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SUELEN TEIXEIRA FARIA
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTRE ESTUDANTES DE ENFERMAGEM
SAUDÁVEIS
MARINGÁ
2009
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
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SUELEN TEIXEIRA FARIA
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTRE ESTUDANTES DE ENFERMAGEM
SAUDÁVEIS
Dissertação apresentada à Universidade Estadual
de Maringá, Programa de Pós-Graduação em
Enfermagem, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Enfermagem.
Orientador: Prof. Dr. João Bedendo
MARINGÁ
2009
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Faria, Suelen Teixeira
F224s Staphylococcus aureus entre estudantes de
enfermagem saudáveis / Suelen Teixeira Faria. --
Maringá, 2009.
57 f. : figs., tabs.
Orientador : Prof. Dr. João Bedendo.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Enfermagem,
2009.
1. Staphylococcus aureus. 2. Staphylococcus aureus
- Prevalênica de carreamento nasal - Estudantes de
Graduação - Enfermagem. I. Bedendo, João, orient. II.
Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-
Graduação em Enfermagem. III. Título.
CDD 21.ed. 610.7369
SUELEN TEIXEIRA FARIA
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTRE ESTUDANTES DE ENFERMAGEM
SAUDÁVEIS
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-
Graduação em Enfermagem, como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Enfermagem.
Aprovado em: 02/12/2009
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. João Bedendo (Orientador)
Universidade Estadual de Maringá
Prof. Dr. Benício Alves de Abreu Filho (Titular)
Universidade Estadual de Maringá
Prof
a
. Dr
a
. Sheila de Araújo Teles (Titular)
Universidade Federal de Goiânia
Profª. Drª. Maria Cristina Bronharo Tognim (Suplente)
Universidade Estadual de Maringá
Profª. Drª. Lourdes Botelho Garcia (Suplente)
Universidade Estadual de Maringá
Dedico este trabalho
Aos meus pais, a minha irmã e ao meu namorado, que são os amores da minha vida, e
que não mediram esforços para que este trabalho pudesse ser concluído. Sem vocês
nada disto seria possível.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que iluminou meu caminho e me conduziu até aqui.
Muito obrigada Senhor!
A meus pais, Terezinha e Vanderley, pelos esforços, pela dedicação
e pela presença sempre constante ao meu lado, acreditando que
venceria mais essa etapa em minha vida.
A minha irmã Káriliny: irmão é aquela pessoa que o tempo não
apaga, que a doença não separa, que a maldade não destrói e que
a saudade aproxima. A você o meu grande beijo.
A meu namorado César, que me proporcionou momentos alegres
em meio a um turbilhão de incertezas, e que esteve comigo em
todas as etapas para concretizar o meu sonho.
Ao prof. João Bedendo, meu orientador, presente nos momentos de
angústias e de alegrias, e apesar dos obstáculos encontrados no
caminho, conseguimos chegar até aqui.
A Aline Cristina Rissato Piekarski, minha companheira de luta;
foi uma batalha difícil, mas vencemos, e seu apoio foi
fundamental.
À Prof.ª Maria Cristina Bronharo Tognim pela amizade, pelos
ensinamentos, pela compreensão e acima de tudo pelo conforto nos
momentos difíceis.
Ao Prof. Benício Alves de Abreu Filho e Prof. Celso Luiz Cardoso,
quanta sabedoria, quanto aprendizado, quanta amizade. Aprendi
muito com vocês. Agradeço por me receberem de braços abertos.
Aos funcionários do Laboratório de Microbiologia e Imunologia
Básica, pelo acolhimento, colaboração e carinho com que me
receberam e pelo conhecimento compartilhado.
À Prof.ª Sueli Donizete Borelli, por sempre me acolher quando
precisei.
À Prof.ª Magda Lúcia Félix de Oliveira, a grande incentivadora
desse momento, uma pessoa maravilhosa, um exemplo, uma
amiga.
À enfermeira Tanimária da Silva Lira Ballani e à psicóloga Ana
Carolina Manna Bellasalma, agradeço pelo apoio e incentivo.
A todos os docentes e funcionários do Departamento de
Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá.
A todos os alunos do curso de graduação em enfermagem, meus
agradecimentos sinceros.
Deus costuma usar a solidão
para nos ensinar sobre a convivência.
Às vezes, usa a raiva para que possamos
compreender o infinito valor da paz.
Outras vezes usa o tédio, quando quer nos mostrar
a importância da aventura e do abandono.
Deus costuma usar o silêncio para nos ensinar
sobre a responsabilidade do que dizemos.
Às vezes usa o cansaço, para que possamos
compreender o valor do despertar.
Outras vezes usa a doença, quando quer
nos mostrar a importância da saúde.
Deus costuma usar o fogo, para nos ensinar
a andar sobre a água.
Às vezes, usa a terra, para que possamos
compreender o valor do ar.
Outras vezes usa a morte, quando quer
nos mostrar a importância da vida.
Fernando Pessoa
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTRE ESTUDANTES DE ENFERMAGEM
SAUDÁVEIS
RESUMO
Staphylococcus aureus é um patógeno envolvido na etiologia de infecções hospitalares
e comunitárias, encontrado como flora normal em um percentual importante da
população em geral. Atualmente, diversos estudos têm demonstrado um aumento da
freqüência de isolamento de amostras de S. aureus resistentes a múltiplas drogas,
particularmente a oxacilina (ORSA). Acadêmicos de Enfermagem podem ser
carreadores nasais de estirpes multirresistentes, representando um fator de risco
potencial na disseminação. O presente estudo tem por objetivo identificar a prevalência
e o perfil fenotípico e genotípico de amostras de S. aureus isoladas dos vestíbulos nasais
de estudantes de graduação em Enfermagem. A população envolveu 101 alunos do
curso de graduação em Enfermagem que foram amostrados nos vestíbulos nasais. As
colônias suspeitas de pertencerem à S. aureus foram submetidas à Coloração de Gram,
Teste da Coagulase em tubo e a seguir avaliadas quanto à susceptibilidade à oxacilina e
à vancomicina através do Teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM). O DNA foi
extraído com CTAB e as amostras identificadas como resistentes à oxacilina foram
submetidas à técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificação do
gene MecA, utilizando-se como controle positivo a cepa de S. aureus ATCC 33591. A
eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio. Um
fragmento de 154 pares de base indica a presença do gene mecA. A tipagem genética
das amostras resistentes à oxacilina foi realizada utilizando o primer RW3A. Dos 101
alunos analisados, 91 (90,1%) proporcionaram o isolamento do S. aureus. Em 8
amostras, a CIM da oxacilina variou entre 4 µg/ml e 256 µg/ml. Todas as amostras
foram sensíveis à vancomicina. A presença do gene mecA foi identificada em todas as
amostras resistentes à oxacilina pelo método da CIM. Todas as amostras resistentes à
oxacilina pela CIM apresentaram resistência à penicilina, trimetropin/sulfametoxazol e à
tetraciclina. A tipagem genética das oito amostras resistentes à oxacilina demonstrou
uma similaridade superior a 84% para quatro amostras, sendo duas com 100%.
Palavra-chave: Staphylococcus aureus, Colonização, Resistência, Enfermagem.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN HEALTHY NURSING STUDENTS
ABSTRACT
Staphylococcus aureus (S. aureus) is a pathogen involved in the etiology of hospital and
community infections, and is also found in the normal flora of a significant percentage
of the general population. Several studies have shown an increase in the isolation of
multiple-drug-resistant samples of S. aureus, especially to oxacillin (ORSA). Nursing
students may be nasal carriers of multi-resistant strains, which represents a potential risk
factor for dissemination. The object of the present study is to identify the prevalence,
phenotypic and genotypic profiles of S. aureus samples isolated from the nasal cavities
of undergraduate Nursing students. The population consisted of 101 undergraduate
Nursing students who had their nasal cavities sampled. Colonies suspected of belonging
to S. aureus were subjected to Gram reaction and tube coagulase tests, and then
evaluated regarding oxacillin and vancomycin susceptibility through the minimum
inhibitory concentration (MIC) test. DNA was extracted through CTAB, and the
samples identified as oxacillin-resistant were submitted to a polymerase chain reaction
(PCR) to identify the MecA gene, with the ATCC 33591 strain of S. aureus as positive
control. Eletrophoresis was performed in agarose gel 1.5% with ethidium bromide. A
fragment of 154 base pairs indicates the presence of the MecA gene. The genetic typing
of oxacillin-resistant samples was performed using the RW3A primer. Among the 101
assayed students, 91 (90.1%) showed isolates of S. aureus. In eight samples, MIC
varied between 4 µg/ml and 256 µg/ml. All samples were sensitive to vancomycin. The
presence of the MecA gene was identified in all oxacillin-resistant samples through the
MIC method. Of the eight oxicillin-resistant samples, 100% were resistant to penicillin,
trimethoprim/sulfamethoxazole and tetracyclin. The genetic typing of all eight oxacillin-
resistant samples showed greater than 84% similarity for four samples, with two of
them being 100%.
