ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
COMPORTAMENTO AVERSIVO NO CARACOL MEGALOBULIMUS
ABBREVIATUS: EVIDÊNCIAS DE SINALIZAÇÃO DO RECEPTOR TRPV1 E
MODULAÇÃO OPIÓIDE EM RESPOSTA A ESTÍMULOS NOCIVOS
Pedro Ivo Kalil-Gaspar
Porto Alegre
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
COMPORTAMENTO AVERSIVO NO CARACOL MEGALOBULIMUS
ABBREVIATUS: EVIDÊNCIAS DE SINALIZAÇÃO DO RECEPTOR TRPV1 E
MODULAÇÃO OPIÓIDE EM RESPOSTA A ESTÍMULOS NOCIVOS
Pedro Ivo Kalil-Gaspar
Orientadora: Profa. Dra. Matilde Achaval Elena
Porto Alegre
2007
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Neurociências da
Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito
parcial para obtenção do título de
mestre em Neurociências.
ads:
3
ÍNDICE
Lista de abreviaturas e figuras................................................................................04
Resumo...................................................................................................................06
Introdução...............................................................................................................08
Objetivos.................................................................................................................22
Artigo.......................................................................................................................23
Conclusões e perspectivas.....................................................................................43
Referências bibliográficas.......................................................................................44
4
LISTA DE ABREVIATURAS
ATPase – adenosina trifosfatase
ARD – domínio de repetição de anquirina
OCR – osmoreceptor-9 and capsaicin-related
PKC – proteinocinase C
PLA2 – fosfolipase A2
SNC – sistema nervoso central
TRPA – transient receptor potential – ankyrin
TRPC – transient receptor potential – canonical
TRPM – transient receptor potential – melastatin
TRPML – transient receptor potential – mucolipin
TRPN– transient receptor potential – (NON-mechano-potential)
TRPP – transient receptor potential – polycistin
TRPV – transient receptor potential – vanilloid
5
FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1 - A árvore filogenética dos canais TRP....................................................09
Figura 2 - Modelo topológico da estrutura do receptor TRPV................................10
Figura 3 - Ligantes endógenos do receptor TRPV em vertebrados.......................13
Figura 4 - Representação esquemática do caracol Megalobulimus abbreviatus na
primeira fase do comportamento aversivo sobre placa aquecida a temperatura
nociva......................................................................................................................17
Figura 5 Representação esquemática do caracol Megalobulimus abbreviatus na
segunda fase do comportamento aversivo sobre placa aquecida a temperatura
nociva......................................................................................................................17
Figura 6 - Representação esquemática do circuito de retirada proposto para Helix
lucorum...................................................................................................................19
ARTIGO
Figura 1 – Respostas à capsaicina em concentrações de 0,1% e 0,5%................40
Figura 2 - Respostas à capsaicina 0,5% após injeção de vermelho de rutênio.....40
Figura 3 - Respostas ao calor após injeção de vermelho de rutênio......................41
Figura 4 - Respostas à capsaicina 0,5% após injeção de capsazepina.................41
Figura 5 - Respostas ao calor após injeção de capsazepina.................................42
Figura 6 – Respostas à capsaicina 0,5% após injeção de morfina, naloxone, e
naloxone mais morfina............................................................................................42
6
RESUMO
O receptor da capsaicina TRPV1 (transient receptor potential channel –
vanilloid 1) é um canal de cátions não-seletivo que promove o influxo de cálcio em
neurônios, quando ativado por estímulos nocivos. O caracol terrestre
Megalobulimus abbreviatus apresenta comportamento aversivo, elevando seu
complexo cabeça-pé quando colocado sobre substratos nocivos, e serve como um
modelo simples e útil em experimentos de nocicepção. O objetivo deste estudo foi
medir a resposta nociceptiva (latência aversiva) do M. abbreviatus após exposição
à capsaicina tópica (soluções aquosas a 0,1% e 0,5%), e compará-la àquelas
obtidas em um modelo prévio de estímulo térmico nocivo (50
o
C). Foi também
testado se o vermelho de rutênio (doses de 3 mg/kg e 6 mg/kg, 5 min antes da
exposição) e a capsazepina (doses de 1 mg/kg e 3 mg/kg, 5 min antes da
exposição), respectivamente antagonistas inespecífico e específico do receptor
vanilóide 1, poderiam modificar tanto as respostas evocadas pela capsaicina
quanto aquelas obtidas com estímulo térmico aversivo. Finalmente, os animais
foram injetados com salina, morfina (20 mg/kg), naloxone (5 mg/kg) ou morfina
mais naloxone, 15 min antes da exposição à capsaicina 0.5%. As latências foram
medidas quando o animal elevava seu complexo cabeça-pé a 1 cm do substrato.
Os dados foram comparados por análise de variância de uma via (ANOVA) e teste
post hoc de mínima diferença significativa (LSD), e por teste T de Student
(p<0,05), em software SPSS 7.0. Resultados (média +/- EMP): a capsaicina tópica
provocou comportamento de retirada intenso de forma dose-dependente (25.4 +/-
7
2.0 s, 15.3 +/- 1.9 s e 9.1 +/- 1.0 s para veículo, capsaicina a 0.1% e a 0.5%,
respectivamente). A capsazepina inibiu significativamente a resposta à capsaicina
(19.2 +/- 1.8 s para concentração de 1 mg/kg; 5.3 +/- 0.4 s para o veículo), e a
resposta ao calor nocivo (28.1 +/- 1.8 s, 48.8 +/- 3.6 s, 20.4 +/- 1.2 s para
concentrações de 1 mg/kg, 3 mg/kg e veículo, respectivamente). O vermelho de
rutênio (6 mg/kg and 3 mg/kg, respectivamente) atenuou tanto as respostas de
retirada à capsaicina (23.1 +/- 1.9 s) e ao calor (55.4 +/- 6.5 s) , quando
comparadas ao veículo (16.8 +/- 2.6 s e 33.9 +/- 6.4 s, respectivamente). A
morfina aumentou as latências induzidas pela capsaicina (26.5 +/- 3.4 s). O
naloxone, tanto sozinho (8.1 +/- 1.1 s) quanto em combinação com a morfina (8.7
+/- 1.3 s), diminuiu marcadamente as latências provocadas pela capsaicina
quando comparado à morfina apenas, ou à salina (18.2 +/- 2.6 s). Estes resultados
indicam que o receptor TRPV1 desempenha um papel no comportamento aversivo
do M. abbreviatus e evidencia um mecanismo regulado por opióides nas respostas
induzidas pela capsaicina.
8
Introdução
O íon cálcio desempenha funções críticas na fisiologia celular, incluindo a
expressão gênica, a proliferação, a secreção, e morfologia. As concentrações de
íons cálcio nos diferentes compartimentos intracelulares dependem de precisa
regulação. Em geral, o aumento do íon no citoplasma decorre tanto da sua
liberação por locais de estoque (principalmente dos retículos endoplasmático e
sarcoplasmático, através de canais ativados por inositol trifosfato ou de receptores
rianodínicos), como do influxo de íons cálcio através da membrana plasmática,
oriundos do meio extracelular, por meio de canais ativados e/ou regulados por
uma diversidade de elementos. A remoção de íons cálcio do citoplasma ocorre
pelo seu transporte para dentro do retículo endoplasmático por bombas de cálcio-
ATPases ou por mecanismos de simporte ou antiporte com outros íons,
especialmente o sódio (Carafoli, 2002).
A descoberta de uma nova classe de canais de cálcio, a Superfamília de
Receptores Transient Receptor Potential (TRP) permitiu um maior entendimento
dos mecanismos de influxo de cálcio em uma grande variedade de células. Canais
TRP são expressos em células excitáveis e não excitáveis, tanto em vertebrados
quanto invertebrados, e representam vias primárias de entrada do íon. O primeiro
receptor TRP foi identificado como um componente central do complexo de
fototransdução da mosca drosófila (Cosens et al., 1969; Cosens, 1971; Hardie et
al., 1992). A subsequente descoberta de homólogos em mamíferos e nematódeos
levou à identificação de mais de 25 canais (Figura 1), que apresentam homologia
9
com os genes Nan presentes na drosófila, e com as proteínas OCR
(Osmoreceptor-9 and capsaicin receptor-related) do nematódeo Caenorhabditis
elegans. Atualmente, os receptores TRP são agrupados nas seguintes subfamílias
principais: TRPCs (clássicos, ou canônicos), TRPVs (vanilóides), TRPMs
(melastatínicos), TRPPs (policistínicos - referentes à proteína da doença do rim
policístico tipo 2), TRPMLs (mucolipínicos), TRPAs (anquirínicos) e TRPNs
(NOMP: no-mechano-potential; O’Neil et al., 2003; Nilius et al., 2005; Clapham et
al., 2005; Minke, 2006).
