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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES VISANDO COMPOR UM
ARRANJO DE SONDAS DE DNA QUE IDENTIFIQUE ESTIRPES DE
PECTOBACTÉRIAS
Janine Palma
Engenheira Agrônoma/UFSM
Dissertação apresentada como um dos
requisitos à obtenção do Grau de
Mestre em Fitotecnia
Área de Concentração Fitossanidade
Porto Alegre (RS), Brasil
Março de 2006
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ii
HOMOLOGAÇÃO
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iii
AGRADECIMENTOS
Ao professor Valmir Duarte, pela orientação e exemplo profissional.
Aos demais professores pelos ensinamentos transmitidos.
Aos colegas Aícha Daniela Ribas e Felipe André S. Graichen, pela
amizade, incentivo e apoio nas horas mais difíceis.
Aos demais colegas do Departamento de Fitossanidade pela boa
convivência e auxílio durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Fitossanidade, pela amizade e
colaboração.
Aos meus pais Silvio Palma e Ivoni Ida A. Palma, e irmãos Evandro e
Josiane, pela compreensão de minha ausência, e ao incentivo e auxílio,
fundamentais para a realização deste trabalho.
Ao Robert Alan Burrow pelo companheirismo, apoio e ajuda durante o
decorrer desta jornada.
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela oportunidade de
estudo numa universidade pública.
Ao CNPq, por disponibilizar uma bolsa de estudo.
E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para realização
deste trabalho.
iv
SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES VISANDO
COMPOR UM ARRANJO DE SONDAS DE DNA QUE IDENTIFIQUE ESTIRPES
DE PECTOBACTÉRIAS
1
Autor: Janine Palma
Orientador: Valmir Duarte
RESUMO
A diferenciação entre espécies e subespécies de pectobactérias e
outras bactérias fitopatogênicas é feita, basicamente, por testes bioquímicos e
fisiológicos. Através de arranjos, macro e micro, de sondas de DNA, uma matriz,
semelhante á gerada pelos resultados dos testes bioquímicos e fisiológicos,
poderia ser construída e utilizada na identificação das estirpes. Para isto, há a
necessidade da seleção de sondas de características a nível de gênero, espécie e
subespécie. Como as sondas são obtidas por PCR, o objetivo desta pesquisa foi
selecionar oligonucleotídeos iniciadores baseados em características fenotípicas
e genotípicas. A maioria dos oligonucleotídeos iniciadores selecionados gerou
produto, diferindo o padrão de amplificação entre os oligonucleotídeos iniciadores
e entre as espécies ou subespécies de pectobactérias. Alguns não produziram
fragmentos e outros geraram muitos produtos inespecíficos. Os oligonucleotídeos
iniciadores 149LF/L1r amplificaram o DNA de todas as Pectobacterium spp.,
enquanto Y1/Y2 amplificaram o DNA apenas da espécie P. carotovorum.
ADE1/ADE2 gerou produto apenas com a espécie P. chrysanthemi. Y45/Y46 e
ECA1F/ECA1R são específicos para a subespécie P. carotovorum subsp.
atrosepticum. Outros oligonucleotídeos iniciadores amplificam o DNA de alguns
indivíduos dentro da espécie ou subespécie, como RdgF/RdgR e PnlF/PnlR com
P. carotovorum, Br1F/L1R e HrpNF/HrpNR com P. caratovorum subsp.
brasiliensis e CytR-RdF/CytR-BR com P. carotovorum subsp. atrosepticum. A
análise do coeficiente de similaridade da matriz gerada mostrou uma alta
similaridade entre as estirpes de cada subespécie, com exceção de P.
carotovorum subsp. carotovorum que mostrou uma alta variabilidade. Estes
resultados indicam que esta estratégia gera uma matriz que pode ser utilizada no
cálculo do coeficiente de similaridade e auxiliar na identificação de estirpes de
pectobactérias.
1
. Dissertação de Mestrado em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil (50 p.). Março, 2006.
v
SELECTION OF PRIMERS FOR BUILDING AN ARRAY OF DNA PROBES FOR
IDENTIFICATION OF PECTOBACTERIA STRAINS
2
Author: Janine Palma
Adviser: Valmir Duarte
ABSTRACT
The differences among species and subspecies of pectobacteria and
other phytopathogenic bacteria are identified mainly by biochemical and
physiological methods. Through arrays (macro and micro) of DNA probes, a
matrix, similar to one generated by the results of biochemical and physiological
tests, could be built and used to identify strains. To accomplish this, it is necessary
to choose probes associated to characteristics at genus, species and subspecies
levels. As probes are obtained by PCR, the objective of this research was to select
primers based on phenotypic and genotypic traits. Most selected primers amplified
the bacterial DNA, giving a distinct pattern to species and subspecies. However,
some primers produced no bands or non-specific ones. Primers 149LF/L1r
amplified DNA from all Pectobacterium spp., while ADE1/ADE2 generated band
only with the DNA of P. chrysanthemi. Y45/Y46 and ECA1F/ECA1R are specific to
P. carotovorum subsp. atrosepticum. Other primers amplified DNA of some strains
inside of a specific species or subspecies: RdgF/RdgR and PnlF/PnlR to P.
carotovorum, Br1F/L1R and HrpNF/HrpNR to P. carotovorum subsp. brasiliensis,
and CytR-RdF/CytR-BR to P. carotovorum subsp. atrosepticum. The analysis of
the similarity coefficient of the matrix revealed a high level of similarity among the
strains of each subspecies, with the except to P. carotovorum subsp. carotovorum.
These results indicate that this strategy can be used to create a matrix for the
calculation of a similarity coefficient which could be used to identify all major
strains of pectobacteria.
2
Master of Science Dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (50 p.).
March, 2006.
vi
SUMÁRIO
Página
INTRODUÇÃO .............................................................................................
1.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................
1.1. Os patógenos Pectobacterium chrysanthemi e Pectobacterium
carotovorum subspp........................................................................................
1.2.A genética das características fenotípicas............................................
1.2.1. Fatores bioquímicos e fisiológicos..............................................
1.2.2. Fatores de patogenicidade e virulência......................................
1.3. Detecção e identificação de Pectobacterium spp................................
1.3.1. Isolamento, testes bioquímicos, fisiológicos e sorológicos.........
1.3.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)...................................
1.4 A nanotecnologia e os arranjos de DNA...............................................
2. MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................
2.1. Estirpes................................................................................................
2.2. Testes bioquímicos e fisiológicos.........................................................
2.3. Extração de DNA bacteriano................................................................
2.4. Seleção de oligonucleotídeos iniciadores............................................
2.5. Reação em cadeia da polimerase (PCR)............................................
2.6. Análise dos dados................................................................................
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................
4. CONCLUSÕES..........................................................................................
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................
1
3
3
4
5
8
11
11
13
14
17
17
17
17
19
19
21
23
40
41
vii
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
Estirpes de pectobactérias, seus hospedeiros e origem........................
Oligonucleotídeos iniciadores selecionados para PCR..........................
Concentrações e condições da PCR para cada par de
oligonucleotídeos iniciadores..................................................................
Características bioquímicas e fisiológicas das estirpes de
pectobactérias oriundas de diversos hospedeiros..................................
Perfil de amplificação da PCR, das estirpes de Pectobacterium
chrysanthemi e de P. carotovorum subspp., utilizando diferentes
oligonucleotídeos iniciadores..................................................................
.
18
20
22
24
33
1.
2.
3.
4.
5.
viii
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
Amplificações de fragmentos de DNA de P. carotovorum subsp.
brasiliensis usando os oligonucleotídeos iniciadores HrpNF/HrpNR,
CytR-RdF/CytR-BR, OutH-Fwd/OutH-Ver e RsmA-F1/RsmA-R1...........
Dendograma gerado pelo método UPGMA usando o coeficiente de
similaridade DICE a partir da análise do perfil de amplificação de 29
pectobactérias.........................................................................................
36
40
1.
2.
INTRODUÇÃO
As pectobactérias são bactérias fitopatogênicas cuja principal
característica é a podução em grande quantidade de enzimas pectolíticas. Estas
bactérias causam doenças em diversas culturas, como batata, cenoura, pimentão,
pimenta, tomate, abóbora, mandioquinha, brócolis, repolho, entre outros,
causando perdas em batata tanto no desenvolvimento da cultura como durante o
armazenamento dos tubérculos. Predominam em batata, Pectobacterium
carotovorum subsp. atrosepticum, P. carotovorum subsp. carotovorum, P.
chrysanthemi e, mais recentemente P. carotovorum subsp. brasiliensis.
A diferenciação das espécies e subespécies de bactérias pectolíticas é
baseada, principalmente, em testes bioquímicos e fisiológicos, através dos quais
a ocorrência de estirpes atípicas com características intermediárias dificulta a
identificação correta destes patógenos. Por outro lado, a detecção através da
PCR é possível para algumas das subespécies, mas restringe-se a apenas uma
característica específica.
Selecionando oligonucleotídeos iniciadores que amplifiquem regiões
específicas associadas a características bioquímicas, fisiológicas, de
patogenicidade e virulência, a identificação das pectobactérias pode ser feita
através de um padrão de amplificação para cada característica, gerando um perfil
2
para cada espécie e subespécie, a partir do qual uma matriz de sondas de DNA
pode ser gerada.
A tecnologia dos arranjos de DNA (macro ou micro) permite a detecção
de vários alvos em um mesmo teste, onde a construção de uma matriz de sondas
para cada espécie e subespécie de pectobactérias possibilita a identificação
através de um perfil de hibridização com as diferentes características.
Este trabalho teve como objetivo selecionar oligonucleotídeos
iniciadores baseados em características fenotípicas e genotípicas, que possam
gerar sondas de DNA, visando a identificação de pectobactérias através de um
perfil para cada estirpe em arranjos de DNA.
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Os patógenos Pectobacterium chrysanthemi e Pectobacterium
carotovorum subspp.
As pectobactérias pertencem ao Domínio Eubactéria, Reino
Proteobacteria, Subdivisão Gamma, Família Enterobacteriaceae, Gênero
Pectobacterium (Young et al., 1992).
Após análise e comparação da seqüência 16S do rDNA das espécies
do gênero Erwinia, a divisão em três grupos filogenéticos foi proposta, resultando
em três gêneros: Erwinia, Pectobacterium e Brenneria (Hauben et al., 1998).