Keywords: Staphylococcus aureus, Colonization, Resistance, nursing.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTRE ESTUDIANTES DE ENFERMERÍA
SALUDABLES
RESUMEN
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno implicado en la etiología de
infecciones hospitalarias y comunitarias siendo también, encontrado como flora normal
en un porcentual importante de la población en general. Actualmente diversos estudios
han demostrado un aumento de la frecuencia de aislamiento de muestras de S. aureus
resistentes a múltiplas drogas particularmente a la oxacilina (ORSA). Académicos de
enfermería pueden ser cargadores nasales de estirpes multirresistentes representando un
factor de riesgo potencial en la diseminación. El presente estudio tiene por objetivo
identificar la prevalencia y el perfil fenotípico y genotípico de muestras de S aureus
aisladas de los vestíbulos nasales de estudiantes de graduación en enfermería. La
población implicó 101 alumnos del curso de graduación en enfermería que fueron
usados de muestra en los vestíbulos nasales. Las colonias sospechas de pertenecer a S.
aureus fueron sometidas a Coloración de Gram, Test de la Coagulasa en tubo y a seguir
evaluadas cuanto a susceptibilidad a la oxacilina y a la vancomicina a través del Teste
de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). El DNA fue extraído con CTAB y las
muestras identificadas como resistentes a la oxacilina fueron sometidas a la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificación del gen MecA,
utilizándose como control positivo la cepa de S. aureus ATCC 33591. La eletroforesis
fue realizada en gel de agarosa a 1,5% con bromuro de etidio. Un fragmento de 154
pares de bases indica la presencia del gen MecA. El tipo genético de las muestras
resistentes a la oxacilina fue realizado utilizando el primer RW3A. Entre los 101
alumnos ensayados, 91 (90,1%) proporcionaron el aislamiento del S. aureus. En 8
muestras el CIM varió entre 4 µg/ml y 256 µg/ml. Todas las muestras fueron sensibles a
la vancomicina. La presencia del gen MecA fue identificada en todas las muestras
resistentes a la oxacilina por el método de la CIM. Las ocho muestras resistentes a la
oxacilina 100% presentaron resistencia a la penicilina, trimetropin/sulfametoxazol y a la
tetraciclina. El tipo genético de las ocho muestras resistentes a la oxacilina demostró
una similitud superior a 84% para cuatro muestras, siendo dos con 100%.
Palabras clave: Staphylococcus aureus, Colonización, Resistencia, Enfermeria.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Distribuição da prevalência de MRSA na América Latina....................
22
Figura 2 - Staphylococcus aureus de origem hospitalar e comunitária..................
25
Figura 3 - Resultados da técnica de PCR utilizada para detecção do gene mecA
entre 8 amostras de S. aureus oxacilina resistentes isoladas de acadêmicos de
graduação de Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá, Paraná.............
40
Figura 4 - Grau de similaridade obtido pelo programa NTSYS das oito amostras
de S. aureus oxacilina resistentes isolados de acadêmicos de Enfermagem da
Universidade Estadual de Maringá, Paraná..............................................................
41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características dos estudantes de Enfermagem da Universidade
Estadual de Maringá, Maringá, 2008.......................................................................
36
Tabela 2 – Distribuição acumulativa da concentração inibitória mínima nos
diferentes anos de graduação relacionado à oxacilina, Maringá, 2008....................
37
Tabela 3 – Distribuição da resistência aos antimicrobianos dos S. aureus
isolados de acadêmicos nos diferentes anos do curso de graduação em
Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá, 2008......................................
38
Tabela 4 – Distribuição da resistência aos antimicrobianos das oito amostras de
S. aureus resistentes á oxacilina isoladas de acadêmicos do curso de Enfermagem
da Universidade Estadual de Maringá, 2008............................................................
39
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
S. aureus: Staphylococcus aureus
ORSA: Staphylococcus aureus resistente à oxacilina
HA-MRSA: Staphylococcus aureus hospitalar resistente à meticilina
CA-MRSA: Staphylococcus aureus comunitário resistente à meticilina
DNA: Ácido desoxirribonucleico
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
CIM: Concentração inibitória mínima
Fem: Factor essential for methicilyn resistance
PBP: Penicillin-binding Protein
SCCmec: Staphylococcal Chromosomal Cassette
VISA: S. aureus com resistência intermediária à vancomicina
VRSA: S. aureus resistentes à vancomicina
PVL: Leucocidina de Panton Valentine
SEC: Enterotoxinas
SEH: Enterotoxinas
UEM: Universidade Estadual de Maringá
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TSB: Caldo de Soja Tripticaseína
AMS: Agar Manitol Salgado
ATCC: American Type Culture Collection
NACL: Cloreto de Sódio
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards
AMH: Agar Mueller Hinton
EDTA: Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
TE: Solução de Tris-HCl 10 mM e EDTA 1 mM
CIA: Clorofórmio Álcool Isoamílico
CTAB: Cetyl Trimethylammonium Bromide
NTSYS: Numerical Taxonomy System
COPEP: Comitê Permanente de Ética em Pesquisa
DMSO: Dimetilsulfóxido
MLST: Multi Locus Sequence Typing
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................
15
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 20
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 20
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 20
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 21
3.1 Origem, morfologia e epidemiologia dos Staphylococcus aureus ...................... 21
3.2 Histórico e mecanismo de resistência antimicrobiana dos Staphylococcus
aureus ........................................................................................................................
22
3.3 Carreamento dos Staphylococcus aureus ............................................................ 26
3.4 Testes antimicrobiano .......................................................................................... 26
3.5 Estudo genotípico ................................................................................................ 27
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 30
4.1 Caracterização do estudo e critérios de inclusão ................................................. 30
4.2 Procedimentos ......................................................................................................
30
4.2.1 Coleta de material biológico ............................................................................. 30
4.2.2 Semeadura .........................................................................................................
31
4.2.3 Estocagem ......................................................................................................... 31
4.3 Suscetibilidade aos antimicrobianos .................................................................... 32
4.3.1 Teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima .......................... 32
4.3.2 Teste de disco difusão ....................................................................................... 33
4.4 Reação em cadeia da polimerase ......................................................................... 33
4.4.1 Extração de DNA .............................................................................................. 33
4.4.2 Genotipagem ..................................................................................................... 34
4.4.3 Reação de amplificação para o gene mecA ...................................................... 34
4.5 Eletroforese .......................................................................................................... 35
4.6 Comitê de Ética ....................................................................................................
35
5 RESULTADOS ..................................................................................................... 36
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 42
7 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 46
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................... 47
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 48
ANEXOS ............................................................................................................... 55
1. INTRODUÇÃO
Diferentes gêneros e espécies de micro-organismos fazem parte da microbiota
normal dos seres humanos (MARTINS, 2002), entre eles o Staphylococcus aureus, que
habita a pele e as membranas mucosas, principalmente as fossas nasais (HESHIKI et
al., 2002; ONANUGA, OYI e ONAOLAPO, 2005; RICARDO, 2004).
O organismo, ao albergar o S. aureus, pode se comportar de duas formas: na
primeira ocorre o processo infeccioso, revelando-se então o caso clínico ou declarado e,
na segunda, ocorre em muitos casos nos quais o organismo está colonizado, porém não
apresenta nenhuma sintomatologia, conhecido genericamente como “portador são” ou
assintomático. Esses podem ainda ser classificados como portadores persistentes ou
permanentes (20%), portadores intermitentes ou transitórios (60%) e não portadores
(20%) (KLUYTMANS, VAN BELKUM e VERBRUGH, 1997).
A colonização nasal por S. aureus está intimamente relacionada à colonização da
superfície cutânea, tornando-se motivo de preocupação ao serem considerados os
procedimentos cirúrgicos (FELIX JUNIOR, 2007; SANTOS e DARINI, 2002), e sua
eliminação nas fossas nasais poderia interromper infecções de origem endógenas
(MENOGOTTO e PICOLI, 2007; VON EIFF et al., 2001). A colonização nasal de S.
aureus é a principal responsável pela colonização da superfície cutânea, tornando-se
motivo de preocupação ao se considerar a prevalência desses micro-organismos na
população em geral e entre trabalhadores hospitalares (SANTOS et al., 2007; SANTOS
e DARINI, 2002).
No Brasil, estudo realizado entre mães, filhos e cuidadores saudáveis em um
centro de convivência de medicina em São Paulo mostrou uma prevalência de 58,2% de
portadores nasais de S. aureus (SANTOS e DARINI, 2002). Entre residentes de
medicina de um hospital ensino do Paraná, observou-se uma prevalência de 17,68%
(HESHIKI et al., 2002). Estudos demonstram que não existe diferença na positividade
dos S. aureus entre os funcionários que prestam assistência direta e os demais
(SANTOS, 1987; VIEIRA e SANTOS, 2007; VOSS, 2004).
A detecção do portador nasal de S. aureus assintomático em ambiente hospitalar
e comunitário é importante para a compreensão da epidemiologia da infecção
16
(CARDOSO, 2007) e para avaliar o risco para sua aquisição e transmissão
(KUEHNERT et al., 2006; LU et al., 2005).
A prevalência de S. aureus entre a população sadia tem sido de 40% entre a
comunidade universitária; segundo estudo realizado entre estudantes universitários da
área da saúde de uma Universidade Estadual do Paraná (PRATES, 2008), foi observado
um percentual expressivo de cepas multirresistentes, particularmente entre os membros
do staff hospitalar (SANTOS et al., 2007).
A colonização de trabalhadores hospitalares pode variar de 30% a 70%, podendo
atingir 90%, dependendo das condições ambientais, dos pacientes atendidos, do uso de
antimicrobianos e da própria estrutura do hospital. Em adultos sem ligação com o
ambiente hospitalar, a variação deveria se limitar entre 20% e 50% (MANDELL,
BENNETT e DOLIN, 2005; SANTOS, 2000).
Menegotto e Picoli (2007), ao estudar uma população sem fatores de risco,
verificaram uma prevalência de 40% para o S. aureus e 7,5% de resistência à oxacilina.
Em sua pesquisa, os autores destacam a escassez de estudos de S. aureus resistente à
oxacilina no Brasil.
Existem alguns fatores de risco para a colonização ou infecção pelo S. aureus
multirresistente, entre eles o uso prolongado de antimicrobianos, a imunossupressão, as
internações em unidades de terapia intensiva, as cirurgias e exposição a pacientes já
colonizados (CHAMBERS, 2001; HONG e GORAN, 2006; MARTINS, 2002;
RICARDO, 2004; SAIID-SALIM, MATHEMA e KREISWIRTH, 2003).
