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BRUNO DUARTE ZIROLDO
ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE
Croton floribundus SPRENG. DE DIFERENTES
FRAGMENTOS DE MATA
LONDRINA
2007
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BRUNO DUARTE ZIROLDO
ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE
Croton floribundus SPRENG. DE DIFERENTES
FRAGMENTOS DE MATA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós -
Graduação, em Genética e Biologia Molecular,
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Orientador: Prof
o
. Dr. André Luis Laforga Vanzela
LONDRINA
2007
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BRUNO DUARTE ZIROLDO
ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE
Croton floribundus SPRENG. DE DIFERENTES
FRAGMENTOS DE MATA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós -
Graduação, em Genética e Biologia Molecular,
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. André Luis Laforga Vanzela
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
Profa. Dra. Maria de Fátima Pires da Silva Machado
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
Profa. Dra. Silvia Helena Sofia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
Londrina, 09 de Março de 2007.
A minha mãe e a minha irmã, dedico.
“Talvez eu seja o pior naquilo que melhor faço”.
Kurt Cobain
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................1
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................4
1.1.1 Considerações sobre Croton floribundus............................................................4
1.1.2 Caracterização da vegetação do Paraná............................................................7
1.1.3 O processo de fragmentação......................................................................................................11
1.1.4 Estratégias e ferramentas para conservação de ambientes
degradados......................................................................................................................................................13
1.1.5 Variabilidade genética e estrutura populacional................................................17
2. OBJETIVOS..........................................................................................................18
2.1 Objetivo geral..........................................................................................................................................18
2.2 Objetivos específicos............................................................................................19
ARTIGO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................23
2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................24
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................28
4. AGRADECIMENTOS.............................................................................................35
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................35
CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................................39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................40
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1: Croton floribundus. Estruturas reprodutivas: flor (A) e fruto (B) e
exemplar adulto em visão geral (C) e ampliada (D)..........................................6
Figura 2: Distribuição da vegetação no estado do Paraná: (A) ocupação
original e (B) ocupação atual...........................................................................10
ARTIGO
Figura 1: Localização dos fragmentos: Cemitério ( ), Fazenda Novo Horizonte
( ), Fazenda Doralice ( ), Mata dos Godoy ( ), Patrimônio Regina ( ) e São
Luís ( ) dentro das diferentes regiões de coleta.
Figure 1: Localization of the fragments Cemitério ( ), Fazenda Novo Horizonte
( ), Fazenda Doralice ( ), Mata dos Godoy ( ), Patrimônio Regina ( ) e São
Luís ( ) inside of the different collections’ regions...... ...................................27
Figura 2: Teste de repetibilidade para os indivíduos para 5 indivíduos
escolhidos aleatoriamente e amplificados com os primers A – 6 (branco), A –
14 (amarelo) e B – 6 (verm
.
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1: Cobertura vegetal original do estado do Paraná...............................9
ARTIGO
Tabela 1: Dados das coletas de C. floribundus realizadas no Norte do Paraná
durante os meses de março e abril de 2005.
Table 1: C. floribundus from Northern Paraná collection’s
datas................................................................................................................26
Tabela 2: Valores de AMOVA para as populações de C. floribundus coletadas
no Norte do Paraná.
Table 2: AMOVA values for C. floribundus from North Paraná state,
Brazil................................................................................................................32
Tabela 3: Valores de similaridade genética de Jaccard para as plantas de C.
floribundus amostradas em cada localidade estudada.
Table 3: Jaccard similarity values from C. floribundus in each studied region
.........................................................................................................................34
ZIROLDO, BRUNO DUARTE. Estrutura genética em diferentes populações de
Croton floribundus Spreng. de diferentes fragmentos de mata. 2007.
Dissertação de Mestrado em Genética e Biologia Molecular – Universidade Estadual
de Londrina.
RESUMO
Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae) é uma espécie arbórea tropical com
ampla distribuição pela Floresta Atlântica, um dos mais importantes e ameaçados
biomas brasileiros. Conhecida popularmente como capixingui, é uma planta pioneira
bastante comum em florestas secundárias. Apesar de seu grande potencial na
recuperação de
1
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é o país de maior biodiversidade de todo o planeta, reunindo pelo
menos 70% das espécies animais e vegetais do mesmo. Estudos de
representatividade ecológica realizados nos biomas brasileiros definem a existência
de 49 ecorregiões distribuídas ao longo dos biomas Caatinga, Cerrado e Mata
Atlântica (IBAMA, 2007a).
A Mata Atlântica concentra, desde o início de nossa história, os principais
pólos de urbanização e desenvolvimento econômico do país. Atualmente, vivem
nessa região mais de cem milhões de brasileiros, cuja maioria não tem consciência
da amplitude de distribuição, da riqueza em biodiversidade, da importância sócio-
econômica e do estado de degradação que caracteriza tal estrutura florestal. Nesse
contexto, as estratégias de conservação tanto para esse quanto para outros
ecossistemas brasileiros se limitavam até bem pouco tempo apenas à conservação
de determinadas áreas, muitas vezes reduzidas, na forma de parques ou outras
Unidades de Conservação (LINO & BECHARA, 2002). Da cobertura vegetal original
deste ecossistema, restam apenas 7,3%, das quais 0,69% estão sob áreas de
proteção especial, o que coloca a Mata Atlântica como o bioma brasileiro mais
ameaçado (IBAMA, 2007b).
Por conta de uma série de perturbações antrópicas ocorridas nos
ecossistemas naturais, um dos maiores desafios da atualidade é a conservação da
biodiversidade (VIANA & PINHEIRO, 1998). Dentre as principais conseqüências
geradas por tais perturbações, destacamos o processo de fragmentação. Tal evento
2
ocorre paralelamente à expansão antrópica e proporciona a formação de mosaicos
de habitats, incluindo fragmentos dos mais diversos tamanhos, bem como áreas
agrícolas e urbanas. De acordo com Santos (1995), estes mosaicos normalmente
apresentam uma baixa probabilidade de estabelecimento e dispersão dos indivíduos
adultos e juvenis de sua fauna. Isso acaba alterando a abundância de dispersores,
polinizadores, predadores e de patógenos de espécies vegetais, o que, por sua vez
pode prejudicar o recrutamento de plântulas.
Do ponto de vista genético, nos ambientes que exibem uma grande riqueza
de espécies arbóreas, como é o caso das florestas tropicais, se torna praticamente
impossível estudar conjunta ou separadamente todas as espécies e populações.
Assim, é fundamental escolher adequadamente as espécies a serem analisadas
para que as informações colhidas possam servir para o desenvolvimento de
estratégias de manejo e conservação de outras espécies próximas (KAGEYAMA et
al., 2003). De acordo com esse mesmo autor, o delineamento de uma boa estratégia
de conservação e manejo passa por uma escolha ou definição adequadas do
tamanho das reservas e das áreas degradadas a serem recuperadas, bem como
das espécies e do plano de coleta de sementes a serem utilizadas na sua produção
e plantio.