Figura 1. A árvore filogenética dos canais TRP. A figura mostra as sete
subfamílias que constituem a família TRP. As quatro diferentes espécies são
indicadas em diferentes cores. Apenas alguns membros da Drosófila e C. elegans
são incluídos (adaptado de Nilius et al, 2005)
Devido às suas propriedades na transdução de estímulos sensoriais e não
sensoriais, a subfamília TRPV (1 a 6) tem recebido uma crescente atenção. Os
10
membros neste grupo apresentam sensibilidades a diversos estímulos ambientais,
nocivos ou não, incluindo pimentas e outros derivados vegetais, mediadores
inflamatórios, calor, prótons, estímulos osmo- e mecano-sensoriais. Os canais
TRPVs, como os outros TRPs, são heterotetrâmeros cujas subunidades
caracterizam-se por 6 domínios transmembranares e longas terminações COOH e
NH2. Um curto segmento hidrofóbico entre os domínios transmebranares 5 e 6 dá
origem a uma alça de poro (Figura 2). A terminação NH2 contém 2 a 5 domínios
de repetição de anquirina, considerados sítios potenciais de interações protéicas,
e também vários sítios potenciais de fosforilação pelas proteína-cinases C e A
(Caterina et al., 1997; Caterina et al., 2001; Szolcsányi, 2004; Ferrer-Montiel et al.,
2004; Rosembaum et al., 2004). Os canais TRPV apresentam uma seletividade
variada ao cálcio. Apesar da maioria dos membros serem apenas modestamente
mais seletivos ao cálcio que a outros ânions monovalentes, dois membros (TRPV5
e TRPV6) possuem poros altamente seletivos ao íon cálcio (Hoenderop et al.,
2005; Nijenhuis et al., 2005).
Figura 2. Modelo topológico da estrutura do receptor TRPV. Propõe-se que o
canal possua 6 domínios transmembranares (TM1-6), uma alça de poro (PL), e
longas caudas NH2 e COOH, ambas citoplasmáticas. A terminação NH2 possui 2
a 5 domínios de repetição de anquirina (ARD; adaptado de O’Neil et al., 2003).
11
A capsaicina, o princípio ardente da pimenta vermelha do gênero capsicum,
é um irritante natural, como o olvanil, o eugenol e a resiniferatoxina (coletivamente
denominados vanilóides), que provoca dor ativando receptores específicos em
terminações nervosas. A descoberta da capsaicina como ativador de fibras
nociceptivas através de um receptor específico precedeu por décadas à sua
posterior classificação como um receptor TRP (Szolcsányi, 2004; Xu et al., 2006).
Compostos vanilóides vêm sendo usados há muitos anos em estudos com
neuropeptídeos e na terapêutica de distúrbios dolorosos (principalmente na
neuralgia pós-herpética e artrite reumatóide, em aplicações tópicas, com efeitos
discretos).
A despolarização de nociceptores polimodais C em mamíferos, por influxo
de cálcio através de canais vanilóides, causa a liberação neuronal periférica de
substância P e outros neuropeptídeos, como o peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina, a somatostatina e o peptídeo intestinal vasoativo (Kalil-Gaspar, 2003;
Stander et al.,. 2004; Steinhoff et al., 2003). O alvo molecular específico da
capsaicina, o receptor TRPV1 (transient receptor potential channel - vanilloid 1) foi
classificado como um TRP após sua clonagem e caracterização funcional
(Caterina et al., 1997). Constitui-se em um canal de cátions não-seletivo, presente
em neurônios de vertebrados e invertebrados, que promove o influxo de cálcio
quando ativado por vanilóides ou por estímulos nocivos, como temperaturas
maiores que 43
o
C, aumento da concentração de prótons (pH<6,5), e derivados de
lipídeos como alguns produtos a jusante (downstream) da ação da lipoxigenase
sobre o ácido araquidônico, N-oleoildopamina e o endocanabinóide anandamida
12
(Jancsó et al., 1967; Caterina et al., 1997; O'Neil et al., 2003; Van der Stelt et al.,
2004; Nilius et al., 2005).
Em mamíferos, o canal TRPV1 funciona como um receptor primário para
estímulos nocivos, apesar de outras funções poderem existir. O TRPV1 é
fortemente expresso em neurônios sensoriais, incluindo aqueles nos gânglios da
raiz dorsal e trigeminais, com expressão moderada em fibras nervosas de outros
tecidos, como pâncreas, encéfalo, fígado, bexiga, pele, vísceras e outros. Um
aspecto importante do funcionamento do TRPV1 é a sua sensibilização por um ou
mais estímulos e/ou por compostos endógenos. A exposição de células que
expressam TRPV1 a um meio ácido sensibiliza o receptor à ativação por calor,
reduzindo seu limiar. Do mesmo modo, prótons sensibilizam o receptor aos efeitos
da capsaicina. Alternativamente, a capsaicina e ativadores da fosfolipase C-beta
em via PKC-dependente (aceto-miristato de éster de forbol, e bradicinina)
diminuem o limiar de ativação por íons H+. Tais eventos podem explicar a
hiperalgesia induzida por inflamação, em que prótons e bradicinina liberados pelo
tecido inflamado ativariam o TRPV1 e levariam à hipersensibilidade regional
(Caterina et al., 2001; Julius et al., 2001; Chuang et al., 2001; O’Neil et al., 2003).
Apesar de sua presença no SNC de mamíferos, o TRPV1, sob condições
normais fisiológicas, dificilmente é ativado por pH baixo ou calor, o que sugere
uma regulação preferencial por ligantes endógenos, os chamados endovanilóides.
Este grupo compreende três compostos identificados até o momento, todos
derivados do metabolismo do ácido araquidônico (liberado de lipídeos de
membrana por ação da fosfolipase A2). São eles (Figura 3) o endocanabinóide
anandamida (que possui dois receptores próprios CB1 e CB2, ligados à proteína G
13
e que não se ligam a vanilóides), a N-araquidonoildopamina e produtos da
lipoxigenase (15-HPETE e 12-HPETE). Tais compostos apresentam similaridades
estruturais entre si e com a capsaicina, e funcionam como neurotransmissores
atípicos lipossolúveis, que podem ser liberados tanto por células não neuronais
(por exemplo, na lesão de tecidos periféricos), quanto por ação da fosfolipase A2
(PLA2) no SNC. A forma lipossolúvel dos derivados de ácidos graxos de
membrana permite a difusão sináptica retrógrada ou anterógrada, além de
sinalização parácrina ou autócrina. A extensão de seus efeitos é estritamente
dependente da complexidade do microambiente celular em que são liberados (Van
der Stelt et al., 2004; Minke, 2006).
Figura 3. Ligantes endógenos do receptor TRPV em vertebrados (adaptado de
Van der Stelt et al, 2004).
Outros três canais vanilóides, TRPV2, TRPV3, e TRPV4, também são
abertos por calor em diferentes faixas de temperatura (>53ºC, >31-39ºC e >25-
33ºC, respectivamente). Em mamíferos, os TRPVs 1
a 3 são vastamente
14
expressos em gânglios das raízes dorsais e trigeminais, enquanto TRPV3 e 4 são
expressos em queratinócitos na pele (i.e., células não neurais), favorecendo a
concepção de que estes quatro receptores possuam um papel integrador na
sensação térmica. Além disto, estes receptores desempenham muitas outras
funções em células excitáveis e não excitáveis, como a osmorrecepção e
mecanorrecepção, em resposta a uma variedade de estímulos. O TRPV4 é
fortemente expresso nos rins e células epiteliais da traquéia, e nas células
osmosensoriais dos órgãos circunventriculares, no hipotálamo, nas células
cocleares pilosas mecanossensoriais, nas células de Merkel do complexo de
vibrissas, em células endoteliais, além de exibir pequena expressão em muitos
outros órgãos do trato gastrointestinal. Como foi dito, os últimos dois membros da
família vanilóide, TRPV5 e 6, são altamente seletivos ao cálcio e apresentam
expressão principalmente em células epiteliais, incluindo todo o trato
gastrointestinal, próstata, mamas e glândulas sudoríparas, e parecem estar
envolvidos na reabsorção de cálcio nas membranas apicais dos epitélios (Nilius et
al., 2005; Minke, 2006).
A nocicepção é definida como “sensação produzida por dano tecidual ou
por estímulo de intensidade potencialmente lesiva, que gera comportamentos
visando à proteção dos tecidos lesados, como reflexos de retirada ou fuga”.
(Kavaliers, 1988). Constitui-se uma característica básica dos animais, implicando a
presença de vias anatômicas aferentes nociceptoras e vias eferentes motoras. A
dor, no entanto, é uma experiência perceptual complexa, definida como “uma
experência sensorial aversiva causada por uma injúria potencial ou real que
provoca reações vegetativas e motoras protetoras, resultando em aversão
15
aprendida, e pode modificar comportamentos específicos da espécie, incluindo o
comportamento social”. A maioria, senão todos os invertebrados, tem a
capacidade de detectar e responder a estímulos nocivos ou aversivos, exibindo
respostas nociceptivas análogas àquelas mostradas por vertebrados (Sanberg et
al., 1988; Kavaliers, 1988).