Estudantes de Enfermagem desenvolvem parte de sua formação acadêmica em
ambiente hospitalar e estão propensos a adquirir e também a veicular micro-organismos,
entre os quais os S. aureus. A identificação de portadores assintomáticos entre grupos
de estudantes, em ambiente hospitalar e comunitário, é importante para se conhecer a
epidemiologia da infecção estafilocócica.
Os hospitais universitários de grande porte são considerados centros de
referência, e por esse motivo recebem um grande número de pacientes, incluindo casos
graves que muitas vezes necessitam de unidades de terapia intensiva, facilitando assim a
disseminação do S. aureus multirresistente (FELIX JUNIOR, 2007; LEISER, TOGNIM
e BEDENDO, 2007; MOREIRA et al., 1998).
17
Os S. aureus são versáteis em desenvolver resistência aos antimicrobianos, e já
na década de 1942 e 1961 observou-se resistência à penicilina e oxacilina,
respectivamente (DEURENBERG e STOBBERINGH, 2008; ENRIGHT et al., 2002;
MAXWEL et al., 1969; MENEGOTTO e PICOLI, 2007). O surgimento de amostras
resistentes à penicilina, oxacilina/meticilina e à vancomicina foi inevitável, devido à
grande exposição que estes micro-organismos sofreram frente aos diferentes
antimicrobianos (CHAMBERS, 2001; MOURA e GIR, 2007).
A origem dos S. aureus comunitário resistente à meticilina (CA-MRSA) ainda é
indefinida, todavia existe a hipótese de que esse micro-organismo tenha sofrido mutação
ao adquirir o gene de resistência a partir de cepas de origem hospitalar (MENEGOTTO
e PICOLI, 2007). Os S. aureus meticilino-resistentes (MRSA) inicialmente estavam
restritos ao ambiente hospitalar, contudo a partir de 1990 começaram relatos de MRSA
associados à comunidade (CA-MRSA) em indivíduos sem fatores de risco (MIMICA e
MENDES, 2007).
Estudos realizados em Nova York indicaram que S. aureus resistentes à
meticilina foram isolados em cerca de 30% das infecções hospitalares e associados a
50% das mortes (SHOPSIN et al., 2000).
Shopsin et al. (2000) identificaram 32% de prevalência de S. aureus sensível à
meticilina entre crianças e seus acompanhantes em um hospital dos EUA, e Hidron et
al. (2005) detectaram, em um hospital de Atlanta, uma prevalência de 23,7% de S.
aureus, sendo que 16,4% eram sensíveis à meticilina e 7,3% foram resistentes.
A tipagem bacteriana tem como finalidade identificar a origem e a disseminação
de infecções e vários métodos podem ser utilizados, entre os quais a biotipagem, a
sorotipagem, a fagotipagem e a resistotipagem. Atualmente, entretanto, os métodos
mais utilizados são os genotípicos, através de algumas variações da técnica de reação
em cadeia da polimerase (PCR), com a utilização de primers específicos (TEIXEIRA et
al., 2008; TENOVER et al., 1994).
O gene que codifica a resistência bacteriana às drogas localiza-se no
cromossomo ou em plasmídios, sendo esse DNA transmitido mais facilmente por
conjugação (NEVES et al., 2007). A identificação do tipo de resistência e a forma pela
qual é transmitida pode ser um instrumental importante na prevenção e controle da
infecção estafilocócica de origem hospitalar ou comunitária.
18
Para a tipagem genotípica e a identificação do gene que codifica a resistência
bacteriana utiliza-se a técnica de PCR, conforme concebida por Kary Mullis, que é um
método rápido, sensível e específico (ANTONINI, MENIGHIN e URASHIMA, 2004;
VANNUFFEL et al., 1995). Essa técnica é capaz de amplificar milhões de vezes um
segmento de DNA a partir de uma única molécula, sendo extremamente útil e versátil
no estudo de micro-organismos (COOKSON et al., 2007; SILVA-PEREIRA, 2003).
O primer RW3A apresenta uma sequência repetitiva de nucleotídeos com as
seguintes bases: 5’ TCGCTCAAAACAACGACACC 3’ (DEL VECCHIO et al., 1995;
REINOSO et al., 2007). Através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
ocorre a formação de vários fragmentos, segundo Del Vecchio et al. (1995), podendo
variar entre 3 e 12. Esses fragmentos podem ser visualizados através da eletroforese dos
produtos amplificados em gel de agarose, o que possibilita a construção de um
dendograma, demonstrando a similaridade entre as amostras.
O desenvolvimento da técnica de PCR para estudo de resistência bacteriana às
drogas de uso clínico implica a busca de marcadores específicos. A resistência à
oxacilina é codificada por genes que compõem um cassete cromossômico denominado
SCCmec, que congrega sete genes de resistência I, II, III, IV, V, VI e VII
(DEURENBERG e STOBBERINGH, 2008; SANTOS et al., 2007). O elemento mec IV
se encontra associado ao CA-MRSA (MENEGOTTO e PICOLI, 2007).
A resistência à oxacilina é mediada por um gene chamado mecA, porém outros
mecanismos podem estar envolvidos, tais como alteração na permeabilidade da
membrana, degradação enzimática dos antimicrobianos e alteração no sítio ativo. Não
obstante, a presença do gene indica que essa resistência pode ser transmitida a outras
gerações através da conjugação (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS
INSTITUTE, 2009c).
Para a determinação da resistência à oxacilina e à vancomicina, o Clinical and
Laboratory Standards Institute (2009c), documento M07-A8, preconiza a realização do
teste de Concentração Inibitória mínima (CIM). O documento técnico não apresenta
parâmetro para a aferição do tamanho do halo de inibição para vancomicina. Uma
amostra só poderá ser confirmada como resistente à vancomicina após a realização do
teste da concentração inibitória mínima (BROWN et al. 2005).
19
Considerando o exposto, o presente estudo teve por objetivo identificar a
prevalência, o perfil fenotípico e genotípico de amostras de Staphylococcus aureus
isoladas dos vestíbulos nasais de estudantes de Graduação em Enfermagem para melhor
compreender o papel do portador nasal na epidemiologia da infecção.
20
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Identificar a frequência de carreamento, o perfil fenotípico e genotípico de
amostras de Staphylococcus aureus isoladas do vestíbulo nasal de estudantes de
Graduação em Enfermagem.
2.2. Objetivos Específicos
Verificar a prevalência de carreamento nasal de Staphylococcus aureus entre
estudantes de Graduação em Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá.
Avaliar o perfil de resistência à oxacilina e aos diferentes antimicrobianos de
amostras de Staphylococcus aureus isolados dos vestíbulos nasais.
Comparar os resultados da resistência à oxacilina e à vancomicina obtidos
através do teste de disco difusão e do teste Concentração Inibitória Mínima (CIM).
Identificar o perfil genético das amostras de Staphylococcus aureus resistentes à
oxacilina através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) empregando a
sequência repetitiva RW3A.
Determinar a presença do gene mecA em amostras de Staphylococcus aureus
resistentes à oxacilina, através da técnica de PCR.
21
3. REVISÂO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Origem, morfologia e epidemiologia dos Staphylococcus aureus
O gênero Staphylococcus possui 37 espécies, das quais 17 podem ser isoladas de
seres humanos. Três espécies de S. aureus apresentam maior importância clínica: o
Staphylococcus saprophyticus, comum em infecções do trato urinário em mulheres, o
Staphylococcus epidermidis, geralmente associado a dispositivos e aparelhos
implantados, e o Staphylococcus aureus, capaz de provocar desde infecções cutâneas e
toxinfecções alimentares até infecções graves e fatais (BRAGA et al., 2009; JAWETZ,
MELNICK e ADELBERG, 1998; NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY
INFORMATION, 2006; SANTOS et al., 2007).
Os S. aureus são capazes de promover processos infecciosos, tanto de origem
hospitalar quanto comunitária, causados por bactérias do próprio indivíduo, de outros
doentes ou de portadores sadios. Geralmente estão associados a infecções superficiais e
discretas, mas em indivíduos imunodeprimidos se tornam graves e fatais (MARTINS,
2002, TEIXEIRA et al., 2008; TORTORA, FUNKE e CASE, 2005).
Pela primeira vez, em 1880, os S. aureus foram descritos pelo cirurgião
Alexandre Ogston, em secreção (pus) de abcesso cirúrgico (SANTOS et al., 2007).
Morfologicamente são cocos Gram e coagulase positivos, encontrados em diversas
formas, desde isolados, aos pares ou agrupados, semelhante a um cacho de uva
(MARTINS, 2002; SANTOS et al., 2007). Fermentam a glicose com a produção de
ácido em aerobiose e em anaerobiose, sendo este facultativo (KLUYTMANS; VAN
BELKUM e VERBRUGH, 1997).
Os S. aureus tem aproximadamente entre 0,5 e 1,5µm de diâmetro, são imóveis,
não esporulados e geralmente não encapsulados, pertencentes à família Micrococcae
(JAWETZ, MELNICK e ADELBERG, 1998; SANTOS et al., 2007).
Os Staphylococcus crescem rapidamente na maioria dos meios a 37º C, porém é
em temperatura ambiente que melhor forma seu pigmento, em meio sólido apresenta-se
arredondado, elevado e brilhante. As colônias geralmente possuem a cor acinzentada ou
amarelo-dourado intenso, sendo de fácil identificação (JAWETZ, MELNICK e
ADELBERG, 1998).
22
O MRSA está presente em todo o mundo, e principalmente na América Latina.
