ação tóxica resultante de altas concentrações dos íons
superóxido e peróxido de hidrogênio na célula (HALLIWELL et al., 1995).
2.6.2.2 Sistema Antioxidante Não Enzimático
Existem várias moléculas que podem agir como antioxidantes
celulares através de diferentes mecanismos. Algumas destas moléculas,
80
como o β-caroteno e o licopeno podem atuar como supressores de
oxigênio singlete e de OH
•
e muitas impedindo a fase de propagação no
processo de lipoperoxidação (KEKRER 1993).
O β-Caroteno e o licopeno são carotenóides que exercem funções
antioxidantes nas fases lipídicas, através da supressão de radicais livres,
como ânion superóxido (O
2
•-
), radical hidroperoxila (HO
2
•-
) e o radical
hidroxila (OH
•
). Normalmente, os carotenóides são conhecidos por esta
função antioxidante, contudo, podem também diminuir a formação de
oxigênio singlete reagindo diretamente com ele e liberando energia na
forma de calor.
Por sua vez, o α-tocoferol (vitamina E) interrompe a abstração de
hidrogênio neste processo, agindo assim como supressor de radicais
peroxila e alcoxila. Entretanto, sua maior ação antioxidante reside na sua
eficiente propriedade de suprimir radicais peroxila (ROO
•
) das porções
lipídicas de membranas biológicas, interrompendo assim, a reação em
cadeia da lipoperoxidação. Inúmeros são os trabalhos relatando que o α-
tocoferol pode atenuar o estresse oxidativo, principalmente por proteger
membranas contra a lipoperoxidação. Por este fato, é uma vitamina
amplamente utilizada tanto como suplemento oral, como em produtos de
uso tópico, para a prevenção de doenças. Além da biotransformação que
pode ocorrer durante a digestão, outros fatores como a composição da
dieta, podem interferir na biodisponibilidade dos suplementos
administrados por via oral. A vitamina E, por ser uma molécula
lipossolúvel, necessita de ingestão concomitante de gordura para que
81
seja absorvida, e assim possa atuar na pele (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 2000).
Existem também as moléculas responsáveis por quelar metais.
Quanto à solubilidade, estas moléculas podem ser divididas em dois
grupos: lipossolúveis e hidrossolúveis, o que assegura à célula, defesas
antioxidantes tanto no citossol quanto nas membranas celulares. Dentre
as vitaminas hidrossolúveis que compõem o sistema antioxidante não
enzimático, a vitamina C, é sem dúvida, uma das mais conhecidas por
sua freqüente utilização em cosméticos.
2.6.3 Peroxidação Lipídica
O processo de oxidação lipídica em alimentos envolve uma reação
em cadeia de radicais livres que é geralmente inicializada pela exposição
dos lipídeos à luz, calor, radiação ionizante e íons metálicos como
catalisadores. As enzimas lipooxigenases podem também iniciar a
oxidação. A rota clássica de oxidação inclui reação de iniciação (produção
de radicais livres lipídicos) (Equação 06), propagação (Equação 07 e 08)
e terminação (produção de compostos não radicais) (Equação 09)
(SHAHIDI e NACZK, 2004).
Iniciação RH R• + H• (06)
Propagação R• + O
2
ROO• (07)
ROO• + RH R• + ROOH (08)
Terminação R• + R•
82
R• + ROO• produtos não radicais (09)
ROO• + ROO•
2.6.4 Mecanismo de Ação dos Antioxidantes Fenólicos
Os antioxidantes fenólicos interferem na oxidação lipídica pela
rápida doação de um átomo de hidrogênio aos radicais lipídicos. O
antioxidante (AH) funciona removendo os radicais livres (R• ou ROO •). A
reação direta do antioxidante com o substrato R• parece ser menos
importante que a reação com o radical peroxil (ROO • ) (Equação 10 e
11).
R• + AH `RH + A• (10)
ROO • + AH ROOH + A• (11)
Outro mecanismo possível é a reação entre o radical peroxil e o
antioxidante, formando o complexo (ROO • AH) que pode então reagir
com outro radical adicional (Equação 12).
ROO• + AH (ROO•AH) (12)
Os compostos fenólicos se incluem principalmente na categoria
de seqüestradores de radicais livres, ainda que também possam exercer
sua ação antioxidante através de outros mecanismos, como quelantes de
íons metálicos que catalisam reações de oxidação. Estes compostos
interferem na oxidação dos lipídeos e de outras moléculas por uma rápida
doação de um átomo de hidrogênio aos radicais livres. Os radicais
fenóxidos formados são intermediários bastante estáveis (ressonância
83
com o anel benzênico) e dificilmente iniciam uma nova reação em cadeia
em função da falta de sítios ativos para o ataque do oxigênio molecular.
Estes radicais intermediários fenóxidos atuam reagindo com outros
radicais livres, culminando com a terminação das reações de propagação
(SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
Os três principais mecanismos que podem suprimir a formação de
radicais livres são antioxidantes, sequestrantes de radicais livres e
quelantes. Antioxidantes e sequestrantes de radicais livres são
usualmente considerados sinônimos, embora nem sempre o sejam. Por
exemplo, etanol é um seqüestrante de radicais hidroxil, mas nunca foi
considerado um antioxidante. Antioxidante é o termo mais antigo, que no
início foi aplicado para a descrição de inibidores de processos oxidativos,
os quais eram capazes de reagir com radical peroxil. Agora, este termo é
aplicado a todos os inibidores de radicais livres. Em adição aos
antioxidantes diretos, há dois outros grupos importantes de inibidores de
radicais livres, as enzimas antioxidantes e os compostos que possuem
propriedades antioxidantes indiretas (DENISOV e AFANAS, 2005).
Inibidores de radicais livres suprimem a formação do radical,
reagindo com os mesmos e formando novos radicais inativos (Figura 23)
ou quelando cataliticamente metais de transição ativos e formando
complexos inativos (PIETTA, 2000) (Figura 24).
84
FIGURA 23 – ESQUEMA DE SEQÜESTRO DE EROS (R) POR
FLAVONÓIDES (FL)
FONTE: PIETTA (2000).
FIGURA 24 – SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE METAIS EM FLAVONÓIDES
FONTE: PIETTA (2000).
A eficiência dos compostos polifenólicos como antioxidantes
depende, em grande parte, de sua estrutura química. O fenol por si só é
inativo como antioxidante, entretanto, os compostos orto e para-
difenólicos possuem atividade antioxidante, a qual é aumentada com a
85
FL - OH
FL – O•
substituição de seus átomos de hidrogênio por grupos etila- ou n-butila e
a atividade antioxidante dos ácidos fenólicos e seus ésteres depende do
número de grupos hidroxila na molécula (FUKUMOTO e MAZZA, 2000;
SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
Os compostos fenólicos são mais efetivos em estender o período
de indução quando adicionado ao óleo ainda não deteriorado. Entretanto
eles são ineficientes em retardar a decomposição de lipídeos já
deteriorados. Desta forma, os antioxidantes devem ser adicionados aos
alimentos tão cedo quanto possível para se conseguir a máxima proteção
contra a oxidação (SHAHIDI e NACZK, 2004).
Muitos estudos têm sido realizados para estabelecer a relação
entre a estrutura de flavonóides e sua atividade de seqüestro de radical.
Segundo Bors et al. (1999), os principais determinantes para a
capacidade de seqüestro de radical são: 1) a presença de
aumentar a estabilidade do radical aroxil. Assim os flavonols e flavonas,
contendo o grupo catecol no anel B, são mais ativos.
FIGURA 25 - ESTRUTURA DO FLAVONOL QUERCETINA MOSTRANDO
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES NA DEFINIÇÃO
DE POTENCIAL ANTIOXIDANTE CLÁSSICO DOS
FLAVONÓIDES.
FONTE: WILLIAMS et al. (2004).
Entretanto, a presença do grupo 3-hidroxil nos flavonols os torna
mais potentes que as correspondentes flavonas. A glicosilação deste
grupo, como a rutina, reduz grandemente a capacidade de seqüestro de
radical. Flavanol e flavanonas, devido a perda da conjugação provida pela
dupla ligação 2,3 com o grupo 4-oxo, são fracos antioxidantes (PIETTA,
2000). A característica mais importante é a presença do grupo catecol ou
dihidroxil no anel B (marcado em amarelo). Outra importante
característica inclui a presença da insaturação no anel C (marcado em
vermelho) e a presença da função 4-oxo no anel C (marcado em verde).
87
O grupo catecol e outras funções podem também explicar a habilidade
dos flavonóides em quelar metais de transição como cobre e ferro
(marcado em azul) (Figura 25).
2.6.5 Antioxidantes Fenólicos Sintéticos
A aplicação de antioxidantes em alimentos é governada por
regulamentações federais. As regulamentações da FDA (Food Drug and
Administration) dos Estados Unidos e América do
oxidação de ácidos graxos de cadeia curta, tais como, os encontrados no
óleo de côco e de semente de palma. O BHT por ser um monofenol, pode
produzir radical intermediário com moderado deslocamento de sua
ressonância. Os grupos butílicos terciários do BHT não permitem
envolvimento do radical formado após a retirada do hidrogênio em outras
reações. Desta forma, um radical lipídico peroxil pode se ligar a molécula
de BHT na posição para do grupo fenoxil. A natureza volátil do BHA e
BHT os torna um importante aditivo em materiais de embalagens, porque
eles podem migrar para o alimento. Estes antioxidantes são diretamente
adicionados na forma de cera ou de emulsão na superfície interna das
embalagens e possuem efeito sinergístico quando usados em
combinação (PORTER, 1993).
FIGURA 26 – ESTRUTURA QUÍMICA DO BUTILIHIDROXIANISOL
(BHA) (a) E BUTILIHIDROXITOLUENO (BHT) (b).
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004).
Os antioxidantes fenólicos sintéticos são baratos e apresentam
grande atividade. No entanto, em doses elevadas podem interferir com a
saúde do consumidor (SORTWELL, 1995; SOARES et al., 2003). Os
principais alvos de toxicidade do BHT são os pulmões, o fígado e as
89
a)
b)
células sanguíneas (BANNWART e TOLEDO, 1999). Segundo Williams et
al. (1999), o BHT em concentrações elevadas aumenta a promoção de
tumores. Pode também promover o desenvolvimento de adenomas e
carcinomas hepatocelulares em ratos (VERHAGEN et al., 1989). O galato
de propila (PG) pode causar dermatite de contato nas pessoas que o
manuseiam (WERTZEN, 1990; SHAHIDI e WANASUNDARA, 1992).
Atualmente, com a busca cada vez maior por produtos naturais e
com a crescente utilização de compostos antioxidantes em terapias
preventivas nas doenças nas quais os radicais livres estão implicados, os
produtos naturais, como vitaminas e flavonóides, têm merecido atenção
especial (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000).
2.6.6 Antioxidantes Fenólicos Naturais
A partir do início dos anos 80, o interesse em encontrar
antioxidantes naturais para o emprego em produtos alimentícios ou para
uso farmacêutico, tem aumentado consideravelmente, com o intuito de
substituir antioxidantes sintéticos, os quais têm sido restringidos devido ao
seu potencial de carcinogênese, bem como pela comprovação de
diversos outros males como: aumento do peso do fígado e significativa
proliferação do retículo endoplasmático (YILDIRIM et al., 2001; ZHENG e
WANG, 2001; MELO e GUERRA, 2002).
Os antioxidantes em alimentos podem ser originários de compostos
que ocorrem naturalmente nos alimentos ou substâncias formadas
90
durante o seu processamento (SHAHIDI e WANASUNDARA, 1992).
Antioxidantes naturais são compostos fenólicos ou polifenólicos que
podem ocorrer em todas as partes da planta. Esses compostos são
multifuncionais e podem agir como agentes redutores (terminadores de
radicais livres), quelantes de metais e receptores do oxigênio singlete. Os
antioxidantes fenólicos de plantas mais comuns são os flavonóides,
derivados de ácido cinâmico, cumarinas, tocoferóis e ácidos orgânicos.
Como fonte de antioxidante natural pode citar as frutas, sementes, soja,
óleos, chás, ervas, vinhos e especiarias entre outras (MINUSSI et al.,
2003).
O β-caroteno é considerado um potente antioxidante natural, é
solúvel em óleos e/ou gorduras e protege da oxidação lipídica. Atua
eficientemente como atenuador físico, dissipando a energia extra contida
no oxigênio singlete, tido como forte agente mutagênico em razão da
peroxidação de lipídeos.
Os tocoferóis são importantes antioxidantes biológicos. Os tipos e
sua ocorrência natural diferem entre si no grau de substituição do anel
aromático e possuem cadeia lateral isoprenóide (C
16
) saturada.
Dependendo da posição dos grupos metil no anel, os tocoferóis são
denominados alfa, beta, gama e sigma (Figura 27).
91
FIGURA 27 – ESTRUTURA QUÍMICA DO α – TOCOFEROL
FONTE: SHAHIDI e NACZK (2004).
Os vegetais contêm quantidades consideráveis de diferentes
tocoferóis na sua fração lipídica. Cereais e produtos de cereais, óleos,
amêndoas e vegetais são fontes de tocoferóis, porém no reino animal os
tocoferóis são encontrados somente em quantidades ínfimas. Alfa-
tocoferol ou vitamina E previne a oxidação do corpo lipídico incluindo
ácidos graxos poliinsturados e componentes lipídicos de células e
organelas das membranas (SHAHIDI e NACZK, 2004).
Os tocoferóis são produzidos em escala comercial e usados como
antioxidante em alimentos. A atividade antioxidante do tocoferol é
baseada principalmente no sistema redox da molécula de tocoferol a
tocoferil quinona. Os tocoferóis são seqüestradores de radicais lipídicos.
Os flavonóides e ácidos cinâmicos são conhecidos como
antioxidantes primários e agem como aceptores de radicais livres e
separadores das cadeias. Os flavonols são conhecidos como quelante de
íons metálicos. Um grupo o-quinol no anel B pode também demonstrar
atividade queladora de metal (PRAT e HUDSON, 1990).
Segundo SHAHIDI e NACZK (2004), a atividade antioxidante dos
ácidos fenólicos e de seus ésteres depende do número de grupos hidroxil
na molécula e, os ácidos cinâmicos hidroxilados são mais efetivos do que
os ácidos benzóicos.
92
2.7 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE IN VITRO
Devido ao reconhecimento dos efeitos maléficos dos radicais livres
a procura por substâncias que possam atenuar ou mesmo impedir suas
ações, assim como os métodos para avaliar o potencial antioxidante
dessas substâncias vem crescendo a cada dia (NIKI, 2002).
Uma variedade de métodos está correntemente sendo utilizada
para se determinar a capacidade antioxidante. De um modo geral, os
efeitos antioxidantes das substâncias podem ser mensurados por meio de
sistemas químicos e biológicos, estes últimos podendo ser in vivo e in
vitro e todos têm suas próprias vantagens e limitações (KOLEVA et al.,
2002). Para ambos os sistemas são necessários estabelecer modelos de
indução da oxidação, selecionar o agente indutor do dano oxidativo e o
modo de se mensurar o efeito exercido pelo antioxidante. Porém,
segundo Niki (2002), deve-se ter em mente que não existe um método
universal simples pelo qual esta atividade possa ser medida de forma
precisa e quantitativa.
Segundo Antolovich et al. (2002), a atividade antioxidante de uma
substância não pode ser avaliada diretamente, mas por meio dos seus
efeitos sobre um substrato ou sistema passível de ser monitorado. A
maioria desses métodos utiliza processos oxidativos, os quais envolvem a
adição de um agente iniciador (temperatura, agitação ou pressão parcial
93
de oxigênio, metal de transição ou mesmo exposição à luz) para acelerar
o processo, e uma fonte de radicais livres específica. Esses radicais são
então oxidados sob condições padronizadas e o grau de oxidação, ou sua
extensão medido.
Entretanto, segundo Frankel e Meyer (2000), resultados
conflitantes podem ser obtidos quando se mede atividade antioxidante por
diferentes métodos, e podem ser relacionados a alguns fatores: a) a
estrutura física do sistema teste, b) a natureza do substrato para
oxidação, c) a presença de componentes que possuam interação, d) o
modo de iniciar a oxidação, e) o método analítico para medir a oxidação.
A influência de alguns fatores tem sido elucidada em sistemas modelo
simples, mas o efeito em sistemas heterogêneos complexos como um
alimento ou o corpo humano não é simples de se estimar e, desta forma,
há a necessidade de se padronizar protocolos para avaliar os efeitos
antioxidantes (FRANKEL e MEYER, 2000).
Becker et al. (2004) propuseram um protocolo com quatro passos
para a aplicação de antioxidantes em alimentos, que podem
posteriormente ser acrescidos para a avaliação dos benefícios a saúde. A
primeira etapa (I) sugere a quantificação e identificação de compostos
fenólicos no produto alimentício. A segunda etapa (II) tem como objetivo
avaliar
sistemas modelos relevantes. No entanto, a quarta etapa (IV) depende do
objetivo do estudo e pode ser subdividido em IV (a) e IV (b). A etapa IV
(a) é sugerido para aplicação em alimentos, onde experimentos de
estocagem são imperativos, enquanto o passo IV (b) é necessário para
avaliação dos efeitos antioxidantes da dieta no corpo humano, onde
estudos de intervenção são necessários.
Dependendo da especificidade de cada método para medir a
atividade antioxidante em substratos ou produtos podem-se gerar
variações nos resultados obtidos. Vários autores relatam que nem todos
os métodos de avaliação da atividade antioxidante fornecem os mesmos
resultados (FRANKEL et al. 1994; BRAND-WILLIANS et al., 1995;
KOLEVA et al. 2002; BECKER et al., 2004). Warner (1997), revendo as
limitações para a análise da atividade antioxidante, sugeriu que a mesma
seja medida usando-se mais de um método e que seja avaliado os
produtos de oxidação primária e secundária, por meio de testes que
meçam produtos ou substratos mais específicos. Entretanto, de uma
forma geral, os métodos de medida da atividade antioxidante podem ser
resumidos em diretos e indiretos.
2.7.1 Método Direto - Habilidade em inibir a oxidação de lipídeos em
sistemas modelo
A maioria das análises de medida da atividade antioxidante
consiste em acelerar a reação de oxidação em um sistema lipídico,
geralmente por aquecimento e monitoramento do oxigênio consumido,
95
com a perda de substrato ou a formação de um produto. A oxidação é
afetada por fatores como temperatura, pressão do oxigênio, metais,
composição e forma das gorduras, que podem causar variações nos
resultados dependendo das condições de oxidação usadas na análise
(FRANKEL et al., 1994).
A avaliação de antioxidantes em sistemas modelo deve ser
baseada nas mudanças de concentração dos compostos que estão sendo
oxidados, na depleção do oxigênio ou na formação de produtos de
oxidação. Os métodos do β-caroteno, TBARS e Rancimat são alguns
exemplos, apesar de apresentarem algumas limitações (BECKER et al.,
2004).
2.7.1.1 Paradoxo Polar
Em sistemas lipofílicos as taxas de reações de seqüestro podem
ser influenciadas pelo coeficiente de partição dos compostos fenólicos
entre a fase aquosa e lipídica, e dessa forma, reduzir a reação dos
fenólicos polares com o radical não-polar
(RICE-EVANS et al.,1996). A
habilidade em quelar metais e de reagir com o radical α-tocoferol,
regenerando-o, são mecanismos possíveis que tornam os flavonóides
capazes de aumentar a estabilidade dos ácidos graxos (SHAHIDI et al.,
1992; RICE-EVANS et al., 1996).
A atividade dos diferentes tipos de antioxidantes pode variar
significativamente dependendo se os lipídeos são triacilgliceróis, metil
96
ésteres, ácidos graxos livres ou incorporados em várias partículas
biológicas tais como, lipoproteínas ou microssomos do fígado. Se os
antioxidantes agem em meio aquoso é importante levar em consideração
o tipo de substrato, ou seja, se é óleo puro ou sistemas heterofásicos. A
estabilidade oxidativa da maioria dos colóides e óleos em alimentos é
extremamente afetada por uma grande variedade de substâncias ativas
na superfície e de sua interação interfacial com os oxidantes e
antioxidantes (FRANKEL, 1998).
Entretanto, segundo Frankel e Meyer (2000), a proteção relativa
proporcionada por diferentes antioxidantes depende do tipo de substrato,
por exemplo, fosfolipídeos, triacilgliceróis ou ácidos graxos livres, o grau
de insaturação dos ácidos graxos bem como a estrutura do substrato
oxidável. Em alimentos, as emulsões apresentam duas fases: óleo e
água. Se a água é a fase contínua e o óleo a fase dispersa, a emulsão é
do tipo óleo em água (O/A), por exemplo, o leite. No caso inverso, a
emulsão é do tipo água em óleo (A/O), como no exemplo da manteiga.
Em sistemas multifases, a eficiência do antioxidante é grandemente
afetada pelas propriedades de solubilidade, que determinam à distribuição
dos compostos nas diferentes fases, incluindo a localização e orientação.
Porter (1980) foi o primeiro a observar estas propriedades e descobriu
que antioxidantes solúveis em água (antioxidantes polares) tendem a ser
mais ativos do que antioxidantes solúveis em lipídeos (antioxidantes
apolares) quando testados em óleo puro. Ao contrário, antioxidantes
97
solúveis em lipídeos tendem a apresentar uma maior proteção para uma
emulsão óleo em água do que os antioxidantes solúveis em água.
Segundo Huang et al. (1996), os antioxidantes hidrofílicos como o
Trolox (ácido carboxílico derivado do α-tocoferol), o ácido ascórbico, o
ácido rosmarínico e o ácido carnosico (compostos presentes no alecrim)
apresentaram maior atividade antioxidante em óleos puros do que os
antioxidantes lipofílicos como o α-tocoferol, o ascorbil palmitato e o
óleo e na interface óleo/água onde eles são mais protetores do que os
antioxidantes hidrofílicos. Esses antioxidantes hidrofílicos são
porcionados na fase aquosa e não são capazes de proteger
adequadamente os lipídeos na interface óleo/água. Quando dissolvidos
na fase aquosa, os antioxidantes hidrofílicos podem tornar-se prooxidante
resultante de uma redução de metais.
A partição de antioxidantes entre as fases óleo e água ocorre em
diferentes extensões, de acordo com a polaridade e estrutura química. O
conhecimento da partição e efetiva atividade antioxidante de compostos
fenólicos naturais, em sistemas heterofásicos, são limitados e governados
pela estrutura química destas substâncias (RICE-EVANS et al., 1996).
99
AR
ÓLEO PURO
AR
Hidrofílicos > Lipofílicos
Interface óleo/ar
Devido a insolubilidade
Mais Protetores
Muito diluídos na
fase óleo
Lipofílicos > Hidrofílicos
Interface óleo/água
Devido a atividade
de superfície
Mais Protetores
Muito diluídos na
fase água
EMULSÃO ÓLEO EM ÁGUA
Óleo
ÁGUA
FIGURA 28 - DISTRIBUIÇÃO INTERFACIAL DE ANTOXIDANTES
LIPOFÍLICOS E HIDROFÍLICOS EM ÓLEO PURO
COMPARADO A EMULSÕES ÓLEO EM ÁGUA.
FONTE: FRANKEL e MAYER (2000).
2.7.1.2 Método da Lipoperoxidação pelo TBARS
O método TBARS é um dos mais utilizados para estudos de
peroxidação lipídica. A avaliação da peroxidação lipídica é realizada pela
detecção dos seus derivados lipoperóxidos, por meio de substâncias que
reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), como o malondialdeído,
produzindo uma base de Shiff de coloração rosa (OHKAWA, 1979; BIRD
e DRAPER, 1984). É um método simples e sensível para mensuração da
peroxidação lipídica, embora não seja muito específico (MEAGHER e
FITZGERALD, 2000).
Segundo Chen e Tappel (1996) o método de avaliação da
proteção a lipoperoxidação pelo ensaio com o TBARS in vitro é utilizado
para avaliar a inibição da peroxidação lipídica provocada por um pró-
oxidante, peróxido de terc-butila, que causa dano oxidativo em
homogenato de fígado. Yagi (1987) já relatava em seus estudos de
peroxidação lipídica, concentração elevada de malondealdeído, produto
final da peroxidação lipídica em tecidos cancerígenos quando comparado
a tecidos normais.
100
Rebello (2005) avaliou a atividade antioxidante e antifúngica de
análogos sintéticos da acetofenona e pró-oxidante e antitumoral de
chalconas sintéticas, utilizando modelos in vitro e in vivo. A avaliação da
atividade pró e antioxidante in vitro foram investigadas pelos métodos de
captação do radical DPPH e pela medida de proteção da lipoperoxidação
(TBARS). Neste estudo foi detectada uma relação dose-dependente para
o controle rutina e também para alguns análogos sintéticos da
acetofenona.
2.7.1.3 Método do β-caroteno-ácido linoleico
Este ensaio baseia-se na perda de cor do β-caroteno durante sua
cooxidação com o ácido linoléico em uma emulsão aquosa, monitorada
com o decaimento da absorbância na região visível (MILLER, 1971). O
ensaio quantifica a atividade antioxidante como porcentagem de inibição.
Em princípio, o ensaio poderia ser mais quantitativo e reproduzível se o
regime de cooxidação fosse transformado em um regime de controle da
reação em cadeia.
Os métodos baseados na oxidação podem ser facilmente
realizáveis dependendo das circunstâncias usadas, visto que no método
do descoloramento do β-caroteno; o β-caroteno reage com os radicais
livres dos compostos. O método é amplamente usado para avaliar a
atividade antioxidante de vários tipos de amostras, tais como, compostos
puros (ABDALLA et al., 1999), extratos de plantas (DAPKEVICIUS et
101
al.,1999), grãos, frutas, vegetais e outros tipos de alimentos (KANNER et
al., 1994; VELIOGLU et al., 1998).
Marco (1968) descreveu o uso do método de descoloramento do
β-caroteno para avaliar os compostos bioativos com ação antioxidante.
Neste método a atividade antioxidante é medida pela habilidade de um
composto em minimizar a perda do β-caroteno durante a oxidação
acoplada do ácido linoléico e β-caroteno em um sistema aquoso
emulsificante. A reação é inicializada usando aquecimento (50°C) e,
embora o método seja simples e sensível, foi criticado por Frankel et al.
(1994) por ser inespecífico, sendo sujeito à interferência da oxidação e
agentes redutores nos extratos brutos, além do ácido linoléico não ser um
representante típico dos lipídeos em alimentos.
A atividade antioxidante pelo método do β-caroteno é baseada na
perda da coloração amarela do β-caroteno em função da reação com os
radicais formados pela oxidação do ácido linoleico na emulsão. O
descoloramento do β-caroteno, medido pelo decréscimo na absorbância
inicial a 470 nm, é mais lento na presença de um antioxidante. Este
método é sensível devido a forte absorção do β-caroteno, porém é mais
lento que o método do DPPH (KOLEVA et al, 2002). Os reagentes são
comuns e não há um tratamento especial prévio com a amostra,
entretanto, é necessário usar nitrogênio para evaporação do solvente e na
preparação da emulsão para se conseguir resultados reprodutíveis.
O método do β-caroteno emprega um emulsificante lipídico, o qual
introduz um grande número de variáveis que influenciam a oxidação em
102
comparação aos lipídeos puros. Neste método o complexo fenômeno
interfacial chamado de paradoxo polar influencia o comportamento dos
antioxidantes. Neste caso os antioxidantes apolares exibem fortes
propriedades antioxidativas em emulsões porque eles estão concentrados
na superfície lipídeo/ar e desta forma asseguram uma maior proteção. Por
outro lado, os antioxidantes polares restantes na fase aquosa estão mais
diluídos e são desta forma, menos efetivos para proteger o lipídeo. O
oposto é observado em óleos puros (KOLEVA et al., 2002).
