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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
RAQUEL CORDEIRO THEODORO
Caracterização da transição micélio – levedura em
Paracoccidioides brasiliensis e sua relação com a
expressão do gene do choque térmico 70 (HSP70)
Orientador: Dr. Eduardo Bagagli
Co-orientador: Ivan de Godoy Maia
Botucatu, 2007
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências da Universidade Estadual Paulista
–
UNESP, Campus de Botucatu, como parte
dos requisitos par
a a obtenção do Título de
Mestre em Ciências Biológicas, Área de
concentração: Genética.
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Índice
Pág.
Agradecimentos 3
I Revisão de Literatura....................................................................................
7
II Proposta do projeto de mestrado.................................................................
28
III Resumo.......................................................................................................
31
IV Artigo.........................................................................................................
32
V Anexos.........................................................................................................
68
VI Discussão Geral.........................................................................................
80
VII Referências Bibliográficas........................................................................
88
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Agradeço
Ao meu orientador e amigo Eduardo,
Sua orientação se baseia em muito mais do que transmitir
conhecimentos, mas também, e principalmente, em nos mostrar o
quanto é bom aprender e o quanto ainda nos falta saber. Sem dúvida
é um mestre muito querido, um exemplo a ser seguido e admirado.
Obrigada Eduardo, por todos esses anos de orientação e convivência.
Ao co-orientador Ivan de Godoy Maia,
Pelas críticas e sugestões sempre pertinentes, pela atenção e
paciência para tirar as minhas dúvidas.
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Ao meu namorado Mateus, por todo amor e carinho, amigo que
consegue sempre arrancar um sorriso meu, não importa o momento.
Aos Tios (Cleide, Nilza, Dorival e Fausto) e aos primos (Anderson,
Andréia, Adriana, Cátia e Elaine) pelo carinho e pela torcida.
Aos amigos de bancada, Sandra, Assis, Lígia, Virgínia, Gisela,
Gabriela, Keila, Juliana, Silvinha e Hélio, sempre unidos e
participativos: minha família Botucatuense.
Aos amigos Martha, Lara, Clívia, Fernanda, Emanuel
(Manezinho), Gisleine, Ana Luísa e a todos os Feitosas, pessoas
únicas e especiais em minha vida.
À Meg, é claro..., companheira de todas as horas, sempre disposta a
longos passeios, trilhas para cachoeiras e brincadeiras, sempre
renovando minhas energias. Sem dúvida, uma amiga fiel e carinhosa
com a qual sempre posso contar.
Ao professor e amigo Guaracy, pela orientação a mim prestada
durante o estágio docência na disciplina de Evolução, por todos os
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ensinamentos e oportunidades. Sem dúvida contribuiu e muito para
a minha formação.
Aos professores João Candeias e João Pessoa por abrirem as portas
de seus laboratórios e por me orientarem durante as reações de PCR
em Tempo real.
À Dra. Sandra, por toda atenção e ensinamentos sobre PCR em
Tempo Real.
Aos professores Gustavo H. Goldman e Everaldo Marques (USP,
Ribeirão Preto) pelas seqüências de alfa e beta tubulinas cedidas
para o desenho de primers.
À professora Cláudia, pela ajuda prestada nas análises
morfométricas.
À professora Luzia, por me socorrer nos testes estatísticos.
Aos funcionários do Depto de Micro e Imunologia, Sônia, Lula,
Ademival, Tino, Pedro e Nice, por todo carinho e dedicação aos
alunos.
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I Revisão de Literatura
I.1 Paracoccidioides brasiliensis: taxonomia, etiologia e ecologia.
P. brasiliensis é a fase anamórfica (mitospórica) de um ascomiceto pertencente à
Ordem Onygenales, Família Onygenaceae, recentemente re-classificado na nova Família
Ajellomycetaceae, a qual representa a um clado monofilético que inclui também os gêneros
Blastomyces, Emmonsia e Histoplasma (UNTEREINER et al., 2004).
O P. brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, doença
caracterizada pelo desenvolvimento de lesões granulomatosas com freqüente evolução
crônica, envolvendo pulmão, pele, membranas mucosas e outros tecidos (FRANCO, 1987).
Este fungo apresenta distribuição geográfica restrita aos países latino-americanos, ocorrendo
com maior incidência no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina (WANKE &
LONDERO, 1994).
Este patógeno possui um dimorfismo morfológico termo-dependente, a 35-37°C
(in vitro, em meios enriquecidos ou no tecido do hospedeiro em condição de parasitismo)
possui forma de levedura com multibrotamentos, aspecto conhecido como “roda de leme”
(LACAZ et al., 1984) e à 25°C (in vitro ou em ambiente sob condições de saprofitismo)
cresce na forma de micélios aéreos curtos bastante aderidos ao meio de cultura, as hifas são
septadas, com artrósporos, clamidoconídios intercalares e aleuriósporos globosos
(MARQUES & CAMARGO et al., 1998).
O P. brasiliensis tem sua ecologia praticamente desconhecida devido aos dados
pouco conclusivos a respeito de seu isolamento ambiental. O caráter casual e não repetitivo
das observações, aliado às dificuldades de isolamento ambiental, dificultam a exata
localização deste patógeno no ambiente. Além disso, a falta de surtos epidêmicos, o
prolongado período de latência da doença e freqüentes migrações das populações de áreas
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endêmicas, tornam praticamente impossível a identificação dos locais onde a infecção foi
adquirida (RESTREPO, 1985).
Apesar destas dificuldades, existe um “certo consenso”, baseado em outras
micoses sistêmicas provocadas por fungos dimórficos, onde, o pulmão é o órgão mais
afetado, de que o P. brasiliensis vive saprofiticamente no solo e/ou vegetais, produzindo
estruturas assexuadas na forma de artroconídias (BUSTAMANTE-SIMON et al., 1985), as
quais seriam as responsáveis pela infecção principalmente pelo trato respiratório
(MCEWEN et al., 1987).
Existem alguns casos de isolamento do P. brasiliensis em solo (SHOME &
BATISTA, 1963; NEGRONI, 1968; ALBORNOZ, 1971 e SILVA-VERGARA et al.,
1998), sendo que os dois primeiros isolamentos não foram totalmente confirmatórios para P.
brasiliensis, já que o isolado nem mesmo foi mantido em coleção (FRANCO et al., 2000).
Além destes isolamentos, o patógeno também já foi detectado em ração canina (FERREIRA
et al., 1990), trato intestinal de morcegos (GROSE & TRAMSITT, 1995) e fezes de
pingüim (GESUELE, 1989).
Um novo indício ambiental da presença do P. brasiliensis em solo foi a
constatação da ocorrência do mesmo, em alta freqüência, em tatus da espécie Dasypus
novemcinctus (NAIFF et al., 1986, MACEDO et al., 1999; SILVA-VERGARA et al., 2000;
CORREDOR et al., 1999; BAGAGLI et al., 1998; 2003), animais com intenso hábito
fossorial e escavatório, cuja distribuição geográfica costuma coincidir com a observada na
paracoccidioidomicose (RESTREPO, 1994). O contato com estes animais está associado a
um aumento dos fatores de riscos para a infecção em pessoas residentes nas áreas endêmicas
da doença (CADAVID & RESTREPO, 1993).
Além da metodologia direta (cultura) e indireta (inoculação animal), métodos
moleculares vem sendo empregados para a detecção do P. brasiliensis em solo através da
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PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) de regiões do rDNA, que compreendem o ITS1
(Internal transcribed spacer 1), 5.8S e ITS2 (Internal transcribed spacer 2), específicas do P.
brasiliensis (THEODORO et al., 2005a). A técnica molecular empregada se mostrou eficaz
na detecção do DNA do patógeno em tocas de tatu, infectados naturalmente pelo fungo.
Por apresentar temperatura corporal e imunidade relativamente baixa (PURTILO
et al., 1975; ULRICH et al., 1976), o tatu parece favorecer o desenvolvimento de certas
doenças infecciosas, podendo ter desempenhado um importante papel na evolução do P.
brasiliensis à condição zoofílica (adaptada ao tecido animal) (BAGAGLI et al., 1998), o que
explica o estabelecimento de lesões crônicas nos hospedeiros e a baixa produção de
conídios (MCEWEN et al., 1987), o que talvez justifique o difícil isolamento ambiental
deste fungo em sua fase saprofítica (FRANCO et al., 2000).
Os isolados de tatus apresentam significativa diversidade em relação à virulência
(SANO et al., 1999; HEBELER-BARBOSA et al., 2003a, 2003b). Hebeler-Barbosa et al
(2003a; 2003b) caracterizaram a biodiversidade de isolados de P. brasiliensis de tatus,
comparando-os com isolados clínicos da região endêmica de Botucatu, com relação aos
diferentes perfis de virulência, através de inoculação animal (hamsters), padrão de RAPD e
sequenciamento da região de ITS rDNA 5.8S. Através da inoculação animal e contagem de
UFC (unidades formadoras de colônias), foi possível caracterizar os isolados quanto à
virulência (muito alta, alta, intermediária e baixa). Apesar de não fornecer uma correlação
clara com os perfis de virulência, o padrão de RAPD mostrou que os isolados de tatu
provenientes de uma mesma área geográfica são mais similares entre si do que isolados
provenientes de áreas distantes uma das outras. Este dado parece ser bastante preciso, visto
que estes animais possuem uma “home range” pequena (LOUGHRY & MCDONOUGH,
1998), locomovendo-se em trilhas relativamente constantes no interior de pequenas matas
de galerias (TABER, 1945, TAMAGE & BUCHANAN, 1954), não tendo hábito migratório
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como no caso dos seres humanos. Com relação ao seqüenciamento da região ITS1, 5.8S e
ITS2, enquanto o gene 5.8S apresentou-se altamente conservado, tanto entre os diferentes
isolados como entre P. brasiliensis e Blastomyces. dermatitidis, a região ITS apresentou-se
significativamente variável entre as duas espécies. Apesar de relativamente conservada
entre os diferentes isolados de P. brasiliensis, tal região mostrou algumas variações, como
por exemplo, o isolado T10B1, que apresentou maior variabilidade em relação aos demais,
tendo uma substituição no ITS1 e duas no ITS2.
Análises comparativas das seqüências da região ITS e também do gene codificador
da glicoproteína antigênica GP43, confirmam a similaridade entre os isolados clínicos e de
tatus (HEBELER-BARBOSA et al., 2003b), indicando que tanto o homem quanto os tatus
estão se infectando pelos mesmos “ecopatogenotipos” (BAGAGLI et al., 1998; FRANCO et
al., 2000; RESTREPO et al., 2000). A caracterização molecular dos isolados de tatu e sua
comparação com os isolados clínicos pode ser de grande utilidade no mapeamento de
genótipos do P. brasiliensis que estão causando infecções humanas.
Além da espécie D. novemcinctus, o fungo também foi isolado do tatu Cabassous
centralis, em Caldas, Colômbia, indicando que outras espécies além do tatu-galinha também
podem estar infectadas com o patógeno (Corredor et al., 2005).
Recentemente foram relatados dois casos de PCM em cães (RICCI et al., 2004,
FARIAS et al., 2005), sendo obtida cultura fúngica apenas para o segundo caso. O isolado
foi caracterizado molecular e morfologicamente (BOSCO et al., 2005). Este achado é de
grande importância para o estudo epidemiológico da PCM, pois representa o primeiro
isolamento de P. brasiliensis de um animal doméstico, cujo contato com humanos é
infinitamente superior se comparado com animais silvestres. Além disso, isolados
provenientes de cães são importantes candidatos para estudos filogenéticos, já que estes
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mamíferos, comparados aos tatus, representam uma condição ambiental distinta, a começar
pela temperatura corporal superior, que pode variar de 37,5 a 39°C.
I.2 P. brasiliensis: uma só espécie?
Trabalhos recentes demonstraram que a variabilidade genética do P. brasiliensis
pode ir além de um simples polimorfismo intraespecífico, caracterizando a presença de
espécies crípticas, ou seja, espécies em divergência cujos caracteres fenotípicos até então
conhecidos não são suficientes para distingui-las (FUTUYAMA, 2002). Matute et al (2006)
analisaram seqüências de DNA de oito regiões a partir de cinco genes nucleares
codificadores (quitina sintase, β-glucana sintase, fator adenil de ribosilação, α-tubulina e
PbGP43). Foram estudados 65 isolados de P. brasiliensis, abrangendo seis áreas endêmicas
de PCM. Através da análise por concordância de genealogia de genes foi possível detectar
três espécies crípticas: S1, encontrada no Brasil, Argentina, Paraguai, Peru e Venezuela;
PS2, encontrada no Brasil e Venezuela e PS3, encontrada apenas na Colômbia. S1 e PS2 são
simpátricas, portanto a divergência genética entre as duas sugere a existência de uma
barreira não geográfica ao fluxo gênico.