O sistema nervoso mais sofisticado dos moluscos é aquele encontrado nos
cefalópodes (ex. Octopus vulgaris), que exibem vias e tratos de “dor” em seu SNC.
Apesar de exibirem sistemas neurais menos complexos que os cefalópodes,
moluscos de outras classes também são considerados capazes de apresentar
respostas nociceptivas. O comportamento aversivo dos moluscos a estímulos
táteis e térmicos nocivos é um conjunto de fenômenos de comportamento
defensivo e resposta nociceptiva bem descritos. Gastrópodes como Cepaea
nemoralis, Megalobulimus sanctipauli, Megalobulimus abbreviatus e Aplysia
californica respondem a estímulos nocivos com uma reação de retirada
acompanhada de secreção de muco. Quando colocados sobre substratos
aquecidos, C. nemoralis (40ºC), M. sanctipauli (52ºC) e M. abbreviatus (50
o
C)
mostram comportamento aversivo dentro de poucos segundos, caracterizado por
elevação das regiões anteriores do complexo cabeça-pé (C-P). Este
comportamento não é detectado em caracóis à temperatura ambiente ou a
temperaturas mais baixas, como a 30-33ºC (Romero et al., 1994; Walters et al.,
1987; Hirst et al., 1987; Balaban, 2002; Achaval et al., 2005).
Sobre uma placa aquecida a 22ºC (estímulo não nocivo), M. abbreviatus
apresenta somente o comportamento denominado exploratório (complexo cabeça-
pé estendido sobre substrato, com movimentos ondulatórios lentos da região
16
parapodial, e palpos labiais e tentáculos protraídos em exploração do ambiente).
Nestas condições, o caracol apresenta discreta elevação da região anterior, sem
atividade locomotora proeminente, produção de muco ou rotação da concha. Ao
contrário, quando colocado sobre substrato aquecido nocivo (50ºC), o M.
abbreviatus apresenta um comportamento aversivo estereotípico de duas fases:
assim que deixado sobre a chapa aquecida, imediatamente recolhe discretamente
o corpo para dentro da concha enquanto retrai tentáculos orais e palpos labiais,
erguendo os bordos laterais do pé. Em movimento seqüenciado e fluido, adquire
então a posição triangular característica da primeira fase do comportamento
aversivo, em que eleva a parte mais interna (ou ventro-medial) do pé, apoiando-se
somente pelos bordos laterais e diminuindo a superfície de contato com o
substrato. Em seguida, Inicia-se a segunda fase de aversão, em que realiza ondas
parapodiais laterais e protração de tentáculos e palpos, e finalmente eleva a parte
anterior do complexo cabeça-pé a até 1 cm ou mais (Figuras 4 e 5). Assim como
ocorre com outros caracóis pulmonados terrestres, o M. abbreviatus apresenta um
aumento da secreção de muco pedioso sob estímulos nociceptivos, que se torna
mais amarelado e espesso (em contraste com a forma fluida e incolor basal), por
pelo menos 30 min após o cessamento do estímulo. Para melhor padronização
dos dados observados, a latência, ou tempo de reação do comportamento
aversivo, é determinada quando o caracol eleva a parte anterior do complexo
cabeça-pé a 1 cm do substrato (Achaval et al., 2005).
17
Figura 4. Representação esquemática do caracol Megalobulimus abbreviatus na
primeira fase do comportamento aversivo sobre placa aquecida a temperatura
nociva, com os palpos labiais e tentáculos orais retraídos e o aspecto triangular do
complexo cabeça-pé (adaptado de Achaval et al, 2005).
Figura 5. Representação esquemática do caracol Megalobulimus abbreviatus na
segunda fase do comportamento aversivo sobre placa aquecida a temperatura
nociva, com elevação da porção anterior do complexo cabeça-pé (adaptado de
Achaval et al, 2005).
18
A administração de sulfato de morfina, metionina-encefalina ou beta-
endorfina inibe significativamente o comportamento aversivo provocado por calor.
Ainda, o aumento de latência resultante da administração de opióides em C.
nemoralis, Limax maximus, M. sanctipauli, and M. abbreviatus antes de um
estímulo térmico pode ser suprimido pelo antagonista opióide naloxone (Walters,
1987; Romero et al., 1994; Kavaliers, 1986; Achaval et al., 2005). Em adição, a
imunorreatividade para encefalina já foi identificada no sistema nervoso central de
diferentes gastropodos, como Aplysia californica, Lymnaea stagnalis, Helix
pomatia e M. abbreviatus (Elekes et al., 1993; Zancan, 1996). O naloxone, por si,
é capaz de diminuir latências provocadas por estresse térmico (Kavaliers et al.,
1983; Achaval et al., 2005). Assim, nestes gastrópodos, a habilidade do
antagonista opióide não-seletivo naloxone em produzir um bloqueio completo da
analgesia por morfina indica que um receptor µ está envolvido neste
comportamento. Assim como já foi demonstrado que a analgesia a estímulos
térmicos pode ser também bloqueada com antagonista de receptor delta (Romero
et al., 1994; Nestler et al., 2001; Kavaliers, 1987).
Em moluscos, a capsaicina é capaz de provocar potenciais de ação por
correntes de cálcio em neurônios de Helix pomatia e Aplysia californica (Hernadi
et, 1995; Erdelyi et al., 1986). Entretanto, não há dados semelhantes para o
gênero Megalobulimus. No comportamento de retirada de Helix lucorum, foi
proposto um circuito nociceptivo composto de 4 grupos de neurônios: sensoriais
(cujos corpos estão nos gânglios pleurais e parietais), neurônios pré-motores de
comando (ou interneurônios pré-motores de comando de retirada), os neurônios
motores e neurônios modulatórios (Zakharov et al., 1995, Balaban, 2002). Células
19
sensoriais (mecano-, termo-, quimio- e fotorreceptores) conectam-se aos
interneurônios de comando, localizados nos gânglios parietais e pleurais. Estes
são nove interneurônios pré-motores que convergem aferências sinápticas,
disparando os componentes do comportamento de retirada, através da ativação
dos neurônios motores, efetores da resposta comportamental (Balaban, 2002). Os
interneurônios de comando são assim considerados sob três critérios:
“participação”, na qual respondem a estímulo nocivo que precede à reposta
comportamental; “suficiência”, onde a ativação intracelular dispara parte da
resposta de retirada; e “necessidade”, quando a hiperpolarização do neurônio
inibe o comportamento de retirada. Um único grupo celular não controla
exclusivamente o comportamento de retirada do H. lucorum, porém, estas células
são fundamentais à resposta aversiva. Por fim, a ativação seqüencial de neurônios
sensoriais, de comando e motores é regulada por neurônios modulatórios
localizados nos gânglios pedais (Balaban, 2002; Figura 6).
Figura 6. Representação esquemática do circuito de retirada proposto para Helix
lucorum (modificado de Balaban, 2002).
20
Tais componentes apresentam semelhança com aqueles encontrados em
M. abbreviatus, especialmente entre neurônios serotoninérgicos (Swarowski et al.,
2005). Apesar da ausência de dados específicos para M. abbreviatus, especula-se
que a presença de um TRPV neste circuito localizaria-se nos neurônios de 1
a
ordem (sensoriais), e ainda no plexo pedioso, região de maior contato com
superfícies e rica em substância P (Zancan, 1996; Rigon et al., 1998). Entretanto,
estudos com Helix pomatia mostraram sensibilidade à capsaicina em neurônios
localizados nos gânglios visceral e parietais (principalmente LPa2) e cerebrais
(neurônio metacerebral gigante, serotoninérgico) (Hernadi et al., 1995). A
localização exata de receptores TRPV no M. abbreviatus permanece motivo de
especulação. A presença de neurotransmissão baseada em derivados de ácidos
graxos, pela ação de fosfolipases sobre lipídeos de membrana em gastrópodos
ainda é especulativa, porém alguns estudos demonstraram a participação do ácido
araquidônico e derivados na nocicepção em Limnaea stagnalis. (Kits et al., 1997;
Lopes et al., 1998) Outros trabalhos anteriores demonstraram tanto a presença de
sinalização anandamidérgica em Hermissenda quanto efeitos diretos do delta-9-
tetra-hidrocanabinol em Aplysia californica (Acosta-Urquidi et al., 1975; Pivovarov,
1995).
Até o momento, não há dados sobre os ligantes endógenos do TRPV1 em
neurônios de moluscos. Também não se dispõe de dados que impliquem o
TRPV1, notoriamente um canal ativado por calor, e outros receptores vanilóides,
nas respostas aversivas de moluscos e, em em particular, nas repostas aversivas
do M. abbreviatus, a estímulos térmicos nocivos. A perspectiva primária dos
estudos com receptores TRPV é a descoberta de drogas analgésicas ou
21
antinflamatórias que não ajam sobre a cicloxigenase ou sobre receptores opióides,
e sim direta e seletivamente sobre fibras nociceptoras. A presença do canal
TRPV1 no Megalobulimus abbreviatus reforçaria sua utilidade como modelo de
estudos em nocicepção.
