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SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA DE
CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS
ALMIR ANDREÃO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
MAIO DE 2010
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ii
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA DE
CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS
ALMIR ANDREÃO
Tese apresentada ao Centro de Ciência
e Tecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para
obtenção do título de Doutor em
Ciências Naturais.
Orientador: Prof. Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda
Universidade Estadual do Norte Fluminense – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
MAIO DE 2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCT / UENF 28/2010
Andreão, Almir
Síntese e avaliação da atividade anticancerígena de caulibugulonas
e análogos / Almir Andreão. – Campos dos Goytacazes, 2010.
xxvi, 146 f. : il.
Tese (Doutorado em Ciências Naturais) --Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciência
e Tecnologia. Laboratório de Ciências Químicas. Campos dos
Goytacazes, 2010.
Orientador: Paulo César Muniz de Lacerda Miranda.
Área de concentração: Ciências Naturais.
Bibliografia: f. 122-125.
1. Caulibugulonas 2. Isoquinolino-5,8-dionas 3.
Anticancerígeno 4. Produtos naturais 5. Síntese I. Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciência
e Tecnologia. Laboratório de Ciências Químicas lI. Título
iii
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA DE
CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS
ALMIR ANDREÃO
.
Tese apresentada ao Centro de Ciência e
Tecnologia da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como
parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências Naturais
Aprovada em 25 de fevereiro de 2010.
Comissão Examinadora:
Dr. Walter Luiz Brasil Medeiros – IF Fluminense - Campus Campos/RJ
Prof.ª Dr.ª Rosana Aparecida Giacomini - UENF
Prof. Dr. Milton Masahiko Kanashiro - UENF
Prof. Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda - UENF
(Orientador)
iv
“Dedico esta tese a minha esposa Patrícia e ao meu filho Felipe, meus pais e
irmãos, pessoas queridas que somaram um sentido especial em minha vida”
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo.
À minha família que sempre me apoiou em todos os momentos, pela educação,
carinho, confiança e motivação.
À minha querida esposa Patrícia pela paciência, incentivo e carinho.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de Ciências e
Tecnologias, pela oportunidade de realização deste trabalho de pesquisa.
Aos Professores Dr. Paulo Miranda e Dra. Rosana Giacomini, pela orientação segura e
competente, pela dedicação, atenção e liberdade durante a realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Milton Masahiko Kanashiro e ao mestrando Willian de Freitas do CBB-
UENF pela disponibilidade e realização das análises com as células cancerígenas.
Aos colegas de laboratório: Karla, Juliana, Leonardo, Letícia, Lindomar, Neidemar, Max,
Marlon e Carol, pela amizade construída e consolidada durante este período de
doutorado, companheirismo, sugestões e ajudas experimentais, conselhos, e troca de
informações.
Aos funcionários do CCT, em especial ao Ulisses, ao Robson, ao Roberto, ao Édson, à
Tânia e à Marisa, pela atenção e disponibilidade.
À FAPERJ-UENF pela bolsa concedida.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
“A vida é aquilo que
você deseja diariamente.”
André Luiz
vii
SUMÁRIO
Lista de figuras …………………………………………………………………… xii
Lista de esquemas ………………………………………………………………..
xix
Lista de tabelas ……………………………………………………………………
xxii
Lista de abreviaturas …………………………………………………………….. xxiii
Resumo …………………………………………………………………………….
xxiv
Abstratc …………………………………………………………………………….
xxv
CAPÍTULO 1
SÍNTESE DE CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS .....................................
1
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................
1
1.1. Caulibugulonas – metabólitos de origem marinha .................................
1.2. Isoquinolinas ..........................................................................................
1
2
1.3. Sínteses de Isoquinolinas ...................................................................... 5
1.3.1. Reação de Pomeranz-Fritsh ............................................................... 5
1.3.2. Reação de Bischler-Napieralski .......................................................... 7
1.3.3. Reação de Pictet-Gams ...................................................................... 9
1.3.4. Reação de Pictet-Spengler ................................................................. 9
1.4. Reações de Isoquinolinas ...................................................................... 11
1.4.1. Nitração ............................................................................................... 11
1.4.2. Sulfonação .......................................................................................... 11
1.4.3. Halogenação ....................................................................................... 12
1.4.4. Substituição nucleofílica aromática..................................................... 13
viii
1.4.5. Redução .............................................................................................. 13
1.4.6. Alquilação e Arilação ...........................................................................
15
1.4.7. Aminação ............................................................................................ 16
1.4.8. Hidroxilação .........................................................................................
16
1.5. Sistemas derivados de isoquinolinas ..................................................... 17
1.5.1. Hidroxiderivados ..................................................................................
17
1.5.2. Aminoderivados ...................................................................................
18
1.5.3. Alquilderivados .................................................................................... 18
1.5.4. Ácidos ..................................................................................................
20
1.5.5. Sais quaternários de isoquinolínio ...................................................... 20
1.6. Aminoisoquinolinoquinonas ................................................................... 23
1.6.1. Sínteses de Aminoisoquinolinoquinonas .............................................
23
1.6.2. Caulibugulonas ....................................................................................
31
2. JUSTIFICATIVA E PROPOSTA DE TRABALHO ....................................
34
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................
36
3.1. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45] .............................................
36
3.2. Preparação da N-2,5-dimetoxibenziliden-N-2,2-dimetoxietilamina [42] . 38
3.3. Preparação da N-[2,2-dimetoxietil]-N-[2,5-dimetoxibenzil]amina [43] .... 40
3.4. Preparação da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] ......................................... 43
3.5. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45] .............................................
46
3.6. Preparação da caulibugulona A [35] ...................................................... 48
3.7. Substituições no carbono 7 de isoquinolino-5,8-dionas ......................... 53
3.8. Estudos de RMN para a caulibugulona A .............................................. 55
3.9. Preparação da caulibugulona D [38] e do análogo [46] ......................... 57
3.10. Preparação da 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32] ..........................
59
3.11. Isoquinolino-5,8-dionas derivadas da isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] . ......................................................................................................
61
3.12. Preparação das alquilisoquinolino-5,8-dionas [37], [47] e [48] .............
62
3.13. Preparação das arilisoquinolino-5,8-dionas [33], [49], [50], [51] e [52] 64
ix
4. METODOLOGIA .......................................................................................
69
4.1. Instrumentos para caracterização das substâncias sintetizadas ........... 70
5. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ....................................................
72
5.1. Preparação da N-2,5-dimetoxibenziliden-N-2,2-dimetoxietilamina [42] .
72
5.2. Preparação da N-[2,2-dimetoxietil]-N-[2,5-dimetoxibenzil]amina [43] ....
72
5.3. Preparação da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] ......................................... 73
5.4. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45] .............................................
74
5.5. Preparação da caulibugulona A [35] ...................................................... 74
5.6. Preparação da caulibugulona D [38] ...................................................... 75
5.7. Preparação da 7-(N-fenilamino)isoquinolino-5,8-diona [46] ...................
75
5.8. Preparação da 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32] ............................
76
5.9. Preparação da 6-cloro-7-(N-metilamino)isoquinolino-5,8-diona [37] ......
76
5.10. Preparação da 6-cloro-7-(N-butilamino)isoquinolino-5,8-diona [47] .....
77
5.11. Preparação da 6-cloro-7-(N-terc-butilamino)isoquinolino-5,8-diona
[48] .....................................................................................................
77
5.12. Preparação da 6-cloro-7-(N-fenilamino)isoquinolino-5,8-diona [33] .....
78
5.13. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-bromofenilamino)isoquinolino-5,8-
diona [49] ..............................................................................................
78
5.14. Preparação da 6-cloro-7-(N-4-bromofenilamino)isoquinolino-5,8-
diona [50] ..............................................................................................
79
5.15. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-metoxifenilamino)isoquinolino-5,8-
diona [51] ..............................................................................................
79
5.16. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-etoxifenilamino)isoquinolino-5,8-diona
[52] ......................................................................................................
80
x
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA DE CAULIBUGULO-
NAS E ANÁLOGOS ......................................................................................
81
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................
81
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................
85
2.1. Ensaios de Viabilidade Celular, Morte Celular por Necrose e Morte
Celular por Apoptose .....................................................................................
86
2.1.1. Isoquinolino-5,8-diona [35] (Caulibugulona A) .................................... 88
2.1.2. Isoquinolino-5,8-diona [37] (Caulibugulona C) .................................... 89
2.1.3. Isoquinolino-5,8-diona [38] (Caulibugulona D) .................................... 91
2.1.4. Isoquinolino-5,8-diona [46] .................................................................. 92
2.1.5. Isoquinolino-5,8-diona [47] .................................................................. 95
2.1.6. Isoquinolino-5,8-diona [48] .................................................................. 98
2.1.7. Isoquinolino-5,8-diona [33] .................................................................. 101
2.1.8. Isoquinolino-5,8-diona [49] .................................................................. 104
2.1.9. Isoquinolino-5,8-diona [50] .................................................................. 107
2.1.10. Isoquinolino-5,8-diona [51] ................................................................ 110
2.1.11. Isoquinolino-5,8-diona [52] ................................................................ 113
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................
116
3.1. Culturas de células ................................................................................
116
3.2. Quantificação e ajuste das culturas ....................................................... 116
3.3. Diluição e armazenamento das isoquinolino-5,8-dionas ........................
116
3.4. Determinação da citotoxicidade celular ..................................................
117
3.5. Ensaio Metabólico do MTT .....................................................................
118
3.6. Microscopia de fluorescência ................................................................ 119
xi
CONSIDERAÇÕES FINAIS ..........................................................................
120
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................
122
APÊNDICE ....................................................................................................
126
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPITULO 1
Figura 1 - Estrutura da isoquinolina [1] ...................................................
2
Figura 2 - Estrutura da papaverina [2] ....................................................
3
Figura 3 - Estruturas da coclaurina [3] e da norarmepavina [4] ............. 3
Figura 4 - Estruturas das naftilisoquinolinas [5], [6] e [7] ........................
4
Figura 5 - Estruturas da elipticina [8], da olivacina [9] e da janetina [10]
4
Figura 6 -
Mansouramicinas isoladas de Cribrochalina sp......................
23
Figura 7 - Quinonas monossubstituídas [11] e dissubstituídas [12] ....... 24
Figura 8 - Estruturas de derivados N-substituídos de 1,4-naftoquinona
[13] e 5,8-quinolinoquinona [14] .............................................
25
Figura 9 - Estrutura da isoquinolino-5,8-quinona [30] com o carbono 7
elétron deficiente ....................................................................
29
Figura 10 - Estrutura de isoquinolino-5,8-dionas cloradas
dissubstituídas nas posições 6 e 7 [31] .................................
29
Figura 11 - Estruturas das caulibugulonas A [35], B [36], C [37] e D [38]. 31
Figura 12 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45] ................................ 36
Figura 13 - Isoquinolino-5,8-dionas com potencial atividade
anticancerígena ......................................................................
37
Figura 14 - Estrutura da imina [42] ........................................................... 38
Figura 15 - Estrutura da imina [42] com os carbonos numerados. ...........
40
Figura 16 - Estrutura da amina [43] ..........................................................
40
Figura 17 - Estrutura da amina [43] com os carbonos numerados .......... 42
Figura 18 - Estrutura da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] ............................. 43
Figura 19 - Estrutura da isoquinolinodimetoxilada [44] com os carbonos
numerados .............................................................................
45
Figura 20 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45] ................................ 46
xiii
Figura 21 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45] com os hidrogênios
numerados .............................................................................
48
Figura 22 - Estrutura da caulibugulona A [35] .......................................... 49
Figura 23 - Espectro no infravermelho da Caulibugulona A [35] ..............
50
Figura 24 - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da caulibugulona
A [35] ......................................................................................
51
Figura 25 - Estrutura da caulibugulona A [35] com os carbonos
numerados .............................................................................
52
Figura 26 - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da
caulibugulona A [35] ...............................................................
52
Figura 27 - Estrutura da caulibugulona A [35] com hidrogênios e
carbonos numerados .............................................................
55
Figura 28 - Espectro de RMN 2D [
1
H e
13
C-HMBC] da caulibugulona A
[35] .........................................................................................
56
Figura 29 - Posição correta dos grupos amínicos na caulibugulona A e
análogos .................................................................................
56
Figura 30 - Estruturas da caulibugulona D [38] e da isoquinolino-5,8-
diona [46] ...............................................................................
57
Figura 31 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32] ............... 61
Figura 32 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [37] ................................ 62
Figura 33 - Estruturas das isoquinolino-5,8-dionas [47] e [48] ................. 63
Figura 34 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [33] ................................ 66
Figura 35 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [49] ................................ 66
Figura 36 - Estruturas das isoquinolino-5,8-dionas [50] e [51] com os
hidrogênios numerados ..........................................................
67
Figura 37 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [51] com os hidrogênios
numerados .............................................................................
67
Figura 38 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [52] com os hidrogênios
numerados .............................................................................
68
Figura 39 - Caulibugulonas A, C, D e análogos sintetizados ................... 69
xiv
CAPITULO 2
Figura 1 - Estruturas do gás mostarda (I) e do ácido fólico (II) .............. 83
Figura 2 - Isoquinolino-5,8-dionas utilizadas na avaliação da atividade
anticancerígena ......................................................................
85
Figura 3 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona A [35], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
88
Figura 4 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona C [37], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
89
Figura 5 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona D [38], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
91
Figura 6 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
92
Figura 7 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
93
Figura 8 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
93
Figura 9 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
94
Figura 10 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
95
Figura 11 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
96
Figura 12 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
96
xv
Figura 13 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
97
Figura 14 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
98
Figura 15 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
99
Figura 16 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
99
Figura 17 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
100
Figura 18 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
101
Figura 19 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
102
Figura 20 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
102
Figura 21 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
103
Figura 22 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
104
Figura 23 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
105
Figura 24 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
105
Figura 25 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
106
Figura 26 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
107
xvi
Figura 27 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
108
Figura 28 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
108
Figura 29 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
109
Figura 30 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
110
Figura 31 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
111
Figura 32 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
111
Figura 33 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
112
Figura 34 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a
viabilidade das células U937, 48 horas após a incubação ....
113
Figura 35 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a
viabilidade das células COLO205, 48 horas após a
incubação ...............................................................................
114
Figura 36 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a
viabilidade das células MOLT4, 48 horas após a incubação .
114
Figura 37 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a
viabilidade das células H460, 48 horas após a incubação ....
115
xvii
APÊNDICE
Figura 1A - Espectro de massas da imina [42] ......................................... 127
Figura 2A - Espectro no infravermelho da imina [42] ................................
127
Figura 3A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da imina [42] ..... 128
Figura 4A - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da imina [42] .... 129
Figura 5A - Espectro de massas da amina [43] ........................................
130
Figura 6A - Espectro no infravermelho da amina [43] .............................. 130
Figura 7A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da amina [43] .... 131
Figura 8A - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da amina [43] ... 132
Figura 9A - Espectro de massas da isoquinolina [44] ...............................
133
Figura 10A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da amina [44]. 133
Figura 11A -
Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da isoquinolina
[44] .........................................................................................
134
Figura 12A -
Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [45] .............. 135
Figura 13A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da isoquinolino-
5,8-diona [45] .........................................................................
135
Figura 14A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da
Caulibugulona D [38] ..............................................................
136
Figura 15A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-
5,8-diona [46] .........................................................................
137
Figura 16A -
Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32]
138
Figura 17A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-
5,8-diona diclorada [32] ..........................................................
132
Figura 18A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da
Caulibugulona C [37] ..............................................................
139
Figura 19A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da Isoquinolino-
5,8-diona [47] .........................................................................
140
Figura 20A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da Isoquinolino-
5,8-diona [48] .........................................................................
141
xviii
Figura 21A -
Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [33] .............. 142
Figura 22A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-
5,8-diona [33] .........................................................................
142
Figura 23A -
Espectro no infravermelho da Isoquinolino-5,8-diona [49] .....
143
Figura 24A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-
5,8-diona [50] .........................................................................
144
Figura 25A -
Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-
5,8-diona [51] .........................................................................
145
Figura 26A -
Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [52] .............. 146
xix
LISTA DE ESQUEMAS
CAPITULO 1
Esquema 1 - Síntese de imina através da condensação do dietilacetal
com o aminoacetaldeído ......................................................
5
Esquema 2 - Síntese de isoquinolina através da ciclização de imina ....... 5
Esquema 3 - Síntese de isoquinolina com grupos eletroretiradores no
anel aromático ......................................................................
6
Esquema 4 - Síntese de isoquinolinas 7-substituídas ............................... 6
Esquema 5 - Síntese de isoquinolinas substituídas no carbono-1 ............
7
Esquema 6 - Desidrogenação de diidroisoquinolinas ................................
8
Esquema 7 -
Ciclização na posição para ao grupo ativante em amidas
meta-substituídas .................................................................
8
Esquema 8 - Síntese de isoquinolinas a partir de aminas potencialmente
insaturadas ...........................................................................
9
Esquema 9 - Síntese de 1,2,3,4-tetraidroisoquinolinas a partir de aminas
do tipo (2-feniletil)-amina e aldeídos em meio ácido ............
10
Esquema 10- Reação de ciclização com anel aromático ativado com
substituintes hidroxílicos ......................................................
10
Esquema 11- Reação de nitração de isoquinolinas ................................... 11
Esquema 12- Reações de sulfonação de isoquinolinas a baixas e altas
temperaturas ........................................................................
12
Esquema 13- Halogenação de isoquinolinas ............................................ 12
Esquema 14- Substituição seletiva em 3-haloisoquinolinas .......................
13
Esquema 15- Redução seletiva dos aneis da isoquinolina ........................ 13
Esquema 16- Redução de isoquinolinas com LiAlH
4
..................................
14
Esquema 17-
Redução de sais N-alquilisoquinolínio com NaBH
4
em meio
prótico ...................................................................................
14
Esquema 18- Alquilação ou arilação de isoquinolinas ............................... 15
Esquema 19- Alquilação de isoquinolinas utilizando reagentes de
Grignard ...............................................................................
15
xx
Esquema 20- Síntese de 1-aminoisoquinolinas utilizando KNH
2
e amônia
16
Esquema 21- Síntese de 1-isoquinolona utilizando KOH ...........................
16
Esquema 22- Tautomeria de isoquinolinas hidroxiladas na posição 1 .......
17
Esquema 23- Formas cetônica e fenólica de isoquinolinas hidroxiladas
na posição 3 .........................................................................
17
Esquema 24- Tautomeria de 1-aminoisoquinolina e de
6-aminoisoquinolina .............................................................
18
Esquema 25- Tautomeria de 3-aminoisoquinolina ..................................... 18
Esquema 26- Condensação de isoquinolinas com grupo alquila na
posição
α
ao nitrogênio em meio básico como ácido ..........
19
Esquema 27- Descarboxilação de ácidos isoquinolino-1-carboxílicos ....... 20
Esquema 28- Adição de nucleófilos organometálicos, hidróxidos e
hidretos a sais de quaternários de isoquinolínio ..................
21
Esquema 29- Reações do sal de N-acilisoquinolínio com cianeto -
processos de Reissert ..........................................................
21
Esquema 30- Síntese de heterocíclicos substituídos utilizando
compostos de Reissert .........................................................
22
Esquema 31- Desprotonação de N-alquilderivados de isoquinolínio na
posição 1 ..............................................................................
22
Esquema 32- Síntese de aminoquinonas por adição direta de aminas ..... 24
Esquema 33- Reação de aminação de quinona halogenada .....................
25
Esquema 34- Síntese da 2-amino-1,4-naftoquinona [17] com ácido
hidrazóico .............................................................................
26
Esquema 35- Síntese da 2-amino-8-hidroxinaftoquinona [19] com azida
de sódio ................................................................................
26
Esquema 36- Síntese da 6-amino-2,4-dimetilquinolino-5,8-quinona [21] a
partir da 2,4-dimetilquinolino-5,8-quinona [20] com ácido
hidrazóico .............................................................................
27
Esquema 37- Síntese da 2-amino-1,4-naftoquinona [22] com
difenilsulfimida ou metilfenilsulfimida ...................................
27
xxi
Esquema 38- Síntese da 2,5-diaminobenzoquinona [24] a partir da
2,5-dimetoxibenzoquinona [23] com amônia em etanol .......
28
Esquema 39- Síntese da 2-metóxi-1,4-naftoquinonas ou da
6-metoxiquinolina-5,8-quinona .............................................
28
Esquema 40- Síntese da 7-aminoisoquinolinoquinona [29] a partir da 7-
bromoisoquinolinoquinona [27] por reação com azida
sódica e trifenilfosfina ...........................................................
29
Esquema 41- Reação de substituição na 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-
diona [32] ..............................................................................
30
Esquema 42- Estruturas de ressonâncias para isoquinolino-5,8-diona
diclorada ...............................................................................
30
Esquema 43- Síntese da 7-aminoisoquinolinoquinona [34] ....................... 31
Esquema 44- Síntese da caulibugulona A [35] a partir do
5-hidroxiisoquinolino [39] ......................................................
32
Esquema 45- Síntese da caulibugulona B [36] a partir da caulibugulona A
[35] e da caulibugulona C [37] a partir da caulibugulona A
[35] .......................................................................................
32
Esquema 46- Síntese da caulibugulona D [38] a partir do
5-hidroxiisoquinolino [39] ......................................................
33
Esquema 47- Rota de síntese empregada na obtenção das isoquinolinas
[44] e [45] ............................................................................
35
Esquema 48- Mecanismo para a preparação da imina [42] e da amina
[43] .......................................................................................
43
Esquema 49- Esquema geral das sínteses das isoquinolino-5,8-dionas
[35], [38] e [46] .....................................................................
48
Esquema 50- Estruturas de ressonância para as isoquinolino-5,8-dionas 54
Esquema 51- Síntese da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32] ................. 59
Esquema 52- Esquema geral da síntese das alquilisoquinolino-5,8-
dionas cloradas ....................................................................
61
Esquema 53- Esquema geral da síntese das arilisoquinolino-5,8-dionas 64
xxii
LISTA DE TABELAS
CAPITULO 1
Tabela 1 - Principais sinais do EM para a imina [42] .................................