Segundo Roedig-Penman e Gordon (1998), a presença de certos
sais metálicos pode resultar no comportamento pro-oxidante de
flavonóides. E se estes sais metálicos estão presentes na planta eles
podem estar dissolvidos na fase aquosa e desta forma podem inibir a
atividade dos antioxidantes ou serem convertidos a pro-oxidantes.
Segundo Koleva et al. (2002), a atividade antioxidante medida pelo
método do β-caroteno em extratos de Sideritis Labiatae da Bulgária, BHT
e ácido rosmarínico apresentaram certa concordância com o fenômeno
paradoxo polar. Os inibidores mais ativos do descoloramento do β-
caroteno foram principalmente os extratos apolares. A maioria dos
extratos mais polares como metanol, acetato de etila e 1-butanol exibiram
atividade menor e próxima do ácido rosmarínico. Neste estudo os extratos
aquosos de Siderintis mostraram efeito pro-oxidante (atividade negativa).
Entretanto, segundo Prat e Hudson (1990), em alguns casos, as
características estruturais do antioxidante, como a localização dos grupos
hidroxilas parece ser mais importante do que a polaridade dos extratos
103
em si. Além disso, a composição complexa dos extratos pode provocar
algumas interações como, efeito sinergístico, aditivo ou antagônico entre
seus componentes e/ou o meio em que eles se encontram. Isso pode
afetar também seu porcionamento nas fases do sistema. Neste sentido,
Pekkarinen et al. (1999) salientam que o porcionamento dos antioxidantes
nas diferentes fases da emulsão parece afetar a atividade antioxidante,
embora ela não seja proporcional à concentração do antioxidante na fase
lipídica ou na interface.
A atividade antioxidante pelo método do β-caroteno pode ser útil
especialmente na investigação de antioxidantes lipofílicos como os óleos
essenciais. Por outro lado, se compostos polares forem testados apenas
pelo método do β-caroteno pode-se correr o risco de subestimar a
atividade antioxidante desses compostos. Dessa forma, é necessário o
uso de outros métodos como o método do DPPH* que independe da
polaridade do substrato.
2.7.2 Método Indireto - Seqüestro de radical
Os radicais livres estão envolvidos na propagação da oxidação
lipídica e muitas espécies de diferentes reatividades são formadas como o
•
OH, O
2
•-
⋅
, ROO•, RO•, etc. Muitas vezes, alguns radicais relativamente
estáveis são preferidos na análise de seqüestro desses radicais livres,
como por exemplo o ABTS
+
(2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico) e o DPPH• (2,2 difenil-1-picrilhidrazina). Ambos apresentam
uma excelente estabilidade em certas condições, mas também
104
apresentam importantes diferenças em suas respostas antioxidantes e em
sua manipulação (BRAND-WILLIANS et al., 1995; ARNAO, 2000).
O método de seqüestro de radical opera pela medida direta da
doação do átomo de hidrogênio ou transferência de elétron de um
antioxidante em potencial a moléculas do radical livre em sistemas livres
de lipídeos. Entretanto, esses métodos necessitam de substratos de
oxidação, e não refletem a situação in vivo ou a peroxidação em
alimentos (ARNAO, 2000; BECKER et al., 2004).
2.7.2.1 Método do ABTS
+
(2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico)
O método ABTS+ foi primeiramente sugerido por Rice-Evans et
al.(1994) para avaliar amostras biológicas e, então foi amplamente
aplicado no estudo de alimentos e fenólicos naturais solúveis em água. O
princípio do método consiste em monitorar o decaimento do radical ABTS
produzido pela oxidação do 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico) (ABTS), causada pela adição de uma amostra contendo
fenólicos. O ABTS absorve na faixa de 600–750 nm e pode ser facilmente
determinado por espectrofotometria. Na ausência de fenólicos, o ABTS é
estável, mas ele reage energeticamente com um doador de H, como os
fenólicos, sendo então convertido em uma forma incolor de ABTS. Os
autores determinaram que a quantidade de ABTS consumida está
relacionada à reação com os fenólicos presentes na amostra, a qual é
expressa em equivalentes Trolox (unidades de concentração). Este valor
105
foi designado TEAC, sigla em inglês para capacidade antioxidante
equivalente ao Trolox. Como o TEAC para o Trolox foi definido como
sendo 1, o valor TEAC para um antioxidante individual é o número de
radicais ABTS consumidos para cada molécula de antioxidante (CAMPOS
e LISSI, 1997). Suas principais limitações são: o valor TEAC caracteriza a
capacidade da amostra estudada em reagir com o ABTS, mais do que
sua capacidade de inibir o processo oxidativo; a reação com o ABTS
ocorre de forma lenta com vários fenólicos e amostras de produtos
naturais (CAMPOS et al., 1996); o resultado da determinação do TEAC
depende do tempo de incubação, assim como a razão entre a quantidade
de amostra e a concentração do radical; além da pequena seletividade do
ABTS na reação com doadores de H é mais uma limitação do método
(ARTS et al., 2004).
2.7.2.2 Método do radical DPPH• (2,2 difenil-1-picrilhidrazina).
O radical estável orgânico DPPH• é amplamente usado para avaliar
a atividade antioxidante em compostos simples (BRAND-WILLIAMS et
al.,1995), extratos de plantas (YEN e DUH, 1994) e alimentos
(YAMAGUCHI et al., 1998). Nos últimos anos, o DPPH tem sido usado
para testar a capacidade de seqüestrar o radical livre em produtos da
apicultura, como o pólen (CAMPOS et al., 2003; SILVA et al., 2006; LEJA
et al., 2007), própolis (KUMAZAWA et al., 2004) e mel (MEDA et al.,
2005). Esse radical é muitas vezes preferido na análise de seqüestro de
106
radicais livres em função da sua rapidez e simplicidade (KOLEVA et al.,
2002; LU et al., 2003).
Esse método é baseado na redução de soluções alcoólicas de
DPPH• a 517 nm na presença de um antioxidante doador de hidrogênio
(AH), devido a formação de um não radical (DPPH-H) (Equação 13).
O DPPH remanescente na reação após certo tempo corresponde
inversamente à atividade de seqüestro do antioxidante que compõe a
matriz. Esse método permite testar substâncias lipofílicas e hidrofílicas, ou
seja, independe da polaridade do substrato (KOLEVA et al., 2002).
Yamaguchi et al. (1998) sugeriram que a lipofilicidade e hidrofilicidade dos
antioxidantes não afetam as reações com o DPPH, uma vez que foi
observada similaridade entre as atividades de seqüestro de radicais livres
do Trolox e α-tocoferol.
Pode-se verificar pela estrutura do DPPH (Figura 29), que o
composto pode aceitar um elétron ou radical hidrogênio para se tornar
uma molécula estável, que apenas raramente pode ser oxidada
irreversivelmente (BLOIS, 1958). O radical livre DPPH• na presença de
um antioxidante doador de hidrogênio pode ser reduzido em meio
alcoólico, formando difenil picrilhidrazina (KOLEVA et al. 2002).
107
DPPH-H + A•
DPPH• + AH
(13)
FIGURA 29 - REAÇÃO DO RADICAL LIVRE DPPH COM UMA MOLÉCULA
ANTIOXIDANTE
FONTE: BRAND-WILLIAMS et al. (1995).
Segundo Arnao (2000), o radical DPPH• é um cromóforo
extremamente estável que apresenta um pico de absorção no
comprimento de onda de 517 nm em meio metanólico e sua solução
possui uma coloração violeta intensa. Esta redução pode ser
acompanhada espectrofotometricamente em 517 nm, pela diminuição da
absorvância, com simultânea mudança de coloração violeta escura
original do radical para uma coloração amarela do produto reduzido,
descorando a medida que a reação se processa. Quanto maior a
atividade antioxidante, menor será a coloração violeta da solução, ou
seja, o DPPH• residual mensurado após certo tempo, corresponde
inversamente à capacidade antioxidante da substância analisada. A
intensidade dessa mudança de coloração é proporcional à concentração
das substâncias com potencial antioxidante presente, de conformidade
com as leis de Lambert e Beer (BLOIS, 1958). Conforme o DPPH vai
sendo reduzido por um antioxidante, seu elétron se torna emparelhado e
a absortividade desaparece (BRAND-WILLIANS et al., 1995).
Segundo Brand-Williams et al. (1995), o radical estável DPPH
gera resultado similar a um método de oxidação lipídica. Entretanto, não é
possível se fazer uma comparação quantitativa porque as reações com o
108
radical DPPH dependem da conformação estrutural dos compostos. Além
disso, há substâncias antioxidantes que reagem de forma particular com o
DPPH• implicando em uma cinética diferenciada. Entre eles existem
compostos que reagem lentamente, levando horas para reagir como o
guaiacol, BHT e BHA, os compostos de cinética rápida, que levam poucos
segundos como o ácido ascórbico e isogenol e os de cinética
intermediaria, com reações entre cinco e trinta minutos, como o alfa-
tocoferol e o ácido rosmarínico. Essas diferenças parecem ser
decorrentes não só de um impedimento esteárico (HOGG et al., 1961)
como também da presença e do número de hidroxilas existentes nessas
moléculas, as quais podem doar H
+
para estabilizar o radical livre.
Desta forma, quando se avalia a atividade antioxidante de extratos
de plantas, os quais são constituídos por uma variedade indefinida de
compostos com potencial antioxidante, torna-se imprescindível estudar o
comportamento nas condições experimentais em vários intervalos de
tempo, com o objetivo de determinar a cinética adequada de reação.
O resultado da atividade antioxidante pelo método do radical
estável DPPH• pode ser expresso de várias formas. Por exemplo, pode-
se expressar os resultados como a capacidade de seqüestrar/reduzir o
radical DPPH• em porcentagem (LU e FOO, 2000;CHOI et al., 2002), pelo
valor de EC
50
, ou seja, a quantidade de substância antioxidante
necessária para reduzir em 50% a concentração inicial do DPPH• e ainda
pelo poder antioxidante ou poder anti-radical, o qual expressa a relação
inversa do EC
50
(BRAND-WILLIANS et al., 1995).
109
2.8 ATIVIDADE BIOLÓGICA DO PÓLEN APÍCOLA
O pólen apícola ou produtos a base de pólen apícola tem
demonstrado várias aplicações benéficas à saúde humana. O pólen das
flores, fonte primária de alimentação das abelhas, contém compostos
fitoquímicos, nutrientes e são ricos em carotenóides, flavonóides e
fitosteróis (MIZRAHI e LENSKY, 1997). O pólen apícola tem ação
antimicrobiana, porém ele é mais conhecido por sua atividade
antioxidante.
Leja et al. (2007)
estudaram os constituintes fenólicos (fenólicos
totais, fenilpropanóides, flavonóis e antocianinas) de pólen apícola de 12
espécies diferentes da região da Krakow na Polônia. Neste estudo foi
encontrada uma grande variabilidade de compostos fenólicos nas
espécies investigadas e, na maioria dos pólens examinados a alta
atividade antioxidante estava relacionada ao nível de fenilpropanóides. A
participação dos flavonóides nos compostos fenólicos totais diferiu
consideravelmente em função da origem floral, de 4,78% (Lamium
purpureum) a 37,3% (Chamerion angustifolium).
Serra Bonvehi et al. (2001) verificaram no pólen apícola da
Espanha a presença de vários compostos antioxidantes (substâncias
polifenólicas e flavonóides). Neste estudo 15 compostos foram separados
por cromatografia líquida de alta eficiência com gradiente de fase reversa,
sendo que 13 foram identificados e quantificados usando detector de
110
arranjo de diodos. Os compostos predominantes foram flavonóides
glicosilados e principalmente flavonols. Vinte e oito porcento das amostras
continham pelo menos 14 tipos de compostos fenólicos, como por
exemplo rutina, quercetina, miricetina e ácido trans cinâmico.
A rutina é o melhor identificador de flavonóides agliconas livres.
Uma quantidade mínima de 200mg de rutina/kg de pólen é sugerida para
se garantir as propriedades nutriticionais e biológicas do pólen apícola,
bem como para a aceitação do mesmo pelo mercado Europeu (SERRA
BONVEHÏ et al., 2001).
Vários estudos sugerem que estes compostos têm importância na
redução da incidência de doenças degenerativas tais como câncer e
arteriosclerose (SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Os flavonóides tais
como o quercetina, rutina e apigenina demonstraram inibição de tumores
carcinogênicos induzidos em ratos. Estes compostos atraíram muita
atenção no campo da nutrição, saúde e da medicina, como resultado das
crescentes evidências que eles podem agir como potentes antioxidantes.
Por outro lado, uma dieta contendo grandes quantidades de lipídeos, os
quais geram radicais lipídicos ROO*, certamente aumentam a
carcinogênese do colo em ratos tratados com N-nitroso-N-methylurea.
Isto sugere promover o câncer ou o potencial carcinogênico dos radicais
ROO*. Desta forma, uma dieta rica em compostos seqüestradores de
radicais poderia reduzir a ação cancerígena dos radicais ROO* (WEI et
al., 1990; DESCHNER et al., 1991).
111
Os extratos de pólen apícola (Cernilton) têm sido usados com
menos evidência de sua eficácia para hiperplasia prostática benigna
(BPH). Em função da sobreposição de sintomas do trato urinário entre
BPH e a prostatite crônica, esse produto, sozinho ou em combinação foi
recomendado também para homens com prostatites. Cernilton, um extrato
do pólen da abelha, foi usado em condições prostática pel’g}
Em geral, e comparado aos vários alimentos, o pólen é rico em
proteínas, possui baixo teor em gordura e alto teor em minerais e
vitaminas. Desta forma, Bell et al. (1983), sugeriram que o pólen apícola
pode melhorar a alimentação materna sem afetar o desenvolvimento
normal do feto, por ser um nutriente prático e eficaz para as mulheres
durante a gravidez.
Altas quantidades de ácido fítico são encontradas em pólen
apícola. O ácido fítico é um antioxidante natural das plantas, e é,
encontrado em grãos, cereais, amêndoas e legumes. Dietas contendo
ácido fítico podem baixar a incidência do câncer de colo do útero e
proteger contra outras doenças inflamatórias (GRAF e EATON, 1990).
A ação inibitória de extratos de pólen apícola de cinco regiões
diferentes da Turquia contra os microrganismos Alternaria alternata e
Fusarium oxysporium f. sp. Melonis foi investigado por Özcan et al.
(2004). O efeito inibitório dos extratos desses pólens contra ambos os
microrganismos testados foi estatisticamente significativo (p< 0,01)
Recentemente, Basim et al. (2006) avaliaram a atividade
antibacteriana do pólen da Turquia contra treze bactérias fitopatogênicas
que causam várias pragas em frutas e vegetais como, Agrobacterium
tumefaciens, Agrobacterium vitis, Clavibacter michiganensis, Erwinia
amylovora, Xanthomonas vesicatoria pv vesicatoria, Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria, Pseudomonas syringae pv. tomato, entre
outras. As zonas de inibição apresentaram variações em relação a
concentração de extrato de pólen utilizados. De acordo com as análises
113
estatísticas, entre as bactérias testadas a A. tumefaciens foi a mais
sensível na concentração de 1/5 dos extratos de pólen. A sensibilidade
das bactérias seguiu a seqüência A. tumefaciens, P. syringae pv. tomato,
X. axonapodis pv. vesicatoria > E. amylovora, P. conrrugata, R.
solanacearum, X. campestris pv. campestris > A. vitis, C. michiganensis
subsp. michiganensis > E. carotovora pv. carotovora, P. savastanoi pv.
savastanoi, P. syringae pv. phaseolicola > P. syringae pv. syringae.
Nenhuma atividade antibacteriana foi encontrada com os extratos de
pólen apícola na concentração de 1/100.
A antividade antibacteriana de vinte e cinco amostras de méis,
contendo pólen de diferentes origens botânicas da Espanha, foram
avaliados contra Staphylococcus aureus ATCC 25923. Os méis de
Labietae e Rosmarinus officinalis exibiram grande atividade contra a
bactéria testada (GARCÍA et al., 2001).
2.9 LEGISLAÇÃO BRASILEIRA DO PÓLEN APÍCOLA
Os produtos apícolas, dentre eles o pólen, são comercializados em
várias regiões do país e no exterior, segundo suas propriedades
nutricionais e medicinais. Todos eles, entretanto, estão submetidos ao
registro como alimentos ou suplementos alimentares, que segundo
Paulino (2004), não corresponde à plena verdade de suas funções.
Segundo a Normativa nº. 03 do Ministério de Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (BRASIL, 2001), que estabelece o Regulamento Técnico
114
para Fixação de Identidade e Qualidade do Pólen Apícola, o pólen apícola
é definido como resultado da aglutinação do pólen das flores, efetuado
pelas abelhas operárias, mediante néctar e suas substâncias salivares, o
qual é recolhido na entrada da colméia. O pólen apícola desidratado é o
produto submetido ao processo de desidratação em temperatura não
superior a 42ºC. Os padrões de identidade e qualidade estão
apresentados na Tabela 5.
A Normativa nº. 03 (BRASIL, 2001) determina que o pólen apícola
deve ser embalado com materiais bromatológicos e não deverá conter
substâncias estranhas de qualquer natureza. Os critérios microbiológicos
são mostrados na Tabela 6.
TABELA 5 - PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS PARA QUALIDADE
DO PÓLEN APÍCOLA DESIDRATADO
Parâmetros Valores
Umidade Máximo de 4%
Cinzas Máximo de 4% *
Lipídeos Mínimo de 1,8%*
Proteínas Mínimo 8%*
Açúcares Totais 14,5 a 55,0 %*
Fibras Brutas Mínimo 2%*
Acidez Livre Máximo 300 mEq/kg
pH 4 a 6
Flavonóides presença
Aditivos ausência
* m/m base seca
FONTE: BRASIL (2001).
115
TABELA 6: PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS DO PÓLEN APÍCOLA
BRASILEIRO
Microrganismo
Critério de
aceitação
categoria
I.C.M.S.F **
Método de
análise
Coliformes a
(45ºC)/g
n=5 c=0 m=0 5
APHA 1992
c.24
Salmonella ssp /
Shigella spp (25g)
n=5 c=0 m=0 10 FIL 93
A
1985
Fungos e leveduras
UFC/g*
n=5 c=2 m=10
M=100
2 FIL 94B: 1990
Paenibacillus
larvae
n=5 C=0 M=0 - -
* UFC/g : Unidade formadora de colônia **International Comission on Microbiological
Specifications for Foods
FONTE: BRASIL, 2001.
2.10 ATIVIDADE E MERCADO DE PÓLEN APÍCOLA NO
BRASIL
A apicultura é uma das raras atividades pecuárias que não têm
impacto ambiental negativo. Ao contrário, transforma o apicultor em um
ecologista prático. Pois, a polinização intensiva favorece a manutenção da
biodiversidade, causando impacto positivo na sustentação do
ecossistema local, bem como aumento de produtividade em diversas
culturas. No Brasil há uma grande disponibilidade de matéria-prima e
atualmente, exploram-se apenas 15% do potencial da flora apícola
(BARRETO et al., 2006).
A produção brasileira de pólen apícola iniciou-se de forma
modesta no final da década de 80. Atualmente, o mercado favorável ao
consumo de produtos naturais, complementares à dieta ou com efeitos
terapêuticos, vem estimulando e promovendo essa modalidade da cadeia
116
produtiva apícola. Se, por um lado, a procura e o consumo pelo produto
vem aumentando, por outro não se constata que a produção científica
brasileira sobre o tema tenha se ampliado com a mesma velocidade
(FUNARI et al., 2006).
Segundo Serra Bonvehí e Escolà Jordà (1997), um dos primeiros
países a estabelecer normas para a padronização do pólen apícola foi a
Espanha, pois a carência de normativas específicas sobre a qualidade do
pólen apícola espanhol resultou na expansão da comercialização de
produtos de baixa qualidade e conseqüente perda do mercado europeu.
Barreto et al. (2006) avaliaram o perfil da produção do pólen
apícola no Brasil. Neste estudo foram coletados dados sobre a produção,
processamento e comercialização do produto por meio de informações
fornecidas por produtores e Associações Apícolas em cada Estado do
país. Os resultados mostraram a existência de dois importantes pólos
produtivos no país: a Região Sul, tendo Santa Catarina como principal
Estado produtor; e o Nordeste, tendo a Bahia como maior produtor. Neste
estudo verificaram-se que ainda existem regiões brasileiras não
produtoras de pólen, porém com alto potencial produtivo, como o Mato
Grosso, Mato Grosso do Sul e Ceará. No que se refere à produção média
de pólen por colméia/mês, esta variou de 900 g no Estado do Rio Grande
do Sul até o extraordinário recorde de 48 kg registrado no município de
Canavieiras/Bahia e proporcionado pela florada de cajá e camaçari, com
coletores especialmente desenvolvidos (tipo tropical africanizado baiano).
117
Ainda, segundo as Associações de Apicultores dos Estados
Brasileiros, a produção de pólen apícola no Estado do Paraná é
concentrada por poucos apicultores cadastrados, os quais disponibilizam
300 colméias para a produção de pólen. Nesse Estado a produção varia
de 1.200 a 1.900g de pólen/mês/colméia durante os meses de agosto a
março. No Estado do Rio Grande do Sul a produção de pólen apícola não
é representativa, pois são registrados apenas dois apicultores com 70
colméias destinadas à produção de pólen, com uma produção mensal de
pólen por colméia que varia de 900 a 2200g de pólen/mês/colméia e
produzidos no período de setembro a abril. O pólen que abastece o
Estado do Rio Grande do Sul é comprado em Santa Catarina. Entretanto,
o Estado de Santa Catarina possui 480 colméias com 15 apicultores
cadastrados, sendo considerado um pólo nacional importante visto a
produtividade durante os meses de agosto a abril, que varia de 930 a
4000g de pólen/mês/colméia, e caracterizado com Estado desenvolvedor
de tecnologias adequadas para o beneficiamento do pólen apícola
(BARRETO, 2002).
Um dos grandes desafios do mercado é padronizar o preço do
pólen apícola no Brasil, uma vez que o quilo do produto apresenta
variações no atacado, sendo entre R$ 10,00 a R$ 15,00 para o pólen não
processado, R$ 15,00 a R$ 40,00 para o pólen processado e entre R$
40,00 a R$ 150,00 no varejo. Outra questão importante é a necessidade
de regularização do produtor de pólen no que se refere à inspeção, pois,
a maioria encontram-se na clandestinidade, seja por desconhecimento,
falta de incentivo ou por encontrar grandes dificuldades na regularização
118
perante os órgãos competentes. Nos estados brasileiros podem-se
encontrar desde produtores com registro no Serviço de Inspeção Federal
(SIF), bem como sem registro (FUNARI et al., 1998).
Quanto a rota de comercialização do pólen apícola, os estados
brasileiros, em sua maioria, produzem somente para o consumo próprio.
O Estado do Paraná, além de atender as necessidades internas,
comercializa para os Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas
Gerais. A Bahia, da mesma maneira, abastece o seu próprio território e
exporta pólen para os Estados já citados. Por outro lado, Santa Catarina,
além de distribuir o produto em praticamente todos os Estados do Brasil,
conta com um produtor exportando para Colômbia e Uruguai (BARRETO
et al., 2006). Segundo Paulino (2004), a baixa produtividade dos apiários
brasileiros é explicada pela pouca utilização de recursos tecnológicos na
produção.
.
119
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL
3.1.1 Amostras de pólen
As amostras de pólen apícola foram fornecidas por apicultores dos
estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná. Todas as
amostras de pólen foram coletadas de colméias de abelhas A. melIífera
durante o ano de agosto 2005 a abril de 2006. Foram coletadas 36
amostras de pólen nas três regiões estudadas, sendo dez amostras do
Estado do Rio Grande do Sul, dez do Estado de Santa Catarina e 16
amostras do Estado do Paraná, conforme descrito na Tabela 7. As
amostras foram armazenadas em freezer à -18 ºC, até o momento das
análises.
120
TABELA 07 - LOCALIDADES DE ORIGEM DO PÓLEN APÍCOLA E
DENOMINAÇÕES DAS AMOSTRAS
Região de coleta Pólen
Altônia, PR PR 16
Arvorezinha, RS RS 07
Balneário Pinhal, RS RS 05
Balsa Nova, PR PR 15
Campos Novos, SC SC 04, SC 05, SC 06, SC 07, SC 08
Canoinha, SC SC 02
Cruz Alta, RS RS 02
Curitiba, PR PR 04, PR 14
Encruzilhada do Sul, RS RS 09
Fraiburgo, SC SC 01
Ijuí, RS RS 01
Itaiópolis, SC SC 10
Lapa, PR PR 01, PR 02
Machadinho, RS RS 03, RS 04, RS 10
Morretes, PR PR 07
Ortigueira, PR PR 13
Palmeira, PR PR 03
Pato Branco, PR PR 05
São João da Urtiga, RS RS 06, RS 08
São Joaquim, SC SC 03
União da Vitória, PR PR 06, PR 08, PR 09, PR 10, PR 11, PR 12
Urupema, SC SC 09
121
3.1.2 Preparo dos Extratos Etanólicos do Pólen (EPE)
Inicialmente foi realizado um estudo preliminar das melhores
condições de extração em duas amostras, uma coletada no Estado de
Alagoas, mas de procedência desconhecida, e outra da cidade de União
da Vitória–PR, do apiário do Médico Veterinário Henrique Felix Breyer. As
amostras de pólen (2g) foram trituradas, homogeneizadas e extraídas
individualmente com 15 mL de etanol em diferentes concentrações (40,
50, 60, 70, 80 e 90% v/v), respectivamente. A extração foi feita a 70°C,
em banho de água termostatizado, por 30 minutos sob agitação
constante. Após a filtragem em papel de filtro Whatman nº 5, os
sobrenadantes obtidos foram armazenados em tubos de ensaio com
rosca a 0 ºC para posterior determinação dos compostos fenólicos totais,
flavonóides, atividade antioxidante e antibacteriana e análises
cromatográficas. Os demais extratos etanólicos das amostras de pólen
apícola foram preparados conforme descrito por Carpes et al. (2007) e
apresentado em anexo 1.
3.1.2.1 Purificação dos extratos etanólicos de pólen em resina hidrofóbica
Primeiramente 100g de pólen apícola foi extraído com 100 mL de
etanol 70%, a 70
0
C, em banho-maria por 30 minutos. O extrato obtido foi
acidificado a pH 2 e misturado com 100g de resina Amberlite XAD2
(Supelco, Bellefonte, PA, USA, poros de 9 nm e partícula de 0,3-1,2 mm).
122
O extrato de pólen foi homogeneizado durante 10 minutos e empacotada
em coluna de vidro (25 x 2 cm). A coluna foi eluída com 100 mL de água
ácida pH 2, 300 mL de água destilada pH 7 e em seguida com 300 mL de
metanol p.a. A fração metanólica foi evaporada sob vácuo em evaporador
rotativo e, a fase orgânica recuperada para a determinação de compostos
fenólicos, flavonóides, atividade antioxidante (seqüestro do radical DPPH)
e análises cromatográficas por CLAE-DAD e CG-EM.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Proteína Total
O teor de proteína foi determinado segundo o método do 928.080
da AOAC (2000). Aproximadamente 0,7g de pólen moído foi digerido em
balão macro Kjeldahl com 4g da mistura catalítica (1:3 de CuSO
4
e K
2
SO
4
)
e 20 mL de H
2
SO
4
concentrado. A solução digerida foi adicionada 80 mL
de NaOH 40% para a liberação da amônia, a qual foi recolhida dentro de
uma solução de H
2
SO
4
e, então, titulada com uma solução padronizada de
NaOH 0,1 M. Para determinação do teor proteína total, os valores de
nitrogênio foram multiplicados pelo fator de conversão de 6,25
(ROULSTON et al., 2000).