De acordo com Guzmán-Blanco (2009), os dados da Pan American Health Organization
e da Pan-American Association of Infectious Diseases informam que em vários países o
índice ultrapassou os 40%. Na Figura 1, é possível observar a distribuição da
prevalência de MRSA na América Latina.
Figura 1 - Distribuição da prevalência de MRSA na América Latina
3.2 Histórico e mecanismo de resistência antimicrobiana dos Staphylococcus aureus
A resistência do S. aureus iniciou com a introdução dos antimicrobianos. Em
1942, já eram relatadas cepas resistentes à penicilina, utilizadas há apenas dois anos,
23
com uma resistência de 80% a 90% em ambiente hospitalar no final de 1960 (MIMICA
e MENDES, 2007). Alguns autores acreditam que a resistência à penicilina,
meticilina/oxacilina e à vancomicina são consequências inevitáveis da exposição aos
diversos antimicrobianos (CHAMBERS, 2001).
A produção de penicilinas semissintéticas em 1959, com a modificação na
cadeia do precursor da penicilina, resultou na proteção do anel betalactâmico contra a
ação hidrolítica das betalactamases. A meticilina foi a primeira penicilina sintética,
contudo em 1961 surgiram as primeiras cepas resistentes (MOREIRA et al., 1998;
MIMICA e MENDES, 2007).
Souza, Reis e Pimenta (2008) afirmam que três mecanismos distintos são
responsáveis pela resistência à meticilina: a hiperprodução de beta-lactamases, a
presença de uma proteína ligadora de penicilina e as modificações na capacidade de
ligação das PBPs.
Os antimicrobianos β-lactâmicos interagem com as proteínas ligadoras de
penicilina, situadas nas membranas da célula e responsáveis pela biossíntese da parede
celular, impedindo a formação completa da camada de peptideoglicano da parede
celular. O gene mecA altera essas proteínas de membrana, codificando uma nova
proteína de ligação denominada PBP2a com baixa afinidade por β-lactâmicos, e dois
genes regulatórios, o mecI e o mecRI, constituindo o complexo cromossômico mec
estafilocócico (SCCmec) (MENEGOTTO e PICOLI, 2007; NEVES et al., 2007).
Existem alguns genes que auxiliam o gene mecA a expressar um alto nível de
resistência aos β-lactâmicos, denominados genes auxiliadores, fatores essenciais ou
genes fem (factor essential for methicillin resistance). Seis genes fem foram
identificados: femA, femB, femC, femD, femE e femF. O gene femA e o gene mecA estão
relacionados à resistência do S. aureus à oxacilina/meticilina, sendo de grande
importância a sua detecção. Ambos os genes podem ser detectados através da técnica de
PCR (VANNUFFEL et al., 1995).
Estudo realizado apontou sete tipos de cassetes cromossomais estafilocócicos
relacionados à meticilina, sendo eles: SCCmec I, II, III, IV, V, VI e VII (SANTOS et al.,
2007), sendo o elemento mec IV associado ao CA-MRSA (MENEGOTTO e PICOLI,
2007). Higuchi et al. (2008) e Deurenberg e Stobberingh (2008) assinalam que, além do
elemento IV, os elementos V e VII também estão associados ao CA-MRSA, os
24
elementos I, IV, V, VI e VII, estão associados à resistência aos antimicrobianos
betalactâmicos, e os elementos II e III associados à resistência de múltiplas drogas.
Os S. aureus meticilino-resistentes (MRSA), no início, estavam presentes apenas
em ambientes hospitalares, mas a partir de 1990 começaram relatos de MRSA
associados à comunidade (CA-MRSA) em indivíduos sem fatores de risco (MIMICA e
MENDES, 2007).
Existem outras enzimas e toxinas produzidas pelo S. aureus que participam dos
mecanismos de patogenicidade e de resistência (Figura 2). As toxinas induzem uma
resposta imune diferenciada para cada hospedeiro, determinando assim o grau de
severidade da infecção (SANTOS et al., 2007).
Saiid-Salim, Mathema e Kreiswirth (2003) pontuam que o S. aureus de origem
hospitalar (HA-MRSA) apresenta algumas características que o diferencia do S. aureus
de origem comunitária (CA-MRSA). O primeiro apresenta resistência a várias drogas,
estão associados à produção de várias toxinas e envolvidos em infecções graves
localizadas em vários sítios. O CA-MRSA ao contrário, possui uma resistência reduzida
aos antimicrobianos, com a produção de poucas toxinas, e geralmente encontram-se
envolvidos em infecções relacionados à pele e tecidos moles (Figura 2).
25
Figura 2 - Staphylococcus aureus de origem hospitalar e comunitária
Fonte: SAIID-SALIM, MATHEMA e KREISWIRTH, 2003.
A susceptibilidade reduzida dos S. aureus a vancomicina (VISA) surgiu em
1996 no Japão, e em 2002, nos EUA, a primeira cepa resistente à vancomicina (VRSA)
(MIMICA e MENDES, 2007; SAIID-SALIM, MATHEMA, KREISWIRTH, 2003;
SANTOS et al., 2007). No Brasil, em 2000, foi encontrada a primeira cepa resistente à
vancomicina, em um hospital de Queimados no Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2007).
Poucos estudos têm sido realizados com relação à resistência do S. aureus à
vancomicina (FRIDKIN et al., 2003). Acredita-se que o mecanismo de resistência do S.
aureus a este antimicrobiano pode estar relacionado ao envolvimento do gene Van, que
determina a resistência a essa droga em Enterococcus sp com a transmissão por meio de
26
plasmídios, ou pelo espessamento da parede celular, com a produção de maiores
quantidades de peptideoglicano e de monômeros de mureína (CUI et al., 2006; SAIID-
SALIM, MATHEMA e KREISWIRTH, 2003; SANTOS et al., 2007).
3.3 Carreamento dos Staphylococcus aureus
O S. aureus está presente na pele e mucosas dos seres humanos, principalmente
em fossas nasais. Indivíduos que carream o S. aureus e não apresentam sintomatologia
são genericamente conhecidos como “portadores são ou assintomáticos”, sendo
considerados uma das principais fontes de transmissão tanto da infecção nosocomial
quanto da comunidade (LU et al., 2005; ONONUGA, OYI e ONAOLAPO, 2005;
SANTOS e DARINI, 2002).
Observa-se que os principais sítios de colonização do S. aureus são o vestíbulo
nasal, com cerca de 35%, seguido pela região perineal, com cerca de 20%; outras
regiões também podem albergar esse micro-organismo, como as regiões umbilical,
axilar e interpododáctila, que, juntas, apresentam entre 5% a 10% (CAVALCANTE et
al., 2006).
Com o decorrer dos anos, a partir do nascimento, há uma diminuição da
prevalência nasal de S. aureus. Entretanto entre os recém-nascidos, até o décimo quinto
dia de vida, essa taxa pode ser de até 100% (CARDOSO, 2007; CHAMBERS, 2001).
Indivíduo colonizado é uma importante fonte de transmissão de S. aureus,
sobretudo para familiares, amigos e contactantes. Profissionais de saúde, por
conviverem em ambiente hospitalar, podem albergar e disseminar estirpes
multirresistentes (CHAMBERS, 2001), agravando a morbimortalidade por doenças
estafilocócicas.
3.4 Testes antimicrobianos
Os testes de sensibilidade são indicados, principalmente, quando se acredita que
o micro-organismo causador pertence a uma espécie capaz de apresentar resistência aos
agentes antimicrobianos. Vários são os mecanismos de resistência: a produção de
enzimas que inativam as drogas, a alteração do sítio-alvo das drogas e a alteração da
absorção ou do efluxo das drogas (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS
INSTITUTE, 2009c).
27
Existem vários testes para detecção de resistência aos diversos antimicrobianos,
entre eles o teste de disco difusão, o teste de ágar diluição em meio sólido ou líquido
para detecção da concentração inibitória mínima (CIM) e os E-test. Este é uma técnica
nova, prática e rápida que não necessita de equipamentos (CLINICAL AND
LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2009c; FELIX JUNIOR, 2007; ETM,
2009).
Os métodos de diluição em caldo ou ágar, assim como o teste de disco difusão
são igualmente aceitos para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente
antimicrobiano (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE,
2009c).
Diversos são os antimicrobianos preconizados pelo Clinical and Laboratory
Standards Institute (2009b) para a realização do Teste de Disco Difusão para S. aureus.
Para sua realização, existe a necessidade de protocolos, padronizações e,
particularmente, medidas do diâmetro do halo de inibição.
A utilização do E-test apresenta grande importância clínica, pois norteia o
tratamento dos pacientes. Esse recurso consiste em uma fita estreita de material plástico
que contém um gradiente com concentrações crescentes de antibiótico, que é colocada
em placas de Petri contendo ágar Mueller-Hinton de maneira semelhante ao teste de
difusão em disco (FERREIRA, 1996).
A fita de E-test é utilizada na mesma temperatura, aplicada aos testes de
difusão em discos, e sua principal vantagem é fornecer o valor da concentração
inibitória mínima diretamente (ETM, 2009).
3.5 Estudo genotípico
Vários são os métodos genotípicos utilizados tanto para localização de genes
específicos quanto para a realização de tipagem genética, os quais baseiam-se na análise
da estrutura genética de um organismo, sendo menos sujeitos à variação natural, apesar
de serem afetados por inserções ou deleções de DNA no cromossomo, por ganho ou
perda de DNA extra cromossômico ou por mutações ao acaso que podem criar ou
eliminar sítios de restrição para as endonucleases (TENOVER, 1997).
Com a tipagem genética é possível localizar amostras bacterianas geneticamente
relacionadas que são indistintas umas das outras, ou amostras tão similares que se
28
presume serem derivadas de um ancestral comum, denominadas clones (TENOVER,
1997).