39
Tabela 2 - Principais sinais do EM para a amina [43] ................................
41
Tabela 3 - Principais sinais do EM para a 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] ...
44
Tabela 4 - Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona [45] ...... 47
Tabela 5 - Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona A [35]
sintética, comparados com valores citados na literatura ..........
51
Tabela 6 - Deslocamentos químicos de RMN
13
C da caulibugulona A [35]
sintética, comparados com valores citados na literatura ..........
53
Tabela 7 - Correlações
1
H-
13
C observadas no espectro de HMBC da
caulibugulona A [35] .................................................................
55
Tabela 8 - Principais dados de RMN
1
H para as isoquinolino-5,8-
dionas
[38] e [46] ..................................................................................
58
Tabela 9 - Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona D [38]
sintética, comparados com valores citados na literatura ..........
58
Tabela 10 - Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona
diclorada [32] ............................................................................
60
Tabela 11 - Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona C [37]
sintética, comparados com valores citados na literatura ..........
63
Tabela 12 - Principais dados de RMN
1
H para as isoquinolino-5,8-
dionas
[47] e [48] ..................................................................................
64
Tabela 13 - Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona clorada
[33] ............................................................................................
65
Tabela 14 - Dados de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para as
arilisoquinolino-5,8-dionas [39], [40] e [41] ...............................
67
Tabela 15 - Principais sinais do EM para a arilisoquinolino-5,8-diona [52]. 68
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS
CCD Cromatografia em camada delgada
CDCl
3
Deuteroclorofórmio
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
DCM Diclorometano
d dupleto
dd duplo dupleto
DMF
N,N-Dimetilformamida
DMSO Dimetilssulfóxido
EM Espectrometria de Massas
Et
2
O Éter dietílico
EtOAc Acetato de etila
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence
IV Infravermelho
m multipleto
Me Metila
MeOH Metanol
m/z Razão entre a massa do fragmento e sua carga elétrica
PENDANT Polarization enhancement nurtured duri
ng attached nucleus
testing
APTS
Ácido p-toluenossulfônico
R
f
Fator de retenção
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN de
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN de
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
s simpleto
t tripleto
t.a. Temperatura ambiente
TMS Tetrametilsilano
δ
Deslocamento químico
xxiv
RESUMO
A busca de solução para a cura do câncer é um trabalho constante conduzido pela
pesquisa química. No presente trabalho foram sintetizadas as caulibugulonas A [35], C
[37] e D [38] e uma série de análogos com potencial atividade anticancerígena e com a
rota sintética ainda não descrita na literatura. Estas substâncias foram preparadas,
inicialmente, a partir da condensação da 2,2-dimetoxietanamina com o 2,5-
dimetoxibenzaldeído, levando à obtenção da N-2,5-dimetoxibenziliden-N-2,2-
dimetoxietilamina, convertida em duas etapas na 5,8-dimetoxiisoquinolina. Como
material de partida, essa isoquinolina foi utilizada no preparo das caulibugulonas A [35],
C [37] e D [38], de quatro isoquinolino-5,8-dionas, de nove isoquinolino-5,8-dionas
cloradas. A avaliação da atividade cancerígena dessas substâncias foi feita em ensaios
preliminares, sob condições de laboratório, com as células cancerígenas U937
(leucêmica humana), MOLT4 (leucêmica humana), COLO205 (colon humano) e H460
(pulmão humano), nas concentrações de 0,25 µg.mL
-1
, 0,5 µg.mL
-1
, 1,0 µg.mL
-1
, 2,0
µg.mL
-1
e 4,0 µg.mL
-1
. Nesses bioensaios, as isoquinolino-5,8-dionas 7-(N-
fenilamino)isoquinolino-5,8-diona [46] e 6-cloro-7-(N-fenilamino)isoquinolino-5,8-diona
[33] demonstraram os maiores efeitos de citotoxicidade sobre as células cancerígenas
testadas. Nos ensaios referentes às atividades citotóxica e citostática, sob condições de
laboratório, num período de incubação de 48 horas, somente a isoquinolino-5,8-diona
[33] apresentou apenas atividade citotóxica e as isoquinolino-5,8-dionas [49] e [50]
apresentaram apenas atividade citostática. Os resultados deste trabalho sugerem a
realização de novos ensaios, com outras espécies de células e também com alguns
tipos de enzimas, testando outras formulações e doses, a fim de se obter conclusão
definitiva sobre o potencial anticancerígeno das substâncias sintetizadas.
xxv
ABSTRACT
The search for a solution for the cure of cancer is a constant work lead by chemical
research. In the present work the caulibugulones A [35], C [37] and D[38] were
synthesized a series of analogs with potential anticancirogenic activity and the synthetic
route yet not described in literature. These substances were prepared, initially, from the
condensation of the 2,2-dimethoxyetanamine with the 2,5-dimethoxybenzaldehyde,
obtaining from it the N-2,5-dimethoxybenzyliden-N-2,2-dimethoxyetylamine, converted in
two phases to the 5,8-dimethoxyisoquinoline. As an starting material this isoquinoline
was used in the preparation of the caulibugulones A [35], C [37] and D [38], of four
isoquinolin-5,8-diones, of nine chloride isoquinolin-5,8-diones. The evaluation of the
carcinogenic activity of these substances was made in preliminary sampling, under lab
conditions, with carcinogenic U937 cells (human leukemia), MOLT4 (human leukemia),
COLO205 (human colon) and H460 (human lung), in the concentrations of 0,25 µg.mL
-1
,
0,5 µg.mL
-1
, 1,0 µg.mL
-1
, 2,0 µg.mL
-1
e 4,0 µg.mL
-1
. In these bioessays, the isoquinolin-
5,8-diones 7-(N-phenylamine)isoquinolin-5,8-dione [46] and 6-chlorine-7-(N-fenilamine)
isoquinolin-5,8-dione [33] demonstrated the largest effects of the citotoxicity regarding
the tested carcinogenic cells. In the samplings regarding the citotoxic and citostatic
activities, under lab conditions, in a 48 hour incubation period, only the isoquinolin-5,8-
dione [33] presented only citotoxic activity and the isoquinolin-5,8-diones [49] and [50]
presented just citostatic activity. The results of this work suggest the making of new
samplings, with other cellular species and also with some kinds of enzymes, testing
other formulas and doses, so as to obtain definite conclusion regarding the synthesized
compounds anticarcinogenic potential.
1
CAPÍTULO 1
SÍNTESE DE CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS
1. Introdução
1.1. Caulibugulonas - metabólitos de origem marinha
Produtos naturais marinhos têm se tornado um campo cada vez mais comum de
pesquisa ao longo dos últimos anos. Mais de 12000 novas substâncias já foram
descritas a partir de organismos marinhos, ainda que o meio marinho permaneça
relativamente inexplorado, em comparação com o meio terrestre (JIMENEZ et alii,
2009).
Metabólitos secundários de briozoários têm uma grande variedade de estruturas. Uma
coleção do briozoário marinho Caulibugula Intermis, do Indo-Pacífico, levou ao
isolamento de quatro novas isoquinolinoquinonas (caulibugulonas A, B, C e D).
D
C
B
A
N
O
O
N
H
OH
N
O
O
N
H
Cl
N
O
O
N
H
Br
N
O
O
N
H
Este interesse nos derivados isoquinolínicos deve-se ao amplo espectro de atividades
biológicas. Estas sustâncias também têm sido usadas na terapia de doenças, como
antitumoral; no combate de endo- e exo-parasitos e, como antimicrobiano, entre outras
(JIMENEZ et alii, 2009).
2
1.2. Isoquinolinas
Nos últimos anos, as substâncias com esqueleto isoquinolínico [1] adquiriram grande
relevância no campo da Química Orgânica por seu esqueleto fazer parte com grande
frequência da estrutura molecular de muitas substâncias naturais ativas biologicamente,
com propriedades antitumorais, antimicrobianas, antiinflamatórias, citotóxicas etc, e
pela sua utilização como substância de partida na síntese de muitos outros produtos
(KOUZNETSOV et alii, 2005).
[1]
N
1
2
3
4
6
7
5
8
Figura 1 – Estrutura da isoquinolina [1].
Segundo Meléndez-Gómez e Kouznetsov (2005), tanto os compostos isoquinolínicos
naturais como os sintéticos são de grande interesse devido a seu amplo espectro de
atividade biológica, assim como o estudo de seu modo de ação e as diversas
estratégias de síntese utilizadas nas suas preparações.
A papaverina [2] e seus derivados são exemplos de alcalóides isoquinolínicos muito
úteis para o tratamento de vários problemas. Dentre os principais destacam-se:
vasodilatador na insuficiência circulatória cerebral, relaxante muscular da musculatura
lisa, coadjuvante na melhoria dos sintomas de senilidade, redutor de risco de acidentes
vasculares cerebrais, e redutor das crises de vertigens em pessoas idosas (SPEICH et
alii, 2002).
3
N
OMe
OMe
MeO
MeO
[2]
Figura 2 – Estrutura da papaverina [2].
Segundo Ozorio e colaboradores (2006), são muitos os alcalóides isoquinolínicos com
atividade antiparasitária. A coclaurina [3] e a norarmepavina [4] apresentam forte
atividade contra o crescimento de epimastigoto de Trypanosoma cruzi com uma IC
50
in
vitro ao redor de 0,30 mM.
N
OH
H
CH
3
O
CH
3
O
N
OH
H
CH
3
O
HO
[3]
[4]
Figura 3 – Estruturas da coclaurina [3] e da norarmepavina [4].
As naftilisoquinolinas [5], [6] e [7] são alcalóides biarílicos quirais isolados de plantas
pertencentes às famílias Ancistrocladaceae e Dioncophyllaceae e têm mostrado
atividades antiprotozoárias, em particular atividade antiplasmodial. Estas substâncias
também mostraram forte atividade contra os parasitos Leishmania donovani e T. cruzi
(OZORIO et alii, 2006).
4
[7][6][5]
N
CH
3
OCH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
O
OCH
3
N
CH
3
CH
3
O
OCH
3
CH
3
CH
3
OCH
3
OCH
3
N
CH
3
CH
3
O
OCH
3
CH
3
HO CH
3
CH
3
O
Figura 4 – Estruturas das naftilisoquinolinas [5], [6] e [7].
Outros exemplos de compostos isoquinolínicos cuja atividade antitumoral já é bastante
conhecida são os alcalóides tetracíclicos elipticina [8], olivacina [9] e janetina [10]
(YSHIKURA et alii, 2000). A elipticina, isolada pela primeira vez em 1959 da Ocrosia
elliptica, desperta grande interesse farmacêutico devido à sua atividade antitumoral
estar relacionada com a interação com o DNA (PEDERSEN et alii, 2005).
[10]
[9]
[8]
N
Me
N
Me
H
H
N
N
Me
Me
H
N
N
Me
MeH
Figura 5 – Estruturas da elipticina [8], da olivacina [9] e da janetina [10].
5
1.3. Sínteses de Isoquinolinas
1.3.1. Reação de Pomeranz-Fritsh
Segundo Shklyaev (2002), a síntese de isoquinolina pelo procedimento de Pomeranz-
Fritsh ocorre através de dois passos:
a) Em primeiro lugar o benzaldeído se condensa com o dietilacetal do aminoacetaldeído
para formar uma imina, em condições suaves (Esquema 1).
O
H
EtO OEt
H
2
N
100 °C
NH
EtO
OEt
H OH
N
OEt
OEt
- H
2
O
Aldimina
Esquema 1 – Síntese de imina através da condensação do dietilacetal com o
aminoacetaldeído.
b) A imina cicliza por tratamento com ácido forte e por eliminação de etanol produz uma
isoquinolina. Um processo competitivo que reduz o rendimento do processo é a
hidrólise da imina (Esquema 2).
i) -H
+
H
+
H
2
SO
4
N
OEt
OEt
100 ºC
N
OEt
OEt
H
-EtOH
N
OEt
N
O EtH
H
H
ii) -EtOH
N
Esquema 2 – Síntese de isoquinolina através da ciclização de imina.
6
Este segundo passo é uma substituição eletrofílica aromática (S
E
Ar), e isto explica o
porquê da reação se processar melhor com substituintes que aumentam a densidade
eletrônica do anel aromático e pior com substituintes que a reduzem. Todavia, esta
metodologia ainda é o melhor procedimento para obter isoquinolinas com grupos
eletroretiradores no anel aromático (Esquema 3).
(30%)
N
Br
160 ºC
Br
N
OEt
OEt
95 ºC
EtO
OEt
H
2
N
Br
O
H
H
2
SO
4
P
2
O
5
Esquema 3 – Síntese de isoquinolina com grupos eletroretiradores no anel aromático.
Os grupos eletrodoadores em posição meta ao grupo formila são os que mais aceleram
a reação (deslocalizam a carga nas duas posições orto ao ∼CHO) e dirigem a ciclização
na posição para em relação a eles dando lugar a isoquinolinas 7-substituídas, conforme
o Esquema 4, a seguir:
R = Eletrodoador
Posição reativa
Posição impedida
N
R
O
H
R
Esquema 4 – Síntese de isoquinolinas 7-substituídas.
Segundo Shklyaev (2002), este método de síntese não permite obter facilmente
isoquinolinas substituídas em C-1 (Figura 1), pois no primeiro passo implicaria formar
uma cetenimina a partir do dietilacetal de aminoacetaldeído e da cetona. Este processo,
não é favorecido pelo fato da carbonila cetônica ser menos eletrofílica e mais impedida
que a carbonila aldeídica. Entretanto, isoquinolinas substituídas em C-1 podem ser
preparadas com uma variante deste procedimento que utiliza uma benzilamina
adequadamente substituída e um dialquilacetal do glioxal (Esquema 5).
7
H
2
SO
4
10 ºC
-H
2
O
ii) -H
+
i) -EtOH
NH
EtO
OEt
MeO
Me
OH
H
EtO
OEt
O H
NH
2
Me
MeO
N
EtO
OEt
MeO
Me
N
EtO
OEt
MeO
Me
H
N
OET
Me
MeO
N
OET
MeO
H
H
Me
N
Me
MeO
140 ºC
(75%)
i) -EtOH
ii) -H
+
+H
+
(50%)
Esquema 5 – Síntese de isoquinolinas substituídas no carbono-1.
Nem o método de Pomeranz-Fritsch nem sua variante permitem obter isoquinolinas
substituídas em C-3 nem em C-4, dessa forma não é um método útil para isoquinolinas
substituídas no anel heteroaromático.
1.3.2. Reação de Bischler-Napieralski
Segundo Min e colaboradores (2004), a reação de Bischler-Napieralski implica na
reação do 1-amino-2-feniletano com um cloreto ou um anidrido de ácido para formar
uma amida que pode ciclizar com perda de água para dar uma 3,4-diidroisoquinolina.
Os agentes de ciclização mais comumente utilizados são o P
2
O
5
(pentóxido de fósforo),
o POCl
3
(oxicloreto de fósforo) e o SOCl
2
(cloreto de tionila).
As diidroisoquinolinas podem desidrogenar (oxidar) originando suas correspondentes
isoquinolinas com paládio, enxofre ou dissulfeto de difenila (Esquema 6).
8
(93%)
Pd/C
190 ºC
(83%)
(95%)
NH
2
CH
3
COCl
N
CH
3
O
H
N
CH
3
N
CH
3
P
2
O
5
CHCl
3
Esquema 6
– Desidrogenação de diidroisoquinolinas.
O passo de ciclização é uma S
E
Ar e portanto será favorecido por substituintes
eletrodoadores no anel aromático do 1-amino-2-feniletano. As aminas
meta
-
substituídas, como no exemplo a seguir, conduzem exclusivamente a isoquinolinas
substituídas em C-6, pois a ciclização ocorre em
para
ao grupo ativante, conforme
demonstrado no
Esquema 7
, a seguir:
(88%)
N
Ph
MeO
100 ºC
MeO
N
Ph
O
H
Posição favorecida
Posição mais impedida
POCl
3
Esquema 7
– Ciclização na posição
para
ao grupo ativante em amidas
meta
-
substituídas.
9
1.3.3. Reação de Pictet-Gams
Segundo Shklyaev (2002), a reação de Pictet-Gams é uma modificação da síntese de
Bischler-Napieralski que utiliza aminas do tipo (2-feniletil)amina potencialmente
insaturadas para obter assim heterociclos totalmente aromáticos e sendo, portanto, não
necessário o passo da oxidação (
Esquema 8
).
(77%)
NH
2
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
N
CH
3
O
H
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
N
CH
3
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
CH
3
COCl
POCl
3
CHCl
3
Esquema 8
– Síntese de isoquinolinas a partir de aminas potencialmente insaturadas.
1.3.4. Reação de Pictet-Spengler
As aminas do tipo (2-feniletil)-amina também podem reagir facilmente com aldeídos e
com bons rendimentos dando aldiminas que podem ciclizar em meio ácido a 1,2,3,4-
tetraidroisoquinolinas. De novo a ciclização é uma S
E
Ar e será favorecida por
substituintes eletrodoadores (
Esquema 9
) (SHKLYAEV, 2002).
10
CH
3
O
N
H
NH
2
CH
3
O
CH
3
O
N
H
OH
H C
O
H
CH
3
O
N
H
H
NH
CH
3
O
NH
CH
3
O
H
2
O
-H
2
O
HCl 20%
(80%)
Esquema 9
– Síntese de 1,2,3,4-tetraidroisoquinolinas a partir de aminas do tipo
(2-feniletil)-amina e aldeídos em meio ácido.
A ciclização precisa de substituintes ativantes colocados adequadamente e, assim,
ativando as posições
orto
ao grupo aminoetila. O fechamento do anel, sempre que
possível, ocorre em
para
ao grupo ativante.
Quando o anel aromático está muito ativado com substituintes hidroxílicos o
fechamento do anel ocorre em condições suaves (
Esquema 10
) (OLIVEIRA & KOIKE,
2003).
HO
N
HO
O
O
NH
2
HO
HO
O
O
CHO
pH 6-7
t.a.
(84%)
Esquema 10
– Reação de ciclização com anel aromático ativado com substituintes
hidroxílicos.
11
1.4. Reações de Isoquinolinas
Segundo Shaikh e colaboradores (1986), as mesmas reações sofridas pela piridina
ocorrem com as isoquinolinas. Formam
N
-óxidos e sais quaternários apresentando
basicidade similares a da piridina, O pK
a
da isoquinolina é 5,4 e o da piridina 5,2.
Em condições fortemente ácidas, a substituição eletrofílica na isoquinolina ocorre
preferencialmente no anel carbocíclico, Em geral é observada a substituição nas
posições 5 ou 8, ou em ambas (SHAIKH
et alii
,1986).
1.4.1. Nitração
As reações de nitração da isoquinolina conduzem majoritariamente à
5-nitroisoquinolina. A reação transcorre por ataque do íon nitrônio ao heterociclo
N-
protonado (
Esquema 11
) (SEIYAKU, 1966).
N
HNO
3
fumegante
H
2
SO
4
conc/
0 °C
N
NO
2
N
NO
2
(72%)
(8%)
Esquema 11
– Reação de nitração de isoquinolinas.
1.4.2. Sulfonação
Segundo Seiyaku (1966), a sulfonação conduz majoritariamente ao produto de
substituição na posição 5- produzindo o respectivo ácido sulfônico. A reação a altas
temperaturas leva ao produto de controle termodinâmico, o ácido
6-isoquinolinossulfônico, de acordo com o
Esquema 12
, a seguir:
12
N
> 250 °C
N
HO
3
S
N
SO
3
H
90 °C
H
2
SO
4
Esquema 12
– Reações de sulfonação de isoquinolinas a baixas e altas temperaturas.
1.4.3. Halogenação
A halogenação de isoquinolinas é bastante complexa e os produtos obtidos dependem
das condições de reação. Em presença de cloreto de alumínio as isoquinolinas se
convertem com bons rendimentos em 5-haloisoquinolinas,
Esquema 13
(SEIYAKU, 1966).
A introdução do halogênio no anel heterocíclico ocorre em condições relativamente
suaves, nas quais o par de elétrons do nitrogênio inicia a sequência por interação com
um eletrófilo conduzindo a 4-bromoisoquinolina. Os processos implicam em um ataque
do halogênio ao sal (
Esquema 13
) (SEIYAKU, 1966).
N
1) HCl
2) Br
2
/PhNO
2
80 °C
N
H
N
H
H Br
Br-Br
Br
-
N
H
H Br
H Br
N
H
H Br
Br
N
Br
- HBr
Br
2
/AlCl
3
75 °C
N
Br
Esquema 13
– Halogenação de isoquinolinas.
13
1.4.4. Substituição nucleofílica aromática
A substituição nas 3-haloisoquinolinas requer condições energéticas e, por isso, é
possível uma substituição seletiva em 1,3-dicloroisoquinolinas (
Esquema 14
)
(SEIYAKU, 1966).
(87%)
MeOH (refluxo)
MeONa
MeOH/DMSO
100 ºC
MeONa
N
Cl
N
OMe
N
Cl
OMe
N
Cl
Cl
Esquema 14
– Substituição seletiva em 3-haloisoquinolinas.
1.4.5. Redução
A redução seletiva do anel heterocíclico da isoquinolina pode ser conseguida utilizando
NaBH
4
/NiCl
2
ou por hidrogenação catalítica a temperatura ambiente. Em condições
fortemente ácidas a hidrogenação catalítica reduz seletivamente o anel carboaromático
e ao se prolongar o tempo de reação obtém-se o derivado peridrogenado
(
Esquema 15
) (SEIYAKU, 1966).
MeOH, t.a.
HCl 12M, t.a.
(87%)
(70%)
NN
N
H
2
/Pt
H
2
/Pt
Esquema 15
- Redução seletiva dos aneis da isoquinolina.
14
Com o LiAlH
4
são geradas 1,2-diidroisoquinolinas, que podem oxidar-se facilmente a
sistemas totalmente aromáticos, ou a uma mistura de tetraidroderivado e composto
aromático, especialmente em meio ácido, conforme evidenciado no
Esquema 16
descrito a seguir (SEIYAKU, 1966).
N
N
H
[O]
N
H
N
H
LiAlH
4
/ Et
2
O
N
-H
+
Esquema 16
– Redução de isoquinolinas com LiAlH
4
.