Uma estratégia adequada de conservação também exige uma melhor
compreensão da diversidade genética presente nas populações naturais, bem como
dos efeitos provocados pela fragmentação na estruturação das populações. Essa
estruturação consiste na alteração das freqüências alélicas entre populações
isoladas, o que pode levar à perda de diversidade e a divergência entre grupos de
uma mesma espécie. A variabilidade genética é uma das condições necessárias
para a mudança evolutiva sendo, portanto, um componente essencial no
3
desenvolvimento dos planos de conservação dos ecossistemas. Quanto maior a
variabilidade genética herdável em características adaptativas, maior a plasticidade
fenotípica dos indivíduos (CARVALHO, 1993). Logo, a curto prazo, a sua perda
poderá levar a uma redução no valor adaptativo das espécies, inviabilizando o
remanescente populacional. A longo prazo, em função da diminuição da riqueza
alélica, a capacidade de resposta às mudanças ocorridas por conta de forças
seletivas também será alterada (ELLSTRAND & ELLAN, 1993). Uma vez que os
polinizadores e dispersores são os maiores responsáveis pelo fluxo gênico entre as
populações vegetais, temos que as populações remanescentes sofrem alterações
no seu padrão de fluxo gênico, na variabilidade e na estrutura genética, bem como
no aumento da endogamia (BALLAL et al., 1994; MURCIA, 1996). Daí a importância
de estudar espécies com alta capacidade de recrutamento animal em áreas em
início de restauração, como por exemplo, Croton floribundus, uma árvore cuja flor
produz um mel saboroso, de aroma diferenciado e considerado de excelente
qualidade, e por tal motivo são constantemente visitadas por espécies de abelhas
que realizam sua polinização (LORENZI, 2002).
Com o crescente aumento das pesquisas neste campo, geneticistas
desenvolveram diversos métodos para detectar e analisar a variabilidade genética.
Hoje temos, além da eletroforese de isoenzimas, tecnologias que envolvem o uso de
marcadores moleculares baseados no DNA (RAPD, AFLP, RFLP, SSR e outros).
Tais ferramentas possibilitam uma ampla cobertura genômica (ZUCCHI, 2002),
refletindo em uma grande quantidade de informações fundamentais no estudo de
populações.
O presente estudo visa utilizar a técnica de marcadores RAPD para avaliar a
estrutura populacional de Croton floribundus (Euphorbiaceae) e a diversidade
4
genética dessa espécie em três localidades da região Norte do estado do Paraná,
todas elas contendo fragmentos remanescentes de floresta. A sua escolha é
justificada por ela fazer parte de um pool de aproximadamente 40 espécies
utilizadas no programa de reflorestamento que o Laboratório de Biodiversidade e
Restauração de Ecossistemas (LABRE) da Universidade Estadual de Londrina
desenvolve na região Norte do Paraná. Os resultados obtidos a partir dessas
análises genéticas poderão servir para a elaboração de estratégias de conservação,
bem como de modelos para outras espécies de ocorrência em habitats semelhantes
e que apresentem o mesmo tipo de comportamento, dispersão e polinização.
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1 Considerações sobre Croton floribundus
Croton floribundus Spreng. (Figura 1), pertence a família Euphorbiaceae, que
se destaca como uma das principais famílias da flora brasileira e uma das mais
complexas do ponto de vista taxonômico. Seus representantes distribuem-se ao
longo do território nacional, podendo ser encontrados cerca de 1.000 espécies de 70
gêneros. Dentre eles estão ervas, arbustos, árvores ou lianas, que geralmente
apresentam látex, folhas alternas, flores não vistosas e unissexuadas, bem como
fruto geralmente capsulado. Muitas apresentam importância econômica, como a
seringueira utilizada no ciclo da borracha, a mandioca na alimentação e a mamona,
da qual o óleo de suas sementes tem uma ampla aplicação. Outras se destacam por
5
serem ornamentais, como o bico-de-papagaio e a coroa-de-cristo, ou por possuírem
látex ou sementes tóxicas ao homem (SOUZA & LORENZI, 2005).
Os estudos mais importantes em torno desta família se devem ao fato que
seus representantes estão entre os mais comuns nas formações vegetais
brasileiras. O gênero Croton recebe destaque especial por ser particularmente
comum em quase todos os ecossistemas (SOUZA & LORENZI, 2005). Croton
floribundus, popularmente conhecida como capixingui, é de ocorrência em florestas
latifoliadas semideciduais e em regiões de altitude elevada nos estados do Rio de
Janeiro, São Paulo, Minas Gerais e Paraná. Sua altura varia de 6 a 10 metros e o
diâmetro do caule a altura do peito é de 20 a 30 centímetros. É uma planta pioneira
tolerante a áreas abertas, ocorrendo geralmente nas bordas ou no interior de matas
que sofreram ação do homem em processos de extração de madeira. Sua madeira
não é de grande valor econômico, sendo indicada apenas para caixotaria leve.
Possui dispersão de frutos do tipo autocórica e a síndrome de polinização é a
melitofilia. Floresce no período de outubro a dezembro e sofre maturação de seus
frutos em janeiro e fevereiro (LORENZI, 2002).
Em um estudo que elegeu as espécies indispensáveis para a restauração de
ambientes degradados a partir de parâmetros ecológicos, C. floribundus, se
destacou quanto aos índices densidade de indivíduos (DI), regeneração natural total
(RNT), posição sociológica relativa (PSR) e valor de importância (VI), sendo
considerada uma espécie essencial para recuperação de áreas fragmentadas
(RONDON NETO et al., 2000).
6
A
D C
B
Figura 1: Croton floribundus. Estruturas reprodutivas: flor (A) e fruto (B) e exemplar adulto
em visão geral (C) e ampliada (D).
Fonte: www.cria.org.br/eventos/tdbi/flora/presentations/PaulBerry/crotonFB
7
1.1.2 Caracterização da vegetação do Paraná
Em 1500, quando os portugueses chegaram ao Brasil, o estado do Paraná
tinha 100% de seu solo coberto por diferentes tipos de vegetação. Entretanto,
referências a essa cobertura original são escassas, se restringindo apenas a relatos
de viajantes. Apenas depois de 1930, quando o processo de desmatamento já se
encontrava bastante avançado, é que trabalhos mais completos passaram a surgir
(MEDRI & SOARES, 2002).
Os estudos de Maack (1981) e Roderjan et al. (2002) indicam que de toda a
extensão territorial do estado do Paraná, 83% de sua superfície era coberta por
florestas, sendo que os 17% restantes eram classificado como formações não-
florestais, como por exemplo, os campos, presentes nas regiões de Guarapuava e
Ponta Grossa, e os cerrados, encontrados em parcelas fragmentadas na região de
Jaguariaíva. Nessa última parcela também estava incluída a vegetação pioneira de
influência marinha (restingas), flúvio-lacustre (várzeas) e flúvio-marinha (mangues),
bem como a vegetação herbácea do alto das montanhas (campos de altitude e
vegetação rupestre) (Tabela 1). Atualmente, sabemos que por conta da
intensificação de ações executadas pelos seres humanos a partir do século XIX,
temos uma paisagem formada de mosaicos resultantes da fragmentação. Isto
implicou em uma redução significativa dessa cobertura florestal (Figura 2), onde
apenas 9% do montante original se encontra em bom estado de conservação, com o
agravante de apenas 2% destes estar localizado em áreas protegidas pelo estado.
