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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”
Efeito de cianobactérias e algas eucarióticas na resistência de
plantas de fumo contra o Tobacco mosaic virus (TMV)
André Boldrin Beltrame
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2005
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
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3
André Boldrin Beltrame
Engenheiro Agrônomo
Efeito de cianobactérias e algas eucarióticas na resistência de plantas de fumo
contra o Tobacco mosaic virus (TMV)
Orientador:
Prof. Dr. SÉRGIO FLORENTINO PASCHOLATI
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2005
André Boldrin Beltrame
Engenheiro Agrônomo
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Beltrame, André Boldrin
Efeito de cianobactérias e algas eucarióticas na resistência de plantas de fumo contra o
Tobacco mosaic vírus (TMV) / André Boldrin Beltrame. - - Piracicaba, 2005.
87 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005.
1. Algas 2. Controle biológico – Fitossanidade 3. Fumo 4. Metabolismo vegetal – Alteração
5. Mosaico – Doença de planta 6. Vírus de plantas I. Título
CDD 632.8
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais Helenice e João Américo,
Irmãs Aline e Camila
e Namorada Ana Elisa
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Sérgio Pascholati pela oportunidade, orientação, ensinamentos e
confiança.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Parasitismo: Camila, Célia,
Daiane, Ely, Júlio, Leonardo Cavalcante, Leonardo Toffano, Maria Cristina, Marizete,
Nelson, Patrícia, Paulo, Solange, Ricardo e, em especial, ao Danilo, ao Maurício, a Nívea,
ao Odair e ao Robson que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos funcionários Carmen, Fernanda, Pedro Arthuso, Rodolfo e Silvia pela
colaboração no decorrer do curso.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio
financeiro.
A
A
A
5
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................................7
ABSTRACT .........................................................................................................................8
1aINTRODUÇÃO ................................................................................................................9
2aDESENVOLVIMENTO.....................................................................................................11
2.1.1aControle Biológico .....................................................................................................11
2.1.2aIndução de resistência...............................................................................................13
2.1.3aAtivação dos mecanismos de defesa ........................................................................15
2.1.3.1aSinalização.............................................................................................................15
2.1.3.2aRotas metabólicas..................................................................................................16
2.1.3.3aProteínas relacionadas à patogênese ....................................................................18
2.1.3.4aFenóis e fitoalexinas...............................................................................................20
2.1.4aTobacco mosaic virus (TMV).....................................................................................22
2.1.5aCianobactérias e algas eucarióticas..........................................................................23
2.1.5.1aAspéctos gerais......................................................................................................23
2.1.5.1.1aCianobactérias.....................................................................................................23
2.1.5.1.2aAlgas eucarióticas ...............................................................................................24
2.1.5.2aPropriedades farmacológicas de cianobactérias e de algas...................................25
2.1.5.3aEfeito de cianobactérias e de algas sobre animais.................................................26
2.1.5.4aEfeito de cianobactérias e de algas sobre o homem..............................................26
2.1.5.5aEfeito de cianobactérias e de algas sobre fitopatógenos .......................................27
2.2aMateriais e Métodos .....................................................................................................29
2.2.1aObtenção e manutenção das cianobactérias e algas eucarióticas............................29
2.2.2aQuantificação da clorofila e do peso seco.................................................................29
2.2.3aObtenção dos preparados das algas.........................................................................30
2.2.4aObtenção e manutenção das plantas hospedeiras....................................................30
2.2.5aObtenção e manutenção do TMV..............................................................................30
2.2.6aEfeito da concentração do TMV no número de lesões em folhas de fumo................31
2.2.7aEfeito local de suspensões das algas na redução dos sintomas provocados por
TMV em plantas de fumo...........................................................................................31
2.2.8aEfeito local e sistêmico de suspensão das algas na redução dos sintomas
provocados por TMV em plantas de fumo.................................................................32
6
2.2.9aEfeito das preparações das algas na redução dos sintomas provocados por TMV
em plantas de fumo...................................................................................................33
2.2.10aEfeito inibitório das algas sobre o TMV ...................................................................33
2.2.11aObtenção das amostras para a realização dos testes bioquímicos.........................33
2.2.12aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de β-1,3-glucanase..............34
2.2.13aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de peroxidases ....................35
2.2.14aVerificação do conteúdo total de fenóis...................................................................35
2.2.15aVerificação de espécies reativas de oxigênio..........................................................36
2.3aResultados....................................................................................................................37
2.3.1aDistinção das algas procarióticas das eucarióticas ...................................................37
2.3.2aQuantificação da clorofila a e do peso seco..............................................................37
2.3.3aEfeito da concentração do TMV no número de lesões em folhas de fumo................38
2.3.4aEfeito local de suspensões das algas na redução dos sintomas provocada por
TMV em plantas de fumo...........................................................................................39
2.3.5aEfeito local e sistêmico de suspensão das algas na redução dos sintomas
provocados por TMV em plantas de fumo.................................................................41
2.3.6aEfeito das preparações das algas na redução dos sintomas provocados por
TMV em plantas de fumo...........................................................................................44
2.3.7aEfeito inibitório das algas sobre o TMV .....................................................................48
2.3.8aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de β-1,3-glucanase................49
2.3.9aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de peroxidases ......................52
2.3.10aVerificação do conteúdo total de fenóis...................................................................55
2.3.11aVerificação de espécies ativa de oxigênio...............................................................58
2.4aDiscussão.....................................................................................................................63
3aCONCLUSÕES ...............................................................................................................67
REFERÊNCIAS...................................................................................................................68
ANEXO................................................................................................................................84
APÊNDICE..........................................................................................................................86
7
RESUMO
Efeito de cianobactérias e algas eucarióticas na resistência de plantas de fumo
contra o Tobacco mosaic virus
As algas produzem uma grande diversidade de compostos com atividade
biológica, inclusive que agem diretamente sobre vírus ou como indutores de fitoalexinas.
Em vista disso, foi investigada a redução de sintomas causados por Tobacco mosaic
vírus (TMV) em plantas de fumo tratadas com cianobactérias ou algas eucarióticas, além
de se tentar elucidar o modo de ação das algas no patossistema estudado. Quando as
plantas de fumo foram tratadas dois dias antes da inoculação, foi verificado que
suspensões dos isolados 004/02, 008/02, 061/02, Anabaena sp. e Nostoc sp. 61, bem
como as preparações do conteúdo intracelular do isolado 004/02 (4 C) e do filtrado do
meio de cultivo do isolado 061/02 (61 M) apresentaram efeito na redução dos sintomas
de TMV em plantas de fumo, cultivar TNN. Além disso, foi estudado o efeito direto das
algas sobre as partículas de vírus. Os resultados mostraram que os isolados Anabaena
sp., Nostoc sp. 21, Nostoc sp. 61 e 090/02 apresentam compostos que agem
diretamente sobre o TMV. Para tentar elucidar o mecanismo de ação das algas no
patossistema estudado, diversos parâmetros bioquímicos foram investigados. Foi
detectado que a preparação 4 C aumentou a atividade de peroxidases e que todos os
tratamentos analizados reduziram a atividade de β-1,3-glucanase em folhas de fumo a
partir do quarto dia após o tratamento das plantas. Por sua vez, as suspensões dos
isolados 008/02 e 061/02 e a preparação 61 M proporcionaram maior acúmulo de
superóxido, enquanto que a preparação 4 C reduziu o acúmulo de peróxido de
hidrogênio, em relação aos controles água destilada e meio de cultura BG 11, 37 horas
após a inoculação do vírus. Em vista disso, as algas podem ser utilizadas como agentes
de controle biológico, por apresentar ação direta sobre fitopatógenos ou alterarem o
metabolismo de plantas, o que pode estar associado com a sintese de compostos de
defesa.
Palavras chaves: algas, TMV, controle biológico, alterações metabólicas
8
ABSTRACT
Effect of cyanobacteria and eukaryotic algae on the resistance of tobacco plants
against Tobacco mosaic virus
Algae produce several different compounds that show biological activity, including
ones with antiviral activity or that act as phytoalexin inducers. Thus, it was investigated the
reduction of Tobacco mosaic virus (TMV) symptoms on tobacco plants treated with
cyanobacteria or eukaryotic algae, and it was studied the way of action of algae on the
studied pathosystem. When the tobacco plants were treated two days before the
inoculation, it was verified that the suspension of 004/02, 008/02, 061/02 Anabaena sp.,
and Nostoc sp. 61 strains as well as the intracellular preparation of 004/02 strain (4 C) and
the medium filtrated from 061/02 strain (61 M) reduced TMV symptoms on tobacco plants,
cultivar TNN. Furthermore, it was studied the direct effect of the algae suspensions on virus
particles. The results showed that Anabaena sp., Nostoc sp. 21, Nostoc sp. 61 and 090/02
strains have compounds with direct activity on TMV. To try to elucidate the way of the
action of algae, on the studied pathosystem, several biochemical parameters were
investigated. It was seen that the preparation 4 C increase peroxidase activity and all
treatments decrease β-1,3-glucanase activity on tobacco leaves from the forth day on after
the treatment. Moreover, 008/02 and 061/02 strains and the 61 M preparation caused
higher superoxide accumulation, and the preparation 4 C decreased hydrogen peroxide
accumulation when compared to the controls distilled water and BG 11 medium 37 hour
after virus inoculation. In this way, the algae could be a biocontrol agents, because it shows
direct action on phytopathogens and/or change the metabolism of the plants, that could be
associated with the synthesis of deffence compounds.
Keywords: cyanobacteria, TMV, biological control, metabolic alterations.
9
1aINTRODUÇÃO
A população mundial está crescendo e, conseqüentemente, a demanda por
alimento. Em vista disso, o homem tem buscado novas técnicas para aumentar a
produtividade das culturas, como o uso de irrigação, adubação química pesada,
variedades mais produtivas e mecanização.
Nesse contexto, o melhorista, por muitos anos, visou a seleção de variedades de
plantas com alta produtividade e ignorou os mecanismos naturais de defesa das mesmas,
com isso as novas cultivares ficaram mais susceptíveis às doenças. Para remediar esse
problema, foi necessário desenvolver outros métodos de controle, dentre os quais o que se
obteve maior sucesso foi o controle químico. Não se pode negar que a aplicação de
produtos químicos é fundamental para o controle de muitas doenças de plantas, porém, o
uso indiscriminado deles, além de contaminar o ambiente e favorecer o aparecimento de
problemas em animais e ao homem, também favorece o surgimento de raças resistentes a
esses compostos (REIMANN; DEISING, 2005).
Em vista desse processo, foi necessário iniciar uma busca por um tipo de controle
alternativo aos produtos químicos para o combate a doenças, como solarização, irradiação
UV, rotação de culturas, imunização biológica, controle biológico e indução de resistência.
É mister lembrar que essas medidas não irão acabar com os a aplicação de produtos
químicos, ma sim reduzir a utilização dos mesmos.
O controle biológico visa controlar patógenos de plantas com outros organismos. As
cianobactérias e as algas eucarióticas apresentam-se como candidatas para o controle de
doenças de plantas, pois podem ser produzidas em larga escala, além de sintetizarem
muitos compostos com atividade biológica sobre microrganismos, inclusive fitopatogênicos.
Além disso, elas podem incitar o acúmulo de fitoalexinas em tecidos vegetais (DI PIERO,
1999; RAO; SARADA; RAVISHANKAR; 1996), o que indica a ativação dos mecanismos de
resistência em plantas.
A indução de resistência é a ativação dos mecanismos de resistência que estão
latentes nas plantas através de agentes bióticos ou abióticos, chamados de elicitores.
Apesar de muitas espécies de cianobactérias e algas eucarióticas produzirem
compostos biologicamente ativos, poucos trabalhos foram realizados para se tentar
controlar doenças em vegetais e, na sua grande maioria, os pesquisadores restringiram-se
em verificar apenas o efeito in vitro das mesmas sobre fitopatógenos. Assim sendo, o
10
objetivo desse trabalho foi verificar o efeito de cianobactérias e de algas eucarióticas na
redução dos sintomas do TMV em plantas de fumo, bem como elucidar o possível modo de
ação.
11
2aDESENVOLVIMENTO
2.1.1aControle Biológico
O controle biológico é uma alternativa para o controle de fitopatógenos (ELSON;
SCHISLER; BOTHAST, 1997; LARKIN; FRAVEL, 1998; MAO et al., 1996). Assim, Cook e
Baker (1983) definiram o controle biológico de doenças de plantas como “a redução do
potencial de inóculo e/ou patogenicidade, pelo uso de um ou mais organismos, exceto o
homem”.
O mecanismo de ação dos agentes de biocontrole pode ser ilustrado através de três
métodos básicos de controle: antibiose, parasitismo e competição.
A antibiose baseia-se na produção de substâncias que agem sobre os
fitopatógenos, as quais são produzidas pelos organismos antagonistas a fim de se
protegerem dos demais microrganismos existentes no habitat que ocupam (LUZ, 1993).
Uma protease produzida pelo isolado 3.1T8 de Lysobacter enzymogenes pode ser a
molécula que reduz o crescimento in vitro de Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f. sp.
raphani, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Didymella
lycopersici, Cladosporium fulvum, Corynespora cassiicola, Verticillium albo-atrum,
Phytophthora capsici, Pythium ultimum, Pythium intermedium e Phytium aphanidermatum
(FOLMAN; POSTMA; VAN VEEN, 2003). Getha e
Vikineswary (2002) verificaram que o
isolado G 10 de Streptomyces violaceusniger produz um metabólito capaz de inibir tanto in
vitro, como em solo esterilizado o fungo F. oxysporum f. sp. cubense, além de deformar e
provocar a hidrólise das hifas desse fitopatógeno. Taechowisan et al. (2005) isolaram e
identificaram, a partir de meio de cultivo, os compostos, produzidos pelo isolado
CMUAc130 de Streptomyces aureofaciens, 5,7-dimetoxi-4-p-metoxilfenilcoumarina e 5,7-
dimetoxi-4-fenilcoumarina, os quais apresentaram efeito inibitório in vitro, respectivamente,
sobre Colletotrichum musae e F. oxysporum.
Diversos trabalhos mostram a capacidade antagônica de várias espécies de
leveduras contra diferentes fitopatógenos. Saligkarias; Gravanis e Eptona (2002)
verificaram que o controle de Botrytis cinerea em tomate por Candida guiliermondii e C.
olephila é devido à produção e excreção de quitinase e glucanase. Ademais, a produção
de β-1,3-glucanase por Pichia anomala provocou deformações nas extremidades das hifas
de B. cinerea (JIJAKLI; LEPOIVRE, 1998).