3.2.2 Atividade de água (A
w
).
123
Este parâmetro foi determinado a 22ºC com medidor de atividade
de água PawKit (Decagon), segundo metodologia do INSTITUTO
ADOLFO LUTZ (1985).
3.2.3 Umidade
Aproximadamente 2g de pólen previamente moídos foram secos
em estufa a vácuo a 60ºC até massa constante, conforme metodologia do
INSTITUTO ADOLFO LUTZ (1985).
3.2.4 Fibras
Dois gramas de pólen moído e desengordurado em éter de
petróleo, foram digeridos a quente com solução de H
2
SO
4
0,113 M e
posteriormente com NaOH teÐ t)tsT/ê_TgeàdsÐeriMe
e e
p
dto’g“••/ç /geàte
tí
3.2.6 Cinzas
Dois gramas de pólen moído foram colocados em cadinhos de
porcelana e incinerados em mufla a 550 ºC, até obtenção de cinzas
brancas (aproximadamente 4h). Após o resfriamento em dessecador, as
cinzas foram determinadas por gravimetria (INSTITUTO ADOLFO LUTZ,
1985).
3.2.7 Açúcares
O teor de açúcar total e açúcar redutor foram determinados pelo
método espectrofotométrico de Somogy-Nelson e, lido em
Espectrofotômetro UV-Vis Femto Modelo 482 R a 535 nm (SOMOGY,
1945).
3.2.8 Minerais
Os minerais foram determinados por inceneração de 1,5 g de pólen
a 550 ºC, até massa constante. As cinzas foram solubilizadas com 25 mL
de HNO
3
50%, aquecidas em banho-maria por 30 min e filtradas em balão
volumétrico de 100 mL. Após a aferição com água destilada quente, os
minerais foram analisados em Espectrofotômetro de Absorção Atômica
Varian Modelo Spectra AA 100 & 200, em comprimento de onda
específico para cada mineral (Fe, Ca, Zn, K, Na, Cu, Mg e Mn). O teor de
125
fósforo foi analisado em Espectrofotômetro Ultravioleta Shimadzu modelo
UV-1601 PC a 650 nm (AOAC, 2000).
3.2.9 Compostos Fenólicos Totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método
espectrofotométrico de Folin-Ciocateau, utilizando ácido gálico como
padrão de referência. O reagente de Folin Ciocalteau é uma solução de
íons complexos poliméricos formados a partir de heteropoliácidos
fosfomolíbdicos e fosfotungsticos (SINGLETON et al., 1999). Esse
reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um complexo azul Mo-
W. Os extratos de pólen foram diluídos em água 1:25. Uma alíquota de
0,5 mL de amostra diluente foi adicionado 2,5 mL do reagente Folin
Ciocalteau (Sigma Co.) diluído em água destilada 1:10 (v/v). A esses
reagentes foram adicionados 2 mL de carbonato de sódio a 4% (v/v).
Após duas horas de repouso foram realizadas leituras em
espectrofotômetro SHIMADZU Modelo UV 1240 V a 740 nm. O branco foi
conduzido nas mesmas condições. Foi construída uma curva analítica
contendo 10, 25, 40, 70, 85 e 100 ppm de ácido gálico e os resultados
expressos em mg GAE/g de pólen. GAE: equivalente em ácido gálico
(SINGLETON et al., 1999).
3.2.10 Flavonóides Totais
126
A concentração de flavonóides totais foi determinada conforme
método descrito por Park et al. (1995), com algumas modificações.
Alíquota de 0,5 mL do extrato de pólen diluído em água (1:10 v/v) foi
transferida para um tubo de ensaio e adicionado 4,3 mL de etanol a 80%
(v/v), 0,1 mL de nitrato de alumínio a 10% (m/v) e 0,1 mL de acetato de
potássio 10% (m/v). Após 40 minutos de repouso, as leituras foram feitas
em espectrofotômetro SHIMADZU Modelo UV 1240 V, a 415 nm. Tubos
em branco foram conduzidos nas mesmas condições, sem adição de
nitrato de alumínio. Foi construída uma curva analítica contendo 10, 25,
40, 70, 85 e 100 ppm de quercetina e os resultados expressos em mg
quercetina/g de pólen apícola (DOWD, 1959).
2.2.11 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível
A determinação do espectro de absorção foi rereÐ 1 so
3.2.12 Cromatografia em camada delgada de alta eficiência em fase
reversa (CCDAE-FR) dos EPE
A cromatografia em camada delgada de alta eficiência do EPE foi
realizada de acordo com o método descrito por Park et al. (2000) e
Alencar et al. (2005). Alíquotas de 10 µL na concentração 133,37mg/mL
foram aplicadas em placas RP18 F
254
S (Merck Co). O tempo de
desenvolvimento dos cromatogramas foi de aproximadamente 3 horas,
utilizando-se um sistema etanol: água destilada (55:45, v/v), como fase
móvel. As cromatoplacas foram visualizadas sob luz ultravioleta, nos
comprimentos de onda de 254 e 366 nm, antes e após a revelação com
anisaldeído sulfúrico com aquecimento a 100ºC, por 5 min.
3.2.13 Análises biológicas dos extratos etanólicos do pólen apícola
3.2.13.1 Atividade antibacteriana dos extratos de pólen pelo método de
difusão em ágar
As análises de atividade antibacteriana foram realizadas no
Laboratório de microbiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba
(FOP/UNICAMP), sob a supervisão do Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen.
O método de difusão em ágar foi aplicado nos extratos de pólen
apícola, segundo Blair et al. (1958). Neste estudo, utilizaram-se cinco
bactérias patogênicas humanas (Bacillus subillis ATCC 21.332,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15.442, Streptococcus mutans Ingbritt
1600, Staphylococcus aureus ATCC 25.923 e Klebsiella pneumoniae) e
128
quatro bactérias fitopatogênicas (Agrobacterium tumefaciens,
Xanthomonas vesicatoria pv vesicatoria, Xanthomonas axonopodis pv.
vesicatoria, Pseudomonas syringae pv. tomato). Foram aplicados 40 μL
dos extratos de pólen (133,37mg/mL), em cilindros de aço-inox estéreis,
dispostos nas placas de Petri, previamente inoculadas. Após a incubação
em estufa a 37°C por 24 horas, a atividade antibacteriana foi determinada
através da medida do diâmetro da zona de inibição (mm) ao redor de
cada cilindro. O solvente utilizado na extração, etanol 70% (v/v), foi usado
como controle negativo e a clorexidina 0,12% (v/v) foi usada como
controle positivo. Os testes foram realizados em duplicata.
3.2.13.2 Concentração inibitória mínima (CIM) em meio líquido
A determinação da CIM foi realizada de acordo com a técnica
descrita por Koo et al. (2000) e Duarte et al. (2003), onde foram utilizados
tubos contendo meio de cultura líquido BHI (Brain heart infusion). Neste
estudo, utilizaram-se cinco bactérias patogênicas humanas (Bacillus
subillis ATCC 21.332, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15.442,
Streptococcus mutans Ingbritt 1600, Staphylococcus aureus ATCC 25.923
e Klebsiella pneumoniae). No método da CIM, tubos contendo 4960 µL de
caldo BHI, previamente inoculados foram incubados após a adição de 40
µL dos extratos, cujas concentrações variaram de 133,37 a 33,34mg/mL
(concentrações seriadas de razão 2). Foi considerada CIM a menor faixa
de concentração do extrato em que não houve crescimento bacteriano
129
visível, ou seja, uma leitura de absorbância menor que 0,05 em 660 nm.
Todos os testes foram realizados em duplicata.
3.2.13.3 Atividade Antioxidante dos Extratos de Pólen
3.2.13.3.1 Atividade de seqüestro do radical DPPH•
A medida da atividade seqüestrante do radical DPPH foi realizada
de acordo com a metodologia descrita por Brand-Williams et al. (1995).
DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazina) é um radical livre estável que aceita um
elétron ou um radical hidrogênio para tornar-se uma molécula
diamagnética estável e, desta forma, é reduzido na presença de um
antioxidante. Para avaliação da atividade antioxidante os EPE (extratos
etanólicos do pólen) foram reagidos com o radical estável DPPH em uma
solução de etanol. Na forma de radical, o DPPH possui uma absorção
característica a 517 nm, a qual desaparece após a redução pelo
hidrogênio arrancado de um composto antioxidante. As soluções
estoques (133,33mg/mL) foram diluídas a concentrações finais de 6,67
mg/mL até 0,25mg/mL. Essa faixa de concentração se fez necessária
devido às particularidades de cada amostra de pólen apícola.
A mistura de reação foi constituída da adição de 0,5mL das
amostras, 3 mL de etanol absoluto e 0,3mL da solução do radical DPPH
0,3 mM em etanol. As substâncias de referência (BHT, BHA e α-tocoferol)
foram avaliadas na concentração final de 90μg/mL.
130
Fez-se uma cinética de cada pólen para determinar o tempo
necessário para chegar à estabilização das absorbâncias. A redução do
radical do DPPH foi medida por meio de um monitoramento contínuo do
declíneo da absorbância a 517 nm, a cada 20 min até valores estáveis de
absorção.
Uma das formas de se expressar a atividade antioxidante pelo
método do DPPH é através do EC
50
, ou seja, a concentração mínima
necessária para o antioxidante reduzir em 50% o DPPH inicial da reação.
Desta forma, leva-se em consideração o branco específico dos extratos
nas várias concentrações utilizadas em cada amostra. O branco
específico da amostra foi determinado usando 3mL de etanol e 0,5mL da
amostra em cada concentração e as absorbâncias lidas a 517 nm após o
tempo de estabilidade da reação. Um tubo contendo 3mL de etanol e 0,3
mL de DPPH 0,3 mM serviu como controle negativo.
Os valores de EC
50
foram calculados por regressão linear de
gráficos onde o eixo das abscissas (X) representa a concentração em
mg/mL e o eixo das ordenadas (Y) a % média da atividade antioxidante
das triplicatas segundo a fórmula de Mensor et al. (2001) (Equação 14).
% AA = 100 -{ [( Abs
amostra
– Abs
branco
) X 100] / Abs
controle
} (14)
131
3.2.13.3.2 Atividade antioxidante pela oxidação acoplada do β-caroteno e
ácido linoléico
A medida da atividade antioxidante foi determinada pela oxidação
acoplada do β-caroteno e do ácido linoléico, de acordo com Ahn et al.
(2004). Foram pesados 10 mg de β-caroteno, os quais foram dissolvidos
em 100 mL de clorofórmio. Após isto, foi retirada uma alíquota de 3 mL da
solução clorofórmio – β-caroteno e adicionada a 40mg de ácido linoléico e
400mg de Tween 40. Em seguida, o clorofórmio foi removido com a
utilização de uma corrente de gás nitrogênio, e o resíduo obtido
redissolvido em 100 mL de água aerada por 30 min. Alíquotas de 3 mL da
emulsão β-caroteno/ácido linoléico foram misturadas com 300 μL do EPE
diluídos 1:20 (v/v) em etanol a 70% (v/v). A leitura da absorbância foi feita
em espectrofotômetro a 470 nm, no tempo inicial e em intervalos de 20
minutos durante 2 horas com incubação a 50ºC, para a reação de
oxidação. A amostra controle continha 300 µL de etanol a 70%. A
atividade antioxidante foi expressa pela porcentagem de inibição relativa
em relação ao controle depois de 120 min de incubação, usando a
Equação 15:
AA = (DR
C
- DR
S
)/DR
C
X 100 (15)
onde AA representa a atividade antioxidante, DR
C
a taxa de degradação
da amostra controle (=ln( a/b)/120); DR
S
a taxa de degradação da amostra
contento a substância teste (=ln(a/b)/120); a a absorbância inicial no
tempo 0 e b a absorbância depois de 120 min. O EPE e as substâncias de
132
referência (BHT, BHA e α-tocoferol) foram avaliadas na concentração final
de 90µg/mL .
3.2.14 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (CLAE-
FR)
Os extratos etanólicos de pólen (EPE) foram analisados por um
sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em cromatógrafo
Shimadzu equipado com coluna RP-18 ODS-A (4,6mm × 250 mm x 5µm)
e um detector de arranjo fotodiodo (SPD-M10AVp, Shimadzu Co.). Os
EPE (100mg/mL) foram filtrados com um filtro 0,22 µm (Millipore) e
injetados 10µL. A fase móvel foi composta de um gradiente linear de
ácido acético: água (1:20) (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B),
iniciando com 5% B e aumentando até 60% B (40 min), mantendo-se em
90% B (55–60 min), e decrescendo até 5% B (60–70 min) com vazão de
solvente de 1 mL/min. Os cromatogramas foram analisados a 260 nm,
conforme descrito por Alencar et al. (2007). Os seguintes padrões
autênticos de ácidos fenólicos e flavonóides (Extrasynthese Co.) foram
examinados: ácido p-cumárico, ácido ferrúlico, ácido cinâmico, ácido
gálico, quercetina, canferol, caferide, apigenina, isosacuranetina,
pinocembrina, crisina, acacetina, galangina e miricetina.
133
3.2.15 Cromatografia Gasosa com espectrometria de massas (CG-MS).
As análises por CG-EM dos extratos de pólen foram realizadas de
acordo com o método modificado descrito por Markham et al. (1996).
Alíquotas de 400 µL de cada extrato alcoólico foram colocados dentro de
vials de vidro e adicionados 1 mL de uma solução etérea de diazometano
(CH
2
N
2
) para a metilação. As amostras foram mantidas em banho de gelo
por 4 horas para completa reação de metilação. As soluções resultantes
foram secas com sulfato de magnésio anidro e analisadas em um
cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas. O
cromatógrafo estava equipado com uma coluna capilar HP-5MS (30 m x
0,25 mm x 0,25 µm) e um detector operando no modo scanning (m/z 40-
500). A programação de temperatura foi de 40ºC (0,0 min) a 140ºC (10ºC
min
-1
); 140ºC (0,0 min) a 300 ºC (5 ºC min
-1
, 10 min). As amostras (0,6µl)
foram injetadas por um auto-injetor, utilizando a técnica de injeção
splitless (1:20). A integração foi feita através do software específico do
equipamento. Os compostos detectados nas amostras foram identificados
por comparação com os dados dos espectros de massas NIST107,
NIST21 e WILEY139 componentes da estação de trabalho CLASS-5000
versão 2.2. Usou-se também, a ferramenta de extração de íons seletivos,
para verificação da presença ou ausência das diversas classes de
compostos esperados, no processo de identificação dos componentes
das amostras.
3.2.16 Microscopia Óptica (MO)
134
Essa análise foi realizada nas dependências dos laboratórios do
Núcleo de apoio à pesquisa em microscopia eletrônica aplicada a
pesquisa agropecuária (NAP/MEPA) da ESALQ-USP, Piracicaba-SP. A
identificação dos pólens foi feita com base nos laminários de referência já
existente nos laboratórios de apicultura do departamento de Entomologia
da ESALQ/USP (Piracicaba) e do Instituto de Botânica, da Secretaria do
Meio Ambiente de São Paulo, sob a supervisão da Dra. Cynthia
Fernandes Pinto da Luz. Por meio de declarações, os apicultores
informavam as espécies que circundavam a região de seus apiários,
contribuindo desta forma para a identificação dos tipos polínicos.
Foram pesados 2g de pólen seco de cada amostra e contadas as
bolotas de pólen (aproximadamente 350 bolotas de pólen apícola). 25
bolotas foram seleciTβ’raa(tÐ s -gÀfe g° xieuóe-o
Microscópio-Esteroscópico marca Zeiss com aumentos de 100x, 200x,
400x e 1000x.
A análise quantitativa foi efetuada mediante contagem de 350
grãos de pólen por amostra e agrupados por espécies botânicas e/ou
tipos polínicos. Essa contagem é caracterizada por agrupar os grãos de
pólen em quatro classes de freqüência, ou seja: pólen predominante ou
dominante em mais de 45% do total de grãos contados (PD); pólen
secundário ou acessório em 16 a 45% (PA); pólen isolado importante (3-
15%) (PII) e pólen isolado ocasional em menos de 3% (PIO) (LOUVEAUX
et al., 1970).
3.2.17 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Essa análise foi realizada nas dependências dos laboratórios do
Núcleo de apoio à pesquisa em microscopia eletrônica aplicada a
pesquisa agropecuária (NAP/MEPA) da ESALQ-USP, Piracicaba-SP. A
identificação do material polínico contou com a ajuda da Dra. Cynthia
Fernandes Pinto da Luz do Instituto de Botânica da Secretaria do Meio
Ambiente do Estado de São Paulo, SP.
A avaliação botânica dos pellets de pólen apícola foi realizada
segundo BARTH (1989). Uma amostra de aproximadamente 2g de cada
espécie, correspondendo aproximadamente a 350 grãos de pólen e foi
considerada representativa para análise do pólen. Os pellets foram
agrupados em subamostras de acordo com sua coloração e cada
136
subamostra foi pesada. Após a separação dos grãos de pólen em função
da sua coloração, cada subamostra foi metalizada em ouro e analisada
por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) em Digital Scanning
Microscope DSM 940 A (Zeiss Co.). Os termos usados para expressar a
freqüência das classes segundo LOUVEAUX et al. (1970) foram:
“Pólen predominante ou dominante” (> 45% do total) (PD);
“Pólen acessório ou secundário”(16-45%) (PA);
“Pólen isolado importante” (3-15%)(PII);
“Pólen isolado ocasional”(<3%) (PIO).
3.2.18 Análise Estatística
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado.
A análise de variança (ANOVA) dos dados foi feita pelo software SAS
Software V9. O teste t student foi usado para comparar a atividade
antioxidante com os padrões comerciais (BHT, BHA e α-tocoferol). A
separação entre as médias dos tratamentos foi realizada usando o teste
de Tukey com um nível de confiança de 95%. A correlação entre atividade
antioxidante e compostos fenólicos e flavonóides foi realizada com o
Statgraphics Plus versão 5.1.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 30 ilustra a aparência das amostras de pólen apícola dos
três estados do Sul do Brasil utilizadas no estudo. Todas as amostras
analisadas demonstraram ser poliflorais, principalmente devido a grande
diversidade de cores dos seus grãos.
137
a)
b)
c)
a)
FIGURA 30 - APARÊNCIA DAS AMOSTRAS DE PÓLEN APÍCOLA a) ESTADO
DO PARANÁ, b) ESTADO DE SANTA CATARINA, c) ESTADO
DO RIO GRANDE DO SUL.
4.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO PÓLEN APÍCOLA
As amostras de pólen apícola da Região Sul do Brasil
demonstraram uma composição nutricional homogênea, com exceção do
teor de umidade que apresentou um coeficiente de variação acima de
40% (Tabela 8).
138
O teor de umidade variou de 1,69% a 7,84%;sendo que 47 % das
amostras encontraram-se fora da Legislação Brasileira, a qual permite a
comercialização de pólen com um teor máximo de umidade de 4%
(BRASIL, 2001). Entre os três estados analisados, o do Rio Grande do
Sul foi o que apresentou o maior número de amostras com teor de
umidade fora da Legislação, correspondendo a 60%, seguido pelo Estado
do Paraná com 50% das amostras.
A atividade de água média das amostras foi de 0,38 ± 0,04, o que é
característico de um alimento desidratado e com boa estabilidade de
armazenagem (Tabela 8). O teor de umidade elevado pode favorecer a
contaminação microbiológica, principalmente por fungos e leveduras. O
pólen é altamente higroscópico, sendo, portanto afetado pelas condições
ambientais.
O conteúdo total de proteínas variou de 15,04 a 27,69%, sendo que
os teores de proteínas das amostras do Estado de Santa Catarina foram
estatisticamente diferentes as dos estados do Rio Grande do Sul e do
Paraná (Tabela 8).
139
TABELA 8 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS AMOSTRAS DE PÓLEN APÍCOLA
Amostras aW* Umidade (%) Proteína % (N x 6,25) Fibras (%) Lipídeos (%) Cinzas (%) AT** (g/100) AR*** (g/100g)
PR 01 0,32
a
6,62
a
18,89
b
3,51
a
4,21
a
2,10
a
54,56
a
48,74
a
PR 02 0,33
a
6,65
a
18,61
b
3,11
a
4,12
a
1,90
a
58,84
a
56,65
a
PR 03 0,36
a
5,26
a
18,89
b
3,64
a
5,12
a
3,20
a
55,33
a
52,81
a
PR 04 0,45
a
7,84
a
15,04
b
2,65
a
4,89
a
3,12
a
58,59
a
56,33
a
PR 05 0,46
a
6,35
a
15,45
b
2,54
a
4,72
a
3,20
a
60,30
a
55,90
a
PR 06 0,36
a
3,33
a
21,74
b
4,85
a
5,17
a
2,50
a
55,18
a
52,58
a
PR 07 0,33
a
1,92
a
22,43
b
3,23
a
5,69
a
2,89
a
51,27
a
45,12
a
PR 08 0,41
a
3,25
a
22,38
b
2,76
a
6,47
a
2,87
a
52,60
a
50,96
a
PR 09 0,42
a
3,15
a
21,55
b
2,98
a
5,43
a
3,91
a
50,82
a
49,55
a
PR 10 0,40
a
3,10
a
21,77
b
3,89
a
3,72
a
3,70
a
50,28
a
47,07
a
PR 11 0,38
a
3,00
a
21,93
b
3,92
a
4,25
a
3,76
a
50,10
a
47,59
a
PR 12 0,44
a
4,39
a
22,46
b
3,87
a
4,89
a
3,84
a
48,67
a
45,15
a
PR 13 0,39
a
4,56
a
21,80
b
2,77
a
5,72
a
2,93
a
52,19
a
48,71
a
PR 14 0,35
a
1,69
a
20,15
b
2,98
a
6,00
a
2,94
a
50,27
a
48,03
a
PR 15 0,35
a
3,42
a
20,86
b
3,51
a
5,25
a
2,98
a
50,05
a
47,97
a
PR 16 0,36
a
5,78
a
21,48
b
3,45
a
5,54
a
2,23
a
50,47
a
46,99
a
SC 01 0,45
a
2,14
a
22,90
a
3,75
a
4,23
a
3,42
a
48,36
a
44,19
a
SC 02 0,39
a
2,90
a
27,69
a
2,23
a
4,12
a
3,31
a
42,76
a
40,38
a
SC 03 0,35
a
3,84
a
22,65
a
3,98
a
5,39
a
3,12
a
49,66
a
45,93
a
SC 04 0,34
a
3,44
a
20,87
a
3,51
a
5,21
a
2,97
a
55,05
a
50,41
a
SC 05 0,38
a
4,77
a
22,95
a
3,42
a
5,33
a
2,95
a
53,27
a
50,45
a
SC 06 0,37
a
4,22
a
24,95
a
2,89
a
4,87
a
2,45
a
52,79
a
50,44
a
SC 07 0,38
a
2,33
a
18,96
a
3,64
a
3,89
a
2,56
a
51,23
a
49,79
a
SC 08 0,38
a
2,94
a
21,51
a
2,85
a
4,51
a
2,46
a
49,43
a
47,56
a
SC 09 0,36
a
2,34
a
24,44
a
4,34
a
4,43
a
3,21
a
50,53
a
46,19
a
SC 10 0,36
a
5,55
a
19,08
a
4,62
a
3,95
a
3,12
a
51,32
a
48,98
a
RS 01 0,35
a
3,69
a
19,99
b
3,54
a
3,97
a
2,65
a
60,42
a
55,04
a
RS 02 0,37
a
1,85
a
18,98
b
3,52
a
4,56
a
1,98
a
49,41
a
45,45
a
RS 03 0,35
a
6,92
a
18,17
b
3,45
a
4,87
a
2,87
a
54,24
a
49,02
a
RS 04 0,37
a
7,28
a
16,37
b
3,24
a
4,23
a
3,05
a
57,66
a
53,02
a
RS 05 0,54
a
5,08
a
18,48
b
3,87
a
5,61
a
3,01
a
54,68
a
52,21
a
RS 06 0,39
a
6,71
a
17,07
b
3,13
a
4,97
a
2,97
a
55,05
a
48,39
a
RS 07 0,36
a
3,93
a
19,25
b
3,35
a
4,53
a
3,28
a
41,11
a
38,21
a
RS 08 0,38
a
5,88
a
19,36
b
3,22
a
4,89
a
2,76
a
46,46
a
41,49
a
RS 09 0,38
a
2,42
a
19,86
b
4,34
a
5,41
a
2,65
a
51,13
a
50,18
a
RS 10 0,40
a
4,79
a
18,02
b
3,54
a
4,96
a
2,93
a
51,43
a
48,75
a
V
máx,
0,54 7,84 27,69 4,85 6,47 3,91 60,42 56,66
V
mín,
0,32 1,69 15,04 2,23 3,72 1,90 41,11 38,21
Média±SD 0,38±0,04 4,19±1,70 20,47±2,64 3,45±0,57 4,86±0,65 2,94±0,48 52,10±4,22 48,79±4,16
CV(%) 10,58 40,57 12,89 16,52 13,37 16,33 8,09 8,53
*atividade de água (22ºC) **Açúcar Total (g/100g) ***Açúcar Redutor (g/100g); Médias seguidas de mesma letra (coluna) não são diferentes estatisticamente pelo teste de Tukey
(p<0,05)
140
Teores mais elevados de proteína, acima de 25,9%, também já
foram encontrados em pólen apícola produzido no sudeste da Austrália
(SOMERVILLE e NICOL, 2006) e no pólen de Minas Gerais (MODRO et
al., 2007). A maior parte do nitrogênio presente no pólen está na fração
protéica, sendo o segundo grupo de nutrientes mais abundantes, após os
carboidratos (AZEREDO et al., 2003). Todas as amostras analisadas
apresentaram teor de proteína acima de 8%, estando desta forma de
acordo com o Regulamento Técnico Brasileiro (BRASIL, 2001). O alto
teor de proteínas (20,47± 2,64), açúcares redutores (48,79± 4,16 %) e
baixo teor de lipídeos encontrados (4,86± 0,65 %) fazem do pólen um
excelente complemento alimentar (Tabela 8).
Esses resultados corroboram com os de Almeida-Muradian et al.
(2005), que avaliaram amostras brasileiras de pólen e encontraram um
teor de umidade, proteínas, lipídeos e cinzas, de 7,4%, 20%, 6% e 2,2 %,
respectivamente. O alto teor de açúcares redutores do pólen pode ser
justificado pela presença de mel ou néctar no fluído que cimenta os grãos
de pólen (STANLEY e LINSKENS,1974). O teor de lipídeos das amostras
(4,86± 0,65 g/100g) (Tabela 8) foi similar ao descrito por SOMERVILLE
(2005), que encontrou no pólen do sudeste da Austrália uma variação,
desde níveis não detectáveis de lipídeos para o pólen de Eucalyptus
macrorhyncha até 11,2% para o pólen de Hypochoeris radicata.
Os minerais predominantes nas amostras foram o fósforo (6923,63
± 872,53mg/kg de pólen), seguido pelo potássio (5116,76± 528,89mg/kg
de pólen), cálcio (1031,98± 377,51mg/kg de pólen) e magnésio (754,64
141
±184,17mg/kg de pólen). A análise estatística pelo teste de Tukey
demonstrou que não há diferença significativa entre os teores de Cálcio,
Cobre, Ferro, Fósforo, Magnésio, Manganês e Sódio das amostras de
pólen do sul do Brasil. Entretanto para o potássio, as amostras do estado
do Paraná apresentaram os maiores teores e diferiram estatisticamente
das amostras do estado do Rio Grande do Sul (Tabela 9). O teor médio
de zinco foi de 50,63mg/kg de pólen e as amostras do estado do Rio
Grande do Sul foram as que apresentaram os maiores teores.