8
As florestas do estado do Paraná representam hoje apenas cerca de 2,5% de
toda a cobertura florestal do território nacional. Porém, esse estado detém a maioria
das unidades fitogeográficas ocorrentes no País. Tais florestas, reconhecidas como
componentes do Bioma da Mata Atlântica (MAACK, 1981), podem ser classificadas
em três principais tipos (Figura 2):
Floresta Estacional Semidecidual, ocorrentes no Oeste e no
Norte do estado;
Floresta Ombrófila Mista ou Floresta de Araucária, localizada
nas regiões Leste e Sul da Região Planaltina;
Floresta Ombrófila Densa, distribuída ao longo do litoral e
Serra do Mar.
Este trabalho se concentrou na Região Norte do estado, mais
especificamente na bacia do baixo rio Tibagi, onde a altitude não ultrapassa 800
metros. A vegetação dominante é a floresta estacional semidecidual, que após sofrer
um processo intenso de fragmentação, hoje é constituída de uma rede de mosaicos
florestais que em sua totalidade representam apenas 2-4% da área originalmente
ocupada (IPARDES, 1993).
Ai
9
alterações físicas e biológicas que se observa na faixa de mata em contato com
outro tipo de ambiente (geralmente pastagens ou áreas abertas).
Tabela 1: Cobertura vegetal original do estado do Paraná
Tipo de vegetação Área em km
2
Mata pluvial subtropical-tropical 94044
Mata de araucária nos planaltos e na
região da mata subtropical acima de
500m
73780
Campos limpos e campos cerrados
(estepes de gramínea baixa)
30532
Vegetação das várzeas e pântanos 17610
Vegetação das praias ilhas, restingas e
vegetação das regiões altas da serra
529
Área das baías com faixa de mangue 557
Total
201203
Fonte: Modificado de Maack (1981).
10
Figura 2: Distribuição da vegetação no estado do Paraná: (A) ocupação original e (B) ocupação atual.
Fonte: Modificado de http://www.rbma.org.br/rbma/images/mapa_area_reserva.gif
A
B
11
1.1.3 O processo de fragmentação
A fragmentação dos ecossistemas, que surge em decorrência de processos
que envolvem a expansão das fronteiras e o desenvolvimento humano, traz uma
série de prejuízos (VIANA, 1990), tais como o isolamento de populações e
alterações nos padrões de fluxo gênico (YOUNG et al., 1996; NASON et al., 1998).
Esse processo é hoje tido como o grande pivô da crise global de biodiversidade
(OLIVEIRA, 2000). E, a exploração madeireira indiscriminada é uma prática que tem
contribuído muito para a perda de biodiversidade. Estudos como os realizados por
Vidal et al., em 1998, utilizando técnicas de exploração de madeira planejada e não
planejada na Amazônia demonstraram que ambos os tipos de ações produzem um
impacto negativo sobre a diversidade e a estrutura das populações de plantas. A
exploração planejada reduz em cerca de 4% o número de espécies, enquanto que a
não planejada chega a 7,4%.
Colli et al. (2003) realizaram um grande estudo relacionado à fragmentação
dos ecossistemas brasileiros e seus efeitos sobre a biodiversidade. Tais efeitos são
colocados a seguir:
a) Efeitos de borda e do tipo de matriz: fragmentos de
ecossistemas considerados abertos, como é o caso de florestas
estacionais e cerrados estão menos sujeitos aos efeitos de borda,
quando comparados com os fragmentos fechados, como as florestas
úmidas. Vale ainda ressaltar que a complexidade estrutural, o tipo e
intensidade do uso da área e a presença de ambientes sucessionais
12
em torno dos fragmentos podem auxiliar na manutenção pelo menos
das espécies menos exigentes.
b) Efeitos da qualidade e estrutura dos fragmentos: as
diferentes formas de utilização de um fragmento podem levar à
alterações significativas em sua estrutura. A exploração seletiva de
madeira, a redução na densidade de famílias vegetais bem como de
espécies dependentes das mesmas (as aves e mamíferos frugívoros,
por exemplo), a redução do banco de sementes por queimadas e pelo
emprego de agrotóxicos, além de fatores internos dos fragmentos
como o número de populações e espécies, podem afetar diretamente a
manutenção de espécies mais exigentes.
c) Efeitos do isolamento dos fragmentos: a probabilidade
de migração de indivíduos entre fragmentos vizinhos leva em
consideração a distância a ser percorrida bem como a estrutura dos
próprios fragmentos. Isso aparece bem claramente quando
comparamos a similaridade faunística entre fragmentos de Floresta
Atlântica. O mesmo pode ser observado na Floresta Estacional
Decidual, onde os fragmentos maiores e mais próximos tendem a ter
similaridade florística. Nas situações onde há corredores ecológicos, a
similaridade tende a ser ainda maior, tanto para a flora quanto para
fauna.
d) Efeitos do tempo de isolamento dos fragmentos: em
fragmentação recente, a avaliação dos prejuízos é bastante limitada,
pelo próprio desconhecimento da dinâmica da área antes da
13
fragmentação. Com o passar do tempo os efeitos danosos ficam mais
claros. Um bom exemplo foi o da Floresta Atlântica da região de Viçosa
– MG. Neste local foi comprovado que após cerca de 70 anos de
isolamento, 31% das espécies de aves frugívoras foram extintas e
outras 77% estão ameaçadas.
e) Efeitos do tamanho dos fragmentos: fragmentos de
tamanho reduzido têm diminuição no número de habitats e
microhabitats (muitas vezes necessários à persistência das
populações) e no número de indivíduos por população. Na região do
Cerrado brasileiro, verificou-se que os fragmentos com tamanho
superiores a faixa de 1.300 ha podem abrigar uma quantidade até 25%
maior que os fragmentos menores que 700 ha. De outro modo,
fragmentos maiores tendem a ser mais eficientes, decorrente da
riqueza de espécies e da manutenção dos diferentes habitats.
1.1.4 Estratégias e ferramentas para conservação de ambientes
degradados
A necessidade de uma maior rapidez e efetividade no processo de
restauração ambiental trouxe consigo a implantação dos chamados critérios
sucessionais (KAGEYAMA, 1994). Esses critérios englobam a dinâmica de
recomposição de tais ambientes, o processo de colonização de um ambiente natural
e o tempo e o sucesso no restabelecimento destas populações. Esse processo de
colonização é freqüentemente subdividido em 3 estágios sucessionais: (i)
14
colonização por espécies pioneiras, com ciclo de vida curto, elevado número de
sementes e elevado fluxo gênico de curta distância (SLATKIN, 1985; SLATKIN,
1987), (ii) sucessão por espécies secundárias, com ciclo de vida maior, uma menor
densidade populacional e um fluxo gênico e uma dispersão de sementes a
distâncias intermediárias, e (iii) chegada das espécies climáxicas que, dentre as
espécies de todos os estágios de sucessão, são as que possuem a menor
densidade populacional e os maiores ciclos de vida, distância de dispersão de
sementes e fluxo gênico, com elevada taxa de cruzamento (KAGEYAMA et al.,
2003).
A elaboração de uma boa estratégia de manejo e conservação envolve
diversos parâmetros e varia muito de acordo com o tipo de ambiente a ser
recuperado. Dentre esses parâmetros, destacamos a época de floração e
frutificação, agentes polinizadores, agentes dispersores, estrato ocupado e o tipo de
microhabitat (CAVALHEIRO & TORREZAN, 2002).