Outro estudo com hibridização DNA:DNA forneceu mais argumentos para a
mudança a favor da nova nomenclatura, onde Erwinia é restrito a E. amylovora e
às espécies patogênicas causadoras de doenças envolvendo necrose, e
Pectobacterium para espécies causadoras de doenças envolvendo podridão mole
(Gardan et al., 2003).
Espécies Pectobacterium chrysanthemi (Bulkholder et al.) Brenner et
al. emend. Hauben et al. e P. carotovorum (Jones) Waldee emend Skerman et al.
causam podridão mole em diversos hospedeiros (Pérombelon & Kelman, 1980;
Jabuonski et al., 1986; Young et al., 1992; De Boer & Kelman, 2001), tais como,
batata, cenoura, pimentão, pimenta, tomate, abóbora, mandioquinha, brócolis,
repolho, entre outros.
4
O grupo carotovorum contém várias subespécies, P. carotovorum
subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al., P. carotovorum subsp.
betavasculorum (Thomson et al.) Hauben et al., P. carotovorum subsp.
carotovorum (Jones) Hauben et al., P. carotovorum subp. odoriferum (Gallois et
al.) Hauben et al. e P. carotovorum subsp. wasabie (Goto & Matsumoto) Hauben
et al. (Hauben et al., 1998). E mais recentemente foi proposta a subespécie P.
carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al. (Duarte et al., 2004).
Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum, P. carotovorum
subsp. brasiliensis, P. carotovorum subsp. carotovorum e P. chrysanthemi estão
associadas a podridão mole em batata (Pérombelon & Kelman, 1980; Oliveira et
al., 2003b; Souza Dias & Iamauti, 2005). Sendo que as únicas pectobactérias
consideradas capazes de causar sintomas típicos de canela preta, nos tecidos da
haste, em plantas de batata são P. carotovorum subsp. atrosepticum (Pérombelon
& Kelman, 1987; Hélias et al., 2000; De Boer, 2002) e P. carotovorum subsp.
brasiliensis (Duarte et al., 2004).
As bactérias pertencentes ao gênero Pectobacterium são bastonetes
retos, medindo de 0,5-1,0 x 1,0-,3,0 μ, móveis por meio de flagelos perítricos, não
formadoras de esporos, Gram negativas, anaeróbicas facultativas, oxidase
negativas e catalase positivas, caracterizadas por produzir grande quantidade de
enzimas pectolíticas (De Boer & Kelman, 2001).
1.2. A genética das características fenotípicas
A emergência do seqüênciamento causou um significante impacto em
muitos campos da biologia. Muitos genomas completos de bactérias patogênicas
da família Enterobacteriaceae já foram revelados, incluindo a bactéria modelo
5
Escherichia coli (Blattner et al., 1997; Perna et al., 2001). Entretanto, entre as
enterobacteriáceas fitopatogênicas, apenas Pectobacterium carotovorum subsp.
atrosepticum teve seu genoma completo seqüenciado (Bell et al., 2004) onde
foram descritos uma série de genes envolvidos em diversos fenótipos. Porém, o
seqüênciamento estratégico de regiões do DNA tem desvendado genes
relacionados com o metabolismo, patogenicidade e virulência de diversas
bactérias (NCBI, 2006).
1.2.1 Fatores bioquímicos e fisiológicos
As pectobactérias podem utilizar diversas fontes de açúcares no seu
metabolismo, como sacarose, glicose (α-metil glicosídeo), sorbitol, melobiose,
rafinose, arabitol, lactose, maltose, entre outros (De Boer & Kelman, 2001). As
enzimas envolvidas no metabolismo de açúcares são codificadas por genes
agrupados em operons. Em Escherichia coli o operon lac (lactose) contem o gene
lacZ, codifica para β-galactosidase, gene lacY, codifica para permease dos β-
galactosídeos e gene lacA, codifica para transacetilase dos β-galactosídeos
(Lewin, 2000). O operon mel (melobiose) contem os genes A e B os quais
codificam, respectivamente, α-galactosidase e melobiose permease (Schmitt,
1968). O operon raf codifica três genes envolvidos no metabolismo da rafinose: α-
galactosidase, rafinose permease e invertase (Schmid & Schmitt, 1976).
Certos açúcares estão envolvidos num sofisticado sistema de
transporte e fosforilação através da membrana celular, o fosfoenolpiruvato:
sistema fosfotransferase de açúcares (PTS). Este sistema também está envolvido
na regulação de vários caminhos metabólicos e no transporte e fosforilação de
proteínas (Saier, Jr. & Reizer, 1994). O PTS é composto por um complexo de
6
proteínas: Enzima I (EI) e fosfoproteína com histidina (HPr), que são proteínas
comuns, e Enzimas II (EII) especificas para os açúcares, composta por três
domínios (IIA, IIB e IIC). As várias enzimas EII podem ser divididas em cinco
classes: Classe glicose (glicose, trealose, maltose, N-acetilglucosamina, sacarose
e β-glicosídeos), classe manitol (manitol e frutose), classe lactose (lactose e
celobiose), classe manose (manose, L-sorbose) e PTS não classificado
(glucitol/sorbitol) (Postma et al., 1993).
Os genes para as proteínas HPr (ptsH) e EI (ptsI) estão agrupados no
operon pts. Em contraste, os genes para os específicos substratos EII, com
poucas exceções, estão agrupados em operons junto com genes estruturais que
codificam para as correspondentes enzimas metabólicas. Genes EII, envolvidos
na ativação e expressão de classes PTS, foram identificados em diversas
bactérias, como os genes umgC, ptsG, crr (glicose) em Escherichia coli; regulon
sac (sacarose) em Bacillus subtilis; operon mtlADR (manitol) em E. coli; genes
lacE e lacF (lactose) em diversas bactérias; e genes gutA e gut B (glucitol/sorbitol)
em E. coli (Postma et al., 1993). Foi identificado em P. chrysanthemi o sistema
celb específico para os β-glicosídeos celobiose, arbutina e salicina, e arb
específico para esculina, arbutina e salicina (el Hassouni et al., 1990). Na busca
de genes que são expressados durante a infecção por P. chrysanthemi foram
identificados três genes do PTS: ptsI e dois genes para glicose (Okinaka et al.,
2002).
As bactérias são capazes de detectar mudanças químicas (atrativos ou
repelentes) em seu ambiente através de específicos quimioreceptores, que
respondem regulando o movimento flagelar. Existem moléculas quimioreceptoras
diretas (ex. asparato, serina), e moléculas quimioreceptores com proteínas
7
ligantes (ex. proteína ligante maltose, galactose e ribose) (Kondoh et al., 1979). O
sinal recebido é traduzido por proteínas quimiotáxicas receptoras de metil (methyl
accepting chemotaxis - MCP), integrantes da membrana celular, que são
essenciais para a resposta e adaptação bacteriana (movimento flagelar) aos
estímulos ambientais. As MCPs sofrem metilação reversível durante a adaptação
da bactéria para atrativos e repelentes ambientais (Kehry & Dahlquist, 1982). Os
genes tsr e tar produzem as MCPs (MCPI e MCPII), o gene cheR
(metiltransferase) está associado com a metilação das MCPs, o gene cheB
(metilesterase) com a demetilação, cheA, cheY e cheZ estão relacionados com o
sinal para o flagelo. (Slocum & Parkinson, 1983).
O seqüênciamento do genoma de P. carotovorum subsp. atrosepticum
revelou uma série de genes envolvidos no metabolismo bacteriano, 36 MCPs, 80
propostos sistemas ABC de transporte e 336 propostos reguladores, sugerindo
que é capaz de responder a várias fontes de nutrientes se adaptando a diversos
ambientes. P. carotovorum subsp. atrosepticum parece ter seqüências similares
ao gene nif para fixação de nitrogênio e aos genes occQMPJ para catabolização
de opinas, mostrando potencial para sobreviver no solo e na rizosfera. Também
carrega genes similares a produção do antibiótico fenazina (ehp) por Pantoae
agglomerans, o qual pode dar vantagens competitivas no solo ou hospedeiro (Bell
et al., 2004).
Pectobacterium chrysanthemi tem como característica ser sensível ao
antibiótico eritromicina, diferentemente das demais pectobactérias (De Boer &
Kelman, 2001). A resistência bacteriana para alguns antibióticos (eritromicina,
lincosamina e streptogamina tipo B) é obtida pela alteração da região 23S rRNA
por uma adenina metilada pelo produto dos genes erm (metilação do ribossomo
8
pela eritromicina) (Weisblum, 1995). Treze genes erm que codificam metilases
rRNA foram identificados a partir de patógenos humanos e bactérias do solo. As
classes ermA, ermB e ermC são encontradas em bactérias patogênicas (Arthur et
al., 1990). Também há outros determinantes de resistência a eritromicina
(macrolideo), como enzimas (ereA e ereB) em E. coli; fosfotransferases (mphA)
em entobacteriáceas; emissores de macrolideos em Staphylococcus (mrsA e
mrsB), Neisseria gonorrhoeae (mtr) e Streptococcus (mefA e mefE) (Sutcliffe et
al., 1996).
1.2.2. Fatores de patogenicidade e virulência
As pectobactérias têm a característica de produzir enzimas
extracelulares, como as pectinases (pectato liases (Pel), pectina liases (Pnl),
poligalacturonases (Peh) e pectina metil-esterases (Pme), que degradam o
pectato presente na lamela média, que cimenta as células do tecido das plantas,
e as celulases (Cel) e proteases (Prt), que auxiliam a atividade das pectinases
(Collmer & Keen, 1986; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; Pérombelon, 2002;
De Boer, 2003; Toth et al., 2003).
Pectobacterium carotovorum e P. chrysanthemi induzem sintomas
similares, mas a produção de enzimas pectolíticas e seus sistemas de regulação
e secreção são bastante distintos. As pectinases se apresentam de várias formas
(isoenzimas), codificadas por genes independentes, variando tipo e número entre
espécies e subespécies, assim como varia a atividade enzimática, onde Pels
secundárias (ou menores) têm atividade reduzida em relação as maiores. P.
chrysanthemi contém, geralmente, cinco Pels maiores em duas famílias (Pel A, D,
E e Pel B, C) e quatro menores (Pel I, L, Z e X), para P. carotovorum subsp.