Espécies crípticas também já foram detectadas, por concordância de genealogias
de genes, em outros fungos patogênicos dimórficos como, por exemplo, Coccidioides
immitis (separado em duas espécies sexuadas, C. immitis e C. posadasii segundo a
concordância de 3 genealogias de genes) (KOUFOPANOU et al., 2001) e Histoplasma
capsulatum (separado em 7 espécies filogenéticas mais 1 espécie da Eurasia que emergiu do
clado da América do Sul, grupo A, segundo a concordância de quatro genealogias de genes)
(KASUGA et al., 1999, 2003).
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O reconhecimento filogenético de espécie, aplicado nos trabalhos acima citados,
parece ser a forma ideal para diagnosticar espécies crípticas. Sabe-se que o reconhecimento
morfológico de espécie, ainda o mais usado para diagnosticar espécie em fungos, pode
englobar em um só grupo espécies que na verdade diferem geneticamente podendo estar até
mesmo isoladas reprodutivamente. Já o reconhecimento biológico de espécie, cujo critério é
a capacidade de intercruzamento, além de apenas ser aplicável às espécies sexuadas, incorre
em um conflito entre fluxo gênico real e fluxo gênico potencial. O reconhecimento
filogenético de espécie, por sua vez detecta divergência genética e passa a ser o método
mais efetivo de definição de espécie em microrganismos, uma vez que muitos caracteres
podem diferir entre duas espécies antes mesmo da perda do potencial de intercruzamento.
Entretanto, adquirir seqüências de vários loci com variação genética suficiente para detectar
espécies filogenéticas pode ser extremamente trabalhoso, tornando o uso de marcadores
hipervariáveis (moleculares e/ou morfológicos) atrativo para um rápido reconhecimento das
diferentes espécies crípticas (TAYLOR et al., 2000).
Sabe-se que nas espécies crípticas de H. capsulatum pode-se detectar diferenças
morfológicas e fisiológicas entre isolados pertencentes às diferentes espécies (KASUGA et
al., 2003). No caso do Coccidioides, observou-se que a espécie C. posadasii cresce mais
lentamente em meio contendo alta concentração de sais quando comparada com a espécie C.
immitis, porém este fenótipo não é usado como diagnóstico (FISHER et al., 2002).
Em P. brasiliensis, existem muitos fenótipos variáveis, como crescimento, aspecto
de colônia miceliana, produção de conídios, transição micélio/levedura, microscopia
leveduriforme (brotamentos, forma e tamanho das células, etc), virulência, termotolerância,
entre outros (THEODORO et al., 2005b). Porém nenhum estudo comparativo e de
agrupamento foi feito, utilizando-se de dados morfológicos, clínicos e ecológicos,
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associados aos moleculares, de forma a melhor organizar e compreender a existência e o
significado de toda a variabilidade fenotípica e genotípica observada.
I.3 P. brasiliensis: virulência e dimorfismo
Além da caracterização molecular, outros estudos, com enfoque em caracteres
morfológicos vêm sendo realizados (MACORIS et al., 2006) a fim de correlacioná-los com
caracteres de virulência. Neste estudo, realizado em nosso laboratório, foram observadas
variações fenotípicas entre as colônias miceliais do P. brasiliensis com relação a caracteres
como curva de crescimento, presença de setores (possível indicativo de rearranjos
cromossomais e recombinação mitótica) diâmetro e textura da colônia (frente e verso). Foi
observada grande variabilidade fenotípica entre os isolados e também em um mesmo
isolado (o isolado Bt84 possui colônias de textura algodonosa e glabra). Tal fenômeno em
Candida albicans e Cryptococcus neoformans é tido como um fator de virulência (SOLL,
1992; LACHKE et al., 2002; FRIES et al., 2002).
Tais variações fenotípicas, tanto inter como intra isolados mostram grande
plasticidade deste patógeno, tal plasticidade pode estar associada á adaptação á diferentes
ambientes pelo fungo. No caso do P. brasiliensis como dos demais fungos dimórficos
patogênicos a mudança do saprofitismo para o parasitismo incorre em inúmeras mudanças
ambientais, já que o hospedeiro promove condições de crescimento diferente das do
ambiente saprofítico, a começar pelo aumento de temperatura, influências hormonais e
resposta do sistema imune (KUROKAWA et al., 1998). Dessa forma, as variações
fenotípicas poderiam ser essenciais para a adaptação ao parasitismo, promovendo a
emergência de variantes capazes de escapar dos mecanismos de defesa do sistema
imunológico do hospedeiro (FRANZOT et al., 1998).
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Alguns caracteres fenotípicos são considerados fatores de virulência em fungos
causadores de micoses sistêmicas, graças a esses fatores, alguns fungos, tais como os fungos
dimórficos apresentam grande habilidade para crescer em condições adversas impostas
pelos seus hospedeiros, sendo estas características resultantes da interação patógeno-
hospedeiro (BULMER & FROMTLING, 1983; HOGAN et al., 1996). Sendo assim os
padrões de virulência de diferentes patógenos poderiam ser considerados frutos de uma
seleção natural resultante da interação entre os dois genótipos, o do patógeno e do
hospedeiro (LEDERBERG, 1999).
Porém, muitos caracteres considerados fatores de virulência e patogenicidade em
fungos dimórficos, como Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix
schenckii e Cryptococcus neoformans, podem ter se originado no meio saprofítico (em geral
solo), através da interação destes patógenos com microrganismos fagocíticos predadores.
Hoje, tais caracteres apresentam papéis distintos durante o saprofitismo e durante o
parasitismo. A idéia de que os fatores de virulência tenham surgido em meio saprofítico
também é sustentada pelo fato de que estes fungos patogênicos dimórficos não necessitam
de seu hospedeiro endotermo para sua sobrevivência, o encontro com este hospedeiro teria
sido acidental e os fatores de virulência já estariam “prontos” (“ready-made virulence”)
(CASADEVALL et al., 2003 e STEENBERGEN et al 2003; 2004). Apesar do animal não
ser indispensável para o ciclo de vida do fungo, ele exerce importante papel na história
evolutiva do mesmo devido sua importância como agente carreador e amplificador de
variabilidade genética do patógeno (BAGAGLI et al., 2006).
Os conceitos de patogenicidade e virulência foram muito bem trabalhados por
Casadevall & Pirofski (1999). Nesta revisão, patogenicidade é tida como a capacidade do
patógeno em causar danos ao seu hospedeiro e virulência como a capacidade relativa de
causar danos; relativa pois a doença depende não só dos fatores de virulência do patógeno
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15
como também da resposta do sistema imunológico de seu hospedeiro. Os autores criaram
seis classes de patógenos com base na virulência do microrganismo e na resposta
imunológica. Ao que tudo indica, o P. brasiliensis pertenceria à classe 3, na qual os
microrganismos causam doença devido tanto à mecanismos de virulência (proliferação das
leveduras para diversos órgãos) como por mecanismos imunológicos do hospedeiro
(inflamação crônica).
No caso de fungos patogênicos, pode-se considerar como fatores de virulência
alguns componentes da parede celular como, por exemplo, o
-(1,3)-glucan (SAN-BLAS &
VERNET, 1977); moléculas de adesão aos tecidos do hospedeiro (VARTIVARIAN, 1992),
observadas em leveduras de P. brasiliensis, bem como em outros fungos dimórficos como
B. dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans (JIMENEZ-LUCHO
et al., 1990; KLEIN et al., 1993); produção de enzimas como proteinases, lípases e
fosforilases, importantes para a nutrição e invasão do fungo nos tecidos (ODDS, 1985;
RUCHEL, 1986). Em P. brasiliensis, por exemplo, foi verificado que uma fração da
glicoproteína GP43 possui atividade proteolítica sobre o colágeno, elastina e caseína
(MENDES-GIANINNI et al., 1990).
A glicoproteína imunodominante GP43 trata-se de um antígeno reconhecido pelo
soro da maioria dos pacientes com PCM (PUCCIA et al., 1991). Conforme o paciente
responde ao tratamento os títulos de anticorpos anti GP43 diminuem. Esta glicoproteína é
tida como fator de virulência devido a sua propriedade adesina (VICENTINI et al., 1994).
MORAIS et al (2000) observaram grande polimorfismo do gene codificador da GP43 entre
diferentes isolados. O mesmo foi observado por Matute et al (2006), indicando uma seleção
Darwiniana Positiva sobre esta seqüência, ou seja, mutações não se mostram desfavoráveis,
mas pelo contrário, são mantidas na população. Especula-se que as mudanças expressas
neste gene são rapidamente fixadas devido ao fato de que antígenos de superfície de
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16
parasitas tendem a sofrer Seleção Positiva mais forte do que outros genes, podendo resultar
em um escape ao reconhecimento imunológico do hospedeiro (KOUFOPANOU et al.,
2001).
Receptores para hormônios também são considerados fatores de virulência,
sugerindo a influência de um metabolismo (do hospedeiro) sobre o outro (do patógeno)
(FELDMAN et al., 1982). Sabe-se que o crescimento do fungo dimórfico Coccidioides
immitis pode ser estimulado por hormônios como testosterona e progesterona e inibido por
seus precursores (ergosterol e colesterol) (DRUTZ & HUPPERT, 1983; DRUTZ et al.,
1981). Uma evidência de que os hormônios podem afetar o padrão de virulência do P.
brasiliensis é a inibição da transição de micélio para levedura por hormônios femininos
(estrógenos) (ARISTIZABAL et al., 1998).
Com relação à transição micélio-levedura, os fatores termo tolerância e
dimorfismo também são considerados fatores de virulência (KUROKAWA et al. 1998). A
habilidade de se reproduzir a 37°C parece ser comum entre os fungos patogênicos
dimórficos, como em C. neoformans, H. capsulatum e Sporothrix schenckii. Foi observado
que maioria dos isolados de C. neoformans var. gatii, que não crescem de maneira eficiente
a 37°C não são capazes de produzir infecção fatal em ratos (KWON-CHUNG, 1979;
RHODES, 1988). Cepas de baixa virulência de H. capsulatum levam um tempo maior para
o processo de transição micélio-levedura do que aquelas cepas mais virulentas, nas quais a
transição se dá de forma mais rápida (MEDOFF et al., 1986). Pequenas diferenças de
tolerância térmica poderiam desempenhar um importante papel no potencial patogênico do
fungo. O dimorfismo (dependente de temperatura e/ou nutrientes) também facilitaria a
instalação e dispersão do fungo nos diferentes tecidos do hospedeiro (KUROKAWA et al.
1998). No caso do P. brasiliensis, além da variável temperatura, fatores nutricionais
também podem influenciar a transição micélio-levedura (VILLAR et al., 1988).
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17
Durante a transição de micélio para levedura em P. brasiliensis, ocorrem inúmeras
mudanças morfológicas que se devem á inibição e indução de determinadas proteínas (DA
SILVA et al., 1994). A identificação das alterações moleculares durante os estágios iniciais
da diferenciação celular pode ser importante para a caracterização de proteínas que
provavelmente estão relacionadas ao dimorfismo. Sabe-se, por exemplo, que ocorre um
aumento na produção de proteínas de 71 e 72Kda nos isolados Pb01 e Pb166 durante a
transição de micélio para levedura (SALEM-IZACC et al., 1997). Existem diferentes
proteínas sendo produzidas durante as duas fases (micelial e leveduriforme) do P.
brasiliensis, sendo interessante notar que a produção destas proteínas pode variar dentre
diferentes isolados. Neste mesmo trabalho observou-se certa variação morfológica entre os
isolados durante a fase leveduriforme (Pb18, Pb166 e Pb2052 apresentaram células
alongadas com brotamentos, Pb113 e Pb 662 apresentaram, mesmo à temperatura de 36°C,
filamentos similares ao micélio). Esta variação também foi observada na síntese de
diferentes proteínas a 36°C, sendo proposto um dendograma.
Outros estudos bastante avançados, como transcriptoma, vêm sendo realizados na
tentativa de identificar genes expressos durante as duas fases morfológicas do P.
brasiliensis (FELIPE et al., 2003 GOLDMAN et al., 2003). Além de identificarem genes de
virulência homólogos a alguns genes de Candida albicans, identificaram vários genes que
poderiam desenvolver papel importante no termodimorfismo, mais especificamente na
transição de micélio para levedura, como por exemplo, genes envolvidos na síntese da
quitina, constituinte da parede celular cuja produção aumenta na fase leveduriforme
(BORGES-WALMSLEY et al. 2002; GOLDMAN et al., 2003). A expressão de genes
codificadores de proteínas de choque térmico (HSP) também foi estudada, sendo
identificado certa similaridade com os genes hsp de S. cerevisiae (GOLDMAN et al., 2003).