12
Vários isolados de Trichoderma spp. e de Clonostachys rosea inibiram a formação
in vitro de basidiocarpos de Crinipellis perniciosa, bem como reduziram a expressão dos
sintomas causados por Moniliophthora roreri e Phytophthora palmivora em plântulas de
cacaueiro. O isolado de Trichoderma sp. T-3 também reduziu a formação dos sintomas de
vassoura-de-bruxa em plântulas de cacaueiro (KRAUSS; SOBERANIS, 2001). Outros
trabalhos mostram que isolados de Trichoderma spp. produzem enzimas líticas
extracelulares, tais como β-1,3-glucanase, celulase, quitinase e protease (SANZ et al.,
2004; RAMOT et al., 2004; MONTERO et al., 2005). Além disso, espécies de Trichoderma
produzem toxinas, tais como gliotoxina e gliovirina, (WILHITE; LUMSDEN; STRANEY,
1994
; KAPAT; ZIMAND; ELAD, 1998).
Diferentes organismos podem produzir compostos voláteis que agem sobre os
fitopatógenos. Fialho (2004) mostrou que diversos isolados de Saccharomyces cerevisiae
produzem compostos voláteis que inibem o crescimento de Guignardia citricarpa, agente
causal da pinta preta em citros. Compostos voláteis, produzidos por Muscodor albus,
proporcionaram menor taxa de tombamento de plântulas de brócolis provocado pelos
patógenos de solo Rhizoctonia solani e Phytophthora capsici em casa-de-vegetação
(MERCIER; MANKER, 2005). Diferentes espécies de Pseudomonas produzem os
compostos voláteis benzotiazol, ciclohexanol, n-decanal, dimetil trisulfeto, 2-etil 1-hexanol,
e nonana, os quais reduziram a germinação de ascósporos de Sclerotinia sclerotiorum em
pelo menos 54%, bem como apresentaram efeito fungicida sobre o micélio desse
fitopatógeno (FERNANDO et al., 2005).
Já o mecanismo de parasitismo, consiste na degradação da parede celular ou
estruturas de resistência dos fungos fitopatogênicos, com posterior penetração no fungo e
absorção do conteúdo celular (CHET, 1987). Assante et al. (2004) mostraram que
Cladosporium tenuissimum inibe a germinação de uredosporos de Uromyces
appendiculatus in vitro por parasitar essa estrutura reprodutiva. Porém, o parasitismo não
foi eficiente o suficiente para reduzir a severidade de ferrugem em plantas de feijão. Em
outro trabalho, Madsen e Neergaard (1999) verificaram que Pythium oligandrum
parasitavam escleródios de S. sclerotiorum in vitro.
Hifas de Pythium ultimum e R. solani foram parasitadas em placas de Petri pelo
isolado J1446 de Gliocladium catenulatum (McQUILKEN; GEMMELL; LAHDENPERA,
2001). Nesse trabalho, também foi verificado que G. catenulatum reduziu, em sementeiras,
13
o tombamento de amor-perfeito e de Antirrhinum majus provocado por P. ultimum, e o
tombamento de Alyssum saxatile e Salvia fulgens provocado por R. solani.
Finalmente, o fenômeno do controle biológico através da competição envolve,
principalmente, a disputa por nutrientes e espaço. Tanto a velocidade de crescimento,
quanto à eficiência na absorção de determinadas formas de carbono e nitrogênio
determinam a sobrevivência dos microrganismos em alguns ambientes (CAMPBELL,
1994).
Isolados de Fusarium oxysporum não patogênicos podem ser utilizados como
medida de controle de isolados patogênicos. Esse controle pode ser devido à competição
por carbono ou por sítios de infecção (ALABOUVETTE; LEMANCEAU; STEINBERG,
1996).
Garmendia; Goicoechea e Aguirreolea (2005) evidenciaram que em rizosféra de
pepino colonizada com a micorriza arbuscular Glomus deserticola, existe uma redução dos
sintomas provocados por Verticillium dahliae quando as plantas hospedeiras estão em
solos bem irrigados. Os autores sugerem que existe a competição por recursos entre os
fungos quando vão penetrar no tecido hospedeiro.
Espécies de Pseudomonas fluorescentes produzem sideróforos, que são compostos
que apresentam a capacidade de quelar ferro. Os isolados WCS358r Pseudomonas putida,
WCS374r P. fluorescens, WCS417r P. fluorescens e 7NSK2 P. aeruginosa inibiram o
crescimento de Ralstonia solanacearum in vitro devido à produção de sideróforos (RANA,
et al., 2005). Além disso, Dey et al. (2004) verificaram que vários isolados de P.
fluorescens controlaram in vitro Aspergillus niger, Aspergillus flavus e Sclerotium rolfsii,
mas em testes in vivo, realizados em amendoim, o controle não foi satisfatório.
Além da produção de enzimas extracelulares e de compostos voláteis, as leveduras
podem exercer ação de biocontrole por competir por nutrientes. Segundo Droby et al.
(1989), o controle de Penicillium digitatum e P. expansum por Debaryomyces hansenii foi
prejudicado com a adição de nutrientes exógenos em citros.
2.1.2aIndução de resistência
As plantas possuem mecanismos de resistência pré-formados, ou seja, estão
presentes antes do contato com o patógeno, bem como mecanismos de resistência pós-
formados, isto é, são ativados ou aumentam a concentração de compostos pré-existentes
14
após a infecção do patógeno. Ambos mecanismos podem ser estruturais ou bioquímicos
(PASCHOLATI; LEITE, 1995).
É mister lembrar ainda que na natureza a resistência é a regra e a suscetibilidade
exceção, (AGRIOS, 1997). Porém, o melhoramento genético visou, por muito tempo, a
seleção de variedades que apresentavam alta produtividade, boas características
agronômicas e comerciais e ignorou os mecanismos naturais de resistência das plantas. A
resistência induzida, em vista disso, consiste no aumento do nível de resistência por meio
da utilização de agentes externos (indutores), sem qualquer alteração do genoma da
planta, além de ocorrer de maneira não-específica, através da ativação de genes que
codificam para diversas respostas de defesa, tais como proteínas relacionadas à
patogênese (proteínas-RP), enzimas envolvidas na rota de síntese de fitoalexinas,
acúmulo de lignina em tecidos circunvizinhos ao local de penetração do microrganismo
(BONALDO, PASCHOLATI, ROMEIRO, 2005).
Como não é específica, agride menos o homem e o ambiente que os agrotóxicos,
não existe, aparentemente, quebra de resistência e a proteção pode ser local ou sistêmica;
então o interesse na indução de resistência como medida de controle de doenças de
plantas estimulou tanto a comunidade acadêmica, bem como empresas. Esse fato pode
ser verificado pelo número considerável de indutores de defesa comerciais, tais como
Oryzamate
®
, Bion
®
, Oxycom
®
, Messenger
®
, Elexa
®
, Phytogard
®
, Milsana
®
, Canary-Bac
®
,
Canary-Bot
®
.
Conforme
Siegrist; Muhlenbeck e Buchenauer (1998), esta parece ser uma
alternativa viável para o controle de doenças em curto prazo, principalmente quando se
pensa em substituir os agrotóxicos. Porém, essa nova tecnologia pode apresentar
desvantagens, como reduzir a colonização de micorrizas devido ao acúmulo de ácido
salicílico (COSTA; RÍOS-RUIZ; LAMBAIS, 2000; MEDINA et al. 2003), a resistência é
parcial, incompleta e pode requerer reativações temporárias (BONALDO; PASCHOLATI;
ROMEIRO, 2005), além de promover gasto energético, o que pode provocar redução na
produção (HAMMERSCHMIDT, 2005).
15
2.1.3aAtivação dos mecanismos de defesa
2.1.3.1aSinalização
Para que os mecanismos de defesa pós-formados sejam ativados, a planta deve
reconhecer o patógeno, emitir um sinal primário e ativar genes de defesa ou aumentar a
atividade de enzimas importantes para a defesa vegetal (VAN LOON; VAN STRIEM,
1999).
O reconhecimento é dado por meio de um elicitor que, segundo Smith (1996), é uma
molécula capaz de estimular resposta de defesa na planta. A natureza dessa molécula é
muito variada, tais como, microrganismos, ácido salicílico, vitamina B1, luz UV, glucana
(STANGARLIN; PASCHOLATI, 1994; LU; CHEN, 2005; AHN; KIM; LEE, 2005; STEVENS
et al.,1999; ANDREU et al., 1998).
Após o reconhecimento, uma cascata de sinais é acionada, o que leva a ativação
dos mecanismos de defesa das plantas. Um dos primeiros eventos na interação planta-
patógeno é a explosão oxidativa, que se constitui na produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (WU et al., 1997). As primeiras ROS produzidas são o ânion superóxido
(O
2
-
) e o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (GRANT; LAAKE, 2000). Um dos resultados da
explosão oxidativa é a reação de hipersensibilidade (RH), um mecanismo de defesa
imediata da célula infectada (KOMBRINK; SCHMELZER 2001) que é sucedido pela
ativação da resistência sistêmica adquirida (SAR). Diversos autores acreditam que a
expressão da SAR só acontece se houver a RH (COSTET et al., 1999;
HAMMERSCHMIDT, 1999). As alterações na fisiologia das células vegetais devido a RH
incluem o aumento rápido e transitório de agentes oxidantes, perda de íon de potássio (K
+
)
e de cálcio (Ca
2+
) e influxo de íon de hidrogênio (H
+
) e de cloro (Cl
-
) pelas células,
destruição de compartimentos, espessamento da parede celular e formação de cutícula,
além de biossíntese de compostos de defesa (FRITIG; HEITZ; LEAGRAND, 1998).
Outra molécula sinalizadora é o óxido nítrico (ON). Delledonne et al. (1998)
observaram efeito sinergístico entre o H
2
O
2
e o ON na expressão de resposta de defesa
em folhas de Arabidopsis contra Pseudomonas syringae, bem como na sinalização da via
do ácido salicílico (AS) (SONG; GOODMAN, 2001) e na ativação de genes, como o da
fenilalanina amônialiase (FAL) e o da chalcona sintase (DELLEDONNE et al., 1998). O
aumento da expressão destas enzimas estimula a via dos fenilpropanóides, o que resulta
16
na produção de vários compostos de defesa de plantas, como as fitoalexinas (WANG et
al., 2003; SHIRLEY, 1996). Estudos recentes focam no envolvimento do ON na RH, agindo
de modo sinergístico com as ROS ou de maneira independente (CLARKE et al., 2000;
DELLEDONNE et al., 1998). Yamamoto et al. (2004) mostraram que a síntese de ON
induzida por um elicitor sintético levou à ativação de uma proteína quinase, importante na
cadeia de sinalização da resistência induzida, e à expressão de genes hsr (hipersensitive-
related), o que ocasionou a morte de células de fumo através da reação de
hipersensitividade. Além disso, plantas de fumo tratadas com ON, apresentaram aumento
na concentração de AS e acúmulo de proteínas relacionadas à patogênese (proteína-RP)
(SONG; GOODMAN, 2001).
As ROS também estão envolvidas na indução de diferentes genes de defesa, como
o gene Ep5C de Arabidopsis, responsável pela síntese de peroxidases, que é expresso
rapidamente pelo H
2
O
2
(COEGO et al., 2005).
2.1.3.2aRotas metabólicas
Após a emissão do sinal primário, duas rotas metabólicas estão envolvidas na
síntese de compostos de defesa: uma dependente de AS e outra independente de AS. No
primeiro caso, o composto sinalizador é o próprio AS e na outra rota os sinalizadores são o
etileno e/ou o ácido jasmônico (KUNKEL; BROOKS, 2002). No geral, as plantas
respondem mais aos patógenos biotróficos, com a ativação da rota do AS, porém ativam a
rota do etileno-jasmonato quando atacadas por patógenos necrotróficos ou herbívoros
(TON et al., 2002).
Plantas infectadas com fitopatógenos apresentam acúmulo de AS em seus tecidos.
Além disso, a aplicação de AS exógeno resulta no incremento da resistência da planta
contra vários fitopatógenos (RYALS;
NEUENSCHWANDER, 1996). É mister lembrar ainda,
que plantas trangênicas, as quais não acumulam esse composto, além de não ativarem os
genes codificadores de proteínas-RP, também são mais vulneráveis aos ataques de
fitopatógenos (GAFFNEY et al., 1993). Por outro lado, plantas trangênicas que convertem
corismato em AS são mais resistentes a diversos fitopatógenos (VERBERNE et al. 2000).
Plantas de Arabdopsis tornaram-se resistentes a Pseudomonas syringae entre 5 e 7
semanas após a germinação das sementes. Essa resistência é devida ao acúmulo de AS
nos espaços intercelulares das plantas (CAMERON; ZATON, 2004). Plantas de lírios
17
tratadas com AS nas raízes ou nas folhas tiveram os sintomas de requeima e necrose,
provocados por Botrytis ellpitica, reduzidos em pelo menos 50 % em relação às não
tratadas (LU; CHEN, 2005).
O etileno, por sua vez, é um hormônio vegetal gasoso e está envolvido em vários
processos fisiológicos, além de ser produzido após a infecção de patógenos e de ativar
mecanismos de defesa das plantas quando aplicado exógenamente, o que leva a acreditar
na sua ligação com a SAR (BOLLER, 1990). Além disso, esse hormônio é requerido para a
produção e/ou transmissão dos sinais sistêmicos produzidos pela SAR (VERBERNE et al.,
2003) e para a expressão de proteínas-RP (JACOBS; DRY; ROBINSON, 1999). O
precursor do etileno é o 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), o qual é produzido
como resultado do ciclo de Yang (ABELES; MORGAN; Jr. SALTVEIT, 1992). O primeiro
passo desse ciclo é catalisado por S-adenosil-L-metionina (SAM) sintetase. Adenosil liga-
se com L-metionina, o que resulta em SAM. No passo seguinte, SAM é convertido em ACC
e 5-metiladenosina, reação catalisada pela ACCsintetase. Finalmente, ACC é oxidado em
etileno pela ACCoxidase (GRICHKO; GLICK, 2001).