O objetivo deste estudo foi medir a resposta nociceptiva (latência aversiva)
do M. abbreviatus após exposição tópica à capsaicina. De modo a testar se as
respostas provocadas pela capsacina ou pelo calor nocivo seriam mediadas por
receptores vanilóides, nós utilizamos o vermelho de rutênio, um antagonista não-
seletivo de receptores vanilóides, e a capsazepina, um antagonista específico do
receptor vanilóide TRPV1 (Bevan et al., 1992; Maia et al., 2006; Santos et al.,
1997). Posteriormente, foi testado se as respostas aversivas induzidas pela
capsaicina poderiam ser moduladas pela morfina e naloxone de formas similares
àquelas observadas em estudos anteriores com estímulo térmico nocivo.
22
OBJETIVOS
1) Medir a resposta nociceptiva (latência aversiva) do caracol terrestre
Megalobulimus abbreviatus após exposição tópica à capsaicina, de modo a testar
se as respostas provocadas pela capsacina ou pelo calor nocivo seriam mediadas
pelo receptor vanilóide TRPV1. Para isto, foi realizada uma abordagem indireta
(farmacológica), utilizando a capsaicina (agonista do receptor TRPV1), vermelho
de rutênio (antagonista não-seletivo de receptores vanilóides), e a capsazepina
(antagonista específico do receptor vanilóide TRPV1).
2) Demonstrar que as respostas aversivas induzidas pela capsaicina são
moduladas por morfina e naloxone de formas similares àquelas observadas em
estudos anteriores com estímulo térmico nocivo (50
o
C).
3) Uma vez demonstrada a participação do receptor TRPV1 através de
evidências farmacológicas, discutir a sua participação como canal ativado por
calor em um modelo de estudo de nocicepção utilizado em nosso laboratório e em
outros centros.
4) Até o momento, não há dados sobre os ligantes endógenos do TRPV1
em moluscos. A partir da comprovação da presença do receptor TRPV1, espera-
se que se inicie a procura de novos TRPVs e endovanilóides no M. abbreviatus.
23
Capsaicin-induced avoidance behavior in the terrestrial Gastropoda
Megalobulimus abbreviatus: evidence for TRPV-1 signalling and opioid
modulation in response to chemical noxious stimuli
Pedro Kalil-Gaspar
a, b
, Simone Marcuzzo
a, b
, Paula Rigon
a, b
, Cynthia Goulart
Molina
b
, Matilde Achaval
a, b
a
Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Instituto de Ciências Básicas da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
b
Laboratório de Histofisiologia Comparada, Departamento de Ciências
Morfológicas, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
Corresponding author: Matilde Achaval
Laboratório de Histofisiologia Comparada
Departamento de Ciências Morfológicas
ICBS, UFRGS
Rua Sarmento Leite 500
90030-170, Porto Alegre, RS, Brazi
fax: +55 51333163092
e-mail: [email protected]
24
Abstract
The aim of this study was to measure the nociceptive response (avoidance
latency) of the land snail Megalobulimus abbreviatus (N = 8 in each group) after
capsaicin topical exposure (0.1% and 0.5% in 20% ethanol) and to compare it to a
well-studied stressfull (50
o
C) thermal stimulus model. We also tested if ruthenium
red, and capsazepine, respectively nonselective and selective TRPV1 receptor
antagonists, could modify both capsaicin- and thermal-evoked responses. Finally,
animals were pretreated with morphine, naloxone or morphine plus naloxone prior
to capsaicin stimuli. Latencies were measured when the animal lifted its head-foot
complex 1 cm from the substrate. Data were compared by ANOVA and LSD post
hoc, and by Student T Test (p<0.05). RESULTS: capsaicin elicited withdrawal
behavior in a dose-dependent manner. The capsaicin vehicle (20% ethanol) also
evoked a less intense but significant avoidance reaction. Capsazepine and
ruthenium red attenuated both capsaicin and heat withdrawal responses, when
compared to vehicles. Morphine increased, and naloxone, either alone or in
combination with morphine, reduced capsaicin-evoked latencies when compared to
morphine or saline. These results indicate that TRPV1 receptor play a role in the
M. abbreviatus nociceptive circuits.
Keywords: avoidance behavior, capsaicin, capsazepine, morphine, nociception,
mollusc, ethanol
25
Introduction
Capsaicin, the pungent ingredient of red hot pepper, is a naturally-occuring
irritant, like olvanil and resiniferatoxin (collectively referred to as vanilloids), that
elicits pain by activating specific receptors on sensory nerve endings. The
molecular target of capsaicin, the TRPV1 receptor (transient receptor potential
channel - vanilloid 1), belongs the Transient Receptor Potential Channel
Superfamily, which shares homology to Drosophila Nan gene and to
Caenorhabditis elegans OCR proteins. The TRPV1 receptor is a nonselective
cation channel which promotes calcium influx in vertebrate neurons when activated
by vanilloids and noxious stimuli, such as heat (>42
o
C), low pH, some lipoxigenase
products, N-oleoyldopamine and the endocannabinoid anandamide (Jancsó et al.,
1967; Caterina et al., 1997; O'Neil et al., 2003; Van der Stelt et al., 2004;
Szolcsányi, 2004).
The avoidance behavior of snails to noxious tactile and thermal stimuli is a
well described phenomenon. Molluscs like Cepaea nemoralis, Megalobulimus
sanctipauli, Megalobulimus abbreviatus and Aplysia californica respond to noxious
stimuli with a withdrawal reaction accompanied by mucus secretion. When placed
on heated substrates, C. nemoralis (40ºC), M. sanctipauli (52ºC) and M.
abbreviatus (50
o
C) show aversive behavior within a few seconds, characterized by
lifting the anterior regions of the head-foot (H-F) complex. This behavior is not
detected in snails at lower temperatures, such as 30-33ºC or at room temperature
(Hirst et al., 1987; Zakharov, 1994; Romero et al., 1994; Achaval et al., 2005).
The administration of morphine sulfate, methionine-enkephalin or ß-
endorphin markedly suppresses thermally-evoked avoidance behavior. Moreover,
the increased latency resulting from opioid administration to C. nemoralis, Limax
maximus, M. sanctipauli, and M. abbreviatus after a thermal stimulus can be
suppressed by the opiate antagonist, naloxone (Kavaliers et al., 1983; Kavaliers et
al., 1986; Walters, 1987; Zakharov, 1994; Romero et al., 1994; Achaval et al.,
2005). In addition, enkephalin immunoreactivity was identified in the central
nervous system of different molluscs such as A. californica, Lymnaea stagnalis,
26
Helix pomatia, and M. abbreviatus (Elekes et al., 1993; Zancan, 1996). Naloxone
alone decreases latencies to thermal stress (Kavaliers et al., 1983; Achaval et al.,
2005). Thus, in these gastropods the ability of the nonselective opiate antagonist
naloxone to produce a complete blockade of morphine analgesia indicates that a µ
receptor is implicated in this behavior. It was also demonstrated that thermal
stimulus-induced analgesia was blocked by a delta receptor antagonist (Kavaliers,
1987; Romero et al., 1994; Nestler et al., 2001).
Until now, there is no data on the endogenous TRPV1 ligands in snail
neurons. Also, it was not clear if TRPV1, a notorious heat-gated calcium channel,
and other vanilloid receptors were involved in terrestrial molluscs thermal
avoidance behavior. In molluscs, capsaicin is able to promote action potentials by
calcium currents in Helix pomatia and Aplysia californica neurons (Erdelyi et al.,
1986; Hernadi et al., 1995). However, there is no such data in the Megalobulimus
genus. The aim of this study was to measure the nociceptive response (avoidance
latency) of M. abbreviatus after capsaicin topical exposure. In order to test if
capsaicin- and thermally-evoked responses were mediated by vanilloid receptors,
we used ruthenium red, a nonselective vanilloid-receptor antagonist, and
capsazepine, a selective TRPV1 antagonist (Bevan et al., 1992; Santos et al.,
1997; Maia et al., 2006). Then we tested if capsaicin-induced aversive responses
could be modulated by morphine and naloxone in ways similar to those observed
in previous studies with heat noxious stimuli.
Materials and Methods
Animals
Adult land snails, M. abbreviatus, Becquaert, 1948, previously classified as
M. oblongus (Thomé et al., 1994), with shell lengths of 56-80 mm and weighing 29-
81 g were collected from the county of Charqueadas, State of Rio Grande do Sul,
Brazil. The animals were kept in a screened terrarium, subjected to normal annual
light and temperature variations, and fed lettuce and water ad libitum.