9
carotovorum há quatro Pels maiores (Pel A, B, C e D) e outros Pels menores, e
três Pels maiores em P. carotovorum subsp. atrosepticum (Pel A, B e C)
(Pérombelon, 2002; Toth et al., 2003). Embora a produção das pectinases seja
importante para a virulência e patogenicidade, nem todas as isoenzimas são
requeridas em todas as situações. As Pels secundárias são produzidas somente
quando a bactéria entra em contato com as células das plantas (Kelemu &
Collmer, 1993). Em P. chrysanthemi, Pel E mostrou ser mais importante na
patogenicidade que Pel B e C, demonstrando diferenças entre famílias maiores
(Payne et al., 1987). Outro estudo mostra diferenças na virulência entre Pels
menores (PelI, PelL, PelZ) de P. chrysanthemi, onde PelI e PelL apresentaram
maior importância que PelZ (Jafra et al., 1999).
Fatores do ambiente como temperatura, concentração de oxigênio
(Pérombelon & Kelman, 1980) e pH (Pérombelon, 2002) afetam a produção das
enzimas extracelulares. A temperatura ótima para produção da Pel para P.
carotovorum subsp. atrosepticum é 12 °C, enquanto que para P. carotovorum
subsp. carotovorum está entre 15 e 17 °C, e a temperatura ótima para a produção
da Prt para estas duas subespécies está entre 17 e 28 °C (Smadja et al., 2004b).
Outro estudo mostrou que os genes das isoenzimas PelA e PelD foram melhor
expressados sob condições de pH ácido (5,5 ou 6,0), e PelE em pH básico (8,0)
(Nachin & Barras, 2000).
Há vários genes envolvidos na regulação da produção das enzimas
pectolíticas (Duarte & El Tassa, 2003; De Boer, 2003). Genes de regulação global
tais como hexA e hexY provavelmente reprimam uma cascata de reguladores
secundários pois mutações nestes genes levam a uma produção excessiva de
exoenzimas e também hipermobilidade e produção de harpin, a proteína
10
envolvida em incitar a resposta de hipersensibilidade (Harris et al., 1998; Shih et
al., 1999). O produto do gene kdgR regula negativamente a produção de
exoenzimas (Liu et al., 1999). Os genes rsmA e rsmB também regulam
negativamente a produção das enzimas pectolíticas, e a produção de ambos é
regulada por um terceiro gene, o rsmC, formando um sistema de regulação global
(Liu et al., 1998). Outros sistemas regulam os fatores de virulência positivamente,
como gacA/gacS (Cui et al., 2001) e expS/expA (Eriksson et al., 1998). O gene
rpfA codifica uma proteína que está envolvida na produção da protease e celulase
(Frederick et al., 1997). E a produção da pectina liase é regulada por um circuito
regulatório envolvendo os genes recA, rdgA e rdgB (Liu et al., 1994; Liu et al.,
1996; Liu et al., 1997).
A patogenicidade bacteriana requer mecanismos para transportar para
fora da célula moléculas envolvidas na patogênese. Em pectobactérias, proteases
são secretadas diretamente dentro da célula vegetal via sistema tipo I. Pectinases
e celulases são secretadas via sistema tipo II, um processo de dois passos que
inclui um estágio periplásmico intermediário (Sandkvist, 2001), e são codificados
por 15 genes do grupo out (out BCDEFGHIJKLMNOS) (Thomas et al., 1997),
onde outN está ausente em P. chrysanthemi (Sandkvist, 2001).
A importância de um terceiro sistema de secreção (tipo III) para a
patogenicidade é indicada pela presença do conjunto de genes hrp (reação de
hipersensibilidade e patogenicidade) em P. chrysanthemi e P. carotovorum
(Rantakari et al., 2001; Bell et al., 2002; Yang et al., 2002; Lehtimaki et al., 2003).
Duas classes de proteínas (24 genes) são secretadas por este sistema: harpins e
proteínas de avirulência, sendo que, a secreção de proteínas para a célula
11
hospedeira requer a presença de um pilus formado pela proteína HrpA (He,
1998).
A produção das enzimas pectolíticas em pectobactérias é dependente
do número de indivíduos bacterianos (sensor de quorum), controlada pela
molécula sinal N-acil homoserina lactona (AHL) (Whitehead et al., 2001; Smadja
et al., 2004a). Esta descoberta tem dado uma nova visão de como a bactéria
responde e interage com seu ambiente.
1.3. Detecção e identificação de Pectobacterium spp.
Meios de cultura seletivos, testes bioquímicos, sorológicos e técnicas
baseadas na PCR têm sido desenvolvidos para isolamento, detecção,
identificação e caracterização de pectobactérias (Duarte & El Tassa, 2003).
1.3.1. Isolamento, testes bioquímicos, fisiológicos e sorológicos
Cristal violeta pectato (CVP) é o mais importante meio de cultura
seletivo usado para o isolamento, detecção e contagem de Pectobacterium sp.
em plantas e do ambiente (Cuppels & Kelman, 1986). A seletividade é baseada
na habilidade do patógeno em hidrolisar o polipectato e formar cavidades típicas
na superfície do meio de cultura (Hyman et al., 2001) . O fruto de pimentão verde
pode ser usado como meio parcialmente seletivo no isolamento de pectobactérias
de vários hospedeiros (Takatsu et al., 1981), visto que, a seletividade do pimentão
para pectobactérias é bastante elevada, permitindo o isolamento mesmo que o
material original esteja em adiantado estado de decomposição.
Testes bioquímicos e fisiológicos são bastante utilizados na
identificação de espécies e subespécies de pectobactérias, onde a identificação é
12
baseada num padrão de reação bacteriana para testes diferencias. Entre os
principais testes bioquímicos e fisiológicos utilizados na identificação de
pectobactérias estão o crescimento a 37 °C, presença de fosfatase, produção de
substâncias redutoras de sacarose, sensibilidade à eritromicina, produção de
indol, utilização de α-metil glicosídeo, produção de ácidos a partir de sorbitol,
melibiose, citrato, rafinose, arabitol, lactose e maltose (Hyman et al., 1998; De
Boer & Kelman, 2001). No entanto a ocorrência de formas intermediárias dificulta
a interpretação dos resultados, impossibilitando muitas vezes a classificação
correta destas bactérias (Stanghellini & Meneley, 1975; Jabuonski et al., 1986;
Oliveira et al., 2003a).
Métodos sorológicos como o de aglutinação (Graham, 1963),
imunofluorescência (De Boer et al., 1979; Van Vuurde et al., 1998), difusão dupla
em agar (De Boer et al., 1979; Dickey et al., 1984) , ELISA - Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (De Boer & McNaughton, 1987; Gorris et al., 1994) e
separação imunomagnética em meio CVP (IMS-CVP) (Van Der Wolf &
Pérombelon, 1998) foram utilizados com diferentes graus de sucesso na detecção
de P. carotovorum subsp. atrosepticum, P. carotovorum subsp. carotovorum e P.
chrysanthemi.
Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum e P. carotovorum
subsp. carotovorum apresentam uma estreita relação sorológica, sendo a
especificidade conferida por componentes da parede celular, principalmente,
lipopolissacarídeos (antígeno O). Anticorpos monoclonais foram desenvolvidos
para detecção de P. carotovorum subsp. atrosepticum, como o 4F6 do Canadá
(De Boer & McNaughton, 1987) e 4G4 da Espanha (Gorris et al., 1994), e para P.
13
chrysanthemi, denominados 6A6, com especificidade a fímbrias (Singh et al.,
2000).
1.3.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A PCR baseia-se na amplificação enzimática do DNA, direcionada por
dois oligonucleotídeos iniciadores, baseados numa seqüência específica, que
permite obter in vitro milhares de cópias de um determinado segmento de DNA
(Mullis & Fallona, 1987).
Na obtenção de oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação de
regiões específicas deve-se levar em conta dois fatores: especificidade e
eficiência de amplificação. Especificidade de um oligonucleotídeo iniciador é a
freqüência que ocorre um evento de anelamento específico a uma seqüência-
alvo, e eficiência é o quanto um par de oligonucleotídoes iniciadores pode duplicar
um produto a cada ciclo da PCR (Dieffenbach et al., 1995).
A sensibilidade é outro fator importante, principalmente na detecção de
microrganismos a partir de material vegetal (Pérombelon et al., 1998; Lievens &
Thomma, 2005). Como para as pectobactérias, que podem permanecer nos
tubérculos de batata (lenticelas, estolão e tecidos suberizados), em baixo nível, de
forma latente, sem causar sintomas (Hélias et al., 2000; De Boer, 2002).
No geral, há duas maneiras de selecionar seqüências alvos
específicas: A primeira buscando genes específicos no DNA, ou variações em
genes conservados como rDNA, a segunda fazer uma varredura ao acaso em
partes do genoma em busca de seqüências distintas usando marcadores
moleculares (Lievens & Thomma, 2005). Diante da necessidade de comparar
filos, ordens, famílias ou gêneros, geralmente, analisa-se genes conservados,
14
mas genes menos conservados podem ser usados quando investigadas espécies
dentro de gêneros ou níveis taxonômicos abaixo de espécie (Lévesque, 2001).
As seqüências-alvo que têm sido utilizadas para a identificação de
pectobactérias através da PCR são: genes codificadores de pectato liase para P.
carotovorum subsp. atrosepticum (Fréchon et al., 1998), P. chrysanthemi (Nassar
et al., 1996) e P. carotovorum (Darrasse et al., 1994), metaloprotease para P.
carotovorum subsp. atrosepticum e P. chrysanthemi (Smid et al., 1995),
seqüências aleatórias do DNA obtidas a partir de RFLP para P. carotovorum
subsp. atrosepticum (De Boer & Ward, 1995), seqüências obtidas do produto de
seqüências repetitivas (URP-PCR) para P. carotovorum subsp. carotovorum
(Kang et al., 2003) ou região 16S do rDNA para P. carotovorum (Toth et al.,
1999).
Marcadores moleculares, como RFLP (Restriction Fragment Length
Polimorphism) e RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA), também vêm
sendo usados para identificação de espécies e subespécies de pectobactérias
(Parent et al., 1996; Toth et al., 2001; Waleron et al., 2002; El Tassa Colodel,
2004).