Segundo Shklyaev (2002), o anel heterocíclico dos sais de
N
-alquilisoquinolínio se
reduz facilmente por hidrogenação catalítica ou com NaBH
4
em meio prótico
(
Esquema 17
).
N
CH
3
NaBH
4
EtOH / t.a.
N
CH
3
Esquema 17
– Redução de sais
N
-alquilisoquinolínio com NaBH
4
em meio prótico.
15
1.4.6. Alquilação e Arilação
Haletos de alquil ou arilmagnésio, assim como aril ou alquilítio, reagem com
isoquinolinas fornecendo diidroisoquinolinas estáveis que podem ser rearomatizadas
com um oxidante adequado (
Esquema 18
) (SEIYAKU, 1966).
H
2
O
N
N
H
nBu
Li
N
H
nBu
H
N
nBu
nBuLi
PhH/t.a.
(90%)
(70%)
PhNO
2
200 ºC
Esquema 18
– Alquilação ou arilação de isoquinolinas.
Os reagentes de Grignard alquílicos requerem temperaturas mais elevadas como pode
ser visto no
Esquema 19
.
PhNO
2
H
2
O
N
N
MgBr
H Et
N
H
H Et
N
Et
EtMgBr
150 ºC
(66%)
Esquema 19
– Alquilação de isoquinolinas utilizando reagentes de Grignard.
16
1.4.7. Aminação
Isoquinolinas reagem com KNH
2
e amônia líquida fornecendo aminas via diidroadutos e
conduzem exclusivamente a 1-aminoisoquinolina, após oxidação, conforme é mostrado
no
Esquema 20
(SEIYAKU, 1966).
N
N
-
H NH
2
N
NH
2
K
+
KNH
2
/NH
3
(líq)
-10 ºC
KMnO
4
-65 ºC
(83%)
Esquema 20
– Síntese de 1-aminoisoquinolinas utilizando KNH
2
e amônia.
1.4.8. Hidroxilação
Segundo Seiyaku (1966), as isoquinolinas podem ser hidroxiladas diretamente com
KOH a alta temperatura desprendendo-se H
2
e originando 1-isoquinolona
(
Esquema 21
).
(60%)
200 ºC
KOH
N
-
K
+
O
H
H
N
N
O
K
+
N
OH
N
O
H
-H
2
H
2
O
Esquema 21 – Síntese de 1-isoquinolona utilizando KOH.
17
1.5. Sistemas derivados de isoquinolinas
1.5.1. Hidroxiderivados
As isoquinolinas com grupos hidroxilas se comportam como fenóis, salvo quando a
hidroxila se encontra em posição 1. Neste caso o tautômero mais estável é a
isoquinolona (Esquema 22) (SEIYAKU, 1966).
1-quinolona
N
H
O
-
N
O
H
N
OH
Esquema 22 – Tautomeria de isoquinolinas hidroxiladas na posição 1.
O derivado hidroxilado na posição 3 da isoquinolina pode existir na forma cetônica ou
fenólica dependendo das condições, já que ambos possuem estabilidades
comparáveis. Em meios pouco polares como o éter ou o éter de petróleo predomina o
isoquinolin-3-ol que é incolor. Já em solventes próticos como a água ou o etanol
observa-se a 2H-isoquinolino-3-ona que é amarela. Experimentalmente, uma solução
etérea incolor de isoquinolin-3-ol se torna amarela pela adição de metanol
(Esquema 23) (SEIYAKU, 1966).
N
H
O
-
N
H
O
N
OH
Isoquinolin-3-ol
(incolor)
2H-isoquinolino-3-ona
(amarela)
Esquema 23 – Formas cetônica e fenólica de isoquinolinas hidroxiladas na posição 3.
18
1.5.2. Aminoderivados
Seiyaku (1966), afirma que as aminoquinolinas e as aminoisoquinolinas existem como
tautômeros amino e todas são protonadas no nitrogênio heterocíclico. As aminas mais
básicas desta família são as 1 e a 6-aminoisoquinolinas com pK
a
de 7,6 e 7,2,
respectivamente (Esquema 24).
N
H
H
2
N
N
H
2
N
H
+
N
H
H
2
N
N
H
NH
2
N
H
NH
2
H
+
N
NH
2
Esquema 24 – Tautomeria de 1-aminoisoquinolina e de 6-aminoisoquinolina.
Entretanto, a 3-aminoisoquinolina é menos básica (pK
a
= 5,0) (Esquema 25).
N
NH
2
H
+
N
NH
2
H
N
NH
2
H
(não aromática)
Esquema 25 - Tautomeria de 3-aminoisoquinolina.
1.5.3. Alquilderivados
Os hidrogênios de um grupo alquila ligados ao carbono
α
colocado em posição 1 de
isoquinolina são ácidos e permitem conduzir processos de condensação tanto em meio
básico como ácido (Esquema 26).
19
(85%)
-OH
-
100 ºC
2 h
N
Ph
N
C
ZnCl
2
H
H
CH
Ph
O
ZnCl
2
Ph C
O
H
ZnCl
2
N
CH
2
ZnCl
2
N
CH
3
ZnCl
2
Ph C
O
H
N
CH
3
ZnCl
2
H
+
-2ZnCl
2
Esquema 26 – Condensação de isoquinolinas com grupo alquila na posição
α
ao
nitrogênio tanto em meio básico como em meio ácido.
20
1.5.4. Ácidos
Os ácidos isoquinolino-1-carboxílicos podem ser descarboxilados com facilidade via um
intermediário carregado que pode ser tratado com um aldeído como eletrófilo
(Esquema 27) (SEIYAKU, 1966).
(57%)
PhCHO
N
HO Ph
H
C
Ph
O
N
+
H
N
+
C
O
O
-
H
N
COOH
(-CO
2
)
Esquema 27 – Descarboxilação de ácidos isoquinolino-1-carboxílicos.
1.5.5. Sais quaternários de isoquinolínio.
A propriedade mais importante das isoquinolinas é a facilidade com que reagem com
reagentes nucleofílicos. Os sais de isoquinolínio reagem só em C-1 (processo
regioespecífico), quando a posição 1 está ocupada se obtém traços de substituição em
C-3 (SEIYAKU, 1966).
A adição de nucleófilos organometálicos, hidróxidos e hidretos transcorre facilmente e
os diidroderivados que se obtém devem ser manejados com cuidado para que não se
decomponham e nem se oxidem. Em muitos casos estes intermediários são estáveis e
requerem oxidantes para se rearomatizarem (Esquema 28) (SEIYAKU, 1966).
21
N
CH
3
O
N
CH
3
HO H
I
-
N
CH
3
H H
N
+
CH
3
N
H
CH
3
CH
3
CH
3
MgI
Et
2
O/t.a.
I
2
/EtOH
LiAlH
4
Et
2
O/t.a.
NaOH
t.a.
K
3
Fe(CN)
6
(70%)
(90%)
Esquema 28 - Adição de nucleófilos organometálicos, hidróxidos e hidretos a sais de
quaternários de isoquinolínio.
Reações do sal de N-acilisoquinolínio com cianeto são conhecidas como processos de
Reissert. O agente acilante é o cloreto de benzoíla e a reação se processa em meio
bifásico diclorometano e água (Esquema 29) (NOVAES et alii, 1999).
(Composto de Reissert)
CN
-
N
+
COPh
PhCOCl
CH
2
Cl
2
/ H
2
O
N
H CN
COPh
N
Esquema 29 – Reações do sal de N-acilisoquinolínio com cianeto - processos de
Reissert.
Os compostos de Reissert são muitos úteis para introduzir eletrófilos (E
+
) no anel
heterocíclico, desprotonar e eliminar CN
-
, conduzindo a heterocíclicos substituídos
(Esquema 30) (SEIYAKU, 1966).
22
(91%)
-CN
-
*NaH/DMF
PhLi ou MeLi (em meio homogênio)
KOH ou NaOH (em meio bifásico)
N
Ph
N
C
HO
Ph
O
-
Ph
N
NC
C
HO
Ph
O
-
Ph
N
NC
C
Ph
O
Ph
N
COPh
CN
Base*
N
H CN
COPh
PhCH
2
Cl
OH
-
/H
2
O
Esquema 30 – Síntese de heterocíclicos substituídos utilizando compostos de Reissert.
Os N-alquilderivados de isoquinolínio em posição 1 se desprotonam no carbono
α
muito
facilmente. Muitas vezes não é necessário sequer bases, já que o carbânion se
encontra muito estabilizado (Esquema 31) (SEIYAKU, 1966).
E
+
= RX, RCOH, etc
X
-
N
+
CH
2
CH
3
E
E
+
N
CH
2
CH
3
N
+
CH
2
CH
3
X
-
N
+
CH
3
CH
3
Esquema 31 – Desprotonação de N-alquilderivados de isoquinolínio na posição 1.
23
1.6. Aminoisoquinolinoquinonas
1.6.1. Sínteses de Aminoisoquinolinoquinonas
Segundo Owton (1999), a unidade aminoquinona se encontra presente em um grande
número de compostos de interesse terapêutico que tem apresentando atividades
antitumorais, antibacterianos, antiprotozoários, antifúngicos, entre outras.
O deslocamento nucleofílico de halogênios nos derivados de isoquinolino-5,8-quinonas
dão resultados interessantes que são utilizados na síntese de antibióticos tais como as
mansouramicinas (Figura 6) que possuem em suas estruturas a
7-aminoisoquinolinoquinona (LAATSCH, 2006).
As mansouramicinas, isoladas da esponja marinha azul Cribrochalina sp., apresentam
pronunciada atividade citotóxica com valores de IC
50
abaixo de 30 ng·mL
-1
e atividade
contra vírus, bactérias e malária (LAATSCH, 2006).
N
O
O
N
H
O
O
N
H
N
O
O
N
H
N
H
N
O
O
N
H
N
H
N
O
O
N
H
OH
N
O
O
N
H
N
H
N
O
O
N
H
N
O
O
N
H
Figura 6 – Mansouramicinas isoladas de Cribrochalina sp.
Muitos destes compostos isolados de produtos naturais têm gerado um grande
interesse científico devido à sua fácil preparação. Os métodos de obtenção de
aminoisoquinolinoquinonas são múltiplos e variados, destacando-se principalmente a
reação de adição/oxidação do anel quinônico, a aminação direta, e as reações de
24
substituição nucleofílica em que um grupo amino substitui um átomo de hidrogênio
(WIPF et alii, 2004).
Segundo Shaikh e colaboradores (1986), a adição direta de aminas a quinonas se
processa por um ataque nucleofílico de aminas primárias ou secundárias, alifáticas ou
aromáticas, ao sistema
α
,
β
-insaturado do anel quinônico mediante um mecanismo de
adição conjugada, para formar um hemiaminal vinílico. Este intermediário se
tautomeriza na hidroquinona e, posteriormente, se oxida na aminoquinona por ação
direta do ar, agentes oxidantes ou mesmo pela quinona de partida (Esquema 32).
O
O
+
HN
R
1
R
2
O
OH
H
N R
1
R
2
OH
OH
N
R
1
R
2
O
O
N
R
1
R
2
[O]
Esquema 32 – Síntese de aminoquinonas por adição direta de aminas.
A aminação oxidativa de p-benzoquinonas está descrita por um grande número de
autores em diferentes condições experimentais, conduzindo a misturas de quinonas
monossubstituídas [11] e dissubstituídas [12] (SHAIKH et alii, 1986).
[12]
[11]
O
O
N
R
1
N
R
2
R
2
R
1
O
O
N
R
1
R
2
Figura 7 – Quinonas monossubstituídas [11] e dissubstituídas [12].
Segundo Llorente (1995), a facilidade com que a amina se adiciona ao sistema
quinônico depende em grande parte da natureza da amina, sendo mais frequente a
formação de produtos de monoadição no caso de aminas secundárias, e de dupla
adição com aminas primárias. No caso de existirem substituintes no anel
benzoquinônico a reação de aminação é regioseletiva dependendo da posição do grupo
amino, da natureza eletrônica e dos efeitos estéreos dos substituintes. Em geral, a
25
substituição ocorre predominantemente na posição mais eletrofílica do anel quinônico.
Por exemplo, a aminação orto a um doador eletrônico como uma metoxila é
desfovorecida, enquanto que a mesma reação é favorecida se um grupo aceptor de
elétrons como o bromo estivesse no lugar da metoxila, como se pode verificar no
Esquema 33. Neste se observa que a adição está favorecida frente à substituição,
provavelmente por razões eletrônicas.
(77%)
O
O
Br
N
H
H
2
N
+
O
O
Br
CH
3
OH
Esquema 33 – Reação de aminação de quinona halogenada.
Na adição de aminas a outros sistemas quinônicos tais como 1,4-naftoquinona e
5,8-quinolinaquinona obtem-se os derivados N-substituídos correspondentes [13] e [14]
(OWTON, 1999 e WIPF et alii, 2004).
O
O
N
R
1
R
2
O
O
N
N
R
1
R
2
[14]
[13]
Figura 8 – Estruturas de derivados N-substituídos de 1,4-naftoquinona [13] e
5,8-quinolinaquinona [14].
Aminoquinonas sem substituintes no nitrogênio amínico são conseguidas através de
adição com ácido hidrazóico. A 2-amino-1,4-naftoquinona [17] pode ser preparada por
adição de azida sódica em ácido acético a 1,4-naftoquinona [15]. A adição de ácido
hidrazóico origina um intermediário instável de azidonaftoidroquinona [16], que se oxida
ao grupo azido por transferência intramolecular redox de átomos de hidrogênio da
hidroquinona e que, finalmente, se reduz com liberação de nitrogênio (Esquema 34)
(FIESER & HARTWELL, 1935).
26
[17] (81%)[16]
[15]
OH
OH
N
3
O
O
HN
3
O
O
NH
2
Esquema 34 – Síntese da 2-amino-1,4-naftoquinona [17] com ácido hidrazóico.
A reação do ácido hidrazóico com quinonas segue um padrão geral de adição a
sistemas carbonílicos
α
,
β
-insaturados.
O caráter eletrônico dos substituintes dirige a regiosseletividade da adição. Na reação
regiosseletiva com azida de sódio a 5-hidroxinaftoquinona [18] produz como único
produto de reação a 2-amino-8-hidroxinaftoquinona [19] (Esquema 35)
(LLORENTE, 1995).
AcOH
O
OOH
NH
2
NaN
3
O
OOH
[18] [19]
Esquema 35 – Síntese da 2-amino-8-hidroxinaftoquinona [19] com azida de sódio.
Para derivados de quinolina-5,8-quinona, a adição de ácido hidrazóico segue
mostrando a regiosseletividade esperada. Assim, a 2,4-dimetilquinolino-5,8-quinona [20]
produz majoritariamente a 6-amino-2,4-dimetilquinolina-5,8-quinona [21] através da
oxido-redução intramolecular do intermediário 6-azido-2,4-dimetil-5,8-diidroxiquinolina
(Esquema 36) (LLORENTE, 1995).
27
N
O
O
CH
3
CH
3
NH
2
HN
3
N
O
O
CH
3
CH
3
[20] [21]
Esquema 36
– Síntese da 6-amino-2,4-dimetilquinolino-5,8-quinona [21] a partir da
2,4-dimetilquinolino-5,8-quinona [20] com ácido hidrazóico.
Segundo Llorente (1995), o tratamento de 1,4-naftoquinona [15] com difenilsulfimida ou
metilfenilsulfimida conduz ao produto aminado [22] (
Esquema 37
).
O
O
HN S
Ph
R
R= CH
3
, Ph
[15]
O
-
O
N
H
S
R Ph
H
O
O
NH
2
[22]
Esquema 37
- Síntese da 2-amino-1,4-naftoquinona [22] com difenilsulfimida ou
metilfenilsulfimida.
Outro método de síntese de aminoquinonas é com a utilização de anéis quinônicos
contendo grupos como o alcóxi ou halogênios. O tratamento de
2,5-dimetoxibenzoquinona [23] com amônia em etanol, leva a obtenção de
2,5-diaminobenzoquinona [24] através dos intermediários indicados no
Esquema 38
(LLORENTE, 1995).
28
O
O
NH
2
H
2
N
NH
3
O
O
NH
2
H
3
CO
+
O
-
O
NH
3
H
3
CO
OCH
3
O
O
OCH
3
H
3
CO
+
NH
3
[23]
[24]
Esquema 38
– Síntese da 2,5-diaminobenzoquinona [24] a partir da
2,5-dimetoxibenzoquinona [23] com amônia em etanol.
Este método pode ser estendido a outras aminas alifáticas e aromáticas com excelentes
resultados assim como a outros anéis quinônicos, como 2-metóxi-1,4-naftoquinonas
[25] ou 6-metoxiquinolina-5,8-quinona [26]
(
Esquema 39
).
N
O
O
N
H
CH
3
N
O
O
OCH
3
H
2
N
CH
3
H
2
N
OH
O
O
N
H
OH
O
O
OCH
3
[25]
[26]
Esquema 39
– Síntese da 2-metóxi-1,4-naftoquinonas ou da
6-metoxiquinolina-5,8-quinona.
Assim, a partir da 7-bromoisoquinolinoquinona [27], por reação com azida sódica, se
obtém o 7-azidoderivado [28], cuja redução posterior com trifenilfosfina origina a
7-aminoisoquinolinoquinona [29] (
Esquema 40
) (LLORENTE, 1995).
29
O
O
N
NH
2
O
O
N
N
3
O
O
N
Br
NaN
3
Ph
3
P
[27]
[28]
[29]
Esquema 40
– Síntese da 7-aminoisoquinolinoquinona [29] a partir da
7-bromoisoquinolinoquinona [27] por reação com azida sódica e trifenilfosfina.
Segundo Shaikh (1986), a reação de adição entre azanaftoquinonas e nucleófilos
apropriados é um método eficiente e regiosseletivo para obter azanaftoquinonas
substituídas devido a maior polaridade da dupla ligação 6-7 da naftoquinona. No caso
da isoquinolino-5,8-quinona [30] tem-se preferencialmente a adição de aminas na
posição 7, já que é mais susceptível ao ataque nucleofílico (Figura 9).
N
O
O
[30]
Figura 9
– Estrutura da isoquinolino-5,8-quinona [30] com o carbono 7 elétron
deficiente.
Segundo Kim e colaboradores (2007), muitas propriedades biológicas têm sido
aumentadas pela presença de substituintes como o cloro e grupos amino em quinonas,
como acontece nas isoquinolino-5,8-dionas dissubstituídas nas posições 6 e 7 [31].
N
Cl
N
R
O
O H
[31]
Figura 10 – Estrutura de isoquinolino-5,8-dionas cloradas dissubstituídas nas posições
6 e 7 [31].
30
A substituição de um átomo de cloro da 2,3-dicloro-1,4-naftoquinona por uma amina na
presença de um equivalente de carbonato de potássio acontece com bons rendimentos
(LLORENTE, 1995). Estes resultados também são observados com a 6,7-dicloro-
isoquinolino-5,8-diona [32] (Esquema 41) (SHAIKH, 1986).
[33] (75%)
N
O
O
Cl
Cl
+
CH
3
OH
N
O
O
N
Cl
H
H
2
N
[32]
Esquema 41
– Reação de substituição na 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32].
De acordo com Shaikh (1986), a reação entre a 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32] e
anilina na presença de metanol origina preferencialmente a 6-cloro-7-
fenilaminoisoquinolino-5,8-diona [33] (
Esquema 42
).
N
O
O
Cl
Cl
N
O
O
Cl
Cl
N
O
Cl
Cl
O
Esquema 42
– Estruturas de ressonâncias para isoquinolino-5,8-diona diclorada.
Já que o efeito retirador de elétrons do nitrogênio isoquinolínico incrementa a
eletrofilicidade da carbonila em 8 e este efeito se transmite através do sistema
α
,
β
-insaturado na posição 6, resulta que o grupo amino nesta posição é menos
nucleófilo que quando se encontra na posição 7 e, portanto, os rendimentos com a
7-aminoisoquinolinoquinona [34] são superiores ao obtidos com seu isômero em
posição 6 (
Esquema 43
) (SHAIKH, 1986)
.
31
H
2
NR
N
O
O
Cl
N
R
H
N
O
O
Cl
Cl
[34]
Esquema 43
– Síntese da 7-aminoisoquinolinoquinona [34].
1.6.2. Caulibugulonas
Caulibugulonas são moléculas isoladas do briozoário marinho
Calibugula intermis
e que
revelaram a ação diretamente sobre a via das enzimas Map p38, com consequente
indução de apoptose em várias linhagens de células cancerígenas (MILANOWSKI
et alii,
2004
apud
MAYER & GUSTAFSON, 2006).
As caulibugulonas isoladas deste animal são em número de seis, denominadas pelas
seis primeiras letras do alfabeto (A-F). A avaliação de suas atividades biológicas
revelou que estas são intensas contra a linhagem celular murina IC2, com
concentrações variando entre 0,03 e 1,67 mg·mL
-1
(WIPF
et alii
, 2004).
Segundo Wipf e colaboradores (2004), as aminoisoquinolinoquinonas caulibugulonas A
[35], B [36], C [37] e D [38] (
Figura 11
), com o grupo amino na posição 7, podem ser
obtidas a partir do 5-hidroxiisoquinolino [39].
N
O
O
N
H
OHN
O
O
N
H
R
Caulibugulona A [35] R = H
Caulibugulona B [36] R = Br
Caulibugulona C [37] R = Cl
Caulibugulona D [38]
Figura 11
– Estruturas das caulibugulonas A [35], B [36], C [37] e D [38].
32
Estes mesmos autores, neste mesmo trabalho, descreveram que a síntese destas
substâncias pode ser realizada através da reação entre o 5-hidroxiisoquinolino [39] com
iodobenzeno bis(trifluoroacetato) PIFA em solução de acetonitrila e água e subsequente
adição
in situ
de CeCl
3
e metilamina (
Esquema 44
).
1. PIFA
H
2
O/CH
3
CN
t.a.
2. CeCl
3
, CH
3
NH
2
t.a.