27
Preparation of solutions
Capsaicin (Laboratório DEG, São Paulo, Brazil) was primarily dissolved in
ethanol, and then in distilled water or distilled water plus ethanol for desired
concentrations. The capsaicin vehicle containing ethanol had its own control group
(distilled water), since ethanol itself is able to potentiate TRPV1 (Trevisani et al.,
2002). Ruthenium red (Merck, Germany) was dissolved in distilled water to 1
mg/mL concentration. Capsazepine (Sigma, USA) was first diluted in dimethyl
sulphoxide (DMSO; VETEC, Brazil) to 1 mg/mL, and further diluted with saline to
the final concetrations of 5% or 1.5% capsazepine. Morphine sulphate (10 mg/mL)
and naloxone hydrochloride (0.4 mg/mL) (Cristália do Brasil S/A, São Paulo, SP,
Brazil) needed no dilutions.
Experimental Procedures
0.1% and 0.5% capsaicin topical solutions: In order to test if capsaicin was able
to evoke nociceptive behavior, four groups of snails (n = 8) were tested in petri
dishes (10-cm diameter), at 22
o
C room temperature, containing aqueous films of
distilled water (vehicle control), 20% ethanol in distilled water (vehicle), 0.1%
capsaicin and 0.5% capsaicin solutions. Prior to capsaicin exposure, snails were
allowed to hydrate for 1 min, to allow protraction out of their shells. Nociceptive
thresholds of individual snails were determined by measuring the latency of their
aversive or withdrawal behavior (Kavaliers et al., 1996). The measurements of
latency started when the snail was placed on a petri dish and ended immediately
after the animal lifted the head-foot complex to a minimum of 1 cm above the plate,
or when the snail reached the time of 60 seconds with no response (Achaval et al.,
2005). The animals were then quickly washed in fresh water to avoid excessive
28
exposure to capsaicin solution. Capsaicin, at 0.5% concentration, was then chosen
for the following tests, for its best uniformity in evoked latency values.
0.5% capsaicin and ruthenium red: Three groups (n = 8) were tested in petri
dishes, at room temperature, containing 0.5% capsaicin. One group received 1 mL
distilled water (vehicle), the second and the third groups received ruthenium red (3
mg/kg and 6 mg/kg body weight, respectively). Ruthenium red and vehicle were
injected into the intrahemocelic cavity through the anterior ventral zone of the foot
5 min prior to capsaicin exposure. Prior to injections and capsaicin exposure, snails
were allowed to hydrate for 1 min. Measurements of latency were obtained as
described above. The animals were then quickly washed in fresh water.
Noxious (50
o
C) heat and ruthenium red: Three groups (n = 8) were allowed to
hydrate for 2 hours. Five minutes before heat exposure, one group received 1 mL
distilled water (vehicle) injection, the second and the third groups received
ruthenium red injections (3mg/kg and 6mg/kg, respectively). Measurements of
latency started when the snail was placed on a 50
o
C hot plate (model-DS37,
Socrel, Comerio, VA, Italy) and ended immediately after the animal lifted the head-
foot complex 1 cm (Achaval et al., 2005; Swarowsky et al., 2005). To avoid lack of
umidity on the substrate, a plastic film containing distilled water (10 mL at 50
o
C)
was placed over the plate.
0.5% capsaicin and capsazepine: Two groups of snails (n = 8) were tested in
petri dishes containing 0.5% capsaicin, at room temperature. Capsazepine (0.5%
concentration) and vehicle were injected into the intrahemocelic cavity 5 min prior
to capsaicin exposure. The vehicle consisted of DMSO in saline only. Prior to
injections and capsaicin exposure, snails were allowed to hydrate for 1 min.
Measurements of latency were obtained as described above. The animals were
then quickly washed in fresh water.
29
Noxious (50
o
C) heat and capsazepine: Three groups (n = 8) were allowed to
hydrate for 2 hours. Five minutes before heat exposure, one group received a
0.5% capsazepine injection (1 mg/kg), the second received a 1.5% capsazepine
injection (3 mg/kg), and the third received vehicle. Latencies were measured as
described above.
0.5% capsaicin solution, morphine and naloxone: The animals were separated
into four groups (n = 8). One group received saline (control group; 1mL), the
second received morphine only (20 mg/kg), the third received naloxone only (5
mg/kg) and the fourth received naloxone (5 mg/kg) plus morphine (20 mg/kg). All
groups were exposed to 0.5% capsaicin, at room temperature. Drugs and saline
were injected into the intrahemocelic cavity 15 min (morphine and saline) prior to
capsaicin exposure. Naloxone was injected 5 min prior to morphine. Before
injections and capsaicin exposure, snails were hydrated for 1 min. Measurements
of latency were obtained as described above. The animals were then quickly
washed in fresh water.
Statistical analysis
For capsazepine versus capsaicin group, data (means ± SEM) were
statistically compared by Student T test. For all other groups, data (means ± SEM)
were statistically compared by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by
Least Significant Difference (LSD) post hoc test (level of significance set at P <
0.05), in SPSS 7.0 software.
Results
0.1% and 0.5% capsaicin topical solutions: Topical capsaicin elicited robust
withdrawal behavior in a dose-dependent manner (25.4 ± 2.0 s, 15.3 ± 1.9 s and
9.1 ± 1.0 s, for vehicle, 0.1% and 0.5% concentrations, respectively). Vehicle (20%
30
ethanol) reduced latencies in comparison to distilled water (no response).
Moreover, at 0.1% and 0.5% concentrations, capsaicin-induced latencies were
shorter than those obtained with 50
o
C stimuli (33.9 ± 6.4 s). In contrast to the
typical yellowish mucus secretion exhibited in previous studies with noxious heat
stimuli (Achaval et al., 2005), no such component was found after capsaicin
exposure (Fig. 1).
0.5% capsaicin solution and ruthenium red: Ruthenium red injections
attenuated capsaicin-evoked responses, increasing latencies at higher (6 mg/kg;
23.1 ± 1.9 s), but not lower doses (3 mg/kg; 12.7 ± 1.4 s; nonstatistically
significant), when compared to vehicle (16.8 ± 2.6 s; Fig.2).
Noxious (50
o
C) heat and ruthenium red: Ruthenium red (3 mg/kg) increased
heat-evoked latencies (55.4 ± 6.5 s), when compared to vehicle (33.9 ± 6.4 s).
Higher doses of ruthenium red did not have additional effects (Fig.3).
0.5% capsaicin solution and capsazepine: Capsazepine injection significantly
inhibited capsaicin-evoked responses, increasing latencies (19.2 ± 1.8 s) when
compared to vehicle (5.3 ± 0.4 s; Fig. 4).
Noxious (50
o
C) heat and capsazepine: Capsazepine (1 mg/kg and 3 mg/kg)
increased heat-evoked latencies (28.1 ± 1.8 s and 48.8 ± 3.6 s, respectively) in
significant dose-dependent levels, when compared to vehicle (20.4 ± 1.2 s; Fig. 5).
0.5% capsaicin solution, morphine and naloxone: Morphine promoted
increased withdrawal latencies (26.5 ± 3.4 s), with partial retraction of the H-F
complex, longer than those observed in control (saline-injected) snails (18.2 ± 2.6
s). The average response obtained with naloxone alone was significantly shorter
than that of the saline-control group (8.1 ± 1.1 s). Those snails pre-treated with
naloxone and injected with morphine 5 min later displayed a similar average
response latency (8.7 ± 1.3 s). The response latencies of this group did not differ
31
significantly (P < 0.05) from those of the animals treated with naloxone alone (Fig.
6).
Discussion
Topical capsaicin (0.1% and 0.5% concentrations in 20% ethanol) elicited
robust withdrawal behavior in a dose-dependent manner with shorter latencies
than those obtained with thermal 50
o
C stimuli. Heat-induced latencies were in
agreement with previous studies (Achaval et al., 2005). Capsaicin is a specific
ligand of the TRPV1 receptor, and our results point toward a role of TRPV1-
mediated signalling in M. abbreviatus nociceptive circuits. TRPV1 is a heat-gated
channel that opens at temperatures higher than 42
o
C. Using capsazepine, a
specific TRPV1 antagonist, there was a significant inhibition of capsaicin-evoked
latencies. Furthermore, capsazepine also increased heat-evoked latencies in a
dose-dependent manner, implicating TRPV1 in the response of M. abbreviatus to
noxious heat.
Ethanol in the capsaicin vehicle revealed to be a confusing bias in our
capsaicin results. Unfortunately, DMSO were not available at the time of capsaicin
dilution. Compared to distilled water, 20% ethanol alone was able to evoke
statistically significant aversive behavior in M. abbreviatus. Due to its solvent
properties, the irritating effect of ethanol should include some cellular damage.