Serra Bonvehí e Escolá Jordá (1997) encontraram uma grande
variedade de minerais no pólen apícola da Espanha, sendo o potássio o
predominante (59% do total), seguido pelo fósforo, cálcio, sódio e
magnésio (39,9%). Os elementos ferro e zinco, encontrados no pólen
perfazem 15% da dose diária recomendada (RDA), sendo que os teores
oTõtβà/•g/•gsÀ5
A composição mineral do pólen não depende somente da origem
floral do pólen, mas também das condições de crescimento da planta,
como solo e origem geográfica. Segundo Stanley e Linskens (1974) há
diferenças no conteúdo mineral do pólen coletado pelas abelhas e o pólen
coletado diretamente da flor, e somente Cálcio e Magnésio tiveram
valores similares em ambos os tipos de pólen.
143
TABELA 9 - CONTEÚDO MINERAL DAS AMOSTRAS DE PÓLEN APÍCOLA
Amostras Ca* Cu Fe P Mg Mn K Na Zn
PR 01 1035,33
a
15,50
a
139,53
a
7345,50
a
763,40
a
73,27
a
5727,43
a
206,47
a
53,07
a,b
PR 02 1036,27
a
15,57
a
145,10
a
7364,30
a
785,47
a
75,37
a
5419,67
a
212,90
a
54,53
a,b
PR 03 1515,73
a
11,43
a
76,77
a
7277,30
a
946,93
a
43,63
a
4820,40
a
459,37
a
46,17
a,b
PR 04 1195,78
a
14,17
a
120,47
a
7328,03
a
831,93
a
64,09
a
5322,50
a
292,91
a
51,26
a,b
PR 05 1249,26
a
13,72
a
114,11
a
7323,54
a
854,78
a
61,03
a
5187,52
a
321,73
a
50,65
a,b
PR 06 1320,26
a
13,11
a
103,78
a
7309,96
a
877,88
a
56,25
a
5110,14
a
358,00
a
49,36
a,b
PR 07 1195,78
a
14,17
a
120,47
a
7329,03
a
831,93
a
64,09
a
5322,50
a
292,91
a
51,26
a,b
PR 08 1123,57
a
10,37
a
57,47
a
6132,73
a
714,40
a
97,53
a
5645,67
a
73,47
a
61,20
a,b
PR 09 1213,20
a
12,55
a
93,91
a
6923,91
a
808,07
a
72,62
a
5359,44
a
241,46
a
53,94
a,b
PR 10 1177,52
a
12,36
a
90,61
a
6795,22
a
784,80
a
78,08
a
5442,53
a
202,61
a
55,47
a,b
PR 11 975,10
a
9,83
a
68,57
a
6404,57
a
738,33
a
83,30
a
5318,00
a
19,67
a
48,73
a,b
PR 12 860,27
a
9,17
a
38,63
a
5724,07
a
463,33
a
51,53
a
3722,50
a
161,80
a
42,97
a,b
PR 13 1764,60
a
11,53
a
58,20
a
7155,47
a
1095,87
a
63,73
a
6363,70
a
231,13
a
55,23
a,b
PR 14 1383,43
a
10,27
a
66,87
a
8865,33
a
924,30
a
129,43
a
5586,77
a
106,80
a
53,73
a,b
PR 15 628,13
a
8,23
a
34,57
a
6609,47
a
713,40
a
98,87
a
5516,80
a
42,67
a
42,73
a,b
PR 16 1190,62
a
10,81
a
57,63
a
7748,16
a
953,57
a
63,46
a
6274,05
a
221,66
a
53,95
a,b
SC 01 938,33
a
13,3
a
103,27
a
5872,40
a
536,03
a
50,17
a
4556,27
a,b
202,47
a
55,63
b
SC 02 1388,77
a
9,33
a
71,20
a
8769,4
a
1039,47
a
25,33
a
5136,00
a,b
636,37
a
42,40
b
SC 03 866,70
a
16,40
a
115,63
a
6958,80
a
558,23
a
59,37
a
5270,07
a,b
227,73
a
60,57
b
SC 04 808,77
a
10,67
a
35,37
a
7691,83
a
799,03
a
110,70
a
5348,83
a,b
229,73
a
45,70
b
SC 05 792,87
a
9,93
a
48,83
a
6079,77
a
544,63
a
82,97
a
4976,10
a,b
55,37
a
36,10
b
SC 06 816,00
a
11,33
a
35,03
a
7433,80
a
818,57
a
110,93
a
5347,03
a,b
239,60
a
46,73
b
SC 07 750,80
a
9,10
a
49,73
a
5913,53
a
534,67
a
59,27
a
4762,83
a,b
46,97
a
38,00
b
SC 08 1518,63
a
10,30
a
48,47
a
5921,33
a
530,30
a
58,87
a
4792,03
a,b
54,87
a
38,90
b
SC 09 868,10
a
13,70
a
51,30
a
8224,47
a
881,30
a
69,37
a
5073,30
a,b
168,30
a
49,63
b
SC 10 870,31
a
8,83
a
35,96
a
5868,63
a
547,91
a
59,85
a
4715,27
a,b
48,75
a
37,05
b
RS 01 843,17
a
11,97
a
54,40
a
6134,67
a
575,93
a
43,53
a
5074,93
b
202,17
a
48,27
a
RS 02 1086,73
a
14,93
a
107,57
a
8456,57
a
908,93
a
48,90
a
5452,50
b
379,93
a
66,90
a
RS 03 291,60
a
4,50
a
69,00
a
6073,20
a
612,80
a
26,50
a
4435,60
b
12,90
a
51,50
a
RS 04 301,83
a
4,83
a
71,57
a
6128,70
a
622,97
a
28,87
a
4462,80
b
13,17
a
51,63
a
RS 05 2149,20
a
11,97
a
27,93
a
7455,43
a
1235,13
a
83,40
a
5133,07
b
323,50
a
55,80
a
RS 06 540,43
a
9,97
a
203,27
a
6119,93
a
809,27
a
24,90
a
4389,77
b
262,03
a
82,13
a
RS 07 964,20
a
17,77
a
101,27
a
7006,27
a
695,47
a
57,47
a
4898,27
b
272,07
a
60,80
a
RS 08 732,03
a
7,03
a
136,93
a
6932,83
a
532,53
a
51,20
a
4782,73
b
193,57
a
40,80
a
RS 09 726,03
a
10,80
a
36,50
a
5647,97
a
540,00
a
18,67
a
4329,63
b
72,13
a
39,13
a
V
máx,
2149,20 17,77 203,27 8865,33 1235,13 129,43 6363,70 636,37 82,13
V
mín,
291,60 4,50 27,93 5647,97 463,33 18,67 3722,50 12,90 36,10
Média±SD 1031,98±377,51 11,4±2,97 79,71±40,33 6923,63±872,63 754,62±184,17 64,19±25,51 5116,76±528,89 202,49±136,8
6
50,63±9,24
144
C.V (%) 36,58 26,03 50,59 12,60 24,40 39,74 10,34 67,65 18,25
* mg/kg de pólen apícola Médias seguidas de mesma letra (coluna) não são diferentes estatisticamente pelo teste de Tukey (p<0,05)
145
4.2 EXTRATOS ETANÓLICOS DE PÓLEN (EPE)
A melhor condição de extração usada nos experimentos foi
determinada em estudo preliminar, descrito por Carpes et al. (2007).
Neste estudo, diferentes concentrações de etanol (40 a 90% v/v) foram
usadas para extrair os compostos fenólicos, flavonóides e determinar a
atividade antioxidante e antibacteriana dos extratos etanólicos de pólen.
As diferentes condições de extração apresentaram diferentes efeitos no
conteúdo dos compostos fenólicos extraídos, entretanto, os extratos de
pólen obtidos com etanol a 70 e 80% (v/v) apresentaram os maiores
teores de compostos fenólicos (>10 mg/g) e atividade antioxidante acima
de 80%, sendo que não houve diferenças estatísticas entre essas duas
condições de extração.
Desta forma, as demais amostras analisadas foram extraídas com
álcool 70% (v/v), durante 30 minutos em banho termostatizado a 70
0
C. Os
extratos de pólen apícola da região Sul do Brasil apresentaram uma
coloração bastante homogênea, não havendo muita diferença entre as 36
amostras analisadas, que variaram de amarelo claro a amarelo mais
escuro (Figuras 31, 32 e 33).
146
FIGURA 31 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DO PARANÁ
FIGURA 32 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA
DO ESTADO DE SANTA CATARINA
147
FIGURA 33 - APARÊNCIA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA
DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
4.2.1 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível dos EPE
Os compostos fenólicos e flavonóides absorvem radiação
eletromagnética na faixa do ultravioleta (UV) e visível; dessa maneira
apresentam um papel de defesa das plantas frente à radiação UV da luz
solar. Além disso, eles podem representar uma barreira química de
defesa contra microrganismos (bactérias, fungos e vírus) e insetos. Mas,
os flavonóides atuam também em relacionamentos harmônicos entre
plantas e insetos, atraindo e orientando esses animais até o néctar,
contribuindo significativamente com a polinização (MARCUCCI,1998).
Os 36 extratos de pólen apícola da Região Sul do Brasil foram
submetidos a uma varredura espectral na região UV-visível (200 a 500
nm), conforme apresentados nas Figuras 34, 35 e 36. De acordo com as
análises espectrofotométricas não foram observadas grande variações no
148
perfil de varredura entre as amostras do Estado do Paraná (Figura 34).
Pode-se observar que a absorbância máxima variou de 294,5 a 319,5 nm,
sendo que os extratos PR 04, PR 05, PR 13, PR15 e PR16 apresentaram
dois picos de absorção. A grande maioria das amostras apresentaram
pico de absorção acima de 306 nm e apenas 3 amostras (PR 02, PR 05 e
PR 15) apresentaram um pico de absorção em 294 nm (Figura 34).
Os compostos fenólicos, de modo geral, apresentam o pico de
absorção da luz ultravioleta na faixa de 250 e 350 nm e as classes de
flavonóides que normalmente absorvem nos comprimentos de onda entre
281 a 284 nm, são os isoflavonóides, flavanonas e diidroflavonas
(MARKHAM et al., 1996).
149
FIGURA 34 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DO PARANÁ
0,996
PR 01 (0,67 mg/mL)
λ=306,5 nm
PR 02 (0,67 mg/mL)
λ = 294,5 nm
0,828
PR 03 (0,5 mg/mL)
λ = 317,5 nm
0,998
PR 04 (0,67 mg/mL)
λ = 307,5 nm
λ = 268,5 nm
0,790
0,744
0,719
PR 05 (1,33 mg/mL)
λ = 294,5 nm
λ = 266,5 nm
0,625
PR 06 (0,67 mg/mL)
λ = 309,5 nm
0,828
PR 07 (0,67 mg/mL)
λ = 311,5 nm
0,779
0,950
PR 08 (0,60 mg/mL)
λ = 319,5 nm
PR 09 (0,5 mg/mL)
λ = 309,5 nm
0,589
PR 10 (0,5 mg/mL)
λ = 309,5 nm
0,756
PR 11 (0,5 mg/mL)
λ = 308 nm
0,897
PR 13 (0,67 mg/mL)
λ = 269,5 nm
λ = 311,5 nm
0,683
778
0,778
PR 14 (0,083
mg/mL)
λ = 317 nm
1,104
778
PR 15 (1,33 mg/mL)
λ =294,5 nm
λ =268,5 nm
0,948
0,996
778
PR 16 (0,68
mg/mL)
λ = 309,5 nm
0,822
1,234
PR 12 (1 mg/mL)
λ = 312 nm
150
Entre as amostras do estado de Santa Catarina, com exceção das
amostras SC02, SC 03 e SC 05 que apresentaram pico de absorção
máximo em 316 nm, todas apresentaram um pico de absorção entre 292
a 296 nm (Figura 35). Os espectros de varredura das amostras do estado
do Rio Grande do Sul apresentaram praticamente o mesmo perfil das
amostras de Santa Catarina, ou seja, os extratos etanólicos de pólen
(EPE) RS 04, RS 05, RS 06, RS09 e RS10 apresentaram um pico de
absorção em 294 nm e as demais em torno de 316 nm (Figura 36).
A faixa de comprimento de onda de absorção máxima da maioria
das amostras (λ
máx
= 310 a 317,5 nm) pode ser relacionada com a banda
de absorção de flavonóides (HARBORNE, 1964; FONTANA et al., 2004;
ADELMANN, 2005).
Analisando as amostras dos extratos de pólen entre os três
estados foi possível perceber a predominância de 3 grandes tipos de
pólen (Figuras 34, 35 e 36). Além disso, em testes preliminares também
foi possível verificar que os extratos de pólen apícola de cada estado
possuíam o mesmo perfil cromatográfico por CLAE-DAD, não havendo a
necessidade de análise por CLAE-DAD e CG-EM das 36 amostras. Desta
forma, cada Estado da Região Sul foi representado por uma amostra de
pólen apícola, levando em consideração também o teor de compostos
fenólicos, flavonóides e atividade antioxidante. Sendo assim, para as
análises de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de
arranjo de diodo (CLAE-DAD) e cromatografia gasosa com espectrometria
de massas (CG-EM) foram eleitas as amostras PR 03, SC 03 e RS 09.
151
FIGURA 35 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DE SANTA CATARINA.
0,603
SC 01 (0,5 mg/mL)
λ = 292 nm
SC 02 (0,5 mg/mL)
λ = 316 nm
1,024
SC 03 (0,5 mg/mL)
λ = 317,5 nm
0,991
0,694
0,715
SC 04 (0,5 mg/mL)
λ = 311,5 nm
λ = 294,5 nm
SC 05 (0,5 mg/mL)
λ = 316,5 nm
λ = 296,5 nm
0,968
0,943
SC 06 (0,67mg/mL)
λ = 308 nm
1,310
0,805
SC 09 (0,67mg/mL)
λ = 292,5 nm
0,625
SC 10 (0,67mg/mL)
λ = 296 nm
0,651
SC 07 (0,67mg/mL)
λ = 291,5 nm
SC 08 (0,67mg/mL)
λ = 293,5 nm
0,692
152
FIGURA 36 - ANÁLISE DE VARREDURA DOS EXTRATOS DE PÓLEN
APÍCOLA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL.
1,053
RS 01 (0,67 mg/mL)
λ = 315,5 nm
0,992
RS 02 (0,67 mg/mL)
λ = 317,5 nm
RS 03 (0,5 mg/mL)
λ = 309 nm
0,590
0,699
RS 04 (0,67 mg/mL)
λ = 293 nm
0,793
RS 05 (1 mg/mL)
λ = 292 nm
λ = 271,5 nm
20 µm (x 800)
0,752
RS 06 (1 mg/mL)
λ = 292,5 nm
λ = 268 nm
0,854
0,774
RS 07 (0,5 mg/mL)
λ = 309,5 nm
0,689
RS 10 (1 mg/mL)
λ = 293,5 nm
0,749
RS 09 (1mg/mL)
λ = 293 nm
λ = 270 nm
1,676
1,604
0,949
RS 08 (0,5 mg/mL)
λ = 315 nm
153
4.2.2 Cromatografia em camada delgada de alta eficiência em fase
reversa (CCDAE-FR) dos EPE
A técnica de cromatografia em camada delgada foi importante, pois
permitiu uma visualização qualitativa rápida e distinta da composição
química entre amostras.
Com base neste método foi possível verificar diferenças entre os
vários EPE. Quando as cromatoplacas de CCDAE foram reveladas sob
luz UV a 366 nm (Figuras 37, 38 e 39), observaram-se bandas
fluorescentes nas cores azuis com intensidades variadas, que também
são características de flavonóides.
Segundo Wagner et al. (1984) neste tipo de cromatoplacas a
presença de bandas com tonalidades que variam de azul claro a azul
escuro são características de compostos fenólicos, principalmente da
classe dos flavonóides, que variam de acordo com o tipo estrutural da
molécula. A CCDAE também confirmou os resultados de
espectrofotometria na região UV-visível e CLAE, de que o pólen coletado
nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, podem ser
representados pelas amostras PR 03, SC 03 e RS 09, respectivamente.
154
FIGURA 37: CROMATOPLACAS DE CCDAE-FR VISUALIZADAS SOB LUZ
ULTRAVIOLETA A 366 nm DOS EPE DO ESTADO DO PARANÁ.
FIGURA 38 - CROMATOPLACAS DE CCDAE-FR VISUALIZADAS SOB LUZ
ULTRAVIOLETA A 366 nm DOS EPE DO ESTADO DE SANTA
CATARINA
155
FIGURA 39 - CROMATOPLACAS DE CCDAE-FR VISUALIZADAS SOB LUZ
ULTRAVIOETA A 366 nm DOS EPE DO ESTADO DO RIO
GRANDE DO SUL
4.2.3 Compostos fenólicos e flavonóides totais dos EPE
As amostras de pólen da Região Sul do Brasil apresentaram uma
concentração heterogênea de compostos fenólicos. Os teores dos
compostos fenólicos totais variaram de 19,28mg a 48,90mg GAE/g de
pólen), com um valor médio de 30,77± 8,22mg, usando uma curva padrão
de ácido gálico (R
2
=0,9987) (Tabela 10 e Figura 40). Entre as amostras
analisadas, as amostras SC 03 (São Joaquim, SC), PR 03 (Palmeiras,
PR) e RS 07 (Arvorezinha, RS) apresentaram os maiores teores de
compostos fenólicos totais (48,90, 46,09 e 43,24mg GAE/g de pólen,
respectivamente) (Tabela 10 e Figura 40). Kroyer e Hegedus (2001)
encontraram 8,2mg/g de compostos fenólicos no pólen apícola in natura,
156
o qual foi aumentado para 24,6 mg/g quando as análises foram feitas a
partir do extrato etanólico.
TABELA 10 - TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS, FLAVONÓIDES
TOTAIS E ATIVIDADE DE SEQUESTRO DO RADICAL EC
50
DOS EXTRATOS
DE PÓLEN APÍCOLA.
*GAE:Equivalente em ácido gálico **SD: Desvio padrão
Médias seguidas pela mesma letra não são diferentes estatisticamente pelo teste de Tukey (p<
0,05).
Amostras
Fenólicos Totais
(mg GAE*/g ± SD**)
Flavonóides Totais
(mg quercetina/g ± SD)
EC
50
(µg/mL ± SD)
PR 01 30,92± 1,27 10,96± 0,32 1760± 90
a,b
PR 02 36,47± 2,36 9,96± 0,90 1390± 30
a,b
PR 03 46,09± 2,03 8,50 ± 0,51 1020± 10
a,b
PR 04 39,74± 1,29 11,24± 1,05 1300± 70
a,b
PR 05 25,26± 2,61 3,99± 0,45 4690± 290
a,b
PR 06 35,79± 3,24 8,30± 0,36 1410± 30
a,b
PR 07 20,14± 0,11 3,31± 0,26 3700± 210
a,b
PR 08 25,78± 1,62 5,15± 0,41 2210± 60
2β°çà”çrgóhðPR 09
1
FIGURA 40 – COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E FLAVONÓIDES TOTAIS
DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DO PÓLEN APÍCOLA.
Os teores de flavonóides totais expressos em equivalentes de
quercetina variaram de 2,10 mg a 28,33 mg de mg/g de pólen usando
uma curva padrão de quercetina (R
2
=0,9924) (Tabela 10 e Figura 40). A
amostra SC 03 que apresentou o maior teor de compostos fenólicos
também apresentou o maior teor de flavonóides (28,33mg de
quercetina/g de pólen). Esta amostra foi coletada em São Joaquim (SC),
região mais fria do país e, segundo os apicultores, sua provável origem
floral é uma mistura de vassouras, carquejas e guamirins. De acordo com
158
Collin et al. (1995), o teor de compostos voláteis (óleos essenciais,
compostos fenólicos, flavonóides) no pólen apícola é maior em regiões de
temperatura mais baixas.
A amostra do Paraná (PR 03) comportou-se de forma diferente,
pois mesmo possuindo teores elevados de compostos fenólicos (46,09
mg de GAE/g de pólen) apresentou baixo teor de flavonóides, apenas
8,50mg de quercetina/g de pólen. Isso sugere que provavelmente outros
compostos não-flavonóides, como ácidos fenólicos ou hidrocinâmicos,
estão compondo esta amostra (Tabela 10 e Figura 40).
As amostras RS 03 e RS 05 apresentaram teores de compostos
fenólicos totais e flavonóides totais muito semelhantes, com 19mg de
GAE/g de pólen e 2mg de quercetina/g de pólen, respectivamente (Tabela
10 e Figura 40).
Leja et al. (2007) estudaram os constituintes fenólicos (fenólicos
totais, fenilpropanóides, flavonóis e antocianinas) e a capacidade
antioxidante do pólen apícola de 12 espécies diferentes da região da
Krakow (Polônia). Nesse estudo foi encontrada uma grande variedade de
compostos fenólicos nas espécies analisadas e, na maioria das amostras,
a atividade antioxidante estava relacionada com o teor de
fenilpropanóides. Também foi verificado que a contribuição dos
flavonóides no teor de compostos fenólicos totais diferia
consideravelmente em função da origem botânica, de 4,78% (Lumium
purpureum) para 37,3% (Chamerion angustifolium). Serra Bonvehí et al.
(2001) determinaram compostos fenólicos totais e flavonóides totais em
159
11 amostras de pólen apícola da Espanha, sendo que quinze compostos
foram separados por CLAE, dentre os quais 13 foram identificados e
quantificados. Os compostos predominantes foram os flavonóides
quercetina e miricetina e o ácido trans cinâmico.
4.2.4 Atividade antioxidante dos extratos de pólen apícola
As propriedades biológicas dos compostos fenólicos estão
relacionadas com a atividade que cada fenol exerce sobre determinado
meio, sendo que a estrutura química dos flavonóides favorece a ação
antioxidante. A alta capacidade dos constituintes fenólicos de
neutralizarem as espécies reativas ao oxigênio está fortemente associada
a sua estrutura, tais como duplas ligações conjugadas e número de
hidroxilas no anel aromático de flavonóides e derivados do ácido cinâmico
(CAMPOS et al., 1997).
4.2.4.1 Cinética de reação do DPPH: determinação do tempo de
estabilização de reação
O radical DPPH tem sido muito usado para se avaliar a capacidade
seqüestrante de radicais livres em produtos apícolas, tais como pólen
(CAMPOS et al., 2003; SILVA et al., 2006; LEJA et al., 2007), própolis (LU
et al., 2003; KUMAZAWA et al., 2004) e mel (MEDA et al., 2005). A
atividade antioxidante do radical livre estável DPPH• se baseia na
160
transferência de elétrons de um composto antioxidante para essa espécie
radicalar, que ao se reduzir perde sua coloração púrpura.
A evolução da reação cinética depende da natureza do
antioxidante a ser testado. Podem ocorrer três tipos de comportamentos
cinéticos entre as amostras: cinética rápida, quando reagem rapidamente
com o DPPH•, atingindo o final da reação em menos de um minuto;
cinética intermediária, quando o final da reação é atingido em até trinta
minutos, e cinética lenta quando a reação demora mais de uma hora para
terminar (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
Desta forma, fez-se necessária a determinação da cinética dos
EPE, pois há substâncias antioxidantes que reagem de forma
diferenciada como, por exemplo, a vitamina C que possui uma cinética
rápida e os antioxidantes artificiais como BHT e BHA que possuem
cinéticas de reação mais lenta. Além disso, os extratos de pólen possuem
uma variedade muito grande de compostos com potencial antioxidante e,
desta forma, é imprescindível se avaliar o comportamento de cada
amostra.
A redução do radical do DPPH foi medida por meio do
monitoramento contínuo do declíneo da absorbância a 517 nm, com
simultânea mudança de coloração, de violeta para amarela, característico
do radical reduzido. Concentrações crescentes de extratos de pólen foram
submetidas à reação e, absorbância lida a cada 20 minutos até valores
estáveis de absorção.
161
As Figuras 41, 42 e 43 ilustram a cinética dos extratos de pólen
apícola do estado do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul
respectivamente, para determinação do tempo necessário de
estabilização da reação com o DPPH. Não foram observadas variações
no perfil cinético das reações de consumo do DPPH• entre as extrações
etanólicas de pólen em concentração dos extratos acima de 0,25 mg/mL e
o tempo necessário à estabilização da reação foi de 100 minutos. Desta
forma, as análises de atividade de seqüestro do radical livre DPPH foram
determinadas após 100 minutos de reação.
162
FIGURA 41 - CINÉTICA DE REDUÇÃO DO DPPH (PORCENTAGEM DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE) DAS AMOSTRAS DE
PÓLEN DO ESTADO DO PARANÁ EM VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DO EXTRATO; AMOSTRAS a) PR 01; b) PR 02; c) PR 03;
d) PR 04; e) PR 05; f) PR 06; g) PR 07; h) PR 08; i) PR 09; j) PR 10; k) PR 11; l) PR 12; m) PR 13; n) PR 14; o) PR 15; p) PR 16.
a
b
c
a
d
a
e
a
f
a
g
g
h
g
i
g
j
a
k
m
l
m
m
n
n
o
o
p
p
q
163
FIGURA 42 -
CINÉTICA DE REDUÇÃO DO DPPH (PORCENTAGEM DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE) DAS AMOSTRAS DE PÓLEN DO
ESTADO DE SANTA CATARINA EM VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DO EXTRATO; AMOSTRAS a) SC 01; b) SC 02; c) SC 03; d)
SC 04; e) SC 05; f) 06; g) SC 07; h) SC 08; i) SC 09; j) SC 10.
a
b
a
c
a
d
a
e
a
f
a
g
a
h
a
i
j
a
164
FIGURA 43 -
CINÉTICA DE
REDUÇÃO
DO DPPH
(PORCENTAGEM DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE) DAS AMOSTRAS DE PÓLEN DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL EM
VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DO EXTRATO; AMOSTRAS a) RS 01; b) RS 02; c) RS 03; d) RS 04; e) RS 05; f) RS 06; g) RS 07;
h) RS 08; i) RS 09; j) RS 10.
a
b
c
d e
f
g
h
i
j
165
4.2.4.2 Atividade de Seqüestro do Radical Livre DPPH
Seguidamente a avaliação da cinética de reação, a atividade
antioxidante foi expressa em termos de EC
50
, ou seja, a concentração
mínima necessária para o antioxidante reduzir em 50% o DPPH inicial da
reação no tempo em que o extrato atingiu a estabilidade. Quanto menor o
seu valor, maior é a capacidade antioxidante dos extratos de pólen
apícola e, para simplificar, vários autores (KROYER e HEGEDUS, 2001;
MEDA et al., 2005) têm expressado seus resultados em ARP (atividade
redutora potencial), ou seja, o inverso da EC
50
.
A Figura 44 apresenta um exemplo do cálculo da meia vida (EC
50
),
feita por meio de uma equação de regressão. Partindo-se do princípio de
que a reação dos polifenóis com o radical DPPH• é de primeira ordem,
foram plotados gráficos que expressam a atividade antioxidante pelo
tempo utilizando a fórmula de Mensor et al. (2001).
%AA = 100 -{ [( Abs
amostra
– Abs
branco
) X 100] / Abs
controle
}
FIGURA 44: EXEMPLO DE GRÁFICO PARA O CÁLCULO DO EC
50
.