Neste trabalho estudou-se de forma comparativa a produção de HSPs (HSP70, 82 e 104)
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18
durante a transição micélio-levedura e levedura-micélio, sendo que para o primeiro processo
houve um aumento da expressão destes genes 5 horas após o aumento de temperatura, para
o segundo processo a expressão caiu subitamente entre 5 e 10 horas após a diminuição da
temperatura, tendo um pequeno aumento após 24 horas. De maneira geral estes genes
parecem ser mais expressos na fase leveduriforme do que na micelial, desempenhando um
importante papel durante a transição. Isso foi também observado por Da Silva et al (1999)
que registraram uma expressão diferencial do gene hsp70 em micélio e levedura,
observando um processamento (“splicing” dos dois introns) mais eficiente do RNA
mensageiro em leveduras, o que explicaria a maior produção da proteína nesta forma do que
em micélio.
Frente a esses dados, conclui-se que genes hsp devem desempenhar importante
papel para o dimorfismo e termotolerância que, como já descrito, são fatores de virulência
essenciais nas mudanças adaptativas necessárias para garantir a sobrevivência do patógeno
no tecido de seu hospedeiro homeotermo, sejam tatus ou seres humanos (FRANCO, 1987).
I.4 Proteínas do Choque Térmico
As proteínas do choque térmico estão presentes em todos os organismos, desde
bactérias e leveduras até seres humanos. Elas ocorrem em várias formas e são categorizadas
em famílias de acordo com seu peso molecular. Há fortes evidências de que as HSPs
desempenham papéis fisiológicos importantes tanto em condições normais como em
situações de estresses térmicos ou químicos. As HSPs estão presentes em procariotos e
eucariotos e seu alto nível de conservação sugere o desempenho de um papel essencial no
processo celular (KREGEL, 2002).
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19
As HSPs foram primeiramente descobertas em larvas de D. melanogaster
(RITOSSA, 1962) expostas a um choque térmico e, nos últimos 30 anos, um grande número
de proteínas de choque térmico vêm sendo descritas nos mais diversos organismos.
A massa molecular das HSPs varia de aproximadamente 15 a 110KDa, sendo
divididas em grupos conforme seu tamanho e função. Elas estão presentes no citoplasma,
mitocôndria, retículo endoplasmático e núcleo. Estas localizações variam conforme a
proteína.
Algumas dessas HSPs, hoje também conhecidas como chaperonas moleculares,
possuem sua estrutura altamente conservada tanto nas células procarióticas como
eucarióticas. A principal função dessas chaperonas é catalisar o dobramento de outras
proteínas, para que elas adquiram conformação tridimensional tornando-se proteínas
funcionais, além de estabilizar proteínas durante seu transporte para diferentes organelas.
Por exemplo, as proteínas da família HSP70 estabilizam cadeias polipeptídicas não
dobradas durante a tradução e durante o transporte para mitocôndria e retículo
endoplasmático, prevenindo a agregação da cadeia polipeptídica, já membros da família das
HSP60 facilitam o dobramento da cadeia polipeptídica. Em E. coli, estas duas proteínas
parecem ter ações seqüenciais (primeiramente a proteína recém sintetizada no ribossomo é
estabilizada pela HSP70 para depois ser transferida para a HSP60 dentro da qual ocorre o
dobramento protéico) (COOPER, 2002).
A família HSP70 comporta várias chaperonas moleculares com duas regiões
conservadas, a região ATPase N-Terminal e o domínio C-terminal de ligação à proteína. Em
muitos organismos a HSP70 constitui uma grande família de proteínas que podem ser
encontradas na maioria dos compartimentos da célula eucariótica. A HSP70 se liga às
pequenas regiões hidrofóbicas de polipeptídeos não dobrados, prevenindo sua agregação.
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20
Elas também dão assistência a certas proteínas, ajudando no dobramento de forma
dependente de ATP (NICOLA et al., 2005).
A família HSP70, considerada a mais sensível ao aumento de temperatura, é uma
das HSPs mais conservada, demonstrando cerca de 60-80% de identidade dentre células
eucarióticas (BARDWELL & CRAIG, 1984; LINDQUIST, 1986).
Em Saccharomyces cerevisiae, HSP70s citosólicas são de extrema importância
para o ciclo celular (GILBERT et al., 2003). De fato estas proteínas desempenham
importante papel no desenvolvimento celular, por estabilizarem produtos de proteínas de
genes que são “ligados ou desligados” durante a diferenciação celular, que no P.
brasiliensis, se dá no período de transição de micélio para levedura (DA SILVA et al.,
1999).
Em P. brasiliensis, a família HSP70 foi a mais estudada, com quatro membros já
descritos. O gene hsp70 codifica uma HSP70 citosólica ortóloga e similar às proteínas Ssa
de S. cerevisiae. São tidas como ortólogas pois se tratam de cópias do mesmo gene, do
mesmo locus, e não de genes também homólogos e produzidos por duplicação gênica porém
localizados em loci diferentes (parálogos). Dois outros genes hsp70 foram caracterizados
por Florez et al (2003). Outra HSP70 descrita em P. brasiliensis foi a HSP 87-kDa, cuja
expressão era induzida pelo choque térmico a 42ºC ou durante a transição M-L. Esta HSP
foi primeiramente reconhecida como alvo específico para anticorpos monoclonais contra
HSP80 de H. capsulatum. Apesar do peso molecular diferente, o sequenciamento direto da
cadeia de aminoácidos mostrou alta similaridade com HSP70 (DIEZ et al., 2002, 2003).
Estudos sobre a expressão da HSP70 de H. capsulatum foram feitos em isolados
com diferentes níveis de patogenicidade e termotolerância. Observou-se que o gene é mais
expresso durante a fase leveduriforme do fungo (a 36°C) e que os baixos níveis de
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21
transcrição deste gene poderiam estar associados à alta sensibilidade à temperatura e baixos
padrões de virulência (CARUSO et al., 1987).
A expressão diferencial do gene codificador da proteína HSP70 também foi
estudada em P. brasiliensis. Técnicas de western blot comprovaram uma maior produção da
proteína na levedura do que no micélio. A proteína foi seqüenciada e comparada às HSPs70
de outros organismos, apresentando 89,2% de similaridade com a HSP70 de H. capsulatum,
73,6% com a de Blastocladiella emersonii (fungo aquático), 73,3% com a de S. cerevisiae e
63,9% com a de seres humanos. A seqüência de DNA do gene permitiu a identificação de
dois introns e o estudo do processamento do RNA mensageiro durante o aumento de
temperatura, através de RT-PCR, mostrou um processamento mais eficiente do mesmo
durante a fase leveduriforme (36 - 42ºC), na qual o “splicing” destes introns parece ser mais
eficaz do que na fase micelial (25 - 36ºC) (DA SILVA et al., 1999).
A importância das HSPs durante o “splicing” de RNA mensageiro já foi ressaltada
anteriormente em D. melanogaster (YOST & LINDQUIST, 1986 e 1988), na qual a
expressão do gene hsp82 (gene que contém introns) é reduzida devido ao não “splicing” do
RNA em altas temperaturas. Outros genes hsp que não possuem introns não tiveram sua
expressão alterada. O bloqueio do “splicing” em altas temperaturas também foi observado
para genes não pertencentes às famílias HSP de D. melanogaster.
Em S. cerevisiae o “splicing” de precursores RNA mensageiro também é
prejudicado pelo aumento de temperatura. Estudos indicam um grande grau de
especialização das funções protetoras das HSPs, algumas delas, como membros da família
HSP70 e HSP82, ajudam a manter normal o processo celular em altas temperaturas, outras
como as HSP104, facilitam a recuperação do processo de “splicing” uma vez que este foi
rompido pelo choque térmico. (YOST & LINDQUIST, 1991).
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22
I.5 Importância imunológica das HSPs
Além da significativa importância para a fisiologia celular, essas proteínas também
apresentam grande importância imunológica, sendo capazes de induzir respostas pró-
inflamatórias.
As HSPs são, tradicionalmente, tidas como moléculas intracelulares, liberadas das
células em condições de necrose e morte celular. Porém essas proteínas podem ser
encontradas na circulação de indivíduos normais (TSAN & GAO, 2004).
As HSPs 60, 70 e 90 são frequentemente associadas com autoimunidade,
apresentação de antígenos e imunidade inata. As HSPs bacterianas (60 e 70), por exemplo,
são consideradas altamente imunogênicas devido à ativação de células T (ZUGEL &
KAUFMAN, 1999a). Porém os anticorpos produzidos e as células T também acabam
reconhecendo HSP 60 e 70 de mamíferos, indicando reação cruzada e implicações em
processos autoimunes (KISSLING et al. 1991).
As HSPs citosólicas, como a 70 e 90, se ligam a peptídeos antigênicos, gerados
dentro das células, e fazem parte da via endógena de apresentação de antígenos pelo MHCI
(Complexo de Histocompatibilidade Principal de Classe I) (TSAN & GAO, 2004).
As HSPs também são tidas como ativadoras do sistema imune inato. Preparações
de HSPs induzem a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como, TNF alfa,
Interleucinas 1, 6 e 12, bem como a liberação de óxido nítrico e quimiocinas por monócitos,
macrófagos e células dendríticas (TSAN & GAO, 2004).
As HSPs podem estar presentes no meio extracelular e a reação a estas proteínas
não necessariamente reflete resposta inflamatória adversa, sendo que a reação contra as
próprias HSP pode regular o processo patogênico, sugerindo um importante papel das HSPs
como agentes terapêuticos. De fato o sistema imune reage contra antígenos próprios. Esta
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23
auto-imunidade natural é benigna e é restrita a poucos antígenos, dentre os quais se
destacam as HSPs. Recentemente, o uso de HSPs vem sendo estudado no tratamento de
doenças autoimunes, como por exemplo, o uso da HSP60 no tratamento da diabetes tipo 1
(SCHWARTZ & COHEN, 2000). Segundo estes autores, a auto-imunidade pode beneficiar
o equilíbrio e manutenção do próprio (“self”). Assim, o tratamento de uma doença auto-
imune deve consistir em ativação (por vacinas, por exemplo) dos mecanismos regulatórios
ao invés de suprimir os clones auto-imunes. A vacinação ativaria o sistema imune a
controlar seus próprios clones auto-imunes (COHEN, 2002).
As HSPs vêm sendo frequentemente reconhecidas como antígenos
imunodominantes em processos infecciosos. Isto surpreendentemente contraria o conceito
de que a resposta imune é primariamente dirigida contra antígenos microbianos específicos
(BURNIE et al. 2006). Sabe-se, por exemplo, que proteínas das famílias HSP60 e HSP70
são moléculas imunodominantes importantes na resposta imune contra microrganismos, elas
atuam como proteínas imunomoduladoras e de sinalização intercelular, tendo efeitos
imunológicos como secreção de citocinas. A HSP60, por exemplo, parece induzir o
aumento da produção de IL-1
, IL-6, IL-12 e IL-15, bem como o aumento de produção de
IL-6 por células endoteliais vasculares e em células musculares de rato (POCKLEY, 2001).
HSPs70 são consideradas importantes fatores alergênicos em Malassezia sympodialis
(ANDERSON et al., 2004), e importantes antígenos em muitos outros patógenos
(MARESCA & KOBAYASHI, 1994).
Em um processo infeccioso, tanto as células do patógeno como as do hospedeiro
passam por alterações dramáticas. O aumento de temperatura e a resposta imune são fatores
prejudiciais para o patógeno, sendo que a síntese de HSPs é essencial para a sobrevivência
do mesmo. Partes destas proteínas provenientes do patógeno são apresentadas por células do
hospedeiro, promovendo o reconhecimento de células infectadas pelo sistema imune.
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24
Embora o exato papel das HSPs na imunidade à infecções microbianas não esteja
completamente clara, as HSPs, aparentemente, servem como importantes antígenos na
defesa contra agentes infecciosos. De fato, a resposta imune às HSPs tem sido observada em
doenças infecciosas produzidas por bactérias, protozoários, fungos e nematóides (ZUGEL &
KAUFMAN, 1999b). Evidentemente, devido a sua alta conservação dentre os vários
microrganismos patogênicos, as HSPs são consideradas antígenos principais, sendo capazes
de produzir imunidade humoral e celular em várias infecções.