A técnica de PCR envolve basicamente um ciclo com três etapas: a
desnaturação, o anelamento e a extensão. A primeira etapa ocorre mediante a elevação
da temperatura e o anelamento através da queda da temperatura rapidamente, de 92
o
C
ou 95
o
C
a 35
o
C ou 60
o
C, dependendo do primer utilizado. A extensão ocorre a 72ºC
com a adição de nucleotídeos, utilizando como molde a sequência alvo (ANTONINI,
MENEGHIN e URASHIMA, 2004).
O ciclo é repetido por várias vezes, na medida em que a quantidade de DNA da
sequência-alvo dobra a cada ciclo, a amplificação segue uma progressão geométrica, de
maneira que, depois de apenas 20 ciclos, produz-se mais de um milhão de vezes a
quantidade inicial de sequência-alvo (ANTONINI, MENEGHIN e URASHIMA, 2004).
A técnica de PCR permite iniciar com quantidades mínimas de DNA e terminar
a reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica de interesse. A
PCR apresenta uma facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade, o que torna essa
técnica particularmente poderosa para estudos genético-moleculares envolvendo grande
número de indivíduos de qualquer micro-organismo vivo (ANTONINI, MENEGHIN e
URASHIMA, 2004).
Os primers utilizados nas reações de PCR são sintetizados artificialmente, de
maneira que suas sequências de nucleotídeos sejam complementares às sequências
específicas que flanqueiam a região-alvo (ANTONINI, MENEGHIN e URASHIMA,
2004). Existem inúmeros primers de sequência repetitiva que podem ser utilizados:
RW3A, IS-256, REP-PCR.
O sequenciamento de DNA é uma técnica utilizada para tipagem de micro-
organismos, com vantagens na velocidade, dados precisos e simplicidade na criação de
base de dados em larga escala, entre elas se encontra a técnica de “Multilocus Sequence
Typing” (MLST) um método molecular com alto poder discriminatório, que caracteriza
isolados bacterianos com base nas sequências de fragmentos com aproximadamente 450
pb, de sete genes conservados (ENRIGHT et al., 2000).
29
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Caracterização do estudo
Este estudo, do tipo transversal, foi desenvolvido na Universidade Estadual de
Maringá (UEM), que oferece dezenas de cursos de graduação e pós-graduação. Destaca-
se que o curso de Enfermagem tem duração de quatro anos, e aproximadamente 40
alunos por ano (UEM, 2009).
O curso de Graduação em Enfermagem possui 40 alunos por turma, e a
população sujeito desta pesquisa foi composta por 40 acadêmicos do primeiro ano de
Enfermagem, 32 acadêmicos do segundo ano e 29 acadêmicos do terceiro ano,
totalizando 101 alunos.
O estudo foi realizado entre maio de 2008 e maio de 2009, utilizando para a
análise dos dados o método de proporções e frequências simples.
As amostras foram coletadas em períodos diferentes para cada ano. Os alunos do
primeiro ano de graduação foram submetidos a uma coleta antes de iniciarem o Estágio
Curricular em ambiente hospitalar. Os demais alunos, no momento da coleta, já haviam
iniciado Estágio em ambiente hospitalar.
Participaram da pesquisa os acadêmicos de Enfermagem que concordaram em
participar e que no momento da coleta não apresentavam sinais e sintomas clínicos de
infecção, como febre, tosse produtiva e coriza.
Os acadêmicos foram orientados quanto aos objetivos da pesquisa, e sendo
esclarecidos de suas dúvidas referentes ao anonimato das informações, para posterior
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 1) e em
seguida foram convidados a responder um questionário estruturado (Anexo 2),
numerado segundo a ordem de entrega.
4.2 Procedimentos
4.2.1. Coleta de material biológico
O material foi obtido através da fricção de um swab estéril em ambos os
vestíbulos nasais, e posteriormente depositado em tubos contendo caldo de Soja
30
Tripticaseína (TSB) enriquecido com 6,5% de Cloreto de Sódio, em estufa a 37º C por
24 horas.
4.2.2 Semeadura
Após o armazenamento por 24 horas em estufa a 37º C, o material foi semeado
na superfície de placas de Petri (90X15 mm) contendo Agar Manitol Salgado (AMS),
(Becton Dicksenson and Company, BD Diagnostic Systems, USA), com e sem
oxacilina, em uma concentração de 4 µg/ml e incubado por 24-48 horas a 37º C. Em
todas as fases da semeadura foram utilizadas amostras controle de S. aureus da
American Type Culture Collection (ATCC), sendo uma amostra sensível (ATCC 25923)
e uma resistente à oxacilina (ATCC 43300).
Colônias suspeitas de pertencerem a S. aureus foram submetidas ao teste de
Coloração de Gram (DIAS FILHO et al., 2001) e aquelas identificadas como cocos
Gram positivo agrupados em cachos de uva foram transferidas para um caldo com TSB
adicionado 6,5% de NaCl. Após seis horas de incubação foi realizado o Teste de
Coagulase em tubo (KONEMAN et al. 2008).
Para o teste da coagulase utilizou-se plasma de coelho liofilizado (Coagulo-
Plasma LB, Laborclin produtos para laboratório Ltda., Pinhais Paraná, Brasil),
considerado positivo após formação de um coágulo, cujas leituras foram realizadas em
30 minutos, quatro horas e 12 horas (KONEMAN, et al., 2008).
4.2.3 Estocagem
Após os testes de identificação, as colônias foram semeadas em placas contendo
Agar Mueller Hinton (AMH) (Becton Dicksenson and Company, BD Diagnostic
Systems, USA) e incubadas por 48 horas em estufa a 37º C, e em seguida por 24 h em
temperatura ambiente. Essas placas, posteriormente, foram raspadas com alças e as
colônias estocadas em um meio TSB com glicerol (20%), e congeladas em freezer a –
20º C para estudos posteriores.
31
4.3 Suscetibilidade aos antimicrobianos
4.3.1 Teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O CIM foi realizado para a oxacilina e para a vancomicina, através do método de
agar diluição, utilizando-se de diferentes concentrações de antimicrobianos, iniciando
pela metade da menor concentração da cepa padrão utilizada (ATCC 29213). Um
controle positivo também foi utilizado, a ATCC 33591.
Para a preparação do antimicrobiano foi utilizada a seguinte fórmula:
Peso (mg) = Vol. do solvente (ml) X Conc. Da solução estoque (mg/ml)
Potência do antibiótico (µg/ ml)
A solução estoque do antimicrobiano foi esterilizada por filtração em membrana
Millipore® de 0,22 µm de diâmetro e mantida resfriada até diluição. As concentrações
testadas iniciaram se em 256 µg/ml para a oxacilina e 32 µg/ml para a vancomicina.
O teste foi realizado em Agar Muller-Hinton, preparado em quantidade
suficiente para se realizar todas as diluições dos antimicrobianos. Em seguida foi
aliquotado 19 ml em cada tubo, esterilizados em autoclave, mantidos em banho-maria
até atingirem a temperatura de aproximadamente 50
o
C, para que não ocorresse a
degradação do antimicrobiano.
Após o resfriamento dos tubos contendo AMH, a eles foram acrescentados 1 ml
do antimicrobiano (já anteriormente diluído nas concentrações utilizadas), totalizando
20 ml; em seguida, os tubos foram homogeneizados e distribuídos em placas de Petri.
As amostras analisadas foram anteriormente submetidas à incubação por 24
horas em AMH. Para o preparo do inóculo foi utilizada como referência uma suspensão
de concentração referente ao tubo 0,5 de MacFarland (1,5 x 10
8
UFC/mL), em seguida
retirados 100µl dessa suspensão e colocados em tubos contendo 900µl de caldo
Mueller-Hinton, e desses distribuídos 200 µl de cada suspensão bacteriana em placas de
Elisa de 96 poços.
Para a aplicação das amostras nas placas de AMH, contendo as diferentes
concentrações do antimicrobiano, foi utilizado um aplicador de 28 pinos. A viabilidade
32
das amostras foi testada inoculando em placa-controle, sem antimicrobiano.
Posteriormente, inoculada nas placas contendo os antimicrobianos, na sequência
crescente das concentrações.
No final da série, as amostras foram novamente inoculadas em uma placa
controle sem antimicrobiano, para se avaliar a contaminação durante o procedimento.
Após a secagem, estas foram incubadas a 37º C por 24 horas, e sua leitura comparada
àqueles propostos pelo documento M07-A8 (CLINICAL AND LABORATORY
STANDARDS INSTITUTE, 2009b).
4.3.2 Teste de disco difusão
A realização deste teste foi baseada nas recomendações do documento M07-A8
(CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2009b), que
preconiza as seguintes drogas: penicilina G 10U, oxacilina 1 µg, cefoxitina 30 µg,
eritromicina 15 µg, clindamicina 2 µg, trimetropina sulfametoxazol 1,25/23,75 µg,
vancomicina 30 µg, telitromicina 15 µg, linezolida 30 µg, tetraciclina 30 µg, doxiciclina
30 µg, rifampicina 5 µg, gentamicina 10 µg, ofloxacina 5 µg e teicoplanina 30 µg.
Inicialmente, preparou-se uma suspensão bacteriana com turvação equivalente à
escala 0,5 de MacFarland, e inoculada na superfície de placas de ágar Muller-Hinton,
em seguida, depositados os discos com uma pinça estéril. Utilizou-se para controle a
cepa se S. aureus ATCC 25923.
As placas foram incubadas a 37º C durante 24 horas, e em seguida comparados
os diâmetros dos halos com os descritos na Tabela 2C, M2-A9, do Clinical and
Laboratory Standards Institute (2009b).