Knoester et al. (1999) mostraram que plantas de Arabidopsis, insensíveis ao etileno,
tratadas com a rizobactéria Pseudomonas fluorenses WCS417r, eram mais suscetíveis a
Pseudomonas syringae pv. tomatoe que plantas sensíveis a esse fitohormônio. Outros
estudos igualmente mostram que o etileno é um importante sinalizador para e expressão
de resistência de plantas a doenças (VERBERNE et al., 2003; KNOESTER et al., 1998;
KNOESTER et al., 2001). Todavia, Lund; Stall e Klee (1998) mostraram que um mutante
natural de tomate, insensível ao etileno, apresentou significante redução nos sintomas
provocados por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Pseudomonas syringae pv.
tomato e Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Ademais, outros trabalhos também
mostram que esse hormônio não é importante para a expressão da resistência de plantas
(STICHER; MAUCH-MANI; MÉTRAUX; 1997; MAUCH; HADWIGER; BOLLER, 1984).
Os trabalhos acima mostram que ainda não existe uma conclusão com relação da
importância do etileno no processo de sinalização para a expressão de resistência de
plantas a doenças.
O acido jasmônico e seus derivados estão distribuídos amplamente nos tecidos
vegetais (BOSTOCK, 1999) e estão envolvidos em vários eventos fisiológicos tais como,
maturação de frutos e de pólen, crescimento e senescência de raízes, além de induzir os
eventos tipicamente associados a SAR, como a síntese de osmotina (proteína-PR da
18
família 5), de chalcona sintase e de FAL (CREELMAN; MULLET,1997; STICHER; MAUCH-
MANI; MÉTRAUX; 1997).
Os jasmonatos são sintetizados pela oxigenação do ácido linoléico com
lipoxigenases e, então, convertidos no ácido 12-oxo-fitodienoico. Finalmente, a redução do
ácido 12-oxo-fitodienoico resulta na produção do ácido jasmônico (CREELMAN; MULLET,
1997). As lipoxigenases são uma classe de enzimas que catalisam a adição do oxigênio
molecular ao sistema pentadieno dos ácidos graxos polinsaturados, formando
hidroperóxidos dos ácidos graxos correspondentes (BUNKER et al., 1995). Quando o
tecido de planta é danificado por patógenos ou mecanicamente, ocorre uma degradação
seqüencial de lipídeos em que os produtos primários da reação das lipoxigenases, os
hidroperóxidos, podem ser metabolizados por duas vias enzimáticas principais:
hidroperóxido liase e hidroperóxido ciclase. A hidroperóxido liase produz aldeídos que,
possivelmente inibem o crescimento dos patógenos (CROFT; JÜTTNER; SLUSARENKO,
1993). Além disso, os jasmonatos estão envolvidos na biossíntese de fitoalexinas,
defensinas e na expressão de genes das proteínas-RP (GUNDLACH et al., 1992;
PENNINCKX et al., 1996; XU et al., 1994).
Yao e Tian (2005) verificaram que a aplicação de metil jasmonato pré ou pós
colheita, reduziu a incidência de Monilinia fructicola em cereja (Prunus avivum L.) 15 e 60
dias após a colheita dos frutos. Além disso, o controle desse patógeno foi mais eficiente
com a aplicação de metil jasmonato em pré-colheita. A aplicação de jasmonatos em
plantas de batata e tomate proporcionou a redução dos sintomas de requeima nas
mesmas, causada por Phytophthora infestans (COHEN; GISI; NIEDERMAN, 1993).
2.1.3.3aProteínas relacionadas à patogênese
As proteínas-RP agem diretamente sobre o patógeno e estão agrupadas em 17
famílias (CAVALCANTI; BRUNELLI; STANGARLIN, 2005). Essas proteínas apresentam
algumas características que as distinguem das demais proteínas vegetais, tais como
estabilidade em pH baixos, em torno de 2,8 (quase a totalidade das demais proteínas das
plantas precipita nessa condição), resistência à ação de enzimas proteolíticas, estabilidade
sob altas temperaturas (em torno de 60-70
o
C), com massa molecular variando entre 8 e
50 kDa e podem estar localizadas no vacúolo, parede celular e/ou apoplasto (STINTIZI et
al., 1993).
19
Há dois mecanismos de ação das proteínas-RP. O primeiro mecanismo é hidrolítico
sobre a parede celular de fungos e bactérias (YOSHIKAWA; TSUDA; TAKEUCHI, 1993),
como as quitinases e glucanases que hidrolisam polímeros de quitina e de glucana,
respectivamente, os principais componentes da parede celular dos fungos (VAN LOON;
VAN STRIEM, 1999). Já o segundo mecanismo de ação é indireto, com a liberação de
elicitores não específicos devido à ação lítica dessas enzimas (YOSHIKAWA; TSUDA;
TAKEUCHI, 1993).
As quitinases são proteínas-RP que pertencem as famílias RP-3, 4, 8 e 11. A
diferença existente entre essas classes de quitinases é o substrato que elas hidrolisam
(VAN LOON; VAN STRIEM, 1999). O indutor comercial acibenzolar-S-metil (ASM) reduziu
a severidade de Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas axonopodis pv.
vesicatoria e Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis em plantas de tomate
(BAYSAL et al., 2003). Nesse trabalho, foi verificada maior atividade de quitinase em
plantas tratadas com ASM em relação às plantas não tratadas 2, 5 e 7 dias após o
tratamento, além de maior atividade de peroxidases 5 dias após o tratamento. Di Piero
(2003) verificou que o extrato aquoso de Lentinula edodes, além de reduzir a severidade
de antracnose em pepino, provocou o acúmulo local e sistêmico de quitinases em plantas
de pepino inoculadas com Colletotrichum lagenarium.
Quanto as glucanases, as mesmas são classificadas como PR-2 e apresentam a
capacidade de hidrolisar polímeros de glucana (VAN LOON; VAN STRIEM, 1999).
Segundo Nishizawa et al. (2003), plantas trangênicas de arroz que super expressam β-1,3-
glucanase são mais resistentes a Magnaporthe grisea do que plantas que não super
expressam essa proteína-RP. Além disso, as plantas trangênicas apresentaram maior
quantidade de lesões características de interações não compatíveis, ou seja, devido à
reação de hipersensibilidade. Em outro experimento com plantas trangênicas, Wro´bel-
Kwiatkowska et al., (2004) verificaram que plantas de Linum usitatissimum que super
expressaram β-1,3-glucanase eram pelo menos 3 vezes mais resistentes do que as
plantas não transformadas. O cultivar de melão PMR-6, resistente a infecção por
Sphaerotheca fusca, acumulou β-1,3-glucanase 2 dias após a inoculação. Porém, no
cultivar Rochet, suscetível, essa enzima só foi detectada 5 dias após a inoculação. Em
vista disso, a diferença na velocidade da expressão dessa enzima pode estar relacionada
com a resistência ou não do melão a S. fusca (RIVERA et al., 2002). Foi verificada por Di
Piero (2003) que plantas de tomate tratadas com estratos aquosos de basidiocarpo de
20
Agaricus blazei tornaram-se mais resistentes a Xanthomonas vesicatoria. Além disso, o
extrato não exerceu ação direta sobre a fitobactéria, mas estimulou o acúmulo de β-1,3-
glucanase no hospedeiro. Por sua vez, plantas de cevada tratadas com goma xantana
tiveram os sintomas local e sistemicos, provocados por Bipolaris sorokiniana, reduzidos em
pelo menos 80% e as plantas tratadas apresentaram maior atividade de β-1,3-glucanase
(CASTRO; BACH, 2004).
Finalmente, as peroxidases (PR-9) são glicoproteínas antioxidantes capazes de
catalisar grande número de reações como, produção ou catálise de H
2
O
2
, formação de
lignina, suberização, catabolismo de auxinas e cicatrização de ferimentos (ALVAREZ et al.,
1998; GRIESEBACH, 1981; HIRAGA et al., 2001). Além disso, em cultivares resistentes ou
em plantas tratadas com indutores de resistência esse aumento é mais pronunciado que
nas relações planta-patógenos compatíveis (RAY; HAMMERSCHMIDT, 1998; GOWDA;
BHAT; BHAT, 1989; RONCATO; PASCHOLATI, 1998). Boudjeko et al. (2005) verificaram
que em cultivares resistentes de Xanthosoma sagittifolium a atividade de peroxidase
cresceu 41% 2 dias após a inoculação com Pythium myriotylum, porém em cultivares
suscetíveis, a atividade dessa enzima cresceu apenas 13%. Em outro trabalho, Egea et al.
(2001) verificaram a existência de uma correlação positiva entre a resistência de três
cultivares de pimentão a Phytophthora capsici e a excreção de peroxidases de culturas
celulares dessas variedades inoculadas com esse oomiceto. Por sua vez, Labanca (2002)
e Di Piero (2003) verificaram que S. cerevisiae e extrato aquoso de basidiocarpo de L.
edodes, respectivamente, elicitaram a atividade de peroxidade no patossistema pepino-C.
lagenarium.
2.1.3.4aFenóis e fitoalexinas
Os fenóis são produzidos por células distribuídas pelo tecido vegetal, ao acaso ou
em locais estratégicos. Esses compostos apresentam um anel benzeno ligado à pelo
menos uma hidroxila e existem mais de 10.000 estruturas diferentes (TAIZ; ZEIGER,
2004). São sintetizados por diferentes rotas metabólicas e a classe mais abundante é
derivada da fenilalanina. Para isso, a fenilalanina amonialiase (FAL) remove uma molécula
de amônia do ácido cinâmico (TAIZ; ZEIGER, 2004). As enzimas dessa síntese são
associadas ao reticulo endoplasmático, o que permite, logo após a produção, que esses
compostos sejam armazenados em vesículas na sua forma original ou glicosilada. A
21
compartimentalização é fundamental para o funcionamento das células, pois os fenóis são
tóxicos e devem ser mantidos em sua forma reduzida. A descompartimentalização dos
fenóis pode levar a sua rápida oxidação, pela ação das peroxidases, em resposta a uma
infecção. Os fenóis que se mantêm livres no citoplasma podem ter ação tóxica tanto sobre
o patógeno como sobre a célula vegetal e contribuir para a resposta de hipersensibilidade
(ISAAC, 1992), sendo esta uma resposta celular extrema por parte da planta podendo
levar a um alto grau de resistência á doença (PASCHOLATI; LEITE, 1995).
Essa classe de compostos apresenta duas maneiras de ação: a primeira é para
reduzir o crescimento do patógeno nos tecidos do hospedeiro como, a deposição de lignina
e formação de fenóis de baixo peso molecular (ácido benzóico, fenilpropanóides). A
segunda envolve a ativação do metabolismo de novo e a síntese de compostos
relacionados ao estresse, como as fitoalexinas (NICHOLSON; HAMMERSCHMIDT, 1992).
A lignina é um polímero de grupos de fenilpropanóides altamente ramificado e pode
ser encontrado nas paredes celulares de diversos tecidos de sustentação e vasculares
(TAIZ; ZEIGER, 2004). Nos tecidos lenhosos, esse composto pode estar presente entre 25
a 40% (ISHERWOOD, 1960). Segundo Pascholati e Leite (1995), a lignina apresenta um
alto potencial de defesa celular contra o ataque de patógenos por aumentar a resistência
da parede celular, dificultar a difusão de toxinas em direção ao hospedeiro e a liberação de
nutrientes para os patógenos. Em estudos com culturas de células de pimentão, Egea et
al. (2001) verificaram que a cultivar Smith-5, que é resistente a Phytophthora capsici,
acumulou mais lignina que a cultivar susceptível Wonder. Dubery e Slater (1997)
verificaram que um elicitor da parede de Verticillium dahliae elicitou o acúmulo de lignina
em discos foliares de plantas de algodão.
Outros compostos fenólicos muito estudados são as fitoalexinas, que apresentam
baixo peso molecular e são produzidas pelas plantas em resposta a infecção ou estresse
(HARTLEB; HEITEFUSS; HOPPE, 1997), sendo sintetizadas pelo metabolismo secundário
das plantas (HAMMERSCHMIDT, 2003). Ademais, dentre as diferentes respostas de
defesa, a síntese desses compostos normalmente é o último evento (HARTLEB;
HEITEFUSS; HOPPE, 1997), a qual pode ser ativada por elicitores exógenos, ou seja,
produzidos pelos patógenos, ou elicitores endógenos, que são produzidos pelas plantas
em resposta a uma situação de estresse (SEKI et al., 1999). Apresentam uma grande
variedade de estruturas químicas, mais de 400, porém todas são lipofílicas, o que permite
atravessar o plasmalema, além de interferir no funcionamento normal das membranas
22
como no aumento da perda de eletrólitos (SMITH, 1996). Apesar dessa diversidade, as
fitoalexinas são sintetizadas através de três rotas metabólicas: acetato-malonato, acetato-
shiquimato e acetato-mevalonato (HARTLEB; HEITEFUSS; HOPPE, 1997).
Bonaldo (2005) verificou que extratos autoclavados de levedura elicitaram o
acúmulo de fitoalexinas em plantas e em mesocótilos de sorgo inoculados com
Colletotrichum sublineolum. Além disso, as plantas de sorgo apresentaram menor
severidade de antracnose tanto local quanto sistemicamente. Thomma et al. (1999)
verificaram que plantas de Arabidopsis deficientes na produção na fitoalexina camalexina,
foram mais susceptíveis á Alternaria brassicicola do que as plantas que produziam esse
composto. Por outro lado, esse mutantes não foram mais susceptíveis a B. cinerea.
2.1.4aTobacco mosaic virus (TMV)
O TMV possui grande importância histórica na fitopatologia mundial. Em 1885,
Mayer, pesquisador alemão, estudando a causa do mosaico em plantações de fumo dos
Países Baixos, testou diversas hipóteses como, a deficiência nutricional, falta ou excesso
de umidade, temperaturas extremas, porém as mesmas não eram responsáveis pelo
desenvolvimento de mosaico em fumo. Paralelamente, esse pesquisador verificou que o
suco de tecido de planta de fumo doente era capaz de infectar uma planta sadia e essa
infectividade era perdida quando o extrato era aquecido a 80ºC por várias horas, além de
que as sementes de plantas doentes geravam plantas sadias e o agente causal não era
veiculado pelo solo. A esse desconhecido patógeno, Mayer chamou de fluido vivo
contagioso. Posteriormente, em 1892, Ivanowski verificou que o agente causal do mosaico
do fumo era capaz de passar através de filtro de porcelana. Em vista dos conhecimentos
científicos da época, para o pesquisador, a causa do mosaico poderia ser uma toxina
produzida por alguma bactéria. Já Beijerinck, em 1898, confirmou os resultados de Mayer
e Ivanowski e, além disso, verificou que o agente causal era capaz de difundir em gel de
agarose e o chamou de vírus. Finalmente, em 1935, Stanley isolou uma estrutura cristalina
protéica com as propriedades do TMV.