N
OH
[39]
N
O
O
N
H
Caulibugulona A [35]
Esquema 44
– Síntese da caulibugulona A [35] a partir do 5-hidroxiisoquinolino [39].
Em seguida, a caulibugulona A [35] foi tratada com N-bromosuccinimida (NBS) e com
N-clorosuccinimida (NCS) para produzir as caulibugulonas B [36] e C [37],
respectivamente (
Esquema 45
).
Dioxano
t.a.
NBS
N
O
O
N
H
Br
N
O
O
N
H
Caulibugulona A [35]
Caulibugulona B [36]
Caulibugulona A [35] Caulibugulona C [37]
MeOH
t.a.
NCS
N
O
O
N
H
Cl
N
O
O
N
H
Esquema 45
– Síntese da caulibugulona B [36] a partir da caulibugulona A [35] e da
caulibugulona C [37] a partir da caulibugulona A [35].
33
Finalmente, a caulibugulona D [38] foi sintetizada a partir do 5-hidroxiisoquinolino [39]
através de duas etapas. Numa primeira etapa oxidou-se o 5-hidroxiisoquinolino [39]
com iodobenzeno bis(trifluoroacetato), PIFA, em solução de acetonitrila e água. Em
seguida, tratou-se a isoquinolino-5,8-diona obtida com 2-aminoetanol (
Esquema 46
).
[39]
Caulibugulona D [38]
N
OH
N
O
O
N
H
OH
1. PIFA
H
2
O/CH
3
CN
t.a.
2. CeCl
3
H
2
NCH
2
CH
2
OH
t.a.
Esquema 46
– Síntese da caulibugulona D [38] a partir do 5-hidroxiisoquinolino [39].
Uma das contribuições mais importantes dos compostos quinolínicos e isoquinolínicos
é seu conhecido aporte na luta contra o câncer. Nos últimos anos, os alcalóides
isoquinolínicos têm despertado um interesse muito grande nos pesquisadores da área,
especialmente as caulibugulonas, por terem demonstrado propriedades citotóxicas
potentes, amplo espectro antitumoral, além de propriedades antimicrobianas e antivirais
(MILANOWSKI
et alii,
2004
apud
MAYER & GUSTAFSON, 2006).
Dessa forma, este trabalho descreve, no capítulo 1, a síntese das caulibugulonas A, C e
D e de análogos estruturais, com o intuito de se obter agentes químicos eficientes no
combate a células cancerígenas, mais seletivos e menos tóxicos ao homem.
Os ensaios biológicos relativos a todas as substâncias são apresentados no capítulo 2,
onde é relatado o estudo da atividade anticancerígena com as células - U937 (leucemia
humana, linhagem monocítica), MOLT4 (leucemia humana, linhagem linfocítica),
COLO205 (câncer de cólon humano, linhagem epitelióide) e H460 (câncer pulmonar
humano, linhagem epitelióide).
Finalmente, são apresentadas as conclusões e as referências bibliográficas
consultadas.
34
2. Justificativa e proposta de trabalho
Tendo em vista o grande impacto das doenças causadas pelo câncer nos dias atuais na
expectativa de vida da população, não só brasileira como mundial, a busca por novos e
mais eficientes fármacos torna-se cada vez mais importante.
O mercado nacional movimentou, em 2008, mais de 10 bilhões de reais com
medicamentos e o aumento previsto na receita para o ano de 2009 foi de 6% a 8%. O
Brasil é considerado o sétimo mercado mundial de medicamentos, com uma taxa
elevada de demanda. Dentre os vários setores em que atua, a produção de
medicamentos representa uma parcela considerável. Todavia, praticamente toda a
tecnologia existente pertence a companhias multinacionais. O desenvolvimento de
tecnologia própria é importante, principalmente quando se considera a vitalidade do
mercado mundial de fármacos.
Uma vez que o tratamento do câncer pode danificar células e tecidos saudáveis,
poderão ocorrer efeitos secundários indesejáveis. Estes efeitos dependem do tipo e
extensão do tratamento e podem variar conforme os doentes ou entre as sessões de
tratamento. Os efeitos secundários dos fármacos anticancerígenos dependem,
sobretudo, do tipo de medicamento e da dose administrada.
Apesar de existirem muitas substâncias com atividade anticancerígena, há a
necessidade de desenvolver novos produtos que sejam seletivos, ligando-se
seletivamente a sítios de ação determinados e em baixas dosagens, e assim
apresentando o mínimo possível de efeitos colaterais.
Dessa forma, como as caulibugulonas apresentam atividade antitumoral comprovada e
devido à limitada quantidade de caulibugulonas obtidas de fontes naturais, decidiu-se
investigar uma rota sintética para a obtenção de maior quantidade de material para
ensaios biológicos.
35
É importante salientar que atualmente existem apenas duas sínteses de caulibugulonas
descritas na literatura, a de Wipf (2004) e a de Tamagnan (2004) e seus respectivos
colaboradores.
Assim, este trabalho descreve a síntese total inédita das caulibugulonas A, C e D, em
um número menor de etapas do que as já descritas na literatura. Aqui também será
mostrada a avaliação da atividade anticancerígena das caulibugulonas A, C e D e de
nove análogos preparados.
As substâncias foram preparadas inicialmente pela condensação entre a
2,2-dimetoxietanamina [40] e o aldeído [41], seguida da redução da imina [42]. Em
seguida, a amina [43] foi ciclizada com ácido trifluoroacético levando à formação da
isoquinolina dimetoxilada [44], que, em presença de nitrato de cério amoniacal (CAN)
produziu a isoquinolino-5,8-diona [45] (
Esquema 47
).
OMe
OMe
O
H
MeO
NH
2
MeO
OMe
OMe
N
MeO
MeO
N
OMe
OMe
H
MeO
OMe
N
OMe
OMe
N
O
O
[40]
[41]
[42]
[43]
[44] [45]
Esquema 47 - Rota de síntese empregada na obtenção das isoquinolinas [44] e [45].
36
3 – Resultados e Discussão
3.1. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45]
Visando o preparo de novas substâncias com atividade anticancerígena foi sintetizada
uma série de substâncias derivadas da isoquinolino-5,8-diona [45], intermediário-chave
para a síntese das caulibugulonas e análogos. A escolha desse esqueleto básico
baseou-se nos dados publicados por Ryu (1999) e Wipf (2004), e seus respectivos
colaboradores, os quais descreveram as sínteses e as avaliações de atividades
biológicas de caulibugulonas A [35], C [37] e D [38] e de alguns análogos que se
mostravam promissores na inibição de células tumorais.
N
O
O
[45]
Figura 12
- Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45].
Dessa forma, a isoquinolino-5,8-diona [45] é um intermediário essencial para a
preparação de substâncias dos tipos mostrados na
Figura 13
, requeridos para
avaliação de atividade anticancerígena.
37
[52]
N
O
O
N
H
Cl
OEt
[51]
N
O
O
N
H
Cl
OMe
[50]
N
O
O
N
H
Cl Br
N
O
O
N
H
Cl
Br
[49]
[33]
N
O
O
N
H
Cl
[48]
N
O
O
N
Cl
H
N
O
O
N
Cl
H
[47]
[37]
N
O
O
N
Cl
H
N
O
O
Cl
Cl
[32]
N
O
O
N
H
[46]
[38]
[35]
N
O
O
N
OH
H
N
O
O
N
H
Figura 13
– Isoquinolino-5,8-dionas com potencial atividade anticancerígena.
38
3.2. Preparação da N-2,5-dimetoxibenziliden-N-2,2-dimetoxietilamina [42]
N
OMe
OMe
MeO
MeO
[42]
Figura 14
- Estrutura da imina [42].
Para o preparo da isoquinolino-5,8-diona [45], utilizou-se como material de partida a
imina [42], que foi preparada a partir da condensação da 2,2-dimetoxietanamina [40]
com o aldeído [41], em tolueno como solvente, sob refluxo (Esquema 47).
A purificação da mistura contendo a imina [42] se fez por meio de coluna cromatográfica
de sílica-gel, tendo como eluente hexano e acetato de etila (2:1, R
f
=0,6), que resultou
na obtenção de um óleo alaranjado com 95% de rendimento.
O primeiro indício da formação da imina [42] se deu pela análise de seu espectro de
massas (
Figura 1A
, Apêndice). Na
Tabela 1
estão indicados os principais sinais do EM
com os possíveis fragmentos iônicos.
39
Tabela 1
– Principais sinais do EM para a imina [42].
Íons (
m/z
)
% do pico base
Fragmento iônico
253 4
190 2
75 100
Outro indício que reforça a formação da imina [42] foi através de seu espectro no
infravermelho por transformada de Fourier, que mostrou um sinal em 1641 cm
-1
,
característica de estiramento imínico e o desaparecimento do sinal em 1676 cm
-1
, de
estiramento carbonílico de aldeído do material de partida [41] (
Figura 2A
, Apêndice).
A análise do espectro de RMN de
1
H da imina [42] (
Figura 3A
, Apêndice) confirmou a
estrutura da substância desejada. Entre as evidências que suportam o sucesso da
transformação se destacam o simpleto em
δ
= 3,37 dos hidrogênios dos grupos
metoxilas alifáticos; os dois simpletos em
δ
= 3,78 e 3,79 dos hidrogênios dos grupos
metoxilas aromáticos; o tripleto em
δ
= 4,64 (
J
= 4,5 Hz) do hidrogênio H1; um dupleto
em
δ
= 7,46 (
J
= 4,5 Hz) do hidrogênio H2; o simpleto em
δ
= 8,65 do hidrogênio H3; o
dupleto em
δ
= 6,78 (
J
= 7,0 Hz) do hidrogênio H6; o duplo dupleto em
δ
= 6,89
OMe
OMe
N
MeO
MeO
N
OMe
MeO
MeO
MeO
MeO
H
40
(
J
= 7,0 Hz e
J
= 1,5 Hz) do hidrogênio H7; o dupleto em
δ
= 6,91 (
J
= 1,5 Hz) do
hidrogênio H9.
No espectro de RMN de
13
C (
Figura 4A
, Apêndice) o sinal em
δ
= 53,8 foi atribuído aos
carbonos das metoxilas alifáticas e os situados em
δ
= 55,9 e 56,4 às metoxilas
aromáticas. Outros sinais atribuídos foram os localizados em
δ
= 104,2, (C1); em
δ
= 64,0, (C2); em
δ
= 159,5, (C3); em
δ
= 125,0, (C4), em
δ
= 153,7, (C5); em
δ
= 118,8, (C6); em
δ
= 110,7, (C7); em
δ
= 153,5, (C8); e em
δ
= 112,8, (C9).
9
8
7
6
OMe
OMe
N
MeO
MeO
5
1
2
3
4
Figura 15
- Estrutura da imina [42] com os carbonos numerados.
3.3. Preparação da N-[2,2-dimetoxietil]-N-[2,5-dimetoxibenzil]amina [43]
[43]
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
Figura 16
- Estrutura da amina [43].
A preparação da amina [43] foi através da redução da imina [42] com boroidreto de
sódio em metanol, à temperatura ambiente. A purificação da mistura contendo a amina
[43] se fez por meio de coluna cromatográfica de sílica-gel, tendo como eluente hexano
e acetato de etila (1:2, R
f
=0,4), que resultou na obtenção de um óleo amarelo com
100% de rendimento. O primeiro indício da formação da amina [43] se deu pela análise
de seu espectro de massas (
Figura 5A
, Apêndice). Na
Tabela 2
estão indicados os
principais sinais do EM com os possíveis fragmentos iônicos.
41
Tabela 2
– Principais sinais do EM para a amina [43].
Íons (
m/z
)
% do pico base
Fragmento iônico
255 7
180 30
151 100
Outro indício da formação da amina [43] se deu pela análise de seu espectro no
infravermelho, que mostrou o desaparecimento do sinal em 1641 cm
-1
, característico de
estiramento imínico do material de partida [42] (
Figura 6A
, Apêndice).
A análise do espectro de RMN de
1
H da amina [43] (
Figura 7A
, Apêndice) confirmou a
estrutura da substância desejada. Destacam-se os seguintes sinais: um simpleto em
δ
= 3,32 dos hidrogênios das metoxilas alifáticas; dois simpletos em
δ
= 3,73 e 3,76 dos
hidrogênios das metoxilas aromáticas; um tripleto em
δ
= 4,50 (
J
= 5,3 Hz) do hidrogênio
H1; um dupleto em
δ
= 2,71 (
J
= 5,3 Hz) do hidrogênio H2; e o aparecimento de um
simpleto relacionado ao hidrogênio amínico (NH) em
δ
= 3,12 e de um simpleto em
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
OMe
OMe
N
CH
2
H
CH
2
OMe
OMe
42
δ
= 3,80 para os hidrogênios H3. Estes dois últimos indícios são corroborados pelo
desaparecimento do simpleto em
δ
= 8,70 relacionado ao hidrogênio H3 imínico. Os
outros sinais desta molécula são um dupleto em
δ
= 6,75 (
J
= 7,0 Hz) do hidrogênio H6;
um duplo dupleto em
δ
= 6,74 (
J
= 7,0 Hz e
J
= 1,6 Hz), relacionado com o hidrogênio
H7; e o dupleto em
δ
= 6,84 (
J
= 1,6 Hz) do hidrogênio H9.
No espectro de RMN de
13
C (
Figura 8A
, Apêndice) o sinal em
δ
= 53,8 foi atribuído aos
carbonos das metoxilas alifáticas, e os localizados em
δ
= 54,9 e 55,8 aos carbonos
das metoxilas aromáticas. Em
δ
= 103,8 tem-se o carbono C1; em
δ
= 48,8 o C2; e em
δ
= 49,8 o C3. Em
δ
= 128,0 observamos o carbono C4, em
δ
= 153,2 o C5; em
δ
= 116,2 o C6; em
δ
= 111,1 o C7; em
δ
= 151,7 o C8; e em
δ
= 112,6 tem-se o
carbono C9.
4
3
2
1
5
OMe
OMe
N
MeO
MeO
H
6
7
8
9
Figura 17
- Estrutura da amina [43] com os carbonos numerados.
43
No
Esquema 48
sugere-se o mecanismo para a formação da imina [42] e sua posterior
redução por transferência de hidreto.
100%
95%
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
O
H H
Na
+
OMe
OMe
MeO
MeO
N
N
OMe
OMe
MeO
MeO
H
B
H
H
H
H
Na
+
N
OMe
OMe
MeO
MeO
OMe
OMe
O
N
H
MeO
MeO
HNH
2
MeO
OMe
H
O OMe
OMe
[42]
[43]
NaBH
4
Esquema 48
– Mecanismo para a preparação da imina [42] e da amina [43].
3.4. Preparação da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44]
N
OMe
OMe
[44]
Figura 18 - Estrutura da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44].
Uma vez produzida a amina [43], foi realizada a ciclização empregando a reação de
Pictet-Spengler, com ácido trifluoroacético, para a preparação da isoquinolina
dimetoxilada [44], conforme metodologia descrita por Rousseau e Do
dd
(apud LE HYARIC et alii, 2002).
44
Nesta reação o ácido trifluoroacético foi adicionado à amina [43], sendo que a adição foi
realizada sob atmosfera de nitrogênio, banho de gelo e com velocidade bastante lenta
para que a reação de ciclização fosse favorecida. A mistura reacional foi submetida ao
fracionamento cromatográfico em coluna de sílica-gel, tendo como eluente hexano e
acetato de etila, na proporção de 3:1 (R
f
= 0,4). Deste processo foi isolado um óleo
amarelo em 68% de rendimento.
A confirmação estrutural da substância foi feita, inicialmente, pela análise do seu
espectro de massas (Figura 9A, Apêndice). Na tabela 3 estão indicados os principais
sinais com os possíveis fragmentos iônicos.
Tabela 3 – Principais sinais do EM para a 5,8-dimetoxiisoquinolina [44].
Íons (m/z) % do pico base Fragmento iônico
189 73
174 100
146 27
N
OMe
OMe
N
O
OMe
N
OMe
45
A análise do espectro de RMN de
1
H da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] (Figura 10A,
Apêndice) confirmou a estrutura da substância desejada, em primeira análise pela
ausência dos sinais dos hidrogênios das metoxilas alifáticas. Outros fatos que
corroboram esta idéia são os simpletos em
δ
= 3,94 e 3,97 dos hidrogênios dos grupos
metoxilas aromáticos, e o simpleto em
δ
= 9,57 associado ao hidrogênio H1. Outros
sinais relevantes são o dupleto em
δ
= 8,55 (J= 5,6 Hz), do hidrogênio H2; o dupleto em
δ
= 7,92 do H3 (J= 5,6 Hz); o dupleto em
δ
= 6,73 (J= 9,0 Hz) do H6; e o dupleto em
δ
= 6,88 (J= 9,0 Hz) do H7.
No espectro de RMN de
13
C (Figura 11A, Apêndice) os sinais em
δ
= 55,8 e 55,9, foram
associados aos carbonos das metoxilas aromáticas. Já os sinais em
δ
= 147,2;
δ
= 143,3; e
δ
= 114,7 foram atribuídos respectivamente aos cabonos C1, C2 e C3 da
parte heterocíclica da isoquinolina. Os carbonos do outro anel foram atribuídos da
seguinte forma:
δ
= 121,3 (C4);
δ
= 148,5 (C5);
δ
= 103,5 (C6);
δ
= 107,8 (C7),
δ
= 149,8
(C8); e
δ
= 129,5 (C9).
1
2
3
4
6
7
9
8
5
N
OMe
OMe
Figura 19 - Estrutura da isoquinolinodimetoxilada [44] com os carbonos numerados.
46
3.5. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45]
N
O
O
[45]
Figura 20 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45].
Segundo Carrijo e Romero (2000) a oxidação de sistemas aromáticos para quinonas
utilizando oxidantes de cério (IV) se processa, normalmente, com bons rendimentos.
Baseando-se no procedimento descrito por Owton (1999) a isoquinolino-5,8-diona [45]
foi preparada através da oxidação da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] com nitrato de cério
amoniacal (CAN), tendo como solvente uma mistura de acetonitrila e água 40%. Nesse
procedimento, a 5,8-dimetoxiisoquinolina [44] dissolvida em acetonitrila foi tratada com
quatro equivalentes de CAN. A reação foi realizada em banho de gelo (0 °C),
adicionando-se o CAN bem lentamente (1 h). A mistura reacional foi deixada sob
agitação durante uma hora, a 0 °C. Após este período, foi observado por CCD que o
material de partida já havia sido consumido. O produto obtido na forma de um sólido
amarelo com faixa de fusão observada entre 136 e 137 ºC foi submetido à purificação
em coluna cromatográfica tendo como eluente hexano e acetato de etila na proporção
de 2:1 (R
f
= 0,3), com 65% de rendimento, entretanto, tivemos dificuldade para purificá-
lo já que o mesmo é bastante instável. A estrutura de [45] foi confirmada por CG-EM e
RMN de
1
H.
A confirmação estrutural da isoquinolino-5,8-diona foi feita, inicialmente, pela análise do
seu espectro de massas (Figura 12A, Apêndice). Na Tabela 4 estão indicados os
principais sinais com os possíveis fragmentos iônicos.
47
Tabela 4 – Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona [45].
Íons (m/z) % do pico base
Fragmento iônico
159 100
131 11
105 25
77 17
N
O espectro de massas para a isoquinolino-5,8-diona [45] mostrou o íon molecular em
m/z=159. A perda de CO (M–28) forneceu o íon em m/z=131. Com a perda HC≡CH
forneceu o íon em m/z=105, que por sua vez perdeu novamente CO fornecendo o sinal
em m/z=77.
O espectro de RMN ¹H apresenta sinais condizentes com [45] (Figura 13A, Apêndice) e
confirma a presença dos 5 hidrogênios da isoquinolino-5,8-diona como dois dupletos
em
δ
= 7,07 (J= 9,0 Hz) para o hidrogênio H4 e em
δ
= 7,14 (J= 9,0 Hz) para o H5; um
dupleto em
δ
= 7,93 (J= 4,7 Hz) para o H3, além do dupleto em
δ
= 9,04 (J= 4,7 Hz)
N
O
O
N
O
N
C
O
48
para o H2 e do simpleto em
δ
= 9,24 para o H1. Associado a estes dados tem-se a
ausência dos sinais referentes às metoxilas aromáticas em
δ
= 3,94 e 3,97.
N
O
O
4
3
2
1
5
Figura 21 - Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [45] com os hidrogênios numerados.
A etapa seguinte do trabalho consistiu na conversão da isoquinolino-5,8-diona [45] nas
caulibugulonas A [35], D [38] e no análogo [46], conforme mostrado no Esquema 49 a
seguir.
3.6. Preparação da caulibugulona A [35]
25 ºC, 20%
25 ºC, 45%
Metilamina, Etanol
Etanolamina, Etanol
Anilina, Etanol
25 ºC, 30%
N
O
O
N
H
[35]
[45]
N
O
O
[38]
N
O
O
N
H
OH
[46]
N
O
O
N
H
Esquema 49 - Esquema geral das sínteses das isoquinolino-5,8-dionas [35], [38] e [46].
49
Para a obtenção das isoquinolino-5,8-dionas, mostradas na no esquema 49, decidiu-se
utilizar etanol 95%, uma vez que Ryu e colaboradores (1999) já haviam alcançado bons
resultados na síntese de outros derivados da isoquinolino-5,8-diona [45]. As misturas
reacionais permaneceram sob agitação magnética por aproximadamente duas horas,
sendo constantemente monitoradas por meio de análises cromatográficas em camada
delgada. Após duas horas de agitação as misturas reacionais foram elaboradas e
submetidas a processo cromatográfico em placa preparativa.
O primeiro derivado sintetizado foi a caulibugulona A [35], cujo indício da sua formação
se deu pelo aparecimento de um ponto que absorve luz UV, em CCD, apresentando
valor de R
f
maior que o da isoquinolino-5,8-diona [45]. Após a elaboração da mistura
reacional e separação por cromatografia preparativa utilizando-se como eluente
diclorometano e metanol (200:1, R
f
= 0,4) obteve-se a caulibugulona A [35] em 45% de
rendimento na forma de um sólido vermelho com faixa de fusão observada entre 228 e
230 ºC.