4.4 Reação em cadeia da polimerase
4.4.1 Extração de DNA
Para a extração do DNA das amostras de S. aureus, foi utilizada metodologia
proposta por Doyle e Doyle (1987), e as amostras foram plaqueadas em AMH, após um
crescimento de 24-48 horas, as colônias foram transferidas para eppendorf contendo
Tris-EDTA (TE) e centrifugadas a 8000 rpm, o sobrenadante foi desprezado e o pellet
suspenso em 600 µl de Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) e 40 µl de de CIA,
33
em seguida aquecidos em banho-maria a 65
o
C por minutos para a lise da parede
bacteriana.
Posteriormente, foi acrescentado 800 µl de CIA e centrifugado a 12000 rpm por
5 min. Cerca de 600 µl do sobrenadante foram transferidos para um outro eppendorf,
com o mesmo volume de isopropanol gelado, e deixado em freezer a -20
o
C overnight
para a precipitação do DNA. A seguir, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por
20 minutos, a uma temperatura de 4
o
C. Eliminou se o sobrenadante, sendo realizada
nova centrifugação após acrescentar 200 µl de etanol 70%. Eliminado o etanol e após
serem secados aos tubos de eppendorf foram acrescentados 200 µl de TE e armazenados
em freezer a -20
o
C. A presença do DNA genômico foi detectada em gel de eletroforese
a 2% por 40 minutos a 100 volts.
4.4.2 Genotipagem
A tipagem genética foi realizada através da técnica de PCR, com a utilização dos
oligonucleotídeos (primers) RW3A (5’ TCGCTCAAAACAACGACACC 3’)
conforme metodologia proposta por DEL VECCHIO et al. (1995), Van Belkun et al.
(1995) e Reinoso et al. (2007), com algumas alterações.
Para a reação com 25 µl foram utilizados como reagentes 9,35 µl de água Milli
Q estéril, 2,5 µl de Tampão 10X, 0,4 µl de Taq polimerase 5U/L, 3,0 µl de dNTP 200
µM, 3,0 µl de Cloreto de Magnésio, 2,25 µl de DMSO, 1,5 µl de primer a 50 pmol, e
3,0 µl de DNA. As reações foram realizadas em termociclador com a seguinte ciclagem:
94º C por 5 minutos, 40 ciclos de: 93º C por 1 minuto, 37º C por 1 minuto, 72º C por 1
minuto, e por fim, 72 ºC por 8 minutos, permanecendo a 4
o
posteriormente.
4.4.3 Reação de amplificação para o gene mecA
As amostras de S. aureus identificadas como resistentes à oxacilina foram
submetidas à técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificação do
gene Mec A. Foram utilizados os seguintes primers: MRS1 5’ TAGAAATGACTCCG
3’ e MRS2 5’ TTGCGATCAATGTTACCGTAG 3’. A reação foi realizada conforme
metodologia proposta por DEL VECCHIO et al. (1995) e Siripommongcolchain et al.
(2002), com algumas alterações.
34
Para a reação com 25 µl foram utilizados como reagentes: 12,1 µl de água Milli
Q estéril, 2,5 µl de Tampão 10X, 0,4 µl de Taq polimerase 5U/L, 1,5 µl de dNTP 200
µM, 1,5 µl de Cloreto de Magnésio, 1,5 µl de cada primer a 50 pmol, e 3,0 µl de DNA.
As reações foram realizadas em termociclador com a seguinte ciclagem: 95º C por 10
minutos, 30 ciclos de: 95º C por 30 segundos, 52º C por 30 segundos, 72º C por 1
minuto, e por fim, 72º C por 10 minutos, como controle foi utilizada a cepa S. aureus
ATCC 33591, por ser resistente à oxacilina.
4.5 Eletroforese
A eletroforese dos produtos amplificados foram realizadas em gel de agarose a
1,5%, corados com brometo de etídio, a 90 volts, por 3 horas para a tipagem genética, e
por 1 hora para a visualização de um fragmento de 154 pares de bases (DEL VECCHIO
et al., 1995), que indica a presença do gene MecA. A análise dos padrões de bandas na
tipagem foi realizada visualmente e o grau de similaridade entre as amostras foi
determinado através do programa NTSYS que proporciona o dendograma.
4.6 Comitê de Ética
Para a realização desta pesquisa, foram respeitados todos os preceitos contidos
na Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, do Ministério da Saúde, que
disciplina as pesquisas com Seres Humanos. O presente Projeto foi avaliado e aprovado
pelo Comitê Permanente de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos (COPEP) da
UEM, sob o parecer 536/2008 (BRASIL, 1996) (Anexo 3).
5. RESULTADOS
Dentre as 101 amostras coletadas, verificou-se uma positividade de 90,1%
(91/101) para o S. aureus. Houve uma predominância do sexo feminino (94,5%), e a
idade variou entre 17 e 33 anos, com 61,5% entre 17 e 20 anos (Tabela 1).
Tabela 1 – Características dos estudantes de Enfermagem da Universidade Estadual de
Maringá, Maringá, 2008
Características N %
Excluído:
Quebra de página
35
Sexo
Feminino
Masculino
Idade
Até 20 anos
Entre 21 e 25 anos
Acima de 25 anos
Não informado
86
05
56
25
08
02
94,5
5,5
61,5
27,5
8,8
2,2
A distribuição da frequência segundo os anos de graduação mostrou que no
primeiro ano 100% (40/40) dos acadêmicos eram portadores; no segundo, foram 84,4%
(27/32), e no terceiro 82,8% (24/29).
Todas as amostras foram sensíveis à vancomicina, sendo que o CIM variou entre
0,5 µg/ml e 2 µg/ml.
Foi possível observar que 87,5% das amostras resistentes à oxacilina
apresentaram a CIM em relação à vancomicina de 2µg/ml, e apenas uma apresentou a
CIM de 1 µg/ml.
Em relação à oxacilina, oito amostras foram resistentes pelo teste de Agar
diluição para determinação da CIM. A Tabela 2 apresenta a distribuição acumulativa da
CIM para oxacilina nos diferentes anos da graduação, demonstrando um aumento da
concentração com o decorrer dos anos de graduação na medida em que ocorria maior
exposição ao ambiente hospitalar.
Tabela 2 – Distribuição acumulativa da concentração inibitória mínima nos diferentes
anos de graduação relacionado à oxacilina, Maringá, 2008
µg/ml 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 CIM
50
CIM
90
Total
1
o
ano
10 18 05 03 02 - - - 01 - - 01 0,25 01 40
2
o
ano
05 15 01 04 01 01 - - - - - - 0,25 01 27
3
o
ano
- 11 06 02 - 01 01 - - 03 - - 0,5 64 24
Total 15 44 12 09 03 02 01 - 01 03 - 01 0,25 02 91
CIM
50
: valor da concentração inibitória mínima em que se localizam cinqüenta por cento das amostras
CIM
90
: valor da concentração inibitória mínima em que se localizam noventa por cento das amostras
Com relação ao antibiograma, observou-se um aumento da resistência bacteriana
com o decorrer dos anos de graduação. Mesmo sendo amostras oriundas da
comunidade, houve amplo espectro de resistência e alto percentual de amostras
36
resistentes às diversas drogas, especialmente a penicilina, telitromicina e a eritromicina,
que ultrapassa os 80%. A Tabela 3 mostra a distribuição da resistência aos
antimicrobianos dos S. aureus isolados de acadêmicos de Enfermagem nos diferentes
anos do curso de Graduação da Universidade Estadual de Maringá, 2008.
Destacou-se a alta prevalência de amostras resistentes de S. aureus entre alunos
do primeiro ano do curso, que são aqueles que tiveram pouca exposição ao ambiente
hospitalar. O percentual de resistência à cefoxitina (62,2%) e teicoplamina (5%) e
também a várias outras drogas entre os alunos do primeiro ano foi superior àqueles
obtidos para os demais grupos.
Das 12 amostras de S. aureus resistentes à oxacilina pelo método de disco
difusão, oito foram confirmadas pelo método de Agar diluição para determinação da
CIM, três amostras apresentaram um CIM próximo ao ponto de corte de 4 µg/ml, e
apenas uma amostra apresentou um CIM de 0,25 µg/ml.
Não foram identificadas amostras de S. aureus resistentes à vancomicina e
linezolide através do teste de disco difusão. O documento M07-A8 do CLSI (2009), que
preconiza diâmetro dos halos de resistência e sensibilidade para os diferentes
antimicrobianos, não determina para a vancomicina e para o linezolide com qual
diâmetro as amostras poderiam ser consideradas resistentes.
Tabela 3 – Distribuição da resistência aos antimicrobianos dos S. aureus isolados de
acadêmicos de Enfermagem nos diferentes anos do curso de graduação da Universidade
Estadual de Maringá, 2008
Antimicrobianos 1
o
ano
2
o
ano
3
o
ano
Total
Penicilina
33/40 (82,2)
26/27 (92,6)
24/24 (100)
80/91 (87,9)
Oxacilina
4/40 (10,0)
2/27 (7,4)
6/24 (25,0)
12/91 (13,2)
Cefoxetina
25/40 (62,2)
8/27 (29,6)
6/24 (25,0)
39/91 (42,9)
Eritromicina
26/40 (65,0)
26/27 (96,3)
23/24 (95,8)
75/91 (82,4)
Clindamicina
15/40 (37,5)
21/27 (77,8)
19/24 (79,2)
55/91 (60,4)
Trimetropin/sulfametoxazol
24/40 (60,0)
23/27 (85,2)
18/24 (75,0)
65/91 (71,4)
Vancomicina
----
----
----
----
Telitromicina
37/40 (92,5)
26/27 (96,3)
23/24 (95,8)
86/91 (94,5)
Linezolide
----
----
----
----
37
Tetraciclina
22/40 (55,0)
20/27 (74,1)
18/24 (75,0)
60/91 (65,9)
Doxiciclina
16/40 (40,0)
15/27 (55,6)
12/24 (50,0)
43/91 (47,3)
Rifampicina
17/40 (42,5)
13/27 (48,1)
11/24 (45,8)
41/91 (45,1)
Gentamicina
4/40 (10,0)
15/27 (55,6)
13/24 (54,2)
32/91 (35,2)
Ofloxacina
25/40 (62,5)
18/27 (66,7)
13/24 (54,2)
56/91 (61,5)
Teicoplamina
2/40 (5,0)
0
0
2/91 (2,2)
Entre as oito amostras de S. aureus resistentes à oxacilina pelo CIM, 100% (8/8)
apresentaram resistência à penicilina, ao trimetropim e à tetraciclina; 87,5% (7/8)
resistência à eritromicina e à telitromicina, e 75% (6/8) resistência à clindamicina e à
doxiciclina. Uma das amostras apresentou resistência a quase todas as drogas, sendo
sensível apenas à teicoplamina e à gentamicina. A Tabela 4 mostra a distribuição da
resistência aos antimicrobianos das oito amostras de S. aureus resistentes à oxacilina
isoladas de acadêmicos do Curso de Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá,
2008.