EC 50 PR 01
y = 23,
Os valores de EC
50
para os extratos de pólen variaram de 810±60 a
4690±290 µg/mL, com um valor médio de 1920±103 µg/mL (Figura 45 e
Tabela 10). O pólen de Santa Catarina apresentou os menores valores de
EC
50
e, consequentemente, maior atividade antioxidante em termos de
seqüestro do radical livre DPPH•. Segundo Campos et al. (2003), a
atividade antioxidante do pólen é em grande parte função de compostos
fenólicos e flavonóides presentes que possuem atividade de seqüestro de
radicais livres, embora outros constituintes como proteínas e vitaminas
também possam contribuir para essa propriedade. Esses autores
encontraram valores de EC
50
que variaram de 40 a 500 µg/mL em
amostras de pólen coletadas em Portugal e Nova Zelândia.
Os resultados da atividade antioxidante das amostras do sul do
Brasil foram superiores aos encontrados por Meda et al. (2005), que
analisaram 27 amostras de diferentes origens geográficas da localidade
de Burkina Faso (localizado na África) e encontraram um valor médio de
EC
50
de 10,60± 7,30mg/mL.
167
FIGURA 45 – ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (EC
50
) DOS EXTRATOS DE
PÓLEN APÍCOLA
Os valores de EC
50
encontrados para os controles positivos BHT,
BHA e α-tocoferol foram de 70µg/mL, 50µg/mL e 30µg/mL,
respectivamente (Figura 45). Entretanto, estas substâncias foram
utilizadas puras e são reconhecidas como antioxidantes de alta
capacidade de seqüestro de radicais livres. Desta forma, as amostras de
pólen brasileiro além de serem uma boa reserva nutricional de proteínas,
carboidratos e minerais podem também ser boa fonte de compostos
fenólicos com atividade antioxidante.
168
Entre as amostras de pólen apícola do Estado do Paraná, os
pólens que apresentaram maior e menor atividade antioxidante foram
respectivamente o da região de Palmeira (PR 03) e de Pato Branco (PR
05). Essa maior atividade antioxidante está provavelmente relacia
BHT (butil hidroxitolueno), BHA (butil hidroxianisol) e α-tocoferol na
concentração final de 90 µg/mL. A porcentagem de atividade antioxidante
(%AA) foi determinada segundo a fórmula de Mensor et al. (2001).
A atividade antioxidante dos extratos de pólen variou de 30,54% a
94,73%, com uma média de 73,44 ±21,10%. O alto coeficiente de
variação (28,73%) pode ser justificado pela diferenças na origem floral
entre as amostras de pólen e pela alta sensibilidade do método
empregado (Tabela 11).
170
TABELA 11 – PORCENTAGEM DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS
EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA (EPE) PELO MÉTODO DO DPPH
EPE % AA *
PR 01 67, 51± 0, 67
PR 02 90, 30 ± 0, 30
PR 03 94, 73± 0, 34
PR 04 92, 60± 0, 53
PR 05 31, 02± 0, 84
PR 06 91, 41± 0, 34
PR 07 40, 74± 0, 11
PR 08 63, 78± 0, 33
PR 09 92, 42± 0, 38
PR 10 92, 71± 0, 38
PR 11 54,77± 0,34
PR 12 32,75± 0,34
PR 13 66,65± 0,16
PR 14 80,44± 0,22
PR 15 56,61± 0,36
PR 16 78,41± 0,24
SC 01 69,13± 0,34
SC 02 92,43± 0,55
SC 03 92,91± 0,36
SC 04 91,98± 0,23
SC 05 92,17± 0,15
SC 06 92,31± 0,14
SC 07 60,67± 0,53
SC 08 89,50± 0,25
SC 09 92,64± 0,29
SC 10 75,81± 0,24
RS 01 92,69± 0,41
RS 02 92,03± 0,05
RS 03 50,65± 0,12
RS 04 50,53± 0,26
RS 05 35,79± 0,34
RS 06 30,54± 0,33
RS 07 73,68± 0,43
RS 08 72,29± 0,19
RS 09 93,18± 0,26
RS 10 75,97± 0,25
V
mín.
30,54
V
máx.
94,73
Média±SD
73,44±21,10
CV(%)
28,73
* média de triplicatas± SD (n=3)
% AA : α-tocoferol: 96,44± 0.44; BHA: 88,08± 0,58; e BHT: 20,68± 0,15
171
4.2.4.3 Atividade antioxidante pelo método do β-caroteno
Segundo vários autores (GORISTEIN et al., 2005; KULISIC et al.,
2004; ABDILLE et al., 2005) a medida da atividade antioxidante por meio
do método de descoloração do β-caroteno é baseada na perda da cor
amarela, devido às reações com radicais formados durante a oxidação do
ácido linoléico em uma emulsão. Neste método, o β-caroteno sofre uma
rápida descoloração na ausência de um antioxidante devido à oxidação
acoplada do β-caroteno e do ácido linoléico, os quais geram radicais
livres. Esses radicais livres atacam as moléculas de β-caroteno altamente
insaturadas. Como resultado disso, o β-caroteno é oxidado, as moléculas
menores são quebradas e subsequentemente o sistema perde o
cromóforo. A descoloração amarelada do β-caroteno pode então ser
monitorada espectrofotometricamente.
A atividade antioxidante por este método pode ser útil
especialmente na investigação de antioxidantes lipofílicos, como os óleos
essenciais. Por outro lado, se compostos polares forem testados apenas
pelo método do β-caroteno pode-se correr o risco de subestimar a
atividade antioxidante dos mesmos. Dessa forma, é necessário o uso de
outros métodos como o método do DPPH• que independe da polaridade
do substrato.
É comum observar que antioxidantes apolares, como o α-tocoferol,
são relativamente ineficientes em óleos, mas altamente eficazes em uma
emulsão água-óleo. Em contraste, um antioxidante polar como o ácido
ascórbico ou trolox (um análogo da vitamina E, solúvel em água) pode ter
172
maior eficiência em óleos do que em emulsões. Este fato tem sido
descrito como o paradoxo polar, ou seja, antioxidantes polares são mais
ativos em lipídios puros enquanto os apolares são mais ativos em
substratos polares (PORTER, 1993; FRANKEL et al., 1994).
A atividade antioxidante dos extratos de pólen apícola pelo método
do β-caroteno variaram de 69,78 a 93,12% com média de 83,60±6,56 e
coeficiente de variação de 7,85% (Figura 46).
FIGURA 46 - ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (%) PELO MÉTODO DO β -
CAROTENO- ÁCIDO LINOLÉICO
173
Pelo sistema de clareamento do β-caroteno/ácido linoléico a
atividade antioxidante do BHT (88,72%) foi estatisticamente maior que a
atividade antioxidante dos extratos de pólen apícola dos estados do
Paraná e de Santa Catarina, porém não houve diferença estatística com a
atividade antioxidante dos extratos do Estado de Rio Grande do Sul.
Embora o BHA tenha apresentado atividade antioxidante maior que os
extratos etanólicos do pólen do estado do Paraná, os extratos de pólen
dos estados de Santa Catarina e do Rio Grande do Sul apresentaram
atividade antioxidante iguais e até superiores ao antioxidante comercial
BHA, respectivamente (p<0,01%). O antioxidante α-tocoferol foi
estatisticamente superior aos extratos de pólen dos estados do Paraná e
Santa Catarina, p C-Ç’g•i
minutos o α-tocoferol apresentou um EC
50
=30µg/mL e atividade
antioxidante de 96,44 ± 0,45% e 89,68 ± 0,28% por meio dos métodos do
DPPH e β-caroteno, respectivamente (Tabela 11, Figura 45 e 46).
Em uma cinética lenta, duas horas de reação, o BHA apresentou
um EC
50
= 50 µg/mL e atividade antioxidante de 88,08 ± 0,58% e 84,29
±0,15%, pelos método do DPPH e β-caroteno, respectivamente.
Entretanto, para o BHT pode-se observar valores altos de atividade
antioxidante (88,72 ±0,92%) quando utilizado o sistema β-caroteno/ácido
linoleico, porém apenas 20,68 ± 0,15% pelo método do DPPH em uma
cinética relativamente lenta (60 minutos de reação) e EC
50
=70µg/mL,
demonstrando comportamento distinto dessa substância pelos dois
métodos de determinação da atividade antioxidante (Tabela 11, Figura 45
e 46).
Esses resultados sugerem não haver uma associação positiva
(p<0,01) entre a capacidade de seqüestro de radical livre pelo método do
DPPH e a atividade antioxidante pela sistema de clareamento do β-
caroteno-ácido linoléico. Estes dados corroboram com resultados de Liu
et al. (2007), os quais não apresentaram interdependência significativa
entre a atividade de sequestro de radical DPPH e a atividade antioxidante
pelo método do β-caroteno-ácido linoléico dos compostos fenólicos de
oriundos de Xylaria sp. de Ginkgo biloba. Segundo os autores, essas
diferenças são atribuídas aos vários mecanismos envolvidos na atividade
antioxidante, conseqüência da alta especificidade da análise dos
compostos lipofílicos (LIU et al., 2007).
175
4.2.5 Correlação entre atividade antioxidante e compostos fenólicos
Quando se analisa a relação entre a atividade antioxidante e o teor
compostos fenólicos, percebe-se muitas vezes que a literatura é
contraditória. Muitos autores encontraram uma correlação positiva entre
os compostos fenólicos e/ou flavonóides e o potencial antioxidante de
uma grande variedade de produtos alimentícios (KROYER e HEGEDUS,
2001; JAVANMARDI
et al., 2003; KULISIC et al., 2004; MEDA et al., 2005;
CARPES et al., 2007; LEJA et al., 2007) enquanto outros relatam uma
correlação muito fraca entre atividade antioxidante e compostos fenólicos
(ZHENG e WANG, 2001; ATOUI et al., 2005).
Neste estudo foi observada uma relação estatisticamente
significativa (p<0,01) entre atividade antioxidante pelo método do DPPH e
teor de compostos fenólicos totais (R=0,63) (Figura 47A) e flavonóides
totais (R=0,60) (Figura 47 B). No entanto, a variabilidade da atividade de
seqüestro do radical nas amostras de pólen apícola parece não
corresponder ao teor de compostos fenólicos totais, sendo manisfestado
atividade antioxidante pelo método do β-caroteno e o teor de compostos
fenólicos em extrato de pólen apícola de Alagoas e Paraná (União da
Vitória).
Essa variação pode ser explicada pelas diferenças no mecanismo
de ação entre os dois métodos. Existe também uma similaridade entre as
metodologias empregadas na atividade antioxidante pelo método do
radical estável DPPH e a determinação dos compostos fenólicos totais,
pois em ambos os casos há transferência de elétrons de um composto
antioxidante para um oxidante, por meio da doação de um hidrogênio.
FIGURA 47 - CORRELAÇÃO ENTRE FENÓLICOS TOTAIS E % ATIVIDADE DE
SEQÜESTRO DE RADICAL (A) E ENTRE FLAVONÓIDES
TOTAIS E % ATIVIDADE DE SEQÜESTRO DE RADICAL (B).
Essa mesma correlação foi percebida por Parejo et al. (2002) que
encontraram uma correlação positiva entre atividade de seqüestro do
radical DPPH e o teor de compostos fenólicos totais estimados pelo
177
método de Folin-Ciocalteu em ervas mediterrâneas (R= 0,70) e plantas
aromáticas (R=0,83). Estes resultados indicam que a atividade de
seqüestro do radical DPPH pode ser fundamentada com base na análise
do Folin-Ciocalteu e que esses dois métodos dependem de um
mecanismo similar, ou seja, a propensão de doação de hidrogênio.
Katsube et al. (2004) estudaram as características antioxidantes de
52 tipos de plantas do Japão através da análise da oxidação da molécula
de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e os resultados foram
correlacionados com o método de seqüestro do radical DPPH* e teor de
fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteu. Neste estudo, foi
encontrada alta correlação entre a atividade de seqüestro do radical
DPPH e o teor de compostos fenólicos totais (Folin Ciocalteu) (R=0,969) e
uma redução da correlação da oxidação da LDL com a atividade
antioxidante pelo método de seqüestro do radical DPPH (R=0,877). Isto
foi uma conseqüência da afinidade do antioxidante frente à molécula LDL
e os mecanismos característicos envolvidos nos métodos utilizados como:
atividade de seqüestro do radical livre, quelação do metal e ligação em
sítios fundamentais na molécula de LDL.
Ainda que em diversos trabalhos o conteúdo fenólico de certos
alimentos está bem correlacionado com a atividade antioxidante, o
conteúdo fenólico total não tem sido o único fator determinante da
atividade, pois outras substâncias não fenólicas contidas poderiam
também exercer tal atividade (LARRAURI et al. 1996; LARRAURI et al.,
1998).
178
4.2.6 Atividade antibacteriana dos extratos de pólen apícola (EPE)
O pólen apícola é um alimento que, além da sua qualidade
nutricional, possui compostos fenólicos com atividade antioxidante
(SERRA BONVEHÍ et al., 2001; KROYER e HEGEDUS, 2001). Apesar
disto, pouco se sabe sobre o seu potencial antimicrobiano. Desta forma,
as 36 amostras de pólen apícola da região Sul do Brasil foram submetidas
à análise de atividade antibacteriana.
Foram utilizados os métodos de difusão em ágar e concentração
inibitória mínima (CIM), contra cinco bactérias patogênicas humanas
(Bacillus subitilis ATCC 21.332, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15.442,
Streptococcus mutans Ingbritt 1600, Staphylococcus aureus ATCC 25.923
e Klebsiella pneumoniae) e quatro bactérias fitopatogênicas
(Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas vesicatoria pv vesicatoria,
Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, Pseudomonas syringae pv.
tomato).
As Figuras 48 e 49 ilustram o teste de difusão em ágar com as
bactérias Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus,
respectivamente. O teste controle utilizado demonstrou que o etanol
usado nas extrações não apresentou nenhuma ação inibitória, enquanto
que a clorexidina, usada como controle positivo, apresentou a mesma
ação com as diferentes bactérias testadas (Figura 48).
179
Todos os extratos etanólicos de pólen apícola da Região Sul do
Brasil não apresentaram inibição contra os nove microrganismos testados
e seguiram a mesma resposta que as apresentadas nas Figuras 48 e 49
(Tabela 12).
FIGURA 48 - TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR DAS AMOSTRAS DE PÓLEN
APÍCOLA (EPE) (PR 01, PR 02, SC 01, SC 02, RS 02) CONTRA
STREPTOCOCCUS MUTANS.
Clorexidina 0,12%
Etanol 70%
PR 01
PR 02
SC 01
SC 02
RS 02
Clorexidina 0,12%
Etanol 70%
PR 01
PR 02
SC 01
SC 02
RS 02
180
FIGURA 49 - TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR DAS AMOSTRAS DE PÓLEN
APÍCOLA (EPE) (RS 01, RS 02, RS 03, SC 09, SC 10)
CONTRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
181
TABELA 12 – ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE PÓLEN (EPE) PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR
* diâmetro do halo de inibição (cm)
EPE
Bactérias*
Streptococcus
mutans
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
euruginosa
Klebsiella
pneumoniae
Bacillus
subtilis
Agrobacterium
tumefaciens
Xanthomonas
vesicatoria
Xanthomonas
axonopodis
Pseudomonas
syringae
PR 01 0
Os extratos de pólen apícola também não demostraram inibição
bactericida nas concentrações testadas, para os microrganismos
utilizados neste estudo. Apesar dos extratos de pólen apícola da
Região Sul do Brasil apresentar alto teor de compostos fenólicos com
atividade antioxidante, estes não foram capazes de inibir a atividade
bacteriana pelos métodos utilizados.
Os resultados encontrados foram diferentes dos encontrados por
Basim et al. (2006), que avaliaram a atividade antibacteriana do pólen da
Turquia contra treze bactérias fitopatogênicas que causam várias pragas
em frutas e vegetais. Neste estudo o pólen apícola apresentou atividade
contra esses microrganismos e as zonas de inibição apresentaram
variações em relação a concentração de extrato de pólen utilizados. Entre
as bactérias testadas, a A. tumefaciens foi a mais sensível na
concentração de 1/5 dos extratos de pólen e a sensibilidade das bactérias
seguiram a seqüência A. tumefaciens, P. syringae pv. tomato, X.
axonapodis pv. vesicatoria > E. amylovora, P. conrrugata, R.
solanacearum, X. campestris pv. campestris > A. vitis, C. michiganensis
subsp. michiganensis > E. carotovora pv. carotovora, P. savastanoi pv.
savastanoi, P. syringae pv. phaseolicola > P. syringae pv. syringae.
Essas diferenças podem ser explicadas pelas diferenças botânicas dos
polens apícolas estudados. Pois, sabe-se que a composição química do
pólen está relacionado com a origem floral, geografia do solo e condições
climáticas.
183
4.2.7 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de
diodo (CLAE-DAD)
Após uma prévia classificação das 36 amostras dos extratos de
pólen apícola pela técnica de varredura na região UV-visível, CLAE,
CCDAE, teor de compostos fenólicos e atividade antioxidante foi possível
perceber a predominância de 3 grandes tipos de pólen. Ou seja, foi
possível verificar uma grande similaridade no perfil de absorção entre as
amostras de um mesmo Estado (Figuras 34, 35 e 36). Foram então
eleitas as amostras PR 03, SC 03 e RS 09 para avaliação do perfil
químico por cromatografia líquida de alta eficiência. A identificação dos
compostos foi realizada utilizando detector de arranjo de diodo
comparando-se o tempo de retenção, o espectro de absorção e co-
cromatografia com os padrões disponíveis.
As Figuras 50-52 demonstram uma composição complexa com
vários picos em diferentes tempos de retenção. O perfil cromatográfico
dos extratos etanólicos do pólen apícola indicou a presença de
aproximadamente 24 compostos e perfis distintos.
O extrato de pólen apícola PR 03 mostrou um perfil cromatográfico
diferenciado das demais amostras analisadas com picos mais
pronunciados no tempo de retenção em torno de 20 minutos e após 60
minutos (Figura 50).
184
FIGURA 50 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE
POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA PR 03.
Na amostra SC 03 foi possível identificar e quantificar os
flavonóides rutina e miricetina, com teores de 84,06mg/100 e
69,49mg/100g de pólen, respectivamente (Figura 51). Estes dois
compostos podem justificar a alta atividade antioxidante dessa amostra.
Concentração: 100 mg/mL com 10µL de injeção. (1), UV λ
máx
259 nm, RT = 3,46 min; (5), UV λ
máx
253 nm, RT = 18,00 min;
(7), UV λ
máx
263 nm, RT = 19,74 min; (10), UV λ
máx
319 nm, RT
= 29,54 min; (17), UV λ
máx
309 nm, RT = 37,86 min; (18), UV λ
máx
313 nm, RT = 39,48 min.
Minutes
0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
200
400
600
800
1000
mAU
0
20 0
40 0
60 0
80 0
10 00
2: 2 60 nm , 8 nm
PR3 - 100m g - 10uL (25-07-07)
PR3 - 100m g - 10uL (25-07-07)
PR 03
7
10
1
5
17
18
185
FIGURA 51 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DE EXTRATOS ETANÓLICOS
DE POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA SC 03.
O cromatograma referente ao pólen apícola da amostra RS 09
apresentou um maior número de picos (24 picos) entre as amostras
analisadas (Figura 52). Entretanto, apenas a rutina pode ser identificada
na concentração de 99,10mg /100g de pólen da amostra RS 09 (Figura
52).
A presença de rutina no pólen apícola indica a qualidade nutricional
e biológica do pólen em função de sua elevada atividade antioxidante. No
mercado europeu, uma quantidade mínima de 20mg de rutina/100g de
Concentração: 100 mg/mL com 10µL de injeção. (3), UV λ
máx
254
nm, RT = 18,00 min; (5), Rutina (84,06 mg de rutina/100 g de
pólen); (6), Miricetina (69,49 mg de miricetina/100g de pólen); (10),
UV λ
máx
351 nm, RT = 26,24 min; (20), UV λ
máx
316 nm, RT =34,52
min; (21), UV λ
máx
311 nm, RT =35,43 min; (22), UV λ
máx
297 nm,
RT =37,69 min.
Minutes
0 10 20 30 40 50 6 0 7 0
mAU
0
200
400
600
800
1000
mAU
0
200
400
600
800
1000
2: 260 nm , 8 nm
SC3 - 0 ,1m g - 10uL (26-07 -07)
SC 3 1 00 m g (26 .0 707)
SC 03
10
20
3
21
22
5
6
186
pólen é necessária para a padronização do pólen comercializado na
Espanha (SERRA BONVEHÍ et al., 2001).
FIGURA 52 - CROMATOGRAMAS EM CLAE DE EXTRATOS ETANÓLICOS
DE POLEN APÍCOLA (EPE) - AMOSTRA RS 09.
Serra Bonvehì et al. (2001) identificaram treze compostos fenólicos
no pólen apícola da Espanha, entre eles sete foram ácidos fenólicos
como: ácido 3,4-dihidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido siringico, ácido p-
cumárico, ácido o-cumárico, éster etílico do ácido 4-hidroxibenzóico, ácido
trans-cinâmico e os flavonóides rutina, quercetina, miricetina, kanferol e
isoramnetina. Leja et al. (2007) estudaram os constituintes fenólicos
Minutes
0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
mAU
0
100
200
300
400
2: 260 nm , 8 nm
RS 9 - 1 00 m g 10uL rep2 (13-07-07)
RS 9 100 m g m L .da t
RS 09
10
18
6
1
20
22
23
24
Concentração: 100 mg/mL com 10µL de injeção. (1), UV λ
máx
259 nm, RT = 3,46 min; (6), Rutina (99,10 mg de rutina/100 g de
pólen); (10), UV λ
máx
263 nm, RT = 25,08 min; (18), UV λ
máx
273
nm, RT = 31,65 min; (20), UV λ
máx
289 nm, RT = 33,64 min; (22),
UV λ
máx
296 nm, RT = 35,42 min; (23), UV λ
máx
297 nm, RT =
37,73 min; (24), UV λ
máx
267 nm, RT = 40,28 min.
187
(fenólicos totais, fenilpropanóides, flavonóis e antocianinas) de pólen
apícola de 12 espécies diferentes da região da Krakow na Polônia. Neste
estudo foi encontrada uma grande variabilidade de compostos fenólicos
nas espécies investigadas e na maioria das amostras examinadas a alta
atividade antioxidante estava relacionada ao nível de fenilpropanóides.
De acordo com essas evidências químicas, o pólen da Região Sul
do Brasil parece possuir uma composição distinta que lhe possibilita
elevada ação antioxidante (Figuras 45; 46, 50-52).
O perfil químico obtido pela técnica de CLAE/DAD demonstrou
poucos compostos com alta polaridade, provavelmente ácidos fenólicos e
uma grande variedade de compostos mais apolares, provavelmente
flavonóides. Devido à não disponibilidade de padrões, não foi possível a
identificação da maioria dos compostos presentes no pólen apícola da
Região Sul do Brasil pela técnica de CLAE/DAD.
Segundo D’arcy (2005), o UV - DAD não é o sistema de detecção
mais adequado para determinação do ácido gálico e crisina quer em 290
mn ou 340 mn. Neste caso, a análise por cromatografia líquida com
espectrômetro de massas (LC-EM) foi mais adequada.
Estudos realizados por Tomás-Barberán et al. (1989) mostraram
que o polen apícola de jara continha principalmente quercetina e
isoramnetina-3-glicosídeo, e concentrações traços de miricetina e
kaempferol-3-glicosideos. Este flavonóide é similar ao encontrado no
pólen natural de jara, sugerindo que este padrão de flavonóide pode ser
usado como marcador químico. Similarmente, o composto 8-methoxi-
188
kaempferol-3-glicosideo pode ser marcador bioquímico do pólen apícola
de almond, pois não está presente em pólens de outros vegetais. Desta
forma, as características dos padrões de flavonóides podem ser usados
como marcadores bioquímicos da planta originaria (CAMPOS et al., 1997;
TOMÁS-BARBERÁN et al., 1989).
4.2.8 Purificação dos Extratos Etanólicos de Pólen Apícola
Uma das principais dificuldades nas análises por CLAE de
compostos fenólicos e flavonóides em produtos apícolas como pólen e
mel, está principalmente na extração de flavonóides e no preparo das
amostras em função do seu alto teor de açúcar (FERRERES et al., 1994).
O fracionamento líquido-líquido produz interfaces inconvenientes, as
quais não permitem a completa recuperação dos flavonóides. Entretanto
este problema pode ser resolvido usando uma resina polimérica não
iônica Amberlite XAD-2 (FERRERES et al., 1994).
Neste estudo foi usado a resina pura Amberlite XAD-2 (Supelco,
Bellefonte, PA, USA) para a completa absorção dos compostos fenólicos
e, posterior eluição com metanol (Figura 53).
D’arcy (2005) utilizou dois métodos para extrair os compostos
fenólicos em méis com o uso de resina hidrofóbica: (1) misturando a
solução de mel com a resina XAD-2 por 10 minutos antes de empacotar
na coluna de vidro e (2) adicionando a solução de mel à resina já
empacotada (método de eluição). A recuperação de todos os compostos
189
fenólicos foi maior quando o autor usou o método de mistura da solução
de mel com a resina XAD-2.
Os flavonóides glicosilados frequentemente necessitam de hidrólise
para remover o açúcar, seja ela ácida, básica ou enzimática. Segundo
Sivam (2002), a análise de CLAE ultravioleta com detector de arranjo de
fotodiodo é o método padrão para a detecção de flavonóides.
FIGURA 53 - (A) HOMOGENEIZAÇÃO DA RESINA XAD2 COM O EXTRATO
DE PÓLEN, (B) EMPACOTAMENTO EM COLUNA E (C)
EXTRATO METANÓLICO IRRADIADO COM LUZ U.V 366 nm.
O uso de resina polimérica hidrofóbica, tipo Amberlite XAD2, se faz
muito importante na recuperação de compostos fenólicos presentes no
pólen apícola. O teor de compostos fenólicos e flavonóides dos extratos
de pólen após o uso da resina polimérica variaram de 20,17 a 33,39mg
GAE/g de pólen e 6,54 a 17,49mg de quercetina/g de pólen,
respectivamente. A amostra SC 3 apresentou a maior variação no teor de
A
B
C
190
flavonóides totais antes e após a resina Amberlitte XAD2 (28,33 e 6,54 de
mg quercetina/g de pólen), respectivamente (Tabela 13).
TABELA 13 – ANÁLISE QUÍMICA DOS EXTRATOS DE PÓLEN APÍCOLA
APÓS O USO DA RESINA HIDROFÓBICA
Extratos etanólicos de pólen apícola
Compostos
fenólicos totais
(mg GAE/g pólen
apícola)
Flavonóides
totais (mg
quercetina/g
pólen apícola)
Atividade antioxidante (%)*
Método β-
caroteno
Método DPPH
Antes** Após** Antes** Após** Antes** Após** Antes** Após**
PR 03 46,09 20,17 8,50 17,49 76,40 86,43 24,61 94,73
SC 03 48,89 33,39 28,33 6,54 79,33 89,21 40,73 92,54
RS 09 30,39 25,37 11,67 14,72 92,84 93,29 14,83 94,05
* concentração do extrato 0,5 mg/mL ; ** antes e após o uso da resina Amberlitte XAD-2
A redução no teor de compostos fenólicos após o uso da resina
(Tabela 13), provavelmente, foi devido à retirada dos compostos fenólicos
polares que puderam ser carreados na fração aquosa. Essa redução foi
também percebida nos cromatogramas dos extratos de pólen apícola
(Figura 54-56). Por outro lado, a atividade de seqüestro do radical DPPH
aumentou significativamente nos extratos de pólen apícola purificados
com resina hidrofóbica (Tabela 13). Apesar do teor de compostos
fenólicos totais ter diminuído em torno de duas vezes, a resina Amberlite
XAD2 proporcionou uma adsorção de compostos fenólicos de efetiva
atividade antioxidante, podendo ser um tratamento indicado na
caracterização de compostos fenólicos do pólen apícola.