N
O
O
N
H
Figura 22 - Estrutura da caulibugulona A [35].
A obtenção da caulibugulona A [35] foi evidenciada, inicialmente, pela análise do
espectro no IV (Figura 23), no qual verificou-se o aparecimento de sinais em 3297 cm
-1
,
atribuído à deformação axial do grupo CH
3
, e em 1693 cm
-1
, referente à absorção da
carbonila cetônica de quinona. A presença do anel aromático na molécula do produto é
suportada pelos sinais em 1584 e 1556 cm
-1
, referentes ao estiramento da ligação C=C.
50
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
% Absorbância
cm
-1
3297
3234
1693
1584
1556
1512
1421
1328
Figura 23 - Espectro no infravermelho da Caulibugulona A [35].
Os deslocamentos químicos de
1
H e de
13
C detectados nos espectros de RMN estão
relacionados nas Tabelas 5 e 6, respectivamente. No espectro de RMN de
1
H
(Figura 24) observam-se os sinais do hidrogênio H1 em
δ
= 9,21 sob a forma de um
simpleto e em
δ
= 9,01 (J= 4,4 Hz) para o hidrogênio H2, sob a forma de um dupleto. Os
hidrogênios H3 sob a forma de um dupleto em
δ
= 7,93 (J= 4,4 Hz) e H4 sob a forma de
um simpleto em
δ
= 5,80. E, finalmente, os hidrogênios da metila apareceram sob a
forma de um simpleto em
δ
= 2,95 e o sinal do hidrogênio ligado ao nitrogênio em
δ
= 6,08 como um simpleto alargado.
51
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
3,0 2,9
8,2 8,0 7,8
9,1 9,0 8,9
2,95
5,80
9,01
9,21
7,93
Figura 24 - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da caulibugulona A [35].
Tabela 5 – Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona A [35] sintética,
comparados com valores citados na literatura.
Sintética Literatura
H
δ
H
δ
Η
1 9,21 9,14
2
9,01 (J= 4,4 Hz) 8,92 (J= 4,5 Hz)
3
7,93 (J= 4,4 Hz) 7,91 (J= 4,5 Hz)
4 5,80 5,76
Metila 2,95 2,92
52
No espectro de RMN de
13
C (Figura 26) verifica-se em
δ
= 147,8 o sinal do carbono C1.
O sinal do C2 em
δ
= 156,5; C3 em
δ
= 119,2; C4 em
δ
= 139,5; C5 em
δ
= 181,4; C6
em
δ
= 101,5; C7 em
δ
= 148,9; C8 em
δ
= 181,0; C9 em
δ
= 124,2 e a metila em
δ
= 29,7.
1
2
3
4
N
O
O
N
H
5
6
7
8
9
Figura 25 - Estrutura da caulibugulona A [35] com os carbonos numerados.
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
181,4
181,0
156,5
148,9
147,8
139,5
124,2
119,2
101,5
29,7
Figura 26 - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da caulibugulona A [35].
53
Tabela 6 – Deslocamentos químicos de RMN
13
C da caulibugulona A [35] sintética,
comparados com valores citados na literatura.
Sintética Literatura
C
δ
C
δ
C
1 147,8 147,8
2 152,5 156,1
3 119,2 120,0
4 139,5 140,7
5 181,4 181,4
6 101,5 100,6
7 148,9 150,7
8 181,0 181,4
9 124,2 125,6
Metila 29,7 29,3
Os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H e de RMN
13
C da caulibugulona A
[35] sintetizada quando comparados com os registrados na literatura por Wipf e
colaboradores (2004) para a caulibugulona A natural isolada da Caulibugula intermis
serviram para confirmar a formação do composto sintético.
3.7. Substituições no carbono 7 de isoquinolino-5,8-dionas.
Nas reações de substituição do hidrogênio ou do cloro nas isoquinolino-5,8-dionas [45]
e [32] pelas alquil ou arilaminas (Esquema 50) é observado a substituição preferencial
no carbono 7. Tal comportamento deve-se, provavelmente, à carbonila que está em
para em relação ao nitrogênio (C5) possuir menos densidade eletrônica que a carbonila
em posição meta ao nitrogênio (C8), como mostrado nas estruturas de ressonância a
seguir.
54
N
O
O
Cl
Cl
[32]
O
O
N
Cl
Cl
N
O
Cl
Cl
O
N
O
O
O
O
N
[45]
N
O
O
Esquema 50 – Estruturas de ressonância para as isoquinolino-5,8-dionas.
A posição de ataque dos nucleófilos à quinona depende de qual dos dois grupos
carbonílicos atrairá mais os elétrons da dupla ligação etilênica. O átomo de carbono
carbonílico C
5
=O da isoquinolino-5,8-diona se situa em posição
γ
ao átomo de
nitrogênio de piridina, e por isso é mais deficiente em elétrons. Já o átomo de carbono
carbonílico C
8
=O ocupa a posição
β
do anel de piridina. Esta maior deficiência no
átomo de carbono 5 se transfere ao carbono 7 por conjugação e permite um ataque
preferencial de nucleófilos a esta posição (SHAIKH et alii, 1986).
55
3.8. Estudos de RMN para a caulibugulona A.
No intuito de obter mais informações a respeito da reação de formação de
caulibugulonas e análogos a partir de isoquinolino-5,8-dionas com ou sem substituintes
nas posições 6 e 7 foram realizados estudos de RMN da caulibugulona A [35]. A análise
do espectro de RMN 2D [
1
H e
13
C-HMBC] (correlação carbono-hidrogênio a longa
distância) forneceu a correta posição (entre as duas possibilidades) dos grupos
amínicos nestas substâncias. Os resultados estão apresentados na Tabela 7 e nas
Figuras 28 e 29.
Tabela 7 – Correlações
1
H-
13
C observadas no espectro de HMBC da caulibugulona A
[35]
Deslocamento (ppm)
1
H Correlações
13
C Observadas Hidrogênio
9,21 C-2, C-4, C-9 H1
9,01 C-1, C-3, C-4 H2
7,93 C-2, C-5, C-9 H3
5,80 C-4, C-5, C-8 H6
2,95 C-7 Metila
1
2
3
4
N
O
O
N
H
5
6
7
8
9
Figura 27 - Estruturas da caulibugulona A [35] com hidrogênios e carbonos numerados.
56
Figura 28 - Espectro de RMN 2D [
1
H e
13
C-HMBC] da caulibugulona A [35].
N
O
O
N
R
H
N
O
O
N
R
H
correto
Figura 29 – Posição correta dos grupos amínicos na caulibugulona A e análogos.
57
3.9. Preparação da caulibugulona D [38] e do análogo [46].
Para a obtenção da caulibugulona D [38] e do análogo [46], decidiu-se utilizar etanol
95% da mesma forma que descrito no item 3.6. As misturas reacionais permaneceram
sob agitação magnética por aproximadamente duas horas, sendo constantemente
monitoradas por meio de análises cromatográficas em camada delgada. Após duas
horas de agitação as misturas reacionais foram elaboradas e submetidas a processo
cromatográfico em placa preparativa, utilizando-se como eluente diclorometano e
metanol (200:1). Obteve-se a caulibugulona D [38] (Rf= 0,3) em 20% de rendimento na
forma de um sólido vermelho com faixa de fusão observada entre 189 e 191 e o
análogo [46] (Rf= 0,4) em 55% de rendimento na forma de um sólido vermelho com
faixa de fusão observada entre 144 e 145 ºC.
Para a identificação da caulibugulona D [38] e do análogo [46] foi utilizado o mesmo
processo de análise citado para a caulibugulona A [35]. Os respectivos espectros de
RMN de
1
H encontram-se no Apêndice Figuras 14A e 15A.
Na Tabela 8 são mostrados os principais dados de RMN de
1
H, para as isoquinolino-
5,8-dionas [38] e [46].
N
N
OH
HO
O
1
2
3
4
5
6
74
3
2
1
N
N
HO
O
[38] [46]
5
6
Figura 30 – Estruturas da caulibugulona D [38] e da isoquinolino-5,8-diona [46].
58
Tabela 8 – Principais dados de RMN
1
H para as isoquinolino-5,8-dionas [38] e [46]
Substância
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H-O
[38] 9,14
(s)
8,96
(d)
7,91
(d)
5,91
(s)
3,41
(t)
3,79
(t)
- 1,28
(s)
[46] 9,34
(s)
9,05
(d)
7,90
(d)
7,65
(s)
7,26
(d)
7,29
(dd)
7,45
(t)
-
Tabela 9 – Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona D [38] sintética,
comparados com valores citados na literatura.
Sintética Literatura
H
δ
H
δ
Η
1 9,14 9,17
2
8,96 (J = 5,2 Hz) 8,94 (J = 4,2 Hz)
3
7,91 (J = 5,4 Hz) 7,92 (J = 5,0 Hz)
4 5,91 5,86
5
3,41 (J = 5,3 Hz) 3,35 (J = 5,4 Hz)
6
3,79 (J = 5,3 Hz) 3,78 (J = 5,4 Hz)
Os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H da caulibugulona D [38] sintetizada
quando comparados com os registrados na literatura por Wipf e colaboradores (2004)
para a caulibugulona D natural isolada da Caulibugula intermis serviram para confirmar
a formação da substância sintética.
59
3.10. Preparação da 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32].
A partir da proposta de síntese do esquema 47 foram preparados o derivado clorado
[32] e análogos. Considerando que, neste trabalho, substâncias possuindo halogênios
na posição 6 ainda não tinham sido preparados, decidiu-se sintetizar também o
composto [32], com o intuito de ampliar as possibilidades de sínteses de compostos
potencialmente anticancerígenos.
[44]
N
OMe
OMe
20%
[32]
N
O
O
Cl
Cl
HCl, HNO
3
, 80-90 ºC
Esquema 51 - Síntese da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32].
Para o preparo da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32] foi adicionado ácido nítrico
concentrado, bem lentamente, a uma solução de isoquinolina dimetoxilada [44] em
ácido clorídrico, sob agitação magnética e à temperatura de 80-90 °C. A mistura
reacional foi elaborada quando se verificou, através de cromatografia em camada
delgada, que o material de partida havia sido consumido. Com a elaboração da reação,
seguida da separação por cromatografia em coluna de sílica-gel usando-se como
eluente hexano e acetato de etila 1:1 (R
f
= 0,6), o produto diclorado [32] foi obtido com
rendimento de 20%, como um sólido amarelo com faixa de fusão observada entre 179 e
181 ºC.
A confirmação estrutural da isoquinolino-5,8-diona [32] foi feita, inicialmente, pela
análise do seu espectro de massas. Na Tabela 10 estão indicados os principais sinais
com os possíveis fragmentos iônicos.
60
Tabela 10 – Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona diclorada [32].
Íons (m/z) % do pico base Fragmento iônico
229 100
N
O
O
Cl
Cl
192 68
N
O
O
Cl
164 64
N
Cl
O
136 45
N
Cl
O espectro de massas para a isoquinolino-5,8-diona diclorada [33] (Figura 16A,
Apêndice) confirmou sua estrutura, primeiramente, com a presença de um pico a (M+4)
em m/z=231 além do pico (M+2) em m/z=229, devido à presença de íons moleculares
contendo átomos dos isótopos mais pesados. O modo de fragmentação da diclorada
[33] mostra um íon em m/z=192 devido a perda de HCl (M-36). Com a perda CO
forneceu o íon em m/z=164, que por sua vez perdeu novamente CO fornecendo o sinal
em m/z=136.
61
A obtenção da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32] também foi evidenciada pela
análise do espectro de RMN-
1
H (Figura 17A, Apêndice), onde foi observada a ausência
dos dupletos em
δ
= 7,07 e 7,14 referentes aos hidrogênios H4 e H5, e dos sinais das
metoxilas em
δ
= 3,94 e 3,97. Também foram observados um dupleto em
δ
= 8,02
(J= 4,5 Hz) para o hidrogênio H3; um dupleto em
δ
= 9,06 (J= 4,5 Hz) para o hidrogênio
H2 e um simpleto para o hidrogênio H1 em
δ
= 9,43, confirmando a estrutura do produto
desejado.
N
O
O
Cl
Cl
1
2
3
Figura 31 – Estruturas da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32].
3.11. Isoquinolino-5,8-dionas derivadas da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32].
A etapa seguinte, da síntese proposta no Esquema 47, consistiu na conversão do
composto [32] nas alquilisoquinolino-5,8-dionas [37], [47] e [48], bem como nas
arilisoquinolino-5,8-dionas [33], [49], [50], [51] e [52] (Figura 13) com o intuito de
investigar a necessidade de grupos alifáticos ou aromáticos para a atividade
anticancerígena em isoquinolino-5,8-diona contendo cloro.
[37] R = metila (65%)
[47] R = butila (75%)
[48] R = t-butila (60%)
N
O
O
N
Cl
R
H
[32]
N
O
O
Cl
Cl
Esquema 52 - Esquema geral da síntese das alquilisoquinolino-5,8-dionas cloradas.
62
3.12. Preparação das alquilisoquinolino-5,8-dionas [37], [47] e [48].
Para obtenção das alquilisoquinolino-5,8-dionas, mostradas no Esquema 52, decidiu-se
utilizar metodologia descrita por Ryu e colaboradores (1999).
As misturas reacionais, contendo a isoquinolinadiona diclorada [32], etanol 95% e a
metilamina ou a butilamina ou a t-butilamina, de aspecto amarelado, permaneceram
sob agitação magnética por aproximadamente uma hora, sob refluxo. As misturas foram
constantemente monitoradas por meio de análises cromatográficas em camada
delgada. Após este intervalo de tempo, as misturas reacionais foram elaboradas e
submetidas a processo cromatográfico de separação.
A primeira alquilisoquinolino-5,8-diona clorada sintetizada foi a caulibugulona C [37],
cujo indício da sua formação se deu pelo aparecimento de um ponto que absorve luz
UV, em CCD, apresentando valor de R
f
maior que o da dicloroisoquinolino-5,8-diona
[32]. Após a elaboração da mistura reacional, seguida da separação por cromatografia
preparativa, utilizando-se como eluente DCM e metanol (200:1, R
f
= 0,3) foi obtida como
um sólido vermelho tendo como rendimento 65% com faixa de fusão observada entre
219 e 220 ºC.
N
O
O
Cl
N
H
1
2
3
Figura 32 – Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [37].
A obtenção da caulibugulona C [37] foi evidenciada pela análise de seu espectro de
RMN de
1
H (Figura 18A, Apêndice), com o sinal do hidrogênio H1 em δ 9,35 sob a
forma de um simpleto, o hidrogênio H2 em δ 9,09 (J = 4,9 Hz) sob a forma de um
dupleto, o hidrogênio H3 em δ 8,04 (J = 4,9 Hz) sob a forma de um dupleto e a metila
63
em δ 3,52 apareceu sob a forma de um simpleto. E, finalmente, o hidrogênio ligado ao
átomo de nitrogênio em δ 6,30 apareceu sob a forma de um simpleto alargado.
Os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H da caulibugulona C [37] sintetizada
quando comparados com os registrados na literatura por Wipf e colaboradores (2004)
para a caulibugulona C natural isolada da Caulibugula intermis serviram para confirmar
a formação da substância sintética (Tabela 11).
Tabela 11 – Deslocamentos químicos de
1
H da caulibugulona C [37] sintética,
comparados com valores citados na literatura.
Sintética Literatura
H
δ
H
δ
Η
1 9,35 9,35
2
9,09 (J = 4,9 Hz) 9,01 (J = 5,0 Hz)
3
8,04 (J = 4,9 Hz) 7,98 (J = 5,0 Hz)
Metila 3,52 3,38
Para a identificação das isoquinolino-5,8-dionas [47] e [48] foi utilizado o mesmo
processo de análise citado para a isoquinolino-5,8-diona [37]. Os respectivos espectros
de RMN de
1
H encontram-se no Apêndice (Figuras 19A e 20A).
Na Tabela 12 são mostrados os principais dados de RMN de
1
H, para as isoquinolino-
5,8-dionas [47] e [48].
N
O
O
N
H
Cl
7
6
5
1
2
3
4
N
O
O
N
H
Cl
4
3
2
1
[47] [48]
Figura 33 – Estruturas das isoquinolino-5,8-dionas [47] e [48].
64
Tabela 12 - Principais dados de RMN
1
H para as isoquinolino-5,8-dionas [47] e [48]
Subst.
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H-N
[47] 9,24
(s)
8,99
(d)
7,94
(d)
3,87
(m)
1,68
(m)
1,43
(m)
0,96
(t)
6,20
(s)
[48] 8,90
(d)
8,85
(dd)
7,83
(d)
1,28
(s)
- - - -
3.13. Preparação das Arilisoquinolino-5,8-dionas [33], [49], [50], [51] e [52].
Considerando que, neste trabalho, substâncias possuindo grupos aromáticos ligados ao
nitrogênio na posição 7 ainda não tinham sido preparadas, decidiu-se sintetizar também
as substâncias [33], [49], [50], [51] e [52], com o intuito de ampliar as possibilidades de
sínteses de substâncias com atividade anticancerígena.
[33] R
1
= H, R
2
= H (75%)
[49] R
1
= Br, R
2
= H (55%)
[50] R
1
= H, R
2
= Br (60%)
[51] R
1
= OMe, R
2
= H (68%)
[52] R
1
= OEt, R
2
= H (73%)
N
O
O
N
Cl
H R
1
R
2
[32]
N
O
O
Cl
Cl
Esquema 53 - Esquema geral da síntese das arilisoquinolino-5,8-dionas.
A partir da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32] foi submetida a reações de substituição
de cloro por arilaminas, na presença de etanol. Para isso, foram dissolvidas em etanol
95%, e, sob agitação magnética e temperatura ambiente (25 °C), adicionaram-se as
arilaminas. As misturas de coloração amareladas permaneceram reagindo por um
período aproximado de uma hora. Após este período, as misturas reagentes foram
elaboradas e submetidas à purificação por cromatografia em coluna de sílica-gel.
65
A primeira arilisoquinolino-5,8-diona sintetizada foi a [33], cujo indício da sua formação
se deu pelo aparecimento de um ponto que absorve luz UV, em CCD, apresentando
valor de R
f
maior que o da isoquinolino-5,8-diona [32]. Após a elaboração da mistura
reacional, seguida da separação por cromatografia em coluna de sílica-gel, utilizando-
se como eluente diclorometano e metanol (200:1, R
f
=0,3), foi obtida a arilisoquinolino-
5,8-diona [33] em 75% de rendimento como um sólido vermelho com faixa de fusão
observada entre 299 e 300 ºC.
A obtenção da arilisoquinolino-5,8-diona [33] foi evidenciada, inicialmente, pela análise
do espectro de massas (Figura 21A, Apêndice) que apresentou o pico referente ao íon
molecular em m/z=284 (70%). O espectro de massas apresentou ainda um pico em
m/z=286 mostrando a presença de cloro (M+2) com aproximadamente um terço da
intensidade do pico do íon molecular, confirmando a presença de íons moleculares
contendo o isótopo mais pesado. A perda de HCl (M–36) forneceu o íon em m/z=249. O
espectro apresentou um sinal em m/z=77 característico de anel aromático. Na Tabela
13 estão indicados os principais sinais com os possíveis fragmentos iônicos.
Tabela 13 – Principais sinais do EM para a isoquinolino-5,8-diona clorada [33].
Íon (m/z) % do pico base Fragmento iônico
284 70
N
O
O
Cl
N
H
249 100
N
O
O
N
H
77 83
66
No espectro de RMN de
1
H (Figura 22A, Apêndice) o sinal dos hidrogênios H1
(
δ
= 9,33) apareceu sob a forma de um simpleto e os hidrogênios H2 e H3 em
δ
= 9,07
(J= 5,0 Hz) e 7,99 (J= 5,0 Hz), respectivamente, apareceram sob a forma de dois
dupletos. Os hidrogênios aromáticos apareceram sob a forma de dupleto em
δ
= 7,10
(J= 7,6 Hz) (H4 e H8); de um multipleto em 7,26 (H5 e H7) e de um multipleto em 7,38
(H6), não observados no material de partida e ainda um simpleto em
δ
= 7,78 referente
ao NH.
N
O
O
N
Cl
H
1
2
4
3
5
6
7
8
Figura 34 – Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [33].
Para a identificação das arilisoquinolino-5,8-dionas [49], [50], [51] e [52] foi utilizado o
mesmo processo de análise citado para a substância [33]. Os respectivos espectros de
IV, RMN de
1
H e massas, encontram-se no Apêndice (Figuras de 23A a 26A).
A obtenção da arilisoquinolino-5,8-diona [49] foi evidenciada pela análise do espectro
no IV (Figura 23A, Apêndice), em que se verificaram o aparecimento do sinal em
3.248 cm
-1
atribuído à deformação axial de C-H de aromático e pelo sinal em 1.593 cm
-1
e em 1561 cm
-1
, referentes ao estiramento da ligação C=C. A presença da carbonila
cetônica de quinona na molécula do produto foi caracterizada pelo sinal em 1.686 cm
-1
.
N
O
O
Cl
N
H Br
[49]
Figura 35 – Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [49].
67
Na Tabela 14 são mostrados os principais dados de RMN de
1
H para as
arilisoquinolino-5,8-dionas [50] e [51].
5
4
3
2
1
7
6
5
4
3
2
1
N
O
O
Cl
N
H OMe
[51]
[50]
N
O
O
Cl
N
H
Br
6
7
Figura 36 – Estruturas das isoquinolino-5,8-dionas [50] e [51] com os hidrogênios
numerados.
Tabela 14 - Dados de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para as arilisoquinolino-5,8-dionas
[39], [40] e [41].
Subst.
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H-N MeO
[50] 9,29
(s)
9,02
(d)
7,97
(d)
7,45
(d)
6,95
(d)
6,95
(d)
7,45
(d)
7,75
-
[51] 9,32
(s)
9,05
(d)
7,99
(d)
7,02
(*)
6,92
(dd)
6,97
(dd)
7,24
(*)
7,67
3,84
(s)
* A multiplicidade do sinal não ficou bem definida.