Pelo menos dois fatos contribuem para a antigenicidade das HSPs: primeiro, estas
proteínas são abundantes nos patógenos, especialmente sob condições de estresse e
segundo, a memória imunológica para a ocorrência de reações cruzadas é gerada durante a
vida do hospedeiro, conforme o contato e constante re-estimulação do sistema imune com
microrganismos de diferentes graus de virulência. Sendo assim, a infecção de um indivíduo
com um patógeno virulento permitiria que o sistema imune, previamente preparado,
reagisse mais rapidamente, antes mesmo de ocorrer uma resposta à antígenos
verdadeiramente espécie-específicos (ZUGEL & KAUFMAN, 1999b).
Esta importância imunológica pode ser de grande utilidade para o
desenvolvimento de vacinas. Um exemplo desta aplicação foi o desenvolvimento de uma
vacina de DNA, usando o gene do choque térmico hsp65, contra tuberculose (LIMA et al.,
2003).
GOMEZ et al (1995) deduziram a seqüência de aminoácidos da proteína HIS-62
(uma glicoproteína de parede e membrana celular) de H. capsulatum e observaram
similaridade de 70 e 50%, entre a HSP60 de S. cerevisiae e E. coli respectivamente,
considerando a HIS-62 como um membro das HSP60. Após o isolamento de um fragmento
do gene por PCR, o mesmo foi clonado em E. coli, sendo que a proteína recombinante
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25
exerceu atividade imunológica similar, se não idêntica, à proteína nativa, conferindo
proteção contra a infecção intranasal com células leveduriformes de H. capsulatum.
Estudos de resposta celular imune contra H. capsulatum também foram realizados
com a HSP70 recombinante. A seqüência deduzida de aminoácidos do gene mostrou,
respectivamente, similaridade de 71 e 76% com HSP70 de humanos e S. cerevisiae. A
proteína recombinante induziu, em ratos, resposta imune celular, mas não promoveu
resposta imune protetora.
Bisio et al (2005) clonaram, caracterizaram e expressaram em E.coli um cDNA
membro da família HSP70 de P. brasiliensis. A proteína recombinante reagiu com anticorpo
policlonal de coelho contra HSP70. Experimentos de western immunoblot demonstraram
que o soro de pacientes com paracoccidioidomicose reconhece a proteína recombinante
purificada. A análise de antigenicidade da HSP70 detectou três peptídeos internos que
poderiam agir como ativadores de proliferação de células T.
Thomas et al (1997) clonaram, sequenciaram e expressaram uma HSP60 de C
immitis. A proteína recombinante foi utilizada para imunizar camundongos, demonstrando
um aumento na proliferação de células T.
Com relação ao gene hsp60 de P. brasiliensis, já foram realizadas clonagem,
caracterização e expressão da proteína por ele codificada. A proteína recombinante reagiu
com anticorpo monoclonal (contra HSP60 de humano) de rato. Experimentos de western
imunoblot demonstraram que tanto a proteína HSP60 nativa como a recombinante são
reconhecidas pelo soro de pacientes com paracoccidioidomicose (IZACC et al., 2001).
Outros estudos demonstraram a ausência de reação cruzada desta proteína recombinante
com o soro de pacientes com aspergilose, esporotricose, criptococose e tuberculose. A
reação foi observada no soro de 9,52% do controle de indivíduos sadios e em 11,5% dos
pacientes com histoplasmose. A alta sensibilidade e especificidade para HSP60 sugerem que
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26
a proteína recombinante pode ser usada associada ou não com outros antígenos
recombinantes para a detecção de anticorpos contra P. brasiliensis em indivíduos infectados
(CUNHA et al., 2002).
I.6 Uso de genes hsp70 em inferências filogenéticas
Como as HSPs, em especial as da família HSP70, se mostram altamente
conservadas, elas vêm sendo usadas em inferências filogenéticas entre grandes grupos,
como por exemplo archaebacteria, eubacteria e eucariotos. Segundo a análise de genes
ribossomais cada um destes três grupos são tidos monofiléticos e distantes uns dos outros.
Adicionalmente, árvores filogenéticas de famílias de genes duplicados sugeriram que a
célula eucariótica tenha evoluído a partir de um ancestral de archaebacteria. Porém estas
hipóteses não parecem ser sustentadas pela análise de seqüências protéicas altamente
conservadas, como por exemplo, a HSP70, cujo estudo comparativo para estes 3 grupos
revelou agrupamento filogenético de archaebacteria com eubacteria Gram-positivas,
enquanto que seqüências eucarióticas se mostraram mais próximas de eubactérias Gram-
negativas (GUPTA & SINGH, 1994).
Análises filogenéticas da HSP70 também sustentam a hipótese de origem
monofilética dos metazoários, bem como reforçam a relação de proximidade filogenética
entre fungos e animais (BORCHIELLINI et al., 1998).
Apesar de genes conservados, como os codificadores das HSPs, serem
amplamente usados em análises filogenéticas de organismos distantes, um fator limitante
deste uso é a paralogia (MARTIN & BURG, 2002). Sabe-se que famílias de genes
evoluíram através de uma série de duplicações gênicas, portanto o uso do termo homologia
para estes casos se torna um tanto grosseiro. É necessário diferenciar os genes destas
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27
famílias em ortólogos e parálogos. Genes ortólogos, em um conjunto de duplicatas, são duas
cópias do mesmo gene, do mesmo lócus; genes parálogos são dois genes, também
homólogos, porém em loci diferentes. Inferências filogenéticas devem ser baseadas em
genes ortólogos, mas pode haver perda de genes ao longo da evolução e erroneamente genes
parálogos são comparados, quando isso ocorre, a árvore gênica ou genealogia de genes
difere da árvore de espécies (filogenia) (RIDLEY, 2006).
O uso do gene hsp70 para inferências filogenéticas nem sempre se mostra similar
às inferências baseadas em outros genes. Segundo um estudo realizado com diferentes
grupos de tubarões, embora o alto grau de conservação do hsp70 faça deste gene um
importante candidato para uso em análises filogenéticas e evolutivas, ganhos e perdas de
genes individuais ao longo do tempo evolutivo aumenta a chance de que genes amostrados
sejam parálogos, comprometendo a filogenia (MARTIN & BURGO, 2002).
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28
II Proposta do projeto de mestrado
Tendo as informações acima referidas, juntamente com os dados de variações de
virulência entre os diferentes isolados de P. brasiliensis, é de essencial importância o
entendimento a respeito da relação que a expressão de genes do choque térmico pode ter
com os diferentes padrões de virulência, bem como com os diferentes perfis de dimorfismo,
observados em nosso laboratório. Estes genes poderiam ser expressos de maneira diferencial
entre os diferentes isolados (clínicos e provenientes de tatus)?
Além da virulência, outras características que também variam dentre os isolados
são a morfologia e a temperatura de transição morfológica. Theodoro et al (2002),
estudando a morfologia microscópica de 15 isolados de P. brasiliensis, em nosso
laboratório, durante a diminuição de temperatura de 36°C para 25°C (o fungo foi
primeiramente mantido a 36ºC em fase leveduriforme, após quinze dias foi feito um novo
cultivo diminuindo-se a temperatura para 35ºC, e assim sucessivamente até 25ºC),
observaram ampla variação morfológica entre os isolados a 36ºC (fase leveduriforme) e
diferentes respostas à diminuição de temperatura. As características analisadas para tal
comparação foram: tamanho e formato das células (alongado ou arredondado) e presença de
brotamentos. Um fator importante e bastante variável entre as cepas foi a temperatura em
que cada uma passava da fase leveduriforme para a micelial. A maioria dos isolados
começou a apresentar formação de hifas entre as temperaturas de 30 a 28ºC, sendo que dois
extremos foram observados: o isolado Bt85, já apresentava hifas a 33ºC, e o isolado
T13LN1 que começou sua transformação a 27ºC.
Essa diversidade morfológica e de virulência poderia ter alguma relação com
termotolerância e conseqüentemente com a produção de proteínas do choque térmico? Se
sim, a variação estaria presente na seqüência de nucleotídeos do gene? Ou então a variação
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29
estaria presente no processamento do RNAm em diferentes temperaturas nos diferentes
isolados, o que poderia refletir em uma maior ou menor expressão gênica?
A fim de elucidar melhor estas questões, o presente projeto de mestrado teve como
objetivo o estudo das variações morfológicas dos diferentes isolados, durante a transição de
micélio para levedura e durante o choque térmico até 42ºC, bem como de suas possíveis
causas moleculares no que diz respeito ao gene hsp70 (sua seqüência parcial e expressão).
O melhor conhecimento da diversidade dos isolados de P. brasiliensis e, em
particular das variações fenotípicas do dimorfismo e sua base genética, poderá ser
importante para um melhor esclarecimento a respeito da disseminação deste patógeno,
podendo de alguma maneira ser correlacionadas à adaptação parasitária aos tecidos de seus
hospedeiros (homem e tatu Dasypus novemcinctus). O estudo da expressão do gene hsp70
de forma comparativa em diferentes isolados pode ser de grande utilidade para trabalhos
que visam o desenvolvimento de vacinas a base de DNA ou proteínas HSPs recombinantes.
Por ser um gene de importante expressão na condição de parasitismo, este estudo
pretendeu elucidar as possíveis relações entre a expressão de genes hsps, em especial o
hsp70, com diferentes perfis de dimorfismo/ termo tolerância e de virulência dos isolados
(dado já obtido em nosso laboratório para alguns dos isolados estudados).
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30
II.1 Objetivos
- Caracterizar morfologicamente os isolados quanto a morfometria de leveduras,
transição micélio-levedura (M-L) (temperatura e tempo de transição) e termo
tolerância;
- estudar a expressão do gene codificador da HSP70 por Real Time RT-PCR;
- analisar o polimorfismo de restrição por PCR – RFLP do gene codificador da
HSP70;
- sequenciar regiões contendo os introns 1 e 2 do gene hsp70,
- comparar os dados morfológicos, fisiológicos e moleculares com os dados de
virulência dos isolados.
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31
III Resumo
O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da
Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este
fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus
novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de
micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de
P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua
relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através
de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram
variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e
morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies
crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados
confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à
termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de
virulência.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, HSP70, expressão, espécies crípticas.
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32
IV Artigo:
Title
Dimorphism, thermo tolerance, virulence and Heat Shock Protein 70 expression
in two cryptic species of
Paracoccidioides brasiliensis
Raquel Cordeiro Theodoro
1
, Sandra de Moraes Gimenes Bosco
1
, Severino Assis da
Graça Macoris
1
, João Pessoa Araújo Jr
1
, João Manuel Grisi Candeias
1
, Luzia Aparecida
Trinca
2
, Ivan de Godoy Maia
3
, Eduardo Bagagli
1
1 Depto. de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências, Unesp-Botucatu
2 Depto. de Bioestatística do Instituto de Biociências, Unesp-Botucatu
3 Depto. de Genética do Instituto de Biociências, Unesp-Botucatu
RCT: raquel@ibb.unesp.br
SMGB: smgbosco@ibb.unesp.br
SAGM: massis@ibb.unesp.br
JPAJr.: jpessoa@ibb.unesp.br
JMGC: candeias@ibb.unesp.br
LAT: ltrinca@ibb.unesp.br
IGM: igmaia@ibb.unesp.br
EB: bagagli@ibb.unesp.br
corresponding autor: Eduardo Bagagli
Depto. de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências de Botucatu –IBB
UNESP-Botucatu
Distrito de Rubião Júnior, s/n
Botucatu-SP-Brasil
CEP: 18618-000
Phone +55 14 3811-6058
Fax +55 14 3815-3744
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33
Abstract
Background: The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the
etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in
Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at
least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast
(M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis,
(including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence
and expression of hsp70 gene.
Results: It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition.
The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates
presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed
arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The
hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70
gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups.
Conclusions: Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence
factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly
related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about
mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for
species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family
that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two
sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil).
Key-words: Paracoccidioides brasiliensis, hsp70 expression, dimorphism and cryptic
species.
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34
Background
P. brasiliensis is the etiologic agent of PCM, the most important systemic mycosis in
Latin America [1]. This pathogen present a thermo dimorphism, at 25°C it grows as mycelia,
producing its infective propagula, and at 36°C as yeast budding cells [2].
This fungus has been frequently isolated from clinical samples and from 9-banded-
armadillo, Dasypus novemcictus [3]. It has recently been isolated in a dog in Curitiba, Paraná
State, Brazil [4]. The isolate was characterized as P. brasiliensis by mycological and
molecular techniques [5].