1.4. A nanotecnologia e os arranjos de DNA
A nanotecnologia está ampliando os limites do diagnóstico molecular
para a nanoescala. Nanotecnologia é o termo usado para a construção e
utilização de estruturas funcionais que tenham ao menos uma característica com
dimensões dentro da escala nano (1 nm = 10
-9
m ou 1 bilionésimo de metro). A
utilização da nanotecnologia nas ciências da vida é chamada nanobiotecnologia
(Durán & Azevedo, 2005).
15
A maior aplicação da nanobiotecnologia no diagnóstico molecular está
dentro da categoria dos biochips ou microarranjos de DNA (Jain, 2004). A
nanobiotecnologia é baseada na construção dos biochips, onde diferentes
tecnologias de manufatura podem ser utilizadas (Lipshutz et al., 1999; Thibault et
al., 2005), sendo que as sondas de DNA são o elemento central na construção de
um arranjo de DNA (Wosik, 2005).
Macroarranjos (macroarrays), microarranjos (microarrays) ou biochips
são denominados de acordo com a quantidade de fragmentos de DNA (sondas)
que são adicionados ao suporte sólido (reverse dot-blot), que pode ser membrana
de nailon ou nitrocelulose para macroarranjos, ou lâmina de vidro para
microarranjos ou biochips. Cada ponto no arranjo é composto de muitas sondas
idênticas complementares a um gene de interesse. Durante a hibridização, um
DNA alvo marcado encontra uma seqüência complementar, se anela e forma um
DNA de dupla fita (Call, 2001).
A tecnologia dos arranjos de DNA possibilita a adição do aspecto
multiplex (Lévesque, 2001; Lievens & Thomma, 2005), onde um grande número
de oligonulcleotídeos integrados a uma pequena área na superfície de um chip
facilita e torna mais rápida a detecção simultânea de muitas seqüências de genes
(Kurata & Suyama, 1999).
Os biochips vêm sendo usados para o monitoramento da expressão
gênica, análise de seqüências de DNA, genotipagem, diagnóstico e identificação
(Lockhart et al., 1996; Lipshutz et al., 1999; Call, 2001). Na fitopatologia foi
aplicado para análise de respostas de defesa da planta (Kazan et al., 2001),
estudos taxonômicos (Cho & Tiedje, 2001), expressão gênica (Okinaka et al.,
16
2002) e identificação de bactérias (Fessehaie et al., 2003), fungos (Lievens et al.,
2003), oomicetos (Lévesque et al., 1998) e vírus (Boonham et al., 2003).
A sondas de DNA são desenhadas para uma perfeita
complementaridade a uma seqüência-alvo (Wosik, 2005) e podem ser obtidas de
diferentes maneiras. Nos microarranjos e biochips, as sondas escolhidas
previamente podem ser sintetizadas in situ (Lipshutz et al., 1999), ou pela PCR
(Kurata & Suyama, 1999; Cho & Tiedje, 2001; Boonham et al., 2003; Thibault et
al., 2005), e nos macroarranjos geralmente são obtidas por PCR (Lévesque et al.,
1998; Lievens et al., 2003; Lievens et al., 2005).
Os arranjos de DNA utilizam a taxonomia numérica para analise de
resultados, entre outras técnicas, para definir níveis hierárquicos na análise
através de coeficientes de similaridade (Dopazo, 2006). A taxonomia numérica
analisa um número grande variantes, onde diferentes estirpes são reunidas em
determinados níveis selecionados de semelhança global, baseando-se na
freqüência (similaridade) com que tais estirpes compartilham determinadas
características (fenotípicas ou genotípicas), fornecendo dados para elaboração de
uma matriz de similaridade para a identificação de estirpes desconhecidas em
relação a taxons definidas. A presença ou ausência da característica (1 ou 0/+ ou
-) são a base para o cálculo do índice de similaridade através de um coeficiente
para a cosntução da matriz de similaridade (Sneath, 1984).
2. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Departamento de Fitossanidade da
Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, RS.
2.1. Estirpes
As estirpes utilizadas neste estudo, procedentes de vários hospedeiros,
estão listadas na TABELA 1.
2.2. Testes bioquímicos e fisiológicos
As estirpes foram avaliadas com os seguintes testes: Gram, atividade
pectolítica em batata, oxidase, catalase, oxidação/fermentação, crescimento a 37
°C, utilização de α-metil glicosídeo, sensibilidade à eritromicina, produção de
substâncias redutoras de sacarose, produção de ácidos a partir de maltose D(+),
lactose e sorbitol (Hyman et al., 1998; De Boer & Kelman, 2001).
2.3. Extração de DNA bacteriano
Culturas bacterianas, crescidas em placa, com 24-48 h, foram
transferidas para 250 μl de tampão de extração (100 mM tris-HCl pH 8,0; 25 mM
18
EDTA; 1% SDS e 5 μg de proteinase K), com o auxílio de um palito de dente e
incubadas por 3 h a 56 °C em banho-de-água. Posteriormente, 250 μl de acetato
TABELA 1. Estirpes de pectobactérias, seus hospedeiros e origem. Porto Alegre,
RS. 2005.
Estirpes Hospedeiro Origem Fonte
Pectobacterium carotovorum
subsp. atrosepticum
Pca 31
Pca 41
Pca 46
Pca 47
Pca 48
Pca 50
151
Pca 5
Pca 6
Batata
Mandioquinha
Batata
Canadá
Distrito Federal, BR
Distrito federal, BR
De Boer, S. H.
1
Henz, G. P.
2
Henz, G. P.
Pectobacterium carotovorum
subsp. brasiliensis
Pcbr 212
T
Pcbr 8
Pcbr 371
Pcbr MB9
Pcbr MB11
Pcbr MB12
Batata
Batata
Rio Grande do Sul, BR
Rio Grande do Sul, BR
Duarte, V.
3
El Tassa, S. O. M.
3
Pectobacterium carotovorum
subsp. carotovorum
IBSBF 1442
Pcc MPB8
Pcc PMAB19
Pcc BAB20
Dianthus caryophylus
Batata
Rio Grande do Sul, BR
Instituto Biológico, SP
El Tassa, S. O. M.
Pectobacterium chrysanthemi
CEN 06
CEN14
CEN80
C14
C16
P16
P41
Abob65
AG8
AG29
Cenoura
Mandioquinha
Abóbora
Pimenta
Minas Gerais, BR
São Paulo, BR
Distrito Federal, BR
Bahia, BR
Henz, G. P.
Henz, G. P.
Henz, G. P.
Henz, G. P.
1
CFIA, Canadá;
2
Embrapa Hortaliças, Brasília, DF;
3
UFRGS, Porto Alegre, RS.
de amônio 7,5 M foram adicionados, misturados e centrifugados (Micro Centrífuga
Refreigerada – CIENTEC) a 14000 g por 10 min à temperatura ambiente. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo, igual volume de isopropanol foi
adicionado e incubado durante a noite a -20 °C. Após, foi centrifugado a 14000 g
por 25 min a 4 °C, e o precipitado lavado com etanol 70%, centrifugado a 14000 g
19
por 5 min a 4 °C, seco a temperatura ambiente, dissolvido em 25 μl de água ultra-
pura e armazenado a -20 °C (De Boer & Ward, 1995). Para utilização na PCR, o
DNA extraído foi diluído em água ultra-pura (1:25).
2.4. Seleção de oligonucleotídeos iniciadores
Oligonucleotídeos iniciadores (TABELA 2) foram escolhidos a partir de
seqüências de genes associados a diferentes características fenotípicas e regiões
genômicas de pectobactérias e de outras bactérias.
2.5. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
O DNA extraído das estirpes (TABELA 1) foi submetido à PCR,
utilizando os oligonucelotídeos iniciadores listados na TABELA 2. As reações
foram feitas em um volume final de 10 μl, contendo tampão de reação (10 mM
Tris pH 8,3; 50 mM KCl), MgCl2, dNTP (Invitrogen), Taq DNA polimerase
(Invitrogen) e DNA da amostra, nos termocicladores MJ Research PTC-100 e
Techne Progene.
As concentrações e condições de reação da PCR variaram para os
oligonucleotídeos iniciadores (TABELA 3). Algumas das reações foram
otimizadas, ajustando componentes da reação assim como a temperatura de
anelamento. Cada reação foi conduzida, no mínimo, duas vezes com cada par de
oligonucleotídeos iniciadores.
Os produtos das amplificações foram separados por eletroforese
(5V/cm por 2 h) em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo,
visualizado sob luz ultra-violeta e fotografado (SONY Cyber-shot).
20
TABELA 2. Oligonucleotídeos iniciadores selecionados para PCR. Porto Alegre,
RS. 2005.