O vírus do mosaico do fumo encontra-se amplamente distribuído nas regiões onde
esta planta é cultivada. Individualmente, as plantas infectadas por este fitopatógeno,
apresentam redução na produção de até 15%, porém a alta incidência do mesmo, faz com
que esta seja uma das principais doenças da cultura (SHEW; LUCAS, 1990). Este
23
retrovírus, ou seja, vírus com ácido nucléico tipo RNA, pertence ao grupo Tobamovirus,
com dimensões de 18 nm x 300 nm e é composto por uma capa protéica com
aproximadamente 2130 subunidades idênticas e por apenas uma fita de ácido nucléico
(CULVER, 2002).
Os sintomas causados pelo vírus nas plantas podem ser observados em todos os
estádios de desenvolvimento. Geralmente, causam redução da área foliar, rugosidades e
má formação das folhas, que se apresentam mais afiladas e espessas. No limbo foliar,
observa-se a presença de mosaico.
A movimentação do vírus na planta pode ser por dois mecanismos. O primeiro
mecanismo é o movimento célula a célula, o que ocorre através dos plasmodesmas. Para
isso, o RNA do vírus forma um complexo com a proteína 30 K, e o conjunto é transportado
para o plasmodesma, o qual tem o limite de exclusão aumentado, o que permite a
passagem da proteína e do RNA viral (CARRINGTON et al., 1996). O segundo mecanismo
é a movimentação sistêmica do vírus, a qual ocorre no floema das plantas inoculadas,
(CHENG, 2000), e para esse movimento, o ácido nucléico viral deve estar encapsulado
(CARRINGTON et al., 1996).
O papel da capa protéica desse Tobamovirus na elicitação de várias respostas de
resistência gene-específica tem sido caracterizada. Várias evidências levam a conclusão
de que a capa proteica é o ativador da resposta de hipersensibilidade conferida pelo gene
N (CULVER, 2002).
2.1.5ACianobactérias e algas eucarióticas
2.1.5.1AAspéctos gerais
2.1.5.1.1aCianobactérias
As cianobactérias (algas verdes-azuis), juntamente com as algas eucarióticas,
compreendem a maior parte da biomassa do mundo (PELCZAR et al., 1996). Sua
ocorrência abrange um espectro ambiental muito variado envolvendo solos, água doce e
salgada, áreas onde a temperatura é muito alta (superior a 60
º
C) e/ou extremamente
áridas (que não comporta o desenvolvimento de outros grupos biológicos). Essa
24
versatilidade é devido em grande parte a capacidade que as cianobactérias exibem de fixar
nitrogênio e realizar fotossíntese (STANIER; COHEN-BAZIRE, 1977).
As principais características das cianobactérias, segundo Pelczar (1996), são
ausência da membrana núclear, de cloroplastos limitados por membrana, de retículo-
endoplasmático, de mitocôndrias e de complexo de Golgi; e se reproduzem por fissão
binária. Além disso, apresentam sensibilidade a infecções virais, morfologia semelhante a
bactérias e formas bastante variadas, como cocos, bastonetes ou filamentos longos; são
uni ou multicelulares; não possuem flagelos.
A parede celular das cianobactérias apresenta peptídeoglicano, o qual corresponde
a 50% do peso seco da parede celular. O mucopolimero da parede celular é composto de
5 unidades básicas típicas, das quais 2 são amino-açúcares (ácido murâmico e
glucosamina) e 3 são aminoácidos (ácido diaminopimélico, ácido glutâmico e alanina)
(Weise et al., 1970).
Algumas cianobactérias podem fixar nitrogênio através de células anaeróbicas
denominadas heterocisto. Nos países do continente asiático, as cianofíceas representam a
principal maneira de manutenção desse nutriente no solo. Quando os campos daquele
continente estão alagados, as cianobactérias fixam nitrogênio, por sua vez quando estão
secos, esses microorganismos morrem e liberam o nitrogênio para o solo. A associação
Azolla sp.-Anabaena sp. pode fixar 0,5 kg de nitrogênio/hectare/dia, suficiente para manter
uma lavoura de arroz (TAIZ; ZEIGER, 2004).
2.1.5.1.2aAlgas eucarióticas
Visto que 75% do planeta Terra é coberto de água, estima-se que 80% do O
2
existente seja produzido por algas (TORTORA et al., 2000). As algas são fotoautotróficas,
porém algumas podem crescer de maneira heterotrófica. Já que todas as células das algas
fazem fotossíntese e são capazes de absorver nutrientes, as mesmas não precisam de
sistemas de vasos (Pelczar et al., 1996). As algas eucarióticas podem ser unicelulares ou
multicelulares. O corpo é formado por um talo, que fixa a alga em um suporte, uma
estrutura caulinifome, que não é lignificada ou lenhosa e por lâminas que se assemelham a
folhas (TORTORA et al., 2000). Segundo Pelczar et al. (1996) as algas podem ser
classificadas de acordo com sua pigmentação, habitat, morfologia, fonte de reserva de
energia e composição da parede celular.
25
De maneira diferente das cianobactérias, a parede celular das algas eucarióticas é
composta principalmente por celulose. Além desse polissacarídeo, elas podem conter
pectina, ácido algínicos e sílica. Também são encontradas algas onde a parede celular
está ausente (Pelczar et al., 1996). Elas contribuem para a formação e integridades dos
solos, além de constituir comunidade pioneira em substratos recentemente expostos à
biosfera, como depósitos vulcânicos. Essa característica é devido à ação de
polissacarídeos extracelulares produzidos pelas algas que liberam os nutrientes insolúveis
dos substratos, além da capacidade de fixar nitrogênio (METTING, 1981).
2.1.5.2aPropriedades farmacológicas de cianobactérias e de algas
Burja (2001) cita que diferentes espécies de Nostoc são utilizadas no tratamento de
artrite, úlcera e várias formas de câncer desde 1500 a.C., além disso, elas podem ser
indicadas como suplemento alimentar, como Nitzschia frustula ou Nostoc flagelliforme que
além de crescerem rápido, apresentam boas qualidades nutricionais e trazem benefícios a
saúde (RAO; PAN; AL-YAMANI, 2005; TAKENAKA et al., 1998).
Dois compostos foram isolados, calothrixina A e B, de Calothrix sp., os quais
apresentaram atividade in vitro sobre células cancerígenas humanas e sobre Plamodium
falciparum, agente causal da malária (RICHARDS et al., 1999). Ademais, mutantes sem
parede celular de Chlamydomonas reinhardtii apresentaram atividade anticancerígena em
células de ratos (MAUCOURT et al., 2002). Por outro lado, diferentes preparações de
algas ou cianobactérias apresentam efeito direto sobre diversos vírus, como o vírus de
gripe A, Avian myelblatosis virus (AMV), Herpes simplex virus (HSV), Human
immunodeficiency virus (HIV) (ZAINUDDIN et al., 2002; HAYASHI; HAYASHI; MORITA,
1992; LAU et al., 1993, HULEIHEL; et al., 2001), bactérias, como, Staphylcoccus aureus,
Staphylcoccus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
(XU et al., 2003, OSTENSVIK et al., 1998); e fungos, como Candida albicans (MILLIGAN et
al., 2000); causadores de enfermidades em seres humanos. Uma vacina desenvolvida a
base de uma β-glucana isolada da alga Laminaria digitata evitou que ratos fossem
infectados por Candida albicans (TOROSANTUCCI et al., 2005)
26
2.1.5.3aEfeito de cianobactérias e de algas sobre animais
Soares; Magalhães e Azevedo (2004) verificaram o acúmulo de microcistina, um
grupo de toxinas compostas por sete peptídeos, isolada de esporos de Microcytis
aeruginosa, no fígado e no músculo de Tilapia rendalli. Não menos importante, toxinas
produzidas por cianobactérias ou algas podem afetar a saúde de outros animais aquáticos,
como salmão, truta, anfíbios, invertebrados aquáticos e ciliados (ANDERSEN et al., 1993;
KANKAANPÄÄ et al., 2002; BROENMARK; MINER, 1992; SMITH; VAN BUSKIRI, 1995;
HAVEL, 1990; FYDA; WIACKOSK, 1998; JULLIARD et al., 2001). A morte de peixes e de
gado na Austrália esta relacionado com a esporulação de varias espécies de algas
(HALLEGRAEFF, 1992). Por sua vez, Rao et al. (1998) verificaram que microcistina
provoca a fragmentação de DNA em ratos vivos. Nogle e Gerwick (2002) verificaram que
somocistinamida A (1) é tóxica a ratos e apresentou IC
50
= 1,4µg/ml. Em outro estudo que
envolveu essa toxina, Delaney e Wilkins (1995) verificaram que a mesma foi mais eficiente
no controle de traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), mosca (Musca domestica) e
lagarta-militar (Spodoptera littorais) do que os inseticidas usados como controles.
2.1.5.4aEfeito de cianobactérias e de algas sobre o homem
A presença de toxinas produzidas por cianobactérias em água está recebendo mais
atenção da comunidade científica mundial (LAMBERT; HOLMES; HRUDEY, 1994;
FALCONER, 1999), a fim de se evitar casos como aqueles que ocorreram na China, onde
a água para o consumo estava contaminada com microcistina, o que provocou o
desenvolvimento de uma epidemia de câncer naquele país (WU et al., 1999), ou no Brasil,
em Caruaru, onde 89% dos pacientes que freqüentaram o centro de hemodiálises “A” em
fevereiro de 1996 morreram, e os sobreviventes apresentaram distúrbios visuais, náuseas
e vômitos. Porém, os pacientes que freqüentaram o centro de hemodiálises “B” não
tiveram esses problemas. Após a analise da água, foi detectado a presença de microcistina
apenas na água do centro de hemodiálises “A”, pois a água desse centro não era filtrada e
clorada, enquanto a do centro “B” recebia esses tratamentos (JOCHIMSEN et al., 1998).
Ademais, de acordo com Soares; Magalhães e Azevedo (2004), 82% das cianobactérias,
isoladas de água doce em diferentes ecossistemas no Brasil, produzem alguma substância
27
tóxica, o que pode representar um risco para o consumo de alimentos oriundos de
ambientes aquáticos.
As cianobactérias não causam problemas apenas na qualidade da água. Em
Guam, Ilhas Maurício, uma espécie de Nostoc vive em simbiose com árvores do gênero
Cica. Todavia, essa cianobactéria produz β metilamino-L-alanina, o qual é absorvido pelas
plantas, translocado e armazenado nos frutos. Os “flying fox”, ou seja, morcegos gigantes,
se alimentam desses frutos contaminados, que posteriormente poderão ser capturados e
preparados em um prato típico da população daquela ilha. Ao se alimentarem da carne do
morcego, as pessoas ingerem, conseqüentemente, o composto produzido pela
cianobactéria, o que provoca alta taxa de indivíduos com distúrbios neurológicos e baixa
expectativa de vida dos habilitantes daquele local (COX; BABACK; MURCH, 2003).
2.1.5.5aEfeito de cianobactérias e de algas sobre fitopatógenos
Alguns fungos de interesse para os fitopatologistas, como os saprófitas Chaetomium
globosum, Cunninghamella blakeslleeana e Aspergillus oryzae (DE MULÉ et al., 1977;
MATUSIAK; KRZYWICKA, 1975), bem como os fitopatógenos R. solani e S. sclerotiorum
(DE CAIRE et al., 1987) podem ser inibidos in vitro por diferentes cianobactérias. Alguns
trabalhos também relatam a capacidade de extratos de algas marinhas, quando aspergidos
sobre plantas reduziram a incidência de B. cinerea em morangos, Erysiphe polygoni em
nabo e “damping-off” em plântulas de tomate (ABETZ; YOUNG, 1983; STEPHENSON,
1966).
De acordo com Kulik (1995), visto que muitas cianobactérias e algas produzem
uma grande quantidade de compostos antibacterianos e antifúngicos e poderem ser
cultivadas em larga escala, as mesmas mostram-se adequadas como candidatas para uso
como possíveis agentes controladores de fitopatógenos. Nesse sentido, o referido autor
escreveu o artigo “The potential for using cyanobacteria (blue-green algae) and algae in the
biological control of plant pathogenic bacteria and fungi”, estimulando estudos visando o
uso de cianobactérias, como possíveis agentes biológicos de controle de fitopatógenos e
elicitores de resistência em plantas. Assim, Di Piero (1999) demonstrou que filtrados de
culturas e os conteúdos intracelulares das cianobactérias Synechococcus leopoliensis e
Nostoc sp. reduziram em pelo menos 50% a quantidade de lesões provocadas pelo TMV
em plantas de fumo, cultivar TNN.
28
Pandey e Pandey (2002) verificaram que extratos etanólicos de Lyngbya majuscula,
Microcystis aeruginosa e Plectonema boryanum, além de terem reduzido o crescimento in
vitro de Xanthomonas vesicatoria, também reduziram o número de lesões provocadas por
essa bactéria, em pimentão, em pelo menos 85%, na concentração de 500 mg.l
-1
. Extratos
metanólicos de várias espécies de Laurencia apresentaram efeito in vitro sobre Erwinia
amylovora (Vairappan et al., 2001).
Além disso, Beltrame e Pascholati (2005) evidenciaram que suspensões de isolados
de cianobactérias, bem como suas preparações reduziram a esporulação, local e
sistêmica, de Podosphaera xanthii em plântulas de pepino. Os mesmos autores também
verificaram que as suspensões de cianobactérias reduziram a germinação de conídios do
patógeno.
Por outro lado, Pascholati et al. (1998) também constataram que o conteúdo
intracelular de Limnothrix planctonica induziu o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de
sorgo. Di Piero (1999) verificou que os preparados de S. leopoliensis elicitaram o acúmulo
de fitoalexinas em cotilédones de soja. Finalmente, Rao, Sarada e Ravishankar (1996)
constataram o acumulo de capsaicina e anthocianina, elicitadas por Spirulina platensis, em
culturas de células de Capsicum frutescens e Daucus carota. Esses resultados mostram
que as cianobactérias podem agir diretamente sobre os patógenos ou ativar respostas de
resistência latentes das plantas.