O método de disco difusão apresentou 12 amostras resistentes à oxacilina, sendo
que apenas oito tiveram essa resistência confirmada pelo teste de CIM. Comparando-se
os dois métodos, constatou-se que das quatro amostras não confirmadas pelo teste de
CIM três estavam próximas do ponto de corte para a resistência.
Tabela 4 – Distribuição da resistência aos antimicrobianos das oito amostras de S.
aureus resistentes à oxacilina isoladas de acadêmicos do Curso de Enfermagem da
Universidade Estadual de Maringá, 2008
Amostra
s
PE
N
CEF ERI CLI
TRI TEL LIN TET DO
X
RIF GE
N
OF
L
TEI
18 R R R R R R S R R R S S S
34 R S S S R I S R I S I R S
61 R R R R R R - R R S R S S
82 R R R R R R - R R R S R S
87 R R R S R R - R R S S S I
90 R S R R R R - R R S S S I
91 R R R R R R - R R S R S S
94 R S R R R R - R S R R R S
R: resistente; S: sensível; I: intermediário; PEN: penicilina; CEF: cefoxetina; ERI: eritromicina; CLI:
clindamicina; TRI: trimetropin/sulfametoxazol; VAN: vancomicina; TEL: telitromicina; LIN: linezolida;
38
TET: tetraciclina; DOX: doxiciclina; RIF: rifampicina; GEN: gentamicina; OFL: ofloxacina; TEI:
teicoplamina.
As amostras resistentes à oxacilina pelo método do CIM foram submetidas à
técnica de PCR e todas apresentaram o gene MecA. Duas amostras foram isoladas de
acadêmicos do primeiro ano; uma foi procedente de acadêmico do segundo ano e cinco
de acadêmico do terceiro. A Figura 3 indica os resultados da técnica de PCR utilizada
para detecção do gene MecA entre oito amostras de S. aureus oxacilina resistentes
isoladas de acadêmicos de graduação de Enfermagem da Universidade Estadual de
Maringá, Paraná.
As amostras de S. aureus resistentes à oxacilina foram submetidas à tipagem
genética através da técnica de PCR, utilizando o primer RW3A. Os resultados foram
inseridos no programa Numerical Taxonomy System (Exeter Software) e o dendograma
apontou que, das oito amostras, quatro tinham um grau de similaridade superior a 84% e
duas tiveram similaridade de 100%. Na Figura 4, visualiza-se o grau de similaridade
entre as oito amostras de S. aureus oxacilina resistentes isolados de acadêmicos de
Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá, Paraná.
Figura 3 - Resultados da técnica de PCR utilizada para detecção do gene mecA entre 8
amostras de S. aureus oxacilina resistentes isoladas de acadêmicos de graduação de
Enfermagem da Universidade Estadual de Maringá, Paraná
Canaleta 10: marcador de peso molecular (100pb DNA ladder, Invitrogen); canaletas 9: controle positivo
ATCC 33591; canaletas 8,7,6,5,4,3,2,1: amostras de S. aureus isoladas dos estudantes de graduação em
enfermagem.
39
As duas amostras de S. aureus com similaridade de 100% foram isoladas de
alunos do terceiro ano de Graduação em Enfermagem. Com relação à CIM da oxacilina,
uma apresentou 64 µg/ml e outra 8 µg/ml. As outras duas amostras com similaridade
superior a 84%, uma pertence a um aluno do terceiro ano e outra a um aluno do
primeiro ano de graduação, com CIM de 4 µg/ml e 256 µg/ml respectivamente.
40
Figura 4 - Grau de similaridade obtido pelo programa NTSYS das oito amostras de S.
aureus oxacilina resistentes isolados de acadêmicos de Enfermagem da Universidade
Estadual de Maringá, Paraná
6. DISCUSSÃO
O Curso de Enfermagem apresenta um perfil de alunos característico, composto
principalmente pelo sexo feminino e por uma população jovem. Os alunos de
Enfermagem nas universidades públicas com faixa etária entre 17 e 19 anos representam
uma clientela de 48% (SPÍNDOLA, MARTINS e FRANCISCO, 2008).
As infecções nosocomiais por S. aureus são de grande relevância,
particularmente quando essas infecções têm os profissionais de saúde como os
potenciais veiculadores, e poucos estudos têm sido desenvolvidos a esse respeito no
Brasil (PALOS, 2006).
Estudo realizado em Goiás em um hospital-escola, entre 2000 e 2001, verificou
que 60,2% dos casos de infecção hospitalar era provocada por MRSA (GUILARDE et
al., 2006).
O S. aureus está presente na pele e mucosas dos seres humanos, sobretudo nas
fossas nasais. Indivíduos que albergam S. aureus e não apresentam sintomatologia são
genericamente conhecidos como “portador são” e considerados uma das principais
fontes de transmissão da infecção tanto nosocomial quanto comunitária (LU et al.,
2005; ONONUGA, OYI e ONAOLAPO, 2005; SANTOS e DARINI, 2002).
Em se tratando de portador assintomático, especificamente o estudante, durante
a prática acadêmica hospitalar, é difícil a aplicação de medidas de prevenção e controle,
devido, principalmente, à proximidade física entre o prestador da assistência e o
paciente (SANTOS e DARINI, 2002).
A prevalência de carreamento nasal de S. aureus entre estudantes de
Enfermagem investigados neste estudo foi de 90,1%, configurando-se como alta em
41
consonância com alguns autores, que relatam que entre grupos de indivíduos que
trabalham em ambiente hospitalar essa taxa geralmente varia entre 30% e 70%, podendo
atingir até 90% (MANDELL, BENNETT e DOLIN, 2005; SANTOS, 2000).
A utilização de TSB enriquecido com NaCl para cultivo inicial incrementa o
isolamento de S. aureus, conforme já demonstrado em outros estudos (CARDOSO,
2007; COOKSON, WEBSTER e PHILIPS, 1987; SAUTTER, BROWN e MATTMAN,
1988).
Alguns autores afirmam que tanto os profissionais de saúde que prestam
assistência direta aos pacientes quanto os funcionários administrativos apresentam uma
positividade semelhante para os S. aureus (SANTOS, 1987; VOSS, 2004). Palos (2006)
obteve uma prevalência de 84,7% entre profissionais e 9,7% de resistência à oxacilina.
A distribuição da frequência de carreamento nasal de S. aureus, de acordo com a
periodicidade do curso, indicou que no primeiro ano 100% (40/40) eram portadores; no
segundo, foram 84,4% (27/32); no terceiro, 82,8% (24/29). Esperava-se que a taxa de
carreamento nasal entre alunos do primeiro ano do curso em relação aos demais fosse
menor, pois além de serem procedentes da comunidade, não mantêm Estágio em
hospitais e unidades básicas de saúde. Essa expectativa, contudo, não se confirmou.
As amostras de S. aureus isoladas de estudantes de graduação saudáveis foram,
inicialmente, avaliadas quanto à susceptibilidade à oxacilina e à vancomicina, através de
método Agar difusão para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). O
antibiograma foi realizado pelo método de disco difusão, conforme recomendação do
Clinical and Laboratory Standards Institute (2009a).
Entre as 91 amostras de S. aureus isoladas, oito (8,8%) se mostraram resistentes
à oxacilina e a faixa de crescimento bacteriano se deu entre 4 µg/ml e 256 µg/ml. Esse
percentual de resistência é expressivo em se tratando de indivíduos assintomáticos,
porque a oxacilina é um importante marcador de resistência para outros
antimicrobianos, como os aminoglicosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, tetraciclina e
fluoroquinolonas (MANDELL, BENNETT e DOLIN, 2005).
Nesse estudo, foi possível observar um aumento da resistência dos S. aureus à
oxacilina no decorrer dos anos de graduação, demonstrando a íntima relação existente
entre a exposição do indivíduo ao ambiente hospitalar, aos diferentes antimicrobianos lá
utilizados e à flora nasal de S. aureus. Os alunos do terceiro ano de Enfermagem já
42
estiveram presente nesse ambiente por dois anos, o que justifica em parte a diferença na
resistência em relação aos demais anos de graduação.
Com relação ao S. aureus resistente à oxacilina, Huang et al. (2005) verificaram
uma prevalência de 1,9% entre estudantes e Wang et al. (2004) obtiveram uma
positividade de 8,3% entre profissionais. Taxas importantes de resistência à oxacilina
entre indivíduos assintomáticos da comunidade também têm sido observadas por alguns
autores (CHARLEBOIS et al., 2002; MENEGOTTO e PICOLI, 2007).