Gene/
região
genômica
Oligonucleotídeos iniciadores Fragmento
(pb)
Proteína/regiã
o genômica
Espécie fonte GenBank
e/ou
referência
IGS
149LF:
5’- GAA GTC GTA ACA AGG TA--3’
L1r:
5’-CA(A/G)GGCATCCACCGT-3’
Pc: 450 e
490
Pch: 356 e
491
Região
intergênica
rDNA
Pectobacterium
(Fessehaie
et al., 2002)
IGS
Br1F:
5’-GCGTGCCGGGTTTATGACCT-3’
L1R:
5’-CA(A/G)GGCATCCACCGT-3’
322
Região
intergênica
rDNA
Pcbr e Pcc
4
(Duarte et
al., 2004)
pelB
Y1:
5’-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3’
Y2:
5’-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3’
434
Pectato liase
Pca
X16397
(Darrasse
et al., 1994)
pelB
Y45:
5’-TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT-3’
Y46:
5’-TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT-3’
438
Pectato liase
Pca
A62563
(Fréchon et
al., 1998)
ECA
1
ECA1F:
5’-CGGCATCATAAAAACACG-3’
ECA1R:
5’-GCACACTTCATCCAGCGA-3’
690
-
Pca
(De Boer &
Ward,
1995)
pelA-pelD-
pelE
ADE1:
5’-GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT-3’
ADE2:
5’-CTGTGGCGATCAGGATGGTTTTGTC
GTGC-3’
420
Pectato liase
Pch
(Nassar et
al., 1996)
Pnl
PnlF:
5'-CGGGAGGTAAAGTCGTTACGG-3'
PnlR:
5'-TCCCTTTATTTTCCGCGCCGG-3'
680
Pectina liase
Pcc
M59909
(Dellagi et
al., 2000)
Rdg
RdgF:
5'-GATTGGCGTATCTCAGGCCG-3'
RdgR:
5'-CGACCAGAAGCTCGGGACC-3'
1160
Pectina liase
Pcc
L32173
(Dellagi et
al., 2000)
hrpN
HrpNF:
5'-GAGTTGAACAACATCAGTACGC-3'
HrpNR:
5'-ATCGCTGCATCAATACCCAGC-3'
344
Hipersensibilida
de
Pcc
L78834
(Dellagi et
al., 2000)
Erm
E1+:
5'-GAGATIGGIIIIGGIAAGGGICA-3'
E2+:
5'-AACTGGTTTTTIGTGAA-3'
530
Resistência à
eritromicina
Enterobacteriace
as e cocos gram-
positivas
(Arthur et
al., 1990)
sdaD
DNA17:
5'-TAATAGCCGATAGCTTAG-3'
DNA18:
5'-TACCAATATACATTAGAC-3'
480
Dnase
Streptococcus
pyogenes
(Podbielski
et al., 1996)
hecA
HecA-1:
5'-CCAGCAATGGCCGCAGGCGTGC-3'
HecA-2:
5'-CCAGATAGCCCGCCAGCGTACTGC-3'
530
Adesina
Pch
L39897
(Bell et al.,
2002)
pecS
PecS-1:
5'-CATGAATACTCCATCCCCATCACAC-
3'
PecS-2:
5'-CGATAATCGGTGTGATTGGCATG-3'
267
Pectinase
Celulase
Pch
X74409
(Bell et al.,
2002)
Xhem
2
Xhem-1:
5'-GGCAGTAACCCTGACTGTAGCTG-3'
Xhem-2:
5'-CGCCAGCGTCAGTGCATC-3'
816
Hemaglutinina
Pcc
AE003928,
AE004032,
AE004082
(Bell et al.,
2002)
21
Continuação TABELA 2. Oligonucleotídeos iniciadores selecionados para PCR.
Porto Alegre, RS. 2005.
Gene Oligonucleotídeos iniciadores Fragmento
(pb)
Proteína Espécie fonte GenBank
e/ou
referência
rsmA
RsmA-F1:
5'-GGA TCC GGC AAG CAG GAT AG-3'
RsmA-R1:
5'-TGC GTC CCG CGA ACA CGA G-3'
500
Regulação
exoenzimas
Pcc
L40173
(Yap et al.,
2004)
outH
OutH-Fwd:
5'-GCT GCT GGA AAT CAT GCT GG-3'
OutH-Rev:
5'-GTC TCC GGC GAC GTG TGC AC-3'
500
Sistema
secreção tipoII
Pcc
X70049
(Yap et al.,
2004)
rpf
Rpf-F:
5'-GCC GGA CGA TAC TGC ATC GC-3'
Rpf-R:
5'-TGA TGT CAT CAT CCG TTT GCC C-
3'
620
Regulação
Celulase,
protease
Pcc
U62023
(Dellagi et
al., 2000)
pehR-
pehS
Peh-F:
5'-GGT ACC AAC CAT TTC CAG CCT
G-3'
Peh-R:
5'-CTC GAG ATT GAG CTG ATA GAC-3'
2500
Regulador/sensor
poligalacturonase
Pcc
AF022772
(Flego et
al., 2000)
cytR
3
CytR-RdF:
5'-ATC TGC TTC GTA GGG TAC ATC
TTT CGG GGT-3'
CytR-BR:
5'-CGG CAG GAT CCA TGG TTT TGA
AGG AGC CGC-3'
1200
Regulador
poligalacturonase
e síntese flagelar
Pcc
AB092604
(Matsumoto
et al., 2003)
1
ECA: oligonucleotídeos iniciadores desenhados a partir de fragmento obtido por RFLP;
2
Xhem: gene tipo ao gene para hemaglutina de Xylella fastidiosa;
3
cytR: gene homólogo ao cytR de Escherichia coli;
4
Pca, Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum; Pcbr, P. carotovorum subsp. brasiliensis;
Pcc, P. carotovorum subsp. carotovorum; Pch, P. chrysanthemi.
2.6. Análise dos dados
Os dados foram analisados pelo programa estatístico NTSYS versão
1.7 onde foi determinada a matriz de similaridade e construído o dendrograma.
Pelo perfil de amplificação dos DNA das estirpes, com os oligonucleotídeos
iniciadores, foi determinada a presença ou ausência da amplificação e codificada
como 1 ou 0, respectivamente. A matriz de similaridade foi construída utilizando o
coeficiente de DICE e os agrupamentos feitos de acordo com o método UPGMA
(Unweight Pair Group Method with Arithmetic Average).
TABELA 3. Concentrações e condições da PCR para cada par de oligonucleotídeos iniciadores. Porto Alegre, RS. 2005.
Oligonucleotídeos
iniciadores
Oligonucleotídeos
iniciadores (μM)
Tampão
(X)
dNTP
(mM)
MgCl2
(mM)
Taq DNA
polimerase (U)
Condições das reações
Referência
149LF/L1R 149LF: 1,0
L1R; 1,0
1,0
0,1
2,5
0,5
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 64 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Fessehaie et al., 2002)
Br1F/L1R Br1: 1,0
L1R: 0,5
1,0
0,1
2,0
0,5
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 64 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Duarte et al., 2004)
Y1/Y2 Y1: 1,0
Y2: 1,0
1,0
0,1
2,5
0,2
94 °C/2’; (94 °C/ 60’’, 64 °C/60’’, 72 °C/30) 24X; 72 °C 10’
(Darrasse et al., 1994)
Y45/Y46 Y45: 1,0
Y46: 1,0
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C 5’; (94 °C/ 50’’, 65 °C/50’’, 72 °C/50’’) 35X; 72 °C/8’
(Fréchon et al., 1998)
ECA1F/ECA1R ECA1F: 1,0
ECA1R: 1,0
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/5’; (94 °C/30’’, 65 °C/45’’, 72 °C/45’’) 25X; 72 °C/5’
(De Boer & Ward, 1995)
ADE1/ADE2 ADE1: 1,0
ADE2: 1,0
1,0
0,1
2,5
0,5
94 °C/4’; (94 °C/60’’, 65 °C/60’’, 72 °C/60’’) 35X; 72 °C/5’
(Nassar et al., 1996)
PnlF/PnlR PnlF: 0,8
PnlR: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C /2’; (94 °C/45’’, 65 °C /45’’, 72 °C/90’) 30X; 72 °C/10’
(Dellagi et al., 2000)
RdgF/RdgR RdgF: 0,8
RdgR: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C /2’; (94 °C/45’’, 64 °C /45’’, 72 °C/90’) 30X; 72 °C/10’
(Dellagi et al., 2000)
HrpNF/HrpNR HrpNF: 0,8
HrpNR: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C /2’; (94 °C/45’’, 64 °C /45’’, 72 °C/90’) 30X; 72 °C/10’
(Dellagi et al., 2000)
E1+/E2+ E1+: 2,0
E2+ 2,0
1,0
0,2
2,5
1,0
93 °C/3’; (93 °C/60’’, 54 °C/60’’, 72 °C/60’’) 35X; 72 °C/5’
(Arthur et al., 1990)
DNA17/DNA18 DNA17: 0,8
/DNA18: 0.8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 64 °C/45’, 72°C/90’’) 30X, 72 °C/10’
(Podbielski et al., 1996)
HecA-1/HecA-2 HecA-1: 0,8
HecA-2: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/30’’, 64 °C/30’’, 72 °C/60’’) 34X; 72 °C/10’
(Bell et al., 2002)
PecS-1/PecS-2 PecS-1: 0,8
PecS-2: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/30’’, 64 °C/30’’, 72 °C/60’’) 34X; 72 °C/10’
(Bell et al., 2002)
Xhem-1/Xhem-2 Xhem-1: 0,8
Xhem-2: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/30’’, 64 °C/30’’, 72 °C/60’’) 34X; 72 °C/10’
(Bell et al., 2002)
RsmA-F1/
RsmA-R1
RsmA-F1: 0,8
RsmA-R1: 0,8
1,0
0,1
2,0
0,5
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 64 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Yap et al., 2004)
OutH-Fwd/
OutH-Rev
OutH-Fwd: 0,8
OutH-Rev: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 65 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Yap et al., 2004)
Rpf-F/Rpf-R Rpf-F: 0,8
Rpf-R: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 66 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Dellagi et al., 2000)
Peh-F/Peh-R Peh-F: 0,8
Peh-R: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 64 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Flego et al., 2000)
CytR-RdF/
CytR-BR
CytR-RdF: 0,8
CytR-BR: 0,8
1,0
0,1
2,0
1,0
94 °C/2’; (94 °C/45’’, 66 °C/45’’, 72 °C/90’’) 30X; 72 °C/10’
(Matsumoto et al., 2003)
22
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As estirpes utilizadas neste trabalho foram cedidas por pesquisadores
(TABELA 1), sendo que algumas tiveram sua identificação mudada a partir da
caracterização bioquímica e fisiológica (TABELA 4).
As vinte e nove estirpes de pectobactérias causaram podridão mole em
batata, foram gram positivas, apresentaram resultado positivo para
oxidação/fermentação e catalase, e negativo para oxidase, o que as caracteriza
como pectobactérias (De Boer & Kelman, 2001). De acordo com os testes
bioquímicos e fisiológicos diferenciais para cada subespécie (TABELA 4) seis
estirpes foram determinadas como Pectobacterium carotovorum subsp.
brasiliensis, 14 como P. carotovorum subsp. carotovorum, uma como P.
carotovorum subsp. atrosepticum e cinco como P. chrysanthemi.
As estirpes Pca05, Pca06, Pca41, Pca46, Pca47, Pca48 e Pca50
apresentavam-se como P. carotovorum subsp. atrosepticum (TABELA 1) e após a
caracterização bioquímica e fisiológica observou-se que elas se caracterizavam
como P. carotovorum subsp. carotovorum, do mesmo modo as estirpes AG8,
AG29, Abob65, e P41 passaram de P. chrysanthemi para P. carotovorum subsp.
carotovorum (TABELA 4). Três estirpes apresentaram características
intermediárias, não sendo possível a caracterização como espécie (CEN80) e
subespécie (BAB20 e CEN06), sendo que CEN80 e CEN06 eram identificadas
24
como P. chrysanthemi e BAB20 como P. carotovorum subsp. carotovorum. A
ocorrência de formas intermediárias pelos testes bioquímicos e fisiológicos tem
dificultado a correta classificação destas bactérias (Stanghellini & Meneley, 1975;
Jabuonski et al., 1986; Oliveira et al., 2003a).