29
2.2aMateriais e Métodos
2.2.1aObtenção e manutenção das cianobactérias e algas eucarióticas
Os isolados de cianobactérias e de algas eucarióticas da coleção do Laboratório de
Fisiologia e Bioquímica do Parasitismo, do Setor de Fitopatologia (ESALQ/USP), foram
utilizados para a realização dos experimentos. Além disso, usou-se os isolados das
cianobactérias Nostoc sp. 21 e Nostoc sp. 61, cedidos pela Dr.ª Marly F. Fiori (CENA/USP,
Piracicaba, SP), bem como Rhabdoglea brasilica, fornecidos pela Dr.ª.Maria T.P. Azevedo
(Instituto de Botânica, SP). As cianobactérias e as algas eucarióticas serão chamadas de
maneira genérica de algas.
O cultivo foi efetuado em frascos tipo erlenmeyer de 250 ml, os quais continham 100
ml de meio de cultivo BG 11 (Anexo 1). A repicagem, periódica, foi efetuada com a adição
de uma alíquota de 1 ml de inóculo por recipiente. Os isolados foram mantidos a 28ºC sob
luz fluorescente constante.
Para verificar se os isolados utilizados eram de organismos eucariotos ou
procariotos, os mesmos foram cultivados em meio de cultivo com 10µg/l de ciclohexamida,
a qual inibe a síntese de proteínas de células de eucariotos.
2.2.2aQuantificação da clorofila a e do peso seco
A produção da biomassa foi monitorada, ao vigésimo dia de cultivo, com a quantificação da
clorofila a, bem como da matéria seca, dos isolados que apresentaram efeito sobre o TMV.
Para a quantificação da clorofila a, alíquotas de 1 ml das suspensões das algas foram
centrifugadas a 10.000 g por 10 min. Os sobrenadantes foram descartados e os
precipitados ressuspensos em metanol 100%. Após 5 min, as amostras foram novamente
centrifugadas a 10.000 g por 10 min. Os sobrenadantes, nos quais estava a clorofila a
extraída, foram avaliados em espectrofotômetro. A determinação da quantidade de clorofila
a foi efetuada com o emprego da fórmula: µg de clorofila a.ml
-1
= Absorbância (665
nm).12,5 (Aguiar, 1992). Por sua vez, o peso seco foi quantificado com a filtragem de 10 ml
de suspensão das algas em filtros GF/A, cujos pesos foram previamente determinados.
Após, os filtros foram mantidos em estufa a 60ºC por 48 h e foram novamente pesados. A
30
quantificação da matéria seca foi feita com base na diferença da segunda para a primeira
pesagem.
2.2.3aObtenção dos preparados das algas
A obtenção dos preparados de algas foi conduzida de acordo com a metodologia
descrita por Di Piero (1999). Alíquotas de 75 ml de culturas das algas (com 20 dias de
cultivo e mantidas a 28ºC, sob luz fluorescente constante) foram filtradas a vácuo em papel
de filtro GF/A, seguida de outra filtragem a vácuo em membrana tipo Millipore (diâmetro de
0,2 µm), obtendo-se o "filtrado do meio de cultivo" (M). Por sua vez, as células retidas na
filtragem das culturas foram colocadas em almofariz e maceradas com pistilo, com a
adição de nitrogênio líquido. O pó obtido foi ressuspenso em 10 ml de água destilada e as
suspensões resultantes centrifugadas a 10.000 g por 10 min, seguida por filtragem a vácuo
do sobrenadante com o uso de membrana tipo Millipore, obtendo-se assim o “filtrado do
conteúdo intracelular” (C).
2.2.4aObtenção e manutenção das plantas hospedeiras
Sementes de fumo, cultivar TNN ou Turkish, obtidas no Laboratório de Fisiologia e
Bioquímica do Parasitismo, do Setor de Fitopatologia (ESALQ/USP), foram semeadas em
bandejas de isopor, contendo 128 células, preenchidas com substrato Plantmax (Hortaliças
HA), da EUCATEX AGRO. As plântulas de fumo, com 20 dias após a semeadura, foram
transplantadas para vasos de alumínio, com volume de 1840 cm
3
, que continham mistura
autoclavada de terra, areia e matéria orgânica (3:1:1, respectivamente). Todo o cultivo foi
realizado em casa-de-vegetação.
2.2.5aObtenção e manutenção do TMV
O isolado do vírus, cedido pelo Prof. Dr. Robson M. Di Piero (UFSC, Florianópolis),
foi inoculado mecanicamente em plantas sadias de fumo, cultivar Turkish, onde a
colonização é sistêmica, com 40 dias de cultivo, obtidas de acordo com o 2.2.4. As
mesmas foram mantidas em condições de casa-de-vegetação. Após 25 dias da inoculação
das plantas, as folhas que exibiam o sintoma típico causado pelo vírus (mosaico) foram
31
coletadas, pesadas, congeladas e a partir dessas feita a purificação parcial do vírus. Para
isto, foram utilizadas 125 gramas do tecido foliar, que foi homogeneizado, com auxílio de
liquidificador, em 250 ml de EDTA 0,003 M (pH 7,0) e 0,2 ml de 2-mercaptoetanol. O
extrato obtido foi filtrado através de gaze, aquecido por 10 min a 55º C e centrifugado por
20 min a 1.500 g. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado por 2 h a 100.000 g. O
precipitado foi ressuspenso em EDTA 0,003 M, pH 7,0 (1 ml/precipitado), acidificado a pH
5,2 com ácido cítrico 0,05 M e centrifugado a 12.000 g. O sobrenadante desta
centrifugação teve o pH ajustado para 7,0 com NaOH 0,05 M e centrifugado por 1 h a
39.500 rpm em rotor 40. O precipitado obtido foi ressuspenso em 1 ml de EDTA 3 mM, pH
7, completando assim a purificação parcial do vírus. A concentração do vírus foi calculada
utilizando-se a fórmula: c = Abs (260 nm)/e, onde “c” é a concentração do vírus em mg.ml
-1
e “e” o coeficiente de extinção do TMV, que equivale a 3,1 de absorbância para cada
mg.ml
-1
de vírus. Após sua quantificação, o vírus parcialmente purificado foi distribuído em
tubos tipo eppendorf. Cada tubo recebeu uma alíquota de 100 µl e foi mantido a - 20ºC.
2.2.6aEfeito da concentração do TMV no número de lesões em folhas de fumo
A fim de se determinar a melhor concentração de vírus para a inoculação das
plantas de fumo, do cultivar TNN, onde a colonização é local, com 40 dias de cultivo,
cultivadas como descrito no item 2.2.4, o vírus TMV foi inoculado, em 3 folhas
intermediárias das plantas, nas concentrações de 0,2; 0,04; 0,02; 0,01; 0,002 e 0,0004 mg
de vírus.ml
-1
de tampão fosfato de potássio 0,02 M, pH 7. Após a inoculação, as plantas
foram mantidas sob condições de casa-de-vegetação. Cada concentração foi composta
por 4 repetições. Após 5 dias, foi efetuada a contagem do número de lesões.
2.2.7aEfeito local de suspensões das algas na redução dos sintomas provocados
por TMV em plantas de fumo
Plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, cultivadas como descrito no
item 3.3, receberam os tratamentos, pincelando-se 3 folhas intermediárias, com as
suspensões de algas (20 dias após a repicagem, mantidas a 28ºC sob luz fluorescente
constante). O meio de cultivo BG 11, além de água destilada e acibenzolar-S-metil (ASM)
(50 i.a. mg.ml
-1
), foram usados como controle. Após 2 dias, as folhas previamente tratadas
32
foram inoculadas com TMV (0,02 mg de vírus.ml
-1
de tampão fosfato de potássio 0,02 M,
pH 7) mecanicamente. Cada tratamento foi composto por 3 repetições. Após 5 dias,
efetuou-se a avaliação, com a contagem do número das lesões. A análise estatística foi
efetuada com o uso do teste de Tukey 5%.
2.2.8aEfeito local e sistêmico de suspensão das algas na redução dos sintomas
provocados por TMV em plantas de fumo
Plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de crescimento, cultivadas como
descrito no item 2.2.4, foram tratadas, pincelando-se meia-folha intermediária, com as
algas Isolado 004/02, Isolado 008/02, Isolado 061/02, Isolado 090/02, Anabaena sp.,
Nostoc sp. 21 ou Nostoc sp. 61 (20 dias após a repicagem, mantidas a 28ºC, sob luz
fluorescente constante), além dos controles ASM
(50 mg.ml
-1
i.a.), água destilada ou meio
de cultura BG 11. A outra meia-folha, bem como a folha imediatamente superior e a inferior
à tratada com as suspensões das algas, foram tratadas com água destilada (Figura 1).
Após 2 dias, as 3 folhas tratadas foram inoculadas mecanicamente com TMV (0,02 mg de
vírus.ml
-1
de tampão fosfato de potássio 0,02 M, pH 7). A avaliação foi realizada 5 dias
após a inoculação do fitopatógeno. Cada tratamento foi composto por 3 repetições. A
análise estatística foi efetuada com o uso do teste de Tukey 5%. O experimento foi
repetido duas vezes.
Figura 1 - Esquema utilizado para os testes de verificação dos efeitos local e sistêmico das algas no controle
de TMV em plantas de fumo, cultivar TNN
Meia folha
tratada com um
dos tratamentos
Folhas tratadas
com água
destilada
Meia folha
tratada com água
destilada
Planta de fumo
33
2.2.9aEfeito das preparações das algas na redução dos sintomas provocados por
TMV em plantas de fumo
Plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de crescimento, cultivadas como
descrito no item 2.2.4, foram tratadas, pincelando-se meia-folha intermediária, com as
preparações das algas Isolado 004/02, Isolado 008/02, Isolado 061/02, Anabaena sp., ou
Nostoc sp. 61, obtidas como descrito no item 2.2.3, além dos controles meio de cultura BG
11, ASM
(50 i. a. mg.ml
-1
) ou água destilada. A outra meia-folha, bem como a folha
imediatamente superior e a inferior à tratada com as suspensões das algas, foram tratadas
com água destilada (Figura 1). Após 2 dias, as 3 folhas tratadas foram inoculadas
mecanicamente com TMV (0,02 mg de vírus.ml
-1
de tampão fosfato de potássio 0,02 M, pH
7). A avaliação foi realizada 5 dias após a inoculação do vírus. Cada tratamento foi
composto por 3 repetições. A análise estatística efetuada com o uso do teste de Tukey 5%.
O experimento foi repetido duas vezes.
2.2.10aEfeito inibitório das algas sobre o TMV
Suspensões dos isolados 004/02, 008/02, 061/02, 090/02, Anabaena sp., Nostoc sp.
21 e Nostoc sp. 61, além dos controles água destilada, meio de cultivo BG 11 e ASM (50
mg.ml
-1
i.a.) foram misturadas com suspensão viral (0,04 mg de vírus.ml
-1
de tampão
fosfato de potássio 0,02 M, pH 7) (1:1 v/v). A seguir, plantas de fumo, com 40 dias de
cultivo, cultivadas como descrito no item 2.2.4, foram inoculadas, mecanicamente, em uma
folha intermediária com um dos tratamentos. A avaliação foi realizada 5 dias após a
inoculação. Cada tratamento foi composto por 3 repetições. A análise estatística efetuada
com o uso do teste de Tukey 5%. O experimento foi repetido duas vezes.
2.2.11aObtenção das amostras para a realização dos testes bioquímicos
Plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de crescimento, cultivadas como
descrito no item 2.2.4, foram tratadas, pincelando-se meia-folha intermediária, com os
Isolado 008/02 ou Isolado 061/02 (20 dias após a repicagem, mantidas a 28ºC, sob luz
fluorescente constante) ou com as preparações 4C ou 61 M, obtidas como descrito no item
34
2.2.3, além dos controles ASM
(50 i. a. mg.ml
-1
), água destilada ou meio de cultura BG 11.
A outra meia-folha, bem como a folha imediatamente inferior à tratada com as suspensões
das algas ou controles, foram tratadas com água destilada (Figura 1). Após 2 dias, as
folhas previamente tratadas foram inoculadas, mecanicamente, com TMV (0,02 mg de
vírus.ml
-1
de tampão fosfato de potássio 0,02 M, pH 7) ou apenas com o tampão fosfato de
potássio.
Amostras de 0,5 g de discos foliares (2,1 cm ∅) foram coletadas e congeladas a
-20ºC. Os tempos de amostragem foram 0, 1, 2, 3, 4 e 6 dias após o tratamento das
plantas. As análises bioquímicas foram realizadas duas vezes. Na primeira análise, cada
tratamento foi composto por duas repetições. Já no segundo ensaio, cada tratamento foi
composto por 3 repetições.
2.2.12aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de β-1,3-glucanase
A determinação da atividade de β-1,3-glucanase foi realizada de acordo com
Kombrink e Hahlbrock (1986). Para isso, as amostras, obtidas como descrito no item
2.2.11, foram maceradas, a baixa temperatura, em almofariz com auxilio de pistilo,
homogeneizadas em 4,0 ml do tampão de extração (tampão acetato de sódio 100 mM, pH
5,0) e centrifugadas a 20.000 g por 25 min. Os sobrenadantes foram recolhidos para a
condução das análises. Em seguida, alíquotas de 150 µl dos extratos, receberam 150 µl de
laminarina 0,2%, dissolvida no tampão de extração, antes (1) (glucanases hidrolisam
laminarina liberando glicose) ou após (2) (glucanases não hidrolisam laminarina) o
aquecimento a 37ºC por 1h. Após, alíquotas de 10 µl das misturas de reação previamente
aquecidas receberam 1,5 ml de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PAHBAH) (1g
dissolvido em 20 ml HCl 0,5 M e, após, adicionado 80 ml NaOH 0,5 M) e então incubadas
em banho-maria a 100ºC por 10 min. A absorbância das amostras foi determinada em
espectrofotômetro a 410 nm e a absorbância da glicose liberada pela laminarina foi obtida
com base na subtração : (1) - (2). Os resultados expressos em µg de glicose/min/mg de
proteína. A curva padrão de glicose foi elaborada de acordo com Lever (1972), utilizando-
se soluções de 30, 60, 90 e 120 µg de glicose (Apêndice A). O teor total de proteínas foi
determinado de acordo com Bradford (1976) (Apêndice B). A análise estatística foi
35
efetuada, com a comparação dos tratamentos em um mesmo tempo de amostragem,
usando-se o teste de Tukey 5%.