P. brasiliensis has been considered, for a long time, as a unique biological entity,
mainly because its peculiar microscopic aspects, both in parasitic and culture conditions. This
fact, although well accepted for practical purpose and medical diagnostic, has been
challenged by several evidences. This fungus present many variable phenotypes, such as
growth, mycelia colony, conidia production, mycelia-yeast transition, yeast microscopy
(budding, size and shape of cells), virulence, thermo tolerance, mycelia colony [6, 7] and
clinical manifestation [8]. However, no comparative study was carried out using morphologic
features associated to molecular data.
Recent studies detected cryptic speciation and recombination in P. brasiliensis by
gene genealogies indicating that this fungus consists of at least three distinct, previously
unrecognized species: S1 (Species 1 from Brazil, Argentina, Paraguay, Peru and Venezuela),
PS2 (phylogenetic species 2 from Brazil and Venezuela) and PS3 (phylogenetic species 3
with 21 isolates from Colombia). Two of the three lineages of P. brasiliensis, S1 and PS2, are
sympatric across their range, suggesting barriers to gene flow other than geographic isolation
[9]. Cryptic species have also been detected by gene genealogies in other pathogenic fungi,
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35
such as Coccidioides immitis (separated in two species: C. immitis and C. posadasii) [10] and
Histoplasma capsulatum (separated in at least seven species) [11].
Since the dimorphism and thermo tolerance are variable and important features for the
parasitic establishment of this pathogen, considered as virulence factors, this work aimed to
evaluated different profiles of virulence and mycelia to yeast (M-Y) transition in nine isolates
of P. brasiliensis from at least two cryptic species (S1 and PS2), as well as its relation to the
expression of hsp70 (Heat Shock Protein 70) gene by Real Time PCR.
Heat shock proteins are found in all organisms and their production is increased
during thermal and chemical stresses. These proteins are known as molecular chaperones;
they have a high conserved structure and play an important role on the folding and
transporting of the proteins synthesized into the cell [12].
The expression of hsp genes has been already studied during the M-Y transition in P.
brasiliensis. These proteins are more expressed during the yeast phase than in the mycelia
phase [13, 14] and an accumulation of cDNA of the gene hsp70 containing introns during the
beginning of M-Y transition was observed [15].
The HSPs also present an immunological role in the induction of pro-inflammatory
responses, being frequently considered as immunodominant antigens in infectious diseases
[16] and studied as a target for vaccine development. Bisio et al [17] cloned, characterized
and expressed a hsp70 cDNA of P. brasiliensis. The recombinant protein reacted to
polyclonal antibody of rabbit against HSP70 and was recognized by sera from PCM patients.
Since prophylactic or treatment measures must include, preferentially, all genotypes
and/or phenotypes of P. brasiliensis that cause PCM, the discovery of three cryptic species in
P. brasiliensis, increased the importance of comparative studies in order to detect some
phenotypic differences among the different species. This could have important consequences
in how this pathogen interacts with its host as well as with its saprobe environment.
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36
This article reported some mycological and molecular features, concerning the hsp70
gene, that are variable among different isolates of P. brasiliensis and may be useful for
understanding some evolutionary aspects of this pathogen, such as cryptic species
divergence.
Results
Morphometry of yeast cells at 36°C and M-Y transition: a boxplot graphic of the
area of yeast cells from the nine isolates is presented in figure 1. There was no significant
difference, concerning cell size among the isolates. The isolate Pb-cão showed the largest
area amplitude, containing cells from 4µm
2
to 1200 µm
2
(or 1,6 to 27,6µm of diameter). The
isolates Bt84 and T10 presented yeast cells with elongated buddings (pseudohyphae-like),
instead of the common circular form of the remaining isolates (figure 2). The microscopic
evaluation of the transition is presented on Table 2. The isolates T4 and S1 were the first ones
to convert mycelia to yeast form. The isolate Bt84 showed completed transition only at 36ºC.
Unexpected, it was possible to observe a high conidia production, at 30ºC, for the isolates
Bt85 and S1 (more than 20 conidia per field) and a low production for the isolates T4 and Pb-
cão (5 – 15 conidia per filed). The isolates T10, T13, Bt84, Pb265 and D01 did not produce
conidia at these conditions (figure 3). It was also observed chlamidoconidia during the M-Y
transition (figure 4).
Time for the occurrence of mycelia to yeast transition: a non-parametric analysis of
Krustal-Wallis showed a significant difference between the isolate Bt84 (slow transition) and
the remaining isolates (p<0,005). The isolates D01, Pb265, S1 and T4 presented the most
mycelia fragments converted to yeast on the fourth day after culture, being considered
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37
isolates of fast transition. The isolates Bt85, Pb-cão, T10 and T13 showed an intermediary
transition (Figure 5).
Thermo tolerance: a logistic regression was performed for the data about decreasing of
viability according to the increasing of temperature. The isolates could be divided in two
groups, one containing the isolates Bt84, Bt85, D01 and Pbcão that tended to lose viability
more quickly being less thermo tolerant, and other group containing the isolates Pb265, S1,
T10, T13 and T4, that showed to be more thermo tolerant (Figure 6).
Virulence assays: the data of CFU/g in the testis, spleen and liver were presented in the
figure 7 and table 3. The isolates were classified in high virulence (S1, Pbcão, T13 and T10)
and low-intermediary virulence (BT85, BT84, Pb265 and T4).
PCR and RFLP of hsp70 gene: a PCR fragment of about 2300pb was observed for the
nine isolates in agarose gel (Figure 8). No restriction polymorphism was observed for the
four enzymes used (data not shown).
Partial sequencing of hsp70 gene: 1022 nucleotides were well resolved sequenced for
our nine isolates, corresponding to sites 256-844 (sense sequencing) and 1901-2385,
(antisense sequencing), considering the same positions of the previous deposited sequence by
Da SILVA et al [15] [GenBank: U91560]. It was observed 1 polymorphic informative site in
the intron 1, 2 in the intron 2 and 2 in the exon 2. It was also observed 6 polymorphic non-
informative sites in the exon 2 and 2 in the exon 3 (Table 4). The nine obtained sequences
presented some differences when compared to the sequence deposited at GenBank (from the
isolate Pb01), mainly in the intron 1, where our nine sequences showed 4 large gaps: one of 4
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38
nucleotides, another of 16, another of 23 and another of 21. This last one corresponds to a CT
microsatellite, observed in the deposited sequence. It was also detected a single nucleotide
polymorphism in the anchoring region of the primer HHA, designed for amplification of the
intron 1 by Da Silva et al [15], thus explaining the negative amplification of this intron in our
isolates (data not shown). The Neighbour Joining tree showed a well resolved divergence
between one group containing the isolates Bt84 and T10 (PS2 species of Matute et al [9]) and
the remaining ones (S1 species of Matute et al [9]) (Figure 9).
PCR of DNA and cDNA with the primers designed for Real Time PCR: the
amplification product of hsp70, alpha and beta tubulins from cDNA presented a fragment of
about 50bp.
The amplicons fragments of hsp70 and alpha tubulin, from DNA samples, were about
100bp
due to the presence of introns between the sites from where the primers were designed
(Figure 10).
Relative quantification of hsp70 gene expression: all the Real Time PCRs presented
dissociation curves of a unique peak. Since the efficiency values of the three primer pairs
were very similar (1.9645 for HSP70, 2.008 for alpha tubulin and 1.9763 for beta tubulin), it
was used the QR values for relative quantification of hsp70 expression in all isolates. The
calibrator gene used for QR calculation, presented in the figure 11, was the alpha tubulin. The
isolates T13, Pb265 and D01 presented high levels of hsp70 gene expression after the
increasing of temperature (major than 13x) and the remaining isolates had an increase of
hsp70 expression of 2.54 to 5.61x.
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39
Discussion
The discovery of three cryptic species in P. brasiliensis, by gene genealogies [9]
increased the importance of comparative studies in order to detect some phenotypic
differences among isolates belonging to the different species, in order to understand the
meaning of such features for species divergence. If the species are genetically separate, they
are supposed to accumulate some morphologic differences, which may result in the
exploration of new ecological niches or in different strategies for survival in saprobe or host
environment.
In this work we used nine isolates of P. brasiliensis: two
(T10 and Bt84) from PS2
species, two (T13 and T4) from S1 species
and five with no species identification in order to
evaluated phenotypic and molecular variation among different isolates.
The dimorphism and thermo tolerance are considered virulence factors that are
important for the adaptation of the pathogen to the host environmental conditions, such as
high temperature, hormones influence and immune response [18]. Different profiles of
dimorphism and thermo tolerance could result in distinct pathogen-host interactions, such as
different virulence degrees or different clinical aspects. Some virulence factors, such as
dimorphism, could reflect a natural selection resultant of the interaction of two genotypes:
pathogen and host [19]. Recently some evidences have been supported the hypothesis that
virulence and pathogenicity features could be developed from saprobe environment (such as
soil), through the interaction of these pathogens with phagocytic and predator
microorganisms. So, one adaptable characteristic could perform different roles during the
saprophytic and parasitic phases [20, 21, 22]. The HSP70 protein, that is considered an
important feature for virulence, is associated to others functions on cell physiology in saprobe
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40
conditions that do not imply directly in pathogenicity. Then virulence and pathogenicity
could be actually a consequence, instead of a cause, of gene expression
Although there was no significant difference among the nine isolates concerning yeast
size, the morphometry of cells at 36ºC showed a great phenotypic plasticity. The larger
diameter amplitude was observed in the isolate Pb-cão. This isolate has also an unusual
characteristic: its yeast colony does not present the typical brain-like aspect, but it presents a
smooth consistence and its growth is very low when compared to the others P. brasiliensis
isolates (data not shown).
The shape of yeast cells was also a variable character. In most isolates, it looks like a
circumference. However the isolate Bt84 presented excessively elongated yeast cells, similar
to pseudo hyphaes. It was also observed elongated buddings in the isolate T10, but additional
analysis, using more isolates from PS2 and from the two others species, are necessary for
elucidate the significance of this feature as phenotypic diagnostic.
It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition and
thermo tolerance among the isolates. The isolates Bt84 and T10 presented no signal of M-Y
transition at 32ºC and the isolate Bt84 was the last one to convert to yeast form (complete
transition at 36ºC and slow transition according to table 2 and figure 5 respectively). It was
speculated that the slow M-Y transition could be due to the “difficulty or low capacity” of
these isolates in acquiring the round shape of the yeast cell.
The arthroconidia production was an unexpected result observed during the M-Y
transition assay, since several studies have pointed to the difficulty in obtaining this
propagula in laboratory (under special conditions, such as 22ºC and low availability of
nutrients) [23]. However, the experimental conditions applied were the opposite from the last
ones (30ºC and a relatively rich media). Maybe the high temperature was a stress factor that
induced the arthroconidia production.
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41
The arthroconidia production seemed to be even more exuberant in Soil Extract Agar
Media [24]. According to others studies developed in our lab, almost all isolates can produce
conidia in Soil Extract Agar Media, in distinct quantities. The isolates Bt84 and T10 were the
only isolates that did not present any conidia in this medium.
The chlamidoconidia are round and intercalar conidia with a thick cell wall. Their
production is raised during the increasing of temperature to 36ºC [25], but their identification
is very difficult since they can be easily mistaken for yeast cells. San Blas et al [26] described
four steps in the M-Y transition that could be observed in our assay: the first consist just of
mycelia forms with or without chlamidoconidia, the second of yeast-like structures, the third
of yeast cells in a chain and the fourth of free and multi budding yeast cells.
About the molecular data, it was observed, as already expected, little polymorphism
in the hsp70 gene among our nine isolates. Since there was no restriction fragment length
polymorphism, it was decided to sequencing the 3’ and 5’ ends of the gene, including the two
introns. The sequencing showed some polymorphism between our nine sequences and the
sequence from GenBank [15]. There was a single nucleotide polymorphism located at the
anchoring region of HHA primer (antisense primer for the amplification of the intron 1)
purposed by Da Silva et al [15], that explain the negative PCR of this intron in our nine
isolates (data not shown).
The hsp70 gene is a member of a gene family that, in P. brasiliensis is compound of,
at least, four described members [27]. It is known that gene families evolve through several
gene duplications, and it is necessary to distinguish between ortolog and paralog genes.
Ortolog genes are copies from the same gene and from the same locus. Paralog genes are also
homolog genes, but they are from different loci. Phylogenetic inferences must be based on
ortolog genes, but some genes can be lost along the time of evolution and paralog genes can
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42
be, erroneously compared. When this mistake happens, the gene tree or gene genealogy
differs from phylogenetic tree [28].
The primers, designed by Da Silva et al [15], used for the amplification and
sequencing of hsp70 gene are specific for just one member of hsp70 in P. brasiliensis, so the
sequences here compared are considered ortolog. The differences between the sequences of
our nine isolates and the sequence from GenBank, of the isolate Pb01 are explained by the
fact that this isolate seems to diverge from others isolates concerning the hsp70 sequence, as
already documented by Teixeira et al [29]. This isolate was not evaluated by Matute et al [9].