Os aspectos mais críticos sobre a fragmentação envolvem o sucesso
reprodutivo das espécies vegetais (MURCIA, 1996), pois muitas dependem de
polinizadores e de dispersores. Esse autor cita que a fragmentação pode trazer
conseqüências como a redução de tamanho e a endogamia, por exemplo, e/ou
ainda ter sua chance de sobrevivência ameaçada pela falta de recursos vegetais.
Assim, o sucesso reprodutivo dos vegetais depende dos polinizadores e dispersores
e estes, por sua vez, dos recursos oferecidos pelas plantas.
Uma alternativa para a restauração ambiental é investir na produção e no
plantio de mudas de espécies arbóreas nativas (VIANA, 1994). Juntamente com o
15
emprego de ferramentas que possam auxiliar na elaboração de estratégias de
restauração.
O crescente desenvolvimento na área da biologia molecular levou ao
surgimento de diversas técnicas para detecção de polimorfismo genético de DNA.
Dentre elas se destaca a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) (MULLINS &
FALOONA, 1987). Variações dessa ferramenta (FERREIRA & GRATTAPAGLIA,
1998) têm sido utilizadas tanto em estudos básicos quanto aplicados. Tais
abordagens podem ser capazes de fornecer informações seguras sobre o status das
populações, bem como sugerir práticas de manejo e conservação da biodiversidade.
Nesse aspecto, o monitoramento da variabilidade genética tem se destacado como
uma das principais ferramentas de apoio. Quando comparados aos marcadores
morfológicos, os moleculares apresentam uma série de vantagens, dentre elas: a
produção de uma grande quantidade de dados; um baixo custo relativo, se levado
em conta o montante de informações produzidas em um curto espaço de tempo;
além de não ser necessária a destruição do material biológico estudado (CIAMPI,
2001). Uma das variações da técnica de PCR mais utilizada é o RAPD (Random
Amplification of Polymorphic DNA) (WILLIANS et al., 1990; WELSH & Mc LELLAND,
1990) que a partir de pequenos primers aleatórios amplifica segmentos de DNA
genômico. Normalmente, esses fragmentos são produzidos em grande quantidade
devido ao reduzido tamanho do primer (10 a 15 nucleotídeos) e a baixa temperatu
16
estudados, caso as populações analisadas não estejam em equilíbrio de Hardy-
Weinberg (ALI et al., 2004; LIU & CORDES, 2004; LOWE et al., ,
17
populacionais são melhores acessados quando os marcadores moleculares são
aplicados aleatoriamente, perfazendo assim uma maior cobertura do genoma.
1.1.5 Variabilidade genética e estrutura populacional
De acordo com Lowe et al. (2004), citado por Paula (2005), a variabilidade
genética presente nas espécies, pode ser desmembrada em três elementos
principais: a) diversidade genética, que se refere a quantidade de variação genética
presente em uma espécie ou em grupos de indivíduos; b) diferenciação genética,
que determina como a variação genética é distribuída entre as populações; e c)
distância genética, relacionada com a quantidade de variação genética existente
entre pares de populações. Quando a variabilidade genética está presente em
características adaptativas, essa irá fornecer aos organismos uma maior flexibilidade
fenotípica, diminuindo assim a susceptibilidade das populações as novas mudanças
ocorridas em seu ambiente e, consequentemente, auxiliando na manutenção da
espécie a longo prazo.
Uma população que por um motivo qualquer sofra uma diminuição de seu
tamanho efetivo (efeito bottleneck ou gargalo de garrafa), ou que colonize um novo
território com um baixo número de indivíduos (efeito do fundador), estará mais
susceptível ao processo de deriva genética. Esse por sua vez terá um papel crucial
na alteração das freqüências bem como no perfil genético das gerações
subseqüentes (HARTL & CLARK, 1997).
18
O entendimento de como a diversidade genética está distribuída nas
populações vem se tornando um ponto-chave na elaboração de estratégias de
manejo e restauração de áreas degradadas (LOWE et al., 2004 apud PAULA, 2005).
Isso porque o conhecimento da estruturação genética de uma população permite ao
pesquisador realizar inferências a respeito, por exemplo, de sua diversidade
genética, de sua taxa de endogamia, da ação da deriva genética e da seleção
natural que levam à diferenciação entre os espécimes, etc. Essas e outras
informações podem auxiliar a montagem de um perfil genético dessa população e
têm um papel fundamental na confecção de um plano de manejo mais eficiente
(PERES-SWEENEY et al., 2003).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo deste estudo é, por meio de marcadores RAPD, analisar a
estrutura genética de plantas adultas de Croton floribundus amostradas em três
localidades na região Norte do estado do Paraná.
19
2.2 Objetivos específicos
Avaliar e caracterizar a diversidade genética da espécie Croton
floribundus de três localidades no Norte do Paraná;
Avaliar se existe diferenciação genética desta espécie nas três
localidades estudadas;
Determinar a similaridade genética das plantas amostradas a fim
de orientar o procedimento de coleta, permuta e repasse de sementes e
mudas, visando garantir um elevado grau de diversidade genética nos
ambientes restaurados.
20
ARTIGO A SER ENVIADO AO PERIÓDICO
JOURNAL OF BRAZILIAN FOREST SCIENCE
(REVISTA ÁRVORE)
EFEITO DA FRAGMENTAÇÃO FLORESTAL SOBRE A ESTRUTURA GENÉTICA
DE Croton Floribundus SPRENG (EUPHORBIACEAE)
Bruno Duarte Ziroldo, André Luís Laforga Vanzela, José Marcelo Domingues Torezan,
Thiago Santos Sabino, Rogério Fernandes de Souza
*
Laboratório de Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Estadual de Londrina.
Endereço: Rodovia Celso Garcia Cid – PR 445 – Km 380 – Campus Universitário
Cx. Postal – 6001 CEP – 86051-990
Londrina – PR – BRASIL
Telefax: 55–43–3371–4509
* Autor Correspondente: E-mail: rogfs@uel.br
21
RESUMO – Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae) é uma espécie arbórea tropical com
ampla distribuição pela Floresta Atlântica, um dos mais importantes e ameaçados biomas
brasileiros. Conhecida popularmente como capixingui, é uma planta pioneira bastante comum
em florestas secundárias. Apesar de seu grande potencial na recuperação de áreas degradadas,
nada é conhecido a respeito de sua diversidade genética. Marcadores moleculares baseados
em primers aleatórios (RAPD) foram utilizados para avaliar a estrutura e a diversidade
genética dessa espécie em três regiões de coleta, todas elas contendo fragmentos
remanescentes da floresta estacional semidecidual da região Norte do estado do Paraná,
Brasil. A avaliação da proporção de locos polimórficos foi obtida de 96 indivíduos, para os
quais foram estimados os: índice de diversidade de Shannon, índice de fixação alélica, análise
de variância molecular e índice de similaridade de Jaccard. Os resultados para as diferentes
estimativas foram concordantes entre si, revelando um alto índice de diversidade genética e
indicando que a maior parcela da variação genética se encontra dentro de região. Esses
resultados concordam com outros estudos envolvendo biomas e plantas de comportamento
semelhantes, sugerindo que fatores como a alta densidade populacional de C. floribundus nas
regiões amostradas, bem como a curta distância entre as regiões de coleta, amenizam os
efeitos da estrutura fragmentada da Floresta Semidecídua do Norte do Paraná sobre a espécie,
entretanto, ainda são suficientes para estruturá-las geneticamente como populações distintas.