Na análise dos dados de RMN de
1
H, mostrados na Tabela 14 verificou-se que os
sinais de hidrogênios na região de
δ
= 6,97 a 7,45 confirmaram a presença dos anéis
aromáticos nas arilisoquinolino-5,8-dionas [50] e [51].
A confirmação da metoxila em C1’, na arilisoquinolino-5,8-diona [51] (Figura 37), foi
evidenciada através da observação de um sinal em
δ
= 3,84, sob a forma de um
simpleto para três hidrogênios, como pode ser observado no espectro de RMN de
1
H
(Figura 25A, Apêndice).
[51]
N
O
O
Cl
N
H OMe
6
7
1
2
3
4
5
Figura 37 – Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [51] com os hidrogênios numerados.
68
A confirmação da etoxila na arilisoquinolino-5,8-diona [52] se deu pela análise de seu
espectro de massas onde se verificou, primeiramente, a presença do íon molecular em
m/z=328. A confirmação da presença da etoxila se deu pelo pico em m/z=264 (100%)
referente ao sinal do íon molecular menos o cloreto de etila, como pode ser verificado
na tabela a seguir e na Figura 26A (Apêndice). Na Tabela 15 estão indicados os
principais sinais com os possíveis fragmentos iônicos.
[52]
N
O
O
Cl
N
H OEt
6
7
1
2
3
4
5
Figura 38 – Estrutura da isoquinolino-5,8-diona [52] com os hidrogênios numerados.
Tabela 15 – Principais sinais do EM para a arilisoquinolino-5,8-diona [52].
Íon (m/z) % do pico base Fragmento iônico
328 87,9
N
O
O
N
H
Cl
OCH
2
CH
3
264
100
N
O
O
N
H O
69
4. METODOLOGIA
Na primeira etapa deste trabalho, foram sintetizadas as caulibugulonas A [35], C [37] e
D [38], já conhecidas na literatura (WIPF
et alii
,
2004) e os análogos [46], [32], [33], [47],
[48], [49], [50], [51] e [52], conforme mostrado na figura a seguir:
[52]
N
O
O
N
H
Cl
OEt
[51]
N
O
O
N
H
Cl
OMe
[50]
N
O
O
N
H
Cl Br
N
O
O
N
H
Cl
Br
[49]
[33]
N
O
O
N
H
Cl
[48]
N
O
O
N
Cl
H
N
O
O
N
Cl
H
[47]
[37]
N
O
O
N
Cl
H
N
O
O
Cl
Cl
[32]
N
O
O
N
H
[46]
[38]
[35]
N
O
O
N
OH
H
N
O
O
N
H
Figura 39
– Caulibugulonas A [35], C [37], D [38] e análogos sintetizados.
Na segunda etapa, foram realizados testes com células cancerígenas - U937 (leucemia
humana, linhagem monocítica), MOLT4 (leucemia humana, linhagem linfocítica),
COLO205 (câncer de colon humano, linhagem epitelióide) e H460 (câncer pulmonar
humano, linhagem epitelióide) com as substâncias sintetizadas em várias dosagens
(0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0
µ
g·mL
-1
), sendo avaliada a taxa de apoptose por microscopia
de fluorescência e avaliação da taxa metabólica por espectrofotometria.
70
4.1. Instrumentos para caracterização das substâncias sintetizadas
Como mencionado anteriormente, para devida caracterização dos compostos
sintetizados foram utilizadas as seguintes técnicas:
(i)
Cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM),
(ii)
Espectroscopia no infravermelho (IV) e
(iii)
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de Hidrogênio-1 (
1
H),
Carbono-13 (
13
C) e HMBC.
Todos os solventes utilizados nas reações e separações foram de grau técnico, tendo
sido previamente tratados como é indicado por Perrin e Armarego (1988). Os solventes
foram evaporados em um evaporador rotatório FISATOM, operando à pressão
reduzida.
(i)
As análises de CG-EM dos compostos foram feitas em um cromatógrafo gasoso
acoplado a um espectrômetro de massas SHIMADZU modelo QP5050A (LCQUI-UENF)
utilizando-se um método com as seguintes especificações:
-
Coluna: DB-5, 30 metros, DI 0,25 mm.
-
Gás de arraste: Hélio.
-
Temperatura do injetor: 280
°
C.
-
Programa de temperatura para a coluna:
* Temperatura inicial: 50
º
C (1 min).
* Temperatura final: 280
°
C (7 min).
* Gradiente de temperatura: 15
°
C/min (12 min).
-
Temperatura do detector: 280
°
C.
-
Programa de pressão:
* Pressão inicial: 111 kPa (1 min).
* Pressão final: 194 kPa (7 min).
* Gradiente de Pressão: 15 kPa/min (12 min).
* Ionização por impacto eletrônico (IE) 70 eV.
* Obtenção do cromatograma de íons totais (TIC)
71
(ii)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos em um
espectrômetro SHIMADZU, modelo FTIR 8300 (LCQUI-UENF). As amostras sólidas
foram analisadas em pastilha de KBr, já as amostras líquidas foram analisadas na
forma de filme entre pastilhas de NaCl.
(iii)
Os espectros de RMN foram obtidos nas frequências de 400 MHz e 100 MHz para
em um espectrômetro JEOL Eclipse + 400 (LCQUI-UENF) e 500 MHz e 125,7 MHz em
um espectrômetro Varian – INOVA 500 (IQ-UNICAMP), para
1
H e
13
C, respectivamente,
utilizando como solvente clorofórmio ou metanol deuterados.
72
5. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
5.1. Preparação da N-2,5-dimetoxibenziliden-N-2,2-dimetoxietilamina [42]
OMe
OMe
N
MeO
MeO
[42]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (100 mL) amino dimetilacetal (1 mmol;
105 mg; 0,109 mL) e 2,5-dimetoxibenzaldeído (1 mmol, 166,2 mg) em tolueno (30 mL) e
manteve-se a solução sob agitação magnética à temperatura ambiente por 3 horas. Em
seguida, a mistura foi refluxada e a água gerada coletada em tubo Dean-Stark. A
mistura permaneceu sob refluxo por 8 horas. Após o término da reação, o solvente
(tolueno) foi sendo retirado aos poucos através do Dean-Stark até quase à secura. A
total retirada do tolueno foi realizada em bomba de vácuo. A imina [42] foi isolada por
coluna cromatográfica de sílica-gel, tendo como eluente hexano e acetato de etila
(2:1, Rf= 0,6) e obtida como um óleo alaranjado com 95% de rendimento.
5.2. Preparação da N-[2,2-dimetoxietil]-N-[2,5-dimetoxibenzil]amina [43]
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
[43]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (50 mL) a imina [42] (400 mg; 1,58 mmol)
e metanol (20 mL). Em seguida, adicionou-se boroidreto de sódio (57 mg; 1,5 mmol),
sob agitação magnética, banho de gelo e atmosfera de nitrogênio. A solução
permaneceu sob agitação por 2 horas. Após este intervalo de tempo, evaporou-se o
73
metanol em evaporador rotativo, adicionaram-se água destilada (10 mL) e solução
saturada de hidrogenocarbonato de sódio. Em seguida, extraiu-se o produto com
diclorometano (DCM, 5x20 mL). Os extratos reunidos foram secos sobre MgSO4 e
concentrados sob pressão reduzida. A amina [43] foi isolada por coluna cromatográfica
de sílica-gel, tendo como eluente hexano e acetato de etila (1:2, Rf= 0,4) e obtida como
um óleo amarelo com rendimento de 100%.
5.3. Preparação da 5,8-dimetoxiisoquinolina [44]
N
OMe
OMe
[44]
Colocou-se em um balão de fundo redondo (50 mL) a amina [43] (255 mg; 1,0 mmol) e
adicionou-se ácido trifluoroacético (20 mL) sob agitação magnética, banho de gelo e
atmosfera de nitrogênio. A solução foi aquecida a 50 °C por 2 horas. Após este intervalo
de tempo, evaporou-se o ácido trifluoroacético em evaporador rotativo, adicionou-se
DCM (5 mL) e carbonato de sódio sólido até pH ligeiramente básico. Em seguida,
secou-se sobre MgSO
4
anidro e concentrou-se sob pressão reduzida. A isoquinolina
[44] foi isolada por coluna cromatográfica de sílica-gel, tendo como eluente hexano e
acetato de etila (3:1, R
f
= 0,4) e obtida como um óleo amarelo com rendimento de 68%.
74
5.4. Preparação da isoquinolino-5,8-diona [45]
N
O
O
[45]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (50 mL) isoquinolina [44] (100 mg;
0,53 mmol), acetonitrila (12 mL) e sob agitação magnética e banho de gelo (0 °C).
Adicionou-se, então, nitrato de cério amoniacal (1161,76 mg; 2,12 mmol) dissolvido em
água destilada (5 mL). A solução permaneceu sob agitação por 1 hora a 0 °C. Após
este intervalo de tempo adicionou-se água destilada (40 mL) e extraiu-se com DCM
(4x50 mL). Adicionou-se novamente água destilada (20 mL), separaram-se as fases e
secou-se a fase orgânica sobre MgSO4 anidro concentrando-a sob pressão reduzida. A
isoquinolinodiona [45] foi isolada por coluna cromatográfica de sílica-gel, tendo como
eluente hexano e acetato de etila (2:1, Rf= 0,3) e obtida como um sólido amarelo
(PF= 136-137 ºC) em 65% de rendimento.
5.5. Preparação da caulibugulona A [35]
[35]
N
O
O
N
H
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona [45]
(120 mg; 0,754 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
metilamina 40% (0,026 mL; 0,754 mmol). A solução permaneceu sob agitação
magnética e refluxo por 2 horas. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o metanol
em evaporador rotativo. A caulibugulona A [35] foi isolada por placa preparativa tendo
como eluente DCM e metanol (200:1, R
f
= 0,4) e obtida como um sólido vermelho
(PF= 228-230 ºC) em 45% de rendimento.
75
5.6. Preparação da caulibugulona D [38]
N
O
O
N
H
OH
[38]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona [45]
(206,9 mg; 1,3 mmol), etanol 95% (15 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
etanolamina (79,3 mg; 1,3 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
temperatura ambiente por 2 horas. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o
metanol em evaporador rotativo. A caulibugulona D [38] foi isolada por placa
preparativa, tendo como eluente DCM e metanol (200:1, Rf= 0,3) e obtida como um
sólido vermelho (PF= 228-230 ºC) com rendimento de 20%.
5.7. Preparação da 7-(N-fenilamino)isoquinolino-5,8-diona [46]
[46]
N
O
O
N
H
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona [45]
(180 mg; 1,13 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
anilina (0,13 mL; 1,13 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
temperatura ambiente por 2 horas. Após este intervalo de tempo, retirou-se todo o
metanol em evaporador rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [46] foi isolada por placa
preparativa tendo como eluente DCM e metanol (200:1, Rf= 0,4) e obtida como um
sólido vermelho (PF= 316-318 ºC) em 55% de rendimento.
76
5.8. Preparação da 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32]
[32]
N
O
O
Cl
Cl
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) 5,8-dimetoxiisoquinolina [44]
(300 mg; 1,6 mmol), ácido clorídrico concentrado (10 mL) e sob agitação magnética, à
temperatura de 80-90 °C, adicionou-se, bem lentamente, ácido nítrico concentrado
(1 mL). Em seguida, adicionou-se água destilada (200 mL), e extraiu-se com éter etílico
(6x100 mL). Adicionou-se novamente água destilada (20 mL), secou-se a fase orgânica
sobre MgSO4 anidro e concentrou-se sob pressão reduzida. A isoquinolina diclorada
[32] foi isolada por coluna cromatográfica de sílica-gel, tendo como eluente hexano e
acetato de etila (1:1, Rf= 0,6) e obtida como um sólido amarelo (PF= 179-181 ºC) em
20% de rendimento.
5.9. Preparação da 6-cloro-7-(N-metilamino)isoquinolino-5,8-diona [37]
N
O
O
N
H
Cl
[37]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (110 mg; 0,48 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
metilamina 40% (0,016 mL; 0,48 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética
e refluxo por 1 hora. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o metanol em
evaporador rotativo. A aminoisoquinolinodiona [37] foi isolada por placa preparativa,
tendo como eluente DCM e metanol (200:1, Rf= 0,3) e obtida como um sólido vermelho
(PF= 219-220 ºC) com rendimento de 65%.
77
5.10. Preparação da 6-cloro-7-(N-butilamino)isoquinolino-5,8-diona [47]
[47]
N
O
O
N
H
Cl
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (60 mg; 0,26 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
butilamina (0,03 mL; 0,26 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
refluxo por 1 hora. Após este intervalo de tempo, retirou-se todo o metanol em
evaporador rotativo. A aminoisoquinolinodiona [47] foi isolada por placa preparativa,
tendo como eluente DCM e metanol (200:1; Rf= 0,45) e obtida como um sólido
alaranjado (PF= 207-209 ºC) em 75% de rendimento.
5.11. Preparação da 6-cloro-7-(N-terc-butilamino)isoquinolino-5,8-diona [48]
N
O
O
N
H
Cl
[48]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (60 mg; 0,26 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
t-butilamina (0,03 mL; 0,26 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
refluxo por 1 hora. Após este intervalo de tempo, retirou-se todo o metanol em
evaporador rotativo. A aminoisoquinolinodiona [48] foi isolada por placa preparativa
tendo como eluente DCM e metanol (200:1; Rf= 0,45) e obtida como um sólido
alaranjado (PF= 189-191 ºC) tendo como rendimento 60%.
78
5.12. Preparação da 6-cloro-7-(N-fenilamino)isoquinolino-5,8-diona [33]
N
O
O
N
H
Cl
[33]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquionolina-5,8-diona diclorada
[32] (110 mg; 0,48 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
anilina (0,5 mL; 0,48 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
temperatura ambiente por 2 horas. Após este intervalo de tempo, retirou-se todo o
metanol em evaporador rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [33] foi isolada por placa
preparativa, tendo como eluente DCM e metanol (200:1, Rf= 0,3) e obtida como um
sólido vermelho (PF= 299-300 ºC) com 75% de rendimento.
5.13. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-bromofenilamino)isoquinolino-5,8-diona [49]
[49]
N
O
O
N
H
Cl
Br
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (80 mg; 0,35 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
2-bromoanilina (60,17 mg; 0,15 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética
e temperatura ambiente por 3 horas. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o
metanol em evaporador rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [49] foi isolada por placa
preparativa, tendo como eluente DCM e acetato de etila (3:1, Rf= 0,5) e obtida como um
sólido vermelho (PF= 264-267 ºC) com rendimento de 55%.
79
5.14. Preparação da 6-cloro-7-(N-4-bromofenilamino)isoquinolino-5,8-diona [50]
N
O
O
N
H
Cl Br
[50]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (120 mg; 0,52 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
4-bromoanilina (89,4 mg; 0,52 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
temperatura ambiente por 3 horas. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o
metanol em evaporador rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [50] foi isolada por placa
preparativa, tendo como eluente DCM e acetato de etila (2:1, Rf= 0,6) e obtida como um
sólido vermelho (PF= 300-301 ºC) com rendimento de 60%.
5.15. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-metoxifenilamino)isoquinolino-5,8-diona [51]
N
O
O
N
H
Cl
OMe
[51]
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (70 mg; 0,30 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
2-metoxianilina (36,9 mg; 0,30 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
refluxo 1 hora. Após este intervalo de tempo retirou-se todo o metanol em evaporador
rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [51] foi isolada por placa preparativa, tendo como
eluente hexano e acetato de etila (3:1, Rf= 0,5) e obtida como um sólido vermelho
(PF= 311-312 ºC) com rendimento de 68%.
80
5.16. Preparação da 6-cloro-7-(N-2-etoxifenilamino)isoquinolino-5,8-diona [52]
[52]
N
O
O
N
H
Cl
OEt
Colocaram-se em um balão de fundo redondo (25 mL) isoquinolino-5,8-diona diclorada
[32] (85 mg; 0,37 mmol), etanol 95% (10 mL) e sob agitação magnética, adicionou-se
2-etoxianilina (0,4 mL; 0,37 mmol). A solução permaneceu sob agitação magnética e
refluxo por 1 hora. Após este intervalo de tempo, retirou-se todo o metanol em
evaporador rotativo. A arilaminoisoquinolinodiona [52] foi isolada por placa preparativa,
tendo como eluente hexano e acetato de etila (4:1, Rf= 0,4) e obtida como um sólido
vermelho (PF= 395-397 ºC) com rendimento de 73%.
81
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA DE
CAULIBUGULONAS E ANÁLOGOS
1. INTRODUÇÃO
Segundo Oliveira e colaboradores (2001), o câncer é uma doença que consiste num
descontrole no crescimento celular, causada por mutações no DNA que bloqueiam as
“instruções normais” que comandam a vida, resultando em crescimento celular
desordenado. De qualquer modo, com divisões sucessivas, as células cancerígenas
perdem cada vez mais o seu controle. O câncer progressivamente resulta em uma
diferenciação do tumor devido um rápido crescimento, onde a malignidade das células
é sinalizada por genes mutados, que ora perderam sua função, ora tiveram um ganho
de função, acelerando assim, a replicação.
O câncer é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo: mais
de 7 milhões de pessoas morrem da doença anualmente. Como a expectativa de vida
tem melhorado gradativamente, a incidência de câncer está em 11 milhões de casos
novos, estimativa de 2002, alcançando quase 20 milhões em 2020 segundo a União
Internacional Contra o Câncer (UICC) (BRASIL, 2007).
No importante setor de combate ao câncer, os produtos químicos constituem uma fonte
permanente de trabalhos de pesquisa em razão do progresso alcançado pela química
que constantemente está oferecendo novas substâncias para serem testadas. No
entanto, poucos chegam a ser comercializados, pois mostram deficiência em uma ou
outra propriedade que os caracterizam. A primeira delas em importância é a toxicidade,
seguida da seletividade, do baixo custo e da formulação conveniente para a aplicação.
82
Para o estudo de compostos antitumorais a indução de apoptose é o tipo de morte
celular mais apropriada, por não promover a liberação de moléculas intracelulares e
mediadores pró-inflamatórios, evitando processos inflamatórios indesejáveis advindos
da necrose. A premissa deste sucesso parte do princípio de que a grande maioria das
células tumorais apresenta danos em seu DNA que as tornam mais sensíveis a agentes
externos como a radioterapia e a quimioterapia. Na radioterapia um feixe de radiação
ionizante é regulado para incidir sobre uma região pré-estabelecida em que se
encontram as células cancerígenas. A quantidade de radiação a ser empregada
depende do tipo tumoral e do tecido em que irá incidir, pois as células do organismo
apresentam sensibilidades diferentes à radiação. O sucesso desta terapia é obtido
quando todas as células tumorais são erradicadas (VERMEULEN et alii, 2003).
A radioterapia pode ser utilizada também como suporte à quimioterapia ou à cirurgia
para remoção da massa tumoral. O princípio de ação da radioterapia parte de que as
ondas eletromagnéticas com grande quantidade de energia aplicadas aos tecidos
promovem a ionização de moléculas intracelulares como a água e as cadeias de DNA.
Um importante efeito da radiação, de relevância clínica para a radioterapia, é a indução
da morte celular por falência reprodutiva ou morte clonogênica, que se caracteriza pela
perda da capacidade de divisão celular. Neste caso, a célula irradiada permanece
morfologicamente íntegra, por vez conseguindo até processar algumas divisões, mas
perde a capacidade de dividirem-se inúmeras vezes ao longo da vida. Considerando o
ciclo celular, a fase de divisão celular ou mitose (M), é extremamente sensível à
radiação, pois existe grande possibilidade de que os danos provocados pela radiação
fiquem permanentemente no DNA, provocando aberrações cromossômicas e morte
celular. Quando os danos sofridos pelo DNA são percebidos e o sistema de reparo não
os consegue recuperar é deflagrado um sinal de morte celular que culmina na célula em
apoptose pela ativação de caspases (ABE et alii, 1995).
O primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás mostarda (I),
usado nas duas Guerras Mundiais como arma química. Após a exposição de soldados
a este agente observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular e linfóide, o que
83
levou ao seu uso no tratamento dos linfomas malignos. A partir da publicação, em 1946,
dos estudos clínicos feitos com o gás mostarda, e das observações sobre os efeitos do
ácido fólico (II) em crianças com leucemias, verificou-se um avanço crescente no
combate ao câncer (LEEN et alii, 2005 e MAKIN & HICKMAN, 2000).
N
N N
N
N
N
OH
O
OH
O
H
2
N
O
H
H
Cl
S
Cl
(I)
(II)
Figura 1 – Estruturas do gás mostarda (I) e do ácido fólico (II).
O conhecimento acerca do funcionamento das estruturas celulares abriu o leque de
opções a serem exploradas para a busca de novas drogas antineoplásicas. Os agentes
utilizados atualmente no tratamento do câncer afetam diretamente o DNA celular,
promovendo danos tanto às células normais como às neoplásicas. Porém eles
acarretam maior dano às células malignas do que às dos tecidos normais, devido às
diferenças quantitativas entre os processos metabólicos dessas duas populações
celulares e ao ciclo de divisões celulares. Por este motivo a quimioterapia obtém
sucesso no tratamento do câncer. A maioria das drogas utilizadas na quimioterapia
antineoplásica interfere de algum modo nesse mecanismo celular, e a melhor
compreensão do ciclo celular normal levou à definição clara dos mecanismos de ação
da maioria das drogas (LEEN et alii, 2005 e MAKIN & HICKMAN, 2000).
Os agentes antineoplásicos mais empregados no tratamento do câncer incluem os
alquilantes polifuncionais, os antimetabólitos, os antibióticos antitumorais, os inibidores
mitóticos e outros. Novas drogas estão sendo permanentemente isoladas e aplicadas
experimentalmente em modelos animais antes de serem usadas no homem (BRUCE &
LIN, 1969).
Os compostos alquilantes são compostos capazes de substituir em outra molécula um
átomo de hidrogênio por um radical alquil. Eles se ligam ao DNA de modo a impedir a
84
separação dos dois filamentos do DNA na dupla hélice espiralar, fenômeno este
indispensável para a replicação. Os alquilantes afetam as células em todas as fases do
ciclo celular de modo inespecífico. Apesar de efetivos como agentes isolados para
inúmeras formas de câncer, eles raramente produzem efeito clínico ótimo sem a
combinação com outros agentes fase-específicos do ciclo celular (OLIVEIRA & ALVES,
2002).