More comparative studies will be developed in our lab and this isolate will be included.
The phylogenetic analysis of hsp70 gene by Neighbour Joining grouped the isolates
T10 and Bt84, corroborating to the previous data obtained in our lab by the sequencing of
ITS1-5.8S-ITS2 region [30], that allow the separation of our isolates in two clusters: one
containing the isolates T10 and Bt84 (from PS2 species) and other containing the isolates T3,
Bt60, T15, Bt85, T13, T4, T5, T8, Pb265, T1, T9 and T7(from S1 species)
It seems that the genotypes from PS2 species occur in less frequency when compared
with the genotypes from S1 species, both from human and armadillos [9]. Particularly, in our
armadillo isolates, all from the same hyper endemic area, this proportion is 1:9. Could the
few cases of fungal isolation from PS2 species be explained by the low capacity or no
production of conidia, the infecting propagula? Could the PS2 genotypes, be associated with
infection by traumatic rout, instead the respiratory and more frequent one? More studies,
including a bigger number of isolates from the three cryptic species, are still necessary for the
identification of morphologic, molecular, physiologic, clinical and ecologic features
associated to the species-specific genotypes of P. brasiliensis.
Concerning the hsp70 gene expression, the isolates Pb265 and T13 presented the
highest transcription of hsp70 after the increasing of temperature. Both isolates also showed
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43
great viability on thermo tolerance analysis. The same could be observed for the isolates T10
and S1 which also presented high hsp70 expression. On the other hand, the isolate T4 that
was grouped among the isolates with high thermo tolerance (with S1, T10, Pb265 and T13),
presented a low HSP70 expression, and D01 that was classified as low thermo tolerant
presented a high HSP expression than some of the isolates belonging to the group of low
thermo tolerance.
There was some difficulty to classify the isolates concerning the virulence profiles,
since it was analyzed CFU from three different organs in two different periods. Based on
table 3, the isolates were classified in two opposite classes, one of high virulence (Pb-cão,
T10, T13 e S1) and other of intermediary-low virulence (BT84, BT85, T4 e Pb265). No
association was observed between de virulence profiles and hsp70 gene expression, thus
denying the initial hypothesis that high levels of hsp70 transcription would be associated to
high virulence, as suggested for Histoplasma capsulatum [31].
Conclusion
The HSPs play a key role for all cellular organisms, being important targets for
evolutionary and physiological studies, and its use for vaccine development seems to be very
promissory due to the immunological role of these proteins. The great amplitude of
expression and polymorphisms of hsp70 gene found among different isolates pointed to the
importance of using more than one isolate, preferentially isolates from the three cryptic
species, in studies concerning the evaluation of protector effect of HSPs vaccines, since all P.
brasiliensis variability must be taken into account for any therapeutic and/or prophylactic
measures.
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44
Methods
P. brasiliensis isolates and cultures: four isolates obtained from armadillo (T4, T10,
T13 and S1), four from human patients (Bt84, Bt85, Pb265 and D01) and one from dog (Pb-
cão) [4] were maintained, both in mycelia and yeast forms, at 25 and 36°C respectively, in
Glucose Peptone Yeast Agar (GPYA OXOID Lyd., Basingstoke, UK).
Morphometry of yeast cells at 36°C and M-Y transition: microscope slides of
yeast cells in the 7
th
day of growth were stained with lactophenol cotton blue. Five random
microscopic fields were analyzed with the Leica Qwin V3 software. Two diameter measures
of each cell were registered into an excel plan to determine the area, according to the
following formula: (diameter 1 x 0,5) x (diameter 2 x 0,5) x 3,1416. The M-Y transition
temperature was estimated by slide culturing mycelia fragments in GPY and maintained at
30°C for 15 days (two replicates for each isolate). The same procedure was carried out at 32,
34 and 36°C. The changes were evaluated microscopically, with slides stained with
lactophenol cotton blue. The transition temperature was considered when it was possible to
observe free yeast cells with buddings.
Time for the occurrence of mycelia to yeast transition: four mycelia fragments
were sub cultured on GPYA in Petri dishes (5 Petri dishes were prepared for each isolate) and
maintained at 36°C. The evaluation of the transition was done macroscopically, noting the
time required (in days) to the transition of each mycelia fragment to the yeast phase.
Thermo tolerance: four yeast fragments were sub cultured on GPY in Petri dishes (3
Petri dishes were prepared for each isolate) and maintained at 37°C for 15 days. After this
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45
period the same fragments were sub cultured again and maintained at 38°C for 15 days and so
on at 39, 40, 41 and 42°C. The lost of viability was evaluated microscopically by counting
the number of viable cells (stained by lacto phenol cotton blue, with a regular cell wall). For
each isolate and temperature, at least five random microscopic fields were digitalized and
analyzed using a Leica Microscopic coupled with Leica Qwin V3 system. .
Virulence assay: it was carried out for isolates S1 and Pb-cão, the others isolates
were previously studied by Hebeler-Barbosa et al (2003) and Macoris et al (2006) with the
same procedures in our laboratory. A suspension with 8x10
6
viable yeast cells/mL was used
to the animal inoculation. Ten hamsters (age of 2 months) were inoculated intratesticulary
with 0,2mL of the yeast suspension.
The counting of CFU/g (Colony-Forming Units/g)
of tissue
was carried out at two moments (4 and 8 weeks after the inoculation). The animals were
anesthetized with Zoletil (15-20mg/Kg) and necropsied under sterile conditions, and
fragments of the liver, spleen and testis were weighted and homogenized in 2mL of
phosphate-buffered saline (PBS). A hundred micro liters of this suspension were cultured in
Petri dishes with BHI agar (Brain Heart Infusion media) supplied with 4% of horse serum
and 5% of growth factor from the yeast culture of the P. brasiliensis strain 192 (obtained by a
filtered liquid culture of 7 days) [32]. Each organ was cultured in triplicates and maintained at
36°C for 30 days. CFU for each organ of individual hamster was counted, and the CFU per
gram of tissue was calculated individually. The results were presented as log10 of the average
value ± standard error.
The local Ethical Committee for Animal Research (CEEA) (Protocols 99/27 and 241)
approved the procedure with animals.
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46
DNA extraction: it was carried out according to McCullough et al [33], with initial cell
disruption with glass beads (425-600 microns, acid washed, Sigma, St Louis, MO, USA) in
solution of 1M Sorbitol and 125mM EDTA. The DNA was quantified by agarose gel
electrophoresis and diluted in ultra pure water to 10ng/µL.
PCR of hsp70 gene:
The reactions were carried out in 25 µL of reaction mixture [20ng
of genomic DNA, 1X PCR buffer (50mM KCl and 10mM Tris HCl), 1.5 mM MgCl
2
, 0.2
mM dNTP, 10 pmoles of each primer HHB sense (5’ CAT CTG CGT TAT ATA CCT 3’) e
HHC antisense (5’TTA GTC AAC CTC CTC GAC 3’) [15] and 1 unit of Taq polymerase -
Amersham Biosciences], in a thermocycler (MJ Research, Inc, USA). The thermal cycling
conditions were: 94°C for 4 min followed by 40 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min,
72°C for 2 min and a final cycle of 72°C for 5 min. The PCR products were identified by
agarose gel electrophoresis.
RFLP of PCR products of hsp70 gene: it was carried out with the endonucleases
RsaI, HaeII, Nci e Sty (Promega). The reactions were performed in separated microtubes for
each enzyme in a final volume of 20µL (12,3µL of ultra pure water, 2µL of Buffer reaction,
0,2µL of BSA, 5µL of PCR product and 0,5µL of restriction enzyme. The samples were
maintained at 37ºC for 4h. The fragments were separated by agarose gel electrophoresis
stained with Ethidium Bromide.
Partial sequencing of hsp70 gene: The PCR amplicons were purified by the
commercial kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (Amersham Biosciences) and the
sequencing reactions were carried out in both strands in a thermocycler (Mastercycler
gradient, Eppendorf, Hamburg, Germany), according to Big Dye kit (Applied Biosystems)
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47
instructions. The polyacrylamide gel electrophoresis was performed in ABI PRISM 377
DNA Sequencer, and the chromatogram visualized by the Chromas program. The sequences,
from the 5` and 3` of the gene, including the two introns were sent to Blastn to compare with
the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). The sense and antisense
sequences of the nine isolates were aligned by Clustal W, in Mega 3.1 software. A Neighbour
Joining tree was proposed.
RNA extraction: the yeast phase was subculture in GPY liquid media (2% glucose,
1% bactopeptone and 0,5% yeast extract) and maintained at 25ºC for 9 days at 140 rpm. The
transition to mycelia phase was confirmed microscopically and the cultures were maintained
at 36ºC for 5h. The RNA was extracted from culture at 25 and 36ºC. The extractions were
carried out with Trizol reagent (Invitrogen) according to the supplier`s instructions after
disruption of the cells in freezing liquid nitrogen. To remove any residual genomic DNA, the
RNA was treated with DNase RQ1 (Promega), during 30 minutes at 37ºC.
cDNA synthesis (RT): 1µL of primer oligo dT (12-18) (Invitrogen), 1µL de dNTP
mix 10pM (Amersham Biosciences) and 1µL sterile water treated with DEPC (1%) were
added to RNA previously treated with DNase, following the supplier’s instructions. The
samples were maintained at 70ºC for 10 minutes and at ice for 1 minute. It was added 4µL of
5X Buffer, 1µL of DTT and 200 units of Reverse Transcriptase SuperScript III (Invitrogen).
The cDNA was synthesized at 50ºC for 1h. The reactions were stopped at 70ºC for 15
minutes. The cDNA was mantained at -20ºC for posterior use in Real Time PCR.
Primer design for Real time PCR: the primers were designed with Primer Express
software (Applied Biosystems), for the hsp70 gene (Gen Bank acess number: Pb U91560),
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48
whose sequence was deposited by Da Silva et al (1999) and for the endogenous controls
alpha and beta tubulins (sequences obtained from data bank of Prof. Gustavo H. Goldman,
USP, Ribeirão Preto). All the primer pairs were designed to amplify 51 base pairs (Table 1).
The designed primers were tested in some DNA and cDNA samples in simple PCR
conditions. The reactions were carried out to a final volume of 25µL, containing 2µL of DNA
or cDNA, 1X Buffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 1,5 mM MgCl
2
and 50mM KCl), 0,2mM
dNTP and 10,0pM of each primer. The thermal cycling conditions were 94ºC for 4 min, 40
cycles of 94ºC for 1 min, 55ºC for 1 min and 72ºC for 2 min and a final cycle of 72ºC for 5
min. The PCR products were visualized by agarose gel electrophoresis.
Real Time PCR of cDNA from the samples at 25ºC and 36ºC: all PCRs were
performed by using a 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). The thermal
cycling conditions comprised an initial step at 50°C for 2 min and 95ºC for 10 minutos, and
40 cycles of 95ºC for 15 seconds and 60ºC for 1 minute, followed by dissociation step at
95ºC for 15 seconds, 60ºC for 20 seconds and 95ºC for 15 seconds. In all experiments,
appropriate negative controls containing no DNA template were subjected to the same
procedure. Each reaction was analyzed at least three times. It was used the Power Sybr Green
(Applied Biosystems). The results were normalized by using Ct values for the alpha and beta
tubulins.
For the calculation of relative quantification of hsp70 gene, due to the increasing of
temperature (25-36°C), it was applied the QR (2
-ΔΔCt
) [34] and R values [35]. For R
calculation, it was necessary to determine the efficiency value of each primer pair. For this
propose, a pool of all cDNA samples were diluted in series to 1:5, 1:25, 1:125, 1:625 and
1:3125. The slopes values were took into account for efficiency calculation (E= 10
(-1/slope)
).
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49
Authors' contributions
RCT: designed and carried out all experiments and discuss the data
SMGB: participated in the virulence assay and English review of the article
SAGM: participated in the virulence assay and RNA extractions
JPAJr and JMGC: helped in the real time PCR assays, as well as the interpretation of
the gene expression results.
LAT: performed all statistical tests
IGM: helped in the design and choice of experimental methodologies
EB: helped in the design and choice of experimental methodologies, and organizing
data and writing.
List of abbreviations
EDTA: EthyleneDiamineTetrAcetic acid
KCl: Potassium Clorete
Tris HCl: Tris-Hydrochloride
MgCl
2
: Magnesium Clorete
DNTP: Desoxirribonucleotides Tri Phosphate
BSA: Bovine Serum Albumine
DEPC: Diethyl Pyrocarbonate
DTT: Dithiothreitol
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50
Figures Legends
Figure 1: Boxplot of area (µm2) x isolate.