Palavras-chave: Croton floribundus, fragmentação florestal, restauração de ecossistemas,
diversidade genética, RAPD.
22
ABSTRACT - Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae) it is a tropical tree specie with
ample distribution for the Atlantic Forest, one of most important and endangered ecosystem
in Brazil. Known popularly as capixingui, it is a pioneering specie very common in secondary
forests. Although to present a great potential in the recovery of degraded areas, nothing is
known about its genetic diversity. Molecular markers based on random primers (RAPD) had
been used to evaluate the structure and genetic diversity of C. floribundus collected in three
different regions of semideciduous estacional forest of the North Paraná state, Brazil. The
evaluation of polymorphic loci percentage was gotten of 96 individuals, for which they had
been estimated: Shannon diversity genetic index, analysis of molecular variance and Jaccard
similarity index. The results for the different estimates had been concordant between itself,
revealing a high genetic diversity index and indicating that the biggest parcel of the genetic
variation is finds within region. These results agree to other studies involving similar
ecosystems and plants behavior, suggesting that factors as the high population density of C.
floribundus in the showed regions, as well as the short distance between the collected
populations, brighten up the effect of the fragmented structure of the semideciduous
estacional forest of Northern Paraná over the specie, however, it is still enough to
structuralize genetically them as distincts populations.
Keywords: Croton floribundus, tropical tree species, forest fragmentation, ecosystems
restoration, genetic diversity, RAPD.
23
1. INTRODUÇÃO
A Floresta Estacional Semidecidual predominante no Norte do Paraná sofreu nas
últimas décadas um processo intenso de fragmentação. Atualmente, essa região é constituída
de uma rede de mosaicos florestais que em sua totalidade representam apenas 2-4% da área
originalmente coberta (IPARDES, 1993). De acordo com Torezan et al. (2005), a paisagem
atual do Norte do Paraná com fragmentos isolados sofre intensas alterações estruturais
provocadas pela redução de populações e pelo efeito de borda, o que torna este um dos
ecossistemas mais ameaçados do Brasil. Esta perturbação antrópica expressiva tem
estimulado os estudos sobre a conservação da biodiversidade e a dinâmica da regeneração
ambiental (induzida ou natural), baseados em ferramentas capazes de acessar a variabilidade e
a estrutura genética das populações. De acordo com Santos (1995), dentre os principais
prejuízos provocados pela ação humana está o processo de fragmentação dos ambientes
florestais, o que leva a modificações na abundância de dispersores, polinizadores, predadores
e patógenos de espécies vegetais. As conseqüências desses eventos sobre as populações
vegetais remanescentes são as alterações no padrão de fluxo gênico, na variabilidade e na
estrutura genética, bem como o aumento do risco de ocorrência de endogamia (BALLAL et
al., 1994; MURCIA, 199Tj1 0 01792 Tm( ) Tj1 042 449.52 Tm(e) Tj1 0 0 .88 Tm(R) Tj1 428.88Tm(o) Tj1 0 Q52 Tm(b(b(b(b(b(b8 0 1 311.68 11 0 0 1 491.52 Tm(b(b(b(b(b(b8 Tj1 428.88Tm8 42e) Tj1 0 0 1 29 0 1 49Tm8 42e) Tj1 0 é) Tj1 0 0 1 114.72 4Tj1 0 (t) Tj1 0 0 1 20.72 4Tj1 0 ( ) Tj1 0 0 136.48 4Tj1 0 Tm(n) Tj1 0 038.72 4Tj1 0 0 1 29 0 1 49Tm49.68 4Tj1 0 ,) Tj1 0 0 1 1460.644Tj1 0 ) Tj1 0 0 1 13520.644Tj1 0 (t) Tj1 0 0 1 153.124Tj1 0 c) Tj1 0 0 1 16.08 44Tj1 0 ,) Tj1 0 0 1 163.68 4Tj1 0 (s) Tj1 0 0 1 7.279 4Tj1 0 u) Tj1 0 0 1 173.76 4Tj1 0 Tm(n) Tj1 0 0178.34Tj1 0 (é) Tj1 0 0 1 80.644Tj1 0 (t) Tj1 0 0 1 940.644Tj1 0 u) Tj1 0 0 1 1492.964Tj1 0 ) Tj1 0 0 1 2495.6 4Tj1 0 u) Tj1 0 0 1 207.84 4Tj1 0 ,) Tj1 0 0 1 211.2 4Tj1 0 (é) Tj1 0 0 215.4Tj1 0 Tm(n) Tj1 0 22548 4Tj1 0 (o) Tj1 0 0 1 23.76 4Tj1 0 o
24
prioritária na aplicação de estratégias de conservação in situ. Estes dois exemplos são bastante
ilustrativos no que diz respeito às aplicações das ferramentas da genética molecular para os
estudos de biodiversidade, conservação e fragmentação florestal.
Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae), conhecido na cultura popular como
capixingui, é uma espécie arbórea encontrada nas florestas latifoliadas semideciduais e em
regiões de altitude elevada nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Minas Gerais e Paraná
(SOUZA & LORENZI, 2005). Sua polinização se dá por abelhas - melitofilia (LORENZI,
2002). Seu fruto é seco e capsular, com coloração castanha e superfície rugosa, medindo por
volta de 9 mm de largura por 8 mm de altura. A dispersão de sementes é do tipo autocórica,
onde os frutos são lançados por deiscência explosiva elástica ao chão e se dividem em 3 cocas
uniloculadas, contendo uma semente ovada, de cor preta, com cerca de 4,4 mm de largura por
4,7 mm de altura por loco (PAOLI et al., 1995). O tempo para a germinação das sementes
oscila em torno de 5 a 10 dias, sendo que a viabilidade das mesmas normalmente não
ultrapassa 4 meses (LORENZI, 2002). É uma espécie pioneira, tolerante a áreas abertas,
ocorrendo geralmente nas bordas ou no interior de fragmentos florestais que sofreram algum
tipo de ação do antrópica e segundo estudo realizado por Rondon Neto et al. (2000),
amparada por altos valores em índices ecológicos, esta é considerada indispensável em
programas de restauração de áreas degradadas. Por essas características, C. floribundus vem
sendo extensamente utilizada nos programas de reflorestamento do norte do Paraná.
Sendo assim, o objetivo deste estudo foi determinar a estrutura e a diversidade genética
dessa espécie, utilizando marcadores RAPD, em três localidades de coleta, todas elas
contendo fragmentos remanescentes da floresta estacional semidecidual no Norte do Paraná,
afim de auxiliar na elaboração de estratégias de conservação.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de folhas de 96 indivíduos adultos de C. floribundus foram coletadas durante
o período de março e abril de 2005 em 3 diferentes localidades no Norte do Paraná. Sendo
elas Bela Vista do Paraíso (51º 11’ 40’’W e 23º 00’ 15’’S), na qual foram amostrados dois
fragmentos distintos; Ibiporã (51º 03’ 00’’W e 26º 16’ 59’’S), onde as coletas se restringiram
a um único fragmento; e Londrina (51º 10’ 14’’W e 23º 18’ 05’’S), onde foram amostrados
três diferentes fragmentos. (Tabela 1, Figura 1). As folhas jovens foram coletadas no campo e
25
diretamente acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados em um isopor com
gelo. No laboratório, as folhas foram utilizadas para a extração do DNA, ou então
armazenadas em um freezer a –20
o
C até o momento do uso. Para a extração do DNA foi
utilizado o método do CTAB (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998) adaptado para C.
floribundus. A fim de melhorar a limpeza do DNA extraído, essas amostras foram submetidas
a um tratamento com NaCl 5M (45 L para cada 100 L de DNA em solução) e RNAse 1
mg/mL (1 L para cada 100 L de DNA em solução). A quantificação do DNA foi estimada
a partir de um fluorímetro Dyna Quant 200 (Hoefer) com um padrão de 100 ng, e em seguida,
o DNA foi diluído para 5 ng/L para ser utilizado nas reações de PCR.