However, several studies have shown that ethanol itself can act through TRPV1
receptors, potentiating capsaicin effects on the channel permeability (Trevisani et
al 2002; Cortright, et al, 2004; Trevisani et al, 2004; Gazzieri et al, 2006; Benedikt
et al, 2007). Therefore, it is reasonable to consider the responses to capsaicin as
also responses to ethanol, although 0.1% and 0.5% capsaicin concentrations
elicited responses in a dose-dependent manner, with the same vehicle
concentrations.
Using ruthenium red, a nonspecific antagonist of vanilloid channels, there
were increases in both capsaicin-evoked and heat-evoked latencies. Although this
is indirect evidence of TRPV1 signalling in molluscal nociceptive circuits, as
32
capsaicin and capsazepine are specific TRPV1 ligands, one cannot rule out the
participation of other members of the vanilloid family in heat-evoked behavior.
There are at least six distinct mammalian TRPV receptors. These receptors
frequently coexist with TRPV1 in neurons. Three of them are also opened by heat,
yet at different temperature thresholds, and are also inhibited by ruthenium red:
TRPV3 opens at 33
o
C, TRPV2 at 55
o
C and TRPV4 at lower temperatures (Julius
et al., 2001; Clapham, 2003). It is noteworthy that ruthenium red, in 6 mg/kg dose,
decreased heat-evoked latencies, which could be the result of different actions on
different heat-gated vanilloid receptors. However, demonstration of vanilloid
receptors in molluscs, except for TRPV1, is still lacking. Also, one can only
presume that vanilloid receptors are specifically expressed in M. abbreviatus nerve
cells, based on the large amount of data in other species, mainly vertebrates.
Moreover, studies with rodent skin demonstrate heat-responsive TRPV3 in
keratinocytes (Moqrich et al., 2005). Currently, a non-neuronal vanilloid receptor
signalling cannot be ruled out for terrestrial molluscs, as these animals are often in
close contact to potentially noxious substrates in their natural environments.
The M. abbreviatus nociceptive circuits are, at least in part, regulated by
opioids. Capsaicin (plus ethanol) elicited aversive behavior that could be
modulated by morphine and naloxone in the same way noxious heat was in
previous studies. Aversive capsaicin-evoked responses were delayed by morphine
and reduced by naloxone either alone or in combination with morphine (Achaval et
al., 2005). Altogether, these data suggest an important nociceptive function for
TRPV1 in M. abbreviatus and demand further investigations on TRPV1 receptor
localization and on putative endogenous ligands for TRPV1 in the nervous system
of terrestrial molluscs.
Aknowledgements
The authors are grateful to Antonio Generoso Severino for his technical
assistance, to Dr. Neide Kalil Gaspar and Hospital Universitário Antonio Pedro (Rio
33
de Janeiro, Brazil) for ruthenium red, and to Ms. Caroline Perinazzo and Dr. Aldo
Lucion (Universidade Federal do Rio Grande do Sul) for DMSO. This work was
supported by Brazilian funding agencies, CNPq and CAPES. M.Achaval is CNPq
investigator.
References
Achaval, M., Penha, M.A.P., Swarowsky, A., Rigon, P., Xavier, L.L., Viola, G.G.,
Zancan, D.M., 2005. The terrestrial Gastropoda Megalobulimus abbreviatus as a
useful model for nociceptive experiments. Effects of morphine and naloxone on
thermal avoidance behavior. Braz. J. Med. Biol. Res. 38, 73-80.
Benedikt, J., Teisinger, J., Vyklicky, L., Vlachova, V., 2007. Ethanol inhibits cold-
menthol receptor TRPM8 by modulating its interaction with membrane
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. J. Neurochem. 100, 211-24.
Bevan, S., Hothi, S., Hughes, G., James, I.F., Rang, H.P., Shah, K., Walpole, C.S.,
Yeats, J.C., 1992. Capsazepine: a competitive antagonist of the sensory neurone
excitant capsaicin. J. Biol. Chem. 107, 544-52.
Caterina, M.J., Schumacher M.A., Tominaga, M., Rosen, T.A., Levine, J.D., Julius,
D., 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.
Nature 389, 816-824.
Clapham, D.E., 2003. TRP channels as cellular sensors. Nature 426, 517-24
Cortright, D.N., Szallasi, A., 2004. Biochemical pharmacology of the vanilloid
receptor TRPV1. An update. Eur. J. Biochem. 271,1814-9.
34
Diakonova, V.E., Elofsson, R., Calberg, M., Sakharov, D.A., 1995. Complex
avoidance behavior and its neurochemical regulation in the land snail Cepaea
nemoralis. Gen. Pharmacol. 26, 773-7.
Elekes, K., Stefano, G.B., Carpenter, D.O., 1993. Enkephalin-like immunoreactive
neurons in the central nervous system of gastropods (Helix pomatia, Lymnaea
stagnalis, Aplysia californica): a comparative immunohistochemical study. Cell
Tissue Res. 272, 257-272.
Erdelyi. L., Such, G., 1986. Effects of capsaicin on molluscan neurons: a voltage
clamp study. Comp. Biochem. Physiol. C. 85, 319-27.
Gazzieri, D., Trevisani, M., Tarantini, F., Bechi, P., Masotti, G., Gensini, G.F.,
Castellani, S., Marchionni, N., Geppetti, P., Harrison, S., 2006. Ethanol dilates
coronary arteries and increases coronary flow via transient receptor potential
vanilloid 1 and calcitonin gene-related peptide. Cardiovasc. Res. 70, 589-99.
Hernadi, L., Erdelyi, L., Parducz, A., Szabadi, H., Such, G., Jancso, G., 1995. In
vitro capsaicin-induced cytological changes and alteration in calcium distribution in
giant serotonergic neurons of the snail Helix pomatia: a light- and electron-
microscopic study. Cell Tissue Res. 282, 445-53.
Hirst, M., Kavaliers, M., 1987. Levorphanol but not dextrorphan suppresses the
foot-lifting response to an aversive thermal stimulus in the terrestrial snail, Cepaea
nemoralis. Neuropharmacology 26, 121-123.
Jancsó, N., Jancsó-Gábor, A., Szolcsányi, J., 1967. Direct evidence for neurogenic
inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin.
Br. J. Pharmacol. Chemother. 31, 138-51.
35
Julius, D., Basbaum, A.I., 2001. Molecular mechanisms of nociception. Nature 413,
203-10.
Kavaliers, M., 1987. Evidence for opioid and non-opioid forms of stress-induced
analgesia in the snail, Cepaea nemoralis. Brain Res. 410, 111-115.
Kavaliers, M., Hirst, M., 1986. Naloxone-reversible stress-induced feeding and
analgesia in the slug Limax maximus. Life Sci. 38, 203-209.
Kavaliers, M., Hirst, M., Teskey, G.C., 1983. A functional role for an opiate system
in snail thermal behavior. Science 220, 99-101.
Kavaliers, M., Perrot-Sinal, T.S., 1996. Pronociceptive effects of the neuropeptide
nociceptin, in the land snail Cepae nemoralis. Peptides 17, 763-8.
Maia, J.L., Lima-Junior, R.C., Melo, C.M., David, J.P., David, J.M., Campos, A.R.,
Santos, F.A., Rao, V.S., 2006. Oleanolic acid, a pentacyclic triterpene attenuates
capsaicin-induced nociception in mice: Possible mechanisms. Pharmacol Res. 54,
282-86.
Moqrich, A., Hwang, S.W., Earley, T.J., Petrus, M.J., Murray, A.N., Spencer, K.S.,
Andahazy, M., Story, G.M., Patapoutian, A., 2005. Impaired thermosensation in
mice lacking TRPV3, a heat and camphor sensor in the skin. Science 307, 1468-
72.
Nestler, E.J., Hyman, S.E., Malenka, R.S., 2001. Molecular Neuropharmacology. A
Foundation for Clinical Neuroscience. McGraw-Hill Companies, Inc., New York.
O'Neil, R.G., Brown, R.C., 2003. The vanilloid receptor family of calcium-
permeable channels: molecular integrators of microenvironmental stimuli. News.
Physiol. Sci. 18, 226-31.
36
Romero, S.M.B., Hoffmann, A., Menescal de Oliveira, L., 1994. Is there an opiate
receptor in the snail Megalobulimus sanctipauli? Action of morphine and naloxone.
Comp. Biochem. Physiol. 107C, 37-40.
Santos, A.R., Calixto, J.B., 1997. Ruthenium red and capsazepine antinociceptive
effect in formalin and capsaicin models of pain in mice. Neurosci Lett. 235, 73-6.
Szolcsányi, J., 2004. Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology
and physiology. Neuropeptides 38, 377-84.
Swarowsky, A., Monteiro, A.F., Xavier, L.L., Zancan, D.M., Achaval, M., 2005.
Serotonergic immunoreactivity in the pedal ganglia of the pulmonate snail
Megalobulimus abbreviatus after thermal stimulus: A semi-quantitative analysis.
Comp. Biochem. Physiol. 141A, 230-8.
Thomé, J.W., Carara, A.E.Q., Mallman, M.T., Lopes, P.T.C., Schneider, V.I., 1994.