Figure 2: Isolates at 36ºC (1000X).
Figure 3: Conidia production at 30ºC. Arthro-aleuro-conidia (A), Planoconidia (B)
and Arthroconidia (C).
Figure 4: Presence of chlamidoconidia during the M-Y transition.
Figure 5: Boxplot of time for occurrence of M-Y transition in days X isolate.
Figure 6: Viability of cells as function of temperature
Figure 7: Estimate of CFU/g in testis (A), spleen (B) and liver (C) after 30 and 60
days of inoculation with the isolates T4, T10, T13, PB265, BT84, BT85 E
Pbcão.
Figure 8: propose dendogram for the virulence character.
Figure 9: PCR of hsp70 gene. Lane 1: 1Kb ladder (Promega), lanes 2-10: PCR of
isolates T4, T10, T13, S1, Bt84, Bt85, Pb265, D01 e Pbcão respectively,
lane 11: negative control.
Figure 10: RFLP of the amplicom from PCR of hsp70 gene with the enzymes Nci (A),
Sty (B), HaeII (C) and RsaI (D). In all digestions, the sequence of samples
was: Lane1: 1Kb Ladder (Promega), lanes 2-10: isolates T4, T10, T13, S1,
Bt84, Bt85, Pb265, D01, Pbcão, lane 11: pet28a vector (control for
digestion).
Figure 11: Neighbour Joining tree.
Figure 12: PCRs of DNA and cDNA with the designed primers for Real Time PCR.
Lanes 1-4: PCR with HSP70fwd/HSP70rev primers, lanes 5-8: PCR with
Betafwd/Betarev primers, lanes 9-12: PCR with Alfafwd/Alfarev primers,
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51
lane 13: 1Kb ladder (Promega). The sample sequence for the three PCRs is:
negative control, S1 DNA, T4 cDNA and S1 cDNA.
Figure 13: Increase of hsp70 expression for each isolate, after the increase of temperature,
from 25 to 36ºC for 5h. QR values, on Y axis, present how many times more the
gene was expressed due to temperature changing).
Acknowledgments
We thank Dr. Everaldo dos Reis Marques, Dr. Silvana Petrofeza da Silva, Dr.
Gustavo Henrique Goldman and Dr. Célia Maria de Almeida Soares, for suppling
gene and primers sequences and for the important suggestions. This work was
supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp Grant
number: 04/12949-6).
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57
Tables
Table 1: primers designed for Real Time PCR.
Gene Primer Sequence (5'-3') Amplicom
for DNA
Amplicom
for cDNA
Alfafwd CCCAGCTTGGAAACAGTGCT Alfa
tubulina
Alfarev TCAAACCGTGCTCGAGGAG
NK 51pb
Betafwd CTCGTCCATTCCCTCACCC Beta
tubulina
Betarev TTCCGACGCAAGGCTTTC
NK 51pb
Hsp70-fwd TTTAATACTTCAAAATGGCTCCAGC Hsp70
Hsp70-rev ACGTGGTCCCGAGATCGAT
164pb 51pb
NK: not know, since the sequences used for primer designed were from cDNA.
Table 2: Evaluation of microscopic M-Y transition.
Isolado 30ºC 32ºC 34ºC 36ºC
T4B17
M/Y Y Y Y
T10B1
M M Y Y
T13YN2
M M/Y Y Y
Pb-S1baço
M Y Y Y
Bt84
M M M/Y Y
Bt85
M M/Y Y Y
Pb265
M M/Y Y Y
D01
M M/Y Y Y
Pb - cão
M/Y M/Y Y Y
M= mycelia phase
M/Y= presence of yeast cell with no buddings and yeast cells in the middle of hyphae. Y=
yeast cells with buddings, completed M-Y transition.
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58
Table 3: Tukey Test for the analysis of virulence profiles (averages with the same
letter are not significantly different).
Organ/days Averages of log CFU/g
BT85 Pb265 BT84 T4 S1 Pbcão T13 T10
Testis 30d 1,82
A
2,55
AB
2,61
AB
3,21
ABC
3,64
ABC
3,78
BC
4,58
C
4,60
C
BT85 T4 BT84 Pbcão Pb265 T13 S1 T10
Testis 60d 1,80
A
2,25
AB
2,39
AB
2,49
AB
2,55
AB
3,42
AB
3,93
B
3,39
*
BT85 T4 BT84 Pb265 Pbcão S1 T13 T10
Spleen 30d 2,52
A
2,54
A
2,54
A
2,76
AB
3,34
AB
3,63
BC
4,41
C
5,80
D
BT85 BT84 Pb265 Pbcão T4 T13 S1 T10
Spleen 60d 2,52
A
2,54
A
2,59
A
2,89
A
3,12
AB
4,11
BC
4,16
C
4,29
*
BT85 Pb265 BT84 T4 S1 Pbcão T13 T10
Liver 30d 1,55
A
1,60
AB
2,00
ABC
2,71
BCD
2,94
CD
3,01
CD
3,83
D
5,21
E
BT85 Pbcão Pb265 BT84 T4 S1 T13 T10
Liver 60d 1,55
A
1,57
A
1,60
A
2,00
A
2,72
AB
3,72
BC
4,22
C
4,97
*
*:Tukey Test was not performed for T10 (60d), since only one, of the five hamsters,
survived at this period.The isolate D01 was not evaluated. The high virulence isolates
are marked in blue, while the low-intermediary virulence ones in black.
Table 4: polymorphic sites found among the 1022 nucleotides sequenced for the 9 isolates.
The bases in capital letters are the informative polymorphisms.
Nucleic acids Site*
T4 T10 T13 S1 BT84 BT85 PB265 D01 PB-Cão
399 (I1)
A G A A G A A A G
593 (E2)
c c c c c c c - c
756 (E2)
- - - - - - - - c
819 (E2)
c c c c c c - c c
828 (E2)
C T C C T C C C T
1920(E2)
a a a a a a a t a
1948 (E2)
C C C G C C C C G
1950 (E2)
c t c c c c c c c
1989 (E2)
g g g g g g g t g
2262 (I2)
C T C C T C C C T
2276 (I2)
A - A A - A A - -
2344 (E3)
G G - G - G G G G
2374 (E3)
g g g g g g - g g
*Sites correspond to the sequence deposited by Da Silva et al [15] [GenBank: U91560].
I1: intron 1, I2: intron 2, E2: exon 2, E3: exon 3.
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63
Testis
0
1
2
3
4
5
6
7
S1 Pbcão Pb265 T4 T13 T10 BT84 BT85
isolates
30 dias
60 dias
spleen
0
1
2
3
4
5
6
7
S1 Pbcão Pb265 T4 T13 T10 BT84 BT85
isolates
30 dias
60 dias
Liver
0
1
2
3
4
5
6
7
S1 Pbcão Pb265 T4 T13 T10 BT84 BT85
isolates
30 dias
60 dias
A
C
B
Figure 7.
Log CFU/g
Log CFU/g
Log CFU/g
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68
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Linha 1: marcador de 1Kb (Promega), linha 2: controle negativo; linhas 3-11: PCR do
hsp70 dos isolados T4B17, T10B1, T13LN2, S1baço, Bt84, Bt85, Pb265, D01 e Pbcão
respectivamente, linha 12: controle negativo; linhas 13 e 14: PCR do intron 1 dos
isolados Bt84 e Pbcão; linha 15: Nested PCR para amplificação do intron 1 do Pb265
(produto resultante da primeira PCR); linha 16: controle negativo, linhas 17 e 18: PCR
do intron 2 dos isolados Bt84 e Pbcão (produto em torno de 680pb).
1000pb
2000pb
V.1 PCR do gene hsp70 e dos introns 1 e 2
V Anexos: figuras não incluídas no artigo.
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74
Exon 3
Fim do intron 2
Retângulos laranjas: polimorfismos encontrados entre os 9 isolados estudados. #: intervalo
não seqüenciado, que corresponde, segundo a seqüência depositada por Da Silva et al
(1999), aos sítios 845-1900.
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75
Amostras: isolados na fase micelial (linhas 1-9) e após 5h a 36ºC (linhas 10-18). A ordem
das amostras miceliais e a 36ºC é: T4B17, T10B1, T13LN2, S1baço, Bt84, Bt85, Pb265,
D01 e Pbcão. As bandas visíveis correspondem ao RNA ribossomal.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
V.3 Extração de RNA total
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76
Curvas de amplificação do HSP70, alfa e beta tubulina para os isolados a 25 e 36ºC. A:
amostras T4B17, T10B1, T13LN2 e S1baço, B: amostras Bt84, Bt85, Pb265 e D01 e C:
Pb-cão
V4 Real Time PCR
V.4.1 Curvas de amplificação
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77
A
C
B
Curvas de amplificação, para HSP70 (A), Alfa – tubulina (B) e Beta – tubulina (C),
obtidas pela diluição em série do cDNA. O Ct correspondente a cada diluição esta
representado pelas setas verticais.
V.4.2 Reação para cálculo da eficiência de cada par de primer
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79
No eixo x estão
os isolados e no y estão os valores de quantas vezes mais o gene hsp70 é
expressa em função do aumento de temperatura.
1,48
19,12
23,68
1,07
3,11
0,49
22,66
11,66
12,61
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
T4 T10 T13 S1 BT84 BT85 PB265 D01 PBCAO
isolados
QR
V.5 Expressão do gene hsp70, segundo os valores de QR, em relação ao aumento de
temperatura, usando como a beta tubulina.
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80
VI Discussão Geral
Foi possível observar ampla variabilidade fenotípica no que se refere aos estudos
morfométricos, de transição M-L e de termo tolerância entre os isolados. O dimorfismo e a
termo tolerância são considerados fatores de virulência que possibilitam a adaptação do
patógeno às diferentes condições impostas pelo hospedeiro, como aumento de temperatura,
influências hormonais e resposta imune (KUROKAWA et al., 1998). Diferentes padrões de
dimorfismo e termo tolerância poderiam refletir interações patógeno-hospedeiro distintas,
como por exemplo uma maior ou menor virulência, aspectos clínicos distintos, etc. Alguns
fatores de virulência, como o dimorfismo, poderiam ser frutos de uma seleção natural
resultante da interação entre os dois genótipos: o do patógeno e do hospedeiro
(LEDERBERG, 1999). Evidências também têm sido apontadas de que algumas
características consideradas fatores de virulência e patogenicidade em fungos dimórficos
poderiam ter tido sua origem e manutenção no meio saprofítico (em geral solo) através da
interação destes patógenos com microrganismos fagocíticos predadores, de forma que uma
mesma característica adaptativa, como por exemplo a resistência lítica celular, poderia
desempenhar papéis distintos durante o saprofitismo e durante o parasitismo
(CASADEVALL et al., 2003 e STEENBERGEN et al 2003; 2004). A própria HSP70,
considerada fator de virulência, por estar associada ao choque térmico, tem funções outras na
fisiologia celular do microrganismo em condições ambientais, que não implicam diretamente
em patogenicidade, sendo esta, na verdade, uma conseqüência e não causa da expressão do
gene.
A descoberta de três espécies crípticas de P. brasiliensis (MATUTE et al., 2006)
proporcionou um segundo enfoque para este projeto que seria detectar alguma diferença
fenotípica (quanto aos caracteres morfológicos e de expressão do gene hsp70) e/ ou
molecular (seqüências do gene hsp70) entre isolados de pelo menos 2 espécies diferentes aqui
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81
estudadas. Sabe-se que os isolados T10 e Bt84 pertencem à espécie PS2 e os isolados T4 e
T13 à espécie S1. Os demais isolados utilizados neste trabalho não foram analisados no
trabalho de Matute et al (2006). Apesar do reconhecimento filogenético de espécie ser o
método mais eficaz de se identificar espécie em microrganismo, a detecção de fenótipos
variáveis entre as diferentes espécies em P. brasiliensis passa a ser atrativa para um rápido
reconhecimento de espécie.
Em P. brasiliensis, existem muitos fenótipos variáveis, como crescimento, aspecto de
colônia miceliana, produção de conídios, transição micélio/levedura, microscopia
leveduriforme (brotamentos, forma e tamanho das células, etc), virulência, termotolerância,
entre outros (THEODORO et al., 2005). Se as espécies estão separadas geneticamente é de se
esperar que com o passar do tempo esta divergência seja detectada por diferenças
morfolólogicas que se traduzem em exploração de diferentes nichos ecológicos, tanto durante
a fase saprofítica como durante a fase de parasitismo.