As reações de RAPD foram realizadas em um termociclador PT-100 (BIO RAD),
utilizando 15 diferentes primers [A2 (5´-GTCCTCGTGT-3´); A3 (5´-ACGGTTCCAC-3´),
A6 (5´-GGCGCGTTAG-3´), A7 (5´-GACGAGCAGG-3´), A8 (5´-GGCTGCCAGT-3´), A12
(5´-TGACCAGGCA-3´), A14 (5´-TCGCAGCGTT-3´), A15 (5´-CTGCAATGGG-3´), A17
(5´-AGTTCCGCGA-3´), B2 (5´-CAGCCGAGAA-3´), B3 (5´-GAAGGAGGCA-3´), B4 (5´-
TTGCGGCTGA-3´), B5 (5´-CCCGATCAGA-3´), B6 (5´-CCGCAGTCTG-3´) e A16 (5´-
AACCCTTCCC-3´)], selecionados de 20 primers, todos da Invitrogen. As reações foram
montadas para um volume final de 15 L por microtubo, com as seguintes quantidades de
reagentes: 1,5 L de tampão de reação de amplificação (10 X), 1,5 L de mistura de dNTPs
(10 mM), 1,5 L de primer (10 mM), 1,2 L de MgCl
2
(50 Mm), 0,2 L de DNA
polimerase (5 U/L), todos adquiridos da Invitrogen e 2 L DNA (5 ng/L). As reações
foram realizadas seguindo o programa: 92
o
C por 4 minutos, seguida de 40 ciclos, cada um
com as seguintes etapas: 40 segundos a 92ºC, 1 minuto e 30 segundos a 40ºC e 2 minutos a
72ºC, seguidos por uma extensão final de 5 minutos a 72ºC. Ao final do último ciclo, as
amostras permaneceram por pelo menos 5 minutos a 10ºC, antes de serem submetidas à
eletroforese em agarose 1,4% em tampão TEB 1X (Tris 0,045 M. EDTA 0,5 mM e Ácido
Bórico 0,045 M, pH 8,3). O gel foi corado com brometo de etídio (5 L/mL), e registrado
utilizando um transiluminador com luz ultravioleta e um sistema de fotodocumentação digital
AlphaDigiDoc – RT. Com a finalidade de se observar o poder de repetibilidade das bandas de
RAPD, foram realizadas duas reações de PCR idênticas, em duas datas diferentes, mas
obedecendo as mesmas condições gerais estabelecidas para este protocolo de extração e
amplificação do DNA.
Após a análise do perfil eletroforético, os dados foram transferidos para planilha
eletrônica, sendo, em seguida, submetidos às análises estatísticas. A proporção de locos
26
polimórficos (P), utilizando o critério de 95%, foi estimada com o software TFPGA 1.3
(MILLER, 1997), considerando a correção de Lynch & Milligan (1994) para locos
dominantes. A análise de variância molecular (AMOVA), utilizada para determinar o grau de
estruturação genética foi feita de acordo com EXCOFFIER et al. (1992). O índice de fixação
(Φ
ST
) (REYNOLDS et al., 1983; SLATKIN, 1995 cf. EXCOFFIER et al., 2005) foi estimado
com software ARLEQUIN versão 3.0 (EXCOFFIER et al., 2005). Para estimar a diversidade
genética dentro de cada população foi utilizado o índice de diversidade de Shannon - I
(LEWONTIN, 1972), utilizando o software Popgen 1:31 (YEH et al., 1999). As inferências
relacionadas com a similaridade genética de Jaccard (J) foram realizadas com os softwares
NTSYS-PC (ROHLF 2002) e SAS (THE SAS INSTITUTE, 1989-1996). Por fim, para
determinar o coeficiente de variação (CV) para o total de marcadores utilizados nas
estimativas de similaridade genética de Jaccard, foi empregado o software DBOOT
(COELHO, 2000).
Tabela 1: Dados das coletas de C. floribundus realizadas no Norte do Paraná durante os
meses de março e abril de 2005.
Table 1: C. floribundus collection’s datas.
Regiões de coleta
Fragmentos
visitados
GPS* Data de coleta
Número de
amostras
Cemitério
0480349
7459765
28/03/2005 15
Bela Vista do Paraíso
Fazenda Novo
Horizonte
0479782
7420558
11/04/2005 17
04/04/2005 13
07/04/2005 11
Ibiporã Fazenda Doralice
0511236
7334540
14/04/2005 7
Parque Estadual
Mata dos Godoy
0473695
7407566
21/03/2005 19
São Luís
0476582
7398402
23/03/2005 4
Londrina
Patrimônio Regina
0477346
7412352
23/03/2005 10
----- ----- ----- ----- 96
* Global Positioning System
27
Figura 1: Localização dos fragmentos: Cemitério ( ), Fazenda Novo Horizonte ( ), Fazenda Doralice ( ), Mata dos Godoy ( ), Patrimônio
Regina ( ) e São Luís ( ) dentro das diferentes regiões de coleta.
Figure 1: Localization of the fragments Cemitério ( ), Fazenda Novo Horizonte ( ), Fazenda Doralice ( ), Mata dos Godoy ( ), Patrimônio
Regina ( ) e São Luís ( ) inside of the different collections’ regions.
28
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os 15 primers empregados nas reações de RAPD geraram um número total de 157
bandas, sendo que o número de bandas produzidas por primer variou de 8 (A-12 e A-15) a 14
(A-14). A Figura 2 mostra o teste de repetibilidade para as reações de RAPD com 5
indivíduos escolhidos aleatoriamente e amplificados com os primers A–6, A-14 e B-6. Os
perfis de bandas obtidos nas reações de RAPD estão exemplificados na Figura 3.
Figura 2: Teste de repetibilidade para os indivíduos para 5 indivíduos escolhidos
aleatoriamente e amplificados com os primers A – 6 (branco), A – 14 (amarelo) e B – 6
(vermelho)
Figure 2: Repeatability test with 5 individuals chosen randomly and amplified with primers A
– 6 (white), A – 14 (yellow) and B – 6 (red).