Manual de aulas práticas de zoologia: estudo morfo-anatômico de um molusco
gastrópode mesuretra. Cadernos EDI-PUCRS, Série Zoologia, Porto alegre. 30pp.
Trevisani, M., Smart, D., Gunthorpe, M.J., Tognetto, M., Barbieri, M., Campi, B.,
Amadesi, S., Gray, J., Jerman, J.C., Brough, S.J., Owen, D., Smith, G.D., Randall,
A.D., Harrison, S., Bianchi, A., Davis, J.B., Geppetti, P. 2002. Ethanol elicits and
potentiates nociceptor responses via the vanilloid receptor-1. Nat Neurosci. 5, 546-
51.
Trevisani, M., Gazzieri, D., Benvenuti, F., Campi, B., Dinh, Q.T., Groneberg, D.A.,
Rigoni, M., Emonds-Alt, X., Creminon, C., Fischer, A., Geppetti, P., Harrison, S.,
2004. Ethanol causes inflammation in the airways by a neurogenic and TRPV1-
dependent mechanism. J. Pharmacol. Exp. Ther. 309,1167-73.
37
Van der Stelt, M., Di Marzo, V., 2004. Putative endogenous ligands of transient
receptor potential vanilloid 1 channels. Eur. J. Biochem. 271, 1827-34.
Walters, E.T., 1987. Multiple sensory neuronal correlates of sitespecific
sensitization in Aplysia. J Neurosci. 7, 408-417.
Zakharov, I.S., 1994. Avoidance behavior of the snail. Neurosci. Behav. Physiol.
24, 63-9
Zancan DM (1996). Localização de mediadores químicos nos gânglios nervosos
centrais e tentaculares e inervação da glândula corpo dorsal do caracol
pulmonado Megalobulimus oblongus. Doctoral thesis, Programa de Pós-
graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
38
Figures
Figure 1 – M. abbreviatus’ responses to capsaicin stimuli in 0.1% and 0.5%
concentrations: Latencies (mean ± SEM) measured for stimuli with distilled water,
20% ethanol (capsaicin vehicle), 0.1% and 0.5% capsaicin topical solutions (“a”
corresponds to p<0.001 when compared to distilled water. “b” corresponds to
p<0.01 when compared to vehicle. “c” corresponds to p<0.01 when compared to
0.1% capsaicin).
Figure 2 – M. abbreviatus’ responses to 0.5% capsaicin after ruthenium red
injections: Latencies (mean ± SEM) measured for 0.5% capsaicin stimuli after
ruthenium red vehicle, 3 mg/kg and 6 mg/kg ruthenium red injections (“a”
corresponds to p<0.05).
Figure 3 – M. abbreviatus’ responses to noxious heat after ruthenium red
injections: Latencies (mean ± SEM) measured for noxious heat plate (50
o
C)
stimuli after ruthenium red vehicle and 3 mg/kg and 6 mg/kg ruthenium red
injections (“a” corresponds to p<0.05).
Figure 4 – M. abbreviatus’ responses to 0.5% capsaicin after capsazepine
injections: Latencies (mean ± SEM) measured for 0.5% capsaicin stimuli after
capsazepine vehicle, and 1 mg/kg capsazepine injections (“a” corresponds to
p<0.05).
Figure 5 – M. abbreviatus’ responses to noxious heat after capsazepine
injections: Latencies (mean ± SEM) measured for noxious heat plate (50
o
C)
stimuli after capsazepine vehicle, 1 mg/kg and 3 mg/kg capsazepine injections (“a”
corresponds to p<0.05 when compared to vehicle. “b” corresponds to p<0.001
when compared to 1 mg/kg capsazepine).
39
Figure 6 – M. abbreviatus’ responses to 0.5% capsaicin stimuli after
morphine and naloxone injections: Latencies (mean ± SEM) measured for 0.5%
capsaicin stimuli after saline, morphine, naloxone and naloxone plus morphine
injections (“a” corresponds to p<0.05 when compared to saline. “b” corresponds to
p<0.001 when compared to morphine).
40
Figure 1
Figure 2
Ruthenium red and 0.5% Capsaicin
0
5
10
15
20
25
30
VEHICLE RUTHENIUM RED 3 mg/Kg RUTHENIUM RED 6 mg/Kg
Response latency (s)
a
0.1% Capsaicin and 0.5% solutions
0
10
20
30
40
50
60
70
CONTROL VEHICLE VEHICLE 0.1% CAPSAICIN 0.5% CAPSAICIN
Response latency (s)
a
ab
abc
41
Figure 3
Figure 4
Ruthenium red X Hot plate
0
10
20
30
40
50
60
70
VEHICLE RUTHENIUM RED 3 mg/Kg RUTHENIUM RED 6 m g/Kg
Response latency (s)
a
Capsazepine and 0.5% capsaicin
0
5
10
15
20
25
VEHICLE CAPSAZEPINE 1 mg/Kg
Response latency (s)
a
42
Figure 5
Figure 6
Morphine and Naloxone X Capsaicin
0
5
10
15
20
25
30
35
SALINE MORPHINE 20 mg/Kg NALOXONE 5 mg/Kg NALOXONE 5 mg/Kg +
MORPHINE 20 m g/Kg
Response latency (s)
a
ab
ab
Capsazepine and hot plate
0
10
20
30
40
50
60
VEHICLE CAPSAZEPINE 1 mg/Kg CAPSAZEPINE 3 mg/Kg
Response latency (s)
a
ab
43
CONCLUSÕES
1) Foi demonstrada resposta nociceptiva (latência aversiva) do caracol
terrestre Megalobulimus abbreviatus após exposição tópica à capsaicina, de modo
que as respostas provocadas pela capsacina ou pelo calor nocivo são mediadas,
ao menos em parte, pelo receptor vanilóide TRPV1. Para isto, foi realizada uma
abordagem indireta (farmacológica), utilizando a capsaicina (agonista do receptor
TRPV1), vermelho de rutênio (antagonista não-seletivo de receptores vanilóides),
e a capsazepina (antagonista específico do receptor vanilóide TRPV1).
2) Demonstrou-se que as respostas aversivas induzidas pela capsaicina
são moduladas por morfina e naloxone de formas similares àquelas observadas
em estudos anteriores com estímulo térmico nocivo (50
o
C).
PERSPECTIVAS
Até o momento, não há dados sobre os ligantes endógenos do TRPV1 em
neurônios de moluscos. Também não se dispõe de dados que impliquem o
TRPV1, notoriamente um canal ativado por calor, e outros receptores vanilóides,
nas respostas aversivas de moluscos e, em em particular, nas repostas aversivas
do M. abbreviatus, a estímulos térmicos nocivos. A partir da comprovação da
presença do receptor TRPV1, espera-se que se inicie a procura de novos TRPVs
e endovanilóides no M. abbreviatus. A perspectiva primária dos estudos com
receptores TRPV é a descoberta de drogas analgésicas ou antinflamatórias que
não ajam sobre a cicloxigenase ou sobre receptores opióides, e sim direta e
44
seletivamente sobre fibras nociceptoras. A presença do canal TRPV1 no
Megalobulimus abbreviatus reforça sua utilidade como modelo de estudos em
nocicepção.
Referências Bibliográficas
Achaval, M., Penha, M.A.P., Swarowsky, A., Rigon, P., Xavier, L.L., Viola, G.G.,
Zancan, D.M., 2005. The terrestrial Gastropoda Megalobulimus abbreviatus as a
useful model for nociceptive experiments. Effects of morphine and naloxone on
thermal avoidance behavior. Braz. J. Med. Biol. Res., 38: 73-80.
Acosta-Urquidi, J., Chase, R., 1975. The effects of delta9-tetrahydrocannabinol on
action potentials in the mollusc Aplysia. Can. J. Physiol. Pharmacol., 53: 793-8.
Balaban, P.M., 2002. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial
snail. Neurosci. Biobehav. Rev., 26: 597-630.
Bevan, S., Hothi, S., Hughes, G., James, I.F., Rang, H.P., Shah, K., Walpole, C.S.,
Yeats, J.C., 1992. Capsazepine: a competitive antagonist of the sensory neurone
excitant capsaicin. J. Biol. Chem., 107: 544-52.
Carafoli, E., 2002. Calcium signaling: a tale for all seasons. Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A., 99: 1115-22.
45
Caterina, M.J., Schumacher M.A., Tominaga, M., Rosen, T.A., Levine, J.D., Julius,
D., 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.
Nature, 389: 816-824.
Caterina, M.J., Julius, D., 2001. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the
pain pathway. Annu. Rev. Neurosci., 24: 487-517.
Chuang, H.H., Prescott, E.D., Kong, H., Shields, S., Jordt, S.E., Basbaum, A.I.,
Chao, M.V., Julius, D., 2001. Bradykinin and nerve growth factor release the
capsaicin receptor from PtdIns(4, 5)P2-mediated inhibition. Nature, 411: 957-962.