2.2.13aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de peroxidases
A atividade de peroxidases nas amostras foi determinada espectrofotometricamente
a 470 nm em uma mistura de reação que consistiu de 0,1 ml de extrato, obtido como
descrito no item 2.2.12, e 2,9 ml do tampão de reação (100 ml tampão fosfato de sódio
0,01 M pH 6, 250 µl guaiacol e 306 µl peróxido de hidrogênio). A reação foi procedida por 1
min, com as medidas de densidade óptica tomadas a cada 6 s. Os resultados foram
expressos em unidades de Densidade Óptica a 470 nm/ mg proteína/ min (DO/mg
prot/min) (RONCATO e PASCHOLATI, 1998). O teor total de proteínas foi determinado de
acordo com Bradford (1976) (Apêndice B). A análise estatística foi efetuada, comparando-
se os tratamento em um mesmo tempo de amostragem, com o uso do teste de Tukey 5%.
2.2.14aVerificação do conteúdo total de fenóis
Para a extração de fenóis totais, amostras de 0,5 g, obtidas como descrito no item
2.2.11 foram homogeneizadas em metanol acidificado 80 % (80 ml de metanol + 0,1 ml
HCl + 19,9 ml H
2
O), centrifugadas a 12.000 g por 5 min e filtradas em papel de filtro
Whatman nº 1. Após, o metanol foi evaporado a 40ºC e o volume ajustado para 3 ml com
água destilada. A seguir, a clorofila foi removida com a adição de 4,5 ml de hexana nas
amostras e auxilio de pipeta Pasteur. Alíquotas de 150 µl do estrato obtido receberam 3 ml
de carbonato de sódio 2 % e, após 5 min, 150 µl do reagente Folin-Ciocalteau 2 N sob
agitação. A leitura da absorbância foi efetuada em espectrofotômetro a 750 nm após 30
min. A leitura da absorbância obtida foi substituída na curva padrão de fenóis, preparada
com ácido clorogênico e os valores foram expressos em equivalente µg de ácido
clorogênico por grama de peso fresco (Eq. µ g ác. clor./ gpf). As concentrações de ácido
clorogênico utilizadas na elaboração da curva foram de 0, 20, 50, 100, 150, 200 e 250
µg/ml (BRAY; THORPE, 1954) (Apêndice C).
36
2.2.15aVerificação de espécies reativas de oxigênio
Visto que, 3,3-diaminobenzidina (DAB) polimeriza-se após entrar em contato com
H
2
O
2
e nitroblue tetrazolium (NBT) é reduzido na presença de O
2
-
, pode-se detectar
espécies reativas de oxigênio in situ, em tecidos vegetais, através de análises histológicas,
com a observação do polímero castanho de DAB ou da coloração azul da forma reduzida
de NTB. Em vista disso, a detecção de H
2
O
2
e de O
2
-
in situ foi realizada de acordo com
Hückelhoven et al. (2000) e Thordal-Christensen et al. (1997), respectivamente. Para isso,
plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de crescimento, cultivadas como descrito no
item 2.2.4, foram tratadas, pincelando-se meia-folha intermediária, com as suspensões dos
isolados 008/02 ou 061/02 (20 dias após a repicagem, mantidas a 28ºC, sob luz
fluorescente constante) ou com as preparações 4C ou 61 M, obtidas como descrito no item
3.2, além dos controles ASM
(50 mg.ml
-1
i.a.), água destilada ou meio de cultura BG 11. A
outra meia-folha, bem como a folha imediatamente superior e a inferior à tratada com as
suspensões das algas, foram tratadas com água destilada (Figura 1). Após 2 dias, as 3
folhas tratadas foram inoculadas mecanicamente com TMV (0,02 mg de vírus.ml
-1
de
tampão fosfato de potássio 0,2 M, pH 7) sem o uso de abrasivo. Após 37 h, quando foi
possível visualizar os primeiros sintomas, discos foliares com 2 cm ∅, que apresentavam
sintomas típico de TMV em plantas de fumo, cultivar TNN, foram coletados e sofreram
infiltração a vácuo com tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,5, o qual continha DAB 1%
ou NBT 0,1 % por 30 min. Em seguida, os discos foram incubados em luz fluorescente por
1 h. Para o clareamento dos discos, os mesmos foram mergulhados em etanol fervente por
15 min. Após, a oxidação do DAB e a polimerização do NBT foram verificadas com o
auxilio de microscópio. O aumento utilizado foi de 40 vezes. O experimento foi repetido
duas vezes.
37
2.3aResultados
2.3.1
a
Distinção das algas procarióticas das eucarióticas
Os isolados 004/02, 063/02, 087/02, 088/02, 106/02, 118/02, Anabaena sp., Nostoc
sp. 21, Nostoc sp. 61 e Rhabdoglea brasilica cresceram em meio de cultivo BG 11 que
continha ciclohexamida (10µg/ml), mostrando que são cianobactérias. Por sua vez, os
isolados 002/02, 008/02, 034/02, 042/02, 061/02, 062/02, 067/02, 072/02, 073/02, 075/02,
082/02, 083/02, 089/02, 090/02, 094/02, 095/02, 113/02 não cresceram, evidenciando
serem algas eucarióticas.
2.3.2aQuantificação da clorofila a e do peso seco
A Figura 2 mostra que os isolados 004/02 e Nostoc sp. 21 apresentaram maior
concentração de clorofila a, aproximadamente 12 µg de clorofila a.ml
-1
, bem como maior
produção de peso seco, (18,5 e 14,5 µg, respectivamente). Por sua vez, os isolados
008/02, 061/02, 090/02, Anabaena sp. e Nostoc sp. 61 produziram entre 3 e 5 µg de
clorofila a.ml
-1
e matéria seca entre 6,5 e 8,8 µg.
38
Figura 2 - Quantificação da clorofila a (A) e da peso seco (B) das algas que reduziram os sintomas de TMV
em plantas de fumo, cultivar TNN, mantidas sob condições de casa-de-vegetação
2.3.3aEfeito da concentração do vírus TMV no número de lesões em folhas de fumo
Foi verificado um aumento exponencial no número de lesões em função do aumento
da concentração do vírus (Figura 3). Com esse resultado, pode-se definir que a melhor
concentração viral para a realização dos testes era de 0,02 mg/ml. Pois, em altas
concentrações de vírus as lesões coalescem, o que impede ou dificulta a contagem. Por
sua vez, em baixas concentrações de vírus, forma-se um baixo número de lesões, o que
pode mascarar os possíveis efeitos dos tratamentos.
0
4
8
12
16
Nostoc sp. 21
0
0
4/0
2
0
61
/0
2
An
a
ba
e
n
a
sp
.
0
0
8/02
0
9
0/0
2
N
o
s
to
c
s
p.
6
1
0
5
10
15
20
25
0
0
4/0
2
Nostoc sp. 21
Ana
ba
en
a sp.
0
9
0/02
0
0
8/02
Nostoc sp. 61
0
6
1/02
A
B
µg de clorofila a ml
-1
µg de peso seco
Isolado das algas
Isolado das algas
39
Figura 3 - Efeito da concentração do TMV no número de lesões em folhas de fumo
2.3.4aEfeito local de suspensões das algas na redução dos sintomas provocados
por TMV em plantas de fumo
Como pode ser observado na Tabela 1, apenas os tratamentos Isolado 008/02,
Isolado 061/02, Isolado 004/02, Nostoc sp. 61 e Anabaena sp. com 20 dias de cultivo, além
do controle ASM (50 mg.ml
-1
i.a.) reduziram o número de lesões em folhas de fumo de
plantas com 40 dias de cultivo, quando comparadas com o meio de cultivo das algas.
Ademais, observou-se, também, redução no tamanho das lesões nas folhas de fumo em
plantas tratadas com as mesmas algas, além dos isolados 090/02 e Nostoc sp. 21.
y = 30,696e
63,819x
R
2
= 0,9838
0
100
200
300
400
500
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
Concentração do TMV (µg.ml
-1
)
Número médio de lesões
por folha
40
Tabela 1 - Influência das suspensões das algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas do TMV,
inoculado mecanicamente, em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de
cultivo, mantidas
sob condições de casa-de-vegetação
* Os dados representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais não diferem
entre si pelo teste de Tukey 5%. ** Isolados que apresentaram diâmetro de lesões menores do que o
controle BG11 (meio de cultivo). ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a.)
Tratamentos Número médio de lesões por folhas*
Isolado 094/02 170,7
±
18,7 a
Isolado 063/02 153,5
±
21,3 a
Isolado 072/02 149,7
±
09,5 a
Isolado 088/02 147,5
±
15,3 a b
Controle – água 144,7
±
14,9 a b
Isolado 087/02 143,1
±
31,1 a b
Isolado 095/02 141,9
±
19,7 a b
Isolado 089/02 141,4
±
16,9 a b
Isolado 002/02 140,7
±
07,9 a b
Isolado 034/02 140,7
±
05,2 a b
Isolado 082/02 140,5
±
14,6 a b
Isolado 083/02 138,7
±
25,3 a b
Isolado 073/02 138,7
±
12,8 a b
R. brasilica 135,3
±
24,2 a b
Isolado 113/02 133,6
±
16,2 a b
Isolado 106/02 132,8
±
10,5 a b
Isolado 118/02 115,8
±
06,9 a b
Isolado042/02 110,4
±
03,5 a b
Controle – BG 11 106,3
±
29,3 a b
Isolado 062/02 93,9
±
17,5 a b c
Isolado 067/02 82,6
±
23,9 b c
Isolado 075/02 91,0
±
11,6 b c
Nostoc sp. 21** 78,6
±
17,5 b c
Isolado 090/02 ** 64,3
±
14,6 b c
Anabaena sp.** 61,3
±
15,5 c
Isolado 008/02** 46,0
±
27,1 c
Isolado 061/02** 38,3
±
08,9 c
Isolado 004/02** 35,0
±
17,3 c
Nostoc sp. 61** 33,3
±
14,5 c
Controle – ASM 9,3 + 18,7 c
41
2.3.5aEfeito local e sistêmico de suspensão das algas na redução dos sintomas
provocados por TMV em plantas de fumo
Pode-se observar na Figura 4, que os isolados 004/02, 008/02, 061/02, Anabaena
sp., Nostoc sp. 61 apresentaram efeito local na redução no número de lesões em plantas
de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-
vegetação, o que confirmou os resultados obtidos no primeiro experimento. Por outro lado,
os isolados 090/02 e Nostoc sp. 21 não promoveram redução no tamanho das lesões.
Figura 4 - Influência local das suspensões de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas do TMV
em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-
vegetação. As barras representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais
não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste
realizado. BG 11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a)
Na Figura 5, pode-e observar que os isolados Anabaena sp., Isolado 004/02,
Isolado 008/02, Isolado 061/02 e Nostoc sp. 61, com 20 dias de cultivo apresentaram efeito
sistêmico na meia da folha tratada com água destilada em plantas de fumo, do cultivar
0
20
40
60
80
100
120
140
Ag
ua
BG 1
1
Nostoc sp.
21
090/02
Nostoc sp
.
61
00
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na
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.
06
1
/0
2
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ASM
0
50
100
150
200
250
A
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BG11
0
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2
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c
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. 21
A
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abaena
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008/02
Nos
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1
061/02
0
04
/0
2
A
S
M
`
`
a ab b bc c c dc d d e
a a ab ab b b b b b b
Número de lesões/meia
folha
Tratamentos
Número de lesões/meia
f
o
lh
a
Tratamentos
A
B
42
TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. Porém, a
redução proporcionada pelo isolado Nostoc sp. 61 no primeiro ensaio, não se confirmou no
segundo ensaio.
Figura 5 - Influência das suspensões dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas
do TMV, inoculado mecanicamente nas meia folhas tratadas com água destilada, em plantas de
fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. As
barras representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre
si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste realizado. BG 11 = meio
de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a)
Além disso, nenhuma suspensão de cianobactéria reduziu o número de lesões
provocadas por TMV em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas
sob condições de casa-de-vegetação, nas folhas superiores às tratadas (Figura 6).
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
150,0
Agua
BG11
N
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oc
s
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21
090
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0
2
0
04/02
N
o
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t
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s
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6
1
06
1/02
008/02
Anaba
e
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ASM
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100
150
200
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B
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21
A
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008/02
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1/0
2
ASM
a a a ab b b b b b b
a a ab bc bc c c c c d
Número de lesões/meia
folha
Tratamentos
Número de lesões/meia
folha
Tratamentos
A
B
`
`
43
Figura 6 - Influência das suspensões dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas
do TMV, inoculado mecanicamente, nas folhas superiores às tratadas com suspensões de algas,
em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-
vegetação. As barras representam as médias ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais
não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste
realizado. BG 11 = meio de cultivo.ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a)
Por fim, apenas as algas Isolado 008/02 e Isolado 061/02 (com 20 dias de cultivo)
reduziram o número médio de lesões nas folhas inferiores as tratadas com suspensões de
algas em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições
de casa-de-vegetação (Figura 7). Entretanto, o Isolado 061/02 não reduziu a severidade do
vírus no segundo experimento.
0
40
80
120
160
200
A
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0
04/
0
2
Nost
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21
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2
Anabaena sp.
061
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008/02
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50
100
150
200
250
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/
0
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0
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B
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Nostoc sp. 61
004/02
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N
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2
1
008/02
A
SM
`
a ab abc abc abc bc bc bc c c
a a a ab b b b b b c
Número de lesões/folha
Tratamentos
Número de lesões/folha
Tratamentos
`
44
Figura 7 - Influência das suspensões dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas
do TMV, inoculado mecanicamente nas folhas inferiores às tratadas com as suspensões de algas,
em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-
vegetação. As barras representam as médias ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais
não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste
realizado. BG 11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a)
2.3.6aEfeito das preparações das algas na redução dos sintomas provocados por
TMV em plantas de fumo
Quando as plantas de fumo foram tratadas previamente com as preparações das
algas, apenas os filtrados do meio de cultivo do Isolado 061/02 (61 M) e do conteúdo
intracelular do isolado 004/02 (4 C) reduziram o número de lesões locais provocadas por
TMV em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, sob condições de casa-de-
vegetação nos dois experimentos realizados (Figura 8).
0
50
100
150
200
250
Agua
BG11
004/
0
2
Nostoc sp. 21
Ana
baena sp
.
09
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61
061/02
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ASM
0
50
100
150
200
250
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Agua
061/0
2
BG11
004/02
Anabaena sp.