191
A atividade antioxidante dos extratos de pólen apícola pelo método
do β-caroteno teve um acréscimo, entretanto menos significativo (Tabela
13). Provavelmente, isto aconteceu pela retirada dos compostos polares
presentes no extrato, já que o método de alguma forma é influenciado por
esses compostos. Neste método o complexo fenômeno interfacial
chamado de paradoxo polar influencia o comportamento dos
antioxidantes, pois os antioxidantes polares restantes na fase aquosa
estão mais diluídos e são desta forma, menos efetivos para proteger o
lipídeo. Koleva et al. (2002) estudaram a atividade antioxidante medida
pelo método do β-caroteno em extratos de Sideritis Labiatae da Bulgária
e, descobriram que os inibidores mais ativos do descoloramento do β-
caroteno foram principalmente os extratos apolares.
4.2.8.1 Cromatografia líquida de alta eficiência dos extratos etanólicos de
pólen apícola após o uso da resina Amberelite XAD2.
Quando se compara os cromatogramas dos extratos etanólicos de
pólen apícola (EPE) antes e após a filtração com resina Amberlite XAD2,
pode-se verificar a presença de novos picos e o desaparecimento de
outros. Os compostos que possuíam tempo de retenção inferior a 18
minutos desapareceram, provavelmente porque são mais polares e foram
arrastados após a lavagem com água (Figura 54-56). Segundo D’arcy
(2005), os novos compostos formados podem ser devido a reações
químicas de compostos como ácido clorogênico e ácido ferulico com a
resina Amberlite XAD2. Entretanto, o autor sugere maiores estudos com
192
relação e essas afirmações.
A amostra PR 03 teve apenas a retirada dos compostos com tempo
de retenção inferior a 18 minutos, sendo que após esse tempo o perfil
cromatográfico manteve-se igual ao extrato não purificado pela resina, ou
seja, sem nenhuma provável interação com a resina hidrofóbica (Figura
54).
FIGURA 54 – PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE
EXTRATOS ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA (EPE)
DA AMOSTRA PR 03 APÓS O USO DA RESINA XAD2.
A resina XAD2 possibilitou a retirada dos poucos compostos
polares presentes na amostra SC 03, que foram solubilizados e
arrastados após a lavagem com água ácida. Foi possível identificar e
quantificar os flavonóides rutina e miricetina, com teores de 77,15mg/100
Minutes
0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
mAU
0
100
200
300
400
2: 260 nm , 8 n m
PR 3 em XAD2 - 7m g - 5u L (26-07 -0 7)
PR3 em XAD2 (26.07.0 7)
PR 03
5
7
10
6
18
17
Concentração: 7mg/mL com 5µL de injeção. ( 5), UV λ
máx
252 nm, RT
= 18,34 min; (6), UV λ
máx
263 nm, RT = 18,84 min; (7), UV λ
máx
263
nm, RT = 20,04 min; (10), UV λ
máx
320 nm, RT = 29,92 min; (17), UV
λ
máx
309 nm, RT = 38,64 min; (18), UV λ
máx
313 nm, RT = 40,19 min.
193
e 23,53 mg/100g de pólen, respectivamente na amostra SC 03 (Figura
55).
FIGURA 55 – PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA DA AMOSTRA SC 03 APÓS O USO DA
RESINA XAD2.
A rutina também foi encontrada na concentração de 42,63 mg/100g
de pólen da amostra RS 09 (Figura 56). Quando se compara os
cromatogramas da amostra RS 09 antes e após o uso da resina XAD2,
constata-se que houve um deslocamento no tempo de retenção de alguns
picos (ex. pico 10 e 20) e a supressão de outros (ex. pico (24), UV λ
máx
267 nm, RT = 40,28 min) (Figura 52 e 56).
Minutes
0 1 0 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
500
600
mAU
0
100
200
300
400
500
600
2: 260 nm , 8 n m
SC3 em XAD2 - 7m g - 5uL (2 6-07-0 7 )
Sc3 XAD2 (26.07 .07 )
SC 03
6
3
10
2020
22
5
Concentração: 7mg/mL com 5µL de injeção. (3), UV λ
máx
253 nm, RT =
18,17 min; (5), Rutina (77,15 mg de rutina/100 g de pólen); (6), Miricetina
(23,53 mg de miricetina/100g de pólen); (10), UV λ
máx
351 nm, RT = 26,27
min; (20), UV λ
máx
317 nm, RT = 34,60 min; (22), ), UV λ
máx
307 nm, RT =
37,77 min.
194
FIGURA 56 – PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CLAE-DAD DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA DA AMOSTRA RS 09 APÓS O USO DA
RESINA XAD2.
Yao (2002) relatou em seus experimentos que a resina Amberlite
XAD2 não possibilitou a recuperação de ácidos fenólicos, como o ácido
gálico e o ácido elágico em soluções ácidas de méis (pH 2). D’arcy
(2005), otimizando a extração de compostos fenólicos com resina XAD2,
encontrou ácido caféico, ácido ferúlico, ácido ρ-coumárico, além de
flavonóides quercetina, hesperetina e crisina em méis da Australia.
Segundo D’arcy (2005), a recuperação de flavonóides tais como,
hesperetina e crisina foram superior a 80% com o uso da resina Amberlite
XAD2 em solução de mel. Esses resultados corroboram com os
23
Concentração: 7mg/mL com 5µL de injeção. (5), UV λ
máx
253, RT =
21,47 min; (6) Rutina (42,63 mg de rutina/100 g de pólen); (10), UV λ
máx
264 nm, RT = 25,05 min; (18), UV λ
máx
273 nm, RT = 31,63 min;
(19), UV λ
máx
290 nm, RT = 33,64 min; 20(C), UV λ
máx
296 nm, RT =
35,43 min; (22), UV λ
máx
297 nm, RT = 37,75 min; (23), UV λ
máx
267
nm, RT = 38,55 min.
Minutes
0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
mAU
0
100
200
300
400
2: 2 60 nm , 8 n m
RS 9 em XAD2 - 7m g - 5 uL rep2 (13-0 7-0 7)
RS 9 em XAD2.dat
RS 09
10
18
20
22
5
6
195
apresentados por Tomás-Barberán et al. (1992) e Martos et al. (1997).
Isto confirma que o método usado neste foi apropriado para a extração de
flavonóides em pólen apícola.
4.2.8.2 Cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas
(CG-EM) dos extratos etanólicos de pólen apícola após o uso da resina
XAD2
Os extratos etanólicos de pólen apícola purificados por meio de
resina hidrofóbica XAD-2 foram submetidos à CG-EM (Figura 57). Nesse
estudo, para a identificação dos compostos foram utilizados as bases de
dados de espectros de massas NIST107, NIST21 e WILEY139,
componentes da estação de trabalho do software CLASS-5000 versão
2.2.
A amostra PR 03 apresentou um perfil cromatográfico contendo 10
picos (Figura 57A), porém apenas 4 compostos foram identificados
(Tabela 14). Os compostos representativos da amostra foram ácidos
graxos (carboxílicos), identificados na forma de ésteres metílicos de C16
(Pico 5), C18:2 (Pico 6) e C18:3 (Pico 7), com predominância deste último
(42,4%). Estes compostos representaram 59,5% da composição total. Foi
identificado o ácido benzóico, metil éster (Pico 1) representando 3,9% da
amostra. A massa molecular e a característica espectral dos fragmentos
de cada composto da amostra PR 03 são apresentados na Tabela 14.
196
FIGURA 57 – PERFIL CROMATOGRÁFICO POR CG-EM DE EXTRATOS
ETANÓLICOS DE POLEN APÍCOLA APÓS O USO DA RESINA
XAD2. (A) PR 03; (B) SC 03; (C) RS 09.
A - PR 03
1
2
3
4
7
5
6
10
8
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
( min)
9
B - SC 03
1
2
3
4
5
6
7
9
8
%
%
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
( min)
%
C - RS 09
1
2
3
4
5
6
8
9
10
7
11
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
( min)
197
TABELA 14 – COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO
EXTRATO ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA PR 03)
Pico número* Nome TR** (min) m/z*** (%)
1 Ácido benzóico, metil éster 7,30 136 [35, M
+
], 105 (100), 77 (83), 51 (60)
2 nd**** 19,71 224 [28, M
+
], 118 (100), 209 (40), 91 (20), 179(12), 77 (12), 41(12)
3 nd 19,86 224 [32, M
+
], 118 (100), 209 (40), 41 (16), 91 (16), 77 (12), 179 (12), 193
(12), 96 (8), 65 (4)
4 nd 21,65 161 [M
+
], 43 (100), 55 (52), 79 (52), 93 (32), 105 (12), 121 (12), 135 (4),
149 (4)
5 Ácido hexadecanóico, metil éster 22,17 270 [M
+
], 74 (100), 43 (68), 87(60), 55 (16), 143 (8)
6 Ácido 9,12-octadecadienóico, metil
éster
25,38 294 [M
+
], 41 (100), 67 (92), 81 (72), 88 (55), 95 (40), 109 (12), 123 (8),
135 (8), 150 (4)
7 Ácido 9,12,15-octadecatrienóico,
metil éster
25,53 292 [M
+
], 41 (100), 55 (68), 79 (76), 93 (36), 108 (20), 121 (8), 135 (6),
149 (6)
9 nd 29,37 234 [4, M
+
], 98 (100), 41 (96), 85 (80), 55 (48), 79 (36), 112 (10), 126 (4),
154 (4), 194 (4)
10 nd 31,54 194[4, M
+
], 91(100), 117(16), 65(8)
* Relacionado ao cromatograma apresentado na Figura 57 A **Tempo de retenção (min) *** relação massa/carga **** nd: não detectado
198
A amostra SC 03 apresentou um perfil cromatográfico
relativamente simples, sendo detectados 9 picos (Figura 57 B) e
identificados apenas 5 compostos com o espectrômetro de massas
(Tabela 15). Foi Identificado os mesmos três ácidos graxos (Pico 4, 6 e 7)
observados na amostra PR 03, mudando apenas a disposição relativa
entre os picos. Desta forma, o ácido hexadecanóico, metil éster, o ácido
9,12-octadecadienóico, metil éster e o ácido 9,12,15-octadecatrienóico,
metil éster perfazem 83,6% dos compostos encontrados na amostra SC
03 (Tabela 15). Também foram identificados ácidos carboxílicos
aromáticos (ácidos fenólicos) relativos aos picos 1 e 2, contribuindo com
6,7% na composição total da amostra SC 03. A massa molecular e a
característica espectral dos fragmentos de cada composto da amostra SC
03 são apresentados na Tabela 15.
199
TABELA 15 – COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO
EXTRATO ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA SC 03)
Pico número* Nome TR** (min) m/z*** (%)
1 Ácido benzóico, metil éster 7,29 136 [32, M
+
], 105 (100), 77 (92), 51 (68)
2 Ácido 4-metóxi-benzóico, metil éster 11,66 166[24, M
+
], 135(100), 40(65), 77(32), 63(16), 92(16), 107(16)
3 nd**** 20,45 224 [24, M
+
], 118 (100), 40 (32), 209 (32), 91(20), 77(16), 193(12), 65(8),
103(8), 179 (8)
4 Ácido hexadecanóico, metil éster 22,18 143[8, M
+
], 74(100), 43 (72), 87(60), 55(36)
5 nd 23,48 157[4, M
+
], 88(100), 43(80), 55(44), 101(36), 70(20)
6 Ácido 9,12-octadecadienóico, metil
éster
25,40 294 [M
+
], 41 (100), 67 (82), 81 (64), 82 (36), 96 (32), 110 (12), 135 (4),
150 (4)
7 Ácido 9,12,15-octadecatrienóico,
metil éster
25,51 292 [M
+
], 41 (100), 55 (72), 79 (56), 95 (28), 108 (12)
8 nd 25,60 137[M
+
], 41(100), 55(96), 69(44), 83(28), 97(16), 110(8)
9 nd 26,61 150[M
+
], 41(100), 67(84), 55 (80), 81(60), 95(36), 110(12)
200
* Relacionado ao cromatograma apresentado na Figura 57 B **Tempo de retenção (min) *** relação massa/carga **** nd: não detectado
201
A amostra RS 09, apresentou um perfil cromatográfico
representado por 11 compostos dos quais 8 puderam ser identificados por
meio do espectrômetro de massas (Figura 57C, Tabela 16). Foram
identificados dois ácidos fenólicos (Picos 2 e 3) representando 15,3% da
composição da amostra, sendo que o composto relativo ao pico 2 (ácido
benzóico, metil éster) também foi detectado na amostra PR 03 e SC 03.
Foram identificados os mesmos três ácidos graxos (Pico 6, 8 e 9)
encontrados nas amostras PR 03 e SC 03, os quais contribuem com
70,4% da composição total. Outros ácidos também foram encontrados,
um di-ácido de cadeia menor C3 (Pico 1) C19 (Pico 10). O composto
relativo ao pico 5 com tempo de retenção de 20,45 minutos também é
comum nas três amostras, no entanto não foi possível sua identificação
(Figura 57C e Tabela 16). A massa molecular e a característica espectral
dos fragmentos de cada composto da amostra RS 09 são apresentados
na Tabela 16.
202
TABELA 16 – COMPOSTOS AVALIADOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS DO
EXTRATO ETANÓLICO DE PÓLEN APÍCOLA (AMOSTRA RS 09)
Pico número* Nome TR** (min) m/z*** (%)
1 Ácido propanodióico, dimetil éster 4,63 132[M
+
], 59 (100), 101( 64), 42(52), 74(40)
2 Ácido benzóico, metil éster 7,29 136 [32, M
+
], 105 (100), 77 (92), 51(68)
3 Ácido fenilacético, metil éster 8,59 150[16, M
+
], 91(100), 65 (16), 40(8)
4 1-Dodeceno 13,29 111 [7, M
+
], 43(100), 55(76), 69(40), 83(28), 97(16)
5 nd**** 20,45 224[24, M+], 118 (100), 209(32), 91(20), 40 (16), 77 (12), 193(12),
96(8), 179(8), 165 (4)
6 Ácido hexadecanóico, metil éster 22,18 143[8, M
+
], 74(100), 43 (48), 87(60), 55(32)
7 nd 25,21 161[4, M
+
], 41(100), 79(96), 67(52), 91(48), 55(44), 105 (20), 119 (8),
133 (4), 147 (4)
8 Ácido 9,12-octadecadienóico, metil
éster
25,39 294 [M
+
], 41 (100), 67 (88), 55(84), 81 (64), 82 (37), 96 (36), 110 (12),
135 (4), 150 (4)
9 Ácido 9,12,15-octadecatrienóico,
metil éster -
25,53 292 [M
+
], 41 (100), 79 (72), 55 (68), 67(56), 93 (32), 108 (16), 121(8),
135(4), 149(4)
10 Ácido nonadecanóico, metil éster 25,97 312[M
+
], 74(100), 43(80), 87(60), 55(36), 143(8)
11
nd
26,29 161[M
+
], 41(100), 67(76), 81(56), 55(52), 95(28), 100(8), 121(8)
* Relacionado ao cromatograma apresentado na Figura 57 C **Tempo de retenção (min) *** relação massa/carga **** nd: não detectado
203
Neste estudo, os extratos etanólicos de pólen foram analisados
previamente por Infra Vermelho (IV) e pode-se observar as frequências de
estiramento do grupo OH, dos grupos COOH entre 3000 e 3500 cm
-1
confirmado pela presença da carbonila C=O do grupo carboxílicos entre
1600 e 1750 cm
-1
. Pode-se observar os ácidos graxos na forma de
ésteres metílicos, os quais são predominantes nestas amostras. Desta
forma ficou comprometida a identificação de outros compostos presentes
como os flavonoides esperados.
Os ácidos fenólicos encontrados nas três amostras podem ser
responsáveis pela alta atividade antioxidante do pólen apícola, entretanto,
muitos compostos não foram identificados pela técnica de CG-EM com a
técnica de derivatização utilizada neste estudo (metilação com
diazometano). É também sabido que esta técnica de derivatização pode
degradar compostos fenólicos, justificando desta forma a não detecção de
flavonóides nas amostras analisadas. Uma sugestão seria aplicar outro
tipo de tratamento para promover a separação dos ácidos carboxílicos
dos compostos fenólicos.
Sabe-se que um grande número de métodos analíticos é sugerido
na literatura para a separação e identificação de compostos fenólicos. A
maioria destes protocolos é baseada na técnica de cromatografia líquida
de alta eficiência com espectrofotometria na região do UV em função de
não ser necessário a derivatização antes da análise (JUSTESEN e
KNUTHESEN, 2001; MATTILA e KUMPULAINEN, 2002). Entretanto,
comparado à espectrometria de massas, o espectro UV-vis não fornece
204
dados suficientes para a identificação desses compostos (CHEN et al.,
2001; YAO et al., 2005). Desta forma a cromatografia gasosa acoplado ao
espectro de massas (CG-EM) pode fornecer resultados mais detalhados,
desde que a metodologia de derivatização esteja adequada. O estudo de
compostos fenólicos não voláteis e termolábeis por CG-EM pressupõe
sua conversão em compostos voláteis e termotolerantes por meio de uma
derivatização química apropriada (VAN BEEK, 2002; ZUO et al., 2002).
Segundo Proestos et al. (2006) a sililação é um procedimento
alternativo para a análise de CG-EM de compostos não voláteis e
termolábeis, como a maioria dos compostos fenólicos. A sililação é uma
reação de substituição nucleofílica em que um hidrogênio ativo do –OH,
-COOH, =NH, -NH
2
ou –SH é substituído por um grupo trimetilsilil. Os
compostos silils devem ser de baixa basicidade e capazes de estabilizar
uma carga negativa no estado de transição (CHU et al., 2001). Entretanto,
a silização necessita de maiores estudos na identificação dos derivados
silil, pois depende de grande habilidade e estrutura laboratorial, uso de
reagentes tóxicos e específicos como BSTFA (N, O-bis trimetilsilil
trifluoroacetamida), TMCS (trimetil clorosilano), HMDS
(hexametildisilazano), DMDCS (dimetildichlorosilano) e tolueno
(PROESTOS et al., 2006). A cromatografia gasosa de flavonóides parece
ser um tópico de interesse contínuo, pois é objeto de estudo de vários
autores (FÜZFAI e MOLN’AR-PERL, 2007; LIU et al., 2007; CHEN e ZUO,
2007).
205
A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao
espectrômetro de massas (CLAE-EM) é muito usada para a identificação
de compostos fenólicos em extratos de plantas, porém, são poucos os
laboratórios brasileiros que possuem esse equipamento com experiência
na análise de compostos fenólicos e flavonóides, além de ser uma técnica
extremamente cara. Segundo Proestos et al. (2006), o uso do CLAE-EM
fornece uma importante vantagem na combinação da capacidade de
separação do cromatógrafo líquido com o poder do espectrômetro de
massas, como um método de identificação e confirmação de compostos
químicos (PROESTOS et al., 2006).
Este estudo fomentou dados importantes com a determinação da
atividade antioxidante e a identificação e concentração de alguns
flavonóides e ácidos fenólicos nas amostras de pólen apícola da Região
Sul do Brasil. Alguns polifenóis puderam ser identificados com ajuda de
técnicas instrumentais tais como CLAE-DAD e CG-EM; mas muitos dos
compostos fenólicos não foram identificados e, desta forma, há a
necessidade de complementar este estudo com técnicas mais
apropriadas como CLAE-EM. Estes dados científicos sobre a
concentração de polifenóis totais e flavonóides em pólen apícola irão
possibilitar a completa caracterização química do pólen apícola da Região
Sul do Brasil e a sua consolidação como um alimento saudável e nutritivo
para a indústria de alimentos e consumidores.
206
207
4.2.9 Caracterização palinológica
Segundo Barth (2004) estudos sobre análise polínica de produtos
apícolas do sul do Brasil não são freqüentes. Porém, sabe-se que os méis
oriundos dessa região são predominantemente de Asteraceae
(Compositae), em especial de Senecio brasiliensis, maria-mole e Lithrea
sp. aroeira (BARTH, 1989; MORETI et al., 2002). Em outros estudos,
como de Barth (1990), Barth e Dutra (2000) verificaram que os tipos
polínicos de diversas espécies de Asteraceae, Eucalyptus, Myrcia e
Mimosa scabrella ocorrem com bastante freqüência nos méis da Região
Sul do Brasil.
As cargas de pólen analisados nesse estudo continham uma
mistura de tipos polínicos de diferentes espécies florais, cuja coloração
variou de amarelo claro até cores mais escuras como o roxo e marrom.
Foram identificados 22 tipos polínicos nas 36 amostras de pólen apícola
da região Sul do Brasil (Tabelas 17, 18 e 19). Com exceção da amostra
PR 12 que se caracterizou como monofloral, todas as demais amostras
de pólen apícola apresentaram pelo menos dois tipos polínicos. O pólen
apícola PR 12, oriundo de um dos apiários de União da Vitória (PR) tinha
na sua composição exclusivamente o pólen do tipo Baccharis
(Asteraceae) (Tabela 17).
208
TABELA 17 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO PÓLEN APÍCOLA DO ESTADO DO PARANÁ
* Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); PD = pólen dominante (> 45%); PA = pólen acessório (15 - 45 %);
PII = pólen isolado importante (3 – 15%); PIO = pólen isolado ocasional (< 3%).
*Imagem Tipos Polínicos
Amostras de pólen apícola do Estado do Paraná
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16
1
Euphorbiaceae
PD
2
Asteraceae Elephantopus
PII PIO PD PIO
3
Asteraceae Eupatorium
PD PD PA PIO PA PD PII PA
4
Asteraceae Gochnatia
PII PIO PA
5
Asteraceae Baccharis
PD PD PII
6
Sapindaceae Matayba
PII
7
Myrtaceae Eucalyptus
PII PA PA PA
8
Mimosaceae Mimosa
scabrella
PA PA PA
9
Verbenaceae Aegiphila
PII
10
Brassicaceae
PD PII PII PD PA
11
Arecaceae Tipo I
PII PD PA
12
Arecaceae Tipo 2
PA
13
Anacardiaceae Schinus
PA
14
Anacardiaceae Tipo I
PII
15
Anacardiaceae Astronium
PIO PII
16
Leguminosae
PIO
17
Boraginaceae Cordia
PA
18
Arecaceae
PD
209
TABELA 18 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DE SANTA CATARINA
*
Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); PD = pólen dominante (> 45%), PA = pólen acessório (15 - 45 %);
PII = pólen isolado importante (3 – 15%); PIO = pólen isolado ocasional (< 3%).
*Imagem Tipos Polínicos
Amostras de pólen apícola do Estado de Santa Catarina
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
1 Euphorbiaceae
PA PII PII
2 Asteraceae
Elephantopus
PII PA
3 Asteraceae Eupatorium
PD PII PA PA PA
4 Asteraceae Gochnatia
PII PII PD PII
5 Asteraceae Baccharis
PII PA PII PII
7 Myrtaceae Eucalyptus
PD PD
10 Brassicaceae
PD PII
11 Arecaceae Tipo I
PII PD
14 Anacardiaceae Tipo I
PA PII
16 Leguminosae
PA
19 Anacardiaceae Tipo 2
PA PA PII
20 Rosaceae Prunus
PD
210
TABELA 19 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS AMOSTRAS DO PÓLEN APÍCOLA DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
*
Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); PD = pólen dominante (> 45%); PA = pólen acessório (15 - 45 %);
PII = pólen isolado importante (3 – 15%); PIO = pólen isolado ocasional (< 3%).
*Imagem Tipos Polínicos
Amostras de pólen apícola do Estado do Rio Grande do Sul
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
2 Asteraceae Elephantopus PA PII PII PII PA PII PA PII
3 Asteraceae Eupatorium PA PA PII PII
4 Asteraceae Gochnatia PA
5 Asteraceae Baccharis PA
6 Sapindaceae Matahyba PA PD PD
7 Myrtaceae Eucalyptus PD PA PD
10 Brassicaceae PA PA PD PD PD
11 Arecaceae Tipo I PA PA PA PA
20 Rosaceae Prunus PIO
21 Rosaceae PA
22 Loranthaceae
Struthanthus
PII
211
Pólen das famílias Euphorbiaceae (Figura 58, imagem 1) e
Asteraceae (tipo Elephantopus) (Figura 58, imagem 2) foram dominantes
(>45%) apenas nas amostras PR 01 e PR 09, respectivamente (Tabela
17). Porém, com exceção da amostras RS 06 e RS 08, todas as amostras
do Estado do Rio Grande do Sul continham o tipo Elephantopus como
pólen acessório (15-45 %) e pólen isolado importante (3-15%) (Tabela 17;
Figura 58, imagem 2).
Nos estados do Paraná e Santa Catarina, o tipo Eupatorium
(Asteraceae) (Figura 58, imagem 3) apareceu em 50% das amostras,
enquanto que no Rio Grande do Sul o tipo Elephantopus esteve presente
em 80% das amostras (Tabelas 17,18 e 19).
O tipo polínico Mimosa scabrella, característica da região de
Curitiba PR, apareceu como pólen acessório (15-45%) apenas nas
amostras PR 02 (Lapa), PR 06 (União da Vitória) e PR 14 (Curitiba).
Entretanto, este tipo polínico não foi encontrado nos demais estados da
região Sul (Tabela 17, Figura 58, imagem 8). Os tipos polínicos presente
na amostra PR 14 estão representados na Figura 59.
Na amostra PR 11 foi detectado o tipo Gochnatia (Asteraceae)
(Tabela 17, Figura 58, imagem 4) na categoria pólen acessório e como
pólen isolado foi observado o tipo Eucalyptus (Myrtaceae) (Figura 58,
imagem 7).
As várias espécies da família Asteraeceae encontrados no pólen
apícola da Região Sul foram identificada também por meio da microscopia
de luz e estão apresentadas na Figura 60.
212
FIGURA 58: TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 1. EUPHORBIACEAE; 2. ASTERACEAE ELEPHANTOPUS; 3. ASTERACEAE EUPATORIUM; 4.
ASTERACEAE GOCHNATIA; 5. ASTERACEAE BACCHARIS; 6. SAPINDACEAE MATAYBA; 7. MYRTACEAE EUCALYPTUS; 8.
MIMOSACEAE MIMOSA SCABRELLA.
20 µm (x 800)
2
20 µm (x 900)
6
5 µm (x 2000)
3
10 µm (x 1800)
7
20 µm (x 650)
8
10 µm (x 1400)
4
10 µm (x 1000)
5
10 µm (x 1850)
1
213
FIGURA 59 - TIPOS POLÍNICOS ENCONTRADOS NA AMOSTRA
PR 14. MICROSCOPIA ÓPTICA (400 X).
FIGURA 60 - ESPÉCIES DA FAMÍLIA ASTERACEAE ENCONTRADAS NO PÓLEN
APÍCOLA DA REGIÃO SUL. MICROSCOPIA ÓPTICA, 50 µM, 400 X.
A: ASTERACEAE BACCHARIS; B: ASTERACEAE ELEPHANTOPUS;
C: ASTERACEAE EUPATORIUM; D: ASTERACEAE GOCHNATIA.
O Estado do Paraná foi o que apresentou a maior riqueza de tipos
polínicos (18 tipos), representando 82% do total identificado neste estudo.
Estes resultados corroboram com os estudos de Ramalho et al. (1991)
com Apis mellifera, que verificaram a presença de Allophylus, Baccharis,
Brasicaceae
Asteraceae Eupatorium
Mimosa scabrella
B
A
D
C
214
Campomanesia, Cecropia, Citrus, Eucalyptus, Matayba, Mimosa scabrella,
Paspalum e Vernonia em méis do Estado do Paraná, constatando se tratar de
um produto basicamente heterofloral, mas nos resultados desse autor se deu
uma maior ocorrência de Eucalyptus.