Clapham, D.E., Julius, D., Montell, C., Schultz, G., 2005. International Union of
Pharmacology. XLIX. Nomenclature and structure-function relationships of
transient receptor potential channels. Pharmacol. Rev., 57: 427-450.
Cosens, D., 1971. Blindness in a Drosophila mutant. J. Insect Physiol., 17: 285-
302.
Cosens, D.J., Manning, A. 1969. Abnormal electroretinogram from a Drosophila
mutant. Nature, 224: 285-287.
Elekes, K., Stefano, G.B., Carpenter, D.O., 1993. Enkephalin-like immunoreactive
neurons in the central nervous system of gastropods (Helix pomatia, Lymnaea
46
stagnalis, Aplysia californica): a comparative immunohistochemical study. Cell
Tissue Res., 272: 257-272.
Erdelyi. L., Such, G., 1986. Effects of capsaicin on molluscan neurons: a voltage
clamp study. Comp. Biochem. Physiol. C., 85: 319-27.
Ferrer-Montiel, A., Garcia-Martinez, C., Morenilla-Palao, C., Garcia-Sanz, N.,
Fernandez-Carvajal, A., Fernandez-Ballester, G., Planells-Cases, R., 2004.
Molecular architecture of the vanilloid receptor. Insights for drug design. Eur. J.
Biochem., 271: 1820-6.
Hardie, R.C., Minke, B., 1992. The trp gene is essential for a light activated Ca2+
channel in Drosophila photoreceptors. Neuron, 8: 643-651.
Hernadi, L., Erdelyi, L., Parducz, A., Szabadi, H., Such, G., Jancso, G., 1995. In
vitro capsaicin-induced cytological changes and alteration in calcium distribution in
giant serotonergic neurons of the snail Helix pomatia: a light- and electron-
microscopic study. Cell Tissue Res., 282: 445-53.
Hirst, M., Kavaliers, M., 1987. Levorphanol but not dextrorphan suppresses the
foot-lifting response to an aversive thermal stimulus in the terrestrial snail, Cepaea
nemoralis. Neuropharmacology, 26: 121-123.
47
Hoenderop, J.G., Nilius, B., Bindels, R.J., 2005. Calcium absorption across
epithelia, Physiol. Rev., 85: 373-422.
Hu, H.Z., Gu, Q., Wang, C., Colton, C.K., Tang, J., Kinoshita-Kawada, M., Lee,
L.Y., Wood, J.D., Zhu, M.X., 2004. 2-Aminoethoxydiphenyl borate is a common
activator of TRPV1, TRPV2, and TRPV3. J. Biol.Chem., 279: 35741-35748.
Jancsó, N., Jancsó-Gábor, A., Szolcsányi, J., 1967. Direct evidence for neurogenic
inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin.
Br. J. Pharmacol. Chemother., 31: 138-51.
Julius, D., Basbaum, A.I., 2001. Molecular mechanisms of nociception. Nature,
413: 203-10.
Kalil-Gaspar, P., 2003. Neuropeptídeos na pele. An. Bras. Dermatol., 78: 483-98.
Kavaliers, M., Hirst, M., Teskey, G.C., 1983. A functional role for an opiate system
in snail thermal behavior. Science, 220: 99-101.
Kavaliers, M., Hirst, M., 1986. Naloxone-reversible stress-induced feeding and
analgesia in the slug Limax maximus. Life Sci., 38: 203-209.
Kavaliers, M., 1987. Evidence for opioid and non-opioid forms of stress-induced
analgesia in the snail, Cepaea nemoralis. Brain Res., 410: 111-115.
48
Kavaliers, M., 1988. Evolutionary and comparative aspects of nociception. Brain
Res. Bull., 21: 923-31.
Kits, K.S., Lodder, J.C., Veerman, M.J., 1997. Phe-Met-Arg-Phe-amide activates a
novel voltage-dependent K+ current through a lipoxygenase pathway in molluscan
neurones. J. Gen. Physiol., 110: 611-28.
Lopes, C.M., Franks, N.P., Lieb, W.R., 1998. Actions of general anaesthetics and
arachidonic pathway inhibitors on K+currents activated by volatile anaesthetics and
FMRFamide in molluscan neurones. Br. J. Pharmacol., 125: 309-18.
Maia, J.L., Lima-Junior, R.C., Melo, C.M., David, J.P., David, J.M., Campos, A.R.,
Santos, F.A., Rao, V.S., 2006. Oleanolic acid, a pentacyclic triterpene attenuates
capsaicin-induced nociception in mice: Possible mechanisms. Pharmacol Res., 54:
282-86.
Minke, B., 2006. TRP channels and Ca2+ signaling. Cell Calcium, 40: 261-275.
Nestler, E.J., Hyman, S.E., Malenka, R.S., 2001. Molecular Neuropharmacology. A
Foundation for Clinical Neuroscience. McGraw-Hill Companies, Inc., New York.
Nijenhuis, T., Hoenderop, J.G., Bindels, R.J., 2005. TRPV5 and TRPV6 in Ca(2+)
(re)absorption: regulating Ca(2+) entry at the gate. Pflugers Arch. 451, 181-92.
49
Nilius, B., Voets, T., 2005. TRP channels: a TR(I)P through a world of
multifunctional cation channels. Pflugers Arch., 451: 1-10.
O'Neil, R.G., Brown, R.C., 2003. The vanilloid receptor family of calcium-
permeable channels: molecular integrators of microenvironmental stimuli. News.
Physiol. Sci., 18: 226-31.
Pivovarov, A.S., 1995. Regulation of neuron cholinoreceptor plasticity of Helix
lucorum by second messengers and opioids. Comp. Biochem. Physiol. C.
Pharmacol. Toxicol. Endocrinol., 110: 229-40.
Rigon, P., Oliveira, A.H., Faccioni-Heuser, M.C., Zancan, D.M., Achaval, M., 1998.
Imunorreatividade a substância P no plexo pedioso do caracol terrestre
Megalobulimus oblongus. VII Cogresso Ibero-Americano de Biologia Celular.
Montevideo. Uruguai.
Romero, S.M.B., Hoffmann, A., Menescal de Oliveira, L., 1994. Is there an opiate
receptor in the snail Megalobulimus sanctipauli? Action of morphine and naloxone.
Comp. Biochem. Physiol., 107C: 37-40.
Rosenbaum, T., Gordon-Shaag, A., Munari, M., Gordon, S.E., 2004. Ca2+/
calmodulin modulates TRPV1 activation by capsaicin. J. Gen.Physiol., 123: 53-62.
50
Sanberg, P.R., Ossenkropp, K., Kavaliers, M., 1988. The Behavioral Biology of
Nociception: an introduction to the Symposium. Brain Res. Bull., 21: 921-22.
Santos, A.R., Calixto, J.B., 1997. Ruthenium red and capsazepine antinociceptive
effect in formalin and capsaicin models of pain in mice. Neurosci Lett., 235: 73-6.
Stander, S., Moorman, C., Schumacher, M., Budenkotte, J., Artuc, M.,
Shpacpvitch, V., Brzoska, T., Lippert, U., Henz, B.M., Luger, T.A., Metze, D.,
Steinhoff, M. 2004. Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous
sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures. Exp.
Dermatol., 13: 129-9.
Steinhoff, M., Stander, S., Seeliger, S., Ansel, J.C., Schmelz, M., Luger, T.A. 2003.
Modern aspects of cutaneous inflammation. Arch. Dermatol., 139: 1479-88.
Swarowsky, A., Monteiro, A.F., Xavier, L.L., Zancan, D.M., Achaval, M., 2005.
Serotonergic immunoreactivity in the pedal ganglia of the pulmonate snail
Megalobulimus abbreviatus after thermal stimulus: A semi-quantitative analysis.
Comp. Biochem. Physiol., 141A: 230-8.
Szolcsányi, J., 2004. Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology
and physiology. Neuropeptides, 38: 377-84.
51
Van der Stelt, M., Di Marzo, V., 2004. Endovanilloids; Putative endogenous ligands
of transient receptor potential vanilloid 1 channels. Eur. J. Biochem., 271: 1827-
1834.
Walters, E.T., 1987. Multiple sensory neuronal correlates of sitespecific
sensitization in Aplysia. J Neurosci., 7: 408-417.
Xu, H., Delling, M., Jun, J.C., Clapham, D.E., 2006. Oregano, thyme and clove-
derived flavors and skin sensitizers activate specific TRP channels. Nat. Neurosci.,
9: 628-635.
Zakharov, I.S., 1994. Avoidance behavior of the snail. Neurosci. Behav. Physiol.,
24: 63-9.
Zancan DM (1996). Localização de mediadores químicos nos gânglios nervosos
centrais e tentaculares e inervação da glândula corpo dorsal do caracol
pulmonado Megalobulimus oblongus. Doctoral thesis, Programa de Pós-
graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