Nostoc s
p. 6
1
N
ostoc s
p. 2
1
090/0
2
008/02
A
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M
`
`
a a a a a ab ab b b b
a a a a a a ab ab b c
Número de lesões/folha
Tratamentos
Número de lesões/folha
Tratamentos
A
B
45
Figura 8 - Influência local das preparações de algas com 20 dias de cultivo, na redução dos sintomas do
TMV, em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-
de-vegetação. As barras representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais
não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste
realizado. BG 11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil ( 50 mg.ml
-1
i.a). C = preparação
do conteúdo intracelular. M = filtrado do meio de cultivo
Porém, a Figura 9 mostra que, no primeiro teste, o tratamento 61 M reduziu o
número de lesões provocadas por TMV nas meia folhas não tratadas, em plantas de fumo,
cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. Já no
segundo, o tratamento Nostoc sp. 61 M reduziu o número de lesões nas plantas. Todavia,
nas duas repetições, ambos tratamentos apresentaram uma tendência de redução nos
sintomas provocados pelo TMV em plantas de fumo, embora não seja observada diferença
estatística.
0
50
100
150
200
250
300
A
g
ua
BG11
8
C
An
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b
a
e
n
a
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.
M
N
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1
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An
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b
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n
a
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C
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c
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p
.
6
1
M
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M
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4
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8M
B
G
1
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Nostoc sp. 61 C
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M
4M
6
1C
8C
Anabaena sp. C
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c
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p
. 6
1
M
6
1
M
4
C
A
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M
`
Número de lesões/meia
folha
Tratamentos
Número de lesões/meia
f
o
lh
a
Tratamentos
a a a ab ab ab ab ab ab ab b b b
a ab abc abc abc bcd bcd bcd bcd bcd cd cd d
A
B
`
46
Figura 9 - Influência das preparações dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, redução dos sintomas do
TMV, inoculado mecanicamente nas meia folhas tratadas com água destilada, em plantas de
fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. As
barras representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre
si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste realizado. BG 11 = meio
de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a). C = preparação do conteúdo intracelular. M
= filtrado do meio de cultivo
Já nas folhas superiores e inferiores às tratadas, nenhuma preparação das algas
reduziu o número de lesões provocadas por TMV, em plantas de fumo, cultivar TNN, com
40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação, nos dois ensaios
realizados (Figuras 10 e 11).
0
50
100
150
200
250
300
B
G
1
1
Agua
8 C
A
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b
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n
a
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M
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c
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8 M
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C
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4
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M
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6
1
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50
100
150
200
250
300
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C
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4
M
B
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1
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C
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C
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p
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M
A
nab
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p
.
C
N
ostoc sp. 61 C
61 M
N
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ASM
Número de lesões/meia
folha
Tratamentos
Número de lesões/meia
folha
a ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab b b
a ab ab ab ab abc abc abc abc abc bc c c
A
B
´
´
Tratamentos
47
Figura 10 - Influência das preparações dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos
sintomas do TMV, inoculado mecanicamente nas folhas superiores às tratadas, em plantas de
fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. As
barras representam as médias ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais não diferem
entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste realizado. BG
11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a). C = preparação do conteúdo
intracelular. M = filtrado do meio de cultivo
0
50
100
150
200
250
300
Agua
8C
BG11
An
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sp.
C
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Ana
baena
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N
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oc
s
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61
M
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M
4C
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ostoc sp. 61 C
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M
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120
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BG11
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4 C
An
a
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na
sp.
C
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1
C
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M
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M
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1
C
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M
Nostoc
sp. 61
M
8
C
`
`
Número de lesões/folha
Tratamentos
Número de lesões/folha
Tratamentos
a a a a a a a a a a a a a
a a a a a a a a a a a a a
A
B
48
0,0
60,0
120,0
180,0
240,0
300,0
BG11
Ag
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A
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a
b
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s
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M
6
1
M
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C
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M
4M
61C
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M
8
C
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s
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o
c
sp
.
6
1
M
Nostoc
sp.
61
C
Figura 11 - Influência das preparações dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, na redução dos
sintomas do TMV, inoculado mecanicamente nas folhas inferiores às tratadas, em plantas de
fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de casa-de-vegetação. As
barras representam as médias ± desvio padrão. Médias seguidas por letras iguais não diferem
entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste realizado. B = segundo teste realizado. BG
11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50 mg.ml
-1
i.a). C = preparação do conteúdo
intracelular. M = filtrado do meio de cultivo
2.3.7 aEfeito inibitório das algas sobre o TMV
Como pode ser visto na Figura 12, o número médio de lesões provocadas por TMV
em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob condições de
casa-de-vegetação, ressuspenso com os isolados 090/02, Anabaena sp., Nostoc sp. 21, ou
Nostoc sp. 61, foi menor que o número de lesões em plantas de fumo inoculadas com TMV
ressuspenso com água destilada ou BG 11. No segundo experimento, a cianobactéria
Anabaena sp., apesar de ter reduzido em 24 % o número de lesões em plantas de fumo,
não deferiu estatisticamente dos tratamentos controles.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
0
04/0
2
C
008/
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2 M
A
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061/02 M
Anabaema
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M
BG11
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004/02
M
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C
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2
C
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M
A
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Anabaen
a
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C
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a a a a a a a a a a a a a
Número de lesões/folha
Tratamentos
Número de lesões/folha
Tratamentos
A
B
`
a a a a a a a a a a a a a
49
Figura 12 - Efeito inibitório dos isolados de algas, com 20 dias de cultivo, sobre o TMV, inoculado
mecanicamente, em plantas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantidas sob
condições de casa-de-vegetação. As barras representam as médias ± desvio padrão. Médias
seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%. A = primeiro teste
realizado. B = segundo teste realizado. BG 11 = meio de cultivo. ASM = acibenzolar-S-metil (50
mg.ml
-1
i.a)
2.3.8aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de β-1,3-glucanase
Foi constatado um incremento na atividade de β-1,3-glucanase nas folhas tratadas
com ASM (50 mg.ml
-1
i.a) ou com o Isolado 008/02 um ou três dias após o tratamento,
respectivamente (Figura 13). Porém, no segundo experimento, não foi observado aumento
na atividade dessa proteína 3 dias após o tratamento das plantas com o Isolado 008/02.
Quatro e seis dias após o tratamento, foi verificado um aumento na atividade dessa
proteína nas plantas tratadas com os controles e inoculadas com o TMV.
0
20
40
60
80
100
00
4
/0
4
A
g
ua
B
G
11
061/02
008/02
Nostoc
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.
N
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2
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90
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00
4
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BG 1
1
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00
8
/02
Anabaena sp.
090/02
Nost
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c
sp.61
Nost
o
c
s
p. 21
ASM
A
B
Número de lesões/folha
Tratamentos
Número de lesões/folha
Tratamentos
a a a ab ab b b b b b
a a a a ab ab b b b b
`
`
50
Figura 13 - Efeito local de preparações de algas sobre a atividade de β-1,3-glucanase em folhas de fumo,
cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-vegetação. A seta
indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a média ± desvio padrão
Já nas meia folhas não tratadas, pode-se observar, um e dois dias após o
tratamento das plantas, um incremento seguido por um decréscimo da atividade de β-1,3-
glucanases nas plantas tratadas com ASM (50 mg.ml
-1
i.a). Além disso, quatro e seis dias
após o tratamento, foi verificado um aumento na atividade dessa proteína nas plantas
tratadas com os controles e inoculadas com o TMV (Figura 14).
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
0
10
20
30
40
0123456
água-vírus 4C-vírus
água-tampão 4C-tampão
0
10
20
30
40
0123456
água-vírus 61M-vírus
água-tampão 61M-tampão
µg de glicose/min/mg de proteína
Tempo (dias)
51
Figura 14 - Efeito nas meia folhas não tratada de suspensão ou de preparações de algas sobre a atividade
de β-1,3-glucanase em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre
condições de casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras
representam a média ± desvio padrão
Por sua vez, folhas inferiores às tratadas de plantas tratadas com água destilada,
meio de cultivo BG 11 ou ASM (50 mg.ml
-1
i.a) e posterior inoculação com TMV
apresentaram maior atividade de β-1,3-glucanase do que os outros tratamentos 4 e 6 dias
após o tratamento (Figura 15).
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus água-tampão
008/02 vírus 008/02-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus água-tampão
061/02-tampão 061/02-vírus
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus 61M-vírus
água-tampão 61M-tampão
µg de glicose/min/mg de proteína
Tempo (dias)
52
Figura 15 - Efeito nas folhas inferiores às tratadas com suspensões de algas sobre a atividade de β-1,3-
glucanase em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de
casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a
média ± desvio padrão
2.3.9aEnsaio enzimático para a determinação da atividade de peroxidases
Plantas de fumo, cultivar TNN, tratadas com ASM ou com 4C, apresentaram maior
atividade de peroxidases local, 2 ou 3 dias após o tratamento, respectivamente (Figura 16).
Tempo (dias)
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
µg de glicose/min/mg de proteína
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
-5
5
15
25
35
45
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
53
Figura 16 - Efeito local de preparações de algas sobre a atividade de peroxidase em folhas de fumo, cultivar
TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-vegetação. A seta indica o
momento da inoculação com TMV. Barras representam a média ± desvio padrão
Na Figura 17, pode-se observar que não houve diferença na atividade de
peroxidases, nas meia folhas não tratadas, entre as plantas tratadas com as algas e os
controles. Seis dias após o tratamento, as plantas inoculadas com vírus apresentaram
maior atividade dessa enzima do que as que receberam tampão mecanicamente.
0
15
30
45
60
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
Abs 470 nm/ min/mg de proteína
Tempo (dias)
0
15
30
45
60
0123456
água-vírus BG11-vírus
á
g
ua-tam
p
ã
o
BG11-tam
p
ã
o
0
15
30
45
60
0123456
água-vírus ASM-vírus
á
g
ua-tam
p
ão bion-tam
p
ão
0
15
30
45
60
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
0
15
30
45
60
0123456
água-vírus 004/02C-vírus
água-tampão 004/02C-tampão
0
20
40
60
0123456
água-vírus 061/02 M-vírus
água-tampão 061/02 M-tampão
54
Figura 17 - Efeito nas meia folhas não tratadas de suspensão ou de preparações de algas sobre a atividade
de peroxidase em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições
de casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a
média ± desvio padrão
Finalmente, nas folhas inferiores às tratadas, o ASM (50 mg.ml
-1
i.a) estimulou a
atividade de peroxidases nas plantas de fumo, dois dias após o tratamento (Figura 18).
Seis dias após o tratamento, observa-se que plantas inoculadas com vírus apresentaram
maior atividade de peroxidases do que aquelas inoculadas com tampão. Nenhum
tratamento envolvendo os isolados das algas estimulou a atividade dessa enzima quando
comparado com os controles água destilada ou meio de cultivo BG 11.
0
30
60
90
120
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
Abs 470 nm/ min/mg de proteína
Tempo (dias)
0
30
60
90
120
0123456
água-vírus
061/02 M-vírus
átã
0
30
60
90
120
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
0
30
60
90
120
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão bion-tampão
0
30
60
90
120
0123456
água-vírus água-tampão
061/02-tampão 061/02-vírus
55
Figura 18 - Efeito nas folhas inferiores às tratadas com as suspensões de algas sobre a atividade de
peroxidase em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições
de casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a
média ± desvio padrão
2.3.10aVerificação do conteúdo total de fenóis
Nenhum tratamento que envolveu as algas estimulou o acúmulo de fenóis nas
plantas de fumo, cultivar TNN. Porém, seis dias após o tratamento, as plantas tratadas
com água destilada ou meio de cultivo BG 11 e inoculadas com TMV, apresentaram maior
teor de fenóis do que os outros tratamentos (Figura 19).
Abs 470 nm/ min/mg de proteína
Tempo (dias)
0
25
50
75
100
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
0
25
50
75
100
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
0
25
50
75
100
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
0
20
40
60
80
100
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
56
Figura 19 - Efeito local de suspensões ou de preparações de algas sobre a concentração de fenóis em folhas
de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-vegetação. A
seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a média ± desvio padrão
Nas Figuras 20 e 21, observa-se que não houve diferença na concentração de
fenóis entre os tratamentos nas meia folhas não tratadas ou nas folhas inferiores às
tratadas.
Tempo (dias)
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus 4C-vírus
água-tampão 4C-tampão
-50
50
150
250
350
450
0123456
água-vírus 61M-vírus
água-tampão 61M-tampão
mg eq. ácido clorogênico/ mg peso fresco
57
Figura 20 - Efeito nas meia folhas não tratadas de suspensão ou de preparações de algas sobre a
concentração de fenóis em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre
condições de casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras
representam a média ± desvio padrão
-50
50
150
250
350
0123456
água-vírus 61M-vírus
água-tampão 61M-tampão
0
100
200
300
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
0
50
100
150
200
250
300
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
mg eq. ácido clorogênico/ mg peso fresco
Tempo (dias)
0
50
100
150
200
250
300
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
-50
50
150
250
350
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
58
Figura 21 – Efeito nas folhas inferiores às tratadas com as suspensões de algas sobre a concentração de
fenóis em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de
casa-de-vegetação. A seta indica o momento da inoculação com TMV. Barras representam a
média ± desvio padrão
2.3.11aVerificação de espécies ativas de oxigênio
Quando as plantas de fumo, cultivar TNN, foram tratadas com as suspensões dos
isolados 008/02 e 061/02, bem como com a preparação 61 M, as mesmas apresentaram,
visualmente, acúmulo local, bem como nas meia folhas não tratadas, de superóxido em
relação aos controles água destilada e meio de cultivo BG 11. Porém, nas folhas inferiores
à tratadas, essa diferença só pode ser detectada apenas nas plantas tratadas com a
suspensão do isolado 008/02 (Figuras 22, 23 e 24).
0
50
100
150
200
250
300
0123456
água-vírus BG11-vírus
água-tampão BG11-tampão
-50
50
150
250
350
0123456
água-vírus ASM-vírus
água-tampão ASM-tampão
0
100
200
300
400
0123456
água-vírus 061/02-vírus
água-tampão 061/02-tampão
0
100
200
300
400
0123456
água-vírus 008/02-vírus
água-tampão 008/02-tampão
mg eq. ácido clorogênico/ mg peso fresco
Tempo (dias)
59
Figura 22 - Efeito local de suspensão ou de preparações de algas sobre a indução de superóxido em folhas
de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-vegetação. A
= água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a). D = suspensão do Isolado 008/02. E
= suspensão do Isolado 061/02. F = preparação 4 C. G = preparação 61 M. Barras representam 1
mm
A
C
D
E F
B
G
60
Figura 23 - Efeito nas meia folhas não tratadas de suspensão ou de preparações de algas sobre a indução
de superóxido em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições
de casa-de-vegetação. A = água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a). D =
suspensão do Isolado 008/02. E = suspensão do Isolado 061/02. F = preparação 61 M. Barras
representam 1 mm
Figura 24 - Efeito na folha inferior á tratada de suspensão de algas sobre a indução de superóxido em folhas
de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-vegetação. A
= água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a). D = suspensão do Isolado 008/02. E
= suspensão do Isolado 061/02. Barras representam 1 mm
A
C
D
E F
B
A
C
E
B
D
61
Por sua vez na, na Figura 25 pode-se ver que apenas o controle ASM (50 mg.ml
-1
i.a)
, apresentou maior coloração que os demais tratamentos nas folhas tratadas. Por outro
lado, aparentemente, as plantas tratadas com a preparação 4C apresenta menor coloração
que os controles.