Segundo Oliveira e Alves (2002), os antimetabólitos afetam as células inibindo a
biossíntese dos componentes essenciais do DNA e do RNA. Deste modo, impedem a
multiplicação e função normais da célula. Esta inibição da biossíntese pode ser dirigida
às purinas e a outras etapas da síntese de ácidos nucléicos. Estas drogas são
particularmente ativas contra células que se encontram na fase de síntese do ciclo
celular (fase S). A duração da vida das células tumorais suscetíveis determina a média
de destruição destas células, as quais são impedidas de entrar em mitose pela ação
dos agentes metabólicos que atuam na fase S.
Os antibióticos antitumorais são um grupo de substâncias com estrutura química
variada que, embora interajam com o DNA e inibam a síntese deste ácido ou de
proteínas, não atuam especificamente sobre uma determinada fase do ciclo celular.
Apesar de apresentarem tal variação possuem em comum anéis insaturados e podem
apresentar outro grupo funcional que lhes acrescentam novos mecanismos de ação,
como alquilação, inibição enzimática ou inibição da função do DNA por intercalação.
Como todos os quimioterápicos, os antibióticos atuam tanto sobre as células normais
como sobre as malignas. Por isso, também apresentam efeitos colaterais indesejáveis
(BRUCE & LIN, 1969).
Na busca para minimizar os danos provocados ao material genético e os efeitos
colaterais que os fármacos antineoplásicos de rotina promovem, diversas linhas de
pesquisas baseadas, principalmente nas vias de apoptose, buscam em moléculas
indutoras de tal morte celular protótipos que possam ser aprimorados para o uso em
rotina de tratamento contra o câncer (MARSIK et alii, 2005).
85
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Uma vez escolhida a melhor formulação para ser utilizada nos ensaios, as
caulibugulonas e análogos (Figura 2), sintetizadas no capítulo 1, após pesagem, foram
diluídos em 100 µL de dimetilsulfóxido e, então, iniciada a avaliação da atividade
anticancerígena.
[52]
N
O
O
N
H
Cl
OEt
[51]
N
O
O
N
H
Cl
OMe
[50]
N
O
O
N
H
Cl Br
N
O
O
N
H
Cl
Br
[49]
[33]
N
O
O
N
H
Cl
[48]
N
O
O
N
Cl
H
N
O
O
N
Cl
H
[47]
N
O
O
N
H
[46]
[38]
[35]
N
O
O
N
OH
H
N
O
O
N
H
N
O
O
N
H
Cl
[37]
Figura 2 – Isoquinolino-5,8-dionas utilizadas na avaliação da atividade anticancerígena.
86
2.1. Ensaios de Viabilidade Celular, Morte Celular por Necrose e Morte Celular por
Apoptose.
Segundo Anazetti e Melo (2007), o termo apoptose descreve um processo ativo de
colapso celular que difere morfologicamente da morte por necrose. É um tipo de morte
celular que ocorre durante várias situações fisiológicas e patológicas, constituindo um
mecanismo de remoção de células lesadas e de renovação celular e tecidual. A morte
celular por apoptose é um fenômeno complexo caracterizado por alteração de
permeabilidade de membranas, condensação da cromatina, encolhimento celular,
formação de corpos apoptóticos sem desintegração de organelas, sendo que a morte e
proliferação celular estão intimamente conectadas. A necrose é caracterizada pela
perda de integridade de membrana plasmática, floculação da cromatina, inchaço
seguido de lise celular com extravasamento do conteúdo intracelular e desintegração
de organelas.
A morte celular programada participa de vários processos fisiológicos vitais, como o
desenvolvimento embrionário, a involução da glândula mamária após o período de
amamentação, o controle da proliferação de tumores e a regulação de populações
celulares do sistema imune. Alterações nos genes responsáveis pelo desencadeamento
do processo apoptótico podem ocasionar diversas patologias. Por ser indispensável à
vida, a morte das células deve seguir um programa meticuloso. Qualquer distúrbio em
sua regulação, ou seja, tanto o excesso quanto à deficiência, podem provocar uma
variedade de doenças (ANAZETTI & MELO, 2007).
Segundo Freitas (2009), as taxas de viabilidade celular podem ser medidas através da
atividade enzimática da redutase mitocondrial. Neste ensaio, o
corante
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazólico - MTT (de coloração amarela) é
acumulado pelas células por endocitose e a redução do anel tetrazólico deste sal
resulta na formação de cristais de cor azul que se acumulam em compartimentos
endossomais e/ou lisossomais, sendo depois transportados para fora das células por
exocitose. Os cristais são solubilizados com uma solução de isopropanol com ácido
87
clorídrico e então a solução colorida (púrpura) é quantificada por espectrofotometria
óptica (570 nm).
O ensaio do LDH é baseado na liberação da Lactato Dehidrogenase, uma enzima
citosólica, de células que tiveram a integridade da membrana plasmática rompida. O
ensaio consiste em retirar o sobrenadante das células e medir a atividade da enzima
liberada oferecendo seu substrato. Nas condições do ensaio, a LDH catalisa a
conversão do piruvato para lactato, enquanto o NADH é oxidado para NAD
+
. A
atividade catalítica é determinada a partir da velocidade de desaparecimento do NADH,
medido em 340 nm.
Determina-se o decréscimo da absorbância em 340 nm, que é
proporcional à atividade de LDH na amostra analisada.
Os resultados das mortes por apoptose, da viabilidade celular, e das mortes por
necrose (liberação de LDH) causadas pelas caulibugulonas e análogos (Figura 2),
estão apresentados e discutidos a seguir.
88
2.1.1. Isoquinolino-5,8-diona [35] (Caulibugulona A)
[35]
N
O
O
N
H
Ensaios sobre as células cancerígenas U937 nas concentrações de 0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 3 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona A [35], sobre a viabilidade das células
U937, 48 horas após a incubação.
Analisando no primeiro ensaio (Figura 3) os resultados da aplicação da caulibugulona
A [35] sobre a viabilidade das células U937, nas concentrações de 0,25
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
g·mL
-1
, após um período de 48 horas,
verifica-se um pequeno efeito apoptótico nas concentrações 0,25
µ
g·mL
-1
, 0,5
µ
g·mL
-1
e
1,0
µ
g·mL
-1
e grande viabilidade nestas concentrações. Na concentração de 2,0
µ
g·mL
-1
a viabilidade comparada com o controle foi muito baixa, e na concentração de 4,0
µg·mL
-1
não foi possível detectar células vivas no intervalo de 48 horas, não sendo
evidenciada a redução de MTT e formação de cristais de coloração púrpura.
89
Os ensaios de liberação de LDH demonstraram que nas culturas submetidas à maior
concentração da caulibugulona A [35], 4,0 µg·mL
-1
, todas as células estavam rompidas,
com total liberação de LDH.
Os experimentos conduzidos na microscopia de fluorescência demonstraram que todas
as células submetidas às duas maiores concentrações do tratamento, 2,0 µg·mL
-1
e
4,0 µg·mL
-1
, num período de 48 horas, estavam em necrose secundária, o que justifica
a taxa de necrose de 100%, com a total liberação de LDH e a reduzida viabilidade
apresentada pelos ensaios.
2.1.2. Isoquinolino-5,8-diona [37] (Caulibugulona C)
N
O
O
N
H
Cl
[37]
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 4 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona C [37], sobre a viabilidade das células
U937, 48 horas após a incubação.
90
Analisando no segundo ensaio (Figura 4) os resultados da aplicação da caulibugulona
[37] sobre a viabilidade das células U937 nas concentrações de 0,25
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
g·mL
-1
, após um período de 48 horas,
verifica-se uma considerável atividade sobre as células U937 nos ensaios realizados.
Nos ensaios de viabilidade, houve uma redução drástica na quantidade de células vivas
na maior concentração testada (4,0 µg·mL
-1
). Quando foi quantificada a liberação de
LDH para o meio de cultura, obteve-se um efeito concentração-dependente, sendo que
na maior concentração, a taxa de liberação superou os 50%.
Na microscopia de fluorescência, a taxa de apoptose foi pronunciada a partir da
concentração de 2,0 µg·mL
-1
(50%) e foi de 100% na concentração de 4,0 µg·mL
-1
.
Estes dados indicam que parte das células na concentração de 4,0 µg·mL
-1
já estava
em necrose secundária o que levou à liberação de LDH no tempo de 48 horas de
experimentação, como pode ser verificado na Figura 4.
91
2.1.3. Isoquinolino-5,8-diona [38] (Caulibugulona D)
N
O
O
N
H
OH
[38]
Ensaios sobre as células cancerígenas U937 nas concentrações de 0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 5 - Efeitos citotóxicos da caulibugulona D [38], sobre a viabilidade das células
U937, 48 horas após a incubação.
Analisando no terceiro ensaio (Figura 5) os resultados da aplicação da caulibugulona D
[38] sobre a viabilidade das células U937, nas concentrações de 0,25
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
g·mL
-1
, após um período de 48 horas
verifica-se que nos testes feitos de viabilidade na concentração de 4,0 µg/mL, houve
uma redução de quase 75% na quantidade de células vivas.
Quanto à avaliação da liberação de LDH, na concentração de 4,0 µg·mL
-1
a liberação
foi de 25%, indicando que nem todas as células mortas haviam entrado em necrose e
conseqüentemente, liberado LDH no meio de cultura. Estes dados foram confirmados
pela microscopia de fluorescência, onde mais de 80% das células estavam em
92
apoptose, e algumas já em necrose secundária e, portanto, liberaram LDH no meio.
Não foram visualizadas necroses primárias, sendo a apoptose a única forma de indução
de morte.
2.1.4. Isoquinolino-5,8-diona [46]
N
O
O
N
H
[46]
As substâncias análogas às caulibugulonas foram testadas frente às células U937,
MOLT4, COLO205 e H460 para os ensaios de viabilidade, liberação de LDH e
microscopia de fluorescência.
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 6 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
93
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 7 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 8 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
94
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25
µ
µµ
µ
g·mL
-1
,
0,5
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
µµ
µ
g·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 9 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [46], sobre a viabilidade
das células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 6, 7, 8 e 9 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-diona
[46] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25
µ
g·mL
-1
, 0,5
µ
g·mL
-1
, 1,0
µ
g·mL
-1
, 2,0
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
g·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [46] foi a mais
ativa dentre todas as testadas. As culturas de U937 apresentaram todas as células
mortas nas concentrações de 1,0 µg·mL
-1
, 2,0
µ
g·mL
-1
e 4,0
µ
g·mL
-1
. Quando foi
analisada a liberação de LDH, o gráfico concentração-dependente obtido indicou que
quanto maior a concentração, mais rápido é a indução de apoptose e
consequentemente, mais células apresentam-se rompidas com 48 horas de
experimento.
Este resultado foi confirmado na microscopia de fluorescência, onde 100% das células
em apoptose foram encontradas nas culturas com concentrações iguais e (ou)
superiores a 1,0 µg·mL
-1
. As células MOLT4 não resistiram sequer à menor
concentração testada (0,25 µg·mL
-1
), com ausência de células vivas e uma liberação de
LDH expressivamente alta. As células epitelióides também foram sensíveis aos
tratamentos. As células H460 apresentaram viabilidade inferior a 50% do controle
mesmo na concentração de 0,25
µg·mL
-1
, mas todas as células estavam mortas apenas
95
nas concentrações iguais e superiores a 1,0 µg·mL
-1
. Já as culturas de COLO205
apesar de exibirem ausência de células vivas já na concentração de 1,0 µg·mL
-1
, na
concentração de 0,5 µg·mL
-1
aproximadamente 70% das células estavam vivas com
48 horas de experimento.
2.1.5. Isoquinolino-5,8-diona [47]
[47]
N
O
O
N
H
Cl
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 10 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
96
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 11 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 12 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
97
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 13 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [47], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 10, 11, 12 e 13 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-
diona [47] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [47] apresentou
elevada atividade no tratamento das células U937, H460 e MOLT4. Quanto à
viabilidade, obteve-se uma boa relação concentração-dependente para as células
U937. Percebeu-se que quanto maior a concentração do composto, menor a viabilidade
das culturas.
A liberação de LDH foi discreta, mesmo que na microscopia de fluorescência mostrando
que na concentração de 4,0 µg·mL
-1
mais de 90% das células estavam em apoptose,
menos de 30% das células estavam liberando LDH, ou seja, não haviam entrado em
necrose secundária. As células da linhagem MOLT4 não resistiram ao tratamento com
4,0 µg·mL
-1
do composto, estando todas mortas nesta concentração. A liberação de
LDH também foi alta, alcançando os 50%. As células epitelióides H460 também não
resistiram a concentrações superiores a 2,0
µg·mL
-1
, apesar da taxa de liberação de
98
LDH ser discreta. No entanto, as culturas de COLO205 foram resistentes a todas as
concentrações da substância [47], apresentando uma redução na viabilidade. Porém,
sem nenhum sinal de liberação de LDH que pudesse indicar morte celular, fazendo-se
suspeitar de um efeito citostático (Figura 11).
2.1.6. Isoquinolino-5,8-diona [48]
N
O
O
N
H
Cl
[48]
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 14 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
99
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 15 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 16 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
100
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 17 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [48], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 14, 15, 16 e 17 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-
diona [48] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [48] apresentou
um reduzido efeito indutor de morte celular sobre as células da linhagem U937, forma
mais resistente que as MOLT4.
Na maior concentração testada (4,0 µg·mL
-1
), foi observada uma redução da
viabilidade de mais de 30% nas culturas de U937. Nas culturas da linhagem MOLT4
apresentou uma redução da viabilidade acima de 80%. A microscopia de fluorescência
para as culturas de U937, demonstrou apenas na concentração de 4,0 µg·mL
-1
uma
taxa significativa de apoptose (40%).
A liberação de LDH foi alta apenas nas culturas de MOLT4 e na concentração de
4,0 µg·mL
-1
, sendo obtida uma liberação de LDH maior que 40%. As células das
linhagens epitelióides H460 e COLO205 foram resistentes aos tratamentos com a
substância [48], conforme apresentam as
Figuras 15 e 17.
101
2.1.7. Isoquinolino-5,8-diona [33]
N
O
O
N
H
Cl
[33]
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 18 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
102
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 19 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 20 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
103
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 21 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [33], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 18, 19, 20 e 21 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-
diona [33] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [33] foi a
segunda mais ativa sendo capaz de promover a morte de todas as células da linhagem
U937 em concentrações acima de 0,5 µg·mL
-1
, sendo que todas as células estavam
liberando LDH a partir da concentração de 2,0 µg·mL
-1
. Estas células estavam em
necrose secundária, resultados estes obtidos pela microscopia de fluorescência, em
que mais de 90% das células já estavam em apoptose nas concentrações acima de
0,5 µg·mL
-1
. Os testes feitos com as demais linhagens celulares demonstraram que a
linhagem H460 foi a mais resistente, pois havia aproximadamente 40% de células
viáveis na concentração de 2,0 µg·mL
-1
e uma pequena liberação de LDH na máxima
concentração de 4,0 µg·mL
-1
. Os dados de LDH e viabilidade indicam que as células
tratadas com 4,0 µg·mL
-1
do composto [33] após 48 horas estavam mortas, porém
apenas 20% tinham sofrido lise e liberado LDH para o meio.
104
As células da linhagem COLO205 também foram resistentes ao tratamento com a
substância [33], sendo que na concentração de 2,0 µg·mL
-1
menos de 5% das células
estavam vivas. A insignificante liberação de LDH indica que as células morreram, porém
foram resistentes à lise, liberando pouco LDH no meio. Já as células MOLT4 foram
resistentes nas concentrações inferiores a 0,5 µg·mL
-1
, porém, morreram em massa e
com intensa taxa de liberação de LDH a partir da concentração de 1,0 µg·mL
-1
.
2.1.8. Isoquinolino-5,8-diona [49]
[49]
N
O
O
N
H
Cl
Br
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 22 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
105
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 23 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 24 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
106
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 25 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [49], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 22, 23, 24 e 25 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-
diona [49] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [49] não causou
morte às células testadas. Porém observou-se uma redução considerável na
viabilidade das culturas U937, MOLT4, COLO205 e H460, sugerindo efeito citostático. A
ausência de apoptose na microscopia de fluorescência e baixíssimos níveis de
liberação de LDH indicam que não ocorreu morte das células, mas apenas uma
redução na proliferação, quando comparado com a viabiliade obtida para as culturas
controles.
107
2.1.9. Isoquinolino-5,8-diona [50]
[50]
N
O
O
N
H
Cl Br
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 26 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
108
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 27 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 28 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
109
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
..
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 29 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [50], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Analisando nas Figuras 26, 27, 28 e 29 os resultados da aplicação da isoquinolino-5,8-
diona [50] sobre a viabilidade das células U937, COLO205, MOLT4 e H460 nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
,
após um período de 48 horas, verifica-se que a isoquinolino-5,8-diona [50] não
apresentou nenhum efeito citotóxico. Nas codições utilizadas, foi observado, no
entando, uma redução de 30% e 40% da viabilidade das células U937 e H460 e de 20%
nas culturas de COLO205 e MOLT4 na concentração de 4,0 µg·mL
-1
(Figuras 27 e 28).
Os resultados indicam um efeito citostático, reduzindo a proliferação das células, o que
levou a uma baixa viabilidade da cultura. Também foi possível observar baixíssimos
níveis de liberação de LDH nas linhagens celulares testadas.
110
2.1.10. Isoquinolino-5,8-diona [51]
[51]
N
O
O
N
H
Cl
OMe
Ensaios sobre as células cancerígenas U937 nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
..
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 30 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
111
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 31 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 32 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
112
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 33 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [51], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Quando são avaliados os resultados obtidos nos ensaios com a isoquinolino-5,8-diona
[51] sobre as células da linhagem U937 (Figura 30), observa-se uma redução da
viabilidade de 50% na concentração de 2,0 µg·mL
-1
e 100% na concentração de
4,0 µg·mL
-1
. Nestas condições, a enzima LDH foi liberada em grande quantidade
apenas na maior concentração (4,0 µg·mL
-1
).
A microscopia de fluorescência indicou que todas as células encontravam-se em
apoptose na maior concentração testada. As células de linhagem epitelióides,
COLO205 e H460 não apresentaram liberação de LDH e a redução da viabilidade foi
observada apenas nas células H460, onde houve uma redução de 40% na
concentração de 4,0 µg·mL
-1
(Figuras 31 e 33). Estes dados não são suficientes para
indicar que as células morreram durante a experimentação, podendo apenas não ter
proliferado. Já as células MOLT4 foram sensíveis à substância [51], inclusive com uma
redução de viabilidade maior que a obtida para as células U937. Houve também um
aumento concentração-dependente de liberação da enzima LDH (Figura 32).
113
2.1.11. Isoquinolino-5,8-diona [52]
[52]
N
O
O
N
H
Cl
OEt
Ensaios sobre as células cancerígenas U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Apoptose Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 34 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a viabilidade das
células U937, 48 horas após a incubação.
114
Ensaios sobre as células cancerígenas COLO205, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 35 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a viabilidade das
células COLO205, 48 horas após a incubação.
Ensaios sobre as células cancerígenas MOLT4, nas concentrações de
0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 36 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a viabilidade das
células MOLT4, 48 horas após a incubação.
115
Ensaios sobre as células cancerígenas H460, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
0
20
40
60
80
100
Viabilidade Liberação LDH
0,25 ug/mL
0,5 ug/mL
1,0 ug/mL
2,0 ug/mL
4,0 ug/mL
Figura 37 - Efeitos citotóxicos da isoquinolino-5,8-diona [52], sobre a viabilidade das
células H460, 48 horas após a incubação.
Os resultados dos ensaios indicam que a isoquinolino-5,8-diona [52] se mostrou
bastante eficiente sobre as células testadas. Com as células U937, já na concentração
de 2,0 µg·mL
-1
não haviam mais células vivas, após 48 horas de tratamento
(Figura 34).
Uma liberação concentração-dependente de LDH também foi verificada, e os dados da
microscopia de fluorescência indicaram que nas duas maiores concentrações testadas
(2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
) todas as células estavam em apoptose, sendo muitas em
apoptose tardia e liberando LDH para o meio de cultura. As células da linhagem MOLT4
foram mais sensíveis, morrendo todas já na concentração de 1,0 µg·mL
-1
e a taxa de
liberação de LDH também foi concentração-dependente, ou seja, quanto maior a
concentração da isoquinolino-5,8-diona [52], mais rápido as células entravam em
apoptose e não resistiam intactas às 48 horas de experimentação, levando à lise
(Figura 36). As células das linhagens epitelióides H460 e COLO205 mostraram-se
sensíveis ao tratamento, principalmente na concentração de 4 µg·mL
-1
, sendo a
primeira mais resistente que a segunda. As células COLO205 tiveram a viabilidade
muito reduzida na concentração de 4,0 µg·mL
-1
, com uma discreta liberação de LDH, ao
passo que as células H460 mantinham-se mais de 40% viáveis na maior concentração
testada, sem liberação de LDH (
Figuras 35 e 37).
116
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Culturas de células
As células de origem leucêmica humana U937 (linhagem pré-monocítica) e MOLT4
(linhagem pré-linfocítica), foram cultivadas em meio de cultura DMEN/F12 (Gibco, BRL)
suplementado com 20 µg·mL
-1
de gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de soro fetal bovino
(Gibco, BRL). As células COLO205 de câncer de colon humano (linhagem epitelióide) e
H460 de câncer pulmonar humano de células pequenas (linhagem epitelióide), foram
cultivadas em meio RPMI (Gibco, BRL) também suplementado com 20 µg·mL
-1
de
gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de soro fetal bovino (Gibco, BRL). As culturas foram
replicadas a cada 2 dias e mantidas em estufa (Forma Scientific Inc., modelo 3159) a
37 °C, com 5% de CO
2
e umidade controlada.