TABELA 4. Características bioquímicas e fisiológicas das estirpes de
pectobactérias oriundas de diversos hospedeiros. Porto Alegre,
RS. 2005.
Produção de ácido a partir de
Testes/
Isolados
37 °C Eritromicina
α-metil
glicosídeo
Redução de
substâncias a
partir de
sacarose
Lactose Maltose Sorbitol Identifi
cação
1
Batata
Pcbr 212 + - + + + + - Pcbr
Pcbr8 + - + + + + - Pcbr
Pcbr371 + - + + + + - Pcbr
MB9 + - + + + + - Pcbr
MB11 + - + + + + - Pcbr
MB12 + - + + + + - Pcbr
PMAB19 + - - - + - - Pcc
MPB8 + - - - + - - Pcc
BAB20 + - + - + - - Pc
Pca05 + - - - + - - Pcc
Pca06 + - - - + - - Pcc
Dianthus
caryophylus
IBSBF1442 + - - - + + - Pcc
Pimenta
AG8 + - - - + - - Pcc
AG29 + - - - + - - Pcc
Cenoura
CEN06 + - + - + - - Pc
Abóbora
Abob65 + - - - + - - Pcc
Mandioquinha
Pca41 + - - - + - - Pcc
Pca46 + - - - + - - Pcc
Pca 47 + - - - + - - Pcc
Pca 48 + - - - + - - Pcc
Pca50 + - - - + - - Pcc
P41 + - - - + - - Pcc
Batata
Pca31 - - + + + + - Pca
Cenoura
CEN14 + - - - - - - Pch
CEN80 + - - + - - - P
Mandioquinha
P16 + - - - - - - Pch
C14 + - - - - - - Pch
C16 + - - - - - - Pch
151 + - - - - - - Pch
1
Pca, Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum; Pcbr, P. carotovorum subsp. brasiliensis;
Pcc, P. carotovorum subsp. carotovorum; Pch, P. chrysanthemi; Pc, P. carotovorum; P,
Pectobacterium.
25
Diferentes genes que codificam características fenotípicas e
genotípicas foram utilizados para a seleção de oligonucleotídeos iniciadores.
Dentre as diversas características fenotípicas que poderiam ser exploradas foram
selecionadas, principalmente, para este estudo aquelas relacionadas à
patogenicidade e virulência (TABELA 1).
Os oligonulcleotídeos iniciadores selecionados foram utilizados para a
amplificação do DNA das pectobactérias (TABELA 2). Dos 19 pares de
oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a PCR, HecA-1/HecA-2, Xhem-
1/Xhem-2, E1+/E2+, PecS-1/PecS-2 e DNA17/DNA18 não produziram produto
algum ou tiveram muitos produtos inespecíficos. Os outros 14 pares de
oligonucleotídeos iniciadores amplificaram o DNA das bactérias testadas,
diferindo o padrão de amplificação entre os oligonucleotídeos iniciadores e entre
as espécies ou subespécies de pectobactérias (TABELA 5).
Todas as estirpes de pectobactérias submetidas à PCR com 149LF/L1r
tiveram seu DNA amplificado, gerando produtos correspondentes a estes
oligonucleotídeos iniciadores (TABELA 5). As estirpes CEN14, CEN80, P16, C14,
C16 e 151 formaram dois fragmentos de aproximadamente 350 pb e 500 pb que
as diferenciaram das demais estirpes que formaram fragmentos de 450pb e 500
pb. A PCR com 149LF/L1r gera bandas que permitem a diferenciação entre as
espécies P. carotovorum e P. chrysanthemi, a partir da amplificação da região
16S-23S rDNA gerando diferentes fragmentos (Fessehaie et al., 2002). O produto
da reação com 149LF/L1r pode ser usado como uma sonda universal, que
detecta em nível de gênero as pectobactérias.
As estirpes identificadas pelos testes bioquímicos como P. carotovorum
subsp. atrosepticum, P. carotovorum subsp. brasiliensis, P. carotovorum subsp.
26
carotovorum e P. carotovorum (TABELA 4) tiveram seu DNA amplificado por
Y1/Y2, obtendo um fragmento de aproximadamente 450 pb. As cinco estirpes
identificadas como P. chrysanthemi e a identificada apenas como Pectobacterium
sp. (CEN80) (TABELA 4) não tiveram seu DNA amplificado (TABELA 5). Y1/Y2
foram desenhados para amplificar uma região correspondente a três genes
(pel153, pelB e pelY) da família Y das pectato liases de Yersinia
pseudotuberculosis, para detectar pectobactérias (Darrasse et al., 1994).
Seis estirpes de pectobactérias tiveram seu DNA amplificado com
ADE1/ADE2 (TABELA 5), formando um produto de aproximadamente 420 pb,
sendo que, o isolado CEN80 não havia sido identificado pelos testes bioquímicos
como P. chrysanthemi (TABELA 4). ADE1/ADE2 foi desenvolvido para amplificar
uma região conservada de um grupo de genes para pectato liase (pelADE)
específicos de P. chrysanthemi (Nassar et al., 1996).
Os oligonucleotídeos iniciadores Y1/Y2 e ADE1/ADE2 tem potencial
para serem usados como sondas que diferenciam em nível de espécie isolados
de pectobactérias, separando P. carotovorum de P. chrysanthemi,
respectivamente.
De todas as estirpes submetidas à PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores ECA1F/ECA1R e Y45/Y46 apenas a P. carotovorum subsp.
atrosepticum (Pca31) teve seu DNA amplificado (TABELA 5), formando
fragmentos de aproximadamente 690 pb e 440 pb, respectivamente.
ECA1F/ECA1R foram desenhados a partir de fragmentos obtidos por RFLP que
diferenciam estirpes de P. carotovorum subsp. atrosepticum das demais
pectobactérias (De Boer & Ward, 1995). Assim como ECA1F/ECA1R, Y45/Y46
foram desenvolvidos para detectar estirpes de P. carotovorum subsp.
27
atrosepticum a partir da amplificação de gene para pectato liase (pelY) (Fréchon
et al., 1998). Estes oligonucleotídeos iniciadores diferenciam a subespécie P.
carotovorum subsp. atrosepticum das demais, sendo que esta subespécie é
considerada a responsável por causar sintomas típicos de canela-peta em batata
na Europa e América do Norte (Pérombelon & Kelman, 1987; Hélias et al., 2000;
De Boer, 2002). A subespécie P. carotovorum subsp. brasiliensis (Duarte et al.,
2004) foi proposta a partir de estirpes identificadas no Brasil, pelos testes
bioquímicos e fisiológicos, como uma P. carotovorum subsp. atrosepticum atípica,
mas quando submetidas aos oligonucleotídeos iniciadores ECA1F/ECA1R e
Y45/Y46, seu DNA não foi amplificado (Oliveira et al., 2003a). Assim, os produtos
de ECA1F/ECA1R e Y45/Y46 são potenciais sondas de diferenciação de
subespécies de importância para batata.
Treze estirpes de pectobactérias tiveram seu DNA amplificado com o
uso de Br1F/L1R (TABELA 5), gerando um produto de aproximadamente 320 pb.
Destas, seis foram identificadas pelos testes bioquímicos como P. carotovorum
subsp. brasiliensis e sete como P. carotovorum subsp. carotovorum (TABELA 4).
Os oligonucleotídeos iniciadores Br1F/L1R amplificam o DNA das estirpes de P.
carotovorum subsp. brasiliensis e algumas P. carotovorum subsp. carotovorum, a
partir da região intergênica do rDNA (Duarte et al., 2004). O produto de Br1F/L1R
têm potencial para ser usado como sonda para a identificação da subespécie P.
carotovorum subsp. brasiliensis, pois estes oligonucleotídeos iniciadores
amplificam as P. carotovorum subsp. brasiliensis e algumas P. carotovorum
subsp. carotovorum.
A estirpe CEN80 não pode ser identificada em nível de espécie pelos
testes bioquímicos e fisiológicos por apresentar características intermediárias a
28
qualquer espécie (TABELA 4), mas através da PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores 149LF/L1r, Y1/Y2 e ADE1/ADE2, foi possível identificá-la como P.
chrysanthemi. Também, as estirpes BAB20 e CEN06 não tiveram a subespécie
determinada pelos testes bioquímicos e fisiológicos, mas através do perfil de
amplificação com alguns oligonucleotídeos iniciadores sugere-se a identificação
como P. carotovorum subsp. carotovorum, pois não foram obtidos produtos com
Y45/Y46 e ECA1F/ECA1R, para P. carotovorum subsp. atrosepticum, e com
Br1F/L1R para P. carotovorum subsp. bralisiensis. Pelo perfil de amplificações
gerado, com o uso de vários oligonucleotídeos iniciadores, foi possível a
identificação de três isolados que pelos testes bioquímicos e fisiológicos
apresentavam características intermediárias as espécies ou subespécies.
As estirpes Pcbr8, Pcbr371, MB9, MB11, MB12, PMAB19, BAB20,
Pcc1442 e Pca50 tiveram seu DNA amplificado pelos oligonucleotídeos
iniciadores HrpNF/HrpNR, produzindo um fragmento de aproximadamente 350
pb. De todas as P. carotovorum subsp. brasiliensis utilizadas neste estudo,
apenas Pcbr212
T
não teve seu DNA amplificado por HrpNF/HrpNR, e das 16 P.
carotovorum subsp. carotovorum, apenas quatro tiveram seu DNA amplificado por
estes oligonucleotídeos iniciadores (TABELA 5). HrpNF/HrpNR foram
desenvolvidos para amplificar uma seqüência do gene hrpN, derivado de uma P.
carotovorum subsp. carotovorum (Dellagi et al., 2000). O gene hrpN faz parte de
um grupo de mais de 20 genes hrp (Reação de hipersensibilidade e
patogenicidade) presentes em várias bactérias fitopatogênicas, incluindo as
pectobactérias, sendo que várias proteínas secretadas pelo sistema de secreção
Tipo III (sistema Hrp) são requeridas para plenitude da virulência e elicitação da
29
resposta de hipersensibilidade (He, 1998; Rantakari et al., 2001; Bell et al., 2002;
Yang et al., 2002; Lehtimaki et al., 2003).