Estudos realizados por Eveillard et al. (2004); Wagenvoort, De Brauwer e
Toenbreker (2005) e Kuehnert et al. (2006) demonstraram a relação de transmissão
entre os profissionais de saúde e seus familiares, sendo uma importante fonte de
transmissão. Os profissionais de saúde, por estar em ambiente hospitalar, podem
disseminar micro-organismos resistentes, entre eles o S. aureus resistente à oxacilina
(CHAMBERS, 2001).
Neste estudo, pelo método de disco difusão, verificou-se que 12 amostras foram
resistentes à oxacilina, sendo que apenas oito tiveram essa resistência confirmada pelo
teste de CIM. Comparando-se os dois métodos, constatou-se que das quatro amostras
não confirmadas pelo teste de CIM três estavam próximas do ponto de corte para a
resistência. A partir desses resultados, fica evidente a correta proposição do Clinical and
Laboratory Standards Institute (2009b), que preconiza a necessidade de se correlacionar
os resultados dos testes de disco difusão com os resultados do teste de determinação da
concentração inibitória mínima (CIM), empregando-se cepas-padrão (ATCC)
reconhecidamente sensíveis e resistentes.
O S. aureus de origem comunitária, conforme alguns autores, apresenta uma
taxa de sensibilidade entre 85% e 100% a drogas como clindamicina, gentamicina,
ciprofloxacina, Trimetropin/sulfametoxazol e vancomicina. Maiores taxas de resistência
foram encontradas nas amostras isoladas neste estudo, possivelmente por se tratar de
alunos em Estágio Curricular em unidades de saúde e, portanto, mais susceptíveis à
aquisição de cepas resistentes (SANTOS et al.,, 2007).
As opções terapêuticas para o tratamento dos S. aureus resistentes à oxacilina
diminuem a cada dia, ficando limitada, atualmente, ao uso da vancomicina e da
linezolida, porém com relatos de resistência em alguns casos isolados (SAIID-SALIM,
MATHEMA e KREISWIRTH, 2003; SANTOS et al., 2007).
Formatado: Português (Brasil)
Formatado: Português (Brasil)
43
Vários autores relatam a importância de políticas de restrição do uso de
antimicrobianos, evitando, assim, seu uso inadequado ou desnecessário e reduzindo a
probabilidade do surgimento e propagação de cepas resistentes ou com sensibilidade
reduzida aos glicopeptídeos (COIA et al., 2006; GUILARDE, et al., 2006).
Todas as amostras avaliadas neste estudo foram sensíveis à vancomicina. A
susceptibilidade reduzida dos S. aureus à vancomicina (VISA) surgiu em 1996 no
Japão, e em 2002, nos EUA, foi identificada a primeira cepa resistente (VRSA)
(MIMICA e MENDES, 2007; SANTOS et al., 2007). No Brasil, em 2000, foi
encontrada a primeira cepa resistente à vancomicina, em um hospital de Queimados no
Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2007), entretanto essa disseminação ainda não se
configurou em nosso meio, sendo restrita a casos isolados.
O perfil genotípico das amostras de S. aureus apresenta grande importância;
através da amplificação de determinados genes e subsequente análise genética dos
fragmentos podem ser obtidas informações da filogenia e da sistemática microbiana de
uma maneira rápida e eficiente (KLUYTMANS, VAN BELKUM e VERBRUGH,
1997). A técnica pode ser utilizada para a ampliação simultânea dos genes mecA e femA
e do gene da termonuclease extracelular e PBP2 (MENEGOTTO e PICOLI, 2007).
As medidas de prevenção para aquisição de infecção por S. aureus incluem a
descontaminação nasal. Um agente tópico bactericida vem sendo utilizado para a
erradicação em fossas nasais, axilas, virilhas e em mão de pacientes e trabalhadores da
saúde. Por meio dessa medida é possível reduzir as taxas de infecção entre aqueles
pacientes que serão submetidos a cirurgias (DOEBBELING, 1993; MANDELL,
BENNETT e DOLIN, 2005), e também entre aqueles imunocomprometidos (FELIX
JUNIOR, 2007; SOCIEDADE BRASILEIRA DE PEDIATRIA, 2007).
O uso de mupirocin deve ser de forma restrita a casos em que seja absolutamente
necessário, para se evitar a disseminação da resistência a esse antimicrobiano (COIA et
al., 2006), tornando-se indispensável que um programa de vigilância contínua de
MRSA seja realizado regularmente nos serviços de saúde (CUI et al., 2006).
O S. aureus resistente à oxacilina deixou de ser um problema hospitalar e passou
a ser encontrado em indivíduos que vivem na comunidade e que não apresentam fator
de risco, fazendo-se necessária a escolha apropriada dos antimicrobianos para seu
44
devido tratamento (FRIDKIN et al., 2005; SAIID-SALIM, MATHEMA e
KREISWIRTH, 2003).
45
7. CONCLUSÃO
▪ Foi verificada uma alta prevalência de carreamento nasal de S. aureus entre
estudantes de Graduação em Enfermagem na Universidade Estadual de Maringá.
▪ 90,1% apresentaram positividade para S. aureus, sendo 100% no primeiro ano
de graduação, 84,4% no segundo ano, e 82,8% no terceiro ano.
▪ A taxa de resistência à oxacilina foi de 8,8% pelo método de Agar diluição e de
13,2% pelo método de disco difusão.
▪ Não houve concordância na identificação de resistência à oxacilina pelos dois
métodos para todas as amostras de S. aureus.
▪ Todas as amostras avaliadas se mostraram sensíveis à vancomicina pelos dois
métodos adotados.
▪ Todas as oito amostras resistentes à oxacilina pelo método de CIM
apresentaram o gene mecA.
▪ Das oito amostras resistentes à oxacilina pelo CIM 100% apresentaram
resistência à penicilina, trimetropin/sulfametoxazol e à tetraciclina.
▪ A tipagem genética demonstrou que quatro amostras de S. aureus tiveram uma
similaridade superior a 84%, e duas com 100%.
46
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A presença de S. aureus multirresistentes nos vestíbulos nasais de portadores
sãos ou assintomáticos, entre estudantes de Enfermagem, é uma ameaça e uma
importante fonte de transmissão do micro-organismo, considerando que esses
estudantes estarão desempenhando atividades acadêmicas junto aos pacientes.
Os objetivos desta pesquisa foram verificar a prevalência de carreamento nasal
de S. aureus entre estudantes de Enfermagem, identificar o perfil fenotípico e genotípico
das amostras isoladas e dessa forma contribuir para uma melhor compreensão da
epidemiologia desse microorganismo no contexto hospitalar.
Os resultados demonstraram uma alta prevalência de S. aureus entre os
estudantes, com uma alta frequência de amostras multirresistentes particularmente à
oxacilina, e carreamento de elemento genético mecA responsável por perpetuação dessa
resistência.
A identificação do estudante de Enfermagem como portador de S. aureus
multirresistentes proporciona a informação necessária para a construção de estratégias
de prevenção de infecções hospitalares.
47
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Formatado: Inglês (EUA)
Formatado: Inglês (EUA)
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54
ANEXO 1
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Estamos realizando uma pesquisa intitulada “Aquisição nasal de Staphylococcus
aureus entre estudantes de enfermagem saudáveis”, a qual deverá ser realizada em três
etapas sendo: uma coleta realizada no período anterior à entrada do aluno no hospital e
duas posteriores a sua inclusão no hospital através do Estágio Supervisionado. Os
resultados da pesquisa destinar-se-ão à elaboração de trabalho de caráter científico e
possível publicação, sendo garantido o anonimato dos participantes.
Estamos disponíveis para fornecer-lhe informações quando julgar necessário,
nos comprometendo a proporcionar respostas adicionais sobre qualquer dúvida que por
ventura venha a ter e informações atualizadas durante o desenvolvimento do estudo,
mesmo que isto possa afetar a sua vontade de continuar participando.
A sua retirada deste processo de pesquisa poderá ocorrer quando considerar
conveniente, sendo que isto não lhe acarretará nenhum dano pessoal e/ou profissional.
Informo que não haverá riscos, nem danos ou custos de qualquer natureza caso
concorde em participar do estudo, assim como não receberá pagamento pela
participação. O presente projeto está em concordância com as exigências da Resolução
196/96, que regulamenta a realização de pesquisa com seres humanos.
Em caso de reclamação e/ou denúncia, procure o pesquisador João Bedendo pelo
telefone (0xx44) 3261-4511, da Universidade Estadual de Maringá, e/ou o Comitê
Permanente de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (COPEP) da
Universidade Estadual de Maringá, na Pró-Reitoria de Pós-Graduação, pelo telefone
(0xx44) 3261-4444.
Eu, ________________________________________, após ter lido e entendido as
informações e esclarecido todas as minhas dúvidas referentes a este estudo,
CONCORDO VOLUNTARIAMENTE em participar desta pesquisa.
______________________________________________ Data: ____/____/______
Assinatura do participante.
Eu, Pesquisadora __________________________________________________,
declaro que forneci todas as informações referentes ao estudo.
Formatado: Português (Brasil)
55
ANEXO 2
Formulário de Identificação do Acadêmico
Acadêmico RA: ____________
Data de Nascimento ___/___/_______
Sexo MASCULINO
( )
FEMININO
( )
Trabalha em alguma instituição de saúde atualmente? SIM
( )
NÃO
( )
Trabalhou em alguma instituição de saúde nos últimos 5
anos?
SIM
( )
NÃO
( )
Apresenta atualmente algum sinal ou sintoma de doença? SIM
( )
NÃO
( )
Está fazendo uso de antimicrobiano atualmente? Quanto
tempo? ___________
SIM
( )
NÃO
( )
56
ANEXO 3
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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Baixar livros de Química
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Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