3.2. Quantificação e ajuste das culturas
A quantificação celular foi feita em câmara de Neubauer (Boeco) sendo utilizada a
coloração vital por Trypan Blue (Sigma T6146). Uma alíquota da cultura era
quantificada e as células ressuspendidas em meio de cultura DMEM/F12 (Gibco, BRL)
suplementado de modo a obter-se a concentração final de 1x10
6
células·mL
-1
de cultura.
3.3. Diluição e armazenamento das isoquinolino-5,8-dionas
As isoquinolino-5,8-dionas, após pesagem, foram diluídas em 100 µL de DMSO (Sigma
D2650) e armazenadas a temperatura de -70 ºC (Freezer Forma Scientific) até o
momento de montagem dos experimentos. Para a realização dos testes as substâncias
eram rediluídas, desta vez em meio de cultura DMEM/F12 (Gibco, BRL) suplementado,
de modo a obter as seguintes concentrações finais: 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
,
1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
.
117
3.4. Determinação da citotoxicidade celular
O volume de 100 µL/poço das células U937 na concentração de 1x10
6
células·mL
-1
foi
distribuídas em placas de cultura celular de 96 poços (TPP 92096), seguida de mais
100 µL das isoquinolino-5,8-dionas, diluídas no meio de cultura DMEM/F12 (Gibco,
BRL) suplementado, nas concentrações finais de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
,
1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
. Como controles negativos e positivos, as células
foram incubadas somente no meio de cultura. Após 48 horas de incubação, foram
acrescentados 10 µL de uma solução de Triton 10X (Vetec 777) aos poços do controle
positivo e, em seguida, 50 µL do sobrenadante de todas as culturas foram transferidos
para outra placa. Os 150 µL restantes foram reservados para o ensaio metabólico do
MTT. A quantidade da enzima Dehidrogenase Láctica foi mensurada pelo Kit
Deidrogenase Láctica Colorimétrico Doles. A densidade óptica das amostras foi medida
em espectrofotômetro multicanal (Labsystems Multiskan) com comprimento de onda
ajustado para 492 nm. A taxa de células necróticas foi calculada pela fórmula a seguir:
TNR = (MDOT – MDOCN) x 100 / (MDOCP – MDOCN)
Onde:
TNR = Taxa de Necrose Celular
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
118
3.5. Ensaio Metabólico do MTT
Aos 150 µL das culturas celulares reservados dos ensaios para a integridade das
membranas celulares acrescentou-se 15 µL de uma solução de MTT
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazólico) (Sigma M2128) em PBS
(Phosphate buffered saline) na concentração de 5 mg·mL
-1
. As culturas incubadas
apenas em meio de cultura suplementado foram consideradas como controle positivo, e
as culturas que tiveram as células lisadas com Triton (Vetec 777) foram consideradas
como controles negativos de viabilidade. Após 4 horas de incubação, foram retirados
100 µL do sobrenadante das culturas e os cristais precipitados de MTT foram
solubilizados em 100 µL de solução isopropanol (Merck 1009781000) com 0,0014% de
HCl fumegante. Para separar do precipitado, as placas foram submetidas à
centrifugação por 10 minutos a 1500 rpm (Centrífuga Sorval RT7) e 100 µL do
sobrenadante foi transferido para outra placa e lido em seguida em espectrofotômetro
multicanal (Labsystems Multiskan) com comprimento de onda ajustado para 570 nm.
A taxa de viabilidade celular foi calculada pela fórmula a seguir:
TVC = (MDOT – MDOCN) x 100 / (MDOCP – MDOCN)
Onde:
TVC = Taxa de Viabilidade Celular
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
119
3.6. Microscopia de fluorescência
Para a avaliação da morte celular induzida pelas isoquinolino-5,8-dionas avaliaram-se
as células U937 (leucemia humana, linhagem monocítica), MOLT4 (leucemia humana,
linhagem linfocítica), COLO 205 (câncer de colon humano, linhagem epitelióide) e H460
(câncer pulmonar humano, linhagem epitelióide). Estas foram submetidas a tratamentos
nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
e avaliadas por microscopia de fluorescência com coloração de laranja de acridina
(Sigma A6529) e brometo de etídio (Sigma E8751), nos tempos de 12, 24 e 48 horas de
incubação. Uma gota da suspensão celular foi colocada entre lâmina e lamínula e
contadas 300 células por lâmina em campos aleatórios, com diferenciação entre células
normais, apoptóticas e necróticas de acordo com as características morfológicas
observadas ao microscópio de fluorescência (Nikon Labophot). Foram obtidas
micrografias das células, sendo capturadas no microscópio Zeiss Axioplan através do
software Axiovision 4.6. As taxas de apoptose para cada experimento foram obtidas de
acordo com o a seguinte fórmula:
TA = NCA x 100 / NCA + NCN + NCNM
Onde:
TA= Taxa de apoptoses
NCA= Número de células em apoptose
NCN=Número de células em necrose
NCNM=Número de células normais
120
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foram sintetizadas dezesseis substâncias, uma imina [42], uma amina
[43], uma isoquinolina dimetoxilada [44], três isoquinolino-5,8-dionas [35], [38] e [46]
derivadas da isoquinolino-5,8-diona [45] e oito isoquinolino-5,8-dionas cloradas [33],
[37], [47], [48], [49], [50], [51] e [52] derivadas da 6,7-dicloroisoquinolino-5,8-diona [32].
Todas as isoquinolino-5,8-dionas foram obtidas em cinco etapas, sendo as
caulibugulonas A [35], C [37] e D [38] com rendimento total de 18,9%, 8,4% e 8,5%,
respectivamente e as demais isoquinolino-5,8-dionas com rendimento total médio de
10,7%.
É importante salientar que a rota sintética proposta neste trabalho é inédita e que
atualmente existem apenas duas sínteses de caulibugulonas descritas na literatura, a
de Wipf (2004) e a de Tamagnan (2004) e seus respectivos colaboradores.
Das dezesseis substâncias sintetizadas, onze foram submetidas à avaliação de
atividade anticancerígena sobre as células U937, COLO205, MOLT4 e H460, nas
concentrações de 0,25 µg·mL
-1
, 0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
, sob
condições de laboratório.
Com esses bioensaios, verificou-se que das substâncias que apresentaram atividade
anticancerígena, as isoquinolino-5,8-dionas [33] e [46] foram as que mostraram as mais
significativas influências sobre o desenvolvimento das células cancerígenas nas
concentrações de 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
, confirmado no teste de
fluorescência.
Esses resultados mostram-se promissores, uma vez que, ao analisar os efeitos
apresentados por estas substâncias, nas culturas de U937, MOLT4, COLO205 e H460,
todas as células se encontravam mortas a partir da concentração de 1,0 µg·mL
-1
,
48 horas após a montagem do experimento, apresentando-se bastante superiores aos
obtidos com as outras substâncias testadas. Outro aspecto importante, ao se
121
analisarem os efeitos provocados por estas substâncias, é que as isoquinolino-5,8-
dionas que apresentam grupos eletronegativos substituindo hidrogênio no anel
aromático, substâncias [49], [50], [51] e [52], apresentaram, nas mesmas condições
experimentais, efeito anticancerígeno bem inferior que as isoquinolino-5,8-dionas [33] e
[46], sugerindo, assim, que a atividade está diretamente ligada à sua estrutura química,
estando de acordo com os resultados dos trabalhos realizados por Kim e colaboradores
(2007).
Nos ensaios referentes às atividades citotóxica e citostática, das onze substâncias
submetidas às avaliações (isoquinolino-5,8-dionas [35], [38], [46], [37], [47], [48], [33],
[49], [50], [51] e [52]), sobre as células U937, nas concentrações de 0,25 µg·mL
-1
,
0,5 µg·mL
-1
, 1,0 µg·mL
-1
, 2,0 µg·mL
-1
e 4,0 µg·mL
-1
, sob condições de laboratório, num
período de incubação de 48 horas, somente a isoquinolino-5,8-dionas [33] apresentou
apenas atividade citotóxica. As isoquinolino-5,8-dionas [49] e [50] apresentaram apenas
atividade citostática e as demais isoquinolino-5,8-dionas apresentaram,
simultaneamente, atividades citostática e citotóxica. Estes resultados são extremamente
interessantes uma vez que sugerem que dependendo da concentração utilizada as
células cancerígenas não entram em processo de apoptose, nem tão pouco de
necrose, mas é observada uma redução da viabilidade celular.
Os resultados deste trabalho sugerem a realização de novos ensaios, com outras
espécies de células e também com alguns tipos de enzimas, testando outras
formulações e doses, a fim de se obter conclusão definitiva sobre o potencial
anticancerígeno das substâncias sintetizadas.
122
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABE, R; ASAISHI, K.; ENOMOTO, K; HATTORI, T; LINO, Y; KIKUCHI, K; KOYAMA, H;
SAWA, K; UCHINO, J; YOSHIDA, M. (1995) Effects of radiotherapy and surgery in early
breast cancer. The New England Journal of Medicine, 333(22):1444-1455.
ANAZETTI, C. M. e MELO, P. S. (2007) Morte celular por apoptose: uma visão
bioquímica e molecular. Disponível em
http://www.metrocamp.edu.br/pesquisa/pdf/02.pdf. Acesso em: 20 de out. 2009,
23:30:45.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência e Tecnologia e Insumos
Estratégicos. Departamento de Ciência e Tecnologia. (2007) Integração de informações
dos registros de câncer brasileiros / Information integration of Brazilian cancer registries.
Revista de Saúde Pública, 41(5):865-868.
BRUCE, W. R. e LIN, H. (1969) An Empirical Cellular Approach to the Improvement of
Cancer Chemotherapy. Cancer Research, 29:2308-2310.
CARRIJO, R. M. e ROMERO, J. R. (2000) Oxidações catalíticas e eletrocatalíticas de
substratos orgânicos. O cério como oxidante. Química Nova, 23(3):331-337.
FIESER, L. F. e HARTWELL, J. L. (1935) The reaction of hydrazoic acid with the
naphthoquinones. Journal of the American Chemical Society, 57(8):1482-1484.
FREITAS, W. R. (2009) Efeitos citostático e citotóxico induzidos in vitro por
isoquinolinas sintéticas. Monografia – Ilhéus-BA, Universidade Estadual de Santa Cruz,
UESC, 36p.
JIMENEZ, J. T.; STURDÍKOVÁ, M.; STURDÍKA, E. (2009) Natural products of marine
origin and their perspectives in the discovery of new anticancer rugs. Acta Chimica
Slovaca, 2(2):63-74.
KIM, J. S.; RHEE, H.; PARK, H. J.; LEE, I.; LEE, S. K.; SUH, M.; LEE, H. J.; RYU, C. e
CHOO, H. P. (2007) Synthesis of 6-chloroisoquinoline-5,8-diones and pyrido[3,4-b]-
phenazine-5,12-diones and evaluation of their cytotoxicity and DNA topoisomerase II
inhibitory activity. Bioorganic Medicinal Chemistry, 15:451-457.
KOUZNETSOV, V. V.; VARGAS-MÉNDEZ, L. Y. e MELÉNDEZ-GÓMES, C. M. (2005)
Recent progress in the synthesis of quinolines. Current Organic Chemistry, 9:141-161.
123
LAATSCH, H. (2006) Marine bacterial metabolites. In: PROKSCH P.; HEINE, H.;
MÜLLER, W. E. G. Frontiers in marine biotechnology. Germany, Cap.6, 350p.
LEEN, W.; LOCKHRAT, A. C.; KIN, R. B. e ROTHEMBERG, M. L. (2005) Cancer
Pharmacogenomics: Powerful Tools in Cancer Chemotherapy and Drug Development.
The Oncologist, 10:104-111.
LE HYARIC, M.; ALMEIDA, M. V. e SOUZA, M. V. N. (2002) Síntese e reatividade de
azaindóis: aplicações na preparação de moléculas de interesse biológico. Química
Nova, 25(6b):1165-1171.
LLORENTE, A. M. (1995) Reactividad de aminoquinonas frente a electrofilos. Sintesis
de analogos de diazaquinomicina A. Tesis Doctoral – Madrid –Facultad de Farmacia,
Universidad Complutense de Madrid - UCM, 310p.
MAKIN, G. e HICKMAN, J. A. (2000) Apoptosis and cancer chemotherapy. Cell Tissue
Research, 301:143–152.
MARSIK, P.; KOKOSKA, L.; LANDA, P.; NEPOVIM, A.; SOUDEK, P. e VANEK, T.
(2005) In vitro inhibitory effects of thymol and quinones of Nigella sativa seeds on
cyclooxygenase-1- and -2-catalyzed prostaglandin E2 biosyntheses. Planta Medica,
71(8):739-42.
MELÉNDEZ-GOMEZ, C. e KOUZNETSOV, V. (2005) Alcalóides quinolínicos:
importância biológica y esfuerzos sintéticos. Universitas Scientiarum, 10(2):5-18.
MILANOWSKI apud MAYER, A. M. S.; GUSTAFSON, K. R. (2006) (Review) Marine
pharmacology in 2003-2004: anti-tumour and cytotoxic compounds. European Journal of
Cancer, 42:2241-2270.
MIN, M. H.; LIU, Z. Z. e CHEN, S. Z. (2004) Bischler-Napieralski reaction of 2-(3,4-
dimethoxy-2-nitrophenyl)- N -[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl]- N - [(S)-1-phenylethyl]
acetamide accompanied by elimination of chiral auxiliary. Chinese Chemical Letters,
15(3):253-256.
NOVAES, M. R. C. G.; SOUZA, J. P. e ARAÚJO, H. C. (1999) Síntese do anti-
helmíntico praziquantel, a partir da glicina. Química Nova, 22(1):05-10.
OLIVEIRA, R. B. e ALVES, R. J. (2002) Agentes antineoplásicos biorredutíveis: uma
nova alternativa para o tratamento de tumores sólidos. Química Nova, 25(6):976-984.
124
OLIVEIRA, A. J. B. e KOIKE, (2003) Luzia. Uma síntese alternativa para o (±)-1,2,3,4-
tetraidro-{9H-pirido-[3,4-b]}-indol. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas,
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 39(3):259-264.
OLIVEIRA, C. F.; NASCIMENTO, J. L. M.; MÜLLER, A. H. e ARRUDA, M. S. P. (2001)
Avaliação in vitro do efeito anti-proliferativo das drogas BSA-1 e 32/26/2-B em linhagens
cancerígenas de retinoblastomaY79. Revistaic, 1(1):01-09.
OWTON, W. M. (1999) The synthesis of quinones. Journal Chemical Society, Perkin
Transactions, 1:2409-2420.
OZORIO, E. J. D.; MONTOYA, G. L. P.; ARANGO, A. (2006) Productos naturales
alcaloidales con actividad antiprotozoaria. Revista de la Faculdade de Química
Farmacêutica, 13(1):61-84.
PEDERSEN, J. M.; BOWMAN, W. R.; ELSEGOOD, M. R. J.; FLETCHER, A. J. e
LOVELL, P. J. (2005) Synthesis of ellipticine: a radical cascade protocol to aryl- and
heteroaryl-annulated[b]carbazoles. Journal Organic Chemistry, 70:10615-10618.
PERRIN, D. D.; ARMAREGO, W. L. F. (1998) Purification of laboratory chemicals,
Oxford, England: Pergamon Press. 3 ed., 1-391.
ROUSSEAU, J. F.; DODD, R. H. apud LE HYARIC, M.; ALMEIDA, M. V. e SOUZA, M.
V. N. (2002) Síntese e reatividade de azaindóis: aplicações na preparação de moléculas
de interesse biológico. Química Nova, 25(6b):1165-1171.
RYU, C. K.; JUNG, S. H.; LEE, J. A.; KIM, H. J.; LEE, S. H. e CHUNG, J. H. (1999) 6-
arylamino-5,8-quinolinediones 7-arylamino-5,8-isoquinolinediones as inhibitors of
endothelium-dependent vasorelaxation. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,
9:2469-2472.
SEIYAKU, T. (1966) Heterociclos Pi-deficientes: quinolina e isoquinolina.
http://www2.uah.es/quimica_organica/docencia/profesores/julioalvarez/2009-10-H/H03.
pdf. Acesso em: 15 de jul. 2009, 22:14:31.
SHAIKH, I. A.; JOHNSON, F. e GROLLMAN, A. (1986) Streptonigrin. Structure-activity
relationships among simple bicyclic analogues. Rate dependence of DNA degradation
on quinone reduction potential. Journal of Medicinal Chemistry, 29(8):1329-1340.
SHKLYAEV, Y. V. (2002) (Review) Synthesis of alkaloids of isoquinoline class. Butlerov
Communications, 2(7):21-34.
125
SPEICH, R.; FENNI, R.; OPRAVIL, M. e FACCARD, R. (2002) Papaverine, a vasodilator
with antiviral activity. Swiss Medical Weekly, 132:115-118.
TAMAGNAN, G. D.; BALDWIN, R. M. e ALAGILLE, D. (2004) Total synthesis of the
marine cytotoxic caulibugulones A–D. Tetrahedron Letters, 45(32):6179-6181.
VERMEULEN, K; VAN BOCKSTAELE, D. R. e BERNEMAN, Z. N. (2003) The cell cycle:
a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation,
36(3):131-149.
YSHIKURA, M.; HINO, A.; YAGINUMA, T.; AGATA, I. e KATAGIRI, N. (2000) A novel
entry to pyrido[4,3-b]carbazoles: an efficient synthesis of ellipticine. Tetrahedron,
56:193-200.
WIPF, P.; JOO, B.; NGUYEN, T. e LAZO, J. S. (2004) Synthesis and biological
evaluation of caulibugulones A-E. Organic Biomolecular Chemistry, 2:2173-2174.
126
APÊNDICE
127
Figura 1A - Espectro de massas da imina [42].
OMe
OMe
N
MeO
MeO
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
cm
-1
2926
2827
1641
1493
1271
1222
1135
1036
702
% Transmitância
Figura 2A - Espectro no infravermelho da imina [42].
128
OMe
OMe
N
MeO
MeO
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
6,9 6,8
4,7 4,6 4,5
8,65
7,46
6,91
6,78
4,64
6,89
Figura 3A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da imina [42].
129
OMe
OMe
N
MeO
MeO
160 140 120 100 80 60 40 20 0
159 156 153
56,7 55,8
159,5
153,7 153,5
125,0
118,8
112,8
110,7
104,2
64,0
56,4
55,9
53,8
Figura 4A - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da imina [42].
130
Figura 5A - Espectro de massas da amina [43].
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
120
140
% Absorbância
cm
-1
2928
2837
1495
1454
1224
1125
1059
820
Figura 6A - Espectro no infravermelho da amina [43].
131
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
6,85 6,80 6,75
4,0 3,8 3,6
2,80 2,73 2,66
3,73
3,76
4,50
3,80
2,71
3,12
6,75
6,74
6,84
ppm
Figura 7A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da amina [43].
132
OMe
OMe
MeO
MeO
N
H
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
153,2
151,7
128,0
116,2
112,6
111,1
103,8
55,8
53,8
49,8
48,8
54,9
Figura 8A - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da amina [43].
133
Figura 9A - Espectro de massas da isoquinolina [44].
OMe
OMe
N
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
3,95
6,84 6,75
8,5 8,0
OMe
3,97
OMe
3,94
H4
6,73
H5
6,88
H3
7,92
H2
8,55
H1
9,57
Figura 10A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da amina [44].
134
OMe
OMe
N
160 140 120 100 80 60 40 20 0
56,0 55,6
149,8
148,5
147,2
143,3
129,5
121,3
103,5
114,7
107,8
55,9
55,8
Figura 11A - Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) da isoquinolina [44].
135
Figura 12A - Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [45].
N
O
O
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
7,96 7,94 7,92
9,06 9,04 9,02
ppm
7,93
7,07
7,14
9,04
9,24
Figura 13A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da isoquinolino-5,8-diona [45].
136
N
O
O
N
OH
H
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
ppm
H1
9,14
H2
8,96
H3
7,91
H4
5,91
H6
3,79
H5
3,41
OH
1,28
Figura 14A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da Caulibugulona D [38].
137
N
O
O
N
H
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
7,65
7,26
7,45
7,90
9,05
9,34
7 ,9 7 ,8 7 ,7 7 , 6 7 ,5 7 ,4 7 ,3 7 ,2
9,40 9,35 9,30 9,25 9,20 9,15 9,10 9,05 9,00
9,34
9,05
7,90
7,45
7,26
7,29
Figura 15A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-5,8-diona [46].
138
N
O
O
Cl
Cl
Figura 16A - Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona diclorada [32].
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
8,02
9,06
9,43
Figura 17A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-5,8-diona
diclorada [32]
139
N
O
O
N
Cl
H
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
ppm
9,35
9,09
8,04
3,52
H
2
O
6,30
Figura 18A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Caulibugulona C [37].
140
N
O
O
N
Cl
H
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
H1
9,24
H2
8,99
H3
7,94
H-N
6,20
H4
3,87
H5
1,68
H7
0,96
H6
1,43
Figura 19A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da Isoquinolino-5,8-diona [47]
141
N
O
O
N
Cl
H
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
8,90
8,85
7,83
1,28
H1
H2
H3
H4
Figura 20A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) da Isoquinolino-5,8-diona [48]
142
N
O
O
N
H
Cl
Figura 21A - Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [33].
N
O
O
N
H
Cl
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
H1
9,33
H2
9,07
H3
7,99
H6
7,38
H5
7,26
H4
7,10
Figura 22A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-5,8-diona [33].
143
N
O
O
N
H
Cl
Br
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
% Transmitância
cm
-1
3248
1686
1639
1593
1561
1499
1318
1296
Figura 23A - Espectro no infravermelho da Isoquinolino-5,8-diona [49].
144
N
O
O
N
H
Cl
Br
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
H1
9,29
H2
9,02
H3
7,97
H4
7,45
H5
6,95
Figura 24A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-5,8-diona [50].
145
N
O
O
N
H
Cl
OMe
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
H1
9,32
H2
9,05
H3
7,99
H4
7,02
H5
6,92
H7
7,24
H6
6,97
OMe
3,84
Figura 25A - Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da Isoquinolino-5,8-diona [51].
146
N
O
O
N
H
Cl
OEt
Figura 26A - Espectro de massas da isoquinolino-5,8-diona [52].
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