Todas as subespécies de P. carotovorum tiveram seu DNA amplificado
com RdgF/RdgR, gerando um produto de aproximadametne 1200 pb. Das P.
chrysanthemi apenas a estirpe P16 teve seu DNA amplificado com este par de
oligonucleotídeos iniciadores (TABELA 5). Estes oligonucleotídeos iniciadores
foram desenhados a partir da seqüência do gene rdg que participa da regulação
das pectina liases, derivado de uma P. carotovorum subsp. carotovorum (Dellagi
et al., 2000).
O DNA das estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis, P.
carotovorum subsp. atrosepticum e de algumas P. carotovorum subsp.
carotovorum foi amplificado pelo par de oligonucleotídeos iniciadores PnlF/PnlR,
formando um fragmento de aproximadamente 650 pb. Nenhuma estirpe de P.
chrysanthemi teve seu DNA amplificado por PnlF/PnlR (TABELA 5). PnlF/PnlR
amplificam um fragmento do gene pnl (pectina liase) e foram desenvolvidos a
partir da P. carotovorum subsp. carotovorum (Dellagi et al., 2000).
A especificidade dos oligonucleotídeos iniciadores RdgF/RdgR e
PnlF/PnlR para a espécie P. carotovora provavelmente está relacionada com a
estirpe a partir dos quais foram desenvolvidos (P. carotovorum subsp.
carotovorum), indicando que anelam em regiões conservadas de genes
homólogos com cada subespécie (TABELA 5).
Apenas P. carotovorum subsp. atrosepticum (Pca31) e a estirpe BAB20
tiveram seu DNA amplificado por CytR-RdF/CytR-BR, gerando um produto de
aproximadametne 1600 pb (TABELA 5). Estes oligonucleotídeos iniciadores foram
desenvolvidos para amplificar um fragmento de um gene homólogo ao gene cytR,
30
que está relacionado com a produção de poligalacturonase e mobilidade em P.
carotovorum subsp. carotovorum (Matsumoto et al., 2003).
Alguns oligonucleotídeos iniciadores amplificam mais o DNA de alguma
espécie ou subespécie do que outras, podendo ser usados para gerar sondas,
como RdgF/RdgR e PnlF/PnlR para P. carotovorum, HrpNF/HrpNR para P.
carotovorum subsp. brasiliensis e CytR-RdF/CytR-BR para P. carotovorum subsp.
atrosepticum.
Os oligonucleotídeos iniciadores RsmA-F1/RsmA-R1, OutH-Fwd/OutH-
Ver, Rpf-F/Rpf-R e Peh-F/Peh-R não demonstraram nenhum padrão de
amplificação em relação a espécies ou subespécies, amplificando as estirpes de
forma aleatória (TABELA 5). RsmA-F1/RsmA-R1 foram desenvolvidos a partir do
gene rsmA, um dos responsáveis pela regulação da produção das enzimas
pectolíticas, e gerar um produto de 500 pb. OutH-Fwd/OutH-Ver amplificam um
fragmento do gene outH, gerando um fragmento de aproximadamente 700 pb
para a espécie P. carotovorum e um de 500 pb para P. chrysanthemi. Ambos
oligonucleotídeos iniciadores foram gerados a partir de uma P. carotovorum
subsp. carotovorum (Yap et al., 2004). A proteína OutH é uma das 15 codificadas
pelo grupo de genes out, responsáveis pelo sistema de secreção tipo II, via de
saída das enzimas pectinase e celulase da célula bacteriana (Thomas et al.,
1997; Sandkvist, 2001). Rpf-F/Rpf-R foram desenvolvidos a partir de uma P.
carotovorum subsp. carotovorum para amplificar uma seqüência do gene rpf,
responsável pela regulação da produção da protease e celulase, e gera um
produto de aproximadamente 650 pb, (Frederick et al., 1997; Dellagi et al., 2000).
Peh-F/Peh-R foram desenvolvidos para amplificar dois genes (pehR-pehS) que
31
compõem um sistema regulatório da produção da poligalacturonase, gerando um
fragmento de 2500 pb (Flego et al., 2000).
RsmA-F1/RsmA-R1 amplificaram todas as P. carotovorum derivadas
de batata, todas as P. carotovorum subsp. carotovorum derivadas de Dianthus
caryophylus, cenoura e abóbora, mas não amplificaram as P. carotovorum subsp.
carotovorum derivadas de pimenta e mandioquinha. Nenhuma estirpe de P.
chrysanthemi, independente do hospedeiro, foi amplificada com o uso de RsmA-
F1/RsmA-R1. Rpf-F/Rpf-R também apresentaram perfil de amplificação
relacionado com os hospedeiros, onde a maioria dos DNA amplificados foi de
estirpes isoladas de batata. Os outros oligonucleotídeos iniciadores não
mostraram perfil de amplificação relacionado com os hospedeiros (TABELA 5). A
visão emergente é das pectobactérias como um grupo de bactérias distintas,
ecologicamente adaptadas, que interagem com o hospedeiro num nível de
sofisticação como outras bactérias fitopatogênicas (De Boer, 2003).
Alguns oligonucleotídeos iniciadores (HecA-1/HecA-2; Xhem-1/Xhem-2;
E1+/E2+) produziram muitos fragmentos inespecíficos quando submetidos à PCR
com o DNA das espécies e subespécies de pectobactérias. HecA-1/HecA-2 foram
desenvolvidos a partir da seqüência do gene hecA, relacionado com adesão e
agregação, derivado da P. chrysanthemi, e Xhem-1/Xhem-2 foram desenvolvidos
a partir da P. carotovorum subsp. carotovorum para amplificar uma seqüência de
um gene semelhante ao que codifica a proteína hemaglutina da Xylella fastidiosa
(Bell et al., 2002). E1+/E2+ foram desenvolvidos para amplificar a região que
contém os genes ermA, ermBC, ermC e ermG, que codificam para resistência ao
antibiótico eritromicina, de enterobacteriáceas e cocos gram-positivas (Arthur et
al., 1990).
32
Os oligonucleotídeos iniciadores PecS-1/PecS-2 e DNA17/DNA18 não
amplificaram o DNA de nenhuma espécie ou subespécie das pectobactérias, nas
condições em que foram utilizados. PecS-1/PecS-2 foram desenvolvidos a partir
da P. chrysanthemi para amplificar uma seqüência do gene pecS que codifica
para pectinase e celulase (Bell et al., 2002). DNA17/DNA18 amplificam um
fragmento do gene sdaD que codifica para a enzima Dnase de Streptococcus
pyogenes (Podbielski et al., 1996).
Os oligonucleotídeos iniciadores HecA-1/HecA-2, Xhem-1/Xhem-2,
PecS-1/PecS-2 e E1+/E2+ não mostraram especificidade e eficiência com uma
seqüência específica no DNA das pectobactérias testadas, apesar de terem sido
desenhados a partir do DNA de pectobactérias, e E1+/E2+ para amplificar o DNA
de enterobacteriáceas.
Algumas das características selecionadas são comuns para as
espécies e subespécies estudadas, como as relacionadas com enzimas
pectolíticas, reação de hipersensibilidade, sistema de secreção tipo II, entretanto
alguns dos oligonucleotídeos iniciadores desenvolvidos a partir da P. carotovorum
subsp. carotovorum amplificaram de forma incostante o DNA das estirpes dentro
das espécies ou subespécies de pectobactérias, ou não mostraram resultado
algum, indicando que as estirpes apresentam perfis genéticos diferentes. Diversos
estudos têm mostrado que as pectobactérias são geneticamente distintas,
formando grupos heterogêneos, mesmo dentro das subespécies (Darrasse et al.,
1994; Waleron et al., 2002; Yahiaoui-Zaidi et al., 2003). Além disto, para cosntatar
que estes oligonucleotídeos amplificam apenas com o DNA das pectobactérias há
a necessidade de testar estes com outras bactérias pectolíticas.
TABELA 5. Perfil de amplificação da PCR, das estirpes de Pectobacterium chrysanthemi e de P. carotovorum subspp.,
utilizando diferentes oligonucleotídeos iniciadores. Porto Alegre, RS. 2005.
Oligonucleotídeos iniciadores
2
Hospedeiro/
Estirpes
1
149L
3
Y1Y2 Br1 Y45Y46 ECA ADE HrpN Rdg Pnl
RsmA
OutH Rpf PehR/S CytR
Identificação
bioquímica
Batata
Pcbr212
T
+ (3)
+ (2) + (2)
4
- (2) - (2) - (2)
-
(3)
+ (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2)
Pcbr
Pcbr8
+ (3)
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2)
Pcbr
Pcbr371
+ (3)
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2)
Pcbr
MB9
+ (2)
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2) - (2)
Pcbr
MB11
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2) + (2) - (2) - (2)
Pcbr
MB12
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcbr
PMAB19
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2)
Pcc
MPB8
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
-
(2)
+ (2)
-
(2)
+ (2)
+
(2)
+
(2) - (2) - (2)
Pcc
BAB20
+ (2) + (2)
-
(2)
- (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2) + (2) + (2) + (2)
Pc
Pca05
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) - (2) + (2) + (2) - (2)
Pcc
Pca06
+ (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) - (2) + (2) - (2) - (2)
Pcc
Dianthus
caryophylus
Pcc1442
+ (3)
+ (2)
+
(2)
- (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) + (2) + (2) - (2) + (2) - (2)
Pcc
Pimenta
AG8
+ (3)
+ (2)
-
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
AG29
+ (2)
+ (2)
-
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
Cenoura
CEN06
+ (2) + (2) - (2)
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
+
(2)
+ (2)
-
(2) + (2)
-
(2) - (2)
Pc
Abóbora
-
(2)
Abob65
+ (2) + (2) + (2)
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
-
(2)
+ (2) - (2)
+
(2)
-
(2) - (2)
Pcc
Mandioquinha
Pca41
+ (2) + (2)
+
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
-
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
Pca46
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
+
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
Pca47
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
-
(2)
- (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
Pca48
+ (3)
+ (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
Pca50
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
P41
+ (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pcc
33
34
Continuação TABELA 5. Perfil de amplificação da PCR, das estirpes de Pectobacterium chrysanthemi e de P. carotovorum
subspp., utilizando diferentes oligonucleotídeos iniciadores. Porto Alegre, RS. 2005.