A proporção de locos polimórficos (P) foi de 84,1% para a região de Ibiporã e 89,2%
para as regiões de Bela Vista do Paraíso e Londrina. Como esses resultados não foram
discrepantes, e para fins de comparação com outros estudos, foi utilizado o valor total da
proporção de locos polimórficos, 94,9%, estimado a partir de uma análise conjunta dos 96
indivíduos sem a diferenciação em localidades. O valor encontrado para C. floribundus é
próximo ao observado por ZIMBACK et al. (2004) em Trichilia pallida – Meliaceae, com
92,6%. Contudo, esse pode ser considerado elevado, se comparamos com os obtidos em
outras espécies arbóreas tropicais, tais como P = 70,8% em Plathymenia reticulata -
Mimosoideae (LACERDA et al., 2001) e P = 78,5% em Aspidosperma polyneuron -
Apocynaceae (TOREZAN et al., 2005). O que chama a atenção nesse caso, é que o valor dos
locos polimórficos encontrado em C. floribundus, uma espécie pioneira com dispersão de
sementes de curta distância, é similar ao de Trichilia pallida, uma espécie do sub-bosque de
florestas maduras, cujas sementes são dispersas pela avefauna. Entretanto, tal acontecimento
29
pode ser explicado pelo fato que em ambos os estudos não foi verificado um grande
isolamento geográfico entre as regiões de coleta, o que pode permitir uma maior taxa de fluxo
gênico e uma diminuição na perda de diversidade. De outro modo, o fato do valor médio dos
locos polimórficos de C. floribundus ser bastante discrepante de Plathymenia reticulata e
Aspidosperma polyneuron parece não ser notável, já que no primeiro caso, se trata de uma
espécie típica do Cerrado e das transições com as florestas semideciduais, e no segundo de
uma espécie exclusiva do interior de florestas semideciduais. Segundo Kageyama et al.
(2003), algumas espécies arbóreas pioneiras, como é o caso de C. floribundus, possuem como
característica uma dispersão de sementes a curta distância, o que confere as mesmas uma
ocorrência agregada e, frequentemente, uma alta densidade populacional, algo que foi
observado nesse estudo. Assim sendo, nossos resultados permitem sugerir que o elevado
número de indivíduos por população, bem como a possibilidade de fluxo gênico entre os
fragmentos, pode contrabalançar os possíveis efeitos do processo de fragmentação florestal,
pelo menos nas regiões amostradas, já que não houve perda significativa da diversidade
genética. Como a perda de diversidade genética em uma espécie está intimamente ligada ao
processo de deriva genética, quanto maior a população, menor a suscetibilidade a esse fator
evolutivo (HARTL & CLARK, 1997).
Os índices de diversidade de Shannon (I) foram de 0,5206 para a população de Bela
Vista do Paraíso, 0,4893 para Ibiporã e 0,5173 para Londrina. Assim como para a proporção
de locos polimórficos, a comparação entre o índice de Shannon obtido para C. floribundus e
outras espécies se baseou no valor de 0,5311, estimado para os indivíduos agrupados em um
único conjunto. O valor de I obtido no presente estudo está próximo ao descrito para
Eremanthus erythropappus – Asteraceae, com I = 0,38 a 0,48 (FREITAS, 2001) e I = 0,58
(ESTOPA et al., 2006), uma espécie pioneira também estudada com marcadores RAPD. No
entanto, esta aproximação também apareceu entre C. floribundus e Swietenia macrophylla –
Meliaceae, com I = 0,45 (GILLIES et al., 1999), uma espécie típica de florestas maduras.
Este evento deve-se provavelmente ao fato de S. macrophylla apesar de apresentar uma baixa
densidade de indivíduos por hectare, possui características imprescindíveis para a manutenção
da diversidade genética, como por exemplo, fecundação cruzada, uma elevada produção de
sementes viáveis, distribuição ampla e uma taxa de crescimento rápido. A mesma explicação
pode ser adotada para a aproximação entre C. floribundus e Aspidosperma polyneuron, com I
= 0,446 (TOREZAN et al., 2005), outra espécie de floresta madura com uma produção
elevada de sementes viáveis, distribuição ampla e que apesar de contar com um sistema de
reprodução de tipo misto, predomina a alogamia (MALTEZ, 1997). Contudo, vale a pena
30
ressaltar que Torezan et al. (2005) encontraram uma diminuição da diversidade genética em
A. polyneuron entre plantas mãe e as progênies. Mas como esta espécie atinge a fase
reprodutiva com 50 a 60 anos, somente em um prazo mais logo os efeitos da fragmentação
sobre as populações serão mais claramente detectados.
31
Figura 3: Padrão de amplificação de bandas para os 96 indivíduos de C. floribundus a partir do primer A -14.
Figure 3: Amplification of 96 C. floribundus individuals by primer A – 14.
32
A análise de variância molecular (AMOVA) em C. floribundus revelou que 97,41% da
variação genética se encontram dentro de localidades, e que apenas 2,59% se devem a
diferenças genéticas entre localidades (Tabela 2).
Tabela 2: Valores da AMOVA para C. floribundus coletadas no Norte do Paraná.
Table 2: AMOVA values for C. floribundus from Northern Paraná state, Brazil.
Fonte de
variação
Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados
Componentes de
variância
Porcentagem de
variação
Entre
localidades
2 61,849 0,44466 2,59*
Dentro de
localidades
93 1553,109 16,70010 97,41*
Total 95 1614,958 17,14476
* = P < 0,001
A variação inter-regiões observada neste estudo foi superior apenas aos valores
estimados em Trema micrantha – Ulmaceae (KAGEYAMA et al., 2003), com 0,7%. Os
resultados observados para outras espécies foram superiores ou ligeiramente superiores, como
por exemplo, em Esenbeckia leiocarpa – Rutaceae, com 4,9% (KAGEYAMA et al., 2003).
T. micrantha é uma espécie pioneira, típica de formações secundárias e de áreas abandonadas
e com uma produção massiva de sementes viáveis (KAGEYAMA et al., 2003). Já, E.
leiocarpa, apesar de ser uma espécie típica de formações florestais maduras, assim como C.
floribundus, apresenta distribuição espacial agregada, é polinizada por insetos (moscas) e
conta com uma dispersão de sementes a curta distância ocasionadas por deiscência explosiva
dos frutos (KAGEYAMA et al., 2003).
Ainda com base nos dados da AMOVA, as variações genéticas interpopulacionais
obtidas para C. floribundus podem ser consideradas baixas quando comparadas as observadas
em Maytenus aquifolia – Celastraceae, com 14,7% (KAGEYAMA et al., 2003),
Aspidosperma polyneuron, com 21% (TOREZAN et al. 2005) e Eugenia dysenterica –
Myrtaceae, com 27% (ZUCCHI, 2002). Todavia, este fato é aceitável, uma vez que M.
aquifolia é uma espécie florestal climáxica, típica de ambientes úmidos e, para Kageyama et
al. (2003), tais valores podem ser explicados pelo fato de que em seu estudo foi amostrado um
grande número de populações, isoladas parcialmente e sob efeito da deriva genética. As
divergências entre os dados obtidos para A. polyneuron e C. floribundus já era esperada por
esta primeira ser uma espécie climáxica e apresentar uma baixa densidade populacional. O
33
simples fato de que ambos os estudos se concentraram na mesma região geográfica poderia
contribuir parta uma maior semelhança entre seus resultados, todavia, devemos destacar a
ocorrência de diferenças metodológicas de coleta (representada pelo número total de
indivíduos analisados e dos fragmentos visitados) e a intensa exploração de A. polyneuron
desde o início da colonização do Norte do Paraná. Sendo assim, é possível que ela tenha
sofrido mais intensamente com o processo de fragmentação e isolamento genético.