O tipo polínico Brassicaceae (Figura 59 e Figura 61, imagem 10) foi
encontrado em pólens dos três estados da Região Sul do Brasil, porém no
Estado do Rio Grande do Sul, ele apareceu em 30% das amostras como pólen
dominante (>45%). O tipo Eucalyptus foi o dominante, estando presente em
20% das amostras oriundas do Estado de Santa Catarina (Tabela 18). O
Estado de Santa Catarina também é um importante produtor de mel, pólen
apícola e própolis, porém são escassos os conhecimentos sobre os grãos de
pólen encontrado nesses produtos (BARTH, 2004).
215
FIGURA 61 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 9 VERBENACEAE AEGIPHILA; 10. BRASSICACEAE; 11. ARECACEAE TIPO I, NA SETA PRETA
PINUS; 12. ARECACEAE TIPO 2; 13. ANACARDIACEAE SCHINUS; 14. ANACARDIACEAE TIPO I; 15. ANACARDIACEAE
ASTRONIUM; 16. LEGUMINOSAE.
10
10 µm (x 1450)
9
10 µm (x 1750)
12
33
20 µm (x 850)
13
10 µm (x 1650)
14
10 µm (x 1750)
15
20 µm (x 750)
16
20 µm (x 625)
11
20 µm (x 925)
216
A Bracatinga (Mimosa scabrella) é uma planta apícola muito importante
no Estado de Santa Catarina (BARTH, 1989) e seu mel foi analisado por
Campos (1998) e classificado como mel de melato. O melato contém enzimas
derivadas de secreções das glândulas salivares e do intestino de insetos
sugadores de plantas e sempre foi classificado como mel inferior ao floral no
mercado interno, por ser pouco atrativo devido a sua cor escura e sabor
marcante, entretanto a partir dos anos 80 o mercado alemão mostrou-se
bastante interessado nesse produto (CAMPOS, 1998).
O pólen das Famílias Leguminosae (Tabela 17; Figura 61, imagem 16) e
Arecaceae (Tabela 18, Figura 62, imagem 18) apareceu individualmente em
apenas uma amostra dentre as 36 analisadas. Esses tipos polínicos foram
encontrados respectivamente na amostra PR 05, coletada na região de Pato
Branco e na PR 15, coletada na região de Balsa Nova, ambas no Estado do
Paraná.
A amostra RS 06 teve como pólen dominante o Eucalyptus, entretanto
observou-se como pólen acessório o tipo polínico da família Rosaceae inédito
entre as 36 amostras de pólen apícola analisadas (Tabela 19; Figura 62,
imagem 21).
217
FIGURA 62 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN DA REGIÃO SUL DO BRASIL. IMAGENS MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA: 17. BORAGINACEAE CORDIA; 18. ARECACEAE; 19. ANACARDIACEAE TIPO 2; 20. ROSACEAE
PRUNUS; 21. ROSACEAE; 22. LORANTHACEAE STRUTHANTHUS.
20
10 µm (x 1000)
19
10 µm (x 1000)
18
20 µm (x 800)
21
20 µm (x 650)
22
20 µm (x 850)
17
20 µm (x 500)
218
O tipo polínico Struthanthus (Loranthaceae) esteve presente
apenas como pólen isolado (3-15%) na amostra RS 09 (Tabela 19; Figura
62, imagem 22). Estes tipos polínicos podem ser vistos por microscopia
óptica na Figura 63. A Anacardiaceae Tipo 1 pode ser encontrada nas
amostras PR 5, SC4 e SC 9 como pólen isolado (Figura 63). No entanto,
a Anacardiaceae Astronium estava presente no pólen apícola da amostra
PR 05 e PR 10 também como pólen isolado (Tabela 17, Figura 64).
FIGURA 63 - TIPOS POLÍNICOS OBSERVADOS NAS CARGAS DE PÓLEN DA
REGIÃO SUL DO BRASIL. MICROSCOPIA ÓPTICA (50 µ, 400 X). A:
MYRTACEAE EUCALYPTUS; B: ROSACEAE; C: LORANTHACEAE
STRUTHANTHUS; D: ANACARDIACEAE TIPO 1.
FIGURA 64 - ANACARDIACEAE ASTRONIUM PRESENTE NO PÓLEN
APÍCOLA DAS AMOSTRAS PR 05 (< 3%) E PR 10 (3 – 15%). MICROSCOPIA
ÓPTICA (400 X).
Anacardiaceae Astronium
A B
C
D
219
5 CONCLUSÕES
Tomando-se os resultados apresentados ao longo deste estudo,
pode-se concluir que 47% das amostras analisadas estavam com teor de
umidade superior ao limite estabelecido pela Legislação Brasileira, sendo
que 60% dessas amostras eram do estado do Rio Grande do Sul,
indicando a necessidade de melhorias no processo de secagem e
armazenagem.
O teor de proteína foi bastante homogêneo entre as amostras com
média de 20,47± 2,64%. O conteúdo total de proteína variou de 15,04 a
27,69%, sendo que os teores de proteínas das amostras do Estado de
Santa Catarina foram estatisticamente diferentes as dos estados do Rio
Grande do Sul e do Paraná.
A composição mineral do pólen apícola mostrou uma grande
variação entre as amostras analisadas e os minerais predominantes
foram fósforo, potássio, cálcio e magnésio. Com exceção do teor de
zinco, os outros minerais das amostras do estado do Paraná
apresentaram-se superiores aos teores de minerais dos demais estados
da Região Sul. Isso pode ser explicado pela grande diversidade de tipos
polínicos encontrados no pólen apícola desse Estado.
O alto teor de proteínas (20,47± 2,64%), açúcares redutores
(48,79± 4,16%) e baixo teor de lipídeos encontrados (4,86± 0,65%) fazem
do pólen apícola um excelente complemento alimentar.
220
Os teores de flavonóides totais expressos em equivalentes de
quercetina variaram de 2,10 a 28,33 mg de quercetina/g de polen. O
polen de São Joaquim SC (SC 03) que apresentou maior teor de
compostos fenólicos também apresentou o maior teor de flavonóides
(28,33mg de quercetina/g de pólen).
Os valores de EC
50
para os extratos de pólen variaram de 810 a
4690µg/mL, com um valor médio de 1920µg/mL.
A atividade antioxidante dos extratos de pólen pelo método do
DPPH variou de 30,54% a 94,73%, com uma média de 73,44% e por
meio do método β-caroteno/ácido linoléico variou de 69,78 a 93,12% com
média de 83,60%.
Os antioxidantes comerciais usados na indústria alimentícia, BHT,
BHA e α-tocoferol, apresentaram valores de atividade diferentes entre os
dois métodos de atividade antioxidante empregados (DPPH e β-caroteno).
O pólen apícola do Estado do Rio Grande do Sul apresentou atividade
antioxidante estatisticamente igual ao antioxidante natural (α-tocoferol) e
ao BHT e superior BHA. O pólen apícola do Estado de Santa Catarina
apresentou atividade antioxidante igual ao BHA, porém foi
estatisticamente inferior ao α-tocoferol e ao BHT (p <0,05%).
A variabilidade da atividade de seqüestro do radical nas amostras
de pólen apícola parece não corresponder ao teor de compostos fenólicos
totais, sendo manisfestado pelo baixo coeficiente de correlação
(R
2
=0,3917). Este mesmo comportamento foi observado com a variável
flavonóides totais (R
2
=0,3604) no estudo da correlação entre atividade de
seqüestro do radical e teor de compostos fenólicos e flavonóides totais.
221
Não houve uma relação estatisticamente significativa (p>0,01)
entre teor de compostos fenólicos (R=-0,05) e flavonóides com a
porcentagem de inibição pelo método β-caroteno/ácido linoléico.
Nenhum dos extratos etanólicos de pólen apícola da Região Sul do
Brasil apresentaram inibição contra os nove microrganismos testados. Os
extratos de pólen apícola não se mostraram inibitórios nem bactericidas
nas concentrações testadas, para os microrganismos utilizados neste
experimento.
A alta atividade antioxidante dos EPE SC 03 e RS 09 podem ser
devido à presença dos flavonóides rutina e miricetina, os quais foram
identificados pela técnica de CLAE-DAD.
A atividade de seqüestro do radical DPPH aumentou
significativamente nos extratos de pólen apícola purificados com resina
hidrofóbica. Apesar do teor de compostos fenólicos totais ter diminuído
em torno de duas vezes, a resina Amberlite XAD2 proporcionou uma
adsorção de compostos fenólicos de efetiva atividade antioxidante,
podendo ser um tratamento indicado na caracterização de compostos
fenólicos do pólen apícola.
O ácido hexadecanóico, metil éster, o ácido 9,12-octadecadienóico,
metil éster e o ácido 9,12,15-octadecatrienóico identificados por CG-EM
estavam presentes nas amostras de pólen apícola analisadas.
Os ácidos fenólicos encontrados pela técnica de CG-EM nas três
amostras analisadas podem ser responsáveis pela alta atividade
222
antioxidante do pólen apícola, entretanto, muitos compostos não foram
identificados por esta técnica com a derivatização com diazometano.
Com exceção da amostra PR 12, todas as outras (35 amostras de
pólen apícola) foram classificadas como heteroflorais. O pólen apícola PR
12, oriundo de um dos apiários de União da Vitória (PR) tinha na sua
composição exclusivamente o pólen do tipo Baccharis (Asteraceae).
Foram encontrados 22 tipos polínicos nas 36 amostras de pólen
apícola analisados. Os tipos polínicos encontrados em maior número nas
amostras de pólen apícola da Região Sul foram os da família Asteraceae.
O tipo polínico Brassicaceae foi encontrado em pólens dos três
estados da Região Sul do Brasil, porém no Estado do Rio Grande do Sul,
ele apareceu em 30% das amostras como pólen dominante (>45%).
Porém, o tipo Eucalyptus foi o dominante, estando presente em 20% das
amostras oriundas do Estado de Santa Catarina. Com exceção da PR 13
todas as amostras do Estado do Paraná continham pólen da família
Asteraceae.
223
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
1) Estudar os efeitos bioativos do pólen apícola em função da sua
sazonalidade;
2) Obter frações distintas por meio de coluna aberta de sílica-gel (LH20,
sefadex etc);
3) Testar a atividade biológica das diferentes frações, analisando se há
um efeito sinergístico;
4) Isolamento de Compostos com Atividade Antioxidante por CLAE
preparative;
5) Avaliação da atividade antioxidante dos compostos isolados;
6) Identificação química dos compostos isolados por CG-MS, RMN;
7) Testar os EPE como antioxidante em vários tipos de alimentos.
224
REFERÊNCIAS
ABDALLA, A. E.; TIRZITE, D.; TIRZITE, G.; ROOZEN, J.P. Antioxidant
activity of 1,4-dihydropyridine derivatives in β-carotene-methyl linoleate,
sunflower oil and emulsions. Food Chemistry, v. 66, n.2, p.189-195,
1999.
ABDILLE, M. H.; SINGH, R.P.; JAYAPRAKASHA, G.K.; JENA, B.S.
Antioxidant activity of the extracts from Dillenia indica fruits. Food
Chemistry, v. 90, n.4, p.891-896, 2005.
ADELMANN, J. Própolis: variabilidade composicional, correlação com a
flora e bioatividade antimicrobiana/antioxidante. 2005. 186p. Universidade
Federal do Paraná, Ciências Farmacêuticas, Curitiba, PR, 2005.
Dissertação de Mestrado.
AHN, M.R.; KUMAZAWA, S.; HAMASAKA, T.; BANG, K.S.; NAKAYAMA,
T. Antioxidant Activity and constituents of propolis collected in various
areas of Korea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52,
n.24, p. 7286-7292, 2004.
ALCARÁZ, L. E.; BLANCO S.E.; PUIG, O.N.; TOMAS, F.; FERRETTI,
F.H. Antibacterial activity of flavonoids against methicilin-resistant
Staphylococcus aureus strains. Journal of Theoretical Biology, v. 205,
n. 2, p. 231-240, 2000.
ALENCAR, S. M. Estudo fitoquímico da origem botânica da própolis e
avaliação da composição química de mel de Apis melífera africanizada de
diferentes regiões do Brasil. 2002, 156p. Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, 2002.
Tese de doutorado.
225
ALENCAR, S.M.; AGUIAR, C.L.; PAREDES-GUSMÁN, J.; PARK, Y. K.
Composição química de Baccharis dracunculifolia, fonte botânica das
própolis dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Ciência Rural, v. 35,
n. 4, p. 909 - 915, 2005.
ALENCAR, S.M.; OLDONI, T. L. C CASTRO, M. L.; CABRAL, I. S. R.;
COSTA-NETO, C. M.; CURY, J. A.; ROSALEN, P. L. Chemical
composition and biological activity of a new type of Brazilian propolis: Red
propolis. Journal of Ethnopharmacology, v. 113, n. 2, p. 278-283,
2007.
ALMARAZ-ABARCA, N.; CAMPOS, M. G.; ÁVILA-REYES, J. A.;
NARANJO-JIMÉNEZ, N.; CORRAL, J. H.; GONZÁLEZ-VALDEZ, L. S.
Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybee-
collected pollen from mesquite (Prosopis juliflora, Leguminosae). Journal
of Food Composition and Analisys,v. 20, p.119-124, 2007.
ALMEIDA-MURADIAN, L. B.; PAMPLONA, L. C.; COIMBRA, S.; BARTH,
O. M. Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen
pellets. Journal of Food Composition and Analysis, v.18, p.105-111,
2005.
ALVAREZ, M. A.; ZARELLI, V. E. P. ; PAPPANO, N. B.; DEBATTISTA,
N. B., Bacteriostatic action of synthetic polyhydroxylated chalcones
against Escherichia coli. Biocell, v. 28, p.31-34, 2004.
ANDRADE, P. B.; AMARAL, M. T.; ISABEL, P.; CARVALHO, J. C.M.F.;
SEABRA, R. M.; CUNHA, A. P. Physicochemical attributes and pollen
spectrum of Portuguese heather honeys. Food Chemistry, v.66, n.4,
p.503-510, 1999.
ANTOLOVICH, M.; PRENZLER, P. D.; PATSALIDES, E.; MCDONALD,
S.; ROBARDS, K. Methods for testing antioxidant activity. Analyst, v.127,
p.183–198, 2002.
226
AOAC, Association of Analytical Chemistry, Official Methods of Analysis of
AOAC International 17
a
Edição. Gaithersburg, 2000.
ARNAO, M. B. Some methodological problems in the determination of
antioxidant activity using chromogen radicals: a practical case. Trends in
Food Science and Technology, v.11, p.419-421, 2000.
ARTS, M. J. T. J.; HAENEN, G. R. M. M.; VOSS, H.; BAST, A. Antioxidant
capacity of reaction products limit the applicability of the Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity (TEAC) assay. Food and Chemical Toxicology,
v.42, p.45 – 49, 2004.
ARUOMA, O.I. Nutrition and health aspects of free radicals and
antioxidants. Food Chemistry and Toxicology, v. 32, p.671- 683, 1994.
ASOLINI, F.C.; TEDESCO, A.; FERRAZ, C.; ALENCAR, S.M.; CARPES,
S.T. Atividade antioxidante e antibacteriana dos compostos fenólicos dos
extratos de plantas usadas como chás. Brazilian Journal Food and
Technology, v.9, p. 209-215, 2006.
ATOUI, A.K.; MANSOURI, A.; BOSKOU, G.; KEFALAS, P. Tea and herbal
infusions: their antioxidant activity and phenolic profile. Food Chemistry,
v. 89, n.1, p. 27-36, 2005.
ATROSHI, F.; RIZZO, A.; WATERMARCK, T.; ALI–VEHMAS, T.
Antioxidant nutrients and mycotoxins. Toxicology, v.180, p.151 – 167,
2003.
AZEREDO, L. C.; AZEREDO, M. A. A.; SOUZA, S. R.; DUTRA, V.M.L.
Protein contents and physicochemical properties in honey samples of Apis
mellifera of different floral origins. Food Chemistry, v.80, n.2, p.249-254,
2003.
227
BANNWART, G.C.M.C.; TOLEDO, M.C.F. Aspectos toxicológicos dos
antioxidantes BHA, BHT e TBHQ. Boletim do SBCTA, v.33, p.245-255,
1999.
BARANOWSKI, J. D.; NAGEL, C. W. Antimicrobial and antioxidant
activities of alkyl hydroxycinnamates (alkacins) in model systems.
Canadian of Institute Food Science and Technology Journal, v.17, p.
79 – 85, 1984.
BARRETO, L. M. R. C.; FUNARI, R. C.; ORSI, R.O.; DIB, A.P.S.
Produção de pólen no Brasil. Taubaté, SP, Cabral Editora e Livraria
Universitária, 100p, 2006.
BARRETO, L.M.R.C. Qualidade do pólen brasileiro. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE APICULTURA, 14, 2002, Campo Grande-MS. Anais.
Campo Grande-MS, p.283-288, 2002.
BARTH, O.M. O polen no mel no brasileiro. Rio de Janeiro. Rio de
Janeiro: Gráfica Luxor, 151p., 1989.
BARTH, O.M. Pollen in monofloral honeys from Brazil. Journal of
Apicultural Research, v.29, p.89-94, 1990.
BARTH, O.M.; DUTRA, V.M.L. Concentração de pólen em amostras de
mel de abelhas monofloral do Brasil. Geociências. Revista da
Universidade de Garulhos, n.esp., p.173-176, 2000.
BARTH, O.M. Melissopalynology in brazil: a review of pollen analysis of
honeys, propolis and pollen loads of bees. Scientia Agricola, v.61, p.342-
350, 2004.
BASIM, E.; BASIM, H, ÖZCAN, M. Antibacterial activities of Turkish pollen
and propolis extracts against plant bacterial pathogens. Journal of Food
Engineering, v.77, p.992-996, 2006.
228
BECKER, E. M.; NISSEN, L. R.; SKIBSTED, L. H. Antioxidant evaluation
protocols: Food quality or health effects. European Food Research and
Technology, Berlin, v. 219, p. 561–571, 2004.
BELL, R.R.; THORNBER, E.J.; SEET, J. L. L.; GROVES, M. T.; HO, N.
P.; BELL, D. T. Composition and Protein Quality of Honeybee-Collected
Pollen of Eucalyptus marginata and Eucalyptus calophylla. Journal of
Nutrition, v.113, n.12, p. 2479-2484, 1983.
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Lipids. Food chemistry, Berlin, Springer
Verlag, 203p., 1987.
BIRD, R. P.; DRAPER, A. H. Comparative studies on different methods of
malondyhaldehyde determination. Methods in Enzymology, v. 90, p.105-
110, 1984.
BLAIR, J. E.; BORMAN, E. K.;BYNOE, E. T.; UPDYKE, E.L.; WILLIANS,
R. E. O. Hospital acquired staphylococcal disease, recommended
procedures for laboratory investigation. Atlanta, G. A: United States
Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service,
1958.
BLOIS, M. S. Antioxidant determinations by the use of a stable free
radical. Nature, v. 181, p. 1199-1200, 1958.
BOSIO, K.; AVANZINI, C.; D'AVOLIO, A.; OZINO, O.; SAVOIA, D. In vitro
activity of propolis against Streptococcus pyogenes. Letters in applied
Microbiology, v. 31, p. 174-177, 2000.
BOGDANOV, S. Quality and standards of pollen and beeswax. Apiacta, v.
38, p.334-341, 2004.
229
CAMPOS, A. M.; ESCOBAR, J.; LISSI, E. A. The total reactive antioxidant
potential (TRAP) and total antioxidant activity (TAR) of Ilex paraguayensis
extracts and red wine. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 7,
p. 43 - 49, 1996.
CAMPOS, M.; MARKHAM, K.R.; MITCHELL, K. A.; CUNHA, A.P.D; An
approach to the characterisation of bee pollens via their flavonoid/phenolic
profiles. Phytochemical Analysis, v. 8, n.3, p.181-185, 1997.
CAMPOS, M.G, WEBBY, R.F., MARKHAM, K.R., MITCHELL, K.A.,
CUNHA, A.P. Age-induced diminution of free radical scavenging capacity
in bee pollens and the contribution of constituent flavonoids. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.51, n.3, p.742-745, 2003.
CARPES, S.T.; BEGNINI, R.; ALENCAR, S.M.; MASSON, M.L. Study of
preprarations of bee pollen extracts. Antioxidant and antibacterial activity.
Ciência e Agrotecnologia, v.31, n.6, p.1818-1825, 2007.
CHEN, H.; TAPPEL, A. L. Protection of multiple antioxidants against heme
protein oxidation and lipid peroxidaions induced by CBrCl3 in liver, lung,
heart, and spleen. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44,
n.3, p.854-858, 1996.
CHEN, H.; ZUO, Y. Identification of flavonol glycosides in American
cranberry fruit. Food Chemistry, v.101, n.4, 1357-1364, 2007.
CHEN, H.; ZUO, Y.; DENG, Y. Separation and determination of flavonoids
and other phenolic copounds in cranberry juice by high-performance liquid
cromatography. Journal of Cromatography A, v.913, p.387-395, 2001.
CHOI, C.W.; KIM, S.C.; HWANG, S.S.; CHOI, B.K.; AHN, H.J.; LEE, M.Y.
Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean
medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison. Plant
Science, v. 163, p. 1161-1168. 2002.
231
CHU, T.Y.; CHANG, C.H.; LIAO, Y.C.; CHEN, Y.C. Microwave-accelerated
derivatization processes for the determination of phenolic acids by gas
chromatography-mass spectrometry. Talanta, v.54, p.1163-1171, 2001.
COLLIN, S.; VANHAVRE, T.; BODART, E.; BOUSETA, A. Heat treatment
of pollens: impact on their volatile flavor constituents. Journal
Agricultural and Food Chemistry, v.43, n.2, p.444-448, 1995.
COOK, N.C.; SAMMAN, S. Flavonoids – Chemistry, metabolism,
cardioprotective effects, and dietary sources. Journal of Nutrition and
Biochemistry, v.7, p.66–76, 1996.
CRESPY, V.; MORAND, C. ; MANACH, C. ; BESSON, C. ; DEMIGNE, C. ;
REMESY, C. Part of quercetin absorbed in the small intestine is
conjugated and further secreted in the intestinal lumen. American
Journal of Physiology, v.277, p.120-126, 1999.
D’ARCY, B. Antioxidants in Australian Floral Honeys – Identification
of health-enhancing nutrient components. Rural Industries Research
and Development Corporation, 2005. Disponível em:
http://www.rirdc.gov.au. Acesso em: 15 de novembro de 2007.
DAPKEVICIUS, A.; VENSKUTONIS, R.; VAN BEEK, T.A.; LISSEN, J.P.H.
Antioxidant activity of extracts obtained by different isolation procedures
from some aromatic herbs grown in Lithuania. Journal of the Science of
Food and Agricultural, v.77, p.140-146, 1999.
DENISOV, E. T.; AFANAS EV, I. B. Oxidation and antioxidants in
organic chemistry and biology. Boca Raton: CRC Taylor & Francis
Group,. 981p. 2005.
DESCHNER, E. E.; RUPERO, J.; WONG, G.; NEWMARK, H. L. Quercetin
and rutin as inhibitors of azoxymethanolinduced colonic neoplasia.
Carcinogenesis, v.7, p.1193- 1196, 1991.
232
DEWICK, P. M. The biosynthesis os shikimate metabolites. Natural
Products Report. Cambridge, v. 15, n. 1, p. 15-58, 1998.
DIMMOCK, J. R. et al. Bioactivities of chalcones. Current Medicinal and
Chemistry, v. 6, p. 1125-1149, 1999.
DONADIEU, D.Y. El pollen: Terapéutica Natural, 4
a
Ed. Paris: Librairie
Maloine, 32p. 1979.
DONAVAN, J.L. ; BELL, J.R. ; KASIM-KARAKAS, S. ; GERMAN, J.B.;
WALZEM, R.L.; HANSEN, R.J. WATERHOUSE, A.L. Catechin is present
as metabolites in human plasma after consumption of red wine. Journal
of Nutrition, v.129, p.1662-1668, 2001.
DOWD, L.E. Spectrophotometric determination of quercetin. Analist
Chemical, v.31, n.7, p.1184-1187, 1959.
DUARTE, S.; KOO, H.; BOWEN, W.H.; HAYACIBARA, M.F.; CURY, J.A;
IKEGAKI, M.; PARK, Y.K.; ROSALEN, P.L. Effect of a novel type of
propolis and its chemical fractions on glucosyltransferases and on growth
and adherence of mutans streptococci. Biological and Pharmaceutical
Bulletin, v 26, n. 4, p. 527-531, 2003.
DUDOV, I.A.; MORENETS, A.A.; ARTIUKH, V.P.; STARODUB, N.F.
Immunomodulatory effect of honeybee flower pollen load. Ukraïns'kyĭ
biokhimichnyĭ zhurnal, v. 66, n.6, p.91-93, 1994.
FERRERES, F.; TOMÁS-BARBERÁN, F.A.; SOLER, C.; GARCÍA-
VIGUERA, C.; ORTIZ, A.; TOMÁS-LORENTE, F. A simple extractive
technique for honey flavonoid CLAE analysis. Apidologie, v.25, n.1, p.21-
30, 1994.
233
FOLCH, J.; LEES, M.; STANLEY, S.G.H. A simple method for the
isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of
Biology and Chemistry, v.226, p.497–509, 1957.
FONTANA, J. D.; ADELMANN, J.; PASSOS, M.; MARASCHIN, M.;
LACERDA, C. A.; LANÇAS, F.M. Propolis: chemical micro-heterogeneity
and bioactivity. In: New Jersey: Humana press, p. 203-218, 2004.
FRANKEL, E.N. Lipid Oxidation. The Oily Press, Dundee, 1998.
FRANKEL, E.N.; MEYER, A.S. Review. The problems of using one-
dimensional methods to evaluate multifunctional food and biological
antioxidants. Journal of the Science of Food Agriculture, v.80, p.1925-
1941, 2000.
FRANKEL, E.N.; HUANG S.W.; KANNER, J.; GERMAN, J.B. Interfacial
phenomena in the evaluation of antioxidants: bulk oils versus emulsions.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.42, n.5, p.1054-1059,
1994.
FUKUMOTO, L.R.; MAZZA, G.J. Assessing Antioxidant and Prooxidant
Activities of Phenolic Compounds. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.48, n.8, p.3597–3604, 2000.
FUNARI, S.R.C. ORSI, R.O; ROCHA, H.C.; SFORCIN, J.M.; CURI, P.R.;
DIERCKX, S. M.A.G.; FUNARI, A.R.M. Composições bromatológica e
mineral do pólen coletado por abelhas africanizadas (Apis mellifera L.) em
Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil. Archivos Latinoamericanos de
Producción Animal, v.11, n.2, p.88-93, 2003.
FUNARI, S.R.C.; ROCHA, H.C.; SFORCIN, J.M.; CURI, P.R.; PEROSA,
J.M.Y. Coleta de pólen e produção de mel e própolis em colônias de
abelhas africanizadas (Apis mellifera L.). Boletim Ind. Animal, v. 55, 189-
93, 1998.
234
FÜZFAI, ZS; MOLN’AR-PERL, I. Gas chromatographic–mass
spectrometric fragmentation study of flavonoids as their trimethylsilyl
derivatives: Analysis of flavonoids, sugars, carboxylic and amino acids in
model systems and in citrus fruits. Journal of Chromatography A,
v.1149, p.88–101, 2007.
GADOW, A. ; JOUBERT,E.; HANSMANN, C. F. Comparison of the
antioxidant activity of aspalathin with that other plant phenols of rooibos
tea (Aspalathus linearis), α- tocopherol, BHT, and BHA. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.45, n.3, p.623-638, 1997.