Oligonucleotídeos iniciadores
2
Hospedeiro/
Estirpes
1
149L
3
Y1Y2 Br1 Y45Y46 ECA ADE HrpN Rdg Pnl
RsmA
OutH Rpf PehR/S CytR
Identificação
bioquímica
Batata
Pca31
+ (3) + (2) - (2) + (3) + (3) - (2) - (2) + (2) + (2) + (2) - (2) - (2) - (2) + (2)
Pca
Cenoura
CEN14
+ (2) Pch
4
- (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2) - (2)
Pch
CEN80
+ (2) Pch - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
P
Mandioquinha
P16
+ (2) Pch - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) + (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
Pch
C14
+ (2) Pch - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
Pch
C16
+ (2) Pch - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
Pch
151
+ (2) Pch - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2) - (2) + (2) - (2) - (2) - (2)
Pch
1
Pca, P. carotovorum subsp. atrosepticum; Pcbr, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis; Pcc, P. carotovorum subsp. carotovorum; Pch, P.
chrysanthemi; Pc, P. carotovorum; P, Pectobacterium.
2
149L, região IGS do rDNA; Br1, região IGS do rDNA; Y1Y2, pectato liase; Y45Y46, pectato liase; ADE, pectato liase; ECA, fragmento obtido por RFLP;
HrpN, reação de hipersensibilidade; Rdg, pectina liase ;Pnl, pectina liase; RsmA, regulação das exoenzimas; OutH, sistema de secreção tipo II; Rpf,
regulação da celulase e protease; PehR/S, regulador/sensor poligalacturonase; CytR, repressor poligalacturonase.
3
Difere Pc de Pch pelo tamanho dos fragmentos: Pc: 450 e 490; Pch: 356 e 491.
4
Número de vezes que foi realizada a PCR.
34
35
Num teste preliminar, outros nove isolados de P. carotovorum subsp.
brasiliensis (PcbrMB1, PcbrMB2, PcbrBAPB6, PcbrPPR3, PcbrPPR9, PcbrPPT12,
PcbrCBR3, PcbrCBC1, PcbrCBC2), foram testados com os oligonucleotídeos
iniciadores HrpNF/HrpNR, CytR-RdF/CytR-BR, OutH-Fwd/OutH-Ver e RsmA-
F1/RsmA-R1. Estes isolados são provenientes de tubérculos de batata-semente,
e já haviam sido identificados por testes bioquímicos e fisiológicos, e pela PCR
com os oligonucleotídeos iniciadores 149LF/L1r da região IGS que separam P.
carotovorum de P. chrysanthemi; Br1F/L1R. da região IGS, específicos para P.
carotovorum subsp. brasiliensis e algumas estirpes de P. carotovorum subsp.
carotovorum; e ECA1F/ECA1R específicos para P. carotovorum subsp.
atrosepticum (El Tassa & Duarte, 2004).
Os oligonucleotídeos iniciadores HrpNF/HrpNR amplificaram o DNA de
quatro dos nove isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis (FIGURA 1A),
totalizando 60% dos isolados com DNA amplificado por este par de
oligonucleotídeos iniciadores.
CytR-RdF/CytR-BR não amplificaram o DNA de nenhum dos isolados
de P. carotovorum subsp. brasiliensis, mas amplificaram a P. carotovorum subsp.
atrosepticum Pca31, mostrando especificidade para esta estirpe (FIGURA 1B).
O par de oligonucleotídeos iniciadores OutH-Fwd/OutH-Ver amplificou
o DNA de quatro isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis (FIGURA 1C),
totalizando 53% dos isolados com DNA amplificado.
RsmA-F1/RsmA-R1 amplificaram o DNA de todas os isolados e P.
carotovorum subsp. brasiliensis testados (FIGURA 1D), mantendo a
especificidade ao hospedeiro batata mostrada anteriormente (TABELA 5).
36
FIGURA 1. Amplificações de fragmentos de DNA de Pectobacterium. carotovorum subsp.
brasiliensis usando: A) oligonucleotídeos iniciadores HrpNF/HrpNR, para o
gene hrpN (reação de hipersensibilidade e patogenicidade). M, marcador 1
Kb plus; 1, MB1; 2, MB2; 3, BAPB6; 4, PPR3; 5, PPR9; 6, PPR12; 7, CBR3;
8, CBC1; 9, CBC2; 10, Pcbr212
T
; 11, Pcbr8. B) oligonucleotídeos iniciadores
CytR-RdF/CytR-BR, para gene homólogo ao gene cytR (produção de
poligalacturonase e mobilidade). M, marcador 1 Kb plus; 1, MB1; 2, MB2; 3,
BAPB6; 4, PPR3; 5, PPR9; 6, PPR12; 7, CBR3; 8, CBC1; 9, CBC2; 10,
Pcbr212
T
; 11, Pca31. C) oligonucleotídeos iniciadores OutH-Fwd/OutH-Ver,
para o gene outH (sistema de secreção tipo II). M, marcador 1Kb plus; 1,
MB1; 2, MB2; 3, BAPB6; 4, PPR3; 5, PPR9; 6, PPR12; 7, CBR3; 8, CBC1; 9,
CBC2; 10, Pcbr212
T
; 11, Pca31. D) oligonucleotídeos iniciadores RsmA-
F1/RsmA-R1, para o gene rsmA (regulação da produção das enzimas
pectolíticas). M, marcador 1Kb plus; 1, MB1; 2, MB2; 3, BAPB6; 4, PPR3; 5,
PPR9; 6, PPR12; 7, CBR3; 8, CBC1; 9, CBC2; 10, AG8; 11, Pcbr212
T
. Porto
Alegre, 2006.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A
B
C
D
350
p
b
1600
p
b
700
p
b
500
p
b
37
Uma matriz de sondas de DNA, que identifique por coeficiente de
similaridade as diferentes pectobactérias, assim como ocorre com os testes
bioquímicos e fisiológicos, pode ser formada com diversas características
fenotípicas ou genotípicas. Através do padrão de amplificação de diferentes
oligonucleotídeos iniciadores pode-se formar um perfil para cada espécie e
subespécie para compor a matriz. Na construção de arranjos de sondas de DNA,
ao invés de poucas características, milhares de características podem ser
utilizadas. Testando um número maior de características e também de indivíduos
de cada espécie e subespécie pode-se chegar a matriz de identificação das
pectobactérias, onde o próximo passo seria testar estas como sondas de DNA
para a construção de um arranjo de DNA.
A análise do dendograma indicou diferenças entre as subespécies de
pectobactérias analisadas. Com exceção de P. carotovorum subsp. carotovorum,
as demais subespécies formaram grupos homogêneos com alta similaridade
intraespecífica.
A formação de dois grupos distintos, com similaridade de 28%, foi
evidenciada, sendo que um dos grupos pode ser dividido em subgrupos (FIGURA
2). O grupo I é dividido em quatro subgrupos, no IA estão as estirpes de P.
carotovorum subsp. brasiliensis, com similaridade de 88 % e duas P. carotovorum
subsp. carotovorum, no IB estão quatro estirpes de P. carotovorum subsp.
Carotovorum e as duas estirpes que não tiveram a subespécie determinada
(CEN06 e BAB20) pelos testes bioquímicos e fisiológicos, no IC estão as
restantes P. carotovorum subsp. carotovorum e no ID está a P. carotovorum
subsp. atrosepticum (FIGURA 2).
38
O grupo II contém as cinco estirpes de P. chrysanthemi e a estirpe que
não tinha a espécie determinada (CEN80) pelos testes bioquímicos e fisiológicos,
com 78 % de similaridade entre as estirpes (FIGURA 2).
Neste estudo pode-se observar uma alta similaridade entre as estirpes
de cada subespécie, com exceção de P. carotovorum subsp. carotovorum que
mostrou uma alta variabilidade, não sendo possível evidenciar um grupo
específico para esta subespécie, por formar dois grupos distintos e estar presente
no grupo das P. carotovorum subsp. brasiliensis. Diversos trabalhos têm mostrado
que P. carotovorum subsp. carotovorum é um grupo heterogêneo, que pode ser
dividido em mais de 50 sorogrupos, e possui uma alta diversidade genética
(Hélias et al., 1998; Yahiaoui-Zaidi et al., 2003).
Este comportamento sugere a identificação de um grupo muito maior
de espécies de Pectobacterium, fato que poderá ser mais fácil e rapidamente
constatado se macro ou microarranjos de DNA, com centenas ou milhares de
sondas, estiverem disponíveis como teste de rotina para a identificação deste
grupo de bactérias fitopatogênicas.
39
Coeficiente de similaridade
FIGURA 2. Dendograma gerado pelo método UPGMA usando o coeficiente de
similaridade DICE a partir da análise do perfil de amplificação de 29
pectobactérias. Porto Alegre, 2006.
Pcbr212
Pcbr8
Pcbr371
PMAB19
Pcc1442
MB9
MB11
MB12
MPB8
Abob65
Pca05
Pca06
CEN06
BAB20
AG8
AG29
Pca46
Pca48
P41
Pca50
Pca41
Pca47
Pca31
CEN14
CEN80
151
C14
C16
P16
0
,
2 0
,
4 0
,
6 0
,
8 1
,
0
I
A
IB
IC
ID
II
5. CONCLUSÕES
Baseado nos resultados obtidos nas condições em que esta pesquisa
foi conduzida, conclui-se o seguinte:
1) O perfil gerado pela amplificação com oligonucleotídeos iniciadores indica
que é possível a identificação das pectobactérias através de uma matriz de
características.
2) Através do perfil de amplificação dos DNA das estirpes com os
oligonucleotídeos iniciadores é possível a identificação de isolados que
apresentam características atípicas pelos testes bioquímicos e fisiológicos.
3) As características bioquímicas e fisiológicas podem indicar regiões
genômicas com especificidade capaz de permitir a construção de macro ou
microarranjos de DNA que facilite a classificação das estirpes de
pectobactérias.
4) Os oligonucleotídeos iniciadores RdgF/RdgR, PnlF/PnlR e CytR-RdF/CytR-
BR podem auxiliar na detecção de espécies ou subespécies de
pectobactérias.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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