De acordo com Hamrick e Loveless (1989), em se tratando de espécies arbóreas
tropicais, a parcela da variabilidade genética presente entre populações tende a ser sempre
menor que a encontrada dentro de populações. Oliveira (2000) sugeriu que quando os
fragmentos não estão sofrendo os efeitos da deriva genética, a variação entre populações
raramente ultrapassa 5%, concentrando-se na maioria dos casos, na faixa de 3%. Hamrick e
Godt (1989) inferiram que um dos maiores determinantes da estruturação genética entre
populações vegetais está na sua biologia reprodutiva. Espécies que realizam autofecundação
podem apresentar até 50% de sua variabilidade genética distribuída entre suas populações,
enquanto que, em espécies de fecundação cruzada, esses valores raramente ultrapassam a casa
dos 20%. Considerando que essa última estratégia é a mais utilizada pelas espécies tropicais
(BAWA, 1990; ALDRICH & HAMRICK, 1998; NASON et al., 1998), inclusive C.
floribundus, temos que as inferências acima dão credibilidade aos resultados encontrados
neste estudo, os quais por sua vez estão dentro do esperado para populações naturais e não
apresentam efeitos que possam ser atribuídos à fragmentação florestal.
O significado, bem como a importância de se averiguar como a variabilidade genética
de uma espécie está distribuída se deve ao fato que, de acordo com Wright (1978), o índice de
fixação, ou F
ST
(a parcela da variabilidade genética contida entre as populações) pode ser
interpretado de modo qualitativo em termos de diferenciação genética entre as populações
estudadas. Valores entre 0 e 0,05 representam uma baixa diferenciação, entre 0,05 e 0,15 uma
diferenciação moderada, entre 0,15 e 0,25 uma diferenciação alta e acima de 0,25 uma
diferenciação genética muito alta. O valor de Φ
ST
(análogo ao F
ST
) encontrado neste estudo foi
de 0,0259, indicando uma baixa diferenciação entre as regiões amostradas. Embora baixa,
essa diferenciação foi estatisticamente significativa, indicando que existe estruturação
genética nas três localidades estudadas.
A distância média entre aos fragmentos visitados em Bela Vista do Paraíso e Ibiporã
foi de 27431,97 m, entre Bela Vista do Paraíso e Londrina, de 28542,28 m e entre Ibiporã e
Londrina, de 21459,18 m. As estimativas de Φ
ST
para cada um desses grupos de localidades
mostraram que as maiores diferenças na estimativa de Φ
ST
foi para a combinação Bela Vista
34
do Paraíso e Ibiporã (Φ
ST
= 0,033), seguido de Bela Vista do Paraíso e Londrina (Φ
ST
=
0,0247), Ibiporã e Londrina (Φ
ST
= 0,0135). Embora a distância entre essas localidades não
seja muito divergente, os valores de Φ
ST
foram maiores para aquelas mais distantes entre si.
Essa baixa estruturação pode ser devido ao fato que ainda exista fluxo gênico entre as
localidades, o que amenizaria os efeitos da seleção natural e da deriva genética, por exemplo.
Por outro lado, ela também pode ser um indicativo que o processo de isolamento dessas
plantas pode estar mostrando os seus primeiros efeitos. Somente estudos a longo prazo
poderão responder a essa questão.
O coeficiente de variação para o total de bandas de RAPD utilizados na estimativa do
coeficiente de similaridade de Jaccard foi 7,64%. Sendo assim, essas estimativas de
similaridade podem ser consideradas consistentes. Os resultados demonstrados na Tabela 3
indicam que Londrina foi a localidade onde se encontrou a menor amplitude de variação para
a similaridade entre as plantas amostradas (0,2612), bem como a maior similaridade média
entre elas (0,6325 0,0486). Por sua vez, Ibiporã foi a localidade com a maior amplitude de
variação (0,4031) para a similaridade entre as plantas estudadas. Vale ressaltar que nessa
localidade foram amostradas plantas de um único fragmento de mata. Entretanto, que
apresentou uma maior área de mata contínua que possuía o melhor estado de conservação.
Tabela 3: Valores de similaridade genética de Jaccard para as plantas de C. floribundus
amostradas em cada localidade estudada.
Table 3: Jaccard similarity values from C. floribundus in each studied region.
N
Similaridade
Mínima
Similaridade
Máxima
Variação
Similaridade
Média
CV%
Londrina 378
0,4927 0,7539 0,2612
0,6325 0,0486
7,6764
Ibiporã 465
0,4553 0,8584 0,4031
0,6155 0,0514
8,3540
B.V. do Paraíso
465
0,4138 0,7563 0,3425
0,5957 0,0590
9,9066
No que diz respeito aos estudos envolvendo Croton floribundus, todos se resumem ao
campo da ecologia, assim, dados referentes à sua diversidade genética são de extrema
importância não só por ampliar o banco de informações disponíveis para espécies tropicais,
mas também por auxiliar o entendimento da eficiência das estratégias reprodutivas para a
perpetuação da espécie e ainda colaborar efetivamente na confecção de planos de manejo e
restauração de ambientes degradados envolvendo C. floribundus, bem como na preservação
de sua diversidade.
Nossos resultados sugerem que embora a maior parte da diversidade genética se
35
encontre dentro de cada localidade, existe um nível baixo, mais significativo, de estruturação
genética entre elas. É possível que a alta densidade de indivíduos de C. floribundus por
fragmento, juntamente com a elevada produção de sementes viáveis (apesar da dispersão ser
autocórica), a polinização por abelhas (NOGUEIRA – NETO, 2002) e a alogamia, além da
semelhança na estrutura ecológica das regiões de coleta e a distância relativamente reduzida
entre as mesmas, justifiquem a baixa diferenciação genética encontrada neste trabalho.
Contudo, os resultados permitem propor que as amostras de C. floribundus analisadas sejam
geneticamente estruturadas como populações distintas. Estas informações trazem uma
contribuição prática imediata, pois sugerem que a coleta de sementes desta espécie, visando a
restauração ambiental, se beneficiaria da amostragem em mais de uma, ou pelo menos,
naquelas que apresentam um maior grau de diferenciação genética entre as plantas
amostradas.
4. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem às agências SEMA-IAP, Fundação Araucária e CNPq pelo
apoio financeiro; e a Rosangela Moreira P. de Carvalho e Josué Maldonado pelas análises
estatísticas.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
As análises realizadas para Croton floribundus a partir de diferentes
parâmetros genéticos forneceram dados que concordam entre si;
Fatores como a alogamia, elevada produção de sementes viáveis,
crescimento e reprodução rápidas e uma alta densidade populacional podem
justificar os elevados valores de diversidade genética encontrados para Croton
floribundus no Norte do Paraná;
A polinização por abelhas e a distância relativamente reduzida entre os
fragmentos podem estar mantendo um nível razoável de fluxo gênico entre os
mesmos, o que juntamente com a semelhança ecológica entre as localidades de
estudo poderiam explicar a baixa estruturação genética entre as localidades
analisadas. Por outro lado, embora baixa, a estruturação observada entre as
localidades foi significativa, o que pode ser um indicativo que o processo de
fragmentação que vem se intensificando nas últimas décadas pode estar
contribuindo para o isolamento entre as plantas de C. floribundus de diferentes
fragmentos;
As análises da distribuição da variabilidade genética fornecem
informações práticas para a elaboração de planos de manejo e conservação,
uma vez que a partir dos resultados observados pode-se propor que a coleta de
sementes se beneficiaria da amostragem de mais de uma localidade.
40
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