GARCÍA, M.; PÉREZ-ARQUILLUE, C.; JUAN, T.; JUAN, M.I.; HERRERA,
A. Note: Pollen analysis and antibacterial activity of Spanish honeys. Food
Science Technology International, v.7, n.2, p.155-158, 2001.
GEBARA, E. C. E.; LIMA, L. A.; MAYER, M. P.A. Propolis antimicrobial
activity against periodontopathic bacteria. Brazilian Journal of
Microbiology, v. 33, n.4, 2002.
GORISTEIN, S.; DRZEWIECKI, J.; LEONTOWICZ, H.; LEONTOWICZ,
M.; NAJMAN, K.; JASTRZEBSKI, Z.; ZACHWIEJA, Z.; BARTON, H.;
SHTABSKY, B.; KATRICH, E.; TRAKHTENBERG, S. Comparison of the
bioactive compounds and antioxidant potentials of fresh and cooked
Polish, krainian, and Israeli garlic. Journal of Agriculture and Food
Chemistry, v. 53, n.7, p.2726-2732, 2005.
GRAF, E.; EATON, J. W. Antioxidant functions of phytic acid. Free
Radical Biology and Medicine, v.8, n.1, p.61-69, 1990.
GREENBERGER, P. A.; FLAIS, M. D. MICHAEL, J. M.D. Bee pollen-
induced anaphylactic reaction in an unknowingly sensitized subject.
Allergy, Asthma & Immunology, v.86, n. 2, p. 239-242, 2001.
235
HALLIWELL, B. Free radicals and other reactive species in disease. In:
Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group, p. 1-7, 2001.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free Rradicals in Biology and
Medicine. 3 ed. Clarendon, Oxford, NY.254p, 2000.
HALLIWELL, B.; AESCHBACH, R.; LÖLIGER, J.; ARUOMA, O.I. The
characterization of antioxidants. Food and Chemical Toxicology, v. 33,
n.7, p. 601-617, 1995.
HAMILTON – MILER, J. M. Anticariogenic properties of tea (Camellia
sinensis). Journal of Medicine and Microbiology, v. 50, p. 299 – 302,
2001.
HARBORNE , J.B. Procedures and measurement of total phenolics. In:
Methods in Plant of Biochemistry. Harbone J.B. Ed. Academic Press,
London, UK., p.1-28, 1989.
HARBORNE, J. B. Phytochemical methods. Champman and Hall,
London, 295 p, 1973.
HARBONE, J. B. Ultraviolet spectroscopy of polyphenols. Methods in
polyphenol chemistry. J.B Pridham. In: Proceedigs of plant phenolics
group symposium, 1964.
HAVSTEEN, B. H. The biochemistry and medical significance of the
flavonoids. Pharmacology and Therapeutics, v. 96, p. 67-202, 2002.
HERTOG, M.; FESKENS, E.; HOLLMAN, P.; KATAN, M.; KROMHOUT, D.
Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the
Zutphen elderly study. Lancet, v.342, p. 1007-1011, 1993.
HODGSON, J. M. ; MORTON, L.W. ; PUDDEY, I.B. ; BEILIN, L.J. ;
CROFT, K.D. Gallic acid metabolites are markers of black tea intake in
236
humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.39, n.3, p.418-
421, 2000.
HOGG, J.S.; LOHMANN, D.H.; RUSSELL, K. E. The kinetics of reaction of
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl with phenols. Canadian Journal of
Chemical, v.39, p.1588-1594, 1961.
HUANG, S-W.; FRANKEL, E.N.; SCHWARZ, K.; AESCHBACH, R.;
GERMAN, J.B. Antioxidant activity of carnosic acid and methyl carnosate
in bulk oils and oil-in-water emulsions. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v. 44, n.10, p.2951-2956, 1996.
IKEGAKI, M. Determinação de qualidade de propolis de Apis mellifera
africanizada da região sul do Brasil: avaliação de algumas propriedades
físico-químicas e biológicas da própolis, 74p, 2001. Universidade Estadual
de Campinas, Campinas, 2001. Tese de Doutorado.
INAMORI, Y. et al.
KATSUBE, T.; TABATA, H.; OHTA, Y.; YAMASAKI, Y.; ANUURAD, E.;
SHIWAKU, K.; YAMANE, Y. Screening for antioxidant activity inedible
plant products: comparison of low-density lipoprotein oxidation assay,
DPPH radical scavenging assay, and Folin-Ciocalteu assay. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.52, n.8, p.2391-2396, 2004.
KEKRER, J.P. Free radicals as mediators of tissue injury. Critical
Reviews Toxicology, v.23, p.21- 48, 1993.
KOLEVA, I.I.; VAN BEEK, T.A.; LINSSEN, J.P.H.; GROOT, A.;
EVSTATIEVA, L.N. Screening of plant extracts for antioxidant activity: a
coparative study on three testing methods. Phytochemical AnalysP1ĭ
KUHNLE, G.;CHOWRIMOOTOO, G..; SCHROETER, H. ; DEBNAM, E.S. ;
KAILA, S. ; RICE-EVANS, C. ; HAHN, U. Resveratrol is absorbed in the
small intestine as resveratrol glucoronide. Biochemistry Biophysic
Resourch Communitary , v.272, p.212-217, 2000.
KUJUMGIEV, A., TSVETKOVA, I., SERKEDJIEVA, Y., BANKOVA, V.,
CHRISTOV, R. E POPOV, S. Antibacterial, antuifungal and antiviral
activity of propolis of different geographic origin. Journal of
Ethnopharmacology, v. 64, p.235-240, 2000.
KULISIC, T., RADONIC, A., KATALINIC, V., MILOS, M. Use of different
methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil. Food
Chemistry, v.85, n.4, p.633-640, 2004.
KUMAZAWA, S.; HAMASAKA, T.; NAKAYAMA, T. Antioxidant activity of
propolis of various geographic origins. Food Chemistry, v.84, n.3, p.329–
339, 2004.
LARRAURI, J. A; RUPEREZ, P; CALIXTO, F. S; Antioxidant activity of
wine pomace. American Journal Enology and Viticultural, v.47, n.4,
p.369-372, 1996.
LARRAURI, J. A; SÁNCHEZ-MORENO, C; SAURA-CALIXTO, F. Effect of
temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red
and white grape pomace peels. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, n.46, n.7, p.2694-2697, 1998.
LEJA, M.; MARECZEK, A.; WYZGOLIK, G; KLEPACZ-BANIAK J.;
CZEKONSKA K. Antioxidative properties of bee pollen in selected plant
species. Food Chemistry, v.100, n.1, p.237-240, 2007.
LIU, X.; DONG, M.; CHEN, X.; JIANG, M.; LV, X.; YAN, G. Antioxidant
activity and phenolics of an endophytic Xylaria sp. from Ginkgo biloba.
Food Chemistry, v.105,n.2, p.548–554, 2007.
239
LOPES, R. M.; OLIVEIRA, T. T.; NAGEM, T. J.; PINTO, A. S.
Flavonóides. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v. 17, p. 18-22,
2000.
LOUVEAUX, J.; MAURIZIO,A.; VORWOHL, G. Methods of
melissopalynology. Bee World, v. 51, n.3, p.125-138, 1970.
LU, L.C.; CHEN, Y.W.; CHOU, C.C. Antibacterial and DPPH free radical-
scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan.
Journal of Food and Drug Analysis, v.1, p.277–282, 2003.
MACHEIX, J.J.; SAPIS, J.C.; FLEURIET, A. Phenolic compounds and
polyphenoloxidase in relation to browning in grapes and wines. Critical
Review Food Science and Nutrition, v.30, n.1, p.441-486, 1991.
MAGALHÃES, E. O. Produção de pólen apícola. Magalhães Ed.,
Itabuna, BA, CD ROOM, 2005.
MAMEDE, M.E.O.; PASTORE, G.M. Compostos fenólicos do
vinho:estrutura e ação antioxidante. Boletim do Ceppa, Curitiba, v.22,
n.2, p. 233-252, 2004.
MARCHINI, L. C.; REIS, V.D.A.; MORETI, A.C.C.C. Composição físico-
química de amostras de pólen coletado por abelhas africanizadas Apis
mellífera (Hymenoptera: Apidae) em Piracicaba, estado de São Paulo.
Ciência Rural, v.36, n.3, p.949-953, 2006.
MARCO, G.J. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of
the American Oil Chemists´ Society, v.45, p. 594-598, 1968.
MARCUCCI, M. C. Propolis: chemical composition, biological properties
and therapeutic activity. Apidologie, v. 26, p. 83-99, 1995.
240
MARCUCCI, M. C. Propriedades biológicas e terapêuticas dos
constituintes químicos da própolis. Química Nova, v. 19, n.5, p. 529-535,
1996.
MARCUCCI, M. C.; WOISKY, R. G; SALATINO, A. Uso de cloreto de
alumínio na quantificação de flavonóides em amostras de própolis.
Mensagem doce, v. 46, p.13-18, 1998.
MARQUES, A. N. Cartilha de apicultura Pólen-Cera. V.5. Ed. MEG
(Mário Editora e Gráfica Ltda), Florianópolis - SC, 72 p., 2000.
MARKHAM, K.R.; MITCHELL, K.A ; WILKINS, A.L.; DALDY, J.A; LU, Y.
CLAE and CG-MS identification of the major organic constituints in new
Zealand propolis. Phytochemistry, v.42, n.1, p. 205-211, 1996.
MATTILA, P.; KUMPULAINEN, J. Determination of free and total phenolic
acids in plant-derived foods by CLAE with diode-array detection. Journal
of Agricultural and Food Chemistry, v.50, n.13, p.3660-3667, 2002.
MARTOS, I.; COSSENTINI, M.; FERRERES, F.; TOMÁS-BARBERÁN,
F.A. Flavonoid composition of Tunisian honeys and propolis. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.45, n.8, p.2824-2829, 1997.
MAZZA, G. Functional Foods – Biochemical and Processing Aspects.
Technomic Publishing Co., Inc, Lancaster, 460 p., 1998.
MAZZA, G.; MINIATI, E. Anthocyanins in fruits, vegetables, and
grains, CRC Press, Boca Raton, FL,180p., 1993.
MEAGHER, E. A.; FITZGERALD, G. A. indices of lipid peroxidation in
vivo: Strengths and limitations. Free Radical Biology and Medicine, v.
26, p. 202-226, 2000.
241
MEDA, A.; LAMIEN, C.E.; ROMITO, M.; MILLOGO, J.; NACOULMA, O.G.;
Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in
Burkina Fasan honey, as their radical scavenging activity. Food
Chemistry, v. 91, n.3, p.571-577, 2005.
MELO, E.A.; GUERRA, N.B. Ação antioxidante de compostos fenólicos
naturalmente presentes em alimentos. Boletim da SBCTA, v.36, n.1, p.
1-11, 2002.
MENSOR, L.L.; MENEZES, F.S.; LEITÃO, G.G.; REIS, A.S.; SANTOS,
T.C.; COUBE, C.S.; LEITÃO, S.G. Screening of brazilian plant extracts for
antioxidant activity by the use of DPPH free radical method.
Phytotheraphy Research, v.15, p.127–130, 2001.
MIDDLETON, E. J. Some effects of flavonoids on mammalian cell
systems, in Flavonoids and Bioflavonoids, Farkas, L., Gabor, M., and
Kallay, F., Eds., Elsevier, Amsterdam, p.381 – 388, 1986.
MILLER, H.E. A simplified method for the evaluation of antioxidants.
Journal of the American Oil Chemists´ Society, v.Ç’gsα
OHKAWA, H. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric
acid reaction. Analytical Biochemistry, v.95, p.351-358, 1979.
OLSZEWER, E. Radicais livres em Medicina. Efrain Olszewer. 2. ed.
São Paulo: Fundo Editorial Byk, 204p, 1995.
OLTHOF, M.R.; HOLLMAN, P.C. H.; Katan, M.B. Bioavailabilities of
quercetin 3-glucoside and querecetin-4’-glucoside do not differ in humans.
Journal of Nutrition, n.130, p.1200 – 1203, 2000.
OPLETALOVÁ, V. Chalcones and their heterocyclic analogs as potential
therapeutic agents in bacterial diseases. Ceská a Slovenská Farmacie, v.
49, n. 6, p. 276-284, 2000.
ÖZCAN, M.; ÜNVER, A.; CEYLAN, D.A.; YETISIR, R. Inhibitory effect of
pollen and propolis extracts. Nahrung-Food, v.48, p.188-194, 2004.
PAREJO, I.; VILADOMAT, F.; BATISDA, J.;nROSAS-ROMERO, A.;
FLERLAGE, N.; BURILLO, J.; CODINA, C. Comparison between the
radical scavenging activity and antioxidant activity of six distilled and
nondistilled Mediterranean herbs and aromatic plants. Journal
Agricultural and Food Chemistry, v.50, n.23, p.6882-6890, 2002.
PARK, Y. K.; HIKEGAKI, M. Preparation of water and ethanolic extracts
of propolis and evaluation of preparations. Bioscience Biotechnology
and Biochemistry, v. 62, n.11, p.85-90, 1998.
PARK, Y. K.; HIKEGAKI, M., ABREU, J.A.S.; ALCICI, N.M.F. Estudo da
preparação dos extratos de própolis e suas aplicações. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. 18, n.3, 1998.
PARK, Y. K.; KOO, M. HIKEGAKI, M.; CONTADO, J. L. Comparison of the
flavonoid aglycone contents of Apis mellifera propolis from various regions
244
of Brazil. Arquivos de Biologia e Tecnologia, v. 40, n.1, p. 97-106,
1997.
PARK, Y. K.; KOO, M. H.; SATO, H. H.; CONTADO, J. L. Estudo de
alguns componentes da própolis coletada por Apis mellifera no Brasil.
Arquivos de Biologia e Tecnologia, v. 38, n.4, p. 1235-1259, 1995.
PARK, Y.K.; PAREDES-GUZMAN, J.F.; AGUIAR, C.L.; ALENCAR, S.M.;
FUJIWARA, F.Y. Chemical constituents in Baccharis dracunculifolia as the
main botanical origin of southeastern Brazilian propolis. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.52, n.5, p.1100–1103, 2004.
PAULINO, N. Disponível em:
http://www.prodapys.com.br/br/pdp_pesq_51.htm Acesso em: 22 out.
2004.
PEKKARINEN, S.S.; STOCKMANN, H.; SCHWARZ. K.; HEINONEN, M.;
HOPIA, A.L. Antioxidant activity and partitioning of phenolic acids in bulk
and emulsified methyl linoleate. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.47, n.8, p.3036-3043, 1999.
PEREIRA, A. S.; SEIXAS, F.R. M. S.; NETO, F.R.A. Própolis: 100 anos de
pesquisa e suas perspectivas futuras. Química Nova, São Paulo, v. 25, n.
2, p. 321 -326, 2002.
PETERSON, J.; DWYER, J. Flavonoids: dietary, occurrence and
biochemical activity. Nutrition Research, New York, v. 18, n. 12, p. 1995-
2018, 1998.
PIERSON, M. D.; REDDY, N. R. Inhibition of Clostridiun botulinium by
antioxidants and related phenolic compounds in comminuted pork.
Journal Food Science, v.47, p. 1926 – 1929, 1982.
245
PIETTA, P. G. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products,
v.63, p. 1035-1042, 2000.
PORTER, W.L. Paradoxical behavior of antioxidants in food and
biological systems. Toxicology e Industrial Health, v.9, p.93-122, 1993.
PORTER, W.L. Recent trends in food applications of antioxidants. In:
Autoxidation in Food and Biological Systems. Ed. Simic Plenum, New
York, 295-365 p., 1980.
PRAT, D.E.; HUDSON, B.J.F. Natural antioxidants not exploited
commercially, in Food Antioxidants. Ed. Elsevier Applied Science,
London, p.171-192, 1990.
PROESTOS, C.; CHORIANOPOULOS, N.; NYCHAS, G.-J.E.; KOMAITIS,
M. RP-CLAE analysis of the phenolic compounds of plant extracts.
Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n.4, p.1190 -1195,
2005.
PROESTOS, D.; SERELI, D.; KOMAITIS, M. Determination of phenolic
compounds in aromatic plants by RP-CLAE and GC-MS. Food
Chemistry, v.95, n.1, p.44-52, 2006.
RAGGI, M.A.; MANDRIOLI, R.; CASAMENTI, G.; MUSIANI, D.; MARINI,
M. CLAE detrmination of glutathione and other thiols in human
mononuclear blood cells. Biomedical Chromatography, v.12, p.262-266,
1998.
RAMALHO, M; KLEINERT-GIOVANNINI, A; IMPERATRIZ-FONSECA, V L
(1989) Utilization of floral resouces by species of Melipona (Apidae,
Meliponinae): floral preferences. Apidologie, v.20, p.185-195.
246
REBELLO, J.M. Avaliação da atividade antioxidante e antifúngica de
análogos sintéticos da acetofenona e pró-oxidante e antitumoral de
chalconas sintéticas, 130p. 2005. Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, 2005. Dissertação de Mestrado.
RICE-EVANS, C.A.; MILLER, N.J. Total antioxidant status in plasma and
body fluids. Methods in Enzymology, v. 234, p. 279-283, 1994.
RICE-EVANS, C.A.; MILLER, N.J.; PAGANGA, G. Structure antioxidant
activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical
Biology and Medicine, v. 20, p.933-956, 1996.
ROEDIG-PENMAN, A.; GORDON, M.H. Antioxidant properties of
myricetin and quercetin in oil and emulsions. Journal American Oil
Chemical Society, v.75, p.169-180, 1998.
ROULSTON, T.H.; CANE, J.H.; BUCHMANN, S.L. What governs protein
content of pollen: pollinator preferences, pollen pistil interactions, or
phylogeny? Ecology Monography, v.70, p.617–643, 2000.
RUGENDORFF, E.W.; WEIDNER, W.; EBELING, L. Results of treatment
with pollen extract (cernilton N) in chronic prostatitis and prostatodynia.
Brazilian Journal Urology, v.71, p.433–438, 1993.
SALOMÉ, J. A.; SALOMÉ, L. G. Manual prático de produção de pólen
apícola. Florianópolis, Secretaria do Estado do Desenvolvimento Rural e
da Apicultura (EPAGRI), 54p, 1998.
SÁNCHEZ-MORENO, C. Compuestos polifenólicos: efectos fisiológicos.
Actividad antioxidante. Alimentaria, v. 329, p. 29-40, 2002.
SCALBERT, A.; WILLIAMSON, G. Dietary intake and bioavailability of
polyphenols. Journal of Nutrition, v.130, p.2073S-2085S, 2000.
247
SERRA BONVEHÍ, J.; ESCOLÀ JORDÀ, R. Nutrient composition and
microbiological quality of honeybee-collected pollen in Spain. Journal
Agricultural and Food Chemistry, v.45, n.3, p.725-732, 1997.
SERRA BONVEHÍ, J.; SOLIVA TORRENTÓ, M.; CENTELLES LORENTE,
E. Evaluation of polyphenolic and flavonoid compounds in honeybee-
collected pollen produced in Spain. Journal Agricultural and Food
Chemistry, v.9, n.4, p.1848-1853, 2001.
SHAHIDI, F.; NACZK, M. Phenolics in food and nutraceuticals.
Capítulo 1. Biosynthesis. Classification, and Nomenclature of Phenolics in
food and nutraceuticals. Boca Raton, FL: CRC Press Ed. 558 p., 2004.
SHAHIDI, F.; WANASUNDARA, P.K.J.P.D. Phenolic antioxidants. Critical
Review Food Science and Nutrition, v.32, p. 67-103, 1992.
SHOSKES, D. A. Phytotherapy In Chronic Prostatitis, Urology, v.60,
p.35–37, 2002.
SILVA, T.M.S.; CÂMARA, C.A.; LINS, A.C.S.; BARBOSA-FILHO, J.A.;
SILVA, S.E.M.; FREITAS, B.M.; SANTOS, F.A.B. Chemical composition
and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee
Melipona subnitida Ducke. Journal of Food Composition and Analysis,
v.19, p.507–511, 2006.
SIMÕES, C. M.C.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.;
MENTZ, L. A.; PETROVICK, P.R.. Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 3 ed. Porto Alegre / Florianópolis: Ed. UFSC/ Ed. UFRGS,
833p., 2001.
SINGLETON, V. L.; JOSEPH, A.; ROSSI, J. Colorimetry of total phenolics
with phosphomolibdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal
of Enology and Viticulture, v.16, p.144-149, 1965.
248
SINGLETON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA-RAVENTOS, R.M.
Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants
by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology, v.299,
p.152-178, 1999.
SIVAM, G. Analysis of Flavonoids. Methods of analysis for functional
foods and nutraceuticals. Editora WJ Hurst. CRC Press, Baca Raton,
2002.
SOARES, D. G. Avaliação da Capacidade Antioxidante do Butil
hidroxitolueno, Propil galato, Resveratrol, Vitamina C e Vitamina E em
Sistemas Biológicos e Químicos, 2001, 178 p. Universidade de Caxias do
Sul, Caxias do Sul, RS. Dissertação de Mestrado.
SOARES, S.E. Ácidos fenólicos como antioxidantes, Revista de
Nutrição, v. 15, p. 71-81, 2002.
SOARES, D.G., ANDREAZZA, A.C., SALVADOR, M. Sequestering ability
of butylated hydroxytoluene, propyl gallate, resveratrol and vitamins C and
E against ABTS, DPPH and hydroxyl free radicals in chemical and
biological systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51,
n.10, p. 1077 – 1080, 2003.
SOMERVILLE, D.C.; NICOL, H.I. Crude protein and amino acid
composition of honey bee-collected pollen pellets from south-east
Australia and note on laboratory disparity. Australian Journal of
Experimental Agriculture, v.46, p.141-149, 2006.
SOMERVILLE, D.C. Lipid content of honey bee-collected pollen pellets
from south-east Australia. Australian Journal of Experimental
Agriculture, v.45, p.1659-1661, 2005.
SOMOGY, M. A new reagent for the determination of sugars. Journal of
Biological Chemistry, v.160, p. 61-68, 1945.
249
SORTWELL, D. El uso de antioxidantes BHA y BHT. Tecnologia de
Alimentos, v.30, n.5, p. 9-11, 1995.
STANLEY, R.G.; LINSKENS, H.F. Pollen. Biology Biochemistry
Management. Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 85p, 1974.
STROHL, M. J.; SEIKEL, M. K. Polyphenols of pine: a survey.
Phytochemistry, v. 4, n.3, p. 383-399, 1965.
TIOSAM. Estames com anteras evidentes, carregadas de pólen.
Disponível em: www.tiosam.com/enciclopédias. Acesso em: 20 de
setembro de 2007.
TOMÁS-BARBERÁN, F.A.; TOMÁS-LORENTE, F.; FERRERES, F.;
GARCIA-VIGUERA, C. Flavonoids as biochemical markers of the plant
origin of bee pollen. Journal Science Food Agricultural, v. 47, p.337-
340, 1989.
TOMÁS-BARBERÁN, F.A.; BLAZQUEZ, M.A.; GARCIA-VIGUERA, C.;
FERRERES, F.; TOMÁS-LORENT, F. A comparative study of different
amberlite XAD resins in flavonoid analysis. Phytochemistry Analysis,
v.3, p.178-181, 1992.
VAN BEEK, T.A. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts.
Journal of Cromatography A, v.967, p.21-55, 2002.
VELIOGLU, Y.S. ; MAZZA, G.; GAO, L.; OOMACH, B.D.; AntioxiMAC
single oral doses of butylated hydroxytoluene in man and rat. Food
Chemistry Toxicology, v.27, n.12, p.765-772, 1989.
VRIES, J. H. M.; HOLLMAN, P. C. H. ; VAN AMERSFOOT, I.; OLTHOF,
M. R.; KATAN, M. B. Red wine is poor source of bioavailable flavonols in
mem. Journal of Nutrition, v.131, p. 745 – 748, 2001.
WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E. M. Plant Drug Analysis: a thin
layer chromatography atlas. Berlin: Springer–Verlag, 394p. , 1984.
WARNER, K. Measuring tocopherol efficacy in fats and oils. In
Antioxidant Methodology; Aruoma, O. I., Cuppett, S. L., Eds.; AOCS
Press: Champaign, IL, p. 223-233, 1997.
WESH, S. O.; MARSTON, R. M. Nutritional Bioavailability of Zinc,
Inglett, G. E., Ed.: ACS Symposium Series 210; American Chemical
Society: Washington, DC, Chapter 2, 1983.
WEI, H.; TYE, L.; BRESNICK, E.; BIRT, D. F. Inhibitory effect of apigenin,
a plant flavonoid, on epidermal ornithine decarboxylase and skin tumor
promotion in mice. Cancer Resourch, v.50, p.499-502, 1990.
WERTZEN, G. Short comings of current strategy for toxicity testing of
food chemicals antioxidants. Food Chemistry and Toxicology, v.28,
n.11, p. 743-745, 1990.
WIESE, H. Novo manual de apicultura. Livraria e Editora Agropecuária,
Guaíba, RS, 292 p, 1995.
WILLIAMS, G.M.; IATROPOULUS, M.J.; WHYSNER, J. Safety
assessment of butyladed hydroxyanisole and butyladed hydroxytoluene as
antioxidant food additives. Food Chemistry and Toxicology, v.37, p.
1027-1038, 1999.
251
WILLIAMS, R.J.; SPENCER, J.P.; RICE-EVANS, C. Flavonoids:
antioxidants or signalling molecules? Free Radical Biology and
Medicine, v.36, n.7, p. 838-849, 2004.
WILT, T., MAC DONALD, R., ISHANI, A, 2000. Cernilton for benign
prostatic hyperplasia. Cochrane Database Systematic Reviews.
Disponível em: h tt ps://www.farrlabs.com . Acesso em em 12 de março de
2007.
YAGI, K. Lipid peroxides and human diseases. Chemistry and Physical
Lipids, v.45, p. 337-351, 1987.
YAMAGUCHI, T.; TAKAMURA, H.; MATOBA, T.; TERAO, J. CLAE
method for evaluation of the fre rdaical-scavenging activity of foods by
using DPPH. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v. 62,
p.1201-1204, 1998.
YEN, G. C.; DUH, P. D. Scavenging effect of methanolic extracts of
peanut hulls on free-radical and active-oxygen species. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.42, n.3, p.629-632, 1994.
YILDIRIM, A.; MAVI, A.; KARA, A.A. Determination of antioxidant and
antimicrobial activities of Rumex crispus L. extracts. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.49, n.8, p. 4083-4089, 2001.
YAO, L.H. Flavonoids and other polyphenols in Australian tea and honey.
2002, 165p. The University of Queensland. Sta. Lucia, Queensland,
Australia, 2002. PhD thesis.
YAO, L.; JIANG, Y.; D’ARCY, B.; SINGANUSONG, R.; DATTA, N.;
CAFFIN, N. A.; Raymont, K. Quantitative high-performance liquid
chromatography analyses of flavonoids in Australian Eucalyptus honeys.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n.2, p. 210 – 214,
2005.
252
ZHENG, W.; WANG, S.Y. Antioxidant activity and phenolic compounds in
selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Chicago,
v.49,n.11, p. 5165-5170, 2001.
ZUO, Y.; Wang, C.; Zhan, J. Separation, characterization and quantitation
of benzoic and phenolic antioxidants in American cranberry fruit by GC-
MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50, n.13, p.3789-
3794, 2002.
253
A N E X O 1.
STUDY OF PREPARATIONS OF BEE POLLEN EXTRACTS,
ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY
Ciênc. agrotec., Lavras, v. 31, n. 6, p. 1818-1825, nov./dez., 2007
254
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