Figura 25 - Efeito local de suspensão ou de preparações de algas sobre o acúmulo de peróxido de hidrogênio
em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de casa-de-
vegetação. A = água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a). D = suspensão do
Isolado 008/02. E = suspensão do Isolado 061/02. F = preparação 4 C. G = preparação 61 M.
Barras representam 1 mm
As preparações de algas, aparentemente, não proporcionaram o acúmulo de H
2
O
2
nas meia folhas não tratadas e nas folhas inferiores á tratadas 37h após a inoculação do
TMV (Figuras 26 e 27).
A
C
D
E F
B
G
62
Figura 26 - Efeito nas meia folhas não tratadas de suspensão ou de preparações de algas sobre o acúmulo
de peróxido de hidrogênio em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre
condições de casa-de-vegetação. A = água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a).
D = suspensão do Isolado 008/02. E = suspensão do Isolado 061/02. F = preparação 61 M.
Barras representam 1 mm
Figura 27 - Efeito nas folhas inferiores á tratadas de suspensão ou de algas sobre o acúmulo de peróxido de
hidrogênio em folhas de fumo, cultivar TNN, com 40 dias de cultivo, mantido sobre condições de
casa-de-vegetação. A = água. B = meio de cultivo BG 11. C = ASM (50 mg.ml
-1
i.a). D =
suspensão do Isolado 008/02. E = suspensão do Isolado 061/02. Barras representam 1 mm
A
C
D
E F
B
A
C
D
E
B
63
2.4aDiscussão
Quando as plantas de fumo foram tratadas com as algas Isolado 004/02, Isolado
008/02, Isolado 061/02, Anabaena sp. e Nostoc sp. 61, as mesmas apresentaram efeito
local, bem como sistêmico na redução dos sintomas provocados por TMV em plantas de
fumo, cultivar TNN, porém para a Nostoc sp. 61, o resultado sistêmico do primeiro teste
não foi confirmado. Em adição, as preparações 4 C e 61 M proporcionaram redução nos
sintomas locais provocados pelo TMV em plantas de fumo, mas apenas a segunda
preparação reduziu os sintomas sistemicamente. Esses resultados evidenciam que grande
parte das moléculas com atividade sobre o TMV foram perdidas no momento da
elaboração das preparações. Ademais, as algas podem apresentar mais de um composto
que reduz os sintomas do TMV, visto que a suspensão do Isolado 004/02 apresentou efeito
local e sistêmico, todavia o preparado 4 C apresentou efeito apenas local. Por outro lado,
foi verificado que as suspensões dos isolados 090/02, Anabaena sp, Nostoc sp. 21 e
Nostoc sp. 61, com 20 dias de cultivo, sob luz fluorescente constante a 28ºC,
apresentaram efeito direto sobre o TMV.
Esses resultados mostram que os isolados 090/02 e Nostoc sp. 21 apresentam
compostos que agem sobre o TMV, mas não sobre a planta. Já as suspensões dos
isolados Anabaena sp. e Nostoc sp. 61, com vinte dias de cultivo, mantidos sob luz
fluorescente constante a 28ºC apresentaram efeito direto sobre o TMV, além de reduzir o
número de lesões, locais e sistêmicas, quando o vírus foi inoculado 2 dias após o
tratamento, o que pode significar que esses isolados apresentam compostos que agem
sobre o vírus e podem também elicitar a resposta de defesa de plantas de fumo.
Finalmente, os isolados 004/02, 008/02 e 061/02 reduziram os sintomas de TMV, apenas
quando as plantas de fumos foram tratadas com os mesmos dois dias antes da inoculação.
A falta de efeito direto sobre o vírus e o intervalo de tempo necessário entre o tratamento
das plantas e a inoculação do vírus para que as plantas de fumo tenham os sintomas
reduzidos, sugerem que as plantas tiveram os mecanismos de defesa ativados pelas algas
(BONALDO, PASCHOLATI, ROMEIRO, 2005).
Zainuddin et al. (2002) mostraram que os extratos metanólicos das cianobactérias
Calothrix gracilis, Lyngbya sp., Microecystis ichthyoblabe, Nodularia spumigena,
Oscillatoria lutae e Seytonema bohnerii, bem como o extrato aquoso de N. spumigena,
64
reduziram em 50% o vírus A da gripe em concentrações entre 20 e 79 µg/ml. Em busca de
melhorar o conhecimento científico no controle da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(AIDS), diversos pesquisadores têm estudado compostos isolados de diferentes gêneros
de cianobactérias. Extratos aquosos de Arthrospira platensis inibiram em 50% a replicação
do HIV em células humanas em concentrações entre 0,01 a 0,1 g/ml (AYEHUNIE et al.,
1998). Além disso, diversos autores (LOYA et al., 1998; RESSHEF et al., 1997;
NAKASHIMA et al., 1988) verificaram que compostos das classes das glicoproteínas e das
sulfoglicoproteínas, isolados de diferentes gêneros de cianobactérias, apresentaram efeito
inibitório sobre o HIV. Lau et al. (1993) estudaram estratos lipofílicos e hidrofílicos de 900
grupos de cianobactérias na inibição da transcriptase reversa do HIV e do AMV. Seus
resultados evidenciaram que 18 estratos hidrofílicos apresentaram efeito sobre os vírus
estudados. Ademais, a maior dose estudada (668 ng/ml) dos estratos, reduziu a atividade
da enzima de maneira semelhante ao AZT.
Di Piero (1999) mostrou que suspensões celulares de Synechococcus leopoliensis e
Nostoc sp., com 30; 60 ou 140 dias de cultivo, bem como preparações dos conteúdos
intracelulares e dos meios de cultivos, com 30; 60 ou 140 de cultivo reduziram os sintomas
locais provocados por TMV. Porém, apenas a suspensão celular da Nostoc sp., com 140
dias, reduziu os sintomas sistêmicos provocados pelo vírus.
Finalmente, Rao, Saranda e Ravisshankar (1996) verificaram que a ficocianana,
produzida por Spirulina plantensis, estimulou o acúmulo de capsaicina em cultura de
células de Capsicum frutescens e de antocianina em cultura de células de Daucus carota.
Di Piero (1999) verificou que suspensões, bem como o filtrado de meio de cultivo de
Synechococcus leopoliensis,com 30, 60 e 120, elicitaram o acúmulo de fitoalexinas em
folhas cotiledonares de soja.
A partir dos resultados obtidos, análises bioquímicas foram feitas para se verificar
possíveis alterações metabólicas provocadas pelas algas nas plantas de fumo, cultivar
TNN.
Não foi verificada diferença no teor total de fenóis nas plantas de fumo, cultivar TNN
tratadas com os controles ou com as algas. É mister lembrar que as plantas, na presença
do desafiador, acionam o metabolismo de novo de fenóis, ou sejam sintetizam fenóis mais
tóxicos a partir de fenóis menos tóxicos ao invasor (NICHOLSON; HAMMERSCHMIDT,
1992). Em vista disso, apesar de não ser detectada diferença no teor total de fenóis, não
65
pode ser descartado que existam diferenças qualitativas entre a composição da fração
fenólica das plantas tratadas com algas e as plantas controles.
Quanto às proteínas-RP, a preparação 4C estimulou a atividade local de
peroxidases em plantas de fumo, cultivar TNN, 3 dias após o tratamento das plantas. Além
disso, foi verificado que no sexto dia, as plantas inoculadas com vírus apresentaram maior
atividade de peroxidases do que as inoculadas com tampão. Diversos autores também
verificaram que a inoculação de TMV em fumo induz ao aumento da atividade de
peroxidase (YE et al., 1992; ANFOKA; BUCHENAUER, 1997; LAGRIMINI; ROTHSTEIN,
1987). Hiraga et al. (2000) evidenciaram que a reação de hipersensibilidade (RH)
observada em plantas de fumo com gene “NN” induzem a expressão do gene de
peroxidases (tpoxC1) desse hospedeiro, porém em plantas “nn”, nas quais não são
observadas RH, essa expressão não foi observada, o que evidencia a importância dessa
proteína-RP na defesa de fumo contra o TMV. Esse fato poderia explicar o menor número
de lesões locais observadas em plantas de fumo tratadas com a preparação 4C. Porém,
Kapoor e Lodha (2004) verificaram que plantas controles de fumo inoculadas com TMV
apresentaram maior severidade dos sintomas que plantas tratadas com o inibidor de
proteína viral Bougainvillea e inoculadas com o vírus, mas esse tratamento apresentou
menor atividade de peroxidase.
Já a atividade de β-1,3-glucanase das plantas tratadas com o Isolado 008/02
apresentou um pico de atividade de glucanases três dias após o tratamento. Por sua vez,
plantas tratadas com água destilada, meio de cultivo BG11 ou ASM (50 mg.ml
-1
i.a.) e
inoculadas com TMV tiveram a atividade dessa enzima aumentada a partir do quarto dia
após o tratamento das plantas, porém as plantas tratadas com as algas, e inoculadas com
vírus, não apresentaram aumento na atividade dessa enzima. Em vista disso, pode-se
concluir que as algas impediram o aumento da atividade de β-1,3-glucanase em folhas de
fumo inoculadas com TMV. A redução da atividade de β-1,3-glucanase poderia aumentar a
deposição de calose, a qual reduz o limite de exclusão dos plasmodesmas, o que dificulta
o movimento célula-a-célula de vírus (BOTHA et al., 2000). Vários trabalhos mostram que
mutantes deficientes em glucanases são mais resistentes a vírus (BEFFA et al., 1996;
IGLESIAS et al., 2000; BUCHER et al., 2001). Essa deposição de calose poderia ser mais
eficiente no controle do vírus de que o efeito direto das glucanases sobre esses
fitopatógenos (BEFFA et al., 1993). Ademais, a super expressão dessa enzima provocou o
aumento dos sintomas dessa doença (BUCHER et al., 2001).
66
Finalmente, às análises para as detecções in situ de peróxido de hidrogênio e
superóxido mostraram que as a suspensões dos isolados 008/02 e 061/02, bem como a
preparação 61 M proporcionaram maior acúmulo de O
2
-
e o tratamento 4C reduziu a
formação local de H
2
O
2
. O reconhecimento de patógenos resulta na ativação da NAD(P)H
oxidase associada com a membrana plasmática, o que provoca a superprodução de
superóxido (JABS, 1999). Após, a enzima superóxido dismutase catalisa o O
2
-
, o que leva
ao acúmulo de H
2
O
2
, a reação de hipersensibilidade e a ativação de mecanismos de
defesa das plantas (KAWANO, 2003). Vários trabalhos relacionam decréscimo da atividade
de catalase, enzima que catalisa o H
2
O
2
em H
2
O e O
2
, com o aumento de proteínas-RP
e/ou AS (ORVAR; ELLIS, 1997; MITTLER, et al., 1999). Além disso, o acréscimo da
atividade dessa enzima tem efeito apenas nos sintomas necróticos locais de TMV em
plantas de fumo (TALARCZYK et al., 2002), o que poderia explicar a falta de controle
sistêmico pela preparação 4C.
67
3aCONCLUSÕES
Alguns isolados de algas eucarióticas ou de cianobactérias apresentaram como
promissores agentes de controle de doenças, pois podem apresentar efeito direto sobre
patógenos e/ou promover alterações no metabolismo das plantas, que podem estar
relacionados a biossíntese de compostos de defesa.
68
REFERÊNCIAS
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p. 1-9, 2001.
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lettuce and cauliflower crops. Botanica Marina, Hamburg, v. 26, p. 487-492, 1983.
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AGUIAR, M. de R. Estudos de fatores que interferem no crescimento de cianobactérias de vida livre,
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em Solos e nutrição de Plantas) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, 1992.
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84
ANEXO
85
Anexo A - Meio de cultivo BG 11
Componentes Concentração (g/l) Componentes Concentração (g/l)
Solução 1:
NaNO
3
3,0
MgSO
4
.H
2
O 0,15
Na
2
CO
3
0,04
CaCl
2
.2H
2
O 0,071
Solução 2:
EDTA (Anidro) 0,1
Ácido cítrico.H
2
O 1,32
FeSO
4
.7H
2
O 0,6
Solução 3:
K
2
HPO
4
3,9
Solução 4:
H
3
BO
3
2,86
MnCl.4H
2
O 1,81
ZnSO
4
.7H
2
O 0,22
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,39
CuSO
4
.5H
2
O 0,08
Co(NO
3
)
2
.6H
2
O 0,05
Preparo do meio:
Solução: 1 2 3 4 Água
Volume: 500 ml 10 ml 10 ml 1 ml 479 ml
Obs.: A solução 1 e H
2
O são combinadas e autoclavadas. O pH dessa solução
deverá estar em torno de 9,0 - 9,5.
As soluções 2, 3 e 4 são autoclavadas individualmente e mantidas em frascos
separados para se evitar a precipitação dos nutrientes.
A adição das soluções 2; 3 e 4 após a autoclavagem causa uma alteração
considerada no pH do meio não tamponado, que deve estar em torno de 6,8.
86
APÊNDICE
87
APÊNDICE A - Curva padrão para a dosagem de glicose através do método de
Lever (1972)
y = 0,0023x + 0,0087
R
2
= 0,9945
0
0,1
0,2
0,3
0 306090120
APÊNDICE B - Curva padrão para dosagem de proteína, com o emprego do
método de Bradford (1976)
y = 0,037x + 0,008
R
2
= 0,9961
0
0,1
0,2
0,3
0123456
APÊNDICE C - Curva padrão para dosagem de fenóis preparada com ácido
clorogênico
µg de glicose/ml
Abs 410 nm
µ
g de proteína/ml
Abs 595 nm
y = 0,0017x + 0,0296
R
2
= 0,9969
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 50 100 150 200 250 300
µ
g de ácido clorogênico/ml
Abs (750 nm)
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