Os dados morfométricos de área de células leveduriformes, apesar de não
apresentarem diferenças significativas entre isolados, mostraram a grande plasticidade
fenotípica de cada isolado quanto ao tamanho das células leveduriformes, merecendo
destaque o isolado Pbcão que apresentou a maior amplitude de área. Este isolado também se
destaca dos demais pelo fato de sua colônia leveduriforme não apresentar aspecto
cerebriforme como os demais isolados do laboratório, sua colônia é lisa e de crescimento
lento (dado não mostrado).
A forma das células leveduriformes também é variável, na maior parte dos isolados se
aproxima de uma circunferência, entretanto o isolado Bt84 se destacou por apresentar
leveduras demasiadamente alongadas, semelhantes à pseudohifas. Observou-se também a
tendência de alongamento, nos brotamentos das leveduras do isolado T10B1. Mais estudos
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82
ainda são necessários, envolvendo mais cepas da espécie PS2 e das outras duas espécies, para
se avaliar com maior clareza a significância desta característica como diagnóstico fenotípico.
Curiosamente os isolados Bt84 e T10B1 foram os únicos que se apresentaram na
forma micelial, sem qualquer sinal de transição M-L a 32ºC. Com relação ao tempo
necessário para a transição M-L, o T10B1 apresentou uma transição intermediária e o Bt84,
converteu para levedura tardiamente, mostrando significativa diferença com relação aos
demais isolados. Especula-se que a demora em se adquirir a forma de levedura seja devido à
“dificuldade” ou “baixa capacidade” deste isolado em atingir forma arredondada de levedura.
A produção de artroconídias foi um resultado inesperado observado nas lâminas de
micro cultivo para determinação da temperatura de transição de cada isolado, já que trabalhos
mais antigos apontam certa dificuldade na obtenção das mesmas, sendo necessárias condições
especiais, de baixa temperatura (cerca de 22ºC) e escassez de nutrientes (Agar - água)
(BUSTAMANTE-SIMON et al., 1985). Entretanto as condições aqui empregadas foram
opostas, ou seja, temperatura alta (30ºC) e meio relativamente rico em nutrientes (GPY).
Talvez a alta temperatura tenha sido uma condição de estresse que proporcionou produção de
artroconídias em alguns isolados. A alta produção de conídias, como a encontrada na cepa
Bt85, se repete de forma ainda mais exuberante em meio Agar extrato de solo
(TERÇARIOLI et al, 2005). Segundo estudos desenvolvidos no laboratório, todos os isolados
são capazes de produzir conídias em meio Agar extrato de solo, porém em quantidades
distintas, mas proporcionais às obtidas no meio GPY. Os isolados T10B1 e BT84,
pertencentes a espécies PS2, também não produzem artroconídias em Agar extrato de solo
(TERÇARIOLI et al, 2005). Maiores estudos sobre o comportamento em solo de isolados das
três espécies crípticas deverão ser realizados.
Quanto aos clamidoconídios, houve grande dificuldade em distingui-los da célula
leveduriforme, já que são conídios predominantemente intercalares, arredondados e de parede
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83
celular mais espessa que a célula miceliana. A formação dos clamidoconídios aumenta com a
elevação da temperatura para 36ºC (SALAZAR & RESTREPO, 1984). San Blas et al (1982)
descreveram quatro etapas na transformação M-L, a primeira só apresentando formas
miceliais, com ou sem clamidósporos, a segunda com estruturas similares a leveduras (não
necessariamente derivadas de clamidósporos), a terceira com leveduras em cadeia, sem
presença de hifas e quarta com leveduras desprendidas contendo multibrotamento.
Com relação aos dados moleculares, observou-se, como já esperado, pouco
polimorfismo no gene hsp70, considerado filogeneticamente conservado. Como os resultados
de PCR-RFLP não proporcionaram nenhum polimorfismo de restrição, e como não foi
possível amplificar o intron 1 (a idéia inicial era sequenciar os introns) optou-se por
sequenciar as pontas do gene, de modo a incluir os intros 1 e 2. O sequenciamento foi
essencial para a análise do gene, pois mostrou polimorfismos entre as seqüências obtidas e a
seqüência depositada no GenBank. Um dos polimorfismos envolveu um único nucleotídeo
localizado no sítio de anelamento do primer HHA (antisense do PCR do intron 1) de Da Silva
et al (1999), o que explica a não amplificação do intron 1 em nossos experimentos. Além
disso, a localização de sítios variáveis entre as seqüências dos nove isolados foi importante
para a confecção dos primers a serem usados para Real Time PCR.
O gene hsp70 é um membro pertencente a uma família gênica que em P. brasiliensis é
composta de pelo menos quatro membros já descritos (FLOREZ et al., 2003). Sabe-se que
famílias de genes evoluíram através de uma série de duplicações gênicas, portanto o uso do
termo homologia para estes casos se torna um tanto grosseiro. É necessário diferenciar os
genes destas famílias em ortólogos e parálogos. Genes ortólogos, em um conjunto de
duplicatas, são duas cópias do mesmo gene, do mesmo lócus; genes parálogos são dois genes,
também homólogos, porém em loci diferentes. Inferências filogenéticas devem ser baseadas
em genes ortólogos, mas pode haver perda de genes ao longo da evolução e erroneamente
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84
genes parálogos serem comparados, quando isso ocorre, a árvore gênica ou genealogia de
genes difere da árvore filogenética (RIDLEY, 2006).
Sendo assim, a comparação e o alinhamento de seqüências feito neste projeto só
resultariam em dados confiáveis caso os genes hsp70 amplificados fossem de fato ortólogos.
Segundo informações pessoais fornecidas pela professora Silvana Petrofeza os primers por
ela desenhados (que foram os mesmos usados para o PCR e sequenciamento parcial do gene
neste trabalho) são específicos para um membro da família hsp70, não amplificando os
demais. As diferenças observadas entre as seqüências dos nove isolados e a seqüência
depositada podem ser explicadas pelo fato de que o isolado usado por Da Silva et al (1999),
Pb01, apresenta inúmeras divergências, mesmo em outras regiões gênicas, quando
comparado com outros isolados. Este isolado não foi avaliado filogeneticamente por Matute
et al (2005), portanto não se sabe a qual espécie críptica ele pertence. Novos estudos
comparativos morfológicos e moleculares, a serem realizados em nosso laboratório, deverão
incluir também este isolado.
Na análise filogenética por Neighbour Joining observou-se o agrupamento dos
isolados T10B1 e Bt84, corroborando com dados anteriormente obtidos em nosso laboratório,
pelo sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 (HEBELER-BARBOSA et al., 2003b) que
permitiu a separação dos isolados de P. brasiliensis em dois grupos genéticos: em um estão
os isolados T10 e Bt84 e no outro estão os isolados T3, Bt60, T15, Bt85, T13, T4, T5, T8,
Pb265, T1, T9 eT7.
Os agrupamentos feitos com base nos caracteres morfológicos não foram totalmente
similares ao agrupamento molecular, mesmo porque, as características aqui avaliadas
envolvem ativação e inibição de muitos outros genes (Da SILVA et al., 1994).
Com relação à análise de expressão do hsp70 por Real Time observou-se significativa
diferença entre a expressão de alguns dos isolados quando utilizado como controle endógeno
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85
a alfa e a beta tubulina. Estes endógenos, juntamente com o gene 18S são os mais usados para
análise de expressão de uma série de genes em P. brasiliensis (GOLDMAN et al., 2003 e
MARQUES et al., 2004). Embora não se possa excluir a possibilidade destes genes terem sua
expressão também modulada pelo aumento de temperatura, esta escolha foi feita com base
nos principais trabalhos de expressão gênica após aumento de temperatura de 25 para 36ºC. O
fato de encontrarmos diferentes expressões de hsp70 quando usamos alfa e beta tubulina
como endógenos aponta para a importância de um estudo mais seletivo para genes candidatos
a normalizadores. Como o gene normalizador mais usado é a alfa tubulina (GOLDMAN et
al., 2003 e MARQUES et al., 2004), optou-se por discutir os resultados com base neste gene.
Os isolados Pb265 e T13 apresentaram os maiores aumentos de transcrição da hsp70
após o aumento de temperatura e ambos isolados mostraram maior viabilidade
(termotolerância conforme aumento de temperatura até 42ºC), juntamente com os isolados
T10, S1, que também apresentaram alta expressão de hsp70. Apesar do isolado T4 ter sido
agrupado dentre os isolados com maior viabilidade, ou seja, uma maior termotolerância, sua
expressão se apresentou inferior a alguns dos demais isolados pertencentes ao grupo de
menor viabilidade. O isolado D01, por sua vez, apresentou uma alta expressão de hsp70 e
uma queda acentuada da viabilidade com o aumento da temperatura.
Quanto à virulência, observou-se algumas dificuldades em classificar os isolados,
visto que foram analisadas contagens de UFCs em três órgãos diferentes, em dois períodos
diferentes. Decidiu-se manter apenas duas classes, uma de alta virulência, na qual são
incluídos os isolados Pbcão, T10, T13 e S1 e outra de virulência intermediária-baixa, na qual
são incluídos os isolados BT84, BT85, T4 e Pb265. Nenhuma correlação pôde ser observada
entre o perfil de virulência e a expressão de hsp70, negando a hipótese inicial de que altos
níveis de expressão desta hsp estariam associados à virulência, como foi sugerido para
Histoplasma capsulatum (CARUSO et al., 1987).
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86
Ainda assim, o emprego destes genes para confecção de vacinas parece ser de grande
interesse visto o potencial imunomodulador destas proteínas. Porém, o fato de se ter
encontrado alguns polimorfismos entre os nossos isolados, e principalmente entre estes e a
seqüência depositada no GenBank, levanta a questão acerca de quão conservado é este gene,
já que foi possível observar claramente a segregação entre as duas espécies crípticas na
árvore de Neighbour Joining (os isolados T10 e BT84 pertencem a uma espécie, segundo
Matute et al, 2006). Além disso, o fato de a amplitude de expressão do gene hsp70 ser
consideravelmente grande entre os diferentes isolados, aponta para a importância de se testar
diferentes isolados na avaliação do efeito protetor destas vacinas.
A importância dos estudos comparativos, contemplados por este projeto, tanto
morfológicos como moleculares, aumentou ainda mais com a descoberta das três espécies
crípticas de P. brasiliensis (MATUTE et al., 2006). Sabe-se que o isolamento genético é
seguido de divergências (morfológicas e fisiológicas) entre as recentes espécies, o que pode
se traduzir na ocupação de diferentes nichos ecológicos, já que teoricamente espécies
diferentes não ocupam o mesmo nicho ecológico, ou seja, não exploram as condições e
recursos do meio de forma semelhante. Segundo este estudo e outros realizados em nosso
laboratório (TERÇAROLI et al., 2006), os isolados BT84 e T10 (pertencentes a uma das
espécies crípticas de P. brasiliensis) parecem não produzir conídios e terem leveduras mais
alongadas, porém estes dados são ainda não conclusivos, necessitando maiores estudos. Os
dados até então obtidos indicam que estes genótipos do grupo PS2 devem ocorrer de forma
bem menos freqüente que os genótipos do grupo S1, tanto em hospedeiros humanos como
nos tatus (MATUTE et al., 2006). Particularmente em nossos isolados de tatus, todos
provenientes de uma mesma região hiperendêmica, esta proporção é de 1:9. Esta menor
freqüência de isolamento de isolados da espécie PS2 poderia ser explicada pela menor
capacidade ou a não produção de conídias infectantes neste grupo? Poderiam ainda estes
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87
genótipos estarem associados aos eventuais casos de infecção pela via traumática e não
inalatória como na maioria das infecções por PCM? Maiores estudos com maior número de
isolados são ainda necessários de forma a se identificar possíveis características
morfológicas, moleculares, fisiológicas e ecológicas associadas aos genótipos espécie-
específicos do P.brasiliensis, e de especial interesse aquelas relacionadas aos diferentes perfis
de manifestação da doença no homem.
Sabe-se que nas espécies crípticas de H. capsulatum pode-se detectar diferenças
morfológicas e fisiológicas entre isolados pertencentes às diferentes espécies (KASUGA et
al., 2003). No caso do Coccidioides, observou-se que a espécie C. posadasii cresce mais
lentamente em meio contendo alta concentração de sais quando comparada com a espécie C.
immitis, porém este fenótipo não é usado como diagnóstico (FISHER et al., 2002).
Entender melhor esta diversidade de isolados de P. brasiliensis significa compreender
de forma mais abrangente a dinâmica populacional, as diferentes formas clínicas e a
importância de se considerar o P. brasiliensis não como uma única cepa, mais sim como um
conjunto complexo de genótipos que devem ser levados em consideração nas medidas
terapêuticas e profiláticas.
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